CN112236162A - 用于裂解选择性癌细胞的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种引起选择性癌细胞坏死、膜溶解或穿孔的方法。在一些方面，所述方法包括给选择性癌细胞施用包括序列为PPLSQUETFSDLLWKLL‑KKWKMRRNQFVKVQRG或ETFSDLLKLL‑KKMRRNQFVKVQRG的肽，以引起所述选择性癌细胞的坏死、膜溶解或穿孔。

Description

用于裂解选择性癌细胞的组合物
交叉引用
本申请要求2018年4月6日向美国专利商标局提交的、申请号为62/653,808的美国临时申请的优先权，并通过引用将其全部内容合并与此。
技术领域
本发明涉及有效治疗多种类型的癌症的方法。具体而言，本发明涉及通过引起选择性癌细胞坏死、膜溶解或穿孔来治疗癌症的方法。
背景技术
最近开发了靶向癌细胞内p53-HDM2蛋白相互作用的癌症治疗方法。然而，一些类型的癌细胞中不含有p53基因，而有些类型的癌细胞以突变形式和/或无活性的形式表达p53。由于这些类型的癌症不会导致癌细胞死亡，使得靶向p53的癌症治疗方法受到限制，因此，靶向p53的癌症治疗方法对于多种类型的癌症无效。
发明内容
一方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括给受试者施用有效治疗量的含有HDM-2靶向组分和膜驻留组分的组合物，其中所述癌症选自：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。
另一方面，本发明提供了引起选择性癌细胞坏死或膜溶解的方法，包括提供含有至少一种癌细胞和至少一种正常细胞的多种细胞，向所述细胞施用含有HDM-2靶向组分和膜驻留组分的组合物，并且，其中所述肽引起所述癌细胞坏死或膜溶解，但不影响所述正常细胞；其中所述癌症选自：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。
另一方面，本发明提供了引起选择性癌细胞坏死或穿孔的方法，包括提供含有至少一种癌细胞和至少一种正常细胞的多种细胞，向所述细胞施用含有HDM-2靶向组分和膜驻留组分的组合物，并且，其中所述组合物引起所述癌细胞坏死或穿孔，但不影响所述正常细胞；其中所述癌症选自：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。
附图说明
图1描述了流式细胞术数据，显示了两种急性髓细胞性白血病细胞系[图1A：人急性髓系白血病细胞(OCI-AML)，图1B：人髓系白血病单核细胞(THP-1)]表面上的HDM2。两个荧光峰(绿色和红色)的分离揭示了在急性髓细胞性白血病细胞表面存在HDM2。
具体实施方式
本发明涉及某些含有HDM-2靶向组分和膜驻留组分的组合物的选择性作用机制；当对选择性癌细胞和正常非癌细胞施用时，引起选择性癌细胞坏死，但正常非癌细胞不受影响。这一惊人的结果带来了治疗癌症的新方法的发明，以及本发明中用于治疗癌症的组合物。更具体地，本发明涉及治疗癌症的方法以及用于癌症治疗的合成肽、非肽与结合分子的组合物，其中将本文所述的合成肽、非肽与结合分子施用于正常非癌细胞和癌细胞的混合物时，仅选择性地破坏恶性细胞和转化细胞。
在一个实施方式中，本发明包括治疗有需要的受试者的选择性癌症的方法，包括向受试者施用有效治疗量的含有HDM-2靶向组分和膜驻留组分的组合物。
本文所述选择性癌症包括急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。
在一种实施方式中，选择性癌症包括乳腺癌亚型，包括导管原位癌(DCIS)、浸润性导管癌(IDC)；IDC型，包括：乳腺小管癌、乳腺髓样癌、乳腺粘液癌、乳腺乳头状癌、乳腺筛状癌、浸润性小叶癌(ILC)、炎性乳腺癌、小叶原位癌(LCIS)、男性乳腺癌、乳腺癌的分子亚型、乳腺佩吉特病、乳腺叶状肿瘤、以及转移性乳腺癌。
包括鲁米那A型的乳腺癌的激素受体阳性(雌激素受体和/或孕激素受体阳性)，人类表皮生长因子受体-2(HER2)阴性，Ki-67蛋白水平低，有助于控制癌细胞的生长速度。
鲁米那B型乳腺癌为激素受体阳性(雌激素受体和/或孕激素受体阳性)，HER2阳性或HER2阴性，且Ki-67水平高。
三阴性/基底样乳腺癌是激素受体阴性(雌激素受体和孕激素受体阴性)和HER2阴性。这种类型的癌症在BRCA1基因突变的女性中更常见。
富含HER2的乳腺癌为激素受体阴性(雌激素受体和孕激素受体阴性)，HER2阳性。
在另一种实施方式中，选择性癌症包括结肠癌亚型，所述结肠癌亚型包括腺癌(癌症细胞排列在结肠内表面)、类癌(起源于肠中产生激素的细胞)、胃肠间质瘤(在结肠中发现的间质瘤)、淋巴瘤(起源于结肠)和遗传性结肠癌。
在另一种实施方式中，选择性癌症包括卵巢癌亚型，所述卵巢癌亚型包括卵巢上皮癌、生殖细胞肿瘤、卵巢性索间质肿瘤、卵巢肉瘤、克鲁肯伯格肿瘤、卵巢囊肿和复发性卵巢癌。卵巢上皮癌的实例包括原发性腹膜癌和输卵管癌。卵巢生殖细胞肿瘤包括畸胎瘤、无性细胞瘤、卵巢生殖细胞癌和内胚窦瘤。卵巢性索间质肿瘤包括颗粒细胞瘤、卵巢颗粒膜肿瘤和睾丸支持细胞间质肿瘤。卵巢肉瘤发生在卵巢细胞的结缔组织中。它们最常见的亚型是癌肉瘤、腺肉瘤、平滑肌肉瘤和纤维肉瘤。克鲁肯伯格肿瘤是从其他器官(通常是胃肠道)扩散到卵巢的癌症。卵巢囊肿是在卵巢内部形成的充满液体的囊。
在另一种实施方式中，选择性癌症包括胰腺癌与胰腺癌亚型，包括外分泌肿瘤和内分泌肿瘤。外分泌肿瘤包括腺癌、导管腺癌和腺泡腺癌。内分泌肿瘤也称为胰腺神经内分泌肿瘤(PNET)或胰岛细胞肿瘤。内分泌肿瘤的实例包括胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、生长抑素瘤、舒血管肠肽瘤(胰腺瘤，VIPomas)和胰多肽瘤(PPomas)。
在另一种实施方式中，选择性癌症包括黑色素瘤和黑色素瘤亚型，包括浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性色斑型黑色素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤。同样考虑眼黑色素瘤和肛门直肠黑色素瘤。
在另一种实施方式中，选择性癌症包括子宫颈癌和子宫颈癌亚型，包括鳞状细胞癌和在子宫颈上部排列的腺细胞中发展的腺癌。
在另一种实施方式中，选择性癌症包括黑色素瘤和黑色素瘤亚型，包括浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性色斑型黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、结缔组织增生性黑素瘤和肢端雀斑样痣性黑素瘤。
在另一种实施方式中，选择性癌症包括前列腺癌和前列腺癌亚型，包括腺泡腺癌、导管腺癌、移行细胞(或尿路上皮)癌、鳞状细胞癌和小细胞前列腺癌。
在另一种实施方式中，选择性癌症包括肺癌和肺癌亚型，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌，所述非小细胞肺癌包括腺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)和大细胞肺癌。考虑到其他肺癌亚型，包括肉瘤样癌、唾液腺肿瘤和其他未分类的肺部肿瘤。
在另一种实施方式中，选择性癌症包括皮肤癌，所述皮肤癌包括鳞状细胞皮肤癌或基底细胞皮肤癌。在一些实施方式中，皮肤癌可以是原发性皮肤癌。在一些实施方式中，皮肤癌可以是继发性皮肤癌。
在另一种实施方式中，选择性癌症包括毛细胞白血病。毛细胞白血病可能以异常的B淋巴细胞为特征，B淋巴细胞在显微镜下观察呈“毛状”。
如本文所用，选择性癌症包括原发性癌症或转移性癌症。
如本文所用，选择性癌症包括原发性癌症和继发性癌症。
如本文所用，“选择性”癌症是指一种癌细胞类型，其比其他癌细胞类型或正常细胞类型优先坏死、膜溶解或穿孔。例如，本文公开的组合物针对一种癌细胞类型造成的坏死、膜溶解或穿孔相比于另一种癌细胞类型或正常细胞类型可超过1倍，例如大于2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或1000倍。
如本文所用，“正常细胞类型”是指非癌细胞类型。
HDM-2靶向组分
在一种实施方式中，HDM-2靶向组分是对HDM-2具有选择性的肽。所述肽可以通过本领域已知的任何方法合成。此外，所述肽可以在N-末端或C-末端包含能够与小分子或肽结合的官能团。在该实施方式中，肽可以包括亚炔基、烷氧基、叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、亚胺基酯、碳化二亚胺、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物和重氮甲烷(diazirine)。
适用于上述结合的官能团和结合反应的实例包括:
Figure BDA0002766656110000041
这种结合方法在本领域中是已知的。例如，Hermanson BioconjugateTechniques，第三版(2013)(ISBN-10:0123822394)中所述；其内容通过引用并入本文。
表1 HDM-2结合肽。
Figure BDA0002766656110000042
Figure BDA0002766656110000051
在一种实施方式中，HDM-2靶向组分是抗体或抗体片段。在一种实施方式中，HDM-2靶向组分是对HDM-2具有选择性的抗体。在一种实施方式中，抗体片段是对HDM-2具有选择性的抗体片段。例如，抗体片段包括单链抗体(scFv)、单域抗体(sdAb)、双单链抗体(di-scFv)。单域抗体是单结构域抗体。单链抗体包括抗体的VH和VL结构域，并通过接头连接。双单链抗体包括通过接头连接的两个单链抗体分子。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一种实施方式中，抗体对HDM-2的表面暴露部分具有选择性。在一种实施方式中，抗体对HDM-2的p53结合位点具有选择性。在一种实施方式中，抗体对HDM-2的残基1-109、1-50、25-75、50-109具有选择性。
在另一种实施方式中，抗体是骆驼来源单域抗体或其一部分。在一种实施方式中，骆驼来源单域抗体包括在骆驼科动物中发现的重链抗体，或VHH抗体。骆驼科动物(例如骆驼、单峰骆驼、骆马和羊驼)的VHH抗体是指骆驼科动物单链抗体的可变片段(参见Nguyen等，2001；Muyldermans，2001)，并且还包括骆驼科动物分离的VHH抗体、骆驼科动物的重组VHH抗体或骆驼科动物的合成VHH抗体。
如本文所用，抗体包括抗体片段。
在另一种实施方式中，HDM-2靶向组分是小分子。
在一种实施方式中，HDM-2结合组分是
Figure BDA0002766656110000061
其中R1、R1.1、R2和R2.1分别任选为H、卤素、低级亚烷基、低级亚烯基或低级亚炔基，并且当R1或R2在对位时，R1或R2不为溴；
R3、R4和R5独立地为H、卤素、低级亚烷基、低级亚烯基、低级亚炔基、烷氧基、叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、酰亚胺酯、碳化二亚胺、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物或重氮甲烷(diazirine)、
Figure BDA0002766656110000062
其中R6和R7独立地为H、卤素、低级亚烷基、低级亚烯基、低级亚炔基、烷氧基或
Figure BDA0002766656110000071
R6.1为H、卤素、低级亚烷基、低级亚烯基、低级亚炔基；A、D、E、G和J独立地为1、2、3、4或5。
在一种实施方式中，R3、R4、R5、R6或R7包括允许与膜驻留组分结合的官能团。这些官能团在本领域中是已知的。例如，官能团包括亚炔基、烷氧基、叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、酰亚胺酯、碳化二亚胺、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物和重氮甲烷(diazirine)。在一种实施方式中，R6为C2H5O。
在一种实施方式中，R3、R4、R5、R6或R7与本文所述的MRC连接或结合。
上述分子可以通过本领域已知的任何方法合成。参见，例如Vassilev等,科学杂志(Science),2004年2月6日；303(5659):844-8；和Zhao等，BioDiscovery 2013。
在一种实施方式中，上述分子可以与膜驻留组分多肽上的N-末端、C-末端、赖氨酸、半胱氨酸或酪氨酸结合。在该实施方式中，膜驻留组分多肽或者本文公开的任何多肽可以在N-末端、C-末端含有额外的赖氨酸、半胱氨酸或酪氨酸残基。
小分子HDM-2靶向组分的实例包括
Figure BDA0002766656110000072
膜驻留组分
在一种实施方式中，膜驻留组分(MRC)是肽或膜驻留肽(MRP)。在一种实施方式中，如上所述，MRP可以包括允许与小分子HDM-2靶向组分结合的官能团。
表2膜驻留肽。
Figure BDA0002766656110000073
Figure BDA0002766656110000081
在一种实施方式中，MRC为小分子。例如，MRC为
Figure BDA0002766656110000091
其中L与HDM-2靶向组分连接或结合；n为0，1，2，3，4，5，6或7；在一种实施方式中，n是介于0和100之间的偶数。
当L为(Z)mNR15R16，其中Z为烃基且m为0或1时，L可以是能够与类似官能化分子结合或能与L反应的官能团；其中R15和R16各自独立地为H、CO(CH2)jQ1或C＝S(NH)(CH2)kQ2，其中j和k各自独立地为0、1、2、3、4或5，Q1和Q2各自独立地选自COOH、生色团
Figure BDA0002766656110000092
R8、R9、R10和R11各自独立为
Figure BDA0002766656110000093
其中Y是亚烷基、亚烯基或亚炔基，它们各自可以任选被一个或多个取代基取代，所述取代基选自烷基、卤素、CF3、OH、烷氧基、NH2、CN、NO2和COOH；W不存在或为O、S或NH；R17、R18、R19和R20各自独立地选自H、烷基、芳基和保护基团P1。保护基团为本领域公知。适宜的保护基团的实例包括叔丁氧羰基(BOC)。
在一种实施方式中，R8、R9、R10和R11各自为
Figure BDA0002766656110000101
R12为
Figure BDA0002766656110000102
其中
R13和R14各自独立为
Figure BDA0002766656110000103
其中Y为亚烷基、亚烯基或亚炔基，它们各自可以任选被一个或多个选自烷基、卤素、CF3、羟基、烷氧基、NH2、CN、NO2和COOH的取代基取代；W不存在或为O、S或NHR17、R18、R19和R20各自独立地选自H、烷基、芳基和保护基团P1。
上述分子可以应用本领域已知的任何方法合成。例如，参见，Okuyama等，NatureMethods，2007年1月。
在另一种实施方式中，膜驻留组分包括被构造为与式I或式II化合物结合的多肽。在该实施方式中，多肽可以包括亚炔基、烷氧基、叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、酰亚胺酯、碳化二亚胺、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物和重氮甲烷(diazirine)。
HDM-2和MRC
如上所述的HDM-2靶向组分和MRC共价连接。它们可以直接连接或通过接头连接。本文公开的组合物被定义为含有与MRC或MRP结合或共价连接的HDM-2靶向组分的组合物。
本发明的肽包括HDM-2靶向组分和膜驻留组分(MRP)。在HDM-2靶向组分是多肽的情况下，它可以结合到MRP的N-末端或C-末端。
本发明的肽可包括，例如，PNC-27和PNC-28。HDM-2靶向组分可以是如与HDM-2结合的p53的残基。PNC-27和PNC-28为均来源于人双微体结合结构域(HDM-2)的p53衍生肽的实例，它们与MRP相连。这些肽诱导癌症肿瘤细胞坏死，但不诱导正常细胞。尽管本发明的各种方法包括其用途和应用，但是特别针对人胰腺癌对PNC-28(p53 aa17-26-MRP)的抗癌活性和机制进行了研究。
在上述作用中，MRC是必要的，因为癌细胞中无MRC的裸p53序列的表达导致野生型p53依赖性细胞的凋亡或细胞程序性死亡，而不是肿瘤细胞坏死。
在一种实施方式中，膜驻留组分(MRC)是膜驻留肽(MRP)。优选地，MRP主要包括带正电荷的氨基酸残基，因为带正电荷的前导序列可以稳定目标肽的α螺旋。在Futaki,S.等，(2001)Arginine-Rich Peptides,J.Biol.Chem.276，5836-5840中描述了可用于本发明的HDM-2靶向组分的MRPs的实例，包括但不限于表2中列出的膜驻留肽。所述膜驻留肽可以是例如具有SEQ ID NO：25-47中的序列的肽。在大多数序列表的大多数实施例和表2中，在组分名称之前标示组成MRP的氨基酸残基的编号。
在一种实施方式中，HDM-2靶向组分多肽和MRP可以单独稳定存在。
表3
Figure BDA0002766656110000111
在一种实施方式中，HDM-2靶向组分和MRC是小分子。例如，以下结构是结合到MRC的小分子HDM-2靶向组分的实例。
Figure BDA0002766656110000121
在另一种实施方式中，如上所述，HDM-2靶向组分为抗体，而MRC为肽(MRP)。MRP的C-末端或N-末端可以与HDM-2靶向抗体结合。
在另一种实施方式中，如上所述，HDM-2靶向组分为抗体，而MRC为小分子。
在另一种实施方式中，HDM-2靶向组分为肽，而MRC为小分子。
在另一种实施方式中，HDM-2靶向组分为小分子，而MRC为肽(MRP)。
HDM-2靶向组分和MRC可以通过接头连接。接头可以是肽接头、大分子接头、化学接头或聚合物接头。
肽接头的最大长度可以为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50或100个氨基酸残基。肽接头可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25或50个氨基酸残基。
在一种实施方式中，接头是聚谷氨酸(PGA)。
其他适宜接头的实例包括聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇可以是支链或直链的，并且每个聚乙二醇可以具有约200至100000道尔顿的分子量。在一种实施方式中，聚乙二醇的最小分子量为400、500、1000、2500、5000或10000。在一种实施方式中，聚乙二醇的最大分子量为1000、2500、5000、10000、25000、50000、75000或100000。
在一种实施方式中，聚乙二醇包括多臂聚乙二醇。
在一种实施方式中，接头为聚肌氨酸(PSR)聚噁唑啉、聚乳酸、聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)或壳聚糖。
接头可以是HDM-2靶向组分上的官能团和MRC之间的缀合反应的结果。
可以通过许多已知技术合成本发明的合成肽。例如，可以应用最初由Merrifield(1963)在J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154中描述的固相技术来制备肽。其他肽合成技术可以在M.Bodanszky等的Peptide Synthesis与John Wiley和Sons,第二版(1976)以及本领域技术人员容易获得的其他参考文献中找到。多肽合成技术的概述可在J.Stuart和J.S.Young的Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.,(1984)中找到。肽也可以通过固相或溶液方法合成，如The Proteins,Vol.II,3d Ed.,Neurath,H.等,第105-237页，Academic Press,New York,N.Y.(1976)所述。上文的列表中以及在J.F.W.McOmie,Protective Groups in Organic Chemistry,Plenum Press,New York,N.Y.(1973)描述了用于不同肽合成的适宜的保护基团。本发明的肽也可以通过化学或酶切从p53蛋白中的较大部分或p53全长蛋白中制备得到。同样，用于本发明合成肽的膜驻留序列可以通过化学或酶切从产生这种前导序列的较大部分或全长蛋白中制备得到。
可以通过许多现有技术合成本发明的合成小分子。例如，可以应用如下方法合成本发明中的分子。
Figure BDA0002766656110000131
此外，本发明的肽也可以通过重组DNA技术制备。对于大多数用于构建蛋白质的氨基酸而言，一个以上的编码核苷酸三联体(密码子)可以编码一个特定的氨基酸残基。遗传密码的这一特性被称为冗余。因此，许多不同的核苷酸序列可以编码对恶性和转化的哺乳动物细胞选择性致死的特定目标肽。本发明还考虑了脱氧核糖核酸(DNA)分子，其定义了编码基因，即，能够表达从本发明的肽酶切或化学裂解得到的目标肽或嵌合肽的基因。
治疗方法
在一种实施方式中，本文公开的组合物引起选择性癌细胞的坏死、膜溶解或穿孔，而不引起其他癌细胞的坏死或膜溶解。在一种实施方式中，本文公开的组合物引起下列癌症的选择性细胞坏死：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。
术语“有效治疗量”和“有效量”是指足以杀死一种或多种癌细胞的量。治疗反应可以是使用者(例如临床医生将认识的)表现出对治疗产生疗效的任何反应，包括前述症状和替代临床标志物。因此，治疗反应通常是疾病或病症(如癌症)的一种或多种症状的改善或缓解。
本领域普通技术人员无需过量实验即可容易地确定给予受试者本发明的一种组合物时的适宜剂量。通常，医生将确定最适于单个患者的实际剂量，而且它将取决于多种因素，包括所使用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄速率、联合用药、具体病症的严重程度以及接受治疗的个体。本文公开的剂量是一般情况的示例。当然，可以有更高或更低剂量范围的个别情况，均在本发明的范围内。
根据需要，药剂可以以0.01～30毫克/千克体重的剂量给予，例如0.1～10毫克/千克体重，更优选0.1～1毫克/千克体重。在一个示例性实施方式中，将对患者施用10～150毫克/天范围内的一个或多个剂量。
本文所用的术语“受试者”可以指被诊断患有本文所述的一种或多种癌症或处于可发展成本文所述的一种或多种癌症的风险中的患者或患者群体。受试者包括哺乳动物(包括人类)。它们还可以包括需要治疗本文所述癌症的家庭宠物或其他动物。同样，如本文所用，受试者可指包括哺乳动物在内的活体动物，其可通过移植或异种移植而患有癌症，随后可用本发明的方法和组合物进行治疗，或其已发展成本文所述的癌症并需要兽医治疗。此类受试者可包括哺乳动物，例如实验动物，如小鼠、大鼠和其他啮齿动物；猫和狗；猴子、狒狒和其他灵长类动物。
除本文所描述的方法之外，给药过程可以通过各种已知形式进行。本发明组合物的施用可以通过口服、静脉内、动脉内、鼻内、栓剂、腹膜内、肌内、皮内或皮下给药，或者通过输注或植入体内，包括直接注射或植入肿瘤内。当以这些方式给药时，本发明的组合物可以与其他成分如载体和/或佐剂组合。其他成分除了优选为药学上可接受的，对其预期给药有效，优选不降低组合物活性成分的活性，并且优选不影响受试组合物进入细胞之外，本文对其他成分的性质没有限制。本文公开的组合物也可以优选以液体或半液体形式浸渍到透皮贴剂中，或包含在皮下植入物中，所述贴剂或植入物随时间释放有效治疗量的一种或多种本文公开的目标合成肽或组合物。
适于注射的药物形式包括无菌水溶液或分散体系以及用于临时配制无菌注射溶液或分散体系的无菌粉末。在所有情况下，最终的溶液形式必须是无菌的和液态的。典型的载体包括溶剂或分散介质，其包含例如水溶性缓冲液，即生物相容性缓冲液、乙醇、多元醇如甘油、丙二醇、聚乙二醇、适宜的上述载体的混合物、表面活性剂或植物油。可以利用任何本领域公认的技术进行灭菌，包括但不限于过滤或添加抗细菌剂或抗真菌剂。
给药可以包括接触。术语“接触”是指直接或间接将细胞与本文公开的组合物在物理上接近在一起。接触可以在体外或体内进行。例如，可以通过已知技术将本文公开的组合物递送到细胞中，使细胞与组合物接触，如直接显微注射到肿瘤中、将本文公开的组合物注射到受试者的血液中、在包含本文公开的组合物的培养基中孵育细胞。
本发明的组合物以实现其目的的有效量施用于人。本领域技术人员可以容易地确定待施用的组合物的有效量，例如，在临床前试验和临床试验期间通过医生和临床医生熟知的方法。通常每日剂量包括约1mg～1000mg。
可以应用本领域技术人员已知的任何使细胞、器官或组织与药物组合物接触的方法。适宜的方法包括体外、离体或体内方法。体外方法通常包括培养样品。例如，可以将细胞置于容器(如组织培养皿)中，并在适于诱导癌细胞坏死的适当条件下与本文公开的组合物共同孵育。本领域技术人员可以容易地确定适宜的培养条件。
离体方法通常包括从哺乳动物(如人)身上取出细胞、器官或组织。例如，细胞、器官或组织可以在合适的条件下与本文公开的组合物共同孵育。处理过的细胞、器官或组织通常被放回供体、放入受体、或保存以备将来使用。因此，该组合物通常在药学上可接受的载体中。
体内方法通常限于将本文公开的组合物(例如上文所述)施用于哺乳动物，优选为人。本文公开的可用于本发明方法的组合物以有效使癌细胞坏死的量施用于哺乳动物，以治疗哺乳动物的癌症。有效量在临床前试验和临床试验期间通过医生和临床医生熟知的方法确定。
可以通过多种公知的药物组合物的施用方法中的任何一种，将有效量的本文公开的可用于本发明方法的组合物，优选为药物组合物，施用于有此需要的哺乳动物。本文公开的组合物可以全身或局部给药。
用于本发明方法的组合物也可以如本领域公知的缓释方式给予哺乳动物。缓释给药是一种在特定时间内达到一定药物水平的药物递送方式。所述水平通常通过血清或血浆浓度来测量。
药学领域中已知的任何制剂均适于本发明方法的组合物的施用。对于口服给药，可以使用液体制剂或固体制剂。制剂的一些实例包括片剂、胶囊剂(如明胶胶囊)、丸剂、含片、酏剂、混悬剂、糖浆、膜剂(wafers)、口嚼剂等。如本领域技术人员所理解的，本文公开的组合物可以与合适的药物载体(载体)或赋形剂混合。载体和赋形剂的实例包括淀粉、牛奶、糖、某些类型的粘土、明胶、乳酸、硬脂酸或其盐(包括硬脂酸镁或硬脂酸钙)、滑石粉、植物脂肪或油、树胶和乙二醇。
用于本发明方法中的组合物的制剂可以应用常规稀释剂、载体或赋形剂，诸如本领域已知的物质来递送组合物。例如，制剂可以包含下列物质的一种或多种：稳定剂、表面活性剂(优选非离子表面活性剂)，以及任选的盐和/或缓冲剂。组合物可以以水溶液的形式或冻干的形式递送。类似地，盐或缓冲剂可以与本文公开的组合物一起使用。
本发明的组合物可以以治疗有效浓度给药，以标准制剂形式提供给受试者，并且可以包括任何药学上可接受的添加剂，例如赋形剂、润滑剂、稀释剂、调味剂、着色剂、缓冲剂和崩解剂。标准制剂为本领域公知的。如，参见Remington's Pharmaceutical Sciences，第20版，Mach Publishing Company，2000。所述制剂可以通过允许组合物接触癌细胞膜的任何途径以有效的给药剂量单位生产。示例性给药途径包括口服、肠胃外、粘膜、鼻内、硫酸化(insulfation)或透皮途径。胃肠外途径包括静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下、腹膜内、导管内、脑室/心室内(intraventricular)、鞘内、肿瘤内和颅内给药。
本发明的组合物可以以固体或液体口服剂型给药，例如片剂、胶囊剂或液体制剂。所述组合物也可以通过注射给药，如推注或连续输注。所述组合物也可以作为贮库制剂给药，如通过植入或肌肉注射。
本发明的组合物和方法可以与药学上可接受的载体混合或以其他方式组合。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂等。这些介质和试剂的使用在本领域是公知的。
术语“药学上可接受的”指的是生理上可耐受的分子实体和组合物，当施用于受试者，特别是人时，通常不会产生非预期的反应。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中记载可用于动物，更具体地说，可用于人类。术语“载体”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物，组合物可与其一起给药以促进递送。这种药物载体可以是无菌液体，如水和油，或有机组合物。优选应用水或水溶性盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液作为载体，特别是作为注射溶液的载体。
当应用于培养物中生长的细胞时，本文所述的组合物对恶性或转化细胞具有选择性致死性，导致细胞数量呈剂量依赖性减少。这种效应通常在1、2、3、4或5小时内最多48小时或72小时内可以观察到。
本发明的一种或多种方法可以进一步包括确定本文公开的组合物能否降低癌细胞活性的步骤，还包括测量细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)的水平，观察细胞穿孔的形成或膜溶解，或观察细胞在一段时间内的分解。可以通过本领域已知的任何方法来测量细胞坏死水平，包括PCR分析、RT-PCR、Northern印迹、蛋白质印迹、免疫组织化学、ELISA测定和荧光素酶报告基因检测。
在另一种实施方式中，本发明的方法可以进一步包括通过诊断成像(包括核磁共振成像(MRI)、正电子发射断层(PET)扫描和X射线)测量癌症水平来确定本发明的组合物是否引起癌细胞坏死、膜溶解或穿孔的步骤。
在另一种实施方式中，本发明的方法可以进一步包括通过在施用本文公开的组合物之前和之后测量诊断性癌症生物标志物的水平来确定本发明的组合物是否引起癌细胞坏死、膜溶解或穿孔的步骤。
在另一种实施方式中，本发明的方法可以进一步包括通过测量血清生物标志物的水平来确定本发明的组合物是否引起癌细胞坏死、膜溶解或穿孔的步骤。在一种实施方式中，血清生物标志物是乳酸脱氢酶(LDH)、细胞角蛋白或HDM-2。血清生物标志物的水平在施用本文公开的组合物之前和之后测量。治疗前后血清生物标志物的增加表明癌细胞坏死、膜溶解或穿孔。在一种实施方式中，增加大于2倍、大于3倍或大于5倍。
本发明的一种或多种方法可以在一个对象上重复或多次重复。例如，如果受试者患有难治性或复发性癌症，可能是希望重复的。此外，如果在一个治疗周期内或根据联合疗法重复施用较低剂量，则可能需要重复施用。
本发明的组合物和方法可以被设计成具有一个或多个期望的特征。当将该组合物施用于至少一种癌细胞或施用于需要癌症治疗的生物体体内，特别是哺乳动物时，所希望的特征可以导致有效性的提高。
理想地，本发明的肽和组合物可以具有α-螺旋-环-α-螺旋的三维结构或构象。这是已确定的PNC-27和PNC-28的肽基组合物的三维形状。α-螺旋-环-螺旋结构允许组合物利于与癌细胞膜相互作用。
本发明的组合物比合成肽PNC-27和PNC-28具有更高的强度也可能是所期望的。众所周知，基于肽的组合物存在与其分子相关的自然运动。如上所述，产生两亲性结构的α-螺旋-环-α-螺旋是分子的期望构象，其中疏水性氨基酸残基位于分子的一面，而极性残基位于分子的相对面。许多膜活性肽，如蜂毒肽和抗菌肽，尽管与PNC-27的特异性不同，却具有导致细胞膜溶解的必需结构。因此，如果可以给基于肽的组合物施用试剂以增加强度，或者如果本发明可以使用具有相似两亲性结构、具有类似刚性分子大小的非肽(称为肽模拟物)，那么此种构象将更直接地影响癌细胞。Rosal R,Brandt-Rauf P W,Pincus M R,WangH,Mao Y,Fine R L.The role of alpha-helical structure in p53 peptides as adeterminant for their mechanism of cell death:necrosis versus apoptosis.AdvDrug Deliv Rev 2005；57:653-60；Pincus,M.R.(2001)“The Physiological Structureand Function of Proteins”in Principles of Cell Physiology(Chapter 2),第三版,Ed.,N.Sperelakis,Academic Press,New York,第19-42页；3.Dathe,M.和Wieprecht,T.(1999)Structural Features of Helical Anti-Microbial Peptides:Their Potentialto Modulate Activity on Model Membranes and Biological Cells.Biochem.Biochem.Biophys.Acta 1462,71-87。
另一个期望的特征是用于本发明的方法的组合物及作为本发明的组合物具有相对小的尺寸。大分子肽、非肽和大分子肽/非肽组合物的缺点是比小分子更有可能引起免疫反应，而小分子肽在体内可能不会被识别出。因此，与大分子组合物(即大于35个氨基酸(35AA)的蛋白质)相比，小分子(即小于35个氨基酸(35AA)的肽)不太可能引发针对被治疗的生物体免疫系统的免疫反应。优选地，本发明的合成肽组分约为五十(50)个氨基酸或更少。
一般来说，当分子(蛋白质)的大小超过5000D(约>35AA)时，即具有免疫原性，即可以在受体中引起免疫反应。已经发现高达5000D(<35AA)的肽在受体中不引起或仅引起轻微的免疫反应。然而，长期(数月)应用2500D至5000D的肽可能会刺激某些受体的免疫反应(这些受体可能会变得具有免疫性)。本文公开的肽和下文描述的长存留时间构建体(long-life constructs)的大小，均考虑在非免疫原性至临界免疫原性的范围内。考虑到(1)所有PNC肽，包括那些连接有亮蛋白的肽，由于肽酶降解的去除作用，将具有相当短的存留时间(估计为10～30分钟)，以及(2)它们被应用于大多数受免疫抑制的肿瘤患者，产生限制其使用的免疫反应的可能性非常小。
然而，肽的另一个理想特性是具有较长的半衰期。半衰期长的组合物在分解前能够在体内停留更长的时间。因此，具有更长半衰期的组合物可以具有更长的存留时间，从而允许其通过体内运输以杀死更多的癌细胞或在单次施用时治疗位于生物体不同部位的癌症。基于肽的肽类，包括PNC-27和PNC-28，可以在氨基末端包括D-氨基酸被修饰，以减弱分子的肽酶活性。类似地，亮肽素(一种已知的肽酶活性抑制剂)可以连接到PNC-27和PNC-28的羧基末端，以减缓肽酶活性并延长分子的半衰期。此外，可以向本文公开的肽中添加额外的氨基酸残基，以进一步帮助减缓肽酶活性和延长体内半衰期。在一个实施例中，可以在N-末端或C-末端添加1～9个氨基酸残基以增加半衰期。在一种实施方式中，N-末端或C-末端的氨基酸选自缬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸或抑制肽酶的氨基酸衍生物。在一种实施方式中，在N-末端或C-末端的一端或两端上添加精氨酸。
与大多数治疗性肽的情况一样，本发明方法中使用的合成肽可能在原位具有几分钟的半衰期。
在整个说明书中，数量由范围以及范围的上下边界来定义。每个下边界可以与每个上边界组合以定义一个范围。上下边界应该分别视为一个独立的元素。
说明书中提到的所有专利和出版物都表明了本发明所属领域的技术人员的技术水平。本公开中引用的所有参考文献通过引用结合于此。
本领域技术人员将容易理解，本发明非常适于实现所述目的并获得所提及的目的和优点，以及其中固有的目的和优点。本文描述的方法和组合物目前代表优选地实施方式，其是示例性的，并不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员将会想到其中的变化和其他用途，这些都包含在本发明的精神内，由权利要求的范围来限定。
对于本领域技术人员而言，显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本公开的发明进行各种替换和修改。因此，这样的附加实施方式在本发明和以下权利要求的范围内。
示例性描述的本发明可以在本文未具体公开的任何一个或多个组件、限制或约束的情况下适当地实施。因此，例如，在本文的每个实例中，术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个都可以由另外两个术语中的任一个来代替。已经使用的术语和表达方式作为描述性术语而不是限制性的，并且没有意图在使用此类术语和表达方式时，排除所描绘和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应当认识到，在要求保护的本发明的范围内，各种修改是可能的。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施方式具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以应用本文公开的概念的可选特征、修改和变化，并且此类修改和变化被视为在由说明书和所附权利要求限定的本发明的范围内。
此外，在根据马库什组或其他替代的分组来描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，也因此根据马库什组或其他组的任何单个成员或部分成员来描述了本发明。
在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)，术语“一”、“一个”和“所述”以及类似指代物的使用应被解释为涵盖单数形式和复数形式，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意是“包括但不限于”)。除非本文中另有说明，否则本文中列举的数值范围仅旨在用作单独提及落入所述范围内的每个独立数值的简略方法，并且每个独立数值被并入说明书中，如同其在本文中被单独列举一样。除非本文另有说明或者上下文明显矛盾，本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另有要求，本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示任何未要求保护的元素对于实施本发明是必不可少的。
本文描述的本发明的实施方式，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读了前述内容后，那些实施方式的变化对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。发明人期望熟练的技术人员适当地采用这种变化，并且发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实施本发明。因此，本发明包括法律允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同形式。此外，除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素所有可能的变化的任何组合。
通过参考以下实施例描述本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并不旨在以任何方式限制本发明。应用本领域公知的标准技术或下面具体描述的技术。
实施例
实施例1
PNC-27和PNC-28对癌细胞的细胞毒性
PNC-27或PNC-28与6×106个癌细胞(例如Mia-PaCa-2细胞)以0.001～750μM的浓度共同孵育5天。在治疗后的不同时间点，评估细胞的坏死情况，例如膜起泡和破裂，以及形成聚集成细胞碎片聚集体的细胞团块。细胞死亡百分比通过测量台盼蓝染料吸收来确定。癌细胞分别应用阴性对照肽PNC-29和仅具有PNC-27或PNC-28的p53衍生部分的肽(由于该肽缺乏MRP肽而不能穿过细胞膜)作为对照，施用与测试肽相同的浓度。测定这些对照肽对细胞生长、细胞形态和生存力的影响。
作为额外的对照，PNC-27或PNC-28与未转化的BMRPA1腺泡细胞和未转化的乳腺上皮细胞系MCF-10-2A以0.001～750μM的浓度混合，以确定该肽对正常细胞生长是否具有致死性。
检测下列癌细胞的细胞系：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。还考虑上述癌症的特定亚型的细胞系。用于上述癌症的细胞系是本领域普通技术人员公知的。例如，Cal27是用于头颈癌的公知细胞系；OE33是公知的食管癌细胞系；SKNAS是公知的神经母细胞瘤细胞系；HEPG2是公知的肝癌细胞系；UT7、THP-1和OCI-AML是公知的AML细胞系；A172是公知的胶质母细胞瘤细胞系。
实施例2
确定细胞表面上HDM2的细胞外表达的流式细胞(FACS)分析
将细胞与无抗体、正常兔IgG(同种型对照，Santa Cruz Biotechnology，Inc.项目#sc-3888)或兔多克隆抗MDM2/HDM2(克隆号N-20，Santa Cruz Biotechnology，Inc.项目#sc-813)在4℃黑暗中孵育15分钟。然后用2.0mLPBS洗涤细胞，吸出上清液，并向每个试管中加入150μL PBS。将所有细胞与缀合藻红蛋白的山羊抗兔二抗(Santa CruzBiotechnology，Inc.项目号sc-3739)在4℃黑暗中孵育15分钟。用2.0mL PBS洗涤细胞，吸出上清液，并向每个试管中加入350μL PBS。样品立即在BD
Figure BDA0002766656110000211
四色流式细胞仪上使用BD
Figure BDA0002766656110000212
软件进行数据采集和分析。
通过以下条件测试每种细胞系：2°山羊抗兔IgG PE，兔正常IgG和2°山羊抗兔IgGPE，以及抗MDM2/HDM2和2°山羊抗兔IgG PE。
检测下列癌细胞的细胞系：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。用于上述癌症的细胞系是本领域普通技术人员公知的。例如，Cal27是用于头颈癌的公知细胞系；OE33是公知的食管癌细胞系；SKNAS是公知的神经母细胞瘤细胞系；HEPG2是公知的肝癌细胞系；UT7、THP-1和OCI-AML是公知的AML细胞系；A172是公知的胶质母细胞瘤细胞系。
实施例3
应用流式细胞仪分析两种AML细胞系(OCI-AML和THP-1)
使用类似于实施例1.1中描述的方法应用流式细胞术，并且在两种AML细胞系(OCI-AML和THP-1)上观察细胞表面的HDM2。参见图1。
实施例4
PNC-27和PNC-28处理的癌细胞中坏死和凋亡的标志物
细胞死亡可以通过坏死或凋亡来发生。靶向p53的治疗通常通过凋亡导致细胞死亡。坏死不是基因控制的，而凋亡是基因控制的。细胞凋亡是细胞对特定环境和发育刺激或程序性细胞死亡的蓄意反应。经历凋亡的细胞表现出细胞收缩、膜泡化、染色质凝集和断裂。坏死涉及细胞质细胞器的破坏和质膜完整性的丧失。尽管细胞凋亡不具有癌细胞因坏死而死亡时导致的炎症，但靶向p53的治疗不能治疗那些未表达p53的癌症，或者因突变表达出对靶向p53治疗无反应的非活性p53形式的癌症。在半胱天冬酶途径的DNA损伤后，发生了一系列涉及钙激活和钙蛋白酶的事件，这些事件进一步导致其他细胞变化和细胞质酶的调节。在p53依赖性的细胞凋亡过程中，膜联蛋白V结合膜磷酸丝氨酸、Bax wafp21和半胱天冬酶依次表达；这些蛋白质作为p53依赖性凋亡的标志物。
体内细胞坏死和细胞凋亡的主要区别在于，在细胞凋亡中，凋亡细胞在免疫反应出现之前被完全清除。坏死通常会引起免疫反应。尽管凋亡可以被认为是一个干净整洁的过程，靶向p53的治疗并不能在所有类型的癌症病例中引发凋亡。尽管细胞坏死通常可引起靶向HDM-2的治疗部位的免疫反应，但靶向HDM-2的治疗对各种形式的癌症更为有效，包括癌细胞中不存在p53的癌症，或者p53处于突变或失活形式的癌症。
为了确定PNC-27或PNC-28是通过坏死还是通过凋亡诱导细胞死亡，如上所述，通过PNC-27或PNC-28处理的癌细胞中乳酸脱氢酶和半胱氨酸蛋白酶的表达来确定。乳酸脱氢酶的早期释放(乳酸脱氢酶水平的升高)表明细胞坏死。半胱天冬酶水平升高表明细胞凋亡。
对应用PNC-27或PNC-28处理的癌细胞或非癌细胞以及未处理的细胞进行电子显微照相，以确定细胞是否表现出质膜溶解或是否具有完整的质膜。质膜溶解是肿瘤细胞坏死的特征。
实施例5
应用编码PNC-27或PNC-28中p53序列的质粒转染癌细胞。
应用空载体或编码PNC-27或PNC-28中p53序列的绿色荧光蛋白载体转染癌细胞和非癌细胞。转染完成2小时后，使用光学显微镜在载玻片上进行细胞计数，然后对显示绿色荧光蛋白的绿色荧光的细胞数量进行计数。并进行倒置光学显微镜可视化的转染细胞的形态学检查，以鉴别坏死或凋亡的细胞。
用空载体转染的表达绿色荧光蛋白的癌细胞(例如MiApaA-2细胞)，将表达PNC-27或PNC-28中p53序列的载体裂解，并针对p53、wafp21(一种由p53依赖性途径诱导的蛋白质)和p5317-26肽本身进行印迹。在这些实验中，使用了识别含有p53残基17-26的决定簇的DO-1抗p53抗体。此外，测量这些细胞中半胱氨酸蛋白酶的活性。为了进行比较，在用0.001～750μM的PNC-27或PNC-28处理的癌细胞上进行相同的实验。测定半胱氨酸蛋白酶活性和p53的waf21水平。肌动蛋白印迹作为对照。
在细胞凋亡的早期，通常在完整细胞双层膜的内小叶中存在磷脂酰丝氨酸(PS)，发现于经历凋亡的细胞的外质膜上。膜联蛋白V结合PS，可以通过携带红色荧光TRITC探针的探针来定位。将用PNC-27或PNC-28或对照载体的p53序列转染的细胞进行处理，依次用膜联蛋白V-生物素、链霉亲和素-TRITC染色，并通过共聚焦显微镜检查。还进行了BMRPA1对照细胞的对照实验，所述对照细胞被表达PNC-27或PNC-28中p53序列的载体或对照载体转染，并分析这些细胞的膜联蛋白V的表达。
实施例6
应用仅编码PNC-27或PNC-28中p53序列的pTracer-SV40质粒转染细胞
为了明确界定MRP的作用，确定PNC-27或PNC-28中p53肽本身对肿瘤细胞生长的影响，即，即使没有MRP，其是否能诱导肿瘤细胞坏死。使用组成型表达该肽的pTracer-SV40质粒，PNC-27或PNC-28中p53肽通过转染被引入癌细胞。测量转染细胞中凋亡和坏死标志物的表达，并与用PNC-27或PNC-28处理的癌细胞的重复样品中这些标志物的水平进行比较。BMRPA1对照细胞中进行相同实验。
实施例7
PNC-27或PNC-28中p53肽处理的癌细胞的诱导凋亡
在表达PNC-27或PNC-28中p53肽的癌细胞中进行实验。为了确定是否发生凋亡，测定Wafp21的表达。Wafp21水平升高表明细胞凋亡。同时也测定半胱氨酸蛋白酶水平。半胱氨酸蛋白酶水平增加表明细胞凋亡。膜中膜联蛋白V结合磷脂酰丝氨酸的表达水平是细胞凋亡中已知的早期现象，其在PNC-27或PNC-28中p53肽转染的癌细胞以及用空载体转染的细胞中测定。同时测定LDH的释放水平。如果肽诱导肿瘤细胞坏死，则LDH的释放将会增加。
实施例8
PNC-27或PNC-28活性的体内分析
在重20～22g的Nu/Nu小鼠(Harlan Laboratories,Indianapolis,Ind.,n＝10)皮下异种移植活性癌细胞。允许肿瘤扩增生长。对下列活性癌细胞进行检测：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。
肿瘤形成后，将小鼠分为三组。一组小鼠施用PNC-27或PNC-28；第二组小鼠施用PNC-29(一种大小相似的对照肽，具有以下氨基酸序列：MPFSTGKRIMLGE)；第三组小鼠不施用肽。将肽注射到小鼠体内，剂量方案如下所述：在14天的过程中，每只小鼠的总剂量为1、10、20、30和50mg。
由于应用的动物为Nu/Nu小鼠，其免疫受损，因而当暴露于病原体时，小鼠高度敏感。所以，手术及所有术前和术后的治疗均在无菌罩中进行的。
可选地，应用与上述相同的方法，将上述活癌细胞(1×106细胞/小鼠)移植到一组小鼠的腹膜腔中，并在肿瘤细胞移植的同时将本文公开的组合物注射到右肩区域。
实施例9
本发明小分子对癌细胞的细胞毒性
将本发明的小分子与6×106个癌细胞(例如Mia-PaCa-2细胞)以0.001～750μM的浓度共同孵育5天。在治疗后的不同时间点，评估细胞的坏死情况，例如膜起泡和破裂，以及形成聚集成细胞碎片聚集体的细胞团块。细胞死亡百分比通过测量台盼蓝染料吸收来确定。癌细胞分别应用阴性对照肽PNC-29和仅具有HDM-2靶向组分的小分子(由于小分子缺乏MRC而无法穿过细胞膜)处理，施用与测试肽相同的浓度。测定这些对照肽对细胞生长、细胞形态和生存力的影响。
作为额外的对照，将本文公开的小分子与未转化的BMRPA1腺泡细胞和未转化的乳腺上皮细胞系MCF-10-2A以0.001～750μM的浓度混合，以确定该组合物对正常细胞生长是否具有致死性。
检测下列癌细胞的细胞系：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。用于上述癌症的细胞系是本领域普通技术人员公知的。
实施例10
抗HDM-2单克隆抗体的制备、鉴定及人源化
制备表达HDM-2或其片段的细胞，用含有25mM EDTA的磷酸盐缓冲液(PBS)收集，并用于免疫BALB/c小鼠。在第0、2、5和7周，小鼠腹膜内注射约溶解约100(～100)个细胞的0.5mL PBS。在第9周和第13周，给具有免疫沉淀32P标记的HDM-2或其片段的抗血清小鼠腹腔注射小麦胚芽凝集素-琼脂糖凝胶(WGA)纯化的HDM-2膜提取物。然后静脉注射0.1mLHDM-2制剂，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系X63-Ag8.653融合。通过ELISA和放射免疫沉淀筛选杂交瘤上清液中的HDM-2结合物。
使用“基因转化诱变”策略将鼠单克隆抗体人源化，如专利号为NO.5,821,337的美国专利中所述，其公开的全部内容通过引用作为参考。
如Hermanson Bioconjugate Techniques,Third Edition(2013)(ISBN-10:0123822394)中所述，将小分子MRC或肽PRP与抗体偶联。

Claims (24)

1.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括给受试者施用有效治疗量的含有HDM-2靶向组分和膜驻留组分的组合物；
其中，所述癌症选自：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。
2.一种引起选择性癌细胞坏死或膜溶解的方法，包括提供含有至少一种癌细胞和至少一种正常细胞的多种细胞，向所述细胞施用含有HDM-2靶向组分和膜驻留组分的组合物，其中，所述肽引起所述癌细胞坏死或膜溶解，但不影响所述正常细胞；
其中所述癌症选自：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述组合物选自具有以下序列的肽：PPLSQETFSDLWKLL-KKWKMRRNQFWVKVQRG或ETFSDLWKLL-KKWKMRRNQFWVKVQRG。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中所述癌症包括急性髓细胞性白血病。
5.一种引起选择性癌细胞坏死或穿孔的方法，包括提供含有至少一种癌细胞和至少一种正常细胞的多种细胞，向所述细胞施用含有HDM-2靶向组分和膜驻留组分的组合物，其中，所述组合物引起所述癌细胞坏死或穿孔，但不影响所述正常细胞；
其中，所述癌症选自：急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、胆管肿瘤、胆道肿瘤、骨髓异常增生综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞瘤/癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、伯基特B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、头颈癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺肿瘤、胃肠间质瘤(GIST)、表皮样瘤、浆细胞瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。
6.根据权利要求1～2和5中任一项所述的方法；其中HDM-2靶向组分选自具有以下序列的肽:
PPLSQETFSDLWKLL、ETFSDLWKLL、MPRFMDYWEGLN、VQNFIDYWTQQF、TGPAFTHYWATF、IDRAPTFRDHWFALV、PRPALVFADYWETLY、PAFSRFWSDLSAGAH、PXFXDYWXXL、QPTFSDYWKLLP、PPL--TSFXEYWALLX-P、PPLSQTSFAEYWNLL、LTFEHYWAQLTS、TSFAEYWNLLSP、QETFSDLWKLLP、MPRFMDYWEGLN、QQMHLMSYAPGP、TIRPSTTMDSPT、YANPQMEKAFES、LTFEHYWAQLTS、LPNLTWALMPGA、YANPQMEKAFAS、LTFEHYWAQLTS和LLADTTHHRPWT。
7.根据权利要求1～2和5中任一项所述的方法；其中HDM-2靶向组分包括：
Figure FDA0002766656100000021
其中R1、R1.1、R2和R2.1分别任选为H、卤素、低级亚烷基、低级亚烯基或低级亚炔基，并且当R1或R2在对位时，R1或R2不为溴；
R3、R4和R5独立地为H、卤素、低级亚烷基、低级亚烯基、低级亚炔基、烷氧基、叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、酰亚胺酯、碳化二亚胺、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物或重氮甲烷、
Figure FDA0002766656100000031
其中R6和R7独立地为H、卤素、低级亚烷基、低级亚烯基、低级亚炔基、支链或直链烷氧基或
Figure FDA0002766656100000032
R6.1为H、卤素、低级亚烷基、低级亚烯基、低级亚炔基，支链或直链；A、D、E、G和J独立地为1、2、3、4或5。
8.根据权利要求1～2、5～6中任一项所述的方法，其中所述膜驻留组分选自具有以下序列的肽:
KKWKMRRNQFWVKVQRG、MPFSTGKRIMLGE,YGRKKRRQRRRPPQ、GRKKRRQRRRPPQ、GAAAAAAAAAPPQ、PKKKRKV、KRPAAIKKAGQAKKKK、TRQARRNRRRRWRERQR、RRRRNRTRRNRRRVR、KMTRAQRRAAARRNRWTAR、TRRQRTRRARRNR、KLTRAQRRAAARKNKRNTR、NAKTRRHERRRKLAIER、MDAQTRRRERRAEKQAQWKAAN、TAKTRYKARRAELIAERR、TRRNKRNRIQEQLNRK、SQMTRQARRLYV、KRRIRRERNKMAAAKSRNRRRELTDTRIKAERKRMRNRIAASKSRKRKLERIAR、KRARNTEAARRSRARKLQRMKQ,KLALKLALKALKAALKLA、LLIILRRRIRKQAKAHSK或RRRRRRRR。
9.根据权利要求1～2、5～7中任一项所述的方法；其中所述膜驻留组分包括
Figure FDA0002766656100000041
其中L与HDM-2靶向组分连接；n为0，1，2，3，4，5，6或7；其中，n是介于0和100之间的偶数；
R8、R9、R10和R11各自独立为
Figure FDA0002766656100000042
其中Y是亚烷基、亚烯基或亚炔基，它们各自可以任选被一个或多个取代基取代，所述取代基选自烷基、卤素、CF3、OH、烷氧基、NH2、CN、NO2和COOH；W不存在或为O、S或NH；R17、R18、R19和R20各自独立地选自H、烷基、芳基和保护基团P1；
R12为H、卤素、低级亚烷基、低级亚烯基、低级亚炔基、支链或直链烷氧基或
Figure FDA0002766656100000043
其中
R13和R14各自独立为
Figure FDA0002766656100000051
其中Y为亚烷基、亚烯基或亚炔基，它们各自可以任选被一个或多个选自烷基、卤素、CF3、羟基、烷氧基、NH2、CN、NO2和COOH的取代基取代；W不存在或为O、S或NH；R17、R18、R19和R20各自独立地选自H、烷基、芳基和保护基团P1。
10.根据权利要求6～9中任一项的方法，其中所述癌症选自急性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤或胶质母细胞瘤。
11.一种引起急性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤或胶质母细胞瘤细胞坏死、穿孔或膜溶解的方法，所述方法包括：
给多种细胞施用具有PPLSQETFSDLWKLL-KKWKMRRNQFWVKVQRG或ETFSDLWKLL-KKWKMRRNQFWVKVQRG序列的肽；
其中所述多种细胞包括至少一种正常细胞和一种选自急性髓细胞性白血病细胞、多发性骨髓瘤细胞或胶质母细胞瘤细胞的癌细胞。
12.一种引起乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、宫颈癌和肺癌的癌症亚型细胞坏死、穿孔或膜溶解的方法，所述方法包括：
给多种细胞施用具有PPLSQETFSDLWKLL-KKWKMRRNQFWVKVQRG或ETFSDLWKLL-KKWKMRRNQFWVKVQRG序列的肽；
其中所述多种细胞包括至少一种正常细胞和一种选自乳腺癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、黑色素瘤细胞、宫颈癌细胞和肺癌的癌细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：
选自导管原位癌(DCIS)、浸润性导管癌(IDC)的乳腺癌亚型；IDC型：乳腺小管癌、乳腺髓样癌、乳腺粘液癌、乳腺乳头状癌、乳腺筛状癌、浸润性小叶癌(ILC)、炎性乳腺癌、小叶原位癌(LCIS)、男性乳腺癌、乳腺癌的分子亚型、乳腺佩吉特病、乳腺叶状肿瘤、以及转移性乳腺癌。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：
乳腺癌分子亚型，选自：鲁米那A型乳腺癌、鲁米那B型乳腺癌、三阴性/基底样乳腺癌和HER2富集乳腺癌。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：
选自腺癌、类癌、胃肠间质瘤、淋巴瘤和遗传性结肠癌的结肠癌亚型。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：
选自卵巢上皮癌、生殖细胞肿瘤、卵巢性索间质肿瘤、卵巢肉瘤、克鲁肯伯格肿瘤、卵巢囊肿和复发性卵巢癌的卵巢上皮癌亚型。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：
选自外分泌肿瘤和内分泌肿瘤的胰腺癌亚型。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：
选自浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性色斑型黑色素瘤和肢端雀斑样痣性黑素瘤的黑色素瘤亚型。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：
选自鳞状细胞癌和腺癌的宫颈癌亚型。
20.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：
选自浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性色斑型黑色素瘤、无色素性黑色素瘤、结缔组织增生性黑色素瘤和肢端雀斑样痣性黑素瘤的黑色素瘤亚型。
21.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：
选自腺泡腺癌、导管腺癌、移行细胞(或尿路上皮)癌、鳞状细胞癌和小细胞前列腺癌的前列腺癌亚型。
22.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：
选自小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌的肺癌亚型；
所述非小细胞肺癌包括腺癌、鳞状细胞肺癌(表皮样癌)和大细胞肺癌。
23.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：原发性癌症和转移性癌症。
24.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症亚型包括：原发性癌症和继发性癌症。
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