JP2023518954A - Ngrコンジュゲート及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、タンパク質のN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)の第1のペプチドと、前記ペプチドのN末端に連結された化合物Xとを含むコンジュゲート、並びに関連する医学的使用に関する。
Description
本発明は、タンパク質、例えば、TNFのN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)の第1のペプチドと、前記ペプチドのN末端に連結された化合物X、例えば、セリンとを含むコンジュゲート、並びにそれらの治療的使用に関する。本発明はまた、タンパク質のN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)の第1のペプチドを含む、均質なコンジュゲートを産生させるための方法にも関する。
がん療法におけるサイトカインの有効性は、全身毒性及び対抗制御機序によって制限されることが多い。近年の研究により、これらの制限は、これらのタンパク質とそれらを腫瘍部位に送達することができるリガンドとのコンジュゲーションに基づく標的化戦略によって克服することができ、それによって、低い用量の投与及び全身作用の低減が可能となることが示唆される(Corti and Curnis 2011、Corti et al. 2013)。現在開発されている様々なアプローチの中でも、サイトカインを、腫瘍組織における特定の受容体を認識することができる抗体又はペプチドリガンドとコンジュゲート又は融合させることが、もっとも前進している。これらのリガンドは、典型的に、腫瘍細胞によって発現される受容体、又は腫瘍血管系を含む腫瘍微小環境のエレメントを認識する。この概念のプロトタイプ例は、CD13陽性腫瘍血管を認識する、CNGRCG(配列番号1)配列を含むペプチドリガンドと、内皮バリア機能を変化させ、腫瘍組織における化学療法薬の浸透/免疫細胞浸潤を促進することができるサイトカインである腫瘍壊死因子-α(TNF)とのコンジュゲーションに基づく薬物である(Corti and Curnis 2011、Corti et al. 2013)。2000年代初期に組換えDNA技術によって調製された、初めて開発されたペプチド-サイトカインコンジュゲートを表すこの薬物は、がん患者に対していくつかの臨床試験で試験されており、活性が示されている(Corti et al. 2013、Ferreri et al. 2019)。CNGRCG-TNF薬物(本明細書において、以降NGR-TNFと称される)及び他のCNGRCG-サイトカインコンジュゲートの主要な制限は、望ましくない改変反応に起因するCNGRCG(配列番号1)モチーフの不安定性及びその不均質性に関連し、これは、薬物の製造及び保管に深刻な問題をもたらし、薬物登録のために明らかにする必要のある重要な薬理学的及び毒物学的関係性を有し得る(Corti et al. 2013)。
NGRモチーフ
NGRモチーフは、腫瘍保持マウスにおけるペプチド-ファージライブラリーのインビボ選択によって、90年代に発見された(Arap, Pasqualini, and Ruoslahti 1998、Corti et al. 2008)。ファージライブラリーを、ヒト乳癌異種移植片を有するヌードマウスに全身投与することにより、このモチーフを含む様々なペプチド配列を有する腫瘍血管系ホーミングファージの選択がもたらされた。機構に関する研究により、NGRを含む環状ジスルフィド架橋型ペプチド(CNGRC(配列番号5))が、正常な血管にはほとんど又はまったく発現されないが新生血管においては上方調節される膜結合型メタロプロテイナーゼであるアミノペプチダーゼN(CD13)を特異的に認識することができることが示された(Curnis et al. 2002、Pasqualini et al. 2000、Lahdenranta et al. 2007、Buehler et al. 2006)。このプロテアーゼは、タンパク質分解、サイトカイン調節、抗原提示、細胞増殖、細胞遊走、及び血管新生において役割を有する(Curnis et al. 2002、Mina-Osorio 2008、Luan and Xu 2007、Bhagwat et al. 2001)。腫瘍組織において、CD13は、内皮細胞及び周皮細胞によって発現され、一部の場合には、腫瘍細胞及び線維芽細胞によって発現される。CD13はまた、小腸、腎近位尿細管、前立腺、毛細胆管に由来する上皮細胞、ケラチノサイト、マスト細胞、骨髄系細胞、及び抗原提示細胞を含む、正常組織の多数の細胞によっても発現される(Curnis et al. 2002; Taylor 1993、Shipp and Look 1993、Dixon et al. 1994、Di Matteo et al. 2010)。免疫組織化学研究及び生体分布研究により、CNGRCを含む化合物が、CD13陽性腫瘍血管に結合するが、他のCD13が豊富な組織には結合しないことが示された(Curnis et al. 2002、Curnis et al. 2000)。CNGRCG-TNFコンジュゲート(NGR-TNF)を用いた直接的結合アッセイ、及び抗CD13抗体を用いた競合的結合アッセイにより、腫瘍血管によって発現されるCD13形態が、NGRモチーフの血管受容体としての機能を果たし得ることが示された。対照的に、正常な腎臓及び骨髄系細胞において発現されるCD13は、NGR-TNFに結合できなかった。これらの結果と一致して、放射標識した125I-NGR-TNFも125I-TNFも、マウスへの投与の後に、CD13を発現する細胞を含む正常な器官には蓄積されなかった(Curnis et al. 2002)。したがって、NGRの結合に関して、CD13の機能的に活性な形態は、腫瘍血管系には存在するが、他のCD13が豊富な組織には存在しないと考えられるであろう。このNGR選択性の構造的基盤は、依然として不明である。NGRによる新生性血管の認識はまた、腫瘍マウスモデルにおける環状NGR標識化常磁性量子ドット及び定量的分子磁気共鳴イメージングによっても示されている(Oostendorp et al. 2008)。エキソビボ二光子レーザー走査顕微鏡により、これらの粒子が、主として腫瘍血管の内皮層に結合することが示された。
NGRモチーフは、腫瘍保持マウスにおけるペプチド-ファージライブラリーのインビボ選択によって、90年代に発見された(Arap, Pasqualini, and Ruoslahti 1998、Corti et al. 2008)。ファージライブラリーを、ヒト乳癌異種移植片を有するヌードマウスに全身投与することにより、このモチーフを含む様々なペプチド配列を有する腫瘍血管系ホーミングファージの選択がもたらされた。機構に関する研究により、NGRを含む環状ジスルフィド架橋型ペプチド(CNGRC(配列番号5))が、正常な血管にはほとんど又はまったく発現されないが新生血管においては上方調節される膜結合型メタロプロテイナーゼであるアミノペプチダーゼN(CD13)を特異的に認識することができることが示された(Curnis et al. 2002、Pasqualini et al. 2000、Lahdenranta et al. 2007、Buehler et al. 2006)。このプロテアーゼは、タンパク質分解、サイトカイン調節、抗原提示、細胞増殖、細胞遊走、及び血管新生において役割を有する(Curnis et al. 2002、Mina-Osorio 2008、Luan and Xu 2007、Bhagwat et al. 2001)。腫瘍組織において、CD13は、内皮細胞及び周皮細胞によって発現され、一部の場合には、腫瘍細胞及び線維芽細胞によって発現される。CD13はまた、小腸、腎近位尿細管、前立腺、毛細胆管に由来する上皮細胞、ケラチノサイト、マスト細胞、骨髄系細胞、及び抗原提示細胞を含む、正常組織の多数の細胞によっても発現される(Curnis et al. 2002; Taylor 1993、Shipp and Look 1993、Dixon et al. 1994、Di Matteo et al. 2010)。免疫組織化学研究及び生体分布研究により、CNGRCを含む化合物が、CD13陽性腫瘍血管に結合するが、他のCD13が豊富な組織には結合しないことが示された(Curnis et al. 2002、Curnis et al. 2000)。CNGRCG-TNFコンジュゲート(NGR-TNF)を用いた直接的結合アッセイ、及び抗CD13抗体を用いた競合的結合アッセイにより、腫瘍血管によって発現されるCD13形態が、NGRモチーフの血管受容体としての機能を果たし得ることが示された。対照的に、正常な腎臓及び骨髄系細胞において発現されるCD13は、NGR-TNFに結合できなかった。これらの結果と一致して、放射標識した125I-NGR-TNFも125I-TNFも、マウスへの投与の後に、CD13を発現する細胞を含む正常な器官には蓄積されなかった(Curnis et al. 2002)。したがって、NGRの結合に関して、CD13の機能的に活性な形態は、腫瘍血管系には存在するが、他のCD13が豊富な組織には存在しないと考えられるであろう。このNGR選択性の構造的基盤は、依然として不明である。NGRによる新生性血管の認識はまた、腫瘍マウスモデルにおける環状NGR標識化常磁性量子ドット及び定量的分子磁気共鳴イメージングによっても示されている(Oostendorp et al. 2008)。エキソビボ二光子レーザー走査顕微鏡により、これらの粒子が、主として腫瘍血管の内皮層に結合することが示された。
薬物送達系としてのNGRペプチドの使用
NGR配列を含むペプチドは、複数の研究者によって、化学療法薬、リポソーム、抗血管新生化合物、DNA複合体、ウイルス粒子、及びイメージング化合物を含む様々な化合物を、腫瘍血管に送達するために使用されている(Corti and Curnis 2011、Corti et al. 2013)。NGRペプチドはまた、それらの抗腫瘍治療インデックスを改善しようとして、サイトカイン、例えば、TNFα、IFNγ、及びIFNα-2aに融合されている(Corti and Curnis 2011、Corti et al. 2013)。したがって、様々な異なる化合物が、異なる研究者によって、NGRペプチドに連結されており、良好な結果を残している。これらの産物が、異なる分子スキャフォールドに埋め込まれたNGRを有する様々なペプチド、例えば、プロトタイプのジスルフィド架橋型CNGRC(配列番号5)、アセチル化CNGRC、CVLNGRMEC(配列番号12)、頭部と尾部が環状化されたKNGRE(配列番号7)、CGNGRG(配列番号8)、又は線形GNGRG(配列番号9)、NGRAHA(配列番号10)、KNGRE(配列番号7)、NGR、及びいくつかのその他のものの使用に依存することは、注目に値する(Corti and Curnis 2011、Corti et al. 2008)。これらのペプチドは、薬物及び粒子に化学的に連結されているか、又はタンパク質のN末端若しくはC末端の配列に融合されているか、又は更には遺伝子操作技術によってタンパク質の内部ループに組み込まれている(Corti and Curnis 2011、Corti et al. 2008)。これらの産物の多くで得られた良好な結果により、薬物開発のための標的化モチーフとしてのNGRの有用性及び万能性が強調される。しかしながら、CNGRC(配列番号5)ペプチドは、患者における腫瘍血管系(脳腫瘍における血管系を含む)への薬物送達の実証された有用性を有し、動物及び患者における免疫原性の低さが報告されているため、薬物開発の好ましい選択肢を表し得る。患者におけるリガンドとしての開発段階が進行したCNGRC(配列番号5)は、したがって、その他のものよりも重要な利点を表し得る。
NGR配列を含むペプチドは、複数の研究者によって、化学療法薬、リポソーム、抗血管新生化合物、DNA複合体、ウイルス粒子、及びイメージング化合物を含む様々な化合物を、腫瘍血管に送達するために使用されている(Corti and Curnis 2011、Corti et al. 2013)。NGRペプチドはまた、それらの抗腫瘍治療インデックスを改善しようとして、サイトカイン、例えば、TNFα、IFNγ、及びIFNα-2aに融合されている(Corti and Curnis 2011、Corti et al. 2013)。したがって、様々な異なる化合物が、異なる研究者によって、NGRペプチドに連結されており、良好な結果を残している。これらの産物が、異なる分子スキャフォールドに埋め込まれたNGRを有する様々なペプチド、例えば、プロトタイプのジスルフィド架橋型CNGRC(配列番号5)、アセチル化CNGRC、CVLNGRMEC(配列番号12)、頭部と尾部が環状化されたKNGRE(配列番号7)、CGNGRG(配列番号8)、又は線形GNGRG(配列番号9)、NGRAHA(配列番号10)、KNGRE(配列番号7)、NGR、及びいくつかのその他のものの使用に依存することは、注目に値する(Corti and Curnis 2011、Corti et al. 2008)。これらのペプチドは、薬物及び粒子に化学的に連結されているか、又はタンパク質のN末端若しくはC末端の配列に融合されているか、又は更には遺伝子操作技術によってタンパク質の内部ループに組み込まれている(Corti and Curnis 2011、Corti et al. 2008)。これらの産物の多くで得られた良好な結果により、薬物開発のための標的化モチーフとしてのNGRの有用性及び万能性が強調される。しかしながら、CNGRC(配列番号5)ペプチドは、患者における腫瘍血管系(脳腫瘍における血管系を含む)への薬物送達の実証された有用性を有し、動物及び患者における免疫原性の低さが報告されているため、薬物開発の好ましい選択肢を表し得る。患者におけるリガンドとしての開発段階が進行したCNGRC(配列番号5)は、したがって、その他のものよりも重要な利点を表し得る。
動物モデル及びがん患者におけるNGR-TNFの薬理学的特性及び毒物学的特性
超低用量(ピコグラム)のマウスCNGRCG-TNF(NGR-TNF)の投与は、黒色腫、前立腺がん、リンパ腫、線維肉腫、及び乳腺腺癌の様々な動物モデルにおいて、薬物浸透バリアを変化させることによって、様々な化学療法薬、例えば、ドキソルビシン、メルファラン、シスプラチン、パクリタキセル、及びゲムシタビンとの相乗的抗腫瘍作用を発揮するが、マウスTNFはそれを示さない(Curnis, Sacchi, and Corti 2002、Sacchi et al. 2006、Curnis et al. 2000)。黒色腫及びリンパ腫の動物モデルにおける腫瘍成長の阻害は、NGR-TNFをコードするプラスミドDNAの筋肉内注射によっても観察されているが、TNF単独をコードするプラスミドDNAでは観察されていない(Zarovni, Monaco, and Corti 2004)。これらの研究は、CNGRCGに媒介されるTNFの血管標的化が、対抗制御機序の活性化及び毒性反応を引き起こすことなく生体活性量のサイトカインを腫瘍内皮細胞に送達するための貴重な戦略であることも示している(Curnis, Sacchi, and Corti 2002、Corti et al. 2013)。更に、これらの研究は、微量のTNFを腫瘍血管に標的化送達することが、内皮バリア機能を変化させるには十分であり、腫瘍における化学療法薬の浸透だけでなく、新生物組織におけるリンパ球の浸潤にも好ましいことを示している(Curnis, Sacchi, and Corti 2002、Sacchi et al. 2006、Calcinotto et al. 2012)。実際に、低用量のNGR-TNF(0.1ng)は、腫瘍血管上の白血球接着分子を上方調節すること、及び腫瘍組織における様々なケモカインの放出を誘導することによって、腫瘍におけるリンパ球血管外遊走を促進し得る(Calcinotto et al. 2012)。これらの機序は、黒色腫の移植可能モデル及び自然発生性前立腺がんのTRAMPモデルにおける、腫瘍保持マウスの血液、脾臓、又は腎臓におけるT細胞分布を改変することのない、内因性又は養子移入された細胞傷害Tリンパ球の腫瘍浸潤の増加(Calcinotto et al. 2012)、並びに毒性の根拠を伴うことのない、腫瘍保持マウスの全生存期間の増加と関連する。NGR-TNFはまた、単独又は化学療法との組合せで、能動的免疫療法(ワクチン接種)の有効性を増加させ得る(Calcinotto et al. 2012)。これらの特性に起因して、ヒトTNF配列に融合されたCNGRCG(配列番号1)からなるNGR-TNFのヒトバージョンが、単独又は化学療法若しくは免疫療法との組合せで、固形腫瘍を有する患者において様々なフェーズII及びIII臨床試験で試験されており、活性が示されている(www.molmed.com)。この産物の生物学的特性及び薬理学的特性、並びにフェーズI及びII臨床試験の結果が、考察されている(Corti et al. 2013)。これらの試験は、NGR-TNFが、十分に寛容されることを示している。悪寒及び発熱が、もっとも頻繁に観察される毒性であり、処置の間に抗NGR-TNF抗体を発生した患者はいなかった。動的造影磁気共鳴イメージングにより、NGR-TNFに対する血管応答が示された。悪性胸膜中皮腫(MPM)、肝細胞癌、及び結腸直腸がんにおいて行われた低用量のNGR-TNF(0.8μg/m2、1時間の注入、3週間ごと又は1週間ごと)を用いた単剤でのフェーズII試験は、放射線的抗血管作用及び有意な疾患制御を示した。具体的には、MPM患者におけるフェーズII試験は、以前に処置を受けた患者の約半数において、疾患制御を示し、これは、3週間ごとのコホートでは4.4カ月間維持され、1週間ごとのコホートでは9.1カ月間維持された(Gregorc et al. 2010)。これらの結果に基づいて、進行MPMを有する以前に処置を受けている患者において、ヒトNGR-TNFに研究者が選んだ最良のもの(「BIC」と称される)を加えたものとプラセボにBICを加えたものとを対比した無作為化二重盲検フェーズIII試験が実施されている。結果は、より侵攻性のMPMを有する患者において全生存期間の有意な増加を示した(Gregorc et al. 2018)。これらの結果は、第1選択肢のペメトレキセドに基づくレジメンが成功していないMPM患者について、現在、標準的な選択肢が存在しないことを考慮すると、またNGR-TNFの容易に管理可能な毒性プロファイルを考慮すると、注目に値する。難治性固形腫瘍を有する患者における化学療法(例えば、ドキソルビシン又はシスプラチン)と組み合わせたヒトNGR-TNFのフェーズI及びIIの試験は、この薬物の組合せが、興味深い臨床活性及び安全な毒性プロファイルを有することを示した(Zucali et al. 2013、Lorusso et al. 2012、Gregorc et al. 2011、Corti et al. 2013)。最後に、再発性/難治性原発性中枢神経系リンパ腫(PCNSL)を有する患者において行われた近年のフェーズII試験は、NGR-TNFが、腫瘍において血液脳関門を変化させ、R-CHOPの有効性を増加させ、75%の応答(50%完全応答)をもたらし得ることを示している(Ferreri et al. 2019)。これらの結果は、全体として、NGR-TNFが、市販薬物へと移行される高い可能性を有する生物学的に活性かつ安全な分子であることを示す。
超低用量(ピコグラム)のマウスCNGRCG-TNF(NGR-TNF)の投与は、黒色腫、前立腺がん、リンパ腫、線維肉腫、及び乳腺腺癌の様々な動物モデルにおいて、薬物浸透バリアを変化させることによって、様々な化学療法薬、例えば、ドキソルビシン、メルファラン、シスプラチン、パクリタキセル、及びゲムシタビンとの相乗的抗腫瘍作用を発揮するが、マウスTNFはそれを示さない(Curnis, Sacchi, and Corti 2002、Sacchi et al. 2006、Curnis et al. 2000)。黒色腫及びリンパ腫の動物モデルにおける腫瘍成長の阻害は、NGR-TNFをコードするプラスミドDNAの筋肉内注射によっても観察されているが、TNF単独をコードするプラスミドDNAでは観察されていない(Zarovni, Monaco, and Corti 2004)。これらの研究は、CNGRCGに媒介されるTNFの血管標的化が、対抗制御機序の活性化及び毒性反応を引き起こすことなく生体活性量のサイトカインを腫瘍内皮細胞に送達するための貴重な戦略であることも示している(Curnis, Sacchi, and Corti 2002、Corti et al. 2013)。更に、これらの研究は、微量のTNFを腫瘍血管に標的化送達することが、内皮バリア機能を変化させるには十分であり、腫瘍における化学療法薬の浸透だけでなく、新生物組織におけるリンパ球の浸潤にも好ましいことを示している(Curnis, Sacchi, and Corti 2002、Sacchi et al. 2006、Calcinotto et al. 2012)。実際に、低用量のNGR-TNF(0.1ng)は、腫瘍血管上の白血球接着分子を上方調節すること、及び腫瘍組織における様々なケモカインの放出を誘導することによって、腫瘍におけるリンパ球血管外遊走を促進し得る(Calcinotto et al. 2012)。これらの機序は、黒色腫の移植可能モデル及び自然発生性前立腺がんのTRAMPモデルにおける、腫瘍保持マウスの血液、脾臓、又は腎臓におけるT細胞分布を改変することのない、内因性又は養子移入された細胞傷害Tリンパ球の腫瘍浸潤の増加(Calcinotto et al. 2012)、並びに毒性の根拠を伴うことのない、腫瘍保持マウスの全生存期間の増加と関連する。NGR-TNFはまた、単独又は化学療法との組合せで、能動的免疫療法(ワクチン接種)の有効性を増加させ得る(Calcinotto et al. 2012)。これらの特性に起因して、ヒトTNF配列に融合されたCNGRCG(配列番号1)からなるNGR-TNFのヒトバージョンが、単独又は化学療法若しくは免疫療法との組合せで、固形腫瘍を有する患者において様々なフェーズII及びIII臨床試験で試験されており、活性が示されている(www.molmed.com)。この産物の生物学的特性及び薬理学的特性、並びにフェーズI及びII臨床試験の結果が、考察されている(Corti et al. 2013)。これらの試験は、NGR-TNFが、十分に寛容されることを示している。悪寒及び発熱が、もっとも頻繁に観察される毒性であり、処置の間に抗NGR-TNF抗体を発生した患者はいなかった。動的造影磁気共鳴イメージングにより、NGR-TNFに対する血管応答が示された。悪性胸膜中皮腫(MPM)、肝細胞癌、及び結腸直腸がんにおいて行われた低用量のNGR-TNF(0.8μg/m2、1時間の注入、3週間ごと又は1週間ごと)を用いた単剤でのフェーズII試験は、放射線的抗血管作用及び有意な疾患制御を示した。具体的には、MPM患者におけるフェーズII試験は、以前に処置を受けた患者の約半数において、疾患制御を示し、これは、3週間ごとのコホートでは4.4カ月間維持され、1週間ごとのコホートでは9.1カ月間維持された(Gregorc et al. 2010)。これらの結果に基づいて、進行MPMを有する以前に処置を受けている患者において、ヒトNGR-TNFに研究者が選んだ最良のもの(「BIC」と称される)を加えたものとプラセボにBICを加えたものとを対比した無作為化二重盲検フェーズIII試験が実施されている。結果は、より侵攻性のMPMを有する患者において全生存期間の有意な増加を示した(Gregorc et al. 2018)。これらの結果は、第1選択肢のペメトレキセドに基づくレジメンが成功していないMPM患者について、現在、標準的な選択肢が存在しないことを考慮すると、またNGR-TNFの容易に管理可能な毒性プロファイルを考慮すると、注目に値する。難治性固形腫瘍を有する患者における化学療法(例えば、ドキソルビシン又はシスプラチン)と組み合わせたヒトNGR-TNFのフェーズI及びIIの試験は、この薬物の組合せが、興味深い臨床活性及び安全な毒性プロファイルを有することを示した(Zucali et al. 2013、Lorusso et al. 2012、Gregorc et al. 2011、Corti et al. 2013)。最後に、再発性/難治性原発性中枢神経系リンパ腫(PCNSL)を有する患者において行われた近年のフェーズII試験は、NGR-TNFが、腫瘍において血液脳関門を変化させ、R-CHOPの有効性を増加させ、75%の応答(50%完全応答)をもたらし得ることを示している(Ferreri et al. 2019)。これらの結果は、全体として、NGR-TNFが、市販薬物へと移行される高い可能性を有する生物学的に活性かつ安全な分子であることを示す。
組換えNGR-TNFの分子不均質性及び安全性
原則として、NGR-TNFは、均質な50kDaのホモ三量体タンパク質である。ヒトNGR-TNFの生化学的特徴付け研究により、この薬物が、実際に、三量体タンパク質であるが、a)予測された値と一致する分子量を有するサブユニット(+0Da)、b)17Da小さい分子量によって特徴付けられるサブユニット(-17Da)、c)42Da大きい分子量によって特徴付けられるサブユニット(+42Da)、d)58Da大きい分子量によって特徴付けられるサブユニット(+58Da)を含む、異なるサブユニットによって構成されていることが示された(Tobias et al. 2013)。サブユニットがランダムな様式で会合して三量体を形成し得ることを考慮して、発明者らは、少なくとも64(43)個の異なる三量体が、ヒトNGR-TNF調製物に存在し得ると推定する。NGRモチーフのアスパラギン(N)が、急速な脱アミド化を受け得ることを考慮すると、この薬物の不均質性は、更に増加し得る。実際に、いくつかの研究により、CNGRC(配列番号5)のアスパラギンが、スクシンイミド中間体を介して非常に急速に脱アミド化し(生理学的緩衝液中の半減期4~5時間)(17Daの喪失によって特徴付けられる)、これが、加水分解による切断時に、L又はD立体配置が1:3の比でAsp(D)及びisoAsp(isoD)の形成をもたらし、いずれも1Daの増加によって特徴付けられることが、示されている。したがって、CNGRC(配列番号5)の脱アミド化により、CDGRC(配列番号11)及びCisoDGRC(配列番号41)配列が生成される(Corti and Curnis 2011、Curnis et al. 2010、Curnis et al. 2006)(概略図については図1を参照されたい)。したがって、予測不可能な数の異なるNGR-TNFバリアントが、NGR-TNF中に存在し得る、及び/又は保管時若しくは患者への注射後に形成され得ることが、想定される。注目すべきことに、CNGRC(配列番号5)脱アミド化は、CD13結合親和性の喪失及びインテグリン結合特性の獲得をもたらす。実際に、CisoDGRC産物は、腫瘍新生血管に発現されるインテグリンであるαvβ3のRGD結合ポケットに結合し得るが、CDGRC(配列番号11)はそうではない(Corti and Curnis 2011、Curnis et al. 2010、Curnis et al. 2006、Spitaleri et al. 2008)。注目すべきことに、αvβ3及び他のインテグリンに対するCisoDGRCの親和性及び特異性は、隣接する残基に強く依存し、小さな変化でさえも、劇的な作用を有し得る。例えば、CisoDGRCは、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及びα5β1よりも10~100倍高い親和性でαvβ3に結合し得るが、アセチル-CisoDGRC(配列番号41)ペプチド(+42Da)は、類似の親和性で、αvβ3、αvβ6、及びα5β1に結合し得る(Curnis et al. 2010)。したがって、NGR-TNFにおいて存在するか又は形成される可能性のあるそれぞれの化合物の薬理学的特性及び毒物学的特性は、それぞれの形態が有し得るCD13又はインテグリンに対する異なる親和性に起因して、異なり得る。NGR-TNFに存在する様々な形態(-17Da、+0Da、+42Da、+58Da、及び脱アミド化された対応する形態)は、大腸菌(E.coli)細胞におけるNGR-TNF発現、その精製、その保管の間、及び可能性としては(わずかではあるが)患者への投与後に生じる改変に関連する可能性が高い。したがって、a)それぞれの成分の生化学的特性、生物学的特性、薬理学的特性、及び毒物学的特性を、薬物の登録前に慎重に規定する必要があること、並びにb)異なるNGR-TNF産生ロットの再生可能な組成物が、患者におけるそれらの使用が保証されなければならないことは、明らかである。これらの作業は、この薬物の複雑性を考慮すると、非常に困難であり得る。
原則として、NGR-TNFは、均質な50kDaのホモ三量体タンパク質である。ヒトNGR-TNFの生化学的特徴付け研究により、この薬物が、実際に、三量体タンパク質であるが、a)予測された値と一致する分子量を有するサブユニット(+0Da)、b)17Da小さい分子量によって特徴付けられるサブユニット(-17Da)、c)42Da大きい分子量によって特徴付けられるサブユニット(+42Da)、d)58Da大きい分子量によって特徴付けられるサブユニット(+58Da)を含む、異なるサブユニットによって構成されていることが示された(Tobias et al. 2013)。サブユニットがランダムな様式で会合して三量体を形成し得ることを考慮して、発明者らは、少なくとも64(43)個の異なる三量体が、ヒトNGR-TNF調製物に存在し得ると推定する。NGRモチーフのアスパラギン(N)が、急速な脱アミド化を受け得ることを考慮すると、この薬物の不均質性は、更に増加し得る。実際に、いくつかの研究により、CNGRC(配列番号5)のアスパラギンが、スクシンイミド中間体を介して非常に急速に脱アミド化し(生理学的緩衝液中の半減期4~5時間)(17Daの喪失によって特徴付けられる)、これが、加水分解による切断時に、L又はD立体配置が1:3の比でAsp(D)及びisoAsp(isoD)の形成をもたらし、いずれも1Daの増加によって特徴付けられることが、示されている。したがって、CNGRC(配列番号5)の脱アミド化により、CDGRC(配列番号11)及びCisoDGRC(配列番号41)配列が生成される(Corti and Curnis 2011、Curnis et al. 2010、Curnis et al. 2006)(概略図については図1を参照されたい)。したがって、予測不可能な数の異なるNGR-TNFバリアントが、NGR-TNF中に存在し得る、及び/又は保管時若しくは患者への注射後に形成され得ることが、想定される。注目すべきことに、CNGRC(配列番号5)脱アミド化は、CD13結合親和性の喪失及びインテグリン結合特性の獲得をもたらす。実際に、CisoDGRC産物は、腫瘍新生血管に発現されるインテグリンであるαvβ3のRGD結合ポケットに結合し得るが、CDGRC(配列番号11)はそうではない(Corti and Curnis 2011、Curnis et al. 2010、Curnis et al. 2006、Spitaleri et al. 2008)。注目すべきことに、αvβ3及び他のインテグリンに対するCisoDGRCの親和性及び特異性は、隣接する残基に強く依存し、小さな変化でさえも、劇的な作用を有し得る。例えば、CisoDGRCは、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及びα5β1よりも10~100倍高い親和性でαvβ3に結合し得るが、アセチル-CisoDGRC(配列番号41)ペプチド(+42Da)は、類似の親和性で、αvβ3、αvβ6、及びα5β1に結合し得る(Curnis et al. 2010)。したがって、NGR-TNFにおいて存在するか又は形成される可能性のあるそれぞれの化合物の薬理学的特性及び毒物学的特性は、それぞれの形態が有し得るCD13又はインテグリンに対する異なる親和性に起因して、異なり得る。NGR-TNFに存在する様々な形態(-17Da、+0Da、+42Da、+58Da、及び脱アミド化された対応する形態)は、大腸菌(E.coli)細胞におけるNGR-TNF発現、その精製、その保管の間、及び可能性としては(わずかではあるが)患者への投与後に生じる改変に関連する可能性が高い。したがって、a)それぞれの成分の生化学的特性、生物学的特性、薬理学的特性、及び毒物学的特性を、薬物の登録前に慎重に規定する必要があること、並びにb)異なるNGR-TNF産生ロットの再生可能な組成物が、患者におけるそれらの使用が保証されなければならないことは、明らかである。これらの作業は、この薬物の複雑性を考慮すると、非常に困難であり得る。
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Borgia and Fields, 2000, TibTech 18: 243-251
したがって、翻訳後改変が欠如した均質なNGR-TNFの産生、又はNGR-TNFの単一成分の安定かつ生体活性な誘導体の特定のための方法の開発が、非常に望ましい。したがって、安定かつ均質な、がんを処置するための標的化サイトカイン誘導体の必要性が存在する。
がん療法におけるサイトカインの有効性を、NGRモチーフを含むペプチド、すなわち、CD13陽性腫瘍血管を認識するリガンドとのコンジュゲーションに基づく標的化戦略によって増加させることができることが、ますます多くの証拠によって示唆されている。標的化アプローチは、一般に、低いが、依然として薬理学的に活性な用量の薬物の投与を可能にし、それによって、毒性反応及び全身性対抗制御機序の活性化を回避するために考案されている。具体的には、CNGRCG(配列番号1)ペプチドが、組換えDNA技術によって、CNGRCG-腫瘍壊死因子-α(TNF)融合タンパク質を産生させるために使用されており、これは、現在、様々な適応症について、臨床試験においてがん患者に使用されている。CNGRCG-TNF(NGR-TNFと称される)及び他のCNGRCG-サイトカイン産物の主要な制限は、CNGRCG(配列番号1)モチーフの不安定性及びその分子不均質性に関連し、望ましくない翻訳後改変反応に起因して、薬物の製造及び保管に深刻な問題及び困難をもたらし、また、薬物の薬理学及び毒性学における潜在的な関係性を有し得る。本発明は、以前に開発されたCNGRCG-サイトカインよりも安定かつ均質であり、よって、より信頼できる第2世代の標的化サイトカインであるCNGRCG-サイトカインコンジュゲート(X-CNGRCG-サイトカイン)に関する。
したがって、本発明は、
- タンパク質のN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)の第1のペプチドと、
- 前記ペプチドのN末端に連結された化合物Xと
を含むコンジュゲートを提供する。
- タンパク質のN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)の第1のペプチドと、
- 前記ペプチドのN末端に連結された化合物Xと
を含むコンジュゲートを提供する。
好ましくは、コンジュゲートは、CD13を認識することができる。
本発明によるコンジュゲートにおいて、タンパク質は、好ましくは、サイトカイン、より好ましくは、抗腫瘍活性を有するサイトカインである。サイトカインは、好ましくは、腫瘍壊死因子(TNF)、好ましくは、TNF-アルファ又はTNF-ベータ、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、内皮単球活性化ポリペプチドII(EMAP-II)、IL12、IFNガンマ、及びIFNアルファからなる群から選択される。
好ましくは、化合物Xは、第2のペプチドである。
好ましくは、化合物Xは、1~200個のアミノ酸残基、より好ましくは、1個、2個、又は3個のアミノ酸残基の第2のペプチドである。
好ましくは、第2のペプチドは、セリン残基若しくは短い側鎖を有する任意のアミノ酸、好ましくは、グリシン若しくはアラニン、IEGR(配列番号2)配列を含むアミノ酸配列、又は真核生物細胞におけるコンジュゲートの発現及び分泌後に除去されるリーダー配列、好ましくは、OmpTリーダー配列(又はOmpTシグナルペプチド若しくはOmpT)、又はアルファ接合因子分泌シグナルペプチドからなる。
好ましくは、第2のペプチドは、セリンからなり、サイトカインは、TNFである。好ましくは、TNFは、ヒトTNF-アルファである。
本発明によるコンジュゲートにおいて、コンジュゲートは、化合物Xとペプチドとの間の結合(X-C結合)の化学的又は酵素的切断のための部位を含み、好ましくは、X-C結合の切断は、アミノペプチダーゼ又はエンドプロテアーゼ、好ましくは、アミノペプチダーゼN(CD13)又はプロテアーゼ、好ましくは、第Xa因子により達成され得る。
本発明の更なる目的は、上記に定義されるコンジュゲートをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、好ましくは、プラスミド又はウイルスベクター、好ましくは、遺伝子療法のためのもの、並びに上記に定義されるコンジュゲートを含むナノ粒子であり、好ましくは、コンジュゲートは、金ナノ粒子の表面に吸着されている。
本発明の別の目的は、上記に定義されるコンジュゲート、又は上記に定義される核酸、又は上記に定義されるベクター、又は上記に定義されるナノ粒子と、好ましくは化学療法剤及び/又は免疫モジュレーター及び/又は自己免疫細胞である少なくとも1つの抗腫瘍薬剤とを含む組合せ物である。好ましくは、化学療法剤は、ドキソルビシン、メルファラン、テモゾロミド、ゲムシタビン、タキソール、シスプラチン、ビンクリスチン、又はビノレルビンである。好ましくは、免疫モジュレーターは、抗がんワクチン、又は免疫チェックポイント遮断剤、例えば、抗PD1抗体、若しくは抗PDL1抗体、若しくは抗CTLA4抗体である。好ましくは、免疫細胞は、リンパ球又は遺伝子改変されたTリンパ球、例えば、CAR-T細胞、又はTCRにより指向性が変更されたT細胞(TCR redirected T-cells)若しくはNK細胞である。好ましくは、更なる抗腫瘍薬剤は、抗体及び化学療法剤、例えば、R-CHOP:リツキシマブ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、プレドニゾロンを含む。
好ましくは、少なくとも1つの抗腫瘍薬は、ドキソルビシンである。好ましくは、少なくとも1つの抗腫瘍薬は、メルファランである。
上記に定義されるコンジュゲート、又は組合せ物、又は核酸、又はベクター、又はナノ粒子は、好ましくは、医学的使用のためのもの、より好ましくは、腫瘍、好ましくは固形腫瘍、より好ましくは、リンパ腫、好ましくは、CNSの原発性びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(PCNSL)、脳腫瘍(例えば、神経膠腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、びまん性内在性脳幹部神経膠腫)、肉腫、黒色腫 口腔若しくは皮膚扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、頭頸部、胃食道部、結腸直腸、膵臓、卵巣、肺(例えば、SCLC、NSCLC、中皮腫)、子宮頸、乳がん、腎臓、尿路上皮、又はそれらの転移の処置における使用のためのものである。
好ましくは、上記に定義される少なくとも1つの抗腫瘍薬剤もまた、投与される。CNSの原発性びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(PCNSL)の処置において、R-CHOPもまた、好ましくは、投与される。
好ましくは、少なくとも1つの抗腫瘍薬が、ドキソルビシンである場合の組合せ物において、組合せ物は、神経膠芽腫の処置における使用のためのものである。
好ましくは、少なくとも1つの抗腫瘍薬が、メルファランである場合の組合せ物において、組合せ物は、リンパ腫の処置における使用のためのものである。
本発明の別の目的は、有効量の、上記に定義されるコンジュゲート、又は核酸、又はベクター、又は組合せ物、又はナノ粒子と、少なくとも1つの薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤とを含む医薬組成物である。任意選択で、医薬組成物は、少なくとも1つの抗腫瘍薬剤を更に含む。
本発明の更なる目的は、タンパク質のN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)を含む、均質なコンジュゲートを産生させるための方法であって、
- 原核生物又は真核生物細胞、好ましくは、大腸菌細胞及び枯草菌(B. subtilis)における、上記に定義されるコンジュゲートの発現工程、
- 好ましくは、アミノペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼ、又はプロテアーゼによるX-C結合の化学的又は酵素的切断工程
を含む方法である。
- 原核生物又は真核生物細胞、好ましくは、大腸菌細胞及び枯草菌(B. subtilis)における、上記に定義されるコンジュゲートの発現工程、
- 好ましくは、アミノペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼ、又はプロテアーゼによるX-C結合の化学的又は酵素的切断工程
を含む方法である。
本発明の別の目的は、タンパク質のN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)を含む、均質なコンジュゲートの産生のための方法であって、アルファ-アミノ基をアセチル化することもCN配列を改変することもできない宿主におけるDNA発現工程を含み、前記宿主が、好ましくは、真核生物細胞である、方法である。好ましくは、真核生物細胞は、CHO細胞、マウス骨髄腫NS0由来細胞、及び昆虫細胞、例えば、Sf 21からなる群から選択される。
本発明の更なる目的は、タンパク質のN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)を含む、均質なコンジュゲートの産生のための方法であって、
真核生物細胞又は植物又は動物、好ましくは、ピキア・パストリス(Pichia Pastoris)細胞、CHO細胞、バキュロウイルス昆虫細胞系における発現の後に除去されるリーダー配列を更に含む前記コンジュゲートの発現工程、
コンジュゲートの分泌工程
を含む方法である。
真核生物細胞又は植物又は動物、好ましくは、ピキア・パストリス(Pichia Pastoris)細胞、CHO細胞、バキュロウイルス昆虫細胞系における発現の後に除去されるリーダー配列を更に含む前記コンジュゲートの発現工程、
コンジュゲートの分泌工程
を含む方法である。
本発明の別の目的は、上記に定義されるコンジュゲートを精製するための方法であって、以下の
- コンジュゲートを発現する細胞を溶解してライセートを得る工程、
- ライセートから可溶性画分を得る工程、
- 可溶性画分を硫酸アンモニウム沈殿させて不溶性画分を得る工程、
- 不溶性画分を可溶化して第2の可溶性画分を得る工程、
- 第2の可溶性画分を、
i.疎水性クロマトグラフィー、
ii.イオン交換クロマトグラフィー、
iii.変性条件下におけるゲル濾過クロマトグラフィー、
iv.再生(renaturation)、及び
v.ゲル濾過クロマトグラフィー
に供する工程
を含む方法である。
- コンジュゲートを発現する細胞を溶解してライセートを得る工程、
- ライセートから可溶性画分を得る工程、
- 可溶性画分を硫酸アンモニウム沈殿させて不溶性画分を得る工程、
- 不溶性画分を可溶化して第2の可溶性画分を得る工程、
- 第2の可溶性画分を、
i.疎水性クロマトグラフィー、
ii.イオン交換クロマトグラフィー、
iii.変性条件下におけるゲル濾過クロマトグラフィー、
iv.再生(renaturation)、及び
v.ゲル濾過クロマトグラフィー
に供する工程
を含む方法である。
サイトカインは、好ましくは、炎症性サイトカインである。1つの好ましい実施形態において、サイトカインは、治療用サイトカインである。好ましくは、サイトカインは、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、2、4、6、12、15、18、EMAP II、血管内皮成長因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF、若しくはケモカイン、又はこれらの前駆体である。一実施形態において、サイトカインは、TNF-α、TNF-β、又はIFN-γである。
好ましくは、コンジュゲートは、融合タンパク質の形態である。別の実施形態において、コンジュゲートは、核酸、プラスミド、又は遺伝子療法のためのウイルスベクターの形態である。別の実施形態において、コンジュゲートは、ナノ粒子の形態であり、例えば、金ナノ粒子の表面に吸着されている。
好ましい実施形態において、組成物は、別の抗腫瘍薬剤を更に含む。
好ましくは、更なる抗腫瘍薬剤は、化学療法薬、又は免疫モジュレーター、又は免疫細胞である。好ましくは、化学療法薬は、ドキソルビシン、メルファラン、ゲムシタビン、タキソール、シスプラチン、ビンクリスチン、又はビノレルビンである。好ましくは、免疫モジュレーターは、抗がんワクチン、又は免疫チェックポイント遮断剤(例えば、抗PD1抗体、若しくは抗PDL1抗体、若しくは抗CTLA4抗体)である。好ましくは、免疫細胞は、リンパ球又は遺伝子改変されたTリンパ球(例えば、CAR-T細胞、若しくはTCRにより指向性が変更されたT細胞)である。好ましくは、更なる抗腫瘍薬剤は、抗体及び化学療法剤(例えば、R-CHOP:リツキシマブ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、プレドニゾロン)を含む。
本発明の他の目的は、上記に定義される核酸を含む発現ベクター、前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞、並びにコンジュゲート又は融合タンパク質の発現をもたらす条件下で前記宿主細胞を培養する工程を含む上記に定義されるコンジュゲート又は融合タンパク質を調製するための方法である。
発明者らは、本明細書において、均質なCNGRCG-サイトカインコンジュゲート(NGR-TNFを含む)の産生のための新規な方法、及びもともと説明されていたものよりも安定、均質、かつ生体活性である新規なCNGRCG-サイトカイン誘導体を開示する。発明者らは、サイトカイン、例えば、TNF及びEMAP-IIに連結されたCNGRCG(配列番号1)ドメインの分子不均質性及び不安定性の重要な源が、NGR-TNFのN末端におけるシステインに続いてアスパラギン残基(CN)の存在に関連していることを見出した。更に、発明者らは、追加のアミノ酸又はポリペプチド配列を付加することによってNGR-TNFのN末端配列を変化させることにより、薬物の安定性が改善され、薬物の不均質性の問題が克服されることを発見した。本発明の好ましい実施形態において、分子不均質性の問題は、NGR-TNFのN末端にセリン残基を付加し(SCNGRCG-TNF、S-NGR-TNFと称される)、従来的なNGR-TNF(CNGRCG-TNF)よりも安定かつ均質である産物にすることによって解決される。この産物は、改善された親和性でCD13に結合することができ、単独又は化学療法との組合せのいずれかで、動物モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有する。したがって、S-NGR-TNFは、NGR-TNFと比較して改善された生化学的特性及び生物学的特性を有する新しい分子を表す。同じ戦略を、他のCNGRCG-サイトカインコンジュゲートの生成にも適用して、CNの不安定性及び分子不均質性の問題を解決することができることが、当業者には明白である。CNGRCG-TNF又は他のCNGRCG-サイトカインコンジュゲートのN末端を、セリンとは異なるアミノ酸で、又は2残基、3残基、若しくは複数残基のペプチドで改変させて、薬物の安定性及び不均質性を改善することができることもまた、当業者には明白である。本明細書において以降、CNGRCG-サイトカインに融合される余剰配列は、「X」配列と称し、これによって、X-CNGRCG-サイトカイン(例えば、X-CNGRCG-TNF)が生成される。
本発明の別の好ましい実施形態において、CNGRCG-サイトカインコンジュゲートの分子不均質性の問題は、CNGRCG(配列番号1)を、適切な系における発現の後に切断されるXポリペプチド配列、例えば、大腸菌細胞におけるペリプラズム発現のためのOmpTリーダー配列、又は酵母若しくは他の真核生物細胞における発現及び分泌後に除去される他のリーダー配列のC末端と融合することによって、解決される。
これらの前提を踏まえると、均質なCNGRCG-サイトカイン(NGR-TNFを含む)の調製のための代替的な方法は、X-CNGRCG-サイトカインの発現、続いて、インビトロでのX配列の化学的又は酵素的除去に依存し得ることもまた、当業者には明らかである。例えば、X-CNGRCG配列におけるX-Cペプチド結合を切断することができるアミノペプチダーゼ又は他のエンドプロテイナーゼを利用して、X部分を除去し、CNGRCG-サイトカインをそのN末端の化学的改変がないまま残すことができる。例えば、Xが、ロイシン又はアラニン残基である場合には、アミノペプチダーゼNを利用することができ、一方で、Xが、CNGRCG(配列番号1)に融合したIEGR配列を含むタグである場合には、第Xa因子を使用することができる。
均質なCNGRCG-サイトカイン産物を生成するための別の可能性は、CN配列を改変することができない生物、例えば、真核生物細胞においてそれらを発現させるか、又はN末端シスチン(cystine)が欠如したペプチドを有する、例えば、NGRに他のアミノ酸残基が続く、コンジュゲート、例えば、NGRAHA(配列番号10)若しくはNGRAGG(配列番号13)を発現させることである。
本発明の文脈において、CD13を認識することができるコンジュゲートには、CD13及び/又は他のアミノペプチダーゼに結合することができるコンジュゲートが含まれる。
本発明は、遺伝子融合又は化学的連結によって、少なくとも1つのサイトカインに連結された少なくとも1つの標的化部分/ポリペプチドを含む分子であるコンジュゲートに関する。「連結された」とは、第1の配列を第2の配列によって標的細胞へと輸送することができるように、第1及び第2の配列が会合していることを、発明者らは意味する。したがって、コンジュゲートは、輸送タンパク質がこれらのタンパク質をコードするDNA分子の遺伝子発現を通じてポリペプチド骨格を介してサイトカインに連結された、融合タンパク質、直接的に合成されたタンパク質、及び事前に形成された配列が架橋剤によって会合された連結タンパク質を含む。この用語はまた、サイトカインと、標的化ペプチド/タンパク質との会合、例えば、凝集体も含意するように、本明細書において使用される。本発明のコンジュゲートは、輸送体配列に連結されたポリペプチド配列に対応するエフェクター機能が生じ得るように、細胞へと直接的に指向性を持たせることができる。ペプチド(例えば、化合物X及び配列番号1)は、サイトカインに直接的に連結されてもよく、又はスペーサーを通じて間接的に連結されてもよく、スペーサーは、単一のアミノ酸、アミノ酸配列、又は有機残基、例えば、6-アミノカプリル-N-ヒドロキシスクシンイミドであり得る。
ペプチドリガンドは、好ましくは、サイトカインのN末端に連結され、それによって、改変されたサイトカインのその受容体への結合における任意の干渉を最小限にする。或いは、ペプチドは、分子において天然に存在し得るか、又は遺伝子操作技法を使用して人工的に挿入され得る、アミド結合又はカルボン酸結合のアクセプターであるアミノ酸残基に連結され得る。改変されたサイトカインは、好ましくは、ペプチドをコードする5'連続配列を含むcDNAの使用によって調製される。好ましい実施形態によると、TNFのアミノ末端が、スペーサーG(グリシン)を通じてCNGRC(配列番号5)ペプチドに連結された、TNFとCNGRC(配列番号5)配列との間のコンジュゲーション産物が、提供される。コンジュゲートはまた、上記に定義される化合物Xを含む。
本発明のコンジュゲート、又はタンパク質、及び/又は化合物XをコードするcDNAは、宿主における発現のためにコドン最適化されていてもよい。
新生物細胞への化学療法薬の浸透は、固形腫瘍化学療法の有効性に極めて重要である。固形腫瘍におけるがん細胞に到達するためには、化学療法薬は、薬物を血管に進入させ、血管壁を越え、最終的には間質を通じて移動しなければならない。不均質な腫瘍灌流、血管透過性、及び細胞密度、並びに間質圧の増加は、新生物細胞への薬物の浸透、及び結果的に化学療法の有効性を制限し得る、極めて重要な障壁を表し得る。
同じことが、抗がん免疫モジュレーター又は免疫細胞に当てはまり、これらもまた、その作用のためには腫瘍組織に浸透する必要がある。したがって、これらの因子に影響を及ぼす作用を有し、薬物浸透の障壁を変更することができるサイトカインは、本発明において有用である。本発明において使用され得るサイトカインの非限定的なリストは、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、2、4、6、12、15、EMAP II、血管内皮成長因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF、又はケモカインである。一実施形態において、TNFは、TNF受容体のうちの1つに選択的に結合することができるTNFの突然変異体形態である(Loetscher H et al (1993) J Biol Chem 268:26350-7、Van Ostade X et al (1993) Nature 361 :266-9)。本発明の別の実施形態において、TNFは、TNF受容体に対して低い親和性を有する突然変異体である(Huyghe et al, EMBO Molecular Medicine 12: e11223, 2020)。
本発明は、TNF(TNF-アルファ)及び内皮単球活性化ポリペプチドII(EMAP-II)に関連して、以下の実施例によって例証される。しかしながら、TNF-アルファの構造及び抗腫瘍活性と、TNF-ベータ(リンホトキシン-アルファとも称される)及びTNF関連アポトーシス誘導性リガンド(TRAIL)のものとの高い類似性を考慮すると、TNF-ベータ又はTRAILに基づく類似の化合物が、当業者によって容易に生成され得る。
好ましくは、本発明によるコンジュゲートは、N末端からC末端に、上記に定義される化合物X、配列CNGRCG(配列番号1)のペプチド、上記に定義されるタンパク質を含む。好ましくは、本発明によるコンジュゲートは、N末端からC末端に、セリン残基、配列CNGRCG(配列番号1)、TNF-アルファを含む。好ましくは、本発明によるコンジュゲートは、N末端からC末端に、アルファ接合因子分泌シグナルペプチド、配列CNGRCG(配列番号1)、TNF-アルファを含む。好ましくは、本発明によるコンジュゲートは、N末端からC末端に、OmpTリーダー配列、配列CNGRCG(配列番号1)、TNF-アルファを含む。
「均質な」とは、予測される分子量を有することを意図する。
上記の配列CNGRCG(配列番号1)の第1のペプチドは、タンパク質のN末端に直接的に連結され得るか、又はリンカーを通じて連結され得る。上記の化合物Xは、前記ペプチド(例えば、配列CNGRCG(配列番号1)のペプチド)のN末端に直接的に連結され得るか、又はリンカーを通じて連結され得る。例えば、本発明のコンジュゲートは、上記のリーダー配列又は化合物Xと配列CNGRCG(配列番号1)の第1のペプチドとの間に、制限部位を含む配列を含み得る。
好ましくは、ヒトTNFは、配列
を含むか、又はそれからなる。
好ましくは、マウスTNFは、配列
を含むか、又はそれからなる。
好ましくは、OmpTシグナルペプチドは、配列
を含むか、又はそれからなる。
好ましくは、アルファ接合因子分泌シグナルペプチドは、配列
を含むか、又はそれからなる。
より好ましくは、本発明によるコンジュゲートは、配列
を含むか、又はそれからなる。
好ましくは、本発明のコンジュゲートをコードする核酸は、配列番号30、31、32、33、又は34を含むか、又はそれからなる。
本発明による均質なコンジュゲートを産生させるための方法において、コンジュゲートの発現は、当業者に公知の任意の発現系において実行され得る。
発現系の例は、原核生物系、例えば、枯草菌、大腸菌、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactoccos Lactis)である。真核生物発現系の例は、酵母系、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)及びP.パストリス、真菌系、例えば、アスペルギウス・ニガー(Aspergillus niger)及び麹菌(oryzae)、昆虫系、哺乳動物系、例えば、HEK293及びCHO、トランスジェニック植物又は動物である。刊行物Gomes et al., Advances in Animal and Veterinary Sciences, June 2016, 4(7):346-356において言及されているすべての発現系が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の文脈において、短い側鎖を有するアミノ酸は、好ましくは、1~6個の炭素原子、好ましくは、1~3個の炭素原子を含む鎖を有するアミノ酸である。そのようなアミノ酸の例は、グリシン、アラニン、セリン、バリンである。
本明細書に記載されるポリヌクレオチド又は核酸は、ベクターに存在してもよい。ベクターは、別のポリヌクレオチドを付加し、付加されたポリヌクレオチドの複製をもたらすことができる、複製ポリヌクレオチド、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドである。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターの構築は、当該技術分野において公知の標準的なライゲーション技法を用いる。例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照されたい。ベクターは、更なるクローニング(ポリヌクレオチドの増幅)を提供し得る、すなわち、クローニングベクター、又はポリヌクレオチドの発現を提供し得る、すなわち、発現ベクターであり得る。ベクターという用語には、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、トランスポゾンベクター、及び人工染色体ベクターが含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターの例としては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、複製能であってもよく、又は複製欠損であってもよい。ベクターは、細胞のゲノムDNAへの組み込みをもたらし得る。典型的には、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞及び/又は細菌細胞、例えば、大腸菌における複製が可能である。
ベクターの選択は、結果として得られるコンストラクトにおける様々な所望される特徴、例えば、選択マーカー、ベクター複製速度、消化管の細胞への遺伝子移入における使用等に依存する。本明細書におけるベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞は、原核生物細胞又は真核生物細胞である。好適な真核生物細胞としては、哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞及びヒト細胞が挙げられる。好適な原核生物細胞としては、真正細菌、例えば、グラム陰性生物、例えば、大腸菌が挙げられる。
発現ベクターは、任意選択で、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含む。調節配列の例は、プロモーターである。プロモーターは、使用される宿主細胞において、例えば、CgAポリヌクレオチド若しくはそのフラグメントの構築及び/若しくは特徴付けにおいて機能性であり得、かつ/又はベクターの最終的なレシピエントにおいて機能性であり得る。プロモーターは、誘導性、抑制性、又は構成的であり得、それぞれのタイプの例は、当該技術分野において公知である。本発明のポリヌクレオチドはまた、転写終結因子も含み得る。好適な転写終結因子は、当該技術分野において公知である。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、インビトロ又はインビボにおいて産生させることができる。例えば、インビトロ合成のための方法としては、従来的なDNA/RNA合成装置を用いた化学合成が挙げられるが、これに限定されない。合成ポリヌクレオチド及びインビトロ合成のための試薬の市販供給業者は、公知である。また、インビトロ合成のための方法としては、例えば、無細胞系において環状又は線形発現ベクターを使用するインビトロ転写も挙げられる。発現ベクターはまた、細胞において本発明のポリヌクレオチドを産生させるためにも使用することができ、ポリヌクレオチドを、次いで、細胞から単離してもよい。
また、本明細書に記載される1つ又は複数のポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む、組成物も提供される。そのような組成物は、典型的に、薬学的に許容される担体を含む。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」としては、薬学的投与と適合性のある、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸収遅延材等が挙げられるが、これらに限定されない。追加の化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。
組成物は、薬学の分野において公知の方法によって調製され得る。一般に、組成物は、その意図される投与経路と適合性となるように製剤化することができる。製剤は、固体であっても液体であってもよい。投与は、全身的であっても局所的であってもよい。いくつかの態様において、局所投与は、部位特異的な標的化された疾患管理の利点を有し得る。局所療法は、高い臨床的に有効な濃度を処置部位に直接的に提供することができ、全身性副作用を引き起こす可能性が低い。
投与経路の例としては、非経口(例えば、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、筋肉内)、腸内(例えば、経口又は直腸)、及び局所(例えば、皮膚、吸入、経粘膜)投与が挙げられる。本発明の化合物の腸内投与に適切な剤形としては、錠剤、カプセル、又は液体を挙げることができる。非経口投与に適切な剤形としては、静脈内投与を挙げることができる。局所投与に適切な剤形としては、鼻内スプレー、定用量吸入装置、乾燥粉末吸入装置、又は噴霧によるものを挙げることができる。溶液又は懸濁液には、以下の成分:滅菌希釈剤、例えば、投与用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒;抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン;抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム;キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸;緩衝化剤、例えば、酢酸、クエン酸、又はリン酸;電解質、例えば、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、及びマグネシウムイオン、並びに等張性の調節のための薬剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースが含まれ得る。pHは、酸又は塩基、例えば、塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて調節することができる。組成物は、例えば、ガラス又はプラスチックで作製された、アンプル、使い捨てのシリンジ、又は複数回投薬用のバイアル中に封入することができる。
組成物は、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含み得る。静脈内投与に関して、好適な担体としては、ヒトアルブミン、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL(商標)(BASF社、Parsippany、N.J.)、又はリン酸緩衝食塩水が挙げられる。組成物は、典型的には滅菌であり、注射用途に好適である場合、容易な注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。それは、製造及び保管の条件下において安定である必要があり、細菌及び真菌等の微生物の混入作用から保存されなければならない。担体は、例えば、アルブミン、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)、並びにそれらの好適な混合物を含有する、溶媒及び分散媒であり得る。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、及び塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによって、もたらすことができる。滅菌溶液は、活性化合物(例えば、本明細書に記載されるポリペプチド又はポリヌクレオチド)を、上述のもの等の成分のうちの1つ又は組合せとともに、必要とされる量で、適切な溶媒中に組み込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、分散媒及び上述のもの以外の他の成分を含む、滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、使用され得る調製の方法には、活性成分に任意の追加の所望される成分を加えた粉末をそれらの事前に滅菌濾過した溶液から得る、真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。
腸内投与については、組成物は、例えば、経鼻栄養チューブ、浣腸によって、結腸内視鏡検査で、又は経口で、送達され得る。経口組成物は、不活性希釈剤又は食用担体を含み得る。経口での治療的投与の目的で、活性化合物を、賦形剤とともに組み込み、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、流体担体を使用して、調製することもできる。薬学的に適合性のある結合剤を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分又は類似の性質の化合物のうちのいずれかを含み得る:結合剤、例えば、微晶質セルロース、トラガカントガム、若しくはゼラチン;賦形剤、例えば、デンプン若しくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Primogel、若しくはトウモロコシデンプン;滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム若しくはSterotes;流動促進剤(glidant)、例えば、コロイド状二酸化ケイ素;甘味剤、例えば、スクロース若しくはサッカリン;又は香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ香料。
吸入による投与については、活性化合物は、エアロゾルスプレー、ネブライザー、又は吸入装置、例えば、鼻内スプレー、定用量吸入装置、又は乾燥粉末吸入装置の形態で送達され得る。全身投与はまた、経粘膜手段又は経皮手段によっても行われ得る。経粘膜投与又は経皮投与に関して、浸透させようとする障壁に適切な浸透剤が、製剤中に使用される。そのような浸透剤は、一般に、当該技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与については、洗浄剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内スプレー又は坐剤の使用を通じて達成することができる。経皮投与については、活性化合物は、当該技術分野において一般的に公知のように、軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームに製剤化され得る。経皮投与の例としては、真皮又は他の関連組織へのイオン泳動送達が挙げられる。活性化合物また、直腸送達のために、坐剤(例えば、従来的な坐剤基剤、例えば、カカオバター及び他のグリセリドを用いる)又は停留浣腸剤の形態で調製することもできる。インプラントを含め、制御放出製剤等、化合物を身体からの急速な排除から保護する担体を用いて、活性化合物を調製してもよい。生体分解性で生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤は、標準的な技法を使用して調製することができる。材料はまた、市販入手することもできる。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。送達試薬、例えば、脂質、カチオン性脂質、リン脂質、リポソーム、及びマイクロカプセル封入もまた、使用され得る。
本発明の別の目的は、腫瘍、好ましくは、固形腫瘍、より好ましくは、リンパ腫、好ましくは、CNSの原発性びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(PCNSL)、脳腫瘍、例えば、神経膠腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、びまん性内在性脳幹部神経膠腫、肉腫、黒色腫 口腔若しくは皮膚扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、頭頸部、胃食道部、結腸直腸、膵臓、卵巣、肺、例えば、SCLC、NSCLC、中皮腫、子宮頸、乳がん、腎臓、尿路上皮、又はこれらの転移の処置及び/又は予防の方法であって、本明細書に開示されるコンジュゲート、又は核酸、又はベクター、又はナノ粒子、又は組合せ物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法である。
本発明の文脈において、「含む」という用語は、「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」という用語を含む。
配列:
また、本明細書及び以下に示される配列に由来する核酸配列及びアミノ酸配列、例えば、機能性フラグメント、突然変異体、誘導体、アナログ、前駆体、及び本明細書に開示される配列と少なくとも70%の同一性%を有する配列も、本発明に含まれる。
また、本明細書及び以下に示される配列に由来する核酸配列及びアミノ酸配列、例えば、機能性フラグメント、突然変異体、誘導体、アナログ、前駆体、及び本明細書に開示される配列と少なくとも70%の同一性%を有する配列も、本発明に含まれる。
以下に記載されるタンパク質は、好ましくは、対応するNCBI受託番号で開示される配列によって特徴付けられる。
pET12プラスミドにクローニングされるマウスNGR-TNF:
(アミノ酸配列:配列番号24、ヌクレオチド配列:配列番号30)
大腸菌細胞のペリプラズム空間におけるマウスNGR-TNF発現のためにpET12プラスミドにクローニングされるcDNA配列。
コドン及び対応するアミノ酸(それぞれのコドンの上に太字で示す)が、示されている。
pET12プラスミドへのcDNAクローニングに使用される制限部位(Sal I)は、二重下線で示されている。
*、終止コドン
斜体:CNGRCG配列をコードするcDNA。
下線:マウスTNFのcDNA配列。
枠で囲んだ配列、ペリプラズム空間への輸送を促進するためのOmpTシグナルペプチド(pET12プラスミドによって提供される)
矢印、大腸菌におけるompT-NGR-TNF融合タンパク質の予測される切断部位pET/101DプラスミドにクローニングされるマウスS-NGR-TNF:
大腸菌細胞のペリプラズム空間におけるマウスNGR-TNF発現のためにpET12プラスミドにクローニングされるcDNA配列。
コドン及び対応するアミノ酸(それぞれのコドンの上に太字で示す)が、示されている。
pET12プラスミドへのcDNAクローニングに使用される制限部位(Sal I)は、二重下線で示されている。
*、終止コドン
斜体:CNGRCG配列をコードするcDNA。
下線:マウスTNFのcDNA配列。
枠で囲んだ配列、ペリプラズム空間への輸送を促進するためのOmpTシグナルペプチド(pET12プラスミドによって提供される)
矢印、大腸菌におけるompT-NGR-TNF融合タンパク質の予測される切断部位pET/101DプラスミドにクローニングされるマウスS-NGR-TNF:
(アミノ酸配列:配列番号25、ヌクレオチド配列:31)
大腸菌細胞におけるマウスS-NGR-TNF発現のためにpET/101DプラスミドにクローニングされるcDNA配列。
化学的に合成されたコドン(大腸菌細胞における発現のために最適化されている)及び対応するアミノ酸(それぞれのコドンの上に太字で)が、示されている。
pET/101DプラスミドへのcDNAクローニングに使用される制限部位(Nde I及びBam HI)は、二重下線で示されている。
*、終止コドン
斜体:SCNGRCG(配列番号6)配列をコードするcDNA。
下線:マウスTNFのcDNA配列。
pET/101DプラスミドにクローニングされるヒトS-NGR-TNF(コドン使用頻度は大腸菌に最適化されている):
大腸菌細胞におけるマウスS-NGR-TNF発現のためにpET/101DプラスミドにクローニングされるcDNA配列。
化学的に合成されたコドン(大腸菌細胞における発現のために最適化されている)及び対応するアミノ酸(それぞれのコドンの上に太字で)が、示されている。
pET/101DプラスミドへのcDNAクローニングに使用される制限部位(Nde I及びBam HI)は、二重下線で示されている。
*、終止コドン
斜体:SCNGRCG(配列番号6)配列をコードするcDNA。
下線:マウスTNFのcDNA配列。
pET/101DプラスミドにクローニングされるヒトS-NGR-TNF(コドン使用頻度は大腸菌に最適化されている):
(アミノ酸配列:配列番号27、ヌクレオチド配列:32)
大腸菌細胞におけるヒトS-NGR-TNF発現のためにpET/101DプラスミドにクローニングされるcDNA配列。
化学的に合成されたコドン(大腸菌細胞における発現のために最適化されている)及び対応するアミノ酸(それぞれのコドンの上に太字で)が、示されている。
pET/101DプラスミドへのcDNAクローニングに使用される制限部位(Nde I及びBam HI)は、二重下線で示されている。
*、終止コドン
斜体:SCNGRCG(配列番号6)配列をコードするcDNA。
下線:ヒトTNFのcDNA配列。pET11プラスミドにクローニングされるヒトS-NGR-TNF:
大腸菌細胞におけるヒトS-NGR-TNF発現のためにpET/101DプラスミドにクローニングされるcDNA配列。
化学的に合成されたコドン(大腸菌細胞における発現のために最適化されている)及び対応するアミノ酸(それぞれのコドンの上に太字で)が、示されている。
pET/101DプラスミドへのcDNAクローニングに使用される制限部位(Nde I及びBam HI)は、二重下線で示されている。
*、終止コドン
斜体:SCNGRCG(配列番号6)配列をコードするcDNA。
下線:ヒトTNFのcDNA配列。pET11プラスミドにクローニングされるヒトS-NGR-TNF:
(アミノ酸配列:配列番号27、ヌクレオチド配列:33)
大腸菌細胞におけるヒトS-NGR-TNF発現のためにpET11プラスミドにクローニングされるcDNA配列。
化学的に合成されたコドン及び対応するアミノ酸(それぞれのコドンの上に太字で示す)が、示されている。
pET11プラスミドへのcDNAクローニングに使用される制限部位(Nde I及びSal I)は、二重下線で示されている。
*、終止コドン
斜体:SCNGRCG(配列番号6)配列をコードするcDNA。
下線:ヒトTNFのcDNA配列。
pPIC9KプラスミドにクローニングされるヒトNGR-TNF(コドン使用頻度はピキア・パストリスに最適化されている):
大腸菌細胞におけるヒトS-NGR-TNF発現のためにpET11プラスミドにクローニングされるcDNA配列。
化学的に合成されたコドン及び対応するアミノ酸(それぞれのコドンの上に太字で示す)が、示されている。
pET11プラスミドへのcDNAクローニングに使用される制限部位(Nde I及びSal I)は、二重下線で示されている。
*、終止コドン
斜体:SCNGRCG(配列番号6)配列をコードするcDNA。
下線:ヒトTNFのcDNA配列。
pPIC9KプラスミドにクローニングされるヒトNGR-TNF(コドン使用頻度はピキア・パストリスに最適化されている):
(アミノ酸配列:配列番号29、ヌクレオチド配列:34)
ピキア・パストリス細胞におけるヒトNGR-TNF発現のためにpPIC9KプラスミドにクローニングされるcDNA配列。
化学的に合成されたコドン(ピキア・パストリス細胞における発現のために最適化されている)及び対応するアミノ酸(それぞれのコドンの上に太字で)が、示されている。
pPIC9KプラスミドへのcDNAクローニングに使用される制限部位(BamHI I及びEcoRI)は、二重下線で示されている。
*、終止コドン
枠で囲んだ配列、培養培地へのNGR-TNFの分泌を促進するためのアルファ接合因子分泌シグナルペプチド(pPIC9K発現プラスミドによって提供される)。
矢印、ピキア・パストリスにおける融合タンパク質の切断部位。
斜体:CNGRCG配列をコードするcDNA。
下線:ヒトTNFのcDNA配列。
ピキア・パストリス細胞におけるヒトNGR-TNF発現のためにpPIC9KプラスミドにクローニングされるcDNA配列。
化学的に合成されたコドン(ピキア・パストリス細胞における発現のために最適化されている)及び対応するアミノ酸(それぞれのコドンの上に太字で)が、示されている。
pPIC9KプラスミドへのcDNAクローニングに使用される制限部位(BamHI I及びEcoRI)は、二重下線で示されている。
*、終止コドン
枠で囲んだ配列、培養培地へのNGR-TNFの分泌を促進するためのアルファ接合因子分泌シグナルペプチド(pPIC9K発現プラスミドによって提供される)。
矢印、ピキア・パストリスにおける融合タンパク質の切断部位。
斜体:CNGRCG配列をコードするcDNA。
下線:ヒトTNFのcDNA配列。
本発明は、したがって、以下の図面を参照して、非限定的な例を用いて例示される。
本発明を説明するとき、本明細書において定義されていないすべての用語は、技術分野において認識されているそれらの一般的な意味を有する。本明細書に明示的に定義されていない任意の用語又は表現は、当業者によって理解されているその広く許容されている定義を有するものとする。以下の説明が、本発明の具体的な実施形態又は特定の使用に関する範囲に関して、それは、例示に過ぎず、特許請求される発明を制限することを意図するものではない。以下の説明は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の趣旨及び範囲に含まれるすべての代替形態、改変、及び均等物を包含することを意図する。
本発明はまた、本明細書に開示されるタンパク質、ペプチド、コンジュゲート、又は配列の機能性フラグメント、バリアント、又は誘導体も含む。本発明の文脈において、特定のDNA配列について言及する場合、それは、RNA配列が、チミンの代わりにウラシルを含み、RNA分子の骨格が、デオキシリボースの代わりにリボースを含むという事実を除いて前記ポリヌクレオチドと同一であるRNA分子、そこに開示される配列に相補的なRNA配列、その機能性フラグメント、突然変異体、及び誘導体、そこからコードされるタンパク質、その機能性フラグメント、突然変異体、及び誘導体も含めることを意図する。「相補的な」配列という用語は、配列と同一ではないが、第1の配列に相補的な塩基配列を有するか、又は第1の配列と同じアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチドを指す。相補的な配列は、DNA及びRNAポリヌクレオチドを含み得る。「機能性(functional)」又は「機能的(functional)」という用語は、同じ活性を維持することができるとして理解され得る「フラグメント」は、好ましくは、少なくとも10個のアミノ酸、20個のアミノ酸、30個のアミノ酸、40個のアミノ酸、50個のアミノ酸、60個のアミノ酸、70個のアミノ酸、80個のアミノ酸、90個のアミノ酸、100個のアミノ酸等の長さである。「誘導体」は、組換え又は合成であり得る。「誘導体」という用語は、タンパク質に関連して本明細書において使用される場合、化学的に改変されたタンパク質又はそのアナログを意味し、少なくとも1つの置換基が、改変されていないタンパク質又はそのアナログには存在しない、すなわち、共有結合的に改変されているタンパク質を意味する。典型的な改変は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル等である。本明細書において使用される場合、「誘導体」という用語はまた、例えば、本明細書に開示される配列よりも長いか又は短く、かつ/又はそれとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、より好ましくは少なくとも99%の同一性パーセンテージを有する、ポリヌクレオチド/タンパク質を指す。本発明において、「少なくとも70%の同一性」は、同一性が、参照配列に対して少なくとも70%、又は75%、又
は80%、又は85%、又は90%、又は95%、又は100%の配列同一性であり得ることを意味する。これは、すべての言及される同一性%に当てはまる。好ましくは、同一性%は、参照される配列の全長に関する。本発明の誘導体はまた、ポリペプチドの「機能性突然変異体」も含み、これは、配列における1つ又は複数のアミノ酸を突然変異させることによって生成され得、その活性を維持する、ポリペプチドである。実際に、本発明のポリペプチドは、必要とされる場合、例えば、グリコシル化、ミリストイル化、アミド化、カルボキシル化、又はリン酸化によって、インビトロ及び/又はインビボで改変されてもよく、例えば、当該技術分野において公知の合成又は組換え技法によって得ることができる。本発明において、「機能性」は、例えば、例として免疫調節活性又は抗炎症活性である「活性を維持すること」を意図する。ポリヌクレオチドの配列内のヌクレオチド置換、付加、又は欠失を除き、本明細書において例証されるポリヌクレオチドの同じヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドもまた、本主題の発明の範囲内であるが、これは、これらのバリアントポリヌクレオチドが、本明細書において具体的に例証されるポリヌクレオチドと同じ関連機能活性を実質的に保持する(例えば、それらは、例証されるポリヌクレオチドによってコードされるものと同じアミノ酸配列又は同じ機能活性を有するタンパク質をコードする)場合に限る。したがって、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、上記で考察されるように、具体的に例証される配列の突然変異体、誘導体、バリアント、及びフラグメントを含むように理解されるものとする。本主題の発明はまた、標準的なストリンジェントな条件下及び標準的な方法において本発明のポリヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが可能となるように、その配列と十分に相同である配列を有するポリヌクレオチド分子も企図する(Maniatis, T. et al, 1982)。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、本明細書に例証されるものとのより具体的な同一性及び/又は類似性の範囲に関して定義され得る。配列同一性は、典型的には、60%を上回り、好ましくは、75%を上回り、より好ましくは、80%を上回り、更により好ましくは90%を上回り、95%を上回ってもよい。配列の同一性及び/又は類似
性は、本明細書に例証される配列と比較して、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、又は99%、又はそれ以上であり得る。別途示されない限り、本明細書において使用される場合、2つの配列の配列同一性及び/又は類似性パーセントは、Karlin and Altschul (1993)において修正されているKarlin and Altschul (1990)のアルゴリズムを使用して判定することができる。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990)のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれる。BLAST検索は、所望される配列同一性パーセントを有する配列を得るために、NBLASTプログラムをスコア=100、ワード長=12で用いて実行することができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るために、ギャップ付きBLASTを、Altschul et al. (1997)に記載されるように使用することができる。BLAST及びギャップ付きBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(NBLAST及びXBLAST)のデフォルトパラメーターを使用することができる。NCBI/NIHウェブサイトを参照されたい。
は80%、又は85%、又は90%、又は95%、又は100%の配列同一性であり得ることを意味する。これは、すべての言及される同一性%に当てはまる。好ましくは、同一性%は、参照される配列の全長に関する。本発明の誘導体はまた、ポリペプチドの「機能性突然変異体」も含み、これは、配列における1つ又は複数のアミノ酸を突然変異させることによって生成され得、その活性を維持する、ポリペプチドである。実際に、本発明のポリペプチドは、必要とされる場合、例えば、グリコシル化、ミリストイル化、アミド化、カルボキシル化、又はリン酸化によって、インビトロ及び/又はインビボで改変されてもよく、例えば、当該技術分野において公知の合成又は組換え技法によって得ることができる。本発明において、「機能性」は、例えば、例として免疫調節活性又は抗炎症活性である「活性を維持すること」を意図する。ポリヌクレオチドの配列内のヌクレオチド置換、付加、又は欠失を除き、本明細書において例証されるポリヌクレオチドの同じヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドもまた、本主題の発明の範囲内であるが、これは、これらのバリアントポリヌクレオチドが、本明細書において具体的に例証されるポリヌクレオチドと同じ関連機能活性を実質的に保持する(例えば、それらは、例証されるポリヌクレオチドによってコードされるものと同じアミノ酸配列又は同じ機能活性を有するタンパク質をコードする)場合に限る。したがって、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、上記で考察されるように、具体的に例証される配列の突然変異体、誘導体、バリアント、及びフラグメントを含むように理解されるものとする。本主題の発明はまた、標準的なストリンジェントな条件下及び標準的な方法において本発明のポリヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが可能となるように、その配列と十分に相同である配列を有するポリヌクレオチド分子も企図する(Maniatis, T. et al, 1982)。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、本明細書に例証されるものとのより具体的な同一性及び/又は類似性の範囲に関して定義され得る。配列同一性は、典型的には、60%を上回り、好ましくは、75%を上回り、より好ましくは、80%を上回り、更により好ましくは90%を上回り、95%を上回ってもよい。配列の同一性及び/又は類似
性は、本明細書に例証される配列と比較して、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、又は99%、又はそれ以上であり得る。別途示されない限り、本明細書において使用される場合、2つの配列の配列同一性及び/又は類似性パーセントは、Karlin and Altschul (1993)において修正されているKarlin and Altschul (1990)のアルゴリズムを使用して判定することができる。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990)のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれる。BLAST検索は、所望される配列同一性パーセントを有する配列を得るために、NBLASTプログラムをスコア=100、ワード長=12で用いて実行することができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るために、ギャップ付きBLASTを、Altschul et al. (1997)に記載されるように使用することができる。BLAST及びギャップ付きBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(NBLAST及びXBLAST)のデフォルトパラメーターを使用することができる。NCBI/NIHウェブサイトを参照されたい。
上記に定義されるペプチド、タンパク質、又は化合物Xは、本明細書に言及される配列に対して少なくとも65%、70%、75%、80%、82%、85%、90%、92%、95%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。2つのアミノ酸配列の同一性パーセントを判定することには、2つの配列の対応する位置においてアミノ酸残基をアライメントし比較することが含まれ得る。2つの配列におけるすべての位置が、同一のアミノ酸残基によって占有されている場合、これらの配列は、100%同一であると称される。同一性パーセントは、Smith Watermanアルゴリズム(Smith T F, Waterman M S 1981 「Identification of Common Molecular Subsequences,」 J Mol Biol 147: 195-197、これは、参照により完全に記載されているかのように本明細書に組み込まれる)によって測定され得る。ペプチド、タンパク質、又は化合物Xは、言及された配列よりも少ないか又は多い残基を有し得る。例えば、ペプチドは、6個を上回るアミノ酸を含み得る。ペプチド、タンパク質、又は化合物Xは、配列番号1の配列又は他の本明細書に言及される配列と比較して、アミノ酸の置き換えを示し得る。置き換えは、天然に存在するか又は合成かに関係なく、任意のアミノ酸との置き換えであり得る。置き換えは、天然に存在するアミノ酸に類似して機能するアミノ酸アナログ又はアミノ酸模倣体との置き換えであってもよい。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、並びに後に改変されるアミノ酸である。後での改変は、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、及びO-ホスホセリン改変であり得るが、これらに限定されない。天然に存在するアミノ酸としては、標準的な20個、及び異常アミノ酸が挙げられる。異常アミノ酸としては、セレノシステインが挙げられる。置き換えは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びR基に結合した炭素を指す、アミノ酸アナログとの置き換えであり得る。アミノ酸アナログの例としては、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアナログは、改変されたR基又は改変されたペプチド骨格を有し得る。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持し得る。置き換えは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する、化学化合物を指す、アミノ酸模倣体との置き換えであり得る。置き換えは、α,α-二置換5-炭素オレフィン非天然アミノ酸との置き換えであり得る。置き換えは、保存的置き換え、又は非保存的置き換えであり得る。保存的置き換えは、アミノ酸と、化学的に類似のアミノ酸との置換を指す。機能的に類似のアミノ酸をもたらす保存的置換の一覧は、当該技術分野において周知である。そのような保存的置き換えとしては、(1)アラニン(A)、グリシン(G)、(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、(4)アルギニン(R)、リジン(K)、(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)、(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、(7)セリン(S)、スレオニン(T)、及び(8)システイン(C)、メチオニン(M)の互いの置換が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい)。置き換えは、1つのアミノ酸から、類似の疎水性、親水性、可溶性、極性、又は酸性度を有する別のものへのものであり得る。参照配列、配列番号1、又は他の言及される配列に対して100%を下回る同一性を有する配列は、バリアントと称され得る。ある実施形態には、配列番号1のバリアントである配列を有するペプチドを含む組成物が含まれる。ある実施形態において、1つ又は複数のアミノ酸残基が、架橋部分を有する残基と置き換えられる。本明細書において使用される場合、「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、ペプチド(アミド)結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基のポリマーを含む。これらの用語は、本明細書において使用される場合、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。典型的には、ペプチド又はポリペプチドは、少なくとも3つのアミノ酸の長さであろう。ペプチド又はポリペプチドは、個々のタンパク質又はタンパク質の集合を
指し得る。本発明のペプチドは、天然のアミノ酸及び/又は非天然のアミノ酸(すなわち、自然界には存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる、化合物)を含み得る。当該技術分野において公知のように、アミノ酸アナログを、代替的に用いてもよい。ペプチド又はポリペプチドにおけるアミノ酸のうちの1つ又は複数を、例えば、化学的実体、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化、又は他の改変のためのリンカーの付加によって、改変してもよい。ペプチド又はポリペプチドはまた、単一分子であってもよく、又はタンパク質等の多分子複合体であってもよい。ペプチド又はポリペプチドは、天然に存在するタンパク質又はペプチドの単なるフラグメントであってもよい。ペプチド又はポリペプチドは、天然に存在してもよく、組換えであってもよく、若しくは合成であってもよく、又はこれらの任意の組合せであってもよい。細胞内容物、細胞コンパートメント、又は特定のタンパク質、脂質、核酸、又は細胞内の他の標的若しくはバイオマーカーを標的とする多数の薬剤が、開発されている。これらの薬剤は、強い親和性でそれらの細胞内標的に結合することができるが、これらの化合物の多くは、それらが分子であるか、タンパク質であるか、核酸であるか、ペプチドであるか、ナノ粒子であるか、又は他の意図される治療剤若しくは診断マーカーであるかに関係なく、効率的に細胞膜を越えることができないか、又はまったくできない。
指し得る。本発明のペプチドは、天然のアミノ酸及び/又は非天然のアミノ酸(すなわち、自然界には存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる、化合物)を含み得る。当該技術分野において公知のように、アミノ酸アナログを、代替的に用いてもよい。ペプチド又はポリペプチドにおけるアミノ酸のうちの1つ又は複数を、例えば、化学的実体、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化、又は他の改変のためのリンカーの付加によって、改変してもよい。ペプチド又はポリペプチドはまた、単一分子であってもよく、又はタンパク質等の多分子複合体であってもよい。ペプチド又はポリペプチドは、天然に存在するタンパク質又はペプチドの単なるフラグメントであってもよい。ペプチド又はポリペプチドは、天然に存在してもよく、組換えであってもよく、若しくは合成であってもよく、又はこれらの任意の組合せであってもよい。細胞内容物、細胞コンパートメント、又は特定のタンパク質、脂質、核酸、又は細胞内の他の標的若しくはバイオマーカーを標的とする多数の薬剤が、開発されている。これらの薬剤は、強い親和性でそれらの細胞内標的に結合することができるが、これらの化合物の多くは、それらが分子であるか、タンパク質であるか、核酸であるか、ペプチドであるか、ナノ粒子であるか、又は他の意図される治療剤若しくは診断マーカーであるかに関係なく、効率的に細胞膜を越えることができないか、又はまったくできない。
組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。薬学的に許容される担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、電解質、硫酸プロタミン、リン酸水素ニナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ワックス、ポリエチレングリコール、デンプン、ラクトース、リン酸二カルシウム、微晶質セルロース、スクロース、デキストロース、タルク、炭酸マグネシウム、カオリン;非イオン性界面活性剤、食用油、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL(商標)(BASF社、Parsippany、N.J.)、及びリン酸緩衝食塩水(PBS)のうちの少なくとも1つを挙げることができるが、これらに限定されない。
投与することは、1ng/kg/日~100μg/kg/日の用量の融合タンパク質又はコンジュゲート産物を送達することを含み得る。用量は、1ng/kg/日~100μg/kg/日の任意の値であり得る。用量は、1ng/kg/日~100μg/kg/日の任意の2つの整数値の間の端点を含む任意の用量であり得る。用量は、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、若しくは100ng/kg/日若しくはmg/kg/日、又は前述のものの任意の2つの間の範囲内の任意の用量であり得る。好ましくは、用量は、約16ng/kg/日であり得る。投与することは、任意の用量の補完治療薬を送達することを含み得る。補完治療用量は、任意の1~100mg/kg/日であり得る。補完治療用量は、1~100mg/kg/日の任意の値であり得る。補完治療用量は、1ng/kg/日~100mg/kg/日の任意の2つの整数値の間の端点を含む任意の用量であり得る。補完治療用量は、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、若しくは100mg/kg/日、又は前述のものの任意の2つの間の範囲内の任意の用量であり得る。補完治療薬は、ナノ粒子(例えば、金ナノ粒子、リポソーム)、治療剤(例えば、サイトカイン、化学療法薬、抗体、及び抗体フラグメント、毒素、核酸)、診断剤(例えば、放射性化合物、蛍光化合物、化学発光性化合物)、造影剤(例えば、マイクロバブル)、又は細胞成分(例えば、キメラ抗原受容体若しくはTCR)のうちの任意の1つ又は複数であり得る。組成物中のペプチド及び少なくとも1つの補完治療薬の濃度は、ある期間にわたって、単回投与、2点投与、複数時点投与、又は連続投与(例えば、静脈内、経皮、腹腔内、分離式四肢灌流により、分離式肝臓灌流により、若しくは局所投与)における1日ごと(又は1週間ごと、3週間ごと、又は1カ月ごと)の投薬量を送達するように設定され得る。期間は、1日であり得る。期間は、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、若しくは24時間、又はこれらの値の任意の2つの間の範囲内の時間であり得る。ペプチド-サイトカイン及び補完治療薬は、同時に、又は1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、48時間の遅延若しくは先行、又は任意の中間時点で、投与することができる。
本発明の融合タンパク質又はコンジュゲート産物を含む組成物は、任意の量のタンパク質又は産物を含み得る。量は、上述の投薬量を、好適な体積又はサイズの送達モードで送達するのに十分なものであり得る。投薬量を、ある期間にわたって複数回投与に分割する場合、1回の体積又は送達モードに含まれる量は、総投薬量を、その期間全体にわたる投与回数で除算したものとなり得る。組成物中に存在する場合、補完治療薬は、任意の補完治療量であり得る。ペプチドと同様に、補完治療量は、正しい補完治療量を投与に使用される体積又は送達モードで送達するように調整され得る。
患者は、動物であり得る。患者は、哺乳動物であり得る。患者は、ヒトであり得る。患者は、がん患者であり得る。がん患者は、リンパ腫、又は肉腫、黒色腫 口腔若しくは皮膚扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、頭頸部、胃食道部、結腸直腸、膵臓、卵巣、肺、子宮頸、乳がん、腎臓、尿路上皮、脳腫瘍(例えば、神経膠芽腫及び星状細胞腫)がん患者、又は他の固形腫瘍若しくは前記腫瘍の転移を有する患者であり得る。組成物又は医薬組成物を投与するための経路は、任意の経路によるものであり得る。投与の経路は、経口、注射、局所、腸内、直腸、消化管、舌下、口唇下、頬内、硬膜外、脳内、脳室内、脳槽内、皮膚上、皮内、皮下、鼻内、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、髄腔内、腹腔内、膀胱内、硝子体内、空洞内、腟内、子宮内、羊水外、経皮、腫瘍内、及び経粘膜を含むがこれらに限定されない、任意の1つ又は複数の経路であり得る。実施形態は、ステープルペプチドを含む、本発明のペプチドを作製する方法を含む。
本方法は、選択された改変されたペプチドの配列を有する融合タンパク質又はコンジュゲート産物を合成する工程を含み得る。
本方法は、ペプチドのCD13への結合を評価する工程を含み得る。ペプチドの結合を評価するための方法及び条件は、以下の実施例に記載されている。
ある実施形態は、本明細書における任意のアミノ酸配列の配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含む、ペプチドを含む、融合タンパク質又はコンジュゲート産物又はその組成物を含む。ペプチド組成物は、本明細書における任意の補完治療薬を含み得る。ペプチド組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。
「タンパク質」という用語は、一本鎖ポリペプチド分子、並びに個々の構成要素であるポリペプチドが共有結合的又は非共有結合的手段によって連結された、多重ポリペプチド複合体を含む。「ポリペプチド」という用語は、2つ又はそれ以上のアミノ酸の長さ、典型的には5個を上回る、10個を上回る、又は20個を上回るアミノ酸を有する、ペプチドを含む。
本発明における使用のためのポリペプチド配列は、特定の配列又はそのフラグメントに限定されるものではなく、任意の供給源、例えば、関連するウイルス細菌タンパク質、細胞ホモログ、及び合成ペプチド、並びにこれらのバリアント又は誘導体から得られる相同性配列も含むことが、理解されるであろう。本発明のポリペプチド配列はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも含む。
本発明のアミノ酸配列に関連する「バリアント」又は「誘導体」という用語は、配列から又は配列に対する1つ(又は複数)のアミノ酸の任意の置換、変更、改変、置き換え、欠失、又は付加を含み、結果として得られるアミノ酸配列が、好ましくは、標的化活性を有する、好ましくは、本明細書に提示されるポリペプチドの活性の少なくとも25~50%、より好ましくは、少なくとも実質的に同じ活性を有することをもたらす。したがって、配列は、本発明における使用のために改変されていてもよい。典型的には、配列の活性を維持する改変が、行われる。したがって、一実施形態において、アミノ酸置換、例えば、1個、2個、又は3個から、10個、20個、又は30個の置換が行われ得るが、ただし、改変された配列が、活性の少なくとも約25~50%、又は実質的に同じ活性を保持することを条件とする。しかしながら、代替的な実施形態において、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に対する改変は、ポリペプチドの生物学的活性を意図的に低減するために行われてもよい。例えば、標的分子への結合能力を保持するが、機能性エフェクタードメインが欠如している短縮型ポリペプチドが、有用であり得る。一般に、好ましくは、バリアント又は誘導体のアミノ酸残基のうちの20%未満、10%未満、又は5%未満が、配列表に示される対応する領域と比較して、変更される。アミノ酸置換は、例えば治療的に投与されるポリペプチドの血漿半減期を増加させるために、天然に存在しないアナログの使用を含み得る。
本発明のポリペプチドはまた、配列のフラグメントを含め、上述のポリペプチド及びそのバリアントのフラグメントも含む。好ましいフラグメントとしては、エピトープを含むものが挙げられる。好適なフラグメントは、少なくとも約5個、例えば、10個、12個、15個、又は20個のアミノ酸の長さであろう。それらはまた、200個未満、100個未満、又は50個未満のアミノ酸の長さでもあり得る。タンパク質並びにその対立遺伝子及び種バリアントのポリペプチドフラグメントは、保存的置換を含め、1つ又は複数(例えば、2個、3個、5個、若しくは10個)の置換、欠失、又は挿入を含み得る。置換、欠失、及び/又は挿入が、例えば、組換え技術によって行われている場合、好ましくは、配列表に示されるアミノ酸残基のうちの20%未満、10%未満、又は5%未満が、変更されている。本発明のタンパク質は、典型的に、組換え手段によって作製される。しかしながら、それらは、当業者に周知の技法を使用する合成手段、例えば、固相合成によって作製されてもよい。ペプチドを化学的に合成するための様々な技法は、Borgia and Fields, 2000, TibTech 18: 243-251によって考察されており、その中に含まれる参考文献に詳細に記載されている。
本発明のコンジュゲートを調製するための方法は、国際公開第WO01/61017号に記載されている。例えば、TNFは、遺伝子操作又は化学的合成によって、CNGRCG(配列番号1)又はSCNGRCG(配列番号6)ペプチドと融合され得る。
材料及び方法
大腸菌細胞におけるマウス及びヒトNGR-TNFの産生。マウス及びヒトCNGRCG-TNF(NGR-TNF)をコードするcDNAを、以前に説明されているように(Curnis et al. 2000)組換えDNA技術によって産生させ、pET-11プラスミド(Novagen社、Madison、WI)にクローニングした。cDNA発現を、pET11製造業者の説明に従って、BL21(DE3)大腸菌細胞(Novagen社)において得た。産物を、硫酸アンモニウム沈殿、フェニル-セファロース6 Fast Flow(Pharmacia- Upjohn社)における疎水性相互作用クロマトグラフィー、DEAE-セファロースFast Flow(Pharmacia-Upjohn社)におけるイオン交換クロマトグラフィー、セファクリル-S-300 HR(Pharmacia-Upjohn社)におけるゲル濾過クロマトグラフィーによって、細菌ライセートから精製した。クロマトグラフィー工程において使用したすべての溶液は、滅菌かつエンドトキシン不含水(Salf社、Bergamo、Italy)を用いて調製した。
大腸菌細胞におけるマウス及びヒトNGR-TNFの産生。マウス及びヒトCNGRCG-TNF(NGR-TNF)をコードするcDNAを、以前に説明されているように(Curnis et al. 2000)組換えDNA技術によって産生させ、pET-11プラスミド(Novagen社、Madison、WI)にクローニングした。cDNA発現を、pET11製造業者の説明に従って、BL21(DE3)大腸菌細胞(Novagen社)において得た。産物を、硫酸アンモニウム沈殿、フェニル-セファロース6 Fast Flow(Pharmacia- Upjohn社)における疎水性相互作用クロマトグラフィー、DEAE-セファロースFast Flow(Pharmacia-Upjohn社)におけるイオン交換クロマトグラフィー、セファクリル-S-300 HR(Pharmacia-Upjohn社)におけるゲル濾過クロマトグラフィーによって、細菌ライセートから精製した。クロマトグラフィー工程において使用したすべての溶液は、滅菌かつエンドトキシン不含水(Salf社、Bergamo、Italy)を用いて調製した。
大腸菌細胞におけるマウス及びヒトS-NGR-TNFの産生。マウスSCNGRCG-TNF融合タンパク質(S-NGR-TNFと称される)を、pET101Dプラスミド(Invitrogen社)を使用して大腸菌細胞(BL21 Star (DE3))において発現させた。ヒトS-NGR-TNF融合タンパク質を、pET101D又はpET11プラスミドを使用して大腸菌細胞(BL21 Star(DE3))において発現させた。
マウスS-NGR-TNFを、細胞超音波処理及び遠心分離によって得られた細胞抽出物から、sTNF-R1(エタネルセプト)-アガロースカラムにおけるアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。100mM Tris-HCl、pH7.3中に7M尿素を含有する変性緩衝液を用いてカラムから溶出させた産物を、333体積の2.33M尿素、100mM Tris-HCl、pH7.3(1時間、4℃で)、続いて、0.77M尿素、100mM Tris-HCl、pH7.3(1時間、4℃)、及び0.26M尿素、100mM Tris-HCl、pH 7.3(1時間、4℃)に対する透析によって、リフォールディングした。最後に、産物を、333体積の100mM Tris-HCl(16時間、4℃)に対して透析し、遠心分離し、0.22μmの膜(Nalgene社、Rochester、NY)を通して濾過し、0.15M塩化ナトリウム、25mM HEPES、pH7.3で事前に平衡処理したHRセファクリルS-300カラム(180ml)を通してゲル濾過した。約1~2mgのリフォールディングしたタンパク質を、1リットルの細胞培養物から回収した。
ヒトS-NGR-TNFを、類似の様式で産生させた。約0.1mgのヒトS-NGR-TNFを、pET101Dを使用して、1リットルの細胞培養物から回収した。収率は、pET11プラスミドを使用してヒトS-NGR-TNFを発現させた場合に顕著に増加し、この場合、100mgを超えるS-NGR-TNFが、1リットルの細胞培養物で産生された。
ピキア・パストリス細胞におけるヒトNGR-TNFの産生。ヒトNGR-TNFをコードするcDNAを、pPIC9Kプラスミド(Proteogenix社)にクローニングした。ピキア・パストリス細胞(株GS115及びK)に、次いで、アルファ接合因子分泌シグナルペプチド(pPIC9K発現プラスミドによって提供される)のC末端に融合されたCNGRCG-TNFをコードする組換えプラスミドのエレクトロポレーションを行って、培養培地への分泌を促進した。細胞培養物を、48時間、メタノール(1%)を添加することによって、28℃で誘導した。
マウス及びヒトNGR-TNFは、-17Da、+0Da、+42Da、+58Da、及びマウスNGR-TNFの場合、+100Daを特徴とする化合物の不均質混合物である。
ヒトNGR-TNFの質量分析(MS)での分析により、この産物のサブユニットが、臨床試験において使用されたヒトNGR-TNFについて以前に報告されていたように(Tobias et al. 2013)、-17Da、+0Da、+42Da、及び+58Daの形態の不均質混合物であることが示された(図2)。また、追加の+100KDaの形態が、マウスNGR-TNFにおいて観察された(図2)。両方の産物の質量スペクトルにおいて観察された+22Da及び他のピークは、イオン付加物に対応する可能性が高い。+42Da、+58Da、及び+100Daの形態は、同じ発現系を使用して産生されたマウス及びヒトTNFにおいて観察されなかった(図2C)。
ヒトNGR-TNFの質量分析(MS)での分析により、この産物のサブユニットが、臨床試験において使用されたヒトNGR-TNFについて以前に報告されていたように(Tobias et al. 2013)、-17Da、+0Da、+42Da、及び+58Daの形態の不均質混合物であることが示された(図2)。また、追加の+100KDaの形態が、マウスNGR-TNFにおいて観察された(図2)。両方の産物の質量スペクトルにおいて観察された+22Da及び他のピークは、イオン付加物に対応する可能性が高い。+42Da、+58Da、及び+100Daの形態は、同じ発現系を使用して産生されたマウス及びヒトTNFにおいて観察されなかった(図2C)。
不均質組成物はまた、マウスNGR-TNFを、BL21 Rosetta(DE3)大腸菌細胞において発現させた場合、又はsTNF-R1(エタネルセプト)-アガロースカラムにおけるアフィニティクロマトグラフィーに基づく異なる方法によって精製した場合にも、観察された(示されない)。
NGR-TNFの異なる形態は、N末端配列の改変に関連する
NGR-TNFに対する分子改変の位置を、次いで、調査した。この目的のために、マウスNGR-TNFを、a)ジチオスレイトールで還元させ、b)ヨードアセトアミドでアルキル化させ、c)アスパラギン酸残基のN側でタンパク質を切断することができるプロテアーゼであるAsp-Nで消化させた。産物のMS分析により、N末端フラグメントCNGRCGLRSSSQNSS(配列番号37)が、不均質であり、ここでも+0、+42、+58、及び+100Daの形態を示すことが示された(図3)。これらのデータは、NGR-TNFの化学的改変が、そのN末端領域(ヒトNGR-TNFにおけるCNGRCGVRSSSRTPS(配列番号18)に対応する)に位置していたことを示唆する。この観点によると、発明者らがヒト又はマウスTNFを大腸菌細胞において発現させた場合には翻訳後改変及び不均質性は観察されなかった(Table 1(表2))。更に、発明者らが、ヒトNGR-TNFのTNFドメインを、異なるサイトカインであるマウスEMAP-IIと置き換え、CNGRCGVRSSSRTPS-EMAP-IIコンジュゲートを大腸菌細胞において発現させた場合に、発明者らは、依然として、分子不均質性を観察したが、発明者らがEMAP-IIを単独で発現させた場合には観察されなかった(図4及びTable 1(表2))。したがって、N末端配列は、NGR-TNF及びNGR-EMAPの両方の分子不均質性に関与していた。
NGR-TNFに対する分子改変の位置を、次いで、調査した。この目的のために、マウスNGR-TNFを、a)ジチオスレイトールで還元させ、b)ヨードアセトアミドでアルキル化させ、c)アスパラギン酸残基のN側でタンパク質を切断することができるプロテアーゼであるAsp-Nで消化させた。産物のMS分析により、N末端フラグメントCNGRCGLRSSSQNSS(配列番号37)が、不均質であり、ここでも+0、+42、+58、及び+100Daの形態を示すことが示された(図3)。これらのデータは、NGR-TNFの化学的改変が、そのN末端領域(ヒトNGR-TNFにおけるCNGRCGVRSSSRTPS(配列番号18)に対応する)に位置していたことを示唆する。この観点によると、発明者らがヒト又はマウスTNFを大腸菌細胞において発現させた場合には翻訳後改変及び不均質性は観察されなかった(Table 1(表2))。更に、発明者らが、ヒトNGR-TNFのTNFドメインを、異なるサイトカインであるマウスEMAP-IIと置き換え、CNGRCGVRSSSRTPS-EMAP-IIコンジュゲートを大腸菌細胞において発現させた場合に、発明者らは、依然として、分子不均質性を観察したが、発明者らがEMAP-IIを単独で発現させた場合には観察されなかった(図4及びTable 1(表2))。したがって、N末端配列は、NGR-TNF及びNGR-EMAPの両方の分子不均質性に関与していた。
NGR-TNFの異なる形態は、N末端CNGRC配列の改変に関連する
NGR-TNFの分子改変の位置を細かくマッピングするために、発明者らは、次いで、マウスNGR-TNFのCNGRCG(配列番号1)配列を、ACDCRGDCFCG(配列番号19)と置き換え、ACDCRGDCFCG-TNFコンジュゲートを生成した。この場合、分子不均質性は観察されず(Table 1(表2))、N末端領域のCNGRCG(配列番号1)配列のみが、改変に重要であったことが示唆された。この観点によると、CNGRCG(配列番号1)を、重炭酸アンモニウム緩衝液、pH8.5において37℃で6時間、部分的自己タンパク質分解によってNGR-TNFから除去することにより、未改変のTNFサブユニットのものに対応する質量(17254Da)を有する均質な産物がもたらされた(図5)。これらのデータは、NGR-TNFの化学的改変が、CNGRCG(配列番号1)標的化ドメイン内に位置していたことを示す。
NGR-TNFの分子改変の位置を細かくマッピングするために、発明者らは、次いで、マウスNGR-TNFのCNGRCG(配列番号1)配列を、ACDCRGDCFCG(配列番号19)と置き換え、ACDCRGDCFCG-TNFコンジュゲートを生成した。この場合、分子不均質性は観察されず(Table 1(表2))、N末端領域のCNGRCG(配列番号1)配列のみが、改変に重要であったことが示唆された。この観点によると、CNGRCG(配列番号1)を、重炭酸アンモニウム緩衝液、pH8.5において37℃で6時間、部分的自己タンパク質分解によってNGR-TNFから除去することにより、未改変のTNFサブユニットのものに対応する質量(17254Da)を有する均質な産物がもたらされた(図5)。これらのデータは、NGR-TNFの化学的改変が、CNGRCG(配列番号1)標的化ドメイン内に位置していたことを示す。
CNGRCG(配列番号1)の改変は、このモチーフが、タンパク質のN末端に融合している場合にのみ生じ、それがタンパク質配列に埋め込まれているか、又はタンパク質のC末端に融合されている場合には生じない
大腸菌細胞におけるCNGRCG(配列番号1)改変が、融合タンパク質におけるその位置に依存するかどうかを評価するために、発明者らは、組換えDNA技術によって大腸菌細胞において産生させた他のNGR-サイトカイン融合タンパク質を、質量分析によって分析した。SGCNGRC(配列番号20)配列を、IFNガンマのC末端に融合した場合には、分子不均質性は観察されなかった(図4及びTable 1 (表2))。更に、CNGRCG(配列番号1)配列がOmpTリーダー配列(ペリプラズム発現のため)とTNFとの間に挿入された融合タンパク質であるOmpT-NGR-TNFでは、分子不均質性は観察されなかった。大腸菌BL21 Star(DE3)において、封入体が観察され、ペリプラズム発現は観察されなかったが、産物は、均質であった(図6及びTable 1 (表2))。したがって、CNGRCG(配列番号1)ドメインの分子不均質性は、このドメインがタンパク質のN末端に融合された場合にのみ生じるとみられる。
大腸菌細胞におけるCNGRCG(配列番号1)改変が、融合タンパク質におけるその位置に依存するかどうかを評価するために、発明者らは、組換えDNA技術によって大腸菌細胞において産生させた他のNGR-サイトカイン融合タンパク質を、質量分析によって分析した。SGCNGRC(配列番号20)配列を、IFNガンマのC末端に融合した場合には、分子不均質性は観察されなかった(図4及びTable 1 (表2))。更に、CNGRCG(配列番号1)配列がOmpTリーダー配列(ペリプラズム発現のため)とTNFとの間に挿入された融合タンパク質であるOmpT-NGR-TNFでは、分子不均質性は観察されなかった。大腸菌BL21 Star(DE3)において、封入体が観察され、ペリプラズム発現は観察されなかったが、産物は、均質であった(図6及びTable 1 (表2))。したがって、CNGRCG(配列番号1)ドメインの分子不均質性は、このドメインがタンパク質のN末端に融合された場合にのみ生じるとみられる。
N末端システイン残基NGR-TNFが、部分的にアセチル化され、+42Daの形態に寄与する
アセチル基の質量が、42Daであることを考慮し、発明者らは、ヒト及びマウスNGR-TNFの+42Daの形態が、N末端アセチル-システイン残基を有する分子に対応するという仮説を立てた。この観点によると、N末端システインが欠如しているコンジュゲートである、大腸菌細胞において発現させたNGRAHA-TNFは、均質であり、+42Daの形態が欠如していた(Table 1 (表2))。この仮説を更に評価するために、発明者らは、アセチル-CisoDGRCGVRY(配列番号17)を認識することができるが、CisoDGRCGVRY(配列番号17)ペプチドを認識することができない抗体を利用し(図7A)、マウス又はヒトNGR-TNFへのその結合を分析した(図7B)。予測した通り、抗体は、両方の産物を認識することができ、a)+42Daの形態が、N末端アセチル-システインを有する分子に対応すること、及びb)両方の産物が、部分的に脱アミド化されていたことを、強く示唆する。可能性としては、+58Daの改変は、+42Daの形態の酸化形態(+16Da)を表す。この点を明らかにするためには、更なる研究が必要である。
アセチル基の質量が、42Daであることを考慮し、発明者らは、ヒト及びマウスNGR-TNFの+42Daの形態が、N末端アセチル-システイン残基を有する分子に対応するという仮説を立てた。この観点によると、N末端システインが欠如しているコンジュゲートである、大腸菌細胞において発現させたNGRAHA-TNFは、均質であり、+42Daの形態が欠如していた(Table 1 (表2))。この仮説を更に評価するために、発明者らは、アセチル-CisoDGRCGVRY(配列番号17)を認識することができるが、CisoDGRCGVRY(配列番号17)ペプチドを認識することができない抗体を利用し(図7A)、マウス又はヒトNGR-TNFへのその結合を分析した(図7B)。予測した通り、抗体は、両方の産物を認識することができ、a)+42Daの形態が、N末端アセチル-システインを有する分子に対応すること、及びb)両方の産物が、部分的に脱アミド化されていたことを、強く示唆する。可能性としては、+58Daの改変は、+42Daの形態の酸化形態(+16Da)を表す。この点を明らかにするためには、更なる研究が必要である。
タンパク質改変の第2のアミノ酸残基の重要性を評価するために、発明者らは、次いで、CDGRCG(配列番号38)-TNFコンジュゲートを調製し、分析した。興味深いことに、この産物は、改変された形態をほとんど含まないか又はまったく含まず(図4及びTable 1 (表2))、N末端における遊離システインの存在が、それ自体ではタンパク質改変に十分ではないが、システインに続いてアスパラギン残基(CN)が同時に存在することが必要であることを、示唆する。
大腸菌細胞におけるヒトS-NGR-TNFの大スケール産生。
比較的多量のヒトS-NGR-TNF(S-NGR-hTNF)を、S-NGR-hTNF(アミノ酸配列:配列番号27、ヌクレオチド配列:33)をコードするcDNAを有するpET11プラスミドを使用して産生させた。1mM IPTGでの誘導(3時間、37℃)後に、BL21 Star (DE3)大腸菌細胞(Novagen社)において、cDNA発現が得られた。a)硫酸アンモニウム沈殿、b)疎水性相互作用クロマトグラフィー(フェニル-セファロース6 Fast Flow)、c)イオン交換クロマトグラフィー(DEAE-セファロースFast Flow)、d)7M尿素の存在下におけるゲル濾過クロマトグラフィー(セファクリル-S-300 HR)によって、産物を細菌ライセートの可溶性画分から精製した。産物を、透析によってリフォールディングし、非変性条件下において、ゲル濾過クロマトグラフィー(セファクリル-S-300 HR)によって更に精製した。S-NGR-hTNFと称される最終産物を、濾過し(0.22μm)、-80℃で保管した。図19は、精製プロセスのフローチャートを示す。クロマトグラフィー工程において使用したすべての溶液は、滅菌かつエンドトキシン不含水(Salf社、Bergamo、Italy)を用いて調製した。
比較的多量のヒトS-NGR-TNF(S-NGR-hTNF)を、S-NGR-hTNF(アミノ酸配列:配列番号27、ヌクレオチド配列:33)をコードするcDNAを有するpET11プラスミドを使用して産生させた。1mM IPTGでの誘導(3時間、37℃)後に、BL21 Star (DE3)大腸菌細胞(Novagen社)において、cDNA発現が得られた。a)硫酸アンモニウム沈殿、b)疎水性相互作用クロマトグラフィー(フェニル-セファロース6 Fast Flow)、c)イオン交換クロマトグラフィー(DEAE-セファロースFast Flow)、d)7M尿素の存在下におけるゲル濾過クロマトグラフィー(セファクリル-S-300 HR)によって、産物を細菌ライセートの可溶性画分から精製した。産物を、透析によってリフォールディングし、非変性条件下において、ゲル濾過クロマトグラフィー(セファクリル-S-300 HR)によって更に精製した。S-NGR-hTNFと称される最終産物を、濾過し(0.22μm)、-80℃で保管した。図19は、精製プロセスのフローチャートを示す。クロマトグラフィー工程において使用したすべての溶液は、滅菌かつエンドトキシン不含水(Salf社、Bergamo、Italy)を用いて調製した。
マウスの脳における腫瘍細胞埋め込み及び薬理学的処置
同所性脳腫瘍に関するインビボ研究が、Explicyte Immuno-Oncology社(Bordeaux、France)によって行われた。ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように操作した生体発光性マウス神経膠腫GL21-Luc2細胞を、C57BL/6Jマウス(9週齢)の右線条体に同所的に埋め込んだ(2.5×104個の細胞/マウス)。薬理学的処置を、腫瘍細胞埋め込みの7日後に開始した。マウスに、5ng/Kgの用量のS-NGR-TNF(約100pg/マウス、100μg/mlのHSAを含有する0.9%塩化ナトリウム水溶液中に希釈)、又は2時間後に投与されるドキソルビシン(5mg/Kg)との組合せを、腹腔内に注射した。ルシフェラーゼ基質の投与(腹腔内)後に、腫瘍成長を、PhotonImager RTシステム(Biospace Lab社、France)を使用して、非侵襲的な生体発光イメージングによってモニタリングした。腫瘍が、約5×107の光子/秒/ステラジアンの生体発光シグナルに達する前、又はそれらが、信頼できる臨床兆候、例えば、呼吸促迫、猫背の姿勢、若しくは15%を上回る体重の減少を示した場合には、動物を殺処分した。
同所性脳腫瘍に関するインビボ研究が、Explicyte Immuno-Oncology社(Bordeaux、France)によって行われた。ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように操作した生体発光性マウス神経膠腫GL21-Luc2細胞を、C57BL/6Jマウス(9週齢)の右線条体に同所的に埋め込んだ(2.5×104個の細胞/マウス)。薬理学的処置を、腫瘍細胞埋め込みの7日後に開始した。マウスに、5ng/Kgの用量のS-NGR-TNF(約100pg/マウス、100μg/mlのHSAを含有する0.9%塩化ナトリウム水溶液中に希釈)、又は2時間後に投与されるドキソルビシン(5mg/Kg)との組合せを、腹腔内に注射した。ルシフェラーゼ基質の投与(腹腔内)後に、腫瘍成長を、PhotonImager RTシステム(Biospace Lab社、France)を使用して、非侵襲的な生体発光イメージングによってモニタリングした。腫瘍が、約5×107の光子/秒/ステラジアンの生体発光シグナルに達する前、又はそれらが、信頼できる臨床兆候、例えば、呼吸促迫、猫背の姿勢、若しくは15%を上回る体重の減少を示した場合には、動物を殺処分した。
(実施例1)
組換えDNA技術によって産生されたマウスSCNGRCG-TNF(S-NGR-TNF)は、+42Da、+58Da、及び+100Daの形態が欠如した均質な産物である。
産生及び保管中のタンパク質改変に関するNGR-TNFのN末端CN残基の重要な役割を踏まえ、発明者らは、余剰残基を付加することによってこの配列を変化させることにより、分子不均質性を低減することができるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、発明者らは、融合タンパク質のpET101Dプラスミド(Invitrogen社)を使用して、マウスSCNGRCG-TNF融合タンパク質(S-NGR-TNFと称される)を大腸菌細胞(BL21 Star(DE3))において発現させた。還元条件下及び非還元条件下におけるマウスS-NGR-TNF及びNGR-TNFのSDS-PAGE分析は、両方の場合で、約17kDaのサブユニットに対応するバンドを示した(図8A)。しかしながら、S-NGR-TNFは、TNFと同様に、質量分析での分析によるとNGR-TNFよりも均質であった(図8B)。これらのデータは、NGR-TNFのシステイン-1のアルファ-アミノ基をセリン残基で遮断することにより、産生及び保管中のすべてのCNGRCG(配列番号1)改変が防止されるという仮説を強く裏付ける。これはまた、大腸菌細胞において封入体として産生されるOmpT-NGR-TNF融合タンパク質が、均質であるという観察も説明し得る(Table 1(表2))。
組換えDNA技術によって産生されたマウスSCNGRCG-TNF(S-NGR-TNF)は、+42Da、+58Da、及び+100Daの形態が欠如した均質な産物である。
産生及び保管中のタンパク質改変に関するNGR-TNFのN末端CN残基の重要な役割を踏まえ、発明者らは、余剰残基を付加することによってこの配列を変化させることにより、分子不均質性を低減することができるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、発明者らは、融合タンパク質のpET101Dプラスミド(Invitrogen社)を使用して、マウスSCNGRCG-TNF融合タンパク質(S-NGR-TNFと称される)を大腸菌細胞(BL21 Star(DE3))において発現させた。還元条件下及び非還元条件下におけるマウスS-NGR-TNF及びNGR-TNFのSDS-PAGE分析は、両方の場合で、約17kDaのサブユニットに対応するバンドを示した(図8A)。しかしながら、S-NGR-TNFは、TNFと同様に、質量分析での分析によるとNGR-TNFよりも均質であった(図8B)。これらのデータは、NGR-TNFのシステイン-1のアルファ-アミノ基をセリン残基で遮断することにより、産生及び保管中のすべてのCNGRCG(配列番号1)改変が防止されるという仮説を強く裏付ける。これはまた、大腸菌細胞において封入体として産生されるOmpT-NGR-TNF融合タンパク質が、均質であるという観察も説明し得る(Table 1(表2))。
組換えDNA技術によって産生されたヒトS-NGR-TNFは、+42Da、+58Da、及び+100Daの形態が欠如した均質な産物である。
発明者らは、次いで、ヒトS-NGR-TNFもまた、大腸菌細胞における発現時に均質であるかどうかを調査した。タンパク質を、pET101Dプラスミドを使用して大腸菌細胞(BL21 Star (DE3)において発現させ、sTNF-R1(エタネルセプト)-アガロースカラムにおけるアフィニティクロマトグラフィーによって細胞抽出物から精製した。約0.1mgのヒトS-NGR-TNFを、pET101Dを使用して、1リットルの細胞培養物から回収した。収率は、pET11プラスミドを使用してヒトS-NGR-TNFを発現させた場合に顕著に増加し(図9A)、この場合、100mgを超えるS-NGR-TNFが、1リットルの細胞培養物で産生された。
発明者らは、次いで、ヒトS-NGR-TNFもまた、大腸菌細胞における発現時に均質であるかどうかを調査した。タンパク質を、pET101Dプラスミドを使用して大腸菌細胞(BL21 Star (DE3)において発現させ、sTNF-R1(エタネルセプト)-アガロースカラムにおけるアフィニティクロマトグラフィーによって細胞抽出物から精製した。約0.1mgのヒトS-NGR-TNFを、pET101Dを使用して、1リットルの細胞培養物から回収した。収率は、pET11プラスミドを使用してヒトS-NGR-TNFを発現させた場合に顕著に増加し(図9A)、この場合、100mgを超えるS-NGR-TNFが、1リットルの細胞培養物で産生された。
アフィニティ精製した産物(低及び高の両方の発現ベクターで得られた)のSDS-PAGE分析は、両方の場合で、ヒトS-NGR-TNFサブユニットに対応するバンドを示した(図9A)。いずれの産物も、質量分析での分析によると、ヒトNGR-TNFよりも均質であった(図9B)。したがって、ヒトS-NGR-TNFの場合も、N末端のセリン残基の付加は、低いレベル又は高いレベルで発現させたいずれの場合でも、大腸菌細胞において、CNGRCG(配列番号1)改変を防止する。
S-NGR-TNFのインビトロ細胞傷害活性は、NGR-TNFのものに類似している
NGR-TNFへのセリン残基の付加が、TNF受容体を認識するその能力、及び結果として、その生物学的活性に影響を及ぼすかどうかを評価するために、発明者らは、次いで、LM細胞の細胞溶解アッセイにおいて、TNF、NGR-TNF、及びS-NGR-TNFの細胞傷害活性を分析した。結果は、TNF、NGR-TNF、及びS-NGR-TNFのEC50が、非常に類似していることを示し(図8C)、CNGRCG(配列番号1)又はSCNGRCG(配列番号6)のいずれのドメインも、これらの細胞におけるTNF受容体認識を損なわないことを示唆する。したがって、S-NGR-TNF及びNGR-TNFのsTNF-R1(エタネルセプト)へのインビトロでの結合は、TNFのものに類似していた(図8D)。
NGR-TNFへのセリン残基の付加が、TNF受容体を認識するその能力、及び結果として、その生物学的活性に影響を及ぼすかどうかを評価するために、発明者らは、次いで、LM細胞の細胞溶解アッセイにおいて、TNF、NGR-TNF、及びS-NGR-TNFの細胞傷害活性を分析した。結果は、TNF、NGR-TNF、及びS-NGR-TNFのEC50が、非常に類似していることを示し(図8C)、CNGRCG(配列番号1)又はSCNGRCG(配列番号6)のいずれのドメインも、これらの細胞におけるTNF受容体認識を損なわないことを示唆する。したがって、S-NGR-TNF及びNGR-TNFのsTNF-R1(エタネルセプト)へのインビトロでの結合は、TNFのものに類似していた(図8D)。
SCNGRCG(配列番号6)配列は、CNGRCG(配列番号1)又はアセチル-CNGRCGのものを上回る親和性で、CD13と相互作用し得る
NGR-TNFのN末端へのセリン残基の付加が、CD13に対するその親和性を抑止又は低減させる可能性を排除するために、発明者らは、CD13(アミノペプチダーゼN)、及びSCNGRCGVRY(配列番号3)、CNGRCGVRY(配列番号4)、又はアセチル-CNGRCGVRY(ヒトS-NGR-TNF及びNGR-TNFのN末端領域に対応する)を用いた酵素動態阻害アッセイを行った。結果は、CD13に対するSCNGRCGVRY(配列番号3)のKi値は、異なる実験条件において、CNGRCGVRY(配列番号4)のものよりも3~5倍低かったことを示し(図10及びTable 2 (表3))、高い親和性が指摘された。したがって、NGR-TNFへのセリン残基の付加は、CD13を認識するその能力を損なわない。
NGR-TNFのN末端へのセリン残基の付加が、CD13に対するその親和性を抑止又は低減させる可能性を排除するために、発明者らは、CD13(アミノペプチダーゼN)、及びSCNGRCGVRY(配列番号3)、CNGRCGVRY(配列番号4)、又はアセチル-CNGRCGVRY(ヒトS-NGR-TNF及びNGR-TNFのN末端領域に対応する)を用いた酵素動態阻害アッセイを行った。結果は、CD13に対するSCNGRCGVRY(配列番号3)のKi値は、異なる実験条件において、CNGRCGVRY(配列番号4)のものよりも3~5倍低かったことを示し(図10及びTable 2 (表3))、高い親和性が指摘された。したがって、NGR-TNFへのセリン残基の付加は、CD13を認識するその能力を損なわない。
SCNGRCG(配列番号6)配列は、CNGRCG(配列番号1)よりも脱アミド化を受ける傾向が低い
CNGRCG(配列番号1)へのセリン残基の付加が、その脱アミド化傾向に影響を及ぼすかどうかを評価するために、発明者らは、SCNGRCGVRY(配列番号3)及びCNGRCGVRY(配列番号4)ペプチドを合成し、PBS、pH7.4において37℃でインキュベーションしたときのそれらの安定性を、質量分析によって研究した。注目すべきことに、2時間のインキュベーションの後に、-17Daの形態(脱アミド化反応のスクシンイミド中間体に対応する)が、CNGRCGVRY(配列番号4)では観察されたが、SCNGRCGVRY(配列番号3)では観察されなかった(図11)。これは、セリン残基の付加が、NGRモチーフが脱アミド化を受ける傾向を低減させたことを示唆する。注目すべきことに、+1Daの脱アミド化産物(DGR/isoDGR)は、いずれの場合も、32時間のインキュベーションの後に観察されたが、多量の-17Daの形態は、CNGRCGVRY(配列番号4)においては依然として存在していたが、SCNGRCGVRY(配列番号3)には存在していなかった(図11)。これらのデータは、CNGRCG(配列番号1)のスクシンイミド誘導体が、加水分解に対して比較的安定しているが、SCNGRCGVRY(配列番号3)のものはそうではないことを示し、NGR-TNFにおいて観察される-17Daの形態が、スクシンイミド中間体に対応することを強く示唆する。
CNGRCG(配列番号1)へのセリン残基の付加が、その脱アミド化傾向に影響を及ぼすかどうかを評価するために、発明者らは、SCNGRCGVRY(配列番号3)及びCNGRCGVRY(配列番号4)ペプチドを合成し、PBS、pH7.4において37℃でインキュベーションしたときのそれらの安定性を、質量分析によって研究した。注目すべきことに、2時間のインキュベーションの後に、-17Daの形態(脱アミド化反応のスクシンイミド中間体に対応する)が、CNGRCGVRY(配列番号4)では観察されたが、SCNGRCGVRY(配列番号3)では観察されなかった(図11)。これは、セリン残基の付加が、NGRモチーフが脱アミド化を受ける傾向を低減させたことを示唆する。注目すべきことに、+1Daの脱アミド化産物(DGR/isoDGR)は、いずれの場合も、32時間のインキュベーションの後に観察されたが、多量の-17Daの形態は、CNGRCGVRY(配列番号4)においては依然として存在していたが、SCNGRCGVRY(配列番号3)には存在していなかった(図11)。これらのデータは、CNGRCG(配列番号1)のスクシンイミド誘導体が、加水分解に対して比較的安定しているが、SCNGRCGVRY(配列番号3)のものはそうではないことを示し、NGR-TNFにおいて観察される-17Daの形態が、スクシンイミド中間体に対応することを強く示唆する。
次いで、同様の実験を、Asn脱アミド化を強制することが知られている条件である0.1M重炭酸アンモニウム、pH8.5において、ペプチドに行った(Curnis et al. 2006)。この緩衝液において、いずれの産物も、対応するAsp/isoAsp形態に急速に変換され、この条件下では、-17Daのスクシンイミド中間体が、CNGRCGVRY(配列番号4)の場合にも急速に加水分解されることを示す。
全体として、これらのデータは、NGR-TNFのCNGRCG(配列番号1)標的化ドメインへのSer残基の付加が、その安定性を増加させ、生理学的緩衝液において-17Daのスクシンイミド-誘導体の形成を低減させることを示唆する。更に、S-NGR-TNFのスクシンイミド誘導体は、形成される場合、加水分解を受けやすい。
S-NGR-TNFの脱アミド化産物は、NGR-TNFの脱アミド化産物のものと類似の親和性で、インテグリンに結合する
S-NGR-TNF及びNGR-TNF標的化ドメインのisoDGR誘導体が、類似の親和性でインテグリンを認識することができるかどうかを評価するために、発明者らは、次いで、以前に説明されている競合的結合アッセイを使用して、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及びα5β1インテグリンへのSCisoDGRCGVRY(配列番号17)、CisoDGRCGVRY、及びアセチル-CisoDGRCGVRYの結合を分析した(Curnis et al. 2010)。結果は、SCisoDGRCGVRYが、CisoDGRCGVRY及びアセチル-CisoDGRCGVRYのものと類似のKi値で、これらのインテグリンに結合し得ることを示した(Table 3 (表4))。予測した通り、並行して試験したSCNGRCGVRY(配列番号3)及びSCDGRCGVRY(配列番号22)は、すべてのインテグリンに対して親和性を示さなかったか、又は非常に低い親和性を示した。ヒトNGR-TNFが、アセチル化形態及び非アセチル化形態を含むこと、並びにCNGRC(配列番号5)及びアセチル-CNGRCの両方が、脱アミド化を受け得ること(Curnis et al. 2010)を考慮し、発明者らは、S-NGR-TNFのisoDGR誘導体が、形成される場合、インテグリンの認識に関して、NGR-TNFのisoDGR誘導体のものと類似の様式で挙動すると結論付けることができる。
S-NGR-TNF及びNGR-TNF標的化ドメインのisoDGR誘導体が、類似の親和性でインテグリンを認識することができるかどうかを評価するために、発明者らは、次いで、以前に説明されている競合的結合アッセイを使用して、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及びα5β1インテグリンへのSCisoDGRCGVRY(配列番号17)、CisoDGRCGVRY、及びアセチル-CisoDGRCGVRYの結合を分析した(Curnis et al. 2010)。結果は、SCisoDGRCGVRYが、CisoDGRCGVRY及びアセチル-CisoDGRCGVRYのものと類似のKi値で、これらのインテグリンに結合し得ることを示した(Table 3 (表4))。予測した通り、並行して試験したSCNGRCGVRY(配列番号3)及びSCDGRCGVRY(配列番号22)は、すべてのインテグリンに対して親和性を示さなかったか、又は非常に低い親和性を示した。ヒトNGR-TNFが、アセチル化形態及び非アセチル化形態を含むこと、並びにCNGRC(配列番号5)及びアセチル-CNGRCの両方が、脱アミド化を受け得ること(Curnis et al. 2010)を考慮し、発明者らは、S-NGR-TNFのisoDGR誘導体が、形成される場合、インテグリンの認識に関して、NGR-TNFのisoDGR誘導体のものと類似の様式で挙動すると結論付けることができる。
S-NGR-TNFは、インキュベーション時に、インテグリン結合部位を生じる傾向がNGR-TNFよりも低い
S-NGR-TNFが、NGR-TNFよりも安定しており、isoDGR-インテグリン結合部位を生じる傾向が低いという仮説を更に評価するために、発明者らは、これらのタンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、EA.hy926内皮細胞接着アッセイを行った。予測した通り、細胞接着は、NGR-TNFでコーティングしたプレートには観察されたが、S-NGR-TNFでコーティングしたプレートには観察されなかった(図12)。脱アミド化を強制するために、タンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを、0.1M重炭酸アンモニウム緩衝液、pH8.5で処置した場合に、発明者らは、S-NGR-TNFへの細胞接着を観察し、このタンパク質が存在していたことが示された。しかしながら、S-NGR-TNFには、細胞接着を得るために、NGR-TNFと比較して、脱アミド化条件下でのより長いインキュベーション時間が必要であった(図12)。この挙動は、TNFに融合した場合のCNGRCG(配列番号1)の安定性における更なる改善を反映する可能性が高い。
S-NGR-TNFが、NGR-TNFよりも安定しており、isoDGR-インテグリン結合部位を生じる傾向が低いという仮説を更に評価するために、発明者らは、これらのタンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、EA.hy926内皮細胞接着アッセイを行った。予測した通り、細胞接着は、NGR-TNFでコーティングしたプレートには観察されたが、S-NGR-TNFでコーティングしたプレートには観察されなかった(図12)。脱アミド化を強制するために、タンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを、0.1M重炭酸アンモニウム緩衝液、pH8.5で処置した場合に、発明者らは、S-NGR-TNFへの細胞接着を観察し、このタンパク質が存在していたことが示された。しかしながら、S-NGR-TNFには、細胞接着を得るために、NGR-TNFと比較して、脱アミド化条件下でのより長いインキュベーション時間が必要であった(図12)。この挙動は、TNFに融合した場合のCNGRCG(配列番号1)の安定性における更なる改善を反映する可能性が高い。
NGR-TNFのN末端へのセリン残基の付加は、腫瘍マウスモデルにおいて高用量で注射した場合に、その毒性を増加させず、その抗腫瘍活性を低減させない
NGR-TNFのN末端に付加した追加のセリン残基の、その毒性及び抗腫瘍活性に対する影響を評価するために、発明者らは、高用量のNGR-TNF又はS-NGR-TNFを、皮下RMA-Tリンパ腫を有するマウス(n=6匹)に注射し、動物の体重減少を評価した。腫瘍埋め込みの後11日目における2μgのNGR-TNFの投与は、動物の顕著な体重減少(0.89±0.29g)を引き起こし、この処置が、毒性であったことを示した。3日後に、マウスは、もともとの体重に回復した。続いて18日目における6μgの投与は、1.28±0.29gの減少を引き起こし、この用量が、予測された通り、更により毒性であったことを示す(図13A、上のパネル)。同様の体重減少が、S-NGR-TNF)で観察され(図13A、上のパネル)、セリン残基によるNGR-TNFのN末端の改変は、その毒性に影響を及ぼさなかったことが示唆された。注目すべきことに、NGR-TNFと比較して、わずかに強力な抗腫瘍作用が、S-NGR-TNFで観察された。
NGR-TNFのN末端に付加した追加のセリン残基の、その毒性及び抗腫瘍活性に対する影響を評価するために、発明者らは、高用量のNGR-TNF又はS-NGR-TNFを、皮下RMA-Tリンパ腫を有するマウス(n=6匹)に注射し、動物の体重減少を評価した。腫瘍埋め込みの後11日目における2μgのNGR-TNFの投与は、動物の顕著な体重減少(0.89±0.29g)を引き起こし、この処置が、毒性であったことを示した。3日後に、マウスは、もともとの体重に回復した。続いて18日目における6μgの投与は、1.28±0.29gの減少を引き起こし、この用量が、予測された通り、更により毒性であったことを示す(図13A、上のパネル)。同様の体重減少が、S-NGR-TNF)で観察され(図13A、上のパネル)、セリン残基によるNGR-TNFのN末端の改変は、その毒性に影響を及ぼさなかったことが示唆された。注目すべきことに、NGR-TNFと比較して、わずかに強力な抗腫瘍作用が、S-NGR-TNFで観察された。
NGR-TNFのN末端へのセリン残基の付加は、腫瘍マウスモデルにおいて低用量で注射した場合に、その抗腫瘍活性を低減させない
NGR-TNFへのSer残基の付加が、低用量においてその抗腫瘍活性に影響を及ぼし得るかどうかを評価するために、発明者らは、次いで、皮下WEHI-164線維肉腫マウスモデルを使用して、NGR-TNF及びS-NGR-TNF(25又は50pg、腹腔内)の治療活性を分析した。いずれのコンジュゲートも、類似の程度に腫瘍成長を遅延させ(図14)、NGR-TNFへのS残基の付加により、その抗腫瘍活性が損なわれないことが示された。毒性の根拠は、いずれの場合も得られなかった。注目すべきことに、25pgのNGR-TNFと比較して、わずかに強力な抗腫瘍作用が、25pgのS-NGR-TNFで得られた。
NGR-TNFへのSer残基の付加が、低用量においてその抗腫瘍活性に影響を及ぼし得るかどうかを評価するために、発明者らは、次いで、皮下WEHI-164線維肉腫マウスモデルを使用して、NGR-TNF及びS-NGR-TNF(25又は50pg、腹腔内)の治療活性を分析した。いずれのコンジュゲートも、類似の程度に腫瘍成長を遅延させ(図14)、NGR-TNFへのS残基の付加により、その抗腫瘍活性が損なわれないことが示された。毒性の根拠は、いずれの場合も得られなかった。注目すべきことに、25pgのNGR-TNFと比較して、わずかに強力な抗腫瘍作用が、25pgのS-NGR-TNFで得られた。
最後に、NGR-TNFに関して以前に観察されたように、低用量のS-NGR-TNFが、化学療法との相乗作用を発揮し得るかどうかを評価するために、発明者らは、マウスRMAリンパ腫モデルを使用して、化学療法薬であるメルファランと組み合わせたS-NGR-TNF及びNGR-TNFを用いてインビボ実験を行った(図15)。いずれの薬物も、このモデルにおいてメルファランの有効性を増強させることができ、S-NGR-TNFとNGR-TNFの両方が、化学療法薬と相乗作用し得ることが示された。ここでも、NGR-TNFと比較して、わずかに強力な抗腫瘍作用が、S-NGR-TNFで観察された。
S-NGR-TNFは、メルファランの毒性を悪化させない。
S-NGR-TNFが、メルファランの毒性を悪化させないことを検証するために、発明者らは、次いで、低用量のS-NGR-TNFとメルファランとの組合せ処置に応答した体重の減少を分析した。発明者らは、S-NGR-TNF(100pg)とメルファラン(50μg)との組合せが、抗腫瘍活性の有意な増加が観察されたにもかかわらず(図16、下のパネル)、対照と比較して、動物の体重減少を増加させなかったことを見出した(図16、上のパネル)。
S-NGR-TNFが、メルファランの毒性を悪化させないことを検証するために、発明者らは、次いで、低用量のS-NGR-TNFとメルファランとの組合せ処置に応答した体重の減少を分析した。発明者らは、S-NGR-TNF(100pg)とメルファラン(50μg)との組合せが、抗腫瘍活性の有意な増加が観察されたにもかかわらず(図16、下のパネル)、対照と比較して、動物の体重減少を増加させなかったことを見出した(図16、上のパネル)。
これらのデータは、NGR-TNFのN末端へのセリン残基の付加が、一方ではNGR-TNFの本質的な毒性を増加させず、もう一方ではメルファランの毒性の悪化に寄与することもないことを示唆する。
S-NGR-TNFが、メルファランの毒性を悪化させないことを検証するために、発明者らは、次いで、低用量のS-NGR-TNFとメルファランとの組合せ処置に応答した体重の減少を分析した。発明者らは、S-NGR-TNF(100pg)とメルファラン(50μg)との組合せが、抗腫瘍活性の有意な増加が観察されたにもかかわらず(図16B、下のパネル)、対照と比較して、動物の体重減少を増加させなかったことを見出した(図16B、上のパネル)。
これらのデータは、NGR-TNFのN末端へのセリン残基の付加が、一方ではNGR-TNFの本質的な毒性を増加させず、もう一方ではメルファランの毒性の悪化に寄与することもないことを示唆する。
結論
生化学的研究の結果は、NGR-TNFのN末端へのセリン残基の付加が、-17Da、+42Da、+58Da、及び+100Daの形態の形成を抑止し(大腸菌細胞における発現、精製、及び保管時)、脱アミド化に対するその安定性を改善することを示す。更に、インビトロ及びインビボでの生物学的研究の結果は、NGR-TNFへのセリン残基の付加が、CD13及びTNF受容体を認識するその能力を損なわず、その治療活性を低減させず、その毒性を増加させないことを示す。対照的に、NGR-TNFへのセリン残基の付加は、CD13に対するその親和性及びその抗腫瘍活性を改善する。
生化学的研究の結果は、NGR-TNFのN末端へのセリン残基の付加が、-17Da、+42Da、+58Da、及び+100Daの形態の形成を抑止し(大腸菌細胞における発現、精製、及び保管時)、脱アミド化に対するその安定性を改善することを示す。更に、インビトロ及びインビボでの生物学的研究の結果は、NGR-TNFへのセリン残基の付加が、CD13及びTNF受容体を認識するその能力を損なわず、その治療活性を低減させず、その毒性を増加させないことを示す。対照的に、NGR-TNFへのセリン残基の付加は、CD13に対するその親和性及びその抗腫瘍活性を改善する。
(実施例2)
NGR-TNFの分子不均質性の問題が、CNGRCG(配列番号1)を適切な宿主における発現の後に切断されるポリペプチド配列のC末端と融合することによって解決され得るかどうかを評価するために、発明者らは、次いで、ヒトCNGRCG-TNFを分泌するように操作されたピキア・パストリス細胞においてヒトNGR-TNFを産生させた。この系において、CNGRCG-TNFをコードするcDNAは、メタノールの添加を通じて培養培地への分泌を促進するために、アルファ接合因子分泌シグナルペプチドのC末端に融合されている(図17)。したがって、この系を使用して、分泌時に切断されるリーダー配列を有するタンパク質を産生させる。様々なクローンで得られた細胞上清のSDS-PAGE分析により、NGR-TNFが、高いレベルで分泌され得ることが示された(図18B)。アフィニティ精製産物の質量分析法による分析により、この様式で産生されたNGR-TNFが、均質であり、予測される分子量、及び+42、+58Daの欠如を特徴としていたことが示された(図18C)。
NGR-TNFの分子不均質性の問題が、CNGRCG(配列番号1)を適切な宿主における発現の後に切断されるポリペプチド配列のC末端と融合することによって解決され得るかどうかを評価するために、発明者らは、次いで、ヒトCNGRCG-TNFを分泌するように操作されたピキア・パストリス細胞においてヒトNGR-TNFを産生させた。この系において、CNGRCG-TNFをコードするcDNAは、メタノールの添加を通じて培養培地への分泌を促進するために、アルファ接合因子分泌シグナルペプチドのC末端に融合されている(図17)。したがって、この系を使用して、分泌時に切断されるリーダー配列を有するタンパク質を産生させる。様々なクローンで得られた細胞上清のSDS-PAGE分析により、NGR-TNFが、高いレベルで分泌され得ることが示された(図18B)。アフィニティ精製産物の質量分析法による分析により、この様式で産生されたNGR-TNFが、均質であり、予測される分子量、及び+42、+58Daの欠如を特徴としていたことが示された(図18C)。
本出願全体を通じて引用される参考文献は、それぞれの参考文献が完全に説明されているかのように、明らかなすべての目的のために本明細書及び参考文献自体に組み込まれる。提示の目的で、これらの参考文献のうちの特定のものが、本明細書の特定の場所で引用されている。特定の場所における参考文献の引用は、参考文献の教示が組み込まれる様式を示す。しかしながら、特定の場所における参考文献の引用は、引用された参考文献の教示のすべてがあらゆる目的で組み込まれる様式を制限するものではない。
したがって、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によって定義され、上述の説明、及び/又は添付の図面に示される、本発明の趣旨及び範囲内にあるすべての改変形態を包含することを意図することを、理解されたい。
表
表
(実施例3)
S-NGR-hTNFの大スケール精製
ヒトS-NGR-TNF(S-NGR-hTNF)の大スケール精製を、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、変性及び非変性ゲル濾過クロマトグラフィーを含む、一連のクロマトグラフィー工程を通じて達成した(図19を参照されたい)。粗抽出物中で100mgを超えることが推測される、約11mgのヒトS-NGR-hTNFを、1リットルの大腸菌細胞培養物から回収した。この産物の生化学的及び生物学的特徴付けにより、SDS-PAGE分析、MS分析、及びバイオアッセイによって判定すると、アフィニティクロマトグラフィーによって精製したものと比べて差がないことを示した(Corti et al., 2020)(図20)。したがって、これらの発見に基づいて、S-NGR-hTNFを、原理として、患者における臨床試験に必要なコンジュゲートの産生のためスケールアップすることができる。
S-NGR-hTNFの大スケール精製
ヒトS-NGR-TNF(S-NGR-hTNF)の大スケール精製を、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、変性及び非変性ゲル濾過クロマトグラフィーを含む、一連のクロマトグラフィー工程を通じて達成した(図19を参照されたい)。粗抽出物中で100mgを超えることが推測される、約11mgのヒトS-NGR-hTNFを、1リットルの大腸菌細胞培養物から回収した。この産物の生化学的及び生物学的特徴付けにより、SDS-PAGE分析、MS分析、及びバイオアッセイによって判定すると、アフィニティクロマトグラフィーによって精製したものと比べて差がないことを示した(Corti et al., 2020)(図20)。したがって、これらの発見に基づいて、S-NGR-hTNFを、原理として、患者における臨床試験に必要なコンジュゲートの産生のためスケールアップすることができる。
S-NGR-hTNFは、RMA-Tリンパ腫モデルにおいて、メルファランと相乗作用する。
発明者らは、低用量のマウスS-NGR-TNF(100pg)が、マウスリンパ腫モデルにおいて、抗がんアルキル化剤であるメルファランの抗腫瘍活性を増強させ得ることを、これまでに示している(Corti et al., 2020)。S-NGR-hTNFもまたメルファランと相乗作用し得るかどうかを評価するために、発明者らは、RMA-Tリンパ腫モデルを使用して、同様の実験を行った。予測した通り、S-NGR-hTNF(100pg)と組み合わせたメルファラン(50μg)の投与は、メルファラン単独よりも強力な抗腫瘍作用を誘導した(図21A~B)。実際に、ビヒクルで処置したマウス及びメルファランで処置したマウスの生存期間中央値は、それぞれ、約24日間及び28日間であり、メルファランが、このモデルにおいて活性が不良であることを示唆している。対照的に、組合せ療法で処置したマウスの生存期間中央値は、36.5日間であり、これは、メルファラン又は対照動物とは有意に異なる(ゲーハン-ブレスロウ-ウィルコクソン検定により、それぞれ、P=0.034及びP=0.006)。この結果は、S-NGR-hTNFが、少なくとも動物の体重減少から判断すると、毒性を増加させることなくメルファランと相乗作用し得ることを示唆する(図21C)。
発明者らは、低用量のマウスS-NGR-TNF(100pg)が、マウスリンパ腫モデルにおいて、抗がんアルキル化剤であるメルファランの抗腫瘍活性を増強させ得ることを、これまでに示している(Corti et al., 2020)。S-NGR-hTNFもまたメルファランと相乗作用し得るかどうかを評価するために、発明者らは、RMA-Tリンパ腫モデルを使用して、同様の実験を行った。予測した通り、S-NGR-hTNF(100pg)と組み合わせたメルファラン(50μg)の投与は、メルファラン単独よりも強力な抗腫瘍作用を誘導した(図21A~B)。実際に、ビヒクルで処置したマウス及びメルファランで処置したマウスの生存期間中央値は、それぞれ、約24日間及び28日間であり、メルファランが、このモデルにおいて活性が不良であることを示唆している。対照的に、組合せ療法で処置したマウスの生存期間中央値は、36.5日間であり、これは、メルファラン又は対照動物とは有意に異なる(ゲーハン-ブレスロウ-ウィルコクソン検定により、それぞれ、P=0.034及びP=0.006)。この結果は、S-NGR-hTNFが、少なくとも動物の体重減少から判断すると、毒性を増加させることなくメルファランと相乗作用し得ることを示唆する(図21C)。
GL261神経膠芽腫モデルにおけるS-NGR-mTNFの薬理学的特性及び毒物学的特性
発明者らは、次に、もっとも頻繁に使用される同系マウス神経膠腫モデルのうちの1つであるGL261神経膠芽腫モデルにおけるマウスS-NGR-TNF(S-NGR-mTNF)の抗腫瘍活性を調査した。この目的で、発明者らは、ルシフェラーゼを発現するように遺伝子操作されたGL261細胞を利用した(GL261-luc2)。これは、生体発光イメージングによって、脳内における腫瘍成長及び処置に対する応答のインビボでの可視化を可能にする。腫瘍埋め込み後7日目、19日目、及び31日目におけるS-NGR-mTNFの投与(腹腔内、5ng/kg、約100pg/マウスに相当)は、腫瘍成長を有意に遅延させた(図22A、C、及びD)。注目すべきことに、S-NGR-mTNFで処置した10匹のマウスのうち4匹が、脳の検死によって判定すると、62日目に腫瘍不在となっていたが、ビヒクルで処置したものでそうなったものはいなかった(図22E)。更に、S-NGR-mTNFは、体重減少を引き起こさず、この薬物が、十分に寛容性であり、毒性作用を引き起こさなかったことが示唆された(図22B)。治癒した動物は、腫瘍根絶から予測される進行的な体重の増加(約+15%)を示した。
発明者らは、次に、もっとも頻繁に使用される同系マウス神経膠腫モデルのうちの1つであるGL261神経膠芽腫モデルにおけるマウスS-NGR-TNF(S-NGR-mTNF)の抗腫瘍活性を調査した。この目的で、発明者らは、ルシフェラーゼを発現するように遺伝子操作されたGL261細胞を利用した(GL261-luc2)。これは、生体発光イメージングによって、脳内における腫瘍成長及び処置に対する応答のインビボでの可視化を可能にする。腫瘍埋め込み後7日目、19日目、及び31日目におけるS-NGR-mTNFの投与(腹腔内、5ng/kg、約100pg/マウスに相当)は、腫瘍成長を有意に遅延させた(図22A、C、及びD)。注目すべきことに、S-NGR-mTNFで処置した10匹のマウスのうち4匹が、脳の検死によって判定すると、62日目に腫瘍不在となっていたが、ビヒクルで処置したものでそうなったものはいなかった(図22E)。更に、S-NGR-mTNFは、体重減少を引き起こさず、この薬物が、十分に寛容性であり、毒性作用を引き起こさなかったことが示唆された(図22B)。治癒した動物は、腫瘍根絶から予測される進行的な体重の増加(約+15%)を示した。
GL261神経膠芽腫モデルにおけるドキソルビシンと組み合わせたS-NGR-mTNFの薬理学的特性及び毒物学的特性
S-NGR-mTNFの抗腫瘍活性を、次いで、GL261-luc2モデルにおいて、化学療法薬であるドキソルビシン(doxo)と組み合わせて調査した。この目的で、腫瘍保持動物を、腫瘍埋め込み後7日目、14日目、及び21日目に、S-NGR-mTNF(5ng/kg、腹腔内)で処置し、2時間後に、ドキソルビシン(腹腔内、5mg/kg、約100μg/マウスに相当)で処置した。並行して、対照マウスを、ビヒクル又はドキソルビシン単独で処置した。結果は、組合せ療法が、腫瘍成長を有意に遅延させ得るが、ドキソルビシン単独では遅延させることができなかったことを示す(図23A及びB)。具体的には、組合せ療法は、35日目の生体発光強度が処置前に測定したものよりも低いことによって示されるように、9匹のマウスのうちの5匹(55%)において、腫瘍成長を効率的に遅延させた(図23Aにおける破線)。ドキソルビシンは、10匹のマウスのうちの2匹(20%)において腫瘍成長を遅延させ、一方で、対照マウスは、腫瘍成長の阻害を示したものはなかった。注目すべきことに、S-NGR-mTNFは、少なくとも、動物の体重減少により判断されるように、ドキソルビシンの毒性を悪化させることはなかった(図23C)。この発見及び以前の発見は、S-NGR-mTNFが、神経膠芽腫のこのモデルにおいて生物学的に活性であるという概念を裏付ける。
S-NGR-mTNFの抗腫瘍活性を、次いで、GL261-luc2モデルにおいて、化学療法薬であるドキソルビシン(doxo)と組み合わせて調査した。この目的で、腫瘍保持動物を、腫瘍埋め込み後7日目、14日目、及び21日目に、S-NGR-mTNF(5ng/kg、腹腔内)で処置し、2時間後に、ドキソルビシン(腹腔内、5mg/kg、約100μg/マウスに相当)で処置した。並行して、対照マウスを、ビヒクル又はドキソルビシン単独で処置した。結果は、組合せ療法が、腫瘍成長を有意に遅延させ得るが、ドキソルビシン単独では遅延させることができなかったことを示す(図23A及びB)。具体的には、組合せ療法は、35日目の生体発光強度が処置前に測定したものよりも低いことによって示されるように、9匹のマウスのうちの5匹(55%)において、腫瘍成長を効率的に遅延させた(図23Aにおける破線)。ドキソルビシンは、10匹のマウスのうちの2匹(20%)において腫瘍成長を遅延させ、一方で、対照マウスは、腫瘍成長の阻害を示したものはなかった。注目すべきことに、S-NGR-mTNFは、少なくとも、動物の体重減少により判断されるように、ドキソルビシンの毒性を悪化させることはなかった(図23C)。この発見及び以前の発見は、S-NGR-mTNFが、神経膠芽腫のこのモデルにおいて生物学的に活性であるという概念を裏付ける。
Claims (24)
- - タンパク質のN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)の第1のペプチドと、
- 前記ペプチドのN末端に連結された化合物Xと
を含むコンジュゲート。 - CD13を認識することができる、請求項1に記載のコンジュゲート。
- 前記タンパク質が、サイトカイン、好ましくは、抗腫瘍活性を有するサイトカインであり、より好ましくは、前記サイトカインが、腫瘍壊死因子(TNF)、好ましくは、TNF-アルファ又はTNF-ベータ、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、内皮単球活性化ポリペプチドII(EMAP-II)、IL12、インターフェロンガンマ(IFNガンマ)、及びインターフェロンアルファ(IFNアルファ)からなる群から選択される、請求項1又は2に記載のコンジュゲート。
- 前記化合物Xが、第2のペプチドである、請求項1から3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記化合物Xが、1~200個のアミノ酸残基、好ましくは、1個、2個、又は3個のアミノ酸残基の第2のペプチドである、請求項1から4のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記第2のペプチドが、セリン残基若しくは短い側鎖を有する任意のアミノ酸、好ましくは、グリシン若しくはアラニン、IEGR(配列番号2)配列を含むアミノ酸配列、又は真核生物細胞における前記コンジュゲートの発現及び分泌後に除去されるリーダー配列、好ましくは、OmpTリーダー配列、又はアルファ接合因子分泌シグナルペプチドからなる、請求項5に記載のコンジュゲート。
- 前記第2のペプチドが、セリンからなり、前記サイトカインが、TNFであり、好ましくは、TNFが、ヒトTNF-アルファである、請求項6に記載のコンジュゲート。
- 前記化合物Xと前記ペプチドとの間の結合(X-C結合)の化学的又は酵素的切断のための部位を含み、好ましくは、前記X-C結合の前記切断が、アミノペプチダーゼ又はエンドプロテアーゼ、好ましくは、アミノペプチダーゼN(CD13)又はプロテアーゼ、好ましくは、第Xa因子により達成され得る、請求項1から7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲートをコードする核酸。
- 請求項9に記載の核酸を含む、より好ましくは遺伝子療法のための、ベクター、好ましくは、プラスミド又はウイルスベクター。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含むナノ粒子であって、好ましくは、前記コンジュゲートが、金ナノ粒子の表面に吸着されている、ナノ粒子。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項9に記載の核酸、又は請求項10に記載のベクター、又は請求項11に記載のナノ粒子と、好ましくは化学療法剤及び/又は免疫モジュレーター及び/又は免疫細胞である少なくとも1つの抗腫瘍薬剤とを含む組合せ物であって、好ましくは、前記化学療法剤が、ドキソルビシン、メルファラン、テモゾロミド、ゲムシタビン、タキソール、シスプラチン、ビンクリスチン、又はビノレルビンであり、好ましくは、前記免疫モジュレーターが、抗がんワクチン又は免疫チェックポイント遮断剤、例えば、抗PD1又は抗PDL1又は抗CTLA4抗体であり、好ましくは、前記免疫細胞が、リンパ球又は遺伝子改変されたTリンパ球、例えば、CAR-T細胞、又はTCRにより指向性が変更されたT細胞若しくはNK細胞であり、好ましくは、更なる抗腫瘍剤が、抗体及び化学療法剤、例えば、R-CHOP:リツキシマブ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、プレドニゾロンを含む、組合せ物。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項9に記載の核酸、又は請求項10に記載のベクター、又は請求項11に記載のナノ粒子と、少なくとも1つの抗腫瘍薬剤とを含み、前記薬剤が、ドキソルビシンである、請求項12に記載の組合せ物。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項9に記載の核酸、又は請求項10に記載のベクター、又は請求項11に記載のナノ粒子と、少なくとも1つの抗腫瘍薬剤とを含み、前記薬剤が、メルファランである、請求項12に記載の組合せ物。
- 医学的使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項9に記載の核酸、又は請求項10に記載のベクター、又は請求項11に記載のナノ粒子、又は請求項12から14のいずれか一項に記載の組合せ物。
- 腫瘍、好ましくは、固形腫瘍、より好ましくは、リンパ腫、好ましくは、CNSの原発性びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(PCNSL)、脳腫瘍、例えば、神経膠腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、びまん性内在性脳幹部神経膠腫、肉腫、黒色腫 口腔若しくは皮膚扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、頭頸部、胃食道部、結腸直腸、膵臓、卵巣、肺、例えば、SCLC、NSCLC、中皮腫、子宮頸、乳がん、腎臓、尿路上皮、又はこれらの転移の処置における使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項9に記載の核酸、又は請求項10に記載のベクター、又は請求項11に記載のナノ粒子、又は請求項12から14のいずれか一項に記載の組合せ物。
- 神経膠芽腫の処置における使用のための、請求項13に記載の組合せ物。
- リンパ腫の処置における使用のための、請求項14に記載の組合せ物。
- 有効量の請求項1から8のいずれか一項において特許請求されるコンジュゲート、又は請求項9に記載の核酸、又は請求項10に記載のベクター、又は請求項12から14のいずれか一項に記載の組合せ物、又は請求項11に記載のナノ粒子を、少なくとも1つの薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤と一緒に含む医薬組成物。
- タンパク質のN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)を含む、均質なコンジュゲートを産生させるための方法であって、
- 原核生物細胞又は真核生物細胞、好ましくは、大腸菌細胞及び枯草菌における、請求項8に記載のコンジュゲートの発現工程、
- 好ましくは、アミノペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼ、又はプロテアーゼによるX-C結合の化学的又は酵素的切断工程
を含む方法。 - タンパク質のN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)を含む、均質なコンジュゲートを産生させるための方法であって、アルファ-アミノ基をアセチル化することもCN配列を改変することもできない宿主におけるDNA発現工程を含み、前記宿主が、好ましくは、真核生物細胞である、方法。
- 前記真核生物細胞が、CHO細胞、マウス骨髄腫NS0由来細胞、及び昆虫細胞、例えば、Sf21からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- タンパク質のN末端に連結された配列CNGRCG(配列番号1)を含む、均質なコンジュゲートを産生させるための方法であって、
- 真核生物細胞又は植物又は動物、好ましくは、ピキア・パストリス細胞、CHO細胞、又はバキュロウイルス昆虫細胞系における発現の後に除去されるリーダー配列を更に含む前記コンジュゲートの発現工程、
- 前記コンジュゲートの分泌工程
を含む方法。 - 請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲートを精製するための方法であって、以下の
- 前記コンジュゲートを発現する細胞を溶解してライセートを得る工程、
- 前記ライセートから可溶性画分を得る工程、
- 前記可溶性画分の硫酸アンモニウム沈殿、前記沈殿した材料の除去、及び前記可溶性画分の回収の工程、
- 高濃度の硫酸アンモニウムによる前記可溶性画分の沈殿工程、
- 不溶性画分の可溶化工程、
i.疎水性クロマトグラフィー、
ii.イオン交換クロマトグラフィー、
iii.変性条件下におけるゲル濾過クロマトグラフィー、
iv.再生、及び
v.ゲル濾過クロマトグラフィー
を含む方法。
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