CN115702159A - Ngr偶联物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含与蛋白质的N末端连接的第一肽序列CNGRCG(SEQ IDNO:1)和与所述肽的N末端连接的化合物X的偶联物以及相关医药用途。

Description

NGR偶联物及其用途

技术领域

本发明涉及偶联物及其医药用途，所述偶联物包含与蛋白质(例如TNF)的N末端连接的第一肽序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)和与所述肽的N末端连接的化合物X，例如，丝氨酸。本发明还涉及产生包含与蛋白质的N末端连接的第一肽序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)的均质偶联物的方法。

背景技术

细胞因子在癌症治疗中的功效通常受限于全身毒性和反调节机制。最近的研究表明，可以通过基于这些蛋白质与能够将其递送至肿瘤位点的配体之间的偶联的靶向策略来克服这些限制，从而能够给予较低剂量并减少全身效应(Corti和Curnis 2011；Corti等2013)。在迄今为止开发的各种方法中，与能够识别肿瘤组织中特定受体的抗体或肽配体偶联或融合的细胞因子是最先进的。这些配体通常识别肿瘤细胞或肿瘤微环境元件(包括肿瘤脉管系统)表达的受体。这一概念的原型示例是基于含有CNGRCG(SEQ ID NO:1)序列的肽配体与肿瘤坏死因子-α(TNF)偶联的药物，所述CNGRCG(SEQ ID NO:1)序列识别CD13阳性肿瘤血管，所述肿瘤坏死因子-α(TNF)是能够改变内皮屏障功能并促进化疗药物在肿瘤组织中渗透/免疫细胞浸润的细胞因子(Corti和Curnis2011；Corti等2013)。该药物在二十一世纪早期通过重组DNA技术制备并代表第一个开发的肽-细胞因子偶联物，正在对癌症患者进行多项临床试验，并有活性证据(Corti等2013；Ferreri等2019)。CNGRCG-TNF药物(下文称为NGR-TNF)和其他CNGRCG-细胞因子偶联物的主要限制与CNGRCG(SEQ IDNO:1)基序的不稳定性以及其异质性有关，这是由于不需要的修饰反应，在药物制造和储存中将导致严重的问题并且可能具有需要在药物注册中阐明的重要药理学和毒理学意义(Corti等2013)。

NGR基序

NGR基序已在九十年代通过在荷瘤小鼠进行体内选择肽-噬菌体文库发现(Arap、Pasqualini和Ruoslahti 1998；Corti等2008)。将噬菌体文库全身给予到负荷人乳腺癌异种移植物的裸鼠中导致选择携带各种含有该基序的肽序列的肿瘤脉管系统归巢噬菌体。机制研究表明，含有NGR(CNGRC(SEQ IDNO:5))的环状二硫键桥肽可以特异性地识别表达氨肽酶N(CD13)的血管，所述氨肽酶N是在正常血管中几乎不表达或根本不表达，但在血管生成的血管中上调的膜结合金属蛋白酶(Curnis等2002；Pasqualini等2000；Lahdenranta等2007；Buehler等2006)。这种蛋白酶在蛋白质降解、细胞因子调节、抗原呈递、细胞增殖、细胞迁移和血管生成中发挥作用(Curnis等2002；Mina-Osorio2008；Luan和Xu 2007；Bhagwat等2001)。在肿瘤组织中，内皮细胞和周细胞表达CD13，在某些情况中，肿瘤细胞和成纤维细胞表达CD13。还有多种正常组织的细胞表达CD13，包括来自小肠、近端肾小管、前列腺、胆管微管的上皮细胞、角质形成细胞、肥大细胞、髓样细胞和抗原呈递细胞(Curnis等2002；Taylor 1993；Shipp和Look 1993；Dixon等1994；Di Matteo等2010)。免疫组织化学和生物分布研究表明，含CNGRC的化合物与CD13阳性肿瘤血管结合，但不与其他富含CD13的组织结合(Curnis等2002；Curnis等2000)。使用CNGRCG-TNF偶联物(NGR-TNF)的直接结合试验和使用抗CD13抗体的竞争性结合试验表明，由肿瘤血管表达的CD13形式可以作为NGR基序的血管受体。相反，正常肾脏和髓样细胞中表达的CD13无法结合NGR-TNF。与这些结果相一致，在给予小鼠后，放射性标记的¹²⁵I-NGR-TNF和¹²⁵I-TNF在含有表达CD13的细胞的正常器官中都没有积累(Curnis等2002)。因此，就NGR结合而言，CD13的功能活性形式似乎存在于肿瘤脉管系统中，而非其他富含CD13的组织中。该NGR选择性的结构基础仍然未知。通过NGR识别血管生成血管也已通过肿瘤小鼠模型中的环状NGR标记的顺磁性量子点和定量分子磁共振成像得到证实(Oostendorp等2008)。离体双光子激光扫描显微镜检表明这些颗粒主要与肿瘤血管的内皮衬里结合。

使用NGR肽作为药物递送系统

一些研究人员已使用含有NGR序列的肽向肿瘤血管递送多种化合物，包括化疗药物、脂质体、抗血管生成化合物、DNA复合物、病毒颗粒和成像化合物(Corti和Curnis 2011；Corti等2013)。NGR肽还已与细胞因子(例如TNFα、IFNγ和IFNα-2a)融合，试图提高其抗肿瘤治疗指数(Corti和Curnis 2011；Corti等2013)。因此，不同的研究人员已将多种不同的化合物与NGR肽偶联，并取得了良好的效果。值得注意的是，这些产物依赖于使用具有以不同分子支架包埋的NGR的各种肽，例如原型二硫键桥接CNGRC(SEQ ID NO:5)、乙酰化CNGRC、CVLNGRMEC(SEQ ID NO:12)、头对尾环化KNGRE(SEQ IDNO:7)、CGNGRG(SEQ ID NO:8)或线性GNGRG(SEQ ID NO:9)、NGRAHA(SEQ ID NO:10)、KNGRE(SEQ ID NO:7)、NGR和多种其他类型(Corti和Curnis2011；Corti等2008)。这些肽已与药物和颗粒化学偶联或与蛋白质的N末端或C末端序列融合，或者甚至通过遗传工程改造技术纳入蛋白质的内部环中(Corti和Curnis 2011；Corti等2008)。藉由多种这些产物获得的良好结果凸显了NGR作为靶向基序用于药物开发的实用性和多功能性。然而，CNGRC(SEQ ID NO:5)肽可能代表了药物开发的优选，因为已证明其用于递送药物至患者中肿瘤脉管系统(包括脑肿瘤中的脉管系统)的实用性，并且已证实其在动物和患者中免疫原性不佳。因此，CNGRC(SEQ ID NO:5)作为配体在患者中的晚期进展可能体现着优于其他方案的重要优势。

NGR-TNF在动物模型和癌症患者中的药理学和毒理学特性

给予超低剂量(皮克)的鼠CNGRCG-TNF(NGR-TNF)而非鼠TNF在各种黑素瘤、前列腺癌、淋巴瘤、纤维肉瘤和乳腺腺癌动物模型中通过改变药物渗透屏障与各种化疗药物(例如多柔比星、美法仑、顺铂、紫杉醇和吉西他滨)发挥协同抗肿瘤作用(Curnis,Sacchi和Corti2002；Sacchi等2006；Curnis等2000)。黑素瘤和淋巴瘤动物模型中，也已观察到肌肉内注射编码NGR-TNF的质粒DNA而非单独编码TNF的质粒DNA抑制肿瘤生长(Zarovni,Monaco和Corti 2004)。这些研究还表明，CNGRCG介导的TNF的血管靶向是一种有价值的策略，用于向肿瘤内皮细胞递送生物活性量的细胞因子，而不会导致反调节机制激活和毒性反应(Curnis,Sacchi和Corti 2002；Corti等2013)。此外，这些研究表明，向肿瘤血管靶向递送微量TNF足以改变内皮屏障功能，并且不仅有利于化疗药物在肿瘤中的渗透，而且有利于肿瘤组织中淋巴细胞的浸润(Curnis,Sacchi和Corti 2002；Sacchi等2006；Calcinotto等2012)。事实上，低剂量的NGR-TNF(0.1ng)可以通过上调肿瘤血管上的白细胞粘附分子以及通过诱导肿瘤组织中各种趋化因子的释放来促进肿瘤中的淋巴细胞外渗(Calcinotto等2012)。这些机制与黑素瘤可移植模型和自发性前列腺癌TRAMP模型中内源性或过继转移的细胞毒性T淋巴细胞的肿瘤浸润增加有关，而不会改变荷瘤小鼠血液、脾脏或肾脏中的T细胞分布(Calcinotto等2012)，并在没有毒性证据的情况下增加荷瘤小鼠的总生存期。NGR-TNF还可以单独或与化学疗法联合提高主动免疫疗法(疫苗接种)的功效。由于这些特性，由与人TNF序列融合的CNGRCG(SEQ ID NO:1)组成的人型NGR-TNF已在实体瘤患者的各种II期和III期临床研究中单独或与化疗或免疫疗法联合进行了测试，并具有活性证据(www.molmed.com)。该产品的生物学和药理学特性以及I期和II期临床研究的结果已经过审查(Corti等2013)。这些研究表明，NGR-TNF具有良好的耐受性。寒战和发热是最常观察到的毒性，并且没有患者在治疗期间产生抗NGR-TNF抗体。动态对比增强磁共振成像显示了血管对NGR-TNF的反应。在恶性胸膜间皮瘤(MPM)、肝细胞癌和结直肠癌中进行的低剂量NGR-TNF(0.8μg/m²，1小时输注，每三周或每周一次)的单药II期研究显示放射抗血管作用和显著的疾病控制。具体而言，针对MPM患者的II期研究显示，大约一半先前接受过治疗的患者的疾病得到了控制，并且在三周组中保持了4.4个月，在每周组中保持了9.1个月(Gregorc等2010)。基于这些结果，在先前接受过治疗的晚期MPM患者中进行了人NGR-TNF加最佳研究者选择(称为“BIC”)相对安慰剂加BIC的随机双盲III期研究。结果表明，患有侵袭性更强的MPM患者的总生存期显著增加(Gregorc等2018)。考虑到当前对于一线基于培美曲塞的方案失败的MPM患者尚无标准选择，并且考虑到NGR-TNF易于控制的毒性概况，这些结果是值得注意的。难治性实体瘤患者中人NGR-TNF联合化疗(例如多柔比星或顺铂)的I期和II期研究表明，该药物组合具有吸引人的临床活性和安全的毒性概况(Zucali等2013；Lorusso等2012；Gregorc等2011；Corti等2013)。最后，最近在复发性/难治性原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)患者中进行的II期研究表明，NGR-TNF可以改变肿瘤中的血脑屏障并提高R-CHOP功效，导致反应为75％(50％完全)(Ferreri等2019)。总之，这些结果表明NGR-TNF是具有生物活性且安全的分子，极有可能转化为市售药物。

重组NGR-TNF的分子异质性和稳定性

原则上，NGR-TNF是均质的50kDa同源三聚体蛋白。人NGR-TNF的生化表征研究表明，该药物确实是三聚体蛋白，但由不同的亚基组成，包括：a)分子量与预期值一致的亚基(+0Da)，b)以较小分子量(-17Da)为特征的亚基，c)以较大分子量(+42Da)为特征的亚基，d)以58Da较大分子量(+58Da)为特征的亚基(Tobias等2013)。考虑到亚基可以随机方式结合以形成三聚体，发明人估计人NGR-TNF制剂中可能存在至少64(4³)种不同的三聚体。考虑到NGR基序的天冬酰胺(N)可能会发生快速脱酰胺作用，该药物的异质性可能会进一步增加。事实上，几项研究表明，CNGRC(SEQ ID NO:5)的天冬酰胺通过琥珀酰亚胺中间体(特征在于损失17Da)非常迅速地脱酰胺化(在生理缓冲液中的半衰期为4-5小时)，在水解裂解后以1:3的比例形成呈L或D构型的Asp(D)和isoAsp(isoD)，两者的特征在于增加1Da。因此，CNGRC(SEQ ID NO:5)的脱酰胺生成CDGRC(SEQ ID NO:11)和Ciso DGRC(SEQ IDNO:41)序列(Corti和Curnis 2011；Curnis等2010；Curnis等2006)(参见图1示意图)。因此可以想象的是，不可预测数量的不同NGR-TNF变体可能存在于NGR-TNF中和/或可能在储存时或注射给患者后形成。值得注意的是，CNGRC(SEQ ID NO:5)脱酰胺导致CD13结合亲和力丧失以及整合素结合特性增加。实际上，CisoDGRC产物而非CDGRC(SEQ ID NO:11)可以结合αvβ3的RGD结合口袋(pocked)(Corti和Curnis 2011；Curnis等2010；Curnis等2006；Spitaleri等2008)，其是在肿瘤新生血管系统中过表达的整合素。值得注意的是，CisoDGRC对αvβ3和其他整合素的亲和力和特异性主要依赖于侧接残基，即使是很小的变化也会产生巨大的影响。例如，虽然CisoDGRC可以相比αvβ5、αvβ6、αvβ8和α51β高10-100倍的亲和力结合αv3β，但乙酰基-CisoDGRC(SEQ ID NO:41)肽(+42Da)可以相似的亲和力结合αvβ3、αvβ6和α5β1(Curnis等2010)。因此，NGR-TNF中可能存在的或形成的各种化合物的药理学和毒理学特性可能是不同的，因为各种形式对CD13或整合素可能具有不同的亲和力。NGR-TNF中存在的各种形式(-17Da、+0Da、+42Da、+58Da和脱酰胺的相应形式)可能与大肠杆菌细胞中NGR-TNF表达、其纯化、其储存期间以及有可能(尽管少量)在患者给药后出现的改变相关。因此明显的是，a)各种成分的生化、生物学、药理学和毒理学特性必须在药物注册前仔细定义，b)应保证不同NGR-TNF生产批次的可重复组成，以便在患者中使用。考虑到该药物的复杂性，这两项任务可能都是非常困难的。

因此，非常需要开发用于生产没有翻译后修饰的均质NGR-TNF或鉴定NGR-TNF的单组分、稳定且具有生物活性的衍生物的方法。因此，需要用于治疗癌症的稳定且均质的靶向细胞因子衍生物。

发明内容

越来越多的证据表明，通过基于与含有NGR基序的肽(即识别CD13阳性肿瘤血管的配体)偶联的靶向策略，可以提高细胞因子在癌症治疗中的功效。通常认为靶向方法允许给予低剂量但具有药理活性的药物，从而避免毒性反应和激活全身反调节机制。具体而言，已将CNGRCG(SEQ ID NO:1)肽用于通过重组DNA技术产生CNGRCG-肿瘤坏死因子-α(TNF)融合蛋白，该蛋白当前用于癌症患者的各种适应症的临床试验。CNGRCG-TNF(称为NGR-TNF)和其他CNGRCG-细胞因子产品的主要限制与CNGRCG(SEQ ID NO:1)基序的不稳定性及其分子异质性有关，这是由于不希望的翻译后修饰反应，在药物制造和储存中将导致严重的问题和困难并且也可能对药物药理学和毒理学产生潜在影响。本发明涉及CNGRCG-细胞因子偶联物(X-CNGRCG-细胞因子)，其比先前开发的CNGRCG-细胞因子更稳定和更均质，从而代表更可靠的第二代靶向细胞因子。

因此，本发明提供了偶联物，其包含：

-第一肽序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)，其与蛋白质的N末端连接；

-化合物X，其与所述肽的N末端连接。

优选地，偶联物能够识别CD13。

在根据本发明的偶联物中，蛋白质优选是细胞因子，更优选是赋予抗肿瘤活性的细胞因子。细胞因子优选选自下组：肿瘤坏死因子(TNF)，优选TNF-α或TNF-β，TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)，内皮单核细胞激活多肽II(EMAP-II)，IL12，干扰素γ和IFNα。

优选地，化合物X是第二肽。

优选地，化合物X是具有1-200个氨基酸残基的第二肽，更优选1、2或3个氨基酸残基。

优选地，第二肽由下述组成：丝氨酸残基或任何具有短侧链的氨基酸，优选甘氨酸或丙氨酸，包含偶联物在真核细胞中表达和分泌时被去除的前导序列或IEGR(SEQ ID NO:2)序列的氨基酸序列，优选OmpT前导序列(或OmpT信号肽或OmpT)或α交配因子分泌信号肽。

优选地，第二肽由丝氨酸组成并且细胞因子是TNF。优选地，TNF是人TNF-α。

在根据本发明的偶联物中，偶联物包含用于化学或酶促裂解化合物X和肽之间的键(X-C键)的位点，优选其中X-C键的裂解能够用氨肽酶或内切蛋白酶实现，优选用氨肽酶N(CD13)或蛋白酶，优选因子Xa。

本发明的其他目的是编码如上定义的偶联物的核酸，载体，优选质粒或病毒载体，优选用于含有所述核酸的基因疗法，以及包含如上定义的偶联物的纳米颗粒，优选偶联物吸附于金纳米颗粒的表面。

本发明的另一个目的是组合产品，其包含如上定义的偶联物或如上定义的核酸或如上定义的载体或如上定义的纳米颗粒和至少一种抗肿瘤剂，优选为化疗剂和/或免疫调节剂和/或自身免疫细胞。优选地，化疗剂是多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、替莫唑胺(temozolomide)、吉西他滨(gemcitabine)、紫杉醇(taxol)、顺铂、长春新碱(vincristine)或长春瑞滨(vinorelbine)。优选地，免疫调节剂是抗癌疫苗或免疫检查点阻断剂，例如抗PD1或抗PDL1或抗CTLA4抗体。优选地，免疫细胞是淋巴细胞或遗传修饰的T淋巴细胞，例如CAR-T细胞，或TCR重定向T细胞或NK细胞。优选地，其他抗肿瘤剂包括抗体和化疗剂，例如R-CHOP：利妥昔单抗(rituximab)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、长春新碱、多柔比星、泼尼松龙(prednisolone)。

优选地，至少一种抗肿瘤剂是多柔比星。优选地，至少一种抗肿瘤剂是美法仑。

如上定义的偶联物或组合产品或核酸或载体或纳米颗粒优选用于医疗用途，更优选用于治疗肿瘤，优选实体瘤，更优选淋巴瘤，优选CNS原发性弥漫性大B细胞淋巴瘤(PCNSL)，脑肿瘤(例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、弥漫性内生脑桥神经胶质瘤)，肉瘤，黑素瘤口腔或皮肤鳞状细胞癌，肝细胞癌，头颈癌，胃食管癌，结直肠癌，胰腺癌，卵巢癌，肺癌(例如，SCLC，NSCLC，间皮瘤)，宫颈癌，乳腺癌，肾癌，尿路上皮癌或其转移。

优选地，还给予至少一种如上定义的抗肿瘤剂。在治疗CNS原发性弥漫性大B细胞淋巴瘤(PCNSL)时，也优选给予R-CHOP。

优选地，当组合产品中至少一种抗肿瘤剂是多柔比星时，组合产品用于治疗胶质母细胞瘤。

优选地，当组合产品中至少一种抗肿瘤剂是美法仑时，组合产品用于治疗淋巴瘤。

本发明的另一个目的是药物组合物，其包含有效量的如上定义的偶联物或核酸或载体或组合产品或纳米颗粒，和至少一种药学上可接受的运载体和/或赋形剂。任选地，药物组合物还包含至少一种抗肿瘤剂。

本发明的另一个目的是产生包含与蛋白质N末端连接的序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)的均质偶联物的方法，所述方法包括：

在原核或真核细胞，优选大肠杆菌(E.coli)细胞和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中表达如上定义的偶联物；

化学或酶促裂解X-C键，优选使用氨肽酶、内切蛋白酶或蛋白酶。

本发明的另一目的是产生包含与蛋白质N末端连接的序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)的均质偶联物的方法，所述方法包括在不能乙酰化α-氨基或修饰CN序列的宿主中进行DNA表达，所述宿主优选为真核细胞。优选地，真核细胞选自下组：CHO细胞、小鼠骨髓瘤NS0衍生的细胞和昆虫细胞，例如Sf 21。

本发明的另一个目的是产生包含与蛋白质N末端连接的序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)的均质偶联物的方法，所述方法包括：

表达还包含前导序列的所述偶联物，所述前导序列在真核细胞或植物或动物中，优选在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、CHO细胞、杆状病毒昆虫细胞系统中表达时被去除；

分泌所述偶联物。

本发明的另一个目的是纯化如上定义的偶联物的方法，其包括下述步骤：

-裂解表达偶联物的细胞以获得裂解物；

-由裂解物获得可溶部分；

-硫酸铵沉淀可溶部分，以获得不溶部分，

-溶解不溶部分，以获得第二可溶部分，

-对第二可溶部分进行：

i.疏水层析，

ii.离子交换层析，

iii.变性条件下的凝胶过滤层析，

iv.复性，和

v.凝胶过滤层析。

细胞因子优选炎性细胞因子。在一个优选的实施方式中，细胞因子是治疗性细胞因子。优选地，细胞因子是TNFα，TNFβ，IFNα，IFNβ，IFNγ，IL-1、2、4、6、12、15、18，EMAP II，血管内皮生长因子(VEGF)，PDGF，PD-ECGF或趋化因子或其前体。在一个实施方式中，细胞因子是TNF-α、TNF-β或IFN-γ。

优选地，偶联物是融合蛋白的形式。在另一个实施方式中，偶联物是用于基因疗法的核酸、质粒或病毒载体的形式。在另一个实施方式中，偶联物是纳米颗粒的形式，例如，吸附于金纳米颗粒的表面。

在一个优选的实施方式中，该组合物还包含另一种抗肿瘤剂。

优选地，其它抗肿瘤剂是化疗药物，或免疫调节剂，或免疫细胞。优选地，化疗药物是多柔比星、美法仑、吉西他滨、紫杉醇、顺铂、长春新碱或长春瑞滨。优选地，免疫调节剂是抗癌疫苗或免疫检查点阻断剂(例如，抗PD1或抗PDL1或抗CTLA4抗体)。优选地，免疫细胞是淋巴细胞或遗传修饰的T淋巴细胞(例如，CAR-T细胞，或TCR重定向T细胞)。优选地，其他抗肿瘤剂包括抗体和化疗剂(例如，R-CHOP：利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、泼尼松龙)。

本发明的其他目的是包含如上定义的核酸的表达载体，用所述表达载体转化的宿主细胞和制备如上定义的偶联物或融合蛋白的方法，包括在使得偶联物或融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞。

具体实施方式

本文的发明人公开了产生相比最初描述的那些偶联物或衍生物更稳定、均质且生物活性更高的均质CNGRCG-细胞因子偶联物(包括NGR-TNF)和新型CNGRCG-细胞因子衍生物的新方法。发明人已经发现，与细胞因子(例如TNF和EMAP-II)偶联的CNGRCG(SEQ ID NO:1)结构域的分子异质性和不稳定性的一个重要来源与NGR-TNF的N末端中存在半胱氨酸后接天冬酰胺残基(CN)相关。此外，发明人已经发现，通过添加其它氨基酸或多肽序列来改变NGR-TNF的N末端序列改善了药物稳定性并克服了药物异质性问题。在本发明的一个优选实施方式中，分子异质性的问题通过向NGR-TNF的N末端添加丝氨酸残基解决(SCNGRCG-TNF，称为S-NGR-TNF)，该产物相比传统NGR-TNF(CNGRCG-TNF)更加稳定和均质化。该产物可以改善的亲和力结合CD13，并且在动物模型中单独或与化疗组合以提供强大的抗肿瘤活性。因此，相较于NGR-TNF，S-NGR-TNF代表生物化学和生物学特性改善的新分子。对于本领域专家而言显而易见的是，同样的策略也可以应用于生成其他CNGRCG-细胞因子偶联物，以解决CN不稳定性和分子异质性的问题。对于本领域专家而言同样显而易见的是，也可以用不同于丝氨酸的氨基酸或者甚至用二、三或多残基肽修饰CNGRCG-TNF或其他CNGRCG-细胞因子偶联物的N末端，以改善药物稳定性和均质性。在下文中，与CNGRCG-细胞因子融合的额外序列称为“X”序列，从而产生X-CNGRCG-细胞因子(例如，X-CNGRCG-TNF)。

在本发明的另一个优选实施方式中，CNGRCG-细胞因子偶联物的分子异质性问题通过将CNGRCG(SEQ ID NO:1)与X多肽序列的C末端融合解决，所述X多肽序列在适当系统中表达后被裂解，例如用于在大肠杆菌细胞中周质表达的OmpT前导序列，或在酵母或其他真核细胞中表达和分泌后被去除的其他前导序列。

鉴于这些前提，对于本领域专家而言显而易见的是，制备均质CNGRCG-细胞因子(包括NGR-TNF)的替代性方法可以依赖于表达X-CNGRCG-细胞因子，然后体外化学或酶促去除X序列。例如，可以利用能够裂解X-CNGRCG序列中X-C肽键的氨肽酶或其他内切蛋白酶来去除X部分，留下CNGRCG-细胞因子，而不对其N末端进行化学修饰。例如，当X是亮氨酸或丙氨酸残基时，可以利用氨肽酶N，而当X是包含与CNGRCG(SEQ ID NO:1)融合的IEGR序列的标签时，可以使用因子Xa。

产生均质CNGRCG-细胞因子产物的另一种可能性是在不能修饰CN序列的生物体中将其表达，例如真核细胞，或者以缺乏N末端胱氨酸的肽表达偶联物，例如NGR，然后是其他氨基酸残基，例如或NGRAHA(SEQ ID NO:10)或NGRAGG(SEQ ID NO:13)。

在本发明的上下文中，能够识别CD13的偶联物包括能够结合CD13和/或其他氨肽酶的偶联物。

本发明涉及偶联物，其是这样的分子，其包含通过遗传融合或化学偶联形成的与至少一种细胞因子连接的靶向部分/多肽。述及“连接”，发明人指第一和第二序列结合，从而使第一序列能够通过第二序列转运至靶细胞。因此，偶联物包括融合蛋白，其中转运蛋白通过其多肽骨架与细胞因子连接，通过遗传表达编码这些蛋白质的DNA分子，直接合成蛋白质和其中预先形成的序列通过交联剂结合的偶联蛋白。该术语在本文中还用于包括细胞因子与靶向肽/蛋白质的结合，例如聚集体。能够本发明的偶联物导向细胞，从而可以发生与转运序列偶联的多肽序列相应的效应子功能。肽(例如，化合物X和SEQ ID NO:1)可以直接或通过间隔子间接偶联细胞因子，所述间隔子可以是单个氨基酸、氨基酸序列或有机残基，例如6-氨基辛基-N-羟基琥珀酰亚胺。

肽配体优选与细胞因子N-末端连接，从而使经修饰的细胞因子与其受体结合的任何干扰最小化。或者，肽可以与作为酰胺键或羧基键受体的氨基酸残基连接，这些氨基酸残基可以天然存在于分子或使用遗传工程改造技术人工插入。经修饰的细胞因子优选通过使用包含编码肽的5'-连续序列的cDNA制备。根据优选实施方式，提供了TNF与CNGRC(SEQ IDNO:5)序列之间的偶联产物，其中TNF的氨基末端通过间隔子G(甘氨酸)与CNGRC(SEQ IDNO:5)肽连接。偶联物还包含如上定义的化合物X。

编码本发明偶联物或蛋白质和/或化合物X的cDNA可以针对在宿主中表达进行密码子优化。

化疗药物渗透到肿瘤细胞中对于实体瘤化疗的有效性而言至关重要。为了到达实体瘤中的癌细胞，化疗药物必须进入药物血管，穿过血管壁，并最后通过间质迁移。异质性肿瘤灌注、血管通透性和细胞密度以及间质压力增加可能代表限制药物渗透到肿瘤细胞中的关键障碍，从而限制了化疗的有效性。

这同样适用于抗癌免疫调节剂或免疫细胞，它们也需要穿透肿瘤组织才能发挥作用。因此，具有影响这些因子作用并且可以改变药物渗透屏障的细胞因子可用于本发明。可用于本发明的细胞因子的非限制性列表是：TNFα，TNFβ，IFNα，IFNβ，IFNγ，IL-1、2、4、6、12、15，EMAP II，血管内皮生长因子(VEGF)，PDGF，PD-ECGF或趋化因子。在一个实施方式中，TNF是能够选择性结合TNF受体之一的突变型TNF(Loetscher H等(1993)J Biol Chem 268:26350-7；Van Ostade X等(1993)Nature 361:266-9)。在本发明的另一实施方式中，TNF是对TNF受体具有较低亲和力的突变体(Huyghe等,EMBO Molecular Medicine12:e11223,2020)。

本发明通过下述与TNF(TNF-α)和内皮单核细胞激活多肽II(EMAP-II)有关的实施例进行说明。然而，考虑到TNF-α与TNF-β(也称为淋巴毒素-α)和TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)在结构和抗肿瘤活性上的高度相似性，本领域技术人员可以容易地生成基于TNF-β或TRAIL的类似化合物。

优选地，根据本发明的偶联物从N端到C端包含：如上定义的化合物X、序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)的肽、如上定义的蛋白质。优选地，根据本发明的偶联物从N端到C端包含：丝氨酸残基、序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)、TNF-α。优选地，根据本发明的偶联物从N端到C端包含：α交配因子分泌信号肽、序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)、TNF-α。优选地，根据本发明的偶联物从N端到C端包含：OmpT前导序列、序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)、TNF-α。

“均质(性/的)”指的是预期的分子量。

上述第一肽序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)可以与蛋白质的N末端直接连接或通过接头连接。上述化合物X可以与所述肽(例如序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)的肽)的N端直接连接，也可以通过接头连接。例如，本发明的偶联物在上述前导序列或化合物X与第一肽序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)之间可以包含具有限制性位点的序列。

优选地，人TNF包含或由下述序列组成：

优选地，鼠TNF包含或由下述序列组成：

优选地，OmpT信号肽包含或由下述序列组成：

M R A K L L G I V L T T P I A I S S F A(SEQ ID NO:16)。

优选地，α交配因子分泌信号肽包含或由下述序列组成：

M R F P S I F T A V L F A A S S A L A(SEQ ID NO:23)。

更优选地，根据本发明的偶联物包含或由下述序列组成：

或者

或者

或者

或者

或者

优选地，编码本发明偶联物的核酸包含或由SEQ ID NO:30、31、32、33或34组成。

在根据本发明产生均质偶联物的方法中，可以在本领域技术人员已知的任何表达系统中进行偶联物的表达。

表达系统的示例是原核系统，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(E.coli)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、乳酸乳球菌(Lactoccos Lactis)。真核表达系统的示例是酵母系统，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)，真菌系统，例如黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillusoryzae)，昆虫系统，哺乳动物系统，例如HEK293和CHO，转基因植物或动物。出版物Gomes等,动物和兽医科学进展(Advances in Animal and Veterinary Sciences),2016年6月,4(7):346-356中提及的所有表达系统通过引用纳入本文。

在本发明的上下文中，具有短侧链的氨基酸优选是具有这样链的氨基酸，所述链包含1-6个碳原子，优选1-3个碳原子。这类氨基酸的示例是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸。

本文所述的多核苷酸或核酸可以存在于载体中。载体是复制型多核苷酸，例如质粒、噬菌体或粘粒，另一个多核苷酸可以与其连接，从而使得所连接的多核苷酸复制。构建包含本发明的多核苷酸的载体采用本领域已知的标准连接技术。参见例如，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)。载体可以用于进一步克隆(扩增多核苷酸)，即克隆载体，或用于表达多核苷酸，即表达载体。术语“载体”包括但不限于质粒载体、病毒载体、粘粒载体、转座子载体和人工染色体载体。病毒载体的示例包括例如腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体和疱疹病毒载体。载体可以是具有复制能力的或者复制缺陷的。载体可能会导致整合到细胞的基因组DNA中。通常，载体能够在宿主细胞中复制，例如哺乳动物和/或细菌细胞，例如大肠杆菌。

载体的选择取决于所得构建体中的多种所需特征，例如选择标志物、载体复制率、在将基因转移到胃肠道细胞中的用途等。用于克隆或表达本文载体的合适宿主细胞是原核或真核细胞。合适的真核细胞包括哺乳动物细胞，例如鼠细胞和人细胞。合适的原核细胞包括真细菌，例如革兰氏阴性生物，例如大肠杆菌。

任选地，表达载体包括与本发明的多核苷酸操作性连接的调节序列。调节序列的示例是启动子启动子可以在使用的宿主细胞中起作用，例如，在构建和/或表征CgA多核苷酸或其片段中，和/或可以在载体的最终受体中起作用。启动子可以是诱导型、抑制型或组成型的，并且本领域已知各类型的示例。本发明的多核苷酸还可以包括转录终止子。本领域已知合适的转录终止子。

本文所述的多核苷酸可以在体外或体内产生。例如，体外合成的方法包括但不限于用常规DNA/RNA合成仪的化学合成。用于体外合成的合成多核苷酸和试剂的商业供应商是已知的。体外合成的方法还包括，例如，在无细胞系统中使用环状或线性表达载体进行体外转录。表达载体也可用于在细胞中产生本发明的多核苷酸，然后可由细胞分离多核苷酸。

还提供了包含本文所述的一种或多种多肽或多核苷酸的组合物。这类组合物通常包括药学上可接受的运载体。如本文所用，“药学上可接受的运载体”包括但不限于与药物给予相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。其他化合物也可掺入组合物。

组合物可以通过药学领域已知的方法制备。通常，可以将组合物配制成与其预期的给药途径相容。制剂可以是固体或液体。给药可以是全身给药或局部给药。在一些方面中，局部给药在位点特异性、靶向疾病管理方面有优势。局部疗法可以直接向治疗位点提供临床上有效的高浓度，引起全身副作用的可能性较小。

给药途径的示例包括胃肠道外(例如静脉内、皮内、皮下、腹膜内、肌内)、肠内(例如口服或直肠)和局部(例如表皮、吸入、经粘膜)给药。用于本发明化合物肠内给药的合适剂型可以包括片剂、胶囊或液体。用于肠胃外给药的合适剂型可以包括静脉内给药。用于局部给药的合适剂型可以包括鼻喷雾剂、定量吸入器、干粉吸入器或通过雾化。溶液或悬浮液可以包括下述组分：无菌稀释剂，诸如给药用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲液，诸如如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；电解质，诸如钠离子、氯离子、钾离子、钙离子和镁离子，和用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠调节pH值。可以将组合物封装在例如安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

组合物可以包括无菌水性溶液或分散体和无菌粉末，用于临时制备无菌溶液或分散体。对于静脉内给药，合适的运载体包括人白蛋白、生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(巴斯夫公司(BASF)，新泽西州帕西潘尼)或磷酸盐缓冲盐水。组合物通常是无菌的，当适合用于注射使用时，应当是达到易于注射的程度的液体。组合物在制造和储存条件下应当是稳定的，并且在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。运载体可以是包含例如白蛋白、水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等)实现防止微生物的作用。在许多情况下，组合物中可优选地包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化钠。可在组合物中包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝和明胶)以延长可注射组合物的吸收。可将所需量的活性化合物(例如，本文所述的多肽或多核苷酸)和诸如上述枚举的一种上述组分或其组合根据需要掺入合适溶剂后过滤灭菌，从而制备无菌溶液。通常，分散液通过将活性活化物掺入含有分散介质和诸如上述枚举的其它成分的无菌载剂中制备。在用于制备无菌注射液的无菌粉末情况中，可以使用的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，由其之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。

对于肠内给药，组合物可通过例如鼻饲管、灌肠、结肠镜或口服递送。口服组合物可以包括惰性稀释剂或可食用运载体。对于口服治疗给药目的，可用赋形剂将活性化合物掺入并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用液体运载体制备。可以包含药学上相容的结合剂作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何以下成分或具有相似特性的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如海藻酸、羧甲基淀粉(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或完全氢化植物油(Sterotes)；助流剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯、或橙调味剂。

对于通过吸入给药，活性化合物可以气溶胶喷雾、雾化器或吸入器的形式，例如鼻腔喷雾、计量吸入器或干粉吸入器递送。也可通过经粘膜或透皮方法进行全身给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中采用适合渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常为本领域已知，并包括例如用于经粘膜给药的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可通过使用鼻喷雾或栓剂实现。对于透皮给药，可以将活性化合物配制成软膏、药膏、凝胶或乳膏，如本领域通常已知的那样。透皮给药的示例包括离子电渗递送至真皮层或其他相关组织。还可以栓剂(例如使用常规的栓剂基料，如可可油或其它甘油酯)或留置灌肠剂的形式制备活性化合物用于直肠递送。活性化合物可联合运载体制备，所述运载体会保护所述化合物不被身体快速清除，例如控释配方，包括植入体。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。可以使用标准技术制备这种制剂。这些材料也可以商购。脂质体悬浮液也能被用作药学上可接受的运载体。它们可以根据本领域技术人员已知的方法制备。也可使用诸如脂质、阳离子脂质、磷脂、脂质体和微胶囊化等递送试剂。

本发明的另一个目的是治疗和/或预防肿瘤的方法，优选实体瘤，更优选淋巴瘤，优选CNS原发性弥漫性大B细胞淋巴瘤(PCNSL)，脑肿瘤，例如神经胶质瘤，星形细胞瘤，胶质母细胞瘤，弥漫性内生脑桥神经胶质瘤，肉瘤，黑素瘤口腔或皮肤鳞状细胞癌，肝细胞癌，头颈癌，胃食管癌，结直肠癌，胰腺癌，卵巢癌，肺癌，例如SCLC，NSCLC，间皮瘤，宫颈癌，乳腺癌，肾癌，尿路上皮癌或其转移，包括将本文所公开的偶联物或核酸或载体或纳米颗粒或组合产品给予有需要的患者。

在本发明的上下文中，术语“包括”包括术语“包含”、“由……组成”和“基本上由……组成”。

序列：

本发明还包括衍生自本文和下文所示序列的核酸序列和氨基酸序列，例如功能性片段、突变体、衍生物、类似物、前体和与本文所公开的序列具有至少70％同一性百分比的序列。

下述蛋白质优选以相应NCBI登录号所公开的序列为特征。

蛋白质	登录号	版本号
			TNF-α	AQY77150	AQY77150.1
淋巴毒素-α前体	NP_001153212	NP_001153212.1
			内皮单核细胞激活多肽II	AAA62202	AAA62202.1
TNF相关的凋亡诱导配体	P50591	P50591.1
			白细胞介素-12亚基β前体	NP_002178	NP_002178.2
白细胞介素12亚基α同种型1前体	NP_000873	P50591.1
			干扰素γ前体	NP_000610	NP_000610.2
干扰素α-2	P01563	P01563.1
			交配因子α-1	P01149	P01149.1
蛋白酶7	P09169	P09169.1

pET12质粒中克隆的鼠NGR-TNF：

(氨基酸序列：SEQ ID NO:24，核苷酸序列：SEQ ID NO:30)

克隆cDNA序列到pET12质粒中，用于在大肠杆菌(Escherichia coli)细胞的周质空间中表达鼠NGR-TNF。

显示了密码子和相应的氨基酸(各密码子上方的粗体字)。

用双下划线标记用于将cDNA克隆到pET12质粒中的限制性位点(Sal I)。

*，终止密码子。

斜体：编码CNGRCG序列的cDNA。

下划线：鼠TNF的cDNA序列。

方框标注的序列，OmpT信号肽(由pET12质粒提供)促进输出进入周质空间中。

箭头，大肠杆菌(E.coli)中ompT-NGR-TNF融合蛋白的预期裂解位点。

pET/101D质粒中克隆的鼠S-NGR-TNF：

(氨基酸序列：SEQ ID NO:25，核苷酸序列：31)

克隆cDNA序列到pET/101D质粒中用于在大肠杆菌细胞中表达鼠S-NGR-TNF。

显示了化学合成的密码子(针对在大肠杆菌细胞中表达进行了优化)和相应的氨基酸(各密码子上方的粗体字)。

用双下划线标记用于将cDNA克隆到pET/101D质粒中的限制性位点(Nde I和BamHI)。

*，终止密码子。

斜体：编码SCNGRCG(SEQ ID NO:6)序列的cDNA。

下划线：鼠TNF的cDNA序列。

pET/101D质粒中克隆的人S-NGR-TNF(针对大肠杆菌优化了密码子使用)：

(氨基酸序列：SEQ ID NO:27，核苷酸序列：32)

克隆cDNA序列到pET/101D质粒中用于在大肠杆菌细胞中表达人S-NGR-TNF。

显示了化学合成的密码子(针对在大肠杆菌细胞中表达进行了优化)和相应的氨基酸(各密码子上方的粗体字)。

用双下划线标记用于将cDNA克隆到pET/101D质粒中的限制性位点(Nde I和BamHI)。

*，终止密码子。

斜体：编码SCNGRCG(SEQ ID NO:6)序列的cDNA。

下划线：人TNF的cDNA序列。

pET11质粒中克隆的人S-NGR-TNF：

(氨基酸序列：SEQ ID NO:27，核苷酸序列：33)

克隆cDNA序列到pET11质粒中用于在大肠杆菌细胞中表达人S-NGR-TNF。

显示了化学合成的密码子和相应的氨基酸(各密码子上方的粗体字)。

用双下划线标记用于将cDNA克隆到pET11质粒中的限制性位点(Nde I和Sal I)。

*，终止密码子。

斜体：编码SCNGRCG(SEQ ID NO:6)序列的cDNA。

下划线：人TNF的cDNA序列。

pPIC9K质粒中克隆的人NGR-TNF(针对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)优化了密码子使用)：

(氨基酸序列：SEQ ID NO:29，核苷酸序列：34)

克隆cDNA序列到pPIC9K质粒中用于在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞中表达人NGR-TNF。

显示了化学合成的密码子(针对在巴斯德毕赤酵母细胞中表达进行了优化)和相应的氨基酸(各密码子上方的粗体字)。

用双下划线标记用于将cDNA克隆到pPIC9K质粒中的限制性位点(BamHI I和EcoRI)。

*，终止密码子。

方框标注的序列，α交配因子分泌信号肽(由pPIC9K表达质粒提供)促进NGR-TNF分泌到培养基中。

箭头，巴斯德毕赤酵母中融合蛋白的裂解位点。

斜体：编码CNGRCG序列的cDNA。

下划线：人TNF的cDNA序列。

本发明通过参考下图非限制性实施例阐述。

图1.NGR脱酰胺反应及其产物的示意图。CNGRC(SEQ ID NO:5)肽和偶联物中NGR转变为isoDGR和DGR可以通过对Asn侧链酰胺羰基上主链NH中心的亲核攻击发生，导致氨损失(-17Da)和形成琥珀酰亚胺中间体。琥珀酰亚胺的水解导致形成isoDGR和DGR混合物，其中isoAsp和Asp呈L和D构型，增加1Da。

图2.人和鼠CNGRCG-TNF的MS分析。通过使用API QStar PULSAR质谱仪(A)和QExactive HF质谱仪(B-C)的ESI-MS测定的人和鼠CNGRCG-TNF(NGR-TNF)或TNF的代表性质谱。显示了预期的平均质量。

图3.用Asp-N消化鼠NGR-TNF产生含有+0Da、+42Da、+58Da和+100Da形式的N末端片段。A)质谱(MS)分析前样品制备的示意图。鼠NGR-TNF用10mM二硫苏糖醇(DTT)还原，用55mM碘乙酰胺(IAA)烷基化，并用内切蛋白酶Asp-N在37℃下在pH 8.0含10％乙腈的0.1M碳酸氢铵缓冲液中消化16小时。B)对应鼠NGR-TNF的N末端区域的片段的质谱，通过MALDI-TOF(Voyager-DE STR质谱仪，应用生物系统公司(Applied Biosystems)，马萨诸塞州弗雷明汉)检测。相较于鼠NGR-TNF未修饰的N末端片段的预期值，下划线标记的数字对应+0、+42、+58和+100Da的片段。其他数字对应各种形式的同位素分布。

图4.大肠杆菌细胞中表达的不同重组蛋白的MS分析。使用API QStar PULSAR质谱仪通过ESI-MS测定所示蛋白质的质谱。显示了预期的平均分子量。

图5.缺乏CNGRCG(SEQ ID NO:1)的鼠NGR-TNF的自降解产物不包含+42Da、+58Da和+100Da分子形式。

鼠NGR-TNF部分自体溶解后的质谱图(通过ESI-MS，API QStar PULSAR质谱仪，PE-Sciex仪器公司(PE-Sciex Instruments)，加拿大)显示完整的CNGRCG-TNF偶联物(异质)和仅对应TNF的片段(缺少CNGRCG(SEQ IDNO:1)，均质)。显示了预期的平均质量。

图6.OmpT-CNGRCG-TNF融合蛋白不包含+42Da、+58Da和+100Da分子形式。A)获自BL21(DE3)大肠杆菌细胞的蛋白质提取物的SDS-PAGE分析，所述BL21(DE3)大肠杆菌细胞用经工程改造表达鼠CNGRCG-TNF的质粒pET12转化。在该质粒中，编码CNGRCG-TNF的cDNA与OmpT信号肽的C末端(由pET12质粒提供)融合以促进向周质空间的输出。在周质分泌时，预计OmpT信号肽会将从融合蛋白中裂解出来。T，总蛋白提取物；SF，可溶性蛋白质部分；IF，不溶性蛋白质部分；和PF，周质部分。MW，分子量标志物。尽管在周质部分中未观察到对应NGR-TNF的条带，但在不溶性蛋白质部分中观察到了约20KDa的更大尺寸的条带(虚线矩形，包涵体)。这表明融合蛋白以不溶性包涵体的形式产生，并且没有去除OmpT序列。B)质谱(MS)分析的样品制备工作流程。将含有20KDa条带(虚线矩形，分图A)的凝胶切下并与10mM二硫苏糖醇(DTT)在56℃下pH为8.0的50mM碳酸氢铵孵育30分钟。然后将凝胶与55mM碘乙酰胺(IAA)在室温下50mM碳酸氢铵中黑暗孵育20分钟。用水洗涤后，将凝胶与胰蛋白酶溶液在37℃下含有5mM CaCl₂的pH为8.0的25mM碳酸氢铵缓冲液中孵育16小时。最后，使用MALDI-TOFVoyager-DE STR质谱仪(应用生物系统公司，马萨诸塞州弗雷明汉)通过质谱分析洗脱自凝胶的肽。C)OmpT-CNGRCG-TNF(鼠)N末端区域在还原、烷基化和胰蛋白酶消化后的质谱。结果表明，信号肽并未从NGR-TNF中裂解出来，并且N末端片段是均质的，不存在+42、+58和+100Da修饰。

图7.抗乙酰基-CisoDGRC抗血清识别鼠和人NGR-TNF，但不识别鼠和人TNF。抗乙酰基-CisoDGRC(SEQ ID NO:41)抗血清获自经乙酰基-CisoDGRCK(SEQ ID NO:36)肽免疫的兔，所述乙酰基-CisoDGRCK(SEQ IDNO:36)肽通过赖氨酸ε-氨基基团与卵白蛋白化学偶联。然后使用过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体作为检测试剂，通过ELISA分析该抗体识别与微量滴定板结合的肽和蛋白质的能力。A)抗乙酰基-CisoDGRC抗体与涂覆含有isoDGR的所示肽的微量滴定板的结合。抗血清识别含有乙酰基-CisoDGRC序列的肽，但不识别含有CisoDGRC或乙酰基-GisoDGRC序列的肽。B)抗乙酰基-CisoDGRC与鼠或人NGR-TNF和TNF的结合。抗血清识别鼠和人脱酰胺NGR-TNF，但不识别TNF，这表明两种产物含有乙酰基-半胱氨酸基团。

图8.鼠S-NGR-TNF和NGR-TNF的生化和生物学特性。A)鼠S-NGR-TNF、NGR-TNF和TNF在还原(βMe+)和非还原条件(βMe-)下的SDS-PAGE。箭头：对应于单体亚基(mon)和可还原二聚体(dim)的条带。B)经Q Exactive HF质谱仪测定的鼠NGR-TNF、TNF和S-NGR-TNF的代表性质谱。显示了预期的平均质量。C)TNF、NGR-TNF和S-NGR-TNF对L-M细胞的细胞毒性活性。L-M细胞在补充有指定剂量的2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素-B、10％胎牛血清、2μg/ml放线菌素D和TNF、NGR-TNF或S-NGR-TNF的DMEM培养基中孵育(37℃下20小时，5％CO₂)。通过标准化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四噻唑(MTT)试验对细胞活力进行定量。D)TNF、NGR-TNF和S-NGR-TNF与sTNF-R1(依那西普(Etanercept))的结合。微量滴定板用或不用指定量的sTNF-R1预涂覆(16小时)，用PBS洗涤，用含3％牛奶、1％BSA的PBS封闭(结合缓冲液，1小时)，并用在结合缓冲液中稀释的指定量的TNF、NGR-TNF或S-NGR-TNF孵育(1.5小时)。然后使用多克隆抗鼠TNF(IP301，在结合缓冲液中为5μg/ml，1小时)，随后用与辣根过氧化物酶偶联的多克隆山羊抗兔抗体(在结合缓冲液中为1:1000，1小时)以及邻苯二胺作为显色底物，检测各种蛋白质与sTNF-R1的结合。

图9.大肠杆菌细胞中不同表达系统产生的人S-NGR-TNF和NGR-TNF的表征。A)在大肠杆菌细胞中使用pET101/D和pET11质粒(允许低和高表达水平)表达的人S-NGR-TNF在还原(βMe+)和非还原条件(βMe-)下的SDS-PAGE。箭头：对应于单体亚基(mon)的条带。B)经QExactive HF质谱仪测定的人S-NGR-TNF(粗制提取物和经亲和纯化的)的代表性质谱。显示了预期的平均质量。人S-NGR-TNF通过在sTNF-R1(依那西普)-琼脂糖柱上进行亲和层析从大肠杆菌细胞提取物中纯化，并通过质谱分析，无需进一步进行其他纯化步骤。

图10.肽SCNGRCGVRY(SEQ ID NO:3)比CNGRCGVRY(SEQ IDNO:4)和乙酰化-CNGRCGVRY更高效地抑制CD13酶促活性。A)不同量的L-丙氨酸对硝基苯胺底物和SCNGRCGVRY(SEQ ID NO:3)、CNGRCGVRY(SEQ ID NO:4)或乙酰化-CNGRCGVRY(ac-CNGRCGVRY)(SEQ ID NO:42)存在下的CD13稳态动力学分析。示出了3-4个独立实验的代表性图，其显示了初始速度(V₀)相对底物浓度(四个技术重复的平均值±SE)的关系。在室温下pH为7.4的60mM磷酸钾缓冲液中用重组人组氨酸标记的CD13(200-300ng/ml)进行试验。用分光光度法(A405 nm)监测对硝基苯胺形成的动力学5-10分钟。各图中报告的抑制常数(Ki)是3-4个独立实验的结果(平均值±SE)。B)分图A中报告了实验的双倒数图。

图11.肽SCNGRCGVRY(SEQ ID NO:3)在pH为7.3的生理缓冲液中具有比CNGRCGVRY(SEQ ID NO:4)更低的脱酰胺倾向，但在pH为8.5的碳酸氢铵缓冲液中则没有。A和B)SCNGRCGVRY(SEQ ID NO:3)和CNGRCGVRY(SEQ ID NO:4)在37℃下在pH为7.4的50mM磷酸钠缓冲液(PBS)或pH为8.5的0.1M碳酸氢铵缓冲液(Ambic)中孵育指定时间后。图中报告的值+0、+1、-17对应以道尔顿表示的肽的观测分子量和预期分子量之间的差异。使用LTQ-Orbitrap质谱仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))进行MS分析。

图12.S-NGR-TNF并不促进内皮EA.hy926细胞粘附，除非用pH为8.5的0.1M碳酸氢铵缓冲液处理以强制脱酰胺。A)将内皮EA.hy926细胞粘附到涂覆有不同量的鼠TNF、NGR-TNF和S-NGR-TNF的96孔微量滴定板上pH为7.4的150mM氯化钠、50mM磷酸钠缓冲液(PBS)中(16小时)。各孔用2％BSA在含氯化钙和氯化镁的PBS(DPBS，30分钟)中封闭，在补充有0.1％BSA的DPBS(DPBS-B)中接种40.000个内皮EA.hy926细胞，并置于37℃、5％CO₂下孵育2小时。用DMEM-B洗涤后，粘附细胞用结晶紫染色，并在570nm处通过分光光度法测量进行定量。B)将在PBS中预涂覆1μg/ml鼠NGR-TNF或S-NGR-TNF(16小时)的微量滴定板在37℃下pH为8.5的0.1M碳酸氢铵缓冲液(Ambic)中孵育指定时间以促进NGR脱酰胺化。然后如上所述进行EA.hy926细胞粘附试验。

图13.向NGR-TNF的N末端添加丝氨酸残基并不削弱其抗肿瘤活性，也不会增加其在高剂量时的毒性。A)高剂量的鼠S-NGR-TNF或NGR-TNF对负荷RMA-T淋巴瘤小鼠的体重和肿瘤体积的影响。6只C57BL/6小鼠(6-7周龄，体重18-20g)通过左侧腹皮下注射5×10 ⁴个RMA-T细胞攻击。负荷RMA淋巴瘤的小鼠(每组6只)在肿瘤植入后的11天经2μg和6μg鼠NGR-TNF或S-NGR-TNF的0.9％氯化钠溶液处理，其中含有如所示(箭头)的100μg/ml无内毒素的人白蛋白(腹膜内(i.p.))。如所示监测动物体重和肿瘤生长。B)美法仑单独或与低剂量鼠S-NGR-TNF组合对负荷RMA-T淋巴瘤小鼠体重的影响。6只荷瘤小鼠注射了指定剂量的S-NGR-TNF(腹膜内)，2小时后，注射美法仑的通用制剂(Melphalan-Tillomed)(腹膜内)。*，P<0.05，**P<0.01，通过使用GraphPad Prism软件对各肿瘤的曲线下面积进行非配对t检验分析。

图14.向NGR-TNF的N末端添加丝氨酸残基并不削弱其抗肿瘤活性，也不会增加其在低剂量时的毒性。在Balb/c小鼠(6-7周龄，体重18-20g)左侧腹皮下注射1.5×10⁶个WEHI-164细胞，并在肿瘤植入后的5天用25或50pg鼠NGR-TNF或S-NGR-TNF的0.9％氯化钠溶液处理(腹膜内)，其中含有100μg/ml无内毒素的人血清白蛋白(箭头)。A)治疗后的肿瘤体积(平均值±SE，每组6只小鼠)。B)第15天的肿瘤重量(用25和50pg药物治疗的两组的累积数据)。*，P<0.05，**P<0.01，通过对各肿瘤的曲线下面积进行非配对t检验分析(GraphPadPrism软件)。

图15.向NGR-TNF的N末端添加丝氨酸残基并不削弱其与美法仑联用时的抗肿瘤活性。C57BL/6小鼠(6-7周龄，体重18-20g)通过左侧腹皮下注射7×10⁴个RMA细胞攻击。负荷RMA淋巴瘤的小鼠(每组6只)在肿瘤植入后10-11天用100pg鼠NGR-TNF或S-NGR-TNF(腹膜内)处理。两小时后，向小鼠注射指定剂量的美法仑(腹膜内)。用含有100μg/ml无内毒素的人白蛋白的0.9％氯化钠稀释所有蛋白质。每天通过用卡尺测量肿瘤来监测肿瘤生长。A-B)显示了两个独立实验的肿瘤体积变化(平均值±SE)。这些实验使用来自阿斯彭制药公司(Aspen Pharma)的美法仑(Alkeran)进行。*，P<0.05，**P<0.01，通过藉由GraphPad Prism软件对各肿瘤的曲线下面积进行非配对t检验分析。C)如上所示，在肿瘤植入后的第10天，荷瘤动物经如上指定剂量的S-NGR-TNF和美法仑的通用制剂(Melphalan-Tillomed，来自Tillomed Italia)处理。显示了第20天的RMA肿瘤重量(平均值±SE)。*，P<0.05，**P<0.01，藉由GraphPad Prism软件的非配对t检验分析。

图16.向NGR-TNF的N末端添加丝氨酸残基并不加剧美法仑的毒性。

美法仑单独或与低剂量鼠S-NGR-TNF联用对负荷RMA-T淋巴瘤小鼠体重和肿瘤生长的影响。6只荷瘤小鼠注射了指定剂量的S-NGR-TNF(腹膜内)，2小时后，注射美法仑的通用制剂(Melphalan-Tillomed)(腹膜内)。每天监测肿瘤重量和肿瘤体积.*,P<0.05，***P<0.001，通过使用GraphPad Prism软件对各肿瘤的曲线下面积进行非配对t检验分析。

图17.克隆cDNA序列到pPIC9K质粒中用于在巴斯德毕赤酵母细胞中表达NGR-hTNF。

显示了化学合成的密码子和相应的氨基酸(各密码子上方的粗体字)。用下划线标记用于将cDNA克隆到pPIC9K质粒中的限制性位点(BamHI和EcorRI)。*，终止密码子。箭头，巴斯德毕赤酵母中融合蛋白的裂解位点。

图18.在巴斯德毕赤酵母细胞中表达的人CNGRCG-TNF(NGR-TNF)的表征。

将巴斯德毕赤酵母细胞(菌株GS115和K)工程改造以表达人CNGRCG-TNF。在该表达系统中，编码CNGRCG-TNF的cDNA与α交配因子分泌信号肽的C末端融合(由pPIC9K表达质粒提供)，以促进分泌到培养基中。A)融合蛋白的序列和预期的裂解位点(箭头)。B)获取自野生型巴斯德毕赤酵母细胞

或经工程改造以表达人NGR-TNF的巴斯德毕赤酵母克隆的培养基的SDS-PAGE分析。通过添加甲醇(1％)在28℃下诱导细胞培养物48小时。显示了MW分子量标志物。菌株K的克隆#1、#2和#4不表达NGR-TNF，而在所有其他克隆中观察到约17KDa的条带。C)人NGR-TNF通过sTNF-R1(依那西普)-琼脂糖柱进行亲和层析从细胞培养基中纯化，并使用ESI-MS QExactive HT质谱仪进行质谱分析。显示了NGR-TNF的质谱和预期的平均质量。

图19.S-NGR-hTNF纯化的流程图

示意性地显示了用于生产人S-NGR-hTNF的纯化过程和材料。进行整个过程需要9天，将各部分保持在4℃或冰上，但离子交换层析步骤后获得的产物除外，其储存在-80℃直至下一步。通过透析进行再折叠如下进行：用33体积的2.33M尿素，100mM Tris-HCl，pH 8.0透析从变性柱(A₂₈₀nm<2)洗脱的产物(140分钟，4℃)。然后，去除2/3的透析缓冲液，并用等体积的100mM Tris-HCl，pH 8.0代替，并置于孵育额外的140分钟。然后将后一步骤重复一次。最后，在搅拌下于4℃用80体积的100mM Tris-HCl pH 8.0透析产物16小时。

缩写：SF和IF，可溶和不溶部分；CV，柱体积；PES，聚醚砜膜、SFCA、无表面活性剂醋酸纤维素膜。

图20.使用大规模方案制备的S-NGR-hTNF的生化和生物学表征。

A)S-NGR-hTNF在还原(βMe+)和非还原条件(βMe-)下的SDS-PAGE。箭头：对应于单体亚基(mon)和可还原二聚体(dim)的条带。还显示了还原条件下分子量标准(MW)的迁移。

B)经Q Exactive HF质谱仪测定的S-NGR-hTNF的代表性质谱。显示了预期的平均质量。

C)S-NGR-hTNF对L-M细胞的细胞毒性活性。L-M细胞在补充有指定剂量的2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素-B、10％胎牛血清、2μg/ml放线菌素D和S-NGR-hTNF的DMEM培养基中孵育(37℃下20小时，5％CO₂)。使用PrestoBlue细胞活力试剂对细胞活力进行定量。显示了一项代表性实验(一式四份的平均值±标准差)。使用国际鼠TNF参考标准(ID：88/532，https://www.nibsc.org)定量S-NGR-hTNF的生物活性。

图21.低剂量的S-NGR-hTNF在鼠RMA-T淋巴瘤模型中可与美法仑产生协同作用。

负荷RMA-T肿瘤的小鼠(每组6只)在肿瘤植入后11天经100pg的S-NGR-hTNF(腹膜内)处理。两小时后，用50μg美法仑(美法仑的通用制剂，Tillomed)注射(腹膜内)小鼠。

A)显示了单个肿瘤体积生长曲线。

B)载剂、美法仑单独和与S-NGR-hTNF组合的Kaplan-Maier曲线。当肿瘤体积≥900mm³或当动物表现出痛苦的临床迹象时，处死动物。*,P<0.05；**P<0.01，通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验。

C)动物体重变化(平均值±标准差，每组6只小鼠)。箭头：药物治疗。

图22.S-NGR-mTNF显著抑制原位同基因GL21-Luc2胶质母细胞瘤的生长。

S-NGR-mTNF对GL21-Luc2胶质母细胞瘤生长和动物体重的影响。将2.5×10⁴个GL21-Luc2细胞颅内植入C57BL/6J小鼠(9周龄，体重18-21g)。负荷GL21-Luc2胶质母细胞瘤的小鼠(每组9-10只)在肿瘤植入后的第7、19和31天经具有或不具有S-NGR-mTNF(5ng/kg，约100pg/小鼠)的0.9％氯化钠溶液处理，其中含有如所示(箭头)的100μg/ml无内毒素的人白蛋白(腹膜内)。通过在给予荧光素后的第7、13、19、25、32、36、41、48、54和62天测量肿瘤相关的生物发光来监测肿瘤生长。

A-B)显示了单个肿瘤体积生长曲线和动物体重变化曲线。

C)载剂和S-NGR-mTNF的Kaplan-Maier曲线。当肿瘤达到生物发光信号≥2x10⁷(光子/秒/球面度)，或当动物表现出痛苦的临床迹象，或体重减轻>15％时，处死动物。*,P<0.05；通过对数秩(Mantel-Cox)检验。

D)4只经S-NGR-mTNF处理、在肿瘤植入62天后仍然存活的动物的照片。值得注意的是，所有动物都发生脑肿瘤，如头中的生物发光信号所示(叠加的伪彩色生物发光)，但它们在第55天显示出非常低的信号(无着色)。虚线描绘了动物身体的部分。

E)显示了肿瘤植入后67天后分图D中描绘的动物之一的脑(反应者)的代表性图像。作为参照，还显示了对S-NGR-mTNF处理无反应的动物(无反应者)的荷瘤的脑的图像。箭头指示胶质母细胞瘤。

图23.S-NGR-mTNF联合多柔比星对原位同基因GL21-Luc2胶质母细胞瘤生长的影响。

负荷GL21-Luc2胶质母细胞瘤的小鼠(每组9-10只)在肿瘤植入后的第7、14和21天经S-NGR-mTNF处理(5ng/kg，约100pg/小鼠，腹膜内)。两小时后，向小鼠注射指定剂量的多柔比星(doxo，腹膜内)。箭头：药物治疗的时间。通过在给予荧光素后的第7、11、14、18、21和28天测量肿瘤相关生物发光来监测肿瘤生长。

A)显示了单个肿瘤体积生长曲线和归一化的累积结果(平均值±SE)。

虚线表示治疗/处理前测量的平均强度生物发光。

**,P<0.01，通过使用GraphPad Prism软件对各肿瘤的曲线下面积进行非配对t检验分析。

B)经载剂、doxo和doxo+S-NGR-mTNF处理前后荷瘤的动物的代表性照片。虚线描绘了动物身体的部分。

C)显示了单只动物体重变化曲线和归一化的累积结果(平均值±SE)。*,P<0.05，***P<0.001，通过使用GraphPad Prism软件对各肿瘤的曲线下面积进行非配对t检验分析。

在描述本发明时，本文未定义的所有术语均具有其通常的本领域公认的含义。本文未明确定义的任何术语或表达应具有本领域技术人员所理解的普遍接受的定义。下述描述针对本发明的特定实施方式或特定用途的描述，旨在做出说明，不是对要求保护的发明的限制。下述描述旨在覆盖如所附权利要求所限定的本发明的精神和范围内所包括的所有替代、修改和等同形式。

本发明还包括本文公开的蛋白质、肽、偶联物或序列的功能片段、变体或衍生物。在本发明的上下文中，当述及特定DNA序列时，旨在包括在本发明中还包括与所述多核苷酸相同的RNA分子，除了RNA序列含有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶，并且RNA分子的骨架包含核糖而不是脱氧核糖，与其中公开的序列互补的RNA序列、其功能片段、突变体和衍生物，由其编码的蛋白质、其功能片段、突变体和衍生物。术语“互补”序列是指与序列不相同但具有与第一序列互补的碱基序列或编码与第一序列相同的氨基酸序列的多核苷酸。互补序列可以包括DNA和RNA多核苷酸。术语“功能”或“功能性”可以理解为能够保持相同活性。优选地，“片段”长度为至少10aa.、20aa.、30aa.、40aa.、50aa.、60aa.、70aa.、80aa.、90aa.、100aa...。“衍生物”可以是重组的或合成的。如本文所用，与蛋白质相关的术语“衍生物”是指化学修饰的蛋白质或其类似物，其中至少一个取代基不存在于未修饰的蛋白质或其类似物，即已经共价修饰的蛋白质。典型的修饰是酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯等。如本文所用，术语“衍生物”还指更长或更短的多核苷酸/蛋白质和/或与本文所公开的序列具有例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的同一性百分比，更优选具有至少99％。在本发明中，“至少70％同一性”意指同一性可以是与提及的序列至少70％、或75％、或80％、或85％或90％或95％或100％序列同一性。这应用于所有提到的同一性％。优选的，同一性％涉及提到序列的全长。本发明的衍生物还包括多肽的“功能突变体”，其是可以通过使其序列中一个或多个氨基酸突变产生并保持其活性的多肽。实际上，如果需要，本发明的多肽可以在体外和/或体内进行修饰，例如通过糖基化、豆蔻酰化、酰胺化、羧化或磷酸化，并且可以例如通过本领域已知的合成或重组技术获得。在本发明中，“功能(性)”意指例如“保持它们的活性”，例如免疫调节活性或抗炎活性。在本发明的范围内还包括具有与本文示例的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核苷酸，除了多核苷酸序列内的核苷酸取代、添加或缺失，只要这些变体多核苷酸保留与本文具体例示的多核苷酸基本相同的相关功能活性(例如，它们编码具有与例示多核苷酸编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列或相同功能活性的蛋白质)。因此，本文公开的多核苷酸应理解为包括如上文所讨论的具体示例序列的突变体、衍生物、变体和片段。本发明还考虑具有与本发明的多核苷酸序列充分同源的序列的那些多核苷酸分子，从而允许在标准严格条件和标准方法下与该序列杂交(Maniatis,T.等l,1982)。本文描述的多核苷酸也可以就与本文示例的那些多核苷酸更具体的同一性和/或相似性范围来定义。序列同一性通常大于60％，优选大于75％，更优选大于80％，甚至更优选大于90％，并且可以大于95％。相较于本文所示例的序列，序列的同一性和/或相似性可以是49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％或更高。除非另有说明，如本文所用，两个序列的百分比序列同一性和/或相似性可以使用Karlin和Altschul(1990)的算法确定，该算法在Karlin和Altschul(1993)中进行了修改。这类算法纳入了Altschul等(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以使用NBLAST程序进行BLAST搜索，得分＝100，字长＝12，以获得具有所需百分比序列同一性的序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如Altschul等(1997)的描述使用缺口(Gapped)BLAST。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用各程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。见NCBI/NIH网站。

如上定义的肽、蛋白质或化合物X可以包括与本文所提及的序列具有至少65％、70％、75％、80％、82％、85％、90％、92％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。确定两个氨基酸序列的同一性百分比可以包括比对和比较两个序列中对应位置的氨基酸残基。如果两个序列中的所有位置都被相同的氨基酸残基占据，那么称这些序列是100％相同的。百分比同一性可以通过Smith Waterman算法来测量(Smith T F,Waterman M S 1981“共同分子子序列的识别(Identification of Common Molecular Subsequences0,”J MolBiol 147:195-197，将其通过引用纳入本文，如同完全阐述一样)。肽、蛋白质或化合物X可以具有比所述序列的残基更少或更多的残基。例如，肽可以包括超过6个氨基酸。相较于序列SEQ ID NO.1或其他本文所述序列，肽、蛋白质或化合物X可能存在氨基酸替换。可以用任何氨基酸进行替换，无论是天然存在的还是合成的。可以用与天然存在的氨基酸功能相似的氨基酸类似物或氨基酸模拟物进行替换。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后续经修饰的氨基酸。后续修饰可以是但不限于羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸修饰。天然存在的氨基酸包括标准的20种氨基酸和稀有氨基酸。稀有氨基酸包括硒代半胱氨酸。可以用氨基酸类似物进行替换，所述氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物；例如，与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳。氨基酸类似物的示例包括但不限于高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这类类似物可能具有修饰的R基团或修饰的肽骨架。氨基酸类似物可以保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。可以用氨基酸模拟物进行替换，所述氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的常规化学结构不同但功能与天然存在的氨基酸相似的化合物。可以用α,α-二取代的5-碳烯烃非天然氨基酸替换。替换可以是保守替换或非保守替换。保守替换是指用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。这类保守替换包括但不限于下述的彼此取代：(1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和(8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton，Proteins(1984))。替换可以是从一个氨基酸到另一个具有相似疏水性、亲水性、溶解性、极性或酸性的氨基酸。与参考序列SEQ ID NO:1或其他提及的序列具有小于100％同一性的序列可称为变体。一个实施方式包括包括肽的组合物，所述肽具有为SEQ ID NO:1变体的序列。在一个实施方式中，用具有交联部分的残基替换一个或多个氨基酸残基。如本文所用，“肽”或“多肽”包含通过肽(酰胺)键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。如本文所用，术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。通常，肽或多肽的长度会至少为3个氨基酸。肽或多肽可以指单个蛋白质或蛋白质集合。本发明的肽可以包含天然氨基酸和/或非天然氨基酸(即，不存在于自然界但可以掺入多肽链中的化合物)。或者，可以采用本领域已知的氨基酸类似物。肽或多肽中的一个或多个氨基酸可以经修饰，例如，通过添加化学实体例如碳水化合物基团、羟基、磷酸基团、法呢基、异法呢基、脂肪酸基团，用于偶联、官能化或其他修饰的接头。肽或多肽也可以是单个分子或可以是多分子复合物，例如蛋白质。肽或多肽可以只是天然存在的蛋白质或肽的片段。肽或多肽可以是天然存在的、重组的或合成的，或其任何组合。开发了大量试剂以靶向细胞内的细胞内容物，细胞区室或特定蛋白质、脂质、核酸或其他靶标或生物标志物。虽然这些试剂可以以强亲和力结合其胞内靶标，但这些化合物，无论其是分子、蛋白质、核酸、肽、纳米颗粒或其他预期的治疗剂或诊断标志物，其中许多化合物都不能高效地或根本不能穿过细胞膜。

组合物可包括药学上可接受的运载体。药学上可接受的运载体可以包括但不限于以下的至少一种：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂，血清蛋白质，人血清白蛋白，缓冲物质，磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐、电解质、硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、蜡、聚乙烯乙二醇、淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖、右旋糖、滑石粉、碳酸镁、高岭土；非离子表面活性剂、食用油、生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF公司,新泽西州帕西潘尼)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

给药可以包括递送1ng/kg/天-100μg/kg/天的融合蛋白或偶联物产物的剂量。剂量可以是1ng/kg/天-100μg/kg/天之间的任何值。剂量可以是介于和包括1ng/kg/天-100μg/kg/天之间的任何两个整数值之间的任何剂量。剂量可以是10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/kg/天或mg/kg/天或上述任何两者之间范围内的任何剂量。优选地，剂量可以是约16ng/kg/天。给药可包括递送任何剂量的补充治疗剂。补充治疗剂量可以是任何1-100mg/kg/天。补充治疗剂量可以是1–100mg/kg/天之间的任何值。补充治疗剂量可以是介于和包括1ng/kg/天-100mg/kg/天之间的任何两个整数值的任何剂量。补充治疗剂量可以是10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/kg/天或上述任何两者之间范围内的任何剂量。补充治疗剂可以是纳米颗粒(例如金纳米颗粒、脂质体)、治疗剂(例如细胞因子、化疗药物、抗体和抗体片段、毒素、核酸)、诊断剂(例如放射性化合物、荧光化合物、化学发光化合物)、造影剂(例如微泡)或细胞成分(例如嵌合抗原受体或TCR)中的任何一种或多种。组合物中一种或多种肽和至少一种补充治疗剂的浓度可以设置为在一段时间内以单次给药、两点给药、多点给药或连续给药(例如，静脉内、经皮、腹膜内、通过孤立的肢体灌注、通过孤立的肝灌注或局部给药)递送每日(或每周、每三周或每月)剂量。该周期可以是1天。该周期可以是1、2、4、8、12或24小时或在这些值中的任何两个之间的范围内的时间。肽-细胞因子和补充治疗剂可以同时给予或延迟或预期1、2、4、8、12、24、48小时或任何中间时间给予。

包含本发明的融合蛋白或偶联物产物的组合物可以包含任何量的蛋白质或产物。该量可以足以合适的体积或大小的递送模式递送上述剂量。当剂量在整个时间段内分成多次给药时，一个体积或递送模式中的量可以是总剂量除以整个时间段内的给药次数。当存在于组合物中时，补充治疗剂可以是任何补充治疗剂量。与肽一样，可以调整补充治疗剂量，以在用于给药的体积或递送模式中递送正确的补充治疗剂量。

患者可以是动物。患者可以是哺乳动物。患者可以是人。患者可以是癌症患者。癌症患者可以是淋巴瘤或肉瘤、黑素瘤口腔或皮肤鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、胃食管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、肾癌、尿路上皮癌、脑瘤(例如胶质母细胞瘤和星形细胞瘤)癌症患者，或者患有其他实体瘤或具有所述肿瘤转移的患者。给予组合物或药物组合物的途径可以是任何途径。给药途径可以是任何一种或多种途径，包括但不限于，口服、注射、局部、肠内、直肠、胃肠道、舌下、唇下、口腔、硬膜外、脑内、脑室内、脑池内、表皮、真皮内、皮下、鼻、静脉内、动脉内、肌肉内、心脏内、骨内、鞘内、腹膜内、膀胱内、玻璃体内、海绵体内、阴道内、子宫内、羊膜外、经皮、肿瘤内和经粘膜。实施方式包括制备本发明的肽(包括钉合肽(stapled peptide))的方法。

该方法可以包括合成具有所选修饰肽序列的融合蛋白或偶联物产物。

该方法可以包括评估肽与CD13的结合。用于评估肽结合的方法和条件可在以下实施例中阐述。

实施方式包括融合蛋白或偶联物产物或其组合物，其包含由本文所述任何氨基酸序列组成、基本上由其组成或包含本文所述任何氨基酸序列的的肽。肽组合物可以包括本文中所述任何补充治疗剂。肽组合物可以包括药学上可接受的运载体。

术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多重多肽复合物，其中单独组分多肽通过共价或非共价方式连接。术语“多肽”包括2个或更多氨基酸长度的肽，通常具有多于5、10或20个氨基酸。

应理解，本发明使用的多肽序列不限于特定序列或其片段，而是还包括从任何来源获得的同源序列，例如相关病毒细菌蛋白质、细胞同源物和合成肽以及其变体或衍生物。本发明的多肽序列还包括由本发明的多核苷酸编码的多肽。

涉及本发明的氨基酸序列的术语“变体”或“衍生物”包括从序列取代、变异、修饰、替换、缺失或添加一个(或多个)氨基酸或对序列取代、变异、修饰、替换、缺失或添加一个(或多个)氨基酸，使得所得氨基酸序列，优选地具有靶向活性，优选地具有至少25％至50％本文所示多肽的活性，更优选地具有至少基本相同的活性。因此，可以修饰序列以用于本发明。通常，进行修饰以保持序列的活性。因此，在一个实施方式中，可以进行氨基酸取代，例如从1、2或3至10、20或30个取代，条件是经修饰的序列保留至少约25％至50％或基本相同的活性。然而，在另一实施方式中，可以有意对本发明的多肽的氨基酸序列进行修饰，以减少该多肽的生物学活性。例如，仍然能够结合靶分子但缺乏功能效应域的截短多肽可能是有用的。通常，与序列表中描述的相应区域相比，变体或衍生物的氨基酸残基的改变优选少于20％、10％或5％。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物，例如以增加治疗性给予的多肽的血浆半衰期。

本发明的多肽还包括以上提及的多肽和其变体的片段，包括序列的片段。优选的片段包括包含表位的那些。合适的片段长度为至少约5个氨基酸，例如10、12、15或20个。它们的长度也会少于200、100或50个氨基酸。蛋白质的多肽片段和其等位变体和物种变体可以包含一个或多个(例如2、3、5或10个)取代、缺失或插入，包括保守取代。在已经进行取代、缺失和/或插入的情况下，例如通过重组技术，优选序列表中描述的氨基酸残基的小于20％、10％或5％被改变。本发明的蛋白质通常通过重组技术制备。然而，它们也可使用技术人员所熟知的技术由合成方式制备，例如固相合成。用于化学合成肽的各种技术由Borgia和Fields,2000,TibTech 18:243-251综述，并在其中包含的参考文献中进行了详细描述。

制备本发明偶联物的方法已在例如WO01/61017中描述。例如，TNF可以通过遗传工程改造或化学合成与CNGRCG(SEQ ID NO:1)或SCNGRCG(SEQ ID NO:6)肽融合

实施例

材料和方法

在大肠杆菌细胞中产生鼠和人NGR-TNF。编码鼠和人CNGRCG-TNF(NGR-TNF)的cDNA通过重组DNA技术产生，并如之前所述(Curnis等2000)克隆到pET-11质粒(诺瓦基公司(Novagen)，斯康星州麦迪逊)中。根据pET11制造商的说明，在BL21(DE3)大肠杆菌细胞(诺瓦基公司)中获得cDNA表达。通过硫酸铵沉淀、苯基-琼脂糖6Fast Flow(Pharmacia-Upjohn公司)上的疏水相互作用层析、DEAE-琼脂糖Fast Flow(Pharmacia-Upjohn公司)上的离子交换层析法、Sephacryl-S-300HR(Pharmacia-Upjohn公司)上的凝胶过滤层析从细菌裂解物中纯化产物。用于层析步骤中的所有溶液均使用无菌和无内毒素的水(Salf公司，意大利贝加莫)制备。

在大肠杆菌细胞中产生鼠和人S-NGR-TNF。使用pET101D质粒(英杰公司(Invitrogen))在大肠杆菌细胞(BL21 Star(DE3))中表达鼠SCNGRCG-TNF融合蛋白(称为S-NGR-TNF)。使用pET101D质粒或pET11质粒在大肠杆菌细胞(BL21 Star(DE3))中表达人S-NGR-TNF融合蛋白。

鼠S-NGR-TNF纯化自细胞提取物，通过细胞超声和离心获得，通过sTNF-R1(依那西普)-琼脂糖柱进行亲和层析。用pH为7.3含有7M尿素的100mM Tris-HCl的变性缓冲液从柱中洗脱产物，通过用333体积的2.33M尿素，100mM Tris-HCl，pH 7.3(1小时，4℃)，然后是0.77M尿素，100mM Tris-HCl，pH 7.3(1小时，4℃)和0.26M尿素，100mM Tris-HCl，pH 7.3(1小时，4℃)进行透析来再折叠。最终，产物经333体积的100mM Tris-HCl透析(16小时，4℃)，离心，通过0.22μm膜(Nalgene公司，纽约州罗切斯特)进行过滤，并通过用0.15M氯化钠，25mM HEPES，pH 7.3预平衡的HR Sephacryl S-300柱(180ml)进行凝胶过滤。从1升细胞培养物回收约1-2mg再折叠的蛋白质。

已经以类似的方式产生人S-NGR-TNF。使用pET101D从1升细胞培养物中回收了约0.1mg人S-NGR-TNF。当使用pET11质粒表达人S-NGR-TNF时，产量显著增加，因为在这种情况中，1升细胞培养物产生了>100mg S-NGR-TNF。

在巴斯德毕赤酵母细胞中产生人NGR-TNF。将编码人NGR-TNF的cDNA克隆到pPIC9K质粒(Proteogenix公司)中。然后用与α交配因子分泌信号肽的C末端融合的编码CNGRCG-TNF的重组质粒(由pPIC9K表达质粒提供)对巴斯德毕赤酵母细胞(菌株GS115和K)进行电穿孔，以促进分泌到培养基中。通过添加甲醇(1％)在28℃下诱导细胞培养物48小时。

鼠和人NGR-TNF是特征在于-17Da、+0Da、+42Da、+58Da的化合物的异质混合物，在鼠NGR-TNF的情况下为+100Da。

人NGR-TNF的质谱(MS)分析表明，该产物的亚基是-17Da、+0Da、+42Da和+58Da形式的异质混合物(图2)，如先前报道的用于临床研究的人NGR-TNF(Tobias等2013)。在鼠NGR-TNF中也观察到了另外一种形式+100KDa(图2)。在两种产物的质谱中观察到的+22Da和其他峰可能对应于离子加合物。在使用相同表达系统产生的鼠和人TNF中未观察到+42Da、+58Da和+100Da形式(图2C)。

当鼠NGR-TNF在BL21 Rosetta(DE3)大肠杆菌细胞中表达或通过基于sTNF-R1(依那西普)-琼脂糖柱上的亲和层析的不同方法纯化时，也观察到异质组合物(未显示)。

NGR-TNF的不同形式与N末端序列的修饰有关

然后研究了NGR-TNF上分子修饰的位置。为此目的，将鼠NGR-TNF a)用二硫苏糖醇还原，b)用碘乙酰胺烷基化，和c)用Asp-N消化，所述Asp-N是可以在天冬氨酸残基N侧裂解蛋白质的蛋白酶。产物的MS分析显示N末端片段CNGRCGLRSSSQNSS(SEQ ID NO:37)是异质的，再次显示+0、+42、+58和+100Da形式(图3)。这些数据表明NGR-TNF的化学修饰位于其N末端区域(对应于人NGR-TNF中的CNGRCGVRSSSRTPS(SEQ ID NO:18))。根据该观点，当发明人在大肠杆菌细胞中表达人或鼠TNF时，未观察到翻译后修饰和异质性(表1)。此外，当发明人用一种不同的细胞因子鼠EMAP-II替换人NGR-TNF的TNF结构域并在大肠杆菌细胞中表达CNGRCGVRSSSRTPS-EMAP-II偶联物时，发明人仍然观察到分子异质性，但当发明人仅表达EMAP-II时未观察到(图4和表1)。因此，N末端序列负责NGR-TNF和NGR-EMAP的分子异质性。

NGR-TNF的不同形式与N末端CNGRC序列的修饰有关

为了精确定位NGR-TNF分子修饰的位置，发明人随后用ACDCRGDCFCG(SEQ ID NO:19)替换了鼠NGR-TNF的CNGRCG(SEQ ID NO:1)序列并产生ACDCRGDCFCG-TNF偶联物。在这种情况下没有观察到分子异质性(表1)，这表明只有N末端区域的CNGRCG(SEQ ID NO:1)序列对修饰是关键的。根据该观点，通过在37℃下pH为8.5的碳酸氢铵缓冲液中进行6小时部分自体溶解来从NGR-TNF中去除CNGRCG(SEQ ID NO:1)，得到具有与未修饰TNF亚基(17254Da)质量对应的质量的均质产物(图5)。这些数据表明NGR-TNF的化学修饰位于CNGRCG(SEQ IDNO:1)靶向域内。

CNGRCG(SEQ ID NO:1)的修饰仅在该基序与蛋白质的N末端融合时发生，但在包埋于蛋白质序列中或与蛋白质的C末端融合时不会发生

为了评估大肠杆菌细胞中的CNGRCG(SEQ ID NO:1)修饰是否取决于其在融合蛋白中的位置，发明人通过质谱分析了通过重组DNA技术在大肠杆菌细胞中产生的其他NGR-细胞因子融合蛋白。当SGCNGRC(SEQ ID NO:20)序列与IFNγ的C末端融合时，未观察到分子异质性(图4和表1)。此外，对于OmpT-NGR-TNF未观察到分子异质性，所述OmpT-NGR-TNF是在OmpT前导序列(用于周质表达)和TNF之间插入了CNGRCG(SEQ ID NO:1)序列的融合蛋白。虽然在大肠杆菌BL21 Star(DE3)中观察到包涵体且未观察到周质表达，但产物是均质的(图6和表1)。因此，CNGRCG(SEQ ID NO:1)结构域的分子异质性似乎仅在该结构域与蛋白质的N末端融合时发生。

N末端半胱氨酸残基NGR-TNF经部分乙酰化并解释了+42Da形式

考虑到乙酰基团的重量为42Da，发明人假设人和鼠NGR-TNF的+42Da形式对应具有N末端乙酰基-半胱氨酸残基的分子。根据这一观点，NGRAHA-TNF是缺少N末端半胱氨酸并在大肠杆菌细胞中表达的偶联物，其是均质的并且没有+42Da形式(表1)。为了进一步评估该假设，发明人开发了这样的抗体，所述抗体能够识别乙酰基-CisoDGRCGVRY(SEQ ID NO:17)，但不能识别CisoDGRCGVRY(SEQ ID NO:17)肽(图7A)，并分析了其与鼠或人NGR-TNF的结合(图7B)。如所预期，抗体可以识别两种产物，这强烈表明a)+42Da形式对应具有N末端乙酰基-半胱氨酸的分子，和b)两种产物经部分脱酰胺化。可能的情况是，+58Da修饰代表+42Da形式的氧化形式(+16Da)。需要进一步的研究来阐明这一点。

为了评估第二个氨基酸残基对蛋白质修饰的重要性，发明人随后制备并分析了CDGRCG(SEQ ID NO:38)-TNF偶联物。有趣的是，该产品包含很少或没有经修饰的形式(图4和表1)，这表明在N末端存在游离半胱氨酸本身不足以进行蛋白质修饰，但伴随存在的半胱氨酸和随后的天冬酰胺残基(CN)是必要的。

在大肠杆菌细胞中大规模生产人S-NGR-TNF

使用含有编码S-NGR-hTNF的cDNA(氨基酸序列：SEQ ID NO:27，核苷酸序列：33)的pET11质粒产生了相对大量的人S-NGR-TNF(S-NGR-hTNF)。在用1mM IPTG(3小时，37℃)诱导后，在BL21 Star(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen公司)中获得cDNA表达。通过a)硫酸铵沉淀，b)疏水相互作用层析法(苯基-琼脂糖6Fast Flow)，c)离子交换层析法(DEAE-琼脂糖FastFlow)，d)凝胶过滤层析法(Sephacryl-S-300HR)，在7M尿素存在的情况下，从细菌裂解物的可溶部分中纯化产物。产物通过透析再折叠，并在非变性条件下通过凝胶过滤层析(Sephacryl-S-300HR)进一步纯化。最终产物称为S-NGR-hTNF，将其经过过滤(0.22μm)并储存在-80℃。图19显示了纯化过程的流程图。用于层析步骤中的所有溶液均使用无菌和无内毒素的水(Salf公司，意大利贝加莫)制备。

小鼠大脑中的肿瘤细胞植入和药物治疗

涉及原位脑肿瘤的体内研究由Explicyte Immuno-Oncology(法国波尔多)进行。将经过工程改造以稳定表达萤火虫荧光素酶的生物发光鼠神经胶质瘤GL21-Luc2细胞原位植入C57BL/6J小鼠(9周龄)右侧纹状体(2.5x10 ⁴个细胞/小鼠)。在肿瘤细胞植入后第7天开始药物治疗。向小鼠腹腔注射5ng/Kg剂量的S-NGR-TNF(约100pg/小鼠，在含有100μg/mlHSA的0.9％氯化钠溶液中稀释)或在2小时后联合多柔比星(5mg/Kg)给药。在荧光素酶底物给予(腹膜内)后，使用PhotonImager RT系统(Biospace Lab，法国)通过非侵入性生物发光成像监测肿瘤生长。在肿瘤达到约5x10 ⁷光子/秒/球面度的生物发光信号之前或当动物表现出可靠的临床迹象例如呼吸窘迫、弓背姿势或体重减轻>15％时，处死动物。

实施例1

通过重组DNA技术生产的鼠SCNGRCG-TNF(S-NGR-TNF)是缺少+42Da、+58Da和+100Da形式的均质产物。

鉴于NGR-TNF的N末端CN残基在生产和储存过程中对蛋白质修饰的关键作用，发明人假设通过添加额外的残基来改变该序列可能会降低分子异质性。为了验证该假设，发明人使用针对融合蛋白的pET101D质粒(英杰公司)在大肠杆菌细胞(BL21 Star(DE3))中表达鼠SCNGRCG-TNF融合蛋白(称为S-NGR-TNF)。还原和非还原条件下的鼠S-NGR-TNF和NGR-TNF的SDS-PAGE分析显示两种情况下对应于约17kDa亚基的条带(图8A)。然而，通过质谱分析，与TNF一样，S-NGR-TNF比NGR-TNF更均质(图8B)。这些数据强烈支持用丝氨酸残基阻断NGR-TNF半胱氨酸-1的α-氨基将防止生产和储存期间所有CNGRCG(SEQ ID NO:1)修饰的假设。这也可以解释在大肠杆菌细胞中作为包涵体产生的OmpT-NGR-TNF融合蛋白是均质的观察(表1)。

通过重组DNA技术生产的人S-NGR-TNF是缺少+42Da、+58Da和+100Da形式的均质产物。

然后，发明人研究了人S-NGR-TNF在大肠杆菌细胞中表达时是否也是均质的。使用pET101D质粒在大肠杆菌细胞(BL21 Star(DE3))中表达蛋白质，并通过sTNF-R1(依那西普)-琼脂糖柱上的亲和层析从细胞提取物中纯化。使用pET101D从1升细胞培养物中回收了约0.1mg人S-NGR-TNF。当使用pET11质粒表达人S-NGR-TNF时产量显著增加(图9A)，如在这种情况中，1升细胞培养物产生了>100mg S-NGR-TNF。

亲和纯化的(用低表达和高表达载体所获)产物的SDS-PAGE分析显示在两种情况下对应于人S-NGR-TNF亚基的条带(图9A)。通过质谱分析，两种产物比人NGR-TNF更均质(图9B)。因此，同样在人S-NGR-TNF的情况下，添加N末端丝氨酸残基防止大肠杆菌细胞中的CNGRCG(SEQ ID NO:1)修饰，无论是在低水平还是高水平表达时。

S-NGR-TNF的体外细胞毒活性与NGR-TNF相似

为了评估向NGR-TNF添加丝氨酸残基是否影响其识别TNF受体的能力并因此影响其生物活性，发明人随后在LM细胞溶解试验中分析了TNF、NGR-TNF和S-NGR-TNF的细胞毒活性。结果表明，TNF、NGR-TNF和S-NGR-TNF的EC ₅₀非常相似(图8C)，这表明CNGRCG(SEQ IDNO:1)和SCNGRCG(SEQ ID NO:6)结构域均不损害对这些细胞的TNF受体识别。因此，S-NGR-TNF和NGR-TNF与sTNF-R1(依那西普)的体外结合与和TNF的体外结合相似(图8D)。

SCNGRCG(SEQ ID NO:6)序列可与CD13相互作用，其亲和力大于CNGRCG(SEQ IDNO:1)或乙酰基-CNGRCG与其的亲合力。

为了排除向NGR-TNF的N末端添加丝氨酸残基会消除或降低其对CD13的亲和力的可能性，发明人用CD13(氨肽酶N)和SCNGRCGVRY(SEQ ID NO:3)、CNGRCGVRY(SEQ ID NO:4)或乙酰基-CNGRCGVRY(对应于人S-NGR-TNF和NGR-TNF的N末端区域)进行了酶动力学抑制试验。结果表明SCNGRCGVRY(SEQ ID NO:3)在不同的实验条件下对CD13的Ki值比CNGRCGVRY(SEQ ID NO:4)低3-5倍(图10和表2)，这表明更高的亲和力。因此，向NGR-TNF添加丝氨酸残基不会削弱其识别CD13的能力。

SCNGRCG(SEQ ID NO:6)序列相比CNGRCG(SEQ ID NO:1)具有更低的脱酰胺倾向

为了评估向CNGRCG(SEQ ID NO:1)添加丝氨酸残基是否可能影响其脱酰胺倾向，发明人合成了SCNGRCGVRY(SEQ ID NO:3)和CNGRCGVRY(SEQ ID NO:4)肽并通过质谱研究它们在37℃下pH为7.4的PBS中孵育后的稳定性。值得注意的是，孵育2小时后，在CNGRCGVRY(SEQ ID NO:4)中观察到-17Da形式(对应脱酰胺反应的琥珀酰亚胺中间体)，但在SCNGRCGVRY(SEQ ID NO:3)中并未观察到(图11)。这表明添加丝氨酸残基降低了NGR基序脱酰胺化的倾向。值得注意的是，虽然在两种情况下都在孵育32小时后观察到+1Da脱酰胺产物(DGR/isoDGR)，但是大量-17Da形式仍存在于CNGRCGVRY(SEQ ID NO:4)而非SCNGRCGVRY(SEQ ID NO:3)中(图11)。这些数据表明CNGRCG(SEQ ID NO:1)而非SCNGRCGVRY(SEQ IDNO:3)的琥珀酰亚胺衍生物对水解相对稳定，这强烈表明在NGR-TNF中观察到的-17Da形式对应琥珀酰亚胺中间体。

然后用pH为8.5的0.1M碳酸氢铵中的肽进行了类似的实验，已知该条件迫使Asn脱酰胺化(Curnis等2006)。在该缓冲液中，两种产物都迅速转化为对应的Asp/isoAsp形式，这表明在这种情况下，同时也在CNGRCGVRY(SEQ ID NO:4)的情况下，-17Da琥珀酰亚胺中间体被快速水解。

总之，这些数据表明向NGR-TNF的CNGRCG(SEQ ID NO:1)靶向结构域添加Ser残基增加了其稳定性并减少了在生理缓冲液中形成-17Da琥珀酰亚胺衍生物。此外，S-NGR-TNF的琥珀酰亚胺衍生物在形成时更易于水解。

S-NGR-TNF的脱酰胺产物结合整合素的亲和力与NGR-TNF的脱酰胺产物相似

为了评估S-NGR-TNF和NGR-TNF靶向结构域的isoDGR衍生物是否可以识别具有相似亲和力的整合素，发明人随后使用先前描述的竞争性结合试验分析了SCisoDGRCGVRY(SEQ ID NO:17)、CisoDGRCGVRY和乙酰基-CisoDGRCGVRY与ανβ3、ανβ5、ανβ6ανβ8和α5β1整合素的结合(Curnis等2010)。结果表明，SCisoDGRCGVRY可以与CisoDGRCGVRY和乙酰基-CisoDGRCGVRY结合相似的Ki值结合这些整合素(表3)。如所预期，以平行测试的SCNGRCGVRY(SEQ ID NO:3)和SCDGRCGVRY(SEQ ID NO:22)显示对所有整合素没有或具有非常低的亲和力。考虑到人NGR-TNF含有乙酰化和非乙酰化形式并且CNGRC(SEQ ID NO:5)和乙酰基-CNGRC都可以发生脱酰胺作用(Curnis等2010)，发明人可以得出结论，如果形成的话，S-NGR-TNF的isoDGR衍生物在整合素识别方面的行为方式类似于NGR-TNF的isoDGR衍生物。

S-NGR-TNF在孵育后比NGR-TNF更不容易产生整合素结合位点

为了进一步评估S-NGR-TNF比NGR-TNF更稳定且更不易产生isoDGR-整合素结合位点的假设，发明人使用涂覆有这些蛋白质的微量滴定板进行EA.hy926内皮细胞粘附试验。正如所预期，在涂覆有NGR-TNF的板上观察到细胞粘附，但在涂覆有S-NGR-TNF的板上没有观察到细胞粘附(图12)。当用pH为8.5的0.1M碳酸氢铵缓冲液处理蛋白质涂覆的微量滴定板以强制脱酰胺化时，发明人观察到细胞与S-NGR-TNF的粘附，表明存在这种蛋白质。然而，相较于NGR-TNF，S-NGR-TNF在脱酰胺化条件下需要更长的孵育时间才能获得细胞粘附(图12)。这种行为可能反映了与TNF融合时CNGRCG(SEQ ID NO:1)稳定性的进一步改善。

当在肿瘤小鼠模型中以高剂量注射时，向NGR-TNF的N末端添加丝氨酸残基不会增加其毒性并不会降低其抗肿瘤活性。

为了评估添加到NGR-TNF的N末端的其它丝氨酸残基对其毒性和抗肿瘤活性的影响，发明人向负荷皮下RMA-T淋巴瘤的小鼠(n＝6)注射了高剂量的NGR-TNF或S-NGR-TNF并评估动物体重的减轻。在肿瘤植入后的第11天给予2μg的NGR-TNF导致动物体重显著下降(0.89±0.29g)，这表明这种治疗具有毒性。三天后，小鼠恢复了原始体重。在第18天后续给予6μg导致损失1.28±0.29g，这表明该剂量如预期的那样毒性更大(图13A，上分图)。用S-NGR-TNF观察到了类似的体重减轻(图13A，上分图)，这表明用丝氨酸残基修饰NGR-TNF的N末端不影响其毒性。值得注意的是，相较于NGR-TNF，观察到S-NGR-TNF的抗肿瘤作用略强。

当在肿瘤小鼠模型中以低剂量注射时，向NGR-TNF的N末端添加丝氨酸残基不会降低其抗肿瘤活性。

为了评估向NGR-TNF添加Ser残基是否会影响其在低剂量下的抗肿瘤活性，发明人随后使用皮下WEHI-164纤维肉瘤鼠模型分析了NGR-TNF和S-NGR-TNF(25或50pg，腹膜内)的治疗活性。两种偶联物都以相似的程度延缓了肿瘤的生长(图14)，这表明向NGR-TNF添加S残基不会削弱其抗肿瘤活性。在这两种情况下都没有获得毒性证据。值得注意的是，相较于25pg的NGR-TNF，使用25pg的S-NGR-TNF获得了稍强的抗肿瘤作用。

最后，为了评估低剂量的S-NGR-TNF是否可以如先前对NGR-TNF观察到的那样与化疗发挥协同作用，发明人使用鼠RMA淋巴瘤模型以S-NGR-TNF和NGR-TNF联合化疗剂美法仑进行了体内实验(图15)这两种药物都可以增强美法仑在该模型中的功效，这表明S-NGR-TNF和NGR-TNF都可以与化疗产生协同作用。同样，相较于NGR-TNF，使用S-NGR-TNF观察到稍强的抗肿瘤作用。

S-NGR-TNF并不加剧美法仑的毒性。

为了验证S-NGR-TNF并不加剧美法仑的毒性，发明人随后分析了响应低剂量的S-NGR-TNF和美法仑的联合治疗的体重减轻。发明人发现，尽管观察到抗肿瘤活性显著增加(图16，下分图)，相较于对照，S-NGR-TNF(100pg)与美法仑(50μg)的组合并不增加动物体重的减轻(图16，上分图)。

这些数据表明，向NGR-TNF的N末端添加丝氨酸残基并不增加NGR-TNF的固有毒性，并且另一方面不导致美法仑的毒性加剧。

为了验证S-NGR-TNF并不加剧美法仑的毒性，发明人随后分析了响应低剂量的S-NGR-TNF和美法仑的联合治疗的体重减轻。发明人发现，相较于对照，S-NGR-TNF(100pg)与美法仑(50μg)的组合并不增加动物体重的减轻(图16B，上分图)，尽管观察到抗肿瘤活性显著增加(图16B，下分图)。

这些数据表明，向NGR-TNF的N末端添加丝氨酸残基一方面并不增加NGR-TNF的固有毒性，并且另一方面不导致美法仑的毒性加剧。

结论

生化研究结果表明，添加到NGR-TNF的N末端的丝氨酸残基消除了-17Da、+42Da、+58Da和+100Da形式的形成(在大肠杆菌细胞中表达、纯化和储存后)并改善了其对脱酰胺化的稳定性。此外，体外和体内生物学研究结果表明，向NGR-TNF添加丝氨酸残基并不削弱其识别CD13和TNF受体的能力，并不降低其治疗活性，并且也不增加其毒性。相反，添加丝氨酸以及向NGR-TNF添加丝氨酸残基改善了其对CD13的亲和力及其抗肿瘤活性。

实施例2

为了评估NGR-TNF的分子异质性问题是否可以通过将CNGRCG(SEQ IDNO:1)与在适当宿主中表达时被裂解的多肽序列的C末端融合来解决，发明人随后在巴斯德毕赤酵母细胞中生产了人NGR-TNF，将其经工程改造以分泌人CNGRCG-TNF。在该系统中，编码CNGRCG-TNF的cDNA与α交配因子分泌信号肽的C末端融合(图17)，以通过添加甲醇促进分泌到培养基中。因此，使用该系统产生的蛋白质具有在分泌时被裂解的前导序列。用各种克隆获得的细胞上清液的SDS-PAGE分析表明NGR-TNF可以高水平分泌(图18B)。亲和纯化的产物的质谱分析表明，以这种方式产生的NGR-TNF是均质的，其特征在于预期的分子量，并且没有+42，+58Da(图18C)。

纳入本申请全文中引用的参考文献，用于本文明示的所有目的，并且参考文献就如同将各参考文献完整阐述一样。出于描述之目的，在本文的特定位置引用了这些参考文献中的特定参考文献。在特定位置对参考文献的引用表明了参考文献的教导纳入的方式。然而，在特定位置对参考文献的引用并不限制为针对所有目的纳入的引用的参考文献的所有教导的方式。

因此，应当理解的是，本发明不限于所公开的特定实施方式，而是意在覆盖由所附权利要求、上述说明书和/或在附图中显示的内容所限定的本发明的精神和范围内的所有修改。

表格

表1.大肠杆菌细胞中表达的重组蛋白质通过质谱分析的表征

a)通过重组DNA技术将粗体氨基酸序列(单字母代码)添加到下述蛋白质中：TNF，肿瘤坏死因子-α；EMAP，内皮-单核细胞激活多肽-II；IFN-γ，干扰素-γ。OmpT，外膜蛋白T前导序列；His_标签-Xpress，六组氨酸标签和Xpress融合产物。

b)通过ESI-MS。

c)通过分析藉由胰蛋白酶消化所得的LLGIVLTTPIAISSFASTCNGR(SEQ ID NO:21)片段所确定(参见图6)。

d)如(Crippa等2008)中所述产生。

e)His_标签：与血管抑制因子-1融合的六组氨酸标签-Xpress表位。

f)如(Curnis等2005)中所述产生。

表2.SCNGRCGVRY(SEQ ID NO:3)、CNGRCGVRY(SEQ ID NO:4)和乙酰基-CNGRCGVRY肽的CD13抑制活性

a)50mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.4。

b)60mM磷酸钾缓冲液，pH 7.4。

c)n，独立实验的数量，各实验一式两份。

d)Ki，使用Prism软件计算的抑制常数(平均值±SE)。每各实验进行4次技术重复。

表3.通过竞争性结合试验确定并表示为抑制常数(Ki,nM)^a的SCNGRCGVRY(SEQ IDNO:3)和CNGRCGVRY(SEQ ID NO:4)肽的脱酰胺产物的整合素结合亲和力

a)乙酰基-CisoDGRCG/链霉亲和素-过氧化物酶与整合素的竞争性结合。如前所述(Curnis等2013)使用整合素涂覆的微量滴定板进行结合试验。

b)n，独立实验的数量，各实验一式两份。

实施例3

大规模纯化S-NGR-hTNF

大规模纯化人S-NGR-TNF(S-NGR-hTNF)通过一系列层析步骤实现，包括疏水相互作用层析、离子交换层析、变性和非变性凝胶过滤层析(参见图19)。约11mg的人S-NGR-hTNF从1升大肠杆菌细胞培养物中回收，粗制提取物中估计>100mg。通过SDS-PAGE分析、MS分析和生物测定(图20)确定，该产物的生化和生物学特性与通过亲和层析(Corti等，2020)纯化的产物没有差异。因此，基于这些发现，原则上可以扩大S-NGR-hTNF的规模，用于产生患者临床试验所需的偶联物。

S-NGR-hTNF在RMA-T淋巴瘤模型中与美法仑产生协同作用。

发明人先前已经表明，低剂量的鼠S-NGR-TNF(100pg)可以增强抗癌烷化剂美法仑在鼠淋巴瘤模型中的抗肿瘤活性(Corti等，2020)。为了评估S-NGR-hTNF是否也可以与美法仑产生协同作用，发明人使用RMA-T淋巴瘤模型进行了类似的实验。如所预期，联合给予美法仑(50μg)与S-NGR-hTNF(100pg)比单独的美法仑诱导更强的抗肿瘤作用(图21A-B)。事实上，载剂和美法仑处理的小鼠的中位生存期分别约为24天和28天，这表明美法仑在该模型中活性很差。相比之下，接受联合治疗的小鼠的中位生存期为36.5天，这与美法仑或对照动物有显著差异(通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验，分别为P＝0.034和P＝0.006)。该结果表明，S-NGR-hTNF可与美法仑产生协同作用而不增加其毒性，至少从动物体重减轻判断(图21C)。

S-NGR-mTNF在GL261胶质母细胞瘤模型中的药理学和毒理学特性。

发明人接下来在GL261胶质母细胞瘤模型中研究了鼠S-NGR-TNF(S-NGR-mTNF)的抗肿瘤活性，所述GL261胶质母细胞瘤模型是最常用的同基因鼠神经胶质瘤模型之一。为此目的，发明人已经开发了经遗传工程改造以表达萤光素酶(GL261-luc2)的GL261细胞。这允许通过生物发光成像在体内可视化肿瘤生长和对脑内治疗的反应。在肿瘤植入后的第7、19和31天给予S-NGR-mTNF(腹膜内，5ng/kg，对应约100pg/小鼠)，这显著延迟了肿瘤生长(图22A、C和D)。值得注意的是，通过脑解剖确定，用S-NGR-mTNF处理的10只小鼠中有4只在第62天时无肿瘤，而用载剂处理的小鼠没有这种情况(图22E)。此外，S-NGR-mTNF并不引起体重减轻，这表明该药物耐受性良好并且不引起毒性作用(图22B)。正如肿瘤根除所预期的那样，治愈的动物体重逐渐增加(约+15％)

S-NGR-mTNF联合多柔比星在GL261胶质母细胞瘤模型中的药理学和毒理学特性。

然后在GL261-luc2模型中研究S-NGR-mTNF与化疗药物多柔比星(doxo)联合使用的抗肿瘤活性。为此，在肿瘤植入后的第7、14和21天用S-NGR-mTNF(5ng/kg，腹膜内)并在2小时后用doxo(腹膜内，5mg/kg，对应约100μg/小鼠)处理荷瘤的动物。平行地，对照小鼠单独用载剂或doxo处理。结果表明，联合治疗而非单独的doxo可以显著延缓肿瘤生长(图23A和B)。具体地，联合疗法高效地延迟了9只小鼠中的5只(55％)的肿瘤生长，如第35天的生物发光强度低于治疗前测量的强度所示(图23A中的虚线)。Doxo延缓了10只小鼠中的2只(20％)的肿瘤生长，而对照小鼠中没有一只表现出对肿瘤生长的抑制作用。值得注意的是，S-NGR-mTNF没有加剧doxo的毒性，至少从动物体重减轻来判断(图23C)。这一发现和之前的发现支持了S-NGR-mTNF在这种胶质母细胞瘤模型中具有生物活性的概念。

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序列表

<110> 圣拉斐尔医院有限公司(Ospedale San Raffaele S.r.l.)

<120> NGR偶联物及其用途

<130> PCT 146877

<150> EP20164689.0

<151> 2020-03-20

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

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1 5

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1

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<400> 14

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

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50 55 60

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

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Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

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<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 15

Leu Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

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Val Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg

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Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu

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Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe

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Lys Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser

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Lys Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro

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<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 16

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<221> MOD_RES

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<223> 乙酰基-Ciso或Ciso或SCiso

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<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 19

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<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 20

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

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<213> 智人（Homo sapiens）

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<211> 19

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 23

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala

<210> 24

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 24

Met Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ile Val Leu Thr Thr Pro Ile Ala Ile

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180

<210> 25

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 偶联物

<400> 25

Met Ser Cys Asn Gly Arg Cys Gly Leu Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser

1 5 10 15

Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn His Gln Val Glu Glu

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Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn

130 135 140

Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly

145 150 155 160

Val Ile Ala Leu

<210> 26

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 偶联物

<400> 26

Ser Cys Asn Gly Arg Cys Gly Leu Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser

1 5 10 15

Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln

20 25 30

Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met

35 40 45

Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu

50 55 60

Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val

65 70 75 80

Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys

85 90 95

Val Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro

100 105 110

Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly

115 120 125

Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu

130 135 140

Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val

145 150 155 160

Ile Ala Leu

<210> 27

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 偶联物

<400> 27

Met Ser Cys Asn Gly Arg Cys Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro

1 5 10 15

Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly

20 25 30

Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly

35 40 45

Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr

50 55 60

Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr

65 70 75 80

His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln

85 90 95

Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu

100 105 110

Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu

115 120 125

Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile

130 135 140

Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe

145 150 155 160

Gly Ile Ile Ala Leu

165

<210> 28

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 偶联物

<400> 28

Ser Cys Asn Gly Arg Cys Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser

1 5 10 15

Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val

35 40 45

Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu

50 55 60

Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His

65 70 75 80

Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr

85 90 95

Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr

100 105 110

Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly

115 120 125

Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn

130 135 140

Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly

145 150 155 160

Ile Ile Ala Leu

<210> 29

<211> 182

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 偶联物

<400> 29

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Cys Asn Gly Arg Cys Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu

35 40 45

Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn

50 55 60

Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser

85 90 95

Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr

100 105 110

Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg

115 120 125

Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr

130 135 140

Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu

145 150 155 160

Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr

165 170 175

Phe Gly Ile Ile Ala Leu

180

<210> 30

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 偶联物

<400> 30

catatgcggg cgaaactcct aggaatagtc ctgacaaccc ctatcgcgat cagctctttt 60

gcgtcgacgt gcaacggccg ttgtggcctc agatcatctt ctcaaaattc gagtgacaag 120

cctgtagccc acgtcgtagc aaaccaccaa gtggaggagc agctggagtg gctgagccag 180

cgcgccaacg ccctcctggc caacggcatg gatctcaaag acaaccaact agtggtgcca 240

gccgatgggt tgtaccttgt ctactcccag gttctcttca agggacaagg ctgccccgac 300

tacgtgctcc tcacccacac cgtcagccga tttgctatct cataccagga gaaagtcaac 360

ctcctctctg ccgtcaagag cccctgcccc aaggacaccc ctgagggggc tgagctcaaa 420

ccctggtatg agcccatata cctgggagga gtcttccagc tggagaaggg ggaccaactc 480

agcgctgagg tcaatctgcc caagtactta gactttgcgg agtccgggca ggtctacttt 540

ggagtcattg ctctgtgagg atcc 564

<210> 31

<211> 505

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 偶联物

<400> 31

caccatgagc tgcaacggcc gttgcggcct cagatcatct tctcaaaatt cgagtgacaa 60

gcctgtagcc cacgtcgtag caaaccacca agtggaggag cagctggagt ggctgagcca 120

gcgcgccaac gccctcctgg ccaacggcat ggatctcaaa gacaaccaac tagtggtgcc 180

agccgatggg ttgtaccttg tctactccca ggttctcttc aagggacaag gctgccccga 240

ctacgtgctc ctcacccaca ccgtcagccg atttgctatc tcataccagg agaaagtcaa 300

cctcctctct gccgtcaaga gcccctgccc caaggacacc cctgaggggg ctgagctcaa 360

accctggtat gagcccatat acctgggagg agtcttccag ctggagaagg gggaccaact 420

cagcgctgag gtcaatctgc ccaagtactt agactttgcg gagtccgggc aggtctactt 480

tggagtcatt gctctgtgag gatcc 505

<210> 32

<211> 508

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 偶联物

<400> 32

caccatgagc tgcaacggcc gttgcggcgt cagatcatct tctcgaaccc cgagtgacaa 60

gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg cagctccagt ggctgaaccg 120

ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga gataaccagc tggtggtgcc 180

atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc aagggccaag gctgcccctc 240

cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc gtctcctacc agaccaaggt 300

caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag accccagagg gggctgaggc 360

caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc cagctggaga agggtgaccg 420

actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt gccgagtctg ggcaggtcta 480

ctttgggatc attgccctgt gaggatcc 508

<210> 33

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 偶联物

<400> 33

catatgagtt gcaacggccg ttgcggcgtc agatcatctt ctcgaacccc gagtgacaag 60

cctgtagccc atgttgtagc aaaccctcaa gctgaggggc agctccagtg gctgaaccgc 120

cgggccaatg ccctcctggc caatggcgtg gagctgagag ataaccagct ggtggtgcca 180

tcagagggcc tgtacctcat ctactcccag gtcctcttca agggccaagg ctgcccctcc 240

acccatgtgc tcctcaccca caccatcagc cgcatcgccg tctcctacca gaccaaggtc 300

aacctcctct ctgccatcaa gagcccctgc cagagggaga ccccagaggg ggctgaggcc 360

aagccctggt atgagcccat ctatctggga ggggtcttcc agctggagaa gggtgaccga 420

ctcagcgctg agatcaatcg gcccgactat ctcgactttg ccgagtctgg gcaggtctac 480

tttgggatca ttgccctgtg aggatcc 507

<210> 34

<211> 566

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 偶联物

<400> 34

ggatccaaac gatgagattc ccttctattt tcactgctgt tttgttcgct gcttcttctg 60

ctttggcttg taacggtaga tgtggtgtta gatcttcttc tagaactcct tctgataagc 120

ctgttgctca tgttgttgct aaccctcaag ctgaaggtca attgcaatgg ttgaacagaa 180

gagctaatgc tttgttggct aatggtgttg aattgagaga taatcaattg gttgttccat 240

ctgaaggttt gtacttgatc tattctcaag ttttgttcaa gggtcaaggt tgtccttcta 300

ctcatgtttt gttgactcat actatttcta gaatcgctgt ttcttatcaa actaaggtta 360

atttgctgtc tgctattaag tctccatgtc aaagagaaac tcctgaaggt gctgaagcta 420

agccatggta cgaaccaatc tatttgggtg gtgtttttca attggaaaag ggtgacagat 480

tgtctgctga aattaataga ccagattatt tggatttcgc tgaatctggt caagtttact 540

ttggtattat tgctttgtaa gaattc 566

<210> 35

<211> 4

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 35

Asp Gly Arg Cys

1

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 乙酰基-Ciso

<400> 36

Asp Gly Arg Cys Lys

1 5

<210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 37

Cys Asn Gly Arg Cys Gly Leu Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser

1 5 10 15

<210> 38

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 38

Cys Asp Gly Arg Cys Gly

1 5

<210> 39

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 39

Cys Asn Gly Arg Cys Gly Leu Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp

1 5 10 15

<210> 40

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 40

Met Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ile Val Leu Thr Thr Pro Ile Ala Ile

1 5 10 15

Ser Ser Phe Ala Ser Thr Cys Asn Gly Arg Cys Gly

20 25

<210> 41

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Ciso或乙酰基-Ciso或iso

<400> 41

Asp Gly Arg Cys

1

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 乙酰化

<400> 42

Cys Asn Gly Arg Cys Gly Val Arg Tyr

1 5

<210> 43

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列

<400> 43

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Cys Asn Gly Arg Cys Gly

20 25

Claims (24)

1.一种偶联物，其包含：

第一肽序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)，其与蛋白质的N末端连接；

化合物X，其与所述肽的N末端连接。

2.如权利要求1所述的偶联物，其能够识别CD13。

3.如权利要求1或2所述的偶联物，其中，所述蛋白质是细胞因子，优选具有抗肿瘤活性的细胞因子，更优选选自下组的细胞因子：肿瘤坏死因子(TNF)，优选TNF-α或TNF-β，TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)，内皮单核细胞激活多肽II(EMAP-II)，IL12，干扰素γ(IFNγ)和干扰素α(IFNα)。

4.如前述权利要求中任一项所述的偶联物，其中，所述化合物X选自第二肽。

5.如前述权利要求中任一项所述的偶联物，其中，所述化合物X是具有1-200个氨基酸残基的第二肽，优选1、2或3个氨基酸残基。

6.如权利要求5所述的偶联物，其中，所述第二肽由下述组成：丝氨酸残基或任何具有短侧链的氨基酸，优选甘氨酸或丙氨酸，包含所述偶联物在真核细胞中表达和分泌时被去除的前导序列或IEGR(SEQ ID NO:2)序列的氨基酸序列，优选OmpT前导序列或α交配因子分泌信号肽。

7.如权利要求6所述的偶联物，其中，所述第二肽由丝氨酸组成并且所述细胞因子是TNF，优选其中TNF是人TNF-α。

8.如前述权利要求中任一项所述的偶联物，其中，所述偶联物包含用于化学或酶促裂解所述化合物X和所述肽之间的键(X-C键)的位点，优选其中所述X-C键的裂解能够用氨肽酶或内切蛋白酶实现，优选用氨肽酶N(CD13)或蛋白酶，优选因子Xa。

9.一种编码权利要求1-8中任一项所述的偶联物的核酸。

10.一种载体，优选质粒或病毒载体，更优选用于基因治疗，其包含权利要求9所述的核酸。

11.一种纳米颗粒，其包含权利要求1-8中任一项所述的偶联物，优选地，所述偶联物吸附在金纳米颗粒的表面。

12.一种组合产品，其包含权利要求1-8中任一项所述的偶联物或权利要求9所述的核酸或权利要求10所述的载体或权利要求11所述的纳米颗粒和至少一种抗肿瘤剂，优选地是化疗剂和/或免疫调节剂和/或免疫细胞，优选地，所述化疗剂是多柔比星、美法仑、替莫唑胺、吉西他滨、紫杉醇、顺铂、长春新碱或长春瑞滨，优选地，所述免疫调节剂是抗癌疫苗或免疫检查点阻断剂，例如抗PD1或抗PDL1或抗CTLA4抗体；优选地，所述免疫细胞是淋巴细胞或遗传修饰的T淋巴细胞，例如CAR-T细胞或TCR重定向的T细胞或NK细胞；优选地，其他抗肿瘤剂包含抗体和化疗剂，如R-CHOP:利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、泼尼松龙。

13.如权利要求12所述的组合，其中，其包含权利要求1-8中任一项所述的偶联物或权利要求9所述的核酸或权利要求10所述的载体或权利要求11所述的纳米颗粒和至少一种抗肿瘤剂，其中所述试剂是多柔比星。

14.如权利要求12所述的组合，其中，其包含权利要求1-8中任一项所述的偶联物或权利要求9所述的核酸或权利要求10所述的载体或权利要求11所述的纳米颗粒和至少一种抗肿瘤剂，其中所述试剂是美法仑。

15.如权利要求1-8中任一项所述的偶联物或权利要求9所述的核酸或权利要求10所述的载体或权利要求11所述的纳米颗粒或权利要求12-14中任一项所述的组合产品，用于医药用途。

16.如权利要求1-8中任一项所述的偶联物或权利要求9所述的核酸或权利要求10所述的载体或权利要求11所述的纳米颗粒或权利要求12-14中任一项所述的组合产品，用于治疗肿瘤，优选实体瘤，更优选淋巴瘤，优选CNS原发性弥漫性大B细胞淋巴瘤(PCNSL)，脑肿瘤，例如，神经胶质瘤，星形细胞瘤，胶质母细胞瘤，弥漫性内生脑桥神经胶质瘤，肉瘤，黑素瘤口腔或皮肤鳞状细胞癌，肝细胞癌，头颈癌，胃食管癌，结直肠癌，胰腺癌，卵巢癌，肺癌，例如，SCLC，NSCLC，间皮瘤，宫颈癌，乳腺癌，肾癌，尿路上皮癌或其转移。

17.如权利要求13所述的组合，用于治疗胶质母细胞瘤。

18.如权利要求14所述的组合，用于治疗淋巴瘤。

19.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-8中任一项所述的偶联物或权利要求9所述的核酸或权利要求10所述的载体或权利要求12-14中任一项所述的组合产品或权利要求11所述的纳米颗粒11，以及至少一种药学上可接受的运载体和/或赋形剂。

20.一种产生包含与蛋白质的N末端连接的序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)的均质偶联物的方法，所述方法包括：

-在原核或真核细胞，优选大肠杆菌细胞和枯草芽孢杆菌中表达权利要求8所定义的偶联物；

-化学或酶促裂解X-C键，优选使用氨肽酶、内切蛋白酶或蛋白酶。

21.一种产生包含与蛋白质的N末端连接的序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)的均质偶联物的方法，其包括在不能乙酰化α-氨基或修饰CN序列的宿主中进行DNA表达，所述宿主优选为真核细胞。

22.如权利要求21所述的方法，其中，所述真核细胞选自下组：CHO细胞、小鼠骨髓瘤NS0衍生的细胞和昆虫细胞，例如Sf 21。

23.一种产生包含与蛋白质的N末端连接的序列CNGRCG(SEQ ID NO:1)的均质偶联物的方法，所述方法包括：

-表达还包含前导序列的所述偶联物，所述前导序列在真核细胞或植物或动物中，优选在巴斯德毕赤酵母细胞、CHO细胞或杆状病毒昆虫细胞系统中表达时被去除；

-分泌所述偶联物。

24.一种纯化权利要求1-8中任一项所述的偶联物的方法，其包括以下步骤：

-裂解表达偶联物的细胞以获得裂解物；

-由所述裂解物获得可溶部分；

-硫酸铵沉淀可溶部分，去除沉淀物质并回收可溶部分，

-用较高浓度的硫酸铵沉淀可溶部分，

-溶解不溶部分，

i.疏水层析，

ii.离子交换层析，

iii.变性条件下的凝胶过滤层析，

iv.复性，和

v.凝胶过滤层析。

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