CN111741771A - 特异于epha2的双环肽配体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与非芳族分子支架共价结合的多肽，使得在与支架的连接点之间相对两个或更多个肽环。具体而言，本发明描述了作为Eph受体酪氨酸激酶A2(EphA2)的高亲和力结合物的肽。本发明还包括药物缀合物，其包含缀合至一个或多个效应物和/或官能团的所述肽、包含所述肽配体和药物缀合物的药物组合物、以及所述肽配体和药物缀合物在预防、抑制或治疗特征在于患病组织(例如肿瘤)中过度表达EphA2的疾病或病症中的用途。

Description

特异于EPHA2的双环肽配体
技术领域
本发明涉及与非芳族分子支架共价结合的多肽，使得与支架的连接点之间相对(subtended)两个或更多个肽环。具体而言，本发明描述了作为Eph受体酪氨酸激酶A2(EphA2)的高亲和力结合物的肽。本发明还包括药物缀合物，其包含缀合至一个或多个效应物和/或官能团的所述肽、包含所述肽配体和药物缀合物的药物组合物、以及所述肽配体和药物缀合物在预防、抑制或治疗特征在于患病组织(例如肿瘤)中过度表达EphA2的疾病或病症的用途。
背景技术
环肽能够以高亲和力和靶向特异性结合于蛋白质靶标，因此是对于治疗学的发展有吸引力的一类分子。事实上，临床上已经成功使用了几种环肽，例如抗菌肽万古霉素、免疫抑制剂药物环孢菌素或抗癌药奥曲肽(Driggers等人(2008)，Nat Rev Drug Discov 7(7)，608-24)。良好的结合性质来源于肽和靶标之间形成的相对大的相互作用表面以及环状结构的降低的构象柔性。典型地，大环结合于数百平方埃的表面，例如环肽CXCR4拮抗剂CVX15(
Figure BDA0002639562330000011
Wu等人(2007)，Science330,1066-71)，结合整合蛋白αVb3的具有Arg-Gly-Asp基序的环肽
Figure BDA0002639562330000012
(Xiong等人(2002)，Science 296(5565)，151-5)，或与尿激酶型纤溶酶原激活物结合的环肽抑制剂upain-1(
Figure BDA0002639562330000013
Zhao等人(2007)，J Struct Biol 160(1)，1-10)。
由于其环状构型，肽大环较线性肽柔性小，导致其与靶标结合时熵的损失较小并产生更高的结合亲和力。降低的柔性还导致锁定靶标特异性构象，与线性肽相比增加结合特异性。这种作用已经通过一种有效的、选择性基质金属蛋白酶8(MMP-8)抑制剂来例证，当其环被打开时该抑制剂丧失对其它MMP的选择性(Cherney等人(1998)，J Med Chem 41(11)，1749-51)。通过大环化获得的有利的结合性质在具有多于一个的肽环的多环肽中更为显著，例如在万古霉素、乳链菌肽和放线菌素中。
不同的研究团队以前已经将具有半胱氨酸残基的多肽连接到合成分子结构上(Kemp和McNamara(1985)，J.Org.Chem；Timmerman等人(2005)，ChemBioChem)。Meloen及其同事已经使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速和定量地环化到合成支架上，用于蛋白质表面的结构模拟(Timmerman等人(2005)，ChemBioChem)。公开了产生候选药物化合物的方法，其中通过将含半胱氨酸的多肽与分子支架例如TATA(1,1’,1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮，Heinis等人Angew Chem,Int Ed.2014；53：1602-1606)连接，产生所述化合物。
已经开发了基于噬菌体展示的组合方法以产生并筛选出针对目标靶标的双环肽的大型文库(Heinis等人(2009)，Nat Chem Biol 5(7)，502-7和WO2009/098450)。简言之，在噬菌体上展示含有三个半胱氨酸残基和六个随机氨基酸的两个区域(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)的线性肽的组合文库，并通过将半胱氨酸侧链共价连接至一个小分子支架而环化。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了特异于EphA2的肽配体，其包含多肽和非芳族分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个半胱氨酸残基，所述非芳族分子支架与所述多肽的半胱氨酸残基形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物缀合物，其包含缀合至一个或多个效应物和/或官能团的本文所定义的肽配体。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本文所定义的肽配体或药物缀合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂。
根据本发明的另一方面，提供了本文所定义的肽配体或药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗特征在于患病组织(例如肿瘤)中过度表达EphA2的疾病或病症。
附图说明
图1：向携带LU-01-0046肿瘤的雌性Balb/C裸鼠施用BCY6031后的体重变化。数据点代表组的平均体重。
图2：向携带LU-01-0046肿瘤的雌性Balb/C裸鼠施用BCY6031后的肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均值。从第28天起停止治疗。
图3：显示制备双环药物缀合物(BDC)概念的一般示意图。
图4：HT1080异种移植小鼠中平均肿瘤体积与BCY6136的时间的图。在第0天和第7天施用剂量(2、3和5mg/kg)。右上插图显示了治疗期间的体重变化，指示肿瘤负荷、药物相关毒理学和整体动物健康。
图5：NCI-H1975异种移植小鼠中平均肿瘤体积与BCY6136的时间的图。在第0、7、14、21、28和35天施用剂量(1、2和3mg/kg)。右上插图显示了治疗期间的体重变化，指示肿瘤负荷、药物相关毒理学和整体动物健康。
图6：MDA-MB-231异种移植小鼠中平均肿瘤体积与BCY6136的时间的图。在第0、7、14、21、28、35和45天施用剂量(1、2和3mg/kg)。右上插图显示了治疗期间的体重变化，指示肿瘤负荷、药物相关毒理学和整体动物健康。
图7至图9：向携带PC-3异种移植的雌性BALB/c裸鼠施用BCY6136(图7)、ADC(图8)和BCY6033(图9)后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图10：向携带PC-3异种移植的雄性Balb/c裸鼠施用BCY6136、EphA2-ADC或多西他赛(Docetaxel)后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图11至图13：向携带NCI-H1975异种移植的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6033(图11)、BCY6136(图12)和BCY6082(图13)后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均肿瘤体积和体重。
图14和图15：向携带LU-01-0251异种移植的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136和ADC后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图16：向携带LU-01-0046的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6033、BCY6136、BCY6082和BCY6031后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图17：向携带LU-01-0046NSCLC PDX的雌性Balb/c裸鼠模型施用BCY6136或ADC后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图18至图22：向携带LU-01-0046的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6033(图18)、BCY6136(图19)、BCY6082(图20)、BCY6173(图21)以及BCY 6175和6031(图22)后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图23：向携带LU-01-0412异种移植的雌性BALB/c裸鼠施用BCY6136(在图23中称为BT5528)、BCY8245或BCY8781后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均肿瘤体积(左图)和体重(右图)。
图24：向携带LU-01-0486异种移植的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图25至图27：向携带MDA-MB-231-luc异种移植的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6033(图25)、BCY6136(图26)和BCY6082(图27)后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均肿瘤体积和体重。
图28：向携带EMT-6同基因的雌性BALB/c小鼠施用BCY6136后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。从第14天起，将第3组和第4组的剂量更改为5mpk和3mpk。
图29：向携带NCI-N87异种移植的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图30：向携带SK-OV-3异种移植的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图31：向携带OE21异种移植的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图32：向携带MOLP-8异种移植的雌性CB17-SCID小鼠施用BCY6136后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图33：向携带MOLP-8异种移植的雌性CB17-SCID小鼠施用BCY6082后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
图34至图42：向携带HT1080异种移植的雌性BALB/c裸鼠施用BCY6082(图34)、BCY6031(图35)、BCY6173(图36)、BCY6135(图37)、BCY6033(图38)、BCY6136(图39)、BCY6174(图40)、BCY6175(图41)和ADC(图42)后，体重变化和肿瘤体积追踪。数据点代表组的平均体重。
误差棒在上图中表示，其代表平均值的标准误差(SEM)。
具体实施方式
在一个实施方案中，所述环序列包含2、3、5、6或7个氨基酸。
在另一个实施方案中，所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列中的一个由2个氨基酸组成，另一个由7个氨基酸组成(例如表4中所列的那些)。
在另一个实施方案中，所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列均由5个氨基酸组成(例如表3和表4中所列的那些)。
在另一个实施方案中，所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列均由6个氨基酸组成(例如表3至表5中所列的那些)。
在另一个实施方案中，所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，其中两个环序列均由6个氨基酸组成(例如表10中列出的那些)。
在另一个实施方案中，所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，其中一个环序列由7个氨基酸组成，另一个环序列由3个氨基酸组成(例如表4中列出的那些)。
在另一个实施方案中，所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，其中一个环序列由6个氨基酸组成，另一个环序列由7个氨基酸组成(例如表5中列出的那些)。
在一个实施方案中，肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
Ci-X1-Cii-X2-Ciii
其中X1和X2代表表3至表5中列出的半胱氨酸残基之间的氨基酸残基，Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基，或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，肽配体包含选自表3至表5中的一个或多个列出的一个或多个肽配体的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
Ci-X1-Cii-X2-Ciii
其中X1和X2代表表10中列出的半胱氨酸残基之间的氨基酸残基，Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基，或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，肽配体包含选自表10中列出的一个或多个肽配体的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列均由6个氨基酸组成，并且所述肽配体具有选自以下的氨基酸序列：
Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：1)；和
CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii(SEQ ID NO：97)；
其中HyP是羟基脯氨酸，HArg是高精氨酸，Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基，或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列均由6个氨基酸组成，并且所述肽配体具有以下氨基酸序列：
Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：1)；
其中HyP是羟基脯氨酸，HArg是高精氨酸，Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基，或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明的肽配体是不同于以下氨基酸序列的肽配体：
Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：1)。
在一个实施方案中，所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列均由6个氨基酸组成，并且所述肽配体具有选自以下的氨基酸序列：
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)(BCY6099；化合物66)；和
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：11))(BCY6014；化合物67)；
其中，Sar是肌氨酸，HArg是高精氨酸，HyP是羟基脯氨酸。
在另一个实施方案中，所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列均由6个氨基酸组成，并且所述肽配体具有以下氨基酸序列：
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)(BCY6099；化合物66)；
其中，Sar是肌氨酸，HArg是高精氨酸，HyP是羟基脯氨酸。
在一个实施方案中，本发明的肽配体是不同于以下氨基酸序列的肽配体：
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)(BCY6099；化合物66)。
在一个实施方案中，分子支架选自1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)，并且肽配体选自表3至表5中列出的任意一种肽配体。
在一个可选的实施方案中，分子支架选自1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)，并且肽配体选自表10中列出的任意一种肽配体。
在一个实施方案中，分子支架选自1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)，并且肽配体选自：
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)(BCY6099；化合物66)；和
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：11))(BCY6014；化合物67)；
其中，Sar是肌氨酸，HArg是高精氨酸，HyP是羟基脯氨酸。
在另一个实施方案中，分子支架选自1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)，并且肽配体为：
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)；其中，Sar是肌氨酸，HArg是高精氨酸，HyP是羟基脯氨酸。
在一个实施方案中，肽配体选自化合物1-113中任一种或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，肽配体是化合物66(BCY6099)或化合物67(BCY6014)或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，肽配体是化合物66(BCY6099)或其药学上可接受的盐。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义，例如肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域。对于分子生物学、遗传和生物化学方法使用标准技术(参见Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratory Manual, 第三版, 2001, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY；Ausubel等人，Short Protocols in MolecularBiology(1999)第四版, John Wiley & Sons, Inc.)，其通过引用并入本文。
命名法
编号
当提及本发明的肽内的氨基酸残基位置时，由于半胱氨酸残基是不变的，因而从编号中省略了半胱氨酸残基(Ci、Cii和Ciii)，因此，本发明的肽内的氨基酸残基的编号参考如下：
-Ci-HyP1-L2-V3-N4-P5-L6-Cii-L7-H8-P9-(D-Asp)10-W11-(HArg)12-Ciii-(SEQ ID NO：1)。
为了该描述的目的，假设所有双环肽都被1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)环化，产生三取代的1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙烷-1-酮结构。用TATA的环化发生在Ci、Cii和Ciii上。
分子形式
将双环核心序列的N-或C-末端延伸加入到序列的左侧或右侧，并用连字符隔开。例如，N末端(β-Ala)- Sar10-Ala尾将表示为：
(β-Ala)-Sar10-A-(SEQ ID NO：X)。
反向肽序列
根据Nair等人(2003)J Immunol 170(3)，1362-1373中公开的，设想本文公开的肽序列也将以其逆反形式使用。例如，顺序是反向的(即，N-末端变成C-末端，反之亦然)，它们的立体化学也被颠倒(即，D-氨基酸变成L-氨基酸，反之亦然)。
肽配体
本文所指的肽配体是指共价结合至分子支架的肽、缩氨酸或拟肽。通常，此类肽、缩氨酸或拟肽包括具有天然或非天然氨基酸的肽、能够与支架形成共价键的两个或更多个反应性基团(即半胱氨酸残基)、以及在所述反应性基团之间相对的序列(称为环序列)，之所以称为环序列，是因为当肽、缩氨酸或拟肽与支架结合时，其形成环。在本申请的情况下，肽、缩氨酸或拟肽包含至少三个半胱氨酸残基(本文称为Ci、Cii和Ciii)，其在支架上形成至少两个环。
肽配体的优势
本发明的某些双环肽具有许多有利的性质，使它们被认为是适合注射、吸入、鼻、眼、口或局部施用的类药物分子。这些有利的性质包括：
-物种交叉反应性。这是临床前疗效学和药代动力学评估的典型要求；
-蛋白酶稳定性。双环肽配体在大多数情况下应显示出对血浆蛋白酶、上皮(“膜锚定”)蛋白酶、胃和肠蛋白酶、肺表面蛋白酶、细胞内蛋白酶等的稳定性。应当在不同物种之间保持蛋白酶的稳定性，以便可以在动物模型中开发双环肽前导候选物，并可以可靠地对人进行施用；
-理想的溶解度曲线。这是带电荷的亲水残基相对于疏水性残基以及分子内/分子间H键的比例的函数，这对于制剂和吸收目的很重要；
-循环中最佳的血浆半衰期。取决于临床适应症和治疗方案，可能需要开发具有短或延长的体内暴露时间的双环肽，以管理慢性或急性疾病状态。最佳暴露时间取决于持续暴露的要求(以实现最大的治疗效率)与短时间暴露的要求(以最大程度地减少由于持续暴露于试剂而产生的毒理学影响)；
-选择性。本发明的某些肽配体对其他Eph受体酪氨酸激酶如EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7和EphB1和因子XIIA、碳酸酐酶9和CD38显示出良好的选择性(对本发明所选肽配体的选择性数据可参见表7和表14)。还应注意，本发明的所选肽配体显示出与其他物种(例如小鼠和大鼠)的交叉反应性，以允许在动物模型中进行测试(表3至表6和表15)；和
-安全性。在使用EphA2抗体药物缀合物的临床前体内模型和临床试验中已经报道了出血事件。例如，由于在6位患者中有5位发生了出血和凝血事件，因此暂停了使用MEDI-547进行的1期开放标签研究(Annunziata等人，Invest New Drugs(2013)31：77-84)。在患者中观察到的出血事件与在大鼠和猴子临床前研究中观察到的对凝血系统的影响是一致的：增加的活化部分凝血活酶时间和增加的纤维蛋白原/纤维蛋白降解产物(Annunziata等人，IBID)。据报道，在猴子的毒理学研究中发现了明显的出血事件(Annunziata等人，IBID)。这些结果加在一起表明，MEDI-547会在临床前物种和患者中引起弥散性血管内凝血(DIC)。本文报道的BDC体内半衰期短(<30分钟)，因此本质上不太可能在患者体内引起DIC。本文显示的结果(参见生物学数据部分5和6以及表20)证明，本发明选定的双环药物缀合物对凝血参数没有影响，并且在临床前研究中不引起出血事件。
药学上可接受的盐
将理解盐形式在本发明的范围内，并且提及肽配体则包括所述配体的盐形式。
本发明的盐可以通过常规的化学方法，例如Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use,P.Heinrich Stahl(编辑)，Camille G.Wermuth(编辑)，ISBN：3-90639-026-8,Hardcover,388页,2002年8月中描述的方法，由含有碱或酸部分的母体化合物合成。通常，这些盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应制备。
酸式加成盐(单盐或二盐)可以用各种酸(无机和有机酸)形成。酸式加成盐的示例包括与选自以下的酸形成的单盐或二盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环己氨磺酸、十二烷基磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸(如D-葡萄糖醛酸)、谷氨酸(如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢卤酸(如氢溴酸、盐酸、氢碘酸)、羟乙磺酸、乳酸(如(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、丹宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸，以及酰化氨基酸和阳离子交换树脂。
一组具体的盐包括由乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟乙磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、硫酸、甲磺酸(甲磺酸盐)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡萄糖醛酸和乳糖醛酸形成的盐。一种具体的盐是盐酸盐。另一种具体的盐是乙酸盐。
如果化合物是阴离子的或具有可以是阴离子的官能团(例如，-COOH可以是-COO-)，则可以用产生适当的阳离子的有机或无机碱形成盐。合适的无机阳离子的示例包括但不限于碱金属离子如Li+、Na+和K+，碱土金属阳离子如Ca2+和Mg2+，以及其它阳离子如Al3+或Zn+。合适的有机阳离子的示例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和取代的铵离子(例如，NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些合适的取代铵离子的示例为衍生自以下的那些：甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的示例是N(CH3)4 +。
当本发明的肽含有胺官能团时，例如根据本领域技术人员熟知的方法通过与烷基化剂反应，它们可以形成季铵盐。这样的季铵化合物在本发明肽的范围内。
修饰的衍生物
应当理解，如本文定义的肽配体的修饰的衍生物在本发明的范围内。这种合适的修饰衍生物的示例包含一个或多个选自以下的修饰：N-末端和/或C-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基(例如用一个或多个等排或等电子氨基酸替换一个或多个极性氨基酸残基；用其它非天然的等排或等电子氨基酸替换一个或多个非极性氨基酸残基)；加入间隔物基团；用一个或多个氧化耐受性氨基酸残基替换一个或多个氧化敏感性氨基酸残基；用一个或多个替换氨基酸(例如，丙氨酸)替换一个或多个氨基酸残基，用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基；双环肽配体中一个或多个酰胺键的N-烷基化；用替代键(surrogate bond)替换一个或多个肽键；肽骨架(peptidebackbone)长度修饰；用另一个化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，用合适的胺、硫醇、羧酸和酚反应性试剂修饰氨基酸如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和酪氨酸，以功能化所述氨基酸，和引入或替换氨基酸，以引入适合于官能化的正交反应性，例如携带叠氮化物或炔烃基团的氨基酸分别允许用携带炔烃或叠氮化物的部分进行官能化。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含N-末端和/或C-末端修饰。在一个进一步实施方案中，其中所述修饰的衍生物包含使用合适的氨基反应性化学的N-末端修饰，和/或使用合适的羧基反应性化学的C-末端修饰。在一个进一步实施方案中，所述N-末端或C-末端修饰包含加入效应物基团，包括但不限于细胞毒性剂、放射螯合剂(radiochelator)或发色团。
在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含N-末端修饰。在一个进一步实施方案中，N-末端修饰包含N-末端乙酰基。在该实施方案中，在肽合成期间，N-末端残基被乙酸酐或其它合适的试剂封端，产生N-末端乙酰化的分子。该实施方案提供了除去氨基肽酶的潜在识别位点并避免双环肽降解可能性的优点。
在一个替代实施方案中，N-末端修饰包含加入有助于效应物基团缀合和保持双环肽对其靶标的效力的分子间隔物基团。
在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含C-末端修饰。在一个进一步实施方案中，C-末端修饰包含酰胺基。在该实施方案中，C-末端残基在肽合成期间被合成为酰胺，产生C末端酰胺化的分子。该实施方案提供了除去羧肽酶的潜在识别位点并降低双环肽的蛋白水解降解可能性的优点。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，可以选择非天然氨基酸，其具有不被降解性蛋白酶识别，也不对靶标效力产生任何副作用的等排/等电子侧链。
可替代地，可以使用具有约束的氨基酸侧链的非天然氨基酸，使得在构象和空间上阻碍邻近肽键的蛋白水解。具体而言，这些涉及脯氨酸类似物、大体积侧链、
Figure BDA0002639562330000101
-二取代衍生物(例如，氨基异丁酸，Aib)、和环氨基酸、为氨基-环丙基羧酸的简单的衍生物。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含加入间隔物基团。在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含向N-末端半胱氨酸(Ci)和/或C-末端半胱氨酸(Ciii)加入间隔物基团。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个氧化耐受性氨基酸残基替换一个或多个氧化敏感性氨基酸残基。在一个进一步实施方案中，修饰的衍生物包含用萘基丙氨酸或丙氨酸残基替换色氨酸残基。该实施方案提供改善所得到的双环肽配体的药物稳定性谱的优点。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个疏水性氨基酸残基替换一个或多个带电荷的氨基酸残基。在替代实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个带电荷的氨基酸残基替换一个或多个疏水性氨基酸残基。带电荷的氨基酸残基与疏水性氨基酸残基的正确平衡是双环肽配体的重要特征。例如，疏水性氨基酸残基影响血浆蛋白结合的程度，因此影响血浆中可利用的游离级分的浓度，而带电荷的氨基酸残基(具体是精氨酸)可以影响肽与细胞表面上的磷脂膜的相互作用。两者组合可以影响肽药物的半衰期、分布容积和暴露，并可以根据临床终点进行调整。另外，带电荷的氨基酸残基与疏水性氨基酸残基的正确组合和数量可以减少注射部位的刺激(如果肽药物已经被皮下施用)。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基。据信该实施方案通过空间位阻增加蛋白水解稳定性并通过D-氨基酸的倾向来稳定
Figure BDA0002639562330000102
-转角的构象(Tugyi等人(2005)PNAS,102(2)，413–418)。
在一个实施方案中，修饰的衍生物包括除去任何氨基酸残基并用丙氨酸(例如D-丙氨酸)进行取代。该实施方案提供了鉴定关键结合残基并除去潜在的蛋白水解攻击位点的优点。
应当注意，上述提及的每种修饰用于有意地改善肽的效力或稳定性。基于修饰的进一步的效力改善可以通过以下机制来实现：
-并入展现疏水效应并导致降低的解离速率的疏水部分，从而实现更高的亲和力；
-并入展现大范围离子相互作用的带电荷基团，导致结合速率更快和更高的亲和力(参见例如Schreiber等人，Rapid,electrostatically assisted association ofproteins(1996)，Nature Struct.Biol.3,427-31)；和
-在肽中合并入另外的约束，例如通过正确地约束氨基酸的侧链，从而使靶标结合后的熵损失最小化；约束骨架的扭转角，从而使靶标结合后的熵损失最小化；和出于相同的原因而在分子中引入另外的环化。
(综述参见Gentilucci等人，Curr.Pharmaceutical Design,(2010)，16,3185-203和Nestor等人，Curr.Medicinal Chem(2009)，16,4399-418)。
同位素变异
本发明包括本发明的所有药学上可接受的(放射性)同位素标记的肽配体，其中一个或多个原子被具有相同原子数的原子代替，但原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数，和本发明的肽配体中连接能够容纳相关的(放射性)同位素的金属螯合基团(称为“效应物”)，和本发明的肽配体中的某些官能团被共价替换为相关的(放射性)同位素或同位素标记的官能团。
适合于包含在本发明肽配体中的同位素的示例包括氢的同位素，如2H(D)和3H(T)，碳的同位素，如11C、13C和14C，氯的同位素，如36Cl，氟的同位素，如18F，碘的同位素，如123I、125I和131I，氮的同位素，如13N和15N，氧的同位素，如15O、17O和18O，磷的同位素，如32P，硫的同位素，如35S，铜的同位素，如64Cu，镓的同位素，如67Ga或68Ga，钇的同位素，如90Y，和镥的同位素，如177Lu，以及铋的同位素，如213Bi。
某些同位素标记的本发明的肽配体，例如并入放射性同位素的那些肽配体，可用于药物和/或底物组织分布研究，并临床评估患病组织的EphA2靶标的存在和/或不存在。本发明的肽配体可以进一步具有有价值的诊断性质，因为它们可用于检测或鉴定标记化合物与其它分子、肽、蛋白质、酶或受体之间的复合物的形成。检测或鉴定方法可以使用用标记试剂标记的化合物，标记试剂如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质(例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、发光蛋白和荧光素酶)等。放射性同位素氚，即3H(T)和碳-14，即14C，鉴于其容易并入和方便的检测手段，而特别用于该目的。
用较重的同位素如氘(即2H(D))的取代可以提供由更大的代谢稳定性产生的某些治疗优势，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求，因此在一些情况下可能是优选的。
用正电子发射同位素(如11C、18F、15O和13N)取代可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检查靶标占有率。
本发明的肽配体的同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例中描述的那些类似的方法来制备，使用适当的同位素标记的试剂代替之前使用的非标记的试剂。
非芳族分子支架
本文提及的术语“非芳族分子支架”是指本文定义的任何分子支架，其不包含芳族(即不饱和)碳环或杂环环体系。
适当的非芳族分子支架的示例描述于Heinis等人(2014)Angewandte Chemie,International Edition 53(6)1602-1606中。
如之前的文件中所述，分子支架可以是小分子，例如有机小分子。
在一个实施方案中，分子支架可以是大分子。在一个实施方案中，分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物组成的大分子。
在一个实施方案中，分子支架包含能够与多肽的官能团反应形成共价键的反应性基团。
分子支架可以包括与肽形成连接的化学基团，例如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤化物和酰基卤化物。
含有α不饱和羰基的化合物的示例是1,1’,1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)(Angewandte Chemie,International Edition(2014)，53(6)，1602-1606)。
效应物和官能团
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供一种药物缀合物，其包含与一个或多个效应物和/或官能团缀合的如本文定义的肽配体。
效应物和/或官能团可以连接于例如多肽的N和/或C末端、多肽内的氨基酸、或分子支架。
合适的效应物基团包括抗体及其部分或片段。例如，效应物基团可以包括抗体轻链恒定区(CL)、抗体CH1重链结构域、抗体CH2重链结构域、抗体CH3重链结构域、或其任何组合，以及一个或多个恒定结构域。效应物基团还可以包含抗体的铰链区(通常在IgG分子的CH1和CH2结构域之间发现这种区域)。
在本发明该方面的一个进一步实施方案中，根据本发明的效应物基团是IgG分子的Fc区。有利地，根据本发明的肽配体-效应物基团包含具有一天或更长、两天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、或7天或更长的tβ半衰期的肽配体Fc融合物，或由其组成。最有利地，根据本发明的肽配体包含具有一天或更长的tβ半衰期的肽配体Fc融合物，或由其组成。
官能团通常包括结合基团、药物、用于连接其它实体的反应性基团、有助于将大环肽摄取入细胞中的官能团等。
肽透入细胞的能力将允许肽有效地针对细胞内的靶标。可以被具有透入细胞能力的肽接近的靶标包括转录因子、细胞内信号传导分子如酪氨酸激酶和参与细胞凋亡途径的分子。能够透入细胞的官能团包括已经加入到肽或分子支架的肽或化学基团。肽，如衍生自如VP22、HIV-Tat、果蝇(触角足(Antennapedia))的同源盒蛋白的那些，例如，如Chen和Harrison,Biochemical Society Transactions(2007)第35卷,第4部分,第821页；Gupta等人，Advanced Drug Discovery Reviews(2004)第57卷9637中所描述。已经显示在通过质膜的易位中有效的短肽的示例包括来自果蝇触角足蛋白的16个氨基酸的穿透肽(Derossi等人(1994)J Biol.Chem.第269卷，第10444页)、18个氨基酸的“模型两亲肽”(Oehlke等人(1998)Biochim Biophys Acts第1414卷，第127页)和HIV TAT蛋白的富含精氨酸的区域。非缩氨酸方法包括使用可以容易地连接到生物分子上的小分子模拟物或SMOC(Okuyama等人(2007)Nature Methods第4卷，第153页)。将胍基加入到分子中的其它化学策略也增强细胞穿透(Elson-Scwab等人(2007)J Biol Chem第282卷，第13585页)。可以将小分子量分子(如类固醇)加入到分子支架中以增强细胞摄取。
可以与肽配体连接的一类官能团包括抗体及其结合片段，如Fab、Fv或单结构域片段。具体而言，可以使用与能够增加体内肽配体半衰期的蛋白质结合的抗体。
在一个实施方案中，根据本发明的肽配体-效应物基团具有选自12小时或更长、24小时或更长、2天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、7天或更长、8天或更长、9天或更长、10天或更长、11天或更长、12天或更长、13天或更长、14天或更长、15天或更长、或20天或更长的tβ半衰期。有利地，根据本发明的肽配体-效应物基团或组合物将具有12至60小时范围内的tβ。在一个进一步实施方案中，其将具有一天或更长的tβ半衰期。在一个更进一步实施方案中，将在12至26小时的范围内。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述官能团选自金属螯合剂，其适合于络合具有药用相关性的金属放射性同位素。
可能的效应物基团还包括酶，例如用于酶/前药治疗的羧肽酶G2，其中肽配体替换ADEPT中的抗体。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述官能团选自药物，例如用于癌症治疗的细胞毒性剂。合适的示例包括：烷化剂如顺铂和卡铂，以及奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢物，包括嘌呤类似物硫唑嘌呤和巯嘌呤或嘧啶类似物；植物生物碱和萜类化合物，包括长春花生物碱类，如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇(paclitaxel)，最初称为紫杉醇(Taxol)；拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱：伊立替康和拓扑替康，以及II型抑制剂，包括安丫啶、依托泊苷，磷酸依托泊苷和替尼泊苷。其它试剂可以包括抗肿瘤抗生素，其包括免疫抑制剂放线菌素D(用于肾移植)、多柔比星、表柔比星、博来霉素、刺胞霉素等。
在本发明的一个进一步具体的实施方案中，细胞毒性剂选自美登木素生物碱类(如DM1)或单甲基奥瑞他汀类(例如MMAE)。
DM1是一种细胞毒性剂，其是美登木素的含巯基衍生物，并具有以下结构：
Figure BDA0002639562330000141
单甲基奥瑞他汀E(MMAE)是合成的抗肿瘤剂，并具有以下结构：
Figure BDA0002639562330000142
在本发明的又一具体实施方案中，细胞毒性剂选自美登木素生物碱类(例如DM1)。数据显示在本文的表6中，该数据证明了缀合至含有DM1的毒素的肽配体的作用。
在一个实施方案中，细胞毒性剂通过可裂解的键(例如二硫键或蛋白酶敏感的键)与双环肽连接。在一个进一步实施方案中，与二硫键相邻的基团被修饰以控制二硫键的阻碍，并且由此控制裂解的速率和伴随的细胞毒性剂的释放。
已发表的工作确定了通过在二硫键的任一侧引入空间位阻来改变二硫键对还原的敏感性的潜力(Kellogg等人(2011)Bioconjugate Chemistry,22,717)。更大程度的空间位阻降低细胞内谷胱甘肽和细胞外(全身的)还原剂的还原速率，从而降低了细胞内外释放毒素的容易程度。因此，可以通过仔细选择二硫键的任一侧的阻碍程度来实现循环中二硫化物稳定性(其使毒素的不良副作用最小化)与细胞内环境中的有效释放(其最大化治疗效果)的最佳选择。
通过在分子构建体的靶向实体(这里是双环肽)或毒素侧上引入一个或多个甲基来调节二硫键的任一侧的阻碍。
在一个实施方案中，药物缀合物在所述肽配体与所述细胞毒性剂之间还包含接头。
在一个实施方案中，细胞毒性剂和接头选自WO 2016/067035中描述的那些细胞毒性剂和接头的任何组合(其细胞毒性剂和接头通过引用并入本文)。
在一个实施方案中，细胞毒性剂选自DM1或MMAE。
在一个实施方案中，所述细胞毒性剂与所述双环肽之间的接头包含一个或多个氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，细胞毒性剂是MMAE，并且接头选自：-Val-Cit-、-Trp-Cit-、-Val-Lys-、-D-Trp-Cit-、-Ala-Ala-Asn-、D-Ala-Phe-Lys-或-Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-Tyr-Leu-(SEQ ID NO：98)。在另一个实施方案中，细胞毒性剂是MMAE，并且接头选自：-Val-Cit-、-Trp-Cit-、-Val-Lys-或-D-Trp-Cit-。在另一个实施方案中，细胞毒性剂是MMAE，接头是-Val-Cit-或-Val-Lys-。在另一个实施方案中，细胞毒剂是MMAE，接头是-Val-Cit-。
在另一个实施方案中，所述细胞毒剂之间的接头包含二硫键，例如可裂解的二硫键。因此，在另一个实施方案中，细胞毒性剂是DM1，并且接头选自：-S-S-、-SS(SO3H)-、-SS-(Me)-、-(Me)-SS-(Me)-、-SS-(Me2)-或-SS-(Me)-SO3H-。在另一个实施方案中，细胞毒性剂是DM1，并且接头包含-S-S-部分，例如(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDB)、或-SS(SO3H)-部分，例如SO3H-SPDB。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂包括不可裂解的细胞毒性剂。因此，在一个实施方案中，细胞毒性剂是不可裂解的MMAE(例如BCY6063内的细胞毒性剂)或不可裂解的DM1(例如BCY6064内的细胞毒性剂)。
在一个实施方案中，细胞毒性剂是DM1，并且药物缀合物包含式(A)的化合物：
Figure BDA0002639562330000151
其中所述双环选自本文定义的BCY6099和BCY6014中的任意一种。
在一个替代的实施方案中，细胞毒性剂是DM1，并且药物缀合物包含式(B)的化合物：
Figure BDA0002639562330000152
其中所述双环选自本文定义的BCY6099和BCY6014中的任意一种。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂是DM1，并且药物缀合物包含式(A)的化合物，其中所述双环选自如本文所定义的BCY6099。该BDC在本文中称为BCY6027。本文提供的数据证明了BCY6027在EphA2竞争结合测定中的出色竞争结合，如表6所示。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂是DM1，并且药物缀合物包含式(B)的化合物，其中所述双环选自如本文所定义的BCY6099。该BDC在本文中称为BCY6028。本文提供的数据证明了BCY6028在EphA2竞争结合测定中的出色的竞争结合，如表6所示。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂是DM1，并且药物缀合物包含式(A)的化合物，其中所述双环选自如本文所定义的BCY6014。该BDC在本文中称为BCY6031。本文提供的数据证明了BCY6031在EphA2竞争结合测定中的出色的竞争结合，如表6所示。在本文的表11和图1和图2中也提供了数据，它们表明BCY6031治疗从第32天完全消除了非小细胞肺癌，在暂停给药后第28天未发生肿瘤再生长。
在一个替代的实施方案中，细胞毒性剂是DM1，并且药物缀合物包含式(B)的化合物，其中所述双环选自如本文所定义的BCY6014。该BDC在本文中称为BCY6032。本文提供的数据证明了BCY6032在EphA2竞争结合测定中的出色的竞争结合，如表6所示。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂是MMAE或DM1，药物缀合物选自表11中列出的任何BDC。本文给出的数据显示这些BDC在人、小鼠和啮齿动物EphA2之间显示出优异的交叉反应性，如表11中所示。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂是MMAE或DM1，并且药物缀合物选自表13中列出的任何BDC。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂是MMAE或DM1，并且药物缀合物选自BCY6033、BCY6082、BCY6136和BCY6173。本文提供的数据表明这四种双环药物缀合物未显示与以下的显著结合：密切相关的人类同系物EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7和EphB4；小鼠EphA3和EphA4；以及大鼠EphA3和EphB1，如表14和表15所示。
在另一个实施方案中，药物缀合物选自以下的任意一种：BCY6031、BCY6033、BCY6082、BCY6135、BCY6136、BCY6173、BCY6174和BCY6175：
Figure BDA0002639562330000171
Figure BDA0002639562330000181
Figure BDA0002639562330000191
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Figure BDA0002639562330000211
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Figure BDA0002639562330000231
Figure BDA0002639562330000241
在一个实施方案中，药物缀合物不是BCY6027、BCY6028、BCY6135、BCY6136、BCY6173、BCY6174和BCY6175。
在另一个实施方案中，药物缀合物是BCY6136。本文在研究7和研究8中提供的数据表明BCY6136在PC-3异种移植的前列腺癌模型中显示出显著且有效的抗肿瘤活性(参见图7至图10和表21至表24)。本文还提供了数据，其显示BCY6136在NCI-H1975异种移植肺癌(NSCLC)模型中显示出有效的抗肿瘤活性(参见图11至图13和表25至表30)。本文的研究10和研究11中提供的数据表明BCY6136在大和小肿瘤尺寸LU-01-0251PDX肺癌(NSCLC)模型中均显示出有效的抗肿瘤作用(参见图14和图15以及表31至表34)，其中观察到完全的肿瘤消退。在本文的研究12中提供的数据表明BCY6136在LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中显示出显著的抗肿瘤作用(参见图16以及表35和表36)，其中观察到BCY6136完全消退肿瘤。在本文的研究13中也提供了数据，该数据表明BCY6136在LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性(参见图17和表37和表38)。在本文的研究14中也提供了数据，该数据表明BCY6136在LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中消除肿瘤(参见图18至图22和表39至表42)。在本文的研究15和研究16中也提供了数据，这些数据证明了BCY6136在使用具有低/可忽略的EphA2表达的细胞系(即Lu-01-0412和Lu-01-0486)的两个模型中的作用。该数据显示在图23和图24以及表43至表46中，证明了BCY6136在这两种的任一细胞系中均对肿瘤消退没有影响，但是BCY(BCY8245和BCY8781)(其与Lu-01-0412细胞系中高度表达的靶标结合)完全消除了肿瘤。本文的研究17中提供的数据显示，BCY6136在MDA-MB-231异种移植乳腺癌模型中显示出有效的抗肿瘤活性(参见图25至图27和表47至表50)。本文的研究18中也提供了数据，这些数据证明了BCY6136在乳腺癌模型中的作用，该模型利用了具有低/可忽略的EphA2表达的细胞系(即EMT6)。该数据显示在图28以及表51和表52中，并证明了BCY6136对该细胞系中的肿瘤消退没有作用。在本文的研究19中也提供了数据，该数据表明BCY6136在NCI-N87异种移植胃癌模型中显示出显著的抗肿瘤活性(参见图29和表53和表54)。本文的研究20也提供了数据，该数据表明BCY6136在SK-OV-3异种移植卵巢癌模型中显示出显著的抗肿瘤活性(参见图30以及表55和表56)，而相较之下ADC MEDI-547显示出中等的抗肿瘤活性。在本文的研究21中也提供了数据，该数据表明BCY6136在OE-21异种移植食管癌模型中显示出显著的抗肿瘤活性(参见图31以及表57和表58)。在本文的研究22中也提供了数据，该数据表明BCY6136在MOLP-8异种移植多发性骨髓瘤模型中显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性，以及BCY6082显示出显著的抗肿瘤活性(参见图32和图33以及表59和表60)。在本文的研究23中也提供了数据，该数据表明BCY6136在HT-1080异种移植纤维肉瘤模型中显示出有效的抗肿瘤活性(参见图34至图41和表61和表62)。
合成
本发明的肽可以通过标准技术合成制备，然后在体外与分子支架反应。当进行此操作时，可以使用标准化学方法。这使得能够快速大规模制备可溶性材料用于进一步的下游实验或验证。这样的方法可以使用例如Timmerman等人(同上)中公开的常规化学方法来实现。
因此，本发明还涉及如本文所述选择的多肽或缀合物的制备，其中制备包括如下说明的任选的进一步步骤。在一个实施方案中，这些步骤在通过化学合成制得的最终产物多肽/缀合物上进行。
当制备缀合物或复合物时，目标多肽中的氨基酸残基任选可以被取代。
肽也可以被延伸，以并入例如另一个环，因此引入多特异性。
为了延伸肽，可以使用标准固相或溶液相化学法，使用正交保护的赖氨酸(和类似物)，简单地在其N-末端或C-末端或在环内化学延伸。可以使用标准(生物)缀合技术来引入活化的或可活化的N-或C-末端。可替代地，可以通过片段缩合或天然化学连接进行加入(例如，如(Dawson等人1994.Synthesis of Proteins by Native ChemicalLigation.Science 266：776-779)中所述)，或通过酶，例如使用如(Chang等人Proc NatlAcad Sci U S A.1994Dec 20；91(26)：12544-8或Hikari等人Bioorganic&MedicinalChemistry Letters Volume 18,Issue 22,15November 2008,页6000-6003)中描述的subtiligase进行加入。
可替代地，可以通过二硫键进一步缀合来延伸或修饰肽。这具有允许第一和第二肽一旦处于细胞还原环境中时彼此分离的另外的优点。在这种情况下，可以在第一肽的化学合成期间加入分子支架，以使得与三个半胱氨酸基团反应；然后可以将另外的半胱氨酸或硫醇附加到第一肽的N或C末端，使得该半胱氨酸或硫醇仅与第二肽的游离半胱氨酸或硫醇反应，形成二硫键连接的双环肽-肽缀合物。
类似的技术同样适用于两种双环和双特异性大环化合物的合成/偶联，潜在地产生四特异性分子。
此外，可以以相同的方式，使用适当的化学方法，在N-或C-末端或通过侧链的偶联来完成其它官能团或效应物基团的加入。在一个实施方案中，以不阻断任一实体活性的方式进行偶联。
药物组合物
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文定义的肽配体或药物缀合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
一般地，本发明的肽配体将与药理学上适当的赋形剂或载体一起以纯化的形式使用。典型地，这些赋形剂或载体包括水性或醇/水溶液、乳剂或混悬液，包括生理盐水和/或缓冲介质。肠胃外载剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠和乳酸林格氏试剂。如果必要，合适的生理学上可接受的佐剂将多肽复合物保持在混悬液中，所述佐剂可以选自增稠剂如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐，。
静脉内载剂包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些。还可以存在防腐剂和其它加入剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版)。
本发明的肽配体可以用作单独施用的组合物，或者与其他试剂联合施用。这些可以包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，例如环孢霉素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可以包括与本发明的蛋白配体联合的各种细胞毒素或其它试剂的“鸡尾酒混合物”，或甚至包括具有不同特异性的根据本发明选择的多肽的组合，例如使用不同靶配体选择的多肽，无论是否在施用之前合并。
根据本发明的药物组合物的施用途径可以是本领域普通技术人员通常已知的那些。对于治疗方法，本发明的肽配体可以根据标准技术施用于任何患者。施用可以通过任何适当的模式，包括肠胃外、静脉内、肌肉内、腹腔内、经皮、经肺途径、或者适当地通过直接导管输注。优选地，通过吸入施用根据本发明的药物组合物。施用的剂量和频率取决于患者的年龄、性别和状况，其它药物的同时施用，禁忌症和临床医生要考虑的其它参数。
本发明的肽配体可以被冻干储存并在使用前重构在合适的载体中。已经证明这种技术是有效的，并且可以采用本领域已知的冻干和重构技术。本领域技术人员将理解，冻干和重构可导致不同程度的活性损失，并且可能必须向上调整水平以进行补偿。
可以施用含有本发明肽配体或其鸡尾酒混合物的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，将实现所选细胞群体的至少部分抑制、阻遏、调节、杀死或某些其它可测量参数的足够量定义为“治疗有效剂量”。实现该剂量所需的量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但通常每千克体重0.005至5.0mg所选择的肽配体，更常用0.05至2.0mg/kg/剂量的剂量。对于预防性应用，含有本发明肽配体或其鸡尾酒混合物的组合物也可以以相似或稍低的剂量施用。
包含根据本发明的肽配体的组合物可以用于在预防和治疗环境中帮助改变、灭活、杀死或除去哺乳动物中的选择性靶细胞群体。此外，本文所述的肽配体可以选择性地用于在体外(extracorporeally)或体外(in vitro)从细胞的异质集合物中杀死、消耗或以其它方式有效除去靶细胞群体。来自哺乳动物的血液可以与选择的肽配体体外组合，由此从血液中将不期望的细胞杀死或以其它方式除去，并根据标准技术返回哺乳动物。
治疗用途
本发明的双环肽作为EphA2结合剂具有特定的用途。
Eph受体酪氨酸激酶(Eph)属于一大群受体酪氨酸激酶(RTK)，这些激酶可在酪氨酸残基上将蛋白质磷酸化。Eph及其膜结合的ephrin配体(ephrin)控制细胞的定位和组织(tissue)的组织化(organization)(Poliakov等人(2004)Dev Cell7，465-80)。功能的和生化的Eph反应在较高的配体低聚状态下发生(Stein等人(1998)Genes Dev 12,667-678)。
在其他模式功能中，表明各种Eph和ephrin在血管发育中起作用。EphB4和ephrin-B2的敲除导致缺乏将毛细血管床重塑成血管的能力(Poliakov等人，同上)，并导致胚胎致死。在新生的成体微血管中也观察到了一些Eph受体和ephrin的持续表达(Brantley-Sieders等人(2004)Curr Pharm Des 10,3431-42；Adams(2003)J Anat 202,105-12)。
还观察到成人中一些ephrin及其受体的不受调控的再生会促进肿瘤的侵袭、转移和新血管生成(Nakamoto等人(2002)Microsc Res Tech 59,58-67；Brantley-Sieders等人，同上)。此外，已经发现一些Eph家族成员在来自多种人类肿瘤的肿瘤细胞上过度表达(Brantley-Sieders等人，同上)Marme(2002)Ann Hematol 81Suppl 2,S66；Booth等人(2002)Nat Med 8,1360-1)。
EPH受体A2(A型ephrin受体2)是一种在人类中由EPHA2基因编码的蛋白质。
EphA2在人的多种癌症中上调，通常与疾病进展、转移和不良预后相关，例如：乳腺癌(Zelinski等人(2001)Cancer Res.61,2301–2306；Zhuang等人(2010)Cancer Res.70,299–308；Brantley-Sieders等人(2011)PLoS One 6,e24426)、肺癌(Brannan等人(2009)Cancer Prev Res(Phila)2,1039–1049；Kinch等人(2003)Clin Cancer Res.9,613-618；Guo等人(2013)J Thorac Oncol.8,301-308)、胃癌(Nakamura等人(2005)Cancer Sci.96,42-47；Yuan等人(2009)Dig Dis Sci 54,2410-2417)、胰腺癌(Mudali等人(2006)Clin ExpMetastasis 23,357-365)、前列腺癌(Walker-Daniels等人(1999)Prostate 41,275–280)、肝癌(Yang等人(2009)Hepatol Res.39,1169–1177)和胶质母细胞瘤(Wykosky等人(2005)Mol Cancer Res.3,541–551；Li等人(2010)Tumour Biol.31,477–488)。
EphA2在癌症进展中的全部作用仍未确定，尽管有证据表明在癌症进展的许多阶段都有相互作用，包括肿瘤细胞生长、存活、侵袭和血管生成。EphA2表达的下调抑制了肿瘤癌细胞的增殖(Binda等人(2012)Cancer Cell 22,765-780)，而EphA2的阻断抑制了VEGF诱导的细胞迁移(Hess等人(2001)Cancer Res.61,3250–3255)、萌发和血管生成(Cheng等人(2002)Mol Cancer Res.1,2–11；Lin等人(2007)Cancer 109,332-40)和转移性进展(Brantley-Sieders等人(2005)FASEB J.19,1884–1886)。
已显示针对EphA2的抗体药物缀合物可在大鼠和小鼠异种移植模型中显著降低肿瘤生长(Jackson等人(2008)Cancer Research 68,9367-9374)，并且已经在人中尝试了类似的方法，尽管由于治疗相关的副作用，治疗已被迫终止(Annunziata等人(2013)InvestNew drugs 31,77-84)。
根据本发明的方法选择的多肽配体可用于体内治疗和预防应用、体外和体内诊断应用、体外测定和试剂应用等。具有选择的特异性水平的配体在其中需要交叉反应性的涉及在非人动物中进行测试的应用中是有用的，或在需要仔细控制与同系物或旁系同系物的交叉反应性的诊断应用中是有用的。在一些应用中，例如疫苗应用，可以利用引发对预定范围的抗原的免疫应答的能力来定制针对具体疾病和病原体的疫苗。
对于哺乳动物施用，优选至少90至95％同质性的基本上纯的肽配体，并且对于药物用途，具体是当哺乳动物是人时，最优选98至99％或更高的同质性。一旦按需要被纯化(部分纯化或纯化至同质)，所选择的多肽可以在诊断或治疗(包括体外)或开发和进行测定程序、免疫荧光染色等中使用(Lefkovite和Pernis,(1979和1981)ImmunologicalMethods,I和II卷,Academic Press,NY)。
根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的肽配体或药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗特征在于患病组织(例如肿瘤)中过度表达EphA2的疾病或病症。
根据本发明的另一方面，提供了一种预防、抑制或治疗特征在于患病组织(例如肿瘤)中过度表达EphA2的疾病或病症的方法，其包括向需要其的患者施用如本文定义的肽配体的效应物基团和药物缀合物。
在一个实施方案中，EphA2是哺乳动物EphA2。在另一个实施方案中，哺乳动物EphA2是人EphA2。
在一个实施方案中，特征在于患病组织中过度表达EphA2的疾病或病症选自癌症。
可以被治疗(或被抑制)的癌症(及其良性对应物)的示例包括但不限于上皮起源的肿瘤(腺瘤和各种类型的癌，包括腺癌、鳞癌、移行细胞癌和其他癌)，例如膀胱和泌尿道癌、乳腺癌、胃肠道癌(包括食道癌、胃(胃)癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌和肛门癌)、肝癌(肝细胞癌)、胆囊和胆道系统癌、外分泌胰腺癌、肾癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈癌(例如舌癌、颊腔癌、喉癌、咽癌、鼻咽癌、扁桃体癌、唾液腺癌、鼻腔癌和鼻旁窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、子宫颈癌、子宫肌癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)、肾癌、前列腺癌、皮肤和附属物癌(例如黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、异常增生痣)；血液系统恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和恶化前的血液系统病症以及边缘恶性病症，包括血液系统恶性肿瘤和淋巴谱系的相关病症(例如急性淋巴细胞性白血病[ALL]、慢性淋巴细胞性白血病[CLL]、B细胞淋巴瘤如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、意义不确定的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴增生性病症)、和血液系统恶性肿瘤和髓系的相关病症(例如急性髓性白血病[AML]、慢性髓性白血病[CML]、慢性骨髓单核细胞白血病[CMML]、嗜酸性粒细胞增多综合征、骨髓增生性病症，例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合症和早幼粒细胞性白血病)；间充质起源的肿瘤，例如软组织肉瘤、骨或软骨肉瘤，例如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性和恶性组织肉瘤以及隆突性皮纤维肉瘤；中枢或周围神经系统的肿瘤(例如星形细胞瘤、神经胶质瘤和胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体瘤、肾上腺肿瘤、胰岛细胞瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌和甲状腺髓样癌)；眼和附件肿瘤(例如视网膜母细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤(dysgerminoma)、葡萄胎和绒毛膜癌)；小儿和胚胎肿瘤(例如，髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、威尔姆斯肿瘤和原始神经外胚层肿瘤)；或先天性或其他形式的综合症，使患者容易患恶性肿瘤(例如着色性干皮病)。
在进一步的实施方案中，所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤和血管生成。
在另一个实施方案中，所述癌症选自前列腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、胃癌、卵巢癌、食道癌、多发性骨髓瘤和纤维肉瘤。
在另一个实施方案中，所述癌症是前列腺癌。在本文的研究7和研究8中提供的数据表明BCY6033和BCY6136在PC-3异种移植前列腺癌模型中显示出显著且有效的抗肿瘤活性(参见图7至图10和表21至表24)。
在又一个实施方案中，药物缀合物可用于预防、抑制或治疗实体瘤，例如纤维肉瘤和乳腺癌以及非小细胞肺癌。
在另一个实施方案中，所述癌症选自肺癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)。本文提供的数据证明，从第32天起，本发明的BDC(BCY6031)完全消除了非小细胞肺癌，在暂停给药后第28天，未发生肿瘤再生长。该数据清楚地证明了本发明的BDC在癌症例如肺癌，具体是非小细胞肺癌中的临床应用。在本文的研究9中还提供了数据，这些数据表明在NCI-H1975异种移植肺癌(NSCLC)模型中，BCY6033显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性，BCY6082显示出显著的抗肿瘤活性，以及BCY6136显示出有效的抗肿瘤活性(参见图11至图13和表25至表30)。在本文的研究10和研究11中也提供了数据，这些数据表明BCY6136在大和小肿瘤尺寸的LU-01-0251PDX肺癌(NSCLC)模型中均显示出有效的抗肿瘤作用(参见图14和图15以及表31至表34)，其中观察到完全肿瘤消退。在本文的研究12中也提供了数据，这些数据表明BCY6033、BCY6136、BCY6082和BCY6031在LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中显示出显著的抗肿瘤作用(参见图16和表35和表36)，其中针对BCY6033和BCY6136观察到完全肿瘤消退。在本文的研究13中也提供了数据，该数据表明BCY6136在LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性(参见图17和表37和表38)。在本文的研究14中还提供了数据，这些数据表明在LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中，BCY6082显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性，BCY6031和BCY6173显示出抗肿瘤活性，以及BCY6033、BCY6136和BCY6175消除肿瘤(参见图18至图22和表39至表42)。在本文的研究15和研究16中也提供了数据，这些数据证明了BCY6136在使用具有低/可忽略的EphA2表达的细胞系(即Lu-01-0412和Lu-01-0486)的两个模型中的作用。该数据显示在图23和图24以及表43至表46中，并证明BCY6136在这两种细胞系中的任一种中均对肿瘤消退没有影响，但是BCY(BCY8245和BCY8781)(其与Lu-01-0412细胞系中高度表达的靶标结合)完全消退肿瘤。在另一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在本文的研究17中提供的数据表明，在MDA-MB-231异种移植乳腺癌模型中，BCY6082显示抗肿瘤活性，BCY6033显示剂量依赖性抗肿瘤活性，以及BCY6136显示有效的抗肿瘤活性(参见图25至图27和表47至表50)。在本文的研究18中还提供了数据，该数据证明了BCY6136在乳腺癌模型中的作用，该模型利用了具有低/可忽略的EphA2表达的细胞系(即EMT6)。该数据显示在图28以及表51和表52中，证明了BCY6136对该细胞系中的肿瘤消退没有影响。在可选的实施方案中，乳腺癌是赫赛汀耐受性乳腺癌。不受理论的束缚，EphA2被认为与对赫赛汀的耐受性有关，因此，靶向EphA2的实体在对赫赛汀没有反应的患者中具有潜在的效用。
在另一个实施方案中，癌症是胃癌。在本文的研究19中提供的数据表明BCY6136在NCI-N87异种移植胃癌模型中显示出显著的抗肿瘤活性(参见图29以及表53和表54)。
在另一个实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在本文的研究20中显示的数据表明BCY6136在SK-OV-3异种移植卵巢癌模型中显示出显著的抗肿瘤活性(参见图30以及表55和表56)，而相较而言，ADC MEDI-547显示出中等的抗肿瘤活性。
在另一个实施方案中，所述癌症是食道癌。在本文的研究21中显示的数据表明BCY6136在OE-21异种移植食管癌模型中显示出显著的抗肿瘤活性(参见图31以及表57和表58)。
在另一个实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。在本文的研究22中显示的数据表明BCY6136在MOLP-8异种移植多发性骨髓瘤模型中显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性，而BCY6082显示出显著的抗肿瘤活性(参见图32和图33以及表59和表60)。
在另一个实施方案中，癌症是纤维肉瘤。在本文的研究23中提供的数据表明，在HT-1080异种移植纤维肉瘤模型中，BCY6173、BCY6135、BCY6174和BCY6175显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性，而BCY6082、BCY6031、BCY6033和BCY6136显示出有效的抗肿瘤活性(参见图34至图41和表61和表62)。
本文提到的术语“预防”涉及在疾病诱导之前施用保护性的组合物。“抑制”是指在诱导事件之后但在疾病的临床表现之前施用组合物。“治疗”涉及在疾病症状变得明显之后施用保护性的组合物。
可获得用于筛选肽配体在预防或治疗疾病中的有效性的动物模型系统。本发明允许开发可以与人和动物靶标交叉反应的多肽配体，从而允许使用动物模型，这促进了动物模型系统的使用。
此外，本文提供的数据证明了多种肿瘤类型的EphA2的拷贝数变化(CNV)与基因表达之间的相关性。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种预防、抑制或治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本文定义的肽配体的效应物基团和药物缀合物，其中所述患者被鉴定为具有增加的EphA2的拷贝数变化(CNV)。
在一个实施方案中，癌症选自本文鉴定为具有增加的EphA2的CNV的那些癌症。在另一个实施方案中，癌症是乳腺癌。
下面参考以下实施例进一步描述本发明。
实施例
Figure BDA0002639562330000321
Figure BDA0002639562330000331
Figure BDA0002639562330000341
材料和方法
肽合成
通过固相合成合成肽。使用了Rink Amide MBHA树脂。向包含Rink Amide MBHA(0.4-0.45mmol/g)和Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0eq)的混合物中加入DMF，然后加入DIC(3eq)和HOAt(3eq)并混合1小时。使用20％哌啶的DMF溶液进行解封。使用活化试剂，DIC(3.0eq)和HOAT(3.0eq)的DMF溶液，将每个随后的氨基酸与3eq偶联。通过茚三酮显色反应或四氯显色反应监测反应。合成完成后，将肽树脂用DMF x 3、MeOH x 3洗涤，然后在N2泡下干燥过夜。然后将肽树脂用92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％EDT/2.5％H2O处理3h。用冷的异丙醚沉淀肽，并离心(3000rpm下3分钟)。将沉淀用异丙醚洗涤两次，并将粗肽在真空下干燥2小时，然后冻干。将冻干的粉末在ACN/H2O(50：50)中溶解，并加入100mM TATA的ACN溶液，然后加入碳酸氢铵的H2O溶液(1M)，并将溶液混合1小时。一旦环化完成，就用1M aq淬灭反应。然后混合半胱氨酸盐酸盐(相对于TATA为10eq)，静置一个小时。将溶液冻干，得到粗产物。通过制备型HPLC纯化粗肽，并冻干，得到产物。
除非另有说明，所有氨基酸均以L-构型使用。
BCY6099(化合物66)
Figure BDA0002639562330000342
序列：(β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：2)-CONH2
8.0g树脂用于生成作为白色固体的2.1g BCY6099(99.2％纯度；16.3％产率)。
Figure BDA0002639562330000351
BCY6014(化合物67)
Figure BDA0002639562330000352
序列：(β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：11)-CONH2
4.79g树脂用于产生作为白色固体的1.07g BCY6014(Q1：131.9mg，97.99％纯度；Q2：141.7mg，99.04％纯度；Q3：800.7mg，92.35％纯度；16.9％产率)。
Figure BDA0002639562330000353
BCY6104(化合物99)
Figure BDA0002639562330000361
序列(β-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)W(HArg)C((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：85))
4.44g树脂用于产生作为白色固体的700mg BCY6104(95.87％纯度，10.5％产率)。
Figure BDA0002639562330000362
BCY6103(化合物100)
Figure BDA0002639562330000363
序列：(β-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)WTC((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：86))
4.44g树脂用于产生作为白色固体的700mg BCY6103(98.9％纯度，11.1％产率)。
Figure BDA0002639562330000371
BCY6101(化合物101)
序列：(β-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)LVNPLCLHP(D-Ala)WTC((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：87))
Figure BDA0002639562330000372
4.44g树脂用于产生作为白色固体的700mg BCY6101(95.9％纯度，10.9％产率)。
Figure BDA0002639562330000373
BCY6102(化合物102)
序列：(β-Ala)-Sar10-A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Ala)WTC((β-Ala)-Sar10-(SEQ IDNO：88))
Figure BDA0002639562330000381
4.44g树脂用于产生作为白色固体的900mg BCY6102(95.9％纯度，14.1％产率)。
Figure BDA0002639562330000382
BCY6139(化合物103)
序列：(β-Ala)-Sar10-ARDC(HyP)LVNPLCLHPGWTC((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：89))
Figure BDA0002639562330000383
4.44g树脂用于产生作为白色固体的900mg BCY6139(97.4％纯度，11.2％产率)。
Figure BDA0002639562330000391
BCY6138(化合物104)
序列：(β-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCL(D-3，3-DPA)PGWTC((β-Ala)-Sar10-(SEQ IDNO：90))
Figure BDA0002639562330000392
1.11g树脂用于产生作为白色固体的200mg BCY6138(95.2％纯度，12.2％产率)。
Figure BDA0002639562330000393
BCY6137(化合物105)
序列：(β-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCLHPGWTCLH((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：91))
Figure BDA0002639562330000401
4.44g树脂用于产生作为白色固体的600mg BCY6137(98.9％纯度，9.06％产率)。
Figure BDA0002639562330000402
BCY6042(化合物91)
Figure BDA0002639562330000403
序列：Ac-(SEQ ID NO：14)-Sar6-(D-K)
1.11g树脂用于产生作为白色固体的99.2mg BCY6042(99.2％纯度，7.0％产率)。
Figure BDA0002639562330000411
BCY6019(化合物77)
Figure BDA0002639562330000412
序列：Ac-(SEQ ID NO：12)-Sar6-(D-K)
4.79g树脂用于产生作为白色固体的732.0mg BCY6019(92.82％纯度，12.2％产率)。
Figure BDA0002639562330000413
BCY6059(化合物106)
Figure BDA0002639562330000421
序列：Ac-(SEQ ID NO：12)-Sar6-(D-K[Ac])
通过Na2CO3(aq)将BCY6019的水溶液(0.05g，17.82μmol，1.00eq)(3mL)调节至pH＝11，并加入乙酸乙酰酯(5.46mg，53.46μmol，5.01μL，3.00eq)。将混合物在15℃下搅拌1小时。LC-MS显示BCY6019已完全消耗，并检测到一个具有期望MS的主峰。通过1N HCl将反应调节至PH＝7，并通过制备型HPLC(TFA条件)直接纯化。获得作为白色固体的化合物BCY6059(18.1mg，6.36μmol，产率35.67％)。
Figure BDA0002639562330000422
BCY6160(化合物107)
Figure BDA0002639562330000423
Figure BDA0002639562330000431
序列：(β-AlaSO3H)-Sar4-(Cya)-Sar4-(Cya)-A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Cya)WTC((β-AlaSO3H)-Sar4-(Cya)-Sar4-(Cya)-(SEQ ID NO：92))
1.11g树脂用于产生作为白色固体的45.2mg BCY6160(95.5％纯度，2.5％产率)。
Figure BDA0002639562330000432
BCY6009(化合物108)
Figure BDA0002639562330000433
序列：(β-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCLHPGWTC((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：10))
4.79g树脂用于产生作为白色固体的2.42g BCY6009(＞88.92％纯度，36.0％产率)。
Figure BDA0002639562330000434
Figure BDA0002639562330000441
BCY6017(化合物109)
Figure BDA0002639562330000442
序列：A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC(SEQ ID NO：11)
1.19g树脂用于产生作为白色固体的189.9mg BCY6017(95.05％纯度，16.8％产率)。
Figure BDA0002639562330000443
BCY6018(化合物110)
Figure BDA0002639562330000451
序列：(β-Ala)-Sar5-(SEQ ID NO：11)
1.19g树脂用于产生作为白色固体的289.1mg BCY6018(97.92％纯度，21.0％产率)。
Figure BDA0002639562330000452
BCY6152(化合物111)
Figure BDA0002639562330000453
序列：(β-AlaSO3H)-Sar10-(SEQ ID NO：11)
1.11g树脂用于产生作为白色固体的150.0mg BCY6152(98.75％纯度；9.5％产率)。
Figure BDA0002639562330000461
BCY6141(化合物112)
Figure BDA0002639562330000462
序列：(β-Ala)-Sar10-A(D-Arg)DC(HyP)LVNPLCL(D-3，3-DPA)P(D-Asp)W(HArg)C((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：93))
1.11g树脂用于产生作为白色固体的120.0mg BCY6141(97.91％纯度；7.3％产率)。
Figure BDA0002639562330000463
BCY6026(化合物87)
Figure BDA0002639562330000471
序列：ACPLVNPLCLHPGWSCRGQ(SEQ ID NO：77)
1.11g树脂用于产生作为白色固体的285.0mg BCY6026(97.7％纯度；24.2％产率)。
Figure BDA0002639562330000472
BCY6153(化合物113)
Figure BDA0002639562330000473
Figure BDA0002639562330000481
序列：(β-AlaSO3H)-Sar5-(SEQ ID NO：11)
1.11g树脂用于产生作为白色固体的140.0mg BCY6153(98.59％纯度；9.9％产率)。
Figure BDA0002639562330000482
双环肽药物缀合物的制备
用于制备双环药物缀合物(BDC)的一般示意图如图3所示，表A描述了每种BDC中的组分靶向双环和接头/毒素的成分。
表A
Figure BDA0002639562330000483
Figure BDA0002639562330000491
表6中所列的双环肽药物缀合物BCY6027、BCY6028、BCY6031和BCY6032的合成使用WO 2016/067035中公开的方案进行。
通过以下方式合成式(C)和(D)所示活化的双环肽：
Figure BDA0002639562330000492
使双环前体的游离氨基分别与SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯，Annova Chem)和SPDB(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，Annova Chem)在DMSO中反应。在室温下，双环前体的浓度为10mM或更高，SPP或SPDB过量1.3倍，二异丙基乙胺过量20倍。在1小时后，根据LCMS判断，判断反应完成。如上所述通过反相进行纯化。将合适的级分冻干。
在半水性条件下(50％二甲基乙酰胺和50％100mM乙酸钠pH 5.0，补充有2mMEDTA)，将具有式(C)和(D)的活化双环肽与1.15当量的DM1(作为游离巯基)进行二硫交换，在氮气保护下于室温下进行21小时。反应中具有结构C和D的活化的双环肽的浓度为10mM或更高。
然后使用C18柱进行标准反相纯化。分离纯度大于95％的级分并冻干。该材料不含可测量量的游离毒素。
MMAE系列
Val-Cit-MMAE系列
Val-Cit-MMAE接头
Figure BDA0002639562330000501
Figure BDA0002639562330000511
化合物2
Figure BDA0002639562330000512
通过固相合成来合成肽。使用50g的CTC树脂(sub：1.0mmol/g)。向包含CTC树脂(50mmol，50g，1.0mmol/g)和Fmoc-Cit-OH(19.8g，50mmol，1.0eq)的混合物中加入DCM(400mL)，然后加入DIEA(6.00eq)，混合3小时。然后加入MeOH(50mL)并混合30分钟以进行封端。使用20％哌啶的DMF溶解进行解封。使用HBTU(2.85eq)和DIPEA(6.0eq)的DMF(400mL)溶液将Boc-Val-OH(32.5g，150mmol，3eq)与3eq偶联。通过茚三酮显色反应测试监测反应。合成完成后，将肽树脂用DMF X 3，MeOH X 3洗涤，然后在N2泡下干燥过夜。之后，将肽树脂用20％HFIP/DCM处理30分钟，共2次。在旋转蒸发仪上除去溶液，得到粗产物。将粗肽溶于ACN/H2O中，然后冻干两次，得到肽产物(17.3g粗产物)。
LCMS(ESI)： m/z 374.9[M+H]<sup>+</sup>
分子量 374.44
化合物3
Figure BDA0002639562330000521
在室温下搅拌化合物2(4.00g，10.68mmol，1.00eq)的DCM(40.00mL)和MeOH(20.00mL)溶液，然后加入(4-氨基苯基)甲醇(1.58g，12.82mmol，1.20eq)和EEDQ(5.28g，21.37mmol，2.00eq)，并将混合物在黑暗中搅拌9小时。TLC(二氯甲烷/甲醇＝5/1，Rf＝0.56)表明已形成一个新斑点。将反应混合物在减压下浓缩以除去溶剂。通过快速硅胶色谱法(
Figure BDA0002639562330000522
120g
Figure BDA0002639562330000523
Silica Flash Column，0至20％MeOH/DCM洗脱，@80mL/min)纯化得到的残余物。
获得为白色固体的化合物3(3.00g，6.26mmol，产率58.57％)。
LCMS(ESI)： m/z 480.1[M+H]<sup>+</sup>
分子量 479.58
化合物4
Figure BDA0002639562330000524
向化合物3(3.00g，6.26mmol，1.00eq)的无水THF(35.00mL)和无水DCM(15.00mL)溶液中加入(4-硝基苯基)氯甲酸酯(6.31g，31.30mmol，5.00eq)和吡啶(2.48g，31.30mmol，2.53mL，5.00eq)，并将混合物在25℃下搅拌5小时。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10/1，Rf＝0.55)表明已形成新斑点。过滤反应混合物，并在减压下浓缩滤液，得到残余物。通过快速硅胶色谱法纯化残余物(
Figure BDA0002639562330000525
120g
Figure BDA0002639562330000526
Silica Flash Column，0至10％DCM/MeOH洗脱@80mL/min)。获得为白色固体的化合物4(2.00g，3.10mmol，49.56％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 667.3[M+Na]<sup>+</sup>
分子量 644.68
化合物5
Figure BDA0002639562330000531
将化合物4(278.43mg，387.80μmol，1.00eq)和DIEA(501.19mg，3.88mmol，677.29μL，10.00eq)的混合物在DMF(5.00mL)中在氮气下搅拌10分钟。加入MMAE(250.00mg，387.80μmol，1.00eq)和HOBt(52.40mg，387.80μmol，1.00eq)，并将混合物在0℃在氮气下搅拌20分钟，并在30℃下另外搅拌18小时。LC-MS显示检测到一个具有期望质量的主峰。通过快速C18凝胶色谱法纯化所得的混合物(
Figure BDA0002639562330000532
130g
Figure BDA0002639562330000533
C18Flash Column，0至50％MeCN/H2O洗脱@75mL/min)。获得为白色固体的化合物5(190.00mg，155.29μmol，40.04％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 1223.4[M+H]<sup>+</sup>
分子量 1223.57
化合物6
Figure BDA0002639562330000534
向化合物5(170.00mg，138.94μmol，1.00eq)的DCM(2.70mL)溶液中加入2，2，2-三氟乙酸(413.32mg，3.62mmol，268.39μL，26.09eq)，并且将混合物在25℃下搅拌1小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗。减压浓缩混合物，得到残余物。将残余物溶解在THF(10.00mL)中，并加入K2CO3(192.03mg，1.39mmol，10.00eq)，将混合物在室温下再搅拌3小时。LC-MS显示检测到一个具有期望质量的主峰。减压浓缩得到的反应混合物以除去溶剂，得到残余物。将残余物通过快速C18凝胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330000535
130g
Figure BDA0002639562330000536
C18Flash Column，0至50％MeCN/H2O洗脱@75mL/min)。获得为白色固体的化合物6(110.00mg，97.92μmol，70.48％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 1123.4[M+H]<sup>+</sup>
分子量 1123.45
化合物7
Figure BDA0002639562330000541
向化合物6(110.00mg，97.92μmol，1.00eq)的DMA(5mL)的溶液中，DIEA(25.31mg，195.83μmol，34.20μL，2.00eq)和四氢吡喃-2,6-二酮(22.34mg，195.83μmol，2.00eq)。将混合物在室温搅拌18小时。LC-MS显示化合物6被完全消耗，检测到一个具有期望质量的主峰。将反应混合物通过快速C18凝胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330000542
130g
Figure BDA0002639562330000543
C18Flash Column，0至50％MeCN/H2O洗脱@75mL/min)。获得为白色固体的化合物7(100.00mg，80.81μmol，82.53％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 1237.4[M+H]<sup>+</sup>
分子量 1236.74
化合物8(MMAE-PABC-Cit-Val-戊二酸酯-NHS)
Figure BDA0002639562330000544
在N2下向化合物7(100.00mg，80.81μmol，1.00eq)的DMA(4.5mL)和DCM(1.5mL)溶液中加入1-羟基吡咯烷-2，5-二酮(27.90mg，242.42μmol，3.00eq)，在0℃下将混合物搅拌30分钟。将EDCI(46.47mg，242.43μmol，3.00eq)加入混合物中，并将混合物在25℃下搅拌另外16小时。LC-MS显示化合物7被完全消耗，检测到一个具有期望质量的主峰。将反应混合物通过快速C18凝胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330000551
130g
Figure BDA0002639562330000552
C18Flash Column，0至50％MeCN/H2O洗脱@75mL/min)。获得为白色固体的化合物8(90.00mg，60.69μmol，75.11％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 1334.5[M+H]<sup>+</sup>
分子量 1334.62
将MMAE-PABC-Cit-Val-戊二酸酯-NHS与靶向双环偶联的通用步骤
向双环(1.0-1.3eq)的DMA溶液中加入DIEA(3eq)和MMAE-PABC-Cit-Val-戊二酸酯-NHS(1eq)。将混合物在25℃下搅拌18小时。通过LC-MS监测反应，一旦完成，就通过制备型HPLC直接纯化。
BCY6136
Figure BDA0002639562330000553
BCY6099(71.5mg，22.48μmol)被用作双环试剂。获得为白色固体的化合物BCY6136(40.9mg，9.05μmol，40.27％产率，97.42％纯度)。
Figure BDA0002639562330000554
Figure BDA0002639562330000555
Figure BDA0002639562330000561
BCY6014(70.00mg，22.47μmol，1.00eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的化合物BCY6033(33.90mg，7.96μmol，34.57％产率)。
Figure BDA0002639562330000562
BCY6029
Figure BDA0002639562330000563
BCY6009(70.0mg，22.47μmol，1eq)被用作双环试剂。得到为白色固体的化合物BCY6029(32.9mg，7.75μmol，33.49％产率)。
Figure BDA0002639562330000564
BCY6122
Figure BDA0002639562330000571
BCY6104(71.59mg，22.48μmol，1.00eq)被用作双环试剂。得到为白色固体的化合物BCY6122(38.30mg，8.57μmol，38.14％产率，98.58％纯度)。
Figure BDA0002639562330000572
BCY6053
Figure BDA0002639562330000573
BCY6018(72.40mg，26.97μmol，1.2eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的化合物BCY6053(38.3mg，9.81μmol，43.65％产率)。
Figure BDA0002639562330000574
Figure BDA0002639562330000581
BCY6049
Figure BDA0002639562330000582
BCY6017(50.75mg，22.48μmol，1.2eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的化合物BCY6049(22.5mg，6.47μmol，34.54％产率)。
Figure BDA0002639562330000583
BCY6037
Figure BDA0002639562330000584
BCY6019(65.00mg，22.47μmol，1.00eq)被用作双环试剂。得到为白色固体的化合物BCY6037(26.80mg，6.66μmol，28.74％产率)。
Figure BDA0002639562330000591
Trp-Cit-MMAE系列
Trp-Cit-MMAE接头
Figure BDA0002639562330000592
Figure BDA0002639562330000601
制备3的通用步骤
Figure BDA0002639562330000602
向化合物2(4.00g，8.67mmol，1.00eq)、DIC(1.61g，12.78mmol，1.97mL，9.00eq)和HOBt(10.54g，78.00mmol，9.00eq)的DMF(30.00mL)溶液中加入(4-氨基苯基)甲醇(9.61g，78.00mmol，9.00eq)。将混合物在15℃下搅拌1小时。LC-MS显示化合物2被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。通过制备型HPLC纯化混合物。获得为白色固体的化合物3(4.20g，7.41mmol，85.49％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 566.9[M+H]<sup>+</sup>
分子量 566.66
制备4的通用步骤
Figure BDA0002639562330000603
在向化合物3(4.20g，6.30mmol，1.00eq)、DIPEA(1.09g，8.40mmol，1.47mL，7.00eq)的DMF(30.00mL)溶液中加入一份(one part)的双(4-硝基苯基)碳酸酯(11.50g，37.79mmol，6.00eq)。将混合物在0-15℃下搅拌1.5小时。LC-MS显示化合物3被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。通过制备型HPLC直接纯化(TFA条件)。获得为白色固体的化合物4(2.00g，2.40mmol，38.16％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 732.0[M+H]<sup>+</sup>
分子量 731.76
制备5的通用步骤
Figure BDA0002639562330000611
在0℃下向化合物4(300.00mg，360.63μmol，1.00eq)、DIEA(93.22mg，721.27μmol，125.97μL，3.00eq)的DMF(10.00mL)溶液中加入MMAE(233.03mg，324.57μmol，0.90eq)和HOBt(48.73mg，360.63μmol，1.00eq)。将混合物在30℃下搅拌18小时。LC-MS显示化合物4被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为黄色固体的化合物5(250.00mg，190.75μmol，52.89％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 1310.5[M+H]<sup>+</sup>
分子量 1310.65
制备6的通用步骤
Figure BDA0002639562330000612
Figure BDA0002639562330000621
向化合物5(240.00mg，183.12μmol，1.00eq)的DCM(10.00mL)溶液中加入TFA(1.54g，13.51mmol，1.00mL，73.76eq)。将混合物在15℃下搅拌2小时。然后将混合物减压浓缩以除去溶剂，得到残余物，将残余物溶于THF中，并加入K2CO3，并在15℃下搅拌2h。LC-MS显示化合物5被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。在减压下浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物。将残余物通过制备型HPLC纯化(中性条件)。粗产物6(125.00mg，94.37μmol，51.53％产率，TFA)无需进一步纯化即可用于下一步。
LCMS(ESI)： m/z 1210.4[M+H]<sup>+</sup>
分子量 1209.53
制备7的通用步骤
Figure BDA0002639562330000622
向化合物6(125.00mg，94.37μmol，1.00eq，TFA)的DMA(5.00mL)溶液中加入DIEA(24.39mg，188.75μmol，32.96μL，2.00eq)，四氢吡喃-2,6-二酮(21.54mg，188.75μmol，2.00eq)。将混合物在15℃下搅拌2小时。LC-MS显示化合物6被完全消耗，并检测到一个具有期望MS的主峰。通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物7(100.00mg，75.49μmol，80.00％产率)。
Figure BDA0002639562330000623
Figure BDA0002639562330000631
制备8的通用步骤(MMAE-PABC-Cit-Trp-戊二酸酯-NHS)
Figure BDA0002639562330000632
向化合物7(100.00mg，75.49μmol，1.00eq)、1-羟基吡咯烷-2，5-二酮(26.07mg，226.48μmol，3.00eq)的DMA(3.00mL)和DCM(1.00mL)溶液中加入EDCI(43.42mg，226.48μmol，3.00eq)。将混合物在15℃下搅拌4小时。LC-MS显示化合物7被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。除去DCM。通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物8(60.00mg，42.20μmol，55.91％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 711.2[M+2H]<sup>2+</sup>
分子量 1421.7
将MMAE-PABC-Cit-Trp-戊二酸酯-NHS与靶向双环偶联的通用步骤
向双环(1.0-1.3eq)的DMA溶液中加入DIEA(3eq)和MMAE-PABC-Cit-Trp-戊二酸酯-NHS(1eq)。将混合物在25℃下搅拌18小时。通过LC-MS监测反应，并且一旦完成，就通过制备型HPLC直接纯化。
BCY6030
Figure BDA0002639562330000633
BCY6009(47.29mg，14.07μmol，1.00eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的化合物BCY6030(0.0156g，3.51μmol，24.93％产率，97.41％纯度)。
Figure BDA0002639562330000634
Figure BDA0002639562330000641
BCY6034
Figure BDA0002639562330000642
BCY6014(88.21mg，23.21μmol，1.10eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的化合物BCY6034(27.70mg，6.05μmol，28.70％产率，95.02％纯度)。
Figure BDA0002639562330000643
BCY6050
Figure BDA0002639562330000644
BCY6017(57.17mg，25.32μmol，1.2eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的化合物BCY6050(0.0519g，14.56μmol，69.01％产率)。
Figure BDA0002639562330000645
BCY6054
Figure BDA0002639562330000651
BCY6018(67.97mg，25.32μmol，1.2eq)被用作双环试剂。得到为白色固体的化合物BCY6054(40.10mg，10.05μmol，47.62％产率)。
Figure BDA0002639562330000652
BCY6038
Figure BDA0002639562330000653
BCY6019(81.39mg，23.21μmol，1.10eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的化合物BCY6038(34.10mg，8.02μmol，38.00％产率，96.68％纯度)。
Figure BDA0002639562330000654
Val-Lys-MMAE系列
Val-Lys-MMAE接头
Figure BDA0002639562330000661
制备化合物2的通用步骤
Figure BDA0002639562330000671
在黑暗中在氮气下，向化合物1(3.00g，5.89mmol，1eq)和(4-氨基苯基)甲醇(869.93mg，7.06mmol，1.2eq)的混合物在DCM(35mL)和MeOH(18mL)溶液中加入EEDQ(2.91g，11.77mmol，2eq)，将混合物在25℃搅拌5小时。LC-MS显示化合物1被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。在减压下浓缩得到的反应混合物，得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330000672
120g
Figure BDA0002639562330000673
Silica Flash Column，0至20％MeOH/DCM洗脱@80mL/min)。获得为白色固体的化合物2(2.2g，3.58mmol，60.79％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 615.0[M+H]<sup>+</sup>
分子量 614.78
制备化合物3的通用步骤
Figure BDA0002639562330000674
向化合物2(500mg，813.31μmol，1eq)的THF(10mL)溶液中加入DIEA(630.69mg，4.88mmol，849.98μL，6eq)，在0℃在氮气下，搅拌30分钟。然后向其中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(1.48g，4.88mmol，6eq)，将混合物在25℃在氮气下搅拌另外21小时。LC-MS显示检测到一个具有期望MS的主峰。在减压下浓缩得到的反应混合物，得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330000675
40g
Figure BDA0002639562330000676
Silica Flash Column，0至20％MeOH/DCM洗脱@40mL/min)。获得为黄色固体的化合物3(500mg，641.13μmol，78.83％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 780.0[M+H]<sup>+</sup>
分子量 779.89
制备化合物4的通用步骤
Figure BDA0002639562330000681
向化合物3(500mg，512.90μmol，1.23eq)的混合物的DMF(8mL)溶液中加入DIEA(135.01mg，1.04mmol，181.95μL，2.5eq)在0℃下搅拌30分钟。然后向其中加入MMAE(300mg，417.84μmol，1eq)和HOBt(84.69mg，626.76μmol，1.5eq)，并将混合物在40℃下搅拌15小时。LC-MS显示化合物3被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。将残余物通过快速C18凝胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330000682
130g
Figure BDA0002639562330000683
C18Flash Column，0至60％MeCN/H2O洗脱@75mL/min)。获得为白色固体的化合物4(330mg，242.87μmol，58.13％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 679.7[M+2H]<sup>2+</sup>
分子量 1358.77
制备化合物5的通用步骤
Figure BDA0002639562330000684
在0℃下向化合物4(325mg，239.19μmol，1eq)的DCM(18mL)溶液中加入TFA(3.03g，26.60mmol，1.97mL，111.22eq)，在25℃下搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物4被完全消耗。然后将反应混合物在减压下浓缩以得到残余物，将残余物溶于THF(10mL)中，并向其中加入K2CO3(661.16mg，4.78mmol，20eq)。将混合物在25℃下搅拌15小时。LC-MS显示检测到一个具有期望MS的主峰。将得到的反应混合物过滤并将滤液在减压下浓缩以得到残余物。将残余物通过快速C18凝胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330000685
130g
Figure BDA0002639562330000686
C18Flash Column，0至60％MeCN/H2O洗脱@75mL/min)。获得为白色固体的化合物5(170mg，135.07μmol，56.47％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 629.7[M+2H]<sup>2+</sup>
分子量 1258.65
制备化合物6的通用步骤
Figure BDA0002639562330000691
使用氮气气球吹扫含有化合物5(140mg，111.23μmol，1eq)的DMA(5mL)溶液的圆瓶，并在0℃下加入DIEA(28.75mg，222.46μmol，38.75μL，2eq)，搅拌10分钟，加入四氢吡喃-2，6-二酮(25.38mg，222.46μmol，2eq)的DMA溶液。将混合物在25℃下搅拌12小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。通过快速C18凝胶色谱法纯化所得到的反应混合物(
Figure BDA0002639562330000692
43g
Figure BDA0002639562330000693
C18Flash Column，0至60％MeCN/H2O洗脱@40mL/min)。获得为白色固体的化合物6(120mg，87.42μmol，78.59％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 686.7[M+2H]<sup>2+</sup>
分子量 1372.75
制备化合物7(MMAE-PABC-Lys(Dde)-Val-戊二酸酯-NHS)的通用步骤
Figure BDA0002639562330000694
Figure BDA0002639562330000701
向化合物6(120mg，87.42μmol，1eq)的DMA(9mL)和DCM(3mL)溶液中加入1-羟基吡咯烷-2，5-二酮(30.18mg，262.25μmol，3eq)，搅拌，并向其中加入EDCI(50.27mg，262.25μmol，3eq)，将混合物在0℃下搅拌30分钟，在25℃下再搅拌19小时。LC-MS显示化合物6被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。将得到的反应混合物在减压下浓缩以除去DCM。将混合物通过快速C18凝胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330000702
43g
Figure BDA0002639562330000703
C18Flash Column，0至60％MeCN/H2O洗脱@40mL/min)。获得为白色固体的化合物7(60mg，40.82μmol，46.70％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 735.3[M+2H]<sup>2+</sup>
分子量 1469.83
MMAE-PABC-Lys(Dde)-Val-戊二酸酯-NHS与靶向双环偶联的通用步骤
Figure BDA0002639562330000704
向双环(1.0-1.3eq)的DMA溶液中加入DIEA(3eq)和MMAE-PABC-Lys(Dde)-Val-戊二酸酯-NHS(1eq)。将混合物在25℃下搅拌18小时。通过LC-MS监测反应，并且一旦完成，就通过制备型HPLC直接纯化。
Dde脱保护的通用步骤
Figure BDA0002639562330000711
向Dde保护的肽(1eq)的DMF溶液中加入水合肼(6500eq)，并将混合物在25℃下搅拌1小时。用LC-MS监测反应，一旦完成后，将混合物通过制备型HPLC纯化，并将干净的级分冻干。
BCY6061
Figure BDA0002639562330000712
BCY6014(124.12mg，40.82μmol，1.2eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的Dde-BCY6038(80mg，18.20μmol，53.51％产率)。
Figure BDA0002639562330000713
Figure BDA0002639562330000721
根据通用步骤，用肼将Dde-BCY6061(78mg，17.75μmol)脱保护，得到为白色固体的BCY6061(47.1mg，11.13μmol，62.73％产率)。
Figure BDA0002639562330000722
BCY6174
Figure BDA0002639562330000723
BCY6099(389.77mg，122.47μmol，1.2eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的Dde-BCY6174(0.250g，55.10μmol，53.99％产率)。
Figure BDA0002639562330000724
Figure BDA0002639562330000731
根据通用步骤，用肼将Dde-BCY6174(0.250g，55.10μmol，1.0eq)脱保护，得到为白色固体的BCY6174(0.1206g，27.45μmol，49.82％产率)。
Figure BDA0002639562330000732
D-Trp-Cit-MMAE系列
D-Trp-Cit-MMAE接头
Figure BDA0002639562330000733
Figure BDA0002639562330000741
制备化合物3的通用步骤
Figure BDA0002639562330000742
向化合物1(2g，4.33mmol，1.00eq)、DIC(4.92g，39.00mmol，6.00mL，9.00eq)、HOBt(5.27g，39.00mmol，9.00eq)的DMF(30.00mL)溶液中加入(4-氨基苯基)甲醇(4.80g，39.00mmol，9.00eq)。将混合物在15℃下搅拌1小时。LC-MS显示化合物1被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物2(2g，3.53mmol，81.45％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 666.9[M+H]<sup>+</sup>
分子量 666.78
制备化合物4的通用步骤
Figure BDA0002639562330000751
在0℃下向化合物2(2g，3.00mmol，1eq)、DIEA(2.71g，21.00mmol，3.66mL，7eq)的DMF(20mL)溶液中加入一份中的双(4-硝基苯基)碳酸酯(5.48g，18.00mmol，6eq)。将混合物在0-15℃下搅拌2小时。LC-MS显示化合物2被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为黄色固体的化合物3(0.9g，1.08mmol，36.07％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 832.0[M+H]<sup>+</sup>
分子量 831.88
制备化合物5的通用步骤
Figure BDA0002639562330000752
在0℃下向化合物3(350mg，420.74μmol，1.00eq)、HOBt(56.85mg，420.74μmol，1eq)和DIEA(163.13mg，1.26mmol，219.86μL，3eq)的DMF(10mL)溶液中加入MMAE(302.08mg，420.74μmol，1eq)。将混合物在40℃搅拌18小时。LC-MS显示化合物4被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为黄色固体的化合物4(0.22g，155.95μmol，37.06％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 1410.5[M+H]<sup>+</sup>,705.7[M+2H]<sup>2+</sup>
分子量 1410.76
制备化合物6的通用步骤
Figure BDA0002639562330000761
向化合物4(0.21g，148.86μmol，1eq)的DCM(9mL)溶液中加入TFA(1.54g，13.51mmol，1mL，90.73eq)。将混合物在15℃下搅拌4h，并在减压下浓缩，得到残余物，将其溶于THF中，然后加入K2CO3(s)，并在15℃下搅拌16h。LC-MS显示化合物4被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。过滤反应混合物，并在减压下浓缩，得到残余物。将残余物通过制备型HPLC纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物5(0.13g，102.02μmol，68.54％产率，95％纯度)。
LCMS(ESI)： m/z 1210.4[M+H]<sup>+</sup>,605.8[M+2H]<sup>2+</sup>
分子量 1210.53
制备化合物7的通用步骤
Figure BDA0002639562330000771
向化合物5(0.12g，99.13μmol，1eq)的DMA(5mL)溶液中加入DIEA(38.44mg，297.40μmol，51.80μL，3eq)和四氢吡喃-2,6-二酮(22.62mg，198.26μmol，2eq)。将混合物在15℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物6(0.09g，67.94μmol，68.54％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 662.7[M+2H]<sup>2+</sup>
分子量 1324.63
制备化合物8的通用步骤
Figure BDA0002639562330000772
向化合物6(0.09g，67.95μmol，1eq)、HOSu(23.46mg，203.84μmol，3eq)的DMA(6mL)和DCM(2mL)溶液中加入EDCI(39.08mg，203.84μmol，3eq)。将混合物在15℃下搅拌16h。LC-MS显示化合物6被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。除去DCM，并通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物7(0.06g，40.09μmol，59.01％产率，95％纯度)。
LCMS(ESI)： m/z 711.2[M+2H]<sup>2+</sup>
分子量 1421.7
BCY6062
向BCY6014(76.99mg，25.32μmol，1.2eq)的DMA(5mL)溶液中加入DIEA(8.18mg，63.31μmol，11.03μL，3eq)、化合物7(0.03g，21.10μmol，1eq)。将混合物在15℃下搅拌16小时。通过LC-MS监测反应，一旦完成，将混合物通过制备型HPLC纯化。获得为白色固体的BCY6062(0.0255g，5.70μmol，27.01％产率，97.15％纯度)。
Figure BDA0002639562330000781
DM1系列
DM1-SS-系列
DM1-SPDP-TFP接头
Figure BDA0002639562330000782
SPDB
Figure BDA0002639562330000791
向2-(2-吡啶基二硫烷基)吡啶(12.37g，56.18mmol，1.50eq)的EtOH(100.00mL)溶液中加入4-硫烷基丁酸(4.50g，37.45mmol，1.00eq)。将混合物在N2下在15℃下搅拌18小时。LC-MS显示化合物1被完全消耗，检测到一个具有期望质量的主峰。在减压下浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物。通过制备型HPLC(C18360g，中性条件)纯化残余物。获得为黄色固体的化合物SPDB(1.9g，8.29mmol，22.12％产率)。
1H NMR:ES6446-8-P1A400MHz CDCl3
δppm 1.98(q,J＝7.09Hz,2H),2.45(t,J＝7.15Hz,2H),2.79(t,J＝7.03Hz,2H),7.03(dd,J＝7.15,4.89Hz,1H),7.19(s,1H),7.56-7.65(m,2H),8.41(d,J＝4.52Hz,1H)。
LCMS(ESI)： m/z 230.0[M+H]<sup>+</sup>
分子量 229.31
DM1-SPDB
Figure BDA0002639562330000792
在氮气下将DM1(250.00mg，338.62μmol，1.00eq)和4-(2-吡啶基二硫烷基)丁酸(100.95mg，440.21μmol，1.30eq)的混合物加入50mL烧瓶中，装有DMF(10.00mL)的烧瓶用N2吹扫30分钟。将混合物在室温搅拌1小时。LC-MS显示DM1已完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。残余物通过快速C18凝胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330000793
120g
Figure BDA0002639562330000794
C18FlashColumn，0至60％MeCN/H2O洗脱@85mL/min)。获得为白色固体的DM1-SPDB(120.00mg，140.11μmol，41.38％产率)。
Figure BDA0002639562330000795
DM1-SPDB-TFP
Figure BDA0002639562330000801
向DM1-SPDB(120.00mg，140.11μmol，1.00eq)和2,3,5,6-四氟苯酚(69.81mg，420.34μmol，3.00eq)的DCM(1.00mL)和DMA(3.00mL)溶液中加入EDCI(80.58mg，420.34μmol，3.00eq)。将混合物在15℃下搅拌4小时。LC-MS显示DM1-SPDB已完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。除去DCM，残余物、混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。得到为白色固体的化合物DM1-SPDB-TFP(60.00mg，59.73μmol，42.63％产率)。
LCMS(ESI)： m/z 985.9[M+H-H<sub>2</sub>O]<sup>+</sup>
分子量 1004.5
将DM1-SPDB-TFP与靶向双环偶联的通用步骤
向靶向双环(1.1-1.3eq)的DMA溶液中加入DIEA(3eq)和DM1-SPDB-TFP(1eq)。将混合物在25℃下搅拌18小时。通过LC-MS监测反应，一旦完成，将混合物通过制备型HPLC直接纯化。
BCY6135
Figure BDA0002639562330000802
BCY6099(114.1mg，35.84μmol)被用作双环试剂。获得为白色固体的22.4mg化合物BCY6135(5.30μmol，17.74％产率，95.14％纯度)。
Figure BDA0002639562330000803
Figure BDA0002639562330000811
BCY6031
Figure BDA0002639562330000812
BCY6014(121.07mg，39.82μmol)被用作双环试剂。获得为白色固体的59.90mg化合物BCY6031(14.67μmol，36.85％产率，95.02％纯度)。
Figure BDA0002639562330000813
BCY6134
Figure BDA0002639562330000814
BCY6104(95.11mg，29.87μmol，1eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6134(0.0232g，5.64μmol，18.89％收率，97.82％纯度)。
Figure BDA0002639562330000815
BCY6027
Figure BDA0002639562330000821
BCY6009(60.24mg，19.91μmol，1.00eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6027(20.40mg，5.11μmol，25.69％收率，96.88％纯度)。
Figure BDA0002639562330000822
BCY6047
Figure BDA0002639562330000823
BCY6017(61.81mg，27.38μmol，1.1eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6047(0.032g，10.34μmol，41.53％产率)。
Figure BDA0002639562330000824
BCY6035
Figure BDA0002639562330000831
BCY6019(115.22mg，32.86μmol，1.10eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6035(37.80mg，10.37μmol，34.73％产率)。
Figure BDA0002639562330000832
BCY6051
Figure BDA0002639562330000833
BCY6018(73.48mg，27.38μmol，1.1eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6051(0.0582g，16.52μmol，66.39％收率)。
Figure BDA0002639562330000834
BCY6154
Figure BDA0002639562330000841
BCY6152(93.17mg，29.87μmol，1eq)被用作双环试剂。得到为白色固体的BCY6154(40.10mg，9.93μmol，33.27％产率，98.06％纯度)。
Figure BDA0002639562330000842
BCY6155
Figure BDA0002639562330000843
BCY6153(82.55mg，29.87μmol，1eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6155(0.0312g，8.55μmol，28.62％产率，98.69％纯度)。
Figure BDA0002639562330000844
DM1-SS(SO3H)-系列
DM1-SPDP(SO3H)-NHS接头
Figure BDA0002639562330000851
化合物2
Figure BDA0002639562330000852
向4-硫烷基丁酸(2.0g，16.64mmol，1eq)和2-(2-吡啶基二硫烷基)吡啶(11.0g，49.93mmol，3eq)的EtOH(50mL)溶液中加入AcOH(1.05g，17.48mmol，1mL，1.05eq)。将混合物在N2下在40℃下搅拌16小时。LC-MS显示检测到一个具有期望质量的主峰，TLC表明4-硫烷基丁酸被完全消耗。在减压下浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物。将残余物通过制备型HPLC纯化(中性条件)。获得为黄色固体的化合物2(2.0g，8.72mmol，52.4％产率)。
1H NMR:400MHz CDCl3
δppm 2.03-2.11(m,2H),2.54(t,J＝7.20Hz,2H),2.88(t,J＝7.20Hz,2H),7.11-7.14(m,1H),7.67-7.74(m,2H),8.50(d,J＝4.80Hz,1H)。
LCMS(ESI)： 230[M+H]<sup>+</sup>
分子量 229.31
化合物3
Figure BDA0002639562330000861
向化合物2(0.5g，2.18mmol，1eq)的DCE(5mL)溶液中加入分成三份的氯磺酸(1.5g，13.08mmol，0.89mL，6eq)和分成两份的DIEA(1.13g，8.72mmol，1.52mL，4eq)。将混合物在75℃下搅拌2小时。LC-MS显示化合物2被完全消耗，检测到一个具有期望质量的主峰。通过加入3mL H2O淬灭反应混合物，并除去DCE。将残余物、混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为浅黄色油的化合物3(0.68g，1.76mmol，80.6％产率，80％纯度)。
1H NMR:400MHz CDCl3
δppm 2.49-2.54(m,2H),3.63-3.67(m,2H),3.90(t,J＝6.60Hz,2H),7.09-7.12(m,1H),7.66-7.76(m,2H),8.47(dd,J＝4.80Hz,0.80Hz,1H),8.56(s,1H)。
LCMS(ESI)： 310.0[M+H]<sup>+</sup>
分子量 309.37
DM1-SO3H-SPDB
Figure BDA0002639562330000862
向DM1(1.0g，1.35mmol，1eq)和化合物3(502.9mg，1.63mmol，1.2eq)的DMF(10mL)溶液中加入NaHCO3(aq)直至pH达到8。在25℃下搅拌混合物1小时。LC-MS显示DM1已完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。将残余物、混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物DM1-SO3H-SPDB(0.28g，299.0μmol，22.1％产率)。
LCMS(ESI)： 918.2[M+H-H<sub>2</sub>O]<sup>+</sup>
分子量 936.50
DM1-SO3H-SPDB-NHS
Figure BDA0002639562330000871
向DM1-SO3H-SPDB(103.2mg，896.95μmol，3eq)、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(103.2mg，896.95μmol，3eq)的DMA(6mL)和DCM(2mL)溶液中加入EDCI(171.9mg，896.95μmol，3eq)。将混合物在25℃下搅拌16小时。LC-MS显示DM1-SO3H-SPDB已完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。除去DCM。将残余物、混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物DM1-SO3H-SPDB-NHS(0.22g，212.85μmol，71.2％产率)。
LCMS(ESI)： 1015.2[M+H-H<sub>2</sub>O]<sup>+</sup>
分子量 1033.57
DM1-SO3H-SPDB-NHS与靶向双环偶联的通用步骤
向靶向双环(1.1-1.3eq)的DMA溶液中加入DIEA(3eq)和DM1-SO3H-SPDB-NHS(1eq)。将混合物在25℃下搅拌16小时。通过LC-MS监测反应，一旦完成，将混合物通过制备型HPLC直接纯化。
BCY6173
Figure BDA0002639562330000872
BCY6099(200.15mg，62.89μmol)被用作双环试剂。得到为白色固体的57.1mg化合物BCY6173(3.40μmol，22.79％产率，95.80％纯度)。
Figure BDA0002639562330000873
Figure BDA0002639562330000881
BCY6082
Figure BDA0002639562330000882
BCY6014(711.9mg，234.14μmol)被用作双环试剂。获得为白色固体的308mg化合物BCY6082(74.97μmol，35.2％产率，96.36％纯度)。
Figure BDA0002639562330000883
BCY6150
Figure BDA0002639562330000884
BCY6018(77.91mg，29.03μmol，1eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6150(0.0249g，6.61μmol，22.78％产率)。
Figure BDA0002639562330000885
Figure BDA0002639562330000895
BCY6151
Figure BDA0002639562330000891
BCY6104(120.17mg，37.73μmol，1.3eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6151(0.0256g，6.16μmol，21.22％产率)。
Figure BDA0002639562330000892
BCY6162
Figure BDA0002639562330000893
BCY6138(82.80mg，26.61μmol，1.1eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6162(0.0362g，8.98μmol，37.13％产率)。
Figure BDA0002639562330000894
BCY6161
Figure BDA0002639562330000901
BCY6137(79.67mg，24.48μmol，1.1eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6161(0.0232g，5.26μmol，21.76％产率)。
Figure BDA0002639562330000902
DM1-SS-Me系列
DM1-SS-Me接头
Figure BDA0002639562330000903
SPP
Figure BDA0002639562330000911
向2-(2-吡啶基二硫烷基)吡啶(2.46g，11.18mmol，1.50eq)和AcOH(1.05g，17.49mmol，1.00mL，2.35eq)的EtOH(50.00mL)溶液中加入4-硫烷基戊酸(1.00g，7.45mmol，1.00eq)。将混合物在N2下在40℃下搅拌18小时。LC-MS显示化合物1被完全消耗，检测到一个具有期望质量的主峰。在减压下浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物。将残余物通过制备型HPLC纯化(中性条件)。获得为黄色固体的化合物SPP(1.61g，6.62mmol，88.81％产率)。
1H NMR:400MHz DMSO-d6
δppm 1.36(d,J＝6.78Hz,3H),1.88-2.07(m,2H),2.56(td,J＝7.53,1.76Hz,2H),3.00-3.09(m,1H),7.11(ddd,J＝7.34,4.96,1.00Hz,1H),7.66(td,J＝7.78,1.76Hz,1H),7.73-7.77(m,1H),8.48(dt,J＝4.02,0.88Hz,1H)。
LCMS(ESI)： 243.8[M+H]<sup>+</sup>
分子量 243.34
DM1-SPP
Figure BDA0002639562330000912
使用NaHCO3(aq)调节DM1(200mg，270.90μmol，1.00eq)、4-(2-吡啶基二硫烷基)戊酸(98.89mg，406.35μmol，1.50eq)的水(5.00mL)溶液为pH＝8。将混合物在15℃下搅拌1小时。LC-MS显示DM1已完全消耗，并且检测到一个具有期望质量的主峰(主MS为M+1-18)。将混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物DM1-SPP(120mg，137.86μmol，50.89％产率)。
LCMS(ESI)： 852.0[M+H-H<sub>2</sub>O]<sup>+</sup>
分子量 870.47
DM1-SPP-TFP
Figure BDA0002639562330000921
向DM1-SPP(0.175g，201.04μmol，1.0eq)、2,3,5,6-四氟苯酚(100.16mg，603.13μmol，3.0eq)的DCM(1.0mL)和DMA(3.0mL)溶液中加入EDCI(115.62mg，603.13μmol，3.0eq)。将混合物在15℃下搅拌12小时。LC-MS显示DM1-SPP已完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰。除去DCM，并将残余物通过制备型HPLC纯化(中性条件)。得到为白色固体的化合物DM1-SPP-TFP(0.123g，120.76μmol，60.07％产率)。
LCMS(ESI)： 999.9[M+H-H<sub>2</sub>O]<sup>+</sup>
分子量 1018.53
将DM1-SPP-TFP与靶向双环偶联的通用步骤
向靶向双环(1.1-1.3eq)的DMA溶液中加入DIEA(3eq)和DM1-SPP-TFP(1eq)。将混合物在25℃下搅拌16小时。通过LC-MS监测反应，一旦完成，将混合物通过制备型HPLC直接纯化。
BCY6032
Figure BDA0002639562330000922
向DM1-SPP(30.00mg，34.46μmol，1.00eq)的DMF(5.00mL)溶液中加入DIEA(13.36mg，103.38μmol，18.05μL，3.00eq)和HATU(13.10mg，34.46μmol，1.00eq)。1小时后，加入BCY6014(104.79mg，34.46μmol，1.00eq)，并将混合物在15℃下搅拌2小时。LC-MS显示剩余40％的DM1-SPP。在LC-MS上观察到几个新峰，检测到20％期望化合物。将混合物通过制备型HPLC(TFA条件)直接纯化。得到为白色固体的化合物BCY6032(10.00mg，2.57μmol，7.45％产率)。
Figure BDA0002639562330000923
Figure BDA0002639562330000931
BCY6052
Figure BDA0002639562330000932
BCY6018(86.96mg，32.40μmol，1.1eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6052(32.30mg，9.13μmol，31.01％产率)。
Figure BDA0002639562330000933
BCY6048
Figure BDA0002639562330000941
BCY6017(66.50mg，29.45μmol，1.2eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6048(40.80mg，13.12μmol，53.45％产率)。
Figure BDA0002639562330000942
BCY6036
Figure BDA0002639562330000943
Figure BDA0002639562330000951
BCY6019(113.60mg，32.40μmol，1.10eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的(53.20mg，14.00μmol，47.54％产率，96.26％纯度)。
Figure BDA0002639562330000952
BCY6028
Figure BDA0002639562330000953
BCY6009(99.00mg，29.45μmol，1.00eq)被用作双环试剂。获得为白色固体的BCY6028(24.30mg，6.05μmol，20.56％产率，96.61％纯度)。
Figure BDA0002639562330000961
二硫化物接头(各种阻碍)
BCY6039(DM1-Me-SS-Me-双环)
Figure BDA0002639562330000962
Figure BDA0002639562330000971
化合物2A
Figure BDA0002639562330000972
向2-(2-吡啶基二硫烷基)吡啶(2.46g，11.18mmol，1.50eq)和AcOH(1.05g，17.49mmol，1.00mL，2.35eq)的EtOH(50.00mL)溶液中加入4-硫烷基戊酸(1A)(1.00g，7.45mmol，1.00eq)。将混合物在N2下在40℃下搅拌18小时。LC-MS显示1A已完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。在减压下浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过制备型HPLC纯化(中性条件)。获得为浅黄色固体的化合物2A(1.61g，6.62mmol，88.81％产率)。
LCMS(ESI)： 243.9[M+H]<sup>+</sup>
分子量 243.34
化合物3A
Figure BDA0002639562330000973
向2A(0.01g，41.09μmol，1.00eq)、1-羟基吡咯烷2,5-二酮(14.19mg，123.28μmol，3.00eq)的DMA(1mL)溶液加入EDCI(23.63mg，123.28μmol，3.00eq)。将混合物在15℃下搅拌16小时。LC-MS显示2A已完全消耗，检测到一个具有期望质量的主峰。将残余物通过制备型HPLC纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物3A(0.011g，32.31μmol，78.63％产率)。
LCMS(ESI)： 340.8[M+H]<sup>+</sup>
分子量 340.41
化合物4A
Figure BDA0002639562330000981
向BCY6014(98.25mg，32.31μmol，1.00eq)的DMA(3mL)溶液中加入DIEA(8.26mg，64.62μmol，11.26μL，2.00eq)和3A(0.011g，32.31μmol，1.00eq)。将混合物在15℃下搅拌18小时。LC-MS显示3A被完全消耗，检测到一个具有期望质量的主峰。混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物4A(0.04g，12.25μmol，37.90％产率)。
LCMS(ESI)： 1088.7[M+3H]<sup>3+</sup>,816.5[M+4H]<sup>4+</sup>
分子量 3264.88
化合物5A
Figure BDA0002639562330000982
向4A(0.04g，12.25μmol，1.00eq)的MeCN(4mL)和水(2mL)溶液中加入TCEP(4.21mg，14.70μmol，4.05μL，1.20eq)。将混合物在15℃下搅拌1小时。LC-MS显示4A已完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。将残余物通过制备型HPLC纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物5A(0.035g，11.09μmol，90.53％产率)。
LCMS(ESI)： 1052.2[M+3H]<sup>3+</sup>
分子量 3155.73
DM3-SPy
Figure BDA0002639562330000983
向4-(2-吡啶基二硫烷基)戊酸(2A)(22.46mg，92.29μmol，1.20eq)、HATU(35.09mg，92.29μmol，1.20eq)、DIEA(29.82mg，230.71μmol，40.19μL，3.00eq)的DMF(5mL)溶液中加入1B(0.05g，76.90μmol，1.00eq)。将混合物在15℃下搅拌1小时。LC-MS显示1B已完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。将残余物通过制备型HPLC纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物DM3-SPy(0.025g，28.56μmol，37.13％产率)。
LCMS(ESI)： 875.1[M+H]<sup>+</sup>
分子量 875.49
BCY6039
Figure BDA0002639562330000991
使用NaHCO3(aq)将DM3-SPy(0.015g，17.13μmol，1.00eq)和5A(54.08mg，17.13μmol，1.00eq)的DMF(3mL)溶液调节至pH＝8。将混合物在15℃下搅拌1小时。LC-MS显示DM3-SPy已完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。将混合物通过制备型HPLC直接纯化(TFA条件)。获得为白色固体的化合物BCY6039(0.0263g，6.58μmol，38.39％产率)。
Figure BDA0002639562330000992
BCY6055(DM1-SS-Me2-双环)
Figure BDA0002639562330000993
Figure BDA0002639562330001001
化合物2
Figure BDA0002639562330001002
使用1N NaOH溶液将化合物1(0.045g，126.96μmol，1eq)的H2O(1mL)溶液调节至pH＝13。将混合物在15℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物1被完全消耗，检测到一个具有期望质量的主峰。将残余物通过制备型HPLC纯化(中性条件)。获得为黄色固体的化合物2(0.03g，116.56μmol，91.81％产率)。
LCMS(ESI)： 257.9[M+H]<sup>+</sup>
分子量 257.37
化合物3
Figure BDA0002639562330001003
将化合物2(0.03，116.56μmol，1.0eq)和DM1(111.87mg，151.53μmol，1.3eq)的DMF(5mL)溶液在15℃下搅拌2小时。LC-MS显示DM1已完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。将混合物通过制备型HPLC直接纯化(NH4HCO3条件)。获得为白色固体的化合物3(0.05g，56.53μmol，48.50％产率)。
LCMS(ESI)： 866.0[M+H-H<sub>2</sub>O]<sup>+</sup>
分子量 884.49
化合物4
Figure BDA0002639562330001011
向化合物3(0.05g，56.53μmol，1.0eq)和2,3,5,6-四氟苯酚(28.16mg，169.59μmol，3.0eq)的DMA(3mL)和DCM(1mL)溶液中加入EDCI(32.51mg，169.59μmol，3eq)。将混合物在15℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物3被完全消耗，检测到一个具有期望质量的主峰。除去DCM，并将混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物4(0.03g，29.05μmol，51.40％产率)。
LCMS(ESI)： 1014.0[M+H-H<sub>2</sub>O]<sup>+</sup>
分子量 1032.55
BCY6055
Figure BDA0002639562330001012
向BCY6014(106.01mg，34.87μmol，1.2eq)的DMA(3mL)溶液中加入DIEA(11.27mg，87.16μmol，15.18μL，3.0eq)和化合物4(0.03g，29.05μmol，1.0eq)。将混合物在15℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物4被完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。将混合物通过制备型HPLC直接纯化(TFA条件)。
获得为白色固体的化合物BCY6055(0.0352g，9.01μmol，31.01％产率)。
Figure BDA0002639562330001013
Figure BDA0002639562330001021
BCY6077(DM1-SS-Me-(SO3H)-双环)
Figure BDA0002639562330001022
制备化合物2的通用步骤
Figure BDA0002639562330001031
向化合物1(0.1g，410.94μmol，1eq)的1,2-二氯乙烷(3mL)溶液中分三份加入氯磺酸(0.86g，7.38mmol，491.43μL，17.96eq)和分两份加入DIEA(318.67mg，2.47mmol，429.47μL，6eq)。将混合物在75℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物1被完全消耗，并且检测到具有期望MS的一个主峰MS324，副产物MS221的一个主峰为PySSPy。除去溶剂并将其溶解于H2O/MeCN＝15/1。通过制备型HPLC直接纯化(中性条件：MeCN/H2O)。获得为黄色油的化合物2(0.055g，170.06μmol，41.38％产率)。
LCMS(ESI)： 323.6[M+H]<sup>+</sup>
分子量 323.4
制备DM1-SO3H-SPP的通用步骤
Figure BDA0002639562330001032
使用NaHCO3(aq)将DM1(113.00mg，153.06μmol，1.1eq)、化合物2(0.045g，139.14μmol，1eq)的DMF(2mL)溶液调节为PH＝8。在15℃下搅拌混合物1小时。LC-MS显示DM1已完全消耗，并且检测到一个具有期望MS的主峰。通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物DM1-SO3H-SPP(0.075g，78.90μmol，56.71％产率)。
LCMS(ESI)： 931.9[M+H-H2O]<sup>+</sup>
分子量 950.52
制备DM1-SO3H-SPP-NHS的通用步骤
Figure BDA0002639562330001041
向DM1-SO3H-SPP(0.06g，63.12μmol，1eq)、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(7.99mg，69.43μmol，1.1eq)的DMA(1.5mL)和DCM(0.5mL)溶液中加入EDCI(13.31mg，69.43μmol，1.1eq)。将混合物在15℃下搅拌18小时。LC-MS显示DM1-SO3H-SPP已完全消耗，并检测到一个具有期望MS的主峰。通过制备型HPLC直接纯化(中性条件：MeCN/H2O)。获得为白色固体的化合物DM1-SO3H-SPP-NHS(0.045g，42.96μmol，68.05％产率)。
LCMS(ESI)： 984[M-NHS+K]<sup>+</sup>
分子量 1047.6
制备BCY6077的通用步骤
向BCY6014(101.58mg，33.41μmol，1eq)的DMA(1mL)溶液中加入DIEA(12.95mg，100.23μmol，17.46μL，3eq)和DM1-SO3H-SPP-TFP(0.035g，33.41μmol，1eq)。将混合物在15℃下搅拌16小时。LC-MS显示DM1-SO3H-SPP-TFP已被完全消耗，并检测到一个具有期望MS的主峰。通过制备型HPLC直接纯化(TFA条件)。得到为白色固体的化合物BCY6077(41.30mg，10.03μmol，30.01％产率，96.44％纯度)。
Figure BDA0002639562330001042
非可裂解的系列
BCY6063(MMAE)
Figure BDA0002639562330001043
Figure BDA0002639562330001051
戊二酸酯-MMAE
Figure BDA0002639562330001052
向MMAE(0.2g，278.56μmol，1.0eq)的DMA(3mL)溶液中加入DIEA(108.01mg，835.68μmol，145.56μL，3.0eq)和四氢吡喃-2,6-二酮(63.57mg，557.12μmol，2.0eq)。将混合物在15℃下搅拌16小时。LC-MS显示MMAE已完全消耗，检测到一个具有期望质量的主峰。将该混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物戊二酸酯-MMAE(0.12g，144.22μmol，51.77％产率)。
LCMS(ESI)： 832.3[M+H]<sup>+</sup>
分子量 832.09
戊二酸酯-MMAE-NHS
Figure BDA0002639562330001053
Figure BDA0002639562330001061
向戊二酸酯-MMAE(0.12g，144.22μmol，1.0eq)、1-羟基吡咯烷-2，5-二酮(49.79mg，432.65μmol，3.0eq)的DMA(3mL)和DCM(1mL)溶液中加入EDCI(82.94mg，432.65μmol，3.0eq)。将混合物在15℃下搅拌16小时。LC-MS显示戊二酸酯-MMAE被完全消耗，并且检测到一个具有期望质量的主峰。将混合物通过制备型HPLC直接纯化(TFA条件)。获得为白色固体的化合物戊二酸酯-MMAE-NHS(0.055g，59.19μmol，41.04％产率)。
LCMS(ESI)： 929.2[M+H]<sup>+</sup>
分子量 929.17
BCY6063
Figure BDA0002639562330001062
向BCY6014(98.17mg，32.29μmol，1.2eq)的DMA(2mL)溶液中加入DIEA(10.43mg，80.72μmol，14.06μL，3eq)和戊二酸酯-MMAE-NHS(0.025g，26.91μmol，1eq)。将混合物在15℃下搅拌16小时。LC-MS显示戊二酸酯-MMAE-NHS被完全消耗，并且检测到一个具有期望质量的主峰。将混合物通过制备型HPLC直接纯化(TFA条件)。获得为白色固体的化合物BCY6063(32.10mg，8.33μmol，30.95％产率)。
Figure BDA0002639562330001063
BCY6064(DM1)
Figure BDA0002639562330001071
化合物1
Figure BDA0002639562330001072
向DM1(0.1g，135.45μmol，1eq)、3-[(2-溴乙酰基)氨基]丙酸(34.14mg，162.54μmol，1.2eq)的DMF(5mL)溶液中加入TEA(41.12mg，406.35μmol，56.56μL，3eq)。将混合物在15℃下搅拌1小时。LC-MS显示DM1已完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。将混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。得到为白色固体的化合物1(0.08g，92.23μmol，68.09％产率)。
LCMS(ESI)： 849.1[M+H-H<sub>2</sub>O]<sup>+</sup>
分子量 867.41
化合物2
Figure BDA0002639562330001073
向化合物1(0.08g，92.23μmol，1eq)、2,3,5,6-四氟苯酚(45.95mg，276.69μmol，3eq)的DMA(3mL)和DCM(1mL)溶液中加入EDCI(53.04mg，276.69μmol，3eq)。将混合物在15℃下搅拌4小时。LC-MS显示化合物1被完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。将混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。
获得为白色固体的化合物2(0.06g，59.09μmol，产率64.06％)。
LCMS(ESI)： 997.0[M+H-H<sub>2</sub>O]<sup>+</sup>
分子量 1015.46
BCY6064
Figure BDA0002639562330001081
向BCY6014(107.79mg，35.45μmol，1.2eq)的DMA(3mL)溶液中加入DIEA(11.45mg，88.63μmol，15.44μL，3.0eq)和化合物2(0.030g，29.54μmol，1eq)。将混合物在15℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物2被完全消耗，并检测到一个具有期望质量的主峰。将混合物通过制备型HPLC直接纯化(TFA条件)。
获得为白色固体的化合物BCY6064(28.40mg，7.30μmol，24.71％产率)。
Figure BDA0002639562330001082
BCY6105
Figure BDA0002639562330001083
Figure BDA0002639562330001091
制备化合物2的通用步骤
在黑暗中向化合物1(3.5g，5.68mmol，1.0eq)的DCM(20mL)和MeOH(10mL)溶液中加入(4-氨基苯基)甲醇(978.5mg，7.95mmol，1.4eq)和EEDQ(2.81g，11.35mmol，2.0eq)，将混合物在25℃下搅拌18小时。LC-MS显示化合物1被完全消耗，并且检测到一个具有期望MS的主峰([M+H+]＝722.0)。在减压下浓缩得到的反应混合物，得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330001092
220g
Figure BDA0002639562330001093
Silica Flash Column，0至10％甲醇/二氯甲烷洗脱@80mL/min)。获得为黄色固体的化合物2(3.0g，4.16mmol，73.2％产率)。
制备化合物3的通用步骤
向化合物2(2.5g，3.46mmol，1.0eq)的THF(30mL)溶液中加入DIEA(2.69g，20.78mmol，3.62mL，6.0eq)和二(4-硝基苯基)碳酸酯(6.32g，20.78mmol，6.0eq)，并将混合物在25℃下搅拌16小时。TLC指示化合物2已完全消耗，形成了一个新斑点。根据TLC，反应完全。在减压下浓缩反应混合物，得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330001094
220g
Figure BDA0002639562330001095
Silica Flash Column，0至5％甲醇/二氯甲烷洗脱@100mL/min)。获得为黄色固体的化合物3(2.2g，2.48mmol，71.6％产率)。
制备化合物4的通用步骤
向化合物3(0.3g，338.24umol，1.0eq)的DMF(5mL)溶液中加入HOBt(50.3mg，372.06umol，1.1eq)、DIEA(131.1mg，1.01mmol，176.7μL，3.0eq)和MMAE(218.6mg，304.42umol，0.9eq)。将混合物在40℃下搅拌16小时。LC-MS显示一个具有期望MS的峰([M+H+]＝1466.4，[M+2H+]/2＝733.2)。然后将反应混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)，得到为白色固体的化合物4(0.2g，136.44umol，40.3％产率)。
制备化合物5的通用步骤
首先将化合物4(0.175g，119.39umol，1.0eq)溶解在TFA(1.8mL)中，然后加入三异丙基硅烷(13.5g，85.20mmol，17.5mL，713.7eq)。将混合物在0℃下搅拌30分钟。LC-MS显示出一个具有期望MS的峰([M+H+]＝1123.4，[M+2H+]/2＝562.2)。在减压下浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物。将残余物通过制备型HPLC纯化(中性条件)。获得为黄色固体的化合物5(0.1g，89.02umol，74.6％产率)。
制备化合物6的通用步骤
向化合物5(0.07g，62.31umol，1.0eq)的DMA(1.0mL)溶液中加入DIEA(24.2mg，186.94umol，32.6μL，3.0eq)和四氢吡喃-2,6-二酮(14.2mg，124.62umol，2.0eq)。将混合物在25℃下搅拌2小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗，并且检测到一个具有期望MS的主峰([M+H+]＝1237.4，[M+2H+]/2＝619.3)。然后将反应混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)，得到为浅黄色固体的化合物6(0.04g，32.32umol，51.8％产率)。
制备化合物7的通用步骤
向化合物6(0.04g，32.32umol，1.0eq)、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(11.2mg，96.97umol，3.0eq)的DMA(3.0mL)和DCM(1.0mL)溶液中加入EDCI(18.6mg，96.97umol，3.0eq)。将混合物在25℃下搅拌18小时。LC-MS显示化合物6被完全消耗，并且检测到具有期望MS的一个主峰([M+H+]＝1334.5，[M+2H+]/2＝667.7)。然后将反应混合物通过制备型HPLC直接纯化(TFA条件)，得到为白色固体的化合物7(0.025g，18.73umol，57.9％产率)。
制备BCY6105的通用步骤
向BCY6014(82.0mg，26.98umol，1.2eq)的DMA(4mL)溶液中加入DIEA(8.7mg，67.44umol，11.7μL，3.0eq)和化合物7(0.03g，22.48umol，1.0eq)。将混合物在25℃下搅拌18小时。LC-MS显示化合物7被完全消耗，并且检测到一个具有期望MS的主峰([M+4H+]/4＝1065.2)。然后将反应混合物通过制备型HPLC直接纯化(TFA条件)。获得为白色固体的化合物BCY6105(0.024g，5.41umol，24.1％产率，96.06％纯度)。
BCY6106
Figure BDA0002639562330001111
Figure BDA0002639562330001121
制备化合物2的通用步骤
向化合物1(5.0g，10.67mmol，1.0eq)的DCM(30mL)和MeOH(10mL)溶液中加入EEDQ(5.28g，21.34mmol，2.0eq)和(4-氨基苯基)甲醇(2.63g，21.34mmol，2.0eq)。将混合物在20℃下搅拌18小时。LC-MS显示化合物1被完全消耗，并检测到一个具有期望MS的主峰(期望m/z＝574，而Boc基团脱落和部分脱落分别对应于m/z＝474和518)。在减压下浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物。将残余物通过制备型HPLC纯化(中性条件)。获得为黄色固体的化合物2(3.7g，6.45mmol，60.4％产率)。
制备化合物3的通用步骤
向化合物2(3.4g，5.93mmol，1.0eq)的DMF(20mL)溶液中加入一份DIEA(5.36g，41.49mmol，7.23mL，7.0eq)和二(4-硝基苯基)碳酸酯(10.82g，35.56mmol，6.0eq)。将混合物在25℃下搅拌2小时。LC-MS显示一个具有期望MS的峰(m/z＝639对应于ESI期间Boc基团脱落的质量)。通过制备型HPLC直接纯化反应混合物(中性条件)。获得为黄色固体的化合物3(3.0g，4.06mmol，68.5％产率)。
制备化合物4的通用步骤
向化合物3(707.4mg，957.55umol，1.0eq)的DMF(15mL)溶液中，加入HOBt(155.3mg，1.15mmol，1.2eq)、DIEA(371.3mg，2.87mmol，500.4μL，3.0eq)和MMAE(0.55g，766.04umol，0.8eq)。将混合物在30℃下搅拌16小时。LC-MS显示一个具有期望MS的峰(期望m/z＝1317，而m/z＝609对应于在ESI期间带有两个质子并且Boc基团脱落的质量)。然后将反应混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为黄色固体的化合物4(0.53g，402.23umol，42.0％产率)。
制备化合物5的通用步骤
向化合物4(0.526g，399.20umol，1.0eq)的DMF(4mL)溶液中，加入哌啶(862.2mg，10.13mmol，1.0mL，25.4eq)。将混合物在25℃下搅拌30分钟。LC-MS显示化合物4被完全消耗，并且检测到一个具有期望MS的主峰(期望m/z＝1095，并且m/z＝265对应于Fmoc-哌啶加合物)。然后将反应混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物5(0.230g，209.97umol，52.6％产率)。
制备化合物6的通用步骤
向Fmoc-(D-Ala)-Phe-OH(125.6mg，273.87umol，1.2eq)的DMF(10mL)溶液中加入EDCI(52.5mg，273.87umol，1.2eq)、HOBt(37.0mg，273.87umol，1.2eq)和化合物5(0.25g，228.23umol，1eq)。将混合物在25℃下搅拌3小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗，并检测到一个具有期望MS的峰(m/z＝718对应于在ESI期间带有两个质子且Boc基团脱落的质量)。然后将反应混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物6(0.18g，117.20umol，51.3％产率)。
制备化合物7的通用步骤
向化合物6(0.18g，117.20umol，1.0eq)的DMF(8mL)溶液中，加入哌啶(1.72g，20.25mmol，2.0mL，172.8eq)。将混合物在25℃下搅拌1小时。LC-MS显示化合物7被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰(m/z＝1314和657，对应于期望质量，m/z＝265对应于Fmoc-哌啶加合物)。然后将反应混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物7(0.13g，98.96umol，84.4％产率)。
制备化合物8的通用步骤
向化合物7(0.105g，79.93umol，1.0eq)的DMA(4mL)溶液中加入DIEA(31.0mg，239.79umol，41.8μL，3.0eq)和四氢吡喃-2,6-二酮(27.4mg，239.79umol，3.0eq)。将混合物在25℃下搅拌2小时。LC-MS显示化合物7被完全消耗，并检测到一个具有期望MS的主峰(m/z664.5对应于在ESI期间带有两个质子且Boc基团脱落的质量)。然后将反应混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)，得到为白色固体的化合物8(0.09g，63.04umol，78.8％产率)。
制备化合物9的通用步骤
向化合物8(0.09g，63.04umol，1.0eq)、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(21.7mg，189.11umol，3.0eq)的DMA(3mL)和DCM(1mL)溶液加入溶于1mL DCM的EDCI(36.2mg，189.11umol，3.0eq)。将混合物在25℃下搅拌18小时。LC-MS显示化合物8被完全消耗，并检测到一个具有期望MS的主峰(期望m/z＝1524(一个质子)和763(两个质子)，而m/z＝713对应于Boc基团在ESI期间脱落的质量)。通过制备型HPLC直接纯化反应混合物(中性条件)。获得为白色固体的化合物9(0.07g，45.91umol，72.8％产率)。
制备化合物10的通用步骤
向BCY6014(167.5mg，55.09umol，1.2eq)的DMF(3mL)溶液中加入DIEA(11.8mg，91.81umol，16.0μL，2.0eq)和化合物9(0.07g，45.91umol，1.0eq)。将混合物在25℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物9被完全消耗，并且检测到一个具有期望MS的主峰([M+4H+]/4＝1112.9，[M+5H+]/5＝890.5)。在减压下浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物。粗产物10(0.220g，粗产物)无需进一步纯化即可用于下一步骤。
制备BCY6106的通用步骤
向化合物10(0.200g，44.95umol，1.0eq)的DCM(4mL)溶液中加入1mL TFA。将混合物在25℃下搅拌1小时。LC-MS显示一个具有期望MS的主峰([M+4H+]/4＝1088.0，[M+5H+]/5＝870.8)。在减压下浓缩反应混合物，得到残余物，然后将其通过制备型HPLC直接纯化(TFA条件)。获得为白色固体的化合物BCY6106(0.0297g，20.06umol，14.5％产率，95.46％纯度)。
BCY6175
Figure BDA0002639562330001141
Figure BDA0002639562330001151
制备化合物9的通用步骤
以类似于BCY6106中所述的方式进行化合物9的合成。
制备化合物10A的通用步骤
向BCY6099(195.15mg，61.32μmol，1.1eq)的DMA(3mL)溶液中加入DIEA(21.61mg，167.23μmol，29.13μL，3eq)和化合物9(0.085g，55.74μmol，1.0eq)。将混合物在25℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物9被完全消耗，检测到一个具有期望m/z的主峰。将反应混合物在减压下浓缩以除去溶剂，得到残余物(浅黄色油)。通过制备型HPLC直接纯化反应物(中性条件)。获得为白色固体的化合物10A(0.160g，34.84μmol，62.50％产率)。
制备BCY6175的通用步骤
向化合物10A的DCM(4.5mL)溶液中加入TFA(4.5mL)。将混合物在0℃下搅拌30分钟。LC-MS显示化合物10A已完全消耗，并检测到一个具有期望m/z的主峰。在减压下浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物，将其通过制备型HPLC纯化(TFA条件)。获得为白色固体的化合物BCY6175(61.40mg，13.56μmol，31.13％产率)。
BCY6107
Figure BDA0002639562330001161
制备化合物2的通用步骤
向化合物1(3.0g，8.49mmol，1.0eq)的DCM(30mL)和MeOH(10mL)溶液中加入EEDQ(2.52g，10.19mmol，1.2eq)和(4-氨基苯基)甲醇(1.25g，10.19mmol，1.2eq)。将混合物在25℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物1被完全消耗，检测到一个具有期望MS的主峰([M+H]+459.5)。另外，TLC表明化合物1被完全消耗并且形成新斑点。在减压下浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330001171
120g
Figure BDA0002639562330001172
SilicaFlash Column，0至60％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，@80mL/分钟)。获得为黄色固体的化合物2(3.5g，7.63mmol，89.9％产率)。
制备化合物3的通用步骤
向化合物2(3.3g，7.20mmol，1.0eq)的THF(100mL)溶液中加入DIEA(4.65g，35.98mmol，6.27mL，5.0eq)和二(4-硝基苯基)碳酸酯(8.76g，28.79mmol，4.0eq)。将混合物在25℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物2被完全消耗，并且检测到一个具有期望MS的主峰([M+H]+624.0)。另外，TLC表明化合物2被完全消耗并且形成新斑点。在减压下浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法纯化(
Figure BDA0002639562330001173
120g
Figure BDA0002639562330001174
Silica Flash Column，0至15％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，@80mL/分钟)。获得为黄色固体的化合物3(3.0g，4.81mmol，66.8％产率)。
制备化合物4的通用步骤
向化合物3(124.09mg，198.97umol，1.0eq)的DMF(5mL)溶液中加入HOBt(32.3mg，238.77umol，1.2eq)、DIEA(77.1mg，596.92μmol，103.9μL，3.0eq)、和MMAE(0.1g，139.28umol，0.7eq)。将混合物在25℃下搅拌1小时。LC-MS显示化合物3被完全消耗，并且检测到具有期望MS的一个主峰([M+H]+1202.5，[M+Na]+1224.5)。然后将反应混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。冻干后，获得为白色固体的化合物4(0.08g，66.53umol，33.4％产率)。
制备化合物5的通用步骤
向化合物4(0.08g，66.53umol，1.0eq)的DMF(4mL)溶液中，加入哌啶(862.2mg，10.13mmol，1mL，152.2eq)。将混合物在25℃下搅拌1小时。LC-MS显示化合物4被完全消耗，并且检测到一个具有期望MS的主峰([M+H]+981.5，[M+Na]+1003.5，而m/z＝264.0对应于Fmoc-哌啶加合物)。通过制备型HPLC直接纯化反应混合物(中性条件)。获得为白色固体的化合物5(0.055g，56.11umol，84.3％产率)。
制备化合物6的通用步骤
向Fmoc-Glu(t-Bu)-Pro-Cit-Gly-HPhe-Tyr(t-Bu)-OH(74.1mg，66.31umol，1.3eq)的DMF(4mL)溶液中加入EDCI(12.7mg，66.31umol，1.3eq)、HOBt(8.9mg，66.31umol，1.3eq)和化合物5(0.05g，51.01umol，1.0eq)。将混合物在25℃下搅拌30分钟。LC-MS表明剩余20％的化合物5，形成了几个新的峰，并且60％的反应混合物是期望产物([M+2H+]/2＝1040.4)。通过制备型HPLC直接纯化反应混合物(中性条件)。获得为白色固体的化合物6(0.07g，33.66umol，66.0％产率)。
制备化合物7的通用步骤
向化合物6(0.07g，33.66umol，1.0eq)的DMF(4mL)溶液中加入哌啶(2.9mg，33.66umol，3.3μL，1.0eq)。将混合物在25℃下搅拌15分钟。LC-MS显示化合物6被完全消耗，并且检测到一个具有期望MS的主峰([M+2H+]/2＝929.1，而m/z＝264.2对应于Fmoc-哌啶加合物)。通过制备型HPLC直接纯化反应混合物(中性条件)。获得为白色固体的化合物7(0.045g，24.23umol，72.0％产率)。
制备化合物8的通用步骤
向化合物7(0.04g，21.54umol，1.0eq)的DMA(1mL)溶液中加入DIEA(8.3mg，64.61umol，11.2μL，3.0eq)和四氢吡喃-2,6-二酮(7.4mg，64.61umol，3eq)。将混合物在25℃下搅拌1小时。LC-MS显示化合物7被完全消耗，并且检测到一个具有期望MS的主峰([M+2H+]/2＝986.4)。然后将反应混合物通过制备型HPLC直接纯化(中性条件)。获得为白色固体的化合物8(0.035g，17.75umol，82.4％产率)。
制备化合物9的通用步骤
向化合物8(0.035g，17.75umol，1.0eq)、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(6.1mg，53.26umol，3.0eq)的DMA(3mL)和DCM(1mL)溶液中加入EDCI(10.2mg，53.26umol，3.0eq)。将混合物在25℃下搅拌16小时。LC-MS显示部分保留了化合物8，并且检测到一个具有期望MS的峰([M+2H+]/2＝1034.7)。然后除去DCM，随后通过制备型HPLC纯化混合物(中性条件)。获得为白色固体的化合物9(0.03g，14.50umol，81.7％产率)。
制备化合物10的通用步骤
向BCY6014(52.9mg，17.40umol，1.59μL，1.2eq)的DMF(2mL)溶液中，加入DIEA(5.6mg，43.51umol，7.6μL，3.0eq)和化合物9(0.03g，14.50umol，1.0eq)。将混合物在25℃下搅拌16小时。LC-MS显示一个具有期望MS的主峰([M+4H+]/4＝1249.2，[M+5H+]/5＝999.3)。然后除去溶剂，将所得粗产物10(0.06g，粗)无需经过进一步纯化而用于下一步。
制备BCY6107的通用步骤
向化合物10(0.055g，11.01umol，1.0eq)的DCM(1mL)溶液中加入1mL TFA。将混合物在0℃下搅拌15分钟。LC-MS显示化合物10被完全消耗，并且检测到一个具有期望MS的主峰([M+4H+]/4＝1221.0，[M+5H+]/5＝977.0)。在减压下浓缩反应混合物以除去溶剂，得到残余物，然后将其通过制备型HPLC直接纯化(TFA条件)。获得为白色固体的化合物BCY6107(20.4mg，4.03umol，36.6％产率，96.36％纯度)。
生物数据
研究1.荧光偏振测量
(a)直接结合测定法
将带有荧光标签的肽(荧光素，SIGMA或Alexa Fluor488TM，Fisher Scientific)在含0.01％吐温20的PBS或含100mM NaCl和0.01％吐温的50mM HEPES，pH 7.4(两者均称为测定缓冲液)中稀释至2.5nM。将其与在与该肽相同的测定缓冲液中的滴定蛋白质组合，在黑色壁和底部的低结合低体积384孔板中得到25μL总体积的1nM肽，通常为5μL测定缓冲液、10μL蛋白质(表1)、然后是10μL荧光肽。使用二分之一系列稀释，给出12个不同的浓度，最高浓度从已知高亲和力结合物的500nM，到低亲和力结合物的10μM，进行选择性测定。在配备有“FP 485 520 520”光学模块的BMG PHERAstar FS上进行测量，该光学模块在485nm处激发，并在520nm处检测平行和垂直发射。将PHERAstar FS设置在25℃，每孔闪烁200次，定位延迟为0.1秒，以5至10分钟的间隔测量每孔，持续60分钟。在60分钟结束时孔中没有蛋白质，针对每个示踪剂测定用于分析的增益。使用Systat Sigmaplot12.0版分析数据。将mP值拟合至用户定义的二次方程式以生成Kd值：f＝ymin+(ymax-ymin)/Lig*((x+Lig+Kd)/2-sqrt((((x+Lig+Kd)/2)^2)-(Lig*x)))。“Lig”是所用示踪剂浓度的定义值。
(b)竞争结合测定法
测试不含荧光标签的肽与具有荧光标签和已知Kd的肽的竞争(表2)。参照化合物A具有序列Fl-G-Sar5-ACPWGPAWCPVNRPGCA(Fl-G-Sar5-(SEQ ID NO：94))。参照化合物B具有序列Fl-G-Sar5-ACPWGPFWCPVNRPGCA(Fl-G-Sar5-(SEQ ID NO：95))。参照化合物C具有序列Fl-G-Sar5-ADVTCPWGPFWCPVNRPGCA(Fl-G-Sar5-(SEQ ID NO：96)。参照化合物A、B和C中的每一个包含TBMB分子支架。如直接结合测定法所述，将肽在测定缓冲液中稀释至适当浓度，所述测定缓冲液具有最大浓度为5％的DMSO，然后以1比2进行系列稀释。将5μL的稀释肽加入到平板中，然后以固定浓度(取决于所使用的荧光肽(表2))加入10μL的人或小鼠EphA2(表1)，然后加入10μL荧光肽。按照直接结合测定法进行测量，但是在第一次测量之前测定增益。数据分析采用Systat Sigmaplot 12.0版进行，其中mP值拟合至用户定义的三次方程式，以生成Ki值：
f＝ymin+(ymax-ymin)/Lig＊((Lig＊((2＊((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcornp))^0.5＊COS(ARCCOS((-2＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^3+9＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp)-27＊(-1＊Klig＊Kcomp＊Prot＊c))/(2＊((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)))/((3＊Klig)+((2＊((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^0.5＊COS(ARCCOS((-2＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^3+9＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp)-27＊(-1＊Klig＊Kcomp＊Prot＊c))/(2＊((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)))).
“Lig”、“KLig”和“Prot”都是定义的值，分别涉及：荧光肽浓度、荧光肽的Kd和EphA2浓度。
表1：EDhrin受体和来源
受体(结构域) 物种 形式标签 供应商 目录号
EphA1(Ecto) 人 Fc融合 R&D systems 7146-A1
EphA2(Ecto) 人 C-末端polyHis R&D systems 3035-A2
EphA2(Ecto) 人 C-末端polyHis 自制 N/A
EphA2(Ecto) 小鼠 Fc融合 R&D Systems 639-A2
EphA2(Ecto) 小鼠 C-末端polyHis Sino Biological 50586-M08H
EphA2(配体结合) 大鼠 C-末端polyHis 自制 N/A
EphA2(配体结合) 狗 C-末端polyHis 自制 N/A
EphA3(Ecto) 人 Fc融合 R&D systems 6444-A3
EphA3(Ecto) 人 N-末端polyHis 自制 N/A
EphA3(Ecto) 大鼠 C-末端polyHis Sino Biological 80465-R08H
EphA4(Ecto) 人 Fc融合 R&D systems 6827-A4
EphA4(Ecto) 人 C-末端polyHis Sino Biological 11314-H08H
EphA4(Ecto) 大鼠 C-末端polyHis Sino Biological 80123-R08H
EphA6(Ecto) 人 Fc融合 R&D systems 5606-A6
EphA7(Ecto) 人 Fc融合 R&D systems 6756-A7
EphB1(Ecto) 大鼠 Fc融合 R&D systems 1596-B1
EphB4(Ecto) 人 C-末端polyHis R&D systems 3038-B4
表2：用于竞争结合测定法的荧光肽和EphA2的最终浓度
Figure BDA0002639562330001201
Figure BDA0002639562330001211
在上述测定法中对本发明的某些肽配体进行了测试，结果列于表3-7：
Figure BDA0002639562330001221
Figure BDA0002639562330001231
Figure BDA0002639562330001241
Figure BDA0002639562330001251
Figure BDA0002639562330001261
Figure BDA0002639562330001271
Figure BDA0002639562330001281
Figure BDA0002639562330001291
Figure BDA0002639562330001301
Figure BDA0002639562330001311
Figure BDA0002639562330001321
Figure BDA0002639562330001331
研究2：荧光偏振测量(替代方案)
(a)竞争结合
测试不含荧光标签的肽与具有荧光标签和已知Kd的肽的竞争(表9)。将5μL递增(2倍)浓度的测试化合物添加到平板中，然后添加10μL固定浓度的EphA2蛋白(表8)(浓度取决于所使用的荧光肽)(表9)，然后添加10μL荧光肽。缓冲液是如上所述的测定缓冲液，DMSO＜1％。在配备有“FP 485 520 520”光学模块的BMG PHERAstar FS上进行测量，该光学模块在485nm处激发并检测在520nm处的平行和垂直发射。将PHERAstar FS设置为25℃，每孔闪烁200次，定位延迟为0.1秒，以5至10分钟的间隔测量每孔，持续60分钟。或者，在PerkinElmer Envision上以相似的时间间隔进行测量，所述Perkin Elmer Envision配备有FITCFP双镜、FITC FP 480激发滤光片和FITC FP P-pol 535和FITC FP S-pol发射滤光片，30次闪烁，G系数为1.2。数据分析在Systat Sigmaplot版本12.0或13.0中进行，其中将60分钟时的mP值拟合至用户定义的三次方程，以产生Ki值：
f＝ymin+(ymax-ymin)/Lig＊((Lig＊((2＊((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^0.5＊COS(ARCCOS((-2＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^3+9＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp)-27＊(-1＊Klig＊Kcomp＊Prot＊c))/(2＊((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)))/((3＊Klig)+((2＊((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^0.5＊COS(ARCCOS((-2＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^3+9＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp)-27＊(-1＊Klig＊Kcomp＊Prot＊c))/(2＊((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)))).
“Lig”、“KLig”和“Prot”均是定义值，分别与以下相关：荧光肽浓度、荧光肽的Kd和EphA2浓度。
表8：Eph受体和来源
受体(结构域) 物种 形式/标签 供应商 目录号
EphA2(Ecto) 人 C-末端polyHis R&D systems 3035-A2
EphA2(Ecto) 人 C-末端polyHis 自制 N/A
EphA2(Ecto) 小鼠 C-末端polyHis Sino Biological 50586-M08H
EphA2(配体结合) 大鼠 C-末端polyHis 自制 N/A
表9：竞争结合测定法中使用的荧光肽和EphA2的最终浓度
Figure BDA0002639562330001341
在上述竞争结合测定法中测试了本发明的某些肽配体和双环药物缀合物，结果示于表10至表11中：
表10：所选双环肽的竞争结合
Figure BDA0002639562330001351
表10中的竞争结合测定法的结果表明，靶向人EphA2的双环肽(BCY6014和BCY6099)与小鼠和大鼠EphA2以高亲和力结合。同样，BCY6019与人和小鼠EphA2结合。这些结果表明，本发明的某些肽可用于体内小鼠和大鼠的疗效和毒理学模型。
表11：所选的双环药物缀合物(BDC)的竞争结合
Figure BDA0002639562330001361
Figure BDA0002639562330001371
表11显示了本发明的某些双环药物缀合物在人、小鼠和啮齿动物EphA2之间表现出优异的交叉反应性。因此，本发明的肽可用于小鼠和大鼠体内的疗效和毒理学模型。
(b)SPR测量
将非Fc融合蛋白用EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-Biotin在4mM乙酸钠、100mM NaCl，pH5.4中生物素化1小时，其中生物素的摩尔量是蛋白质的3倍过量。在将反应混合物透析到PBS中之后，使用荧光生物素定量试剂盒(Thermo)确定标记的程度。为了分析肽结合，使用了Biacore T200仪器，其利用XanTec CMD500D芯片。使用标准胺偶联化学，在25℃下，以HBS-N(10mM HEPES，0.15M NaCl，pH 7.4)作为运行缓冲液，将链霉亲和素固定在芯片上。简而言之，通过以10μl/分钟的流速注入1：1比率的0.4M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)/0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)7分钟，活化羧甲基葡聚糖表面。为了捕获链霉亲和素，将蛋白质在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至0.2mg/ml，并通过将120μl注入活化的芯片表面进行捕获。通过7分钟注射1M乙醇胺(pH 8.5)：HBS-N(1：1)，封闭残余的活化基团。将缓冲液交换为PBS/0.05％Tween 20，并使用缓冲液中0.2μM的蛋白质稀释液将生物素化的EphA2捕获至500-1500RU的水平。在该缓冲液中制备肽的系列稀释液，最终DMSO浓度为0.5％，最高肽浓度为50或100nM，再进行6次2-倍稀释。SPR分析在25℃下以90μl/分钟的流速运行，其中结合60秒，解离900-1200秒。针对DMSO排除体积效应校正了数据。所有数据使用标准处理程序针对空白注入和参照表面进行双重参照，并使用2.0c版Scrubber软件(BioLogic软件)进行数据处理和动力学拟合。使用简单的1：1结合模型拟合数据，以便在适当的情况下实现大量传输效应(mass transport effect)。
对于双环药物缀合物的结合，使用了Biacore 3000仪器。对于生物素化的蛋白质，固定水平为1500RU，最高浓度为100nM。或者，使用CMD500D或CM5芯片(GE Healthcare)，方法与上述方法相同。对于Fc标签蛋白，如上所述活化CM5芯片，然后将山羊抗人IgG抗体(Thermo-Fisher H10500)在10mM乙酸钠pH5.0中稀释至20μg/ml，并捕获至约3000RU。然后如上所述将表面阻断。随后进行Fc-标签蛋白的捕获，以获得约200-400RU的靶蛋白。所用蛋白质描述如下。按照制造商建议的缓冲液和浓度重新构建所有蛋白质，并使用5-10μg/ml蛋白质的PBS/0.05％Tween 20溶液进行捕获。
表12
Figure BDA0002639562330001381
在上述竞争结合测定法中测试了本发明的某些肽配体和双环药物缀合物，结果示于表13至表15中：
表13：本发明所选的双环肽和双环药物缀合物的SPR结合分析
Figure BDA0002639562330001382
Figure BDA0002639562330001391
表13详细描述了使用SPR测定法测定的所选双环药物缀合物与人EphA2结合的结合亲和力和动力学参数(Koff和Kon)。
表14：本发明的所选双环药物缀合物与人Eph同系物的SPR结合分析
Figure BDA0002639562330001392
表14说明了在SPR测定法中四个双环药物缀合物(BCY6033、BCY6082、BCY6136和BCY6173)与密切相关的人Ephrin同系物的结合结果。结果表明，本发明的化合物不显示与密切相关的人同系物(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7和EphB4)的显著结合。
表15：本发明所选的双环药物缀合物与小鼠和大鼠Eph直向同系物的SPR结合分析
Figure BDA0002639562330001393
表15中的结果表明，本发明的某些双环药物缀合物(BCY6033、BCY6082、BCY6136和BCY6173)也对小鼠和大鼠EphA2具有选择性，并且对密切相关的同系物(小鼠EphA3和EphA4；和大鼠EphA3和EphB1)不显示显著的结合。
研究3和7-23
在研究3和7-23的每一项中，每个研究采用以下方法：
(a)材料
(i)动物和饲养条件
动物
物种：小鼠(Mus Musculus)
株：Balb/c裸色或CB17-SCID
年龄：6-8周
体重：18-22g
动物数量：9-90只小鼠
动物供应商：上海灵昌生物技术实验动物有限公司
饲养条件
将小鼠以恒定的温度和湿度保持在单独的通风笼中，每笼中有3-5只动物。
·温度：20至26℃。
·湿度40-70％。
笼子：由聚碳酸酯制成。尺寸为300毫米x 180毫米x 150毫米。垫底材料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由获得经辐射灭菌的干颗粒食品。
水：动物可以自由获得无菌饮用水。
笼子识别：每个笼子的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、株、收到日期、处理、研究编号、组号和处理的开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
(ii)测试和阳性对照物
Figure BDA0002639562330001401
1MEDI-547的完整细节(通过mc接头与MMAF缀合的全人单克隆抗体1C1(识别人和鼠EphA2))描述在Jackson等人(2008)Cancer Res 68，9367-74中。
(b)实验方法与步骤
(i)观察
本研究中与动物操作、看护和处理有关的所有步骤均按照无锡AppTec机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的指南进行，并遵循实验室动物护理的评估与鉴定协会(AAALAC)的指导。在常规监测时，每天检查动物的肿瘤生长和治疗对正常行为的任何影响，例如活动性、食物和水的消耗(仅通过目测)，体重增加/减少，眼睛/毛发消光以及其他任何异常影响，如规程中所规定的。根据每个亚组中的动物编号记录死亡和观察到的临床体征。
(ii)肿瘤测量和终点
主要终点是观察肿瘤生长是否可以被延迟或小鼠是否可以治愈。使用卡尺每周三次测量肿瘤体积，以二维计，体积用mm 3表示，使用下式：V＝0.5a x b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。然后将肿瘤尺寸用于T/C值的计算。T/C值(百分数)表示抗肿瘤效果的指标；T和C分别是在指定某天的治疗组和对照组的平均体积。
使用下式计算每组的TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；Ti是指定某天的治疗组的平均肿瘤体积，T0是治疗开始那一天的治疗组的平均肿瘤体积，Vi是与Ti同一天的空载体对照组在平均肿瘤体积，V0是治疗开始那一天的空载体组的平均肿瘤体积。
(iii)样品采集
在研究结束时，收集所有组的肿瘤用于FFPE。
(iv)统计分析
提供每个时间点各组肿瘤体积的总结统计数据，包括平均值和平均值的标准误差(SEM)。
根据最终剂量后最佳治疗时间点获得的数据，对各组之间的肿瘤体积差异进行统计学分析。
进行单因素方差分析(one-way ANOVA)以比较各组之间的肿瘤体积，并且当获得显著的F统计量(处理方差与误差方差的比率)时，使用Games-Howell检验进行组间比较。所有数据均使用GraphPad Prism 5.0进行分析。P<0.05被认为具有统计学显著性。
研究3：LU-01-0046PDX模型中的体内疗效
癌细胞系(CCL)最初源自患者的肿瘤，但获得在体外细胞培养物中增殖的能力。作为体外操作的结果，对传统上用于癌症研究的CCL进行遗传转化，当细胞在体内生长时，该遗传转化无法恢复。由于细胞的培养过程，选择了更适合在培养物中存活的细胞，因此消除了与癌细胞相互作用的肿瘤驻留细胞和蛋白质，并且培养物在表型上变得均质化。研究人员开始将在临床前测试后食品和药物管理局仅批准5％的抗癌剂的原因归因于缺乏肿瘤异质性和缺少人基质微环境。具体而言，CCL异种移植通常不能预测原发性肿瘤中的药物反应，因为CCL不遵循人原发性肿瘤中存在药物耐受性途径或微环境对药物反应的影响。为了克服这些问题，发明人已经使用PDX模型来改善临床前模型的预测能力。
当将患者的原发性肿瘤的癌组织直接植入免疫缺陷小鼠体内时，就会产生PDX。PDX可以维持患者的组织学，包括非肿瘤细胞(例如基质细胞)的存在，因此可以更好地模拟肿瘤微环境。因此，与CCL异种移植相比，PDX通常更能反映原发性肿瘤的异质性和组织学。
在来源于非小细胞肺癌(NSCLC)患者的原发性腺癌PDX异种移植中(LU-01-0046)筛选了BCY6031。使用RNA测序已经证明，LU-01-0046可表达高水平的EphA2。BCY6031在LU-01-0046模型中显示出优异的疗效，因此是治疗非小细胞肺癌的有前途的新疗法。
(a)治疗组
设计该实验以比较空载体处理的动物和用5mg/kg，qw的BCY6031治疗4周的动物的肿瘤生长。
表16
Figure BDA0002639562330001421
注：n：动物数；给药体积：根据体重调整给药体积。
(b)实验方法
(i)PDX信息
表17
Figure BDA0002639562330001422
(ii)肿瘤接种
每只小鼠在右侧皮下接种约30mm3 LU-01-0046肿瘤碎片。当平均肿瘤体积达到943mm3时开始药物治疗。上面描述了每组中的测试物、施用途径、给药频率和动物数。
(iii)测试物制剂的制备
表18
Figure BDA0002639562330001423
(c)结果
(i)死亡率、发病率和体重增加或减少
定期监测动物体重，作为毒性的间接度量。图1显示了携带LU-01-0046肿瘤的雌性Balb/C裸鼠的体重变化，向该小鼠施用BCY6031。
(ii)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图2所示。
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第7天的肿瘤体积测量，计算PDX模型LU-01-0046中BCY6031的肿瘤生长抑制率。
表19：第7天的肿瘤生长抑制分析(T/C和TGI)
Figure BDA0002639562330001431
a.平均值±SEM。
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)讨论
该研究评估了BCY6031在LU-01-0046PDX模型中的治疗效果。图1显示了测得的体重。表19和图2显示了不同时间点治疗组的肿瘤体积。
空载体处理小鼠的平均肿瘤尺寸在第7天达到2191mm3。5mg/kg的BCY6031产生了有效的抗肿瘤活性，到第7天测量的肿瘤为463mm3(TGI＝138.6％，p<0.05)。而且，BCY6031治疗从第32天就完全消除了肿瘤，在停药后第28天没有发生肿瘤再生长。BCY6031没有引起明显的体重减轻(图1)，并且在整个研究过程中没有观察到药物治疗小鼠的不良的临床表现。
研究4：BCY6136在CDX异种移植模型中的体内功效
这项研究评估了BCY6136在三种癌细胞衍生(CDX)模型中的治疗效果：HT1080纤维肉瘤系、MDA-MB-231三阴性乳腺癌系和NCI-H1975非小细胞肺癌(NSCLC)系。
(a)实验方法
在Balb/c小鼠右侧皮下接种肿瘤细胞，并且当平均肿瘤体积达到150至200mm3时开始药物治疗。如上所述进行肿瘤测量和统计分析。每周用BCY6136或空载体治疗荷瘤动物。
(b)讨论
图4-6显示，在每周一次给药后，BCY6136在乳腺、肺和纤维肉瘤异种移植模型中有效。
HT1080纤维肉瘤模型：
在HT1080模型中，在第0天和第7天以3和5mg/kg的剂量每周一次给药BCY6136之后，到第14天实现肿瘤生长的完全消退(图4)。在第0天和第7天每周一次以2mg/kg的剂量给药BCY6136导致肿瘤停滞(部分消退)(图4)。BCY6136治疗没有导致显著的体重减轻(图4插图)，并且在整个研究过程中，药物治疗的小鼠均未出现不良的临床观察。
NCI-H1975 NSCLC模型：
在每周一次以2和3mg/kg给药BCY6136后的第28天左右，在NCI-H1975模型中观察到肿瘤生长的完全消退(图5)。在第35天停止给药后，在3mg/kg组测量结束时，从第35天至第72天在3mg/kg治疗的动物中未观察到肿瘤再生长(图5)。在此模型中，以2mg/kg给药BCY6136从第28天左右导致完全消退。在第35天停止给药后，直到第51天左右，2mg/kg剂量中才出现肿瘤再生长。在此剂量水平下，从第51天左右开始直到第77天研究终止，观察到中等的肿瘤再生长。用1mg/kg的BCY6136进行治疗导致肿瘤停滞(部分消退)(图5)。BCY6136治疗没有导致显著的体重减轻(图5中的插图)，并且在整个研究过程中，对药物治疗的小鼠均无不良临床观察。
MDA-MB-231乳腺模型：
从第0天到第45天，每周一次以2和3mg/kg的剂量给药后，在MDA-MB231模型中观察到肿瘤停滞(部分消退)(图6)。在2mg/kg治疗的动物中观察到一些体重减轻(归因于肿瘤负荷)(图6插图)。
这些结果证明BCY6136在每天给药一次后，在植入纤维肉瘤、乳腺和肺CDX异种移植的小鼠中产生了深远的肿瘤生长抑制。
研究5：大鼠中的安全性研究
将六(6)只雌性大鼠随机分为3组，每组2只，以确定BCY6136的毒性，之后在第1和第8天静脉推注5、7.5和10mg/kg进行施用。研究在第15天终止。
在第2、12和15天未观察到对凝血参数的显著影响(凝血酶原时间(秒)，活化的部分凝血活酶时间(秒)或纤维蛋白原水平(g/L)(数据未显示)。在生存期间没有报道出血事件，病理检查后未检测到内部出血迹象。
研究6：食蟹猴的安全性研究
我们在食蟹猴中对BCY6136进行了28天的毒理学研究。在第1、8、15和22天，BCY6136的给药剂量为1.0和2.0mg/kg。在第29天(最终剂量后7天)对动物实施安乐死并进行尸检。
在第18、22和25天(数据未显示)和第29天(表20)，未观察到相对于基线的对凝血参数的显著影响。在生存期间没有报道出血事件，病理检查后未检测到内部出血迹象。
表20：向食蟹猴给药1.0和2.0mg/kg BCY6136后第29天的凝血参数
Figure BDA0002639562330001451
研究7：BCY6033和BCY6136和ADC在治疗Balb/c裸鼠中的PC-3异种移植的体内功效 研究
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6033和BCY6136在治疗PC-3异种移植中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001452
(c)实验方法与步骤
(i)细胞培养
将PC-3肿瘤细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清的F12K培养基中、在空气中5％CO2的气氛中、在37℃下维持。常规每周两次将肿瘤细胞传代培养。收获在指数生长期生长的细胞，并计数以进行肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
在每个小鼠的右侧皮下接种PC-3(10*106)肿瘤细胞，以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到约150mm3时，将动物随机分组，并开始治疗。测试物的施用和每组中的动物数显示在以下实验设计表中。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001453
Figure BDA0002639562330001461
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图7至图9所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表21中显示了携带PC-3异种移植的雌性Balb/c裸鼠中，随时间推移的平均肿瘤体积。
表21：随时间推移的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002639562330001462
Figure BDA0002639562330001463
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第16天肿瘤体积的测量值计算PC-3异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表22：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001471
a.平均值±SEM。
b.通过将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在PC-3异种移植模型中的治疗效果。图7至图9以及表21和表22示出了在各个时间点所有治疗组中测量的体重和肿瘤体积。
空载体治疗小鼠的平均肿瘤尺寸在第16天达到2070mm3。BCY6136在1mg/kg，qw(TV＝107mm3，TGI＝102.2％，p<0.001)，BCY6136在2mg/kg，qw(TV＝79mm3，TGI＝103.6％，p<0.001)和BCY6136在3mg/kg，qw(TV＝70mm3，TGI＝104.1％，p<0.001)时显示出有效的抗肿瘤作用。
BCY6033在3mg/kg，qw(TV＝116mm3，TGI＝101.8％，p<0.001)和ADC在3mg/kg，qw(TV＝124mm3，TGI＝101.4％，p<0.001)时，显示出相当的抗肿瘤作用。
在这项研究中，定期监测动物体重。所有小鼠均保持良好体重。
研究8.BCY6136在治疗Balb/c裸鼠中的PC-3异种移植的体内功效研究
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6136在治疗Balb/c裸鼠中的PC-3异种移植的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001472
Figure BDA0002639562330001481
a.N，每组中的动物数。
b.在实验设计表中显示的4周治疗后，在监测时间表期间，第3、5和6组的小鼠从第52天起用1.5mg/kg qw的BCY6136治疗。
c.由于第一次给药后多西他赛治疗小鼠严重的体重减轻，因此该治疗暂停了2周，然后在第28天进行了更低剂量的治疗(多西他赛，10mg/kg)。在那之后，小鼠从第42天到第70天用1.5mg/kg qw的BCY6136治疗。
(c)实验方法与步骤
(i)细胞培养
将肿瘤细胞在37℃、在空气中5％CO2的气氛中维持在F-12K培养基中，该培养基补充有10％热灭活的胎牛血清。每周两次常规对肿瘤细胞进行传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数，用于接种肿瘤。
(ii)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种0.2ml含有PC-3肿瘤细胞(10x 106)的PBS，以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到454mm3时，将52只动物随机分组。在实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001482
Figure BDA0002639562330001491
(c)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图10所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表23显示了携带PC-3异种移植的雄性Balb/c裸鼠随时间推移的平均肿瘤体积。
表23：随时间推移的肿瘤体积追踪(第0天至第20天)
Figure BDA0002639562330001492
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第20天的肿瘤体积测量值计算PC-3异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表24：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001501
a.平均值±SEM。
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(d)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在PC-3异种移植模型中的治疗效果。图10和表23和表24显示了在各个时间点所有治疗组的测量体重和肿瘤体积。
空载体治疗小鼠的平均肿瘤尺寸在第20天达到2364mm3。BCY6136，0.167mg/kg，qw(TV＝1188mm3，TGI＝61.4％，p<0.001)，0.5mg/kg，q2w(TV＝530mm3，TGI＝96.0％，p<0.001)，0.5mg/kg，qw(TV＝234mm3，TGI＝111.4％，p<0.001)和1.5mg/kg，qw(TV＝131mm3，TGI＝117.2％，p<0.001)在第20天以剂量或剂量频率依赖性方式产生了显著的抗肿瘤活性。BCY6136，1.5mg/kg，q2w(TV＝128mm3，TGI＝117.0％，p<0.001)产生了与BCY6136，1.5mg/kg qw相当的抗肿瘤活性。其中，用BCY6136，0.5mg/kg，qw或BCY6136，0.5mg/kg，q2w治疗的小鼠在停止治疗后显示出明显的肿瘤复发，从第52天开始用BCY6136，1.5mg/kg，qw进一步治疗可有效地实现肿瘤消退。在停止治疗后，用BCY6136，1.5mg/kg q2w治疗的小鼠也显示出肿瘤复发，但进一步给药不能完全使肿瘤消退。用BCY6136，1.5mpk，qw治疗的小鼠直到第48天才显示出任何肿瘤复发。
EphA2-ADC，0.33mg/kg，qw(TV＝1637mm3，TGI＝38.1％，p<0.001)，1mg/kg，qw(TV＝981mm3，TGI＝72.2％，p<0.001)和3mg/kg，qw(TV＝184mm3，TGI＝114.0％，p<0.001)在第20天以剂量依赖性方式产生了显著的抗肿瘤活性。用EphA2-ADC，3mg/kg，qw治疗的小鼠直至第59天未显示任何肿瘤复发。
多西他赛，15mg/kg，qw(TV＝419mm3，TGI＝101.8％，p<0.001)产生了显著的抗肿瘤活性，但引起了严重的动物体重减轻。停止治疗后，小鼠显示出明显的肿瘤复发。从第42天开始，用BCY6136，1.5mg/kg，qw治疗实现了这些小鼠中的肿瘤消退。
研究9.BCY6033、BCY6136和BCY6082在Balb/c裸鼠中治疗NCI-H1975异种移植的体 内功效测试
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6033、BCY6136和BCY6082在Balb/c裸鼠中治疗NCI-H1975异种移植模型的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001511
(c)实验方法与步骤
(i)细胞培养
收获在指数生长期生长的细胞并计数，以用于肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种0.2ml含有NCI-H1975肿瘤细胞(10×10^6)的PBS，以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到149mm3时，将36只动物随机分组。在实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001512
Figure BDA0002639562330001521
(iv)样品收集
在PG-D23，我们固定了第1组的肿瘤用于FFPE。
在PG-D44，我们固定了第2组和第5组肿瘤用于FFPE。
在研究结束时，我们固定了第6组肿瘤用于FFPE。
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长如图11至图13所示。
(ii)肿瘤体积追踪
在表25至表29中显示了携带NCI-H1975异种移植的雌性Balb/c裸鼠中随时间的平均肿瘤体积。
表25：肿瘤体积追踪(PG-D0至PG-D17)
Figure BDA0002639562330001522
Figure BDA0002639562330001531
表26：肿瘤体积追踪(PG-D18至PG-D35)
Figure BDA0002639562330001532
表27：肿瘤体积追踪(PG-D37至PG-D53)
Figure BDA0002639562330001533
Figure BDA0002639562330001541
表28：肿瘤体积追踪(PG-D56至PG-D74)
Figure BDA0002639562330001542
表29：肿瘤体积追踪(PG-D77至PG-D98)
Figure BDA0002639562330001543
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第21天的肿瘤体积测量值计算BCY6033、BCY6136和BCY6082在NCI-H1975异种移植模型中的肿瘤生长抑制率。
表30：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001544
Figure BDA0002639562330001551
a.平均值±SEM。
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6033、BCY6136和BCY6082在NCI-H1975异种移植模型中的治疗效果。图11至图13和表25至表30显示了在各个时间点所有治疗组中测量的体重和肿瘤体积。
在第21天，空载体治疗的小鼠中平均肿瘤尺寸达到2371mm3。BCY6033，1mg/kg(TV＝306mm3，TGI＝92.9％，p<0.001)，2mg/kg(TV＝95mm3，TGI＝102.5％，p＜0.001)和3mg/kg(TV＝29mm3，TGI＝105.4％，p＜0.001)产生剂量依赖性抗肿瘤活性。2mg/kg和3mg/kg的BCY6033消除肿瘤或使肿瘤消退至较小尺寸，从第35天起暂停治疗，在随后的5-6周监测中，肿瘤未显示出明显的再生长。
BCY6136，1mg/kg(TV＝205mm3，TGI＝97.5％，p<0.001)，2mg/kg(TV＝99mm3，TGI＝102.3％，p<0.001)和3mg/kg(TV＝94mm3，TGI＝102.4％，p＜0.001)产生了有效的抗肿瘤活性。2mg/kg和3mg/kg的BCY6136消除肿瘤或使肿瘤消退至较小的尺寸。从第35天起暂停治疗，在随后的5-6周监测中，在3mg/kg组中肿瘤未显示出明显的再生长，但是2mg/kg组中肿瘤则显示出明显的再生长，并且恢复给药时没有显示显著的肿瘤抑制。
BCY6082，2mg/kg的(TV＝1528mm3，TGI＝37.9％，p>0.05)没有显示明显的抗肿瘤活性，BCY6082，5mg/kg(TV＝390mm3，TGI＝89.1％，p<0.001)产生了显著的抗肿瘤活性。
在这项研究中，一只用BCY6033，3mg/kg治疗的小鼠在监测过程中体重减轻了15％以上，另一只小鼠很好地保持了体重。
研究10.BCY6136在Balb/c裸鼠LU-01-0251PDX模型中的体内功效研究
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠LU-01-0251PDX模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001561
(c)实验方法与步骤
(i)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种肿瘤碎片的LU-01-0251(约30mm3)，以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到174mm3时开始治疗，以进行疗效研究。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001562
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图14所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表31显示了在携带LU-01-0251异种移植的雌性Balb/c裸鼠中，治疗开始后第28天的平均肿瘤体积。
表31：随时间推移的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002639562330001563
Figure BDA0002639562330001571
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第28天的肿瘤体积测量值，计算LU-01-0251PDX模型中BCY6136和ADC的肿瘤生长抑制率。
表32：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001572
a.平均值±SEM；b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在本研究中评估了BCY6136和ADC在LU-01-0251PDX模型中的治疗效果。在不同时间点的所有治疗组测量的体重和肿瘤体积示于图14和表31和32。
在这项研究中，空载体治疗的小鼠的平均肿瘤体积在治疗开始后的第28天达到2208mm3。BCY6136，1mg/kg，qw(TV＝499mm3，TGI＝84.0％，p＜0.001)，2mg/kg，qw(TV＝32mm3，TGI＝107.0％，p＜0.001)和3mg/kg，qw(TV＝0mm3，TGI＝108.6％，p＜0.001)产生剂量依赖性的抗肿瘤活性。ADC，3mg/kg，qw(TV＝39mm3，TGI＝106.6％，p＜0.001)表现出显著的抗肿瘤活性。
研究11：BCY6136在Balb/c裸鼠LU-01-0251PDX模型中的体内功效研究
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠的LU-01-0251PDX模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001581
a.对于该组的所有小鼠，保持从第0天到第70天的给药时间表，然后从第77天起向小鼠3-2和小鼠3-4再给予BCY6136，3mg/kg，qw，而其他3只小鼠暂停治疗。对于该组的所有小鼠，从第0天到第56天保持给药时间表。
b.对于该组的所有小鼠，保持从第0天到第70天的给药时间表。
(c)实验方法与步骤
(i)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种肿瘤碎片的LU-01-0251(约30mm3)，以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到960mm3时开始治疗，用于疗效研究。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001582
(iii)样品收集
在第94天收集小鼠#3-2的肿瘤用于FFPE。在第140天收集小鼠#5-2和5-3的肿瘤，并包埋在1个FFPE块中。
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图15所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表33中显示了在携带LU-01-0251异种移植的雌性Balb/c裸鼠中，治疗开始后第0天至第28天的平均肿瘤体积。
表33：随时间推移的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002639562330001591
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第17天的肿瘤体积测量值，计算LU-01-0251PDX模型中BCY6136和ADC的肿瘤生长抑制率。
表34：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001592
a.平均值±SEM；
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在本研究评估了BCY6136和ADC在LU-01-0251PDX模型中的治疗效果。所有治疗组在不同时间点的测量体重和肿瘤体积示于图15以及表33和34。
在这项研究中，当平均肿瘤体积达到960mm3时开始治疗。在治疗开始后的第17天，空载体治疗的小鼠的平均肿瘤体积达到2301mm 3。BCY6136，1mg/kg，qw(TV＝1672mm3，TGI＝47.0％，p＞0.05)没有表现出明显的抗肿瘤活性。BCY6136，2mg/kg，qw(TV＝398mm3，TGI＝142.1％，p＜0.001)和3mg/kg，qw(TV＝216mm3，TGI＝155.6％，p＜0.001)在第17天产生剂量依赖性抗肿瘤活性。
用BCY6136，2mg/kg，qw治疗70天后，其中5只小鼠中有3只显示出完全的肿瘤消退，另外2只小鼠从第42天到第77天出现明显的肿瘤复发。然后用BCY6136，3mg/kg，qw从第7天开始对这两种复发性肿瘤进行进一步治疗，肿瘤之一表现出明显的肿瘤消退，而另一表现出对治疗的耐受性。
BCY6136以3mg/kg，qw治疗56天后，该组所有小鼠均显示出完全的肿瘤消退。
ADC，3mg/kg，qw(TV＝1143mm3，TGI＝86.3％，p＜0.01)在第17天显示出明显的抗肿瘤活性，在另一个53天的治疗后，这些小鼠表现出进一步的肿瘤消退，但未完全消退。
在这项研究中，有些小鼠表现出突然的体重减轻，这可能与免疫缺陷小鼠的长期喂养有关。
研究12：BCY6033、BCY6136、BCY6082和BCY6031在Balb/c裸鼠的LU-01-0046NSCLC PDX模型中的体内功效研究
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6033、BCY6136、BCY6082和BCY6031在Balb/c裸鼠的大LU-01-0046PDX肿瘤中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001601
(c)实验方法与步骤
(i)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种肿瘤碎片LU-01-0046(约30mm3)，以形成肿瘤。对于BT17BDC，当平均肿瘤体积达到955mm3时开始治疗，对于BCY研究，当平均肿瘤体积达到1039mm3时开始治疗。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001611
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图16所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表35显示了携带LU-01-0046的雌性Balb/c裸鼠中随时间推移的平均肿瘤体积。
表35：随时间推移的肿瘤体积追踪(BCY选择)
Figure BDA0002639562330001612
Figure BDA0002639562330001621
注：对于第3、5、7和9组，并没有显示第22天后的肿瘤体积追踪。
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据在治疗开始后的两部分研究中，分别在第22天和第28天测量的肿瘤体积，计算了LU-01-0046PDX模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表36：肿瘤生长抑制分析(BCY部分，在第22天)
Figure BDA0002639562330001622
a.平均值±SEM；
b.通过用治疗组的平均肿瘤体积除以对照组的平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
*某些组在第22天之前终止，并且通过指数生长方程式获取来计算肿瘤尺寸，如下所示：
空载体组：Y＝995.4×exp(0.1134×X)。
BCY6082,1mpk组：Y＝939.1×exp(0.1128×X)。
BCY6033,1mpk组：Y＝846.6×exp(0.0945×X)。
BCY6136,1mpk组：Y＝855.0×exp(0.0974×X)。
ADC,3mpk组：Y＝757.4×exp(0.1312×X)。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在大LU-01-0046肿瘤中的治疗效果。图16和表35和36显示了所有治疗组在各个时间点的测得体重和肿瘤体积。
在BCY研究中，在第22天计算的空载体治疗小鼠的平均肿瘤尺寸为6186mm3。1mg/kg的BCY6082、BCY6033、BCY6136和3mg/kg的ADC从肿瘤尺寸为1000mm3开始治疗时，没有显示出明显的抗肿瘤活性。
BCY6082(TV＝1999mm3，TGI＝81.2％，p<0.01)、BCY6033(TV＝88mm3，TGI＝118.6％，p<0.001)、BCY6136(TV＝233mm3，TGI＝115.6％，p<0.001)和BCY6031(TV＝115mm3，TGI＝110.2％，p＜0.001)在3mg/kg产生了显著的抗肿瘤活性。其中，BCY6033和BCY6136完全消除了2/5和4/5肿瘤。
研究13：BCY6136在携带LU-01-0046NSCLC PDX模型的Balb/c裸鼠中的体内功效
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6136在携带LU-01-0046NSCLC PDX模型的Balb/c裸鼠中的体内治疗效果。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001631
注意：当平均肿瘤体积超过2000mm3将各组终止，并收集肿瘤用于FFPE：第1组在PG-D14，第5组在PG-D18，第2&6组在PG-D21，第3&4组在PG-D31。
(c)实验方法和步骤
(i)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种某种类型的肿瘤碎片(约30mm3)用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到约198mm 3时开始治疗。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001632
Figure BDA0002639562330001641
注：给药制剂经常是新鲜制备的。
(iii)样品收集
当平均肿瘤体积超过2000mm3时终止各组，最后一次测量后收集肿瘤用于FFPE：第1组在PG-D14，第5组在PG-D18，第2&6组在PG-D21，第3&4组在PG-D31。
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图17所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表37显示了携带LU-01-0046NSCLC PDX模型的雌性Balb/c裸鼠随时间推移的平均肿瘤体积。
表37：随时间推移的肿瘤体积追踪(mm3)
Figure BDA0002639562330001642
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据在PG-D14测量的肿瘤体积，计算携带LU-01-0046PDX模型的Balb/c裸鼠中测试物的肿瘤生长抑制率。
表38：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001651
a.平均值±SEM。
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
c.使用下式计算每个组的TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100
(e)结果总结与讨论
在本研究中，评估了测试物在LU-01-0046PDX模型中的治疗效果。在图17和表37和38中显示了所有治疗组在各个时间点的测量的体重和肿瘤体积。
用空载体治疗的小鼠的平均肿瘤尺寸在PG-D14达到2307mm3。BCY6136在1mg/kg(TV＝1058mm3，TGI＝59.1％，p<0.05)、2mg/kg(TV＝264mm3，TGI＝97.0％，p<0.001)和3mg/kg(TV＝26mm 3，TGI＝108.3％，p＜0.001)时，产生剂量依赖性的抗肿瘤活性。ADC在3mg/kg和5mg/kg时，没有显示出明显的抗肿瘤活性(p>0.05)。在这项研究中，该组所有动物的体重均保持良好。
研究14：BCY6033、BCY6136、BCY6082、BCY6173、BCY6175和BCY6031在Balb/c裸鼠的 LU-01-0046NSCLC PDX模型中的体内功效研究
(a)研究目的
该研究的目的是评估测试物在Balb/c裸鼠的LU-01-0046NSCLC PDX模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001652
Figure BDA0002639562330001661
(c)实验方法与步骤
(i)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种肿瘤碎片LU-01-0046(约30mm3)，用于形成肿瘤。当第1部分研究的平均肿瘤体积达到200mm3时开始治疗，而第2部分研究的平均肿瘤体积达到192mm3时，开始治疗。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001662
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图18至22所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表39和40显示了在治疗开始后的第21天在携带LU-01-0046的雌性Balb/c裸鼠中的平均肿瘤体积。
表39：随时间推移的肿瘤体积追踪(第1部分)
Figure BDA0002639562330001671
表40：随时间推移的肿瘤体积追踪(第2部分)
Figure BDA0002639562330001672
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第21天的肿瘤体积测量值，计算LU-01-0046PDX模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表41：肿瘤生长抑制分析(第1部分)
Figure BDA0002639562330001673
Figure BDA0002639562330001681
a.平均值±SEM；b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
表42：肿瘤生长抑制分析(第2部分)
Figure BDA0002639562330001682
a.平均值±SEM；b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了LU-01-0046PDX模型中测试物的治疗效果。图18至图22和表39至表42示出了所有治疗组在各个时间点的测量的体重和肿瘤体积。
在第1部分研究中，空载体治疗的小鼠的平均肿瘤尺寸在治疗开始后的第21天达到2551mm3。
BCY6033，1/2mg/kg，qw(TV＝1285mm3，TGI＝53.9％，p＜0.001)和BCY6136，1/2mg/kg，qw(TV＝1285mm3，TGI＝53.9％，p＜0.001)产生了显著的抗肿瘤活性，但未表现出任何肿瘤消退。BCY6033，3mg/kg，qw(TV＝0mm3，TGI＝108.6％，p＜0.001)和BCY6136，3mg/kg，qw(TV＝0mm3，TGI＝108.5％，p＜0.001)完全消除了肿瘤，在3mg/kg的BCY6033和BCY6136组中，分别在5个肿瘤中有1个在暂停给药后显示出再生长，并且在恢复给药时，肿瘤对BCY6033或BICY6136治疗具有耐受性。BCY6033和BCY6136组中的其余肿瘤(每组4/5)在暂停给药80天后未出现再生长。
BCY6082，1mg/kg，qw(TV＝1826mm3，TGI＝30.8％，p＜0.05)和3mg/kg，qw(TV＝1042mm3，TGI＝64.2％，p<0.001)产生剂量依赖性抗肿瘤活性，但未显示出肿瘤消退。
在第2部分的研究中，在治疗开始后的第21天，用空载体治疗的小鼠的平均肿瘤尺寸达到了2342mm3。BCY6173，1mg/kg，qw(TV＝2151mm3，TGI＝8.9％，p＞0.05)没有显示出抗肿瘤活性。BCY6173，3mg/kg，qw(TV＝890mm3，TGI＝67.5％，p＜0.05)产生明显的抗肿瘤活性。
BCY6175，3mg/kg，qw(TV＝0mm3，TGI＝108.9％，p＜0.001)在第14天完全消除了4/5肿瘤。BCY6031，3mg/kg，qw(TV＝874mm3，TGI＝68.2％，p＜0.05)产生明显的抗肿瘤活性，但未显示任何肿瘤消退。
研究15：BCY6136在Balb/c裸鼠的LU-01-0412NSCLC PDX模型中的体内功效研究
(a)研究目的
该项目的目的是评估BCY6136在BALB/c裸鼠的LU-01-0412NSCLC PDX模型中的体内治疗功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001691
(c)实验方法与步骤
(i)肿瘤接种
在每个小鼠的右侧皮下接种LU-01-0412肿瘤碎片(约30mm3)，用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到159mm3时，将动物随机分组。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001692
(iii)样品收集
在给药后30分钟和24小时，从空载体和BCY6136、BCY8245和BCY8781治疗的另外3只小鼠收集血浆。在给药后24小时，从空载体和BCY6136、BCY8245和BCY8781治疗的另外3只小鼠收集肿瘤。
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图23所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表43显示了携带LU-01-0412异种移植的雌性BALB/c裸鼠中随时间推移的平均肿瘤体积。
表43：随时间推移的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002639562330001701
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第32天的肿瘤体积测量值，计算LU-01-0412异种移植模型中BCY6136、BCY8245和BCY8781的肿瘤生长抑制率。
表44：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001702
a.平均值±SEM；
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136、BCY8245和BCY8781在LU-01-0412异种移植模型中的治疗效果。所有治疗组在不同时间点的测得体重和肿瘤体积示于图23和表43和44中。
在治疗开始后第32天，空载体治疗的小鼠的平均肿瘤体积达到1104mm3。BCY6136，1mg/kg，qw*4(TV＝758mm3，TGI＝36.7％，p＜0.05)和3mg/kg，qw*4(TV＝416mm3，TGI＝72.9％，p＜0.001)产生剂量依赖性抗肿瘤活性，但未显示任何肿瘤消退。BCY8245，3mg/kg，qw*4(TV＝1mm3，TGI＝116.8％，p<0.001)和BCY8781，3mg/kg，qw*4(TV＝12mm3，TGI＝115.6％，p<0.001)使肿瘤明显消退。在第32天，其中用BCY8245，3mg/kg治疗的6个肿瘤中的5个和用d BCY8781，3mg/kg治疗的6个肿瘤中的2个被完全消除。
在这项研究中，所有组的动物都保持了良好的体重。
研究16：BCY6136在治疗Balb/c裸鼠的LU-01-0486PDX模型中的体内功效研究
(a)研究目的
本研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠的LU-01-0486PDX模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001711
(c)实验方法与步骤
(i)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种肿瘤碎片LU-01-0486(约30mm3)，用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到180mm3时，开始治疗，用于疗效研究。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001712
Figure BDA0002639562330001721
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图24所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表45显示了在治疗开始后第14天，携带LU-01-0486异种移植的雌性Balb/c裸鼠的平均肿瘤体积。
表45：随时间推移的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002639562330001722
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据在治疗开始后第14天的肿瘤体积测量值，计算LU-01-0486PDX模型中BCY6136的肿瘤生长抑制率。
表46：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001723
a.平均值±SEM；b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在LU-01-0486PDX模型中的治疗效果。所有治疗组在不同时间点的测得体重和肿瘤体积示于图24和表45和46。
在这项研究中，在治疗开始后的第14天，用空载体治疗的小鼠的平均肿瘤体积达到651mm3。BCY6136在1mg/kg，qw(TV＝638mm3，TGI＝3.0％，p＞0.05)和2mg/kg，qw(TV＝645mm3，TGI＝1.2％，p＞0.05)下没有显示任何抗肿瘤活性。BCY6136在3mg/kg，qw(TV＝449mm3，TGI＝43.1％，p＞0.05)产生轻微的抗肿瘤活性，无统计学显著性。
研究17：BCY6033、BCY6136和BCY6082在治疗Balb/c裸鼠的MDA-MB-231-luc异种移 植中的体内功效测试
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6033、BCY6136和BCY6082在治疗Balb/c裸鼠的MDA-MB-231-luc异种移植模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001731
(c)实验方法与步骤
(i)细胞培养
收获在指数生长期生长的细胞并计数，用于肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种0.1ml含有MDA-MB-231-luc肿瘤细胞(10×10^6)的PBS(其中含有0.1ml基质胶(matrigel))，用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到159mm3时，将36只动物随机分组。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001732
Figure BDA0002639562330001741
(iv)样品收集
在PG-D24，我们收集并固定了第1、8和9组的肿瘤用于FFPE。
在PG-D33，我们收集并固定了第2和5组的肿瘤用于FFPE。
在研究结束时，我们收集并固定了第3、4、6和7组的肿瘤用于FFPE。
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长如图25至图27所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表47至表49显示了携带MDA-MB-231-luc异种移植的雌性Balb/c裸鼠随时间推移的平均肿瘤体积。
表47：肿瘤体积追踪(PG-D0至PG-D17)
Figure BDA0002639562330001742
表48：肿瘤体积追踪(PG-D19至PG-D33)
Figure BDA0002639562330001743
Figure BDA0002639562330001751
表49：肿瘤体积追踪(PG-D35至PG-D47)
Figure BDA0002639562330001752
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第21天的肿瘤体积测量值，计算BCY6033、BCY6136和BCY6082在MDA-MB-231-luc异种移植模型中的肿瘤生长抑制率。
表50：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001753
Figure BDA0002639562330001761
a.平均值±SEM。
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6033、BCY6136和BCY6082在MDA-MB-231-luc异种移植模型中的治疗效果。图25至27和表47至50显示了所有治疗组在各个时间点的测得体重和肿瘤体积。
在第21天，空载体治疗的小鼠的平均肿瘤尺寸达到1661mm3。BCY6033，1mg/kg(TV＝880mm3，TGI＝52.0％，p<0.001)，2mg/kg(TV＝67mm3，TGI＝106.1％，p＜0.001)和3mg/kg(TV＝22mm3，TGI＝109.1％，p＜0.001)产生剂量依赖性抗肿瘤活性。BCY6033，2mg/kg和3mg/kg能有效消退肿瘤，但从第21天起，肿瘤显示出明显的再生长。
BCY6136，1mg/kg(TV＝994mm3，TGI＝44.4％，p<0.01)显示中度抗肿瘤活性，BCY6136，2mg/kg(TV＝33mm3，TGI＝108.4％，p<0.001)和3mg/kg(TV＝132mm3，TGI＝101.1％，p<0.001)产生了有效的抗肿瘤活性，但从第28天起肿瘤表现出明显的再生长。
BCY6082，2mg/kg(TV＝1287mm3，TGI＝24.9％，p>0.05)没有显示出明显的抗肿瘤活性，BCY6082，5mg/kg(TV＝218mm3，TGI＝96.1％，p<0.001)产生了显著的抗肿瘤活性。
在这项研究中，一只用2mg/kg BCY6136治疗的小鼠在治疗过程中体重减轻了15％以上，其他小鼠很好地保持了体重。
研究18：BCY6136在治疗BALB/c小鼠的EMT-6同基因模型中的体内功效测试
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6136在治疗BALB/c小鼠的EMT-6同基因模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001771
a.每只小鼠的注射体积为10ml/kg。
b.从第14天起，将第3组和第4组的剂量更改为5mpk和3mpk。
(c)实验方法与步骤
(i)细胞培养
将EMT-6肿瘤细胞以单层培养的形式在37℃下、在空气中5％CO2的气氛中，体外维持在EMEM培养基中，所述EMEM培养基补充有10％热灭活的胎牛血清。通过胰蛋白酶-EDTA处理，每周两次常规将肿瘤细胞传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数，用于肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种0.1ml含有EMT-6肿瘤细胞(5x 106)PBS，用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到75mm3时，将44只动物随机分组。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001772
(iv)样品收集
在第11天，从备用小鼠中收集3个肿瘤用于FACS。数据由生物小组提供。
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图28所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表51显示了携带EMT-6同基因的雌性BALB/c小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。
表51：随时间推移的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002639562330001781
从第14天起，将第3组和第4组的剂量更改为5mpk和3mpk。
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第21天的肿瘤体积测量值，计算BCY6136在EMT-6同基因模型中的肿瘤生长抑制率。
表52：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001782
a.平均值±SEM。
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
c.从第14天起，将第3组和第4组的剂量更改为5mpk和3mpk。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在EMT-6同基因模型中的治疗效果。图28和表51和52显示了所有治疗组在各个时间点的测得体重和肿瘤体积。
空载体治疗的小鼠的平均肿瘤尺寸在第21天达到1499mm3。BCY6136，3mg/kg，qw(TV＝561mm3，TGI＝66.2％，p＜0.05)显示出明显的抗肿瘤活性。BCY6136，1/5mg/kg，qw(TV＝1272mm3，TGI＝16.1％，p>0.05)和BCY6136，0.3/3mg/kg，qw(TV＝1394mm3，TGI＝7.4％，p>0.05)未显示任何抗肿瘤活性。
从第14天起，将第3组和第4组的剂量改变为5mpk和3mpk。在小鼠3-5中在第14天发现了肿瘤溃疡，并给小鼠施用抗生素乳膏。在这项研究中，所有小鼠均保持了良好的体重。
研究19：BCY6136在治疗Balb/c裸鼠的NCI-N87异种移植中的体内功效研究
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6136在治疗Balb/c裸鼠的NCI-N87异种移植中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001791
(c)实验方法与步骤
(i)细胞培养
将NCI-N87肿瘤细胞在37℃下、在空气中5％CO2的气氛中维持在RPMI-1640培养基中，该RPMI-1640培养基中补充有10％热灭活的胎牛血清。常规每周将肿瘤细胞传代培养两次。收获在指数生长期生长的细胞并计数，用于肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种0.2ml含有NCI-N87肿瘤细胞(10x 106)和基质胶(1：1)的PBS，用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到约176mm3时，将动物随机分组并开始治疗。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001792
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图29所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表53显示了携带NCI-N87异种移植的雌性Balb/c裸鼠随时间推移的平均肿瘤体积。
表53：随时间推移的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002639562330001801
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据在治疗开始后第30天的肿瘤体积测量值，计算BCY6136在NCI-N87异种移植中的肿瘤生长抑制率。
表54：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001802
a.平均值±SEM。
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在NCI-N87模型中的治疗效果。所有治疗组在不同时间点的测得体重和肿瘤体积示于图29和表53和54中。
在第30天空载体治疗的小鼠的平均肿瘤尺寸达到1465mm3。BCY6136，1mg/kg，qw(TV＝425mm3，TGI＝80.7％，p<0.001)和2mg/kg，qw(TV＝210mm3，TGI＝97.4％，p<0.001)以剂量依赖性方式产生显著的抗肿瘤活性，BCY6136，3mg/kg，qw(TV＝201mm3，TGI＝98.1％，p<0.001)表现出与2mpk的BCY6136相当的抗肿瘤活性。
在这项研究中，在治疗过程中所有组均未发现明显的体重减轻。
研究20：BCY6136在治疗Balb/c裸鼠的SK-OV-3异种移植中的体内功效研究
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6136在治疗Balb/c裸鼠的SK-OV-3异种移植中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001811
(c)实验方法与步骤
(i)细胞培养
将SK-OV-3肿瘤细胞在37℃下、空气中5％CO2的气氛下保持在McCoy 5a培养基中，该McCoy 5a培养基中补充有10％热灭活的胎牛血清。常规每周将肿瘤细胞传代培养两次。收获在指数生长期生长的细胞并计数，用于肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种0.2ml含有SK-OV-3肿瘤细胞(10x 106)和基质胶(1：1)的PBS，用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到约186mm3时，将动物随机分组并开始治疗。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001812
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图30所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表55显示了携带SK-OV-3异种移植的雌性Balb/c裸鼠随时间推移的平均肿瘤体积。
表55：随时间推移的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002639562330001821
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第28天的肿瘤体积测量值，计算BCY6136在SK-OV-3异种移植中的肿瘤生长抑制率。
表56：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001822
a.平均值±SEM。
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在SK-OV-3模型中的治疗效果。图30和表55和表56显示了所有治疗组在不同时间点测得的体重和肿瘤体积。
在第28天空载体治疗小鼠的平均肿瘤尺寸达到1560mm3。ADC，3mg/kg，qw(TV＝684mm3，TGI＝63.8％，p<0.01)表现出中度抗肿瘤功效。BCY6136，1mg/kg，qw(TV＝1035mm3，TGI＝38.1％，p>0.05)没有显示出明显的抗肿瘤活性。BCY6136，2mg/kg，qw(TV＝277mm3，TGI＝93.3％，p<0.001)和3mg/kg，qw(TV＝254mm3，TGI＝95.0％，p<0.001)产生显著的抗肿瘤活性。
在这项研究中，在治疗过程中，在所有组中均未发现明显的体重减轻。
研究21：BCY6136在治疗Balb/c裸鼠的OE21异种移植中的体内功效研究
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6136在治疗Balb/c裸鼠的OE21异种移植中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001831
(c)实验方法与步骤
(i)细胞培养
将OE21肿瘤细胞在37℃下、空气中5％CO2的气氛下保持在RPMI-1640培养基中，该RPMI-1640培养基中补充有10％热灭活的胎牛血清。常规每周将肿瘤细胞传代培养两次。收获在指数生长期生长的细胞并计数，用于肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种0.2ml含有OE21肿瘤细胞(5x 106)和基质胶(1：1)的PBS，用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到约157mm3时，将动物随机分组并开始治疗。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001832
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图31所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表57显示了携带OE21异种移植的雌性Balb/c裸鼠随时间推移的平均肿瘤体积。
表57：随时间推移的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002639562330001841
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第23天的肿瘤体积测量值，计算BCY6136在OE21异种移植中的肿瘤生长抑制率。
表58：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001842
a.平均值±SEM。
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在OE21模型中的治疗效果。所有治疗组在不同时间点测得的体重和肿瘤体积示于图31和表57和58。
在第23天，空载体治疗的小鼠的平均肿瘤尺寸达到1586mm3。BCY6136，1mg/kg，qw(TV＝1155mm3，TGI＝30.4％，p<0.05)显示出轻微的抗肿瘤活性。BCY6136，2mg/kg，qw(TV＝537mm3，TGI＝73.4％，p<0.001)和3mg/kg，qw(TV＝489mm3，TGI＝76.7％，p<0.001)产生显著的抗肿瘤活性。
在这项研究中，在治疗过程中所有组均未发现明显的体重减轻。
研究22：BCY6136和BCY6082在治疗CB17-SCID小鼠的MOLP-8异种移植中的体内功 效测试
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY6136和BCY6082在治疗CB17-SCID小鼠的MOLP-8异种移植中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001851
(c)实验方法与步骤
(i)细胞培养
将MOLP-8肿瘤细胞在37℃下、空气中5％CO2的气氛下作为单层培养物体外保持在RPMI-1640中，该RPMI-1640补充有20％热灭活的胎牛血清。常规通过胰蛋白酶-EDTA处理将肿瘤细胞传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数，用于肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种0.2ml含有MOLP-8肿瘤细胞(10x 106)的PBS(含有50％基质胶)，用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到约141mm3时，将36只动物随机分组。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001852
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图32和33所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表59显示了携带MOLP-8异种移植的雌性CB17-SCID小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。
表59：随时间推移的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002639562330001861
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第14天的肿瘤体积测量值，计算BCY6136和BCY6082在MOLP-8异种移植模型中的肿瘤生长抑制率。
表60：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001862
a.平均值±SEM。
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136和BCY6082在MOLP-8异种移植模型中的治疗效果。图32和33和表59和60显示了所有治疗组在各个时间点测得的体重和肿瘤体积。
在第14天空载体治疗小鼠的平均肿瘤尺寸达到2528mm3。BCY6136，1mg/kg(TV＝1146mm3，TGI＝45.5％，p>0.05)，2mg/kg(TV＝1218mm3，TGI＝54.9％，p<0.05)和3mg/kg(TV＝938mm3，TGI＝66.7％，p<0.01)产生了剂量依赖性的抗肿瘤活性，但所有剂量均未使MOLP-8异种移植肿瘤消退。
BCY6082，1mg/kg(TV＝2296mm3，TGI＝9.8％，p>0.05)和2mg/kg(TV＝1554mm3，TGI＝40.8％，p>0.05)的没有显示出明显的抗肿瘤活性。BCY6082，3mg/kg显著抑制了肿瘤的生长(TV＝1321mm3，TGI＝50.6％，p<0.05)，但在MOLP-8异种移植中并未使肿瘤消退。
在这项研究中，所有小鼠均保持了良好的体重。
研究23：BCY在治疗BALB/c裸鼠的HT1080异种移植中的体内功效测试
(a)研究目的
该研究的目的是评估BCY在治疗BALB/c裸鼠的HT1080异种移植模型的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002639562330001871
Figure BDA0002639562330001881
注：n：动物数；给药体积：根据体重调整给药体积10μl/g。
(c)实验方法与步骤
(i)细胞培养
将HT1080肿瘤细胞在37℃下、空气中5％CO2的气氛下保持在补充有10％热灭活的胎牛血清的培养基中。常规每周将肿瘤细胞传代培养两次。收获在指数生长期生长的细胞并计数，用于肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
在每只小鼠的右侧皮下接种HT1080肿瘤细胞(5x 106)，用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到约150-200mm3时，将动物随机分组，并开始治疗。实验设计表中显示了每组中的测试物施用和动物数。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002639562330001882
Figure BDA0002639562330001891
(d)结果
(i)体重变化和肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图34至图42所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表61显示了携带HT1080异种移植的雌性Balb/c裸鼠随时间推移的平均肿瘤体积。
表61：随时间推移的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002639562330001892
Figure BDA0002639562330001901
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据治疗开始后第14天的肿瘤体积测量值，计算BCY在HT1080异种移植模型中的肿瘤生长抑制率。
表62：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002639562330001902
Figure BDA0002639562330001911
a.平均值±SEM。
b.通过用治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY在HT1080异种移植模型中的治疗效果。图34至42和表61和62示出了所有治疗组在各个时间点测得的体重和肿瘤体积。
在第14天，空载体治疗的小鼠的平均肿瘤尺寸达到1737mm3。
BCY6082，2mg/kg，qw(TV＝5mm3，TGI＝111.1％，p<0.01)和BCY6031，2mg/kg，qw(TV＝7mm3，TGI＝106.8％，p<0.01)显示有效的抗肿瘤活性。
BCY6173，1mg/kg，qw(TV＝1074mm3，TGI＝42.5％，p>0.05)，2mg/kg，qw(TV＝480mm3，TGI＝80.6％，p<0.05)和3mg/kg，qw(TV＝7mm3，TGI＝108.4％，p<0.01)产生剂量依赖性抗肿瘤活性。
BCY6135，1mg/kg，qw(TV＝871mm3，TGI＝55.5％，p<0.01)，2mg/kg，qw(TV＝62mm3，TGI＝107.5％，p<0.001)和3mg/kg，qw(TV＝44mm3，TGI＝108.6％，p<0.001)产生剂量依赖性抗肿瘤活性。
BCY6033，3mg/kg，qw(TV＝9mm3，TGI＝110.8％，p<0.001)和5mg/kg，qw(TV＝0mm3，TGI＝111.4％，p<0.001)表现出有效的抗肿瘤活性，并且5mg/kg在第14天完全消除肿瘤。
BCY6136，2mg/kg，qw(TV＝345mm3，TGI＝95.7％，p<0.001)，3mg/kg，qw(TV＝3mm3，TGI＝111.2％，p<0.001)和5mg/kg，qw(TV＝2mm3，TGI＝111.3％，p＜0.001)显示出有效的抗肿瘤活性。
BCY6174，1mg/kg，qw(TV＝1066mm3，TGI＝43.1％，p<0.05)，2mg/kg，qw(TV＝532mm3，TGI＝77.3％，p<0.01)和3mg/kg，qw(TV＝11mm3，TGI＝110.7％，p<0.001)产生剂量依赖性抗肿瘤活性。
BCY6175，1mg/kg，qw(TV＝769mm3，TGI＝62.1％，p<0.01)，2mg/kg，qw(TV＝295mm3，TGI＝92.5％，p<0.001)和3mg/kg，qw(TV＝11mm3，TGI＝110.8％，p<0.001)产生剂量依赖性抗肿瘤活性。
ADC，3mg/kg，qw(TV＝0mm3，TGI＝111.5％)在第14天完全消除肿瘤。
研究24：来自多种肿瘤类型的EphA2的拷贝数变化(CNV)与基因表达之间的相关性 研究
方法
1.在cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)中选择所有研究，然后搜索EPHA2。
(a)删除临时研究。
(b)取消选择具有重叠样本的研究，以防止样本偏倚(基于cBioPortal中的警告)-如果可以选择，通常保留PanCancer研究。
(c)选择用于分析的研究(表63)。
表63：cBioPortal分析的研究和研究中的单元
Figure BDA0002639562330001921
Figure BDA0002639562330001931
2.从cBioPortal导出CNV和RNA表达数据。
3.测试CNV是否与EphA2 mRNA表达的变化在统计学上显著相关(未应用log2)。
(a)在GraphPad Prism(7.04)和R/R工作室中运行非参数Kruskal-Wallis检验(显著性的阈值：p<0.01)。
(i)GraphPad Prism：设置列表，运行不匹配或配对非参数检验，且不假设高斯分布。
(ii)R中使用的软件包：
1.XLConnect
2.dplyr
3.Kruskal-Wallis等秩和检验：Kruskal.test。
4.使用Dunn检验在R/Rstudio中调整多重比较(即使在组中n＝1，也包括所有可能的比较)(显著性阈值：p<0.025)。
(a)使用多重比较方法的dunn.test＝“bonferonni”。
结果
结果显示在下表64中。在cBioPortal中收集的41个公开可用的数据集中，报告了EphA2的拷贝数变化(CNV)和mRNA基因表达，其中有许多癌症类型报告了具有EphA2轻度缺失(shallow-deletion)(<2个拷贝)的病例。尽管不太常见，但在这些相同的癌症类型中，一部分肿瘤亚组具有EphA2深度缺失(deep deletion)(>1个拷贝缺失或双等位基因缺失)、EphA2增益(gain)(2-3个拷贝)或EphA2扩增(>3个拷贝)。超过33％的肿瘤具有EphA2的轻度缺失或深度缺失的适应症包括：肾嫌色细胞癌、胆管癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、肺鳞癌、乳腺癌、直肠癌、脑低级胶质瘤、肝癌、肾上腺皮质癌、间皮瘤、食管腺癌和结肠癌。相反，没有研究表明>33％的样品具有EphA2的增益或扩增。这些结果一起表明，EphA2DNA的缺失存在于各种适应症中。
在41项研究中分析的所有样本中，大约有三分之一带有EphA2 CNV。基于整个研究中高百分比的CNV，以及具体肿瘤类型中高百分比的轻度缺失，进行统计学检验以鉴定拷贝数变化与RNA表达之间的可能的相关性。每个适应症的肿瘤被指定为5类中的1类：
a)深度缺失；
b)轻度缺失；
c)二倍体(diploid)；
d)增益；或
e)扩增。
然后进行Kruskall-Wallis检验，以检测各类之间每类的mRNA表达值的分布是否不同(P<0.01)。对于那些P<0.01的TCGA数据集，通过计算Z统计量来进行事后检验(post-hoc testing)，计算调整后的P值(Bonferroni)，来确定哪些类别彼此不同。为了简化解释，回顾了每个适应症的配对比较与二倍体的比较(尽管计算了所有配对的P值)。这些研究中19/41的Kruskall-Wallis的p值小于0.01，这说明拷贝数在统计学上与RNA表达显著相关。在这19项研究中，其中17项针对二倍体与轻度缺失的Bonferroni的调整的P<0.025，表明EphA2 mRNA表达减少与EphA2拷贝数减少相关。在这19项研究中，只有两项针对二倍体与增益之间的Bonferroni的调整的P<0.025，并且均为乳腺癌研究。此外，这些乳腺癌研究中的一项(乳腺浸润癌(TCGA，PanCancer Atlas))中，针对二倍体与轻度缺失和二倍体与增益的Bonferroni调整的P<0.025，这表明拷贝数变化可能对乳腺癌中EphA2 RNA表达具有很强的影响。
遗传学的中心法则表明，EphA2拷贝数减少导致RNA和蛋白质表达减少。因此，在多种肿瘤类型中观察到的EphA2拷贝数缺失与mRNA表达降低之间的相关性表明，EphA2蛋白表达也可以降低。类似地，与mRNA表达增加相关的乳腺癌中EphA2的拷贝数的增益也可能暗示EphA2蛋白表达的增加。此外，在临床前的体内模型中，较高的EphA2蛋白表达(通过FACS测量)与本发明的某些EphA2双环药物缀合物的功效增加(通过肿瘤体积测量)相关。总之，如果与mRNA表达变化相关的拷贝数变化确实预测了蛋白表达水平，则具有EphA2拷贝数缺失的肿瘤患者可能不太可能对本发明的EphA2双环药物缀合物发生反应。类似地，如果肿瘤患者具有EphA2的拷贝数增益(例如乳腺癌)，这些患者更有可能对本发明的EphA2双环药物缀合物发生反应。因此，如果通过EphA2拷贝数状态对患者进行分类，则该信息可以用于排除和选择用本发明的EphA2双环药物缀合物进行治疗的患者，以增加功效。
Figure BDA0002639562330001961
Figure BDA0002639562330001981
Figure BDA0002639562330001991
Figure BDA0002639562330002001
Figure BDA0002639562330002011
Figure BDA0002639562330002021
Figure BDA0002639562330002031
Figure BDA0002639562330002041
序列表
<110> 拜斯科技术开发有限公司
<120> 特异于EPHA2的双环肽配体
<130> BIC-C-P2288PCT
<150> GB1721259.8
<151> 2017-12-19
<150> GB1804102.0
<151> 2018-03-14
<150> GB1818603.1
<151> 2018-11-14
<160> 98
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> X代表HyP
<220>
<221> Xaa
<222> (12)..(12)
<223> Xaa代表D-Asp
<220>
<221> Xaa
<222> (14)..(14)
<223> Xaa代表HArg
<400> 1
Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp Xaa Cys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa代表Beta-Ala
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa代表Sar10
<220>
<221> Xaa
<222> (4)..(4)
<223> Xaa代表HArg
<220>
<221> Xaa
<222> (7)..(7)
<223> Xaa代表HyP
<220>
<221> Xaa
<222> (17)..(17)
<223> Xaa代表D-Asp
<220>
<221> Xaa
<222> (19)..(19)
<223> Xaa代表HArg
<400> 2
Xaa Xaa Ala Xaa Asp Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro
1 5 10 15
Xaa Trp Xaa Cys
20
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Ala Cys Met Asn Asp Trp Trp Cys Ala Met Gly Trp Lys Cys Ala
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys Ala
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Ala Cys Val Val Asp Gly Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys Ala
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Ala Cys Val Val Asp Ser Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys Ala
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Ala Cys Val Pro Asp Ser Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys Ala
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Ala Cys Tyr Val Gly Lys Glu Cys Ala Ile Arg Asn Val Cys Ala
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Ala Cys Tyr Val Gly Lys Glu Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys Ala
1 5 10 15
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
Ala Arg Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HArg
<400> 11
Ala Xaa Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Thr Cys Leu
1 5 10 15
His Gly
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是D-His
<400> 13
Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Thr Cys Leu
1 5 10 15
Xaa Gly
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Ser Cys Arg
1 5 10 15
Gly Gln
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是HArg
<400> 15
Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Ser Cys Xaa
1 5 10 15
Gly Gln
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
1 5 10
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Asp Leu Arg Cys Gly Gly Asp Pro Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Ser Arg Pro Cys Val Ile Asp Ser Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Glu Ser Arg Cys Ser Pro Asp Ala Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
His Ser Gly Cys Arg Pro Asp Pro Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Gly Ser Gly Cys Lys Pro Asp Ser Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Glu Thr Val Cys Leu Pro Asp Ser Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Gly Gln Val Cys Ile Val Asp Ala Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala Phe Glu Asn Val Cys Val Asp
1 5 10 15
His
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala Phe Met Asn Val Cys Glu Asp
1 5 10 15
Arg
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala Phe Gln Asp Val Cys Asp His
1 5 10 15
Glu
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala Phe Arg Asp Val Cys Leu Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
Ala Cys Gln Pro Ser Asn His Cys Ala Phe Met Asn Tyr Cys Ala
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 29
Ala Cys Ser Pro Thr Pro Ala Cys Ala Val Gln Asn Leu Cys Ala
1 5 10 15
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
Ala Cys Thr Ser Cys Trp Ala Tyr Pro Asp Ser Phe Cys Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
Ala Cys Thr Lys Pro Thr Gly Phe Cys Ala Tyr Pro Asp Thr Ile Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
Ala Cys Arg Gly Glu Trp Gly Tyr Cys Ala Tyr Pro Asp Thr Ile Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Ala Cys Arg Asn Trp Gly Met Tyr Cys Ala Tyr Pro Asp Thr Ile Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Ala Cys Pro Asp Trp Gly Lys Tyr Cys Ala Tyr Pro Asp Thr Ile Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
Ala Cys Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Cys Ala Tyr Pro Asp Thr Ile Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 36
Ala Cys Ser Ser Cys Trp Ala Tyr Pro Asp Ser Val Cys Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Ala Cys Gln Ser Cys Trp Ala Tyr Pro Asp Thr Tyr Cys Ala
1 5 10
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys Glu Thr Phe Cys Ala
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Val Pro Cys Glu Val His Cys Ala
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys Glu Met Val Cys Ala
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys Val Thr Tyr Cys Ala
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys Glu Leu Val Cys Ala
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Val Pro Cys Asn Val Phe Cys Ala
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys Glu Leu Phe Cys Ala
1 5 10 15
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys Glu Leu Phe Cys Met Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 46
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys Glu Leu Tyr Cys Ala
1 5 10 15
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 47
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys Glu Leu Tyr Cys Ala His
1 5 10 15
Thr
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 48
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys Glu Met Tyr Cys Ala
1 5 10 15
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 49
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Val Pro Cys Glu Leu Tyr Cys Ala Asp
1 5 10 15
Asn
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 50
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Thr Ser Gly Trp Lys Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 51
Ala Cys Pro Met Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Ile Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 52
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Ile Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 53
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Arg Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 54
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Asn Leu Pro Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 55
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Val Pro Gly Trp Ser Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 56
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Leu Asp Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 57
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Met Pro Gly Trp Gly Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 58
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Met Ile Gly Asn Trp Thr Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 59
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Met Thr Gly Trp Ser Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 60
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Met Met Gly Gly Trp Lys Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 61
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Tyr Gly Ser Trp Lys Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 62
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 63
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 63
Ala Arg Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys Ala
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 64
Arg Pro Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys Ala
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 65
Arg Pro Pro Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys Ala
<210> 66
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 66
Lys His Ser Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys Ala
<210> 67
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 67
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
Leu His Gly
<210> 68
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (18)..(18)
<223> Xaa是D-His
<400> 68
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
Leu Xaa Gly
<210> 69
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是2Nal
<400> 69
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Xaa Thr Cys
1 5 10 15
Leu His Gly
<210> 70
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 70
Arg His Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Leu Pro Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys Ala
<210> 71
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 71
Thr Pro Arg Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Met Pro Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys Ala
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 72
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Ala Pro Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 73
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 73
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Ala Pro Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
Ser Arg Ser
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 74
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Glu Pro Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 75
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 75
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Glu Pro Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
Ala Lys Arg
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 76
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Ser Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 77
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 77
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Ser Cys
1 5 10 15
Arg Gly Gln
<210> 78
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是HArg
<400> 78
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Ser Cys
1 5 10 15
Xaa Gly Gln
<210> 79
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是2Nal
<400> 79
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Xaa Ser Cys
1 5 10 15
Arg Gly Gln
<210> 80
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 80
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Thr Pro Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
Thr Asn Thr
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 81
Ala Cys Pro Met Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Lys Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 82
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 82
Ala Cys Pro Met Val Asn Pro Leu Cys Leu Thr Pro Gly Trp Ile Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 83
Ala Cys Pro Met Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 84
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是D-Asp
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Aib
<220>
<221> Xaa
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是1Nal
<220>
<221> Xaa
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Aib
<220>
<221> Xaa
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是1Nal
<220>
<221> Xaa
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是tBuGly
<220>
<221> Xaa
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是HArg
<220>
<221> Xaa
<222> (18)..(18)
<223> Xaa是D-Asp
<400> 84
His Xaa Val Thr Cys Xaa Xaa Gly Xaa Phe Xaa Cys Pro Xaa Asn Xaa
1 5 10 15
Pro Xaa Cys
<210> 85
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HArg
<220>
<221> Xaa
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是HyP
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Hse(Me)
<220>
<221> Xaa
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是D-Asp
<220>
<221> Xaa
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是HArg
<400> 85
Ala Xaa Asp Cys Xaa Xaa Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp
1 5 10 15
Xaa Cys
<210> 86
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HArg
<220>
<221> Xaa
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是HyP
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Hse(Me)
<220>
<221> Xaa
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是D-Asp
<400> 86
Ala Xaa Asp Cys Xaa Xaa Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp
1 5 10 15
Thr Cys
<210> 87
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HArg
<220>
<221> Xaa
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是HyP
<220>
<221> Xaa
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是D-Ala
<400> 87
Ala Xaa Asp Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp
1 5 10 15
Thr Cys
<210> 88
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HArg
<220>
<221> Xaa
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是D-Ala
<400> 88
Ala Xaa Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp
1 5 10 15
Thr Cys
<210> 89
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是HyP
<400> 89
Ala Arg Asp Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys
<210> 90
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是D-3,3-DPA
<400> 90
Ala Arg Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys
<210> 91
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 91
Ala Arg Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys Leu His
20
<210> 92
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是HArg
<220>
<221> Xaa
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是Cya
<400> 92
Ala Xaa Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp
1 5 10 15
Thr Cys
<210> 93
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是D-Arg
<220>
<221> Xaa
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是HyP
<220>
<221> Xaa
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是D-3,3-DPA
<220>
<221> Xaa
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是D-Asp
<220>
<221> Xaa
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是HArg
<400> 93
Ala Xaa Asp Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Xaa Trp
1 5 10 15
Xaa Cys
<210> 94
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 94
Ala Cys Pro Trp Gly Pro Ala Trp Cys Pro Val Asn Arg Pro Gly Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 95
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 95
Ala Cys Pro Trp Gly Pro Phe Trp Cys Pro Val Asn Arg Pro Gly Cys
1 5 10 15
Ala
<210> 96
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 96
Ala Asp Val Thr Cys Pro Trp Gly Pro Phe Trp Cys Pro Val Asn Arg
1 5 10 15
Pro Gly Cys Ala
20
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 97
Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Thr Cys
1 5 10 15
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Cit
<220>
<221> Xaa
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是hPhe
<400> 98
Glu Pro Xaa Gly Xaa Tyr Leu
1 5

Claims (31)

1.一种特异于EphA2的肽配体，其包含多肽和非芳族分子支架，所述多肽包含由至少两个环序列隔开的至少三个半胱氨酸残基，所述非芳族分子支架与所述多肽的半胱氨酸残基形成共价键从而在所述分子支架上形成至少两个多肽环。
2.根据权利要求1所述的肽配体，其中所述环序列包含2、3、5、6或7个氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的肽配体，其中所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列中的一个由2个氨基酸组成，另一个由7个氨基酸组成(例如表4中列出的那些)。
4.根据权利要求1或2所述的肽配体，其中所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列均由5个氨基酸组成(例如表3和4中列出的那些)。
5.根据权利要求1或2所述的肽配体，其中所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列均由6个氨基酸组成(例如表3至表5和表10中所列的那些)。
6.根据权利要求1或2所述的肽配体，其中所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列中的一个由7个氨基酸组成，而另一个由3个氨基酸组成(例如表4中所列的那些)。
7.根据权利要求1或2所述的肽配体，其中所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列中的一个由6个氨基酸组成，而另一个由7个氨基酸组成(例如表5中所列的那些)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的肽配体，其中所述肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
Ci-X1-Cii-X2-Ciii，
其中X1和X2代表表3至表5和表10中列出的半胱氨酸残基之间的氨基酸残基，Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基，或其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽配体，其中所述肽配体包含选自表3至表5和表10中的一个或多个所列出的一个或多个肽配体的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的肽配体，其中所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列均由6个氨基酸组成，并且所述肽配体具有以下氨基酸序列：
Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Cii(SEQ ID NO：1)；和
CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii(SEQ ID NO：97)；
例如：Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：1)；
其中HyP是羟基脯氨酸，HArg是高精氨酸，Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基，或其药学上可接受的盐。
11.根据权利要求10所述的肽配体，其中所述环序列包含由两个环序列隔开的三个半胱氨酸残基，所述两个环序列均由6个氨基酸组成，并且所述肽配体具有以下氨基酸序列：
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)(BCY6099；化合物66)；和
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：11))(BCY6014；化合物67)；
例如：
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)(BCY6099；化合物66)；
其中，Sar是肌氨酸，HArg是高精氨酸，HyP是羟基脯氨酸。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的肽配体，其中所述分子支架选自1，1′，1″-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)，所述肽配体选自表3、表4、表5和表10所列出的任意一种肽配体。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的肽配体，其中所述分子支架选自1，1′，1″-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)，所述肽配体是
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)(BCY6099；化合物66)；和
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：11))(BCY6014；化合物67)；
例如：
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)(BCY6099；化合物66)；
其中，Sar是肌氨酸，HArg是高精氨酸，HyP是羟基脯氨酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的肽配体，其选自化合物1-113中的任一种或其药学上可接受的盐。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的肽配体，其是化合物66(BCY6099)或化合物67(BCY6014)，或其药学上可接受的盐，例如化合物66(BCY6099)或其药学上可接受的盐。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的肽配体，其中所述药学上可接受的盐选自游离酸或钠、钾、钙、铵盐。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的肽配体，其中所述EphA2为人EphA2。
18.一种药物缀合物，其包含缀合至一个或多个效应物和/或官能团的权利要求1至17中任一项所述的肽配体。
19.根据权利要求18所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂选自DM1或MMAE。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的药物缀合物，其在所述肽配体和所述细胞毒性剂之间还包含接头。
21.根据权利要求20所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是MMAE，所述接头选自：-Val-Cit-、-Trp-Cit-、-Val-Lys-、-D-Trp-Cit-、-Ala-Ala-Asn-、D-Ala-Phe-Lys-或-Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-Tyr-Leu-(SEQ ID NO：98)。
22.根据权利要求21所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是MMAE，所述接头是-Val-Cit-。
23.根据权利要求20所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是DM1，所述接头选自：-S-S-、-SS(SO3H)-、-SS-(Me)-、-(Me)-SS-(Me)-、-SS-(Me2)-或-SS-(Me)-SO3H-。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的药物缀合物，其选自BCY6027、BCY6028、BCY6031和BCY6032；表11或表13所列的BDC；或BCY6033、BCY6082、BCY6136和BCY6173中的任一种。
25.根据权利要求24所述的药物缀合物，其选自：BCY6031、BCY6033、BCY6082、BCY6135、BCY6136、BCY6173、BCY6174和BCY6175中的任一种。
26.根据权利要求24或25所述的药物缀合物，其为BCY6136。
27.一种药物组合物，其包含权利要求1至17中任一项所述的肽配体或权利要求18至26中任一项所述的药物缀合物，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
28.根据权利要求18至26中任一项所述的药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗特征在于患病组织中过度表达EphA2的疾病或病症的用途。
29.根据权利要求18至26中任一项所述的药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗癌症的用途。
30.根据权利要求29所述的药物缀合物的用途，其中所述癌症选自：前列腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、胃癌、卵巢癌、食道癌、多发性骨髓瘤和纤维肉瘤。
31.一种用于预防、抑制或治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用权利要求18至26中任一项所述的药物缀合物，其中所述患者被鉴定为具有增加的EphA2拷贝数变化(CNV)。
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