KR20200105839A - EphA2에 특이적인 바이사이클릭 펩티드 리간드 - Google Patents

EphA2에 특이적인 바이사이클릭 펩티드 리간드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2개 이상의 펩티드 루프가 스캐폴드에 대한 부착점 사이에 대향하도록 비-방향족 분자 스캐폴드에 공유 결합되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Eph 수용체 티로신 키나제 A2 (EphA2)의 고친화성 결합제인 펩티드를 기술한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 이펙터 및/또는 관능 그룹에 접합된 상기 펩티드를 포함하는 약물 접합체, 상기 펩티드 리간드 및 약물 접합체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 질환이 있는 조직 (예를 들어 종양)에서 EphA2의 과발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 예방, 억제 또는 치료하는데 있어서의 상기 펩티드 리간드 및 약물 접합체의 용도를 포함한다.

Description

EphA2에 특이적인 바이사이클릭 펩티드 리간드
본 발명은 2개 이상의 펩티드 루프가 스캐폴드에 대한 부착점 사이에 대향하도록 비-방향족 분자 스캐폴드에 공유 결합되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Eph 수용체 티로신 키나제 A2 (EphA2)의 고친화성 결합제인 펩티드를 기술한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 이펙터(effector) 및/또는 관능 그룹(functional group)에 접합된 상기 펩티드를 포함하는 약물 접합체(drug conjugate), 상기 펩티드 리간드 및 약물 접합체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 질환이 있는 조직 (예를 들어 종양)에서 EphA2의 과발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 예방, 억제 또는 치료하는데 있어서의 상기 펩티드 리간드 및 약물 접합체의 용도를 포함한다.
사이클릭 펩티드는 단백질 표적에 높은 친화성 및 표적 특이성으로 결합할 수 있으며, 따라서 치료제의 개발에 매력적인 분자 부류이다. 실제로, 몇몇 사이클릭 펩티드가, 예를 들면, 항균성 펩티드 반코마이신, 면역억제 약물 사이클로스포린 또는 항암 약물 옥트레오티드로서 진료소에서 이미 성공적으로 사용되었다 (Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). 우수한 결합 특성은 펩티드와 표적 사이에 형성된 비교적 큰 상호작용 표면 뿐만 아니라 사이클릭 구조의 감소된 입체구조적 유연성으로부터 야기된다. 전형적으로, 마크로사이클은, 예를 들면, 사이클릭 펩티드 CXCR4 길항제 CVX15 (400 Å2; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), 인테그린 αVb3에 결합하는 Arg-Gly-Asp 모티프를 갖는 사이클릭 펩티드 (355 Å2) (Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151-5) 또는 유로키나제-타입 플라스미노겐 활성화제에 결합하는 사이클릭 펩티드 억제제 유파인-1 (603 Å2; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10)으로서 수백 평방 옹스트롬의 표면에 결합한다.
이들의 사이클릭 배위로 인해, 펩티드 마크로사이클은 선형 펩티드보다 덜 유연하여, 표적에 결합시 엔트로피의 손실이 적어지고 더 높은 결합 친화도를 야기한다. 감소된 유연성은 또한 표적-특이 입체구조를 고정시켜 선형 펩티드에 비해 결합 특이성을 증가시킨다. 이러한 효과는 개환되는 경우 다른 MMP에 비해 선택성이 상실되는 매트릭스 메탈로프로테이나제 8 (MMP-8)의 강력하고 선택적인 억제제에 의해 예시되었다 (Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749-51). 마크로폐환 (macrocyclization)을 통해 달성되는 유리한 결합 특성은 예를 들면 반코마이신, 니신 및 악티노마이신에서와 같이 하나 이상의 펩티드 환을 갖는 멀티사이클릭 펩티드에서 더욱 현저하다.
다른 연구팀들은 이전에 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드를 합성 분자 구조로 묶었다 (Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Meloen과 동료들은 단백질 표면의 구조적 모방을 위해 합성 스캐폴드에 다중 펩티드 루프를 신속하고 정량적으로 폐환시키기 위해 트리스(브로모메틸)벤젠 및 관련 분자를 사용하였다 (Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). 예를 들어 TATA (1,1',1''-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온, Heinis et al. Angew Chem, Int Ed. 2014; 53:1602-1606)으로서의 분자 스캐폴드에 시스테인 함유 폴리펩티드를 연결함으로써 상기 화합물이 생성되는 후보 약물 화합물의 생성 방법.
바이사이클릭 펩티드의 큰 라이브러리를 생성하고 관심 표적에 스크리닝하기 위해 파지 디스플레이-기반 조합 접근법이 개발되었다 (Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 및 제WO 2009/098450호). 간략하게 말하면, 3개의 시스테인 잔기 및 6개의 랜덤 아미노산의 2개의 영역을 함유하는 선형 펩티드의 조합 라이브러리 (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)를 파지 상에 표시하고 시스테인 측쇄를 소분자 스캐폴드에 공유 결합시킴으로써 폐환시켰다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 적어도 두 개의 루프 서열(loop sequence)에 의해 분리된 적어도 세 개의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드 및, 적어도 두 개의 폴리펩티드 루프가 비-방향족 분자 스캐폴드(non-aromatic molecular scaffold) 상에 형성되도록 폴리펩티드의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 비-방향족 분자 스캐폴드를 포함하는 EphA2에 특이적인 펩티드 리간드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 제공되며, 여기서 펩티드 리간드는 다음의 아미노산 서열을 포함하고:
Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (서열 번호 1);
여기서 HyP는 하이드록시프롤린이고, HArg는 호모아르기닌이고, Ci, Cii 및 Ciii은 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 나타낸다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 하나 이상의 이펙터 및/또는 관능 그룹에 접합된 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 리간드를 포함하는 약물 접합체가 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 리간드 또는 약물 접합체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 질환이 있는 조직 (예를 들어 종양)에서 EphA2의 과발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 예방, 억제 또는 치료하는데 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 리간드 및 약물 접합체가 제공된다.
도 1: 바이사이클 약물 접합체 (BDC)의 제조 개념을 입증하는 일반적인 개략도.
도 2: HT1080 이종이식 마우스에서 BCY6136에 대한 평균 종양 용적 대 시간의 플롯. 용량 (2, 3 및 5 mg/kg)을 0일 및 7일에 투여하였다.
도 3: NCI-H1975 이종이식 마우스에서 BCY6136에 대한 평균 종양 용적 대 시간의 플롯. 용량 (1, 2 및 3 mg/kg)을 0, 7, 14, 21, 28 및 35일에 투여하였다.
도 4: MDA-MB-231 이종이식 마우스에서 BCY6136에 대한 평균 종양 용적 대 시간의 플롯. 용량 (1, 2 및 3 mg/kg)을 0, 7, 14, 21, 28, 35 및 45일에 투여하였다.
도 5 및 6: PC-3 이종이식편을 갖는 암컷 BALB/c 누드 마우스에게 BCY6136 (도 5) 및 ADC (도 6)를 투여한 후의 종양 용적 추적.
도 7: PC-3 이종이식편을 갖는 수컷 BALB/c 누드 마우스에게 BCY6136, EphA2-ADC 또는 도세탁셀 (Docetaxel)을 투여한 후의 종양 용적 추적.
도 8: NCI-H1975 이종이식편을 갖는 암컷 BALB/c 누드 마우스에게 BCY6136을 투여한 후의 종양 용적 추적. 데이터 포인트는 그룹 평균 종양 용적을 나타낸다.
도 9 및 10: LU-01-0251 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에게 BCY6136 및 ADC를 투여한 후의 종양 용적 추적.
도 11: LU-01-0046을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에게 BCY6136을 투여한 후의 종양 용적 추적.
도 12: LU-01-0046 NSCLC PDX 모델을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에게 BCY6136 또는 ADC를 투여한 후의 종양 용적 추적.
도 13 내지 15: LU-01-0046을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에게 BCY6136 (도 13), BCY6173 (도 14) 및 BCY6175 (도 15)를 투여한 후의 종양 용적 추적.
도 16: LU-01-0412 이종이식편을 갖는 암컷 BALB/c 누드 마우스에게 BCY6136 (도 16에서는 BT5528이라고 함), BCY8245 또는 BCY8781을 투여한 후의 종양 용적 추적. 데이터 포인트는 그룹 평균 종양 용적을 나타낸다.
도 17: LU-01-0486 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에게 BCY6136을 투여한 후의 종양 용적 추적.
도 18: MDA-MB-231-luc 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에게 BCY6136을 투여한 후의 종양 용적 추적. 데이터 포인트는 그룹 평균 종양 용적을 나타낸다.
도 19: EMT-6 공통유전자를 갖는 암컷 BALB/c 마우스에게 BCY6136을 투여한 후의 종양 용적 추적. 그룹 3 및 그룹 4의 투여량은 14일째부터 5 mpk 및 3 mpk로 변경하였다.
도 20: NCI-N87 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에게 BCY6136을 투여한 후의 종양 용적 추적.
도 21: SK-OV-3 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에게 BCY6136을 투여한 후의 종양 용적 추적.
도 22: OE21 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에게 BCY6136을 투여한 후의 종양 용적 추적.
도 23: MOLP-8 이종이식편을 갖는 암컷 CB17-SCID 마우스에게 BCY6136을 투여한 후의 종양 용적 추적.
도 24 내지 29: HT1080 이종이식편을 갖는 암컷 BALB/c 누드 마우스에게 BCY6173 (도 24), BCY6135 (도 25), BCY6136 (도 26), BCY6174 (도 27), BCY6175 (도 28) 및 ADC (도 29)를 투여한 후의 종양 용적 추적.
상기 도면에 오차 막대가 있는 경우, 이것은 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
하나의 실시양태에서, 펩티드 리간드는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (서열 번호 2) (BCY6099);
여기서, Sar는 사르코신이고, HArg는 호모아르기닌이고 HyP는 하이드록시프롤린이다.
하나의 실시양태에서, 분자 스캐폴드는 1,1',1''-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온 (TATA)이다.
추가의 실시양태에서, 분자 스캐폴드 1,1',1''-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온 (TATA)이고 펩티드 리간드는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (서열 번호 2) (BCY6099);
여기서, Sar는 사르코신이고, HArg는 호모아르기닌이고, HyP는 하이드록시프롤린이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 펩티드 화학, 세포 배양 및 파지 디스플레이, 핵산 화학 및 생화학 분야에서와 같은 당업계에서 통상의 숙련가들에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 표준 기술이 분자 생물학, 유전자 및 생화학적 방법에 사용되며 (참조; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc.), 이것은 본원에 참고로 포함된다.
명명법
넘버링
본 발명의 펩티드 내에서 아미노산 잔기 위치를 언급할 때, 시스테인 잔기 (Ci, Cii 및 Ciii)는 변하지 않기 때문에 넘버링에서 생략되며, 따라서 본 발명의 펩티드 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 아래를 참조한다:
-Ci-HyP1-L2-V3-N4-P5-L6-Cii-L7-H8-P9-(D-Asp)10-W11-(HArg)12-Ciii- (서열 번호 1).
당해 설명의 목적을 위해, 모든 바이사이클릭 펩티드는 1,1',1''-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온 (TATA)으로 폐환되어 삼치환된 1,1',1''-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로판-1-온 구조를 생성하는 것으로 가정된다. TATA로의 폐환은 Ci, Cii, 및 Ciii 상에서 일어난다.
분자 형식
바이사이클 코어 서열에 대한 N- 또는 C-말단 연장부는 하이픈으로 구분된 서열의 좌측 또는 우측에 추가된다. 예를 들면, N-말단 (β-Ala)-Sar10-Ala 꼬리는 다음과 같이 표시된다:
(β-Ala)-Sar10-A-(서열 번호 X).
역 펩티드 서열
문헌 [Nair et al (2003) J Immunol 170(3), 1362-1373]의 개시내용에 비추어, 본원에 개시된 펩티드 서열은 이들의 레트로-인버소 (retro-inverso) 형태로도 유용할 것으로 예상된다. 예를 들면, 서열은 역전되고 (즉, N-말단은 C-말단이 되고 그 반대도 마찬가지임) 이들의 입체화학도 마찬가지로 역전된다 (즉, D-아미노산은 L-아미노산이 되고 그 반대도 마찬가지임).
펩티드 리간드
본원에서 언급된 펩티드 리간드는 분자 스캐폴드에 공유 결합된 펩티드, 펩티딕 (peptidic) 또는 펩티드모방체 (peptidomimetic)를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 펩티드, 펩티딕 또는 펩티드모방체는 천연 또는 비천연 아미노산, 스캐폴드에 공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 반응성 그룹 (즉, 시스테인 잔기) 및 루프 서열로 언급된 상기 반응성 그룹 사이에 대향된 서열을 갖는 펩티드를 포함하는데, 이것은 펩티드, 펩티딕 또는 펩티드모방체가 스캐폴드에 결합될 때 루프를 형성하기 때문이다. 본 발명의 경우에, 펩티드, 펩티딕 또는 펩티드모방체는 적어도 3개의 시스테인 잔기 (본원에서 Ci, Cii 및 Ciii이라고 함)를 포함하고, 스캐폴드 상에 적어도 2개의 루프를 형성한다.
펩티드 리간드의 이점
본 발명의 특정 바이사이클릭 펩티드는 주사, 흡입, 비강, 안구, 경구 또는 국소 투여에 적합한 약물-유사 분자로 간주될 수 있게 하는 다수의 유리한 특성을 갖는다. 이러한 유리한 특성은 다음을 포함한다:
- 종 교차-반응성. 이것은 전임상 약력학 및 약동학 평가를 위한 전형적인 요건이다;
- 프로테아제 안정성. 바이사이클릭 펩티드 리간드는 대부분의 상황에서 혈장 프로테아제, 상피 ("막-고정된") 프로테아제, 위 및 장 프로테아제, 폐 표면 프로테아제, 세포내 프로테아제 등에 대한 안정성을 입증해야 한다. 바이사이클릭 펩티드 주요 후보물질이 동물 모델에서 개발될 수 있을 뿐만 아니라 인간에게 자신있게 투여될 수 있도록 상이한 종들간에 프로테아제 안정성이 유지되어야 한다;
- 바람직한 용해도 프로파일. 이것은 하전된 친수성 대 소수성 잔기의 비율 및 분자내/분자간 H-결합의 함수이며, 이는 제형화 및 흡수 목적에 중요하다;
- 순환에서의 최적 혈장 반감기. 임상 지표 및 치료 섭생에 따라, 만성 또는 급성 질환 상태의 관리를 위해 짧은 또는 연장된 생체내 노출 시간을 갖는 바이사이클릭 펩티드를 개발하는 것이 필요할 수 있다. 최적 노출 시간은 (최대 치료 효율을 위한) 지속 노출에 대한 요건 대 제제에 대한 지속 노출로부터 야기되는 독성학적 효과를 최소화하기 위한 짧은 노출 시간에 대한 요건에 의해 좌우될 것이다;
- 선택성. 본 발명의 특정 펩티드 리간드는 다른 Eph 수용체 티로신 키나제, 예를 들어 EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphB1, XIIA 인자, 탄산 탈수 효소 9 및 CD38에 비해 우수한 선택성을 입증한다 (본 발명의 선택된 펩티드 리간드에 대한 선택성 데이터는 표 11 및 12에서 볼 수 있다). 또한 본 발명의 선택된 펩티드 리간드는 동물 모델에서 시험을 허용하기 위해 다른 종 (예를 들어, 마우스 및 래트)과 교차 반응성을 나타냄을 주지해야 한다 (표 3, 7-8, 10 및 12);
- 안전성. 출혈 사례는 전임상 생체내 모델 및 EphA2 항체 약물 접합체를 사용한 임상 시험에서 보고되었다. 예를 들면, 6명의 환자 중 5명에서 발생한 출혈 및 응고 사례로 인해 MEDI-547을 사용한 1상 개방-표지 연구가 중단되었다 (Annunziata et al, Invest New Drugs (2013) 31:77-84). 환자에서 관찰된 출혈 사례는 래트 및 원숭이 전임상 연구에서 관찰된 응고 시스템에 미치는 영향과 일치하였다: 증가된 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 및 증가된 피브리노겐/피브린 분해 생성물 (Annunziata et al IBID). 보고된 바에 따르면 원숭이에서의 독성학 연구에서 명백한 출혈 사례가 나타났다 (Annunziata et al, IBID). 종합하면, 이러한 결과는 MEDI-547이 전임상 종 및 환자 둘 다에서 파종성 혈관내 응고 (DIC)를 유발한다는 것을 암시한다. 여기에 보고된 BDC는 짧은 생체내 반감기 (< 30분)를 가지며 따라서 환자에서 DIC가 발생할 가능성이 본질적으로 적다. 여기에 나타낸 결과 (생물학적 데이터 섹션 5 및 6 및 표 15 참조)는 본 발명의 선택된 바이사이클 약물 접합체가 응고 파라미터에 영향을 미치지 않으며 전임상 연구에서 출혈 사례를 야기하지 않음을 입증한다.
약제학적으로 허용되는 염
염 형태는 본 발명의 범위 내에 있으며, 펩티드 리간드에 대한 언급은 상기 리간드의 염 형태를 포함하는 것으로 인지될 것이다.
본 발명의 염은 문헌 [Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002]에 기술된 방법과 같은 통상의 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 이 둘의 혼합물 중에서 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
산 부가염 (단일- 또는 이염)은 광범위한 산, 무기산 및 유기산 둘 다로 형성될 수 있다. 산 부가염의 예는 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산 (예를 들어, L-아스코르브산), L-아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 부탄산, (+) 캄포르산, 캄포르-설폰산, (+)-(1S)-캄포르-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 시클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-디설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티신산, 글루코헵톤산, D-글루콘산, 글루쿠론산 (예를 들어, D-글루쿠론산), 글루탐산 (예를 들어, L-글루탐산), α-옥소글루타르산, 글리콜산, 히푸르산, 할로겐화수소산 (예를 들어, 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산), 이세티온산, 락트산 (예를 들어, (+)-L-락트산, (±)-DL-락트산), 락토비온산, 말레산, 말산, (-)-L-말산, 말론산, (±)-DL-만델산, 메탄설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, 프로피온산, 피루브산, L-피로글루탐산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세박산, 스테아르산, 석신산, 황산, 타닌산, (+)-L-타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 운데실렌산 및 발레르산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산 뿐만 아니라 아실화 아미노산 및 양이온 교환 수지로 형성된 단일- 또는 이-산을 포함한다.
염의 하나의 특정 그룹은 아세트산, 염산, 요오드화수소산, 인산, 질산, 황산, 시트르산, 락트산, 석신산, 말레산, 말산, 이세티온산, 푸마르산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산, 황산, 메탄설폰산 (메실레이트), 에탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 발레르산, 프로판산, 부탄산, 말론산, 글루쿠론산 및 락토비온산으로부터 형성된 염으로 이루어진다. 하나의 특정 염은 하이드로클로라이드 염이다. 또 다른 특정 염은 아세테이트 염이다.
화합물이 음이온성이거나, 음이온성일 수 있는 관능 그룹을 갖는 경우 (예를 들어, -COOH는 -COO-일 수 있음), 염은 유기 또는 무기 염기로 형성되어, 적합한 양이온을 생성할 수 있다. 적합한 무기 양이온의 예는 Li+, Na+ 및 K+와 같은 알칼리 금속 이온, Ca2 + 및 Mg2 +와 같은 알칼리 토금속 양이온, 및 Al3 + 또는 Zn+와 같은 기타 양이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 유기 양이온의 예는 암모늄 이온 (즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온 (예를 들어, NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 적합한 치환된 암모늄 이온의 예는 메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 프로필아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민, 및 트로메타민 뿐만 아니라 아미노산, 예를 들어 리신 및 아르기닌으로부터 유도된 것이다. 일반적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 +이다.
본 발명의 펩티드가 아민 관능기를 함유하는 경우, 이들은, 예를 들면, 숙련가에게 널리 공지된 방법에 따라 알킬화제와의 반응에 의해 4급 암모늄 염을 형성할 수 있다. 이러한 4급 암모늄 화합물은 본 발명의 펩티드의 범위 내에 있다.
동위원소 변형
본 발명은 하나 이상의 원자가 동일한 원자 번호를 갖지만 자연에서 통상적으로 발견되는 원자 질량 또는 질량 수와는 다른 원자 질량 또는 질량 수를 갖는 원자로 대체된 본 발명의 모든 약제학적으로 허용되는 (방사)동위원소-표지된 펩티드 리간드, 및 관련 (방사)동위원소를 보유할 수 있는 금속 킬레이트 그룹이 부착된 본 발명의 펩티드 리간드 ("이펙터"로 지칭됨), 및 특정 관능 그룹이 관련 (방사)동위원소 또는 동위원소로 표지된 관능 그룹으로 공유적으로 대체된 본 발명의 펩티드 리간드를 포함한다.
본 발명의 펩티드 리간드에 포함시키기에 적합한 동위원소의 예는 수소의 동위원소, 예를 들어 2H (D) 및 3H (T), 탄소의 동위원소, 예를 들어 11C, 13C 및 14C, 염소의 동위원소, 예를 들어 36Cl, 불소의 동위원소, 예를 들어 18F, 요오드의 동위원소, 예를 들어 123I, 125I 및 131I, 질소의 동위원소, 예를 들어 13N 및 15N, 산소의 동위원소, 예를 들어 15O, 17O 및 18O, 인의 동위원소, 예를 들어 32P, 황의 동위원소, 예를 들어 35S, 구리의 동위원소, 예를 들어 64Cu, 갈륨의 동위원소, 예를 들어 67Ga 또는 68Ga, 이트륨의 동위원소, 예를 들어 90Y 및 루테튬의 동위원소, 예를 들어 177Lu, 및 비스무트의 동위원소, 예를 들어 213Bi를 포함한다.
본 발명의 특정 동위원소-표지된 펩티드 리간드, 예를 들면, 방사성 동위원소를 포함하는 것은 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 유용하고, 질환이 있는 조직에서 EphA2 표적의 존재 및/또는 부재를 임상적으로 평가하는데 유용하다. 본 발명의 펩티드 리간드는 또한 표지된 화합물과 다른 분자, 펩티드, 단백질, 효소 또는 수용체 사이의 복합체의 형성을 검출 또는 식별하는데 사용될 수 있다는 점에서 귀중한 진단 특성을 가질 수 있다. 검출 또는 식별 방법은 방사성 동위원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 (예를 들면, 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 에쿼린 및 루시퍼라제) 등과 같은 표지제로 표지된 화합물을 사용할 수 있다. 방사성 동위원소 삼중수소, 즉 3H (T), 및 탄소-14, 즉 14C가 이들의 혼입 용이성 및 준비된 검출 수단의 관점에서 이러한 목적에 특히 유용하다.
중수소, 즉 2H (D)와 같은 보다 중동위 원소로의 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들면, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투여량 요건으로부터 야기되는 특정의 치료적 이점을 제공할 수 있으며, 따라서 일부 상황에서 바람직할 수 있다.
11C, 18F, 15O 및 13N과 같은 양전자 방출 동위원소로의 치환은 표적 점유율 (target occupancy)를 검사하기 위한 PET (Positron Emission Topography) 연구에서 유용할 수 있다.
본 발명의 펩티드 리간드의 동위원소-표지된 화합물은 당업계의 숙련가들에게 공지된 통상의 기술에 의해 또는 이전에 사용된 비-표지된 시약 대신에 적절한 동위원소-표지된 시약을 사용하여 첨부된 실시예에 기술된 것과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다.
비방향족 분자 스캐폴드
본원에서 용어 "비방향족 분자 스캐폴드"에 대한 언급은 방향족 (즉, 불포화) 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환 시스템을 함유하지 않는 본원에 정의된 바와 같은 임의의 분자 스캐폴드를 지칭한다.
비방향족 분자 스캐폴드의 적합한 예는 문헌[Heinis et al　(2014) Angewandte Chemie , International Edition 53(6) 1602- 1606]에 기술되어 있다.
상기 문서에서 주지되는 바와 같이, 분자 스캐폴드는 소분자, 예를 들어 유기 소분자일 수 있다.
하나의 실시양태에서 분자 스캐폴드는 거대분자일 수 있다. 하나의 실시양태에서 분자 스캐폴드는 아미노산, 뉴클레오티드 또는 탄수화물로 구성된 거대분자이다.
하나의 실시양태에서 분자 스캐폴드는 폴리펩티드의 관능 그룹(들)과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 반응 그룹을 포함한다.
분자 스캐폴드는 아민, 티올, 알콜, 케톤, 알데히드, 니트릴, 카복실산, 에스테르, 알켄, 알킨, 아지드, 무수물, 석신이미드, 말레이미드, 알킬 할라이드 및 아실 할라이드와 같은 펩티드와의 결합을 형성하는 화학 그룹을 포함할 수 있다.
α 불포화 카보닐 함유 화합물의 예는 1,1',1''-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온 (TATA)이다 (Angewandte Chemie, International Edition (2014), 53(6), 1602-1606).
이펙터 및 관능 그룹
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 하나 이상의 이펙터 및/또는 관능 그룹에 접합된 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 리간드를 포함하는 약물 접합체가 제공된다.
이펙터 및/또는 관능 그룹은, 예를 들면, 폴리펩티드의 N 및/또는 C 말단에, 폴리펩티드 내의 아미노산에, 또는 분자 스캐폴드에 부착될 수 있다.
적합한 이펙터 그룹은 항체 및 이의 부분 또는 단편을 포함한다. 예를 들어, 이펙터 그룹은 하나 이상의 불변 영역 도메인 이외에 항체 경쇄 불변 영역 (CL), 항체 CH1 중쇄 도메인, 항체 CH2 중쇄 도메인, 항체 CH3 중쇄 도메인, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이펙터 그룹은 또한 항체의 힌지 영역 (이러한 영역은 IgG 분자의 CH1과 CH2 도메인 사이에서 정상적으로 발견된다)을 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 측면의 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따르는 이펙터 그룹은 IgG 분자의 Fc 영역이다. 유리하게는, 본 발명에 따르는 펩티드 리간드-이펙터 그룹은 하루 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상 또는 7일 이상의 tβ 반감기를 갖는 펩티드 리간드 Fc 융합체를 포함하거나 이로 구성된다. 가장 유리하게는, 본 발명에 따르는 펩티드 리간드는 하루 이상의 tβ 반감기를 갖는 펩티드 리간드 Fc 융합체를 포함하거나 이로 구성된다.
관능 그룹은 일반적으로 결합 그룹, 약물, 다른 실체의 부착을 위한 반응 그룹, 세포로의 마크로사이클릭 펩티드의 흡수를 돕는 관능 그룹 등을 포함한다.
펩티드가 세포 내로 침투하는 능력은 세포내 표적에 대해 펩티드가 효과적일 수 있게 한다. 세포 내로 침투하는 능력을 갖는 펩티드에 의해 접근될 수 있는 표적은 전사 인자, 세포내 신호 전달 분자, 예를 들어 티로신 키나제 및 아폽토시스 경로에 관련된 분자를 포함한다. 세포의 침투를 가능하게 하는 관능 그룹은 펩티드 또는 분자 스캐폴드에 첨가된 펩티드 또는 화학 그룹을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Chen and Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 4, p821; Gupta et al. in Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57 9637]에 기술된 바와 같이 VP22, HIV-Tat, 초파리(Drosophila)의 호메오박스 단백질 (안테나페디아(Antennapedia))로부터 유도된 것들과 같은 펩티드. 원형질 막을 통한 전위에서 효과적인 것으로 나타난 짧은 펩티드의 예는 초파리 안테나페디아 단백질로부터의 16개 아미노산 침투 펩티드 (Derossi et al (1994) J Biol. Chem. Volume 269 p10444), 18개의 아미노산 '모델 양친매성 펩티드' (Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127) 및 HIV TAT 단백질의 아르기닌 풍부 영역을 포함한다. 비 펩티드성 접근법은 생체분자에 쉽게 부착될 수 있는 소분자 모방체 또는 SMOC의 사용을 포함한다 (Okuyama et al (2007) Nature Methods Volume 4 p153). 구아니디늄 그룹을 분자에 추가하는 또 다른 화학 전략이 또한 세포 침투를 향상시킨다 (Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem Volume 282 p13585). 스테로이드와 같은 소분자량 분자가 분자 스캐폴드에 추가되어 세포로의 흡수를 향상시킬 수 있다.
펩티드 리간드에 부착될 수 있는 관능 그룹의 한 부류는 항체 및 이의 결합 단편, 예를 들어 Fab, Fv 또는 단일 도메인 단편을 포함한다. 특히, 생체내에서 펩티드 리간드의 반감기를 증가시킬 수 있는 단백질에 결합하는 항체가 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따르는 펩티드 리간드-이펙터 그룹은 12시간 이상, 24시간 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상 또는 20일 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 tβ 반감기를 갖는다. 유리하게는, 본 발명에 따르는 펩티드 리간드-이펙터 그룹 또는 조성물은 12 내지 60시간 범위의 tβ를 가질 것이다. 추가의 실시양태에서, 이것은 하루 이상의 tβ 반감기를 가질 것이다. 추가의 실시양태에서 여전히, 이것은 12 내지 26시간의 범위일 것이다.
본 발명의 하나의 특정 실시양태에서, 관능 그룹은 금속 킬레이트제로부터 선택되며, 이것은 의학적으로 관련된 금속 방사성 동위원소를 착물화하는데 적합하다.
가능한 이펙터 그룹은 또한 효소/프로드럭 요법에 사용하기 위한 카복시펩 티다제 G2와 같은 효소를 포함하며, 여기서 펩티드 리간드가 ADEPT의 항체를 대체한다.
본 발명의 하나의 특정 실시양태에서, 관능 그룹은 암 치료법을 위한 세포독성제와 같은 약물로부터 선택된다. 적합한 예는 시스플라틴 및 카보플라틴, 뿐만 아니라 옥살리플라틴, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 이포스파미드와 같은 알킬화제; 퓨린 유사체 아자티오프린 및 마캅토퓨린 또는 피리미딘 유사체를 포함한 항-대사산물; 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈데신과 같은 빈카 알칼로이드를 포함한 식물 알칼로이드 및 테르페노이드; 포도필로톡신 및 이의 유도체 에토포시드 및 테니포시드; 원래 탁솔로 알려진, 파클리탁셀을 포함한 탁산; 캄프토테신을 포함한 토포이소머라제 억제제: 이리노테칸 및 토포테칸, 및 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 및 테니포시드를 포함한 타입 II 억제제를 포함한다. 추가의 제제는 면역억제제 닥티노마이신 (신장 이식에 사용됨), 독소루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 칼리케아마이신 등을 포함하는 항종양 항생제를 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 추가의 특정 실시양태에서, 세포독성제는 메이탄시노이드 (예를 들어 DM1) 또는 모노메틸 오리스타틴 (예를 들어 MMAE)으로부터 선택된다.
DM1은 메이탄신의 티올-함유 유도체인 세포독성제이며 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00001
모노메틸 오리스타틴 E (MMAE)는 합성 항신생물제이며 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00002
하나의 실시양태에서, 세포독성제는 이황화 결합 또는 프로테아제 민감성 결합과 같은 절단 가능한 결합에 의해 바이사이클릭 펩티드에 연결된다. 추가의 실시양태에서, 이황화 결합에 인접한 그룹은 이황화 결합의 방해를 제어하고 이에 의해 세포독성제의 절단 및 수반되는 방출의 속도를 제어하도록 변형된다.
공개된 연구는 이황화 결합의 어느 한 쪽에 입체 장애를 도입함으로써 환원에 대한 이황화 결합의 민감성을 변형시킬 가능성을 확립하였다 (Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717). 입체 장애의 정도가 클수록 세포내 글루타티온 및 또한 세포외 (전신) 환원제에 의한 환원율이 감소하여, 결과적으로 세포 내부 및 외부 둘 다에서 독소가 방출될 용이성을 감소시킨다. 따라서, 세포내 환경에서의 효과적인 방출 (이것은 치료 효과를 최대화함)에 비해 순환에서의 이황화 안정성 (이것은 독소의 바람직하지 않은 부작용을 최소화함)에 있어서의 최적의 선택은 이황화 결합의 어느 한 쪽에 대한 장애의 정도를 신중하게 선택함으로써 달성될 수 있다.
이황화 결합의 어느 한 쪽에 대한 장애는 분자 작제물의 표적화 실체 (여기서는 바이사이클릭 펩티드) 또는 독소 측면에 하나 이상의 메틸 그룹을 도입함으로써 조절된다.
하나의 실시양태에서, 약물 접합체는 상기 펩티드 리간드와 상기 세포독성제 사이에 링커를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 세포독성제 및 링커는 제WO 2016/067035호에 기술된 것들의 임의의 조합으로부터 선택된다 (세포독성제 및 이의 링커는 본원에 참고로 포함됨).
하나의 실시양태에서 세포독성제는 MMAE이다.
하나의 실시양태에서, 상기 세포독성제와 상기 바이사이클릭 펩티드 사이의 링커는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 세포독성제는 MMAE이고 링커는 -Val-Cit-, -Trp-Cit-, -Val-Lys-, -D-Trp-Cit-, -Ala-Ala-Asn-, D-Ala-Phe-Lys- 또는 -Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-Tyr-Leu- (서열 번호 3)으로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 세포독성제는 MMAE이고 링커는 -Val-Cit-, -Trp-Cit-, -Val-Lys- 또는 -D-Trp-Cit-로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 세포독성제는 MMAE이고 링커는 -Val-Cit- 또는 -Val-Lys-이다. 여전히 추가의 실시양태에서, 세포독성제는 MMAE이고 링커는 -Val-Cit-이다.
대안적인 실시양태에서, 상기 세포독성제 사이의 링커는 절단 가능한 이황화 결합과 같은 이황화 결합을 포함한다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 세포독성제는 DM1이고 링커는 -S-S-, -SS(SO3H)-, -SS-(Me)-, -(Me)-SS-(Me)-, -SS-(Me2)- 또는 -SS-(Me)-SO3H-로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 세포독성제는 DM1이고 링커는 (N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDB)와 같은 -S-S- 모이어티, 또는 SO3H-SPDB와 같은 -SS(SO3H)- 모이어티를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 세포독성제는 DM1이고 링커는 -S-S- 또는 -S-S-(SO3H)-와 같은 -S-S- 모이어티를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 세포독성제는 DM1이고 약물 접합체는 화학식 A의 화합물을 포함한다:
[화학식 A]
Figure pct00003
여기서, 상기 바이사이클은 본원에 정의된 바와 같은 BCY6099이다.
대안적인 실시양태에서, 세포독성제는 DM1이고 약물 접합체는 화학식 B의 화합물을 포함한다:
[화학식 B]
Figure pct00004
여기서, 상기 바이사이클은 본원에 정의된 바와 같은 BCY6099이다.
대안적인 실시양태에서, 세포독성제는 DM1이고 약물 접합체는 화학식 A의 화합물을 포함하며, 여기서 상기 바이사이클은 본원에 정의된 바와 같은 BCY6099로부터 선택된다. 이러한 BDC는 BCY6027로서 본원에 공지되어 있다. 표 4 및 8에 나타낸 바와 같이 EphA2 경쟁 결합 분석에서 BCY6027에 대한 탁월한 경쟁 결합을 입증하는 데이터가 본원에 제시되어 있다.
대안적인 실시양태에서, 세포독성제는 DM1이고 약물 접합체는 화학식 B의 화합물을 포함하며, 여기서 상기 바이사이클은 본원에 정의된 바와 같은 BCY6099로부터 선택된다. 이러한 BDC는 BCY6028로서 본원에 공지되어 있다. 표 4 및 8에 나타낸 바와 같이 EphA2 경쟁 결합 분석에서 BCY6028에 대한 탁월한 경쟁 결합을 입증하는 데이터가 본원에 제시되어 있다.
추가의 실시양태에서, 세포독성제는 MMAE 또는 DM1이고 약물 접합체는 BCY6136 및 BCY6173으로부터 선택된다. 표 11 및 12에 나타낸 바와 같이 이러한 두 개의 바이사이클 약물 접합체는 밀접하게 관련된 인간 상동체 EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7 및 EphB4; 마우스 EphA3 및 EphA4; 및 래트 EphA3 및 EphB1에 대해 유의적인 결합을 나타내지 않았음을 보여주는 데이터가 본원에 제시되어 있다.
추가의 실시양태에서, 약물 접합체는 다음 중의 어느 하나로부터 선택된다: BCY6135, BCY6136, BCY6173, BCY6174 및 BCY6175:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
여전히 추가의 실시양태에서, 약물 접합체는 BCY6136이다. BCY6136이 PC-3 이종이식 전립선 암 모델에서 유의적이고 강력한 항종양 활성을 나타내었음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 7 및 8에 제시되어 있다 (도 5와 6 및 표 16 내지 19 참조). BCY6136이 NCI-H1975 이종이식 폐암 (NSCLC) 모델에서 강력한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에 제공된다 (도 8 및 표 20 내지 25 참조). BCY6136이 크고 작은 종양 크기 LU-01-0251 PDX 폐암 (NSCLC) 모델 둘 다에서 강력한 항종양 효과를 입증하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에서 연구 10 및 11에 제시되어 있으며 (도 9와 10 및 표 26 내지 29 참조), 여기서 완전한 종양 퇴화가 관찰되었다. BCY6136이 LU-01-0046 PDX 폐암 (NSCLC) 모델에서 유의한 항종양 효과를 입증하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에서 연구 12에 제시되어 있으며 (도 11 및 표 30과 31 참조) 여기서 BCY6136에 대해 완전한 종양 퇴화가 관찰되었다. BCY6136이 LU-01-0046 PDX 폐암 (NSCLC) 모델에서 용량 의존적 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에서 연구 13에 제시되어 있다 (도 12 및 표 32와 33 참조). BCY6136이 LU-01-0046 PDX 폐암 (NSCLC) 모델에서 종양을 근절하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에서 연구 14에 제시되어 있다 (도 13 내지 15 및 표 34 내지 37 참조). 낮은/무시할 수 있는 EphA2 발현을 갖는 세포주를 사용한 두 가지 모델 (즉, Lu-01-0412 및 Lu-01-0486)에서 BCY6136의 효과를 입증하는 데이터가 또한 본원에서 연구 15 및 16에 제시되어 있다. 이 데이터는 도 23과 24 및 표 38 내지 41에 나타내어져 있으며 BCY6136은 어느 세포주에서도 종양 퇴화에 영향을 미치지 않았지만 BCY BCY8245 및 BCY8781은 Lu-01-0412 세포주에서 고도로 발현된 표적에 결합하여 종양을 완전히 근절하였음을 입증한다. BCY6136이 MDA-MB-231 이종이식 유방암 모델에서 강력한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 17에 제시되어 있다 (도 18 및 표 42 내지 45 참조). 또한, 낮은/무시할 수 있는 EphA2 발현을 갖는 세포주를 사용한 유방암 모델 (즉, EMT6)에서 BCY6136의 효과를 입증하는 데이터가 또한 본원에서 연구 18에 제시되어 있다. 이러한 데이터는 도 19 및 표 46과 47에 나타내어져 있으며 BCY6136이 이러한 세포주에서 종양 퇴화에 영향을 미치지 않았음을 입증한다. BCY6136이 NCI-N87 이종이식 위암 모델에서 유의한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에서 연구 19에 제시되어 있다 (도 20 및 표 48과 49 참조). BCY6136이 중등도의 항종양 활성을 나타내는 ADC MEDI-547과 비교하여 SK-OV-3 이종이식 난소암 모델에서 유의한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에서 연구 20에 제시되어 있다 (도 21 및 표 50과 51 참조). BCY6136이 OE-21 이종이식 식도암 모델에서 유의한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 21에 제시되어 있다 (도 22 및 표 52와 53 참조). BCY6136이 MOLP-8 이종이식 다발성 골수종 모델에서 용량-의존적 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에서 연구 22에 제시되어 있다 (도 23 및 표 59와 60 참조). BCY6136이 HT-1080 이종이식 섬유육종 모델에서 강력한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에서 연구 23에 제시되어 있다 (도 24 내지 28 및 표 56과 57 참조).
합성
본 발명의 펩티드는 표준 기술에 이은 시험관내 분자 스캐폴드와의 반응에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 이것이 수행될 때, 표준 화학이 사용될 수 있다. 이것은 추가 다운스트림 실험 또는 검증을 위한 가용성 물질의 신속한 대규모 준비를 가능하게 한다. 이러한 방법은 Timmerman 등 (상기)에 개시된 것과 같은 통상적인 화학을 사용하여 달성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본원에 제시된 바와 같이 선택된 폴리펩티드 또는 접합체의 제조에 관한 것이며, 여기서 제조는 하기 설명된 바와 같은 임의의 추가 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 이들 단계는 화학적 합성에 의해 제조된 최종 생성물 폴리펩티드/접합체에서 수행된다.
임의로 관심 폴리펩티드의 아미노산 잔기는, 접합체 또는 복합체를 제조할 때, 치환될 수 있다.
펩티드는 또한 예를 들면 다른 루프를 통합하고 이에 따라 다중 특이성을 도입하기 위해 연장될 수 있다.
펩티드를 연장시키기 위해, 표준 고체상 또는 용액상 화학을 사용하여 직교로 보호된 리신 (및 유사체)을 사용하여 N-말단 또는 C-말단에서 또는 루프 내에서 화학적으로 간단히 연장될 수 있다. 표준 (바이오)접합 기술이 활성화된 또는 활성화 가능한 N- 또는 C-말단을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로 부가는, 예를 들어, 문헌 (Dawson et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779)에 기술된 바와 같은 단편 축합 또는 천연 화학 결찰에 의해 또는, 예를 들면, 문헌 (Chang et al　 Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20; 91(26):12544-8 or in Hikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters　 Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003)에 기술된 바와 같은 서브틸리가제 (subtiligase)를 사용하여 효소에 의해 이루어질 수 있다.
대안적으로, 펩티드는 이황화 결합을 통한 추가의 접합에 의해 연장되거나 변형될 수 있다. 이것은 제1 및 제2 펩티드가 세포의 환원 환경내에서 한 번 서로 분리되도록 하는 추가 이점을 갖는다. 이러한 경우에, 3개의 시스테인 그룹과 반응하도록 분자 스캐폴드가 제1 펩티드의 화학적 합성 동안 부가될 수 있고; 그후 추가의 시스테인 또는 티올이 제1 펩티드의 N 또는 C-말단에 부가될 수 있어, 이러한 시스테인 또는 티올 만이 제2 펩티드의 유리 시스테인 또는 티올과 반응하여 이황화-결합된 바이사이클릭 펩티드-펩티드 접합체를 형성할 수 있다.
유사한 기술들이 두 개의 바이사이클릭 및 이특이성 마크로사이클의 합성/커플링에 동일하게 적용되어, 잠재적으로 사특이성 분자를 생성한다.
또한, 다른 관능 그룹 또는 이펙터 그룹의 부가는 N- 또는 C-말단에서 또는 측쇄를 통해 커플링하는 적절한 화학을 사용하여 동일한 방식으로 달성될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 커플링은 어느 실체의 활성도 차단하지 않도록 하는 방식으로 수행된다.
약제학적 조성물
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 리간드 또는 약물 접합체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일반적으로, 본 발명의 펩티드 리간드는 약리학적으로 적합한 부형제 또는 담체와 함께 정제된 형태로 사용될 것이다. 전형적으로, 이러한 부형제 또는 담체는 염수 및/또는 완충 매질을 포함하는 수성 또는 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨 및 락테이트화 링거를 포함한다. 폴리펩티드 복합체를 현탁액으로 유지하기 위해 필요에 따라, 적합한 생리학적으로 허용되는 보조제는 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트와 같은 증점제로부터 선택될 수 있다.
정맥내 비히클은 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 체액 및 영양소 보충제 및 전해질 보충제를 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제, 예를 들어 항균제, 산화방지제, 킬레이트제 및 불활성 가스가 또한 존재할 수 있다 (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).
본 발명의 펩티드 리간드는 별도로 투여되는 조성물로서 또는 다른 제제와 함께 사용될 수 있다. 이들은 항체, 항체 단편 및 다양한 면역치료 약물, 예를 들어 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티눔 및 면역독소를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질 리간드와 함께 다양한 세포독성제 또는 다른 제제의 "칵테일", 또는 상이한 특이성을 갖는 본 발명에 따르는 선택된 폴리펩티드의 조합, 예를 들어 상이한 표적 리간드를 사용하여 선택된 폴리펩티드를, 이들이 투여 전에 풀링되든 그렇지 않든 간에, 포함할 수 있다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물의 투여 경로는 당업계의 통상의 숙려가들에게 일반적으로 알려진 임의의 것일 수 있다. 치료법을 위해, 본 발명의 펩티드 리간드는 표준 기술에 따라 임의의 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피, 폐 경로를 통한, 또는 또한 적절하게는, 카테터로의 직접 주입에 의한 임의의 적절한 방식에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 흡입에 의해 투여될 것이다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 연령, 성별 및 상태, 다른 약물의 동시 투여, 반대 징후 (counterindication) 및 임상의가 고려할 기타 파라미터에 따라 좌우될 것이다.
본 발명의 펩티드 리간드는 저장을 위해 동결건조될 수 있고 사용 전에 적합한 담체에서 재구성될 수 있다. 이 기술은 효과적인 것으로 나타났으며 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다. 동결건조 및 재구성은 다양한 정도의 활성 손실을 초래할 수 있고 그 수준을 보상하기 위해 상향 조정해야 할 수 있음을 당업계의 숙련가들은 인지할 것이다.
본 발명의 펩티드 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 특정의 치료적 용도에서, 선택된 세포 집단의 적어도 부분적인 억제, 조절, 사멸 또는 일부 다른 측정 가능한 파라미터를 달성하기에 충분한 양은 "치료학적 유효량"으로 정의된다. 이러한 투여량을 달성하는데 필요한 양은 질환의 중증도와 환자 자신의 면역계의 일반적인 상태에 따라 좌우되지만, 일반적으로 체중 킬로그램 당 선택된 펩티드 리간드 0.005 내지 5.0 mg 범위이며, 0.05 내지 2.0 mg/kg/용량이 더 일반적으로 사용된다. 예방적 용도를 위해, 본 발명의 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 또한 유사하거나 약간 더 낮은 투여량으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따르는 펩티드 리간드를 함유하는 조성물은 포유동물에서 선택된 표적 세포 집단의 변경, 불활성화, 사멸 또는 제거를 돕기 위해 예방적 및 치료적 환경에서 이용될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 펩티드 리간드는 이종 세포 집단으로부터 표적 세포 집단을 사멸, 고갈 또는 달리 효과적으로 제거하기 위해 체외에서 또는 시험관내에서 선택적으로 사용될 수 있다. 포유동물로부터의 혈액을 선택된 펩티드 리간드와 체외에서 조합할 수 있고, 이에 의해 표준 기술에 따라 포유동물에 복귀시키기 위해 혈액으로부터 바람직하지 않은 세포가 사멸되거나 달리 제거된다.
치료적 용도
본 발명의 바이사이클릭 펩티드는 EphA2 결합제로서 특정한 유용성을 갖는다.
Eph 수용체 티로신 키나제 (Ephs)는 티로신 잔기 상의 단백질을 인산화시키는 키나제인 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 큰 그룹에 속한다. Eph와 이들의 막 결합 에프린 리간드 (에프린)는 세포 위치 및 조직 구성을 제어한다 (Poliakov et al. (2004) Dev Cell 7, 465-80). 기능적 및 생화학적 Eph 반응은 더 높은 리간드 올리고머화 상태에서 발생한다 (Stein et al. (1998) Genes Dev 12, 667-678).
다른 패턴화 기능 중에서, 다양한 Eph 및 에프린이 혈관 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. EphB4 및 에프린-B2의 녹아웃은 모세혈관상 (capillary bed)을 혈관으로 재형성하는 능력의 부족 (상기 Poliakov 등) 및 배아 치사를 초래한다. 일부 Eph 수용체와 에프린의 지속적인 발현은 새로 형성된 성인 미세혈관에서도 관찰되었다 (Brantley-Sieders et al. (2004) Curr Pharm Des 10, 3431-42; Adams (2003) J Anat 202, 105-12).
성인에서 일부 에프린과 이들의 수용체의 비조절된 재-출현이 또한 종양 침습, 전이 및 신생 혈관형성에 기여하는 것으로 관찰되었다 (Nakamoto et al. (2002) Microsc Res Tech 59, 58-67; Brantley-Sieders et al., supra). 또한, 일부 Eph 패밀리 구성원은 다양한 인간 종양으로부터의 종양 세포에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다 (Brantley-Sieders et al., supra); Marme (2002) Ann Hematol 81 Suppl 2, S66; Booth et al. (2002) Nat Med 8, 1360-1).
EPH 수용체 A2 (에프린 타입-A 수용체 2)는 인간에서 EPHA2 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다.
EphA2는 남성에서 다발성 암, 예를 들어,: 유방암 (Zelinski et al (2001) Cancer Res. 61, 2301-2306; Zhuang et al (2010) Cancer Res. 70, 299-308; Brantley-Sieders et al (2011) PLoS One 6, e24426), 폐암 (Brannan et al (2009) Cancer Prev Res (Phila) 2, 1039-1049; Kinch et al (2003) Clin Cancer Res. 9, 613-618; Guo et al (2013) J Thorac Oncol. 8, 301-308), 위암 (Nakamura et al (2005) Cancer Sci. 96, 42-47; Yuan et al (2009) Dig Dis Sci 54, 2410-2417), 췌장암 (Mudali et al (2006) Clin Exp Metastasis 23, 357-365), 전립선암 (Walker-Daniels et al (1999) Prostate 41, 275-280), 간암 (Yang et al (2009) Hepatol Res. 39, 1169-1177) 및 교모세포종 (Wykosky et al (2005) Mol Cancer Res. 3, 541-551; Li et al (2010) Tumour Biol. 31, 477-488)에서 상향조절되며, 종종 질환 진행, 전이 및 나쁜 예후와 관련이 있다.
암 진행에 있어서의 EphA2의 완전한 역할은 아직 정의되지 않았지만, 종양 세포 성장, 생존, 침윤 및 혈관형성을 포함하여 암 진행의 여러 단계에서 상호작용에 대한 증거가 존재한다. EphA2 발현의 하향조절은 종양 암세포 증식을 억제하는 반면 (Binda et al (2012) Cancer Cell 22, 765-780), EphA2 차단은 VEGF 유도된 세포 이동 (Hess et al (2001) Cancer Res. 61, 3250-3255), 발아 및 혈관형성 (Cheng et al (2002) Mol Cancer Res. 1, 2-11; Lin et al (2007) Cancer 109, 332-40) 및 전이 진행 (Brantley-Sieders et al (2005) FASEB J. 19, 1884-1886)을 억제한다.
EphA2에 대한 항체 약물 접합체는 래트 및 마우스 이종이식 모델에서 종양 성장을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났으며 (Jackson et al (2008) Cancer Research 68, 9367-9374) 유사한 접근법이 남성에서 시도되었지만 치료 관련 부작용에 대해 치료를 중단해야 했다 (Annunziata et al (2013) Invest New drugs 31, 77-84).
본 발명의 방법에 따라 선택된 폴리펩티드 리간드는 생체내 치료적 및 예방적 용도, 시험관내 및 생체내 진단 용도, 시험관내 분석 및 시약 용도 등에 사용될 수 있다. 선택된 수준의 특이성을 갖는 리간드는 교차-반응성이 요구되는 경우 비-인간 동물에서 시험을 수반하는 용도에서, 또는 호모로그 또는 파라로그와의 교차 반응성이 신중하게 제어될 필요가 있는 경우 진단 용도에서 유용하다. 백신 용도와 같은 일부 용도에서, 미리 결정된 범위의 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 능력은 백신을 특정 질환 및 병원체에 맞게 조정하기 위해 이용될 수 있다.
포유동물에 투여하기 위해서는 적어도 90 내지 95% 동질성 (homogeneity)의 실질적으로 순수한 펩티드 리간드가 바람직하고, 특히 포유동물이 인간인 경우 약제학적 용도를 위해서는 98 내지 99% 이상의 동질성이 가장 바람직하다. 일단 경우에 따라 부분적으로 또는 균질하게 정제되면, 선택된 폴리펩티드는 진단적으로 또는 치료적으로 (체외를 포함하여) 또는 분석 절차, 면역형광 염색 등을 개발 및 수행하는데 사용될 수 있다 (Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).
본 발명의 추가의 측면에 따르면, (종양과 같은) 질환이 있는 조직에서 EphA2의 과발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 예방, 억제 또는 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 리간드 또는 약물 접합체가 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, (종양과 같은) 질환이 있는 조직에서 EphA2의 과발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공되며, 당해 방법은 본원에 정의된 바와 같은 이펙터 그룹 및 펩티드 리간드의 약물 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함한다.
하나의 실시양태에서, EphA2는 포유동물 EphA2이다. 추가의 실시양태에서, 포유동물 EphA2는 인간 EphA2이다.
하나의 실시양태에서, 질환이 있는 조직에서 EphA2의 과발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애는 암으로부터 선택된다.
치료 (또는 억제)될 수 있는 암 (및 이들의 양성 대응물)의 예는 상피 기원의 종양 (선암종 (adenocarcinomas), 편평 암종 (squamous carcinomas), 이행 세포 암종 (transitional cell carcinomas) 및 기타 암종을 포함한 다양한 유형의 선종 및 암종), 예를 들어 방광 및 요로, 유방, 위장관 (식도, 위 (위), 소장, 결장, 직장 및 항문 포함), 간 (간세포 암종), 담낭 및 담도계, 외분비 췌장, 신장, 폐 (예를 들면, 선암종 (adenocarcinomas), 소세포 폐 암종 (small cell lung carcinomas), 비-소세포 폐 암종 (non-small cell lung carcinomas), 기관지폐포 암종 (bronchioalveolar carcinomas) 및 중피종 (mesotheliomas)), 두경부 (예를 들면, 혀, 협측강, 후두, 인두, 비인두, 편도선, 타액선, 비강 및 부비동의 암), 난소, 나팔관, 복막, 질, 외음부, 음경, 자궁경부, 자궁근층, 자궁내막, 갑상선 (예를 들면, 갑상선 여포 암종 (thyroid follicular carcinoma)), 부신, 전립선, 피부 및 부속기 (예를 들면, 흑색종 (melanoma), 기저 세포 암종 (basal cell carcinoma), 편평 세포 암종 (squamous cell carcinoma), 각질극 세포종 (keratoacanthoma), 이형성성 모반 (dysplastic naevus))의 암종; 림프계 계통의 혈액학적 악성 종양 및 관련 병태 (예를 들면 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphocytic leukemia) [ALL], 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia) [CLL], B-세포 림프종, 예를 들어 미만성 거대 B-세포 림프종 (diffuse large B-cell lymphoma) [DLBCL], 여포성 림프종 (follicular lymphoma), 버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma), 맨틀 세포 림프종 (mantle cell lymphoma), T-세포 림프종 (T-cell lymphomas) 및 백혈병 (leukaemias), 자연 살해 [NK] 세포 림프종, 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphomas), 모발 세포 백혈병 (hairy cell leukaemia), 미결정의 단클론 감마병증 (monoclonal gammopathy of uncertain significance), 형질세포종 (plasmacytoma), 다발성 골수종 (multiple myeloma) 및 이식후 림프증식성 장애 (post-transplant lymphoproliferative disorder)), 및 골수 계통의 혈액학적 악성 종양 및 관련 병태 (예를 들면 급성 골수성 백혈병 (acute myelogenousleukemia) [AML], 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenousleukemia) [CML], 만성 골수단핵구 백혈병 (chronic myelomonocyticleukemia) [CMML], 과호산구 증후군 (hypereosinophilic syndrome), 골수증식성 장애 (myeloproliferative disorder), 예를 들어, 진성 적혈구증가증 (polycythaemia vera), 본질적 혈소판 증가증 (essential thrombocythaemia) 및 원발성 골수섬유증 (primary myelofibrosis), 골수증식 증후군 (myeloproliferative syndrome), 골수이형성 증후군 (myelodysplastic syndrome) 및 전골수구성 백혈병 (promyelocyticleukemia))를 포함한 혈액학적 악성 종양 (즉, 백혈병, 림프종) 및 전암성 혈액학적 장애 및 경계선상 악성 종양의 장애; 중간엽 기원의 종양, 예를 들면, 연조직, 뼈 또는 연골의 육종, 예를 들어 골육종 (osteosarcomas), 섬유육종 (fibrosarcomas), 연골육종 (chondrosarcomas), 횡문근 육종 (rhabdomyosarcomas), 평활근 육종 (leiomyosarcomas), 지방 육종 (liposarcomas), 혈관 육종 (angiosarcomas), 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma), 유잉 육종 (Ewing's sarcoma), 활막 육종 (synovial sarcomas), 상피모양 육종 (epithelioid sarcomas), 위장관 간질성 종양 (gastrointestinal stromal tumour), 양성 및 약성 조직구종 (benign and malignant histiocytomas), 및 융기성 피부 섬유육종 (dermatofibrosarcomaprotuberans); 중추 또는 말초 신경계의 종양 (예를 들면, 성상 세포종 (astrocytomas), 신경교종 (gliomas) 및 교아세포종 (glioblastomas), 수막종 (meningiomas), 뇌실막세포종 (ependymomas), 송과체 종양 (pineal tumours) 및 신경초종 (schwannomas); 내분비 종양 (예를 들면, 뇌하수체 종양 (pituitary tumours), 부신 종양 (adrenal tumours), 섬 세포 종양 (islet cell tumours), 부갑상선 종양 (parathyroid tumours), 유암종 종양 (carcinoid tumour) 및 갑상선의 수질 암종 (medullary carcinoma of the thyroid); 안구 및 부속기 종양 (예를 들면 망막모세포종 (retinoblastoma)); 생식 세포 및 영양성 종양 (예를 들면 기형종 (teratomas), 정상피종 (seminomas), 난소고환종 (dysgerminomas), 포상기태 (hydatidiform mole) 및 융모암종 (choriocarcinomas); 및 소아 및 배아 종양 (예를 들면, 수모세포종 (medulloblastoma), 신경모세포종 (neuroblastoma), 윌름스 종양 (Wilms tumour) 및 원시 신경 외배엽 종양 (primitive neuroectodermal tumour)); 또는 선천성 증후군 또는 달리 환자가 악성 종양에 걸리기 쉬운 상태로 두는 증후군 (예를 들면, 색소성 건피증 (Xeroderma Pigmentosum))을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
추가의 실시양태에서, 암은 유방암, 폐암, 위암, 췌장암, 전립선암, 간암, 교모세포종 및 혈관형성으로부터 선택된다.
추가의 실시양태에서, 암은 전립선암, 폐암 (예를 들어, 소세포 폐 암종 (NSCLC), 유방암 (예를 들어, 삼중 음성 유방암 (triple negative breast cancer)), 위암, 난소암, 식도암, 다발성 골수종 (multiple myeloma) 및 섬유육종 (fibrosarcoma)으로부터 선택된다.
추가의 실시양태에서, 암은 전립선암이다. BCY6136이 PC-3 이종이식 전립선암 모델에서 유의하고 강력한 항종양 활성을 나타냈음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 7 및 8에 제시되어 있다 (도 5와 6 및 표 16 내지 19 참조).
추가의 실시양태에서, 약물 접합체는 고형 종양, 예를 들어, 섬유육종 및 유방암, 및 비-소세포 폐 암종을 예방, 억제 또는 치료하는데 유용하다.
추가의 실시양태에서, 암은 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)과 같은 폐암으로부터 선택된다. BCY6136이 NCI-H1975 이종이식 폐암 (NSCLC) 모델에서 강력한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 9에 제시되어 있다 (도 8 및 표 20 내지 25 참조). BCY6136이 크고 작은 종양 크기 LU-01-0251 PDX 폐암 (NSCLC) 모델 둘 다에서 강력한 항종양 효과를 입증하였음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 10 및 11에 또한 제시되어 있으며 (도 9와 10 및 표 26 내지 29 참조), 여기서 완전한 종양 퇴화가 관찰되었다. BCY6136이 LU-01-0046 PDX 폐암 (NSCLC) 모델에서 유의한 항종양 효과를 입증하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에서 연구 12에 제시되어 있으며 (도 11 및 표 30과 31 참조), 여기서 BCY6136에 대해 완전한 종양 퇴화가 관찰되었다. BCY6136이 LU-01-0046 PDX 폐암 (NSCLC) 모델에서 용량 의존적 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에서 연구 13에 제시되어 있다 (도 12 및 표 32와 33 참조). LU-01-0046 PDX 폐암 (NSCLC) 모델에서 BCY6173은 항종양 활성을 입증하고 BCY6136 및 BCY6175는 종양을 근절하였음을 보여주는 데이터가 또한 본원에서 연구 14에 제시되어 있다 (도 13 내지 15 및 표 34 내지 37 참조). 낮은/무시할 수 있는 EphA2 발현을 갖는 세포주를 사용한 두 가지 모델 (즉, Lu-01-0412 및 Lu-01-0486)에서 BCY6136의 효과를 입증하는 데이터가 또한 본원에서 연구 15 및 16에 제시되어 있다. 이 데이터는 도 23과 24 및 표 38 내지 41에 도시되어 있으며 BCY6136은 세포주에서 종양 퇴화에 영향을 미치지 않았지만 Lu-01-0412 세포주에서 고도로 발현된 표적에 결합하는 BCY BCY8245 및 BCY8781은 종양을 완전히 근절하였음을 입증한다. 추가의 실시양태에서, 암은 유방암이다. 추가의 실시양태에서, 유방암은 삼중 음성 유방암이다. BCY6136이 MDA-MB-231 이종이식 유방암 모델에서 강력한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 17에 제시되어 있다 (도 18 및 표 42 내지 45 참조). 낮은/무시할 수 있는 EphA2 발현을 갖는 세포주를 사용하는 유방암 모델 (즉, EMT6)에서 BCY6136의 효과를 입증하는 데이터가 또한 본원에서 연구 18에 제시되어 있다. 이러한 데이터는 도 19 및 표 46과 47에 나타내어져 있으며 BCY6136이 이러한 세포주에서 종양 퇴화에 영향을 미치지 않았음을 입증한다. 대안적인 실시양태에서, 유방암은 헤르셉틴 내성 유방암이다. 이론에 구속됨이 없이, EphA2는 헤르셉틴에 대한 내성에 연루되어 있다고 여겨지므로, EphA2-표적화 실체는 헤르셉틴에 반응하지 않은 환자에서 잠재적 유용성을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 암은 위암이다. BCY6136이 NCI-N87 이종이식 위암 모델에서 유의한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 19에 제시되어 있다 (도 20 및 표 48과 49 참조).
추가의 실시양태에서, 암은 난소암이다. BCY6136이 중등도의 항종양 활성을 입증한 ADC MEDI-547과 비교하여 SK-OV-3 이종이식 난소암 모델에서 유의한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 20에 제시되어 있다 (도 21 및 표 50과 51 참조).
추가의 실시양태에서, 암은 식도암이다. BCY6136이 OE-21 이종이식 식도암 모델에서 유의한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 21에 제시되어 있다 (도 22 및 표 52와 53 참조).
추가의 실시양태에서, 암은 다발성 골수종이다. BCY6136이 MOLP-8 이종이식 다발성 골수종 모델에서 용량-의존적 항종양 활성을 입증하였고 BCY6082가 유의한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 22에 제시되어 있다 (도 23 및 표 59와 60 참조).
추가의 실시양태에서, 암은 섬유육종이다. HT-1080 이종이식 섬유육종 모델에서 BCY6173, BCY6135, BCY6174 및 BCY6175는 용량 의존적 항종양 활성을 입증하였고 BCY6136은 강력한 항종양 활성을 입증하였음을 보여주는 데이터가 본원에서 연구 23에 제시되어 있다 (도 24 내지 28 및 표 56과 57 참조).
본원에서 용어 "예방"에 대한 언급은 질환의 유도 전의 예방적 조성물의 투여를 포함한다. "억제"는 유도성 이벤트 후, 그러나 질환의 임상적 출현 전의 조성물의 투여를 지칭한다. "치료"는 질환 증상이 나타난 후 예방적 조성물의 투여를 포함한다.
질환을 예방하거나 치료하는데 있어서 펩티드 리간드의 효과를 스크리닝하는데 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용 가능하다. 동물 모델 시스템의 사용은 본 발명에 의해 촉진되며, 이것은 인간 및 동물 표적과 교차반응할 수 있는 폴리펩티드 리간드의 개발을 허용하여 동물 모델의 사용을 가능하게 한다.
또한, 다수의 종양 유형으로부터의 EphA2에 대한 카피 수 변화 (copy number variation; CNV)와 유전자 발현 사이의 연관성을 입증하는 데이터가 본원에서 연구 3에 제시되어 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 이펙터 그룹 및 펩티드 리간드의 약물 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하여 암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 환자는 EphA2의 증가된 카피 수 변화 (CNV)를 갖는 것으로 확인된다.
하나의 실시양태에서, 암은 EphA2의 증가된 CNV를 갖는 것으로 본원에서 확인된 것들로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 암은 유방암이다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 아래에 추가로 설명된다.
실시예
Figure pct00010
재료 및 방법
펩티드 합성
펩티드는 고체상 합성에 의해 합성하였다. Rink 아미드 MBHA 수지를 사용하였다. Rink 아미드 MBHA (0.4-0.45 mmol/g) 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH (3.0 eq)를 함유하는 혼합물에 DMF를 첨가한 다음 DIC (3 eq) 및 HOAt (3 eq)를 첨가하고 1시간 동안 혼합하였다. DMF 중 20% 피페리딘을 디블로킹(deblocking)에 사용하였다. 각각의 후속 아미노산을 DMF 중의 3 eq 활성화제 시약, DIC (3.0 eq) 및 HOAT (3.0 eq)를 사용하여 커플링시켰다. 반응은 닌하이드린 색 반응 또는 테트라클로르 색 반응에 의해 모니터링하였다. 합성 완료 후, 펩티드 수지를 DMF x 3, MeOH x 3로 세척한 다음 N2 버블링하에 밤새 건조시켰다. 그후 펩티드 수지를 92.5% TFA/2.5% TIS/2.5% EDT/2.5% H2O로 3시간 동안 처리하였다. 펩티드를 냉각 이소프로필 에테르로 침전시키고 원심분리하였다 (3000 rpm에서 3분). 펠릿을 이소프로필 에테르로 2회 세척하고 조 펩티드를 2시간 동안 진공하에 건조시킨 다음 동결건조시켰다. 동결건조된 분말을 ACN/H2O (50:50)에 용해시키고, ACN 중의 100 mM TATA의 용액을 첨가한 다음 H2O 중의 중탄산암모늄 (1M)을 첨가하고 용액을 1시간 동안 혼합하였다. 일단 페환이 완료되면, 반응을 1M aq. 시스테인 하이드로클로라이드 (TATA에 비해 10 eq)로 켄칭시킨 다음 혼합하고 한 시간 동안 정치시켰다. 용액을 동결건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 펩티드를 분취용 HPLC로 정제하고 동결건조시켜 생성물을 수득하였다.
모든 아미노산은, 달리 언급되지 않는 한, L-배위로 사용되었다.
BCY6099
Figure pct00011
서열: (β-Ala)- Sar 10 -(서열 번호 2)- CONH 2
8.0 g의 수지를 사용하여 2.1 g BCY6099 (99.2% 순도; 16.3% 수율)를 백색 고체로서 생성하였다.
Figure pct00012
바이사이클릭 펩티드 약물 접합체의 제조
바이사이클 약물 접합체 (BDC)를 제조하기 위한 일반적인 개략도는 도 1에 도시되어 있고, 표 A는 각 BDC 내의 표적화 바이사이클 및 링커/독소 성분을 기술한다.
[표 A]
Figure pct00013
BCY6135
Figure pct00014
BCY6099 (114.1 mg, 35.84 μmol)를 바이사이클 시약으로서 사용하였다. 22.4 mg 화합물 BCY6135 (5.30 μmol, 17.74% 수율, 95.14% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00015
BCY6136
Figure pct00016
BCY6099 (71.5 mg, 22.48 μmol)를 바이사이클 시약으로서 사용하였다. 화합물 BCY6136 (40.9 mg, 9.05 μmol, 40.27% 수율, 97.42% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00017
BCY6173
Figure pct00018
BCY6099 (200.15 mg, 62.89 μmol)를 바이사이클 시약으로서 사용하였다. 57.1 mg 화합물 BCY6173 (3.40 μmol, 22.79% 수율, 95.80% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00019
BCY6174
Figure pct00020
BCY6099 (389.77 mg, 122.47 μmol, 1.2 eq)를 바이사이클 시약으로서 사용하였다. Dde-BCY6174 (0.250 g, 55.10 μmol, 53.99% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00021
Dde-BCY6174 (0.250 g, 55.10 μmol, 1.0 eq)를 일반적인 과정에 따라 하이드라진을 사용하여 탈보호하여 BCY6174 (0.1206 g, 27.45 μmol, 49.82% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00022
BCY6175
Figure pct00023
화합물 10A의 제조를 위한 일반적인 과정
DMA (3 mL) 중의 BCY6099 (195.15 mg, 61.32 μmol, 1.1 eq)의 용액에 DIEA (21.61 mg, 167.23 μmol, 29.13 μL, 3 eq) 및 화합물 9 (0.085 g, 55.74 μmol, 1.0 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS에서는 화합물 9가 완전히 소모되었고 원하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하여 잔류물 (담황색 오일)을 수득하였다. 반응물을 prep-HPLC (중성 조건)에 의해 직접 정제하였다. 화합물 10A (0.160 g, 34.84 μmol, 62.50% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
BCY6175의 제조를 위한 일반적인 과정
DCM (4.5 mL) 중의 화합물 10A의 용액에 TFA (4.5 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. LC-MS에서는 화합물 10A가 완전히 소모되었고 원하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하여 잔류물을 수득하고, 이를 prep-HPLC (TFA 조건)로 정제하였다. 화합물 BCY6175 (61.40 mg, 13.56 μmol, 31.13% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
생물학적 데이터
연구 1: 형광 편광 측정
(a) 직접 결합 분석
형광 태그 (플루오레세인, SIGMA 또는 Alexa Fluor488™ 중의 어느 하나, Fisher Scientific)를 갖는 펩티드를 0.01% tween 20을 갖는 PBS 또는 100mM NaCl과 0.01% tween을 갖는 50mM HEPES pH 7.4 (둘 다 분석 완충액이라고 함) 중에서 2.5nM로 되도록 희석시켰다. 이를 펩티드와 동일한 분석 완충액 중에서 단백질의 적정물과 조합하여 흑색 벽 및 바닥 저 결합 저 용적 384 웰 플레이트에서 총 25μL 용적의 1nM 펩티드, 전형적으로 5μL 분석 완충액, 10μL 단백질 (표 1)에 이어 10μL 형광 펩티드를 수득하였다. 2개의 연속 희석물 중 1개를 사용하여, 공지된 고친화도 결합제에 대해 500nM 내지 저친화도 결합제 및 선택성 분석에 대해 10μM에 이르는 최고 농도를 갖는 12개의 상이한 농도를 제공하였다. 485nm에서 여기되고 520nm에서 평행 및 수직 방출을 검출하는 "FP 485 520 520" 광학 모듈이 장착된 BMG PHERAstar FS에서 측정을 수행하였다. PHERAstar FS는 웰당 200회 플래시와 0.1초의 위치지정 지연으로 25℃로 설정하였으며, 각 웰은 5분에서 10분 간격으로 60분 동안 측정하였다. 60분의 말기에 각 추적자 (tracer)에 대해 분석에 사용된 이득 (gain)을 결정하였으며, 웰에 단백질은 없었다. Systat Sigmaplot 버전 12.0을 사용하여 데이터를 분석하였다. mP 값을 사용자 정의된 2차 방정식에 피팅하여 Kd 값을 생성하였다: f = ymin+(ymax-ymin)/Lig*((x+Lig+Kd)/2-sqrt((((x+Lig+Kd)/2)^2)-(Lig*x))). "Lig"는 사용된 추적자의 농도의 정의된 값이었다.
(b) 경쟁 결합 분석
형광 태그가 없는 펩티드를 형광 태그 및 공지된 Kd를 갖는 펩티드와 경쟁하여 시험하였다 (표 2). 참조 화합물 A는 서열 Fl-G-Sar5-ACPWGPAWCPVNRPGCA (Fl-G-Sar5-(서열 번호 4))를 갖는다. 참조 화합물 B는 서열 Fl-G-Sar5-ACPWGPFWCPVNRPGCA (Fl-G-Sar5-(서열 번호 5))를 갖는다. 참조 화합물 C는 서열 Fl-G-Sar5-ADVTCPWGPFWCPVNRPGCA (Fl-G-Sar5-(서열 번호 6))을 갖는다. 참조 화합물 A, B 및 C 각각은 TBMB 분자 스캐폴드를 함유한다. 펩티드를 최대 5% DMSO로 직접 결합 분석에 기술된 바와 같이 분석 완충액에서 적절한 농도로 희석시킨 다음 2에서 1로 연속 희석시켰다. 5 μL의 희석된 펩티드를 플레이트에 첨가한 다음 사용된 형광 펩티드 (표 2)에 의존하는 고정된 농도로 10μL 인간 또는 마우스 EphA2 (표 1)에 이어 10μL 형광 펩티드를 첨가하였다. 직접 결합 분석에 대해 측정을 수행하였으나, 1차 측정 전에 이득을 측정하였다. 데이터 분석은 Systat Sigmaplot 버전 12.0에서 이루어졌으며, 여기서 mP 값을 사용자 정의된 3차 방정식에 피팅하여 Ki 값을 생성하였다.
Figure pct00024
"Lig", "KLig" 및 "Prot"는 각각 형광 펩티드 농도, 형광 펩티드의 Kd 및 EphA2 농도에 관한 모든 정의된 값이었다.
[표 1] 에프린 수용체 및 공급원
Figure pct00025
[표 2] 경쟁 결합 분석에 사용된 바와 같은 형광 펩티드 및 EphA2의 최종 농도
Figure pct00026
본 발명의 특정 펩티드 리간드를 상기 언급된 분석으로 시험하였으며 결과는 표 3 및 4에 나타내어져 있다:
[표 3] 본 발명의 펩티드 리간드에 대한 생물학적 분석 데이터 ( TATA 펩티드, 경쟁 결합 분석)
Figure pct00027
[표 4] 본 발명의 펩티드 리간드에 대한 생물학적 분석 데이터 ( TATA 스캐폴드를 사용한 BDC 경쟁 결합 데이터)
Figure pct00028
연구 2: 형광 편광 측정 (대안적인 프로토콜)
(a) 경쟁 결합
형광 태그가 없는 펩티드를 형광 태그 및 공지된 Kd를 갖는 펩티드와 경쟁하여 시험하였다 (표 9). 5 μL의 증가하는 (2배) 농도의 시험 화합물을 플레이트에 첨가한 다음 사용된 형광 펩티드 (표 9)에 의존하는 고정된 농도로 10μL의 EphA2 단백질 (표 8)에 이어 10μL 형광 펩티드를 첨가하였다. 완충액은 DMSO <1%를 갖는 상기와 같은 분석 완충액이었다. 485nm에서 여기되고 520nm에서 평행 및 수직 방출을 검출하는 "FP 485 520 520" 광학 모듈이 장착된 BMG PHERAstar FS에서 측정을 수행하였다. PHERAstar FS는 웰당 200회 플래시와 0.1초의 위치지정 지연으로 25℃로 설정하였으며, 각 웰은 5분에서 10분 간격으로 60분 동안 측정하였다. 대안적으로, FITC FP 듀얼 미러, FITC FP 480 여기 필터 및 FITC FP P-pol 535 및 FITC FP S-pol 방출 필터가 장착된 Perkin Elmer Envision에서 30회 플래시 및 1.2의 G-인자로 하여 유사한 시간 간격으로 측정을 수행하였다. Systat Sigmaplot 버전 12.0 또는 13.0에서 데이터를 분석하였으며, 60분에서의 mP 값을 사용자 정의된 3차 방정식에 피팅하여 Ki 값을 생성하였다:
Figure pct00029
"Lig", "KLig" 및 "Prot"는 각각 형광 펩티드 농도, 형광 펩티드의 Kd 및 EphA2 농도에 관한 모든 정의된 값이었다.
[표 5] Eph 수용체 및 공급원
Figure pct00030
[표 6] 경쟁 결합 분석에 사용된 바와 같은 형광 펩티드 및 EphA2의 최종 농도
Figure pct00031
본 발명의 특정 펩티드 리간드 및 바이사이클 약물 접합체를 상기 언급된 경쟁 결합 분석으로 시험하였으며 결과는 표 7에 나타내어져 있다:
[표 7] 선택된 바이사이클릭 펩티드를 사용한 경쟁 결합
Figure pct00032
표 7의 경쟁 결합 분석으로부터의 결과는 인간 EphA2를 표적으로 하는 바이사이클 펩티드 (BCY6099)가 마우스 및 래트 EphA2에 높은 친화도로 결합한다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 본 발명의 펩티드가 생체내 마우스 및 래트 효능 및 독성학 모델에서 사용될 수 있음을 보여준다.
[표 8] 선택된 바이사이클 약물 접합체 ( BDC )를 사용한 경쟁 결합
Figure pct00033
표 8은 본 발명의 특정 바이사이클 약물 접합체가 인간, 마우스 및 설치류 EphA2 사이에 탁월한 교차 반응성을 나타내는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 생체내 모델에서 마우스 및 래트 효능 및 독성학에 사용될 수 있다.
(b) SPR 측정
비-Fc 융합 단백질을 단백질에 비해 3x 몰 과량의 비오틴으로 하여 4mM 나트륨 아세테이트, 100mM NaCl, pH 5.4에서 1시간 동안 EZ-Link™ 설포-NHS-LC-비오틴으로 비오틴화시켰다. PBS로의 반응 혼합물의 투석 후 형광 비오틴 정량 키트 (Thermo)를 사용하여 표지화 정도를 결정하였다. 펩티드 결합의 분석을 위해, XiaTec CMD500D 칩을 이용하여 Biacore T200 기기를 사용하였다. 스트렙타비딘을 25℃에서 HBS-N (10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, pH 7.4)을 작업 완충액으로 하여 표준 아민-커플링 화학을 사용하여 칩 상에 고정시켰다. 간단히 말하면, 카복시메틸 덱스트란 표면을 10 μl/min의 유속에서 1:1 비의 0.4M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC)/0.1M N-하이드록시 석신이미드 (NHS)의 7분 주입으로 활성화시켰다. 스트렙타비딘의 포획을 위해, 단백질을 10 mM 아세트산 나트륨 (pH 4.5)에서 0.2 mg/ml로 되도록 희석시키고 120μl를 활성화된 칩 표면에 주입하여 포획하였다. 잔류 활성화 그룹을 1M 에탄올아민 (pH 8.5):HBS-N (1:1)의 7분 주입으로 차단하였다. 완충액을 PBS/0.05% Tween 20으로 교체하고, 비오티닐화된 EphA2를 완충액에서 0.2μM로의 단백질의 희석을 사용하여 500-1500 RU 수준으로 포획하였다. 0.5%의 최종 DMSO 농도를 갖는 이러한 완충액에서 펩티드의 일련의 희석물을 제조하였으며, 최고 펩티드 농도는 50 또는 100nM이었고 6개의 추가의 2배 희석을 수행하였다. SPR 분석을 60초 결합 및 900-1200초 해리로 하여 90μl/분의 유속으로 25℃에서 수행하였다. DMSO 배제된 용적 효과에 대해 데이터를 보정하였다. 표준 처리 절차를 사용하여 블랭크 주입 및 참조 표면에 대해 모든 데이터를 이중-참조하고, Scrubber 소프트웨어, 버전 2.0c (BioLogic Software)를 사용하여 데이터 처리 및 동역학적 피팅을 수행하였다. 적절한 경우 질량 이동 효과 (mass transport effect)를 허용하는 단순 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 피팅하였다.
바이사이클 약물 접합체의 결합을 위해 Biacore 3000 기기를 사용하였다. 비오티닐화된 단백질에 대해 고정화 수준은 1500 RU이고 최고 농도는 100nM이었다. 그 외에는 방법은 CMD500D 또는 CM5 칩 (GE Healthcare)을 사용하여 상기 기술된 바와 동일하였다. Fc-태그된 단백질의 경우, CM5 칩을 상기 기술된 바와 같이 활성화시킨 다음 염소 항-인간 IgG 항체 (Thermo-Fisher H10500)를 10mM 나트륨 아세테이트 pH5.0에서 20μg/ml로 되도록 희석시키고 대략 3000 RU로 포획하였다. 그후 표면을 상기 기술된 바와 같이 차단하였다. Fc-태그된 단백질의 후속 포획을 수행하여 대략 200-400 RU의 표적 단백질을 수득하였다. 사용되는 단백질은 아래에 기술되어 있다. 모든 단백질은 제조사의 제안된 완충액 및 농도에 따라 재구성하였으며 PBS/0.05% Tween 20 중의 5-10μg/ml 단백질을 사용하여 포획하였다.
[표 9]
Figure pct00034
본 발명의 특정 펩티드 리간드 및 바이사이클 약물 접합체를 상기 언급된 경쟁 결합 분석으로 시험하였으며 결과는 표 10 내지 12에 나타내어져 있다:
[표 10] 본 발명의 선택된 바이사이클릭 펩티드 및 바이사이클 약물 접합체를 사용한 SPR 결합 분석
Figure pct00035
표 10은 SPR 분석을 사용하여 결정된 선택된 인간 EphA2에 대한 선택된 바이사이클 약물 접합체의 결합에 대한 결합 친화도 및 동역학 파라미터 (Koff 및 Kon)를 상세하게 설명한다.
[표 11] 본 발명의 선택된 바이사이클 약물 접합체와 인간 Eph 상동체를 사용한 SPR 결합 분석
Figure pct00036
표 11은 밀접한 관련이 있는 인간 에프린 상동체를 사용한 SPR 분석에서 4개의 바이사이클 약물 접합체 (BCY6136 및 BCY6173)에 의한 결합 결과를 예시한다. 결과는 본 발명의 화합물이 밀접하게 관련된 인간 상동체: EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7 및 EphB4에 유의한 결합을 나타내지 않음을 보여준다.
[표 12] 본 발명의 선택된 바이사이클 약물 접합체와 마우스 및 래트 Eph 오 르소로그를 사용한 SPR 결합 분석
Figure pct00037
표 12의 결과는 본 발명의 특정 바이사이클 약물 접합체 (BCY6136 및 BCY6173)가 또한 마우스 및 래트 EphA2에 대해 선택적이며, 밀접하게 관련된 상동체: 마우스 EphA3 및 EphA4; 및 래트 EphA3 및 EphB1에 대해 유의한 결합을 나타내지 않음을 보여준다.
연구 3 및 7-23
연구 3 및 7-23 각각에서, 각 연구에 대해 다음 방법을 채택하였다:
(a) 재료
(i) 동물 및 수용 조건
동물
종: 생쥐 (Mus Musculus )
품종: Balb/c 누드 또는 CB17-SCID
연령: 6-8주
체중: 18-22 g
동물의 수: 9-90마리 마우스
동물 공급처: Shanghai Lingchang Biotechnology Experimental Animal Co. Limited
수용 조건
마우스를 각 케이지에 3-5마리 동물을 넣어 일정한 온도 및 습도에서 개별 환기 케이지에 유지시켰다.
· 온도: 20~26℃.
· 습도 40-70%.
케이지: 폴리카보네이트로 만들어짐. 크기는 300 mm x 180 mm x 150 mm이다. 베딩 재료는 옥수수 속대이며 일주일에 두 번 교체한다.
식이: 동물은 전체 연구 기간 동안 조사 멸균된 건조 과립 식품에 자유롭게 접근할 수 있었다.
물: 동물들은 살균 식수에 자유롭게 접근할 수 있었다.
케이지 식별: 각 케이지의 식별 표지는 다음의 정보를 담고 있었다: 동물 수, 성별, 품종, 접수일, 치료, 연구 번호, 그룹 번호 및 치료 시작일.
동물 식별: 동물은 귀 코딩에 의해 표시하였다.
(ii) 시험 및 양성 대조 물품
Figure pct00038
1MEDI-547 (mc 링커를 통해 MMAF에 접합된 완전 인간 단클론 항체 1C1 (인간 및 뮤린 EphA2 둘 다를 인식함))의 상세한 설명은 문헌[Jackson et al (2008) Cancer Res 68, 9367-74]에 기술되어 있다.
(b) 실험 방법 및 절차
(i) 관찰
동물 취급, 관리 및 치료에 관한 모든 절차는 실험실 동물 관리의 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 지침에 따라 WuXi AppTec의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인된 지침에 따라 수행하였다. 일상적인 모니터링 시점에, 동물을 기동성, 음식 및 물 소비 (보기만 함으로써), 체중 증가/손실, 눈/털 매트감 및 프로토콜에 명시된 바와 같은 임의의 다른 비정상적인 영향과 같은 정상적인 행동에 대한 종양 성장 및 치료의 영향에 대해 매일 확인하였다. 사망 및 관찰된 임상 징후를 각각의 서브세트 내의 동물의 수에 기초하여 기록하였다.
(ii) 종양 측정 및 종점
주요 종점은 종양 성장이 지연될 수 있는지 또는 마우스가 치료될 수 있는지를 알아보는 것이었다. 종양 용적은 캘리퍼를 사용하여 2차원에서 매주 3회 측정하였으며, 용적은 다음 공식을 사용하여 mm3으로 표현하였다: V = 0.5 a x b 2 , 여기서 a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경이다. 그후, 종양 크기를 T/C 값의 계산에 사용하였다. T/C 값 (단위; 퍼센트)이 항종양 효과의 지표이다; T 및 C는 각각 주어진 날짜에 처리군 및 대조군의 평균 용적이다.
각 그룹에 대한 TGI는 공식을 사용하여 계산하였다: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)]×100; Ti는 주어진 날짜의 처리군의 평균 종양 용적이고, T0는 치료 시작일의 처리군의 평균 종양 용적이고, Vi는 Ti와 같은 날 비히클 대조군의 평균 종양 용적이고, V0는 치료 시작일의 비히클 그룹의 평균 종양 용적이다 .
(iii) 샘플 수집
연구의 말기에 모든 그룹의 종양을 FFPE를 위해 수집하였다.
(iv) 통계 분석
각 시점에서 각 그룹의 종양 용적에 대해 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)를 포함한 요약 통계가 제공된다. 그룹 간 종양 용적 차이의 통계 분석은 최종 투여 후 최상의 치료 시점에서 얻은 데이터에 대해 수행하였다. 일원 ANOVA를 수행하여 그룹 간 종양 용적을 비교하였으며, 유의한 F-통계량 (오류 분산에 대한 처리 분산의 비)이 수득되었을 때, Games-Howell 검정으로 그룹 간의 비교를 수행하였다. 모든 데이터는 GraphPad Prism 5.0을 사용하여 분석하였다. P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
연구 3: 다수의 종양 유형으로부터의 EphA2에 대한 카피 수 변화 ( CNV )와 유전자 발현 간의 연관성 조사
방법
1. cBioPortal (http://www.cbioportal.org/)에서 모든 연구를 선택하고 EPHA2를 검색한다.
(a) 임시 연구를 제거한다.
(b) (cBioPortal의 경고를 기반으로) 샘플 바이어스를 방지하기 위해 샘플이 겹치는 연구의 선택을 해제한다. 이것이 옵션인 경우 항상 PanCancer 연구를 유지한다.
(c) 분석을 위해 선택된 연구 (표 13).
[표 13] cBioPortal로부터 분석된 연구 및 연구 단위
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
2. cBioPortal로부터 CNV 및 RNA 발현 데이터를 엑스포트한다.
3. CNV가 EphA2에 대한 mRNA 발현의 변화와 통계적으로 유의하게 관련되어 있는지 검정한다 (log2 미적용).
(a) GraphPad Prism (7.04) 및 R/R studio에서 비모수적 Kruskal-Wallis 검정을 실행한다 (유의도에 대한 역치: p<0.01).
(i) GraphPad Prism: 열 표를 설정하고, 매칭 또는 페어링 없이 비모수 검정을 실행하며 Gaussian 분포를 가정하지 않는다.
(ii) R에서 사용되는 패키지:
1. XLConnect
2. dplyr
3. Kruskal-Wallis 순위합 검정: Kruskal.test.
4. Dunn의 검정을 사용하여 R/Rstudio에서 다중 비교 (그룹 내에서 n=1인 경우에도 가능한 모든 비교 포함)를 조정한다 (유의도에 대한 역치: p<0.025).
(a) 다중 비교 방법 = "bonferroni"로 dunn.test.
결과
결과는 아래 표 14에 나타내어져 있다. EphA2에 대한 카피 수 변화 (CNV)와 mRNA 유전자 발현 둘 다를 보고하는 cBioPortal에 컴파일된 41개의 공개적으로 이용 가능한 데이터세트에 걸쳐, EphA2 얕은 결실 (shallow-deletion) (<2 카피)로 사례가 보고된 수많은 암 유형이 있다. 비록 덜 흔하지만, 이러한 동일한 암 유형에서, 종양의 서브세트는 EphA2 깊은 결실 (deep deletio) (>1 카피 손실 또는 이중대립형질 손실), EphA2 이득 (2-3 카피) 또는 EphA2 증폭 (>3 카피)을 가졌다. EphA2에서 종양의 >33%가 얕은 결실 또는 깊은 결실을 갖는 징후는 다음을 포함하였다: 신장 혐색소, 담관암종, 크롬친화성 세포종 및 부신 경절종, 폐 편평 암, 유방, 직장, 뇌 하급 신경교종, 간, 부신피질 암종, 중피종, 식도 선암 및 대장암. 대조적으로, 샘플의 >33%가 EphA2에서 이득 또는 증폭을 갖는 연구는 없었다. 종합하면, 이들 결과는 EphA2 DNA의 결실이 다양한 징후에 걸쳐 발견됨을 입증한다.
41개의 연구에서 분석된 모든 샘플의 대략 1/3이 EphA2 CNV를 가졌다. 연구 전반에 걸친 이러한 높은 퍼센트의 CNV 및 특정 종양 유형 내에서의 높은 퍼센트의 얕은 결실에 기초하여, 카피 수 변화와 RNA 발현 사이의 가능한 연관성을 확인하기 위해 통계 검정을 수행하였다. 징후 당 종양은 5개의 클래스 중 하나에 할당되었다:
a) 깊은 결실 (Deep deletion);
b) 얕은 결실 (Shallow deletion);
c) 이배체 (Diploid);
d) 이득 (Gain); 또는
e) 증폭 (Amplification).
그후 Kruskal-Wallis 검정을 수행하여 클래스 당 mRNA 발현 값의 분포가 클래스마다 다른지 여부를 검출하였다 (P < 0.01). P < 0.01인 이러한 TCGA 데이터 세트에 대해 어떠한 클래스가 서로 다른지를 식별하기 위해 조정된 P-값이 계산된 Z-통계량을 계산함으로써 사후 검정을 수행하였다 (Bonferroni). 해석의 단순화를 위해 징후 당 쌍별 비교 vs. 이배체를 검토하였다 (모든 쌍별 P-값이 계산되었지만). 이들 연구의 19/41은 Kruskall-Wallis p-값이 <0.01이며, 이것은 카피 수가 RNA 발현과 통계적으로 유의하게 관련됨을 입증한다. 이들 19개의 연구 중, 17개는 이배체 vs. 얕은 결실에 대해 Bonferroni 조정된 P < 0.025를 가졌으며, 이것은 감소된 EphA2 카피 수와 감소된 EphA2 mRNA 발현의 연관성을 나타냈다. 이들 19개 연구 중 2개만이 이배체 vs. 이득에 대해 Bonferroni 조정된 P < 0.025를 가졌으며 둘 다 유방암 연구였다. 게다가, 이러한 유방암 연구 중 하나 (유방 침습 암종 (TCGA, PanCancer Atlas))는 이배체 vs. 얕은 결실 및 이배체 vs. 이득 둘 다에 대해 Bonferroni 조정된 P <0.025를 가졌으며, 이것은 카피 수 변화가 유방암에서 EphA2 RNA 발현에 강한 영향을 줄 수 있음을 시사한다. //유전학의 중심 교리는 EphA2에서의 감소된 카피 수가 RNA 및 단백질 발현 감소를 야기함을 시사한다. 따라서, 다양한 종양 유형에서 EphA2의 카피 수와 감소된 mRNA 발현 사이의 관찰된 연관성은 EphA2 단백질 발현이 또한 감소될 수 있음을 시사한다. 유사하게, 증가된 mRNA 발현과 관련된 유방암에서의 EphA2의 카피 수 이득은 또한 증가된 EphA2 단백질 발현을 시사할 수 있다. 또한, 더 높은 EphA2 단백질 발현 (FACS에 의해 측정됨)은 전임상 생체내 모델에서 본 발명의 특정 EphA2 바이사이클릭 약물 접합체의 증가된 효능 (종양 용적에 의해 측정됨)과 관련된다. 종합하면, mRNA 발현 변화와 관련된 카피 수 변화가 단백질 발현 수준을 예측한다면 EphA2의 카피 수 결실을 함유하는 종양을 가진 환자는 본 발명의 EphA2 바이사이클릭 약물 접합체에 덜 반응할 가능성이 있을 수 있다. 유사하게, 환자가 EphA2의 종양 카피 수 이득을 갖는다면 (예를 들어, 유방암) 이들 환자가 본 발명의 EphA2 바이사이클릭 약물 접합체에 더 반응할 가능성이 있을 수 있다. 따라서, 환자를 EphA2 카피 수 상태에 의해 계층화한다면, 이 정보는 본 발명의 EphA2 바이사이클릭 약물 접합체로 치료하기 위해 환자를 배제 및 선택하여 효능을 증가시키는데 사용될 수 있다.
[표 14] EphA2에 대한 카피 수 변화 (CNV)와 유전자 발현 사이의 연관성의 조사 결과
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
연구 4: CDX 이종이식 모델에서 BCY6136의 생체내 효능
당해 연구는 3가지 암 세포주 유래 (CDX) 모델에서 BCY6136의 치료 효능을 평가하였다: HT1080 섬유육종 계통, MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 계통 및 NCI-H1975 비소세포 폐암 (NSCLC) 계통.
(a) 실험 방법
Balb/c 마우스에게 종양 세포를 우측 옆구리에 피하로 접종하고 평균 종양 용적이 150 내지 200 mm3에 도달할 때 약물 처리를 시작하였다. 종양 측정 및 통계 분석은 상기한 바와 같이 수행하였다. 종양 보유 동물을 BCY6136 또는 비히클로 매주 1회 처리하였다.
(b) 논의
도 4-6은 BCY6136이 매주 1회 투여 후 유방, 폐 및 섬유육종 이종이식 모델에서 효과적임을 보여준다.
HT1080 섬유육종 모델:
HT1080 모델에서 0일 및 7일에 BCY6136을 3 및 5 mg/kg으로 매주 1회 투여 후 14일까지 종양 성장의 완전 퇴화가 달성되었다 (도 2). 0일과 7일에 BCY6136을 2mg/kg으로 매주 1회 투여하면 종양 정체 (부분 퇴화)가 야기되었다 (도 2). BCY6136 처리는 유의한 체중 감소를 야기하지 않았으며, 연구 전반에 걸쳐 약물 처리된 마우스에 대한 불리한 임상적 관찰은 없었다.
NCI-H1975 NSCLC 모델:
NCI-H1975 모델에서 종양 성장의 완전 퇴화는 2 및 3 mg/kg으로 매주 1회 BCY6136을 투여한 후 28일쯤에 관찰되었다 (도 3). 35일에 투여 중단 후, 3 mg/kg 팔 측정이 종료된 35일부터 72일까지 3 mg/kg 처리된 동물에서 어떠한 종양 재성장도 관찰되지 않았다 (도 3). BCY6136을 2mg/kg으로 투여하면 28일쯤부터 이 모델에서 완전 퇴화가 야기되었다. 35일에 투여 중단 후, 2 mg/kg 용량에서 약 51일까지 종양 재성장이 없었다. 이 용량 수준에서, 약 51일부터 77일 연구 종료시까지 중간 정도의 종양 재성장이 관찰되었다. BCY6136으로 1 mg/kg 처리하면 종양 정체 (부분 퇴화)가 야기되었다 (도 3). BCY6136 처리는 유의한 체중 감소를 야기하지 않았으며, 연구 전반에 걸쳐 약물 처리된 마우스에 대한 불리한 임상적 관찰은 없었다.
MDA -MB-231 유방 모델:
0일부터 45일까지 2 및 3 mg/kg으로 매주 1회 투여 후 MDA-MB231 모델에서 종양 정체 (부분 퇴화)가 관찰되었다 (도 4). 2 mg/kg 처리된 동물에서 약간의 체중 감소 (종양 부담에 기인함)가 관찰되었다.
이러한 결과는 BCY6136이 1일 1회 투여 후 섬유육종, 유방 및 폐 CDX 이종이식편이 이식된 마우스에서 극심한 종양 성장 억제를 야기한다는 것을 입증한다.
연구 5: 래트에서의 안전성 연구
1일 및 8일에 5, 7.5 및 10 mg/kg으로 IV 농축괴 주사로 투여한 후, 여섯 (6) 마리의 암컷 래트를 2마리 래트/그룹의 3개 그룹에 무작위로 할당하여 BCY6136의 독성을 결정하였다. 연구는 15일에 종료하였다.
2, 12 및 15일에 응고 매개변수 (프로트롬빈 시간 (초), 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (초) 또는 피브로기노겐 수준 (g/L)에 대한 유의한 영향이 관찰되지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). 생전 출혈 사례는 보고되지 않았으며 병리 검사 후 내부 출혈의 증거는 검출되지 않았다.
연구 6: 시노몰로구스 원숭이에서의 안전성 연구
BCY6136을 사용한 28일 독성 연구를 시노몰로구스 원숭이에서 수행하였다. BCY6136은 1일, 8일, 15일 및 22일에 1.0 및 2.0 mg/kg으로 투여하였다. 동물을 안락사시키고 29일 (최종 투여한지 7일 후)에 부검하였다.
기준선에 비한 응고 파라미터에 대한 유의한 효과는 18일, 22일 및 25일 (데이터는 표시되지 않음) 및 29일 (표 15)에 관찰되지 않았다. 생전 출혈 사례는 보고되지 않았으며 병리 검사 후 내부 출혈의 증거는 검출되지 않았다.
[표 15] 시노몰로구스 원숭이에게 1.0 및 2.0 mg/kg BCY6136 투여 후 29일째 응고 매개변수
Figure pct00056
연구 7: Balb /c 누드 마우스에서 PC-3 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136 및 ADC의 생체내 효능 연구
(a) 연구 목적
연구의 목적은 PC-3 이종이식편의 치료에서 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00057
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 세포 배양
PC-3 종양 세포를 공기 중 5% CO2의 대기에서 37℃에서 10% 열 불활성화 태아 소 혈청이 보충된 F12K 배지에서 유지할 것이다. 종양 세포는 매주 2회 일상적으로 계대배양할 것이다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수할 것이다.
(ii) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 PC-3 (10*106) 종양 세포를 오른쪽 옆구리에 피하로 접종할 것이다. 동물을 무작위화하고 평균 종양 용적이 대략 150 mm3에 도달할 때 치료를 시작할 것이다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 하기 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(iii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00058
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 5 및 6에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
PC-3 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적이 표 16에 나타내어져 있다.
[표 16] 시간에 따른 종양 용적 추적
Figure pct00059
(iii) 종양 성장 억제 분석
PC-3 이종이식 모델에서 시험 물품에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 16일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 17] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00060
a. 평균 ± SEM.
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, PC-3 이종이식 모델에서 시험 물품의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 5와 6 및 표 16과 17에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 16일째에 2070 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV=107 mm3, TGI=102.2%, p<0.001), 2 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV=79 mm3, TGI=103.6%, p<0.001) 및 3 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV=70 mm3, TGI=104.1%, p<0.001)는 강력한 항종양 효과를 보여 주었다. 당해 연구에서, 동물 체중을 정기적으로 모니터링하였다. 모든 마우스는 체중을 잘 유지하였다.
연구 8. Balb /c 누드 마우스에서 PC-3 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 효능 연구
(a) 연구 목적
연구의 목적은 Balb/c 누드 마우스에서 PC-3 이종이식편의 치료에서의 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00061
a. N, 각 그룹에서의 동물의 수.
b. 실험 설계 표에서 입증된 4주 처리 후, 그룹 3, 5 및 6의 마우스를 모니터링 스케줄 동안 52일부터 BCY6136 1.5 mg/kg qw으로 처리하였다.
c. 첫 번째 투여 후 도세탁셀 처리된 마우스의 심각한 체중 감소로 인해, 처리를 2주 동안 유예한 다음 28일째에 더 낮은 투여량 (도세탁셀, 10 mg/kg)으로 수행하였다. 그 후, 마우스를 42일부터 70일까지 BCY6136 1.5 mg/kg qw으로 처리하였다.
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 세포 배양
종양 세포를 공기 중 5% CO2의 대기에서 37℃에서 10% 열 불활성화 태아 소 혈청이 보충된 F-12K 배지에서 유지하였다. 종양 세포를 매주 2회 일상적으로 계대배양하였다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
(ii) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 0.2 ml PBS 중의 PC-3 종양 세포 (10 x 106)를 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 454 mm3에 도달할 때 52마리 동물을 무작위화하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(iii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00062
(c) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 7에 도시되어 있다.(ii) 종양 용적 추적PC-3 이종이식편을 갖는 수컷 Balb/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적이 표 18에 나타내어져 있다.
[표 18] 시간에 따른 종양 용적 추적 (0일째 내지 20일째)
Figure pct00063
(iii) 종양 성장 억제 분석
PC-3 이종이식 모델에서 시험 물품에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 20일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 19] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00064
a. 평균 ± SEM.
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(d) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, PC-3 이종이식 모델에서 시험 물품의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 7 및 표 18과 19에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 20일째에 2364 mm3에 도달하였다. 0.167 mg/kg, qw (TV=1188 mm3, TGI=61.4%, p<0.001), 0.5 mg/kg, q2w (TV=530 mm3, TGI=96.0%, p<0.001), 0.5 mg/kg, qw (TV=234 mm3, TGI=111.4%, p<0.001) 및 1.5 mg/kg, qw (TV=131 mm3, TGI=117.2%, p<0.001)의 BCY6136은 20일째에 용량-빈도 의존적 방식으로 유의한 항종양 활성을 생성하였다. 1.5 mg/kg, q2w의 BCY6136 (TV=128 mm3, TGI=117.0%, p<0.001)은 BCY6136 1.5 mg/kg qw와 필적하는 항종양 활성을 생성하였다. 이들 중에서, BCY6136, 0.5 mg/kg qw 또는 BCY6136, 0.5 mg/kg q2w로 처리된 마우스는 치료 중단 후 명백한 종양 재발을 보였으며, 52일째부터 BCY6136, 1.5 mg/kg qw로의 추가 처리가 종양 퇴화에 잘 작용하였다. BCY6136, 1.5 mg/kg q2w로 처리된 마우스도 치료 중단 후 종양 재발을 보였지만, 추가의 투여가 완전 종양 퇴화에 작용하지는 않았다. BCY6136, 1.5 mpk qw로 처리된 마우스는 48일째까지 어떠한 종양 퇴화도 보이지 않았다.
0.33 mg/kg, qw (TV=1637 mm3, TGI=38.1%, p<0.001), 1 mg/kg, qw (TV=981 mm3, TGI=72.2%, p<0.001) 및 3 mg/kg, qw (TV=184 mm3, TGI=114.0%, p<0.001)의 EphA2-ADC는 20일째에 용량 의존적 방식으로 유의한 항종양 활성을 생성하였다. EphA2-ADC, 3 mg/kg qw로 처리된 마우스는 59일째까지 어떠한 종양 퇴화도 보이지 않았다.
15 mg/kg, qw의 도세탁셀 (TV=419 mm3, TGI=101.8%, p<0.001)은 유의한 항종양 활성을 생성하지만 심각한 동물 체중 감소를 야기하였다. 치료 중단 후, 마우스는 명백한 종양 재발을 보였다. 42일째부터 BCY6136, 1.5 mg/kg qw로의 처리가 이러한 마우스의 종양 퇴화에 잘 작용하였다.
연구 9. Balb /c 누드 마우스에서 NCI-H1975 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 효능 연구
(a) 연구 목적
연구의 목적은 Balb/c 누드 마우스에서 NCI-H1975 이종이식 모델의 치료에서의 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이었다.
(b) 실험 설계
Figure pct00065
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 세포 배양
지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
(ii) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 0.2 ml PBS 중의 NCI-H1975 종양 세포 (10×10^6)를 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 149 mm3에 도달할 때 36마리 동물을 무작위화하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(iii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00066
(iv) 샘플 수집
PG-D44에, 우리는 FFPE를 위해 그룹 2의 종양을 고정시켰다.
연구의 말기에, 우리는 FFPE를 위해 그룹 3의 종양을 고정시켰다.
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장은 도 8에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
NCI-H1975 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적이 표 20 내지 24에 나타내어져 있다.
[표 20] 종양 용적 추적 ( PG -D0~ PG -D17)
Figure pct00067
[표 21] 종양 용적 추적 ( PG -D18~ PG -D35)
Figure pct00068
[표 22] 종양 용적 추적 ( PG -D37~ PG -D53)
Figure pct00069
[표 23] 종양 용적 추적 ( PG -D56~ PG -D74)
Figure pct00070
[표 24] 종양 용적 추적 ( PG -D77~ PG -D98)
Figure pct00071
(iii) 종양 성장 억제 분석
NCI-H1975 이종이식 모델에서 BCY6136에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 21일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 25] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00072
a. 평균 ± SEM.
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, NCI-H1975 이종이식 모델에서 BCY6136의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 8 및 표 20 내지 25에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 21일째에 2371 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg (TV=205 mm3, TGI=97.5%, p<0.001), 2 mg/kg (TV=99 mm3, TGI=102.3%, p<0.001) 및 3 mg/kg (TV=94 mm3, TGI=102.4%, p<0.001)의 BCY6136은 강력한 항종양 활성을 생성하였다. 2 mg/kg 및 3 mg/kg의 BCY6136은 종양을 근절하거나 종양을 작은 크기로 퇴화시켰다. 처리는 35일째부터 유예되었으며, 3 mg/kg 그룹의 종양은 5-6주 모니터링 후에 명백한 재성장을 보이지 않았지만, 2 mg/kg 그룹의 종양은 명백한 재성장을 보였으며 투여를 재개할 때 유의한 종양 억제를 보이지 않았다. 당해 연구에서, 마우스는 체중을 잘 유지하였다.
연구 10. Balb /c 누드 마우스에서 LU -01-0251 PDX 모델에서의 BCY6136의 생 체내 효능 연구
(a) 연구 목적
연구의 목적은 Balb/c 누드 마우스에서 LU-01-0251 PDX 모델에서의 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00073
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 LU-01-0251의 종양 단편 (~30 mm3)을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 효능 연구를 위해 평균 종양 용적이 174 mm3에 도달할 때 치료를 시작하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(ii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00074
(d) 결과
(i) 체중 변화 및 종양 성장 곡선
체중 변화 및 종양 성장 곡선은 도 9에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
LU-01-0251 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 처리 시작 후 28일째의 평균 종양 용적이 표 26에 나타내어져 있다.
[표 26] 시간에 따른 종양 용적 추적
Figure pct00075
(iii) 종양 성장 억제 분석
LU-01-0251 PDX 모델에서 BCY6136 및 ADC에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 28일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 27] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00076
a. 평균 ± SEM.; b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, LU-01-0251 PDX 모델에서 BCY6136 및 ADC의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 9 및 표 26과 27에 나타내어져 있다.
당해 연구에서, 비히클 처리된 마우스의 평균 종양 용적은 처리 시작 후 28일째에 2208 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg, qw (TV=499 mm3, TGI=84.0%, p<0.001), 2 mg/kg, qw (TV=32 mm3, TGI=107.0%, p<0.001) 및 3 mg/kg, qw (TV=0 mm3, TGI=108.6%, p<0.001)의 BCY6136은 용량-의존적 항종양 활성을 생성하였다. 3 mg/kg, qw의 ADC (TV=39 mm3, TGI=106.6%, p<0.001)는 유의한 항종양 활성을 보였다.
연구 11: Balb /c 누드 마우스에서 LU -01-0251 PDX 모델에서의 BCY6136의 생체내 효능 연구
(a) 연구 목적
연구의 목적은 Balb/c 누드 마우스에서 LU-01-0251 PDX 모델에서의 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00077
a. 투여 스케줄을 이 그룹의 모든 마우스에 대해 0일부터 70일까지 유지한 다음 마우스 3-2 및 마우스 3-4는 77일부터 BCY6136 3 mg/kg qw을 추가로 투여한 반면 다른 3마리 마우스의 처리는 유예하였다. 투여 스케줄을 이 그룹의 모든 마우스에 대해 0일부터 56일까지 유지하였다.
b. 투여 스케줄을 이 그룹의 모든 마우스에 대해 0일부터 70일까지 유지하였다.
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 LU-01-0251의 종양 단편 (~30 mm3)을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 효능 연구를 위해 평균 종양 용적이 960 mm3에 도달할 때 처리를 시작하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(ii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00078
(iii) 샘플 수집
마우스 #3-2의 종양은 94일째에 FFPE를 위해 수집하였다. 마우스 #5-2 및 5-3의 종양은 140일째에 수집하여 1 FFPE 블록에 끼워 넣었다.
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 10에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
LU-01-0251 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 처리 시작 후 0일 내지 28일의 평균 종양 용적이 표 28에 나타내어져 있다.
[표 28] 시간에 따른 종양 용적 추적
Figure pct00079
(iii) 종양 성장 억제
LU-01-0251 PDX 모델에서 BCY6136 및 ADC에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 17일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 29] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00080
a. 평균 ± SEM;
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, LU-01-0251 PDX 모델에서 BCY6136 및 ADC의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 10 및 표 28과 29에 나타내어져 있다.
당해 연구에서, 평균 종양 용적이 960 mm3에 도달할 때 처리를 시작하였다. 처리 시작 후 17일째에, 비히클 처리된 마우스의 평균 종양 용적은 2301 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg qw의 BCY6136 (TV=1672 mm3, TGI=47.0%, p＞0.05)은 명백한 항종양 활성을 보이지 않았고; 2 mg/kg qw (TV=398 mm3, TGI=142.1%, p<0.001) 및 3 mg/kg qw (TV=216 mm3, TGI=155.6%, p<0.001)의 BCY6136은 17일째에 용량-의존적 항종양 활성을 생성하였다.
2 mg/kg qw의 BCY6136으로 70일 처리 후, 이들 마우스 5마리 중 3마리는 완전 종양 퇴화를 보였고, 나머지 2마리 마우스는 42일부터 77일까지 명백한 종양 재발을 보였다. 그후 7일부터 두 개의 재발 종양에 대해 BCY6136 3 mg/kg qw로의 추가의 처리를 수행하였으며, 종양 중 하나는 명백한 종양 퇴화를 보인 반면 다른 하나는 처리에 대해 내성을 보였다.
3 mg/kg qw의 BCY6136으로 56일 처리 후, 이 그룹의 모든 마우스는 완전 종양 퇴화를 보였다.
3 mg/kg qw의 ADC (TV=1143 mm3, TGI=86.3%, p<0.01)는 17일째에 명백한 항종양 활성을 보였으며, 또 다른 53일간의 처리 후, 이들 마우스는 추가의 종양 퇴화를 보였지만 완전한 종양 퇴화는 보이지 않았다.
당해 연구에서, 일부 마우스는 갑작스러운 체중 감소를 보였으며, 이것은 면역-결핍 마우스의 장기간 급식과 관련이 있을 수 있다.
연구 12: Balb /c 누드 마우스에서 LU -01-0046 NSCLC PDX 모델에서의 BCY6136의 생체내 효능 연구
(a) 연구 목적
연구의 목적은 Balb/c 누드 마우스에서 거대 LU-01-0046 PDX 종양에서의 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00081
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 LU-01-0046의 종양 단편 (~30 mm3)을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 1039 mm3에 도달할 때 처리를 시작하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(ii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00082
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 11에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
LU-01-0046을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적은 표 30에 나타내어져 있다.
[표 30] 시간에 따른 종양 용적 추적 ( BCY 섹션)
Figure pct00083
(iii) 종양 성장 억제 분석
LU-01-0046 PDX 모델에서 시험 물품에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 두 개의 섹션 연구에 대해 각각 22일째 및 28일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 31] 종양 성장 억제 분석 (22일째의 BCY 섹션)
Figure pct00084
a. 평균 ± SEM;
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹의 평균 종양 용적을 대조 그룹의 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
*일부 그룹은 22일차 전에 종결되었고, 종양 크기는 아래와 같이 지수 성장 방정식 획득 (equation acquisition)에 의해 계산되었다:
비히클 그룹: Y = 995.4 × exp (0.1134 × X).
BCY6136, 1mpk 그룹: Y = 855.0 × exp (0.0974 × X).
ADC, 3mpk 그룹: Y = 757.4 × exp (0.1312 × X).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, 거대 LU-01-0046 종양에서 시험 물품의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 11 및 표 30과 31에 나타내어져 있다.
당해 연구에서, 비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 22일차에 6186 mm3로서 계산되었다. 1 mg/kg의 BCY6136 및 3mg/kg의 ADC는 1000mm3의 종양 크기로부터 처리를 시작하였을 때 명백한 항종양 활성을 보이지 않았다.
3 mg/kg의 BCY6136 (TV=233 mm3, TGI=115.6%, p<0.001)은 유의한 항종양 활성을 생성하였다. 특히, BCY6136은 2/5 및 4/5 종양을 완전히 근절하였다.
연구 13: LU -01-0046 NSCLC PDX 모델을 갖는 Balb /c 누드 마우스에서의 BCY6136의 생체내 효능
(a) 연구 목적
연구의 목적은 LU-01-0046 NSCLC PDX 모델을 갖는 Balb/c 누드 마우스에서 BCY6136의 생체내 치료 효능을 평가하는 것이었다.
(b) 실험 설계
Figure pct00085
참고: 그룹은 평균 종양 용적이 2000 mm3 이상에 도달할 때 종료하였으며 종양을 FFPE를 위해 수확하였다: PG-D14의 그룹 1, PG-D18의 그룹 5, PG-D21의 그룹 2 & 6 및 PG-D31의 그룹 3 & 4.
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 특정 종류의 종양 단편 (~30 mm3)을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 대략 198 mm3에 도달할 때 처리를 시작하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(ii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00086
참고 : 투여 제형은 자주 적기에 신선하게 제조된다.
(iii) 샘플 수집
그룹은 평균 종양 용적이 2000 mm3 이상에 도달할 때 종료하였으며 마지막 측정 후 FFPE를 위해 종양을 수확하였다: PG-D14의 그룹 1, PG-D18의 그룹 5, PG-D21의 그룹 2 & 6 및 PG-D31의 그룹 3 & 4.
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 12에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
LU-01-0046 NSCLC PDX 모델을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적은 표 32에 나타내어져 있다.
[표 32] 시간에 따른 종양 용적 추적 ( mm 3 )
Figure pct00087
(iii) 종양 성장 억제 분석
LU-01-0046 PDX 모델을 갖는 Balb/c 누드 마우스에서 시험 물품에 대한 종양 성장 억제율은 PG-D14에 측정된 종양 용적에 기초하여 계산하였다.
[표 33] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00088
a. 평균 ± SEM;
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
c. TGI는 각 그룹에 대해 식을 사용하여 계산하였다: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)]×100
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, LU-01-0046 PDX 모델에서의 시험 물품의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 12 및 표 32와 33에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 PG-D14에서 2307 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg (TV=1058 mm3, TGI=59.1%, p<0.05), 2 mg/kg (TV=264 mm3, TGI=97.0%, p<0.001) 및 3 mg/kg (TV=26 mm3, TGI=108.3%, p<0.001)의 BCY6136은 용량-의존적 항종양 활성을 생성하였다. 3 mg/kg 및 5 mg/kg의 ADC는 명백한 항종양 활성을 보이지 않았다 (p>0.05).
당해 연구에서, 그룹의 동물 모두는 체중을 잘 유지하였다.
연구 14: Balb /c 누드 마우스에서 LU -01-0046 NSCLC PDX 모델에서의 BCY6136, BCY6173 및 BCY6175의 생체내 효능 연구
(a) 연구 목적
연구의 목적은 Balb/c 누드 마우스에서 LU-01-0046 NSCLC PDX 모델에서의 시험 물품의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00089
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 LU-01-0046의 종양 단편 (~30 mm3)을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 파트 1 연구의 경우 200 mm3 및 파트 2 연구의 경우 192 mm3에 도달할 때 처리를 시작하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(ii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00090
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 13 내지 15에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
LU-01-0046을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 처리 시작 후 21일째의 평균 종양 용적은 표 34 및 35에 나타내어져 있다.
[표 34] 시간에 따른 종양 용적 추적 ( 파트 1)
Figure pct00091
[표 35] 시간에 따른 종양 용적 추적 ( 파트 2)
Figure pct00092
(iii) 종양 성장 억제 분석
LU-01-0046 PDX 모델에서 시험 물품에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 21일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 36] 종양 성장 억제 분석 ( 파트 1)
Figure pct00093
a. 평균 ± SEM; b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
[표 37] 종양 성장 억제 분석 ( 파트 2)
Figure pct00094
a. 평균 ± SEM; b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, LU-01-0046 PDX 모델에서의 시험 물품의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 13 내지 15 및 표 34 내지 37에 나타내어져 있다.
파트 1 연구에서, 비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 처리 시작 후 21일째에 2551 mm3에 도달하였다.
1/2 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV=1285 mm3, TGI=53.9%, p<0.001)은 유의한 항종양 활성을 생성하였지만 어떠한 종양 퇴화도 나타내지 않았다. 3 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV=0 mm3, TGI=108.5%, p<0.001)은 종양을 완전히 근절하였으며, BCY6136 3 mg/kg 그룹에서 각각 5개 종양 중 1개는 투여 유예 후 재성장을 보였으며 투여를 재개하였을 때 종양은 BICY6136 처리에 내성이 있었다. BCY6136 그룹의 남은 종양 (각 그룹에 대해 4/5)은 80일의 투여 유예 후 재성장을 보이지 않았다.
파트 2 연구에서, 비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 처리 시작 후 21일째에 2342 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg, qw의 BCY6173 (TV=2151 mm3, TGI=8.9%, p＞0.05)은 항종양 활성을 보이지 않았다. 3 mg/kg, qw의 BCY6173 (TV=890 mm3, TGI=67.5%, p<0.05)은 명백한 항종양 활성을 생성하였다.
3 mg/kg, qw의 BCY6175 (TV=0 mm3, TGI=108.9%, p<0.001)는 14일째에 4/5 종양을 완전히 근절하였다.
연구 15: Balb /c 누드 마우스에서 LU -01-0412 NSCLC PDX 모델에서의 BCY6136의 생체내 효능 연구
(a) 연구 목적
프로젝트의 목적은 BALB/c 누드 마우스에서 LU-01-0412 NSCLC PDX 모델에서의 BCY6136의 생체내 치료 효능을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00095
(c ) 실험 방법 및 절차
(i) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 LU-01-0412 종양 단편 (~30 mm3)을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 159 mm3에 도달할 때 동물을 무작위화하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(ii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00096
(iii) 샘플 수집
비히클 및 BCY6136, BCY8245 및 BCY8781로 처리된 3마리 여분의 마우스로부터의 혈장을 투여 후 30분 및 24시간에 수집하였다. 비히클 및 BCY6136, BCY8245 및 BCY8781로 처리된 3마리 여분의 마우스로부터의 종양을 투여 후 24시간에 수집하였다.
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 16에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
LU-01-0412 이종이식편을 갖는 암컷 BALB/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적은 표 38에 나타내어져 있다.
[표 38] 시간에 따른 종양 용적 추적
Figure pct00097
(iii) 종양 성장 억제 분석
LU-01-0412 이종이식 모델에서 BCY6136, BCY8245 및 BCY8781에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 32일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 39] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00098
a. 평균 ± SEM;
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, LU-01-0412 이종이식 모델에서의 BCY6136, BCY8245 및 BCY8781의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 16 및 표 38과 39에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 용적은 처리 시작 후 32일째에 1104 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg, qw*4 (TV=758 mm3, TGI=36.7%, p<0.05) 및 3 mg/kg, qw*4 (TV=416 mm3, TGI=72.9%, p<0.001)의 BCY6136은 용량-의존적 항종양 활성을 생성하였지만 어떠한 종양 퇴화도 보이지 않았다. 3 mg/kg, qw*4의 BCY8245 (TV=1 mm3, TGI=116.8%, p<0.001) 및 3 mg/kg, qw*4의 BCY8781 (TV=12 mm3, TGI=115.6%, p<0.001)은 명백히 종양을 퇴화시켰다. 이들 중에서, BCY8245 3 mg/kg로 처리된 6개 종양 중 5개 및 BCY8781 3 mg/kg으로 처리된 6개 종양 중 2개는 32일차에 완전히 근절되었다.
당해 연구에서, 모든 그룹의 동물은 체중을 잘 유지하였다.
연구 16: Balb /c 누드 마우스에서 LU -01-0486 PDX 모델의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 효능 연구
(a) 연구 목적
연구의 목적은 Balb/c 누드 마우스에서 LU-01-0486 PDX 모델에서의 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00099
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 LU-01-0486의 종양 단편 (~30 mm3)을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 효능 연구를 위해 평균 종양 용적이 180 mm3에 도달할 때 처리를 시작하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(ii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00100
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 17에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
LU-01-0486 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 처리 시작 후 14일째의 평균 종양 용적은 표 40에 나타내어져 있다.
[표 40] 시간에 따른 종양 용적 추적
Figure pct00101
(iii) 종앙 성장 억제 분석
LU-01-0486 PDX 모델에서 BCY6136에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 14일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 41] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00102
a. 평균 ± SEM; b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, LU-01-0486 PDX 모델에서의 BCY6136의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 17 및 표 40과 41에 나타내어져 있다.
당해 연구에서, 비히클 처리된 마우스의 평균 종양 용적은 처리 시작 후 14일째에 651 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg, qw (TV=638 mm3, TGI=3.0%, p＞0.05) 및 2 mg/kg, qw (TV=645 mm3, TGI=1.2%, p＞0.05)의 BCY6136은 어떠한 항종양 활성도 보이지 않았다. 3 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV=449 mm3, TGI=43.1%, p＞0.05)은 통계적 유의성 없이 약간의 항종양 활성을 생성하였다.
연구 17: Balb /c 누드 마우스에서 MDA -MB-231-luc 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 효능 시험
(a) 연구 목적
연구의 목적은 Balb/c 누드 마우스에서 MDA-MB-231-luc 이종이식 모델의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이었다.
(b) 실험 설계
Figure pct00103
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 세포 배양
지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
(ii) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 0.1ml의 PBS 중의 MDA-MB-231-luc 종양 세포 (10×10^6)와 0.1 ml 매트리겔을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 159 mm3에 도달할 때 36마리 동물을 무작위화하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(iii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00104
(iv) 샘플 수집
PG-D33에, 우리는 FFPE를 위해 그룹 2의 종양을 수집하고 고정시켰다.
연구의 말기에, 우리는 FFPE를 위해 그룹 3 및 4의 종양을 수집하고 고정시켰다.
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장은 도 18에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
MDA-MB-231-luc 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적은 표 42 내지 44에 나타내어져 있다.
[표 42] 종양 용적 추적 ( PG -D0~ PG -D17)
Figure pct00105
[표 43] 종양 용적 추적 ( PG -D19~ PG -D33)
Figure pct00106
[표 44] 종양 용적 추적 ( PG -D35~ PG -D47)
Figure pct00107
(iii) 종양 성장 억제 분석
MDA-MB-231-luc 이종이식 모델에서 BCY6136에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 21일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 45] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00108
a. 평균 ± SEM.
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, MDA-MB-231-luc 이종이식 모델에서의 BCY6136의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 18 및 표 42 내지 45에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 21일째에 1661 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg의 BCY6136 (TV=994 mm3, TGI=44.4%, p<0.01)은 중간 정도의 항종양 활성을 보였으며, 2 mg/kg (TV=33 mm3, TGI=108.4%, p<0.001) 및 3 mg/kg (TV=132 mm3, TGI=101.1%, p<0.001)의 BCY6136은 강력한 항종양 활성을 생성하였지만 종양이 28일째부터 명백한 재성장을 보였다.
당해 연구에서, BCY6136 2 mg/kg으로 처리된 한 마리의 마우스는 처리 스케줄 동안 체중이 15% 이상 감소하였고, 다른 마우스는 체중을 잘 유지하였다.
연구 18: BALB /c 마우스에서 EMT -6 공통유전자 모델의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 효능 시험
(a) 연구 목적
연구의 목적은 BALB/c 마우스에서 EMT-6 공통유전자 모델의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이었다.
(b) 실험 설계
Figure pct00109
a. 각 마우스의 주사 용적은 10 ml/kg이다.
b. 그룹 3 및 그룹 4의 투여량은 14일째부터 5 mpk 및 3 mpk로 변경하였다.
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 세포 배양
EMT-6 종양 세포를 공기 중 5% CO2의 대기에서 37℃에서 10% 열 불활성화 태아 소 혈청이 보충된 EMEM 배지에서 단일층 배양물로서 시험관내 유지시켰다. 종양 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 매주 2회 일상적으로 계대배양하였다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
(ii) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 0.1ml의 PBS 중의 EMT-6 종양 세포 (5 x 106)를 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 75 mm3에 도달할 때 44마리 동물을 무작위화하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(iii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00110
Figure pct00111
(iv) 샘플 수집
여분 마우스로부터의 3개의 종양을 11일째에 FACS를 위해 수집하였다. 데이터는 생물학 팀에 의해 공급되었다.
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 19에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
EMT-6 공통유전자를 갖는 암컷 BALB/c 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적은 표 46에 나타내어져 있다.
[표 46] 시간에 따른 종양 용적 추적
Figure pct00112
그룹 3 및 그룹 4의 투여량을 14일째부터 5 mpk 및 3 mpk로 변경하였다.
(iii) 종양 성장 억제 분석
EMT-6 공통유전자 모델에서 BCY6136에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 21일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 47] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00113
a. 평균 ± SEM.
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
c. 그룹 3 및 그룹 4의 투여량은 14일째부터 5 mpk 및 3 mpk로 변경되었다.
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, EMT-6 공통유전자 모델에서의 BCY6136의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 19 및 표 46과 47에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 21일째에 1499 mm3에 도달하였다. 3 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV=561 mm3, TGI=66.2%, p<0.05)은 명백한 항종양 활성을 보였다. 1/5 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV=1272 mm3, TGI=16.1%, p>0.05) 및 0.3/3 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV=1394 mm3, TGI=7.4%, p>0.05)은 어떠한 항종양 활성도 보이지 않았다.
그룹 3 및 그룹 4의 투여량을 14일부터 5 mpk 및 3 mpk로 변경하였다. 14일째에 마우스 3-5에서 종양 궤양이 발견되었으며, 마우스에 항생제 크림을 발라 주었다.
당해 연구에서, 모든 마우스는 체중을 잘 유지하였다.
연구 19: Balb /c 누드 마우스에서 NCI-N87 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 효능 연구
(a) 연구 목적
연구의 목적은 Balb/c 누드 마우스에서 NCI-N87 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00114
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 세포 배양
NCI-N87 종양 세포를 공기 중 5% CO2의 대기에서 37℃에서 10% 열 불활성화 태아 소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지시켰다. 종양 세포를 매주 2회 일상적으로 계대배양하였다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
(ii) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 0.2ml의 PBS 중의 NCI-N87 종양 세포 (10 x 106)와 매트리겔 (1:1)을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 176 mm3에 도달할 때 동물을 무작위화하고 처리를 시작하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(iii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00115
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 20에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
NCI-N87 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적은 표 48에 나타내어져 있다.
[표 48] 시간에 따른 종양 용적 추적
Figure pct00116
(iii) 종양 성장 억제 분석
NCI-N87 이종이식편에서 BCY6136에 대한 종앙 성장 억제율은 처리 시작 후 30일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 49] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00117
a. 평균 ± SEM.
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, NCI-N87 모델에서의 BCY6136의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 20 및 표 48과 49에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 30일째에 1465 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg, qw (TV=425 mm3, TGI=80.7%, p<0.001) 및 2 mg/kg, qw (TV=210 mm3, TGI=97.4%, p<0.001)의 BCY6136은 용량-의존적 방식으로 유의한 항종양 활성을 생성하였으며, 3 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV=201 mm3, TGI=98.1%, p<0.001)은 2 mpk의 BCY6136과 필적하는 항종양 활성을 보였다.
당해 연구에서, 처리 스케줄 동안 모든 그룹에서 명백한 체중 감소는 발견되지 않았다.
연구 20: Balb /c 누드 마우스에서 SK- OV -3 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 효능 연구
(a) 연구 목적
연구의 목적은 Balb/c 누드 마우스에서 SK-OV-3 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00118
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 세포 배양
SK-OV-3 종양 세포를 공기 중 5% CO2의 대기에서 37℃에서 10% 열 불활성화 태아 소 혈청이 보충된 McCoy's 5a 배지에서 유지시켰다. 종양 세포를 매주 2회 일상적으로 계대배양하였다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
(ii) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 0.2ml의 PBS 중의 SK-OV-3 종양 세포 (10 x 106)와 매트리겔 (1:1)을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 대략 186 mm3에 도달할 때 동물을 무작위화하고 처리를 시작하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(iii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00119
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 21에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
SK-OV-3 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적은 표 50에 나타내어져 있다.
[표 50] 시간에 따른 종양 용적 추적
Figure pct00120
(iii) 종양 성장 억제 분석
SK-OV-3 이종이식편에서 BCY6136에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 28일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 51] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00121
a. 평균 ± SEM.
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, SK-OV-3 모델에서의 BCY6136의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 21 및 표 50과 51에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 28일째에 1560 mm3에 도달하였다. 3 mg/kg, qw의 ADC (TV=684 mm3, TGI=63.8%, p<0.01)는 중간 정도의 항종양 효능을 보였다. 1 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV=1035 mm3, TGI=38.1%, p>0.05)은 명백한 항종양 활성을 보이지 않았다. 2 mg/kg, qw (TV=277 mm3, TGI=93.3%, p<0.001) 및 3 mg/kg, qw (TV=254 mm3, TGI=95.0%, p<0.001)의 BCY6136는 유의한 항종양 활성을 생성하였다.
당해 연구에서, 처리 스케줄 동안 모든 그룹에서 명백한 체중 감소는 발견되지 않았다.
연구 21: Balb /c 누드 마우스에서 OE21 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 효능 연구
(a) 연구 목적
연구의 목적은 Balb/c 누드 마우스에서 OE21 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 항종양 효율을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00122
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 세포 배양
OE21 종양 세포를 공기 중 5% CO2의 대기에서 37℃에서 10% 열 불활성화 태아 소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지시켰다. 종양 세포를 매주 2회 일상적으로 계대배양하였다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
(ii) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 0.2ml의 PBS 중의 OE21 종양 세포 (5 x 106)와 매트리겔 (1:1)을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 대략 157 mm3에 도달할 때 동물을 무작위화하고 처리를 시작하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(iii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00123
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 22에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
OE21 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적은 표 52에 나타내어져 있다.
[표 52] 시간에 따른 종양 용적 추적
Figure pct00124
(iii) 종양 성장 억제 분석
OE21 이종이식편에서 BCY6136에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 23일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 53] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00125
a. 평균 ± SEM.
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, OE21 모델에서의 BCY6136의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 22 및 표 52와 53에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 23일째에 1586 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg, qw의 BCY6136 (TV= 1155 mm3, TGI = 30.4% p<0.05)은 약간의 항종양 활성을 보였다. 2 mg/kg, qw (TV=537 mm3, TGI=73.4%, p<0.001) 및 3 mg/kg, qw (TV=489 mm3, TGI=76.7%, p<0.001)의 BCY6136은 유의한 항종양 활성을 생성하였다. 당해 연구에서, 처리 스케줄 동안 모든 그룹에서 명백한 체중 감소는 발견되지 않았다.
연구 22: CB17- SCID 마우스에서 MOLP -8 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 효능 시험
(a) 연구 목적
연구의 목적은 CB17-SCID 마우스에서 MOLP-8 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY6136의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이다.
(b) 실험 설계
Figure pct00126
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 세포 배양
MOLP-8 종양 세포를 공기 중 5% CO2의 대기에서 37℃에서 20% 열 불활성화 태아 소 혈청이 보충된 RMPI-1640 배지에서 단일층 배양물로서 시험관내에 유지시켰다. 종양 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 일상적으로 계대배양하였다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
(ii) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 0.2ml PBS 중의 MOLP-8 종양 세포 (10 x 106)와 50% 매트리겔을 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 용적이 141 mm3에 도달할 때 36마리 동물을 무작위화하였다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(iii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00127
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 23에 나타내어져 있다.
(ii) 종양 용적 추적
MOLP-8 이종이식편을 갖는 암컷 CB17-SCID 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적은 표 54에 나타내어져 있다.
[표 54] 시간에 따른 종양 용적 추적
Figure pct00128
(iii) 종양 성장 억제 분석
MOLP-8 이종이식 모델에서 BCY6136에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 14일째의 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 55] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00129
a. 평균 ± SEM.
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, MOLP-8 이종이식편에서의 BCY6136의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 처리 그룹의 측정된 종양 용적은 도 23 및 표 54와 55에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 14일째에 2528 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg (TV=1146 mm3, TGI=45.5%, p>0.05), 2 mg/kg (TV=1218 mm3, TGI=54.9%, p<0.05) 및 3 mg/kg (TV=938 mm3, TGI=66.7%, p<0.01)의 BCY6136은 용량-의존적 항종양 활성을 생성하였지만, 모든 투여량이 MOLP-8 이종이식편에서 종양을 퇴화시키지는 않았다. 당해 연구에서, 마우스 모두는 체중을 잘 유지하였다.
연구 23: BALB /c 누드 마우스에서 HT1080 이종이식편의 치료에 있어서의 BCY의 생체내 효능 시험
(a) 연구 목적
연구의 목적은 BALB/c 누드 마우스에서 HT1080 이종이식 모델의 치료에 있어서의 BCY의 생체내 항종양 효능을 평가하는 것이었다.
(b) 실험 설계
Figure pct00130
참고: n: 동물 수; 투여 용적: 체중에 기초하여 투여 용적을 10 μl/g 조절함.
(c) 실험 방법 및 절차
(i) 세포 배양
HT1080 종양 세포를 공기 중 5% CO2의 대기에서 37℃에서 10% 열 불활성화 태아 소 혈청이 보충된 배지에서 유지시킬 것이다. 종양 세포를 매주 2회 일상적으로 계대배양할 것이다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수할 것이다.
(ii) 종양 접종
각각의 마우스에게 종양 발달을 위해 HT1080 종양 세포 (5*106)를 오른쪽 옆구리에 피하로 접종할 것이다. 평균 종양 용적이 대략 150-200 mm3에 도달할 때 동물을 무작위화하고 처리를 시작할 것이다. 각 그룹의 시험 물품 투여 및 동물 수는 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
(iii) 시험 물품 제형 제조
Figure pct00131
(d) 결과
(i) 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선은 도 24 내지 29에 도시되어 있다.
(ii) 종양 용적 추적
HT1080 이종이식편을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 용적은 표 56에 나타내어져 있다.
[표 56] 시간에 따른 종양 용적 추적
Figure pct00132
Figure pct00133
(iii) 종양 성장 억제 분석
HT1080 이종이식 모델에서 BCY에 대한 종양 성장 억제율은 처리 시작 후 14일째에 종양 용적 측정에 기초하여 계산하였다.
[표 57] 종양 성장 억제 분석
Figure pct00134
a. 평균 ± SEM.
b. 종양 성장 억제는 처리된 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적을 대조 그룹에 대한 그룹 평균 종양 용적으로 나눔으로써 계산된다 (T/C).
(e) 결과 요약 및 논의
당해 연구에서, HT1080 이종이식 모델에서의 BCY의 치료 효능을 평가하였다. 다양한 시점에서 모든 치료 그룹의 측정된 종양 용적은 도 24 내지 29 및 표 56과 57에 나타내어져 있다.
비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 14일째에 1737 mm3에 도달하였다. 1 mg/kg, qw (TV=1074 mm3, TGI=42.5%, p>0.05), 2 mg/kg, qw (TV=480 mm3, TGI=80.6%, p<0.05) 및 3 mg/kg, qw (TV=7 mm3, TGI=108.4%, p<0.01)의 BCY6173은 용량-의존적 항종양 활성을 생성하였다.
1 mg/kg, qw (TV=871 mm3, TGI=55.5%, p<0.01), 2 mg/kg, qw (TV=62 mm3, TGI=107.5%, p<0.001) 및 3 mg/kg, qw (TV=44 mm3, TGI=108.6%, p<0.001)의 BCY6135는 용량-의존적 항종양 활성을 생성하였다.
2 mg/kg, qw (TV=345 mm3, TGI=95.7%, p<0.001), 3 mg/kg, qw (TV=3 mm3, TGI=111.2%, p<0.001) 및 5 mg/kg, qw (TV=2 mm3, TGI=111.3%, p<0.001)의 BCY6136은 강력한 항종양 활성을 보였다.
1 mg/kg, qw (TV=1066 mm3, TGI=43.1%, p<0.05), 2 mg/kg, qw (TV=532 mm3, TGI=77.3%, p<0.01) 및 3 mg/kg, qw (TV=11 mm3, TGI=110.7%, p<0.001)의 BCY6174는 용량-의존적 항종양 활성을 생성하였다.
1 mg/kg, qw (TV=769 mm3, TGI=62.1%, p<0.01), 2 mg/kg, qw (TV=295 mm3, TGI=92.5%, p<0.001) 및 3 mg/kg, qw (TV=11 mm3, TGI=110.8%, p<0.001)의 BCY6175는 용량-의존적 항종양 활성을 생성하였다.
3 mg/kg, qw의 ADC (TV=0 mm3, TGI=111.5%)는 14일까지 종양을 완전히 근절하였다.
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Claims (21)

  1. 적어도 두 개의 루프 서열(loop sequence)에 의해 분리된 적어도 세 개의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드 및, 적어도 두 개의 폴리펩티드 루프가 비-방향족 분자 스캐폴드(non-aromatic molecular scaffold) 상에 형성되도록 폴리펩티드의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 비-방향족 분자 스캐폴드를 포함하는 EphA2에 특이적인 펩티드 리간드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서,
    여기서 펩티드 리간드는 다음의 아미노산 서열을 포함하고:
    Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (서열 번호 1);
    여기서 HyP는 하이드록시프롤린이고, HArg는 호모아르기닌이고, Ci, Cii 및 Ciii은 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 나타내는 펩티드 리간드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  2. 제1항에 있어서, 분자 스캐폴드가 1,1',1''-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온 (TATA)인 펩티드 리간드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드 리간드가 다음의 아미노산 서열을 포함하고:
    (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (서열 번호 2) (BCY6099);
    여기서 Sar은 사르코신이고, HArg는 호모아르기닌이고 HyP는 하이드록시프롤린인 펩티드 리간드.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 염이 유리 산 또는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄 염으로부터 선택되는 펩티드 리간드.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, EphA2가 인간 EphA2인 펩티드 리간드.
  6. 하나 이상의 이펙터(effector) 및/또는 관능 그룹(functional group), 예를 들어 세포독성제에 접합된, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드 리간드를 포함하는 약물 접합체(drug conjugate).
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포독성제가 DM1 또는 MMAE로부터 선택되는 약물 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 세포독성제가 MMAE로부터 선택되는 약물 접합체.
  9. 제6항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 리간드와 상기 세포독성제 사이에 링커를 추가로 포함하는 약물 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포독성제가 MMAE이고 링커가 -Val-Cit-, -Trp-Cit-, -Val-Lys-, -D-Trp-Cit-, -Ala-Ala-Asn-, D-Ala-Phe-Lys- 또는 -Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-Tyr-Leu- (서열 번호 3)로부터 선택되는 약물 접합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포독성제가 MMAE이고 링커가 -Val-Cit-인 약물 접합체.
  12. 제9항에 있어서, 상기 세포독성제가 DM1이고 링커가 -S-S-, -SS(SO3H)-, -SS-(Me)-, -(Me)-SS-(Me)-, -SS-(Me2)- 또는 -SS-(Me)-SO3H-로부터 선택되는 약물 접합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포독성제가 DM1이고 링커가 -S-S- 및 -SS(SO3H)-로부터 선택되는 약물 접합체.
  14. 제6항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, BCY6027, BCY6028, BCY61535, BCY6136, BCY6173, BCY6174 및 BCY6175 중의 어느 하나로부터 선택되는 약물 접합체.
  15. 제14항에 있어서, BCY6031, BCY6033, BCY6082, BCY6135, BCY6136, BCY6173, BCY6174 및 BCY6175 중의 어느 하나로부터 선택되는 약물 접합체.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, BCY6136인 약물 접합체.
  17. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 펩티드 리간드 또는 제6항 내지 제16항 중의 어느 한 항의 약물 접합체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 제6항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 질환이 있는 조직에서 EphA2의 과발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 예방, 억제 또는 치료하는데 사용하기 위한 약물 접합체.
  19. 제6항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 암을 예방, 억제 또는 치료하는데 사용하기 위한 약물 접합체.
  20. 제19항에 있어서, 암이 전립선암, 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐 암종 (non-small cell lung carcinomas)(NSCLC)), 유방암 (예를 들어, 삼중 음성 유방암 (triple negative breast cancer)), 위암, 난소암, 식도암, 다발성 골수종 (multiple myeloma) 및 섬유육종 (fibrosarcoma)으로부터 선택되는 약물 접합체.
  21. 제6항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 약물 접합체를 이를 필요로 하는 환자 (여기서, 상기 환자는 EphA2의 증가된 카피 수 변화 (CNV)를 갖는 것으로 확인된다)에게 투여함을 포함하여, 암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법.
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