CN111787955A - 特异于EphA2的双环肽配体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽，所述多肽共价结合至非芳香族分子支架，从而使得两个或更多个肽环在与支架的附着点之间彼此相对。具体而言，本发明描述了作为Eph受体酪氨酸激酶A2(EphA2)的高亲和力结合物的肽。本发明还包括药物缀合物，其包含缀合至一个或多个效应物和/或官能团的所述肽，涉及药物组合物，其包含所述肽配体和药物缀合物，以及涉及所述肽配体和药物缀合物在预防、抑制或治疗疾病或病症中的用途，所述疾病或病症的特征在于在患病组织(比如肿瘤)中过度表达EphA2。

Description

特异于EphA2的双环肽配体
技术领域
本发明涉及多肽，所述多肽与非芳香族分子支架共价结合从而使得两个或更多个肽环在与支架的附着点之间彼此相对(subtend)。具体而言，本发明描述了作为Eph受体酪氨酸激酶A2(EphA2)的高亲和力结合物的肽。本发明还包括药物缀合物，其包含与一个或多个效应物和/或官能团缀合的所述肽，涉及药物组合物，其包含所述肽配体和药物缀合物，以及涉及所述肽配体和药物缀合物在预防、抑制或治疗疾病或病症中的用途，所述疾病或病症的特征在于在患病组织(比如肿瘤)中过度表达EphA2。
背景技术
环肽能够以高亲和力和靶标特异性结合蛋白靶标，因此对于开发治疗剂是有吸引力的分子类别。实际上，临床上已经成功使用了几种环肽，例如抗菌肽万古霉素、免疫抑制剂药物环孢霉素或抗癌药奥曲肽(Driggers等人(2008)，Nat Rev Drug Discov 7(7)，608-24)。良好的结合特性是由于肽和靶标之间形成的相对大的相互作用表面以及环结构的构象柔韧性降低。通常，大环结合至数百平方埃的表面，例如环肽CXCR4拮抗剂CVX15(
Figure BDA0002637477470000011
Wu等人(2007)，Science 330，1066-71)、与整联蛋白αVb3
Figure BDA0002637477470000012
结合的具有Arg-Gly-Asp基序的环肽(Xiong等人(2002)，Science 296(5565)，151-5)或与尿激酶型纤溶酶原激活剂结合的环肽抑制剂upain-1(
Figure BDA0002637477470000013
Zhao等人(2007)，J Struct Biol 160(1)，1-10)。
由于其环状构型，肽大环比线性肽的柔韧性差，导致与靶标结合时的熵损失较小，并导致更高的结合亲和力。与线性肽相比，降低的柔韧性还导致锁定靶标特异性构象，增加结合特异性。这种作用已通过基质金属蛋白酶8(MMP-8)的有效且选择性的抑制剂得到了例证，该抑制剂在开环时失去了对其他MMP的选择性(Cherney等人(1998)，J Med Chem 41(11)，1749-51)。通过大环化获得的有利的结合特性在具有多于一个肽环的多环肽中更为显著，例如在万古霉素、乳链菌肽和放线菌素中。
不同的研究团队先前已将具有半胱氨酸残基的多肽附着到合成的分子结构上(Kemp和McNamara(1985)，J.Org.Chem；Timmerman等人(2005)，ChemBioChem)。Meloen及其同事已使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速定量地环化到合成的支架上，以便在结构上模拟蛋白表面(Timmerman等人(2005)，ChemBioChem)。用于产生候选药物化合物的方法，其中通过将含半胱氨酸的多肽连接至分子支架而产生所述化合物，所述分子支架例如TATA(1,1',1″-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮；Heinis等人Angew Chem,Int Ed.2014；53:1602–1606)。
已经开发了基于噬菌体展示的组合方法来产生和筛选针对感兴趣靶标的双环肽的大文库(Heinis等人(2009)，Nat Chem Biol 5(7)，502-7和WO2009/098450)。简而言之，在噬菌体上展示线性肽的组合文库，所述线性肽包含三个半胱氨酸残基和两个区域的六个随机氨基酸(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)，并通过将半胱氨酸侧链共价连接至小分子支架而环化。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了EphA2特异性的肽配体、或其药学上可接受的盐，所述肽配体包含多肽以及非芳香族分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个半胱氨酸残基，所述分子支架与所述多肽的半胱氨酸残基形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环，其中肽配体包含氨基酸序列：
Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：1)；
其中HyP是羟基脯氨酸，HArg是高精氨酸，以及Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物缀合物，其包含与一个或多个效应物和/或官能团缀合的本文定义的肽配体。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的本文所定义的肽配体或药物缀合物。
根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的肽配体或药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗疾病或病症，所述疾病或病症的特征在于在患病组织(比如肿瘤)中过度表达EphA2。
附图说明
图1：展示制备双环药物缀合物(BDC)概念的总体示意图。
图2：HT1080异种移植小鼠中，BCY6136的平均肿瘤体积相对于时间的图。在第0和第7天施用剂量(2、3和5mg/kg)。
图3：NCI-H1975异种移植小鼠中，BCY6136的平均肿瘤体积相对于时间的图。在第0、7、14、21、28和35天施用剂量(1、2和3mg/kg)。
图4：MDA-MB-231异种移植小鼠中，BCY6136的平均肿瘤体积相对于时间的图。在第0、7、14、21、28、35和45天施用剂量(1、2和3mg/kg)。
图5和图6：对携带有PC-3异种移植物的雌性BALB/c裸鼠施用BCY6136(图5)和ADC(图6)后，对肿瘤体积的追踪。
图7：对携带有PC-3异种移植物的雄性Balb/c裸鼠施用BCY6136、EphA2-ADC或多西紫杉醇后，对肿瘤体积的追踪。
图8：对携带有NCI-H1975异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136后，对肿瘤体积的追踪。数据点代表组的平均肿瘤体积。
图9和图10：对携带有LU-01-0251异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136和ADC后，对肿瘤体积的追踪。
图11：对携带有LU-01-0046的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136后，对肿瘤体积的追踪。
图12：对携带有LU-01-0046NSCLC PDX模型的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136或ADC后，对肿瘤体积的追踪。
图13至图15：对携带有LU-01-0046的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136(图13)、BCY6173(图14)和BCY6175(图15)后，对肿瘤体积的追踪。
图16：对携带有LU-01-0412异种移植物的雌性BALB/c裸鼠施用BCY6136(在图16中称为BT5528)、BCY8245或BCY8781后，对肿瘤体积的追踪。数据点代表组的平均肿瘤体积。
图17：对携带有LU-01-0486异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136后，对肿瘤体积的追踪。
图18：对携带有MDA-MB-231-luc异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136后，对肿瘤体积的追踪。数据点代表组的平均肿瘤体积。
图19：对携带有EMT-6同基因的雌性BALB/c小鼠施用BCY6136后，对肿瘤体积的追踪。从第14天起，将第3组和第4组的剂量更改为5mpk和3mpk。
图20：对携带有NCI-N87异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136后，对肿瘤体积的追踪。
图21：对携带有SK-OV-3异种移植的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136后，对肿瘤体积的追踪。
图22：对携带有OE21异种移植物的雌性Balb/c裸鼠施用BCY6136后，对肿瘤体积的追踪。
图23：对携带有MOLP-8异种移植物的雌性CB17-SCID小鼠施用BCY6136后，对肿瘤体积的追踪。
图24至图29：对携带有HT1080异种移植物的雌性BALB/c裸鼠施用BCY6173(图24)、BCY6135(图25)、BCY6136(图26)、BCY6174(图27)、BCY6175(图28)和ADC(图29)后，对肿瘤体积的追踪。
当上图中出现误差条时，表示平均值的标准误差(SEM)。
具体实施方式
在一个实施方案中，肽配体包含氨基酸序列：
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)(BCY6099)；
其中，Sar是肌氨酸，HArg是高精氨酸，以及HyP是羟基脯氨酸。
在一个实施方案中，分子支架是1，1′，1″-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。
在其他实施方案中，分子支架是1，1′，1″-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)，以及肽配体包含氨基酸序列：
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)(BCY6099)；以及
其中Sar是肌氨酸，HArg是高精氨酸，以及HyP是羟基脯氨酸。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义，例如肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域。标准技术用于分子生物学、遗传和生化方法(参见Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2001年第三版，冷泉港实验室出版社，冷泉港NY；Ausubel等人，ShortProtocols in Molecular Biology(1999)，第4版，John Wiley&Sons，Inc)，其通过引用并入本文。
命名
编号
当提及本发明的肽中氨基酸残基位置时，从编号中省略半胱氨酸残基(Ci、Cii和Ciii)，因为它们不变；因此，本发明的肽中的氨基酸残基的编号参照如下：
-Ci-HyP1-L2-V3-N4-P5-L6-Cii-L7-H8-P9-(D-Asp)10-W11-(HArg)12-Ciii-(SEQ ID NO：1)。
出于描述的目的，假定所有双环肽都与1，1′，1″-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)环化，生成三取代的1，1′，1″-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-1-酮结构。与TATA的环化反应发生在Ci、Cii和Ciii上。
分子形式
双环核心序列的N或C端延伸添加到序列的左侧或右侧，并用连字符隔开。例如，N端(β-Ala)-Sar10-Ala尾将表示为：
(β-Ala)-Sar10-A-(SEQ ID NO：X)。
反向肽序列
根据Nair等人(2003)J Immunol 170(3)1362-1373中的公开，可以设想也可以按照逆反(retro-inverso)形式使用本文公开的肽序列。例如，顺序相反(即N端变成C端，反之亦然)，其立体化学也同样相反(即，D-氨基酸变成L-氨基酸，反之亦然)。
肽配体
如本文所指，肽配体是指共价结合至分子支架的肽、缩氨酸(peptidic)或拟肽。通常，此类肽、缩氨酸或拟肽包含具有天然或非天然氨基酸的肽、两个或更多个反应性基团(即，半胱氨酸残基)(所述反应性基团能够与支架形成共价键)、和在所述反应性基团之间彼此相对的称为环序列的序列，因为当肽、缩氨酸或拟肽与支架结合时，它形成环。在此情况下，肽、缩氨酸或拟肽包含至少三个半胱氨酸残基(在本文中称为Ci、Cii和Ciii)，并在支架上形成至少两个环。
肽配体的优势
本发明的某些双环肽具有许多有利的性质，使它们被认为是适用于注射、吸入、鼻、眼、口或局部施用的类药物分子。这些优势性质包括：
-物种交叉反应性。这是临床前药效学和药代动力学评估的典型要求；
-蛋白酶稳定性。在大多数情况下，双环肽配体应表现出对血浆蛋白酶、上皮(“膜锚定”)蛋白酶、胃和肠蛋白酶、肺表面蛋白酶、细胞内蛋白酶等的稳定性。应当在不同物种之间维持蛋白酶的稳定性，从而可以在动物模型中开发双环肽先导候选物，并且可信地对人进行施用；
-理想的溶解度曲线。这是带电荷的亲水性残基与疏水性残基的比例、以及分子内/分子间氢键的函数，这对于制剂和吸收目的很重要；
-循环中最佳的血浆半衰期。取决于临床适应症和治疗方案，可能需要开发具有短或延长的体内暴露时间的双环肽，以管理慢性或急性疾病状态。最佳暴露时间取决于对持续暴露的要求(以实现最大的治疗效率)以及对短时间暴露的要求，以最大程度地减少因持续暴露于试剂而产生的毒理作用。
-选择性。本发明的某些肽配体对其他Eph受体酪氨酸激酶表现出良好的选择性，例如EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphB1、因子XIIA、碳酸酐酶9和CD38(本发明所选肽配体的选择性数据见表11和表12)。还应当注意，本发明的所选肽配体表现出与其他物种(例如小鼠和大鼠)的交叉反应性，以允许在动物模型中进行测试(表3、7至8、10和12)；以及
-安全性。在临床前的体内模型和EphA2抗体药物缀合物的临床试验中已经报道了出血事件。例如，由于6位患者中有5位发生了出血和凝血事件，因此停止了使用MEDI-547进行1期开放标签研究(Annunziata等人，Invest New Drugs(2013)31：77-84)。在患者中观察到的出血事件与在大鼠和猴子临床前研究中观察到的对凝血系统的影响一致：增加的活化部分凝血活酶时间和增加的纤维蛋白原/纤维蛋白降解产物(Annunziata等人IBID)。据报道，在猴子的毒理学研究中发现了明显的出血事件(Annunziata等人，IBID)。综合这些结果，表明MEDI-547在临床前物种和患者中均引起弥散性血管内凝血(DIC)。此处报道的BDC体内半衰期短(<30分钟)，因此从本质上讲，患者中产生DIC的可能性较小。此处显示的结果(请参阅第5和6章节的生物学数据、以及表15)表明，本发明的所选双环药物缀合物对凝血参数没有影响，并且在临床前研究中未引起出血事件。
药学上可接受的盐
应当理解，盐形式属于本发明的范围内，并且提及肽配体时包括所述配体的盐形式。
可以通过常规化学方法，例如在Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use，P.Heinrich Stahl(编)、Camille G.Wermuth(编)ISBN：3-90639-026-8精装388页，2002年8月中描述的方法，从含有碱性或酸性部分(moiety)的母体化合物来合成本发明的盐。通常，可以通过水中、或在有机溶剂中、或在两者的混合物中，使这些化合物的游离酸或碱形式与适当的碱或酸进行反应，来制备这些盐。
能够与多种无机和有机酸形成酸加成盐(单盐或二盐)。酸加成盐的示例包括与选自以下的酸形成的单盐或二盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸(如D-葡萄糖醛酸)、谷氨酸(如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢卤酸(如氢溴酸、盐酸、氢碘酸)、羟乙基磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟碱、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、丹宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一烯酸和戊酸、以及酰化氨基酸和阳离子交换树脂。
一组具体的盐由以下形成的盐组成：乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟乙基磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、硫酸、甲磺酸(甲磺酸盐)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡萄糖醛酸和乳糖酸。一种具体的盐是盐酸盐。另一种具体的盐是乙酸盐。
如果化合物是阴离子化合物，或具有可以是阴离子的官能团(例如，-COOH可以是-COO-)，则可以与有机或无机碱形成盐，产生合适的阳离子。合适的无机阳离子的示例包括但不限于碱金属离子，如Li+、Na+和K+；碱土金属阳离子，如Ca2+和Mg2+；和其他阳离子。如Al3+或Zn+。合适的有机阳离子的示例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和取代的铵离子(例如，NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些合适的取代铵离子的示例是衍生自以下的那些：甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的示例是N(CH3)4 +。
当本发明的肽含有胺官能团时，这些可以形成季铵盐，例如通过根据本领域技术人员熟知的方法与烷化剂反应。这种季铵化合物在本发明的肽范围内。
同位素变异
本发明包括所有药学上可接受的(放射性)同位素标记的本发明肽配体，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子所取代，本发明的肽配体，其中附着能够保持相关的(放射性)同位素的金属螯合基团(称为“效应物”)，以及本发明的肽配体，其中某些官能团被相关的(放射性)同位素或同位素标记的官能团共价取代。
适合包含在本发明肽配体中的同位素的示例包括氢的同位素，如2H(D)和3H(T)；碳，如11C、13C和14C；氯，如36Cl；氟，如18F；碘，如123I、125I和131I；氮，如13N和15N；氧，如15O、17O和18O；磷，如32P；硫，如35S；铜，如64Cu；镓，如67Ga或68Ga；钇，如90Y；和镏，如177Lu；和铋，如213Bi。
某些同位素标记的本发明肽配体，例如并入放射性同位素的那些，可用于药物和/或底物组织分布的研究中，并用于临床评估患病组织中EphA2靶标的存在和/或不存在。本发明的肽配体还可具有有价值的诊断性质，因为它们可用于检测或鉴定标记化合物与其他分子、肽、蛋白、酶或受体之间复合物的形成。检测或鉴定方法可以使用标记有标记试剂的化合物，如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质(例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、水母发光蛋白和荧光素酶)等。鉴于其易于并入和现成的检测手段，放射性同位素氚(即3H(T))和碳-14(即14C)特别适用于此目的。
用较重的同位素如氘(即2H(D))取代，可以提供某些治疗优势，这是由于更高的代谢稳定性，例如体内半衰期延长或剂量需求减少，因此在某些情况下可能是优选的。
用正电子发射同位素(如11C、18F、15O和13N)取代，可用于正电子发射断层扫描(PET)研究，以检查靶标占有率。
通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例中描述的那些方法类似的方法，使用适当的同位素标记试剂代替之前所用的非标记试剂，来制备本发明肽配体的同位素标记化合物。
非芳香族分子支架
本文提及的术语“非芳香族分子支架”是指本文定义的任何分子支架，其不包含芳香族的(即，不饱和)碳环或杂环系统。
Heinis等人(2014)Angewandte Chemie，国际版53(6)1602-1606中描述了非芳香族分子支架的合适示例。
如前述文献所述，分子支架可以是小分子，例如有机小分子。
在一个实施方案中，分子支架可以是大分子。在一个实施方案中，分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物组成的大分子。
在一个实施方案中，分子支架包含能够与多肽的官能团反应以形成共价键的反应性基团。
分子支架可包含与肽形成键的化学基团，例如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤化物和酰基卤化物。
含α不饱和羰基的化合物的示例是1,1',1″-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)(Angewandte Chemie，国际版(2014)，53(6)，1602-1606)。
效应物和官能团
根据本发明的另一方面，提供了一种药物缀合物，其包含缀合至一个或多个效应物和/或官能团的本文定义的肽配体。
效应物和/或官能团可以连接至例如多肽的N和/或C端、连接至多肽内的氨基酸或连接至分子支架。
适当的效应物基团包括抗体及其部分或片段。例如，效应物基团可以包括抗体轻链恒定区(CL)、抗体CH1重链结构域、抗体CH2重链结构域、抗体CH3重链结构域或其任意组合，以及一个或更多个恒定区结构域。效应物基团还可以包含抗体的铰链区(通常在IgG分子CH1和CH2结构域之间发现的这种区域)。
在本发明该方面的另一个实施方案中，根据本发明的效应物基团是IgG分子的Fc区。有利地，根据本发明的肽配体-效应物基团包含以下或由以下组成：肽配体Fc融合，其tβ半衰期为1天或更长时间，2天或更长时间，3天或更长时间，4天或更长时间，5天或更长时间，6天或更长时间，或7天或更长时间。最有利地，根据本发明的肽配体包含以下或由以下组成：tβ半衰期为1天或更长时间的肽配体Fc融合。
官能团通常包括结合基团、药物、用于连接其他实体的反应性基团、有助于将大环肽摄取到细胞中的官能团等。
肽穿透细胞的能力将允许肽有效针对细胞内的靶标。可以被具有穿透细胞能力的肽所接近的靶标，包括转录因子、细胞内信号传导分子(如酪氨酸激酶)和参与细胞凋亡途径的分子。能够穿透细胞的官能团包括已经添加到肽或分子支架的肽或化学基团。肽，如衍生自如VP22、HIV-Tat、果蝇(触角足(Antennapedia))的同源盒蛋白的那些，例如，如Chen和Harrison,Biochemical Society Transactions(2007)第35卷,第4部分，第821页；Gupta等人，Advanced Drug Discovery Reviews(2004)第57卷9637中所描述。已经显示有效通过质膜易位的短肽的示例，包括来自果蝇触角足蛋白的16个氨基酸的穿透肽(Derossi等人(1994)J Biol.Chem.第269卷，第10444页)、18个氨基酸的“模型两亲肽”(Oehlke等人(1998)Biochim Biophys Acts第1414卷，第127页)和HIV TAT蛋白的富含精氨酸的区域。非缩氨酸方法包括使用可以容易地附着到生物分子上的小分子模拟物或SMOC(Okuyama等人(2007)Nature Methods第4卷，第153页)。将胍基添加到分子中的其他化学策略也增强细胞穿透(Elson-Scwab等人(2007)J Biol Chem第282卷，第13585页)。可将小分子量分子(如类固醇)添加到分子支架中以增强细胞摄取。
可以附着至肽配体的一类官能团包括抗体及其结合片段，如Fab、Fv或单结构域片段。具体而言，可以使用能够增加肽配体体内半衰期的结合蛋白的抗体。
在一个实施方案中，根据本发明的肽配体-效应物基团具有选自12小时或更长时间、24小时或更长时间、2天或更长时间、3天或更长时间、4天或更长时间、5天或更长时间、6天或更长时间、7天或更长时间、8天或更长时间、9天或更长时间、10天或更长时间、11天或更长时间、12天或更长时间、13天或更长时间、14天或更长时间、15天或更长时间、或20天或更长时间的tβ半衰期。有利地，根据本发明的肽配体-效应物基团或组合物将具有12至60小时范围的tβ半衰期。在一个进一步实施方案中，其将具有一天或更长时间的tβ半衰期。在一个更进一步的实施方案中，tβ半衰期将在12至26小时的范围内。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述官能团选自金属螯合剂，其适合于络合具有药用相关性的金属放射性同位素。
可能的效应物基团还包括酶，例如用于酶/前药治疗的羧肽酶G2，其中肽配体替换ADEPT中的抗体。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述官能团选自：药物，例如用于癌症治疗的细胞毒性剂。合适的示例包括：烷化剂如顺铂和卡铂，以及奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢物，包括嘌呤类似物硫唑嘌呤和巯嘌呤或嘧啶类似物；植物生物碱和萜类化合物，包括长春花生物碱类，如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇(paclitaxel)，最初称为紫杉醇(Taxol)；拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱：伊立替康和拓扑替康，以及II型抑制剂，包括安丫啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。其他试剂可以包括抗肿瘤抗生素，其包括免疫抑制剂放线菌素D(其用于肾移植)、多柔比星、表柔比星、博来霉素、刺胞霉素等。
在本发明的一个进一步具体实施方案中，细胞毒性剂选自美登木素生物碱(如DM1)或单甲基奥瑞他汀(例如MMAE)。
DM1是一种细胞毒性剂，其是美登素的含巯基衍生物，并具有以下结构：
Figure BDA0002637477470000091
单甲基奥瑞他汀E(MMAE)是一种合成抗肿瘤药，具有以下结构：
Figure BDA0002637477470000101
在一个实施方案中，细胞毒性剂通过可裂解键(例如二硫键或蛋白酶敏感键)与双环肽相连。在其他实施方案中，对邻近二硫键的基团进行修饰以控制二硫键的阻碍，并由此控制细胞毒性剂的裂解速率和伴随的释放。
已发表的工作通过在二硫键的任一侧引入空间位阻，实现了改变二硫键对还原敏感性的潜力(Kellogg等人(2011)，Bioconjugate Chemistry，22，717)。更大程度的空间位阻会降低细胞内谷胱甘肽和细胞外(全身)还原剂的还原速率，从而降低了细胞内外毒素释放的难易程度。因此，通过仔细选择在二硫键任一侧的阻碍程度，可以实现循环中二硫化物稳定性(使毒素的不良副作用最小化)与细胞内环境中的有效释放(使治疗功效最大化)之间的最佳选择。
通过在分子构建体的靶向实体(此处为双环肽)或毒素侧引入一个或多个甲基，来调节在二硫键任一侧的阻碍。
在一个实施方案中，药物缀合物还包括在所述肽配体和所述细胞毒性剂之间的接头。
在一个实施方案中，细胞毒性剂和接头选自WO 2016/067035中所述的任意组合(细胞毒性剂和接头通过引用并入本文)。
在一实施方案中，细胞毒性剂是MMAE。
在一个实施方案中，所述细胞毒性剂和所述双环肽之间的接头包含一个或多个氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，细胞毒性剂是MMAE，并且接头选自：-Val-Cit-、-Trp-Cit-、-Val-Lys-、-D-Trp-Cit-、-Ala-Ala-Asn-、D-Ala-Phe-Lys-或-Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-Tyr-Leu-(SEQ ID NO：3)。在其他实施方案中，细胞毒性剂为MMAE，接头选自：-Val-Cit-、-Trp-Cit-、-Val-Lys-或-D-Trp-Cit-。在另一个实施方案中，细胞毒性剂是MMAE，接头是-Val-Cit-或-Val-Lys-。在另一个实施方案中，细胞毒性剂是MMAE，接头是-Val-Cit-。
在另一个实施方案中，所述细胞毒性剂之间的接头包含二硫键，例如可切割的二硫键。因此，在其他实施方案中，细胞毒性剂是DM1，并且接头选自：-S-S-、-SS(SO3H)-、-SS-(Me)-、-(Me)-SS-(Me)-、-SS-(Me2)-或-SS-(Me)-SO3H-。在其他实施方案中，细胞毒性剂是DM1，接头包含-S-S-部分，例如(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDB)或-SS(SO3H)-部分，例如SO3H-SPDB。在又一个实施方案中，细胞毒性剂是DM1，并且接头包含-S-S-部分，例如-S-S-或-S-S-(SO3H)-。
在一个实施方案中，细胞毒性剂为DM1，药物缀合物包含式(A)所示化合物：
Figure BDA0002637477470000111
其中所述双环是如本文定义的BCY6099。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂是DM1，药物缀合物包含式(B)所示化合物：
Figure BDA0002637477470000112
其中所述双环是如本文定义的BCY6099。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂是DM1，药物缀合物包含式(A)所示化合物，其中所述双环选自：如本文所定义的BCY6099。该BDC在本文中称为BCY6027。本文提供的数据表明在EphA2竞争性结合测定中BCY6027的出色竞争性结合，如表4和表8所示。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂是DM1，药物缀合物包含式(B)所示化合物，其中所述双环选自如本文定义的BCY6099。该BDC在本文中称为BCY6028。本文提供的数据表明在EphA2竞争性结合测定中BCY6028的出色竞争性结合，如表4和表8所示。
在其他实施方案中，细胞毒性剂为MMAE或DM1，药物缀合物选自BCY6136和BCY6173。本文提供的数据表明，这两种双环药物缀合物与以下没有显著结合：密切相关的人类同源物EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7和EphB4、小鼠EphA3和EphA4；以及大鼠EphA3和EphB1，如表11和表12所示。
在又一个实施方案中，药物缀合物选自BCY6135、BCY6136、BCY6173、BCY6174和BCY6175中的任何一个：
Figure BDA0002637477470000131
Figure BDA0002637477470000141
Figure BDA0002637477470000151
Figure BDA0002637477470000161
Figure BDA0002637477470000171
在另一个实施方案中，药物缀合物是BCY6136。本文在研究7和8中提供了数据，这些数据表明BCY6136在PC-3异种移植前列腺癌模型中显示出显著而有效的抗肿瘤活性(参见图5和图6以及表16至表19)。本文还提供了数据，该数据表明BCY6136在NCI-H1975异种移植肺癌(NSCLC)模型中显示出有效的抗肿瘤活性(参见图8和表20至表25)。研究10和11中也提供了数据，这些数据表明BCY6136在大肿瘤尺寸和小肿瘤尺寸的LU-01-0251PDX肺癌(NSCLC)模型中均显示出有效的抗肿瘤作用(参见图9和图10以及表26至表29)，其中观察到完全的肿瘤消退。研究12中也提供了数据，该数据表明BCY6136在LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中显示出显著的抗肿瘤作用(参见图11以及表30和表31)，其中观察到BCY6136完全的肿瘤消退。本文在研究13中也提供了数据，这些数据表明BCY6136在LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性(参见图12以及表32和表33)。本文在研究14中也提供了数据，该数据显示了BCY6136消除LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中的肿瘤(参见图13至图15和表34至表37)。本文的研究15和研究16中也提供了数据，表明了BCY6136在两个模型中的作用，这些模型使用具有低的/可忽略的EphA2表达的细胞系(即Lu-01-0412和Lu-01-0486)。该数据示于图23和图24以及表38至表41中，并表明BCY6136对任一细胞系中的肿瘤消退均无影响，但是结合Lu-01-0412细胞系中高表达靶标的BCY(BCY8245和BCY8781)完全消除了肿瘤。本文在研究17中提供的数据，表明BCY6136在MDA-MB-231异种移植乳腺癌模型中显示出有效的抗肿瘤活性(参见图18和表42至表45)。本文在研究18中还提供了数据，表明了BCY6136在乳腺癌模型中的作用，该模型利用具有低的/可忽略的EphA2表达的细胞系(即EMT6)。该数据显示在图19以及表46和表47中，并表明BCY6136对该细胞系中的肿瘤消退没有影响。本文在研究19中也提供了数据，表明BCY6136在NCI-N87异种移植胃癌模型中显示出显著的抗肿瘤活性(参见图20以及表48和表49)。在研究20中也提供了数据，其表明相较于ADC MEDI-547，BCY6136在SK-OV-3异种移植卵巢癌模型中具有显著的抗肿瘤活性(见图21以及表50和表51)，而ADC MEDI-547则显示出中等的抗肿瘤活性。本文在研究21中也提供了数据，表明BCY6136在OE-21异种移植食道癌模型中显示出显著的抗肿瘤活性(参见图22和表52和表53)。本文在研究22中也提供了数据，表明BCY6136在MOLP-8异种移植多发性骨髓瘤模型中显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性(参见图23以及表59和表60)。本文在研究23中也提供了数据，表明BCY6136在HT-1080异种移植纤维肉瘤模型中显示出有效的抗肿瘤活性(参见图24至图28和表56和表57)。
合成
本发明的肽可以通过标准技术合成制备，然后在体外与分子支架反应。当进行此操作时，可以使用标准化学方法。这使得能够快速大规模制备可溶性材料用于进一步的下游实验或验证。这样的方法可以使用常规化学方法来实现，例如Timmerman等人(同上)中公开的方法。
因此，本发明还涉及如本文所述所选的多肽或缀合物的制备，其中制备包括如下说明的任选的其他步骤。在一个实施方案中，这些步骤在通过化学合成制得的最终产物多肽/缀合物上进行。
当制备缀合物或复合物时，目标多肽中的氨基酸残基任选可以被取代。
肽也可以进行延伸，以并入例如另一个环，因此引入多特异性。
为了延伸肽，可以使用标准固相或溶液相化学法，使用正交保护的赖氨酸(和类似物)，简单地在其N-端或C-端或在环内化学延伸。可以使用标准(生物)缀合技术来引入活化的或可活化的N-或C-端。可替代地，可以通过片段缩合或天然化学连接进行添加，例如，如(Dawson等人1994.Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.Science266:776-779)中所述，或通过酶，例如使用如(Chang等人Proc Natl Acad SciUSA.1994Dec 20；91(26):12544-8或Hikari等人Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters Volume 18,Issue 22,15November 2008，6000-6003页)中描述的subtiligase进行添加。
可替代地，可以通过二硫键进一步缀合来延伸或修饰肽。这具有以下另外的优点：允许第一和第二肽在细胞的还原环境中彼此分离。在这种情况下，可以在第一肽的化学合成期间加入分子支架，以使得与三个半胱氨酸基团反应；然后可以将另外的半胱氨酸或硫醇附加到第一肽的N或C端，使得该半胱氨酸或硫醇仅与第二肽的游离半胱氨酸或硫醇反应，形成二硫键连接的双环肽-肽缀合物。
类似的技术同样适用于两种双环和双特异性大环化合物的合成/偶联，潜在地产生四特异性分子。
此外，可以以相同的方式，使用适当的化学方法，在N-或C-端或通过侧链的偶联，来完成其他官能团或效应物基团的加入。在一个实施方案中，以不阻断任一实体的活性的方式进行偶联。
药物组合物
根据本发明的一个进一步方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文定义的肽配体或药物缀合物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
一般地，本发明的肽配体将与药理学上适当的赋形剂或载体一起以纯化的形式使用。典型地，这些赋形剂或载体包括水性或醇/水溶液、乳剂或混悬液，包括生理盐水和/或缓冲介质。肠胃外载剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠和乳酸林格氏试剂。如果需要在混悬液中保持多肽复合物，合适的生理学上可接受的佐剂可以选自增稠剂如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐。
静脉内载剂包括流体和营养补充剂和电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版)。
本发明的肽配体可以用作单独施用的组合物，或者与其他试剂结合施用。这些可以包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，例如环孢霉素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可以包括与本发明的蛋白配体结合的各种细胞毒素或其他试剂的“鸡尾酒混合物”，或甚至包括具有不同特异性的根据本发明所选多肽的组合，例如使用不同靶标配体选择的多肽，而无论是否在施用之前进行合并。
根据本发明的药物组合物的施用途径可以是本领域普通技术人员通常已知的那些。对于治疗方法，本发明的肽配体可以根据标准技术施用于任何患者。施用可以通过任何适当的模式，包括肠胃外、静脉内、肌肉内、腹腔内、经皮、经肺途径、或者适当地通过直接导管输注。优选地，通过吸入施用根据本发明的药物组合物。施用的剂量和频率取决于患者的年龄、性别和状况，其他药物的同时施用、禁忌症和临床医生要考虑的其他参数。
本发明的肽配体可以被冻干储存并在使用前重构在合适的载体中。已经表明这种技术是有效的，并且可以采用本领域已知的冻干和重构技术。本领域技术人员将理解，冻干和重构可导致不同程度的活性损失，并且可能需要向上调整水平以进行补偿。
可以施用含有本发明肽配体的组合物或其鸡尾酒混合物用于预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，将实现所选细胞群体的至少部分抑制、阻遏、调节、杀死或某些其他可测量参数的足够量定义为“治疗有效剂量”。实现该剂量所需的量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但通常每千克体重0.005至5.0mg所选的肽配体，更常用0.05至2.0mg/kg/剂量的剂量。对于预防性应用，含有本发明肽配体的组合物或其鸡尾酒混合物也可以以相似或稍低的剂量施用。
包含根据本发明的肽配体的组合物可以用于在预防和治疗环境中帮助改变、灭活、杀死或去除哺乳动物中的选择的靶细胞群体。此外，本文所述的肽配体可以选择性地用于在体外(extracorporeally)或体外(in vitro)，以从异质的细胞集合中杀死、消耗或以其他方式有效去除靶细胞群体。来自哺乳动物的血液可以与所选的肽配体体外组合，由此从血液中将不期望的细胞杀死或以其他方式去除，并根据标准技术返回哺乳动物。
治疗用途
本发明的双环肽作为EphA2结合剂具有特定的用途。
Eph酪氨酸激酶受体(Eph)属于一大组酪氨酸激酶受体(RTK)，这些激酶可在酪氨酸残基上将蛋白磷酸化。Eph及其膜结合的ephrin配体(ephrin)控制细胞的定位和组织的组织化(organization)(Poliakov等人(2004)Dev Cell 7，465-80)。功能的和生化的Eph反应在较高的配体低聚化状态下发生(Stein等人(1998)Genes Dev 12,667-678)。
在其他模式功能中，表明各种Eph和ephrin在血管发育中起作用。EphB4和ephrin-B2的敲除导致缺乏将毛细血管床重塑成血管的能力(Poliakov等人，同上)，并导致胚胎致死。在新形成的成体微血管中也观察到了一些Eph受体和ephrin的持续表达(Brantley-Sieders等人(2004)Curr Pharm Des 10,3431-42；Adams(2003)J Anat 202,105-12)。
还观察到成人中一些ephrin及其受体的不受调控的再生会促进肿瘤的侵袭、转移和新血管生成(Nakamoto等人(2002)Microsc Res Tech 59,58-67；Brantley-Sieders等人,同上)。此外，已经发现一些Eph家族成员在来自多种人类肿瘤的肿瘤细胞上过度表达(Brantley-Sieders等人，同上)；Marme(2002)Ann Hematol 81Suppl 2,S66；Booth等人(2002)Nat Med 8,1360-1)。
EPH受体A2(A型ephrin受体2)是一种在人类中由EPHA2基因编码的蛋白。
EphA2在人的多种癌症中上调，通常与疾病进展、转移和不良预后相关，例如：乳腺(Zelinski等人(2001)Cancer Res.61,2301–2306；Zhuang等人(2010)Cancer Res.70,299–308；Brantley-Sieders等人(2011)PLoS One 6,e24426)、肺(Brannan等人(2009)CancerPrev Res(Phila)2,1039–1049；Kinch等人(2003)Clin Cancer Res.9,613-618；Guo等人(2013)J Thorac Oncol.8,301-308)、胃(Nakamura等人(2005)Cancer Sci.96,42-47；Yuan等人(2009)Dig Dis Sci 54,2410-2417)、胰腺(Mudali等人(2006)Clin Exp Metastasis23,357-365)、前列腺(Walker-Daniels等人(1999)Prostate 41,275–280)、肝(Yang等人(2009)Hepatol Res.39,1169–1177)和胶质母细胞瘤(Wykosky等人(2005)Mol CancerRes.3,541–551；Li等人(2010)Tumour Biol.31,477–488)。
EphA2在癌症进展中的全部作用仍未确定，尽管有证据表明在癌症进展的许多阶段都有相互作用，包括肿瘤细胞生长、存活、侵袭和血管生成。EphA2表达的下调抑制了肿瘤癌细胞的增殖(Binda等人(2012)Cancer Cell 22,765-780)，而EphA2的阻断抑制了VEGF诱导的细胞迁移(Hess等人(2001)Cancer Res.61,3250–3255)、萌发和血管生成(Cheng等人(2002)Mol Cancer Res.1,2–11；Lin等人(2007)Cancer 109,332-40)和转移性进展(Brantley-Sieders等人(2005)FASEB J.19,1884–1886)。
已显示针对EphA2的抗体药物缀合物可在大鼠和小鼠异种移植模型中显著降低肿瘤生长(Jackson等人(2008)Cancer Research 68,9367-9374)，并且已经在人中尝试了类似的方法，尽管由于治疗相关的不良事件，治疗已被迫终止(Annunziata等人(2013)InvestNew drugs 31,77-84)。
根据本发明的方法选择的多肽配体可用于体内治疗和预防应用、体外和体内诊断应用、体外测定和试剂应用等。具有所选特异性水平的配体在其中需要交叉反应性的涉及在非人动物中进行测试的应用中是有用的，或在需要仔细控制与同系物或旁系同源物的交叉反应性的诊断应用中是有用的。在一些应用中，例如疫苗应用，可以利用对预定范围的抗原引发免疫应答的能力来定制针对特定疾病和病原体的疫苗。
对于哺乳动物施用，优选至少90至95％同质性的基本上纯的肽配体，并且对于药物用途，特别是当哺乳动物是人时，最优选98至99％或更高的同质性。一旦按需要被纯化(部分纯化或纯化至同质)，所选的多肽可以在诊断或治疗(包括体外)或开发和进行测定程序、免疫荧光染色等中使用(Lefkovite和Pernis,(1979和1981)Immunological Methods,卷I和卷II,Academic Press,NY)。
根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的肽配体或药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗特征在于患病组织(例如肿瘤)中过度表达EphA2的疾病或病症。
根据本发明的另一方面，提供了一种预防、抑制或治疗特征在于患病组织(例如肿瘤)中过度表达EphA2的疾病或病症的方法，其包括向有需求的患者施用本文定义的肽配体的效应物基团和药物缀合物。
在一个实施方案中，EphA2是哺乳动物EphA2。在另一个实施方案中，哺乳动物EphA2是人EphA2。
在一个实施方案中，特征在于患病组织中过度表达EphA2的疾病或病症选自癌症。
可以被治疗(或被抑制)的癌症(及其良性对应物)的示例，包括但不限于上皮起源的肿瘤(腺瘤和各种类型的癌，包括腺癌、鳞癌、移行细胞癌和其他癌)，例如膀胱和泌尿道癌、乳腺癌、胃肠道癌(包括食道癌、胃(胃)癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌和肛门癌)、肝癌(肝细胞癌)、胆囊和胆道系统癌、外分泌胰腺癌、肾癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈癌(例如舌癌、颊腔癌、喉癌、咽癌、鼻咽癌、扁桃体癌、唾液腺癌、鼻腔癌和鼻旁窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、子宫颈癌、子宫肌瘤、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)、肾癌、前列腺癌、皮肤和附属物癌(例如黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、异常增生痣)；血液系统恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和恶化前的血液系统疾病以及边缘恶性疾病，包括血液系统恶性肿瘤和淋巴谱系的相关病症(例如急性淋巴细胞性白血病[ALL]、慢性淋巴细胞性白血病[CLL]、B细胞淋巴瘤如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、意义不确定的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴增生性疾病)、和血液系统恶性肿瘤和髓系的相关病症(例如急性髓性白血病[AML]、慢性髓性白血病[CML]、慢性骨髓单核细胞白血病[CMML]、嗜酸性粒细胞增多综合征、骨髓增生性疾患，例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合症和早幼粒细胞性白血病)；间充质起源的肿瘤，例如软组织肉瘤、骨或软骨肉瘤，例如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性和恶性组织肉瘤以及隆突性皮纤维肉瘤；中枢或周围神经系统的肿瘤(例如星形细胞瘤、神经胶质瘤和胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体瘤、肾上腺肿瘤、胰岛细胞瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌和甲状腺髓样癌)；眼和附属器肿瘤(例如视网膜母细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、胚芽细胞瘤、葡萄胎和绒毛膜癌)；以及小儿和胚胎肿瘤(例如，髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、威尔姆斯肿瘤和原始神经外胚层肿瘤)；或先天性或其他形式的综合症，使患者容易患恶性肿瘤(例如着色性干皮病)。
在进一步的实施方案中，所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤和血管生成。
在其他实施方案中，癌症选自：前列腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、胃癌、卵巢癌、食道癌、多发性骨髓瘤和纤维肉瘤。
在另一个实施方案中，所述癌症是前列腺癌。本文在研究7和8中提供了数据，这些数据表明BCY6136在PC-3异种移植前列腺癌模型中显示出显著而有效的抗肿瘤活性(参见图5和图6以及表16至表19)。
在又一个实施方案中，药物缀合物可用于预防、抑制或治疗实体瘤，例如纤维肉瘤和乳腺癌以及非小细胞肺癌。
在又一个实施方案中，所述癌症选自肺癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)。本文在研究9中提供了数据，其表明BCY6136在NCI-H1975异种移植肺癌(NSCLC)模型中显示出有效的抗肿瘤活性(参见图8和表20至表25)。本文在研究10和11中提供了数据，其表明BCY6136在大肿瘤尺寸和小肿瘤尺寸LU-01-0251PDX肺癌(NSCLC)模型中均显示出有效的抗肿瘤作用(参见图9和图10以及表26至表29)，其中观察到肿瘤完全消退。本文在研究12中还提供了数据，表明BCY6136在LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中显示出显著的抗肿瘤作用(参见图11以及表30和表31)，其中针对BCY6136观察到肿瘤完全消退。本文在研究13中还提供了数据，其表明BCY6136在LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性(参见图12和表32和表33)。本文在研究14中还提供了数据，其表明在LU-01-0046PDX肺癌(NSCLC)模型中BCY6173显示出抗肿瘤活性，并且BCY6136和BCY6175消除了肿瘤(见图13至图15和表34至表37)。本文在研究15和研究16中也提供了数据，其表明BCY6136在使用低的/可忽略的EphA2表达的细胞系(即Lu-01-0412和Lu-01-0486)的两个模型中的作用。该数据显示在图23和图24以及表38至表41中，表明BCY6136在任一细胞系中均对肿瘤消退没有影响，但BCY(BCY8245和BCY8781)与Lu-01-0412细胞系中高度表达的靶标结合，并彻底消除了肿瘤。在其他实施方案中，癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。本文在研究17中提供了数据，其表明BCY6136在MDA-MB-231异种移植乳腺癌模型中显示出有效的抗肿瘤活性(参见图18和表42至表45)。本文在研究18中也提供了数据，其表明BCY6136在乳腺癌模型中的作用，该模型利用了低的/可忽略的EphA2表达的细胞系(即EMT6)。该数据显示在图19以及表46和表47中，并表明BCY6136对该细胞系中的肿瘤消退没有影响。在一个替代实施方案中，乳腺癌是赫赛汀(Herceptin)抗性的乳腺癌。不受理论的束缚，EphA2被认为与对赫赛汀的抗性有关，因此靶向EphA2的实体在对赫赛汀没有响应的患者中具有潜在的用途。
在其他实施方案中，癌症是胃癌。本文在研究19中提供了数据，其表明BCY6136在NCI-N87异种移植胃癌模型中显示出显著的抗肿瘤活性(参见图20以及表48和表49)。
在其他实施方案中，癌症是卵巢癌。本文在研究20中提供了数据，其表明相较于ADC MEDI-547，BCY6136在SK-OV-3异种移植卵巢癌模型中具有显著的抗肿瘤活性(参见图21以及表50和表51)，所述ADC MEDI-547显示中等的抗肿瘤活性。
在其他实施方案中，癌症是食道癌。本文在研究21中提供了数据，其表明BCY6136在OE-21异种移植食道癌模型中显示出显著的抗肿瘤活性(参见图22和表52和表53)。
在其他实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。本文在研究22中提供了数据，其表明BCY6136在MOLP-8异种移植多发性骨髓瘤模型中显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性，而BCY6082显示出显著的抗肿瘤活性(参见图23和表59和表60)。
在其他实施方案中，癌症是纤维肉瘤。本文在研究23中提供了数据，其表明在HT-1080异种移植纤维肉瘤模型中，BCY6173、BCY6135、BCY6174和BCY6175表现出剂量依赖性抗肿瘤活性，而BCY6136表现出有效的抗肿瘤活性(参见图24至图28和表56和表57)。
本文提及的术语“预防”涉及在诱导疾病之前施用保护性组合物。“抑制”是指在诱导事件之后但在疾病产生临床表现之前施用组合物。“治疗”涉及在疾病症状变得明显之后施用保护性组合物。
可用于筛选肽配体在预防或治疗疾病中有效性的动物模型系统，是可获得的。本发明促进了动物模型系统的使用，其允许开发可以与人和动物靶标交叉反应的多肽配体，从而允许使用动物模型。
此外，本文在研究3中提供的数据表明来自多种肿瘤类型的EphA2拷贝数变化(CNV)与基因表达之间的关联。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种预防、抑制或治疗癌症的方法，该方法包括向有此需求的患者施用本文所定义的肽配体的效应物基团和药物缀合物，其中所述患者被鉴定为具有增加的EphA2拷贝数变化(CNV)。
在一个实施方案中，癌症选自本文鉴定为具有增加的EphA2的CNV的那些癌症。在其他实施方案中，癌症是乳腺癌。
参考以下实施例进一步描述本发明。
实施例
Figure BDA0002637477470000251
材料和方法
肽合成
通过固相合成合成肽。使用了Rink Amide MBHA树脂。向混合物中加入DMF，所述混合物含有Rink Amide MBHA(0.4-0.45mmol/g)和Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0个当量)，然后加入DIC(3个当量)和HOAt(3个当量)并混合1小时。含有20％哌啶的DMF用于解封。随后的每个氨基酸都用3个当量使用活化剂的在DMF中的DIC(3.0个当量)和HOAT(3.0个当量)进行偶联。通过茚三酮显色反应或四氯显色反应监测反应。合成完成后，将肽树脂用DMF×3、MeOH×3洗涤，然后在N2泡下干燥过夜。然后将肽树脂用92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％EDT/2.5％H2O处理3h。用冷的异丙醚沉淀该肽，并离心(3000rpm 3分钟)。将沉淀用异丙醚洗涤两次，并将粗制肽在真空下干燥2小时，然后冻干。将冻干的粉末溶于ACN/H2O(50：50)中，加入100mMTATA的ACN溶液，然后加入碳酸氢铵的H2O溶液(1M)，溶液混合1h。一旦完成环化，就用1Maq.的半胱氨酸盐酸盐(相对于TATA为10个当量)淬灭反应，然后混合，静置一个小时。将溶液冻干得到粗产物。粗制的肽通过制备型HPLC进行纯化，并冻干得到产物。
除非另有说明，所有氨基酸均以L-构型使用。
BCY6099
Figure BDA0002637477470000261
序列：(β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO：2)-CONH2
用8.0g树脂生成作为白色固体的2.1g BCY6099(纯度99.2％；产率16.3％)。
Figure BDA0002637477470000262
双环肽药物缀合物的制备
图1中显示了制备双环药物缀合物(BDC)的一般示意图，表A描述了每个BDC中靶向双环的成分和接头/毒素。
表A
BDC(BCY编号) 靶向双环(BCY编号) 接头/毒素
6135 6099 DM1-SS-
6136 6099 ValCit-MMAE
6173 6099 DM1-SS(SO<sub>3</sub>H)-
6174 6099 ValLys-MMAE
6175 6099 MMAE-D-Ala-Phe-Lys-
BCY6135
Figure BDA0002637477470000271
BCY6099(114.1mg，35.84μmol)用作双环试剂。获得白色固体的22.4mg化合物BCY6135(5.30μmol，产率17.74％，纯度95.14％)。
Figure BDA0002637477470000272
BCY6136
Figure BDA0002637477470000273
BCY6099(71.5mg，22.48μmol)用作双环试剂。获得白色固体的化合物BCY6136(40.9mg，9.05μmol，产率40.27％，纯度97.42％)。
Figure BDA0002637477470000274
Figure BDA0002637477470000281
BCY6173
Figure BDA0002637477470000282
BCY6099(200.15mg，62.89μmol)用作双环试剂。得到白色固体的57.1mg化合物BCY6173(3.40μmol，产率22.79％，纯度95.80％)。
Figure BDA0002637477470000283
BCY6174
Figure BDA0002637477470000284
Figure BDA0002637477470000291
BCY6099(389.77mg，122.47μmol，1.2个当量)用作双环试剂。获得白色固体的Dde-BCY6174(0.250g，55.10μmol，产率53.99％)。
LCMS(ESI)： m/z 1513.0[M+3H]<sup>3+</sup>，1135.0[M+4H]<sup>4+</sup>，908.2[M+5H]<sup>5+</sup>
分子量 4538.38
根据一般步骤，使用肼将Dde-BCY6174(0.250g，55.10μmol，1.0当量)脱保护，得到白色固体的BCY6174(0.1206g，27.45μmol，产率49.82％)。
Figure BDA0002637477470000292
BCY6175
Figure BDA0002637477470000293
Figure BDA0002637477470000301
Figure BDA0002637477470000311
制备化合物10A的一般程序
向BCY6099(195.15mg，61.32μmol，1.1个当量)的DMA溶液(3mL)中添加DIEA(21.61mg，167.23μmol，29.13μL，3个当量)和化合物9(0.085g，55.74μmol，1.0个当量)。将混合物在25℃下搅拌16小时。LC-MS显示化合物9被完全消耗，检测到具有所需m/z的一个主峰。减压浓缩反应混合物以去除溶剂，得到残留物(浅黄色油)。通过制备型HPLC(中性条件)直接纯化反应物。获得白色固体的化合物10A(0.160g，34.84μmol，产率62.50％)。
制备BCY6175的一般程序
向化合物10A的DCM溶液(4.5mL)中加入TFA(4.5mL)。将混合物在0℃下搅拌30分钟。LC-MS显示化合物10A已完全耗尽，并检测到具有所需m/z的一个主峰。减压浓缩反应混合物以去除溶剂，得到残留物，将其通过制备型HPLC进行纯化(TFA条件)。得到白色固体的化合物BCY6175(61.40mg，13.56μmol，产率31.13％)。
生物数据
研究1.荧光偏振测量
(a)直接结合测定法
将带有荧光标签的肽(荧光素、SIGMA或Alexa Fluor488TM，Fisher Scientific)在含0.01％吐温20的PBS或含100mM NaCl和0.01％吐温的50mM HEPES，pH 7.4(两者均称为测定缓冲液)中稀释至2.5nM。将其与(与该肽相同的)测定缓冲液中的滴定蛋白组合，在黑色壁和底部的低结合低体积384孔板中得到25μL总体积的1nM肽，通常为5μL测定缓冲液、10μL蛋白(表1)、然后是10μL荧光肽。使用二分之一系列稀释，给出12种不同的浓度，最高浓度范围从已知高亲和力结合物的500nM，到低亲和力结合物的10μM，进行选择性测定。在配备有“FP 485 520520”光学模块的BMG PHERAstar FS上进行测量，该光学模块在485nm处激发，并在520nm处检测平行和垂直发射。将PHERAstar FS设置在25℃，每孔闪烁200次，定位延迟为0.1秒，以5至10分钟的间隔测量每孔，持续60分钟。在60分钟结束时孔中没有蛋白，针对每个示踪剂确定用于分析的增益。使用Systat Sigmaplot 12.0版分析数据。将mP值拟合至用户定义的二次方程式以生成Kd值：f＝ymin+(ymax-ymin)/Lig*((x+Lig+Kd)/2-sqrt((((x+Lig+Kd)/2)^2)-(Lig*x)))。“Lig”是所用示踪剂浓度的定义值。
(b)竞争结合测定法
在与具有荧光标签和已知Kd的肽的竞争中测试不含荧光标签的肽(表2)。参考化合物A具有序列Fl-G-Sar5-ACPWGPAWCPVNRPGCA(Fl-G-Sar5-(SEQ ID NO：4))。参考化合物B具有序列Fl-G-Sar5-ACPWGPFWCPVNRPGCA(Fl-G-Sar5-(SEQ ID NO：5))。参考化合物C具有序列Fl-G-Sar5-ADVTCPWGP FWCPVNRPGCA(Fl-G-Sar5-(SEQ ID NO：6))。参考化合物A、B和C中的每种含有TBMB分子支架。如直接结合测定法所述，将肽在具有最大浓度5％的DMSO的测定缓冲液中稀释至适当浓度，然后进行1/2系列稀释。将5μL的稀释肽添加到平板中，然后以固定浓度(取决于所使用的荧光肽(表2))添加10μL的人或小鼠EphA2(表1)，然后添加10μL荧光肽。按照直接结合测定法进行测量，但是在第一次测量之前确定增益。数据分析采用Systat Sigmaplot 12.0版进行，其中mP值拟合至用户定义的三次方程式，以生成Ki值：
f＝ymin+(ymax-ymin)/Lig＊((Lig＊((2＊((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^0.5＊COS(ARCCOS((-2＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^3+9＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp)-27＊(-1＊Klig＊Kcomp＊Prot＊c))/(2＊((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)))/((3＊Klig)+((2＊((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^0.5＊COS(ARCCOS((-2＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^3+9＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp)-27＊(-1＊Klig＊Kcomp＊Prot＊c))/(2＊((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c))))。
“Lig”、“KLig”和“Prot”都是定义的值，分别涉及：荧光肽浓度、荧光肽的Kd和EphA2浓度。
表1：Ephrin受体和来源
Figure BDA0002637477470000321
Figure BDA0002637477470000331
表2：竞争性结合测定法所用的荧光肽和EphA2的终浓度
Figure BDA0002637477470000332
在上述测定法中测试了本发明的某些肽配体，结果示于表3和表4中：
表3：本发明肽配体的生物测定数据(TATA肽，竞争性结合测定法)
Figure BDA0002637477470000333
表4：本发明的肽配体的生物测定数据(采用TATA支架进行的BDC竞争性结合数据)
Figure BDA0002637477470000334
研究2：荧光偏振测量(替代方法)
(a)竞争性结合
在与具有荧光标签和已知Kd的肽的竞争中测试不含荧光标签的肽(表9)。将5μL递增(2倍)浓度的测试化合物添加到平板中，然后以固定浓度(取决于所使用的荧光肽(表9))添加10μL的EphA2蛋白(表8)，然后添加10μL荧光肽。缓冲液是上述测定缓冲液，其中DMSO＜1％。在配备有“FP 485 520 520”光学模块的BMG PHERAstar FS上进行测量，该光学模块在485nm处激发，并在520nm处检测平行和垂直发射。将PHERAstar FS设置在25℃，每孔闪烁200次，定位延迟为0.1秒，以5至10分钟的间隔测量每孔，持续60分钟。或者，在配备有FITCFP双反射镜、FITC FP 480激发滤光片和FITC FP P-pol 535以及FITC FP S-pol发射滤光片的Perkin Elmer Envision上，以30次闪烁和1.2的G系数，以相似的时间间隔，进行测量。使用Systat Sigmaplot 12.0或13.0版分析数据，其中60分钟时的mP值拟合至用户定义的三次方程式以生成Ki值：
f＝ymin+(ymax-ymin)/Lig＊((Lig＊((2＊((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^0.5＊COS(ARCCOS((-2＊(Klig+Kcomp+Lig+ComProt＊c)^3+9＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp)-27＊(-1＊Klig＊Kcomp＊Prot＊c))/(2＊((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)))/((3＊Klig)+((2＊((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^0.5＊COS(ARCCOS((-2＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^3+9＊(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp)-27＊(-1＊Klig＊Kcomp＊Prot＊c))/(2＊((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c)^2-3＊(Kcomp＊(Lig-Prot＊c)+Klig＊(Comp-Prot＊c)+Klig＊Kcomp))^3)^0.5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot＊c))))。
“Lig”、“KLig”和“Prot”都是定义的值，分别涉及：荧光肽浓度、荧光肽的Kd和EphA2浓度。
表5：Eph受体及来源
受体(结构域) 物种 形式/标签 供应商 目录号
EphA2(Ecto) 人 C-端polyHis R&D systems 3035-A2
EphA2(Ecto) 人 C-端polyHis 内部 N/A
EphA2(Ecto) 小鼠 C-端polyHis Sino Biological 50586-M08H
EphA2(配体结合) 大鼠 C-端polyHis 内部 N/A
表6：竞争性结合测定法所用的荧光肽和EphA2的终浓度
Figure BDA0002637477470000341
在上述竞争性结合测定法中测试了本发明的某些肽配体和双环药物缀合物，结果示于表7：
表7：用所选双环肽进行的竞争性结合
Figure BDA0002637477470000342
表7的竞争性结合测定法的结果表明，靶向人EphA2(BCY6099)的双环肽以高亲和力与小鼠和大鼠EphA2结合。这些结果表明，本发明的肽可用于小鼠和大鼠体内的功效和毒理学模型。
表8：所选双环药物缀合物(BDC)的竞争性结合
双环ID 人Ki(nM) 小鼠Ki(nM) 大鼠Ki(nM)
BCY6027 10.2
BCY6028 13.0
BCY6135 2.4 5.0 2.9
BCY6136 1.9 5.5 3.2
BCY6173 1.7 4.3 2.5
BCY6174 1.7 3.9 3.0
表8表明本发明的某些双环药物缀合物在人、小鼠和啮齿动物EphA2之间表现出优异的交叉反应性。因此，本发明的肽可以用于小鼠和大鼠体内的功效和毒理学模型。
(b)SPR测量
在4mM乙酸钠、100mM NaCl、pH 5.4中，用EZ-LinkTM磺基-NHS-LC-生物素将非Fc融合蛋白生物素化1小时，其中生物素是蛋白的3倍摩尔过量。将反应混合物透析至PBS后，使用荧光生物素定量试剂盒(Thermo)确定标记程度。为了分析肽的结合，使用利用了XanTecCMD500D芯片的Biacore T200仪器。使用标准的胺偶联化学方法，在25℃以HBS-N(10mMHEPES，0.15M NaCl，pH 7.4)作为运行缓冲液，将链霉亲和素固定在芯片上。简而言之，以1：1的比例注射0.4M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)/0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)7分钟，流速为10μl/min，活化羧甲基葡聚糖表面。为了捕获链霉亲和素，将蛋白在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至0.2mg/ml，并通过在活化的芯片表面上注射120μl进行捕获。注射1M乙醇胺(pH 8.5)：HBS-N(1：1)7分钟，封闭残留的活化基团。将缓冲液交换为PBS/0.05％Tween 20，并使用在缓冲液中稀释至0.2μM的蛋白稀释液，将生物素化的EphA2捕获至500-1500RU的水平。在该缓冲液中制备了肽的系列稀释液，最终DMSO浓度为0.5％，最高肽浓度为50nM或100nM，再制备另外6个2倍稀释液。在25℃下以90μl/min的流速进行SPR分析，结合60秒，解离900-1200秒。针对DMSO排除体积效应，校正数据。使用标准处理程序，针对空白注射和参考表面对所有数据进行双重参考，并使用2.0c版Scrubber软件(BioLogic Software)进行数据处理和动力学拟合。使用简单的1：1结合模型来拟合数据，并在适当的情况下考虑了质量迁移的影响。
对于双环药物缀合物的结合，使用了Biacore 3000仪器。对于生物素化的蛋白的固定水平为1500RU，最高浓度为100nM。否则，方法与上述使用CMD500D或CM5芯片(GEHealthcare)的方法相同。对于带有Fc标签的蛋白，如上所述激活CM5芯片，然后在10mM乙酸钠pH5.0中将山羊抗人IgG抗体(Thermo-Fisher H10500)稀释至20μg/ml，并捕获至约3000RU。然后如上所述将表面封闭。随后进行带有Fc标签的蛋白的捕获，以获得约200-400RU的靶标蛋白。所用的蛋白描述如下。按照制造商建议的缓冲液和浓度重构所有蛋白，并使用PBS/0.05％Tween20中的5-10μg/ml蛋白进行捕获。
表9
受体 物种 形式/标签 供应商 目录号
EphA1 人 Fc融合 Sino Biologics 15789-H02H
EphA2 人 0.95mol生物素/单体 内部 N/A
EphA2 小鼠 Fc融合 R&D Systems 639-A2
EphA2 大鼠 1.4mol生物素/单体 内部 N/A
EphA3 人 Fc融合 R&D Systems 6444-A3
EphA3 小鼠 Fc融合 Sino Biologics 51122-M02H
EphA3 大鼠 Fc融合 Sino Biologics 80465-R02H
EphA4 人 Fc融合 Sino Biologics 11314-H03H
EphA4 小鼠 Fc融合 Sino Biologics 50575-M02H
EphA4 大鼠 Fc融合 Sino Biologics 80123-R02H
EphA5 人 3.1mol生物素/单体 R&D Systems 3036-A5
EphA6 人 Fc融合 R&D Systems 5606-A6
EphA7 人 Fc融合 R&D Systems 6756-A7
EphB1 大鼠 Fc融合 R&D Systems 1596-B1
EphB4 人 Fc融合 Sino Biologics 10235-H02H
在上述竞争性结合测定法中测试了本发明的某些肽配体和双环药物缀合物，结果示于表10至表12：
表10：所选的本发明双环肽和双环药物缀合物的SPR结合分析
Figure BDA0002637477470000361
表10详细列出了用SPR测定法所确定的所选双环药物缀合物结合人EphA2的结合亲和力和动力学参数(Koff和Kon)。
表11：所选的本发明的双环药物缀合物与人Eph同源物的SPR结合分析
Figure BDA0002637477470000371
表11显示在SPR测定法中，四个双环药物缀合物(BCY6136和BCY6173)与密切相关的人Ephrin同源物的结合结果。结果表明，本发明化合物对以下密切相关的人同源物没有显著结合：EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7和EphB4。
表12：使用本发明的所选双环药物缀合物与小鼠和大鼠Eph直系同源物的SPR结合分析
Figure BDA0002637477470000372
表12中的结果表明，本发明的某些双环药物缀合物(BCY6136和BCY6173)也对小鼠和大鼠EphA2具有选择性，并且对以下密切相关的同源物没有显著结合：小鼠EphA3和EphA4；大鼠EphA3和EphB1。
研究3和7-23
在研究3和研究7-23中的每个研究中，各研究采用以下方法：
(a)材料
(i)动物和饲养条件
动物
物种：家鼠Mus Musculus
品系：Balb/c裸或CB17-SCID
周龄：6-8周
体重：18-22g
动物数目：9-90只小鼠
动物供应商：上海灵昌生物技术实验动物有限公司
饲养状况
将小鼠保持在恒定的温度和湿度下的单独的通风笼中，每个笼中3-5只动物。
·温度：20至26℃。
·湿度：40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。尺寸为300毫米×180毫米×150毫米。垫料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可自由获取经辐射灭菌的干颗粒食品。
水：动物可以自由获取无菌饮用水。
笼子识别：每个笼子的识别标签包含以下信息：动物数目、性别、品系、接收日期、治疗、研究编号、组号和治疗的开始日期。
动物识别：用耳朵编码标记动物。
(ii)测试和阳性对照品
Figure BDA0002637477470000381
1MEDI-547的完整细节(通过mc接头缀合至MMAF的完全人单克隆抗体1C1(识别人和鼠EphA2)描述于Jackson等人(2008)Cancer Res 68，9367-74。
(b)实验方法与程序
(i)观察
本研究中与动物处理、护理和治疗有关的所有程序，均按照WuXi AppTec研究动物护理和使用委员会(IACUC)批准的指南进行，并遵循实验动物饲养评估认证协会(AAALAC)的指导。在常规监测时，每天检查动物是否有肿瘤生长和治疗对正常行为的任何影响，例如活动性、食物和水的消耗(仅视检)、体重增加/减少，眼睛/头发失去光泽以及其他协议中规定的其他异常作用。根据每个子集中的动物数目，记录死亡和观察到的临床体征。
(ii)肿瘤测量和终点
主要终点是观察是否可以延迟肿瘤生长或小鼠是否可以治愈。使用卡尺每周二维测量三次肿瘤体积，并使用以下公式以mm3表示体积：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。然后，将肿瘤尺寸用于T/C值的计算。T/C值(以百分比表示)是抗肿瘤效果的指标；T和C分别是治疗组和对照组在给定天的平均体积。
使用以下公式计算各组的TGI：TGI(％)≤[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；Ti是治疗组在给定天的平均肿瘤体积，T0是开始治疗当天治疗组的平均肿瘤体积，Vi是与Ti同一天的载剂对照组的平均肿瘤体积，V0是载剂组在开始治疗当天的平均肿瘤体积。
(iii)样品收集
在研究结束时，收集所有组的肿瘤用于FFPE。
(iv)统计分析
提供每个时间点各组肿瘤体积的总结统计数据，包括平均值和平均值的标准误差(SEM)。
根据最终剂量后最佳治疗时间点获得的数据，对各组之间肿瘤体积差异进行统计学分析。
进行单因素ANOVA以比较各组之间的肿瘤体积，并在获得显著F统计量(治疗方差与误差方差之比)后，使用Games-Howell检验进行组间比较。所有数据均使用GraphPadPrism 5.0进行分析。P<0.05被认为具有统计学显著性。
研究3：来自多种肿瘤类型的EphA2拷贝数变化(CNV)与基因表达之间的相关性研 究
方法
1.在cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)中选择所有研究，然后搜索EPHA2。
(a)去除临时研究。
(b)取消选择使用重叠样品的研究，以防止样品偏差(基于cBioPortal中的警告)，如果这是一个选项，则始终保留PanCancer研究。
(c)选择进行分析的研究(表13)。
表13：在研究中分析的来自cBioPortal和单元的研究
Figure BDA0002637477470000391
Figure BDA0002637477470000401
Figure BDA0002637477470000411
2.从cBioPortal导出CNV和RNA表达数据。
3.测试CNV是否与EphA2的mRNA表达变化在统计学上显著相关(未应用log2)。
(a)在GraphPad Prism(7.04)和R/R工作室(显著性的阈值：p<0.01)中运行非参数Kruskal-Wallis检验。
(i)GraphPad Prism：设置列表，在未匹配的或配对条件下运行非参数检验，未假设高斯分布。
(ii)R中使用的软件包：
1.XLConnect
2.dplyr
3.Kruskal-Wallis秩和检验：Kruskal.test。
4.使用Dunn检验，在R/R工作室中调整多个比较(即使在组中n＝1，也包括所有可能的比较)(显著性的阈值：p<0.025)。
(a)使用多重比较法的dunn.test＝“bonferonni”。
结果
结果显示在下面的表14中。在cBioPortal中编辑的41个公开可获得的数据集中，报告了EphA2的拷贝数变化(CNV)和mRNA基因表达，其中有许多癌症类型报告了EphA2的轻度缺失(shallow-deletion)(小于2个拷贝)的病例。尽管不常见，但在这些相同的癌症类型中，一部分肿瘤具有EphA2深度缺失(>1个拷贝的丢失或双等位基因丢失)、EphA2增加(2-3个拷贝)或EphA2扩增(>3个拷贝)。>33％的肿瘤具有EphA2轻度缺失或深度缺失的适应症包括：肾嫌色细胞癌、胆管癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、肺鳞癌、乳腺癌、直肠癌、脑低级神经胶质瘤、肝癌、肾上腺皮质癌、间皮瘤、食管腺癌和结肠癌。相反，没有研究表明>33％的样品存在EphA2增加或扩增。这些结果共同表明，在多种适应症中都发现了EphA2 DNA的缺失。
在41项研究中分析的所有样品中，大约有三分之一有EphA2 CNV。基于整个研究中的高百分比CNV，以及特定肿瘤类型中高百分比的轻度缺失，进行了统计测试以鉴定拷贝数变化与RNA表达之间的可能关联。每个适应症的肿瘤被分配到5个类别中的1个：
a)深度缺失；
b)轻度缺失；
c)二倍体；
d)增加；或
e)扩增。
然后进行Kruskall-Wallis检验，以检测每类mRNA表达值分布在类别之间是否存在差异(P<0.01)。对于那些P<0.01的TCGA数据集，为了鉴定哪些类别与其他的不同，进行了事后检验，计算Z统计量，校正计算的P值(Bonferroni)。为了简化解释，回顾了每个适应症的配对比较与二倍体的比较(尽管计算了所有配对的P值)。这些研究中有19/41的Kruskall-Wallis p值<0.01，表明拷贝数与RNA表达在统计学上显著相关。在这19项研究中，17项研究针对二倍体与轻度缺失的Bonferroni校正P<0.025，表明EphA2 mRNA表达减少与EphA2拷贝数减少相关。针对二倍体与增加，这19项研究中仅有2项的Bonferroni校正P<0.025，且均为乳腺癌研究。此外，针对二倍体与轻度缺失以及针对二倍体与增加，这些乳腺癌研究中有一项(乳腺浸润癌(TCGA，PanCancer Atlas))的Bonferroni校正P<0.025，表明拷贝数变化可能对在乳腺癌中的EphA2 RNA表达有强烈影响。
遗传学的核心法则表明，EphA2拷贝数减少导致RNA和蛋白表达减少。因此，在多种肿瘤类型中观察到的EphA2拷贝数丢失与mRNA表达降低之间的关联性，提示EphA2蛋白表达也可能降低。类似地，乳腺癌中与mRNA表达增加相关的EphA2拷贝数增加也可能提示EphA2蛋白的表达增加。此外，在临床前体内模型中，较高的EphA2蛋白表达(通过FACS测量)与本发明某些EphA2双环药物缀合物的功效增加(通过肿瘤体积测量)相关。总之，如果与mRNA表达变化相关的拷贝数变化确实能够预测蛋白表达水平，则携带包含EphA2拷贝数缺失的肿瘤的患者不太可能对本发明的EphA2双环药物缀合物产生响应。同样，如果肿瘤患者的EphA2拷贝数增加(例如乳腺癌)，这些患者更有可能对本发明的EphA2双环药物缀合物产生响应。因此，如果通过EphA2拷贝数状态对患者进行分层，则该信息可用于排除和选择用本发明的EphA2双环药物缀合物进行治疗的患者，以增加功效。
Figure BDA0002637477470000431
Figure BDA0002637477470000441
Figure BDA0002637477470000451
Figure BDA0002637477470000461
Figure BDA0002637477470000471
Figure BDA0002637477470000481
这项研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠LU-01-0251PDX模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000491
(c)实验方法与程序
(i)肿瘤接种
每只小鼠的右侧腹皮下接种LU-01-0251肿瘤碎片(约30mm3)，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到174mm3时，开始治疗，以进行功效研究。各组中测试物的施用和动物数目在以下实验设计表中显示。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000492
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图9所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表26显示携带LU-01-0251异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中，开始治疗后第28天的平均肿瘤体积。
表26：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000493
Figure BDA0002637477470000501
Figure BDA0002637477470000511
研究4：BCY6136在CDX异种移植模型中的体内功效
本研究评估了BCY6136在三种癌细胞系衍生(CDX)模型中的疗效：HT1080纤维肉瘤细胞系、MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞系和NCI-H1975非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系。
(a)实验方法
向Balb/c小鼠的右侧腹皮下接种肿瘤细胞，当平均肿瘤体积达到150至200mm3时，开始药物治疗。如上所述进行肿瘤测量和统计分析。每周用BCY6136或载剂治疗一次荷瘤动物。
(b)讨论
图4-图6显示，在每周一次给药后，BCY6136在乳腺、肺和纤维肉瘤异种移植模型中有效。
HT1080纤维肉瘤模型：
在HT1080模型中，在第0天和第7天，以3mg/kg和5mg/kg每周一次给药BCY6136后，在第14天达到了肿瘤生长的完全消退(图2)。在第0天和第7天，每周一次以2mg/kg给药BCY6136会导致肿瘤停滞(部分消退)(图2)。在整个研究过程中，BCY6136治疗未引起显著的体重减轻，并且药物治疗的小鼠没有不良临床观察。
NCI-H1975 NSCLC模型：
在每周一次以2mg/kg和3mg/kg给药BCY6136后，在第28天左右，观察到NCI-H1975模型的肿瘤生长完全消退(图3)。在第35天停止给药后，从第35天至第72天，当3mg/kg组测量结束时，在3mg/kg治疗的动物中未观察到肿瘤再生长(图3)。在此模型中，以2mg/kg进行BCY6136给药从28天左右开始可产生完全消退。在第35天停止给药后，2mg/kg剂量时，直到第51天左右没有出现肿瘤再生长。在该剂量水平下，从第51天左右开始直到第77天研究终止，观察到中等程度的肿瘤再生长。用1mg/kg BCY6136进行治疗会导致肿瘤停滞(部分消退)(图3)。在整个研究过程中，BCY6136治疗未引起显著的体重减轻，并且在药物治疗的小鼠中没有不良临床观察。
MDA-MB-231乳腺模型：
从第0天到第45天，每周一次以2mg/kg和3mg/kg的剂量给药后，在MDA-MB231模型中观察到肿瘤停滞(部分消退)(图4)。在2mg/kg治疗的动物中观察到一些体重减轻(归因于肿瘤负担)。
这些结果证明，在每天一次给药后，BCY6136在植入纤维肉瘤、乳腺和肺CDX异种移植物的小鼠中产生了深远的肿瘤生长抑制作用。
研究5：大鼠中的安全性研究
在第1和第8天，静脉推注5、7.5和10mg/kg施用后，将六(6)只雌性大鼠随机分为3组，每组2只，以确定BCY6136的毒性。第15天终止研究。
在第2、12和15天，对凝血参数(凝血酶原时间(sec)、活化的部分凝血活酶时间(sec)或纤维蛋白原水平(g/L))没有观察到显著影响(数据未显示)。在病理检查后，没有生存中出血事件的报道，也没有发现内部出血的证据。
研究6：食蟹猴中的安全性研究
在食蟹猴中对BCY6136进行了28天的毒理学研究。在第1、8、15和22天，以1.0mg/kg和2.0mg/kg进行BCY6136给药。在第29天(最终剂量后7天)对动物实施安乐死并进行尸检。
在第18、22和25天(未显示数据)和第29天(表15)，相对于基线，对凝血参数没有观察到显著影响。没有生存中出血事件的报道，在病理检查后也没有发现内部出血的证据。
表15：以1.0mg/kg和2.0mg/kg的BCY6136对食蟹猴给药后，第29天的凝血参数
Figure BDA0002637477470000531
研究7：在Balb/c裸鼠中BCY6136和ADC治疗PC-3异种移植的体内功效研究
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在治疗PC-3异种移植物中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
组 治疗 n 剂量(mg/kg) 给药体积(μl/g) 给药途径 方案
1 载剂 3 - 10 iv qw
2 BCY6136 3 1 10 iv qw
3 BCY6136 3 2 10 iv qw
4 BCY6136 3 3 10 iv qw
5 ADC 3 3 10 iv qw
(c)实验方法与程序
(i)细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的F12K介质中，于37℃在空气中5％CO2的气氛中，培养PC-3肿瘤细胞。常规每周两次传代肿瘤细胞。收获在指数生长期生长的细胞，并计数以进行肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
将每只小鼠的右侧腹皮下接种PC-3肿瘤细胞(10*106)，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到约150mm3时，将动物随机分组，并开始治疗。各组中测试物的施用和动物数目在以下实验设计表中显示。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000541
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图5和图6所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表16显示携带PC-3异种移植物的雌性Balb/c裸鼠随时间变化的平均肿瘤体积。
表16：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000542
Figure BDA0002637477470000551
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第16天的肿瘤体积测量结果，计算PC-3异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表17：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000552
a.平均值±SEM。
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在PC-3异种移植模型中的治疗功效。图5和图6以及表16和表17显示了在各个时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸在第16天达到2070mm3。BCY6136以1mg/kg，qw(TV＝107mm3，TGI＝102.2％，p<0.001)，BCY6136以2mg/kg，qw(TV＝79mm3，TGI＝103.6％，p<0.001)以及BCY6136以3mg/kg，qw(TV＝70mm3，TGI＝104.1％，p<0.001)显示出有效的抗肿瘤作用。在这项研究中，定期监测动物体重。所有小鼠均保持良好体重。
研究8.在Balb/c裸鼠中BCY6136对治疗PC-3异种移植的体内功效研究
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠中治疗PC-3异种移植的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000561
a.N，每组中的动物数目。
b.如在实验设计表中所示的4周治疗后，在监测方案期间，从第52天开始对第3、5和6组的小鼠以1.5mg/kg qw的BCY6136进行治疗。
c.由于第一次给药后多西紫杉醇治疗的小鼠体重严重减轻，因此将治疗暂停2周，然后在第28天进行较低剂量的治疗(多西紫杉醇10mg/kg)。此后，从第42天到第70天，小鼠以1.5mg/kg qw的BCY6136治疗。
(c)实验方法与程序
(i)细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的F-12K介质中，于37℃在空气中5％CO2的气氛中，培养肿瘤细胞。常规每周两次传代肿瘤细胞。收获在指数生长期生长的细胞，并计数以进行肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
将每只小鼠的右侧腹皮下接种0.2ml PBS中的PC-3肿瘤细胞(10×106)，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到454mm3时，将52只动物随机分组。各组中测试物的施用和动物数目在以下实验设计表中显示。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000562
Figure BDA0002637477470000571
(c)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图7所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表18显示携带PC-3异种移植物的雄性Balb/c裸鼠随时间变化的平均肿瘤体积。
表18：随时间变化的肿瘤体积追踪(第0天至第20天)
Figure BDA0002637477470000572
Figure BDA0002637477470000581
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第20天的肿瘤体积测量结果，计算PC-3异种移植模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表19：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000582
a.平均值±SEM。
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在PC-3异种移植模型中的治疗功效。图7以及表18和表19显示了在各个时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸在第20天达到2364mm3。BCY6136以0.167mg/kg，qw(TV＝1188mm3，TGI＝61.4％，p<0.001)，0.5mg/kg，q2w(TV＝530mm3，TGI＝96.0％，p<0.001)，0.5mg/kg，qw(TV＝234mm3，TGI＝111.4％，p<0.001)和1.5mg/kg，qw(TV＝131mm3，TGI＝117.2％，p<0.001)在第20天产生剂量依赖性或剂量-频率依赖性的显著抗肿瘤活性。BCY6136以1.5mg/kg，q2w(TV＝128mm3，TGI＝117.0％，p<0.001)时产生和1.5mg/kg qwBCY6136可比的抗肿瘤活性。其中，以0.5mg/kg qw的BCY6136或以0.5mg/kg q2w的BCY6136治疗的小鼠在停止治疗后显示出明显的肿瘤复发，从第52天起进一步以1.5mg/kg qw的BCY6136治疗对肿瘤消退效果良好。用1.5mg/kg q2w的BCY6136治疗的小鼠在停止治疗后也显示出肿瘤复发，但进一步给药不能完全消退肿瘤。用1.5mpk qw的BCY6136治疗的小鼠直到第48天没有显示出任何肿瘤复发。
0.33mg/kg，qw(TV＝1637mm3，TGI＝38.1％，p<0.001)、1mg/kg，qw(TV＝981mm3，TGI＝72.2％，p<0.001)和3mg/kg，qw(TV＝184mm3，TGI＝114.0％，p<0.001)的EphA2-ADC，在第20天产生剂量依赖性的显著抗肿瘤活性。用EphA2-ADC，3mg/kg qw治疗的小鼠直至第59天没有显示任何肿瘤复发。
15mg/kg qw(TV＝419mm3，TGI＝101.8％，p<0.001)的多西紫杉醇产生显著的抗肿瘤活性，但引起严重的动物体重减轻。停止治疗后，小鼠显示出明显的肿瘤复发。从第42天开始，以1.5mg/kg qw的BCY6136进行治疗，对这些小鼠的肿瘤消退作用良好。
研究9.Balb/c裸鼠中BCY6136对治疗NCI-H1975异种移植的体内功效测试
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠中治疗NCI-H1975异种移植模型的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000591
(c)实验方法与程序
(i)细胞培养
收获在指数生长期生长的细胞，并计数以进行肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
每只小鼠的右侧腹皮下接种0.2ml PBS中的NCI-H1975肿瘤细胞(10×106)，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到149mm3时，将36只动物随机分组。各组中测试物的施用和动物数目在以下实验设计表中显示。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000592
Figure BDA0002637477470000601
(iv)样品采集
在PG-D44上，我们固定了第2组的肿瘤用于FFPE。
在研究结束时，我们将第3组的肿瘤用于FFPE。
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长如图8所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表20至表24显示携带NCI-H1975异种移植物的雌性Balb/c裸鼠随时间变化的平均肿瘤体积。
表20：肿瘤体积追踪(PG-D0至PG-D17)
Figure BDA0002637477470000602
表21：肿瘤体积追踪(PG-D18至PG-D35)
Figure BDA0002637477470000603
表22：肿瘤体积追踪(PG-D37至PG-D53)
Figure BDA0002637477470000604
Figure BDA0002637477470000611
表23：肿瘤体积追踪(PG-D56至PG-D74)
Figure BDA0002637477470000612
表24：肿瘤体积追踪(PG-D77至PG-D98)
Figure BDA0002637477470000613
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第21天的肿瘤体积测量结果，计算NCI-H1975异种移植模型中BCY6136的肿瘤生长抑制率。
表25：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000614
a.平均值±SEM。
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在NCI-H1975异种移植模型中的治疗功效。图8和表20至表25显示了在各个时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸在第21天达到2371mm3。BCY6136以1mg/kg(TV＝205mm3，TGI＝97.5％，p<0.001)，2mg/kg(TV＝99mm3，TGI＝102.3％，p<0.001)和3mg/kg(TV＝94mm3，TGI＝102.4％，p<0.001)产生有效的抗肿瘤活性。2mg/kg和3mg/kg的BCY6136消除了肿瘤或使肿瘤消退至较小的尺寸。从第35天起暂停治疗，在随后的5-6周监测中3mg/kg组的肿瘤未显示出明显的再生长，但是2mg/kg组的肿瘤则显示出明显的再生长，且恢复给药时未显示显著的肿瘤抑制。在这项研究中，小鼠体重保持良好。
研究10.BCY6136在Balb/c裸鼠的LU-01-0251PDX模型中的体内功效研究
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠LU-01-0251PDX模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000621
(c)实验方法与程序
(i)肿瘤接种
每只小鼠的右侧腹皮下接种LU-01-0251肿瘤碎片(约30mm3)，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到174mm3时，开始治疗以进行功效研究。各组中测试物的施用和动物数目在以下实验设计表中显示。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000622
(d)结果
(i)体重变化与肿瘤生长曲线
体重和肿瘤生长曲线如图9所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表26显示携带LU-01-0251异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中，开始治疗后第28天的平均肿瘤体积。
表26：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000623
Figure BDA0002637477470000631
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第28天的肿瘤体积测量结果，计算LU-01-0251PDX模型中BCY6136和ADC的肿瘤生长抑制率。
表27：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000632
a.平均值±SEM。b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136和ADC在LU-01-0251PDX模型中的治疗功效。图9和表26和表27显示了在各个时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
在这项研究中，在开始治疗后的第28天，载剂治疗小鼠的平均肿瘤体积达到2208mm3。BCY6136以1mg/kg，qw(TV＝499mm3，TGI＝84.0％，p＜0.001)，2mg/kg，qw(TV＝32mm3，TGI＝107.0％，p＜0.001)和3mg/kg，qw(TV＝0mm3，TGI＝108.6％，p＜0.001)产生剂量依赖性的抗肿瘤活性。ADC在3mg/kg，qw(TV＝39mm3，TGI＝106.6％，p＜0.001)下表现出显著的抗肿瘤活性。
研究11：BCY6136在Balb/c裸鼠LU-01-0251PDX模型中的体内功效研究
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠LU-01-0251PDX模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000633
Figure BDA0002637477470000641
a.对于该组的所有小鼠，从第0天至第70天保持给药方案，然后从第77天起向小鼠3-2和小鼠3-4再给药3mg/kg qw BCY6136，而其他3只小鼠被暂停治疗。对于该组的所有小鼠，从第0天到第56天保持给药方案。
b.对于该组的所有小鼠，从第0天到第70天保持给药方案。
(c)实验方法与程序
(i)肿瘤接种
每只小鼠的右侧腹皮下接种LU-01-0251肿瘤碎片(约30mm3)，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到960mm3时，开始治疗已进行功效研究。各组中测试物的施用和动物数目在以下实验设计表中显示。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000642
(iii)样品采集
在第94天收集小鼠#3-2的肿瘤用于FFPE。在第140天收集小鼠#5-2和5-3的肿瘤并将其包埋入1个FFPE块中。
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图10所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表28显示在携带LU-01-0251异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中开始治疗后第0天至第28天的平均肿瘤体积。
表28：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000643
Figure BDA0002637477470000651
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第17天的肿瘤体积测量结果，计算LU-01-0251PDX模型中BCY6136和ADC的肿瘤生长抑制率。
表29：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000652
a.平均值±SEM；
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136和ADC在LU-01-0251PDX模型中的治疗功效。图10和表28和表29显示了在各个时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
在这项研究中，当平均肿瘤体积达到960mm3时开始治疗。在开始治疗后的第17天，载剂治疗小鼠的平均肿瘤体积达到2301mm3。在第17天，1mg/kg qw的BCY6136(TV＝1672mm3，TGI＝47.0％，p＞0.05)没有显示明显的抗肿瘤活性；2mg/kg qw的BCY6136(TV＝398mm3，TGI＝142.1％，p＜0.001)和3mg/kg qw的BCY6136(TV＝216mm3，TGI＝155.6％，p＜0.001)产生了剂量依赖性的抗肿瘤活性。
用2mg/kg qw的BCY6136治疗70天后，其中5只小鼠中有3只显示出完全的肿瘤消退，其他2只小鼠从第42天到第77天出现明显的肿瘤复发。然后从第7天开始用3mg/kg qw的BCY6136进一步对这两个复发性肿瘤进行治疗，其中一个肿瘤显示出明显的肿瘤消退，而另一个则显示出对治疗的抗性。
用3mg/kg qw的BCY6136治疗56天后，该组所有小鼠均显示出完全的肿瘤消退。
第17天，3mg/kg qw的ADC(TV＝1143mm3，TGI＝86.3％，p＜0.01)显示出明显的抗肿瘤活性，在另一53天的治疗后，这些小鼠表现出进一步但未完全消退的肿瘤。
在这项研究中，有些小鼠表现出突然的体重减轻，这可能与免疫缺陷小鼠的长期喂养有关。
研究12：BCY6136在Balb/c裸鼠LU-01-0046NSCLC PDX模型中的体内功效研究
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠的大LU-01-0046PDX肿瘤中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000661
(c)实验方法与程序
(i)肿瘤接种
每只小鼠的右侧腹皮下接种LU-01-0046肿瘤碎片(约30mm3)，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到1039mm3时开始治疗。各组中测试物的施用和动物数目在以下实验设计表中显示。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000662
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图11所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表30显示携带LU-01-0046的雌性Balb/c裸鼠随时间变化的平均肿瘤体积。
表30：随时间变化的肿瘤体积追踪(BCY部分)
Figure BDA0002637477470000663
Figure BDA0002637477470000671
注：第2和第4组在第22天后未显示肿瘤体积追踪。
(iii)肿瘤生长抑制分析
在开始治疗后的两部分研究中，分别基于第22天和第28天的肿瘤体积测量结果，计算LU-01-0046PDX模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表31：肿瘤生长抑制分析(第22天BCY部分)
Figure BDA0002637477470000672
a.平均值±SEM；
b.将治疗组的平均肿瘤体积除以对照组的平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
*某些组在第22天之前终止，并通过指数增长方程式获取计算肿瘤尺寸，如下：
载剂组：Y＝995.4×exp(0.1134×X)。
BCY6136，1mpk组：Y＝855.0×exp(0.0974×X)。
ADC，3mpk组：Y＝757.4×exp(0.1312×X)。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在大LU-01-0046肿瘤中的治疗功效。图11以及表30和表31显示了在各个时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
在这项研究中，载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸在第22天计算为6186mm3。当从1000mm3的肿瘤尺寸开始治疗时，1mg/kg的BCY6136和3mg/kg的ADC均未显示明显的抗肿瘤活性。
3mg/kg的BCY6136(TV＝233mm3，TGI＝115.6％，p<0.001)产生显著的抗肿瘤活性。具体而言，BCY6136消除了整个肿瘤的2/5和4/5。
研究13：BCY6136在携带LU-01-0046NSCLC PDX模型的Balb/c裸鼠中的体内功效
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在携带LU-01-0046NSCLC PDX模型的Balb/c裸鼠中的体内治疗功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000681
注：当平均肿瘤体积超过2000mm3时，组终止，并收集肿瘤用于FFPE：组1在PG-D14、组5在PG-D18、组2和组6在PG-D21，以及组3和组4在PG-D31。
(c)实验方法与程序
(i)肿瘤接种
每只小鼠的右侧腹皮下接种某种肿瘤碎片(约30mm3)，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到约198mm3时，开始治疗。各组中测试物的施用和动物数目在以下实验设计表中显示。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000682
注：通常，给药制剂应及时新鲜配制。
(iii)样品采集
当平均肿瘤体积超过2000mm3时，组终止，并在最后一次测量后，收集肿瘤用于FFPE：组1在PG-D14、组5在PG-D18、组2和组6在PG-D21、组3和组4在PG-D31。
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图12所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表32显示携带LU-01-0046NSCLC PDX模型的雌性Balb/c裸鼠随时间变化的平均肿瘤体积。
表32：随时间变化的肿瘤体积追踪(mm3)
Figure BDA0002637477470000691
(iii)肿瘤生长抑制分析
基于在PG-D14测量的肿瘤体积，计算出携带LU-01-0046PDX模型的Balb/c裸鼠中测试物的肿瘤生长抑制率。
表33：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000692
a.平均值±SEM。
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
c.用以下公式计算每组的TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100
(e)结果总结与讨论
在本研究中，评估了测试物在LU-01-0046PDX模型中的治疗功效。图12和表32和表33显示了在各个时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
在PG-D14，载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸达到2307mm3。BCY6136以1mg/kg(TV＝1058mm3，TGI＝59.1％，p<0.05)、以2mg/kg(TV＝264mm3，TGI＝97.0％，p<0.001)和3mg/kg(TV＝26mm3，TGI＝108.3％，p<0.001)时，产生剂量依赖性的抗肿瘤活性。3mg/kg和5mg/kg的ADC均无明显的抗肿瘤活性(p>0.05)。
在这项研究中，该组所有动物的体重均保持良好。
研究14：BCY6136、BCY6173和BCY6175在Balb/c裸鼠的LU-01-0046 NSCLC PDX模型 中的体内功效研究
(a)研究目的
这项研究的目的是评估测试物在Balb/c裸鼠LU-01-0046NSCLC PDX模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000701
(c)实验方法与程序
(i)肿瘤接种
每只小鼠的右侧腹皮下接种LU-01-0046肿瘤碎片(约30mm3)用以形成肿瘤。当第1部分研究的平均肿瘤体积达到200mm3，而第2部分研究的平均肿瘤体积达到192mm3时，开始治疗。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数目。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000702
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图13至图15所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表34和表35显示了开始治疗后第21天携带LU-01-0046的雌性Balb/c裸鼠的平均肿瘤体积。
表34：随时间变化的肿瘤体积追踪(第1部分)
Figure BDA0002637477470000711
表35：随时间变化的肿瘤体积追踪(部分2)
Figure BDA0002637477470000712
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第21天的肿瘤体积测量值，计算LU-01-0046PDX模型中测试物的肿瘤生长抑制率。
表36：肿瘤生长抑制分析(第1部分)
Figure BDA0002637477470000713
a.平均值±SEM；b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
表37：肿瘤生长抑制分析(第2部分)
Figure BDA0002637477470000714
Figure BDA0002637477470000721
a.平均值±SEM；b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了测试物在LU-01-0046PDX模型中的治疗功效。图13至图15和表34至表37显示了在各时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
在第1部分研究中，在开始治疗后的第21天，载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸达到了2551mm3。
1/2mg/kg，qw的BCY6136(TV＝1285mm3，TGI＝53.9％，p＜0.001)产生显著的抗肿瘤活性，但未显示任何肿瘤消退。3mg/kg，qw的BCY6136(TV＝0mm3，TGI＝108.5％，p＜0.001)完全消除了肿瘤，在3mg/kg BCY6136的组中，5个肿瘤中的一个分别在给药暂停之后显示再生长，当恢复给药时，肿瘤对BICY6136治疗产生抗性。BCY6136组的其余肿瘤(每组中的4/5)在给药暂停80天后没有再生长。在第2部分的研究中，在开始治疗后的第21天，载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸达到了2342mm3。1mg/kg，qw的BCY6173(TV＝2151mm3，TGI＝8.9％，p＞0.05)没有显示出抗肿瘤活性。3mg/kg qw的BCY6173(TV＝890mm3，TGI＝67.5％，p＜0.05)产生明显的抗肿瘤活性。
3mg/kg，qw的BCY6175(TV＝0mm3，TGI＝108.9％，p＜0.001)在第14天完全消除4/5的肿瘤。
研究15：BCY6136在Balb/c裸鼠的LU-01-0412NSCLC PDX模型中的体内功效研究
(a)研究目的
该项目的目的是评估BCY6136在BALB/c裸鼠LU-01-0412NSCLC PDX模型中的体内治疗功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000722
(c)实验方法与程序
(i)肿瘤接种
每只小鼠在右侧腹皮下接种LU-01-0412肿瘤碎片(约30mm3)用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到159mm3时，将动物随机分组。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数目。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000731
(iii)样品收集
在给药后30分钟和24小时，收集来自载剂和另外3只用BCY6136、BCY8245和BCY8781治疗的小鼠的血浆。在给药后24小时，收集来自载剂和另外3只用BCY6136、BCY8245和BCY8781治疗的小鼠的肿瘤。
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图16所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表38显示了携带LU-01-0412异种移植物的雌性BALB/c裸鼠中随时间变化的平均肿瘤体积。
表38：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000732
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第32天的肿瘤体积测量结果，计算LU-01-0412异种移植模型中BCY6136、BCY8245和BCY8781的肿瘤生长抑制率。
表39：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000741
a.平均值±SEM；
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136、BCY8245和BCY8781在LU-01-0412异种移植模型中的治疗功效。图16以及表38和表39显示了在各个时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
在开始治疗后的第32天，载剂治疗小鼠的平均肿瘤体积达到1104mm3。1mg/kg，qw*4的BCY6136(TV＝758mm3，TGI＝36.7％，p＜0.05)和3mg/kg，qw*4的BCY6136(TV＝416mm3，TGI＝72.9％，p＜0.001)产生剂量依赖性抗肿瘤活性，但未显示任何肿瘤消退。3mg/kg，qw*4的BCY8245(TV＝1mm3，TGI＝116.8％，p<0.001)和3mg/kg，qw*4的BCY8781在(TV＝12mm3，TGI＝115.6％，p<0.001))使肿瘤明显消退。其中，在第32天，用3mg/kg BCY8245治疗的6个肿瘤中的5个和用3mg/kg BCY8781治疗的6个肿瘤中的2个被完全消除。
在这项研究中，所有组的动物都保持良好的体重。
研究16：BCY6136在Balb/c裸鼠中治疗LU-01-0486PDX模型的体内功效研究
(a)研究目的
本研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠LU-01-0486PDX模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000742
(c)实验方法与程序
(i)肿瘤接种
每只小鼠的右侧腹皮下接种LU-01-0486肿瘤碎片(约30mm3)，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到180mm3时，开始治疗，以进行疗效研究。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数目。
(ii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000751
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图17所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表40显示了在开始治疗后第14天携带LU-01-0486异种移植物的雌性Balb/c裸鼠的平均肿瘤体积。
表40：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000752
(iii)肿瘤生长抑制分析
基于开始治疗后第14天的肿瘤体积测量结果，计算LU-01-0486PDX模型中BCY6136的肿瘤生长抑制率。
表41：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000753
a.平均值±SEM；b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在LU-01-0486PDX模型中的治疗功效。图17以及表40和表41显示了在各时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
在这项研究中，在开始治疗后的第14天，载剂治疗小鼠的平均肿瘤体积达到651mm3。BCY6136在1mg/kg，qw(TV＝638mm3，TGI＝3.0％，p＞0.05)和2mg/kg，qw(TV＝645mm3，TGI＝1.2％，p＞0.05)时，均未显示任何抗肿瘤活性。BCY6136在3mg/kg，qw(TV＝449mm3，TGI＝43.1％，p＞0.05)时产生轻微的抗肿瘤活性，无统计学显著性。
研究17：BCY6136在Balb/c裸鼠中治疗MDA-MB-231-luc异种移植的体内功效测试
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠中治疗MDA-MB-231-luc异种移植模型中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000761
(c)实验方法与程序
(i)细胞培养
收获在指数生长期生长的细胞并计数以进行肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
将每只小鼠的右侧腹皮下接种0.1ml PBS中的MDA-MB-231-luc肿瘤细胞(10×10^6)和0.1ml基质胶，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到159mm3时，将36只动物随机分组。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数目。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000762
(iv)样品采集
在PG-D33，我们收集并固定组2的肿瘤用于FFPE。
在研究结束时，我们收集并固定组3和组4的肿瘤用于FFPE。
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长如图18所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表42至表44显示了携带MDA-MB-231-luc异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中随时间变化的平均肿瘤体积。
表42：肿瘤体积追踪(PG-D0至PG-D17)
Figure BDA0002637477470000771
表43：肿瘤体积追踪(PG-D19至PG-D33)
Figure BDA0002637477470000772
表44：肿瘤体积追踪(PG-D35至PG-D47)
Figure BDA0002637477470000773
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第21天的肿瘤体积测量结果，计算MDA-MB-231-luc异种移植模型中BCY6136的肿瘤生长抑制率。
表45：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000774
Figure BDA0002637477470000781
a.平均值±SEM。
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在MDA-MB-231-luc异种移植模型中的治疗功效。图18和表42至表45显示了在各时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸在第21天达到1661mm3。1mg/kg的BCY6136(TV＝994mm3，TGI＝44.4％，p<0.01)显示出中等的抗肿瘤活性，BCY6136在2mg/kg(TV＝33mm3，TGI＝108.4％，p<0.001)和3mg/kg(TV＝132mm3，TGI＝101.1％，p<0.001)产生有效的抗肿瘤活性，但从第28天起，肿瘤表现出明显的再生长。在这项研究中，用2mg/kg BCY6136治疗的一只小鼠在治疗方案中体重减轻了15％以上，其他小鼠保持了良好的体重。
研究18：BCY6136在BALB/c小鼠中治疗EMT-6同基因模型的体内功效测试
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在BALB/c小鼠的EMT-6同基因模型治疗中的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000782
a.每只小鼠的注射体积为10ml/kg。
b.从第14天起，将第3组和第4组的剂量改为5mpk和3mpk。
(c)实验方法与程序
(i)细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的EMEM介质中，在37℃空气中5％CO2的气氛中，EMT-6肿瘤细胞以单层培养的形式进行体外培养。常规每周两次，通过胰蛋白酶-EDTA处理将肿瘤细胞传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数以进行肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
每只小鼠在右侧腹皮下接种0.1ml PBS中的EMT-6肿瘤细胞(5x 106)，用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到75mm3时，将44只动物随机分组。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数目。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000791
Figure BDA0002637477470000792
(iv)样品采集
在第11天从备用小鼠中收集3个肿瘤用于FACS。数据由生物学小组提供。
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图19所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表46显示了携带EMT-6同基因的雌性BALB/c小鼠中随时间变化的平均肿瘤体积。
表46：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000793
从第14天起，将第3组和第4组的剂量改为5mpk和3mpk。
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第21天的肿瘤体积测量结果，计算BCY6136在EMT-6同基因模型中的肿瘤生长抑制率。
表47：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000801
a.平均值±SEM。
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
c.从第14天起，将第3组和第4组的剂量改为5mpk和3mpk。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在EMT-6同基因模型中的治疗功效。图19以及表46和表47显示了在各时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
在第21天，载剂治疗小鼠的肿瘤尺寸达到1499mm3。BCY6136在3mg/kg，qw(TV＝561mm3，TGI＝66.2％，p＜0.05)时表现出明显的抗肿瘤活性。BCY6136在1/5mg/kg，qw(TV＝1272mm3，TGI＝16.1％，p>0.05)和BCY6136在0.3/3mg/kg，qw(TV＝1394mm3，TGI＝7.4％，p>0.05)时未显示任何抗肿瘤活性。
从第14天起，将第3组和第4组的剂量改为5mpk和3mpk。在第14天，小鼠3-5中发现了肿瘤溃疡，并用抗生素乳膏处理小鼠。在这项研究中，所有小鼠均保持良好的体重。
研究19：BCY6136在Balb/c裸鼠中治疗NCI-N87异种移植的体内功效研究
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠中治疗NCI-N87异种移植的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000802
(c)实验方法与程序
(i)细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640介质中，在37℃于空气中5％的CO2气氛中，培养NCI-N87肿瘤细胞。常规每周两次将肿瘤细胞传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数以进行肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
将每只小鼠的右侧腹皮下接种0.2ml PBS中的NCI-N87肿瘤细胞(10×106)和基质胶(1：1)，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到约176mm3时，将动物随机分组并开始治疗。实验设计表中显示每组的测试物施用和动物数目。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000811
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图20所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表48显示了携带NCI-N87异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中随时间变化的平均肿瘤体积。
表48：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000812
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第30天的肿瘤体积测量结果，计算BCY6136在NCI-N87异种移植中的肿瘤生长抑制率。
表49：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000813
Figure BDA0002637477470000821
a.平均值±SEM。
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在NCI-N87模型中的治疗功效。图20以及表48和表49显示了在各时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸在第30天达到1465mm3。BCY6136在1mg/kg，qw(TV＝425mm3，TGI＝80.7％，p<0.001)和2mg/kg，qw(TV＝210mm3，TGI＝97.4％，p<0.001)时，以剂量依赖性方式产生显著的抗肿瘤活性，BCY6136在3mg/kg，qw(TV＝201mm3，TGI＝98.1％，p<0.001)时，表现出与2mpk的BCY6136相当的抗肿瘤活性。
在这项研究中，治疗方案期间所有组均未发现明显的体重减轻。
研究20：BCY6136在Balb/c裸鼠中治疗SK-OV-3异种移植的体内功效研究
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠中治疗SK-OV-3异种移植的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000822
(c)实验方法与程序
(i)细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的McCoy’s 5a介质中，于37℃在空气中5％CO2的气氛中，培养SK-OV-3肿瘤细胞。常规每周两次将肿瘤细胞传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数以进行肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
将每只小鼠的右侧腹皮下接种0.2ml PBS中的SK-OV-3肿瘤细胞(10×106)和基质胶(1：1)，用于肿瘤的形成。当平均肿瘤体积达到约186mm3时，将动物随机分组并开始治疗。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数目。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000831
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图21所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表50显示携带SK-OV-3异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中随时间变化的平均肿瘤体积。
表50：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000832
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第28天的肿瘤体积测量结果，计算BCY6136在SK-OV-3异种移植中的肿瘤生长抑制率。
表51：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000833
Figure BDA0002637477470000841
a.平均值±SEM。
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在SK-OV-3模型中的治疗功效。图21以及表50和表51显示了在各时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸在第28天达到1560mm3。ADC在3mg/kg，qw(TV＝684mm3，TGI＝63.8％，p<0.01)时，显示出中等的抗肿瘤功效。BCY6136在1mg/kg，qw(TV＝1035mm3，TGI＝38.1％，p>0.05)时，没有显示明显的抗肿瘤活性。BCY6136在2mg/kg，qw(TV＝277mm3，TGI＝93.3％，p<0.001)和3mg/kg，qw(TV＝254mm3，TGI＝95.0％，p<0.001)时产生显著的抗肿瘤活性。
在这项研究中，治疗方案期间所有组均未发现明显的体重减轻。
研究21：BCY6136在Balb/c裸鼠中治疗OE21异种移植的体内功效研究
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在Balb/c裸鼠中治疗OE21异种移植的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
Figure BDA0002637477470000842
(c)实验方法与程序
(i)细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640介质中，于37℃在空气中5％CO2的气氛中，培养OE21肿瘤细胞。常规每周两次将肿瘤细胞传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数以进行肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
将每只小鼠的右侧腹皮下接种0.2ml PBS中的OE21肿瘤细胞(5×106)和基质胶(1：1)，用于肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到约157mm3时，将动物随机分组并开始治疗。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数目。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000843
Figure BDA0002637477470000851
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图22所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表52显示携带OE21异种移植的雌性Balb/c裸鼠中随时间变化的平均肿瘤体积。
表52：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000852
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第23天的肿瘤体积测量结果，计算BCY6136在OE21异种移植中的肿瘤生长抑制率。
表53：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000853
a.平均值±SEM。
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在OE21模型中的治疗功效。图22以及表52和表53显示了在各个时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸在第23天达到1586mm3。BCY6136在1mg/kg，qw(TV＝1155mm3，TGI＝30.4％p<0.05)时显示出轻微的抗肿瘤活性。BCY6136在2mg/kg，qw(TV＝537mm3，TGI＝73.4％，p<0.001)和3mg/kg，qw(TV＝489mm3，TGI＝76.7％，p<0.001)时，产生显著的抗肿瘤活性。
在这项研究中，治疗方案期间所有组均未发现明显的体重减轻。
研究22：BCY6136在CB17-SCID小鼠中治疗MOLP-8异种移植的体内功效测试
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY6136在CB17-SCID小鼠中治疗MOLP-8异种移植的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
组 治疗 n 剂量(mg/kg) 给药体积(μl/g) 给药途径 方案
1 载剂 3 -- 10 iv qw
2 BCY6136 3 1 10 iv qw
3 BCY6136 3 2 10 iv qw
4 BCY6136 3 3 10 iv qw
(c)实验方法与程序
(i)细胞培养
在补充有20％热灭活胎牛血清的RMPI-1640中，在37℃空气中5％CO2的气氛中，MOLP-8肿瘤细胞以单层培养的形式进行体外培养。常规通过胰蛋白酶-EDTA处理将肿瘤细胞传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数以进行肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
每只小鼠在右侧腹皮下接种0.2ml PBS中的MOLP-8肿瘤细胞(10×106)和50％基质胶，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到141mm3时，将36只动物随机分组。实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数目。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000861
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图23所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表54显示了携带MOLP-8异种移植物的雌性CB17-SCID小鼠中随时间变化的平均肿瘤体积。
表54：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000871
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第14天的肿瘤体积测量结果，计算MOLP-8异种移植模型中BCY6136的肿瘤生长抑制率。
表55：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000872
a.平均值±SEM。
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY6136在MOLP-8异种移植模型中的治疗功效。图23以及表54和表55显示了在各个时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
在第14天，载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸达到2528mm3。BCY6136在1mg/kg(TV＝1146mm3，TGI＝45.5％，p>0.05)，2mg/kg(TV＝1218mm3，TGI＝54.9％，p<0.05)和3mg/kg(TV＝938mm3，TGI＝66.7％，p<0.01)时，产生剂量依赖性的抗肿瘤活性，但所有剂量均未使MOLP-8异种移植中的肿瘤消退。在这项研究中，所有小鼠均保持了良好的体重。
研究23：BCY在BALB/c裸鼠中治疗HT1080异种移植的体内功效测试
(a)研究目的
这项研究的目的是评估BCY在BALB/c裸鼠中治疗HT1080异种移植模型的体内抗肿瘤功效。
(b)实验设计
组 治疗 n 剂量(mg/kg) 给药体积(μl/g) 给药途径 方案
1 载剂 3 -- 10 iv qw
2 BCY6173 3 1 10 iv qw
3 BCY6173 3 2 10 iv qw
4 BCY6173 3 3 10 iv qw
5 BCY6135 3 1 10 iv qw
6 BCY6135 3 2 10 iv qw
7 BCY6135 3 3 10 iv qw
8 BCY6136 3 2 10 iv qw
9 BCY6136 3 3 10 iv qw
10 BCY6136 3 5 10 iv qw
11 BCY6174 3 1 10 iv qw
12 BCY6174 3 2 10 iv qw
13 BCY6174 3 3 10 iv qw
14 BCY6175 3 1 10 iv qw
15 BCY6175 3 2 10 iv qw
16 BCY6175 3 3 10 iv qw
17 ADC 3 3 10 iv qw
注：n：动物数目；给药体积：根据体重10μl/g调整给药体积。
(c)实验方法与程序
(i)细胞培养
在补充有10％热灭活胎牛血清的介质中，于37℃在空气中5％CO2的气氛中，培养HT1080肿瘤细胞。常规每周两次传代培养肿瘤细胞。将收获在指数生长期生长的细胞，并计数以进行肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
将每只小鼠的右侧腹皮下接种HT1080肿瘤细胞(5*106)，用以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到约150-200mm3时，将动物随机分组并开始治疗。以下实验设计表中显示了每组的测试物施用和动物数目。
(iii)测试物制剂的制备
Figure BDA0002637477470000881
Figure BDA0002637477470000891
(d)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图24至图29所示。
(ii)肿瘤体积追踪
表56显示了携带HT1080异种移植物的雌性Balb/c裸鼠中随时间变化的平均肿瘤体积。
表56：随时间变化的肿瘤体积追踪
Figure BDA0002637477470000892
Figure BDA0002637477470000901
(iii)肿瘤生长抑制分析
根据开始治疗后第14天的肿瘤体积测量结果，计算HT1080异种移植模型中BCY的肿瘤生长抑制率。
表57：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0002637477470000902
a.平均值±SEM。
b.将治疗组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)，来计算肿瘤生长抑制。
(e)结果总结与讨论
在这项研究中，评估了BCY在HT1080异种移植模型中的治疗功效。图24至图29以及表56和表57显示了在各个时间点所有治疗组测量的肿瘤体积。
在第14天，载剂治疗小鼠的平均肿瘤尺寸达到1737mm3。
1mg/kg，qw(TV＝1074mm3，TGI＝42.5％，p>0.05)、2mg/kg，qw(TV＝480mm3，TGI＝80.6％，p<0.05)和3mg/kg qw(TV＝7mm3，TGI＝108.4％，p<0.01)的BCY6173产生剂量依赖性的抗肿瘤活性。
1mg/kg，qw(TV＝871mm3，TGI＝55.5％，p<0.01)、2mg/kg，qw(TV＝62mm3，TGI＝107.5％，p<0.001)和3mg/kg，qw(TV＝44mm3，TGI＝108.6％，p<0.001)的BCY6135产生剂量依赖性的抗肿瘤活性。
2mg/kg，qw(TV＝345mm3，TGI＝95.7％，p<0.001)、3mg/kg，qw(TV＝3mm3，TGI＝111.2％，p<0.001)和5mg/kg，qw(TV＝2mm3，TGI＝111.3％，p<0.001)的BCY6136显示出有效的抗肿瘤活性。
1mg/kg，qw(TV＝1066mm3，TGI＝43.1％，p<0.05)、2mg/kg，qw(TV＝532mm3，TGI＝77.3％，p<0.01)和3mg/kg，qw(TV＝11mm3，TGI＝110.7％，p<0.001)的BCY6174产生剂量依赖性的抗肿瘤活性。
1mg/kg，qw(TV＝769mm3，TGI＝62.1％，p<0.01)、2mg/kg，qw(TV＝295mm3，TGI＝92.5％，p<0.001)和3mg/kg，qw(TV＝11mm3，TGI＝110.8％，p<0.001)的BCY6175产生剂量依赖性的抗肿瘤活性。
3mg/kg，qw(TV＝0mm3，TGI＝111.5％)ADC在第14天时完全消除肿瘤。
序列表
<110> 拜斯科技术开发有限公司
<120> 特异于EphA2的双环肽配体
<130> BIC-C-P2469PCT
<150> GB1721259.8
<151> 2017-12-19
<150> GB1804102.0
<151> 2018-03-14
<150> GB1818603.1
<151> 2018-11-14
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> X代表HyP
<220>
<221> Xaa
<222> (12)..(12)
<223> Xaa代表D-Asp
<220>
<221> Xaa
<222> (14)..(14)
<223> Xaa代表HArg
<400> 1
Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp Xaa Cys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa代表Beta-Ala
<220>
<221> Xaa
<222> (2)..(2)
<223> Xaa代表Sar10
<220>
<221> Xaa
<222> (4)..(4)
<223> Xaa代表HArg
<220>
<221> Xaa
<222> (7)..(7)
<223> Xaa代表HyP
<220>
<221> Xaa
<222> (17)..(17)
<223> Xaa代表D-Asp
<220>
<221> Xaa
<222> (19)..(19)
<223> Xaa代表HArg
<400> 2
Xaa Xaa Ala Xaa Asp Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro
1 5 10 15
Xaa Trp Xaa Cys
20
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa代表Cit
<220>
<221> Xaa
<222> (5)..(5)
<223> Xaa代表hPhe
<400> 3
Glu Pro Xaa Gly Xaa Tyr Leu
1 5
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa代表Fl
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa代表Sar5
<400> 4
Xaa Gly Xaa Ala Cys Pro Trp Gly Pro Ala Trp Cys Pro Val Asn Arg
1 5 10 15
Pro Gly Cys Ala
20
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa代表Fl
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa代表Sar5
<400> 5
Xaa Gly Xaa Ala Cys Pro Trp Gly Pro Phe Trp Cys Pro Val Asn Arg
1 5 10 15
Pro Gly Cys Ala
20
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa代表Fl
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> Xaa代表Sar5
<400> 6
Xaa Gly Xaa Ala Asp Val Thr Cys Pro Trp Gly Pro Phe Trp Cys Pro
1 5 10 15
Val Asn Arg Pro Gly Cys Ala
20

Claims (21)

1.一种特异于EphA2的肽配体或其药学上可接受的盐，所述肽配体包含多肽和非芳香族分子支架，其中所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个半胱氨酸残基，所述非芳香族分子支架与所述多肽的半胱氨酸残基形成共价键，使得在所述分子支架上形成至少两个多肽环，其中所述肽配体包含氨基酸序列：
Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：1)；
其中HyP是羟基脯氨酸，HArg是高精氨酸，以及Ci、Cii和Ciii分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的肽配体，其中所述分子支架为1，1′，1″-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。
3.根据权利要求1或2所述的肽配体，其中所述肽配体包含氨基酸序列：
(β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii(SEQ ID NO：2)(BCY6099)；
其中，Sar是肌氨酸，HArg是高精氨酸，以及HyP是羟基脯氨酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽配体，其中所述药学上可接受的盐选自游离酸、或钠、钾、钙、铵盐。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽配体，其中所述EphA2是人EphA2。
6.一种药物缀合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的肽配体，所述肽配体缀合至一个或多个效应物和/或官能团，例如细胞毒性剂。
7.根据权利要求6所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂选自DM1或MMAE。
8.根据权利要求7所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂选自MMAE。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的药物缀合物，其在所述肽配体和所述细胞毒性剂之间还包含接头。
10.根据权利要求9所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是MMAE，并且所述接头选自：-Val-Cit-、-Trp-Cit-、-Val-Lys-、-D-Trp-Cit-、-Ala-Ala-Asn-、D-Ala-Phe-Lys-或-Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-Tyr-Leu-(SEQ ID NO：3)。
11.根据权利要求10所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是MMAE，并且所述接头是-Val-Cit-。
12.根据权利要求9所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是DM1，并且所述接头选自：-S-S-、-SS(SO3H)-、-SS-(Me)-、-(Me)-SS-(Me)-、-SS-(Me2)-或-SS-(Me)-SO3H-。
13.根据权利要求12所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是DM1，并且所述接头选自：-S-S-和-SS(SO3H)-。
14.根据权利要求6至13中任一项所述的药物缀合物，其选自以下的任一项：BCY6027、BCY6028、BCY61535、BCY6136、BCY6173、BCY6174和BCY6175。
15.根据权利要求14所述的药物缀合物，其选自以下的任一项：BCY6031、BCY6033、BCY6082、BCY6135、BCY6136、BCY6173、BCY6174和BCY6175。
16.根据权利要求14或15所述的药物缀合物，其为BCY6136。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的肽配体或权利要求6至16中任一项所述的药物缀合物，以及联合一种或多种药学上可接受的赋形剂。
18.根据权利要求6至16中任一项所述的药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗疾病或病症的用途，所述疾病或病症的特征在于在患病组织中过度表达EphA2。
19.根据权利要求6至16中任一项所述的药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗癌症的用途。
20.根据权利要求19所述的药物缀合物的用途，其中所述癌症选自：前列腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、胃癌、卵巢癌、食道癌、多发性骨髓瘤和纤维肉瘤。
21.一种预防、抑制或治疗癌症的方法，其包括向有需求的患者施用权利要求6至16中任一项所限定的药物缀合物，其中所述患者被鉴定为具有增加的EphA2拷贝数变化(CNV)。
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