EA047678B1 - БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДНЫЕ ЛИГАНДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К EphA2 - Google Patents
БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДНЫЕ ЛИГАНДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К EphA2 Download PDFInfo
- Publication number
- EA047678B1 EA047678B1 EA202091519 EA047678B1 EA 047678 B1 EA047678 B1 EA 047678B1 EA 202091519 EA202091519 EA 202091519 EA 047678 B1 EA047678 B1 EA 047678B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- ala
- sar
- harg
- μmol
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 296
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims description 106
- 108010055196 EphA2 Receptor Proteins 0.000 title claims description 7
- 102000051096 EphA2 Receptor Human genes 0.000 title claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 335
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 170
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 162
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 136
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 135
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N Arginine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 73
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 66
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 53
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 42
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 claims description 39
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 39
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 39
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 39
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 36
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 35
- IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N [4-[[(2S)-5-(carbamoylamino)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)hexanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]pentanoyl]amino]phenyl]methyl N-[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1S,2R)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-methylamino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-N-methylcarbamate Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]([C@@H](CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)c1ccccc1)OC)N(C)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)OCc1ccc(NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCCN2C(=O)CCC2=O)C(C)C)cc1)C(C)C IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N 0.000 claims description 32
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 27
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 27
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 20
- 239000002062 molecular scaffold Substances 0.000 claims description 20
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 17
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 17
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 16
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 15
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N homoserine Chemical compound OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical group C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 claims description 11
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 9
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 8
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 claims description 8
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- RSIWALKZYXPAGW-NSHDSACASA-N 6-(3-fluorophenyl)-3-methyl-7-[(1s)-1-(7h-purin-6-ylamino)ethyl]-[1,3]thiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-one Chemical compound C=1([C@@H](NC=2C=3N=CNC=3N=CN=2)C)N=C2SC=C(C)N2C(=O)C=1C1=CC=CC(F)=C1 RSIWALKZYXPAGW-NSHDSACASA-N 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 7
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 claims description 7
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 7
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 claims description 7
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N L-cysteine sulfonic acid Natural products OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 5
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000022679 triple-negative breast carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N (2s)-2-(naphthalen-1-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC=CC2=C1 IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 claims description 3
- RWLSBXBFZHDHHX-VIFPVBQESA-N (2s)-2-(naphthalen-2-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC=C21 RWLSBXBFZHDHHX-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N D-Cysteine Chemical compound SC[C@@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 2
- 229930028154 D-arginine Natural products 0.000 claims description 2
- 229930195710 D‐cysteine Natural products 0.000 claims description 2
- JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N L-homophenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC1=CC=CC=C1 JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims 7
- 125000001431 2-aminoisobutyric acid group Chemical group [#6]C([#6])(N*)C(*)=O 0.000 claims 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229930195721 D-histidine Natural products 0.000 claims 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 101100434216 Physarum polycephalum ARDC gene Proteins 0.000 claims 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N tert-butylglycine Chemical group CC(C)(C)C(N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 190
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 176
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 148
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 146
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 134
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 133
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 110
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 102
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 101
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 95
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 93
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 93
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 88
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 79
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 79
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 73
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 72
- 102100030340 Ephrin type-A receptor 2 Human genes 0.000 description 71
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 70
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 70
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 62
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 58
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 55
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 55
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 53
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 53
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 53
- 108091022873 acetoacetate decarboxylase Proteins 0.000 description 49
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 49
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 47
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 46
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 46
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 44
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 44
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 42
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 41
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 36
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 36
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 32
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 32
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 31
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 31
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 29
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 29
- -1 factor XIIA Proteins 0.000 description 29
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 29
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 28
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 28
- 108010093470 monomethyl auristatin E Proteins 0.000 description 28
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 27
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 27
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 27
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 27
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 26
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 23
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 23
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 21
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 21
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 20
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 19
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 18
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 18
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 16
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- 108010055191 EphA3 Receptor Proteins 0.000 description 14
- 102100030324 Ephrin type-A receptor 3 Human genes 0.000 description 14
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108010055179 EphA4 Receptor Proteins 0.000 description 13
- 102100021616 Ephrin type-A receptor 4 Human genes 0.000 description 13
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 13
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 13
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 12
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 229910006069 SO3H Inorganic materials 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 11
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 11
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 10
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 10
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 10
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 10
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 9
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 9
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 9
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 9
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 9
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- VANNPISTIUFMLH-UHFFFAOYSA-N glutaric anhydride Chemical compound O=C1CCCC(=O)O1 VANNPISTIUFMLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 8
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 8
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 8
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 8
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 8
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 8
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 8
- AXKGIPZJYUNAIW-UHFFFAOYSA-N (4-aminophenyl)methanol Chemical compound NC1=CC=C(CO)C=C1 AXKGIPZJYUNAIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WGFNXGPBPIJYLI-UHFFFAOYSA-N 2,6-difluoro-3-[(3-fluorophenyl)sulfonylamino]-n-(3-methoxy-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridin-5-yl)benzamide Chemical compound C1=C2C(OC)=NNC2=NC=C1NC(=O)C(C=1F)=C(F)C=CC=1NS(=O)(=O)C1=CC=CC(F)=C1 WGFNXGPBPIJYLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- GKQLYSROISKDLL-UHFFFAOYSA-N EEDQ Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)OCC)C(OCC)C=CC2=C1 GKQLYSROISKDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101000797092 Mesorhizobium japonicum (strain LMG 29417 / CECT 9101 / MAFF 303099) Probable acetoacetate decarboxylase 3 Proteins 0.000 description 7
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010055207 EphA6 Receptor Proteins 0.000 description 6
- 108010055153 EphA7 Receptor Proteins 0.000 description 6
- 102100021606 Ephrin type-A receptor 7 Human genes 0.000 description 6
- 102100031983 Ephrin type-B receptor 4 Human genes 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- ACBQROXDOHKANW-UHFFFAOYSA-N bis(4-nitrophenyl) carbonate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 ACBQROXDOHKANW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 6
- 102000012803 ephrin Human genes 0.000 description 6
- 108060002566 ephrin Proteins 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 6
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 5
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 5
- 102000050554 Eph Family Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108091008815 Eph receptors Proteins 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 5
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JSHOVKSMJRQOGY-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(pyridin-2-yldisulfanyl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCSSC1=CC=CC=N1 JSHOVKSMJRQOGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GTBCXYYVWHFQRS-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(pyridin-2-yldisulfanyl)pentanoate Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC(C)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O GTBCXYYVWHFQRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 4
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PBYIIRLNRCVTMQ-UHFFFAOYSA-N 2,3,5,6-tetrafluorophenol Chemical compound OC1=C(F)C(F)=CC(F)=C1F PBYIIRLNRCVTMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OOUPHXWHXYLQBK-UHFFFAOYSA-N 4-(pyridin-2-yldisulfanyl)pentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(C)SSC1=CC=CC=N1 OOUPHXWHXYLQBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TYMIFYJJOPYXBG-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl piperidine-1-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N1CCCCC1 TYMIFYJJOPYXBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 4
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010055182 EphA5 Receptor Proteins 0.000 description 4
- 102100021605 Ephrin type-A receptor 5 Human genes 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 4
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 4
- 102100030859 Tissue factor Human genes 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 4
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 4
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 4
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 4
- DTRIDVOOPAQEEL-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylbutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCS DTRIDVOOPAQEEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NEAFWRKPYYJETG-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylpentanoic acid Chemical compound CC(S)CCC(O)=O NEAFWRKPYYJETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 3
- 102100030322 Ephrin type-A receptor 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100030779 Ephrin type-B receptor 1 Human genes 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000938354 Homo sapiens Ephrin type-A receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 101001064150 Homo sapiens Ephrin type-B receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 150000002678 macrocyclic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical group 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FODJWPHPWBKDON-LJQANCHMSA-N (2r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@H](CC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 FODJWPHPWBKDON-LJQANCHMSA-N 0.000 description 2
- PCJHOCNJLMFYCV-NRFANRHFSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-2-phenylacetic acid Chemical compound C1([C@H](NC(=O)OCC2C3=CC=CC=C3C3=CC=CC=C32)C(=O)O)=CC=CC=C1 PCJHOCNJLMFYCV-NRFANRHFSA-N 0.000 description 2
- VZOHGJIGTNUNNC-GOSISDBHSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 VZOHGJIGTNUNNC-GOSISDBHSA-N 0.000 description 2
- VSGACONKQRJFGX-NDEPHWFRSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(4-phenylphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(C=C1)=CC=C1C1=CC=CC=C1 VSGACONKQRJFGX-NDEPHWFRSA-N 0.000 description 2
- AJXDCHXGNUFBRC-FQEVSTJZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(furan-2-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CO1 AJXDCHXGNUFBRC-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 2
- JQLPMTXRCLXOJO-NRFANRHFSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-pyridin-3-ylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CN=C1 JQLPMTXRCLXOJO-NRFANRHFSA-N 0.000 description 2
- SCSSXJVRZMQUKA-NRFANRHFSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-pyridin-4-ylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=NC=C1 SCSSXJVRZMQUKA-NRFANRHFSA-N 0.000 description 2
- PXBMQFMUHRNKTG-FQEVSTJZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-thiophen-2-ylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CS1 PXBMQFMUHRNKTG-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 2
- AGGWFDNPHKLBBV-YUMQZZPRSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-5-(carbamoylamino)pentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=O AGGWFDNPHKLBBV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 2
- HTFVKMHFUBCIMH-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-triiodo-1,3,5-triazinane-2,4,6-trione Chemical compound IN1C(=O)N(I)C(=O)N(I)C1=O HTFVKMHFUBCIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KEQGZUUPPQEDPF-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloro-5,5-dimethylimidazolidine-2,4-dione Chemical compound CC1(C)N(Cl)C(=O)N(Cl)C1=O KEQGZUUPPQEDPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- VCUXVXLUOHDHKK-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminopyrimidin-4-yl)-4-(2-chloro-4-methoxyphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide Chemical compound ClC1=CC(OC)=CC=C1C1=C(C(N)=O)SC(C=2N=C(N)N=CC=2)=N1 VCUXVXLUOHDHKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QEBYEVQKHRUYPE-UHFFFAOYSA-N 2-(2-chlorophenyl)-5-[(1-methylpyrazol-3-yl)methyl]-4-[[methyl(pyridin-3-ylmethyl)amino]methyl]-1h-pyrazolo[4,3-c]pyridine-3,6-dione Chemical compound C1=CN(C)N=C1CN1C(=O)C=C2NN(C=3C(=CC=CC=3)Cl)C(=O)C2=C1CN(C)CC1=CC=CN=C1 QEBYEVQKHRUYPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl n-[[4-[2-[bis(4-methylphenyl)methylamino]-2-oxoethoxy]phenyl]-(2,4-dimethoxyphenyl)methyl]carbamate Chemical compound COC1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OCC(=O)NC(C=2C=CC(C)=CC=2)C=2C=CC(C)=CC=2)=CC=1)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHNRLQRZRNKOKU-UHFFFAOYSA-N CCN(CC1=NC2=C(N1)C1=CC=C(C=C1N=C2N)C1=NNC=C1)C(C)=O Chemical compound CCN(CC1=NC2=C(N1)C1=CC=C(C=C1N=C2N)C1=NNC=C1)C(C)=O UHNRLQRZRNKOKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000938346 Homo sapiens Ephrin type-A receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000033833 Myelomonocytic Chronic Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102000056189 Neutrophil collagenases Human genes 0.000 description 2
- 108030001564 Neutrophil collagenases Proteins 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N butan-1-amine Chemical compound CCCCN HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWIUPIRUAQMTTK-UHFFFAOYSA-N carbazic acid Chemical compound NNC(O)=O OWIUPIRUAQMTTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N chlorosulfonic acid Substances OS(Cl)(=O)=O XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 201000010902 chronic myelomonocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- JBDSSBMEKXHSJF-UHFFFAOYSA-N cyclopentanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCC1 JBDSSBMEKXHSJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 2
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical compound CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 2
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 2
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMTDKXQYAKLQKF-INIZCTEOSA-N (2r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 RMTDKXQYAKLQKF-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- KLBPUVPNPAJWHZ-UMSFTDKQSA-N (2r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-tritylsulfanylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)SC(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 KLBPUVPNPAJWHZ-UMSFTDKQSA-N 0.000 description 1
- HNICLNKVURBTKV-MUUNZHRXSA-N (2r)-5-[[amino-[(2,2,4,6,7-pentamethyl-3h-1-benzofuran-5-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@@H](C(O)=O)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C1=C(C)C(C)=C2OC(C)(C)CC2=C1C HNICLNKVURBTKV-MUUNZHRXSA-N 0.000 description 1
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- RMTDKXQYAKLQKF-MRXNPFEDSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@H](CS)C(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 RMTDKXQYAKLQKF-MRXNPFEDSA-N 0.000 description 1
- VVDBQHCKPZBJPG-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(furan-2-ylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1=CC=CO1 VVDBQHCKPZBJPG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N (2s)-2-[[(2r,3r)-3-methoxy-3-[(2s)-1-[(3r,4s,5s)-3-methoxy-5-methyl-4-[methyl-[(2s)-3-methyl-2-[[(2s)-3-methyl-2-(methylamino)butanoyl]amino]butanoyl]amino]heptanoyl]pyrrolidin-2-yl]-2-methylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- PECGVEGMRUZOML-AWEZNQCLSA-N (2s)-2-amino-3,3-diphenylpropanoic acid Chemical compound C=1C=CC=CC=1C([C@H](N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 PECGVEGMRUZOML-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- NRCSJHVDTAAISV-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-(3,4-dichlorophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 NRCSJHVDTAAISV-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- PEMUHKUIQHFMTH-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-(4-bromophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(Br)C=C1 PEMUHKUIQHFMTH-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- SRGOJUDAJKUDAZ-LURJTMIESA-N (2s)-2-amino-3-cyclobutylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1CCC1 SRGOJUDAJKUDAZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- XVWFTOJHOHJIMQ-BYPYZUCNSA-N (2s)-2-azaniumyl-3-(1,2,4-triazol-1-yl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CN1C=NC=N1 XVWFTOJHOHJIMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XGUXJMWPVJQIHI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-azaniumyl-3-cyclopropylpropanoate Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CC1CC1 XGUXJMWPVJQIHI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FQFVANSXYKWQOT-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-azaniumyl-3-pyridin-4-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=NC=C1 FQFVANSXYKWQOT-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- SZXBQTSZISFIAO-ZETCQYMHSA-N (2s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C SZXBQTSZISFIAO-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- NBMSMZSRTIOFOK-SFHVURJKSA-N (2s)-5-(carbamoylamino)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCNC(=O)N)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NBMSMZSRTIOFOK-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- WPBXBYOKQUEIDW-VFNWGFHPSA-N (2s,4r)-1-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C1[C@H](OC(C)(C)C)C[C@@H](C(O)=O)N1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 WPBXBYOKQUEIDW-VFNWGFHPSA-N 0.000 description 1
- CJEQUGHYFSTTQT-SGTLLEGYSA-N (2s,4s)-1-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)-4-fluoropyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1C[C@H](F)CN1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 CJEQUGHYFSTTQT-SGTLLEGYSA-N 0.000 description 1
- NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) carbonochloridate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(Cl)=O)C=C1 NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N (4r,7s,10s,13r,16s,19r)-10-(4-aminobutyl)-19-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-16-benzyl-n-[(2r,3r)-1,3-dihydroxybutan-2-yl]-7-[(1r)-1-hydroxyethyl]-13-(1h-indol-3-ylmethyl)-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carboxa Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC1=O)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N 0.000 description 1
- DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N (R)-camphor Chemical compound C1C[C@@]2(C)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N 0.000 description 1
- 229930007886 (R)-camphor Natural products 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- FABVRSFEBCDJLC-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-tris(bromomethyl)benzene Chemical compound BrCC1=CC=CC(CBr)=C1CBr FABVRSFEBCDJLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVTVMQPGKVHSEY-UHFFFAOYSA-N 1-AMINOCYCLOBUTANE CARBOXYLIC ACID Chemical compound OC(=O)C1(N)CCC1 FVTVMQPGKVHSEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NILQLFBWTXNUOE-UHFFFAOYSA-N 1-aminocyclopentanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1(N)CCCC1 NILQLFBWTXNUOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAJPWUMXBYXFCZ-UHFFFAOYSA-N 1-aminocyclopropanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1(N)CC1 PAJPWUMXBYXFCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- SZEBGAQWWSUOHT-UHFFFAOYSA-N 2-(4-bromophenoxy)acetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Br)C=C1 SZEBGAQWWSUOHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRHRHAWNXCGABU-UHFFFAOYSA-N 2-(cyclopentylazaniumyl)acetate Chemical compound OC(=O)CNC1CCCC1 LRHRHAWNXCGABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DXQCCQKRNWMECV-UHFFFAOYSA-N 2-(cyclopropylazaniumyl)acetate Chemical compound OC(=O)CNC1CC1 DXQCCQKRNWMECV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-thiophen-2-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CS1 WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-15-(4-hydroxy-18-methoxycarbonyl-5,18-seco-ibogamin-18-yl)-16-methoxy-1-methyl-6,7-didehydro-aspidospermidine-3-carboxylic acid methyl ester Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ULKDIPSSLZFIQU-UHFFFAOYSA-N 3-[(2-bromoacetyl)amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCNC(=O)CBr ULKDIPSSLZFIQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 1
- SLMVEZKWNOGJPD-UHFFFAOYSA-N 4-(pyridin-2-yldisulfanyl)butanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCSSC1=CC=CC=N1 SLMVEZKWNOGJPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPMKMQHJHDHPBE-RUZDIDTESA-N 4-[[(2r)-1-(1-benzothiophene-3-carbonyl)-2-methylazetidine-2-carbonyl]-[(3-chlorophenyl)methyl]amino]butanoic acid Chemical compound O=C([C@@]1(N(CC1)C(=O)C=1C2=CC=CC=C2SC=1)C)N(CCCC(O)=O)CC1=CC=CC(Cl)=C1 MPMKMQHJHDHPBE-RUZDIDTESA-N 0.000 description 1
- QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 4-[[(3ar,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13as)-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-3a-[(5-methylpyridine-3-carbonyl)amino]-2-oxo-1-propan-2-yl-4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-dodecahydro-3h-cyclopenta[a]chrysen-9-yl]oxy]-2,2-dimethyl-4-oxobutanoic acid Chemical group N([C@@]12CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@H]5C(C)(C)[C@@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@@H]3C1=C(C(C2)=O)C(C)C)C(=O)C1=CN=CC(C)=C1 QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 0.000 description 1
- JQVMMZMKXGQVGQ-UHFFFAOYSA-N 4-benzylpyrrolidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound C1NC(C(=O)O)CC1CC1=CC=CC=C1 JQVMMZMKXGQVGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIWHMENIDGOELV-UHFFFAOYSA-N 4-fluoropyrrolidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound OC(=O)C1CC(F)CN1 ZIWHMENIDGOELV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GTVVZTAFGPQSPC-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenylalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 GTVVZTAFGPQSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHHOFXBPLJDHOR-UHFFFAOYSA-N 4-phenylpyrrolidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound C1NC(C(=O)O)CC1C1=CC=CC=C1 JHHOFXBPLJDHOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101800002011 Amphipathic peptide Proteins 0.000 description 1
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 1
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 201000011057 Breast sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241001598984 Bromius obscurus Species 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 description 1
- 101100294106 Caenorhabditis elegans nhr-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N Carbon-14 Chemical compound [14C] OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 150000008541 D-alanines Chemical class 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008334 Dermatofibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010057070 Dermatofibrosarcoma protuberans Diseases 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical compound C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 108700006830 Drosophila Antp Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000007033 Dysgerminoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000471 Dysplastic Nevus Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010062805 Dysplastic naevus Diseases 0.000 description 1
- 101150076616 EPHA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000001976 Endocrine Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010014967 Ependymoma Diseases 0.000 description 1
- 101710116743 Ephrin type-A receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100023721 Ephrin-B2 Human genes 0.000 description 1
- 108010044090 Ephrin-B2 Proteins 0.000 description 1
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005231 Epithelioid sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032027 Essential Thrombocythemia Diseases 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001134 F-test Methods 0.000 description 1
- 108010058861 Fibrin Fibrinogen Degradation Products Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004463 Follicular Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010155 Games-Howell test Methods 0.000 description 1
- 206010051066 Gastrointestinal stromal tumour Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical group NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001258 Hemangiosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000910338 Homo sapiens Carbonic anhydrase 9 Proteins 0.000 description 1
- 101100507424 Homo sapiens HPSE gene Proteins 0.000 description 1
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 208000006937 Hydatidiform mole Diseases 0.000 description 1
- 206010048643 Hypereosinophilic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010065042 Immune reconstitution inflammatory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 208000009164 Islet Cell Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010023347 Keratoacanthoma Diseases 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- XVOYSCVBGLVSOL-REOHCLBHSA-N L-cysteic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N L-pipecolic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]1CCCC[NH2+]1 HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052765 Lutetium Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000037196 Medullary thyroid carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DMUAPQTXSSNEDD-QALJCMCCSA-N Midecamycin Chemical compound C1[C@](O)(C)[C@@H](OC(=O)CC)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N(C)C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)CC)CC(=O)O[C@H](C)C/C=C/C=C/[C@H](O)[C@H](C)C[C@@H]2CC=O)OC)O[C@@H]1C DMUAPQTXSSNEDD-QALJCMCCSA-N 0.000 description 1
- 208000010190 Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100451971 Mus musculus Ephx2 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000014767 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- NUGPIZCTELGDOS-QHCPKHFHSA-N N-[(1S)-3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-pyridin-3-ylpropyl]cyclopentanecarboxamide Chemical compound C(C)(C)C1=NN=C(N1C1CCN(CC1)CC[C@@H](C=1C=NC=CC=1)NC(=O)C1CCCC1)C NUGPIZCTELGDOS-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 238000007126 N-alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028729 Nasal cavity cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000034176 Neoplasms, Germ Cell and Embryonal Diseases 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 description 1
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 description 1
- GEYBMYRBIABFTA-UHFFFAOYSA-N O-methyltyrosine Chemical compound COC1=CC=C(CC(N)C(O)=O)C=C1 GEYBMYRBIABFTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016076 Octreotide Proteins 0.000 description 1
- 208000003937 Paranasal Sinus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010033963 Parathyroid tumour Diseases 0.000 description 1
- 241000157426 Pernis Species 0.000 description 1
- 208000009565 Pharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000007641 Pinealoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004337 Salivary Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061934 Salivary gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 201000010208 Seminoma Diseases 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 1
- 101710192266 Tegument protein VP22 Proteins 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006842 Tonsillar Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N Trichloroethylene Chemical compound ClC=C(Cl)Cl XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 206010050283 Tumour ulceration Diseases 0.000 description 1
- 102100031358 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 201000006083 Xeroderma Pigmentosum Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- YVJDMFNWKCNZAT-SQKCAUCHSA-L [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@H](CS([O-])(=O)=O)NC(=O)OCC1c2ccccc2-c2ccccc12 Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@H](CS([O-])(=O)=O)NC(=O)OCC1c2ccccc2-c2ccccc12 YVJDMFNWKCNZAT-SQKCAUCHSA-L 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 159000000021 acetate salts Chemical group 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 208000017733 acquired polycythemia vera Diseases 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001266 acyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- UGJQDKYTAYNNBH-UHFFFAOYSA-N amino cyclopropanecarboxylate Chemical compound NOC(=O)C1CC1 UGJQDKYTAYNNBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- XCPGHVQEEXUHNC-UHFFFAOYSA-N amsacrine Chemical compound COC1=CC(NS(C)(=O)=O)=CC=C1NC1=C(C=CC=C2)C2=NC2=CC=CC=C12 XCPGHVQEEXUHNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001220 amsacrine Drugs 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940045688 antineoplastic antimetabolites pyrimidine analogues Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 230000034720 apoptotic signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 description 1
- HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N azetidine Chemical compound C1CNC1 HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid group Chemical group C(C1=CC=CC=C1)(=O)O WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052797 bismuth Inorganic materials 0.000 description 1
- JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N bismuth atom Chemical compound [Bi] JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229930195731 calicheamicin Natural products 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 208000002458 carcinoid tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 150000001767 cationic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002576 chemokine receptor CXCR4 antagonist Substances 0.000 description 1
- 208000012191 childhood neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 229940121384 cxc chemokine receptor type 4 (cxcr4) antagonist Drugs 0.000 description 1
- TXWOGHSRPAYOML-UHFFFAOYSA-N cyclobutanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCC1 TXWOGHSRPAYOML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- YMGUBTXCNDTFJI-UHFFFAOYSA-N cyclopropanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CC1 YMGUBTXCNDTFJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001944 cysteine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 208000014616 embryonal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 231100001129 embryonic lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 201000011523 endocrine gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YJGVMLPVUAXIQN-UHFFFAOYSA-N epipodophyllotoxin Natural products COC1=C(OC)C(OC)=CC(C2C3=CC=4OCOC=4C=C3C(O)C3C2C(OC3)=O)=C1 YJGVMLPVUAXIQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960000752 etoposide phosphate Drugs 0.000 description 1
- LIQODXNTTZAGID-OCBXBXKTSA-N etoposide phosphate Chemical compound COC1=C(OP(O)(O)=O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 LIQODXNTTZAGID-OCBXBXKTSA-N 0.000 description 1
- 210000003020 exocrine pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000208 fibrin degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000000282 fibrinogen degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- RZRRJPNDKJOLHI-QFIPXVFZSA-N fmoc-4-nitro-l-phenylalanine Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 RZRRJPNDKJOLHI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000004744 fore-foot Anatomy 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 229910052733 gallium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010062699 gamma-Glutamyl Hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000003911 head and neck carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 201000000284 histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 102000051505 human CA9 Human genes 0.000 description 1
- 102000052645 human CD38 Human genes 0.000 description 1
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 description 1
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229910001411 inorganic cation Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N l-pipecolic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 201000005264 laryngeal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 201000004962 larynx cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000003866 lung sarcoma Diseases 0.000 description 1
- OHSVLFRHMCKCQY-UHFFFAOYSA-N lutetium atom Chemical compound [Lu] OHSVLFRHMCKCQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005710 macrocyclization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 208000025848 malignant tumor of nasopharynx Diseases 0.000 description 1
- WKPWGQKGSOKKOO-RSFHAFMBSA-N maytansine Chemical class CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@](OC(=O)N1)([C@H]([C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(C)=O)CC(=O)N1C)C)[H])\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 WKPWGQKGSOKKOO-RSFHAFMBSA-N 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical compound ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 208000023356 medullary thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960003194 meglumine Drugs 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 description 1
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 201000005328 monoclonal gammopathy of uncertain significance Diseases 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 206010028537 myelofibrosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002071 myeloproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000754 myometrium Anatomy 0.000 description 1
- GTWJETSWSUWSEJ-UHFFFAOYSA-N n-benzylaniline Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNC1=CC=CC=C1 GTWJETSWSUWSEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 201000007425 nasal cavity carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007538 neurilemmoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004649 neutrophil actin dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 1
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002700 octreotide Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid group Chemical group C(CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)(=O)O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 201000005443 oral cavity cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 150000002892 organic cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N palmitic acid group Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022102 pancreatic neuroendocrine neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003695 paranasal sinus Anatomy 0.000 description 1
- 208000022775 paranasal sinus carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000004466 pelleted feed Substances 0.000 description 1
- 108010043655 penetratin Proteins 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N pentanoic acid group Chemical class C(CCCC)(=O)O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 201000008006 pharynx cancer Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229960001237 podophyllotoxin Drugs 0.000 description 1
- YJGVMLPVUAXIQN-XVVDYKMHSA-N podophyllotoxin Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@H](O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 YJGVMLPVUAXIQN-XVVDYKMHSA-N 0.000 description 1
- YVCVYCSAAZQOJI-UHFFFAOYSA-N podophyllotoxin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2C3=CC=4OCOC=4C=C3C(O)C3C2C(OC3)=O)=C1 YVCVYCSAAZQOJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000037244 polycythemia vera Diseases 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 208000017805 post-transplant lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 208000003476 primary myelofibrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000029340 primitive neuroectodermal tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 108010037022 subtiligase Proteins 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical class O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002653 sulfanylmethyl group Chemical group [H]SC([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 208000030901 thyroid gland follicular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000013818 thyroid gland medullary carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
- 208000029387 trophoblastic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000017997 tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N vindesine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(N)=O)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1N=C1[C]2C=CC=C1 UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N 0.000 description 1
- 229960004355 vindesine Drugs 0.000 description 1
- GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N vinorelbine Chemical compound C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N 0.000 description 1
- 229960002066 vinorelbine Drugs 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012447 xenograft mouse model Methods 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
- VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N yttrium atom Chemical compound [Y] VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые ковалентно связываются с неароматическими молекулярными каркасами таким образом, что между точками присоединения к каркасу размещаются две или более пептидных петель. В частности, в изобретении описываются пептиды, которые с высокой аффинностью связывают Eph-рецептор A2 тирозинкиназы (EphA2). Изобретение также относится к конъюгатам лекарственных средств, включающим указанные пептиды, конъюгированные с одной или более эффекторными и/или функциональными группами, к фармацевтическим композициям, включающим указанные пептидные лиганды и конъюгаты лекарственных средств, и к применению указанных пептидных лигандов и конъюгатов лекарственных средств для предотвращения, торможения развития или лечения заболевания или нарушения, характеризующегося сверхэкспрессией EphA2 в пораженной ткани (такой как опухоль).
Уровень техники
Циклические пептиды способны связываться с высокой аффинностью и специфичностью с белками-мишенями и, поэтому, являются перспективным классом молекул для создания терапевтических средств. И в действительности, несколько циклических пептидов уже успешно применяются в клинике, такие как, например, антибактериальный пептид ванкомицин, иммунодепрессант циклоспорин или противораковое средство октреотид (Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). Высокие характеристики связывания обусловлены относительно большой поверхностью взаимодействия, образованной между пептидом и мишенью, а также пониженной конформационной гибкости циклических структур. Как правило, макроциклы связываются с поверхностями в несколько сотен квадратных ангстрем, например, в случае циклического пептида CXCR4 антагониста CVX15 площадь связывания составляет 400 А2 (Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), в случае циклического пептида с мотивом Arg-GlyAsp связывания с интегрином aVb3-355 А2 (Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151-5) или в случае циклического пептидного ингибитора связывания упаин-1 с активатор плазминогена урокиназного типа 603 А2 (Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10).
Вследствие циклической конфигурации, пептидные макроциклы являются менее гибкими, чем линейные пептиды, что приводит к меньшим потерям энтропии после связывания с мишенями и обуславливает более высокую аффинность связывания. Пониженная гибкость также приводит к фиксации специфичных к мишени конформаций, что повышает специфичность связывания по сравнению с линейными пептидами. Этот эффект был проиллюстрирован на примере высокоактивного и селективного ингибитора матриксной металлопротеиназы 8 (MMP-8), который терял свою селективность в отношении других матриксных металлопротеиназ (MMP) в случае раскрытия его кольца (Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749-51). Благоприятные характеристики связывания, которые достигаются в результате макроциклизации, проявляются в еще большей степени у полициклических пептидов, имеющих более чем одно пептидное кольцо, например, у ванкомицина, низина и актиномицина.
Ранее, различные группы исследователей осуществляли связывание полипептидов, содержащих остатки цистеина, с синтетической молекулярной структурой (Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Meloen с коллегами использовали трис(бромметил)бензол и родственные молекулы для быстрой и количественной циклизации множества пептидных петель на синтетических каркасах для структурной мимикрии поверхностей белков (Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Методы синтеза представляющих интерес лекарственных соединений, в которых указанные соединения синтезируют путем связывания содержащих цистеин полипептидов с молекулярным каркасом, таким как, например, TATA (1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1-он, описаны в публикации Heinis et al. Angew Chem, Int Ed. 2014; 53:1602-1606).
Для генерирования и изображения больших библиотек бициклических пептидов для представляющих интерес мишеней были разработаны основанные на комбинаторных подходах метод фагового дисплея (Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 и WO 2009/098450). Вкратце, комбинаторные библиотеки линейных пептидов, содержащих три остатка цистеина и две области шести рандомизированных аминокислот (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys) отображали на фаге и циклизировали путем ковалентного связывания боковых цепей цистеина с каркасом малой молекулы.
Сущность изобретения
В соответствии с первым аспектом изобретения, предлагается пептидный лиганд, обладающий специфичностью к EphA2, включающий полипептид, содержащий, по меньшей мере, три остатка цистеина, разделенных, по меньшей мере, двумя петлевыми последовательностями, и неароматический молекулярный каркас, который образует ковалентные связи с остатками цистеина полипептида, в результате чего образуются, по меньшей мере, две полипептидных петли на молекулярном каркасе.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения, предлагается конъюгат лекарственного средства, включающий определенный выше пептидный лиганд, конъюгированный с одной или более эффекторными и/или функциональными группами.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения, предлагается фармацевтическая композиция, включающая определенные выше пептидный лиганд или конъюгат лекарственного средства в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.
- 1 047678
В соответствии с еще одним аспектом изобретения, предлагается определенные выше пептидный лиганд или конъюгат лекарственного средства для применения для предотвращения, торможения развития или лечения заболевания или нарушения, характеризующегося сверхэкспрессией EphA2 в пораженной ткани (такой как опухоль).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Изменения массы тела после введения BCY6031 самкам бестимусных мышей линии Balb/C, несущих опухоль LU-01-0046. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела в группе.
Фиг. 2. Объем остаточной опухоли после введения BCY6031 самкам бестимусных мышей линии Balb/C, несущих опухоль LU-01-0046. Экспериментальные точки представляют среднюю величину. Лечение прекращали со дня 28.
Фиг. 3. Общая схема, демонстрирующая концепцию приготовления бициклических конъюгатов лекарственных средств (BDC).
Фиг. 4. Графическая зависимость средней величины объема опухоли от времени для BCY6136 у мышей с ксенотрансплантатом HT1080. Дозы (2, 3 и 5 мг/кг) вводили в дни 0 и 7. Изменения массы тела в процессе проведения лечения, отражающие размер опухоли, токсическое действие, связанное с применением лекарственного средства, и общее состояние здоровья животного, приведены на графике в правом верхнем углу.
Фиг. 5. Графическая зависимость средней величины объема опухоли от времени для BCY6136 у мышей с ксенотрансплантатом NCI-H1975. Дозы (1, 2 и 3 мг/кг) вводили в дни 0, 7, 14, 21, 28 и 35. Изменения массы тела в процессе проведения лечения, отражающие размер опухоли, токсическое действие, связанное с применением лекарственного средства, и общее состояние здоровья животного, приведены на графике в правом верхнем углу.
Фиг. 6. Графическая зависимость средней величины объема опухоли от времени для BCY6136 у мышей с ксенотрансплантатом MDA-MB-231. Дозы (1, 2 и 3 мг/кг) вводили на день 0, 7, 14, 21, 28, 35 и 45. Изменения массы тела в процессе проведения лечения, отражающие размер опухоли, токсическое действие, связанное с применением лекарственного средства, и общее состояние здоровья животного, приведены на графике в правом верхнем углу.
Фиг. 7-9. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6136 (фиг. 7), ADC (фиг. 8) и BCY6033 (фиг. 9) самкам бестимусных мышей линии Balb/C, несущих ксенотрансплантат PC-3. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 10. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6136, EphA2ADC или доцетаксела самцам бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат PC-3. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 11-13. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6033 (фиг. 11), BCY6136 (фиг. 12) и BCY6082 (фиг. 13) самкам бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат NCI-H1975. Экспериментальные точки представляют средний объем опухоли и среднюю массу тела в группе.
Фиг. 14 и 15. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6136 и ADC самкам бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат LU-01-0251. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 16. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6033, BCY6136, BCY6082 и BCY6031 самкам бестимусных мышей линии Balb/c, несущих LU-01-0046. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 17. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6136 или ADC самкам бестимусных мышей линии Balb/c в модели LU-01-0046 NSCLC PDX. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 18-22. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6033 (фиг. 18), BCY6136 (фиг. 19), BCY6082 (фиг. 20), BCY6173 (фиг. 21) и BCY6175 and BCY6031 (фиг. 22) самкам бестимусных мышей линии Balb/c, несущих LU-01-0046. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 23. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6136 (обозначенного на фиг. 23 как BT5528), BCY8245 или BCY8781 самкам бестимусных мышей линии Balb/C, несущих ксенотрансплантат LU-01-0412. Экспериментальные точки представляют средний объем опухоли (левый график) и среднюю массу тела (правый график) в группе.
Фиг. 24. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6136 самкам бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат LU-01-0486. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 25-27. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6033 (фиг. 25), BCY6136 (фиг. 26) и BCY6082 (фиг. 27) самкам бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат MDA-MB-231-luc. Экспериментальные точки представляют средний объем опухоли и среднюю массу тела в группе.
- 2 047678
Фиг. 28. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6136 самкам мышей линии BALB/c, несущих сингенную EMT-6. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела. Дозы в группе 3 и группе 4 изменяли до 5 мг/кг и 3 мг/кг со дня 14.
Фиг. 29. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6136 самкам бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат NCI-N87. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 30. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6136 самкам бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат SK-OV-3. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 31. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6136 самкам бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат OE21. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 32. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6136 самкам мышей линии CB17-SCID, несущих ксенотрансплантат MOLP-8. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 33. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6082 самкам мышей линии CB17-SCID, несущих ксенотрансплантат MOLP-8. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
Фиг. 34-42. Изменения массы тела и объема остаточной опухоли после введения BCY6082 (фиг. 34), BCY6031 (фиг. 35), BCY6173 (фиг. 36), BCY6135 (фиг. 37), BCY6033 (фиг. 38), BCY6136 (фиг. 39), BCY6174 (фиг. 40), BCY6175 (фиг. 41) и ADC (фиг. 42) самкам бестимусных мышей линии Balb/C, несущих ксенотрансплантат HT1080. Экспериментальные точки представляют среднюю величину массы тела.
В тех случаях, когда на описанных выше фигурах приведены отрезки погрешностей, они представляют стандартную ошибку среднего значения (SEM).
Подробное описание изобретения
В одном варианте осуществления, указанные петлевые последовательности включают 2, 3, 5, 6 или 7 аминокислот.
В еще одном варианте осуществления, указанные петлевые последовательности включают три остатка цистеина, разделенных двумя петлевыми последовательностями, одна из которых состоит из 2 аминокислот, а другая состоит из 7 аминокислот (таких как аминокислоты, которые приведены в табл. 4).
В еще одном варианте осуществления, указанные петлевые последовательности включают три остатка цистеина, разделенных двумя петлевыми последовательностями, обе из которых состоят из 5 аминокислот (таких как аминокислоты, которые приведены в табл. 3 и 4).
В еще одном варианте осуществления, указанные петлевые последовательности включают три остатка цистеина, разделенных двумя петлевыми последовательностями, обе их которых состоят из 6 аминокислот (таких как аминокислоты, которые приведены в табл. 3 и 5).
В еще одном варианте осуществления, указанные петлевые последовательности включают три остатка цистеина, разделенных двумя петлевыми последовательностями, обе их которых состоят из 6 аминокислот (таких как аминокислоты, которые приведены в табл. 10).
В еще одном варианте осуществления, указанные петлевые последовательности включают три остатка цистеина, разделенных двумя петлевыми последовательностями, одна из которых состоит из 7 аминокислот, а другая состоит из 3 аминокислот (таких как аминокислоты, которые приведены в табл. 4).
В еще одном варианте осуществления, указанные петлевые последовательности включают три остатка цистеина, разделенных двумя петлевыми последовательностями, одна из которых состоит из 6 аминокислот, а другая состоит из 7 аминокислот (таких как аминокислоты, которые приведены в табл. 5).
В одном варианте осуществления, пептидный лиганд включает аминокислотную последовательность, выбранную из:
Ci-XrCjj-Xj-Cjjj где X1 и Х2 представляют аминокислотные остатки между остатками цистеина, приведенные в табл. 3-5, и Ci, Cii и Ciii представляют первый, второй и третий остатки цистеина, соответственно, или его фармацевтически приемлемая соль.
В еще одном варианте осуществления, пептидный лиганд включает аминокислотную последовательность, выбранную из одного или более пептидных лигандов, приведенных в одной или более табл. 35.
В еще одном варианте осуществления, пептидный лиганд включает аминокислотную последовательность, выбранную из:
СГХГСИ-Х2-СШ где X1 и Х2 представляют аминокислотные остатки между остатками цистеина, приведенные в табл. 10, и Ci, Cii и Ciii представляют первый, второй и третий остатки цистеина, соответственно, или его фармацевтически приемлемая соль.
В еще одном варианте осуществления, пептидный лиганд включает аминокислотную последова
- 3 047678 тельность, выбранную из одного или более пептидных лигандов, приведенных в табл. 10.
В одном варианте осуществления, указанные петлевые последовательности включают три остатка цистеина, разделенных двумя петлевыми последовательностями, обе из которых состоят из 6 аминокислот, и пептидный лиганд имеет аминокислотную последовательность, выбранную из:
Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ Ш NO: 1) и
CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii (SEQ ID NO: 97);
где HyP представляет собой гидроксипролин, HArg представляет собой гомоаргинин, и Ci, Cii и Ciii представляю первый, второй и третий остатки цистеина, соответственно, или его фармацевтически приемлемая соль.
В еще одном варианте осуществления, указанные петлевые последовательности включают три остатка цистеина, разделенных двумя петлевыми последовательностями, обе из которых состоят из 6 аминокислот, и пептидный лиганд имеет следующую аминокислотную последовательность:
Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 1);
где HyP представляет собой гидроксипролин, HArg представляет собой гомоаргинин, и Ci, Cii и Ciii представляет первый, второй и третий остатки цистеина, соответственно, или его фармацевтически приемлемая соль.
В одном варианте осуществления, пептидный лиганд по изобретению представляет собой пептидный лиганд, который не является аминокислотной последовательностью:
Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 1).
В одном варианте осуществления, указанные петлевые последовательности включают три остатка цистеина, разделенных двумя петлевыми последовательностями, обе из которых состоят из 6 аминокислот, и пептидный лиганд имеет аминокислотную последовательность, выбранную из:
(3-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2)
I(BCY6099; соединение 66); и (3-Ala)-Sar1o-A(HArg)D-CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii ((3-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 11)) (BCY6014; соединение 67);
где Sar представляет собой саркозин, HArg представляет собой гомоаргинин, и HyP представляет собой гидроксипролин.
В еще одном варианте осуществления, указанные петлевые последовательности включают три остатка цистеина, разделенных двумя петлевыми последовательностями, обе из которых состоят из 6 аминокислот, и пептидный лиганд имеет следующую аминокислотную последовательность:
(3-Ala)-Sar1o-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2) (BCY6099; соединение 66);
где Sar представляет собой саркозин, HArg представляет собой гомоаргинин, и HyP представляет собой гидроксипролин.
В одном варианте осуществления, пептидный лиганд по изобретению представляет собой пептидный лиганд, который не является аминокислотной последовательностью:
(3-Ala)-Sar1o-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2) (BCY6099; соединение 66).
В одном варианте осуществления, молекулярный каркас выбирают из 1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5триил)трипроп-2-ен-1-она (TATA), и пептидный лиганд выбирают из любого одного из пептидных лигандов, приведенных в табл. 3-5.
В альтернативном варианте осуществления, молекулярный каркас выбирают из 1,1',1-(1,3,5триазинан-1,3,5-триил)-трипроп-2-ен-1-она (TATA), и пептидный лиганд выбирают из любого одного из пептидных лигандов, приведенных в табл. 10.
В одном варианте осуществления, молекулярный каркас выбирают из 1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5триил)трипроп-2-ен-1-она (TATA), и пептидный лиганд выбирают из:
(3-Ala)-Sar1o-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2)
I(BCY6099; соединение 66); и (3-Ala)-Sar1o-A(HArg)D-CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii((3-Ala)-Sarlo-(SEQ ID NO: 11)) (BCY6014; соединение 67);
где Sar представляет собой саркозин, HArg представляет собой гомоаргинин, и HyP представляет собой гидроксипролин.
В еще одном варианте осуществления, молекулярный каркас выбирают из 1,1',1-(1,3,5-триазинан1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1-она (TATA), и пептидный лиганд представляет собой:
(3-Ala)-Sar1o-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ Ш NO: 2);
где Sar представляет собой саркозин, HArg представляет собой гомоаргинин, и HyP представляет собой гидроксипролин.
В одном варианте осуществления, пептидный лиганд выбирают из любого одного из соединений 1
- 4 047678
113, или его фармацевтически приемлемую соль.
В еще одном варианте осуществления, пептидный лиганд представляет собой соединение 66 (BCY6099) или соединение 67 (BCY6014) или его фармацевтически приемлемую соль.
В еще одном варианте осуществления, пептидный лиганд представляет собой соединение 66 (BCY6099) или его фармацевтически приемлемую соль.
Если не указано иное, то все используемые в изобретении технические и научные термины имеют значение, которое является общепринятым для обычных специалистов в таких областях, как химия пептидов, культивирование клеток и фаговый дисплей, химия нуклеиновых кислот и биохимия. Стандартные методики, используемые в методах молекулярной биологии, в генетических и биохимических методах, описаны в руководствах Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., полное содержание которых включено в настоящее изобретение путем ссылок на них.
Номенклатура.
Нумерация.
При указании положений аминокислотного остатка в пептидах по изобретению, остатки цистеина (Ci, Cii и Ciii) пропускают при нумерации, так как они являются инвариантными, и поэтому, нумерацию аминокислотных остатков в пептидах по изобретению указывают, как показано ниже:
-Ci-HyPl-L2-V3-N4-P5-L6-Cii-L7-H8-P9-(D-Asp)10-Wl l-(HArg)12-Ciii- (SEQ ID NO: 1).
Применительно к целям этого изобретения, предполагается, что все бициклические пептиды циклизируют с 1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1-оном (TATA) с получением структуры тризамещенного 1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипропан-1-она. Циклизация с TATA происходит на Ci, Cii, и Ciii.
Молекулярный формат.
N- или C-концевые удлинения к бициклической сердцевинной последовательности добавляют к левой и правой стороне последовательности через дефис. Например, N-концевой (e-Ala)-Sar10-Ala хвост может обозначаться как:
(e-Ala)-Sar10-A-(SEQ ID NO: X).
Инверсионные пептидные последовательности.
В свете публикации Nair et al. (2003), J Immunol 170(3), 1362-1373, предполагается, что раскрытые в изобретении пептидные последовательности могут также находить применение в их ретро-инверсной форме. Например, последовательность подвергают инверсии (то есть N-конец становится C-концом и наоборот), и их стереохимия аналогично также подвергается инверсии (то есть D-аминокислоты становятся L-аминокислотами и наоборот).
Пептидные лиганды.
Указанный в изобретении пептидный лиганд относится к пептиду, пептидному фрагменту или пептидомиметику, ковалентно связанному с молекулярным каркасом. Обычно, такие пептиды, пептидные фрагменты или пептидомиметики включают пептид, имеющий природные или искусственные аминокислоты, в которых две или более реакционноспособных групп (то есть остатки цистеина) способны образовывать ковалентные связи с каркасом, и последовательность, расположенную между указанными реакционноспособными группами, которую называют петлевой последовательностью, так как она образует петлю, когда пептид, пептидный фрагмент или пептидомиметик связывается с каркасом. В данном случае, пептиды, пептидные фрагменты или пептидомиметики включают, по меньшей мере, три остатка цистеина (обозначаемых в изобретении как Ci, Cii и Ciii) и образуют, по меньшей мере, две петли на каркасе.
Преимущества пептидных лигандов.
Конкретные бициклические пептиды по настоящему изобретению имеют ряд выгодных свойств, которые позволяют рассматривать их в качестве подходящих подобных лекарствам молекул для инъекционного, ингаляционного, назального, офтальмологического, перорального или местного введения. Такие выгодные свойства включают следующие:
перекрестная реактивность с другими видами. Она является обычным требованием для преклинической оценки фармакодинамики и фармакокинетики;
устойчивость к воздействию протеазы. Бициклические пептидные лиганды должны в большинстве случаев демонстрировать устойчивость к воздействию протеаз плазмы, эпителиальных (заякоренных на мембране) протеаз, желудочных и кишечных протеаз, протеаз поверхности легких, внутриклеточных протеаз и других подобных протеаз. Устойчивость к воздействию протеазы должна поддерживаться между различными видами, благодаря чему на животных моделях может быть разработан перспективный прототип бициклического пептида и, кроме того, он может быть введен без опасений людям;
требуемый профиль растворимости. Он представляет собой соотношение заряженных и гидрофильных остатков к гидрофобным остаткам и внутренним/межмолекулярным H-связям, которое является важной для приготовления лекарственной формы и для всасывания;
- 5 047678 оптимальный период полувыведения из плазмы крови. В зависимости от клинических показаний и схемы лечения, может потребоваться разработка бициклического пептида с коротким или пролонгированным in vivo временем экспозиции для проведения лечения либо хронических, либо острых болезненных состояний. Оптимальное время экспозиции будет определяться, с одной стороны, с учетом требования использования пролонгированного времени экспозиции (для максимальной терапевтической эффективности), а с другой стороны, с учетом требования использования короткого времени экспозиции для минимизации токсикологических воздействий, возникающих при использовании пролонгированного воздействия лекарственного средства;
селективность. Конкретные пептидные лиганды по изобретению характеризуются высокой селективностью в отношении других Eph-рецепторов тирозинкиназы, таких как EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphB1, фактора XIIA, карбоангидразы 9 и CD38 (данные по селективности для выбранных пептидных лигандов по изобретению представлены в табл. 7 и 14). Следует также отметить, что выбранные пептидные лиганды по изобретению проявляют перекрестную реактивность с другими видами (например, с мышью и крысой), что позволяет проводить испытания на животных моделях (табл. 3-6 и 15); и безопасность. Сообщалось о случаях кровотечения при проведении преклинических исследований in vivo на моделях и при проведении клинических испытаний с использованием конъюгатов антитела EphA2. Например, было прекращено в фазе 1 открытое исследование препарата MEDI-547 вследствие случаев кровотечения и коагуляции, которые наблюдались у 5 из 6 пациентов (Annunziata et al, Invest New Drugs (2013) 31:77-84). Наблюдаемые случаи кровотечения у пациентов находились в соответствии с воздействиями на систему коагуляции, наблюдаемыми при проведении преклинических исследований на крысах и обезьянах: повышение активированного частичного тромбопластинового времени и увеличение продуктов деградации фибриногена/фибрина (Annunziata et al IBID). Как сообщалось, наблюдались случаи явно выраженных кровотечений при проведении токсикологических исследований на обезьянах (Annunziata et al, IBID). Взятые в совокупности, эти результаты позволяют сделать вывод, что MEDI-547 вызывает диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови (DIC) как у видов животных при проведении преклинических исследований, так и у пациентов. Описанные в изобретении бициклические конъюгаты лекарственных средств (BDC) имеют короткие периоды полувыведения in vivo (< 30 минут) и, вследствие этого, маловероятно, что они будут вызывать диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови (DIC) у пациентов. Приведенные в изобретении результаты (см. Данные исследований биологической активности разделы 5 и 6 и табл. 20) показывают, что выбранные бициклические конъюгаты лекарственных средств по изобретению не влияют на параметры свертывания крови и не вызывают случаев кровотечения при проведении преклинических исследований.
Фармацевтически приемлемые соли.
Следует иметь в виду, что солевые формы включены в объем этого изобретения, и ссылки на пептидные лиганды относятся и к солевым формам указанных лигандов.
Соли по настоящему изобретению могут быть синтезированы из исходного соединения, которое содержит фрагмент с основными или кислотными свойствами, традиционными химическими методами, такими как методы, описанные в монографии Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002. Обычно, такие соли могут быть приготовлены путем взаимодействия форм свободной кислоты или свободного основания этих соединений с соответствующим основанием или кислотой в воде или в органическом растворителе, или в смеси и того и другого.
Соли присоединения кислоты (моно- или дисоли) могут быть образованы с широким разнообразием кислот, как неорганических, так и органических. Примеры солей добавления кислоты включают моноили дисоли, образованные с кислотой, выбранной из группы, состоящей из уксусной, 2,2дихлоруксусной, адипиновой, альгиновой, аскорбиновой (например, L-аскорбиновой), L-аспарагиновой, бензолсульфоновой, бензойной, 4-ацет-амидобензойной, бутановой, (+)-камфорной, камфорсульфоновой, (+)-(^)-камфор-10-сульфоновой, каприновой, капроновой, каприловой, коричной, лимонной, цикламовой, додецилсерной, этан-1,2-дисульфоновой, этансульфоновой, 2-гидроксиэтансульфоновой, муравьиной, фумаровой, галактаровой, гентизиновой, глюкогептоновой, D-глюконовой, глюкуроновой (например, D-глюкуроновой), глутаминовой (например, L-глутаминовой), а-оксоглутаровой, гликолевой, гиппуровой, галогенводородных кислот (например, бромистоводородной, хлористоводородной, йодистоводородной), изетионовой, молочной (например, (+)-Ь-молочной, (±)-DL-молочной), лактобионовой, малеиновой, яблочной, (-)-Ь-яблочной, малоновой, (±)-DL-миндальной, метансульфоновой, нафталин-2сульфоновой, нафталин-1,5-дисульфоновой, 1-гидрокси-2-нафтойной, никотиновой, азотной, олеиновой, оротовой, щавелевой, пальмитиновой, памовой, фосфорной, пропионовой, пировиноградной, Lпироглутаминовой, салициловой, 4-аминосалициловой, себациновой, стеариновой, янтарной, серной, дубильной, (+)-Ь-винной, тиоциановой, п-толуолсульфоновой, ундециленовой и валериановой кислот, а также ацилированных аминокислот и катионообменных смол.
Одна конкретная группа солей состоит из солей, образованных с уксусной, хлористоводородной,
- 6 047678 йодистоводородной, фосфорной, азотной, серной, лимонной, молочной, янтарной, малеиновой, яблочной, изетионовой, фумаровой, бензолсульфоновой, толуолсульфоновой, серной, метансульфоновой (мезилатом), этансульфоновой, нафталинсульфоновой, валериановой, пропановой, бутановой, малоновой, глюкуроновой и лактобионовой кислотами. Одна конкретная соль представляет собой гидрохлоридную соль. Другая конкретная соль представляет собой ацетатную соль.
Если соединение является анионным или имеет функциональную группу, которая может быть анионной (например, COOH может представлять собой COO), то тогда соль может быть образована с органическим или неорганическим основанием, генерирующим подходящий катион. Примеры подходящих неорганических катионов включают, но этим не ограничивая, катионы щелочных металлов, такие как Li+, Na+ и K+, катионы щелочноземельных металлов, такие как Ca2+ и Mg2+, и другие катионы, такие как Al3+ или Zn2+. Примеры подходящих органических катионов включают, но этим не ограничивая, ион аммония (то есть, NH4+) и ионы замещенного аммония (например, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+). Примерами некоторых подходящих ионов замещенного аммония являются ионы, образованные из метиламина, этиламина, диэтиламина, пропиламина, дициклогексиламина, триэтиламина, бутиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, пиперазина, бензиламина, фенилбензиламина, холина, меглумина и трометамина, а также аминокислот, таких как лизин и аргинин. Примером обычного иона четвертичного аммония является N(CH3)4 +.
Когда пептиды по изобретению содержат аминную функциональность, они могут образовывать четвертичные аммониевые соли, например, путем взаимодействия с алкилирующим реагентом в соответствии с методами, которые хорошо известны специалистам. Такие соединения четвертичного аммония включены в объем пептидов по изобретению.
Модифицированные производные.
Следует иметь в виду, что модифицированные производные определенных выше пептидных лигандов входят в объем настоящего изобретения. Примеры таких подходящих модифицированных производных включают одну или более модификаций, выбранных из N-концевых и/или C-концевых модификаций; из замены одного или более аминокислотных остатков на один или более аминокислотных остатков неприродного происхождения (такой как замена одного или более полярных аминокислотных остатков на одну или более изостерических или изоэлектронных аминокислот; такой как замена одного или более полярных аминокислотных остатков на другие неприродные изостерические или изоэлектронные аминокислоты); из добавления спейсерной группы; из замены одного или более чувствительных к окислению аминокислотных остатков на один или более устойчивых к окислению аминокислотных остатков; из замены одного или более аминокислотных остатков с одной или более заменами аминокислот, таких как аланин, из замены одного или более L-аминокислотных остатков на один или более D-аминокислотных остатков; из N-алкилирования одной или более амидных связей внутри бициклического пептидного лиганда; из замены одной или более пептидных связей на суррогатную связь; из модификации длины основной пептидной цепи; из замещения водорода на альфа-углероде одного или более аминокислотных остатков на другую химическую группу, из модификации аминокислот, таких цистеин, лизин, глутамат/аспартат и тирозин, с помощью подходящих аминов, тиолов, карбоновых кислот и реакционноспособных фенольных реагентов, с целью функционализации указанных аминокислот и введения или замены аминокислот, которые придают подходящую для функционализации ортогональную реакционную способность, например, аминокислот, несущих азидную или алкиновую группу, что позволяет проводить функционализацию с помощью фрагментов, несущих алкиновую или азидную группу, соответственно.
В одном варианте осуществления, модифицированное производное включает N-концевую и/или Cконцевую модификацию. В еще одном варианте осуществления, модифицированное производное включает N-концевую модификацию с использованием реакций с подходящими реакционноспособными аминами, и/или C-концевую модификацию с использованием реакций с подходящими реакционноспособными карбоксильными группами. В еще одном варианте осуществления, указанная N-концевая или Cконцевая модификация включает введение эффекторной группы, включающей, но этим не ограничивая, цитотоксическое средство, вещество, образующее хелат с радиоактивным изотопом, или хромофор.
В еще одном варианте осуществления, модифицированное производное включает N-концевую модификацию. В еще одном варианте осуществления, N-концевая модификация включает N-концевую ацетильную группу. В этом варианте осуществления, N-концевой остаток блокируют с помощью уксусного ангидрида или других соответствующих реагентов в процессе проведения пептидного синтеза, что приводит к молекуле, ацетилированной по N-концу. Этот вариант осуществления дает преимущество, заключающееся в удалении возможной точки распознавания для аминопептидаз и в предотвращении возможного распада бициклического пептида.
В альтернативном варианте осуществления, N-концевая модификация включает введение группы молекулярного спейсера, которая облегчает конъюгацию эффекторных групп и сохранение активности бициклического пептида в отношении его мишени.
В еще одном варианте осуществления, модифицированное производное включает C-концевую модификацию. В еще одном варианте осуществления, C-модификация включает амидную группу. В этом варианте осуществления, C-концевой остаток синтезируют в форме амида в процессе проведения синтеза
- 7 047678 пептида, что приводит к молекуле, которая является амидированной на C-конце. Этот вариант осуществления дает преимущество, заключающееся в удалении возможной точки распознавания для аминопептидаз и в предотвращении возможного протеолитического распада бициклического пептида.
В одном варианте осуществления, модифицированное производное включает замену одного или более аминокислотных остатков на один или более неприродных аминокислотных остатков. В этом варианте осуществления, могут быть выбраны неприродные аминокислоты, имеющие изостерические/изоэлектронные боковые цепи, которые не распознаются деструктивными протеазами и не оказывают неблагоприятного воздействия на активность в отношении мишени.
В качестве варианта, могут быть использованы неприродные аминокислоты, имеющие ограниченные боковые цепи аминокислоты, вследствие чего затруднен конформационно и стерически протеолитический гидролиз находящейся рядом пептидной связи. В частности, это относится к аналогам пролина, объемным боковым цепям, Ca-дизамещенным производным (например, аминоизомасляной кислоте, Aib) и циклоаминокислотам, при этом простым производным является аминоциклопропилкарбоновая кислота.
В одном варианте осуществления, модифицированное производное включает введение спейсерной группы. В еще одном варианте осуществления, модифицированное производное включает введение спейсерной группы в N-концевой цистеин (Ci) и/или C-концевой цистеин (Ciii).
В одном варианте осуществления, модифицированное производное включает замену одного или более чувствительных к окислению аминокислотных остатков на один или более устойчивых к окислению аминокислотных остатков. В еще одном варианте осуществления, модифицированное производное включает замену остатка триптофана на остаток нафтилаланина или аланина. Этот вариант осуществления дает преимущество, заключающееся в улучшении профиля фармацевтической стабильности получаемого бициклического пептидного лиганда.
В одном варианте осуществления, модифицированное производное включает замену одного или более заряженных аминокислотных остатков на один или более гидрофобных аминокислотных остатков. В альтернативном варианте осуществления, модифицированное производное включает замену одного или более гидрофобных аминокислотных остатков на один или более заряженных аминокислотных остатков. Правильный баланс между заряженными и гидрофобными аминокислотными остатками является важной характеристикой бициклических пептидных лигандов. Например, гидрофобные аминокислотные остатки влияют на степень связывания белка плазмы и, соответственно, на концентрацию фракции свободного пептида при равновесии в плазме крови, в то время как заряженные аминокислотные остатки (в частности, аргинин) могут влиять на взаимодействие пептида с фосфолипидными мембранами на поверхностях клеток. Комбинация этих двух видов остатков могут влиять на период полувыведения, объем распределения и экспозицию пептидного лекарственного средства, и она может быть адаптирована в соответствии с требуемыми клиническими результатами. Кроме того, скорректированные комбинация и баланс между числом заряженных и гидрофобных аминокислотных остатков может уменьшать разрежение в месте инъекции (если пептидное лекарственное средство вводили подкожно).
В одном варианте осуществления, модифицированное производное включает замену одного или более L-аминокислотным остатков на один или более D-аминокислотным остатков. Предполагают, что этот вариант осуществления позволяет повышать протеолитическую устойчивость, обусловленную стерическим затруднением и предрасположенностью D-аминокислот стабилизировать конформации βповорота (Tugyi et al. (2005) PNAS, 102(2), 413-418).
В одном варианте осуществления, модифицированное производное включает удаление любых аминокислотных остатков и замену их на аланины, такие как D-аланины. Этот вариант осуществления дает преимущество, заключающееся в идентификации ключевых связывающих остатков и удалении места (мест) возможной протеолитической атаки.
Следует отметить, что каждая из упомянутых выше модификаций служит для продуманного улучшения активности или стабильности пептида. Дополнительные повышения активности за счет проведения модификаций может быть достигнуто путем использования следующих механизмов:
введение гидрофобных фрагментов, которые оказывают гидрофобный эффект и приводят к более низкой величине скорости диссоциации, благодаря чему достигаются более высокие величины аффиностей;
введение заряженных групп, которые вызывают дальнее межионное взаимодействие, приводящее к более высокой величине скорости ассоциации и к более высоким величинам аффиностей (смотрите, например, публикацию Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31); и введение дополнительного ограничения в пептид, например, путем скорректированного ограничения боковых цепей аминокислот, в результате чего становится минимальной потеря энтропии после связывания мишени, путем ограничения углов поворота основной цепи, в результате чего становится минимальной потеря энтропии после связывания мишени, и путем введения в молекулу дополнительных циклизаций по тем же самым причинам (для более подробного ознакомления смотрите публикации Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, и Nestor et al., Curr. Medicinal Chem (2009), 16,
- 8 047678
4399-418).
Изотопные варианты.
Настоящее изобретение включает все фармацевтически приемлемые меченые изотопом (радиоактивным изотопом) пептидные лиганды по изобретению, в которых один или более атомов заменены на атомы, имеющие один и тот же атомный номер, но атомную массу или массовое число, отличающиеся от атомной массы или массового числа, обычно обнаруживаемых в природе, и пептидные лиганды по изобретению, к которым присоединены группы, образующие хелаты с металлами, (называемые эффекторными), которые способны удерживать соответствующие изотопы (радиоактивные изотопы), и пептидные лиганды по изобретению, в которых конкретные функциональные группы ковалентно заменены на соответствующие изотопы (радиоактивные изотопы) или меченые изотопом функциональные группы.
Примеры изотопов, применяемых для введения в пептидные лиганды по изобретению, включают изотопы водорода, такие как 2H (D) и 3H (T), углерода, такие как C. 13C и 14C, хлора, такой как36Cl, фтора, такой как 18F, йода, такие как 123I, 125I и 131I, азота, такие как 13N и 15N, кислорода, такие как 15O, 17O и 18O, фосфора, такой как 32P, серы, такой как 35S, меди, такой как 64Cu, галлия, такие как 67Ga или 68Ga, иттрия, такой как 90Y, и лютеция, такой как 177Lu, и висмута, такой как 213Bi.
Конкретные меченые изотопом пептидные лиганды по изобретению, например, пептидные лиганды, в которые введен радиоактивный изотоп, применяют при исследовании распределения лекарственного средства и/или субстрата в ткани и для клинической оценки присутствия и/или отсутствия EphA2мишени в пораженных тканях. Кроме того, пептидные лиганды по изобретению могут иметь важные с точки зрения диагностики свойства, благодаря которым они могут применяться для обнаружения или идентификации образования комплекса между меченым соединением и другими молекулами, пептидами, белками, ферментами или рецепторами. В методах обнаружения или идентификации могут применяться соединения, которые помечены с помощью реагентов для введения метки, таких как радиоактивные изотопы, ферменты, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества (например, люминол, производные люминола, люциферин, экворин и люцифераза), и другие подобные. Для этой цели особенно подходят радиоактивный изотопы тритий, то есть 3H (T), и углерод-14, то есть 14C, с точки зрения легкости их введения и доступности средств для их детекции.
Замена на более тяжелые изотопы, такие как дейтерий, то есть 2H (D), может давать определенные положительные терапевтические эффекты, обусловленные более высокой устойчивостью к инактивации в процессе метаболизма, например, увеличение in vivo периода полувыведения или снижение уровня требуемых доз, и, следовательно, может быть предпочтительным при некоторых обстоятельствах.
Замена на позитронно-активные изотопы, такие как 11C, 18F, 15O и 13N, может быть использована при исследованиях методом позитронной эмиссионной томографии (PET) с целью определения степени заполнения мишени.
Меченые изотопом соединения пептидных лигандов по изобретению могут быть приготовлены, как правило, традиционными методами, известными специалистам в данной области, или методами, аналогичными методам, описанным в примерах изобретения, путем использования соответствующего меченого изотопом реагента вместо ранее используемого немеченого изотопом реагента.
Неароматический молекулярный каркас.
Используемый в изобретении термин неароматический молекулярный каркас относится к любому определенному выше молекулярному каркасу, который не содержит ароматической (то есть ненасыщенной) карбоциклической или гетероциклической кольцевой системы.
Подходящие примеры неароматических молекулярных каркасов описаны в публикации Heinis et al. (2014) Angewandte Chemie, International Edition 53(6) 1602-1606.
Как отмечается в упомянутых выше документах, молекулярный каркас может представлять собой малую молекулу, такую как малая органическая молекула.
В одном варианте осуществления, молекулярный каркас может представлять собой макромолекулу. В одном варианте осуществления, молекулярный каркас представляет собой макромолекулу, состоящую из аминокислот, нуклеотидов или углеводов.
В одном варианте осуществления, молекулярный каркас включает реакционноспособные группы, которые способны взаимодействовать с функциональной группой (группами) полипептида с образованием ковалентных связей.
Молекулярный каркас может включать химические группы, которые образуют связь с пептидом, такие как амины, тиолы, спирты, кетоны, альдегиды, нитрилы, карбоновые кислоты, сложные эфиры, алкены, алкины, азиды, ангидриды, сукцинимиды, малеимиды, алкилгалогениды и ацилгалогениды.
Примером а ненасыщенного карбонилсодержащего соединения является 1,1',1-(1,3,5-триазинан1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1-он (TAtA) (Angewandte Chemie, International Edition (2014), 53(6), 16021606).
Эффекторные и функциональные группы.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения, предлагается конъюгат лекарственного средства, включающий определенный выше пептидный лиганд, конъюгированный с одной или более эффекторными и/или функциональными группами.
- 9 047678
Эффекторные и/или функциональные группы могут быть присоединены, например, к N- и/или Cконцам полипептида, к аминокислоте в полипептиде или к молекулярному каркасу.
Подходящие эффекторные группы включают антитела и их части или фрагменты. Например, эффекторная группа может включать константную область легкой цепи антитела (CL), домен CH1 тяжелой цепи антитела, домен CH2 тяжелой цепи антитела, домен CH3 тяжелой цепи антитела или любую их комбинацию, помимо одного или более доменов константной области. Эффекторная группа может также включать шарнирную область антитела (такую область обычно обнаруживают между доменами CH1 и CH2 в молекуле IgG).
В еще одном варианте осуществления этого аспекта изобретения, эффекторная группа по настоящему изобретению представляет собой Fc область молекулы IgG. Предпочтительно, чтобы, пептидный лиганд-эффекторная группа по настоящему изобретению включал или состоял из слитой конструкции пептидный лиганд-Fc, имеющей te период полувыведения один день или более, два дня или более, 3 дня или более, 4 дня или более, 5 дней или более, 6 дней или более или 7 дней или более. Более предпочтительно, чтобы пептидный лиганд по настоящему изобретению включал или состоял из слитой конструкции пептидный лиганд-Fc, имеющей te период полувыведения один день или более.
Функциональные группы включают, как правило, связывающие группы, лекарственные средства, реакционноспособные группы для присоединения других структурных фрагментов, функциональные группы, которые способствуют захвату макроциклических пептидов клетками, и другие подобные группы.
Способность пептидов проникать в клетки позволяет пептидам быть эффективными в отношении внутриклеточных мишеней. Мишени, доступ пептидов к которым обеспечивается способностью пептидов проникать в клетки, включают факторы транскрипции, внутриклеточные сигнальные молекулы, такие как тирозинкиназы, и молекулы, принимающие участие в апоптозном сигнальном пути. Функциональные группы, которые способны проникать в клетки, включают пептиды или химические группы, которые были добавлены либо к пептиду, либо к молекулярному каркасу. Пептиды, такие как пептиды, полученные из VP22, HIV-Tat, гомеобокса белка дрозофилы (локус Antennapedia), описаны, например в публикациях Chen and Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 4, p821; Gupta et al. in Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57 9637. Примеры коротких пептидов, которые, как было показано, являются эффективными при транслокации через клеточные цитоплазматические мембраны, включают пептид пенетратина из белка дрозофилы локуса Antennapedia с длиной 16 аминокислот (Derossi et al. (1994) J Biol. Chem. Volume 269 p10444), модель амфипатического пептида с длиной 18 аминокислот (Oehlke et al. (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127) и обогащенные аргинином области белка TAT вируса иммунодефицита человека (HIV). Непептидные подходы включают применение имитаторов малых молекул или кальциевых каналов, управляемых вторичным мессенджером (SMOC), которые могут быть легко присоединены к биомолекулам (Okuyama et al. (2007) Nature Methods Volume 4 p153). Другие химические стратегии добавления к молекулам групп гуанидиния также усиливают проникновение в клетки (Elson-Scwab et al. (2007) J Biol Chem Volume 282 p13585). Молекулы с низкой молекулярной массой, такие как стероиды, могут быть добавлены к молекулярному каркасу для усиления усвоения в клетках.
Один класс функциональных групп, которые могут быть присоединены к пептидным лигандам, антитела и их связывающие фрагменты, такие как Fab, Fv, или однодоменные фрагменты. В частности, могут быть использованы антитела, которые связываются с белками, способные увеличивать период полувыведения пептидного лиганда in vivo.
В одном варианте осуществления, пептидный лиганд-эффекторная группа по изобретению имеет te период полувыведения, выбранный из группы, состоящей из 12 ч или более, 24 ч или более, 2 дней или более, 3 дней или более, 4 дней или более, 5 дней или более, 6 дней или более, 7 дней или более, 8 дней или более, 9 дней или более, 10 дней или более, 11 дней или более, 12 дней или более, 13 дней или более, 14 дней или более, 15 дней или более или 20 дней или более. Предпочтительно, чтобы пептидный лиганд-эффекторная группа или композиция по изобретению имела te в диапазоне от 12 до 60 ч. В еще одном варианте осуществления, te период полувыведения составляет один день или более. В еще одном варианте осуществления, te период полувыведения составляет от 12 до 26 ч.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения, функциональную группу выбирают из реагента, образующего хелат с металлом, который применяют для комплексообразования с радиоактивными изотопами металлов медицинского назначения.
Возможные эффекторные группы также включают ферменты, например, такие как карбоксипептидаза G2, для применения в антитело-опосредованной терапии с использованием фермента и пролекарства (ADEPT), в которой антитела заменяют на пептидный лиганд.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения, функциональную группу выбирают из лекарственного средства, такого как цитотоксическое средство для противораковой терапии. Подходящие примеры включают алкилирующие агенты, такие как цисплатин и карбоплатин, а также оксалиплатин, мехлорэтамин, циклофосфамид, хлорамбуцил, ифосфамид; антиметаболиты, в том числе аналоги
- 10 047678 пурина, азатиоприн и меркаптопурин или аналоги пиримидина; растительные алкалоиды и терпеноиды, в том числе алкалоиды барвинка, такие как винкристин, винбластин, винорелбин и виндезин; подофиллотоксин и его производные этопозид и тенипозид; таксаны, включая паклитаксел, ранее известный как таксол; ингибиторы топоизомеразы, в том числе камптотецины; иринотекан и топотекан, и ингибиторы типа II, в том числе амсакрин, этопозид, этопозида фосфат и тенипозид. Другие средства могут включать противоопухолевые антибиотики, которые включают иммунодепрессант дактиномицин (который используется при трансплантациях почки), доксорубицин, эпирубицин, блеомицин, калихеамицины, и другие средства.
В еще одном конкретном варианте осуществления изобретения, цитотоксическое средство выбирают из майтанзиноидов (таких как DM1) или монометил ауристатинов (таких как MMAE).
DM1 представляет собой цитотоксическое средство, которое является тиолсодержащим производным майтансина и имеет следующую структуру:
Монометил ауристатин E (MMAE) представляет собой синтетическое противоопухолевое средство и имеет следующую структуру:
В еще одном дополнительном конкретном варианте осуществления изобретения, цитотоксическое средство выбирают из майтанзиноидов (таких как DM1). Представленные в изобретении данные в табл. 6 иллюстрируют эффекты пептидных лигандов, конъюгированных с токсическими средствами, содержащими DM1.
В одном варианте осуществления, цитотоксическое средство связано с бициклическим пептидом легко расщепляемой связью, такой как дисульфидная связь или чувствительная к воздействию протеазы связь. В еще одном варианте осуществления, модифицируют группы, расположенные рядом с дисульфидной связью, с целью регулирования стерического затруднения при доступе к дисульфидной связи и тем самым скорости расщепления и одновременного высвобождения цитотоксического средства.
Были опубликованы результаты исследования по возможности модифицирования подверженности дисульфидной связи к разрушению путем введения стерического затруднения с обеих сторон дисульфидной связи (Kellogg et al. (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717). Более высокая степень стерического затруднения приводит к снижению скорости разрушения дисульфидной связи под воздействием внутриклеточного глутатиона, а также внеклеточных (системных) восстановителей, в результате чего возрастает затруднения при высвобождении токсического средства как внутри, так и снаружи клетки. Таким образом, путем тщательного выбора степени стерического затруднения с обеих сторон дисульфидной связи может быть достигнуто оптимальное соотношение между стабильностью дисульфидной связи в кровотоке (которая минимизирует нежелательные побочные эффекты токсина) и эффективностью высвобождения во внутриклеточной среде (которое максимизирует терапевтический эффект).
Стерическое затруднение с обеих сторон дисульфидной связи регулируют путем введения одной или более метальных групп либо в тагетирующий структурный фрагмент (в данном случае, в бициклический пептид), либо на стороне токсического средства молекулярной конструкции.
В одном варианте осуществления, конъюгат лекарственного средства дополнительно включает линкер между указанным пептидным лигандом и указанными цитотоксическими средствами.
В одном варианте осуществления, цитотоксическое средство и линкер выбирают из их любых комбинаций, описанных в патентном документе WO 2016/067035 (полное содержание которого включено в настоящее изобретение путем ссылки на него).
В одном варианте осуществления, цитотоксическое средство выбирают из DM1 или MMAE.
- 11 047678
В одном варианте осуществления, линкер между указанным цитотоксическим средством и указанным бициклическим пептидом включает один или более аминокислотных остатков. Так, в одном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой MMAE, и линкер выбирают из -Val-Cit-, -Trp-Cit-, -Val-Lys-, -D-Trp-Cit-, -Ala-Ala-Asn-, D-Ala-Phe-Lys- или -Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-TyrLeu- (SEQ ID NO: 98). В еще одном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой MMAE, и линкер выбирают из -Val-Cit-, -Trp-Cit-, -Val-Lys- или -D-Trp-Cit-. В еще одном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой MMAE, и линкер представляет собой Val-Cit-или -Val-Lys-. И еще в одном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой MMAE и линкер представляет собой -Val-Cit-.
В альтернативном варианте осуществления, линкер между указанным цитотоксическим средством включает дисульфидную связь, такую как способную к расщеплению дисульфидную связь. Так, в еще одном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой DM1, и линкер выбирают из -S-S-, -SS(SO3H)-, -SS-(Me)-, -(Me)-SS-(Me)-, -SS-(Me2)- или -SS-(Me)-SO3H-. В еще одном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой DM1, и линкер включает -S-S-фрагмент, такой как N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDB), или -SS(SO3H)-фрагмент, такой как SO3H-SPDB. В еще одном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой DM1, и линкер включает -S-S- фрагмент, такой как -S-S- или -S-S-(SO3H)-.
В альтернативном варианте осуществления, цитотоксическое средство включает нерасщепляемое цитотоксическое средство. Так, в одном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой нерасщепляемое MMAE (такое как цитотоксическое средство внутри BCY6063) или нерасщепляемое DM1 (такое как цитотоксическое средство внутри BCY6064).
В одном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой DM1, и конъюгат лекарственного средства включает соединение формулы (A):
где указанный бицикл выбирают из любого одного из определенных выше BCY6099 и BCY6014.
В альтернативном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой DM1, и конъюгат лекарственного средства включает соединение формулы (B):
где указанный бицикл выбирают из любого одного из определенных выше BCY6099 и BCY6014.
В альтернативном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой DM1, и конъюгат лекарственного средства включает соединение формулы (A), где указанный бицикл выбирают из определенного выше BCY6099. Этот бициклический конъюгат лекарственного средства (BDC) обозначен в изобретении как BCY6027. Представленные в изобретении данные иллюстрируют отличное конкурирующее связывание для BCY6027 в анализе конкурирующего связывания EphA2, результаты которого приведены в табл. 6.
- 12 047678
В альтернативном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой DM1, и конъюгат лекарственного средства включает соединение формулы (B), где указанный бицикл выбирают из определенного выше BCY6099. Этот бициклический конъюгат лекарственного средства (BDC) обозначен в изобретении как BCY6028. Представленные в изобретении данные иллюстрируют отличное конкурирующее связывание для BCY6028 в анализе конкурирующего связывания EphA2, результаты которого приведены в табл. 6.
В альтернативном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой DM1, и конъюгат лекарственного средства включает соединение формулы (A), где указанный бицикл выбирают из определенного выше BCY6014. Этот BDC обозначен в изобретении как BCY6031. Представленные в изобретении данные иллюстрируют отличное конкурирующее связывание для BCY6031 в анализе конкурирующего связывания EphA2, результаты которого приведены в табл. 6. Также представленные в изобретении данные в табл. 11 и на фиг. 1 и 2 показывают, что лечение с помощью BCY6031 полностью уничтожала немелкоклеточные карциномы легкого со дня 32, и не происходило возобновления роста опухоли после временного прекращения дозирования на день 28.
В альтернативном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой DM1, и конъюгат лекарственного средства включает соединение формулы (B), где указанный бицикл выбирают из определенного выше BCY6014. Этот BDC обозначен в изобретении как BCY6032. Представленные в изобретении данные иллюстрируют отличное конкурирующее связывание для BCY6032 в анализе конкурирующего связывания EphA2, результаты которого приведены в табл. 6.
В альтернативном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой MMAE или DM1, и конъюгат лекарственного средства выбирают из любого из BDC, приведенных в табл. 11. Представленные в изобретении данные показывают, что эти BDC проявляли отличную перекрестную реактивность между EphA2 человека, мыши и грызунами, как это показано в табл. 11.
В еще одном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой MMAE или DM1, и конъюгат лекарственного средства выбирают из любого из BDC, приведенных в табл. 13.
В еще одном варианте осуществления, цитотоксическое средство представляет собой MMAE или DM1, и конъюгат лекарственного средства выбирают из BCY6033, BCY6082, BCY6136 и BCY6173. Представленные в изобретении данные показывают, что эти четыре бициклических конъюгата лекарственных средств не проявляли значительного связывания с близкородственными гомологами EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7 и EphB4 человека, EphA3 и EphA4 мыши и EphA3 и EphB1 крысы, как это показано в табл. 14 и 15.
В еще одном варианте осуществления, конъюгат лекарственного средства выбирают из любого одного из BCY6031, BCY6033, BCY6082, BCY6135, BCY6136, BCY6173, BCY6174 и BCY6175:
- 13 047678
- 14 047678
BCY6136
BCY6173
BCY6174
BCY6175 осуществления, конъюгат лекарственного средства не является BCY6027,
В одном варианте
Токсическое средство (ММАЕ средство (ММАЕ)
Токсическое средство (DM1J
Ращепляемыи линкер (Val-Cit) (SarlO средство
ММАЕ)
Бицикл (BCY6099)
SarlO спеисер
SarlO) (SarlO)
Бицикл
BCY6099
Р асцепляемый линкер (Val-Cit)
Расщепляемый линкер
S-S(SO3H )
Расщепляемый линкер (Val-Cxt)
Бицикл (BCY6099)
Бицикл (BCY6099)
Моле кулярныи спеисер
Молекулярный спеисер
Молекулярный спеисер
Молекулярный
- 15 047678
BCY6028, BCY6135, BCY6136, BCY6173, BCY6174 и BCY6175.
И еще в одном варианте осуществления, конъюгат лекарственного средства представляет собой BCY6136. Данные, представленные в изобретении в исследованиях 7 и 8, показывают, что BCY6136 проявлял значительную и высокую противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака предстательной железы PC-3 (см. фиг. 7-10 и табл. 21-24). Представленные в изобретении данные также показывают, что BCY6136 проявлял высокую противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака легкого NCI-H1975 (немелкоклеточного рака легкого) (см. фиг. 11-13 и табл. 25-30). Данные, представленные в изобретении в исследованиях 10 и 11, также показывают, что BCY6136 проявлял высокую противоопухолевую активность в моделях рака легкого LU-01-0251 PDX (немелкоклеточного рака легкого) как в случае опухоли большого размера, так и опухоли малого размера (см. фиг. 14 и 15 и табл. 31 и 34), в которых наблюдался полный регресс опухоли. Данные, представленные в изобретении в исследовании 12, также показывают, что BCY6136 проявлял статистически значимое противоопухолевое действие в модели рака легкого LU-01-0046 PDX (немелкоклеточного рака легкого) (см. фиг. 16 и табл. 35-36), в которой наблюдался полный регресс опухоли в случае использования BCY6136. Данные, представленные в изобретении в исследовании 13, также показывают, что BCY6136 проявлял дозозависимую противоопухолевую активность в модели рака легкого LU-01-0046 PDX (немелкоклеточного рака легкого) (см. фиг. 17 и табл. 37 и 38). Данные, представленные в изобретении в исследовании 14, также показывают, что использование BCY6136 приводило к полному уничтожению опухолей в модели рака легкого LU-01-0046 PDX (немелкоклеточного рака легкого) (см. фиг. 18-22 и табл. 39-42). Данные, представленные в изобретении в исследованиях 15 и 16, также иллюстрируют эффекты BCY6136 в двух моделях, в которых используются клеточные линии с низкой/пренебрежимо малой экспрессией EphA2 (а именно Lu-01-0412 и Lu-01-0486). Эти данные, приведенные на фиг. 23 и 24 и в табл. 43-46, показывают, что использование BCY6136 не приводило к регрессу опухоли ни в одной из клеточных линий, но использование BCY8245 и BCY8781, которые связываются с мишенью, в высокой степени экспрессированной в клеточной линии Lu-01-0412, приводило к полному уничтожению опухоли. Данные, представленные в исследовании 17, показывают, что BCY6136 проявлял высокую противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака молочной железы MDA-MB-231 (см. фиг. 25-27 и табл. 47-50). Данные, представленные в изобретении в исследовании 18, иллюстрируют воздействия BCY6136 в модели рака молочной железы, в которой используются клеточная линия с низкой/пренебрежимо малой экспрессией EphA2 (а именно EMT6). Эти данные, представленные на фиг. 28 и в табл. 51 и 52, показывают, что использование BCY6136 не приводило к регрессу опухоли в случае этой клеточной линии. Данные, представленные в изобретении в исследовании 19, показывают, что BCY6136 проявлял значительную противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака желудка NCI-N87 (см. фиг. 29 и табл. 53 и 54). Данные, представленные в изобретении в исследовании 20, показывают, что BCY6136 проявлял значительную противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака яичников SK-OV-3 (см. фиг. 30 и табл. 55 и 56) по сравнению с ADC MEDI-547, который проявлял умеренную противоопухолевую активность. Данные, представленные в изобретении в исследовании 21, показывают, что BCY6136 проявлял значительную противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака пищевода OE-21 (см. фиг. 31 и табл. 57 и 58). Данные, представленные в изобретении в исследовании 22, показывают, что BCY6136 проявлял дозозависимую противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели множественной миеломы MOLP-8 (см. фиг. 32 и 33 и табл. 59 и 60). Данные, представленные в изобретении в исследовании 23, показывают, что BCY6136 проявлял высокую противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели фибросаркомы HT-1080 (см. фиг. 34-41 и табл. 61 и 62).
Синтез.
Пептиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы с использованием стандартных методик и затем подвергнуты реакции с молекулярным каркасом in vitro. Для этого могут быть использованы стандартные химические методы. Такой подход позволяет проводить препаративный синтез растворимого материала для проведения последующих экспериментов или валидации. Такие методы могут быть реализованы с использованием традиционных химических подходов, таких как раскрытые в публикации Timmerman et al. (supra).
Соответственно, изобретение также относится к получению полипептидов или конъюгатов, выбранных, как это указано в изобретении, где получение включает, необязательно, дополнительные стадии, которым приводятся разъяснения ниже. В одном варианте осуществления, эти стадии проводят на конечном продукте полипептид/конъюгат, который был получен методом химического синтеза.
При получении конъюгата или комплекса, в представляющем интерес полипептиде могут быть, необязательно, заменены аминокислотные остатки.
Пептиды могут быть также удлинены с целью введения, например, еще одной петли и, вследствие этого, придания пептидам полиспецифичности.
Удлинение пептида может быть осуществлено простым химическим путем на его N-конце или Cконце или в пределах его петель с использованием ортогонально защищенных лизинов (и аналогов) стандартными методами твердофазного или жидкофазного химического синтеза. Для введения активи
- 16 047678 рованного или активируемого N- или C-конца могут быть использованы стандартные методы (био)конъюгации. В качестве варианта, могут быть сделаны дополнительные удлинения путем конденсации фрагментов или нативного химического лигирования, например как описано в публикации Dawson et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779, или с помощью ферментов, например, с использованием субтилигазы, как описано в публикации Chang et al Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Dec 20; 91(26): 12544-8, или в публикации Hikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003).
В качестве варианта, пептиды могут быть удлинены или модифицированы путем последующей конъюгации с использованием дисульфидных связей. Такой подход имеет дополнительное преимущество, позволяющее первому и второму пептиду диссоциировать друг от друга при попадании в восстановительную среду клетки. В этом случае, молекулярный каркас (например, TBMB) может быть добавлен в процессе химического синтеза первого пептида, для того чтобы он вступал в реакцию с тремя группами цистеина; затем к N- или C-концу первого пептида может быть присоединен дополнительный цистеин или тиол, для того чтобы этот цистеин или тиол взаимодействовал только со свободным цистеином или тиолом второго пептида, образуя связанный дисульфидной связью конъюгат бициклического пептидапептида.
Аналогичные методы применимы в равной степени к синтезу/сопряжению двух бициклических и биспецифических макроциклов, что потенциально позволяет создавать тетраспецифическую молекулу.
Кроме того, может быть осуществлено таким же способом добавление других функциональных групп или эффекторных групп, используя соответствующие химические методы, присоединение на Nили C-концах или через боковые цепи. В одном варианте осуществления, присоединение проводят таким образом, что оно не блокирует активность любого из структурных фрагментов.
Фармацевтические композиции.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения, предлагается фармацевтическая композиция, включающая определенные выше пептидный лиганд или конъюгат лекарственного средства в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.
Обычно, представленные пептидные лиганды должны использоваться в очищенной форме совместно с фармакологически приемлемыми вспомогательными веществами или носителями. Как правило, эти вспомогательные вещества или носители включают водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе физиологический раствор и/или забуференные среды. Среды для парентерального введения включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой, декстрозу и хлорид натрия, и раствор Рингера с лактатом. Подходящие физиологически приемлемые вспомогательные средства, если требуется поддерживать полипептидный комплекс в суспензионной форме, могут быть выбраны из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.
Среды для внутривенного введения включают восполнители недостатка жидкости и питательных веществ и восполнители недостатка электролитов, такие как восполнители на основе раствора Рингера с декстрозой. Кроме того, могут также присутствовать консерванты и другие добавки, такие как противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие реагенты и инертные газы (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).
Пептидные лиганды по настоящему изобретению могут применять в форме отдельно вводимых композиций или в сочетании с другими лекарственными средствами. Эти лекарственные средства могут включать антитела, фрагменты антител и различные иммунотерапевтические лекарственные средства, такие как циклоспорин, метотрексат, адриамицин или цисплатин, и иммунотоксины. Фармацевтические композиции могут включать коктейли различных цитотоксических или других средств в сочетании с белковыми лигандами по настоящему изобретению, или даже комбинации выбранных полипептидов по настоящему изобретению, имеющих различную специфичность, таких как полипептиды, выбранные с использованием различных целевых лигандов, независимо от того, будут ли их объединять вместе перед введением или не будут.
Способ введения фармацевтических композиций согласно изобретению может быть любым из способов, которые хорошо известны специалистам в данной области. С целью проведения терапии, пептидные лиганды по изобретению могут быть введены любому пациенту стандартными способами. Введение может быть осуществлено любым подходящим способом, включая парентеральный, внутривенный, внутримышечный, интраперитонеальный, трансдермальный, ингаляционный способы, или же, соответственно, путем прямой инфузии с использованием катетера. Доза и частота введения будет зависеть от возраста, пола и состояния больного, от одновременного введения других лекарственных средств, противопоказаний и других параметров, которые должны приниматься во внимание лечащим врачом.
Пептидные лиганды по настоящему изобретению могут быть лиофилизированы с целью хранения и затем восстановления в подходящем носителе перед использованием. Было показано, что этот метод является эффективным, и известные методы лиофилизации и восстановления могут быть использованы в изобретении. Для специалистов в данной области является очевидным, что лиофилизация и восстановление могут приводить к различной степени потери активности, и что для компенсации этих потерь, необходимо проводить корректировку концентрации пептидных лиганд в сторону повышения.
- 17 047678
Композиции, содержащие представленные в изобретении пептидные лиганды или их коктейль, могут быть введены с целью профилактического и/или терапевтического лечения. При конкретных вариантах применения в терапевтических целях, под терапевтически эффективной дозой подразумевают соответствующее количество, применение которого позволяет достигать, по меньшей мере, частичного ингибирования, подавления, модуляции, уничтожения или какого-либо другого измеримого параметра популяции выбранных клеток. Количества, необходимые для достижения этой дозы, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния собственной иммунной системы пациента, но обычно эти количества находятся в диапазоне от 0,005 до 5,0 мг выбранного пептидного лиганда на килограмм массы тела, причем чаще всего используются дозы от 0,05 до 2,0 мг/кг/доза. Для профилактических целей, композиции, включающие представленные в изобретении пептидные лиганды или их смеси, также могут быть введены в аналогичных или слегка более низких дозах.
Композиция, содержащая пептидный лиганд по настоящему изобретению, может применяться в профилактических и терапевтических целях, для того чтобы способствовать изменению, инактивации, уничтожению или удалению выбранной популяции клеток-мишеней в организме млекопитающего. Кроме того, пептидные лиганды, описанные в изобретении, могут селективно применяться экстракорпорально или in vitro для избирательного уничтожения, истощения или эффективного удаления иным образом популяции клеток-мишеней из гетерогенной популяции клеток. Взятая у млекопитающего кровь может быть экстракорпорально объединена с выбранными пептидными лигандами, в результате чего нежелательные клетки уничтожаются или иным образом удаляются из крови, которую возвращают млекопитающему с использованием стандартных методов.
Терапевтическое применение.
Бициклические пептиды по изобретению обладает специфической способностью связывать EphA2.
Eph-рецепторы тирозинкиназы (Eph) относятся к большой группе рецепторных тирозинкиназ (RTK), киназы которых фосфорилируют белки на остатках тирозина. Ephs и их мембраносвязанные эфриновые лиганды (эфрины) контролируют позиционирование клеток и организацию тканей (Poliakov et al. (2004) Dev Cell 7, 465-80). Функциональные и биохимические Eph-ответы возникают при более высоких состояниях олигомеризации лигандов (Stein et al. (1998) Genes Dev 12, 667-678).
Было показано, что среди других функций формирования паттернов, различные Ephs и эфрины играют определенную роль в развитии сосудов. Нокаут EphB4 и эфрин-Б2 приводит к отсутствию способности ремоделировать капиллярные русла в кровеносные сосуды (Poliakov et al., supra) и к эмбриональной летальности. Персистирующая экспрессия некоторых рецепторов Eph и эфринов также наблюдалась во вновь образованных микрососудах у взрослых (Brantley-Sieders et al. (2004) Curr Pharm Des 10, 343142; Adams (2003) J Anat 202, 105-12).
Также было обнаружено, что нерегулированное повторное появление некоторых эфринов и их рецепторов у взрослых людей способствует инвазии опухоли, метастазированию и неоангиогенезу (Nakamoto et al. (2002) Microsc Res Tech 59, 58-67; Brantley-Sieders et al., supra). Кроме того, было обнаружено, что некоторые представители семейства Eph сверхэкспрессируются в опухолевых клетках из различных опухолей человека (Brantley-Sieders et al., supra); Marme (2002) Ann Hematol 81 Suppl 2, S66; Booth et al. (2002) Nat Med 8, 1360-1).
EPH рецептор A2 (эфрин типа-A рецептор 2) представляет собой белок, который у людей кодируется геном EPHA2.
EphA2 активируется при наличии множественных злокачественных заболеваниях у человека, часто коррелируя с прогрессированием заболевания, метастазированием и неблагоприятным прогнозом, например, при раке молочной железы (Zelinski et al. (2001) Cancer Res. 61, 2301-2306; Zhuang et al. (2010) Cancer Res. 70, 299-308; Brantley-Sieders et al. (2011) PLoS One 6, e24426), раке легкого (Brannan et al. (2009) Cancer Prev Res (Phila) 2, 1039-1049; Kinch et al. (2003) Clin Cancer Res. 9, 613-618; Guo et al. (2013) J Thorac Oncol. 8, 301-308), раке желудка (Nakamura et al. (2005) Cancer Sci. 96, 42-47; Yuan et al. (2009) Dig Dis Sci 54, 2410-2417), раке поджелудочной железы (Mudali et al. (2006) Clin Exp Metastasis 23, 357365), раке предстательной железы (Walker-Daniels et al. (1999) Prostate 41, 275-280), раке печени (Yang et al. (2009) Hepatol Res. 39, 1169-1177) и глиобластоме (Wykosky et al. (2005) Mol Cancer Res. 3, 541-551; Li et al. (2010) Tumour Biol. 31, 477-488).
Полностью роль EphA2 в прогрессировании рака до сих пор не выяснена, хотя и существуют доказательства его влияния на многочисленных этапах прогрессирования рака, включая рост опухолевых клеток, выживание, инвазию и ангиогенез. Понижающая регуляция экспрессии EphA2 подавляет размножение опухолевых раковых клеток (Binda et al. (2012) Cancer Cell 22, 765-780), в то время как блокада EphA2 ингибирует VEGF-индуцированную миграцию клеток (Hess et al. (2001) Cancer Res. 61, 32503255), прорастание и ангиогенез (Cheng et al. (2002) Mol Cancer Res. 1, 2-11; Lin et al. (2007) Cancer 109, 332-40), и прогрессирование метастазирования (Brantley-Sieders et al. (2005) FASEB J. 19, 1884-1886).
Было показано, что конъюгат лекарственного средства с антителом против EphA2 значительно снижает рост опухоли в ксенотрансплантатных моделях на крысах и мышах (Jackson et al. (2008) Cancer Research 68, 9367-9374), и аналогичный подход был опробован на мужчине, хотя лечение пришлось прервать из-за необходимости проведения лечения взаимосвязанных неблагоприятных побочных эффектов
- 18 047678 (Annunziata et al. (2013) Invest New drugs 31, 77-84).
Полипептидные лиганды, выбранные в соответствии со способом по настоящему изобретению, могут быть использованы при in vivo терапевтическом и профилактическом применениях, in vitro и in vivo диагностических применениях, при проведении in vitro исследования и в качестве реагента, и в других подобных целях. Лиганды с выбранными уровнями специфичности могут применяться при проведении испытаний на животных, не относящихся к человеку, когда желательно наличие перекрестной реактивности, или при диагностике, когда необходимо тщательно контролировать перекрестную реактивность с гомологами или паралогами. При некоторых применениях, таких как применение вакцин, может быть использована способность пептидных лигандов вызывать иммунный ответ на заранее определенные ряды антигенов, для того чтобы адаптировать вакцину к конкретным заболеваниям и патогенам.
Практически чистые пептидные лиганды с гомогенностью, по меньшей мере, от 90 до 95% являются предпочтительными для введения млекопитающему, и с гомогенностью от 98 до 99% или более являются наиболее предпочтительными для фармацевтического применения, в частности, когда млекопитающим является человек. После очистки, частичной или до состояния гомогенности, в зависимости от требований, выбранные полипептиды могут быть использованы в диагностике или терапии (в том числе экстракорпорально), или при разработке и проведении методик анализа, иммунофлуоресцентных окрашиваний и для других подобных целей (Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).
В соответствии с еще одним аспектом изобретения, предлагается определенный выше пептидный лиганд или конъюгат лекарственного средства для применения для предотвращения, торможения развития или лечения заболевания или нарушения, характеризующегося сверхэкспрессией EphA2 в пораженной ткани (такой как опухоль).
В соответствии с еще одним аспектом изобретения, предлагается способ предотвращения, торможения развития или лечения заболевания или нарушения, характеризующегося сверхэкспрессией EphA2 в пораженной ткани (такой как опухоль), который включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффекторной группы и определенного выше конъюгата лекарственного средства с пептидным лигандом.
В одном варианте осуществления, EphA2 представляет собой EphA2 млекопитающего. В еще одном варианте осуществления, EphA2 млекопитающего представляет собой EphA2 человека.
В одном варианте осуществления, заболевание или нарушение, характеризующееся сверхэкспрессией EphA2 в пораженной ткани, выбирают из рака.
Примеры раковых заболеваний (и их доброкачественных типов), которые могут быть подвергнуты лечению (или ингибированию), включают, но этим не ограничивая, опухоли эпителиального происхождения (аденомы и карциномы различных типов, включая аденокарциномы, плоскоклеточные карциномы, переходные клеточные карциномы и другие карциномы), такие как карциномы мочевого пузыря и мочевых путей, молочной железы, желудочно-кишечного тракта (включая карциномы пищевода, желудка (желудочные), тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки и заднего прохода), печени (гепатоцеллюлярная карцинома), желчного пузыря и билиарной системы, экзокринной части поджелудочной железы, почек, легких (например, аденокарциномы, мелкоклеточные карциномы легких, немелкоклеточные карциномы легких, бронхоальвеолярные карциномы и мезотелиомы), карциномы головы и шеи (например, рак языка, ротовой полости, гортани, глотки, носоглотки, миндалин, слюнных желез, полости носа и околоносовых пазух), яичников, маточных труб, брюшины, влагалища, вульвы, пениса, шейки матки, миометрия, эндометрия, щитовидной железы (например, фолликулярную карциному щитовидной железы), надпочечников, предстательной железы, кожи и прилежащих органов (например, меланому, базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак, кератоакантому, диспластический невус); гематологические злокачественные опухоли (например, лейкозы, лимфомы) и предраковые гематологические нарушения и нарушения с пограничной злокачественностью, включая гематологические злокачественные заболевания и связанные с ними состояния клеток лимфоидного ряда (например, острый лимфоцитарный лейкоз [ALL], хронический лимфоцитарный лейкоз [CLL], B-клеточные лимфомы, такие как диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома [DLBCL], фолликулярная лимфома, лимфома Беркитта, лимфома клеток мантии, T-клеточные лимфомы и лейкозы, лимфомы с природными клетками-киллерами [NK], лимфомы Ходжкина, волосатоклеточный лейкоз, моноклональную гаммапатию неясного генеза, плазмоцитому, множественную миелому и лимфопролиферативные нарушения после трансплантации), а также гематологические злокачественные и родственные состояния клеток миелоидного ряда (например, острый миелолейкоз [AML], хронический миелолейкоз [CML], хронический миеломоноцитарный лейкоз [CMML], гиперэозинофильный синдром, миелопролиферативные расстройства, такие как полицитемия вера, эссенциальная тромбоцитемия и первичный миелофиброз, миелопролиферативный синдром, синдром миелодисплазии и промиелоцитарный лейкоз); опухоли мезенхимального происхождения, например, саркомы мягких тканей, кости или хряща, такие как остеосаркомы, фибросаркомы, хондросаркомы, рабдомиосаркомы, лейомиосаркомы, липосаркомы, ангиосаркомы, саркому Капоши, саркому Юинга, синовиальную саркому, эпителиоидные саркомы, желудочно-кишечные стромальные опухоли, доброкачественные и злокачественные гистоцитомы и дерматофибросаркому протуберанс; опухоли центральной или периферической нервной системы (например, астроцитомы, глиомы и глиобластомы, менингиомы,
- 19 047678 эпендимомы, опухоли эпифиза и шванномы); эндокринные опухоли (например, опухоли гипофиза, опухоли надпочечников, опухоли островковых клеток, опухоли паращитовидных желез, карциноидные опухоли и медуллярную карциному щитовидной железы); опухоли глаз и их придатков (например, ретинобластому); опухоли зародышевых клеток и трофобласта (например, тератомы, семиномы, дисгерминомы, пузырный занос и хориокарциному); и педиатрические и эмбриональные опухоли (например, медуллобластомы, нейробластомы, опухоль Вильмса и примитивные нейроэктодермальные опухоли); или синдромы, врожденные или иные, которые делают пациента восприимчивым к возникновению злокачественного новообразования (например, пигментную ксеродерму).
В еще одном варианте осуществления, рак выбирают из рака молочной железы, рака легкого, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака печени, глиобластомы и ангиогенеза.
В еще одном варианте осуществления, рак выбирают из рака предстательной железы, рака легкого (такого как немелкоклеточная карцинома легкого (NSCLC)), рака молочной железы (такого как трижды негативный рак молочной железы), рака желудка, рака яичников, рака пищевода, множественной миеломы и фибросаркомы.
В еще одном варианте осуществления, рак представляет собой рак предстательной железы. Данные, представленные в изобретении в исследованиях 7 и 8, показывают, что BCY6136 проявлял значительную и высокую противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака предстательной железы PC-3 (см. фиг. 7-10 и табл. 21-24).
В еще одном варианте осуществления, конъюгат лекарственного средства применяют для предотвращения, торможения развития или лечения солидных опухолей, таких как фибросаркомы и карциномы молочной железы, и немелкоклеточные карциномы легкого.
В еще одном варианте осуществления, рак выбирают из рака легкого, такого как немелкоклеточные карциномы легкого (NSCLC). Представленные в изобретении данные показывают, что BDC по изобретению (BCY6031) полностью уничтожал немелкоклеточные карциномы легкого со дня 32, и не возникало возобновления роста опухоли после временного прекращения дозирования на день 28. Эти данные однозначно подтверждают возможность клинического применения BDC по настоящему изобретению при раке, таком как рак легкого, в частности, немелкоклеточные карциномы легкого. Данные, представленные в изобретении в исследовании 9, показывают, что BCY6033 проявлял дозозависимую противоопухолевую активность, BCY6082 проявлял значительную противоопухолевую активность, и BCY6136 проявлял высокую противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака легкого (NSCLC) NCI-H1975 (см. фиг. 11-13 и табл. 25-30). Данные, также представленные в изобретении в исследованиях 10 и 11, показывают, что BCY6136 проявлял мощный противоопухолевый эффект в моделях рака легкого (NSCLC) LU-01-0251 PDX как в случае опухоли большого размера, так и в случае опухоли малого размера (см. фиг. 14 и 15 и табл. 31-34), когда обнаруживали полный регресс опухоли. Данные, представленные в изобретении в исследовании 12, показывают, что BCY6033, BCY6136, BCY6082 и BCY6031 проявляли значительный противоопухолевый эффект в модели рака легкого (NSCLC) LU-010046 PDX (см. фиг. 16 и табл. 35 и 36), когда обнаруживали регресс опухоли для BCY6033 и BCY6136. Данные, представленные в изобретении в исследовании 13, показывают, что BCY6136 проявлял дозозависимую противоопухолевую активность в модели рака легкого (NSCLC) LU-01-0046 PDX (см. фиг. 17 и табл. 37 и 38). Данные, представленные в изобретении в исследовании 14, показывают, что BCY6082 проявлял дозозависимую противоопухолевую активность, BCY6031 и BCY6173 проявляли противоопухолевую активность, и BCY6033, BCY6136 и BCY6175 уничтожали опухоли в модели рака легкого (NSCLC) LU-01-0046 PDX (см. фиг. 18-22 и табл. 39-42). Данные, также представленные в изобретении в исследованиях 15 и 16, иллюстрируют эффекты BCY6136 в двух моделях, в которых используются клеточные линии с низкой/пренебрежимо малой экспрессией EphA2 (а именно Lu-01-0412 и Lu-01-0486). Эти данные, представленные на фиг. 23 и 24 и в табл. 43 и 46, показывают, что использование BCY6136 не приводило к регрессу опухоли ни в одном из случаев этой клеточной линии, но BCY8245 и BCY8781, которые связываются с мишенью, сверхэкспрессирующейся в клеточной линии Lu-01-0412, полностью уничтожали опухоль. В еще одном варианте осуществления, рак представляет собой рак молочной железы. В еще одном варианте осуществления, рак молочной железы представляет собой трижды негативный рак молочной железы. Данные, представленные в изобретении в исследовании 17, показывают, что BCY6082 проявлял противоопухолевую активность, BCY6033 проявлял дозозависимую противоопухолевую активность, и BCY6136 проявлял высокую противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака молочной железы MDA-MB-231 (см. фиг. 25-27 и табл. 47-50). Данные, представленные в изобретении в исследовании 18, иллюстрируют эффекты BCY6136 в модели рака молочной железы, в которой используются клеточные линии с низкой/пренебрежимо малой экспрессией EphA2 (a именно EMT6). Эти данные, представленные на фиг. 28 и в табл. 51 и 52, показывают, что BCY6136 не оказывал воздействия на регресс опухоли в этой клеточной линии. В альтернативном варианте осуществления, рак молочной железы представляет собой резистентный к герцептину рак молочной железы. Не ссылаясь в качестве доказательства на какую-либо теорию, тем не менее, предполагают, что EphA2 имеет непосредственное отношение к возникновению резистентности к герцептину, и поэтому, нацеленный на EphA2
- 20 047678 структурный фрагмент имеет перспективу использования у пациентов, у которых не достигается ответ при лечении герцептином.
В еще одном варианте осуществления, рак представляет собой рак желудка. Данные, представленные в изобретении в исследовании 19, показывают, что BCY6136 проявлял значительную противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака желудка NCI-N87 (см. фиг. 29 и табл. 53 и 54).
В еще одном варианте осуществления, рак представляет собой рак яичников. Данные, представленные в изобретении в исследовании 20, показывают, что BCY6136 проявлял значительную противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака яичников SK-OV-3 (см. фиг. 30 и табл. 55 и 56) по сравнению с ADC MEDI-547, который проявлял умеренную противоопухолевую активность.
В еще одном варианте осуществления, рак представляет собой рак пищевода. Данные, представленные в изобретении в исследовании 21, показывают, что BCY6136 проявлял значительную противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели рака пищевода OE-21 (см. фиг. 31 и табл. 57 и 58).
В еще одном варианте осуществления, рак представляет собой множественную миелому. Данные, представленные в изобретении в исследовании 22, показывают, что BCY6136 проявлял дозозависимую противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели множественной миеломы MOLP-8, a BCY6082 проявлял значительную противоопухолевую активность (см. фиг. 32 и 33 и табл. 59 и 60).
В еще одном варианте осуществления, рак представляет собой фибросаркому. Данные, представленные в изобретении в исследовании 23, показывают, что BCY6173, BCY6135, BCY6174 и BCY6175 проявляли дозозависимую противоопухолевую активность, a BCY6136 проявлял высокую противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели фибросаркомы HT-1080 (см. фиг. 34-41 и табл. 61 и 62).
Используемый в изобретении термин предотвращение подразумевает введение защитной композиции до возникновения заболевания. Торможение развития относится к введению композиции после возникновения заболевания, но до клинического проявления заболевания. Лечение подразумевает введение защитной композиции после проявления симптомов заболевания.
Доступны экспериментальные модели на животных, в которых можно проводить исследования по эффективности пептидных лигандов при предотвращении или лечении заболевания. Использованию экспериментальных моделей на животных способствует настоящее изобретение, которое позволяет разрабатывать полипептидные лиганды, способные перекрестно реагировать с мишенями человека и животных, что делает возможным использование моделей на животных с последующей интерпретацией полученных данных в отношении человека.
Кроме того, данные, представленные в изобретении, иллюстрируют взаимосвязь между вариацией числа копий (CNV) и экспрессией гена для EphA2 для типов множественных опухолей. Так, в соответствии с еще одним аспектом изобретения, предлагается способ предотвращения, торможения развития или лечения рака, который включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффекторной группы и определенного выше конъюгата лекарственного средства с пептидным лигандом, где указанный пациент идентифицируется как имеющий повышенную вариацию числа копий (CNV) EphA2.
В одном варианте осуществления, рак выбирают из тех типов рака, которые идентифицируется в изобретении как имеющие повышенную вариацию числа копий (CNV) EphA2. В еще одном варианте осуществления, рак представляет собой рак молочной железы.
Далее приводится дополнительное описание изобретения с использованием следующих примеров.
- 21 047678
Примеры
Условные сокращенные обозначения | Название | Название прекурсора | Прекурсор CAS | Фирмапроизводитель |
INal | 1 -Нафтилаланин | Fmoc-3 -(1 -нафтил)-Ьаланин | 96402-49-2 | Fluorochem |
2FuAla | 2-Фурилаланин | Fmoc-L-2-фурилаланин | 159611-02-6 | Combi Blocks |
2Nal | 2-Нафтилаланин | Fmoc-З -(2-нафтил)-Ьаланин | 112883-43-9 | Alfa Aesar |
3,3-DP А | 3,3 -Дифенилаланин | fmoc-3,3дифенилаланин | 189937-46-0 | Alfa Aesar |
3,4DCPhe | 3,4Дихлорфенилаланин | Fmoc-З ,4-дихлор-Ьфенилаланин | 17766-59-5 | PolyPeptide |
3Pal | З-(З-Пиридил)аланин | N-Fmoc-3 -(3 -пир ид ил)аланин | 175453-07-3 | Fluorochem |
4,4-BPA | 4,4'-Бифенилаланин | Fmoc-L-4,4'бифенилаланин | 199110-64-0 | Alfa Aesar |
4БензилРг 0 | 4-Бензилпирролидин2-карбоновая кислота | Fmoc-4Бензилпирролидин-2карбоновая кислота | PolyPeptide | |
4BrPhe | 4-Бромфенилаланин | Fmoc-4-BpOM-Lфенилаланин | 198561-04-5 | PolyPeptide |
4FlPro | 4-Фтор-пирролидин2-карбоновая кислота | Fmoc-4-φτορпирролидин-2карбоновая кислота | 203866-19-7 | PolyPeptide |
4MeoPhe | 4Метоксифенилалани н | Fmoc-4Метоксиф енил ал анин | 77128-72-4 | Iris Biotech |
4Pal | 3-(4-Пир ид ил)аланин | N-Fmoc-З-(4-пир ид ил)L-аланин | 169555-95-7 | Fluorochem |
4ФенилРг 0 | 4-Фенилпирролидин-2кар боновая кислота | Fmoc-4-фенилпирролидин-2карбоновая кислота | 269078-71-9 | Cambridge Bioscience |
Ac | Ацетил | |||
AC3C | 1Аминоциклопропан1-карбоновая кислота | 1-(Ртос-амино)циклопропанкарбонова я кислота | 126705-22-4 | Iris Biotech |
- 22 047678
AC4C | 1-Амино-1циклобутанкарбонов ая кислота | 1-(Ршос-амино)циклобутанкарбоновая кислота | 885951-77-9 | Fluorochem |
AC5C | 1 - Амино-1 циклопентанкарбоно вая кислота | 1-(Ршос-амино)циклопентанкарбонова я кислота | 117322-30-2 | Iris Biotech |
AF488 | AlexaFluor488 | AlexaFluor488-NHS эфир | Fisher Scientific | |
Aib | 2-Аминоизомасляная кислота | Fmoc-aаминоизомасляная кислота | 94744-50-0 | Fluorochem |
Aza-Gly | Азаглицин | |||
Aze | Азетидин | Ршос-Т-азетидин-2карбоновая кислота | 136552-06-2 | Combi Blocks |
β-Ala | β-Аланин | Ршос^-аланин | 35737-10-1 | Fluorochem |
βAlaSO3H | β-Aлaнин(SOзH) | Fmoc-альфа-сульфобета-аланин | 1005412-03- 2 | Iris Biotech |
C5g | Циклопентилглицин | Fmoc-Lциклопентилглицин | 220497-61-0 | Fluorochem |
Cba | β-Циклобутилаланин | Ршос^-циклобутил-Таланин | 478183-62-9 | IRIS Biotech GmbH |
Cpa | βЦиклопропилаланин | Ршос^-циклопропилL-аланин | 214750-76-2 | Fluorochem |
Cpg | Циклопропилглицин | Fmoc-Lциклопропилглицин | 1212257-18- 5 | Apollo Scientific |
Cya | Цистеиновая кислота | Fmoc-L-цистеиновая кислота | 320384-09-6 | |
D-3,3DPA | 3,3-дифенил-Оаланин | Fmoc-3,3 -дифенил-Dаланин | 189937-46-0 | Chem-Impex international |
D-Arg | D-Аргинин | Fmoc-D-aprnHHH(Pbf) | 187618-60-6 | Iris Biotech |
D-Asp | D-Аспарагиновая кислота | Fmoc-D-аспарагиновой кислоты 4третбутиловый эфир | 112883-39-3 | Sigma Aldrich |
D-Cya | D-цистеиновая кислота | Fmoc-D-цистеиновая кислота | Costom synthesis | |
D-K | D-Лизин | Ршос-О-Лизин(Вос) | 92122-45-7 | Sigma Aldrich |
DOTA | 1,4,7,10-тетраазацикл од од екан-1,4,7,10тетрауксусная кислота |
- 23 047678
F1 | 5(6)-карбоксифлуоресцеин | Sigma | ||
HArg | Г омоаргинин | Fmoc-L-HomoArg(Pbf)ОН | 401915-53-5 | Fluorochem |
HPhe | Г омофенил аланин | Fmoc-Lгомоф енил ал анин | 132684-59-4 | Iris Biotech |
НуР | Г идроксипролин | FmocгидроксипролинЦВи)ОН | 122996-47-8 | Sigma |
hSerMe | Г омосерин(метил) | Ршос-О-метил-Ьгомосерин | 173212-86-7 | Iris Biotech |
Lys(Dde) | Лизин(ЕМе) | N-a-Fmoc-N-ε-1-(4,4- диметил-2,6диоксоциклогекс-1 илиден)этил-Ь-лизин | 150629-67-7 | Sigma Aldrich |
NO2Phe | 4-нитрофенилаланин | Ртос-4-нитро-Ьфенилаланин | 95753-55-2 | PolyPeptide |
Phg | Фенилглицин | Fmoc-L-фенилглицин | 102410-65-1 | Combi Blocks |
Pip | Пипеколиновая кислота | Fmoc-Lпипеколиновая кислота | 86069-86-5 | Peptech |
Sar | Саркозин, так что Sarx представляет х остатков Sar | F шос-саркозин-ОН | 77128-70-2 | Sigma |
tBuGly | Трет-лейцин | Fmoc-L-трет-лейцин | 132684-60-7 | Fluorochem |
Thi | 2-Тиенилаланин | Fmoc-2-тиенилаланин | 130309-35-2 | Novabioche m |
ThiAz | 3-(1,2,4-триазол-1ил)-аланин | Ршос-3-(1,2,4-триазол1-ил)-А1а-ОН | 1217449-370 | Sigma |
TAla | В осстанов ленный амид на основной цепи |
Материалы и методы.
Синтез пептидов.
Пептиды синтезировали методом твердофазного синтеза. Использовали смолу Rink Amide MBHA. К смеси, содержащей смолу Rink Amide MBHA (0,4-0,45 ммоль/г) и Fmoc-Cys(Trt)-OH (3,0 экв.) добавляли DMF, затем добавляли DIC (3 экв.) и HOAt (3 экв.) и смешивали в течение 1 ч. Для разблокирования использовали 20% пиперидина в DMF. Каждую последующую аминокислоту присоединяли с использованием 3 экв активирующих реагентов, DIC (3,0 экв.) и HOAT (3,0 экв.) в DMF. Контролировали протекание реакции с использованием цветной реакции нингидрина или цветной реакции tetrachlor. После завершения синтеза, пептидную смолу промывали с помощью DMF x 3, MeOH x 3, и затем сушили при барботировании N2 в течение ночи. Затем пептидную смолу обрабатывали с помощью 92,5% TFA/2,5% TIS/2,5% EDT/2,5% H2O в течение 3 ч. Пептид осаждали холодным изопропиловым эфиром и центрифугировали (3 минуты при 3000 об/мин). Осадок промывали два раза изопропиловым эфиром, и неочищенный пептид сушили под вакуумом в течение 2 ч и затем лиофилизировали. Лиофилизированный порошок растворяли в смеси ACN/H2O (50:50), и добавляли раствор 100 мМ TATA в ACN, затем бикарбонат аммония в H2O (1М), и раствор перемешивали в течение 1 ч. После завершения циклизации, реакцию останавливали 1М водным раствором гидрохлорида цистеина (10 экв относительно TATA), затем перемешивали и выдерживали в течение одного часа. Раствор лиофилизировали с получением неочищенного продукта. Неочищенный пептид очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и лиофилизировали с получением продукта.
Если не указаны иначе, то все аминокислоты использовали в L-конфигурациях.
BCY6099 (соединение 66).
- 24 047678
Последовательность: (e-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 2)-CONH2
8,0 г смолы использовали для генерации 2,1 г BCY6099 (чистота 99,2%; выход 16,3%) в виде белого твердого вещества.
Даь Подвижная фаза: Расход: Колонка: Прибор: Метод: | 1ные анализа BCY6099 А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN 1,0 мл/мин Gemini-NX Cl8 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) 15-45% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 11,31 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1061,8 [М+ЗН]3+, 796,5 [М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3183,68 |
BCY6014 (соединение 67)
°-х
Твердофа&иый синтез
Последовательность: (e-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 11)-CONH2
4,79 г смолы использовали для генерации 1,07 г BCY6014 (Q1: 131,9 мг, чистота 97,99%; Q2: 141,7 мг, чистота 99,04%; Q3: 800,7 мг, чистота 92,35%; выход 16,9%) в виде белого твердого вещества.
- 25 047678
BCY6104 (соединение 99)
Последовательность: (e-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)W(HArg)C ((βAla)-Sarw-(SEQ ID NO: 85))
4,44 г смолы использовали для генерации 700 мг BCY6104 (чистота 95,87%, выход 10,5%) в виде белого твердого вещества.___________________________________________________________
BCY6104 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 7,06 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1062,1 ГМ+ЗН]3+, 796,8 ГМ+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3185,65 |
BCY6103 (соединение 100)
О
Последовательность: (e-Ala)-Sarw-A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)WTC ((β-Ala)Sarw-(SEQ ID NO: 86))
- 26 047678
4,44 г смолы использовали для генерации 700 мг BCY6103 (чистота 98,9%, выход 11,1%) в виде бе-
лого твердого вещества._____________________________________________________________ | |
BCY6103 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 8,02 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1039,1 ГМ+ЗН]3+, 779.,5 |М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3117,55 |
BCY6101 (соединение 101)
Последовательность: (e-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)LVNPLCLHP(D-Ala)WTC ((e-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 87))
4,44 г смолы использовали для генерации 700 мг BCY6101 (чистота 95,9%, выход 10,9%) в виде белого твердого вещества.
BCY6101 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 9,79 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1023,6 (М+ЗН]3+, 768,0 (М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3069,55 |
BCY6102 (соединение 102)
Последовательность: (e-Ala)-Sar10-A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Ala)WTC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 88))
- 27 047678
4,44 г смолы использовали для генерации 900 мг BCY6102 (чистота 95,9%, выход 14,1%) в виде белого твердого вещества.
BCY6102 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 9,89 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1018 [М+ЗН]3+, 763,9 [М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3053,56 |
BCY6139 (соединение 103)
Последовательность: (e-Ala)-Sarw-ARDC(HyP)LVNPLCLHPGWTC((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 89))
HQ
О
4,44 г смолы использовали для генерации 900 мг BCY6139 (чистота 97,4%, выход 11,2%) в виде белого твердого вещества._______________________________________________________________
BCY6139 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 8,95 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1014,6 |М+ЗН]3+, 761,2 ГМ+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3042,51 |
BCY6138 (соединение 104)
- 28 047678
Последовательность: (e-Ala)-Sario-ARDCPLVNPLCL(D-3,3-DPA)PGWTC ((e-Ala)-Sario-(SEQ ID NO: 90))
1,11 г смолы использовали для генерации 200 мг BCY6138 (чистота 95,2%, выход 12,2%) в виде белого твердого вещества.
BCY6138 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110 А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 14,46 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1037,6 ГМ+ЗН]3+ |
Молекулярная масса пептида | 3111,63 |
BCY6137 (соединение 105)
Последовательность: (e-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCLHPGWTCLH ((e-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 91))
4,44 г смолы использовали для генерации 600 мг BCY6137 (чистота 98,9%, выход 9,06%) в виде белого твердого вещества.______________________________________________________________
BCY6137 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 14,46 min |
LCMS (ESI): | m/z 1092,7 |М+ЗН]3+, 819,6 |М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3275,8 |
- 29 047678
BCY6042 (соединение 91)
Последовательность: Ac-(SEQ ID NO: 14)-Sar6-(D-K)
1,11 г смолы использовали для генерации 99,2 мг BCY6042 (чистота 99,2%, выход 7,0%) в виде белого твердого вещества.
BCY6019 (соединение 77)
Последовательность: Ac-(SEQ ID NO: 12)-Sar6-(D-K)
4,79 г смолы использовали для генерации 732,0 мг BCY6019 (чистота 92,82%, выход 12,2%) в виде белого твердого вещества.
- 30 047678
BCY6019 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 11,36 мин |
LCMS (ESI): | m/z 935,5 |М+ЗН]3+ |
Молекулярная масса пептида | 2805,32 |
BCY6059 (соединение 106)
Последовательность: Ac-(SEQ ID NO: 12)-Sar6-(D-K[Ac])
К раствору BCY6019 (0,05 г, 17,82 мкмоль, 1,00 экв.) в H2O (3 мл), доведенному до pH 11 с помощью водного раствора Na2CO3, добавляли ацетилацетат (5,46 мг, 53,46 мкмоль, 5,01 мкл, 3,00 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что BCY6019 был полностью израсходован, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Реакционную смесь доводили до pH 7 с помощью 1 N HCl, и непосредственно очищали методом препаративной HPLC (условие TFA). Соединение BCY6059 (18,1 мг, 6,36 мкмоль, 35,67% выход) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6059 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 6,67 мин |
LCMS (ESI): | m/z 949,8 ГМ+ЗН13+ |
Молекулярная масса пептида | 2848,36 |
BCY6160 (соединение 107)
- 31 047678
Последовательность: (e-AlaSO3H)-Sar4-(Cya)-Sar4-(Cya)-A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Cya)WTC ((βAlaSO3H)-Sar4-(Cya)-Sar4-(Cya)-(SEQ ID NO: 92))
1,11 г смолы использовали для генерации 45,2 мг BCY6160 (чистота 95,5%, выход 2,5%) в виде белого твердого вещества.
BCY6160 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX Cl 8 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 11,38 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1124,9 |М+ЗН]3+ |
Молекулярная масса пептида | 3376,83 |
BCY6009 (соединение 108)
Последовательность: (e-Ala)-Sarw-ARDCPLVNPLCLHPGWTC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 10))
4,79 г смолы использовали для генерации 2,42 г BCY6009 (чистота >88,92%, выход 36,0%) в виде белого твердого вещества.
- 32 047678
BCY6009 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX Cl 8 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 10,16 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1008,9 ГМ+ЗН]3+, 756,9 [М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3025,5 |
BCY6017 (соединение 109)
i Ί Z О о О ( ... г А° о | 1 | 1 J Твердофазный 1 синтез о ГЛ ' S -L V N Р L N ·· L Η Р G W Т N > N / О ч V /....... о о |
BCY-6017
Последовательность: A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC (SEQ ID NO: 11)
1,19 г смолы использовали для генерации 189,9 мг BCY6017 (чистота 95,05%, выход 16,8%) в виде белого твердого вещества.____________________________________________________________
BCY6017 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150x4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 10,01 min |
LCMS (ESI): | m/z 1129,1 [М+2Н]2+, 753,0 [М+ЗН]3+ |
Молекулярная масса пептида | 2257,67 |
BCY6018 (соединение 110)
- 33 047678
Последовательность: (e-Ala)-Sar5-(SEQ ID NO: 11)
1,19 г смолы использовали для генерации 289,1 мг BCY6018 (97,92% чистота, 21,0% выход) в виде белого твердого вещества.
BCY6018 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 9,77 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1342,9 ГМ+2Н]2+, 895,3 ГМ+ЗН]3+ |
Молекулярная масса пептида | 2684,14 |
BCY6152 (соединение 111)
Последовательность: (e-AlaSO3H)-Sar10-(SEQ ID NO: 11)
1,11 г смолы использовали для генерации 150,0 мг BCY6152 (чистота 98,75%; выход 9,5%) в виде белого твердого вещества.____________________________________________________________
BCY6152 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 10,09 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1040,3 ГМ+ЗН]3+ |
Молекулярная масса пептида | 3119,59 |
BCY6141 (соединение 112)
- 34 047678 о
а‘-° °',.
Твердофазный мн синтез
НО '-/Л
СО А
-W-N' ,1 , NH2 screw
Последовательность: (e-Ala)-Sarw-A(D-Arg)DC(HyP)LVNPLCL(D-3,3-DPA)P(D-Asp)W(HArg)C((eAla)-Sarw-(SEQ ID NO: 93))
1,11 г смолы использовали для генерации 120,0 мг BCY6141 (чистота 97,91%; выход 7,3%) в виде белого твердого вещества.__________________________________________________________
BCY6141 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 11,41 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1085,5 ГМ+ЗН]3+ |
Молекулярная масса пептида | 3255,78 |
BCY6026 (соединение 87)
Последовательность: ACPLVNPLCLHPGWSCRGQ (SEQ ID NO: 77)
1,11 г смолы использовали для генерации 285,0 мг BCY6026 (чистота 97,7%; выход 24,2%) в виде белого твердого вещества.
- 35 047678
BCY6026 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 9,31 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1150 [М+2Н]2+, 767,0 [М+ЗН]3+ |
Молекулярная масса пептида | 2299,71 |
BCY6153 (соединение 113)
BCY61S3
Последовательность: (e-AlaSO3H)-Sar5-(SEQ ID NO: 11)
1,11 г смолы использовали для генерации 140,0 мг BCY6153 (чистота 98,59%; выход 9,9%) в виде белого твердого вещества._____________________________________________________________
BCY6153 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 20-50% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 10,33 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1382,6 [М+2Н]2+, 922,0 [М+ЗН]3+ |
Молекулярная масса пептида | 2764,2 |
Приготовление конъюгатов лекарственных средств с бициклическим пептидом.
Общая схема приготовления бициклических конъюгатов лекарственных средств (BDC) представле на на фиг. 1, и в табл. A описан компонент таргетирующего бицикла и линкер/токсическое средство внутри каждого BDC.
Таблица A
BDC (номер BCY) | Таргетирующий бицикл (номер BCY) | Линкер/токсическое средство |
6136 | 6099 | ValCit-MMAE |
6033 | 6014 | |
6029 | 6009 | |
6122 | 6104 | |
6053 | 6018 | |
6049 | 6017 |
- 36 047678
6037 | 6019 | |
6030 | 6009 | |
6034 | 6014 | |
6050 | 6017 | TrpCit-MMAE |
6054 | 6018 | |
6038 | 6019 | |
6061 | 6014 | ValLys-MMAE |
6174 | 6099 | |
6062 | 6014 | D-TrpCit-MMAE |
6135 | 6099 | |
6031 | 6014 | |
6134 | 6104 | |
6027 | 6009 | |
6047 | 6017 | DM1-SS- |
6035 | 6019 | |
6051 | 6018 | |
6154 | 6152 | |
6155 | 6153 | |
6173 | 6099 | |
6082 | 6014 | |
6150 | 6018 | DM1-SS(SO3H)- |
6151 | 6104 | |
6162 | 6138 | |
6161 | 6137 | |
6032 | 6014 | |
6052 | 6018 | |
6048 | 6017 | DMl-SS-(Me)- |
6036 | 6019 | |
6028 | 6009 | |
6039 | 6014 | DMl-(Me)-SS-(Me)- |
6055 | 6014 | DMl-SS-(Me2)- |
6077 | 6014 | DMl-SS-(Me)-SO3H- |
6063 | 6014 | Нерасщепляемое (MMAE) |
6064 | 6014 | Нерасщепляемое (DM1) |
6105 | 6014 | MMAE-Ala-Ala-Asn |
6106 | 6014 | MM AE-D-Al a-Phe-Ly s- |
6175 | 6099 | |
MMAE-Glu-Pro-Cit-Gly- | ||
6107 | 6014 | |
hPhe-Tyr-Leu- |
Синтез конъюгатов лекарственных средств с бициклическими пептидами BCY6027, BCY6028, BCY6031 и BCY6032, представленными в табл. 6, проводили с использованием протокола, раскрытого в патентном документе WO 2016/067035.
Активированные бициклические пептиды с формулой (C) и (D):
Г :'Ί С
L л (С)
(D)
- 37 047678 синтезировали путем реакции свободной аминогруппы бициклических прекурсоров, соответственно, с SPP (N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноатом, Annova Chem) и SPDB (N-сукцинимидил 3(2-пиридилдитио)пропионатом, Annova Chem) в DMSO. Концентрации бициклических прекурсоров составляли 10 мМ или выше, при 1,3-кратном избытке SPP или SPDB 20-кратном избытке диизопропилэ тиламина, при комнатной температуре. На основании данных анализа методом LCMS, реакция завершалась через 1 час. Очистку проводили высокоэффективной хроматографией с обращенной фазой, как описано выше. Соответствующие фракции лиофилизировали.
Активированные бициклические пептиды с формулой (C) и (D) подвергали реакции замена дисульфида на 1,15 эквивалента DM1 (в форме свободного триола) в полуводных условиях (50% диметилацетамид и 50% 100 мМ ацетат натри pH 5,0, дополненные 2мМ EDTA) в течение 21 часа при комнатной температуре в атмосфере азота. Концентрации активированных бициклических пептидов со структурой
C и D в реакции составляли 10 мМ или выше.
Затем следовала стандартная очистка методом высокоэффективной хроматографией с обращенной фазой с использованием колонки C18. Выделяли фракции с чистотой выше чем 95% и лиофилизировали их. Материалы не содержали обнаруживаемых количеств свободного токсического вещества.
Серии MMAE.
Серии Val-Cit-MMAE.
Val-Cit-MMAE Линкер.
- 38 047678
Соединение 2
Пептид синтезировали методом твердофазного синтеза. Использовали 50 г смолы CTC Resin (концентрация: 1,0 ммоль/г). К смеси, содержащей смолу CTC Resin (50 ммоль, 50 г, 1,0 ммоль/г) и Fmoc-CitOH (19,8 г, 50 ммоль, 1,0 экв.) добавляли DCM (400 мл), затем добавляли DIEA (6,00 экв.) и смешивали в течение 3 ч. И затем добавляли MeOH (50 мл) и смешивали в течение 30 мин для блокирования. Для деблокирования использовали 20% пиперидина в DMF. Boc-Val-OH (32,5 г, 150 ммоль, 3 экв.) подвергали реакции связывания с HBTU (2,85 экв.) и DIPEA (6,0 экв.) в DMF (400 мл). Контролировали протекание реакции с использованием цветной реакции нингидрина. После завершения синтеза, пептидную смолу промывали с помощью DMF x 3, MeOH x 3, и затем сушили при барботировании N2 в течение ночи. После чего пептидную смолу обрабатывали 2 раза с помощью 20% HFIP/DCM в течение 30 мин. Растворитель удаляли на роторном испарителе с получением неочищенного вещества. Неочищенный пептид растворяли в ACN/H2O, затем дважды лиофилизировали с получением пептидного продукта (17,3 г неочищенный). _________________________________
ELCMS (ESI): m/z 374,9 [М+Н]+
Молекулярная масса__374,44_______
Соединение 3
Раствор соединения 2 (4,00 г, 10,68 ммоль, 1,00 экв.) в DCM (40,00 мл) и MeOH (20,00 мл) перемешивали при комнатной температуре, затем добавляли (4-аминофенил)метанол (1,58 г, 12,82 ммоль, 1,20 экв.) и EEDQ (5,28 г, 21,37 ммоль, 2,00 экв.), и смесь перемешивали в темноте в течение 9 ч. Анализ методом тонкослойной хроматографии (TLC) (дихлорметан/метанол=5/1, Rf=0,56) показал, что образовалась новое пятно. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с удалением растворителя. Полученный остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле (ISCO®; колонка 120 g SepaFlash® Silica Flash, элюент 0~20% MeOH/DCM и 80 мл/мин). Соединение 3 (3,00 г, 6,26 ммоль, вы ход 58,57%) получали в виде белого твердого вещества.
Соединение 4
LCMS (ESI): Молекулярная масса m/z 480,1 [М+Н] 479,58
К раствору соединения 3 (3,00 г, 6,26 ммоль, 1,00 экв.) в безводном THF (35,00 мл) и безводном DCM (15,00 мл) добавляли (4-нитрофенил)хлорформиат (6,31 г, 31,30 ммоль, 5,00 экв.) и пиридин (2,48 г, 31,30 ммоль, 2,53 мл, 5,00 экв.), и смесь перемешивали при 25°C в течение 5 ч. Анализ методом TLC (дихлорметан/метанол=10/1, Rf=0,55) показал, что образовалось новое пятно. Реакционную смесь фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали
- 39 047678 флэш-хроматографией на силикагеле (ISCO®; колонка 120 g SepaFlash® Silica Flash, элюент 0~10% DCM/MeOH и 80 мл/мин). Соединение 4 (2,00 г, 3,10 ммоль, выход 49,56%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): | m/z 667,3 [M+Na]+ |
Молекулярная масса | 644,68 |
Соединение 5
Смесь соединения 4 (278,43 мг, 387,80 мкмоль, 1,00 экв.) и DIEA (501,19 мг, 3,88 ммоль, 677,29 мкл, 10,00 экв.) в DMF (5,00 мл) перемешивали в атмосфере азота в течение 10 мин. Добавляли MMAE (250,00 мг, 387,80 мкмоль, 1,00 экв.) и HOBt (52,40 мг, 387,80 мкмоль, 1,00 экв.), и смесь перемешивали при 0°C в атмосфере азота в течение 20 мин и перемешивали при 30°C в течение еще 18 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Полученную смесь очищали флэш-гель-хроматографией C18 (ISCO®; 130 г колонка SepaFlash® C18 Flash, элюент 0~50% MeCN/H2O и 75 мл/мин). Соединение 5 (190,00 мг, 155,29 мкмоль, выход 40,04%) получали в виде белого твердого вещества.
Соединение 6 m/z 1223,4 [М+Н] 1223,57
LCMS (ESI): Молекулярная масса
К раствору соединения 5 (170,00 мг, 138,94 мкмоль, 1,00 экв.) в DCM (2,70 мл) добавляли 2,2,2трифторуксусную кислоту (413,32 мг, 3,62 ммоль, 268,39 мкл, 26,09 экв.), и смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 5 было полностью израсходовано. Смесь концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток растворяли в THF (10,00 мл) и добавляли K2CO3 (192,03 мг, 1,39 ммоль, 10,00 экв.), смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 3 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Полученную реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Остаток очищали флэш-гель-хроматографией C18 (ISCO®; колонка 130 g SepaFlash® C18 Flash, элюент 0~50% MeCN/H2O и 75 мл/мин). Соединение 6 (110,00 мг, 97,92 мкмоль, выход 70,48%) получали в виде белого твердого вещества.
| LCMS (ESI): | m/z 1123,4 [М+Н]+ | | Молекулярная масса | 1123,45 |
- 40 047678
Соединение 7
К раствору соединения 6 (110,00 мг, 97,92 мкмоль, 1,00 экв.) в DMA (5 мл) добавляли DIEA (25,31 мг, 195,83 мкмоль, 34,20 мкл, 2,00 экв.) и тетрагидропиран-2,6-дион (22,34 мг, 195,83 мкмоль, 2,00 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 6 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Реакционную смесь очищали флэш-гель-хроматографией (ISCO®; колонка 130 g SepaFlash® C18 Flash, элюент 0~50% MeCN/H2O и 75 мл/мин). Соединение 7 (100,00 мг, 80,81 мкмоль, 82,53% выход) получали в виде белого твердого вещества._____________________________________
LCMS (ESI):
DM m/z 1237,4 [M+H] 1236,74
Молекулярная масса__
Соединение 8 (MMAE-PABC-Cit-Val-Глутарат-NHS)
К раствору соединения 7 (100,00 мг, 80,81 мкмоль, 1,00 экв.) в DMA (4,5 мл) и DCM (1,5 мл) добавляли 1-гидроксипирролидин-2,5-дион (27,90 мг, 242,42 мкмоль, 3,00 экв.) в атмосфере N2, смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин. К смеси добавляли EDCI (46,47 мг, 242,43 мкмоль, 3,00 экв.), и смесь перемешивали при 25°C в течение еще 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 7 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Реакционную смесь очищали флэш-гель-хроматографией (ISCO®; колонка 130 g SepaFlash® C18 Flash, элюент 0-50% MeCN/H2O и 75 мл/мин). Соединение 8 (90,00 мг, 60,69 мкмоль, 75,11% выход) получали в виде белого твердого вещества. _________________________________
LCMS (ESI): Молекулярная масса m/z 1334,5 [М+НГ
1334,62
Общая методика для связывания MMAE-PABC-Cit-Val-Глутарат-NHS с таргетирующими бициклами.
К раствору бицикла (1,0-1,3 экв.) в DMA добавляли DIEA (3 экв.) и MMAE-PABC-Cit-Val-ГлутаратNHS (1 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 18 ч. Ход реакции контролировали методом LCMS, и после ее окончания, реакционную смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
- 41 047678
BCY6136
BCY6099 (71,5 мг, 22,48 мкмоль) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6136 (40,9 мг, 9,05 мкмоль, выход 40,27%, чистота 97,42%) получали в виде белого твердого веще ства.
BCY6136 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68%o В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 11,35 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1468,1 [М+ЗН]3+, 1101,2 [М+4Н]4+, 881,3 |·Μ+5Η]5+ |
Молекулярная масса пептида | 4404,2 |
BCY6033
BCY6014 (70,00 мг, 22,47 мкмоль, 1,00 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6033 (33,90 мг, 7,96 мкмоль, выход 34,57%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6033 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 35-65%o В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 7,47 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1065,2 [М+4Н]4+, 852,2 (М+5Н]5+ |
Молекулярная масса пептида | 4259,04 |
- 42 047678
BCY6029
BCY6009 (70,0 мг, 22,47 мкмоль, 1 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6029 (32,9 мг, 7,75 мкмоль, выход 33,49%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6029 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 35-65% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 7,46 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1061,7 ГМ+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 4245,02 |
BCY6122
BCY6104 (71,59 мг, 22,48 мкмоль, 1,00 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6122 (38,30 мг, 8,57 мкмоль, выход 38,14%, чистота 98,58%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6122 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX Cl8 5 мкм ΠΟΑ 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 10,72 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1101,8 ГМ+4Н14+, 881,5 ГМ+5Н]5+ |
Молекулярная масса пептида | 4406,18 |
- 43 047678
BCY6053
BCY6018 (72,40 мг, 26,97 мкмоль, 1,2 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6053 (38,3 мг, 9,81 мкмоль, 43,65% выход) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6049
BCY6017 (50,75 мг, 22,48 мкмоль, 1,2 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6049 (22,5 мг, 6,47 мкмоль, выход 34,54%) получали в виде белого твердого вещества.
- 44 047678
BCY6037
Η-Ν Ο
BCY6019 (65,00 мг, 22,47 мкмоль, 1,00 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6037 (26,80 мг, 6,66 мкмоль, выход 28,74%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6037 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX Cl 8 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 35-65% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 8,79 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1342,1 [М+ЗН]3+, 1006,6 ГМ+4Н]4+ |
Мо л еку ляр ная масса пептида | 4025,84 |
Trp-Cit-MMAE серии.
Trp-Cit-MMAE линкер.
o^nh2
- 45 047678
Общая методика получения соединения 3
К раствору соединения 2 (4,00 г, 8,67 ммоль, 1,00 экв.), DIC (1,61 г, 12,78 ммоль, 1,97 мл, 9,00 экв.) и HOBt (10,54 г, 78,00 ммоль, 9,00 экв.) в DMF (30,00 мл) добавляли (4-аминофенил)метанол (9,61 г, 78,00 ммоль, 9,00 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Смесь очищали методом препаративной HPLC. Соединение 3 (4,20 г, 7,41 ммоль, выход 85,49%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): Молекулярная масса Общая методика получения соединения 4 m/z 566,9 [М+Н] 566,66
- 46 047678
К раствору соединения 3 (4,20 г, 6,30 ммоль, 1,00 экв.), DIPEA (1,09 г, 8,40 ммоль, 1,47 мл, 7,00 экв.) в DMF (30,00 мл) добавляли одной порцией бис(4-нитрофенил)карбонат (11,50 г, 37,79 ммоль, 6,00 экв.). Смесь перемешивали при 0-15°C в течение 1,5 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (TFA условие). Соединение 4 (2,00 г, 2,40 ммоль, выход 38,16%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): Молекулярная масса Общая методика получения соединения 5 m/z 732,0 [М+Н]731,76
К раствору соединения 4 (300,00 мг, 360,63 мкмоль, 1,00 экв.), DIEA (93,22 мг, 721,27 мкмоль, 125,97 мкл, 3,00 экв.) в DMF (10,00 мл) добавляли MMAE (233,03 мг, 324,57 мкмоль, 0,90 экв.) и HOBt (48,73 мг, 360,63 мкмоль, 1,00 экв.) при 0°C. Смесь перемешивали при 30°C в течение 18 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 4 был полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 5 (250,00 мг, 190,75 мкмоль, выход 52,89%) получали в виде желтого твердого вещества. ______________________________________________
LCMS (ESI): Молекулярная масса Общая методика получения соединения 6 m/z 1310,5 [М+Н] 1310,65
- 47 047678
К раствору соединения 5 (240,00 мг, 183,12 мкмоль, 1,00 экв.) в DCM (10,00 мл) добавляли TFA (1,54 г, 13,51 ммоль, 1,00 мл, 73,76 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 2 ч. И смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка, остаток растворяли в THF и добавляли K2CO3, и перемешивали при 15°C в течение 2 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 5 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Остаток очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Неочищенный продукт 6 (125,00 мг, 94,37 мкмоль, выход 51,53%, TFA) использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
LCMS (ESI): | m/z 1210,4 [М+Н]+ |
Молекулярная масса | 1209,53 |
Общая методика получения соединения 7
HjN'X)
К раствору соединения 6 (125,00 мг, 94,37 мкмоль, 1,00 экв, TFA) в DMA (5,00 мл) добавляли DIEA (24,39 мг, 188,75 мкмоль, 32,96 мкл, 2,00 экв.), тетрагидропиран-2,6-дион (21,54 мг, 188,75 мкмоль, 2,00 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 2 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 6 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 7 (100,00 мг, 75,49 мкмоль, выход 80,00%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): | m/z 1324,5 [М+Н]+ |
Молекулярная масса | 1324,63 |
Общая методика получения соединения 8 (MMAE-PABC-Cit-Trp-Глутарат-NHS)
- 48 047678
К раствору соединения 7 (100,00 мг, 75,49 мкмоль, 1,00 экв.), 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (26,07 мг, 226,48 мкмоль, 3,00 экв.) в DMA (3,00 мл) and DCM (1,00 мл) добавляли EDCI (43,42 мг, 226,48 мкмоль, 3,00 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 4 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 7 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. DCM удаляли. Непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 8 (60,00 мг, 42,20 мкмоль, выход 55,91%) получали в виде белого твердого вещества.
ELCMS (ESI): ~m/z 711,2 [М+2Н)2+
Молекулярная масса__1421,7_______
Общая методика связывания MMAE-PABC-Cit-Trp-Глутарат-NHS с таргетирующими бициклами.
К раствору бицикла (1,0-1,3 экв.) в DMA добавляли DIEA (3 экв.) и MMAE-PABC-Cit-Trp-ГлутаратNHS (1 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 18 ч. Ход реакции контролировали методом LCMS, и после завершения реакции, реакционную смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). BCY6030
BCY6009 (47,29 мг, 14,07 мкмоль, 1,00 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6030 (0,0156 г, 3,51 мкмоль, выход 24,93%, чистота 97,41%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6030 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 35-65% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 7,90 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1083,7 [М+4Н]4 |
Молекулярная масса пептида | 4332,17 |
BCY6034
BCY6014 (88,21 мг, 23,21 мкмоль, 1,10 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6034 (27,70 мг, 6,05 мкмоль, выход 28,70%, чистота 95,02%) получали в виде белого твердого вещества.
- 49 047678
BCY6034 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 30-60% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 11,49 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1449,3 |М+ЗН]3+, 1087,4 |М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 4346,13 |
BCY6050
N ЧО
BCY6017 (57,17 мг, 25,32 мкмоль, 1,2 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6050 (0,0519 г, 14,56 мкмоль, выход 69,01%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6050 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 13,55 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1188,5 [М+ЗН]3+, 891,7 |·Μ+4Η]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3564,25 |
BCY6054
BCY6018 (67,97 мг, 25,32 мкмоль, 1,2 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6054 (40,10 мг, 10,05 мкмоль, выход 47,62%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6054 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX Cl8 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 13,73 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1330,4 [М+ЗН]34, 998,1 |М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3990,72 |
BCY6038
BCY6019 (81,39 мг, 23,21 мкмоль, 1,10 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. Соединение BCY6038 (34,10 мг, 8,02 мкмоль, выход 38,00%, чистота 96,68%) получали в виде белого твер дого вещества.
- 50 047678
BCY6038 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 35-65% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 9,56 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1371,0 ГМ+ЗН]3+, 1028,3 |М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 4111,9 |
MVAE. ί OBt
Π FA THF
DIEA, DMF kXCC
DGM I Hl·
Val-Lys-MMAE серии.
Val-Lys-MMAE Линкер.
- 51 047678
ОН
X NH .
i о i о...
о.
: ιΚ)ΝΗΛη х б он
HOSu EDCI
DMA, DCM
О;
ЫН о
ОН !
Общая методика получения соединения 2
К смеси соединения 1 (3,00 г, 5,89 ммоль, 1 экв.) и (4-аминофенил)метанола (869,93 мг, 7,06 ммоль, 1,2 экв.) в DCM (35 мл) и MeOH (18 мл) добавляли EEDQ (2,91 г, 11,77 ммоль, 2 экв.) в темноте в атмосфере азота, смесь перемешивали при 25°C в течение 5 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Полученную реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле (ISCO®; колонка 120 g SepaFlash® Silica Flash, элюент 0~20% MeOH/DCM и 80 мл/мин). Соединение 2 (2,2 г, 3,58 ммоль, выход 60,79%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): Молекулярная масса Общая методика получения соединения 3 m/z 615,0 ГМ+Н] 614,78
К раствору соединения 2 (500 мг, 813,31 мкмоль, 1 экв.) в THF (10 мл) добавляли DIEA (630,69 мг, 4,88 ммоль, 849,98 мкл, 6 экв.) при 0°C в атмосфере азота с перемешиванием в течение 30 мин. Затем добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (1,48 г, 4,88 ммоль, 6 экв.), смесь перемешивали при 25°C в атмосфере азота в течение еще 21 часа. Анализ методом LC-MS показывал, что был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Полученную реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле (ISCO®; колонка 40 g SepaFlash® Silica Flash, элюент 0~20% MeOH/DCM и 40 мл/мин). Соединение 3 (500 мг, 641,13 мкмоль, выход 78,83%) получали в виде желтого твердого вещества.
- 52 047678
LCMS (ESI): Молекулярная масса Общая методика получения соединения 4
МИДЕ, HOBI
DIEA. DMF
.Вос
К смеси соединения 3 (500 мг, 512,90 мкмоль, 1,23 экв.) в DMF (8 мл) добавляли DIEA (135,01 мг, 1,04 ммоль, 181,95 мкл, 2,5 экв.) с перемешиванием при 0°C в течение 30 мин. Затем добавляли MMAE (300 мг, 417,84 мкмоль, 1 экв.) и HOBt (84,69 мг, 626,76 мкмоль, 1,5 экв.), и смесь перемешивали при 40°C в течение 15 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Остаток очищали флэш-гельхроматографией (ISCO®; колонка 130 g SepaFlash® C18 Flash, элюент 0--60% MeCN/H2O и 75 мл/мин). Соединение 4 (330 мг, 242,87 мкмоль, 58,13% выход) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): Молекулярная масса Общая методика получения соединения 5 m/z 679,7 [М+2Н]2
1358,77
TFA, КгСОз
DCM. THF
К раствору соединения 4 (325 мг, 239,19 мкмоль, 1 экв.) в DCM (18 мл) добавляли TFA (3,03 г, 26,60 ммоль, 1,97 мл, 111,22 экв.) при 0°C, смесь перемешивали при 25°C в течение 2 ч. Анализ методом LCMS показывал, что соединение 4 было полностью израсходовано. Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением остатка, остаток растворяли в THF (10 мл) и добавляли K2CO3 (661,16 мг, 4,78 ммоль, 20 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 15 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Полученную реак- 53 047678 ционную смесь фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали флэш-гель-хроматографией (ISCO®; колонка 130 g SepaFlash® C18 Flash, элюент 0~60% MeCN/H2O и 75 мл/мин). Соединение 5 (170 мг, 135,07 мкмоль, выход 56,47%) получали в виде белого твердого вещества______________________________________
LCMS (ESI): Молекулярная масса Общая методика получения соединения 6 m/z 629,7 [М+2Н]2+
1258,65
Круглодонную колбу, содержащую раствор соединения 5 (140 мг, 111,23 мкмоль, 1 экв.) в DMA (5 мл), продували азотом из баллона и добавляли в нее DIEA (28,75 мг, 222,46 мкмоль, 38,75 мкл, 2 экв.) при 0°C с перемешиванием в течение 10 минут, добавляли тетрагидропиран-2,6-дион (25,38 мг, 222,46 мкмоль, 2 экв.) в виде раствора в DMA. Смесь перемешивали при 25°C в течение 12 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 5 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Полученную реакционную смесь очищали флэш-гель-хроматографией (ISCO®; колонка 43 g SepaFlash® C18 Flash, элюент 0~60% MeCN/H2O и 40 мл/мин). Соединение 6 (120 мг, 87,42 мкмоль, выход 78,59%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 7 (MMAE-PABC-Lys(Dde)-Val-ETyTapam-NHS) m/z 686,7 [М+2Н]2+
1372,75
LCMS (ESI): Молекулярная масса
К раствору соединения 6 (120 мг, 87,42 мкмоль, 1 экв.) в DMA (9 мл) и DCM (3 мл) добавляли 1гидроксипирролидин-2,5-дион (30,18 мг, 262,25 мкмоль, 3 экв.) с перемешиванием, и добавляли EDCI
HOStl.EDCI
DMA, DCM
- 54 047678 (50,27 мг, 262,25 мкмоль, 3 экв.), смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин и при 25°C в течение еще 19 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 6 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Полученную реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с удалением DCM. Смесь очищали флэш-гель-хроматографией (ISCO®; колонка 43 g SepaFlash® C18 Flash, элюент 0~60% MeCN/H2O и 40 мл/мин). Соединение 7 (60 мг, 40,82 мкмоль, 46,70% выход) . получали в виде белого, твердого вещества.
LCMS (ESI): Молекулярная масса m/z 735,3 [М+2Н]2+
1469,83
Общая методика связывания MMAE-PABC-Lys(Dde)-Val-Глутарат-NHS с таргетирующими бициклами
К раствору бицикла (1,0-1,3 экв.) в DMA добавляли DIEA (3 экв.) и MMAE-PABC-Lys(Dde)-ValГлутарат-NHS (1 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 18 ч. Ход реакции контролировали методом LC-MS, и после завершения реакции, реакционную смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
Общая методика удаления защитной группы Dde (№а-1-(4,4-диметил-2,6-диоксо-циклогексилен))
' ) V о Г4 ч, ' NH ί Ν 1
О
IJ Гаргетируищий ' (sj ' видам
а
Ta р г р тиру юти й j бидижл
BCY6O61
К раствору пептида, защищенного группой Dde, (1 экв.) в DMF добавляли гидрат гидразина (6500 экв.), и смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. Ход реакции контролировали методом LC-MS, и после окончания реакции, смесь очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), и очищенные фракции лиофилизировали.
- 55 047678
BCY6061
BCY6014 (124,12 мг, 40,82 мкмоль, 1,2 экв.) использовали в качестве бициклического реагента.
Dde-BCY6038 (80 мг, 18,20 мкмоль, 53,51% выход) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): | m/z 1099,0 |M+4H]4+, 879,4 |M+5H]5+ |
Молекулярная масса | 4395,24 |
Dde-BCY6061 (78 мг, 17,75 мкмоль) подвергали реакции удаления защитной группы в соответствии с общей методикой с получением BCY6061 (47,1 мг, 11,13 мкмоль, выход 62,73%) в виде белого твердого вещества.
BCY6061 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX Cl 8 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 12,01 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1058,1 [М+4Н]4, 846,5 ГМ+5Н]5+ |
Молекулярная масса пептида | 4230,03 |
BCY6174 ; О | О !NH ,н BCv6099
DIEA, DMA
- 56 047678
BCY6099 (389,77
122,47 мкмоль, 1,2 экв.) использовали в качестве бициклического реагента.
мг,
Dde-BCY6174 (0,250 г, 55,10 мкмоль, выход 53,99%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): | m/z 1513,0 [М+ЗН]3+, 1135,0 [М+4Н]4+, 908,2 [М+5Н]5+ |
Молекулярная масса | 4538,38 |
Dde-BCY6174 (0,250 г, 55,10 мкмоль, 1,0 экв.) подвергали реакции удаления защитной группы в соответствии с общей методикой с получением BCY6174 (0,1206 г, 27,45 мкмоль, выход 49,82%) в виде белого твердого вещества.____________________________________________________________
BCY6174 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 9,85 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1458,5 |М-ЗН|3 , 1094,1 [М+4Н]4+, 875,4 [М+5Н]5+ |
Молекулярная масса пептида | 4373,17 |
D-Trp-Cit-MMAE серии.
D-Trp-Cit-MMAE Линкер.
- 57 047678
- 58 047678
Общая методика получения соединения 3
К раствору соединения 1 (2 г, 4,33 ммоль, 1,00 экв.), DIC (4,92 г, 39,00 ммоль, 6,00 мл, 9,00 экв.), HOBt (5,27 г, 39,00 ммоль, 9,00 экв.) в DMF (30,00 мл) добавляли (4-аминофенил)метанол (4,80 г, 39,00 ммоль, 9,00 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 2 (2 г, 3,53 ммоль, 81,45% выход) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): Молекулярная масса Общая методика получения соединения 4 m/z 666,9 [М+Н] 666,78
К раствору соединения 2 (2 г, 3,00 ммоль, 1 экв.), DIEA (2,71 г, 21,00 ммоль, 3,66 мл, 7 экв.) в DMF (20 мл) добавляли одной порцией бис(4-нитрофенил)карбонат (5,48 г, 18,00 ммоль, 6 экв.) при 0°C. Смесь перемешивали при 0-15°C в течение 2 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 3 (0,9 г, 1,08 ммоль, выход 36,07%) получали в виде желтого твердого вещества.
- 59 047678
К раствору соединения 3 (350 мг, 420,74 мкмоль, 1,00 экв.), HOBt (56,85 мг, 420,74 мкмоль, 1 экв.) и DIEA (163,13 мг, 1,26 ммоль, 219,86 мкл, 3 экв.) в DMF (10 мл) добавляли MMAE (302,08 мг, 420,74 мкмоль, 1 экв.) при 0°C. Смесь перемешивали при 40°C в течение 18 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 4 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 4 (0,22 г, 155,95 мкмоль, выход 37,06%) получали в виде желтого твердого вещества.
m/z 1410,5 |М+Н]+, 705,7 |М+2Н]2+ 1410,76
LCMS (ESI): Молекулярная масса Общая методика получения соединения 6
К раствору соединения 4 (0,21 г, 148,86 мкмоль, 1 экв.) в DCM (9 мл) добавляли TFA (1,54 г, 13,51 ммоль, 1 мл, 90,73 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 4 ч и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка, который растворяли в THF, затем добавляли в твердом виде K2CO3 и перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 4 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 5 (0,13 г, 102,02 мкмоль, выход 68,54%, чистота 95%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): Молекулярная масса m/z 1210,4 [М+Н]+, 605,8 [М+2Н]2+ 1210,53
- 60 047678
Общая методика получения соединения 7
К раствору соединения 5 (0,12 г, 99,13 мкмоль, 1 экв.) в DMA (5 мл) добавляли DIEA (38,44 мг, 297,40 мкмоль, 51,80 мкл, 3 экв.) и тетрагидропиран-2,6-дион (22,62 мг, 198,26 мкмоль, 2 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 5 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 6 (0,09 г, 67,94 мкмоль, выход 68,54%) получали в виде белого твердого вещества.
m/z 662,7 [М+2Н]2+
1324,63
LCMS (ESI): Молекулярная масса Общая методика получения соединения 8
К раствору соединения 6 (0,09 г, 67,95 мкмоль, 1 экв.), HOSu (23,46 мг, 203,84 мкмоль, 3 экв.) в DMA (6 мл) и DCM (2 мл) добавляли EDCI (39,08 мг, 203,84 мкмоль, 3 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 6 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. DCM удаляли, и остаток непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 7 (0,06 г, 40,09 мкмоль, выход 59,01%, чистота 95%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): Молекулярная масса m/z 711,2 [М+2Н]2+
1421,7
BCY6062
К раствору BCY6014 (76,99 мг, 25,32 мкмоль, 1,2 экв.) в DMA (5 мл) добавляли DIEA (8,18 мг, 63,31 мкмоль, 11,03 мкл, 3 экв.), соединение 7 (0,03 г, 21,10 мкмоль, 1 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Ход реакции контролировали методом LC-MS, и после завершения реакции, смесь
- 61 047678 очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). BCY6062 в виде белого (0,0255 г, 5,70 мкмоль, выход 27,01%, чистота 97,15%)
BCY6062 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 13,15 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1449,2 ГМ+ЗН]3+, 1087,0 ГМ+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 4346,13 |
вещества.
DM1 серии.
DM1-SS- серии.
DM1-SPDP-TFP Линкер.
К раствору 2-(2-пиридилдисульфанил)пиридина (12,37 г, 56,18 ммоль, 1,50 экв.) в EtOH (100,00 мл) добавляли 4-сульфанилбутановую кислоту (4,50 г, 37,45 ммоль, 1,00 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 18 ч в атмосфере N2. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Остаток очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (C18 360 г, нейтральное условие). Соединение SPDB (1,9 г, 8,29 ммоль, выход 22,12%) получали в виде желтого твердого вещества.
1H ЯМР: ES6446-8-P1A 400 МГц CDCls δ ppm 1,98 (кв, J=7,09 Гц, 2H), 2,45 (т, J=7,15 Гц, 2H), 2,79 (т, J=7,03 Гц, 2H), 7,03 (дд, J=7,15, 4,89 Гц, 1H), 7,19 (с, 1H), 7,56-7,65 (м, 2H), 8,41 (д, J=4,52 Гц, 1H).
LCMS (ESI): Молекулярная масса m/z 230,0 [М+НГ 229,31
- 62 047678
DM1-SPDB
Смесь DM1 (250,00 мг, 338,62 мкмоль, 1,00 экв.) и 4-(2-пиридилдисульфанил)бутановой кислоты (100,95 мг, 440,21 мкмоль, 1,30 экв.) добавляли в атмосфере азота в колбу объемом 50 мл of с DMF (10,00 мл), продували с помощью N2 в течение 30 мин. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что DM1 был полностью израсходовано, и был зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Остаток очищали флэш-гель-хроматографией (ISCO®; колонка 120 g SepaFlash® C18 Flash, элюент 0-60% MeCN/H2O и 85 мл/мин). DM1-SPDB (120,00 мг, 140,11 мкмоль, выход 41,38%) получали в виде белого твердого вещества.
DM1-SPDB-TFP m/z 838,0 [М+Н-Н2О1 856,44
LCMS (ESI): Молекулярная масса
К раствору DM1-SPDB (120,00 мг, 140,11 мкмоль, 1,00 экв.) и 2,3,5,6-тетрафторфенола (69,81 мг, 420,34 мкмоль, 3,00 экв.) в DCM (1,00 мл) и DMA (3,00 мл) добавляли EDCI (80,58 мг, 420,34 мкмоль, 3,00 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 4 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что DM1SPDB было полностью израсходовано, и был зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. DCM удаляли, и остаток непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение DM1-SPDB-TFP (60,00 мг, 59,73 мкмоль, выход 42,63%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): Молекулярная масса m/z 985,9 [М+Н-Н2О]
1004,5
Общая методика связывания DM1-SPDB-TFP с таргетирующими бициклами
К раствору таргетирующего бицикла (1,1-1,3 экв.) в DMA добавляли DIEA (3 экв.) и DM1-SPDBTFP (1 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 18 ч. Ход реакции контролировали методом LCMS, и после завершения реакции, смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
- 63 047678
BCY6135
- --H / ν ·;θ Λ ϋ с ο 2 ϊί BCY6099 S ' F ° r DIEADMA.ft
DM'I-SPOB-'TP,
F ' · =' F
-OHOhn-A ,—' V \ \ /V'vo 'N-A Ckjo
Cl ’ ° I JJL X s' BCY6099
BCY6135
BCY6099 (114,1 мг, 35,84 мкмоль) использовали в качестве бициклического реагента. Получали 22,4 мг соединения BCY6135 (5,30 мкмоль, выход 17,74%, чистота 95,14%) в виде белого твердого вещества.
в Подвижная фаза: Расход: | 1CY6135 Данные анализа А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX Cl 8 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 9,81 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1341,5 [М+ЗН]3+, 805,0 [М+5Н]5+ |
Молекулярная масса пептида | 4021,08 |
BCY6031
BCY6031
BCY6014 (121,07 мг, 39,82 мкмоль) использовали в качестве бициклического реагента. Получали 59,90 мг соединения BCY6031 (14,67 мкмоль, выход 36,85%, чистота 95,02%) в виде белого твердого вещества.
- 64 047678
BCY6031 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 35-65% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 6,284 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1286,4 [М+ЗН-Н2О]3+, 965,6 [М+4Н-Н2О]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3877,96 |
BCY6134
BCY6134
BCY6104 (95,11 мг, 29,87 мкмоль, 1 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. BCY6134 (0,0232 г, 5,64 мкмоль, выход 18,89%, чистота 97,82%) получали в виде белого твердого веще ства.
BCY6134 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150x4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 9,10 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1001,8 [М+4Н-Н2О]4+ |
Молекулярная масса пептида | 4026,1 |
BCY6027
BCY6027
BCY6009 (60,24 мг, 19,91 мкмоль, 1,00 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. BCY6027 (20,40 мг, 5,11 мкмоль, выход 25,69%, чистота 96,88%) получали в виде белого твердого веще- 65 047678 ства.
BCY6027 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 35-65% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 5,97 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1932,1 |М+2Н]2+, 1282,5 ГМ+ЗН-Н2О]3+ |
Молекулярная масса пептида | 3863,99 |
BCY6047 п ''· > о Ύ 0 θ
Ч Ci J > л -S BCYS017 F F -IF Л :-Д’А *
DM1--SPDB-TFP J J
F'' F л О θΗΟΗΝ - . л Р
BCYS017
BCYS047
BCY6017 (61,81 мг, 27,38 мкмоль, 1,1 экв.) использовали в качестве бициклического реагента.
BCY6047 (0,032 г, 10,34 мкмоль, выход 41,53%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6047 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150x4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 38-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 12,28 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1026,3 [М+ЗН-Н2О]3+ |
Молекулярная масса пептида | 3096,1 |
BCY6035 о
BCY6035 , .BCY6019
АГ Н
BCY6019
DIEA, DMA. rt
BCY6019 (115,22 мг, 32,86 мкмоль, 1,10 экв.) использовали в качестве бициклического реагента.
- 66 047678
BCY603 5 (37,80 мг, 10,37 мкмоль, выход 34,73%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6035 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX Cl 8 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 35-65% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 12,28 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1208,8 ГМ+ЗН-Н2О]3+, 911,5 ГМ+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3643,73 |
BCY6051
BCY6018 (73,48 мг, 27,38 мкмоль, 1,1 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. BCY6051 (0,0582 г, 16,52 мкмоль, выход 66,39%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6051 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX Cl 8 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 11,37 мин |
LCMS (ESI): | m/z 880,5 [М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3522,57 |
BCY6154 _\ Р \ z. ” 'у-Ш \ V/'VAO v_, м-у о ;о« о к °° к С! 1 1 BCYS152
I А DIE A. DMA, ft
DM1-SPDB-TFPJ
F·' %
О °' CI ' ° ) S A _.BCY6152
BCY6154
BCY6152 (93,17 мг, 29,87 мкмоль, 1 экв.) использовали в качестве бициклического реагента.
- 67 047678
BCY6154 (40,10 мг, 9,93 мкмоль, выход 33,27%, чистота 98,06%) получали в виде белого твердого веще ства.
BCY6154 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 11,94 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1313,8 [М+ЗН-Н2О]3+, 985,8 [М+4Н-Н2О]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3958,02 |
BCY6155 о
.......... -«н . ..'•h \ К / V ;о м о ;о„ о г, ’ © 0°
Ч Cl j . , Bcre-isa ·· S' о ---------------j Fx DIE A. DMA, rt
DM1-SPDB-TFP t J F ' >· x F Л -О
BCY6155
BCY6153 (82,55 мг, 29,87 мкмоль, 1 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. BCY6155 (0,0312 г, 8,55 мкмоль, выход 28,62%, чистота 98,69%) получали в виде белого твердого вещества.
DM1-SS(SO3H)- серии.
DM1-SPDP(SO3H)-NHS Линкер.
- 68 047678
Соединение 2
К раствору 4-сульфанилбутановой кислоты (2,0 г, 16,64 ммоль, 1 экв.) и 2-(2-пиридилдисульфанил) пиридина (11,0 г, 49,93 ммоль, 3 экв.) в EtOH (50 мл) добавляли AcOH (1,05 г, 17,48 ммоль, 1 мл, 1,05 экв.). Смесь перемешивали при 40°C в течение 16 ч в атмосфере N2. Анализ методом LC-MS показывал, что зарегистрирован один главный пик с требуемой массой, а анализ методом TLC указывал, что 4сульфанилбутановая кислота была полностью израсходована. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Остаток очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение 2 (2,0 г, 8,72 ммоль, выход 52,4%) получали в виде желтого твердого вещества.
1H ЯМР: 400 МГц CDCl3 δ ppm 2,03-2,11 (м, 2 H), 2,54 (т, J=7,20 Гц, 2H), 2,88 (т, J=7,20 Гц, 2H), 7,11-7,14 (м, 1H), 7,67-7,74 (м, 2H), 8,50 (д, J=4,80 Гц, 1H).
ELCMS (ESI): 230 [М+Н]+
Молекулярная масса__229,31_______
Соединение 3
[r^N о ciso3H |f| 9
DIEA, 1,2-DCE S' ОН
SO3H
3
К раствору соединения 2 (0,5 г, 2,18 ммоль, 1 экв.) в DCE (5 мл) добавляли тремя порциями хлорсульфоновую кислоту (1,5 г, 13,08 ммоль, 0,89 мл, 6 экв.) и двумя порциями DIEA (1,13 г, 8,72 ммоль, 1,52 мл, 4 экв.). Смесь перемешивали при 75°C в течение 2 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Реакционную смесь гасили путем добавления 3 мл H2O, и DCE удаляли. Остаток непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральные условия). Соединение 3 (0,68 г, 1,76 ммоль, выход 80,6%, чистота 80%) получали в виде светло-желтого масла.
1H ЯМР: 400 МГц CDCl3 δ ppm 2,49-2,54 (м, 2H), 3,63-3,67 (м, 2H), 3,90 (т, J=6,60 Гц, 2H), 7,09-7,12 (м, 1H), 7,66-7,76 (м, 2H), 8,47 (дд, J=4,80 Гц, 0,80 Гц, 1H), 8,56 (с, 1H).
LCMS (ESI): | 310,0 [М+Н1+ |
Молекулярная масса | 309,37 |
DM1-SC3H-SPDB
- 69 047678
I SO3H
DM1-SO3H-SPDB
К раствору DM1 (1,0 г, 1,35 ммоль, 1 экв.) и соединения 3 (502,9 мг, 1,63 ммоль, 1,2 экв.) в DMF (10 мл) добавляли водный раствор NaHCO3 для доведения величины pH до 8. Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что DM1 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Остаток непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение DM1SO3H-SPDB (0,28 г, 299,0 мкмоль, выход 22,1%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): | 918,2 ГМ+Н-Н2О]+ |
Молекулярная масса | 936,50 |
но? | .С W Ъ ? X*? λ i Z |
- 70 047678
57,1 мг соединения BCY6173 (3,40 мкмоль, выход 22,79%, чистота 95,80%) в виде белого твердого веще ства.
BCY6173 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 10,30 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1361,9 [М+ЗН-Н2О]3+, 1021,8 [М+4Н-Н2О]4+ |
Молекулярная масса пептида | 4101,15 |
BCY6082
BCY6O82
BCY6014 (711,9 мг, 234,14 мкмоль) использовали в качестве бициклического реагента. Получали 308 мг соединения BCY6082 (74,97 мкмоль, выход 35,2%, чистота 96,36%) в виде белого твердого веще ства.
BCY6082 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX Cl8 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 11,95 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1299,3 [М+ЗН-Н2О]3+, 975,0 [М+4Н-Н2О]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3911,04 |
BCY6150
BCY6018
DMA, DIEA
BCY6018
BCY6018 (77,91 мг, 29,03
BCYS150 мкмоль, 1 экв.) использовали в качестве бициклического реагента.
BCY6150 (0,0249 г, 6,61 мкмоль, выход 22,78%) получали в виде белого твердого вещества.
- 71 047678
BCY6150 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 12,31 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1195,4 ГМ+ЗН-Н2О]3+ |
Молекулярная масса пептида | 3602,63 |
BCY6151
BCY6104 (120,17 мг, 37,73 мкмоль, 1,3 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. BCY6151 (0,0256 г, 6,16 мкмоль, выход 21,22%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6151 Данные анализа | |
Подвижная фаза: Расход: Колонка: Прибор: Метод: Время удерживания: LCMS (ESI): | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN 1,0 мл/мин Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В 8,68 мин m/z 1362,3 [М+ЗН-Н2О]3+ |
Молекулярная масса пептида | 4105,16 |
BCY6162
DM1-SO3H-SPDB
BCY6138 (82,80 мг, 26,61 мкмоль, 1,1 экв.) использовали в качестве бициклического реагента.
BCY6162 (0,0362 г, 8,98 мкмоль, выход 37,13%) получали в виде белого твердого вещества.
- 72 047678
BCY6162 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 21,09 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1323,5 [М+ЗН-Н2О-44]3+ |
Молекулярная масса пептида | 4026,74 |
BCY6161
DM1-SO3H-SPDB
BCY6161
BCY6137 (79,67 мг, 24,48 мкмоль, 1,1 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. BCY6161 (0,0232 г, 5,26 мкмоль, выход 21,76%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6161 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 10,22 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1392 [М+ЗН-Н2О]3+ |
Молекулярная масса пептида | 4192,33 |
DM1-SS-Me серии. DM1-SS-Me Линкер. о ’ о н _ , \ --- 'г^ '° |F N 3·' Η. ...................SP₽ ..................... < Kio DMF.rtlh o' % ό у θ ! DM1 | -ο θ i _b )==/ - ><η о / =1 ' ° X JUs 4 n '3- Ύ он i 1 DM1 -SPP |
- 73 047678
К раствору 2-(2-пиридилдисульфанил)пиридина (2,46 г, 11,18 ммоль, 1,50 экв.) и AcOH (1,05 г, 17,49 ммоль, 1,00 мл, 2,35 экв.) в EtOH (50,00 мл) добавляли 4-сульфанилпентановую кислоту (1,00 г, 7,45 ммоль, 1,00 экв.). Смесь перемешивали при 40°C в течение 18 ч в атмосфере N2. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Остаток очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение SPP (1,61 г, 6,62 ммоль, 88,81% выход) получали в виде желтого твердого вещества.
1H ЯМР: 400 МГц DMSO-d6 δ ppm 1,36 (д, J=6,78 Гц, 3H), 1,88-2,07 (м, 2H), 2,56 (тд, J=7,53, 1,76 Гц, 2H), 3,00-3,09 (м, 1H), 7,11 (ддд, J=7,34, 4,96, 1,00 Гц, 1H), 7,66 (тд, J=7,78, 1,76 Гц, 1H), 7,73-7,77 (м, 1H),
8,48 (дт, J=4,02, 0,88 Гц, 1H).
DM1-SPP
LCMS (ESI): | 243,8 [М+Н]+ |
Молекулярная масса | 243,34 |
раствора DM1 (200 мг, 270,90 мкмоль,
Величину pH
1,00 экв.), 4-(2 пиридилдисульфанил)пентановой кислоты (98,89 мг, 406,35 мкмоль, 1,50 экв.) в H2O (5,00 мл) доводили до 8 с помощью водного раствора NaHCO3. Смесь перемешивали при 15°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что DM1 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой (главный MS составлял M+1-18). Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение
DM1-SPP (120 мг, 137,86 мкмоль, выход 50,89%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): | 852,0 [М+Н-Н2О]+ |
Молекулярная масса | 870,47 |
- 74 047678
DM1-SPP-TFP
К раствору DM1-SPP (0,175 г, 201,04 мкмоль, 1,0 экв.), 2,3,5,6-тетрафторфенола (100,16 мг, 603,13 мкмоль, 3,0 экв.) в DCM (1,0 мл) и DMA (3,0 мл) добавляли EDCI (115,62 мг, 603,13 мкмоль, 3,0 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 12 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что DM1-SPP было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. DCM удаляли, и остаток очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение DM1-SPP-TFP (0,123 г, 120,76 мкмоль, 60,07% выход) получали в , виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): 999,9 [М+Н-Н2О]+
Молекулярная масса__1018,53__________
Общая методика связывания DM1-SPP-TFP с таргетирующими бициклами.
К раствору таргетирующего бицикла (1,1-1,3 экв.) в DMA добавляли DIEA (3 экв.) и DM1-SPP-TFP (1 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 16 ч. Ход реакции контролировали методом LC-MS, и после завершения реакции, смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
BCY6032
ВС¥6032
К раствору DM1-SPP (30,00 мг, 34,46 мкмоль, 1,00 экв.) в DMF (5,00 мл) добавляли DIEA (13,36 мг, 103,38 мкмоль, 18,05 мкл, 3,00 экв.) и HATU (13,10 мг, 34,46 мкмоль, 1,00 экв.). Через 1 час добавляли
- 75 047678
BCY6014 (104,79 мг, 34,46 мкмоль, 1,00 экв.), и смесь перемешивали при 15°C в течение 2 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что 40% DM1-SPP оставалось непрореагировавшим. Анализ методом LC-MS обнаруживал несколько новых пиков, и было определено присутствие 20% требуемого соединения. Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (TFA условие). Соединение BCY6032 (10,00 мг, 2,57 мкмоль, 7,45% выход) получали в виде белого твердого вещества._________________________________________________________
BCY6032 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 25-55% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 13,38 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1292,1 [М+ЗН-Н2О]3+, 969,0 [М+4Н-Н2О]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3892,94 |
BCY6052
BCY6052
BCY6018 (86,96 мг, 32,40 мкмоль, 1,1 экв.) использовали в качестве бициклического реагента.
BCY6052 (32,30 мг, 9,13 мкмоль, выход 31,01%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6052 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% муравьиной кислоты в Н2О В: ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Eclipse XDB-Фенил 3,5 мкм 100 х 3,0 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 35-65% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 6,96 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1173,4 [М+ЗН-Н2О]3+, 884,6 [М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3536,58 |
BCY6048
BCY6048
BCY6017 (66,50 мг, 29,45 мкмоль, 1,2 экв.) использовали в качестве бициклического реагента.
BCY6048 (40,80 мг, 13,12 мкмоль, выход 53,45%) получали в виде белого твердого вещества.
- 76 047678
BCY6036
BCY6048 Данные анализа
Подвижная фаза:___________
Расход:_____________________
Колонка:__________________
Прибор:__________________
Метод:___________________
Время удерживания:________
LCMS (ESI):_______________
Молекулярная масса пептида
А: 0,1% муравьиной кислоты в Н2О В: ACN_______
1,0 мл/мин________________________________________
Eclipse ХРВ-Фенил 3,5 мкм 100 х 3,0 мм__________
Agilent 1200 НРЕС-ВЕ(1-614)_____________________
35-65% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В
7,56 мин________________________________________ m/z 1031,0 |М+ЗН-Н2О]3+, 884,6 |М+4Н]4+
BYS019
DIEA, DMA, rt
BCY6O36
BCY6019 (113,60 мг, 32,40 мкмоль, 1,10 экв.) использовали в качестве бициклического реагента. BCY6036 (53,20 мг, 14,00 мкмоль, выход 47,54%, чистота 96,26%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6036 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX Cl 8 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 35-65% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 8,19 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1213,6 [М+ЗН-Н2О13+, 914,7 |М+4Н]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3657,76 |
BCY6028
BCY6028
BCY6009 (99,00 мг, 29,45 мкмоль, 1,00 экв.) использовали в качестве бициклического реагента.
- 77 047678
BCY6028 (24,30 мг, 6,05 мкмоль, выход 20,56%, чистота 96,61%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6028 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150x4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 35-65% В в течение 20 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 6,43 мин |
LCMS (ESI): | m/z 965,6 ГМ+4Н-Н2О14+ |
Молекулярная масса пептида | 3877,96 |
Соединение 2A
Дисульфидные линкеры (различные стерические затруднения).
BCY6039 (DM1-Me-SS-Me-Бицикл).
К раствору 2-(2-пиридилдисульфанил)пиридина (2,46 г, 11,18 ммоль, 1,50 экв.) и AcOH (1,05 г, 17,49 ммоль, 1,00 мл, 2,35 экв.) в EtOH (50,00 мл) добавляли 4-сульфанилпентановую кислоту (1A) (1,00 г, 7,45 ммоль, 1,00 экв.). Смесь перемешивали при 40°C в течение 18 ч в атмосфере N2. Анализ методом LC-MS показывал, что 1A было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной массы. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением остатка, который очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение 2A (1,61 г, 6,62 ммоль, 88,81% выход) получали в виде светло-желтого твердого вещества._____________________________________________
LCMS (ESI): | 243,9 ГМ+Н]+ |
Молекулярная масса | 243,34 |
Соединение 3A
К раствору 2A (0,01 г, 41,09 мкмоль, 1,00 экв.), 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (14,19 мг, 123,28
- 78 047678 мкмоль, 3,00 экв.) в DMA (1 мл) добавляли EDCI (23,63 мг, 123,28 мкмоль, 3,00 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что 2A было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Остаток очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение 3A (0,011 г, 32,31 мкмоль, 78,63% выход) получали в виде белого твердого вещества.
Соединение 4A
340,8 [М+Н]
340,41
LCMS (ESI): Молекулярная масса
К раствору BCY6014 (98,25 мг, 32,31 мкмоль, 1,00 экв.) в DMA (3 мл) добавляли DIEA (8,26 мг, 64,62 мкмоль, 11,26 мкл, 2,00 экв.) и соединение 3A (0,011 г, 32,31 мкмоль, 1,00 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 18 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 3A было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение 4A (0,04 г, 12,25 мкмоль, выход 37,90%) получали в виде белого твердого вещества. ___________________________________________________________________
ELCMS (ES1): 1088,7 ГМ+ЗЕГ|3+, 816,5 ГМ+4ЕГ|4+
Молекулярная масса__3264,88________________
Соединение 5A
ОО |1 Д е Д BCY6014 __ТСЕР__> HS^ Д γ BCY6014
I нI
4Α5Α
К раствору 4A (0,04 г, 12,25 мкмоль, 1,00 экв.) в MeCN (4 мл) и H2O (2 мл) добавляли TCEP (4,21 мг, 14,70 мкмоль, 4,05 мкл, 1,20 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 1 ч. Анализ методом LCMS показывал, что соединение 4A было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Остаток очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение 5A (0,035 г, 11,09 мкмоль, выход 90,53%) получали в виде белого твердого веществ_а._________________________________________
ELCMS (ESI): 1052,2 [М+ЗН]3+ ~
Молекулярная масса 3155,73
DM3-SPy
1В DM3-SPy
К раствору 4-(2-пиридилдисульфанил)пентановой кислоты (2A) (22,46 мг, 92,29 мкмоль, 1,20 экв.), HATU (35,09 мг, 92,29 мкмоль, 1,20 экв.), DIEA (29,82 мг, 230,71 мкмоль, 40,19 мкл, 3,00 экв.) в DMF (5 мл) добавляли соединение 1B (0,05 г, 76,90 мкмоль, 1,00 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 1B было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Остаток очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение DM3-SPy (0,025 г, 28,56 мкмоль, 37,13% выход) получали в виде белого твердого вещества.__________
ELCMS (ESI): I 875,1 (М+Н]+
Молекулярная масса 875,49
- 79 047678
BCY6039
DMs-SPy
Величину pH раствора DM3-SPy (0,015 г, 17,13 мкмоль, 1,00 экв.) и соединения 5A (54,08 мг, 17,13 мкмоль, 1,00 экв.) в DMF (3 мл) доводили до 8 с помощью водного раствора NaHCO3. Смесь перемешивали при 15°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что DM3-SPy было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (TFA условие). Соединение BCY6039 (0,0263 г, 6,58 мкмоль, выход 38,39%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6039 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 13,01 мин |
LCMS (ESI): | m/z 976,1 [М+4Н-Н2О]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3921,01 |
BCY6055 фМ1^-Ме2-Бицикл)
Соединение 2
Величину pH раствора соединения 1 (0,045 г, 126,96 мкмоль, 1 экв.) в H2O (1 мл) доводили до 13 с помощью 1 N раствора NaOH. Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Остаток очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматогра
- 80 047678 фии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение 2 (0,03 г, 116,56 мкмоль, 91,81% выход) получали в виде желтого твердого вещества.
Соединение 3
LCMS (ESI): | 257,9 [М+Н]1 |
Молекулярная масса | 257,37 |
Раствор соединения 2 (0,03, 116,56 мкмоль, 1,0 экв.) и DM1 (111,87 мг, 151,53 мкмоль, 1,3 экв.) в DMF (5 мл) перемешивали при 15°C в течение 2 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что DM1 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (NH4HCO3 условие). Соединение 3 (0,05 г, 56,53 мкмоль, 48,50% выход) получали в виде белого твердого вещества. ________________________________________
LCMS (ESI): 866,0 ГМ+Н-Н2О]+
Молекулярная масса 884,49
Соединение 4
К раствору соединения 3 (0,05 г, 56,53 мкмоль, 1,0 экв.) и 2,3,5,6-тетрафторфенола (28,16мг, 169,59 мкмоль, 3,0 экв.) в DMA (3 мл)и DCM (1 мл) добавляли EDCI (32,51 мг, 169,59 мкмоль, 3 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. DCM удаляли, и смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение 4 (0,03 г, 29,05 мкмоль, выход 51,40%) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): Молекулярная масса
1014,0 [М+Н-Н2О1+
1032,55
- 81 047678
BCY6055
BCY6055
К раствору BCY6014 (106,01 мг, 34,87 мкмоль, 1,2 экв.) в DMA (3 мл) добавляли DIEA (11,27 мг, 87,16 мкмоль, 15,18 мкл, 3,0 экв.) и соединение 4 (0,03 г, 29,05 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 4 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (TFA условие). Соединение BCY6055 (0,0352 г, 9,01 мкмоль, выход 31,01%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6055 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 12,68 мин |
LCMS (ESI): | m/z 1296,1 ГМ+ЗН-Н2О13+, 972,4 ГМ+4Н-Н2О]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3906,98 |
BCY6077 (DM1-SS-Me-(SOзH)-Бицикл)
[ДД О CISO3H, DIEA f % ...............Д S у ЛЭН 1 \ Д '|ф\ ° Д ъ Д о A Λ о й 1 1 so3h DM1-SO3H-SPP о к А ° V Ά Д=\ ЯвДтн КГтДКд о о Vn °' α ° 1 1 эо3н ° DM1-SO3H-SPP-NHS | у © DM1, DMF Д ----- s У^ он 4' SO3H 2 WHS_______ EDGI BCY6014 |
- 82 047678
Общая методика получения соединения 2
К раствору соединения 1 (0,1 г, 410,94 мкмоль, 1 экв.) в 1,2-дихлорэтане (3 мл) добавляли тремя порциями хлорсульфоновую кислоту (0,86 г, 7,38 ммоль, 491,43 мкл, 17,96 экв.) и добавляли двумя порциями DIEA (318,67 мг, 2,47 ммоль, 429,47 мкл, 6 экв.). Смесь перемешивали при 75°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS 324, один главный пик побочного продукта MS 221 относился к PySSPy. Растворитель удаляли, и остаток растворяли в H2O/MeCN=15/1. Непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие: MeCN/H2O). Соединение 2 (0,055 г, 170,06 мкмоль, выход 41,38%) получали в виде желтого масла.
LCMS (ESI): Молекулярная масса Общая методика получения DM1-SO3H-SPP
323,6 [М+Н]
Величину pH раствора DM1 (113,00 мг, 153,06 мкмоль,
1,1 экв.), соединения 2(0,045 г, 139,14 мкмоль, 1 экв.) в DMF (2 мл) доводили до 8 с помощью водного раствора NaHCO3. Смесь перемешивали при 15°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что DM1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение DM1-SO3H-SPP (0,075 г, 78,90 мкмоль, выход
56,71%) получали в виде белого вещества.
LCMS (ESI): | 931,9 [М+Н-Н2О]+ |
Молекулярная масса | 950,52 |
Общая методика получения DM1-SO3H-SPP-NHS
- 83 047678
К раствору DM1-SO3H-SPP (0,06 г, 63,12 мкмоль, 1 экв.), 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (7,99 мг, 69,43 мкмоль, 1,1 экв.) в DMA (1,5 мл) и DCM (0,5 мл) добавляли EDCI (13,31 мг, 69,43 мкмоль, 1,1 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 18 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что DM1-SO3H-SPP было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие: MeCN/H2O). Соединение DM1-SO3H-SPP-NHS (0,045 г, 42,96 мкмоль, 68,05% выход) получали в виде белого твердого вещества.
LCMS (ESI): Молекулярная масса
984 [M-NHS+K]
1047,6
Общая методика получения BCY6077.
К раствору BCY6014 (101,58 мг, 33,41 мкмоль, 1 экв.) в DMA (1 мл) добавляли DIEA (12,95 мг, 100,23 мкмоль, 17,46 мкл, 3 экв.) и DM1-SO3H-SPP-TFP (0,035 г, 33,41 мкмоль, 1 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что DM1-SO3H-SPP-TFP было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS. Непосредственно очищали методом препаративной HPLC (TFA условие). Соединение BCY6077 (41,30 мг, 10,03 мкмоль, выход 30,01%, чистота 96,44%) в виде белого вещества.
BCY6077 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 11,80 мин |
LCMS (ESI): | m/z 978,2 ГМ+4Н-18-44]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3972,06 |
Нерасщепляемые серии.
BCY6063 (MMAE)
□
HOSu, EDCI
DMA, DCM
- 84 047678
Г лутарат-MMAE
К раствору MMAE (0,2 г, 278,56 мкмоль, 1,0 экв.) в DMA (3 мл) добавляли DIEA (108,01 мг, 835,68 мкмоль, 145,56 мкл, 3,0 экв.) и тетрагидропиран-2,6-дион (63,57 мг, 557,12 мкмоль, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что MMAE было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение глутарат-MMAE (0,12 г, 144,22 мкмоль, 51,77% выход) получали в виде белого твердого вещества.
Глутарат-MMAE-NHS
832,3 [М+Н]
832,09
LCMS (ESI): Молекулярная масса
он н
N 0х , .о „X X О 0 -у γHOSu, EDCI
ОН ______
DMA, DCM
О j n'Vy H ό о
Υ'°·νΑ о Л—
СТ
К раствору Глутарат-MMAE (0,12 г, 144,22 мкмоль, 1,0 экв.), 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (49,79 мг, 432,65 мкмоль, 3,0 экв.) в DMA (3 мл) и DCM (1 мл) добавляли EDCI (82,94 мг, 432,65 мкмоль, 3,0 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что Глутарат-MMAE было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (TFA условие).
Соединение Глутарат-MMAE-NHS (0,055 г, 59,19 мкмоль, выход 41,04%) получали в виде белого твердого вещества. ______________________________________
BCY6063
929,2 ГМ+Н]
929,17
LCMS (ESI): Молекулярная масса
К раствору BCY6014 (98,17 мг, 32,29 мкмоль, 1,2 экв.) в DMA (2 мл) добавляли DIEA (10,43 мг,
- 85 047678
80,72 мкмоль, 14,06 мкл, 3 экв.) и Глутарат-MMAE-NHS (0,025 г, 26,91 мкмоль, 1 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что Глутарат-MMAE-NHS было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (TFA условие). Соединение BCY6063 (32,10 мг, 8,33 мкмоль, выход 30,95%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6063 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 10,86 мин |
LCMS (ESI): | m/z 963,8 ГМ+4Н]4+, 771,1 |М+5Н]5+ |
Молекулярная масса пептида | 3854,56 |
BCY6064 (DM1)
VT isuZ но (S)OZvH \\ /к /О о /ъ θ Т п \ С1 Л 1 1 DM1 \ Я € /к /тк° N--4 о >0 \α' ° к а 1 о 1 о —О О у_у о /<Е) (s)L.h \ iSV\ Z=\ jZ-Чо Ул ΐΈ°·γ° ? о ci 1 к к/% 1 \ Cl Z-N- о 1 О —о о УЛ Я в/иА_Δ.Η /® js)Lh BCY6014 \ икЗк) ..............*Qi4py°o О С! к 1 /ч. * ό BCY6064 | О О К-Ах н EDCI 0 кя F Н Ν'4^^χβΟΥ66014 О |
- 86 047678
Соединение 1
К раствору DM1 (0,1 г, 135,45 мкмоль, 1 экв.), 3-[(2-бромацетил)амино]пропановой кислоты (34,14 мг, 162,54 мкмоль, 1,2 экв.) в DMF (5 мл) добавляли TEA (41,12 мг, 406,35 мкмоль, 56,56 мкл, 3 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что DM1 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральные условия). Соединение 1 (0,08 г, 92,23 мкмоль, 68,09% выход) получали в виде белого твердого вещества.
Соединение 2
К раствору соединения 1 (0,08 г, 92,23 мкмоль, 1 экв.), 2,3,5,6-тетрафторфенола (45,95 мг, 276,69 мкмоль, 3 экв.) в DMA (3 мл) и DCM (1 мл) добавляли EDCI (53,04 мг, 276,69 мкмоль, 3 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 4 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (нейтральное условие). Соединение 2 (0,06 г, 59,09 мкмоль, выход 64,06%) получали в виде белого твердого вещества.
Е LCMS (ESI): I 997,0 |М+Н-Н2О]
Молекулярная масса__1015,46______
BCY6064
BCY6064
К раствору BCY6014 (107,79 мг, 35,45 мкмоль, 1,2 экв.) в DMA (3 мл) добавляли DIEA (11,45 мг, 88,63 мкмоль, 15,44 мкл, 3,0 экв.) и соединение 2 (0,030 г, 29,54 мкмоль, 1 экв.). Смесь перемешивали при 15°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и зарегистрирован один главный пик с требуемой массой. Смесь непосредственно очищали методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (TFA условие). Соединение BCY6064 (28,40 мг, 7,30 мкмоль, выход 24,71%) получали в виде белого твердого вещества.
- 87 047678
BCY6105
BCY6064 Данные анализа | |
Подвижная фаза: | А: 0,1% TFA в Н2О В: 0,1% TFA в ACN |
Расход: | 1,0 мл/мин |
Колонка: | Gemini-NX С18 5 мкм 110А 150 х 4,6 мм |
Прибор: | Agilent 1200 HPLC-BE(1-614) |
Метод: | 28-68% В в течение 30 минут, затем 3 минуты 95% В |
Время удерживания: | 10,26 мин |
LCMS (ESI): | m/z 968,4 [М+4Н-Н2О]4+ |
Молекулярная масса пептида | 3889,89 |
Слабая кжл&та
- 88 047678
Общая методика получения соединения 2.
К раствору соединения 1 (3,5 г, 5,68 ммоль, 1,0 экв.) в DCM (20 мл) и MeOH (10 мл) добавляли в темноте (4-аминофенил)метанол (978,5 мг, 7,95 ммоль, 1,4 экв.) и EEDQ (2,81 г, 11,35 ммоль, 2,0 экв.), и смесь перемешивали при 25°C в течение 18 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+H+]=722,0). Полученную реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле (ISCO®; колонка 220 g SepaFlash® Silica Flash, элюент 0~10% метанол/дихлорметан и 80 мл/мин). Соединение 2 (3,0 г, 4,16 ммоль, выход 73,2%) получали в виде желтого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 3.
К раствору соединения 2 (2,5 г, 3,46 ммоль, 1,0 экв.) в THF (30 мл) добавляли DIEA (2,69 г, 20,78 ммоль, 3,62 мл, 6,0 экв.) и бис(4-нитрофенил)карбонат (6,32 г, 20,78 ммоль, 6,0 экв.), и смесь перемешивали при 25°C в течение 16 ч. Анализ методом TLC показывал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и образовалось одно новое пятно. Реакционную смесь очищали под контролем TLC. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле (ISCO®; колонка 220 g SepaFlash® Silica Flash, элюент 0~5% метанол/дихлорметан и 100 мл/мин). Соединение 3 (2,2 г, 2,48 ммоль, выход 71,6%) получали в виде желтого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 4.
К раствору соединения 3 (0,3 г, 338,24 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (5 мл) добавляли HOBt (50,3 мг, 372,06 мкмоль, 1,1 экв.), DIEA (131,1 мг, 1,01 ммоль, 176,7 мкл, 3,0 экв.) и MMAE (218,6 мг, 304,42 мкмоль, 0,9 экв.). Смесь перемешивали при 40°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал наличие одного пика с требуемой MS ([M+H|]=1466,4, [M+2H+]/2=733,2). Реакционную смесь затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие), и соединение 4 (0,2 г, 136,44 мкмоль, выход 40,3%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 5.
Соединение 4 (0,175 г, 119,39 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в TFA (1,8 мл), и затем добавляли триизопропилсилан (13,5 г, 85,20 ммоль, 17,5 мл, 713,7 экв.). Смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин. Анализ методом LC-MS показывал наличие одного пика с требуемой MS ([M+H+]=1123,4, [M+2H+]/2=562,2). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Остаток очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 5 (0,1 г, 89,02 мкмоль, выход 74,6%) получали в виде желтого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 6.
К раствору соединения 5 (0,07 г, 62,31 мкмоль, 1,0 экв.) в DMA (1,0 мл) добавляли DIEA (24,2 мг,
- 89 047678
186,94 мкмоль, 32,6 мкл, 3,0 экв.) и тетрагидропиран-2,6-дион (14,2 мг, 124,62 мкмоль, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 2 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 5 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+H+]=1237,4, [M+2H+]/2=619,3). Реакционную смесь затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие), и соединение 6 (0,04 г, 32,32 мкмоль, выход 51,8%) получали в виде светложелтого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 7.
К раствору соединения 6 (0,04 г, 32,32 мкмоль, 1,0 экв.), 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (11,2 мг, 96,97 мкмоль, 3,0 экв.) в DMA (3,0 мл) и DCM (1,0 мл) добавляли EDCI (18,6 мг, 96,97 мкмоль, 3,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 18 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 6 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+H+]=1334,5, [M+2H+]/2=667,7). Реакционную смесь затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (TFA условие), и соединение 7 (0,025 г, 18,73 мкмоль, выход 57,9%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения BCY6105.
К раствору BCY6014 (82,0 мг, 26,98 мкмоль, 1,2 экв.) в DMA (4 мл) добавляли DIEA (8,7 мг, 67,44 мкмоль, 11,7 мкл, 3,0 экв.) и соединение 7 (0,03 г, 22,48 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 18 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 7 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+4H+]/4=1065,2). Реакционную смесь затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (TFA условие). Соединение BCY6105 (0,024 г, 5,41 мкмоль, выход 24,1%, чистота 96,06%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6106
•BwHN ί ВоаНМ Нам. .,.¾ S '% Fmoc EEDQ эшмеон.1 н hcxZI О ® ОН < 2 | СШ.А, о аЖ, DEA г: |
Шлекул«фная масса 5Ж.ва
н „ ь Osa*' ” ’L ‘ NO. ' S Молекулярная масса 738.7в ВосНМ \ ./ 0% ММЙВ f Иояекуляряая масса 1095.41 | ИМАД, НОМ, дел, CHF - ' Н Пиперидин. DMF, 11 ММАЕ 4 Молекулярная масса 1317.65 ВосНЫ \ EDCl.HOBt й ) 'N' \ Г‘ Г ·. % 5 1 J 1. —° , ММАЕ Молекулярная масса 15358(1 |
- 90 047678
Общая методика получения соединения 2.
К раствору соединения 1 (5,0 г, 10,67 ммоль, 1,0 экв.) в DCM (30 мл) и MeOH (10 мл) добавляли EEDQ (5,28 г, 21,34 ммоль, 2,0 экв.) и (4-аминофенил)метанол (2,63 г, 21,34 ммоль, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при 20°C в течение 18 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS (требуемая величина m/z=574, в то время как распад и частичный распад группы Boc соответствовал величине m/z=474 и 518, соответственно). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Остаток очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 2 (3,7 г, 6,45 ммоль, выход 60,4%) получали в виде желтого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 3.
К раствору соединения 2 (3,4 г, 5,93 ммоль, 1,0 экв.) в DMF (20 мл) добавляли одной порцией DIEA (5,36 г, 41,49 ммоль, 7,23 мл, 7,0 экв.) и бис(4-нитрофенил)карбонат (10,82 г, 35,56 ммоль, 6,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 2 ч. Анализ методом LC-MS показывал наличие одного пика с требуемой MS (величина m/z=639 соответствовала массе с группой Boc, распадавшейся в процессе электрораспылительной ионизации (ESI). Реакционную смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 3 (3,0 г, 4,06 ммоль, выход 68,5%) получали в виде желтого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 4.
К раствору соединения 3 (707,4 мг, 957,55 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (15 мл) добавляли HOBt (155,3 мг, 1,15 ммоль, 1,2 экв.), DIEA (371,3 мг, 2,87 ммоль, 500,4 мкл, 3,0 экв.), и MMAE (0,55 г, 766,04 мкмоль, 0,8 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал наличие одного пика с требуемой MS (требуемая m/z=1317, a m/z=609 соответствовала массе с двумя про
- 91 047678 тонами и распаду Boc группы в процессе электрораспылительной ионизации (ESI). Реакционную смесь затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 4 (0,53 г, 402,23 мкмоль, выход 42,0%) получали в виде желтого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 5.
К раствору соединения 4 (0,526 г, 399,20 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (4 мл) добавляли пиперидин (862,2 мг, 10,13 ммоль, 1,0 мл, 25,4 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 30 мин. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 4 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS (требуемая m/z=1095, и величина m/z=265 соответствовала аддукту Fmoc-пиперидин). Реакционную смесь затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 5 (0,230 г, 209,97 мкмоль, выход 52,6%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 6.
К раствору Fmoc-(D-Ala)-Phe-OH (125,6 мг, 273,87 мкмоль, 1,2 экв.) в DMF (10 мл) добавляли EDCI (52,5 мг, 273,87 мкмоль, 1,2 экв.), HOBt (37,0 мг, 273,87 мкмоль, 1,2 экв.) и соединение 5 (0,25 г, 228,23 мкмоль, 1 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 3 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 5 было полностью израсходовано, и был обнаружен один пик с требуемой величиной MS (величина m/z=718 соответствовала массе с двумя протонами и распаду группы Boc в процессе ESI). Реакционную смесь затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 6 (0,18 г, 117,20 мкмоль, выход 51,3%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 7.
К раствору соединения 6 (0,18 г, 117,20 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (8 мл) добавляли пиперидин (1,72 г, 20,25 ммоль, 2,0 мл, 172,8 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 7 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS (величины m/z=1314 и 657 соответствовали требуемой массе, и m/z=265 соответствовала аддукту Fmoc-пиперидин). Реакционную смесь затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 7 (0,13 г, 98,96 мкмоль, выход 84,4%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 8.
К раствору соединения 7 (0,105 г, 79,93 мкмоль, 1,0 экв.) в DMA (4 мл) добавляли DIEA (31,0 мг, 239,79 мкмоль, 41,8 мкл, 3,0 экв.) и тетрагидропиран-2,6-дион (27,4 мг, 239,79 мкмоль, 3,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 2 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 7 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS (величина m/z 664,5 соответствовала массе с двумя протонами и распаду группы Boc в процессе ESI). Реакционную смесь затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие), и соединение 8 (0,09 г, 63,04 мкмоль, выход 78,8%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 9.
К раствору соединения 8 (0,09 г, 63,04 мкмоль, 1,0 экв.), 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (21,7 мг, 189,11 мкмоль, 3,0 экв.) в DMA (3 мл) и DCM (1 мл), добавляли EDCI (36,2 мг, 189,11 мкмоль, 3,0 экв.), растворенный в 1 мл DCM. Смесь перемешивали при 25°C в течение 18 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 8 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS (требуемая величина m/z=1524 (один протон) и 763 (два протона), в то время как величина m/z=713 соответствовала массе при распаде группы Boc в процессе ESI). Реакционную смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 9 (0,07 г, 45,91 мкмоль, выход 72,8%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 10.
К раствору BCY6014 (167,5 мг, 55,09 мкмоль, 1,2 экв.) в DMF (3 мл) добавляли DIEA (11,8 мг, 91,81 мкмоль, 16,0 мкл, 2,0 экв.) и соединение 9 (0,07 г, 45,91 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 9 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+4H+]/4=1112,9, [M+5H+]/5=890,5). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Неочищенный продукт 10 (0,220 г, неочищенный) использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Общая методика получения BCY6106.
К раствору соединения 10 (0,200 г, 44,95 мкмоль, 1,0 экв.) в DCM (4 мл) добавляли 1 мл TFA. Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал наличие одного главного пика с требуемой MS ([M+4H+]/4=1088,0, [M+5H+]/5=870,8). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением остатка, который затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (TFA условие). Соединение BCY6106 (0,0297 г, 20,06 мкмоль, выход 14,5%, чистота 95,46%) получали в виде белого твердого вещества.
- 92 047678
BCY6175
EEDQ ПСМЖеСЖ Й
О' О О
ГЭИЛ DMA π
2, К СО 3MF7THF
Общая методика получения соединения 9.
Синтез соединения 9 проводили таким же методом, который описан для BCY6106. Общая методика
- 93 047678 получения соединения 10A.
К раствору BCY6099 (195,15 мг, 61,32 мкмоль, 1,1 экв.) в DMA (3 мл) добавляли DIEA (21,61 мг, 167,23 мкмоль, 29,13 мкл, 3 экв.) и соединения 9 (0,085 г, 55,74 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 9 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной m/z. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка (светло-желтого масла). Реакционную смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 10A (0,160 г, 34,84 мкмоль, выход 62,50%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения BCY6175.
К раствору соединения 10A в DCM (4,5 мл) добавляли TFA (4,5 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 10A было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной m/z. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка, который очищали методом препаративной HPLC (TFA условие). Соединение BCY6175 (61,40 мг, 13,56 мкмоль, выход 31,13%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY6107
NOj
2 3
Молекулярная масса Молекулярная масса ι?Λΐώ
Молекулярная масса 1W1.41
NHS^Mara&Siu(Wu>PwCM^
В
Молеку®фиая масса зоввл
BC¥g014-Qrtarale-Glu(1-Bu >Pro-at-SI^HPhe-W«ti-Bu Hsu-MIMAE
TFA
BCyE014-Glu-Pro-Git-.GI>'-4Phe-’yr-Leu ММАЬ
Молекулярная масса 4Й8в.8в
BCY6107
Молекулярная масса 4881.68
Общая методика получения соединения 2.
К раствору соединения 1 (3,0 г, 8,49 ммоль, 1,0 экв.) в DCM (30 мл) и MeOH (10 мл) добавляли EEDQ (2,52 г, 10,19 ммоль, 1,2 экв.) и (4-аминофенил)метанол (1,25 г, 10,19 ммоль, 1,2 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 1 было полно- 94 047678 стью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+H]+ 459,5). Кроме того, анализ методом TLC указывал на полное расходование соединения 1 и образование новых пятен. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле (ISCO®; колонка 120 g SepaFlash® Silica Flash, элюент градиент 0~60% этилацетат/петролейный эфир и 80 мл/мин). Соединение 2 (3,5 г, 7,63 ммоль, выход 89,9%) получали в виде желтого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 3.
К раствору соединения 2 (3,3 г, 7,20 ммоль, 1,0 экв.) в THF (100 мл), добавляли D1EA (4,65 г, 35,98 ммоль, 6,27 мл, 5,0 экв.) и бис(4-нитрофенил)карбонат (8,76 г, 28,79 ммоль, 4,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+H]+ 624,0). Кроме того, анализ методом TLC указывал на полное расходование соединения 2 и образование новых пятен. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле (ISCO®; колонка 120 g SepaFlash® Silica Flash, элюент градиент 0~15% этилацетат/петролейный эфир и 80 мл/мин). Соединение 3 (3,0 г, 4,81 ммоль, выход 66,8%) получали в виде желтого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 4.
К раствору соединения 3 (124,09 мг, 198,97 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (5 мл) добавляли HOBt (32,3 мг, 238,77 мкмоль, 1,2 экв.), DIEA (77,1 мг, 596,92 мкмоль, 103,9 мкл, 3,0 экв.) и MMAE (0,1 г, 139,28 мкмоль, 0,7 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+H]+ 1202,5, [M+Na]+ 1224,5). Реакционную смесь затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). После лиофилизации, получали соединение 4 (0,08 г, 66,53 мкмоль, выход 33,4%) в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 5.
К раствору соединения 4 (0,08 г, 66,53 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (4 мл) добавляли пиперидин (862,2 мг, 10,13 ммоль, 1 мл, 152,2 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 4 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+H]+ 981,5, [M+Na]+ 1003,5, в то время как величина m/z=264,0 соответствовала аддукту Fmoc-пиперидин). Реакционную смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 5 (0,055 г, 56,11 мкмоль, выход 84,3%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 6.
К раствору Fmoc-Glu(t-Bu)-Pro-Cit-Gly-HPhe-Tyr(t-Bu)-OH (74,1 мг, 66,31 мкмоль, 1,3 экв.) в DMF (4 мл) добавляли EDCI (12,7 мг, 66,31 мкмоль, 1,3 экв.), HOBt (8,9 мг, 66,31 мкмоль, 1,3 экв.) и соединение 5 (0,05 г, 51,01 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 30 мин. Анализ методом LC-MS показал, что 20% соединения 5 не прореагировало, появилось несколько новых пиков, и 60% реакционной смеси составлял требуемый продукт ([M+2H+]/2=1040,4). Реакционную смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 6 (0,07 г, 33,66 мкмоль, выход 66,0%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 7.
К раствору соединения 6 (0,07 г, 33,66 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (4 мл) добавляли пиперидин (2,9 мг, 33,66 мкмоль, 3,3 мкл, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 15 минут. Анализ методом LCMS показывал, что соединение 6 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+2H+]/2=929,1, в то время как величина m/z=264,2 соответствовала аддукту Fmoc-пиперидин). Реакционную смесь непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 7 (0,045 г, 24,23 мкмоль, выход 72,0%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 8.
К раствору соединения 7 (0,04 г, 21,54 мкмоль, 1,0 экв.) в DMA (1 мл) добавляли DIEA (8,3 мг, 64,61 мкмоль, 11,2 мкл, 3,0 экв.) и тетрагидропиран-2,6-дион (7,4 мг, 64,61 мкмоль, 3,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 7 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+2H+]/2=986,4). Реакционную смесь затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие). Соединение 8 (0,035 г, 17,75 мкмоль, выход 82,4%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 9.
К раствору соединения 8 (0,035 г, 17,75 мкмоль, 1,0 экв.), 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (6,1 мг, 53,26 мкмоль, 3,0 экв.) в DMA (3 мл) и DCM (1 мл) добавляли EDCI (10,2 мг, 53,26 мкмоль, 3,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 8 частично не прореагировало, и был обнаружен один пик с требуемой величиной массы ([M+2H+]/2=1034,7). Затем удаляли DCM, после чего смесь очищали методом препаративной HPLC (нейтральное условие).
- 95 047678
Соединение 9 (0,03 г, 14,50 мкмоль, выход 81,7%) получали в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения соединения 10.
К раствору BCY6014 (52,9 мг, 17,40 мкмоль, 1,59 мкл, 1,2 экв.) в DMF (2 мл) добавляли DIEA (5,6 мг, 43,51 мкмоль, 7,6 мкл, 3,0 экв.) и соединение 9 (0,03 г, 14,50 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+4H+]/4=1249,2, [M+5H+]/5=999,3). Затем удаляли растворитель, и полученный неочищенный продукт 10 (0,06 г, неочищенный) использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Общая методика получения BCY6107.
К раствору соединения 10 (0,055 г, 11,01 мкмоль, 1,0 экв.) в DCM (1 мл) добавляли 1 мл TFA. Смесь перемешивали при 0°C в течение 15 минут. Анализ методом LC-MS показывал, что соединение 10 было полностью израсходовано, и был обнаружен один главный пик с требуемой величиной MS ([M+4H+]/4=1221,0, [M+5H+]/5=977,0). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая в результате остаток, который затем непосредственно очищали методом препаративной HPLC (TFA условие). Соединение BCY6107 (20,4 мг, 4,03 мкмоль, выход 36,6%, чистота 96,36%) получали в виде белого твердого вещества.
Данные исследований биологической активности
Исследование 1. Измерения флуоресцентной поляризации.
(a) Анализ прямого связывания.
Пептиды с флуоресцентной меткой (либо с флуоресцеином, фирмы SIGMA, либо с Alexa Fluor488™, фирмы Fisher Scientific) разводили до 2,5 нМ в PBS с 0,01% tween 20 или в 50 мМ HEPES с 100 мМ NaCl и 0,01% tween pH 7,4 (оба называют буфером для анализа). В этот же раствор пептида в буфере для анализа добавляли белок и проводили его титрование с получением 1 нМ пептида в суммарном об 25 мкл в 384-луночных планшетах с черными стенками и дном с малым объемом и с низкой степенью связывания, в итоге, 5 мкл буфера для анализа, 10 мкл белка (табл. 1), затем 10 мкл флуоресцентного пептида. Использовали последовательные разведения один к двум для получения 12 различных концентраций с наивысшими концентрациями в диапазоне от 500 нМ для известных лекарственных препаратов для связывания, обладающих высокой аффинностью, до 10 мкМ для известных лекарственных препаратов для связывания, обладающих низкой аффинностью, и для проведения исследований по селективности. Измерения проводили на считывающем устройстве для микропланшетов BMG PHERAstar FS, оснащенном оптическим модулем FP 485 520 520, в котором используется возбуждающее излучение при 485 нм и проводится детекция параллельной и перпендикулярной эмиссии при 520 нм. Прибор PHERAstar FS использовали при 25°C в режиме 200 вспышек на лунку и с задержкой позиционирования 0,1 секунды, при этом измерение каждой лунки проводили с интервалами от 5 до 10 мин в течение 60 мин. Используемое для анализа приращение определяли для каждого меченого вещества по истечению 60 минут, когда уже в лунке отсутствовал белок. Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Systat Sigmaplot version 12.0. Величины mP апроксимировали с помощью определенного пользователем уравнения второго порядка с получением величины Kd: f=ymin+(ymaxymin)/Lig*((x+Lig+Kd)/2-sqrt((((x+Lig+Kd)/2)A2)-(Lig*x))). Lig представляло собой определяемую величину концентрации используемого меченого вещества.
(b) Анализ конкурентного связывания.
Пептиды без флуоресцентной метки подвергали испытаниям на конкурентное связывание с пептидом с флуоресцентной меткой и известной величиной Kd (табл. 2). Референсное соединение A имеет последовательность F1-G-Sar5-ACPWGPAWCPVNRPGCA (F1-G-Sar5-(SEQ ID NO: 94)). Референсное соединение B имеет последовательность F1-G-Sar5-ACPWGPFWCPVNRPGCA (F1-G-Sar5-(SEQ ID NO: 95)). Референсное соединение C имеет последовательность F1-G-Sam5-ADVTCPWGPFWCPVNRPGCA (F1-G-Sar5-(SEQ ID NO: 96). Каждое из референсных соединений A, B и C содержит молекулярный каркас TBMB. Пептиды разбавляли до соответствующей концентрации в буфере для анализа, описанном для анализа прямого связывания, с максимальным содержанием 5% DMSO, затем последовательно разбавляли 1 к 2. Добавляли в планшет пять микролитров разбавленного пептида, затем 10 мкл человеческого или мышиного EphA2 (табл. 1) при фиксированной концентрации, которая зависела от используемого флуоресцентного пептида (табл. 2), затем добавляли 10 мкл флуоресцентного пептида. Измерения проводили таким же способом, как в случае проведения анализа прямого связывания, однако, приращение определяли перед первым измерением. Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Systat Sigmaplot version 12.0. Величины mP апроксимировали с помощью определенного пользователем уравнения третьего порядка с получением величины Ki:
- 96 047678 f=ymin+(ymax-ymin)/Lig%(Lig*((2%(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)A23*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))A0,5*COS(ARCCOS((2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)A3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Cornp-Prot*c)*(Kconip*(LigProt*c)+Klig%Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(l*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)A2-3*(Kcomp*(LigProt*c)+Klig%Comp-Prot4)+Klig*Kcomp))A3)A0,5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+CompProt%)))/((3*Klig)+((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)A2-3*(Kcomp*(LigProt*c)+Klig*(Comp-Prot%)+Klig*Kcomp))A0,5*COS(ARCCOS((-2*(Klig+Kcomp+Lig+CompProt*c)A3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(CompProt*c)+Klig*Kcomp)-27*(-1 *Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcornp+Lig+Cornp-Prot*c)A23*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))A3)A0,5)))/3))(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))).
Lig, Klig и Prot представляли собой определяемые величины, относящиеся к концентрации флуоресцентного пептида, Kd флуоресцентного пептида и концентрации EphA2, соответственно.
Таблица 1 Рецепторы эфрина . и источник
Рецептор (домен) | Вид | Формат/метка | Фирма-поставщик | Номер no каталогу |
EphAl (Ecto) | Человек | Fc-слияние С-концевой | R&D systems | 7146-Al |
EphA2 (Ecto) | Человек | полиН18 С-концевой | R&D systems | 3035-A2 |
EphA2 (Ecto) | Человек | полиШз | In-house | N/A |
EphA2 (Ecto) | Мышь | Fc-слияние С-концевой | R&D Systems | 639-A2 |
EphA2 (Ecto) EphA2 (ligand binding) EphA2 (ligand binding) | Мышь Крыса Собака | ПОЛИН18 С-концевой ПОЛИН18 С-концевой ПОЛИН18 | Sino Biological In-house In-house | 50586-M08H N/A N/A |
EphA3 (Ecto) | Человек | Fc-слияние N-концевой | R&D systems | 6444-A3 |
EphA3 (Ecto) | Человек | полиН! s С-концевой | In-house | N/A |
EphA3 (Ecto) | Крыса | полиШз | Sino Biological | 80465-R08H |
EphA4 (Ecto) | Человек | Fc-слияние С-концевой | R&D systems | 6827-A4 |
EphA4 (Ecto) | Человек | ПОЛИН18 С-концевой | Sino Biological | 11314-H08H |
EphA4 (Ecto) | Крыса | полиШз | Sino Biological | 80123-R08H |
EphA6 (Ecto) | Человек | Fc-слияние | R&D systems | 5606-A6 |
EphA7 (Ecto) | Человек | Fc-слияние | R&D systems | 6756-A7 |
EphBl (Ecto) | Крыса | Fc-слияние | R&D systems | 1596-B1 |
EphB4 (Ecto) | Человек | С-концевой ПОЛИН18 | R&D systems | 3038-B4 |
- 97 047678
Таблица 2
Конечные концентрации флуоресцентного пептида и EphA2, используемые при проведении анализов на конкурентное связывание
Флуоресцентный пептид | Концентрация флуоресцентного пептида (нМ) | Концентрация человеческого EphA2 (нМ) | Концентрация мышиного EphA2 (нМ) |
Референсное соединение А | 10 | 75 | |
Референсное соединение В | 1 | 30 | |
Референсное соединение С | 0,8 (человек) 1 (мышь) | 2,4 | 50 |
Проводили испытания конкретных пептидных лигандов по изобретению с помощью упомянутых выше методов анализа, результаты которых приведены в табл. 3-7.
Таблица 3
Данные биологических испытаний пептидных лигандов по изобретению (TATA пептиды, анализ прямо го связывания)
Номер бициклического соединения | Последовательность | EphA2 человека (KD, нМ ± 95% CI) |
1 | ACMNDWWCAMGWKCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 3)-Sar6-K(Fl)) | 304 ±91,99 |
2 | ACVPDRRCAYMNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 4)-Sar6-K(Fl)) | 74,91 ± 6,6 |
3 | ACVVDGRCAYMNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 5)-Sar6-K(Fl)) | 129,8 ±80,75 |
4 | ACVVDSRCAYMNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 6)-Sar6-K(Fl)) | 124,6 ±51,74 |
5 | ACVPDSRCAYMNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 7)-Sar6-K(Fl)) | 93,95 ±23,62 |
6 | ACYVGKECAIRNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 8)-Sar6-K(Fl)) | 168,5 ±20,58 |
7 | ACYVGKECAYMNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 9)-Sar6-K(Fl)) | 149,73 ± 39,2 |
- 98 047678
8 | Fl-G-Sar5-ACYVGKECAYMNVCA (F1-G- Sar5-(SEQ ID NO: 9)) | 218,33 ± 10,51 |
9 | Fl-(3-Ala)-SarioARDCPLVNPLCLHPGWTC (Fl-(P-Ala)Sar10-(SEQ ID NO: 10)) | 6,43 ± 1,15 |
10 | Fl-(3-Ala)-Sar10- A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC (Π-(β- Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 11) | 9,07 ± 2,49 |
И | Ac-CPL VNPLCLHPGWTCLHG-Sar6-(DK[F1]) (Ac-(SEQ ID NO: 12)-Sar6-(DK[F1])) | 3,08 ±0,43 |
12 | Ac-CPL VNPLCLHPGW TCL(D-Hi s)GSar6-(D-K[F1]) (Ас-SEQ ID NO: 13)-Sar6(D-K[F1])) | 10,56 ±0,77 |
13 | Ac-CPL VNPLCLHPGWSCRGQ-Sar6-(DK[F1]) (Ac-(SEQ ID NO: 14)- Sar6-(DK[F1])) | 5,29 ±0,79 |
14 | Ac-CPL VNPLCLHPGWSC(HArg)GQSar6-(D-K[F1]) (Ac-(SEQ Ш NO: 15)- Sar6(D-K[F1])) | 9,96 ±0,55 |
Таблица 4
Данные биологических испытаний пептидных лигандов по изобретению _______ (TATA пептиды, анализ конкурентного связывания)________
Номер бицикли ческого соедине ния | Последовательность | Ki, нМ ± 95% CI | |||
EphA2 человека | EphA2 мыши | ||||
Флуоресцентный пептид | |||||
Референсное соединение С | Референсное соединение В | Референсное соединение А | Референсное соединение С | ||
15 | ACMNDW WCAMGW КСА (SEQ ГО NO: 3) | 277,5 ± 38,22 | |||
16 | ACVPDRR CAYMNV | 69,97 ± 8,67 |
- 99 047678
CA (SEQ Ю NO: 4) | |||||
17 | (β-Ala)Sar10ACVPDRR CAYMNV C ((β-Ala)Sari0-(SEQ ID NO: 16)) | 85,05 ± 1,08 | |||
18 | DLRCGGD PRCAYMN VGA (SEQ ID NO: 17) | 70,8 ±2,35 | |||
19 | SRPC VIDS RCAYMN VCA (SEQ ID NO: 18) | 94,75 ±24,01 | |||
20 | ESRCSPD ARCAYM NVCA (SEQ ID NO: 19) | 57,05 ±4,61 | |||
21 | HSGCRPD PRCAYMN VCA (SEQ ID NO: 20) | 62,15 ±4,61 | |||
22 | GSGCKPD SRCAYMN VCA | 63,25 ± 13,82 |
- 100 047678
(SEQ ID NO: 21) | |||||
23 | ETVCLPD SRCAYMN VCA (SEQ ID NO: 22) | 130 ± 15,68 | |||
24 | GQVCIVD ARCAYM NVCA (SEQ ID NO: 23) | 168,5 ± 16,66 | |||
25 | ACVPDRR CAFENVC VDH (SEQ ID NO: 24) | 97,3 ±3,33 | |||
26 | ACVPDRR CAFMNVC EDR (SEQ ID NO: 25) | 39,05 ± 10,29 | |||
27 | ACVPDRR CAFQDVC DHE (SEQ ID NO: 26) | 159 n=l | |||
28 | ACVPDRR CAFRDVC LTG (SEQ ID NO: 27) | 1700 n=l |
- 101 047678
29 | ACYVGKE CAYMNV CA (SEQ Ю NO: 9) | 209,5 ± 110,74 | 106,65 ± 24,94 | 87,7 n=l | |
30 | ACQPSNH CAFMNYC A (SEQ ID NO: 28) | 293 n=l | 186,53 ±86,86 | 137 n=l | |
31 | ACSPTPA CAVQNLC A (SEQ ID NO: 29) | 223 n=l | 177 ±60,76 | ||
32 | ACTSCWA YPDSFCA (SEQ ID NO: 30) | 232 ±52,19 | 151 n=l | ||
33 | ACTKPTG FCAYPDTI CA (SEQ ID NO: 31) | 268,5 ± 16,66 | |||
34 | ACRGEW GYCAYPD TICA (SEQ ID NO: 32) | 347,5 ± 57,82 | |||
35 | ACRNWG MYCAYP DTICA (SEQ ID NO: 33) | 282,5 ± 65,66 |
- 102 047678
36 | ACPDWG KYCAYPD TICA (SEQ ID NO: 34) | 160 ± 1,96 | |||
37 | ACRVYGP YCAYPDT ICA (SEQ ID NO: 35) | 294,5 ± 20,58 | |||
38 | ACSSCWA YPDSVCA (SEQ ID NO: 36) | 400,33 ± 205,19 | |||
39 | ACQSCW AYPDTYC A (SEQ ID NO: 37) | 321,33 ± 119,53 | |||
40 | ACGFMGL EPCETFC A (SEQ ID NO: 38) | 187,5 ±20,58 | |||
41 | ACGFMGL VPCEVHC A (SEQ ID NO: 39) | 155 ±9,8 | |||
42 | ACGFMGL EPCEMVC A | 320,5 ± 14,7 |
- 103 047678
(SEQ ID NO: 40) | |||||
43 | ACGFMGL EPCVTYC A (SEQ ID NO: 41) | 233,5 ±20,58 | |||
44 | ACGFMGL EPCELVC A (SEQ ID NO: 42) | 126,8 ±21,17 | |||
45 | ACGFMGL VPCNVFC A (SEQ ID NO: 43) | 142 ± 41,16 | |||
46 | ACGFMGL EPCELFC A (SEQ ID NO: 44) | 81,7 ±7,06 | |||
47 | ACGFMGL EPCELFC MPK (SEQ ID NO: 45) | 185 ±74,48 | |||
48 | ACGFMGL EPCELYC A (SEQ ID NO: 46) | 127,5 ± 14,7 |
- 104 047678
49 | ACGFMGL EPCELYC АНТ (SEQ ID NO: 47) | 144 ± 17,64 | |||
50 | ACGFMGL EPCEMYC A (SEQ ID NO: 48) | 140 ±45,08 | |||
51 | ACGFMGL VPCELYC ADN (SEQ ID NO: 49) | 84,4 ± 36,46 | |||
52 | ACPLVNP LCLTSGW KCA (SEQ ID NO: 50) | 115,33 ± 11,33 | |||
53 | ACPMVNP LCLHPGW ICA (SEQ ID NO: 51) | 15,4 ± 3,17 | |||
54 | ACPLVNP LCLHPGW ICA (SEQ ID NO: 52) | 15,25 ±2,84 | |||
55 | ACPLVNP LCLHPGW RCA | 20,55 ±0,88 |
- 105 047678
(SEQ ID NO: 53) | |||||
56 | ACPLVNP LCNLPGW TCA (SEQ ID NO: 54) | 184 ± 115,64 | |||
57 | ACPLVNP LCLVPGW SCA (SEQ ID NO: 55) | 35,4 ± 10 | |||
58 | ACPLVNP LCLLDGW TCA (SEQ ID NO: 56) | 38,35 ±5,39 | |||
59 | ACPLVNP LCLMPG WGCA (SEQ ID NO: 57) | 114,5 ± 10,78 | |||
60 | ACPLVNP LCMIGNW TCA (SEQ ID NO: 58) | 96,2 ±0,59 | |||
61 | ACPLVNP LCLMTG WSCA (SEQ ID NO: 59) | 241,5 ±44,1 |
- 106 047678
62 | ACPLVNP LCMMGG WKCA (SEQ ID NO: 60) | 67,1 ± 19,21 | |||
63 | ACPLVNP LCLYGSW KCA (SEQ ID NO: 61) | 59,05 ± 28,32 | |||
64 | ACPLVNP LCLHPGW TCA (SEQ ID NO: 62) | 30n=l | |||
65 | ARDCPLV NPLCLHP GWTCA (SEQ ID NO: 63) | 6,05 ± 1,38 | 39,1 ±0,39 | ||
66 (BCY60 99) | (β-Ala)SarioA(HArg)D C(HyP)LV NPLCLHP( D- Asp)W(HA rg)C (SEQ ID NO: 2) | 4,94 ± 1,41 | 57,6 ± 24,86 | ||
67 (BCY60 14) | (β-Ala)Sar10A(HArg)D CPLVNPL | 8,51 ±0,17 | 61,7 ± 15,48 |
- 107 047678
CLHPGWT С ((β-Ala)Sari0-(SEQ ID NO: 11) | |||||
68 | AcARDCPLV NPLCLHP GWTCASar6-(D-K) (Ac-(SEQ ID NO: 63)Sar6-(D-K)) | 19,3 ± 4,92 | 166,5 ±30,38 | ||
69 | AcA(HArg)D CPLVNPL CLHPGWT CA- Sar6(D-K) (Ac-(SEQ ID NO: 11)A-Sar6-(D- K)) | 17,5 ± 0,98 | 164,5 ±2,94 | ||
70 | RPACPLV NPLCLHP GWTCA (SEQ ID NO: 64) | 10,06 ±2,96 | |||
71 | RPPCPLV NPLCLHP GWTCA (SEQ ID NO: 65) | 11,11 ±2,25 |
- 108 047678
72 | KHSCPLV NPLCLHP GWTCA (SEQ ID NO: 66) | 11,92 ±6,04 | |||
73 | ACPLVNP LCLHPGW TCLHG (SEQ ID NO: 67) | 1,98 ± 0,49 | 7,27 ± 1,09 | ||
74 | AcCPLVNPL CLHPGWT CLHG (Ac(SEQ ID NO: 12)) | 1,76 ±0,54 | |||
75 | (β-Ala)SarioACPLVNP LCLHPGW TCLHG ((β-Ala)- Sario-(SEQ ID NO: 67)) | 2,48 ± 0,27 | 18± 1,18 | ||
76 | (β-Ala)SarioACPLVNP LCLHPGW TCL(DHis)G ((β-Ala)Sari0-(SEQ ID NO: 68)) | 10,01 ± 1,55 | 75,15 ± 14,41 |
- 109 047678
77 (BCY60 19) | AcCPLVNPL CLHPGWT CLHGSar6-(D-K) (Ac-(SEQ ID NO: 12)Sar6-(D-K)) | 5,41 ±0,86 | 48,23 ± 15,72 | ||
78 | AcCPLVNPL CLHPGWT CL(DHis)G-Sar6(D-K) (Ac-(SEQ ID NO: 13)Sar6-(D-K)) | 15,6 ±4,7 | 115,03 ±41,16 | ||
79 | ACPLVNP LCLHPG(2 Nal)TCLH G (SEQ ID NO: 69) | 162 ± 17,64 | |||
80 | RHDCPLV NPLCLLP GWTCA (SEQ ID NO: 70) | 7,11 ±0,72 | |||
81 | TPRCPLV NPLCLMP GWTCA (SEQ ID NO: 71) | 9,8 ±2,61 |
- 110 047678
82 | ACPLVNP LCLAPGW TCA (SEQ ID NO: 72) | 46,2 n=l | |||
83 | ACPLVNP LCLAPGW TCSRS (SEQ ID NO: 73) | 7,05 ± 1,11 | |||
84 | ACPLVNP LCLEPGW TCA (SEQ ID NO: 74) | 53,9 n=l | |||
85 | ACPLVNP LCLEPGW TCAKR (SEQ ID NO: 75) | 10,95 ± 1,6 | |||
86 | ACPLVNP LCLHPGW SCA (SEQ ID NO: 76) | 56,15 ± 11,27 | |||
87 (BCY60 26) | ACPLVNP LCLHPGW SCRGQ (SEQ ID NO: 77) | 2,57 ±0,63 | 18,6 ±0,59 | ||
88 | Ac- CPLVNPL | 1,64 ±0,75 |
- 111 047678
CLHPGWS CRGQ (Ac-(SEQ ID NO: 14)) | |||||
89 | (β-Ala)- SarioACPLVNP LCLHPGW SCRGQ ((β-Ala)- Sario-(SEQ ID NO: 77) | 2,86 ± 1,29 | 29,55 ±4,61 | ||
90 | (β-Ala)Sari0ACPLVNP LCLHPGW SC(HArg)G Q ((β-Ala)Sari0-(SEQ ID NO: 78)) | 5,41 ± 0,67 | 47,05 ± 11,47 | ||
91 (BCY60 42) | AcCPLVNPL CLHPGWS CRGQSar6-(D-K) (Ac-(SEQ ID NO: 14)Sar6-(D-K)) | 5,98 ± 1,42 | 49,87 ± 14,44 | ||
92 | AcCPLVNPL CLHPGWS C(HArg)G | 10,56 ±6,56 | 75,27 ±21,72 |
- 112 047678
Q-Sar6-(D- К) (Ac-(SEQ ID NO: 15) -Sar6-(D- K)) | |||||
93 | ACPLVNP LCLHPG(2 Nal)SCRG Q (SEQ ID NO: 79) | 228 ± 103,88 | |||
94 | ACPLVNP LCLTPGW TCTNT (SEQ ID NO: 80) | 13,25 ±4,05 | |||
95 | ACPMVNP LCLHPGW KCA (SEQ ID NO: 81) | 11,91 ±3,73 | |||
96 | ACPMVNP LCLTPGW 1CA (SEQ ID NO: 82) | 16,07 ±4,58 | |||
97 | ACPMVNP LCLHPGW TCA (SEQ ID NO: 83) | 20 ± 1,02 |
Таблица 5
Данные биологических испытаний TATA пептидных лигандов по изобретению (анализ конкурентного связывания)
Номер бициклического соединения | Последовательность | Ki, hM ± 95% CI | |
EphA2 человека | EphA2 мыши | ||
Флуоресцентный пептид | |||
Референсное соединение С | Референсное соединение С | ||
98 | (P-Ala)-Sario-H(DAsp)VTC(Aib)(lNal)G(Aib)F(l Nal)CP(tBuGly)N(HArg) P(D-Asp)C ((P-Ala)-Sario-(SEQ ID NO: 84)) | 251,5 ±73,5 |
- 113 047678
Таблица 6
Данные биологических испытаний пептидных лигандов по изобретению (данные по конкурентному связыванию BDC с TATA каркасами)
Номер соединения BDC | Прекурсор бицикла | Общая формула | Ki, нМ | |
EphA2 человека | EphA2 мыши | |||
Флуоресцентный пептид | ||||
Референсное соединение С | Референсное соединение С | |||
BCY6027 | BCY6099 | Формула (А) | 10,23 | |
BCY6028 | BCY6099 | Формула (В) | 13,04 | |
BCY6031 | BCY6014 | Формула (А) | 12,62 | 34,70 |
BCY6032 | BCY6014 | Формула (В) | 11,42 | 35,90 |
Таблица 7
Данные по селективности для пептидных лигандов по изобретению (селективность при анализе прямого связывания)
Номер бициклического соединения | EphA2 мыши | EphA2 крысы | EphA2 собаки | ЕрИАЗ человека и мыши | ЕрИАЗ крысы | EphA4 человека | EphA4 крысы и мыши | EphBl крысы | EphB4 человека | EphA7 человека | EphA6 человека | EphAl человека | Фактор ХПа человека | Карбоангидраза 9 человека | CD38 человека |
сч | 516,5 ± 236,18 | 210 ± 1,96 | >1000 | >1000 | >1000 | 10890 п=1 | о о о <о Л | ||||||||
О | 216 | 252,5 ±6,86 | |||||||||||||
О' | о о о Л | ||||||||||||||
>3000 | |||||||||||||||
CI | >3000 | ||||||||||||||
СП | >3000 | ||||||||||||||
>3000 |
- 114 047678
Исследование 2. Измерения флуоресцентной поляризации (альтернативный протокол).
(а) Конкурентное связывание.
Пептиды без флуоресцентной метки подвергали испытаниям на конкурентное связывание с пептидом с флуоресцентной меткой и известной величиной Kd (табл. 9). Добавляли в планшет пять микролитров испытуемого соединения с возрастающими концентрациями (двухкратно), затем 10 мкл EphA2 белка (табл. 8) при фиксированной концентрации, которая зависела от используемого флуоресцентного пептида (табл. 9), затем добавляли 10 мкл флуоресцентного пептида. Буфер представлял собой буфер для анализа, такой как описанный выше, с DMSO <1%. Измерения проводили на считывающем устройстве для микропланшетов BMG PHERAstar FS, оснащенном оптическим модулем FP 485 520 520, в котором используется возбуждающее излучение при 485 нм и проводится детекция параллельной и перпендикулярной эмиссии при 520 нм. Прибор PHERAstar FS использовали при 25°C в режиме 200 вспышек на лунку и с задержкой позиционирования 0,1 секунды, при этом измерение каждой лунки проводили с интервалами от 5 до 10 мин в течение 60 мин. В качестве варианта, измерения проводили с аналогичными вариантами времени на планшетном анализаторе Perkin Elmer Envision, оснащенном двухзеркальным FITC FP Dual Mirror, фильтром возбуждающего излучения FITC FP 480 и фильтрами эмиссионного излучения FITC FP P-pol 535 и FITC FP S-pol с 30 вспышками и со значением G-фактора 1,2. Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Systat Sigmaplot версии 12.0 или 13.0, где величины mP в момент времени 60 мин апроксимировали с помощью определенного пользователем уравнения третьего порядка с получением величины Ki:
f=ymin+(ymax-ymin)/Lig:i!((Lig*((2:|<((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot:|<c)A23*(Kcomp*(Lig-Prot:i:c)+Klig*(Comp-Prot:,:c)+Klig:i:Kconip))A0,5:t:COS(ARCCOS((2^Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)A3+9*(KligH<comp+Lig+Comp-Prot*c)*(Kcomp*(LigProt4)+Klig^Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(1 *Klig*Kcomp*Prot* c))/(2 * ((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot* c)A2-3 *(Kcomp * (LigProt*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))A3)A0,5)))/3))-(Klig+Kcomp+Lig+CompProt*c)))/((3*Klig)+((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)A2-3*(Kcomp*(LigProt*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))A0,5*COS(ARCCOS((-2*(Klig+Kcomp+Lig+CompProt * c)A3+9 * (Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot* c) * (Kcomp * (Lig-Prot* c)+Klig * (C ompProt*c)+Klig*Kcomp)-27*(-l*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)A23*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))A3)A0,5)))/3))(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))).
Lig, Klig и Prot представляли собой определяемые величины, относящиеся к концентрации флуоресцентного пептида, Kd флуоресцентного пептида и концентрации EphA2, соответственно.
Таблица 8 Рецепторы Eph и источник
Рецептор (домен) | Вид | Формат/метка | Фирма-поставщик | Номер по каталогу |
EphA2 (Ecto) | Человек | С-концевой ПОЛИН15 | R&D systems | 3035-А2 |
EphA2 (Ecto) | Человек | С-концевой полиН is | In-house | N/A |
EphA2 (Ecto) | Мышь | С-концевой | Sino Biological | 50586-М08Н |
ПОЛИН18 | ||||
EphA2 (ligand binding) | Крыса | С-концевой ПОЛиН18 | In-house | N/A |
Таблица 9
Конечные концентрации флуоресцентного пептида и EphA2, используемые при проведении анализов на ______________ конкурентное связывание_________________
Флуоресцентный пептид | Концентрация флуоресцентного пептида (нМ) | Концентрация человеческого EphA2 (нМ) | Концентраци я мышиного EphA2 (нМ) | Концентра ция крысиного EphA2 (нМ) |
Референсное соединение С | 0,8 | 2,4 или 25 | 50 или 15 нМ | 25 |
Конкретные пептидные лиганды и бициклические конъюгаты лекарственных средств по изобретению подвергали испытанию в упомянутом выше анализе на конкурентное связывание, и результаты представлены в табл. 10-11.
- 115 047678
Таблица 10
Конкурентное связывание с выбранными бициклическими пептидами
Номер бицикла | Человек Ki (нМ) | Мышь Ki (нМ) | Крыса Ki (нМ) |
BCY6009 (Соединение 108) | 12,7 | 26,7 | 18,0 |
BCY6014 (Соединение 67) | 14,5 | 39,6 | 24,4 |
BCY6017 (Соединение 109) | 8,3 | ||
BCY6018 (Соединение ПО) | 13,1 | ||
BCY6019 (Соединение 77) | 6,4 | 16,0 | |
BCY6026 (Соединение 87) | 4,4 | ||
BCY6042 (Соединение 91) | 6,7 | ||
BCY6059 (Соединение 106) | 43,2 | ||
BCY6099 | 2,7 | 4,5 | 1,9 |
(Соединение 66) | |||
BCY6101 (соединение 101) | 9,7 | 6,9 | |
BCY6102 (соединение 102) | 14,6 | 25,1 | |
BCY6103 (соединение 100) | 14,8 | 20,8 | |
BCY6104 (соединение 99) | 5,1 | 19,8 | |
BCY6137 (Соединение 105) | 2,2 | ||
BCY6138 (Соединение 104) | 566,0 | ||
BCY6139 (соединение 103) | 5,7 | ||
BCY6141 (Соединение 112) | 90,4 | ||
BCY6152 (Соединение 111) | 23,3 | ||
BCY6153 (Соединение 113) | 18,2 | ||
BCY6160 (Соединение 107) | 14,0 | ||
BCY6039 | 9,4 | ||
BCY6105 | 8,86 | ||
BCY6106 | 12,9 | ||
BCY6175 | 1 | ||
BCY6107 | 19,18 |
Результаты анализа конкурентного связывания в табл. 10 показывают, что нацеленные на EphA2 человека бициклические пептиды (BCY6014 и BCY6099) связываются с высокой аффинностью с EphA2 мыши и крысы. Аналогично, BCY6019 связывается с EphA2 как человека, так и мыши. Эти результаты показывают, что конкретные пептиды по изобретению могут использоваться в in vivo эксперименталь- 116 047678 ных моделях на мышах и крысах для проведения исследований по оценке эффективности и токсических эффектов.
Таблица 11
Конкурентное связывание с выбранными бициклическими конъюгатами лекарственных средств (BDC)
Идентификационный номер бицикла | Человек Ki (нМ) | Мышь Ki (нМ) | Крыса Ki (нМ) |
BCY6061 | 12,0 | 32,3 | 14,2 |
BCY6174 | 1,7 | 3,9 | з,о |
BCY6029 | 2,3 | ||
BCY6033 | 9,9 | 34,2 | 13,4 |
BCY6037 | 7,3 | ||
BCY6049 | 8,8 | 28,1 | |
BCY6053 | 48,2 | 29,7 | |
BCY6122 | 13,7 | 10,4 | |
BCY6136 | 1,9 | 5,5 | 3,2 |
BCY6030 | 5,6 | ||
BCY6034 | 5,9 | 35,9 | |
BCY6038 | 2,8 | ||
BCY6050 | 168,1 | 62,2 | |
BCY6054 | 53,6 | 73,6 | |
BCY6027 | 10,2 | ||
BCY6031 | 12,5 | 35,1 | 20,0 |
BCY6035 | 15,2 | ||
BCY6047 | 53,2 | 34,2 | |
BCY6051 | 54,0 | 43,6 | |
BCY6134 | 7,4 | 12,6 | |
BCY6135 | 2,4 | 5,0 | 2,9 |
BCY6154 | 8,0 | ||
BCY6155 | 12,5 | ||
BCY6063 | 7,8 | 66,8 | |
BCY6028 | 13,0 | ||
BCY6032 | Н,4 | 35,9 | |
BCY6036 | 18,6 | ||
BCY6048 | 120,7 | 87,2 | |
BCY6052 | 30,5 | 27,1 | |
BCY6064 | 12,5 | 40,7 | |
BCY6162 | 44,9 | ||
BCY6082 | 10,5 | 34,1 | 13,9 |
BCY6150 | 17,9 | ||
BCY6151 | 9,0 | ||
BCY6161 | 2,1 | ||
BCY6173 | 1,7 | 4,3 | 2,5 |
BCY6077 | 6,5 | 25,3 | |
BCY6055 | 15,8 | ||
BCY6062 | 12,9 | 20,3 |
Данные, приведенные в табл. 11, показывают, что конкретные бициклические конъюгаты лекарственных средств по изобретению проявляют отличную перекрестную реактивность между EphA2 человека, мыши и грызунов. Поэтому, пептиды по изобретению может быть использован в in vivo эксперимен- 117 047678 тальных моделях на мышах и крысах для проведения исследований по оценке эффективности и токсических эффектов.
(b) Измерения методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
Не подвергавшиеся Fc-слиянию белки биотинилировали с помощью EZ-Link™ Sulfo-NHS-LCBiotin в течение 1 ч в 4 мМ ацетата натрия, 100 мМ NaCl, pH 5,4 при трехкратном мольном избытке биотина относительно белка. Степень нанесения метки определяли с использованием набора Fluorescence Biotin Quantification Kit (Thermo) после диализа реакционной смеси в PBS. Для анализа связывания пептидов, использовали прибор Biacore T200 с чипом XanTec CMD500D. Стрептавидин иммобилизировали на чипе, используя стандартную химическую реакцию сочетания амина при 25°C с HBS-N (10 мМ HEPES, 0,15 М NaCl, pH 7,4) в качестве подвижного буфера. Вкратце, активировали поверхность карбоксиметилдекстрана путем введения в течение 7 минут смеси 1:1 0,4 М 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (EDC)/0,l M N-гидрокси-сукцинимид (NHS) при расходе 10 мкл/мин. Для захвата стрептавидина, белок разбавляли до 0,2 мг/мл в 10 мМ ацетата натрия (pH 4,5) и захватывали путем введения 120 мкл на активированную поверхность чипа. Остаточные активированные группы блокировали путем введения в течение 7 минут смеси 1 М этаноламин (pH 8,5):HBS-N (1:1). Буфер заменяли на PBS/0,05% Tween 20, и биотинилированный EphA2 захватывали до уровня 500-1500 резонансных единиц, используя разбавление белка до 0,2 мкМ в буфере. Приготавливали серию разбавлений пептидов в этом буфере с конечной концентрацией DMSO 0,5%, при этом наивысшая концентрация пептида составляла 50 или 100 нМ и 6 дополнительных двухкратных разбавлений. Анализ методом SPR проводили при 25°C при расходе 90 мкл/мин при 60 секундах ассоциации и 900-1200 секундах диссоциации. Проводили корректировку данных для исключения объемных эффектов DMSO. Все данные дважды сопоставляли с холостыми введениями и референсной поверхностью, используя стандартные процедуры обработки, и обработку данных и аппроксимацию кинетических данных проводили с использованием программного обеспечения Scrubber software, version 2.0c (фирмы BioLogic Software). Данные апроксимировали с использованием модели простого связывания 1:1, учитывающей в требуемых случаях эффекты переноса массы.
Для исследования связывания бициклических конъюгатов лекарственных средств использовали прибор Biacore 3000. Для биотинилированных белков уровни иммобилизирования составляли 1500 резонансных единиц, а наивысшая концентрация составляла 100 нМ. Во всех других отношениях, метод был таким же, как описанный выше метод, с использованием либо чипа CMD500D, либо чипа CM5 (GE Healthcare). Для Fc-меченых белков, чип CM5 активировали, как описано выше, и затем козье антитело против человеческого IgG (Thermo-Fisher H10500) разбавляли до 20 мкг/мл в 10 мМ ацетата натрия pH 5,0 и захватывали до приблизительно 3000 резонансных единиц. Поверхность затем блокировали, как описано выше. Проводили последовательный захват Fc-меченых белков с получением приблизительно 200-400 резонансных единиц белка-мишени. Используемые белки описаны ниже. Все белки ресуспендировали в рекомендованных фирмой-производителем буферах и концентрациях и захватывали с использованием 5-10 мкг/мл белка в PBS/0,05% Tween 20.
Таблица 12
Рецептор | Вид | Формат/метка | Фирмапоставщик | Номер no каталогу |
EphAl | Человек | Fc-слияние | Sino Biologies | 15789-H02H |
EphA2 | Человек | 0,95 моль биотин/мономер | In house | N/A |
EphA2 | Мышь | Fc-слияние | R&D Systems | 639-A2 |
EphA2 | Крыса | 1,4 моль биотин/мономер | In house | N/A |
EphA3 | Человек | Fc-слияние | R&D Systems | 6444-A3 |
EphA3 | Мышь | Fc-слияние | Sino Biologies | 51122-M02H |
EphA3 | Крыса | Fc-слияние | Sino Biologies | 80465-R02H |
EphA4 | Человек | Fc-слияние | Sino Biologies | 11314-H03H |
EphA4 | Мышь | Fc-слияние | Sino Biologies | 50575-M02H |
- 118 047678
EphA4 | Крыса | Fc-слияние | Sino Biologies | 80123-R02H |
EphA5 | Человек | 3,1 моль биотин/мономер | R&D Systems | 3036-A5 |
EphA6 | Человек | Fc-слияние | R&D Systems | 5606-A6 |
EphA7 | Человек | Fc-слияние | R&D Systems | 6756-A7 |
EphBl | Крыса | Fc-слияние | R&D Systems | 1596-B1 |
EphB4 | Человек | Fc-слияние | Sino Biologies | 10235-H02H |
Конкретные пептидные лиганды и бициклические конъюгаты лекарственных средств по изобретению подвергали испытанию в упомянутом выше анализе на конкурентное связывание, и результаты представлены в табл. 13-15.
Таблица 13
Анализ связывания методом SPR выбранных бициклических пептидов и бициклических конъюгатов ле-
- 119 047678
Таблица 14
Анализ связывания методом SPR выбранных бициклических конъюгатов лекарственных средств по изобретению с гомологами Eph человека
В табл. 14 представлены результаты связывания для четырех бициклических конъюгатов лекарственных средств (BCY6033, BCY6082, BCY6136 and BCY6173) при проведении анализа методом SPR с близкородственными гомологами эфрина человека. Результаты показывают, что соединения по изобретению не проявляют значимого связывания с близкородственными гомологами EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7 и EphB4 человека.
Таблица 15
Анализ связывания методом SPR выбранных бициклических конъюгатов лекарственных средств по изобретению с ортологами Eph мыши и крысы
Номер BDC | EphA3 мыши | EphA4 мыши | ЕрЬАЗ крысы | EphBl крысы |
отсутствие | отсутствие | отсутствие | отсутствие | |
BCY6033 | связывания | связывания | связывания | связывания |
@ 20 мкМ | @ 20 мкМ | @ 20 мкМ | @ 20 мкМ | |
отсутствие | отсутствие | отсутствие | отсутствие | |
BCY6082 | связывания | связывания | связывания | связывания |
@ 20 мкМ | @ 20 мкМ | @ 20 мкМ | @ 20 мкМ | |
отсутствие | отсутствие | отсутствие | отсутствие | |
BCY6136 | связывания | связывания | связывания | связывания |
@ 20 мкМ | @ 20 мкМ | @ 20 мкМ | @ 20 мкМ | |
отсутствие | отсутствие | отсутствие | отсутствие | |
BCY6173 | связывания | связывания | связывания | связывания |
@ 20 мкМ | @ 20 мкМ | @ 20 мкМ | @ 20 мкМ |
Результаты в табл. 15 показывают, что конкретные бициклические конъюгаты лекарственных средств по изобретению (BCY6033, BCY6082, BCY6136 и BCY6173) являются также селективными в отношении EphA2 мыши и крысы и не проявляют значимого связывания с близкородственными гомологами EphA3 и EphA4 мыши, и EphA3 и EphB1 крысы.
Исследования 3 и 7-23.
В каждом из исследований 3 и 7-23, применяли следующую методологию для каждого исследования.
a) Материалы.
(i) Животные и условия их содержания.
Животные.
Вид: домовая мышь.
- 120 047678
Штамм: Balb/c nude или CB17-SCID.
Возраст: 6-8 недель.
Масса тела: 18-22 г.
Число животных: 9-90 мышей.
Фирма-поставщик животных: Shanghai Lingchang Biotechnology Experimental Animal Co. Limited.
Условия содержания.
Мышей содержали в индивидуально вентилируемых клетках при постоянной температуре и влажности по 3-5 животных в каждой клетке.
Температура: 20~26°C.
Влажность 40-70%.
Клетки изготовлены из поликарбоната. Размер 300 мм x 180 мм x 150 мм. Материал для подстилки стержень кукурузного початка, который заменяют дважды в неделю.
Рацион. Животные имели свободный доступ к стерилизованному облучением сухому гранулированному корму на протяжении всего периода исследования.
Вода. Животные имели свободный доступ к стерилизованной питьевой воде.
Идентификация клетки. Идентифицирующие этикетки для каждой клетки содержали следующую информацию: число животных, пол, штамм, дата получения, лечение, номер исследования, номер группы и дата начала лечения.
Идентификация животного. Животных маркировали путем маркировки уха.
(ii) Испытание и материалы для положительного контроля.________________________
Номер | Описание физического состояния | Молекулярная масса | Чистота | Условие хранения |
BCY6031 | Лиофилизированный порошок | 3878,92 | 97,99% | Хранили при -80°С |
BCY6033 | Лиофилизированный порошок | 4260,01 | 99,12% | Хранили при -80°С |
BCY6082 | Лиофилизированный порошок | 3911,04 | 96,8% | Хранили при -80°С |
BCY6135 | Лиофилизированный порошок | 4021 | 95,14% | Хранили при -80°С |
BCY6136 | Лиофилизированный порошок | 4402,23 | 97,5-98,6% | Хранили при -80°С |
BCY6173 | Лиофилизированный порошок | 4101,15 | 95,80% | Хранили при -80°С |
BCY6174 | Лиофилизированный порошок | 4537 | 99,50% | Хранили при -80°С |
BCY6175 | Лиофилизированный порошок | 4492,29 | 96,20% | Хранили при -80°С |
BCY8245 | Лиофилизированный порошок | 4173,85 | 99,30% | Хранили при -80°С |
BCY8781 | Лиофилизированный порошок | 4173,83 | 99,00% | Хранили при -80°С |
ADC (MEDI547)1 | Раствор (концентрация 10,47 мг/мл) | - | > 99,00% | Хранили при -80°С |
Подробные сведения о MEDI-547 (полностью человеческое моноклональное антитело 1C1 (распознающее как человеческий, так и мышиный EphA2), конъюгированное с MMAF через MC линкер) приведены в публикации Jackson et al. (2008) Cancer Res 68, 9367-74.
(b) Экспериментальные методы и методики.
(i) Наблюдения.
Все методики, относящиеся к содержанию, уходу и лечению животных при исследовании проводили в соответствии с руководящими принципами, одобренными Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC) международной фармацевтической, биофармацевтической и медицинской компанией WuXi AppTec, следуя руководству Международной ассоциации оценки и аккредитации лабораторных исследований на животных (AAALAC). Во время проведения мониторинга, осуществляемого по обычной программе, животных подвергали ежедневному осмотру на наличие любых воздействий роста опухоли и лечения на нормальное поведение, такое как подвижность, потребление корма и воды (путем только визуального осмотра), прибавление/потеря массы тела, тусклость глаз/шерсти и любое другое аномальное воздействие, указанное в протоколе. Случай смерти и наблюдаемые клинические проявления регистрировали с учетом числа животных в каждой подгруппе.
(ii) Измерения опухоли и конечные клинические результаты.
Главным конечным клиническим результатом являлось обнаружение возможности отсрочки роста опухоли или возможности излечивания мышей. Объем опухоли измеряли три раза в неделю в двух направлениях, используя штангенциркуль, и объем выражали в мм3, используя формулу: V=0,5 a x b2, где a
- 121 047678 и b представляют собой наибольший и наименьший диаметры опухоли, соответственно. Затем размер опухоли использовали для расчетов величины T/C. Величина T/C (в процентах) представляет собой показатель противоопухолевой активности; T и C представляют собой средние объемы в подвергаемых лечению и контрольных группах, соответственно, на данный день.
Для каждой группы рассчитывали TGI, используя формулу: TGI (%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] х 100; T представляет собой средний объем опухоли в подвергаемой лечению группе на данный день, T0 представляет собой средний объем опухоли в подвергаемой лечению группе на день начала лечения, Vi представляет собой средний объем опухоли в контрольной группе с плацебо на тот же самый день, что и для Ti, и V0 представляет собой средний объем опухоли в группе с плацебо на день начала лечения.
(iii) Сбор образцов.
В конце исследования, опухоли во всех группах собирали для фиксирования формалином и заливки парафином (FFPE).
(iv) Статистический анализ.
Сводная статистика, включающая смраднее значение и стандартную ошибку среднего значения (SEM), приведена для объема опухоли в каждой группе в каждый момент времени.
Статистический анализ различия в объеме опухоли между группами проводили на данных, полученных в момент времени достижения наилучшего терапевтического результата после введения последней дозы.
Для сравнения объема опухоли между группами использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), и затем получали оценка статистической значимости с критерием Фишера (F-критерий) (отношение дисперсии результатов лечения к дисперсии ошибки), сравнения между группами проводили с использованием теста Геймса-Ховелла (Games-Howell). Все данные анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 5.0. Статистически значимой считали величину P < 0,05.
Исследование 3. In vivo эффективность в модели LU-01-0046 PDX.
Сначала получают линии раковых клеток (CCL) из опухолей пациентов, которые приобретают способность к пролиферации в in vitro культурах клеток. В результате in vitro манипуляции, линии раковых клеток (CCL), которые традиционно используют при исследованиях рака, подвергаются генетическим трансформациям, которые не восстанавливаются, когда клетки выращивают in vivo. В результате культивирования клеток, отбирают клетки, которые лучше приспособлены для выживания в культуре, удаляют резидентные опухолевые клетки и белки, которые взаимодействуют с раковыми клетками, и культура становится фенотипически гомогенной. В настоящее время, исследователи объясняют причину того, что только 5% противораковых препаратов одобряется Управлением по контролю за качеством пищевых и фармацевтических препаратов США после преклинических испытаний, так как при проведении исследований отсутствует гетерогенность опухоли и отсутствует стромальное микроокружение, свойственное человеку. В частности, CCL-ксенотрансплантаты часто не позволяют предсказать ответ на воздействие лекарственного средства в первичных опухолях, так как CCL не позволяют изучить механизм возникновения резистентности к лекарственному средству или влияния микроокружения на ответ при действии лекарственного средства, которые обнаруживаются в первичных опухолях человека. Для того чтобы преодолеть эти проблемы, авторы изобретения использовали модели PDX для повышения предсказательной способности преклинических моделей.
Модель PDX создают путем имплантации раковой ткани из первичной опухоли пациента непосредственно иммунодефицитной мыши. В модели PDX может сохраняться гистология опухоли пациента, в том числе присутствие неопухолевых клеток (например, стромальных клеток), и поэтому, эта модель лучше имитирует микроокружение опухоли. В силу этого, модели PDX обычно лучше отражают гетерогенность и гистологию первичных опухолей, чем CCL-ксенотрансплантаты.
BCY6031 подвергали скринингу в PDX ксенотрансплантате первичной аденокарциномы (LU-010046), полученном от пациента с немелкоклеточной карциномой легкого (NSCLC). Было показано, что LU-01-0046 экспрессирует высокие уровни EphA2, используя секвенирование РНК. BCY6031 проявлял высокую активность в модели LU-01-0046 и, поэтому, он является новым перспективным терапевтическим препаратом для лечения немелкоклеточного рака легкого.
(a) Подвергаемые лечению группы.
Цель проведения эксперимента заключалась в сравнении роста опухоли у животных, подвергаемых лечению с помощью плацебо, с ростом опухоли у животных, подвергаемых лечению с помощью BCY6031 при дозе 5 мг/кг один раз в неделю в течение четырех недель.
- 122 047678
Таблица 16
Группа | η | Лечение | Доза (мг/кг) | Объем дозирования (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
1 | 6 | Плацебо | - | 10 | внутривенно | Один раз в две недели х 1 неделя |
2 | 3 | BCY6031 | 5 | 10 | внутривенно | один раз в неделю х 4 недели |
Примечание: n: число животных; объем дозирования: скорректированный объем дозирования с учетом массы тела.
(b) Метод эксперимента.
(i) Информация о PDX
Таблица 17
Название модели | Тип рака | Скорость роста опухоли | Массив данных | RSQ | Экспрессия ЕРН2 |
LU-01-0046 | NSCLC | Размер опухоли может достигать 1000 мм3 через 40 дней после инокуляции опухоли | 6,790 | 31,312 | Высокая |
(ii) Инокуляция опухоли.
Каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность приблизительно 30 мм3 фрагмента опухоли LU-01-0046. Лечение лекарственным средством начинали, когда средний объем опухоли достигал 943 мм3. Испытуемый препарат, способ введения, частота дозирования и число животных в каждой группе описаны выше.
(iii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.
Таблица 18
Испытуемый препарат | Доза(мг/кг) | Рецептура |
Плацебо | - | 50 мМ ацетат, 10% сахароза pH 5 (без DMSO) |
BCY6031 | 5 | Растворить 4,59 мг BCY6031 в 4,498 мл буфера для приготовления с получением исходного раствора 1 мг/мл BCY6031. Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6031 с помощью 450 мкл буфера для приготовления. |
(c) Результаты.
(i) Летальность, процент смертности и прибавка и потеря массы тела.
Массу тела животных регулярно контролировали в качестве косвенной меры токсичности. Изменение массы тела у самок бестимусных мышей линии BALB/c, несущих опухоль LU-01-0046, которым вводили BCY6031, представлено на фиг. 1.
(ii) Кривая роста опухоли.
Кривая роста опухоли представлена на фиг. 2.
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования опухоли для BCY6031 в PDX модели LU-01-0046 рассчитывали на основе измерений объема опухолей на день 7 после начала лечения.
- 123 047678
Таблица 19
Анализ ингибирования роста опухоли (T/C и TGI) на день 7
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGI (%) | Р-величина |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 2191±473 | - | - | - |
2 | BCY6031, 5 мг/кг, один раз в неделю | 463±158 | 21,1 | 138,6 | р<0,05 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Обсуждение.
В исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6031 в PDX модели LU-01-0046. Измеренные массы тела представлены на фиг. 1. Объемы опухолей в подвергнутой лечению группе в различные моменты времени представлены в табл. 19 и на фиг. 2.
Средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 2191 мм3 на день 7. Препарат BCY6031 при дозе 5 мг/кг проявлял высокую противоопухолевую активность с измеренной величиной объема опухоли 463 мм3 (TGI=138,6%, p<0,05) ко дню 7. Кроме того, лечение препаратом BCY6031 приводило к полному уничтожению опухолей от дня 32, и не происходило возобновления роста опухоли после временного прекращения дозирования на день 28. Лечение препаратом BCY6031 не вызывало значительной потери массы тела (фиг. 1), и не было обнаружено признаков неблагоприятного воздействия у подвергавшихся лечению мышей на протяжении всего исследования.
Исследование 4. In vivo эффективность BCY6136 в ксенотрансплантатных моделях CDX.
В исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6136 в трех полученных моделях раковых клеточных линий (CDX): линии фибросаркомы HT1080, линии трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231 и линии немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) NCI-H1975.
(a) Методика проведения эксперимента.
Мышам линии Balb/c подкожно инокулировали опухолевые клетки в правую боковую поверхность, и лечение с помощью лекарственного средства начинали, когда средний объем опухоли достигал от 150 до 200 мм3. Измерения опухоли и статистический анализ проводили так, как описано выше. Несущим опухоль животным вводили один раз в неделю BCY6136 или плацебо.
(b) Обсуждение.
На фиг. 4-6 показано, что BCY6136 является эффективным в ксенотрансплантатных моделях рака молочной железы, легкого и фибросаркомы после дозирования один раз в неделю
Модель фибросаркомы HT1080.
В модели HT1080 полный регресс роста опухоли достигался к дню 14 после дозирования BCY6136 один раз в неделю в дни 0 и 7 7 при дозе 3 и 5 мг/кг (фиг. 4). Дозирование BCY6136 один раз в неделю при дозе 2 мг/кг в дни 0 и 7 вызывало остановку роста опухоли (частичный регресс) (фиг. 4). Лечение с применением BCY6136 приводило к незначительной потере массы тел (фиг. 4, график в правом верхнем углу), и на протяжении всего исследования не обнаруживались неблагоприятные клинические проявления у подвергнутых лечению лекарственным средством мышей.
Модель NCI-H1975 NSCLC.
Полный регресс роста опухоли в модели NCI-H1975 наблюдался приблизительно на день 28 после дозирования BCY6136 один раз в неделю при дозе 2 и 3 мг/кг (фиг. 5). После прекращения дозирования на день 35, не обнаруживалось возобновление роста опухоли у животных, которым вводили дозу 3 мг/кг, в период от дня 35 до дня 72, когда были закончены измерения размера передней лапы животных, которым вводили дозу 3 мг/кг (фиг. 5). Дозирование BCY6136 при величине дозы 2 мг/кг вызывало полный регресс в этой модели приблизительно со дня 28. После прекращения дозирования на день 35, не обнаруживалось возобновление роста опухоли приблизительно вплоть до дня 51 при величине дозы 2 мг/кг. При этом уровне дозы наблюдалось умеренное возобновление роста опухоли приблизительно от дня 51 и вплоть до окончания исследования в день 77. Лечение с помощью BCY6136 при дозе 1 мг/кг вызывало остановку роста опухоли (частичный регресс) (фиг. 5). Лечение с применением BCY6136 вызывало незначительную потерю массы тела (фиг. 5, график в правом верхнем углу), и на протяжении всего исследования не обнаруживались неблагоприятные клинические проявления у подвергнутых лечению лекарственным средством мышей.
Модель рака молочной железы MDA-MB-231.
Остановку роста опухоли (частичный регресс) наблюдали в модели MDA-MB231 после дозирования один раз в неделю при дозе 2 и 3 мг/кг от дня 0 до дня 45 (фиг. 6). Наблюдалась некоторая потеря массы тела (относимая за счет массы опухоли) у животных, которым вводили дозу 2 мг/кг (фиг. 6, гра- 124 047678 фик в правом верхнем углу).
Эти результаты показывают, что BCY6136 вызывает глубокое ингибирование роста опухоли у мышей, которым имплантировали ксенотрансплантаты CDX фибросаркомы, рака молочной железы и рака легкого, после дозирования один раз в неделю.
Исследование 5. Исследования безопасности на крысах.
Шесть (6) самцов крыс распределяли случайным образом на 3 группы по 2 крысы в группе для определения токсичности BCY6136, затем вводили внутривенно болюсную инъекцию при дозе 5, 7,5 и 10 мг/кг в дни 1 и 8. Исследование заканчивали на день 15.
Не было обнаружено значительных воздействий на показатели коагуляции (протромбиновое время (сек), активированное парциальное тромбопластиновое время (сек) или уровни фибриногена (г/л)) в дни 2, 12 и 15 (данные не показаны). Не сообщалось по поводу прижизненных случаев кровотечения, и не было обнаружено доказательств внутреннего кровотечения после патологоанатомического вскрытия.
Исследование 6. Исследования безопасности на яванских макаках.
Проводили токсилогические исследования продолжительностью двадцать восемь дней при применении BCY6136 на яванских макаках. BCY6136 дозировали в дозе 1,0 и 2,0 мг/кг в дни 1, 8, 15 и 22. Животных подвергали эвтаназии и проводили вскрытие в день 29 (через 7 дней после введения последней дозы).
Не было обнаружено значительных воздействий на показатели коагуляции по сравнению с исходным уровнем в дни 18, 22 и 25 (данные не показаны) и день 29 (табл. 20). Не сообщалось по поводу прижизненных случаев кровотечения, и не было обнаружено доказательств внутреннего кровотечения после патологоанатомического вскрытия.
Таблица 20
Показатели коагуляции на день 29 после дозирования BCY6136 яванским макакам при дозе 1,0 и 2,0 мг/кг
1,0 мг/кг х 4 | 2,0 мг/кг х 4 | |||
Исходный уровень | День 29 | Исходный уровень | День 29 | |
Протромбиновое время (сек) | 13,4 | И,7 | 9,4 | 9,7 |
Протромбиновое время (сек) | 11 | 9,2 | И,2 | и,о |
Активированное парциальное тромбопластиновое время (сек) Активированное парциальное тромбопластиновое время (сек) | 18,9 16,1 | 19,4 15,7 | 19,4 18,7 | 20,9 18,2 |
Уровни фибриногена (г/л) | 2,08 | 2,42 | 1,86 | 6,1 |
Уровни фибриногена (г/л) | 2,28 | 2,35 | 1,82 | 3,1 |
Исследование 7. Исследование in vivo эффективности BCY6033 и BCY6136 и ADC при лечении ксенотрансплантата PC-3 у бестимусных мышей линии Balb/c.
(a) Цель исследования.
Целью исследования является оценка in vivo противоопухолевой эффективности BCY6033 и BCY6136 при лечении ксенотрансплантата PC-3.
(b) Дизайн эксперимента.
- 125 047678
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Объем дозирования (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | 3 | - | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
2 | BCY6136 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
3 | BCY6136 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
4 | BCY6136 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
5 | ADC | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
6 | BCY6033 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Культивирование клеток.
Клетки опухоли PC-3 следует содержать в среде F12K, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой при 37°C в атмосфере 5% CO2 в воздухе. Опухолевые клетки следует пересеивать стандартным методом два раза в неделю. Для инокуляции опухоли, следует собирать клетки, находящиеся в фазе экспоненциального роста, и подсчитывать их.
(ii) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши следует инокулировать подкожно в правую боковую поверхность опухолевые клетки PC-3 (10 x 106). Животных следует рандомизировать, и лечение следует начинать, когда средний объем опухоли достигнет приблизительно 150 мм3. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в следующей таблице дизайна эксперимента.
(iii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.
Испытуемый препарат | Концентрация (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | - | 50 мМ ацетат/уксусная кислота pH 5 10% сахарозы |
BCY6136 | 0,1 | Разбавить 90 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 810 мкл буфера для плацебо |
0,2 | Разбавить 180 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 720 мкл буфера для плацебо | |
о,з | Разбавить 270 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 630 мкл буфера для плацебо | |
ADC | о,з | Разбавить 26 мкл исходного раствора 10,47 мг/мл ADC с помощью 874 мкл буфера для ADC |
BCY6033 | о,з | Разбавить 270 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6033 с помощью 630 мкл буфера для плацебо |
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и кривая роста опухоли представлена на фиг. 7-9.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самок бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат PC-3, приведен в табл. 21.
- 126 047678
Таблица 21
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени
Группа | Лечение | о | г- | о | ОО | η | |||||
Плацебо, один раз в неделю | 149±9 | 235±9 | 377±9 | о -н ОО | 1126=1=41 | о -н | 1792±69 | 2070±152 | |||
ci | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 150=1=11 | 185±25 | 228±31 | 201=Ы7 | СЯ +1 ОО | 153±38 | 137±33 | 107±32 | 64±28 | 45±23 |
ео | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | ОО ± о> | 179±28 | 158±22 | 137±16 | 122=1=15 | 114±20 | 91±101 | 79±20 | 57±19 | 42±17 |
BCY613 6 3 мг/кг, один раз в неделю | 149±2 | 155±8 | 144±16 | 132±20 | 107±28 | 94±23 | 83±22 | 70±27 | 38±16 | 35±17 | |
ADC 3 мг/кг, один раз в неделю | 151±27 | 4? О | 210±12 | -н о ОО | 185=1=16 | 190±37 | 158±36 | 124±35 | ся ± о | 74±14 | |
О | BCY603 3, 3 мг/кг, один раз в неделю | 151=1=33 | 214±53 | 204±51 | 192±53 | 163±43 | о ± | 141±39 | 116±36 | 83±28 | 63±32 |
Группа | Лечение | ci | ся | ОО (N | СП | СП | сп | СП | ся | ||
Плацебо, один раз в неделю | |||||||||||
ci | BCY613 6, 1 мг/кг, один раз в неделю | 35±18 | 28±14 | 37±19 | 34±17 | 42±21 | 42±23 | 43±21 | 28±14 | 18±9 | |
СО | BCY613 6, 2 мг/кг, один раз в неделю | 21=1=11 | 22±12 | 22±12 | 24±12 | 33±16 | 22±11 | <м | 22±12 | 16±9 | |
тГ | BCY613 6 3 мг/кг, один раз в неделю | 21±10 | 23±12 | 27±14 | 22±11 | 24±12 | 20±11 | ± <м | 12±6 | -Н η | |
ADC 3 мг/кг, один раз в неделю | 53±16 | 50±22 | 46±23 | 70±35 | 78±39 | 53±27 | 60±30 | 53±27 | 40±22 | ||
о | BCY603 3, 3 мг/кг, один раз в неделю | 59±31 | 44±27 | 39±24 | 40±29 | 47±32 | 41 ±27 | 41±30 | ri ± со | 33±27 |
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования роста опухоли для испытуемых препаратов в ксенотрансплантатной модели PC-3 рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 16 после начала лечения.
- 127 047678
Таблица 22
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGI (%) | Рвеличин а при сравнен ИИ с плацебо |
1-Н | Плацебо, один раз в неделю | 2070±152 | 1 | 1 | j |
ci | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 107±32 | сч | 102,2 | о о o' V а |
СО | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 79±20 | 103,6 | о о <=> V а | |
BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 70±27 | 3,4 | 104,1 | р<0,001 | |
ADC, 3 мг/кг, один раз в неделю | 124±35 | 6,0 | 101,4 | р<0,001 | |
ю | BCY6033, 3 мг/кг, один раз в неделю | 116±36 | 5,6 | ОО о | о о Ον а |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность испытываемых препаратов в ксенотрансплантатной модели PC-3. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергаемых лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 7-9 и в табл. 21 и 22.
Средний размер опухоли у мышей, которым вводили плацебо, достигал 2070 мм3 на день 16. Препарат BCY6136 при дозе 1 мг/кг, один раз в неделю (TV=107 mm3, TGI=102,2%, p<0,001), BCY6136 при дозе 2 мг/кг, один раз в неделю (TV=79 mm3, TGI=103,6%, p<0,001) и BCY6136 при 3 мг/кг, один раз в неделю (TV=70 mm3, TGI=104,l%, p<0,001) демонстрировали мощное противоопухолевое действие.
BCY6033 при дозе 3 мг/кг, один раз в неделю (TV=116 mm3, TGI=101,8%, p<0,001) и ADC при дозе 3 мг/кг, один раз в неделю (TV=124 mm3, TGI=101,4%, p<0,001) демонстрировали сопоставимое противоопухолевое действие.
В этом исследовании, регулярно контролировали массу тела животных. У всех мышей масса тела сохранялась на нормальном уровне.
Исследование 8. Изучение in vivo эффективности BCY6136 при лечении бестимусных мышей линии Balb/c в ксенотрансплантатной модели PC-3.
(a) Цель исследования.
Целью исследования является оценка in vivo противоопухолевой активности BCY6136 при лечении ксенотрансплантата PC-3 у бестимусных мышей линии Balb/c.
- 128 047678 (b) Дизайн эксперимента.
Группа | Лечение | Доза (мг/кг) | Na | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | - | 4 | внутривенно | Один раз в неделю х 4 недели |
2 | BCY6136 | 0,167 | 4 | внутривенно | Один раз в неделю х 4 недели |
Зь | BCY6136 | 0,5 | 4 | внутривенно | Один раз в неделю х 4 недели |
4 | BCY6136 | 1,5 | 4 | внутривенно | Один раз в неделю х 4 недели |
5Ь | BCY6136 | 0,5 | 4 | внутривенно | Один раз в две недели х 2 недели |
6Ь | BCY6136 | 1,5 | 4 | внутривенно | Один раз в две недели х 2 недели |
7 | EphA2-ADC | 0,33 | 4 | внутривенно | Один раз в неделю х 4 недели |
8 | EphA2-ADC | 1 | 4 | внутривенно | Один раз в неделю х 4 недели |
9 | EphA2-ADC | 3 | 4 | внутривенно | Один раз в неделю х 4 недели |
10е | Доцетаксел | 15 | 4 | внутривенно | Один раз в неделю х 4 недели |
a N, число животных в каждой группе.
b После 4 недельного лечения, представленного в таблице дизайна эксперимента, мышей в группах 3, 5 и 6 подвергали лечению с помощью BCY6136 в дозе 1,5 мг/кг один раз в неделю от дня 52 по схеме текущего контроля.
c Вследствие очень большой потери массы тела у мышей после первого дозирования, которых подвергали лечению доцетакселом, лечение приостанавливали в течение 2 недель, затем на день 28 проводили лечение при более низкой дозе (доцетаксел, 10 мг/кг). После чего, мышей подвергали лечению с помощью BCY6136 при дозировании 1,5 мг/кг один раз в неделю со дня 42 до дня 70.
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Культивирование клеток.
Опухолевые клетки содержали в среде F12K, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой при 37°C в атмосфере 5% CO2 в воздухе. Опухолевые клетки пересеивали стандартным методом два раза в неделю. Для инокуляции опухоли, собирали клетки, находящиеся в фазе экспоненциального роста, и подсчитывали их.
(ii) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность опухолевые клетки PC-3 (10 x 106) в 0,2 мл PBS. Когда средний объем опухоли достигал 454 мм3, 52 животных рандомизировали. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в следующей таблице дизайна эксперимента.
(iii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.
- 129 047678
Испытуемый препарат Плацебо BCY6136 | Чистота 98,6% | Концентрация (мг/мл) 1 0,3 0,15 0,05 0,0167 | Рецептура 25 мМ гистидина pH 7 10% сахарозы 50 мМ ацетата 10% сахарозы pH 5 Растворить 2,70 мг BCY6136 в 2,662 мл ацетатного буфера Разбавить 300 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 700 мкл ацетатного буфера1 Разбавить 600 мкл исходного раствора 0,3 мг/мл BCY6136 с помощью 600 мкл ацетатного буфера Разбавить 200 мкл исходного раствора 0,3 мг/мл BCY6136 с помощью 1000 мкл ацетатного буфера Разбавить 66,7 мкл исходного раствора 0,3 мг/мл BCY6136 с помощью 1133,3 мкл ацетатного буфера |
EphA2-ADC | - | - | 25 мМ гистидин pH 5,5 |
0,033 | Разбавить 9,3 мкл исходного раствора 4,24 мг/мл EphA2-ADC с помощью 1191 мкл гистидинового буфера | ||
0,1 | Разбавить 28 мкл исходного раствора 4,24 мг/мл EphA2-ADC с помощью 1172 мкл гистидинового буфера | ||
0,3 | Разбавить 84,9 мкл исходного раствора 4,24 мг/мл EphA2-ADC с помощью 1115 мкл гистидинового буфера | ||
Доцетаксел | - | 10 | Смешать 0,5 мл 20 мг доцетаксела с 1,5 мл буфера |
1,5 | Разбавить 180 мкл исходного раствора 10 мг/мл доцетаксела с помощью 1020 мкл солевого буфера |
1 50 мМ ацетат 10% сахарозы pH 5,3. 25 мМ гистидин pH 5,5 (c) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Кривая роста опухоли представлена на фиг. 10.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самцов бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат PC-3, приведен в табл. 23.
Таблица 23
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени (от дня 0 до дня 20)
- 130 047678
BCY6136 1,5 мг/кг, один раз в неделю | 458±49 | 587±63 | 494±54 | СЧ СП -н | +1 ОО сч | 237±24 | 192±13 | 164±16 | сч -н МП | 131±19 | |
К) | BCY6136 0,5 мг/кг, один раз в две недели | 454±37 | 643±25 | 531±37 | 458±33 | 411±32 | 382±49 | 430±88 | 522±124 | 560±129 | 530±147 |
о | га -'° | ci +1 СЧ | 590±75 | 457±49 | 375±44 | 328±47 | 242±63 | 206±61 | 197±62 | 182±55 | 128±36 |
1,5 мг/кг, один раз в неделю | |||||||||||
t | EphA2-ADC 0,33 мг/кг, один раз в две недели | 457±43 | 636±57 | 712±70 | 792±78 | 870±87 | ОО 1 | 1049±66 | 1242±123 | 1443±129 | 1637±181 |
ОО | EphA2-ADC 1 мг/кг, один раз в две недели | 450±49 | 617±48 | 673±50 | 721±61 | 782±78 | 755±67 | 840±93 | 913±91 | 978±100 | 981±100 |
σ> | EphA2-ADC 3 мг/кг, один раз в две недели | о ю -н сч | 593±98 | 643±141 | 593±106 | 433±103 | 290±81 | 268±64 | 232±60 | 225±66 | 184±62 |
о | Доцетаксел 15 мг/кг, один раз в две недели | 453±62 | 584±72 | 632±56 | 636±48 | 568±50 | СП +1 ОО о | 374±26 | 388±36 | 361±25 | 419±31 |
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования роста опухоли для испытуемых препаратов в ксенотрансплантатной модели PC-3 рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 20 после начала лечения.
- 131 047678
Таблица 24
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | т/сь (%) | TGI (%) | Р-величина при сравнении с плацебо |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 2364±102 | - | - | - |
2 | BCY6136, 0,167 мг/кг, один раз в неделю | 1188=1=111 | 50,2 | 61,4 | р<0,001 |
3 | BCY6136, 0,5 мг/кг, один раз в неделю | 234±42 | 9,9 | 111,4 | р<0,001 |
4 | BCY6136, 1,5 мг/кг, один раз в неделю | 131=1=19 | 5,5 | 117,2 | р<0,001 |
5 | BCY6136, 0,5 мг/кг, один раз в две недели | 530±147 | 22,4 | 96,0 | р<0,001 |
6 | BCY6136, 1,5 мг/кг, один раз в две недели | 128±36 | 5,4 | 117,0 | р<0,001 |
7 | EphA2-ADC, 0,33 мг/кг, один раз в неделю | 1637=1=181 | 69,2 | 38,1 | р<0,001 |
8 | EphA2-ADC, 1 мг/кг, один раз в неделю | 981±100 | 41,5 | 72,2 | р<0,001 |
9 | EphA2-ADC, 3 мг/кг, один раз в неделю | 184±62 | 7,8 | 114,0 | р<0,001 |
10 | Доцетаксел, 15 мг/кг, один раз в неделю | 419±31 | 17,7 | 101,8 | р<0,001 |
а Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(d) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность испытываемых препаратов в ксенотрансплантатной модели PC-3. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергаемых лечению, в различные моменты времени представлены 10 и в табл. 23 и 24.
Средний размер опухоли у мышей, которым вводили плацебо, достигал 2364 мм3 на день 20. Препарат BCY6136 при дозе 0,167 мг/кг один раз в неделю (TV=1188 мм3, TGI=61,4%, p<0,001), при и дозе 0,5 мг/кг один раз в две недели (TV=530 mm3, TGI=96,0%, p<0,001), при дозе 0,5 мг/кг один раз в неделю (TV=234 мм3, TGI=111,4%, p<0,001) и при дозе 1,5 мг/кг один раз в неделю (TV=131 mm3, TGI=117,2%, p<0,001) проявлял значительную противоопухолевая активность, зависимую от дозы или от частоты введения дозы, на день 20. Препарат BCY6136 при дозе 1,5 мг/кг один раз в две недели (TV=128 mm3, TGI=117,0%, p<0,001) проявлял сопоставимую противоопухолевая активность с препаратом BCY6136 при дозе 1,5 мг/кг один раз в неделю. Из них, мыши, подвергаемые лечению препаратом BCY6136 при дозе 0,5 мг/кг один раз в неделю или препаратом BCY6136 при дозе 0,5 мг/кг один раз в две недели, обнаруживали очевидный рецидив опухоли после прекращения лечения, дальнейшее лечение препаратом BCY6136 при дозе 1,5 мг/кг один раз в неделю со дня 52 давало хороший результат по регрессу опухоли. Мыши, подвергавшиеся лечению препаратом BCY6136 при дозе 1,5 мг/кг один раз в две недели, также обнаруживали рецидив опухоли после прекращения лечения, но дальнейшее дозирование не приводило к полному регрессу опухоли. Мыши, подвергавшиеся лечению препаратом BCY6136 при дозе 1,5 мг/кг один раз в неделю, не обнаруживали рецидива опухоли вплоть дня 48.
Препарат EphA2-ADC при дозе 0,33 мг/кг один раз в неделю (TV=1637 mm3, TGI=38,1%, p<0,001), при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=981 mm3, TGI=72,2%, p<0,001) и при дозе 3 мг/кг, один раз в неделю (TV=184 mm3, TGI=114,0%, p<0,001) проявлял значительную противоопухолевую активность, зависящую от величины дозы, на день 20. Мыши, подвергнутые лечению препаратом EphA2-ADC при дозе 3 мг/кг один раз в неделю, не обнаруживали рецидива опухоли вплоть дня 59.
Доцетаксел при дозе 15 мг/кг один раз в неделю (TV=419 mm3, TGI=101,8%, p<0,001) проявлял значительную противоопухолевую активность, но вызывал очень большие потери массы тела у животных.
- 132 047678
После прекращения лечения, мыши обнаруживали очевидный рецидив опухоли. Лечение препаратом BCY6136 при дозе 1,5 мг/кг один раз в неделю со дня 42 давало хороший результат по регрессу опухоли у этих мышей.
Исследование 9.
Испытание in vivo эффективности BCY6033, BCY6136 и BCY6082 при лечении ксенотрансплантата NCI-H1975 у бестимусных мышей линии Balb/c (a) Цель исследования.
Целью исследования являлась оценка in vivo противоопухолевой активности BCY6033, BCY6136 и BCY6082 при лечении ксенотрансплантата NCI-H1975 у бестимусных мышей линии Balb/c.
(b) Дизайн эксперимента.________________________________________________________
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Дозируемый объем (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | 3 | - | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
2 | BCY6033 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
3 | BCY6033 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
4 | BCY6033 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
5 | BCY6136 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
6 | BCY6136 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
7 | BCY6136 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
8 | BCY6082 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
9 | BCY6082 | 3 | 5 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Культивирование клеток.
Для инокуляции опухоли, собирали клетки, находящиеся в фазе экспоненциального роста, и подсчитывали их.
(ii) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность опухолевые клетки NCI-H1975 (10 x 106) в 0,2 мл PBS. Когда средний объем опухоли достигал 149 мм3, 36 животных рандомизировали. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в следующей таблице дизайна эксперимента.
(iii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.____________________________
Лечение | Доза (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | 50 мМ ацетат, 10% сахароза pH 5 | |
BCY6033 | 1 | Растворить 6,71 мг BCY6033 в 6,710 мл буфера для приготовления |
- 133 047678
о,з | Разбавить 270 мкл 1 мг/мл BCY6033 с помощью 630 мкл буфера для приготовления | |
0,2 | Разбавить 180 мкл 1 мг/мл BCY6033 с помощью 720 мкл буфера для приготовления | |
0,1 | Разбавить 90 мкл 1 мг/мл BCY6033 с помощью 810 мкл буфера для приготовления | |
BCY6136 | 1 | Растворить 3,79 мг BCY6136 в 3,695 мл буфера для приготовления |
о,з | Разбавить 270 мкл 1 мг/мл BCY6136 с помощью 630 мкл буфера для приготовления | |
0,2 | Разбавить 180 мкл 1 мг/мл BCY6136 с помощью 720 мкл буфера для приготовления | |
0,1 | Разбавить 90 мкл 1 мг/мл BCY6136 с помощью 810 мкл буфера для приготовления | |
BCY6082 | 1 | Взвесить и растворить 4,30 мг BCY6082 в 4,162 мл буфера для приготовления |
0,5 | Разбавить 450 мкл 1 мг/мл BCY6082 с помощью 450 мкл буфера для приготовления | |
0,2 | Разбавить 180 мкл 1 мг/мл BCY6082 с помощью 720 мкл буфера для приготовления |
(iv) Сбор образцов.
На PG-D23, фиксировали формалином и заливали парафином (FFPE) опухоли группы 1.
На PG-D44, фиксировали формалином и заливали парафином (FFPE) опухоли группы 2 и 5.
В конце исследования, фиксировали формалином и заливали парафином (FFPE) опухоли группы 6.
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и рост опухоли представлены на фиг. 11-13.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самцов бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат NCI-H1975, приведен в табл. 25-29.
- 134 047678
Таблица 25
Объем остаточной опухоли (PG-D0-PG-D17)
Груп | Лечени | Дни после начала лечения | |||||||
па | е | 0 | 2 | 4 | 7 | 9 | И | 14 | 17 |
1 | Плацеб о, один раз в неделю | 148±4 | 195±1 1 | 297±3 3 | 466±6 4 | 732±10 7 | 1028±1 92 | 1278±2 52 | 1543±2 98 |
2 | BCY60 33, 1 мг/кг, один раз в неделю | 149±1 0 | 160±4 | 207±1 3 | 259±4 9 | 330±69 | 365±83 | 341±59 | 336±54 |
3 | BCY60 33, 2 мг/кг, один раз в неделю | 149=1=1 0 | 183±1 1 | 276±2 4 | 365±4 2 | 405±20 | 364±19 | 319±32 | 304±33 |
4 | BCY60 33, 3 мг/кг, один раз в неделю | 149±6 | 161±4 | 207±2 6 | 260±2 1 | 270±42 | 243±52 | 187±53 | 131±43 |
5 | BCY61 36, 1 мг/кг, один раз в неделю | 150±6 | 178±2 0 | 232±4 9 | 336±4 3 | 400±24 | 407±42 | 299±11 3 | 261±12 7 |
б | BCY61 36, 2 мг/кг, один | 150±1 4 | 181±2 6 | 237±2 7 | 277±3 6 | 297±37 | 306±55 | 256±53 | 218±49 |
- 135 047678
раз в неделю | |||||||||
7 | BCY61 36, 3 мг/кг, один раз в неделю | 148±9 | 168±1 0 | 231±6 | 365±1 6 | 390±13 | 423±42 | 319±26 | 228±16 |
8 | BCY60 82, 2 мг/кг, один раз в неделю | 148±5 | 157±4 | 223±1 9 | 370±8 4 | 447±10 2 | 658±18 8 | 906±33 2 | 1123±4 10 |
9 | BCY60 82, 5 мг/кг, один раз в неделю | 148±6 | 176±1 2 | 235±1 9 | 378±5 9 | 436±68 | 510±82 | 484±78 | 491±10 3 |
Таблица 26
Объем остаточной опухоли (PG-D18-PG-D35)
Груп па | Лечен не | Дни после начала лечения | |||||||
18 | 21 | 23 | 25 | 28 | 30 | 33 | 35 | ||
1 | Плаце бо, один раз в недел ю | 1864±3 95 | 2371± 470 | — | — | — | — | — | — |
2 | BCY6 033, 1 мг/кг, один | 278±71 | 306±8 1 | 343±8 6 | 366±8 9 | 466±1 15 | 481±1 12 | 619±1 70 | 780±2 36 |
- 136 047678
раз в недел ю | |||||||||
3 | BCY6 033, 2 мг/кг, один раз в недел ю | 172±25 | 95±12 | 61±6 | 39±4 | 13=1=1 | 12±1 | 6±3 | 6±3 |
4 | BCY6 033, 3 мг/кг, один раз в недел ю | 75±15 | 29±4 | 20±6 | 13±2 | 6±0 | 4±0 | 1±0 | 2±1 |
5 | BCY6 136, 1 мг/кг, один раз в недел ю | 215±11 3 | 205±1 17 | 197±1 13 | 200±1 05 | 202±1 12 | 202±1 17 | 230±1 42 | 241±1 27 |
6 | BCY6 136, 2 мг/кг, один раз в | 149±31 | 99±30 | 69±22 | 42±13 | 30±10 | 16±8 | 20±9 | 4±2 |
- 137 047678
недел ю | |||||||||
7 | BCY6 136, 3 мг/кг, один раз в недел ю | 149±17 | 94±30 | 50±15 | 41±21 | 21±8 | 6±6 | 10±6 | 3±1 |
8 | BCY6 082, 2 мг/кг, один раз в недел ю | 1199±4 08 | 1528± 604 | 1978± 792 | 2499± 931 | - | - | - | - |
9 | BCY6 082, 5 мг/кг, один раз в недел ю | 471±14 | 390±1 | 368±1 22 | 295±1 02 | 227±8 6 | - | - | - |
Таблица 27
Объем остаточной опухоли (PG-D37-PG-D53)
Групп а | Лечение | Дни после начала лечения | |||||||
37 | 39 | 42 | 44 | 46 | 49 | 51 | 53 | ||
2 | BCY603 3, 1 мг/кг, один раз в неделю | 877±188 | 945±145 | 1258±17 3 | - | - | - | - | - |
- 138 047678
3 | BCY603 2 мг/кг, один раз в неделю | 3±1 | НО | НО | НО | 1±0 | НО | НО | но |
4 | BCY603 3, 3 мг/кг, один раз в неделю | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | НО | 0±0 | но | но |
5 | BCY613 6, 1 мг/кг, один раз в неделю | 277±149 | 294±159 | 35Н188 | - | - | - | - | - |
6 | BCY613 6, 2 мг/кг, один раз в неделю | 7±4 | 2±1 | НО | 3±1 | 2±1 | 3±2 | 6±3 | 14± 10 |
7 | BCY613 6, 3 мг/кг, один раз в неделю | 3±3 | 2±1 | НО | 0±0 | 0±0 | 0±0 | но | но |
Таблица 28
Объем остаточной опухоли (PG-D56-PG-D74)
Группа | Лечение | 56 | Дни после начала лечения | 74 | ||||||
58 | 60 | 63 | 65 | 67 | 70 | 72 | ||||
BCY6033 | ||||||||||
3 | 2 мг/кг, один раз в неделю BCY6033 | НО | НО | но | но | НО | 2±1 | 4±3 | 7±6 | - |
4 | 3 мг/кг, один раз в неделю | НО | НО | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | - |
BCY6136 | ||||||||||
6 | 2 мг/кг, один раз в неделю | 16±1 1 | 27± 18 | 34±2 3 | 45±3 1 | 63±4 0 | 7Н4 7 | 95±7 0 | ИН 73 | 122± 75 |
BCY6136 | ||||||||||
7 | 3 мг/кг, один раз в неделю | НО | НО | но | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | - |
- 139 047678
Таблица 29
Объем остаточной опухоли (PG-D77~PG-D98)
Групп а | Лечение | Дни после начала лечения | ||||||
77 | 81 | 84 | 88 | 91 | 95 | 98 | ||
6 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 208±1 12 | 337±1 23 | 501±172 | 626±1 82 | 856±2 45 | 1035±16 9 | 1266±39 |
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования опухоли для BCY6033, BCY6136 и BCY6082 в ксенотрансплантатной модели NCI-H1975 рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 21 после начала лечения.
Таблица 30
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TG1 (%) | Р-величина |
1 2 | Плацебо, один раз в неделю BCY6033, 1 мг/кг, один раз в неделю | 237Н470 306±81 | 12,9 | 92,9 | р<0,001 |
3 | BCY6033, 2 мг/кг, один раз в неделю | 95±12 | 4,0 | 102,5 | р<0,001 |
4 | BCY6033, 3 мг/кг, один раз в неделю | 29±4 | 1,2 | 105,4 | р<0,001 |
5 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 205±117 | 8,6 | 97,5 | р<0,001 |
6 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 99±30 | 4,2 | 102,3 | р<0,001 |
7 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 94±30 | 4,0 | 102,4 | р<0,001 |
8 | BCY6082, 2 мг/кг, один раз в неделю | 1528±604 | 64,4 | 37,9 | р>0,05 |
9 | BCY6082, 5 мг/кг, один раз в неделю | 390±133 | 16,4 | 89,1 | р<0,001 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6033, BCY6136 и BCY6082 в ксенотрансплантатной модели NCI-H1975. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергаемых лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 11-13 и в табл. 25-30.
Средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 2371 мм3 на день 21. Препарат BCY6033 при дозе 1 мг/кг (TV=306 mm3, TGI=92,9%, p<0,001), при дозе 2 мг/кг (TV=95 mm3, TGI=102,5%, p<0,001) и дозе 3 мг/кг (TV=29 mm3, TGI=105,4%, p<0,001) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность. Препарат BCY6033 при дозе 2 мг/кг и при дозе 3 мг/кг уничтожал опухоли
- 140 047678 или вызывал регресс опухоли до малого размера, лечение приостанавливали со дня 35, и опухоли не обнаруживали очевидного возобновления роста в течение следующих 5-6 недель постоянного наблюдения.
Препарат BCY6136 при дозе 1 мг/кг (TV=205 mm(i) * 3, TGI=97,5%, p<0,001), при дозе 2 мг/кг (TV=99 mm3, TGI=102,3%, p<0,001) и при дозе 3 мг/кг (TV=94 mm3, TGI=102,4%, p<0,001) проявлял высокую противоопухолевую активность. BCY6136 при дозе 2 мг/кг и дозе 3 мг/кг уничтожал опухоли или вызывал регресс опухоли до малого размера. Лечение приостанавливали со дня 35, и опухоли в группе с дозой 3 мг/кг не обнаруживали очевидного возобновления роста в течение следующих 5-6 недель постоянного наблюдения, однако опухоли в группе с дозой 2 мг/кг обнаруживали очевидное возобновление роста, и возобновление дозирования не приводило к значительному ингибированию опухоли.
Препарат BCY6082 при дозе 2 мг/кг (TV=1528 mm3, TGI=37,9%, p>0,05) не проявлял очевидной противоопухолевой активности, препарат BCY6082 при дозе 5 мг/кг (TV=390 мм3, TGI=89,1%, p<0,001) проявлял значительную противоопухолевую активность.
В этом исследовании, у одной мыши, подвергнутой лечению препаратом BCY6033 при дозе 3 мг/кг, в процессе проведения контроля была обнаружена потеря массы тела более 15%, у других мышей масса тела практически не изменялась.
Исследование 10. Исследование in vivo эффективности BCY6136 в модели LU-01-0251 PDX на бестимусных мышах линии Balb/c.
(a) Цель исследования.
Целью изучения является оценка in vivo противоопухолевой активности BCY6136 в модели LU-01-
(i) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность фрагмент опухоли LU-01-0251 (~30 мм3). Для исследования эффективности, лечение начинали, когда средний объем опухоли достигал 174 мм3. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в следующей таблице дизайна эксперимента.
(ii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.
- 141 047678
Испытуемый препарат | Концентрация (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | — | 50 мМ ацетат, 10% сахароза pH 5 |
BCY6136 | о,з | Растворить 6,11 мг BCY6136 в 20 мл ацетатного буфера1 |
0,2 | Разбавить 940 мкл исходного раствора 0,3 мг/мл BCY6136 с помощью 470 мкл ацетатного буфера | |
0,1 | Разбавить 470 мкл исходного раствора 0,3 мг/мл BCY6136 с помощью 940 мкл ацетатного буфера | |
ADC | о,з | Разбавить 43 мкл исходного раствора 10,47 мг/мл ADC с помощью 1457 мкл буфера для ADC2 |
'Ацетатный буфер: 50 мМ ацетат 10% сахарозы pH 5 2Буфер для ADC: 20 мМ гистидин pH 5,5 (d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и кривая роста опухоли представлена на фиг. 14.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли на день 28 после начала лечения у самок бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат LU-01-0251, приведен в табл. 31.
Таблица 31
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени
День | Группа 1 | Группа 2 | Группа 3 | Г руппа 4 | Группа 5 |
Плацебо | BCY6136 1 мг/кг, один раз в неделю | BCY6136 2 мг/кг, один раз в неделю | BCY6136 3 мг/кг, один раз в неделю | ADC, 3 мг/кг, один раз в неделю | |
0 | 174±17 | 175±15 | 174±17 | 175±14 | 174±16 |
3 | 264±33 | 230±29 | 205±21 | 187±19 | 227±12 |
7 | 403±68 | 281±55 | 154±21 | 118=1=13 | 239±42 |
10 | 562±83 | 370±104 | 111±19 | 72±12 | 241±46 |
14 | 777±163 | 362±104 | 62±17 | 30±5 | 191±47 |
17 | 1021±246 | 437±136 | 46±13 | 17±3 | 139±39 |
21 | 1472±342 | 526±167 | 30±18 | 4±3 | 101±31 |
24 | 1790±417 | 491±132 | 32±24 | 1±1 | 70±23 |
28 | 2208±512 | 499±128 | 32±30 | 0±0 | 39±14 |
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования роста опухоли для BCY6136 и ADC в модели LU-01-0251 PDX рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 28 после начала лечения.
- 142 047678
Таблица 32
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGI (%) | Р-величина |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 2208±512 | - | - | - |
2 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 499±128 | 22,6 | 84,0 | Р<0,001 |
3 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 32±30 | 1,4 | 107,0 | Р<0,001 |
4 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 0±0 | 0,0 | 108,6 | Р<0,001 |
5 | ADC, 3 мг/кг, один раз в | 39±14 | 1,8 | 106,6 | р<0,001 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6136 и ADC в модели LU-01025 1 PDX. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергаемых лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 14 и в табл. 31 и 32.
В этом исследовании, средний размер опухоли у мышей, которым вводили плацебо, достигал 2208 мм3 на день 28 после начала лечения. Препарат BCY6136 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=499 mm3, TGI=84,0%, p<0,001), при дозе 2 мг/кг, один раз в неделю (TV=32 мм3, TGI=107,0%, p<0,001) и при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=0 мм3, TGI=108,6%, p<0,001) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность. Препарат ADC при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=39 mm3, TGI=106,6%, p<0,001) проявлял значительную противоопухолевую активность.
Исследование 11. Исследование in vivo эффективности BCY6136 в модели LU-01-0251 PDX на бестимусных мышах линии Balb/c.
(a) Цель исследования.
Целью изучения является оценка in vivo противоопухолевой активности BCY6136 в модели LU-010251 PDX на бестимусных мышах линии Balb/c.
(b) Дизайн эксперимента.______ _______________________________________
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Дозируемый объем (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | 5 | - | 10 | внутривенно | один раз в неделю х21 неделя |
2 | BCY6136 | 5 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю х28 недель |
За | BCY6136 | 5 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю х 70 недель |
4Ь | BCY6136 | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю х 56 недель |
5 е | ADC | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю х 70 недель |
a Схему дозирования сохраняли от дня 0 до дня 70 для всех мышей в этой группе, затем мышь 3-2 и мышь 3-4 подвергали дополнительному дозированию BCY6136 в дозе 3 мг/кг один раз в неделю со дня 77, в то время как лечение других мышей из группы 3 временно прекращали.
b Схему дозирования сохраняли от дня 0 до дня 56 для всех мышей в этой группе.
c Схему дозирования сохраняли от дня 0 до дня 70 для всех мышей в этой группе.
(c) Методы и методики эксперимента (i) Инокуляция опухоли
- 143 047678
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность фрагмент опухоли LU-01-0251 (~30 мм3). Для исследования эффективности, лечение начинали, когда средний объем опухоли достигал 960 мм3. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
(ii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.____________________________
Испытуемый препарат | Концентрация (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | - | 25 мМ гистидин 10% сахароза pH 7 |
BCY6136 | 0,3 | 0,3 мг/мл BCY6136 получали как описано выше в исследовании 10 |
0,2 | Разбавить 940 мкл исходного раствора 0,3 мг/мл BCY6136 с помощью 470 мкл гистидинового буфера1 | |
0,1 | Разбавить 470 мкл исходного раствора 0,3 мг/мл BCY6136 с помощью 940 мкл гистидинового буфера | |
ADC | о,з | Разбавить 43 мкл исходного раствора 10,47 мг/мл ADC с помощью 1457 мкл буфера для ADC2 |
'Гистидиновый буфер: 25 мМ гистидин 10% сахароза pH 7 2 Буфер для ADC: 20 мМ гистидин pH 5,5 (iii) Сбор образцов.
Опухоль мыши #3-2 собирали для фиксирования формалином и заливки парафином (FFPE) на день 94. Опухоли мышей #5-2 и 5-3 собирали и помещали в один блок для фиксирования формалином и заливки парафином (FFPE) на день 140.
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и кривая роста опухоли представлена на фиг. 15.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в период времени от дня 0 до дня 28 после начала лечения у самок бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат LU-01-0251, приведен в табл. 33.
Таблица 33
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени
День | Группа 1 | Г руппа 2 | Группа 3 | Группа 4 | Группа 5 |
Плацебо | BCY6136 1 мг/кг, один раз в неделю | BCY6136 | BCY6136 3 мг/кг, один раз в неделю | ADC, 3 мг/кг, один раз в неделю | |
2 мг/кг, один раз в неделю | |||||
0 | 962±102 | 963±97 | 962±137 | 960±103 | 959±124 |
3 | 1176±108 | 1003=1=121 | 973±105 | 989±128 | 1043±158 |
7 | 1351=1=142 | 1056=1=151 | 873±125 | 890±98 | 1100=1=156 |
10 | 159Н179 | 1122±139 | 722±157 | 674±96 | 1172±188 |
14 | 195Н225 | 1417=1=191 | 5ОЗ±151 | 342±64 | 1228±174 |
17 | 230Н344 | 1672±262 | 398±160 | 216±43 | 1143=1=186 |
21 | 1794±328 | 307±169 | 94±26 | 996±187 | |
24 | 1867±408 | 261±168 | 62±14 | 867±178 | |
28 | 2120±483 | 217±167 | 45±16 | 713=1=178 |
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования роста опухоли для BCY6136 и ADC в модели LU-01-0251 PDX рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 17 после начала лечения.
- 144 047678
Таблица 34
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGT (%) | Р-величина |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 2301±344 | - | - | - |
2 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 1672±262 | 72,7 | 47,0 | р>0,05 |
3 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 398±160 | 17,3 | 142,1 | Р<0,001 |
4 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 216±43 | 9,4 | 155,6 | ΡΟ,ΟΟΙ |
5 | ADC, 3 мг/кг, один раз в неделю | 1143±186 | 49,7 | 86,3 | ΡΟ,ΟΙ |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6136 и ADC в модели LU-01025 1 PDX. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергаемых лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 15 и в табл. 33 и 34.
В этом исследовании, лечение начинали, когда средний объем опухоли достигал 960 мм3. На день 17 после начала лечения, средний объем опухоли мышей, подвергаемых лечению с помощью плацебо, достигал 2301 мм3. Препарат BCY6136 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=1672 мм3, TGI=47,0%, p>0,05) не проявлял очевидной противоопухолевой активности; препарат BCY6136 при дозе 2 мг/кг один раз в неделю (TV=398 mm3, TGI=142,1%, p<0,001) и при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=216 mm3, TGI=155,6%, p<0,001) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность на день 17.
После лечения в течение 70 дней препаратом BCY6136 при дозе 2 мг/кг один раз в неделю, у 3 из 5 этих мышей обнаруживали полный регресс опухоли, у оставшихся 2 мышей обнаруживали очевидный рецидив опухоли от дня 42 до дня 77. При последующем проведении лечения двух рецидивов опухолей препаратом BCY6136 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю со дня 7, у одной из опухолей достигался очевидный регресс опухоли, в то время как другая опухоль проявляла резистентность к лечению.
После лечения в течение 56 дней препаратом BCY6136 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю, у всех мышей в этой группе обнаруживали полный регресс опухоли.
Препарат ADC при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=1143 мм3, TGI=86,3%, p<0,01) проявлял очевидную противоопухолевую активность на день 17, после проведения лечения в течение еще 53 дней, у этих мышей обнаруживали дополнительный, но не полный регресс опухоли.
В этом исследовании, у некоторых мышей обнаруживалась резкая потеря массы тела, которая может быть связана с длительным периодом кормления иммунодефицитных мышей.
Исследование 12. Исследование in vivo эффективности BCY6033, BCY6136, BCY6082 и BCY6031 в модели LU-01-0046 NSCLC PDX у бестимусных мышей линии Balb/c.
(a) Цель исследования.
Целью исследования является оценка in vivo противоопухолевой эффективности BCY6033, BCY6136, BCY6082 и BCY6031 в обширных опухолях LU-01-0046 PDX у бестимусных мышей линии
- 145 047678
4 | BCY6033 | 5 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
5 | BCY6033 | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
6 | BCY6136 | 5 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
7 | BCY6136 | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
8 | ADC | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
9 | BCY6031 | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность фрагмент опухоли LU-01-0046 (~30 мм3). Лечение начинали, когда средний объем опухоли достигал 955 мм3 для исследования препаратов BT17BDC и 1039 мм3 для исследования препаратов BCY. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
(ii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.___________________________
Испытуемый препарат | Концентрация (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | - | 50 мМ ацетат 10% сахароза pH 5 |
BCY6033 | 0,1 | Разбавить 150 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6033 с помощью 1350 мкл ацетатного буфера1 |
0,3 | Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6033 с помощью 1050 мкл ацетатного буфера | |
BCY6136 | 0,1 | Разбавить 150 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 1350 мкл ацетатного буфера |
о,з | Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 1050 мкл ацетатного буфера | |
BCY6082 | 0,1 | Разбавить 150 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6082 с помощью 1350 мкл ацетатного буфера |
0,3 | Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6082 с помощью 1050 мкл ацетатного буфера | |
BCY6031 | 0,3 | Растворить 5,72 mtBCY6031 в 5,6 мл ацетатного буфера с получением исходного раствора 1 мг/мл. Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6031 с помощью 1050 мкл ацетатного буфера |
ADC | 0,3 | Разбавить 43 мкл исходного раствора 10,47 мг/мл ADC с помощью 1457 мкл буфера2 |
1 Ацетатный буфер: 50 мМ ацетат 10% сахароза pH 5 2 Растворить 0,419 г гидрохлорида гистидина в 100 мл воды, использовать IM НС1 для доведения величины pH 5,5 |
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и кривая роста опухоли представлена на фиг. 16.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самок бестимусных мышей линии Balb/c, несущих LU-01-0046, представлен в табл. 35.
- 146 047678
Таблица 35
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени (кросс-секционное исследование бициклических препаратов (BCY))
- 147 047678
Примечание: объем остаточной опухоли не обнаруживали после дня 22 для групп 3, 5, 7 и 9.
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования роста опухоли для испытуемых препаратов в модели LU-01-0046 PDX рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 22 и день 28, соответственно, для двух кросссекционных исследований после начала лечения.
Таблица 36
Анализ ингибирования роста опухоли (кросс-секционные исследования BCYs на день 22)
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGI (%) | Р-величина |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 6186±596* | - | - | - |
2 | BCY6082, 1 мг/кг, один раз в неделю | 5805±428* | 93,8 | 7,5 | р>0,05 |
3 | BCY6082, 3 мг/кг, один раз в неделю | 1999±425 | 32,3 | 81,2 | р<0,01 |
4 | BCY6033, 1 мг/кг, один раз в неделю | 4384±881* | 70,9 | 34,8 | р>0,05 |
5 | BCY6033, 3 мг/кг, один раз в неделю | 88±76 | 1,4 | 118,6 | Р<0,001 |
6 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 4564±981* | 73,8 | 31,4 | р>0,05 |
7 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 233±187 | 3,8 | 115,6 | р<0,001 |
8 | ADC, 3 мг/кг, один раз в неделю | 5446±1250* | 88,0 | 14,2 | р>0,05 |
9 | BCY6031, 3 мг/кг, один раз в неделю | 515±323 | 8,3 | 110,2 | р<0,001 |
- 148 047678 a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
* В некоторых группах исследования прекращали до дня 22, и объем опухоли вычисляли путем ис пользования уравнения экспоненциального роста, представленного ниже:
Группа плацебо: Y=995,4 х exp(0,1134 х X).
Группа BCY6082, 1мг/кг: Y=939,1 х exp(0,1128 х X).
Группа BCY6033, 1мг/кг: Y=846,6 х exp(0,0945 х х).
Группа BCY6136, 1мг/кг: Y=855,0 х exp(0,0974 х X).
Группа ADC, 3мг/кг: Y=757,4 х exp(0,1312 х X).
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании проводили оценку терапевтической эффективности испытуемых препаратов в отношении обширных опухолей LU-01-0046. Измеренные объемы опухолей для всех подвергаемых лечению групп в различные моменты времени представлены на фиг. 16 и в табл. 35 и 36.
В этом исследовании BCYs, средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, составлял 6186 мм3 на день 22. Препараты BCY6082, BCY6033, BCY6136 при дозе 1 мг/кг и препарат ADC при дозе 3 мг/кг не проявляли очевидной противоопухолевой активности, когда размер опухоли перед началом лечения составлял 1000 мм3.
Препарат BCY6082 (TV=1999 mm3, TGI=81,2%, p<0,01), препарат BCY6033 (TV=88 мм3, TGI=118,6%, p<0,001), препарат BCY6136 (TV=233 mm3, TGI=115,6%, p<0,001) и препарат BCY6031 (TV=115 mm3, TGI=110,2%, p<0,001) при дозе 3 мг/кг проявляли значительную противоопухолевую активность. Среди них, применение BCY6033 и BCY6136 приводило к полному уничтожению 2/5 и 4/5 опухолей.
Исследование 13. In vivo эффективность BCY6136 в модели бестимусных мышей линии Balb/c, несущих LU-01-0046 NSCLC PDX.
(a) Цель исследования.
Целью исследования являлась оценка in vivo терапевтической эффективности BCY6136 в модели бестимусных мышей линии Balb/c, несущих LU-01-0046 NSCLC PDX.
(b) Дизайн эксперимента.____________________________________________________
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | 5 | - | внутривенно | один раз в неделю х 2 недели |
2 | BCY6136 | 5 | 1 | внутривенно | один раз в неделю х 3 недели |
3 | BCY6136 | 5 | 2 | внутривенно | один раз в неделю х 4 недели |
4 | BCY6136 | 5 | 3 | внутривенно | один раз в неделю х 4 недели |
5 | ADC | 5 | 3 | внутривенно | один раз в неделю х 3 недели |
6 | ADC | 5 | 5 | внутривенно | один раз в неделю х 3 недели |
Примечание: исследование в группах прекращали, когда средний объем опухоли превышал 2000 мм3, и опухоли собирали для фиксирования формалином и заливки парафином (FFPE): группа 1 на PG- 149 047678
D14, группа 5 на PG-D18, группа 2 и 6 на PG-D21, и группа 3 и 4 на PG-D31.
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность фрагмент опухоли конкретного типа (~30 мм3). Лечение начинали, когда средний объем опухоли достигал приблизительно 198 мм3. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
(ii) Рецептура приготовления испытуемого препарата. _______________________
Группа | Соединения | Доза (мг/кг) | Концентрация (мг/мл) | Рецептура |
1 | Плацебо | - | - | 50 мМ ацетат, 10% сахароза pH 5 (без DMSO) |
2 | BCY6136 | 1 | ОД | Растворить 10,93 mtBCY6136 в 10,766 мл среды, используя ультразвуковую обработку, для получения исходного раствора 1 мг/мл BCY6136. Разбавить 150 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 1350 мкл среды |
3 | BCY6136 | 2 | 0,2 | Разбавить 300 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 1200 мкл среды |
4 | BCY6136 | 3 | о,з | исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 1050 мкл среды |
Буфер 2: растворить 0,419 г гидрохлорида гистидина в 100 мл воды, использовать 1 М НС1 для доведения величины pH до 5,5 | ||||
5 | ADC | 3 | о,з | Разбавить 43 мкл исходного раствора 10,47 мг/мл ADC с помощью 1457 мкл буфера 2 |
6 | ADC | 5 | 0,5 | Разбавить 71,6 мкл исходного раствора 10,47 мг/мл ADC с помощью 1428,4 мкл буфера 2 |
Примечание: дозируемый препарат обычно является свежеприготовленным.
(iii) Сбор образцов.
Исследования в группах прекращали, когда средний объем опухоли достигал более 2000 мм3, и, после последнего измерения, опухоли собирали для фиксирования формалином и заливки парафином (FFPE): группа 1 на PG-D14, группа 5 на PG-D18, группа 2 и 6 на PG-D21, и группа 3 и 4 на PG-D31.
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и кривая роста опухоли представлена на фиг. 17.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени в модели на самках бестимусных мышей линии Balb/c, несущих LU-01-0046 NSCLC PDX, представлен в табл. 37.
Таблица 37
Объем остаточной опухоли (мм3) в зависимости от времени
Группа | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
Лечение | Плацебо один раз в неделю | BCY6136 1 мг/кг, один раз в неделю | BCY6136 2 мг/кг, один раз в неделю | BCY6136 3 мг/кг, один раз в неделю | ADC 3 мг/кг, один раз в неделю | ADC 5 мг/кг, один раз в неделю |
0 | 201 ±37 | 198 ±39 | 201 ± 40 | 200 ± 46 | 195 ±28 | 195 ±40 |
3 | 441 ± 82 | 310 ± 59 | 283 ± 77 | 155 ± 40 | 418 ±99 | 389 ±68 |
7 | 927±171 | 547 ±88 | 423 ±132 | 74 ± 19 | 643 ± 159 | 596± 116 |
10 | 1546 ±377 | 747±121 | 321±108 | 31 ±8 | 938 ±230 | 882± 134 |
14 | 2307 ± 594 | 1058± 140 | 264 ± 95 | 26 ± И | 1475 ±466 | 1215 ± 193 |
17 | - | 1390 ±205 | 127 ±41 | 26 ± 13 | 2281 ±556 | 1576 ±228 |
21 | - | 2138 ±301 | 118 ± 34 | 64 ±42 | - | 2049 ± 242 |
24 | - | - | 101 ±40 | 99 ±63 | - | - |
28 | - | - | 255 ±140 | 276± 176 | - | - |
31 | - | - | 582 ±346 | 477 ± 283 | - | - |
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
- 150 047678
Степень ингибирования роста опухоли для испытуемых препаратов в модели на бестимусных мышах линии Balb/c, несущих LU-01-0046 PDX, рассчитывали на основе объема опухоли, измеренного на PG-D14.
Таблица 38 _______________Анализ ингибирования роста опухоли ______________
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | т/с (%)ь | TGI (%)с | P-величина при сравнении с плацебо |
1 | Плацебо | 2307 ±594 | - | - | - |
один раз в неделю | |||||
2 | BCY6136 1 мг/кг, один раз в неделю | 1058±140 | 45,9 | 59,1 | р<0,05 |
3 | BCY6136 2 мг/кг, один раз в неделю | 264 ± 95 | 11,4 | 97,0 | р<0,001 |
4 | BCY6136 3 мг/кг, один раз в неделю | 26 ± И | 1,1 | 108,3 | р<0,001 |
5 | ADC 3 мг/кг, один раз в неделю | 1475 ± 466 | 63,9 | 39,2 | р>0,05 |
6 | ADC 5 мг/кг, один раз в неделю | 1215± 193 | 52,7 | 51,6 | р>0,05 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывали путем деления среднего объема опухоли в группе для подвергавшейся лечению группы на средний объем опухоли в группе для контрольной группы (T/C).
c TGI рассчитывали для каждой группы, используя формулу: TGI (%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]x100.
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В настоящем исследовании оценивали терапевтическую эффективность испытуемых препаратов в модели LU-01-0046 PDX. Измеренные объемы опухолей во всех подвергавшихся лечению группах в различные моменты времени представлены на фиг. 17 и в табл. 37 и 38.
Средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 2307 мм3 на PG-D14. Препарат BCY6136 при дозе 1 мг/кг (TV=1058 mm3, TGI=59,1%, p<0,05), при дозе 2 мг/кг (TV=264 mm3, TGI=97,0%, p<0,001) и при дозе 3 мг/кг (TV=26 mm3, TGI=108,3%, p<0,001) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность. ADC при дозе 3 мг/кг и 5 мг/кг не проявлял явной противоопухолевой активности (p>0,05).
В этом исследовании, масса тела животных во всех группах сохранялась практически постоянной.
Исследование 14. Исследование in vivo эффективности BCY6033, BCY6136, BCY6082, BCY6173, BCY6175 и BCY6031 в модели LU-01-0046 NSCLC PDX на бестимусных мышах линии Balb/c (a) Цель исследования.
Целью исследования является оценка in vivo противоопухолевой эффективности испытуемых препаратов в модели LU-01-0046 NSCLC PDX на бестимусных мышах линии Balb/c (b) Дизайн эксперимента.
- 151 047678
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Объем дозирования (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
Часть 1 | ||||||
1 | Плацебо | 5 | — | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
2 | BCY6033 | 5 | 1/2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
3 | BCY6033 | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
4 | BCY6136 | 5 | 1/2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
5 | BCY6136 | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
6 | BCY6082 | 5 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
7 | BCY6082 | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
Часть 2 | ||||||
8 | Плацебо | 5 | — | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
9 | BCY6173 | 5 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
10 | BCY6173 | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
11 | BCY6175 | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
12 | BCY6031 | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность фрагмент опухоли LU-01-0046 (~30 мм3). Лечение начинали, когда средний объем опухоли достигал 200 мм3, в случае части 1 исследования, и 192 мм3, в случае части 2 исследования. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
(ii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.
- 152 047678
Test article | Концентрация (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | - | 50 мМ ацетат 10% сахароза pH 5 |
θ,ι 0,3 | Разбавить 150 мкл исходного раствора 1 мг/мл | |
BCY6033 | BCY6033 с помощью 1350 мкл ацетатного буфера1 Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6033 с помощью 1050 мкл ацетатного буфера | |
0,1 0,3 | Разбавить 150 мкл исходного раствора 1 мг/мл | |
BCY6136 | BCY6136 с помощью 1350 мкл ацетатного буфера Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 1050 мкл ацетатного буфера | |
0,1 0,3 | Разбавить 150 мкл исходного раствора 1 мг/мл | |
BCY6082 | BCY6082 с помощью 1350 мкл ацетатного буфера Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6082 с помощью 1050 мкл ацетатного буфера | |
Растворить 3,65 мг BCY6173 в 3,5 мл ацетатного буфера | ||
0,1 | с получением 1 мг/мл исходного раствора. Разбавить | |
BCY6173 | 150 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6173 с помощью 1350 мкл ацетатного буфера | |
0,3 | Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6173 с помощью 1050 мкл ацетатного буфера | |
Растворить 3,02 мг BCY6175 в 2,9 мл ацетатного буфера | ||
BCY6175 | 0,3 | с получением 1 мг/мл исходного раствора. Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6175 с |
помощью 1050 мкл ацетатного буфера | ||
Растворить 5,72 мг BCY6031 в 5,6 мл ацетатного буфера | ||
BCY6031 | 0,3 | с получением 1 мг/мл исходного раствора. Разбавить 450 мкл 1 мг/мл BCY6031 с помощью 1050 мкл |
ацетатного буфера |
1. Ацетатный буфер: 50 мМ ацетат 10% сахароза pH 5 (d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и кривая роста опухоли представлена на фиг. 18-22.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли на день 21 после начала лечения у самок бестимусных мыши линии Balb/c, несущих LU-01-0046, представлен в табл. 39 и 40.
Таблица 39
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени (часть 1)
Груп па | Лечение | Дни после начала лечения | ||||||
0 | 3 | 6 | 10 | 14 | 17 | 21 | ||
1 | Плацебо, один раз в неделю | 202±2 6 | 328±4 8 | 536±6 8 | 953±10 7 | 1386±97 | 1833±13 2 | 2551±24 2 |
2 | BCY6033, 1 мг/кг, один раз в неделю | 201±2 3 | 285±4 7 | 449±8 7 | 623±11 2 | 891±196 | 967±228 | 1285±23 4 |
3 | BCY6033, | 201 ±2 6 | 187±4 3 | 91±34 | 37±14 | 3±3 | 0±0 | 0±0 |
- 153 047678
3 мг/кг, один раз в неделю | ||||||||
4 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 200±3 | 293±5 6 | 426±9 1 | 682±15 1 | 964±194 | 976±258 | 1285±23 4 |
5 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 201±3 3 | 194±3 1 | 135±2 7 | 52±18 | 13±9 | 4±4 | 0±0 |
6 | BCY6082, 1 мг/кг, один раз в неделю | 201±2 9 | 295±4 | 466±6 5 | 877±80 | 1201=1=10 6 | 1502±10 8 | 1826±22 4 |
7 | BCY6082, 3 мг/кг, один раз в неделю | 201±3 4 | 235±3 6 | 310±4 4 | 398±65 | 634±136 | 729±184 | 1042±29 0 |
Таблица 40
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени (часть 2)
Групп а | Лечение | Дни после начала лечения | ||||||
0 | 3 | 7 | 10 | 14 | 17 | 21 | ||
8 | Плацебо один раз в неделю | 192±3 0 | 311±8 | 562±14 6 | 830±23 0 | 1320±44 4 | 1652±52 8 | 2342±65 1 |
9 10 И 12 | BCY617 3, 1 мг/кг, один раз в неделю BCY617 3 мг/кг, один раз в неделю BCY617 5, 3 мг/кг, один раз в неделю BCY603 1, 3 мг/кг, один раз в неделю | 191±3 3 192±3 7 192±4 2 191±3 8 | 318±5 8 259±5 1 186±5 7 207±4 6 | 553±88 400±53 92±38 387±70 | 817±16 5 455±28 19±11 355±11 0 | 1314±27 6 636±92 0±0 544±159 | 1546±27 6 646±138 0±0 643±185 | 2151±26 2 890±260 0±0 874±281 |
- 154 047678 (iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования роста опухоли для испытуемых препаратов в модели LU-01-0046 PDX рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 21 после начала лечения.
Таблица 41
Анализ ингибирования роста опухоли (часть 1)
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGI (%) | Р-величина |
1 2 4 | Плацебо, один раз в неделю BCY6033, 1 мг/кг, один раз в неделю BCY6033, 3 мг/кг, один раз в неделю BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 2551±242 1285±234 0±0 1285±234 | 50,4 0,0 50,4 | 53,9 108,6 53,9 | р<0,001 р<0,001 р<0,001 |
5 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 0±0 | 0,0 | 108,5 | р<0,001 |
6 | BCY6082, 1 мг/кг, один раз в неделю | 1826±224 | 71,6 | 30,8 | р<0,05 |
7 | BCY6082, 3 мг/кг, один раз в неделю | 1042±290 | 40,8 | 64,2 | р<0,001 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM); b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
Таблица 42
Анализ ингибирования роста опухоли (часть 2)
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGI (%) | Р-величина |
8 | Плацебо, один раз в неделю | 2342±651 | - | - | - |
9 | BCY6173, 1 мг/кг, один раз в неделю | 2151±262 | 91,8 | 8,9 | р>0,05 |
10 | BCY6173, 3 мг/кг, один раз в неделю | 890±260 | 38,0 | 67,5 | р<0,05 |
И | BCY6175, 3 мг/кг, один раз в неделю | 0±0 | о,о | 108,9 | р< 0,001 |
12 | BCY6031, 3 мг/кг, один раз в неделю | 874±281 | 37,3 | 68,2 | р<0,05 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
- 155 047678 (e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность испытуемых препаратов в модели LU-01-0046 PDX. Измеренные объемы опухолей для всех подвергаемых лечению групп в различные моменты времени представлены на фиг. 18-22 и в табл. 39-42.
В части 1 исследования, средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 2551 мм3 на день 21 после начала лечения.
Препарат BCY6033 при дозе 1/2 мг/кг один раз в неделю (TV=1285 mm3, TGI=53,9%, p<0,001) и препарат BCY6136 при дозе 1/2 мг/кг один раз в неделю (TV=1285 mm3, TGI=53,9%, p<0,001) проявлял значительную противоопухолевую активность, но она не приводила к регрессу опухоли. Препарат BCY6033 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=0 мм3, TGI=108,6%, p<0,001) и препарат BCY6136 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=0 мм3, TGI=108,5%, p<0,001) полностью уничтожали опухоли, 1 из 5 опухолей, соответственно, в группах BCY6033 и BCY6136 3 мг/кг обнаруживала возобновление роста после временного прекращения дозирования, и после возобновления дозирования опухоли были резистентны к лечению препаратами BCY6033 или BICY6136. Остальные опухоли в группах дозирования BCY6033 и BCY6136 (4/5 в каждой группе) не обнаруживали возобновления роста после 80 дней временного прекращения дозирования.
Препарат BCY6082 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=1826 mm3, TGI=30,8%, p<0,05) и при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=1042 mm3, TGI=64,2%, p<0,001) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность, но не вызывал регресса опухоли.
В части 2 исследования, средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 2342 мм3 на день 21 после начала лечения. BCY6173 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=2151 mm3, TGI=8,9%, p>0,05) не проявлял противоопухолевой активности. BCY6173 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=890 mm3, TGI=67,5%, p<0,05) проявлял очевидную противоопухолевую активность.
Препарат BCY6175 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=0 mm3, TGI=108,9%, p<0,001) полностью уничтожал 4/5 опухолей на день 14. Препарат BCY6031 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=874 mm3, TGI=68,2%, p<0,05) проявлял очевидную противоопухолевую активность, но не вызывал регресса опухоли.
Исследование 15. Исследование in vivo эффективности BCY6136 в модели LU-01-0412 NSCLC PDX на бестимусных мышах линии Balb/c.
(a) Цель исследования.
Целью исследования является оценка in vivo терапевтической эффективности BCY6136 в модели LU-01-0412 NSCLC PDX на бестимусных мышах линии Balb/c.
(b) Дизайн эксперимента.________________________________________________________
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Дозирую щи й объем (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | 6 | - | 10 | внутривенно | Один раз в неделю, 4 недели |
2 | BCY613 6 | 6 | 1 | 10 | внутривенно | Один раз в неделю, 4 недели |
3 | BCY613 6 | 6 | 3 | 10 | внутривенно | Один раз в неделю, 4 недели |
4 | BCY824 5 | 6 | 3 | 10 | внутривенно | Один раз в неделю, 4 недели |
5 | BCY878 1 | 6 | 3 | 10 | внутривенно | Один раз в неделю, 4 недели |
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность фрагмент опухоли LU-01-0412 (~30 мм3). Животных рандомизировали, когда средний объем опухоли
- 156 047678 достигал 159 мм3. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
(ii) Рецептура приготовления испытуемого препарата. | |||
Испытуемый препарат | Концентрация (мг/мл) | Рецептура | |
Плацебо | - | 25 мМ гистидин 10% сахароза pH 7 | |
BCY6136 | 1 | Растворить 6,06 мг BCY6136 в 5,969 мл 50 мМ ацетат/уксусная кислота pH 5 10% сахароза | |
θ,ι | Разбавить 180 мкл раствора 1 мг/мл ВТ5528 с помощью 1620 мкл 50 мМ ацетат/уксусная кислота pH 5 10% сахароза | ||
о,з | Разбавить 540 мкл раствора 1 мг/мл ВТ5528 с помощью 1260 мкл 50 мМ ацетат/уксусная кислота pH 5 10% сахароза | ||
BCY8245 | 1 | Растворить 4,15 мг порошка BCY8245 в 4,121 мл в буфере для плацебо | |
о,з | Разбавить 540 мкл раствора 1 мг/мл BCY8245 с помощью 1260 мкл буфера для плацебо | ||
BCY8781 | 1 | Растворить 4,08 мг порошка BCY8781 в 80,8 мкл DMSO, затем разбавить до 1 мг/мл с помощью 3958 мкл буфера для плацебо | |
0,3 | Разбавить 540 мкл раствора 1 мг/мл BCY8781 с помощью 1260 мкл буфера для плацебо | ||
(iii) Сбор образцов. |
Собирали плазму мышей, которым вводили плацебо и которым вводили BCY6136, BCY8245 и BCY8781, через 30 мин и через 24 часа после дозирования. Собирали опухоли у мышей, которым вводили плацебо и которым вводили BCY6136, BCY8245 и BCY8781, через 24 часа после дозирования.
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Кривая роста опухоли представлена на фиг. 23.
(ii) Объем остаточной опухоли
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самок бестимусных мышей линии BALB/c, несущих ксенотрансплантат LU-01-0412, представлен в табл. 43.
Таблица 43
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени
Группа 1 | Группа 2 | Группа 3 | Группа 4 | Группа 5 | |
Плацебо | BCY6136 | BCY6136 | BCY8245 | BCY8781 | |
Дни | один раз в | 1 мг/кг, один | 3 мг/кг, один | 3 мг/кг, один | 3 мг/кг, один |
неделю х 4 | раз в неделю х | раз в неделю х | раз в неделю х | раз в неделю х | |
недели | 4 недели | 4 недели | 4 недели | 4 недели | |
0 | 159±11 | 159=1=13 | 159±11 | 159±12 | 159=1=11 |
4 | 255±12 | 214±16 | 197±16 | 168±18 | 176±21 |
7 | 309±20 | 237±16 | 195±16 | 132±10 | 167±13 |
И | 395±31 | 246±19 | 156±18 | 78±4 | 107±15 |
14 | 464±31 | 300±18 | 177±29 | 45±5 | 72±12 |
18 | 521±26 | 369±32 | 210±32 | 21±2 | 44±8 |
21 | 611±33 | 470±46 | 225±32 | 11±1 | 31±6 |
25 | 737±68 | 632±47 | 252±37 | 6±1 | 20±6 |
28 | 788±80 | 664±52 | 299±37 | 2±1 | 14±5 |
32 | 1104±142 | 758±70 | 416±52 | 1±1 | 12±5 |
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования опухоли для BCY6136, BCY8245 и BCY8781 в ксенотрансплантатной модели LU-01-0412 рассчитывали на основе измерений объема опухолей на день 32 после начала лечения.
- 157 047678
Таблица 44
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | т/сь (%) | TGI (%) | Р-величина |
1 | Плацебо, один раз в неделю х 4 недели | 1104±142 | - | - | - |
2 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю х 4 недели | 758±70 | 68,6 | 36,7 | Р<0,05 |
3 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю х 4 недели | 416±52 | 37,6 | 72,9 | Р<0,001 |
4 | BCY8245, 3 мг/кг, один раз в неделю х 4 недели | 1±1 | 0,1 | 116,8 | Р<0,001 |
5 | BCY8781, 3 мг/кг, один раз в неделю х 4 недели | 12±5 | 1,0 | 115,6 | Р<0,001 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6136, BCY8245 и BCY8781 в ксенотрансплантатной модели LU-01-0412. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергавшихся лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 23 и в табл. 43 и 44.
Средний объем опухоли мышей, подвергаемых лечению с помощью плацебо, достигал 1104 мм3 на день 32 после начала лечения. Препарат BCY6136 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю x 4 недели (TV=758 мм3, TGI=36,7%, p<0,05) и при дозе 3 мг/кг один раз в неделю x 4 недели (TV=416 mm3, TGI=72,9%, p<0,001) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность, но его применение не приводило к регрессу опухоли. Препарат BCY8245 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю x 4 недели (TV=1 мм3, TGI=116,8%, p<0,001) и препарат BCY8781 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю x 4 недели (TV=12 mm3, TGI=115,6%, p<0,001) вызывали очевидный регресс опухоли. В том числе, 5 из 6 опухолей, подвергнутых лечению препаратом BCY8245 в дозе 3 мг/кг, и 2 из 6 опухолей, подвергнутых лечению препаратом BCY8781 в дозе 3 мг/кг, были полностью уничтожены на день 32.
В этом исследовании, у животных во всех группах масса тела сохранялась практически постоянной.
Исследование 16. Исследование in vivo эффективности BCY6136 при лечении бестимусных мыши линии Balb/c в модели LU-01-0486 PDX.
(a) Цель исследования.
Целью исследования является оценка in vivo противоопухолевой эффективности BCY6136 в модели LU-01-0486 PDX на бестимусных мышах линии Balb/c.
(b) Дизайн эксперимента._____________________________________________________
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Дозирующий объем (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | 5 | - | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
2 | BCY6136 | 5 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
3 | BCY6136 | 5 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
4 | BCY6136 | 5 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
- 158 047678 (c) Методы и методики эксперимента.
(i) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность фрагмент опухоли LU-01-0486 (~30 мм3). Для исследования эффективности, лечение начинали, когда средний объем опухоли достигал 180 мм3. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
(ii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.
Испытуемый препарат | Концентрация (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | - | 50 мМ ацетат 10% сахароза pH 5 |
BCY6136 | 0,3 0,2 | Раствор 0,3 мг/мл BCY6136 готовили так, как описано в исследовании 10 Разбавить 940 мкл раствора 0,3 мг/мл BCY6136 с помощью 470 мкл ацетатного буфера1 |
0,1 | Разбавить 470 мкл раствора 0,3 мг/мл BCY6136 с помощью 940 мкл ацетатного буфера | |
1 Ацетатный бу( | зер: 50 мМ ацетат 10% сахароза pH 5 |
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и кривая роста опухоли представлена на фиг. 24.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли на день 14 после начала лечения у самок бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат LU-01-0486, приведен в табл. 45.
Таблица 45
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени
Группа | Лечение | Дни после начала лечения | ||||
0 | 3 | 7 | 10 | 14 | ||
1 | Плацебо, один раз в неделю | 179±20 | 232±30 | 358±45 | 450±47 | 651±112 |
2 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 180±23 | 221±20 | 326±34 | 420±34 | 638±71 |
3 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 179±27 | 222±26 | 365±44 | 459±82 | 645±105 |
4 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 180±25 | 209±37 | 304±51 | 348±77 | 449±115 |
(iii ) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования опухоли для BCY6136 в модели LU-01-0486 PDX рассчитывали на основе измерения объема опухоли в день 14 после начала лечения.
- 159 047678
Таблица 46
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGI (%) | Р-величина |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 651±112 | - | - | - |
2 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 638±71 | 98,0 | 3,0 | р>0,05 |
3 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 645±105 | 99,1 | 1,2 | р>0,05 |
4 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 449±115 | 68,9 | 43,1 | р>0,05 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6136 в модели LU-01-0486 PDX. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергавшихся лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 24 и в табл. 45 и 46.
В этом исследовании, средний объем опухоли мышей, подвергаемых лечению с помощью плацебо, достигал 651 мм3 на день 14 после начала лечения. Препарат BCY6136 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=638 mm3, TGI=3,0%, p>0,05) и при дозе 2 мг/кг один раз в неделю (TV=645 mm3, TGI=1,2%, p>0,05) не проявлял противоопухолевой активности. Препарат BCY6136 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=449 mm3, TGI=43,1%, p>0,05) проявлял в небольшой степени противоопухолевую активность без статистической значимости.
Исследование 17. Испытание in vivo эффективности BCY6033, BCY6136 и BCY6082 при лечении ксенотрансплантата MDA-MB-231-luc у бестимусных мышей линии Balb/c.
(a) Цель исследования.
Целью исследования являлась оценка in vivo противоопухолевой активности BCY6033, BCY6136 и BCY6082 при лечении бестимусных мышей линии Balb/c в ксенотрансплантатной модели MDA-MB-231luc.
(b) Дизайн эксперимента._____ ___________________________________________
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Объем дозирования (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | 3 | - | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
2 | BCY6033 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
3 | BCY6033 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
4 | BCY6033 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
5 | BCY6136 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
6 | BCY6136 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
- 160 047678
7 | BCY6136 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
8 | BCY6082 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
9 | BCY6082 | 3 | 5 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Культивирование клеток.
Для инокуляции собирали клетки на стадии экспоненциального роста и подсчитывали их. (ii) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность клетки опухоли MDA-MB-231-luc (10х10б) в 0,1 мл PBS с 0,1 мл матригеля. Когда средний объем опухоли достигал 159 мм3, 36 животных рандомизировали. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
(iii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.
Лечение | Доза (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | 50 мМ ацетат, 10% сахароза pH 5 | |
BCY6033 | 1 | Растворить 6,71 мг BCY6033 в 6,710 мл буфера для приготовления |
0,3 | Разбавить 270 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6033 с помощью 630 мкл буфера для приготовления | |
0,2 | Разбавить 180 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6033 с помощью 720 мкл буфера для приготовления | |
0,1 | Разбавить 90 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6033 с помощью 810 мкл буфера для приготовления | |
BCY6136 | 1 | Растворить 3,79 мг BCY6136 в 3,695 мл буфера для приготовления |
0,3 | Разбавить 270 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 630 мкл буфера для приготовления | |
0,2 | Разбавить 180 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 720 мкл буфера для приготовления | |
0,1 | Разбавить 90 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 810 мкл буфера для приготовления | |
BCY6082 | 1 | Взвесить и растворить 4,30 mtBCY6082 в 4,162 мл буфера для приготовления |
0,5 | Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6082 с помощью 450 мкл буфера для приготовления | |
0.2* | Разбавить 180 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6082 с помощью 720 мкл буфера для приготовления |
(iv) Сбор образцов.
На PG-D24, для фиксирования формалином и заливки парафином (FFPE), собирали опухоли группы 1, 8 и 9.
На PG-D33, для фиксирования формалином и заливки парафином (FFPE), собирали и фиксировали и фиксировали опухоли группы 2 и 5.
В конце исследования, для фиксирования формалином и заливки парафином (FFPE), собирали и фиксировали опухоли группы 3, 4, 6 и 7.
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и рост опухоли представлены на фиг. 25-27.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самок бестимусных мышей линии Balb/c, не
- 161 047678 сущих ксенотрансплантат MBA-MB-231-luc, представлен в табл. 47-49.
Таблица 47
Объем остаточной опухоли (PG-D0-PG-D17)
Групп а | Лечение | 0 | 2 | Д 4 | ни поел 7 | е начала 9 | лечени> И | 14 | 17 |
1 | Плацебо, один раз в неделю BCY603 | 159± 14 | 269±8 | 306± 19 | 425± 52 | 688±5 4 | 908± 54 | 1064±9 8 | 1315±95 |
2 | 3, 1 мг/кг, один раз в неделю BCY603 | 159± 6 | 219±1 9 | 221± 55 | 296± 76 | 329±6 4 | 421± 77 | 479±84 | 609±122 |
3 | 3, 2 мг/кг, один раз в неделю BCY603 | 159± 10 | 240±7 3 | 215± 57 | 201± 47 | 109±3 6 | 84±3 4 | 64±32 | 59±35 |
4 | 3, 3 мг/кг, один раз в неделю BCY613 | 158± 7 | 189±2 7 | 147± 32 | 109± 26 | 79±11 | 66±7 | 41±5 | 31±6 |
5 | 6, 1 мг/кг, один раз в неделю BCY613 | 159± 10 | 226±3 6 | 221± 54 | 310± 72 | 416±8 9 | 526± 77 | 636±92 | 809±135 |
6 | 6, 2 мг/кг, один раз в неделю BCY613 | 159± 16 | 218±1 7 | 182± 22 | 182± 26 | 101±2 0 | 77±2 4 | 36±4 | 41±10 |
7 | 6, 3 мг/кг, один раз в неделю | 158± 5 | 241±1 2 | 259± 6 | 325± 14 | 258±1 2 | 246± 15 | 162±19 | 178±10 |
BCY608 | |||||||||
8 | 2, 2 мг/кг, один раз в неделю | 159± 13 | 210±1 0 | 242± 16 | 305± 19 | 445±5 8 | 611± 76 | 734±13 9 | 926±105 |
BCY608 | |||||||||
9 | 2, 5 мг/кг, один раз в неделю | 159± 7 | 227±3 1 | 247± 47 | 250± 65 | 276±7 9 | 241± 61 | 220±56 | 184±85 |
- 162 047678
Таблица 48
Объем остаточной опухоли (PG-D19~PG-D33)
Групп а 1 2 3 4 5 | Лечение Плацебо, один раз в неделю BCY6033, 1 мг/кг, один раз в неделю BCY6033, 2 мг/кг, один раз в неделю BCY6033, 3 мг/кг, один раз в неделю BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 19 1453±1 28 724±16 2 61±35 29±7 879±19 0 | 21 1661±17 880±156 67±44 22±12 994±213 | Дни пос 24 1069±1 89 100±76 22±8 1253±3 13 | ле начала 26 1182=1=1 64 133±96 21±9 1431±3 53 | лечения 28 1342±1 66 163±10 6 21±10 1507±2 53 | 31 1647±1 13 221±14 3 43±20 2181±6 09 | 33 257±152 57±29 |
6 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 35±9 | 33±9 | 31=1=17 | 41±32 | 59±45 | 82±59 | 87±71 |
7 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 171±21 | 132±19 | 108±19 | 85±15 | 81±8 | 87±14 | 92±18 |
8 | BCY6082, 2 мг/кг, один раз в неделю | 1034=1=1 78 | 1287±94 | - | - | - | - | - |
9 | BCY6082, 5 мг/кг, один раз в неделю | 214±12 0 | 218±146 | - | - | - | - | - |
- 163 047678
Таблица 49
Объем остаточной опухоли (PG-D35~PG-D47)
Групп а | Лечение | 35 | Дни после начала лечения | 47 | |||
38 | 40 | 42 | 45 | ||||
3 | BCY603 3, 2 мг/кг, один раз в неделю BCY603 | 352±210 | 456±271 | 525±302 | 683±400 | 738±429 | 853±476 |
4 6 | 3 мг/кг, один раз в неделю BCY613 6, 2 мг/кг, один раз в неделю | 79±47 124±106 | 118±71 156±120 | 139±82 179±142 | 220±125 239±197 | 312±176 285±239 | 423±222 350±298 |
7 | BCY613 6, 3 мг/кг, один раз в неделю | 129±38 | 173±65 | 181±65 | 269±113 | 293±114 | 371±128 |
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования опухоли для BCY6033, BCY6136 и BCY6082 в ксенотрансплантатной модели MDA-MB-231-luc рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 21 после начала лечения.
Таблица 50
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGI (%) | Р-величина |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 166U173 | - | - | - |
2 | BCY6033, 1 мг/кг, один раз в неделю | 880±156 | 53,0 | 52,0 | р<0,001 |
3 | BCY6033, 2 мг/кг, один раз в неделю | 67±44 | 4,1 | 106,1 | р<0,001 |
4 | BCY6033, 3 мг/кг, один раз в неделю | 22±12 | 1,3 | 109,1 | р<0,001 |
5 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 994±213 | 59,8 | 44,4 | р<0,01 |
6 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 33±9 | 2,0 | 108,4 | р<0,001 |
- 164 047678
7 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 132±19 | 8,0 | 101,7 | р<0,001 |
8 | BCY6082, 2 мг/кг, один раз в неделю | 1287±94 | 77,5 | 24,9 | р>0,05 |
9 | BCY6082, 5 мг/кг, один раз в неделю | 218±146 | 13,1 | 96,1 | р<0,001 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6033, BCY6136 и BCY6082 в ксенотрансплантатной модели MDA-MB-231-luc. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергнутых лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 25-27 и в табл. 47-50.
Средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 1661 мм3 на день 21. Препарат BCY6033 при дозе 1 мг/кг (TV=880 mm3, TGI=52,0%, p<0,001), при дозе 2 мг/кг (TV=67 mm3, TGI=106,1%, p<0,001) и при дозе 3 мг/кг (TV=22 mm3, TGI=109,l%, p<0,001) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность. Препарат BCY6033 при дозе 2 мг/кг и дозе 3 мг/кг эффективно вызывал регресс опухолей, но опухоли обнаруживали очевидное возобновление роста со дня 21.
Препарат BCY6136 при дозе 1 мг/кг (TV=994 mm3, TGI=44,4%, p<0,01) проявлял умеренную противоопухолевую активность, препарат BCY6136 при дозе 2 мг/кг (TV=33 мм3, TGI=108,4%, p<0,001) и при дозе 3 мг/кг (TV=132 mm3, TGI=101,l%, p<0,001) проявлял высокую противоопухолевую активность, но опухоли обнаруживали очевидное возобновление роста со дня 28.
Препарат BCY6082 при дозе 2 мг/кг (TV=1287 ммЗ, TGI=24,9%, p>0,05) не проявлял очевидной противоопухолевой активности, препарат BCY6082 при дозе 5 мг/кг (TV=218 мм3, TGI=96,1%, p<0,001) проявлял значительную противоопухолевую активность.
В этом исследовании, одна мышь, подвергавшаяся лечению препаратом BCY6136 при дозе 2 мг/кг, потеряла более 15% массы тела в процессе курса лечения, у других мышей сохранялась практически постоянная масса тела.
Исследование 18. Испытание in vivo эффективности BCY6136 при лечении мышей линии BALB/c в сингенной модели EMT-6.
(a) Цель исследования.
Целью исследования являлась оценка in vivo противоопухолевой активности препарата BCY6136 при лечении мышей линии BALB/c в сингенной модели EMT-6.
(b) Дизайн эксперимента. ________ ____________________________________
Группа | Лечение | Доза (мг/кг) | N | Способ дозирования | Схема | Сбор образцов |
1 | Плацебо | - | 5 | внутривенно | один раз в неделю х 4 недели | будет проводиться сбор опухолей от резервных мышей для сортировки флуоресцентноактивированных клеток (FACS) |
2 | BCY6136 | 3 | 5 | внутривенно | один раз в неделю х 4 недели | |
3 | BCY6136 | 1/5ь | 5 | внутривенно | один раз в неделю х 4 недели | |
4 | BCY6136 | о,з/зь | 5 | внутривенно | один раз в неделю х 4 недели |
a Инъецируемый объем каждой мыши составляет 10 мл/кг.
b Дозу в группе 3 и группе 4 изменяли на 5 мг/кг и 3 мг/кг со дня 14.
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Культивирование клеток.
- 165 047678
Опухолевые клетки EMT-6 содержали in vitro в виде монослойной культуры в среде EMEM, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой при 37°C в атмосфере 5% CO2 в воздухе. Опухолевые клетки в установленном порядке пассировали два раза в неделю путем обработки с помощью трипсин-EDTA. Для инокуляции, клетки собирали на стадии экспоненциального роста и подсчитывали их.
(ii) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность клетки опухоли EMT-6 (5x106) в 0,1 мл PBS. Когда средний объем опухоли достигал 75 мм3, 44 животных рандомизировали. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
Приготовление препарата BCY6136 | ||
Лечение Плацебо/буфер BCY6136 BCY6136 BCY6136 BCY6136 Лечение Плацебо/буфер BCY6136 BCY6136 | Концентрация (мг/мл) 1 0,3 0,1 0,03 Приготовление ι Концентрация (мг/мл) 1 о,з | Рецептура 50 мМ ацетат, 10% сахароза pH 5 Растворить 6,2 mtBCY6136 с помощью 6113 мкл буфера Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 1050 мкл буфера Разбавить 150 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 1350 мкл буфера Разбавить 45 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью1455 мкл буфера препарата BCY6136 Рецептура 50 мМ ацетат, 10% сахароза pH 5 Исходный раствор Разбавить 420 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 980 мкл буфера |
BCY6136 | о,з | Разбавить 420 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 980 мкл буфера |
BCY6136 | 0,5 | Разбавить 700 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 700 мкл буфера |
(iv) Сбор образцов.
Собирали 3 опухоли от резервных мышей для сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) на день 11. Данные были представлены командой биологов.
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и кривая роста опухоли представлена на фиг. 28.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самок мышей линии BALB/c, несущих сингенную EMT-6, представлен в табл. 51.
- 166 047678
Таблица 51
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени
Группа | Лечение | Дни после начала лечения | |||||||||
0 | 3 | 5 | 7 | 10 | 12 | 14 | 17 | 19 | 21 | ||
1 | Плацебо, один раз в неделю | 82±4 | 141=1=11 | 260±24 | 443±90 | 557±99 | 703±119 | 812±139 | 948±191 | 1129±248 | СИ -н os OS |
2 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 82±4 | 58±1 | 59±2 | 125=1=18 | 240±23 | 322±23 | 374±22 | 431±37 | 486±50 | 561±61 |
3 | BCY6136, 1/5а мг/кг, один раз в неделю | 82±4 | 108±18 | сч -н о οι | 350±57 | 426±49 | 588±72 | 691±65 | ОО CN +1 ОО | 1018=1=115 | 1272±140 |
4 | BCY6136, 0,3/За мг/кг, один раз в неделю | 82±4 | 130±16 | 255±35 | 358±34 | 450±67 | 607±94 | 731=1=112 | О л ОО | СИ -н ОО о | 1394±161 |
Дозирование группы 3 и группы 4 заменяли на 5 мг/кг и 3 мг/кг со дня 14.
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования опухоли для BCY6136 в сингенной модели EMT-6 рассчитывали на основе измерений объема опухолей на день 21 после начала лечения.
Таблица 52
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | т/сь (%) | TG1 (%) | P-величина при сравнении с плацебо |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 1499±340 | - | - | - |
2 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 561±61 | 37,4 | 66,2 | р<0,05 |
3 | BCY6136, 1/5с мг/кг, один раз в неделю | 1272±140 | 84,8 | 16,1 | ns |
4 | BCY6136, О,3/3С мг/кг, один раз в неделю | 1394±161 | 93,0 | 7,4 | ns |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
c Дозирование группы 3 и группы 4 заменяли на 5 мг/кг и 3 мг/кг со дня 14.
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6136 в сингенной модели EMT-6. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергнутых лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 28 и в табл. 51 и 52.
Средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 1499 мм3 на день 21. Препарат BCY6136 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=561 mm3, TGI=66,2%, p<0,05) проявлял очевидную противоопухолевую активность. Препарат BCY6136 при дозе 1/5 мг/кг один раз в неделю (TV=1272mm3, TGI=16,1%, p>0,05) и препарат BCY6136 при дозе 0,3/3 мг/кг один раз в неделю (TV=1394 mm3, TGI=7,4%, p>0,05) не проявлял противоопухолевой активности.
Дозирование группы 3 и группы 4 заменяли на 5 мг/кг и 3 мг/кг со дня 1414. Обнаруживали изъязвление опухоли у мыши 3-5 на день 14, и мышей подвергали обработке кремом с антибиотиком. В этом исследовании, у всех мышей масса тела сохранялась практически неизменной.
Исследование 19. Исследование in vivo эффективности BCY6136 при лечении ксенотрансплантата NCI-N87 у бестимусных мышей линии Balb/c.
- 167 047678 (a) Цель исследования.
Целью исследования является оценка in vivo противоопухолевой эффективности BCY6136 при лечении ксенотрансплантата NCI-N87 у бестимусных мышей линии Balb/c.
(b) Дизайн эксперимента. ____________________________________________
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Объем дозирования (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | 3 | - | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
2 | BCY6136 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
3 | BCY6136 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
4 | BCY6136 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Культивирование клеток.
Клетки опухоли NCI-N87 содержали в среде RPMI-1640, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой при 37°C в атмосфере 5% CO2 в воздухе. Опухолевые клетки в установленном порядке пассировали два раза в неделю. Для инокуляции собирали клетки на стадии экспоненци ального роста и подсчитывали их.
(ii) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность клетки опухоли NCI-N87 (10x106) с матригелем(1:1) в 0,2 мл PBS. Когда средний объем опухоли достигал приблизительно 176 мм3, животных рандомизировали и начинали проведение лечения. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
(iii) Рецептура приготовления испытуемого препарата._______________________________
Испытуемый препарат | Концентрация (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | - | 50 мМ ацетат 10% сахароза pH 5 |
BCY6136 | 1 | Растворить 4,295 мг BCY6136 в 4,214 мл ацетатного буфера1 |
ОД | Разбавить 90 мкл 1 мг/мл исходного раствора BCY6136 с помощью 810 мкл ацетатного буфера | |
02 | Разбавить 180 мкл 1 мг/мл исходного раствора BCY6136 с помощью 720 мкл ацетатного буфера | |
0,3 | Разбавить 270 мкл 1 мг/мл исходного раствора BCY6136 с помощью 63 0 мкл ацетатного буфера | |
1 Ацетатный буфер: 50 мМ ацетат 10% сахароза pH 5 |
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Кривая роста опухоли представлена на фиг. 29.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самок бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат NCI-N87, представлен в табл. 53.
- 168 047678
Таблица 53
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования опухоли препаратом BCY6136 в случае ксенотрансплантата NCI-N87 рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 30 после начала лечения.
Таблица 54
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь(%) | TGI (%) | Р-величина |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 1465±90 | - | - | - |
2 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 425±47 | 29,0 | 80,7 | Р<0,001 |
3 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 210±60 | 14,3 | 97,4 | Р<0,001 |
4 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 201±22 | 13,7 | 98,1 | Р<0,001 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли для группы, подвергнутой лечению, на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6136 в модели NCI-N87. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергавшихся лечению, в различные моменты времени
- 169 047678 представлены на фиг. 29 и в табл. 53 и 54.
Средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 1465 мм3 на день 30. Препарат BCY6136 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=425 mm3, TGI=80,7%, p<0,001) и при дозе 2 мг/кг один раз в неделю (TV=210 mm3, TGI=97.4%, p<0,001) проявлял значительную дозозависимую противоопухолевую активность, BCY6136 в дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=201 mm3, TGI=98,1%, p<0,001) проявлял сравнимую противоопухолевую активность с активностью BCY6136 при дозе 2 мг/кг.
В этом исследовании, у мышей во всех группах не обнаруживали очевидной потери масса тела в процессе проведения курса лечения.
Исследование 20. Исследование in vivo эффективности BCY6136 при лечении ксенотрансплантат SK-OV-3 у бестимусных мышей линии Balb/c.
(a) Цель исследования.
Целью исследования является оценка in vivo противоопухолевой эффективности BCY6136 при лечении ксенотрансплантат SK-OV-3 у бестимусных мышей линии Balb/c.
(b) Дизайн эксперимента. | |||||||
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Объем дозирования (мкл/г) | Способ дозирования | Схема | |
1 | Плацебо | 3 | - | 10 | внутривенно | один раз в неделю | |
2 | ADC | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю | |
3 | BCY6136 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю | |
4 | BCY6136 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю | |
5 | BCY6136 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Культивирование клеток.
Клетки опухоли SK-OV-3 содержали в среде МакКоя 5a, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой при 37°C в атмосфере 5% СО2 в воздухе. Опухолевые клетки в установ ленном порядке пассировали два раза в неделю. Для инокуляции собирали клетки на стадии экспоненци ального роста и подсчитывали их.
(ii) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность клетки опухоли SK-OV-3 (10x106) с матригелем (1:1) в 0,2 мл PBS. Животных рандомизировали, и начинали проведение лечения, когда средний объем опухоли достигал приблизительно 186 мм3. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
(iii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.
- 170 047678
Испытуемый препарат | Чистота | Концентрация (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо BCY6136 | 98,5% | 1 0,1 0,2 о,з | 50 мМ ацетат 10% сахароза рН5 Растворить 3,65 mtBCY6136 в 3,60 мл 50 мМ ацетатного буфера1 Разбавить 90 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 810 мкл ацетатного буфера1 Разбавить 180 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 720 мкл ацетатного буфера1 Разбавить 270 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 630 мкл ацетатного буфера1 |
ADC | ADC | о,з | Разбавить 69 мкл исходного раствора 10,47 мг/мл ADC с помощью 2331 мкл буфера для ADC2 |
1 Ацетатный буфер: 50 мМ ацетат 10% сахароза pH 5 2 Буфер для ADC: 25 мМ гистидин 10% сахароза pH 5,5 (d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Кривая роста опухоли представлена на фиг. 30.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самок бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат SK-OV-3, представлен в табл. 55.
iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
- 171 047678
Степень ингибирования опухоли для BCY6136 в случае ксенотрансплантата SK-OV-3 рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 28 после начала лечения.
Таблица 56
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGI (%) | Рвеличина |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 1560±305 | — | — | — |
2 | ADC, 3 мг/кг, один раз в неделю | 684±111 | 43,9 | 63,8 | Р<0,01 |
3 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 1035±67 | 66,4 | 38,1 | р>0,05 |
4 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 277±58 | 17,8 | 93,3 | Р<0,001 |
5 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 254±48 | 16,3 | 95,0 | Р<0,001 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6136 в модели SK-OV-3. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергавшихся лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 30 и в табл. 55 и 56.
Средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 1560 мм3 на день 28. ADC при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=684 mm3, TGI=63,8%, p<0,01) проявлял умеренную противоопухолевую активность. BCY6136 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=1035 mm3, TGI=38,1%, p>0,05) не проявлял очевидной противоопухолевой активности. BCY6136 при дозе 2 мг/кг один раз в неделю (TV=277 mm3, TGI=93,3%, p<0,001) и при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=254 mm3, TGI=95,0%, p<0,001) проявлял значительную противоопухолевую активность.
В этом исследовании не было обнаружено очевидной потери массы тела у животных во всех груп пах в процессе проведения курса лечения.
Исследование 21. Исследование in vivo эффективности BCY6136 при лечении ксенотрансплантата OE21 у бестимусных мышей линии Balb/c.
(a) Цель исследования.
Целью исследования является оценка in vivo противоопухолевой эффективности BCY6136 при лечении ксенотрансплантата OE21 у бестимусных мышей линии Balb/c.
(b) Дизайн эксперимента.
- 172 047678
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Объем дозирования (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | 3 | - | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
2 | BCY6136 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
3 | BCY6136 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
4 | BCY6136 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Культивирование клеток.
Клетки опухоли OE21 содержали в среде RPMI-1640, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой при 37°C в атмосфере 5% CO2 в воздухе. Опухолевые клетки в установленном порядке пассировали два раза в неделю. Для инокуляции собирали клетки на стадии экспоненци ального роста и подсчитывали их.
(ii) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность клетки опухоли OE21 (5x106) с матригелем (1:1) в 0,2 мл PBS. Животных рандомизировали, и начинали проведение лечения когда средний объем опухоли достигал приблизительно 157 мм3. Введение испы туемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
Испытуемый препарат | Концентрация (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | - | 50 мМ ацетат 10% сахароза pH 5 |
BCY6136 | 1 | Растворить 4,295 mtBCY6136 в 4,214 мл ацетатного буфера1 |
0,1 | Разбавить 90 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 810 мкл ацетатного буфера | |
02 | Разбавить 180 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 720 мкл ацетатного буфера | |
0,3 | Разбавить 270 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6136 с помощью 630 мкл ацетатного буфера | |
1 Ацетатный бус | зер: 50 мМ ацетат 10% сахароза pH 5 |
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Кривая роста опухоли представлена на фиг. 31.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самок бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат OE21, представлен в табл. 57.
- 173 047678
Таблица 57
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени
Группа | Лечение | Дни после начала лечения | ||||||||||
о | СП | г- | О' | с | ОО | С1 | сч | |||||
Плацебо, один раз в неделю | 155±9 | 211±16 | 291±16 | 379±14 | 456±32 | 539±13 | 828±42 | о Л О' | ОО о | 1250±46 | 1586±57 | |
<м | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 159±14 | 202±28 | 251±29 | 282±6 | 331=1=19 | 392±35 | 609±56 | 694±44 | 777±68 | 1083±85 | 1155±98 |
СП | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 157±19 | 197±13 | 219±6 | 235±27 | 268±35 | 243±37 | 346±78 | 371±98 | 601Т96Е | 515±94 | 537±122 |
BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 155±19 | 200±16 | 197±7 | 209±11 | 229±26 | 211±14 | 289±38 | ОО | 330±40 | 474±42 | 489±51 |
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования опухоли для BCY6136 в случае ксенотрансплантата OE21 рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 23 после начала лечения.
Таблица 58
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGI (%) | Р-величина |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 1586±57 | - | - | - |
2 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 1155±98 | 72,8 | 30,4 | Р<0,05 |
3 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 537±122 | 33,9 | 73,4 | Р<0,001 |
4 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 489±51 | 30,8 | 76,7 | Р<0,001 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли для группы, подвергнутой лечению, на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6136 в модели OE21. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергавшихся лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 31 и в табл. 57 и 58.
Средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 1586 мм3 на день 23. Препарат BCY6136 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=1155 мм3, TGI=30,4% p<0,05) проявлял противоопухолевая активность в слабой степени. BCY6136 при дозе 2 мг/кг один раз в неделю (TV=537 mm3, TGI=73,4%, p<0,001) и при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=489 мм3, TG1=76,7%, p<0,001) проявлял значительную противоопухолевую активность.
В этом исследовании не было обнаружено очевидной потери массы тела у животных во всех группах в процессе проведения курса лечения.
Исследование 22. Испытание in vivo эффективности BCY6136 и BCY6082 при лечении ксенотрансплантат MOLP-8 у мышей линии CB17-SCID.
(a) Цель исследования.
Целью исследования является оценка in vivo противоопухолевой эффективности BCY6136 и BCY6082 при лечении ксенотрансплантат MOLP-8 у мышей линии CB17-SC1D.
(b) Дизайн эксперимента.
- 174 047678
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Объем дозирования (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | 3 | - | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
2 | BCY6136 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
3 | BCY6136 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
4 | BCY6136 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
5 | BCY6082 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
6 | BCY6082 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
7 | BCY6082 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Культивирование клеток.
Клетки опухоли MOLP-8 содержали in vitro в виде монослойной культуры в среде RMPI-1640, дополненной 20% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой при 37°C в атмосфере 5% СО2 в воздухе. Опухолевые клетки в установленном порядке пассировали путем обработки трипсин-EDTA. Для инокуляции собирали клетки на стадии экспоненциального роста и подсчитывали их.
(ii) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши инокулировали подкожно в правую боковую поверхность клетки опухоли MOLP-8 (10x106) в 0,2 мл PBS с 50% матригеля. Когда средний объем опухоли достигал 141 мм3, 36 животных рандомизировали. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе представлены в таблице дизайна эксперимента.
(iii) Рецептура приготовления испытуемого препарата._____________________________
Лечение | Концентрация (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | - | 50 мМ ацетат, 10% сахароза pH 5 |
ОД | Разбавить 90 мкл исходных растворов 1 мг/мл BCY6136* с помощью 810 мкл буфера*** | |
BCY6136 | 0,2 | Разбавить 180 мкл исходных раствором 1 мг/мл BCY6136* с помощью 720 мкл буфера*** |
0,3 | Разбавить 270 мкл исходных растворов 1 мг/мл | |
BCY6136* с помощью 630 мкл буфера*** | ||
0,1 | Разбавить 90 мкл исходных растворов 1 мг/мл BCY6082** с помощью 810 мкл буфера*** | |
BCY6082 | ОД | Разбавить 180 мкл исходных растворов 1 мг/мл BCY6082** с помощью 720 мкл буфера*** |
о,з | Разбавить 270 мкл 1 мг/мл исходных растворов BCY6082** wc помощью 630 мкл буфера*** |
* Исходные растворы BCY6136: 10,93 мг BCY6136 растворяли в 10,93 мл 50 мМ ацетат,
10% сахароза, pH 5, и разливали в отдельные пробирки, и хранили при -80°С.
* * Исходные растворы BCY6082: 2,43 мг BCY6136 растворяли в 2,43 мл 50 мМ ацетат, 10% сахароза, pH 5, и разливали в отдельные пробирки, и хранили при -80°С.
* ** Буфер: 50 мМ ацетат, 10% сахароза pH 5
- 175 047678 (d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и кривая роста опухоли представлены на фиг. 32 и 33.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самок мышей линии CB17-SCID, несущих ксенотрансплантат MOLP-8, представлен в табл. 59.
Таблица 59
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени
Г руппа | Лечение | Дни после начала лечения | ||||||
0 | 2 | 4 | 7 | 9 | И | 14 | ||
1 | Плацебо, один раз в неделю | 139±2 | 375±3 6 | 604±2 8 | 984±88 | 1451=1=1 33 | 1981=1=1 96 | 2528±2 95 |
2 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 143=1=1 | 299±б | 444±4 9 | 576±31 | 806±85 | 1132=1=1 70 | 1446±2 34 |
3 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 140±1 5 | 271±4 3 | 250±2 | 509±23 | 662±78 | 873±49 | 1218±1 44 |
4 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 142±1 9 | 239±6 7 | 197±2 0 | 342±78 | 425±90 | 693±13 3 | 938±15 5 |
5 | BCY6082, 1 мг/кг, один раз в неделю | 142±4 | 303±4 9 | 456±8 | 809±16 9 | 1365±2 77 | 1708±1 90 | 2296±5 И |
6 | BCY6082, 2 мг/кг, один раз в неделю | 139±5 | 273±4 6 | 428±1 8 | 682±50 | 945±73 | 1240±8 5 | 1554±8 4 |
7 | BCY6082, 3 мг/кг, один раз в неделю | 142±4 | 219±7 | 369±7 7 | 471±81 | 656±11 5 | 997±21 2 | 1321±3 36 |
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли.
Степень ингибирования опухоли для BCY6136 and BCY6082 в ксенотрансплантатной модели MOLP-8 рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 14 после начала лечения.
- 176 047678
Таблица 60
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | т/сь (%) | TGI (%) | P-величина при сравнении с плацебо |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 2528±295 | - | - | - |
2 | BCY6136, 1 мг/кг, один раз в неделю | 1446±234 | 57,2 | 45,5 | р>0,05 |
3 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 1218±144 | 48,2 | 54,9 | р<0,05 |
4 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 938±155 | 37,1 | 66,7 | р<0,01 |
5 | BCY6082, 1 мг/кг, один раз в неделю | 2296±511 | 90,8 | 9,8 | р>0,05 |
6 | BCY6082, 2 мг/кг, один раз в неделю | 1554±84 | 61,5 | 40,8 | р>0,05 |
7 | BCY6082, 3 мг/кг, один раз в неделю | 132Н336 | 52,3 | 50,6 | р<0,05 |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность BCY6136 и BCY6082 в ксенотрансплантатной модели MOLP-8. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергнутых лечению, в различные моменты времени представлены на фигуре. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергнутых лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 32 и 33 и в табл. 59 и 60.
Средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 2528 мм3 на день 14. Препарат BCY6136 при дозе 1 мг/кг (TV=1146 mm3, TGI=45,5%, p>0,05), при дозе 2 мг/кг (TV=1218 mm3, TGI=54,9%, p<0,05) и при дозе 3 мг/кг (TV=938 mm3, TGI=66,7%, p<0,01) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность, но при всех величинах доз не достигался регресс опухолей в ксенотрансплантатах MOLP-8
Препарат BCY6082 при дозе 1 мг/кг (TV=2296 mm3, TGI=9,8%, p>0,05) и при дозе 2 мг/кг (TV=1554 mm3, TGI=40,8%, p>0,05) не проявлял очевидной противоопухолевой активности. Препарат BCY6082 при дозе 3 мг/кг значительно ингибировал рост опухоли (TV=1321 mm3, TGI=50,6%, p<0,05), но регресс опухоли не достигался в ксенотрансплантатах MOLP-8.
В этом исследовании у всех мышей сохранялась масса тела практически на постоянном уровне.
Исследование 23. Испытание in vivo эффективности препаратов BCY при лечении ксенотрансплантата HT1080 у бестимусных мышей линии BALB/c.
(a) Цель исследования.
Целью исследования являлась оценка in vivo противоопухолевой активности препаратов BCY при лечении ксенотрансплантатной модели HT1080 на бестимусных мышах линии BALB/c.
(b) Дизайн эксперимента. _____________________________________________
Группа | Лечение | η | Доза (мг/кг) | Объем дозирования (мкл/г) | Способ дозирования | Схема |
1 | Плацебо | 3 | - | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
2 | BCY6082 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
- 177 047678
3 | BCY6031 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
4 | BCY6173 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
5 | BCY6173 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
6 | BCY6173 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
7 | BCY6135 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
8 | BCY6135 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
9 | BCY6135 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
10 | BCY6033 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
11 | BCY6033 | 3 | 5 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
12 | BCY6136 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
13 | BCY6136 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
14 | BCY6136 | 3 | 5 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
15 | BCY6174 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
- 178 047678
16 | BCY6174 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
17 | BCY6174 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
18 | BCY6175 | 3 | 1 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
19 | BCY6175 | 3 | 2 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
20 | BCY6175 | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
21 | ADC | 3 | 3 | 10 | внутривенно | один раз в неделю |
Примечание: n: число животных; объем дозирования: скорректированный объем дозирования 10 мкл/г с учетом массы тела.
(c) Методы и методики эксперимента.
(i) Культивирование клеток.
Клетки опухоли HT1080 следует содержать в среде, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой при 37°C в атмосфере 5% CO2 в воздухе. Опухолевые клетки следует в установленном порядке пассированы два раза в неделю. Для инокуляции опухоли, клетки следует собирать в экспоненциальной фазе роста и посчитать их число.
(ii) Инокуляция опухоли.
Для развития опухоли, каждой мыши следует инокулировать подкожно в правую боковую поверхность клетки опухоли HT1080 (5х106). Животных следует рандомизировать, и лечение следует начать, когда средний объем опухоли достигнет приблизительно 150-200 мм3. Введение испытуемого препарата и число животных в каждой группе приведены в таблице дизайна эксперимента.
(iii) Рецептура приготовления испытуемого препарата.____________________________
Лечение | Доза (мг/мл) | Рецептура |
Плацебо | - | 50 мМ ацетат/уксусная кислота pH 5 10% сахароза |
BCY6082 | 0,2 | Разбавить 160 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6082 с помощью 640 мкл буфера |
- 179 047678
Разбавить 180 мкл исходного раствора 1 мг/мл | ||
BCY6031 | 0,2 | |
BCY6031 с помощью 720 мкл буфера | ||
1 0,1 | Растворить 2,13 mtBCY6173 в 2,04 мл буфера Разбавить 90 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6173 | |
с помощью 810 мкл буфера | ||
BCY6173 | 02 | Разбавить 180 мкл исходного раствора 1 мг/мл |
BCY6173 с помощью 720 мкл буфера | ||
0,3 | Разбавить 270 мкл исходного раствора 1 мг/мл | |
BCY6173 с помощью 630 мкл буфера | ||
1 | Растворить 2 мг BCY6135 в 1,9 мл буфера | |
0,1 | Разбавить 90 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6135 | |
с помощью 810 мкл буфера | ||
BCY6135 | 02 | Разбавить 180 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6135 с помощью 720 мкл буфера Разбавить 270 мкл исходного раствора 1 мг/мл |
0,3 | ||
BCY6135 с помощью 630 мкл буфера | ||
о,з | Разбавить 270 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6033 с помощью 630 мкл буфера | |
BCY6033 | 0,5 | |
Разбавить 450 мкл исходного раствора 1 мг/мл | ||
BCY6033 с помощью 450 мкл буфера Разбавить 200 мкл исходного раствора 1 мг/мл | ||
0,2 | ||
BCY6136 с помощью 800 мкл буфера Разбавить 300 мкл исходного раствора 1 мг/мл | ||
BCY6136 | 0,3 | |
BCY6136 с помощью 700 мкл буфера Разбавить 500 мкл исходного раствора 1 мг/мл | ||
0,5 | ||
1 ОД | BCY6136 с помощью 500 мкл буфера Растворить 2,69 мг BCY6174 в 2,677 мл буфера Разбавить 90 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6174 | |
с помощью 810 мкл буфера | ||
BCY6174 | 0,2 | Разбавить 180 мкл исходного раствора 1 мг/мл |
BCY6174 с помощью 720 мкл буфера | ||
0,3 | Разбавить 270 мкл исходного раствора 1 мг/мл | |
BCY6174 с помощью 630 мкл буфера | ||
1 | Растворить 2 мг BCY6175 в 1,924 мл буфера | |
Разбавить 90 мкл исходного раствора 1 мг/мл BCY6175 | ||
0,1 | ||
с помощью 810 мкл буфера | ||
BCY6175 | 0,2 | Разбавить 180 мкл исходного раствора 1 мг/мл |
BCY6175 с помощью 720 мкл буфера | ||
0,3 | Разбавить 270 мкл исходного раствора 1 мг/мл | |
BCY6175 с помощью 630 мкл буфера | ||
Разбавить 25,78 мкл исходного раствора 10,47 мг/мл | ||
ADC | 0,3 | ADC с помощью 874,22 мкл 25 мМ гистидин pH 7 10% |
сахароза |
(d) Результаты.
(i) Кривая роста опухоли.
Масса тела и кривая роста опухоли представлена на фиг. 34-42.
(ii) Объем остаточной опухоли.
Средний объем опухоли в зависимости от времени у самок бестимусных мышей линии Balb/c, несущих ксенотрансплантат HT1080, приведен в табл. 61.
- 180 047678
Таблица 61
Объем остаточной опухоли в зависимости от времени
Груп па | Лечение | Дни после начала лечения | ||||||
0 | 2 | 4 | 7 | 9 | И | 14 | ||
1 | Плацебо, один раз в неделю | 179±22 | 312±8 4 | 529±13 5 | 886±20 7 | 1185±1 72 | 1467±2 24 | 1737±2 58 |
2 | BCY6082, 2 мг/кг, один раз в неделю | 177±16 | 183±3 1 | 99±27 | 61±17 | 33±10 | 12±5 | 5±3 |
3 | BCY6031, 2 мг/кг, один раз в неделю | 177±24 | 215±3 5 | 133±37 | 63±31 | 53±37 | 45±36 | 71±67 |
4 | BCY6173 1 мг/кг, один раз в неделю | 178±26 | 276±8 | 328±73 | 594±62 | 745±22 | 960±53 | 1074±1 50 |
5 | BCY6173, 2 мг/кг, один раз в неделю | 178±28 | 277±6 1 | 262±12 5 | 309±23 8 | 425±33 4 | 436±32 О | 480±34 7 |
- 181 047678
6 | BCY6173, 3 мг/кг, один раз в неделю | 179±43 | 182±7 1 | 133±88 | 87±68 | 77±65 | 60±54 | 47±42 |
7 | BCY6135 1 мг/кг, один раз в неделю | 178±22 | 267±6 6 | 262±58 | 436±67 | 599±89 | 703±36 | 871±28 |
8 | BCY6135 2 мг/кг, один раз в неделю | 178±23 | 176±4 8 | 117±43 | 70±23 | 67±23 | 52±21 | 62±7 |
9 | BCY6135 3 мг/кг, один раз в неделю | 177±39 | 178±7 9 | 92±67 | 62±46 | 62±51 | 57±51 | 44±40 |
10 | BCY6033 3 мг/кг, один раз в неделю | 178±26 | 186±3 4 | 79±30 | 29±15 | 12±8 | 6±4 | 9±7 |
И | BCY6033 5 мг/кг, один раз в неделю | 178±36 | 117±2 0 | 41±10 | 12±4 | 6±2 | 4±0 | 0±0 |
12 | BCY6136 2мг/кг, один раз в неделю | 178=1=19 | 249±2 2 | 115±8 | 126±53 | 158±71 | 140±89 | 245±11 6 |
13 | BCY6136 3 мг/кг, один раз в неделю | 178±36 | 168±2 1 | 72±18 | 22±7 | 21±15 | 8±6 | 3±2 |
14 | BCY6136 5 мг/кг, один раз в неделю | 178±26 | 165±3 3 | 52±10 | 18±7 | 9±4 | 5±2 | 2±1 |
15 | BCY6174 1 мг/кг, один раз в неделю | 180±35 | 231±1 9 | 226±29 | 432±37 | 602±63 | 742±62 | 1066±1 30 |
16 | BCY6174 2мг/кг, один раз в неделю | 178=1=31 | 203±5 0 | 123±29 | 216±47 | 291±40 | 326±68 | 532±91 |
- 182 047678
17 | BCY6174 3 мг/кг, один раз в неделю | 178+33 | 195±1 3 | 110+39 | 58+23 | 34±17 | 21=1=11 | 11+7 |
18 | BCY6175 1 мг/кг, один раз в неделю | 178+27 | 248+6 2 | 244+74 | 347+18 | 435+18 | 558+38 | 769+26 |
19 | BCY6175 2 мг/кг, один раз в неделю | 178+22 | 223+4 2 | 158+59 | 116+35 | 156+52 | 166+51 | 295+88 |
20 | BCY6175 3 мг/кг, один раз в неделю | 179+39 | 189+4 8 | 116+50 | 43+18 | 33+18 | 25+13 | 11+9 |
21 | ADC 3 мг/кг, один раз в неделю | 180+26 | 158+3 0 | 58+8 | 18+2 | 7+1 | 2+2 | 0+0 |
(iii) Анализ ингибирования роста опухоли
Степень ингибирования опухоли для препаратов BCY в ксенотрансплантатной модели HT1080 рассчитывали на основе измерений объема опухоли на день 14 после начала лечения.
Таблица 62
Анализ ингибирования роста опухоли
Группа | Лечение | Объем опухоли (мм3)а | Т/Сь (%) | TGI (%) | Р-величина при сравнении с плацебо |
1 | Плацебо, один раз в неделю | 1737+258 | - | — | — |
2 | BCY6082, 2 мг/кг, один раз в неделю | 5±3 | 0,3 | 111,1 | р<0,01 |
3 | BCY6031, 2 мг/кг, один раз в неделю | 71+67 | 4,1 | 106,8 | р<0,01 |
- 183 047678
4 | BCY6173, 1 мг/кг, один раз в неделю | 1074±150 | 61,8 | 42,5 | р>0,05 |
5 | BCY6173, 2 мг/кг, один раз в неделю | 480±347 | 27,6 | 80,6 | р<0,05 |
6 | BCY6173, 3 мг/кг, один раз в неделю | 47±42 | 2,7 | 108,4 | р<0,01 |
7 | BCY6135, 1 мг/кг, один раз в неделю | 871±28 | 50,1 | 55,5 | р<0,01 |
8 | BCY6135, 2 мг/кг, один раз в неделю | 62±7 | 3,5 | 107,5 | р<0,001 |
9 | BCY6135, 3 мг/кг, один раз в неделю | 44±40 | 2,5 | 108,6 | р<0,001 |
10 | BCY6033, 3 мг/кг, один раз в неделю | 9±7 | 0,5 | 110,8 | р<0,001 |
И | BCY6033, 5 мг/кг, один раз в неделю | 0±0 | о,о | 111,4 | р<0,001 |
12 | BCY6136, 2 мг/кг, один раз в неделю | 245±116 | 14,1 | 95,7 | р<0,001 |
13 | BCY6136, 3 мг/кг, один раз в неделю | 3±2 | 0,2 | 111,2 | р<0,001 |
14 | BCY6136, 5 мг/кг, один раз в неделю | 2±1 | 0,1 | 111,3 | р<0,001 |
- 184 047678
15 | BCY6174, 1 мг/кг, один раз в неделю | 1066±130 | 61,4 | 43,1 | р<0,05 |
16 | BCY6174, 2 мг/кг, один раз в неделю | 532±91 | 30,6 | 77,3 | р<0,01 |
17 | BCY6174, 3 мг/кг, один раз в неделю | 11±7 | 0,6 | 110,7 | р<0,001 |
18 | BCY6175, 1 мг/кг, один раз в неделю | 769±26 | 44,3 | 62,1 | р<0,01 |
19 | BCY6175, 2 мг/кг, один раз в неделю | 295±88 | 17,0 | 92,5 | р<0,001 |
20 | BCY6175, 3 мг/кг, один раз в неделю | 11±9 | 0,6 | 110,8 | р<0,001 |
21 | ADC, 3 мг/кг, один раз в неделю | 0±0 | о,о | 111,5 | - |
a Средняя величина ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
b Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в подвергнутой лечению группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).
(e) Полученные результаты и их обсуждение.
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность препаратов BCY в ксенотрансплантатной модели HT1080. Измеренные объемы опухолей во всех группах, подвергнутых лечению, в различные моменты времени представлены на фиг. 34-42 и в табл. 61 и 62.
Средний объем опухоли мышей, которым вводили плацебо, достигал 1737 мм3 на день 14.
Препарат BCY6082 при дозе 2 мг/кг один раз в неделю (TV=5 mm3, TGI=111,1%, p<0,01) и препарат BCY6031 при 2 мг/кг один раз в неделю (TV=7 mm3, TGI=106,8%, p<0,01) проявляли высокую противоопухолевая активность.
Препарат BCY6173 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=1074 mm3, TGI=42,5%, p>0,05), при дозе 2 мг/кг один раз в неделю (TV=480 mm3, TGI=80,6%, p<0,05) и при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=7 mm3, TGI=108,4%, p<0,01) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность.
Препарат BCY6135 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=871 mm3, TGI=55,5%, p<0,01), при дозе 2 мг/кг один раз в неделю (TV=62 мм3, TGI=107,5%, p<0,001) и при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=44 mm3, TGI=108,6%, p<0,001) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность.
Препарат BCY6033 при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=9 mm3, TGI=110,8%, p<0,001) и при дозе 5 мг/кг один раз в неделю (TV=0 mm3, TGI=111,4%, p<0,001) проявлял высокую противоопухолевую активность и полностью уничтожал опухоли ко дню 14 при дозе 5 мг/кг.
Препарат BCY6136 при дозе 2 мг/кг один раз в неделю (TV=345 mm3, TGI=95,7%, p<0,001), при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=3 mm3, TG1=111,2%, p<0,001) и при дозе 5 мг/кг один раз в неделю (TV=2 mm3, TGI=111,3%, p<0,001) проявлял высокую противоопухолевую активность.
Препарат BCY6174 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=1066 mm3, TGI=43,1%, p<0,05), при дозе 2 мг/кг один раз в неделю (TV=532 mm3, TGI=77,3%, p<0,01) и при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=11 mm3, TGI=110,7%, p<0,001) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность.
Препарат BCY6175 при дозе 1 мг/кг один раз в неделю (TV=769 mm3, TGI=62,1%, p<0,01), при дозе 2 мг/кг один раз в неделю (TV=295 mm3, TGI=92,5%, p<0,001) и при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=11 mm3, TGI=110,8%, p<0,001) проявлял дозозависимую противоопухолевую активность.
Препарат ADC при дозе 3 мг/кг один раз в неделю (TV=0 mm3, TGI=111,5%) полностью уничтожал опухоли ко дню 14.
Исследование 24. Выяснение наличия взаимосвязи между вариацией числа копий (CNV) и экспрессия гена для EphA2 в случае типов множественных опухолей.
Методы.
- 185 047678
1. Выберите все исследования на портале cBioPortal (http://www.cbioportal.org/) и ищите исследования для EPHA2.
(a) Удалите предварительные исследования.
(b) Снимите выделение исследования с перекрывающимися образцами для предотвращения ошибки выборки (на основе предупреждения в портале cBioPortal), всегда выбирайте исследование PanCancer, если можно использовать этот выбор.
(c) Исследования, выбранные для анализа (табл. 63).
Таблица 63
Исследования, подвергнутые анализу на портале cBioPortal, и подразделы в исследовании
Название исследования Подразделы
Инвазивная карцинома молочной железы (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Плоскоклеточная карцинома легкого (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Папиллярная почечно-клеточная карцинома (TCGA, PanCancer Atlas) | Экспрессия мРНК, RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Светлоклеточная карцинома почки (TCGA, PanCancer Atlas) | Экспрессия мРНК, RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Аденокарцинома толстой кишки (TCGA, PanCancer Atlas) | RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Плоскоклеточная карцинома головы и шеи (TCGA, PanCancer Atlas) | Экспрессия мРНК, RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Уротелиальная карцинома мочевого пузыря (TCGA, PanCancer Atlas) | RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Увеальная меланома (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Аденокарцинома легкого (TCGA, PanCancer Atlas) | Экспрессия мРНК, RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Серозная цистаденокарцинома яичников (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Рак молочной железы (METABRIC, Nature 2012 & Nat Commun 2016) | Экспрессии мРНК (микроматричный анализ) |
Мезотелиома (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Колоректальная аденокарцинома (TCGA, Nature 2012) | РНК последовательность RPKM |
Плоскоклеточная карцинома шейки матки (TCGA, PanCancer Atlas) | RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
- 186 047678
Саркома (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Энциклопедия линий раковых клеток (Novartis/Broad, Nature 2012) | Экспрессии мРНК (микроматричный анализ) |
Аденокарцинома прямой кишки (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Гепатоцеллюлярная карцинома печени (TCGA, PanCancer Atlas) | ЕРНА2: экспрессия мРНК, RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Аденокарцинома желудка (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Эндометриальная карцинома тела матки (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Меланома кожи (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq RNASeqV2 syn4976369 |
Аденокарцинома предстательной железы (TCGA, PanCancer Atlas) | Экспрессия мРНК, RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Хромофобная почечно-клеточная карцинома (TCGA, PanCancer Atlas) | Экспрессия мРНК, RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Опухоль Вильмса в детском возрасте (TARGET, 2018) | Epha2: экспрессия мРНК (РНКпоследовательность RPKM) |
Феохромоцитома и параганглиома (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Карцинома щитовидной железы (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Аденокарцинома пищевода (TCGA, PanCancer Atlas) | RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
- 187 047678
Холангиокарцинома (TCGA, PanCancer Atlas) | RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Глиома головного мозга низкой степени злокачественности (TCGA, PanCancer Atlas) | RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Тимома (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Острый лимфолейкоз в детском возрасте - фаза II (TARGET, 2018) | Epha2: экспрессия мРНК (РНКпоследовательность RPKM) |
Диффузная В-крупноклеточная лимфома (TCGA, PanCancer Atlas) | Экспрессия мРНК, RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Мультиформная глиобластома (TCGA, PanCancer Atlas) | Экспрессия мРНК, RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Метастатический рак предстательной железы, SU2C/PCF Dream Team (Robinson et al., Cell 2015) | Экспрессия мРНК/захват (РНКпоследовательность RPKM) |
Острый миелолейкоз (TCGA, PanCancer Atlas) | Экспрессия мРНК, RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Опухоли половых клеток яичка (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Адренокортикальная карцинома (TCGA, PanCancer Atlas) | RSEM (партия, нормализованная из Illumina HiSeq_RNASeqV2) |
Карциносаркома матки (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Аденокарцинома поджелудочной железы (TCGA, PanCancer Atlas) | Партия нормализованной/объединенной экспрессии мРНК из Illumina HiSeq_RNASeqV2 syn4976369 |
Аденокарцинома предстательной железы (MSKCC, Cancer Cell 2010) | Экспрессия мРНК |
Аденокарцинома предстательной железы (Fred Hutchinson CRC, Nat Med 2016) | Экспрессия мРНК |
2. Экспортируйте данные по вариациям числа копий (CNV) и экспрессии РНК из портала cBioPortal.
3. Проведите тест на то, что вариации числа копий (CNV) статистически значимо связаны с изменениями экспрессии мРНК для EphA2 (log2 не используют).
(a) Запустите непараметрический критерий Крускала-Уоллиса в программе GraphPad Prism (7.04) и R/R studio (пороговое значением для значимости: p<0,01).
(i) GraphPad Prism: установите столбец в табл., запустите непараметрический критерий без подгонки или сопряжения и не выдвигайте предположение о распределении Г аусса.
(ii) Пакеты, используемые в R:
1. XLConnect.
2. dplyr.
3. Критерий для суммы рангов Крускала-Уоллиса: Kruskal. test.
4. Проведите коррекцию для множественных сравнений (включите все возможные сравнения, даже если n= 1 внутри группы) в R/Rstudio, используя критерий Данна (пороговое значением для значимости: p<0.025).
- 188 047678 (a) dunn.test с методом множественного сравнения = бонферрони.
Результаты.
Результаты представлены в табл. 64 ниже. Во всех 41 общедоступных наборах данных, собранных на портале cBioPortal, в которых сообщается как о вариации числа копий (CNV), так и экспрессии гена мРНК для EphA2, существуют многочисленные типов рака, при которых сообщали о случаях мелких делециях EphA2 (<2 копий). Хотя это встречалось и более редко, но, при этих же самых типах рака, субпопуляция опухолей скрывала глубокие делеции EphA2 (потеря >1 копии или биаллельная потеря), приращения EphA2 (2-3 копии) или амплификации EphA2 (>3 копий). Случаи, при которых >33% опухолей имели либо мелкие делеции, либо глубокие делеции, в EphA2 включали: хромофобную почечноклеточную карциному, холангиокарциному, феохромоцитому и параганглиому, плоскоклеточный рак легкого, молочной железы, прямой кишки, глиому головного мозга низкой степени злокачественности, рак печени, адренокортикальную карциному, мезотелиому, аденокарциному пищевода и рак толстой кишки. В отличие от этого, не было исследований, при которых >33% образцов имели либо приращения, либо амплификацию в EphA2. Взятые в совокупности, эти результаты показывают, что делеции в EphA2 ДНК обнаруживаются для целого ряда типов рака.
Приблизительно одна треть из всех образцов, проанализированных в 41 исследовании, скрывала вариации числа копий (CNV) EphA2. Исходя из этого высокого процента вариаций числа копий (CNV) во всех исследованиях и высокого процента мелких делеций в опухолях специфического типа, проводили статистическое испытание для выявления возможных взаимосвязей между изменениями числа копий и экспрессией РНК. Опухоли по признаку были отнесены к 1 из 5 классов:
a) глубокая делеция;
b) мелкая делеция;
c) диплоид;
d) приращение; или
e) амплификация.
Затем проводили тест Краскела-Уоллиса с целью выявления наличия отличий между классами (P < 0,01) при распределении величин экспрессии мРНК по классам. Для этих наборов данных TCGA с P<0,01 и для определения, какие классы отличались друг от друга, было проведено апостериорное тестирование путем расчета Z-статистики с скорректированными вычисленными P-величинами (Бонферони). Для простоты интерпретации, рассматривали попарные сравнения против диплоида по показателю (хотя рассчитывали все попарные P-величины). 19/41 из этих исследований имели в тесте Краскела-Уоллиса pвеличину <0,01, что указывало на то, что число копий статистически значимо связано с экспрессией РНК. Из этих 19 исследований, 17 из них имели поправку Бонферрони P < 0,025 для диплоида относительно мелкой делеции, что указывало на взаимосвязь снижения экспрессии EphA2 mRNA со уменьшением числа копий EphA2. Толька 2 из этих 19 исследований имели поправку Бонферрони P < 0,025 для диплоида относительно приращения, и эти оба исследования были исследованиями рака молочной железы. Кроме того, одно из этих исследований рака молочной железы (инвазивная карцинома молочной железы (TCGA, PanCancer Atlas)) имела поправку Бонферрони P < 0,025 как для диплоида относительно мелкой делеции, так и для диплоида относительно приращения, что позволяло предположить, что альтерации числа копий могут иметь сильное влияние на экспрессию EphA2 РНК при раке молочной железы.
Центральная догма генетики предполагает, что уменьшение числа копий в EphA2 приводит к снижению экспрессии РНК и белка. Поэтому, наблюдаемые взаимосвязи между потерей числа копий EphA2 и снижением экспрессии мРНК при различных типах опухолей позволяют предположить, что может быть также снижена и экспрессия белка EphA2. Аналогично, приращение числа копий EphA2 при раке молочной железы, которые были взаимосвязаны с повышением экспрессии мРНК, может также предполагать повышение экспрессии белка EphA2. Более того, более высокая экспрессия белка EphA2 (измеряемая методом сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS)) связана с повышением эффективности в отношении EphA2 конкретных бициклических конъюгатов лекарственных средств по изобретению (измеряемой по объему опухоли) в преклинических in vivo моделях. Исходя из совокупности приведенных выше фактов, можно предположить, что если альтерации числа копий, которые взаимосвязаны с изменениями экспрессии мРНК, действительно позволяют предсказывать уровни экспрессии белка, то тогда пациенты с опухолями, содержащими делеции числа копий EphA2, могут, с определенной долей вероятности, в меньшей степени отвечать на лечение бициклическими конъюгатами лекарственных средств по изобретению, специфичных к EphA2. Аналогично, если пациенты с опухолью имеют приращение числа копий EphA2 (например, при раке молочной железы), то, возможно, что эти пациенты, с определенной долей вероятности, будут в большей степени отвечать на лечение бициклическими конъюгатами лекарственных средств по изобретению в отношении EphA2. Поэтому, если пациенты были разделены на группы по статусу числа копий EphA2, то эта информация могла бы быть использована как для исключения, так и для отбора пациентов с целью повышения эффективности лечения бициклическими конъюгатами лекарственных средств по изобретению, специфичных к EphA2.
- 189 047678
Таблица 64
Результаты изучения взаимосвязи между вариациями числа копий (CNV) и экспрессией гена для EphA2
Название исследования | Подразделы | Число образцов/группа (n=X) | Критерий КраскелаУоллиса | Парное сравнение, Zстатистика(поправка рвеличины), Бонферрони | ||||||||
Глубокая делеция | Мелкая делеция | Диплоид | Приращени е | Амплифика ция | Статистика КраскелаУоллиса | р-величина | Глубокая делеция диплоид | Диплоид мелкая делеция | Диплоидприращени е | Амплифика ция диплоид | ||
Инв азив ная карц ино ма мол очи ой жел езы (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ИИ мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | 5 | 41 5 | 51 1 | 61 | 2 | 80,81 6 | 2,2Е -16 | 0,176 118 (1,000 0) | 6,4605 80 (0,0000 )* | 4,603 180 (0,000 0)* | 0,7139 78 (1,0000 ) |
- 190 047678
Пло скок лето чная карц ино ма легк ого (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ии мРН К из Ши mina HiSe q R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | 3 | 20 7 | 20 1 | 55 | 0 | 52,94 2 | 1,89 E-ll | 1,584 610 (0,339 2) | 6,7865 01 (0,0000 )* | 0,019 607 (1,000 0) | N/A |
Пап илля рная поче чноклет очна я карц ино ма (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Экс npec СИЯ мРН k, RSE M (nap ТИЯ, нор мал ИЗОВ айна я из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | 1 | 48 | 22 4 | 0 | 1 | 42,16 1 | 3,71 Е-09 | 1,586 207 (0,338 1) | 6,0973 75 (0,0000 )* | N/A | 1,5491 07 (0,3641 ) |
Свет локл еточ ная карц | Экс npec сия мРН к, | 0 | 69 | 27 8 | 5 | 0 | 38,34 2 | 4,72 Е-09 | N/A | 6,1332 19 (0,0000 )* | 0,487 059 (0,939 3) | N/A |
- 191 047678
ино ма почк и (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | RSE Μ (пар тия, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | |||||||||||
Аде нока рци ном а толе той киш ки (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | RSE M (nap ТИЯ, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | 3 | 13 2 | 24 5 | 8 | 0 | 35,39 7 | 1,00 E-07 | 2,158 194 (0,092 7) | 5,6706 00 (0,0000 )* | 0,781 046 (1,000 0) | N/A |
Пло скок лето чная карц ино ма голо вы и шеи (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Экс прес сия мРН к, RSE М (пар тия, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q_R NAS | 3 | 86 | 34 5 | 54 | 0 | 32,72 | 3,69 E-07 | 2,444 914 (0,043 5) | 4,6807 89 (0,0000 )* | 1,530 670 (0,377 6) | N/A |
- 192 047678
eqV 2) | ||||||||||||
Уро тели альн ая карц ино ма моч евог о пуз ыря (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | RSE М (пар тия, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | 0 | 73 | 24 5 | 80 | 4 | 28,90 6 | 2,34 E-06 | N/A | 5,2032 51 (0,0000 r | 0,211 744 (1,000 0) | 0,5817 04 (1,0000 ) |
Уве альн ая мела ном а (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ии мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | 0 | 24 | 56 | 0 | 0 | 21,05 1 | 4,47 E-06 | N/A | 4,5880 95 (0,0000 )* | N/A | N/A |
Аде нока рци | Экс npec СИЯ | 1 | 11 5 | 26 3 | 12 1 | 3 | 28,87 4 | 8,29 E-06 | 0,690 460 | 4,2801 00 | 0,626 707 | 2,2764 58 |
- 193 047678
ном а легк ого (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | мРН к, RSE М (пар тия, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | (1,000 0) | (0,0001 )* | (1,000 0) | (0,1141 ) | |||||||
Сер озна я цист аден окар цин ома яичн иков (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ии мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | 0 | 59 | 78 | 60 | 4 | 25,34 9 | 1,31 Е-05 | N/A | 4,3900 97 (0,0000 )* | 0,239 249 (1,000 0) | 0,2405 43 (1,0000 ) |
Рак мол очн ой жел езы (ME ТАВ | Экс npec СИИ мРН К (мик ром атри | 1 | 49 1 | 13 49 | 25 | 0 | 23,87 5 | 2,65 Е-05 | 0,568 937 (1,000 0) | 2,2745 64 (0,0688 ) | 4,115 288 (0,000 1)* | N/A |
- 194 047678
RIC, Natu re 2012 & Nat Com mun 2016 ) | чны й анал из) | |||||||||||
Мез отел иом a (ТС GA, Pan Can cer Atla s) | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ии мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | 0 | 29 | 50 | 3 | 0 | 18,86 6 | 8,00 Е-05 | N/A | 4,3194 25 (0,0000 г | 0,170 478 (1,000 0) | N/A |
Кол орек таль ная аден окар ЦИН ома (ТС GA, Natu re 2012 ) | PHK поел едовате льно сть RPK М | 0 | 53 | 13 8 | 2 | 0 | 18,84 7 | 8,08 Е-05 | N/A | 4,2980 92 (0,0000 )* | 0,338 975 (1,000 0) | N/A |
- 195 047678
Пло скок лето чная карц ино ма шей ки матк и (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | RSE М (пар тия, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | 1 | 31 | 16 7 | 76 | 0 | 19,43 5 | 2,22 Е-04 | 1,618 248 (0,316 8) | 3,4296 09 (0,0018 )* | 1,446 339 (0,444 2) | N/A |
Cap ком а (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ии мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | 0 | 43 | И 3 | 70 | 4 | 19,38 9 | 2,27 Е-04 | N/A | 3,6669 49 (0,0007 )* | 0,852 454 (1,000 0) | 0,9530 27 (1,0000 ) |
Энц икло леди я ЛИН ий рако вых | Экс npec СИИ мРН К (мик ром атри | 17 | 27 9 | 41 8 | 15 0 | 13 | 20,97 7 | 0,00 032 | 2,084 879 (0,185 4) | 3,6159 35 (0,0015 )* | 2,007 004 (0,223 | 0,1088 80 (1,0000 ) |
- 196 047678
клет ок (No varti s/Br oad, Natu re 2012 ) | чны й анал из) | |||||||||||
Аде нока рци ном а пря мой киш ки (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ии мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | 1 | 54 | 78 | 3 | 0 | 18,21 5 | 0,00 0397 1 | 1,926 519 (0,162 1) | 3,8771 66 (0,0003 г | 1,167 400 (0,729 1) | N/A |
Гепа тоце ллю лярн ая карц ино ма пене ни (ТС GA, Pan Сап сег | EPH A2: ЭКСП pecc ИЯ мРН k, RSE M (nap ТИЯ, нор мал изов анна я из | 1 | 13 0 | 19 4 | 21 | 2 | 15,51 4 | 0,00 3745 | 0,302 341 (1,000 0) | 3,6972 48 (0,0011 )* | 0,336 659 (1,000 0) | 0,4544 54 (1,0000 ) |
- 197 047678
Atla s) | Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | |||||||||||
Аде нока рци ном а жел удка (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар ТИЯ нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ИИ мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | 2 | 90 | 26 4 | 44 | 7 | 13,96 6 | 0,00 7404 | 2,072 978 (0,190 9) | 1,6060 72 (0,5413 ) | 1,750 466 (0,400 2) | 1,6028 06 (0,5449 ) |
Энд омет риал ьная карц ино ма тела матк и (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар ТИЯ нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ИИ мРН К из Ши mina HiSe q R | 3 | 61 | 39 5 | 43 | 5 | 12,91 6 | 0,01 17 | 1,905 863 (0,283 3) | 1,0393 07 (1,0000 ) | 1,597 383 (0,550 9) | 2,2687 98 (0,1164 ) |
- 198 047678
NAS eqV 2 syn4 9763 69 | ||||||||||||
Мел ано ма КОЖ и (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ни мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | 2 | 70 | 21 6 | 72 | 3 | 12,24 2 | 0,01 564 | 1,094 526 (1,000 0) | 2,6744 93 (0,0374 ) | 0,095 966 (1,000 0) | 1,6926 28 (0,4526 ) |
Аде нока рци ном а пред стат ельн ой жел езы (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Экс npec СИЯ мРН k, RSE M (nap ТИЯ, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q_R NAS | 0 | 44 | 43 8 | 4 | 1 | 10,11 2 | 0,01 764 | N/A | 2,9055 02 (0,0110 )* | 1,374 609 (0,507 8) | 0,0827 90 (1,0000 ) |
- 199 047678
eqV 2) | ||||||||||||
Χρο моф обна я поче чноклет очна я карц ино ма (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Экс прес сия мРН к, RSE М (пар тия, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | 0 | 52 | 12 | 1 | 0 | 7,878 1 | 0,01 947 | Ν/Α | 2,4983 40 (0,0187 )* | 1,863 169 (0,093 7) | Ν/Α |
Опу холь Вил ьмса в детс ком возр асте (ТА RGE т, 2018 ) | Eph a2: ЭКСП pecc ИЯ мРН К (PH K- ПОСЛ едовате льно сть RPK Μ) | 0 | 22 | 74 | 5 | 0 | 7,491 2 | 0,02 362 | Ν/Α | 2,6907 66 (0,0107 )* | 0,173 274 (1,000 0) | Ν/Α |
Фео хро моц ито ма и пара ганг ЛИО ма (ТС | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой | 4 | 96 | 60 | 1 | 0 | 8,807 4 | 0,03 196 | 1,411 567 (0,474 2) | 2,2013 44 (0,0831 ) | 1,946 134 (0,154 9) | Ν/Α |
- 200 047678
θΑ, | эксп | |||||||||||
Pan Can cer Atla s) | ресс ин мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | |||||||||||
Кар ЦИН ома щит ОВИД ной жел езы (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ИИ мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | 0 | 4 | 47 4 | 2 | 0 | 5,177 3 | 0,08 | N/A | 2,2218 84 (0,0394 ) | 0,503 577 (0,921 8) | N/A |
Аде нока рци ном а пищ евод а (ТС GA, Pan | RSE M (nap ТИЯ, нор мал изов анна я из Ши mina | 1 | 64 | 83 | 32 | 1 | 7,688 6 | 0,10 37 | 1,462 679 (0,717 8) | 0,9109 90 (1,0000 ) | 1,682 311 (0,462 5) | 0,3622 98 (1,0000 ) |
- 201 047678
Can сег Atla s) | HiSe q_R NAS eqV 2) | |||||||||||
Хол анги окар ЦИН ома (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | RSE M (nap ТИЯ, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | 2 | 27 | 7 | 0 | 0 | 4,169 1 | 0,12 44 | 2,037 840 (0,062 3) | 0,9721 00 (0,4965 ) | N/A | N/A |
Гли ома голо вног о мозг а низк ой степ ени злок ачес твен ноет и (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | RSE M (nap ТИЯ, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | 0 | 19 1 | 30 3 | 13 | 0 | 4,047 3 | 0,13 22 | N/A | 0,7223 83 (0,7051 ) | 1,771 514 (0,Н4 Ό | N/A |
Тим ома (ТС GA, Pan Сап сег | Пар тия нор мал изов анно й/об | 0 | 8 | И 0 | 1 | 0 | 4,032 2 | 1,33 Е-01 | N/A | 1,9823 34 (0,0712 ) | 0,369 115 (1,000 0) | N/A |
- 202 047678
Atla s) | ъеди ненн ой эксп ресс ИИ мРН К из Ши mina HiSe q R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | |||||||||||
Ост рый ЛИМ фол ейко з в детс ком возр асте фаза П (ТА RGE т, 2018 ) | Eph a2: ЭКСП pecc ИЯ мРН К (PH K- ПОСЛ едовате льно сть RPK Μ) | 1 | 6 | 70 | 4 | 0 | 5,530 9 | 0,13 68 | 1,437 404 (0,451 8) | 0,8051 00 (1,0000 ) | 1,607 586 (0,323 8) | Ν/Α |
Диф фуз ная Вкруп нокл еточ ная ЛИМ фом а (ТС GA, Pan Сап | Экс прес сия мРН к, RSE М (пар тия, нор мал изов анна я из Ши | 0 | 4 | 33 | 0 | 0 | 1,744 | 0,18 66 | Ν/Α | 1,3206 13 (0,0933 ) | Ν/Α | Ν/Α |
- 203 047678
cer Atla s) | mina HiSe q_R NAS eqV 2) | |||||||||||
Мул ьти фор мна я глио блас тома (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Экс npec СИЯ mPH k, RSE M (nap ТИЯ, нор мал ИЗОВ анна я из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | 0 | 13 | 10 4 | 28 | 0 | 2,937 6 | 0,23 02 | Ν/Α | 1,4287 78 (0,2296 ) | 0,716 110 (0,710 9) | Ν/Α |
Мет аста типе ский рак пред стат ельн ой жел езы, SU2 С/Р CF Drea m Tea m (Rob inso n et al., Cell | Экс npec СИЯ mPH К/за хват (PH K- ПОСЛ едов ател ьнос ть RPK Μ) | 2 | 21 | 87 | 7 | 0 | 4,069 | 0,25 4 | 1,812 613 (0,209 Ό | 0,9925 71 (0,9628 ) | 0,314 089 (1,000 0) | Ν/Α |
- 204 047678
2015 ) | ||||||||||||
Ост рый мие лоле йкоз (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Экс npec сия мРН к, RSE М (пар тия, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2) | 0 | 1 | 16 0 | 4 | 0 | 2,401 6 | 0,30 1 | N/A | 1,5391 42 (0,1857 ) | 0,199 532 (1,000 0) | N/A |
Опу ХОЛ и пол овы X клет ок яичк а (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ии мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 | 1 | 29 | 92 | 22 | 0 | 3,314 4 | 0,34 56 | 0,574 846 (1,000 0) | 0,4431 10 (1,0000 ) | 1,751 161 (0,239 8) | N/A |
- 205 047678
9763 69 | ||||||||||||
Адр енок орти каль ная карц ино ма (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | RSE М (пар тия, нор мал изов анна я из Ши mina HiSe q R NAS eqV 2) | 0 | 28 | 47 | 1 | 0 | 2,000 3 | 0,36 78 | N/A | 1,3463 97 (0,2673 ) | 0,550 103 (0,873 4) | N/A |
Кар ЦИН осар ком а матк и (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | Пар тия нор мал изов анно й/об ъеди ненн ой эксп ресс ии мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | 0 | 16 | 22 | 16 | 2 | 2,44 | 0,48 62 | N/A | 0,4760 71 (1,0000 ) | 0,550 292 (1,000 0) | 1,2151 02 (0,6730 ) |
Аде нока рци ном а под | Пар тия нор мал изов анно | 2 | 50 | 10 6 | 9 | 1 | 3,383 3 | 4,96 Е-01 | 1,195 082 (1,000 0) | 0,1594 42 (1,0000 ) | 0,602 558 (1,000 0) | 1,2176 97 (1,0000 ) |
- 206 047678
жел удоч ной жел езы (ТС GA, Pan Сап сег Atla s) | й/об ъеди ненн ой эксп ресс ни мРН К из Ши mina HiSe q_R NAS eqV 2 syn4 9763 69 | |||||||||||
Аде нока рци ном а пред стат ельн ой жел езы (MS КС с, Сап сег Cell 2010 ) | Экс npec СИЯ мРН К | 0 | 5 | 77 | 3 | 0 | 1,313 9 | 0,51 84 | N/A | 0,4065 79 (1,0000 ) | 1,089 948 (0,413 6) | N/A |
Аде нока рци ном а пред стат ельн ой жел езы (Fre d Hute hins on CRC , Nat Med 2016 ) | Экс npec сия мРН К | 0 | 39 | 84 | 10 | 0 | 0,028 351 | 0,98 59 | N/A | 0,1604 04 (1,0000 ) | 0,079 785 (1,000 0) | N/A |
- 207 047678
Перечень последовательностей <110> BicycleTx Limited <120> БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДНЫЕ ЛИГАНДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К EphA2 <130> BIC-C-P2288PCT <150> GB1721259.8 <151> 2017-12-19 <150> GB1804102.0 <151> 2018-03-14 <150> GB1818603.1 <151> 2018-11-14 <160>98 <170> PatentIn version 3.5 <210>1 <211>15 <212> БЕЛОК < 213> Искусственный <220>
< 223> Синтетический пептид <220>
< 221> Xaa < 222> (2) .. (2) < 223> X представляет HyP <220>
< 221> Xaa < 222> (12)..(12) < 223> Xaa представляет D-Asp <220>
< 221> Xaa < 222> (14)..(14) <223> Xaa представляет HArg <400>1
Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp Xaa Cys 1 5 1015 <210>2 <211>20 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (1)..(1)
- 208 047678 <223> Xaa представляет Beta-Ala <220>
<221> Xaa <222> (2) .. (2) <223> Xaa представляет Sar10 <220>
<221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa представляет HArg <220>
<221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa представляет HyP <220>
<221> Xaa <222> (17)..(17) <223> Xaa представляет D-Asp <220>
<221> Xaa <222> (19)..(19) <223> Xaa представляет HArg <400>2
Xaa Xaa Ala Xaa Asp Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His 1 5 1015
Pro
Xaa Trp Xaa Cys 20 <210>3 <211>15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>3
Ala Cys Met Asn Asp Trp Trp Cys Ala Met 1 510
Gly Trp Lys Cys Ala <210>4 <211>15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 4
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala 1 5
Tyr Met Asn Val Cys Ala
15
- 209 047678 <210> 5 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 5
Ala Cys Val Val Asp Gly Arg Cys Ala 1 5
Tyr Met Asn Val Cys Ala
15 <210> 6 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 6
Ala Cys Val Val Asp Ser Arg Cys Ala 1 5
Tyr Met Asn Val Cys Ala
15 <210> 7 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 7
Ala Cys Val Pro Asp Ser Arg Cys Ala 1 5
Tyr Met Asn Val Cys Ala
15 <210> 8 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 8
Ala Cys Tyr Val Gly Lys Glu Cys Ala 1 5
Ile Arg Asn Val Cys Ala
15 <210> 9 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный
- 210 047678 <220>
<223> Синтетический пептид <400> 9
Ala Cys Tyr Val Gly Lys Glu Cys Ala 1 5 <210> 10 <211> 18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 10
Ala Arg Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro
5
Thr Cys <210> 11 <211> 18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa представляет собой HArg <400> 11
Ala Xaa Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro 1 5
Thr Cys <210> 12 <211> 18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 12
Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu 1 5
Met Asn Val Cys Ala
Cys Leu His Pro Gly Trp
Cys Leu His Pro Gly Trp 15
Pro Gly Trp Thr Cys Leu 15
- 211 047678
His Gly <210> 13 <211> 18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (17)..(17) <223> Xaa представляет собой D-His <400>13
Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Thr Cys Leu
5 1015
Xaa Gly <210>14 <211>18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>14
Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu 15
His Pro Gly Trp Ser Cys Arg
15
Gly Gln <210>15 <211>18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (16)..(16) <223> Xaa представляет собой HArg <400> 15
- 212 047678
Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu His Pro Gly Trp Ser Cys Xaa
15
Gly Gln <210> 16 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 16
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala 1 5
Tyr Met Asn Val Cys <210> 17 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 17
Asp Leu Arg Cys Gly Gly Asp Pro Arg 1 5
Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
15
Ala <210> 18 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 18
Ser Arg Pro Cys Val Ile Asp Ser Arg
5
Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
15
Ala <210> 19 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный
- 213 047678 <220>
<223> Синтетический пептид <400>19
Glu Ser Arg Cys Ser Pro Asp Ala Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
5 1015
Ala <210>20 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>20
His Ser Gly Cys Arg Pro Asp Pro Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
5 1015
Ala <210>21 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>21
Gly Ser Gly Cys Lys Pro Asp Ser Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
5 1015
Ala <210>22 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 22
Glu Thr Val Cys Leu Pro Asp Ser Arg Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
5 10 15
- 214 047678
Ala <210> 23 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 23
Gly Gln Val Cys Ile Val Asp Ala Arg 1 5
Ala
Cys Ala Tyr Met Asn Val Cys
15 <210> 24 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 24
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala 1 5
Phe Glu Asn Val Cys Val Asp
15
His <210> 25 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 25
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala 1 5
Phe Met Asn Val Cys Glu Asp
15
Arg <210> 26 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный
- 215 047678 <220>
<223> Синтетический пептид <400> 26
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala 1 5
Glu <210> 27 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 27
Ala Cys Val Pro Asp Arg Arg Cys Ala
5
Gly <210> 28 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 28
Ala Cys Gln Pro Ser Asn His Cys Ala 1 5 <210> 29 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 29
Ala Cys Ser Pro Thr Pro Ala Cys Ala 1 5
Gln Asp Val Cys Asp His 15
Arg Asp Val Cys Leu Thr
Met Asn Tyr Cys Ala
Gln Asn Leu Cys Ala <210> 30 <211> 14 <212> БЕЛОК
- 216 047678 <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 30
Ala Cys Thr Ser Cys Trp Ala 1 5
Tyr Pro Asp Ser Phe Cys Ala 10 <210> 31 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 31
Ala Cys Thr Lys Pro Thr Gly Phe Cys 1 5
Ala Tyr Pro Asp Thr Ile Cys
15
Ala <210> 32 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 32
Ala Cys Arg Gly Glu Trp Gly Tyr Cys 1 5
Ala Tyr Pro Asp Thr Ile Cys
15
Ala <210> 33 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 33
Ala Cys Arg Asn Trp Gly Met Tyr Cys 1 5
Ala Tyr Pro Asp Thr Ile Cys
15
Ala
- 217 047678 <210> 34 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>34
Ala Cys Pro Asp Trp Gly Lys Tyr Cys 15
Ala <210>35 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>35
Ala Cys Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Cys 15
Ala Tyr Pro Asp Thr Ile Cys
15
Ala Tyr Pro Asp Thr Ile Cys
15
Ala <210>36 <211>14 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 36
Ala Cys Ser Ser Cys Trp Ala 1 5
Tyr Pro Asp Ser Val Cys Ala 10 <210> 37 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 37
Ala Cys Gln Ser Cys Trp Ala Tyr Pro Asp Thr
Tyr Cys Ala
- 218 047678 <210> 38 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>38
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys 1 510
Glu Thr Phe Cys Ala <210>39 <211>15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 39
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Val 1 5
Pro Cys Glu Val His Cys Ala
15 <210> 40 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 40
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys 1 5 10
Glu Met Val Cys Ala <210> 41 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 41
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys Val
5 10
Thr Tyr Cys Ala 15 <210> 42 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный
- 219 047678 <220>
<223> Синтетический пептид <400>42
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys 1 510
Glu Leu Val Cys Ala <210>43 <211>15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 43
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Val 1 5
Pro Cys Asn Val Phe Cys Ala
15 <210> 44 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 44
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys 1 5 10
Glu Leu Phe Cys Ala <210> 45 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 45
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro 1 5
Cys Glu Leu Phe Cys Met Pro
15
Lys <210> 46 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид
- 220 047678 <400> 46
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys 1 5 10
Glu Leu Tyr Cys Ala <210> 47 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 47
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro 1 5
Cys Glu Leu Tyr Cys Ala His
15
Thr <210> 48 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 48
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Glu Pro Cys Glu Met 1 5 10
Tyr Cys Ala <210> 49 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 49
Ala Cys Gly Phe Met Gly Leu Val Pro 1 5
Cys Glu Leu Tyr Cys Ala Asp
15
Asn <210> 50 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
- 221 047678 <223> Синтетический пептид <400> 50
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Ala
Leu Thr Ser Gly Trp Lys Cys
15 <210> 51 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 51
Ala Cys Pro Met Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu His Pro Gly Trp Ile Cys
15
Ala <210> 52 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 52
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu His Pro Gly Trp Ile Cys
15
Ala <210> 53 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 53
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu His Pro Gly Trp Arg Cys
15
Ala
- 222 047678 <210> 54 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>54
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 15
Ala
Asn Leu Pro Gly Trp Thr Cys
15 <210>55 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>55
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Val Pro Gly Trp Ser Cys
5 1015
Ala <210>56 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 56
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Leu Asp Gly Trp Thr Cys
5 10 15
Ala <210> 57 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
- 223 047678 <223> Синтетический пептид <400> 57
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Ala
Leu Met Pro Gly Trp Gly Cys
15 <210> 58 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 58
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Met Ile Gly Asn Trp Thr Cys
15
Ala <210> 59 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 59
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu Met Thr Gly Trp Ser Cys
15
Ala <210> 60 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 60
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Met Met Gly Gly Trp Lys Cys
15
Ala
- 224 047678 <210> 61 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>61
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 15
Ala
Leu Tyr Gly Ser Trp Lys Cys
15 <210>62 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>62
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Thr Cys
5 1015
Ala <210>63 <211>19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 63
Ala Arg Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp
5 10 15
Thr Cys Ala <210> 64 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
- 225 047678 <223> Синтетический пептид <400> 64
Arg Pro Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro
5
Thr Cys Ala <210> 65 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 65
Arg Pro Pro Cys Pro Leu Val Asn Pro 1 5
Thr Cys Ala <210> 66 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 66
Lys His Ser Cys Pro Leu Val Asn Pro
5
Thr Cys Ala <210> 67 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 67
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Cys Leu His Pro Gly Trp 15
Cys Leu His Pro Gly Trp 15
Cys Leu His Pro Gly Trp 15
His Pro Gly Trp Thr Cys 15
Leu His Gly
- 226 047678 <210> 68 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (18).. (18) <223> Xaa представляет собой D-His <400> 68
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu Xaa Gly <210> 69 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa представляет собой 2Nal <400> 69
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu His Gly <210> 70 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 70
Arg His Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro 1 5
His Pro Gly Trp Thr Cys 15
His Pro Gly Xaa Thr Cys 15
Cys Leu Leu Pro Gly Trp 15
- 227 047678
Thr Cys Ala <210> 71 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 71
Thr Pro Arg Cys Pro Leu Val Asn Pro 1 5
Leu Cys Leu Met Pro Gly Trp
15
Thr Cys Ala <210> 72 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 72
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu Ala Pro Gly Trp Thr Cys
15
Ala <210> 73 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 73
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu Ala Pro Gly Trp Thr Cys
15
Ser Arg Ser <210> 74 <211> 17 <212> БЕЛОК
- 228 047678 <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>74
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Glu Pro Gly Trp Thr Cys
5 1015
Ala <210>75 <211>19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>75
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Glu Pro Gly Trp Thr Cys
5 1015
Ala Lys Arg <210>76 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>76
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Ser Cys
5 1015
Ala <210>77 <211>19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 77
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp Ser Cys
5 10 15
- 229 047678
Arg Gly Gln <210> 78 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (17)..(17) <223> Xaa представляет собой HArg <400>78
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 15
Xaa Gly Gln <210>79 <211>19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa представляет собой 2Nal <400>79
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 15
Leu His Pro Gly Trp Ser Cys
15
Leu His Pro Gly Xaa Ser Cys
15
Arg Gly Gln <210>80 <211>19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 80
- 230 047678
Ala Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Thr Asn Thr
Leu Thr Pro Gly Trp Thr Cys
15 <210> 81 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 81
Ala Cys Pro Met Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu His Pro Gly Trp Lys Cys
15
Ala <210> 82 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 82
Ala Cys Pro Met Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu Thr Pro Gly Trp Ile Cys
15
Ala <210> 83 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 83
Ala Cys Pro Met Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu His Pro Gly Trp Thr Cys
15
Ala
- 231 047678 <210> 84 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> | Xaa |
<222> | (2) . . (2) |
<223> | Xaa представляет собой D-Asp |
<220> <221> <222> <223> | Xaa (6) . Xaa | . (6) представляет | собой | Aib |
<220> | ||||
<221> | Xaa | |||
<222> | (7) . | .(7) | ||
<223> | Xaa | представляет | собой | 1Nal |
<220> | ||||
<221> | Xaa | |||
<222> | (9) . | .(9) | ||
<223> | Xaa | представляет | собой | Aib |
<220> | ||||
<221> | Xaa | |||
<222> | (11) | ..(11) | ||
<223> | Xaa | представляет | собой | 1Nal |
<220> | ||||
<221> | Xaa | |||
<222> | (14) | ..(14) | ||
<223> | Xaa | представляет | собой | tBuGly |
<220> | ||||
<221> | Xaa | |||
<222> | (16) | ..(16) | ||
<223> | Xaa | представляет | собой | HArg |
<220> | ||||
<221> | Xaa | |||
<222> | (18) | ..(18) | ||
<223> | Xaa | представляет | собой | D-Asp |
<400> | 84 |
His Xaa Val Thr Cys Xaa Xaa Gly Xaa 15
Phe Xaa Cys Pro Xaa Asn Xaa
15
Pro Xaa Cys <210>85 <211>18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный
- 232 047678 <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa представляет собой HArg <220>
<221> Xaa < 222> (5)..(5) < 223> Xaa представляет собой HyP <220>
< 221> Xaa < 222> (6)..(6) < 223> Xaa представляет собой Hse(Me) <220>
< 221> Xaa < 222> (15)..(15) < 223> Xaa представляет собой D-Asp <220>
< 221> Xaa < 222> (17) .. (17) <223> Xaa представляет собой HArg <400>85
Ala Xaa Asp Cys Xaa Xaa Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp 1 5 1015
Xaa Cys <210>86 <211>18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa < 222> (2)..(2) < 223> Xaa представляет собой HArg <220>
< 221> Xaa < 222> (5)..(5) < 223> Xaa представляет собой HyP <220>
< 221> Xaa < 222> (6)..(6) <223> Xaa представляет собой Hse(Me)
- 233 047678 <220>
<221> Xaa <222> (15)..(15) <223> Xaa представляет собой D-Asp <400>86
Ala Xaa Asp Cys Xaa Xaa Val Asn Pro 15
Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp
15
Thr Cys <210>87 <211>18 <212> БЕЛОК < 213> Искусственный <220>
< 223> Синтетический пептид <220>
< 221> Xaa < 222> (2)..(2) < 223> Xaa представляет собой HArg <220>
< 221> Xaa < 222> (5)..(5) < 223> Xaa представляет собой HyP <220>
< 221> Xaa < 222> (15)..(15) < 223> Xaa представляет собой D-Ala <400>87
Ala Xaa Asp Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp
5 1015
Thr Cys <210>88 <211>18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa представляет собой HArg
- 234 047678 <220>
<221> Xaa <222> (15)..(15) <223> Xaa представляет собой D-Ala <400>88
Ala Xaa Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp
5 1015
Thr Cys <210>89 <211>18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa представляет собой HyP <400>89
Ala Arg Asp Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Gly Trp
5 1015
Thr Cys <210>90 <211>18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa представляет собой D-3,3-DPA <400> 90
Ala Arg Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Gly Trp
5 10 15
Thr Cys
- 235 047678 <210> 91 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>91
Ala Arg Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro 15
Leu Cys Leu His Pro Gly Trp
15
Thr Cys Leu His <210>92 <211>18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa представляет собой HArg <220>
<221> Xaa <222> (15)..(15) <223> Xaa представляет собой Cya <400>92
Ala Xaa Asp Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp
5 1015
Thr Cys <210>93 <211>18 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa представляет собой D-Arg <220>
- 236 047678 <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa представляет собой HyP <220>
<221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa представляет собой D-3,3-DPA <220>
<221> Xaa <222> (15)..(15) <223> Xaa представляет собой D-Asp <220>
<221> Xaa <222> (17) .. (17) <223> Xaa представляет собой HArg <400>93
Ala Xaa Asp Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Xaa Trp
5 1015
Xaa Cys <210>94 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400>94
Ala Cys Pro Trp Gly Pro Ala 1 5
Trp Cys Pro Val Asn Arg Pro Gly Cys
1015
Ala <210>95 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 95
Ala Cys Pro Trp Gly Pro Phe Trp Cys 1 5
Pro Val Asn Arg Pro Gly Cys
15
Ala
- 237 047678 <210> 96 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 96
Ala Asp Val 1
Thr Cys Pro Trp Gly Pro 5
Phe Trp Cys Pro Val Asn Arg
1015
Pro Gly Cys Ala <210>97 <211>15 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <400> 97
Cys Pro Leu Val Asn Pro Leu Cys 1 5
Leu His Pro Gly Trp Thr Cys
15 <210> 98 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственный <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> Xaa < 222> (3)..(3) < 223> Xaa представляет собой Cit <220>
< 221> Xaa < 222> (5)..(5) < 223> Xaa представляет собой hPhe <400> 98
Glu Pro Xaa Gly Xaa Tyr Leu
Claims (19)
1. Пептидный лиганд, обладающий специфичностью к EphA2, или его фармацевтически приемлемая соль, включающий полипептид, содержащий, по меньшей мере, три остатка цистеина, разделенных, по меньшей мере, двумя петлевыми последовательностями, и неароматический молекулярный каркас, который образует ковалентные связи с остатками цистеина полипептида таким образом, что на молекулярном каркасе формируются, по меньшей мере, две полипептидные петли, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
ACMNDWWCAMGWKCA (SEQ ID NO: 3);
ACVPDRRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 4);
ACVVDGRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 5);
ACVVDSRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 6);
ACVPDSRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 7);
ACYVGKECAIRNVCA (SEQ ID NO: 8);
ACYVGKECAYMNVCA (SEQ ID NO: 9);
ARDCPLVNPLCLHPGWTC (SEQ ID NO: 10);
A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC (SEQ ID NO: 11);
CPLVNPLCLHPGWTCLHG (SEQ ID NO: 12);
CPLVNPLCLHPGWTCL(D-His)G (SEQ ID NO: 13);
CPLVNPLCLHPGWSCRGQ (SEQ ID NO: 14);
CPLVNPLCLHPGWSC(HArg)GQ (SEQ ID NO: 15);
ACVPDRRCAYMNVC (SEQ ID NO: 16);
DLRCGGDPRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 17);
SRPCVIDSRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 18);
ESRCSPDARCAYMNVCA (SEQ ID NO: 19);
HSGCRPDPRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 20);
GSGCKPDSRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 21);
ETVCLPDSRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 22);
GQVCIVDARCAYMNVCA (SEQ ID NO: 23);
ACVPDRRCAFENVCVDH (SEQ ID NO: 24);
CVPDRRCAFMNVCEDR (SEQ ID NO: 25);
ACVPDRRCAFQDVCDHE (SEQ ID NO: 26);
ACQPSNHCAFMNYCA (SEQ ID NO: 28);
ACSPTPACAVQNLCA (SEQ ID NO: 29);
ACTSCWAYPDSFCA (SEQ ID NO: 30);
ACTKPTGFCAYPDTICA (SEQ ID NO: 31);
ACRGEWGYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 32);
ACRNWGMYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 33);
ACPDWGKYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 34);
ACRVYGPYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 35);
ACSSCWAYPDSVCA (SEQ ID NO: 36);
ACQSCWAYPDTYCA (SEQ ID NO: 37);
ACGFMGLEPCETFCA (SEQ ID NO: 38);
ACGFMGLVPCEVHCA (SEQ ID NO: 39);
ACGFMGLEPCEMVCA (SEQ ID NO: 40);
ACGFMGLEPCVTYCA (SEQ ID NO: 41);
ACGFMGLEPCELVCA (SEQ ID NO: 42);
ACGFMGLVPCNVFCA (SEQ ID NO: 43);
ACGFMGLEPCELFCA (SEQ ID NO: 44);
ACGFMGLEPCELFCMPK (SEQ ID NO: 45);
ACGFMGLEPCELYCA (SEQ ID NO: 46);
ACGFMGLEPCELYCAHT (SEQ ID NO: 47);
ACGFMGLEPCEMYCA (SEQ ID NO: 48);
ACGFMGLVPCELYCADN (SEQ ID NO: 49);
ACPLVNPLCLTSGWKCA (SEQ ID NO: 50);
ACPMVNPLCLHPGWICA (SEQ ID NO: 51);
ACPLVNPLCLHPGWICA (SEQ ID NO: 52);
ACPLVNPLCLHPGWRCA (SEQ ID NO: 53);
ACPLVNPLCNLPGWTCA (SEQ ID NO: 54);
ACPLVNPLCLVPGWSCA (SEQ ID NO: 55);
ACPLVNPLCLLDGWTCA (SEQ ID NO: 56);
- 239 047678
ACPLVNPLCLMPGWGCA (SEQ ID NO: 57);
ACPLVNPLCMIGNWTCA (SEQ ID NO: 58);
ACPLVNPLCLMTGWSCA (SEQ ID NO: 59);
ACPLVNPLCMMGGWKCA (SEQ ID NO: 60);
ACPLVNPLCLYGSWKCA (SEQ ID NO: 61);
ACPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 62);
ARDCPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 63);
RPACPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 64);
RPPCPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 65);
KHSCPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 66);
ACPLVNPLCLHPGWTCLHG (SEQ ID NO: 67);
ACPLVNPLCLHPGWTCL(D-His)G (SEQ ID NO: 68);
ACPLVNPLCLHPG(2Nal)TCLHG (SEQ ID NO: 69);
RHDCPLVNPLCLLPGWTCA (SEQ ID NO: 70);
TPRCPLVNPLCLMPGWTCA (SEQ ID NO: 71);
ACPLVNPLCLAPGWTCA (SEQ ID NO: 72);
ACPLVNPLCLAPGWTCSRS (SEQ ID NO: 73);
ACPLVNPLCLEPGWTCA (SEQ ID NO: 74);
ACPLVNPLCLEPGWTCAKR (SEQ ID NO: 75);
ACPLVNPLCLHPGWSCA (SEQ ID NO: 76);
ACPLVNPLCLHPGWSCRGQ (SEQ ID NO: 77);
ACPLVNPLCLHPGWSC(HArg)GQ (SEQ ID NO: 78);
ACPLVNPLCLHPG(2Nal)SCRGQ (SEQ ID NO: 79);
ACPLVNPLCLTPGWTCTNT (SEQ ID NO: 80);
ACPMVNPLCLHPGWKCA (SEQ ID NO: 81);
ACPMVNPLCLTPGWICA (SEQ ID NO: 82);
ACPMVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 83);
H(D-Asp)VT-C(Aib)(1Nal)G(Aib)F(1Nal)CP(tBuGly)N(HArg)P(D-Asp)C (SEQ ID NO: 84);
A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)W(HArg)C (SEQ ID NO: 85);
A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)WTC (SEQ ID NO: 86);
A(HArg)DC(HyP)LVNPLCLHP(D-Ala)WTC (SEQ ID NO: 87);
A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Ala)WTC (SEQ ID NO: 88);
ARDC(HyP)LVNPLCLHPGWTC (SEQ ID NO: 89);
ARDCPLVNPLCL(D-3,3-DPA)PGWTC (SEQ ID NO: 90);
ARDCPLVNPLCLHPGWTCLH (SEQ ID NO: 91);
A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Cya)WTC (SEQ ID NO: 92);
A(D-Arg)DC(HyP)LVNPLCL(D-3,3-DPA)P(D-Asp)W(HArg)C (SEQ ID NO: 93); и
CPLVNPLCLHPGWTC (SEQ ID NO: 97);
где HyP представляет собой гидроксипролин, HArg представляет собой гомоаргинин, Sar представляет собой саркозин, HArg представляет собой гомоаргинин, D-Asp представляет собой Dаспарагиновую кислоту, 2Nal представляет собой 2-нафтилаланин, 1Nal представляет собой 1нафтилаланин, Aib представляет собой 2-аминоизомасляную кислоту, tBuGly представляет собой третлейцин, hSerMe представляет собой гомосерин(метил), D-Ala представляет собой D-аланин, D-3,3-DPA представляет собой 3,3-дифенил^-аланин, D-Cya представляет собой D-цистеиновую. кислоту, D-Arg представляет собой D-аргинин, HPhe представляет собой гомофенилаланин и D-His представляет собой D-гистидин.
2. Пептидный лиганд по п.1, где молекулярный каркас выбирают из 1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5триил)трипроп-2-ен-1 -она (TATA).
3. Пептидный лиганд по п.1 или 2, где молекулярный каркас выбирают из 1,1',1-(1,3,5-триазинан1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1-она (TATA), и пептидный лиганд представляет собой (e-Ala)-Sar10-A(HArg)D-C1PLVNPLC11LHPGWTC111 ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 11)) (BCY6014; соединение 67);
где Sar представляет собой саркозин и HArg представляет собой гомоаргинин.
4. Пептидный лиганд по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный пептидный лиганд выбран из:
ACMNDWWCAMGWKCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 3)-Sai6-K(F1));
ACVPDRRCAYMNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 4)-Sar6-K(F1));
ACVVDGRCAYMNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 5)-Sar6-K(F1));
ACVVDSRCAYMNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 6)-Sar6-K(F1));
ACVPDSRCAYMNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 7)-Sar6-K(F1));
ACYVGKECAIRNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 8)-Sar6-K(F1));
ACYVGKECAYMNVCA-Sar6-K(F1) ((SEQ ID NO: 9)-Sar6-K(F1));
- 240 047678
F1-G-Sar5-ACYVGKECAYMNVCA (F1-G-Sar5-(SEQ ID NO: 9));
F1-(e-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCLHPGWTC (Fl-(e-Ala)-SarlO-(SEQ ID NO: 10));
F1-(e-Ala)-Sar10-A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC (Fl-(e-Ala)-SarlO-(SEQ ID NO: 11);
Ac-CPLVNPLCLHPGWTCLHG-Sar6-(D-K[F1]) (Ac-(SEQ ID NO: 12)-Sar6-(D-K[F1]));
Ac-CPLVNPLCLHPGWTCL(D-His)G-Sar6-(D-K[F1]) (Ac-SEQ ID NO: 13)-Sar6-(D-K[F1]));
Ac-CPLVNPLCLHPGWSCRGQ-Sar6-(D-K[F1]) (Ac-(SEQ ID NO: 14)- Sar6-(D-K[F1]));
Ac-CPLVNPLCLHPGWSC(HArg)GQ-Sar6-(D-K[F1]) (Ac-(SEQ ID NO: 15)- Sar6-(D-K[F1]));
ACMNDWWCAMGWKCA (SEQ ID NO: 3);
ACVPDRRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 4);
(e-Ala)-Sar10-ACVPDRRCAYMNVC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 16));
DLRCGGDPRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 17);
SRPCVIDSRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 18);
ESRCSPDARCAYMNVCA (SEQ ID NO: 19);
HSGCRPDPRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 20);
GSGCKPDSRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 21);
ETVCLPDSRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 22);
GQVCIVDARCAYMNVCA (SEQ ID NO: 23);
ACVPDRRCAFENVCVDH (SEQ ID NO: 24);
ACVPDRRCAFMNVCEDR (SEQ ID NO: 25);
ACVPDRRCAFQDVCDHE (SEQ ID NO: 26);
ACYVGKECAYMNVCA (SEQ ID NO: 9);
ACQPSNHCAFMNYCA (SEQ ID NO: 28);
ACSPTPACAVQNLCA (SEQ ID NO: 29);
ACTSCWAYPDSFCA (SEQ ID NO: 30);
ACTKPTGFCAYPDTICA (SEQ ID NO: 31);
ACRGEWGYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 32);
ACRNWGMYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 33);
ACPDWGKYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 34);
ACRVYGPYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 35);
ACSSCWAYPDSVCA (SEQ ID NO: 36);
ACQSCWAYPDTYCA (SEQ ID NO: 37);
ACGFMGLEPCETFCA (SEQ ID NO: 38);
ACGFMGLVPCEVHCA (SEQ ID NO: 39);
ACGFMGLEPCEMVCA (SEQ ID NO: 40);
ACGFMGLEPCVTYCA (SEQ ID NO: 41);
ACGFMGLEPCELVCA (SEQ ID NO: 42);
ACGFMGLVPCNVFCA (SEQ ID NO: 43);
ACGFMGLEPCELFCA (SEQ ID NO: 44);
ACGFMGLEPCELFCMPK (SEQ ID NO: 45);
ACGFMGLEPCELYCA (SEQ ID NO: 46);
ACGFMGLEPCELYCAHT (SEQ ID NO: 47);
ACGFMGLEPCEMYCA (SEQ ID NO: 48);
ACGFMGLVPCELYCADN (SEQ ID NO: 49);
ACPLVNPLCLTSGWKCA (SEQ ID NO: 50);
ACPMVNPLCLHPGWICA (SEQ ID NO: 51);
ACPLVNPLCLHPGWICA (SEQ ID NO: 52);
ACPLVNPLCLHPGWRCA (SEQ ID NO: 53);
ACPLVNPLCNLPGWTCA (SEQ ID NO: 54);
ACPLVNPLCLVPGWSCA (SEQ ID NO: 55);
ACPLVNPLCLLDGWTCA (SEQ ID NO: 56);
ACPLVNPLCLMPGWGCA (SEQ ID NO: 57);
ACPLVNPLCMIGNWTCA (SEQ ID NO: 58);
ACPLVNPLCLMTGWSCA (SEQ ID NO: 59);
ACPLVNPLCMMGGWKCA (SEQ ID NO: 60);
ACPLVNPLCLYGSWKCA (SEQ ID NO: 61);
ACPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 62);
ARDCPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 63);
(e-Ala)-Sar10-A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 11);
Ac-ARDCPLVNPLCLHPGWTCA-Sar6-(D-K) (Ac-(SEQ ID NO: 63)-Sar6-(D-K));
Ac-A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTCA-Sar6-(D-K) (Ac-(SEQ ID NO: 11)-A-Sar6-(D-K));
RPACPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 64);
- 241 047678
RPPCPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 65);
KHSCPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 66);
ACPLVNPLCLHPGWTCLHG (SEQ ID NO: 67);
Ac-CPLVNPLCLHPGWTCLHG (Ac-(SEQ ID NO: 12));
(e-Ala)-Sario-ACPLVNPLCLHPGWTCLHG ((p-Ala)-Sario-(SEQ ID NO: 67));
(e-Ala)-Sar1o-ACPLVNPLCLHPGWTCL(D-His)G ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 68));
Ac-CPLVNPLCLHPGWTCLHG-Sar6-(D-K) (Ac-(SEQ ID NO: 12)-Sar6-(D-K));
Ac-CPLVNPLCLHPGWTCL(D-His)G-Sar6-(D-K) (Ac-(SEQ ID NO: 13)- Sar6-(D-K));
ACPLVNPLCLHPG(2Nal)TCLHG (SEQ ID NO: 69);
RHDCPLVNPLCLLPGWTCA (SEQ ID NO: 70);
TPRCPLVNPLCLMPGWTCA (SEQ ID NO: 71);
ACPLVNPLCLAPGWTCA (SEQ ID NO: 72);
ACPLVNPLCLAPGWTCSRS (SEQ ID NO: 73);
ACPLVNPLCLEPGWTCA (SEQ ID NO: 74);
ACPLVNPLCLEPGWTCAKR (SEQ ID NO: 75);
ACPLVNPLCLHPGWSCA (SEQ ID NO: 76);
ACPLVNPLCLHPGWSCRGQ (SEQ ID NO: 77);
Ac-CPLVNPLCLHPGWSCRGQ (Ac-(SEQ ID NO: 14));
(e-Ala)-Sarw-ACPLVNPLCLHPGWSCRGQ ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 77);
(e-Ala)-Sarw-ACPLVNPLCLHPGWSC(HArg)GQ ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 78));
Ac-CPLVNPLCLHPGWSCRGQ-Sar6-(D-K) (Ac-(SEQ ID NO: 14)-Sar6-(D-K));
Ac-CPLVNPLCLHPGWSC(HArg)GQ-Sar6-(D-K) (Ac-(SEQ ID NO: 15)-Sar6-(D-K));
ACPLVNPLCLHPG(2Nal)SCRGQ (SEQ ID NO: 79);
ACPLVNPLCLTPGWTCTNT (SEQ ID NO: 80);
ACPMVNPLCLHPGWKCA (SEQ ID NO: 81);
ACPMVNPLCLTPGWICA (SEQ ID NO: 82);
ACPMVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 83);
(e-Ala)-Sar10-H(D-Asp)VT-C(Aib)(1Nal)G(Aib)F(1Nal)CP(tBuGly)N(HArg)P(D-Asp)C ((e-Ala)-Sarw(SEQ ID NO: 84));
(e-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)W(HArg)C ((p-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 85));
(e-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)WTC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 86));
(e-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)LVNPLCLHP(D-Ala)WTC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 87));
(e-Ala)-Sar=-A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Ala)WTC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 88));
(e-Ala)-Sar10-ARDC(HyP)LVNPLCLHPGWTC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 89));
(e-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCL(D-3,3-DPA)PGWTC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 90));
(e-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCLHPGWTCLH ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 91));
Ac-(SEQ ID NO: 12)-Sar6-(D-K[Ac]);
(e-AlaSO3H)-Sar4-(Cya)-Sar4-(Cya)-A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Cya)WTC ((e-AlaSO3H)-Sar4-(Cya)Sar4-(Cya)-(SEQ ID NO: 92));
(e-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCLHPGWTC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 10));
A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC (SEQ ID NO: 11);
(e-Ala)-Sar5-(SEQ ID NO: 11);
(e-AlaSO3H)-Sar10-(SEQ ID NO: 11);
(e-Ala)-Sar10-A(D-Arg)DC(HyP)LVNPLCL(D-3,3-DPA)P(D-Asp)W(HArg)C ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 93)); и (e-AlaSO3H)-Sar5-(SEQ ID NO: 11);
или его фармацевтически приемлемая соль.
5. Пептидный лиганд по любому из пп.1-3, который представляет собой соединение 67 (BCY6014):
BCY-6014 или его фармацевтически приемлемую соль.
6. Пептидный лиганд по любому из пп.1-5, где фармацевтически приемлемую соль выбирают из соли свободной кислоты или соли натрия, калия, кальция, аммония.
- 242 047678
7. Пептидный лиганд по любому из пп.1-6, где EphA2 представляет собой EphA2 человека.
8. Конъюгат лекарственного средства, включающий пептидный лиганд по любому из пп.1-7, конъюгированный с одним или более цитотоксическими средствами.
9. Конъюгат лекарственного средства по п.8, где указанное цитотоксическое средство выбирают из DM1 или MMAE.
10. Конъюгат лекарственного средства по п.8 или 9, который дополнительно включает линкер между указанным пептидным лигандом и указанными цитотоксическими средствами.
11. Конъюгат лекарственного средства по п.10, где указанное цитотоксическое средство представляет собой MMAE, и линкер выбирают из -Val-Cit-, -Trp-Cit-, -Val-Lys-, -D-Trp-Cit-, -Ala-Ala-Asn-, DAla-Phe-Lys- или -Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-Tyr-Leu- (SEQ ID NO: 98).
12. Конъюгат лекарственного средства по п.11, где указанное цитотоксическое средство представляет собой MMAE, и линкер представляет собой -Val-Cit-.
13. Конъюгат лекарственного средства по п.10, где указанное цитотоксическое средство представляет собой DM1, и линкер выбирают из -S-S-, -SS(SO3H)-, -SS-(Me)-, -(Me)-SS-(Me)-, -SS-(Me2)- или -SS(Me)-SO3H-.
14. Конъюгат лекарственного средства по любому из пп.8-13, который выбирают из любого одного из BCY6031:
О θ Cl
BCY6032:
/А о °\ с
BCY6061:
о
BCY6029:
он н т г
(X1 0^
BCY6037:
/ \ Р V х
1 А О A0 Q
1 о θ м
1 U q A, ^BCY6014
n Ь н
BCY6031
О
OHOhN-A
ΊΑ
< г^°
о °А° о 9
:| Ь ,s^^An-BCY6014
BCY6032 .
γ* ο γ о
°- 1 ° 1 AnhA^An.BCY6014
S Η
BCY6061 ΝΗ2
Ά ο
1 Г μ Υ ? /°ΎΊ ο н-o °
Α, ο Η A 7ΛΝΓ-·Νλ^Α-ΚΥ“
HNJ
BCY6029 HzNA0
- 243 047678
BCY6049:
BCY6053:
BCY6122:
BCY6034:
BCY6038:
BCY6050:
BCY6030:
- 244 047678
BCY6047:
BCY6051:
BCY6054:
BCY6035:
BCY6134:
- 245 047678
BCY6154:
BCY6155:
BCY6063:
BCY6036:
BCY6048:
- 246 047678
BCY6052:
BCY6064:
BCY6162:
BCY6150:
BCY6151:
- 247 047678
BCY6082:
BCY6161:
BCY6077:
BCY6055:
BCY6033:
- 248 047678
где BCY6014 представляет собой (e-Ala)-Sarw-A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 11));
BCY6017 представляет собой A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC (SEQ ID NO: 11);
BCY6018 представляет собой (e-Ala)-Sar5-(SEQ ID NO: 11);
BCY6019 представляет собой Ac-(SEQ ID NO: 12)-Sar6-(D-K);
BCY6137 представляет собой (e-Ala)-Sarw-ARDCPLVNPLCLHPGWTCLH ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO:91));
BCY3138 представляет собой (e-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCL(D-3,3-DPA)PGWTC ((e-Ala)-Sarw(SEQ ID NO: 90));
BCY6152 представляет собой (e-AlaSO3H)-Sarw-(SEQ ID NO: 11); и
BCY6153 i представляет собой s (e-AlaSO3H)-Sar5-(SEQ ID NO: 11).
15. Конъюгат лекарственного средства по п.14, который выбирают из любого одного из:
BCY6031:
BCY6033:
BCY6082:
где BCY6014 представляет собой (e-Ala)-Sario-A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC ((e-Ala)-Sarw-(SEQ ID NO: 11)).
16. Фармацевтическая композиция, которая включает пептидный лиганд по любому из пп.1-7 или конъюгат лекарственного средства по любому одному из пп.8-15 в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.
17. Применение конъюгата лекарственного средства по любому из пп.8-15 для предотвращения, торможения развития или лечения заболевания или нарушения, характеризующегося сверхэкспрессией EphA2 в пораженной ткани.
18. Применение конъюгата лекарственного средства по любому из пп.8-15 для предотвращения,
- 249 047678 торможения развития или лечения рака, где рак выбирают из рака предстательной железы, рака легкого (такого как немелкоклеточные карциномы легкого (NSCLC)), рака молочной железы (такого как трижды негативный рак молочной железы), рака желудка, рака яичников, рака пищевода, множественной миеломы и фибросаркомы.
19. Способ предотвращения, торможения развития или лечения рака, который включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, конъюгата лекарственного средства по любому из пп.8-15, где у указанного пациента выявлено наличие повышенной вариации числа копий (CNV) EphA2.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1721259.8 | 2017-12-19 | ||
GB1804102.0 | 2018-03-14 | ||
GB1818603.1 | 2018-11-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA047678B1 true EA047678B1 (ru) | 2024-08-26 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2018387418B2 (en) | Bicyclic peptide ligands specific for EphA2 | |
US11312749B2 (en) | Heterotandem bicyclic peptide complex | |
US20220306689A9 (en) | Bicyclic peptide ligands specific for pd-l1 | |
US20240173422A1 (en) | Bicyclic peptide ligand drug conjugates | |
EA047678B1 (ru) | БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДНЫЕ ЛИГАНДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К EphA2 | |
EA044626B1 (ru) | БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДНЫЕ ЛИГАНДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К EphA2 |