WO2023061482A1 - EphA2的双环肽配体及其缀合物 - Google Patents

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WO2023061482A1 PCT/CN2022/125377 CN2022125377W WO2023061482A1 WO 2023061482 A1 WO2023061482 A1 WO 2023061482A1 CN 2022125377 W CN2022125377 W CN 2022125377W WO 2023061482 A1 WO2023061482 A1 WO 2023061482A1
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Abstract

一种对Eph受体酪氨酸激酶A2(EphA2)具有高亲和力的双环肽配体、含有该双环肽配体的药物缀合物及其药学上可接受的盐，和含它们的药物组合物，以及将所述药物缀合物和药物组合物用于制备预防和/或治疗EphA2过表达的疾病的药物中的用途。

Description

EphA2的双环肽配体及其缀合物 技术领域
本发明涉及一种具有Eph受体酪氨酸激酶A2(EphA2)高亲和力的肽配体。本发明还涉及将肽配体缀合至一个或多个毒素分子的多肽药物缀合物，以及所述肽配体和药物缀合物在预防和/或治疗过度表达EphA2的疾病的药物中的用途。
背景技术
肾上腺素受体(Eph)是受体酪氨酸激酶(RTK)中很重要的一类。Eph受体信号参与多种生物事件，主要引起细胞间的排斥或粘附。因此，Eph受体和相应的配体在胚胎的组织构型、神经元靶向和血管发育中具有重要功能。同时，在多种恶性肿瘤中发现高水平的Eph蛋白，这种过度表达极大地促进了癌症的发生。一些Eph受体，特别是EphA2，已经证实对癌症发生和肿瘤进展的调控过程有重要作用。
EphA2是一个跨膜酪氨酸激酶受体，属于酪氨酸激酶受体(RTKs)超家族成员之一。与其他酪氨酸激酶一样，EphA2分子可以分为三个结构域，及胞外的配体结合区，胞内的酪氨酸激酶活性功能区及跨膜区共同组成。与大多数在发育过程中合成的Eph激酶不同，EphA2主要局限于成人增生的上皮细胞。成人的EphA2只有在具有高度增殖的上皮细胞时才会在正常组织中表达。然而，越来越多的证据表明，人类EphA2在前列腺癌、肺癌、食管癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌和皮肤癌中大量表达。EphA2的表达与肿瘤患者预后不良、转移潜能增加和生存期降低相关。因此，EphA2的转录模式和在恶性肿瘤中的功能相关性使该蛋白成为癌症治疗的一个有吸引力的靶点。
EphA2靶向治疗已经出现在多种类型和阶段的恶性肿瘤的临床试验中。临床上抑制EphA2的策略包括EphA2靶向抗体-细胞毒药物结合物(ADC)或肽-药物结合物(PDC)；酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如已批准上市的达沙替尼；识别和靶向EphA2抗原的CAR-T细胞；以及设计用于向肿瘤细胞运送靶向EphA2的siRNAs的纳米载体。
尽管有大量数据支持EphA2药物用于癌症治疗，但仍存在一些挑战。EphA2在多种细胞和组织类型中的表达，在正常组织的表达可能导致意外的毒副作用。EphA2受体的多种信号模式也使靶向策略变得复杂，最合适的方法可能会因环境而异。此外，由于EphA2可能是非激酶依赖性的，传统的RTK小分子抑制剂阻断受体的激酶活性可能不能抑制EphA2配体非依赖性致癌效应。基于EphA2在肿瘤发展中的作用以及目前以EphA2靶点的药物的局限性，开发具有疗效好，高选择性的靶向EphA2的配体，进而用于过度表达EphA2肿瘤病人的治疗将具有重要的临床意义。
发明内容
本发明首先提供了特异于EphA2的肽配体，所述肽配体具有双环肽结构，对靶标具有高亲和力，选择性好、稳定性高，而且具有适合于注射、吸入、鼻、眼、口服或局部施用等有利特点。
一种特异于EphA2的肽配体，其包含多肽和非芳香族分子支架，所述多肽包含至少三个独立选自Cys和Hcys的残基，且其中至少一个是Hcys残基，所述三个Cys和Hcys残基被两个环序列隔开，所述多肽的Cys或Hcys残基经硫醚键与所述支架连接，从而在所述分子支架上形成两个多肽环；
在一些具体实施方案中，所述肽配体包含多肽和非芳香族分子支架，所述多肽包含至少三个独立选自Cys和Hcys的残基，且其中两个是Hcys残基，所述三个Cys和Hcys残基被两个环序列隔开，所述多肽的Cys或Hcys残基经硫醚键与所述支架连接，从而在所述分子支架上形成两个多肽环；
在一些具体实施方案中，所述肽配体包含多肽和非芳香族分子支架，所述多肽包含至少三个独立选自Cys和Hcys的残基，且其中一个是Hcys残基，所述三个Cys和Hcys残基被两个环序列隔开，所述多肽的Cys或Hcys残基经硫醚键与所述支架连接，从而在所述分子支架上形成两个多肽环；
在一些具体实施方案中，所述肽配体包含多肽和非芳香族分子支架，所述多肽包含至少三个独立选自Cys和Hcys的残基，且其中两个是Hcys残基，所述三个Cys和Hcys残基被两个环序列隔开，所述多肽的Cys或Hcys残基经硫醚键与所述支架连接，从而在所述分子支架上形成两个多肽环，所述的分子支架选自TATA；
在一些具体实施方案中，所述肽配体包含多肽和非芳香族分子支架，所述多肽包含至少三个独立选自Cys和Hcys的残基，且其中一个是Hcys残基，所述三个Cys和Hcys残基被两个环序列隔开，所述多肽的Cys或Hcys残基经硫醚键与所述支架连接，从而在所述分子支架上形成两个多肽环，所述的分子支架选自TATA；
在一些具体实施方案中，所述肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
Xa1-A1-Xa2-A2-Xa3，
其中，A1、A2表示Xa1、Xa2、Xa3之间的氨基酸残基，并且A1和A2各自独立地包含5或6个氨基酸残基；在一些具体实施方案中，A1、A2包含的氨基酸残基任选地选自Hyp、Leu、Val、Asn、Pro、Leu、His、D-Asp、Trp、hArg、Ser、Thr、Tyr、Val、Ile和Gly等；
Xa1、Xa2、Xa3独立地为Cys或Hcys残基，且至少有一个是Hcys残基，所述非芳香族分子支架与所述多肽的Xa1、Xa2、Xa3形成硫醚键从而在所述分子支架上形成两个多肽环；
在一些具体实施方案中，所述多肽包含以下所示的氨基酸序列：
Xa1-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Xa2-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Xa3；
在一些具体实施方案中，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一所示的氨基酸序列：
Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:1)；
Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:2)；
Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:3)；
Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:4)；
Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:5)；
Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:6)；
Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:7)。
在一些具体实施方案中，所述肽配体的多肽序列选自SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:14之一：
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:8)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:9)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:10)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:11)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:12)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:13)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:14)。
在一些具体实施方案中，所述肽配体是含有以下结构之一的双环肽，在以下结构的N末端或C末端可选地含有其他氨基酸序列：
Figure PCTCN2022125377-appb-000001
其中，Xa1、Xa2或Xa3残基上的-SH基团与分子支架共价结合形成硫醚键，因此，当Xa1、Xa2或Xa3为Cys时，对应地，m1、m2或m3为1；
当Xa1、Xa2或Xa3为Hcys，对应地，m1、m2或m3为2；
n1、n2、n3独立地为1或2；
在一些具体实施方案中，所述肽配体是具有以下结构之一的双环肽，其中双环如前所述(如I-1或II-1)，t为5-15的整数，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，在一些实施方式中，t为10：
Figure PCTCN2022125377-appb-000002
在一些具体实施方案中，所述肽配体是具有以下结构之一的双环肽：
Figure PCTCN2022125377-appb-000003
在一些具体实施方案中，式I-2或II-2的双环肽，其中，
(1)Xa1为Hcys，m1为2，n1为1或2；或者
(2)Xa2为Hcys，m2为2，n2为1或2；或者
(3)Xa3为Hcys，m3为2，n3为1或2。
其次，本发明还提供了一种药物缀合物或其药学上可接受的盐，所述缀合物包含通过连接子缀合至一个或多个效应物和/或官能团的如前所述的肽配体；在一些具体实施方案中，所述缀合物包含通过连接子缀合至1个效应物和/或官能团的如前所述的肽配体；在一些具体实施方案中，所述缀合物包含通过连接子缀合至2个效应物和/或官能团的如前所述的肽配体；
在一些具体实施方案中，其中所述效应物为细胞毒性剂；在一些具体实施方案中，所述细胞毒性剂选自如下组中：烷化剂类、抗代谢物类、植物生物碱类、萜类化合物类、鬼臼毒素类及其衍生物、紫杉烷类及其衍生物、拓扑异构酶抑制剂、抗肿瘤抗生素类；在一些具体实施方案中，所述细胞毒性剂选自如下组中：顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、硫唑嘌呤、巯嘌呤、嘧啶类似物、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、喜树碱、伊立替康、拓扑替康、安丫啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、埃博霉素及其衍生物、博来霉素及其衍生物、更生霉素及其衍生物、普卡霉素及其衍生物、丝裂霉素C、刺胞霉素、美登素及其衍生物、澳瑞他汀及其衍生物；在一些具体实施方案中，所述细胞毒性剂选自DM1、MMAE或SN38；
在一些具体实施方案中，所述连接子为肽类连接子、二硫化物连接子、酶依赖性连接子或pH依赖型连接子；这些连接子在一定条件下可裂解以释放出效应物分子；
在一些具体实施方案中，所述连接子为肽类连接子、二硫化物连接子或pH依赖型连接子；这些连接子在一定条件下可裂解以释放出效应物分子；
在一些具体实施方案中，所述二硫化物连接子选自DMDS、MDS、DSDM、NDMDS或式III结构：
Figure PCTCN2022125377-appb-000004
其中，R 1、R 2、R 3和R 4独立地选自H、甲基、乙基、丙基和异丙基；
p和q独立地为1、2、3、4或5；
所述肽类连接子选自：-Cit-Val-、-Phe-Lys-和-Val-Lys-；
所述的酶依赖性连接子选自：
Figure PCTCN2022125377-appb-000005
所述pH依赖型连接子选自顺乌头酸酐；
上述连接子主要起连接毒性剂和肽配体，以及在特定条件下裂解释放毒性物的作用，为控制裂解的速率和伴随的效应物分子的释放，连接子可做适当修饰，如在其与肽配体或效应物连接处连接一些基团增加链长度，以及在裂解键周围增加基团修饰控制裂解键的阻碍，本发明的连接子包括基于上述加以修饰的连接子衍生物；
在一些具体实施方案中，所述连接子为-PABC-Cit-Val-戊二酰-或-PABC-环丁基-Ala-Cit-βAla-、
Figure PCTCN2022125377-appb-000006
其中PABC代表p-氨基苄基氨基甲酸酯；在一些具体实施方案中，所述连接子为(-PABC-Cit-Val-CO-CH 2) 2N-CH 2(CH 2OCH 2) 2CH 2NH-戊二酰-；
在一些具体实施方案中，所述药物缀合物具有式I、式II、式III、式IV、V或VI的结构：
Figure PCTCN2022125377-appb-000007
Figure PCTCN2022125377-appb-000008
Figure PCTCN2022125377-appb-000009
其中，Xa1、Xa2、Xa3独立地为Cys或Hcys残基，且至少有一个是Hcys残基；
当Xa1、Xa2或Xa3为Cys时，对应地，m1、m2或m3为1；
当Xa1、Xa2或Xa3为Hcys，对应地，m1、m2或m3为2；
n1、n2、n3独立地为1或2。
作为本发明的更具体的第一技术方案，本发明提供了一种特异于EphA2的肽配体，其包含多肽和非芳香族分子支架，所述多肽包含至少三个独立选自Cys和Hcys的残基，且其中至少一个是Hcys残基，所述三个Cys和Hcys残基被两个环序列隔开，所述多肽的Cys或Hcys残基经硫醚键与所述支架连接，从而在所述分子支架上形成两个多肽环。
作为本发明的更具体的第二技术方案，特异于EphA2的肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
Xa1-A1-Xa2-A2-Xa3
其中，A1、A2表示Xa1、Xa2、Xa3之间的氨基酸残基，并且A1和A2各自独立地包含5或6个氨基酸残基；
Xa1、Xa2、Xa3独立地为Cys或Hcys残基，且至少有一个是Hcys残基，所述非芳香族分子支架与所述多肽的Xa1、Xa2、Xa3形成硫醚键从而在所述分子支架上形成两个多肽环。
作为本发明的更具体的第三技术方案，第一或第二技术方案所述多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：
Xa1-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Xa2-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Xa3(SEQ ID NO:1)。
作为本发明的更具体的第四技术方案，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一所示的氨基酸序列：
Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:1)；
Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:2)；
Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:3)；
Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:4)；
Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:5)；
Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:6)；
Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:7)。
作为本发明的更具体的第五技术方案，所述肽配体的多肽序列选自SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:14之一：
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:8)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:9)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:10)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:11)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:12)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:13)；
(β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:14)。
作为本发明的更具体的第六技术方案，所述肽配体是含有以下结构之一的双环肽：
Figure PCTCN2022125377-appb-000010
其中，当Xa1、Xa2或Xa3为Cys时，对应地，m1、m2或m3为1；
当Xa1、Xa2或Xa3为Hcys，对应地，m1、m2或m3为2；
n1、n2、n3独立地为1或2。
作为本发明的更具体的第七技术方案，所述肽配体是具有以下结构之一的双环肽：
Figure PCTCN2022125377-appb-000011
Figure PCTCN2022125377-appb-000012
作为本发明的更具体的第八技术方案，式I-2或II-2所述的肽配体，其中，
(1)Xa1为Hcys，m1为2，n1为1或2；或者
(2)Xa2为Hcys，m2为2，n2为1或2；或者
(3)Xa3为Hcys，m3为2，n3为1或2。
作为本发明的更具体的第九技术方案，提供了一种药物缀合物或其药学上可接受的盐，所述缀合物包含通过连接子缀合至一个或多个效应物和/或官能团的第一至八中任意一项所述的肽配体。
作为本发明的更具体的第十技术方案，第七技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述效应物为细胞毒性剂。
作为本发明的更具体的第十一技术方案，第十技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述细胞毒性剂选自如下组中：烷化剂类、抗代谢物类、植物生物碱类、萜类化合物类、鬼臼毒素类及其衍生物、紫杉烷类及其衍生物、拓扑异构酶抑制剂、抗肿瘤抗生素类。
作为本发明的更具体的第十二技术方案，第十技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述细胞毒性剂选自如下组中：顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、硫唑嘌呤、巯嘌呤、嘧啶类似物、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、喜树碱、伊立替康、拓扑替康、安丫啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、埃博霉素及其衍生物、博来霉素及其衍生物、更生霉素及其衍生物、普卡霉素及其衍生物、丝裂霉素C、刺胞霉素、美登素及其衍生物、澳瑞他汀及其衍生物。
作为本发明的更具体的第十三技术方案，第十技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述细胞毒性剂选自DM1、MMAE或SN38。
作为本发明的更具体的第十四技术方案，第九技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述连接子为肽类连接子、二硫化物连接子、酶依赖性连接子或pH依赖型连接子；在某些实施方案中，所述连接子为肽类连接子、二硫化物连接子或pH依赖型连接子。
作为本发明的更具体的第十五技术方案，第十四技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，所述二硫化物连接子选自DMDS、MDS、DSDM、NDMDS或式III结构：
Figure PCTCN2022125377-appb-000013
其中，R 1、R 2、R 3和R 4独立地选自H、甲基、乙基、丙基和异丙基；
p和q独立地为1、2、3、4或5；
所述肽类连接子选自：-Cit-Val-、-Phe-Lys-和-Val-Lys-；
所述的酶依赖性连接子选自：
Figure PCTCN2022125377-appb-000014
所述pH依赖型连接子选自顺乌头酸酐。
作为本发明的更具体的第十六技术方案，第十四技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述连接子为-PABC-Cit-Val-戊二酰-或-PABC-环丁基-Ala-Cit-βAla-或(-PABC-Cit-Val-CO-CH 2) 2N-CH 2(CH 2OCH 2) 2CH 2NH-戊二酰-，其中PABC代表p-氨基苄基氨基甲酸酯；或者所述连接子为
Figure PCTCN2022125377-appb-000015
作为本发明的更具体的第十七技术方案，第九技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述药物缀合物具有式I、式II、或者式III、式IV、式V、式VI的结构：
Figure PCTCN2022125377-appb-000016
Figure PCTCN2022125377-appb-000017
其中，Xa1、Xa2、Xa3独立地为Cys或Hcys残基，且至少有一个是Hcys残基；
当Xa1、Xa2或Xa3为Cys时，对应地，m1、m2或m3为1；
当Xa1、Xa2或Xa3为Hcys，对应地，m1、m2或m3为2；
n1、n2、n3独立地为1或2。
作为本发明的更具体的第十八技术方案，一种药物缀合物或其药学上可接受的盐，所述药物缀合物选自以下结构之一：
Figure PCTCN2022125377-appb-000018
Figure PCTCN2022125377-appb-000019
Figure PCTCN2022125377-appb-000020
Figure PCTCN2022125377-appb-000021
本发明还涉及一种药物组合物，其含前述第九至第十八任一技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
进一步，所述的药物组合物或药物制剂包含1-1500mg的前述任一技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明还涉及一种用途，前述第九至第十八任一技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，或者其组合物在制备预防和/或治疗过度表达EphA2的疾病中的用途。
通常，过度表达EphA2的疾病为癌症。可以被治疗(或被抑制)的癌症(及其良性对应物)的示例包括但不限于上皮起源的肿瘤(腺瘤和各种类型的癌，包括腺癌、鳞癌、移行细胞癌和其他癌)，例如膀胱和泌尿道癌、乳腺癌、胃肠道癌(包括食道癌、胃(胃)癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌和肛门癌)、肝癌(肝细胞癌)、胆囊和胆道系统癌、外分泌胰腺癌、肾癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈癌(例如舌癌、颊腔癌、喉癌、咽癌、鼻咽癌、扁桃体癌、唾液腺癌、鼻腔癌和鼻旁窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、子宫颈癌、子宫肌癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)、肾癌、前列腺癌、皮肤和附属物癌(例如黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、异常增生痣)；血液系统恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和恶化前的血液系统病症以及边缘恶性病症，包括血液系统恶性肿瘤和淋巴谱系的相关病症(例如急性淋巴细胞性白血病[ALL]、慢性淋巴细胞性白血病[CLL]、B细胞淋巴瘤如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、意义不确定的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴增生性病症)、和血液系统恶性肿瘤和髓系的相关病症(例如急性髓性白血病[AML]、慢性髓性白血病[CML]、慢性骨髓单核细胞白血病[CMML]、嗜酸性粒细胞增多综合征、骨髓增生性病症，例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合症和早幼粒细胞性白血病)；间充质起源的肿瘤，例如软组织肉瘤、骨或软骨肉瘤，例如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性和恶性组织肉瘤以及隆突性皮纤维肉瘤；中枢或周围神经系统的肿瘤(例如星形细胞瘤、神经胶质瘤和胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体瘤、肾上腺肿瘤、胰岛细胞瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌和甲状腺髓样癌)；眼和附件肿瘤(例如视网膜母细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤(dysgerminoma)、葡萄胎和绒毛膜癌)；小儿和胚胎肿瘤(例如，髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、威尔姆斯肿瘤和原始神经外胚层肿瘤)；或先天性或其他形式的综合症，使患者容易患恶性肿瘤(例如着色性干皮病)。
进一步过度表达EphA2的疾病选自：前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、多发性骨髓瘤和纤维肉瘤。
本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的前述任意一项技术方案所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂，所述受试者包括哺乳动物或人，治疗有效量优选1-1500mg；所述的肿瘤优选前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、多发性骨髓瘤和纤维肉瘤。
本发明还提供一种用于治疗肿瘤的方法，其包括向所述哺乳动物或人给予治疗有效量的本发明所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐或共晶或药物组合物。
本申请中所述“有效量”或“治疗有效量”是指给予足够量的本申请公开的化合物，其将在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一种或多种症状。在一些实施方案中，结果是减少和/或缓和疾病的体征、症状或原因，或生物系统的任何其它希望改变。例如，针对治疗用途的“有效量”是提供临床上显著的疾病症状降低所需的包含本申请公开的化合物的组合物的量。治疗有效量的实例包括但不限于1-1500mg、1-1400mg、1-1300mg、1-1200mg、1-1000mg、1-900mg、1-800mg、1-700mg、1-600mg、1-500mg、1-400mg、1-300mg、1-250mg、1-200mg、1-150mg、1-125mg、1-100mg、1-80mg、1-60mg、1-50mg、1-40mg、1-25mg、1-20mg、5-1500mg、5-1000mg、5-900mg、5-800mg、5-700mg、5-600mg、5-500mg、5-400mg、5-300mg、5-250mg、5-200mg、5-150mg、5-125mg、5-100mg、5-90mg、5-70mg、5-80mg、5-60mg、5-50mg、5-40mg、5-30mg、5-25mg、5-20mg、10-1500mg、10-1000mg、10-900mg、10-800mg、10-700mg、10-600mg、10-500mg、10-450mg、10-400mg、10-300mg、10-250mg、10-200mg、10-150mg、10-125mg、10-100mg、10-90mg、10-80mg、10-70mg、10-60mg、10-50mg、10-40mg、10-30mg、10-20mg；20-1500mg、20-1000mg、20-900mg、20-800mg、20-700mg、20-600mg、20-500mg、20-400mg、20-350mg、20-300mg、20-250mg、20-200mg、20-150mg、20-125mg、20-100mg、20-90mg、20-80mg、20-70mg、20-60mg、20-50mg、20-40mg、20-30mg；50-1500mg、50-1000mg、50-900mg、50-800mg、50-700mg、50-600mg、50-500mg、50-400mg、50-300mg、50-250mg、50-200mg、50-150mg、50-125mg、50-100mg；100-1500mg、100-1000mg、100-900mg、100-800mg、100-700mg、100-600mg、100-500mg、100-400mg、100-300mg、100-250mg、100-200mg。
本发明涉及一种药物组合物或药物制剂，所述的药物组合物或药物制剂包含治疗有效量的本发明所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐或共晶和载体和/或赋形剂。该药物组合物可以为单位制剂形式(单位制剂中主药的量也被称为“制剂规格”)。在一些实施方案中，该药物组合物包括但不限于1-1500mg、5-1000mg、10-800mg、20-600mg、25-500mg、40-200mg、50-100mg、1mg、1.25mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、110mg、120mg、125mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg、1500mg的本发明化合物或者其立体异构体、氘代物、溶剂化物、药学上可接受的盐或共晶。
一种用于治疗哺乳动物或人的疾病的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的本发明药物缀合物或其药学上可接受的盐或共晶，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂，治疗有效量优选1-1500mg；所述的疾病优选前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、多发性骨髓瘤和纤维肉瘤。
一种用于治疗哺乳动物或人的疾病的方法，所述方法包括，将药物本发明缀合物或其药学上可接受的盐或共晶，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂，以1-1500mg/天的日剂量给予受试者，所述日剂量可以为单剂量或分剂量，在一些实施方案中，日剂量包括但不限于10-1500mg/天、20-1500mg/天、25-1500mg/天、50-1500mg/天、75-1500mg/天、100-1500mg/天、200-1500mg/天、10-1000mg/天、20-1000mg/天、25-1000mg/天、50-1000mg/天、75-1000mg/天、100-1000mg/天、200-1000mg/天、25-800mg/天、50-800mg/天、100-800mg/天、200-800mg/天、25-400mg/天、50-400mg/天、100-400mg/天、200-400mg/天，在一些实施方案中，日剂量包括但不限于1mg/天、5mg/天、10mg/天、20mg/天、25mg/天、50mg/天、75mg/天、100mg/天、125mg/天、150mg/天、200mg/天、400mg/天、600mg/天、800mg/天、1000mg/天、1200mg/天、1400mg/天、1500mg/天。
本发明涉及一种试剂盒，该试剂盒可以包括单剂量或多剂量形式的组合物，该试剂盒包含本发明缀合物或其药学上可接受的盐或共晶，本发明缀合物或其药学上可接受的盐或共晶量与上述药物组合物中其量相同。
本发明中本发明缀合物或其药学上可接受的盐或共晶的量在每种情况下以游离碱的形式换算。
“制剂规格”是指每一支、片或其他每一个单位制剂中含有主药的重量。
合成
本领域技术人员可以结合已知的有机合成技术制备本发明的化合物，其起始原料为市售化学品和(或)化学文献中所述的化合物。“市售化学品”是从正规商业来源获得的，供应商包括：泰坦科技、安耐吉化学、上海德默、成都科龙化工、韶远化学科技、南京药石、药明康德和百灵威科技等公司。
本发明的肽可以通过标准技术合成制备，然后在体外与分子支架反应。当进行此操作时，可以使用标准化学方法。这使得能够快速大规模制备可溶性材料用于进一步的下游实验或验证。这样的方法可以使用例如Timmerman等人(2005，ChemBioChem)中公开的常规化学方法来实现。
一些实施方式中，本发明的药物缀合物按以下路线合成：
Figure PCTCN2022125377-appb-000022
更具体的合成步骤参见实施例。
术语
肽配体是指共价结合至分子支架的肽。通常，此类肽包含能够与支架形成共价键(如硫醚键)的两个或更多个反应性基团(即半胱氨酸残基或高半胱氨酸残基)、以及在所述反应性基团之间相对的序列(称 为环序列)，之所以称为环序列，是因为当肽与支架结合时，其形成环。在本申请的情况下中，肽包含至少三个半胱氨酸残基或高半胱氨酸残基(Cys残基或Hcys残基)，其在支架上形成两个环。
分子支架包括非芳族分子支架。非芳族分子支架是指本文定义的任何不包含芳族碳环或芳族杂环环体系的分子支架。适当的非芳族分子支架的示例描述于Heinis等人(2014)Angewandte Chemie,International Edition 53(6)1602-1606中。分子支架可以是小分子，例如有机小分子。分子支架也可以是大分子，在一些情形中，分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物组成的大分子。在一些情形中，分子支架包含能够与多肽的官能团反应形成共价键的反应性基团。分子支架可以包括与肽形成连接的化学基团，例如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤化物和酰基卤化物。含有αβ不饱和羰基的化合物的示例是1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)(Angewandte Chemie,International Edition(2014)，53(6)，1602-1606)。
多肽是指三个及以上氨基酸分子以肽键连接在一起而形成的化合物。多肽中的氨基酸单位称为氨基酸残基。
效应物和/或官能团是可以(通过连接子)连接于例如多肽的N和/或C末端、多肽内的氨基酸、或分子骨架的、具有药理作用或特定功能的分子或片段。合适的效应物和/或官能团包括抗体及其部分或片段、细胞毒分子或片段、酶抑制剂分子或片段、金属螯合剂等。在一些情形中，效应物和/或官能团是药物。特别地是细胞毒性剂，包括烷化剂类、抗代谢物类、植物生物碱类、萜类化合物类、鬼臼毒素类及其衍生物、紫杉烷类及其衍生物、拓扑异构酶抑制剂、抗肿瘤抗生素类等。更具体地是顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、硫唑嘌呤、巯嘌呤、嘧啶类似物、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、喜树碱、伊立替康、拓扑替康、安丫啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、埃博霉素及其衍生物、博来霉素及其衍生物、更生霉素及其衍生物、普卡霉素及其衍生物、丝裂霉素C、刺胞霉素、美登素及其衍生物、澳瑞他汀及其衍生物。
衍生物是指一种化合物中的氢原子或原子团被其他原子或原子团取代而衍生的产物。
除非特别说明，所有氨基酸均以L-构型使用。
β-Ala：β-丙氨酸
Sar：肌氨酸
Cys：半胱氨酸
Hcys：高半胱氨酸
Hyp：羟脯氨酸
Asn：天冬酰胺
Pro：脯氨酸
Leu：亮氨酸
His：组氨酸
D-Asp：D-天冬氨酸
Trp：色氨酸
hArg：高精氨酸
Ser：丝氨酸
Thr：苏氨酸
Phe：苯丙氨酸
Tyr：酪氨酸
Val：缬氨酸
Ile：异亮氨酸
Lys：赖氨酸
Gly：甘氨酸
Cit：瓜氨酸
DM1：
Figure PCTCN2022125377-appb-000023
MMAE：
Figure PCTCN2022125377-appb-000024
SN38：7-乙基-10-羟基喜树碱
DMDS：
Figure PCTCN2022125377-appb-000025
MDS：
Figure PCTCN2022125377-appb-000026
DSDM：
Figure PCTCN2022125377-appb-000027
NDMDS：
Figure PCTCN2022125377-appb-000028
TATB：
Figure PCTCN2022125377-appb-000029
TATA：
Figure PCTCN2022125377-appb-000030
本发明所述基团和化合物中所涉及的碳、氢、氧、硫、氮或卤素均包括它们的同位素，及本发明所述基团和化合物中所涉及的碳、氢、氧、硫、氮或卤素任选进一步被一个或多个它们对应的同位素所替代，其中碳的同位素包括 12C、 13C和 14C，氢的同位素包括氕(H)、氘(氘，又称为重氢)、氚(T，又称为超重氢)，氧的同位素包括 16O、 17O和 18O，硫的同位素包括 32S、 33S、 34S和 36S，氮的同位素包括 14N和 15N，氟的同位素 19F，氯的同位素包括 35Cl和 37Cl，溴的同位素包括 79Br和 81Br。
“药学上可接受的盐”是指本发明化合物保持游离酸或者游离碱的生物有效性和特性，且所述的游离酸通过与无毒的无机碱或者有机碱，所述的游离碱通过与无毒的无机酸或者有机酸反应获得的盐。
“药物组合物”表示一种或多种本文所述化合物或其立体异构体、溶剂化物、药学上可接受的盐或共晶，与其他组成成分的混合物，其中其他组分包含生理学/药学上可接受的载体和/赋形剂。
“载体”指的是：不会对生物体产生明显刺激且不会消除所给予化合物的生物活性和特性，并能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系，非限制性的实例包括微囊与微球、纳米粒、脂质体等。
“赋形剂”指的是：其本身并非治疗剂，用作稀释剂、辅料、粘合剂和/或媒介物，用于添加至药物组合物中以改善其处置或储存性质或允许或促进化合物或药物组合物形成用于给药的单位剂型。如本领域技术人员所已知的，药用赋形剂可提供各种功能且可描述为润湿剂、缓冲剂、助悬剂、润滑剂、乳化剂、崩解剂、吸收剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂及甜味剂。药用赋形剂的实例包括但不限于：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉及马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、微晶纤维素及交联羧甲基纤维素(例如交联羧甲基纤维素钠)；(4)黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂及栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油及大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁及氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液(Ringer’ssolution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；及(22)其他用于药物制剂中的无毒相容物质。
附图说明
图1是小鼠PC3皮下体内移植瘤模型的肿瘤生长曲线。
图2是小鼠PC3皮下体内移植瘤模型的动物体重变化曲线。
具体实施方式
以下将通过实施例对本发明的内容进行详细描述。实施例中未注明具体条件的，按照常规条件的实验方法进行。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不能理解为本发明的内容仅限于所举实例。本领域常规技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
化合物的制备
双环肽HSK-P14的合成
Figure PCTCN2022125377-appb-000031
P14合成方法：
Figure PCTCN2022125377-appb-000032
多肽的合成采用标准的Fmoc化学方法：
1.向反应器中加入MBHA树脂(0.5mmol，1.85g，sub:0.27mmol/g)和DMF溶剂，震摇2小时。
2.抽干并以DMF淋洗三次。
3.加入20％的哌啶/DMF，混合30分钟。
4.抽干并以DMF淋洗五次。
5.加入Fmoc保护的氨基酸溶液，混合30秒后加入偶联试剂，氮气鼓泡1小时。
6.下一个氨基酸偶联重复步骤2-5.
# 原料 偶联试剂
1 Fmoc-HCys(Trt)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
2 Fmoc-HArg(Pbf)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
3 Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
4 Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
5 Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
6 Fmoc-His(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
7 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
8 Fmoc-HCys(Trt)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
9 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
10 Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
11 Fmoc-Asn(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
12 Fmoc-Val-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
13 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
14 Fmoc-Hyp-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
15 Fmoc-HCys(Trt)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
16 Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
17 Fmoc-HArg(Pbf)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
18 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
19 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
20 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
21 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
22 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
23 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
24 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
25 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
26 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
27 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
28 Fmoc-β-Ala-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
20％哌啶DMF溶液，30分钟用于Fmoc保护剂的脱除。使用茚三酮监测偶联反应，树脂以DMF洗涤5次。
肽的断裂和纯化：
1.将多肽侧链保护的多肽加入反应瓶中，加入断裂缓冲液(90％TFA/2.5％TIS/2.5％H 2O/5.0％DTT)，室温搅拌2小时。
2.加入冰的异丙醚，多肽析出，离心(3min at 3000rpm)。
3.用异丙醚洗涤两次。
4.真空干燥得到白色固体粗品肽化合物P14(1.50g,粗品)。
HSK-P14的合成方法：
Figure PCTCN2022125377-appb-000033
将粗品肽P14溶于50％MeCN/H 2O(500mL)，室温搅拌下缓慢加入TATB(购自药明康德，270mg，0.60mmol)，加料时间30分钟以上，加完，室温搅拌30分钟，加入碳酸氢铵调节pH值至8，反应液室温搅拌12小时，LC-MS显示反应完毕，制备HPLC纯化(流动相，A:0.075％TFA in H 2O,B:CH 3CN)得到白色固体HSK-P14(135mg，纯度95.3％)。
双环肽HSK-P15的合成
Figure PCTCN2022125377-appb-000034
P15合成方法：
Figure PCTCN2022125377-appb-000035
多肽的合成采用标准的Fmoc化学方法：
1.向反应器中加入MBHA树脂(0.5mmol,1.85g,sub:0.27mmol/g)和DMF溶剂，震摇2小时。
2.抽干并以DMF淋洗三次。
3.加入20％的哌啶/DMF，混合30分钟。
4.抽干并以DMF淋洗五次。
5.加入Fmoc保护的氨基酸溶液，混合30秒后加入偶联试剂，氮气鼓泡1小时。
6.下一个氨基酸偶联重复步骤2-5.
# 原料 偶联试剂
1 Fmoc-HCys(Trt)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
2 Fmoc-HArg(Pbf)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
3 Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
4 Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
5 Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
6 Fmoc-His(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
7 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
8 Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
9 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
10 Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
11 Fmoc-Asn(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
12 Fmoc-Val-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
13 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
14 Fmoc-Hyp-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
15 Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
16 Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
17 Fmoc-HArg(Pbf)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
18 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
19 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
20 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
21 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
22 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
23 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
24 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
25 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
26 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
27 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
28 Fmoc-β-Ala-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
20％哌啶DMF溶液，30分钟用于Fmoc保护剂的脱除。使用茚三酮监测偶联反应，树脂以DMF洗涤5次。
肽的断裂和纯化：
1.将多肽侧链保护的多肽加入反应瓶中，加入断裂缓冲液(90％TFA/2.5％TIS/2.5％H 2O/5.0％DTT)，室温搅拌2小时。
2.加入冰的异丙醚，多肽析出，离心(3min at 3000rpm)。
3.用异丙醚洗涤两次。
4.真空干燥得到白色固体粗品肽化合物P15(1.60g,粗品)。
HSK-P15的合成方法：
Figure PCTCN2022125377-appb-000036
将粗品肽P15溶于50％MeCN/H 2O(500mL),室温搅拌下缓慢加入TATA(购自药明康德，150mg,0.60mmol)，加料时间30分钟以上，加完，室温搅拌30分钟，加入碳酸氢铵调节PH值至8，反应液室温搅拌12小时，LC-MS显示反应完毕，制备HPLC纯化(流动相，A:0.075％TFA in H 2O,B:CH 3CN)得到白色固体HSK-P15(115mg,纯度95.8％)。
双环肽HSK-P17的合成
Figure PCTCN2022125377-appb-000037
P17合成方法：
Figure PCTCN2022125377-appb-000038
多肽的合成采用标准的Fmoc化学方法：
1.向反应器中加入MBHA树脂(0.5mmol,1.85g,sub:0.27mmol/g)和DMF溶剂，震摇2小时。
2.抽干并以DMF淋洗三次。
3.加入20％的哌啶/DMF，混合30分钟。
4.抽干并以DMF淋洗五次。
5.加入Fmoc保护的氨基酸溶液，混合30秒后加入偶联试剂，氮气鼓泡1小时。
6.下一个氨基酸偶联重复步骤2-5.
# 原料 偶联试剂
1 Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
2 Fmoc-HArg(Pbf)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
3 Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
4 Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
5 Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
6 Fmoc-His(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
7 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
8 Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
9 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
10 Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
11 Fmoc-Asn(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
12 Fmoc-Val-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
13 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
14 Fmoc-Hyp-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
15 Fmoc-HCys(Trt)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
16 Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
17 Fmoc-HArg(Pbf)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
18 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
19 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
20 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
21 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
22 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
23 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
24 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
25 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
26 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
27 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
28 Fmoc-β-Ala-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
20％哌啶DMF溶液，30分钟用于Fmoc保护剂的脱除。使用茚三酮监测偶联反应，树脂以DMF洗涤5次。
肽的断裂和纯化：
1.将多肽侧链保护的多肽加入反应瓶中，加入断裂缓冲液(90％TFA/2.5％TIS/2.5％H 2O/5.0％DTT)，室温搅拌2小时。
2.加入冰的异丙醚，多肽析出，离心(3min at 3000rpm)。
3.用异丙醚洗涤两次。
4.真空干燥得到白色固体粗品肽化合物P17(1.75g,粗品)。
HSK-P17的合成方法：
Figure PCTCN2022125377-appb-000039
将粗品肽P17溶于50％MeCN/H 2O(500mL),室温搅拌下缓慢加入TATA(购自药明康德，150mg,0.60mmol)，加料时间30分钟以上，加完，室温搅拌30分钟，加入碳酸氢铵调节PH值至8，反应液室温搅拌12小时，LC-MS显示反应完毕，制备HPLC纯化(流动相，A:0.075％TFA in H 2O,B:CH 3CN)得到白色固体HSK-P17(110mg,纯度96.8％)。
双环肽HSK-P30的合成
Figure PCTCN2022125377-appb-000040
P30合成方法：
Figure PCTCN2022125377-appb-000041
多肽的合成采用标准的Fmoc化学方法：
1.向反应器中加入MBHA树脂(0.5mmol,1.85g,sub:0.27mmol/g)和DMF溶剂，震摇2小时。
2.抽干并以DMF淋洗三次。
3.加入20％的哌啶/DMF，混合30分钟。
4.抽干并以DMF淋洗五次。
5.加入Fmoc保护的氨基酸溶液，混合30秒后加入偶联试剂，氮气鼓泡1小时。
6.下一个氨基酸偶联重复步骤2-5.
# 原料 偶联试剂
1 Fmoc-HCys(Trt)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
2 Fmoc-HArg(Pbf)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
3 Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
4 Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
5 Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
6 Fmoc-His(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
7 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
8 Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
9 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
10 Fmoc-Pro-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
11 Fmoc-Asn(Trt)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
12 Fmoc-Val-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
13 Fmoc-Leu-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
14 Fmoc-Hyp-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
15 Fmoc-HCys(Trt)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
16 Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
17 Fmoc-HArg(Pbf)-OH(2.0eq.) HATU(1.90eq.)and DIEA(4.0eq.)
18 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
19 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
20 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
21 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
22 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
23 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
24 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
25 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
26 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
27 Fmoc-Sar-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
28 Fmoc-β-Ala-OH(3.0eq.) HATU(2.85eq.)and DIEA(6.0eq.)
20％哌啶DMF溶液，30分钟用于Fmoc保护剂的脱除。使用茚三酮监测偶联反应，树脂以DMF洗涤5次。
肽的断裂和纯化：
1.将多肽侧链保护的多肽加入反应瓶中，加入断裂缓冲液(90％TFA/2.5％TIS/2.5％H 2O/5.0％DTT)，室温搅拌2小时。
2.加入冰的异丙醚，多肽析出，离心(3min at 3000rpm)。
3.用异丙醚洗涤两次。
4.真空干燥得到白色固体粗品肽化合物P30(1.55g,粗品)。
HSK-P30的合成方法：
Figure PCTCN2022125377-appb-000042
将粗品肽P30溶于50％MeCN/H 2O(500mL),室温搅拌下缓慢加入TATA(购自药明康德，150mg,0.60mmol)，加料时间30分钟以上，加完，室温搅拌30分钟，加入碳酸氢铵调节PH值至8，反应液室温搅拌12小时，LC-MS显示反应完毕，制备HPLC纯化(流动相，A:0.075％TFA in H 2O,B:CH 3CN) 得到白色固体HSK-P30(115mg,纯度96.4％)。
按照上述方法，分别合成了HSK-P16，HSK-P21，HSK-P23，HSK-P24，HSK-P25，HSK-P26，HSK-P27，HSK-P28，HSK-P29，HSK-P31，HSK-P32，HSK-P33。
HSK-P15:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:2(Cys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Hcys)，分子支架选自TATA。
HSK-P16:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:3(Cys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Cys)，分子支架选自TATA。
HSK-P17:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:4(Hcys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Cys)，分子支架选自TATA。
HSK-P21:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:1(Hcys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Hcys)，分子支架选自TATA。
HSK-P23:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:2(Cys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Hcys)，分子支架选自TATB。
HSK-P24:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:3(Cys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Cys)，分子支架选自TATB。
HSK-P25:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:4(Hcys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Cys)，分子支架选自TATB。
HSK-P26:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:7(Hcys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Cys)，分子支架选自TATB。
HSK-P27:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:6(Hcys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Hcys)，分子支架选自TATB。
HSK-P28:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:5(Cys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Hcys)，分子支架选自TATB。
HSK-P29:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:7(Hcys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Cys)，分子支架选自TATA。
HSK-P30:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:6(Hcys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Hcys)，分子支架选自TATA。
HSK-P31:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:5(Cys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Hcys)，分子支架选自TATA。
HSK-P32:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:1(Hcys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Hcys)，分子支架选自
Figure PCTCN2022125377-appb-000043
HSK-P33:氨基酸序列为(β-Ala)-Sar10-Ala(hArg)Asp-SEQ ID NO:1(Hcys-HyP-Leu-Val-Asn-Pro-Leu -Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-hArg-Hcys)，分子支架选自
Figure PCTCN2022125377-appb-000044
中间体13
Figure PCTCN2022125377-appb-000045
第一步：
将中间体11(6g，43.46mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(5.50g，47.74mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(12.50g，65.19mmol)加入DCM(12mL)和DMF(50mL)的混合体系中，室温反应3h。LC-MS监测反应完全。减压浓缩掉DCM，加入水(300ml)，用乙酸乙酯萃取(100ml×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到白色固体中间体12(10g，97.83％)。
第二步：
将5-氨基戊酸叔丁酯(2g，11.54mmol)，中间体2(2.71g，11.54mmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.48g，34.64mmol)依次加入DMF(20ml)中。室温反应5h，加入水(100ml)，用乙酸乙酯萃取(50ml×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩后硅胶柱色谱分离纯化(EA:PE＝1:3)得到油状物中间体13(1.8g，53.17％)。
LCMS m/z＝238.2[M-tBu+1] +。
实施例1
Figure PCTCN2022125377-appb-000046
第一至第四步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000047
将CTC树脂(75g，1.0mmol/g)和Fmoc-L-瓜氨酸(30.0g，75.4mmol，1.0eq)加入到二氯甲烷(600mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(58.4g，453mmol，6.0eq)，反应3小时。抽滤，树脂用DMF洗两次，向树脂混合物中加入配好的20％哌啶/DMF的溶液，体系反应2小时，抽滤，树脂用DMF洗两次。向树脂混合物中依次加入DMF(600mL)，Boc-L-缬氨酸(48.0g，0.22mmol，3.0eq)和HBTU(85.0g，0.21mmol 2.85eq)和N,N-二异丙基乙胺(58.4g，453mmol，6.0eq)，体系反应3小时，抽滤，树脂用DMF洗三次，甲醇洗三次，二氯甲烷洗两次。向树脂混合物中加入配好的20％六氟异丙醇/二氯甲烷溶液，体系反应30分钟，抽滤，再重复一次前面操作。合并母液，浓缩至干，得到25.0g中间体4(四步收率＝88％)。
LCMS m/z＝374.9[M+1] +。
第五步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000048
将中间体4(25g，66.7mmol)加入到二氯甲烷(250mL)和甲醇(250mL)中，再加入对氨基苯甲醇(9.84g，80.0mmol)和EEDQ(39.5g，80.0mmol)，室温搅拌16h，浓缩至干，柱层析纯化(DCM:MeOH＝10:1)，得到10g中间体5(收率＝31％)。
LCMS m/z＝480.1[M+1] +。
第六步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000049
将中间体5(10.0g，20.8mmol)加入到干燥的二氯甲烷(120mL)和干燥的四氢呋喃(60mL)中，氮气保护，再加入对硝基苯基氯甲酸酯(6.2g，31.2mmol)和吡啶(3.3g，41.6mmol)，室温搅拌5h，过滤，母液浓缩至干，柱层析纯化(DCM:MeOH＝10:1)得到2.3g中间体6(收率＝16.6％)。
LCMS m/z＝664.3[M+1] +。
第七步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000050
将中间体6(2.1g，3.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.6g，31mmol)加入到DMF(40mL)中，氮气保护，室温搅拌10分钟，降温至0℃，再加入MMAE(购自成都华捷明生物科技有限公司，2.0g，3.1mmol)和HOBT(0.38g，3.1mmol)，保温搅拌30分钟，移至室温搅拌18h，直接C18反相柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝50:50)，得到2.7g中间体7(收率＝70％)。
LCMS m/z＝1223.4[M+1] +。
第八步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000051
向中间体7(2.0g，1.6mmol)中加入混合均匀的TFA/DCM＝1:10的混合液(34mL)，室温搅拌2h，25℃浓缩干溶剂，加入四氢呋喃(110mL)和碳酸钾(2.26g，16mmol)，室温搅拌3h。浓缩至干，直接C18反相柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝60:40)，得到1.4g中间体8(收率＝76.5％)。
LCMS m/z＝1123.4[M+1] +。
第九步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000052
将中间体8(1.4g，1.25mmol)，戊二酸酐(0.29g，2.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.33g，2.5mmol)加入到DMA(14mL)中，室温搅拌18h，C18反相制备柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝50:50)，得到1.3g中间体9(收率＝84.4％)。
LCMS m/z＝1237.4[M+1] +。
第十步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000053
将中间体9(1.3g，1.05mmol)，加入到DMA(58mL)和二氯甲烷(20mL)中，氮气保护，降温至0℃，加入N-羟基丁二酰亚胺(0.37g，3.15mmol)和EDCI(0.61g，3.15mmol)，室温搅拌18h，C18反相制备柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝50:50)，得到1.0g中间体10(收率＝71.4％)。
LCMS m/z＝1334.5[M+1] +。
第十一步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000054
将中间体10(10mg，7.5μmol)和HSK-P14(20mg，6.2μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mg，18.6μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯(液相制备条件：C18反相制备柱，流动相为含0.1％三氟乙酸的去离子水(A)，含0.1％三氟乙酸的乙腈(B)，梯度洗脱，B含量＝5％～70％，洗脱时间15min，流速12mL/min，柱温：30℃，保留时间：4.56min)得到10mg化合物1(收率＝37％)。
LCMS m/z＝881.3[M/5+1] +,1101.3[M/4+1] +,1467.9[M/3+1] +。
实施例2
Figure PCTCN2022125377-appb-000055
将中间体10(10mg，7.5μmol)和HSK-P15(20mg，6.2μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mg，18.6μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯(液相制备条件：C18反相制备柱，流动相为含0.1％三氟乙酸的去离子水(A)，含0.1％三氟乙酸的乙腈(B)，梯度洗脱，B含量＝5％～70％，洗脱时间15min，流速12mL/min，柱温：30℃，保留时间：4.66min)得到10mg化合物2。
LCMS m/z＝884.2[M/5+1] +,1104.8[M/4+1] +,1472.5[M/3+1] +。
实施例3
Figure PCTCN2022125377-appb-000056
合成方法参照实施例1：
将中间体10(10mg，7.5μmol)和HSK-P16(20mg，6.2μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mg，18.6μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到10mg化合物3。
LCMS m/z＝884.2[M/5+1] +,1104.8[M/4+1] +,1472.8[M/3+1] +。
实施例4
Figure PCTCN2022125377-appb-000057
将中间体10(10mg，7.5μmol)和HSK-P17(20mg，6.2μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mg，18.6μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯(液相制备条件：C18反相制备柱，流动相为含0.1％三氟乙酸的去离子水(A)，含0.1％三氟乙酸的乙腈(B)，梯度洗脱，B含量＝5％～70％，洗脱时间15min，流速12mL/min，柱温：30℃，保留时间：4.54min)得到10mg化合物4。
LCMS m/z＝884.2[M/5+1] +,1104.8[M/4+1] +,1472.6[M/3+1] +。
实施例5
Figure PCTCN2022125377-appb-000058
合成方法参照实施例1：
将中间体10(10mg，7.5μmol)和HSK-P21(20mg，6.2μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(2.4mg，18.6μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到10mg化合物5。
LCMS m/z＝889.8[M/5+1] +,1111.9[M/4+1] +,1482.3[M/3+1] +。
实施例6
Figure PCTCN2022125377-appb-000059
合成方法参照实施例1：
将中间体10(15mg，11.4μmol)和HSK-P23(30mg，9.5μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3.7mg，28.5μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到15mg化合物6。
LCMS m/z＝875.7[M/5+1] +,1094.3[M/4+1] +,1458.8[M/3+1] +。
实施例7
Figure PCTCN2022125377-appb-000060
合成方法参照实施例1：
将中间体10(15mg，11.4μmol)和HSK-P24(30mg，9.5μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3.7mg，28.5μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到15mg化合物7。
LCMS m/z＝875.8[M/5+1] +,1094.4[M/4+1] +,1458.9[M/3+1] +。
实施例8
Figure PCTCN2022125377-appb-000061
合成方法参照实施例1：
将中间体10(15mg，11.4μmol)和HSK-P25(30mg，9.5μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3.7mg，28.5μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到15mg化合物8。
LCMS m/z＝875.7[M/5+1] +,1094.3[M/4+1] +,1458.7[M/3+1] +。
实施例9
Figure PCTCN2022125377-appb-000062
合成方法参照实施例1：
将中间体10(15mg，11.3μmol)和HSK-P26(30mg，9.4μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3.7mg，28.5μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到14mg化合物9。
LCMS m/z＝878.6[M/5+1] +,1097.9[M/4+1] +,1463.4[M/3+1] +。
实施例10
Figure PCTCN2022125377-appb-000063
合成方法参照实施例1：
将中间体10(15mg，11.3μmol)和HSK-P27(30mg，9.4μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3.7mg，28.5μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到16mg化合物10。
LCMS m/z＝878.6[M/5+1] +,1097.9[M/4+1] +,1463.4[M/3+1] +。
实施例11
Figure PCTCN2022125377-appb-000064
合成方法参照实施例1：
将中间体10(15mg，11.3μmol)和HSK-P28(30mg，9.4μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3.7mg，28.5μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到15mg化合物11。
LCMS m/z＝878.5[M/5+1] +,1097.8[M/4+1] +,1463.4[M/3+1] +。
实施例12
Figure PCTCN2022125377-appb-000065
合成方法参照实施例1：
将中间体10(15mg，11.2μmol)和HSK-P29(30mg，9.3μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3.7mg，28.5μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到14mg化合物12。
LCMS m/z＝887.0[M/5+1] +,1108.4[M/4+1] +,1477.4[M/3+1] +。
实施例13
Figure PCTCN2022125377-appb-000066
将中间体10(15mg，11.2μmol)和HSK-P30(30mg，9.3μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3.7mg，28.5μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯(液相制备条件：C18反相制备柱，流动相为含0.1％三氟乙酸的去离子水(A)，含0.1％三氟乙酸的乙腈(B)，梯度洗脱，B含量＝5％～70％，洗脱时间15min，流速12mL/min，柱温：30℃，保留时间：4.75min)得到15mg化合物13。
LCMS m/z＝887.0[M/5+1] +,1108.4[M/4+1] +,1477.3[M/3+1] +。
实施例14
Figure PCTCN2022125377-appb-000067
合成方法参照实施例1：
将中间体10(15mg，11.2μmol)和HSK-P31(30mg，9.3μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3.7mg，28.5μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到17mg化合物14。
LCMS m/z＝886.9[M/5+1] +,1108.3[M/4+1] +,1477.6[M/3+1] +。
实施例15
Figure PCTCN2022125377-appb-000068
合成方法参照实施例1：
将中间体10(15mg，11.2μmol)和HSK-P32(30mg，9.3μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3.7mg，28.5μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到17mg化合物15。
LCMS m/z＝908.6[M/5+1],1135.5[M/4+1]。
实施例16
Figure PCTCN2022125377-appb-000069
合成方法参照实施例1：
将中间体10(15mg，11.2μmol)和HSK-P33(30mg，9.3μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3.7mg，28.5μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯得到15mg化合物16。
LCMS m/z＝900.2[M/5+1] +,1125.1[M/4+1] +,1499.7[M/3+1] +。
实施例17
Figure PCTCN2022125377-appb-000070
第一步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000071
依次将已知化合物2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯(25.0g，0.1mol)，溴乙酸乙酯(43.2g，0.22mol)，碳酸钠(40.5g，0.25mol)加入到乙腈(1.2L)中，升温至50℃搅拌18h，冷却至室温，过滤，母液浓缩至干，得到42g粗品17b。(收率＝99％)。
LCMS m/z＝421.3[M+1] +。
第二、三步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000072
将化合物17b(42.0g，0.1mol)加入到甲醇(500mL)和水(500mL)中，再加入氢氧化钠(40.3g，1.0mol)，室温搅拌4h，用6N的盐酸调pH至1～2，搅拌0.5h。反应液直接用于下一步反应。
LCMS m/z＝265.2[M+1] +。
第四步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000073
向17d的反应液中依次加入9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(34.0g，0.1mol)，碳酸氢钠(42.0g，0.5mol)，室温搅拌4h，C18反相柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝60:40)，得到22g 17e(两步收率＝45.2％)。
LCMS m/z＝487.2[M+1] +。
第五步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000074
依次将17e(5.0g，0.01mol)，五氟苯酚(3.86g，0.02mol)和N,N-二异丙基碳二亚胺(2.65g，0.02mol)，室温搅拌2h，柱层析纯化(PE:EA＝2:1)得到4.0g 17f(收率＝47.6％)。
LCMS m/z＝819.1[M+1] +。
第六步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000075
依次将17f(140mg，0.17mmol)，中间体8(390mg，0.34mmol)和N,N-二异丙基乙胺(152mg，1.02mmol)加入到DMF(5mL)中，室温搅拌12h，C 18反相柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝40:60)，得到300mg17g(收率＝65.1％)。
LCMS m/z＝899.8[M/3+1] +，1349.5[M/2+1] +。
第七步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000076
将17g(300mg，0.11mmol)加入到哌啶：DMF＝1:4的混合溶液(5mL)中，室温搅拌2h，C18反相柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝50:50)，得到200mg 17h(收率＝72.5％)。
LCMS m/z＝825.8[M/3+1] +，1238.1[M/2+1] +。
第八步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000077
将17h(200mg，0.08mmol)，戊二酸酐(19mg，0.16mmol)和N,N-二异丙基乙胺(21mg，0.16mmol)加入到DMA(2mL)中，室温搅拌18h，C18反相制备柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝50:50)，得到140mg17i(收率＝66.9％)。
LCMS m/z＝863.8[M/3+1] +，1295.3[M/2+1] +。
第九步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000078
将17i(46mg，0.017mmol)加入到DMA(1mL)和二氯甲烷(0.3mL)中，氮气保护，降温至0℃，加入N-羟基丁二酰亚胺(6mg，0.051mmol)和EDCI(10mg，0.051mmol)，室温搅拌18h，C18反相制备柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝50:50)，得到40mg 17j(收率＝83.8％)。
LCMS m/z＝896.3[M/3+1] +，1343.6+1] +。
第十步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000079
将17j(40mg，15μmol)和HSK-P17(30mg，13μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(6mg，45μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯(液相制备条件：C18反相制备柱，流动相为含0.1％三氟乙酸的去离子水(A)，含0.1％三氟乙酸的乙腈(B)，梯度洗脱，B含量＝5％～70％，洗脱时间15min，流速12mL/min，柱温：30℃，保留时间：5.32min)得到20mg化合物17(收率＝47％)。
LCMS m/z＝962.2[M/6+1] +,1154.6[M/5+1] +,1442.9[M/4+1] +。
实施例18：
Figure PCTCN2022125377-appb-000080
第一步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000081
依次将已知化合物SN38(4.0g，0.01mol)，二碳酸二叔丁酯(3.1g，0.013mol)加入到二氯甲烷(300mL)中，再加入吡啶(26.0g，0.3mol)，室温搅拌18h，浓缩至干得到5.0g粗品18a。(收率＝99％)。
LCMS m/z＝493.1[M+1] +。
第二步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000082
依次将18a(2.0g，4mmol)，N,N-二异丙基乙胺(2.63g，20mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.5g，4mmol)加入到干燥的二氯甲烷(40mL)中，氮气保护，降温至0℃，缓慢滴加三光气(0.52g，1.72mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)，滴毕，0℃搅拌5分钟，室温搅拌10分钟，再滴加Boc-Val-Cit-PABC(1.75g，3.6mmol)的二甲基亚砜(10mL)和二氯甲烷(10mL)的混合溶液，滴毕，搅拌2小时，加水(100mL)和二氯甲烷(50mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干柱层析纯化(DCM:MeOH＝20:1)得到1.4g化合物18b。(收率＝35％)。
LCMS m/z＝998.4[M+1] +。
第三步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000083
将18b(1.26g，0.126mmol)加入到二氯甲烷(13mL)和三氟乙酸(13mL)的混合溶液中，室温搅拌30分钟，30℃浓缩至干得到1.0g粗品18c。(收率＝99％)。
LCMS m/z＝798.4[M+1] +。
第四步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000084
将17f(150mg，0.18mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(60mg，0.46mmol)，滴加Val-Cit-PABC-MMAE(200mg，0.16mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(1mL)，室温搅拌30分钟，再加入N,N-二异丙基乙胺(60mg，0.46mmol)，滴加18c(165mg，0.18mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(1mL)，室温搅拌2h，C18反相制备柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝35:65)，得到80mg18d(收率＝23.2％)。
LCMS m/z＝1186.5[M/2+1] +。
第五步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000085
将18d(80mg，0.034mmol)加入到20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(1mL)溶液中，室温搅拌1分钟，C18反相制备柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝50:50)，得到40mg 18e(收率＝55.5％)。
LCMS m/z＝1075.3[M/2+1] +。
第六步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000086
将18e(40mg，0.018mmol)和戊二酸酐(2.4mg，0.018mmol)加入到N,N-二甲基乙酰胺(1mL)溶液中，再加入N,N-二异丙基乙胺(5mg，0.038mmol)，室温搅拌2小时，C18反相制备柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝50:50)，得到40mg 18f(收率＝95％)。
LCMS m/z＝1132.7[M/2+1] +。
第七步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000087
依次将18f(40mg，0.018mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(6mg，0.054mmol)和EDCI(11mg，0.054mmol)加入到N,N-二甲基乙酰胺(1mL)和二氯甲烷(0.3mL)溶液中，氮气保护，室温搅拌18小时，20℃浓缩除去二氯甲烷，C18反相制备柱纯化(0.1％TFA)(H 2O:ACN＝45:55)，得到40mg 18g(收率＝96％)。
LCMS m/z＝1181.1[M/2+1] +。
第八步：
Figure PCTCN2022125377-appb-000088
依次将18g(20mg，8μmol)和HSK-P17(19mg，6μmol)加入到DMA(1mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(3mg,18μmol)，室温搅拌18h。用液相制备柱分离提纯(液相制备条件：C18反相制备柱，流动相为含0.1％三氟乙酸的去离子水(A)，含0.1％三氟乙酸的乙腈(B)，梯度洗脱，B含量＝5％～70％，洗脱时间15min，流速12mL/min，柱温：30℃，保留时间：5.54min)得到5mg化合物18(收率＝15％)。
LCMS m/z＝908.0[M/6+1] +,1089.3[M/5+1] +,1361.4[M/4+1] +。
实施例19
Figure PCTCN2022125377-appb-000089
第一步：
将19a(20g，108.05mmol)加入二氯亚砜(80mL)中，再加入DMF(1ml)，90℃反应3h。减压浓缩掉SOCl 2,将残留物用甲苯(40ml)稀释后直接用于下一步反应。
第二步：
在单口瓶(500ml)中依次加入三乙胺(21.8g，216.1mmol)，1,3-丙二酸二甲酯(17.13g，129.70mmol)和氯化镁(7.20g，75.54mmol)。室温下搅拌1.5h(搅拌过程中体系凝固，加入少量甲苯便于搅拌)。缓慢滴入19b的甲苯溶液，加完后室温搅拌过夜。加入水(200ml)洗涤，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，有机相用稀盐酸(4mol/L)的水溶液调洗涤，分液，有机相减压浓缩干后加入6N盐酸(200ml)回流过夜。降至室温，乙酸乙酯萃取(100ml×3)，有机相减压浓缩后硅胶柱色谱分离纯化(EA:PE＝1/20)得到19c(14g)，两步收率70％。
LCMS m/z＝184.1[M+1] +。
第三步：
在单口瓶(100ml)中加入19c(1.1g，6.01mmol)，中间体13(1.76g，6.01mmol)，乙腈(20mL)和碳酸钾(1.66g，12.01mmol)。80℃反应5h。LC-MS监测反应完全，降至室温，过滤，固体用少量乙酸乙酯洗涤，滤液直接减压浓缩后硅胶柱色谱分离纯化(EA:PE＝1:3)得到19d(1.8g，65.61％)。
LCMS m/z＝401.1[M-tBu+1] +。
第四步：
在单口瓶(100ml)中加入19d(1.8g，3.94mmol)，甲醇(20mL)。0℃下分批加入硼氢化钠(0.18g，4.73mmol)。保持0℃反应30min。TLC监测反应完全。加入水(50ml)，乙酸乙酯萃取(30ml×3)合并有 机相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩后得到19e(1.8g，99.64％)。
19e(1.9g，4.14mmol)经手性制备得19e-1(0.64g，35.5％，保留时间：1.878min)和19e-2(0.6g，33.3％，保留时间：1.965min)。手性制备方法：仪器：Waters 150MGM；色谱柱：cellulose-2Column(250×30mm,I.D 30mm,10um particle size)；流动相：A：二氧化碳and B：IPA；等度洗脱：20％流动相B；流速：100mL/min；背压：100bar；柱温：25℃；波长：220nm；洗脱时间：5min。
LCMS m/z＝403.1[M- tBu+1] +。
第五步：
将19e-1(0.60g，1.31mmol)，二(对硝基苯)碳酸酯(0.40g，1.31mmol)和三乙胺(0.13g，1.31mmol)加入二氯甲烷(10mL)中，室温反应16h。直接将反应液减压浓缩后硅胶柱色谱分离纯化(EA/PE＝0-60％)得到19f(0.65g，79.57％)。
LCMS m/z＝568.2[M-tBu+1] +。
第六步：
将19f(0.6g，0.96mmol)，MMAE(0.69g，0.96mmol)，1-羟基苯并三唑(0.13g，0.96mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.62g，4.83mmol)依次加入DMF(10mL)中，室温反应16h。LC-MS监测反应完全。C18反相柱纯化，流动相A,B组成：流动相A：乙腈；流动相B：水(含0.1％TFA)，(A/B＝60％/40％)分离提纯得到标题化合物(0.8g，69％)。
LCMS m/z＝1202.8[M+1] +。
第七步：
将19g(0.8g，0.67mmol)加入二氯甲烷(20mL)中，再加入三氟乙酸(2ml)，室温搅拌4h。LC-MS监测反应完全。室温下减压浓缩掉溶剂，加入四氢呋喃(20ml)，再加入碳酸钾(0.93g，6.73mmol)，室温搅拌3h。将四氢呋喃减压浓缩后加入水(10ml)和甲醇(10ml)。C18反相柱纯化，流动相A,B组成，动相A：乙腈；流动相B：水(含0.1％TFA)，(A/B＝60％/40％)分离提纯得到标题化合物(0.45g，58％)。
LCMS m/z＝1147.4[M+1] +。
第八步：
将19h(0.30g，0.26mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(0.089g，0.77mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.15g，0.78mmol)依次加入DMA(5ml)和二氯甲烷(1ml)的混合体系中。室温反应过夜。LC-MS监测反应。减压将二氯甲烷浓缩。C18反相柱纯化，流动相A，B组成，动相A：乙腈；流动相B：水(含0.1％TFA)，(A/B＝65％/35％)分离提纯得到19i(0.2g，62％)。
LCMS m/z＝1243.7[M+1] +。
第九步：
将19i(14mg，0.011mmol)，HSK-P17(30mg，0.0094mmol)和N,N-二异丙基乙胺(7.11mg，0.055mmol)加入DMF(2mL)中。室温反应3h。LC-MS监测反应完全。直接将反应液送HPLC纯化，得到化合物19(30mg，63.09％)。制备HPLC分离方法：1.仪器：waters 2767制备液相；色谱柱:SunFire@Prep C18(19mm×250mm)2.样品用DMF溶解，用0.45μm滤头过滤，制成样品液。3.制备色谱条件：a.流动相A,B组成：流动相A：乙腈；流动相B：水(含0.1％TFA)b.梯度洗脱，流动相A含量从5％-70％c.流量12mL/min。d洗脱时间20min。
LCMS m/z＝1082.1[M/4+1] +，1442.4[M/3+1] +。
实施例20
Figure PCTCN2022125377-appb-000090
合成方法参照实施例19：以化合物19e-2为原料，经反应、纯化得到化合物20(28mg，58.89％)。
制备HPLC分离方法：1.仪器：waters 2767制备液相；色谱柱:SunFire@Prep C18(19mm×250mm)2.样品用DMF溶解，用0.45μm滤头过滤，制成样品液。3.制备色谱条件：a.流动相A,B组成：流动相A：乙腈；流动相B：水(含0.1％TFA)b.梯度洗脱，流动相A含量从5％-70％c.流量12mL/min。d洗脱时间20min。
LCMS m/z＝1082.1[M/4+1] +，1442.4[M/3+1] +。
生物测试例
1.PC3细胞增殖抑制实验
PC3细胞培养条件：RPMI-1640+10％FBS+1％双抗，培养于37℃，5％CO 2孵箱中。第一天收集指数生长期的PC3细胞铺板96孔培养板，每孔90μL，铺板密度为500个/孔，于37℃，5％CO 2孵箱中培养过夜。第二天每孔加入10μL不同浓度化合物，使每孔DMSO终浓度均为0.1％，于37℃，5％CO 2孵箱中培养3天。培养结束后，每孔加入50μL检测液(Cell Viability Assay，Promega，G7573)，混匀2分钟，室温孵育10分钟，酶标仪检测化学发光读数。结果按照式(1)处理，计算出化合物各个浓度的增殖抑制率，并使用origin9.2软件，计算抑制率为50％时化合物的浓度IC 50值。其中RLU  compound为药物处理组的读数，RLU  control为溶剂对照组的平均值。
Inhibition％＝(1-(RLU  compound/RLU  control)×100％   式(1)
部分实施例的试验结果见表1。
表1化合物对PC3细胞增殖抑制活性
化合物 IC 50(nM) Max inh.％10μM
化合物2 A 75.0
化合物4 A 73.5
化合物8 B 77.8
化合物9 B 71.7
化合物13 B 72.9
化合物17 A 69.4
化合物18 B 92.7
注：A≤10nM，10nM＜B≤50nM，50nM＜C≤100nM。
结论：本发明的化合物具有非常优异的抑制活性，化合物的IC50小于100nM，部分结构IC50小 于50nM，部分结构小于10nM，优异的结构小于5nM，更优异的小于2nM，例如化合物2、4和17，其IC 50分别为3.1nM、2.9nM和1nM。对照化合物BT5528的IC 50为7.4nM。
2.MOLP8细胞增殖抑制实验
购自DSMZ的人多发性骨髓瘤MOLP8细胞置于RPMI-1640完全培养基(添加20％胎牛血清)中，在37℃、5％CO 2条件下培养。收集处于指数生长期的细胞，用培养基将细胞悬液调整到8000个/135μL。每孔加135μL细胞悬液于96孔细胞培养板，孵育过夜。第二天，加入不同浓度的化合物，置于孵箱中培养孵育5天。培养结束后，按照CellTiter-Glo试剂盒(Promega，Cat#G7573)操作说明，每孔加入75μL预先融化并平衡至室温的CTG溶液，用微孔板震荡器混匀2分钟，于室温放置10分钟后用Envision 2104读板仪(PerkinElmer)测定萤光信号值。按公式[(1–(RLU compound–RLU blank)/(RLU control–RLU  blank))×100％]计算细胞增殖抑制率。使用GraphPad Prism软件通过四参数非线性拟合获得IC 50值。部分实施例试验结果见表2。
表2化合物对MOLP8细胞的抑制活性
化合物 IC 50(nM) Max inh.％10μM 化合物4IC 50/MMAE IC 50
化合物4 143.6 99.1 120
结论：本发明的化合物4在体外对阴性细胞MOLP8活性远弱于对阳性细胞PC3活性，表明其具有良好的细胞选择性。
3.大鼠药代动力学测试
3.1试验动物：雄性SD大鼠，220g左右，6～8周龄，3只/化合物。购于成都达硕实验动物有限公司。
3.2试验设计：试验当天，3只SD大鼠按体重随机分组。给药前1天禁食不禁水12～14h，给药后4h给食。
表3.给药信息
Figure PCTCN2022125377-appb-000091
注：5％DMA+95％(20％SBE-CD)
于给药前及给药后异氟烷麻醉经眼眶取血0.15ml，置于EDTAK2离心管中，5000rpm，4℃离心10min，收集血浆。静脉组和灌胃组采血时间点均为：0,5,15,30min,1,2,4,6,8,24h。分析检测前，所有样品存于-80℃，用LC-MS/MS对样品进行定量分析。
表4.测试化合物在大鼠血浆中的药代动力学参数
Figure PCTCN2022125377-appb-000092
结论：化合物4具有良好的大鼠体内药代动力特征。
4.猴药代动力学测试
4.1试验动物：雄性食蟹猴，3～5kg，3～6年龄，3只/化合物。购于苏州西山生物技术有限公司。
4.2试验方法：试验当天，3只猴按体重随机分组。给药前1天禁食不禁水14～18h，给药后4h给食。
表5.给药信息
Figure PCTCN2022125377-appb-000093
静脉给药溶媒:5％DMA+95％(20％SBE-CD)。
于给药前及给药后通过四肢静脉取血1.0mL，置于EDTAK2离心管中。5000rpm，4℃离心10min，收集血浆。静脉组采血时间点均为：0,2,5,15,30min,1,2,4,6,8,24h。分析检测前，所有样品存于-80℃，用LC-MS/MS对样品进行定量分析。
表6.测试化合物在猴血浆中的药代动力学参数
Figure PCTCN2022125377-appb-000094
NC：无法计算；
结论：化合物4具有良好的猴体内药代动力特征。
5.小鼠PC3细胞皮下体内移植瘤模型
人前列腺癌PC3细胞置于RPMI-1640培养基(添加10％胎牛血清和1％双抗)，在37℃条件下培养。一周两次用胰酶进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，数量达到要求时，收集细胞，计数后接种。将0.1mL(2×10 6个)PC3细胞(加基质胶，体积比为1:1)皮下接种于雄性CB-17SCID小鼠(来源于北京维通利华实验动物技术有限公司)的右后背，肿瘤平均体积达到约80-120mm 3时开始分组给药(记为Day 0)。溶媒组给予50mM醋酸和10％蔗糖溶液(PH＝5)，给药组静脉给予0.5mg/kg的化合物2、化合物4或化合物13，给药频率为每周一次，给药周期为35天(Day 0-Day 34)。分组后开始每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径，肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5×a×b 2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。化合物的抑瘤疗效用TGI(％)＝[1–(某处理组给药结束时平均瘤体积–该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积–溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％进行评价。肿瘤生长曲线与动物体重变化曲线分别如图1与图2所示。
测试结果：每周一次给药35天后，给予化合物2、化合物4与化合物13组的TGI分别为90％、92％与88％；所有给药组动物体重最大下降幅度均明显低于溶媒组。
结论：在小鼠PC3皮下体内移植瘤模型中，本发明的化合物2、化合物4与化合物13具有良好的肿瘤生长抑制药效，且耐受性良好。

Claims (22)

  1. 一种特异于EphA2的肽配体，其包含多肽和非芳香族分子支架，所述多肽包含至少三个独立选自Cys和Hcys的残基，且其中至少一个是Hcys残基，所述三个Cys和Hcys残基被两个环序列隔开，所述多肽的Cys或Hcys残基经硫醚键与所述支架连接，从而在所述支架上形成两个多肽环。
  2. 根据权利要求1所述的肽配体，其中所述肽配体包含以下的氨基酸序列：
    Xa1-A1-Xa2-A2-Xa3
    其中，A1、A2表示Xa1、Xa2、Xa3之间的氨基酸残基序列，并且A1和A2各自独立地包含5或6个氨基酸残基；
    Xa1、Xa2、Xa3独立地为Cys或Hcys残基，且至少有一个是Hcys残基，所述非芳香族分子支架与所述多肽的Xa1、Xa2、Xa3形成硫醚键从而在所述分子支架上形成两个多肽环。
  3. 根据权利要求2所述的肽配体，其中所述多肽配体包含以下所示的氨基酸序列：
    Xa1-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Xa2-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Xa3。
  4. 根据权利要求3所述的肽配体，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一所示的氨基酸序列：
    Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:1)；
    Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:2)；
    Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:3)；
    Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:4)；
    Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:5)；
    Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:6)；
    Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:7)。
  5. 根据权利要求4所述的肽配体，其中所述肽配体的多肽序列选自SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:14之一：
    (β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:8)；
    (β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:9)；
    (β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:10)；
    (β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:11)；
    (β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Cys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:12)；
    (β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Cys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Hcys(SEQ ID NO:13)；
    (β-Ala)-Sar 10-Ala-hArg-Asp-Hcys-Hyp-Leu-Val-Asn-Pro-Leu-Hcys-Leu-His-Pro-(D-Asp)-Trp-(hArg)-Cys(SEQ ID NO:14)。
  6. 根据权利要求4所述的肽配体，其中所述肽配体是含有以下结构之一的双环肽：
    Figure PCTCN2022125377-appb-100001
    其中，当Xa1、Xa2或Xa3为Cys时，对应地，m1、m2或m3为1；
    当Xa1、Xa2或Xa3为Hcys，对应地，m1、m2或m3为2；
    n1、n2、n3独立地为1或2。
  7. 根据权利要求6所述的肽配体，其中所述肽配体是具有以下结构之一的双环肽：
    Figure PCTCN2022125377-appb-100002
  8. 根据权利要求7所述的肽配体，其中，
    (1)Xa1为Hcys，m1为2，n1为1或2；或者
    (2)Xa2为Hcys，m2为2，n2为1或2；或者
    (3)Xa3为Hcys，m3为2，n3为1或2。
  9. 一种药物缀合物或其药学上可接受的盐，所述缀合物包含通过连接子缀合至一个或多个效应物和/或官能团的权利要求1-8中任意一项所述的肽配体。
  10. 根据权利要求9所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述效应物为细胞毒性剂。
  11. 根据权利要求10所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述细胞毒性剂选自如下组中：烷化剂类、抗代谢物类、植物生物碱类、萜类化合物类、鬼臼毒素类及其衍生物、紫杉烷类及其衍生物、拓扑异构酶抑制剂、抗肿瘤抗生素类。
  12. 根据权利要求10所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述细胞毒性剂选自如下组中：顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、硫唑嘌呤、巯嘌呤、嘧啶类似物、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、喜树碱、伊立替康、拓扑替康、安丫啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、埃博霉素及其衍生物、博来霉素及其衍生物、更生霉素及其衍生物、普卡霉素及其衍生物、丝裂霉素C、刺胞霉素、美登素及其衍生物、澳瑞他汀及其衍生物。
  13. 根据权利要求10所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述细胞毒性剂选自DM1、MMAE或SN38。
  14. 根据权利要求9所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述连接子为肽类连接子、二硫化物连接子、酶依赖性连接子或pH依赖型连接子。
  15. 根据权利要求14所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，所述二硫化物连接子选自DMDS、MDS、DSDM、NDMDS或式III结构：
    Figure PCTCN2022125377-appb-100003
    其中，R 1、R 2、R 3和R 4独立地选自H、甲基、乙基、丙基和异丙基；
    p和q独立地为1、2、3、4或5；
    所述肽类连接子选自：-Cit-Val-、-Phe-Lys-和-Val-Lys-；
    所述的酶依赖性连接子选自：
    Figure PCTCN2022125377-appb-100004
    所述pH依赖型连接子选自顺乌头酸酐。
  16. 根据权利要求14所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述连接子为-PABC-Cit-Val-戊二酰-、-PABC-环丁基-Ala-Cit-βAla-或(-PABC-Cit-Val-CO-CH 2) 2N-CH 2(CH 2OCH 2) 2CH 2NH-戊二酰-、
    Figure PCTCN2022125377-appb-100005
    其中PABC代表p-氨基苄基氨基甲酸酯。
  17. 根据权利要求9所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述药物缀合物具有式I、式II、式III、式IV、式V或VI的结构：
    Figure PCTCN2022125377-appb-100006
    Figure PCTCN2022125377-appb-100007
    其中，Xa1、Xa2、Xa3独立地为Cys或Hcys残基，且至少有一个是Hcys残基；
    当Xa1、Xa2或Xa3为Cys时，对应地，m1、m2或m3为1；
    当Xa1、Xa2或Xa3为Hcys，对应地，m1、m2或m3为2；
    n1、n2、n3独立地为1或2。
  18. 一种药物缀合物或其药学上可接受的盐，所述药物缀合物选自以下结构之一：
    Figure PCTCN2022125377-appb-100008
    Figure PCTCN2022125377-appb-100009
    Figure PCTCN2022125377-appb-100010
    Figure PCTCN2022125377-appb-100011
  19. 一种药物组合物，其含有权利要求9-18任意一项所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
  20. 权利要求9-18任意一项所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，或者权利要求19所述的组合物在制备预防和/或治疗过度表达EphA2的疾病中的用途，优选过度表达EphA2的疾病选自：前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、多发性骨髓瘤和纤维肉瘤。
  21. 一种药物组合物或药物制剂，所述的药物组合物或药物制剂包含选1-1500mg的权利要求9-18任意一项所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
  22. 一种用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的权利要求9-18任意一项所述的药物缀合物或其药学上可接受的盐，所述受试者包括哺乳动物或人，治疗有效量优选1-1500mg，所述的肿瘤优选前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、多发性骨髓瘤和纤维肉瘤。
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GAVIN BENNETT, AMY BROWN, GEMMA MUDD, PHILIP HUXLEY, KATERINE VAN RIETSCHOTEN, SILVIA PAVAN, LIUHONG CHEN, SOPHIE WATCHAM, JOHANNA: "MMAE Delivery Using the Bicycle Toxin Conjugate BT5528", MOLECULAR CANCER THERAPEUTICS, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, US, vol. 19, no. 7, 1 July 2020 (2020-07-01), US , pages 1385 - 1394, XP055719952, ISSN: 1535-7163, DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-19-1092 *
GEMMA E. MUDD, AMY BROWN, LIUHONG CHEN, KATERINE VAN RIETSCHOTEN, SOPHIE WATCHAM, DANIEL P. TEUFEL, SILVIA PAVAN, RACHID LANI, PHI: "Identification and Optimization of EphA2-Selective Bicycles for the Delivery of Cytotoxic Payloads", JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 63, no. 8, 23 April 2020 (2020-04-23), US , pages 4107 - 4116, XP055719953, ISSN: 0022-2623, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.9b02129 *

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