BR112020012246A2 - ligantes peptídicos bicíclicos específicos para epha2 - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a polipeptídeos que são ligados covalentemente a arcabouços moleculares não aromáticos, tal que duas ou mais alças peptídicas estejam subtendidas entre pontos de fixação ao arcabouço. Em particular, a invenção descreve peptídeos que são aglutinantes de alta afinidade do receptor tirosina quinase EpH A2 (EphA2). A invenção também inclui conjugados de fármaco que compreendem os ditos peptídeos, conjugados a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais, a composições farmacêuticas que compreendem os ditos ligantes peptídicos e conjugados de fármaco e ao uso dos ditos ligantes peptídicos e conjugados de fármaco para prevenir, suprimir ou tratar uma doença ou distúrbio caracterizado por superexpressão de EphA2 em tecido doente (tal como um tumor).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LIGAN- TES PEPTÍDICOS BICÍCLICOS ESPECÍFICOS PARA EphA2". Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos que são liga- dos covalentemente a arcabouços moleculares não aromáticos tal que dois ou mais loops (laços) peptídicos estejam subtendidos entre pon- tos de fixação ao arcabouço. Em particular, a invenção descreve pep- tídeos que são aglutinantes (binders) de alta afinidade do receptor tiro- sina quinase EpH A2 (EphA2). A invenção também inclui conjugados de fármaco que compreendem os ditos peptídeos, conjugados a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais, a composições farmacêuticas que compreendem os ditos ligantes peptídicos e conjugados de fárma- co e ao uso dos ditos ligantes peptídicos e conjugados de fármaco pa- ra prevenir, suprimir ou tratar uma doença ou distúrbio caracterizado por superexpressão de EphA2 em tecido doente (tal como um tumor). Antecedentes da Invenção
[002] Peptídeos cíclicos são capazes de ligarem-se com alta afi- nidade e especificidade pelo alvo a alvos proteicos e, consequente- mente, constituem uma classe molecular atraente para o desenvolvi- mento de agentes terapêuticos. De fato, diversos peptídeos cíclicos já são usados com êxito na clínica, como, por exemplo, o peptídeo anti- bacteriano vancomicina, o fármaco imunossupressor ciclosporina ou o fármaco antineoplásico octreotida (Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). As boas propriedades de ligação resultam de uma superfície de interação relativamente grande formada entre o peptídeo e o alvo, bem como a flexibilidade conformacional reduzida das estruturas cíclicas. Tipicamente, macrociclos ligam-se a superfí- cies de diversas centenas de angstrons quadrados, como, por exem- plo, o peptídeo cíclico CVX15 antagonista de CXCR4 (400 Å2; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), um peptídeo cíclico com o motivo de ligação Arg-Gly-Asp à integrina αVb3 (355 Å2) (Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151-5) ou a ligação do inibidor peptídico cíclico upain-1 ao ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (603 Å2; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10).
[003] Devido às suas configurações cíclicas, os macrociclos pep- tídicos são menos flexíveis do que os peptídeos lineares, levando a menor perda da entropia quando da ligação aos alvos e resultando em maior afinidade de ligação. A flexibilidade reduzida também leva ao bloqueio de conformações específicas do alvo, aumentando a especi- ficidade de ligação em comparação aos peptídeos lineares. Esse efeito foi exemplificado por um inibidor potente e seletivo da metaloprotei- nase da matriz 8, (MMP-8) que perdeu sua seletividade em relação a outras MMPs quando seu anel foi aberto (Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749-51). As propriedades de ligação favoráveis alcan- çadas através da macrociclização são ainda mais acentuadas em pep- tídeos multicíclicos que contêm mais de um anel peptídico como, por exemplo, em vancomicina, nisina e actinomicina.
[004] Diferentes equipes de pesquisa já prenderam polipeptídeos com resíduos de cisteína a uma estrutura molecular sintética (Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Meloen e colegas usaram tris(bromometil)benzeno e moléculas correlatas para ciclização rápida e quantitativa de múltiplos loops peptídicos em arcabouços sintéticos para simulação estrutural da superfície de proteínas (Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Métodos para a geração de compostos candidatos a fármacos em que os ditos compostos são gerados ligando-se polipeptídeos contendo cisteína a um arcabouço molecular como, por exemplo, TATA (1,1',1''- (1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona, Heinis et al. Angew Chem, Int Ed. 2014; 53:1602-1606).
[005] Abordagens combinatórias com base na expressão em fa-
gos foram desenvolvidas para gerar grandes bibliotecas de peptídeos bicíclicos e rastrear alvos de interesse (Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 e WO 2009/098450). Resumidamente, bibliotecas combinatórias de peptídeos lineares contendo três resíduos de cisteí- na e duas regiões de seis aminoácidos aleatórios (Cys-(Xaa)6-Cys- (Xaa)6-Cys) foram expressas em fago e ciclizadas, ligando-se covalen- temente as cadeias laterais das cisteínas a um arcabouço de pequena molécula. Sumário da Invenção
[006] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, provê-se um ligante peptídico específico para EphA2, o qual compreende um polipeptídeo incluindo pelo menos três resíduos de cisteína, separados por pelo menos duas sequências de loop, e um arcabouço molecular não aromático que forma ligações covalentes com os resíduos de cis- teína do polipeptídeo, de tal que pelo menos dois loops polipeptídicos sejam formados no arcabouço molecular.
[007] De acordo com um aspecto adicional da invenção, provê-se um conjugado de fármaco que compreende um ligante peptídico, como aqui definido, conjugado a um ou mais grupos efetores e/ou funcio- nais.
[008] De acordo com um aspecto adicional da invenção, provê-se uma composição farmacêutica que compreende um ligante peptídico ou um conjugado de fármaco, como aqui definidos, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[009] De acordo com um aspecto adicional da invenção, provê-se um ligante peptídico ou conjugado de fármaco, como aqui definidos, para uso na prevenção, supressão ou tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por superexpressão de EphA2 em tecido doen- te (tal como um tumor). Breve Descrição das Figuras
[0010] Figura 1: Mudanças no peso corporal após a administração de BCY6031 a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do tumor LU-01-0046. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0011] Figura 2: Traçado do volume tumoral após a administração de BCY6031 a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do tumor LU-01-0046. Os pontos de dados representam a média do grupo. O tratamento foi interrompido a partir do Dia 28.
[0012] Figura 3: Esquema geral demonstrando o conceito da pre- paração de conjugados fármaco-Biciclo (BDCs).
[0013] Figura 4: Gráfico de volume tumoral médio versus tempo de BCY6136 em camundongos com xenoenxerto de HT1080. As doses (2, 3 e 5 mg/kg) foram administradas nos dias 0 e 7. Mudanças no pe- so corporal durante o tratamento, indicativas de carga tumoral, toxico- logia associada ao fármaco e saúde global do animal, estão ilustradas na inserção em cima à direita.
[0014] Figura 5: Gráfico de volume tumoral médio versus tempo de BCY6136 em camundongos com xenoenxerto de NCI-H1975. As do- ses (1, 2 e 3 mg/kg) foram administradas nos dias 0, 7, 14, 21, 28 e
35. Mudanças no peso corporal durante o tratamento, indicativas de carga tumoral, toxicologia associada ao fármaco e saúde global do animal, estão ilustradas na inserção em cima à direita.
[0015] Figura 6: Gráfico de volume tumoral médio versus tempo de BCY6136 em camundongos com xenoenxerto de MDA-MB-231. As doses (1, 2 e 3 mg/kg) foram administradas nos dias 0, 7, 14, 21, 28, 35 e 45. Mudanças no peso corporal durante o tratamento, indicativas de carga tumoral, toxicologia associada ao fármaco e saúde global do animal, estão ilustradas na inserção em cima à direita.
[0016] Figuras 7 a 9: Mudanças no peso corporal e traçados do volume tumoral após a administração de BCY6136 (Figura 7), ADC
(Figura 8) e BCY6033 (Figura 9) a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de PC-3. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0017] Figura 10: Mudanças no peso corporal e traçados do volu- me tumoral após a administração de BCY6136, EphA2-ADC ou Doce- taxel a camundongos Balb/c nude machos portadores do xenoenxerto de PC-3. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0018] Figuras 11 a 13: Mudanças no peso corporal e traçado do volume tumoral após a administração de BCY6033 (Figura 11), BCY6136 (Figura 12) e BCY6082 (Figura 13) a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de NCI-H1975. Os pontos de dados representam o volume tumoral e o peso corporal médios do grupo.
[0019] Figuras 14 e 15: Mudanças no peso corporal e traçados do volume tumoral após a administração de BCY6136 e ADC a camun- dongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de LU-01-
0251. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do gru- po.
[0020] Figura 16: Mudanças no peso corporal e traçados do volu- me tumoral após a administração de BCY6033, BCY6136, BCY6082 e BCY6031 a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores de LU-01-
0046. Pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0021] Figura 17: Mudanças no peso corporal e traçados do volu- me tumoral após a administração de BCY6136 ou ADC a camundon- gos Balb/c nude fêmeas portadores do modelo de PDX LU-01-0046 de CPNPN. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0022] Figuras 18 a 22: Mudanças no peso corporal e traçados do volume tumoral após a administração de BCY6033 (Figura 18),
BCY6136 (Figura 19), BCY6082 (Figura 20), BCY6173 (Figura 21) e BCYs 6175 e 6031 (Figura 22) a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores de LU-01-0046. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0023] Figura 23: Mudanças no peso corporal e traçados do volu- me tumoral após a administração de BCY6136 (referido como BT5528 na Figura 23), BCY8245 ou BCY8781 a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de LU-01-0412. Os pontos de da- dos representam a média do volume tumoral (painel esquerdo) e peso corporal (painel direito) do grupo.
[0024] Figura 24: Mudanças no peso corporal e traçados do volu- me tumoral após a administração de BCY6136 a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de LU-01-0486. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0025] Figuras 25 a 27: Mudanças no peso corporal e traçado do volume tumoral após a administração de BCY6033 (Figura 25), BCY6136 (Figura 26) e BCY6082 (Figura 27) a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de MDA-MB-231-luc. Os pon- tos de dados representam o volume tumoral e o peso corporal médios do grupo.
[0026] Figura 28: Mudanças no peso corporal e traçados do volu- me tumoral após a administração de BCY6136 a camundongos BALB/c fêmeas portadores do enxerto singênico de EMT-6. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo. A dose do gru- po 3 e grupo 4 foi trocada para 5 mpk e 3 mpk a partir do Dia 14.
[0027] Figura 29: Mudanças no peso corporal e traçados do volu- me tumoral após a administração de BCY6136 a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de NCI-N87. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0028] Figura 30: Mudanças no peso corporal e traçados do volu-
me tumoral após a administração de BCY6136 a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de SK-OV-3. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0029] Figura 31: Mudanças no peso corporal e traçados do volu- me tumoral após a administração de BCY6136 a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de OE21. Os pontos de da- dos representam o peso corporal médio do grupo.
[0030] Figura 32: Mudanças no peso corporal e traçados do volu- me tumoral após a administração de BCY6136 a camundongos CB17- SCID fêmeas portadores do xenoenxerto de MOLP-8. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0031] Figura 33: Mudanças no peso corporal e traçados do volu- me tumoral após a administração de BCY6082 a camundongos CB17- SCID fêmeas portadores do xenoenxerto de MOLP-8. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0032] Figuras 34 a 42: Mudanças no peso corporal e traçados do volume tumoral após a administração de BCY6082 (Figura 34, BCY6031 (Figura 35), BCY6173 (Figura 36), BCY6135 (Figura 37), BCY6033 (Figura 38), BCY6136 (Figura 39), BCY6174 (Figura 40), BCY6175 (Figura 41) e ADC (Figura 42) a camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de HT1080. Os pontos de dados representam o peso corporal médio do grupo.
[0033] Quando presentes nas Figuras acima, as barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Descrição Detalhada da Invenção
[0034] Em uma modalidade, as ditas sequências de loop compre- endem 2, 3, 5, 6 ou 7 aminoácidos.
[0035] Em uma modalidade adicional, as ditas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína, separados por duas sequên- cias de loop, uma das quais consiste em 2 aminoácidos e a outra con-
siste em 7 aminoácidos (tais quais aqueles listados na Tabela 4).
[0036] Em uma modalidade adicional, as ditas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína, separados por duas sequên- cias de loop, ambas as quais consistem em 5 aminoácidos (tais quais aqueles listados nas Tabelas 3 e 4).
[0037] Em uma modalidade adicional, as ditas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína, separados por duas sequên- cias de loop, ambas as quais consistem em 6 aminoácidos (tais quais aqueles listados nas Tabelas 3 a 5).
[0038] Em uma modalidade adicional, as ditas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína, separados por duas sequên- cias de loop, ambas as quais consistem em 6 aminoácidos (tais quais aqueles listados na Tabela 10).
[0039] Em uma modalidade adicional, as ditas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína, separados por duas sequên- cias de loop uma das quais consiste em 7 aminoácidos e a outra con- siste em 3 aminoácidos (tais quais aqueles listados na Tabela 4).
[0040] Em uma modalidade adicional, as ditas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína, separados por duas sequên- cias de loop, uma das quais consiste em 6 aminoácidos e a outra con- siste em 7 aminoácidos (tais quais aqueles listados na Tabela 5).
[0041] Em uma modalidade, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-X1-Cii-X2-Ciii em que X1 e X2 representam os resíduos de aminoácidos entre os re- síduos de cisteína listados nas Tabelas 3 a 5 e Ci, Cii e Ciii represen- tam o primeiro, o segundo e o terceiro resíduo de cisteína, respectiva- mente, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0042] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico compre- ende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de um ou mais dos ligantes peptídicos listados em uma ou mais Tabelas 3 a 5.
[0043] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico compre- ende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-X1-Cii-X2-Ciii em que X1 e X2 representam os resíduos de aminoácidos entre os re- síduos de cisteína listados na Tabela 10 e Ci, Cii e Ciii representam o primeiro, o segundo e o terceiro resíduo de cisteína, respectivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0044] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico compre- ende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de um ou mais dos ligantes peptídicos listados na Tabela 10.
[0045] Em uma modalidade, as ditas sequências de loop compre- endem três resíduos de cisteína, separados por duas sequências de loop, ambas as quais consistem em 6 aminoácidos e o ligante peptídi- co possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 1); e CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii (SEQ ID NO: 97); em que HyP é hidroxiprolina, HArg é homoarginina e Ci, Cii e Ciii repre- sentam o primeiro, o segundo e o terceiro resíduo de cisteína, respec- tivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0046] Em uma modalidade adicional, as ditas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína, separados por duas sequên- cias de loop, ambas as quais consistem em 6 aminoácidos e o ligante peptídico possui a seguinte sequência de aminoácidos: Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 1); em que HyP é hidroxiprolina, HArg é homoarginina e Ci, Cii e Ciii repre- sentam o primeiro, o segundo e o terceiro resíduo de cisteína, respec- tivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0047] Em uma modalidade, o ligante peptídico da invenção é um ligante peptídico que é outro diferente da sequência de aminoácidos:
Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 1).
[0048] Em uma modalidade, as ditas sequências de loop compre- endem três resíduos de cisteína, separados por duas sequências de loop, ambas as quais consistem em 6 aminoácidos e o ligante peptídi- co possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D- Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2) (BCY6099; Composto 66); e (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii ((β-Ala)- Sar10-(SEQ ID NO: 11)) (BCY6014; Composto 67); em que Sar é sarcosina, HArg é homoarginina e HyP é hidroxiprolina.
[0049] Em uma modalidade adicional, as ditas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína, separados por duas sequên- cias de loop, ambas as quais consistem em 6 aminoácidos e o ligante peptídico possui a seguinte sequência de aminoácidos: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D- Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2) (BCY6099; Composto 66); em que Sar é sarcosina, HArg é homoarginina e HyP é hidroxiprolina.
[0050] Em uma modalidade, o ligante peptídico da invenção é um ligante peptídico que é outro diferente da sequência de aminoácidos: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D- Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2) (BCY6099; Composto 66).
[0051] Em uma modalidade, o arcabouço molecular é selecionado a partir de 1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA) e o ligante peptídico é selecionada a partir de qualquer um dos ligan- tes peptídicos listados nas Tabelas 3 a 5.
[0052] Em uma modalidade alternativa, o arcabouço molecular é selecionado a partir de 1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en- 1-ona (TATA) e o ligante peptídico é selecionado a partir de qualquer um dos ligantes peptídicos listados na Tabela 10.
[0053] Em uma modalidade, o arcabouço molecular é selecionado a partir de 1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA) e o ligante peptídico é selecionado a partir de: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D- Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2) (BCY6099; Composto 66); e (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii ((β-Ala)- Sar10-(SEQ ID NO: 11)) (BCY6014; Composto 67); em que Sar é sarcosina, HArg é homoarginina e HyP é hidroxiprolina.
[0054] Em uma modalidade adicional, o arcabouço molecular é selecionado a partir de 1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en- 1-ona (TATA) e o ligante peptídico é: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D- Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2); em que Sar é sarcosina, HArg é homoarginina e HyP é hidroxiprolina.
[0055] Em uma modalidade, o ligante peptídico é selecionado a partir de qualquer um dos Compostos 1-113 ou um sal farmaceutica- mente aceitável dos mesmos.
[0056] Em uma modalidade adicional, o ligante peptídico é o Com- posto 66 (BCY6099) ou Composto 67 (BCY6014) ou um sal farmaceu- ticamente aceitável dos mesmos.
[0057] Em ainda outra modalidade, o ligante peptídico é o Com- posto 66 (BCY6099) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo.
[0058] A menos que definido de outro modo, todos os termos téc- nicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comu- mente entendido por qualquer técnico no assunto, tal como nas técni- cas da química de peptídeos, cultura celular e expressão em fagos (phage display), química dos ácidos nucleicos e bioquímica. Técnicas padrão são empregadas para os métodos de biologia molecular, gené- tica e bioquímica (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora- tory Manual, 3a ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a ed., John Wiley & Sons, Inc.), cujos conteúdos são aqui in- corporados por referência. Nomenclatura Numeração
[0059] Quando são mencionadas posições de resíduos de amino- ácidos dentro dos peptídeos da invenção, os resíduos de cisteína (Ci, Cii e Ciii) são omitidos da numeração, pois estes não variam, portanto, a numeração dos resíduos de aminoácidos dentro dos peptídeos da invenção é referida como mostrado abaixo: -Ci-HyP1-L2-V3-N4-P5-L6-Cii-L7-H8-P9-(D-Asp)10-W11-(HArg)12- Ciii- (SEQ ID NO: 1).
[0060] Para fins desta descrição, pressupõem-se que todos os peptídeos bicíclicos estejam ciclizados com 1,1',1''-(1,3,5-triazinano- 1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA), produzindo uma estrutura de 1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)tripropan-1-ona tri-substituída. A ci- clização com TATA ocorre em Ci, Cii, e Ciii. Formato Molecular
[0061] Extensões N- ou C-terminal à sequência central do biciclo são adicionadas ao lado esquerdo ou direito da sequência, separadas por um hífen. Por exemplo, uma cauda (β-Ala)-Sar10-Ala N-terminal seria indicada como: (β-Ala)-Sar10-A-(SEQ ID NO: X). Sequências Peptídicas Invertidas
[0062] À luz da descrição em Nair et al (2003) J Immunol 170(3), 1362-1373, prevê-se que as sequências de peptídeos aqui descritas também encontram utilidade na sua forma retro inverso. Por exemplo, a sequência é invertida (ou seja, N-terminal torna-se C-terminal e vice- versa) e a sua estereoquímica é igualmente invertida também (ou seja, D-aminoácidos tornam-se L-aminoácidos e vice-versa).
Ligantes Peptídicos
[0063] Um ligante peptídico, como aqui mencionado, refere-se a um peptídeo, fragmento peptídico ou peptidomimético ligado covalen- temente a um arcabouço molecular. Tipicamente, tais peptídeos, frag- mentos peptídicos ou peptidomiméticos compreendem um peptídeo com aminoácidos naturais ou não naturais, dois ou mais grupos reati- vos (ou seja, resíduos de cisteína) que são capazes de formar ligações covalentes com o arcabouço, e uma sequência subtendida entre os ditos grupos reativos que é referida como a sequência de loop (laço), pois essa forma um loop quando o peptídeo, fragmento peptídico ou peptidomimético é ligado ao arcabouço. No presente caso, os peptí- deos, fragmentos peptídicos ou peptidomiméticos compreendem pelo menos três resíduos de cisteína (aqui referidos como Ci, Cii e Ciii) e formam pelo menos dois loops no arcabouço. Vantagens dos Ligantes Peptídicos
[0064] Certos peptídeos bicíclicos da presente invenção possuem diversas propriedades vantajosas que lhes permite ser considerados moléculas do tipo fármaco adequadas para injeção, inalação, adminis- tração nasal, ocular, oral ou tópica. Tais propriedades vantajosas in- cluem: - Reatividade cruzada entre espécies. Este é um requisito típico para avaliação farmacodinâmica e farmacocinética pré-clínica; - Estabilidade de proteases. Os ligantes peptídicos bicícli- cos devem, na maioria das circunstâncias, demonstrar estabilidade frente às proteases plasmáticas, proteases epiteliais ("ancoradas na membrana"), proteases gástricas e intestinais, proteases da superfície pulmonar, proteases intracelulares e similares. A estabilidade de pro- teases deve ser mantida entre espécies diferentes, de tal modo que um candidato líder ao peptídeo bicíclico possa ser desenvolvido em modelos animais, bem como administrado com confiança a humanos;
- Perfil de solubilidade desejável.
Este é em função da pro- porção de resíduos carregados e hidrofílicos versus hidrofóbicos e li- gação intra/intermolecular de H, que é importante para fins de formula- ção e absorção; - Meia-vida plasmática ótima na circulação.
Dependendo da indicação clínica e o esquema de tratamento, pode ser necessário de- senvolver um peptídeo bicíclico com tempos de exposição curtos ou prolongados in vivo para o controle de estados de doença crônicos ou agudos.
O tempo de exposição ótimo será regulado pelo requisito para exposição sustentada (para eficiência terapêutica máxima) versus o requisito para tempos curtos de exposição visando minimizar os efei- tos toxicológicos resultantes da exposição sustentada ao agente; - Seletividade.
Certos ligantes peptídicos da invenção de- monstram boa seletividade sobre outros receptores tirosina quinases Eph, tais como EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7 e EphB1 e fator XIIA, anidrase carbônica 9 e CD38 (dados de seletivida- de para ligantes peptídicos selecionados da invenção podem ser vistos nas Tabelas 7 e 14). Deve-se notar também que ligantes peptídicos selecionados da invenção exibem reatividade cruzada com outras es- pécies (p. ex., camundongo e rato) para permitir testes em modelos animais (Tabelas 3 a 6 e 15); e - Segurança.
Eventos de sangramento foram relatados em modelos pré-clínicos in vivo e estudos clínicos com Conjugados Fár- maco-Anticorpo contra EphA2. Por exemplo, um estudo de Fase I aberto com MEDI-547 foi interrompido por causa de eventos de san- gramento e coagulação ocorridos em 5 de 6 pacientes (Annunziata et al, Invest New Drugs (2013) 31:77-84). Os eventos de sangramento observados em pacientes eram coerentes com efeitos sobre o sistema de coagulação observados em estudos pré-clínicos com ratos e maca- cos: tempo de tromboplastina parcial ativada aumentado e produto de degradação de fibrinogênio/fibrina aumentado (Annunziata et al IBID). Eventos de sangramento evidente foram supostamente vistos em es- tudos de toxicologia em macacos (Annunziata et al, IBID). Considera- dos em conjunto, esses resultados implicam que MEDI-547 causa Co- agulação Intravascular Disseminada (CID) em espécies pré-clínicas e em pacientes. Os BDCs aqui relatados têm meia-vida curta in vivo (< 30 minutos) e são, portanto, intrinsicamente menos propensos a dar origem a CID em DIC in pacientes. Os resultados mostrados abaixo (ver as seções 5 e 6 de DADOS BIOLÓGICOS e a Tabela 20) de- monstram que Conjugados Fármaco-Biciclo selecionados da invenção não têm efeito sobre parâmetros de coagulação nem deram origem ar eventos de sangramento estudos pré-clínicos. Sais Farmaceuticamente Aceitáveis
[0065] Será apreciado que formas em sal são abrangidas pelo âmbito desta invenção, e referência a ligantes peptídicos incluem o as formas em sal dos ditos ligantes.
[0066] Os sais da presente invenção podem ser sintetizados a par- tir do composto original que contém uma porção básica ou ácida por métodos químicos convencionais como os métodos descritos em Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardco- ver, 388 páginas, Agosto de 2002. Em geral, tais sais podem ser pre- parados reagindo as formas de ácido ou base livre desses compostos com a base ou ácido adequado em água ou em um solvente orgânico, ou uma mistura dos dois.
[0067] Sais de adição de ácidos (mono ou di-sais) podem ser for- mados com uma grande variedade de ácidos, tanto inorgânicos como orgânicos. Os exemplos de sais de adição de ácidos incluem sais mo- no ou di-sais formados com um ácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, 2,2-dicloroacético, adípico, algínico,
ascórbico (p. ex., L-ascórbico), L-aspártico, benzenossulfônico, ben- zoico, 4-acetamidobenzoico, butanoico, (+) canfórico, canfossulfônico, (+)-(1S)-canfo-10-sulfônico, cáprico, caproico, caprílico, cinâmico, cítri- co, ciclâmico, dodecilsulfúrico, etano-1,2-dissulfônico, etanossulfônico, 2-hidroxietanossulfônico, fórmico, fumárico, galactárico, gentísico, gli- coheptonico, D-glucônico, glicurônico (p. ex., D-glicurônico), glutâmico (p. ex., L-glutâmico), α-oxoglutárico, glicólico, hipúrico, ácidos hidro- hálicos (p. ex., bromídrico, clorídrico, iodídrico), isetiônico, láctico (p. ex., (+)-L-láctico, (±)-DL-láctico), lactobiônico, maleico, málico, (-)-L- málico, malônico, (±)-DL-mandélico, metanossulfônico, naftaleno-2- sulfônico, naftaleno-1,5-dissulfônico, 1-hidroxi-2-naftoico, nicotínico, nítrico, oleico, orótico, oxálico, palmítico, pamoico, fosfórico, propiôni- co, pirúvico, L-piroglutâmico, salicílico, 4-amino-salicílico, sebácico, esteárico, succínico, sulfúrico, tânico, (+)-L-tartárico, tiociânico, p- toluenossulfônico, undecilênico e valérico, bem como aminoácidos aci- lados e resinas de troca catiônica.
[0068] Um grupo de sais em particular consiste em sais formados a partir dos ácidos acético, clorídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, cítri- co, láctico, succínico, maleico, málico, isetiônico, fumárico, benzenos- sulfônico, toluenossulfônico, sulfúrico, metanossulfônico (mesilato), etanossulfônico, naftalenossulfônico, valérico, propanoico, butanoico, malônico, glicurônico e lactobiônico. Um sal em particular é o sal clori- drato. Outro sal em particular é o sal acetato.
[0069] Se o composto for aniônico, ou se tiver um grupo funcional que possa ser aniônico (p. ex., -COOH pode ser -COO-), então um sal pode ser formado com uma base orgânica ou inorgânica, gerando um cátion adequado. Os exemplos de cátions inorgânicos adequados in- cluem, entre outros, íons de metais alcalinos como Li+, Na+ e K+, de cátions de metais alcalinos terrosos como Ca2+ e Mg2+, e outros cá- tions como Al3+ ou Zn+. Os exemplos de cátions orgânicos adequados incluem, entre outros, íon amônio (ou seja, NH4+) e íons amônio substi- tuídos (p. ex., NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+). Os exemplos de alguns íons amônio substituídos adequados são aqueles derivados de: meti- lamina, etilamina, dietilamina, propilamina, diciclohexilamina, trietilami- na, butilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, colina, meglumina e trometamina, bem como aminoácidos, como lisina e arginina. Um exemplo de um íon de amônio quaternário comum é N(CH3)4+.
[0070] Quando os peptídeos da invenção contiverem uma função amina, esses podem formar sais de amônio quaternário, por exemplo, por reação com um agente alquilante de acordo com métodos bem conhecidos pelo técnico no assunto. Tais compostos de amônio qua- ternário estão incluídos no âmbito dos peptídeos da invenção. Derivados Modificados
[0071] Será apreciado que derivados modificados dos ligantes peptídicos como aqui definidos são abrangidos pelo âmbito da presen- te invenção. Exemplos de tais derivados modificados adequados in- cluem uma ou mais modificações selecionadas a partir de: modifica- ções no N-terminal e/ou C-terminal; substituição de um ou mais resí- duos de aminoácidos por um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais (como a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos polares por um ou mais aminoácidos isoestéricos ou isoeletrônicos; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos não polares por outros aminoácidos não naturais isoestéricos ou isoeletrônicos); adi- ção de um grupo espaçador; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos sensíveis à oxidação por um ou mais resíduos de amino- ácidos resistentes à oxidação; substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por um ou mais aminoácidos de substituição, como uma alanina, substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácidos por um ou mais resíduos de D-aminoácidos; N-alquilação de uma ou mais li-
gações amida dentro do ligante peptídico bicíclico; substituição de uma ou mais ligações peptídicas por uma ligação substituta; modificação no comprimento da cadeia principal (backbone) do peptídeo; substituição do hidrogênio no carbono alfa de um ou mais resíduos de aminoácidos por outro grupo químico, modificação de aminoácidos como cisteína, lisina, glutamato/aspartato e tirosina com reagentes reativos adequa- dos a amina, tiol, ácido carboxílico e fenol de maneira a funcionalizar os ditos aminoácidos e introdução ou substituição de aminoácidos que introduzem reatividades ortogonais que são adequadas para funciona- lização, por exemplo, aminoácidos contendo grupo azida ou alcino que permite a funcionalização com porções contendo alcino ou azida, res- pectivamente.
[0072] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende uma modificação N-terminal e/ou C-terminal. Em uma modalidade adi- cional, o derivado modificado compreende uma modificação N-terminal usando química amino-reativa adequada e/ou modificação C-terminal usando química carboxi-reativa adequada. Em uma modalidade adici- onal, a dita modificação N-terminal ou C-terminal compreende a adição de grupo efetor, incluindo, entre outros, um agente citotóxico, um radi- oquelante ou um cromóforo.
[0073] Em uma modalidade adicional, o derivado modificado com- preende uma modificação N-terminal. Em uma modalidade adicional, a modificação N-terminal compreende um grupo acetila N-terminal. Nes- sa modalidade, o resíduo N-terminal é coroado (capped) com anidrido acético ou outros reagentes adequados durante a síntese do peptídeo levando a uma molécula que é acetilada no N-terminal. Essa modali- dade tem como vantagem remover um ponto de reconhecimento po- tencial para aminopeptidases e evitar o potencial para degradação do peptídeo bicíclico.
[0074] Em uma modalidade alternativa, a modificação N-terminal compreende a adição de um grupo molecular espaçador que facilita a conjugação de grupos efetores e retenção da potência do peptídeo bicíclico para seu alvo.
[0075] Em uma modalidade adicional, o derivado modificado com- preende uma modificação C-terminal. Em uma modalidade adicional, a modificação C-terminal compreende um grupo amida. Nessa modali- dade, o resíduo C-terminal é sintetizado como uma amida durante a síntese do peptídeo levando a uma molécula que é amidada no C- terminal. Essa modalidade tem como vantagem remover um ponto de reconhecimento potencial para carboxipeptidase e reduz o potencial para degradação proteolítica do peptídeo bicíclico.
[0076] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais. Nessa modalidade, podem ser selecionados aminoácidos não naturais com cadeias laterais isoestéri- cas/isoeletrônicas que não são reconhecidas por proteases degrada- doras nem têm qualquer efeito desfavorável sobre a potência do alvo.
[0077] Alternativamente, é possível utilizar aminoácidos não natu- rais que tenham cadeias laterais com restrições, tal que a hidrólise proteolítica da ligação peptídica próxima fique impedida conformacio- nal e estericamente. Em particular, estes dizem respeito a análogos da prolina, cadeias laterais volumosas, derivados C-dissubstituídos (por exemplo, ácido aminoisobutírico, Aib) e aminoácidos cíclicos, sendo um derivado simples ácido amino-ciclopropilcarboxílico.
[0078] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a adição de um grupo espaçador. Em uma modalidade adicional, o deri- vado modificado compreende a adição de um grupo espaçador à ciste- ína N-terminal cisteína (Ci) e/ou à cisteína C-terminal (Ciii).
[0079] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos sensíveis à oxi-
dação por um ou mais resíduos de aminoácidos resistentes à oxida- ção. Em uma modalidade adicional, o derivado modificado compreen- de a substituição de um resíduo de triptofano por um resíduo de nafti- lalanina ou alanina. Essa modalidade tem como vantagem melhorar a perfil de estabilidade farmacêutica do ligante peptídico bicíclico resul- tante.
[0080] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos com carga por um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Em uma modalida- de alternativa, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos por um ou mais re- síduos de aminoácidos com carga. O equilíbrio correto entre resíduos de aminoácidos com carga versus hidrofóbicos é uma característica importante dos ligantes peptídicos bicíclicos. Por exemplo, resíduos de aminoácidos hidrofóbicos influenciam o grau de ligação às proteínas plasmáticas e, assim, a concentração da fração livre disponível no plasma, enquanto resíduos de aminoácidos com carga (em particular arginina) podem influenciar a interação do peptídeo com as membra- nas fosfolipídicas nas superfícies celulares. Os dois em combinação podem influenciar a meia-vida, o volume de distribuição e a exposição do fármaco peptídico, e podem ser ajustados de acordo com o desfe- cho clínico. Além disso, a combinação correta e o número de resíduos de aminoácidos com carga versus hidrofóbicos pode reduzir a irritação no local da injeção (se o fármaco peptídeo tiver sido administrado por via subcutânea).
[0081] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a substituição de um ou mais resíduos de L-aminoácidos por um ou mais resíduos de D-aminoácidos. Acredita-se que essa modalidade aumen- te a estabilidade proteolítica por impedimento estérico e por uma pro- pensão de D-aminoácidos estabilizarem conformações em volta [sic]
(Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418).
[0082] Em uma modalidade, o derivado modificado compreende a remoção de quaisquer resíduos de aminoácidos e a substituição por alaninas, como D-alaninas. Essa modalidade tem como vantagem identificar resíduos fundamentais para ligação e remover sítios poten- ciais de ataque proteolítico.
[0083] Deve-se notar que cada uma das modificações menciona- das acima tem como função melhorar a potência ou estabilidade do peptídeo. Outras melhorias da potência com base em modificações podem ser conseguidas pelos seguintes mecanismos: - Incorporação de porções hidrofóbicas que exploram o efeito hidrofóbico e levam a taxas off (dissociação) menores, de tal que afinidades maiores sejam conseguidas; - Incorporação de grupos com carga que exploram intera- ções iônicas de alcance longo, levando a taxas on (associação) mais rápidas e a afinidades maiores (ver, por exemplo, Schreiber et al, Ra- pid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31); e - Incorporação de restrição adicional no peptídeo, por exemplo, restringindo corretamente cadeias laterais de aminoácidos de tal modo que a perda em entropia seja mínima quando da ligação ao alvo, restringindo os ângulos de torção da cadeia principal de tal modo que a perda em entropia seja mínima quando da ligação ao alvo e introdução de ciclizações adicionais na molécula por motivos idênti- cos. (para revisões ver Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, e Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418). Variações Isotópicas
[0084] A presente invenção inclui todos os ligantes peptídicos marcados com (radio)isótopos farmaceuticamente aceitáveis da inven- ção, em que um ou mais átomos são substituídos por átomos do mesmo número atômico, mas massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa normalmente encon- trado na natureza, e ligantes peptídicos da invenção, em que são ane- xados grupos quelantes de metais (denominado "efetor") capazes de prender (radio)isótopos relevantes, e ligantes peptídicos da invenção, em que certos grupos funcionais são substituídos covalentemente por (radio)isótopos relevantes ou grupos funcionais isotopicamente mar- cados.
[0085] Os exemplos de isótopos adequados para inclusão nos li- gantes peptídicos da invenção compreendem isótopos de hidrogênio, como 2H (D) e 3H (T), carbono, como 11 C, 13 Ce 14 C, cloro, como 36 Cl, 18 123 125 131 13 15 flúor, como F, iodo, como I, Ie I, nitrogênio, como Ne N, 15 17 18 32 35 oxigênio, como O, Oe O, fósforo, como P, enxofre, como S, 64 67 68 90 cobre, como Cu, gálio, como Ga ou Ga, ítrio, como Y e lutécio, como 177Lu, e bismuto, como 213Bi.
[0086] Certos ligantes peptídicos isotopicamente marcados da in- venção, por exemplo, aqueles incorporando um isótopo radioativo, são úteis em estudos de distribuição do fármaco e/ou substrato em tecidos e para avaliar clinicamente a presença e/ou ausência do alvo EphA2 em tecidos doentes. Os ligantes peptídicos da invenção podem ter ainda propriedades diagnósticas valiosas no sentido de que podem ser usados para detectar ou identificar a formação de um complexo entre um composto marcado e outras moléculas, peptídeos, proteínas, en- zimas ou receptores. Os métodos de detecção ou identificação podem usar compostos que são marcados com agentes de marcação como radioisótopos, enzimas, substâncias fluorescentes, substâncias lumi- nosas (por exemplo, luminol, derivados do luminol, luciferina, aequori- na e luciferase), etc. Os isótopos radioativos trítio, ou seja, 3H (T), e carbono-14, ou seja, C, são especialmente úteis tendo em vista a sua facilidade de incorporação e meios rápidos de detecção.
[0087] A substituição por isótopos mais pesados como deutério, ou seja, 2H (D), pode dar origem a certas vantagens resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo, aumento da meia-vida in vivo ou redução dos requisitos de dosagem e, consequentemente, podem ser preferidos em algumas circunstâncias.
[0088] A substituição por isótopos emissores de pósitrons, como 11 18 C, F, 15O e 13 N, pode ser útil em estudos de Tomografia por Emis- são de Pósitrons (PET) para examinar a ocupação do alvo.
[0089] Compostos isotopicamente marcados dos ligantes peptídi- cos da invenção podem ser, em geral, preparados por técnicas con- vencionais conhecidas pelos entendidos no assunto ou por processo análogos àqueles descritos nos Exemplos anexos usando um rea- gente apropriado marcado isotopicamente no lugar do reagente não marcado empregado anteriormente. Arcabouço Molecular não Aromático
[0090] O termo "arcabouço molecular não aromático", neste relató- rio descritivo, refere-se a qualquer arcabouço molecular como aqui de- finido que não contenha um sistema de anel aromático (ou seja, insa- turado) carbocíclico ou heterocíclico.
[0091] Exemplos adequados de arcabouços moleculares não aro- máticos são descritos em Heinis et al (2014) Angewandte Chemie, In- ternational Edition 53(6) 1602-1606.
[0092] Como observado nos documentos precedentes, o arcabou- ço molecular pode ser uma molécula pequena, como uma molécula orgânica pequena.
[0093] Em uma modalidade, o arcabouço molecular pode ser uma macromolécula. Em uma modalidade, o arcabouço molecular é uma macromolécula composta por aminoácidos, nucleotídeos ou carboidra-
tos.
[0094] Em uma modalidade, o arcabouço molecular compreende grupos reativos que são capazes de reagir com grupo(s) funcional(is) do polipeptídeo para formar ligações covalentes.
[0095] O arcabouço molecular pode compreender grupos químicos que formam a ligação com um peptídeo, como aminas, tióis, álcoois, cetonas, aldeídos, nitrilas, carboxílicos, ésteres, alcenos, alcinos, azi- das, anidridos, succinimidas, maleimidas, haletos de alquila e haletos de acila.
[0096] Um exemplo de um composto contendo carbonila α insatu- rado é 1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5-triil)triprop-2-en-1-ona (TATA) (Angewandte Chemie, International Edition (2014), 53(6), 1602-1606). Grupos Efetores e Funcionais
[0097] De acordo com um aspecto adicional da invenção, provê-se um conjugado de fármaco compreendendo um ligante peptídico como aqui definido conjugado a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais.
[0098] Grupos efetores e/ou funcionais podem ser anexados, por exemplo, aos terminais N e/ou C do polipeptídeo, a um aminoácido dentro do polipeptídeo ou ao arcabouço molecular.
[0099] Os grupos efetores adequados incluem anticorpos e partes ou fragmentos dos mesmos. Por exemplo, o grupo efetor pode incluir uma região constante da cadeia leve (CL) de anticorpo, um domínio CH1 da cadeia pesada de anticorpo, um domínio CH2 da cadeia pe- sada de anticorpo, um domínio CH3 da cadeia pesada de anticorpo, ou qualquer combinação destes, além de um ou mais domínios da re- gião constante. O grupo efetor pode também compreender um região hinge (dobradiça) de um anticorpo (tal como uma região entre os do- mínios CH1 e CH2 de uma molécula de IgG).
[00100] Em uma modalidade adicional desse aspecto da invenção, o grupo efetor de acordo com a presente invenção é uma região Fc de uma molécula de IgG. Vantajosamente, um ligante peptídico-grupo efetor de acordo com a presente invenção compreende ou consiste em uma fusão de ligante peptídico-Fc tendo uma meia-vida tβ de um dia ou mais, dois dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais, 5 dias ou mais, 6 dias ou mais ou 7 dias ou mais. Mais vantajosamente, o ligante peptídico de acordo com a presente invenção compreende ou consiste em uma fusão ligante peptídico-Fc com uma meia-vida tβ de um dia ou mais.
[00101] Os grupos funcionais incluem, em geral, grupos de ligação, fármacos, grupos reativos para a fixação de outras entidades, grupos funcionais que auxiliam a absorção dos peptídeos macrocíclicos para as células e semelhantes.
[00102] A capacidade de peptídeos para penetrar em células permi- tirá que os peptídeos sejam eficazes contra alvos intracelulares. O sal- vos que podem ser atingidos por peptídeos com a capacidade para penetrar em células incluem fatores de transcrição, moléculas de sina- lização intracelular como tirosina quinases e moléculas envolvidas na via apoptótica. Os grupos funcionais que possibilitam a penetração de células incluem peptídeos ou grupos químicos que tenham sido adici- onados ao peptídeo ou ao arcabouço molecular. Peptídeos como aqueles derivados de, por exemplo, VP22, HIV-Tat, uma proteína ho- meobox de Drosophila (Antennapedia), p. ex., como descrito em Chen and Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, parte 4, p821; Gupta et al. em Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57 9637. Os exemplos de peptídeos curtos que de- monstraram ser eficientes na translocação através de membranas plasmáticas incluem o peptídeo penetratina com 16 aminoácidos da proteína Antennapedia de Drosophila (Derossi et al (1994) J Biol. Chem. Volume 269 p10444), o "peptídeo anfipático modelo" com 18 aminoácidos (Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts, Volume 1414 p127) e regiões ricas em arginina proteína TAT do HIV. Abordagens não peptídicas incluem o uso de mímicos de molécula pequena ou SMOCs que podem ser facilmente anexados a biomoléculas (Okuya- ma et al (2007) Nature Methods, Volume 4 p153). Outras estratégias químicas para adicionar grupos de guanidínio a moléculas também melhoram a penetração na célula (Elson-Scwab et al (2007) J Biol Chem, Volume 282, p13585). Moléculas de pequeno peso molecular, como esteroides, podem ser adicionados ao arcabouço molecular para reforçar a absorção pelas células.
[00103] Uma classe de grupos funcionais que podem ser anexados aos ligantes peptídicos inclui anticorpos e fragmentos de ligação dos mesmos, como Fab, Fv ou fragmentos de domínio único. Em particu- lar, é possível utilizar anticorpos que se ligam a proteínas capazes de aumentar a meia-vida do ligante peptídico in vivo.
[00104] Em uma modalidade, um ligante peptídico-grupo efetor de acordo com a invenção possui uma meia-vida tβ selecionada a partir do grupo que consiste em: 12 horas ou mais, 24 horas ou mais, 2 dias ou mais, 3 dias ou mais, 4 dias ou mais, 5 dias ou mais, 6 dias ou mais, 7 dias ou mais, 8 dias ou mais, 9 dias ou mais, 10 dias ou mais, 11 dias ou mais, 12 dias ou mais, 13 dias ou mais, 14 dias ou mais, 15 dias ou mais ou 20 dias ou mais. Vantajosamente, um ligante peptídi- co-grupo efetor ou composição de acordo com a invenção terá uma faixa de tβ de 12 a 60 horas. Em uma modalidade adicional, terá uma meia-vida tβ de um dia ou mais. Em uma modalidade adicional ainda, estará na faixa de 12 a 26 horas.
[00105] Em uma modalidade em particular da invenção, o grupo funcional é selecionado dentre um quelante metálico, que seja ade- quado para complexação de radioisótopos metálicos de relevância medicinal.
[00106] Os grupos efetores possíveis também incluem enzimas, por exemplo, como carboxipeptidase G2 para uso em terapia enzimáti- ca/pró-fármaco, onde o ligante peptídico substitui anticorpos na ADEPT.
[00107] Em uma modalidade em particular da invenção, o grupo funcional é selecionado dentre um fármaco, como um agente citotóxico para terapia antineoplásica. Exemplos adequados incluem: agentes alquilantes como cisplatina e carboplatina, bem como oxaliplatina, me- cloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, ifosfamida; antimetabólitos incluindo os análogos da purina, azatioprina e mercaptopurina, ou aná- logos da pirimidina; alcaloides de plantas e terpenoides incluindo alca- loides da vinca como Vincristina, Vinblastina, Vinorelbina e Vindesina; Podofilotoxina e seus derivados etoposídeo e teniposídeo; Taxanos, incluindo paclitaxel, originalmente conhecido como Taxol; inibidores da topoisomerase incluindo camptotecinas: irinotecano e topotecano e inibidores tipo II incluindo ansacrina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo e teniposídeo. Outros agentes podem incluir antibióticos antitumorais, os quais incluem o imunossupressor dactinomicina (que é usado em transplantes de rim), doxorrubicina, epirrubicina, bleomicina, caliquea- micinas e outros.
[00108] Em mais modalidade em particular da invenção, o agente citotóxico é selecionado a partir de maitansinoides (como DM1) ou monometil auristatinas (como MMAE).
[00109] DM1 é um agente citotóxico que é um derivado contendo tiol da maitansina e possui e a estruture seguinte:
[00110] Monometil auristatina E (MMAE) é um agente antineoplási- co sintético e possui a estrutura seguinte:
[00111] Em ainda outra modalidade em particular da invenção, o agente citotóxico é selecionado a partir de maitansinoides (como DM1). Abaixo, são apresentados dados na Tabela 6 que demonstram os efeitos de ligantes peptídicos conjugados a toxinas contendo DM1.
[00112] Em uma modalidade, o agente citotóxico é ligado ao peptí- deo bicíclico por uma ligação clivável, como uma ligação dissulfeto ou uma ligação sensível à protease. Em uma modalidade adicional, os grupos adjacentes à ligação dissulfeto são modificados para controlar o impedimento da ligação dissulfeto e, por isso, a taxa de clivagem e a liberação concomitante do agente citotóxico.
[00113] Trabalho publicado estabeleceu o potencial para modificar a suscetibilidade da ligação dissulfeto para redução pela introdução de impedimento estérico em qualquer lado da ligação dissulfeto (Kellogg et al (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717). Um grau maior de im- pedimento estérico reduz a taxa de redução por glutationa intracelular glutationa e também agentes redutores extracelulares (sistêmicos), reduzindo consequentemente a facilidade com a qual a toxina é libera- da, tanto dentro como fora da célula. Assim, a seleção do optimum na estabilidade do dissulfeto na circulação (que minimiza efeitos colate- rais indesejáveis da toxina) versus a liberação eficiente no meio intra- celular (que maximiza o efeito terapêutico) pode ser conseguida pela seleção cuidados do grau de impedimento em qualquer lado da liga- ção dissulfeto.
[00114] O impedimento em qualquer lado da ligação dissulfeto é modulado pela introdução de um ou mais grupos metila quer no lado da entidade de direcionamento (aqui, o peptídeo bicíclico) ou no da toxina da construção molecular.
[00115] Em uma modalidade, o conjugado do fármaco compreende adicionalmente um ligante (elemento de ligação) entre o dito ligante peptídico e os ditos agentes citotóxicos.
[00116] Em uma modalidade, o agente citotóxico e o ligante são selecionados dentre qualquer uma das combinações daqueles descri- tos em WO 2016/067035 (os agentes citotóxicos e ligantes deste são aqui incorporados por referência).
[00117] Em uma modalidade, o agente citotóxico é selecionado dentre DM1 ou MMAE.
[00118] Em uma modalidade, o ligante entre o dito agente citotóxico e dito peptídeo bicíclico compreende um ou mais resíduos de aminoá- cidos. Assim, em uma modalidade, o agente citotóxico é MMAE e o é is selecionado dentre: -Val-Cit-, -Trp-Cit-, -Val-Lys-, -D-Trp-Cit-, -Ala- Ala-Asn-, D-Ala-Phe-Lys- ou -Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-Tyr-Leu- (SEQ ID NO: 98). Em uma modalidade adicional, o agente citotóxico é MMAE e o ligante é selecionado dentre: -Val-Cit-, -Trp-Cit-, -Val-Lys- ou -D-Trp- Cit-. Em ainda outra modalidade, o agente citotóxico é MMAE e o li- gante é -Val-Cit- ou -Val-Lys-. Em ainda outra modalidade adicional, o agente citotóxico é MMAE e o ligante é -Val-Cit-.
[00119] Em uma modalidade alternativa, o ligante entre o dito agen- te citotóxico compreende uma ligação dissulfeto, como uma ligação dissulfeto clivável. Assim, em uma modalidade adicional, o agente cito- tóxico é DM1 e o ligante é selecionado dentre: -S-S-, -SS(SO3H)-, -SS- (Me)-, -(Me)-SS-(Me)-, -SS-(Me2)- ou -SS-(Me)-SO3H-. Em uma moda-
lidade adicional, o agente citotóxico é DM1 e o ligante compreende uma porção -S-S-, como (N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDB), ou uma porção -SS(SO3H)-, como SO3H-SPDB.
[00120] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico com- preende um agente citotóxico não clivável. Assim, em uma modalidade o agente citotóxico é MMAE não clivável (como o agente citotóxico dentro de BCY6063) ou DM1 não clivável (como o agente citotóxico dentro de BCY6064).
[00121] Em uma modalidade, o agente citotóxico é DM1 e o conju- gado do fármaco compreende um composto de fórmula (A): Biciclo (A) em que o dito biciclo é selecionado dentre qualquer um BCY6099 ou BCY6014 como aqui definidos.
[00122] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é DM1 e o conjugado do fármaco compreende um composto de fórmula (B): Biciclo
(B) em que o dito biciclo é selecionado dentre qualquer um BCY6099 ou BCY6014 como aqui definidos.
[00123] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é DM1 e o conjugado do fármaco compreende um composto de fórmula (A), em que o dito biciclo é selecionada dentre BCY6099 como aqui defini- do. Esse BDC é aqui conhecido como BCY6027. São apresentados dados abaixo que demonstram excelente competição de ligação para BCY6027 no ensaio de competição de ligação de EphA2 como mos- trado na Tabela 6.
[00124] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é DM1 e o conjugado do fármaco compreende um composto de fórmula (B), em que o dito biciclo é selecionado dentre BCY6099 como aqui defini- do. Esse BDC é aqui conhecido como BCY6028. São apresentados dados abaixo que demonstram excelente competição de ligação para BCY6028 no ensaio de competição de ligação de EphA2 como mos- trado na Tabela 6.
[00125] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é DM1 e o conjugado do fármaco compreende um composto de fórmula (A), em que o dito biciclo é selecionado dentre BCY6014 como aqui defini- do. Esse BDC é aqui conhecido como BCY6031. São apresentados dados abaixo que demonstram excelente competição de ligação para BCY6031 no ensaio de competição de ligação de EphA2 como mos- trado na Tabela 6. Os dados são também apresentados na Tabela 11 e Figuras 1 e 2 que demonstram que o tratamento com BCY6031 er- radicou completamente carcinomas pulmonares de células não pe- quenas a partir do dia 32 e não houve recidiva do tumor após a sus- pensão da administração no dia 28.
[00126] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é DM1 e o conjugado do fármaco compreende a composto de fórmula (B), em que o dito biciclo é selecionado dentre BCY6014 como aqui definido. Esse BDC é aqui conhecido como BCY6032. São apresentados dados abaixo que demonstram excelente competição de ligação para BCY6032 no ensaio de competição de ligação de EphA2 como mos- trado na Tabela 6.
[00127] Em uma modalidade alternativa, o agente citotóxico é MMAE ou DM1 e o conjugado do fármaco é selecionada a partir de qualquer um dos BDCs listados na Tabela 11. São apresentados da- dos abaixo mostrando que esses BDCs exibiram excelente reatividade cruzada entre EpHA2 humano, de camundongo e roedor, como mos- trado na Tabela 11.
[00128] Em uma modalidade adicional, o agente citotóxico é MMAE ou DM1 e o conjugado do fármaco é selecionado dentre qualquer um dos BDCs listados na Tabela 13.
[00129] Em uma modalidade adicional, o agente citotóxico é MMAE ou DM1 e o conjugado do fármaco é selecionado dentre BCY6033, BCY6082, BCY6136 e BCY6173. São apresentados dados abaixo mostrando que quatro Conjugados Biciclo-Fármaco não exibiram liga- ção significativa a: homólogos estritamente relacionados a EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7 e EphB4 humanos; EphA3 e EphA4 de camundongo; e EphA3 e EphB1 de rato como mostrado nas Tabelas 14 e 15.
[00130] Em ainda outra modalidade, o conjugado do fármaco é se- lecionado a partir de qualquer um dentre: BCY6031, BCY6033, BCY6082, BCY6135, BCY6136, BCY6173, BCY6174 e BCY6175:
N-terminal
C-terminal
33/299 Toxina Linker clivável Espaçador molecular Biciclo (Sar10) (BCY6014)
N-terminal
C-terminal
Toxina Linker clivável Espaçador molecular Biciclo
34/299 (Sar10) (BCY6014)
N-terminal
C-terminal
35/299 Linker clivável Espaçador molecular Biciclo Toxina (Sar10) (BCY6014) (DM1)
N-terminal
C-terminal
36/299 Toxina Linker clivável Espaçador molecular Biciclo (DM1) (Sar10) (BCY6099)
N-terminal
C-terminal
37/299 Toxina Linker clivável Espaçador molecular Biciclo (Sar10) (BCY6099)
N-terminal
C-terminal
38/299 Toxina Linker clivável Espaçador molecular Biciclo (Sar10) (BCY6099)
N-terminal
C-terminal
Espaçador molecular
39/299 Toxina Linker clivável Biciclo (Sar10) (BCY6099)
N-terminal
C-terminal
Toxina Linker clivável Espaçador molecular Biciclo
40/299 (Sar10) (BCY6099)
[00131] Em uma modalidade, o conjugado do fármaco é outro que não BCY6027, BCY6028, BCY6135, BCY6136, BCY6173, BCY6174 e BCY6175.
[00132] Em ainda outra modalidade adicional, o conjugado do fár- maco é BCY6136. São apresentados dados abaixo, nos Estudos 7 e 8, mostrando que BCY6136 revelou atividade antitumoral significativa e potente no modelo de câncer de próstata do xenoenxerto de PC-3 (ver Figuras 7 a 10 e Tabelas 21 a 24). São também fornecidos dados abaixo mostrando que BCY6136 demonstrou atividade antitumoral po- tente no modelo de câncer de pulmão (CPNPC) do xenoenxerto de NCI-H1975 (ver Figuras 11 a 13 e Tabelas 25 a 30). São também apresentados dados abaixo, nos Estudos 10 e 11, mostrando que BCY6136 demonstrou efeito antitumoral potente nos modelos de cân- cer de pulmão (CPNPC) PDX LU-01-0251 de tamanho tumoral grande e pequeno (ver Figuras 14 e 15 e Tabelas 31 a 34) em que se obser- vou regressão completa do tumor. São também apresentados dados abaixo, no Estudo 12, mostrando que BCY6136 demonstrou efeito an- titumoral significativo no modelo de câncer de pulmão (CPNPC) PDX LU-01-0046 (ver Figura 16 e Tabelas 35 e 36) em que se observou regressão completa do tumor para BCY6136. São também apresenta- dos dados abaixo, no Estudo 13, mostrando que BCY6136 demons- trou atividade antitumoral dependente da dose no modelo de câncer de pulmão (CPNPC) PDX LU-01-0046 (ver Figura 17 e Tabelas 37 e 38). São também apresentados dados abaixo, no Estudo 14, mostran- do que BCY6136 erradicou tumores no modelo de câncer de pulmão (CPNPC) PDX LU-01-0046 (ver Figuras 18 a 22 e Tabelas 39 a 42). São também apresentados dados abaixo, nos Estudos 15 e 16, que demonstram os efeitos de BCY6136 em dois modelos que fazem uso de linhagens celulares com expressão baixa/mínimo de EphA2 (a sa- ber LU-01-0412 e LU-01-0486). Esses dados são mostrados nas Figu-
ras 23 e 24 e Tabelas 43 a 46 e demonstram que BCY6136 não teve efeito sobre a regressão do tumor em qualquer uma das linhagens ce- lulares, mas os BCYs BCY8245 e BCY8781, que se ligam a um alvo altamente expresso na linhagem celular LU-01-0412, erradicaram completamente o tumor.
São apresentados dados abaixo, no Estudo 17, mostrando que BCY6136 demonstrou atividade antitumoral potente no modelo de câncer de mama do xenoenxerto de MDA-MB-231 (ver Figuras 25 a 27 e Tabelas 47 a 50). São também apresentados dados abaixo, no Estudo 18 que demonstram os efeitos de BCY6136 em um modelo de câncer de mama que faz uso de uma linhagem celular com expressão baixa/mínima de EphA2 (a saber, EMT6). Esses dados são mostrados nas Figura 28 e Tabelas 51 e 52 e demonstram que BCY6136 não teve efeito sobre a regressão do tumor nessa linhagem celular.
São também apresentados dados abaixo, no Estudo 19, mos- trando que BCY6136 demonstrou atividade antitumoral significativa no modelo de câncer gástrico do xenoenxerto de NCI-N87 (ver Figura 29 e Tabelas 53 e 54). São também apresentados dados abaixo, no Es- tudo 20, mostrando que BCY6136 demonstrou atividade antitumoral significativa no modelo de câncer de ovário do xenoenxerto de SK-OV- 3 (ver Figura 30 e Tabelas 55 e 56) quando comparado ao ADC MEDI- 547 que demonstrou atividade antitumoral moderada.
São também apresentados dados abaixo, no Estudo 21, mostrando que BCY6136 demonstrou atividade antitumoral significativa no modelo de câncer de esôfago do xenoenxerto de OE-21 (ver Figura 31 e Tabelas 57 e 58). São também apresentados dados abaixo, no Estudo 22, mostrando que BCY6136 demonstrou atividade antitumoral dependente da dose no modelo de mieloma múltiplo do xenoenxerto de MOLP-8 e BCY6082 demonstrou atividade antitumoral significativa (ver Figuras 32 e 33 e Tabelas 59 e 60). São também apresentados dados abaixo, no Estudo 23, mostrando que BCY6136 demonstrou atividade antitu-
moral potente no modelo de fibrossarcoma do xenoenxerto de HT- 1080 (ver Figuras 34 a 41 e Tabelas 61 e 62). Síntese
[00133] Os peptídeos da presente invenção podem ser produzidos sinteticamente por técnicas padrão seguidas pela reação com um ar- cabouço molecular in vitro. Quando isso é realizado, pode-se usar química padrão. Isso permite a preparação rápida em larga escala de material solúvel para experimentos ou validação a jusante (downstre- am). Tais métodos poderiam ser conduzidos utilizando a química con- vencional como aquela descrita em Timmerman et al (supra).
[00134] Assim, a invenção também se refere à produção de poli- peptídeos ou conjugados selecionados como aqui estabelecidos, em que a produção compreende etapas opcionais adicionais como expli- cado abaixo. Em uma modalidade, essas etapas são realizadas no po- lipeptídeo/conjugado obtido como produto final por síntese química.
[00135] Opcionalmente, resíduos de aminoácidos no polipeptídeo de interesse podem ser substituídos durante a produção de um conju- gado ou complexo.
[00136] Os peptídeos podem também ser ampliados, para incorpo- rar, por exemplo, outro loop e, portanto, introduzir múltiplas especifici- dades.
[00137] Para ampliar o peptídeo, pode-se simplesmente ampliar quimicamente seu N-terminal ou C-terminal ou o interior dos loops uti- lizando lisinas protegidas ortogonalmente (e análogos) por meio da química padrão em fase sólida ou fase de solução. Podem ser utiliza- das técnicas padrão de (bio)conjugação para introduzir um N- ou C- terminal ativado ou ativável. Alternativamente, adições podem ser fei- tas por condensação de fragmentos ou ligação química nativa, p. ex., como descrito em Dawson et al. (Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779, 1994), ou por enzimas, por exemplo, usando subtiligase como descrito em Chang et al. (Proc Natl Acad Sci U S A., 1994 Dec 20; 91(26):12544-8) ou em Hikari et al (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003).
[00138] Alternativamente, os peptídeos podem ser ampliados ou modificados por conjugação adicional através de ligações dissulfeto. Isso tem como vantagem adicional permitir que o primeiro e o segundo peptídeo se dissociem dentro do ambiente redutor da célula. Nesse caso, o arcabouço molecular poderia ser adicionado durante a síntese química do primeiro peptídeo de maneira a reagir com os três grupos de cisteína; uma cisteína ou tiol adicional poderia então ser anexado ao N ou C-terminal do primeiro peptídeo, demo do que essa cisteína ou tiol reagisse somente com uma cisteína ou tiol livre do segundo peptídeo, formando uma conjugado peptídeo bicíclico-peptídeo ligado por dissulfeto.
[00139] Técnicas similares aplicam-se igualmente à sínte- se/acoplamento de dois macrociclos bicíclicos e biespecíficos, poten- cialmente criando uma molécula tetraespecífico.
[00140] Além disso, a adição de outros grupos funcionais ou grupos efetores pode ser realizada da mesma maneira, usando a química apropriada, acoplamento no N- ou C-terminal ou através das cadeias laterais. Em uma modalidade, o acoplamento é conduzido de tal ma- neira que não bloqueie a atividade de qualquer uma das entidades. Composições Farmacêuticas
[00141] De acordo com um aspecto adicional da invenção, provê-se uma composição farmacêutica que compreende um ligante peptídico ou um conjugado de fármaco como aqui definido em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00142] Em geral, os presentes ligantes peptídicos serão utilizados em forma purificada junto com excipientes ou veículos farmacologica-
mente adequados. Tipicamente, esses excipientes ou veículos incluem soluções aquosas ou alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e/ou tamponados. Os veículos parenterais in- cluem solução de cloreto de sódio, solução de Ringer com dextrose, dextrose e cloreto de sódio e solução de Ringer com lactato. Adjuvan- tes fisiologicamente aceitáveis adequados, se necessários para man- ter um complexo polipeptídico em suspensão, podem ser escolhidos dentre espessantes como carboximetilcelulose, polivinilpirrolidona, ge- latina e alginatos.
[00143] Veículos intravenosos incluem repositores hídricos e de nu- trientes e repositores de eletrólitos, como aquele à base de solução de Ringer com dextrose. Conservantes e outros aditivos, como antimicro- bianos, antioxidantes, agente quelantes e gases inertes, podem tam- bém estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Scien- ces, 16a Edição).
[00144] Os ligantes peptídicos da presente invenção podem ser usados como composições administradas separadamente ou em con- junto com outros agentes. Esses podem incluir anticorpos, fragmentos de anticorpos e vários fármacos imunoterápicos, como ciclosporina, metotrexato, adriamicina ou cisplatina e imunotoxinas. As composi- ções farmacêuticas podem incluir "coquetéis" de vários agentes citotó- xicos ou outros agentes em conjunto com os ligantes proteicos da pre- sente invenção, ou mesmo combinações de polipeptídeos, seleciona- dos de acordo com a presente invenção, tendo diferentes especificida- des, como polipeptídeos selecionados usando ligantes alvo diferentes, sejam ou não agrupados antes da administração.
[00145] A via de administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser qualquer daquelas comumente co- nhecidas pelos técnicos no assunto. Para terapia, os ligantes peptídi- cos da invenção podem ser administrados a qualquer paciente de acordo com técnicas padrão. A administração pode ser por qualquer modo apropriado, incluindo via parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, através da via pulmonar ou, também, adequadamente, por infusão direta com um cateter. De preferência, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção serão adminis- tradas por inalação. A dose e frequência de administração dependerão da idade, sexo e condição do paciente, a administração simultânea de outros fármacos, contraindicações e outros parâmetros a serem leva- dos em conta pelo médico.
[00146] Os ligantes peptídicos desta invenção podem ser liofiliza- dos para armazenamento e reconstituídos em um veículo adequado antes do uso. Essa técnica demonstrou ser eficaz, e técnicas de liofili- zação e reconstituição conhecidas na área podem ser empregadas. Será apreciado pelos técnicos no assunto que a liofilização e reconsti- tuição podem levar a graus variáveis de perda da atividade e que, para compensar, os níveis podem ser ajustados para cima.
[00147] As composições contendo os presentes ligantes peptídicos ou um coquetel dos mesmos podem ser administradas para tratamen- to profilático e/ou terapêutico. Em certas aplicações terapêuticas, uma quantidade adequada para alcançar pelo menos inibição parcial, su- pressão, modulação, morte ou algum outro parâmetro mensurável de uma população de células selecionadas é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz". As quantidades necessárias para atingir es- sa dose dependerão da gravidade da doença e do estado geral do próprio sistema imune do paciente, mas em geral varia de 0,005 a 5,0 mg de ligante peptídico selecionado por quilograma de peso corporal, sendo as doses de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose mais comumente utilizadas. Para aplicações profiláticas, as composições contendo os presentes ligantes peptídicos ou coquetéis dos mesmos podem também ser ad- ministradas em doses semelhantes ou ligeiramente menores.
[00148] Uma composição contendo um ligante peptídico de acordo com a presente invenção pode ser utilizada em contexto profilático e terapêutico para ajudar na alteração, inativação, morte ou remoção de uma população de células alvo selecionadas em um mamífero. Além disso, os ligantes peptídicos aqui descritos podem ser usados de mo- do extracorpóreo ou in vitro seletivamente para eliminar, esgotar ou de outra forma efetivamente remover uma população de células alvo de uma coleção heterogênea de células. O sangue de um mamífero pode ser integrado com modo extracorpóreo com os ligantes peptídicos se- lecionados, pelo qual as células indesejadas são mortas ou de outra forma removidas do sangue para devolução ao mamífero de acordo com técnicas padrão. Usos terapêuticos
[00149] Os peptídeos bicíclicos da invenção possuem utilidade es- pecífica como agentes de ligação ao EphA2.
[00150] Os receptores tirosina quinases Eph (Ephs) pertencem a um grande grupo de receptores tirosina quinases (RTKs), quinases que fosforilam proteínas em resíduos de tirosina. Ephs e seus ligantes efrina ligados à membrana (efrinas) controlam o posicionamento da célula e a organização de tecidos (Poliakov et al. (2004) Dev Cell 7, 465-80). Respostas funcionais e bioquímicas de Eph ocorrem em es- tados de maior oligomerização do ligante (Stein et al. (1998) Genes Dev 12, 667-678).
[00151] Entre outras funções de padronização, vários Ephs e efri- nas demonstraram desempenhar um papel no desenvolvimento vascu- lar. O knockout (inativação) de EphB4 e efrina-B2 resulta em falta da capacidade para remodelar leitos capilares em vasos sanguíneos (Po- liakov et al., supra) e letalidade embrionária. A expressão persistente de alguns receptores Eph e efrinas também foi observada em micro- vasos adultos recentemente formados (Brantley-Sieders et al. (2004)
Curr Pharm Des 10, 3431-42; Adams (2003) J Anat 202, 105-12).
[00152] Observou-se também que a ressurgimento desregulado de algumas efrinas e seus receptores em adultos contribuía para invasão tumoral, metástase e neo-angiogênese (Nakamoto et al. (2002) Mi- crosc Res Tech 59, 58-67; Brantley-Sieders et al., supra). Além disso, verificou-se que alguns membros da família Eph são superexpressos em células tumorais de uma variedade de tumores humanos (Brantley- Sieders et al., supra); Marme (2002) Ann Hematol 81 Suppl 2, S66; Booth et al. (2002) Nat Med 8, 1360-1).
[00153] O receptor EPH A2 (receptor 2 tipo A de efrina) é uma pro- teína que, em humanos, é codificada pelo gene EPHA2.
[00154] EphA2 é regulado positivamente em múltiplos cânceres no homem, frequentemente correlacionando-se com progressão da doen- ça, metástase e mau prognóstico, p. ex.: mama (Zelinski et al (2001) Cancer Res. 61, 2301-2306; Zhuang et al (2010) Cancer Res. 70, 299- 308; Brantley-Sieders et al (2011) PLoS One 6, e24426), pulmão (Brannan et al (2009) Cancer Prev Res (Phila) 2, 1039-1049; Kinch et al (2003) Clin Cancer Res. 9, 613-618; Guo et al (2013) J Thorac On- col. 8, 301-308), gástrico (Nakamura et al (2005) Cancer Sci. 96, 42- 47; Yuan et al (2009) Dig Dis Sci 54, 2410-2417), pancreático (Mudali et al (2006) Clin Exp Metastasis 23, 357-365), próstata (Walker- Daniels et al (1999) Prostate 41, 275-280), fígado (Yang et al (2009) Hepatol Res. 39, 1169-1177) e glioblastoma (Wykosky et al (2005) Mol Cancer Res. 3, 541-551; Li et al (2010) Tumour Biol. 31, 477-488).
[00155] A participação completa de EphA2 na progressão do câncer não está definida ainda, embora exista evidência para interação em inúmeros estágios de progressão do câncer, incluindo crescimento de células tumorais, sobrevivência, invasão e angiogênese. A regulação negative da expressão de EphA2 suprime a propagação de células cancerígenas do tumor (Binda et al (2012) Cancer Cell 22, 765-780),
enquanto o bloqueio de EphA2 inibe a migração de células induzida por VEGF (Hess et al (2001) Cancer Res. 61, 3250-3255), brotamento e angiogênese (Cheng et al (2002) Mol Cancer Res. 1, 2-11; Lin et al (2007) Cancer 109, 332-40) e progressão metastática (Brantley- Sieders et al (2005) FASEB J. 19, 1884-1886).
[00156] Um conjugado fármaco-anticorpo contra EphA2 demonstrou diminuir significativamente o crescimento tumoral em modelos de xe- noenxertos no rato e camundongo (Jackson et al (2008) Cancer Rese- arch 68, 9367-9374) e uma abordagem semelhante foi tentada no ho- mem embora o tratamento tivesse que ser descontinuado por eventos adversos relacionados ao tratamento (Annunziata et al (2013) Invest New drugs 31, 77-84).
[00157] Ligantes polipeptídicos selecionados de acordo com o mé- todo da presente invenção podem ser empregados em aplicações te- rapêuticas e profiláticas in vivo, aplicações diagnósticas in vitro e in vivo, aplicações em ensaios e reagentes in vitro e similares. Ligantes com níveis selecionados de especificidade são úteis em aplicações que envolvem a testagem em animais não humanos, onde a reativida- de cruzada é desejável, ou em aplicações diagnósticas, onde a reativi- dade cruzada com homólogos e parálogos precisa ser cuidadosamen- te controlada. Em algumas aplicações, como aplicações vacinais, a capacidade para suscitar uma resposta imune a faixas predetermina- das de antígenos pode ser explorada para ajustar uma vacina para doenças e patógenos específicos.
[00158] Ligantes peptídicos substancialmente puros com pelo me- nos 90 a 95% de homogeneidade são preferidos para administração a um mamífero e, para usos farmacêuticos, 98 a 99% ou mais de homo- geneidade são mais preferidos, especialmente quando o mamífero é um humano. Uma vez purificados, parcialmente ou até a homogenei- dade, conforme desejado, os polipeptídeos selecionados podem ser usados para fins diagnósticos ou terapêuticos (incluindo de modo ex- tracorpóreo) ou no desenvolvimento e realização de procedimentos de ensaios, colorações imunofluorescentes e similares (Lefkovite and Pernis, (1979 e 1981) Immunological Methods, Volumes I e II, Acade- mic Press, NY).
[00159] De acordo com um aspecto adicional da invenção, provê-se um ligante peptídico ou um conjugado de fármaco, como aqui definido, para uso na prevenção, supressão ou no tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por superexpressão de EphA2 em tecido doente (tal como um tumor).
[00160] De acordo com um aspecto adicional da invenção, provê-se um método de prevenção, supressão ou tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por superexpressão de EphA2 em tecido doen- te (tal como um tumor), o qual compreende administrar a um paciente com necessidade do mesmo um conjugado fármaco-grupo efetor do ligante peptídico como aqui definido.
[00161] Em uma modalidade, o EphA2 é EphA2 de mamífero. Em uma modalidade adicional, o EphA2 de mamífero é o EphA2 humano.
[00162] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio caracterizado por superexpressão de EphA2 em tecido doente é selecionado dentre câncer.
[00163] Os exemplos de cânceres (e seus equivalentes benignos) que podem ser tratados (ou inibidos) incluem, entre outros, tumores de origem epitelial (adenomas e carcinomas de vários tipos incluindo adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, carcinomas de células transicionais e outros carcinomas) como carcinomas da bexiga e trato urinário, mama, trato gastrointestinal (incluindo o esôfago, es- tômago (gástrico), intestino delgado, cólon, reto e ânus), fígado (carci- noma hepatocelular), vesícula biliar e sistema biliar, pâncreas exócri- no, rim, pulmão (por exemplo, adenocarcinomas, carcinomas de pul-
mão de pequenas células, carcinomas de pulmão de células não pe- quenas, carcinomas broncoalveolares e mesoteliomas), cabeça e pes- coço (por exemplo, cânceres da língua, cavidade bucal, laringe, farin- ge, nasofaringe, amígdala, glândulas salivares, cavidade nasal e seios paranasais), ovário, trompas de Falópio, peritônio, vagina, vulva, pê- nis, colo do útero, miométrio, endométrio, tireoide (por exemplo, carci- noma folicular de tireoide), adrenal, próstata, pele e anexos (por exemplo, melanoma, carcinoma basocelular, carcinoma espinocelular, ceratoacantoma, nevo displásico); neoplasias hematológicas malignas (ou seja, leucemias, linfomas) e distúrbios hematológicos pré-malignos e distúrbios de malignidade limítrofe incluindo neoplasias hematológi- cas malignas e condições relacionadas da linhagem linfoide (por exemplo, leucemia linfocítica aguda [LLA], leucemia linfocítica crônica [LLC], linfomas de células B como linfoma difuso de grandes células B [LDGCB], linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células do manto, linfoma de células T e leucemias, linfomas de células natural killer [NK], linfomas de Hodgkin, leucemia de células cabeludas, ga- mopatia monoclonal de significância incerta, plasmocitoma, mieloma múltiplo e distúrbios linfoproliferativo pós-transplante), e neoplasias hematológicas malignas e condições relacionadas da linhagem mieloi- de (por exemplo, leucemia mielogênica aguda [LMA], leucemia mielo- gênica crônica [LMC], leucemia mielomonocítica crônica [LMMC], sín- drome hipereosinofílica, distúrbios mieloproliferativos como policitemia verdadeira, trombocitopenia essencial e mielofibrose primária, síndro- me mieloproliferativa, síndrome mielodisplásica e leucemia promielocí- tica); tumores de origem mesenquimal, por exemplo, sarcomas de te- cidos moles, osso ou cartilagem como osteossarcomas, fibrossarco- mas, condrossarcomas, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, sar- comas sinoviais, sarcomas epitelioides, tumores estromais gastrointes- tinais, histiocitomas benignos e malignos e dermatofibrossarcoma pro-
tuberante; tumores do sistema nervoso central ou periférico (por exemplo, astrocitomas, gliomas e glioblastomas, meningiomas, epen- dimomas, tumores pineais e schwannomas); tumores endócrinos (por exemplo, tumores de hipófise, tumores de adrenais, tumores das célu- las de ilhotas, tumores de paratireoide, tumores carcinoides e carci- noma medular da tireoide); tumores oculares e de anexos (por exem- plo, retinoblastoma); tumores de células germinativas e trofoblásticos (por exemplo, teratomas, seminomas, disgerminomas, mola hidatidi- forme e coriocarcinomas); e tumores pediátricos e embrionários (por exemplo, meduloblastoma, neuroblastoma, tumor de Wilms e tumores neuroectodérmicos primitivos); ou síndromes, congênitas ou não, que deixam o paciente suscetível à neoplasias malignas (por exemplo, Xe- roderma Pigmentoso).
[00164] Em uma modalidade adicional, o câncer é selecionado a partir de: câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de fígado, glioblastoma e an- giogênese.
[00165] Em uma modalidade adicional, o câncer é selecionado a partir de: câncer de próstata, câncer de pulmão (como carcinomas de pulmão de células não pequenas (CPNPC)), câncer de mama (como câncer de mama triplo negativo), câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de esôfago, mieloma múltiplo e fibrossarcoma.
[00166] Em ainda outra modalidade, o câncer é câncer de próstata. São apresentados dados abaixo, nos Estudos 7 e 8, mostrando que BCY6033 e BCY6136 revelaram atividade antitumoral significativa e potente no modelo de câncer de próstata do xenoenxerto de PC-3 (ver Figuras 7 a 10 e Tabelas 21 a 24).
[00167] Em ainda outra modalidade, o conjugado do fármaco é útil para prevenção, supressão ou tratamento de tumores sólidos como fibrossarcomas e de mama e carcinomas de pulmão de células não pequenas.
[00168] Em ainda outra modalidade, o câncer é selecionado a partir de câncer de pulmão, como carcinomas de pulmão de células não pe- quenas (CPNPC). São apresentados dados abaixo que demonstram que a BDC da invenção (BCY6031) erradicou completamente carci- nomas de pulmão de células não pequenas a partir do Dia 32 e não houve recidiva do tumor após a suspensão da administração no Dia
28. Esses dados demonstram claramente a utilidade clínica dos BDCs da presente invenção em cânceres como cânceres de pulmão, em par- ticular, carcinomas de pulmão de células não pequenas. São também apresentados dados abaixo, no Estudo 9, mostrando que BCY6033 demonstrou atividade antitumoral dependente da dose, BCY6082 de- monstrou atividade antitumoral significativa e BCY6136 demonstrou atividade antitumoral potente no modelo de câncer de pulmão (CPNPC) do xenoenxerto de NCI-H1975 (ver Figuras 11 a 13 e Tabe- las 25 a 30). São também apresentados dados abaixo, nos Estudos 10 e 11, mostrando que BCY6136 demonstrou efeito antitumoral potente nos modelos de câncer de pulmão (CPNPC) PDX LU-01-0251 de ta- manho tumoral grande e pequeno (ver Figuras 14 e 15 e Tabelas 31 a 34) em que se observou regressão completa do tumor. São também apresentados dados abaixo, no Estudo 12, mostrando que BCY6033, BCY6136, BCY6082 e BCY6031 demonstraram efeito antitumoral sig- nificativo no modelo de câncer de pulmão (CPNPC) PDX LU-01-0046 (ver Figura 16 e Tabelas 35 e 36) em que se observou regressão completa do tumor para BCY6033 e BCY6136. São também apresen- tados dados abaixo, no Estudo 13, mostrando que BCY6136 demons- trou atividade antitumoral dependente da dose no modelo de câncer de pulmão (CPNPC) PDX LU-01-0046 (ver Figura 17 e Tabelas 37 e 38). São também apresentados dados abaixo, no Estudo 14, mostran- do que BCY6082 demonstrou atividade antitumoral dependente da do-
se, BCY6031 e BCY6173 demonstraram atividade antitumoral e BCY6033, BCY6136 e BCY6175 erradicaram tumores no modelo de câncer de pulmão (CPNPC) PDX LU-01-0046 (ver Figuras 18 a 22 e Tabelas 39 a 42). São também apresentados dados abaixo, nos Estu- dos 15 e 16, que demonstram os efeitos de BCY6136 em dois mode- los que fazem uso de linhagens celulares com expressão bai- xa/mínimo de EphA2 (a saber, LU-01-0412 e LU-01-0486). Esses da- dos são mostrados nas Figuras 23 e 24 e Tabelas 43 a 46 e demons- tram que BCY6136 não teve efeito sobre a regressão do tumor em qualquer uma das linhagens celulares, mas BCYs BCY8245 e BCY8781, que se ligam a um alvo altamente expresso na linhagem celular LU-01-0412, erradicaram completamente o tumor. Em uma modalidade adicional, o câncer é câncer de mama. Em ainda outra modalidade, o câncer de mama é câncer de mama triplo negativo. São apresentados dados abaixo, no Estudo 17, mostrando que BCY6082 demonstrou atividade antitumoral, BCY6033 demonstrou atividade an- titumoral dependente da dose e BCY6136 demonstrou atividade anti- tumoral potente no modelo de câncer de mama do xenoenxerto de MDA-MB-231 (ver Figuras 25 a 27 e Tabelas 47 a 50). São também apresentados dados abaixo, no Estudo 18 que demonstram os efeitos de BCY6136 em um modelo de câncer de mama que faz uso de uma linhagem celular com expressão baixa/mínima de EphA2 (a saber, EMT6). Esses dados são mostrados nas Figura 28 e Tabelas 51 e 52 e demonstram que BCY6136 não teve efeito sobre a regressão do tu- mor nessa linhagem celular. Em uma modalidade alternativa, o câncer de mama é câncer de mama resistente à herceptina. Sem se limitar à teoria, acredita-se que EphA2 esteja implicado na resistência à Her- ceptina, portanto, uma entidade que atinja EphA2 tem utilidade poten- cial em pacientes que não responderam à Herceptina.
[00169] Em uma modalidade adicional, o câncer é câncer gástrico.
São apresentados dados abaixo, no Estudo 19, mostrando que BCY6136 demonstrou atividade antitumoral significativa no modelo de câncer gástrico do xenoenxerto de NCI-N87 (ver Figura 29 e Tabelas 53 e 54).
[00170] Em uma modalidade adicional, o câncer é câncer de ovário. São apresentados dados abaixo, no Estudo 20, mostrando que BCY6136 demonstrou atividade antitumoral significativa no modelo de câncer de ovário do xenoenxerto de SK-OV-3 (ver Figura 30 e Tabelas 55 e 56) quando comparado ao ADC MEDI-547 que demonstrou ativi- dade antitumoral moderada.
[00171] Em uma modalidade adicional, o câncer é câncer de esôfa- go. São apresentados dados abaixo, no Estudo 21, mostrando que BCY6136 demonstrou atividade antitumoral significativa no modelo de câncer de esôfago do xenoenxerto de OE-21 (ver Figura 31 e Tabelas 57 e 58).
[00172] Em uma modalidade adicional, o câncer é mieloma múltiplo. São apresentados dados abaixo, no Estudo 22, mostrando que BCY6136 demonstrou atividade antitumoral dependente da dose no modelo de mieloma múltiplo do xenoenxerto de MOLP-8 e BCY6082 demonstrou atividade antitumoral significativa (ver Figuras 32 e 33 e Tabelas 59 e 60).
[00173] Em uma modalidade adicional, o câncer é fibrossarcoma. São apresentados dados abaixo, no Estudo 23, mostrando que BCY6173, BCY6135, BCY6174 e BCY6175 demonstraram atividade antitumoral dependente da dose e BCY6082, BCY6031, BCY6033 e BCY6136 demonstraram atividade antitumoral potente no modelo de fibrossarcoma do xenoenxerto de HT-1080 (ver Figuras 34 a 41 e Ta- belas 61 e 62).
[00174] Referências, neste relatório descritivo, ao termo "preven- ção" envolvem a administração da composição protetora antes da in-
dução da doença. "Supressão" refere-se à administração da composi- ção depois de um evento indutivo, mas antes da apresentação clínica da doença. "Tratamento" envolve a administração da composição pro- tetora depois que os sintomas da doença se tornam manifestos.
[00175] Existem disponíveis sistemas de modelo animal que podem ser utilizados para examinar a eficácia dos ligantes peptídicos para proteger contra ou tratar a doença. O uso de sistemas de modelo ani- mal é facilitado pela presente invenção, o qual permite o desenvolvi- mento de ligantes polipeptídicos capazes de reatividade cruzada com alvos humanos e animais, visando o uso de modelos animais.
[00176] Além disso, são apresentados dados abaixo que demons- tram uma associação entre variação no número de cópias (CNV) e ex- pressão gênica de EphA2 para múltiplos tipos de tumor. Assim, de acordo com um aspecto adicional da invenção, provê-se um método de prevenção, supressão ou tratamento de câncer, o qual compreende administrar a um paciente com necessidade do mesmo um conjugado fármaco-grupo efetor do ligante peptídico como aqui definido, em que o dito paciente é identificado como portador de variação aumentada do número de cópias (CNV) de EphA2.
[00177] Em uma modalidade, o câncer é selecionado dentre aque- les aqui identificados como apresentando CNV aumentado de EphA2. Em uma modalidade adicional, o câncer é câncer de mama.
[00178] A invenção é descrita mais detalhadamente abaixo com re- ferência aos exemplos a seguir.
Exemplos Abreviação Nome Nome do precursor CAS do pre- Fornece- cursor dor 1Nal 1-Naftilalanina Fmoc-3-(1-naftil)-L- 96402-49-2 Fluorochem alanina 2FuAla 2-Furilalanina Fmoc-L-2-furilalanina 159611-02-6 Combi Blo- cks 2Nal 2-Naftilalanina Fmoc-3-(2-naftil)-L- 112883-43-9 Alfa Aesar alanina 3,3-DPA 3,3-Difenilalanina fmoc-3,3-difenilalanina 189937-46-0 Alfa Aesar 3,4-DCPhe 3,4- Fmoc-3,4-dicloro-L- 17766-59-5 PolyPeptide Diclorofenilalanina fenilalanina 3Pal 3-(3-Piridil)- N-Fmoc-3-(3-piridil)- 175453-07-3 Fluorochem Alanina Lβnina 4,4-BPA 4,4'-Bifenilalanina Fmoc-L-4, 4'- 199110-64-0 Alfa Aesar Bifenilalanina 4BenzilPro 4-Benzil- Fmoc-4-Benzil- PolyPeptide pirrolidina-2- pirrolidina-2-carboxílico carboxílico 4BrPhe 4- Fmoc-4-Bromo-L- 198561-04-5 PolyPeptide Bromofenilalanina fenilalanina 4FlPro 4-Fluoro- Fmoc-4-fluoro- 203866-19-7 PolyPeptide pirrolidina-2- pirrolidina-2-carboxílico carboxílico 4MeoPhe 4- Fmoc-4- 77128-72-4 Iris Biotech Metoxifenilalanina Metoxifenilalanina 4Pal 3-(4-Piridil)- N-Fmoc-3-(4-piridil)-L- 169555-95-7 Fluorochem Alanina alanina 4FenilPro 4-Fenil-pirrolidina- Fmoc-4-fenil-pirrolidina- 269078-71-9 Cambridge 2-carboxílico 2-carboxílico Bioscience Ac Acetila AC3C 1- 1-(Fmoc- 126705-22-4 Iris Biotech Aminociclopropa- ami- no-1-carboxílico no)ciclopropanocarboxíli co AC4C 1-Amino-1- 1-(Fmoc-amino)- 885951-77-9 Fluorochem ciclobutanecarbo- ciclobutilcarboxílico xílico
Abreviação Nome Nome do precursor CAS do pre- Fornece- cursor dor AC5C 1-Amino-1- 1-(Fmoc- 117322-30-2 Iris Biotech ciclopentanocar- ami- boxílico no)ciclopentanocarboxíli co AF488 AlexaFluor488 AlexaFluor488-NHS Fisher Sci- Ester entific Aib Ácido 2- Ácido Fmoc-α- 94744-50-0 Fluorochem aminoisobutírico aminoisobutírico Aza-Gly Azaglicina Aze Azetidina Fmoc-L-azetidina-2- 136552-06-2 Combi Blo- carboxílico cks β-Ala β-Alanina Fmoc-β-alanina 35737-10-1 Fluorochem β-AlaSO3H β-Alanina(SO3H) Fmoc-alfa-sulfo-beta- 1005412-03-2 Iris Biotech Alanina C5g Ciclopentilglicina Fmoc-L- 220497-61-0 Fluorochem ciclopentilglicina Cba β-Ciclobutilalanina Fmoc-β-ciclobutil-L- 478183-62-9 IRIS Bio- alanina tech GmbH Cpa β- Fmoc-β-ciclopropil-L- 214750-76-2 Fluorochem Ciclopropilalanina alanina Cpg Ciclopropilglicina Fmoc-L- 1212257-18-5 Apollo Sci- cicloproprilglicina entific Cya Ácido cisteico Ácido Fmoc-L-cisteico 320384-09-6 D-3,3-DPA 3,3-difenil-D- Fmoc-3,3-difenil-D- 189937-46-0 Chem- alanina alanina Impex in- ternational D-Arg D-Arginina Fmoc-D-Arginina(Pbf) 187618-60-6 Iris Biotech D-Asp Ácido D-Aspártico Éster 4-terc-butilíco do 112883-39-3 Sigma Al- ácido Fmoc-D-aspártico drich D-Cya Ácido D-cisteico Ácido Fmoc-D-cisteico Costom síntese D-K D-Lisina Fmoc-D-Lisina(Boc) 92122-45-7 Sigma Al- drich DOTA Ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano- 1,4,7,10-tetraacético Fl 5(6)- Sigma carboxifluoresceí- na
Abreviação Nome Nome do precursor CAS do pre- Fornece- cursor dor HArg HomoArginina Fmoc-L-HomoArg(Pbf)- 401915-53-5 Fluorochem
OH HPhe HomoFenilalanina Fmoc-L- 132684-59-4 Iris Biotech Homofenilalanina HyP Hidroxiprolina Fmoc- 122996-47-8 Sigma Hidroxiprolina(tBu)-OH hSerMe HomoSerina(metil) Fmoc-O-metil-L- 173212-86-7 Iris Biotech homosserina Lys(Dde) Lisina(Dde) N-α-Fmoc-N-ε-1-(4,4- 150629-67-7 Sigma Al- dimetil-2,6- drich dioxociclohex-1- ilideno)etil-L-lisina NO2Phe 4-Nitrofenilalanina Fmoc-4-nitro-L- 95753-55-2 PolyPeptide fenilalanina Phg Fenilglicina Fmoc-L-fenilglicina 102410-65-1 Combi Blo- cks Pip Ácido pipecólico Ácido Fmoc-L- 86069-86-5 Peptech pipecólico Sar Sarcosina, tal que Fmoc-Sarcosina-OH 77128-70-2 Sigma Sarx representa x resíduos de Sar tBuGly Terc-leucina Fmoc-L-terc-leucina 132684-60-7 Fluorochem Thi 2-Tienilalanina Fmoc-2-tienilalanina 130309-35-2 Novabio- chem ThiAz 3-(1,2,4-triazol-1- Fmoc-3-(1,2,4-triazol-1- 1217449-37-0 Sigma il)-Alanina il)-Ala-OH ΨAla Amida reduzida na cadeia principal Materiais e Métodos Síntese de Peptídeos
[00179] Os peptídeos foram sintetizados por síntese em fase sólida. Utilizou-se a resina Rink Amide MBHA. A uma mistura contendo Rink Amide MBHA (0,4-0,45 mmol/g) e Fmoc-Cys(Trt)-OH (3,0 eq.), adicio- nou-se DMF, depois DIC (3 eq.) e HOAt (3 eq.) foram adicionados e misturados por 1 hora. Usou-se piperidina 20% em DMF para o des- bloqueio. Cada aminoácido subsequente foi acoplado com 3 eq. usan- do reagentes ativadores, DIC (3,0 eq.) e HOAT (3,0 eq.) em DMF. A reação foi monitorada por reação colorimétrica com ninidrina ou rea- ção colorimétrica com tetracloro. Depois completada a síntese, a resi- na peptídica foi lavada com DMF x 3, MeOH x 3 e, a seguir, seca sob borbulhamento de N2 durante a noite. A resina peptídica foi então tra- tada com TFA 92,5%/TIS 2,5%/EDT 2,5%/H2O 2,5% por 3 horas. O peptídeo foi precipitado com éter isopropílico frio e centrifugado (3 mi- nutos a 3000 rpm). O pellet foi lavado duas vezes com éter isopropílico e o peptídeo bruto foi seco sob vácuo por 2 horas e depois liofilizado. O pó liofilizado foi dissolvido em ACN/H2O (50:50), e uma solução de TATA 100 mM em ACN foi adicionada, seguida por bicarbonato de amônio em H2O (1M) e a solução misturada por 1 hora. Uma vez com- pletada a ciclização, a reação foi interrompida com cloridrato de cisteí- na aq. 1M (10 eq. em relação a TATA), então misturada e deixada em repouso por uma hora. A solução foi liofilizada para fornecer o produto bruto. O peptídeo bruto foi purificado por HPLC preparativa e liofilizado para fornecer o produto.
[00180] Todos os aminoácidos, a menos que anotado de outra for- ma, foram usados nas configurações L.
BCY6099 (Composto 66) Síntese em fase sólida Sequência: (β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 2)-CONH2
[00181] 8,0 g de resina foram usadas para gerar 2,1 g de BCY6099 (99,29% de pureza; 16,3% de rendimento) co- mo um sólido branco.
61/299 BCY6099 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 15-45% ao longo de 20 minutos, depois B 95% 3 minutos Tempo de retenção: 11,31 min. LCMS (ESI): m/z 1061,8 [M+3H]3+, 796,5 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3183,68
BCY6014 (Composto 67) Síntese em fase sólida Sequência: (β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 11)-CONH2
[00182] 4,79 g de resina foram usadas para gerar 1,07g de BCY6014 (Q1: 131,9 mg, 97,99% de pureza; Q2: 141,7 62/299 mg, 99,04% de pureza; Q3: 800,7 mg, 92,35% de pureza; 16,9% de rendimento) como um sólido branco. BCY6014 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 9,95 min. LCMS (ESI): m/z 1013,8 [M+3H]3+, 760,4 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3039,53
BCY6104 (Composto 99) Síntese em fase sólida Sequência: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)W(HArg)C ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 85))
[00183] 4,44 g de resina foram usadas para gerar 700 mg de BCY6104 (95,87% de pureza, 10,5% de rendimento) como um sólido branco.
63/299 BCY6104 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 7,06 min. LCMS (ESI): m/z 1062,1 [M+3H]3+, 796,8 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3185,65
BCY6103 (Composto 100) Síntese em fase sólida Sequência: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)(Hse(Me))VNPLCLHP(D-Asp)WTC ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 86))
[00184] 4,44 g de resina foram usadas para gerar 700 mg de BCY6103 (98,9% de pureza, 11,1% de rendimento) como um sólido branco.
64/299 BCY6103 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 8,02 min. LCMS (ESI): m/z 1039,1 [M+3H]3+, 779,5 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3117,55
BCY6101 (Composto 101) Sequência: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)LVNPLCLHP(D-Ala)WTC ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 87)) Síntese em fase sólida
[00185] 4,44 g de resina foram usadas para gerar 700 mg de BCY6101 (95,9% de pureza, 10,9% de rendimento) como um sólido branco.
65/299 BCY6101 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 9,79 min. LCMS (ESI): m/z 1023,6 [M+3H]3+, 768,0 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3069,55
BCY6102 (Composto 102) Sequência: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Ala)WTC ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 88)) Síntese em fase sólida
[00186] 4,44 g de resina foram usadas para gerar 900 mg de BCY6102 (95,9% de pureza, 14,1% de rendimento) como um sólido branco.
66/299 BCY6102 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 9,89 min. LCMS (ESI): m/z 1018 [M+3H]3+, 763,9 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3053,56
BCY6139 (Composto 103) Sequência: (β-Ala)-Sar10-ARDC(HyP)LVNPLCLHPGWTC ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 89)) Síntese em fase sólida
[00187] 4,44 g de resina foram usadas para gerar 900 mg de BCY6139 (97,4% de pureza, 11,2% de rendimento) 67/299 como um sólido branco. BCY6139 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 8,95 min. LCMS (ESI): m/z 1014,6 [M+3H]3+, 761,2 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3042,51
BCY6138 (Composto 104) Sequência: (β-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCL(D-3,3-DPA)PGWTC ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 90)) Síntese em fase sólida
[00188] 1,11 g de resina foram usadas para gerar 200 mg de BCY6138 (95,2% de pureza, 12,2% de rendimento) 68/299 como um sólido branco. BCY6138 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 14,46 min. LCMS (ESI): m/z 1037,6 [M+3H]3+ PM do peptídeo 3111,63
BCY6137 (Composto 105) Sequência: (β-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCLHPGWTCLH ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 91)) Síntese em fase sólida
[00189] 4,44 g de resina foram usadas para gerar 600 mg de BCY6137 (98,9% de pureza, 9,06% de rendimento) 69/299 como um sólido branco. BCY6137 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 14,46 min. LCMS (ESI): m/z 1092,7 [M+3H]3+, 819,6 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3275,8
BCY6042 (Composto 91) Síntese em fase sólida Sequência: Ac-(SEQ ID NO: 14)-Sar6-(D-K) 70/299
[00190] 1,11 g de resina foram usadas para gerar 99,2 mg de BCY6042 (99,2% de pureza, 7,0% de rendimento) como um sólido branco. BCY6042 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 9,12 min. LCMS (ESI): m/z 943,5 [M+3H]3+ PM do peptídeo 2825,31
BCY6019 (Composto 77) Síntese em fase sólida Sequência: Ac-(SEQ ID NO: 12)-Sar6-(D-K)
[00191] 4,79 g de resina foram usadas para gerar 732,0 mg de BCY6019 (92,82% de pureza, 12,2% de rendimen- 71/299 to) como um sólido branco. BCY6019 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 11,36 min. LCMS (ESI): m/z 935,5 [M+3H]3+ PM do peptídeo 2805,32
BCY6059 (Composto 106) Sequência: Ac-(SEQ ID NO: 12)-Sar6-(D-K[Ac])
[00192] A uma solução de BCY6019 (0,05 g, 17,82 µmol, 1,00 eq.) em H2O (3 mL), ajustou-se o pH=11 com Na2CO3 (aq.) e adicionou-se acetato de acetila (5,46 mg, 53,46 µmol, 5,01 µL, 3,00 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou que BCY6019 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi de- 72/299 tectado. A reação foi ajustada para pH=7 com HCl 1 N e purificada diretamente por HPLC preparativa (Condição TFA). O Composto BCY6059 (18,1 mg, 6,36 µmol, 35,67% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6059 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 6,67 min. LCMS (ESI): m/z 949,8 [M+3H]3+ PM do peptídeo 2848,36
BCY6160 (Composto 107) Síntese em fase sólida Sequência: (β-AlaSO3H)-Sar4-(Cya)-Sar4-(Cya)-A(HArg)DCPLVNPLCLHP(D-Cya)WTC ((β-AlaSO3H)-Sar4-(Cya)- Sar4-(Cya)-(SEQ ID NO: 92)) 73/299
[00193] 1,11 g de resina foram usadas para gerar 45,2 mg de BCY6160 (95,5% de pureza, 2,5% de rendimento) como um sólido branco. BCY6160 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 11,38 min. LCMS (ESI): m/z 1124,9 [M+3H]3+ PM do peptídeo 3376,83
BCY6009 (Composto 108) Síntese em fase sólida Sequência: (β-Ala)-Sar10-ARDCPLVNPLCLHPGWTC ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 10))
[00194] 4,79 g de resina foram usadas para gerar 2,42 g de BCY6009 (>88,92% de pureza, 36,0% de rendimento) 74/299 como um sólido branco. BCY6009 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 10,16 min. LCMS (ESI): m/z 1008,9 [M+3H]3+, 756,9 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3025,5
BCY6017 (Composto 109) Síntese em fase sólida Sequência: A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC (SEQ ID NO: 11) 75/299
[00195] 1,19 g de resina foram usadas para gerar 189,9 mg de BCY6017 (95,05% de pureza, 16,8% de rendimen- to) como um sólido branco. BCY6017 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 10,01 min. LCMS (ESI): m/z 1129,1 [M+2H]2+, 753,0 [M+3H]3+ PM do peptídeo 2257,67
BCY6018 (Composto 110) Síntese em fase sólida Sequência: (β-Ala)-Sar5-(SEQ ID NO: 11)
[00196] 1,19 g de resina foram usadas para gerar 289,1 mg de BCY6018 (97,92% de pureza, 21,0% de rendimen- 76/299 to) como um sólido branco. BCY6018 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 9,77 min. LCMS (ESI): m/z 1342,9 [M+2H]2+, 895,3 [M+3H]3+ PM do peptídeo 2684,14
BCY6152 (Composto 111) Síntese em fase sólida Sequência: (β-AlaSO3H)-Sar10-(SEQ ID NO: 11)
[00197] 1,11 g de resina foram usadas para gerar 150,0 mg de BCY6152 (98,75% de pureza; 9,5% de rendimento) como um sólido branco.
77/299 BCY6152 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 10,09 min. LCMS (ESI): m/z 1040,3 [M+3H]3+ PM do peptídeo 3119,59
BCY6141 (Composto 112) Síntese em fase sólida Sequência: (β-Ala)-Sar10-A(D-Arg)DC(HyP)LVNPLCL(D-3,3-DPA)P(D-Asp)W(HArg)C ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 93))
[00198] 1,11 g de resina foram usadas para gerar 120,0 mg de BCY6141 (97,91% de pureza; 7,3% de rendimento) 78/299 como um sólido branco. BCY6141 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 11,41 min. LCMS (ESI): m/z 1085,5 [M+3H]3+ PM do peptídeo 3255,78
BCY6026 (Composto 87) Síntese em fase sólida Sequência: ACPLVNPLCLHPGWSCRGQ (SEQ ID NO: 77) 79/299
[00199] 1,11 g de resina foram usadas para gerar 285,0 mg de BCY6026 (97,7% de pureza; 24,2% de rendimento) como um sólido branco. BCY6026 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 9,31 min LCMS (ESI): m/z 1150 [M+2H]2+, 767,0 [M+3H]3+ PM do peptídeo 2299,71
BCY6153 (Composto 113) Síntese em fase sólida Sequência: (β-AlaSO3H)-Sar5-(SEQ ID NO: 11)
[00200] 1,11 g de resina foram usadas para gerar 140,0 mg de BCY6153 (98,59% de pureza; 9,9% de rendimento) 80/299 como um sólido branco. BCY6153 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 20-50% ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 10,33 min. LCMS (ESI): m/z 1382,6 [M+2H]2+, 922,0 [M+3H]3+ PM do peptídeo 2764,2
Preparação de Conjugados Peptídeo Bicíclico-Fármaco
[00201] O esquema geral para preparar conjugados Biciclo-fármaco (BDCs) é mostrado na Figura 3 e Tabela A descreve o componente biciclo de direcionamento e ligante/toxina dentro de cada BDC. Tabela A Biciclo de direcionamento BDC (BCY No) Ligante/Toxina (BCY No) 6136 6099 6033 6014 6029 6009 6122 6104 ValCit-MMAE 6053 6018 6049 6017 6037 6019 6030 6009 6034 6014 6050 6017 TrpCit-MMAE 6054 6018 6038 6019 6061 6014 ValLys-MMAE 6174 6099 6062 6014 D-TrpCit-MMAE 6135 6099 6031 6014 6134 6104 6027 6009 6047 6017 DM1-SS- 6035 6019 6051 6018 6154 6152 6155 6153 6173 6099 DM1-SS(SO3H)- 6082 6014
Biciclo de direcionamento BDC (BCY No) Ligante/Toxina (BCY No) 6150 6018 6151 6104 6162 6138 6161 6137 6032 6014 6052 6018 6048 6017 DM1-SS-(Me)- 6036 6019 6028 6009 6039 6014 DM1-(Me)-SS-(Me)- 6055 6014 DM1-SS-(Me2)- 6077 6014 DM1-SS-(Me)-SO3H- 6063 6014 Não clivável (MMAE) 6064 6014 Não clivável (DM1) 6105 6014 MMAE-Ala-Ala-Asn 6106 6014 MMAE-D-Ala-Phe- 6175 6099 Lys- MMAE-Glu-Pro-Cit- 6107 6014 Gly-hPhe-Tyr-Leu-
[00202] A síntese dos Conjugados Peptídeo Bicíclico-Fármaco BCY6027, BCY6028, BCY6031 e BCY6032 listados na Tabela 6 foi realizada usando o protocolo descrito em WO 2016/067035.
[00203] Os peptídeos ativados pelo biciclo com fórmula (C) e (D): Biciclo (C) Biciclo (D)
foram sintetizados reagindo o grupo amino livre dos precursores do biciclo com, respectivamente, SPP (N-succinimidil 4-(2- piridilditio)pentanoato, Annova Chem) e SPDB (N-succinimidil 3-(2- piridilditio)propionato, Annova Chem) em DMSO. As concentrações dos precursores do biciclo foram 10 mM ou mais altas, com excesso de 1,3 vezes de SPP ou SPDB, e excesso de 20 vezes de diisopropile- tilamina, à temperatura ambiente. A reação foi julgada completada de- pois de 1 hora, conforme avaliado por LCMS. A purificação foi realiza- da por fase reversa como descrito acima. As frações apropriadas fo- ram liofilizadas.
[00204] Os peptídeos ativados pelo biciclo com fórmula (C) e (D) foram tiveram o dissulfeto trocado com 1,15 equivalentes de DM1 (como o tiol livre), em condições semi-aquosas (dimetilacetamida 50% e acetato de sódio 100 mM 50%, pH 5,0 suplementado com EDTA 2mM) por 21 horas à temperatura ambiente sob uma cobertura de gás nitrogênio. As concentrações dos peptídeos ativados pelo biciclo com estrutura C e D na reação foram 10 mM ou mais altas.
[00205] Isso foi seguido por purificação em fase reversa padrão com uma coluna C18. Frações com pureza superior a 95% foram iso- ladas e liofilizadas. Os materiais não continham quantidades mensurá- veis de toxina livre. Série MMAE Série Val-Cit-MMAE Ligante Val-Cit-MMAE
Composto 2 Fase sólida Ácido fraco
[00206] O peptídeo foi sintetizado por síntese em fase sólida. 50 g de Resina CTC (sub: 1,0 mmol/g) foram usados. A uma mistura con- tendo Resina CTC (50 mmol, 50 g, 1,0 mmol/g) e Fmoc-Cit-OH (19,8 g, 50 mmol, 1,0 eq.), adicionou-se DCM (400 mL), depois DIEA (6,00 eq.) e foram misturados por 3 horas. Em seguida, MeOH (50 mL) foi adicionado e misturado por 30 minutos para capeamento. Piperidina 20% em DMF foi usada para desbloqueio. Boc-Val-OH (32,5 g, 150 mmol, 3 eq.) foi acoplado com 3 eq. usando HBTU (2,85 eq.) e DIPEA (6,0 eq.) em DMF (400 mL). A reação foi monitorada por teste por rea- ção colorimétrica com ninidrina. Depois de completada a síntese, a resina peptídica foi lavada com DMF X 3, MeOH X 3, então, seca sob borbulhamento de N2 durante a noite. Depois a resina peptídica foi tra- tada com HFIP 20%/DCM por 30 minutos, 2 vezes. A solução foi re- movida em evaporador rotativo para fornecer o produto bruto. O peptí- deo bruto foi dissolvido em ACN/H2O, então liofilizado duas vezes pa- ra fornecer o peptídeo como produto (17,3 g bruto). LCMS (ESI): m/z 374,9 [M+H]+ Peso molecular 374,44 Composto 3
[00207] Uma solução do Composto 2 (4,00 g, 10,68 mmol, 1,00 eq.) em DCM (40,00 mL) e MeOH (20,00 mL) foi agitada à temperatura ambiente, a seguir, (4-aminofenil)metanol (1,58 g, 12,82 mmol, 1,20 eq.) e EEDQ (5,28 g, 21,37 mmol, 2,00 eq.) foram adicionados e a mistura agitada no escuro por 9 horas. TLC (diclorometano/metanol= 5/1, Rf = 0,56) indicou que um novo ponto havia se formado. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o sol- vente. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia flash em sílica-gel (ISCO®; 120 g SepaFlash® Coluna Silica Flash, Eluente de MeOH/DCM 0~20% a 80 mL/min). O Composto 3 (3,00 g, 6,26 mmol, 58,57% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 480,1 [M+H]+ Peso molecular 479,58 Composto 4
[00208] A uma solução do Composto 3 (3,00 g, 6,26 mmol, 1,00 eq.) em THF anidro (35,00 mL) e DCM anidro (15,00 mL), adicionou-se cloroformato de 4-nitrofenila (6,31 g, 31,30 mmol, 5,00 eq.) e piridina (2,48 g, 31,30 mmol, 2,53 mL, 5,00 eq.), e a mistura foi agitada a 25 ºC por 5 horas. TLC (diclorometano/metanol= 10/1, Rf = 0,55) indicou que um novo ponto havia se formado. A mistura de reação foi filtrada, e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer um resí- duo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica-gel (IS- CO®; 120 g SepaFlash® Coluna Silica Flash, Eluente de DCM/MeOH 0~10% a 80 mL/min). O Composto 4 (2,00 g, 3,10 mmol, 49,56% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 667,3 [M+Na]+ Peso molecular 644,68 Composto 5
[00209] Uma mistura do Composto 4 (278,43 mg, 387,80 µmol, 1,00 eq.) e DIEA (501,19 mg, 3,88 mmol, 677,29 µL, 10,00 eq.) em DMF (5,00 mL) foi agitada sob nitrogênio por 10 min. MMAE (250,00 mg, 387,80 µmol, 1,00 eq.) e HOBt (52,40 mg, 387,80 µmol, 1,00 eq.) fo- ram adicionados e a mistura foi agitada a 0 ºC sob nitrogênio por 20 min. e agitada a 30 ºC por 18 horas adicionais. LC-MS mostrou que um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura re- sultante foi purificada por cromatografia flash em C18 gel (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Column, Eluente de MeCN/H2O 0~50% a 75 mL/min). Composto 5 (190,00 mg, 155,29 µmol, 40,04% de rendimen- to) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 1223,4 [M+H]+ Peso molecular 1223,57 Composto 6
[00210] A uma solução do Composto 5 (170,00 mg, 138,94 µmol, 1,00 eq.) em DCM (2,70 mL), adicionou-se ácido 2,2,2-trifluoroacético (413,32 mg, 3,62 mmol, 268,39 µL, 26,09 eq.), e a mistura foi agitada a 25 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou que o Composto 5 foi consumido completamente. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida para fornecer um resíduo. O resíduo foi dissolvido em THF (10,00 mL) e adicionou-se K2CO3 (192,03 mg, 1,39 mmol, 10,00 eq.), a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas mais. LC-MS mostrou que um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura de reação resultante foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente e fornecer um resíduo. O resíduo foi purificado por croma- tografia flash em C18 gel (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Co- lumn, Eluente de MeCN/H2O 0~50% a 75 mL/min). O Composto 6 (110,00 mg, 97,92 µmol, 70,48% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 1123,4 [M+H]+ Peso molecular 1123,45 Composto 7
[00211] A uma solução do Composto 6 (110,00 mg, 97,92 µmol, 1,00 eq.) em DMA (5 mL), DIEA (25,31 mg, 195,83 µmol, 34,20 µL, 2,00 eq.) e tetrahidropiran-2,6-diona (22,34 mg, 195,83 µmol, 2,00 eq.). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 18 horas. LC- MS mostrou que o Composto 6 foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura de rea- ção foi purificada por cromatografia flash em C18 gel (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Column, Eluente de MeCN/H2O 0~50% a 75 mL/min). O Composto 7 (100,00 mg, 80,81 µmol, 82,53% de rendimen- to) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 1237,4 [M+H]+ Peso molecular 1236,74 Composto 8 (MMAE-PABC-Cit-Val-Glutarato-NHS)
[00212] A uma solução do Composto 7 (100,00 mg, 80,81 µmol, 1,00 eq.) em DMA (4,5 mL) e DCM (1,5 mL), adicionou-se 1- hidroxipirrolidina-2,5-diona (27,90 mg, 242,42 µmol, 3,00 eq.) sob N2 e a mistura foi agitada a 0 ºC por 30 minutos. Adicionou-se EDCI (46,47 mg, 242,43 µmol, 3,00 eq.) à mistura que foi agitada a 25 ºC por 16 horas mais. LC-MS mostrou que o Composto 7 foi consumido comple- tamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura de reação foi purificada por cromatografia flash em C18 gel (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Column, Eluente de MeCN/H2O 0~50% a 75 mL/min). O Composto 8 (90,00 mg, 60,69 µmol, 75,11% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 1334,5 [M+H]+ Peso molecular 1334,62 Procedimento geral para o acoplamento de MMAE-PABC-Cit-Val- Glutarato-NHS com biciclos de direcionamento
[00213] A uma solução do Biciclo (1,0 – 1,3 eq.) em DMA, adicio- nou-se DIEA (3 eq.) e MMAE-PABC-Cit-Val-Glutarato-NHS (1 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 18 horas. A reação foi monitorada por LC-MS e, uma vez completada, foi purificada diretamente por HPLC preparativa. BCY6136
[00214] BCY6099 (71,5 mg, 22,48 µmol) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6136 (40,9 mg, 9,05 µmol, 40,27% de rendi- mento, 97,42% de pureza) foi obtido como um sólido branco. BCY6136 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min.
Tempo de retenção: 11,35 min. LCMS (ESI): m/z 1468,1 [M+3H]3+, 1101,2 [M+4H]4+, 881,3 [M+5H]5+ PM do peptídeo 4404,2 BCY6033
[00215] BCY6014 (70,00 mg, 22,47 µmol, 1,00 eq.) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6033 (33,90 mg, 7,96 µmol, 34,57% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6033 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 7,47 min. LCMS (ESI): m/z 1065,2 [M+4H]4+, 852,2 [M+5H]5+ PM do peptídeo 4259,04 BCY6029
[00216] BCY6009 (70,0 mg, 22,47 µmol, 1 eq.) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6029 (32,9 mg, 7,75 µmol, 33,49% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6029 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min.
Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 7,46 min. LCMS (ESI): m/z 1061,7 [M+4H]4+ PM do peptídeo 4245,02 BCY6122
[00217] BCY6104 (71,59 mg, 22,48 µmol, 1,00 eq.) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6122 (38,30 mg, 8,57 µmol, 38,14% de rendimento, 98,58% de pureza) foi obtido como um sólido branco. BCY6122 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 10,72 min. LCMS (ESI): m/z 1101,8 [M+4H]4+, 881,5 [M+5H]5+ PM do peptídeo 4406,18 BCY6053
[00218] BCY6018 (72,40 mg, 26,97 µmol, 1,2 eq.) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6053 (38,3 mg, 9,81 µmol, 43,65%
de rendimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6053 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 12,95 min. LCMS (ESI): m/z 1301,7 [M+3H]3+, 976,5 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3905,67 BCY6049
[00219] BCY6017 (50,75 mg, 22,48 µmol, 1,2 eq.) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6049 (22,5 mg, 6,47 µmol, 34,54% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6049 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 14,28 min. LCMS (ESI): m/z 1159,6 [M+3H]3+, 869,8 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3479,2
BCY6037
[00220] BCY6019 (65,00 mg, 22,47 µmol, 1,00 eq.) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6037 (26,80 mg, 6,66 µmol, 28,74% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6037 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de reten- 8,79 min. ção: LCMS (ESI): m/z 1342,1 [M+3H]3+, 1006,6 [M+4H]4+ PM do peptídeo 4025,84 Série Trp-Cit-MMAE Ligante Trp-Cit-MMAE
Procedimento geral para a preparação de 3
[00221] A uma solução do composto 2 (4,00 g, 8,67 mmol, 1,00 eq.), DIC (1,61 g, 12,78 mmol, 1,97 mL, 9,00 eq.) e HOBt (10,54 g, 78,00 mmol, 9,00 eq.) em DMF (30,00 mL), adicionou-se (4- aminofenil)metanol (9,61 g, 78,00 mmol, 9,00 eq.). A mistura foi agita- da a 15 ºC for 1 hora. LC-MS mostrou que o composto 2 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. A mistura foi purificada por HPLC preparativa. O Composto 3 (4,20 g, 7,41 mmol, 85,49% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 566,9 [M+H]+ Peso molecular 566,66 Procedimento geral para a preparação de 4
[00222] A uma solução do composto 3 (4,20 g, 6,30 mmol, 1,00 eq.), DIPEA (1,09 g, 8,40 mmol, 1,47 mL, 7,00 eq.) em DMF (30,00 mL), adicionou-se carbonato de bis(4-nitrofenila) (11,50 g, 37,79 mmol, 6,00 eq.) em uma parte. A mistura foi agitada a 0-15 ºC por 1,5 hora. LC-MS mostrou que o composto 3 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. Purificado diretamente por HPLC preparativa (Condição TFA). O Composto 4 (2,00 g, 2,40 mmol, 38,16% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 732,0 [M+H]+ Peso molecular 731,76 Procedimento geral para a preparação de 5
[00223] A uma solução do composto 4 (300,00 mg, 360,63 µmol, 1,00 eq.), DIEA (93,22 mg, 721,27 µmol, 125,97 µL, 3,00 eq.) em DMF (10,00 mL), adicionou-se MMAE (233,03 mg, 324,57 µmol, 0,90 eq.) e HOBt (48,73 mg, 360,63 µmol, 1,00 eq.) a 0 ºC. A mistura foi agitada a 30 ºC por 18 horas. LC-MS mostrou que o composto 4 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. Purificado diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 5 (250,00 mg, 190,75 µmol, 52,89% de rendimento) foi obti- do como um sólido amarelo. LCMS (ESI): m/z 1310,5 [M+H]+ Peso molecular 1310,65 Procedimento geral para a preparação de 6
[00224] A uma solução do composto 5 (240,00 mg, 183,12 µmol, 1,00 eq.) em DCM (10,00 mL), adicionou-se TFA (1,54 g, 13,51 mmol, 1,00 mL, 73,76 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 2 horas e con- centrada sob pressão reduzida para remover o solvente e fornecer um resíduo. O resíduo foi dissolvido em THF e K2CO3 e foi adicionado e agitado a 15 ºC por 2 horas. LC-MS mostrou que o composto 5 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente e fornecer um resíduo. O resíduo foi purifica- do por HPLC preparativa (condição neutra). O produto bruto 6 (125,00 mg, 94,37 µmol, 51,53% de rendimento, TFA) foi usado na etapa se- guinte sem purificação adicional. LCMS (ESI): m/z 1210,4 [M+H]+ Peso molecular 1209,53 Procedimento geral para a preparação de 7
[00225] A uma solução do composto 6 (125,00 mg, 94,37 µmol, 1,00 eq. TFA) em DMA (5,00 mL), adicionou-se DIEA (24,39 mg, 188,75 µmol, 32,96 µL, 2,00 eq.) e tetrahidropiran-2,6-diona (21,54 mg, 188,75 µmol, 2,00 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 2 horas. LC- MS mostrou que o composto 6 foi consumido completamente e um pi- co principal com MS desejada foi detectado. Purificado diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 7 (100,00 mg, 75,49 µmol, 80,00% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 1324,5 [M+H]+ Peso molecular 1324,63 Procedimento geral para a preparação de 8 (MMAE-PABC-Cit-Trp- Glutarato-NHS)
[00226] A uma solução do composto 7 (100,00 mg, 75,49 µmol, 1,00 eq.), 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (26,07 mg, 226,48 µmol, 3,00 eq.) em DMA (3,00 mL) e DCM (1,00 mL), adicionou-se EDCI (43,42 mg, 226,48 µmol, 3,00 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 4 horas. LC-MS mostrou que o composto 7 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. O DCM foi removido. Purificado diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 8 (60,00 mg, 42,20 µmol, 55,91% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 711,2 [M+2H]2+ Peso molecular 1421,7 Procedimento geral para o acoplamento de MMAE-PABC-Cit-Trp- Glutarato-NHS com biciclos de direcionamento
[00227] A uma solução do Biciclo (1,0-1,3 eq.) em DMA, adicionou- se DIEA (3 eq.) e MMAE-PABC-Cit-Trp-Glutarato-NHS (1 eq.). A mis- tura foi agitada a 25 ºC por 18 horas. A reação foi monitorada por LC- MS e, uma vez completada, foi purificada diretamente por HPLC pre- parativa. BCY6030
[00228] BCY6009 (47,29 mg, 14,07 µmol, 1,00 eq.) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6030 (0,0156 g, 3,51 µmol, 24,93% de rendimento, 97,41% de pureza) foi obtido como um sólido branco. BCY6030 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 7,90 min. LCMS (ESI): m/z 1083,7 [M+4H]4+ PM do peptídeo 4332,17 BCY6034
[00229] BCY6014 (88,21 mg, 23,21 µmol, 1,10 eq.) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6034 (27,70 mg, 6,05 µmol, 28,70% de rendimento, 95,02% de pureza) foi obtido como um sólido branco.
BCY6034 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 30-60% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 11,49 min. LCMS (ESI): m/z 1449,3 [M+3H]3+, 1087,4 [M+4H]4+ PM do peptídeo 4346,13 BCY6050
[00230] BCY6017 (57,17 mg, 25,32 µmol, 1,2 eq.) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6050 (0,0519 g, 14,56 µmol, 69,01% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6050 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 13,55 min. LCMS (ESI): m/z 1188,5 [M+3H]3+, 891,7 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3564,25
BCY6054
OH H O N HN N O O O O O O O O N N H
O N N H N N BCY6018
O H H
O BCY6054 HN H2N O
[00231] BCY6018 (67,97 mg, 25,32 µmol, 1,2 eq.) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6054 (40,10 mg, 10,05 µmol, 47,62% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6054 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 13,73 min. LCMS (ESI): m/z 1330,4 [M+3H]3+, 998,1 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3990,72 BCY6038
[00232] BCY6019 (81,39 mg, 23,21 µmol, 1,10 eq.) foi usado como o reagente biciclo. O composto BCY6038 (34,10 mg, 8,02 µmol, 38,00% de rendimento, 96,68% de pureza) foi obtido como um sólido branco. BCY6038 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm
Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min.
Tempo de retenção: 9,56 min.
LCMS (ESI): m/z 1371,0 [M+3H]3+, 1028,3 [M+4H]4+ PM do peptídeo 4111,9 Série Val-Lys-MMAE Ligante Val-Lys-MMAE
Procedimento geral para a preparação do Composto 2
[00233] A uma mistura do Composto 1 (3,00 g, 5,89 mmol, 1 eq.) e (4-aminofenil)metanol (869,93 mg, 7,06 mmol, 1,2 eq.) em DCM (35 mL) e MeOH (18 mL), adicionou-se EEDQ (2,91 g, 11,77 mmol, 2 eq.) no escuro sob nitrogênio e a mistura foi agitada a 25 ºC por 5 horas. LC-MS mostrou que o Composto 1 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. A mistura de reação re- sultante foi concentrada sob pressão reduzida para fornecer um resí- duo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica-gel (IS- CO®; 120 g SepaFlash® Coluna Silica Flash, Eluente de MeOH/DCM 0~20% a 80mL/min). O Composto 2 (2,2 g, 3,58 mmol, 60,79% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 615,0 [M+H]+ Peso molecular 614,78 Procedimento geral para a preparação do Composto 3
[00234] A uma solução do Composto 2 (500 mg, 813,31 µmol, 1 eq.) em THF (10 mL), adicionou-se DIEA (630,69 mg, 4,88 mmol, 849,98 µL, 6 eq.) a 0 ºC sob nitrogênio com agitação por 30 minutos. Em seguida, adicionou-se carbonato de bis(4-nitrofenila) (1,48 g, 4,88 mmol, 6 eq.) e a mistura foi agitada a 25 ºC sob nitrogênio por 21 ho-
ras mais. LC-MS mostrou que um pico principal com MS desejada foi detectado. A mistura de reação resultante foi concentrada sob pressão reduzida para fornecer um resíduo. O resíduo foi purificado por croma- tografia flash em sílica-gel (ISCO®; 40 g SepaFlash® Coluna Silica Flash, Eluente de MeOH/DCM 0~20% a 40 mL/min). O Composto 3 (500 mg, 641,13 µmol, 78,83% de rendimento) foi obtido como um só- lido amarelo. LCMS (ESI): m/z 780,0 [M+H]+ Peso molecular 779,89 Procedimento geral para a preparação do Composto 4
[00235] A uma mistura do Composto 3 (500 mg, 512,90 µmol, 1,23 eq.) em DMF (8 mL), adicionou-se DIEA (135,01 mg, 1,04 mmol, 181,95 µL, 2,5 eq.) com agitação a 0 ºC por 30 minutos. Em seguida, adicionou-se MMAE (300 mg, 417,84 µmol, 1 eq.) e HOBt (84,69 mg, 626,76 µmol, 1,5 eq.) e a mistura foi agitada a 40 ºC por 15 horas. LC- MS mostrou que o composto 3 foi consumido completamente e um pi- co principal com MS desejada foi detectado. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em C18 gel (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Column, Eluente de MeCN/H2O 0~60% a 75 mL/min). O Com- posto 4 (330 mg, 242,87 µmol, 58,13% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 679,7 [M+2H]2+ Peso molecular 1358,77 Procedimento geral para a preparação do Composto 5
[00236] A uma solução de Composto 4 (325 mg, 239,19 µmol, 1 eq.) em DCM (18 mL), adicionou-se TFA (3,03 g, 26,60 mmol, 1,97 mL, 111,22 eq.) a 0 ºC e a mistura foi agitada a 25 ºC por 2 horas. LC- MS mostrou que o composto 4 foi consumido completamente. Em se- guida, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para fornecer um resíduo que foi dissolvido em THF (10 mL) e adicionou-se K2CO3 (661,16 mg, 4,78 mmol, 20 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 15 horas. LC-MS mostrou que um pico principal com MS desejada foi detectado. A mistura de reação resultante foi filtrada e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer um resíduo. O resí- duo foi purificado por cromatografia flash em C18 gel (ISCO®; 130 g SepaFlash® C18 Flash Column, Eluente de MeCN/H2O 0~60% a 75 mL/min). O Composto 5 (170 mg, 135,07 µmol, 56,47% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 629,7 [M+2H]2+ Peso molecular 1258,65 Procedimento geral para a preparação do Composto 6
[00237] Um frasco redondo contendo uma solução do composto 5 (140 mg, 111,23 µmol, 1 eq.) em DMA (5 mL) foi purgado usando um balão de nitrogênio e DIEA (28,75 mg, 222,46 µmol, 38,75 µL, 2 eq.) foi adicionado a 0 ºC com agitação por 10 minutos, seguido por tetra- hidropiran-2,6-diona (25,38 mg, 222,46 µmol, 2 eq.) como uma solução em DMA. A mistura foi agitada a 25 ºC por 12 horas. LC-MS mostrou que o composto 5 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. A mistura de reação resultante foi pu- rificada por cromatografia flash em C18 gel (ISCO®; 43 g SepaFlash® C18 Flash Column, Eluente de MeCN/H2O 0~60% a 40 mL/min). O Composto 6 (120 mg, 87,42 µmol, 78,59% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 686,7 [M+2H]2+ Peso molecular 1372,75 Procedimento geral para a preparação do Composto 7 (MMAE-PABC- Lys(Dde)-Val-Glutarato-NHS)
[00238] A uma solução do composto 6 (120 mg, 87,42 µmol, 1 eq.) em DMA (9 mL) e DCM (3 mL), adicionou-se 1-hidroxipirrolidina-2,5- diona (30,18 mg, 262,25 µmol, 3 eq.) com agitação, seguida por EDCI (50,27 mg, 262,25 µmol, 3 eq.) e a mistura foi agitada a 0 ºC por 30 minutos e a 25 ºC por 19 horas adicionais. LC-MS mostrou que o com- posto 6 foi consumido completamente e um pico principal com MS de- sejada foi detectado. A mistura de reação resultante foi concentrada sob pressão reduzida para remover DCM. A mistura foi purificada por cromatografia flash em C18 gel (ISCO®; 43 g SepaFlash® C18 Flash Column, Eluente de MeCN/H2O 0~60% a 40 mL/min). O Composto 7 (60 mg, 40,82 µmol, 46,70% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 735,3 [M+2H]2+ Peso molecular 1469,83 Procedimento geral para o acoplamento de MMAE-PABC-Lys(Dde)- Val-Glutarato-NHS com biciclos de direcionamento
Biciclo de direcionamento
[00239] A uma solução do Biciclo (1,0-1,3 eq.) em DMA, adicionou- se DIEA (3 eq.) e MMAE-PABC-Lys(Dde)-Val-Glutarato-NHS (1 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 18 horas. A reação foi monitorada por LC-MS e, uma vez completada, foi purificada diretamente por HPLC preparativa. Procedimento geral para desproteção de Dde Biciclo de direcionamento
[00240] A uma solução do peptídeo Dde protegido (1 eq.) em DMF, adicionou-se hidrazina hidratada (6500 eq.) e a mistura foi agitada a 25 ºC por 1 hora. Usou-se LC-MS para monitorar a reação e, uma vez completada, a mistura foi purificada por HPLC preparativa e as frações limpas, liofilizadas. BCY6061
[00241] BCY6014 (124,12 mg, 40,82 µmol, 1,2 eq.) foi usado como o reagente biciclo. Dde-BCY6038 (80 mg, 18,20 µmol, 53,51% de ren- dimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 1099,0 [M+4H]4+, 879,4 [M+5H]5+ Peso molecular 4395,24
[00242] Dde-BCY6061 (78 mg, 17,75 µmol) foi desprotegido usando hidrazina de acordo com o procedimento geral para fornecer BCY6061 (47,1 mg, 11,13 µmol, 62,73% de rendimento) como um sólido branco.
BCY6061 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 12,01 min. LCMS (ESI): m/z 1058,1 [M+4H]4+, 846,5 [M+5H]5+ PM do peptídeo 4230,03 BCY6174
[00243] BCY6099 (389,77 mg, 122,47 µmol, 1,2 eq.) foi usado como o reagente biciclo. Dde-BCY6174 (0,250 g, 55,10 µmol, 53,99% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 1513,0 [M+3H]3+, 1135,0 [M+4H]4+, 908,2 [M+5H]5+ Peso molecular 4538,38
[00244] Dde-BCY6174 (0,250 g, 55,10 µmol, 1,0 eq.) foi desprotegi- do usando hidrazina de acordo com o procedimento geral para forne- cer BCY6174 (0,1206 g, 27,45 µmol, 49,82% de rendimento) como um sólido branco. BCY6174 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614)
Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min.
Tempo de retenção: 9,85 min.
LCMS (ESI): m/z 1458,5 [M+3H]3+, 1094,1 [M+4H]4+, 875,4 [M+5H]5+ PM do peptídeo 4373,17 Série D-Trp-Cit-MMAE Ligante D-Trp-Cit-MMAE
Procedimento geral para a preparação do Composto 3
[00245] A uma solução do composto 1 (2 g, 4,33 mmol, 1,00 eq.), DIC (4,92 g, 39,00 mmol, 6,00 mL, 9,00 eq.), HOBt (5,27 g, 39,00 mmol, 9,00 eq.) em DMF (30,00 mL), adicionou-se (4- aminofenil)metanol (4,80 g, 39,00 mmol, 9,00 eq.). A mistura foi agita- da a 15 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou que o composto 1 foi consumi- do completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. Purificado diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 2 (2 g, 3,53 mmol, 81,45% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 666,9 [M+H]+ Peso molecular 666,78 Procedimento geral para a preparação do Composto 4
[00246] A uma solução do composto 2 (2 g, 3,00 mmol, 1 eq.), DIEA (2,71 g, 21,00 mmol, 3,66 mL, 7 eq.) em DMF (20 mL), adicionou-se carbonato de bis(4-nitrofenila) (5,48 g, 18,00 mmol, 6 eq.) em uma par- te a 0 ºC. A mistura foi agitada a 0-15 ºC por 2 horas. LC-MS mostrou que o composto 2 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. Purificado diretamente por HPLC pre- parativa (condição neutra). O Composto 3 (0,9 g, 1,08 mmol, 36,07% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo.
LCMS (ESI): m/z 832,0 [M+H]+ Peso molecular 831,88 Procedimento geral para a preparação do Composto 5
[00247] A uma solução do composto 3 (350 mg, 420,74 µmol, 1,00 eq.), HOBt (56,85 mg, 420,74 µmol, 1 eq.) e DIEA (163,13 mg, 1,26 mmol, 219,86 µL, 3 eq.) em DMF (10 mL), adicionou-se MMAE (302,08 mg, 420,74 µmol, 1 eq.) a 0 ºC. A mistura foi agitada a 40 ºC por 18 horas. LC-MS mostrou que o composto 4 foi consumido completamen- te e um pico principal com MS desejada foi detectado. Purificado dire- tamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 4 (0,22 g, 155,95 µmol, 37,06% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. LCMS (ESI): m/z 1410,5 [M+H]+, 705,7 [M+2H]2+ Peso molecular 1410,76 Procedimento geral para a preparação do Composto 6
[00248] A uma solução do composto 4 (0,21 g, 148,86 µmol, 1 eq.) em DCM (9 mL), adicionou-se TFA (1,54 g, 13,51 mmol, 1 mL, 90,73 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 4 horas, concentrada sob pres- são reduzida para fornecer um resíduo, dissolvida em THF, então K2CO3(s) foi adicionado e agitado a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mos- trou que o composto 4 foi consumido completamente e um pico princi- pal com MS desejada foi detectado. A mistura de reação foi filtrada e concentrada sob pressão reduzida para fornecer um resíduo. O resí- duo foi purificado por HPLC preparativa (condição neutra). O Compos- to 5 (0,13 g, 102,02 µmol, 68,54% de rendimento, 95% de pureza) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 1210,4 [M+H]+, 605,8 [M+2H]2+ Peso molecular 1210,53 Procedimento geral para a preparação do Composto 7
[00249] A uma solução do composto 5 (0,12 g, 99,13 µmol, 1 eq.) em DMA (5 mL), adicionou-se DIEA (38,44 mg, 297,40 µmol, 51,80 µL, 3 eq.) e tetrahidropiran-2,6-diona (22,62 mg, 198,26 µmol, 2 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o com- posto 5 foi consumido completamente e um pico principal com MS de- sejada foi detectado. Purificado diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 6 (0,09 g, 67,94 µmol, 68,54% de ren- dimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 662,7 [M+2H]2+ Peso molecular 1324,63 Procedimento geral para a preparação do Composto 8
[00250] A uma solução do composto 6 (0,09 g, 67,95 µmol, 1 eq.), HOSu (23,46 mg, 203,84 µmol, 3 eq.) em DMA (6 mL) e DCM (2 mL), adicionou-se EDCI (39,08 mg, 203,84 µmol, 3 eq.). A mistura foi agita- da a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 6 foi consu- mido completamente e um pico principal com MS desejada foi detec- tado. Remoção de DCM e purificado diretamente por HPLC preparati- va (condição neutra). O Composto 7 (0,06 g, 40,09 µmol, 59,01% de rendimento, 95% de pureza) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 711,2 [M+2H]2+ Peso molecular 1421,7
BCY6062
[00251] A uma solução de BCY6014 (76,99 mg, 25,32 µmol, 1,2 eq.) em DMA (5 mL), adicionou-se DIEA (8,18 mg, 63,31 µmol, 11,03 µL, 3 eq.) e o composto 7 (0,03 g, 21,10 µmol, 1 eq.). A mistura foi agi- tada a 15 ºC por 16 horas. A reação foi monitorada por LC-MS e, uma vez completada, a mistura foi purificada por HPLC preparativa. BCY6062 (0,0255 g, 5,70 µmol, 27,01% de rendimento, 97,15% de pureza) foi obtido como um sólido branco. BCY6062 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 13,15 min. LCMS (ESI): m/z 1449,2 [M+3H]3+, 1087,0 [M+4H]4+ PM do peptídeo 4346,13 Série DM1 Série DM1-SS- Ligante DM1-SPDP-TFP
SPDB
[00252] A uma solução de 2-(2-piridildisulfanil)piridina (12,37 g, 56,18 mmol, 1,50 eq.) em EtOH (100,00 mL), adicionou-se ácido 4-
sulfanilbutanoico (4,50 g, 37,45 mmol, 1,00 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 18 horas sob N2. LC-MS mostrou que o composto 1 foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura de reação foi concentrada sob pressão redu- zida para remover o solvente e fornecer um resíduo. O resíduo foi puri- ficado por HPLC preparativa (C18 360 g, condição neutra). O compos- to SPDB (1,9 g, 8,29 mmol, 22,12% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. RMN 1H: ES6446-8-P1A 400 MHz CDCl3 δ ppm 1,98 (q, J=7,09 Hz, 2 H), 2,45 (t, J=7,15 Hz, 2 H), 2,79 (t, J=7,03 Hz, 2 H), 7,03 (dd, J=7,15; 4,89 Hz, 1 H), 7,19 (s, 1 H), 7,56 - 7,65 (m, 2 H), 8,41 (d, J=4,52 Hz, 1 H). LCMS (ESI): m/z 230,0 [M+H]+ Peso molecular 229,31 DM1-SPDB
[00253] Uma mistura de DM1 (250,00 mg, 338,62 µmol, 1,00 eq.) e ácido 4-(2-piridildisulfanil)butanoico (100,95 mg, 440,21 µmol, 1,30 eq.) foi adicionada sob nitrogênio a um balão de 50 mL com DMF (10,00 mL) e purgada com N2 por 30 minutos. A mistura foi agitada à tempe- ratura ambiente por 1 hora. LC-MS mostrou que que o DM1 foi con- sumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em C18 gel (ISCO®; 120 g SepaFlash® C18 Flash Column, Eluente de MeCN/H2O 0~60% a 85 mL/min). DM1-SPDB (120,00 mg, 140,11 µmol, 41,38% de rendimento) foi obtido como um sólido branco.
LCMS (ESI): m/z 838,0 [M+H-H2O]+ Peso molecular 856,44 DM1-SPDB-TFP
[00254] A uma solução de DM1-SPDB (120,00 mg, 140,11 µmol, 1,00 eq.) e 2,3,5,6-tetrafluorofenol (69,81 mg, 420,34 µmol, 3,00 eq.) em DCM (1,00 mL) e DMA (3,00 mL), adicionou-se EDCI (80,58 mg, 420,34 µmol, 3,00 eq.). A mistura foi agitada a 15 °C por 4 horas. LC- MS mostrou que DM1-SPDB foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. O DCM foi removido e o resíduo foi purificado diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O composto DM1-SPDB-TFP (60,00 mg, 59,73 µmol, 42,63% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): m/z 985,9 [M+H-H2O]+ Peso molecular 1004,5 Procedimento geral para o acoplamento de DM1-SPDB-TFP com bici- clos de direcionamento
[00255] A uma solução do Biciclo de direcionamento (1,1-1,3 eq.) em DMA, adicionou-se DIEA (3 eq.) e DM1-SPDB-TFP (1 eq.). A mis- tura foi agitada a 25 ºC por 18 horas. A reação foi monitorada por LC- MS e, uma vez completada, a mistura foi purificada diretamente por HPLC preparativa. BCY6135
[00256] BCY6099 (114,1 mg, 35,84 µmol) foi usado como o rea- gente biciclo. 22,4 mg do composto BCY6135 (5,30 µmol, 17,74% de rendimento, 95,14% de pureza) foram obtidos como um sólido branco. BCY6135 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 9,81 LCMS (ESI): m/z 1341,5 [M+3H]3+, 805,0 [M+5H]5+ PM do peptídeo 4021,08 BCY6031
[00257] BCY6014 (121,07 mg, 39,82 µmol) foi usado como o rea- gente biciclo. 59,90 mg do composto BCY6031 (14,67 µmol, 36,85% de rendimento, 95,02% de pureza) foram obtidos como um sólido branco. BCY6031 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min.
Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 6,284 min. LCMS (ESI): m/z 1286,4 [M+3H-H2O]3+, 965,6 [M+4H-H2O]4+ PM do peptídeo 3877,96 BCY6134
[00258] BCY6104 (95,11 mg, 29,87 µmol, 1 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6134 (0,0232 g, 5,64 µmol, 18,89% de rendimen- to, 97,82% de pureza) foi obtido como um sólido branco. BCY6134 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 9,10 min. LCMS (ESI): m/z 1001,8 [M+4H-H2O]4+ PM do peptídeo 4026,1 BCY6027
[00259] BCY6009 (60,24 mg, 19,91 µmol, 1,00 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6027 (20,40 mg, 5,11 µmol, 25,69% de rendi- mento, 96,88% de pureza) foi obtido como um sólido branco. BCY6027 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de reten- 5,97 min. ção: LCMS (ESI): m/z 1932,1 [M+2H]2+, 1282,5 [M+3H-H2O]3+ PM do peptídeo 3863,99 BCY6047
[00260] BCY6017 (61,81 mg, 27,38 µmol, 1,1 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6047 (0,032 g, 10,34 µmol, 41,53% de rendimen- to) foi obtido como um sólido branco. BCY6047 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 38-68% B ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 12,28 min. LCMS (ESI): m/z 1026,3 [M+3H-H2O]3+ PM do peptídeo 3096,1 BCY6035
[00261] BCY6019 (115,22 mg, 32,86 µmol, 1,10 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6035 (37,80 mg, 10,37 µmol, 34,73% de ren- dimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6035 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de reten- 12,28 min. ção: LCMS (ESI): m/z 1208,8 [M+3H-H2O]3+, 911,5 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3643,73 BCY6051
[00262] BCY6018 (73,48 mg, 27,38 µmol, 1,1 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6051 (0,0582 g, 16,52 µmol, 66,39% de rendi- mento) foi obtido como um sólido branco. BCY6051 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614)
Método: 28 - 68% B ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 11,37 min. LCMS (ESI): m/z 880,5 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3522,57 BCY6154
[00263] BCY6152 (93,17 mg, 29,87 µmol, 1 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6154 (40,10 mg, 9,93 µmol, 33,27% de rendi- mento, 98,06% de pureza) foi obtido como um sólido branco. BCY6154 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 28 - 68% B ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 11,94 min. LCMS (ESI): m/z 1313,8 [M+3H-H2O]3+, 985,8 [M+4H-H2O]4+ PM do peptídeo 3958,02 BCY6155
[00264] BCY6153 (82,55 mg, 29,87 µmol, 1 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6155 (0,0312 g, 8,55 µmol, 28,62% de rendimen- to, 98,69% de pureza) foi obtido como um sólido branco.
BCY6155 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min.
Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 28 - 68% B ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min.
Tempo de retenção: 12,93 min.
LCMS (ESI): m/z 897,1 [M+4H-H2O]4+ PM do peptídeo 3602,63 Série DM1-SS(SO3H)- Ligante DM1-SPDP(SO3H)-NHS
Composto 2
[00265] A uma solução de ácido 4-sulfanilbutanoico (2,0 g, 16,64 mmol, 1 eq.) e 2-(2-piridildisulfanil) piridina (11,0 g, 49,93 mmol, 3 eq.) em EtOH (50 mL), adicionou-se AcOH (1,05 g, 17,48 mmol, 1 mL, 1,05 eq.). A mistura foi agitada a 40 ºC por 16 horas sob N2. LC-MS mos- trou que um pico principal com a massa desejada foi detectado e TLC indicou que o ácido 4-sulfanilbutanoico foi consumido completamente. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remo- ver o solvente e fornecer um resíduo. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 2 (2,0 g, 8,72 mmol, 52,4% de rendimento) foi obtido como sólido amarelo.
[00266] RMN 1H: 400 MHz CDCl3
[00267] δ ppm 2,03-2,11 (m, 2 H), 2,54 (t, J=7,20 Hz, 2 H), 2,88 (t, J=7,20 Hz, 2 H), 7,11-7,14 (m, 1 H), 7,67-7,74 (m, 2 H), 8,50 (d, J=4,80 Hz, 1 H). LCMS (ESI): 230 [M+H]+ Peso molecular 229,31 Composto 3
[00268] A uma solução do composto 2 (0,5 g, 2,18 mmol, 1 eq.) em DCE (5 mL), adicionou-se ácido clorossulfônico (1,5 g, 13,08 mmol, 0,89 mL, 6 eq.) em três porções e DIEA (1,13 g, 8,72 mmol, 1,52 mL, 4 eq.) em duas porções. A mistura foi agitada a 75 ºC por 2 horas. LC- MS mostrou que o composto 2 foi consumido completamente e um pi-
co principal com a massa desejada foi detectado. A mistura de reação foi interrompida pela adição de 3 mL de H2O e o DCE foi removido. O resíduo foi purificado diretamente por HPLC preparativa (condições neutras). O Composto 3 (0,68 g, 1,76 mmol, 80,6% de rendimento, 80% de pureza) foi obtido como óleo amarelo claro.
[00269] RMN 1H: 400 MHz CDCl3
[00270] δ ppm 2,49-2,54 (m, 2 H), 3,63-3,67 (m, 2 H), 3,90 (t, J=6,60 Hz, 2 H), 7,09-7,12 (m, 1 H), 7,66-7,76 (m, 2 H), 8,47 (dd, J=4,80 Hz, 0,80 Hz, 1 H), 8,56 (s, 1 H). LCMS (ESI): 310,0 [M+H]+ Peso molecular 309,37 DM1-SO3H-SPDB
[00271] A uma solução de DM1 (1,0 g, 1,35 mmol, 1 eq.) e o com- posto 3 (502,9 mg, 1,63 mmol, 1,2 eq.) em DMF (10 mL), adicionou-se NaHCO3 (aq.) até que o pH atingisse 8. A mistura foi agitada a 25 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou que DM1 foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. O resíduo foi purificado diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O composto DM1-SO3H-SPDB (0,28 g, 299,0 µmol, 22,1% de rendimen- to) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): 918,2 [M+H-H2O]+ Peso molecular 936,50 DM1-SO3H-SPDB-NHS
[00272] A uma solução de DM1-SO3H-SPDB (103,2 mg, 896,95 µmol, 3 eq.), 1-Hidroxipirrolidina -2,5-diona (103,2 mg, 896,95 µmol, 3 eq.) em DMA (6 mL) e DCM (2 mL), adicionou-se EDCI (171,9 mg, 896,95 µmol, 3 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que DM1-SO3H-SPDB foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. DCM foi removido. O resíduo foi purificado diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O composto DM1-SO3H-SPDB-NHS (0,22 g, 212,85 µmol, 71,2% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): 1015,2 [M+H-H2O]+ Peso molecular 1033,57 Procedimento geral para o acoplamento de DM1-SO3H-SPDB-NHS com biciclos de direcionamento
[00273] A uma solução do Biciclo de direcionamento (1,1-1,3 eq.) em DMA, adicionou-se DIEA (3 eq.) e DM1-SO3H-SPDB-NHS (1 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 16 horas. A reação foi monitorada por LC-MS e, uma vez completada, a mistura foi purificada diretamente por HPLC preparativa. BCY6173
[00274] BCY6099 (200,15 mg, 62,89 µmol) foi usado como o rea- gente biciclo. 57,1 mg do composto BCY6173 (3,40 µmol, 22,79% de rendimento, 95,80% de pureza) foram obtidos como um sólido branco.
BCY6173 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 10,30 min. LCMS (ESI): m/z 1361,9 [M+3H-H2O]3+, 1021,8 [M+4H- H2O]4+ PM do peptídeo 4101,15 BCY6082
[00275] BCY6014 (711,9 mg, 234,14 µmol) foi usado como o rea- gente biciclo. 308 mg do composto BCY6082 (74,97 µmol, 35,2% de rendimento, 96,36% de pureza) foram obtidos como um sólido branco. BCY6082 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de reten- 11,95 min. ção: LCMS (ESI): m/z 1299,3 [M+3H-H2O]3+, 975,0 [M+4H-H2O]4+ PM do peptídeo 3911,04 BCY6150
[00276] BCY6018 (77,91 mg, 29,03 µmol, 1 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6150 (0,0249 g, 6,61 µmol, 22,78% de rendimen- to) foi obtido como um sólido branco. BCY6150 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de reten- 12,31 min. ção: LCMS (ESI): m/z 1195,4 [M+3H-H2O]3+ PM do peptídeo 3602,63 BCY6151
[00277] BCY6104 (120,17 mg, 37,73 µmol, 1,3 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6151 (0,0256 g, 6,16 µmol, 21,22% de rendi- mento) foi obtido como um sólido branco. BCY6151 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 um 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614)
Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de reten- 8,68 min. ção: LCMS (ESI): m/z 1362,3 [M+3H-H2O]3+ PM do peptídeo 4105,16 BCY6162
[00278] BCY6138 (82,80 mg, 26,61 µmol, 1,1 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6162 (0,0362 g, 8,98 µmol, 37,13% de rendimen- to) foi obtido como um sólido branco. BCY6162 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 21,09 min. LCMS (ESI): m/z 1323,5 [M+3H-H2O-44]3+ PM do peptídeo 4026,74 BCY6161
[00279] BCY6137 (79,67 mg, 24,48 µmol, 1,1 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6161 (0,0232 g, 5,26 µmol, 21,76% de rendimen-
to) foi obtido como um sólido branco. BCY6161 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de reten- 10,22 min. ção: LCMS (ESI): m/z 1392 [M+3H-H2O]3+ PM do peptídeo 4192,33 Série DM1-SS-Me Ligante DM1-SS-Me
SPP
[00280] A uma solução de 2-(2-piridildisulfanil)piridina (2,46 g, 11,18 mmol, 1,50 eq.) e AcOH (1,05 g, 17,49 mmol, 1,00 mL, 2,35 eq.) em EtOH (50,00 mL), adicionou-se ácido 4-sulfanilpentanoico (1,00 g, 7,45 mmol, 1,00 eq.). A mistura foi agitada a 40 ºC por 18 horas sob N2. LC- MS mostrou que o composto 1 foi consumido completamente e um pi- co principal com a massa desejada foi detectado. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente e for- necer um resíduo. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa (con- dição neutra). O composto SPP (1,61 g, 6,62 mmol, 88,81% de rendi-
mento) foi obtido como um sólido amarelo. RMN 1H: 400 MHz DMSO-d6 δ ppm 1,36 (d, J=6,78 Hz, 3 H), 1,88 - 2,07 (m, 2 H), 2,56 (td, J=7,53; 1,76 Hz, 2 H), 3,00 - 3,09 (m, 1 H), 7,11 (ddd, J=7,34; 4,96; 1,00 Hz, 1 H), 7,66 (td, J=7,78, 1,76 Hz, 1 H), 7,73 - 7,77 (m, 1 H), 8,48 (dt, J=4,02, 0,88 Hz, 1 H). LCMS (ESI): 243,8 [M+H]+ Peso molecular 243,34 DM1-SPP
[00281] Uma solução do DM1 (200 mg, 270,90 µmol, 1,00 eq.), áci- do 4-(2-piridildisulfanil)pentanoico (98,89 mg, 406,35 µmol, 1,50 eq.) em H2O (5,00 mL) foi ajustada para pH = 8 com NaHCO3 (aq.). A mis- tura foi agitada a 15 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou que DM1 foi con- sumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado (MS principal foi M+1-18). A mistura foi purificada direta- mente por HPLC preparativa (condição neutra). O composto DM1-SPP (120 mg, 137,86 µmol, 50,89% de rendimento) foi obtido como um só- lido branco. LCMS (ESI): 852,0 [M+H-H2O]+ Peso molecular 870,47 DM1-SPP-TFP
[00282] A uma solução de DM1-SPP (0,175 g, 201,04 µmol, 1,0 eq.), 2,3,5,6-tetrafluorofenol (100,16 mg, 603,13 µmol, 3,0 eq.) em DCM (1,0 mL) e DMA (3,0 mL), adicionou-se EDCI (115,62 mg, 603,13 µmol, 3,0 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 12 horas. LC-MS mos- trou que DM1-SPP foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. O DCM foi removido e o resíduo foi purificado por HPLC preparativa (condição neutra). O composto DM1- SPP-TFP (0,123 g, 120,76 µmol, 60,07% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): 999,9 [M+H-H2O]+ Peso molecular 1018,53 Procedimento geral para o acoplamento de DM1-SPP-TFP com bici- clos de direcionamento
[00283] A uma solução do Biciclo de direcionamento (1,1-1,3 eq.) em DMA, adicionou-se DIEA (3 eq.) e DM1-SPP-TFP (1 eq.). A mistu- ra foi agitada a 25 ºC por 16 horas. A reação foi monitorada por LC-MS e, uma vez completada, a mistura foi purificada diretamente por HPLC preparativa. BCY6032
[00284] A uma solução de DM1-SPP (30,00 mg, 34,46 µmol, 1,00 eq.) em DMF (5,00 mL), adicionou-se DIEA (13,36 mg, 103,38 µmol,
18,05 µL, 3,00 eq.) e HATU (13,10 mg, 34,46 µmol, 1,00 eq.). Depois de 1 hora, adicionou-se BCY6014 (104,79 mg, 34,46 µmol, 1,00 eq.) e a mistura foi agitada a 15 ºC por 2 horas. LC-MS mostrou que 40% do DM1-SPP haviam restado. Diversos novos picos foram observados em LC-MS e 20% do composto desejado foram detectados. A mistura foi purificada diretamente por HPLC preparativa (Condição TFA). O com- posto BCY6032 (10,00 mg, 2,57 µmol, 7,45% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6032 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 25-55% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 13,38 min. LCMS (ESI): m/z 1292,1 [M+3H-H2O]3+, 969,0 [M+4H-H2O]4+ PM do peptídeo 3892,94 BCY6052
[00285] BCY6018 (86,96 mg, 32,40 µmol, 1,1 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6052 (32,30 mg, 9,13 µmol, 31,01% de rendi- mento) foi obtido como um sólido branco. BCY6052 Dados analíticos Fase móvel: A: Ácido fórmico 0,1% em H2O B: ACN Vazão: 1,0 mL/min.
Coluna: Eclipse XDB-Fenil 3,5 µm 100*3,0mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de reten- 6,96 min. ção: LCMS (ESI): m/z 1173,4 [M+3H-H2O]3+, 884,6 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3536,58 BCY6048
[00286] BCY6017 (66,50 mg, 29,45 µmol, 1,2 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6048 (40,80 mg, 13,12 µmol, 53,45% de rendi- mento) foi obtido como um sólido branco. BCY6048 Dados analíticos Fase móvel: A: Ácido fórmico 0,1% em H2O B: ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Eclipse XDB-Fenil 3,5um 100*3,0mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de reten- 7,56 min. ção: LCMS (ESI): m/z 1031,0 [M+3H-H2O]3+, 884,6 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3110,13 BCY6036
[00287] BCY6019 (113,60 mg, 32,40 µmol, 1,10 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6036 (53,20 mg, 14,00 µmol, 47,54% de ren- dimento, 96,26% de pureza) foi obtido como um sólido branco. BCY6036 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de reten- 8,19 min. ção: LCMS (ESI): m/z 1213,6 [M+3H-H2O]3+, 914,7 [M+4H]4+ PM do peptídeo 3657,76 BCY6028
[00288] BCY6009 (99,00 mg, 29,45 µmol, 1,00 eq.) foi usado como o reagente biciclo. BCY6028 (24,30 mg, 6,05 µmol, 20,56% de rendi- mento, 96,61% de pureza) foi obtido como um sólido branco. BCY6028 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5um 110A 150*4,6 mm
Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: 35-65% B ao longo de 20 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 6,43 min LCMS (ESI): m/z 965,6 [M+4H-H2O]4+ PM do peptídeo 3877,96 Ligantes dissulfeto (Vários impedimentos) BCY6039 (DM1-Me-SS-Me-Biciclo) Composto 2A
[00289] A uma solução de 2-(2-piridildisulfanil)piridina (2,46 g, 11,18 mmol, 1,50 eq.) e AcOH (1,05 g, 17,49 mmol, 1,00 mL, 2,35 eq.) em EtOH (50,00 mL), adicionou-se ácido 4-sulfanilpentanoico (1A) (1,00 g, 7,45 mmol, 1,00 eq.). A mistura foi agitada a 40 ºC por 18 horas sob N2. LC-MS mostrou que 1A foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para fornecer um resíduo, que foi purificado por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 2A (1,61 g, 6,62 mmol, 88,81% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo claro. LCMS (ESI): 243,9 [M+H]+ Peso molecular 243,34 Composto 3A
[00290] A uma solução de 2A (0,01 g, 41,09 µmol, 1,00 eq.), 1- hidroxipirrolidina-2,5-diona (14,19 mg, 123,28 µmol, 3,00 eq.) em DMA (1 mL), adicionou-se EDCI (23,63 mg, 123,28 µmol, 3,00 eq.). A mistu- ra foi agitada a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que 2A foi consu- mido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 3A (0,011 g, 32,31 µmol, 78,63% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): 340,8 [M+H]+ Peso molecular 340,41 Composto 4A
[00291] A uma solução de BCY6014 (98,25 mg, 32,31 µmol, 1,00 eq.) em DMA (3 mL), adicionou-se DIEA (8,26 mg, 64,62 µmol, 11,26 µL, 2,00 eq.) e 3A (0,011 g, 32,31 µmol, 1,00 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 18 horas. LC-MS mostrou que 3A foi consumido comple- tamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 4A (0,04 g, 12,25 µmol, 37,90% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): 1088,7 [M+3H]3+, 816,5 [M+4H]4+ Peso molecular 3264,88 Composto 5A
N O O BCY6014 TCEP
S HS S N BCY6014
H 4A 5A
[00292] A uma solução de 4A (0,04 g, 12,25 µmol, 1,00 eq.) em MeCN (4 mL) e H2O (2 mL), adicionou-se TCEP (4,21 mg, 14,70 µmol, 4,05 µL, 1,20 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou que 4A foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 5A (0,035 g, 11,09 µmol, 90,53% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): 1052,2 [M+3H]3+ Peso molecular 3155,73 DM3-SPy
[00293] A uma solução de ácido 4-(2-piridildisulfanil)pentanoico (2A) (22,46 mg, 92,29 µmol, 1,20 eq.), HATU (35,09 mg, 92,29 µmol, 1,20 eq.), DIEA (29,82 mg, 230,71 µmol, 40,19 µL, 3,00 eq.) em DMF (5 mL), adicionou-se 1B (0,05 g, 76,90 µmol, 1,00 eq.). A mistura foi agi- tada a 15 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou que 1B foi consumido com- pletamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa (condição neutra). O Com- posto DM3-SPy (0,025 g, 28,56 µmol, 37,13% de rendimento) foi obti- do como um sólido branco. LCMS (ESI): 875,1 [M+H]+ Peso molecular 875,49 BCY6039
[00294] Uma solução do DM3-SPy (0,015 g, 17,13 µmol, 1,00 eq.) e 5A (54,08 mg, 17,13 µmol, 1,00 eq.) em DMF (3 mL) foi ajustada para pH=8 com NaHCO3 (aq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 1 hora. LC- MS mostrou que DM3-SPy foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura foi purificada diretamente por HPLC preparativa (Condição TFA). O Composto BCY6039 (0,0263 g, 6,58 µmol, 38,39% de rendimento) foi obtido co- mo um sólido branco. BCY6039 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 13,01 min. LCMS (ESI): m/z 976,1 [M+4H-H2O]4+ PM do peptídeo 3921,01 BCY6055 (DM1-SS-Me2-Biciclo)
Composto 2
[00295] Uma solução de composto 1 (0,045 g, 126,96 µmol, 1 eq.) em H2O (1 mL) foi ajustada para pH = 13 com solução de NaOH 1N. A mistura foi agitada a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o com- posto 1 foi consumido completamente e um pico principal com a mas- sa desejada foi detectado. O resíduo foi purificado por HPLC prepara- tiva (condição neutra). O Composto 2 (0,03 g, 116,56 µmol, 91,81% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. LCMS (ESI): 257,9 [M+H]+ Peso molecular 257,37 Composto 3
[00296] Uma solução do composto 2 (0,03, 116,56 µmol, 1,0 eq.) e DM1 (111,87 mg, 151,53 µmol, 1,3 eq.) em DMF (5 mL) foi agitada a 15 ºC por 2 horas. LC-MS mostrou que DM1 foi consumido completa- mente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mis- tura foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condição NH4HCO3). O Composto 3 (0,05 g, 56,53 µmol, 48,50% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): 866,0 [M+H-H2O]+ Peso molecular 884,49 Composto 4
[00297] A uma solução do composto 3 (0,05 g, 56,53 µmol, 1,0 eq.) e 2,3,5,6-tetrafluorofenol (28,16 mg, 169,59 µmol, 3,0 eq.) em DMA (3 mL) e DCM (1 mL), adicionou-se EDCI (32,51 mg, 169,59 µmol, 3 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 3 foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. DCM foi removido e a mistura foi purifi- cada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Compos- to 4 (0,03 g, 29,05 µmol, 51,40% de rendimento) foi obtido como um sólido branco.
LCMS (ESI): 1014,0 [M+H-H2O]+ Peso molecular 1032,55 BCY6055
[00298] A uma solução de BCY6014 (106,01 mg, 34,87 µmol, 1,2 eq.) em DMA (3 mL), adicionou-se DIEA (11,27 mg, 87,16 µmol, 15,18 µL, 3,0 eq.) e o composto 4 (0,03 g, 29,05 µmol, 1,0 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 4 foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura foi purificada diretamente por HPLC preparati- va (Condição TFA). O composto BCY6055 (0,0352 g, 9,01 µmol, 31,01% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6055 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de reten- 12,68 min. ção: LCMS (ESI): m/z 1296,1 [M+3H-H2O]3+, 972,4 [M+4H-H2O]4+ PM do peptídeo 3906,98 BCY6077 (DM1-SS-Me-(SO3H)-Biciclo)
Procedimento geral para a preparação do composto 2
[00299] A uma solução do composto 1 (0,1 g, 410,94 µmol, 1 eq.) em 1,2-dicloroetano (3 mL), adicionou-se ácido sulfoclorídrico (0,86 g, 7,38 mmol, 491,43 µL, 17,96 eq.) em três partes e DIEA (318,67 mg, 2,47 mmol, 429,47 µL, 6 eq.) em duas partes. A mistura foi agitada a 75 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 1 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado MS324, um pico principal do subproduto MS 221 era PySSPy. O sol- vente foi removido e dissolvido em H2O/MeCN=15/1. Purificado dire- tamente por HPLC preparativa (condição neutra: MeCN/H2O). O Com- posto 2 (0,055 g, 170,06 µmol, 41,38% de rendimento) foi obtido como um óleo amarelo. LCMS (ESI): 323,6 [M+H]+ Peso molecular 323,4 Procedimento geral para a preparação de DM1-SO3H-SPP
[00300] Uma solução de DM1 (113,00 mg, 153,06 µmol, 1,1 eq.) e o composto 2(0,045 g, 139,14 µmol, 1 eq.) em DMF (2 mL) foi ajustada para pH=8 com NaHCO3 (aq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 1 ho- ra. LC-MS mostrou que DM1 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. Purificado diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O composto DM1-SO3H-SPP
(0,075 g, 78,90 µmol, 56,71% de rendimento) foi obtido como um sóli- do branco. LCMS (ESI): 931,9 [M+H-H2O]+ Peso molecular 950,52 Procedimento geral para a preparação de DM1-SO3H-SPP-NHS
[00301] A uma solução de DM1-SO3H-SPP (0,06 g, 63,12 µmol, 1 eq.), 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (7,99 mg, 69,43 µmol, 1,1 eq.) em DMA (1,5 mL) e DCM (0,5 mL), adicionou-se EDCI (13,31 mg, 69,43 µmol, 1,1 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 18 horas. LC-MS mos- trou que DM1-SO3H-SPP foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. Purificado diretamente por HPLC preparativa (condição neutra: MeCN/H2O). O composto DM1- SO3H-SPP-NHS (0,045 g, 42,96 µmol, 68,05% de rendimento) foi ob- tido como um sólido branco. LCMS (ESI): 984 [M-NHS+K]+ Peso molecular 1047,6 Procedimento geral para a preparação de BCY6077
[00302] A uma solução de BCY6014 (101,58 mg, 33,41 µmol, 1 eq.) em DMA (1 mL), adicionou-se DIEA (12,95 mg, 100,23 µmol, 17,46 µL, 3 eq.) e DM1-SO3H-SPP-TFP (0,035 g, 33,41 µmol, 1 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que DM1-SO3H- SPP-TFP foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado. Purificado diretamente por HPLC preparativa (Condição TFA). O composto BCY6077 (41,30 mg, 10,03 µmol, 30,01% de rendimento, 96,44% de pureza) foi obtido como um sólido branco.
BCY6077 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 11,80 min. LCMS (ESI): m/z 978,2 [M+4H-18-44]4+ PM do peptídeo 3972,06 Série não clivável BCY6063 (MMAE) Glutarato-MMAE
[00303] A uma solução de MMAE (0,2 g, 278,56 µmol, 1,0 eq.) em DMA (3 mL), adicionou-se DIEA (108,01 mg, 835,68 µmol, 145,56 µL, 3,0 eq.) e tetrahidropiran-2,6-diona (63,57 mg, 557,12 µmol, 2,0 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que MMAE foi consumido completamente e um pico principal com a massa dese- jada foi detectado. A mistura foi purificada diretamente por HPLC pre- parativa (condição neutra). O composto Glutarato-MMAE (0,12 g, 144,22 µmol, 51,77% de rendimento) foi obtido como um sólido bran- co. LCMS (ESI): 832,3 [M+H]+ Peso molecular 832,09
Glutarato-MMAE-NHS
[00304] A uma solução de Glutarato-MMAE (0,12 g, 144,22 µmol, 1,0 eq.), 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (49,79 mg, 432,65 µmol, 3,0 eq.) em DMA (3 mL) e DCM (1 mL), adicionou-se EDCI (82,94 mg, 432,65 µmol, 3,0 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mos- trou que Glutarato-MMAE foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura foi purificada diretamente por HPLC preparativa (Condição TFA). O composto Gluta- rato-MMAE-NHS (0,055 g, 59,19 µmol, 41,04% de rendimento) foi ob- tido como um sólido branco. LCMS (ESI): 929,2 [M+H]+ Peso molecular 929,17 BCY6063
[00305] A uma solução de BCY6014 (98,17 mg, 32,29 µmol, 1,2 eq.) em DMA (2 mL), foram adicionados DIEA (10,43 mg, 80,72 µmol, 14,06 µL, 3 eq.) e Glutarato-MMAE-NHS (0,025 g, 26,91 µmol, 1 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que Gluta- rato-MMAE-NHS foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura foi purificada direta- mente por HPLC preparativa (Condição TFA). O composto BCY6063 (32,10 mg, 8,33 µmol, 30,95% de rendimento) foi obtido como um sóli- do branco. BCY6063 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min. Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614)
Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min. Tempo de retenção: 10,86 min. LCMS (ESI): m/z 963,8 [M+4H]4+, 771,1 [M+5H]5+ PM do peptídeo 3854,56 BCY6064 (DM1) Composto 1
O O O HO HN O HO HN O O
H O O H Br
HO N H H H O O N O O N O O
O O O O O O Cl H Cl N OH
N SH N S
O O DM1 1
[00306] A uma solução de DM1 (0,1 g, 135,45 µmol, 1 eq.), ácido 3- [(2-bromoacetil)amino]propanoico (34,14 mg, 162,54 µmol, 1,2 eq.) em DMF (5 mL), adicionou-se TEA (41,12 mg, 406,35 µmol, 56,56 µL, 3 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou que DM1 foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condição neutras). O Composto 1 (0,08 g, 92,23 µmol, 68,09% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): 849,1 [M+H-H2O]+ Peso molecular 867,41
Composto 2
[00307] A uma solução do composto 1 (0,08 g, 92,23 µmol, 1 eq.), 2,3,5,6-tetrafluorofenol (45,95 mg, 276,69 µmol, 3 eq.) em DMA (3 mL) e DCM (1 mL), adicionou-se EDCI (53,04 mg, 276,69 µmol, 3 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 4 horas. LC-MS mostrou que o compos- to 1 foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 2 (0,06 g, 59,09 µmol, 64,06% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. LCMS (ESI): 997,0 [M+H-H2O]+ Peso molecular 1015,46 BCY6064
[00308] A uma solução de BCY6014 (107,79 mg, 35,45 µmol, 1,2 eq.) em DMA (3 mL), adicionou-se DIEA (11,45 mg, 88,63 µmol, 15,44 µL, 3,0 eq.) e o composto 2 (0,030 g, 29,54 µmol, 1 eq.). A mistura foi agitada a 15 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 2 foi consumido completamente e um pico principal com a massa desejada foi detectado. A mistura foi purificada diretamente por HPLC preparati- va (Condição TFA). O Composto BCY6064 (28,40 mg, 7,30 µmol, 24,71% de rendimento) foi obtido como um sólido branco.
BCY6064 Dados analíticos Fase móvel: A: TFA 0,1% em H2O B: TFA 0,1% em ACN Vazão: 1,0 mL/min.
Coluna: Gemini-NX C18 5 µm 110A 150*4,6 mm Instrumento: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614) Método: B 28-68% ao longo de 30 minutos, então B 95% 3 min.
Tempo de reten- 10,26 min ção: LCMS (ESI): m/z 968,4 [M+4H-H2O]4+ PM do peptídeo 3889,89 BCY6105
Procedimento geral para a preparação do Composto 2
[00309] A uma solução do composto 1 (3,5 g, 5,68 mmol, 1,0 eq.) em DCM (20 mL) e MeOH (10 mL), foram adicionados (4-
aminofenil)metanol (978,5 mg, 7,95 mmol, 1,4 eq.) e EEDQ (2,81 g, 11,35 mmol, 2,0 eq.) no escuro, e a mistura foi agitada a 25 ºC por 18 horas. LC-MS mostrou que o composto 1 foi consumido completamen- te e um pico principal com MS desejada foi detectado ([M+H+]=722,0). A mistura de reação resultante foi concentrada sob pressão reduzida para fornecer um resíduo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica-gel (ISCO®; 220g SepaFlash® Coluna Silica Flash, Eluente de Metanol/Diclorometano 0~10% a 80 mL/min). O Composto 2 (3,0 g, 4,16 mmol, 73,2% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. Procedimento geral para a preparação de Composto 3
[00310] A uma solução do composto 2 (2,5 g, 3,46 mmol, 1,0 eq.) em THF (30 mL), adicionou-se DIEA (2,69 g, 20,78 mmol, 3,62 mL, 6,0 eq.) e carbonato de bis(4-nitrofenila) (6,32 g, 20,78 mmol, 6,0 eq.), e a mistura foi agitada a 25 ºC por 16 horas. TLC indicou que o composto 2 foi consumido completamente e um novo ponto formado. A reação foi limpa de acordo com TLC. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para fornecer um resíduo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica-gel (ISCO®; 220 g SepaFlash® Co- luna Silica Flash, Eluente de Metanol/Diclorometano 0~5% a 100 mL/min). O Composto 3 (2,2 g, 2,48 mmol, 71,6% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. Procedimento geral para a preparação do Composto 4
[00311] A uma solução do composto 3 (0,3 g, 338,24 µmol, 1,0 eq.) em DMF (5 mL), foram adicionados HOBt (50,3 mg, 372,06 µmol, 1,1 eq.), DIEA (131,1 mg, 1,01 mmol, 176,7 µL, 3,0 eq.) e MMAE (218,6 mg, 304,42 µmol, 0,9 eq.). A mistura foi agitada a 40 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que um pico com MS desejada ([M+H+]=1466,4, [M+2H+]/2=733,2). A mistura de reação foi então purificada diretamen- te por HPLC preparativa (condição neutra), e o composto 4 (0,2 g,
136,44 µmol, 40,3% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação do Composto 5
[00312] O Composto 4 (0,175 g, 119,39 µmol, 1,0 eq.) foi primeira- mente dissolvido em TFA (1,8 mL) e, a seguir, triisopropilsilano (13,5 g, 85,20 mmol, 17,5 mL, 713,7 eq.) foi adicionado. A mistura foi agita- da a 0 ºC por 30 minutos. LC-MS mostrou um pico com MS desejada ([M+H+]=1123,4, [M+2H+]/2=562,2). A mistura de reação foi concentra- da sob pressão reduzida para remover o solvente e fornecer um resí- duo. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 5 (0,1 g, 89,02 µmol, 74,6% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. Procedimento geral para a preparação do Composto 6
[00313] A uma solução do composto 5 (0,07 g, 62,31 µmol, 1,0 eq.) em DMA (1,0 mL), foram adicionados DIEA (24,2 mg, 186,94 µmol, 32,6 µL, 3,0 eq.) e tetrahidropiran-2,6-diona (14,2 mg, 124,62 µmol, 2,0 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 2 horas. LC-MS mostrou que o composto 5 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado ([M+H+]=1237,4, [M+2H+]/2=619,3). A mistura de reação foi então purificada diretamente por HPLC preparativa (con- dição neutra), e o composto 6 (0,04 g, 32,32 µmol, 51,8% de rendi- mento) foi obtido como um sólido amarelo claro. Procedimento geral para a preparação do Composto 7
[00314] A uma solução do composto 6 (0,04 g, 32,32 µmol, 1,0 eq.), 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (11,2 mg, 96,97 µmol, 3,0 eq.) em DMA (3,0 mL) e DCM (1,0 mL), EDCI (18,6 mg, 96,97 µmol, 3,0 eq.) adicio- nou-se. A mistura foi agitada a 25 ºC por 18 horas. LC-MS mostrou que o composto 6 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado ([M+H+]=1334,5, [M+2H+]/2=667,7). A mistura de reação foi então purificada diretamente por HPLC prepara- tiva (Condição TFA), e o composto 7 (0,025 g, 18,73 µmol, 57,9% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação de BCY6105
[00315] A uma solução de BCY6014 (82,0 mg, 26,98 µmol, 1,2 eq.) em DMA (4 mL), foram adicionados DIEA (8,7 mg, 67,44 µmol, 11,7 µL, 3,0 eq.) e o composto 7 (0,03 g, 22,48 µmol, 1,0 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 18 horas. LC-MS mostrou que o composto 7 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado ([M+4H+]/4=1065,2). A mistura de reação foi então purifica- da diretamente por HPLC preparativa (Condição TFA). O composto BCY6105 (0,024 g, 5,41 µmol, 24,1% de rendimento, 96,06% de pure- za) foi obtido como um sólido branco. BCY6106
Procedimento geral para a preparação de Composto 2
[00316] A uma solução do composto 1 (5,0 g, 10,67 mmol, 1,0 eq.) em DCM (30 mL) e MeOH (10 mL), foram adicionados EEDQ (5,28 g, 21,34 mmol, 2,0 eq.) e (4-aminofenil)metanol (2,63 g, 21,34 mmol, 2,0 eq.). A mistura foi agitada a 20 ºC por 18 horas. LC-MS mostrou que o composto 1 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado (m/z=574 desejada, enquanto a queda do gru- po Boc caindo e queda parcial corresponderam a m/z=474 e 518, res- pectivamente). A mistura de reação foi concentrada sob pressão redu- zida para remover o solvente e fornecer um resíduo. O resíduo foi puri- ficado por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 2 (3,7 g, 6,45 mmol, 60,4% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. Procedimento geral para a preparação do Composto 3
[00317] A uma solução do composto 2 (3,4 g, 5,93 mmol, 1,0 eq.) em DMF (20 mL), adicionou-se DIEA (5,36 g, 41,49 mmol, 7,23 mL, 7,0 eq.) e carbonato de bis(4-nitrofenila) (10,82 g, 35,56 mmol, 6,0 eq.) em uma parte. A mistura foi agitada a 25 ºC por 2 horas. LC-MS mos- trou um pico com MS desejada (m/z=639 corresponderam à massa com queda do grupo Boc durante ESI). A mistura de reação foi purifi- cada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Compos- to 3 (3,0 g, 4,06 mmol, 68,5% de rendimento) foi obtido como um sóli- do amarelo. Procedimento geral para a preparação do Composto 4
[00318] A uma solução do composto 3 (707,4 mg, 957,55 µmol, 1,0 eq.) em DMF (15 mL), foram adicionados HOBt (155,3 mg, 1,15 mmol, 1,2 eq.), DIEA (371,3 mg, 2,87 mmol, 500,4 µL, 3,0 eq.) e MMAE (0,55 g, 766,04 µmol, 0,8 eq.). A mistura foi agitada a 30 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou um pico com MS desejada (m/z=1317 desejada e m/z=609 correspondeu à massa com dois prótons e queda do grupo Boc durante ESI). A mistura de reação foi então purificada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 4 (0,53 g, 402,23 µmol, 42,0% de rendimento) foi obtido como um sólido ama- relo. Procedimento geral para a preparação do Composto 5
[00319] A uma solução do composto 4 (0,526 g, 399,20 µmol, 1,0 eq.) em DMF (4 mL), adicionou-se piperidina (862,2 mg, 10,13 mmol, 1,0 mL, 25,4 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 30 minutos. LC-MS mostrou que o composto 4 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado (m/z=1095 desejada, e m/z=265 correspondeu ao aduto Fmoc-piperidina). A mistura de rea- ção foi então purificada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 5 (0,230 g, 209,97 µmol, 52,6% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação do Composto 6
[00320] A uma solução de Fmoc-(D-Ala)-Phe-OH (125,6 mg, 273,87 µmol, 1,2 eq.) em DMF (10 mL), foram adicionados EDCI (52,5 mg, 273,87 µmol, 1,2 eq.), HOBt (37,0 mg, 273,87 µmol, 1,2 eq.) e o com- posto 5 (0,25 g, 228,23 µmol, 1 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 3 horas. LC-MS mostrou que o composto 5 foi consumido completa- mente e um pico com MS desejada foi detectado (m/z=718 correspon- deu à massa com dois prótons e queda do grupo Boc durante ESI). A mistura de reação foi então purificada diretamente por HPLC prepara- tiva (condição neutra). O Composto 6 (0,18 g, 117,20 µmol, 51,3% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação do Composto 7
[00321] A uma solução do composto 6 (0,18 g, 117,20 µmol, 1,0 eq.) em DMF (8 mL), adicionou-se piperidina (1,72 g, 20,25 mmol, 2,0 mL, 172,8 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 1 hora. LC-MS mos- trou que o composto 7 foi consumido completamente e um pico princi- pal com MS desejada foi detectado (m/z=1314 e 657 corresponderam à massa desejada, e m/z=265 correspondeu ao aduto Fmoc- piperidina). A mistura de reação foi então purificada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 7 (0,13 g, 98,96 µmol, 84,4% de rendimento) foi obtido como um sólido branco.
Procedimento geral para a preparação do Composto 8
[00322] A uma solução do composto 7 (0,105 g, 79,93 µmol, 1,0 eq.) em DMA (4 mL), foram adicionados DIEA (31,0 mg, 239,79 µmol, 41,8 µL, 3,0 eq.) e tetrahidropiran-2,6-diona (27,4 mg, 239,79 µmol, 3,0 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 2 horas. LC-MS mostrou que o composto 7 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado (m/z 664,5 correspondeu à massa com dois prótons e queda do grupo Boc durante ESI). A mistura de reação foi então purificada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra), e o composto 8 (0,09 g, 63,04 µmol, 78,8% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação do Composto 9
[00323] A uma solução do composto 8 (0,09 g, 63,04 µmol, 1,0 eq.), 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (21,7 mg, 189,11 µmol, 3,0 eq.) em DMA (3 mL) e DCM (1 mL), adicionou-se EDCI (36,2 mg, 189,11 µmol, 3,0 eq.) dissolvido em1 mL de DCM. A mistura foi agitada a 25 ºC por 18 horas. LC-MS mostrou que o composto 8 foi consumido completamen- te e um pico principal com MS desejada foi detectado (m/z=1524 dese- jada (um próton) e 763 (dois prótons), enquanto m/z=713 correspon- deu à massa com queda do grupo Boc durante ESI). A mistura de rea- ção foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 9 (0,07 g, 45,91 µmol, 72,8% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação do Composto 10
[00324] A uma solução de BCY6014 (167,5 mg, 55,09 µmol, 1,2 eq.) em DMF (3 mL), foram adicionados DIEA (11,8 mg, 91,81 µmol, 16,0 µL, 2,0 eq.) e o composto 9 (0,07 g, 45,91 µmol, 1,0 eq.). A mistu- ra foi agitada a 25 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 9 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado ([M+4H+]/4=1112,9, [M+5H+]/5=890,5). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente e for- necer um resíduo. O produto bruto 10 (0,220 g, bruto) foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. Procedimento geral para a preparação de BCY6106
[00325] A uma solução do composto 10 (0,200 g, 44,95 µmol, 1,0 eq.) em DCM (4 mL), adicionou-se 1 mL de TFA. A mistura foi agitada a 25 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou um pico principal com MS deseja- da ([M+4H+]/4=1088,0, [M+5H+]/5=870,8). A mistura de reação foi con- centrada sob pressão reduzida para fornecer um resíduo, que foi então purificado diretamente por HPLC preparativa (Condição TFA). O com- posto BCY6106 (0,0297 g, 20,06 µmol, 14,5% de rendimento, 95,46% de pureza) foi obtido como um sólido branco. BCY6175
Procedimento geral para a preparação do Composto 9
[00326] A síntese do Composto 9 foi realizada de maneira análoga àquela descrita em BCY6106. Procedimento geral para a preparação do Composto 10A
[00327] A uma solução de BCY6099 (195,15 mg, 61,32 µmol, 1,1 eq.) em DMA (3 mL), foram adicionados DIEA (21,61 mg, 167,23 µmol, 29,13 µL, 3 eq.) e o composto 9 (0,085 g, 55,74 µmol, 1,0 eq.). A mis-
tura foi agitada a 25 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 9 foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejada foi detectado. A mistura de reação foi concentrada sob pressão redu- zida para remover o solvente e fornecer um resíduo (óleo amarelo cla- ro). A reação foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condi- ção neutra). O Composto 10A (0,160 g, 34,84 µmol, 62,50% de rendi- mento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação de BCY6175
[00328] A uma solução do composto 10A em DCM (4,5 mL), adicio- nou-se TFA (4,5 mL). A mistura foi agitada a 0 ºC por 30 minutos. LC- MS mostrou que o composto 10A foi consumido completamente e um pico principal com m/z desejada foi detectado. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente e fornecer um resíduo, que purificado por HPLC preparativa (Condição TFA). O composto BCY6175 (61,40 mg, 13,56 µmol, 31,13% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. BCY6107
Procedimento geral para a preparação do Composto 2
[00329] A uma solução do composto 1 (3,0 g, 8,49 mmol, 1,0 eq.) em DCM (30 mL) e MeOH (10 mL), foram adicionados EEDQ (2,52 g, 10,19 mmol, 1,2 eq.) e (4-aminofenil)metanol (1,25 g, 10,19 mmol, 1,2 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 1 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado ([M+H]+ 459,5). Além disso, TLC indicou que o composto 1 foi consumido completamente e novos pontos formados. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente e fornecer um resíduo. O resíduo foi purificado por croma- tografia flash em sílica-gel (ISCO®; 120 g SepaFlash® Coluna Silica Flash, Eluente com gradiente de acetato de etila/éter de petróleo 0~60% a 80 mL/min). O Composto 2 (3,5 g, 7,63 mmol, 89,9% de ren- dimento) foi obtido como um sólido amarelo. Procedimento geral para a preparação de Composto 3
[00330] A uma solução do composto 2 (3,3 g, 7,20 mmol, 1,0 eq.) em THF (100 mL), foram adicionados DIEA (4,65 g, 35,98 mmol, 6,27 mL, 5,0 eq.) e carbonato de bis(4-nitrofenila) (8,76 g, 28,79 mmol, 4,0 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 2 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado ([M+H]+ 624,0). Além disso, TLC indicou que o composto 2 foi consumido completamente e novos pontos formados. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente e fornecer um resíduo. O resíduo foi purificado por croma- tografia flash em sílica-gel (ISCO®; 120 g SepaFlash® Coluna Silica Flash, Eluente com gradiente de acetato de etila/éter de petróleo 0~15% a 80 mL/min). O Composto 3 (3,0 g, 4,81 mmol, 66,8% de ren- dimento) foi obtido como um sólido amarelo. Procedimento geral para a preparação de Composto 4
[00331] A uma solução do composto 3 (124,09 mg, 198,97 µmol, 1,0 eq.) em DMF (5 mL), foram adicionados HOBt (32,3 mg, 238,77 µmol, 1,2 eq.), DIEA (77,1 mg, 596,92 µmol, 103,9 µL, 3,0 eq.) e MMAE (0,1 g, 139,28 µmol, 0,7 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou que o composto 3 foi consumido completa- mente e um pico principal com MS desejada foi detectado ([M+H]+
1202,5, [M+Na]+ 1224,5). A mistura de reação foi então purificada dire- tamente por HPLC preparativa (condição neutra). Após liofilização, o composto 4 (0,08 g, 66,53 µmol, 33,4% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação de Composto 5
[00332] A uma solução do composto 4 (0,08 g, 66,53 µmol, 1,0 eq.) em DMF (4 mL), adicionou-se piperidina (862,2 mg, 10,13 mmol, 1 mL, 152,2 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou que o composto 4 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado ([M+H]+ 981,5, [M+Na]+ 1003,5, en- quanto m/z=264,0 correspondeu ao aduto Fmoc-piperidina). A mistura de reação foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 5 (0,055 g, 56,11 µmol, 84,3% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação do Composto 6
[00333] A uma solução de Fmoc-Glu(t-Bu)-Pro-Cit-Gly-HPhe-Tyr(t- Bu)-OH (74,1 mg, 66,31 µmol, 1,3 eq.) em DMF (4 mL), foram adicio- nados EDCI (12,7 mg, 66,31 µmol, 1,3 eq.), HOBt (8,9 mg, 66,31 µmol, 1,3 eq.) e o composto 5 (0,05 g, 51,01 µmol, 1,0 eq.). A mistura foi agi- tada a 25 ºC por 30 minutos. LC-MS indicou que 20% do composto 5 restavam, diversos novos picos formados e que 60% da mistura de reação era o produto desejado ([M+2H+]/2=1040,4). A mistura de rea- ção foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 6 (0,07 g, 33,66 µmol, 66,0% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação do Composto 7
[00334] A uma solução de composto 6 (0,07 g, 33,66 µmol, 1,0 eq.) em DMF (4 mL), adicionou-se piperidina (2,9 mg, 33,66 µmol, 3,3 µL, 1,0 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 15 minutos. LC-MS mostrou que o composto 6 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado ([M+2H+]/2=929,1, enquanto m/z=264,2 correspondia ao aduto Fmoc-piperidina). A mistura de rea- ção foi purificada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 7 (0,045 g, 24,23 µmol, 72,0% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação do Composto 8
[00335] A uma solução do composto 7 (0,04 g, 21,54 µmol, 1,0 eq.) em DMA (1 mL), foram adicionados DIEA (8,3 mg, 64,61 µmol, 11,2 µL, 3,0 eq.) e tetrahidropiran-2,6-diona (7,4 mg, 64,61 µmol, 3,0 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 1 hora. LC-MS mostrou que o composto 7 foi consumido completamente e um pico principal com MS desejada foi detectado ([M+2H+]/2=986,4). A mistura de reação foi então purifi- cada diretamente por HPLC preparativa (condição neutra). O Compos- to 8 (0,035 g, 17,75 µmol, 82,4% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. Procedimento geral para a preparação do Composto 9
[00336] A uma solução do composto 8 (0,035 g, 17,75 µmol, 1,0 eq.), 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (6,1 mg, 53,26 µmol, 3,0 eq.) em DMA (3 mL) e DCM (1 mL), adicionou-se EDCI (10,2 mg, 53,26 µmol, 3,0 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou que o composto 8 restava parcialmente e um pico com MS desejada foi detectado ([M+2H+]/2=1034,7). DCM foi então removido, seguido pela purificação da mistura por HPLC preparativa (condição neutra). O Composto 9 (0,03 g, 14,50 µmol, 81,7% de rendimento) foi obtido co- mo um sólido branco. Procedimento geral para a preparação do Composto 10
[00337] A uma solução de BCY6014 (52,9 mg, 17,40 µmol, 1,59 µL, 1,2 eq.) em DMF (2 mL), foram adicionados DIEA (5,6 mg, 43,51 µmol, 7,6 µL, 3,0 eq.) e o composto 9 (0,03 g, 14,50 µmol, 1,0 eq.). A mistura foi agitada a 25 ºC por 16 horas. LC-MS mostrou um pico principal com
MS desejada ([M+4H+]/4=1249,2, [M+5H+]/5=999,3). O solvente foi então removido e o produto bruto resultante 10 (0,06 g, bruto) foi usa- do na etapa seguinte sem purificação adicional. Procedimento geral para a preparação de BCY6107
[00338] A uma solução do composto 10 (0,055 g, 11,01 µmol, 1,0 eq.) em DCM (1 mL), adicionou-se 1 mL de TFA. A mistura foi agitada a 0 ºC por 15 minutos. LC-MS mostrou que o composto 10 foi consu- mido completamente e um pico principal com MS desejada foi detec- tado ([M+4H+]/4=1221,0, [M+5H+]/5=977,0). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente, resultan- do em um resíduo que foi então purificado diretamente por HPLC pre- parativa (Condição TFA). O composto BCY6107 (20,4 mg, 4,03 µmol, 36,6% de rendimento, 96,36% de pureza) foi obtido como um sólido branco. Dados biológicos Estudo 1: Medições de fluorescência por polarização (a) Ensaio de ligação direta
[00339] Peptídeos com uma etiqueta fluorescente (fluoresceína, SIGMA ou Alexa Fluor488™, Fisher Scientific) foram diluídos até 2,5 nM em PBS com Tween 20 0,01% ou HEPES 50 mM com NaCl 100 mM e Tween 0,01%, pH 7,4 (ambos referidos como tampão do en- saio). Isso foi combinado com titulação de proteína no mesmo tampão do ensaio que o peptídeo, para fornecer uma concentração de peptí- deo 1nM em volume total de 25 µL em placas de parede preta e fundo raso com 384 cavidades, tipicamente, 5 µL de tampão do ensaio, 10 µL de proteína (Tabela 1), então 10 µL de peptídeo fluorescente. Uma em duas diluições seriadas foi usada para fornecer 12 concentrações diferentes com concentrações máximas variando de 500 nM , para aglutinantes conhecidos de alta afinidade, a 10 µM para aglutinantes de baixa afinidade e ensaios seletividade. As medições foram condu-
zidas em um BMG PHERAstar FS equipado com um módulo óptico "FP 485 520 520" que excita a 485 nm e detecta emissão paralela e perpendicular a 520 nm. O PHERAstar FS foi configurado a 25 ºC com 200 flashes por cavidade e tempo de espera para posicionamento de 0,1 segundo, com cada cavidade medida em intervalos de 5 a 10 mi- nutos durante 60 minutos. O ganho usado para análise foi determinado para cada traçador no final dos 60 minutos quando não havia proteína na cavidade. Os dados foram analisados com Systat Sigmaplot versão
12.0. Os valores mP foram ajustados a uma equação quadrática defi- nida pelo usuário para gerar um valor de Kd: f = ymin+(ymax- ymin)/Lig*((x+Lig+Kd)/2-sqrt((((x+Lig+Kd)/2)^2)-(Lig*x))). "Lig" era um valor definido da concentração do traçador utilizado. (b) Ensaio de competição pela ligação
[00340] A competição entre peptídeos sem etiqueta fluorescente e um peptídeo com etiqueta fluorescente e Kd conhecida foi testada (Tabela 2). O Composto de Referência A tem a sequência Fl-G-Sar5- ACPWGPAWCPVNRPGCA (Fl-G-Sar5-(SEQ ID NO: 94)). O Composto de Referência B tem a sequência Fl-G-Sar5- ACPWGPFWCPVNRPGCA (Fl-G-Sar5-(SEQ ID NO: 95)). O Composto de Referência C tem a sequência Fl-G-Sar5- ADVTCPWGPFWCPVNRPGCA (Fl-G-Sar5-(SEQ ID NO: 96). Cada um dos Compostos de Referência A, B e C contêm TBMB como arcabou- ço molecular. Os peptídeos foram diluídos até uma concentração ade- quada em tampão do ensaio, conforme descrito no ensaio de ligação direta, com, no máximo 5% de DMSO, depois diluídos em série 1 em
2. Cinco µL de peptídeo diluído foram adicionados à placa, seguidos por 10 µL de EphA2 humano ou de camundongo (Tabela 1), em uma concentração fixa que dependia do peptídeo fluorescente usado (Ta- bela 2), depois adicionaram-se 10 µL de peptídeo fluorescente. As medições foram conduzidas como para o ensaio de ligação direta, no entanto, o ganho foi determinado antes da primeira medição. A análise de dados foi no Systat Sigmaplot versão 12.0, onde os valores mP fo- ram ajustados a uma equação cúbica, definida pelo usuário, para gerar um valor de Ki: f=ymin+(ymax-ymin)/Lig*((Lig*((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp- Prot*c)+Klig*Kcomp))^0,5*COS(ARCCOS((- 2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp- Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(- 1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0,5)))/3))- (Klig+Kcomp+Lig+Comp- Prot*c)))/((3*Klig)+((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp- Prot*c)+Klig*Kcomp))^0,5*COS(ARCCOS((- 2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp- Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(- 1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0,5)))/3))- (Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))).
[00341] "Lig", "KLig" e "Prot" eram todos valores definidos relacio- nados a: peptídeo fluorescente concentração, a Kd do peptídeo fluo- rescente e EphA2 concentração, respectivamente. Tabela 1: Receptores de efrina e fonte Receptor (do- Espécie Forma- Fornecedor Número de mínio) to/etiqueta catálogo EphA1 (Ecto) Humano Fusão com R&D systems 7146-A1 Fc EphA2 (Ecto) Humano Poli-His C- R&D systems 3035-A2 terminal
Receptor (do- Espécie Forma- Fornecedor Número de mínio) to/etiqueta catálogo EphA2 (Ecto) Humano Poli-His C- Interno N/A terminal EphA2 (Ecto) Camundon- Fusão com R&D Systems 639-A2 go Fc EphA2 (Ecto) Camundon- Poli-His C- Sino Biologi- 50586-M08H go terminal cal EphA2 (ligação Rato Poli-His C- Interno N/A de ligante) terminal EphA2 (ligação Cão Poli-His C- Interno N/A de ligante) terminal EphA3 (Ecto) Humano Fusão com R&D systems 6444-A3 Fc EphA3 (Ecto) Humano Poli-His N- Interno N/A terminal EphA3 (Ecto) Rato Poli-His C- Sino Biologi- 80465-R08H terminal cal EphA4 (Ecto) Humano Fusão com R&D systems 6827-A4 Fc EphA4 (Ecto) Humano Poli-His C- Sino Biologi- 11314-H08H terminal cal EphA4 (Ecto) Rato Poli-His C- Sino Biologi- 80123-R08H terminal cal EphA6 (Ecto) Humano Fusão com R&D systems 5606-A6 Fc EphA7 (Ecto) Humano Fusão com R&D systems 6756-A7 Fc EphB1 (Ecto) Rato Fusão com R&D systems 1596-B1 Fc EphB4 (Ecto) humano Poli-His C- R&D systems 3038-B4 terminal
Tabela 2: Concentrações finais de peptídeo fluorescente e EphA2 usadas com os ensaios de competição pela ligação Peptídeo fluores- Concentração de Concentração de Concentração de cente peptídeo fluores- EphA2 humano EphA2 (nM) de cente (nM) (nM) camundongo Composto de Re- 10 75 ferência A Composto de Re- 1 30 ferência B Composto de Re- 0,8 (humano) 1 2,4 50 ferência C (camundongo)
[00342] Certos ligantes peptídicos da invenção foram testados nos ensaios mencionados acima e os resultados são mostrados nas Tabe- las 3-7: Tabela 3: Dados dos ensaios biológicos dos ligantes peptídicos da in- venção (Peptídeos TATA, Ensaio de ligação direta) Número do Sequência EphA2 humano composto biciclo (KD, nM ± IC 95%) 1 ACMNDWWCAMGWKCA-Sar6- 304 ± 91,99 K(Fl) ((SEQ ID NO: 3)-Sar6-K(Fl)) 2 ACVPDRRCAYMNVCA-Sar6-K(Fl) 74,91 ± 6,6 ((SEQ ID NO: 4)-Sar6-K(Fl)) 3 ACVVDGRCAYMNVCA-Sar6-K(Fl) 129,8 ± 80,75 ((SEQ ID NO: 5)-Sar6-K(Fl)) 4 ACVVDSRCAYMNVCA-Sar6-K(Fl) 124,6 ± 51,74 ((SEQ ID NO: 6)-Sar6-K(Fl)) 5 ACVPDSRCAYMNVCA-Sar6-K(Fl) 93,95 ± 23,62 ((SEQ ID NO: 7)-Sar6-K(Fl)) 6 ACYVGKECAIRNVCA-Sar6-K(Fl) 168,5 ± 20,58 ((SEQ ID NO: 8)-Sar6-K(Fl)) 7 ACYVGKECAYMNVCA-Sar6-K(Fl) 149,73 ± 39,2 ((SEQ ID NO: 9)-Sar6-K(Fl)) 8 Fl-G-Sar5-ACYVGKECAYMNVCA 218,33 ± 10,51 (Fl-G-Sar5-(SEQ ID NO: 9))
Número do Sequência EphA2 humano composto biciclo (KD, nM ± IC 95%) 9 Fl-(β-Ala)-Sar10- 6,43 ± 1,15 ARDCPLVNPLCLHPGWTC (Fl-(β- Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 10)) 10 Fl-(β-Ala)-Sar10- 9,07 ± 2,49 A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC (Fl-(β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 11) 11 Ac-CPLVNPLCLHPGWTCLHG- 3,08 ± 0,43 Sar6-(D-K[Fl]) (Ac-(SEQ ID NO: 12)-Sar6-(D-K[Fl])) 12 Ac-CPLVNPLCLHPGWTCL(D- 10,56 ± 0,77 His)G-Sar6-(D-K[Fl]) (Ac-SEQ ID NO: 13)-Sar6-(D-K[Fl])) 13 Ac-CPLVNPLCLHPGWSCRGQ- 5,29 ± 0,79 Sar6-(D-K[Fl]) (Ac-(SEQ ID NO: 14)- Sar6-(D-K[Fl])) 14 Ac- 9,96 ± 0,55 CPLVNPLCLHPGWSC(HArg)GQ- Sar6-(D-K[Fl]) (Ac-(SEQ ID NO: 15)- Sar6-(D-K[Fl]))
Tabela 4: Dados dos ensaios biológicos de ligantes peptídicos da invenção (Peptídeos TATA, Ensaio de competição pela ligação) Ki, nM ± IC 95% EphA2 camun- Número do EphA2 humano dongo composto Sequência Peptídeo fluorescente biciclo Composto de Composto de Composto de Composto de Referência C Referência B Referência A Referência C 15 ACMNDWWCAMGWKCA (SEQ ID NO: 3) 277,5 ± 38,22
171/299 16 ACVPDRRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 4) 69,97 ± 8,67 (β-Ala)-Sar10-ACVPDRRCAYMNVC ((β-Ala)-Sar10- 17 85,05 ± 1,08 (SEQ ID NO: 16)) 18 DLRCGGDPRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 17) 70,8 ± 2,35 19 SRPCVIDSRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 18) 94,75 ± 24,01 20 ESRCSPDARCAYMNVCA (SEQ ID NO: 19) 57,05 ± 4,61 21 HSGCRPDPRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 20) 62,15 ± 4,61 22 GSGCKPDSRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 21) 63,25 ± 13,82 23 ETVCLPDSRCAYMNVCA (SEQ ID NO: 22) 130 ± 15,68 24 GQVCIVDARCAYMNVCA (SEQ ID NO: 23) 168,5 ± 16,66 25 ACVPDRRCAFENVCVDH (SEQ ID NO: 24) 97,3 ± 3,33 26 ACVPDRRCAFMNVCEDR (SEQ ID NO: 25) 39,05 ± 10,29
Ki, nM ± IC 95% EphA2 camun- Número do EphA2 humano dongo composto Sequência Peptídeo fluorescente biciclo Composto de Composto de Composto de Composto de Referência C Referência B Referência A Referência C 27 ACVPDRRCAFQDVCDHE (SEQ ID NO: 26) 159; n=1 28 ACVPDRRCAFRDVCLTG (SEQ ID NO: 27) 1700; n=1 209,5 ± 29 ACYVGKECAYMNVCA (SEQ ID NO: 9) 106,65 ± 24,94 87,7 n=1 110,74
172/299 30 ACQPSNHCAFMNYCA (SEQ ID NO: 28) 293; n=1 186,53 ± 86,86 137 n=1 31 ACSPTPACAVQNLCA (SEQ ID NO: 29) 223; n=1 177 ± 60,76 32 ACTSCWAYPDSFCA (SEQ ID NO: 30) 232 ± 52,19 151; n=1 33 ACTKPTGFCAYPDTICA (SEQ ID NO: 31) 268,5 ± 16,66 34 ACRGEWGYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 32) 347,5 ± 57,82 35 ACRNWGMYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 33) 282,5 ± 65,66 36 ACPDWGKYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 34) 160 ± 1,96 37 ACRVYGPYCAYPDTICA (SEQ ID NO: 35) 294,5 ± 20,58 400,33 ± 38 ACSSCWAYPDSVCA (SEQ ID NO: 36) 205,19 321,33 ± 39 ACQSCWAYPDTYCA (SEQ ID NO: 37) 119,53
Ki, nM ± IC 95% EphA2 camun- Número do EphA2 humano dongo composto Sequência Peptídeo fluorescente biciclo Composto de Composto de Composto de Composto de Referência C Referência B Referência A Referência C 40 ACGFMGLEPCETFCA (SEQ ID NO: 38) 187,5 ± 20,58 41 ACGFMGLVPCEVHCA (SEQ ID NO: 39) 155 ± 9,8 42 ACGFMGLEPCEMVCA (SEQ ID NO: 40) 320,5 ± 14,7 43 ACGFMGLEPCVTYCA (SEQ ID NO: 41) 233,5 ± 20,58
173/299 44 ACGFMGLEPCELVCA (SEQ ID NO: 42) 126,8 ± 21,17 45 ACGFMGLVPCNVFCA (SEQ ID NO: 43) 142 ± 41,16 46 ACGFMGLEPCELFCA (SEQ ID NO: 44) 81,7 ± 7,06 47 ACGFMGLEPCELFCMPK (SEQ ID NO: 45) 185 ± 74,48 48 ACGFMGLEPCELYCA (SEQ ID NO: 46) 127,5 ± 14,7 49 ACGFMGLEPCELYCAHT (SEQ ID NO: 47) 144 ± 17,64 50 ACGFMGLEPCEMYCA (SEQ ID NO: 48) 140 ± 45,08 51 ACGFMGLVPCELYCADN (SEQ ID NO: 49) 84,4 ± 36,46 115,33 ± 52 ACPLVNPLCLTSGWKCA (SEQ ID NO: 50) 11,33 53 ACPMVNPLCLHPGWICA (SEQ ID NO: 51) 15,4 ± 3,17
Ki, nM ± IC 95% EphA2 camun- Número do EphA2 humano dongo composto Sequência Peptídeo fluorescente biciclo Composto de Composto de Composto de Composto de Referência C Referência B Referência A Referência C 54 ACPLVNPLCLHPGWICA (SEQ ID NO: 52) 15,25 ± 2,84 55 ACPLVNPLCLHPGWRCA (SEQ ID NO: 53) 20,55 ± 0,88 56 ACPLVNPLCNLPGWTCA (SEQ ID NO: 54) 184 ± 115,64 57 ACPLVNPLCLVPGWSCA (SEQ ID NO: 55) 35,4 ± 10
174/299 58 ACPLVNPLCLLDGWTCA (SEQ ID NO: 56) 38,35 ± 5,39 59 ACPLVNPLCLMPGWGCA (SEQ ID NO: 57) 114,5 ± 10,78 60 ACPLVNPLCMIGNWTCA (SEQ ID NO: 58) 96,2 ± 0,59 61 ACPLVNPLCLMTGWSCA (SEQ ID NO: 59) 241,5 ± 44,1 62 ACPLVNPLCMMGGWKCA (SEQ ID NO: 60) 67,1 ± 19,21 63 ACPLVNPLCLYGSWKCA (SEQ ID NO: 61) 59,05 ± 28,32 64 ACPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 62) 30; n=1 65 ARDCPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 63) 6,05 ± 1,38 39,1 ± 0,39 66 (β-Ala)-Sar10-A(HArg)DC(HyP)LVNPLCLHP(D- 4,94 ± 1,41 57,6 ± 24,86 (BCY6099) Asp)W(HArg)C (SEQ ID NO: 2) 67 (β-Ala)-Sar10-A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTC ((β- 8,51 ± 0,17 61,7 ± 15,48 (BCY6014) Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 11)
Ki, nM ± IC 95% EphA2 camun- Número do EphA2 humano dongo composto Sequência Peptídeo fluorescente biciclo Composto de Composto de Composto de Composto de Referência C Referência B Referência A Referência C Ac-ARDCPLVNPLCLHPGWTCA-Sar6-(D-K) (Ac- 68 19,3 ± 4,92 166,5 ± 30,38 (SEQ ID NO: 63)-Sar6-(D-K)) Ac-A(HArg)DCPLVNPLCLHPGWTCA- Sar6-(D-K) 69 17,5 ± 0,98 164,5 ± 2,94 (Ac-(SEQ ID NO: 11)-A-Sar6-(D-K))
175/299 70 RPACPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 64) 10,06 ± 2,96 71 RPPCPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 65) 11,11 ± 2,25 72 KHSCPLVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 66) 11,92 ± 6,04 73 ACPLVNPLCLHPGWTCLHG (SEQ ID NO: 67) 1,98 ± 0,49 7,27 ± 1,09 74 Ac-CPLVNPLCLHPGWTCLHG (Ac-(SEQ ID NO: 12)) 1,76 ± 0,54 (β-Ala)-Sar10-ACPLVNPLCLHPGWTCLHG ((β-Ala)- 75 2,48 ± 0,27 18 ± 1,18 Sar10-(SEQ ID NO: 67)) (β-Ala)-Sar10-ACPLVNPLCLHPGWTCL(D-His)G ((β- 76 10,01 ± 1,55 75,15 ± 14,41 Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 68)) 77 Ac-CPLVNPLCLHPGWTCLHG-Sar6-(D-K) (Ac-(SEQ 5,41 ± 0,86 48,23 ± 15,72 (BCY6019) ID NO: 12)-Sar6-(D-K))
Ki, nM ± IC 95% EphA2 camun- Número do EphA2 humano dongo composto Sequência Peptídeo fluorescente biciclo Composto de Composto de Composto de Composto de Referência C Referência B Referência A Referência C Ac-CPLVNPLCLHPGWTCL(D-His)G-Sar6-(D-K) (Ac- 78 15,6 ± 4,7 115,03 ± 41,16 (SEQ ID NO: 13)- Sar6-(D-K)) 79 ACPLVNPLCLHPG(2Nal)TCLHG (SEQ ID NO: 69) 162 ± 17,64 80 RHDCPLVNPLCLLPGWTCA (SEQ ID NO: 70) 7,11 ± 0,72
176/299 81 TPRCPLVNPLCLMPGWTCA (SEQ ID NO: 71) 9,8 ± 2,61 82 ACPLVNPLCLAPGWTCA (SEQ ID NO: 72) 46,2 n=1 83 ACPLVNPLCLAPGWTCSRS (SEQ ID NO: 73) 7,05 ± 1,11 84 ACPLVNPLCLEPGWTCA (SEQ ID NO: 74) 53,9 n=1 85 ACPLVNPLCLEPGWTCAKR (SEQ ID NO: 75) 10,95 ± 1,6 86 ACPLVNPLCLHPGWSCA (SEQ ID NO: 76) 56,15 ± 11,27 87 ACPLVNPLCLHPGWSCRGQ (SEQ ID NO: 77) 2,57 ± 0,63 18,6 ± 0,59 (BCY6026) 88 Ac-CPLVNPLCLHPGWSCRGQ (Ac-(SEQ ID NO: 14)) 1,64 ± 0,75 (β-Ala)-Sar10-ACPLVNPLCLHPGWSCRGQ ((β-Ala)- 89 2,86 ± 1,29 29,55 ± 4,61 Sar10-(SEQ ID NO: 77)
Ki, nM ± IC 95% EphA2 camun- Número do EphA2 humano dongo composto Sequência Peptídeo fluorescente biciclo Composto de Composto de Composto de Composto de Referência C Referência B Referência A Referência C (β-Ala)-Sar10-ACPLVNPLCLHPGWSC(HArg)GQ ((β- 90 5,41 ± 0,67 47,05 ± 11,47 Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 78)) 91 Ac-CPLVNPLCLHPGWSCRGQ-Sar6-(D-K) (Ac-(SEQ 5,98 ± 1,42 49,87 ± 14,44 (BCY6042) ID NO: 14)-Sar6-(D-K))
177/299 Ac-CPLVNPLCLHPGWSC(HArg)GQ-Sar6-(D-K) (Ac- 92 10,56 ± 6,56 75,27 ± 21,72 (SEQ ID NO: 15) -Sar6-(D-K)) 93 ACPLVNPLCLHPG(2Nal)SCRGQ (SEQ ID NO: 79) 228 ± 103,88 94 ACPLVNPLCLTPGWTCTNT (SEQ ID NO: 80) 13,25 ± 4,05 95 ACPMVNPLCLHPGWKCA (SEQ ID NO: 81) 11,91 ± 3,73 96 ACPMVNPLCLTPGWICA (SEQ ID NO: 82) 16,07 ± 4,58 97 ACPMVNPLCLHPGWTCA (SEQ ID NO: 83) 20 ± 1,02
Tabela 5: Dados dos ensaios biológicos for TATA de ligantes peptídicos da invenção (Ensaio de competição pela liga- ção) Ki, nM ± IC 95% EphA2 camundon- Número do EphA2 humano go composto Sequência biciclo Peptídeo fluorescente Composto de Referên- Composto de Refe- cia C rência C (β-Ala)-Sar10-H(D-Asp)VT- 98 C(Aib)(1Nal)G(Aib)F(1Nal)CP(tBuGly)N(HArg)P(D-Asp)C 251,5 ± 73,5
178/299 ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 84)) Tabela 6: Dados dos ensaios biológicos de ligantes peptídicos da invenção (dados de competição pela ligação de BDC com arcabouços TATA) Ki, nM Número do EphA2 humano EphA2 camundongo composto Precursor do biciclo Fórmula geral Peptídeo fluorescente BDC Composto de Refe- Composto de Refe- rência C rência C BCY6027 BCY6099 Fórmula (A) 10,23 BCY6028 BCY6099 Fórmula (B) 13,04 BCY6031 BCY6014 Fórmula (A) 12,62 34,70 BCY6032 BCY6014 Fórmula (B) 11,42 35,90
Tabela 7: Dados de seletividade de ligantes peptídicos da invenção (Ensaio de seletividade da ligação direta) Número EphA2 EphA2 EphA2 EphA3 EphA3 EphA4 EphA4 EphB1 EphB4 EphA7 EphA6 EphA1 Fator Anidra- CD38 do com- camun- rato cão humano rato humano rato e rato humano humano humano humano XIIa se car- humano posto dongo e cão camun- humano bônica 9 biciclo dongo humana 2 516,5 ± 210 ± >1000 >1000 >1000 10890 >6000 236,18 1,96 n=1 7 216 252,5 ± 6,86 9 >3000 11 >3000
179/299 12 >3000 13 >3000 14 >3000
Estudo 2: Medições de fluorescência por polarização (Protocolo alternativo) (a) Competição pela ligação
[00343] A competição entre peptídeos sem etiqueta fluorescente e um peptídeo com etiqueta fluorescente e Kd conhecida foi testada (Tabela 9). Cinco µL de concentrações crescentes (2 vezes) e um composto em teste foram adicionados à placa, seguidos por 10 µL de proteína EphA2 (Tabela 8) a uma concentração fixa que dependia do peptídeo fluorescente usado (Tabela 9), depois 10 µL de peptídeo fluo- rescente foram adicionados. O tampão foi o tampão do ensaio acima com DMSO <1%. As medições foram conduzidas em um BMG PHE- RAstar FS equipado com um módulo óptico "FP 485 520 520" que ex- cita a 485 nm e detecta emissão paralela e perpendicular a 520 nm. O PHERAstar FS foi configurado a 25 ºC com 200 flashes por cavidade e tempo de espera para posicionamento de of 0,1 segundo, com cada cavidade medida em intervalos de 5 a 10 minutos durante 60 minutos. Alternativamente, as medições foram efetuadas em intervalos seme- lhantes de tempo em um Perkin Elmer Envision equipado com Espelho Duplo FITC FP, filtro de excitação FITC FP 480 e os filtros de emissão FITC FP P-pol 535 e FITC FP S-pol com 30 flashes e fator G-igual a 1,2. A análise de dados foi no Systat Sigmaplot versão 12.0 ou 13.0, onde os valores mP em 60 minutos foram ajustados a uma equação cúbica definida pelo usuário para gerar um valor de Ki: f=ymin+(ymax-ymin)/Lig*((Lig*((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp- Prot*c)+Klig*Kcomp))^0,5*COS(ARCCOS((- 2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp- Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(- 1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0,5)))/3))-
(Klig+Kcomp+Lig+Comp- Prot*c)))/((3*Klig)+((2*((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp- Prot*c)+Klig*Kcomp))^0,5*COS(ARCCOS((- 2*(Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^3+9*(Klig+Kcomp+Lig+Comp- Prot*c)*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp)-27*(- 1*Klig*Kcomp*Prot*c))/(2*((((Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)^2- 3*(Kcomp*(Lig-Prot*c)+Klig*(Comp-Prot*c)+Klig*Kcomp))^3)^0,5)))/3))- (Klig+Kcomp+Lig+Comp-Prot*c)))).
[00344] "Lig", "KLig" e "Prot" foram todos valores definidos em rela- ção a: concentração do peptídeo fluorescente, a Kd do peptídeo fluo- rescente e concentração de EphA2 respectivamente. Tabela 8: Receptores de Eph e fonte Receptor Espécie Forma- Fornecedor Número de (domínio) to/etiqueta catálogo EphA2 (Ecto) Humano Poli-His C- R&D systems 3035-A2 terminal EphA2 (Ecto) Humano Poli-His C- Interno N/A terminal EphA2 (Ecto) Camundongo Poli-His C- Sino Biologi- 50586-M08H terminal cal EphA2 (liga- Rato Poli-His C- Interno N/A ção de ligan- terminal te) Tabela 9: Concentrações finais de peptídeo fluorescente e EphA2 usadas com os ensaios de competição pela ligação Peptídeo fluo- Concentração Concentração Concentração Concentração rescente de peptídeo de EphA2 de EphA2 de de EphA2 de fluorescente humano (nM) camundongo rato (nM) (nM) (nM) Composto de 0,8 2,4 ou 25 50 ou 15nM 25 Referência C
[00345] Certos ligantes peptídicos e conjugados biciclo-fármaco da invenção foram testados no ensaio de competição pela ligação menci- onado acima e os resultados são mostrados Tabelas 10 a 11: Tabela 10: Ligação por competição com peptídeos bicíclicos selecio- nados Biciclo No Ki humana Ki de camun- Ki de rato (nM) (nM) dongo (nM) BCY6009 12,7 26,7 18,0 (Composto 108) BCY6014 14,5 39,6 24,4 (Composto 67) BCY6017 8,3 (Composto 109) BCY6018 13,1 (Composto 110) BCY6019 6,4 16,0 (Composto 77) BCY6026 4,4 (Composto 87) BCY6042 6,7 (Composto 91) BCY6059 43,2 (Composto 106) BCY6099 2,7 4,5 1,9 (Composto 66) BCY6101 9,7 6,9 (Composto 101) BCY6102 14,6 25,1 (Composto 102) BCY6103 14,8 20,8 (Composto 100) BCY6104 5,1 19,8 (Composto 99) BCY6137 2,2 (Composto 105)
Biciclo No Ki humana Ki de camun- Ki de rato (nM) (nM) dongo (nM) BCY6138 566,0 (Composto 104) BCY6139 5,7 (Composto 103) BCY6141 90,4 (Composto 112) BCY6152 23,3 (Composto 111) BCY6153 18,2 (Composto 113) BCY6160 14,0 (Composto 107) BCY6039 9,4 BCY6105 8,86 BCY6106 12,9 BCY6175 1 BCY6107 19,18
[00346] Os resultados do ensaio de competição pela ligação na Ta- bela 10 mostram que os peptídeos Biciclo direcionados ao EphA2 hu- mano (BCY6014 e BCY6099) ligam-se com alta afinidade ao EphA2 de camundongo e rato. Do mesmo modo, BCY6019 liga-se ao EphA2 humano e de camundongo. Esses resultados mostram que certos pep- tídeos da invenção podem ser usados em modelos de eficácia e toxi- cologia in vivo no camundongo e no rato. Tabela 11: Ligação competitiva com Conjugados Biciclo-Fármaco (BDCs) selecionados ID do Biciclo Ki Ki Ki Humano (nM) Camundongo (nM) Rato (nM) BCY6061 12,0 32,3 14,2 BCY6174 1,7 3,9 3,0 BCY6029 2,3
ID do Biciclo Ki Ki Ki Humano (nM) Camundongo (nM) Rato (nM) BCY6033 9,9 34,2 13,4 BCY6037 7,3 BCY6049 8,8 28,1 BCY6053 48,2 29,7 BCY6122 13,7 10,4 BCY6136 1,9 5,5 3,2 BCY6030 5,6 BCY6034 5,9 35,9 BCY6038 2,8 BCY6050 168,1 62,2 BCY6054 53,6 73,6 BCY6027 10,2 BCY6031 12,5 35,1 20,0 BCY6035 15,2 BCY6047 53,2 34,2 BCY6051 54,0 43,6 BCY6134 7,4 12,6 BCY6135 2,4 5,0 2,9 BCY6154 8,0 BCY6155 12,5 BCY6063 7,8 66,8 BCY6028 13,0 BCY6032 11,4 35,9 BCY6036 18,6 BCY6048 120,7 87,2 BCY6052 30,5 27,1 BCY6064 12,5 40,7 BCY6162 44,9 BCY6082 10,5 34,1 13,9 BCY6150 17,9 BCY6151 9,0
ID do Biciclo Ki Ki Ki Humano (nM) Camundongo (nM) Rato (nM) BCY6161 2,1 BCY6173 1,7 4,3 2,5 BCY6077 6,5 25,3 BCY6055 15,8 BCY6062 12,9 20,3
[00347] A Tabela 11 mostra que certos Conjugados Biciclo- Fármaco da invenção exibem excelente reatividade cruzada entre EphA2 humano, de camundongo e roedor. Os peptídeos da invenção podem, portanto, ser utilizados em modelos de eficácia e toxicologia in vivo em camundongos e ratos. (b) Medições por SPR
[00348] Proteínas de fusão não com Fc foram biotiniladas com EZ- Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotina durante 1 hora em acetato de sódio 4 mM, NaCl 10 mM, pH 5,4, com 3x excesso molar de biotina acima da proteína. O grau de marcação foi determinado com um kit Fluorescen- ce Biotin Quantification (Thermo) após diálise da mistura de reação em PBS. Para análise de ligação do peptídeo, usou-se um instrumento Biacore T200 com um chip XanTec CMD500D. Estreptavidina foi imo- bilizada no chip usando química padrão de acoplamento de amina a 25 ºC com HBS-N (HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4) como o tam- pão de corrida. Resumidamente, a superfície de carboximetil-dextrano foi ativada com uma injeção por 7 minutos de cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida 0,4 M (EDC)/N-hidroxissuccinimida 0,1 M (NHS) em razão 1:1 e vazão de 10 μL/min. Para captura de estrep- tavidina, a proteína foi diluída até 0,2 mg/mL em acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) e capturada injetando 120 µL na superfície ativada do chip. Grupos ativados residuais foram bloqueados com uma injeção por 7 minutos etanolamina 1 M (pH 8,5):HBS-N (1:1). O tampão foi tro- cado para PBS/0,05% Tween 20 e EphA2 biotinilado foi capturado até um nível de 500-1500 RU com diluição da proteína para 0,2 µM em tampão. Uma série de diluição dos peptídeos foi preparada nesse tampão com concentração final de DMSO de 0,5% e a concentração máxima de peptídeo foi 50 ou 100nM e 6 diluições de 2 vezes mais. A análise de SPR foi realizada a 25 ºC a uma vazão de 90 µL/min com associação em 60 segundos e dissociação em 900-1200 segundos. Os dados foram corrigidos para efeitos do volume excluindo DMSO. Todos os dados foram verificados duas vezes com injeções de branco e superfície de referência por meio de procedimentos de processa- mento padrão, e o processamento de dados e ajuste cinético foram realizados com o software Scrubber, versão 2.0c (BioLogic Software). Os dados foram ajustados usando um modelo de ligação simples 1:1 que permite efeitos pelo transporte de massa, quando adequado.
[00349] Para ligação de Conjugados Biciclo-Fármaco, usou-se um instrumento Biacore 3000. Para proteínas biotiniladas, os níveis de imobilização foram 1500 RU e a concentração máxima foi 100 nM. Do contrário, o método foi igual ao descrito acima, usando o chip CMD500D ou CM5 (GE Healthcare). Para proteínas com etiqueta Fc, um chip CM5 foi ativado como descrito acima e, a seguir, um anticorpo de cabra anti-IgG humana (Thermo-Fisher H10500) foi diluído até 20 µg/mL em acetato de sódio 10 mM, pH 5,0, e capturado até aproxima- damente 3000 RU. A superfície foi então bloqueada como descrito acima. A captura subsequente das proteínas com etiqueta Fc foi reali- zada para obter aproximadamente 200-400 RU da proteína alvo. As proteínas usadas são descritas abaixo. Todas as proteínas foram re- constituídas de acordo com os tampões e concentrações sugeridos pelo fabricante e capturadas utilizando proteína 5-10 µg/mL em PBS/Tween 20 0,05%.
Tabela 12 Receptor Espécie Formato/etiqueta FornecedorNúmero do catálogo EphA1 Humano Fusão com Fc Sino Biolo- 15789-H02H gics EphA2 Humano Biotina/monômero Interno N/A 0,95 mol EphA2 Camundon- Fusão com Fc R&D Sys- 639-A2 go tems EphA2 Rato biotina/ monôme- Interno N/A ro1,4 mol EphA3 Humano Fusão com Fc R&D Sys- 6444-A3 tems EphA3 Camundon- Fusão com Fc Sino Biolo- 51122-M02H go gics EphA3 Rato Fusão com Fc Sino Biolo- 80465-R02H gics EphA4 Humano Fusão com Fc Sino Biolo- 11314-H03H gics EphA4 Camundon- Fusão com Fc Sino Biolo- 50575-M02H go gics EphA4 Rat Fusão com Fc Sino Biolo- 80123-R02H gics EphA5 Humano Biotina/monômero R&D Sys- 3036-A5 3,1 mol tems EphA6 Humano Fusão com Fc R&D Sys- 5606-A6 tems EphA7 Humano Fusão com Fc R&D Sys- 6756-A7 tems EphB1 Rato Fusão com Fc R&D Sys- 1596-B1 tems EphB4 Humano Fusão com Fc Sino Biolo- 10235-H02H gics
[00350] Certos ligantes peptídicos e Conjugados Biciclo-Fármaco da invenção foram testados no ensaio de competição pela ligação mencionado acima e os resultados são mostrados nas Tabelas 13 a 15:
Tabela 13: Análise de ligação por SPR com Peptídeos bicíclicos e Conjugados Biciclo-Fármaco selecionados da in- venção Biciclo/BDC Humano Camundongo Rato No KD (nM) Koff t1/2 Kon KD (nM) Koff t1/2 Kon KD (nM) Koff t1/2 Kon (s-1) (min.) (M-1s-1) (s-1) (min.) (M-1s-1) (s-1) (min.) (M-1s-1) BCY6026 1,02 1,02E-03 11,3 9,92E+05 BCY6031 1,99 4,95E-03 2,3 2,49E+06 BCY6032 2,10 5,27E-03 2,2 2,52E+06 188/299 BCY6033 3,41 3,43E-03 3,5 9,99E+05 21,8 6,37E-03 1,8 2,92E+05 166 4,42E-03 2,6 2,67E+04 BCY6034 1,64 3,65E-03 3,2 2,23E+06 BCY6082 2,42 2,42E-03 4,8 9,87E+05 18,3 5,97E-03 1,9 3,27E+05 28,8 3,64E-03 3,2 1,26E+05 BCY6136 1,17 1,15E-03 10,0 9,86E+05 2,53 1,11E-03 10,4 4,37E+05 2,96 9,11E-04 12,6 3,07E+05 BCY6173 0,73 1,24E-03 9,3 1,69E+06 2,95 1,14E-03 10,1 3,86E+05 1,10 9,60E-04 12,0 8,81E+05
[00351] A Tabela 13 detalha afinidades de ligação e parâmetros cinéticos (Koff e Kon) para ligação de Conjugados Biciclo-Fármaco selecionados ao EphA2 humano, determinadas pelo ensaio de SPR.
Tabela 14: Análise de ligação por SPR com Conjugados Biciclo-Fármaco selecionados da invenção com homólogos de Eph humana BDC No EphA1 EphA3 EphA4 EphA5 EphA6 EphA7 EphB4 nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- BCY6033 ção a 5 µM ção a 5 µM ção a 5 µM ção a 25 µM ção a 20 µM ção a 20 µM ção a 20 µM nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- BCY6082 ção a 5 µM ção a 5 µM ção a 5 µM ção a 25 µM ção a 20 µM ção a 20 µM ção a 20 µM nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- BCY6136 ção a 5 µM ção a 5 µM ção a 5 µM ção a 25 µM ção a 20 µM ção a 20 µM ção a 20 µM
189/299 nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- nenhuma liga- BCY6173 ção a 5 µM ção a 5 µM ção a 5 µM ção a 25 µM ção a 20 µM ção a 20 µM ção a 20 µM
[00352] A Tabela 14 ilustra os resultados de ligação com quatro Conjugados Biciclo-Fármaco (BCY6033, BCY6082, BCY6136 e BCY6173) no ensaio SPR com homólogos de Efrina humana estreita- mente relacionados. Os resultados mostram que compostos da inven- ção não exibem ligação significativa aos homólogos humanos estrei- tamente relacionados: EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7 e EphB4. Tabela 15: Análise de ligação por SPR com Conjugados Biciclo- Fármaco selecionados da invenção com ortólogos de Eph de camun- dongo e rato BDC No EphA3 de EphA4 de EphA3 de EphB1 de camundongo camundongo rato rato BCY6033 nenhuma li- nenhuma li- nenhuma li- nenhuma li- gação a 20 gação a 20 gação a 20 gação a 20 µM µM µM µM BCY6082 nenhuma li- nenhuma li- nenhuma li- nenhuma li- gação a 20 gação a 20 gação a 20 gação a 20 µM µM µM µM BCY6136 nenhuma li- nenhuma li- nenhuma li- nenhuma li- gação a 20 gação a 20 gação a 20 gação a 20 µM µM µM µM BCY6173 nenhuma li- nenhuma li- nenhuma li- nenhuma li- gação a 20 gação a 20 gação a 20 gação a 20 µM µM µM µM
[00353] Os resultados na Tabela 15 mostram que certos Conjuga- dos Biciclo-Fármaco da invenção (BCY6033, BCY6082, BCY6136 e BCY6173) são também seletivos para EphA2 de camundongo e rato e não exibem ligação significativa a homólogos estreitamente relaciona- dos: EphA3 e EphA4 de camundongo; e EphA3 e EphB1 de rato. Estudos 3 e 7-23
[00354] Em cada um dos Estudos 3 e 7-23, a seguinte metodologia foi adotada para cada estudo: (a) Materiais
(i) Animais e condição de alojamento Animais Espécie: Mus Musculus Linhagem: Balb/c nude ou CB17-SCID Idade: 6-8 semanas Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 9-90 camundongos Fornecedor dos animais: Shanghai Lingchang Biotechno- logy Experimental Animal Co. Limited Condição de alojamento
[00355] Os camundongos foram mantidos em gaiolas com ventila- ção individual e temperatura e umidade constantes, sendo 3-5 animais em cada gaiola.  Temperatura: 20~26 ºC.  Umidade: 40-70%.
[00356] Gaiolas: Feitas de policarbonato. O tamanho é 300 mm x 180 mm x 150 mm. O material de cama é espiga de milho, que é tro- cada duas vezes por semana.
[00357] Dieta: Os animais tinham acesso livre à ração em grânulos secos esterilizados por irradiação durante o período inteiro do estudo.
[00358] Água: Os animais tinham acesso livre à água potável esté- ril.
[00359] Identificação das gaiolas: As etiquetas de identificação de cada gaiola continham as seguintes informações: número de animais, sexo, linhagem, a data de recebimento, tratamento, número do estudo, número do grupo e a data de início do tratamento.
[00360] Identificação dos animais: Os animais foram marcados por código na orelha. (ii) Artigos de teste e controle positivo
Número Descrição física Peso mole- Pureza Condição de cular armazena- mento BCY6031 Pó liofilizado 3878,92 97,99% Armazenado a -80 ºC BCY6033 Pó liofilizado 4260,01 99,12% Armazenado a -80 ºC BCY6082 Pó liofilizado 3911,04 96,8% Armazenado a -80 ºC BCY6135 Pó liofilizado 4021 95,14% Armazenado a -80 ºC BCY6136 Pó liofilizado 4402,23 97,5-98,6% Armazenado a -80 ºC BCY6173 Pó liofilizado 4101,15 95,80% Armazenado a -80 ºC BCY6174 Pó liofilizado 4537 99,50% Armazenado a -80 ºC BCY6175 Pó liofilizado 4492,29 96,20% Armazenado a -80 ºC BCY8245 Pó liofilizado 4173,85 99,30% Armazenado a -80 ºC BCY8781 Pó liofilizado 4173,83 99,00% Armazenado a -80 ºC ADC (MEDI- Solução (concen- - > 99,00% Armazenado 1 547) tração 10,47 a -80 ºC mg/mL) 1 Detalhes completos de MEDI-547 (um anticorpo monoclonal inteira- mente humano 1C1 (reconhece EphA2 humano e murino) conjugado a MMAF via um ligante mc) são descritos em Jackson et al (2008) Can- cer Res 68, 9367-74. (b) Métodos e procedimentos experimentais (i) Observações
[00361] Todos os procedimentos relacionados ao manejo, cuidados e o tratamento dos animais no estudo foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê para Usos e Cuidados Institucio- nais de Animais (IACUC) de WuXi AppTec, seguindo a orientação da Association for Assessment e Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). No momento do monitoramento rotineiro, os animais eram verificados diariamente quanto a quaisquer efeitos de crescimento tu- moral e tratamentos sobre comportamento normal como mobilidade, consumo alimentar e água (por inspeção visual somente), ganho/perda de peso corporal, opacidade olhos/pelagem e quaisquer outros efeitos anormais declarados no protocolo. Morte e sinais clínicos observados eram registrados com base nos números de animais dentro de cada subgrupo. (ii) Medições do tumor e os desfechos
[00362] O principal desfecho era ver se o crescimento de tumor po- deria ser retardado ou se os camundongos podiam ser curados. O vo- lume do tumor foi medido três vezes por semana em duas dimensões com um paquímetro, e o volume foi expresso em mm3 usando a fórmu- la: V = 0,5 a x b2, onde a e b são o diâmetro longo e o curto do tumor, respectivamente. O tamanho do tumor então usados para cálculos do valor T/C. O valor T/C (em porcentagem) é uma indicação de eficácia antitumoral; T e C são os volumes médios do grupos tratado e contro- le, respectivamente, em um dado dia.
[00363] TGI foi calculado para cada grupo usando a fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] ×100; Ti é o volume tumoral médio de um gru- po de tratamento em um dado dia, T0 é o volume tumoral médio do grupo de tratamento no dia de início do tratamento, Vi é o volume tu- moral médio do grupo veículo controle no mesmo dia com Ti e V0 é o volume tumoral médio do grupo veículo no dia de início do tratamento. (iii) Coleta de amostras
[00364] No final do estudo, os tumores de todos os grupos foram coletados para FFPE.
(iv) Análise estatística
[00365] Estatística resumida, incluindo média e o erro padrão da média (SEM), fornecida para o volume tumoral de cada grupo em cada momento.
[00366] A análise estatística da diferença em volume tumoral entre os grupos foi conduzida nos dados obtidos no melhor momento tera- pêutico após a dose final.
[00367] Uma análise ANOVA one-way foi realizada para comparar o volume tumoral entre os grupos, e, quando uma estatística F significa- tiva (razão variância de tratamento/variância do erro) era obtida, eram feitas comparações entre os grupos com o teste de Games-Howell. Todos os dados foram analisados com GraphPad Prism 5.0. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Estudo 3: Eficácia in vivo no modelo de PDX LU-01-0046
[00368] Linhagens de células de câncer (CCL) são derivadas origi- nalmente de tumores de pacientes, mas adquirem a capacidade para proliferar dentro de culturas celulares in vitro. Como resultado da ma- nipulação in vitro, CCL que têm sido tradicionalmente usadas na pes- quisa sobre o câncer passam por transformações genéticas que não são restabelecidas quando se permite que as células cresçam in vivo. Por causa do processo de cultivo celular, as células que se melhor adaptam para sobreviver em cultura são selecionadas, células que po- voam o tumor e proteínas que interagem com células cancerosas são eliminadas, e a cultura torna-se fenotipicamente homogênea. Os pes- quisadores estão começando a atribuir o motivo por que apenas 5% dos agentes antineoplásicos são aprovados pela agência Food and Drug Administration após testes pré-clínicas à falta de heterogeneida- de do tumor e a ausência do microambiente do estroma humano. Es- pecificamente, xenoenxertos de CCL com frequências não são prediti- vos da resposta ao fármaco nos tumores primários porque as CCL não seguem vias de resistência a fármacos ou os efeitos do microambiente sobre a resposta ao fármaco encontrada em tumores primários huma- nos. Para superar esses problemas, os inventores usaram modelos de PDX para melhorar o poder preditivo de modelos pré-clínicos.
[00369] Os PDX são criados quando o tecido canceroso do tumor primário de um paciente é implantado diretamente em um camundon- go imunodeficiente. Os PDX conseguem manter a histologia do paci- ente, incluindo a presença de células não tumorais (p. ex., células es- tromais) e, assim, simular melhor o microambiente tumoral. Em geral, os PDX refletem mais, portanto, a heterogeneidade e histologia de tu- mores primários do que xenoenxertos de CCL.
[00370] BCY6031 foi examinado em um xenoenxerto PDX de ade- nocarcinoma primário (LU-01-0046) derivado de um paciente com car- cinoma de pulmão de células não pequenas (CPNPC). LU-01-0046 demonstrou expressar níveis elevados de EphA2 usando o sequenci- amento de RNA. BCY6031 exibiu excelente eficácia no modelo de LU- 01-0046 e é, portanto, uma nova terapia promissora para o tratamento de câncer de pulmão de células não pequenas. (a) Braços de tratamento
[00371] O experimento foi delineado para comparar crescimento tumoral em animais tratados com veículo e animais tratados com BCY6031 a 5 mg/kg, 1x/semana, durante quatro semanas. Tabela 16 Gr n Tratamen- Dose Volume de Via de Esquema to (mg/kg) administra- adminis- ção (µL/g) tração 1 6 Veículo - 10 i.v. 2x/sem*1 se- mana 2 3 BCY6031 5 10 i.v. 1x/sem*4 se- manas Observação: n: número de animais; Volume de administração: ajustar o volume de administração com base no peso corporal. (b) Método experimental (i) Informação sobre PDX Tabela 17 Nome do Tipo de Velocidade de cresci- Arranjo RSQ Expres- modelo câncer mento do tumor são de EPH2 LU-01- CPNPC O tamanho do tumor po- 6,790 31,312 Alta 0046 de atingir 1000 mm3 em 40 dias após inoculação do tumor (ii) Inoculação do tumor
[00372] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com um fragmento do tumor LU-01-0046 de aproxima- damente 30 mm3. O tratamento com o fármaco foi iniciado quando o volume tumoral médio atingiu 943 mm3. O artigo em teste, a via de administração, a frequência de administração e os números de ani- mais em cada grupo são descritos acima. (iii) Preparação da formilação do artigo em teste Tabela 18 Artigo em Dose Formulação teste (mg/kg) Veículo -- Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH5 (sem DMSO) BCY6031 5 Dissolver 4,59 mg de BCY6031 em 4,498 mL do tampão de formilação para obter a solução estoque de BCY6031 1 mg/mL; Diluir 450 µL de BCY6031 1 mg/mL com 450 µL do tampão de formulação. (c) Resultados (i) Mortalidade, morbidade e ganho ou perda de peso corporal
[00373] O peso corporal dos animais foi monitorado regularmente como uma medida indireta de toxicidade. A variação do peso corporal em camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do tumor LU-01- 0046 que receberam BCY6031 é mostrada na Figura 1.
(ii) Curva de crescimento tumoral
[00374] A curva de crescimento tumoral é mostrada na Figura 2. (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00375] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCY6031 no modelo de PDX de LU-01-0046 foi calculada com base em medi- ções do volume tumoral no 7o dia após o início do tratamento. Tabela 19: Análise de inibição do crescimento tumoral (T/C e TGI) no Dia 7 Grupo Tratamento Volume tumoral T/Cb (%) TGI (%) Valor p (mm3)a 1 Veículo 2191±473 -- -- -- 2x/sem 2 BCY6031 463±158 21,1 138,6 p<0,05 5 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM. b. Inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tu- moral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral mé- dio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Discussão
[00376] O estudo avaliou a eficácia terapêutica de BCY6031 no modelo de PDX LU-01-0046. Os pesos corporais medidos são mostra- dos na Figura 1. Os volumes tumorais do grupo de tratamento em vá- rios momentos são mostrados na Tabela 19 e Figura 2.
[00377] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 2191 mm3 no 7o dia. BCY6031 a 5 mg/kg produziu ati- vidade tumoral potente com tumor medindo 463 mm3 (TGI=138,6%, p<0,05) em 7 dias. Além disso, o tratamento com BCY6031 erradicou completamente os tumores a partir de 32 dias e não houve recidiva do tumor após a suspensão da administração no 28o dia. BCY6031 não resultou em uma perda significativa de peso corporal (Figura 1) e não houve observações clínicas adversas em camundongos tratados com o fármaco por todo o estudo. Estudo 4: Eficácia in vivo de BCY6136 em modelos de xenoenxerto de
CDX
[00378] O estudo avaliou a eficácia terapêutica de BCY6136 em três modelos Derivados de Linhagem de Células de Câncer (CDX): a linhagem HT1080 fibrossarcoma, a linhagem MDA-MB-231 câncer de mama triplo negativo e a linhagem NCI-H1975 de câncer de pulmão de células não pequenas (CPNPC). (a) Método experimental
[00379] Camundongos Balb/c foram inoculados por via subcutânea com células tumorais no flanco direito e o tratamento com o fármaco começou quando a média do volume tumoral médio atingiu entre 150 e 200 mm3. As medições do tumor e análise estatística foram realizadas como descrito acima. Animais portadores do tumor foram tratados uma vez por semana com BCY6136 ou veículo. (b) Discussão
[00380] As Figuras 4-6 mostram que BCY6136 é eficaz nos mode- los de xenoenxerto de mama, pulmão e fibrossarcoma após adminis- tração uma vez por semana. O modelo HT1080 de fibrossarcoma:
[00381] No modelo HT1080, a regressão completa de crescimento do tumor foi alcançada em 14 dias, após a administração uma vez por semana de BCY6136 nos Dias 0 e 7 a 3 e 5 mg/kg (Figura 4). A admi- nistração uma vez por semana de BCY6136 a 2 mg/kg nos Dias 0 e 7 fez surgir estase tumoral (regressão parcial) (Figura 4). O tratamento com BCY6136 não resultou em uma perda significativa de peso corpo- ral (Inserção na Figura 4) nem houve observações clínicas adversas em camundongos tratados com o fármaco por todo o estudo. O modelo NCI-H1975 de CPNPC:
[00382] Regressão completa do crescimento tumoral no modelo
NCI-H1975 foi observada em torno de 28 dias após administração de BCY6136 2 e 3 mg/kg uma vez por semana (Figura 5). Após a sus- pensão da administração no Dia 35, não foi observada recidiva do tu- mor nos animais tratados com 3 mg/kg do Dia 35 ao Dia 72 quando finalizaram as medições no braço 3 mg/kg (Figura 5). A dose de BCY6136 a 2 mg/kg levou à regressão completa nesse modelo por volta de 28 dias. Após a suspensão da administração no Dia 35, não houve recidiva do tumor até em torno de 51 dias na dose de 2 mg/kg. Nesse nível de dose, recidiva moderada do tumor foi observada a par- tir de 51 dias até o encerramento do estudo no Dia 77. O tratamento com BCY6136 1 mg/kg fez surgir estase tumoral (regressão parcial) (Figura 5). O tratamento com BCY6136 não resultou em uma perda significativa de peso corporal (Inserção na Figura 5) nem houve obser- vações clínicas adversas em camundongos tratados com o fármaco por todo o estudo. O modelo MDA-MB-231 de mama:
[00383] Estase tumoral (regressão parcial) foi observada no modelo MDA-MB231 após administração uma vez por semana de 2 e 3 mg/kg a partir do Dia 0 ao Dia 45 (Figura 6). Alguma perda do peso corporal (atribuída à carga tumoral) nos animais tratados com 2 mg/kg (Inser- ção na Figura 6).
[00384] Esses resultados demonstram que BCY6136 faz surgir ini- bição profunda do crescimento tumoral em camundongos com xeno- enxertos CDX implantados de fibrossarcoma, mama e pulmão após administração uma vez ao dia [sic]. Estudo 5: Estudos de segurança no rato
[00385] Seis (6) ratos fêmeas foram designados aleatoriamente a 3 grupos de 2 ratos/grupo para determinar a toxicidade de BCY6136, depois de administrado por injeção de bolus IV a 5, 7,5 e 10 mg/kg nos Dias 1 e 8. O estudo foi finalizado no Dia 15.
[00386] Não foram observados efeitos significativos em parâmetros da coagulação (tempo da protrombina (segundos), tempo de trombo- plastina parcial ativada (segundos) ou níveis de fibrinogênio (g/L) em 2, 12 e 15 dias (dados não mostrados). Não foram relatados eventos de sangramento em vida nem foi detectada evidência de sangramento interno após exame patológico. Estudo 6: Estudos de segurança nos macacos cinomolgos
[00387] Conduziram-se estudos de toxicologia de vinte e oito dias com BCY6136 em macacos cinomolgos. BCY6136 foi administrado nas doses de 1,0 e 2,0 mg/kg nos dias 1, 8, 15 e 22. Os animais foram sacrificados e submetidos à necropsia no Dia 29 (7 dias depois da do- se final).
[00388] Não foram observados efeitos significativos em parâmetros da coagulação em relação ao basal em 18, 22 e 25 dias (dados não mostrados) e em 29 dias (Tabela 20). Não foram relatados eventos de sangramento em vida nem foi detectada evidência de sangramento interno após exame patológico. Tabela 20: Parâmetros de coagulação no Dia 29 após administração de BCY6136 a 1,0 e 2,0 mg/kg a macacos cinomolgos 1,0 mg/kg x 4 2,0 mg/kg x 4 Basal Dia 29 Basal Dia 29 PT(s) 13,4 11,7 9,4 9,7 PT(s) 11 9,2 11,2 11,0 APTT(s) 18,9 19,4 19,4 20,9 APTT(s) 16,1 15,7 18,7 18,2 FIB(g/L) 2,08 2,42 1,86 6,1 FIB(g/L) 2,28 2,35 1,82 3,1 Estudo 7: Estudo de eficácia in vivo de BCY6033 e BCY6136 e ADC no tratamento de xenoenxerto de PC-3 em camundongos Balb/c nude (a) Objetivo do estudo
[00389] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6033 e BCY6136 no tratamento de xenoenxerto de PC-3. (b) Experimental Design Gru- Tratamento n Dose Volume de admi- Via de ad- Esquema po (mg/kg) nistração (µL/g) ministração 1 Veículo 3 - 10 iv 1x/sem 2 BCY6136 3 1 10 iv 1x/sem 3 BCY6136 3 2 10 iv 1x/sem 4 BCY6136 3 3 10 iv 1x/sem 5 ADC 3 3 10 iv 1x/sem 6 BCY6033 3 3 10 iv 1x/sem (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Cultura celular
[00390] As células do tumor PC-3 serão mantidas em meio F12K suplementado com soro fetal bovino 10% inativado com calor a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 5% no ar. As células tumorais serão rotinei- ramente subcultivadas duas vezes por semana. As células desenvol- vendo-se em fase de crescimento exponencial serão colhidas e conta- das para inoculação do tumor. (ii) Inoculação do tumor
[00391] Cada camundongo será inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais PC-3 (10*106) para desenvolvimen- to do tumor. Os animais serão randomizados e o tratamento será inici- ado quando o volume tumoral médio atingir aproximadamente 150 mm3. A administração do artigo em teste e os números de animais em cada grupo são mostrados na tabela do desenho experimental a se- guir.
(iii) Preparação da formulação do artigo em teste Artigo em Conc. Formulação teste (mg/mL) Veículo - Acetato/ácido acético 50 mM, pH 5, sacarose 10% BCY6136 0,1 Diluir 90 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 810 µL de tampão de veículo 0,2 Diluir 180 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 720 µL de tampão de veículo 0,3 Diluir 270 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 630 µL de tampão de veículo ADC 0,3 Diluir 26 µL de estoque de ADC 10,47 mg/mL com 874 µL de tampão de ADC BCY6033 0,3 Diluir 270 µL de estoque de BCY6033 1 mg/mL com 630 µL de tampão de veículo (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00392] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados nas Figuras 7 a 9. (ii) Traçado do volume tumoral
[00393] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de PC-3 é mos- trado na Tabela 21.
Tabela 21: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo Gr Tratamento 0 2 4 7 9 11 14 16 18 21 1 Veículo, 149±9 235±9 377±9 718±30 1126±41 1431±79 1792±69 2070±15 1x/sem 2 2 BCY6136, 150±11 185±25 228±31 201±17 183±23 153±38 137±33 107±32 64±28 45±23 1 mpk, 1x/sem 3 BCY6136, 149±18 179±28 158±22 137±16 122±15 114±20 101±16 79±20 57±19 42±17 2 mpk, 1x/sem 4 BCY6136 149±2 155±8 144±16 132±20 107±28 94±23 83±22 70±27 38±16 35±17 3 mpk, 1x/sem 5 ADC 151±27 203±10 210±12 189±11 185±16 190±37 158±36 124±35 103±27 74±14
203/299 3 mpk, 1x/sem 6 BCY6033, 151±33 214±53 204±51 192±53 163±43 151±40 141±39 116±36 83±28 63±32 3 mpk, 1x/sem
Gr Tratamento 23 25 28 30 32 35 37 39 42 1 Veículo, 1x/sem 2 BCY6136, 35±18 28±14 37±19 34±17 42±21 42±23 43±21 28±14 18±9 1 mpk, 1x/sem 3 BCY6136, 21±11 22±12 22±12 24±12 33±16 22±11 26±14 22±12 16±9 2 mpk, 1x/sem 4 BCY6136 21±10 23±12 27±14 22±11 24±12 20±11 27±14 12±6 12±6 3 mpk, 1x/sem 5 ADC 53±16 50±22 46±23 70±35 78±39 53±27 60±30 53±27 40±22 3 mpk, 1x/sem
Gr Tratamento 0 2 4 7 9 11 14 16 18 21 6 BCY6033, 59±31 44±27 39±24 40±29 47±32 41±27 41±30 34±24 33±27 3 mpk, 1x/sem (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00394] A taxa de inibição do crescimento tumoral para os artigos em teste no modelo de xenoenxerto de PC-3 foi calculada com base em medições do volume tumoral em 16 dias após o início do tratamento. Tabela 22: Análise de inibição do crescimento tumoral Gr Tratamento Volume tumoral(mm3)a T/Cb (%) TGI (%) Valor p comparado com veículo 1 Veículo, 1x/sem 2070±152 -- -- -- 204/299 2 BCY6136, 107±32 5,2 102,2 p<0,001 1 mpk, 1x/sem 3 BCY6136, 79±20 3,8 103,6 p<0,001 2 mpk, 1x/sem 4 BCY6136, 70±27 3,4 104,1 p<0,001 3 mpk, 1x/sem 5 ADC, 124±35 6,0 101,4 p<0,001 3 mpk, 1x/sem 6 BCY6033, 116±36 5,6 101,8 p<0,001 3 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pe- lo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C).
(e) Sumário e discussão dos resultados
[00395] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de artigos em teste foi avaliada no modelo de xenoenxerto de PC-3. Os pesos corporais me- didos e volumes tumorais de todos os grupos de tratamento em vários momentos são mostrados nas Figuras 7 a 9 e Tabelas 21 e 22.
[00396] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 2070 mm3 no Dia 16. BCY6136 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV=107 mm3, TGI=102,2%, p<0,001), BCY6136 a 2 mg/kg, 1x/semana (TV=79 mm3, TGI=103,6%, p<0,001) e BCY6136 a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=70 mm3, TGI=104,1%, p<0,001) revelaram efeito antitumoral potente.
[00397] BCY6033 a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=116 mm3, TGI=101,8%, p<0,001) e ADC a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=124 mm3, TGI=101,4%, p<0,001) mostraram efeito antitumoral comparável.
[00398] Nesse estudo, o peso corporal dos animais foi monitorado regularmente. Todos os camundongos mantiveram bem os seus pesos corporais. Estudo 8. Estudo de eficácia in vivo de BCY6136 no tratamento de xe- noenxerto de PC-3 em camundongos Balb/c nude (a) Objetivo do estudo
[00399] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6136 no tratamento de xenoenxerto de PC-3 em camun- dongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento Dose Na Via de admi- Esquema (mg/kg) nistração 1 Veículo -- 4 i.v. 1x/sem x4 se- manas 2 BCY6136 0,167 4 i.v. 1x/sem x4 se- manas
Grupo Tratamento Dose Na Via de admi- Esquema (mg/kg) nistração 3b BCY6136 0,5 4 i.v. 1x/sem x4 se- manas 4 BCY6136 1,5 4 i.v. 1x/sem x4 se- manas 5b BCY6136 0,5 4 i.v. 2/2 sem x2 se- manas 6b BCY6136 1,5 4 i.v. 2/x sem x2 se- manas 7 EphA2-ADC 0,33 4 i.v. 1x/sem x4 se- manas 8 EphA2-ADC 1 4 i.v. 1x/sem x4 se- manas 9 EphA2-ADC 3 4 i.v. 1x/sem x4 se- manas 10c Docetaxel 15 4 i.v. 1x/sem x4 se- manas a. N, o número de animais em cada grupo. b. Depois do tratamento de 4 semanas demonstrado na tabela do de- senho experimental, os camundongos do grupo 3, 5 e 6 foram tratados com BCY6136 1,5 mg/kg, 1x/semana, a partir do Dia 52 durante o es- quema de monitoramento. c. Devido à perda intensa do peso corporal dos camundongos tratados com Docetaxel após a primeira administração, o tratamento foi sus- penso por 2 semanas, depois uma dose menor (Docetaxel, 10 mg/kg) foi feita no Dia 28. Depois disso, os camundongos foram tratados com BCY6136 1,5 mg/kg, 1x/semana, do Dia 42 ao Dia 70. (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Cultura celular
[00400] As células tumorais foram mantidas meio F-12K suplemen- tado com soro fetal bovino 10% inativado com calor a 37ºC em uma atmosfera de CO2 5% no ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células desenvolvendo-se em fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor. (ii) Inoculação do tumor
[00401] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais PC-3 (10 x 106) em 0,2 mL de PBS para desenvolvimento do tumor. 52 animais foram randomizados quando o volume tumoral médio atingiu 454 mm3. A administração do artigo em teste e os números de animais em cada grupo foram mos- trados na tabela do desenho experimental. (iii) Preparação da formulação do artigo em teste Artigo em Pureza Conc. Formulação teste (mg/mL) Veículo - - Histidina 25 mM, pH 7, sacarose 10% BCY6136 98,6% - Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH 5 1 Dissolver 2,70 mg de BCY6136 em 2,662 mL de tampão Acetato 0,3 Diluir 300 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 700 µL de tampão Acetato1 0,15 Diluir 600 µL de estoque de BCY6316 0,3 mg/mL com 600 µL de tampão Ace- tato 0,05 Diluir 200 µL de estoque de BCY6316 0,3 mg/mL com 1000 µL de tampão Acetato 0,0167 Diluir 66,7 µL de estoque de BCY6316 0,3 mg/mL com 1133,3 µL de tampão Acetato EphA2- - - Histidina 25 mM, pH 5,5 ADC 0,033 Diluir 9,3 µL de estoque de EphA2-ADC 4,24 mg/mL com 1191 µL de tampão His
Artigo em Pureza Conc. Formulação teste (mg/mL) 0,1 Diluir 28 µL de estoque de EphA2-ADC 4,24 mg/mL com 1172 µL de tampão His 0,3 Diluir 84,9 µL de estoque de EphA2- ADC 4,24 mg/mL com 1115 µL de tam- pão His Docetaxel - 10 Misturar 0,5 mL de Docetaxel 20 mg com 1,5 mL de tampão 1,5 Diluir 180 µL de estoque de Docetaxel 10 mg/mL com 1020 µL de tampão sali- no
1. Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH 5,3. Histidina 25 mM pH 5,5 (c) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00402] O Peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figura 10. (ii) Traçado do volume tumoral
[00403] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nude machos portadores do xenoenxerto de PC-3 é mos- trado na Tabela 23.
Tabela 23: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo (Dia 0 ao Dia 20) Gr.
Tratamento Dias após o início do tratamento 0 2 4 6 8 10 13 15 17 20 1 Veículo, 1x/sem 456±25 648±50 880 ±23 1022±29 1178±118 1327±133 1631±93 1868±90 2052±139 2364±102 2 BCY6136 450±33 631±55 695±78 739 ±39 850 ±68 904±73 975±47 1089±74 1124±92 1188±111 0,167 mpk, 1x/sem 3 BCY6136 451±47 622±96 519±70 460±55 398 ±50 329±38 260±33 249±33 231±38 234 ±42 0,5 mpk, 1x/sem 4 BCY6136 458±49 587±63 494±54 363±32 283 ±32 237±24 192±13 164±16 155±20 131 ±19 1,5 mpk, 1x/sem 5 BCY6136 454±37 643±25 531±37 458±33 411±32 382±49 430±88 522±124 560±129 530±147
209/299 0,5 mpk, 2/2 sem 6 BCY6136 452±42 590±75 457±49 375±44 328±47 242±63 206±61 197±62 182±55 128±36 1,5 mpk, 2/2 sem 1,5 mpk, 1x/sem 7 EphA2-ADC 457±43 636±57 712±70 792±78 870±87 900±58 1049±66 1242±123 1443±129 1637±181 0,33 mpk, 1x/sem 8 EphA2-ADC 450±49 617±48 673±50 721±61 782±78 755±67 840±93 913±91 978±100 981±100 1 mpk, 1x/sem 9 EphA2-ADC 452±60 593±98 643±141 593±106 433±103 290±81 268±64 232±60 225±66 184±62 3 mpk, 1x/sem 10 Docetaxel 453±62 584±72 632±56 636±48 568±50 408±31 374±26 388±36 361±25 419±31 15 mpk, 1x/sem
(iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00404] A taxa de inibição do crescimento tumoral para artigos em teste no modelo de xenoenxerto de PC-3 foi calculada com base em medições do volume tumoral em 20 dias após o início do tratamento. Tabela 24: Análise de inibição do crescimento tumoral Gr Tratamento Volume T/Cb TGI Valor p com- tumoral (%) (%) parado com (mm3)a veículo 1 Veículo, 1x/sem 2364±102 -- -- -- 2 BCY6136 1188±111 50,2 61,4 p<0,001 0,167 mpk, 1x/sem 3 BCY6136 234±42 9,9 111,4 p<0,001 0,5 mpk, 1x/sem 4 BCY6136 131±19 5,5 117,2 p<0,001 1,5 mpk, 1x/sem 5 BCY6136 530±147 22,4 96,0 p<0,001 0,5 mpk, 2/2 sem 6 BCY6136 128±36 5,4 117,0 p<0,001 1,5 mpk, 2/2 sem 7 EphA2-ADC 1637±181 69,2 38,1 p<0,001 0,33 mpk, 1x/sem 8 EphA2-ADC 981±100 41,5 72,2 p<0,001 1 mpk,1x/sem 9 EphA2-ADC 184±62 7,8 114,0 p<0,001 3 mpk,1x/sem 10 Docetaxel 419±31 17,7 101,8 p<0,001 15 mpk,1x/sem a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (d) Sumário e discussão dos resultados
[00405] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de artigos em teste foi avaliada no modelo de xenoenxerto de PC-3. Os pesos corporais me-
didos e os volumes tumorais de todos os grupos de tratamento em vá- rios momentos são mostrados na Figura 10 e Tabelas 23 e 24.
[00406] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 2364 mm3 no Dia 20. BCY6136 a 0,167 mg/kg, 1x/semana (TV=1188 mm3, TGI=61,4%, p<0,001), 0,5 mg/kg, 2/2 se- manas (TV=530 mm3, TGI=96,0%, p<0,001), 0,5 mg/kg, 1x/semana (TV=234 mm3, TGI=111,4%, p<0,001) e 1,5 mg/kg, 1x/semana (TV=131 mm3, TGI=117,2%, p<0,001) produziram atividade antitumo- ral significativa de maneira dependente da dose ou frequência da dose no Dia 20. BCY6136 a 1,5 mg/kg, 2/2 semanas (TV=128 mm3, TGI=117,0%, p<0,001) produziu atividade antitumoral comparável com BCY6136 1,5 mg/kg, 1x/semana. Dentre esses, os camundongos tra- tados com BCY6136, 0,5 mg/kg, 1x/semana, ou com BCY6136, 0,5 mg/kg, 2/2 semanas, mostraram recidiva óbvia do tumor depois de terminado o tratamento, mas o tratamento adicional com BCY6136, 1,5 mg/kg, 1x/semana, a partir do Dia 52, funcionou bem na regressão tu- moral. Os camundongos tratados com BCY6136, 1,5 mg/kg, 2/2 se- manas, também mostraram recidiva do tumor depois de terminado o tratamento, mas a administração adicional não funcionou na regressão completa do tumor. Os camundongos tratados com BCY6136, 1,5 mpk, 1x/semana, não mostraram recidiva do tumor até o Dia 48.
[00407] EphA2-ADC a 0,33 mg/kg, 1x/semana (TV=1637 mm3, TGI=38,1%, p<0,001), 1 mg/kg, 1x/semana (TV=981 mm3, TGI=72,2%, p<0,001) e 3 mg/kg, 1x/semana (TV=184 mm3, TGI=114,0%, p<0,001) produziram atividade antitumoral significativa de maneira dose- dependente no Dia 20. Os camundongos tratados com EphA2-ADC, 3 mg/kg, 1x/semana, não mostraram recidiva tumoral até o Dia 59.
[00408] Docetaxel a 15 mg/kg, 1x/semana (TV=419 mm3, TGI=101,8%, p<0,001) produziu atividade antitumoral significativa, mas causou perda intensa do peso corporal nos animais. Depois de terminado o tratamento, os camundongos mostraram recidiva óbvia do tumor. O tratamento com BCY6136, 1,5 mg/kg, 1x/semana, a partir do Dia 42, funcionou bem na regressão do tumor desses camundongos. Estudo 9. Teste de eficácia in vivo de BCY6033, BCY6136 e BCY6082 no tratamento de xenoenxerto de NCI-H1975 em camundongos Balb/c nude (a) Objetivo do estudo
[00409] O objetivo da pesquisa era avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6033, BCY6136 e BCY6082 no tratamento do modelo de xenoenxerto de NCI-H1975 em camundongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Via de Esquema (mg/kg) administra- adminis- ção (µL/g) tração 1 Veículo 3 -- 10 iv 1x/sem 2 BCY6033 3 1 10 iv 1x/sem 3 BCY6033 3 2 10 iv 1x/sem 4 BCY6033 3 3 10 iv 1x/sem 5 BCY6136 3 1 10 iv 1x/sem 6 BCY6136 3 2 10 iv 1x/sem 7 BCY6136 3 3 10 iv 1x/sem 8 BCY6082 3 2 10 iv 1x/sem 9 BCY6082 3 5 10 iv 1x/sem (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Cultura celular
[00410] As células desenvolvendo-se em fase de crescimento ex- ponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor. (ii) Inoculação do tumor
[00411] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais NCI-H1975 (10× 106) em 0,2 mL de PBS para desenvolvimento do tumor. 36 animais foram randomizados quando o volume tumoral médio atingiu 149 mm3. A administração do artigo em teste e os números de animais em cada grupo foram mos- trados na tabela do desenho experimental. (iii) Preparação da formulação do artigo em teste Dose Tratamento Formulação (mg/mL) Veículo Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH=5 Dissolver 6,71 mg de BCY6033 em 6,710 mL de 1 tampão de formulação Diluir 270 µL de BCY6033 1 mg/mL com 630 µL 0,3 de tampão de formulação BCY6033 Diluir 180 µL de BCY6033 1 mg/mL com 720 µL 0,2 de tampão de formulação Diluir 90 µL de BCY6033 1 mg/mL com 810 µL 0,1 de tampão de formulação Dissolver 3,79 mg de BCY6136 em 3,695 mL de 1 tampão de formulação Diluir 270 µL de BCY6136 1 mg/mL com 630 µL 0,3 de tampão de formulação BCY6136 Diluir 180 µL de BCY6136 1 mg/mL com 720 µL 0,2 de tampão de formulação Diluir 90 µL de BCY6136 1 mg/mL com 810 µL 0,1 de tampão de formulação Pesar e dissolver 4,30 mg de BCY6082 em 1 4,162 mL de tampão de formulação Diluir 450 µL de BCY6082 1 mg/mL com 450 µL BCY6082 0,5 de tampão de formulação Diluir 180 µL de BCY6082 1 mg/mL com 720 µL 0,2 de tampão de formulação (iv) Coleta de amostras
[00412] Em PG-D23, os tumores do Grupo 1 foram fixados para FFPE.
[00413] Em PG-D44, os tumores do Grupo 2 e 5 foram fixados para FFPE.
[00414] No final do estudo, os tumores do Grupo 6 foram fixados para FFPE. (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00415] O peso corporal e o crescimento tumoral são mostrados na Figuras 11 a 13. (ii) Traçado do volume tumoral
[00416] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de NCI-H1975 é mostrado na Tabela 25 a 29. Tabela 25: Traçado do volume tumoral (PG-D0~PG-D17) Gr. Tratamento Dias após o início do tratamento 0 2 4 7 9 11 14 17 1 Veículo, 148± 195± 297± 466± 732± 1028± 1278± 1543± 1x/sem 4 11 33 64 107 192 252 298 2 BCY6033, 149± 160± 207± 259± 330± 365± 341± 336± 1 mpk, 1x/sem 10 4 13 49 69 83 59 54 3 BCY6033, 149± 183± 276± 365± 405± 364± 319± 304± 2 mpk, 1x/sem 10 11 24 42 20 19 32 33 4 BCY6033, 149± 161± 207± 260± 270± 243± 187± 131± 3 mpk, 1x/sem 6 4 26 21 42 52 53 43 5 BCY6136, 150± 178± 232± 336± 400± 407± 299± 261± 1 mpk, 1x/sem 6 20 49 43 24 42 113 127 6 BCY6136, 150± 181± 237± 277± 297± 306± 256± 218± 2 mpk, 1x/sem 14 26 27 36 37 55 53 49 7 BCY6136, 148± 168± 231± 365± 390± 423± 319± 228± 3 mpk, 1x/sem 9 10 6 16 13 42 26 16 8 BCY6082, 148± 157± 223± 370± 447± 658± 906± 1123± 2 mpk, 1x/sem 5 4 19 84 102 188 332 410 9 BCY6082, 148± 176± 235± 378± 436± 510± 484± 491± 5 mpk, 1x/sem 6 12 19 59 68 82 78 103
Tabela 26: Traçado do volume tumoral (PG-D18~PG-D35) Gr.
Tratamento Dias após o início do tratamento 18 21 23 25 28 30 33 35 1 Veículo, 1864± 2371± -- -- -- -- -- -- 1x/sem 395 470 2 BCY6033, 278± 306± 343± 366± 466± 481± 619± 780± 1 mpk, 71 81 86 89 115 112 170 236 1x/sem 3 BCY6033, 172± 95± 61± 39± 13± 12± 6± 6± 2 mpk, 25 12 6 4 1 1 3 3 1x/sem 4 BCY6033, 75± 29± 20± 13± 6± 4± 1± 2± 3 mpk, 15 4 6 2 0 0 0 1 1x/sem 5 BCY6136, 215± 205± 197± 200± 202± 202± 230± 241± 1 mpk, 113 117 113 105 112 117 142 127 1x/sem 6 BCY6136, 149± 99± 69± 42± 30± 16± 20± 4± 2 mpk, 31 30 22 13 10 8 9 2 1x/sem 7 BCY6136, 149± 94± 50± 41± 21± 6± 10± 3± 3 mpk, 17 30 15 21 8 6 6 1 1x/sem 8 BCY6082, 1199± 1528± 1978± 2499± -- -- -- -- 2 mpk, 408 604 792 931 1x/sem 9 BCY6082, 471± 390± 368± 295± 227± -- -- -- 5 mpk, 143 133 122 102 86 1x/sem
Tabela 27: Traçado do volume tumoral (PG-D37~PG-D53) Gr.
Tratamento Dias após o início do tratamento 37 39 42 44 46 49 51 53 2 BCY6033, 877± 945± 1258± -- -- -- -- -- 1 mpk, 188 145 173 1x/sem 3 BCY6033, 3± 1± 1± 1± 1± 1± 1± 1± 2 mpk, 1 0 0 0 0 0 0 0 1x/sem 4 BCY6033, 0± 0± 0± 0± 1± 0± 1± 1± 3 mpk, 0 0 0 0 0 0 0 0 1x/sem 5 BCY6136, 277± 294± 351± -- -- -- -- -- 1 mpk, 149 159 188 1x/sem 6 BCY6136, 7± 2± 1± 3± 2± 3± 6± 14± 2 mpk, 4 1 0 1 1 2 3 10 1x/sem 7 BCY6136, 3± 2± 1± 0± 0± 0± 1± 1± 3 mpk, 3 1 0 0 0 0 0 0 1x/sem Tabela 28: Traçado do volume tumoral (PG-D56~PG-D74) Gr.
Tratamento Dias após o início do tratamento 56 58 60 63 65 67 70 72 74 3 BCY6033, 1± 1± 1± 1± 1± 2± 4± 7± -- 2 mpk, 0 0 0 0 0 1 3 6 1x/sem 4 BCY6033, 1± 1± 0± 0± 0± 0± 0± 0± -- 3 mpk, 0 0 0 0 0 0 0 0 1x/sem 6 BCY6136, 16± 27± 34± 45± 63± 71± 95± 111± 122± 2 mpk, 11 18 23 31 40 47 70 73 75 1x/sem
Gr. Tratamento Dias após o início do tratamento 56 58 60 63 65 67 70 72 74 7 BCY6136, 1± 1± 1± 0± 0± 0± 0± 0± -- 3 mpk, 0 0 0 0 0 0 0 0 1x/sem Tabela 29: Traçado do volume tumoral (PG-D77~PG-D98) Gr. Tratamento Dias após o início do tratamento 77 81 84 88 91 95 98 6 BCY6136, 208± 337± 501± 626± 856± 1035± 1266± 2 mpk, 112 123 172 182 245 169 39 1x/sem (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00417] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCY6033, BCY6136 e BCY6082 no modelo de xenoenxerto de NCI-H1975 foi calculada com base em medições do volume tumoral em 21 dias após o início do tratamento. Tabela 30: Análise de inibição do crescimento tumoral Gr Tratamento Volume tumo- T/Cb (%) TGI (%) Valor p ral (mm3)a 1 Veículo, 2371±470 -- -- -- 1x/sem 2 BCY6033, 306±81 12,9 92,9 p<0,001 1 mpk, 1x/sem 3 BCY6033, 95±12 4,0 102,5 p<0,001 2 mpk, 1x/sem 4 BCY6033, 29±4 1,2 105,4 p<0,001 3 mpk, 1x/sem 5 BCY6136, 205±117 8,6 97,5 p<0,001 1 mpk, 1x/sem 6 BCY6136, 99±30 4,2 102,3 p<0,001 2 mpk, 1x/sem 7 BCY6136, 94±30 4,0 102,4 p<0,001 3 mpk, 1x/sem
Gr Tratamento Volume tumo- T/Cb (%) TGI (%) Valor p ral (mm3)a 8 BCY6082, 1528±604 64,4 37,9 p>0,05 2 mpk, 1x/sem 9 BCY6082, 390±133 16,4 89,1 p<0,001 5 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00418] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCY6033, BCY6136 e BCY6082 foi avaliada no modelo de xenoenxerto de NCI- H1975. Os pesos corporais medidos e os volumes tumorais de todos os grupos de tratamento em vários momentos são mostrados nas Fi- guras 11 a 13 e Tabelas 25 a 30.
[00419] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 2371 mm3 no Dia 21. BCY6033 a 1 mg/kg (TV=306 mm3, TGI=92,9%, p<0,001), 2 mg/kg (TV=95 mm3, TGI=102,5%, p<0,001) e 3 mg/kg (TV=29 mm3, TGI=105,4%, p<0,001) produziram atividade antitumoral dose-dependente. BCY6033 a 2 mg/kg e 3 mg/kg erradicou os tumores ou fez com que o tumor regredisse para tamanho pequeno, o tratamento foi suspenso a partir do Dia 35, e os tumores não mostraram recidiva evidente no monitoramento seguinte de 5-6 semanas.
[00420] BCY6136 a 1 mg/kg (TV=205 mm3, TGI=97,5%, p<0,001), 2 mg/kg (TV=99 mm3, TGI=102,3%, p<0,001) e 3 mg/kg (TV=94 mm3, TGI=102,4%, p<0,001) produziu atividade tumoral potente. BCY6136 a 2 mg/kg e 3 mg/kg erradicou os tumores ou fez com que o tumor re- gredisse para tamanho pequeno. O tratamento foi suspenso a partir do Dia 35, e os tumores no grupo 3 mg/kg grupo não mostraram recidiva evidente no monitoramento seguinte de 5-6 semanas, no entanto, tu- mores no grupo 2 mg/kg mostram recidiva óbvia e não mostraram ini- bição tumoral significativa quando reiniciada a administração.
[00421] BCY6082 a 2 mg/kg (TV=1528 mm3, TGI=37,9%, p>0,05) não mostrou atividade antitumoral óbvia, BCY6082 a 5 mg/kg (TV=390 mm3, TGI=89,1%, p<0,001) produziu atividade antitumoral significati- va.
[00422] Nesse estudo, um camundongo tratado com BCY6033 3 mg/kg perdeu mais de 15% do peso corporal durante o monitoramen- to, outros camundongos mantiveram bem o peso corporal. Estudo 10. Estudo de eficácia in vivo de BCY6136 no modelo de PDX de LU-01-0251 em camundongos Balb/c nude (a) Objetivo do estudo
[00423] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6136 no modelo de PDX de LU-01-0251 em camundongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Via de Esquema (mg/kg) administração adminis- (µL/g) tração 1 Veículo 5 -- 10 iv 1x/sem 2 BCY6136 5 1 10 iv 1x/sem 3 BCY6136 5 2 10 iv 1x/sem 4 BCY6136 5 3 10 iv 1x/sem 5 ADC 5 3 10 iv 1x/sem (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Inoculação do tumor
[00424] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com um fragmento tumoral LU-01-0251 (~30 mm3) para desenvolvimento do tumor. O tratamento foi iniciado quando o volume tumoral médio atingiu 174 mm3 para estudo de eficácia. A administra-
ção do artigo em teste e o número de animais em cada grupo são mostrados na tabela do desenho experimental. (ii) Preparação da formulação do artigo em teste Artigo em Conc. Formulação teste (mg/mL) Veículo -- Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH 5 BCY6136 0,3 Dissolver 6,11 mg de BCY6136 em 20 mL de tampão Acetato1 0,2 Diluir 940 µL de estoque de BCY6316 0,3 mg/mL com 470 µL de tampão Acetato 0,1 Diluir 470 µL de estoque de BCY6316 0,3 mg/mL com 940 µL de tampão Acetato ADC 0,3 Diluir 43 µL de estoque de ADC 10,47 mg/mL com 1457 µL de tampão ADC2
1. Tampão Acetato: Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH 5
2. Tampão ADC: Histidina 20 mM, pH 5,5 (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00425] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figura 14. (ii) Traçado do volume tumoral
[00426] Volume tumoral médio no Dia 28 após o início do tratamen- to in camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de LU-01-0251 é mostrado na Tabela 31. Tabela 31: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo Dia Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Veículo BCY6136, BCY6136, BCY6136, ADC, 1 mpk, 2 mpk, 3 mpk, 3 mpk, 1x/sem 1x/sem 1x/sem 1x/sem 0 174±17 175±15 174±17 175±14 174±16 3 264±33 230±29 205±21 187±19 227±12 7 403±68 281±55 154±21 118±13 239±42
Dia Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Veículo BCY6136, BCY6136, BCY6136, ADC, 1 mpk, 2 mpk, 3 mpk, 3 mpk, 1x/sem 1x/sem 1x/sem 1x/sem 10 562±83 370±104 111±19 72±12 241±46 14 777±163 362±104 62±17 30±5 191±47 17 1021±246 437±136 46±13 17±3 139±39 21 1472±342 526±167 30±18 4±3 101±31 24 1790±417 491±132 32±24 1±1 70±23 28 2208±512 499±128 32±30 0±0 39±14 (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00427] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCY6136 e ADC no modelo de PDX de LU-01-0251 foi calculada com base em medições do volume tumoral em 28 dias após o início do tratamento. Tabela 32: Análise de inibição do crescimento tumoral Grupo Tratamento Volume tumoral T/Cb (%) TGI (%) Valor p (mm3)a 1 Veículo, 1x/sem 2208±512 -- -- -- 2 BCY6136, 1 499±128 22,6 84,0 p<0,001 mpk, 1x/sem 3 BCY6136, 2 32±30 1,4 107,0 p<0,001 mpk, 1x/sem 4 BCY6136, 3 0±0 0,0 108,6 p<0,001 mpk, 1x/sem 5 ADC, 3 mpk, 39±14 1,8 106,6 p<0,001 1x/sem a. Média ± SEM; b. A inibição do crescimento tumoral é calculada divi- dindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo vo- lume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00428] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCY6136 e ADC foi avaliada no modelo de PDX de LU-01-0251 PDX. O peso corporal me-
dido e o volume tumoral de todos os grupos de tratamento em vários momentos são mostrados na Figura 14 e Tabelas 31 e 32.
[00429] Nesse estudo, o volume tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 2208 mm3 no Dia 28 após o início do tra- tamento. BCY6136 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV=499 mm3, TGI=84,0%, p<0,001), 2 mg/kg, 1x/semana (TV=32 mm3, TGI=107,0%, p<0,001) e 3 mg/kg, 1x/semana (TV=0 mm3, TGI=108,6%, p<0,001) produziram atividade antitumoral dose-dependente. ADC a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=39 mm3, TGI=106,6%, p<0,001) mostrou atividade antitumoral significativa. Estudo 11: Estudo de eficácia in vivo de BCY6136 no modelo de PDX de LU-01-0251 em camundongos Balb/c nude (a) Objetivo do estudo
[00430] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6136 no modelo de PDX de LU-01-0251 em camundongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Via de Esquema (mg/kg) administra- adminis- ção (µL/g) tração 1 Veículo 5 -- 10 iv 1x/sem*21 2 BCY6136 5 1 10 iv 1x/sem*28 3a BCY6136 5 2 10 iv 1x/sem*70 4b BCY6136 5 3 10 iv 1x/sem*56 5c ADC 5 3 10 iv 1x/sem*70 a. O esquema de administração foi mantido do Dia 0 ao Dia 70 para todos os camundongos desse grupo, então, o camundongo 3-2 e o camundongo 3-4 receberam ainda BCY6136 3 mg/kg, 1x/semana, a partir do Dia 77 enquanto o tratamento dos outros 3 camundongos foi suspenso. O esquema de administração foi mantido do Dia 0 ao Dia 56 para todos os camundongos desse grupo.
b. O esquema de administração foi mantido do Dia 0 ao Dia 70 para todos os camundongos desse grupo. (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Inoculação do tumor
[00431] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com fragmento tumoral LU-01-0251 (~30 mm3) para de- senvolvimento do tumor. O tratamento foi iniciado quando o volume tumoral médio atingiu 960 mm3 para estudo de eficácia. A administra- ção do artigo em teste e o número de animais em cada grupo são mostrados na tabela do desenho experimental. (ii) Preparação da formulação do artigo em teste Artigo Conc. Formulação em teste (mg/mL) Veículo -- Histidina 25 mM, sacarose 10%, pH 7 BCY613 0,3 BCY6136 0,3 mg/mL foi preparado como no 6 Estudo 10 acima 0,2 Diluir 940 µL de estoque de BCY6316 0,3 mg/mL com 470 µL de tampão His1 0,1 Diluir 470 µL de estoque de BCY6316 0,3 mg/mL com 940 µL de tampão His ADC 0,3 Diluir 43 µL estoque de ADC 10,47 mg/mL com 1457 µL de tampão ADC2
1. Tampão His: Histidina 25 mM, sacarose 10%, pH 7
2. Tampão ADC: Histidina 20 mM, pH 5,5 (iii) Coleta de amostras
[00432] O tumor do camundongo no 3-2 foi coletado para FFPE no Dia 94. Os tumores dos camundongos no 5-2 e 5-3 foram coletados e incorporados em 1 bloco FFPE no Dia140. (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00433] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figura 15.
(ii) Traçado do volume tumoral
[00434] O volume tumoral médio do Dia 0 ao Dia 28 após o início do tratamento em camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de LU-01-0251 é mostrado na Tabela 33. Tabela 33: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo Dia Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Veículo BCY6136, BCY6136, BCY6136, ADC, 1 mpk, 2 mpk, 3 mpk, 3 mpk, 1x/sem 1x/sem 1x/sem 1x/sem 0 962±102 963±97 962±137 960±103 959±124 3 1176±108 1003±121 973±105 989±128 1043±158 7 1351±142 1056±151 873±125 890±98 1100±156 10 1591±179 1122±139 722±157 674±96 1172±188 14 1951±225 1417±191 503±151 342±64 1228±174 17 2301±344 1672±262 398±160 216±43 1143±186 21 1794±328 307±169 94±26 996±187 24 1867±408 261±168 62±14 867±178 28 2120±483 217±167 45±16 713±178 (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00435] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCY6136 e ADC no modelo de PDX de LU-01-0251 foi calculada com base em medições do volume tumoral em 17 dias após o início do tratamento. Tabela 34: Análise de inibição do crescimento tumoral Grupo Tratamento Volume tumo- T/Cb (%) TGI (%) Valor p ral (mm3)a 1 Veículo, 1x/sem 2301±344 -- -- -- 2 BCY6136, 1 1672±262 72,7 47,0 p>0,05 mpk, 1x/sem 3 BCY6136, 2 398±160 17,3 142,1 p<0,001 mpk, 1x/sem 4 BCY6136, 3 216±43 9,4 155,6 p<0,001 mpk, 1x/sem 5 ADC, 3 mpk, 1143±186 49,7 86,3 p<0,01 1x/sem a. Média ± SEM; b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00436] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCY6136 e ADC foi avaliada no modelo de PDX LU-01-0251. O peso corporal medido e o volume tumoral de todos os grupos de tratamento em vários momen- tos são mostrados na Figura 15 e Tabelas 33 e 34.
[00437] Nesse estudo, o tratamento foi iniciado quando o volume tumoral médio atingiu 960 mm3. No 17o dia após o início do tratamen- to, o volume tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 2301 mm3. BCY6136 a 1 mg/kg, 1x/semana, (TV=1672 mm3, TGI=47,0%, p＞0,05) não mostrou atividade antitumoral óbvia; BCY6136 a 2 mg/kg, 1x/semana, (TV=398 mm3, TGI=142,1%, p<0,001) e 3 mg/kg, 1x/semana, (TV=216 mm3, TGI=155,6%, p<0,001) produziram atividade antitumoral dose-dependente no Dia 17.
[00438] Depois do tratamento de 70 dias com BCY6136 a 2 mg/kg, 1x/semana, 3 em 5 desses camundongos mostraram regressão com- pleta do tumor e os outros 2 camundongos, recidiva tumoral evidente do Dia 42 ao Dia 77. Então, tratamento adicional com BCY6136 3 mg/kg, 1x/semana, foi realizado para os dois tumores com recidiva e, a partir do 7 dia, um dos tumores mostrou regressão óbvia enquanto o outro revelou resistência ao tratamento.
[00439] Após o tratamento de 56 dias com BCY6136 a 3 mg/kg, 1x/semana, todos os camundongos desse grupo mostraram regressão tumoral completa.
[00440] ADC a 3 mg/kg, 1x/semana, (TV=1143 mm3, TGI=86,3%, p<0,01) mostrou atividade antitumoral óbvia no 17o dia e, depois de outro tratamento por 53 dias, esses camundongos mostraram mais regressão tumoral, mas não completa.
[00441] Nesse estudo, alguns camundongos mostraram perda súbi- ta do peso corporal, a qual pode ter relação com a alimentação de lon- go prazo dos camundongos com deficiência imune. Estudo 12: Estudo de eficácia in vivo de BCY6033, BCY6136, BCY6082 e BCY6031 no modelo de PDX LU-01-0046 de CPNPC em camundongos Balb/c nude (a) Objetivo do estudo
[00442] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6033, BCY6136, BCY6082 e BCY6031 em tumores gran- des de PDX LU-01-0046 PDX em camundongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Via de Esquema (mg/kg) administração adminis- (µL/g) tração BCYs 1 Veículo 5 -- 10 iv 1x/sem 2 BCY6082 5 1 10 iv 1x/sem 3 BCY6082 5 3 10 iv 1x/sem 4 BCY6033 5 1 10 iv 1x/sem 5 BCY6033 5 3 10 iv 1x/sem 6 BCY6136 5 1 10 iv 1x/sem 7 BCY6136 5 3 10 iv 1x/sem 8 ADC 5 3 10 iv 1x/sem 9 BCY6031 5 3 10 iv 1x/sem (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Inoculação do tumor
[00443] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com fragmento tumoral LU-01-0046 (~30 mm3) para de- senvolvimento do tumor. O tratamento foi iniciado quando o volume tumoral médio atingiu 955 mm3, para o estudo de BT17BDCs, e 1039 mm3 para o estudo de BCYs. A administração do artigo em teste e os números de animais em cada grupo são mostrados na tabela do dese- nho experimental. (ii) Preparação da formulação do artigo em teste Artigo em Conc. Formulação teste (mg/mL) Veículo - Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH 5 BCY6033 0,1 Diluir 150 µL de estoque de BCY6033 1 mg/mL com 1350 µL de tampão Acetato1 0,3 Diluir 450 µL de estoque de BCY6033 1 mg/mL com 1050 µL de tampão Acetato BCY6136 0,1 Diluir 150 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 1350 µL de tampão Acetato 0,3 Diluir 450 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 1050 µL de tampão Acetato BCY6082 0,1 Diluir 150 µL de estoque de BCY6082 1 mg/mL com 1350 µL de tampão Acetato 0,3 Diluir 450 µL de estoque de BCY6082 1 mg/mL com 1050 µL de tampão Acetato BCY6031 0,3 Dissolver 5,72 mg de BCY6031 em 5,6 mL de tampão Acetato para produzir estoque de 1 mg/mL. Diluir 450 µL BCY6031 1 mg/mL com 1050 µL de tampão Acetato ADC 0,3 Diluir 43 µL de solução estoque de ADC 10,47 mg/mL para 1457 µL com tampão 2
1. Tampão Acetato: Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH5
2. Dissolver 0,419 g de cloridrato de Histidina em 100mL de água. Usar HCl 1M pra ajustar o pH para 5,5 (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00444] Peso corporal e curva de crescimento tumoral são mostra- dos na Figura 16. (ii) Traçado do volume tumoral
[00445] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nude fêmeas portadores de LU-01-0046 é mostrado na Ta- bela 35.
Tabela 35: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo (Seção de BCYs) Grupo Tratamento Dias após o início do tratamento 0 4 8 11 15 18 22 1 Veículo, 1044±115 1762±178 2404±262 -- -- -- -- 1x/sem 2 BCY6082, 1049±133 1592±178 2279±168 -- -- -- -- 1 mpk, 1x/sem 3 BCY6082, 1033±111 1040±124 1294±182 1298±101 1849±189 2052±168 1999±425 3 mpk, 1x/sem 4 BCY6033, 1030±124 1173±227 1791±324 2408±484 -- -- --
228/299 1 mpk, 1x/sem 5 BCY6033, 1046±128 555±85 441±144 182±76 163±94 114±54 88±76 3 mpk, 1x/sem 6 BCY6136, 1037±130 1163±146 1927±283 2483±530 -- -- -- 1 mpk, 1x/sem 7 BCY6136, 1036±100 784±146 548±107 362±110 325±122 275±152 233±187 3 mpk, 1x/sem 8 ADC, 1033±114 1155±230 2200±505 -- -- -- -- 3 mpk, 1x/sem 9 BCY6031, 1042±117 820±149 1319±233 901±188 672±198 522±315 515±323 3 mpk, 1x/sem Observação: O traçado do volume tumoral não mostrou dados após o 22o dia para os grupos 3, 5, 7 e 9.
(iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00446] A taxa de inibição do crescimento tumoral para artigos em teste no modelo de PDX LU-01-0046 foi calculada com base em medi- ções do volume tumoral no Dia 22 e Dia 28, respectivamente, para o estudo das duas seções após o início do tratamento. Tabela 36: Análise de inibição do crescimento tumoral (Seção de BCYs no Dia 22) Grupo Tratamento Volume tumoral T/Cb (%) TGI (%) Valor p (mm3)a 1 Veículo, 6186±596* -- -- -- 1x/sem 2 BCY6082, 5805±428* 93,8 7,5 p>0,05 1 mpk, 1x/sem 3 BCY6082, 1999±425 32,3 81,2 p<0,01 3 mpk, 1x/sem 4 BCY6033, 4384±881* 70,9 34,8 p>0,05 1 mpk, 1x/sem 5 BCY6033, 88±76 1,4 118,6 P<0,001 3 mpk, 1x/sem 6 BCY6136, 4564±981* 73,8 31,4 p>0,05 1 mpk, 1x/sem 7 BCY6136, 233±187 3,8 115,6 p<0,001 3 mpk, 1x/sem 8 ADC, 5446±1250* 88,0 14,2 p>0,05 3 mpk, 1x/sem 9 BCY6031, 515±323 8,3 110,2 p<0,001 3 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM; b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo tratado pelo volume tumoral médio do grupo controle (T/C). *Alguns grupos foram encerrados antes do Dia 22, e o tamanho do tumor foi calculado por aquisição da equação de crescimento expo-
nencial conforme abaixo: Grupo veículo: Y = 995,4 × exp (0,1134 × X). BCY6082, grupo 1 mpk: Y = 939,1 × exp (0,1128 × X). BCY6033, grupo 1 mpk: Y = 846,6 × exp (0,0945 × X). BCY6136, grupo 1 mpk: Y = 855,0 × exp (0,0974 × X). ADC, grupo 3 mpk: Y = 757,4× exp (0,1312 × X). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00447] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de artigos em teste foi avaliada em tumores LU-01-0046 grandes. Os pesos corporais medi- dos e os volumes tumorais de todos os grupos de tratamento em vá- rios momentos são mostrados na Figura 16 e Tabelas 35 e 36.
[00448] No estudo de BCYs, o tamanho tumoral médio de camun- dongos tratados com veículo foi calculado como 6186 mm3 no Dia 22. BCY6082, BCY6033, BCY6136 a 1 mg/kg e ADC a 3mg/kg não mos- traram atividade antitumoral óbvia quando iniciado o tratamento a par- tir do tamanho tumoral de 1000mm3.
[00449] BCY6082 (TV=1999 mm3, TGI=81,2%, p<0,01), BCY6033 (TV=88 mm3, TGI=118,6%, p<0,001), BCY6136 (TV=233 mm3, TGI=115,6%, p<0,001) e BCY6031 (TV=115 mm3, TGI=110,2%, p<0,001) a 3 mg/kg produziram atividade antitumoral significativa. Den- tre estes, BCY6033 e BCY6136 erradicaram completamente 2/5 e 4/5 tumores. Estudo 13: Eficácia in vivo de BCY6136 em camundongos Balb/c nude portadores do modelo de PDX LU-01-0046 de CPNPN (a) Objetivo do estudo
[00450] O objetivo da pesquisa era avaliar a eficácia terapêutica in vivo de BCY6136 em camundongos Balb/c nude portadores do modelo de PDX LU-01-0046 de CPNPN. (b) Desenho experimental
Grupo Tratamento n Dose Via de adminis- Esquema (mg/kg) tração 1 Veículo 5 -- i.v. 1x/sem*2 s 2 BCY6136 5 1 i.v. 1x/sem *3 s 3 BCY6136 5 2 i.v. 1x/sem *4 s 4 BCY6136 5 3 i.v. 1x/sem *4 s 5 ADC 5 3 i.v. 1x/sem *3 s 6 ADC 5 5 i.v. 1x/sem *3 s Observação: Os grupos foram encerrados quando o volume tumoral médio atingiu mais de 2000 mm3 e os tumores foram recolhidos para FFPE: Grupo 1 em PG-D14, grupo 5 em PG-D18, grupo 2 e 6 em PG- D21 e grupo 3 e 4 em PG-D31. (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Inoculação do tumor
[00451] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com um determinado tipo de fragmento tumoral (~30 mm3) for desenvolvimento do tumor. Os tratamentos foram iniciados quando o volume tumoral médio atingiu aproximadamente 198 mm3. A administração do artigo em teste e os números de animais em cada grupo são mostrados na tabela do desenho experimental. (ii) Preparação da formulação do artigo em teste
Gr Compos- Dose Con. Formulação tos (mg/kg) (mg/mL) 1 Veículo - - Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH 5 (sem DMSO) 2 BCY6136 1 0,1 Dissolver 10,93 mg de BCY6136 em 10,766 mL de ve- ículo, submeter à ultrassonica- ção simplesmente para produzir a solução estoque de BCY6136 1 mg/mL Diluir 150 µL de solução esto- que de BCY6136 1 mg/mL com 1350 µL de veículo 3 BCY6136 2 0,2 Diluir 300 µL de solução esto- que de BCY6136 1 mg/mL com 1200 µL de veículo 4 BCY6136 3 0,3 Diluir 450 µL de solução esto- que de BCY6136 1 mg/mL com 1050 µL de volume veículo Tampão 2: Dissolver 0,419 g de cloridrato de histidina em 100 mL de água, usar HCl 1 M para ajustar o pH para 5,5 5 ADC 3 0,3 Diluir 43 µL de solução estoque de ADC 10,47 mg/mL com 1457 µL de tampão 2 6 ADC 5 0,5 Diluir 71,6 µL de solução esto- que de ADC 10,47 mg/mL com 1428,4 µL de tampão 2 Observação: A formilação para administração frequentemente é prepa- rada fresca oportunamente. (iii) Coleta de amostras
[00452] Os grupos foram encerrados quando o volume tumoral mé- dio atingiu mais de 2000 mm3 e os tumores foram recolhidos para FFPE depois da última medição: Grupo 1 em PG-D14, grupo 5 em PG- D18, grupo 2 e 6 em PG-D21 e grupo 3 e 4 em PG-D31.
(d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00453] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figura 17. (ii) Traçado do volume tumoral
[00454] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nude fêmeas portadores do modelo de PDX LU-01-0046 de CPNPN é mostrado na Tabela 37. Tabela 37: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo (mm3) Gr 1 2 3 4 5 6 Trata- Veículo BCY6136 BCY6136 BCY6136 ADC ADC mento 1x/sem 1 mpk, 2 mpk, 3 mpk, 3 mpk, 5 mpk, 1x/sem 1x/sem 1x/sem 1x/sem 1x/sem 0 201 ± 37 198 ± 39 201 ± 40 200 ± 46 195 ± 28 195 ± 40 3 441 ± 82 310 ± 59 283 ± 77 155 ± 40 418 ± 99 389 ± 68 7 927 ± 171 547 ± 88 423 ± 132 74 ± 19 643 ± 159 596 ± 116 10 1546 ± 747 ± 121 321 ± 108 31 ± 8 938 ± 230 882 ± 134 377 14 2307 ± 1058 ± 264 ± 95 26 ± 11 1475 ± 1215 ± 594 140 466 193 17 - 1390 ± 127 ± 41 26 ± 13 2281 ± 1576 ± 205 556 228 21 - 2138 ± 118 ± 34 64 ± 42 - 2049 ± 301 242 24 - - 101 ± 40 99 ± 63 - - 28 - - 255 ± 140 276 ± 176 - - 31 -- - 582 ± 346 477 ± 283 - - (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00455] A taxa de inibição do crescimento tumoral para artigos em teste em camundongos Balb/c nude portadores do modelo de PDX LU- 01-0046 foi calculada com base no volume tumoral medido em PG- D14.
Tabela 38: Análise de inibição do crescimento tumoral Gr Tratamento Volume tu- T/C (%)b TGI Valor p comparado moral (mm3)a (%)c com veículo 1 Veículo 2307 ± 594 -- -- -- 1x/sem 2 BCY6136 1058 ± 140 45,9 59,1 p<0,05 1 mpk, 1x/sem 3 BCY6136 264 ± 95 11,4 97,0 p<0,001 2 mpk, 1x/sem 4 BCY6136 26 ± 11 1,1 108,3 p<0,001 3 mpk, 1x/sem 5 ADC 1475 ± 466 63,9 39,2 p>0,05 3 mpk, 1x/sem 6 ADC 1215 ± 193 52,7 51,6 p>0,05 5 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral foi calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). c. TGI foi calculada para cada grupo usando a fórmula: TGI (%) = [1- (Ti-T0)/ (Vi-V0)] ×100 (e) Sumário e discussão dos resultados
[00456] No presente estudo, a eficácia terapêutica de artigos em teste foi avaliada no modelo de PDX LU-01-0046. Os pesos corporais medidos e os volumes tumorais de todos os grupos de tratamento em vários momentos foram mostrados na Figura 17 e Tabelas 37 e 38.
[00457] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 2307 mm3 em PG-D14. BCY6136 a 1 mg/kg (TV=1058 mm3, TGI=59,1%, p<0,05), a 2 mg/kg (TV=264 mm3, TGI=97,0%, p<0,001) e a 3 mg/kg (TV=26 mm3, TGI=108,3%, p<0,001) produziram atividade antitumoral dose-dependente. ADC a 3 mg/kg e 5 mg/kg não mostrou atividade antitumoral óbvia (p>0,05).
[00458] Nesse estudo, todos os animais do grupo mantiveram bem o peso corporal. Estudo 14: Estudo de eficácia in vivo de BCY6033, BCY6136, BCY6082, BCY6173, BCY6175 e BCY6031 no modelo de PDX LU-01- 0046 de CPNPC em camundongos Balb/c nude (a) Objetivo do estudo
[00459] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de artigos em teste no modelo de PDX LU-01-0046 de CPNPC em camundongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Via de Esquema (mg/kg) administração adminis- (µL/g) tração Parte 1 1 Veículo 5 -- 10 iv 1x/sem 2 BCY6033 5 1/2 10 iv 1x/sem 3 BCY6033 5 3 10 iv 1x/sem 4 BCY6136 5 1/2 10 iv 1x/sem 5 BCY6136 5 3 10 iv 1x/sem 6 BCY6082 5 1 10 iv 1x/sem 7 BCY6082 5 3 10 iv 1x/sem Parte 2 8 Veículo 5 -- 10 iv 1x/sem 9 BCY6173 5 1 10 iv 1x/sem 10 BCY6173 5 3 10 iv 1x/sem 11 BCY6175 5 3 10 iv 1x/sem 12 BCY6031 5 3 10 iv 1x/sem (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Inoculação do tumor
[00460] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com fragmento tumoral LU-01-0046 (~30 mm3) para de- senvolvimento do tumor. O tratamento foi iniciado quando o volume tumoral médio atingia 200 mm3, no estudo da Parte 1, e 192 mm3 no estudo da Parte 2. A administração do artigo em teste e os números de animais em cada grupo são mostrados na tabela do desenho expe- rimental. (ii) Preparação da formulação do artigo em teste Artigo em Conc. Formulação teste (mg/mL) Veículo - Acetato 50mM, sacarose 10% pH 5 BCY6033 0,1 Diluir 150 µL de estoque de BCY6033 1 mg/mL com 1350 µL de tampão Acetato1 0,3 Diluir 450 µL de estoque de BCY6033 1 mg/mL com 1050 µL de tampão Acetato BCY6136 0,1 Diluir 150 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 1350 µL de tampão Acetato 0,3 Diluir 450 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 1050 µL de tampão Acetato BCY6082 0,1 Diluir 150 µL de estoque de BCY6082 1 mg/mL com 1350 µL de tampão Acetato 0,3 Diluir 450 µL de estoque de BCY6082 1 mg/mL com 1050 µL de tampão Acetato BCY6173 0,1 Dissolver 3,65 mg de BCY6173 em 3,5 mL de tampão Acetato para produzir estoque de 1 mg/mL. Diluir 150 µL BCY6173 1 mg/mL com 1350 µL de tampão Acetato 0,3 Diluir 450 µL de estoque de BCY6173 1 mg/mL com 1050 µL de tampão Acetato BCY6175 0,3 Dissolver 3,02 mg de BCY6175 em 2,9 mL de tampão Acetato para produzir estoque de 1 mg/mL. Diluir 450 µL BCY6175 1 mg/mL com 1050 µL de tampão Acetato BCY6031 0,3 Dissolver 5,72 mg de BCY6031 em 5,6 mL de tampão Acetato para produzir estoque de 1 mg/mL. Diluir 450 µL de BCY6031 1 mg/mL com 1050 µL de tampão Acetato
1. Tampão Acetato: Acetato 50 mM, sacarose 10% pH 5 (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00461] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figuras 18 a 22. (ii) Traçado do volume tumoral
[00462] O volume tumoral médio no Dia 21 após o início do trata- mento em camundongos Balb/c nude fêmeas portadores de LU-01- 0046 é mostrado nas Tabelas 39 e 40. Tabela 39: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo (Parte 1) Gr Tratamento Dias após o início do tratamento 0 3 6 10 14 17 21 1 Veículo, 202± 328± 536± 953± 1386± 1833±1 2551±2 1x/sem 26 48 68 107 97 32 42 2 BCY6033, 201± 285± 449± 623± 891± 967±22 1285±2 1 mpk, 23 47 87 112 196 8 34 1x/sem 3 BCY6033, 201± 187± 91± 37± 3±3 0±0 0±0 3 mpk, 26 43 34 14 1x/sem 4 BCY6136, 200± 293± 426± 682± 964± 976±25 1285±2 1 mpk, 33 56 91 151 194 8 34 1x/sem 5 BCY6136, 201± 194± 135± 52± 13±9 4±4 0±0 3 mpk, 33 31 27 18 1x/sem 6 BCY6082, 201± 295± 466± 877± 1201± 1502±1 1826±2 1 mpk, 29 43 65 80 106 08 24 1x/sem 7 BCY6082, 201± 235± 310± 398± 634± 729±18 1042±2 3 mpk, 34 36 44 65 136 4 90 1x/sem
Tabela 40: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo (Parte 2) Gr Tratamento Dias após o início do tratamento 0 3 7 10 14 17 21 8 Veículo, 192± 311± 562± 830± 1320± 1652± 2342± 1x/sem 30 83 146 230 444 528 651 9 BCY6173, 191± 318± 553± 817± 1314± 1546± 2151± 1 mpk, 33 58 88 165 276 276 262 1x/sem 10 BCY6173, 192± 259± 400± 455± 636± 646± 890± 3 mpk, 37 51 53 28 92 138 260 1x/sem 11 BCY6175, 192± 186± 92± 19± 0± 0± 0± 3 mpk, 42 57 38 11 0 0 0 1x/sem 12 BCY6031, 191± 207± 387± 355± 544± 643± 874± 3 mpk, 38 46 70 110 159 185 281 1x/sem (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00463] A taxa de inibição do crescimento tumoral para artigos em teste no modelo de PDX LU-01-0046 foi calculada com base em medi- ções do volume tumoral em 21 dias após o início do tratamento. Tabela 41: Análise de inibição do crescimento tumoral (Parte 1) Grupo Tratamento Volume tumo- T/Cb (%) TGI (%) Valor p ral (mm3)a 1 Veículo, 2551±242 -- -- -- 1x/sem 2 BCY6033, 1285±234 50,4 53,9 p<0,001 1 mpk, 1x/sem 3 BCY6033, 0±0 0,0 108,6 p<0,001 3 mpk, 1x/sem 4 BCY6136, 1285±234 50,4 53,9 p<0,001 1 mpk, 1x/sem 5 BCY6136, 0±0 0,0 108,5 p<0,001 3 mpk, 1x/sem
Grupo Tratamento Volume tumo- T/Cb (%) TGI (%) Valor p ral (mm3)a 6 BCY6082, 1826±224 71,6 30,8 p<0,05 1 mpk, 1x/sem 7 BCY6082, 1042±290 40,8 64,2 p<0,001 3 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM; b. A inibição do crescimento tumoral é calculada divi- dindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo vo- lume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). Tabela 42: Análise de inibição do crescimento tumoral (Parte 2) Grupo Tratamento Volume tumo- T/Cb (%) TGI (%) Valor p ral (mm3)a 8 Veículo, 2342±651 -- -- -- 1x/sem 9 BCY6173, 2151±262 91,8 8,9 p＞0,05 1 mpk, 1x/sem 10 BCY6173, 890±260 38,0 67,5 p<0,05 3 mpk, 1x/sem 11 BCY6175, 0±0 0,0 108,9 p<0,001 3 mpk, 1x/sem 12 BCY6031, 874±281 37,3 68,2 p<0,05 3 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM; b. A inibição do crescimento tumoral é calculada divi- dindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo vo- lume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00464] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de artigos em teste foi avaliada no modelo de PDX LU-01-0046. Os pesos corporais medidos e os volumes tumorais de todos os grupos de tratamento em vários momentos são mostrados nas Figuras 18 a 22 e Tabelas 39 a 42.
[00465] No estudo da Parte 1, o tamanho tumoral médio de camun- dongos tratados com veículo atingiu 2551 mm3 no Dia 21 após o início do tratamento.
[00466] BCY6033 a 1/2 mg/kg, 1x/semana (TV=1285 mm3, TGI=53,9%, p<0,001) e BCY6136 a 1/2 mg/kg, 1x/semana (TV=1285 mm3, TGI=53,9%, p<0,001) produziram atividade antitumoral significa- tiva, mas não exibiram qualquer regressão tumoral. BCY6033 a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=0 mm3, TGI=108,6%, p<0,001) e BCY6136 a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=0 mm3, TGI=108,5%, p<0,001) erradicaram completamente os tumores, 1 de 5 tumores, respectivamente. Os gru- pos de BCY6033 e BCY6136 3 mg/kg grupos mostraram recidiva após a suspensão da dose e os tumores eram resistentes ao tratamento com BCY6033 ou BICY6136 quando reintroduzida a administração. Os tumores restantes nos grupos de BCY6033 e BCY6136 (4/5 de cada grupo) não mostraram recidiva após 80 dias de suspensão da adminis- tração.
[00467] BCY6082 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV=1826 mm3, TGI=30,8%, p<0,05) e 3 mg/kg, 1x/semana (TV=1042 mm3, TGI=64,2%, p<0,001) produziram atividade antitumoral dose- dependente, mas não regressão tumoral.
[00468] No estudo da Parte 2, o tamanho tumoral médio de camun- dongos tratados com veículo atingiu 2342 mm3 no Dia 21 após o início do tratamento. BCY6173 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV=2151 mm3, TGI=8,9%, p＞0,05) não mostraram atividade antitumoral. BCY6173 a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=890 mm3, TGI=67,5%, p<0,05) produziu ati- vidade antitumoral óbvia.
[00469] BCY6175 a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=0 mm3, TGI=108,9%, p<0,001) erradicou completamente 4/5 tumores no Dia 14. BCY6031 a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=874 mm3, TGI=68,2%, p<0,05) produziram atividade antitumoral óbvia, mas não regressão tumoral. Estudo 15: Estudo de eficácia in vivo de BCY6136 no modelo de PDX de LU-01-0412 CPNPC em camundongos Balb/c nude
(a) Objetivo do estudo
[00470] O objetivo do projeto é avaliar a eficácia terapêutica in vivo de BCY6136 no modelo de PDX de LU-01-0412 CPNPC em camun- dongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Gr Tratamento n Dose Volume de ad- Via de Esquema (mg/kg) ministração adminis- (µL/g) tração 1 Veículo 6 -- 10 iv 1x/sem, 4 semanas 2 BCY6136 6 1 10 iv 1x/sem, 4 semanas 3 BCY6136 6 3 10 iv 1x/sem, 4 semanas 4 BCY8245 6 3 10 iv 1x/sem, 4 semanas 5 BCY8781 6 3 10 iv 1x/sem, 4 semanas (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Inoculação do tumor
[00471] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com fragmento tumoral LU-01-0412 (~30 mm3) para de- senvolvimento do tumor. Os animais foram randomizados quando o volume tumoral médio atingiu 159 mm3. A administração do artigo em teste e os números de animais em cada grupo foram mostrados na tabela do desenho experimental. (ii) Preparação da formulação do artigo em teste
Artigo em Conc. Formulação teste (mg/mL) Veículo - Histidina 25 mM, sacarose 10% pH7 BCY6136 1 Dissolver 6,06 mg de BCY6136 em 5,969 mL de Acetato/ácido acético 50 mM, pH5, sacarose 10% 0,1 Diluir 180 µL de BT5528 1 mg/mL com 1620 µL de Acetato/ácido acético 50 mM, pH5, sacarose 10% 0,3 Diluir 540 µL BT5528 1 mg/mL com 1260 µL de Acetato/ácido acético 50 mM, pH5, saca- rose 10% BCY8245 1 Dissolver 4,15 mg de BCY8245 pó em 4,121 mL de tampão de veículo 0,3 Diluir 540 µL BCY8245 1 mg/mL com 1260 µL de tampão de veículo BCY8781 1 Dissolver 4,08 mg de BCY8781 pó em 80,8 µL de DMSO, então diluir até 1 mg/mL com 3,958 de tampão de veículo 0,3 Diluir 540 µL de BCY8781 1 mg/mL com 1260 µL de tampão de veículo (iii) Coleta de amostras
[00472] O plasma dos camundongos tratados com veículo e de 3 adicionais tratados com BCY6136, BCY8245 e BCY8781 foi coletado 30 minutos e 24 horas após a administração. O tumor dos camundon- gos tratados com veículo e de 3 adicionais tratados com BCY6136, BCY8245 e BCY8781 foi coletado 30 minutos e 24 horas após a admi- nistração. (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00473] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figura 23.
(ii) Traçado do volume tumoral
[00474] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de LU-01-0412 é mostrado na Tabela 43. Tabela 43: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo Dias Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Veículo BCY6136 BCY6136 BCY8245 BCY8781 1x/sem*4 1 mpk, 3 mpk, 3 mpk, 3 mpk, 1x/sem*4 1x/sem*4 1x/sem*4 1x/sem*4 0 159±11 159±13 159±11 159±12 159±11 4 255±12 214±16 197±16 168±18 176±21 7 309±20 237±16 195±16 132±10 167±13 11 395±31 246±19 156±18 78±4 107±15 14 464±31 300±18 177±29 45±5 72±12 18 521±26 369±32 210±32 21±2 44±8 21 611±33 470±46 225±32 11±1 31±6 25 737±68 632±47 252±37 6±1 20±6 28 788±80 664±52 299±37 2±1 14±5 32 1104±142 758±70 416±52 1±1 12±5 (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00475] A taxa de inibição do crescimento tumoral for BCY6136, BCY8245 e BCY8781 no modelo de xenoenxerto de LU-01-0412 foi calculada com base em medições do volume tumoral 32 dias após o início do tratamento. Tabela 44: Análise de inibição do crescimento tumoral Grupo Tratamento Volume tu- T/Cb TGI (%) Valor p moral (mm3)a (%) 1 Veículo, 1x/sem*4 1104±142 -- -- -- 2 BCY6136, 1mpk, 758±70 68,6 36,7 p<0,05 1x/sem*4 3 BCY6136, 3mpk, 416±52 37,6 72,9 p<0,001 1x/sem*4
Grupo Tratamento Volume tu- T/Cb TGI (%) Valor p moral (mm3)a (%) 4 BCY8245, 3 mpk, 1±1 0,1 116,8 p<0,001 1x/sem*4 5 BCY8781, 3 mpk, 12±5 1,0 115,6 p<0,001 1x/sem*4 a. Média ± SEM; b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00476] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCY6136, BCY8245 e BCY8781 foi avaliada no modelo de xenoenxerto de LU- 01-0412. O peso corporal medido e volume tumoral de todos os gru- pos de tratamento em vários momentos são mostrados na Figura 23 e Tabelas 43 e 44.
[00477] O volume tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 1104 mm3 no Dia 32 após o início do tratamento. BCY6136 a 1 mg/kg, 1x/semana *4 (TV=758 mm3, TGI=36,7%, p<0,05) e 3 mg/kg, 1x/semana*4 (TV=416 mm3, TGI=72,9%, p<0,001) produziram atividade antitumoral dose-dependente, mas não mostra- ram regressão tumoral. BCY8245 a 3 mg/kg, 1x/semana*4 (TV=1 mm3, TGI=116,8%, p<0,001) e BCY8781 a 3 mg/kg, 1x/semana*4 (TV=12 mm3, TGI=115,6%, p<0,001) regrediram os tumores nitidamente. Den- tre esses, 5 de 6 tumor tratados com BCY8245 3 mg/kg e 2 de 6 tumor tratados com BCY8781 3 mg/kg foram completamente erradicados no Dia 32.
[00478] Nesse estudo, os animais em todos os grupos mantiveram bem o peso corporal. Estudo 16: Estudo de eficácia in vivo de BCY6136 no tratamento do modelo de PDX LU-01-0486 em camundongos Balb/c nude.
(a) Objetivo do estudo
[00479] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6136 no modelo de PDX LU-01-0486 em camundongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Gr Tratamento n Dose Volume de ad- Via de ad- Esquema (mg/kg) ministração ministração (µL/g) 1 Veículo 5 -- 10 iv 1x/sem 2 BCY6136 5 1 10 iv 1x/sem 3 BCY6136 5 2 10 iv 1x/sem 4 BCY6136 5 3 10 iv 1x/sem (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Inoculação do tumor
[00480] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com fragmento tumoral LU-01-0486 (~30 mm3) para de- senvolvimento do tumor. O tratamento foi iniciado quando o volume tumoral médio atingiu 180 mm3 para estudo de eficácia. A administra- ção do artigo em teste e o número de animais em cada grupo são mostrados na tabela do desenho experimental. (ii) Preparação da formulação do artigo em teste Artigo em Conc. Formulação teste (mg/mL) Veículo -- Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH 5 BCY6136 0,3 BCY6136 0,3 mg/mL foi preparado como descrito no Estudo 10 0,2 Diluir 940 µL de BCY6136 0,3 mg/mL com 470 µL de tampão Acetato1 0,1 Diluir 470 µL de BCY6136 0,3 mg/mL com 940 µL de tampão Acetato
1. Tampão Acetato: Acetato 50 mM, sacarose 10% pH 5 (d) Resultados
(i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00481] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figura 24. (ii) Traçado do volume tumoral
[00482] O volume tumoral médio no Dia 14 após o início do trata- mento em camundongos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoen- xerto de LU-01-0486 é mostrado na Tabela 45. Tabela 45: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo Grupo Tratamento Dias após o início do tratamento 0 3 7 10 14 1 Veículo, 179±20 232±30 358±45 450±47 651±112 1x/sem 2 BCY6136, 180±23 221±20 326±34 420±34 638±71 1 mpk, 1x/sem 3 BCY6136, 179±27 222±26 365±44 459±82 645±105 2 mpk, 1x/sem 4 BCY6136, 180±25 209±37 304±51 348±77 449±115 3 mpk, 1x/sem (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00483] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCY6136 no modelo de PDX LU-01-0486 foi calculada com base no volume tu- moral medido 14 dias após o início do tratamento. Tabela 46: Análise de inibição do crescimento tumoral Grupo Tratamento Volume tumo- T/Cb (%) TGI (%) Valor p ral (mm3)a 1 Veículo, 1x/sem 651±112 -- -- -- 2 BCY6136, 1 mpk, 638±71 98,0 3,0 p＞0,05 1x/sem 3 BCY6136, 2 mpk, 645±105 99,1 1,2 p＞0,05 1x/sem 4 BCY6136, 3 mpk, 449±115 68,9 43,1 p＞0,05 1x/sem a. Média ± SEM; b. A inibição do crescimento tumoral é calculada divi- dindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo vo- lume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00484] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCY6136 foi avali- ada no modelo de PDX LU-01-0486. O peso corporal medido e o vo- lume tumoral de todos os grupos de tratamento em vários momentos são mostrados na Figura 24 e Tabelas 45 e 46.
[00485] Nesse estudo, o volume tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 651 mm3 no Dia 14 após o início do tra- tamento. BCY6136 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV=638 mm3, TGI=3,0%, p＞0,05) e 2 mg/kg, 1x/semana (TV=645 mm3, TGI=1,2%, p＞0,05) não mostraram qualquer atividade antitumoral. BCY6136 a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=449 mm3, TGI=43,1%, p＞0,05) produziu ligeira ativi- dade antitumoral sem significância estatística. Estudo 17: Teste de eficácia in vivo de BCY6033, BCY6136 e BCY6082 no tratamento de xenoenxerto MDA-MB-231-luc em camun- dongos Balb/c nude (a) Objetivo do estudo
[00486] O objetivo da pesquisa era avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6033, BCY6136 e BCY6082 no tratamento do modelo de xenoenxerto MDA-MB-231-luc em camundongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Gr Tratamento n Dose Volume de Via de Esquema (mg/kg) administração adminis- (µL/g) tração 1 Veículo 3 -- 10 iv 1x/sem 2 BCY6033 3 1 10 iv 1x/sem 3 BCY6033 3 2 10 iv 1x/sem 4 BCY6033 3 3 10 iv 1x/sem 5 BCY6136 3 1 10 iv 1x/sem
Gr Tratamento n Dose Volume de Via de Esquema (mg/kg) administração adminis- (µL/g) tração 6 BCY6136 3 2 10 iv 1x/sem 7 BCY6136 3 2 10 iv 1x/sem 8 BCY6082 3 2 10 iv 1x/sem 9 BCY6082 3 5 10 iv 1x/sem (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Cultura celular
[00487] As células desenvolvendo-se em fase de crescimento ex- ponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor. (ii) Inoculação do tumor
[00488] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais MDA-MB-231-luc (10× 106) em 0,1mL de PBS com 0,1 mL de matrigel para desenvolvimento do tu- mor. 36 animais foram randomizados quando o volume tumoral médio atingiu 159 mm3. A administração do artigo em teste e os números de animais em cada grupo foram mostrados na tabela do desenho expe- rimental. (iii) Preparação da formulação do artigo em teste Tratamento Dose (mg/mL) Formulação Veículo Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH=5 BCY6033 1 Dissolver 6,71 mg de BCY6033 em 6,710 mL de tampão de formulação 0,3 Diluir 270 µL de BCY6033 1 mg/mL em 630 µL de tampão de formulação 0,2 Diluir 180 µL de BCY6033 1 mg/mL em 720 µL de tampão de formulação 0,1 Diluir 90 µL de BCY6033 1 mg/mL em 810 µL de tampão de formulação BCY6136 1 Dissolver 3,79 mg de BCY6136 em 3,695 mL de tampão de formulação
Tratamento Dose (mg/mL) Formulação 0,3 Diluir 270 µL de BCY6136 1 mg/mL em 630 µL de tampão de formulação 0,2 Diluir 180 µL de BCY6136 1 mg/mL em 720 µL de tampão de formulação 0,1 Diluir 90 µL de BCY6136 1 mg/mL em 810 µL de tampão de formulação BCY6082 1 Pesar e dissolver 4,30 mg de BCY6082 em 4,162 mL de tampão de formulação 0,5 Diluir 450 µL de BCY6082 1 mg/mL em 450 µL de tampão de formulação 0,2* Diluir 180 µL de BCY6082 1 mg/mL em 720 µL de tampão de formulação (iv) Coleta de amostras
[00489] Em PG-D24, os tumores do Grupo 1, 8 e 9 foram coletados e fixados para FFPE.
[00490] On PG-D33, os tumores do Grupo 2 e 5 foram coletados e fixados para FFPE.
[00491] No final do estudo, os tumores do Grupo 3, 4, 6 e 7 foram coletados e fixados para FFPE. (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00492] O peso corporal e o crescimento tumoral são mostrados na Figuras 25 a 27. (ii) Traçado do volume tumoral
[00493] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de MDA-MB-231- luc é mostrado nas Tabelas 47 a 49.
Tabela 47: Traçado do volume tumoral (PG-D0~PG-D17) Gr.
Tratamento Dias após o início do tratamento 0 2 4 7 9 11 14 17 1 Veículo, 159± 269± 306± 425± 688± 908± 1064± 1315± 1x/sem 14 8 19 52 54 54 98 95 2 BCY6033, 159± 219± 221± 296± 329± 421± 479± 609± 1 mpk, 6 19 55 76 64 77 84 122 1x/sem 3 BCY6033, 159± 240± 215± 201± 109± 84± 64± 59± 2 mpk, 10 73 57 47 36 34 32 35 1x/sem 4 BCY6033, 158± 189± 147± 109± 79± 66± 41± 31± 3 mpk, 7 27 32 26 11 7 5 6 1x/sem 5 BCY6136, 159± 226± 221± 310± 416± 526± 636± 809± 1 mpk, 10 36 54 72 89 77 92 135 1x/sem 6 BCY6136, 159± 218± 182± 182± 101± 77± 36± 41± 2 mpk, 16 17 22 26 20 24 4 10 1x/sem 7 BCY6136, 158± 241± 259± 325± 258± 246± 162± 178± 3 mpk, 5 12 6 14 12 15 19 10 1x/sem 8 BCY6082, 159± 210± 242± 305± 445± 611± 734± 926± 2 mpk, 13 10 16 19 58 76 139 105 1x/sem 9 BCY6082, 159± 227± 247± 250± 276± 241± 220± 184± 5 mpk, 7 31 47 65 79 61 56 85 1x/sem
Tabela 48: Traçado do volume tumoral (PG-D19~PG-D33) Gr. Tratamento Dias após o início do tratamento 19 21 24 26 28 31 33 1 Veículo, 1453± 1661± -- -- -- -- -- 1x/sem 128 173 2 BCY6033, 724± 880± 1069± 1182± 1342± 1647± -- 1 mpk, 1x/sem 162 156 189 164 166 113 3 BCY6033, 61± 67± 100± 133± 163± 221± 257± 2 mpk, 1x/sem 35 44 76 96 106 143 152 4 BCY6033, 29± 22± 22± 21± 21± 43± 57± 3 mpk, 1x/sem 7 12 8 9 10 20 29 5 BCY6136, 879± 994± 1253± 1431± 1507± 2181± -- 1 mpk, 1x/sem 190 213 313 353 253 609 6 BCY6136, 35± 33± 31± 41± 59± 82± 87± 2 mpk, 1x/sem 9 9 17 32 45 59 71 7 BCY6136, 171± 132± 108± 85± 81± 87± 92± 3 mpk, 1x/sem 21 19 19 15 8 14 18 8 BCY6082, 1034± 1287± -- -- -- -- -- 2 mpk, 1x/sem 178 94 9 BCY6082, 214± 218± -- -- -- -- -- 5 mpk, 1x/sem 120 146 Tabela 49: Traçado do volume tumoral (PG-D35~PG-D47) Dias após o início do tratamento Gr. Tratamento 35 38 40 42 45 47 BCY6033, 352± 456± 525± 683± 738± 853± 3 2 mpk, 1x/sem 210 271 302 400 429 476 BCY6033, 79± 118± 139± 220± 312± 423± 4 3 mpk, 1x/sem 47 71 82 125 176 222 BCY6136, 124± 156± 179± 239± 285± 350± 6 2 mpk, 1x/sem 106 120 142 197 239 298 BCY6136, 129± 173± 181± 269± 293± 371± 7 3 mpk, 1x/sem 38 65 65 113 114 128 (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00494] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCY6033,
BCY6136 e BCY6082 no modelo de xenoenxerto de MDA-MB-231-luc foi calculada com base em medições do volume tumoral em 21dias após o início do tratamento. Tabela 50: Análise de inibição do crescimento tumoral Gr Tratamento Volume tumoral T/Cb (%) TGI (%) Valor p (mm3)a 1 Veículo, 1x/sem 1661±173 -- -- -- 2 BCY6033, 880±156 53,0 52,0 p<0,001 1 mpk, 1x/sem 3 BCY6033, 67±44 4,1 106,1 p<0,001 2 mpk, 1x/sem 4 BCY6033, 22±12 1,3 109,1 p<0,001 3 mpk, 1x/sem 5 BCY6136, 994±213 59,8 44,4 p<0,01 1 mpk, 1x/sem 6 BCY6136, 33±9 2,0 108,4 p<0,001 2 mpk, 1x/sem 7 BCY6136, 132±19 8,0 101,7 p<0,001 3 mpk, 1x/sem 8 BCY6082, 1287±94 77,5 24,9 p>0,05 2 mpk, 1x/sem 9 BCY6082, 218±146 13,1 96,1 p<0,001 5 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00495] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCY6033, BCY6136 e BCY6082 foi avaliada no modelo de xenoenxerto de MDA- MB-231-luc. Os pesos corporais medidos e volumes tumorais de todos os grupos de tratamento em vários momentos são mostrados nas Fi- guras 25 a 27 e Tabelas 47 a 50.
[00496] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 1661 mm3 no Dia 21. BCY6033 a 1 mg/kg (TV=880 mm3, TGI=52,0%, p<0,001), 2 mg/kg (TV=67 mm3, TGI=106,1%, p<0,001) e 3 mg/kg (TV=22 mm3, TGI=109,1%, p<0,001) produziram atividade antitumoral dose-dependente. BCY6033 a 2 mg/kg e 3 mg/kg regrediu potentemente os tumores, mas os tumores mostraram recidi- va óbvia a partir do Dia 21.
[00497] BCY6136 a 1 mg/kg (TV=994 mm3, TGI=44,4%, p<0,01) mostrou atividade antitumoral moderada, BCY6136 a 2 mg/kg (TV=33 mm3, TGI=108,4%, p<0,001) e 3 mg/kg (TV=132 mm3, TGI=101,1%, p<0,001) produziu atividade tumoral potente, mas os tumores mostra- ram recidiva óbvia a partir do Dia 28.
[00498] BCY6082 a 2 mg/kg (TV=1287 mm3, TGI=24,9%, p>0,05) não mostrou atividade antitumoral óbvia, BCY6082 a 5 mg/kg (TV=218 mm3, TGI=96,1%, p<0,001) produziu atividade antitumoral significati- va.
[00499] Nesse estudo, um camundongo tratado com BCY6136 2 mg/kg perdeu mais de 15% do peso corporal durante o esquema de tratamento, outros camundongos mantiveram bem o peso corporal. Estudo 18: Teste de eficácia in vivo de BCY6136 no tratamento de modelo singênico EMT-6 em camundongos BALB/c (a) Objetivo do estudo
[00500] O objetivo da pesquisa era avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6136 no tratamento de modelo singênico EMT-6 em ca- mundongos BALB/c. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento Dose N Via de Esquema Coleta de (mg/kg) adminis- amostras tração 1 Veículo -- 5 iv 1x/sem*4 Tumores de semanas camundongos
Grupo Tratamento Dose N Via de Esquema Coleta de (mg/kg) adminis- amostras tração 2 BCY6136 3 5 iv 1x/sem*4 sobressalen- semanas tes serão co- 3 BCY6136 1/5b 5 iv 1x/sem*4 letados para semanas FACS 4 BCY6136 0,3/3b 5 iv 1x/sem*4 semanas a. O volume de injeção de cada camundongo é 10 ml/kg. b. A dose do grupo 3 e grupo 4 foi trocada para 5 mpk e 3 mpk a partir do Dia 14. (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Cultura celular
[00501] As células tumorais EMT-6 foram mantidas in vitro como cultura monocamada em meio EMEM suplementado com soro fetal bovino 10% inativado com calor a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 5% no ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana e submetidas ao tratamento com tripsina-EDTA. As células desenvolvendo-se em fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor. (ii) Inoculação do tumor
[00502] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais EMT-6 (5 x 106) em 0,1 mL de PBS para desenvolvimento do tumor. 44 animais foram randomizados quando o volume tumoral médio atingiu 75 mm3. A administração do artigo em teste e os números de animais em cada grupo foram mos- trados na tabela do desenho experimental. (iii) Preparação da formulação do artigo em teste
Formulação de BCY6136 Tratamento Conc.(mg/mL) Formulação Veícu- -- Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH=5 lo/tampão BCY6136 1 Dissolver 6,2 mg de BCY6136 com 6113 µL de tampão BCY6136 0,3 Diluir 450 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 1050 µL de tampão BCY6136 0,1 Diluir 150 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 1350 µL de tampão BCY6136 0,03 Diluir 45 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 1455 µL de tampão Formulação de BCY6136 Tratamento Conc. (mg/mL) Formulação Veículo/tampão -- Acetato 50 mM, sacarose 10%, pH=5 BCY6136 1 estoque BCY6136 0,3 Diluir 420 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 980 µL de tampão BCY6136 0,3 Diluir 420 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 980 µL de tampão BCY6136 0,5 Diluir 700 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 700 µL de tampão (iv) Coleta de amostras
[00503] 3 tumores de camundongos sobressalentes foram coleta- dos para FACS no Dia 11. Os dados foram fornecidos pela equipe de biologia. (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00504] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figura 28. (ii) Traçado do volume tumoral
[00505] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos BALB/c fêmeas portadores do enxerto singênico de EMT-6 é mos- trado na Tabela 51. Tabela 51: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo Gr. Tratamen- Dias após o início do tratamento to 0 3 5 7 10 12 14 17 19 21 1 Veículo, 82± 141± 260± 443± 557± 703± 812± 948± 1129 1499 1x/sem 4 11 24 90 99 119 139 191 ± ± 248 340 2 BCY6136, 82± 58± 59± 125± 240± 322± 374± 431± 486± 561± 3 mpk, 4 1 2 18 23 23 22 37 50 61 1x/sem 3 BCY6136, 82± 108± 204± 350± 426± 588± 691± 850± 1018 1272 1/5a mpk, 4 18 27 57 49 72 65 98 ± ± 1x/sem 115 140 4 BCY6136, 82± 130± 255± 358± 450± 607± 731± 872± 1082 1394 0,3/3a 4 16 35 34 67 94 112 119 ± ± mpk, 133 161 1x/sem A dose do grupo 3 e grupo 4 foi trocada para 5 mpk e 3 mpk a partir do Dia 14. (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00506] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCY6136 no modelo singênico EMT-6 foi calculada com base em medições do volume tumoral em 21 dias após o início do tratamento. Tabela 52: Análise de inibição do crescimento tumoral Gr Tratamento Volume tu- T/Cb (%) TGI (%) Valor p com- moral (mm3)a parado com veículo 1 Veículo, 1x/sem 1499±340 -- -- -- 2 BCY6136,3 mpk, 561±61 37,4 66,2 p<0,05 1x/sem
Gr Tratamento Volume tu- T/Cb (%) TGI (%) Valor p com- moral (mm3)a parado com veículo 3 BCY6136,1/5c 1272±140 84,8 16,1 ns mpk, 1x/sem 4 BCY6136,0,3/3c 1394±161 93,0 7,4 ns mpk, 1x/sem a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). c. A dose do grupo 3 e grupo 4 foi trocada para 5 mpk e 3 mpk a partir do Dia 14. (e) Sumário e discussão dos resultados
[00507] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCY6136 foi avali- ada no modelo singênico EMT-6. Os pesos corporais medidos e os volumes tumorais de todos os grupos de tratamento em vários mo- mentos são mostrados na Figura 28 e Tabelas 51 e 52.
[00508] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 1499 mm3 no Dia 21. BCY6136 a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=561 mm3, TGI=66,2%, p<0,05) mostrou atividade antitumoral ób- via. BCY6136 a 1/5 mg/kg, 1x/semana (TV=1272 mm3, TGI=16,1%, p>0,05) e BCY6136 a 0,3/3 mg/kg, 1x/semana (TV=1394 mm3, TGI=7,4%, p>0,05) não mostraram qualquer atividade antitumoral.
[00509] A dose do grupo 3 e grupo 4 foi trocada para 5 mpk e 3 mpk a partir do Dia 14. Ulceração do tumor foi encontrada nos camun- dongos 3-5 no Dia 14, e os camundongos foram tratados com creme antibiótico. Nesse estudo, todos os camundongos mantiveram bem o peso corporal. Estudo 19: Estudo de eficácia in vivo de BCY6136 no tratamento de xenoenxerto de NCI-N87 em camundongos Balb/c nude.
(a) Objetivo do estudo
[00510] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6136 no tratamento de xenoenxerto de NCI-N87 em ca- mundongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Via de Esquema (mg/kg) administra- adminis- ção (µL/g) tração 1 Veículo 3 -- 10 iv 1x/sem 2 BCY6136 3 1 10 iv 1x/sem 3 BCY6136 3 2 10 iv 1x/sem 4 BCY6136 3 3 10 iv 1x/sem (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Cultura celular
[00511] As células tumorais NCI-N87 foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino 10% inativado com calor a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 5% no ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células desenvolvendo-se em fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor. (ii) Inoculação do tumor
[00512] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais NCI-N87 (10 x 106) e matrigel (1:1) em 0,2 mL de PBS para desenvolvimento do tumor. Os animais foram randomizados e o tratamento foi iniciado quando o volume tumoral médio atingiu aproximadamente 176 mm3. A administração do artigo em teste e o número de animais em cada grupo são mostrados na ta- bela do desenho experimental. (iii) Preparação da formulação do artigo em teste
Artigo em Conc. Formulação teste (mg/mL) Veículo - Acetato 50 mM, sacarose 10% pH 5 BCY6136 1 Dissolver 4,295 mg de BCY6136 em 4,214 mL de tampão Acetato1 0,1 Diluir 90 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 810 µL de tampão Acetato 0,2 Diluir 180 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 720 µL de tampão Acetato 0,3 Diluir 270 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 630 µL de tampão Acetato
1. Tampão Acetato: Acetato 50 mM, sacarose 10% pH 5 (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00513] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figura 29. (ii) Traçado do volume tumoral
[00514] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de NCI-N87 é mostrado na Tabela 53.
Tabela 53: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo Gr.
Tratamento Dias após o início do tratamento 0 2 4 7 9 11 14 16 18 21 23 25 28 30 1 Veículo, 174± 213± 266± 421± 537± 598± 734± 821± 918± 1024± 1151± 1305± 1407± 1465± 1x/sem 7 5 6 10 17 30 46 55 91 83 68 57 64 90 2 BCY6136, 176± 200± 210± 224± 238± 184± 244± 276± 308± 343± 390± 406± 422 ± 425 ± 1 mpk, 1x/sem 7 8 14 27 21 18 23 35 44 37 43 48 42 47 3 BCY6136, 176± 197± 168± 170± 165± 96± 133± 150± 160± 190± 203± 218± 201± 210± 2 mpk, 1x/sem 18 25 25 26 34 27 35 52 49 63 65 66 53 60
260/299 4 BCY6136, 177± 197± 169± 158± 148± 95± 141± 145± 164± 202± 205± 201± 196± 201± 3 mpk, 1x/sem 8 9 7 3 8 16 12 24 28 28 30 16 21 22
(iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00515] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCY6136 no xenoenxerto de NCI-N87 foi calculada com base em medições do volume tumoral em 30 dias após o início do tratamento. Tabela 54: Análise de inibição do crescimento tumoral Grupo Tratamento Volume tumo- T/Cb (%) TGI (%) Valor p ral (mm3)a 1 Veículo, 1x/sem 1465±90 -- -- -- 2 BCY6136, 1 425±47 29,0 80,7 p<0,001 mpk, 1x/sem 3 BCY6136, 2 210±60 14,3 97,4 p<0,001 mpk, 1x/sem 4 BCY6136, 3 201±22 13,7 98,1 p< 0,001 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00516] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCY6136 foi avali- ada no modelo NCI-N87. O peso corporal medido e o volume tumoral de todos os grupos de tratamento em vários momentos são mostrados na Figura 29 e Tabelas 53 e 54.
[00517] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 1465 mm3 no Dia 30. BCY6136 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV=425 mm3, TGI=80,7%, p<0,001) e 2 mg/kg, 1x/semana (TV=210 mm3, TGI=97,4%, p<0,001) produziu atividade antitumoral significativa de maneira dose-dependente, BCY6136 a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=201 mm3, TGI=98,1%, p<0,001) mostrou atividade antitumoral comparável a BCY6136 a 2 mpk.
[00518] Nesse estudo, não se verificou perda óbvia do peso corpo-
ral em todos os grupos durante o esquema de tratamento. Estudo 20: Estudo de eficácia in vivo de BCY6136 no tratamento de xenoenxerto de SK-OV-3 em camundongos Balb/c nude. (a) Objetivo do estudo
[00519] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6136 no tratamento de xenoenxerto de SK-OV-3 em ca- mundongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Via de Esquema (mg/kg) administra- adminis- ção (µL/g) tração 1 Veículo 3 -- 10 iv 1x/sem 2 ADC 3 3 10 iv 1x/sem 3 BCY6136 3 1 10 iv 1x/sem 4 BCY6136 3 2 10 iv 1x/sem 5 BCY6136 3 3 10 iv 1x/sem (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Cultura celular
[00520] As células tumorais SK-OV-3 foram mantidas em meio 5a de McCoy suplementado com soro fetal bovino 10% inativado com ca- lor a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 5% no ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células desenvolvendo-se em fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor. (ii) Inoculação do tumor
[00521] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais SK-OV-3 (10 x 106) e matrigel (1:1) em 0,2 mL de PBS para desenvolvimento do tumor. Os animais foram randomizados e o tratamento foi iniciado quando o volume tumoral médio atingiu aproximadamente 186 mm3. A administração do artigo em teste e o número de animais em cada grupo são mostrados na ta-
bela do desenho experimental. (iii) Preparação da formulação do artigo em teste Artigo em Pureza Conc. Formulação teste (mg/mL) Veículo - - Acetato 50 mM, sacarose 10% pH5 BCY6136 98,5% 1 Dissolver 3,65 mg de BCY6136 em 3,60 mL de tampão Acetato 50 mM1 0,1 Diluir 90 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 810 µL de tampão Acetato1 0,2 Diluir 180 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 720 µL de tampão Acetato1 0,3 Diluir 270 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 630 µL de tampão Acetato1 ADC ADC 0,3 Diluir 69 µL de estoque de ADC 10,47 mg/mL com 2331 µL de tampão ADCr2
1. Tampão Acetato: Acetato 50 mM, sacarose 10% pH5
2. Tampão ADC: Histidina 25 mM, sacarose 10% pH5,5 (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00522] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figura 30. (ii) Traçado do volume tumoral
[00523] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de SK-OV-3 é mostrado na Tabela 55.
Tabela 55: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo Gr.
Tratamento Dias após o início do tratamento 0 2 5 7 9 12 14 16 19 21 23 26 28 1 Veículo, 187± 243± 313± 399± 470± 606± 742 ± 891 ± 1076± 1173± 1340± 1490± 1560± 1x/sem 16 24 28 37 23 61 103 133 185 214 236 273 305 2 ADC, 187± 181± 212± 263± 268± 335± 353 ± 392 ± 449 ± 481 ± 573 ± 647 ± 684 ± 3 mpk, 1x/sem 16 15 16 35 14 23 18 63 4 27 33 26 111 3 BCY6136, 186± 222± 293± 331± 356± 440± 503 ± 587 ± 702 ± 752 ± 893 ± 1002± 1035± 2 mpk, 1x/sem 23 19 34 21 23 8 28 33 43 26 34 68 67
264/299 4 BCY6136, 186± 170± 164± 188± 180± 202± 200 ± 230 ± 229 ± 231 ± 236 ± 240 ± 277 ± 2 mpk, 1x/sem 23 18 28 33 34 29 29 46 48 58 49 48 58 5 BCY6136, 184± 168± 150± 164± 158± 180± 187 ± 212 ± 208 ± 204 ± 205 ± 227 ± 254 ± 3 mpk, 1x/sem 24 18 12 12 8 8 4 17 29 12 17 31 48
(iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00524] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCY6136 no xenoenxerto de SK-OV-3 foi calculada com base em medições do volume tumoral em 28 dias após o início do tratamento. Tabela 56: Análise de inibição do crescimento tumoral Grupo Tratamento Volume tumoral T/Cb (%) TGI (%) Valor p (mm3)a 1 Veículo, 1x/sem 1560±305 -- -- -- 2 ADC, 3 mpk, 684±111 43,9 63,8 p<0,01 1x/sem 3 BCY6136, 1 1035±67 66,4 38,1 p＞0,05 mpk, 1x/sem 4 BCY6136, 2 277±58 17,8 93,3 p<0,001 mpk, 1x/sem 5 BCY6136, 3 254±48 16,3 95,0 p<0,001 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00525] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCY6136 foi avali- ada no modelo SK-OV-3. O peso corporal medido e o volume tumoral de todos os grupos de tratamento em vários momentos são mostrados na Figura 30 e Tabelas 55 e 56.
[00526] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 1560 mm3 no Dia 28. ADC a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=684 mm3, TGI=63,8%, p<0,01) mostrou eficácia antitumoral mo- derada. BCY6136 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV=1035 mm3, TGI=38,1%, p>0,05) não mostrou atividade antitumoral óbvia. BCY6136 a 2 mg/kg, 1x/semana (TV=277 mm3, TGI=93,3%, p<0,001) e 3 mg/kg, 1x/semana (TV=254 mm3, TGI=95,0%, p<0,001) produziu atividade antitumoral significativa.
[00527] Nesse estudo, não se verificou perda óbvia de peso corpo- ral em todos os grupos durante o esquema de tratamento esquema. Estudo 21: Estudo de eficácia in vivo de BCY6136 no tratamento de xenoenxerto de OE21 em camundongos Balb/c nude. (a) Objetivo do estudo
[00528] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6136 no tratamento de xenoenxerto de OE21 em camun- dongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Via de Esquema (mg/kg) administração adminis- (µL/g) tração 1 Veículo 3 -- 10 iv 1x/sem 2 BCY6136 3 1 10 iv 1x/sem 3 BCY6136 3 2 10 iv 1x/sem 4 BCY6136 3 3 10 iv 1x/sem (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Cultura celular
[00529] As células tumorais OE21 foram mantidas meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino 10% inativado com calor a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 5% no ar. As células tumorais foram rotinei- ramente subcultivadas duas vezes por semana. As células desenvol- vendo-se em fase de crescimento exponencial foram colhidas e conta- das para inoculação do tumor. (ii) Inoculação do tumor
[00530] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais OE21 (5 x 106) e matrigel (1:1) em 0,2 mL de PBS para desenvolvimento do tumor. Os animais foram randomizados e o tratamento foi iniciado quando o volume tumoral médio atingiu aproximadamente 157 mm3. A administração do artigo em teste e o número de animais em cada grupo são mostrados na ta- bela do desenho experimental. (iii) Preparação da formulação do artigo em teste Artigo em Conc. Formulação teste (mg/mL) Veículo - Acetato 50 mM, sacarose 10% pH 5 BCY6136 1 Dissolver 4,295 mg de BCY6136 em 4,214 mL de tampão de Acetato1 0,1 Diluir 90 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 810 µL de tampão Acetato 0,2 Diluir 180 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 720 µL de tampão Acetato 0,3 Diluir 270 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 630 µL de tampão Acetato
1. Tampão Acetato: Acetato 50 mM, sacarose 10% pH 5 (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00531] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figura 31. (ii) Traçado do volume tumoral
[00532] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de OE21 é mos- trado na Tabela 57.
Tabela 57: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo Dias após o início do tratamento Gr.
Tratamento 0 2 4 7 9 11 14 16 18 21 23 155± 1035± 1250± 1586± 1 Veículo, 1x/sem 211±16 291±16 379±14 456±32 539±13 828±42 955±40 9 58 46 57 BCY6136, 159± 777± 1083± 1155± 2 202±28 251±29 282±6 331±19 392±35 609±56 694±44 1 mpk, 1x/sem 14 68 85 98 BCY6136, 157± 396± 537± 3 197±13 219±6 235±27 268±35 243±37 346±78 371±98 515±94 2 mpk, 1x/sem 19 109 122
268/299 BCY6136, 155± 4 200±16 197±7 209±11 229±26 211±14 289±38 318±53 330±40 474±42 489±51 3 mpk, 1x/sem 19
(iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00533] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCY6136 no xenoenxerto de OE21 foi calculada com base em medições do vo- lume tumoral em 23 dias após o início do tratamento. Tabela 58: Análise de inibição do crescimento tumoral Grupo Tratamento Volume tumo- T/Cb (%) TGI (%) Valor p ral (mm3)a 1 Veículo, 1x/sem 1586±57 -- -- -- 2 BCY6136, 1 1155±98 72,8 30,4 p<0,05 mpk, 1x/sem 3 BCY6136, 2 537±122 33,9 73,4 p<0,001 mpk, 1x/sem 4 BCY6136, 3 489±51 30,8 76,7 p<0,001 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00534] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCY6136 foi avali- ada no modelo OE21. O peso corporal medido e volume tumoral de todos os grupos de tratamento em vários momentos são mostrados na Figura 31 e Tabelas 57 e 58.
[00535] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 1586 mm3 no Dia 23. BCY6136 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV= 1155 mm3, TGI = 30,4% p<0,05) mostrou leve atividade antitu- moral. BCY6136 a 2 mg/kg, 1x/semana (TV=537 mm3, TGI=73,4%, p<0,001) e 3 mg/kg, 1x/semana (TV=489 mm3, TGI=76,7%, p<0,001) produziu atividade antitumoral significativa.
[00536] Nesse estudo, não se verificou perda óbvia do peso corpo- ral em todos os grupos durante o esquema de tratamento.
Estudo 22: Teste de eficácia in vivo de BCY6136 e BCY6082 no trata- mento de xenoenxerto de MOLP-8 em camundongos CB17-SCID (a) Objetivo do estudo
[00537] O objetivo da pesquisa é avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCY6136 e BCY6082 no tratamento de xenoenxerto de MOLP- 8 em camundongos CB17-SCID. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Via de ad- Esquema (mg/kg) administra- ministração ção (µL/g) 1 Veículo 3 -- 10 iv 1x/sem 2 BCY6136 3 1 10 iv 1x/sem 3 BCY6136 3 2 10 iv 1x/sem 4 BCY6136 3 3 10 iv 1x/sem 5 BCY6082 3 1 10 iv 1x/sem 6 BCY6082 3 2 10 iv 1x/sem 7 BCY6082 3 3 10 iv 1x/sem (c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Cultura celular
[00538] As células tumorais MOLP-8 foram mantidas in vitro como cultura monocamada em RMPI-1640 suplementado com soro fetal bo- vino 20% inativado com calor a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 5% no ar. As células tumorais foram subcultivadas e submetidas ao trata- mento com tripsina-EDTA tratamento. As células desenvolvendo-se em fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor. (ii) Inoculação do tumor
[00539] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais MOLP-8 (10 x 106) em 0,2 mL de PBS com matrigel 50% para desenvolvimento do tumor. 36 animais foram randomizados quando o volume tumoral médio atingiu 141 mm3. A administração do artigo em teste e os números de animais em cada grupo foram mostrados na tabela do desenho experimental. (iii) Preparação da formulação do artigo em teste Tratamento Concentração Formulação (mg/mL) Veículo -- Acetato 50 mM, sacarose 10% pH=5 BCY6136 0,1 Diluir 90 µL de estoques de BCY6136 1 mg/mL* com 810 µL de tampão*** 0,2 Diluir 180 µL de estoques de BCY6136 1 mg/mL* com 720 µL de tampão*** 0,3 Diluir 270 µL de estoques de BCY6136 1 mg/mL* com 630 µL de tampão*** BCY6082 0,1 Diluir 90 µL de estoques de BCY6082 1 mg/mL** com 810 µL de tampão*** 0,2 Diluir 180 µL de estoques de BCY6082 1 mg/mL** com 720 µL de tampão*** 0,3 Diluir 270 µL de estoques de BCY6082 1 mg/mL** com 630 µL de tampão*** * Estoques de BCY6136: 10,93 mg de BCY6136 dissolvidos em 10,93 mL de Acetato 50 mM, sacarose 10% ,pH=5, e separados em tubos individuais e armazenados a -80 ºC. ** Estoques de BCY6082: 2,43 mg de BCY6136 dissolvidos em 2,43 mL de Acetato 50 mM, sacarose 10% ,pH=5, e separados em tubos individuais e armazenados a -80 ºC. ***Tampão: Acetato 50 mM, sacarose 10% pH=5 (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00540] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figuras 32 e 33. (ii) Traçado do volume tumoral
[00541] O volume tumoral médio ao longo do tempo de camundon- gos CB17-SCID fêmeas portadores do xenoenxerto de MOLP-8 é mostrado na Tabela 59.
Tabela 59: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo Gru- Tratamento Dias após o início do tratamento po 0 2 4 7 9 11 14 1 Veículo, 139± 375± 604± 984± 1451± 1981± 2528± 1x/sem 2 36 28 88 133 196 295 2 BCY6136,1 143± 299± 444± 576± 806±8 1132± 1446± mpk, 1x/sem 13 6 49 31 5 170 234 3 BCY6136,2 140± 271± 250± 509± 662± 873± 1218± mpk, 1x/sem 15 43 2 23 78 49 144 4 BCY6136,3 142± 239± 197± 342± 425± 693± 938± mpk, 1x/sem 19 67 20 78 90 133 155 5 BCY6082,1 142± 303± 456± 809± 1365± 1708± 2296± mpk, 1x/sem 4 49 83 169 277 190 511 6 BCY6082,2 139± 273± 428± 682± 945± 1240± 1554± mpk, 1x/sem 5 46 18 50 73 85 84 7 BCY6082, 142± 219± 369± 471± 656± 997± 1321± 3mpk, 1x/sem 4 7 77 81 115 212 336 (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00542] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCY6136 e BCY6082 no modelo de xenoenxerto de MOLP-8 foi calculada com base em medições do volume tumoral em 14 dias após o início do tra- tamento. Tabela 60: Análise de inibição do crescimento tumoral Grupo Tratamento Volume tumoral T/Cb TGI Valor p compa- (mm3)a (%) (%) rado com veículo 1 Veículo, 1x/sem 2528±295 -- -- -- 2 BCY6136, 1 1446±234 57,2 45,5 p>0,05 mpk, 1x/sem 3 BCY6136, 2 1218±144 48,2 54,9 p<0,05 mpk, 1x/sem 4 BCY6136, 3 938±155 37,1 66,7 p<0,01 mpk, 1x/sem
Grupo Tratamento Volume tumoral T/Cb TGI Valor p compa- (mm3)a (%) (%) rado com veículo 5 BCY6082, 1 2296±511 90,8 9,8 p>0,05 mpk, 1x/sem 6 BCY6082, 2 1554±84 61,5 40,8 p>0,05 mpk, 1x/sem 7 BCY6082, 3 1321±336 52,3 50,6 p<0,05 mpk, 1x/sem a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00543] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCY6136 e BCY6082 foi avaliada no modelo de xenoenxerto de MOLP-8. Os pe- sos corporais medidos e os volumes tumorais de todos os grupos de tratamento em vários momentos são mostrados nas Figuras 32 e 33 e Tabelas 59 e 60.
[00544] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 2528 mm3 no Dia 14. BCY6136 a 1 mg/kg (TV=1146 mm3, TGI=45,5%, p>0,05), 2 mg/kg (TV=1218 mm3, TGI=54,9%, p<0,05) e 3 mg/kg (TV=938 mm3, TGI=66,7%, p<0,01) produziu ativi- dade antitumoral dose-dependente, mas todas as doses não regredi- ram os tumores nos xenoenxertos de MOLP-8.
[00545] BCY6082 a 1 mg/kg (TV=2296 mm3, TGI=9,8%, p>0,05) e 2 mg/kg (TV=1554 mm3, TGI=40,8%, p>0,05) não mostrou atividade an- titumoral óbvia. BCY6082 a 3 mg/kg inibiu significativamente o cresci- mento tumoral (TV=1321 mm3, TGI=50,6%, p<0,05), mas não regrediu os tumores nos xenoenxertos de MOLP-8.
[00546] Nesse estudo, todos os camundongos mantiveram bem o peso corporal.
Estudo 23: Teste de eficácia in vivo de BCYs no tratamento de xeno- enxerto de HT1080 em camundongos Balb/c nude (a) Objetivo do estudo
[00547] O objetivo da pesquisa era avaliar a eficácia antitumoral in vivo de BCYs no tratamento do modelo de xenoenxerto HT1080 em camundongos Balb/c nude. (b) Desenho experimental Grupo Tratamento n Dose Volume de Via de Esquema (mg/kg) administração adminis- (µL/g) tração 1 Veículo 3 -- 10 iv 1x/sem 2 BCY6082 3 2 10 iv 1x/sem 3 BCY6031 3 2 10 iv 1x/sem 4 BCY6173 3 1 10 iv 1x/sem 5 BCY6173 3 2 10 iv 1x/sem 6 BCY6173 3 3 10 iv 1x/sem 7 BCY6135 3 1 10 iv 1x/sem 8 BCY6135 3 2 10 iv 1x/sem 9 BCY6135 3 3 10 iv 1x/sem 10 BCY6033 3 3 10 iv 1x/sem 11 BCY6033 3 5 10 iv 1x/sem 12 BCY6136 3 2 10 iv 1x/sem 13 BCY6136 3 3 10 iv 1x/sem 14 BCY6136 3 5 10 iv 1x/sem 15 BCY6174 3 1 10 iv 1x/sem 16 BCY6174 3 2 10 iv 1x/sem 17 BCY6174 3 3 10 iv 1x/sem 18 BCY6175 3 1 10 iv 1x/sem 19 BCY6175 3 2 10 iv 1x/sem 20 BCY6175 3 3 10 iv 1x/sem 21 ADC 3 3 10 iv 1x/sem Observação: n: número de animais; Volume de administração: ajuste do volume de administração com base no peso corporal; 10 L/g.
(c) Métodos e procedimentos experimentais (i) Cultura celular
[00548] As células tumorais HT1080 serão mantidas em meio su- plementado com soro fetal bovino 10% inativado com calor a 37 ºC em uma atmosfera de CO2 5% no ar. As células tumorais serão rotineira- mente subcultivadas duas vezes por semana. As células desenvolven- do-se em fase de crescimento exponencial serão colhidas e contadas para inoculação do tumor. (ii) Inoculação do tumor
[00549] Cada camundongo será inoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais HT1080 (5*106) para desenvolvi- mento do tumor. Os animais serão randomizados e o tratamento será iniciado quando o volume tumoral médio atinja aproximadamente 150- 200 mm3. A administração do artigo em teste e os números de animais em cada grupo são mostrados na tabela do desenho experimental a seguir. (iii) Preparação da formulação do artigo em teste Tratamento Dose (mg/mL) Formulação Veículo -- 50 mM Acetato/ácido acético, pH5, sa- carose 10% BCY6082 0,2 Diluir160 µL de estoque de BCY6082 1 mg/mL com 640 µL de tampão BCY6031 0,2 Diluir 180 µL de estoque de BCY6031 1 mg/mL com 720 µL de tampão BCY6173 1 Dissolver 2,13 mg de BCY6173 com 2,04 mL de tampão 0,1 Diluir 90 µL de estoque de BCY6173 1 mg/mL com 810 µL de tampão 0,2 Diluir 180 µL de estoque de BCY6173 1 mg/mL com 720 µL de tampão 0,3 Diluir 270 µL de estoque de BCY6173 1 mg/mL com 630 µL de tampão
Tratamento Dose (mg/mL) Formulação BCY6135 1 Dissolver 2 mg de BCY6135 com 1,9 mL de tampão 0,1 Diluir 90 µL de estoque de BCY6135 1 mg/mL com 810 µL de tampão 0,2 Diluir 180 µL de estoque de BCY6135 1 mg/mL com 720 µL de tampão 0,3 Diluir 270 µL de estoque de BCY6135 1 mg/mL com 630 µL de tampão BCY6033 0,3 Diluir 270 µL de estoque de BCY6033 1 mg/mL com 630 µL de tampão 0,5 Diluir 450 µL de estoque de BCY6033 1 mg/mL com 450 µL de tampão BCY6136 0,2 Diluir 200 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 800 µL de tampão 0,3 Diluir 300 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 700 µL de tampão 0,5 Diluir 500 µL de estoque de BCY6136 1 mg/mL com 500 µL de tampão BCY6174 1 Dissolver 2,69 mg de BCY6174 com 2,677 mL de tampão 0,1 Diluir 90 µL de estoque de BCY6174 1 mg/mL com 810 µL de tampão 0,2 Diluir 180 µL de estoque de BCY6174 1 mg/mL com 720 µL de tampão 0,3 Diluir 270 µL de estoque de BCY6174 1 mg/mL com 630 µL de tampão BCY6175 1 Dissolver 2 mg de BCY6175 com 1,924 mL de tampão 0,1 Diluir 90 µL de estoque de BCY6175 1 mg/mL com 810 µL de tampão 0,2 Diluir 180 µL de estoque de BCY6175 1 mg/mL com 720 µL de tampão 0,3 Diluir 270 µL de estoque de BCY6175 1 mg/mL com 630 µL de tampão
Tratamento Dose (mg/mL) Formulação ADC 0,3 Diluir 25,78 µL de estoque de ADC 10,47 mg/mL com 874,22 µL de Histidi- na 25 mM, pH 7, sacarose 10% (d) Resultados (i) Variação do peso corporal e curva de crescimento tumoral
[00550] O peso corporal e a curva de crescimento tumoral são mos- trados na Figuras 34 a 42. (ii) Traçado do volume tumoral
[00551] O volume tumoral médio ao longo do tempo em camundon- gos Balb/c nude fêmeas portadores do xenoenxerto de HT1080 é mos- trado na Tabela 61. Tabela 61: Traçado do volume tumoral ao longo do tempo Gr. Tratamento Dias após o início do tratamento 0 2 4 7 9 11 14 1 Veículo, 179± 312± 529± 886± 1185± 1467± 1737± 1x/sem 22 84 135 207 172 224 258 2 BCY6082, 177± 183± 99± 61± 33± 12± 5± 2 mpk, 1x/sem 16 31 27 17 10 5 3 3 BCY6031, 177± 215± 133± 63± 53± 45± 71± 2 mpk, 1x/sem 24 35 37 31 37 36 67 4 BCY6173 178± 276± 328± 594± 745± 960± 1074± 1 mpk, 1x/sem 26 8 73 62 22 53 150 5 BCY6173, 178± 277± 262± 309± 425± 436± 480± 2 mpk, 1x/sem 28 61 125 238 334 323 347 6 BCY6173, 179± 182± 133± 87± 77± 60± 47± 3 mpk, 1x/sem 43 71 88 68 65 54 42 7 BCY6135 178± 267± 262± 436± 599± 703± 871± 1 mpk, 1x/sem 22 66 58 67 89 36 28 8 BCY6135 178± 176± 117± 70± 67± 52± 62± 2 mpk, 1x/sem 23 48 43 23 23 21 7 9 BCY6135 177± 178± 92± 62± 62± 57± 44± 3 mpk, 1x/sem 39 79 67 46 51 51 40
Gr. Tratamento Dias após o início do tratamento 0 2 4 7 9 11 14 10 BCY6033 178± 186± 79± 29± 12± 6± 9± 3 mpk, 1x/sem 26 34 30 15 8 4 7 11 BCY6033 178± 117± 41± 12± 6± 4± 0± 5 mpk, 1x/sem 36 20 10 4 2 0 0 12 BCY6136 178± 249± 115± 126± 158± 140± 245± 2mpk, 1x/sem 19 22 8 53 71 89 116 13 BCY6136 178± 168± 72± 22± 21± 8± 3± 3 mpk, 1x/sem 36 21 18 7 15 6 2 14 BCY6136 178± 165± 52± 18± 9± 5± 2± 5 mpk, 1x/sem 26 33 10 7 4 2 1 15 BCY6174 180± 231± 226± 432± 602± 742± 1066± 1 mpk, 1x/sem 35 19 29 37 63 62 130 16 BCY6174 178± 203± 123± 216± 291± 326± 532± 2mpk, 1x/sem 31 50 29 47 40 68 91 17 BCY6174 178± 195± 110± 58± 34± 21± 11± 3 mpk, 1x/sem 33 13 39 23 17 11 7 18 BCY6175 178± 248± 244± 347± 435± 558± 769± 1 mpk, 1x/sem 27 62 74 18 18 38 26 19 BCY6175 178± 223± 158± 116± 156± 166± 295± 2 mpk, 1x/sem 22 42 59 35 52 51 88 20 BCY6175 179± 189± 116± 43± 33± 25± 11± 3 mpk, 1x/sem 39 48 50 18 18 13 9 21 ADC 180± 158± 58± 18± 7± 2± 0± 3 mpk, 1x/sem 26 30 8 2 1 2 0 (iii) Análise de inibição do crescimento tumoral
[00552] A taxa de inibição do crescimento tumoral para BCYs no modelo de xenoenxerto de HT1080 foi calculada com base em medi- ções do volume tumoral em 14 dias após o início do tratamento.
Tabela 62: Análise de inibição do crescimento tumoral Gr Tratamento Volume tumo- T/Cb TGI Valor p compara- ral (mm3)a (%) (%) do com veículo 1 Veículo, 1x/sem 1737±258 -- -- -- 2 BCY6082, 2 mpk, 5±3 0,3 111,1 p<0,01 1x/sem 3 BCY6031, 2 mpk, 71±67 4,1 106,8 p<0,01 1x/sem 4 BCY6173, 1 mpk, 1074±150 61,8 42,5 p>0,05 1x/sem 5 BCY6173, 2 mpk, 480±347 27,6 80,6 p<0,05 1x/sem 6 BCY6173, 3 mpk, 47±42 2,7 108,4 p<0,01 1x/sem 7 BCY6135, 1 mpk, 871±28 50,1 55,5 p<0,01 1x/sem 8 BCY6135, 2 mpk, 62±7 3,5 107,5 p<0,001 1x/sem 9 BCY6135, 3 mpk, 44±40 2,5 108,6 p<0,001 1x/sem 10 BCY6033, 3 mpk, 9±7 0,5 110,8 p<0,001 1x/sem 11 BCY6033, 5 mpk, 0±0 0,0 111,4 p<0,001 1x/sem 12 BCY6136, 2mpk, 245±116 14,1 95,7 p<0,001 1x/sem 13 BCY6136, 3 mpk, 3±2 0,2 111,2 p<0,001 1x/sem 14 BCY6136, 5 mpk, 2±1 0,1 111,3 p<0,001 1x/sem 15 BCY6174, 1 mpk, 1066±130 61,4 43,1 p<0,05 1x/sem 16 BCY6174, 2 mpk, 532±91 30,6 77,3 p<0,01 1x/sem
Gr Tratamento Volume tumo- T/Cb TGI Valor p compara- ral (mm3)a (%) (%) do com veículo 17 BCY6174, 3 mpk, 11±7 0,6 110,7 p<0,001 1x/sem 18 BCY6175, 1 mpk, 769±26 44,3 62,1 p<0,01 1x/sem 19 BCY6175, 2 mpk, 295±88 17,0 92,5 p<0,001 1x/sem 20 BCY6175, 3 mpk, 11±9 0,6 110,8 p<0,001 1x/sem 21 ADC, 3 mpk, 0±0 0,0 111,5 - 1x/sem a. Média ± SEM. b. A inibição do crescimento tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio do grupo, para o grupo tratado, pelo volume tumoral médio do grupo para o grupo controle (T/C). (e) Sumário e discussão dos resultados
[00553] Nesse estudo, a eficácia terapêutica de BCYs foi avaliada no modelo de xenoenxerto de HT1080. Os pesos corporais medidos e os volumes tumorais de todos os grupos de tratamento em vários mo- mentos são mostrados nas Figuras 34 a 42 e Tabelas 61 e 62.
[00554] O tamanho tumoral médio de camundongos tratados com veículo atingiu 1737 mm3 no Dia 14.
[00555] BCY6082 a 2 mg/kg, 1x/semana (TV=5 mm3, TGI=111,1%, p<0,01) e BCY6031 a 2 mg/kg, 1x/semana, (TV=7 mm3, TGI=106,8%, p<0,01) mostraram atividade antitumoral potente.
[00556] BCY6173 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV=1074 mm3, TGI=42,5%, p>0,05), 2 mg/kg, 1x/semana (TV=480 mm3, TGI=80,6%, p<0,05) e 3 mg/kg, 1x/semana (TV=7 mm3, TGI=108,4%, p<0,01) pro- duziram atividade antitumoral dose-dependente.
[00557] BCY6135 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV=871 mm3, TGI=55,5%, p<0,01), 2 mg/kg, 1x/semana (TV=62 mm3, TGI=107,5%,
p<0,001) e 3 mg/kg, 1x/semana (TV=44 mm3, TGI=108,6%, p<0,001) produziu atividade antitumoral dose-dependente.
[00558] BCY6033 a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=9 mm3, TGI=110,8%, p<0,001) e 5 mg/kg, 1x/semana (TV=0 mm3, TGI=111,4%, p<0,001) mostrou atividade antitumoral potente e erradicou completamente os tumores no Dia 14 a 5 mg/kg.
[00559] BCY6136 a 2 mg/kg, 1x/semana (TV=345 mm3, TGI=95,7%, p<0,001), 3 mg/kg, 1x/semana (TV=3 mm3, TGI=111,2%, p<0,001) e 5 mg/kg, 1x/semana (TV=2 mm3, TGI=111,3%, p<0,001) mostrou atividade antitumoral potente.
[00560] BCY6174 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV=1066 mm3, TGI=43,1%, p<0,05), 2 mg/kg, 1x/semana (TV=532 mm3, TGI=77,3%, p<0,01) e 3 mg/kg, 1x/semana (TV=11 mm3, TGI=110,7%, p<0,001) produziu atividade antitumoral dose-dependente.
[00561] BCY6175 a 1 mg/kg, 1x/semana (TV=769 mm3, TGI=62,1%, p<0,01), 2 mg/kg, 1x/semana (TV=295 mm3, TGI=92,5%, p<0,001) e 3 mg/kg, 1x/semana (TV=11 mm3, TGI=110,8%, p<0,001) produziu atividade antitumoral dose-dependente.
[00562] ADC a 3 mg/kg, 1x/semana (TV=0 mm3, TGI=111,5%) erra- dicou completamente os tumores no Dia 14. Estudo 24: Investigação da associação entre variação no número de cópias (CNV) e expressão gênica de EphA2 em múltiplos tipos de tu- mor Métodos
1. Selecionar todos os estudos em cBioPortal (http://www.cbioportal.org/) e pesquisar EPHA2. (a) Retirar estudos provisórios. (b) Desmarcar estudos com amostras sobrepostas para evitar viés cri- ado pelas amostras (com base em advertência no cBioPortal) – manter sempre o estudo PanCancer se este for uma opção.
(c) Estudos selecionados para análise (Tabela 63). Tabela 63: Estudos analisados do cBioPortal e unidades no Estudo Nome do estudo Unidades Carcinoma de mama invasivo Expressão de mRNA, Lote norma- (TCGA, PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma de pulmão de células Expressão de mRNA, Lote norma- escamosas (TCGA, PanCancer lizado/integrado com Illumina HiS- Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma renal de células renais Expressão de mRNA, RSEM (Lote papilares (TCGA, PanCancer normalizado com Illumina HiS- Atlas) eq_RNASeqV2) Carcinoma renal de células claras Expressão de mRNA, RSEM (Lote (TCGA, PanCancer Atlas) normalizado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Adenocarcinoma de cólon (TCGA, RSEM (Lote normalizado com Illu- PanCancer Atlas) mina HiSeq_RNASeqV2) Carcinoma de células escamosas Expressão de mRNA, RSEM (Lote da cabeça e pescoço (TCGA, normalizado com Illumina HiS- PanCancer Atlas) eq_RNASeqV2) Carcinoma urotelial de bexiga RSEM (Lote normalizado com Illu- (TCGA, PanCancer Atlas) mina HiSeq_RNASeqV2) Melanoma uveal (TCGA, PanCan- Expressão de mRNA, Lote norma- cer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma pulmonar (TCGA, Expressão de mRNA, RSEM (Lote PanCancer Atlas) normalizado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Cistoadenocarcinoma seroso de Expressão de mRNA, Lote norma- ovário (TCGA, PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Câncer de mama (METABRIC, Na- Expressão de mRNA (microarran- ture 2012 & Nat Commun 2016) jo)
Nome do estudo Unidades Mesotelioma (TCGA, PanCancer Expressão de mRNA, Lote norma- Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma colorretal (TCGA, RNA Seq RPKM Nature 2012) Carcinoma cervical de células es- RSEM (Lote normalizado com Illu- camosas (TCGA, PanCancer mina HiSeq_RNASeqV2) Atlas) Sarcoma (TCGA, PanCancer Expressão de mRNA, Lote norma- Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Cancer Cell Line Enciclopedia (No- Expressão de mRNA (microarran- vartis/Broad, Nature 2012) jo) Adenocarcinoma de reto (TCGA, Expressão de mRNA, Lote norma- PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Fígado - carcinoma hepatocelular EPHA2: Expressão de mRNA, (TCGA, PanCancer Atlas) RSEM (Lote normalizado com Illu- mina HiSeq_RNASeqV2) Adenocarcinoma de estômago Expressão de mRNA, Lote norma- (TCGA, PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma do endométrio do corpo Expressão de mRNA, Lote norma- uterino (TCGA, PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Pele - melanoma cutâneo (TCGA, Expressão de mRNA, Lote norma- PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma de próstata Expressão de mRNA, RSEM (Lote (TCGA, PanCancer Atlas) normalizado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Carcinoma renal cromófobo Expressão de mRNA, RSEM (Lote (TCGA, PanCancer Atlas) normalizado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2)
Nome do estudo Unidades Tumor de Wilms pediátrico (TAR- Epha2: Expressão de mRNA GET, 2018) (RNA-Seq RPKM) Feocromocitoma e Paraganglioma Expressão de mRNA, Lote norma- (TCGA, PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma de tireoide (TCGA, Expressão de mRNA, Lote norma- PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma de esôfago RSEM (Lote normalizado com Illu- (TCGA, PanCancer Atlas) mina HiSeq_RNASeqV2) Colangiocarcinoma (TCGA, Pan- RSEM (Lote normalizado com Illu- Cancer Atlas) mina HiSeq_RNASeqV2) Glioma cerebral de grau baixo RSEM (Lote normalizado com Illu- (TCGA, PanCancer Atlas) mina HiSeq_RNASeqV2) Timoma (TCGA, PanCancer Atlas) Expressão de mRNA, Lote norma- lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Leucemia linfoide aguda pediátrica Epha2: Expressão de mRNA - Fase II (TARGET, 2018) (RNA-Seq RPKM) Linfoma difuso de grandes células Expressão de mRNA, RSEM (Lote B (TCGA, PanCancer Atlas) normalizado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Glioblastoma Multiforme (TCGA, Expressão de mRNA, RSEM (Lote PanCancer Atlas) normalizado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Câncer de próstata metastático, Expressão de mRNA / capture SU2C/PCF Dream Team (Robin- (RNA Seq RPKM) son et al., Cell 2015) Leucemia mieloide aguda (TCGA, Expressão de mRNA, RSEM (Lote PanCancer Atlas) normalizado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Tumores testiculares da linhagem Expressão de mRNA, Lote norma- germinativa (TCGA, PanCancer lizado/integrado com Illumina HiS- Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369
Nome do estudo Unidades Carcinoma adrenocortical (TCGA, RSEM (Lote normalizado com Illu- PanCancer Atlas) mina HiSeq_RNASeqV2) Carcinossarcoma uterino (TCGA, Expressão de mRNA, Lote norma- PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma pancreático Expressão de mRNA, Lote norma- (TCGA, PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma de próstata Expressão de mRNA (MSKCC, Cancer Cell 2010) Adenocarcinoma de próstata (Fred Expressão de mRNA Hutchinson CRC, Nat Med 2016)
2. Exportar dados de CNV e expressão de RNA desde o cBioPortal.
3. Testar se CNVs são estatística e significativamente associadas com alterações na expressão de mRNA para EphA2 (log2 não aplicado). (a) Executar teste não paramétrico de Kruskal-Wallis no GraphPad Prism (7,04) e R/R studio (limite para significância: p<0,01). (i) GraphPad Prism: estabelecer a tabela de colunas, executar o teste não paramétrico sem correspondência ou pareamento e não pressupor distribuição gaussiana. (ii) Pacotes usados em R:
1. XLConnect
2. dplyr
3. Teste da Soma de Postos de Kruskal-Wallis: Kruskal.test.
4. Ajustar para comparações múltiplas (incluir todas as comparações possíveis mesmo se n=1 dentro de i, grupo) no R/R studio usando o teste de Dunn (limite para significância: p<0,025). (a) dunn.test com método de comparações múltiplas= "bonferonni". Resultados
[00563] Os resultados são mostrados na Tabela 64 abaixo. Entre 41 conjuntos de dados disponíveis publicamente, compilados no cBioPor-
tal, que relatam a Variação no número de cópias (CNV) e expressão gênica de mRNA para EphA2, houve inúmeros tipos de câncer onde foram relatados casos com deleções heterozigotas (shallow deletions) em EphA2 (<2 cópias). Embora menos comum, nesses mesmos tipos de câncer, um subconjunto de tumores abrigava deleções homozigo- tas (deep deletions) em EphA2 (>1 perda de cópia ou perda bialélica), ganhos em EphA2 (2-3 cópias) ou amplificações de EphA2 (>3 có- pias). As indicações onde >33% dos tumores apresentavam deleções heterozigotas ou deleções homozigotas em EphA2 incluíram: carcino- ma renal cromófobo, colangiocarcinoma, feocromocitoma e paragan- glioma, câncer de pulmão de células escamosas, mama, reto, glioma cerebral de grau baixo, fígado, carcinoma adrenocortical, mesotelioma, adenocarcinoma de esôfago e câncer de cólon. Em contraste, não ha- via estudos onde >33% das amostras apresentavam ganhos ou ampli- ficação em EphA2. Considerados em conjunto, esses resultados de- monstram que deleções no DNA de EphA2 são encontradas em uma variedade de indicações.
[00564] Aproximadamente um terço de todas as amostras analisa- das nos 41 estudos abrigava CNVs de EphA2. Com base nessa por- centagem elevada de CNVs nos estudos, e na alta porcentagem de deleções heterozigotas dentro de tipos específicos de tumor, foram realizados testes estatísticos para identificar possíveis associações entre variações do número de cópias e expressão do RNA. Os tumo- res por indicação foram alocados para 1 de 5 classes: a) Deleção homozigota; b) Deleção heterozigota; c) Diploide; d) Ganho; ou e) Amplificação.
[00565] Os testes de Kruskall-Wallis foram então realizados para detectar se as distribuições dos valores de expressão de mRNA por classes diferia entre as classes (P < 0,01). Para aqueles conjuntos de dados no TCGA com P < 0,01 e para identificar quais classes eram diferentes umas das outras, realizaram-se testes post hoc calculando Z estatístico com valores P ajustados calculados (Bonferroni). Para simplicidade de interpretação, comparações pareadas versus diploide por indicação foram revisadas (embora todos os valores P pareados fossem calculados). 19/41 desses estudos apresentam valor p <0,01 no teste de Kruskall-Wallis, demonstrando que o número de cópias está estatística e significativamente associado com expressão de RNA. Desses 19 estudos, 17 destes apresentaram valor p ajustado por Bonferroni < 0,025 para Diploide versus Deleção Heterozigota, indi- cando uma associação de expressão diminuída do mRNA de EphA2 com número diminuído de cópias de EphA2. Somente 2 desses 19 es- tudos tiveram um P ajustado por Bonferroni < 0,025 para Diploide ver- sus Ganho e ambos eram estudos de câncer de mama. Além disso, um desses estudos de câncer de mama (Carcinoma de mama invasivo (TCGA, PanCancer Atlas)) apresentou valor P ajustado por Bonferroni P<0,025 para Diploide versus Deleção Homozigota e para Diploide versus Ganho, sugerindo que alterações no número de cópias pode ter um impacto forte sobre a expressão de RNA de EphA2 no câncer de mama.
[00566] O dogma central da genética sugere que o número reduzi- do de cópias em EphA2 levou a expressão reduzida de RNA e protei- ca. Portanto, as associações observadas entre perda do número de cópias de EphA2 e expressão reduzida de mRNA em uma variedade de tipos de tumor sugerem que a expressão proteica de EphA2 pode igualmente ser reduzida. Do mesmo modo, ganhos do número de có- pias de EphA2 no câncer de mama que foram associados com ex- pressão aumentada do mRNA podem também sugerir expressão pro-
teica aumentada de EphA2. Além disso, maior expressão proteica de EphA2 (medida por FACS) está associada com eficácia aumentada de certos conjugados de fármaco bicíclico para EphA2 da invenção (me- dida pelo volume tumoral) em modelos pré-clínicos in vivo.
Considera- dos em conjunto, se alterações no número de cópias que estão asso- ciadas com mudanças na expressão de mRNA efetivamente predizem os níveis de expressão da proteína, então, pacientes com tumores contendo deleções no número de cópias de EphA2 podem ser menos propensos a responder aos conjugados de fármaco bicíclico para EphA2 da invenção.
Do mesmo modo, se pacientes com ganhos no número de cópias em EphA2 (p. ex., câncer de mama), é possível que esses pacientes sejam mais propensos a responder aos conjugados de fármaco bicíclico para EphA2 da invenção.
Portanto, se os pacien- tes fossem estratificados pelo status do número de cópias de EphA2, então essa informação poderia ser utilizada para excluir e para seleci- onar pacientes para o tratamento com conjugados de fármaco bicíclico para EphA2 da invenção visando aumentar a eficácia.
Tabela 64: Resultados da investigação da associação entre variação no número de cópias (CNV) e expressão do ge- ne para EphA2 Número de amostras/grupo (n=X) Teste de Kruskal- Comparação pareada, Z estatístico (valor p ajus- Wallis tado), Bonferonni Nome do estudo Unidades Deleção Deleção Diploide Ganho Amplifi- Estatísti- Valor p Deleção Diploide- Diploide- Amplifica- homozi- hetero- cação ca de homozigo- depleção hete- ganho ção- gota zigota Kruskal- ta-Diploide rozigota diploide Wallis Carcinoma de Expressão de 5 415 511 61 2 80,816 < 2,2e-16 0,176118 6,460580 -4,603180 0,713978 mama invasivo mRNA, Lote norma- (1,0000) (0,0000)* (0,0000)* (1,0000) (TCGA, PanCan- lizado/integrado
289/299 cer Atlas) com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma de Expressão de 3 207 201 55 0 52,942 1,89E-11 -1,584610 6,786501 -0,019607 N/A pulmão de células mRNA, Lote norma- (0,3392) (0,0000)* (1,0000) escamosas lizado/integrado (TCGA, PanCan- com Illumina HiS- cer Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma renal Expressão de 1 48 224 0 1 42,161 3,71E-09 -1,586207 6,097375 N/A 1,549107 de células renais mRNA, RSEM (Lote (0,3381) (0,0000)* (0,3641) papilares (TCGA, normalizado com PanCancer Atlas) Illumina HiS- eq_RNASeqV2)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste de Kruskal- Comparação pareada, Z estatístico (valor p ajus- Wallis tado), Bonferonni Nome do estudo Unidades Deleção Deleção Diploide Ganho Amplifi- Estatísti- Valor p Deleção Diploide- Diploide- Amplifica- homozi- hetero- cação ca de homozigo- depleção hete- ganho ção- gota zigota Kruskal- ta-Diploide rozigota diploide Wallis Carcinoma renal Expressão de 0 69 278 5 0 38,342 4,72E-09 N/A 6,133219 -0,487059 N/A de células claras mRNA, RSEM (Lote (0,0000)* (0,9393) (TCGA, PanCan- normalizado com cer Atlas) Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Adenocarcinoma RSEM (Lote norma- 3 132 245 8 0 35,397 1,00E-07 -2,158194 5,670600 0,781046 N/A
290/299 de cólon (TCGA, lizado com Illumina (0,0927) (0,0000)* (1,0000) PanCancer Atlas) HiSeq_RNASeqV2) Carcinoma de Expressão de 3 86 345 54 0 32,72 3,69E-07 -2,444914 4,680789 -1,530670 N/A células escamosas mRNA, RSEM (Lote (0,0435) (0,0000)* (0,3776) da cabeça e pes- normalizado com coço (TCGA, Illumina HiS- PanCancer Atlas) eq_RNASeqV2) Carcinoma uroteli- RSEM (Lote norma- 0 73 245 80 4 28,906 2,34E-06 N/A 5,203251 0,211744 0,581704 al de bexiga lizado com Illumina (0,0000)* (1,0000) (1,0000) (TCGA, PanCan- HiSeq_RNASeqV2) cer Atlas)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste de Kruskal- Comparação pareada, Z estatístico (valor p ajus- Wallis tado), Bonferonni Nome do estudo Unidades Deleção Deleção Diploide Ganho Amplifi- Estatísti- Valor p Deleção Diploide- Diploide- Amplifica- homozi- hetero- cação ca de homozigo- depleção hete- ganho ção- gota zigota Kruskal- ta-Diploide rozigota diploide Wallis Melanoma uveal Expressão de 0 24 56 0 0 21,051 4,47E-06 N/A 4,588095 N/A N/A (TCGA, PanCan- mRNA, Lote norma- (0,0000)* cer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369
291/299 Adenocarcinoma Expressão de 1 115 263 121 3 28,874 8,29E-06 -0,690460 4,280100 -0,626707 2,276458 pulmonar (TCGA, mRNA, RSEM (Lote (1,0000) (0,0001)* (1,0000) (0,1141) PanCancer Atlas) normalizado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Cistoadenocarci- Expressão de 0 59 78 60 4 25,349 1,31E-05 N/A 4,390097 -0,239249 0,240543 noma seroso de mRNA, Lote norma- (0,0000)* (1,0000) (1,0000) ovário (TCGA, lizado/integrado PanCancer Atlas) com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Câncer de mama Expressão de 1 491 1349 25 0 23,875 2,65E-05 0,568937 2,274564 -4,115288 N/A (METABRIC, Na- mRNA (microarran- (1,0000) (0,0688) (0,0001)* ture 2012 & Nat jo) Commun 2016)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste de Kruskal- Comparação pareada, Z estatístico (valor p ajus- Wallis tado), Bonferonni Nome do estudo Unidades Deleção Deleção Diploide Ganho Amplifi- Estatísti- Valor p Deleção Diploide- Diploide- Amplifica- homozi- hetero- cação ca de homozigo- depleção hete- ganho ção- gota zigota Kruskal- ta-Diploide rozigota diploide Wallis Mesotelioma Expressão de 0 29 50 3 0 18,866 8,00E-05 N/A 4,319425 0,170478 N/A (TCGA, PanCan- mRNA, Lote norma- (0,0000)* (1,0000) cer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369
292/299 Adenocarcinoma RNA Seq RPKM 0 53 138 2 0 18,847 8,08E-05 N/A 4,298092 -0,338975 N/A colorretal (TCGA, (0,0000)* (1,0000) Nature 2012) Carcinoma cervi- RSEM (Lote norma- 1 31 167 76 0 19,435 2,22E-04 -1,618248 3,429609 -1,446339 N/A cal de células es- lizado com Illumina (0,3168) (0,0018)* (0,4442) camosas (TCGA, HiSeq_RNASeqV2) PanCancer Atlas) Sarcoma (TCGA, Expressão de 0 43 113 70 4 19,389 2,27E-04 N/A 3,666949 -0,852454 0,953027 PanCancer Atlas) mRNA, Lote norma- (0,0007)* (1,0000) (1,0000) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369
Número de amostras/grupo (n=X) Teste de Kruskal- Comparação pareada, Z estatístico (valor p ajus- Wallis tado), Bonferonni Nome do estudo Unidades Deleção Deleção Diploide Ganho Amplifi- Estatísti- Valor p Deleção Diploide- Diploide- Amplifica- homozi- hetero- cação ca de homozigo- depleção hete- ganho ção- gota zigota Kruskal- ta-Diploide rozigota diploide Wallis Cancer Cell Line Expressão de 17 279 418 150 13 20,977 0,00032 -2,084879 -3,615935 -2,007004 -0,108880 Enciclopedia (No- mRNA (microarran- (0,1854) (0,0015)* (0,2237) (1,0000) vartis/Broad, Natu- jo) re 2012) Adenocarcinoma Expressão de 1 54 78 3 0 18,215 0,000397 -1,926519 3,877166 1,167400 N/A de reto (TCGA, mRNA, Lote norma- 1 (0,1621) (0,0003)* (0,7291)
293/299 PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Fígado - carcino- EPHA2: Expressão 1 130 194 21 2 15,514 0,003745 0,302341 3,697248 -0,336659 0,454454 ma hepatocelular de mRNA, RSEM (1,0000) (0,0011)* (1,0000) (1,0000) (TCGA, PanCan- (Lote normalizado cer Atlas) com Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Adenocarcinoma Expressão de 2 90 264 44 7 13,966 0,007404 -2,072978 1,606072 -1,750466 1,602806 de estômago mRNA, Lote norma- (0,1909) (0,5413) (0,4002) (0,5449) (TCGA, PanCan- lizado/integrado cer Atlas) com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369
Número de amostras/grupo (n=X) Teste de Kruskal- Comparação pareada, Z estatístico (valor p ajus- Wallis tado), Bonferonni Nome do estudo Unidades Deleção Deleção Diploide Ganho Amplifi- Estatísti- Valor p Deleção Diploide- Diploide- Amplifica- homozi- hetero- cação ca de homozigo- depleção hete- ganho ção- gota zigota Kruskal- ta-Diploide rozigota diploide Wallis Carcinoma do Expressão de 3 61 395 43 5 12,916 0,0117 -1,905863 1,039307 -1,597383 2,268798 endométrio do mRNA, Lote norma- (0,2833) (1,0000) (0,5509) (0,1164) corpo uterino lizado/integrado (TCGA, PanCan- com Illumina HiS- cer Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369
294/299 Pele - melanoma Expressão de 2 70 216 72 3 12,242 0,01564 1,094526 2,674493 0,095966 1,692628 cutâneo (TCGA, mRNA, Lote norma- (1,0000) (0,0374) (1,0000) (0,4526) PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma Expressão de 0 44 438 4 1 10,112 0,01764 N/A 2,905502 1,374609 -0,082790 de próstata mRNA, RSEM (Lote (0,0110)* (0,5078) (1,0000) (TCGA, PanCan- normalizado com cer Atlas) Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Carcinoma renal Expressão de 0 52 12 1 0 7,8781 0,01947 N/A 2,498340 1,863169 N/A cromófobo (TCGA, mRNA, RSEM (Lote (0,0187)* (0,0937) PanCancer Atlas) normalizado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste de Kruskal- Comparação pareada, Z estatístico (valor p ajus- Wallis tado), Bonferonni Nome do estudo Unidades Deleção Deleção Diploide Ganho Amplifi- Estatísti- Valor p Deleção Diploide- Diploide- Amplifica- homozi- hetero- cação ca de homozigo- depleção hete- ganho ção- gota zigota Kruskal- ta-Diploide rozigota diploide Wallis Tumor de Wilms Epha2: Expressão 0 22 74 5 0 7,4912 0,02362 N/A 2,690766 -0,173274 N/A pediátrico (TAR- de mRNA (RNA- (0,0107)* (1,0000) GET, 2018) Seq RPKM) Feocromocitoma e Expressão de 4 96 60 1 0 8,8074 0,03196 -1,411567 2,201344 1,946134 N/A Paraganglioma mRNA, Lote norma- (0,4742) (0,0831) (0,1549) (TCGA, PanCan- lizado/integrado
295/299 cer Atlas) com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Carcinoma de Expressão de 0 4 474 2 0 5,1773 0,08 N/A 2,221884 0,503577 N/A tireoide (TCGA, mRNA, Lote norma- (0,0394) (0,9218) PanCancer Atlas) lizado/integrado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma RSEM (Lote norma- 1 64 83 32 1 7,6886 0,1037 -1,462679 0,910990 -1,682311 -0,362298 de esôfago lizado com Illumina (0,7178) (1,0000) (0,4625) (1,0000) (TCGA, PanCan- HiSeq_RNASeqV2) cer Atlas) Colangiocarcino- RSEM (Lote norma- 2 27 7 0 0 4,1691 0,1244 -2,037840 0,972100 N/A N/A ma (TCGA, Pan- lizado com Illumina (0,0623) (0,4965) Cancer Atlas) HiSeq_RNASeqV2)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste de Kruskal- Comparação pareada, Z estatístico (valor p ajus- Wallis tado), Bonferonni Nome do estudo Unidades Deleção Deleção Diploide Ganho Amplifi- Estatísti- Valor p Deleção Diploide- Diploide- Amplifica- homozi- hetero- cação ca de homozigo- depleção hete- ganho ção- gota zigota Kruskal- ta-Diploide rozigota diploide Wallis Glioma cerebral de RSEM (Lote norma- 0 191 303 13 0 4,0473 0,1322 N/A 0,722383 -1,771514 N/A grau baixo (TCGA, lizado com Illumina (0,7051) (0,1147) PanCancer Atlas) HiSeq_RNASeqV2) Timoma (TCGA, Expressão de 0 8 110 1 0 4,0322 1,33E-01 N/A 1,982334 0,369115 N/A PanCancer Atlas) mRNA, Lote norma- (0,0712) (1,0000) lizado/integrado
296/299 com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Leucemia linfoide Epha2: Expressão 1 6 70 4 0 5,5309 0,1368 1,437404 -0,805100 1,607586 N/A aguda pediátrica - de mRNA (RNA- (0,4518) (1,0000) (0,3238) Fase II (TARGET, Seq RPKM) 2018) Linfoma difuso de Expressão de 0 4 33 0 0 1,744 0,1866 N/A 1,320613 N/A N/A grandes células B mRNA, RSEM (Lote (0,0933) (TCGA, PanCan- normalizado com cer Atlas) Illumina HiS- eq_RNASeqV2)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste de Kruskal- Comparação pareada, Z estatístico (valor p ajus- Wallis tado), Bonferonni Nome do estudo Unidades Deleção Deleção Diploide Ganho Amplifi- Estatísti- Valor p Deleção Diploide- Diploide- Amplifica- homozi- hetero- cação ca de homozigo- depleção hete- ganho ção- gota zigota Kruskal- ta-Diploide rozigota diploide Wallis Glioblastoma Mul- Expressão de 0 13 104 28 0 2,9376 0,2302 N/A 1,428778 -0,716110 N/A tiforme (TCGA, mRNA, RSEM (Lote (0,2296) (0,7109) PanCancer Atlas) normalizado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Câncer de prósta- Expressão de 2 21 87 7 0 4,069 0,254 -1,812613 0,992571 0,314089 N/A
297/299 ta metastático, mRNA / captura (0,2097) (0,9628) (1,0000) SU2C/PCF Dream (RNA Seq RPKM) Team (Robinson et al., Cell 2015) Leucemia mieloide Expressão de 0 1 160 4 0 2,4016 0,301 N/A -1,539142 -0,199532 N/A aguda (TCGA, mRNA, RSEM (Lote (0,1857) (1,0000) PanCancer Atlas) normalizado com Illumina HiS- eq_RNASeqV2) Tumores testicula- Expressão de 1 29 92 22 0 3,3144 0,3456 0,574846 -0,443110 -1,751161 N/A res da linhagem mRNA, Lote norma- (1,0000) (1,0000) (0,2398) germinativa lizado/integrado (TCGA, PanCan- com Illumina HiS- cer Atlas) eq_RNASeqV2 syn4976369
Número de amostras/grupo (n=X) Teste de Kruskal- Comparação pareada, Z estatístico (valor p ajus- Wallis tado), Bonferonni Nome do estudo Unidades Deleção Deleção Diploide Ganho Amplifi- Estatísti- Valor p Deleção Diploide- Diploide- Amplifica- homozi- hetero- cação ca de homozigo- depleção hete- ganho ção- gota zigota Kruskal- ta-Diploide rozigota diploide Wallis Carcinoma adre- RSEM (Lote norma- 0 28 47 1 0 2,0003 0,3678 N/A 1,346397 0,550103 N/A nocortical (TCGA, lizado com Illumina (0,2673) (0,8734) PanCancer Atlas) HiSeq_RNASeqV2) Carcinossarcoma Expressão de 0 16 22 16 2 2,44 0,4862 N/A 0,476071 -0,550292 1,215102 uterino (TCGA, mRNA, Lote norma- (1,0000) (1,0000) (0,6730) PanCancer Atlas) lizado/integrado
298/299 com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma Expressão de 2 50 106 9 1 3,3833 4,96E-01 -1,195082 0,159442 -0,602558 1,217697 pancreático mRNA, Lote norma- (1,0000) (1,0000) (1,0000) (1,0000) (TCGA, PanCan- lizado/integrado cer Atlas) com Illumina HiS- eq_RNASeqV2 syn4976369 Adenocarcinoma Expressão de 0 5 77 3 0 1,3139 0,5184 N/A -0,406579 -1,089948 N/A de próstata mRNA (1,0000) (0,4136) (MSKCC, Cancer Cell 2010)
Número de amostras/grupo (n=X) Teste de Kruskal- Comparação pareada, Z estatístico (valor p ajus- Wallis tado), Bonferonni Nome do estudo Unidades Deleção Deleção Diploide Ganho Amplifi- Estatísti- Valor p Deleção Diploide- Diploide- Amplifica- homozi- hetero- cação ca de homozigo- depleção hete- ganho ção- gota zigota Kruskal- ta-Diploide rozigota diploide Wallis Adenocarcinoma Expressão de 0 39 84 10 0 0,028351 0,9859 N/A 0,160404 0,079785 N/A de próstata (Fred mRNA (1,0000) (1,0000) Hutchinson CRC, Nat Med 2016)
299/299

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. Ligante peptídico específico para EphA2, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo compreendendo pelo menos três resíduos de cisteína, separadas por pelo menos duas se- quências de loop, e um arcabouço molecular não aromático que forma ligações covalentes com os resíduos de cisteína do polipeptídeo tal que pelo menos dois loops polipeptídicos sejam formados no arcabou- ço molecular.
2. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que as ditas sequências de loop compreen- dem 2, 3, 5, 6 ou 7 aminoácidos.
3. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências de loop compreen- dem três resíduos de cisteína, separados por duas sequências de loop uma das quais consiste em 2 aminoácidos e a outra consiste em 7 aminoácidos (tais quais aqueles listados na Tabela 4).
4. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências de loop compreen- dem três resíduos de cisteína, separados por duas sequências de loop, ambas as quais consistem em 5 aminoácidos (tais quais aqueles listados nas Tabelas 3 e 4).
5. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências de loop compreen- dem três resíduos de cisteína, separados por duas sequências de loop, ambas as quais consistem em 6 aminoácidos (tais quais aqueles listados nas Tabelas 3 a 5 e 10).
6. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências de loop compreen- dem três resíduos de cisteína, separados por duas sequências de loop uma das quais consiste em 7 aminoácidos e a outra consiste em 3 aminoácidos (tais quais aqueles listados na Tabela 4).
7. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências de loop compreen- dem três resíduos de cisteína, separados por duas sequências de loop uma das quais consiste em 6 aminoácidos e a outra consiste em 7 aminoácidos (tais quais aqueles listados na Tabela 5).
8. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: Ci-X1-Cii-X2-Ciii em que X1 e X2 representam os resíduos de aminoácidos entre os re- síduos de cisteína listados nas Tabelas 3 a 5 e 10 e Ci, Cii e Ciii repre- sentam o primeiro, o segundo e o terceiro resíduo de cisteína, respec- tivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
9. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de um ou mais dos ligantes peptídicos listados em uma ou mais Tabelas 3 a 5 e 10.
10. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências de loop compreendem três resíduos de cisteína, separados por duas sequências de loop, ambas as quais consistem em 6 aminoácidos e o ligante peptídico possui a seguinte sequência de aminoácidos: Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 1); e CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii (SEQ ID NO: 97); como: Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 1); em que HyP é hidroxiprolina, HArg é homoarginina e Ci, Cii e Ciii repre- sentam o primeiro, o segundo e o terceiro resíduo de cisteína, respec-
tivamente, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
11. Ligante peptídico de acordo com a reivindicação 10, ca- racterizado pelo fato de que as ditas sequências de loop compreen- dem três resíduos de cisteína, separados por duas sequências de loop, ambas as quais consistem em 6 aminoácidos e o ligante peptídi- co possui a seguinte sequência de aminoácidos: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2) (BCY6099; Composto 66); e (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 11)) (BCY6014; Composto 67); como: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2) (BCY6099; Composto 66); em que Sar é sarcosina, HArg é homoarginina e HyP é hidroxiprolina.
12. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o arcabouço mole- cular é selecionado a partir de 1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5- triil)triprop-2-en-1-ona (TATA) e o ligante peptídico é selecionado a partir de qualquer um dos ligantes peptídicos listados nas Tabelas 3, 4, 5 e 10.
13. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o arcabouço mole- cular é selecionado a partir de 1,1',1''-(1,3,5-triazinano-1,3,5- triil)triprop-2-en-1-ona (TATA) e o ligante peptídico é: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ ID NO: 2) (BCY6099; Composto 66); e (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-CiPLVNPLCiiLHPGWTCiii ((β-Ala)-Sar10-(SEQ ID NO: 11)) (BCY6014; Composto 67); como: (β-Ala)-Sar10-A(HArg)D-Ci(HyP)LVNPLCiiLHP(D-Asp)W(HArg)Ciii (SEQ
ID NO: 2) (BCY6099; Composto 66); em que Sar é sarcosina, HArg é homoarginina e HyP é hidroxiprolina.
14. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é selecionado den- tre qualquer um dos Compostos 1-113 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
15. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é o Composto 66 (BCY6099) ou o Composto 67 (BCY6014) ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo, como o Composto 66 (BCY6099) ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
16. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceutica- mente aceitável é selecionada dentre o ácido livre ou o sal de sódio, potássio, cálcio ou amônio.
17. Ligante peptídico de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o EphA2 é EphA2 humano.
18. Conjugado de fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende um ligante peptídico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, conjugado a um ou mais grupos efetores e/ou funcionais.
19. Conjugado de fármaco de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dito agente citotóxico é seleciona- do dentre DM1 e MMAE.
20. Conjugado de fármaco de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um ligante entre o dito ligante peptídico e os ditos agentes citotóxicos.
21. Conjugado de fármaco de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o dito agente citotóxico é MMAE e o ligante é selecionado dentre: -Val-Cit-, -Trp-Cit-, -Val-Lys-, -D-Trp-Cit-, -Ala-Ala-Asn-, D-Ala-Phe-Lys- ou -Glu-Pro-Cit-Gly-hPhe-Tyr-Leu- (SEQ ID NO: 98).
22. Conjugado de fármaco de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o dito agente citotóxico é MMAE e o ligante é -Val-Cit-.
23. Conjugado de fármaco de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o dito agente citotóxico é DM1 e o ligante é selecionado dentre: -S-S-, -SS(SO3H)-, -SS-(Me)-, -(Me)-SS- (Me)-, -SS-(Me2)- ou -SS-(Me)-SO3H-.
24. Conjugado de fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de que é selecio- nado a partir de qualquer um dentre BCY6027, BCY6028, BCY6031 e BCY6032; os BDCs listados nas Tabelas 11 ou 13; ou BCY6033, BCY6082, BCY6136 e BCY6173.
25. Conjugado de fármaco de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir de qualquer um dentre: BCY6031, BCY6033, BCY6082, BCY6135, BCY6136, BCY6173, BCY6174 e BCY6175.
26. Conjugado de fármaco de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que é BCY6136.
27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o ligante peptídico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 ou o conjugado de fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 26, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
28. Conjugado de fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção, supressão ou no tratamento de uma doença ou distúr- bio caracterizado por superexpressão de EphA2 em tecido doente.
29. Conjugado de fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção, supressão ou no tratamento de câncer.
30. Conjugado de fármaco para uso de acordo com a rei- vindicação 29, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de: câncer de próstata, câncer de pulmão (como carcinomas de pulmão de células não pequenas (CPNPC)), câncer de mama (como câncer de mama triplo negativo), câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de esôfago, mieloma múltiplo e fibrossarcoma.
31. Método de prevenção, supressão ou tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente com necessidade do mesmo um conjugado de fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 26, em que o dito paciente é identificado como portador de aumento da variação no nú- mero de cópias (CNV) de EphA2.
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