KR20220051345A - 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EphA2에 결합하고, CD137에 결합하는 2개의 제2 펩티드 리간드에 링커를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암을 예방, 억제 또는 치료하는 데 있어서 상기 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체의 용도에 관한 것이다.

Description

헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체

본 발명은 EphA2에 결합하고, CD137에 결합하는 2개의 제2 펩티드 리간드에 링커(linker)를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암을 예방, 억제 또는 치료하는 데 있어서 상기 헤테로탠덤(heterotandem) 바이사이클릭 펩티드 복합체의 용도에 관한 것이다.

사이클릭 펩티드는 단백질 표적에 높은 친화도 및 표적 특이성으로 결합할 수 있기 때문에 치료제의 개발를 위한 매력적인 분자 부류이다. 사실, 예를 들어, 항균 펩티드 반코마이신, 면역억제제 사이클로스포린 또는 항암제 옥트레오티드와 같은 일부 사이클릭 펩티드는 이미 클리닉(clinic)에서 성공적으로 사용되고 있다(참조: Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). 양호한 결합 특성은 펩티드와 표적 사이에 형성된 비교적 큰 상호작용 표면 및 사이클릭 구조의 감소된 형태적 유연성으로 인해 발생한다. 전형적으로, 매크로사이클은, 예를 들어, 사이클릭 펩티드 CXCR4 길항제 CVX15(400Ų; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), 인테그린 αVb3에 결합하는 Arg-Gly-Asp 모티프를 갖는 사이클릭 펩티드(355Ų)(Xiong et al. (2002), Science 296(5565), 151-5) 또는 우로키나제형 플라스미노겐 활성제에 결합하는 사이클릭 펩티드 억제제 우파인-1(603Ų; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160(1), 1-10)과 같이 수백 평방 옹스트롬(square angstrom)의 표면에 결합한다.

이들의 사이클릭 구성으로 인해, 펩티드 매크로사이클(macrocycle)은 선형 펩티드보다 덜 유연하여 표적에 결합시 더 적은 엔트로피의 손실을 유도하고, 더 높은 결합 친화성을 초래한다. 감소된 유연성은 또한 표적 특이적 형태를 잠그게 하여 선형 펩티드와 비교하여 결합 특이성을 증가시킨다. 이 효과는 환이 개방되었을 때 다른 MMP에 비해 선택성을 상실한 매트릭스 메탈로프로테이나제 8(MMP-8)의 강력하고 선택적인 억제제에 의해 예시되었다(참조: Cherney et al. (1998), J Med Chem 41(11), 1749-51). 매크로사이클릭화를 통해 달성된 유리한 결합 특성은, 예를 들어, 반코마이신, 니신, 및 악티노마이신에서와 같이 하나 이상의 펩티드 환을 갖는 다환식 펩티드에서 훨씬 더 두드러진다.

다양한 연구팀이 이전에 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드를 합성 분자 구조에 결합시켰다(참조: Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). 멜로엔(Meloen) 및 공동 연구자들은 단백질 표면의 구조적 모방을 위한 합성 스캐폴드 상의 다중 펩티드 루프의 신속하고 정량적인 사이클릭화를 위해 트리스(브로모메틸)벤젠과 관련 분자를 사용하였다(참조: Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). 예를 들어, 1,1',1"-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온(TATA)으로서 분자 스캐폴드에 시스테인 함유 폴리펩티드를 연결함으로써 상기 화합물이 생성되는 후보 약물 화합물의 생성 방법은 WO2019/122860 및 WO2019/122863에 개시되어 있다.

파지 디스플레이 기반 조합 접근법은 관심 표적에 대한 바이사이클릭 펩티드의 큰 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위해 개발되었다(참조: Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 및 WO2009/098450). 간단히, 3개의 시스테인 잔기와 6개의 랜덤 아미노산(Cys-(Xaa)₆-Cys-(Xaa)₆-Cys)의 2개의 영역을 함유하는 선형 펩티드의 조합 라이브러리를 파지에 표시하고, 시스테인 측쇄를 작은 분자 (트리스-(브로모메틸)벤젠)에 공유 결합시킴으로써 사이클릭화했다.

본 발명의 제1 측면에 따르면,

(a) EphA2에 결합하고, 서열 A-[HArg]-D-C_i[HyP]LVNPLC_iiLEP[d1Nal]WTC_iii (서열번호 1; BCY13118)을 갖고;

(b) 둘 다 서열 Ac-C_i[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYC_iiFADPY[Nle]C_iii-A(서열번호 2; BCY8928)를 갖는, CD137에 결합하는 2개의 제2 펩티드 리간드에 N-(산-PEG₃)-N-비스(PEG₃-아지드) 링커를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공되며, 여기서 상기 펩티드 리간드 각각은 2개의 루프 서열에 의해 분리된, 3개의 반응성 시스테인 그룹(C_i, C_ii 및 C_iii)을 포함하는 폴리펩티드, 및 1,1',1"-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온(TATA)이고 2개의 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되도록 폴리펩티드의 반응성 시스테인 그룹과 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함하고;

여기서, Ac는 아세틸을 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, d1Nal은 D-1-나프틸알라닌을 나타내고, tBuAla는 3급-부틸-알라닌을 나타내고, PYA는 4-펜티노산(pentynoic acid)을 나타내고, Nle는 노르류신을 나타낸다.

본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 추가의 측면에 따르면, 암을 예방, 억제 또는 치료하는 데 사용하기 위한, 본원에 정의된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공된다.

도 1: A549, PC-3 및 HT29 세포(n=3)를 발현하는 EphA2의 존재하에 프로메가 CD137 루시퍼라제 리포터 검정에서 EphA2/CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY13272의 분석. BCY13626은 BCY13272와 유사한 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체이지만 D-아미노산을 포함하고 EphA2 또는 CD137에 결합하지 않는다.
도 2: CD1 마우스(n=3)에서 5.5mg/kg IV 투여, SD 래트(n=3)에서 3.6mg/kg IV 주입(15분) 및 시노몰구스 원숭이(n = 2)에서 8.9mg/kg IV 주입(15분)으로부터 BCY13272의 혈장 농도 대 시간 플롯. BCY13272의 약동학적 프로파일의 최종 반감기는 CD-1 마우스에서 2.9시간, SD 래트에서 2.5시간, 시노에서 8.9시간이다.
도 3: 동계 MC38 종양 모델에서 BCY13272의 항종양 활성. (a) BCY13272 치료 중 및 치료 후 MC38 종양 용적. D28의 완전 반응자(CR) 마우스의 수(및 D62에 CR로 잔류함)는 괄호 안에 표시된다. BIW: 주 2회 투약. IV: 정맥내 투여. (b) MC38 종양 세포 이식 후 BCY13272에 대한 완전 반응자 동물 및 나이브 연령 일치된 대조군 동물의 종양 성장 곡선. CR: 완전 반응자.
도 4: BCY13272는 (a) PBMC/MC38 및 (b) PBMC/HT29 공배양 검정에서 IFN-γ 사이토카인 분비를 유도한다. BCY12762는 EphA2에 결합하지만 CD137에는 결합하지 않는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체이다. BCY13692는 CD137에 결합하지만 EphA2에는 결합하지 않는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체이다. (c) 5명의 PBMC 공여자를 갖는 MC38 (마우스) 세포주 및 4명의 PBMC 공여자를 갖는 HT1080 (인간) 세포주를 이용한 PBMC 공배양 검정에서 BCY13272 유도된 IL-2 및 IFN-y 분비의 EC50(nM) 값의 플롯.
도 5: 고정된 (a) EphA2 및 (b) CD137에 대한 BCY13272의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 결합.

본 발명의 제1 측면에 따르면,

(a) EphA2에 결합하고, 서열 A-[HArg]-D-C_i[HyP]LVNPLC_iiLEP[d1Nal]WTC_iii (서열번호 1; BCY13118)을 갖고;

(b) 둘 다 서열 Ac-C_i[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYC_iiFADPY[Nle]C_iii-A(서열번호 2; BCY8928)를 갖는, CD137에 결합하는 2개의 제2 펩티드 리간드에 N-(산-PEG₃)-N-비스(PEG₃-아지드) 링커를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공되며, 여기서 상기 펩티드 리간드 각각은 2개의 루프 서열에 의해 분리된, 3개의 반응성 시스테인 그룹(C_i, C_ii 및 C_iii)을 포함하는 폴리펩티드, 및 1,1',1"-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온(TATA)이고 2개의 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되도록 폴리펩티드의 반응성 시스테인 그룹과 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함하고;

여기서, Ac는 아세틸을 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, d1Nal은 D-1-나프틸알라닌을 나타내고, tBuAla는 3급-부틸-알라닌을 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, Nle는 노르류신을 나타낸다.

N-(산-PEG₃)-N-비스(PEG₃-아지드) 링커에 대한 본원에서의 언급은 다음을 포함한다:

하나의 구현예에서, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 BCY13272이다:

BCY13272의 전체 세부 사항은 이하 표 A에 제시되어 있다:

[표 A]

데이터는 BCY13272가 마우스의 MC38 종양 모델에서 유의한 항종양 효과를 유도함을 입증하는 본원의 도 3에 제시되어 있다.

본원에서는 BCY13272의 특정 유사체(즉, 변형된 유도체) 및 대사산물을 참조하며, 이들 각각은 본 발명의 추가 측면을 형성하고 하기 표 B에 요약되어 있다:

[표 B]

여기서, BCY14601은 분자 스캐폴드로서 TATA를 갖는 C_i[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYC_iiFADPY[Nle]C_iii-A(서열번호 3)의 서열을 갖는 바이사이클릭 펩티드 리간드를 나타내고;

BCY13389는 분자 스캐폴드로서 TATA를 갖는 [Ac]C_i[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYC_iiFADPY[Nle]C_iii-K(서열번호 4)의 서열을 갖는 바이사이클릭 펩티드 리간드를 나타낸다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 펩티드 화학, 세포 배양 및 파지 디스플레이, 핵산 화확 및 생화학 분야에서와 같은 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 표준 기술은 본원에 참고로 포함되는 분자 생물학, 유전적 및 생화학적 방법에 사용된다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4^th ed., John Wiley & Sons, Inc.).

명명법

넘버링(numbering)

본 발명의 화합물 내의 아미노산 잔기 위치를 언급하는 경우, 시스테인 잔기(C_i, C_ii 및 C_iii)는 불변이기 때문에 넘버링으로부터 생략되며, 따라서 서열번호 1내의 아미노산 잔기의 넘버링은 하기와 같이 참조된다:

C_i-HyP₁-L₂-V₃-N₄-P₅-L₆-C_ii-L₇-E₈-P₉-d1Nal₁₀-W₁₁-T₁₂-C_iii(서열번호 1).

이 설명의 목적을 위해, 바이사이클릭 펩티드는 1,1',1"-(1,3,5-트리스-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온(TATA)으로 사이클릭화되고, 삼치환된 구조를 생성한다. TATA에 의한 사이클릭화는 C_i, C_ii 및 C_iii 상에서 발생한다.

분자 형식

바이사이클 코어 서열로의 N-말단 또는 C-말단 확장은 하이픈으로 분리된 서열의 왼쪽 또는 오른쪽에 추가된다. 예를 들어, N-말단 βAla-Sar10-Ala 꼬리는 다음과 같이 표시된다:

βAla-Sar10-A-(서열번호 X).

역전된 펩티드 서열

문헌(참조: Nair et al (2003) J Immunol 170(3), 1362-1373)의 개시내용에 비추어, 본원에 개시된 펩티드 서열은 또한 그들의 레트로-역함수 형태에서 유용성을 발견할 것으로 예상된다. 예를 들어, 서열은 역전되고(즉, N-말단이 C-말단이 되고, 그 반대도 마찬가지이다), 입체화학도 마찬가지로 또한 역전된다(즉, D-아미노산이 L-아미노산이 되고, 그 반대도 마찬가지이다). 의심의 여지를 피하기 위해, 그들의 전체 명칭으로 또는 그들의 아미노산 단일 또는 3문자 코드로서 아미노산에 대한 참조는 달리 명시되지 않는 한 본원에서 L-아미노산으로 표현되는 것으로 의도된다. 이러한 아미노산이 D-아미노산으로 표현되도록 의도된 경우, 아미노산은 사각 괄호 안의 소문자 d로, 예를 들어, [dA], [dD], [dE], [dK], [d1Nal], [dNle] 등으로 서문을 달 것이다.

펩티드 리간드의 장점

본 발명의 특정 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 주사, 흡입, 비강, 눈, 경구 또는 국소 투여에 적합한 약물-유사 분자로 간주될 수 있게 하는 많은 유리한 특성을 갖는다. 이러한 유리한 특성은 다음을 포함한다:

- 종 교차 반응성(species cr0ss-reactivity). 이것은 전임상 약력학적 및 약동학적 평가의 전형적인 요건이다.

- 프로테아제 안정성. 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 이상적으로 혈장 프로테아제, 상피("막-고정") 프로테아제, 위 및 장 프로테아제, 폐 표면 프로테아제, 세포내 프로테아제 등에 대한 안정성을 입증해야 한다. 프로테아제 안정성은 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 리드 후보가 동물 모델에서 개발될 수 있을 뿐만 아니라 인간에게 자신있게 투여될 수 있도록 상이한 종 사이에 유지되어야 한다.

- 바람직한 용해도 프로파일. 이는 하전된 및 친수성 대 소수성 잔기 및 분자내/분자간 H-결합의 비율의 함수이고, 이는 제형화 및 흡수 목적으로 중요하다.

- 선택성. 본 발명의 특정 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 다른 표적에 대해 양호한 선택성을 입증한다.

- 순환 중 최적 혈장 반감기. 임상적 조짐 및 치료 섭생에 따라 급성 질병 관리 환경에서 단기 노출을 위한 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 개발하거나 순환 중 체류가 증강된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 개발하는 것이 필요할 수 있고, 따라서 보다 만성 질환 상태의 관리에 최적이다. 바람직한 혈장 반감기를 구동하는 다른 요인은 최대 치료 효율에 대한 지속적인 노출 대 제제의 지속적인 노출로 인한 동반되는 독성학의 요건이다.

중요하게는, 본 발명의 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 화합물의 시험관내 EC₅₀ 초과의 혈장 농도를 유지하지 않는 빈도로 투여될 때 항종양 효과를 입증하는 데이터가 본원에 제시된다. 이는 CD137 효능 작용 또는 이중특이적 CD137 효능 작용에 대한 더 큰 재조합 생물학적(즉, 항체 기반) 접근법과는 대조적이다(참조: Segal et al., Clin Cancer Res., 23(8):1929-1936 (2017), Claus et al., Sci Trans Med., 11(496): eaav5989, 1-12 (2019), Hinner et al., Clin Cancer Res., 25(19):5878-5889 (2019)). 이론에 얽매이지 않고, 이 관찰의 이유는 헤테로탠덤 바이사이클릭 복합체가 비교적 낮은 분자량(전형적으로 <15kDa)을 갖고, 완전히 합성적이고 CD137의 종양 표적화 작용제라는 사실에 기인한다고 여겨진다. 이와 같이, 그들은 혈장 반감기는 상대적으로 짧지만 종양 침투와 유지는 양호하다. 이러한 장점을 완전히 뒷받침하는 데이터가 본원에 제시된다. 예를 들어, 인간화 CD137을 갖는 마우스의 동계 설치류 모델에서의 항종양 효능은 매일 또는 3일 마다 입증된다. 또한, 복강내 약동학적 데이터는 혈장 반감기가 3시간 미만임을 보여주며, 이는 복합체의 순환 농도가 투여간에 지속적으로 시험관내 EC₅₀ 미만으로 떨어질 것으로 예측될 것이다. 또한, 종양 약동학적 데이터는 종양 조직에서 헤테로탠덤 바이사이클 복합체의 수준이 혈장 수준과 비교하여 더 높고 더 지속될 수 있음을 보여준다.

이러한 관찰은 본 발명의 중요한 추가 측면을 형성하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면에 따르면, 본원에 정의된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 상기 복합체의 시험관내 EC₅₀ 초과의 상기 복합체의 혈장 농도를 유지하지 않는 투여 빈도로 투여함을 포함하는, 암 치료 방법이 제공된다.

- 면역 기억. 암 세포 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 면역 세포 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드와 결합시키면 면역 기억의 상승적 이점을 제공한다. 본 발명의 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 종양을 근절할 뿐만 아니라 종양 형성제의 재투여시 접종된 완전 반응자 마우스 중 어느 것도 종양을 발병하지 않은 것으로 간주된다. 이는 본 발명의 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체에 의한 치료가 완전한 반응자 마우스에서 면역원성 기억을 유도하였음을 나타낸다. 이는 종양이 최초로 제어되고 근절되면 상기 종양의 재발을 방지하기 위해 중요한 임상적 이점을 갖는다.

펩티드 리간드

본원에 언급된 펩티드 리간드는 분자 스캐폴드에 공유 결합된 펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 펩티드는 스캐폴드에 공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 반응성 그룹(즉, 시스테인 잔기), 및 루프 서열로서 지칭되는 상기 반응성 그룹 사이에 대향하는 서열을 포함하는 데, 이는 펩티드가 스캐폴드에 결합될 때 루프를 형성하기 때문이다. 본 사례의 경우, 펩티드는 시스테인, 3-머캅토프로피온산 및/또는 시스테아민으로부터 선택되는 적어도 3개의 반응성 그룹을 포함하고, 스캐폴드 상에 적어도 2개의 루프를 형성한다.

약제학적으로 허용되는 염

염 형태는 본 발명의 범위 내에 있으며, 펩티드 리간드에 대한 언급은 상기 리간드의 염 형태를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 염은 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모체 화합물로부터 통상적인 화학적 방법, 예를 들어, 문헌(참조: Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002)에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 중 또는 유기 용매 중 또는 둘의 혼합물 중의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.

산 부가염(일염(mono-salt) 또는 이염(di-salt))은 무기 및 유기 둘 다의 다양한 산으로 형성될 수 있다. 산 부가염의 예로는 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산(예: L-아스코르브산), L-아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 부탄산, (+) 캄포르산, 캄포-설폰산, (+)-(1S)-캄포-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-디설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, 글루코헵톤산, D-글루콘산, 글루쿠론산(예: D-글루쿠론산), 글루탐산(예: L-글루탐산), α-옥소글루타르산, 글리콜산, 히푸르산, 할로겐화수소산(예: 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산), 이세티온산, 락트산(예: (+)-L-락트산, (±)-DL-락트산), 락토비온산, 말레산, 말산, (-)-L-말산, 말론산, (±)-DL-만델산, 메탄설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, 프로피온산, 피루브산, L-피로글루탐산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세박산, 스테아르산, 석신산, 황산, 타닌산, (+)-L-타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 운데실렌산 및 발레르산뿐만 아니라 아실화 아미노산 및 양이온 교환 수지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산으로 형성된 일염 또는 이염을 포함한다.

염의 하나의 특정 그룹은 아세트산, 염산, 요오드화수소산, 인산, 질산, 황산, 시트르산, 락트산, 석신산, 말레산, 말산, 이세티온산, 푸마르산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산, 황산, 메탄설폰산(메실레이트), 에탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 발레산, 프로판산, 부탄산, 말론산, 글루쿠론산 및 락토비온산으로부터 형성된 염으로 구성된다. 하나의 특정 염은 염산염이다. 또 다른 특정 염은 아세테이트 염이다.

화합물이 음이온성이거나 음이온성일 수 있는 작용성 그룹을 갖는 경우(예를 들어, -COOH는 -COO^-일 수 있다), 염은 유기 또는 무기 염기로 형성되어 적합한 양이온을 생성할 수 있다. 적합한 무기 양이온의 예는 Li⁺, Na⁺ 및 K+와 같은 알칼리 금속 이온, Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +}와 같은 알칼리 토금속 양이온, 및 Al^{3 +} 또는 Zn⁺와 같은 다른 양이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 유기 양이온의 예는 암모늄 이온(즉, NH₄ ⁺) 및 치환된 암모늄 이온(예: NH₃R⁺, NH₂R₂ ⁺, NHR₃ ⁺, NR₄ ⁺)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 적합한 치환된 암모늄 이온의 예는 메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 프로필아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민 및 트로메타민뿐만 아니라 아미노산, 예를 들어, 리신 및 아르기닌으로부터 유래된 것들이다. 일반적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)₄ ⁺이다.

본 발명의 화합물이 아민 작용기를 함유하는 경우, 이들은, 예를 들어, 당업자에게 익히 공지된 방법에 따른 알킬화제와의 반응에 의해 4급 암모늄염을 형성할 수 있다. 이러한 4급 암모늄 화합물은 본 발명의 범위 내에 있다.

변형된 유도체

본원에 정의된 펩티드 리간드의 변형된 유도체는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해될 것이다. 이러한 적합한 변형된 유도체의 예는 하기에서 선택되는 하나 이상의 변형을 포함한다: N-말단 및/또는 C-말단 변형; 하나 이상의 아미노산 잔기의 하나 이상의 비천연 아미노산 잔기로의 치환(하나 이상의 극성 아미노산 잔기의 하나 이상의 등배전자 또는 등전자 아미노산에 의한 치환; 하나 이상의 비극성 아미노산 잔기의 다른 비천연 등배전자 또는 등전자 아미노산에 의한 치환); 스페이서 그룹의 첨가; 하나 이상의 산화 민감성 아미노산 잔기의 하나 이상의 산화 내성 아미노산 잔기에 의한 치환; 하나 이상의 아미노산 잔기의 알라닌에 의한 치환, 하나 이상의 L-아미노산 잔기의 하나 이상의 D-아미노산 잔기에 의한 치환; 바이사이클릭 펩티드 리간드 내의 하나 이상의 아미드 결합의 N-알킬화; 하나 이상의 펩티드 결합의 대리 결합에 의한 치환; 펩티드 백본 길이 변형; 하나 이상의 아미노산 잔기의 알파 탄소 상의 수소의 다른 화학적 그룹에 의한 치환, 상기 아미노산을 작용화하기 위해 적합한 아민, 티올, 카르복실산 및 페놀 반응성 시약에 의한 아미노산, 예를 들어, 시스테인, 리신, 글루타메이트/아스파르테이트 및 티로신의 변형, 및 작용화에 적합한 직교 반응성을 도입하는 아미노산, 예를 들어, 각각 알킨 또는 아지드 보유 모이어티에 의한 작용화를 허용하는 아지드 또는 알킨 그룹 보유 아미노산의 도입 또는 치환.

한 구현예에서, 변형된 유도체는 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 포함한다. 추가의 구현예에서, 변형된 유도체는 적합한 아미노 반응성 화학을 사용하는 N-말단 변형 및/또는 적합한 카르복시 반응성 화학을 사용하는 C-말단 변형을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 N-말단 또는 C-말단 변형은 세포독성제, 방사성 킬레이트제 또는 발색단을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이펙터 그룹의 첨가를 포함한다.

추가의 구현예에서, 변형된 유도체는 N-말단 변형을 포함한다. 추가의 구현예에서, N-말단 변형은 N-말단 아세틸 그룹을 포함한다. 이 구현예에서, N-말단 시스테인 그룹(본원에서 C_i로 지칭되는 그룹)은 펩티드 합성 동안 아세트산 무수물 또는 다른 적합한 시약으로 캡핑하여 N-말단 아세틸화되는 분자를 초래한다. 이 구현예는 아미노펩티다제의 가능한 인식 지점을 제거하는 이점을 제공하며, 바이사이클릭 펩티드의 분해 가능성을 회피한다.

대안적인 구현예에서, N-말단 변형은 이펙터 그룹의 접합 및 바이사이클릭 펩티드의 이의 표적에 대한 효능의 유지를 용이하게 하는 분자 스페이서 그룹의 부가를 포함한다.

추가의 구현예에서, 변형된 유도체는 C-말단 변형을 포함한다. 추가의 구현예에서, C-말단 변형은 아미드 그룹을 포함한다. 이 구현예에서, C-말단 시스테인 그룹(본원에서 C_iii로서 지칭되는 그룹)은 펩티드 합성 동안 아미드로서 합성되어 C-말단 아미드화되는 분자를 초래한다. 이 구현예는 카르복시펩티다제의 가능한 인식 지점을 제거하는 이점을 제공하고, 바이사이클릭 펩티드의 단백질 분해 가능성을 감소시킨다.

한 구현예에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 아미노산 잔기의 하나 이상의 비천연 아미노산 잔기에 의한 치환을 포함한다. 이 구현예에서, 분해성 프로테아제에 의해 인식되지도 않고 표적 효능에 임의의 악영향을 미치지 않는 등배전자/등전자 측쇄를 갖는 비천연 아미노산이 선택될 수 있다.

대안적으로, 인접한 펩티드 결합의 단백질분해 가수분해가 구조적 및 입체적으로 방해되도록 강제된 아미노산 측쇄를 갖는 비천연 아미노산이 사용될 수 있다. 특히, 이들은 프롤린 유사체, 벌키한 측쇄, Cα-이치환된 유도체(예: 아미노이소부티르산, Aib), 및 사이클로 아미노산에 관한 것이며, 단순한 유도체는 아미노-사이클로프로필카르복실산이다.

한 구현예에서, 변형된 유도체는 스페이서 그룹의 부가를 포함한다. 추가의 구현예에서, 변형된 유도체는 N-말단 시스테인(C_i) 및/또는 C-말단 시스테인(C_iii)에 스페이서 그룹의 부가를 포함한다.

한 구현예에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 산화 민감성 아미노산 잔기의 하나 이상의 산화 내성 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 추가의 구현예에서, 변형된 유도체는 트립토판 잔기의 나프틸알라닌 또는 알라닌 잔기로의 치환을 포함한다. 이 구현예는 생성된 바이사이클릭 펩티드 리간드의 약제학적 안정성 프로파일을 개선시키는 이점을 제공한다.

한 구현예에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기의 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 대안적인 구현예에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기의 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 하전된 아미노산 잔기 대 소수성 아미노산 잔기의 정확한 균형은 바이사이클릭 펩티드 리간드의 중요한 특징이다. 예를 들어, 소수성 아미노산 잔기는 혈장 단백질 결합의 정도에 영향을 미치고, 따라서 혈장 중의 유리 이용 가능한 분획의 농도에 영향을 미치는 반면, 하전된 아미노산 잔기(특히 아르기닌)는 펩티드 및 세포 표면 상의 인지질 막과의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 조합된 둘은 반감기, 분포 용적 및 펩티드 약물의 노출에 영향을 미칠 수 있으며, 임상 종점에 따라 조정될 수 있다. 또한, 하전된 아미노산 잔기 대 소수성 아미노산 잔기의 정확한 조합 및 수는 주사 부위에서의 자극을 감소시킬 수 있다(펩티드 약물이 피하 투여된 경우).

한 구현예에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 L-아미노산 잔기의 하나 이상의 D-아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 이 구현예는 입체 장애 및 D-아미노산이 β-회전 형태를 안정화시키는 경향에 의해 단백질 분해 안정성을 증가시키는 것으로 여겨진다(참조: Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418).

한 구현예에서, 변형된 유도체는 임의의 아미노산 잔기의 제거 및 알라닌으로의 치환을 포함한다. 이 구현예는 가능한 단백질 분해 공격 부위(들)를 제거하는 이점을 제공한다.

상기 언급된 변형 각각은 의도적으로 펩티드의 효능 또는 안정성을 개선시키는 역할을 한다는 것을 주시해야 한다. 변형에 기초한 추가의 효능의 개선은 다음 메커니즘을 통해 달성될 수 있다:

- 소수성 효과를 이용하고 더 높은 친화성이 달성되도록 더 낮은 오프율을 초래하는 소수성 모이어티의 통합;

- 장거리(long-range) 이온 상호작용을 이용하여 보다 빠른 온 비율 및 더 높은 친화성을 초래하는 하전된 그룹의 통합(참조: 예를 들어, Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31); 및

- 예를 들어, 엔트로피의 손실이 표적 결합시 최소이도록 아미노산의 측쇄를 정확하게 강제하고, 엔트로피의 손실이 표적 결합시 최소이도록 백본의 비틀림 각을 강제하고, 동일한 이유로 분자에 추가의 사이클릭화를 도입하여 펩티드에 추가 제약의 통합.

(검토를 위해, 문헌(Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, 및 Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418)을 참조한다).

동위원소 변동

본 발명은 하나 이상의 원자가 동일한 원자 번호를 갖지만, 원자 질량 또는 질량수가 자연에서 일반적으로 발견된 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자로 치환되는 본 발명의 모든 약제학적으로 허용되는 (방사성) 동위원소 표지된 펩티드 리간드, 관련 (방사성) 동위원소를 보유할 수 있는 금속 킬레이트 그룹이 부착된("이펙터"로서 칭명됨) 본 발명의 펩티드 리간드, 및 특정 작용성 그룹이 관련 (방사성) 동위원소 또는 동위원소로 표지된 작용성 그룹으로 공유적으로 치환된 본 발명의 펩티드 리간드를 포함한다.

본 발명의 펩티드 리간드에 포함하기에 적합한 동위원소의 예로는 수소의 동위원소, 예를 들어, ²H(D) 및 ³H(T), 탄소, 예를 들어, ¹¹C, ¹³C 및 ¹⁴C, 염소, 예를 들어, ³⁶Cl, 불소, 예를 들어, ¹⁸F, 요오드, 예를 들어, ¹²³I, ¹²⁵I 및 ¹³¹I, 질소, 예를 들어, ¹³N 및 ¹⁵N, 산소, 예를 들어, ¹⁵O, ¹⁷O 및 ¹⁸O, 인, 예를 들어, ³²P, 황, 예를 들어, ³⁵S, 구리, 예를 들어, ⁶⁴Cu, 갈륨, 예를 들어, ⁶⁷Ga 또는 ⁶⁸Ga, 이트륨, 예를 들어, ⁹⁰Y, 루테륨, 예를 들어, ¹⁷⁷Lu 및 비스무트, 예를 들어, ²¹³Bi를 포함한다.

본 발명의 특정 동위원소 표지된 펩티드 리간드, 예를 들어, 방사성 동위원소를 포함하는 것들은 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구 및 병든 조직 상의 넥틴-4 표적의 존재 및/또는 부재를 임상적으로 평가하는 데 유용하다. 본 발명의 펩티드 리간드는 표지된 화합물과 다른 분자, 펩티드, 단백질, 효소 또는 수용체 사이에 복합체의 형성을 검출 또는 동정하는데 사용될 수 있다는 점에서 귀중한 진단 특성을 추가로 가질 수 있다. 검출 또는 동정 방법은 방사성 동위원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질(예: 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 에쿠오린 및 루시퍼라제) 등과 같은 표지제로 표지된 화합물을 사용할 수 있다. 방사성 동위원소 삼중수소, 즉 ³H(T), 및 탄소-14, 즉 ¹⁴C는 통합의 용이성 및 검출 준비 수단의 관점에서 이 목적에 특히 유용하다.

중수소, 즉 ²H(D)와 같은 더 무거운 동위원소로의 치환은 보다 큰 대사 안정성, 예를 들어, 생체내 반감기의 증가 또는 용량 요건의 감소로 인한 특정 치료적 이점을 수득할 수 있고, 따라서 일부 상황에서 바람직할 수 있다.

양전자 방출 동위원소, 예를 들어, ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O 및 ¹³N에 의한 치환은 표적 점유율을 조사하기 위한 양전자 방출 단층촬영(PET) 연구에 유용할 수 있다.

본 발명의 펩티드 리간드의 동위원소 표지 화합물은 일반적으로 당업자에게 공지된 종래 기술에 의해 또는 이전에 사용된 비표지 시약 대신 적합한 동위원소 표지 시약을 사용하여 첨부된 실시예에 기재된 것들과 유사한 공정에 의해 제조될 수 있다.

합성

본 발명의 펩티드는 표준 기술에 이어 시험관내에서 분자 스캐폴드와의 반응에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 이것이 수행될 때, 표준 화학이 사용될 수 있다. 이는 추가의 다운스트림 실험 또는 검증을 위한 가용성 물질의 신속한 대규모 제조를 가능하게 한다. 이러한 방법은 문헌(참조: Timmerman et al(상기)]에 개시된 바와 같은 통상적인 화학을 사용하여 달성될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본원에 제시된 바와 같이 선택된 폴리펩티드 또는 접합체의 제조에 관한 것으로, 여기서 제조는 이하에 설명되는 바와 같은 임의의 추가 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 이들 단계는 화학적 합성에 의해 제조된 최종 생성물 폴리펩티드/접합체에 대해 수행된다.

임의로, 관심 폴리펩티드의 아미노산 잔기는 접합체 또는 복합체를 제조할 때 치환될 수 있다.

펩티드를 또한 확장하여, 예를 들어, 다른 루프를 통합할 수 있고, 따라서 여러 특이성을 도입할 수 있다.

펩티드를 확장하기 위해, 표준 고상 또는 액상 화학을 사용하여 직교적으로 보호된 리신(및 유사체)을 사용하여 N-말단 또는 C-말단에서 또는 루프 내에서 단순히 화학적으로 확장될 수 있다. 표준 (생체)접합 기술을 사용하여 활성화된 또는 활성화 가능한 N-말단 또는 C-말단을 도입할 수 있다. 대안적으로, 첨가는, 예를 들어, 문헌(참조: Dawson et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779)에 기재된 바와 같이 단편 응축 또는 천연 화학적 결찰에 의해, 또는 효소, 예를 들어, 문헌(참조: Chang et al.　Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20; 91(26):12544-8 또는 Hikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters　Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003)에 기재된 서브틸리가제를 사용하여 수행될 수 있다.

대안적으로, 펩티드는 이황화 결합을 통한 추가 접합에 의해 확장되거나 변형될 수 있다. 이것은 제1 및 제2 펩티드가 세포의 환원 환경 내에서 한 번 서로 해리되도록 하는 추가의 이점을 갖는다. 이 경우, 분자 스캐폴드(예: TATA)는 3개의 시스테인 그룹과 반응하도록 제1 펩티드의 화학 합성 동안 추가될 수 있고; 이어서, 추가의 시스테인 또는 티올을 제1 펩티드의 N 또는 C-말단에 첨부하여 이 시스테인 또는 티올이 제2 펩티드의 유리 시스테인 또는 티올과만 반응하여 이황화물 결합된 바이사이클릭 펩티드-펩티드 접합체를 형성하도록 할 수 있다.

유사한 기술을 2개의 바이사이클릭 및 이중특이적 매크로사이클의 합성/커플링에 동등하게 적용하여 잠재적으로 사중특이적 분자를 생성한다.

또한, 다른 작용성 그룹 또는 이펙터 그룹의 첨가는 적절한 화학을 사용하여 N-말단 또는 C-말단에 또는 측쇄를 통해 커플링하여 동일한 방식으로 달성될 수 있다. 한 구현예에서, 커플링은 어느 하나의 실체의 활성을 차단하지 않는 방식으로 수행된다.

약제학적 조성물

본 발명의 추가의 측면에 따르면, 본원에 정의된 펩티드 리간드를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

일반적으로, 본 발명의 펩티드 리간드는 약리학적으로 적합한 부형제 또는 담체와 함께 정제된 형태로 이용될 것이다. 전형적으로, 이들 부형제 또는 담체는 식염수 및/또는 완충 매질을 포함하는 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨 및 락테이트화 링거를 포함한다. 폴리펩티드 복합체를 현탁액에 유지시키기 위해 필요한 경우, 적합한 생리학적으로 허용되는 보조제는 증점제, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 및 알기네이트로부터 선택될 수 있다.

정맥내 비히클은 링거 덱스트로스에 기초하는 것들과 같은 유체 및 영양소 보충제 및 전해질 보충제를 포함한다. 방부제 및 다른 첨가제, 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스도 또한 존재할 수 있다(참조: Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).

본 발명의 펩티드 리간드는 별도로 투여되는 조성물로서 또는 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 이들은 항체, 항체 단편 및 다양한 면역치료제, 예를 들어, 실코스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라틴 및 면역독소를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질 리간드와 조합된 다양한 세포독성제 또는 다른 제제의 "칵테일", 또는 심지어 상이한 특이성을 갖는 본 발명에 따르는 선택된 폴리펩티드, 예를 들어, 투여 이전에 풀링되든 되지 않든 상이한 표적 리간드를 사용하여 선택된 폴리펩티드의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 당업자에게 일반적으로 공지된 것들 중의 어느 하나일 수 있다. 요법의 경우, 본 발명의 펩티드 리간드는 표준 기술에 따라 임의의 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피, 폐 경로를 통해, 또는 적절하게는 카테터에 의한 직접 주입을 포함하는 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 흡입에 의해 투여될 것이다. 용량 및 투여 빈도는 환자의 연령, 성별 및 상태, 다른 약물의 동시 투여, 금기 및 임상의가 고려해야 할 다른 매개변수에 의존한다.

본 발명의 펩티드 리간드는 저장을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적절한 담체에서 재구성될 수 있다. 이 기술은 효과적인 것으로 나타났으며, 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다. 당업자는 동결건조 및 재구성은 다양한 정도의 활성 상실을 초래할 수 있고, 보상하기 위해 수준을 상향으로 조정해야할 수 있음을 이해할 것이다.

본 펩티드 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료용으로 투여될 수 있다. 특정 치료적 용도에서, 선택된 세포 집단의 적어도 부분적 억제, 억압, 조절, 사멸, 또는 일부 다른 측정 가능한 매개변수를 달성하기 위한 적절한 양은 "치료적 유효량"으로서 정의된다. 이 용량을 달성하는 데 필요한 양은 질환의 중증도와 환자 자신의 면역계의 일반적인 상태에 따라 다르지만, 일반적으로 체중 1kg당 0.005 내지 5.0mg의 선택된 펩티드 리간드의 범위이며, 0.05 내지 2.0mg/kg/투여의 투여량이 보다 일반적으로 사용된다. 예방적 용도의 경우, 본 펩티드 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 또한 유사하거나 약간 낮은 용량으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드 리간드를 함유하는 조성물은 포유동물에서 선택된 표적 세포 집단의 변화, 불활성화, 사멸 또는 제거를 돕기 위해 예방적 및 치료적 설정에서 이용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 펩티드 리간드는 체외 또는 시험관내에서 선택적으로 사용하여 세포의 불균일한 수집으로부터 표적 세포 집단을 사멸시키거나, 고갈시키거나, 그렇지 않으면 효과적으로 제거할 수 있다. 포유동물의 혈액은 선택된 펩티드 리간드와 체외에서 조합될 수 있고, 이에 의해 원치 않는 세포는 사멸되거나, 그렇지 않으면 표준 기술에 따라 포유동물로의 반환을 위해 혈액으로부터 제거된다.

치료 용도

본 발명의 추가의 측면에 따르면, 암의 예방, 억제 또는 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공된다.

치료 (또는 억제)될 수 있는 암 (및 그들의 양성 대응물)의 예는 상피 기원 종양(선암(adenocarcinoma), 편평 세포 암종(squamous carcinomas), 전이 세포 암종(transitional cell carcinomas) 및 기타 암종을 포함하는 다양한 유형의 선종(adenomas) 및 암종), 예를 들어, 방광 및 요로 암종, 유방, 위장관(식도, 위(위), 소장, 결장, 직장 및 항문 포함), 간(간세포 암종(hepatocellular carcinoma)), 담낭 및 담도계, 외분비 췌장, 신장, 폐(예: 선암, 소세포 폐 암종(small cell lung carcinomas), 비소세포 폐 암종(non-small cell lung carcinomas), 기관지 폐포 암종(bronchioalveolar carcinomas) 및 중피종(mesotheliomas)), 두경부(예: 혀, 구강, 후두, 인두, 비인두, 편도선, 타액선, 비강 및 부비동의 암), 난소, 나팔관, 복막, 질, 외음부, 음경, 자궁경부, 근막, 자궁내막, 갑상선(예: 갑상선 여포성 암종(thyroid follicular carcinoma)), 부신, 전립선, 피부 및 부속기(예: 흑색종(melanoma), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 각질가시세포종(keratoacanthoma), 이형성 모반(dysplastic naevus)); 혈액학적 악성 종양(haematological malignancy)(즉, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma)) 및 림프구 계통의 혈액학적 악성 종양 및 관련 상태를 포함하는 전암성 혈액학적 장애 및 경계선 악성 종양의 장애(예: 급성 림프구성 백혈병 [acute lymphocytic leukemia; ALL], 만성 림프구성 백혈병[chronic lymphocytic leukemia; CLL], B-세포 림프종(B-cell lymphoma), 예를 들어, 확산성 거대 B-세포 림프종[diffuse large B-cell lymphoma; DLBCL], 여포성 림프종(follicular lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 맨틀 세포 림프종(mantle cell lymphoma), T-세포 림프종 및 백혈병(T-cell lymphomas and leukaemias), 자연 살해[NK] 세포 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphomas), 모세포 백혈병(hairy cell leukaemia), 불확실한 유의성의 모노클로날 감마글로불린병증(monoclonal gammopathy of uncertain significance), 형질세포종(plasmacytoma), 다발성 골수종(multiple myeloma) 및 이식 후 림프증식성 장애(post-transplant lymphoproliferative disorder)) 및 골수 계통의 혈액학적 악성 종양 및 관련 상태(예: 급성 골수성 백혈병[acute myelogenousleukemia; AML], 만성 골수성 백혈병[chronic myelogenousleukemia; CML], 만성 골수단핵구성 백혈병[chronic myelomonocyticleukemia; CMML], 과다호산구성 증후군(hypereosinophilic syndrome), 골수증식성 장애(myeloproliferative disorder), 예를 들어, 진성 적혈구증가증(polycythaemia vera), 본태성 혈소판혈증(essential thrombocythaemia) 및 원발성 골수섬유증(primary myelofibrosis), 골수증식성 증후군(myeloproliferative syndrome), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome) 및 전골수구백혈병(promyelocyticleukemia)); 중간엽 기원 종양(tumors of mesenchymal origin), 예를 들어, 연조직, 골 또는 연골의 육종(sarcoma), 예를 들어, 골육종(osteosarcomas), 섬유육종(fibrosarcomas), 연골육종(chondrosarcomas), 횡문근육종(rhabdomyosarcomas), 평활근육종(leiomyosarcomas), 지방육종(liposarcomas), 혈관육종(angiosarcomas), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 활막 육종(synovial sarcomas), 상피 육종(epithelioid sarcomas), 위장 간질 종양(gastrointestinal stromal tumors), 양성 및 악성 조직구종(benign and malignant histiocytomas) 및 융기성피부섬유육종(dermatofibrosarcomaprotuberans); 중추 또는 말초 신경계의 종양(예: 성상세포종(astrocytomas), 신경교종(gliomas) 및 교모세포종(glioblastomas), 수막종(meningiomas), 뇌질피복세포종(ependymomas), 송과체 종양(pineal tumors) 및 신경초종(schwannomas)); 내분비 종양(endocrine tumors)(예: 뇌하수체 종양(pituitary tumors), 부신 종양(adrenal tumors), 췌도 세포 종양(islet cell tumors), 부갑상선 종양(parathyroid tumors), 카르시노이드 종양(carcinoid tumors) 및 갑상샘수질암(medullary carcinoma of the thyroid)); 눈 및 부속기 종양(예: 망막모세포종(retinoblastoma)); 배아 세포 및 영양막 종양(예: 기형종(teratomas), 정상피종(seminomas), 미분화배세포종(dysgerminomas), 포상기태(hydatidiform moles) 및 융모암(choriocarcinomas)); 및 소아 및 배아 종양(예: 수모세포종(medulloblastoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 윌름즈 종양(Wilms tumor), 및 원시 신경외배엽 종양(primitive neuroectodermal tumors)). 또는 환자가 악성 종양에 민감하게 하는 선천성 또는 기타 증후군(예: 색소성 건피증(Xeroderma Pigmentosum))을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

추가의 구현예에서, 암은, 예를 들어, 비호지킨 림프종(NHL), 버킷 림프종(BL), 다발성 골수종(MM), B 만성 림프성 백혈병(B-CLL), B 및 T 급성 림프성 백혈병(ALL), T 세포 림프종(TCL), 급성 골수성 백혈병(AML), 모세포 백혈병(HCL), 호지킨 림프종(HL) 및 만성 골수성 백혈병(CML)으로부터 선택된 조혈 악성 종양으로부터 선택된다.

본원에서 "예방"이라는 용어에 대한 언급은 질환의 유발 전에 보호 조성물의 투여를 포함한다. "억제"는 유발 사건 후, 그러나 질환의 임상적 출현 전 조성물의 투여를 지칭한다. "치료"는 질환의 증상이 나타난 후 보호 조성물의 투여를 포함한다.

질환에 대해 보호하거나 질환을 치료하는 데 있어서 펩티드 리간드의 효능을 스크리닝하는데 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용 가능하다. 동물 모델 시스템의 사용은 본 발명에 의해 촉진되고, 이는 동물 모델의 사용을 허용하기 위해 인간 및 동물 표적과 교차 반응할 수 있는 폴리펩티드 리간드의 개발을 가능하게 한다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 이하 추가로 기재된다.

실시예

일반적으로, 본 발명의 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 하기 일반적인 방법에 따라 제조될 수 있다:

모든 용매를 탈기시키고 N₂로 3회 퍼징한다. DMF 중의 BP-23825(1.0당량), HATU(1.2당량) 및 DIEA(2.0당량)의 용액을 5분 동안 혼합한 다음, 바이사이클1(1.2당량)을 첨가한다. 반응 혼합물을 40℃에서 16시간 동안 교반한다. 이어서, 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하고, prep-HPLC로 정제하여 중간체 2를 수득한다.

중간체 2(1.0당량)와 바이사이클2(2.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H₂O(1:1)에 용해시킨 다음, CuSO₄(1.0당량), VcNa(4.0당량) 및 THPTA(2.0당량)를 첨가한다. 마지막으로, 0.2M NH₄HCO₃를 첨가하여 pH를 8로 조정한다. 반응 혼합물을 N₂ 분위기하에 40℃에서 16시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 prep-HPLC로 직접 정제하였다.

본 발명의 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체에 대한 보다 상세한 실험은 이하 본원에 제공된다:

실시예 1: BCY13272의 합성

BCY14964의 제조 절차

BP-23825(155.5mg, 249.40μmol, 1.2당량) 및 HATU(95.0mg, 249.92μmol, 1.2당량)의 혼합물을 NMP(1.0mL)에 용해시킨 다음, DIEA(64.6mg, 499.83μmol, 87.0μL, 2.4당량)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정한 후, 용액을 25℃에서 5분 동안 교반하였다. BCY13118(500.0mg, 207.83μmol, 1.0당량)를 NMP(5.0mL)에 용해시킨 다음, 반응 용액에 첨가하고, DIEA를 적가하여 생성되는 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 45분 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY13118이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하고, 잔류물을 생성하였다. 이어서, 잔류물을 예비-HPLC로 정제하여 BCY14964(1.35g, 403.46μmol, 64.7% 수율, 90% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 3011.53, 관측치 m/z: 1506.8([M+2H]²⁺), 1005.0([M+3H]³⁺).

화합물 BCY13272의 제조 절차

BCY8928(644.0mg, 290.55μmol, 2.5당량), THPTA(50.5mg, 116.22μmol, 1.0당량), CuSO₄(0.4M, 145.0μL, 0.5당량) 및 나트륨 아스코르베이트(82.0.0mg, 464.89μmol, 4.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/0.2M NH₄HCO₃(1:1, 6.0mL)에 용해시켰다. 0.2M NH₄HCO₃(1:1 t-BuOH/0.2M NH₄HCO₃ 중)를 적가하여 이 용액의 pH를 7.5로 조정한 다음, 용액을 25℃에서 3분 동안 교반하였다. BCY14964(350.0mg, 116.22μmol, 1.0당량)을 t-BuOH/0.2M NH₄HCO₃(1:1, 11.0mL)에 용해시킨 다음, 교반 용액에 적가하였다. 여기서 모든 용매는 사전에 탈기시키고, N₂로 퍼징하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH₄HCO₃(1:1 t-BuOH/0.2M NH₄HCO₃ 중)를 적가하여 7.5로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N₂ 분위기하에 25℃에서 6시간 동안 교반하였다. LC-MS는 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 생성물 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY13272(1.75g, 235.01μmol, 67.40% 수율, 94% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7446.64, 관측치 m/z: 1242.0([M+6H]⁶⁺), 1491.0([M+5H]⁵⁺).

실시예 2: BCY14414의 합성

BCY14798의 제조 절차

BCY14964(55.0mg, 18.26μmol, 1.0당량), BCY8928(32.4mg, 14.61μmol, 0.8당량), 및 THPTA(39.8mg, 91.32μmol, 5.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/0.2M NH₄HCO₃(1:1, 0.5mL, 미리 탈기되고 N₂로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO₄(0.4M, 23.0μL, 0.5당량) 및 나트륨 아스코르베이트(72.0mg, 365.27μmol, 20.0당량)를 N₂하에 첨가하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH₄HCO₃(1:1 t-BuOH/0.2M NH₄HCO₃ 중)를 적가하여 7.5로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N₂ 분위기하에 25℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14964가 잔류하였고, 화합물 BCY8928이 완전히 소비되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY14798(51mg, 9.17μmol, 33.37% 수율, 94% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 5229.07, 관측치 m/z: 1308.3 ([M+4H]⁴⁺), 1046.7 ([M+5H]⁵⁺).

BCY14414의 제조 절차

BCY14798(21.0mg, 4.02μmol, 1.0당량), BCY13389(10.0mg, 4.42μmol, 1.1당량) 및 THPTA(1.8mg, 4.02μmol, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/0.2M NH₄HCO₃(1:1, 0.5mL, 미리 탈기되고 N₂로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO₄(0.4M, 5.0μL, 0.5당량) 및 나트륨 아스코르베이트(2.8mg, 16.06μmol, 4.0당량)를 N₂하에 첨가하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH₄HCO₃(1:1 t-BuOH/0.2M NH₄HCO₃ 중)를 적가하여 7.5로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N₂ 분위기하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14798이 완전히 소비되었고, 일부 BCY13389는 잔류되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비적으로 정제하고, BCY14414(20mg, 2.40μmol, 59.73% 수율, 90.9% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7503.74, 관측치 m/z: 1251.5 ([M+5H]⁵⁺), 1072.9([M+7H]⁷⁺).

실시예 3: BCY14417의 합성

BCY14417의 제조 절차

BCY14414(13.0mg, 1.73μmol, 1.0당량) 및 비오틴-PEG12-NHS 에스테르(CAS 365441-71-0, 4.2mg, 4.50μmol, 2.6당량)의 혼합물을 DMF(0.5mL)에 용해시켰다. DIEA를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14414가 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY14417(9.0mg, 1.07μmol, 80.49% 수율, 90.8% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 8329.74, 관측치 m/z: 1389.6([M+6H]⁶⁺), 1191.9([M+7H]⁷⁺).

실시예 4: BCY14418의 합성

BCY14418의 제조 절차

BCY14414(5.6mg, 0.75μmol, 1.0당량) 및 Alexafluor® 488(0.9mg, 1.49μmol, 2.0당량)의 혼합물을 DMF(0.3mL)에 용해시켰다. 이어서, DIEA를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 1.0시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14414가 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY14418(2.3mg, 0.25μmol, 32.89% 수율, 85.6% 순도)을 적색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 8020.19, 관측치 m/z: 1337.2([M+6H]⁶⁺).

실시예 5: BCY15217의 합성

BCY15217의 제조 절차

BCY14964(20.0mg, 6.64μmol, 1.0당량), BCY14601(30.5mg, 13.95μmol, 2.1당량), 및 THPTA(2.9mg, 6.64μmol, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/0.2M NH₄HCO₃(1:1, 0.5mL, 미리 탈기되고 N₂로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO₄(0.4M, 16.6μL, 1.0당량) 및 나트륨 아스코르베이트(4.7mg, 26.56μmol, 4.0당량)를 N₂하에 첨가하였다. 이 용액의 pH를 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N₂ 분위기하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14964가 잔류되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY15217(19.7mg, 2.41μmol, 36.26% 수율, 96.2% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7362.5, 관측치 m/z: 1473.5 ([M+5H]⁵⁺), 1228.2 ([M+6H]⁶⁺), 1052.8 ([M+7H]⁷⁺).

실시예 6: BCY15218의 합성

BCY15218의 제조 절차

BCY14798(30.0mg, 5.74μmol, 1.0당량), BCY14601(15.0mg, 6.88μmol, 1.2당량), 및 THPTA(2.5mg, 5.74μmol, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/0.2M NH₄HCO₃(1:1, 0.5mL, 미리 탈기되고 N₂로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO₄(0.4M, 14.0μL, 1.0당량) 및 나트륨 아스코르베이트(4.0mg, 22.95μmol, 4.0당량)를 N₂하에 첨가하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH₄HCO₃(1:1 t-BuOH/0.2M NH₄HCO₃ 중)를 적가하여 7.5로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N₂ 분위기하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14798이 완전히 소비되었고, BCY14601이 잔류되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY15218(22mg, 2.67μmol, 46.61% 수율, 95.0% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7404.6, 관측치 m/z: 1234.8 ([M+6H]⁶⁺).

분석 데이터

본 발명의 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 질량 분석법 및 HPLC를 사용하여 분석하였다. HPLC 설정은 다음과 같았다:

이동상: A: H₂O 중 0.1% TFA B: ACN 중 0.1% TFA

유량: 1.0ml/분

컬럼: Kintex 1.7um C18 100A 2.1mm^*150mm

장비: Agilent UPLC 1290

사용된 구배는 10분에 걸쳐 30 내지 60% B이고, 데이터는 다음과 같이 생성되었다:

생물학적 데이터

1. 종양 세포에 의한 CD137 리포터 검정 공배양

R1 배지라 지칭되는 배양 배지는 RPMI-1640(프로메가 키트 CS196005의 구성 요소)에 1% FBS를 첨가함으로써 제조된다. R1에서 시험 품목의 일련의 희석은 멸균 96 웰 플레이트에서 제조된다. 백혈구 배양 플레이트에서 지정된 웰에 웰당 25μL의 시험 품목 또는 R1(배경 대조군으로서)을 첨가한다. 종양 세포^*를 수거하고 R1 배지에 400,000 세포/mL의 농도로 재현탁시킨다. 25μL/웰의 종양 세포를 백혈구 배양 플레이트에 첨가한다. Jurkat 세포(프로메가 키트 CS196005, 0.5mL)를 수조에서 해동한 다음, 5ml의 예열된 R1 배지에 첨가한다. 그런 다음, 25μL/웰의 Jurkat 세포를 백혈구 배양 플레이트에 첨가한다. 세포 및 시험 품목을 37℃, 5% CO₂에서 6시간 동안 배양한다. 6시간이 끝나면, 75μL/웰의 Bio-Glo™ 시약(프로메가)을 첨가하고, 10분 동안 배양한 후 플레이트 판독기(Clariostar, BMG)에서 발광을 판독한다. 세포 단독(Jurkat 세포 + 공배양에 사용된 세포주)에 대한 배수 변화를 계산하고, log(작용제) 대 반응으로서 GraphPad Prism에 플롯팅하여 EC₅₀(nM) 및 배경에 대한 배수 유도(Max)를 결정한다.

EphA2의 공배양에 사용되는 종양 세포 유형은 A549, PC-3 및 HT29이다.

도 1에 제시된 데이터는 EphA2/CD137 헤테로탠덤 BCY13272가 EphA2 발현 세포주(A549)의 존재하에 CD137 리포터 검정에서 강력한 CD137 활성화를 유도하는 반면, 비결합 대조군 분자(BCY13626)는 CD137의 활성화를 나타내지 않음을 보여준다.

도 1 및 표 1에 제시된 데이터는 BCY13272가 CD137 리포터 검정에서 강력한 CD137 활성화를 유도함을 보여준다. 활성화는 Epha2 또는 CD137에 결합하지 않는 비결합 대조군(BCY13626)의 활성의 부재하에 나타낸 바와 같이 CD137 및 EphA2 모두에 대한 헤테로탠덤의 결합에 의존한다.

EphA2 발현 종양 세포주와의 공배양에서 CD137 리포터 검정에서 BCY13272에 의해 유도된 EC₅₀(nM) 및 배수 유도의 요약은 하기 표 1에 기록된다:

[표 1]

2. SD 래트에서 헤테로탠덤 복합체 BCY13272의 약동학

수컷 SD 래트에게 25mM 히스티딘 HCl, 10% 수크로스 pH 7로 제형화된 헤테로탠덤 복합체 BCY13272를 IV 볼러스 또는 IV 주입(15분)으로 투여하였다. 연속 출혈(약 80μL 혈액/시점)은 각 시점에서 턱밑 또는 복재 정맥을 통해 수행되었다. 모든 혈액 샘플은 항응고제로서 2μL의 K2-EDTA(0.5M)를 함유하는 사전 냉각된 미세원심분리 튜브로 즉시 옮기고 습식 얼음 위에 배치했다. 혈액 샘플은 약 4℃, 3000g에서 원심분리로 혈장용으로 즉시 처리하였다. 내부 표준을 포함하는 침전제를 즉시 혈장에 첨가하고, 충분히 혼합하고, 12,000rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 사전 표지된 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브에 옮긴 다음, 드라이 아이스로 급속 동결시켰다. 샘플은 분석까지 필요에 따라 70℃ 이하에 보관하였다. 분석물의 농도를 결정하기 위해, 양이온 방식으로 Orbitrap Q Exactive를 사용하는 LC-MS/MS 분석을 위해 7.5μL의 상청액 샘플을 직접 주사하였다. 혈장 농도 대 시간 데이터는 Phoenix WinNonlin 6.3 소프트웨어 프로그램을 이용한 비구획 접근법에 의해 분석되었다. C0, Cl, Vdss, T½, AUC(0-last), AUC(0-inf), MRT(0-last), MRT(0-inf) 및 혈장 농도 대 시간 프로파일의 그래프가 기록되었다. 실험으로부터의 약동학적 매개변수는 표 2에 나타낸 바와 같다:

[표 2]

3. 시노몰구스 원숭이에서 헤테로탠덤 복합체 BCY13272의 약동학

비-나이브 시노몰구스 원숭이에게 25mM 히스티딘 HCl, 10% 수크로스 pH 7로 제형화된 1mg/kg의 헤테로탠덤 복합체 BCY13272를 정맥내 주입(15 또는 30분)을 통해 노쪽 피부 정맥에 투여하였다. 연속 출혈(약 1.2ml 혈액/시점)은 각 시점에서 강제된 진정되지 않은 동물의 말초 혈관으로부터 습식 얼음에서 칼륨(K2) EDTA^*2H₂O(0.85-1.15mg)를 함유하는 시판용 튜브로 수행되었고, 혈장용으로 처리했다. 샘플을 수집 직후 원심분리하였다(3,000×g, 2 내지 8℃에서 10분 동안). 0.1mL의 혈장을 표지된 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브로 옮겼다. MeOH 중의 내부 표준 100ng/mL 라베탈롤 & 100ng/mL 덱사메타손 & 100ng/mL 톨부타미드 & 100ng/mL 베라파밀 & 100ng/mL 글리브리드 & 100ng/mL 셀레콕시브를 포함하는 침전제의 5배를 즉시 혈장에 첨가하고, 충분히 혼합하고, 12,000rpm에서 10분 동안 2 내지 8℃에서 원심분리하였다. 상청액의 샘플을 사전 표지된 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브로 옮기고 드라이 아이스로 동결시켰다. 샘플을 LC-MS/MS 분석까지 -60℃ 이하에 보관하였다. 40μL 교정 표준, 품질 관리, 단일 블랭크 및 이중 블랭크 샘플의 분취액을 1.5mL 튜브에 첨가했다. 각 샘플(이중 블랭크 제외)을 각각 200μL의 IS1로 급냉시키고(이중 블랭크 샘플은 0.5% tritonX-100을 포함하는 200μL의 MeOH로 급냉시켰다), 이어서 혼합물을 볼텍서를 사용하여 충분히 와동 혼합하고(적어도 15초), 12000g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 양이온 방식으로 Orbitrap Q Exactive를 사용하여 LC-MS/MS 분석을 위해 10μL의 상청액을 주입하여 분석물의 농도를 결정하였다. 혈장 농도 대 시간 데이터는 Phoenix WinNonlin 6.3 소프트웨어 프로그램을 이용한 비구획 접근법에 의해 분석되었다. C0, Cl, Vdss, T½, AUC(0-last), AUC(0-inf), MRT(0-last), MRT(0-inf) 및 혈장 농도 대 시간 프로파일의 그래프를 기록하였다. BCY13272의 약동학적 매개변수는 표 3에 제시된 바와 같다.

[표 3]

도 2는 SD 래트(n=3)에서 3.6mg/kg IV 주입(15분) 및 시노몰구스 원숭이(n=3)에서 9.2mg/kg IV 주입(15분)으로부터의 BCY13272의 혈장 농도 대 시간 곡선을 도시한다. BCY13272는 2.9시간의 최종 반감기를 초래하는 래트에서 1.0L/kg의 정상 상태의 분포 용적(Vdss) 및 7.5mL/분/kg의 클리어런스(clearance)를 갖는다. BCY13272는 8.9시간의 최종 반감기를 초래하는 시노에서 0.82L/kg의 정상 상태의 분포 용적(Vdss) 및 4.1mL/분/kg의 클리어런스를 갖는다.

4. CD1 마우스에서 헤테로탠덤 복합체 BCY13272의 약동학

6마리의 수컷 CD-1 마우스에게 25mM 히스티딘 HCl, 10% 수크로스 pH 7로 제형화된 헤테로탠덤 복합체 BCY13272 15mg/kg을 복강내 또는 정맥내 투여를 통해 투여하였다. 연속 출혈(약 80μL 혈액/시점)은 각 시점에서 턱밑 또는 복재 정맥을 통해 수행되었다. 모든 혈액 샘플은 항응고제로서 2μL의 K2-EDTA(0.5M)를 함유하는 사전 냉각된 미세원심분리 튜브로 즉시 옮기고 습식 얼음 위에 놓았다. 혈액 샘플은 약 4℃, 3000g에서 원심분리로 혈장용으로 즉시 처리되었다. 내부 표준을 포함하는 침전제를 즉시 혈장에 첨가하고, 충분히 혼합하고, 12,000rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 사전 표지된 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브로 옮긴 다음, 드라이 아이스로 급속 동결시켰다. 샘플을 분석까지 필요에 따라 70℃ 이하에 보관하였다. 분석물의 농도를 결정하기 위해, 양이온 방식으로 Orbitrap Q Exactive를 사용하여 LC-MS/MS 분석을 위해 7.5μL의 상청액 샘플을 직접 주입하였다. 혈장 농도 대 시간 데이터는 Phoenix WinNonlin 6.3 소프트웨어 프로그램을 이용한 비구획 접근법에 의해 분석되었다. C0, Cl, Vdss, T½, AUC(0-last), AUC(0-inf), MRT(0-last), MRT(0-inf) 및 혈장 농도 대 시간 프로파일의 그래프를 기록하였다.

도 2는 CD1 마우스(n=3)에서 5.5mg/kg IV 용량으로부터의 BCY13272의 혈장 농도 대 시간 곡선을 도시하고; BCY13272의 분포 용적(Vdss)은 1.1L/kg이고, 클리어런스는 최종 혈장 반감기 2.9시간을 초래하는 7.5mL/분/kg이다.

5. EphA2 /CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY13272는 MC38 공배양 검정에서 IFN -γ 사이토카인 분비를 유도한다

MC38 및 HT1080 세포주는 권장 프로토콜에 따라 배양되었다. 건강한 인간 공여자의 냉동 PBMC를 해동시키고, 벤조나제를 포함하는 실온 PBS로 1회 세척한 후, 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS), 1x 페니실린/스트렙토마이신, 10mM HEPES 및 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI(본원에서 R10 배지로서 지칭됨)에 재현탁시켰다. 100μl의 PBMC(1,000,000 PBMC/ml) 및 100μl의 종양 세포(100,000 종양 세포/ml)(이펙터:표적 세포 비(E:T) 10:1)를 공배양 검정용 96-웰 평저 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 100ng/ml의 가용성 항-CD3 mAb(클론 OKT3)를 0일째에 배양물에 첨가하여 인간 PBMC를 자극하였다. 시험, 대조군 화합물 또는 비히클 대조군을 R10 배지에서 희석하고, 50μL를 각각의 웰에 첨가하여 웰당 최종 용적이 250μL가 되도록 했다. 플레이트를 통기성 필름으로 덮고 가습 챔버 내에서 37℃, 5% CO₂에서 2일 동안 배양했다. 자극 후 24시간 및 48시간에 상청액을 수집하고, Luminex에 의해 인간 IFN-γ가 검출되었다. 간단히 설명하면, 표준 및 샘플을 검정색 96 웰 플레이트에 추가했다. 미립자 칵테일(Luminex 키트에 제공됨, R & D Systems)을 추가하고, 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 자기 홀더를 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 이어서, 비오틴 칵테일을 플레이트에 첨가하고, RT에서 1시간 동안 진탕시켰다. 자기 홀더를 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 스트렙타비딘 칵테일을 플레이트에 첨가하고 RT에서 30분 동안 진탕시켰다. 플레이트를 자기 홀더를 사용하여 3회 세척하고, 100μL의 세척 완충제에 재현탁시키고, RT에서 2분 동안 진탕시키고, Luminex 2000을 사용하여 판독하였다. 원시 데이터를 내장 Luminex 소프트웨어를 사용하여 분석하여 표준 곡선을 생성하고, 단백질 농도를 보간하고, 다른 모든 데이터 분석 및 그래프 분석은 Excel 및 Prism 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 데이터는 실험 복제물에서 테스트된 3개의 독립적인 공여자 PBMC를 사용하는 하나의 연구를 나타낸다.

도 2 및 이하 표 4에 제시된 데이터는 BCY13272가 CD3 자극시 IFN-y 및 IL-2 분비에 의해 입증된 바와 같이 강력한 CD137 활성화를 유도함을 보여준다. 활성화는 비결합 대조군 BCY12762 및 BCY13692의 활성의 결여에 의해 입증된 바와 같이 CD137 및 EphA2 둘 다에 대한 헤테로탠덤의 결합에 의존하고, 여기서 CD137 및 EphA2 결합제가 각각 비결합 유사체를 초래하는 모든 D-아미노산을 포함한다.

[표 4]

6. 동계 MC38 종양 모델에서 BCY13272의 항종양 활성

6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J-hCD137 마우스[B-hTNFRSF9(CD137) 마우스; Biocytogen]는 1x10⁶개의 MC38 세포를 피하 이식하였다. 평균 종양 용적이 약 80mm³에 도달할 때 마우스를 치료군(n=6/코호트)으로 무작위화하고, 비히클(25mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 7) 정맥내(IV), 8mg/kg BCY13272, 0.9mg/kg BCY13272 및 0.1mg/kg BCY13272 IV로 처리했다. 모든 치료는 일주일에 2회(BIW), 총 6회 투여량으로 제공되었다. 종양 성장은 치료 개시부터 28일째까지 모니터링되었다. 완전 반응자 동물(n=7)은 치료 개시 후 62일째까지 추적되었고, 2x10⁶개의 MC38 종양 세포의 이식으로 재도전되었고, 종양 성장은 28일 동안 모니터링되었다. 병행하여, 나이브 연령 일치된 대조군 huCD137 C57Bl/6 마우스(n=5)는 28일 동안 모니터링된 2x10⁶개의 MC38 종양 세포를 이식하였다. 이 실험의 결과는 도 3에서 알 수 있고, 여기서 BCY13272가 유의한 항종양 활성을 초래하고, 완전한 반응은 0.9(6명의 완전한 반응자 중 2명) 및 8mg/kg(6명의 완전한 반응자 중 5명) 투여량 수준에서 관찰되었음을 알 수 있다(도 3a). 나이브 연령 일치된 대조군 huCD137 C57Bl/6 마우스(종양 점유율 100%)와는 달리, BCY13272 완전 반응자 동물에서는 종양 재성장이 관찰되지 않았다(도 3b). 이러한 데이터는 BCY13272가 유의한 항종양 활성을 가지며, BCY13272 치료가 완전한 반응자 동물에서 면역원성 기억으로 이어질 수 있음을 나타낸다.

7. SPR로 측정된 EphA2 및 CD137에 대한 BCY13272의 결합

(a) CD137

Biacore 실험을 수행하여 인간 CD137 단백질에 대한 헤테로탠덤 펩티드 결합의 k_a(M^-1s^-1), k_d(s^-1), K_D(nM) 값을 결정하였다. 재조합 인간 CD137(R&D systems)을 PBS에 재현탁시키고, 제조자 제안 프로토콜에 따라 EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-LC-비오틴 시약(Thermo Fisher)을 사용하여 비오티닐화하였다. 단백질을 탈염시켜 스핀 컬럼을 사용하여 결합되지 않은 비오틴을 PBS로 제거하였다.

펩티드 결합의 분석을 위해, Biacore T200 또는 Biacore 3000 장비를 XanTec CMD500D 칩과 함께 사용하였다. 스트렙타비딘은 HBS-N(10mM HEPES, 0.15M NaCl, pH 7.4)을 작동 완충액으로서 사용하여 25℃에서 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 칩에 고정시켰다. 간단히, 카르복시메틸 덱스트란 표면은 10μL/분의 유속으로 0.4M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)/0.1M N-하이드록시 석신이미드(NHS)의 1:1 비의 7분 주입으로 활성화시켰다. 스트렙타비딘의 포획을 위해, 단백질을 10mM 나트륨 아세테이트(pH 4.5)에서 0.2 mg/ml로 희석하고, 활성화된 칩 표면에 120μl를 주입하여 포획하였다. 나머지 활성화 그룹은 1M 에탄올아민(pH 8.5)의 7분 주입으로 차단되었고, 비오티닐화 CD137은 270 내지 1500 RU 수준으로 포획되었다. 완충액을 PBS/0.05% Tween 20으로 변경하고, 펩티드의 희석 시리즈를 이 완충액에서 최종 DMSO 농도 0.5%로 제조하였다. 최상의 펩티드 농도는 6개의 추가의 2배 또는 3배 희석물과 함께 500nM였다. SPR 분석은 60초 결합 및 900초 해리로 25℃에서 90μl/분의 유속으로 수행되었다. 각 사이클 후, 재생 단계(10μL의 10mM 글리신 pH 2)를 사용하였다. 필요한 경우 DMSO 배재된 용적 효과에 대해 데이터를 수정했다. 모든 데이터는 표준 처리 절차를 사용하여 블랭크 주입 및 참조 평면을 위해 이중 참조되었으며, 데이터 처리 및 동적 피팅은 Scrubber 소프트웨어 버전 2.0c(BioLogic Software)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 경우에 따라 질량 전달 효과를 허용하는 간단한 1:1 결합 모델을 사용하여 적합화했다.

(b) EphA2

비아코어 실험을 수행하여 인간 EphA2 단백질에 결합하는 BCY13272의 k_a(M^-1s^-1), k_d(s^-1), K_D(nM) 값을 결정하였다.

EphA2는 단백질보다 3배 몰 과량의 비오틴으로 EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-비오틴을 사용하여 4mM 나트륨 아세테이트, 100mM NaCl, pH 5.4에서 1시간 동안 비오티닐화하였다. 표지화 정도는 반응 혼합물을 PBS로 투석 후 형광 비오틴 정량화 키트(Thermo)를 사용하여 결정되었다. 펩티드 결합의 분석을 위해, XanTec CMD500D 칩이 장착된 Biacore T200 장비를 사용하였다. 스트렙타비딘은 HBS-N(10mM HEPES, 0.15M NaCl, pH 7.4)을 작동 완충액으로 사용하여 25℃에서 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 칩에 고정시켰다. 간단히, 카르복시메틸 덱스트란 표면은 10μl/분의 유속으로 0.4M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)/0.1M N-하이드록시 석신이미드(NHS)의 1:1 비의 7분 주입으로 활성화했다. 스트렙타비딘의 포획을 위해, 단백질을 10mM 나트륨 아세테이트(pH 4.5)에서 0.2 mg/ml로 희석하고, 활성화된 칩 표면에 120μl를 주입하여 포획하였다. 나머지 활성화 그룹은 1M 에탄올아민(pH 8.5):HBS-N(1:1)의 7분 주사로 차단하였다. 완충액을 PBS/0.05% Tween 20으로 변경하고, 비오티닐화 EphA2를 완충액에서 0.2μM로의 단백질 희석을 사용하여 500 내지 1500 RU 수준으로 포획하였다. 펩티드의 희석 시리즈는 최고 펩티드 농도가 50 또는 100nM였고, 6회의 추가 2배 희석물을 갖는 최종 DMSO 농도와 함께 이 완충액에서 제조하였다. SPR 분석은 60초 결합과 900 내지 1200초 해리로 25℃에서 90μl/분의 유속으로 수행되었다. DMSO 배제된 용적 효과에 대해 데이터가 수정되었다. 모든 데이터는 표준 처리 절차를 사용하여 블랭크 주입 및 참조 평면를 위해 이중 참조되었으며, 데이터 처리 및 동적 피팅은 Scrubber 소프트웨어 버전 2.0c(BioLogic Software)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 경우에 따라 질량 전달 효과를 허용하는 간단한 1:1 결합 모델을 사용하여 적합화했다.

도 5a는 BCY13272가 2.0nM의 친화도로 EphA2(인간)에 결합함을 입증하는 센서그램을 도시한다. 도 5b는 BCY13272가 CD137(인간)에 높은 친화도로 결합하는 센서그램을 도시한다. BCY13272에 2개의 CD137 결합 바이사이클릭의 존재로 인해, 고정된 CD137 단백질로부터의 오프 속도는 매우 느리고, 기록된 K_D는 과대평가일 수 있다(도 4b).

SEQUENCE LISTING <110> BICYCLETX LIMITED <120> HETEROTANDEM BICYCLIC PEPTIDE COMPLEX <130> BIC-C-P2831PCT <150> 62/880,191 <151> 2019-07-30 <150> 62/910,088 <151> 2019-10-03 <150> 62/931,442 <151> 2019-11-06 <150> 63/022,667 <151> 2020-05-11 <150> 63/024,715 <151> 2020-05-14 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (15)..(15) <223> Xaa is d1Nal <400> 1 Ala Xaa Asp Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Glu Pro Xaa Trp 1 5 10 15 Thr Cys <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is D-Lys(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 2 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys Ala 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is D-Lys(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 3 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys Ala 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is D-Lys(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 4 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys Lys 1 5 10 15

Claims (6)

1. (a) EphA2에 결합하고, 서열 A-[HArg]-D-C_i[HyP]LVNPLC_iiLEP[d1Nal]WTC_iii (서열번호 1; BCY13118)을 갖고;
   (b) 둘 다 서열 Ac-C_i[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYC_iiFADPY[Nle]C_iii-A(서열번호 2; BCY8928)를 갖는, CD137에 결합하는 2개의 제2 펩티드 리간드에 N-(산-PEG₃)-N-비스(PEG₃-아지드) 링커(linker)를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤(heterotandem) 바이사이클릭 펩티드 복합체로서,
   여기서 상기 펩티드 리간드 각각은 2개의 루프 서열(loop sequence)에 의해 분리된, 3개의 반응성 시스테인 그룹(C_i, C_ii 및 C_iii)을 포함하는 폴리펩티드, 및 1,1',1"-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온(TATA)이고 2개의 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드(scaffold) 상에 형성되도록 폴리펩티드의 반응성 시스테인 그룹과 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함하고;
   여기서, Ac는 아세틸을 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, 1Nal은 1-나프틸알라닌을 나타내고, tBuAla는 3급-부틸-알라닌을 나타내고, PYA는 4-펜티노산(pentynoic acid)을 나타내고, Nle는 노르류신을 나타내는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
2. 제1항에 있어서, BCY13272인, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체:
   

   

   .
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 염이 유리산(free acid) 또는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄 염으로부터 선택되는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 예방, 억제 또는 치료에 사용하기 위한 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체의 시험관내 EC₅₀ 초과의 상기 복합체의 혈장 농도를 유지하지 않는 투여 빈도로 상기 복합체를 투여함을 포함하는, 암을 치료하는 방법.

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