KR20220049529A - 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 세포에 존재하는 성분에 결합하고, 면역 세포에 존재하는 성분에 결합하는 2개 이상의 제2 펩티드 리간드에 링커를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암을 예방, 억제 또는 치료하는 데 있어서 상기 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체의 용도에 관한 것이다.

Description

헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체
본 발명은 암 세포에 존재하는 성분에 결합하고, 면역 세포에 존재하는 성분에 결합하는 2개 이상의 제2 펩티드 리간드에 링커(linker)를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤(heterotandem) 바이사이클릭 펩티드 복합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암을 예방, 억제 또는 치료하는 데 있어서 상기 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체의 용도에 관한 것이다.
사이클릭 펩티드는 단백질 표적에 높은 친화도 및 표적 특이성으로 결합할 수 있기 때문에 치료제의 개발를 위한 매력적인 분자 부류이다. 사실, 예를 들어, 항균 펩티드 반코마이신, 면역억제제 사이클로스포린 또는 항암제 옥트레오티드와 같은 일부 사이클릭 펩티드는 이미 클리닉에서 성공적으로 사용되고 있다(참조: Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). 양호한 결합 특성은 펩티드와 표적 사이에 형성된 비교적 큰 상호작용 표면 및 사이클릭 구조의 감소된 형태적 유연성으로 인해 발생한다. 전형적으로, 매크로사이클은, 예를 들어, 사이클릭 펩티드 CXCR4 길항제 CVX15(400Å2; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), 인테그린 αVb3에 결합하는 Arg-Gly-Asp 모티프를 갖는 사이클릭 펩티드(355Å2)(Xiong et al. (2002), Science 296(5565), 151-5) 또는 우로키나제형 플라스미노겐 활성제에 결합하는 사이클릭 펩티드 억제제 우파인-1(603Å2; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160(1), 1-10)과 같이 수백 평방 옹스트롬의 표면에 결합한다.
이들의 사이클릭 구성으로 인해, 펩티드 매크로사이클은 선형 펩티드보다 덜 유연하여 표적에 결합시 더 적은 엔트로피의 손실을 유도하고, 더 높은 결합 친화성을 초래한다. 감소된 유연성은 또한 표적 특이적 형태를 잠그게 하여 선형 펩티드와 비교하여 결합 특이성을 증가시킨다. 이 효과는 환이 개방되었을 때 다른 MMP에 비해 선택성을 상실한 매트릭스 메탈로프로테이나제 8(MMP-8)의 강력하고 선택적인 억제제에 의해 예시되었다(참조: Cherney et al. (1998), J Med Chem 41(11), 1749-51). 매크로사이클릭화를 통해 달성된 유리한 결합 특성은, 예를 들어, 반코마이신, 니신, 및 악티노마이신에서와 같이 하나 이상의 펩티드 환을 갖는 다환식 펩티드에서 훨씬 더 두드러진다.
다양한 연구팀이 이전에 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드를 합성 분자 구조에 결합시켰다(참조: Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). 멜로엔(Meloen) 및 공동 연구자들은 단백질 표면의 구조적 모방을 위한 합성 스캐폴드(scaffold) 상의 다중 펩티드 루프의 신속하고 정량적인 사이클릭화를 위해 트리스(브로모메틸)벤젠과 관련 분자를 사용하였다(참조: Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). 예를 들어, 트리스(브로모메틸)벤젠과 같이 시스테인 함유 폴리펩티드를 분자 스캐폴드에 연결함으로써 상기 화합물이 생성되는 후보 약물 화합물의 생성 방법은 WO2004/077062 및 WO2006/078161에 개시되어 있다.
파지 디스플레이 기반 조합 접근법은 관심 표적에 대한 바이사이클릭 펩티드의 큰 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위해 개발되었다(참조: Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 및 WO2009/098450). 간단히, 3개의 시스테인 잔기와 6개의 랜덤 아미노산(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)의 2개의 영역을 함유하는 선형 펩티드의 조합 라이브러리를 파지에 표시하고, 시스테인 측쇄를 작은 분자 (트리스-(브로모메틸)벤젠)에 공유 결합시킴으로써 사이클릭화했다.
본 발명의 제1 측면에 따르면,
(a) 암 세포에 존재하는 성분에 결합하고, (b) 면역세포 상에 존재하는 성분에 결합하는 2개 이상의 제2 펩티드 리간드에 링커를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공되고,
여기서, 상기 펩티드 리간드 각각은 적어도 2개의 루프 서열(loop sequence)에 의해 분리된, 적어도 3개의 반응성 그룹을 포함하는 폴리펩티드, 및 적어도 2개의 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되도록 폴리펩티드의 반응성 그룹과 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함한다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 암을 예방, 억제 또는 치료하는 데 사용하기 위한, 본원에 정의된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공된다.
도 1: (a) 넥틴-4 (Nectin-4) 발현 H292 세포의 존재하에 프로메가 CD137 루시퍼라제 리포터 검정에서 넥틴-4/CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체의 분석. BCY11617은 BCY11863과 동일한 친화도로 넥틴-4에 결합하지만, CD137에는 결합하지 않는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체이다. (b) 넥틴-4를 내인적으로 발현하거나 넥틴-4를 과발현하도록 조작된 상이한 세포주와의 공배양에서 프로메가 CD137 루시퍼라제 리포터 검정에서 BCY11863의 EC50(nM)의 요약.
도 2: 넥틴-4/CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 PBMC-4T1 공배양 검정에서 IFN-γ(도 2a) 및 IL-2(도 2b) 사이토카인 분비를 유도한다. 4T1 세포는 넥틴-4를 발현하도록 조작되었다. BCY11617은 BCY11863과 동일한 친화도로 넥틴-4에 결합하지만, CD137에는 결합하지 않는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체이다. 도 2c는 다수의 인간 PBMC 공여자 및 종양 세포주를 이용한 사이토카인 분비 검정에서 BCY11863의 EC50(nM)의 요약을 나타낸다.
도 3: SD 래트 및 시노몰구스 원숭이(시노)에 각각 2mg/kg(n=3) 및 1mg/kg(n=2)으로 IV 투여된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY11863의 약동학.
도 4: 동계 넥틴-4 과발현 MC38 종양 모델(MC38#13)에서 BCY11863의 MC38#13 항종양 활성. BCY11863 치료 중 및 치료 후 종양 용적. D69의 완전 반응자(CR) 마우스의 수는 괄호 안에 표시된다. QD: 매일 투약; Q3D: 3일 마다 투약, ip: 복강내 투여.
도 5: BCY11863 치료는 넥틴-4 과발현 MC38 종양 모델에 대한 면역원성 기억을 유도한다. 나이브 C57BL/6J-hCD137 마우스 또는 BCY11863에 대한 완전한 반응(CR)을 나타낸 마우스에 접종 후의 MC38#13 종양 용적. 관찰 기간(22일)의 종료까지 어떤 CR 마우스도 종양이 발병하지 않았음을 주시한다.
도 6: BCY11863은 동계 넥틴-4 과발현 CT26 종양 모델(CT26#7)에서 항종양 활성을 입증한다. BCY11863 치료 중 CT26#7 종양 용적. Q3D: 3일 마다 투약; ip: 복강내 투여.
도 7: 총 T 세포 및 CD8+ T 세포는 BCY11863의 마지막(6번째) Q3D 투여 1시간 후에 CT26#7 종양 조직에서 증가한다. BCY11863의 마지막 Q3D 투여 1시간 후 CT26#7 종양 조직에서 총 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, Treg 및 CD8+ T 세포/Treg 비율의 분석.
도 8: 5mg/kg의 BCY11863의 단일 정맥내(iv) 투여 후 CT26#7 동계 종양 보유 동물의 혈장 및 종양 조직에서의 BCY11863의 약동학적 프로파일.
도 9: 동계 MC38 종양 모델에서 BCY12491의 항종양 활성. BCY12491 치료 중 및 치료 후 MC38 종양 용적. D73의 완전 반응자(CR) 마우스의 수는 괄호 안에 표시된다. QD: 매일 투약; Q3D: 3일 마다 투약; ip: 복강내 투여.
도 10: EphA2/CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY12491은 MC38 공배양 검정에서 IFN-γ 사이토카인 분비를 유도한다. BCY12762는 BCY12491과 동일한 친화도로 EphA2에 결합하지만 CD137에는 결합하지 않는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체이다. (a) 공여자 1 = 환자 228769, EC50 = 34pM. (b) 공여자 2 = 환자 228711, EC50 = 85pM.
도 11: CD-1 마우스(n=3)에서 15mg/kg의 복강내 투여로부터의 BCY11863 및 BCY12491의 혈장 농도 대 시간 곡선 및 BCY11863 및 BCY12491의 최종 혈장 반감기.
도 12: 시노몰구스 원숭이(n=2)에 1mg/kg의 15분 IV 주입 후 헤테로탠덤 이중특이적 복합체 BCY12491의 혈장 농도 대 시간 플롯.
도 13: BCY11027은 원발성 환자 유래 폐 종양의 생체외 배양에서 표적 의존성 사이토카인 방출을 유도한다. (a) 생체외 환자 유래 종양 세포는 배양 4시간 이내에 3D 회전 타원체를 형성하고 광학 현미경 하에 10배의 이미지이다. (b) 환자 유래 종양 샘플에서 넥틴-4 발현의 유세포 분석. 표는 3명의 공여자 샘플에서 %CD137+ T 세포 및 넥틴-4+ 세포를 나타낸다. (c) BCY11027에 의한 치료에 반응한 %CD8 +ki67+ T 세포. (d) BCY11027의 농도의 함수로서 IL-2 사이토카인 방출(배경 제외됨). (e) 대조군/시험 화합물에 의한 치료에 반응하는 면역 마커(비히클로 정규화됨)의 변화 %를 나타내는 히트맵.
도 14: OX40L 및 비-결합 대조군 펩티드 BCY12968과 비교하여 종양 세포와의 공배양에서 프로메가 OX40 세포 활성 검정에서 BCY12967의 결과.
도 15: 마우스 종양 모델에서 BCY12491의 결과. BCY12491 및 항-CD137 치료는 (a) 세포독성 세포 스코어, (b) T 세포 스코어, (c) 대식세포 세포 스코어 및 (d) 치료 개시 후 D6에 MC38 동계 종양에서 CD8+ 세포 침윤을 증가시킨다.
도 16: A549, PC-3 및 HT29 세포(n=3)를 발현하는 EphA2의 존재하에 프로메가 CD137 루시퍼라제 리포터 검정에서 EphA2/CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY13272의 분석. BCY13626은 BCY13272와 유사한 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체이지만 D-아미노산을 포함하고 EphA2 또는 CD137에 결합하지 않는다.
도 17: CD1 마우스(n=3)에서 5.5mg/kg IV 투여, SD 래트(n=3)에서 3.6mg/kg IV 주입(15분) 및 시노몰구스 원숭이(n = 2)에서 8.9mg/kg IV 주입(15분)으로부터 BCY13272의 혈장 농도 대 시간 플롯. BCY13272의 약동학적 프로파일의 최종 반감기는 CD-1 마우스에서 2.9시간, SD 래트에서 2.5시간, 시노에서 8.9시간이다.
도 18: 동계 MC38 종양 모델에서 BCY13272의 항종양 활성. (a) BCY13272 치료 중 및 치료 후 MC38 종양 용적. D28의 완전 반응자(CR) 마우스의 수(및 D62에 CR로 잔류함)는 괄호 안에 표시된다. BIW: 주 2회 투약. IV: 정맥내 투여. (b) MC38 종양 세포 이식 후 BCY13272에 대한 완전 반응자 동물 및 나이브 연령 일치된 대조군 동물의 종양 성장 곡선. CR: 완전 반응자.
도 19: BCY13272는 (a) PBMC/MC38 및 (b) PBMC/HT29 공배양 검정에서 IFN-γ 사이토카인 분비를 유도한다. BCY12762는 EphA2에 결합하지만 CD137에는 결합하지 않는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체이다. BCY13692는 CD137에 결합하지만 EphA2에는 결합하지 않는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체이다. (c) 5명의 PBMC 공여자를 갖는 MC38 (마우스) 세포주 및 4명의 PBMC 공여자를 갖는 HT1080 (인간) 세포주를 이용한 PBMC 공배양 검정에서 BCY13272 유도된 IL-2 및 IFN-y 분비의 EC50(nM) 값의 플롯.
도 20: 고정된 (a) EphA2 및 (b) CD137에 대한 BCY13272의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 결합.
도 21: 고정된 (a) 넥틴-4 및 (b) CD137에 대한 BCY11863의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 결합 연구. (c) CD137 및 (d) 넥틴-4를 SPR 칩에 고정화한 후, BCY11863을 포획하는 이중 결합 SPR 검정. 결합된 BCY11863의 가용성 인간 넥틴-4(c) 또는 CD137(d)에 대한 친화도는 가용성 수용체를 칩에 상이한 농도로 유동시킴으로써 측정된다. (e) 스트렙타비딘 SPR 칩에 고정된 BCY13582(비오티닐화 BCY11863)의 가용성 인간 CD137에의 결합.
도 22: BCY13582(비오티닐화 BCY11863)의 비특이적 표적외 상호작용을 탐색하는 데 사용되는 Retrogenix의 세포 마이크로어레이 기술. 여기에 표시된 것은 11개의 상이한 단백질을 발현하는 마이크로어레이 슬라이드에 추가된 1μM의 BCY13582가 CD137 및 넥틴-4(AlexaFluor647 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 검출됨)에만 결합함을 보여주는 스크리닝 데이터이다. BCY11863과 함께 배양하면 결합 신호가 대체된다.
도 23: huCD137 C57Bl/6 마우스에서 MC38#13 종양의 종양 성장 곡선은 상이한 투여량 및 투여 간격 후 BCY11863의 항종양 활성을 입증한다. 치료 개시 후 15일째의 완전 반응자 동물(CR; 촉지 가능한 종양 없음)의 수는 괄호 안에 나타낸다.
도 24: huCD137 C57Bl/6 마우스에서 MC38#13 종양(n=6/코호트)의 종양 성장 곡선(평균±SEM)은 상이한 투여량 및 투여 스케줄에서 BCY11863의 항종양 활성을 입증한다. 치료 개시 후 52일째의 완전 반응자 동물(CR; 촉지 가능한 종양 없음)의 수는 괄호 안에 나타낸다. (a) 비히클 또는 3mg/kg의 총 주 용량의 BCY11863을 투여한 코호트. (b) 비히클 또는 10mg/kg의 총 주 용량의 BCY11863을 투여한 코호트. (c) 비히클 또는 30mg/kg의 총 주 용량의 BCY11863을 투여한 코호트.
도 25: 100mg/kg(n=3)으로 IV 투여된 SD 래트에서의 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY11863의 약동학, 및 혈장 중의 BCY11863 및 잠재적인 대사산물 BCY15155 및 BCY14602의 농도 측정.
도 26: EphA2/CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 PBMC-MC38 공배양 검정(A, B, C)에서 IFN-γ 사이토카인 분비를 유도한다. BCY12762 및 BCY12759는 1:2 및 1:1의 헤테로탠덤 복합체이며, 여기서 CD137 바이사이클은 모든 D-아미노산 비결합 대조군으로 대체된다.
도 27: a) 27일째까지 huCD137 C57Bl/6 마우스(n=6/코호트)에서 MC38 종양의 성장 곡선은 상이한 투여량 및 투여 간격에서 BCY12491의 항종양 활성을 입증한다. b) 73일째까지의 MC38 종양의 개별 종양 성장 측정. 완전 반응자 동물(CR; 촉지 가능한 종양 없음)의 수는 괄호 안에 나타낸다. c) MC38 세포가 이식된 완전 반응자 동물 또는 나이브 대조군 동물로부터의 종양 성장 곡선(n=5/코호트). 종양 점유율(촉지 가능한 종양 성장이 있는 동물의 %)은 괄호 안에 나타낸다.
도 28: BCY12491 활성은 CD8+ T 세포에 의존하지만 NK 세포에는 의존하지 않는다. (a) CD8+ 세포 및/또는 NK 세포(D-5, D0 및 D5)가 고갈되었거나 비히클 또는 아이소타입 대조군 항체로 처리된 MC38#13 종양 보유 마우스는 15mg/kg BCY12491 또는 비히클 BIW를 4회 용량을 받았다. (b) 생존 사건이 2000mm3를 초과하는 종양 용적인 그래프 (a)에 상응하는 생존 데이터. 치료 개시 후 중앙 생존 시간은 괄호 안에 나타낸다. 정의되지 않은 생존 시간은 중앙 생존 시간이 28일(연구 종료)까지 도달하지 않았음을 의미한다.
도 29: huCD137 C57Bl/6 마우스의 개별 MC38 종양의 성장 곡선은 15mg/kg 용량으로 Q3D 투여 스케줄에서 BCY12491, BCY12730 및 BCY12723의 항종양 활성을 입증한다. 치료 개시 후 28일째의 완전 반응자 동물(CR; 촉지 가능한 종양 없음)의 수를 괄호 안에 나타낸다.
도 30: huCD137 C57Bl/6 마우스(n=6/코호트)에서 MC38 종양의 성장 곡선은 5mg/kg 용량의 BIW 투여 스케줄에서 BCY12491, BCY13048 및 BCY13050의 항종양 활성을 입증한다. 치료 개시 후 28일째의 완전 반응자 동물(CR; 촉지 가능한 종양 없음)의 수는 괄호 안에 나타낸다.
본 발명의 제1 측면에 따르면,
(a) 암 세포에 존재하는 성분에 결합하고, (b) 면역세포 상에 존재하는 성분에 결합하는 2개 이상의 제2 펩티드 리간드에 링커를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공되고,
여기서, 상기 펩티드 리간드 각각은 적어도 2개의 루프 서열에 의해 분리된, 적어도 3개의 반응성 그룹을 포함하는 폴리펩티드, 및 적어도 2개의 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되도록 폴리펩티드의 반응성 그룹과 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함한다.
언급될 수 있는 본 발명의 한 측면에 따르면,
(a) 암 세포에 존재하는 성분에 결합하고, (b) 면역세포 상에 존재하는 성분에 결합하는 2개 이상의 제2 펩티드 리간드에 링커를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공되고,
여기서, 상기 펩티드 리간드 각각은 적어도 2개의 루프 서열에 의해 분리된, 적어도 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 및 적어도 2개의 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되도록 폴리펩티드의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함한다.
제1 펩티드 리간드
본원에서 용어 "암 세포"에 대한 언급은 암에 관여하는 것으로 공지된 임의의 세포를 포함한다. 암 세포는 세포 분열을 조절하는 유전자가 손상되는 경우 생성된다. 발암은 정상 세포의 유전 물질의 돌연변이와 후성돌연변이에 의해 유발되며, 이는 증식과 세포 사멸 사이의 정상적인 균형을 깨뜨린다. 이것은 통제되지 않은 세포 분열과 신체의 자연 선택에 의한 세포의 진화를 초래한다. 통제되지 않고 종종 급속한 세포 증식은 양성 또는 악성 종양(암)으로 이어질 수 있다. 양성 종양은 신체의 다른 부분으로 퍼지거나 다른 조직을 침해하지 않는다. 악성 종양은 다른 기관에 침입하여 먼 위치로 퍼질 수 있으며(전이), 생명을 위협할 수 있다.
한 구현예에서, 암 세포는 HT108, A549, SC-OV-3, PC3, HT1376, NCI-H292, LnCap, MC38, MC38 #13, 4T1-D02, H322, HT29, T47D 및 RKO 종양 세포로부터 선택된다.
한 구현예에서, 암 세포에 존재하는 성분은 넥틴-4이다.
넥틴-4는 4개의 구성원을 포함하는 넥틴 계열의 단백질에 속하는 표면 분자이다. 넥틴은 발달 및 성인기 동안 상피, 내피, 면역 및 신경 세포의 극성, 증식, 분화 및 이동과 같은 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하는 세포 부착 분자이다. 그들은 인간의 여러 병리학적 과정에 관여한다. 그들은 폴리오 바이러스, 단순 포진 바이러스 및 홍역 바이러스의 주요 수용체이다. 넥틴-1(PVRL1) 또는 넥틴-4(PVRL4)를 인코딩하는 유전자의 돌연변이는 다른 이상과 관련된 외배엽 이형성 증후군(ectodermal dysplasia syndromes)을 유발한다. 넥틴-4는 태아 발달 중에 발현된다. 성인 조직에서 그의 발현은 패밀리의 다른 구성원의 발현보다 더 제한된다. 넥틴-4는 유방, 난소 및 폐 암종의 각각 50%, 49% 및 86%에서 종양 관련 항원이며, 대부분 예후가 불량한 종양에 있다. 그의 발현은 상응하는 정상 조직에서는 검출되지 않는다. 유방 종양에서, 넥틴-4는 주로 삼중 음성 및 ERBB2+ 암종에서 발현된다. 이러한 암 환자의 혈청에서, 넥틴-4의 가용성 형태의 검출은 불량한 예후와 관련이 있다. 혈청 넥틴-4의 수준은 전이 진행 동안 증가하고 치료 후 감소한다. 이러한 결과는 넥틴-4가 암 치료의 신뢰할 수 있는 표적일 수 있음을 시사한다. 따라서, 몇몇 항-넥틴-4 항체가 종래 기술에 기재되어 있다. 특히, 엔포르투맙 베도틴(ASG-22ME)은 넥틴-4를 표적으로 하는 항체-약물 접합체(ADC)이며, 현재 고형 종양으로 고통받는 환자의 치료용으로 임상적으로 연구되고 있다.
한 구현예에서, 제1 펩티드 리간드는 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함한다.
넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드의 적합한 예는 WO 2019/243832에 개시되어 있으며, 이들 펩티드는 본원에 참고로 포함된다.
한 구현예에서, 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 1; 본원에서 BCY8116으로서 지칭됨);
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]D[dW]STP[HyP][dW]Ciii (서열번호 2);
CiP[1Nal][dK](Sar10-(B-Ala))CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 3);
CiPFGCiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 4; 본원에서 BCY11414로서 지칭됨);
CiP[1Nal][dK]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 14);
[MerPro]iP[1Nal][dK]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 15; 본원에서 BCY12363으로서 지칭됨);
CiP[1Nal][dK]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]W[Cysam]iii (서열번호 16);
[MerPro]iP[1Nal][dK]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]W[Cysam]iii (서열번호 17; 본원에서 BCY12365로서 지칭됨);
CiP[1Nal][dK]CiiM[HArg]HWSTP[HyP]WCiii (서열번호 18);
CiP[1Nal][dK]CiiM[HArg]EWSTP[HyP]WCiii (서열번호 19);
CiP[1Nal][dE]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 20; 본원에서 BCY12368로서 지칭됨);
CiP[1Nal][dA]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 21; 본원에서 BCY12369로서 지칭됨);
CiP[1Nal][dE]CiiL[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 22; 본원에서 BCY12370으로서 지칭됨); 및
CiP[1Nal][dE]CiiM[HArg]EWSTP[HyP]WCiii (서열번호 23; 본원에서 BCY12384로서 지칭됨);
여기서, [MerPro]i, Ci, Cii, Ciii 및 [Cysam]iii는 시스테인, MerPro 및 Cysam으로부터 선택된 제1 (i), 제2 (ii) 및 제3 (iii) 반응성 그룹을 나타내고, 1Nal은 1-나프틸알라닌을 나타내고, HArg은 호모아르기닌을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, Sar10은 10개의 사르코신 단위를 나타내고, B-Ala는 베타-알라닌을 나타내고, MerPro는 3-머캅토프로피온산을 나타내고, Cysam은 시스테아민을 나타낸다.
추가의 구현예에서, 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 1; 본원에서 BCY8116으로서 지칭됨);
CiP[1Nal][dK](Sar10-(B-Ala))CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 3); 및
CiPFGCiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 4; 본원에서 BCY11414로서 지칭됨);
여기서, Ci, Cii 및 Ciii는 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 나타내고, 1Nal은 1-나프틸알라닌을 나타내고, HArg은 호모아르기닌을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, Sar10은 10개의 사르코신 단위를 나타내고, B-Ala는 베타-알라닌을 나타낸다.
추가의 구현예에서, 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 임의로 N-말단 변형을 포함하고;
서열번호 1 (본원에서 BCY8116으로서 지칭됨);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(서열번호 1)(본원에서 BCY8846으로서 지칭됨);
[PYA]-(서열번호 1)(본원에서 BCY11015로서 지칭됨);
[PYA]-[B-Ala]-(서열번호 1)(본원에서 BCY11016으로서 지칭됨);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(서열번호 2)(본원에서 BCY11942로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 3)(본원에서 BCY8831로서 지칭됨);
서열번호 4 (본원에서 BCY11414로서 지칭됨);
[PYA]-[B-Ala]-(서열번호 14)(본원에서 BCY11143으로서 지칭됨);
팔미트산 -yGlu-yGlu-(서열번호 14)(본원에서 BCY12371로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 14)(본원에서 BCY12024로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 16)(본원에서 BCY12364로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 18)(본원에서 BCY12366으로서 지칭됨); 및
Ac-(서열번호 19)(본원에서 BCY12367로서 지칭됨); 또는
이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
여기서, PYA는 4-펜티노산(4-pentynoic acid)을 나타내고, B-Ala는 베타-알라닌을 나타내고, Sar10은 10개의 사르코신 단위를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 임의로 N-말단 변형을 포함하고;
서열번호 1 (본원에서 BCY8116으로서 지칭됨);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(서열번호 1)(본원에서 BCY8846으로서 지칭됨);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(서열번호 2)(본원에서 BCY11942로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 3)(본원에서 BCY8831로서 지칭됨); 및
서열번호 4 (본원에서 BCY11414로서 지칭됨); 또는
이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
여기서, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, B-Ala는 베타-알라닌을 나타내고, Sar10은 10개의 사르코신 단위를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 서열번호 1(본원에서 BCY8116으로서 지칭됨)을 포함한다.
대안적인 구현예에서, 암 세포에 존재하는 성분은 EphA2이다.
Eph 수용체 티로신 키나제(Eph)는 티로신 잔기 상의 단백질을 인산화하는 키나제인 수용체 티로신 키나제(RTK)의 큰 그룹에 속한다. Eph 및 그들의 막 결합된 에프린 리간드(에프린)는 세포 위치 및 조직 조직화를 제어한다(참조: Poliakov et al. (2004) Dev Cell 7, 465-80). 기능적 및 생화학적 Eph 반응은 더 높은 리간드 올리고머화 상태에서 발생한다(참조: Stein et al. (1998) Genes Dev 12, 667-678).
다른 패턴화 기능 중에서, 다양한 Eph 및 에프린이 혈관 발달에 역할을 하는 것으로 나타났다. EphB4 및 에프린-B2의 녹아웃은 모세혈관 층을 혈관으로 리모델링하는 능력의 결여(참조: Poliakov et al., 상기) 및 배아의 치사율을 초래한다. 일부 Eph 수용체 및 에프린의 지속적인 발현은 새로 형성된 성체 미세혈관에서도 관찰되었다(참조: Brantley-Sieders et al. (2004) Curr Pharm Des 10, 3431-42; Adams (2003) J Anat 202, 105-12).
성인에서 일부 에프린 및 그들의 수용체의 조절되지 않은 재출현은 또한 종양 침습, 전이 및 신생혈관형성에 기여하는 것으로 관찰되었다(참조: Nakamoto et al. (2002) Microsc Res Tech 59, 58-67; Brantley-Sieders et al., 상기). 또한, 일부 Eph 패밀리 구성원은 다양한 인간 종양의 종양 세포에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다(참조: Brantley-Sieders et al., 상기); Marme (2002) Ann Hematol 81 Suppl 2, S66; Booth et al. (2002) Nat Med 8, 1360-1).
EPH 수용체 A2(에프린 A형 수용체 2)는 인간에서 EPHA2 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다.
EphA2는 종종 질환 진행, 전이 및 불량한 예후와 관련되는 인간의 여러 암, 예를 들어, 유방암(Zelinski et al (2001) Cancer Res. 61, 2301-2306; Zhuang et al (2010) Cancer Res. 70, 299-308; Brantley-Sieders et al (2011) PLoS One 6, e2442), 폐암(Brannan et al (2009) Cancer Prev Res (Phila) 2, 1039-1049; Kinch et al (2003) Clin Cancer Res. 9, 613-618; Guo et al (2013) J Thorac Oncol. 8, 301-308), 위암(Nakamura et al(2005) Cancer Sci. 96, 42-47; Yuan et al (2009) Dig Dis Sci 54, 2410-2417), 췌장암(Mudali et al (2006) Clin Exp Metastasis 23, 357-365), 전립선암(Walker-Daniels et al(1999) Prostate 41, 275-280), 간암(Yang et al (2009) Hepatol Res. 39, 1169-1177) 및 신경교아세포종(Wykosky et al(2005)) Mol Cancer Res. 3, 541-551; Li et al (2010) Tumor Biol. 31, 477-488)에서 상향 조절된다.
암 진행에서 EphA2의 완전한 역할은 아직 정의되지 않았지만, 종양 세포 성장, 생존, 침습 및 혈관신생을 포함하는 암 진행의 많은 단계에서 상호작용의 증거가 있다. EphA2 발현의 하향 조절은 종양 암 세포 증식을 억제하는(참조: Binda et al (2012) Cancer Cell 22, 765-780) 반면, EphA2 차단은 VEGF 유도 세포 이동(참조: Hess et al (2001) Cancer Res. 61, 3250-3255), 발아 및 혈관신생(참조: Cheng et al (2002) Mol Cancer Res. 1, 2-11; Lin et al (2007) Cancer 109, 332-40) 및 전이 진행(참조: Brantley-Sieders et al (2005) FASEB J. 19, 1884-1886)을 억제한다.
EphA2에 대한 항체 약물 접합체는 래트 및 마우스 이종이식 모델에서 종양 성장을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났고(참조: Jackson et al (2008) Cancer Research 68, 9367-9374), 치료 관련 부작용으로 치료가 중단되어야 했지만 유사한 접근법이 인간에서 시도되었다(참조: Annunziata et al (2013) Invest New Drugs 31, 77-84).
한 구현예에서, 제1 펩티드 리간드는 EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함한다.
EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드의 적합한 예는 WO 2019/122860, WO 2019/122861 및 WO 2019/122863에 개시되어 있으며, 이들 펩티드는 본원에 참고로 포함된다.
한 구현예에서, EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 24);
CiLWDPTPCiiANLHL[HArg]Ciii (서열번호 25);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[K(PYA)]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 26);
Ci[HyP][K(PYA)]VNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 27);
Ci[HyP]LVNPLCii[K(PYA)]HP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 28);
Ci[HyP]LVNPLCiiLKP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 29);
Ci[HyP]KVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 30);
Ci[HyP]LVNPLCiiKHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 31);
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dE]W[HArg]Ciii (서열번호 32);
Ci[HyP]LVNPLCiiLEP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 33);
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]WTCiii (서열번호 34);
Ci[HyP]LVNPLCiiLEP[dD]WTCiii (서열번호 35);
Ci[HyP]LVNPLCiiLEP[dA]WTCiii (서열번호 36);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[3,3-DPA]P[dD]WTCiii (서열번호 37; 본원에서 BCY12860으로서 지칭됨);
Ci[HyP][Cba]VNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 38);
Ci[HyP][Cba]VNPLCiiLEP[dD]WTCiii (서열번호 39);
Ci[HyP][Cba]VNPLCiiL[3,3-DPA]P[dD]WTCiii (서열번호 40);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[3,3-DPA]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 41);
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[d1Nal]W[HArg]Ciii (서열번호 42);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[1Nal]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 43);
Ci[HyP]LVNPLCiiLEP[d1Nal]WTCiii (서열번호 44);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[1Nal]P[dD]WTCiii (서열번호 45; 본원에서 BCY13119로서 지칭됨);
Ci[HyP][Cba]VNPLCiiLEP[dA]WTCiii (서열번호 46);
Ci[HyP][hGlu]VNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 47);
Ci[HyP]LVNPLCii[hGlu]HP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 48);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[hGlu]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 49);
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dNle]W[HArg]Ciii (서열번호 50);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[Nle]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 51);
[MerPro]i[HyP]LVNPLCiiL[3,3-DPA]P[dD]WTCiii (서열번호 154);
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg][Cysam]iii (서열번호 155);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[His3Me]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 156);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[His1Me]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 157);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[4ThiAz]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 158);
Ci[HyP]LVNPLCiiLFP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 159);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[Thi]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 160);
Ci[HyP]LVNPLCiiL[3Thi]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 161);
Ci[HyP]LVNPLCiiLNP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 162);
Ci[HyP]LVNPLCiiLQP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 163); 및
Ci[HyP]LVNPLCiiL[K(PYA-(Palmitoyl-Glu-LysN3)]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 164);
여기서, [MerPro]i, Ci, Cii, Ciii 및 [Cysam]iii는 시스테인, MerPro 및 Cysam으로부터 선택된 제1 (i), 제2 (ii) 및 제3 (iii) 반응성 그룹을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, HArg은 호모아르기닌을 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, 3,3-DPA는 3,3-디페닐알라닌을 나타내고, Cba는 β-사이클로부틸알라닌을 나타내고, 1Nal은 1-나프틸알라닌을 나타내고, hGlu는 호모글루탐산을 나타내고, Thi는 2-티에닐-알라닌을 나타내며, 4ThiAz는 베타-(4-티아졸릴)-알라닌을 나타내고, His1Me는 N1-메틸-L-히스티딘을 나타내고, His3Me는 N3-메틸-L-히스티딘을 나타내고, 3Thi는 3-티에닐알라닌을 나타내고, 팔미토일-Glu-LysN3[PYA]는
Figure pct00001
을 나타내고, [K(PYA-(팔미토일-Glu-LysN3)]는
Figure pct00002
을 나타내고, Nle은 노르류신을 나타내고, MerPro는 3-머캅토프로피온산을 나타내고, Cysam은 시스테아민을 나타낸다.
하나의 특정 구현예에서, EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 하기 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii(서열번호 24);
여기서, Ci, Cii 및 Ciii는 제1 (i), 제2 (ii) 및 제3 (iii) 시스테인 그룹을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타낸다.
하나의 대안적인 특정 구현예에서, EphA2-결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 하기 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
Ci[HyP]LVNPLCiiLEP[d1Nal]WTCiii(서열번호 44);
여기서, Ci, Cii 및 Ciii는 제1 (i), 제2 (ii) 및 제3 (iii) 시스테인 그룹을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, 1Nal은 1-나프틸알라닌을 나타낸다.
추가의 구현예에서, EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 임의로 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 포함하고;
A-[HArg]-D-(서열번호 24)(본원에서 BCY9594로서 지칭됨);
[B-Ala]-[Sar10]-A-[HArg]-D-(서열번호 24)(본원에서 BCY6099로서 지칭됨);
[PYA]-A-[HArg]-D-(서열번호 24)(본원에서 BCY11813으로서 지칭됨);
Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 24)-[K(PYA)](본원에서 BCY11814로서 지칭됨);
Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 24)-K(본원에서 BCY12734로서 지칭됨);
[NMeAla]-[HArg]-D-(서열번호 24)(본원에서 BCY13121로서 지칭됨);
[Ac]-(서열번호 24)-L[dH]G[dK](본원에서 BCY13125로서 지칭됨);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-VGP-(서열번호 25)(본원에서 BCY8941로서 지칭됨);
Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 26)(본원에서 BCY11815로서 지칭됨);
Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 27)(본원에서 BCY11816으로서 지칭됨);
Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 28)(본원에서 BCY11817로서 지칭됨);
Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 29)(본원에서 BCY12735로서 지칭됨);
(팔미토일-Glu-LysN3)[PYA]A[HArg]D-(서열번호 29)(이하, BCY14327로서 공지되어 있음);
Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 30)(본원에서 BCY12736으로서 지칭됨);
Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 31)(본원에서 BCY12737로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 32)(본원에서 BCY12738로서 지칭됨);
A-[HArg]-E-(서열번호 32)(본원에서 BCY12739로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 33)(본원에서 BCY12854로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 34)(본원에서 BCY12855로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 35)(본원에서 BCY12856으로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 35)-[dA](본원에서 BCY12857로서 지칭됨);
(서열번호 35)-[dA] (본원에서 BCY12861로서 지칭됨);
[NMeAla]-[HArg]-D-(서열번호 35)(본원에서 BCY13122로서 지칭됨);
[dA]-ED-(서열번호 35)(본원에서 BCY13126으로서 지칭됨);
[dA]-[dA]-D-(서열번호 35)(본원에서 BCY13127로서 지칭됨);
AD-(서열번호 35)(본원에서 BCY13128로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 36)(본원에서 BCY12858로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 37)(본원에서 BCY12859로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 37)-[dK](본원에서 BCY13120으로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 38)(본원에서 BCY12862로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 39)(본원에서 BCY12863으로서 지칭됨);
[dA]-[HArg]-D-(서열번호 39)-[dA](본원에서 BCY12864로서 지칭됨);
(서열번호 40)-[dA](본원에서 BCY12865로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 41)(본원에서 BCY12866으로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 42)(본원에서 BCY13116으로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 43)(본원에서 BCY13117로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 44)(본원에서 BCY13118로서 지칭됨);
[dA]-[HArg]-D-(서열번호 46)-[dA](본원에서 BCY13123으로서 지칭됨);
[d1Nal]-[HArg]-D-(서열번호 46)-[dA](본원에서 BCY13124로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 47)(본원에서 BCY13130으로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 48)(본원에서 BCY13131로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 49)(본원에서 BCY13132로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 50)(본원에서 BCY13134로서 지칭됨);
A-[HArg]-D-(서열번호 51)(본원에서 BCY13135로서 지칭됨);
(서열번호 154)-[dK](본원에서 BCY13129로서 지칭됨);
A[HArg]D-(서열번호 155)(본원에서 BCY13133으로서 지칭됨);
A[HArg]D-(서열번호 156)(본원에서 BCY13917로서 지칭됨);
A[HArg]D-(서열번호 157)(본원에서 BCY13918로서 지칭됨);
A[HArg]D-(서열번호 158)(본원에서 BCY13919로서 지칭됨);
A[HArg]D-(서열번호 159)(본원에서 BCY13920으로서 지칭됨);
A[HArg]D-(서열번호 160)(본원에서 BCY13922로서 지칭됨);
A[HArg]D-(서열번호 161)(본원에서 BCY13923으로서 지칭됨);
A[HArg]D-(서열번호 162)(본원에서 BCY14047로서 지칭됨);
A[HArg]D-(서열번호 163)(본원에서 BCY14048로서 지칭됨); 및
A[HArg]D-(서열번호 164)(본원에서 BCY14313으로서 지칭됨); 또는
이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
여기서, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, B-Ala는 베타-알라닌을 나타내고, Sar10은 10개의 사르코신 단위를 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타내고, NMeAla는 N-메틸-알라닌을 나타내고, 1Nal은 1-나프틸알라닌을 나타내고, 팔미토일-Glu-LysN3 [PYA]는
Figure pct00003
을 나타낸다.
하나의 특정 구현예에서, EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 임의로 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 포함하고;
A-[HArg]-D-(서열번호 24)(본원에서 BCY9594로서 지칭됨); 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
여기서, HArg는 호모아르기닌을 나타낸다.
하나의 대안적인 특정 구현예에서, EphA2-결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 임의로 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 포함하고;
A-[HArg]-D-(서열번호 44)(본원에서 BCY13118로서 지칭됨); 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
여기서, HArg는 호모아르기닌을 나타낸다.
대안적인 구현예에서, 암 세포에 존재하는 성분은 PD-L1이다.
프로그램된 세포 사망 1 리간드 1(PD-L1)은 마우스 염색체 19 및 인간 염색체 9 상의 CD274 유전자에 의해 인코딩되는 290 아미노산 유형 I 막관통 단백질이다. PD-L1의 발현은 만성 감염, 예를 들어, 만성 바이러스 감염(특히, 예를 들어, HIV, HBV, HCV 및 HTLV를 포함함), 만성 박테리아 감염(특히, 예를 들어, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)를 포함함), 및 만성 기생충 감염(예를 들어, 시스토소마 만소니(Schistosoma mansoni)를 포함함)에 관련된 면역 반응의 회피에 관여한다. PD-L1 발현은 T-세포, B-세포, 대식세포, 수지상 세포(dendritic cell), 및 내피 세포, 간 세포, 근육 세포 및 태반을 포함하는 비조혈 세포를 포함한 다수의 조직 및 세포 유형에서 검출된다.
PD-L1 발현은 항종양 면역 활성의 억제에도 관여한다. 종양은 숙주 T 세포에 의해 인식될 수 있는 항원을 발현하지만, 종양의 면역학적 클리어런스는 드물다. 이 실패의 일부는 종양 미세 환경에 의한 면역 억제 때문이다. 많은 종양에서 PD-L1 발현은 이 억제 환경의 구성 요소이며, 다른 면역 억제 신호와 협력하여 작용한다. PD-L1 발현은 유방, 폐, 결장, 난소, 흑색종, 방광, 간, 타액, 위, 신경교종, 갑상선, 흉선 상피, 두부 및 경부와 같은 다양한 고형 종양의 원위치에서 나타났다(참조: Brown JA et al. 2003 Immunol. 170:1257-66; Dong H et al. 2002 Nat. Med. 8:793-800; Hamanishi J, et al. 2007 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-65; Strome SE et al. 2003 Cancer Res. 63:6501-5; Inman BA et al. 2007 Cancer 109:1499-505; Konishi J et al. 2004 Clin. Cancer Res. 10:5094-100; Nakanishi J et al. 2007 Cancer Immunol. Immunother. 56:1173-82; Nomi T et al. 2007 Clin. Cancer Res. 13:2151-57; Thompson RH et al. 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17174-79; Wu C et al. 2006 Acta Histochem. 108:19-24). 또한, PD-L1, 프로그램된 세포 사망 단백질 1(PD-1 및 CD279로도 공지되어 있음)의 수용체 발현은 종양 침윤 림프구에서 상향 조절되며, 이는 또한 종양 면역 억제에도 기여한다(참조: Blank C et al. 2003 Immunol. 171:4574-81). 가장 중요하게도, 종양에서 PD-L1 발현을 질환 결과와 연관시키는 연구는 PD-L1 발현이 신장암, 난소암, 방광암, 유방암, 위암 및 췌장암의 불리한 예후와 강하게 상관관계가 있음을 보여준다(참조: Hamanishi J et al. 2007 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-65; Inman BA et al. 2007 Cancer 109:1499-505; Konishi J et al. 2004 Clin. Cancer Res. 10:5094-100; Nakanishi J et al. 2007 Cancer Immunol. Immunother. 56:1173-82; Nomi T et al. 2007 Clin. Cancer Res. 13:2151-57; Thompson RH et al. 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17174-79; Wu C et al. 2006 Acta Histochem. 108:19-24). 또한, 이러한 연구는 종양에서 높은 수준의 PD-L1 발현이 종양 병기의 진행과 더 깊은 조직 구조로의 침습을 촉진할 수 있음을 시사한다.
PD-1 경로는 혈액학적 악성 종양에서도 역할을 할 수 있다. PD-L1은 다발성 골수종 세포에서 발현되지만 정상 형질 세포에서는 발현되지 않는다(참조: Liu J et al. 2007 Blood 110:296-304). PD-L1은 일부 원발성 T 세포 림프종, 특히 역형성 대세포 T 림프종에서 발현된다(참조: Brown JA et al, 2003 Immunol. 170:1257-66). PD-1은 혈관면역모세포 림프종의 T 세포에서 고도로 발현되고, PD-L1은 관련 여포성 수지상 세포 네트워크에서 발현된다(참조: Dorfman DM et al. 2006 Am. J. Surg. Pathol. 30:802-10). 결절성 림프구 지배적 호지킨 림프종에서, 림프구 또는 조직구(L&H) 세포와 관련된 T 세포는 PD-1을 발현한다. PD-1 결찰에 의해 유발된 유전자의 판독치를 이용한 마이크로어레이 분석은 종양 관련 T 세포가 호지킨 림프종의 원위치에서 PD-1 신호에 반응한다는 것을 시사한다(참조: Chemnitz JM et al. 2007 Blood 110:3226-33). PD-1 및 PD-L1은 HTLV-1-매개 성인 T 세포 백혈병 및 림프종의 CD4 T-세포에서 발현된다(참조: Shimauchi T et al. 2007 Int. J. Cancer 121:2585-90). 이러한 종양 세포는 TCR 신호에 대해 저반응성이다.
동물 모델에서의 연구는 종양의 PD-L1이 종양 세포의 T 세포 활성화 및 용해를 억제하고, 어떤 경우에는 종양 특이적 T-세포 사멸의 증가를 초래한다는 것을 입증한다(참조: Dong H et al. 2002 Nat. Med. 8:793-800; Hirano F et al. 2005 Cancer Res. 65:1089-96). 종양 관련 APC는 또한 PD-1:PD-L1 경로를 이용하여 항종양 T-세포 반응을 제어할 수 있다. 종양 관련 골수성 DC 집단에서의 PD-L1 발현은 종양 환경 요인에 의해 상향 조절된다(참조: Curiel TJ et al. 2003 Nat. Med. 9:562-67). B16 흑색종의 종양 배출 림프절의 형질세포양 수지상 세포(DC)는 조절 T 세포의 억제 활성을 강하게 활성화하는 IDO를 발현한다. IDO 처리된 조절 T 세포의 억제 활성은 IDO 발현 DC와의 세포 접촉을 필요로 했다(참조: Sharma MD et al. 2007 Clin. Invest. 117:2570-82).
한 구현예에서, 제1 펩티드 리간드는 PD-L1 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함한다.
PD-L1 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드의 적합한 예는 WO2020/128526 및 WO2020/128527에 개시되어 있으며, 이들 펩티드는 본원에 참고로 포함된다.
한 구현예에서, PD-L1 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
CiSAGWLTMCiiQKLHLCiii (서열번호 52);
CiSAGWLTMCiiQ[K(PYA)]LHLCiii (서열번호 53);
CiSKGWLTMCiiQ[K(Ac)]LHLCiii (서열번호 54);
CiSAGWLTKCiiQ[K(Ac)]LHLCiii (서열번호 55);
CiSAGWLTMCiiK[K(Ac)]LHLCiii (서열번호 56);
CiSAGWLTMCiiQ[K(Ac)]LKLCiii (서열번호 57);
CiSAGWLTMCiiQ[HArg]LHLCiii (서열번호 58); 및
CiSAGWLTMCii[HArg]QLNLCiii (서열번호 59);
여기서, Ci, Cii 및 Ciii는 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타낸다.
추가의 구현예에서, PD-L1 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 임의로 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 포함하고;
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-SDK-(서열번호 52)(본원에서 BCY10043으로서 지칭됨);
Ac-D-[HArg]-(서열번호 52)-PSH(본원에서 BCY11865로서 지칭됨);
Ac-SDK-(서열번호 53)(본원에서 BCY11013으로서 지칭됨);
Ac-SDK-(서열번호 53)-PSH(본원에서 BCY10861로서 지칭됨);
Ac-D-[HArg]-(서열번호 54)-PSH(본원에서 BCY11866으로서 지칭됨);
Ac-D-[HArg]-(서열번호 55)-PSH(본원에서 BCY11867로서 지칭됨);
Ac-D-[HArg]-(서열번호 56)-PSH(본원에서 BCY11868로서 지칭됨);
Ac-D-[HArg]-(서열번호 57)-PSH(본원에서 BCY11869로서 지칭됨);
Ac-SD-[HArg]-(서열번호 58)-PSHK(본원에서 BCY12479로서 지칭됨); 및
Ac-SD-[HArg]-(서열번호 59)-PSHK(본원에서 BCY12477로서 지칭됨); 또는
이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
여기서, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, B-Ala는 베타-알라닌을 나타내고, Sar10은 10개의 사르코신 단위를 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타낸다.
대안적인 구현예에서, 암 세포 상에 존재하는 성분은 전립선 특이적 막 항원(PSMA)이다.
전립선 특이적 막 항원(PSMA)(글루타메이트 카르복시펩티다제 II(GCPII), N-아세틸-L-아스파르틸-L-글루타메이트 펩티다제 I(NAALADase I) 및 NAAG 펩티다제로도 공지되어 있음)은 인간에서 FOLH1(폴레이트 하이드롤라제 1) 유전자에 의해 인코딩되는 효소이다. 인간 GCPII는 750개의 아미노산을 함유하고, 무게는 약 84kDa이다.
인간 PSMA는 전립선에서 고도로 발현되며, 대부분의 다른 조직에서보다 약 100배 더 크다. 일부 전립선암에서, PSMA는 두 번째로 상향 조절된 유전자 산물이며, 비암성 전립선 세포 수준의 8 내지 12배로 증가한다. 이러한 고발현 때문에, PSMA는 여러 암의 요법 및 영상화를 위한 잠재적인 바이오마커로서 개발되었다. 인간 전립선 암에서, 종양의 발현이 높을수록 진행 시간이 더 빨라지고, 재발로 고통받는 환자의 비율이 높아진다.
한 구현예에서, 제1 펩티드 리간드는 PSMA 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함한다.
PSMA 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드의 적합한 예는 WO2019/243455 및 WO2020/120980에 개시되어 있으며, 이들 펩티드는 본원에 참고로 포함된다.
제2 펩티드 리간드
본원에서 용어 "면역 세포"에 대한 언급은 면역계 내의 임의의 세포를 포함한다. 적합한 예는 백혈구, 예를 들어, 림프구(예: T 림프구 또는 T 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포)를 포함한다. 한 구현예에서, T 세포는 CD8 또는 CD4이다. 추가의 구현예에서, T 세포는 CD8이다. 면역 세포의 다른 예는 수지상 세포, 여포성 수지상 세포 및 과립구를 포함한다.
한 구현예에서, 면역 세포 상에 존재하는 성분은 CD137이다.
CD137은 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 패밀리의 구성원이다. 그의 대안적인 명칭은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9(TNFRSF9), 4-IBB이며, 림프구 활성화(ILA)에 의해 유도된다. CD137은 활성화된 T 세포에 의해 발현되지만 CD4+ T 세포에서보다 CD8+에서 더 큰 정도로 발현된다. 또한, CD137 발현은 수지상 세포, 여포성 수지상 세포, 자연 살해 세포, 과립구 및 염증 부위의 혈관벽 세포에서 발견된다. CD137의 하나의 특성화된 활성은 활성화 T 세포에 대한 그의 공동 자극 활성이다. CD137의 가교결합은 T 세포 증식, IL-2 분비, 생존 및 세포 용해 활성을 향상시킨다. 또한, 그것은 면역 활성을 향상시켜 마우스의 종양을 제거할 수 있다.
CD137은 TCR 활성화에 대해 유도된 T 세포 공동 자극 수용체이다(참조: Nam et al., Curr. Cancer Drug Targets, 5:357-363 (2005); Waits et al., Annu. Rev, Immunol., 23:23-68 (2005)). CD137은 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 발현 이외에, CD4+CD25+ 조절 T 세포, 자연 살해(NK) 및 NK-T 세포, 단핵구, 호중구 및 수지상 세포에서 또한 발현된다. 그의 천연 리간드인 CD137L은 B 세포, 단핵구/대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 항원 제시 세포에 대해 기재되었다(참조: Watts et al. Annu. Rev. Immunol, 23:23-68 (2005)). CD137은 그의 리간드와 상호작용시, TCR-유도 T-세포 증식, 사이토카인 생산, 기능적 성숙의 증가 및 CD8+ T-세포 생존의 연장을 초래한다(참조: Nam et al, Curr. Cancer Drug Targets, 5:357-363 (2005), Watts et d - I., Annu. Rev. Immunol, 23:23-68 (2005)).
CD137L 또는 CD137에 대한 작용제 모노클로날 항체(mAb)에 의한 CD137을 통한 신호전달은 TCR-유도 T 세포 증식, 사이토카인 생산 및 기능적 성숙의 증가, 및 CD8+ T 세포 생존의 연장을 초래한다. 이러한 효과는 (1) NF-κB, c-Jun NH2-말단 키나제/스트레스 활성화 단백질 키나제(JNK/SAPK), 및 p38 미토겐 활성화 단백질 키나제(MAPK) 신호전달 경로의 활성화, 및 (2) 항아폽토시스 및 세포 주기 관련 유전자 발현의 조절로부터 생성된다.
CD137 및 CD137L 결핍 마우스 모두에서 수행된 실험은 완전히 유능한 T 세포 반응의 생성에서 CD137 공자극의 중요성을 추가로 입증했다.
IL-2 및 IL-15 활성화된 NK 세포는 CD137을 발현하고, 작용제 mAb에 의한 CD137의 결찰은 NK 세포 증식 및 IFN-γ 분비를 자극하지만, 세포 용해 활성은 자극하지 않는다.
또한, CD137 자극된 NK 세포는 시험관내에서 활성화된 T 세포의 확장을 촉진한다.
그들의 공자극 기능에 따라, CD137에 대한 작용제 mAb는 심장 및 피부 동종 이식편의 거부를 촉진하고, 확립된 종양을 근절시키고, 원발성 항바이러스 CD8+ T 세포 반응을 넓히고, T 세포 세포 용해능을 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 연구는 CD137 신호전달이 종양과 감염에 대한 면역력을 향상시킬 수 있는 T 세포 기능을 촉진한다는 견해를 뒷받침한다.
한 구현예에서, 2개 이상의 제2 펩티드 리간드는 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함한다.
CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드의 적합한 예는 WO 2019/025811에 개시되어 있으며, 그들 펩티드는 본원에 참고로 포함된다.
한 구현예에서, CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 다음 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
CiIEEGQYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 5);
Ci[tBuAla]PE[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 6);
CiIEEGQYCiiF[D-Ala]DPY[Nle]Ciii (서열번호 7);
Ci[tBuAla]PK[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 8);
Ci[tBuAla]PE[D-Lys]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 9);
Ci[tBuAla]P[K(PYA)][D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 10);
Ci[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 11);
CiIEE[D-Lys(PYA)]QYCiiFADPY(Nle)Ciii (서열번호 12);
[dCi][dI][dE][dE][K(PYA)][dQ][dY][dCii][dF][dA][dD][dP][dY][dNle][dCiii] (서열번호 13);
Ci[tBuAla]PE[dK]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 60);
CiIEE[dK(PYA)]QYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 61);
Ci[tBuAla]EE(dK)PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 62);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 63);
Ci[tBuAla]EE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 64);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFANPY[Nle]Ciii (서열번호 65);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFAEPY[Nle]Ciii (서열번호 66);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFA[Aad]PY[Nle]Ciii (서열번호 67);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFAQPY[Nle]Ciii (서열번호 68);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle][Cysam]iii (서열번호 69);
[MerPro]i[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 70; 본원에서 BCY12353으로서 지칭됨);
[MerPro]i[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle][Cysam]iii (서열번호 71; 본원에서 BCY12354로서 지칭됨);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 72);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 73);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 74; 본원에서 BCY12372로서 지칭됨);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFAD[NMeAla]Y[Nle]Ciii (서열번호 75);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFAD[NMeDAla]Y[Nle]Ciii (서열번호 76);
Ci[tBuAla]P[K(PYA)][dA]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 77);
Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 78);
Ci[tBuAla]PE[dK(Me,PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 79);
Ci[tBuAla]PE[dK(Me,PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 80); 및
[MerPro]i[tBuAla]EE[dK]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 81; 본원에서 BCY13137로서 지칭됨);
여기서, [MerPro]i, Ci, Cii, Ciii 및 [Cysam]iii는 시스테인, MerPro 및 Cysam으로부터 선택된 제1 (i), 제2 (ii) 및 제3 (iii) 반응성 그룹을 나타내고, Nle은 노르류신을 나타내고, tBuAla는 t-부틸-알라닌을 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, Aad는 α-L-아미노아디프산을 나타내고, MerPro는 3-머캅토프로피온산을 나타내고, Cysam은 시스테아민을 나타내고, NMeAla는 N-메틸-알라닌을 나타낸다.
추가의 구현예에서, CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 다음 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
CiIEEGQYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 5);
Ci[tBuAla]PE[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 6);
CiIEEGQYCiiF[D-Ala]DPY[Nle]Ciii (서열번호 7);
Ci[tBuAla]PK[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 8);
Ci[tBuAla]PE[D-Lys]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 9);
Ci[tBuAla]P[K(PYA)][D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 10);
Ci[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 11);
CiIEE[D-Lys(PYA)]QYCiiFADPY(Nle)Ciii (서열번호 12); 및
[dCi][dI][dE][dE][K(PYA)][dQ][dY][dCii][dF][dA][dD][dP][dY][dNle][dCiii] (서열번호 13);
여기서, Ci, Cii 및 Ciii는 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 나타내고, Nle는 노르류신을 나타내고, tBuAla는 t-부틸-알라닌을 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타낸다.
한 구현예에서, 바이사이클릭 펩티드 리간드는 CD137에 결합하지 않는 것으로 입증된 아미노산 서열 [dCi][dI][dE][dE][K(PYA)][dQ][dY][dCii][dF][dA][dD][dP][dY][dNle][dCiii](서열번호 13)이 아니다.
언급될 수 있는 하나의 특정 구현예에서, CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 다음 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
Ci[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii(서열번호 11);
여기서, Ci, Cii 및 Ciii는 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 나타내고, tBuAla는 t-부틸-알라닌을 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, Nle는 노르류신을 나타낸다.
추가의 구현예에서, CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 N-말단 및 C-말단 변형을 포함하고,
Ac-A-(서열번호 5)-Dap(본원에서 BCY7732로서 지칭됨);
Ac-A-(서열번호 5)-Dap(PYA)(본원에서 BCY7741로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 6)-Dap(본원에서 BCY9172로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 6)-Dap(PYA)(본원에서 BCY11014로서 지칭됨);
Ac-A-(서열번호 7)-Dap(본원에서 BCY8045로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 8)-A(본원에서 BCY8919로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 9)-A(본원에서 BCY8920으로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 10)-A(본원에서 BCY8927로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 11)-A(본원에서 BCY8928로서 지칭됨);
(서열번호 11)-A(본원에서 BCY14601로서 지칭됨);
Ac-A-(서열번호 12)-A(본원에서 BCY7744로서 지칭됨);
Ac-[dA]-(서열번호 13)-[dA]-NH2(본원에서 BCY11506으로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 60)-Dap(PYA)(본원에서 BCY11144로서 지칭됨);
Ac-A-(서열번호 61)-K(본원에서 BCY11613으로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 62)-Dap(PYA)(본원에서 BCY12023으로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 63)(본원에서 BCY12149로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 64)(본원에서 BCY12143으로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 65)(본원에서 BCY12147로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 66)(본원에서 BCY12145로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 67)(본원에서 BCY12146으로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 68)(본원에서 BCY12150으로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 69)(본원에서 BCY12352로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 72)-[1,2-디아미노에탄](본원에서 BCY12358로서 지칭됨);
[팔미트산]-[yGlu]-[yGlu]-(서열번호 73)(본원에서 BCY12360으로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 75)(본원에서 BCY12381로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 76)(본원에서 BCY12382로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 77)-K(본원에서 BCY12357로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 78)-[dA](본원에서 BCY13095로서 지칭됨);
[Ac]-(서열번호 78)-K(본원에서 BCY13389로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 79)-[dA](본원에서 BCY13096으로서 지칭됨); 및
Ac-(서열번호: 80)(본원에서 BCY13097로서 지칭됨); 또는
이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
여기서, Ac는 아세틸 그룹을 나타내고, Dap는 디아미노프로피온산을 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 N-말단 및 C-말단 변형을 포함하고,
Ac-A-(서열번호 5)-Dap(본원에서 BCY7732로서 지칭됨);
Ac-A-(서열번호 5)-Dap(PYA)(본원에서 BCY7741로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 6)-Dap(본원에서 BCY9172로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 6)-Dap(PYA)(본원에서 BCY11014로서 지칭됨);
Ac-A-(서열번호 7)-Dap(본원에서 BCY8045로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 8)-A(본원에서 BCY8919로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 9)-A(본원에서 BCY8920으로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 10)-A(본원에서 BCY8927로서 지칭됨);
Ac-(서열번호 11)-A(본원에서 BCY8928로서 지칭됨);
Ac-A-(서열번호 12)-A(본원에서 BCY7744로서 지칭됨); 및
Ac-[dA]-(서열번호 13)-[dA]-NH2(본원에서 BCY11506으로서 지칭됨); 또는
이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
여기서, Ac는 아세틸 그룹을 나타내고, Dap은 디아미노프로피온산을 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타낸다.
한 구현예에서, 바이사이클릭 펩티드 리간드는 CD137에 결합하지 않는 것으로 입증된 BCY11506이 아니다.
언급될 수 있는 추가의 구현예에서, CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 N-말단 및 C-말단 변형을 포함하고,
Ac-(서열번호 11)-A(본원에서 BCY8928로서 지칭됨); 또는
이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
여기서, Ac는 아세틸 그룹을 나타낸다.
대안적인 구현예에서, 면역 세포 상에 존재하는 성분은 OX40이다.
OX40 수용체(종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 구성원 4(TNFRSF4)로서 공지되기도 하고, CD134 수용체로서 공지되기도 함)는 CD28과 달리 휴지 중인 나이브 T 세포에서 구성적으로 발현되지 않는 수용체의 TNFR-슈퍼패밀리의 구성원이다. OX40은 활성화 후 24 내지 72시간 후에 발현된 제2 공자극 면역 체크포인트 분자이며; 그의 리간드인 OX40L은 휴지 중인 항원 제시 세포에서 또한 발현되지 않지만, 그들의 활성화를 따른다. OX40의 발현은 T 세포의 완전한 활성화에 의존하고; CD28 없이 OX40의 발현은 지연되고, 4배 더 낮은 수준이다.
OX40은 처음 3일 동안 CD4+ 세포의 증식 능력에 영향을 주지 않지만, 이 시간 후, 높은 수준의 PKB 활성과 Bcl-2, Bcl-XL 및 서바이빈의 발현을 유지할 수 없기 때문에 증식이 느려지고 세포가 더 빠른 속도로 사멸된다. OX40L은 T 세포의 OX40 수용체에 결합하여 그들이 사멸하는 것을 방지하고 후속적으로 사이토카인 생산을 증가시킨다. OX40은 생존을 향상시키는 능력으로 인해 처음 며칠 이상 기억 반응에 대한 면역 반응을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. OX40은 또한 생체내에서 Th1 및 Th2 매개 반응 모두에서 중요한 역할을 한다.
OX40은 공지되지 않은 메커니즘에 의해 TRAF2, 3 및 5, 및 PI3K에 결합한다. TRAF2는 NF-κB와 기억 세포 생성을 통한 생존에 필요한 반면, 녹아웃이 높은 수준의 사이토카인을 갖고 Th2 매개 염증에 더 민감하기 때문에, TRAF5는 보다 부정적 또는 조절적 역할을 갖는 것으로 보인다. TRAF3는 OX40 매개 신호 전달에서 중요한 역할을 할 수 있다. CTLA-4는 생체내에서 OX40 결합 후 하향 조절되며, OX40 특이적 TRAF3 DN 결함은 생체내에서 CTLA-4 차단에 의해 부분적으로 극복되었다. TRAF3은 OX40 매개 기억 T 세포 확장 및 생존에 연결될 수 있으며, OX40 신호전달을 통해 초기 T 세포 확장을 향상시키기 위한 가능한 제어 요소로서 CTLA-4의 하향 조절을 가리킨다.
한 구현예에서, OX40은 포유류 OX40이다. 추가의 구현예에서, 포유류 OX40은 인간 OX40(hOX40)이다.
OX40 펩티드는 주로 (배타적이지는 않지만) OX40 및 결과적으로 면역 세포를 작용적으로 활성화하는 데 사용하여 고형 종양, 예를 들어, 비소세포 폐 암종(Non-Small Cell Lung Carcinomas; NSCLC), 삼중 음성 유방암(triple negative breast cancer; TNBC)을 포함한 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 방광암(bladder cancer), 요로 상피암(urothelial carcinoma), 결장직장암(colorectal cancer), 두경부암(head and neck cancer), 두경부의 편평 세포 암종(Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck; SCCHN), 흑색종(melanoma), 췌장암(pancreatic cancer) 및 면역억제가 항종양 면역을 차단하는 다른 진행된 고형 종양을 포함하는 초기 또는 말기 인간 악성 종양과 같은 암을 예방, 억제 또는 치료한다. OX40 펩티드가 치료제로서 사용될 다른 고형 및 비고형 악성 종양은 저등급/여포성 비호지킨 림프종(low grade/follicular non-Hodgkin's lymphoma)을 포함하는 B-세포 림프종(B-cell lymphoma) 및 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia; AML)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
한 구현예에서, 2개 이상의 제2 펩티드 리간드는 OX40 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함한다.
OX40 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드의 적합한 예는 국제 특허 출원 제 PCT/GB2020/051144에 개시되어 있으며, 그들 펩티드는 본원에 참고로 포함된다.
한 구현예에서, OX40 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
CiILWCiiLPEPHDECiii (서열번호 82);
CiAK/S N/ECiiDPFWYQFYCiii (서열번호 83);
CiAKNCiiDPFWYQFYCiii (서열번호 84);
CiASECiiDPFWYQFYCiii (서열번호 85);
Ci L/NYSPCiiWHPLND/KCiii (서열번호 86);
CiLYSPCiiWHPLNDCiii (서열번호 87);
CiNYSPCiiWHPLNKCiii (서열번호 88);
CiWYEYDCiiNNWERCiii (서열번호 89);
CiVIRYSPCiiSHYLNCiii (서열번호 90);
CiDYSPWWHPCiiNHICiii (서열번호 91);
CiDACiiLYPDYYVCiii (서열번호 92);
CiRLWCiiIPAPTDDCiii (서열번호 93);
CiTMWCiiIPAKGDWCiii (서열번호 94);
CiMLWCiiLPAPTDECiii (서열번호 95);
CiILWCiiLPEPPDECiii (서열번호 96);
CiLLWCiiIPNPDDNCiii (서열번호 97);
CiWLWCiiVPNPDDTCiii (서열번호 98);
CiVLWCiiTPYPGDDCiii (서열번호 99);
CiALWCiiIPDPQDECiii (서열번호 100);
CiTLWCiiIPDASDSCiii (서열번호 101);
CiQLWCiiIPDADDDCiii (서열번호 102);
CiQLWCiiVPEPGDSCiii (서열번호 103);
CiALWCiiIPEESDDCiii (서열번호 104);
CiVLWCiiIPEPQDKCiii (서열번호 105);
CiTLWCiiIPDPDDSCiii (서열번호 106);
CiRLWCiiVPKAEDYCiii (서열번호 107);
CiTKPCiiIAYYNQSCiii (서열번호 108);
CiMNPCiiIAYYQQECiii (서열번호 109);
CiTNACiiVAYYHQACiii (서열번호 110);
CiSDPCiiISYYNQACiii (서열번호 111);
CiDPPCiiDPFWYAFYCiii (서열번호 112);
CiPDDCiiDPFWYNFYCiii (서열번호 113);
CiRYSPCiiYHPHNCiii (서열번호 114);
CiLYSPCiiNHPLNSCiii (서열번호 115);
CiEDNYCiiFMWTPYCiii (서열번호 116);
CiLDSPCiiWHPLNDCiii (서열번호 117);
CiRFSPCiiSHPLNQCiii (서열번호 118);
CiKYSPCiiWHPLNLCiii (서열번호 119);
CiRYSPCiiWHPLNNCiii (서열번호 120);
CiEWISCiiPGEPHRWWCiii (서열번호 121);
CiVWEACiiPEHPDQWWCiii (서열번호 122);
CiSTWHCiiFWNLQEGKCiii (서열번호 123);
CiEWKACiiEHDRERWWCiii (서열번호 124);
CiRTWQCiiFYEWQNGHCiii (서열번호 125);
CiKTWDCiiFWASQVSECiii (서열번호 126);
CiSTWQCiiFYDLQEGHCiii (서열번호 127);
CiTTWECiiFYDLQEGHCiii (서열번호 128);
CiETWECiiFWRLQAGECiii (서열번호 129);
CiRTWQCiiFWDLQEGLCiii (서열번호 130);
CiSTWQCiiFWDSQLGACiii (서열번호 131);
CiETWECiiFWEWQVGSCiii (서열번호 132);
CiTTWECiiFWDLQEGLCiii (서열번호 133);
CiHTWDCiiFYQWQDGHCiii (서열번호 134);
CiTTWECiiFYSLQDGHCiii (서열번호 135);
CiNEDMYCiiFMWMECiii (서열번호 136);
CiLYEYDCiiYTWRRCiii (서열번호 137);
CiRYEYDCiiHTWQRCiii (서열번호 138);
CiWYEYDCiiTTWERCiii (서열번호 139);
CiWYEYDCiiRTWTRCiii (서열번호 140);
CiLYEYDCiiHTWTRCiii (서열번호 141);
CiWYEYDCiiRTWTFCiii (서열번호 142);
CiHGGVWCiiIPNINDSCiii (서열번호 143);
CiDSPVRCiiYWNTQKGCiii (서열번호 144);
CiGSPVPCiiYWNTRKGCiii (서열번호 145);
CiAPFEFNCiiYTWRPCiii (서열번호 146);
CiRVLYSPCiiYHWLNCiii (서열번호 147);
CiSIMYSPCiiEHPHNHCiii (서열번호 148);
CiDKWEPDHLCiiYWWCiii (서열번호 149);
CiDAWPETHVCiiYWWCiii (서열번호 150);
CiDEYTPEHLCiiYWWCiii (서열번호 151);
CiWINYSISPCiiYVGECiii (서열번호 152); 및
CiRYEYPEHLCiiYTWQCiii (서열번호 153); 예를 들어,
CiLYSPCiiWHPLNDCiii (서열번호 87);
여기서 Ci, Cii 및 Ciii는 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기 또는 변형된 유도체를 나타낸다.
추가의 구현예에서, OX40 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드는 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 추가로 포함하고, 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
A-(서열번호 82)-A-[Sar6]-[KBiot](본원에서 BCY10551로서 지칭됨);
A-(서열번호 82)-A(본원에서 BCY10371로서 지칭됨);
A-(서열번호 84)-A-[Sar6]-[KBiot](본원에서 BCY10552로서 지칭됨);
[Biot]-G-[Sar5]-A-(서열번호 84)-A(본원에서 BCY10479로서 지칭됨);
A-(서열번호 84)-A(본원에서 BCY10378로서 지칭됨);
[Biot]-G-[Sar5]-A-(서열번호 85)-A(본원에서 BCY11371로서 지칭됨);
A-(서열번호 85)-A(본원에서 BCY10743으로서 지칭됨);
[Biot]-G-[Sar5]-A-(서열번호 87)-A(본원에서 BCY10482로서 지칭됨);
A-(서열번호 87)-A-[Sar6]-[KBiot](본원에서 BCY10549로서 지칭됨);
A-(서열번호 87)-A-K(Pya)(본원에서 BCY11607로서 지칭됨);
Ac-A-(서열번호 87)-A-K(Pya)(본원에서 BCY12708로서 지칭됨);
A-(서열번호 87)-A(본원에서 BCY10351로서 지칭됨);
A-(서열번호 88)-A-[Sar6]-[KBiot](본원에서 BCY11501로서 지칭됨);
A-(서열번호 88)-A(본원에서 BCY10729로서 지칭됨);
A-(서열번호 89)-A-[Sar6]-[KBiot](본원에서 BCY10550으로서 지칭됨);
A-(서열번호 89)-A(본원에서 BCY10361로서 지칭됨);
A-(서열번호 90)-A-[Sar6]-[KBiot](본원에서 BCY10794로서 지칭됨);
A-(서열번호 90)-A(본원에서 BCY10349로서 지칭됨);
[Biot]-G-[Sar5]-A-(서열번호 91)-A(본원에서 BCY11369로서 지칭됨);
A-(서열번호 91)-A(본원에서 BCY10331로서 지칭됨);
A-(서열번호 92)-A(본원에서 BCY10375로서 지칭됨);
A-(서열번호 93)-A(본원에서 BCY10364로서 지칭됨);
A-(서열번호 94)-A(본원에서 BCY10365로서 지칭됨);
A-(서열번호 95)-A(본원에서 BCY10366으로서 지칭됨);
A-(서열번호 96)-A(본원에서 BCY10367로서 지칭됨);
A-(서열번호 97)-A(본원에서 BCY10368로서 지칭됨);
A-(서열번호 98)-A(본원에서 BCY10369로서 지칭됨);
A-(서열번호 99)-A(본원에서 BCY10374로서 지칭됨);
A-(서열번호 100)-A(본원에서 BCY10376으로서 지칭됨);
A-(서열번호 101)-A(본원에서 BCY10737로서 지칭됨);
A-(서열번호 102)-A(본원에서 BCY10738로서 지칭됨);
A-(서열번호 103)-A(본원에서 BCY10739로서 지칭됨);
A-(서열번호 104)-A(본원에서 BCY10740으로서 지칭됨);
A-(서열번호 105)-A(본원에서 BCY10741로서 지칭됨);
A-(서열번호 106)-A(본원에서 BCY10742로서 지칭됨);
A-(서열번호 107)-A(본원에서 BCY10380으로서 지칭됨);
A-(서열번호 108)-A(본원에서 BCY10370으로서 지칭됨);
A-(서열번호 109)-A(본원에서 BCY10372로서 지칭됨);
A-(서열번호 110)-A(본원에서 BCY10373으로서 지칭됨);
A-(서열번호 111)-A(본원에서 BCY10379로서 지칭됨);
A-(서열번호 112)-A(본원에서 BCY10377로서 지칭됨);
A-(서열번호 113)-A(본원에서 BCY10744로서 지칭됨);
A-(서열번호 114)-A(본원에서 BCY10343으로서 지칭됨);
A-(서열번호 115)-A(본원에서 BCY10350으로서 지칭됨);
A-(서열번호 116)-A(본원에서 BCY10352로서 지칭됨);
A-(서열번호 117)-A(본원에서 BCY10353으로서 지칭됨);
A-(서열번호 118)-A(본원에서 BCY10354로서 지칭됨);
A-(서열번호 119)-A(본원에서 BCY10730으로서 지칭됨);
A-(서열번호 120)-A(본원에서 BCY10731로서 지칭됨);
A-(서열번호 121)-A(본원에서 BCY10339로서 지칭됨);
A-(서열번호 122)-A(본원에서 BCY10340으로서 지칭됨);
A-(서열번호 123)-A(본원에서 BCY10342로서 지칭됨);
A-(서열번호 124)-A(본원에서 BCY10345로서 지칭됨);
A-(서열번호 125)-A(본원에서 BCY10347로서 지칭됨);
A-(서열번호 126)-A(본원에서 BCY10348로서 지칭됨);
A-(서열번호 127)-A(본원에서 BCY10720으로서 지칭됨);
A-(서열번호 128)-A(본원에서 BCY10721로서 지칭됨);
A-(서열번호 129)-A(본원에서 BCY10722로서 지칭됨);
A-(서열번호 130)-A(본원에서 BCY10723으로서 지칭됨);
A-(서열번호 131)-A(본원에서 BCY10724로서 지칭됨);
A-(서열번호 132)-A(본원에서 BCY10725로서 지칭됨);
A-(서열번호 133)-A(본원에서 BCY10726으로서 지칭됨);
A-(서열번호 134)-A(본원에서 BCY10727로서 지칭됨);
A-(서열번호 135)-A(본원에서 BCY10728로서 지칭됨);
A-(서열번호 136)-A(본원에서 BCY10360으로서 지칭됨);
A-(서열번호 137)-A(본원에서 BCY10363으로서 지칭됨);
A-(서열번호 138)-A(본원에서 BCY10732로서 지칭됨);
A-(서열번호 139)-A(본원에서 BCY10733으로서 지칭됨);
A-(서열번호 140)-A(본원에서 BCY10734로서 지칭됨);
A-(서열번호 141)-A(본원에서 BCY10735로서 지칭됨);
A-(서열번호 142)-A(본원에서 BCY10736으로서 지칭됨);
A-(서열번호 143)-A(본원에서 BCY10336으로서 지칭됨);
A-(서열번호 144)-A(본원에서 BCY10337로서 지칭됨);
A-(서열번호 145)-A(본원에서 BCY10338로서 지칭됨);
A-(서열번호 146)-A(본원에서 BCY10346으로서 지칭됨);
A-(서열번호 147)-A(본원에서 BCY10357로서 지칭됨);
A-(서열번호 148)-A(본원에서 BCY10362로서 지칭됨);
A-(서열번호 149)-A(본원에서 BCY10332로서 지칭됨);
A-(서열번호 150)-A(본원에서 BCY10717로서 지칭됨);
A-(서열번호 151)-A(본원에서 BCY10718로서 지칭됨);
A-(서열번호 152)-A(본원에서 BCY10334로서 지칭됨); 및
A-(서열번호 153)-A(본원에서 BCY10719로서 지칭됨); 예를 들어,
A-(서열번호 87)-A-K(Pya)(본원에서 BCY11607로서 지칭됨);
여기서 Pya는 4-펜티노일 모이어티를 나타낸다.
한 구현예에서, 2개 이상의 제2 펩티드는 동일한 면역 세포에 특이적이다. 추가의 구현예에서, 상기 2개 이상의 제2 펩티드 각각은 동일한 면역 세포 상의 동일한 결합 부위 또는 표적에 특이적이다. 대안적인 구현예에서, 상기 2개 이상의 제2 펩티드 각각은 동일한 면역 세포 상의 상이한 결합 부위 또는 표적에 특이적이다. 대안적인 구현예에서, 2개 이상의 제2 펩티드는 2개의 상이한 면역 세포(즉, CD137 및 OX40)에 특이적이다. 추가의 구현예에서, 상기 2개 이상의 제2 펩티드 각각은 2개의 상이한 면역 세포 상의 동일한 결합 부위 또는 표적에 특이적이다. 대안적인 구현예에서, 상기 2개 이상의 제2 펩티드 각각은 2개의 상이한 면역 세포 상의 상이한 결합 부위 또는 표적에 특이적이다.
한 구현예에서, 상기 2개 이상의 제2 펩티드 각각은 동일한 펩티드 서열을 갖는다.
한 구현예에서, 상기 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 2개의 제2 펩티드 리간드를 포함한다. 따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면,
(a) 암 세포에 존재하는 성분에 결합하고, (b) 면역 세포에 존재하는 성분에 결합하는 2개의 제2 펩티드 리간드에 링커를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공되고,
여기서, 상기 펩티드 리간드 각각은 적어도 2개의 루프 서열에 의해 분리된, 적어도 3개의 반응성 그룹을 포함하는 폴리펩티드, 및 적어도 2개의 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되도록 폴리펩티드의 반응성 그룹과 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함한다.
언급될 수 있는 본 발명의 추가 측면에 따르면,
(a) 암 세포에 존재하는 성분에 결합하고, (b) 면역 세포에 존재하는 성분에 결합하는 2개의 제2 펩티드 리간드에 링커를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공되고,
여기서, 상기 펩티드 리간드 각각은 적어도 2개의 루프 서열에 의해 분리된, 적어도 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 및 적어도 2개의 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되도록 폴리펩티드의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함한다.
대안적인 구현예에서, 상기 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 3개의 제2 펩티드 리간드를 포함한다. 따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면,
(a) 암 세포에 존재하는 성분에 결합하고, (b) 면역 세포에 존재하는 성분에 결합하는 3개의 제2 펩티드 리간드에 링커를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공되고,
여기서, 상기 펩티드 리간드 각각은 적어도 2개의 루프 서열에 의해 분리된, 적어도 3개의 반응성 그룹을 포함하는 폴리펩티드, 및 적어도 2개의 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되도록 폴리펩티드의 반응성 그룹과 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함한다.
언급될 수 있는 본 발명의 추가 측면에 따르면,
(a) 암 세포에 존재하는 성분에 결합하고, (b) 면역 세포에 존재하는 성분에 결합하는 3개의 제2 펩티드 리간드에 링커를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공되고,
여기서, 상기 펩티드 리간드 각각은 적어도 2개의 루프 서열에 의해 분리된, 적어도 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 및 적어도 2개의 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드 상에 형성되도록 폴리펩티드의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함한다.
추가의 구현예에서, 상기 2개 이상의 제2 펩티드 각각은 동일한 펩티드 서열을 가지며, 상기 펩티드 서열은 Ac-(서열번호 11)-A(본원에서 BCY8928로서 지칭됨)또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고, 여기서 Ac는 아세틸 그룹을 나타낸다.
또 추가의 구현예에서, 상기 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 2개의 제2 펩티드 리간드를 포함하고, 상기 2개의 제2 펩티드는 모두 Ac-(서열번호 11)-A(본 본원에서 BCY8928로서 지칭됨) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 동일한 펩티드 서열을 갖고, 여기서 Ac는 아세틸 그룹을 나타낸다.
링커
제1 펩티드 리간드는 임의의 적합한 링커를 통해 2개 이상의 제2 펩티드 리간드에 접합될 수 있음이 이해될 것이다. 전형적으로, 상기 링커의 설계는 3개의 바이사이클릭 펩티드가 단독으로 또는 두 표적 수용체에 동시에 결합하는 동안 그들 각각의 표적에 방해받지 않도록 결합할 수 있는 방식으로 제공되도록 한다. 추가로, 링커는 목적하는 기능적 결과를 초래하는 표적 세포 사이의 적절한 거리를 유지하면서 두 표적에 대한 결합을 동시에 허용해야 한다. 링커의 특성은 길이, 강성, 또는 용해도를 증가시키도록 조절하여 목적하는 기능적 결과를 최적화할 수 있다. 링커는 동일한 표적에 하나 이상의 바이사이클의 부착을 허용하도록 설계될 수도 있다. 어느 하나의 결합 펩티드의 원자가를 증가시키는 것은 표적 세포에 대한 헤테로탠덤의 친화도를 증가시키는 역할을 할 수 있거나, 또는 표적 수용체 중 하나 또는 둘 모두의 올리고머화를 유도하는데 도움이 될 수 있다.
한 구현예에서, 링커는 하나의 말단에 하나의 제1 펩티드를, 다른 말단에 2개 이상의 제2 펩티드를 허용하는 분지형 링커이다.
추가의 구현예에서, 분지형 링커는 하기로부터 선택된다:
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
특별한 구현예에서, 분지형 링커는 다음과 같다:
Figure pct00009
헤테로탠덤 복합체
하나의 특정 구현예에서, 제1 펩티드 리간드는 TATA 스캐폴드에 부착된 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 2개 이상의 제2 펩티드 리간드는 TATA 스캐폴드에 부착된 2개의 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 상기 헤테로탠덤 복합체는 표 A에 열거된 복합체로부터 선택된다:
[표 A]
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
한 구현예에서, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 BCY11027, BCY11863 및 BCY11864로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 BCY11863 및 BCY11864로부터 선택된다.
헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY11863은 N-(산-PEG3)-N-비스(PEG3-아지드) 링커를 통해 2개의 CD137 특이적 펩티드(둘 다 BCY8928이다)에 연결된 넥틴-4 특이적 펩티드 BCY8116로 구성되고, 다음과 같이 그림으로 표시된다:
Figure pct00013
CD137은 동종삼량체 단백질이며, 천연 리간드 CD137L은 면역 세포에서 발현되거나 분비되는 동종삼량체로서 존재한다. CD137의 생물학은 면역 세포에서 CD137 활성을 유도하기 위해 다량체화에 크게 의존한다. CD137의 다량체화를 생성하는 한 가지 방법은 다른 세포에 존재하는 특정 수용체와의 상호작용을 통한 CD137 특이적 작용제의 세포 가교결합을 통해서이다. 본 발명의 헤테로탠덤 복합체의 이점은 CD137과 같은 면역 세포 성분에 특이적인 2종 이상의 펩티드 리간드의 존재가 CD137의 보다 효과적인 클러스터링을 제공한다는 것이다. 예를 들어, 데이터는 BCY11863이 CD137 리포터 검정에서 강력한 CD137 활성화를 입증했음을 보여주는 본원의 도 1 및 표 1에 제시된다. 또한, 데이터는 BCY11863이 PBMC-4T1 공배양 검정에서 강력한 IL-2 및 IFN-γ 사이토카인 분비를 유도함을 보여주는 본원의 도 2 및 표 5에 제시된다. 또한, 데이터는 BCY11863이 SD 래트에서 4.1시간 및 시노에서 5.3시간의 최종 반감기와 함께 우수한 PK 프로파일을 입증했음을 보여주는 본원의 도 3 및 표 7에 제시된다.
헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY11027은 TCA-[Peg10]3 링커를 통해 2개의 CD137 특이적 펩티드(이들 둘 다는 BCY8928이다)에 연결된 넥틴-4 특이적 펩티드 BCY11015로 구성되며, 다음과 같이 그림으로 표시된다:
Figure pct00014
도 13에 제시된 데이터는 넥틴-4/CD137 헤테로탠덤 BCY11027이 원발성 환자 유래 폐 종양의 생체외 배양에서 표적 의존성 사이토카인 방출을 유도함을 입증한다. BCY11027에 의한 치료는 넥틴-4 발현 수준과 상관되는 환자 유래 샘플에서 여러 면역 마커(비히클로 정규화됨) 및 %CD8+ki67+ T 세포에서 넥틴-4 의존적 변화를 유도했다.
대안적인 특정 구현예에서, 제1 펩티드 리간드는 TATA 스캐폴드에 부착된 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 2개 이상의 제2 펩티드 리간드는 TATA 스캐폴드에 부착된 3개의 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 상기 헤테로탠덤 복합체는 표 B에 나열된 복합체로부터 선택된다:
[표 B]
Figure pct00015
하나의 특정 구현예에서, 제1 펩티드 리간드는 TATA 스캐폴드에 부착된 EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 2개 이상의 제2 펩티드 리간드는 TATA 스캐폴드에 부착된 2개의 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 상기 헤테로탠덤 복합체는 표 C에 나열된 복합체로부터 선택된다:
[표 C]
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
하나의 구현예에서, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 BCY12491, BCY12730, BCY13048, BCY13050, BCY13053 및 BCY13272로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 BCY12491, BCY12730, BCY13048, BCY13050 및 BCY13053으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 BCY12491이다.
헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY12491은 N-(산-PEG3)-N-비스(PEG3-아지드) 링커를 통해 2개의 CD137 특이적 펩티드(이들 둘 다는 BCY8928이다)에 연결된 EphA2 특이적 펩티드 BCY9594로 구성되며, 다음과 같이 그림으로 표시된다:
Figure pct00026
데이터는 BCY12491이 종양 침윤성 면역 세포 및 면역 반응의 유의한 항종양 반응 및 조절(증가)을 초래함을 입증하는 본원의 도 9 및 도 15에 제시된다.
대안적인 구현예에서, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 BCY13272이다.
헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY13272는 N-(산-PEG3)-N-비스(PEG3-아지드) 링커를 통해 2개의 CD137 특이적 펩티드(이들 둘 다는 BCY8928이다)에 연결된 EphA2 특이적 펩티드 BCY13118로 구성되고, 다음과 같이 그림으로 표시된다:
Figure pct00027
데이터는 BCY13272가 마우스의 MC38 종양 모델에서 유의한 항종양 효과를 초래함을 입증하는 본원의 도 18에 제시된다.
하나의 특정 구현예에서, 제1 펩티드 리간드는 TATA 스캐폴드에 부착된 PD-L1 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 2개 이상의 제2 펩티드 리간드는 TATA 스캐폴드에 부착된 2개의 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 상기 헤테로탠덤 복합체는 표 D에 열거된 복합체로부터 선택된다:
[표 D]
Figure pct00028
하나의 특정 구현예에서, 제1 펩티드 리간드는 TATA 스캐폴드에 부착된 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 2개 이상의 제2 펩티드 리간드는 TATA 스캐폴드에 부착된 2개의 OX40 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 상기 헤테로탠덤 복합체는 표 E에 열거된 복합체이다:
[표 E]
Figure pct00029
하나의 특정 구현예에서, 제1 펩티드 리간드는 TATA 스캐폴드에 부착된 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 2개 이상의 제2 펩티드 리간드 중 하나는 TATA 스캐폴드에 부착된 OX40 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 2개 이상의 제2 펩티드 리간드의 나머지는 TATA 스캐폴드에 부착된 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하고, 상기 헤테로탠덤 복합체는 표 F에 나열된 복합체이다:
[표 F]
Figure pct00030
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 펩티드 화학, 세포 배양 및 파지 디스플레이, 핵산 화확 및 생화학 분야에서와 같은 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 표준 기술은 본원에 참고로 포함되는 분자 생물학, 유전적 및 생화학적 방법에 사용된다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc.).
명명법
넘버링
본 발명의 화합물 내의 아미노산 잔기 위치를 언급하는 경우, 시스테인 잔기(Ci, Cii 및 Ciii)는 불변이기 때문에 넘버링으로부터 생략되며, 따라서 서열번호 1내의 아미노산 잔기의 넘버링은 하기와 같이 참조된다:
Ci-P1-1Nal2-dD3-Cii-M4-HArg5-D6-W7-S8-T9-P10-HyP11-W12-Ciii(서열번호 1).
이 설명의 목적을 위해, 모든 바이사이클릭 펩티드는 TBMB(1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠) 또는 1,1',1"-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온(TATA)으로 사이클릭화되어 삼치환된 구조를 생성하는 것으로 가정된다. TBMB 및 TATA에 의한 사이클릭화는 Ci, Cii 및 Ciii 상에서 발생한다.
분자 형식
바이사이클 코어 서열로의 N-말단 또는 C-말단 확장은 하이픈으로 분리된 서열의 왼쪽 또는 오른쪽에 추가된다. 예를 들어, N-말단 βAla-Sar10-Ala 꼬리는 다음과 같이 표시된다:
βAla-Sar10-A-(서열번호 X).
역전된 펩티드 서열
문헌(참조: Nair et al (2003) J Immunol 170(3), 1362-1373)의 개시내용에 비추어, 본원에 개시된 펩티드 서열은 또한 그들의 레트로-역함수 형태에서 유용성을 발견할 것으로 예상된다. 예를 들어, 서열은 역전되고(즉, N-말단이 C-말단이 되고, 그 반대도 마찬가지이다), 입체화학도 마찬가지로 또한 역전된다(즉, D-아미노산이 L-아미노산이 되고, 그 반대도 마찬가지이다). 의심의 여지를 피하기 위해, 그들의 전체 명칭으로 또는 그들의 아미노산 단일 또는 3문자 코드로서 아미노산에 대한 참조는 달리 명시되지 않는 한 본원에서 L-아미노산으로 표현되는 것으로 의도된다. 이러한 아미노산이 D-아미노산으로 표현되도록 의도된 경우, 아미노산은 사각 괄호 안의 소문자 d로, 예를 들어, [dA], [dD], [dE], [dK], [d1Nal], [dNle] 등으로 서문을 달 것이다.
펩티드 리간드의 장점
본 발명의 특정 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 주사, 흡입, 비강, 눈, 경구 또는 국소 투여에 적합한 약물-유사 분자로 간주될 수 있게 하는 많은 유리한 특성을 갖는다. 이러한 유리한 특성은 다음을 포함한다:
- 종 교차 반응성. 이것은 전임상 약력학적 및 약동학적 평가의 전형적인 요건이다.
- 프로테아제 안정성. 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 이상적으로 혈장 프로테아제, 상피("막-고정") 프로테아제, 위 및 장 프로테아제, 폐 표면 프로테아제, 세포내 프로테아제 등에 대한 안정성을 입증해야 한다. 프로테아제 안정성은 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 리드 후보가 동물 모델에서 개발될 수 있을 뿐만 아니라 인간에게 자신있게 투여될 수 있도록 상이한 종 사이에 유지되어야 한다.
- 바람직한 용해도 프로파일. 이는 하전된 및 친수성 대 소수성 잔기 및 분자내/분자간 H-결합의 비율의 함수이고, 이는 제형화 및 흡수 목적으로 중요하다.
- 선택성. 본 발명의 특정 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 다른 표적에 대해 양호한 선택성을 입증한다.
- 순환 중 최적 혈장 반감기. 임상적 조짐 및 치료 섭생에 따라 급성 질병 관리 환경에서 단기 노출을 위한 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 개발하거나 순환 중 체류가 증강된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 개발하는 것이 필요할 수 있고, 따라서 보다 만성 질환 상태의 관리에 최적이다. 바람직한 혈장 반감기를 구동하는 다른 요인은 최대 치료 효율에 대한 지속적인 노출 대 제제의 지속적인 노출로 인한 동반되는 독성학의 요건이다.
중요하게는, 선택된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 화합물의 시험관내 EC50 초과의 혈장 농도를 유지하지 않는 빈도로 투여될 때 항종양 효과를 입증하는 데이터가 본원에 제시된다. 이는 CD137 효능 작용 또는 이중특이적 CD137 효능 작용에 대한 더 큰 재조합 생물학적(즉, 항체 기반) 접근법과는 대조적이다(참조: Segal et al., Clin Cancer Res., 23(8):1929-1936 (2017), Claus et al., Sci Trans Med., 11(496): eaav5989, 1-12 (2019), Hinner et al., Clin Cancer Res., 25(19):5878-5889 (2019)). 이론에 얽매이지 않고, 이 관찰의 이유는 헤테로탠덤 바이사이클릭 복합체가 비교적 낮은 분자량(전형적으로 <15kDa)을 갖고, 완전히 합성적이고 CD137의 종양 표적화 작용제라는 사실에 기인한다고 여겨진다. 이와 같이, 그들은 혈장 반감기는 상대적으로 짧지만 종양 침투와 유지는 양호하다. 이러한 장점을 완전히 뒷받침하는 데이터가 본원에 제시된다. 예를 들어, 인간화 CD137을 갖는 마우스의 동계 설치류 모델에서의 항종양 효능은 매일 또는 3일 마다 입증된다. 또한, 복강내 약동학적 데이터는 혈장 반감기가 3시간 미만임을 보여주며, 이는 복합체의 순환 농도가 투여간에 지속적으로 시험관내 EC50 미만으로 떨어질 것으로 예측될 것이다. 또한, 종양 약동학적 데이터는 종양 조직에서 헤테로탠덤 바이사이클 복합체의 수준이 혈장 수준과 비교하여 더 높고 더 지속될 수 있음을 보여준다.
이러한 관찰은 본 발명의 중요한 추가 측면을 형성하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면에 따르면, 본원에 정의된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 상기 복합체의 시험관내 EC50 초과의 상기 복합체의 혈장 농도를 유지하지 않는 투여 빈도로 투여함을 포함하는, 암 치료 방법이 제공된다.
- 면역 기억. 암 세포 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 면역 세포 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드와 결합시키면 면역 기억의 상승적 이점을 제공한다. 본 발명의 선택된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 종양을 근절할 뿐만 아니라 종양 형성제의 재투여시 접종된 완전 반응자 마우스 중 어느 것도 종양을 발병하지 않았음을 입증하는 데이터가 본원에 제시된다(도 5 참조). 이는 본 발명의 선택된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체에 의한 치료가 완전한 반응자 마우스에서 면역원성 기억을 유도하였음을 나타낸다. 이는 종양이 최초로 제어되고 근절되면 상기 종양의 재발을 방지하기 위해 중요한 임상적 이점을 갖는다.
펩티드 리간드
본원에 언급된 펩티드 리간드는 분자 스캐폴드에 공유 결합된 펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 펩티드는 스캐폴드에 공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 반응성 그룹(즉, 시스테인 잔기), 및 루프 서열로서 지칭되는 상기 반응성 그룹 사이에 대향하는 서열을 포함하는 데, 이는 펩티드가 스캐폴드에 결합될 때 루프를 형성하기 때문이다. 본 사례의 경우, 펩티드는 시스테인, 3-머캅토프로피온산 및/또는 시스테아민으로부터 선택되는 적어도 3개의 반응성 그룹을 포함하고, 스캐폴드 상에 적어도 2개의 루프를 형성한다.
반응성 그룹
본 발명의 분자 스캐폴드는 폴리펩티드 상의 작용성 또는 반응성 그룹을 통해 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 이들은 전형적으로 폴리펩티드 중합체에서 발견되는 특정 아미노산의 측쇄로부터 형성된다. 이러한 반응성 그룹은 시스테인 측쇄, 리신 측쇄, 또는 N-말단 아민 그룹, 또는 임의의 다른 적합한 반응성 그룹, 예를 들어, 페니실라민일 수 있다. 적합한 반응성 그룹의 상세는 WO2009/098450에서 발견될 수 있다.
천연 아미노산의 반응성 그룹의 예는 시스테인의 티올 그룹, 리신의 아미노 그룹, 아스파르테이트 또는 글루타메이트의 카르복실 그룹, 아르기닌의 구아니디늄 그룹, 티로신의 페놀 그룹 또는 세린의 하이드록실 그룹이다. 비천연 아미노산은 아지드, 케토-카르보닐, 알킨, 비닐 또는 아릴 할라이드 그룹을 포함하는 광범위한 범위의 반응성 그룹을 제공할 수 있다. 폴리펩티드의 말단의 아미노 및 카르복실 그룹은 또한 분자 스캐폴드/분자 코어에 공유 결합을 형성하기 위한 반응성 그룹으로서 기능할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 적어도 3개의 반응성 그룹을 함유한다. 상기 폴리펩티드는 또한 4개 이상의 반응성 그룹을 함유할 수 있다. 더 많은 반응성 그룹이 사용될수록 분자 스캐폴드 내에 더 많은 루프가 형성될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 3개의 반응성 그룹을 갖는 폴리펩티드가 생성된다. 상기 폴리펩티드와 3중 회전 대칭을 갖는 분자 스캐폴드/분자 코어의 반응은 단일 생성물 이성체를 생성한다. 단일 생성물 이성체의 생성은 여러 가지 이유로 유리하다. 화합물 라이브러리의 핵산은 폴리펩티드의 1차 서열만을 인코딩하고, 폴리펩티드와 분자 코어의 반응시 형성된 분자의 이성체 상태는 인코딩하지 않는다. 하나의 생성물 이성체만이 형성될 수 있는 경우, 생성물 이성체에 대한 핵산의 할당이 명확하게 정의된다. 다수의 생성물 이성체가 형성되는 경우, 핵산은 스크리닝 또는 선택 과정에서 단리된 생성물 이성체의 성질에 대한 정보를 제공할 수 없다. 본 발명의 라이브러리의 특정 구성원이 합성되는 경우, 단일 생성물 이성체의 형성 또한 유리하다. 이 경우, 폴리펩티드와 분자 스캐폴드의 화학 반응은 이성체의 혼합물보다는 단일 생성물 이성체를 생성한다.
또 다른 구현예에서, 4개의 반응성 그룹을 갖는 폴리펩티드가 생성된다. 상기 폴리펩티드와 정사면체 대칭성을 갖는 분자 스캐폴드/분자 코어의 반응은 2개의 생성물 이성체를 생성한다. 2개의 상이한 생성물 이성체가 하나의 동일한 핵산에 의해 인코딩되더라도, 단리된 이성체의 이성체의 성질은 두 이성체를 화학적으로 합성하고, 2개의 이성체를 분리하고 표적 리간드에 대한 결합에 대해 두 이성체를 시험함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 폴리펩티드의 반응성 그룹 중 적어도 하나는 나머지 반응성 그룹에 직교한다. 직교 반응성 그룹의 사용은 상기 직교 반응성 그룹을 분자 코어의 특정 부위로 향하게 한다. 직교 반응성 그룹을 포함하는 연결 전략을 사용하여 형성된 생성물 이성체의 수를 제한할 수 있다. 즉, 적어도 3개의 결합 중 하나 이상에 대해 적어도 3개의 결합의 나머지에 대해 선택된 것에 대해 별개의 또는 상이한 반응성 그룹을 선택함으로써, 분자 스캐폴드 상의 특정 위치에 폴리펩티드의 특정 반응성 그룹을 결합하거나 지시하는 특정 순서가 유용하게 달성될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드의 반응성 그룹은 분자 링커와 반응하고, 여기서 상기 링커는 링커가 최종 결합 상태에서 분자 스캐폴드와 폴리펩티드 사이에 개입하도록 분자 스캐폴드와 반응할 수 있다.
일부 구현예에서, 라이브러리 또는 폴리펩티드 세트의 구성원의 아미노산은 임의의 천연 또는 비천연 아미노산으로 대체될 수 있다. 루프 서열만이 교환가능하도록 분자 코어에 폴리펩티드를 가교결합시키기 위한 작용성 그룹을 보유하는 것은 이러한 교환 가능한 아미노산으로부터 제외된다. 교환 가능한 폴리펩티드 서열은 랜덤 서열, 불변 서열, 또는 무작위 및 불변 아미노산을 갖는 서열 중 어느 하나를 갖는다. 반응성 그룹을 갖는 아미노산은 이들 아미노산의 위치가 루프 크기를 결정하기 때문에 폴리펩티드 내의 정의된 위치에 위치한다.
한 구현예에서, 3개의 반응성 그룹을 갖는 폴리펩티드는 서열 (X)lY(X)mY(X)nY(X)o를 가지며, 여기서 Y는 반응성 그룹을 갖는 아미노산을 나타내고, X는 랜덤 아미노산을 나타내고, m 및 n은 동일하거나 상이할 수 있는 개재성 폴리펩티드 세그먼트의 길이를 정의하는 3 내지 6의 숫자이며, l 및 o는 인접한 폴리펩티드 세그먼트의 길이를 정의하는 0 내지 20의 숫자이다.
티올 매개 접합에 대한 대안이 공유 상호작용을 통해 분자 스캐폴드을 펩티드에 부착시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 이러한 기술은 본 발명에 따라 선택되거나 단리된 후에 폴리펩티드로의 추가 모이어티(예: 분자 스캐폴드와는 다른 관심 소분자)의 변형 또는 부착에 사용될 수 있고 - 이어서, 이 구현예에서, 명백히 부착은 공유일 필요는 없으며, 비공유 부착을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 상보적인 반응성 그룹을 보유하는 소분자와 조합하여 필요한 화학적 반응성 그룹을 갖는 비천연 아미노산을 보유하는 단백질 및 펩티드를 표시하는 파지를 생성하거나, 분자가 선택/단리 단계 후에 제조되는 경우 비천연 아미노산을 화학적으로 또는 재조합적으로 합성된 폴리펩티드에 혼입함으로써 티올 매개 방법 대신 (또는 조합하여) 사용될 수 있다. 추가의 상세는 문헌(참조: WO2009/098450 또는 Heinis et al., Nat Chem Biol 2009, 5 (7), 502-7)에서 찾을 수 있다.
한 구현예에서, 반응성 그룹은 시스테인, 3-머캅토프로피온산 및/또는 시스테아민 잔기로부터 선택된다.
약제학적으로 허용되는 염
염 형태는 본 발명의 범위 내에 있으며, 펩티드 리간드에 대한 언급은 상기 리간드의 염 형태를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 염은 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모체 화합물로부터 통상적인 화학적 방법, 예를 들어, 문헌(참조: Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002)에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 중 또는 유기 용매 중 또는 둘의 혼합물 중의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
산 부가염(일염 또는 이염)은 무기 및 유기 둘 다의 다양한 산으로 형성될 수 있다. 산 부가염의 예로는 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산(예: L-아스코르브산), L-아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 부탄산, (+) 캄포르산, 캄포-설폰산, (+)-(1S)-캄포-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-디설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, 글루코헵톤산, D-글루콘산, 글루쿠론산(예: D-글루쿠론산), 글루탐산(예: L-글루탐산), α-옥소글루타르산, 글리콜산, 히푸르산, 할로겐화수소산(예: 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산), 이세티온산, 락트산(예: (+)-L-락트산, (±)-DL-락트산), 락토비온산, 말레산, 말산, (-)-L-말산, 말론산, (±)-DL-만델산, 메탄설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, 프로피온산, 피루브산, L-피로글루탐산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세박산, 스테아르산, 석신산, 황산, 타닌산, (+)-L-타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 운데실렌산 및 발레르산뿐만 아니라 아실화 아미노산 및 양이온 교환 수지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산으로 형성된 일염 또는 이염을 포함한다.
염의 하나의 특정 그룹은 아세트산, 염산, 요오드화수소산, 인산, 질산, 황산, 시트르산, 락트산, 석신산, 말레산, 말산, 이세티온산, 푸마르산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산, 황산, 메탄설폰산(메실레이트), 에탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 발레산, 프로판산, 부탄산, 말론산, 글루쿠론산 및 락토비온산으로부터 형성된 염으로 구성된다. 하나의 특정 염은 염산염이다. 또 다른 특정 염은 아세테이트 염이다.
화합물이 음이온성이거나 음이온성일 수 있는 작용성 그룹을 갖는 경우(예를 들어, -COOH는 -COO-일 수 있다), 염은 유기 또는 무기 염기로 형성되어 적합한 양이온을 생성할 수 있다. 적합한 무기 양이온의 예는 Li+, Na+ 및 K+와 같은 알칼리 금속 이온, Ca2 + 및 Mg2 +와 같은 알칼리 토금속 양이온, 및 Al3 + 또는 Zn+와 같은 다른 양이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 유기 양이온의 예는 암모늄 이온(즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온(예: NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 적합한 치환된 암모늄 이온의 예는 메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 프로필아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민 및 트로메타민뿐만 아니라 아미노산, 예를 들어, 리신 및 아르기닌으로부터 유래된 것들이다. 일반적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 +이다.
본 발명의 화합물이 아민 작용기를 함유하는 경우, 이들은, 예를 들어, 당업자에게 익히 공지된 방법에 따른 알킬화제와의 반응에 의해 4급 암모늄 염을 형성할 수 있다. 이러한 4급 암모늄 화합물은 본 발명의 범위 내에 있다.
변형된 유도체
본원에 정의된 펩티드 리간드의 변형된 유도체는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해될 것이다. 이러한 적합한 변형된 유도체의 예는 하기에서 선택되는 하나 이상의 변형을 포함한다: N-말단 및/또는 C-말단 변형; 하나 이상의 아미노산 잔기의 하나 이상의 비천연 아미노산 잔기로의 치환(하나 이상의 극성 아미노산 잔기의 하나 이상의 등배전자 또는 등전자 아미노산에 의한 치환; 하나 이상의 비극성 아미노산 잔기의 다른 비천연 등배전자 또는 등전자 아미노산에 의한 치환); 스페이서 그룹의 첨가; 하나 이상의 산화 민감성 아미노산 잔기의 하나 이상의 산화 내성 아미노산 잔기에 의한 치환; 하나 이상의 아미노산 잔기의 알라닌에 의한 치환, 하나 이상의 L-아미노산 잔기의 하나 이상의 D-아미노산 잔기에 의한 치환; 바이사이클릭 펩티드 리간드 내의 하나 이상의 아미드 결합의 N-알킬화; 하나 이상의 펩티드 결합의 대리 결합에 의한 치환; 펩티드 백본 길이 변형; 하나 이상의 아미노산 잔기의 알파 탄소 상의 수소의 다른 화학적 그룹에 의한 치환, 상기 아미노산을 작용화하기 위해 적합한 아민, 티올, 카르복실산 및 페놀 반응성 시약에 의한 아미노산, 예를 들어, 시스테인, 리신, 글루타메이트/아스파르테이트 및 티로신의 변형, 및 작용화에 적합한 직교 반응성을 도입하는 아미노산, 예를 들어, 각각 알킨 또는 아지드 보유 모이어티에 의한 작용화를 허용하는 아지드 또는 알킨 그룹 보유 아미노산의 도입 또는 치환.
한 구현예에서, 변형된 유도체는 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 포함한다. 추가의 구현예에서, 변형된 유도체는 적합한 아미노 반응성 화학을 사용하는 N-말단 변형 및/또는 적합한 카르복시 반응성 화학을 사용하는 C-말단 변형을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 N-말단 또는 C-말단 변형은 세포독성제, 방사성 킬레이트제 또는 발색단을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이펙터 그룹의 첨가를 포함한다.
추가의 구현예에서, 변형된 유도체는 N-말단 변형을 포함한다. 추가의 구현예에서, N-말단 변형은 N-말단 아세틸 그룹을 포함한다. 이 구현예에서, N-말단 시스테인 그룹(본원에서 Ci로 지칭되는 그룹)은 펩티드 합성 동안 아세트산 무수물 또는 다른 적합한 시약으로 캡핑하여 N-말단 아세틸화되는 분자를 초래한다. 이 구현예는 아미노펩티다제의 가능한 인식 지점을 제거하는 이점을 제공하며, 바이사이클릭 펩티드의 분해 가능성을 회피한다.
대안적인 구현예에서, N-말단 변형은 이펙터 그룹의 접합 및 바이사이클릭 펩티드의 이의 표적에 대한 효능의 유지를 용이하게 하는 분자 스페이서 그룹의 부가를 포함한다.
추가의 구현예에서, 변형된 유도체는 C-말단 변형을 포함한다. 추가의 구현예에서, C-말단 변형은 아미드 그룹을 포함한다. 이 구현예에서, C-말단 시스테인 그룹(본원에서 Ciii로서 지칭되는 그룹)은 펩티드 합성 동안 아미드로서 합성되어 C-말단 아미드화되는 분자를 초래한다. 이 구현예는 카르복시펩티다제의 가능한 인식 지점을 제거하는 이점을 제공하고, 바이사이클릭 펩티드의 단백질 분해 가능성을 감소시킨다.
한 구현예에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 아미노산 잔기의 하나 이상의 비천연 아미노산 잔기에 의한 치환을 포함한다. 이 구현예에서, 분해성 프로테아제에 의해 인식되지도 않고 표적 효능에 임의의 악영향을 미치지 않는 등배전자/등전자 측쇄를 갖는 비천연 아미노산이 선택될 수 있다.
대안적으로, 인접한 펩티드 결합의 단백질분해 가수분해가 구조적 및 입체적으로 방해되도록 강제된 아미노산 측쇄를 갖는 비천연 아미노산이 사용될 수 있다. 특히, 이들은 프롤린 유사체, 벌키한 측쇄, Cα-이치환된 유도체(예: 아미노이소부티르산, Aib), 및 사이클로 아미노산에 관한 것이며, 단순한 유도체는 아미노-사이클로프로필카르복실산이다.
한 구현예에서, 변형된 유도체는 스페이서 그룹의 부가를 포함한다. 추가의 구현예에서, 변형된 유도체는 N-말단 시스테인(Ci) 및/또는 C-말단 시스테인(Ciii)에 스페이서 그룹의 부가를 포함한다.
한 구현예에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 산화 민감성 아미노산 잔기의 하나 이상의 산화 내성 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 추가의 구현예에서, 변형된 유도체는 트립토판 잔기의 나프틸알라닌 또는 알라닌 잔기로의 치환을 포함한다. 이 구현예는 생성된 바이사이클릭 펩티드 리간드의 약제학적 안정성 프로파일을 개선시키는 이점을 제공한다.
한 구현예에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기의 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 대안적인 구현예에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기의 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 하전된 아미노산 잔기 대 소수성 아미노산 잔기의 정확한 균형은 바이사이클릭 펩티드 리간드의 중요한 특징이다. 예를 들어, 소수성 아미노산 잔기는 혈장 단백질 결합의 정도에 영향을 미치고, 따라서 혈장 중의 유리 이용 가능한 분획의 농도에 영향을 미치는 반면, 하전된 아미노산 잔기(특히 아르기닌)는 펩티드 및 세포 표면 상의 인지질 막과의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 조합된 둘은 반감기, 분포 용적 및 펩티드 약물의 노출에 영향을 미칠 수 있으며, 임상 종점에 따라 조정될 수 있다. 또한, 하전된 아미노산 잔기 대 소수성 아미노산 잔기의 정확한 조합 및 수는 주사 부위에서의 자극을 감소시킬 수 있다(펩티드 약물이 피하 투여된 경우).
한 구현예에서, 변형된 유도체는 하나 이상의 L-아미노산 잔기의 하나 이상의 D-아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 이 구현예는 입체 장애 및 D-아미노산이 β-회전 형태를 안정화시키는 경향에 의해 단백질 분해 안정성을 증가시키는 것으로 여겨진다(참조: Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418).
한 구현예에서, 변형된 유도체는 임의의 아미노산 잔기의 제거 및 알라닌으로의 치환을 포함한다. 이 구현예는 가능한 단백질 분해 공격 부위(들)를 제거하는 이점을 제공한다.
상기 언급된 변형 각각은 의도적으로 펩티드의 효능 또는 안정성을 개선시키는 역할을 한다는 것을 주시해야 한다. 변형에 기초한 추가의 효능의 개선은 다음 메커니즘을 통해 달성될 수 있다:
- 소수성 효과를 이용하고 더 높은 친화성이 달성되도록 더 낮은 오프율을 초래하는 소수성 모이어티의 통합;
- 장거리 이온 상호작용을 이용하여 보다 빠른 온 비율 및 더 높은 친화성을 초래하는 하전된 그룹의 통합(참조: 예를 들어, Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31); 및
- 예를 들어, 엔트로피의 손실이 표적 결합시 최소이도록 아미노산의 측쇄를 정확하게 강제하고, 엔트로피의 손실이 표적 결합시 최소이도록 백본의 비틀림 각을 강제하고, 동일한 이유로 분자에 추가의 사이클릭화를 도입하여 펩티드에 추가 제약의 통합.
(검토를 위해, 문헌(Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, 및 Nestor et al, Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418)을 참조한다).
본 발명의 변형된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체의 예는 하기 표 G 및 H에 열거된 것들을 포함한다:
[표 G]
Figure pct00031
[표 H]
Figure pct00032
동위원소 변동
본 발명은 하나 이상의 원자가 동일한 원자 번호를 갖지만, 원자 질량 또는 질량수가 자연에서 일반적으로 발견된 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자로 치환되는 본 발명의 모든 약제학적으로 허용되는 (방사성) 동위원소 표지된 펩티드 리간드, 관련 (방사성) 동위원소를 보유할 수 있는 금속 킬레이트 그룹이 부착된("이펙터"로서 칭명됨) 본 발명의 펩티드 리간드, 및 특정 작용성 그룹이 관련 (방사성) 동위원소 또는 동위원소로 표지된 작용성 그룹으로 공유적으로 치환된 본 발명의 펩티드 리간드를 포함한다.
본 발명의 펩티드 리간드에 포함하기에 적합한 동위원소의 예로는 수소의 동위원소, 예를 들어, 2H(D) 및 3H(T), 탄소, 예를 들어, 11C, 13C 및 14C, 염소, 예를 들어, 36Cl, 불소, 예를 들어, 18F, 요오드, 예를 들어, 123I, 125I 및 131I, 질소, 예를 들어, 13N 및 15N, 산소, 예를 들어, 15O, 17O 및 18O, 인, 예를 들어, 32P, 황, 예를 들어, 35S, 구리, 예를 들어, 64Cu, 갈륨, 예를 들어, 67Ga 또는 68Ga, 이트륨, 예를 들어, 90Y, 루테륨, 예를 들어, 177Lu 및 비스무트, 예를 들어, 213Bi를 포함한다.
본 발명의 특정 동위원소 표지된 펩티드 리간드, 예를 들어, 방사성 동위원소를 포함하는 것들은 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구 및 병든 조직 상의 넥틴-4 표적의 존재 및/또는 부재를 임상적으로 평가하는 데 유용하다. 본 발명의 펩티드 리간드는 표지된 화합물과 다른 분자, 펩티드, 단백질, 효소 또는 수용체 사이에 복합체의 형성을 검출 또는 동정하는데 사용될 수 있다는 점에서 귀중한 진단 특성을 추가로 가질 수 있다. 검출 또는 동정 방법은 방사성 동위원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질(예: 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 에쿠오린 및 루시퍼라제) 등과 같은 표지제로 표지된 화합물을 사용할 수 있다. 방사성 동위원소 삼중수소, 즉 3H(T), 및 탄소-14, 즉 14C는 통합의 용이성 및 검출 준비 수단의 관점에서 이 목적에 특히 유용하다.
중수소, 즉 2H(D)와 같은 더 무거운 동위원소로의 치환은 보다 큰 대사 안정성, 예를 들어, 생체내 반감기의 증가 또는 용량 요건의 감소로 인한 특정 치료적 이점을 수득할 수 있고, 따라서 일부 상황에서 바람직할 수 있다.
양전자 방출 동위원소, 예를 들어, 11C, 18F, 15O 및 13N에 의한 치환은 표적 점유율을 조사하기 위한 양전자 방출 단층촬영(PET) 연구에 유용할 수 있다.
본 발명의 펩티드 리간드의 동위원소 표지 화합물은 일반적으로 당업자에게 공지된 종래 기술에 의해 또는 이전에 사용된 비표지 시약 대신 적합한 동위원소 표지 시약을 사용하여 첨부된 실시예에 기재된 것들과 유사한 공정에 의해 제조될 수 있다.
분자 스캐폴드
분자 스캐폴드는, 예를 들어, WO2009/098450 및 그에 인용된 참고문헌, 특히 WO2004/077062 및 WO 2006/078161에 기재되어 있다.
전술한 문서에서 주시된 바와 같이, 분자 스캐폴드는 작은 유기 분자와 같은 작은 분자일 수 있다.
한 구현예에서, 분자 스캐폴드는 거대분자일 수 있다. 한 구현예에서, 분자 스캐폴드는 아미노산, 뉴클레오티드, 또는 탄수화물로 구성된 거대분자이다.
한 구현예에서, 분자 스캐폴드는 폴리펩티드의 작용성 그룹(들)과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 그룹을 포함한다.
분자 스캐폴드는 펩티드와 결합을 형성하는 화학적 그룹, 예를 들어, 아민, 티올, 알코올, 케톤, 알데히드, 니트릴, 카르복실산, 에스테르, 알켄, 알킨, 아지드, 무수물, 석신이미드, 말레이미드, 알킬 할라이드 및 아실 할라이드를 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 분자 스캐폴드는 헥사하이드로-1,3,5-트리아진, 특히 1,3,5-트리아크릴로일헥사하이드로-1,3,5-트리아진("TATA"), 또는 이의 유도체를 포함할 수 있거나 그들로 이루어질 수 있다.
본 발명의 분자 스캐폴드는 본 발명의 인코딩된 라이브러리의 폴리펩티드의 작용성 그룹이 분자 스캐폴드와 공유 결합을 형성하도록 하는 화학적 그룹을 함유한다. 상기 화학적 그룹은 아민, 티올, 알코올, 케톤, 알데히드, 니트릴, 카르복실산, 에스테르, 알켄, 알킨, 무수물, 석신이미드, 말레이미드, 아지드, 알킬 할라이드 및 아실 할라이드를 포함하는 광범위한 작용기로부터 선택된다.
시스테인의 티올 그룹과 반응하기 위해 분자 스캐폴드에 사용될 수 있는 스캐폴드 반응성 그룹은 알킬 할라이드이다(또는 할로게노알칸 또는 할로알칸으로 칭명된다).
예로는 브로모메틸벤젠(TBMB에 의해 예시되는 스캐폴드 반응성 그룹) 또는 요오도아세트아미드가 포함된다. 화합물을 단백질의 시스테인에 선택적으로 결합시키는데 사용되는 다른 스캐폴드 반응성 그룹은 말레이미드, α-불포화 카르보닐함유 화합물 및 α-할로메틸카르보닐 함유 화합물이다. 본 발명에서 분자 스캐폴드로서 사용될 수 있는 말레이미드의 예는 트리스-(2-말레이미도에틸)아민, 트리스-(2-말레이미도에틸)벤젠, 트리스-(말레이미도)벤젠을 포함한다. αβ 불포화 카르보닐 함유 화합물의 예는 1,1',1"-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온(TATA)이다(참조: Angewandte Chemie, International Edition (2014), 53(6), 1602-1606). α-할로메틸카르보닐 함유 화합물의 예는 N,N',N"-(벤젠-1,3,5-트리일)트리스(2-브로모아세트아미드)이다. 셀레노시스테인은 시스테인과 유사한 반응성을 가지며 동일한 반응에 사용될 수 있는 천연 아미노산이기도 하다. 따라서, 시스테인이 언급되는 경우에는 문맥이 달리 시사하지 않는 한 셀레노시스테인을 치환하는 것이 전형적으로 허용된다.
합성
본 발명의 펩티드는 표준 기술에 이어 시험관내에서 분자 스캐폴드와의 반응에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 이것이 수행될 때, 표준 화학이 사용될 수 있다. 이는 추가의 다운스트림 실험 또는 검증을 위한 가용성 물질의 신속한 대규모 제조를 가능하게 한다. 이러한 방법은 문헌(참조: Timmerman et al(상기)]에 개시된 바와 같은 통상적인 화학을 사용하여 달성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본원에 제시된 바와 같이 선택된 폴리펩티드 또는 접합체의 제조에 관한 것으로, 여기서 제조는 이하에 설명되는 바와 같은 임의의 추가 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 이들 단계는 화학적 합성에 의해 제조된 최종 생성물 폴리펩티드/접합체에 대해 수행된다.
임의로, 관심 폴리펩티드의 아미노산 잔기는 접합체 또는 복합체를 제조할 때 치환될 수 있다.
펩티드를 또한 확장하여, 예를 들어, 다른 루프를 통합할 수 있고, 따라서 여러 특이성을 도입할 수 있다.
펩티드를 확장하기 위해, 표준 고상 또는 액상 화학을 사용하여 직교적으로 보호된 리신(및 유사체)을 사용하여 N-말단 또는 C-말단에서 또는 루프 내에서 단순히 화학적으로 확장될 수 있다. 표준 (생체)접합 기술을 사용하여 활성화된 또는 활성화 가능한 N-말단 또는 C-말단을 도입할 수 있다. 대안적으로, 첨가는, 예를 들어, 문헌(참조: Dawson et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779)에 기재된 바와 같이 단편 응축 또는 천연 화학적 결찰에 의해, 또는 효소, 예를 들어, 문헌(참조: Chang et al.　Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20; 91(26):12544-8 또는 Hikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters　Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003)에 기재된 서브틸리가제를 사용하여 수행될 수 있다.
대안적으로, 펩티드는 이황화 결합을 통한 추가 접합에 의해 확장되거나 변형될 수 있다. 이것은 제1 및 제2 펩티드가 세포의 환원 환경 내에서 한 번 서로 해리되도록 하는 추가의 이점을 갖는다. 이 경우, 분자 스캐폴드(예: TATA)는 3개의 시스테인 그룹과 반응하도록 제1 펩티드의 화학 합성 동안 추가될 수 있고; 이어서, 추가의 시스테인 또는 티올을 제1 펩티드의 N 또는 C-말단에 첨부하여 이 시스테인 또는 티올이 제2 펩티드의 유리 시스테인 또는 티올과만 반응하여 이황화물 결합된 바이사이클릭 펩티드-펩티드 접합체를 형성하도록 할 수 있다.
유사한 기술을 2개의 바이사이클릭 및 이중특이적 매크로사이클의 합성/커플링에 동등하게 적용하여 잠재적으로 사중특이적 분자를 생성한다.
또한, 다른 작용성 그룹 또는 이펙터 그룹의 첨가는 적절한 화학을 사용하여 N-말단 또는 C-말단에 또는 측쇄를 통해 커플링하여 동일한 방식으로 달성될 수 있다. 한 구현예에서, 커플링은 어느 하나의 실체의 활성을 차단하지 않는 방식으로 수행된다.
약제학적 조성물
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 본원에 정의된 펩티드 리간드를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일반적으로, 본 발명의 펩티드 리간드는 약리학적으로 적합한 부형제 또는 담체와 함께 정제된 형태로 이용될 것이다. 전형적으로, 이들 부형제 또는 담체는 식염수 및/또는 완충 매질을 포함하는 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨 및 락테이트화 링거를 포함한다. 폴리펩티드 복합체를 현탁액에 유지시키기 위해 필요한 경우, 적합한 생리학적으로 허용되는 보조제는 증점제, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 및 알기네이트로부터 선택될 수 있다.
정맥내 비히클은 링거 덱스트로스에 기초하는 것들과 같은 유체 및 영양소 보충제 및 전해질 보충제를 포함한다. 방부제 및 다른 첨가제, 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스도 또한 존재할 수 있다(참조: Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).
본 발명의 펩티드 리간드는 별도로 투여되는 조성물로서 또는 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 이들은 항체, 항체 단편 및 다양한 면역치료제, 예를 들어, 실코스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라틴 및 면역독소를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질 리간드와 조합된 다양한 세포독성제 또는 다른 제제의 "칵테일", 또는 심지어 상이한 특이성을 갖는 본 발명에 따르는 선택된 폴리펩티드, 예를 들어, 투여 이전에 풀링되든 되지 않든 상이한 표적 리간드를 사용하여 선택된 폴리펩티드의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 당업자에게 일반적으로 공지된 것들 중의 어느 하나일 수 있다. 요법의 경우, 본 발명의 펩티드 리간드는 표준 기술에 따라 임의의 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피, 폐 경로를 통해, 또는 적절하게는 카테터에 의한 직접 주입을 포함하는 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 흡입에 의해 투여될 것이다. 용량 및 투여 빈도는 환자의 연령, 성별 및 상태, 다른 약물의 동시 투여, 금기 및 임상의가 고려해야 할 다른 매개변수에 의존한다.
본 발명의 펩티드 리간드는 저장을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적절한 담체에서 재구성될 수 있다. 이 기술은 효과적인 것으로 나타났으며, 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다. 당업자는 동결건조 및 재구성은 다양한 정도의 활성 상실을 초래할 수 있고, 보상하기 위해 수준을 상향으로 조정해야할 수 있음을 이해할 것이다.
본 펩티드 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료용으로 투여될 수 있다. 특정 치료적 용도에서, 선택된 세포 집단의 적어도 부분적 억제, 억압, 조절, 사멸, 또는 일부 다른 측정 가능한 매개변수를 달성하기 위한 적절한 양은 "치료적 유효량"으로서 정의된다. 이 용량을 달성하는 데 필요한 양은 질환의 중증도와 환자 자신의 면역계의 일반적인 상태에 따라 다르지만, 일반적으로 체중 1kg당 0.005 내지 5.0mg의 선택된 펩티드 리간드의 범위이며, 0.05 내지 2.0mg/kg/투여의 투여량이 보다 일반적으로 사용된다. 예방적 용도의 경우, 본 펩티드 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 또한 유사하거나 약간 낮은 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드 리간드를 함유하는 조성물은 포유동물에서 선택된 표적 세포 집단의 변화, 불활성화, 사멸 또는 제거를 돕기 위해 예방적 및 치료적 설정에서 이용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 펩티드 리간드는 체외 또는 시험관내에서 선택적으로 사용하여 세포의 불균일한 수집으로부터 표적 세포 집단을 사멸시키거나, 고갈시키거나, 그렇지 않으면 효과적으로 제거할 수 있다. 포유동물의 혈액은 선택된 펩티드 리간드와 체외에서 조합될 수 있고, 이에 의해 원치 않는 세포는 사멸되거나, 그렇지 않으면 표준 기술에 따라 포유동물로의 반환을 위해 혈액으로부터 제거된다.
치료 용도
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 암의 예방, 억제 또는 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 제공된다.
치료 (또는 억제)될 수 있는 암 (및 그들의 양성 대응물)의 예는 상피 기원 종양(선암(adenocarcinoma), 편평 세포 암종(squamous carcinomas), 전이 세포 암종(transitional cell carcinomas) 및 기타 암종을 포함하는 다양한 유형의 선종(adenomas) 및 암종), 예를 들어, 방광 및 요로 암종, 유방, 위장관(식도, 위(위), 소장, 결장, 직장 및 항문 포함), 간(간세포 암종(hepatocellular carcinoma)), 담낭 및 담도계, 외분비 췌장, 신장, 폐(예: 선암, 소세포 폐 암종(small cell lung carcinomas), 비소세포 폐 암종(non-small cell lung carcinomas), 기관지 폐포 암종(bronchioalveolar carcinomas) 및 중피종(mesotheliomas)), 두경부(예: 혀, 구강, 후두, 인두, 비인두, 편도선, 타액선, 비강 및 부비동의 암), 난소, 나팔관, 복막, 질, 외음부, 음경, 자궁경부, 근막, 자궁내막, 갑상선(예: 갑상선 여포성 암종(thyroid follicular carcinoma)), 부신, 전립선, 피부 및 부속기(예: 흑색종(melanoma), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 각질가시세포종(keratoacanthoma), 이형성 모반(dysplastic naevus)); 혈액학적 악성 종양(haematological malignancy)(즉, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma)) 및 림프구 계통의 혈액학적 악성 종양 및 관련 상태를 포함하는 전암성 혈액학적 장애 및 경계선 악성 종양의 장애(예: 급성 림프구성 백혈병 [acute lymphocytic leukemia; ALL], 만성 림프구성 백혈병[chronic lymphocytic leukemia; CLL], B-세포 림프종(B-cell lymphoma), 예를 들어, 확산성 거대 B-세포 림프종[diffuse large B-cell lymphoma; DLBCL], 여포성 림프종(follicular lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 맨틀 세포 림프종(mantle cell lymphoma), T-세포 림프종 및 백혈병(T-cell lymphomas and leukaemias), 자연 살해[NK] 세포 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphomas), 모세포 백혈병(hairy cell leukaemia), 불확실한 유의성의 모노클로날 감마글로불린병증(monoclonal gammopathy of uncertain significance), 형질세포종(plasmacytoma), 다발성 골수종(multiple myeloma) 및 이식 후 림프증식성 장애(post-transplant lymphoproliferative disorder)) 및 골수 계통의 혈액학적 악성 종양 및 관련 상태(예: 급성 골수성 백혈병[acute myelogenousleukemia; AML], 만성 골수성 백혈병[chronic myelogenousleukemia; CML], 만성 골수단핵구성 백혈병[chronic myelomonocyticleukemia; CMML], 과다호산구성 증후군(hypereosinophilic syndrome), 골수증식성 장애(myeloproliferative disorder), 예를 들어, 진성 적혈구증가증(polycythaemia vera), 본태성 혈소판혈증(essential thrombocythaemia) 및 원발성 골수섬유증(primary myelofibrosis), 골수증식성 증후군(myeloproliferative syndrome), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome) 및 전골수구백혈병(promyelocyticleukemia)); 중간엽 기원 종양(tumors of mesenchymal origin), 예를 들어, 연조직, 골 또는 연골의 육종(sarcoma), 예를 들어, 골육종(osteosarcomas), 섬유육종(fibrosarcomas), 연골육종(chondrosarcomas), 횡문근육종(rhabdomyosarcomas), 평활근육종(leiomyosarcomas), 지방육종(liposarcomas), 혈관육종(angiosarcomas), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 활막 육종(synovial sarcomas), 상피 육종(epithelioid sarcomas), 위장 간질 종양(gastrointestinal stromal tumors), 양성 및 악성 조직구종(benign and malignant histiocytomas) 및 융기성피부섬유육종(dermatofibrosarcomaprotuberans); 중추 또는 말초 신경계의 종양(예: 성상세포종(astrocytomas), 신경교종(gliomas) 및 교모세포종(glioblastomas), 수막종(meningiomas), 뇌질피복세포종(ependymomas), 송과체 종양(pineal tumors) 및 신경초종(schwannomas)); 내분비 종양(endocrine tumors)(예: 뇌하수체 종양(pituitary tumors), 부신 종양(adrenal tumors), 췌도 세포 종양(islet cell tumors), 부갑상선 종양(parathyroid tumors), 카르시노이드 종양(carcinoid tumors) 및 갑상샘수질암(medullary carcinoma of the thyroid)); 눈 및 부속기 종양(예: 망막모세포종(retinoblastoma)); 배아 세포 및 영양막 종양(예: 기형종(teratomas), 정상피종(seminomas), 미분화배세포종(dysgerminomas), 포상기태(hydatidiform moles) 및 융모암(choriocarcinomas)); 및 소아 및 배아 종양(예: 수모세포종(medulloblastoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 윌름즈 종양(Wilms tumor), 및 원시 신경외배엽 종양(primitive neuroectodermal tumors)). 또는 환자가 악성 종양에 민감하게 하는 선천성 또는 기타 증후군(예: 색소성 건피증(Xeroderma Pigmentosum))을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
추가의 구현예에서, 암은, 예를 들어, 비호지킨 림프종(NHL), 버킷 림프종(BL), 다발성 골수종(MM), B 만성 림프성 백혈병(B-CLL), B 및 T 급성 림프성 백혈병(ALL), T 세포 림프종(TCL), 급성 골수성 백혈병(AML), 모세포 백혈병(HCL), 호지킨 림프종(HL) 및 만성 골수성 백혈병(CML)으로부터 선택된 조혈 악성 종양으로부터 선택된다.
본원에서 "예방"이라는 용어에 대한 언급은 질환의 유발 전에 보호 조성물의 투여를 포함한다. "억제"는 유발 사건 후, 그러나 질환의 임상적 출현 전 조성물의 투여를 지칭한다. "치료"는 질환의 증상이 나타난 후 보호 조성물의 투여를 포함한다.
질환에 대해 보호하거나 질환을 치료하는 데 있어서 펩티드 리간드의 효능을 스크리닝하는데 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용 가능하다. 동물 모델 시스템의 사용은 본 발명에 의해 촉진되고, 이는 동물 모델의 사용을 허용하기 위해 인간 및 동물 표적과 교차 반응할 수 있는 폴리펩티드 리간드의 개발을 가능하게 한다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 이하 추가로 기재된다.
실시예
일반적으로, 본 발명의 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체의 일부는 하기 일반적인 방법에 따라 제조될 수 있다:
Figure pct00033
모든 용매를 탈기시키고 N2로 3회 퍼징한다. DMF 중의 BP-23825(1.0당량), HATU(1.2당량) 및 DIEA(2.0당량)의 용액을 5분 동안 혼합한 다음, 바이사이클1(1.2당량)을 첨가한다. 반응 혼합물을 40℃에서 16시간 동안 교반한다. 이어서, 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하고, prep-HPLC로 정제하여 중간체 2를 수득한다.
중간체 2(1.0당량)와 바이사이클2(2.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1)에 용해시킨 다음, CuSO4(1.0당량), VcNa(4.0당량) 및 THPTA(2.0당량)를 첨가한다. 마지막으로, 0.2M NH4HCO3를 첨가하여 pH를 8로 조정한다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 16시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 prep-HPLC로 직접 정제하였다.
이 방법을 사용하여 제조된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체는 하기에 나열된다:
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
본 발명의 선택된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체에 대한 보다 상세한 실험은 이하 본원에 제공된다:
실시예 1: BCY11863의 합성
Figure pct00037
화합물 2의 제조
Figure pct00038
N-(산- PEG3 )-N- 비스 ( PEG3 -아지드)(70.0mg, 112.2μmol, 1.0당량), HATU(51.2mg, 134.7μmol, 1.2당량) 및 DIEA(29.0mg, 224.4μmol, 40μL, 2.0당량)의 혼합물을 DMF(2mL)에 용해시키고 5분 동안 혼합하였다. 다음으로, BCY8116(294.0mg, 135.3μmol, 1.2당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 2의 작은 분획이 잔류하였고(MW: 2172.49, 관측치 m/z: 1087.1), 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크(MW: 2778.17, 관측치 m/z: 1389.3([(M/2+H+]), 926.7([(M/3+H+]))가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하고 잔류물을 생성하였다. 이어서, 잔류물을 prep-HPLC(중성 조건)로 정제하였다. 화합물 2(194.5mg, 66.02μmol, 29.41% 수율, 94.3% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
BCY11863의 제조
Figure pct00039
화합물 2(100.0mg, 36.0μmol, 1.0당량), BCY8928(160.0mg, 72.0μmol, 2.0당량)의 혼합물을 먼저 2mL의 t-BuOH/H2O(1:1)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 180μL, 1.0당량) 및 VcNa(28.5mg, 143.8μmol, 4.0당량), THPTA(31.2mg, 71.8μmol, 2.0당량)를 첨가하였다. 마지막으로, 0.2M NH4HCO3를 추가하여 pH를 8로 조정했다. 여기서 모든 용매를 탈기시키고, N2로 3회 퍼징하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY8928이 잔류되었고 목적하는 m/z(계산치 MW: 7213.32, 관측치 m/z: 1444.0([M/5+H]+))도 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 prep-HPLC로 직접 정제하였다. 초기 정제로 BCY11863(117.7mg, 15.22μmol, 42.29% 수율, 93.29% 순도)을 TFA 염으로서 초래한 반면, 순도가 낮은 분획은 prep-HPLC(TFA 조건)에 의해 다시 정제하고, BCY11863(33.2mg, 4.3μmol, 11.92% 수율, 95.55% 순도)을 TFA 염으로서 생성하였다.
실시예 2: BCY12491의 합성
Figure pct00040
BP-23825- BCY9594 제조를 위한 일반적인 절차
Figure pct00041
DMF(3mL) 중 화합물 1(BP-23825, 60.0mg, 96.2μmol, 1.0당량)의 혼합물에 DIEA(12.4mg, 96.2μmol, 16.8μL, 1.0당량) 및 HATU(38.4mg, 101μmol, 1.05당량)를 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 이어서, BCY9594(243mg, 101μmol, 1.05당량)를 혼합물에 첨가하고, N2로 3회 퍼징한 후, N2 분위기하에 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 1이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 예비 HPLC로 정제하여 (BP-23825)- BCY9594(154mg, 48.1μmol, 50.0% 수율, 94.0% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 3006.48, 관측치 m/z: 1002.8[M/3+H]+, 1504.4[M/2+H]+
화합물 BCY12491의 제조를 위한 일반적인 절차
Figure pct00042
화합물 1(56.0mg, 18.6μmol, 1.0당량), BCY8928(83.0mg, 37.2μmol, 2.0당량) 및 THPTA(17.0mg, 39.1μmol, 2.1당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1mL, 미리 탈기되고 N2로 3회 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 94.0μL, 2.0당량) 및 VcNa(15.0mg, 74.5μmol, 4.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 3이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 prep-HPLC(TFA 조건)로 정제하고, BCY12491(59.2mg, 7.79μmol, 41.81% 수율, 97.9% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7441.63, 관측치 m/z: 1861.1([M/4+H]+), 1489.0([M/5+H]+).
실시예 3: BCY12730의 합성
Figure pct00043
화합물 BCY12730의 제조를 위한 일반적인 절차
(BP-23825)- BCY9594(20.0mg, 6.65μmol, 1.0당량), BCY12153(27.8mg, 13.3μmol, 2.0당량) 및 THPTA(5.8mg, 13.3μmol, 2.0당량)의 혼합물을 t-BuOH(0.5mL) 및 H2O(0.5mL)(모든 용매를 미리 탈기시키고 N2로 3회 퍼징시켰다)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 33.3μL, 13.3μmol, 2.0당량), VcNa(0.4M, 66.5μL, 26.6μmol, 4.0당량)을 N2 분위기하에 혼합물에 첨가하였다. 이어서, pH가 8이 될 때까지 NH4HCO3를 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LC-MS는 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 prep-HPLC로 2회 정제하여 화합물 BCY12730(7.50mg, 0.84μmol, 12.7% 수율, 96.3% 순도)을 백색 고체로서 수득했다. 계산치 MW: 7185.39, 관측치 m/z: 1197.5[M/6+H]+, 1438.4[M/5+H]+.
실시예 4: BCY13048의 합성
Figure pct00044
BP-23825- BCY12860의 제조 절차
Figure pct00045
BP-23825(12.0mg, 19.24μmol, 1.2당량) 및 HATU(7.32mg, 19.24μmol, 1.2당량)의 혼합물을 NMP(0.3mL)에 용해시킨 다음, DIEA(5.12mg, 40.26μmol, 7μL, 2.4당량)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정한 후 용액을 40℃에서 5분 동안 활성화시켰다. 화합물 2(33.0mg, 16.03μmol, 1.0당량)를 NMP(0.5mL)에 용해시킨 다음, 활성화 용액에 적가하고, DIEA를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY12860이 완전히 소모되고, 목적하는 m/z(MW:2667.12, 관측치 m/z:1334.2([(M/2+H+]), 889.8([(M/3+H+]))를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하고, 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(중성 조건)에 의해 정제하였다. BP -23825- BCY12860(26.5mg, 7.88μmol, 49.12% 수율, 79.26% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
BCY13048의 제조 절차
Figure pct00046
화합물 3(26.5mg, 9.94μmol, 1.0당량), 화합물 4(47.0mg, 20.87μmol, 2.1당량) 및 THPTA(0.4M, 58μL, 2.3당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1mL, 미리 탈기되고 N2로 3회 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 58μL, 2.3당량) 및 VcNa(0.4M, 115μL, 4.6당량)을 N2하에 추가했다. 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 4가 잔류되었고, 목적하는 m/z(계산치 MW: 7102.28, 관측치 m/z:1776.4([M/4+H]+), 1421.3([ M/3+H]+))를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득했다. 조 생성물을 prep-HPLC(TFA 조건)로 정제하고, BCY13048(14.1mg, 1.91μmol, 19.00% 수율, 96.2% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 5: BCY13050의 합성
Figure pct00047
BP-23825- BCY12862의 제조 절차
Figure pct00048
BP-23825(10.0mg, 16.03μmol, 1.2당량) 및 HATU(6.10mg, 16.03μmol, 1.2당량)의 혼합물을 NMP(0.3mL)에 용해시킨 다음, DIEA(4.45mg, 34.37μmol, 6μL, 2.6당량)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정한 후, 용액을 25℃에서 6분 동안 교반하였다. 화합물 2(33.0mg, 13.36μmol, 1.0당량)를 NMP(0.5mL)에 용해시킨 다음, 활성화 용액에 적가하였다. DIEA를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY12862가 완전히 소모되었으며 목적하는 m/z(MW: 3018.49, 관측치 m/z:1007.0([(M/3+H+]))를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하고, 잔류물을 생성하였다. 이어서, 잔류물을 prep-HPLC(중성 조건)에 의해 정제하였다. BP-23825- BCY12862(20.9mg, 6.92μmol, 51.82%의 수율, 94.9%의 순도)가 백색 고체로서 수득되었다.
BCY13050의 제조 절차
Figure pct00049
화합물 3(20.9mg, 6.92μmol, 1.0당량), 화합물 4(32.2mg, 14.54μmol, 2.1당량) 및 THPTA(7.0mg, 15.93μmol, 2.3당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1mL, 미리 탈기되고 N2로 3회 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 39μL, 2.3당량) 및 VcNa(6.3mg, 31.85μmol, 4.6당량)를 N2하에 첨가했다. 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 4가 잔류되었고, 목적하는 m/z(계산치 MW: 7453.66, 관측치 m/z: 1864.2([M/4+H]+))를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 prep-HPLC(TFA 조건)로 정제하고, BCY13050(6.0mg, 0.77μmol, 11.24% 수율, 96.7% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 6: BCY13053의 합성
Figure pct00050
BCY12865 -BP23825의 제조 절차
Figure pct00051
BP-23825(14.0mg, 22.45μmol, 1.2당량) 및 HATU(8.5mg, 22.35μmol, 1.2당량)를 먼저 0.5mL의 NMP에 용해시킨 다음, DIEA(7.8μL, 44.77μmol, 2.4당량)를 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 6분 동안 교반한 후, BCY12865(40.0mg, 18.65μmol, 1.0당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 목적하는 m/z(계산치 MW: 2750.21, 관측치 m/z: 1375.5([M/2+H]+))를 갖는 하나의 피크를 보여주었다. 반응 혼합물을 prep-HPLC(TFA 조건)로 정제하고, 화합물 1(15.9mg, 5.78μmol, 수율 31.0%, 순도 96.69%)을 백색 고체로서 수득하였다.
BCY13053의 제조 절차
Figure pct00052
화합물 1(15.9mg, 5.78μmol, 1.0당량) 및 BCY8928(26.0mg, 11.72μmol, 2.1당량)을 먼저 2mL의 t-BuOH/H2O(1:1)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 29.0μL, 2.0당량), VcNa(4.6mg, 23.2μmol, 4.0당량) 및 THPTA(5.1mg, 11.7μmol, 2.0당량)를 첨가하였다. 마지막으로 0.2M NH4HCO3를 추가하여 pH를 8로 조정했다. 여기서 모든 용매를 탈기시키고, N2로 3회 퍼징하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 1이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z(계산치 MW: 7185.38, 관측치 m/z: 1796.7([M/4+H]+))를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 prep-HPLC(TFA 조건)에 의해 정제하였고, BCY13053(21.8mg, 3.03μmol, 52.84% 수율, 98.01% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 7: BCY13341의 합성
Figure pct00053
BP-23825- BCY12865의 제조 절차
Figure pct00054
화합물 1(14.0mg, 22.45μmol, 1.20당량)과 HATU(8.5mg, 22.37μmol, 1.20당량)의 혼합물을 NMP(0.3mL)에 용해시킨 다음, DIEA(5.8mg, 44.86μmol, 7.8μL, 2.40당량)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정한 다음, 용액을 25℃에서 6분 동안 활성화시켰다. BCY12865(40.0mg, 18.65μmol, 1.00당량)를 NMP(0.2mL)에 용해시킨 다음, 활성화 용액에 적가하였다. DIEA를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY12865가 완전히 소모되었고, 목적하는 m/z(MW: 2750.21, 관측치 m/z: 1375.5([(M/2+H+])) 및 917.3([(M/3+H+]))를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하였고, 잔류물을 생성하였다. 이어서, 잔류물을 prep-HPLC(중성 조건)에 의해 정제하였다. 화합물 2(20.6mg, 7.24μmol, 38.83% 수율, 95.51% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
BCY13341의 제조 절차
Figure pct00055
화합물 2(20.6mg, 7.49μmol, 1.00당량), BCY12353(31.5mg, 15.08μmol, 2.01당량) 및 THPTA(7.0mg, 16.11μmol, 2.15당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1mL, 미리 탈기되고 N2로 3회 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 37.5μL, 2.00당량) 및 VcNa(6.0mg, 30.29μmol, 4.04당량)를 N2하에 첨가했다. 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 바꼈다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS는 목적하는 m/z(계산치 MW: 6929.13, 관측치 m/z: 1386.5([M/5+H]+) 및 1155.8([M/6+H]+))를 갖는 하나의 주요 피크를 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 prep-HPLC(TFA 조건에서의 제1 실행 및 AcOH 조건에서의 제2 실행)에 의해 정제하였고, BCY13341(10.3mg, 1.49μmol, 19.85% 수율, 93.48% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 8: BCY13343의 합성
Figure pct00056
BP-23825- BCY12860의 제조 절차
Figure pct00057
BP-23825(13.0mg, 20.84μmol, 1.2당량) 및 HATU(8.0mg, 20.84μmol, 1.2당량)의 혼합물을 NMP(0.3mL)에 용해시킨 다음, DIEA(5.4mg, 41.69μmol, 7.3μL, 2.4당량)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정한 다음, 용액을 25℃에서 5분 동안 활성화시켰다. 화합물 2(35.8mg, 17.37μmol, 1.0당량)를 NMP(0.5mL)에 용해시킨 다음, 활성화 용액에 적가하고, DIEA를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY12860이 완전히 소모되었고, 목적하는 m/z(MW:2667.12, 관측치 m/z:1334.4([(M/2+H+]))를 갖는 하나의 주요 피크를 보여주었다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하고, 잔류물을 생성하였다. 이어서, 잔류물을 prep-HPLC(중성 조건)로 정제하였다. BP-23825-BCY12860(25.2mg, 9.16μmol, 52.76% 수율, 97.0% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
BCY13343의 제조 절차
Figure pct00058
화합물 3(25.2mg, 9.45μmol, 1.0당량), 화합물 4(40.4mg, 19.37μmol, 2.05당량) 및 THPTA(9.5mg, 21.73μmol, 2.3당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1mL, 미리 탈기되고 N2로 3회 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 54.3μL, 2.3당량) 및 VcNa(8.7mg, 43.51μmol, 2.5당량)를 N2하에 첨가하였다. 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 3이 또한 완전히 소모되었고, 목적하는 m/z(계산치 MW: 6846.04, 관측치 m/z: 1370.3([M/5+H+]))를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 prep-HPLC(TFA 조건)로 정제하였고, BCY13343(28.2mg, 3.61μmol, 38.23% 수율, 87.7% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 9: BCY11027의 합성
Figure pct00059
TCA - PEG10 - BCY11015의 제조 절차
Figure pct00060
TCA - PEG10 -N 3 (22.0mg, 10.58μmol, 1.0당량) 및 BCY11015(26.0mg, 34.72μmol, 1.1당량)를 먼저 2mL의 t-BuOH/H2O(1:1)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 26.4μL, 1.0당량), VcNa(4.2mg, 21.2μmol, 2.0당량) 및 THPTA(4.6mg, 10.58μmol, 1.0당량)를 첨가하였다. 마지막으로, 1M NH4HCO3를 추가하여 pH를 8로 조정했다. 여기서 모든 용매를 탈기시키고 N2로 3회 퍼징하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 30℃에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS는 목적하는 m/z(계산치 MW: 4143.75, 관측치 m/z: 1040.50([(M+18]/4+H]+) 및 1381.27([M/3+H)]+))를 갖는 1개의 주요 피크를 보여주었다. 반응 혼합물을 prep-HPLC(TFA 조건)로 정제하고, TCA - PEG10 -BCY11015(11.0mg, 2.50μmol, 23.66% 수율, 94.26% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
BCY11027의 제조 절차
Figure pct00061
화합물 2(5.5mg, 1.33μmol, 1.0당량) 및 BCY8928(5.9mg, 2.66μmol, 2.0당량)을 먼저 2mL의 T-BuOH/H2O(1:1)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 10.0μL, 3.0당량), VcNA(1.0mg, 5.05μmol, 3.8당량) 및 THPTA(1.0mg, 2.30μmol, 1.7당량)를 첨가하였다. 마지막으로, 1M NH4HCO3를 추가하여 pH를 8로 조정했다. 여기서 모든 용매를 탈기시키고 N2로 3회 퍼징하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 35℃에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 2가 완전히 소비되었고, 목적하는 m/z(계산치 MW: 8578.91, 관측치 m/z: 1430.6([M/6+H]+))를 갖는 하나의 주요 피크를 보였다. 반응 혼합물을 prep-HPLC(TFA 조건)로 정제하였고, BCY11027(2.8mg, 0.32μmol, 24.5% 수율, 91.71% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 10: BCY12967의 합성
Figure pct00062
화합물 1(20.0mg, 7.20μmol, 1.0당량) 및 BCY11607(32.0mg, 14.9μmol, 2.1당량)을 먼저 2mL의 t-BuOH/H2O(1:1)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 36.0μL, 2.0당량), VcNa(6.0mg, 30.3μmol, 4.2당량) 및 THPTA(6.4mg, 14.7μmol, 2.0당량)를 첨가하였다. 마지막으로, 1M NH4HCO3를 추가하여 pH를 8로 조정했다. 여기서 모든 용매를 탈기시키고 N2하에 3회 퍼징하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 2가 완전히 소비되었고, 목적하는 m/z(계산치 MW: 7077.7 관측치 m/z: 1416.3([M/5+H]+), 1180.4([M/6+H]+), 1011.9([M/7+H]+))를 갖는 하나의 주요 피크를 보였주었다. 반응 혼합물을 prep-HPLC(TFA 조건)로 정제하였고, BCY12967(20.6mg, 2.82μmol, 39.17% 수율, 96.82% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 11: BCY13272의 합성
Figure pct00063
BP-23825- BCY13118의 제조를 위한 일반적인 절차
Figure pct00064
화합물 1(BP-23825, 155.5mg, 249.40μmol, 1.2당량) 및 HATU(95.0mg, 249.92μmol, 1.2당량)의 혼합물을 NMP(1.0mL)에 용해시킨 다음, DIEA(64.6mg, 499.83μmol, 87.0μL, 2.4당량)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정한 후, 용액을 25℃에서 5분 동안 교반하였다. 화합물 2(BCY13118, 500.0mg, 207.83μmol, 1.0당량)를 NMP(5.0mL)에 용해시킨 다음, 반응 용액에 첨가하고, DIEA를 적가하여 생성되는 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 45분 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY13118이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하고, 잔류물을 생성하였다. 이어서, 잔류물을 예비-HPLC로 정제하여 BP-23825-BCY13118(1.35g, 403.46μmol, 64.71% 수율, 90% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 3011.53, 관측치 m/z: 1506.8([M/2+H]+), 1005.0([M/3+H]+).
화합물 BCY13272의 제조를 위한 일반적인 절차
Figure pct00065
BCY8928(644.0mg, 290.55μmol, 2.5당량), THPTA(50.5mg, 116.22μmol, 1.0당량), CuSO4(0.4M, 145.0μL, 0.5당량) 및 Vc(82.0.0mg, 464.89μmol, 4.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/0.2M NH4HCO3(1:1, 6.0mL)에 용해시켰다. 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/0.2M NH4HCO3 중)를 적가하여 이 용액의 pH를 7.5로 조정한 다음, 용액을 25℃에서 3분 동안 교반하였다. BP -23825- BCY13118(350.0mg, 116.22μmol, 1.0당량)을 t-BuOH/0.2M NH4HCO3(1:1, 11.0mL)에 용해시킨 다음, 교반 용액에 적가하였다. 여기서 모든 용매는 사전에 탈기시키고, N2로 3회 퍼징하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/0.2M NH4HCO3 중)를 적가하여 7.5로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 6시간 동안 교반하였다. LC-MS는 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 생성물 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC(TFA 조건)로 정제하고, BCY13272(1.75g, 235.01μmol, 67.40% 수율, 94% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7446.64, 관측치 m/z: 1242.0([M/6+H]+), 1491.0([M/5+H]+).
실시예 12: BCY12733의 합성
Figure pct00066
BP23825- BCY8116 - BCY7744의 제조 절차
Figure pct00067
화합물 1(10.0mg, 3.60μmol, 1.0당량), 화합물 2(6.73mg, 2.88μmol, 0.8당량) 및 THPTA(3.0mg, 6.90μmol, 2.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 0.5mL, 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 9μL, 1.0당량) 및 VcNa(2.0mg, 10.10μmol, 2.8당량)의 수용액을 N2하에 첨가했다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 2가 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, 화합물 3(5.0mg, 0.93μmol, 25.88% 수율, 95.33% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 5115.80, 관측치 m/z: 1278.95([M+4H]4+).
BCY12733의 제조 절차
Figure pct00068
화합물 1(5.0mg, 9.77μmol, 1.0당량), 화합물 2(2.4mg, 1.08μmol, 1.1당량) 및 THPTA(0.4M, 3μL, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 0.5mL, 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 3μL, 1.0당량) 및 VcNa(0.4M, 3μL, 1.0당량)의 수용액을 N2하에 첨가했다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 3 및 화합물 4도 또한 잔류되었고, 목적하는 m/z가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하였고, BCY12733(3.3mg, 0.41μmol, 42.42% 수율, 94.60% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7307.33, 관측치 m/z: 1827.1([M+4H]4+), 1462.1([M+5H]5+).
실시예 13: BCY14413의 합성
Figure pct00069
BCY9594 -BP-23825- BCY8928의 제조 절차
Figure pct00070
화합물 1(50.0mg, 16.6μmol, 1.0당량), 화합물 2(29.5mg, 13.3μmol, 0.8당량) 및 THPTA(36.1mg, 83.1μmol, 5.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 8mL, 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 20.8μL, 0.5당량) 및 VcNa(65.9mg, 332.6μmol, 20.0당량)의 수용액을 N2하에 첨가했다. 이 용액의 pH는 0.5mL의 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 7.5로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 이어서, 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응은 두 배치에 대해 병렬로 설정되었다. LC-MS는 화합물 1과 소량의 화합물 2가 잔류하였고 목적하는 m/z가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하여 불용성 잔류물을 제거하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, 화합물 3(31.5mg, 5.44μmol, 16.36% 수율, 90.22% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 5224.07, 관측치 m/z: 1306.9([M+4H]4+), 871.6([M+6H]6+).
BCY14413의 제조 절차
Figure pct00071
화합물 1(31.5mg, 6.03μmol, 1.0당량), 화합물 2(14.4mg, 6.33μmol, 1.05당량) 및 THPTA(2.62mg, 6.03μmol, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1.0mL, 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 15.07μL, 1.0당량) 및 VcNa(4.78mg, 24.12μmol, 4.0당량)의 수용액을 N2하에 첨가했다. 이 용액의 pH는 0.5mL의 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 7.5로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 이어서, 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 2가 거의 잔류하지 않았고 화합물 1이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하여 불용성 잔류물을 제거하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하였고, BCY14413(22.5mg, 3.00μmol, 43.10% 수율, 86.63% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7498.75, 관측치 m/z: 938.3([M+8H]8+), 1072.2([M+7H]7+), 1250.9([M+6H]6+), 1500.8([M+5H]5+).
실시예 14: BCY14415의 합성
Figure pct00072
BCY14415의 제조 절차
Figure pct00073
BCY14413(10.0mg, 1.33μmol, 1.0당량) 및 비오틴-Peg12-NHS(2.6mg, 2.80μmol, 2.6당량)의 혼합물을 DMF(0.3mL)에 용해시켰다. DIEA를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14413이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하였고, BCY14415(10mg, 1.07μmol, 수율 80.49%, 순도 90.2%)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 8324.73, 관측치 m/z: 1388.4([M+6H]6+), 1190.2([M+7H]7+), 1041.5([M+8H]8+), 926.0([M+9H]9+)
실시예 15: BCY14416의 합성
Figure pct00074
BCY14416의 제조 절차
Figure pct00075
화합물 BCY14413(5.1mg, 0.68μmol, 1.0당량) 및 Alexa Fluor 488 NHS 에스테르(0.5mg, 8.16e-1μmol, 1.2당량)의 혼합물을 DMF(0.3mL)에 용해시켰다. DIEA를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 일부 BCY14413이 잔류되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, 주요 피크를 순도가 다른 2개의 분획으로 수집하고, BCY14416(0.7mg, 0.065μmol, 9.84% 수율, 96.4% 순도) 및 (0.5mg, 0.047μmol, 7.03% 수율, 91.2% 순도)을 적색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 8015, 관측치 m/z: 1336.5([M+7H]7+).
실시예 16: BCY14414의 합성
Figure pct00076
BCY14798의 제조 절차
Figure pct00077
BCY14964(55.0mg, 18.26μmol, 1.0당량), BCY8928(32.4mg, 14.61μmol, 0.8당량), 및 THPTA(39.8mg, 91.32μmol, 5.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/0.2M NH4HCO3(1:1, 0.5mL, 미리 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 23.0μL, 0.5당량) 및 나트륨 아스코르베이트(72.0mg, 365.27μmol, 20.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/0.2M NH4HCO3 중)를 적가하여 7.5로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14964가 잔류하였고, 화합물 BCY8928이 완전히 소비되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY14798(51mg, 9.17μmol, 33.37% 수율, 94% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 5229.07, 관측치 m/z: 1308.3 ([M+4H]4+), 1046.7 ([M+5H]5+).
BCY14414의 제조 절차
Figure pct00078
BCY14798(21.0mg, 4.02μmol, 1.0당량), BCY13389(10.0mg, 4.42μmol, 1.1당량) 및 THPTA(1.8mg, 4.02μmol, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/0.2M NH4HCO3(1:1, 0.5mL, 미리 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO4(0.4M, 5.0μL, 0.5당량) 및 나트륨 아스코르베이트(2.8mg, 16.06μmol, 4.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/0.2M NH4HCO3 중)를 적가하여 7.5로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14798이 완전히 소비되었고, 일부 BCY13389는 잔류되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비적으로 정제하고, BCY14414(20mg, 2.40μmol, 59.73% 수율, 90.9% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7503.74, 관측치 m/z: 1251.5 ([M+5H]5+), 1072.9([M+7H]7+).
실시예 17: BCY14417의 합성
Figure pct00079
BCY14417의 제조 절차
Figure pct00080
BCY14414(13.0mg, 1.73μmol, 1.0당량) 및 비오틴-PEG12-NHS 에스테르(CAS 365441-71-0, 4.2mg, 4.50μmol, 2.6당량)의 혼합물을 DMF(0.5mL)에 용해시켰다. DIEA를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14414가 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY14417(9.0mg, 1.07μmol, 80.49% 수율, 90.8% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 8329.74, 관측치 m/z: 1389.6([M+6H]6+), 1191.9([M+7H]7+).
실시예 18: BCY14418의 합성
Figure pct00081
BCY14418의 제조 절차
Figure pct00082
BCY14414(5.6mg, 0.75μmol, 1.0당량) 및 Alexafluor® 488(0.9mg, 1.49μmol, 2.0당량)의 혼합물을 DMF(0.3mL)에 용해시켰다. 이어서, DIEA를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 1.0시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14414가 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY14418(2.3mg, 0.25μmol, 32.89% 수율, 85.6% 순도)을 적색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 8020.19, 관측치 m/z: 1337.2([M+6H]6+).
실시예 19: BCY15217의 합성
Figure pct00083
BCY15217의 제조 절차
Figure pct00084
BCY14964(20.0mg, 6.64μmol, 1.0당량), BCY14601(30.5mg, 13.95μmol, 2.1당량), 및 THPTA(2.9mg, 6.64μmol, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/0.2M NH4HCO3(1:1, 0.5mL, 미리 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO4(0.4M, 16.6μL, 1.0당량) 및 나트륨 아스코르베이트(4.7mg, 26.56μmol, 4.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 이 용액의 pH를 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14964가 잔류되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY15217(19.7mg, 2.41μmol, 36.26% 수율, 96.2% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7362.5, 관측치 m/z: 1473.5 ([M+5H]5+), 1228.2 ([M+6H]6+), 1052.8 ([M+7H]7+).
실시예 20: BCY15218의 합성
Figure pct00085
BCY15218의 제조 절차
Figure pct00086
BCY14798(30.0mg, 5.74μmol, 1.0당량), BCY14601(15.0mg, 6.88μmol, 1.2당량), 및 THPTA(2.5mg, 5.74μmol, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/0.2M NH4HCO3(1:1, 0.5mL, 미리 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO4(0.4M, 14.0μL, 1.0당량) 및 나트륨 아스코르베이트(4.0mg, 22.95μmol, 4.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/0.2M NH4HCO3 중)를 적가하여 7.5로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY14798이 완전히 소비되었고, BCY14601이 잔류되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY15218(22mg, 2.67μmol, 46.61% 수율, 95.0% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7404.6, 관측치 m/z: 1234.8 ([M+6H]6+).
실시예 21: BCY12979의 합성
Figure pct00087
Fmoc - BAPG - BCY9594의 제조 절차
Figure pct00088
화합물 1(N,N-비스[3-(Fmoc-아미노)프로필]글리신 황산칼륨, 10.0mg, 15.78μmol, 1.0당량) 및 HATU(7.2mg, 18.94μmol, 1.2당량)를 먼저 1mL의 DMF에 용해시킨 다음, DIEA(11.0μL, 63.15μmol, 4.0당량)를 추가했다. 혼합물을 30℃에서 30분 동안 교반한 후, BCY9594(80.0mg, 30.09μmol, 1.0당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LC-MS는 목적하는 m/z(계산치 MW: 3016.51, 관측치 m/z: 1006.4([M+3H]3+)를 갖는 하나의 주요 피크를 보여주었다. 반응 혼합물을 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
BAPG - BCY9594의 제조 절차 :
Figure pct00089
화합물 2(47.6mg, 15.78μmol, 1.0당량)를 먼저 1mL의 DMF에 용해시킨 후, 피페리딘(0.2mL, 2.03mmol, 128.0당량)을 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 30분 동안 교반하였다. LC-MS는 목적하는 m/z(계산치 MW: 2572.04, 관측치 m/z: 1286.8([M+2H]2+), 858.1([M+3H]3+))를 갖는 하나의 주요 피크를 보여주었다. 반응 혼합물을 예비 HPLC에 의해 정제하였고, 화합물 3(24.4mg, 9.06μmol, 57% 수율, 95% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
BCY9594 - BAPG - PEG5 -N 3 의 제조 절차
Figure pct00090
화합물 3(24.4mg, 9.06μmol, 1.0당량) 및 화합물 4(10.0mg, 23.13μmol, 2.4당량)를 2mL의 MeCN/H2O(1:1)에 용해시키고, 1M NaHCO3를 첨가하여 pH를 8로 조정하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 3이 완전히 소비되었고 목적하는 m/z(계산치 MW: 3206.71, 관측치 m/z: 1069.7([M+3H]3+))를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 예비 HPLC로 정제하였고, 화합물 5(12.8mg, 3.99μmol, 42.08% 수율, 88.62% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
BCY12979의 제조 절차
Figure pct00091
화합물 5(12.8mg, 3.99μmol, 1.0당량) 및 BCY8928(18.0mg, 8.12μmol, 2.0당량)을 먼저 2mL의 t-BuOH/H2O(1:1)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 20.0μL, 2.0당량), VcNa(3.2mg, 16.1μmol, 4.0당량) 및 THPTA(3.5mg, 8.0μmol, 2.0당량)를 첨가하였다. 마지막으로, 1M NH4HCO3를 추가하여 pH를 8로 조정했다. 여기서 모든 용매를 탈기시키고 N2로 퍼징하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 5가 완전히 소모되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크를 보여주었다. 반응 혼합물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY12979(16.0mg, 2.02μmol, 51% 수율, 96.6% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7641.87, 관측치 m/z: 1911.2([M+4H]4+), 1528.3([M+5H]5+), 1247.5([M+6H]6+), 1092.2([M+7H]7+).
실시예 22: BCY10918의 합성
Figure pct00092
화합물 1의 제조 절차
Figure pct00093
COM00000329(102mg, 58.76μmol, 1.0당량), BCY11015(92.6mg, 41.13μmol, 0.7당량) 및 THPTA(0.4M, 146.9μL, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 2mL, 사전에 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 146.9μL, 1.0당량) 및 VcNa(0.4M, 293.8μL, 2.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25 내지 30℃에서 12시간 동안 교반하였다. LS-MS는 COM00000329가 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 예비 HPLC로 직접 정제하였다. 화합물 1(60mg, 13.61μmol, 23.16% 수율, 90.45% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 3988.52, 관측치 m/z: 1329.97 ([M+3H]3+), 990.56 ([M+4H]4+).
BCY10918의 제조 절차
Figure pct00094
화합물 1(60mg, 15.04μmol, 1.0당량), BCY8928(72.0mg, 32.47μmol, 2.2당량) 및 THPTA(0.4M, 37.6μL, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1mL, 사전에 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO4(0.4M, 37.6μL, 1.0당량) 및 VcNa(0.4M, 75.2μL, 2.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25 내지 30℃에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 1이 완전히 소비되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 예비 HPLC에 의해 직접 정제하였다. BCY10918(48mg, 5.47μmol, 36% 수율, 96% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 8423.67, 관측치 m/z: 1404.27 ([M+6H]6+), 1203.73 ([M+7H]7+).
실시예 23: BCY10919의 합성
Figure pct00095
BCY10919의 제조 절차
Figure pct00096
화합물 1(75mg, 18.8μmol, 1.0당량), BCY11014(93.75mg, 43.1μmol, 2.3당량) 및 THPTA(0.4M, 47.0μL, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1mL, 사전에 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO4(0.4M, 47.0μL, 1.0당량) 및 VcNa(0.4M, 94.0μL, 2.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25 내지 30℃에서 12시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 1이 완전히 소비되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 예비 HPLC에 의해 직접 정제하였다. BCY10919(96mg, 11.39μmol, 60.59% 수율, 96.12% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 8339.54, 관측치 m/z: 1391.3 ([M+6H]6+), 1192.5 ([M+7H]7+).
실시예 24: BCY11021의 합성
Figure pct00097
화합물 3의 제조 절차
Figure pct00098
화합물 1(15.0mg, 6.10μmol, 1.0당량), BCY11016(18.4mg, 7.93μmol, 1.3당량) 및 THPTA(2.65mg, 6.10μmol, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1mL, 미리 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO4(30.0μL, 0.4M, 2.0당량) 및 VcNa(0.4M, 30.0μL, 2.0당량)를 N2하에 첨가했다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 4시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 1이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 이어서, 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하고, 잔류물을 생성한 후, 예비 HPLC로 정제하였다. 화합물 3(2.89mg, 0.514μmol, 8.42% 수율, 83.4% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 4782.46, 관측치 m/z: 963.9([M+3H+2H2O]5+).
BCY11021의 제조 절차
Figure pct00099
화합물 3(2.89mg, 0.60μmol, 1.0당량), BCY7744(4.38mg, 1.87μmol, 3.1당량) 및 THPTA(0.9mg, 2.1μmol, 3.5당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1mL, 미리 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 3.0μL, 2.0당량) 및 VcNa(0.4M, 6.0μL, 4.0당량)를 N2하에 첨가했다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 4시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 3이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY11021(2.8mg, 0.229μmol, 37% 수율, 96.4% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 11795.38, 관측치 m/z: 1310.6([M+9H]9+), 786.6([M+15H]15+).
실시예 25: BCY11022의 합성
Figure pct00100
BCY11022의 제조 절차
Figure pct00101
화합물 3(2.7mg, 0.6μmol, 1.0당량), BCY8928(5.3mg, 2.38μmol, 4.0당량) 및 THPTA(0.9mg, 2.1μmol, 3.5당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1mL, 사전에 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 6.0μL, 4.0당량) 및 VcNa(0.4M, 6.0μL, 4.0당량)를 N2하에 첨가했다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 4시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 3이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY11022(1.9mg, 1.0μmol, 23.2% 수율, 94.6% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 11435.19, 관측치 m/z: 1143.2([M+10H]10+).
실시예 26: BCY11864의 합성
Figure pct00102
BCY11864의 제조 절차
Figure pct00103
화합물 2(5mg, 1.80μmol, 1.0당량), BCY7744(9mg, 3.85μmol, 2.1당량), THPTA(0.4M, 9μL, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 2mL, 사전에 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 9μL, 2.0당량) 및 VcNa(0.4M, 18μL, 4.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY7744가 잔류되었고, 목적하는 m/z가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 예비 HPLC로 직접 정제하였다. BCY11864(5.2mg, 0.62μmol, 34% 수율, 89% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7453.44, 관측치 m/z: 1490.70([M+5H]5+).
실시예 27: BCY11780의 합성
Figure pct00104
화합물 3의 제조 절차
Figure pct00105
화합물 1(40.0mg, 21.15μmol, 1.0당량), 화합물 2(43.0mg, 15.86μmol, 0.75당량) 및 THPTA(10.0mg, 21.20μmol, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1mL, 사전에 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(53.0μL, 0.4M, 1.0당량) 및 VcNa(0.4M, 53.0μL, 1.0당량)를 N2하에 추가했다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 4시간 동안 교반하였고, LC-MS는 화합물 2가 완전히 소모되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 이어서, 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하고, 잔류물을 생성하였다. 이것을 예비 HPLC로 정제하였다. 화합물 3(11.7mg, 2.44μmol, 11% 수율, 96.2% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 4607.33, 관측치 m/z: 1152.36([M+4H]4+).
BCY11780의 제조 절차
Figure pct00106
화합물 3(11.7mg, 2.54μmol, 1.0당량), BCY8928(11.8mg, 5.33μmol, 2.1당량) 및 THPTA(2.3mg, 5.3μmol, 2.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1mL, 사전에 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 다음, CuSO4(0.4M, 12.7μL, 2.0당량) 및 VcNa(0.4M, 25.4μL, 4.0당량)를 N2하에 첨가했다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 40℃에서 4시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 3이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY11780(5.0mg, 0.509μmol, 수율 20.03%, 순도 92.0%)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 9042.48, 관측치 m/z: 1292.8([M+7H]7+), 1130.96([M+8H]8+).
실시예 28: BCY13390의 합성
BCY12476의 제조 절차
Figure pct00107
N-(산- PEG3 )-N- 비스 ( PEG3 -아지드)(70.0mg, 112.2μmol, 1.0당량), HATU(51.2mg, 134.7μmol, 1.2당량) 및 DIEA(29.0mg, 224.4μmol, 40μL, 2.0당량)의 혼합물을 DMF(2mL)에 용해시키고 5분 동안 혼합하였다. 다음으로, BCY8116(294.0mg, 135.3μmol, 1.2당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS는 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크를 보여주었다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 용매를 제거하고 잔류물을 생성하였다. 이어서, 잔류물을 예비 HPLC로 정제하였다. BCY12476(194.5mg, 66.02μmol, 29% 수율, 94% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 2778.17, 관측치 m/z: 1389.3([M+2H]2+), 926.7([M+3H]3+).
Figure pct00108
BCY13689의 제조 절차
Figure pct00109
BCY12476(47.0mg, 16.91μmol, 1.0당량), BCY8928(30.0mg, 13.53μmol, 0.8당량), 및 THPTA(36.7mg, 84.55μmol, 5.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 8mL, 미리 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO4(0.4M, 21.0μL, 0.5당량) 및 VcNa(67.0mg, 338.21μmol, 20.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 이 용액의 pH는 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 일부 BCY12476이 잔류되었고, BCY8928이 완전히 소모되었고 목적하는 m/z의 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY13689(25.3mg, 4.56μmol, 27% 수율, 90% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 4995.74, 관측치 m/z: 1249.4([M+4H]4+), 999.9([M+5H]5+).
BCY13390의 제조 절차
Figure pct00110
BCY13689(43.6mg, 8.73μmol, 1.0당량), BCY13389(20.8mg, 9.16μmol, 1.05당량), 및 THPTA(3.8mg, 8.73μmol, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/H2O(1:1, 1mL, 미리 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO4(0.4M, 22.0μL, 1.0당량) 및 VcNa(3.5mg, 17.45μmol, 2.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O 중)를 적가하여 이 용액의 pH를 8로 조정하였고, 용액은 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LS-MS는 목적하는 m/z에 상응하는 유의한 피크를 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하였고, BCY13390(33.8mg, 4.21μmol, 48% 수율, 90% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7270.41, 관측치 m/z: 1454.9([M+5H]5+), 1213.2([M+6H]6+).
실시예 29: BCY13582의 합성
Figure pct00111
BCY13582의 제조 절차
Figure pct00112
BCY13390(5.0mg, 0.6μmol, 1.0당량), 비오틴-PEG12-NHS 에스테르(CAS 365441-71-0, 0.7mg, 0.72μmol, 1.1당량)의 혼합물을 MeCN/H2O(1:1, 2mL)에 용해시켰다. 이 용액의 pH는 1.0M NaHCO3를 적가하여 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY13390이 완전히 소비되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY13582(2.5mg, 0.30μmol, 43% 수율, 96% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 8096.43, 관측치 m/z: 1351.1([M+6H]6+), 1158.5([M+7H]7+).
실시예 30: BCY13583의 합성
Figure pct00113
BCY13583의 제조 절차
Figure pct00114
BCY13390(15.0mg, 2.06μmol, 1.0당량) 및 Alexafluor® 488 NHS 에스테르(2.5mg, 4.12μmol, 2.0당량)의 혼합물을 DMF(0.5mL)에 용해시켰다. 다음으로, DIEA(2.6mg, 20.63μmol, 3.6μL, 10당량)를 적가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY13390이 잔류되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보유주었다. 추가의 Alexafluor® 488 NHS 에스테르(2.0mg, 3.09μmol, 1.5당량)를 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 25℃에서 추가 1시간 동안 교반하였다. HPLC는 BCY13390이 완전히 소비되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY13583(5mg, 0.61μmol, 29% 수율, 95% 순도)을 적색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7787.9, 관측치 m/z: 1948.8([M+4H+H2O]4+), 1558.6([M+5H+H2O]5+), 1299.1([M+7H+H2O]7+).
실시예 31: BCY13628의 합성
Figure pct00115
BCY13628의 제조 절차
Figure pct00116
BCY13390(5.6mg, 0.77μmol, 1.0당량) 및 시아닌 5 NHS 에스테르(0.5mg, 0.85μmol, 1.1당량)의 혼합물을 MeCN/H2O(1:1, 2mL)에 용해시켰다. 이 용액의 pH는 1.0M NaHCO3를 적가하여 8로 조정하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY13390이 완전히 소비되었고 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY13628(2.9mg, 0.36μmol, 46% 수율, 95% 순도)을 청색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7736.06, 관측치 m/z: 1289.9([M+6H]6+), 1105.5([M+7H]7+).
실시예 32: BCY15155의 합성
Figure pct00117
BCY15155의 제조 절차
Figure pct00118
BCY13689(25.0mg, 5.00μmol, 1.0당량), BCY14601(13.0mg, 6.01μmol, 1.2당량) 및 THPTA(2.0mg, 5.00μmol, 1.0당량)의 혼합물을 t-BuOH/0.2M NH4HCO3(1:1, 0.5mL, 미리 탈기되고 N2로 퍼징됨)에 용해시킨 후, CuSO4(0.4M, 12.5μL, 1.0당량) 및 Vc(3.5mg, 20.02μmol, 4.0당량)를 N2하에 첨가하였다. 이 용액의 pH를 8로 조정하고, 용액은 담황색으로 변했다. 반응 혼합물을 N2 분위기하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LC-MS는 BCY13689가 완전히 소모되었고, 일부 BCY14601이 잔류되었고, 목적하는 m/z를 갖는 하나의 주요 피크가 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고, 감압하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물을 예비 HPLC로 정제하고, BCY15155(19.7mg, 2.41μmol, 36% 수율, 97% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 계산치 MW: 7171.3, 관측치 m/z: 1434.7 ([M+5H]5+), 1196.2 ([M+6H]6+).
분석 데이터
본 발명의 하기 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 질량 분석법 및 HPLC를 사용하여 분석하였다. 이하 분석 방법 A 내지 C에 대한 HPLC 설정은 다음과 같았다:
이동상: A: H2O 중 0.1% TFA B: ACN 중 0.1% TFA
유량: 1.0ml/분
컬럼: Gemini-NX C18 5um 110A 150*4.6mm
장비: Agilent 1200 HPLC-BE (1-614)
이하 분석 방법 D에 대한 HPLC 설정은 다음과 같았다:
이동상: A: H2O 중 0.1% TFA B: ACN 중 0.1% TFA
유량: 1.0ml/분
컬럼: Kintex 1.7um C18 100A 2.1mm*150mm
장비: Agilent UPLC 1290
사용된 구배는 이하 표에 기재되었고:
Figure pct00119
데이터는 다음과 같이 생성되었다:
Figure pct00120
Figure pct00121
추가의 분석 데이터는 다음과 같이 생성되었다:
Figure pct00122
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
생물학적 데이터
1. 종양 세포 공배양에 의한 CD137 리포터 검정
R1 배지라 지칭되는 배양 배지는 RPMI-1640(프로메가 키트 CS196005의 구성 요소)에 1% FBS를 첨가함으로써 제조된다. R1에서 시험 품목의 일련의 희석은 멸균 96 웰 플레이트에서 제조된다. 백혈구 배양 플레이트에서 지정된 웰에 웰당 25μL의 시험 품목 또는 R1(배경 대조군으로서)을 첨가한다. 종양 세포*를 수거하고 R1 배지에 400,000 세포/mL의 농도로 재현탁시킨다. 25μL/웰의 종양 세포를 백혈구 배양 플레이트에 첨가한다. Jurkat 세포(프로메가 키트 CS196005, 0.5mL)를 수조에서 해동한 다음, 5ml의 예열된 R1 배지에 첨가한다. 그런 다음, 25μL/웰의 Jurkat 세포를 백혈구 배양 플레이트에 첨가한다. 세포 및 시험 품목을 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 배양한다. 6시간이 끝나면, 75μL/웰의 Bio-Glo™ 시약(프로메가)을 첨가하고, 10분 동안 배양한 후 플레이트 판독기(Clariostar, BMG)에서 발광을 판독한다. 세포 단독(Jurkat 세포 + 공배양에 사용된 세포주)에 대한 배수 변화를 계산하고, log(작용제) 대 반응으로서 GraphPad Prism에 플롯팅하여 EC50(nM) 및 배경에 대한 배수 유도(Max)를 결정한다.
공배양에 사용되는 종양 세포 유형은 넥틴-4를 발현하는 것으로 나타난 NCI-H292 및 HT1376이다. EphA2의 공배양에 사용되는 종양 세포 유형은 A549, PC3 및 HT29이다. PD-L1의 공배양에 사용되는 종양 세포의 유형은 RKO이다.
도 1a에 제시된 데이터는 넥틴-4/CD137 헤테로탠덤(BCY11863)이 CD137 리포터 검정에서 강력한 CD137 활성화를 유도하고, 활성화가 헤테로탠덤의 CD137에 대한 결합에 의존한다는 것을 나타낸다. CD137 바이사이클릭 펩티드가 결합을 폐기하는 모든 D-아미노산으로 구성된 분자인 BCY11617은 CD137 효능 작용을 유발하지 않는다.
넥틴-4 발현 종양 세포주와의 공배양에서 CD137 리포터 검정에서 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체에 의해 유도된 EC50(nM) 및 배수 유도의 요약을 하기 표 1A에 기록된다:
[표 1A]
Figure pct00127
넥틴-4 발현 종양 세포주와의 공배양에서 CD137 리포터 검정에서 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY11863 및 근접한 유사체에 의해 유도된 EC50(nM)의 요약은 하기 표 1B에 기록되고, 도 1B에서 가시화되었다. 이 데이터는 넥틴-4의 발현 범위를 갖는 세포주와의 공배양에서 CD137 효능 작용을 유도할 BCY11863의 가능성을 입증한다.
[표 1B]
Figure pct00128
NCI-H292 세포를 이용한 CD137 리포터 공배양 검정에서 넥틴-4/CD137 헤테로탠덤 펩티드에 의해 유도된 배수 유도의 요약은 하기 표 2에 제시된다. 모든 화합물은 평균 EC50 1.1±0.5nM, 배경에 대한 28±11배의 Emax를 갖는 플레이트 대조군 BCY10000과 비교된다.
[표 2]
Figure pct00129
HT1376 종양 세포를 이용한 CD137 리포터 공배양 검정에서 넥틴-4/CD137 헤테로탠덤 펩티드에 의해 유도된 배수 유도의 요약을 하기 표 2A에 제시되어 있고, EC50(nM) 및 Emax(배경에 대한 배수 유도)가 기록된다. 대부분의 넥틴-4/CD137 헤테로탠덤의 EC50은 1nM 미만이다.
[표 2A]
Figure pct00130
도 16에 제시된 데이터는 EphA2/CD137 헤테로탠덤 BCY13272가 EphA2 발현 세포주(PC3, A549 및 HT29)의 존재하에 CD137 리포터 검정에서 강력한 CD137 활성화를 유도하는 반면, 비결합 대조군 분자(BCY13626)는 CD137의 활성화를 나타내지 않음을 보여준다.
PC3 세포를 이용한 CD137 리포터 공배양 검정에서 EphA2/CD137 헤테로탠덤 펩티드에 의해 유도된 배수 유도의 요약은 하기 표 3A에 제시된다. 모든 화합물은 평균 EC50 0.54nM, 배경에 대한 42배의 Emax를 갖는 플레이트 대조군 BCY9173과 비교된다.
[표 3A]
Figure pct00131
EphA2 발현 종양 세포주와의 공배양에서 CD137 리포터 검정에서 BCY13272에 의해 유도된 EC50(nM) 및 배수 유도의 요약은 하기 표 3B에 기록된다:
[표 3B]
Figure pct00132
PC3 종양 세포를 이용한 CD137 리포터 공배양 검정에서 EphA2/CD137 헤테로탠덤 펩티드에 의해 유도된 배수 유도의 요약은 하기 표 3C에 제시되어 있고, EC50(nM) 및 Emax(배경에 대한 배수 유도)가 기록된다. 대부분의 EphA2/CD137 헤테로탠덤의 EC50은 1nM 미만이다.
[표 3C]
Figure pct00133
Figure pct00134
RKO 세포에 의한 CD137 리포터 공배양 검정에서 PD-L1/CD137 헤테로탠덤 펩티드에 의해 유도된 배수 유도의 요약은 하기 표 4에 제시된다.
[표 4]
Figure pct00135
2. 인간 PBMC -종양 세포 공배양 (사이토카인 자극 검정) 검정
종양 세포주는 공급자가 권장하는 프로토콜에 따라 배양되었다. 건강한 인간 공여자의 냉동 PBMC를 해동하고 실온 PBS로 1회 세척한 후 R10 배지에 재현탁시켰다. 100μl의 PBMC(1,000,000 PBMC/ml) 및 100μl의 종양 세포(100,000 종양 세포/ml)(이펙터:표적 세포 비(E:T) 10:1)를 공배양 검정을 위한 96 웰 평저 플레이트의 각 웰에 플레이팅했다. 100ng/ml의 가용성 항-CD3 mAb(클론 OKT3)를 0일째에 배양물에 첨가하여 인간 PBMC를 자극하였다. 시험, 대조군 화합물 또는 비히클 대조군을 R10 배지로 희석하고, 50μL를 각각의 웰에 첨가하여 웰당 최종 용적을 250μL로 만들었다. 플레이트를 통기성 필름으로 덮고, 5% CO2와 함께 37℃에서 가습 챔버 내에서 3일 동안 배양했다. 자극 48시간 후 상청액을 수집하고, 인간 IL-2 및 IFN-γ가 Luminex에 의해 검출되었다. 간단히 설명하면, 표준 및 샘플을 검정색 96 웰 플레이트에 첨가했다. 미립자 칵테일(Luminex 키트에 제공됨, R & D Systems)을 추가하고, 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 자기 홀더를 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 이어서, 비오틴 칵테일을 플레이트에 첨가하고, RT에서 1시간 동안 진탕시켰다. 자기 홀더를 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 스트렙타비딘 칵테일을 플레이트에 첨가하고 RT에서 30분 동안 진탕시켰다. 플레이트를 자기 홀더를 사용하여 3회 세척하고, 100μL의 세척 완충제에 재현탁시키고, RT에서 2분 동안 진탕시키고, Luminex 2000을 사용하여 판독하였다. 원시 데이터를 내장 Luminex 소프트웨어를 사용하여 분석하여 표준 곡선을 생성하고, 단백질 농도를 보간하고, 모든 다른 데이터 분석 및 그래프 분석은 Excel 및 Prism 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 데이터는 실험 복제물에서 테스트된 3개의 독립적인 공여자 PBMC를 사용하는 하나의 연구를 나타낸다.
도 2a 및 2b에 제시된 데이터는 넥틴-4/CD137 헤테로탠덤(BCY11863)이 PBMC-4T1 공배양 검정에서 강력한 IL-2 및 IFN-γ 사이토카인 분비를 유도함을 입증한다. BCY11617은 넥틴-4에 결합하지만 CD137에는 결합하지 않는 음성 대조군이다.
인간 PBMC 공배양(사이토카인 방출) 검정에서 선택된 넥틴-4/CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체에 의해 유도된 EC50(nM) 및 최대 IFN-γ 사이토카인 분비(pg/ml)의 요약은 이하 표 4A에 기록되고, 도 2C에 가시화되어 있다. 이는 넥틴-4를 발현하는 다수의 상이한 종양 세포주의 존재하에 사이토카인 분비를 유도할 BCY11863의 가능성을 입증한다.
[표 4A]
Figure pct00136
3. SD 래트에서 CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체의 약동학
수컷 SD 래트에게 25mM 히스티딘 HCl, 10% 수크로스 pH 7로 제형화된 각 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 IV 볼러스 또는 IV 주입(15분)으로 투여하였다. 연속 출혈(약 80μL 혈액/시점)은 각 시점에서 턱밑 또는 복재 정맥을 통해 수행되었다. 모든 혈액 샘플은 항응고제로서 2μL의 K2-EDTA(0.5M)를 함유하는 사전 냉각된 미세원심분리 튜브로 즉시 옮기고 습식 얼음 위에 배치했다. 혈액 샘플은 약 4℃, 3000g에서 원심분리로 혈장용으로 즉시 처리하였다. 내부 표준을 포함하는 침전제를 즉시 혈장에 첨가하고, 충분히 혼합하고, 12,000rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 사전 표지된 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브에 옮긴 다음, 드라이 아이스로 급속 동결시켰다. 샘플은 분석까지 필요에 따라 70℃ 이하에 보관하였다. 분석물의 농도를 결정하기 위해, 양이온 방식으로 Orbitrap Q Exactive를 사용하는 LC-MS/MS 분석을 위해 7.5μL의 상청액 샘플을 직접 주사하였다. 혈장 농도 대 시간 데이터는 Phoenix WinNonlin 6.3 소프트웨어 프로그램을 이용한 비구획 접근법에 의해 분석되었다. C0, Cl, Vdss, T½, AUC(0-last), AUC(0-inf), MRT(0-last), MRT(0-inf) 및 혈장 농도 대 시간 프로파일의 그래프가 기록되었다. 실험으로부터의 약동학적 매개변수는 표 6A에 나타낸 바와 같다:
[표 6A]
Figure pct00137
구체적으로, BCY11863의 약동학적 매개변수는 표 6B에 제시된 바와 같다:
[표 6B]
Figure pct00138
상기 표 6B 및 도 5의 데이터는 BCY11863이 혈장 용적보다 큰 분포 용적을 갖는 낮은 클리어런스 분자임을 보여준다. 또한, BCY11863의 SC 투여에 의한 생체이용률은 래트에서 높다.
[표 6C]
Figure pct00139
표 6C 및 도 25의 데이터는 SD 래트에게 BCY11863의 IV 투여시 BCY11863의 1% 미만이 BCY15155로 대사됨을 보여준다. 연구의 처음 24시간 동안 BCY14602로의 유의한 전환은 주시되지 않는다.
4. 시노몰구스 원숭이에서 CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체의 약동학
비-나이브 시노몰구스 원숭이에게 25mM 히스티딘 HCl, 10% 수크로스 pH 7로 제형화된 1mg/kg의 각 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 정맥내 주입(15 또는 30분)을 통해 노쪽 피부 정맥에 투여하였다. 연속 출혈(약 1.2ml 혈액/시점)은 각 시점에서 강제된 진정되지 않은 동물의 말초 혈관으로부터 습식 얼음에서 칼륨(K2) EDTA*2H2O(0.85-1.15mg)를 함유하는 시판용 튜브로 수행되었고, 혈장용으로 처리했다. 샘플을 수집 직후 원심분리하였다(3,000×g, 2 내지 8℃에서 10분 동안). 0.1mL의 혈장을 표지된 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브로 옮겼다. MeOH 중의 내부 표준 100ng/mL 라베탈롤 & 100ng/mL 덱사메타손 & 100ng/mL 톨부타미드 & 100ng/mL 베라파밀 & 100ng/mL 글리브리드 & 100ng/mL 셀레콕시브를 포함하는 침전제의 5배를 즉시 혈장에 첨가하고, 충분히 혼합하고, 12,000rpm에서 10분 동안 2 내지 8℃에서 원심분리하였다. 상청액의 샘플을 사전 표지된 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브로 옮기고 드라이 아이스로 동결시켰다. 샘플을 LC-MS/MS 분석까지 -60℃ 이하에 보관하였다. 40μL 교정 표준, 품질 관리, 단일 블랭크 및 이중 블랭크 샘플의 분취액을 1.5mL 튜브에 첨가했다. 각 샘플(이중 블랭크 제외)을 각각 200μL의 IS1로 급냉시키고(이중 블랭크 샘플은 0.5% tritonX-100을 포함하는 200μL의 MeOH로 급냉시켰다), 이어서 혼합물을 볼텍서를 사용하여 충분히 와동 혼합하고(적어도 15초), 12000g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 양이온 방식으로 Orbitrap Q Exactive를 사용하여 LC-MS/MS 분석을 위해 10μL의 상청액을 주입하여 분석물의 농도를 결정하였다. 혈장 농도 대 시간 데이터는 Phoenix WinNonlin 6.3 소프트웨어 프로그램을 이용한 비구획 접근법에 의해 분석되었다. C0, Cl, Vdss, T½, AUC(0-last), AUC(0-inf), MRT(0-last), MRT(0-inf) 및 혈장 농도 대 시간 프로파일의 그래프를 기록하였다. 3개의 이중특이적 화합물의 약동학적 매개변수는 표 7에 제시된 바와 같다.
[표 7]
Figure pct00140
도 3은 SD 래트(n=3)에서 2mg/kg IV 투여 및 시노몰구스 원숭이(n=2)에서 1mg/kg IV 주입으로부터의 BCY11863의 혈장 농도 대 시간 곡선을 도시한다. BCY11863은 4.1시간의 최종 반감기를 초래하는 래트에서 1.6L/kg의 정상 상태의 분포 용적(Vdss) 및 7.7mL/분/kg의 클리어런스를 갖는다. BCY11863은 5.3시간의 최종 반감기를 초래하는 시노에서 0.62L/kg의 정상 상태의 분포 용적(Vdss) 및 3.3mL/분/kg의 클리어런스를 갖는다.
도 12는 시노몰구스 원숭이(n=2)에서 15분 동안 1mg/kg IV 주입으로부터의 BCY12491의 혈장 농도 대 시간 곡선을 도시한다.
도 17은 SD 래트(n=3)에서 3.6mg/kg IV 주입(15분) 및 시노몰구스 원숭이(n=3)에서 9.2mg/kg IV 주입(15분)으로부터의 BCY13272의 혈장 농도 대 시간 곡선을 도시한다. BCY13272는 2.9시간의 최종 반감기를 초래하는 래트에서 1.0L/kg의 정상 상태의 분포 용적(Vdss) 및 7.5mL/분/kg의 클리어런스를 갖는다. BCY13272는 8.9시간의 최종 반감기를 초래하는 시노에서 0.82L/kg의 정상 상태의 분포 용적(Vdss) 및 4.1mL/분/kg의 클리어런스를 갖는다.
5. CD1 마우스에서 CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체의 약동학
6마리의 수컷 CD-1 마우스에게 25mM 히스티딘 HCl, 10% 수크로스 pH 7로 제형화된 각 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 15mg/kg을 복강내 또는 정맥내 투여를 통해 투여하였다. 연속 출혈(약 80μL 혈액/시점)은 각 시점에서 턱밑 또는 복재 정맥을 통해 수행되었다. 모든 혈액 샘플은 항응고제로서 2μL의 K2-EDTA(0.5M)를 함유하는 사전 냉각된 미세원심분리 튜브로 즉시 옮기고 습식 얼음 위에 놓았다. 혈액 샘플은 약 4℃, 3000g에서 원심분리로 혈장용으로 즉시 처리되었다. 내부 표준을 포함하는 침전제를 즉시 혈장에 첨가하고, 충분히 혼합하고, 12,000rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 사전 표지된 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브로 옮긴 다음, 드라이 아이스로 급속 동결시켰다. 샘플을 분석까지 필요에 따라 70℃ 이하에 보관하였다. 분석물의 농도를 결정하기 위해, 양이온 방식으로 Orbitrap Q Exactive를 사용하여 LC-MS/MS 분석을 위해 7.5μL의 상청액 샘플을 직접 주입하였다. 혈장 농도 대 시간 데이터는 Phoenix WinNonlin 6.3 소프트웨어 프로그램을 이용한 비구획 접근법에 의해 분석되었다. C0, Cl, Vdss, T½, AUC(0-last), AUC(0-inf), MRT(0-last), MRT(0-inf) 및 혈장 농도 대 시간 프로파일의 그래프를 기록하였다.
도 11은 CD1 마우스(n=3)에서 15mg/kg IP 투여량으로부터의 BCY11863 및 BCY12491의 혈장 농도 대 시간 곡선 및 BCY11863 및 BCY12491의 최종 혈장 반감기를 도시한다.
[표 7A]
Figure pct00141
도 11 및 상기 표 7A의 데이터는 BCY11863이 마우스에게 IV 볼루스 및 IP로 투여될 수 있음을 보여준다. BCY11863의 IP 투여에 의한 생체이용률은 마우스에서 높다. IV 연구의 PK 매개변수는 이것이 혈장 용적보다 더 큰 분포 용적을 갖는 낮은 클리어런스 분자임을 나타낸다.
도 17은 CD1 마우스(n=3)에서 5.5mg/kg IV 용량으로부터의 BCY13272의 혈장 농도 대 시간 곡선을 도시하고; BCY13272의 분포 용적(Vdss)은 1.1L/kg이고, 클리어런스는 최종 혈장 반감기 2.9시간을 초래하는 7.5mL/분/kg이다.
6. 동계 넥틴 -4 과발현 MC38 종양 모델(MC38#13)에서 BCY11863의 항종양 활성
6 내지 8주령의 C57BL/6J-hCD137 암컷 마우스의 옆구리에 1x106개의 동계 넥틴-4 과발현 MC38 세포(MC38#13)를 접종하였다. 종양이 평균 72mm3의 크기에 도달했을 때, 마우스는 비히클 또는 BCY11863(복강내 투여)을 받도록 무작위화되었다. BCY11863은 매일(QD) 또는 3일 마다(Q3D) 1mg/kg 또는 10mg/kg으로 투여되었다(n=6 마우스/치료 코호트). QD 투여 마우스는 16회 투여량의 BCY11863을 받았고, Q3D 투여 마우스는 10회 투여량의 BCY11863을 받았다. 종양 성장은 치료 개시 후 69일째까지 캘리퍼스 측정에 의해 모니터링되었다. 이 실험의 결과는 도 4에서 알 수 있으며, 여기서 7일째까지 2개 치료 코호트에서 종양 성장의 유의한 감소(p<0.05, 다중 비교를 위한 던넷 테스트(Dunnett's test)에 의한 2원 ANOVA)가 관찰되었고, 14일째까지 모든 치료 그룹은 비히클 그룹과 유의하게 상이했다. 48일째까지, 24마리의 BCY11863 치료 동물 중 22마리가 치료에 완전히 반응하였고, 촉지 가능한 종양은 잔류하지 않았다.
IP 주사(2.5시간) 후 마우스에서 BCY11863의 순환 혈장 반감기에 기초하여, BCY11863 투여량(1 및 10mg/kg) 및 투여 간격(QD 및 Q3D) 모두 후, 혈장 최저치는 0에 가까울 것이고, 따라서 간헐적인 투여로부터 BCY11863의 연속적인 혈장 노출 미만은 지속적인 완전한 반응으로 이어지는 유의한 항종양 활성을 유도하기에 충분하다는 것을 입증한다.
7. BCY11863 치료는 넥틴 -4 과발현 MC38 종양 모델에 대한 면역원성 기억을 유도한다
69일째에, BCY11863 치료에 완전히 반응한 5마리의 동물에 1x106개의 MC38#13 세포를 재접종하였다. 5마리의 나이브 C57BL/6J-hCD137 암컷 마우스의 코호트에 대조군으로서 1x106개의 MC38#13 세포를 접종하였다. 이 실험의 결과는 도 5에서 알 수 있고, 여기서 5마리의 접종된 나이브 C57BL/6J-hCD137 암컷 마우스는 모두 접종 후 13일째까지 종양이 성장되었지만, 접종된 완전 반응자 마우스 중 어느 것도 종양을 발생시키지 않았다. 이는 BCY11863 치료의 결과로 완전한 항종양 반응을 달성한 동물이 면역원성 기억을 발생시켰음을 입증한다.
8. BCY11863은 동계 넥틴 -4 과발현 CT26 종양 모델(CT26#7)에서 항종양 활성을 입증한다
6 내지 8주령의 BALB/c-hCD137 암컷 마우스의 옆구리에 3x105개의 동계 넥틴-4 과발현 CT26 세포(CT26#7)를 접종하였다. 종양이 평균 약 70mm3의 크기에 도달했을 때, 마우스는 3일마다 비히클 또는 5mg/kg BCY11863을 복강내로 받도록 무작위화되었다(총 6회 투여). 종양의 성장은 치료 개시 후 14일째까지 캘리퍼스 측정에 의해 모니터링되었다. 이 실험의 결과는 도 6에서 알 수 있고, 여기서 BCY11863 치료는 7일째 이후 종양 성장을 유의하게(p<0.0001, 스튜던츠 t-테스트) 감소시켰다.
IP 주사시(2.5시간) 마우스에서 BCY11863의 순환 혈장 반감기에 기초하여, 혈장 노출은 투여 기간 전반에 걸쳐 연속적이지 않으며, BCY11863의 지속적인 혈장 노출 미만이 유의한 항종양 활성을 유도하기에 충분하다는 것을 입증한다.
9. 총 T 세포 및 CD8+ T 세포는 BCY11863의 마지막(6번째) Q3D 투여 1시간 후에 CT26#7 종양 조직에서 증가한다
마지막 비히클 또는 BCY11863 투여 1시간 후, CD26#7 보유 마우스를 희생시키고, 종양을 채취하고, 단일 세포 현탁액을 위해 처리하고, 전체 T 세포(CD45+CD3+), CD8+ T 세포(CD45+CD3+CD8+), CD4+ T 세포(CD45+CD3+CD4+) 및 조절 T 세포(Treg; CD45+CD3+CD4+Foxp3+)에 대한 유세포 계측법 분석을 위해 염색했다. 이 실험의 결과는 도 7에 알 수 있고, 여기서 BCY11863 치료가 총 T 세포(p<0.0001, 스튜던츠 t-테스트) 및 CD8+ T 세포(p<0.0001, 스튜던츠 t-테스트)의 유의한 증가 및 CD8+ T 세포/Treg 비율의 유의한 증가(p<0.05, 스튜던츠 t-테스트)를 유도함을 알 수 있다.
이는 BCY11863에 의한 치료가 간헐적인 투여 후에 종양 조직에서 국소적으로 T 세포의 수준을 증가시킬 수 있음을 입증한다.
10. 5mg/kg의 BCY11863의 단일 정맥내 (iv) 투여 후 CT26#7 동계 종양 보유 동물의 혈장 및 종양 조직에서 BCY11863의 약동학적 프로파일
6 내지 8주령의 BALB/c 암컷 마우스의 옆구리에 3x105개의 동계 넥틴-4 과발현 CT26 세포(CT26#7)를 접종하였다. 종양이 평균 약 400mm3의 크기에 도달했을 때, 마우스를 무작위화하여 비히클 또는 5mg/kg BCY11863의 단일 정맥내 투여를 받았다. 마우스의 코호트(n=3/시점)를 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 및 24시간의 시점에서 희생시키고, 수거된 혈장 및 종양 조직을 BCY11863을 위해 분석하였다. 종양 BCY11863 함량 분석을 위해, 종양 조직을 10 용적(w:v)의 균질화 용액(MeOH/15mM PBS(1:2, v:v))으로 균질화하여 종양 균질물을 제조하였다. 40μL의 샘플을 200μL의 IS1로 급냉시키고, 혼합물을 800rpm에서 10분 동안 와동시켜 혼합하고, 4℃에서 3220g에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 다른 투명한 96-웰 플레이트로 옮기고 4℃에서 3220g에서 5분 동안 원심분리한 다음, 10.0μL의 상청액을 양이온 방식으로 Orbitrap Q Exactive를 사용하여 LC-MS/MS 분석을 위해 주입하여 분석물의 농도를 결정하였다. 혈장 BCY11863 함량 분석을 위해, 혈액 샘플을 K2-EDTA 튜브에 수집하고, 약 4℃, 3000g에서 원심분리에 의해 혈장으로 즉시 처리하였다. 40μL의 혈장 샘플을 200μL의 IS1로 급냉시키고, 혼합물을 800rpm에서 10분 동안 와동시켜 혼합하고, 4℃에서 3220g에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 다른 투명한 96-웰 플레이트로 옮기고, 4℃에서 3220g에서 5분 동안 원심분리한 다음, 10.0μL의 상청액을 양이온 방식으로 Orbitrap Q Exactive를 사용하여 LC-MS/MS 분석용으로 주입하여 분석물의 농도를 결정했다.
이 실험의 결과는 도 8에서 알 수 있고, 여기서 BCY11863 혈장 T1/2(1.65시간)와 종양 T1/2(13.4시간)의 차이에 의해 나타낸 바와 같이, 혈장 BCY11863이 순환으로부터 제거된 후, BCY11863이 종양 조직에 잔류되었음을 알 수 있다.
11. 동계 MC38 종양 모델에서 BCY12491의 항종양 활성
6 내지 8주령의 C57BL/6J-hCD137 암컷 마우스의 옆구리에 1x106개의 동계 MC38 세포를 접종하였다. 종양이 평균 76mm3의 크기에 도달했을 때, 마우스는 비히클 또는 BCY12491(복강내 투여)을 받도록 무작위화되었다. BCY12491은 5mg/kg 또는 15mg/kg으로 매일(QD) 또는 3일 마다(Q3D) 투여되었다(n=6 마우스/치료 코호트). QD 투여 마우스는 22회 투여량의 BCY12491을 받았고, Q3D 투여 마우스는 8회 투여량의 BCY12491을 받았다. 종양 성장은 치료 개시 후 73일째까지 캘리퍼스 측정에 의해 모니터링되었다. 이 실험의 결과를 도 9에서 알 수 있고, 여기서 종양 성장에 대한 BCY12491의 효과는 투여 기간의 처음 2주 동안 분명해지고, 종양 성장을 감소시키고, 다수의 치료된 종양의 용적의 감소를 유도한다는 것을 알 수 있다. 41일째까지, 24마리의 BCY12491 치료된 동물 중 15마리가 치료에 완전히 반응하였고, 촉지 가능한 종양은 잔류하지 않았다.
IP 주사(2.5시간) 후 마우스 마우스의 순환 혈장 반감기 BCY12491에 기초하여, BCY12491 투여량(5 및 15mg/kg) 및 투여 간격(QD 및 Q3D) 둘 다 후, 혈장 최저치는 0에 가까울 것이고, 따라서 간헐적 투여에 의한 BCY12491의 지속적인 혈장 노출 미만이 유의한 항종양 활성과 지속적인 완전한 반응을 유도하기에 충분하다는 것을 입증한다.
12. EphA2 /CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY12491 , BCY13272, BCY12723 , BCY13050 , BCY13048 및 BCY13047은 MC38 공배양 검정에서 IFN-γ 사이토카인 분비를 유도한다
마우스 유선 종양 세포주 MC38은 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청(FBS), 1x 페니실린/스트렙토마이신, 10mM HEPES, 및 2mM L-글루타민이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(R10 배지로서 지칭됨)에서 배양했다. 건강한 인간 공여자의 냉동 PBMC를 해동시키고, 벤조나제를 포함하는 실온 PBS로 1회 세척한 후, 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS), 1x 페니실린/스트렙토마이신, 10mM HEPES 및 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI(본원에서 R10 배지로서 지칭됨)에 재현탁시켰다. 100μl의 PBMC(1,000,000 PBMC/ml) 및 100μl의 종양 세포(100,000 종양 세포/ml)(이펙터:표적 세포 비(E:T) 10:1)를 공배양 검정용 96-웰 평저 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 100ng/ml의 가용성 항-CD3 mAb(클론 OKT3)를 0일째에 배양물에 첨가하여 인간 PBMC를 자극하였다. 시험, 대조군 화합물 또는 비히클 대조군을 R10 배지에서 희석하고, 50μL를 각각의 웰에 첨가하여 웰당 최종 용적이 250μL가 되도록 했다. 플레이트를 통기성 필름으로 덮고 가습 챔버 내에서 37℃, 5% CO2에서 2일 동안 배양했다. 자극 후 24시간 및 48시간에 상청액을 수집하고, Luminex에 의해 인간 IFN-γ가 검출되었다. 간단히 설명하면, 표준 및 샘플을 검정색 96 웰 플레이트에 추가했다. 미립자 칵테일(Luminex 키트에 제공됨, R & D Systems)을 추가하고, 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 자기 홀더를 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 이어서, 비오틴 칵테일을 플레이트에 첨가하고, RT에서 1시간 동안 진탕시켰다. 자기 홀더를 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 스트렙타비딘 칵테일을 플레이트에 첨가하고 RT에서 30분 동안 진탕시켰다. 플레이트를 자기 홀더를 사용하여 3회 세척하고, 100μL의 세척 완충제에 재현탁시키고, RT에서 2분 동안 진탕시키고, Luminex 2000을 사용하여 판독하였다. 원시 데이터를 내장 Luminex 소프트웨어를 사용하여 분석하여 표준 곡선을 생성하고, 단백질 농도를 보간하고, 다른 모든 데이터 분석 및 그래프 분석은 Excel 및 Prism 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 데이터는 실험 복제물에서 테스트된 3개의 독립적인 공여자 PBMC를 사용하는 하나의 연구를 나타낸다.
도 10에 제시된 데이터는 EphA2/CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체 BCY12491이 두 명의 다른 인간 공여자의 PBMC를 사용하여 34pM(도 10a = 공여자 228769) 또는 85pM(도 10b = 공여자 228711)의 EC50과 함께 MC38 공배양 검정에서 IFN-γ 사이토카인 분비를 유도함을 입증한다. BCY12762는 BCY12491과 동일한 친화도로 EphA2에 결합하지만 CD137에는 결합하지 않는 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체이다.
유사하게, 건강한 공여자의 PBMC는 항-CD3 및 BCY13272의 존재하에 5:1의 비율로 EphA2 발현 암 세포(MC38 및 HT-1080)와 공배양되었다. 상청액을 48시간 후 Luminex에 의해 사이토카인(IL-2 및 IFNγ)에 대해 분석되었고, 데이터는 표 8에 제시되어 있고, 1명의 공여자의 PBMC의 대표이다(총 n= 4 또는 5회의 개별 실험으로부터).
[표 8]
Figure pct00142
도 26에 제시되고, 표 8A에 표로 나타낸 데이터는 EphA2/CD137 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체가 나노몰 이하의 효능으로 MC38 공배양 검정에서 IFN-γ 사이토카인 분비를 유도함을 입증한다.
[표 8A]
Figure pct00143
13. 원발성 환자 유래 폐 종양의 생체외 배양에서 표적 의존성 사이토카인 방출
Discovery Life Sciences(DLS)에서 원발성 환자 유래 종양 세포를 벤조나제로 새로 스파이킹된 10mL의 예열된 세척 배지에서 부드럽게 해동시켰다. Greiner의 3D 회전 타원체 키트(cat# 655840)를 사용하여 세포를 2일 동안 배양에 유지시킨다. 간단히, 혈구 계산기를 사용하여 트리판 블루로 종양 세포를 계수했다. 세포를 1500rpm으로 5분간 원심분리하여 세척하고, 펠릿을 1 x 106개 세포의 N3D 나노셔틀당 100μL에 재현탁시킨다. 그들을 자성으로 만들기 위해, 세포를 1500rpm에서 5분 동안 스핀 다운하고 재현탁시켰고; 이 과정을 총 4회 반복한다. 마지막 스핀 후, 세포를 적절한 양의 신선한 폐 DTC 배지(DLS)에 재현탁시켜 100μL/웰로 웰당 50,000 내지 100,000개의 세포를 생성하였다. 이 실험에는 Greiner 세포 기피제의 96-웰 플레이트(cat #655976)를 사용하였다. 세포 덩어리 또는 파편이 가시화된 경우, 플레이팅 전에 샘플을 70-100μm 필터에 적용한다. 샘플당 적어도 50,000개의 세포를 0일째 유세포 계측 패널용으로 보유하였고, 이들 세포를 염색하고, 고정시키고 이후 흐름 분석을 위해 4℃에서 저장하였다. 대조군/시험 화합물 희석액을 폐 DTC 배지에서 2배로 다른 플레이트에서 제조하고, 플레이트 맵에 기재된 바와 같이, 이러한 2배의 약물 용액의 100μL/웰을 웰에 첨가하였다. 이어서, 검정 플레이트를 37℃, 5% CO2의 가습 챔버 내의 96-웰 자기 회전 타원체 드라이브 상에 위치시켰다. 24시간에, 자기 회전 타원체 드라이브가 제거되었다. 48시간에, 사이토카인 분석을 위해 배지를 수집하고, 2일째 유세포 계측 패널을 위해 세포를 수집하였다. 사이토카인은 Luminex 판독기 상의 R & D 시스템의 맞춤형 사이토카인/케모카인 패널(IP-10, 그랜자임 B, IFNγ, IL-2, IL-6, TNFα, IL-8, MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, IL-10, MIG)을 사용하여 정량화했다. 흐름 패널: 0일째 = 생/사망, CD45, EpCAM, 넥틴4, CD3, CD4, CD8, CD137; 2일째 = 생/사망, CD45, EpCAM, 넥틴4, CD3, CD8, Ki67 및 계수 비드. 흐름 데이터는 Flowjo 소프트웨어로 분석된다.
도 13에 제시된 데이터는 넥틴-4/CD137 헤테로탠덤 BCY11027이 원발성 환자 유래 폐 종양의 생체외 배양에서 표적 의존성 사이토카인 방출을 유도함을 입증한다. BCY11027에 의한 치료는 여러 면역 마커(비히클로 정규화됨) 및 넥틴-4 발현 수준과 연관된 환자 유래 샘플의 %CD8+ki67+T 세포에서 넥틴-4 의존적 변화를 유도하였다.
14. 종양 세포와의 공배양에서 프로메가 OX40 세포 활성 검정
프로메가는 Jurkat 세포(프로메가 CS197704)에서 OX40 활성화의 판독값으로 NF-κB 루시퍼라제 발광을 사용하는 OX40 세포 활성 검정을 개발하였다. 실험 당일에, FBS를 해동하고 RPMI-1640에 5% FBS를 첨가하여 배지를 제조한다. OX40 Jurkat 세포를 수조에서 해동한 다음, 500μl의 세포를 11.5mL의 예열된 5% FBS RPMI-1640 배지에 첨가한다. 55μl 세포/웰을 백혈구 배양 플레이트에 첨가한다. 배양물로부터 종양 세포를 수거한다. 4T1은 넥틴-4 음성 뮤린 유선 상피암 세포이며, 세포 표면에서 뮤린 넥틴-4를 발현하도록 유전자 변형되었다(4T1 넥틴-4 양성; 클론 4T1-D02). 종양 세포를 10% 열 불활성화 FBS, 1X 페니실린/스트렙토마이신, 1X L-글루타민, 20mM HEPES 및 1X NEAA(RPMI 작업 배지)가 보충된 RPMI1640 배지에서 시험관내에서 80% 컨플루언시까지 배양하였다. 종양 세포를 트립신화하고, 37℃로 예열된 RPMI1640 작업 배지에서 5분 동안 1500rpm으로 2회 세척하였다. 세포를 계수하고, R5 배지에 2,000,000 세포/mL로 재현탁시킨다(10,000 세포/웰의 경우). 웰당 5μL의 종양 세포를 첨가한다.
최대 배수 유도를 제공하는 농도로 작용제를 희석한 다음, 멸균 96 웰 플레이트에서 양을 적정한다. 복제 샘플에 충분한 시약을 제조한 후 1/3 희석 계열 또는 1/10 희석 계열을 수행한다. 양성 대조군 OX40L 삼량체(AcroBiosystems, R&D systems) 및 음성 대조군 단량체 또는 비결합 펩티드를 포함한다. 20μl의 작용제를 복제 샘플로, 또는 5% FBS RPMI-1640 단독을 배경 대조군으로 첨가한다.
세포를 작용제와 함께 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 공배양한다. 6시간 후 Bio-Glo™를 해동하고 실온에서 검정을 개발한다. 웰당 80μl의 Bio-Glo™를 추가하고 5 내지 10분 동안 배양한다. MARS 프로그램을 사용하여 CLAIROStar 플레이트 판독기 상의 루시퍼라제 신호를 판독하고, 배경(배지 단독)에 대한 배수 유도를 정규화한다. 데이터를 x=log(X)로 변환하여 데이터를 분석하고, log(작용제) 대 반응 변수 기울기(4개 매개변수)를 플롯팅하여 EC50 값을 계산한다.
이 검정의 결과는 표 9 및 도 14에 제시되어 있고, 여기서 BCY12967 넥틴-4:OX40 화합물은 OX40L 및 비결합 대조군 펩티드 BCY12968과 비교하여 넥틴-4 양성 4T1-D02 세포와 공배양시 강력한 OX40 효능 작용을 나타냈음을 알 수 있다.
[표 9]
Figure pct00144
15. EphA2:CD137 1:2 헤테로탠덤 복합체의 투여는 마우스 종양 모델에서 극적인 면역 반응을 유도한다
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J-hCD137 마우스[B-hTNFRSF9(CD137) 마우스; Biocytogen]는 1x106개의 MC38 세포를 피하 이식하였다. 평균 종양 용적이 약 240mm3에 도달될 때, 마우스를 치료 그룹으로 무작위화하고, 비히클(25mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 7) 정맥내(IV), 15mg/kg BCY12491(EphA2:CD137 1:2 헤테로탠덤 복합체) IV, 15mg/kg BCY13626(EphA2의 비결합 대조군) IV 또는 2mg/kg 항-CD137 (우렐루맙 유사체) 복강내 치료했다(n = 6/치료 코호트). 모든 치료는 3회 투여량에 대해 Q3D 제공되었고, 종양 조직은 마지막 투여 1시간 후에 수거되었다. 종양 조직의 일부는 전사 분석을 위한 RNA 단리에 사용되었고, 종양 조직의 일부는 면역조직화학(IHC) 분석을 위한 포르말린 고정된 파라핀 매립(FFPE) 샘플 제조에 사용되었다. RNAeasy 키트[Qiagen]를 사용하여 종양 조직에서 RNA를 단리시키고, 100ng RNA/종양의 nCounter Mouse PanCancer IO 360 패널(Nanostring)을 사용하여 전사 분석을 수행했다. nSolver 분석 소프트웨어(Nanostring)를 사용하여 데이터를 분석했다. CD8+ 종양 침윤성 세포를 항-마우스 CD8 항체(Abcam, #ab217344) 및 Ventana Discovery OmniMap 항토끼-HRP 키트(Ventana #760 4310)를 사용하여 FFPE 조직 절편으로 염색하였다.
이 연구의 결과는 도 15a-d에 제시되어 있고, 여기서 전사 분석이 비히클 처리 마우스의 종양과 비교할 때 EphA2 BCY12491 치료시 종양 조직에서 세포독성 세포 스코어(도 15a), 대식세포 세포(도 15b) 및 T 세포 스코어(도 15c)와 같은 면역 세포 스코어의 유의한 증가를 나타냈음이 관찰될 수 있다. 항-CD137 항체 치료는 또한 BCY12491보다 적은 정도이지만, 종양 조직에서 세포독성 세포 스코어 및 T 세포 스코어를 유의하게 증가시켰다. 비결합 대조군(BCY13626) 처리된 동물의 종양 조직에서 면역 세포 스코어에는 변화가 관찰되지 않았다. 종양 조직에서 CD8+ 세포의 IHC 분석은 비히클 또는 비-결합자 BCY13626 처리 마우스의 종양과 비교했을 때 BCY12491 치료 마우스의 종양에서 CD8+ 세포의 강한 침윤을 입증했다(도 15d). CD8+ 세포 침윤의 일부 증가는 항-CD137 항체로 처리된 마우스의 종양에서 또한 관찰되었다. 종양 조직의 면역 세포 스코어 및 CD8+ 세포의 이러한 변화는 EphA2:CD137 1:2 헤테로탠덤 복합체 BCY12491에 의한 종양 조직에서 CD137의 효능 작용이 종양 침윤성 면역 세포 및 면역 반응의 유의한 조절(증가)로 이어짐을 나타낸다.
16. 동계 MC38 종양 모델에서 BCY13272의 항종양 활성
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J-hCD137 마우스[B-hTNFRSF9(CD137) 마우스; Biocytogen]는 1x106개의 MC38 세포를 피하 이식하였다. 평균 종양 용적이 약 80mm3에 도달할 때 마우스를 치료군(n=6/코호트)으로 무작위화하고, 비히클(25mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 7) 정맥내(IV), 8mg/kg BCY13272, 0.9mg/kg BCY13272 및 0.1mg/kg BCY13272 IV로 처리했다. 모든 치료는 일주일에 2회(BIW), 총 6회 투여량으로 제공되었다. 종양 성장은 치료 개시부터 28일째까지 모니터링되었다. 완전 반응자 동물(n=7)은 치료 개시 후 62일째까지 추적되었고, 2x106개의 MC38 종양 세포의 이식으로 재도전되었고, 종양 성장은 28일 동안 모니터링되었다. 병행하여, 나이브 연령 일치된 대조군 huCD137 C57Bl/6 마우스(n=5)는 28일 동안 모니터링된 2x106개의 MC38 종양 세포를 이식하였다. 이 실험의 결과는 도 18에서 알 수 있고, 여기서 BCY13272가 유의한 항종양 활성을 초래하고, 완전한 반응은 0.9(6명의 완전한 반응자 중 2명) 및 8mg/kg(6명의 완전한 반응자 중 5명) 투여량 수준에서 관찰되었음을 알 수 있다(도 18a). 나이브 연령 일치된 대조군 huCD137 C57Bl/6 마우스(종양 점유율 100%)와는 달리, BCY13272 완전 반응자 동물에서는 종양 재성장이 관찰되지 않았다(도 18b). 이러한 데이터는 BCY13272가 유의한 항종양 활성을 가지며, BCY13272 치료가 완전한 반응자 동물에서 면역원성 기억으로 이어질 수 있음을 나타낸다.
17. SPR로 측정된 EphA2 및 CD137에 대한 BCY13272의 결합
(a) CD137
Biacore 실험을 수행하여 인간 CD137 단백질에 대한 헤테로탠덤 펩티드 결합의 ka(M-1s-1), kd(s-1), KD(nM) 값을 결정하였다. 재조합 인간 CD137(R&D systems)을 PBS에 재현탁시키고, 제조자 제안 프로토콜에 따라 EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-LC-비오틴 시약(Thermo Fisher)을 사용하여 비오티닐화하였다. 단백질을 탈염시켜 스핀 컬럼을 사용하여 결합되지 않은 비오틴을 PBS로 제거하였다.
펩티드 결합의 분석을 위해, Biacore T200 또는 Biacore 3000 장비를 XanTec CMD500D 칩과 함께 사용하였다. 스트렙타비딘은 HBS-N(10mM HEPES, 0.15M NaCl, pH 7.4)을 작동 완충액으로서 사용하여 25℃에서 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 칩에 고정시켰다. 간단히, 카르복시메틸 덱스트란 표면은 10μL/분의 유속으로 0.4M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)/0.1M N-하이드록시 석신이미드(NHS)의 1:1 비의 7분 주입으로 활성화시켰다. 스트렙타비딘의 포획을 위해, 단백질을 10mM 나트륨 아세테이트(pH 4.5)에서 0.2 mg/ml로 희석하고, 활성화된 칩 표면에 120μl를 주입하여 포획하였다. 나머지 활성화 그룹은 1M 에탄올아민(pH 8.5)의 7분 주입으로 차단되었고, 비오티닐화 CD137은 270 내지 1500 RU 수준으로 포획되었다. 완충액을 PBS/0.05% Tween 20으로 변경하고, 펩티드의 희석 시리즈를 이 완충액에서 최종 DMSO 농도 0.5%로 제조하였다. 최상의 펩티드 농도는 6개의 추가의 2배 또는 3배 희석물과 함께 500nM였다. SPR 분석은 60초 결합 및 900초 해리로 25℃에서 90μl/분의 유속으로 수행되었다. 각 사이클 후, 재생 단계(10μL의 10mM 글리신 pH 2)를 사용하였다. 필요한 경우 DMSO 배재된 용적 효과에 대해 데이터를 수정했다. 모든 데이터는 표준 처리 절차를 사용하여 블랭크 주입 및 참조 평면을 위해 이중 참조되었으며, 데이터 처리 및 동적 피팅은 Scrubber 소프트웨어 버전 2.0c(BioLogic Software)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 경우에 따라 질량 전달 효과를 허용하는 간단한 1:1 결합 모델을 사용하여 적합화했다.
(b) EphA2
비아코어 실험을 수행하여 인간 EphA2 단백질에 결합하는 BCY13272의 ka(M-1s-1), kd(s-1), KD(nM) 값을 결정하였다.
EphA2는 단백질보다 3배 몰 과량의 비오틴으로 EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-비오틴을 사용하여 4mM 나트륨 아세테이트, 100mM NaCl, pH 5.4에서 1시간 동안 비오티닐화하였다. 표지화 정도는 반응 혼합물을 PBS로 투석 후 형광 비오틴 정량화 키트(Thermo)를 사용하여 결정되었다. 펩티드 결합의 분석을 위해, XanTec CMD500D 칩이 장착된 Biacore T200 장비를 사용하였다. 스트렙타비딘은 HBS-N(10mM HEPES, 0.15M NaCl, pH 7.4)을 작동 완충액으로 사용하여 25℃에서 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 칩에 고정시켰다. 간단히, 카르복시메틸 덱스트란 표면은 10μl/분의 유속으로 0.4M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)/0.1M N-하이드록시 석신이미드(NHS)의 1:1 비의 7분 주입으로 활성화했다. 스트렙타비딘의 포획을 위해, 단백질을 10mM 나트륨 아세테이트(pH 4.5)에서 0.2 mg/ml로 희석하고, 활성화된 칩 표면에 120μl를 주입하여 포획하였다. 나머지 활성화 그룹은 1M 에탄올아민(pH 8.5):HBS-N(1:1)의 7분 주사로 차단하였다. 완충액을 PBS/0.05% Tween 20으로 변경하고, 비오티닐화 EphA2를 완충액에서 0.2μM로의 단백질 희석을 사용하여 500 내지 1500 RU 수준으로 포획하였다. 펩티드의 희석 시리즈는 최고 펩티드 농도가 50 또는 100nM였고, 6회의 추가 2배 희석물을 갖는 최종 DMSO 농도와 함께 이 완충액에서 제조하였다. SPR 분석은 60초 결합과 900 내지 1200초 해리로 25℃에서 90μl/분의 유속으로 수행되었다. DMSO 배제된 용적 효과에 대해 데이터가 수정되었다. 모든 데이터는 표준 처리 절차를 사용하여 블랭크 주입 및 참조 평면를 위해 이중 참조되었으며, 데이터 처리 및 동적 피팅은 Scrubber 소프트웨어 버전 2.0c(BioLogic Software)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 경우에 따라 질량 전달 효과를 허용하는 간단한 1:1 결합 모델을 사용하여 적합화했다.
도 20a는 BCY13272가 2.0nM의 친화도로 EphA2(인간)에 결합함을 입증하는 센서그램을 도시한다. 도 20b는 BCY13272가 CD137(인간)에 높은 친화도로 결합하는 센서그램을 도시한다. BCY13272에 2개의 CD137 결합 바이사이클릭의 존재로 인해, 고정된 CD137 단백질로부터의 오프 속도는 매우 느리고, 기록된 KD는 과대평가일 수 있다(도 19b).
18. 4개의 전임상 종에 걸친 넥틴 -4 및 CD137에 대한 BCY11863의 결합
BCY11863의 1차 표적 넥틴-4 및 CD137에 대한 결합은 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 특성화되었다.
(a) 넥틴 -4
BCY11863은 비오티닐화되고 스트렙타비딘 센서 칩 표면에서 포획된 세포외 도메인에 직접 결합함으로써 측정된 5 내지 27nM의 KD로 시노, 래트, 마우스 및 인간 넥틴-4에 결합한다.
[표 10]
Figure pct00145
넥틴-4에 대한 BCY11863의 결합이 삼원 복합체의 맥락에서, 즉 또한 CD137에 결합된 경우, 변경되었는지를 이해하기 위해, 다성분 SPR 결합 검정이 개발되었다. BCY11863은 먼저 SPR 칩 표면에 고정된 인간 CD137에 포획되었고, 다음으로 상이한 종의 넥틴-4가 칩을 통과하여 포획된 BCY11863에 대한 친화성을 결정하였다(도 21c 참조). 넥틴-4에 대한 친화성은 일반적으로 이하 제시된 바와 같은 CD137 결합의 존재하에 유지되었다.
[표 11]
Figure pct00146
(b) CD137
표면 결합된 CD137에 대한 BCY11863의 직접 결합은 SPR에 의해 정확하게 측정될 수 없는데, 이는 매우 느린 koff로 이어지는 BCY11863의 2개의 CD137 결합 바이사이클로부터의 결합력 때문이다(도 21b 참조). 또한, 시노 CD137의 비오티닐화는 아마도 BCY11863 결합에 중요한 시노 단백질 상의 리신의 변형 때문에 BCY11863의 결합을 폐기한다. 따라서, C-말단 비오티닐화 리신을 함유하는 BCY11863 유사체(BCY13582)를 SPR로 시험하여 BCY11863의 교차 종 특이성을 결정하였다. 가역적 비오틴 포획 키트를 사용하여 BCY13582를 센서 칩에 포획하고 상이한 종의 넥틴-4에 대한 친화성을 결정하였다. 두 전략은 이들 BCY11863 유사체가 KD < 10nM로 인간 및 시노 CD137에 결합되고, 마우스 및 래트 CD137 모두에 대해 무시할 만한 결합을 가졌음을 보여주었다.
[표 12]
Figure pct00147
BCY11863의 CD137에 대한 결합이 삼원 복합체의 맥락에서, 즉 또한 넥틴-4에 결합되었을 때 변경되었는지를 이해하기 위해, 이중 결합 SPR 결합 검정이 개발되었다. BCY11863은 먼저 SPR 칩 표면에 고정된 인간 넥틴-4에 포획되었고, 이어서 상이한 종으로부터의 가용성 CD137이 칩을 통과하여 포획된 BCY11863에 대한 친화성을 결정하였다(도 21d 참조). CD137에 대한 친화성은 일반적으로 이하 제시된 바와 같이 넥틴-4 결합의 존재하에 유지되었다:
[표 13]
Figure pct00148
도 21a는 BCY11863이 4.1nM의 친화성으로 넥틴-4(인간)에 결합함을 입증하는 일례의 센서그램을 도시한다. 도 21b는 BCY11863이 CD137(인간)에 높은 친화성으로 결합하는 센서그램을 도시한다. BCY11863에 2개의 CD137 결합 바이사이클릭의 존재로 인해, 고정된 CD137 단백질로부터의 오프 속도는 매우 느리고, 기록된 KD는 과대평가일 수 있다(도 21b). 도 21c는 BCY11863이 넥틴-4에 결합하는 반면, CD137 암이 칩에 고정된 CD137 단백질에 결합하여 삼원 복합체를 형성함을 보여준다. 도 21d는 BCY11863이 CD137에 결합하는 반면, 넥틴-4 결합 암이 칩에 고정된 넥틴-4 단백질에 결합하여 삼원 복합체를 형성함을 보여준다. 도 21e는 인간 CD137에 결합하는 SPR 칩에 고정된 BCY13582의 능력을 입증한다.
19. 넥틴 -4 및 CD137에 대한 BCY11863의 선택성
넥틴-4 파라로그 스크리닝: BCY11863의 결합은 비오틴으로 표지하고 스트렙타비딘 표면에 고정시킴으로써 넥틴-1(2880-N1, R&D Systems), 넥틴-2(2229-N2, R&D Systems), 넥틴-3(3064-N3, R&D Systems), 넥틴-유사-1(3678-S4-050, R&D Systems), 넥틴-유사-2(3519-S4-050, R&D Systems), 넥틴-유사-3(4290-S4-050, R&D Systems), 넥틴-유사-4(4164-S4, R&D Systems) 및 넥틴-유사-5(2530-CD-050, R&D Systems)에 대해 SPR을 사용하여 평가했다. BCY11863은 5000nM 농도까지 이러한 표적에 대한 임의의 결합을 나타내지 않았다.
CD137 파라로그 스크리닝: 스트렙타비딘 포획된 BCY13582(비오티닐화 BCY11863)의 결합은 가용성 TNF 패밀리 수용체 OX40 및 CD40에 대한 SPR을 사용하여 평가되었다. BCY13582는 100nM 농도까지 이러한 표적에 결합하지 않았다.
Retrogenix 마이크로어레이 스크리닝: Retrogenix의 세포 마이크로어레이 기술을 사용하여 BCY13582로서 공지된 비오티닐화 BCY11863의 특정 표적외 결합 상호작용을 스크리닝했다.
고정된 형질감염되지 않은 HEK293 세포 및 넥틴-4 및 CD137(TNFRSF9)을 과발현하는 세포에 대한 시험 펩티드의 결합 수준의 조사는 1μM의 시험 펩티드가 적절한 스크리닝 농도임을 나타냈다. 이러한 조건하에, 시험 펩티드를 인간 HEK293 세포에 대한 결합에 대해 스크리닝하고, 5484개의 전장 인간 원형질막 단백질 및 분비된 단백질을 개별적으로 발현시켰다. 이것은 넥틴-4와 CD137을 포함한 9개의 주요 히트를 나타냈다.
각각의 1차 히트는 2개의 대조군 수용체(TGFBR2 및 EGFR)와 함께 재발현되었고, 1μM BCY13582 시험 펩티드, 100μM BCY11863의 존재하의 1μM BCY13582 시험 펩티드, 및 기타 양성 및 음성 대조군 치료로 재시험되었다(도 4). 비특이적이고, 재현 가능하지 않고 유의하지 않은 히트를 제거한 후, 시험 펩티드에 대해 3개의 특이적 상호작용이 잔류했다. 이들은 넥틴-4 및 CD137-1차 표적의 비결합 형태 및 결합 형태가 존재했다.
BCY13582에 대해 특이적 표적외 상호작용은 동정되지 않았으며, 그의 1차 표적에 대한 높은 특이성을 나타낸다.
20. 0, 24시간에 5mg/kg 및 0시간에 10mg/kg으로 주 2회 투여시 동계 넥틴 -4 과발현 MC38 종양 모델(MC38#13)에서 BCY11863의 항종양 활성
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J-hCD137 마우스[B-hTNFRSF9(CD137) 마우스; Biocytogen]는 1x106개의 MC38#13(뮤린 넥틴-4를 과발현하도록 조작된 MC38 세포) 세포를 피하 이식하였다. 평균 종양 용적이 약 95mm3에 도달하면, 마우스를 치료 군(n=6/코호트)에 무작위화하고, 2개의 투여 사이클 동안 2개의 다른 투여 스케쥴(D0 및 D7째에 0시간 및 24시간에 5mg/kg BCY11863, 또는 D0 및 D7째에 0시간에 10mg/kg)을 사용하여 비히클(25mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 7)의 1주 용량 또는 10mg/kg BCY11863으로 치료했다. 모든 치료는 정맥내(IV) 투여되었다. 종양 성장은 치료 개시부터 15일째까지 모니터링되었다.
BCY11863은 양 투여 스케줄로 유의한 항종양 활성을 유도하지만, 치료 개시 후 15일째에 완전한 반응이 분석된 경우, 0시간 및 24시간에 5mg/kg 투여에 의한 투여 스케줄이 0시간에 10mg/kg 투여보다 우수하였다(도 23). D0 및 D7째에 0시간 및 24시간에 5mg/kg BCY11863의 투여는 6개의 완전한 종양 반응 중 4개를 초래하였으나, D0 및 D7째 0시간에 10mg/kg BCY11863의 투여는 6개의 완전한 종양 반응 중 하나를 초래했다. BCY11863 마우스 혈장 PK 데이터와 함께 이러한 데이터는 BCY11863 혈장 노출을 매주 주기로 5mg/kg 0시간 및 24시간 투여에 의해 생성된 수준으로 유지할 때 MC38#13 종양 모델에서 거의 완전한 항종양 반응을 생성함을 나타낸다.
21. 동계 넥틴 -4 과발현 MC38 종양 모델(MC38#13)에서 BCY11863의 항종양 활성
매주, 2주 마다 및 매일 분획화된 투여량으로 3, 10 및 30mg/kg의 주 3회 투여로, 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J-hCD137 마우스[B-hTNFRSF9(CD137) 마우스; Biocytogen]는 1x106개의 MC38#13(뮤린 넥틴-4를 과발현하도록 조작된 MC38 세포) 세포를 피하 이식하였다. 평균 종양 용적이 약 107mm3에 도달했을 때, 마우스를 치료군(n=6/코호트)으로 무작위화하고, 21회의 1일 용량의 비히클(25mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 7)로 치료하였다. BCY11863 치료는 3가지 상이한 스케줄(QD: 매일, BIW: 주 2회, 또는 QW: 매주)로 분획화된 3개의 상이한 총 투여량 수준(3, 10 및 30mg/kg의 총 매주 용량)에서 수행되었다. 상이한 BCY11863 치료 코호트는 21회의 1일 용량(0.43, 1.4 또는 4.3mg/kg), 6회의 주 2회 용량(1.5, 5, 또는 15mg/kg), 또는 3회의 매주 용량(3, 10 또는 30mg/kg) 중 어느 하나를 받았다. 모든 치료는 정맥내(IV) 투여되었다. 종양이 2000mm3 초과의 용적에 도달할 때까지 또는 치료 개시 후 31일째까지 종양 성장을 모니터링하였다. 완전한 반응자(촉지 가능한 종양이 없는 동물)는 D52까지 추적되었다.
BCY11863은 다수의 투여 스케줄로 유의한 항종양 활성을 초래하고, BIW 투여 스케줄이 가장 효과적인 스케줄이며, 특히 5mg/kg BIW 투여량이 그렇다. 이는 52일째의 완전 반응자 동물의 수로 입증된다. 치료 개시 후 52일째에, BCY11863으로 BIW 치료된 15/18 마우스가 완전 반응자였고, BCY11863으로 QD 치료된 12/18 마우스가 완전 반응자이며, BCY11863으로 QW 치료된 6/18 마우스가 완전 반응자였다. 5mg/kg의 BIW 투여는 6/6 CR로 100% 완전 반응률을 유도한다(도 24). BCY11863 마우스 혈장 PK 데이터와 함께 이들 데이터는 MC38#13 종양 모델에서 BCY11863에 대한 항종양 반응에 연속적인 BCY11863 혈장 노출이 필요하지 않음을 나타낸다.
22. EphA2 헤테로탠덤 바이사이클릭 복합체의 생체내 효능 연구
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J-hCD137 마우스[B-hTNFRSF9(CD137) 마우스; Biocytogen]는 1x106개의 MC38 세포를 피하 이식하였다. 평균 종양 용적이 약 76mm3에 도달했을 때, 마우스를 치료군(n=6/코호트)으로 무작위화하고, 1일 용량의 비히클(25mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 7)로 처리하였다. BCY12491 치료는 2개의 상이한 용량 수준(5 및 15mg/kg) 및 2개의 상이한 투여 스케줄(QD: 매일; Q3D: 3일 마다)로 수행되었다. 동물은 복강내로(ip) 22회의 QD 용량 또는 8회의 Q3D 용량을 받았다. 종양이 2000mm3 초과의 용적에 도달할 때까지 또는 치료 개시 후 73일째까지 종양 성장을 모니터링하였다. 73일 후, 5마리의 완전 반응자 동물을 5마리의 나이브 C57BL/6J-hCD137 마우스와 함께 MC38 종양 세포 이식으로 재도전하였다. 종양 성장을 20일 동안 모니터링하였다.
BCY12491은 연구에 사용된 모든 용량 및 투여 스케줄에서 유의한 항종양 활성을 유도하였다. 치료 개시 후 41일째까지, 6마리의 BCY12491 5mg/kg Q3D 치료 동물 중 2마리가 완전 반응자가 되었고(CR; 촉지 가능한 종양이 남지 않음), 6마리의 BCY12491 5mg/kg QD 치료 동물 중 3마리가 CR이 되었고, 6마리의 BCY12491 15mg/kg Q3D 치료 동물 중 4마리가 CR이 되었고, BCY12491 15mg/kg QD 치료 동물 모두(6/6) CR이 되었다. 이들 데이터는 BCY12491 마우스 혈장 PK 데이터와 함께 MC38 종양 모델에서 BCY12491에 대한 최대 항종양 반응에 연속적인 BCY12491 혈장 노출이 필요하지 않음을 나타낸다. 또한, 완전 반응자 동물은 MC38 종양 세포 이식에 의한 재도전을 거부하였고 임의의 종양 성장을 나타내지 않은 반면, 동일한 종양 세포와 동시에 이식된 나이브 마우스는 종양 세포 이식 후 22일째까지 100% 점유율로 종양 성장을 확립하였다. 이는 BCY12491 치료시 면역원성 기억의 개발이 완전한 종양 반응을 일으킨다는 것을 나타낸다(도 27).
상이한 면역 세포 집단의 BCY12491 활성의 의존성은 CD8+ T 세포 또는 NK 1.1+ NK 세포가 고갈된 MC38 종양 보유 C57BL/6J-hCD137 마우스를 BCY12491로 치료하는데에서 결정되었다. 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J-hCD137 마우스[B-hTNFRSF9 (CD137) 마우스; Biocytogen]는 1x106개의 MC38#13 세포(넥틴-4를 과발현하도록 조작된 MC38의 클론)를 피하 이식하였다. 세포 이식 3일 후, 마우스는 비히클(PBS), 100μg의 고갈 항-CD8(Rat IgG2b, 클론 2.42) 또는 항-NK(마우스 IgG2a, 클론 PK136) 항체 (또는 그들의 조합) 또는 상응하는 아이소타입 대조군 항체(래트 IgG2b 아이소타입 대조군 또는 마우스 IgG2a 아이소타입 대조군)를 IP 주사로 받았다. 마우스는 항체 최초 투여 5일 및 10일 후에 고갈 항체 (또는 아이소타입 대조군)의 추가 투여량을 받았다. 세포 고갈은 고갈 항체의 최초 투여 4일 후 및 12일 후에 유세포 계측법에 의해 확인되었다. 종양 용적이 약 111mm3에 도달했을 때(고갈 항체의 최초 투여 5일 후), 마우스는 비히클 또는 BCY12491을 주 2회(BIW) 15mg/kg으로 정맥내(iv)로 받기 시작하였다. 마우스는 총 4회 용량의 BCY12491을 받았다. 종양 성장은 28일째까지 또는 종양 용적이 2000mm3를 초과할 때까지 모니터링하였다.
BCY12491 치료는 비히클 또는 이소타입 대조군 항체로 치료된 MC38#13 종양 보유 마우스에서 유의하게 감소된 종양 성장률 및 증가된 생존을 유도했다. 종양 성장률 및 생존율 감소에 대한 BCY12491 치료의 이점은 CD8 고갈 마우스에서 손실되었다. NK1.1+ 세포의 고갈은 BCY12491 치료의 항종양 활성과 후속적 생존 이점에 영향을 미치지 않았다. 이 데이터는 MC38#13 종양 모델에서 BCY12491의 활성이 CD8+ T 세포에 의존하지만 NK1.1+ NK 세포에는 의존하지 않음을 입증한다(도 28).
BCY12730 및 BCY12723의 항종양 활성은 BCY12491 활성과 함께 입증되었다. 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J-hCD137 마우스[B-hTNFRSF9(CD137) 마우스; Biocytogen]는 1x106개의 MC38 세포를 피하 이식하였다. 평균 종양 용적이 약 92mm3에 도달되면, 마우스를 치료군(n=6/코호트)으로 무작위화하고, Q3D 용량의 비히클(25mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 7), 15mg/kg의 BCY12730, BCY12723 또는 BCY12491(7회의 Q3D 용량)로 정맥내 치료했다. 종양 성장을 28일 동안 또는 종양이 2000mm3을 초과할 때까지 모니터링하였다. BCY12491, BCY12730 및 BCY12723은 6마리의 BCY12491 치료 동물 중 4마리, 6마리의 BCY12730 치료 동물 중 3마리, 및 6마리의 BCY12723 치료 동물 중 2마리에서 완전한 반응을 초래하는 유의한 항종양 활성을 입증했다(도 29).
BCY13048 및 BCY13050의 항종양 활성은 BCY12491 활성과 함께 입증되었다. 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J-hCD137 마우스[B-hTNFRSF9(CD137) 마우스; Biocytogen]는 1x106개의 MC38 세포를 피하 이식하였다. 평균 종양 용적이 약 76mm3에 도달될 때 마우스를 치료군(n=6/코호트)으로 무작위화하고, 주 2회(BIW) 용량의 비히클(25mM 히스티딘, 10% 수크로스, pH 7), 5mg/kg의 BCY13048, BCY13050, 또는 BCY12491(6회 BIW 용량)로 정맥내 치료했다. 종양 성장을 28일 동안 또는 종양이 2000mm3을 초과할 때까지 모니터링하였다. BCY12491, BCY13048 및 BCY13050은 6마리의 BCY12491 치료 동물 중 2마리, 6마리의 BCY13048 치료 동물 중 5마리, 및 6마리의 BCY13050 치료 동물 중 3마리에서 완전한 반응을 초래하는 유의한 항종양 활성을 입증한다(도 30).
SEQUENCE LISTING <110> BICYCLETX LIMITED <120> HETEROTANDEM BICYCLIC PEPTIDE COMPLEXES <130> BIC-C-P2610PCT <150> 62/880,191 <151> 2019-07-30 <150> 62/910,088 <151> 2019-10-03 <150> 62/931,442 <151> 2019-11-06 <150> 63/022,667 <151> 2020-05-11 <150> 63/024,715 <151> 2020-05-14 <160> 164 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <400> 1 Cys Pro Xaa Asp Cys Met Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <400> 2 Cys Pro Xaa Asp Cys Met Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is Sar10-(B-Ala) <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HyP <400> 3 Cys Pro Xaa Lys Xaa Cys Met Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <400> 4 Cys Pro Phe Gly Cys Met Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 5 Cys Ile Glu Glu Gly Gln Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 6 Cys Xaa Pro Glu Ala Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 7 Cys Ile Glu Glu Gly Gln Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 8 Cys Xaa Pro Lys Ala Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 9 Cys Xaa Pro Glu Lys Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is K(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 10 Cys Xaa Pro Xaa Ala Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is D-Lys(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 11 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is D-Lys(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 12 Cys Ile Glu Glu Xaa Gln Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is K(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is dNle <400> 13 Cys Ile Glu Glu Xaa Gln Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <400> 14 Cys Pro Xaa Lys Cys Met Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is MerPro <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <400> 15 Xaa Pro Xaa Lys Cys Met Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (15)..(15) <223> Xaa is Cysam <400> 16 Cys Pro Xaa Lys Cys Met Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Xaa 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is MerPro <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (15)..(15) <223> Xaa is Cysam <400> 17 Xaa Pro Xaa Lys Cys Met Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Xaa 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <400> 18 Cys Pro Xaa Lys Cys Met Xaa His Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <400> 19 Cys Pro Xaa Lys Cys Met Xaa Glu Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <400> 20 Cys Pro Xaa Glu Cys Met Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <400> 21 Cys Pro Xaa Ala Cys Met Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <400> 22 Cys Pro Xaa Glu Cys Leu Xaa Asp Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (13)..(13) <223> Xaa is HyP <400> 23 Cys Pro Xaa Glu Cys Met Xaa Glu Trp Ser Thr Pro Xaa Trp Cys 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 24 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 25 Cys Leu Trp Asp Pro Thr Pro Cys Ala Asn Leu His Leu Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is K(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 26 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is K(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 27 Cys Xaa Xaa Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (9)..(9) <223> Xaa is K(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 28 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Xaa His Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 29 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Lys Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 30 Cys Xaa Lys Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 31 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Lys His Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 32 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Glu Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 33 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Glu Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <400> 34 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Asp Trp Thr Cys 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <400> 35 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Glu Pro Asp Trp Thr Cys 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <400> 36 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Glu Pro Ala Trp Thr Cys 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is 3,3-DPA <400> 37 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Thr Cys 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cba <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 38 Cys Xaa Xaa Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cba <400> 39 Cys Xaa Xaa Val Asn Pro Leu Cys Leu Glu Pro Asp Trp Thr Cys 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cba <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is 3,3-DPA <400> 40 Cys Xaa Xaa Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Thr Cys 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is 3,3-DPA <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 41 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (12)..(12) <223> Xaa is d1Nal <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 42 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is 1Nal <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 43 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (12)..(12) <223> Xaa is d1Nal <400> 44 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Glu Pro Xaa Trp Thr Cys 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is 1Nal <400> 45 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Thr Cys 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cba <400> 46 Cys Xaa Xaa Val Asn Pro Leu Cys Leu Glu Pro Ala Trp Thr Cys 1 5 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is hGlu <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 47 Cys Xaa Xaa Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (9)..(9) <223> Xaa is hGlu <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 48 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Xaa His Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is hGlu <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 49 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (12)..(12) <223> Xaa is dNle <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 50 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is Nle <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 51 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 52 Cys Ser Ala Gly Trp Leu Thr Met Cys Gln Lys Leu His Leu Cys 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> Xaa is K(PYA) <400> 53 Cys Ser Ala Gly Trp Leu Thr Met Cys Gln Xaa Leu His Leu Cys 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> Xaa is K(Ac) <400> 54 Cys Ser Lys Gly Trp Leu Thr Met Cys Gln Xaa Leu His Leu Cys 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> Xaa is K(Ac) <400> 55 Cys Ser Ala Gly Trp Leu Thr Lys Cys Gln Xaa Leu His Leu Cys 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> Xaa is K(Ac) <400> 56 Cys Ser Ala Gly Trp Leu Thr Met Cys Lys Xaa Leu His Leu Cys 1 5 10 15 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> Xaa is K(Ac) <400> 57 Cys Ser Ala Gly Trp Leu Thr Met Cys Gln Xaa Leu Lys Leu Cys 1 5 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> Xaa is HArg <400> 58 Cys Ser Ala Gly Trp Leu Thr Met Cys Gln Xaa Leu His Leu Cys 1 5 10 15 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is HArg <400> 59 Cys Ser Ala Gly Trp Leu Thr Met Cys Xaa Gln Leu Asn Leu Cys 1 5 10 15 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 60 Cys Xaa Pro Glu Lys Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 61 Cys Ile Glu Glu Xaa Gln Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 62 Cys Xaa Glu Glu Lys Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 63 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 64 Cys Xaa Glu Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 65 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asn Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 66 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Glu Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> Xaa is Aad <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 67 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Xaa Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 68 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Gln Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <220> <221> Xaa <222> (15)..(15) <223> Xaa is Cysam <400> 69 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is MerPro <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 70 Xaa Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is MerPro <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <220> <221> Xaa <222> (15)..(15) <223> Xaa is Cysam <400> 71 Xaa Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 72 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 73 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 74 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (12)..(12) <223> Xaa is NMeAla <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 75 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Xaa Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (12)..(12) <223> Xaa is NMeDAla <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 76 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Xaa Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is K(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 77 Cys Xaa Pro Xaa Ala Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 78 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(Me,PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 79 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is dK(Me,PYA) <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 80 Cys Xaa Pro Glu Xaa Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is MerPro <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is tBuAla <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is Nle <400> 81 Xaa Xaa Glu Glu Lys Pro Tyr Cys Phe Ala Asp Pro Tyr Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 82 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 82 Cys Ile Leu Trp Cys Leu Pro Glu Pro His Asp Glu Cys 1 5 10 <210> 83 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is K or S <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is N or E <400> 83 Cys Ala Xaa Xaa Cys Asp Pro Phe Trp Tyr Gln Phe Tyr Cys 1 5 10 <210> 84 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 84 Cys Ala Lys Asn Cys Asp Pro Phe Trp Tyr Gln Phe Tyr Cys 1 5 10 <210> 85 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 85 Cys Ala Ser Glu Cys Asp Pro Phe Trp Tyr Gln Phe Tyr Cys 1 5 10 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is L or N <220> 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<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 100 Cys Ala Leu Trp Cys Ile Pro Asp Pro Gln Asp Glu Cys 1 5 10 <210> 101 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 101 Cys Thr Leu Trp Cys Ile Pro Asp Ala Ser Asp Ser Cys 1 5 10 <210> 102 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 102 Cys Gln Leu Trp Cys Ile Pro Asp Ala Asp Asp Asp Cys 1 5 10 <210> 103 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 103 Cys Gln Leu Trp Cys Val Pro Glu Pro Gly Asp Ser Cys 1 5 10 <210> 104 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 104 Cys Ala Leu Trp Cys Ile Pro Glu Glu Ser Asp Asp Cys 1 5 10 <210> 105 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 105 Cys Val Leu Trp Cys Ile Pro Glu Pro Gln Asp Lys Cys 1 5 10 <210> 106 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 106 Cys Thr Leu Trp Cys Ile Pro Asp Pro Asp Asp Ser Cys 1 5 10 <210> 107 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 107 Cys Arg Leu Trp Cys Val Pro Lys Ala Glu Asp Tyr Cys 1 5 10 <210> 108 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 108 Cys Thr Lys Pro Cys Ile Ala Tyr Tyr Asn Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 109 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 109 Cys Met Asn Pro Cys Ile Ala Tyr Tyr Gln Gln Glu Cys 1 5 10 <210> 110 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 110 Cys Thr Asn Ala Cys Val Ala Tyr Tyr His Gln Ala Cys 1 5 10 <210> 111 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 111 Cys Ser Asp Pro Cys Ile Ser Tyr Tyr Asn Gln Ala Cys 1 5 10 <210> 112 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 112 Cys Asp Pro Pro Cys Asp Pro Phe Trp Tyr Ala Phe Tyr Cys 1 5 10 <210> 113 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 113 Cys Pro Asp Asp Cys Asp Pro Phe Trp Tyr Asn Phe Tyr Cys 1 5 10 <210> 114 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 114 Cys Arg Tyr Ser Pro Cys Tyr His Pro His Asn Cys 1 5 10 <210> 115 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 115 Cys Leu Tyr Ser Pro Cys Asn His Pro Leu Asn Ser Cys 1 5 10 <210> 116 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 116 Cys Glu Asp Asn Tyr Cys Phe Met Trp Thr Pro Tyr Cys 1 5 10 <210> 117 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 117 Cys Leu Asp Ser Pro Cys Trp His Pro Leu Asn Asp Cys 1 5 10 <210> 118 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 118 Cys Arg Phe Ser Pro Cys Ser His Pro Leu Asn Gln Cys 1 5 10 <210> 119 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 119 Cys Lys Tyr Ser Pro Cys Trp His Pro Leu Asn Leu Cys 1 5 10 <210> 120 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 120 Cys Arg Tyr Ser Pro Cys Trp His Pro Leu Asn Asn Cys 1 5 10 <210> 121 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 121 Cys Glu Trp Ile Ser Cys Pro Gly Glu Pro His Arg Trp Trp Cys 1 5 10 15 <210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 122 Cys Val Trp Glu Ala Cys Pro Glu His Pro Asp Gln Trp Trp Cys 1 5 10 15 <210> 123 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 123 Cys Ser Thr Trp His Cys Phe Trp Asn Leu Gln Glu Gly Lys Cys 1 5 10 15 <210> 124 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 124 Cys Glu Trp Lys Ala Cys Glu His Asp Arg Glu Arg Trp Trp Cys 1 5 10 15 <210> 125 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 125 Cys Arg Thr Trp Gln Cys Phe Tyr Glu Trp Gln Asn Gly His Cys 1 5 10 15 <210> 126 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 126 Cys Lys Thr Trp Asp Cys Phe Trp Ala Ser Gln Val Ser Glu Cys 1 5 10 15 <210> 127 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 127 Cys Ser Thr Trp Gln Cys Phe Tyr Asp Leu Gln Glu Gly His Cys 1 5 10 15 <210> 128 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 128 Cys Thr Thr Trp Glu Cys Phe Tyr Asp Leu Gln Glu Gly His Cys 1 5 10 15 <210> 129 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 129 Cys Glu Thr Trp Glu Cys Phe Trp Arg Leu Gln Ala Gly Glu Cys 1 5 10 15 <210> 130 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 130 Cys Arg Thr Trp Gln Cys Phe Trp Asp Leu Gln Glu Gly Leu Cys 1 5 10 15 <210> 131 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 131 Cys Ser Thr Trp Gln Cys Phe Trp Asp Ser Gln Leu Gly Ala Cys 1 5 10 15 <210> 132 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 132 Cys Glu Thr Trp Glu Cys Phe Trp Glu Trp Gln Val Gly Ser Cys 1 5 10 15 <210> 133 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 133 Cys Thr Thr Trp Glu Cys Phe Trp Asp Leu Gln Glu Gly Leu Cys 1 5 10 15 <210> 134 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 134 Cys His Thr Trp Asp Cys Phe Tyr Gln Trp Gln Asp Gly His Cys 1 5 10 15 <210> 135 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 135 Cys Thr Thr Trp Glu Cys Phe Tyr Ser Leu Gln Asp Gly His Cys 1 5 10 15 <210> 136 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 136 Cys Asn Glu Asp Met Tyr Cys Phe Met Trp Met Glu Cys 1 5 10 <210> 137 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 137 Cys Leu Tyr Glu Tyr Asp Cys Tyr Thr Trp Arg Arg Cys 1 5 10 <210> 138 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 138 Cys Arg Tyr Glu Tyr Asp Cys His Thr Trp Gln Arg Cys 1 5 10 <210> 139 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 139 Cys Trp Tyr Glu Tyr Asp Cys Thr Thr Trp Glu Arg Cys 1 5 10 <210> 140 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 140 Cys Trp Tyr Glu Tyr Asp Cys Arg Thr Trp Thr Arg Cys 1 5 10 <210> 141 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 141 Cys Leu Tyr Glu Tyr Asp Cys His Thr Trp Thr Arg Cys 1 5 10 <210> 142 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 142 Cys Trp Tyr Glu Tyr Asp Cys Arg Thr Trp Thr Phe Cys 1 5 10 <210> 143 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 143 Cys His Gly Gly Val Trp Cys Ile Pro Asn Ile Asn Asp Ser Cys 1 5 10 15 <210> 144 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 144 Cys Asp Ser Pro Val Arg Cys Tyr Trp Asn Thr Gln Lys Gly Cys 1 5 10 15 <210> 145 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 145 Cys Gly Ser Pro Val Pro Cys Tyr Trp Asn Thr Arg Lys Gly Cys 1 5 10 15 <210> 146 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 146 Cys Ala Pro Phe Glu Phe Asn Cys Tyr Thr Trp Arg Pro Cys 1 5 10 <210> 147 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 147 Cys Arg Val Leu Tyr Ser Pro Cys Tyr His Trp Leu Asn Cys 1 5 10 <210> 148 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 148 Cys Ser Ile Met Tyr Ser Pro Cys Glu His Pro His Asn His Cys 1 5 10 15 <210> 149 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 149 Cys Asp Lys Trp Glu Pro Asp His Leu Cys Tyr Trp Trp Cys 1 5 10 <210> 150 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 150 Cys Asp Ala Trp Pro Glu Thr His Val Cys Tyr Trp Trp Cys 1 5 10 <210> 151 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 151 Cys Asp Glu Tyr Thr Pro Glu His Leu Cys Tyr Trp Trp Cys 1 5 10 <210> 152 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 152 Cys Trp Ile Asn Tyr Ser Ile Ser Pro Cys Tyr Val Gly Glu Cys 1 5 10 15 <210> 153 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 153 Cys Arg Tyr Glu Tyr Pro Glu His Leu Cys Tyr Thr Trp Gln Cys 1 5 10 15 <210> 154 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is MerPro <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is 3,3-DPA <400> 154 Xaa Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Thr Cys 1 5 10 15 <210> 155 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <220> <221> Xaa <222> (15)..(15) <223> Xaa is Cysam <400> 155 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Asp Trp Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 156 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is His3Me <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 156 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 157 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is His1Me <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 157 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 158 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is 4ThiAz <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 158 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 159 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 159 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Phe Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 160 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is Thi <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 160 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 161 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is 3Thi <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 161 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 162 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 162 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Asn Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 163 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 163 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Gln Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 164 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Xaa is HyP <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is K(PYA-(Palmitoyl-Glu-LysN3 <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> Xaa is HArg <400> 164 Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu Xaa Pro Asp Trp Xaa Cys 1 5 10 15

Claims (43)

  1. (a) 암 세포에 존재하는 성분에 결합하고; (b) 면역 세포에 존재하는 성분에 결합하는 2개 이상의 제2 펩티드 리간드에 링커(linker)를 통해 접합된 제1 펩티드 리간드를 포함하는 헤테로탠덤(heterotandem) 바이사이클릭 펩티드 복합체로서,
    상기 펩티드 리간드 각각은 적어도 2개의 루프 서열(loop sequence)에 의해 분리된, 적어도 3개의 반응성 그룹을 포함하는 폴리펩티드, 및 적어도 2개의 폴리펩티드 루프가 분자 스캐폴드(scaffold) 상에 형성되도록 폴리펩티드의 반응성 그룹과 공유 결합을 형성하는 분자 스캐폴드를 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포가 백혈구; 림프구(예: T 림프구 또는 T 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포); CD8 또는 CD4; CD8; 수지상 세포(dendritic cell), 여포성 수지상 세포 및 과립구로부터 선택되는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 반응성 그룹이 시스테인, 3-머캅토프로피온산 및/또는 시스테아민 잔기로부터 선택되는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역세포 상에 존재하는 상기 성분이 CD137인, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 제2 펩티드 리간드가 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체:
    CiIEEGQYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 5);
    Ci[tBuAla]PE[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 6);
    CiIEEGQYCiiF[D-Ala]DPY[Nle]Ciii (서열번호 7);
    Ci[tBuAla]PK[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 8);
    Ci[tBuAla]PE[D-Lys]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 9);
    Ci[tBuAla]P[K(PYA)][D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 10);
    Ci[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 11);
    (서열번호 11)-A (본원에서 BCY14601로서 지칭됨);
    CiIEE[D-Lys(PYA)]QYCiiFADPY(Nle)Ciii (서열번호 12);
    Ci[tBuAla]PE[dK]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 60);
    CiIEE[dK(PYA)]QYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 61);
    Ci[tBuAla]EE(dK)PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 62);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 63);
    Ci[tBuAla]EE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 64);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFANPY[Nle]Ciii (서열번호 65);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFAEPY[Nle]Ciii (서열번호 66);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFA[Aad]PY[Nle]Ciii (서열번호 67);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFAQPY[Nle]Ciii (서열번호 68);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle][Cysam]iii (서열번호 69);
    [MerPro]i[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 70; 본원에서 BCY12353으로서 지칭됨);
    [MerPro]i[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle][Cysam]iii (서열번호 71; 본원에서 BCY12354로서 지칭됨);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 72);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 73);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 74; 본원에서 BCY12372로서 지칭됨);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFAD[NMeAla]Y[Nle]Ciii (서열번호 75);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFAD[NMeDAla]Y[Nle]Ciii (서열번호 76);
    Ci[tBuAla]P[K(PYA)][dA]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 77);
    Ci[tBuAla]PE[dK(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 78);
    Ci[tBuAla]PE[dK(Me,PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 79);
    Ci[tBuAla]PE[dK(Me,PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 80); 및
    [MerPro]i[tBuAla]EE[dK]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (서열번호 81; 본원에서 BCY13137로서 지칭됨);
    여기서, [MerPro]i, Ci, Cii, Ciii 및 [Cysam]iii는 시스테인, MerPro 및 Cysam으로부터 선택된 제1 (i), 제2 (ii) 및 제3 (iii) 반응성 그룹을 나타내고, Nle은 노르류신을 나타내고, tBuAla는 t-부틸-알라닌을 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, Aad는 α-L-아미노아디프산을 나타내고, MerPro는 3-머캅토프로피온산을 나타내고, Cysam은 시스테아민을 나타내고, NMeAla는 N-메틸-알라닌을 나타낸다.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 하기 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체:
    Ci[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii(서열번호 11);
    여기서, Ci, Cii 및 Ciii는 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 나타내고, tBuAla는 t-부틸-알라닌을 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, Nle는 노르류신을 나타낸다.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 N-말단 및 C-말단 변형을 포함하고,
    Ac-A-(서열번호 5)-Dap(본원에서 BCY7732로서 지칭됨);
    Ac-A-(서열번호 5)-Dap(PYA)(본원에서 BCY7741로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 6)-Dap(본원에서 BCY9172로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 6)-Dap(PYA)(본원에서 BCY11014로서 지칭됨);
    Ac-A-(서열번호 7)-Dap(본원에서 BCY8045로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 8)-A(본원에서 BCY8919로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 9)-A(본원에서 BCY8920으로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 10)-A(본원에서 BCY8927로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 11)-A(본원에서 BCY8928로서 지칭됨);
    Ac-A-(서열번호 12)-A(본원에서 BCY7744로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 60)-Dap(PYA)(본원에서 BCY11144로서 지칭됨);
    Ac-A-(서열번호 61)-K(본원에서 BCY11613으로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 62)-Dap(PYA)(본원에서 BCY12023으로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 63)(본원에서 BCY12149로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 64)(본원에서 BCY12143으로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 65)(본원에서 BCY12147로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 66)(본원에서 BCY12145로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 67)(본원에서 BCY12146으로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 68)(본원에서 BCY12150으로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 69)(본원에서 BCY12352로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 72)-[1,2-디아미노에탄](본원에서 BCY12358로서 지칭됨);
    [팔미트산]-[yGlu]-[yGlu]-(서열번호 73)(본원에서 BCY12360으로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 75)(본원에서 BCY12381로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 76)(본원에서 BCY12382로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 77)-K(본원에서 BCY12357로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 78)-[dA](본원에서 BCY13095로서 지칭됨);
    [Ac]-(서열번호 78)-K(본원에서 BCY13389로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 79)-[dA](본원에서 BCY13096으로서 지칭됨); 및
    Ac-(서열번호 80)(본원에서 BCY13097로서 지칭됨); 또는
    이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
    여기서, Ac는 아세틸 그룹을 나타내고, Dap은 디아미노프로피온산을 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타내는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 N-말단 및 C-말단 변형을 포함하고,
    Ac-(서열번호 11)-A(본원에서 BCY8928로서 지칭됨); 또는
    이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
    여기서, Ac는 아세틸 그룹을 나타내는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포 상에 존재하는 상기 성분이 OX40인, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 제2 펩티드 리간드가 OX40 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 OX40 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 하기 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체:
    CiILWCiiLPEPHDECiii (서열번호 82);
    CiAK/S N/ECiiDPFWYQFYCiii (서열번호 83);
    CiAKNCiiDPFWYQFYCiii (서열번호 84);
    CiASECiiDPFWYQFYCiii (서열번호 85);
    Ci L/NYSPCiiWHPLND/KCiii (서열번호 86);
    CiLYSPCiiWHPLNDCiii (서열번호 87);
    CiNYSPCiiWHPLNKCiii (서열번호 88);
    CiWYEYDCiiNNWERCiii (서열번호 89);
    CiVIRYSPCiiSHYLNCiii (서열번호 90);
    CiDYSPWWHPCiiNHICiii (서열번호 91);
    CiDACiiLYPDYYVCiii (서열번호 92);
    CiRLWCiiIPAPTDDCiii (서열번호 93);
    CiTMWCiiIPAKGDWCiii (서열번호 94);
    CiMLWCiiLPAPTDECiii (서열번호 95);
    CiILWCiiLPEPPDECiii (서열번호 96);
    CiLLWCiiIPNPDDNCiii (서열번호 97);
    CiWLWCiiVPNPDDTCiii (서열번호 98);
    CiVLWCiiTPYPGDDCiii (서열번호 99);
    CiALWCiiIPDPQDECiii (서열번호 100);
    CiTLWCiiIPDASDSCiii (서열번호 101);
    CiQLWCiiIPDADDDCiii (서열번호 102);
    CiQLWCiiVPEPGDSCiii (서열번호 103);
    CiALWCiiIPEESDDCiii (서열번호 104);
    CiVLWCiiIPEPQDKCiii (서열번호 105);
    CiTLWCiiIPDPDDSCiii (서열번호 106);
    CiRLWCiiVPKAEDYCiii (서열번호 107);
    CiTKPCiiIAYYNQSCiii (서열번호 108);
    CiMNPCiiIAYYQQECiii (서열번호 109);
    CiTNACiiVAYYHQACiii (서열번호 110);
    CiSDPCiiISYYNQACiii (서열번호 111);
    CiDPPCiiDPFWYAFYCiii (서열번호 112);
    CiPDDCiiDPFWYNFYCiii (서열번호 113);
    CiRYSPCiiYHPHNCiii (서열번호 114);
    CiLYSPCiiNHPLNSCiii (서열번호 115);
    CiEDNYCiiFMWTPYCiii (서열번호 116);
    CiLDSPCiiWHPLNDCiii (서열번호 117);
    CiRFSPCiiSHPLNQCiii (서열번호 118);
    CiKYSPCiiWHPLNLCiii (서열번호 119);
    CiRYSPCiiWHPLNNCiii (서열번호 120);
    CiEWISCiiPGEPHRWWCiii (서열번호 121);
    CiVWEACiiPEHPDQWWCiii (서열번호 122);
    CiSTWHCiiFWNLQEGKCiii (서열번호 123);
    CiEWKACiiEHDRERWWCiii (서열번호 124);
    CiRTWQCiiFYEWQNGHCiii (서열번호 125);
    CiKTWDCiiFWASQVSECiii (서열번호 126);
    CiSTWQCiiFYDLQEGHCiii (서열번호 127);
    CiTTWECiiFYDLQEGHCiii (서열번호 128);
    CiETWECiiFWRLQAGECiii (서열번호 129);
    CiRTWQCiiFWDLQEGLCiii (서열번호 130);
    CiSTWQCiiFWDSQLGACiii (서열번호 131);
    CiETWECiiFWEWQVGSCiii (서열번호 132);
    CiTTWECiiFWDLQEGLCiii (서열번호 133);
    CiHTWDCiiFYQWQDGHCiii (서열번호 134);
    CiTTWECiiFYSLQDGHCiii (서열번호 135);
    CiNEDMYCiiFMWMECiii (서열번호 136);
    CiLYEYDCiiYTWRRCiii (서열번호 137);
    CiRYEYDCiiHTWQRCiii (서열번호 138);
    CiWYEYDCiiTTWERCiii (서열번호 139);
    CiWYEYDCiiRTWTRCiii (서열번호 140);
    CiLYEYDCiiHTWTRCiii (서열번호 141);
    CiWYEYDCiiRTWTFCiii (서열번호 142);
    CiHGGVWCiiIPNINDSCiii (서열번호 143);
    CiDSPVRCiiYWNTQKGCiii (서열번호 144);
    CiGSPVPCiiYWNTRKGCiii (서열번호 145);
    CiAPFEFNCiiYTWRPCiii (서열번호 146);
    CiRVLYSPCiiYHWLNCiii (서열번호 147);
    CiSIMYSPCiiEHPHNHCiii (서열번호 148);
    CiDKWEPDHLCiiYWWCiii (서열번호 149);
    CiDAWPETHVCiiYWWCiii (서열번호 150);
    CiDEYTPEHLCiiYWWCiii (서열번호 151);
    CiWINYSISPCiiYVGECiii (서열번호 152); 및
    CiRYEYPEHLCiiYTWQCiii (서열번호 153); 예를 들어,
    CiLYSPCiiWHPLNDCiii (서열번호 87);
    여기서, Ci, Cii 및 Ciii는 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기, 또는 변형된 유도체를 나타낸다.
  13. 제12항에 있어서, 상기 OX40 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 추가로 포함하고, 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체:
    A-(서열번호 82)-A-[Sar6]-[KBiot] (본원에서 BCY10551로서 지칭됨);
    A-(서열번호 82)-A (본원에서 BCY10371로서 지칭됨);
    A-(서열번호 84)-A-[Sar6]-[KBiot] (본원에서 BCY10552로서 지칭됨);
    [Biot]-G-[Sar5]-A-(서열번호 84)-A (본원에서 BCY10479로서 지칭됨);
    A-(서열번호 84)-A (본원에서 BCY10378로서 지칭됨);
    [Biot]-G-[Sar5]-A-(서열번호 85)-A (본원에서 BCY11371로서 지칭됨);
    A-(서열번호 85)-A (본원에서 BCY10743으로서 지칭됨);
    [Biot]-G-[Sar5]-A-(서열번호 87)-A (본원에서 BCY10482로서 지칭됨);
    A-(서열번호 87)-A-[Sar6]-[KBiot] (본원에서 BCY10549로서 지칭됨);
    A-(서열번호 87)-A-K(Pya) (본원에서 BCY11607로서 지칭됨);
    Ac-A-(서열번호 87)-A-K(Pya) (본원에서 BCY12708로서 지칭됨);
    A-(서열번호 87)-A (본원에서 BCY10351로서 지칭됨);
    A-(서열번호 88)-A-[Sar6]-[KBiot] (본원에서 BCY11501로서 지칭됨);
    A-(서열번호 88)-A (본원에서 BCY10729로서 지칭됨);
    A-(서열번호 89)-A-[Sar6]-[KBiot] (본원에서 BCY10550으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 89)-A (본원에서 BCY10361로서 지칭됨);
    A-(서열번호 90)-A-[Sar6]-[KBiot] (본원에서 BCY10794로서 지칭됨);
    A-(서열번호 90)-A (본원에서 BCY10349로서 지칭됨);
    [Biot]-G-[Sar5]-A-(서열번호 91)-A (본원에서 BCY11369로서 지칭됨);
    A-(서열번호 91)-A (본원에서 BCY10331로서 지칭됨);
    A-(서열번호 92)-A (본원에서 BCY10375로서 지칭됨);
    A-(서열번호 93)-A (본원에서 BCY10364로서 지칭됨);
    A-(서열번호 94)-A (본원에서 BCY10365로서 지칭됨);
    A-(서열번호 95)-A (본원에서 BCY10366으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 96)-A (본원에서 BCY10367로서 지칭됨);
    A-(서열번호 97)-A (본원에서 BCY10368로서 지칭됨);
    A-(서열번호 98)-A (본원에서 BCY10369로서 지칭됨);
    A-(서열번호 99)-A (본원에서 BCY10374로서 지칭됨);
    A-(서열번호 100)-A (본원에서 BCY10376으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 101)-A (본원에서 BCY10737로서 지칭됨);
    A-(서열번호 102)-A (본원에서 BCY10738로서 지칭됨);
    A-(서열번호 103)-A (본원에서 BCY10739로서 지칭됨);
    A-(서열번호 104)-A (본원에서 BCY10740으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 105)-A (본원에서 BCY10741로서 지칭됨);
    A-(서열번호 106)-A (본원에서 BCY10742로서 지칭됨);
    A-(서열번호 107)-A (본원에서 BCY10380으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 108)-A (본원에서 BCY10370으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 109)-A (본원에서 BCY10372로서 지칭됨);
    A-(서열번호 110)-A (본원에서 BCY10373으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 111)-A (본원에서 BCY10379로서 지칭됨);
    A-(서열번호 112)-A (본원에서 BCY10377로서 지칭됨);
    A-(서열번호 113)-A (본원에서 BCY10744로서 지칭됨);
    A-(서열번호 114)-A (본원에서 BCY10343으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 115)-A (본원에서 BCY10350으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 116)-A (본원에서 BCY10352로서 지칭됨);
    A-(서열번호 117)-A (본원에서 BCY10353으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 118)-A (본원에서 BCY10354로서 지칭됨);
    A-(서열번호 119)-A (본원에서 BCY10730으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 120)-A (본원에서 BCY10731로서 지칭됨);
    A-(서열번호 121)-A (본원에서 BCY10339로서 지칭됨);
    A-(서열번호 122)-A (본원에서 BCY10340으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 123)-A (본원에서 BCY10342로서 지칭됨);
    A-(서열번호 124)-A (본원에서 BCY10345로서 지칭됨);
    A-(서열번호 125)-A (본원에서 BCY10347로서 지칭됨);
    A-(서열번호 126)-A (본원에서 BCY10348로서 지칭됨);
    A-(서열번호 127)-A (본원에서 BCY10720으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 128)-A (본원에서 BCY10721로서 지칭됨);
    A-(서열번호 129)-A (본원에서 BCY10722로서 지칭됨);
    A-(서열번호 130)-A (본원에서 BCY10723으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 131)-A (본원에서 BCY10724로서 지칭됨);
    A-(서열번호 132)-A (본원에서 BCY10725로서 지칭됨);
    A-(서열번호 133)-A (본원에서 BCY10726으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 134)-A (본원에서 BCY10727로서 지칭됨);
    A-(서열번호 135)-A (본원에서 BCY10728로서 지칭됨);
    A-(서열번호 136)-A (본원에서 BCY10360으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 137)-A (본원에서 BCY10363으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 138)-A (본원에서 BCY10732로서 지칭됨);
    A-(서열번호 139)-A (본원에서 BCY10733으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 140)-A (본원에서 BCY10734로서 지칭됨);
    A-(서열번호 141)-A (본원에서 BCY10735로서 지칭됨);
    A-(서열번호 142)-A (본원에서 BCY10736으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 143)-A (본원에서 BCY10336으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 144)-A (본원에서 BCY10337로서 지칭됨);
    A-(서열번호 145)-A (본원에서 BCY10338로서 지칭됨);
    A-(서열번호 146)-A (본원에서 BCY10346으로서 지칭됨);
    A-(서열번호 147)-A (본원에서 BCY10357로서 지칭됨);
    A-(서열번호 148)-A (본원에서 BCY10362로서 지칭됨);
    A-(서열번호 149)-A (본원에서 BCY10332로서 지칭됨);
    A-(서열번호 150)-A (본원에서 BCY10717로서 지칭됨);
    A-(서열번호 151)-A (본원에서 BCY10718로서 지칭됨);
    A-(서열번호 152)-A (본원에서 BCY10334로서 지칭됨); 및
    A-(서열번호 153)-A (본원에서 BCY10719로서 지칭됨); 예를 들어,
    A-(서열번호 87)-A-K(Pya) (본원에서 BCY11607로서 지칭됨);
    여기서, Pya는 4-펜티노일 모이어티를 나타낸다.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 HT1080, A549, SC-OV-3, PC3, HT1376, NCI-H292, LnCap, MC38, MC38 #13, 4T1-D02, H322, HT29, T47D 및 RKO 종양 세포로부터 선택되는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포 상에 존재하는 상기 성분이 넥틴-4 (Nectin-4)인, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 펩티드 리간드가 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드를 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체:
    CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 1; 본원에서 BCY8116으로서 지칭됨);
    CiP[1Nal][dK](Sar10-(B-Ala))CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 3);
    CiPFGCiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 4; 본원에서 BCY11414로서 지칭됨);
    CiP[1Nal][dK]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 14);
    [MerPro]iP[1Nal][dK]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 15; 본원에서 BCY12363으로서 지칭됨);
    CiP[1Nal][dK]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]W[Cysam]iii (서열번호 16);
    [MerPro]iP[1Nal][dK]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]W[Cysam]iii (서열번호 17; 본원에서 BCY12365로서 지칭됨);
    CiP[1Nal][dK]CiiM[HArg]HWSTP[HyP]WCiii (서열번호 18);
    CiP[1Nal][dK]CiiM[HArg]EWSTP[HyP]WCiii (서열번호 19);
    CiP[1Nal][dE]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 20; 본원에서 BCY12368로서 지칭됨);
    CiP[1Nal][dA]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 21; 본원에서 BCY12369로서 지칭됨);
    CiP[1Nal][dE]CiiL[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (서열번호 22; 본원에서 BCY12370으로서 지칭됨); 및
    CiP[1Nal][dE]CiiM[HArg]EWSTP[HyP]WCiii (서열번호 23; 본원에서 BCY12384로서 지칭됨);
    여기서, [MerPro]i, Ci, Cii, Ciii 및 [Cysam]iii는 시스테인, MerPro 및 Cysam으로부터 선택된 제1 (i), 제2 (ii) 및 제3 (iii) 반응성 그룹을 나타내고, 1Nal은 1-나프틸알라닌을 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, Sar10은 10개의 사르코신 단위를 나타내고, B-Ala는 베타-알라닌을 나타내고, MerPro는 3-머캅토프로피온산을 나타내고, Cysam은 시스테아민을 나타낸다.
  18. 제17항에 있어서, 상기 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 임의로 N-말단 변형을 포함하고,
    서열번호 1 (본원에서 BCY8116으로서 지칭됨);
    [PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(서열번호 1) (본원에서 BCY8846으로서 지칭됨);
    [PYA]-(서열번호 1) (본원에서 BCY11015로서 지칭됨);
    [PYA]-[B-Ala]-(서열번호 1) (본원에서 BCY11016으로서 지칭됨);
    [PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(서열번호 2) (본원에서 BCY11942로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 3) (본원에서 BCY8831로서 지칭됨);
    서열번호 4 (본원에서 BCY11414로서 지칭됨);
    [PYA]-[B-Ala]-(서열번호 14) (본원에서 BCY11143으로서 지칭됨);
    팔미트산-yGlu-yGlu-(서열번호 14) (본원에서 BCY12371로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 14) (본원에서 BCY12024로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 16) (본원에서 BCY12364로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 18) (본원에서 BCY12366으로서 지칭됨); 및
    Ac-(서열번호 19) (본원에서 BCY12367로서 지칭됨); 또는
    이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
    여기서, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, B-Ala는 베타-알라닌을 나타내고, Sar10은 10개의 사르코신 단위를 나타내는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 넥틴-4 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 서열번호 1(본원에서 BCY8116으로서 지칭됨)을 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 표 A 및 B에 열거된 복합체 중 어느 하나, 예를 들어, BCY11027, BCY11863 및 BCY11864로부터 선택되는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  21. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 표 E에 열거된 복합체 중 어느 하나, 예를 들어, BCY12967로부터 선택되는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포에 존재하는 상기 성분이 EphA2인, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체:
    Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 24);
    CiLWDPTPCiiANLHL[HArg]Ciii (서열번호 25);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[K(PYA)]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 26);
    Ci[HyP][K(PYA)]VNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 27);
    Ci[HyP]LVNPLCii[K(PYA)]HP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 28);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLKP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 29);
    Ci[HyP]KVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 30);
    Ci[HyP]LVNPLCiiKHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 31);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dE]W[HArg]Ciii (서열번호 32);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLEP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 33);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]WTCiii (서열번호 34);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLEP[dD]WTCiii (서열번호 35);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLEP[dA]WTCiii (서열번호 36);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[3,3-DPA]P[dD]WTCiii (서열번호 37; 본원에서 BCY12860으로서 지칭됨);
    Ci[HyP][Cba]VNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 38);
    Ci[HyP][Cba]VNPLCiiLEP[dD]WTCiii (서열번호 39);
    Ci[HyP][Cba]VNPLCiiL[3,3-DPA]P[dD]WTCiii (서열번호 40);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[3,3-DPA]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 41);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[d1Nal]W[HArg]Ciii (서열번호 42);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[1Nal]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 43);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLEP[d1Nal]WTCiii (서열번호 44);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[1Nal]P[dD]WTCiii (서열번호 45; 본원에서 BCY13119로서 지칭됨);
    Ci[HyP][Cba]VNPLCiiLEP[dA]WTCiii (서열번호 46);
    Ci[HyP][hGlu]VNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 47);
    Ci[HyP]LVNPLCii[hGlu]HP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 48);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[hGlu]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 49);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dNle]W[HArg]Ciii (서열번호 50);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[Nle]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 51);
    [MerPro]i[HyP]LVNPLCiiL[3,3-DPA]P[dD]WTCiii (서열번호 154);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg][Cysam]iii (서열번호 155);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[His3Me]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 156);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[His1Me]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 157);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[4ThiAz]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 158);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLFP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 159);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[Thi]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 160);
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[3Thi]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 161);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLNP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 162);
    Ci[HyP]LVNPLCiiLQP[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 163); 및
    Ci[HyP]LVNPLCiiL[K(PYA-(Palmitoyl-Glu-LysN3)]P[dD]W[HArg]Ciii (서열번호 164);
    여기서, [MerPro]i, Ci, Cii, Ciii 및 [Cysam]iii는 시스테인, MerPro 및 Cysam으로부터 선택된 제1 (i), 제2 (ii) 및 제3 (iii) 반응성 그룹을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, HArg은 호모아르기닌을 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, 3,3-DPA는 3,3-디페닐알라닌을 나타내고, Cba는 β-사이클로부틸알라닌을 나타내고, 1Nal은 1-나프틸알라닌을 나타내고, hGlu는 호모글루탐산을 나타내고, Thi는 티에닐-알라닌을 나타내며, 4ThiAz는 베타-(4-티아졸릴)-알라닌을 나타내고, His1Me는 N1-메틸-L-히스티딘을 나타내고, His3Me는 N3-메틸-L-히스티딘을 나타내고, 3Thi는 3-티에닐알라닌을 나타내고, 팔미토일-Glu-LysN3[PYA]는
    Figure pct00149
    을 나타내고, [K(PYA-(팔미토일-Glu-LysN3)]는
    Figure pct00150
    을 나타내고, Nle은 노르류신을 나타내고, MerPro는 3-머캅토프로피온산을 나타내고, Cysam은 시스테아민을 나타낸다.
  24. 제23항에 있어서, 상기 EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 하기 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체:
    Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii(서열번호 24);
    여기서, Ci, Cii 및 Ciii는 제1 (i), 제2 (ii) 및 제3 (iii) 시스테인 그룹을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타낸다.
  25. 제23항에 있어서, 상기 EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 하기 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체:
    Ci[HyP]LVNPLCiiLEP[d1Nal]WTCiii(서열번호 44);
    여기서, Ci, Cii 및 Ciii는 제1 (i), 제2 (ii) 및 제3 (iii) 시스테인 그룹을 나타내고, HyP는 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린을 나타내고, 1Nal은 1-나프틸알라닌을 나타낸다.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 임의로 N-말단 변형을 포함하고,
    A-[HArg]-D-(서열번호 24)(본원에서 BCY9594로서 지칭됨);
    [B-Ala]-[Sar10]-A-[HArg]-D-(서열번호 24)(본원에서 BCY6099로서 지칭됨);
    [PYA]-A-[HArg]-D-(서열번호 24)(본원에서 BCY11813으로서 지칭됨);
    Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 24)-[K(PYA)](본원에서 BCY11814로서 지칭됨);
    Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 24)-K(본원에서 BCY12734로서 지칭됨);
    [NMeAla]-[HArg]-D-(서열번호 24)(본원에서 BCY13121로서 지칭됨);
    [Ac]-(서열번호 24)-L[dH]G[dK](본원에서 BCY13125로서 지칭됨);
    [PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-VGP-(서열번호 25)(본원에서 BCY8941로서 지칭됨);
    Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 26)(본원에서 BCY11815로서 지칭됨);
    Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 27)(본원에서 BCY11816으로서 지칭됨);
    Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 28)(본원에서 BCY11817로서 지칭됨);
    Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 29)(본원에서 BCY12735로서 지칭됨);
    (팔미토일-Glu-LysN3)[PYA]A[HArg]D-(서열번호 29)(이하, BCY14327로서 공지되어 있음);
    Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 30)(본원에서 BCY12736으로서 지칭됨);
    Ac-A-[HArg]-D-(서열번호 31)(본원에서 BCY12737로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 32)(본원에서 BCY12738로서 지칭됨);
    A-[HArg]-E-(서열번호 32)(본원에서 BCY12739로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 33)(본원에서 BCY12854로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 34)(본원에서 BCY12855로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 35)(본원에서 BCY12856으로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 35)-[dA](본원에서 BCY12857로서 지칭됨);
    (서열번호 35)-[dA] (본원에서 BCY12861로서 지칭됨);
    [NMeAla]-[HArg]-D-(서열번호 35)(본원에서 BCY13122로서 지칭됨);
    [dA]-ED-(서열번호 35)(본원에서 BCY13126으로서 지칭됨);
    [dA]-[dA]-D-(서열번호 35)(본원에서 BCY13127로서 지칭됨);
    AD-(서열번호 35)(본원에서 BCY13128로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 36)(본원에서 BCY12858로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 37)(본원에서 BCY12859로서 지칭됨);
    Ac-(서열번호 37)-[dK](본원에서 BCY13120으로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 38)(본원에서 BCY12862로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 39)(본원에서 BCY12863으로서 지칭됨);
    [dA]-[HArg]-D-(서열번호 39)-[dA](본원에서 BCY12864로서 지칭됨);
    (서열번호 40)-[dA](본원에서 BCY12865로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 41)(본원에서 BCY12866으로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 42)(본원에서 BCY13116으로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 43)(본원에서 BCY13117로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 44)(본원에서 BCY13118로서 지칭됨);
    [dA]-[HArg]-D-(서열번호 46)-[dA](본원에서 BCY13123으로서 지칭됨);
    [d1Nal]-[HArg]-D-(서열번호 46)-[dA](본원에서 BCY13124로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 47)(본원에서 BCY13130으로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 48)(본원에서 BCY13131로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 49)(본원에서 BCY13132로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 50)(본원에서 BCY13134로서 지칭됨);
    A-[HArg]-D-(서열번호 51)(본원에서 BCY13135로서 지칭됨);
    (서열번호 154)-[dK](본원에서 BCY13129로서 지칭됨);
    A[HArg]D-(서열번호 155)(본원에서 BCY13133으로서 지칭됨);
    A[HArg]D-(서열번호 156)(본원에서 BCY13917로서 지칭됨);
    A[HArg]D-(서열번호 157)(본원에서 BCY13918로서 지칭됨);
    A[HArg]D-(서열번호 158)(본원에서 BCY13919로서 지칭됨);
    A[HArg]D-(서열번호 159)(본원에서 BCY13920으로서 지칭됨);
    A[HArg]D-(서열번호 160)(본원에서 BCY13922로서 지칭됨);
    A[HArg]D-(서열번호 161)(본원에서 BCY13923으로서 지칭됨);
    A[HArg]D-(서열번호 162)(본원에서 BCY14047로서 지칭됨);
    A[HArg]D-(서열번호 163)(본원에서 BCY14048로서 지칭됨); 및
    A[HArg]D-(서열번호 164)(본원에서 BCY14313으로서 지칭됨); 또는
    이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
    여기서, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, B-Ala는 베타-알라닌을 나타내고, Sar10은 10개의 사르코신 단위를 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타내고, NMeAla는 N-메틸알라닌을 나타내고, 1Nal은 1-나프틸알라닌을 나타내고, 팔미토일-Glu-LysN3 [PYA]는
    Figure pct00151
    을 나타낸다.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 임의로 N-말단 변형을 포함하고,
    A-[HArg]-D-(서열번호 24)(본원에서 BCY9594로서 지칭됨); 또는
    이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
    여기서, HArg는 호모아르기닌을 나타내는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  28. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EphA2 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 임의로 N-말단 변형을 포함하고,
    A-[HArg]-D-(서열번호 44)(본원에서 BCY13118로서 지칭됨); 또는
    이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
    여기서, HArg는 호모아르기닌을 나타내는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 표 C에 열거된 복합체 중 어느 하나, 예를 들어, BCY12491, BCY12730, BCY13048, BCY13050, BCY13053 및 BCY13272로부터 선택되는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  30. 제29항에 있어서, BCY12491인 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  31. 제29항에 있어서, BCY13272인 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  32. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포에 존재하는 상기 성분이 PD-L1인, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 PD-L1 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 하기로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체:
    CiSAGWLTMCiiQKLHLCiii (서열번호 52);
    CiSAGWLTMCiiQ[K(PYA)]LHLCiii (서열번호 53);
    CiSKGWLTMCiiQ[K(Ac)]LHLCiii (서열번호 54);
    CiSAGWLTKCiiQ[K(Ac)]LHLCiii (서열번호 55);
    CiSAGWLTMCiiK[K(Ac)]LHLCiii (서열번호 56);
    CiSAGWLTMCiiQ[K(Ac)]LKLCiii (서열번호 57);
    CiSAGWLTMCiiQ[HArg]LHLCiii (서열번호 58); 및
    CiSAGWLTMCii[HArg]QLNLCiii (서열번호 59);
    여기서, Ci, Cii 및 Ciii는 각각 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 나타내고, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타낸다.
  34. 제33항에 있어서, 상기 PD-L1 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드가 임의로 N- 말단 및/또는 C-말단 변형을 포함하고,
    [PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-SDK-(서열번호 52) (본원에서 BCY10043으로서 지칭됨);
    Ac-D-[HArg]-(서열번호 52)-PSH (본원에서 BCY11865로서 지칭됨);
    Ac-SDK-(서열번호 53) (본원에서 BCY11013으로서 지칭됨);
    Ac-SDK-(서열번호 53)-PSH (본원에서 BCY10861로서 지칭됨);
    Ac-D-[HArg]-(서열번호 54)-PSH (본원에서 BCY11866으로서 지칭됨);
    Ac-D-[HArg]-(서열번호 55)-PSH (본원에서 BCY11867로서 지칭됨);
    Ac-D-[HArg]-(서열번호 56)-PSH (본원에서 BCY11868로서 지칭됨);
    Ac-D-[HArg]-(서열번호 57)-PSH (본원에서 BCY11869로서 지칭됨);
    Ac-SD-[HArg]-(서열번호 58)-PSHK (본원에서 BCY12479로서 지칭됨); 및
    Ac-SD-[HArg]-(서열번호 59)-PSHK (본원에서 BCY12477로서 지칭됨); 또는
    이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
    여기서, PYA는 4-펜티노산을 나타내고, B-Ala는 베타-알라닌을 나타내고, Sar10은 10개의 사르코신 단위를 나타내고, HArg는 호모아르기닌을 나타내는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 표 D에 열거된 복합체 중 어느 하나로부터 선택되는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  36. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 제2 펩티드 리간드가 하나의 CD137 결합 바이사이클릭 펩티드 리간드 및 하나의 OX40 결합 바이사이클릭 펩티드를 포함하는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  37. 제36항에 있어서, 표 F에 열거된 복합체인, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  38. 제1항에 있어서, 표 G 및 H에 열거된 복합체 중 어느 하나로부터 선택되는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자 스캐폴드가 1,1', 1"-(1,3,5-트리아지난-1,3,5-트리일)트리프로프-2-엔-1-온(TATA)으로부터 선택되는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 염이 유리산, 또는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄 염으로부터 선택되는, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물.
  42. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 예방, 억제 또는 치료에 사용하기 위한, 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체.
  43. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 정의된 헤테로탠덤 바이사이클릭 펩티드 복합체의 시험관내 EC50 초과의 상기 복합체의 혈장 농도를 유지하지 않는 투여 빈도로 상기 복합체를 투여함을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
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