EA045834B1 - Гетеротандемные бициклические пептидные комплексы - Google Patents

Гетеротандемные бициклические пептидные комплексы Download PDF

Info

Publication number
EA045834B1
EA045834B1 EA202092388 EA045834B1 EA 045834 B1 EA045834 B1 EA 045834B1 EA 202092388 EA202092388 EA 202092388 EA 045834 B1 EA045834 B1 EA 045834B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
μmol
seq
compound
pya
hereinafter referred
Prior art date
Application number
EA202092388
Other languages
English (en)
Inventor
Николас Кин
Кевин Макдоннелл
Питер ПАРК
Пунит Упадхиайа
Джемма Мадд
Original Assignee
Байсиклтэкс Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байсиклтэкс Лимитед filed Critical Байсиклтэкс Лимитед
Publication of EA045834B1 publication Critical patent/EA045834B1/ru

Links

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к гетеротандемным бициклическим пептидным комплексам, которые содержат первый пептидный лиганд, который связывается с компонентом, присутствующим на иммунной клетке, конъюгированный через линкер со вторым пептидным лигандом, который связывается с компонентом, присутствующим на раковой клетке. Изобретение также относится к применению указанных гетеротандемных бициклических пептидных комплексов для профилактики, подавления или лечения рака.
Уровень техники
Циклические пептиды способны с высокой аффинностью и специфичностью к мишени связываться с белками-мишенями и, поэтому, представляют собой перспективный класс молекул для разработки терапевтических средств. Фактически, несколько циклических пептидов уже успешно используются в клинической практике, например антибактериальный пептид ванкомицин, иммунодепрессант циклоспорин или противораковый препарат октреотид (Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). Хорошие связывающие свойства являются результатом относительно большой поверхности взаимодействия, образующейся между пептидом и мишенью, а также пониженной конформационной гибкости циклических структур. Обычно макроциклы связываются с поверхностями площадью несколько сотен квадратных ангстрем, как, например, циклический пептидный антагонист CXCR4-CVX15 (400 A2; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), циклический пептид с мотивом Arg-Gly-Asp, связывающийся с интегрином aVb3 (355 A2) (Xiong et al. (2002), Science 296 (5565), 151-5), или циклический пептидный ингибитор упаин-1, связывающийся с активатором плазминогена урокиназного типа (603 A2; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10).
Из-за своей циклической конфигурации пептидные макроциклы являются менее гибкими, чем линейные пептиды, что приводит к меньшей потере энтропии при связывании с мишенями и приводит к более высокой аффинности связывания. Сниженная гибкость также приводит к блокировке мишеньспецифичных конформаций, повышая специфичность связывания по сравнению с линейными пептидами. Этот эффект был продемонстрирован на мощном и селективном ингибиторе матриксной металлопротеиназы-8 (ММП-8), который терял свою селективность относительно других ММП при раскрытии его кольца (Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749 -51). Усиление связывающих свойств, достигаемое за счет макроциклизации, даже более выражено у полициклических пептидов, имеющих более одного пептидного кольца, как, например, у ванкомицина, низина и актиномицина.
Различные исследовательские группы ранее осуществляли связывание полипептидов с остатками цистеина с синтетической молекулярной структурой (Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Meloen с соавторами использовали трис(бромметил)бензол и родственные молекулы для быстрой и количественной циклизации множества пептидных петель на синтетических каркасах для структурной имитации поверхности белков (Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Способы получения лекарственных соединений-кандидатов, где указанные соединения получают путем связывания цистеинсодержащих полипептидов с молекулярным каркасом, таким как, например, трис(бромметил)бензол, раскрыты в WO 2004/077062 и WO 2006/078161.
Для создания и скрининга больших библиотек бициклических пептидов на связывание с представляющими интерес мишенями были разработаны комбинаторные подходы на основе фагового дисплея (Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 и WO 2009/098450). Кратко, комбинаторные библиотеки линейных пептидов, содержащих три остатка цистеина и две области из шести случайных аминокислот (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys), представлялись на фаге и подвергались циклизации путем ковалентного связывания боковых цепей цистеина с низкомолекулярным соединением трис(бромметил)бензолом.
Сущность изобретения
Согласно первому аспекту изобретения предложен комплекс гетеротандемных бициклических пептидов, содержащий:
(a) первый пептидный лиганд, который связывается с компонентом иммунной клетки; конъюгированный через линкер с (b) вторым пептидным лигандом, который связывается с компонентом раковой клетки; где каждый из указанных пептидных лигандов включает полипептид, содержащий по крайней мере три остатка цистеина, разделенных по меньшей мере двумя последовательностями петель, и молекулярный каркас, который образует ковалентные связи с цистеиновыми остатками полипептида, так что на молекулярном каркасе образуются по меньшей мере две полипептидные петли.
Согласно дополнительному аспекту изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая гетеротандемный бициклический пептидный комплекс согласно настоящему документу в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями.
В соответствии с дополнительным аспектом изобретения предложен комплекс гетеротандемных бициклических пептидов согласно настоящему документу для применения в профилактике, подавлении или лечении рака.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: схематическое изображение гетеротандемного бициклического пептидного комплекса, со- 1 045834 держащего пептидный лиганд EphA2 и CD137, связывающийся как с иммунной клеткой, так и с раковой клеткой.
Фиг. 2: структура и композиция EphA2-CD137 гетеротандемного бициклического пептидного комплекса, BCY7985.
Фиг. 3: анализ EphA2-CD137 гетеротандемного бициклического пептидного комплекса, BCY7985, в люциферазном репортерном анализе на CD137 от Promega (CS196008) в присутствии клеток НТ1080, экспрессирующих EphA2.
Фиг. 4: гетеротандемы EphA2/CD137 активны в репортерном анализе на CD137, и кратность индукции активации зависит от уровня экспрессии опухолевой мишени на клеточной линии, используемой в совместном культивировании.
Фиг. 5: гетеротандемы EphA2/CD137 индуцируют уничтожение опухолевых клеток в анализе, основанном на совместном культивировании первичных Т-клеток человека и раковых клеток. Уничтожение опухолевых клеток оценивают путем подсчета жизнеспособных NucLight Red-положительных опухолевых клеток с течением времени. Окрашивание каспаз-3/7 используется для идентификации апоптотических опухолевых клеток.
Фиг. 6: гетеротандемы нектин-4/CD137 активны в репортерном анализе на CD137, и кратность индукции активации зависит от уровня экспрессии опухолевой мишени в клеточной линии (НТ1376: высокая экспрессия нектина-4, и NCI-H292: средняя экспрессия нектина-4), используемой в совместном культивировании.
Фиг. 7: гетеротандемы нектин-4/CD137 индуцируют секрецию цитокинов IL-2 и IFN-γ в анализе, основанном на совместном культивировании с РВМС-4Т1. BCY9350 и BCY9351 представляют собой несвязывающие контроли для нектина-4 и CD137 соответственно.
Фиг. 8: гетеротандемы нектин-4/CD137 индуцируют зависимое от мишени высвобождение цитокинов в ex vivo культурах клеток первичных опухолей легких, полученных от пациента. (A) Ex vivo опухолевые клетки, полученные от пациента, образуют трехмерные сфероиды в течение 4 ч в культуре, 10кратное изображение под световым микроскопом. (В) Проточный анализ экспрессии нектина-4 в полученных от пациентов образцах опухолей от 3 доноров. (С) Таблица показывает % CD137+ Т-клеток и нектин-4+ клеток в образцах от 3 доноров. (D) Тепловая карта, показывающая % изменения иммунных маркеров (нормализованных по носителю) в ответ на обработку контрольными/тестируемыми соединениями. (Е) % CD8+ki67+ Т-клеток в ответ на обработку контрольными/тестируемыми соединениями (носитель обозначен пунктирной линией).
Фиг. 9: гетеротандемы PD-L1/CD137 активны в репортерном анализе на CD137 в присутствии клеточной линии RKO, экспрессирующей PD-L1.
Фиг. 10: фармакокинетика гетеротандемов у крыс SD: BCY10572 и BCY10000 вводили внутривенно в дозе 2 мг/кг (n=3).
Подробное описание изобретения
Согласно первому аспекту изобретения предложен гетеротандемный бициклический пептидный комплекс, содержащий:
(a) первый пептидный лиганд, который связывается с компонентом иммунной клетки; конъюгированный через линкер с (b) вторым пептидным лигандом, который связывается с компонентом раковой клетки; где каждый из указанных пептидных лигандов включает полипептид, содержащий по меньшей мере три остатка цистеина, разделенных по меньшей мере двумя последовательностями петель, и молекулярный каркас, который образует ковалентные связи с цистеиновыми остатками полипептида, так что на молекулярном каркасе образуются по меньшей мере две полипептидные петли.
Первые пептидные лиганды
Ссылки в данном документе на термин иммунная клетка включают любую клетку в иммунной системе. Подходящие примеры включают лейкоциты, такие как лимфоциты (например, Т-лимфоциты или Т-клетки, В-клетки или естественные клетки-киллеры). В одном варианте осуществления Т-клетка представляет собой экспрессирующую CD8 или CD4 клетку. В другом варианте осуществления Т-клетка представляет собой экспрессирующую CD8 клетку. Другие примеры иммунных клеток включают дендритные клетки, фолликулярные дендритные клетки и гранулоциты.
В одном варианте осуществления компонент, присутствующий на иммунной клетке, представляет собой CD137.
CD137 является представителем семейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNF). Его альтернативные названия - представитель суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей 9 (TNFRSF9), 4-IBB и белок, индуцированный активацией лимфоцитов (ILA). CD137 может экспрессироваться активированными Т-клетками, но в большей степени на CD8+, чем на CD4+, Т-клетках. Кроме того, экспрессия CD137 обнаруживается на дендритных клетках, фолликулярных дендритных клетках, естественных клетках-киллерах, гранулоцитах и клетках стенок кровеносных сосудов в местах воспаления. Одной из характеристик активности CD137 является его костимулирующая активность в отношении активированных Т-клеток. Сшивание CD137 усиливает пролиферацию Т-клеток, секрецию IL-2, выжи- 2 045834 ваемость и цитолитическую активность. Кроме того, он может повысить иммунную активность для уничтожения опухолей у мышей.
CD137 является костимулирующим рецептором Т-клеток, индуцируемым активацией TCR (Nam et al., Curr. Cancer Drug Targets, 5:357-363 (2005); Waits et al., Annu. Rev, Immunol., 23:23-68 (2005)). В дополнение к его экспрессии на активированных CD4+ и CD8+ Т-клетках, CD137 также экспрессируется на CD4+ CD25+ регуляторных Т-клетках, естественных киллерах (NK) и NK-T-клетках, моноцитах, нейтрофилах и дендритных клетках. Его природный лиганд, CD137L, был описан на антигенпрезентирующих клетках, включая В-клетки, моноциты/макрофаги и дендритные клетки (Watts et al. Annu. Rev. Immunol, 23:23-68 (2005)). При взаимодействии со своим лигандом CD137 приводит к повышенной TCRиндуцированной пролиферации Т-клеток, продукции цитокинов, функциональному созреванию и увеличению выживаемости CD8+ Т-клеток (Nam et al, Curr. Cancer Drug Targets, 5:357-363 (2005), Watts et al., Annu. Rev. Immunol, 23:23-68 (2005)).
CD137-сигнальный путь, активируемый либо CD137L, либо с использованием агонистических моноклональных антител (mAb) против CD137 приводит к усилению TCR-индуцированной пролиферации Т-клеток, продукции цитокинов и функциональному созреванию, а также к увеличению выживаемости CD8+ Т-клеток. Эти эффекты являются результатом: (1) активации сигнальный путей NF-кВ, c-Jun NH2концевой киназы/стресс-активируемой протеинкиназы (JNK/SAPK) и митоген-активируемой протеинкиназы р38 (MAPK); и (2) регуляции антиапоптотической экспрессии и экспрессии генов, связанных с клеточным циклом.
Эксперименты, проведенные на мышах с дефицитом CD137 и CD137L, дополнительно продемонстрировали важность костимуляции CD137 для формирования полностью компетентного Т-клеточного ответа.
NK-клетки, активируемые IL-2 и IL-15, экспрессируют CD137, и лигирование CD137 агонистическими mAb стимулирует пролиферацию NK-клеток и секрецию IFN-γ, но не их цитолитическую активность.
Кроме того, стимулированные CD137 NK-клетки способствуют размножению активированных Тклеток in vitro.
В соответствии с их костимулирующей функцией, агонистические mAb против CD137, как было показано, способствуют отторжению сердечных и кожных аллотрансплантатов, уничтожают сформировавшиеся опухоли, увеличивают первичные противовирусные ответы CD8+ Т-клеток и повышают цитолитический потенциал Т-клеток. Эти исследования подтверждают мнение о том, что сигнальный путь CD137 способствует функционированию Т-клеток, что может повысить иммунитет против опухолей и инфекции.
В одном варианте осуществления первый пептидный лиганд включает связывающий CD137 бициклический пептидный лиганд.
Подходящие примеры связывающих CD137 бициклических пептидных лигандов раскрыты в патентных заявках Великобритании №№ 1712589.9 и 1802934.8, пептиды из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.
В одном варианте осуществления изобретения связывающий CD137 бициклический пептидный лиганд содержит аминокислотную последовательность:
CiIEEGQYCiiFADPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 1);
Ci[tBuAla]PE[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 3);
CiIEEGQYCiiF[D-Ala]DPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 4);
Ci[tBuAla]PK[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 5);
CittBuAlalPEID-LyslPYCiiFADPYINlelCiii (SEQ ID NO: 6);
Ci[tBuAla]P[K(PYA)][D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 7);
Ci[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 8);
CiIEE[D-Lys(PYA)]QYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 9); и
[dCi][dI][dE][dE][K(PYA)][dQ][dY][dCii][dF][dA][dD][dP][dY][dNle][dCiii] (SEQ ID NO: 10);
где Ci, Cii и Ci представляют собой первый, второй и третий остатки цистеина, соответственно, Nle представляет собой норлейцин, tBuAla представляет собой трет-бутилаланин, PYA представляет собой 4пентиновую кислоту, или их фармацевтически приемлемую соль.
В одном конкретном варианте осуществления, который можно указать, связывающий CD137 бициклический пептидный лиганд содержит аминокислотную последовательность:
CiIEEGQYCiiFADPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 1);
где Ci, Cii и Ci представляют собой первый, второй и третий остатки цистеина, соответственно, Nle представляет собой норлейцин, или их фармацевтически приемлемую соль.
В дополнительном варианте осуществления связывающий CD137 бициклический пептидный лиганд содержит N- и С-концевые модификации и включает
- 3 045834
Ac-A-(SEQ ID NO: 1)-Dap (далее обозначается как BCY7732);
Ac-A-(SEQ ID NO: l)-Dap(PYA) (далее обозначается как BCY7741);
Ac-(SEQ ID NO: 3)-Dap (далее обозначается как BCY9172);
Ac-(SEQ ID NO: 3)-Dap(PYA) (далее обозначается как BCY11014);
Ac-A-(SEQ ID NO: 4)-Dap (далее обозначается как BCY8045);
Ac-(SEQ ID NO: 5)-A (далее обозначается как BCY8919);
Ac-(SEQ ID NO: 6)-A (далее обозначается как BCY8920);
Ac-(SEQ ID NO: 7)-A (далее обозначается как BCY8927);
Ac-(SEQ ID NO: 8)-A (далее обозначается как BCY8928);
Ac-A-(SEQ ID NO: 9)-A (далее обозначается как BCY7744); и
Ac-[dA]-(SEQ ID NO: 10)-[dA]-NH2 (далее обозначается как BCY11506);
где Ас представляет собой ацетильную группу, Dap представляет собой диаминопропионовую кислоту, и PYA представляет собой 4-пентиновую кислоту, или их фармацевтически приемлемую соль.
В дополнительном варианте осуществления, который можно указать, связывающий CD137 бициклический пептидный лиганд содержит N- и С-концевые модификации и включает:
Ac-A-(SEQ ID NO: 1)-Dap (далее обозначается как BCY7732);
где Ас представляет собой ацетильную группу, a Dap представляет собой диаминопропионовую кислоту, или их фармацевтически приемлемую соль.
Вторые пептидные лиганды
Ссылки в данном документе на термин раковая клетка включают любую клетку, которая, как известно, относится к раковым. Раковые клетки образуются при повреждении генов, отвечающих за регуляцию деления клеток. Канцерогенез вызывается мутацией и эпимутацией генетического материала нормальных клеток, что нарушает нормальный баланс между пролиферацией и гибелью клеток. Это приводит к неконтролируемому делению клеток и эволюции этих клеток путем естественного отбора в организме. Неконтролируемое и часто быстрое разрастание клеток может привести к доброкачественным или злокачественным опухолям (раку). Доброкачественные опухоли не распространяются на другие части тела и не проникают в другие ткани.
Злокачественные опухоли могут поражать другие органы, распространяться в отдаленные места (метастазы) и становиться опасными для жизни.
В одном варианте осуществления изобретения злокачественную клетку выбирают из опухолевой клетки НТ1080, SC-OV-3, PC3, Н1376, NCI-H292, LnCap, MC38, 4T1-D02 и RKO.
В одном варианте осуществления изобретения компонент, присутствующий на раковой клетке, представляет собой EphA2.
Рецепторные тирозинкиназы Eph принадлежат к большой группе рецепторных тирозинкиназ (RTK), киназ, которые фосфорилируют белки по остаткам тирозина. Eph и связанные с ними мембранные эфриновые лиганды (эфрины) контролируют положение клеток и организацию ткани (Poliakov et al. (2004) Dev Cell 7, 465-80). Функциональные и биохимические ответы Eph возникают при более высоких состояниях олигомеризации лигандов (Stein et al. (1998) Genes Dev 12, 667-678).
Помимо других функций формирования паттерна клеток, различные Eph и эфрины, как было показано, играют роль в развитии сосудов. Нокаут EphB4 и эфрина-В2 приводит к отсутствию способности ремоделировать капиллярные русла в кровеносные сосуды (Poliakov et al., supra) и к гибели эмбрионов. Устойчивая экспрессия некоторых Eph-рецепторов и эфринов также наблюдалась в новообразованных взрослых микрососудах (Brantley-Sieders et al. (2004) Curr Pharm Des 10, 3431-42; Adams (2003) J Anat 202, 105-12).
Разрегулированное повторное появление некоторых эфринов и их рецепторов у взрослых также способствует инвазии опухоли, метастазированию и неоангиогенезу ((Nakamoto et al. (2002) Microsc Res Tech 59, 58-67; Brantley-Sieders et al., supra). Кроме того, было обнаружено, что некоторые члены семейства Eph сверхэкспрессируются на опухолевых клетках из различных опухолей человека (BrantleySieders et al., supra) Marme (2002) Ann Hematol 81 Suppl 2, S66; Booth et al. (2002) Nat Med 8, 1360-1).
ЕРН-рецептор А2 (рецептор-2 эфрина А-типа) представляет собой белок, который у человека кодируется геном ЕРНА2.
EphA2 активируется при множественных раковых заболеваниях у человека, часто коррелируя с прогрессированием заболевания, метастазами и плохим прогнозом, например: при раке молочных желез (Zelinski et al. (2001) Cancer Res. 61, 2301-2306; Zhuang et al. (2010) Cancer Res. 70, 299-308; BrantleySieders et al. (2011) PLoS One 6, e24426), легких (Brannan et al. (2009) Cancer Prev Res (Phila) 2, 1039-1049; Kinch et al. (2003) Clin Cancer Res. 9, 613-618; Guo et al. (2013) J Thorac Oncol. 8, 301-308, желудка (Nakamura et al. (2005) Cancer Sci. 96, 42-47; Yuan et al. (2009) Dig Dis Sci 54, 2410-2417, поджелудочной железы (Mudali et al. (2006) Clin Exp Metastasis 23, 357-365), простаты (Walker-Daniels et al. (1999) Prostate 41, 275-280), печени (Yang et al. (2009) Hepatol Res. 39, 1169-1177) и глиобластоме (Wykosky et al (2005) Mol Cancer Res. 3, 541-551; Li et al. (2010) Tumor Biol. 31, 477-488).
- 4 045834
Полностью роль EphA2 в прогрессировании рака до сих пор не установлена, хотя есть доказательства взаимодействия на многих стадиях развития рака, включая рост опухолевых клеток, выживаемость, инвазию и ангиогенез. Подавление экспрессии EphA2 подавляет распространение раковых клеток опухоли (Binda et al. (2012) Cancer Cell 22, 765-780), тогда как блокада EphA2 ингибирует индуцированную VEGF миграцию клеток (Hess et al. (2001) Cancer Res. 61, 3250-3255), прорастание и ангиогенез (Cheng et al. (2002) Mol Cancer Res.1, 2-11; Lin et al. (2007) Cancer 109, 332-40) и прогресс метастазирования (Brantley-Sieders et al. (2005) FASEB J. 19, 1884-1886).
Было показано, что конъюгат антитела и лекарственного средства к EphA2 значительно снижает рост опухоли на крысиных и мышиных моделях ксенотрансплантатов (Jackson et al.(2008) Cancer Research 68, 9367-9374), и аналогичный подход был опробован на человеке, хотя лечение вынуждено было прекращено из-за побочных эффектов, связанных с лечением (Annunziata et al. (2013) Invest New drugs 31, 77-84).
В одном варианте осуществления изобретения второй пептидный лиганд включает бициклический пептидный лиганд, связывающийся с EphA2.
Подходящие примеры связывающих EphA2 бициклических пептидных лигандов раскрыты в патентных заявках Великобритании №№ 1721259.8 и 1804102.0, пептиды из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.
В одном варианте осуществления изобретения связывающийся с EphA2 бициклический пептидный лиганд содержит аминокислотную последовательность:
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (SEQ ID NO: 2); и
CiLWDPTPCiiANLHL[HArg]Ciii (SEQ ID NO: 11);
где Ci, Ci и Ciii представляют собой первый, второй и третий остатки цистеина, соответственно, НуР представляет собой гидроксипролин, dD представляет собой аспарагиновую кислоту в D-конфигурации, и HArg представляет собой гомоаргинин, или их фармацевтически приемлемую соль.
В одном варианте осуществления изобретения, который можно указать, связывающий EphA2 бициклический пептидный лиганд содержит аминокислотную последовательность:
Ci[HyP]LVNPLCi1LHP[dD]W[HArg]Clil (SEQ ID NO: 2);
где Ci, Cii и Ciii представляют собой первый, второй и третий остатки цистеина, соответственно, НуР представляет собой гидроксипролин, dD представляет собой аспарагиновую кислоту в D-конфигурации, и HArg представляет собой гомоаргинин, или их фармацевтически приемлемую соль.
В дополнительном варианте осуществления изобретения связывающий EphA2 бициклический пептидный лиганд содержит N-концевые модификации и включает
A-HArg-D-(SEQ ID NO: 2) (далее обозначается как BCY9594);
[B-Ala]-[Sario]-A-[HArg]-D-(SEQ ID NO: 2) (далее обозначается как BCY6099);
[PYA]-[B-Ala]-[Sari0]-A-[HArg]-D-(SEQ ID NO: 2) (далее обозначается как
BCY6169); и
[PYA]-[B-Ala]-[Sari0]-VGP-(SEQ ID NO: 11) (далее обозначается как BCY8941);
где HArg представляет собой гомоаргинин, PYA представляет собой 4-пентиновую кислоту, Sar10 представляет собой 10 саркозиновых звеньев, B-Ala представляет собой бета-аланин, или их фармацевтически приемлемую соль.
В дополнительном варианте осуществления изобретения, который можно указать, связывающий EphA2 бициклический пептидный лиганд содержит N-концевые модификации и включает
A-HArg-D-(SEQ Ш NO: 2) (далее обозначается как BCY9594).
где HArg представляет собой гомоаргинин, или их фармацевтически приемлемую соль.
В альтернативном варианте осуществления изобретения компонент, присутствующий на раковой клетке, представляет собой PD-L1.
Лиганд-1 белка запрограммированной гибели клеток-1 (PD-L1) представляет собой 290аминокислотный трансмембранный белок I типа, кодируемый геном CD274 на хромосоме 19 мыши и хромосоме 9 человека. PD-L1 задействован в избегании от иммунного ответа, связанного с хронической инфекцией, например, хронической вирусной инфекцией (включая, среди прочего, HIV, HBV, HCV и HTLV), хронической бактериальной инфекцией (включая, например, среди прочего, Helicobacter pylori) и хронической паразитарной инфекцией (включая, например, Schistosoma mansoni). Экспрессия PD-L1 была обнаружена в ряде тканей и типов клеток, включая Т-клетки, В-клетки, макрофаги, дендритные клетки и негематопоэтические клетки, включая эндотелиальные клетки, гепатоциты, мышечные клетки и плаценту.
PD-L1 также участвует в подавлении противоопухолевой иммунной активности. Опухоли экспрессируют антигены, которые могут распознаваться Т-клетками хозяина, но иммунологический клиренс опухолей случается редко. Частично этот сбой происходит из-за подавления иммунитета микросредой опухоли. Экспрессия PD-L1 на многих опухолях является компонентом этой подавляющей среды и действует совместно с другими иммунодепрессивными сигналами. Экспрессия PD-L1 была продемонстрирована in situ на большом количестве солидных опухолей, включая молочную железу, легкие, толстую
- 5 045834 кишку, яичники, меланому, мочевой пузырь, печень, слюну, желудок, глиомы, щитовидную железу, эпителий тимуса, голову и шею (Brown JA et al. 2003 Immunol. 170:1257-66; Dong H et al. 2002 Nat. Med. 8:793-800; Hamanishi J, et al. 2007 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-65; Strome SE et al. 2003 Cancer Res. 63:6501-5; Inman BA et al. 2007 Cancer 109:1499-505; Konishi J et al. 2004 Clin. Cancer Res. 10:5094-100; Nakanishi J et al. 2007 Cancer Immunol. Immunother. 56:1173-82; Nomi T et al. 2007 Clin. Cancer Res. 13:2151-57; Thompson RH et al. 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 17174-79; Wu С et al. 2006 Acta Histochem. 108:19-24). Кроме того, экспрессия рецептора PD-L1, белка запрограммированной гибели клеток-1 (также известного как PD-1 и CD279) повышается в лимфоцитах, инфильтрирующих опухоль, и это также способствует иммуносупрессии в опухоли (Blank С et al. 2003 Immunol. 171: 4574-81). Что наиболее важно, исследования, связывающие экспрессию PD-L1 в опухолях с исходом заболевания, показывают, что экспрессия PD-L1 сильно коррелирует с неблагоприятным прогнозом при раке почек, яичников, мочевого пузыря, молочных желез, желудка и поджелудочной железы (Hamanishi J et al. 2007 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-65; Inman BA et al. 2007 Cancer 109:1499-505; Konishi J et al. 2004 Clin. Cancer Res. 10:5094-100; Nakanishi J et al. 2007 Cancer Immunol. Immunother. 56:1173-82; Nomi T et al. 2007 Clin. Cancer Res. 13:2151-57; Thompson RH et al. 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17174-79; Wu С et al. 2006 Acta Histochem. 108:19-24). Кроме того, эти исследования показывают, что более высокие уровни экспрессии PD-L1 в опухолях могут способствовать продвижению стадии опухоли и инвазии в более глубокие тканевые структуры.
Сигнальный путь PD-1 также может играть роль в гематологических злокачественных новообразованиях. PD-L1 экспрессируется на клетках множественной миеломы, но не на нормальных плазматических клетках (Liu J et al. 2007 Blood 110: 296-304). PD-L1 экспрессируется на некоторых первичных Тклеточных лимфомах, особенно на анапластических крупноклеточных Т-лимфомах (Brown JA et al. 2003 Immunol. 170: 1257-66). PD-1 экспрессируется на высоком уровне на Т-клетках ангиоиммунобластных лимфом, a PD-L1 экспрессируется на ассоциированной сети фолликулярных дендритных клеток (Dorfman DM et al. 2006 Am. J. Surg. Pathol. 30: 802-10). В лимфоме Ходжкина с преобладанием узловых лимфоцитов Т-клетки, связанные с лимфоцитарными или гистиоцитарными (L&H) клетками, экспрессируют PD-1. Микроматричный анализ на экспрессию генов, индуцированных лигированием PD-1, предполагает, что ассоциированные с опухолью Т-клетки отвечают на сигналы PD-1 in situ при лимфоме Ходжкина (Chemnitz JM et al. 2007 Blood 110: 3226-33). PD-1 и PD-L1 экспрессируются на CD4 Т-клетках при HTLV-1-опосредованном Т-клеточном лейкозе и лимфоме у взрослых (Shimauchi T et al. 2007 Int. J. Cancer 121: 2585-90). Эти опухолевые клетки имеют сниженный ответ на сигналы от TCR.
Исследования на животных моделях демонстрируют, что PD-L1 на опухолях ингибирует активацию Т-клеток и лизис опухолевых клеток и в некоторых случаях приводит к повышенной опухолеспецифической гибели Т-клеток (Dong H et al. 2002 Nat. Med. 8:793-800; Hirano F et al. 2005 Cancer Res. 65:1089-96). APC (антигенпредставляющие клетки), ассоциированные с опухолью, также могут использовать путь PD-1:PD-L1 для контроля противоопухолевых Т-клеточных ответов. Экспрессия PD-L1 в популяции ассоциированных с опухолью миелоидных DC (дендритных клеток) активируется факторами из среды, окружающей опухоль (Curiel TJ et al. 2003 Nat. Med. 9:562-67). Плазмацитоидные DC в дренирующем опухоль лимфатическом узле меланомы В16 экспрессируют IDO, которая сильно активирует супрессорную активность регуляторных Т-клеток. Супрессорная активность регуляторных Т-клеток, обусловленная воздействием IDO, требовала контакта клеток с IDO-экспрессирующими DC (Sharma MD et al. 2007 Clin. Invest. 117:2570-82).
В одном варианте осуществления второй пептидный лиганд включает связывающий PD-L1 бициклический пептидный лиганд.
Подходящие примеры связывающих PD-L1 бициклических пептидных лигандов раскрыты в патентных заявках Великобритании №№ 1820956.9 и 1820969.2, пептиды из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.
В одном варианте осуществления изобретения связывающий PD-L1 бициклический пептидный лиганд содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
Ci[HArg]DWCiiHWTFSHGHPCiii (SEQ ГО NO: 12);
CiSAGWLTMCiiQKLHLCiii (SEQ ID NO: 13); и CiSAGWLTMCiiQ[K(PYA)]LHLCiii (SEQ ID NO: 14);
где Ci, Cii и Ciij представляют собой первый, второй и третий остатки цистеина соответственно, HArg представляет собой гомоаргинин, и PYA представляет собой 4-пентиновую кислоту, или их фармацевтически приемлемую соль.
В другом варианте осуществления изобретения связывающий PD-L1 бициклический пептидный лиганд содержит N-концевые и/или С-концевые модификации и включает:
- 6 045834
[PYA]-[B-Ala]-[Sario]-(SEQ ID NO: 12) (далее обозначается как BCY8938); [PYA]-[B-Ala]-[Sari0]-SDK-(SEQ ID NO: 13) (далее обозначается как BCY10043); NH2-SDK-(SEQ ID NO: 13)-[San0]-[K(PYA)] (далее обозначается как BCY10044); NH2-SDK-(SEQ ID NO: 14) (далее обозначается как BCY10045); и Ac-SDK-(SEQ ID NO: 14)-PSH (далее обозначается как BCY10861);
где PYA представляет собой 4-пентиновую кислоту, B-Ala представляет собой бета-аланин, Sar10 представляет собой 10 саркозиновых звеньев, или их фармацевтически приемлемую соль.
В альтернативном варианте осуществления изобретения компонент, присутствующий на раковой клетке, представляет собой нектин-4.
Нектин-4 является поверхностной молекулой, которая принадлежит к семейству белков нектинов, которое состоит из 4 членов. Нектины являются молекулами клеточной адгезии, которые играют ключевую роль в различных биологических процессах, таких как полярность, пролиферация, дифференцировка и миграция, для эпителиальных, эндотелиальных, иммунных и нейрональных клеток во время развития и взрослой жизни биологических особей. Они участвуют в нескольких патологических процессах у человека. Нектины являются основными рецепторами полиовируса, вируса простого герпеса и вируса кори. Мутации в генах, кодирующих нектин-1 (PVRL1) или нектин-4 (PVRL4), вызывают синдромы эктодермальной дисплазии, связанные с другими аномалиями. Нектин-4 экспрессируется во время внутриутробного развития. Во взрослых тканях его экспрессия более ограничена, чем других представителей семейства. Нектин-4 представляет собой опухоль-ассоциированный антиген в 50%, 49% и 86% случаях карциномы молочных желез, яичников и легких, соответственно, в основном на опухолях с плохим прогнозом. Его экспрессия не обнаруживается в соответствующих нормальных тканях. В опухолях молочной железы нектин-4 экспрессируется в основном в трижды негативных карциномах и карциномах ERBB2+. В сыворотке крови пациентов с этими видами рака обнаружение растворимых форм нектина-4 связано с плохим прогнозом. Уровни нектина-4 в сыворотке крови повышаются при прогрессировании метастазирования и снижаются после лечения. Эти результаты предполагают, что нектин-4 может являться хорошей мишенью для лечения рака. Соответственно, в прототипах было описано несколько антител против нектина-4. В частности, энфортумаб-ведотин (ASG-22ME) представляет собой конъюгат антителолекарственное средство (ADC), нацеленный на нектин-4, и в настоящее время он проходит клинические испытания для лечения пациентов с солидными опухолями.
В одном варианте осуществления изобретения второй пептидный лиганд содержит связывающий нектин-4 бициклический пептидный лиганд.
Подходящие примеры связывающих нектин-4 бициклических пептидных лигандов раскрыты в патентных заявках Великобритании №№ 1810250.9, 1815684.4 и 1818499.4, пептиды из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.
В одном варианте осуществления изобретения связывающий нектин-4 бициклический пептидный лиганд содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
CiP[lNal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 15; далее обозначается какВСУ8116);
CiP[lNal][dD]CiiM[HArg]D[dW]STP[HyP][dW]Ciii (SEQ ID NO: 16; далее обозначается как BCY11415); и
CiP[lNal][dK](Sari0-(B-Ala))CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 17);
CiPFGCiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 18; далее обозначается как
BCY11414);
где Ci, Cu и CiU представляют собой первый, второй и третий остатки цистеина, соответственно, 1Nal представляет собой 1-нафтилаланин, HArg представляет собой гомоаргинин, НуР представляет собой гидроксипролин, B-Ala представляет собой бета-аланин, или их фармацевтически приемлемую соль.
В другом варианте осуществления изобретения связывающий нектин-4 бициклический пептидный лиганд необязательно содержит N-концевые модификации и включает
SEQ ID NO: 15 (далее обозначается как BCY8116);
[PYA]-[B-Ala]-[Sari0]-(SEQ ID NO: 15) (далее обозначается как BCY8846);
SEQ ID NO: 16 (далее обозначается как BCY11415);
[PYA]-[B-Ala]-[Sari0]-(SEQ ID NO: 16) (далее обозначается как BCY11942);
Ac-(SEQ ID NO: 17) (далее обозначается как BCY8831); и
SEQ ГО NO: 18 (далее обозначается как BCY11414);
где PYA представляет собой 4-пентиновую кислоту, B-Ala представляет собой бета-аланин, Sar10 представляет собой 10 саркозиновых звеньев, или их фармацевтически приемлемую соль.
В альтернативном варианте осуществления изобретения компонент, присутствующий на раковой клетке, представляет собой простатоспецифический мембранный антиген (PSMA).
Простатоспецифический мембранный антиген (PSMA) (также известный как глутаматкарбоксипептидаза II (GCPII), N-aцетил-L-aспaртил-L-глутaмaтпептидaза I (NAALADase I) и пептидаза NAAG) пред- 7 045834 ставляет собой фермент, который у человека кодируется геном FOLH1 (фолатгидролазой 1). GCPII человека содержит 750 аминокислот и имеет молекулярный вес приблизительно 84 кДа.
PSMA у человека на высоком уровне экспрессируется в простате, примерно в сто раз выше, чем в большинстве других тканей. При некоторых формах рака предстательной железы PSMA является вторым по повышению уровня генным продуктом с превышением в 8-12 раз по сравнению с уровнем в доброкачественных клетках простаты. Из-за этой высокой экспрессии PSMA принят в разработку в качестве потенциального биомаркера для терапии и визуализации некоторых видов рака. При раке простаты человека более высокая экспрессия PSMA в опухоли связана с более быстрым прогрессированием и большим процентом пациентов, страдающих рецидивами.
В одном варианте осуществления изобретения второй пептидный лиганд включает связывающийся с PSMA бициклический пептидный лиганд.
Подходящие примеры связывающих PSMA бициклических пептидных лигандов описаны в патентных заявках Великобритании №№ 1810318.4, 1810325.9 и 1820325.7, пептиды из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.
Линкеры
Следует понимать, что первый пептидный лиганд может быть конъюгирован со вторым пептидным лигандом через любой подходящий линкер. Обычно конструкция указанного линкера будет такой, что два бициклических пептида представлены таким образом, что они могут связываться беспрепятственно со своими соответствующими мишенями либо по отдельности, либо при одновременном связывании с обоими рецепторами-мишенями. Кроме того, линкер должен позволять связываться с обеими мишенями одновременно, сохраняя при этом соответствующее расстояние между клетками-мишенями, которое может привести к желаемому функциональному результату. Свойства линкера можно модулировать для увеличения длины, жесткости или растворимости для оптимизации желаемого функционального результата. Линкер также может быть подобран таким образом, чтобы позволить присоединяться более чем одному бициклическому соединению к одной мишени. Повышение валентности любого связывающего пептида может способствовать увеличению сродства гетеротандема к клеткам-мишеням или может помочь индуцировать олигомеризацию одного или обоих рецепторов-мишеней.
В одном варианте осуществления изобретения линкер выбран из следующих последовательностей: -СН2-, -PEG5-, -PEG10-, -PEG12-, -PEG23-, -PEG24-, -PEG15-Sar5-, -PEG10-Sarw-, -PEG5-Sar15-, -PEG5-Sar5-, -BAla-Sar20-, -B-Ala-Sar10-PEG10-, -B-Ala-Sar5-PEG15- и -B-Ala-Sar5-PEG5-.
Структуры подходящих линкеров подробно описаны ниже
H2N-Peg5-N3 H2N-Peg10-N3 H2N-Peg23-N3
GOM00000132 COM0D000134 COM000D0135
N3-PEG5-COOH N3 c:h? ССЮН NJ PI G17 CDOH
COM 00 00 0467 COM 00 00 0468 COM00000466
NHS-PEG5-N3 NHS-PEG12-N3
- 8 045834
H2N-PEG15-SAR5-N3
COM DO DOO 12В
H2N-PEG10-SAR10-N3
COMOOOOD12D
H 0
Wt
H 0 N N H2
H2N-PEG5-SAR1AN3
GOMDQD0013D
H2N-PEG5-SAR5-N3
COM000Q0131 lrYNHi
NHS-PEG24-NH3
H2N-iB-Ala)-SAR20-N3
COMaoaDQ4ij9 coMioaoaDira
H2N-(B-AI a )-SA R10- PEG 10- N 3
COM DO 00(1471
H 2 N-( В-Al a J-SAR5-PEG15-N3 COMO 00 00472
H2N-(B-Ala}-SAR5-PEG5-N3
COM 00 000473
Г етеротандемные комплексы
В одном конкретном варианте осуществления первый пептидный лиганд содержит связывающий CD137 бициклический пептидный лиганд, присоединенный к каркасу ТАТА, второй пептидный лиганд включает связывающий EphA2 бициклический пептидный лиганд, присоединенный к каркасу ТАТА, и указанный гетеротандемный комплекс выбирают из:
№ комплекса BCY номер для EphA2. Точка присоединения Линкер BCY номер для CD137 Точка присоединения
BCY9173 BCY6169 N-концевая PYA -PEGii- BCY9172 С-концевая Dap
BCY7985 BCY6169 N-концевая PYA -PEG12- BCY7732 С-концевая Dap
BCY8942 BCY6169 N-концевая PYA -PEG12- BCY8045 С-концевая Dap
BCY8943 BCY8941 N-концевая PYA -PEG12- BCY7732 С-концевая Dap
BCY9647 BCY6099 N-конец -PEGio- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9648 BCY6099 N-конец -peg23- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9655 BCY6099 N-конец -PEGi5- Sar5- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9656 BCY6099 N-конец -PEG10- Sario- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9657 BCY6099 N-конец -PEG5- Sari5- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9658 BCY6099 N-конец -peg5- Sars- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9659 BCY6099 N-конец -peg5- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9758 BCY6099 N-конец -PEG24- BCY7732 С-концевая Dap
BCY10568 BCY6169 N-концевая PYA -PEG12- BCY8919 Lys3
BCY10570 BCY6169 N-концевая PYA -PEG12- BCY8920 dLys4
BCY10574 BCY9594 N-конец -PEG5- BCY8927 Lys (PYA)3
BCY10575 BCY9594 N-конец -peg5- BCY8928 dLys (PYA)4
BCY10576 BCY9594 N-конец -peg5- BCY11014 С-концевая Dap(PYA)
BCY10577 BCY6169 N-конец -CH2- BCY9172 С-концевая Dap
Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс BCY7985 состоит из CD137-специфичного пептида BCY7859, связанного с N-концевой PYA-группой EphA2-специфичного пептида BCY6169 через PEG12 (графически показан на фиг. 2).
- 9 045834
CD137 представляет собой гомотримерный белок, а природный лиганд CD137L существует в виде гомотримера, который либо экспрессируется на иммунных клетках, либо секретируется. Биологическая активность CD137 сильно зависит от мультимеризации в отношении индукции активности CD137 в иммунных клетках. Одним из способов осуществления мультимеризации CD137 является клеточное перекрестное связывание специфичного агониста CD137 посредством взаимодействия со специфичным рецептором, присутствующим на другой клетке.
EphA2 на высоком уровне экспрессируется на опухолевых клетках, и олигомеризация этой рецепторной тирозинкиназы А-эфриновыми лигандами приводит к ее активации. Не ограничиваясь какойлибо одной гипотезой, авторы изобретения полагают, что гетеротандем EphA2-CD137, состоящий из одного EphA2-специфичного пептида, связанного с одним CD137-специфичным пептидом, действует для перекрестного связывания CD137. Подразумевается, что CD137 будет мультимеризоваться и активироваться в присутствии EphA2 на клетках, таких как опухолевые клетки. Это будет приводить к активации CD137-иммунных клеток в локальной среде опухоли (фиг. 1).
Эта гипотеза была проверена в репортерном анализе на клеточную активность CD137, описанном в настоящем документе, и результаты показаны в настоящем документе на фиг. 3, где можно увидеть, что BCY7985 продемонстрировал сильную индукцию активности CD137 в клетке в репортерном люциферазном анализе на CD137 от Promega (CS196008) в присутствии экспрессирующих EphA2 клеток НТ1080.
В одном альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения первый пептидный лиганд содержит связывающий CD137 бициклический пептидный лиганд, присоединенный к каркасу ТАТА, второй пептидный лиганд включает связывающий нектин-4 бициклический пептидный лиганд, присоединенный к каркасу ТАТА, и указанный гетеротандемный комплекс выбирают из:
№ комплекс а BCY номер для некпшна-4 Точка присоединения Линкер BCY номер для CD137 Точка присоединения
BCY8854 BCY8846 N-концевая PYA -PEG12- BCY7732 С-концевая Dap
BCY9350 BCY11942 N-концевая PYA -PEG12- BCY7732 С-концевая Dap
BCY9351 BCY8846 N-концевая PYA -PEG12- BCY8045 С-концевая Dap
BCY9399 BCY8116 N-конец -PEGio- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9400 BCY8116 N-конец -PEG23- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9401 BCY8116 N-конец -В-А1а- Sar2o- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9403 BCY8116 N-конец -В-А1а- SarioPEG10- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9405 BCY8116 N-конец -В-А1а- Sar5peg15- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9406 BCY8116 N-конец -В-А1а- Sars- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
- 10 045834
peg5-
BCY9407 BCY8116 N-конец -PEG15- Sars- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9408 BCY8116 N-конец -PEGio- Sario- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9409 BCY8116 N-конец -peg5- Saris- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9410 BCY8116 N-конец -peg5- Sar5- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9411 BCY8116 N-конец -peg5- BCY7741 С-концевая Dap(PYA)
BCY9759 BCY8116 N-конец -peg24- BCY7732 С-концевая Dap
BCY1000 0 BCY8846 N-концевая PYA -PEG12- BCY9172 С-концевая Dap
BCY1056 7 BCY8846 N-концевая PYA -PEG12- BCY8919 Lys3
BCY1056 9 BCY8846 N-концевая PYA -PEG12- BCY8920 dLys4
BCY1057 1 BCY8116 N-конец -peg5- BCY8927 Lys(PYA)3
BCY1057 2 BCY8116 N-конец -peg5- BCY8928 dLys (PYA)4
BCY1057 3 BCY8116 N-конец -peg5- BCY11014 С-концевая Dap(PYA)
BCY1057 8 BCY8846 N-концевая PYA -CH2- BCY9172 С-концевая Dap
BCY1091 7 BCY8831 dLys(Sario)-(B- А1а))4 -PEG12- BCY11014 С-концевая Dap(PYA)
BCY1102 0 BCY8831 dLys(Sario)-(B- А1а))4 -peg5- BCY11014 С-концевая Dap(PYA)
BCY1137 3 BCY8116 N-конец -CH2- BCY8927 Lys(PYA)3
BCY1137 4 BCY8116 N-конец -CH2- BCY8928 dLys (PYA)4
BCY1137 5 BCY8116 N-конец -CH2- BCY11014 С-концевая Dap(PYA)
BCY1161 6 BCY8116 N-конец -peg5- BCY7744 dLys (PYA)4
BCY1161 7 BCY8116 N-конец -peg5- BCY11506 Lys(PYA)4
BCY1185 7 BCY11414 N-конец -peg5- BCY7744 dLys (PYA)4
BCY1185 8 BCY11414 N-конец -peg5- BCY8928 dLys (PYA)4
BCY1185 9 BCY11415 N-конец -peg5- BCY8928 dLys (PYA)4
Не ограничиваясь какой-либо одной гипотезой, авторы изобретения полагают, что гетеротандем HeKTUH-4-CD137, состоящий из одного нектин-4-специфичного пептида, связанного с одним CD137специфичным пептидом, действует в отношении перекрестного связывания CD137 таким же образом, как описано выше для EphA2.
В одном варианте осуществления изобретения гетеротандем нектин-4-CD137 отличается от любого одного или нескольких из: BCY11857, BCY11858 и/или BCY11859.
В одном альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения первый пептидный лиганд содержит связывающий CD137 бициклический пептидный лиганд, присоединенный к каркасу ТА- 11 045834
ТА, второй пептидный лиганд включает связывающий PD-L1 бициклический пептидный лиганд, присоединенный к каркасу ТАТА, и указанный гетеротандемный комплекс выбирают из:
№ комплекса BCY номер для PD-L1 Точка присоединения Линкер BCY номер для CD137 Точка присоединения
BCY8939 BCY8938 N-концевая PYA -PEG12- BCY7732 С-концевая Dap
BCY10580 BCY10043 N-концевая PYA -PEG12- BCY9172 С-концевая Dap
BCY10581 BCY10044 С-концевая Lys(PYA) -PEG12- BCY9172 С-концевая Dap
BCY10582 BCY10045 Lys(PYA)9 -PEG12- BCY9172 С-концевая Dap
BCY11017 BCY10861 Lys(PYA)9 -PEG12- BCY8919 Lys3
BCY11018 BCY10861 Lys(PYA)9 -PEG12- BCY8920 dLys4
BCY11019 BCY10861 Lys(PYA)9 -PEG12- BCY9172 С-концевая Dap
BCY11376 BCY10861 Lys(PYA)9 -CH2- BCY8919 Lys3
BCY11377 BCY10861 Lys(PYA)9 -CH2- BCY8920 dLys4
BCY11378 BCY10861 Lys(PYA)9 -CH2- BCY9172 С-концевая Dap
BCY11379 BCY10861 Lys(PYA)9 -peg5- BCY8919 Lys3
BCY1138O BCY10861 Lys(PYA)9 -peg5- BCY8920 dLys4
BCY11381 BCY10861 Lys(PYA)9 -peg5- BCY9172 С-концевая Dap
Не ограничиваясь какой-либо одной гипотезой, авторы изобретения полагают, что гетеротандем PD-L1-CD137, состоящий из одного PD-L1-специфичного пептида, связанного с одним CD137специфичным пептидом, действует в отношении перекрестного связывания CD137 таким же образом, как описано выше для EphA2.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистами в данной области, например в области химии пептидов, культуры клеток и фагового дисплея, химии нуклеиновых кислот и биохимии. Стандартные методы используются для молекулярной биологии, генетических и биохимических методов (см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc.), которые включены в настоящий документ посредством ссылки.
Номенклатура
Нумерация
При указании положений аминокислотных остатков в соединениях по изобретению остатки цистеина (Ci, Cii и Ciii) опускаются в нумерации, поскольку они являются инвариантными, поэтому нумерация аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 1 является такой, как показано ниже:
Для целей этого описания предполагается, что все бициклические пептиды циклизованы с использованием ТВМВ (1,3-трис(бромметил)бензола или 1,1',1''-(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1она (ТАТА) с образованием тризамещенной структуры. Циклизация с помощью ТВМБ и ТАТА происходит по Ci, Cii и Ciii.
Молекулярный формат
N- или С-концевые удлинения основной последовательности бицикла добавляются к левой или правой стороне последовательности и отделяются дефисом. Например, N-концевой хвост eAla-Sar10-Ala а будет указываться как:
PAla-SarlO-A-(SEQ ID NO: X).
Инвертированные пептидные последовательности
В свете раскрытия в Nair et al (2003) J Immunol 170(3), 1362-13733 предполагается, что описанные в настоящем документе пептидные последовательности также найдут применение в их ретроинвертированной форме. Например, последовательность является инвертированной (т.е. N-конец становится С-концом и наоборот), и ее стереохимия также является обращенной (т.е. D-аминокислоты становятся L-аминокислотами и наоборот).
Пептидные лиганды
Пептидный лиганд, указанный настоящем документе, относится к пептиду, ковалентно связанному с молекулярным каркасом. Обычно такие пептиды содержат две или более реакционноспособные группы (то есть остатки цистеина), которые способны образовывать ковалентные связи с каркасом, и последовательность между указанными реакционноспособными группами, которую называют последовательностью петли, поскольку она образует петлю, когда пептид связывается с каркасом. В данном случае пеп- 12 045834 тиды содержат по меньшей мере три остатка цистеина (указываемых в настоящем документе как Ci, Cii и
Ciii) и образуют по меньшей мере две петли на каркасе.
Фармацевтически приемлемые соли
Следует понимать, что солевые формы входят в объем данного изобретения, и ссылки на пептидные лиганды включают солевые формы указанных лигандов.
Соли по настоящему изобретению могут быть синтезированы из исходного соединения, которое содержит основную или кислотную составляющую, обычными химическими способами, такими как способы, описанные в Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, твердая обложка, 388 страниц, август 2002. Как правило, такие соли можно получить реакцией свободных кислотных или основных форм этих соединений с подходящим основанием или кислотой в воде или в органическом растворителе, или в их смеси.
Соли присоединения кислот (моно- или ди-соли) могут быть образованы с широким спектром кислот, как неорганических, так и органических. Примеры солей включают моно- или ди-соли, образованные с кислотой, выбранной из группы, состоящей из уксусной, 2,2-дихлоруксусной, адипиновой, альгиновой, аскорбиновой (например, L-аскорбиновой), L-аспарагиновой, бензолсульфоновой, бензойной, 4ацетамидобензойной, бутановой, (+)-камфорной, камфорно-сульфоновой, (+)-(1S)-камфора-10сульфоновой, каприновой, капроновой, каприловой, коричной, лимонной, цикламовой, додецилсерной, этан-1,2-дисульфоновой, этансульфоновой, 2-гидроксиэтансульфоновой, муравьиной, фумаровой, галактарной, гентизиновой, глюкогептоновой, D-глюконовой, глюкуроновой (например, D-глюкуроновой), глутаминовой (например, L-глутаминовой), α-оксоглутаровой, гликолевой, гиппуровой, гидрогалогеновых кислот (например, бромистоводородной, хлористоводородной, йодистоводородной), изетионовой, молочной (например, (+)Ж-молочной, (±)-DL-молочной), лактобионовой, малеиновой, яблочной, (-)-Lяблочной, малоновой, (±)-DL-миндальной, метансульфоновой, нафталин-2-сульфоновой, нафталин-1,5дисульфоновой, 1-гидрокси-2-нафтойной, никотиновой, азотной, олеиновой, оротовой, щавелевой, пальмитиновой, памоиновой, фосфорной, пропионовой, пировиноградной, L-пироглутаминовой, салициловой, 4-амино-салициловой, себациновой, стеариновой, янтарной, серной, дубильной, (+)-L-винной, тиоциановой, п-толуолсульфоновой, ундециленовой и валериановой кислот, а также ацилированных аминокислот и катионообменных смол.
Одна определенная группа солей состоит из солей, образованных из уксусной, соляной, йодистоводородной, фосфорной, азотной, серной, лимонной, молочной, янтарной, малеиновой, яблочной, изетионовой, фумаровой, бензолсульфоновой, толуолсульфоновой, серной, метансульфоновой (мезилат), этансаленсульфоновой, нафталинсульфоновой, валериановой, пропановой, бутановой, малоновой, глюкуроновой и лактобионовой кислот. Одна конкретная соль представляет собой гидрохлорид. Другой конкретной солью является ацетат.
Если соединение является анионным или имеет функциональную группу, которая может быть анионной (например, -СООН может быть -СОО), то соль может быть образована с органическим или неорганическим основанием, генерирующим подходящий катион. Примеры подходящих неорганических катионов включают, но не ограничиваются ими, ионы щелочных металлов, такие как Li+, Na+ и K+, катионы щелочно-земельных металлов, такие как Са2+ и Mg2+, и другие катионы, такие как Al3+ или Zn+. Примеры подходящих органических катионов включают, но не ограничиваются ими, ион аммония (например, NH4+) и замещенные ионы аммония (например, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR+). Примерами некоторых подходящих замещенных ионов аммония являются те, которые получены из метиламина, этиламина, диэтиламина, пропиламина, дициклогексиламина, триэтиламина, бутиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, пиперазина, бензиламина, фенилбензиламина, холина, меглумина и трометамина, а также аминокислот, таких как лизин и аргинин. Примером обычного иона четвертичного аммония является N(CH3)4 +.
Когда соединения по изобретению содержат аминогруппу, они могут образовывать четвертичные аммониевые соли, например, путем реакции с алкилирующим агентом в соответствии со способами, хорошо известными специалисту в данной области. Такие соединения четвертичного аммония входят в объем изобретения.
Модифицированные производные
Следует принимать во внимание, что модифицированные производные пептидных лигандов, описанные в данном документе, входят в объем настоящего изобретения. Примеры таких подходящих модифицированных производных включают одну или несколько модификаций, выбранных из: модификаций N-конца и/или С-конца; замены одного или нескольких аминокислотных остатков одним или несколькими неприродными аминокислотными остатками (например, замены одного или нескольких полярных аминокислотных остатков одной или несколькими изостерическими или изоэлектронными аминокислотами; замены одной или нескольких неполярных аминокислотных остатков другими неприродными изостерическими или изоэлектронными аминокислотами); добавления спейсерной группы; замены одного или нескольких чувствительных к окислению аминокислотных остатков одним или несколькими устойчивыми к окислению аминокислотными остатками; замены одного или нескольких аминокислот- 13 045834 ных остатков на аланин, замены одного или нескольких L-аминокислотных остатков одним или несколькими D-аминокислотными остатками; N-алкилирования одной или нескольких амидных связей внутри бициклического пептидного лиганда; замены одной или нескольких пептидных связей суррогатной связью; модификации длины пептидного остова; замена водорода на альфа-углероде одного или нескольких аминокислотных остатков другой химической группой, модификации аминокислот, таких как цистеин, лизин, глутамат/аспартат и тирозин, подходящими аминами, тиолами, карбоновой кислотой и реагентами, реагирующими с фенолом, для функционализации указанных аминокислот, и введения или замены на аминокислоты, которые вводят ортогональные реакционноспособные группы, которые подходят для функционализации, например, аминокислоты, несущие азидные или алкиновые группы, которые позволяют функционализировать с помощью алкиновых или несущих азид фрагментов, соответственно.
В одном варианте осуществления модифицированное производное содержит модификацию на Nконце и/или С-конце. В дополнительном варианте осуществления, где модифицированное производное включает N-концевую модификацию с использованием подходящих химических реакций с аминогруппой, и/или С-концевую модификацию с использованием подходящих химических реакций с карбоксильной группой. В дополнительном варианте осуществления указанная N-концевая или С-концевая модификация включает добавление эффекторной группы, включая, но не ограничиваясь этим, цитотоксический агент, хелатирующий радиоактивное вещество агент или хромофор.
В другом варианте осуществления модифицированное производное содержит модификацию на Nконце. В другом варианте осуществления N-концевая модификация содержит N-концевую ацетильную группу. В этом варианте осуществления N-концевая цистеиновая группа (группа, обозначаемая в настоящем документе как Ci) блокирована уксусным ангидридом или другими подходящими реагентами во время пептидного синтеза, дающего молекулу, которая ацетилируется на N-конце. Этот вариант осуществления обеспечивает преимущество удаления потенциальной точки распознавания для аминопептидаз и избегания возможности деградации бициклического пептида.
В альтернативном варианте осуществления N-концевая модификация включает добавление молекулярной спейсерной группы, которая облегчает конъюгацию эффекторных групп и сохранение активности бициклического пептида в отношении его мишени.
В дополнительном варианте осуществления модифицированное производное содержит С-концевую модификацию. В другом варианте осуществления С-концевая модификация содержит амидную группу. В этом варианте осуществления С-концевая цистеиновая группа (группа, обозначаемая в настоящем документе как Ciii) синтезируется как амид во время пептидного синтеза, дающего молекулу, которая амидирована на С-конце. Этот вариант осуществления обеспечивает преимущество удаления потенциальной точки распознавания для карбоксипептидаз и снижает вероятность протеолитической деградации бициклического пептида.
В одном варианте осуществления модифицированное производное включает замену одного или нескольких аминокислотных остатков одним или несколькими остатками неприродных аминокислот. В этом варианте осуществления могут быть выбраны неприродные аминокислоты, имеющие изостерические/изоэлектронные боковые цепи, которые не распознаются деградирующими протеазами и не оказывают какого-либо неблагоприятного воздействия на эффективность в отношении мишени.
В альтернативном варианте могут использоваться неприродные аминокислоты, имеющие ограниченные в степенях свободы боковые цепи аминокислот, так что протеолитический гидролиз соседней пептидной связи конформационно и стерически затруднен. В частности, они касаются аналогов пролина, объемных боковых цепей, Са-дизамещенных производных (например, аминоизомасляной кислоты, Aib) и циклоаминокислот, простым производным которых является аминоциклопропилкарбоновая кислота.
В одном варианте осуществления изобретения модифицированное производное включает добавление спейсерной группы. В другом варианте осуществления модифицированное производное включает добавление спейсерной группы к N-концевому цистеину (Ci) и/или С-концевому цистеину (Ciii).
В одном варианте осуществления изобретения модифицированное производное включает замену одного или нескольких чувствительных к окислению аминокислотных остатков одним или несколькими устойчивыми к окислению аминокислотными остатками. В другом варианте осуществления модифицированное производное включает замену остатка триптофана остатком нафтилаланина или аланина. Этот вариант осуществления обеспечивает преимущество улучшения профиля фармацевтической стабильности полученного бициклического пептидного лиганда.
В одном варианте осуществления изобретения модифицированное производное включает замену одного или нескольких заряженных аминокислотных остатков одним или несколькими гидрофобными аминокислотными остатками. В альтернативном варианте осуществления модифицированное производное включает замену одного или нескольких гидрофобных аминокислотных остатков одним или несколькими заряженными аминокислотными остатками. Правильный баланс заряженных и гидрофобных аминокислотных остатков является важной характеристикой бициклических пептидных лигандов. Например, гидрофобные аминокислотные остатки влияют на степень связывания с белками плазмы и, таким образом, на концентрацию свободной доступной фракции в плазме, в то время как заряженные аминокислотные остатки (в частности, аргинин) могут влиять на взаимодействие пептида с фосфолипидны- 14 045834 ми мембранами на поверхности клеток. Эти два типа остатков в комбинации могут влиять на время полужизни, объем распределения и экспозиции пептидного лекарственного средства, и могут быть адаптированы в соответствии с конечными клиническим требованиями. Кроме того, правильная комбинация и количество заряженных аминокислотных остатков по сравнению с гидрофобными может уменьшить раздражение в месте инъекции (при подкожном введении пептидного лекарственного средства).
В одном варианте осуществления изобретения модифицированное производное включает замену одного или нескольких остатков L-аминокислоты одним или несколькими остатками D-аминокислоты. Полагают, что этот вариант осуществления увеличивает протеолитическую стабильность за счет стерических затруднений и склонности D-аминокислот к стабилизации конформации β-изгиба (Tugyi et al (2005) PNAS, 102(2), 413-418).
В одном варианте осуществления изобретения модифицированное производное включает удаление любых аминокислотных остатков и замену их аланинами. Этот вариант осуществления обеспечивает преимущество удаления потенциального сайта (сайтов) протеолитической атаки.
Следует отметить, что каждая из вышеуказанных модификаций намеренно введена для улучшения эффективности или стабильности пептида. Дальнейшее улучшение эффективности на основе модификаций может быть достигнуто с помощью следующих механизмов:
включения гидрофобных фрагментов, что за счет гидрофобного эффекта приводит к более низким скоростям диссоциации, так что достигается более высокое сродство;
включения заряженных групп, что за счет дальнодействующих ионных взаимодействий приводит к более быстрым скоростям ассоциации и более высокому сродству (см., например, Schreiber et al, Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31); и включения в пептид дополнительных ограничений степеней свободы, например, путем корректного ограничения степеней свободы боковых цепей аминокислот, чтобы потеря энтропии была минимальной при связывании с мишенью, путем ограничения торсионных углов основной цепи, чтобы потеря энтропии была минимальной при связывании с мишенью, и введения дополнительных циклизаций в молекулу по тем же причинам (обзоры см. в Gentilucci et al., Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203, и Nestor et al., Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).
Изотопные варианты
Настоящее изобретение включает все фармацевтически приемлемые (радио)изотопно-меченые пептидные лиганды по изобретению, в которых один или несколько атомов заменены атомами, имеющими тот же атомный номер, но атомную массу или массовое число, отличное от атомной массы или массового числа, обычно встречающихся в природе, и пептидные лиганды по изобретению, к которым присоединены хелатные группы с металлами (называемые эффекторными), которые способны удерживать соответствующие (радио)изотопы, и пептидные лиганды по изобретению, в которых некоторые функциональные группы ковалентно заменены соответствующими (радио)изотопами или изотопно меченными функциональными группами.
Примеры изотопов, подходящих для включения в пептидные лиганды по изобретению, включают изотопы водорода, такие как Н (D) и Н (Т), углерод, такой как 1С, 13С и 14С, хлор, такой как 36С1, фтор, такой как 18F, йод, такой как 123I, 125I и 131I, азот, такой как 13N и 15N, кислород, такой как 15О, 17О и 18О, фосфор, такой как 32Р, серу, такую как 35S, медь, такую как 64Cu, галлий, такой как 67Ga или 68Ga, иттрий, такой как 90Y, и лютеции, такой как 177Lu, и висмут, такой как 213Bi.
Некоторые изотопно-меченные пептидные лиганды по изобретению, например те, которые включают радиоактивный изотоп, полезны в исследованиях распределения лекарственных соединений и/или субстратов в тканях, а также для клинической оценки присутствия и/или отсутствия мишени нектина-4 в пораженных тканях. Пептидные лиганды по изобретению могут, кроме того, обладать ценными диагностическими свойствами, поскольку их можно использовать для обнаружения или идентификации образования комплекса между меченым соединением и другими молекулами, пептидами, белками, ферментами или рецепторами. В способах обнаружения или идентификации могут использоваться соединения, которые помечены метящими агентами, такими как радиоизотопы, ферменты, флуоресцентные вещества, светящиеся вещества (например, люминол, производные люминола, люциферин, экворин и люцифераза) и т. Радиоактивные изотопы тритий, а именно 3Н (Т), и углерод-14, а именно 14С, особенно подходят для этой цели ввиду простоты их включения и готовых средств обнаружения.
Замещение более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий, а именно 2Н (D), может обеспечить некоторые терапевтические преимущества, обусловленные большей метаболической стабильностью, например, увеличенным периодом полужизни in vivo или уменьшенными требованиями к дозировке, и, таким образом, может быть предпочтительным при некоторых обстоятельствах.
Замещение изотопами, излучающими позитроны, такими как 11С, 18F, 15О и 13N, может быть полезным при исследованиях с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) для проверки распределения в мишени.
Меченые изотопами соединения пептидных лигандов по изобретению, как правило, могут быть получены обычными методами, известными специалистам в данной области, или способами, аналогичными тем, которые описаны в сопроводительных примерах, с использованием соответствующего меченого
- 15 045834 изотопом реагента вместо немеченого реагента, применяемого ранее.
Молекулярный каркас
Молекулярные каркасы описаны, например, в WO 2009/098450 и цитируемых там ссылках, в частности в WO 2004/077062 и WO 2006/078161.
Как отмечено в предшествующих документах, молекулярный каркас может представлять собой низкомолекулярное соединение, например, низкомолекулярное органическое соединение.
В одном варианте осуществления изобретения молекулярный каркас может представлять собой макромолекулу. В одном варианте молекулярный каркас представляет собой макромолекулу, состоящую из аминокислот, нуклеотидов или углеводов.
В одном варианте осуществления изобретения молекулярный каркас содержит реакционноспособные группы, которые способны реагировать с функциональной группой (группами) полипептида с образованием ковалентных связей.
Молекулярный каркас может содержать химические группы, которые образуют связь с пептидом, такие как амины, тиолы, спирты, кетоны, альдегиды, нитрилы, карбоновые кислоты, сложные эфиры, алкены, алкины, азиды, ангидриды, сукцинимиды, малеимиды, алкилгалогениды и ацилгалогениды.
В одном варианте осуществления изобретения молекулярный каркас может содержать или может состоять из гексагидро-1,3,5-триазина, особенно 1,3-триакрилоилгексагидро-1,3,5-триазина (ТАТА) или его производного.
В одном варианте осуществления изобретения молекулярный каркас представляет собой 2,4,6трис(бромметил)мезитилен. Эта молекула похожа на 1,3-трис(бромметил)бензол (ТВМВ), но содержит три дополнительные метальные группы, присоединенные к бензольному кольцу. Это имеет то преимущество, что дополнительные метальные группы могут образовывать дополнительные контакты с полипептидом и, следовательно, создавать дополнительные структурные ограничения.
Молекулярный каркас по изобретению содержит химические группы, которые позволяют функциональным группам полипептида кодируемой библиотеки по изобретению образовывать ковалентные связи с молекулярным каркасом. Указанные химические группы выбираются из широкого диапазона функциональных групп, включая амины, тиолы, спирты, кетоны, альдегиды, нитрилы, карбоновые кислоты, сложные эфиры, алкены, алкины, ангидриды, сукцинимиды, малеимиды, азиды, алкилгалогениды и ацилгалогениды.
Реакционноспособные группы каркаса, которые можно использовать на молекулярном каркасе для реакции с тиоловыми группами цистеинов, представляют собой алкилгалогениды (или также называемые галогеноалканами или галогеналканами).
Примеры включают бромметилбензол (реакционноспособная группа каркаса, примером является ТВМВ) или йодацетамид. Другие реакционноспособные группы каркаса, которые используются для селективного связывания соединений с цистеинами в белках, представляют собой малеимиды, αβненасыщенные карбонилсодержащие соединения и α-галогенметилкарбонилсодержащие соединения. Примеры малеимидов, которые можно использовать в качестве молекулярных каркасов в изобретении, включают: трис-(2-малеимидоэтил)амин, трис-(2-малеимидоэтил)бензол, трис-(малеимидо)бензол. Примером αβ-ненасыщенного карбонилсодержащего соединения является 1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5триил)трипроп-2-ен-1-он (TATA) (Angewandte Chemie, International Edition (2014), 53 (6), 1602-1606). Примером α-галогенметилкарбонилсодержащего соединения является ^№,№'-(бензол-1,3-триил)трис(2бромацетамид)). Селеноцистеин также является природной аминокислотой, которая имеет такую же реакционную способность, что и цистеин, и может использоваться для тех же реакций. Таким образом, везде, где упоминается цистеин, обычно допустима замена на селеноцистеин, если контекст не предполагает иное.
Синтез
Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены синтетическим путем стандартными методами с последующей реакцией с молекулярным каркасом in vitro. После этого процесса можно использовать стандартные химические реакции. Это дает возможность быстрого получения растворимого материала в больших масштабах для дальнейших экспериментов или проверки. Такие способы могут быть реализованы с использованием обычных химических методов, таких как описанные у Timmerman et al (supra).
Таким образом, изобретение также относится к получению полипептидов или конъюгатов, выбранных, как изложено в данном документе, где получение включает дополнительные необязательные стадии, описанные ниже. В одном варианте осуществления эти стадии проводят с конечным продуктом полипептидом/конъюгатом, полученным путем химического синтеза.
Необязательно, аминокислотные остатки в интересующем полипептиде могут быть заменены при получении конъюгата или комплекса.
Пептиды также могут быть удлинены, например, для включения другой петли и, следовательно, для введения возможности связывания с несколькими мишенями.
Чтобы удлинить пептид, его можно просто химически удлинить по его N-концу или С-концу или
- 16 045834 внутри петель с использованием ортогонально защищенных лизинов (и аналогов) с использованием стандартных методов твердофазного синтеза или методов синтеза в растворе. Стандартные методики (био)конъюгации могут использоваться для введения активированного или активируемого N- или Сконца. В альтернативном варианте, добавление фрагментов можно осуществить конденсацией фрагментов или естественным химическим лигированием, например, как описано в (Dawson et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779), или с помощью ферментов, например, с использованием субтилигазы, как описано в (Chang et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Dec 20; 91(26): 12544-8 или в Hikari et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003).
В альтернативном варианте, пептиды можно удлинить или модифицировать путем дополнительной конъюгации через дисульфидные связи. Этот способ имеет дополнительное преимущество в том, что он позволяет первому и второму пептиду диссоциировать при попадании в восстановительную среду в клетке. В этом случае молекулярный каркас (например, ТВМВ) может быть добавлен во время химического синтеза первого пептида, чтобы прореагировать с тремя цистеиновыми группами; затем к N- или С-концу первого пептида может быть присоединен дополнительный цистеин или тиол, так что этот цистеин или тиол вступает в реакцию только со свободным цистеином или тиолом второго пептида с образованием дисульфидно-связанного бициклического пептид-пептидного конъюгата.
Аналогичные методики в равной степени применимы к синтезу/связыванию двух бициклических и биспецифичных макроциклов с возможностью создания тетраспецифичной молекулы.
Кроме того, добавление других функциональных или эффекторных групп может быть выполнено таким же образом, с использованием соответствующих химических реакций, присоединения на N- или С-концах или через боковые цепи. В одном варианте осуществления присоединение осуществляется таким образом, что оно не блокирует активность ни одного объекта.
Фармацевтические композиции
В соответствии с дополнительным аспектом изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая пептидный лиганд, описанный в настоящем документе, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями.
В общем, пептидные лиганды по настоящему изобретению будут использоваться в очищенной форме вместе с фармакологически подходящими наполнителями или носителями. Обычно эти эксципиенты или носители включают водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и/или забуференные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, а также раствор Рингера с лактатом. Подходящие физиологически приемлемые адъюванты, если необходимо поддерживать полипептидный комплекс в суспензии, могут быть выбраны из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.
Внутривенные носители включают составы, восполняющие жидкость и питательные вещества, и электролиты, например, на основе декстрозы Рингера. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-e издание).
Пептидные лиганды по настоящему изобретению можно использовать в виде отдельно вводимых композиций или в сочетании с другими агентами. Они могут включать антитела, фрагменты антител и различные иммунотерапевтические препараты, такие как циклоспорин, метотрексат, адриамицин или цисплатин, а также иммунотоксины. Фармацевтические композиции могут включать коктейли различных цитотоксических или других агентов в сочетании с белковыми лигандами по настоящему изобретению или даже комбинацией выбранных полипептидов по настоящему изобретению, обладающих различной специфичностью, таких как полипептиды, выбранные с использованием различных мишеней лигандов, независимо от того, объединяются ли они до введения.
Путь введения фармацевтических композиций согласно изобретению может представлять собой любой из способов, обычно известных специалистам в данной области. Для лечения пептидные лиганды по изобретению можно вводить любому пациенту в соответствии со стандартными методами. Введение может осуществляться любым подходящим способом, включая парентеральный, внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный, трансдермальный способы, введение через легкие, или также, при необходимости, путем прямой инфузии с помощью катетера. Предпочтительно, чтобы фармацевтические композиции согласно изобретению вводили путем ингаляции. Дозировка и частота введения будут зависеть от возраста, пола и состояния пациента, одновременного приема других лекарств, противопоказаний и других параметров, которые должны быть приняты во внимание лечащим врачом.
Пептидные лиганды по настоящему изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед использованием. Было показано, что этот метод является эффективным, и можно использовать известные в данной области методы лиофилизации и восстановления. Специалистам в данной области будет понятно, что лиофилизация и восстановление могут приводить к различной степени потери активности и что уровни, возможно, придется отрегулировать в сторону увеличения для компенсации.
- 17 045834
Композиции, содержащие пептидные лиганды по настоящему изобретению или их коктейль, можно вводить для профилактического и/или терапевтического лечения. В некоторых вариантах терапевтического применения количество, достаточное для достижения по меньшей мере частичного ингибирования, подавления, модуляции, уничтожения или какого-либо другого измеримого параметра популяции выбранных клеток, определяется как терапевтически эффективная доза. Количества, необходимые для достижения этой дозировки, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния собственной иммунной системы пациента, но обычно варьируются от 0,005 до 5,0 мг выбранного пептидного лиганда на килограмм веса тела, причем чаще всего используются дозы от 0,05 до 2,0 мг/кг/доза. Для профилактических целей композиции, включающие представленные пептидные лиганды или их смеси, могут также вводиться в аналогичных или немного меньших дозах.
Композиция, содержащая пептидный лиганд в соответствии с настоящим изобретением, может использоваться в профилактических и терапевтических целях для помощи в изменении, инактивации, уничтожении или удалении выбранной популяции клеток-мишеней у млекопитающего. Кроме того, описанные в настоящем документе пептидные лиганды можно использовать экстракорпорально или селективно in vitro для уничтожения, истощения или иного эффективного удаления популяции клеток-мишеней из гетерогенного набора клеток. Кровь млекопитающего может быть экстракорпорально объединена с выбранными пептидными лигандами, в результате чего нежелательные клетки уничтожаются или иным образом удаляются из крови для возврата млекопитающему в соответствии со стандартными методами.
Терапевтическое применение
В соответствии с дополнительным аспектом изобретения предложен гетеротандемный бициклический пептидный комплекс, описанный в настоящем документе, для применения в профилактике, подавлении или лечении рака.
Примеры раковых заболеваний (и их доброкачественных аналогов), которые можно лечить (или ингибировать) включают, но не ограничиваются этим, опухоли эпителиального происхождения (аденомы и карциномы различных типов, включая аденокарциномы, плоскоклеточный рак, переходные клеточные карциномы и другие карциномы), такие как карциномы мочевого пузыря и мочевых путей, молочной железы, желудочно-кишечного тракта (включая карциномы пищевода, желудка (желудочные), тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки и заднего прохода), печени (гепатоцеллюлярную карциному), желчного пузыря и желчевыделительной системы, экзокринной части поджелудочной железы, почек, легких (например, аденокарциномы, мелкоклеточные карциномы легких, немелкоклеточные карциномы легких, бронхоальвеолярные карциномы и мезотелиомы), карциномы головы и шеи (например, рак языка, ротовой полости, гортани, глотки, носоглотки, миндалин, слюнных желез, полости носа и околоносовых пазух), яичников, маточных труб, брюшины, влагалища, вульвы, пениса, шейки матки, миометрия, эндометрия, щитовидной железы (например, фолликулярную карциному щитовидной железы), надпочечников, предстательной железы, кожи и прилежащих органов (например, меланому, базальноклеточную карциному, сквамозноклеточную карциному, кератоакантому, диспластический невус); гематологические злокачественные опухоли (например, лейкозы, лимфомы) и предраковые гематологические нарушения и нарушения с пограничной злокачественностью, включая гематологические злокачественные заболевания и связанные с ними состояния клеток лимфоидного ряда (например, острый лимфоцитарный лейкоз [ALL], хронический лимфоцитарный лейкоз [CLL], В-клеточные лимфомы, такие как диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома [DLBCL], фолликулярная лимфома, лимфома Беркитта, лимфома клеток мантийной зоны, Т-клеточные лимфомы и лейкозы, лимфомы натуральных клеток-киллеров [NK], лимфомы Ходжкина, лейкоз ворсистых клеток, моноклональную гаммапатию неясного генеза, плазмоцитому, множественную миелому и лимфопролиферативные нарушения после трансплантации), а также гематологические злокачественные и родственные состояния клеток миелоидного ряда (например, острый миелогенный лейкоз [AML], хронический миелогенный лейкоз [CML], хронический миеломоноцитарный лейкоз [CMML], гиперэозинофильный синдром, миелопролиферативные расстройства, такие как полицитемия вера, эссенциальная тромбоцитемия и первичный миелофиброз, миелопролиферативный синдром, синдром миелодисплазии и промиелоцитный лейкоз); опухоли мезенхимального происхождения, например саркомы мягких тканей, кости или хряща, такие как остеосаркомы, фибросаркомы, хондросаркомы, рабдомиосаркомы, лейомиосаркомы, липосаркомы, ангиосаркомы, саркому Капоши, саркому Юинга, синовиальную саркому, эпителиоидные саркомы, желудочно-кишечные стромальные опухоли, доброкачественные и злокачественные гистоцитомы и дерматофибросаркому протуберанс; опухоли центральной или периферической нервной системы (например, астроцитомы, глиомы и глиобластомы, менингиомы, эпендимомы, опухоли эпифиза и шванномы); эндокринные опухоли (например, опухоли гипофиза, опухоли надпочечников, опухоли островковых клеток, опухоли паращитовидных желез, карциноидные опухоли и медуллярную карциному щитовидной железы); опухоли глаз и их придатков (например, ретинобластому); опухоли зародышевых клеток и трофобласта (например, тератомы, семиномы, дисгерминомы, пузырный занос и хориокарциному); и педиатрические и эмбриональные опухоли (например, медуллобластомы, нейробластомы, опухоль Вильмса и примитивные нейроэктодермальные опухоли); или синдромы, врожденные или иные, которые делают больного восприимчивым к злокачественному новообразованию (например, пигментную ксеродерму).
- 18 045834
В дополнительном варианте осуществления рак выбран из гематологических злокачественных заболеваний, таких как: неходжкинская лимфома (NHL), лимфома Беркитта (BL), множественная миелома (ММ), В-клеточный хронический лимфолейкоз (B-CLL), В- и Т-клеточный острый лимфолейкоз (ALL),
Т-клеточная лимфома (TCL), острый миелоидный лейкоз (AML), лейкоз ворсистых клеток (HCL), лимфома Ходжкина (HL) и хронический миелоидный лейкоз (CML).
Ссылки в данном документе на термин профилактика включают введение защитной композиции до начала заболевания. Подавление относится к введению композиции после события начала, но до клинического проявления заболевания. Лечение включает введение защитной композиции после появления симптомов заболевания.
Доступны модельные системы на животных, которые можно использовать для скрининга эффективности пептидных лигандов при защите или лечении заболевания. Настоящее изобретение облегчает использование модельных систем на животных, что позволяет разрабатывать полипептидные лиганды, которые могут перекрестно реагировать с мишенями у человека и животных, что позволяет использовать модели на животных.
Изобретение более подробно описано ниже со ссылкой на следующие примеры.
Примеры
Пример 1. Синтез линкеров
СОМ128
LutttULI. 1 it
Смесь соединения 1 (700,0 мг, 1,18 ммоль, 1,0 экв.), 3-азидопропан-1-амина (117,66 мг, 1,18 ммоль, 1,0 экв.), EDCI (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, 270,4 мг, 1,41 ммоль, 1,2 экв.), HOBt (1гидроксибензотриазол, 190,6 мг 1,41 ммоль, 1,2 экв.) растворяли в DCM (дихлорметане, 20 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 20-25°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 677,33, наблюдаемое m/z: 678,2 ([М+Н]+)). Растворитель выпаривали, получая соединение 2 (600 мг, неочищенное) в виде белого твердого вещества.
Смесь соединения 2 (600,0 мг, 885,3 мкмоль, 1,0 экв.), N-этилэтанамина (1,29 г, 15,19 ммоль, 1,50 мл, 17,2 экв.) растворяли в DCM (3 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 455,51, наблюдаемое m/z: 456,3 ([М+Н]+)). Растворитель выпаривали, получая соединение 3 (400 мг, неочищенное) в виде бесцветного масла.
Смесь соединения 3 (150,0 мг, 329,3 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 4 (320,1 мг, 329,3 мкмоль, 1,0 экв), HATU (125,2 мг, 329,3 мкмоль, 1,0 экв), DTEA (42,6 мг, 329,3 мкмоль, 57,4 мкл, 1,0 экв.) растворяли в DMF (2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 дней в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1408,76, наблюдаемое m/z: 705,3 ([М/2+Н]+)). Растворитель выпаривали, получая соединение 5 (400 мг, неочищенное) в виде желтого масла.
Соединение 5 (400 мг, 283,77 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в DMF (диметилформамиде, 4 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза) с последующим добавлением пиперидина (862,2 мг, 10,13 ммоль, 1 мл, 35,7 экв.), и затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 15 мин в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 5 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1187,37, наблюдаемое m/z: 594,4 ([М/2+Н+], 1187,4 ([М+Н]+)). Растворитель выпаривали, получая соединение СОМ128 (250 мг, неочищенное) в виде бесцветного масла.
- 19 045834
COM129
::cm(woooizi
Смесь соединения 1 (1,4 г, 1,47 ммоль, 1,0 экв.), 3-азидопропан-1-амина (162,1 мг, 1,62 ммоль, 1,1 экв.), EDCI (338,6 мг, 1,77 ммоль, 1,2 экв.), HOBt (238,7 мг 1,77 ммоль, 1,2 экв.) растворяли в DCM (5 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 20-25°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1033,14, наблюдаемое m/z: 1033,2 ([М+Н]+)). Реакционную смесь обрабатывали несколькими каплями 1 М НС1, и органический слой упаривали при пониженном давлении для удаления растворителя. Соединение 2 (1,1 г, неочищенное) получали в виде желтого масла.
Смесь соединения 2 (1,1 г, 1,06 ммоль, 1 экв.), N-этилэтанамина (3,89 г, 53,24 ммоль, 5,48 мл, 50 экв.) растворяли в DCM (5 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 20-25°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 810,90, наблюдаемое m/z: 810,9 ([М+Н]+)). Реакционную смесь упаривали при пониженном давлении и получали соединение 3 (810 мг, неочищенное) в виде белого твердого вещества.
Смесь соединения 3 (810,0 мг, 998,9 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 4 (810,7 мг, 1,10 ммоль, 1,1 экв.), HATU (гексафторфосфат азабензотриазолтетраметилурония, 455,8 мг, 1,20 ммоль, 1,2 экв.), DIEA (258,2 мг, 2,00 ммоль, 348,0 мкл, 2,0 экв.) растворяли в DMF (2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 дней в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1530,72, наблюдаемое m/z. 765,5 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь обрабатывали несколькими каплями 1 М HCl, органический слой собирали и упаривали при пониженном давлении для удаления растворителя. Соединение 5 (1,1 г, неочищенное) получали в виде желтого твердого вещества.
Соединение 5 (1 г, 653,29 мкмоль, 1 экв.) растворяли в DCM (10 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза) с последующим добавлением пиперидина (2,39 г, 32,66 ммоль, 3,36 мл, 50 экв.), а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 5 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1308,47, наблюдаемое m/z. 1308,4 ([М+Н]+)). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA (трифторуксусной кислоты): фаза А: 0,075% TFA в Н2О, фаза В: MeCN, колонка: Luna 200x25 мм, 10 мкм, С18, 110А и Gemin 150x30 мм, С18, 5 мкм, 110А, подключение, 50°C). СОМ129 (700 мг, 463,72 мкмоль, выход 70,98%) получали в виде желтого твердого вещества.
- 20 045834
COM130
СОМОООООПО
Смесь соединения 1 (291 мг, 222,75 мкмоль, 1,0 экв.), 3-азидопропан-1-амина (24,53 мг, 245,02 мкмоль, 1,1 экв.), EDCI (51,24 мг, 267,30 мкмоль, 1,2 экв.), HOBt (36,12 мг 267,30 мкмоль, 1,2 экв.) растворяли в DCM (3 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 20-25°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 1388,53, наблюдаемое m/z: 694,7 ([М/2+Н]+)). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). Соединение 2 (200 мг, 144,04 мкмоль, выход 64,66%) получали в виде белого твердого вещества.
Смесь соединения 2 (200 мг, 144,04 мкмоль, 1,0 экв.), N-этилэтанамина (210,7 мг, 2,88 ммоль, 297 мкл, 20,0 экв.) растворяли в DCM (3 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 20-25°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 1166,29, наблюдаемое m/z: 1166,3 ([М+Н]+)). Реакционную смесь упаривали и получали соединение 3 (150 мг, неочищенное) в виде желтого масла.
Смесь соединения 3 (150 мг, 128,61 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 4 (75 мг, 144,91 мкмоль, 1,13 экв.), HATU (58,7 мг, 154,34 мкмоль, 1,2 экв.) и DIEA (диизопропилэтиламин, 33,24 мг, 257,23 мкмоль, 44,80 мкл, 2,0 экв.) растворяли в DMF (5 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 20-25°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 1665,84, наблюдаемое m/z: 833,2 ([М/2+Н]+)). Растворитель удаляли при пониженном давлении и получали соединение 5 (300 мг, неочищенное) в виде желтого масла.
К неочищенному соединению 5 (300 мг, растворенному в 10 мл DMF) добавляли пиперидин (2 мл), и смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 1443,60, наблюдаемое m/z: 722,7 ([М/2+Н]+)). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). СОМ130 (140 мг, 58,19 мкмоль, выход 32,31%, чистота 60%) получали в виде белого твердого вещества.
СОМ131
Точки масса: 954,48
Мапеяужярный вес: 9SB_,Q6
1' I . ··
Смесь соединения 1 (700,0 мг, 1,18 ммоль, 1,0 экв.), 3-азидопропан-1-амина (117,7 мг, 1,18 ммоль, 1,0 экв.), HOBt (190,6 мг, 1,41 ммоль, 1,2 экв.), EDCI (270,4 мг 1,41 ммоль, 1,2 экв.) растворяли в DCM (20 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 25-30°C
- 21 045834 в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 677,75, наблюдаемое m/z: 678,2 ([М+Н]+)). Реакционную смесь обрабатывали несколькими каплями 1 М HCl, органический слой собирали и упаривали при пониженном давлении. Соединение 2 (600,0 мг, неочищенное) получали в виде белого твердого вещества.
Соединение 2 (600,0 мг, 885,2 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в DMF (3 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли пиперидин (1,29 г, 15,19 ммоль, 1,50 мл, 17,2 экв.) и смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 455,51, наблюдаемое m/z: 456,3 ([М+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали соединение 3 (400,0 мг, 879,1 мкмоль) в виде бесцветного масла.
Смешивали соединение 3 (250,0 мг, 548,83 мкмоль, 1,0 экв.), соединение 4 (284,1 мг, 548,83 мкмоль, 1 экв.), HATU (229,6 мг, 603,72 мкмоль, 1,1 экв.), DIEA (141,9 мг, 1,10 ммоль, 191,19 мкл, 2,0 экв.) в DCM (20 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 2530°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 955,06, наблюдаемое m/z: 955,6 ([М+Н]+)). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 5 (400,0 мг, 419,1 мкмоль) получали в виде белого твердого вещества.
Смесь соединения 5 (400,0 мг, 418,82 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в DMF (4 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли пиперидин (862,2 мг, 10,13 ммоль, 1 мл, 24,2 экв.) и смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 5 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 732,83 наблюдаемое m/z: 733,3 ([М+Н]+)). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). COM131 (200 мг, 272,9 мкмоль) получали в виде бесцветного масла.
СОМ470
К раствору СОМ122 (228 мг, 149,83 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 1 (51,31 мг, 164,82 мкмоль, 1,1 экв.) в DMF (6 мл) добавляли HATU (85,40 мг, 224,75 мкмоль, 1,5 экв.) и DIEA (19,37 мг, 149,83 мкмоль, 26,10 мкл, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 1814,99, наблюдаемое m/z: 908,2 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). Соединение 2 (54 мг, 29,75 мкмоль, выход 19,86%) получали в виде белого твердого вещества.
К раствору соединения 2 (54 мг, 29,8 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (2 мл) добавляли пиперидин (61 мг, 715 мкмоль, 71 мкл, 24,0 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 1592,75 m/z: 796,27 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). COM470 (40 мг, 25,11 мкмоль, выход 84,41%) получали в виде белого твердого вещества.
- 22 045834
СОМ471
Смесь соединения 1 (900 мг, 1,23 ммоль, 1,0 экв.) и соединения 2 (1,0 г, 3,21 ммоль, 2,6 экв.) растворяли в DCM (20 мл) с последующим добавлением (284,0 мг, 1,48 ммоль, 1,2 экв.), HOBt (200,2 мг, 1,48 ммоль, 1,2 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1021,49, наблюдаемое m/z: 1022,2 ([М+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (0,900 г, 880,53 мкмоль, выход 71,30%) получали в виде белого твердого вещества.
Смесь соединения 3 (500,0 мг, 489,19 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 4 (257,6 мг, 489,19 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в DCM (5 мл) с последующим добавлением HOBt (132,2 мг, 978,37 мкмоль, 2,0 экв.), EDCI (187,6 мг, 978,37 мкмоль, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (наблюдаемый MW: 1529,80 m/z. 765,9 ([M/2+H]+). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением остатка. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). Соединение 3 (420 мг, 246,94 мкмоль, выход 50,48%) получали в виде бесцветного масла.
Соединение 5 (420 мг, 274,38 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в DMF (4 мл) с последующим добавлением пиперидина (865,2 мг, 10,16 ммоль, 1 мл, 37 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 5 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1308,48, наблюдаемое m/z: 654,8 ([М/2+Н]+). Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). COM471 (386 мг, 265,50 мкмоль, выход 96,76%) получали в виде бесцветного масла.
СОМ472
Смесь соединения 1 (0,5 г, 839,43 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 2 (627,0 мг, 839,43 мкмоль, 1,0 экв.) и DIEA (217,0 мг, 1,68 ммоль, 292,4 мкл, 2,0 экв.) растворяли в DMF (2 мл), затем к смеси добавляли HATU (319,2 мг, 839,4 мкмоль, 1,0 экв.). Затем смесь перемешивали при 25°C в течение 30 мин. ТСХ (DCM: CH3OH=10:1, Rf=0,24) показала, что соединение 1 было полностью израсходовано, и образовалось
- 23 045834 одно новое пятно. Растворитель выпаривали, получая соединение 3 (0,45 г, 339,75 мкмоль, выход 40,47%, неочищенное) в виде бесцветного масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Соединение 3 (450,0 мг, 339,75 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в DMF (8 мл) с последующим добавлением пиперидина (2 мл). Смесь перемешивали в течение 15 мин при 25°C. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемой массой (рассчитанная MW: 1102,27, наблюдаемое m/z: 552,1 ([М/2+Н]+)). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (370,0 мг, 335,67 мкмоль, выход 98,80%) получали в виде бесцветного масла.
К раствору СОМ126 (60 мг, 54,45 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 4 (15,5 мг, 81,68 мкмоль, 1,5 экв.) в DMF (5 мл) добавляли HATU (31 мг, 81,68 мкмоль, 1,5 экв.) и DIEA (10,5 мг, 61,68 мкмоль, 15 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ126 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемой массой. Смесь выпаривали для удаления растворителя и получали соединение 5 (30 мг, неочищенное) в виде бесцветного масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Соединение 5 (30 мг, 23,57 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в DCM (4,5 мл), а затем добавляли TFA (0,5 мл) и смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 5 полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемой массой. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). COM472 (10 мг, 8,52 мкмоль) получали в виде белого твердого вещества.
СОМ473
Т^чмаж шмгга.: 666, 30
Точжая ; Ш,Н : 6. . . 306,36
L-··
Смесь соединения 1 (300 мг, 449,96 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 2 (138 мг, 449,96 мкмоль, 1,0 экв.), HOBt (122 мг, 899,93 мкмоль, 2,0 экв.), EDCI (173 мг, 899,93 мкмоль, 2,0 экв) растворяли в DCM (10 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем смесь перемешивали при 20-25°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 955,06, наблюдаемое m/z: 955,3 ([М+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя. Смесь упаривали при пониженном давлении и получали соединение 3 (300 мг, неочищенное) в виде желтого масла.
Соединение 3 (300 мг, 314,12 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в DMF (4 мл), затем добавляли пиперидин (1 мл) и смесь перемешивали при 20-25°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 732,83, m/z: 733,2 ([М+Н]+)). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). СОМ473 (160 мг, 218,33 мкмоль, выход 69,51%) получали в виде бесцветного масла.
- 24 045834
Пример 2. Синтез связывающих EphA2/CD137 гетеротандемных бициклических пептидов BCY9173
Методика получения BCY9172-PEG12-N3
BGYQ0009172 NHS-PEG12-N^ ........BCY00009172-PEG12-Щ
Ыс^М ,.ϋ 1 2
BCY9172 (520 мг, 248,16 мкмоль, 1 экв.) и соединение 1 (370 мг, 499,47 мкмоль, 2,01 экв.) растворяли в DMF (5 мл) и добавляли DIEA (48,11 мг, 372,24 мкмоль, 64,84 мл, 1,5 экв.), а затем смесь выдерживали при 30°C в течение 12 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY9172 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2721,12, наблюдаемое m/z: 1360,9 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали соединение 2 (284 мг, 101,10 мкмоль, выход 40,74%, чистота 96,87%) в виде белого твердого вещества.
BCY00009172-PEG12-N. - BCY0O00S1S9 Г|Л - BCY00009173
I ΛΐϋΙ I
Л
Методика получения BCY9173
Эту реакцию проводили параллельно в двух независимых сосудах. В одном сосуде сначала растворяли соединение 2 (100 мг, 36,75 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY6169 (120 мг, 36,78 мкмоль, 1,0 экв.) в 10 мл tBuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 91,9 мкл, 1,0 экв.), VcNa (аскорбат натрия, 0,4 М, 183,8 мкл, 2,0 экв.) и ТНРТА (трис-гидроксипропилтриазолилметиламин, 0,4 М, 91,9 мкл, 1,0 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХМС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5983,85, наблюдаемое m/z: 997,6600 ([М/6+Н]+) и 1197,2300 ([М/5+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY9173 (218 мг, 34,97 мкмоль, выход 47,58%, чистота 96%) в виде белого твердого вещества.
- 25 045834
BCY7985
Общая методика получения BCY7859 ) HCSd EDCI. DYADCIvl N3-PEG12-COOH . BCY00007859
Τι BCY00007732. ΙΊ· Λ, EUf
К раствору N3-PEG12-COOH (250 мг, 388 мкмоль) и HOSu (N-гидроксисукцинимид, 67,0 г, 583 мкмоль) в DMA (N,N-диметилацетамид, 4,5 мл) и DCM (1,5 мл) добавляли EDCI (89,3 мг, 466 мкмоль) при перемешивании при 20°C в течение 16 ч. В другую круглую колбу объемом 50 мл, содержащую смесь BCY7732 (855 мг, 388 мкмоль) в 5 мл DMA, добавляли DIEA (186 мг, 1,44 ммоль, 250 мкл) при перемешивании в течение 10 мин. Затем в колбу добавляли исходную реакционную смесь с дальнейшим перемешиванием при 20°C в течение дополнительных 5 ч. ЖХ-МС анализ (ES8396-3O7-P1B1) показал, что BCY7732 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемой массой. Полученную реакционную смесь очищали напрямую с помощью препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), получая соединение BCY7859 (621 мг, 200 мкмоль, выход 51,6%, соль TFA) в виде белого твердо го вещества.
Общая методика получения BCY6169
ΡΥΛ NIIS
IKYUUWJbU99 ----------* HCYUOOOGWy •:·ιι л uvia
К раствору BCY6099 (300 мг, 94,3 мкмоль) в DMA (2 мл) добавляли DIEA (36,6 мг, 283 мкмоль, 49,3 мкл) при перемешивании в течение 10 мин. После этого добавляли PYA-NHS (36,8 мг, 189 мкмоль) с дальнейшим перемешиванием при 20°C в течение дополнительных 15 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY6099 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемой массой. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях), получая соединение BCY6169 (299 мг, 86,2 мкмоль, выход 91,5%) в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения BCY7985
Vr GuS{).
L5CYO(M)OG1G9 hcyowmizwj ---:--—%. BCYmOHItt
L-ϊνΙ
К раствору BCY7859 (220 мг, 77,8 мкмоль) и BCY6169 (251 мг, 77,1 мкмоль) в DMF (5 мл), продутого азотом в течение 2 часов, добавляли водный раствор аскорбиновой кислоты (Vc, 0,8 М, 963 мкл) с последующим добавлением водного раствора CuSO4 (0,8 М, 289 мкл) в атмосфере азота. Затем смесь перемешивали при 20°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY6169 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемой массой. Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), получая соединение BCY7985 (283 мг, 43,4 мкмоль, выход 56,3%, TFA) в виде белого твердого вещества.
- 26 045834
BCY8942
(у VC
Общая методика получения BCY8940
EDCi HOSli
BCY00OO8045 + N3-PEG12-COOH BCY00008940
П\1А UGh,
К раствору N3-PEG12-COOH (120 мг, 186 мкмоль, 1,0 экв.) в DMA (3 мл) и DCM (1 мл) при перемешивании добавляли HOSu (32,2 г, 280 мкмоль, 1,5 экв.). Затем к смеси добавляли EDCI (42,9 мг, 224 мкмоль, 1,2 экв.) при дальнейшем перемешивании в течение дополнительных 7 ч при 20°C. ЖХ-МС анализ показал, что активированный сложный эфир образовался полностью. В другую колбу с BCY8045 (410 мг, 186 мкмоль, 1,0 экв.) в DMA (3 мл) добавляли DIEA (120 мг, 932 мкмоль, 162 мл, 5,0 экв.) при перемешивании, затем добавляли активированный сложный эфир и смесь перемешивали 18 ч при 20°C. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z. Реакционную смесь концентрировали в вакууме для удаления DCM. Полученную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), получая BCY8940 (190 мг, 67,2 мкмоль, выход 36,1%) в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения BCY8942
BCY000O6169 * ΒϋΥ00ΰ08942
Vc ZJvF
К раствору BCY8940 (28,6 мг, 10,1 мкмоль, 1,1 экв.) и BCY6169 (30,0 мг, 9,19 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (2,0 мл) добавляли (2R)-2-[(1S)-1,2-дигидроксиэтил]-3,4-дигидрокси-2Н-фуран-5-он (1,0 М, 92,0 мл) и CuSO4 (1,0 М, 27,6 мл) при перемешивании в атмосфере азота в течение 2 ч при 20°C. ЖХ-МС анализ показал, что BCY6169 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 6089,91, наблюдаемое m/z: 1218,4 ([М/5+Н]+), 1016,0 ([М/6+Н]+), 870,7 ([[М/7+Н]+). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), получая соединение BCY8942 (15,4 мг, 2,46 мкмоль, выход 26,8%, чистота 97,3%) в виде белого твердого вещества.
- 27 045834
BCY8943
Μ
0CYOOOOB943
Общая методика получения BCY8941
о..
Л—-·. 'Ш. П'·'·.
8CY00O06015 + £ BCY00Q08941 : <
К раствору BCY6015 (пептида, идентичного BCY8941, за исключением отсутствия фрагмента PYA; 100 мг, 32,9 мкмоль) в DMA (2 мл) добавляли DIEA (12,8 мг, 98,7 мкмоль, 17,2 мл) при перемешивании в течение 10 мин. Затем к смеси добавляли (2,5-диоксопирролидин-1-ил)пент-4-иноат (12,8 мг, 65,8 мкмоль) с последующим перемешиванием при 20°C в течение 16 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 3119,60, наблюдаемое m/z. 1040,5 ([[М/3+Н]+). Смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях), получая соединение BCY8941 (90,0 мг, 28,9 мкмоль, выход 87,7%) в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения BCY8943
BCY00007859
BCY00008941 --------------------- BCY00008943
V: CbSC4. и MF н;О
К раствору BCY7859 (которое может быть получено, как описано в BCY7985; 40,0 мг, 14,2 мкмоль) и BCY8941 (42,0 мг, 13,5 мкмоль) в DMSO (диметилсульфоксиде, 2 мл, предварительно продутом азотом в течение 1 ч) добавляли (2R)-2-[(1S)-1,2-дигидроксиэтил]-3,4-дигидрокси-2Н-фуран-5-он (1,0 М, 270 мкл) и CuSO4 (1,0 М, 80,9 мл). Смесь продували азотом 3 раза и перемешивали при 15°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8941 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5946,77, наблюдаемое m/z: 1190,2 ([М/5+Н]+), 991,5 ([М/6+Н]+), 849,9 ([[М/7+Н]+). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (А: 0,075% TFA в Н2О, В: ACN), получая соединение BCY8943 (11,5 мг, 1,90 мкмоль, выход 14,1%, чистота 98,1%) в виде белого твердого вещества.
- 28 045834
BCY9647
Методика получения соединения 2 о л - * ' ' '!; * _ , ’ I : -.................Д............* -,.-4--- Ь·. J ·. - J
J.M Теви .ЯЛ ва_ вя.иж ^631«
СОИНЮМШ 1 2
К раствору СОМ134 (30,0 мг, 57,0 мкмоль, 1,0 экв.) соединение 1 (17,2 мг, 85,3 мкмоль, 1,5 экв.) в DCM (0,5 мл) добавляли TEA (8,65 мг, 11,9 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ134 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемой массой (расчетный MW: 691,72, наблюдаемое m/z: 692,3 ([М+Н]+) и 709,3 ([M+NH4]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, а затем лиофилизировали, получая неочищенное соединение 2 (30,5 мг, неочищенное) в виде белого вещества.
Методика получения соединения 3
С П У ,1 к 7-НИ.:: ;·,:.::
DIEA ^vm· амесал 3196,35
Л—и ik : 41.1«: ki. 3182 gt н и
Таима» κίβάί 3732,5-5 л._.и а4.1 3735,МЛ.
К раствору соединения 2 (10 мг, 1,0 экв.) в DMF (1 мл) добавляли BCY6099 (46 мг, 1,0 экв.) и DIEA (5,61 мг, 7,55 мкл, 3,0 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 3735,28, наблюдаемое m/z: 1245,9 ([[М/3+Н]+) и 934,5 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (34 мг, 62,96% выход, 100% чистота) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9647 “ГЛ+ +·
JLVJJuL^i nram essa; .3732 , es ^-.4,11^.1,4-44..4 n.. 3-735,21 х_а«»·.uj-hm-i it, . гга; si ouL- -.-J
Т&ЧМЛЯ €#12,7# >. , 1 м ¢.1 «К! 6&1Б,:Й2
Смесь соединения 3 (34 мг, 9,10 мкмоль, 1,0 экв), BCY7741 (23 мг, 10,08 мкмоль, 1,11 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 11,4 мл, 0,5 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом 3 раза), а затем под N2 добавляли CuSO4 (0,4 М, 11,4 мкл, 0,5 экв.) и VcNa (0,4 М, 22,8 мкл, 1 экв.). рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 6016,82, наблюдаемое m/z: 1204,1 ([М/5+Н]+), 1003,5 ([М/6+Н]+), 860,3 ([[М/7+Н]+)). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9647 (31,2 мг, выход 54,67%, чистота 95,96%) получали в виде белого твердого вещества.
- 29 045834
BCY9648
Методика получения соединения 2
тдвмм дат»; 1ОМ. 66215 Течмая 20.58
Х_Ла> ав^; ИЗЗ. 21472 Λ-ϊ лм.. 201,56 ι MUIII11 1
Течмая ^ааеа: 12 63, 668ЭЭ
126чг4'.’74
К раствору СОМ135 (30 мг, 27,29 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 1 (8,25 мг, 40,94 мкмоль, 1,5 экв.) в
DCM (0,5 мл) добавляли TEA (4,14 мг, 40,94 мкмоль, 5,70 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ135 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемой массой [расчетный MW: 1264,41, наблюдаемое m/z: 1281,4 ([M+NH4]+), 649,8 ([М/2+Н]+)]. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления рас творителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), получая соединение 2 (18 мг, 14,2 мкмоль, выход 52,14%).
Методика получения соединения 3
63. ббВЗЭ ме: 1264,407'74 * Ж
1, J, · _| .
шцаеа : 4,305,1.31
Х_. аг улй_Ы*л: ди. 42.Э6
К раствору соединения 3 (9 мг, 7,12 мкмоль, 1 экв.) в DMF (1 мл) добавляли BCY6099 (23 мг, 7,23 мкмоль, 1,02 экв.) и DIEA (2,76 мг, 21,35 мкмоль, 3,72 мкл, 3,0 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4307,96, наблюдаемое m/z: 1436,9 ([[М/3+Н]+), 1077,9 ([М/4+Н]+), 862,5 ([М/5+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (14,6 мг, выход 47,61%, чистота 100%) получали в виде белого твердого веще ства.
Методика получения BCY9648 2 । ι 1 .
ьгтсазлг.сза . J , ι- ♦ hu.yuull/z41 -----------------тем» .Щ|Я 4305,11 Т»и.я: «5/11 aft-мм 5Ж1,.Е4 у-Шек*-.·. u«j_. Ё5ЭП J
S
Смесь соединения 3 (14,6 мг, 3,39 мкмоль, 1 экв.), BCY7741 (8,5 мг, 3,73 мкмоль, 1,1 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 4,3 мкл, 0,5 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 4,3 мкл, 0,5 экв.) и VcNa (0,4 М, 8,6 мкл, 1,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и
- 30 045834 один основной пик с желаемым m/z (MW: 6589,50, наблюдаемое m/z: 1098,8 ([М/6+Н]+), 942,1 ([М/7+Н]+), 824,6 ([М/8+Н]+)). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9648 (14,7 мг, выход 63,34%, чистота 96,22%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY9655
Методика получения соединения 2
К раствору СОМ128 (120 мг, 101,06 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 1 (25 мг, 124,03 мкмоль, 1,25 экв.) в DCM (0,5 мл) добавляли TEA (15,34 мг, 151,59 мкмоль, 21,10 мкл, 1,5 экв). Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один новый пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1352,48, наблюдаемое m/z: 676,8 ([М/2+Н]+), 1369,3 ([M+NH4]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). Соединение 2 (14 мг, 8,99 мкмоль, выход 8,90%, чистота 86,86%) получали в виде бесцветного масла.
Методика получения соединения 3
Л..; X Х.1 - ОЭЮИ!» ------U----- у ί· ’№», <ТЛтам »с!са.: 13-51,70 Г®®»» иаееа: 31W‘,.S5 Живые шша: «3*3,32 и„ 1 1«.. 3102 СЕ i._. 4356.:3
К раствору соединения 2 (7 мг, 5,18 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY6099 (16 мг, 5,03 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (2 мл) добавляли DIEA (2,01 мг, 15,53 мкмоль, 2,70 мкл). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4396,02, наблюдаемое m/z: 879,8 ([М/5+Н]+) и 1099,8 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии 0,1% TFA). Соединение 3 (11,8 мг, выход 48,29%, чистота 93,1 1%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9655 п:.Ю|т^ * =icvnm.W ‘ (
Т&тааж ; гзт&.&З ί663,15 'Течлаа ОЭЗ.И 2231 Μ X—( **
Смесь соединения 3 (11,8 мг, 2,69 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (7,0 мг, 3,07 мкмоль, 1,14 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 6,8 мкл, 1 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 6,8 мл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 13,6 мл, 2,0 экв.) под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 6677,57, наблюдаемое m/z: 1113,7 ([М/6+Н]+), 954,7
- 31 045834 ([[М/7+Н]+)). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA).
BCY9655 (1,9 мг, 0,26 мкмоль, выход 9,65%, чистота 91,15%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY9656
Методика получения соединения 2
К раствору СОМ129 (30,0 мг, 22,93 мкмоль, 1,0 экв), соединения 1 (6,9 мг, 34,39 мкмоль, 1,5 экв.) в DCM (3 мл) добавляли TEA (3,5 мг, 34,39 мкмоль, 4,8 мкл, 1,5 экв.). Смесь дегазировали и продували N2 3 раза, а затем смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ129 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1473,58, наблюдаемое m/z: 737,3 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях), получая соединение 2 (12,3 мг, 8,35 мкмоль, выход 36,41%) в виде белого твердого вещества.
Методика получения соединения 3
- - L | T “ ц - _ - A ' Г W ·.···*;«’·:* i й _ I ώ _ It.’? p - .... и! 4735 ZS St—Juk л «З!”' 13 $ &
К раствору соединения 2 (9,26 мг, 6,28 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY6099 (10 мг, 3,14 мкмоль, 0,5 экв.) в DMF (3 мл) добавляли TEA (0,7 мг, 6,93 мкмоль, 1 мкл, 1,1 экв.). Смесь дегазировали и продували N2 3 раза, а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4517,12, наблюдаемое m/z: 1129,8 [М/4+Н]+), 904,1 ([М/5+Н]+), 753,7 ([М/6+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (12 мг, выход 72,36%, чистота 85,58%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9656
III 'μ' ' У ' %' aL,|LJBUJ33 ’ 1 с, ,-ί μ-. ' . IKfUCUJKtt.
%.»!%. Z6 .а Щ 33 6754.15 ju. ЦГ.12 1Ы.. 2^21,5·. **_. 67-3,67 ί
Смесь соединения 3 (11 мг, 2,44 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (6,0 мг, 2,63 мкмоль, 1,08 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 6,1 мкл, 1,0 экв) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 6,1 мл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 12,2 мл, 2,0 экв.) под в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25- 32 045834
30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 6798,66, наблюдаемое m/z: 1133,8 ([М/6+Н]+), 971,9 ([[М/7+Н]+), 850,7 ([М/8+Н]+)). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9656 (6,8 мг, выход 37,36%, чистота 90,97%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY9657
Методика получения соединения 2
К раствору СОМ130 (30,0 мг, 20,78 мкмоль, 1,0 экв), соединения 1 (6,3 мг, 31,17 мкмоль, 1,5 экв.) в DCM (3 мл) добавляли TEA (3,2 мг, 31,17 мкмоль, 4,4 мкл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ130 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1608,7, наблюдаемое m/z: 804,8 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и лиофилизировали, получая соединение 2 (7,9 мг, неочищенное) в виде белого твердого вещества.
Методика получения соединения 3
К раствору соединения 2 (7,9 мг, 4,91 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY6099 (16 мг, 5,03 мкмоль, 1,02 экв.) в DMF (1 мл) добавляли DIEA (1,9 мг, 14,73 мкмоль, 2,6 мкл, 3,0 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4652,25, наблюдаемое m/z: 1551,3 ([[М/3+Н]+), 1163,6 ([М/4]+), 931,1 ([М/5+Н]+), 776,1 ([М/6+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (13,3 мг, 2,86 мкмоль, выход 53,22%, чистота 91,42%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9657 |l^¥0U№099| [СЮМОЮЮПЩ · ΒΓΎϋϋϋϋ/ΜΙ . b 11'1Л BCY00004657 :-euOH;h--O
Смесь соединения 3 (13,3 мг, 2,86 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (7,0 мг, 3,07 мкмоль, 1,03 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 7,5 мкл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 7,5 мкл, 1 экв.) и VcNa (0,4 М, 15 мкл, 2,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z LMW: 6933,78, наблюдаемое m/z: 1156,7 ([М/6+Н]+), 991,4 ([[М/7+Н]+), 867,4 ([М/8+Н]+)]. Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9657 (8,4 мг, выход 40,21%, чистота 94,9%) получали в виде белого
- 33 045834 твердого вещества.
BCY9658
Методика получения соединения 2
К раствору С0М131 (167,0 мг, 227,89 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 1 (55,0 мг, 272,87 мкмоль, 1,2 экв.) в DCM (5 мл) добавляли TEA (36,4 мг, 359,23 мкмоль, 50,0 мкл, 1,6 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 897,93, наблюдаемый 920,3 ([M+Na+]). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (35 мг, 33,74 мкмоль, выход 14,81%, чистота 86,56%) получали в виде бесцветного масла.
Методика получения соединения 3
К раствору соединения 2 (15 мг, 16,71 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY6099 (53 мг, 16,65 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (2 мл) добавляли DIEA (6,48 мг, 65,05 мкмоль, 50,1 мкл, 4,0 экв). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 3941,47, наблюдаемое m/z: 986,0 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). [BCY6099]-[COM131] (5 мг, выход 50,48%, чистота 94,96%) получали в виде белого твердого вещества. Методика получения BCY9658 lBC¥0GU0liU99] [СОМОООШИЩ
BCYUOOG7/41 ....................71/.//2...-2......» BCY0000S658 >?ιίΟΗ/Η.·Ο
Смесь соединения 3 (35 мг, 8,88 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (21 мг, 9,20 мкмоль, 1,03 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 22,2 мкл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 22,2 мл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 44,4 мл, 2,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 6223,01 наблюдаемое m/z: 1038,0 ([М/6+Н]+) и 889,8 ([М/8+Н]+)]. Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9658 (13,2 мг, выход 21,54%, чистота 90,16%) получали в виде белого твердого вещества.
- 34 045834
BCY9659
Методика получения соединения 2
К раствору СОМ132 (20,0 мг, 65,28 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 1 (15,8 мг, 78,34 мкмоль, 1,2 экв.) в DCM (5 мл) добавляли TEA (36,4 мг, 359,23 мкмоль, 50 мл, 5,5 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. С помощью ЖХ-МС анализа был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 471,46, наблюдаемое m/z: 489,2 ([M+NH4]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, получая соединение 2 (26 мг, неочищенное) в виде бесцветного масла.
Методика получения соединения 3
К раствору соединения 2 (15,0 мг, 4,71 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY6099 (3,33 мг, 7,07 мкмоль, 1,5 экв.) в DMF (3 мл) добавляли TEA (0,7 мг, 6,93 мкмоль, 1 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 3515,01, наблюдаемое m/z: 1172,1 ([[М/3+Н]+) 879,5 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (12,7 мг, 3,26 мкмоль, выход 69,23%, чистота 90,3%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9659 |НС Y000[i6D9i)I |СОМйОМ101 37]
..............................11.....Нс/Д.....„ всуииоомм t -шочя-п
Смесь соединения 3 (12,7 мг, 2,89 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (6,80 мг, 2,98 мкмоль, 1,03 экв.) и ТНРТА (1,3 мг, 2,99 мкмоль, 1,03 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 7,3 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 14,6 мкл, 2,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 2530°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 5796,54 наблюдаемое m/z: 1159,8 ([М/5+Н]), 966,7 ([М/6+Н]+)]. Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9659 (6,2 мг, 1,06 мкмоль, выход 36,58%, чистота 98,86%) получали в виде белого твердого вещества.
- 35 045834
BCY9758
Методика получения соединения 2 .-% - Ф
А’11- -:-4- '“‘у1’. + HCYonuufiUM : / JtJ' |и:¥шиюыт н gm niis^.,.
К раствору соединения 1 (5,0 мг, 3,54 мкмоль, 1,0 экв), BCY6099 (11,3 мг, 3,54 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (3 мл) добавляли DIEA (0,9 мг, 7,07 мкмоль, 1,2 мкл, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 20 мин. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один пик с желаемым m/z (MW: 4481,11, наблюдаемое m/z: 1101,3 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, и лиофилизировали, получая соединение 2 (15 мг, неочищенное) в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9758
2-, О »а.
бСУООЮбШШ PLGM NHS + ВС¥0000Ш2 ———BCYM0(W58 еужШ в а
К раствору соединения 2 (15 мг, 3,35 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY7732 (14,74 мг, 6,69 мкмоль, 2,0 экв.) в DMF (3 мл) добавляли DIEA (0,9 мг, 7,07 мкмоль, 1,2 мкл, 2,1 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 6567,48, наблюдаемое m/z: 1095,1 ([М/6+Н]), 938,8 ([[М/7+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9758 (5,8 мг, выход 24,26%, чистота 91,97%) получали в виде белого твердого вещества.
- 36 045834
BCY10568
BCY00010568
Методика получения BCY8919-PEG12-N3
D'LA
BCY0000SS19 * NHS-FEG12-N3 ------------------ BCY000O8919-PEG12-N·,
DMSO 1 t
BCY8919 (80,0 мг, 38,47 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (29,6 мг, 40,01 мкмоль, 1,04 экв.) растворяли в DMSO (1 мл). Затем к раствору добавляли DIPEA (7,46 мг, 55,71 мкмоль, 10,0 мкл, 1,5 экв.), а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что большая часть BCY8919 была израсходована, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2705,16, наблюдаемое m/z: 1353,1 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), и соединение 2 (18,6 мг, 6,86 мкмоль, выход 17,83%, чистота 99,76%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10568
CuSO.1
V:Na
BL'Y00008913 РГ612Ыч + |!С¥(}(Ш(№1й9 HCY0001OMB t BuCHDW
I
Соединение 2 (9,0 мг, 3,33 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY6169 (11,0 мг, 3,36 мкмоль, 1,01 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 8,3 мкл, 1,0 экв.), VcNa (1,4 мг, 7,06 мкмоль, 2,1 экв.) и ТНРТА (1,4 мг, 3,22 мкмоль, 1,0 экв.). Наконец, добавляли 0,4 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5967,90, наблюдаемое m/z: 995,00 ([М/5+Н]+) и 1194,70 ([М/6+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY10568 (13,4 мг, 2,16 мкмоль, выход 69,44%, чистота 96,3%) в виде белого твердого вещества.
- 37 045834
BCY10570
BCY00010570
Методика получения BCY8920-PEG12-N3
D?EA
BCYIHKWBS2U - NIIS PI G12 fh -----------------BCYD0008S20-PEG12-N,
DMSO
2
К раствору BCY8920 (37 мг, 17,31 мкмоль, 1,0 экв.) и соединения 1 (15 мг, 20,25 мкмоль, 1,2 экв.) в DMSO (2 мл) добавляли DIEA (3,36 мг, 25,96 мкмоль, 4,5 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 12 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8920 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2763,2, наблюдаемое m/z: 689,07 ([М/4-Н+])). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и получали остаток. Затем остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). Соединение 2 (22,8 мг, 8,15 мкмоль, выход 47,09%, чистота 98,78%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10570 (?jSC
VcNa
HCY0O0OBW0 PI G12 + 15CYOOHOG1GH ——HCYOOMOWO t BbCh.'l-C
Соединение 2 (6 мг, 2,17 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY6169 (7,08 мг, 2,17 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 5,4 мл, 1,0 экв.), VcNa (0,4 М, 10,8 мкл, 2,0 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 5,4 мкл, 1,0 экв). Наконец добавляли 0,2 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 4 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MS: 6025,93, наблюдаемое m/z: 1004,56 ([М/6]+Н+) и 861,48 ([М/7+Н+])). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY10570 (7,2 мг, 1,17 мкмоль, выход 53,90%, чистота 97,95%) получали в виде белого твердого вещества.
- 38 045834
BCY10574
Методика получения соединения 2
IBCY00009594 * NHS-PEG5-N3 -------Р'ЕА-----BCY00009594-PEG5-N3 DVSO 1 2
К раствору BCY9594 (65 мг, 27,07 мкмоль, 1 экв.), соединения 1 (12,00 мг, 27,75 мкмоль, 1,02 экв.) в DMSO (1 мл) добавляли DIEA (5,25 мг, 40,61 мкмоль, 7,07 мИ, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 2530°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY9594 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2718,13, наблюдаемое m/z: 906,04 ([[М/3+Н]+), 1359,07 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (42,6 мг, 15,67 мкмоль, выход 57,89%, чистота 100%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10574
BCYQ0009594-PEG5-N3 + BCY00008927 BCY00010574
I ВиОН/Н2О
Смесь соединения 2 (20 мг, 7,36 мкмоль, 1,0 экв.), BCY8927 (17 мг, 7,87 мкмоль, 1,07 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 18,4 мл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем CuSO4 (0,4 М, 18,4 мл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 36,8 мл, 2,0 экв.) были добавлены под N2. pH этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4877,68, наблюдаемое m/z: 1219,42 ([М/4+Н]+) и 975,54 ([М/5+Н]+)). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY10574 (17,6 мг, 3,41 мкмоль, выход 46,29%, чистота 94,40%) получали в виде белого твердого вещества.
- 39 045834
BCY10575
Методика получения соединения 2
IBCY0O0O9594 - NHS-PEG5-N3 -------BCY00009594-PEG5-N3
DA'S О 1 2
К раствору BCY9594 (65 мг, 27,07 мкмоль, 1 экв.), соединения 1 (12,0 мг, 27,75 мкмоль, 1,02 экв.) в DMSO (1 мл) добавляли DIEA (5,25 мг, 40,61 мкмоль, 7,07 мИ, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 2530°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [расчетный MW: 2718,13, наблюдаемое m/z: 906,04 ([[М/3+Н]+) и 1359,07 ([М/2+Н]+)]. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (42,6 мг, 15,67 мкмоль, выход 57,89%, чистота 100%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10575
BCY00009594-PEG5^3 + BCY00008928 BCY0OO10575
I Βι.-ϋΗ.·Ί4;?
:2
Смесь соединения 2 (20 мг, 7,36 мкмоль, 1,0 экв.), BCY8928 (17 мг, 7,67 мкмоль, 1,04 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 18,4 мл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 18,4 мл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 36,8 мл, 2,0 экв.) под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [расчетный MW: 4935,71, наблюдаемое m/z: 1234,59 ([М/4+Н]+) и 987,71 ([М/5+Н]+). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY10575 (12 мг, 2,37 мкмоль, выход 32,27%, чистота 97,67%) получали в виде белого твердого вещества.
- 40 045834
BCY10576
Методика получения соединения 2
ECY00009S94 · NHS-PEG5-N. -------—-----BCY00009594-PEG5-N-J
DM SO 1 2
К раствору BCY9594 (30,0 мг, 12,50 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 1 (5,54 мг, 12,81 мкмоль, 1,02 экв.) в DMSO (1 мл) добавляли DIEA (2,42 мг, 18,74 мкмоль, 3,3 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [расчетный MW: 2718,13, наблюдаемое m/z: 906,45 ([[М/3+Н]+) и 1359,50 ([М/2+Н]+)]. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (16 мг, 5,80 мкмоль, выход 46,42%, чистота 98,54%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10576
BCY00009594-PEG5-N3 + BCY00011014 οΧΧ^τΎΞίϊθΧΧΡΤΑ^ BCY0C01057S
I ы.он/г.о
Λ
Смесь соединения 2 (17,0 мг, 6,25 мкмоль, 1,0 экв.), BCY11014 (13,6 мг, 6,25 мкмоль, 1,0 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 1,8 мл, 2,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 15,6 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 1,84 мл, 2,0 экв.) под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что большая часть соединения 2 была израсходована, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [расчетный MW: 4893,63, наблюдаемое m/z: 1224,7 ([М/4+Н]+) и 980,0 ([М/6+Н]+). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY10576 (20,5 мг, 4,13 мкмоль, выход 66,02%, чистота 98,57%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY10577
Методика получения соединения 2
BCY00009172 + NrCHrCOOH ---1-EDCI. HOSu » BCY00009172-CH.-N, .DIEA. DMF
1
К раствору соединения 1 (5,0 мг, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (1 мл) добавляли EDCI (8,5 мг, 54,8 мкмоль, 1,1 экв.) и HOSu (5,7 мг, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 30 мин. ТСХ показала, что соединение 1 было полностью израсходовано, и образовалось одно новое пятно. Затем к реакционной смеси добавляли BCY9172 (53 мг, 25,29 мкмоль, 0,47 экв.) и DIEA (3,27 мг, 25,29 мкмоль, 4,4 мл, 0,47 экв). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что
- 41 045834
BCY9172 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW:
2178,46, наблюдаемое m/z: 1089,5700 ([(M/2+H+])). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и получали остаток. Затем остаток очищали препаративной
ВЭЖХ (в нейтральных условиях). Соединение 2 (30 мг, 13,77 мкмоль, выход 54,45%, чистота 100%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10577 (•uSOt
УгМи
BCY00009172-CH2-Ns + BCY000G6169 BCY00010577 2 tBuOH/H2O
Соединение 2 (20 г, 9,18 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY6169 (32,95 мг, 10,10 мкмоль, 1,1 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 23 мкл, 1 экв.), VcNa (0,4 М, 46 мл, 2,0 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 23 мл, 1,0 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 4 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5441,20, наблюдаемое m/z: 1361,8 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY10577 (16,2 мг, 2,98 мкмоль, выход 32,43%) получали в виде белого твердого вещества.
Пример 3. Синтез связывающих нектин-4/CD137 гетеротандемных бициклических пептидов
BCY8854
Общая методика получения BCY8846
о.
• - ' 7 ' о
BCY0O008234 BCY00008848
IJU А ОМА
К раствору BCY8234 (пептида, идентичного BCY8846, за исключением отсутствия фрагмента PYA; 300 г, 102 мкмоль, 1,0 экв.) в DMA (3 мл) добавляли DIEA (52,5 мг, 406 мкмоль, 70,8 мкл, 4,0 экв.) при перемешивании в течение 10 мин. Затем к смеси добавляли (2,5-диоксопирролидин-1-ил)пент-4-иноат (25,8 мг, 132 мкмоль, 1,3 экв.) и смесь дополнительно перемешивали при 20°C в течение дополнительных 16 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8234 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 3034,43, наблюдаемое m/z: 1011,8 ([[М/3+Н]+), 1517,0 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях), получая соединение BCY8846 (290 мг, 95,6 мкмоль, выход 94,1%) в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения BCY8854
BCY00007S59
BCY0000B84S . - - ► BCYO0O08854
-< U.S:Л. |л/| ··<
К раствору BCY8846 (234 мг, 77,1 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (5 мл) добавляли BCY7859 (которое может быть получено, как описано в BCY7985; 220 мг, 77,8 мкмоль, 1,0 экв.) с последующим добавлением (2R)-2-[(1S)-1,2-дигидроксиэтил]-3,4-дигидрокси-2Н-фуран-5-он (0,80 М, 963 мкл, 1,0 экв.) и CuSO4 (0,80 М, 289 мл, 0,3 экв.). Смесь перемешивали при 20°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8846 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW:
- 42 045834
5861,59, наблюдаемое m/z: 837,9 ([[М/7+Н]+), 977,6 ([М/6+Н]+), 1173,3 ([М/5+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (А: 0,075% TFA в H2O, В: ACN (ацетонитрил)), получая соединение
BCY8854 (292 мг, 46,8 мкмоль, выход 60,8%, чистота 95,9%, TFA) в виде белого твердого вещества.
BCY9350
Общая методика получения BCY8782-PYA о
....... .1.
’ 9 * HCY000084D OtEA ► BCYOOOIIW и-. N < ПМЛ
К раствору BCY8782 (пептида, идентичного BCY11942, за исключением отсутствия фрагмента PYA; 20,0 мг, 6,77 мкмоль, 1,0 экв.) в DMA (1 мл) добавляли DIEA (4,37 мг, 33,9 мкмоль, 5,90 мкл, 5,0 экв.) и (2,5-диоксопирролидин-1-ил)пент-4-инноат (2,64 мг, 13,5 мкмоль, 2,0 экв.) при перемешивании в течение 12 ч при 25°C. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8782 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 3034,43, наблюдаемое m/z: 1012,1 [[М/3+Н]+). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях), получая BCY11942 (20,0 мг, 6,00 мкмоль, выход 88,6%, чистота 91,0%) в виде белого твердого вещества.
Общая методика получения BCY9350
Ш.УШЮПМ? . НСУОЫЮУЗЫ)
DM Г
К раствору BCY11942 (20 мг, 6,59 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY7859 (которое может быть получено, как описано в BCY7985; 20,5 мг, 7,25 мкмоль, 1,1 экв.) в DMF (1 мл) добавляли (2R)-2-[(1S)-1,2дигидроксиэтил]-3,4-дигидрокси-2Н-фуран-5-он (0,4 М, 330 мл, 20,0 экв) и к смеси добавляли CuSO4 (0,4 М, 98,9 мл, 6,0 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8782PYA было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5861,59, наблюдаемое m/z: 1173,3 [М/5+Н]+). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (А: 0,075% TFA в Н2О, В: ACN), получая BCY9350 (14,5 мг, 2,40 мкмоль, выход 36,5%, чистота 97,2%) в виде белого твердого вещества.
- 43 045834
BCY9351
Общая методика получения BCY9351
Vc Ci/SOi
BCY00008940 · BCY00008846 .....-......— - BCY00009351
DMF
К раствору BCY8940 (которое может быть получено, как описано в BCY8942; 9,4 мг, 3,33 мкмоль, 1,01 экв.) и BCY8846 (10,0 мг, 3,30 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (1 мл) добавляли Vc (0,4 М, 165 мкл, 20,0 экв.) и CuSO4 (0,4 М, 49,4 мл, 6,0 экв.) в атмосфере азота. Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8940 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5861,59, наблюдаемое m/z: 975,4 [М/6+Н]+, 1172,3 [М/5+Н]+). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (А: 0,075% TFA в Н2О, В: ACN), получая BCY9351 (5,30 мг, 0,904 мкмоль, выход 26,3%, чистота 96,0%) в виде белого твердого вещества.
BCY9399
Методика получения соединения 2
К раствору СОМ134 (30 мг, 56,97 мкмоль), соединения 1 (17,22 мг, 85,45 мкмоль) в DCM (0,5 мл) добавляли TEA (8,65 мг, 85,45 мкмоль, 11,9 мл). Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ134 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 691,72, наблюдаемое m/z: 692,3 ([М+Н]+) и 709,3 ([M+NH4]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). Соединение 2 (30,5 мг) получали в виде бесцветного масла.
- 44 045834
Методика получения соединения 3
А?)О
I !| Ц , n1 + BCY00008116 ► [1«УООМ811ШСОМШИМ4|
- ‘ о 'И·- 1< ч-‘
К раствору соединения 2 (15 мг, 21,68 мкмоль) и BCY8116 (47 мг, 21,68 мкмоль) в DMF (1 мл) добавляли DIEA (8,41 мг, 65,05 мкмоль, 11,33 мкл). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 2725,1, наблюдаемое m/z: 1362,7 ([М/2+Н]+), 909,0 ([[М/3+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (20 мг, выход 33,41%, чистота 98,71%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9399
IBCY0UUU81WI [COMOOOUIHMI 4 bcywhwmi bcyoooomum t-RuOWW s
Смесь соединения 3 (20,0 мг, 5,35 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (13,0 мг, 5,70 мкмоль, 1,01 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 13,4 мкл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем CuSO4 (0,4 М, 13,4 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 26,8 мкл, 2,0 экв.) были добавлены под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 5006,64, наблюдаемое m/z: 834,9 ([М/6+Н]+), 1002,3 ([М/5+Н]+), 1252,4 ([М/4+Н]+)]. Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9399 (9,1 мг, выход 27,20%, чистота 96,29%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY9400
Методика получения соединения 2
К раствору СОМ135 (которое может быть получено, как описано в BCY9648; 30,0 мг, 27,29 мкмоль), соединение 1 (8,3 мг, 40,94 мкмоль) в DCM (2 мл) добавляли TEA (4,14 мг, 40,94 мкмоль, 5,7 пл). Затем реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ135 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1264,40, наблюдаемое m/z: 1281,4 ([M+NH4]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях), получая соединение 2 (18 мг) в виде белого твердого вещества.
Методика получения соединения 3
К раствору соединения 2 (15,5 мг, 7,12 мкмоль) и BCY8116 (9 мг, 7,12 мкмоль) в DMF (2 мл) добавляли DIEA (1,4 мг, 10,68 мкмоль, 1,9 мкл). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ
- 45 045834 показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 3297,78, наблюдаемое m/z: 1099,7 ([[М/3+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (19,5 мг, 5,91 мкмоль, выход 33,41%, чистота
83,07%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9400 |ΐκ:yooco81 ΐίί। [соммотτη + βγυοογ.ο/μι н<-υοοοιγμοι:
' t ЙиСΗ'Γ,ϋ '
Смесь соединения 3 (19,5 мг, 5,91 мкмоль), BCY7741 (14 мг, 6,14 мкмоль, 1,01 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 15 мкл, 1 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 15 мкл, 1 экв.) и VcNa (0,4 М, 30 мкл, 2 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 5579,31, наблюдаемое m/z: 930,5 ([М/6+Н]+), 1116,6 ([М/5+Н]+)]. Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9400 (13,9 мг, 2,33 мкмоль, выход 27,20%, чистота 93,56%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY9401
Методика получения соединения 3
Течжия шикай 1591;, 8Д4Я»
Л. J и ► . ил -I о i :1598 , 75*39
......
Тачкая киш: .1155,8Ж 9 иг. 17 J7, *6135
К раствору соединения 1 (50,0 г, 31,39 мкмоль, 1 экв.), соединения 2 (6,6 мг, 32,96 мкмоль, 1,05 экв.) в DCM (2 мл) добавляли TEA (4,8 мг, 47,09 мкмоль, 6,6 мкл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°С в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (молекулярная масса: 1757,86 наблюдаемое m/z: 879,10 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (0,02 г, 6,56 мкмоль, выход 20,91%, чистота 57,7%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения соединения 4 г- , .% .^¾.
-11 У ' ” Ί - * встаевне -----------s ’ с
К раствору соединения 3 (20 г, 11,38 мкмоль, 1 экв.), BCY8116 (25 мг, 11,51 мкмоль, 1,01 экв.) в DMF (4 мл) добавляли DIEA (2,2 мг, 17,07 мкмоль, 2,97 мкл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C
- 46 045834 в течение 12 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 3791,23, наблюдаемое m/z: 1263,2 ([[М/3+Н]+)). Реакционную смесь очищали напрямую препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). Соединение 4 (10 мг,
2,43 мкмоль, выход 21,33%, чистота 92%) получали в виде бесцветного масла.
Методика получения BCY9401
СиВОСШМаТНРТА
IHCYOOOOIHIH] ICOMOOWHIW] + l!C:YWJ(WM1 ... * BCYO0O09401 ► L.-JH - у.·
Смесь соединения 4 (10 мг, 2,43 мкмоль, 0,9 экв.), BCY7741 (6,32 мг, 2,77 мкмоль, 1,0 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 6,7 мкл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем CuSO4 (0,4 М, 6,7 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 13,4 мкл, 2,0 экв.) были добавлены под N2. pH этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 4 было израсходовано полностью, и один был обнаружен основной пик с желаемым m/z [MW: 6072,77, наблюдаемое m/z: 1012,00 ([М/6+Н]+)]. Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9401 (8,4 мг, 1,56 мкмоль, выход 59,31%, чистота 95,52%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY9403
Методика получения соединения 2
К раствору СОМ471 (100,0 мг, 76,42 мкмоль, 1,0 экв.), 4-нитрофенилхлорформиата (16,2 мг, 80,25 мкмоль, 1,05 экв.) в DCM (10 мл) добавляли TEA (11,6 мг, 114,64 мкмоль, 16,0 мл, 1,5 экв). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ471 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 1473,58, наблюдаемое m/z: 736,83 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (62,8 мг, 42,67 мкмоль, выход 55,84%, чистота 48,37%) получали в виде белого масла.
Методика получения соединения 3
К раствору соединения 2 (44 мг, 29,46 мкмоль, 1,0 экв.) BCY8116 (63 мг, 29,18 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (2 мл) добавляли DIEA (5,66 мг, 43,77 мкмоль, 7,62 мкл, 1,5 экв.).
- 47 045834
Смесь перемешивали при 40°C в течение 12 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 3506,95, наблюдаемое m/z: 1168,58 ([[М/3+Н]+)). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение (20 мг, 5,42 мкмоль, выход 18,57%, чистота 95,04%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9403 |ш:уо(мтп11Ы |сомооооо4Л| + всупмшм! VcNa ™рта нсуаджшиз t ΒιιοΗ.'Η,-Ο 3
Смесь соединения 3 (10,0 мг, 2,71 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (6,83 мг, 2,99 мкмоль, 1,1 экв.) и THPTA (0,4 М, 7 мкл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 7 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 14 мкл, 2,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 5788,49, наблюдаемое m/z: 1157,00 ([М/5+Н]+) и 964,60 ([М/6+Н]+). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9403 (2,1 мг, 0,34 мкмоль, выход 11,93%, чистота 93,80%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY9405 >·.ίΜ-
Методика получения соединения 2 . [ о „
К раствору СОМ472 (44,7 мг, 38,1 мкмоль), соединения 1 (9,2 мг, 45,72 мкмоль) в DCM (4 мл) добавляли TEA (5,8 мг, 57,14 мкмоль, 8 мл). Смесь перемешивали при 25°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ472 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 1338,45, наблюдаемое m/z: 686,23 ([M/2+NH4+])). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). Соединение 2 (20 мг, 14,94 мкмоль, выход 39,2%) получали в виде бесцветного масла.
Методика получения соединения 3
К раствору соединения 2 (20 мг, 14,94 мкмоль) и BCY8116 (38,96 мг, 17,93 мкмоль) в DMF (4 мл) добавляли DIEA (1,9 мг, 14,94 мкмоль, 2,6 мкл). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 3371,82, наблюдаемое m/z: 1123,94 ([М/3+Н+])). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (10 мг, выход 99,07%, чистота 19,66) получа- 48 045834 ли в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9405
[BCYOOO0R11 б][ГОММООТМ ПI
ΒΓ.Υ00Π07741
Cjf.n, VcMa TH^TA .„ vnnnnmn.
КЛЮЧ··!, О а
Смесь соединения 3 (10,0 мг, 2,97 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (7,4 мг, 3,26 мкмоль, 1,1 экв.) и ТНРТА (1,3 мг, 2,97 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 7,5 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 151 мкл, 2,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 2530°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 5653,36, наблюдаемое m/z: 1130,47 ([М/5+Н]+). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9405 (7,8 мг, выход 46,08%, чистота 97,8%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY9406
Методика получения соединения 2
К раствору СОМ473 (130,0 мг, 177,40 мкмоль, 1,0 экв.), (4-нитрофенил)карбонохлоридата (36,4 мг, 180,59 мкмоль, 1,02 экв.) в DCM (3 мл) добавляли TEA (27,0 мг, 266,09 мкмоль, 37 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 35°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ473 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 897,93, наблюдаемое m/z: 897,65 ([М+Н]+), 914,60 ([M+NH4]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (90 мг, 95,87 мкмоль, выход 54,04%, чистота 95,65%) получали в виде бесцветного масла.
Методика получения соединения 3
К раствору соединения 2 (10 мг, 11,14 мкмоль, 1 экв.), BCY8116 (25 мг, 11,51 мкмоль, 1,03 экв.) в DMF (2 мл) добавляли DIEA (2,16 мг, 16,71 мкмоль, 2,91 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 2931,30, наблюдаемое m/z: 977,00 ([[М/3+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии FTA). Соединение 3 (15 мг, 5,12 мкмоль, выход 45,79%, чистота 99,66%) получали в виде
- 49 045834 белого твердого вещества.
Методика получения BCY9406 lBCyOUGU81WMCOMOUUUU4/3] ' НСΥϋϋϋΟ/741 Си5°4 VrNa 7НРТА BCY00009406 t
S
Смесь соединения 3 (15 мг, 5,12 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (12 мг, 5,26 мкмоль, 1,03 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 12,8 мкл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 12,8 мл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 25,6 мл, 2,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 5212,84 наблюдаемое m/z: 1042,74 ([М/4+Н]+). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9406 (14,4 мг, 2,57 мкмоль, выход 50,21%, чистота 93,01%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY9407
Методика получения соединения 2 ··*>,-•„А' ,, ' η
СЛМПОООП12В - '1 j Г ·* I Д Ϊ 1
..41 ' - ”, ?
К раствору СОМ128 (60 мг, 50,53 мкмоль, 1,0 экв.) соединения 1 (13 мг, 64,50 мкмоль, 1,28 экв.) добавляли DIEA (9,80 мг, 75,80 мкмоль, 13,20 мл, 1,5 экв.) в DCM (5 мл), дегазировали и продували N2 3 раза, а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ128 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 1352,48, наблюдаемое m/z: 676,7 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (12 мг, 8,87 мкмоль, выход 17,56%) получали в виде бесцветного масла.
Методика получения [BCY8116]-[COM128] : > . - к -Г --- ' * ικζγίΗΐ™™ ----► ιπκγποαοίπtq.[согташп
А
К раствору соединения 2 (7 мг, 5,18 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY8116 (11 мг, 5,06 мкмоль, 1,0 экв.) добавляли DIEA (2,01 мг, 15,53 мкмоль, 2,70 мкл, 3,0 экв.) в DMF (3 мл), дегазировали и продували N2 3 раза, а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (вычисленное MW: 3385,85, наблюдаемое m/z: 1129,3 ([[М/3+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). [BCY8116]-[COM128] (15,6 мг, 4,46 мкмоль, выход 86,13%, чистота 96,75%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9407 [ВС¥ООООВ11ЙЦСОМООО{Ш1281 + RCY(MWM1 .........................ίВСУОТШИШИ ’ ЫСМ'Н.О
Смесь [BCY8116]-[COM128] (15,6 мг, 4,61 мкмоль, 1,0 экв.), BCY774I (11 мг, 4,82 мкмоль, 1,05
- 50 045834 экв.) и ТНРТА (0,8 М, 5,8 мкл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем CuSO4 (0,4 М, 11,6 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 23,2 мкл, 2,0 экв.) были добавлены под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один пик с желаемым m/z (вычисленное MW: 5667,39, наблюдаемое m/z: 945,6 ([М/6+Н]+) и 1134,2 ([М/5+Н]+)). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9407 (1,3 мг, 0,23 мкмоль, выход 4,33%, чистота 86,90%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY9408
Методика получения соединения 2
СОМ0000012Э . Рг |'· г'' г'% rl'i- 'l-1· ' I - ' ' *
1
К раствору СОМ129 (45,0 мг, 34,39 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 1 (15,0 мг, 74,42 мкмоль, 2,1 экв.) в DCM (5 мл) добавляли TEA (5,5 мг, 53,88 мкмоль, 7,5 мл, 1,5 экв), а затем смесь перемешивали при 2530°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что СОМ129 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 1473,58, наблюдаемое m/z: 737,3 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (9 мг, 6,11 мкмоль, выход 17,01%, чистота 95,76%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения соединения 3 г ~ ' Г , всуоооваиб----——►
I1 I ) лд
-
-3
К раствору соединения 2 (9,0 мг, 6,11 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY8116 (13,3 мг, 6,11 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (3 мл) добавляли DIEA (2,4 мг, 18,32 мкмоль, 3,2 мкл, 3,0 экв.). Все растворители дегазировали и продували N2 3 раза, а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 1 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 3506,95, наблюдаемое m/z: 877,4 ([М/4+Н]+) и m/z: 1169,6 ([[М/3+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (7,2 мг, 2,05 мкмоль, выход 31,93%, чистота 95%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9408
[BCY00008116HCOM00000129] , BCY00007741 BCY00009408 f
Смесь соединения 3 (7,2 мг, 2,05 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (5,0 мг, 2,19 мкмоль, 1,03 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 5,1 мкл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 5,1 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 10,2 мкл, 2,0 экв) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1
- 51 045834 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 5788,49 наблюдаемое m/z: 968,9 ([М/6+Н]+) и 1158,0 ([М/5+Н]+)]. Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9408 (3,1 мг, 4,97е-1 мкмоль, выход 24,23%, чистота 92,87%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY9409
Методика получения соединения 2 смижш + J Ϊ 'Г * | Г b J 1 И ' &»»'' ОгМ' ’
Ч 2
К раствору соединения 1 (30 мг, 20,78 мкмоль), СОМ130 (6,28 мг, 31,17 мкмоль) в DCM (3 мл) добавляли TEA (3,15 мг, 31,17 мкмоль, 4,34 мкл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 1608,70, m/z: 804,8 ([М/2+Н]+). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем лиофилизировали, получая соединение 2 (10,2 мг, неочищенное) в виде белого твердого вещества.
Методика получения соединения 3
Ϊ’ J С р .1; - - * bL^LLCHllL ---;вг7г^1Ч11с;ргмпл191М] :: Я
К раствору соединения 2 (10,2 мг, 6,34 мкмоль) и BCY8116 (13,50 мг, 6,22 мкмоль) в DMF (2 мл) добавляли DIEA (0,8 мг, 6,22 мкмоль, 1,1 мкл, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ обнаружил желаемое m/z (MW: 3642,08, наблюдаемое m/z: 1214,4 ([[М/3+Н]+). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (15,0 мг, 4,12 мкмоль, выход 62,94%, чистота 95%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9409 |i«:Y0<wme] |сомсшо(И)1зо] bcyoooo7741 hcyotoomhi t-BuOH/H-C д
Смесь соединения 3 (15 мг, 4,12 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (10 мг, 4,38 мкмоль, 1,03 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 10,3 мкл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1,2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 10,3 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 20,6 мкл, 2,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 5923,61, наблюдаемое m/z: 988,2 ([М/6+Н]+)]. Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9409 (3,1 мг, 0,52 мкмоль, выход 12,62%, чистота 90,89%) получали в виде белого твердого вещества.
- 52 045834
BCY9410
К раствору СОМ131 (167,0 мг, 227,89 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 1 (55,0 мг, 272,87 мкмоль, 1,2
Методика получения соединения 2 экв.) в DCM (5 мл) добавляли TEA (36,4 мг, 359,23 мкмоль, 50,0 мл, 1,6 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 897,93, наблюдаемый 920,3 ([M+Na+]). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (35 мг, 33,74 мкмоль, выход 14,81%, чистота 86,56%) получали в виде бесцветного масла.
Методика получения соединения 3
К раствору соединения 2 (20 мг, 22,27 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY8116 (48 мг, 22,09 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (2 мл) добавляли DIEA (8,64 мг, 66,82 мкмоль, 1 1,64 мкл, 3,0 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 2931,32, наблюдаемое m/z: 977,7 ([М+Н]+)). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (40 мг, 13,08 мкмоль, выход 58,7%, чистота 95,82%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9410
[В С ¥00008116]-[С О М 00000131]
BCY0(WM1 всуоооофио
I
Смесь соединения 3 (40 мг, 13,08 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (35 мг, 15,34 мкмоль, 1,17 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 34 мкл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 34 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 68 мкл, 2,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 5212,85, наблюдаемое m/z: 1043,2 ([М/5+Н]+). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9410 (38,6 мг, 6,78 мкмоль, выход 49,71%, чистота 91,6%) получали в виде белого твердого вещества.
- 53 045834
BCY9411
Методика получения соединения 2
К раствору СОМ132 (5 мг, 16,32 мкмоль, 1 экв.), соединения 1 (4 мг, 19,85 мкмоль, 1,22 экв.) в DCM (5 мл) добавляли TEA (2,8 мг, 24,48 мкмоль, 3,4 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. ЖХ-МС анализ показал, чтоб был обнаружен один пик с желаемым m/z (расчетный MW: 471,46, наблюдаемое m/z: 489,2 ([M+NH4]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, а затем лиофилизировали, получая соединение 2 (8 мг, неочищенное) в виде белого твердого вещества.
Методика получения соединения 3
К раствору соединения 2 (3,3 мг, 6,9 мкмоль, 1,5 экв.) и BCY8116 (10,0 мг, 4,6 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (5 мл) добавляли DIEA (0,7 мг, 6,90 мкмоль, 1 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2504,83, наблюдаемое m/z: 1252,3 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (4,2 мг, 1,51 мкмоль, выход 32,78%, чистота 90%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9411
IBcyoooobug] [cowwooowj
BCY00O07741 BCY00009411 t BuOl '.·4«
I .....
Смесь соединения 3 (4,2 мг, 1,68 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7741 (4,0 мг, 1,75 мкмоль, 1,05 экв.) и ТНРТА (0,04 М, 84 мкл, 2,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,04 М, 84 мкл, 2,0 экв.) и VcNa (0,04 М, 168 мкл, 4,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 4786,37, наблюдаемое m/z: 1596,2 ([М/3+Н]+), 1196,9 ([М/4+Н]+)]. Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9411 (4,1 мг, 0,86 мкмоль, выход 50,20%, чистота 98,26%) получали в виде белого твердого вещества.
- 54 045834
BCY9759
Методика получения соединения 2
К раствору соединения 1 (5,0 мг, 3,54 мкмоль, 1,0 экв.), BCY8116 (7,7 мг, 3,54 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (3 мл) добавляли DIEA (0,9 мг, 7,07 мкмоль, 1,2 мкл, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при 0°C в течение 20 мин. ЖХ-МС анализ обнаружил массу, соответствующую соединению 2 с отщепленной группой NHS (расчетный MW: 3470,95, гидролизованный MW: 3373,81, наблюдаемое m/z: 1125,0 ([[М/3+Н]+) Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении и лиофилизировали, получая соединение 2 (15 мг, неочищенное) в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY9759
2,1 зжй. ОГРЕЙ.
ВСУПОООЯНб PEGM NHS + НСУШИИИЛ? ----------BCY00009759 . j л—!
К раствору соединения 2 (20 г, 5,76 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY7732 (12,7 мг, 5,76 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (3 мл) добавляли DIEA (1,5 мг, 11,52 мкмоль, 2,0 мкл, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 5557,3, наблюдаемое m/z: 927,0 ([М/6+Н]+) и 1112,2 ([М/5+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY9759 (2,3 мг, выход 6,92%, чистота 96,29%) получали в виде белого твердого вещества.
- 55 045834
BCY10000
BCY00010000
Методика получения BCY9172-PEG12-N3
Di А
BCY00009172 - NHS-PEG12-N; - ........... ► 8CY00009172-PEG12-N·.
U .II 1 1
BCY9172 (520 мг, 248,16 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (370 мг, 499,47 мкмоль, 2,01 экв.) растворяли в DMF (5 мл), затем к смеси добавляли DIEA (48,11 мг, 372,24 мкмоль, 64,84 мл, 1,5 экв.) и перемешивали при 30°C в течение 12 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY9172 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2721,12, наблюдаемое m/z: 1360,9 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали соединение 2 (284 мг, 101,10 мкмоль, выход 40,74%, чистота 96,87%) в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10000
Си SC :
VL\d
ВСУОШЮУШ N3 HCY0U008B4G ,IIPIA ► НСУОШИОООО
I LX .1 J)
Эту реакцию проводили параллельно в двух независимых сосудах. В одном сосуде сначала растворяли соединение 2 (142 мг, 52,18 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY8846 (157 мг, 51,74 мкмоль, 1,0 экв.) в 10 мл tBuOH/H2O (1:1), а затем CuSO4 ( Добавляли 0,4 М, 130,5 мкл, 1,0 экв.), VcNa (0,4 М, 261,0 мкл, 2,0 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 130,5 мкл, 1,0 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5755,54, наблюдаемое m/z: 959,60 ([М/6+Н]+) и 1151,55 ([М/5+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY10000 (314,9 мг, 51,99 мкмоль, выход 49,82%, чистота 95,03%) в виде белого твердого вещества.
- 56 045834
BCY10567
BCY00010567
Методика получения BCY8919-PEG12-N3
ЛЬ А BCY00003919 * NHS-PEGIZ-hh ----------------* BCY00008919-PEG12-N,
DMSO
2
BCY8919 (60,0 мг, 28,85 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (22,2 мг, 30,01 мкмоль, 1,04 экв.) растворяли в DMSO (1 мл). К раствору добавляли DIPEA (5,6 мг, 43,28 мкмоль, 7,6 мкл, 1,5 экв.), а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8919 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2705,16, наблюдаемое m/z: 1353,15 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали соединение 2 (BCY8919-PEG12-N3, 18,5 мг, 6,77 мкмоль, выход 23,47%, чистота 99,04%) в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10567
B(:Y(J0(]089T9PtGl? «, с О.|
VcNa нсуосошимь —HILLA'— ! ΒυΰΙ-,Ή2ϋ
ШЛОООКЬб/ я
Примечание: эту реакцию проводили дважды, и первая из них описана ниже.
Соединение 2 (9,0 мг, 3,33 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY8846 (10,1 мг, 3,33 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 8,3 мкл, 1,0 экв.), VcN (1,3 мг, 6,56 мкмоль, 2,0 экв.) и ТНРТА (1,4 мг, 3,22 мкмоль, 1,0 экв.). Наконец, добавляли 0,4 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5739,58, наблюдаемое m/z: 956,75 ([М/6+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY10567 (6,85 мг, 1,18 мкмоль, выход 35,48%, чистота 98,91%) в виде белого твердого вещества.
- 57 045834
BCY10569
БСУ00О1О569
Методика получения соединения 3
DIEA вглготу + wm пу и, ---—--► нс^жов-уорт:· \ ' 3
Смесь соединения BCY8920 (40,0 мг, 18,71 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 2 (16,0 мг, 21,6 мкмоль, 1,15 экв.) и DIEA (5,0 мкл, 28,0 мкмоль, 1,5 экв.) растворяли в DMF. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 1 ч до тех пор, пока ЖХ-МС анализ не показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2763,2, наблюдаемое m/z: 912,17 ([(М-28)/2+Н]+). Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и получения остатка с последующей очисткой с помощью препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (23,4 мг, 8,47 мкмоль, выход 45,25%, чистота 99,0%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10569
’..Ί Ί J
5СШУ8'УЗ-Г.н:--РЕ311-Ч- + PCTi!()0№ --------2212------ВГУПЖЖП DMF
Смесь соединения 3 (5,0 мг, 1,81 мкмоль, 1,0 экв.), BCY8846 (5,8 мг, 1,9 мкмоль, 1,05 экв.) и ТНРТА (1,0 мг, 2,3 мкмоль, 1,3 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 1 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем CuSO4 (0,4 М, 5,0 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 5,0 мкл, 1,0 экв.) добавляли под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5797,62, наблюдаемое m/z: 1160,7 ([М/5+Н]+). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY10569 (5,7 мг, 1,18 мкмоль, выход 52,25%, чистота 96,16%) в виде белого твердого вещества.
- 58 045834
BCY10571
BCY00010571
Методика получения BCY8116-PEG5-N3 nil Λ
BGY(IOUU811 ΰ + NHS HI GO ► BCYC00O8116-PEG5-N ,
RM SO 1 1
BCY8116 (60 мг, 27,62 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (12,0 мг, 27,75 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в DMSO (1 мл), затем к смеси добавляли DIEA (5,4 мг, 41,43 мкмоль, 7,22 мкл, 1,5 экв). Смесь перемешивали при 30°C в течение 12 ч. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 2489,82, наблюдаемое m/z: 1245,1700 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (48 мг, 19,28 мкмоль, выход 69,80%, чистота 100%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10571
GuSC,
VcNa
BCY00008116-PEG5-N3 + BCY00008927 —BCY00010571 ι Bur; ·ί /;
Эту реакцию проводили параллельно в двух независимых сосудах. Для одного сосуда соединение 2 (10 мг, 4,02 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY8927 (9 мг, 4,17 мкмоль, 1,04 экв.) сначала растворяли в 2 мл tBuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 10,0 мкл, 1,0 экв.), VcNa (0,4 М, 20,1 мкл, 2,0 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 10,0 мкл, 1 экв.). Наконец, добавляли 0,4 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 4 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 4649,36, наблюдаемое m/z: 1162,57 ([М/4+Н]+), 1549,69 ([М/3+Н]+)). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY10571 (13 мг, 2,79 мкмоль, выход 34,88%, чистота 96,48%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY10572
BCY00010572
Методика получения BCY8116-PEG5-N3
ГНЕЛ
BCYOOOOtmb + NH8 PI G'j BCY00008116-PEG5-N, ι; msgι a
- 59 045834
BCY8116 (60 мг, 27,62 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (12,0 мг, 27,75 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в DMSO (1 мл), затем к смеси добавляли DIEA (5,4 мг, 41,43 мкмоль, 7,22 мкл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 12 ч. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 2489,82, наблюдаемое m/z: 1245,1700 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (48 мг, 19,28 мкмоль, выход 69,80%, чистота 100%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10572
GjSOVcNa
ВСУШМШШЬРЬОЬ + BCY0000M/8 —Ι2Ε1Δ—» [ 5СУООО1О5/7 t BuGI Л -G
Эту реакцию проводили параллельно в двух независимых сосудах. В одном сосуде сначала растворяли соединение 2 (10 мг, 4,02 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY8928 (9 мг, 4,06 мкмоль, 1,01 экв.) в 2 мл tBuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 10,1 мл, 1 экв.), VcNa (0,4 М, 20,2 мкл, 2,0 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 10,1 мкл, 1,0 экв.). Наконец, добавляли 0,4 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 4 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 4707,40, наблюдаемое m/z: 1568,29 ([[М/3+Н]+) и 1176,83 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY10572 (21 мг, 4,46 мкмоль, выход 55,7%, чистота 97,51%) получали в виде белого твердо го вещества.
BCY10573
щ.уоооюмсз
Методика получения соединения 2
BCY0000S116 ► NHS-PEGS’Nj -------ВС¥00С08116'РЕС5Ща а
К раствору BCY8116 (35 мг, 16,11 мкмоль, 1 экв.), соединения 1 (7,00 мг, 16,19 мкмоль, 1 экв.) в DMSO (1 мл) добавляли DIEA (3,12 мг, 24,17 мкмоль, 4,21 мкл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 2530°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что большая часть BCY8116 была израсходована, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2489,82, наблюдаемое m/z: 1245,37 ([М/2+Н]+) и 830,25 ([М/3+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (26,8 мг, 10,76 мкмоль, выход 66,81%, чистота 100%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10573
BCYiJ0U08116-PEG5-N3 ι В LY (ДНИ 1U14 ВСУ0О010573
Г ЧциН ь
Смесь соединения 2 (15 мг, 6,02 мкмоль, 1,0 экв.), BCY11014 (13,50 мг, 6,21 мкмоль, 1,03 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 15,1 мкл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 15,1 мл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 30,2 мл, 2,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [MW: 4665,32, наблюдаемое m/z: 1167,50
- 60 045834 ([М/4+Н+])]. Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA).
BCY10573 (11,5 мг, 2,42 мкмоль, выход 40,14%, чистота 98,11%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY10578
BCY00010578
Методика получения соединения 2
BCY0O0O9172 + N3-CHrCOOH 1 ЕРС|· HOSu BCY00009172-CH,-N.
2.DIEA. DMF
I
Соединение 1 (5,0 мг, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.) сначала активировали смешиванием с EDCI (8,5 мг, 54,8 мкмоль, 1,1 экв.) и HOSu (5,7 мг, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 30 мин. ТСХ показала, что соединение 1 было полностью израсходовано, и образовалось одно новое пятно. Затем к этой смеси добавляли соединение BCY9172 (80,0 мг, 38,18 мкмоль, 0,8 экв.) и DIEA (6,3 мг, 8,5 мкл, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.) и перемешивали при 40°C в течение 1 ч до тех пор, пока ЖХ-МС анализ не показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2178,46, наблюдаемое m/z: 1089,44 ([М/2+Н]+). Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и получали остаток с последующей очисткой препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (15 мг, 6,88 мкмоль, выход 18,66%, чистота 73,3%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10578
V- м 11 4 · 1 г г ΚΪ - -IX
DMF
Смесь соединения 2 (9,8 мг, 4,5 мкмоль, 1,0 экв.), BCY8846 (14,0 мг, 4,6 мкмоль, 1,0 экв.) и ТНРТА (2,0 мг, 4,6 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 1 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 12 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 24 мкл, 2,0 экв.) под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5212,88, наблюдаемое m/z: 1304,2 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY10578 (13,78 мг, 2,64 мкмоль, выход 58,66%, чистота 96,23%) в виде белого твердого вещества.
- 61 045834
BCY10917
Методика получения BCY8831-PEG12-N3
ВСУООООВМП * NHS PI G17 N4 ------2L2------UC¥{J(jmH31 PLG12 N,
DMF ΐ a:
BCY8831 (40,0 мг, 13,29 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (10,5 мг, 14,17 мкмоль, 1,07 экв.) растворяли в DMF (1 мл). К раствору добавляли DIPEA (2,6 мг, 20,09 мкмоль, 3,5 мкл, 1,5 экв.), а затем смесь перемешивали при 30°C в течение 16 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8831 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 3635,16, наблюдаемое m/z: 1212,0 ([[М/3+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), и соединение 2 (22,0 мг, 5,83 мкмоль, выход 43,85%, чистота 96,39%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10917
CuSO4
VcNa
HCY00U08831 PIG12 Η·, + HCYOO011014 —ВСУОООЮШ t ΗυΟΜΓΟ
Примечание: было получено две партии, и получение первой включено в описание финального отчета.
Соединение 2 (10,0 мг, 2,75 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY11014 (5,98 мг, 2,75 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 13,7 мкл, 2,0 экв.), VcNa (1,1 мг, 5,55 мкмоль, 2,0 экв.) и ТНРТА (1,2 мг, 2,76 мкмоль, 1,0 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5810,66, наблюдаемое m/z: 1163,0 ([М/5+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY10917 (6,4 мг, 1,07 мкмоль, выход 39,03%, чистота 97,49%) в виде белого твердого вещества.
- 62 045834
BCY11020
Методика получения BCY8831-PEG5-N3
ΊΙ Λ НСУОООШПШ · NHS PI G5 Na ------2--------BCYULWUmi PLUb N.
DMF
1
BCY8831 (25,0 мг, 8,31 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (3,9 мг, 9,02 мкмоль, 1,09 экв.) растворяли в DMF (1 мл). К раствору добавляли DIPEA (1,6 мг, 12,46 мкмоль, 2,2 мкл, 1,5 экв), а затем смесь перемешивали при 35°C в течение 2 ч ЖХ-МС анализ показал, что BCY8831 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 3326,79, наблюдаемое m/z: 1109,66 ([[М/3+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), и соединение 2 (7,3 мг, 2,09 мкмоль, выход 25,20%, чистота 95,41%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY11020
I j1·· :,
V:Na
BCYUDOOmi PLG5 + HC¥O(H)11O14 ВС ¥00011020 : ВиСЫГО
Соединение 2 (7,3 мг, 2,19 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY11014 (4,8 мг, 2,19 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 5,5 мкл, 1,0 экв.), VcNa (1,0 мг, 5,05 мкмоль, 2,3 экв.) и ТНРТА (1,0 мг, 2,30 мкмоль, 1,0 экв.).
Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5502,29, наблюдаемое m/z: 1101,74 ([М/5+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11020 (3,3 мг, 0,577 мкмоль, выход 26,30%, чистота 96,24%) в виде белого твердого вещества.
- 63 045834
BCY11373
8CYW01W3
Методика получения соединения 2
BCY&OO08116 - n3-ch?-cooh ............„ всуошмпиш сн-n,
2.DIEA, DMF '
2
К раствору соединения 1 (5,0 мг, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (1 мл) добавляли EDCI (8,5 мг, 54,8 мкмоль, 1,1 экв.) и HOSu (5,7 мг, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 30 мин. ТСХ показала, что соединение 1 было полностью израсходовано, и образовалось одно новое пятно. Затем к 0,3 мл этой смеси добавляли BCY8116 (30,0 мг, 13,81 мкмоль, 0,28 экв.) и DIEA (2,4 мкл, 13,81 мкмоль, 0,28 экв.) и перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8116 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2255,53, наблюдаемое m/z: 1128,34 ([М/2+Н]+). Затем реакционную смесь концентрировали при пони женном давлении для удаления растворителя и получали остаток с последующей очисткой с помощью препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (21 мг, 8,9 мкмоль, выход 64,43%, чистота
95,56%) получали в виде белого твердого вещества. Методика получения BCY11373
НСУООШШПб сн? щ а
Си so,
VcNa
J Τ'? НС¥0001 ПЛ
I BuOU.'H/J
Смесь соединения 2 (5 мг, 2,22 мкмоль, 1,0 экв.), BCY8928 (4,79 мг, 2,22 мкмоль, 1,0 экв.) и ТНРТА (1,0 мг, 2,30 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 1 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем CuSO4 (0,4 М, 5,6 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 5,6 мкл, 1,0 экв.) добавляли под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4415,07, наблюдаемое m/z: 1471,5 ([[М/3+Н]+ и 1103,8 ([М/4+Н]+). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11373 (4,9 мг, 1,03 мкмоль, выход 46,26%, чистота 92,4%) в виде белого твердого веще ства.
- 64 045834
BCY11374
Методика получения BCY11374
HCYOilOOIM 1Б СМ? N:i
HCYOOOOHWB
Гн SO, VcNa ΙΗΙΊΛ ! IhiOI Ι,ΊΙ/)
Смесь соединения 2 (которое может быть получено, как описано в методике получения BCY11373; 5 мг, 2,22 мкмоль, 1,0 экв.), BCY8928 (4,9 мг, 2,22 мкмоль, 1,0 экв.) и ТНРТА (1,0 мг, 2,30 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 1 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем CuSO4 (0,4 М, 5,6 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 5,6 мкл, 1,0 экв.) добавляли в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4473,11, наблюдаемое m/z: 1491,5 ([[М/3+Н]+ и 1118,5 ([М/4+Н]+) Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11374 (4,1 мг, 1,27 мкмоль, выход 38,04%, чистота 92,0%) в виде белого твердого вещества.
BCY11375
BCY00011375
- 65 045834
Методика получения BCY11375
CuSOi
VcNa
BCYOOOG8116-CHrN.; + RCY00011014 -------► BCY00011375 ϋ M г
Смесь соединения 2 (которое может быть получено, как описано в BCY11373; 5 мг, 2,22 мкмоль, 1,0 экв.), BCY11014 (4,8 мг, 2,22 мкмоль, 1,0 экв.) и ТНРТА (0,5 мг, 2,30 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в tBuOH/H2O (1:1, 1 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 5,6 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 5,6 мл, 1,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светложелтым. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ обнаружил присутствие некоторого количества желаемого значения m/z (расчетный MW: 4431,03, наблюдаемое m/z: 1107,59 ([М/4+Н]+ и 1477,90 ([[М/3+Н]+). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), и BCY11375 (6 мг, 1,31 мкмоль, выход 59,13%, чистота 96,8%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY11616
BCYWI1616
Методика получения соединения 3
ВСУПЖБШ + NHS-Perp N, ----ВС Υ%ίΚΠ1 МТГмД N-
2 Э
Смесь соединения BCY8116 (30,0 мг, 13,81 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 2 (6,0 мг, 13,88 мкмоль, 1,0 экв.) и DIEA (2,4 мкл, 13,82 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в DMF. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 1 ч до тех пор, пока ЖХ-МС анализ не показал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2489,82, наблюдаемое m/z: 1245,4 ([М/2+Н]+). Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и получали остаток с последующей очисткой препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 3 (27 мг, 10,29 мкмоль, выход 74,52%, 94,9% чистоты) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY11616
Ciiso^
Реуь + ВСУ’ЖШЛН --------BCYCMUSIh Γ3Μί
Смесь соединения 3 (5 мг, 2,01 мкмоль, 1,0 экв.), BCY7744 (5,2 мг, 2,21 мкмоль, 1,1 экв.) и ТНРТА (1,0 мг, 2,30 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 1 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем CuSO4 (0,4 М, 5,0 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 5,0 мкл, 1,0 экв.) были добавлены под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4827,46, наблюдаемое m/z: 1207,12 ([М/4+Н]+). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая
- 66 045834 остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), и получали
BCY11616 (4,7 мг, 1,0 мкмоль, выход 48,48%, чистота 94,7%) в виде белого твердого вещества.
BCY11617
Методика получения BCY11617
CuSO4 VcNa
I I :' Λ
CW °ΟΥί2ΰΟ&·Ί6-Ρθα5-Νύ
РГЛОСГПБ·! '
Смесь соединения 3 (которое может быть получено, как описано в методике получения BCY11616; 5 мг, 2,01 мкмоль, 1,0 экв.), BCY11506 (5,2 мг, 2,21 мкмоль, 1,1 экв.) и ТНРТА (1,0 мг, 2,30 мкмоль, 1,1 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 1 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем CuSO4 (0,4 М, 5,0 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 5,0 мкл, 1,0 экв.) добавляли в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8 путем добавления по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4828,45, наблюдаемое m/z: 1206,97 ([М/4+Н]+) и 965,91 ([М/5+Н]+). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), и BCY11617 (3,2 мг, 0,63 мкмоль, выход 31,37%, чистота 95,05%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY11857
- 67 045834
Методика получения BCY11414-PEG5 N3
BCY00011414 · NHS-PEG5-N, ------------► BCY00011414-PEG5^.(
Me jV-Η С 1 2
BCY11414 (60,0 мг, 29,06 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (13,0 мг, 30,06 мкмоль, 1,03 экв.) растворяли в 2 мл MeCN/H2O (1:1). Доводили рН до 8 с помощью NaHCO3 (0,4 М), а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2381,72, наблюдаемое m/z: 1 191,07 ([М/2+Н]+))). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), и соединение 2 (38,0 мг, 15,9 мкмоль, выход 54,71%, чистота 97,35%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY11857
Ш.ШХИ1414 Hi G6 ΝΊ + l5CY(H)U(lfЖ .....- - ВС : ίΜ1ό:ΓΉ:ϋ
Соединение 2 (10,0 мг, 4,20 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY7744 (11,5 мг, 4,92 мкмоль, 1,2 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 11,0 мл, 1,0 экв.), VcNa (2,0 мг, 10 мкмоль, 2,4 экв.) и ТНРТА (2,0 мг, 4,6 мкмоль, 1,1 экв.). Наконец, добавляли 0,2 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4719,37, наблюдаемое m/z: 1180,24 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11857 (10,3 мг, 2,18 мкмоль, выход 51,90%, чистота 96,02%) в виде белого твердого вещества.
BCY11858 с-
ВйадЮПбЗв
Методика получения BCY11414-PEG5-N3 \arrj-.
BCY0O011414 < NHS-PEG5-N-, ------------------* BCY00011414-PEG5-N·,
МёСМГГС
2
BCY11414 (60,0 мг, 29,06 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (13,0 мг, 30,06 мкмоль, 1,03 экв.) растворяли в 2 мл MeCN/H2O (1:1). Доводили рН до 8 с помощью NaHCO3 (0,4 М), а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2381,72, наблюдаемое m/z: 1191,07 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), и соединение 2 (38,0 мг, 15,9 мкмоль, выход 54,71%, чистота
97,35%) получали в виде белого твердого вещества. Методика получения BCY11858
ΒΓΥϋϋϋ11414 PLG5N, + HCY0000B97H
C/.jSDj VcNa ’НН i А : ;лг Л ΙΡύ
НСУШЮНИМ!
Соединение 2 (20,0 мг, 8,40 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY8928 (22,0 мг, 9,92 мкмоль, 1,1 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 21,0 мл, 1,0 экв.), VcNa (4,0 мг,
- 68 045834
20,19 мкмоль, 2,4 экв.) и ТНРТА (4,0 мг, 9,20 мкмоль, 1,1 экв.). Наконец, добавляли 0,4 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4599,30, наблюдаемое m/z: 920,38 ([М/5+Н]+), 1150,79 ([М/4+Н]+), 1533,35 ([М/3+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11858 (16,9 мг, 3,67 мкмоль, выход 43,43%, чистота 99,25%) в виде белого твердого вещества.
BCY11859
Методика получения BCY11415-PEG5-N3
BCY00011415 1 NHS-PEG5-Nj -----------------► BCY00011415-’PEG5-H3
2
BCY11415 (30,0 мг, 13,81 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (6,0 мг, 30,06 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в 2 мл MeCN/H2O (1:1). Доводили рН до 8 с помощью NaHCO3 (0,4 М), а затем смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2489,82, наблюдаемое m/z: 1245,18 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и соединение 2 (24,0 мг, 9,63 мкмоль, выход 69,7%, чистота 99,28%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY11859
HL'Y00(J11415 PI G5 N, + BCYOOOOBiDB BCY000118M ! 6uGl-'H;U
I
Соединение 2 (20,0 мг, 8,03 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY8928 (21,0 мг, 9,47 мкмоль, 1,1 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 21,0 мкл, 1,0 экв), VcNa (4,0 мг, 2,5 экв.) и ТНРТА (4,0 мг, 1,1 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4707,40, наблюдаемое m/z: 941,7 ([М/5+Н]+), 1176,9 ([М/4+Н]+), 1569,6 ([М/3+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11859 (19,2 мг, 4,01 мкмоль, выход 49,87%, чистота 98,22%) в виде белого твердого вещества.
- 69 045834
Пример 4. Синтез связывающих PD-L1/CD137 гетеротандемных бициклических пептидов
BCY8939
Общая методика получения BCY8939 : HC'Su. ED?
N3-PEG12-COOH - ......>- BCY00007859
2i BCY000O7732 DEA
К раствору N3-PEG12-COOH (250 мг, 388 мкмоль) и HOSu (67,0 г, 583 мкмоль) в DMA (4,5 мл) и DCM (1,5 мл) добавляли EDCI (89,3 мг, 466 мкмоль) при перемешивании при 20°C в течение 16 ч. ЖХМС анализ показал, что желаемое промежуточное соединение образовалось полностью. BCY7732 (854,97 мг, 388,37 мкмоль, 1 экв.) и DIEA (186 мг, 1,44 ммоль, 250 мл) добавляли к смеси с дальнейшим перемешиванием при 20°C в течение дополнительных 5 ч ЖХ-МС анализ показал, что BCY7732 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемой массой. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), получая соединение BCY7859 (621 мг, 200,58 мкмоль, выход 51,65%, чистота 95%, TFA) в виде белого твердого вещества. Расчетный MW: 2817,16, наблюдаемое m/z: 942,7 [М/3+Н]+.
Общая методика получения BCY8939 □ r- VA Л ПЛ 7 о с л -': Υ ϋί £! 9 38 О г- V Л Л Л ЛОО 70 BCY00007859 ------------BCY0U008939
Vc/A SiM IJMI
К раствору BCY7859 (31,1 мг, 11,0 мкмоль) и BCY8938 (30,0 мг, 10,0 мкмоль) в DMF (2 мл) добавляли (2R)-2-[(1S)-1,2-дигидроксиэтил]-3,4-дигидроксил-2Н-фуран-5-он (1 М, 100 мкл) и CuSO4 (1 M, 30,0 мл) при перемешивании в атмосфере азота в течение 2 ч при 20°C. ЖХ-МС анализ показал, что BCY7859 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемой массой. Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), получая соединение BCY8939 (16,1 мг, 2,72 мкмоль, выход 27,1%, чистота 98,3%) в виде белого твердого вещества. Расчетный MW: 5823,49, наблюдаемое m/z: 1165,4 [М/5+Н]+, 971,0 [М/6+Н]+, 832,9 [М/7+Н]+.
BCY10580
Методика получения BCY9172-PEG12-N3
Г: F А
HLYOIWJW - NHS Pt G12 N, ----------------w BCY00009172-PEG12-N,
BMSO %
К BCY9172 (100,0 мг, 47,72 мкмоль, 1 экв.) и соединение 1 (40,0 мг, 54,00 мкмоль, 1,13 экв.) в
DMSO (2 мл) добавляли DIEA (9,25 мг, 71,58 мкмоль, 12,47 мл, 1,5 экв). Смесь перемешивали при 30°C в течение 12 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY9172 было полностью израсходовано, и был обнаружен
- 70 045834 один основной пик с желаемым m/z (MW: 2721,12, наблюдаемое m/z: 1361,07 ([(M/2+H+])). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и получения остатка. Остаток затем очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). Соединение 2 (48 мг, 17,44 мкмоль, выход 45,68%, чистота 98,87%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10580
Gusts
VcNa
HCYUUU09V2 Hh(J!7 + BCY000100W BCY0O010M0 t Suahuu
I
Соединение 2 (20 г, 7,35 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY10043 (23,1 мг, 7,35 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 18,4 мкл, 1,0 экв.), VcNa (0,4 М, 36,8 мл, 2,0 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 18,4 мл, 1,0 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 4 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 5855,74, наблюдаемое m/z: 976,40 ([М/6+Н]+) и 1171,67 ([М/5+Н]+). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY10580 (29 мг, 4,85 мкмоль, выход 65,95%, чистота 97,879%) получали в виде белого твердого вещества.
BCY10581
Методика получения BCY9172-PEG12-N3
РТА
HCY00()09V2 - NHS P1G12 ------------------ BCYO0009172-PEG12-N.
PMSO
2
К BCY9172 (100 мг, 47,72 мкмоль, 1 экв.) и соединение 1 (40,00 мг, 54,00 мкмоль, 1,13 экв.) в DMSO (2 мл) добавляли DIEA (9,25 мг, 71,58 мкмоль, 12,47 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 12 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY9172 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 2721,12, наблюдаемое m/z: 1361,07 ([(М/2+Н+])). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с образованием остатка. Остаток затем очищали препаративной ВЭЖХ (в нейтральных условиях). Соединение 2 (48 мг, 17,44 мкмоль, выход 45,68%, чистота 98,87%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10581
GuSy
VcNa + Е1CY0001 (НМЛ BCYOOOWMH 1 SuUl ,iy »
Соединение 2 (12 мг, 4,41 мкмоль, 1 экв.) и BCY10044 (14,08 мг, 4,41 мкмоль, 1 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 11,02 мкл, 1 экв.), VcNa (0,4 М, 22,05 мл, 2 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 10,04 мл, 1 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 4 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (MW: 5912,84, наблюдаемое m/z: 985,90 ([М/6+Н]+) и 1183,28 ([М/5+Н]+)). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY10581 (9,3 мг, 1,47 мкмоль, выход 33,36%, чистота 93,541%) получали в виде белого твердого
- 71 045834 вещества.
BCY10582 ей
Методика получения соединения 2
IBCYO0009172 + NHS-PEG12’N3 -------► BGYQ0009172’PEG12-Nj
Df/ ЯП 1 2
К раствору BCY9172 (100,0 мг, 47,7 мкмоль, 1,0 экв.), соединения 1 (40,0 мг, 54,0 мкмоль, 1,13 экв.) в DMSO (2 мл) добавляли DIEA (9,2 мг, 71,6 мкмоль, 12,5 мл, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при 30°C в течение 12 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY9172 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2721,12, наблюдаемое m/z: 1361,07 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, получая остаток. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (37 мг, 13,60 мкмоль, выход 28,49%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY10582
BCY00a03172-PEG12-N3 + BCY00010045 BCY00010582
Г IЛАЛ Ι.Ί ЬО * '
Смесь соединения 2 (16,0 мг, 5,9 мкмоль, 1,0 экв.), BCY10045 (14,0 мг, 6,0 мкмоль, 1,01 экв.) и ТНРТА (0,4 М, 14,7 мл, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 2 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 14,7 мл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 29,4 мл, 2,0 экв.) в атмосфере N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 12 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z [расчетный MW: 5073,89, наблюдаемое m/z: 1015,24 ([М/5+Н]+) и 1268,97 ([М/4+Н]+). Реакционную смесь напрямую очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). BCY10582 (10 мг, 1,92 мкмоль, выход 32,58%, чистота 97,21%) получали в виде белого твердого вещества.
- 72 045834
BCY11017 : -:l I
8CY00011017
Методика получения BCY11017
CuSO.
V;Na
BCY«00089iy Pi G1? Щ + ВСУМИШЖИ ШШ—* BCY0O0110V ! BuGlNEd i
Соединение 2 (которое может быть получено, как описано в методике получения BCY10567; 7,0 мг, 2,59 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY10861 (7,03 мг, 2,59 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 13,0 мкл, 2,0 экв.), VcNa (1,0 мг, 5,03 мкмоль, 2,0 экв.) и ТНРТА (1,1 мг, 2,53 мкмоль, 1,0 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 35°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5421,30, наблюдаемое m/z: 1084,7 ([М/5+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11017 (6,6 мг, 1,17 мкмоль, выход 45,24%, чистота 96,16%) в виде белого твердого вещества.
BCY11018
Методика получения BCY11018
VcNe ΗΤΥϋ0ϋϋ№0 PLG17 + BCYOOOIMM — ВСУМОГНИВ ! BuCMPU
Й
Соединение 2 (которое может быть получено, как описано в методике получения BCY10570; 6,0 мг, 2,17 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY10861 (5,9 мг, 2,17 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O
- 73 045834 (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 11,0 мкл, 2,0 экв.), VcNa (1,0 мг, 2,3 экв.) и ТНРТА (1,1 мг, 1,0 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 35°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым значением m/z (расчетный MW: 5479,34, наблюдаемое m/z: 1096,40 ([М/5+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11018 (2,3 мг, 0,40 мкмоль, выход 18,31%, чистота 94,73%) в виде белого твердого вещества.
BCY11019
Методика получения BCY11019
CuSO4 VcNa
BCYOMOBW PI G1? N, + BCYIJOOWMI ---ВСУОООПСИЭ I nuGH'IPO
St
Соединение 2 (которое может быть получено, как описано в методике получения BCY10581; 8,0 мг, 2,94 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY10861 (8,0 мг, 2,95 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 14,7 мкл, 2,0 экв.), VcNa (1,2 мг, 6,05 мкмоль, 2,0 экв.) и ТНРТА (1,3 мг, 2,99 мкмоль, 1,0 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 35°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5437,26, наблюдаемое m/z: 1088,09 ([М/5+Н]+) и 1360,19 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11019 (7,6 мг, 1,36 мкмоль, выход 46,09%, чистота 96,95%) в виде белого твердого вещества.
- 74 045834
BCY11376
Βαγοοαιΐ376
Методика получения соединения 2
HCY(W0mi9 - Ν,ΟΓ,ίΌΟΗ 1·1 DLL USu ВСУ00008919-СНГ^ 2.DIEA, DMF
2
К раствору соединения 1 (5,0 г, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (1 мл) добавляли EDCI (8,5 мг, 54,8 мкмоль, 1,1 экв.) и HOSu (5,7 мг, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 30 мин. ТСХ показала, что соединение 1 было полностью израсходовано, и образовалось одно новое пятно. Затем к 0,2 мл этой смеси добавляли BCY8919 (20,0 мг, 9,62 мкмоль) и DIEA (1,7 мкл, 9,62 мкмоль). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8919 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2162,51, наблюдаемое m/z: 1081,8 ([М/2+Н]+)). Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и получали остаток с последующей очисткой с помощью препаративной
ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (12 мг, 5,55 мкмоль, выход 56,28%, чистота 97,54%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY11376
ΒΟΥϋϋΟϋΒΰΙΰ СН2 + BCYOUUWBGI ж
Си SO4
VcMa
I HIM Λ
BCY00011376
Смесь соединения 2 (3 мг, 1,39 мкмоль, 1,0 экв.), BCY10861 (3,8 мг, 1,40 мкмоль, 1,0 экв.) и ТНРТА (1,2 мг, 2,76 мкмоль, 2,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 1 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 3,5 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 3,5 мкл, 1,0 экв.) под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с tBuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что BCY10861 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4878,64, наблюдаемое m/z: 1220,8 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11376 (1,9 мг, 1,0 мкмоль, выход 27,01%, чистота 96,2%) в виде белого твердого вещества.
- 75 045834
BCY11377
BCY00011377
Методика получения соединения 2
ΗοΥΰϋϋϋΒΰΖϋ + м3 cn2 ссюп ,—М 44:/1./29—BCYOrjcnggiO-CH^-N·.
.0« Л, ПМГ '
2
К раствору соединения 1 (5,0 г, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (1 мл) добавляли EDCI (8,5 мг, 54,8 мкмоль, 1,1 экв.) и HOSu (5,7 мг, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 30 мин. ТСХ показала, что соединение 1 было полностью израсходовано и образовалось одно новое пятно. Затем к 0,2 мл этой смеси добавляли BCY8920 (20,0 мг, 9,36 мкмоль) и DIEA (1,2 мг, 9,36 мкмоль). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8920 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2220,54, наблюдаемое m/z: 1110,90 ([М/2+Н]+)). Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и получали остаток с последующей очисткой с помощью препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (12 мг, 5,15 мкмоль, выход 56,28%, чистота 95,3%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY11377
CuSO4
VcNa
ΤΗΡΤΑ
BCY00008920-С Η-,-Νη + BCY00010S61 ----------------------► BCY00011377 2 5 t-BuOH-'H2O
Смесь соединения 2 (3 мг, 1,35 мкмоль, 1,0 экв.), BCY10861 (3,8 мг, 1,35 мкмоль, 1,0 экв.) и ТНРТА (0,6 мг, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 1 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 3,4 мкл, 1 экв.) и VcNa (0,4 М, 3,4 мл, 1 экв.) под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1 с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4936,68, наблюдаемое m/z: 1234,9 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11377 (3,5 мг, 0,66 мкмоль, выход 48,86%, чистота 93,1%) в виде белого твердого вещества.
- 76 045834
BCY11378
BCY00011378
Методика получения соединения 2
ΗΚΥΟϋϋΟΟνζ * М2СЦ?ССЮН BCY00009172-CH^-Ni
2,DHA. DMF ' ί
К раствору соединения 1 (5,0 г, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.) в DMF (1 мл) добавляли EDCI (8,5 мг, 54,8 мкмоль, 1,1 экв.) и HOSu (5,7 мг, 49,5 мкмоль, 1,0 экв.). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 30 мин. ТСХ показала, что соединение 1 было полностью израсходовано и образовалось одно новое пятно. Затем 0,2 мл этой смеси добавляли к BCY9172 (20,0 мг, 9,54 мкмоль) и DIEA (1,7 мкл, 9,62 мкмоль). Смесь перемешивали при 25-30°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 1 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2176,49, наблюдаемое m/z: 1090,0 ([М/2+Н]+)). Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и получали остаток с последующей очисткой с помощью препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение 2 (20,2 мг, 7,48 мкмоль, выход 78,34%, чистота 80,57%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY11378
CuSO4
VcNa * BCY00010861 , Д.ДЛ „ ► ВСУ000Ш7Я а
Смесь соединения 2 (5 мг, 2,30 мкмоль, 1,0 экв.), BCY10861 (6,24 мг, 2,30 мкмоль, 1,0 экв.) и ТНРТА (1,0 мг, 1,0 экв.) растворяли в t-BuOH/H2O (1:1, 1 мл, предварительно дегазированном и продутом N2 3 раза), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 5,8 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (0,4 М, 5,8 мл, 1,0 экв.) под N2. рН этого раствора доводили до 8, добавляя по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в соотношении 1:1с t-BuOH/H2O), и раствор становился светло-желтым. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 2 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 3 было полностью израсходовано, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 4894,61, наблюдаемое m/z: 1224,3 ([М/4+Н]+). Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая остаток. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11378 (1,2 мг, 0,34 мкмоль, выход 10,07%, чистота 94,3%) в виде белого твердого вещества.
- 77 045834
BCY11379 /: t
Ik VJUJ 11J Gj
Методика получения BCY8919-PEG5-N3 у-чнио·,
IBCY00008919 + NHS-PEG5-N3 -----------------* BCY00008919-PEG5-N3
1
BCY8919 (30,0 мг, 14,43 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (6,3 мг, 14,57 мкмоль, 1,01 экв.) растворяли в смеси MeCN (1 мл) и H2O (1 мл). К раствору добавляли 1 М NaHCO3 для доведения рН до 8, а затем смесь перемешивали при 35°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8919 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2396,79, наблюдаемое m/z: 1198,74 ([М/2+Н]+) и 799,50 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали соединение 2 (20 мг, 8,07 мкмоль, выход 55,92%, чистота 96,68%) в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY11379
Vc\a
ΙΠ·Υ0{)ϋϋ«919 PtG5 N. + HCYiHHHMGI ---HCYOiHMIV!) t ВЮЛ-,0 2
Соединение 2 (3,0 мг, 1,25 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY10861 (3,4 мг, 1,25 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 7 мкл, 2,24 экв.), VcNa (1 мг, 5,04 мкмоль, 4,03 экв.) и ТНРТА (1 мг, 2,30 мкмоль, 1,84 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что соединение 2 было полностью израсходовано, и один основной пик с желаемым m/z, (расчетный MW: 5112,93, наблюдаемое m/z: 1022,96 ([М/5+Н]+) и 1278,74 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11379 (3,4 мг, 0,615 мкмоль, выход 52,00%, чистота 97,88%) в виде белого твердого вещества.
- 78 045834
BCY11380
Наишнфо* вей; «9М.Т5
Методика получения BCY8920-PEG5-N3
Na v Г.,
BCY00008920 + NHS-PEG5-N3 -----------------* BCY00008920-PEG5-N3
VeCN.'l W
1
BCY8920 (30,0 мг, 14,04 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (6,1 мг, 14,11 мкмоль, 1,01 экв.) растворяли в смеси MeCN (1 мл) и H2O (1 мл). К раствору добавляли 1 М NaHCO3, чтобы довести рН до 8, а затем смесь перемешивали при 35°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY8920 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2454,83, наблюдаемое m/z: 1227,63 ([М/2+Н]+) и 818,66 ([[М/3+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), и соединение 2 (20 мг, 8,03 мкмоль, выход 57,21%, чистота 98,56%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY11380
CuSO<
VcNa
HCYUOIHWWU Н G5 Ν3 - ВСУОТОШМ И1|:,Л - BCYOOO1138O ι Вистьо
Соединение 2 (3,5 мг, 1,43 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY10861 (3,9 мг, 1,44 мкмоль, 1,0 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 8 мкл, 2,24 экв.), VcNa (1 мг, 5,04 мкмоль, 3,52 экв.) и ТНРТА (1 мг, 2,30 мкмоль, 1,61 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал, что большая часть соединения 2 была израсходована, и один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5170,97, наблюдаемое m/z: 1034,28 ([М/5+Н]+) и 1293,10 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11380 (1,6 мг, 0,296 мкмоль, выход 20,77%, чистота 96,77%) в виде белого твердого вещества.
- 79 045834
BCY11381
Методика получения BCY8920-PEG5-N3
Vi'-Ob· ВСУ0000Э172 + NHS-PEG5-N3 ------------------ BCY00009172-PEG5-N·.
dcJM I I I 2
BCY9172 (30,0 мг, 14,32 мкмоль, 1,0 экв.) и соединение 1 (6,2 мг, 14,34 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в смеси MeCN (1 мл) и Н2О (1 мл). К раствору добавляли 1 М NaHCO3, чтобы довести рН до 8, а затем смесь перемешивали при 35°C в течение 2 ч. ЖХ-МС анализ показал, что BCY9172 было израсходовано полностью, и был обнаружен один основной пик с желаемым m/z (расчетный MW: 2412,75, наблюдаемое m/z: 1206,72 ([М/2+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA), и соединение 2 (15 мг, 6,14 мкмоль, выход 42,87%, чистота 98,75%) получали в виде белого твердого вещества.
Методика получения BCY11381
CuSCL
Vc\a
Gh + BCY000108M —- всуоштда t tiuOH;h2C
Соединение 2 (3,0 мг, 1,24 мкмоль, 1,0 экв.) и BCY10861 (3,4 мг, 1,25 мкмоль, 1,01 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H2O (1:1), а затем добавляли CuSO4 (0,4 М, 7 мкл, 2,25 экв.), VcNa (1 мг, 5,04 мкмоль, 4,06 экв.) и ТНРТА (1 мг, 2,30 мкмоль, 1,85 экв.). Наконец, добавляли 1 М NH4HCO3, чтобы довести рН до 8. Все растворители в настоящей методике дегазировали и продували N2 3 раза. Реакционную смесь перемешивали при 25-30°C в течение 16 ч в атмосфере N2. ЖХ-МС анализ показал один пик с желаемым m/z (расчетный MW: 5128,89, наблюдаемое m/z: 1026,05 ([М/5+Н]+) и 1282,50 ([М/4+Н]+)). Реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA) и получали BCY11381 (1,6 мг, 0,295 мкмоль, выход 23,73%, чистота 94,59%) в виде белого твердого вещества.
Пример 5. Продукция моноклонального антитела-агониста CD137
Последовательность моноклонального антитела-агониста CD137, которую использовали для сравнения с мультимерами CD137 в представленных в настоящем документе экспериментах, раскрыта в патенте США № 7288638. Антитело с изотипом IgG4 экспрессировали с использованием системы экспрессии ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific) после транзиентной трансфекции конструкцией для экспрессии ДНК. Антитело очищали аффинной хроматографией на белке А и получали в фосфатно-буферном растворе (PBS), рН 7,2. Анализ чистоты с использованием гель-фильтрационной ВЭЖХ (колонка GF-250, Agilent) показал, что количество мономеров моноклонального антитела CD137 составляет примерно 95%. Анализ активности связывания показал, что анти-CD137 моноклональное антитело с концентрацией выше 1 мкг/мл может связываться с клетками СНО, экспрессирующими CD137. Анализ на эндотоксины с использованием набора для анализа на эндотоксины, ToxinSensor™ Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (Genscript), показал, что препарат анти-CD137 моноклонального антитела содержал <7 эндотокисновых единиц/мг эндотоксина.
Биологические данные
1. Описание эксперимента по связыванию с CD137 на Biacore
Эксперименты на установке Biacore проводили для определения значений ka (M-1c-1), kd (с-1), KD (нМ) для гетеротандемных пептидов, связывающихся с белком CD137 человека. Рекомбинантный CD137 человека (R&D systems) ресуспендировали в PBS и биотинилировали с использованием реагента EZLink™ Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Thermo Fisher) в соответствии с протоколом, предложенным производи- 80 045834 телем. Белок обессоливали для удаления несвязанного биотина с помощью спин-колонок в PBS.
Для анализа связывания пептидов использовали прибор Biacore Т200 или Biacore 3000 с чипом XanTec CMD500D. Стрептавидин иммобилизовали на чипе с использованием стандартных реакций присоединения по аминам при 25°С с HBS-N (10 мМ HEPES, 0,15 М NaCl, pH 7,4) в качестве рабочего буфера. Кратко, карбоксиметилдекстрановую поверхность активировали путем 7-минутного впрыскивания 0,4 М гидрохлорида 1-этил-3-(З-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и 0,1 MN-гидроксисукцинимида (NHS) в соотношении 1:1 при расходе 10 мкл/мин. Для захвата стрептавидина белок разводили до 0,2 мг/мл в 10 мМ ацетате натрия (pH 4,5) и захватывали путем впрыскивания 120 мкл на активированную поверхность чипа. Остаточные активированные группы блокировали 7-минутным впрыскиванием 1 М этаноламина (pH 8,5), и биотинилированный CD137 захватывали до уровня 270-1500 RU. Заменяли буфер был на PBS/0,05% Tween 20, и в этом же буфере приготавливали серию разведений пептидов с конечной концентрацией DMSO 0,5%. Максимальная концентрация пептида составляла 500 нМ с 6 дополнительными 2-кратными или 3-кратными разведениями. SPR-анализ проводили при 25°C при скорости потока 90 мкл/мин с 60 с на связывание и 900 секундами на диссоциацию. После каждого цикла проводили стадию регенерации (1 мл 10 мМ глицина, pH 2). При необходимости данные были скорректированы с учетом объемных эффектов с исключением DMSO. Все данные дважды корректировали на холостые впрыскивания и эталонную поверхность с использованием стандартных процедур обработки, а обработку данных и кинетическую подгонку выполняли с использованием программного обеспечения Scrubber, версия 2.0с (программное обеспечение BioLogic). Данные аппроксимировали с использованием простой модели связывания 1:1с учетом эффектов массопереноса при необходимости.
Некоторые гетеротандемные пептиды были протестированы в этом анализе, и результаты показаны в табл. 1 ниже.
Таблица 1. Данные анализа на связывание СР 137 гетеротандемными пептидами на установке Biacore
Идентификационный номер (ID) комплекса SPR (Kd)(hM)
BCY9173 7,98
BCY7985 143
BCY8942 853
BCY8943 156
BCY9647 206
BCY9648 202
BCY9655 199
BCY9656 159
BCY9657 256
BCY9658 152
BCY9659 88,1
BCY9758 189
BCY8854 108
BCY9350 69,4
BCY9351 3640
BCY9399 73
BCY9400 53
BCY9408 105
BCY9409 97,7
BCY9410 65,8
BCY9411 71,1
BCY9759 44,3
BCY10000 6,19
BCY10571 12,03
BCY10572 5,00
BCY10573 3,39
2. Описание эксперимента по связыванию с нектином-4 на Biacore
Эксперименты Biacore проводили для определения значений ka (М^с1), kd (с1), KD (нМ) для гетеротандемных пептидов, связывающихся с белком нектин-4 человека (полученным от Charles River). Нектин-4 человека (остатки Gly32-Ser349; NCBI RefSeq: NP_112178.2) с сигнальной последовательностью gp67 и С-концевой меткой FLAG клонировали в pFastbac-Ι, и получали в бакуловирусах с использованием стандартных протоколов Bac-to-Bac™ (Life Technologies). Клетки Sf21 в количестве 1х106/мл в среде Ехсе11-420 (Sigma) при 27°С инфицировали при MOI, равной 2, используя вирусный концентрат Р1, и супернатант собирали через 72 ч. Супернатант связывали в объеме в течение 1 ч при 4°С на аффинной агарозной смоле Anti-FLAG М2 (Sigma), промытой PBS, а затем смолу переносили в колонку и тщательно промывали PBS. Белок элюировали 100 мкг/мл пептида FLAG. Элюированный белок концентрирова-81 045834 ли до 2 мл и наносили в колонку S-200 Superdex (GE Healthcare) в PBS со скоростью 1 мл/мин. Собирали фракции по 2 мл, и фракции, содержащие нектин-4, концентрировали до 16 мг/мл.
Белок биотинилировали случайным образом в PBS с использованием реагента EZ-Link™ SulfoNHS-LC-LC-Biotin (Thermo Fisher) в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Белок обессоливали для удаления несвязанного биотина с помощью спин-колонок в PBS.
Для анализа связывания пептидов использовали прибор Biacore 3000 с чипом СМ5 chip (GE Healthcare). Стрептавидин иммобилизовали на чипе с использованием стандартных реакций присоединения по аминам при 25°C с HBS-N (10 мМ HEPES, 0,15 М NaCl, pH 7,4) в качестве рабочего буфера. Кратко, карбоксиметилдекстрановую поверхность активировали путем 7-минутного впрыскивания 0,4 М гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и 0,1 М N-гидроксисукцинимида (NHS) в соотношении 1:1 при расходе 10 мкл/мин. Для захвата стрептавидина белок разводили до 0,2 мг/мл в 10 мМ ацетате натрия (рН 4,5) и захватывали путем впрыскивания 120 мкл стрептавидина на активированную поверхность чипа. Остаточные активированные группы блокировали 7-минутным впрыскиванием 1 М этаноламина (рН 8,5), и биотинилированный нектин-4 захватывали до уровня 1200-1800 RU. Заменяли буфер был на PBS/0,05% Tween 20 и в этом же буфере приготавливали серию разведений пептидов с конечной концентрацией DMSO 0,5%. Максимальная концентрация пептида составляла 100 нМ с 6 дополнительными 2-кратными разведениями. SPR-анализ проводили при 25°C при скорости потока 50 мкл/мин с 60 с на связывание и 400-1200 с на диссоциацию в зависимости от отдельного пептида. Все данные дважды корректировали на холостые впрыскивания и эталонную поверхность с использованием стандартных процедур обработки, а обработку данных и кинетическую подгонку выполняли с использованием программного обеспечения Scrubber, версия 2.0с (программное обеспечение BioLogic). Данные аппроксимировали с использованием простой модели связывания 1:1 с учетом эффектов массопереноса при необходимости.
Некоторые гетеротандемные пептиды были протестированы в описанном выше анализе на связывание нектина-4, и результаты показаны в табл. 2 ниже.
Таблица 2. Данные анализа на связывание нектина-4 гетеротандемными пептидами на установке Biacore
Идентификационный номер (ID) комплекса SPR (Kd)(hM)
BCY8854 2,76
BCY9350 > 200 нМ
BCY9351 2,47
BCY9399 1,67
BCY9400 1,8
BCY9408 1,57
BCY9409 1,66
BCY9410 1,49
BCY9411 1,48
BCY9759 2,14
BCY10000 2,26
3. Описание эксперимента по связыванию с EphA2 на Biacore
Эксперименты Biacore проводили для определения значений ka (М'1с'1), kd (с-1), KD (нМ) для гетеротандемных пептидов, связывающихся с белком EphA2 человека.
EphA2 биотинилировали с помощью EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotin в течение 1 ч в 4 мМ ацетате натрия, 100 мМ NaCl, pH 5,4 с 3-кратным молярным избытком биотина над белком. Степень мечения определяли с использованием набора для количественного определения флуоресценции биотина (Thermo) после диализа реакционной смеси в PBS. Для анализа связывания пептидов использовали прибор Biacore Т200 с чипом XanTec CMD500D. Стрептавидин иммобилизовали на чипе с использованием стандартных реакций присоединения по аминам при 25°C с HBS-N (10 мМ HEPES, 0,15 М NaCl, pH 7,4) в качестве рабочего буфера. Кратко, карбоксиметилдекстрановую поверхность активировали путем 7минутного впрыскивания 0,4 М гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и 0,1 М N-гидроксисукцинимида (NHS) в соотношении 1:1 при расходе 10 мкл/мин. Для захвата стрептавидина белок разводили до 0,2 мг/мл в 10 мМ ацетате натрия (рН 4,5) и захватывали путем впрыскивания 120 мкл стрептавидина на активированную поверхность чипа. Остаточные активированные группы блокировали 7-минутной инъекцией 1 М этаноламина (рН 8,5):HBS-N (1:1). Буфер заменяли на PBS/0,05% Tween 20, и биотинилированный EphA2 захватывали до уровня 500-1500 RU с использованием белка, разведенного до 0,2 мМ в буфере. В этом буфере готовили серию разведений пептидов с конечной концентрацией DMSO 0,5% с максимальной концентрацией пептида 50 или 100 нМ и еще 6 2-кратных разведений. SPR-анализ проводили при 25°C при скорости потока 90 мкл/мин с 60 с на связывание и 9001200 с на диссоциацию. Данные были скорректированы с учетом объемных эффектов, исключенных DMSO. Все данные дважды корректировали на холостые впрыскивания и эталонную поверхность с использованием стандартных процедур обработки, а обработку данных и кинетическую подгонку выполняли с использованием программного обеспечения Scrubber, версия 2.0с (программное обеспечение Bio- 82 045834
Logic). Данные аппроксимировали с использованием простой модели связывания 1:1 с учетом эффектов массопереноса при необходимости.
Некоторые гетеротандемные пептиды были протестированы в описанном выше анализе на связывание EphA2, и результаты показаны в табл. 3 ниже.
Таблица 3. Данные анализа на связывание EphA2 гетеротандемными пептидами на установке Biacore
4. Репортерный анализ на CD137 при совместном культивировании с опухолевыми клетками
Культуральную среду, называемую средой R1, готовят путем добавления 1% FBS к RPMI-1640 (компоненту набора Promega CS196005). Серийные разведения исследуемых препаратов в R1 готовят в стерильном 96-луночном планшете. Используют 25 мкл на лунку тестируемых препаратов или R1 (в качестве фонового контроля) для указанных лунок в белом клеточном культуральном планшете. Опухолевые клетки* собирают и ресуспендируют при концентрации 400000 клеток/мл в среде R1. Двадцать пять (25) мкл/лунку опухолевых клеток используют в белом клеточном культуральном планшете.
Клетки Jurkat (набор Promega CS196005, 0,5 мл) размораживают на водяной бане и затем добавляют в 5 мл предварительно нагретой среды R1. Двадцать пять (25) мкл/лунку клеток Jurkat используют в белом клеточном культуральном планшете. Клетки инкубируют с тестируемыми образцами в течение 6 ч при 37°C, 5% CO2. Через 6 ч добавляют по 75 мл/лунку Bio-Glo™ (Promega) и инкубируют 10 мин перед считыванием люминесценции в планшетном ридере (Clariostar, BMG). Рассчитывают кратность изменения относительно клеток (клетки Jurkat+клеточная линия, используемая в совместном культивировании) и строят график в GraphPad Prism зависимости ответа от логарифма концентрации агониста для определения ЕС50 (нМ) и кратности индукции относительно фона (максимальной)
Тип опухолевых клеток, используемых в совместном культивировании, зависит от опухолевой мишени, специфичной для гетеротандема, как показано в табл. 4 ниже.
Таблица 4. Клеточные линии, используемые для каждой опухолевой мишени
Опухолевая мишень Клеточные линии, используемые для совместного культивирования
EphA2 Нектин-4 PD-L1 А549, SC-OV-3, РСЗ, LNCaP НТ 1376, NCI-H292 RKO
Данные представлены на фиг. 3, которая показывает, что гетеротандем EphA2-CD137, BCY7985, показал сильную индукцию CD137-аkтивности клеток в люциферазном репортерном анализе на CD137 от Promega в присутствии экспрессирующих EphA2 клеток НТ1080. Индукция CD137 гетеротандемом отсутствует без клеток НТ1080.
Данные представлены на фиг. 4, которая показывает, что гетеротандемы EphA2/CD137 индуцируют сильную активацию CD137 в репортерном анализе на CD137, и кратность индукции активации зависит от уровня экспрессии опухолевой мишени в клеточной линии (А549 и SC-OV-3: высокий уровень экспрессии EphA2 (высок. EphA2) и LNCaP: низкий уровень экспрессии EphA2 (низк. EphA2)), используемой в совместном культивировании.
Данные представлены на фиг. 6, которая показывает, что гетеротандемы нектин-4/CD137 индуцируют сильную активацию CD137 репортерном анализе на CD137, и кратность индукции активации зависит от уровня экспрессии опухолевой мишени в клеточной линии (НТ1376: высокий уровень экспрессии нектина-4 (высок, нектин-4), и NCI-H292: средний уровень экспрессии нектина-4 (средн. нектин-4), используемой в совместном культивировании.
Данные представлены на фиг. 9, которая показывает, что гетеротандемы PD-L1/CD137 индуцируют сильную активацию CD137 в репортерном анализе на CD137 в присутствии линии клеток, экспрессирующей PD-L1. Сводные данные по ЕС50 (нМ) и кратности индукции, вызываемой гетеротандемными пептидами, в репортерном анализе на CD137 при совместном культивировании с различными клеточными линиями, представлены в табл. 5 ниже.
- 83 045834
Таблица 5. Кратность индукции, вызываемой гетеротандемными пептидами в _____________репортерном анализе на CD 137______________
ID комплекса Опухолевая мишень Клеточная линия, используемая в совместном культивировании EC50 (hM) Кратность индукции относительно фона
BCY9173 EphA2 SC-OV-3 0,94 21
BCY7985 EphA2 SC-OV-3 4,0 15
BCY8942 EphA2 РСЗ - < 2-кратной индукции при 100 нМ
BCY8943 EphA2 РСЗ - < 2-кратной индукции при 100 нМ
BCY9647 EphA2 SC-OV-3 7,2 24
BCY9648 EphA2 SC-OV-3 9,3 20
BCY9655 EphA2 SC-OV-3 4,1 6
BCY9656 EphA2 SC-OV-3 1,1 3
BCY9657 EphA2 SC-OV-3 9,0 26
BCY9658 EphA2 SC-OV-3 6,2 11
BCY9659 EphA2 SC-OV-3 9,9 7
BCY9758 EphA2 SC-OV-3 1,2 7
BCY10568 EphA2 PC3 0,25 32
BCY10570 EphA2 PC3 0,41 38
BCY10574 EphA2 PC3 1,0 32
BCY10575 EphA2 PC3 0,62 38
BCY10576 EphA2 PC3 0,51 38
BCY10577 EphA2 PC3 0,28 37
BCY8854 Нектин-4 H1376 1,2 30
BCY9350 Нектин-4 H1376 - < 2-кратной индукции при 100 нМ
BCY9351 Нектин-4 H1376 - < 2-кратной индукции при 100 нМ
BCY9399 Нектин-4 H1376 11 13
BCY9400 Нектин-4 H1376 2,9 13
- 84 045834
5. Совместное культивирование первичных Т-клеток человека и А549 (уничтожение опухолевых клеток)
РВМС выделяли из образцов крови от трех здоровых доноров и добавляли к меченным Nuclight Red опухолевым клеткам-мишеням (клеткам карциномы легкого человека, А549®, АТСС CLL-185™) в двух определенных соотношениях при двух концентрациях анти-CDS стимуляции. Совместные культуры опухолевых клеток и РВМС инкубировали с перспективными бициклами при трех концентрациях. Все экспериментальные условия также проверяли на опухолевых клетках в отсутствие стимулированных РВМС для выявления прямой цитотоксичности в отношении опухолевых клеток. Уничтожение опухолей оценивали путем подсчета жизнеспособных Nuclight red-положительных опухолевых клеток через определенное время. Кроме того, использовали окрашивание на каспазы-3/7 для идентификации апоптотических опухолевых клеток. Культуры анализировали с использованием прибора IncuCyte S3, который позволяет получать флуоресцентные изображения живых клеток в реальном времени. Совместные культуры визуализировали в течение 72 ч. Каждое экспериментальное условие выполняли в трипликатах.
Данные представлены на фиг. 5, которая демонстрирует, что гетеротандемы EphA2/CD137 индуцируют гибель опухолевых клеток в анализе совместного культивирования первичных Т-клеток человека и раковых клеток. Анти-CD137 агонистическое mAb использовали в качестве контроля.
6. Анализ совместного культивирования РВМС человека и 4Т1 (высвобождение цитокинов)
Линию опухолевых клеток молочной железы мыши 4Т1-1 (4Т1-родительская) и 4Т1 со сверхэкспрессией мышиного нектина-4 (4T1-D02) культивировали в RPMI1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина, 20 мМ HEPES, 1X незаменимых аминокислот и 2 мМ L-глутамина (рабочая среда RPMI). Замороженные РВМС от здоровых доноров (человека) размораживали и промывали один раз в PBS при комнатной температуре, а затем ресуспендировали в рабочей среде RPMI. Для совместного культивирования опухолевых клеток и РВМС, 10000 РВМС и 2000 опухолевых клеток (5:1) смешивали и высевали в каждую лунку 384-луночного планшета. Для стимуляции РВМС человека в культуру добавляли 125 нг/мл растворимого mAb против CD3 (клон ОКТЗ) в нулевой день. Тестируемые соединения, контрольные соединения
- 85 045834 или контрольные носители добавляли в соответствующие лунки и доводили конечный объем на лунку до 100 мкл. Планшеты инкубировали в инкубаторе для культивирования клеток при 37°C с 5% CO2 в течение до трех дней. Супернатанты собирали через 48 ч после стимуляции, и IL-2 и IFNy человека определяли с помощью HTRF-анализа. Исходные данные анализировали с использованием программного обеспечения Excel или Prism для построения стандартных кривых для интерполяции концентраций белка. Данные представляют одно исследование с тремя различными донорскими РВМС, протестированными в дубликатах.
Данные, представленные на фиг. 7, демонстрируют, что нектин-4/CD137 гетеротандемы индуцируют устойчивую секрецию цитокинов IL-2 и IFN-γ в анализе совместного культивирования РВМС и 4Т1. BCY9350 и BCY9351 являются несвязывающими контролями для нектина-4 и CD137 соответственно.
Сводные данные по ЕС50 (нМ) и максимальной секреции цитокинов IFN-γ (пг/мл), индуцированной выбранными нектин-4/CD137 гетеротандемными пептидами в анализе совместного культивирования РВМС и 4Т1 человека (высвобождение цитокинов), представлены в табл. 6 ниже.
Таблица 6. ЕС50 и максимальная секреция цитокинов IFN-γ, индуцированная выбранными нектин-4/CD137 гетеротандемными пептидами в анализе совместного культивирования РВМС и 4Т1 человека (высвобождение цитокинов)
ID комплекса Клеточная линия ЕС50 (нМ) Максимальная концентрация IFN-γ (пг/мл)
BCY8854 4Т1 -D02( некти н4+) 0,89 15962
BCY9350 4Т1 -D02( некти н4+) - Нет активности до 1 мкМ
BCY9351 4Т1 -D02( некти н4+) - Нет активности до 1 мкМ
BCY10000 4Т1 -D02( некти н4+) 0,21 19642
BCY10571 4Т1 -D02( некти н4+) 0,44 18349
BCY10572 4Т1 -D02( некти н4+) 0,25 17915
7. Протокол культивирования ex vivo
Первичные опухолевые клетки, полученные от пациентов из Discovery Life Sciences (DLS), осторожно размораживают в 10 мл предварительно нагретой промывочной среды, содержащей свежую бензоназу. Набор 3D сфероидов от Greiner (номер по каталогу 655840) используется для содержания клеток в культуре в течение 2 дней. Кратко, количество опухолевых клеток подсчитывают с помощью трипанового синего с использованием гемоцитометра. Клетки центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин для промывания и осадок ресуспендируют в 100 мкл N3D-наношатла на 1 х 106 клеток. Чтобы сделать их магнитными, клетки вращают со скоростью 1500 об/мин в течение 5 мин и ресуспендируют; этот процесс повторяют в целом 4 раза. После последнего вращения клетки ресуспендируют в соответствующем количестве свежей среды Lung DTC (DLS), чтобы получить 50000-100000 клеток на лунку в 10 мкл/лунку. Для этого эксперимента использовали 96-луночные клеточные планшеты с репеллентом от Greiner (кат. № 655976). Если видны скопления клеток или мусор, то образец наносят на фильтр 70-100 мкм перед посевом. По меньшей мере 50000 клеток на образец резервируются для панели проточной цитометрии в нулевой день, эти клетки окрашивают, фиксируют и хранят при 4°C для последующего проточного анализа. Разведения контрольного/тестируемого соединения готовят в отдельном планшете в 2кратной среде Lung DTC, и 100 мкл/лунку этих двукратных растворов соединений добавляют в лунки согласно схеме, расписанной для планшета. Затем аналитический планшет помещают на 96-луночный магнитный сфероидальный привод в увлажненной камере при 37°C, 5% CO2. Через 24 ч магнитный сфероидальный привод удаляют. Через 48 ч среду собирают для анализа цитокинов, и клетки собирают для панели проточной цитометрии на 2-й день. Содержание цитокинов количественно оценивают с использованием специально созданной панели цитокинов/хемокинов (IP-10, гранзим В, IFNy, IL-2, IL-6, TNFa, IL-8, МIР-1а, MIP-1b, MCP-1, IL-10, MIG) от R&D systems на ридере Luminex. Панели для проточной цитометрии: день 0=живые/мертвые, CD45, ЕрСАМ, нектин-4, CD3, CD4, CD8, CD 137; день 2=живые/мертвые, CD45, ЕрСАМ, нектин-4, CD3, CD8, Ki67 и счетные шарики. Данные проточной цитометрии анализируют с помощью программного обеспечения Flowjo.
Данные, представленные на фиг. 8, демонстрируют, что гетеротандемы нектин-4/CD137 индуцируют зависимое от мишени высвобождение цитокинов в культурах ех-vivo первичных опухолей легких, полученных от пациента. Обработка BCY10572 индуцировала зависимое от нектина-4 изменение нескольких иммунных маркеров (нормализованных на носитель) и % CD8 +ki67+ Т-клеток в образцах, полученных от пациентов.
8. Фармакокинетика CD137-биспецифических бициклов у крыс SD
Самцам крыс SD вводили по 2 мг/кг каждого бицикличесего мультимера в буфере, содержащем 25 мМ гистидин-HCl, 10% сахарозы, рН 7. Серийное забор образцов крови (около 80 мкл крови/на временную точку) проводили через субмадибулярную или подкожную вену в каждый заданный момент времени. Все образцы крови немедленно переносили в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки, содержащие 2 мл K2-EDTA (0,5 М) в качестве антикоагулянта, и помещали в воду со льдом.
-

Claims (11)

  1. Образцы крови немедленно процессировали для получения плазмы, центрифугируя при приблизительно 4°C, 3000 g. Осадок, включающий внутренний стандарт, немедленно добавляли в плазму, хорошо перемешивали и центрифугировали при 12000 об./мин, 4°C в течение 10 мин. Супернатант переносили в предварительно маркированные полипропиленовые микроцентрифужные пробирки, а затем быстро замораживали на сухом льду. Образцы хранили при 70°C или ниже как необходимо для анализа. 7,5 мкл образцов супернатанта использовали напрямую для вспрыскивания в анализе ЖХ-МС/МС с использованием Orbitrap Q Exactive в режиме положительных ионов для определения концентраций бициклического мультимера. Данные о зависимости концентрации в плазме от времени анализировали с помощью некомпартментных подходов с использованием программы Phoenix WinNonlin 6.3. Приведены данные о С0, Cl, Vdss, T1/2, AUC(0-последн.конц), AUC(0-бескон.), MRT(О-последн.конц), MRT(0-бескон.) и графики зависимости концентрации в плазме от времени.
    На фиг. 10 показана зависимость концентрации в плазме от времени для BCY10572 и BCY10000 при внутривенном введении 2 мг/кг крысам SD (n=3). Фармакокинетические параметры эксперимента показаны в табл. 7.
    Таблица 7. Фармакокинетические параметры зависимости концентрации в плазме от времени для BCY10572 и BCY10000
    Соединение Т1/2(ч) Плазматический клиренс (CLp, мл/мин/кг) Объем распределения (Vdss, л/кг)
    BCY10000 0,357 16,1 0,395
    BCY10572 0,926 15,6 0,882
    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс, содержащий:
    (a) первый пептидный лиганд, который связывается с компонентом иммунной клетки, где первый пептидный лиганд представляет собой связывающий CD137 бициклический пептидный лиганд, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из:
    CiIEEGQYCuFADPY[Nle]Cni (SEQ ID NO: 1);
    Ci[tBuAla]PE[D-Ala]PYCnFADPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 3);
    CiIEEGQYCuF[D-Ala]DPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 4);
    Ci[tBuAla]PK[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 5);
    Ci[tBuAla]PE[D-Lys]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 6);
    Ci[tBuAla]P[K(PYA)][D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 7);
    Ci[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]Ciii (SEQ ID NO: 8);
    CiIEE[D-Lys(PYA)]QYCiiFADPY(Nle)Ciii (SEQ ID NO: 9) и
    [dCi][dI][dE][dE][K(PYA)][dQ][dY][dCii][dF][dA][dD][dP][dY][dNle][dCiii] (SEQ ID NO: 10), или их фармацевтически приемлемой соли;
    конъюгированный через линкер со (b) вторым пептидным лигандом, который связывается с компонентом раковой клетки; где каждый из указанных пептидных лигандов включает полипептид, содержащий по крайней мере три остатка цистеина, разделенных по меньшей мере двумя последовательностями петель, и молекулярный каркас, который образует ковалентные связи с цистеиновыми остатками полипептида, так что на молекулярном каркасе образуются по меньшей мере две полипептидные петли, где второй пептидный лиганд представляет собой:
    (i) связывающий EphA2 бициклический пептидный лиганд, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из:
    Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii (SEQ ID NO: 2) и
    CiLWDPTPCiiANLHL[HArg]Ciii (SEQ ID NO: 11); или их фармацевтически приемлемой соли;
    (ii) связывающий PD-L1 бициклический пептидный лиганд, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из
    Ci[HArg]DWCuHWTFSHGHPCUi (SEQ ID NO: 12);
    CiSAGWLTMCnQKLHLCUi (SEQ ID NO: 13) и
    CiSAGWLTMCnQ[K(PYA)]LHLCUi (SEQ ID NO: 14); или их фармацевтически приемлемой соли; или (iii) связывающий нектин-4 бициклический пептидный лиганд, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
    CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 15; далее обозначается как BCY8116);
    CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]D[dW]STP[HyP][dW]Ciii (SEQ ID NO: 16; далее обозначается как BCY11415) и
    CiP[1Nal][dK](Sar10-(B-Ala))CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii (SEQ ID NO: 17);
    - 87 045834
    C1PFGC11M[HArg]DWSTP[HyP]WC111 (SEQ ID NO: 18; далее обозначается как BCY11414); или их фармацевтически приемлемой соли;
    где Ci, Cii и Cjii представляют собой первый, второй и третий остатки цистеина соответственно, 1Nal представляет собой 1-нафтилаланин, dD представляет собой аспарагиновую кислоту в D-конфигурации, HArg представляет собой гомоаргинин, НуР представляет собой гидроксипролин, Nle представляет собой норлейцин, Sar10 представляет собой 10 саркозиновых звеньев, tBuAla представляет собой третбутилаланин, PYA представляет собой 4-пентиновую кислоту и B-Ala представляет собой бета-аланин.
  2. 2. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс по п.1, в котором связывающий CD137 бициклический пептидный лиганд содержит N- и С-концевые модификации и содержит
    Ac-A-(SEQ ID NO: 1)-Dap (далее обозначается как BCY7732);
    Ac-A-(SEQ ID NO: 1)-Dap(PYA) (далее обозначается как BCY7741);
    Ac-(SEQ ID NO: 3)-Dap (далее обозначается как BCY9172);
    Ac-(SEQ ID NO: 3)-Dap(PYA) (далее обозначается как BCY11014);
    Ac-A-(SEQ ID NO: 4)-Dap (далее обозначается как BCY8045);
    Ac-(SEQ ID NO: 5)-A (далее обозначается как BCY8919);
    Ac-(SEQ ID NO: 6)-A (далее обозначается как BCY8920);
    Ac-(SEQ ID NO: 7)-A (далее обозначается как BCY8927);
    Ac-(SEQ ID NO: 8)-A (далее обозначается как BCY8928);
    Ac-A-(SEQ ID NO: 9)-А (далее обозначается как BCY7744) и
    Ac-[dA]-(SEQ ID NO: 10)-[dA]-NH2 (далее обозначается как BCY11506);
    где Ас представляет собой ацетильную группу, Dap представляет собой диаминопропионовую кислоту и PYA представляет собой 4-пентиновую кислоту, или их фармацевтически приемлемую соль.
  3. 3. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс по п.1 или 2, в котором связывающий EphA2 бициклический пептидный лиганд содержит N-концевые модификации и содержит
    A-HArg-D-(SEQ ID NO: 2) (далее обозначается как BCY9594);
    [B-A1a]-[Sar10]-A-[HArg]-D-(SEQ ID NO: 2) (далее обозначается как BCY6099);
    [PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-A-[HArg]-D-(SEQ ID NO: 2) (далее обозначается как BCY6169) и
    [PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-VGP-(SEQ ID NO: 11) (далее обозначается как BCY8941);
    где HArg представляет собой гомоаргинин, PYA представляет собой 4-пентиновую кислоту, Sar10 представляет собой 10 саркозиновых звеньев, B-Ala представляет собой бета-аланин, или их фармацевтически приемлемую соль.
  4. 4. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс по п.3, который представляет собой CD137/EphA2-комплекс, выбранный из
    - 88 045834
    BCY8942
    - 89 045834
    BCY9647:
    - 90 045834
    BCY9655
    - 91 045834
    - 92 045834
    BCY9659
    - 93 045834
    BCY10568
    - 94 045834
    - 95 045834
    - 96 045834
  5. 5. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс по п.1 или 2, в котором связывающий PDL1 бициклический пептидный лиганд содержит N-концевые и/или С-концевые модификации и содержит
    [PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(SEQ ID NO: 12) (далее обозначается как BCY8938);
    [PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-SDK-(SEQ ID NO: 13) (далее обозначается как BCY10043);
    NH2-SDK-(SEQ ID NO: 13)-[Sarw]-[K(PYA)] (далее обозначается как BCY10044);
    NH2-SDK-(SEQ ID NO: 14) (далее обозначается как BCY10045) и
    Ac-SDK-(SEQ ID NO: 14)-PSH (далее обозначается как BCY10861);
    где PYA представляет собой 4-пентиновую кислоту, B-Ala представляет собой бета-аланин, Sar10 представляет собой 10 саркозиновых звеньев, или их фармацевтически приемлемую соль.
  6. 6. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс по п.5, который представляет собой CD137/PD-L1-комплекс, выбранный из
    - 97 045834
    - 98 045834
    BCY11017:
    - 99 045834
    - 100 045834
    BCY11377:
    - 101 045834
    BCY11379:
    - 102 045834
  7. 7. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс по п.1 или 2, в котором связывающий нектин-4 бициклический пептидный лиганд необязательно содержит N-концевые модификации и содержит
    SEQ ID NO: 15 (далее обозначается как BCY8116);
    [PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(SEQ ID NO: 15) (далее обозначается как BCY8846);
    SEQ ID NO: 16 (далее обозначается как BCY11415);
    [PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(SEQ ID NO: 16) (далее обозначается как BCY11942);
    Ac-(SEQ ID NO: 17) (далее обозначается как BCY8831) и
    SEQ ID NO: 18 (далее обозначается как BCY11414);
    - 103 045834 где PYA представляет собой 4-пентиновую кислоту, B-Ala представляет собой бета-аланин, Sar10 представляет собой 10 саркозиновых звеньев, или их фармацевтически приемлемую соль.
  8. 8. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс по п.7, который представляет собой
    CD137/нектин-4-комплекс, выбранный из
    BCY8854:
    - 104 045834
    BCY9400
    - 105 045834
    BCY9403
    - 106 045834
    - 107 045834
    BCY9408:
    - 108 045834
    BCY9411
    - 109 045834
    BCY10000:
    - 110 045834
    - 111 045834
    BCY10572
    - 112 045834
    BCY10578
    - 113 045834
    BCY11020:
    - 114 045834
    BCY11374:
    - 115 045834
    BCY11616:
    - 116 045834
    - 117 045834
  9. 9. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс по любому из пп.1-8, в котором линкер выбирают из -СН2-, -PEG5-, -PEG10-, -PEG12-, -PEG23-, -PEG24-, -PEG15-Sars-, -PEG10-Sarw-, -PEGs-Sar^-, -PEG5-Sar5-, -B-Ala-Sar20-, -B-Ala-Sarw-PEG10-, -B-Ala-Sar5-PEG15- и -B-Aa-SaiyPEGs-.
  10. 10. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс по любому из пп.1-9, в котором молекулярный каркас выбирают из 1,1',1''-(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1-она (ТАТА).
  11. 11. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс по любому из пп.1-10, в котором фармацевтически приемлемую соль выбирают из свободной кислоты или натриевой, калиевой, кальциевой,
    - 118 -
EA202092388 2018-04-04 2019-04-02 Гетеротандемные бициклические пептидные комплексы EA045834B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1805492.4 2018-04-04
GB1820981.7 2018-12-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA045834B1 true EA045834B1 (ru) 2023-12-29

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11453703B2 (en) Heterotandem bicyclic peptide complexes
US11312749B2 (en) Heterotandem bicyclic peptide complex
JP7404241B2 (ja) ＥｐｈＡ２に特異的な二環ペプチドリガンド
US11332500B2 (en) Heterotandem bicyclic peptide complexes
BR112020014576A2 (pt) Ligantes peptídicos bicíclicos multiméricos
CN113811541A (zh) Ox40特异性的双环肽配体
CN113474046A (zh) Il-17特异性的双环肽配体
CN113507960A (zh) Psma特异性的双环肽配体
CN112533937A (zh) 用于结合cd38的肽配体
EA045834B1 (ru) Гетеротандемные бициклические пептидные комплексы
CN113543813B (zh) Cd38特异性的双环肽配体
EA046193B1 (ru) Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс
EA046294B1 (ru) Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс
CN118215505A (zh) 双环肽配体药物偶联物