CN117693519A - 基于单体拟抗体的嵌合抗原受体和包含其的免疫细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于单体拟抗体的嵌合抗原受体。所述基于单体拟抗体的嵌合抗原受体包含含有单体拟抗体的胞外配体结合域。并且，本发明涉及一种用于在细胞表面膜上表达基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的免疫细胞。所述基于单体拟抗体的嵌合抗原受体，具有以下效果：第一，通过将用于在癌细胞表面上表达的受体为靶标来表现出预防或治疗癌症的优异的效果；第二，与动物源性基于scFv的CAR免疫细胞不同地，由于将基于人FN3的单体拟抗体作为细胞外配体结合结构域，故在施用于人体时表现出低的免疫原性；第三，由于尺寸比scFv小，故具有较高的组织穿透力；第四，可使传统用于治疗癌症的抗体治疗的副作用(例如，非特异性结合导致的自身免疫性疾病的发生)；第五，可以利用针对各种癌细胞抗原构建的单体拟抗体库来制造多种基于单体拟抗体的CAR‑免疫细胞，故可用于预防或治疗具有多种抗原的难治性实体癌。

Description

基于单体拟抗体的嵌合抗原受体和包含其的免疫细胞
技术领域
本发明涉及一种基于单体拟抗体的嵌合抗原受体。所述基于单体拟抗体的嵌合抗原受体包含含有单体拟抗体的胞外配体结合域。并且，本发明涉及一种用于在细胞表面膜上表达基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的免疫细胞。
背景技术
在治疗实体癌时，仅通过外科切除很难完全清除癌症干细胞、残留癌细胞或转移性癌细胞，故正在使用外科切除术以及放射疗法(radiation therapy)、化学疗法(chemotherapy)、靶向治疗(target therapy)和免疫治疗(immunotherapy)等并行的复合治疗方法。尤其，对于免疫治疗方法而言，由于利用免疫系统，故几乎没有放射治疗或化学疗法中所见的副作用。
T细胞作为介导适应性免疫反应(adaptive immunity)的免疫细胞，占淋巴细胞总数的75％。T细胞在大部分血液中以非活性状态存在，但当受到抗原刺激时，转变成活性形态，从而可以消除具有特定抗原的细胞。T细胞的作用在于，可以通过可识别抗原的受体(Tcell receptor，TCR)、共同刺激因子(co-stimulatory molecules)和细胞因子(cytokine)等来活化。
然而，T细胞的受体(TCR)结合至与肿瘤相关抗原结合的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子，而癌细胞则抑制这种MHC的表达，或者通过改变在T细胞表面上表达的诸如CTLA-4、PD-1等的免疫检查点(immune checkpoint)的功能来抑制T细胞的功能。由此，开始开发在细胞内表达可直接识别肿瘤相关抗原而不是识别MHC分子的嵌合抗原受体的T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T)，或者在细胞内表达对癌细胞的免疫检查点受体具有特异性的抗体序列的T细胞。
现有已开发的嵌合抗原受体的结构分为可识别抗原的单链可变片段(singlechain variable fragment，scFv)部分、跨膜域(transmembrane domain)和向细胞内转导信号的信号转导域(signaling domain)。作为血液癌治疗方法，诺华(Novatis)、吉利德(Gilead)、新基(Celgene)、爱博泰克(ABclonal)等的制药公司以及临床医生已开发出利用与血液癌细胞的CD19抗原特异性结合的scFv的CAR-T(国际公开号WO201616473、WO2015157252、WO2018023025、WO2017211900、WO2017211900、WO2016028896)。
融合多种基因工程化技术的基于CAR的免疫细胞治疗对于实体癌也是绝对需要的，但对于实体癌而言，由于如不同患者表达不同抗原的异质性(heterogeneity)、低氧环境(hypoxia)等的肿瘤微环境(tumor microenvironment)的复杂的特性、T细胞的迁移和活性的制约等而没有任何进展。
肝配蛋白受体(Ephrin receptor)作为一种大小为108kDa的膜受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase，RTK)，分为三部分，在细胞膜的外侧有配体结合域(ligand-binding domain)、半胱氨酸部位(cystein-rich region)和两个纤连蛋白(fibronectin)III重复结构，中间有跨膜部分，并且在细胞质侧具有细胞激酶活性结构域(Labradoretal.,1997；Pasquale,1997)。肝配蛋白受体是通过与配体肝配蛋白结合，将细胞外部信号通过磷酸化过程转导至细胞内的蛋白质，其参与细胞增殖、细胞迁移、分化和神经细胞的突触转导、组织重塑、骨细胞分化和血管形成(Pasquale EB.Cell.133:38-52,2008；Barquilla A et al.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.55:465-487,2015)。根据肝配蛋白受体的结构和配体-受体间的结合特异性(ligand-receptor specificity)，分为9个种类的A组(EphA1-8和EphA10)和5个种类的B组(EphB1-4和EphB6)(Ieguchi K.内分泌代谢免疫紊乱药物靶点(Endocr Metab Immune Disord Drug Target)s.15:119-128,2015；Eph命名委员会(Eph Nomenclature Committee).Cell.90:403-404,1997；Lindberg RA etal.,Mol Cell Biol.10(12):6316-6324,1990；Davis S et al.,Science.266(5186):816-819,1994)。其中，肝配蛋白受体A2(Ephrin receptor A2，EphA2)在正常细胞中的表达量极少，但在肝癌、前列腺癌、胰腺癌、头颈癌、胃癌、结肠癌、肺癌、宫颈癌和卵巢癌等大部分的癌细胞中则非特异性过度表达，并且促进癌症进展(carcinogenesis)、转移(metastasis)、血管形成(angiogenesis)、癌症的耐性(resistance of tumors)等。对于EphA2而言，其与EphA1具有约65％的蛋白质同源性，并且在小鼠肺部几乎相同的位置处被发现，并且与EphA1和配体Ephrin-A1一起在包括非细胞肺癌在内的许多恶行肿瘤中过度表达，并通过EphA2/A1-Ephrin-A1之间的相互作用，参与致癌和恶性化进程(Naj AC et al.,NatGenet.43:436-441,2011；Finney AC et al.,Circulation.136:566-582,2017)。
[现有技术文献]
[专利文献]
专利文献1KR10-2020-0105840A
专利文献2KR10-2018-0121904A
专利文献3KR10-2018-0127344A
专利文献4KR10-2007-0107721A
专利文献5KR10-1528939B1
专利文献6KR10-1521668B1
专利文献7KR10-1636882B1
专利文献8KR10-2018-0134347A
专利文献9KR10-2157197B1
[非专利文献]
非专利文献1Park SH,Park S,Kim DY,Pyo A,Kimura RH,Sathirachinda A,ChoyHE,Min JJ,Gambhir SS,Hong Y.具有特异结合EphA2的纤维连接蛋白域III支架的单体拟抗体的分离和表征(Isolation and Characterization of a Monobody with aFibronectin Domain III Scaffold That Specifically Binds EphA2).PLoS O n e.
2015Jul 15；10(7):e0132976.doi:10.1371/journal.pone.0132976.eCollection 2015.PMID:26177208
非专利文献2Kim MA,Yoon HS,Park SH,Kim DY,Pyo A,Kim HS,Min JJ,Hong Y.用于人EphA2特异性光学成像的单体拟抗体共轭物工程(Engineering of monobodyconjugates for human EphA2-specific optical imaging).PLoS One.2017Jul 7；12(7):e0180786.doi:10.1371/journal.pone.0180786.eCollection 2017.PMID:28686661
非专利文献3Pyo A,You SH,Sik Kim H,Young Kim J,Min JJ,Kim DY,Hong Y.用于人EphA2表达肿瘤显像的(64)Cu标记单体拟抗体的制备(Production of(64)Cu-labeledmonobody for imaging of human EphA2-expressing tumors).Bioorg Med ChemLett.2020Jul15；30(14):127262.doi:10.1016/j.bmcl.2020.127262.Epub 2020May15.PMID:32527560
发明内容
本发明要解决的技术问题
在将传统抗体的单链可变片段(single chain variable fragment，scFv)用作胞外配体结合域的CAR-免疫细胞(例如：CAR-T细胞)中存在如下问题：
第一，由于是从小鼠的单克隆抗体中获得的动物源性蛋白质，故与癌抗原的强效结合会导致严重的副作用，如细胞因子风暴(cytokine release syndrome，CRS)、移植物抗宿主病和肿瘤溶解综合征，并且免疫系统的过度活跃导致免疫系统快速收缩，从长远来看降低抑癌效果。
第二，与将CD19作为单一抗原的血液癌不同，对于实体癌而言，不同患者具有多种不同的抗原(heterogeneity)，并且为了构建癌抗原的多样化库，必须使用基于动物的抗体信息，故需要很多费用、较长时间和诸多努力。
第三，由于抗体、双重抗体和scFv的尺寸大，故当用于治疗实体癌时，组织内穿透力低，从而难以表现出充分的治疗效果。
第四，当在T细胞或NK细胞中表达双顺反子(bicistronic)scFv，即两个抗原识别位点时，scFv与抗原的亲和力降低而导致治疗效果低，或者产生因非特异性结合导致的副作用。
第五，即使施用基于scFv的CAR-免疫细胞治疗剂，作为CAR靶标的癌细胞表位也会发生突变，从而导致抗原回避发生率高。
为了解决scFv的这些问题，开发了单体拟抗体。单体拟抗体具有如下优点：与scFv相似而可以抗原识别，与scFv相比尺寸小而对组织的穿透力强，但在用于治疗癌细胞方面具有如下问题：
第一，与scFv相比，与抗原的结合力相对低。
第二，由于单体拟抗体本身对癌细胞没有毒性，故为了用作癌症治疗剂，需要进行多种工程化(例如：结合抗癌剂，或者融合T细胞或NK细胞的方式等)。
第三，单体拟抗体本身在血清中的稳定性低，并且例如，为了以造影剂的用途来使用单体拟抗体，必须施用相对多的量(例如：超过约60ug)。
第四，单体拟抗体在体内半衰期短(<24小时)，故必须经常注入。
为了解决上述问题，本发明人完成了一种新型的基于单体拟抗体的CAR-免疫细胞，其可以选择性地识别癌细胞并结合，并且生物体内穿透力优异而效果高，即使大剂量施用也无害，并且可以持续停留在组织内诱导免疫记忆。
本发明的目的在于，提供基于单体拟抗体的嵌合抗原受体和用于在细胞表面膜上表达该嵌合抗原受体的免疫细胞，以解决上述现有技术的问题。
技术方案
本发明涉及一种包含含有单体拟抗体的胞外配体结合域的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体。
所述单体拟抗体可以特异性地与选自由CRL1、肝配蛋白受体、EphA2、β-半乳糖苷酶、RAS、Abl激酶、VEGFR2、MBP、SARS-CoV-2、Bcr-Abl激酶、STAT3、EGFR、VEGFR2、人酪氨酸激酶Lyn的SH3域、MLKL、Fluc同源物(homologues)、丝裂原-活性蛋白质激酶(MAPK)、ERK2、MAPK14、激酶SH2域、SUMO、AurA、WDR5、Fluc家族、GFP、SARS-CoV-2的受体结合域、FYN的SH3域、ABL的SH2域、SUMO1、Bcr-Abl、GPR56ECR、PD-L1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、PCSK9、Gp41、CD4和IL-23组成的组中的蛋白质结合。
所述单体拟抗体可以特异性地与肝配蛋白受体、EphA2、或人EphA2结合。
所述单体拟抗体可以包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
所述基于单体拟抗体的嵌合抗原受体可以进一步包含跨膜域和细胞内信号转导域。
所述跨膜域可以是选自由T-细胞受体α链、T-细胞受体β链、T-细胞受体ζ链、CD8α链、CD8β链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其部分和其组合组成的组中的一种以上。
所述细胞内信号转导域可以包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d组成的组中的一种以上的信号转导域。
所述细胞内信号转导域可以进一步包括选自由OX40域、CD2域、CD27域、CD28域、CDS域、ICAM-1域、LFA-1域和4-1BB域组成的组中的一种以上。
本发明的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体可以进一步包含铰链。
本发明可以涉及包含用于编码基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的核酸序列的多聚核苷酸。
本发明可以包含所述多聚核苷酸的表达载体。
本发明可以涉及用于在细胞表面膜上表达所述基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的工程化免疫细胞。
所述免疫细胞可以是白细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、树枝状细胞或其组合。
本发明可以涉及包含所述免疫细胞的用于治疗癌症的药学组合物。
发明效果
根据本发明的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体、用于在细胞表面膜上表达该嵌合抗原受体的免疫细胞、以及利用其来预防或治疗癌症的组合物可以表现出如下效果：
第一，在仅抑制快速细胞增殖的传统方式的放射线治疗方法或者DNA核苷酸类似物(顺铂系列及5-FU系列)等的化学治疗方法中，通过抑制正常细胞的生长，可以降低所产生的副作用(例如：脱发和消化障碍)。
第二，由于使用基于人FN3的小尺寸的单体拟抗体，故可以最小化在靶向抗体治疗方法和嵌合T-细胞治疗方法中发生的自身免疫疾病副作用以及抗癌剂耐性导致的癌细胞转移等，其中，所述靶向抗体治疗方法为用作基于源自动物的抗体的抗癌治疗方法，所述嵌合T-细胞治疗方法利用从小鼠单克隆抗体的库中获得的scFv。
第三，克服单体拟抗体因缺乏杀癌能力、不稳定、寿命短等原因而仅用于诊断的局限性，可以有效抑制或去除用于表达癌抗原(如EphA2)的实体癌，故可以同时进行癌症的诊断和治疗。
第四，与传统的单独施用T-细胞的实体癌的治疗相比，基于单体拟抗体的CAR-免疫细胞可以表现出优异的抗癌效果，并且例如，可以用作用于治疗或预防将EphA2表达为抗原的胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌等实体癌的免疫抗癌剂。
第五，FN3单体拟抗体具有可针对靶标抗原制备多种类型的单体拟抗体的优点。由此，可制备对于多种抗原具有特异性的基于单体拟抗体的CAR-免疫细胞，故在治疗癌症方面非常有效。
第六，与其他CAR-免疫细胞相比，基于单体拟抗体的CAR-免疫细胞尺寸小(例如，单体拟抗体的尺寸为scFv尺寸的1/3左右)，故与基于scFv的CAR相比，其更容易穿透癌组织，并且要在病毒载体中构建多价CAR(multivalent CAR)时，考虑到病毒包装(viralpacking)，可以将最多识别四个癌抗原的单体拟抗体序列加载于载体中，这成为可克服实体癌的特性即癌抗原的多样性(heterogeneity)的优点。并且，由于对癌抗原具有充分的选择性和特异性，故可以阻断癌症的免疫细胞回避等而有效地预防或治疗癌症。
附图说明
图1示出用于表达基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的载体的结构。
图2a和图2b示出用于表达基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的载体的制备方法。
图3示出基于单体拟抗体的嵌合抗原受体在细胞膜表面上表达的结构。
图4示出在导入有用于表达E1单体拟抗体嵌合抗原受体的载体的免疫细胞中载体的表达程度的FACS分析结果。
图5示出在VEC-1和VEC-2免疫细胞中T细胞活性因子CD25和CD69的活性程度的FACS分析结果。
图6示出在实体癌细胞(胃癌、大肠癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌)中EphA2蛋白质的表达程度的FACS分析结果。
图7示出利用RTCA分析的VEC-1和VEC-2免疫细胞的癌细胞的杀伤能力。
图8示出利用3D共培养法的E1单体拟抗体CAR-T(VEC-1)免疫细胞的癌细胞杀伤能力。
图9示出异种移植小鼠模型中的肿瘤尺寸的变化。
图10示出异种移植小鼠模型中小鼠体重的变化。
图11示出在异种移植小鼠模型中利用卡普兰-迈耶公式图示的小鼠生存曲线图。
图12是比较在异种移植小鼠模型中移植肿瘤后第44天的小鼠肿瘤尺寸的照片。
图13是比较在胰腺癌异种移植小鼠模型中胰腺癌肿瘤的转移和增殖程度的IVIS拍摄结果。
图14示出通过生物发光成像分析的胰腺癌异种移植模型中的胰腺癌肿瘤生长曲线。
具体实施方式
除非本发明中详细定义，否则本发明中所使用的所有技术术语和科技术语可具有与基因治疗方法、生物化学、遗传学和分子生物学领域技术人员通常理解的含义相同的含义。
除非另有说明，实施本发明可以利用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学中的常规技术，这可以属于该领域的技术范围内。
基于单体拟抗体的嵌合抗原受体
本发明涉及一种基于单体拟抗体的嵌合抗原受体(CAR)。
本发明的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体可以包含胞外配体结合域。
本发明中使用的术语“胞外配体结合域”可以意指可使配体结合的寡肽或多肽。优选地，结构域可以与细胞表面分子相互作用。例如，可选择胞外配体结合域来识别配体，该配体在与任意疾病相关的靶细胞上充当细胞表面标记物。
本发明中使用的术语“单体拟抗体(monobody)”可以特异性地与靶细胞的表面上存在的配体或抗原结合。可以根据所需靶标以多种方式选择单体拟抗体。例如，单体拟抗体可以特异性地与选自由CRL1、肝配蛋白受体、EphA2、β-半乳糖苷酶(β-galatosidase)、RAS、Abl激酶、VEGFR2、MBP、SARS-CoV-2、Bcr-Abl激酶、STAT3、EGFR、VEGFR2、人酪氨酸激酶Lyn的SH3域、MLKL、Fluc同源物(homologues)、丝裂原-活性蛋白质激酶(MAPK)、ERK2、MAPK14、激酶SH2域、SUMO、AurA、WDR5、Fluc家族、GFP、SARS-CoV-2的受体结合域、FYN的SH3域、ABL的SH2域、SUMO1、Bcr-Abl、GPR56ECR、PD-L1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、PCSK9、Gp41、CD4和IL-23组成的组中的蛋白质结合，但不限于此。
并且，单体拟抗体可以是公知的。
单体拟抗体可以特异性地与肝配蛋白受体、EphA2或人EphA2结合。
单体拟抗体可以与SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少具有70％，优选至少具有80％，更优选至少具有90％、95％、97％或99％的序列同一性。
基于单体拟抗体的CAR还可以包含选自由铰链、跨膜域和细胞内信号转导域组成的组中的一种以上。
并且，基于单体拟抗体的CAR在细胞的表面膜上表达。由此，基于单体拟抗体的CAR可以包含跨膜域。合适的跨膜域的区别特征在于，在细胞的表面表达，优选地，本发明中在免疫细胞(尤其是淋巴细胞细胞或NK细胞)的表面上表达，并且包括为了针对预定的靶细胞诱导免疫细胞的细胞反应而一起相互作用的能力。跨膜域可以源自天然来源或合成来源。跨膜域可以源自任意的膜-结合或跨膜蛋白质。
跨膜域可以是选自由T-细胞受体α链、T-细胞受体β链、T-细胞受体ζ链、CD8α链、CD8β链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其部分和其组合组成的组中的一种以上。
铰链和跨膜域可以包含人CD8α链或其部分。铰链和跨膜域可以包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选地，可以包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少具有70％，优选至少具有80％，更优选至少具有90％、95％、97％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
基于单体拟抗体的CAR的细胞内信号转导域，在用于活化免疫细胞和免疫反应的靶标结合胞外配体结合域之后，可以成为细胞内信号转导的原因。信号转导域可以成为用于表达基于单体拟抗体的CAR的免疫细胞的正常效应器功能中的至少一种的活化的原因。例如，T细胞的效应器功能可以是包括细胞因子的分泌在内的细胞毒性活性或辅助活性。
本发明中使用的术语“信号转导域”可以意指为了在免疫细胞内转换效应器功能信号并执行特定功能而诱导细胞的蛋白质的一部分。
细胞内信号转导域可以包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d组成的组中的一种以上。
细胞内信号转导域可以包括选自由OX40域、CD2域、CD27域、CD28域、CDS域、ICAM-1域、LFA-1域和4-1BB域组成的组中的一种以上。
细胞内信号转导域可以包括CD28域、4-1BB域和CD3ζ域组成的组中的一种以上，优选地，可以包括CD28域和CD3ζ域、或4-1BB域和CD3ζ域。
CD28域可以包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或者与其至少具有70％，优选至少具有80％，更优选至少具有90％、95％、97％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
4-1BB域可以包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列或者与其至少具有70％，优选至少具有80％，更优选至少具有90％、95％、97％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
CD3ζ域可以包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或者与其至少具有70％，优选至少具有80％，更优选至少具有90％、95％、97％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
多聚核苷酸和载体
本发明可以涉及用于编码基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的核酸序列的多聚核苷酸、或包含这种核酸序列或多聚核苷酸的载体。其中，载体可以意指表达载体。
多聚核苷酸可以包含SEQ ID NO：2的核酸序列。多聚核苷酸可以包含与SEQ IDNO：2的核酸序列至少具有70％，优选至少具有80％，更优选至少具有90％、95％、97％或99％的序列同一性的核酸序列。
多聚核苷酸可以包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中一种以上的核酸序列、或者可以包含与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6的核酸序列至少具有70％，优选至少具有80％，更优选至少具有90％、95％、97％或99％的序列同一性的每个核酸序列中的一种以上。
为了在人细胞中的表达，用于编码基于单体拟抗体的CAR编码核酸序列可以是经密码子优化的。
本发明中使用的“载体”可以意指一种构建物，其可在宿主细胞中转导一个以上的目标基因或序列，优选地，表达一个以上的目标基因或序列。例如，包括病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子性缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、囊封在脂质体中的DNA或RNA表达载体和特定的真核细胞(如生产者细胞)，但不限于此。
病毒载体可以包括：逆转录病毒；腺病毒细小病毒(如腺相关病毒)；冠状病毒；负链RNA病毒，例如，正粘病毒(如流感病毒)、弹状病毒(如狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(如麻疹病毒和仙台病毒)；正链RNA病毒，例如，马诺病毒和α病毒；以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒1型和2型、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(如牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。可以用作载体的其他病毒可以是例如诺瓦克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例可以包括禽类白血病肉瘤(avian leukosis-sarcoma)、哺乳动物C-型、B-型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒和泡沫病毒。
免疫细胞的工程化方法
本发明可以涉及一种用于免疫治疗的免疫细胞的制备方法，其中，包括：在免疫细胞中导入基于单体拟抗体的CAR，并且扩大所述细胞。
本发明可以涉及一种免疫细胞的工程化方法，其中，包括：提供免疫细胞的步骤；以及在所述免疫细胞中导入多聚核苷酸的步骤。
本发明可以涉及一种免疫细胞的工程化方法，其中，包括：提供免疫细胞，并且在所述细胞的表面上表达基于单体拟抗体的CAR。
本发明可以包括：用至少一个用于编码基于单体拟抗体的CAR的多聚核苷酸修饰免疫细胞，并且用所述细胞表达所述多聚核苷酸。本发明的免疫细胞制备或工程化方法可以是体内或体外方法。所述多聚核苷酸可以包含于慢病毒载体中，以在细胞中稳定地表达。
工程化免疫细胞
本发明可以涉及可基于所述免疫细胞的制备方法或工程化方法而获得的分离的细胞或细胞系。其中，分离的细胞可以包含基于单体拟抗体的CAR。
本发明的分离的细胞可以包含含有彼此不同的胞外配体结合域的CAR的群体。尤其，所述分离的细胞可以包含CAR编码外源多聚核苷酸序列。
本发明的免疫细胞可以意指在先天性和/或后天性免疫反应的起始和/或执行中以功能性包括在内的造血起源的细胞。本发明的免疫细胞可以源自干细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人胚胎干细胞、非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、多能干细胞或造血干细胞。
本发明的免疫细胞可以是人CD3+T细胞。在一实施方式中，分离的细胞可以是树突状细胞、杀伤性树突状细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或选自由炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞组成的组的T-细胞。在一实施方式中，所述细胞可以源自由CD4+T-淋巴细胞和CD8+T-淋巴细胞组成的组。
细胞可以通过多种非限制性方法从受检体获得。细胞可以从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸膜渗出液、脾脏组织和肿瘤。
可以使用本领域技术人员可利用且已知的任意的T细胞系。所述细胞可源自健康的捐赠者、诊断患有癌症的患者或诊断患有感染症的患者。所述细胞可以是表现出不同表型特征的细胞的混合群体的一部分。可以使用从根据上述方法工程化的T细胞而获得的细胞系，并且根据本发明的免疫细胞可以对免疫抑制处理具有耐性。
所述免疫细胞可以是白细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、树突状细胞或其组合，但不限于此。
利用基于单体拟抗体的CAR-免疫细胞的治疗
基于单体拟抗体的CAR-免疫细胞、工程化免疫细胞或这些细胞的群体可作为用于预防或治疗癌症的药学组合物来使用。
本发明可以涉及一种包含基于单体拟抗体的CAR-免疫细胞或工程化免疫细胞的用于预防或治疗癌症的药学组合物。
本发明可以涉及一种在有需要的受试者中预防或治疗癌症的方法，其中，包括：向有需要的受试者施用基于单体拟抗体的CAR-免疫细胞的步骤。
本发明可以涉及基于单体拟抗体的CAR-免疫细胞在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
本发明可以涉及用于预防或治疗癌症的基于单体拟抗体的CAR免疫细胞。
本发明中使用的术语“受试者”是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物包括家畜、宠物、灵长类、马、狗、猫、小鼠和大鼠等，但不限于此。
本发明中所述治疗可以是自体免疫疗法的一部分或同种异体免疫治疗疗法中的一部分。自体(autologous)可以意指用于治疗受试者的细胞、细胞系或细胞的群体获自受试者或可与人类白细胞抗原(HLA)相合的捐赠者。同种异体(allogeneic)受试者可以意指用于治疗受试者的细胞、细胞系或细胞的群体获自捐赠者而不是所述受试者。
癌症可以是黑色素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、血管肉瘤、肥大细胞瘤、白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、大肠癌、造血肿瘤或其转移性癌症，但不限于此。并且，癌症可以是非实体瘤或实体癌。
非实体瘤或非实体癌症可以是骨髓瘤、淋巴瘤或白血病，但不限于此。
实体癌可以是选自胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌和肺癌组成的组中的一种以上，但不限于此。
提供以下实施例仅出于例示性目的，并不以任何方式限制本发明的范围。事实上，除了本发明中所示和记载内容之外，本领域技术人员根据上述记载内容将清楚本发明的各种修改，并且所述修改属于所附权利要求的范围内。
已知传统抗癌免疫治疗是一种血液癌治疗方法，其中，在使用基于小鼠的抗体分子，具体是抗体片段(scFv)来识别并结合人癌抗原之后，通过分泌多种细胞因子或攻击周围的免疫细胞来消除癌细胞，但存在如下问题，包括：动物源抗体引起的副作用；scFv的尺寸导致的组织内低的穿透力；以及，就实体癌而言，由于不同患者表达不同抗原的特性(Heterogeneity)而需要同时识别至少两种以上的抗原。
在本发明中，为了弥补scFv的这些缺点，确认了当使用基于人纤连蛋白FN3的单体拟抗体作为嵌合抗原受体的胞外配体结合位点时，具有优异的预防和治疗实体癌的效果。
[实施例1]
用于表达基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的载体的制备
1.用于制备重组慢病毒载体的准备
为了制备用于表达基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的重组质粒载体，准备了以下菌株和载体。
(1)作为复制对象的载体
包含用于表达特异性地与EphA2结合的单体拟抗体(以下E1单体拟抗体)的核酸序列(SEQ ID NO：2)的pETh-E1GSE1载体购自韩国全南大学校产学协力团属洪永镇教授的研究小组，准备了用于表达嵌合抗原受体的载体。具体地，表达载体使用了美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)的pLenti7.3/V5-DESTTM GatewayTM载体，使得在所述pLenti7.3/V5-DEST载体的5’UTR和3’UTR之间包含由CD8α前导序列-MSLN scFv-CD8 H&TM-CD28-CD3ζ或CD8α前导序列-MSLN scFv-CD8 H&TM-4-1BB-CD3ζ构成的用于表达嵌合抗原受体的核酸序列。如此，准备了两个慢病毒载体(pLenti7.3::CD8α前导序列-MSLN scFv-CD8 H&T-CD28-CD3ζ载体和pLenti7.3::CD8α前导序列-MSLN scFv-CD8 H&T-4-1BB-CD3ζ载体)。
在重组质粒载体中构成基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的核酸序列如下表1所示。
[表1]
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所述表1的核酸序列可以在免疫细胞中表达，使得由下表2的氨基酸序列组成的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体在细胞表面膜上表达。
[表2]
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(2)用于复制载体的细胞的准备
用于pETh-E1GSE1载体的宿主细胞：E.coli DH5α(F-endA1glnV44 thi-1recA1relA1 gyrA96 deoR nupG purB20dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169,hsdR17(rK-mK+),λ-)
用于p慢病毒载体的宿主细胞：E.coli Stbl3(F-mcrB mrrhsdS20(rB-,mB-)recA13 supE44 ara-14galK2 lacY1 proA2 rpsL20(StrR)xyl-5λleumtl-1),InvitrogenTM
使用LB(Luria-Bertani)固体培养基(Difco Laboratories公司，USA)在37℃、200rpm条件下培养了所述宿主细胞，并且在所有培养基中添加100μg/ml卡那霉素或氨苄青霉素，由此准备了宿主细胞。然后，将培养的每个宿主细胞的单菌接种到LB液体培养基(Difco Laboratories公司，美国)中来进行预培养，并将其以1％接种到SOB
(肉汤培养基，Super Optimal Broth)培养基中，在18℃下培养24小时之后，用Inoue TB缓冲液洗涤来准备。
(3)用于大量生产载体的转化细胞的制备
将上述准备的各载体与宿主细胞混合后，将混合物在冰中静置10分钟，并在42℃下处理90秒，在冰中处理3分钟，由此制备了导入各载体的转化细胞。将上述制备的转化细胞铺板于含有抗生素的所述LB固体培养基，并在37℃下培养。由此，大量制备了各载体。
2.用于表达E1单体拟抗体-嵌合抗原受体的重组慢病毒载体的制备
在上述准备的两个慢病毒载体(pLenti7.3::CD8α前导序列-MSLN scFv-CD8 H&T-CD28-CD3ζ载体和pLenti7.3::CD8α前导序列-MSLN scFv-CD8 H&T-4-1BB-CD3ζ载体)中制备了不含scFv序列的慢病毒载体。首先，使用两种类型的载体作为模板，使用下表3的CPL-F引物、CPL-R引物和CloneAmp HiFi PCR预混物(宝日公司(Takara))进行了反向PCR。分离纯化由此扩增的载体，从而准备了两种类型的无MSLN scFv(MSLN scFv-free)嵌合抗原受体载体。
使用下表3中的E1-F引物和E1-R引物，对pETH-E1GSE1载体进行了PCR扩增，然后分离纯化，由此制备了E1单体拟抗体序列。
[表3]
对准备的载体和E1单体拟抗体序列，使用重叠克隆DNA克隆试剂盒(Overlapcloner DNA cloning kit，Elpisbio公司)，通过同源重组(homologous recombination)方法，将E1单体拟抗体序列插入至scFv序列存在的位点，从而制备了包含E1单体拟抗体的用于表达嵌合抗原受体的重组慢病毒载体(pLenti7.3-EphA2单体拟抗体嵌合抗原受体载体)。制备的重组慢病毒载体分别命名为EphA2 mCAR-1和EphA2mCAR-2，其结构如图1所示，所述载体制备方法的示意图如图2a和图2b所示。
[实施例2]
用于在细胞膜表面上表达E1单体拟抗体-嵌合抗原受体的免疫细胞的制备(VEC-1和VEC-2)和评价
1.包含重组慢病毒载体的慢病毒的制备
准备了包含实施例1中制备的EphA2 mCAR-1和EphA2 mCAR-2的慢病毒。
2.免疫细胞的准备和通过病毒感染的转导
(1)从PBMC中分离CD3+T细胞
使用LymphoprepTM(STEMCELL)从人类供体血液中分离出末梢血单核细胞(PBMC)。然后，使用CD3微珠(德国美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))，通过正选择(Positive selection)方法，从分离的PBMC分离出CD3+T细胞。
(2)CD3+T细胞的活化
将抗-CD3/抗-CD28磁珠(anti-CD3/CD28 Dynabead，Gibco公司)和分离的人CD3+T细胞按1：1混合。混合24小时后，使用MACSiMAG分离器去除活化的磁珠。然后，使用RPMI-1640来洗涤细胞。
(3)利用慢病毒的转导
通过使用聚凝胺(polybrene，西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))的病毒感染方法，制备了慢病毒感染的T细胞。具体地，向活化的人CD3+T细胞分别用包含EphA2 mCAR-1和EphA2 mCAR-2的感染慢病毒，并在24小时后更换了病毒培养基。感染48小时后，细胞开始增殖。由此制备的工程化免疫细胞分别命名为VEC-1和VEC-2(分别包含EphA2 mCAR-1和EphA2 mCAR-2)。基于单体拟抗体的嵌合抗原受体在细胞膜表面上表达的结构如图3所示。
3.工程化免疫细胞的评价
通过荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting，FACS)确认了在上述制备的VEC-1和VEC-2免疫细胞中导入的EphA2mCAR-1和EphA2 mCAR-2载体是否正常表达，以及这种免疫细胞的活性状态。
实验中使用了AttuneNxT流式细胞分析仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))。使用抗绿色荧光蛋白质(Green Fluorescent Protein，GFP)对每个免疫细胞抗体确认导入的载体是否表达。用于该载体中同时存在GFP表达位点，故在用于大量表达这种载体的免疫细胞中，基于抗GFP抗体的分析结果会高。并且，使用CD25-PE抗体(小鼠抗人(PE Mouse Anti-Human)CD25，BD PharmingenTM)和抗CD69-APC抗体(小鼠抗人(APCMouse Anti-Human)CD69，BD PharmingenTM)确认了T细胞是否活化。
通过FACS，比较分析导入的载体(即E1单体拟抗体-嵌合抗原受体序列)的表达率的结果，与未导入载体的对照组相比，VEC-1免疫细胞表现出约40％的表达率，VEC-2免疫细胞表现出约30％的表达率(见图4)。基于这种结果可确认，免疫细胞中导入的载体良好表达，并且在工程化免疫细胞VEC-1和VEC-2中E1单体拟抗体-嵌合抗原受体正常表达。
并且，在工程化免疫细胞VEC-1和VEC-2中，可以确认细胞生长活性标记物CD25的表达程度类似于对照组，细胞毒性T细胞的活性标记物CD69的表达比对照组更多(见图5)。因此，确认了VEC-1和VEC-2均为活性状态。
[实施例3]
体内癌细胞杀伤能力的评价
为了评价用于表达E1单体拟抗体-嵌合抗原受体的工程化免疫细胞VEC-1和VEC-2的对EphA2特异性癌抗原的抗癌能力，共培养用于表达EphA2的癌细胞(卵巢癌细胞系OVCAR-3、胰腺癌细胞系CAPAN-2和AsPC-1、前列腺癌细胞系PC-3、MSI-H胃癌细胞系SNU638和MSI-H大肠癌细胞系DLD1、Lovo、HCT8、HCT15，见图6)和E1单体拟抗体CAR-T细胞(即VEC-1和VEC-2细胞)，并测定了工程化免疫细胞的癌细胞杀伤能力(见图7、图8)。
(1)卵巢癌细胞系OVCAR-3、胰腺癌细胞系Capan-2和AsPC-1、前列腺癌细胞系PC-3、胃癌细胞系SNU638、大肠癌细胞系DLD1、LoVo、HCT-8、HCT-15购自韩国细胞系银行(Korean Cell Line Bank)来使用。
为了确认EphA2是否在这种细胞系中表达，使用抗EphA2抗体，并通过FACS，分析了EphA2抗原是否表达以及表达程度。其结果，确认了这种癌细胞系均高水平表达EphA2(见图6)，并且通过这一点，可以确认将EphA2作为靶标的E1单体拟抗体CAR-T细胞的癌细胞杀伤能力。
(2)将上述已确认表达EphA2抗原的癌细胞系以每孔1x104个分别接种于96孔板中，置于BSC中30分钟，然后将癌细胞以37℃、5％的CO2条件在细胞培养箱中培养了24小时。然后，每孔处理4x104个E1单体拟抗体CAR-T细胞(即VEC-1和VEC-2细胞)，共培养72至90小时，同时用RTCA对细胞的生存状态和细胞运动活动作如下分析。
(3)基于RTCA(xCELLigence，艾森生物科学公司(ACEA Biosciences,Inc.))的运动学分析
将附着于微量滴定板(microtiter plate，E-Plate)孔(well)的底表面的金微电极(gold microelectrodes)用作生物传感器。当浸入导电性溶液(如缓冲液或标准组织培养培养基)，并且在这种电极(生物传感器两端)上施加电位时，电子离开阴极端子。该电子穿过本体(bulk)溶液，并沉积在阳极端子上，从而完成回路。电极-溶液界面处贴壁细胞的存在会干扰电子流，这是因为信号会根据本体溶液和生物传感器之间的相互作用而变化。因此，通过测定细胞生长期间产生的称为阻抗(impedance)的电阻值，可以以运动学(kinetic)的方式自动测定多种细胞反应(细胞数、增殖速度、细胞尺寸、细胞形状和基质附着质量的变化)。基于细胞检测的电阻值以细胞指数(Cell Index，CI)的指标显示，CI值的变化示出细胞形状的变化。
(4)比较分析转导的E1单体拟抗体CAR-T细胞(VEC-1或VEC-2)和未转导的人T细胞(对照组)对癌细胞的杀伤能力，其结果，通过基于RTCA的分析，确认了VEC-1和VEC-2的杀伤能力比对照组显著增强(20～100％)，(见图7)。从这种结果可知，根据本发明的工程化免疫细胞具有优异的癌细胞杀伤能力。
(5)通过与对照组进行比较来评价了利用3D共培养法的E1单体拟抗体CAR-T(VEC-1)免疫细胞的癌细胞杀伤能力。
在通过将前列腺癌细胞(PC-3)以细胞数1x103接种于96孔板(96well plate)培养3天后形成的球形(sphere)中，将细胞数2x103的VEC-1放入培养基进行共培养后，使用德国赛多利斯公司(Sartorius)的S3活细胞分析系统(/>S3 Live-CellAnalysis System)，比较分析细胞毒性(cytotoxic)-T细胞对照组(Control-T)和VEC-1的癌细胞杀伤能力，其结果，VEC-1先于对照组从共培养58分钟后开始观察到前列腺癌细胞系(PC-3)穿透到球形结构物中破坏球形的结构而杀伤细胞系。共培养14小时58分钟时，观察到VEC-1完全消灭前列腺癌细胞(PC-3)的球形(sphere)结构，而对于细胞毒性(cytotoxic)-T细胞对照组而言，观察到球形结构的形状没有被破坏而保持球形，且在球形形状中心观察到细胞毒性(cytotoxic)-T细胞(见图8)。
[实施例4]
异种移植小鼠模型中免疫细胞的抗肿瘤能力的评价
所有动物实验均经生物伦理委员会(IACUC，全南大学，韩国)的批准进行。4周龄雌性NSG(NOD SCID gamma)小鼠由韩国和顺疫苗中心SPF动物实验室提供。
胰腺癌细胞AsPC-1/luc以细胞数4x106/200ul～细胞数8x106/200ul的浓度悬浮于将PBS(Welgene公司)和高浓度基质胶(matrigel)
(Corning公司)按照1:1混合的溶液中。在实验中，将AsPC-1/luc(细胞数2x106)和PC-3(细胞数3x106)皮下注射于小鼠的右侧胁腹。
当肿瘤的尺寸达到100～150mm3时，静脉注射一次1x107/200ul的准备的PBS、对照组T细胞、VEC-1、VEC-2免疫细胞。每组使用5～10只小鼠，每周测定两次肿瘤的尺寸和小鼠体重。
1.细胞解冻(Cell thawing)和细胞培养(Cell culture)
实验材料：RPMI 1640(Gibco公司)、FBS(Gibco公司)、P/S
(Gibco公司)、200mM的L-谷氨酰胺(Gibco公司)、100∮细胞培养瓶、篮子、肿瘤细胞系(AsPC-1和PC-3)、溶液(Solution)18AO·DAPI
(ChemoMetec公司)、PBS(Welgene公司)、TrypLETM(Gibco公司)。人胰腺癌细胞系AsPC-1和人前列腺癌细胞系PC-3由美国模式培养物集存库(American Type CultureCollection，ATCC)提供来使用。用于表达荧光素酶(luciferase)的人胰腺癌细胞系AsPC-1/luc由JCRB(细胞库(Cell bank)，澳大利亚)提供来使用。
细胞解冻：在液氮罐中，将肿瘤细胞系置于37℃恒温水浴中快速解冻，待薄冰漂浮时，转移至超净工作台上，置于15mL锥形管中。将9mL的细胞培养培养基(RPMI 1640+10％的FBS+1％的P/S+2mM的L-谷氨酰胺)置于15ml的试管中，并在350g下离心3分钟。除去上层液，加入1mL的细胞培养液并完全重悬，然后加入9mL的细胞培养液至10mL并进行重悬。使用细胞计数液(PBS：溶液(Solution)18＝90：5)来计算细胞数，并以细胞密度为0.5x106/10mL和1x106/10mL(分别对于PC-3和AsPC-1)，将细胞铺展于100∮瓶中。然后，每隔3天进行一次传代培养(当细胞密度为70～80％时)。
传代培养：除去瓶中上层液后，加入10mL的PBS，洗涤除去细胞碎片等的不纯物，弃去上层液。为了从瓶中分离细胞，将TrypLETM(2mL或4mL)分别添加到100∮和150∮瓶中。显微镜下观察细胞呈圆形漂浮时，加入10mL或30mL的细胞培养基(RPMI 1640+10％的FBS+1％的P/S+2mM的L-谷氨酰胺)，并将细胞置于50ml锥形管，以500g离心3～5分钟。除去上层液后，加入1mL的细胞培养液重悬，然后加入9mL的细胞培养液。使用细胞计数液(PBS：溶液18＝90：5)测定细胞数后，将癌细胞(如胰腺癌细胞AsPC-1：1x106/10mL)放入培养容器中进行培养。
2.小鼠的准备
实验材料：PICO 5053(Orient Bio)、g-辐射18％的beta-chip牌垫料(g-irradiated 18％beta-chip)(Orient Bio)、灭菌自来水和水瓶、高压蒸汽灭菌器、剪具(Jongdo B&P)、湿巾、Ifran液体(Hana制药)、脱毛剂(veet)、呼吸麻醉机和麻醉室
实验方法：每周更换两次饲料(PICO 5053)和垫料(r-irradiated18％beta-chip)、灭菌自来水和笼子。种植肿瘤前3天去除毛发，并在实验过程中当肿瘤生长到难以看见的程度时去除毛发。设置异氟醚浓度为2-3％，使小鼠呼吸麻醉，并用剪具去除小鼠右侧胁腹处毛发，涂上脱毛剂，静置约1分钟，用湿巾擦掉脱毛剂。
3.人肿瘤异种移植小鼠模型的制备
实验材料：细胞、1mL的注射器(韩国疫苗公司)、251/2G针头(韩国疫苗公司)、高浓度基质胶(Corning公司)、冰盒、EP管、呼吸麻醉机和麻醉室、Ifran溶液(Hana制药公司)。对于基质胶，在异种移植前一天将其在冰箱中保存过夜。由于基质胶在室温下凝胶化，故始终以插入于冰的状态进行实验。
实验方法：将AsPC-1/luc(细胞数2x106)和PC-3(细胞数3x106)以及基质胶按照1：1混合的溶液100ul，皮下注射于用2～3％的异氟醚呼吸麻醉的小鼠的右侧胁腹。
4.嵌合抗原受体T细胞的注入
实验材料：271/2G针头(Jeonglim公司)、1ml的注射器(韩国疫苗公司)、PBS、正常T细胞(对照组)、E1单体拟抗体CAR-T细胞(VEC-1和VEC-2)、小鼠校准器(Jongdo B&P公司)、热辐射器(Jongdo B&P公司)、70％的酒精棉、游标卡尺(Jongdo B&P公司)、体重秤、相机。
实验方法：测定小鼠肿瘤尺寸和体重，调整各组小鼠肿瘤尺寸和体重使其相似。当肿瘤尺寸达到100～150mm3时，将200ul的PBS和细胞(1x107/200ul的对照组正常T细胞和E1单体拟抗体CAR-T细胞)静脉注射到小鼠尾静脉中。
5.观察小鼠(测定肿瘤尺寸和体重)
实验材料：呼吸麻醉机及麻醉室、Ifran溶液(Hana制药)、游标卡尺(Jongdo B&P公司)、体重秤、相机。
实验方法：用2-3％的异氟醚麻醉小鼠，每周测定两次肿瘤尺寸和体重。使用游标卡尺测量长轴(L)、短轴(W)和高度(H)，然后乘以0.52来计算小鼠肿瘤的尺寸，使用电子秤测定小鼠的体重。
6.实验结果
(1)利用前列腺癌细胞系的实验
在将细胞数1x107/100ul的前列腺癌细胞系(PC-3)和1xPBS异种移植于小鼠右侧背部皮下组织的小鼠模型中，肿瘤形成12天后，每组分别静脉注射PBS、对照组T细胞(未用病毒转导的活化的对照组正常T细胞，Cont-T)、VEC-1细胞和VEC-2细胞，然后使用比例尺测量肿瘤尺寸，结果如图9所示。
如图9所示，从注入VEC-1或VEC-2的小鼠肿瘤形成22天以后开始，与注入对照组正常T细胞或仅注入PBS的小鼠相比，肿瘤的尺寸显著减小。
静脉施用E1单体拟抗体CAR-T细胞后，测定小鼠体重，以确定小鼠的身体状况是否恢复以及是否存在注射引起的副作用，结果如图10所示。
如图10所示，施用VEC-1或VEC-2的小鼠比施用对照组正常T细胞的小鼠健康状况恢复更快，随后正常T细胞在30天后开始表现出恢复趋势，对于仅注入PBS的小鼠的健康状况而言，体重与肿瘤尺寸成比例地持续下降，健康状况恶化。
利用卡普兰-迈耶公式评价实验结束时(第50天)前列腺癌异种移植小鼠模型的存活率，结果如图11所示。如图11所示，施用VEC-1和VEC-2的两组小鼠均表现出高存活率，明显优于对照组正常T细胞。
在小鼠右侧背部种植肿瘤44天之后，静脉注射E1单体拟抗体CAR-T细胞(VEC-1或VEC-2)，在第28天测量肿瘤尺寸，结果如图12所示。如图12所示，确认了施用VEC-1或VEC-2的小鼠组中的肿瘤明显小于施用正常T细胞的小鼠组和仅施用PBS的小鼠组中的肿瘤。
(2)利用胰腺癌细胞系的实验
将胰腺癌细胞(AsPC-1，2×106个细胞)移植到小鼠腹腔中，14天后，腹腔内施用PBS、正常T细胞、VEC-1和VEC-2。在施用后的第4周，使用体内成像系统(In Vivo ImagingSystem，IVIS)对胰腺癌细胞的转移程度进行拍摄，结果如图13所示。如图13所示，确认了与仅施用正常T细胞和PBS的小鼠相比，施用VEC-1和VEC-2的小鼠中肿瘤几乎不增殖或转移。
将2x106个胰腺癌细胞移植到小鼠的腹腔内，14天后，腹腔内施用PBS、正常T细胞(Con T)、VEC-1和VEC-2，并通过生物发光成像(Bioluminescence Imaging，BLI)来测量肿瘤尺寸，结果如图14所示。如图14所示，与施用正常T细胞的小鼠和仅施用PBS的小鼠相比，施用VEC-1或VEC-2的小鼠肿瘤几乎没有增殖，这种情况一直持续到胰腺癌细胞移植后的第4周。
根据本发明的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体和用于在细胞膜表面上表达其的免疫细胞(如细胞毒性T细胞)，具有显著抑制前列腺癌细胞和胰腺癌细胞的增殖并显著提高小鼠的存活率的优异的抗癌作用。因此，可以利用包含基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的免疫细胞来预防或治疗包括实体癌在内的多种癌症。
<110> 瓦克斯细胞生物
<120> 基于单体拟抗体的嵌合抗原受体和包含其的免疫细胞
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α信号序列核苷酸
<400> 1
atggccctgc ctgtgacagc tttgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgctgctaga 60
cct 63
<210> 2
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1单体核苷酸
<400> 2
gtttctgatg ttccgaggga cctggaagtt gttgctgcga cccccaccag cctactgatc 60
agctggtatt atccgttttg tgcgttttat tacaggatca cttacggaga aacaggagga 120
aatagccctg tccaggagtt cactgtgcct cgtccgtctg acactgctac catcagcggc 180
cttaaacctg gagttgatta taccatcact gtgtatgctg tcacgtgtct gggctcgtat 240
tctcgcccaa tttccattaa ttaccgaaca 270
<210> 3
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α H&TM核苷酸
<400> 3
accaccacac cagctccacg gcctccaaca ccagcaccta caattgcctc tcagcccctg 60
tctctgaggc cagaagcttg tagacctgct gcaggcggag ccgtgcatac cagaggactg 120
gatttcgcct gcgacatcta catttgggcc cctctggctg gaacatgtgg cgtcctgctg 180
ctgtctctcg tgatcaccct gtactgc 207
<210> 4
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28核苷酸
<400> 4
agaagcaaga gaagccggct gctgcacagc gactacatga acatgacccc tagacggccc 60
ggacctacca gaaagcacta ccagccttac gctcctcctc gggactttgc cgcctataga 120
tcc 123
<210> 5
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB核苷酸
<400> 5
aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60
accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 120
gagctg 126
<210> 6
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ核苷酸
<400> 6
agagtgaagt tctctagatc tgccgacgct cctgcctacc agcagggaca gaatcagctg 60
tacaacgagc tgaatctggg gcgcagagaa gagtacgacg tgctggataa gagaagaggc 120
agagatcccg agatgggcgg caagccccag agaagaaaga atccccaaga gggcctgtat 180
aatgagctgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggaat gaagggcgaa 240
cgcagaagag gaaagggcca cgacggactg tatcagggcc tgagcacagc caccaaggat 300
acctatgatg ccctgcacat gcaggccctg ccacctagg 339
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α信号序列氨基酸
<400> 7
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 8
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E1单体氨基酸
<400> 8
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ile Ser Trp Tyr Tyr Pro Phe Cys Ala Phe Tyr Tyr Arg
20 25 30
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr
35 40 45
Val Pro Arg Pro Ser Asp Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Cys Leu Gly Ser Tyr
65 70 75 80
Ser Arg Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr
85 90
<210> 9
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α H&TM氨基酸
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28氨基酸
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB氨基酸
<400> 11
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ氨基酸
<400> 12
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPL F
<400> 13
accaccacac cagctcc 17
<210> 14
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<212> DNA
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<220>
<223> CPL R
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aggtctagca gcatgcag 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 15
catgctgcta gacctgtttc tgatgttccg agggac 36
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1 R
<400> 16
agctggtgtg gtggttgttc ggtaattaat ggaaattggg c 41

Claims (16)

1.一种基于单体拟抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，
包含含有单体拟抗体的胞外配体结合域。
2.根据权利要求1所述的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述单体拟抗体与选自由CRL1、肝配蛋白受体、EphA2、β-半乳糖苷酶、RAS、Abl激酶、VEGFR2、MBP、SARS-CoV-2、Bcr-Abl激酶、STAT3、EGFR、VEGFR2、人酪氨酸激酶Lyn的SH3域、MLKL、Fluc同源物、丝裂原-活性蛋白质激酶、ERK2、MAPK14、激酶SH2域、SUMO、AurA、WDR5、Fluc家族、GFP、SARS-CoV-2的受体结合域、FYN的SH3域、ABL的SH2域、SUMO1、Bcr-Abl、GPR56ECR、PD-L1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、PCSK9、Gp41、CD4和IL-23组成的组中的蛋白质特异性结合。
3.根据权利要求2所述的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述单体拟抗体与肝配蛋白受体、EphA2或人EphA2特异性结合。
4.根据权利要求3所述的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述单体拟抗体包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，
进一步包含选自由跨膜域和细胞内信号转导域组成的组中的一种以上。
6.根据权利要求5所述的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述跨膜域选自由T-细胞受体α链、T-细胞受体β链、T-细胞受体ζ链、CD8α链、CD8β链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其一部分和其组合组成的组中的一种以上。
7.根据权利要求5所述的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述细胞内信号转导域选自由TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d组成的组中的一种以上。
8.根据权利要求5所述的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述细胞内信号转导域选自由OX40域、CD2域、CD27域、CD28域、CDS域、ICAM-1域、LFA-1域和4-1BB域组成的组中的一种以上。
9.根据权利要求5所述的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，
进一步包含铰链。
10.一种多聚核苷酸，其特征在于，
包含用于编码根据权利要求1至9中任一项所述的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体的核酸序列。
11.一种表达载体，其特征在于，
包含根据权利要求10所述的多聚核苷酸。
12.一种免疫细胞，其特征在于，
用于在细胞表面膜上表达根据权利要求1至9中任一项所述的基于单体拟抗体的嵌合抗原受体。
13.根据权利要求12所述的免疫细胞，其特征在于，
所述免疫细胞是白细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、树枝状细胞或其组合。
14.一种用于预防或治疗癌症的药学组合物，其特征在于，
包含根据权利要求12所述的免疫细胞。
15.根据权利要求14所述的用于预防或治疗癌症的药学组合物，其特征在于，
所述癌症选自由黑色素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、血管肉瘤、肥大细胞瘤、白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、大肠癌、造血肿瘤或其转移性癌症组成的组中的一种以上。
16.根据权利要求15所述的用于预防或治疗癌症的药学组合物，其特征在于，
所述癌症是胰腺癌、前列腺癌或卵巢癌。
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