KR102389014B1

KR102389014B1 - 신규 암 치료 및 진단용 방사성 화합물이 결합된 인간 EphA2 특이적 모노바디 제조법 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102389014B1
Application number: KR1020190089682A
Authority: KR
Inventors: 홍영진; 김동연; 표아영; 민정준
Original assignee: 전남대학교 산학협력단
Priority date: 2019-07-24
Filing date: 2019-07-24
Publication date: 2022-04-20
Also published as: KR20210012263A

Abstract

본 발명은 hEphA2 발현 암세포에 대한 표적능이 향상되어 양전자 단층 촬영(PET)시 hEphA2 발현 암세포의 효율적인 진단이 가능한 신규 암 치료 및 진단용 방사성 화합물이 결합된 인간 EphA2 특이적 모노바디 제조법 및 그의 용도를 제공한다.

Description

신규 암 치료 및 진단용 방사성 화합물이 결합된 인간 EphA2 특이적 모노바디 제조법 및 그의 용도{Synthesis of human EphA2-specific monobody conjugated with a novel radioactive compound for cancer diagnosis and therapy and use thereof}

본 발명은 신규 암 치료용 방사성 화합물 및 그의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 신규 암 치료 및 진단용 방사성 화합물이 결합된 인간 EphA2 특이적 모노바디 제조법 및 그의 용도에 관한 것이다.

양전자 방출 단층 촬영(Positron Emission Tomography, PET)은 양전자 단층 촬영이라고도 부르며 양전자 방출을 이용하는 핵의학 검사 방법 중 하나로 양전자를 방출하는 방사성 동위원소를 결합한 의약품을 체내에 주입한 후 양전자 방출 단층 촬영기를 통해 이를 추적하여 체내 분포를 알아보는 방법이다. 이를 통해 암 검사, 심장 질환, 뇌 질환 및 뇌 기능 평가를 위한 수용체 영상이나 대사 영상도 얻을 수 있다. 양전자를 방출하는 방사성동위원소는 반감기가 짧은 특징이 있어 의료용으로 적당하며, 이 중 F-18은 방사성의 약품을 제조하여 사용하기에 적당한 110분의 반감기를 가지며, 산소-18 농축수([18O]H₂O)로부터 쉽게 대량생산이 가능하고, 비방사능(Specific activity)이 높을 뿐만 아니라, 방출되는 에너지가 낮은 장점들이 있어 PET 방사성의약품에 가장 많이 사용되는 핵종이다. 가장 대표적인 PET용 방사성의약품인 2-[¹⁸F]fluoro-D-glucose([¹⁸F]FDG)는 F-18이 표지된 글루코오스 유도체로 생체 내 글루코오스 대사이상을 영상화할 수 있어 종양진단에 사용되고 있다. 하지만 일반적으로 글루코오스를 많이 섭취하는 심장과 뇌의 경우 [¹⁸F]FDG를 이용한 질병 진단이 어려운 단점이 있으며, 특히 대식세포가 활성화된 각종 염증 조직에도 글루코오스 섭취가 증가하여 영상화된다. [¹⁸F]FDG는 종양 진단을 목적으로 처방되지만 염증 부위도 같이 영상화되기 때문에 PET 영상으로 얻어진 이상 부위가 종양인지 염증인지를 구분하기 어려운 단점이 있고, 이에 따라 질병 진단에 오류를 가져올 수 있다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2014-0113622호는 ¹⁸F-표지 PET 방사성의약품의 전구체 및 그 제조방법에 대해 개시하고 있다.

상기 선행기술의 경우, 현재 임상에서는 종양의 진단에 사용할 수 있는 방사성의약품은 ¹⁸F FDG 밖에 없어 종양이 아닌 부위의 섭취(근육, 염증, 중추신경계)로 인해 사용에 제약이 따르다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, hEphA2 발현 암세포에 대한 표적능이 향상되어 암세포의 효율적인 조영이 가능한 신규 암 치료 및 진단용 방사성 화합물이 결합된 인간 EphA2 특이적 모노바디 제조법 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 일반식 1의 구조를 갖는 신규 방사성 화합물 또는 그의 허용가능한 염이 제공된다:

(일반식 1)

(상기 구조식에서 E1은 인간 ephrin A형 수용체 2(hEphA2)에 특이적으로 결합하는, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 항-hEphA2 모노바디이고, L₁은 적어도 둘 이상의 측쇄 반응기를 갖는 링커이며, L₂는 소수성 부여 모이어티이고, L₃는 알부민 결합 모이어티이며, R₁은 킬레이터이고, R₂는 진단 또는 치료용 방사성 동위원소이며 상기 소수성 부여 모이어티는

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, 및

로 구성된 군으로부터 선택되고 상기 알부민 결합 모이어티는

,

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,

,

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,

,

및

로 구성되는 군으로부터 선택되며 상기 킬레이터는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DOTA-NCS, DOTA-NHS ester, DOTA-Bz-NCS, tris(t-bu)DOTA, HBED-CC-TFP ester, DTPA(Diethylene triamine penta aeetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid), NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA(1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N"'-tetraacetic acid), TE3A(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid), TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid), PCTA(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid), 사이클렌(Cyclen), 사이클람(cyclam) 및 DFO(Deferrioxamine)로 구성되는 군으로부터 선택된다.)

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 방사성 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, hEphA2에 대한 분자 조영용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 방사성 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, hEphA2가 과발현된 암 진단 또는 조영용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 방사성 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

상기한 바와 같이 본 발명의 신규 암 치료 및 진단용 방사성 화합물이 결합된 인간 EphA2 특이적 모노바디는 hEphA2 발현 암세포에 대한 표적능이 향상되어 양전자 단층 촬영(PET)시 hEphA2 발현 암세포의 효율적인 진단을 위한 조영제 및 암 치료제의 제조에 활용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 방사성 동위원소가 표지된 항-EphA2 모노바디(이하, 'E1'으로 약칭함)을 위한 전구체의 합성 및 표지 방법을 개략적으로 나타내고 있는 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 방사성 동위원소 표지 E1을 이용하여 시간에 따른 hEphA2 과발현 PC3 세포의 섭취능을 분석한 그래프이다(*P < 0.05).
도 3은 hEphA2 과발현 PC3 세포를 주입하여 제조한 마우스 종양 모델에 본 발명의 일 실시예에 따른 방사성 동위원소 표지 E1를 처리한 후 섭취능을 관찰한 PET 이미지이다(흰색 화살표: 종양).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 방사성 동위원소 표지 E1의 처리에 따른 마우스 종양 모델의 장기 섭취값 및 종양/장기 섭취비를 비교 분석한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 방사성 동위원소 표지 E1의 처리에 따른 마우스 종양 모델의 48시간 후 장기별 섭취값을 분석한 그래프이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어, "인간 ephrin A형 receptor 2(이하, 'hEphA2'로 약칭함)"는 단백질-티로신 키나제 군 수용체군 속의 ephrin 수용체군 단백질(Eph)중 A형 아군(EphA)에 속한 막단백질로 세포 표면에 발현된다. Eph들은 배아 신경계 발달, 줄기 세포 분화, 자가 사멸 및 종양 발달 과정과 연관되어 있다. Eph는 구조적으로 ephrin 결합 도메인, 시스테인-풍부 지역 및 2개의 FnⅢ-형 반복체로 구성된 세포외 영역과 세포막 통과 도메인 및 키나제 도메인을 포함한 세포 내 영역으로 구성되어 있다. Eph는 ephrin 리간드 결합에 대한 친화도와 아미노산 유사성에 따라 EphA 및 EphB, 두 그룹으로 나누어진다. EphA2는 ephrin-A 리간드와 결합한다. 특히 EphA2는 위, 폐, 유방 및 전립선 암의 초기 발병의 마커 단백질로 유용하다.

본 문서에서 사용되는 용어, "소수성 부여 모이어티(hydrophobic imparting moiety)"는 PET 또는 SPECT로 암 병변을 영상화하기 위한 방사성 화합물의 체내 안정기을 증가시키고 표적분자에 대한 결합력을 강화시키기 위한 목적으로 도입되는 나프틸기나, 벤질기와 같은 소수성 모핵을 갖는 모이어티를 의미한다.

본 문서에서 사용되는 용어, "알부민 결합 모이어티(albumin binding moiety)"는 방사성 화합물을 이용한 방사선 치료의 순환 시간을 개선하기 위한 모이어티로 목표한 방사선 치료법의 순환 반감기를 연장시키는데 사용된다(Cindy J. Choy et al., Theranostics, Vol. 7, Issue 7. 2017)

발명의 상세한 설명:

본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 일반식 1의 구조를 갖는 신규 방사성 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 제공된다:

(일반식 1)

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, 및

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및

상기 신규 방사성 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에 있어서, 상기 링커는

및/또는

을 포함하는 링커일 수 있다. (상기 링커에서 상기 n은 1 내지 10 또는 1 내지 20의 정수이다). 상기 반응기는 아민기 또는 카르복실기일 수 있다.

상기 신규 방사성 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에 있어서, 상기 소수성 부여 모이어티는

,

,

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,

,

, 및

로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 아울러, 상기 소수성 부여 모이어티에는 링커 골격(L₁)과의 일정 거리를 부여하기 위해서 라이신, 아르기닌, 글루타민, 글루탐산, 아스파라긴 또는 아르파르트산과 같은 염기성 또는 산성 아미노산이 부가될 수 있다. 이러한 염기성 또는 산성 아미노산의 구체예는 하기와 같다:

,

, 및

,

상기 신규 방사성 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에 있어서, 상기 알부민 결합 모이어티는

,

,

,

,

,

,

,

및

로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 신규 방사성 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에 있어서, 상기 킬레이터는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DOTA-NCS, DOTA-NHS ester, DOTA-Bz-NCS, tris(t-bu)DOTA, HBED-CC-TFP ester, DTPA(Diethylene triamine penta aeetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid), NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA(1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N"'-tetraacetic acid), TE3A(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid), TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid), PCTA(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid), 사이클렌(Cyclen), 사이클람(cyclam) 및 DFO(Deferrioxamine)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있고 상기 방사성 동위원소는 ¹⁸F, ⁴⁴Sc, ³²P, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁹⁰Cu, ⁶⁸Ga, ^80mBr, ⁸⁵Sr, ⁸⁹Sr, ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ^99mTc, ¹¹¹In, ^114mIn, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴⁹Tb, ¹⁵²Tb, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁵Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁹Er, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁸Au, ²²³Ra 및 ²²⁵Ac로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 신규 방사성 화합물 또는 그의 허용가능한 염에 있어서, 상기 결합은 에스테르 결합, 아마이드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 티오에스테르 결합, 또는 디설파이드 결합일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 방사성 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, hEphA2에 대한 분자 조영용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 방사성 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, hEphA2가 과발현된 암 진단 또는 조영용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 방사성 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

상기 암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 암은 hEphA2가 과발현된 암일 수 있다.

상기 신규 방사성 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에 있어서 상기 L1, L2, 및 L3가 연결되는 구조는 하기 구체적인 구조로 설명될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다:

,

, 또는

.

상기 구체적인 구조 외에도, L₂ 및 L₃의 위치는 L₁ 내의 다른 골격 탄소로 바뀔 수 있고, L1 내의 단위체의 조합 및 길이는 다양하게 조절될 수 있다.

현재 암, 감염 등 질환에 대한 진단 및 치료제 개발 등의 임상적인 목적으로 지금까지 다양한 타겟과 결합하는 Fn3 단백질들, 즉 모노바디들이 개발되어 시험되고 있다(Lipovsek, D., Protein Eng. Des. Sel. 24(1-2): 3-9, 2011). 이와 관련하여 본 발명자들은 종래 hEphA2 및 인간 세포 표면의 hEphA2와 특이적으로 결합하기 때문에, 종양의 생체 내 진단과 치료를 위한 프로브의 후보물질로서 유용하게 사용될 수 있는 인간 ephrin A형 수용체 2(hEphA2)와 특이적으로 결합하는 인간 피브로넥틴 도메인 Ⅲ(Fn3)를 기본골격으로 하는 펩타이드를 개발하였다(대한민국 등록특허 제1636882호). 상기 특허문헌을 본 문서에 참조로 삽입한다.

상기 "약학적으로 허용가능한 염"은 무기산 또는 유기산을 이용한 염이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 메톡시, 아세톡시, 트리플루오로아세톡시 음이온 등과 같은 지방족을 이용한 염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 방향족 또는 아릴지방족 카르복실산염, 질산염, 황산염, 인산염, 설폰산염, 메실산염, 베실산염, 토실산염 등의 염일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 허용 가능한 염은 F^-, Cl^-, Br^-, 또는 I^-를 이용한 염들도 포함된다. 그러나 이들로 본 발명의 허용 가능한 염이 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 환부의 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.

본 발명의 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있고 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 항암 약물은 파클리탁셀, 5-FU, 도세탁셀, 타목신, 아나스테로졸, 카보플라틴, 토포테칸, 벨로테칸, 이마티닙, 이리노테칸, 플록수리딘, 비노렐빈, 겜시타빈, 루프롤리드(leuprolide), 플루타미드, 졸레드로네이트, 시스플라틴, 독소루비신, 빈크리스틴, 히드록시우레아, 스트렙토조토신 및 발루비신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 상기 항암 단백질은 단백질 독소, 암항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 단백질(tumor suppressor protein) 또는 항혈관생성 인자(antiangiogenic factor)일 수 있다. 이 때, 상기 단백질 독소는 보툴리눔 독소(Botulinum toxin), 테타누스 독소(Tetanus toxin), 시가 독소(Shiga toxin), 디프테리아 독소(Diphtheria toxin, DT), 리신(ricin), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin, PE), 사이토라이신 A(cytolysin A, ClyA), r-Gelonin일 수 있다. 상기 종양억제 단백질은 종양의 발생을 억제하는 단백질로서, 대표적으로 VHL(von HippelLindau), APC(Adenomatous polyposis coli), CD95(cluster of differentiation 95), ST5(Suppression of tumorigenicity 5), YPEL3(Yippee like 3), p53, ST7(Suppression of tumorigenicity 7) 및 ST14(Suppression of tumorigenicity 14)를 들 수 있다. 상기 항 신생혈관생성 인자는 항-VEGF 항체, 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 아포리포프로테인의 크링글 V 도메인 등을 들 수 있다.

현재 hEphA2 발현 암의 진단에 대한 연구 및 개발은 광학장비를 이용한 진단을 제외하고는 방사성동위원소를 사용한 연구는 전무하였다. 또한 종양의 진단에 사용할 수 있는 방사성의약품은 ¹⁸F FDG 밖에 없는 상황이나 종양이 아닌 부위의 섭취(근육, 염증, 중추신경계)등의 문제점이 있었다. 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 예의노력한 결과, hEphA2 발현 암세포의 효율적인 조영이 가능한 인간 EphA2을 표적하는 피브로넥틴 도메인Ⅲ 기본 골격 방사성 화합물을 개발하였다. 상기 방사성 화합물은 hEphA2 발현 암세포에 대한 표적능이 향상되어 PET 조영용 특히 hEphA2 발현 암세포 특이적인 조영제로 사용가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

공시 재료

본 발명에 사용한 2-(p-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacetic acid trihydrochloride([p-SCN-Bn]-NOTA)는 퓨쳐켐에서 구입하였으며 완충용액 제조 시 사용한 NaHCO_3,NH₄OAc은 시그마에서 구입하여 사용하였다. 표지된 E1을 분리할 때 사용하는 G-10컬럼은 GE healthcare에서 구입하였으며 실험에 사용한 PC3 세포는 ATCC에서 마우스는 오리엔트에서 구입하여 사용하였다.

실시예 1: E1 ⁶⁴ Cu 표지 방법

본 발명자들은 ⁶⁴Cu 표지를 위해 정제된 E1(한국 등록특허 제1636882호, 서열번호 1 )과 2-(p-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacetic acid trihydrochloride([p-SCN-Bn]-NOTA)를 5:1 비율로 1.0 M NaHCO₃ 완충액(pH 9.2)에 녹인 후 24시간 동안 반응시킴으로써 NOTA-E1을 제조하였다. 그 후 제조된 NOTA-E1은 G-10 컬럼으로 분리한 다음 표지에 사용하였고 0.1 M NH₄OAc buffer(pH 5.5)에 녹여진 ⁶⁴Cu에 NOTA-E1을 첨가한 후 40℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 최종 표지된 ⁶⁴Cu이 표지된 E1을 "⁶⁴Cu-NOTA-E1"으로 명명하고 G-10 컬럼을 통하여 분리하여 이후 실험에 사용하였다(도 1).

실시예 2: 세포주 및 세포배양

세포배양을 위해 인간 전립선암 세포주(Human prostate cancer cell line)인 PC3 세포는 5% 우태아혈청(fetal bovine serum) 및 1% 항생제를 첨가한 고-포도당 RPMI 배지를 사용하여 배양하였다.

실시예 3: 세포 섭취율 실험

세포 섭취 실험은 실험 24시간 전에 12 웰 플레이트에 PC3 세포(1ㅧ10⁶개)를 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후 상기 실시예 1에서 제조된 ⁶⁴Cu-NOTA-E1(0.74 MBq)을 처리하였고 37℃ 배양기에서 1, 6 및 24 시간 동안 각각 배양하였다. 마지막으로 DPBS로 2회 세척하였고 트립신으로 처리한 후 감마카운터로 각 시간 군의 세포 배양액 및 세포 내에 있는 ⁶⁴Cu-NOTA-E1의 함량을 측정하였다.

그 결과, ⁶⁴Cu-NOTA-E1 처리 후 한 시간이 지났을 때 PC3 세포의 ⁶⁴Cu-NOTA-E1 섭취율이 17%, 24시간이 지났을 때는 77%로 시간이 경과함에 따라 섭취율이 증가하는 것으로 나타났다(도 2).

실시예 4: 종양 이식 마우스 모델 PET 영상

종양 이식 마우스 모델을 제조하기 위해 누드 마우스 우측 어깨부위에 PC3 세포주를 주입하였고 약 3주 후 종양의 크기가 100 ~ 120 mm³ 정도 증식한 마우스를 선정하였다. 그 후 실험에 사용하기 위해 상기 마우스를 마취시킨 후 본 발명의 일실시예에 따른 ⁶⁴Cu-NOTA-E1(7.4 MBq)를 꼬리정맥을 통해 주입하였다. 상기 표지화합물 주입 1, 6, 24 시간 경과시점에 정적 microPET 영상을 획득하여 종양, 혈액 및 다른 장기에서의 섭취능을 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 표지 화합물인 ⁶⁴Cu-NOTA-E1 주입 후 시간 경과에 따라 다른 장기에서의 섭취율이 감소하였지만 종양에서 섭취능이 증가하는 것으로 나타났다(도 3). 따라서 종양과 다른 장기와의 비율은 시간 경과에 따라 점차 높아짐을 확인하였다(도 4).

실시예 5: 체내 분포 실험

본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 종양 이식 마우스 모델의 체내 분포 실험을 위해 누드 마우스 우측 어깨부위에 PC3 세포주를 주입하였고 약 3주 후 종양의 크기가 100 ~ 120 mm³ 정도 증식한 마우스를 선정한 다음 ⁶⁴Cu-NOTA-E1(7.4 MBq)를 마우스 꼬리정맥에 주입하였다. 그 후 48시간 경과시점에서 상기 마우스를 희생시켜 종양, 혈액 및 장기들을 적출하였고 감마카운터로 상기 적출한 장기의 섭취율 측정하였다.

그 결과 48시간이 지났음에도 불구하고 종양에서 ⁶⁴Cu-NOTA-E1이 약 4 %ID/g의 섭취값을 나타내었다(도 5).

결론적으로, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 표지 화합물인 ⁶⁴Cu-NOTA-E1은 hEphA2 발현 암세포에 대한 표적능이 향상되어 양전자 단층 촬영 시 hEphA2 발현 암세포의 효율적인 진단을 위한 조영제로 활용될 수 있다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1의 구조를 갖고 방사성 동위원소가 킬레이션된 신규 방사성 화합물 또는 그의 허용가능한 염:

(화학식 1)
(상기 화학식 1에서 E1은 인간 ephrin A형 수용체 2(hEphA2)에 특이적으로 결합하는, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 항-hEphA2 모노바디이고, 상기 방사성 동위원소는 ⁴⁴Sc, ⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,⁹⁰Cu,⁶⁸Ga,^80mBr,⁸⁵Sr,⁸⁹Sr,⁸⁶Y,⁹⁰Y,^99mTc,¹¹¹In,^114mIn,¹⁴⁹Tb,¹⁵²Tb,¹⁵³Sm,¹⁶⁵Dy,¹⁶⁶Ho,¹⁶⁹Er,¹⁷⁷Lu,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,¹⁹⁸Au,²²³Ra 및 ²²⁵Ac로 구성되는 군으로부터 선택된다.)
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제1항의 방사성 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, hEphA2에 대한 분자 조영용 조성물.
제1항의 방사성 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, hEphA2가 과발현된 암 진단 또는 조영용 조성물.
제1항의 방사성 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
제11항에 있어서,
상기 암은 hEphA2가 과발현된 암인, 암 치료용 약학적 조성물.