CN117915941A - 抗原特异性t细胞受体与嵌合共刺激受体的组合 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及表达TCR和共刺激受体的免疫细胞，其是多功能的，即分泌2种或更多种蛋白质。示例性的免疫细胞表达：(i)对PRAME肽SLLQHLIGL特异性的T细胞受体(TCR)或对NY‑ESO‑1肽SLLMWITQC特异性的TCR和(ii)包含源自PD‑1(CD279)的胞外结构域和源自4‑1BB(CD137)的胞内结构域的嵌合共刺激受体。
Description
技术领域
本发明涉及表达TCR和共刺激受体的免疫细胞，其是多功能的，即分泌2种或更多种蛋白质。示例性的免疫细胞表达：(i)对PRAME肽SLLQHLIGL特异性的T细胞受体(TCR)或对NY-ESO-1肽SLLMWITQC特异性的TCR和(ii)包含源自PD-1(CD279)的胞外结构域和源自4-1BB(CD137)的胞内结构域的嵌合共刺激受体。
背景技术
PRAME是在多种肿瘤，优选黑色素瘤中表达的肿瘤相关抗原。此外，PRAME已被描述为肿瘤转移(例如葡萄膜黑色素瘤)的独立生物标志物(Fiedl et al.,Clin Cancer Res2016March；22(5):1234-1242)和DLBCL的预后标志物(Mitsuhashi et al.,Hematology2014,1/2014)。除睾丸外，其不在正常组织中表达。这种表达模式与其他癌症-睾丸(CT)抗原(例如MAGE、BAGE和GAGE)的表达模式相似。编码的蛋白质充当视黄酸受体的阻遏蛋白，并可能通过此功能赋予癌细胞生长优势。选择性剪接引发多种转录本变体。还发现，三阴性乳腺癌中的PRAME过表达通过诱导上皮间质转化来促进癌细胞移动(Al-Khadairi et al.,Journal of Translational Medicine 2019；17:9)。据报道，慢性淋巴细胞白血病中存在PRAME缺失，然而这与功能性无关，因为该基因不在B细胞中表达，并且缺失是生理性免疫球蛋白轻链重排的结果。根据所描述的CT抗原PRAME的特征，它构成了通过使用TCR定向的基于细胞的免疫疗法来治疗不同类型癌症的合适靶标。为此，需要对抗原具有高特异性的TCR，其使细胞产物能够发挥肿瘤清除所需的效应功能，包括细胞因子的释放、细胞毒性和增殖。
NY-ESO-1和LAGE-1是属于癌症/睾丸抗原家族的重要免疫治疗靶抗原。癌症/睾丸抗原在各种恶性肿瘤和睾丸的生殖细胞中表达，但不在其他成体组织中表达。
TCR修饰的T细胞免疫疗法的成功不仅取决于靶抗原的选择，还取决于具有高抗原特异性和敏感性的TCR的选择。另一个挑战，特别是在实体瘤的治疗中，是免疫抑制性肿瘤微环境(TME)，它会对TCR修饰的T细胞的功效、适应性和持久性产生负面影响。除了抑制性细胞因子和必需代谢因子的缺乏之外，T细胞还面临TME中的抑制性检查点PD-1/PD-L1轴，这会减少T细胞浸润并导致其耗竭。因此，需要新的策略来使TCR修饰的T细胞具有克服抑制性免疫抑制性TME的特性。更具体地，需要对靶向特定抗原(例如NY-ESO-1或PRAME)具有高特异性并具有增强的增殖、细胞因子释放和细胞毒性的TCR修饰的T细胞。
发明内容
为了满足这些需要，本发明提供了高亲和力TCR和嵌合共刺激受体的组合，其允许产生靶向抗原(例如PRAME或NY-ESO-1)并具有增强的细胞因子释放、增殖和细胞毒性的高度特异性T细胞，特别是分泌2种或更多种细胞因子的多功能免疫细胞。
本发明涉及一种靶标特异性免疫细胞，其表达：
(A)抗原特异性TCR，和
(B)嵌合共刺激受体，
其中所述靶标特异性免疫细胞分泌至少两种蛋白质。
因此，本发明的一个实施方案是提供一种细胞，包含：
(A)NY-ESO-1/LAGE-1特异性TCR，其包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:36的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:37的序列的CDR 3；和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:39的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:40的序列的CDR 3，
(B)嵌合共刺激受体，其包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
所使用的NY-ESO-1特异性TCR能够结合具有氨基酸序列SLLMWITQC(SEQ ID NO:34)或其部分或其HLA-A2结合形式的NY-ESO-1肽。它提供了高功能性亲和力和有利的肿瘤细胞识别和杀伤特性。共刺激受体逆转抑制性检查点轴PD-1/PD-L1以改善T细胞功能，特别是在抑制性TME中。因此，本发明的TCR和嵌合共刺激受体的组合允许以高特异性改善NY-ESO-1的靶向，并且具有增强的增殖、细胞因子释放和细胞毒性。
本发明的另一个实施方案是提供一种细胞，包含：
(A)PRAME特异性T细胞受体(TCR)，其包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和
(B)嵌合共刺激受体，其包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
所使用的PRAME特异性TCR能够结合具有氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分或其HLA-A2结合形式的PRAME肽。它提供了高功能性亲和力和有利的肿瘤细胞识别和杀伤特性。特别地，本发明的TCR比现有技术公开的TCR具有更高的功能性亲和力，其最佳地识别所测试的肿瘤细胞系，并且更有效地裂解PRAME阳性肿瘤细胞。共刺激受体逆转抑制性检查点轴PD-1/PD-L1以改善T细胞功能，特别是在抑制性TME中。因此，本发明的TCR和嵌合共刺激受体的组合允许以高特异性改善PRAME的靶向，并且具有增强的增殖、细胞因子释放和细胞毒性。
在一些实施方案中，PRAME特异性TCR能够结合SLLQHLIGL的HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04或HLA-A*02:09结合形式。与PRAME表位SLLQHLIGL或其部分或其HLA-A2结合形式的结合尤其诱导转导或转染有TCR的细胞的IFN-γ分泌。
在一些实施方案中，TCR包含具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的TCRα可变区和具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ可变区。在更具体的实施方案中，TCR包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的TCRα可变区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的TCRβ可变区。TCR可包含具有与SEQ ID NO:10相同或至少80％相同的氨基酸序列的TCRα恒定区和具有与SEQ ID NO:11相同或至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ恒定区。
嵌合共刺激受体可以包含源自PD-1的跨膜结构域。在具体实施方案中，嵌合共刺激受体的序列可以包括SEQ ID NO:26的序列。
因此，另一方面涉及一种组合物，包含：
-编码PRAME特异性T细胞受体(TCR)的核酸，所述T细胞受体(TCR)包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
此外，一方面涉及一种核酸，其包含：
-编码PRAME特异性T细胞受体(TCR)的核酸，所述T细胞受体(TCR)包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和
-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
因此，另一方面涉及一种组合物，其包含
-编码NY-ESO-1特异性T细胞受体(TCR)的核酸，所述T细胞受体(TCR)包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:36的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR 3；和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:39的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR 3；和
-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
此外，一方面涉及一种核酸，其包含
-编码NY-ESO-1特异性T细胞受体(TCR)的核酸，所述T细胞受体(TCR)包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:36的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR 3；和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:39的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR 3；和
-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
另一方面涉及包含核酸的载体，所述核酸包含PRAME特异性TCR和嵌合共刺激受体的序列。另一方面涉及包含核酸的载体，所述核酸包含NY-ESO-1特异性TCR和嵌合共刺激受体的序列。还涵盖包含核酸组合物和/或载体的细胞。
通常，所述细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。在一个具体实施方案中，所述细胞是T细胞。
多功能免疫细胞
因此，本发明的一个目的涉及一种细胞群，其包含表达以下的细胞：
(A)抗原特异性TCR
(B)嵌合共刺激受体
其中所述细胞群包含分泌至少两种蛋白质的细胞。
在一些实施方案中，嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
其中所述细胞群包含分泌至少两种蛋白质的细胞。
本发明的另一方面涉及一种靶标特异性免疫细胞，其表达
(A)抗原特异性TCR，和
(B)如本文所述的嵌合共刺激受体，
其中所述靶标特异性免疫细胞分泌至少两种蛋白质。
在一些实施方案中，所述细胞分泌至少三种蛋白质，例如至少四种或至少5种蛋白质。
另一些方面涉及包含本文定义的细胞、组合物、核酸和载体的药物组合物。另一些方面涉及本文定义的细胞、组合物、核酸和载体用于癌症的治疗。
令人惊奇的是，发明人发现表达本文定义的嵌合共刺激受体的TCR-T细胞与缺乏本文定义的嵌合共刺激受体的TCR-T细胞相比显示出更高的多功能性。转基因T细胞更高的多功能性意味着更高的体内功能和抗肿瘤活性，并与临床结果相关。
特别地，我们可以证明表达本文定义的靶标特异性(例如PRAME特异性或NY-ESO-2特异性)TCR和嵌合共刺激受体二者的细胞群包含分泌至少两种蛋白质(例如至少三种蛋白质、至少四种蛋白质、至少5种蛋白质)的细胞。
附图说明
图1：PD1-41BB的共表达不会改变TCR表达水平。
从健康供体中分离出CD8+T细胞，并在IL-7和IL-15的存在下用CD3/CD28抗体激活。用包含T23.8-2.1-027-004(＝TCR)或T23.8-2.1-027-004和PD1-41BB的组合(＝TCR_PD1-41BB)的序列的逆转录病毒颗粒转导经激活的细胞。以相同方式制备的未转导的(＝UT)CD8+T细胞用作对照。通过抗TCR-β链(TRBV09)和PD-1的抗体染色以及随后的流式细胞术分析来确定转基因的转导效率和表达水平。
图2：PD1-41BB的共表达不会改变TCR转基因T细胞的功能性亲和力。
TCR转基因T细胞群的功能性亲和力测量为与负载滴定量的SLLQHLIGL(SLL)肽(10-5M至10-10M)的PD-L1转基因T2细胞的共培养物中的IFN-γ释放。最大IFN-γ释放的半数作为TCR转基因效应T细胞功能性亲和力的量度。左图显示共培养20小时后通过ELISA测定的IFN-γ浓度的绝对值，右图显示相对值的非线性回归曲线。在PD1-41BB的共表达增加了TCR转基因T细胞响应于PD-L1阳性靶细胞所释放的IFN-γ水平时，该共表达不会改变T细胞的功能性亲和力。
图3：PD1-41BB的共表达不会改变HLA-A*02亚型识别。
TCR转导的T细胞与选定的HLA-A*02亚等位基因阳性类淋巴母细胞系(lymphoblastoid cell line，LCL；EBV转化的B细胞)以1:1的E:T比例(20.000个T细胞/孔)体外共培养。与用10-5M SLL肽脉冲的LCL共培养20小时后，通过ELISA测定IFN-γ浓度。转导有或未转导PD1-41BB的TCR转基因T细胞以与A*02:01相比相似的水平识别由HLA-A*02亚等位基因A*02:02、A*02:04和A*02:09编码的MHC分子所呈递的SLL肽。
图4：成功降低潜在的肽脱靶毒性的风险。
为了降低潜在脱靶毒性的风险，使用Expitope 选择了与SLL肽相比具有最多达4个氨基酸差异的191种部分同源肽(错配(MM)肽)。在使用负载有10-6M MM肽或SLL肽的PD-L1转基因T2细胞的预筛选共培养中，鉴定出33种可被TCR转导的T细胞识别的MM肽(数据未示出)。当表位(肽)被PRAME阴性靶细胞系SNB-19的蛋白酶体内源加工时，检查了这33种MM肽诱导TCR转基因效应T细胞释放IFN-γ的潜力。将编码最多达5种MM肽的体外转录(ivt)RNA电穿孔至SNB-19细胞中。对在预筛选共培养中诱导TCR转基因T细胞中的最高IFN-γ释放的MM肽(MM01、MM26、MM66)分别作为“midigene”构建体(约400bp)进行测试。所有其他MM肽均作为编码5种MM肽的小基因(minigene)构建体(每种肽约90bp)进行测试。编码SLL肽的midigene构建体用作阳性对照。所有RNA构建体均包含被阳性对照TCR识别的表位。转染的SNB-19细胞与TCR转基因效应T细胞共培养20小时后测定IFN-γ浓度。检测到的IFNγ水平表明没有识别到细胞内加工的MM肽。因此，可以降低所有MM肽的风险，并且不太可能导致潜在的脱靶毒性。此外，PD1-41BB的共表达并没有改变单独使用TCR时所观察到的识别MM肽的模式。
图5：使用涵盖常见HLA的LCL文库未发现脱靶毒性。
为了评估潜在的脱靶毒性，将具有和不具有PD1-41BB的TCR转导T细胞与由36个类淋巴母细胞系(LCL)组成的文库共培养，该文库涵盖了白种人群体中最常见的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因。这些LCL表达多种内源性表达的肽，并且由于匹配的HLA-A2分子或最常见的其他HLA分子上呈递的内源性肽的识别，有助于鉴定潜在的交叉反应性。与LCL共培养20小时后，通过ELISA测定IFN-γ浓度。负载有SLL肽的HLA-A*02:01阳性LCL作为阳性对照。TCR转基因T细胞仅在与LCL#5共培养时才分泌非常低水平的IFN-γ，其中可以通过qPCR证实低水平的PRAME表达。所有其他LCL均未被表达转基因TCR或表达与PD1-41BB组合的转基因TCR的效应T细胞识别。因此，在此安全模型中没有鉴定出脱靶毒性。
图6：使用一组正常细胞未鉴定出脱靶毒性。
通过与多种组织来源的正常细胞共培养，分析了关键健康组织的潜在脱靶识别。正常细胞负载有SLL肽作为阳性对照。共培养20小时后通过ELISA测定共培养上清液中的IFN-γ浓度。没有观察到健康细胞的脱靶识别。只有PRAME阳性的成熟树突状细胞(DC)触发了TCR转基因T细胞中高于未转导T细胞背景的IFN-γ释放，而成熟DC的祖细胞(单核细胞和未成熟DC)不会导致T细胞释放IFN-γ。PD1-41BB的加入不会改变表达PRAME特异性TCR的T细胞的安全性。(人肾上皮细胞(HREpC)、人肾皮质上皮细胞(HRCEpC)、肾近端小管上皮细胞(RPTEC)、正常人肺成纤维细胞(NHLF)、人成骨细胞(HOB)、单核细胞(Mono)、未成熟DC(iDC)、成熟DC(mDC)、iCell心肌细胞2(iCardio)。
图7：响应于表达PD-L1的肿瘤细胞，PD1-41BB增强IFN-γ特异性释放。
(A)通过实时定量PCR测定肿瘤细胞系中的PRAME-mRNA表达水平，并根据管家基因GUSB进行归一化。(B)具有和不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞与表达不同水平的PRAME和PD-L1的各种适应症的HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系共培养。为了使PD-L1稳定表达，一些肿瘤细胞用PD-L1转导(TD)。此外，通过抗体染色和随后的流式细胞术分析，确定一些细胞系在用IFN-γ处理后表现出经诱导的(ind)PD-L1表达，而其他细胞系在未经IFN-γ处理的情况下已经表现出一定水平的内源性PD-L1表达(end)。未转导的T细胞用作对照。共培养20小时后通过ELISA测定IFN-γ浓度。PD1-41BB的共表达增强了响应于PD-L1阳性肿瘤细胞的IFN-γ释放。
图8：PD1-41BB增强针对3维(3D)肿瘤细胞球体的特异性细胞毒性反应。
将具有和不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞与表达不同水平的PRAME和PD-L1的来自HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系的3维(3D)肿瘤细胞球体共培养。通过在20天内使用Incucyte 或/>装置每4小时记录一次图像中的红色荧光的损失来确定针对肿瘤球体的细胞毒性。在第3、7、10、13和16天将新鲜肿瘤细胞球体转移到共培养板中。在反复暴露于肿瘤细胞的挑战性环境中，PD1-41BB的表达对T细胞的效应功能和适应性具有有益影响。在利用肿瘤细胞球体的多重挑战过程中，与仅表达转基因TCR的效应T细胞相比，表达PD1-41BB的效应T细胞可以更好地控制肿瘤细胞生长。
图9：PD1-41BB响应于表达PD-L1的肿瘤细胞而增加TCR转基因T细胞的增殖。
将具有和不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞与表达不同水平PRAME和PD-L1的HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系以效应细胞与靶细胞为1:1的比例共培养。未转导的T细胞用作对照。7天后，根据总细胞计数计算共培养中T细胞的X倍扩增。PD1-41BB的共表达增强了响应于PD-L1阳性肿瘤细胞的增殖和/或存活。
图10：共表达PD1-41BB的T细胞在体内表现出强烈的抗肿瘤反应性。
将5x106个PD-L1转基因MelA375肿瘤细胞皮下注射到18只免疫缺陷(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)小鼠中。一周后，将小鼠分配到三个治疗组，每组六只小鼠。向小鼠注射10x106个(16x106个总细胞)具有PD1-41BB的TCR阳性细胞(TCR_PD1-41BB)或不具有PD1-41BB的TCR阳性细胞(TCR)，或等量的未转导T细胞(UT)。每周测量肿瘤体积2-3次。与未转导的T细胞相比，表达PD1-41BB的效应T细胞可以控制体内肿瘤细胞的生长，而仅表达转基因TCR的效应T细胞几乎没有作用。
图11：与缺乏PD1-41BB的靶向PRAME的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的靶向PRAME的TCR-T细胞显示出更高的多功能性。使用技术(IsoPlexis)分析具有或不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞的单细胞多功能性(释放2种或更多种细胞因子)。在与PD-L1过表达的PRAME阳性MelA375肿瘤细胞共培养后，评估单个CD8+T细胞的32种T细胞细胞因子/蛋白质的分泌，并与未经刺激的TCR-T细胞进行比较。(A)与缺乏PD1-41BB的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的TCR-T细胞显示出更高比例的多功能性T细胞。不同深浅的灰色显示单个T细胞同时释放多少细胞因子。(B)通过将各种分泌的细胞因子的强度与多功能性T细胞的百分比相乘来计算多功能强度指数(PSI)。与缺乏PD1-41BB的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的TCR-T细胞表现出更高的多功能强度指数(PSI)。对释放的各种细胞因子的分类显示了效应蛋白(Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β)和刺激性(GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12)细胞因子对卓越的PSI的高度贡献，其次是化学吸引性(chemo-attractive)(IP-10、MIP-1β)细胞因子。调节性(IL-10、IL-22)和炎性(IL-6、MCP-1)细胞因子的释放程度较低。(C)使用多功能热图对单细胞多细胞因子释放进行详细分析表明，具有和不具有PD1-41BB的TCR-T细胞的多细胞因子特征不同。值得注意的是，表达PD1-41BB的TCR-T细胞含有较高比例的同时分泌4-10种细胞因子的单细胞。
图12：与缺乏PD1-41BB的靶向NY-ESO-1的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的靶向NY-ESO-1的TCR-T细胞显示出更高的多功能性。使用技术(IsoPlexis)分析具有或不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞的单细胞多功能性(释放2种或更多种细胞因子)。在与PD-L1过表达的NY-ESO-1阳性MelA375和Mel624.38肿瘤细胞共培养后，评估单个CD8+T细胞的32种T细胞细胞因子/蛋白质的分泌，并与未转导的TCR-T细胞进行比较。
(A)与缺乏PD1-41BB的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的TCR-T细胞显示出更高比例的多功能性T细胞。不同深浅的灰色显示单个T细胞同时释放多少细胞因子。
(B)通过将各种分泌的细胞因子的强度与多功能性T细胞的百分比相乘来计算多功能强度指数(PSI)。与缺乏PD1-41BB的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的TCR-T细胞表现出更高的多功能强度指数(PSI)。对释放的各种细胞因子/溶解蛋白的分类显示效应蛋白(Gzm-B、IFN-γ、MIP-1a、穿孔素、TNF-α、TNF-β)和刺激性(GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-8、IL-9、IL-12)细胞因子/溶解蛋白对卓越的PSI的高度贡献，其次是化学吸引性(IP-10、MIP-1β、RANTES)细胞因子。调节性(IL-4、IL-10、IL-22、sCD137、TGF-β)和炎性(IL-6、IL-17F、MCP-1)细胞因子的释放程度较低。
(C)使用多功能热图对单细胞多细胞因子释放进行详细分析表明，具有和不具有PD1-41BB的TCR-T细胞的多细胞因子特征不同。值得注意的是，表达PD1-41BB的TCR-T细胞含有较高比例的同时分泌2-6种细胞因子的单细胞。
具体实施方式
在详细描述本发明的有关优选实施方案之前，提供以下一般性定义。
下面示例性描述的本发明可以在本文中未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制不存在的情况下适当地实践。
将就特定实施方案并结合某些附图来描述本发明，但本发明不限于此而仅受限于权利要求书。
当本说明书和权利要求中使用术语“包括”时，其不排除其他要素。出于本发明的目的，术语“由......组成”被认为是术语“包括”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包括至少一定数量的实施方案，则这也应当理解为公开了优选地仅由这些实施方案组成的组。
出于本发明的目的，术语“获得的”被认为是术语“可获得的”的优选实施方案。如果下文中例如抗体被定义为是从特定来源可获得的，这也应理解为公开了从该来源获得的抗体。
当指代单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“a”、“an”或“the”，除非另有明确说明，否则包括该名词的复数形式。在本发明的上下文中，术语“约”或“大约”表示本领域技术人员会理解的仍然确保所讨论的特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示与所指示的数值的偏差为±10％，并且优选为±5％。
技术术语按照本领域技术人员的常识或含义来使用。如果某些术语表达了特定含义，则下面将在使用这些术语的上下文中给出术语的定义。
TCR背景
TCR由两条不同且独立的蛋白质链组成，即TCR alpha(α)链和TCR beta(β)链。TCRα链包含可变区(V)、连接区(J)和恒定区(C)。TCRβ链包含可变区(V)、多样性区(D)、连接区(J)和恒定区(C)。TCRα和TCRβ链二者的重排V(D)J区均包含高变区(CDR，互补决定区)，其中CDR3区决定特异性表位识别。在C末端区域，TCRα链和TCRβ链均包含疏水性跨膜结构域，并以短胞质尾结束。
通常，TCR是一条α链和一条β链的异二聚体。该异二聚体可以与呈递肽的MHC分子结合。
在本发明的上下文中，术语“TCRα可变区”或“TCRα可变链”或“可变结构域”是指TCRα链的可变区。在本发明的上下文中，术语“TCRβ可变区”或“TCRβ可变链”是指TCRβ链的可变区。
TCR基因座和基因使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法命名(IMGT数据库,www.IMGT.org；Giudicelli,V.,et al.IMGT/LIGM-DB,the comprehensivedatabase of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences,Nucl.Acids Res.,34,D781-D784(2006).PMID:16381979；T cell Receptor Factsbook,LeFranc and LeFranc,Academic Press ISBN 0-12-441352-8)。
靶标
在一些实施方案中，本文提供的与嵌合共刺激受体组合的TCR能够有利地与源自(人)PRAME(SEQ ID NO:1)的肽结合。因此，所述TCR对如SEQ ID NO:1中所示的PRAME肽(也称为PRAME-SLL)具有特异性。在本发明的上下文中，术语“特异性”是指TCR与靶标特异性结合。PRAME(Preferentially Expressed Antigen in Melanoma，黑色素瘤中优先表达的抗原，Uniprot登录号P78395)，也称为MAPE(melanoma antigen preferentially expressedin tumors，肿瘤中优先表达的黑色素瘤抗原)和OIP4(OPA相互作用蛋白4)，被报道为功能未知的CT抗原。PRAME是一种蛋白质编码基因，与黑色素瘤、白血病和慢性骨髓细胞相关。与该基因相关的基因本体论(GO)注释包括视黄酸受体结合。PRAME蛋白作为转录阻遏蛋白发挥作用，通过视黄酸受体RARA、RARB和RARG抑制视黄酸信号传导。它可以防止视黄酸诱导的细胞增殖的停滞、分化和凋亡。
在一些实施方案中，本发明提供了嵌合共刺激受体和TCR的组合，其能够结合包含在如SEQ ID NO:1所示的PRAME氨基酸序列内的肽(参见表1)。术语“能够结合”是指所述肽与所述TCR特异性结合。术语“特异性(地)结合”通常表示与随机、不相关的非靶抗原相比，TCR通过其抗原结合位点更容易与其预期抗原靶标结合。特别地，术语“特异性结合”表示与TCR对于非靶标抗原的结合特异性相比，TCR对于其靶标抗原的结合特异性要高至少约5倍、优选10倍、更优选25倍、甚至更优选50倍、最优选100倍或更多。由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列所组成的PRAME肽在本文中也称为“抗原靶标”或“SLL肽”。因此，由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列所组成的PRAME肽是或包含本发明的TCR的靶向表位。
术语“表位”一般指结合结构域所识别的抗原(通常是(多)肽)上的位点。术语“结合结构域”在其最广泛的意义上是指“抗原结合位点”，即表征与抗原靶标上的特定表位结合/相互作用的分子结构域。抗原靶标可包含单个表位，但通常包含至少两个表位，并且可包含任意数量的表位，具体取决于抗原的大小、构象和类型。术语“表位”一般涵盖线性表位和构象表位。线性表位是包含在氨基酸一级序列中的连续表位并且通常包括至少2个氨基酸或更多。构象表位是由通过折叠靶抗原、特别是靶(多)肽而并置的非连续氨基酸形成的。
发明人发现，本发明的TCR识别的最小氨基酸序列对应于PRAME(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。具体地，本发明的TCR已显示出(特异性地)识别包含氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或由其组成的氨基酸序列，特别是其HLA-A2结合形式，如所附实施例中所示。这种选择性识别可以通过TCR的识别基序来实现，显示仅几个固定位置。序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)的氨基酸LLQ并且尤其是HLI是该识别基序的一部分。
一些实施方案涉及一种细胞，其包含：
(A)PRAME特异性T细胞受体(TCR)，其包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和
(B)嵌合共刺激受体，其包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
其中所述细胞分泌多于两种蛋白质。
另一些实施方案涉及一种细胞，其包含：
(A)NY-ESO1特异性T细胞受体(TCR)，其包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:36的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR 3；和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:39的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR 3；和
(B)嵌合共刺激受体，其包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
其中所述细胞分泌多于两种蛋白质。
TCR特异性序列
因此，本发明的组合中使用的示例性TCR包含：
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；或
在一些实施方案中，TCR包含具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的TCRα可变区和具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ可变区。
如本文所用，“至少80％相同”，特别是“具有与……至少80％相同的氨基酸序列”包括与列出的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
优选使用Vector NTI AdvanceTM 10程序(Invitrogen Corporation,CarlsbadCA,USA)的AlignX应用程序来确定多个序列之间的百分比同一性。该程序使用改进的Clustal W算法(Thompson et al.,1994.Nucl Acids Res.22:pp.4673-4680；InvitrogenCorporation；Vector NTI AdvanceTM 10DNA and protein sequence analysissoftware.User’s Manual,2004,pp.389-662)。使用AlignX应用程序的标准参数来进行百分比同一性的确定。
在具体实施方案中，TCR包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的TCRα可变区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的TCRβ可变区。
从一些实施方案的实施例可以看出，TCR对PRAME、特别是PRAME表位SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)具有特异性，并且对于其他表位或抗原仅表现出非常低的交叉反应性。
在具体实施方案中，本文所述的TCR包含具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列的TCRα恒定区和具有与SEQ ID NO:11至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ恒定区。
因此，更具体地，在一些实施方案中，TCR可以包含具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的TCRα可变区、具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ可变区、具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列的TCRα恒定区和具有与SEQ ID NO:11至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ恒定区。
在更为具体的实施方案中，TCR可以包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的TCRα可变区、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的TCRβ可变区、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的TCRα恒定区和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的TCRβ恒定区。
因此，在具体实施方案中，TCR可包含具有与SEQ ID NO:24相同或至少80％相同的氨基酸序列的TCRα链，和具有与SEQ ID NO:22相同或至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ链。
在另一些实施方案中，TCR对NY-ESO-1、特别是NY-ESO-1表位SLLMWITQC(SEQ IDNO:34)具有特异性，并且对于其他表位或抗原仅表现出非常低的交叉反应性。
因此，用于本发明组合的示例性TCR包含：
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:36的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR 3；和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:39的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR 3。
在一些实施方案中，TCR包含具有与SEQ ID NO:41至少80％相同的氨基酸序列的TCRα可变区和具有与SEQ ID NO:42至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ可变区。
在具体实施方案中，TCR包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的TCRα可变区和具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的TCRβ可变区。
在一些实施方案中，TCR可包含具有与SEQ ID NO:43相同或至少80％相同的氨基酸序列的TCRα链，和具有与SEQ ID NO:44相同或至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ链。
在一些实施方案中，TCR可包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的TCRβ链。
修饰
在一些实施方案中，TCR和/或嵌合共刺激受体的氨基酸序列可包含一个或多个表型沉默取代。
“表型沉默取代”也称为“保守氨基酸取代”。“保守氨基酸取代”的概念是本领域技术人员所理解的，并且优选地是指编码带正电的残基(H、K和R)的密码子被编码带正电的残基的密码子取代，编码带负电的残基(D和E)的密码子被编码带负电的残基的密码子取代，编码中性极性残基(C、G、N、Q、S、T和Y)的密码子被编码中性极性残基的密码子取代，编码中性非极性残基(A、F、I、L、M、P、V和W)的密码子被编码中性非极性残基的密码子取代。这些变异可以自发地发生、通过随机诱变引入、或者可以通过定向诱变引入。这些改变可以在不破坏这些多肽的基本特征的情况下进行。普通技术人员可以通过本领域已知的方法容易且常规地筛选变体氨基酸和/或编码它们的核酸以确定这些变体是否显著降低或破坏配体结合能力。
技术人员理解，编码TCR和/或嵌合共刺激受体的核酸也可以被修饰。整个核酸序列中的有用修饰包括序列的密码子优化。可以在所表达的氨基酸序列内进行导致保守取代的改变。这些变异可以在TCR链氨基酸序列的不影响功能的互补决定区和非互补决定区中进行。通常，不应在CDR3区域进行添加和缺失。
根据本发明的一些实施方案，TCR和/或嵌合共刺激受体的氨基酸序列被修饰以包含可检测标记、治疗剂或药代动力学修饰部分(moiety)。
可检测标记的非限制性实例是放射性标记、荧光标记、核酸探针、酶和造影剂。可以与TCR缔合的治疗剂包括放射性化合物、免疫调节剂、酶或化疗剂。治疗剂可以被封装在与TCR连接的脂质体中，以便化合物可以在靶位点缓慢释放。这将避免在体内运输过程中受到损害并确保治疗剂(例如毒素)在TCR与相关抗原呈递细胞结合后发挥最大效果。治疗剂的其他实例是：
肽细胞毒素，即能够杀死哺乳动物细胞的蛋白质或肽，如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、DNase和RNase。小分子细胞毒性剂，即能够杀死分子量小于700道尔顿的哺乳动物细胞的化合物。此类化合物可包含能够产生细胞毒性作用的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒性剂还包括前药，即在生理条件下分解或转化以释放细胞毒性剂的化合物。此类药剂可例如包括多西紫杉醇、吉西他滨、顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、依托泊苷、异环磷酰胺、伊立替康、卟吩姆钠光敏剂II(porfimer sodium photofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、三甲曲沙(trimetrexateglucoronate)、米托蒽醌、奥瑞他汀E(auristatin E)、长春新碱和多柔比星。放射性核素，例如碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213。放射性核素与TCR或其衍生物的缔合可以例如通过螯合剂进行。免疫刺激物，也称为免疫刺激剂，即刺激免疫反应的免疫效应分子。示例性的免疫刺激剂有细胞因子，例如IL-2和IFN-γ、抗体或其片段，包括抗T细胞或NK细胞决定簇抗体(例如抗CD3、抗CD28或抗CD16)；具有抗体样结合特性的替代蛋白质支架；超级抗原，即引起T细胞的非特异性激活、导致多克隆T细胞激活和大量细胞因子释放的抗原及其突变体；趋化因子，如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；补体激活剂；异种蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域、病毒/细菌肽。
治疗剂可优选选自由免疫效应分子、细胞毒性剂和放射性核素组成的组。优选地，免疫效应分子是细胞因子。
药代动力学修饰部分可以是例如至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个乙二醇基团、至少一个唾液酸基团或其组合。至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个乙二醇基团、至少一个唾液酸基团的缔合可以以本领域技术人员已知的多种方式引发。在一个优选的实施方案中，这些单元与TCR共价连接。根据本发明的TCR可以被一种或多种药代动力学修饰部分修饰。特别地，TCR的可溶形式是被一种或数种药代动力学修饰部分修饰的。药代动力学修饰部分可以实现治疗剂的药代动力学特征的有益改变，例如改善血浆半衰期、降低或增强免疫原性以及改善溶解度。
TCR和/或嵌合共刺激受体可以通过连接附加的功能部分进行修饰，例如，用于降低免疫原性、增加流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)溶解度和/或稳定性(例如通过增强对蛋白水解降解的保护)和/或延长血清半衰期的部分。
其他有用的功能性部分和修饰包括“自杀”或“安全开关”，其可用于关闭患者体内携带本发明TCR的效应宿主细胞。一个实例是Gargett and Brown Front Pharmacol.2014；5:235描述的诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)“安全开关”。简言之，通过众所周知的方法修饰效应宿主细胞以表达胱天蛋白酶9结构域，其二聚化依赖于小分子二聚化药物(例如AP1903/CIP)，并导致在经修饰的效应细胞中快速诱导细胞凋亡。该系统例如在EP2173869(A2)中描述。其他“自杀”“安全开关”的实例是本领域已知的，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、CD20的表达以及随后使用抗CD20抗体或myc标签进行消耗(Kieback et al,ProcNatl Acad Sci U S A.2008Jan 15；105(2):623-8)。
本文还设想了具有改变的糖基化模式的TCR。如本领域已知的，糖基化模式可以取决于氨基酸序列(例如，特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在，如下所述)和/或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。向结合分子添加N-连接糖基化位点可方便地通过改变氨基酸序列来完成，使得其包含选自天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸的一个或多个三肽序列(其中X是除脯氨酸之外的任意氨基酸)。O-连接糖基化位点可通过向起始序列添加或取代为一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来引入。
TCR糖基化的另一种方法是通过糖苷与蛋白质的化学或酶偶联。根据所使用的偶联模式，糖可以连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基基团，例如如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基基团，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。类似地，去糖基化(即，去除结合分子上存在的碳水化合物部分)可以通过化学方式完成，例如，通过将TCR暴露于三氟甲磺酸，或通过使用内切糖苷酶和外切糖苷酶的酶促方式完成。
还可以想到将药物例如小分子化合物添加至TCR，特别是本发明的可溶形式的TCR。连接可以通过共价键或非共价相互作用(例如通过静电力)来实现。可以使用本领域已知的各种接头来形成药物缀合物。
TCR，特别是本发明的可溶形式的TCR可以另外被修饰为引入有助于鉴定、追踪、纯化和/或分离相应分子(标签)的另外的结构域。因此，在一些实施方案中，TCRα链或TCRβ链可被修饰为包含表位标签。
表位标签是可以并入本发明的TCR中的标签的有用实例。表位标签是一段短的氨基酸，其允许特定抗体的结合，因此能够识别和跟踪可溶性TCR或宿主细胞在患者体内或培养的(宿主)细胞内的结合和运动。表位标签以及由此标签标记的TCR的检测可以使用多种不同的技术来实现。
通过在对所述标签具有特异性的结合分子(抗体)存在下培养细胞，标签还可用于刺激和扩增携带本发明TCR的宿主细胞。
一般而言，在一些情况下，TCR可以被修饰为具有各种突变，这些突变改变了TCR与靶抗原的亲和力和解离率。特别地，突变可以增加亲和力和/或降低解离率。因此，TCR可以在至少一个CDR及其可变结构域框架区中突变。
然而，在优选的实施方案中，TCR的CDR未被修饰或体外亲和力成熟，例如对于实施例中的TCR。这意味着CDR具有天然存在的序列。这可能是有利的，因为体外亲和力成熟可能导致TCR分子的免疫原性。这可能导致降低或消除治疗效果和治疗的抗药物抗体的产生和/或诱发副作用。
突变可以是一种或多种取代、缺失或插入。这些突变可以通过本领域已知的任何合适的方法引入，例如聚合酶链式反应、基于限制酶的克隆、不依赖于连接的克隆程序，其描述于Sambrook,Molecular Cloning–4th Edition(2012)Cold Spring HarborLaboratory Press中的实例中。
理论上，由于内源性和外源性TCR链之间的错配，可能会出现具有交叉反应风险的不可预测的TCR特异性。为了避免TCR序列错配，可以对重组TCR序列进行修饰以包含鼠源化或最小鼠源化Cα和Cβ区域，该技术已被证明可以有效增强几种不同转导的TCR链的正确配对。TCR的鼠源化(即用其鼠类对应物交换人类Cα和Cβ区域)是一种常用于改善宿主细胞中TCR的细胞表面表达的技术。不希望受具体理论的束缚，认为鼠源化TCR与CD3共受体更有效地缔合；和/或优先彼此配对并且不太容易在经离体基因修饰以表达具有期望的抗原特异性的TCR的人T细胞上形成混合TCR，但仍保留有并表达其“原始”TCR。
已鉴定出用于改进鼠源化TCR表达的九个氨基酸(Sommermeyer and Uckert,JImmunol.2010Jun 1；184(11):6223-31)，并设想将TCRα和/或β链恒定区中的一个或全部氨基酸残基替换为它们的鼠对应物残基。该技术也称为“最小鼠源化”，具有增强细胞表面表达的同时减少氨基酸序列中“外来”氨基酸残基的数量由此降低免疫原性的优点。
一些实施方案涉及如本文所述的分离的TCR，其中TCR是单链类型，其中TCRα链和TCRβ链通过接头序列连接。
合适的单链TCR形式包含由对应于TCRα可变区的氨基酸序列构成的第一区段，由与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ可变区的氨基酸序列构成的第二区段，和将第一区段的C末端连接到第二区段的N末端的接头序列。或者，第一区段可以由对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成，第二区段可以由与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成。上述单链TCR还可以在第一链和第二链之间包含二硫键，并且其中接头序列的长度和二硫键的位置使得第一区段和第二区段的可变结构域序列基本上如天然T细胞受体中那样相互定方位。更具体地，第一区段可以由与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成，第二区段可以由与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成，并且可以在第一链和第二链之间提供二硫键。接头序列可以是不损害TCR功能的任意序列。
在本发明的上下文中，“功能性”TCRα和/或β链融合蛋白应指TCR或TCR变体(例如通过氨基酸的添加、缺失或取代进行修饰)，其保持至少基本的生物活性。在TCR的α和/或β链的情况中，这应意味着两条链仍然能够形成TCR(与未修饰的α和/或β链或与另一种本发明的融合蛋白α和/或β链)，其发挥其生物学功能，特别是与所述TCR的特定肽-MHC复合物结合，和/或在特定肽:MHC相互作用时的进行功能性信号转导。
在具体实施方案中，TCR可以被修饰为功能性TCRα和/或β链融合蛋白，其中所述表位标签的长度为6至15个氨基酸、优选9至11个氨基酸。在另一个实施方案中，TCR可以被修饰为功能性T细胞受体(TCR)α和/或β链融合蛋白，其中所述TCRα和/或β链融合蛋白包含两个或更多个间隔开或者直接串联的表位标签。融合蛋白的实施方案可包含2、3、4、5或甚至更多表位标签，只要该融合蛋白保持其生物活性(“功能性”)。
优选的是根据本发明的功能性TCRα和/或β链融合蛋白，其中所述表位标签选自但不限于CD20或Her2/neu标签，或其他常规标签例如myc标签、FLAG-标签、T7-标签、HA(血凝素)-标签、His-标签、S-标签、GST-标签或GFP-标签。myc、T7、GST、GFP标签是源自现有分子的表位。相反，FLAG是设计为用于高抗原性的合成表位标签(参见例如美国专利号4,703,004和4,851,341)。可以优选使用myc标签，因为高质量的试剂可用于其检测。表位标签当然可以具有一种或多种超出抗体识别范围的附加功能。这些标签的序列描述于文献中且为本领域技术人员所熟知。
嵌合共刺激受体
与抗原特异性TCR(例如PRAME特异性TCR或NY-ESO特异性TCR)组合使用的嵌合共刺激受体包含：
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
与抗原特异性TCR(例如PRAME特异性TCR或NY-ESO-1特异性TCR)组合使用的嵌合共刺激受体在本文中可以特别地包含胞外结构域，该胞外结构域含有源自PD-1(例如人PD-1)的胞外结构域。在本文中，术语“源自”具体指胞外结构域中所含的多肽分别包含PD-1(例如人PD-1)的至少一部分，优选包含PD-1的胞外结构域。含有源自PD-1的胞外结构域的嵌合共刺激受体具有对PD-L1、PD-L2或PD-1的其他抑制性配体的结合活性。如本文所用，术语“源自”PD-1还允许与PD-1(例如人PD-1)或其部分(例如胞外结构域)的天然序列相比最多达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸的取代、缺失和/或插入。
在一个实施方案中，含有源自PD-1的多肽的胞外结构域包括SEQ ID NO:28中列出的序列或与SEQ ID NO:28至少80％相同的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，含有源自PD-1的多肽的胞外结构域包括SEQ ID NO:28中列出的序列。
在本发明的一个实施方案中，嵌合共刺激受体包含的含有源自PD-1的多肽的胞外结构域与人或鼠PD-1(例如SEQ ID NO:28所示的人PD-1)的胞外结构域的氨基酸序列相比，包含具有最多达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代(优选保守或高度保守取代)、缺失和/或插入的氨基酸序列。
与抗原特异性TCR(例如PRAME特异性TCR或NY-ESO-1特异性TCR)组合使用的嵌合共刺激受体在本文中还包含可操作地连接在胞外结构域和胞内结构域之间的跨膜结构域。通常，跨膜结构域不限于特定的跨膜结构域。优选地，跨膜结构域允许融合蛋白稳定锚定在表达该融合蛋白的细胞(例如，T细胞)的膜中，并且进一步允许胞外结构域分别与PD-L1结合，并且在与PD-L1结合后，允许信号转导至含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
在一个优选的实施方案中，嵌合共刺激受体的跨膜结构域源自PD-1。在一个实施方案中，跨膜结构域包括SEQ ID NO:30中列出的序列或与SEQ ID NO:30至少80％相同的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，含有源自PD-1的多肽的跨膜结构域包括SEQ ID NO:30中列出的序列。
与抗原特异性TCR(例如PRAME特异性TCR或NY-ESO-1特异性TCR)组合使用的嵌合共刺激受体在本文中可以特别包含含有源自4-1BB(也称为“41BB”)的多肽的胞内结构域、优选4-1BB(例如人4-1BB)的胞内结构域。在本文中，术语“源自”具体意味着胞内结构域中所含的多肽分别包含4-1BB(例如人4-1BB)的至少一部分，优选4-1BB的胞内结构域。包含源自4-1BB的胞内结构域的嵌合共刺激受体能够在用PD-L1、PD-L2或PD-1的另一种抑制性配体刺激后增加表达所述嵌合共刺激受体的T细胞的增殖速率，和/或与不表达嵌合共刺激受体的相应T细胞相比，能够增强表达所述嵌合共刺激受体的T细胞的效应功能(例如增加IFN-γ释放和/或增加细胞毒性)。如本文所用，术语“源自”4-1BB还允许与4-1BB(人或鼠，优选人4-1BB)或其部分(例如胞外结构域)的天然序列相比最多达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸的取代、缺失和/或插入。在一个实施方案中，含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域包括SEQ ID NO:32中列出的序列或与SEQ ID NO:32至少80％相同的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，含有源自4-1BB的多肽的胞外结构域包括SEQ ID NO:32中列出的序列。
如本文所用，“至少80％相同”，特别是“具有与……至少80％相同的氨基酸序列”包括与列出的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
优选使用Vector NTI AdvanceTM 10程序(Invitrogen Corporation,CarlsbadCA,USA)的AlignX应用程序来确定多个序列之间的百分比同一性。该程序使用改进的Clustal W算法(Thompson et al.,1994.Nucl Acids Res.22:pp.4673-4680；InvitrogenCorporation；Vector NTI AdvanceTM 10DNA and protein sequence analysissoftware.User’s Manual,2004,pp.389-662)。使用AlignX应用程序的标准参数来进行百分比同一性的确定。
核酸、核酸组合物和载体
本发明涵盖编码抗原特异性TCR、特别是本文所述的NY-ESO-1或PRAME特异性TCR的核酸，以及包含所述核酸的相应核酸组合物和载体。
编码PRAME特异性TCR的相关区域和结构域的核苷酸序列列于表1中：
表1
| 肽序列SEQ ID NO | 核酸序列SEQ ID NO | 说明 |
| 2 | 12 | TCR1α链CDR1 |
| 3 | 13 | TCR1α链CDR2 |
| 4 | 14 | TCR1α链CDR3 |
| 5 | 15 | TCR1β链CDR1 |
| 6 | 16 | TCR1β链CDR2 |
| 7 | 17 | TCR1β链CDR3 |
| 8 | 18 | TCR1α链可变区 |
| 9 | 19 | TCR1β链可变区 |
| 10 | 20 | TCRα链恒定区 |
| 11 | 21 | TCRβ链恒定区 |
| 22 | 23 | TCRβ可变链 |
| 24 | 25 | TCRα可变链 |
编码嵌合共刺激受体的相关区域和结构域的核苷酸序列列于表2中：
表2
因此，另一方面涉及一种组合物，其包含：
-编码PRAME特异性T细胞受体(TCR)的核酸，所述T细胞受体(TCR)包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
此外，一方面涉及一种核酸，其包含：
-编码PRAME特异性T细胞受体(TCR)的核酸，所述T细胞受体(TCR)包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
此外，另一方面涉及一种组合物，其包含：
-编码NY-ESO-1特异性T细胞受体(TCR)的核酸，所述T细胞受体(TCR)包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:36的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR 3；和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:39的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR 3；和
-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
此外，一方面涉及一种核酸，其包含
-编码NY-ESO-1特异性T细胞受体(TCR)的核酸，所述T细胞受体(TCR)包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:36的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR 3；和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:39的氨基酸序列的CDR 2和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR 3；和
-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
另一方面涉及包含核酸的载体，所述核酸包含PRAME特异性TCR和嵌合共刺激受体的序列。另一方面涉及包含核酸的载体，所述核酸包含NY-ESO-1特异性TCR和嵌合共刺激受体的序列。还涵盖包含核酸组合物和/或载体的细胞。
“核酸分子”通常是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，合成的或从天然来源获得(例如，分离和/或纯化)的，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间键合，例如氨基磷酸酯键合或硫代磷酸酯键合，而不是在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。优选地，本文描述的核酸是重组的。本文使用的术语“重组的”是指(i)在活细胞外通过将天然或合成的核酸片段连接至可在活细胞中复制的核酸分子而构建的分子，或(ii)由上文(i)中描述的那些的复制产生的分子。出于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。可以使用本领域已知的或市售(例如来自Genscript,Thermo Fisher等公司)的程序基于化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸。参见例如Sambrook等人，可以使用天然存在的核苷酸或经设计用于增加分子的生物稳定性或增加杂交时形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸(参见例如Sambrook et al.2001)(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)来化学合成核酸。核酸可包含编码任意重组TCR和/或嵌合共刺激受体、多肽或蛋白质、或其功能性部分或功能性变体的任意核苷酸序列。
例如，本公开还提供了分离的或纯化的核酸的变体，其中变体核酸包含与编码本文所述TCR的核苷酸序列至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。这样的变体核苷酸序列编码特异性识别PRAME或NY-ESO-2、尤其是PRAME表位SLLQHLIGL(SEQ IDNO:1)或SEQ ID NO:34的NY-ESO-1表位的功能性TCR。
例如，本公开还提供了分离的或纯化的核酸的变体，其中变体核酸包含与本文所述的嵌合共刺激受体至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。这样的变体核苷酸序列编码如本文所述的功能性嵌合共刺激受体。
如本文别处已经描述的，编码TCR和/或嵌合共刺激受体的核酸可以被修饰。整个核酸序列中有用的修饰可以是密码子优化。可以在翻译出的氨基酸序列内进行导致保守取代的改变。对于TCR，这些变异可以在TCR链氨基酸序列的不影响功能的互补决定区和非互补决定区中进行。通常，不应在CDR3区域进行添加和缺失。
另一个实施方案涉及包含编码本文所述的TCR和嵌合共刺激受体的核酸的载体。
载体优选是质粒、穿梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或用于基因治疗的颗粒和/或载体。
“载体(vector)”是能够将核酸序列携带到合适的宿主细胞中的任何分子或组合物，在所述宿主细胞中可以发生所编码的多肽的合成。通常且优选地，载体是已使用本领域已知的重组DNA技术进行改造以掺入期望的核酸序列(例如本发明的核酸)的核酸。载体可以包括DNA或RNA和/或包含脂质体和/病毒颗粒。载体可以是质粒、穿梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或用于基因治疗的颗粒和/或载体。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含一种或多种选择性标记基因和本领域普通技术人员已知的其他遗传元件。载体优选是表达载体，其包含与允许表达所述核酸的序列可操作地连接的根据本发明的核酸。
优选地，载体是表达载体。更优选地，载体是逆转录病毒，更具体地是γ-逆转录病毒或慢病毒载体。
技术人员理解，嵌合共刺激受体序列和TCR链TCR-α和TCR-β链序列可以包含在一个核酸(例如载体)中。在这种情况下，序列与内部核糖体进入位点(IRES)序列或源自猪捷申病毒(P2A)或源自其他物种的2A肽序列(例如明脉扁刺蛾病毒2A肽(T2A)或口蹄疫病毒2A肽(F2A)连接(如Szymczak et al.:Development of 2A peptide-based strategies inthe design of multicistronic vectors中所述)，使得在病毒启动子的控制下在转导细胞内表达单信使RNA(mRNA)分子。
在具体的实施方案中，细胞可以包含编码本文所述的TCR和嵌合共刺激受体的核酸或包含所述核酸的载体。
术语“转染”和“转导”是可互换的，并且是指将外源核酸序列引入宿主细胞(例如真核宿主细胞)中的过程。值得注意的是，核酸序列的引入或转移不限于所提及的方法，而是可以通过许多手段中的任一种来实现，包括电穿孔、显微注射、基因枪递送、脂质转染、超转染以及所提及的逆转录病毒或其他适合转导或转染的病毒的感染。TCR的克隆和外源表达的方法例如描述于Engels等人(Relapse or eradication of cancer is predicted bypeptide-major histocompatibility complex affinity.Cancer Cell,23(4),516–26.2013)中。例如，Cribbs“simplified production and concentration of lentiviralvectors to achieve high transduction in primary human T cells”BMCBiotechnol.2013；13:98中描述了用慢病毒载体转导原代人T细胞。
在本发明上下文中描述和提供的包含本文描述和提供的核酸分子或载体的细胞优选能够稳定地或瞬时地(例如，稳定地)表达(组成型或条件性)抗原特异性TCR(例如PRAME特异性TCR或NY-ESO-1特异性TCR)和嵌合共刺激受体。通常可以通过任何方法用任何合适的核酸分子或载体转导或转化宿主细胞。在一个实施方案中，用逆转录病毒或慢病毒(例如，逆转录病毒)载体转导宿主细胞，所述载体包含编码如上所述本发明的融合蛋白或其部分(例如，ECD、TMD和/或ICD)的核酸分子。
在一些实施方案中，细胞(包括例如本文提及的靶标特异性免疫细胞或细胞群的细胞)是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。细胞可以是自然杀伤细胞或T细胞。优选地，细胞是T细胞。T细胞可以是CD4+或CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞样记忆T细胞。
干细胞样记忆T细胞(TSCM)是CD8+或CD4+T细胞的低分化亚群，其特点是能够自我更新和长期持续。一旦这些细胞在体内遇到它们的抗原，它们就会进一步分化为中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和终末分化效应记忆T细胞(TEMRA)，和一些剩余的静止状态的TSCM(Flynn et al.,Clinical&Translational Immunology(2014)。这些剩余的TSCM细胞表现出在体内建立持久免疫记忆的能力，因此被认为是用于过继性T细胞治疗的重要T细胞亚群(Lugli et al.,Nature Protocols 8,33–42(2013)Gattinoni et al.,Nat.Med.2011Oct；17(10):1290–1297)。可以使用免疫磁力选择来将T细胞库限制为干细胞记忆T细胞亚型，参见(Riddell et al.2014,Cancer Journal 20(2):141–44)。
药物组合物、药物治疗和试剂盒
本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含细胞，所述细胞包含抗原特异性TCR(例如NY-ESO-1特异性TCR或PRAME特异性TCR)和嵌合共刺激受体，或包含编码本文所述分子的核酸分子，所述核酸编码抗原特异性TCR(例如NY-ESO-1特异性TCR或PRAME特异性TCR)和嵌合共刺激受体，或一种组合物，其包含编码抗原特异性TCR(例如NY-ESO-1特异性TCR或PRAME特异性TCR)的核酸和编码嵌合共刺激受体的核酸，如本文所述的相应载体。
本发明的那些活性成分优选以与可接受的运载体(carrier)或运载体材料混合的剂量用于这样的药物组合物，使得可以治疗或至少减轻疾病。这样的组合物可以(除了活性组分和运载体之外)包括填充材料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域已知的其他材料。
术语“药学上可接受的”定义为无毒材料，其不干扰活性成分的生物活性的有效性。运载体的选择取决于应用。
药物组合物可以含有增强活性成分的活性或补充治疗的附加成分。此类附加成分和/或因子可以是药物组合物的一部分以实现协同效应或使不利或不期望的作用最小化。
本发明的活性成分的配制或制备以及应用/药物治疗的技术公开于"Remington'sPharmaceutical Sciences",Mack Publishing Co.,Easton,PA最新版中。合适的施用是肠胃外施用，例如肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、结内(intranodal)、腹膜内或瘤内注射。静脉内注射是患者的优选治疗方法。
根据一个优选的实施方案，所述药物组合物是输注或注射剂。
可注射组合物是药学上可接受的液体组合物，其包含至少一种活性成分，例如包含抗原特异性TCR(例如NY-ESO-1特异性TCR或PRAME特异性TCR)和嵌合共刺激受体的扩增T细胞群(例如对于待治疗患者为自体的或同种异体的)。活性成分通常溶解或混悬于生理学上可接受的运载体，并且组合物还可包含少量的一种或多种无毒辅助物质，例如乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等。可用于与本公开内容的融合蛋白一起使用的此类可注射组合物是常规的；合适的制剂是本领域普通技术人员所周知的。
通常，药物组合物包含至少一种药学上可接受的运载体。
因此，本发明的另一方面涉及本文所述的细胞、本文所述的组合物、本文所述的核酸和/或本文所述的载体，其用作药物。
一些实施方案涉及本文所述的细胞、本文所述的组合物、本文所述的核酸和/或载体用于在治疗癌症中使用。
在一个实施方案中，癌症是血液癌症或实体瘤。
血液癌症也称为血癌，其不形成实体瘤，因此分散在体内。血液癌症的例子有白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。实体瘤有两种主要类型：肉瘤和恶性上皮肿瘤(carcinoma)。肉瘤是例如血管、骨、脂肪组织、韧带、淋巴管、肌肉或腱的肿瘤。在一个具体的实施方案中，癌症是实体瘤。
在一个实施方案中，癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞恶性上皮肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞恶性上皮肿瘤、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结直肠癌、胃腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、粒细胞白血病和急性成淋巴细胞白血病、恶性上皮肿瘤、肉瘤或骨肉瘤。
包含如本文所述的修饰的T细胞的组合物可用于根据已知技术的过继免疫治疗的方法和组合物或其变体，这基于本公开内容对本领域技术人员来说是明白易懂的。
在一些实施方案中，通过首先从细胞的培养基中收获细胞，然后在适合于施用的介质和容器系统(“药学上可接受的”运载体)中洗涤和聚集细胞来配制治疗有效量的细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)，但也可以使用5％葡萄糖水溶液或林格氏乳酸盐。输注介质中可以补充有人血清白蛋白。
组合物中用于有效治疗的细胞数量通常大于10个细胞，并且最多达106个，最多达并包括108或109个细胞，并且可以多于1010个细胞。细胞的数量将取决于组合物预期的最终用途以及其中包含的细胞的类型。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为一升或更少，可以是500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。因此，所需细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且一般大于107个细胞/ml，一般为108个细胞/ml或更大。临床相关的免疫细胞的数量可分配到多次输注中，其累计等于或超过109、1010或1011个细胞。本文提供的药物组合物可以是各种形式，例如固体、液体、粉末、含水的或冻干形式。合适的药物运载体的实例是本领域已知的。此类运载体和/或添加剂可以通过常规方法配制并且可以以合适的剂量施用于受试者。稳定剂例如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可以防止组合物在体内降解。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、混悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
包含编码本文提供的抗原特异性TCR(例如NY-ESO-1特异性TCR或PRAME特异性TCR)和嵌合共刺激受体的核苷酸序列的病毒载体颗粒可以包装为试剂盒。试剂盒可以任选地包括一种或多种组分，例如使用说明书、装置和附加试剂，以及用于方法实施的组分，例如管、容器和注射器。示例性试剂盒可以包括编码本文提供的重组TCR和嵌合共刺激受体的核酸、重组多肽或病毒，并且可以任选地包括使用说明书、用于检测受试者体内病毒的装置、用于将组合物施用于受试者的装置，以及用于将组合物施用于受试者的装置。
本文还考虑了包含编码抗原特异性TCR(例如NY-ESO-1特异性TCR或PRAME特异性TCR)和嵌合共刺激受体的多核苷酸的试剂盒。本文还考虑了包含编码感兴趣序列(例如重组TCR)的病毒载体和任选地编码免疫检查点抑制剂的多核苷酸序列的试剂盒。
本文考虑的试剂盒还包括用于实施检测编码本文公开的TCR和/或嵌合共刺激受体中的任何一种或多种的多核苷酸的存在的方法的试剂盒。特别地，此类诊断试剂盒可以包括适当的扩增和检测引物组以及用于进行深度测序以检测编码本文公开的TCR和/或嵌合共刺激受体的多核苷酸的其他相关试剂。在进一步的实施方案中，本文的试剂盒可以包含用于检测本文公开的TCR和/或嵌合共刺激受体的试剂，例如抗体或其他结合分子。诊断试剂盒还可包含用于确定编码本文公开的TCR和/或嵌合共刺激受体的多核苷酸的存在或用于确定本文公开的TCR和/或嵌合共刺激受体的存在的说明书。试剂盒还可以包含说明书。说明书通常包括描述试剂盒中包含的组分以及施用方法的明确表述，施用方法包括用于确定受试者的适当的状态、适当的剂量量和适当的施用方法的方法。说明书还可以包括在治疗持续时间内监测受试者的指导。
本文提供的试剂盒还可以包括用于向受试者施用本文描述的组合物的装置。本领域已知的用于施用药物或疫苗的多种装置中的任意装置均可以包括在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如点眼药器。通常，用于施用试剂盒的病毒的装置将与试剂盒的病毒相容；例如，诸如高压注射装置的无针注射装置可以包含在具有不被高压注射破坏的病毒的试剂盒中，但通常不包含在具有会被高压注射破坏的病毒的试剂盒中。
细胞因子释放
同时表达TCR和共刺激分子(例如PD1-4BB)的细胞显示出增强的细胞因子释放。群体大量分泌的细胞因子/溶解蛋白尤其是IFN-γ、Gzm-B和IP-10、MIP-1β。
令人惊奇的是，与缺乏本文定义的嵌合共刺激受体的TCR-T细胞相比，表达本文定义的嵌合共刺激受体的免疫细胞，特别是TCR-T细胞显示出更高的多功能性。
转基因T细胞的更高的多功能性是指更高的体内功能和抗肿瘤活性，并与临床结果相关。
术语“多功能性”是指细胞分泌至少2种，例如至少3种、至少4种、至少5种蛋白质。
技术人员理解，在抗原特异性刺激后，例如当细胞与在MHC分子中呈递抗原的抗原呈递细胞接触时，细胞分泌蛋白质。
特别地，细胞群包含显著百分比的细胞，例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％、4.5％的多功能性细胞。
特别地，细胞群包含显著百分比的至少1％、优选至少1.5％、更优选1.75％的表达3种或更多种蛋白质的细胞。
在一些实施方案中，多功能强度指数为80或更高，优选90或更高，更优选100或更高。
多功能强度指数(PSI)是通过将各种分泌的细胞因子的强度与多功能性T细胞的百分比相乘来计算的。
特别地，我们可以证明表达本文定义的靶标特异性(例如PRAME或NY-ESO-1特异性)TCR和嵌合共刺激受体二者的细胞群包含分泌至少两种蛋白质，例如至少三种蛋白质、至少四种蛋白质、至少5种蛋白质的细胞。
因此，本发明的另一方面涉及通过指示T细胞群体是否包含显著比例的本文定义的多功能性T细胞来指示T细胞群体的效力的体外测定。
因此，一般来说，需要高效的靶标特异性T细胞，其分泌选自由效应蛋白、刺激性细胞因子和化学吸引性细胞因子组成的组的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种蛋白质。
特别地，本发明涉及指示免疫细胞群体的效力的体外测定，包括以下步骤
-测量第一细胞群体中多功能性免疫细胞的比例，
-评估免疫细胞的第一群体的效力并评估T细胞的第二群体的效力，其中与第二群体相比，第一群体中多功能性细胞的比例增加表明第一群体比第二群体具有更高的效力。
多功能性免疫细胞比例的测量可以通过技术(Isoplexis)进行。
因此，包含靶标特异性T细胞的T细胞群是所期望的，其中所述细胞群包含分泌选自由效应蛋白、刺激性细胞因子和化学吸引性细胞因子组成的组的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种蛋白质的T细胞。
效应蛋白可选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β、MIP-1α组成的组。
在一个实施方案中，刺激性细胞因子可选自由GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12组成的组。在一个实施方案中，刺激蛋白选自GM-CSF、IL-2和IL-8。在一个实施方案中，刺激蛋白是GM-CSF。
化学吸引性细胞因子可以选自IP-10和MIP-1β。
在一些实施方案中，分泌至少两种蛋白质的每个细胞分泌至少一种选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β、MIP-1α、GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IP-10和MIP-1β组成的组的蛋白质。在一些实施方案中，分泌至少两种蛋白质的每个细胞分泌至少一种选组由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、IL-2、IL-8、MIP-1β和IP-10组成的组的蛋白质。在一些实施方案中，分泌至少两种蛋白质的每个细胞分泌至少一种选自由IFN-γ、Gzm-B、GM-CSF、MIP-1β和IP-10组成的组的蛋白质。在一些实施方案中，分泌至少两种蛋白质的每个细胞分泌至少一种选自由IFN-γ、Gzm-B、GM-CSF组成的组的蛋白质。在一些实施方案中，分泌至少两种蛋白质的每个细胞分泌至少一种选自由IFN-γ、Gzm-B和IP-10组成的组的蛋白质。在一些实施方案中，分泌至少两种蛋白质的每个细胞分泌选至少一种自由IFN-γ和Gzm-B组成的组的蛋白质。
通常，细胞群不包含分泌显著量的IL-6和/或IL-10的细胞。
因此，一些实施方案涉及表达(A)本文定义的PRAME特异性TCR和(B)本文定义的嵌合共刺激受体的T细胞，其中所述T细胞分泌至少两种、至少三种、至少四种、至少五种选自由效应蛋白、刺激性细胞因子和化学吸引性细胞因子组成的组的蛋白质。
因此，一些实施方案涉及包含表达(A)本文定义的PRAME特异性TCR和(B)本文定义的嵌合共刺激受体的T细胞的细胞群，其中所述细胞群包含分泌至少两种、至少三种、至少四种、至少五种选自由效应蛋白、刺激性细胞因子和化学吸引性细胞因子组成的组的蛋白质的T细胞。
另一些实施方案涉及表达(A)本文定义的NY-ESO-1特异性TCR和(B)本文定义的嵌合共刺激受体的T细胞，其中所述T细胞分泌至少两种、至少三种、至少四种、至少五种选自由效应蛋白、刺激性细胞因子和化学吸引性细胞因子组成的组的蛋白质。
因此，一些实施方案涉及包含表达(A)本文定义的NY-ESO-1特异性TCR和(B)本文定义的嵌合共刺激受体的T细胞的细胞群，其中所述细胞群包含分泌至少两种、至少三种、至少四种、至少五种选自由效应蛋白、刺激性细胞因子和化学吸引性细胞因子组成的组的蛋白质的T细胞。
实验
实施例1：PD1-41BB的共表达不会改变TCR表达水平。
为了制备用于测试和表征转基因TCR T23.8-2.1-027-004(＝TCR)以及与PD1-41BB组合的TCR(＝TCR_PD1-41BB)的效应T细胞，从健康供体中分离了CD8+T细胞并在IL-7和IL-15存在的情况下用CD3/CD28抗体激活。经激活的细胞用含有TCR序列或与PD1-41BB偶联的TCR序列的逆转录病毒颗粒转导。以相同方式制备的未转导的CD8+T细胞(＝UT)用作对照。第14天，通过TCR-β链(TRBV09)和PD-1的抗体染色以及随后的流式细胞术分析确定转基因的转导效率和表达水平。
分析表明，构建体TCR(90.2％)和TCR_PD1-41BB(82％)均可实现高转导率(图1)。在未转导的(UT)和TCR转导的效应T细胞中无法检测到PD-1表达。然而，PD-1抗体与TCR_PD1-41BB转导的T细胞的结合表明与转基因TCR的表达相关的PD1-41BB的高水平表达。PD-41BB的共表达使得TCR表达水平与仅表达转基因TCR的效应T细胞中所测量的水平相当。这表明PD1-41BB转换受体和转基因TCR的共表达在T细胞中是可行的，并引起细胞表面的等摩尔表达。
实施例2：TCR转基因T细胞的功能性亲和力不因PD1-41BB的共表达而改变。
功能性亲和力是指单个非共价结合相互作用的多重亲和力的累积强度，例如转基因TCR和肽-MHC复合物。因此，效应T细胞的功能性亲和力可以作为肽敏感性的量度。具有高肽敏感性的TCR能够识别较低量的肽。为了研究PD1-41BB受体的共表达是否影响TCR转基因效应T细胞的肽敏感性，将它们与携带所需HLA(HLA-A2:01)并过度表达PD-L1的PD-L1转基因T2细胞(T2_PD-L1)共培养，以允许与PD1-41BB连接。
使T2_PD-L1细胞负载滴定量的SLLQHLIGL(SLL)-肽(10-5M至10-10M)，并与不表达转基因TCR(UT)、仅表达转基因TCR(TCR)或表达TCR和PD1-41BB的组合(TCR_PD1-41BB)的效应T细胞以E:T为1:1(20.000个细胞)进行共培养。共培养20小时后进行IFN-γELISA，用于评估效应T细胞在受到T2_PD-L1细胞呈递的不同肽浓度攻击时的反应性(图2)。最大IFN-γ释放的半数作为TCR转基因效应T细胞的功能性亲和力的量度。左图中描绘了绝对IFN-γ水平，而右图显示了计算出的相对值的非线性回归曲线。如通过绝对IFN-γ值所示，与仅表达转基因TCR的效应细胞相比，PD1-41BB的共表达增加了T细胞分泌的IFN-γ总量。然而，非线性回归曲线表明，无论PD1-41BB表达如何，总体功能性亲和力都是相当的。因此，即使存在配体PD-L1，TCR转基因T细胞的肽敏感性也不会因PD1-41BB转换受体的共表达而改变。
实施例3：HLA-A*02亚型识别不因PD1-41BB的共表达而改变。
HLA-A2蛋白可由不同的HLA-A*02亚等位基因(HLA-A*02:XX)编码，从而使得氨基酸序列略有不同。在HLA-A*02:01背景下识别其同源肽的特定TCR不一定识别另一个HLA-A*02亚等位基因所呈递的肽。为了定义可成功基于TCR的细胞疗法所需的遗传特征并潜在地扩大患者群体，在最常见的HLA-A*02亚等位基因的背景下对TCR进行了表征(图3)。
将不表达转基因TCR(UT)、仅表达转基因TCR(TCR)或表达TCR和PD1-41BB的组合(TCR_PD1-41BB)的T细胞与携带选定的HLA-A*02亚等位基因(HLA-A*02:XX)的类淋巴母细胞系(LCL；EBV转化的B细胞)以1:1的E:T比例(20.000个细胞/孔)共培养。为了允许被转基因TCR识别，LCL负载有10-5M SLL肽。共培养20小时后通过ELISA测定IFN-γ浓度。
TCR转基因效应T细胞以与A*02:01相似的水平识别由HLA-A*02亚等位基因A*02:02、A*02:04和A*02:09编码的MHC分子呈递的SLL肽。该识别模式并未因PD1-41BB的共表达而改变，并且与之前的结果一致。TCR转基因效应T细胞在4个不同的HLA-A*02亚等位基因背景下识别SLL肽，而与PD1-41BB的共表达无关。
实施例4：成功降低潜在的肽脱靶毒性的风险。
当TCR不仅识别特定肽(例如SLL肽)，而且还识别与原始肽具有高度序列同源性的其他肽时，就会出现脱靶毒性。为了鉴定与特定肽表现出高度序列相似性并可能被TCR识别的候选肽，可以使用计算工具，例如Expitope [Jaravine V,/>A,Raffegerst S,et al.Expitope 2.0:a tool to assess immunotherapeutic antigens for theirpotential cross-reactivity against naturally expressed proteins in humantissues.BMC Cancer 2017；17(1):892.]。该工具基于基因组、转录组和蛋白质组数据预测最可能错配(MM)的肽。通过应用Expitope />搜索，可以鉴定191种MM肽，其与特定SLL肽相比显示出最多达4个氨基酸差异。在使用负载有10-6M MM肽或SLL肽的PD-L1转基因T2细胞的预筛选共培养中，鉴定出33种可被TCR转导的T细胞识别的MM肽。由于高肽浓度的外源负载不一定转化为对内源加工和呈递肽的生理识别，因此当表位(肽)从体外转录RNA(ivtRNA)翻译出来并在PRAME阴性靶细胞系SNB-19中进行内源加工时，检查了这33种MM肽的诱导TCR转基因效应T细胞释放IFN-γ的潜力。将编码最多达5种MM肽的ivtRNA电穿孔至SNB-19细胞中。在预筛选的共培养中诱导TCR转基因T细胞中最高IFN-γ释放的MM肽(MM01、MM26、MM66)作为“midigene”构建体(约400bp)单独进行测试。其他全部MM肽均作为编码5种MM肽的小基因构建体(每种肽约90bp)进行测试。编码SLL肽的midigene构建体用作阳性对照。为了确认ivtRNA转染成功，所有RNA构建体都包含被阳性对照TCR识别的表位。在将转染的SNB-19细胞与TCR转基因效应T细胞共培养20小时后测定IFN-γ浓度。所有转染的SNB-19细胞均被阳性对照TCR识别，证实了成功的转染(图4)。用编码SLL肽的ivtRNA构建体转染的SNB-19细胞可被具有或不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞识别，而细胞内加工的MM肽均未被识别。因此，可以降低所有MM肽的风险，并且不太可能导致脱靶毒性。
实施例5：使用覆盖常见HLA的LCL文库未鉴定出脱靶毒性。
为了获得有关TCR转基因T细胞与其他HLA同种异型的潜在交叉反应性的信息，使用覆盖白种人群体中最常见的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因的类淋巴母细胞系(LCL)文库作为靶细胞。这些LCL表达多种内源性表达的肽，并且由于识别匹配的HLA-A2分子或最常见的其他HLA分子上呈递的内源性肽，有助于鉴定潜在的交叉反应性。检测到特定HLA同种异型的交叉识别将导致将具有相应HLA等位基因的患者排除在临床研究之外。将不表达转基因TCR(UT)、仅表达转基因TCR(TCR)或表达TCR和PD1-41BB的组合(TCR_PD1-41BB)的T细胞与36种不同的LCL以1:1的E:T比例共培养。共培养20小时后通过ELISA测定IFN-γ浓度。具有和不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞识别作为阳性对照的负载有SLL肽的HLA-A*02:01阳性LCL(图5)。仅与一种HLA-A*02:01LCL共培养而没有任何外源肽负载导致了IFN-γ的释放。由于通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)可以在该细胞系中检测到低水平的PRAME-RNA，因此对HLA-A2呈递的SLL肽的靶标识别很可能为轻微识别。其他LCL均未被表达转基因TCR或表达与PD1-41BB组合的转基因TCR的效应T细胞识别。因此，没有检测到因识别匹配的HLA-A2分子或最常见的其他HLA分子呈递的内源肽而引起的脱靶毒性。
实施例6：使用一组正常细胞未鉴定出脱靶毒性。
本实验的目的是评估具有或不具有PD1-41BB的PRAME特异性TCR转基因T细胞可能引起的潜在靶向/脱瘤和脱靶毒性。测试HLA-A*02:01阳性原代正常细胞和代表重要组织或器官的诱导多能干细胞(iPS)衍生细胞系是否被TCR转导的T细胞识别。根据各个靶标的特性，在共培养开始前1至7天，按照制造商指示的细胞密度接种细胞，并在平底孔中进行单层培养。通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)分析所有经测试的正常细胞的PRAME mRNA表达，以区分靶向/脱瘤与潜在的脱靶毒性。负载10-5M肽的靶细胞用作内部阳性对照(SLL肽)。共培养20小时后通过ELISA测定IFN-γ浓度。所有负载有特定SLL肽的正常细胞均被具有或不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞识别(图6)。在没有肽负载的情况下，只有成熟的树突状细胞(mDC)导致了IFN-γ水平高于未转导细胞的背景。由于mDC表达PRAME，该识别是由于对HLA-A2呈递的SLL肽的靶向识别。其他靶细胞均未被表达转基因TCR或表达与PD1-41BB组合的转基因TCR的效应T细胞识别。因此，没有观察到由内源肽识别引起的脱靶毒性。
实施例7：响应于表达PD-L1的肿瘤细胞，PD1-41BB增强IFN-γ的特异性释放。
肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞上的PD-1的相互作用通常会产生抑制信号，从而降低T细胞活性。当转基因TCR与其同源肽-MHC复合物结合时，PD1-41BB应逆转该信号并增加T细胞反应性。为了测试PD1-41BB共表达对TCR转基因T细胞反应性的影响，将具有或不具有PD1-41BB的效应T细胞与表达配体PD-L1的肿瘤细胞共培养。选择源自表达不同水平的特定抗原PRAME的各种适应症的肿瘤细胞进行这种共培养(图7A)。通过实时定量PCR测定肿瘤细胞系中的PRAME-RNA表达水平，并根据管家基因GUSB进行归一化。虽然10个肿瘤细胞系显示PRAME表达，但在4个肿瘤细胞系中未检测到PRAME mRNA的表达。然而，这4个PRAME阴性肿瘤细胞系表达PD1-41BB配体PD-L1，并用作阴性对照以确保PD1-41BB不会对转基因TCR-T细胞的特异性产生负面影响。PD-L1表达水平通过抗体染色和随后的流式细胞术分析来确定。为了实现稳定表达，一些肿瘤细胞系用PD-L1转导(TD)。虽然一些肿瘤细胞系表现出内源(end)PD-L1表达，但通过IFN-γ处理，可以在其他细胞系中诱导(ind)PD-L1表达。用于诱导表达的IFN-γ水平与识别其抗原的特定T细胞共培养实验中产生的水平相当。肿瘤细胞中的内源PD-L1表达水平通常可以通过IFN-γ处理进一步增加(end、ind)。
为了确定PD1-41BB共表达对细胞因子释放的影响，将具有和不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞与表达不同水平的PRAME和PD-L1的选定的HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系共培养(图7B)。未转导的(UT)T细胞用作对照。TCR转基因T细胞和肿瘤细胞以1:1的E:T比例(20.000个细胞)共培养，并且在共培养20小时后通过ELISA测定IFN-γ浓度。PD1-41BB的共表达增强了响应于PD-L1阳性肿瘤细胞的IFN-γ的释放，表明PD1-41BB的共表达提高了响应于PD-L1阳性肿瘤细胞的T细胞反应性。同时，未识别出显示有PD-L1表达的PRAME阴性肿瘤细胞，这表明PD1-41BB的共表达不会影响TCR转基因T细胞的特异性。仅当转基因TCR T细胞识别特定的PRAME抗原时，才会观察到细胞因子的释放增加。
实施例8：PD1-41BB增强针对3D肿瘤细胞球体的特异性细胞毒性反应。
为了确定PD1-41BB共表达是否对细胞毒性有有益影响，将TCR转基因T细胞与PD-L1阳性3D肿瘤细胞球体共培养(图8)。这些3维肿瘤细胞球体应作为实体瘤的体外模型。从实施例7介绍的肿瘤细胞组中，选择了三种HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系，其表现出不同水平的PRAME表达并表达红色荧光蛋白(NucLight-Red)。针对肿瘤球体的细胞毒性是通过在20天内使用Incucyte 或/>装置每4小时记录一次图像中的红色荧光的损失来确定的。为了研究PD1-41BB共表达对T细胞适应性和恢复力的影响，在第3、7、10、13和16天将新鲜肿瘤细胞球体转移到共培养板中。在此多次暴露于肿瘤细胞球体的挑战性环境中，PD1-41BB的表达对T细胞的效应功能和适应性具有有利影响。在利用肿瘤细胞球体的多次挑战过程中，与仅表达转基因TCR的效应T细胞相比，表达PD1-41BB的效应T细胞可以更好地控制肿瘤细胞生长。此外，无论PD1-41BB是否表达，PRAME阴性PD-L1阳性肿瘤细胞都不会被转基因TCR T细胞靶向。因此，共表达PD1-41BB的T细胞保持严格的抗原依赖性，同时针对PD-L1阳性3D肿瘤细胞球体的特异性细胞毒性反应增强。
实施例9：PD1-41BB增加响应于表达PD-L1的肿瘤细胞的TCR转基因T细胞的增殖。
通过响应于PD-L1阳性肿瘤细胞的细胞因子释放和细胞毒性的增强确定了共表达PD1-41BB的TCR转基因T细胞的效应功能和恢复力的增强(实施例7、8)。特别是，即使在肿瘤细胞球体多次攻击后，肿瘤细胞也能得到更好的控制，这表明T细胞在抑制性肿瘤细胞环境中的适应性有所增加，这也可能与T细胞更好的存活或增殖有关。PD1-41BB开关受体中包含的4-1BB信号传导结构域已知可提供共刺激，其提高了T细胞的增殖率(Choi et al.,4-1BBsignaling activates glucose and fatty acidmetabolism to enhance CD8+T cellproliferation；2017)。为了研究当PD1-41BB与其配体PD-L1相互作用时是否也能观察到这种T细胞扩增的增加，将TCR转基因T细胞与表达不同水平PRAME抗原的PD-L1阳性肿瘤细胞共培养(图9)。TCR转基因T细胞和HLA-A*02:01阳性肿瘤细胞系以1:1的E:T共培养，并且未转导的T细胞(UT)用作对照。为了确定T细胞在与PD-L1阳性肿瘤细胞共培养中的X倍扩增，在第7天收获细胞并使用X分析仪确定总细胞计数。基于流式细胞术的细胞计数允许容易的区分T细胞和可能仍存在于共培养物中的肿瘤细胞。正如预期的那样，未转导的T细胞不会响应于PRAME阳性肿瘤细胞而增殖，因为不存在扩增所需的特定TCR刺激。转基因TCR-T细胞响应于PD-L1阳性肿瘤细胞而增殖，其增殖方式似乎依赖于特定抗原PRAME的水平。与仅表达转基因TCR的T细胞相比，PD1-41BB的共表达也以抗原水平依赖性方式增强了响应于PD-L1阳性肿瘤细胞的增殖和存活。因此，TCR转基因T细胞中PD1-41BB的表达提高了增殖率，并有助于细胞在含有抑制性PD-L1受体的挑战性肿瘤细胞环境中更好地存活。
实施例10：共表达PD1-41BB的T细胞在体内表现出强的抗肿瘤反应性。
在体外试验中，PD1-41BB的共表达增加了TCR转基因T细胞的抗肿瘤效应功能。为了证实PD1-41BB在体内也对TCR转基因T细胞有这种积极作用，我们使用免疫缺陷(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)小鼠和PRAME/HLA-A*02:01阳性黑色素瘤细胞系MelA375开发了小鼠模型。为了模拟实体瘤的免疫抑制环境，用PD-L1转导MelA375细胞。皮下注射5x106PD-L1转基因MelA375一周后，小鼠出现了明显的肿瘤。此时，小鼠被分配到三个治疗组，每组六只小鼠。向小鼠注射10x106个(16x106总细胞)具有PD1-41BB的TCR阳性细胞(TCR_PD1-41BB)或不具有PD1-41BB的TCR阳性细胞(TCR)或等量的未转导T细胞(UT)。每周测量肿瘤体积2-3次。处死肿瘤体积超过1000mm3的小鼠。用未转导的T细胞处理的小鼠中的肿瘤迅速生长并在T细胞注射后2-4周内达到最大肿瘤体积(图10)。仅表达转基因TCR的效应T细胞对肿瘤生长几乎没有作用。只有共表达PD1-41BB的T细胞才能排斥肿瘤，并在治疗后3.5周后无肿瘤。这些数据表明，将显示出有效体外抗肿瘤反应性的PRAME特异性TCR与PD1-41BB组合得到了高效的T细胞，其可以消除体内模型中积极生长的肿瘤细胞。
实施例11：与缺乏PD1-41BB的靶向PRAME的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的靶向PRAME的TCR-T细胞显示出更高的多功能性。
使用技术(IsoPlexis)分析具有或不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞的单细胞多功能性(释放2种或更多种蛋白质)。所谓的“多功能性”T细胞分泌多种蛋白质(特别是细胞因子和其他效应蛋白，例如Gzm-B)，从而实现多种效应功能和高效的免疫反应。与PD-L1过表达的PRAME阳性MelA375肿瘤细胞系共培养24小时后，使用CD8微珠(MiltenyiBiotec)将单个CD8+T细胞与肿瘤细胞分离，并加载到IsoCode芯片(IsoPlexis)上。使用IsoLight装置和IsoSpeak软件(IsoPlexis)分析32种T细胞细胞因子/蛋白质的分泌。与缺乏PD1-41BB的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的TCR-T细胞显示出更高比例的多功能性T细胞(指分泌2种或更多种蛋白质的T细胞)(图11A)。多功能强度指数(PSI)是通过将各种分泌蛋白/细胞因子的强度与多功能性T细胞的百分比相乘来计算的。与缺乏PD1-41BB的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的TCR-T细胞显示出更高的PSI(图11B)。对释放的各种蛋白质/细胞因子的分类显示了效应蛋白(Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β)和刺激性细胞因子(GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12)对卓越的PSI的高度贡献，其次是化学吸引性细胞因子(IP-10、MIP-1β)。调节性细胞因子(IL-10、IL-22)和炎性细胞因子(IL-6、MCP-1)的释放程度较低。使用多功能热图对单细胞多蛋白/细胞因子释放进行详细分析表明，具有和不具有PD1-41BB的TCR-T细胞的多蛋白/细胞因子特征不同(图11C)。值得注意的是，表达PD1-41BB的TCR-T细胞含有更高比例的同时分泌4-10种蛋白质/细胞因子的单细胞，这表明与缺乏PD1-41BB的TCR-T细胞相比其具有更优越的功能。表达PD1-41BB的TCR-T细胞释放的主要蛋白质/细胞因子是Gzm-B、IFN-γ、IP-10和MIP-1β，其属于效应蛋白和化学吸引性细胞因子家族，因此表明TCR-T细胞具有高功能性和潜在的抗肿瘤活性，这实际上也在使用相同肿瘤细胞系(MelA375_PD-L1)的体内实验中观察到(图10)。
实施例12：与缺乏PD1-41BB的靶向NY-ESO-1的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的靶向NY-ESO-1的TCR-T细胞显示出更高的多功能性。
使用技术(IsoPlexis)分析具有或不具有PD1-41BB的TCR转基因T细胞的单细胞多功能性(释放2种或更多种蛋白质)。所谓的“多功能性”T细胞分泌多种蛋白质(特别是细胞因子和其他效应蛋白，例如Gzm-B)，从而实现多种效应功能和高效的免疫反应。与PD-L1过表达的NY-ESO-1阳性MelA375或Mel624.38肿瘤细胞系共培养20小时后，使用CD8微珠(Miltenyi Biotec)将单个CD8+T细胞与肿瘤细胞分离，并加载到IsoCode芯片(IsoPlexis)上。使用IsoLight装置和IsoSpeak软件(IsoPlexis)分析32种T细胞细胞因子/蛋白质的分泌。与缺乏PD1-41BB的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的TCR-T细胞显示出更高比例的多功能性T细胞(指分泌2种或更多种蛋白质的T细胞)(图12A)。多功能强度指数(PSI)是通过将各种分泌蛋白/细胞因子的强度与多功能性T细胞的百分比相乘来计算的。与缺乏PD1-41BB的TCR-T细胞相比，表达PD1-41BB的TCR-T细胞显示出更高的PSI(图12B)。
对释放的各种蛋白质/细胞因子的分类显示了效应蛋白(Gzm-B、IFN-γ、MIP-1a、穿孔素、TNF-α、TNF-β)和刺激性细胞因子(GM-CSF、IL-12、IL-2、IL-5、IL-8、IL-9)对卓越的PSI的高度贡献，其次是化学吸引性细胞因子(IP-10、MIP-1β、RANTES)。调节性细胞因子(IL-4、IL-10、IL-22、sCD137、TGF-β1)和炎性细胞因子(CP-1、IL-17F、IL8)的释放程度较低。使用多功能热图对单细胞多蛋白/细胞因子释放进行详细分析表明，具有和不具有PD1-41BB的TCR-T细胞的多蛋白/细胞因子特征不同(图1C)。值得注意的是，表达PD1-41BB的TCR-T细胞含有更高比例的同时分泌2-6种蛋白质/细胞因子的单细胞，这表明与缺乏PD1-41BB的TCR-T细胞相比其具有更优越的功能。表达PD1-41BB的TCR-T细胞释放的主要蛋白质/细胞因子是Gzm-B、IFN-γ、GM-CSF和MIP-1β，其属于效应蛋白和刺激性细胞因子家族，因此表明TCR-T细胞具有高功能性和潜在的抗肿瘤活性。
本申请描述了以下项目：
项目1：一种细胞，包含：
(A)PRAME特异性T细胞受体(TCR)，其包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和
(B)嵌合共刺激受体，其包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
项目2：根据项目1所述的细胞，其中所述TCR能够结合具有氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分的PRAME肽，或其HLA-A2结合形式。
项目3：根据项目2所述的细胞，其中所述HLA-A2是HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04或HLA-A*02:09编码的分子。
项目4：根据项目1至3中任一项所述的细胞，其中与序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分或其HLA-A2结合形式的结合诱导TCR转导或转染的细胞分泌IFN-γ。
项目5：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述TCR包含具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的TCRα可变区和具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ可变区。
项目6：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述TCR包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的TCRα可变区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的TCRβ可变区。
项目7：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述TCR包含：
具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列的TCRα恒定区和具有与SEQ IDNO:11至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ恒定区。
项目8：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述TCR包含，
具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的TCRα恒定区和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的TCRβ恒定区。
项目9：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中含有源自PD-1的多肽的胞外结构域包括SEQ ID NO:28的序列。
项目10：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域包括SEQ ID NO:32的序列。
项目11：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述跨膜结构域源自PD-1。
项目12：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中含有源自PD-1的多肽的跨膜结构域包括SEQ ID NO:30的序列。
项目13：根据前述项目中任一项所述的细胞，其中所述嵌合共刺激受体包括SEQID NO:26的序列。
项目14：一种组合物，其包含
-编码PRAME特异性TCR的核酸，所述TCR包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和
-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
项目15：一种核酸，其包含
-编码PRAME特异性TCR的核酸，所述TCR包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和
-编码嵌合共刺激受体的核酸，所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域。
项目16：根据项目14所述的组合物或根据项目15所述的核酸，其中所述TCR能够结合具有氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分的PRAME肽，或其HLA-A2结合形式。
项目17：根据项目16所述的组合物或核酸，其中所述HLA-A2是HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04或HLA-A*02:09编码的分子。
项目18：根据项目14和16至17所述的组合物或根据项目15至17所述的核酸，其中与序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分或其HLA-A2结合形式的结合诱导TCR转导或转染的细胞分泌IFN-γ。
项目19：根据项目14和16至18所述的组合物或根据项目15至18所述的核酸，其中所述TCR包含具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列的TCRα可变区和具有与SEQID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ可变区。
项目20：根据项目14和15至19所述的组合物或根据项目15至19所述的核酸，其中所述TCR包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的TCRα可变区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的TCRβ可变区。
项目21：根据项目14和15至20所述的组合物或根据项目15至20所述的核酸，其中所述TCR包含具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列的TCRα恒定区和具有与SEQID NO:11至少80％相同的氨基酸序列的TCRβ恒定区。
项目22：根据项目14和16至21所述的组合物或根据项目15至21所述的核酸，其中所述TCR包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的TCRα恒定区和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的TCRβ恒定区。
项目23：根据项目14和16至22所述的组合物或根据项目15至22所述的核酸，其中含有源自PD-1的多肽的胞外结构域包括SEQ ID NO:28的序列。
项目24：根据项目14和16至23所述的组合物或根据项目15至23所述的核酸，其中含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域包括SEQ ID NO:32的序列。
项目25：根据项目14和16至24所述的组合物或根据项目15至24所述的核酸，其中所述跨膜结构域源自PD-1。
项目26：根据项目14和16至25所述的组合物或根据项目15至25所述的核酸，其中含有源自PD-1的多肽的跨膜结构域包括SEQ ID NO:30的序列。
项目27：根据项目14和16至26所述的组合物或根据项目15至26所述的核酸，其中所述嵌合共刺激受体包括SEQ ID NO:26的序列。
项目28：一种载体，其包含根据项目15至27所述的核酸。
项目29：一种细胞，其包含根据项目14和16至27所述的组合物、根据项目15至27所述的核酸或根据项目28所述的载体。
项目30：根据项目1至13和项目29所述的细胞，其中所述细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。
项目31：根据项目1至13和项目29至30中任一项的细胞，其中所述细胞是T细胞。
项目32：药物组合物，其包含根据项目1至13所述的细胞、根据项目29至31所述的细胞、根据项目14和16至27所述的组合物、根据项目15至27所述的核酸和/或根据项目28所述的载体。
项目33：根据项目20所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少一种药学上可接受的运载体。
项目34：根据项目1至13所述的细胞、根据项目29至31所述的细胞、根据项目14和16至27所述的组合物、根据项目15至27所述的核酸和/或根据项目28所述的载体，其用作药物。
第35项：根据项目1至13所述的细胞、根据项目29至31所述的细胞、根据项目14和16至27所述的组合物、根据项目15至27所述的核酸和/或根据项目28所述的载体，用于在治疗癌症中使用。
项目36：根据项目1至13所述的细胞、根据项目29至31所述的细胞、根据项目14和16至27所述的组合物、根据项目15至27所述的核酸和/或根据项目28所述的载体，用于在治疗癌症中使用，其中所述癌症优选选自由以下组成的组：黑色素瘤、膀胱癌、结肠癌和乳腺腺癌、肉瘤、前列腺癌、子宫癌、葡萄膜癌、葡萄膜黑色素瘤、鳞状头颈癌、滑膜癌、尤因氏肉瘤、三阴性乳腺癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、结直肠癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、骨髓性白血病和急性淋巴细胞白血病，优选地其中所述癌症选自由NSCLC、SCLC、乳腺癌、卵巢癌或结直肠癌、肉瘤或骨肉瘤组成的组。
项目37:一种细胞群，其包含表达以下的细胞：
(A)PRAME特异性T细胞受体(TCR)，其包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和
(B)嵌合共刺激受体，其包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
其中所述细胞群包含分泌至少两种蛋白质的细胞。
项目38：根据项目37所述的细胞群，其中所述细胞群包含分泌至少三种蛋白质的细胞。
项目39：根据项目38所述的细胞群，其中所述细胞群包含分泌至少四种蛋白质的细胞。
项目40：根据项目39所述的细胞群，其中所述细胞群包含分泌至少五种蛋白质的细胞。
项目41：根据项目40所述的细胞群，其中所述蛋白质选自由效应蛋白、刺激性细胞因子和化学吸引性细胞因子组成的组。
项目42：根据项目41所述的细胞群，其中所述效应蛋白选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β组成的组。
项目43：根据项目41或42所述的细胞群，其中所述刺激性细胞因子选自由GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12组成的组。
项目44：根据项目41至43所述的细胞群，其中所述化学吸引性细胞因子选自IP-10和MIP-1β。
项目45：根据前述项目中任一项所述的细胞群，其中每个分泌至少两种蛋白质的细胞分泌至少一种选自由IFN-γ、Gzm-B和IP-10组成的组的蛋白质。
项目46：根据前述项目中任一项所述的细胞群，其中每个分泌至少两种蛋白质的细胞分泌至少一种选自由IFN-γ和Gzm-B组成的组的蛋白质。
项目47：根据前述项目中任一项所述的细胞群，其中所述TCR能够结合具有氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分的PRAME肽、优选其HLA-A2结合形式。
项目48：根据前述项目中任一项所述的细胞群，其中所述含有源自PD-1的多肽的胞外结构域包括SEQ ID NO:28的序列并且
其中所述含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域包括SEQ ID NO:32的序列。
项目49：根据前述项目中任一项所述的细胞群，其中所述跨膜结构域源自PD-1，其中优选地所述含有源自PD-1的多肽的跨膜结构域包括SEQ ID NO:30的序列，优选地其中所述嵌合共刺激受体包括SEQ ID NO:26的序列。
项目50：根据前述项目中任一项所述的细胞群，用于在治疗癌症中使用。
Claims (53)
1.一种细胞群，包含表达以下的细胞：
(A)抗原特异性TCR，和
(B)嵌合共刺激受体，
其中所述细胞群包含分泌至少两种蛋白质的细胞。
2.根据权利要求2所述的细胞群，其中所述嵌合共刺激受体包含：
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
其中所述细胞群包含分泌至少两种蛋白质的细胞。
3.根据权利要求2所述的细胞群，其中所述嵌合共刺激受体包含：
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-源自PD-1的跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
其中所述细胞群包含分泌至少两种蛋白质的细胞。
4.根据权利要求3所述的细胞群，包含表达以下的细胞：
(A)NY-ESO-1/LAGE-1特异性TCR，其包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:37的序列的CDR3；和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:40的序列的CDR3；和
(B)嵌合共刺激受体，其包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
其中所述细胞群包含分泌至少两种蛋白质的细胞。
5.根据权利要求1至3所述的细胞群，包含表达以下的细胞：
(A)PRAME特异性T细胞受体(TCR)，其包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和
(B)嵌合共刺激受体，其包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
其中所述细胞群包含分泌至少两种蛋白质的细胞。
6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞群，其中所述细胞群包含分泌至少三种蛋白质的细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞群，其中所述细胞群包含分泌至少四种蛋白质的细胞。
8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞群，其中所述细胞群包含分泌至少五种蛋白质的细胞。
9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞群，其中所述蛋白质选自效应蛋白、刺激性细胞因子和化学吸引性细胞因子的组。
10.根据权利要求9所述的细胞群，其中所述效应蛋白选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β、MIP-1α组成的组。
11.根据权利要求10所述的细胞群，其中所述效应蛋白选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β组成的组。
12.根据权利要求9至11所述的细胞群，其中所述刺激性细胞因子选自由GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12组成的组。
13.根据权利要求9至12所述的细胞群，其中所述刺激性细胞因子选自由GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12组成的组。
14.根据权利要求9至13所述的细胞群，其中所述化学吸引性细胞因子选自IP-10和MIP-1β。
15.根据前述权利要求中任一项所述的细胞群，其中所述蛋白质选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β、MIP-1α、GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IP-10和MIP-1β组成的组。
16.根据前述权利要求中任一项所述的细胞群，其中所述蛋白质选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、IL-2、IL-8、MIP-1β和IP-10组成的组。
17.根据前述权利要求中任一项所述的细胞群，其中所述蛋白质选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、IL-2、MIP-1β组成的组。
18.根据前述权利要求中任一项所述的细胞群，其中所述蛋白质选自由IFN-γ、Gzm-B和IP-10组成的组。
19.根据前述权利要求中任一项所述的细胞群，其中所述蛋白质选自由IFN-γ和Gzm-B组成的组。
20.根据权利要求4和6至19中任一项所述的细胞群，其中所述TCR能够结合具有SEQ IDNO:34所示氨基酸序列或其部分的NY-ESO肽、优选其HLA-A2结合形式。
21.根据权利要求20所述的细胞群，其中所述HLA-A2是HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04或HLA-A*02:09编码的分子，优选HLA-A*2:01编码的分子。
22.根据权利要求5至19中任一项所述的细胞群，其中所述TCR能够结合具有氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分的PRAME肽、优选其HLA-A2结合形式。
23.根据权利要求22所述的细胞群，其中所述HLA-A2是HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04或HLA-A*02:09编码的分子。
24.根据权利要求3至23中任一项所述的细胞群，其中所述含有源自PD-1的多肽的胞外结构域包括SEQ ID NO:28的序列，并且
其中所述含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域包括SEQ ID NO:32的序列。
25.根据权利要求3至24中任一项所述的细胞群，其中所述跨膜结构域源自PD-1，其中优选地所述含有源自PD-1的多肽的跨膜结构域包括SEQ ID NO:30的序列，优选地其中所述嵌合共刺激受体包括SEQ ID NO:26的序列。
26.根据前述权利要求中任一项所述的细胞群，用于在治疗癌症中使用。
27.一种靶标特异性免疫细胞，表达：
(A)抗原特异性TCR，和
(B)嵌合共刺激受体，
其中所述靶标特异性免疫细胞分泌至少两种蛋白质。
28.根据权利要求27所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
其中所述靶标特异性免疫细胞分泌至少两种蛋白质。
29.根据权利要求28所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述嵌合共刺激受体包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-源自PD-1的跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
其中所述靶标特异性免疫细胞分泌至少两种蛋白质。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述靶标特异性免疫细胞表达：
(A)NY-ESO-1/LAGE-1特异性TCR，其包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:37的序列的CDR3；和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:40的序列的CDR3；
(B)嵌合共刺激受体，其包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
其中所述靶标特异性免疫细胞分泌至少两种蛋白质。
31.根据权利要求27至29中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述靶标特异性免疫细胞表达：
(A)PRAME特异性T细胞受体(TCR)，其包含
-TCRα链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和
-TCRβ链，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和
(B)嵌合共刺激受体，其包含
-含有源自PD-1的多肽的胞外结构域，
-跨膜结构域，和
-含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域，
其中所述靶标特异性免疫细胞分泌至少两种蛋白质。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述靶标特异性免疫细胞分泌至少三种蛋白质。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述靶标特异性免疫细胞分泌至少四种蛋白质。
34.根据权利要求27至33中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述靶标特异性免疫细胞分泌至少五种蛋白质。
35.根据权利要求27至34中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述蛋白质选自效应蛋白、刺激性细胞因子和化学吸引性细胞因子的组。
36.根据权利要求35所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述效应蛋白选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β、MIP-1α组成的组。
37.根据权利要求36所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述效应蛋白选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β组成的组。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述刺激性细胞因子选自由GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12组成的组。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述刺激性细胞因子选自由GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12组成的组。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述化学吸引性细胞因子选自IP-10和MIP-1β。
41.根据权利要求27至40中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述蛋白质选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β、MIP-1α、GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IP-10和MIP-1β组成的组。
42.根据权利要求27至41中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述蛋白质选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、IL-2、IL-8、MIP-1β和IP-10组成的组。
43.根据权利要求27至42中任一项所述的细胞群，其中所述蛋白质选自由Gzm-B、IFN-γ、穿孔素、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、IL-2、MIP-1β组成的组。
44.根据权利要求27至43中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述蛋白质选自由IFN-γ、Gzm-B和IP-10组成的组。
45.根据权利要求27至44中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述蛋白质选自由IFN-γ和Gzm-B组成的组。
46.根据权利要求30和32至45中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述TCR能够结合具有SEQ ID NO:34所示氨基酸序列或其部分的NY-ESO肽、优选其HLA-A2结合形式。
47.根据权利要求46所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述HLA-A2是HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04或HLA-A*02:09编码的分子，优选HLA-A*2:01编码的分子。
48.根据权利要求31至45中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述TCR能够结合具有氨基酸序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)或其部分的PRAME肽、优选其HLA-A2结合形式。
49.根据权利要求48所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述HLA-A2是HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:04或HLA-A*02:09编码的分子。
50.根据权利要求29至49中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述含有源自PD-1的多肽的胞外结构域包括SEQ ID NO:28的序列，并且
其中所述含有源自4-1BB的多肽的胞内结构域包括SEQ ID NO:32的序列。
51.根据权利要求29至50中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述跨膜结构域源自PD-1，其中优选地所述含有源自PD-1的多肽的跨膜结构域包括SEQ ID NO:30的序列，优选地其中所述嵌合共刺激受体包括SEQ ID NO:26的序列。
52.根据权利要求27至51中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，其中所述靶标特异性免疫细胞是淋巴细胞。
53.根据权利要求27至52中任一项所述的靶标特异性免疫细胞，用于在治疗癌症中使用。
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