CN118339165A - 抗体-药物缀合物及其使用方法 - Google Patents

抗体-药物缀合物及其使用方法 Download PDF

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CN118339165A CN202280064079.7A CN202280064079A CN118339165A CN 118339165 A CN118339165 A CN 118339165A CN 202280064079 A CN202280064079 A CN 202280064079A CN 118339165 A CN118339165 A CN 118339165A
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P·M·德拉克
S·丘普拉科夫
A·O·奥古科亚
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Abstract

本公开提供了抗体缀合物(例如，抗体‑药物缀合物(ADC))。本公开还涵盖产生此类缀合物的方法，以及使用所述缀合物的方法。还提供了包含本公开的所述ADC的组合物，所述组合物在一些情况下包含药物组合物。在某些方面，提供了使用所述ADC的方法，所述方法包含向个体施用治疗有效量的本公开的所述ADC。

Description

抗体-药物缀合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年7月30日提交的美国临时申请第63/227,666号、于2022年3月23日提交的美国临时申请第63/322,914号和于2022年5月23日提交的美国临时申请第63/344,932号的优先权权益，所述美国临时申请中的每一个申请的公开内容通过引用并入本文。
背景技术
蛋白质-小分子治疗缀合物领域取得了巨大进展，提供了许多临床有益的药物，有望在未来几年提供更多药物。蛋白质缀合物治疗剂可以提供若干种优势，由于例如特异性，功能的多样性和相对较低的脱靶活性，产生较少的副作用。蛋白质的化学修饰可以通过使所述蛋白质更有效、稳定或多模式来扩展这些优势。
许多标准化学转化通常用于创建和操纵蛋白质的翻译后修饰。有多种能够选择性地修饰某些氨基酸的侧链的方法。例如，可以通过用水溶性碳二亚胺试剂进行初始活化以及随后与胺反应来靶向羧酸侧链(天冬氨酸和谷氨酸)。类似地，可以通过使用活化酯或异硫氰酸酯来靶向赖氨酸，并且可以用马来酰亚胺和α-卤代羰基来靶向半胱氨酸硫醇。
创建化学改变的蛋白质治疗剂或试剂的一个重大障碍是生产具有生物活性的同质形式的蛋白质。药物或可检测标记与多肽的缀合可能难以控制，产生缀合物的异质混合物，其所连接的药物分子的数量和化学缀合的位置不同。在一些情况下，可能期望使用合成有机化学工具来控制与多肽缀合的缀合位点和/或药物或可检测标记，以引导在多肽上精确且选择性地形成化学键。
发明内容
本公开提供了抗体缀合物(例如，抗体-药物缀合物(ADC))。本公开还涵盖产生此类缀合物的方法，以及使用所述缀合物的方法。还提供了包含本公开的所述ADC的组合物，所述组合物在一些情况下包含药物组合物。在某些方面，提供了使用所述ADC的方法，所述方法包含向个体施用治疗有效量的本公开的所述ADC。
附图说明
图1小图A示出了使用标准分子生物学技术沿抗体主链在期望位置处插入的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)识别序列。表达时，真核细胞内源性FGE会催化共有序列中的Cys转化为甲酰甘氨酸残基(fGly)。图1小图B示出了携带醛部分(每个抗体2个)的与肼基-异皮克泰-斯彭格勒(Hydrazino-iso-Pictet-Spengler，HIPS)接头和有效载荷反应以生成位点特异性缀合的ADC的抗体。图1小图C示出了HIPS化学，所述HIPS化学通过中间体肼离子进行，随后用亲核吲哚进行分子内烷基化，以生成稳定的C-C键。
图2示出了根据本公开的实施例的给药后第5天大鼠体内的淋巴细胞群体的图。
图3示出了根据本公开的实施例的给药后第5天大鼠体内的循环天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平的图。
图4示出了根据本公开的实施例的给药后第5天大鼠体内的循环丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的图。
图5示出了根据本公开的实施例的给药后第5天大鼠体内的红细胞计数的图。
图6示出了根据本公开的实施例的给药后第5天大鼠体内的血红蛋白水平的图。
图7示出了根据本公开的实施例的给药后第5天大鼠体内的血细胞比容水平的图。
图8示出了根据本公开的实施例的在第7天用单剂量的ADC进行的第一次Granta异种移植物研究的图。
图9示出了根据本公开的实施例的在第0天用单个2mg/kg剂量的ADC进行的第二次Granta异种移植物研究的图。与贝多汀(vedotin)缀合物相比，使用内部标签58Q和91N在DAR的一半时提供了优越的功效。
图10示出了根据本公开的实施例的重复给药媒剂或ADC的大鼠体内的循环嗜中性粒细胞计数的图。
图11示出了根据本公开的实施例的重复给药媒剂或ADC的大鼠体内的循环单核细胞计数的图。
图12示出了根据本公开的实施例的重复给药媒剂或ADC的大鼠体内的红细胞计数的图。
图13示出了根据本公开的实施例的重复给药媒剂或ADC的大鼠体内的血红蛋白水平的图。
图14示出了根据本公开的实施例的重复给药媒剂或ADC的大鼠体内的血细胞比容水平的图。
图15示出了根据本公开的实施例的重复给药大鼠交叉反应性粘连蛋白-4ADC的大鼠体内的临床观察结果的图。箭头表示给药天数。在给药化合物5缀合物的动物体内没有观察结果，而贝多汀给药组的临床观察结果在第17天平均为2.5，并且以动物的死亡而告终。
图16A描绘了示出用于产生醛标记的Ig多肽的可能的修饰位点的位点图。上部序列是IgG1轻链多肽(SEQ ID NO:1)的保守区的氨基酸序列，并且示出了Ig轻链中可能的修饰位点；下部序列是Ig重链多肽(SEQ ID NO:2)(GenBank登录号AAG00909)的保守区的氨基酸序列，并且示出了Ig重链中可能的修饰位点。重链和轻链编号基于全长重链和轻链。
图16B-16C描绘了IgG1(SEQ ID NO:3；GenBank P01857.1)、IgG2(SEQ ID NO:4；GenBank P01859.2)、IgG3(SEQ ID NO:5；GenBank P01860.2)、IgG4(SEQ ID NO:6；GenBankAAB59394.1)与IgA(SEQ ID NO:7；GenBank AAT74070)的智人(homo sapiens)免疫球蛋白重链恒定区的比对，示出了可以在免疫球蛋白重链中提供醛标签的修饰位点。重链和轻链编号基于全重链和轻链。
图16D描绘了免疫球蛋白轻链恒定区的比对，示出了可以在免疫球蛋白轻链中提供醛标签的修饰位点。Seq1＝智人κ轻链恒定区；GenBank CAA75031.1；SEQ ID NO:8。Seq2＝智人κ轻链恒定区；GenBank BAC0168.1；SEQ ID NO:9。Seq3＝智人λ轻链恒定区；GenBankCAA75033；SEQ ID NO:10。Seq4＝小家鼠(Mus musculus)轻链恒定区；GenBankAAB09710.1；SEQ ID NO:11。Seq5＝褐家鼠(Rattus norvegicus)轻链恒定区；GenBankAAD10133；SEQ ID NO:12。
图17示出了在第0天用单次静脉内剂量的所列出的抗CD30 ADC进行的L-82异种移植物研究的图。VH4/VL4化合物8(RED-601)使用内部91N标签，并且与安适利(Adcetris)相比递送一半的有效载荷剂量。在50％ADC给药(1.5mg/kg)和同等给药(3mg/kg)下，与安适利相比，VH4/VL4化合物8同等有效，所有组显示出8只小鼠/组中有8个完全应答。单独的VH4/VL4抗体具有最小活性。
图18示出了在第0天用单次静脉内剂量的所列出的抗CD30 ADC进行的Karpas299异种移植物研究的图。VH4/VL4化合物8(RED-601)使用内部91N标签，并且与安适利相比递送一半的有效载荷剂量。在50％ADC给药(1.5mg/kg)和同等给药(3mg/kg)时，与安适利相比，VH4/VL4化合物8给出5/6和6/6完全应答，所述安适利给出6/6完全应答，尽管与VH4/VL4化合物8相比有效载荷量是其有效载荷量的2倍。单独的VH4/VL4抗体具有最小活性。
图19示出了在第0天用单次2.5或7.5mg/kg静脉内剂量的所列出的抗粘连蛋白-4ADC进行的NCI-H1781异种移植物研究的图。VH4/VL1化合物8(RED-601)和VH4/VL5化合物8两者都使用内部91N标签，并且与Padcev相比递送一半的有效载荷剂量。同种型对照ADC具有最低活性。
图20示出了来自多剂量非GLP大鼠毒理学研究2号的大鼠血浆样品的毒代动力学分析。分析证实了给药水平，并且显示出维恩妥尤单抗(enfortumab)化合物5缀合物相对于维恩妥尤单抗贝多汀缀合物的改进的体内稳定性。
定义
“烷基”是指具有1至10个碳原子以及如1至6个碳原子、或1至5个、或1至4个或1至3个碳原子的单价饱和脂肪族烃基。举例来说，此术语包含直链和支链烃基，如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、异丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、异丁基((CH3)2CHCH2-)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)和新戊基((CH3)3CCH2-)。
术语“经取代的烷基”是指如本文所定义的烷基，其中烷基链中的一个或多个碳原子(除了C1碳原子)已经任选地被如-O-、-N-、-S-、-S(O)n-(其中n是0至2)、-NR-(其中R是氢或烷基)等杂原子替代并且具有1至5个选自由以下组成的组的取代基：烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫代、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基和-NRaRb，其中R'和R"可以是相同或不同的并且选自氢，任选地经取代的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基和杂环。
“亚烷基”是指优选具有1至6个、并且更优选地1至3个碳原子的二价脂肪族烃基，其为直链或支链，并且任选地被选自-O-、-NR10-、-NR10C(O)-、-C(O)NR10-等的一个或多个基团中断。举例来说，此术语包含亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、正亚丙基(-CH2CH2CH2-)、异亚丙基(-CH2CH(CH3)-)、(-C(CH3)2CH2CH2-)、(-C(CH3)2CH2C(O)-)、(-C(CH3)2CH2C(O)NH-)、(-CH(CH3)CH2-)等。
“经取代的亚烷基”是指具有被如下“经取代的”定义中针对碳所描述的取代基替代的1至3个氢的亚烷基。
术语“烷烃”是指如本文所定义的烷基和亚烷基。
术语“烷基氨基烷基”、“烷基氨基烯基”和“烷基氨基炔基”是指基团R'NHR"-其中R'是如本文所定义的烷基，并且R"是如本文所定义的亚烷基、亚烯基或亚炔基。
术语“烷芳基”或“芳烷基”是指基团-亚烷基-芳基和-经取代的亚烷基-芳基，其中亚烷基、经取代的亚烷基和芳基是本文所定义的。
“烷氧基”是指基团–O-烷基，其中烷基如所本文定义的。举例来说，烷氧基包含甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正苯氧基等。术语“烷氧基”也指基团烯基-O-、环烷基-O-、环烯基-O-和炔基-O-，其中烯基、环烷基、环烯基和炔基如本文所定义的。
术语“经取代的烷氧基”是指基团经取代的烷基-O-、经取代的烯基-O-、经取代的环烷基-O-、经取代的环烯基-O-和经取代的炔基-O-，其中经取代的烷基、经取代的烯基、经取代的环烷基、经取代的环烯基和经取代的炔基如本文所定义的。
术语“烷氧基氨基”是指基团–NH-烷氧基，其中烷氧基是本文所定义的。
术语“卤代烷氧基”是指基团烷基-O-，其中烷基上的一个或多个氢原子已被卤基取代并且包含，举例来说，如三氟甲氧基等基团等等。
术语“卤代烷基”是指如以上描述的经取代的烷基，其中烷基上的一个或多个氢原子已被卤基取代。此类基团的实例包含但不限于氟烷基，如三氟甲基、二氟甲基、三氟乙基等。
术语“烷基烷氧基”是指基团-亚烷基-O-烷基、亚烷基-O-经取代的烷基、经取代的亚烷基-O-烷基和经取代的亚烷基-O-经取代的烷基，其中烷基、经取代的烷基、亚烷基和经取代的亚烷基如本文所定义的。
术语“烷基硫代烷氧基”是指基团-亚烷基-S-烷基、亚烷基-S-经取代的烷基、经取代的亚烷基-S-烷基和经取代的亚烷基-S-经取代的烷基，其中烷基、经取代的烷基、亚烷基和经取代的亚烷基如本文所定义的。
“烯基”是指具有2至6个碳原子并且优选地2至4个碳原子，并且具有至少1个并且优选地1至2个双键不饱和位点的直链或支链烃基。举例来说，此术语包含双-乙烯基、烯丙基和丁-3-烯-1-基。此术语内包含顺式和反式异构体或这些异构体的混合物。
术语“经取代的烯基”是指具有1至5个取代基或1至3个取代基的如本文所定义的烯基，所述取代基选自烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫代、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-经取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-经取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基。
“炔基”是指具有2至6个碳原子并且优选地2至3个碳原子，并且具有至少1个并且优选地1至2个三键不饱和位点的直链或支链单价烃基。此类炔基的实例包含乙炔基(-C≡CH)和炔丙基(-CH2C≡CH)。
术语“经取代的炔基”是指具有1至5个取代基或1至3个取代基的如本文所定义的炔基，所述取代基选自烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫代、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、SO-烷基、-SO-经取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-经取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基。
“炔氧基”是指基团–O-炔基，其中炔基如本文所定义的。举例来说，炔氧基包含乙炔氧基、丙炔氧基等。
“酰基”是指基团H-C(O)-、烷基-C(O)-、经取代的烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、经取代的烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、经取代的炔基-C(O)-、环烷基-C(O)-、经取代的环烷基-C(O)-、环烯基-C(O)-、经取代的环烯基-C(O)-、芳基-C(O)-、经取代的芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-、经取代的杂芳基-C(O)-、杂环基-C(O)-和经取代的杂环基-C(O)-，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环以及经取代的杂环如本文所定义的。例如，酰基包含“乙酰基”CH3C(O)-。
“酰氨基”是指基团–NR20C(O)烷基、-NR20C(O)经取代的烷基、N R20C(O)环烷基、-NR20C(O)经取代的环烷基、-NR20C(O)环烯基、-NR20C(O)经取代的环烯基、-NR20C(O)烯基、-NR20C(O)经取代的烯基、-NR20C(O)炔基、-NR20C(O)经取代的炔基、-NR20C(O)芳基、-NR20C(O)经取代的芳基、-NR20C(O)杂芳基、-NR20C(O)经取代的杂芳基、-NR20C(O)杂环和-NR20C(O)经取代的杂环，其中R20是氢或烷基，并且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环以及经取代的杂环如本文所定义的。
“氨基羰基”或术语“氨酰基”是指基团-C(O)NR21R22，其中R21和R22独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环，并且其中R21和R22任选地与其所结合的氮接合在一起以形成杂环或经取代的杂环基，并且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环以及经取代的杂环如本文所定义的。
“氨基羰基氨基”是指基团–NR21C(O)NR22R23，其中R21、R22和R23独立地选自氢、烷基、芳基或环烷基，或其中两个R基团接合以形成杂环基。
术语“烷氧基羰基氨基”是指基团-NRC(O)OR，其中每个R独立地是氢、烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基或杂环基，其中烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基和杂环基如本文所定义的。
术语“酰氧基”是指基团烷基-C(O)O-、经取代的烷基-C(O)O-、环烷基-C(O)O-、经取代的环烷基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、杂芳基-C(O)O-和杂环基-C(O)O-，其中烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、芳基、杂芳基和杂环基如本文所定义的。
“氨基磺酰基”是指基团–SO2NR21R22，其中R21和R22独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环、经取代的杂环，并且其中R21和R22任选地与其所结合的氮接合在一起以形成杂环或经取代的杂环基，并且烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环以及经取代的杂环如本文所定义的。
“磺酰基氨基”是指基团–NR21SO2R22，其中R21和R22独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环，并且其中R21和R22任选地与其所结合的原子接合在一起以形成杂环或经取代的杂环基，并且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环以及经取代的杂环如本文所定义的。
“芳基”或“Ar”是指具有单环(如存在于苯基中)或具有多个稠环(此类芳香族环体系的实例包含萘基、蒽基和茚满基)的环体系的6至18个碳原子的单价芳香族碳环基团，其中稠环可以是或可以不是芳香族的，条件是连接点通过芳香族环的原子。举例来说，此术语包含苯基和萘基。除非另外受芳基取代基的定义限制，否则此类芳基可以任选地被1至5个取代基或1至3个取代基取代，所述取代基选自酰氧基、羟基、硫代、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、经取代的烷基、经取代的烷氧基、经取代的烯基、经取代的炔基、经取代的环烷基、经取代的环烯基、氨基、经取代的氨基、氨酰基、酰氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、氨基酰氧基、氧基酰氨基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-SO-烷基、-SO-经取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-经取代的烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基和三卤甲基。
“芳氧基”是指基团–O-芳基，其中芳基如本文所定义的，举例来说，包含苯氧基、萘氧基等，包含也如本文所定义的任选地经取代的芳基。
“氨基”是指基团–NH2。
术语“经取代的氨基”是指基团-NRR，其中每个R独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、烯基、经取代的烯基、环烯基、经取代的环烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、杂芳基和杂环基，条件是至少一个R不是氢。
术语“叠氮基”是指基团–N3。
“羧基”、“羧”或“羧酸酯”是指–CO2H或其盐。
“羧基酯”或“羧酯”或术语“羧烷基”或“羧基烷基”是指基团-C(O)O-烷基、-C(O)O-经取代的烷基、-C(O)O-烯基、-C(O)O-经取代的烯基、-C(O)O-炔基、-C(O)O-经取代的炔基、-C(O)O-芳基、-C(O)O-经取代的芳基、-C(O)O-环烷基、-C(O)O-经取代的环烷基、-C(O)O-环烯基、-C(O)O-经取代的环烯基、-C(O)O-杂芳基、-C(O)O-经取代的杂芳基、-C(O)O-杂环和-C(O)O-经取代的杂环，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环以及经取代的杂环如本文所定义的。
“(羧基酯)氧基”或“碳酸酯”是指基团–O-C(O)O-烷基、-O-C(O)O-经取代的烷基、-O-C(O)O-烯基、-O-C(O)O-经取代的烯基、-O-C(O)O-炔基、-O-C(O)O-经取代的炔基、-O-C(O)O-芳基、-O-C(O)O-经取代的芳基、-O-C(O)O-环烷基、-O-C(O)O-经取代的环烷基、-O-C(O)O-环烯基、-O-C(O)O-经取代的环烯基、-O-C(O)O-杂芳基、-O-C(O)O-经取代的杂芳基、-O-C(O)O-杂环和-O-C(O)O-经取代的杂环，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环以及经取代的杂环如本文所定义的。
“氰基”或“腈”是指基团–CN。
“环烷基”是指具有3至10个碳原子的具有单个环或多个环的环烷基，所述环包含稠合、桥连和螺环体系。适合的环烷基的实例包含例如金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等。举例来说，此类环烷基包含单环结构(如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等)或多环结构(如金刚烷基等)。
术语“经取代的环烷基”是指具有1至5个取代基或1至3个取代基的环烷基，所述取代基选自烷基、经取代的烷基、烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫代、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-经取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-经取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基。
“环烯基”是指具有3至10个碳原子的非芳香族环烷基，其具有单环或多环并且具有至少一个双键并且优选地1至2个双键。
术语“经取代的环烯基”是指具有1至5个取代基或1至3个取代基的环烯基，所述取代基选自烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫代、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-经取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-经取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基。
“环炔基”是指具有5至10个碳原子的非芳香族环烷基，其具有单环或多环并且具有至少一个三键。
“环烷氧基”是指–O-环烷基。
“环烯氧基”是指–O-环烯基。
“卤代”或“卤素”是指氟基、氯基、溴基和碘基。
“羟”或“羟基”是指基团–OH。
“杂芳基”是指在环内具有1至15个碳原子，如1至10个碳原子以及1至10个选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子的芳香族基团。此类杂芳基可以在环体系中(例如在如吲哚嗪基、喹啉基、苯并呋喃、苯并咪唑基或苯并噻吩基等基团中)具有单个环(如吡啶基、咪唑基或呋喃基)或多个稠环，其中所述环体系中的至少一个环是芳香族的。为了满足化合价要求，此类杂芳基环中的任何杂原子可以与或可以不与H或取代基，例如，烷基或如本文所述的其它取代基键合。在某些实施例中，杂芳基的氮和/或硫环原子被任选地氧化以提供N-氧化物(N→O)、亚磺酰基或磺酰基部分。举例来说，此术语包含吡啶基、吡咯基、吲哚基、硫代苯基和呋喃基。除非另外受杂芳基取代基的定义限制，否则此类杂芳基可以任选地被1至5个取代基或1至3个取代基取代，所述取代基选自酰氧基、羟基、硫代、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、经取代的烷基、经取代的烷氧基、经取代的烯基、经取代的炔基、经取代的环烷基、经取代的环烯基、氨基、经取代的氨基、氨酰基、酰氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、氨基酰氧基、氧基酰氨基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-SO-烷基、-SO-经取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-经取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基以及三卤甲基。
术语“杂芳烷基”是指基团-亚烷基-杂芳基，其中亚烷基和杂芳基是本文定义的。举例来说，此术语包含吡啶基甲基、吡啶基乙基、吲哚基甲基等。
“杂芳氧基”是指–O-杂芳基。
“杂环(Heterocycle/heterocyclic)”、“杂环烷基”和“杂环基”是指具有单个环或多个稠环的饱和或不饱和基团，其包含稠合的桥连和螺环体系，并且具有3至20个环原子，包含1至10个杂原子。这些环原子选自氮、硫或氧，其中在稠环体系中，所述环中的一个或多个环可以是环烷基、芳基或杂芳基，条件是连接点通过非芳香族环。在某些实施例中，杂环基团的氮和/或硫原子任选地被氧化以提供N-氧化物、-S(O)-或–SO2-部分。为了满足化合价要求，此类杂环中的任何杂原子可以与或可以不与一个或多个H或者一个或多个取代基，例如，烷基或如本文所述的其它取代基键合。
杂环和杂芳基的实例包含但不限于氮杂环丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、邻苯二甲酰亚胺、1,2,3,4-四氢异喹啉、4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)(也被称为硫代吗啉基(thiamorpholinyl))、1,1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。
除非另外受杂环取代基的定义限制，否则此类杂环基团可以任选地被1至5个或1至3个取代基取代，所述取代基选自烷氧基、经取代的烷氧基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫代、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-经取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-经取代的烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基和稠合杂环。
“杂环氧基”是指基团–O-杂环基。
术语“杂环基硫代”是指基团杂环-S-。
术语“杂环烯”是指如本文所定义的由杂环形成的双自由基。
术语“羟氨基”是指基团-NHOH。
“硝基”是指基团–NO2。
“氧代”是指原子(＝O)。
“磺酰基”是指基团SO2-烷基、SO2-经取代的烷基、SO2-烯基、SO2-经取代的烯基、SO2-环烷基、SO2-经取代的环烷基、SO2-环烯基、SO2-经取代的环烯基、SO2-芳基、SO2-经取代的芳基、SO2-杂芳基、SO2-经取代的杂芳基、SO2-杂环和SO2-经取代的杂环，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。举例来说，磺酰基包含甲基-SO2-、苯基-SO2-和4-甲基苯基-SO2-。
“磺酰基氧基”是指基团–OSO2-烷基、OSO2-经取代的烷基、OSO2-烯基、OSO2-经取代的烯基、OSO2-环烷基、OSO2-经取代的环烷基、OSO2-环烯基、OSO2-经取代的环烯基、OSO2-芳基、OSO2-经取代的芳基、OSO2-杂芳基、OSO2-经取代的杂芳基、OSO2-杂环和OSO2经取代的杂环，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。
术语“氨基羰基氧基”是指基团-OC(O)NRR，其中每个R独立地为氢、烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基或杂环，其中烷基、经取代的烷基、芳基、杂芳基和杂环如本文所定义的。
“硫代”是指基团-SH。
“硫代氧”或术语“硫酮基”是指原子(＝S)。
“烷硫基”或术语“硫代烷氧基”是指基团-S-烷基，其中烷基如本文所定义的。在某些实施例中，硫可以被氧化成-S(O)-。亚砜可以作为一个或多个立体异构体存在。
术语“经取代的硫代烷氧基”是指基团-S-经取代的烷基。
术语“硫代芳氧基”是指基团芳基-S-，其中芳基如本文所定义的，包含也如本文所定义的任选地经取代的芳基。
术语“硫代杂芳氧基”是指基团杂芳基-S-，其中杂芳基如本文所定义的，包含也如本文所定义的任选地经取代的芳基。
术语“硫代杂环氧基”是指基团杂环基-S-，其中杂环基如本文所定义的，包含也如本文所定义的任选地经取代的杂环基。
除了本文的公开内容之外，当用于修饰指定基团或自由基时，术语“经取代的”还可以意指指定基团或自由基的一个或多个氢原子各自彼此独立地被如下文所定义的相同或不同的取代基替代。
除了本文关于单独术语所公开的基团之外，除非另外说明，否则用于取代指定基团或自由基中的饱和碳原子上的一个或多个氢(单个碳上的任何两个氢可以被＝O、＝NR70、＝N-OR70、＝N2或＝S替代)的取代基是-R60、卤代、＝O、-OR70、-SR70、-NR80R80、三卤甲基、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-SO2R70、-SO2O–M+、-SO2OR70、-OSO2R70、-OSO2O–M+、-OSO2OR70、-P(O)(O–)2(M+)2、-P(O)(OR70)O–M+、-P(O)(OR70)2、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-C(O)O–M+、-C(O)OR70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OC(O)O-M+、-OC(O)OR70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70CO2 –M+、-NR70CO2R70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70和-NR70C(NR70)NR80R80，其中R60选自由以下组成的组：任选地经取代的烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳基烷基，每个R70独立地是氢或R60；每个R80独立地是R70，或者可替代地，两个R80'与其所键合的氮原子一起形成5元、6元或7元杂环烷基，所述杂环烷基可以任选地包含1至4个相同或不同的选自由O、N和S组成的组的另外的杂原子，其中N可以具有-H或C1-C3烷基取代；并且每个M+是具有净单个正电荷的抗衡离子。每个M+可以独立地是例如碱离子，如K+、Na+、Li+；铵离子，如+N(R60)4；或碱土金属离子，如[Ca2+]0.5、[Mg2+]0.5或[Ba2+]0.5(“下标0.5意指此类二价碱土金属离子的抗衡离子之一可以是本发明的化合物的电离形式，并且另一个典型的抗衡离子(如氯化物)或本文所公开的两种电离化合物可以用作此类二价碱土金属离子的抗衡离子，或者本发明的双重电离化合物可以用作此类二价碱土金属离子的抗衡离子)。作为具体实例，-NR80R80意指包含-NH2、-NH-烷基、N-吡咯烷基、N-哌嗪基、4N-甲基-哌嗪-1-基和N-吗啉基。
除了本文的公开内容之外，除非另外指明，否则“经取代的”烯烃、炔烃、芳基和杂芳基中的不饱和碳原子上的氢的取代基是-R60、卤代、-O-M+、-OR70、-SR70、-S–M+、-NR80R80、三卤甲基、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、-N3、-SO2R70、-SO3 –M+、-SO3R70、-OSO2R70、-OSO3 –M+、-OSO3R70、-PO3 -2(M+)2、-P(O)(OR70)O–M+、-P(O)(OR70)2、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-CO2 –M+、-CO2R70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OCO2 –M+、-OCO2R70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70CO2 –M+、-NR70CO2R70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70和-NR70C(NR70)NR80R80，其中R60、R70、R80和M+如先前所定义的，条件是在经取代的烯烃或炔烃的情况下，所述取代基不是-O-M+、-OR70、-SR70或-S–M+。
除了本文关于单独术语所公开的基团之外，除非另外说明，否则“经取代的”杂烷基和环杂烷基中的氮原子上的氢的取代基是-R60、-O-M+、-OR70、-SR70、-S-M+、-NR80R80、三卤甲基、-CF3、-CN、-NO、-NO2、-S(O)2R70、-S(O)2O-M+、-S(O)2OR70、-OS(O)2R70、-OS(O)2O-M+、-OS(O)2OR70、-P(O)(O-)2(M+)2、-P(O)(OR70)O-M+、-P(O)(OR70)(OR70)、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-C(O)OR70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OC(O)OR70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70C(O)OR70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70和-NR70C(NR70)NR80R80，其中R60、R70、R80和M+如先前所定义的。
除了本文的公开内容之外，在某个实施例中，被取代的基团具有1个、2个、3个或4个取代基、1个、2个或3个取代基、1个或2个取代基或1个取代基。
应当理解，在以上定义的所有经取代的基团中，通过将具有另外的取代基的取代基定义为自身(例如，具有经取代的芳基作为被经取代的芳基自身取代的取代基的经取代的芳基，所述经取代的芳基被经取代的芳基进一步取代等)达成的聚合物不旨在用于包含在本文。在此类情况下，此类取代的最大数量为三。例如，本文具体设想的经取代的芳基的系列取代限于经取代的芳基-(经取代的芳基)-经取代的芳基。
除非另有说明，否则在本文中未明确定义的取代基的命名通过将官能团的端部分命名，然后将朝连接点的相邻官能团命名而达成。例如，取代基“芳基烷氧基羰基”是指基团(芳基)-(烷基)-O-C(O)-。
关于本文所公开的含有一个或多个取代基的基团中的任何基团，应理解，此类基团当然不包含任何在空间上不切实际和/或在合成上不可行的取代或取代模式。另外，主题化合物包含由这些化合物的取代产生的所有立体化学异构体。
术语“药学上可接受的盐”意指对于向患者，如哺乳动物的施用可接受的盐(具有对于给定剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的抗衡离子的盐)。此类盐可以衍生自药学上可接受的无机碱或有机碱并且衍生自药学上可接受的无机酸或有机酸。“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐衍生自本领域熟知的多种有机和无机抗衡离子，并且仅举例来说，包含钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；并且当分子含有碱性官能团时，有机酸或无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
术语“其盐”意指当酸的质子被阳离子(如金属阳离子或有机阳离子等)替代时形成的化合物。在适用的情况下，所述盐是药学上可接受的盐，但是对于不旨在向患者施用的中间化合物的盐来说，这不是所必需的。举例来说，本发明的化合物的盐包含其中化合物被无机酸或有机酸质子化以形成阳离子的那些化合物，其中无机酸或有机酸的缀合碱作为盐的阴离子组分。
“溶剂化物”是指通过溶剂分子与溶质的分子或离子组合形成的复合物。溶剂可以是有机化合物、无机化合物或两者的混合物。溶剂的一些实例包含但不限于甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲亚砜和水。当溶剂是水时，所形成的溶剂化物是水合物。
“立体异构体(stereoisomer)”和立体异构体(stereoisomers)”是指具有相同原子连通性但在空间中原子布置不同的化合物。立体异构体包含顺式-反式异构体、E和Z异构体、对映异构体和非对映异构体。
“互变异构体”是指仅在原子的电子键合中和/或质子的位置中不同的分子的替代形式，如烯醇-酮基和亚胺-烯胺互变异构体，或含有-N＝C(H)-NH-环原子布置的杂芳基的互变异构形式，如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑和四唑。本领域普通技术人员将认识到其它互变异构环原子布置是可能的。
将理解，术语“或其盐或溶剂化物或立体异构体”旨在包含盐、溶剂化物和立体异构体的所有排列，如主题化合物的立体异构体的药学上可接受的盐的溶剂化物。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包含任何同种型的抗体或免疫球蛋白(例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgE、IgD、IgA、IgM等)、完整抗体(例如，由四聚体构成的抗体，所述四聚体又由重链和轻链多肽的两个二聚体构成)；单链抗体(例如scFv)；保持与抗原特异性结合的抗体片段(例如，全链或单链抗体片段)，所述抗体片段包含但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体，以及包括抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。抗体可以被可检测地标记，例如，用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等。抗体可以进一步与其它部分缀合，如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员)等。抗体还可以与固体支持物结合，所述固体支持物包含但不限于聚苯乙烯板或珠粒等。所述术语还涵盖Fab'、Fv、F(ab')2和或其它保留与抗原特异性结合的抗体片段，以及单克隆抗体。抗体可以是单价或二价的。“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包含Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段；双功能抗体；线性抗体(Zapata等人,《蛋白质工程(Protein Eng.)》8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生了：两个相同的抗原结合片段，被称为“Fab”片段，每个抗原结合片段具有单个抗原结合位点和；以及残留的“Fc”片段，这一名称反映了容易结晶的能力。胃蛋白酶处理得到具有两个抗原组合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区由紧密地非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在此构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单可变结构域(或仅包括对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管以比完整结合位点更低的亲和力进行。
“Fab”片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于在包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链CH1结构域的羧基末端加入几个残基。Fab'-SH是本文对于Fab'的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离硫醇基。F(ab')2抗体片段最初是作为成对的Fab'片段产生的，其之间具有铰链半胱氨酸。还已知抗体片段的其它化学偶联。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而指定为称为κ和λ的两种明显不同类型中的一种。根据其“重链”的恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分配为不同类别。存在五个类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干类别可以被进一步划分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些方面，Fv多肽进一步包括位于VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头使sFv能够形成用于抗原结合的期望结构。
术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括与同一条多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。
如本文所使用的，术语“亲和力”是指两种试剂的可逆结合的平衡常数，且被表示为解离常数(Kd)。亲和力可比抗体针对不相关氨基酸序列的亲和力高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍或更高。抗体对于目标蛋白质的亲和力可以是例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)，或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更高。如本文所使用的，术语“亲合力”是指两种或更多种药剂的复合物在稀释之后对解离的抗性。关于抗体和/或抗原结合片段，术语“免疫反应性”及“优先结合”在本文中可互换地使用。
术语“结合”是指由于例如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用(包含如盐桥和水桥等相互作用)而产生的两个分子之间的直接缔合。主题抗体与多肽(例如人多肽，例如糖基化多肽或其片段)内的表位特异性结合。非特异性结合将是指以小于约10-7M的亲和力结合，例如以10-6M、10-5M、10-4M等的亲和力结合。
在抗体和抗原的上下文中，术语“特异性结合”意指抗体以例如大于或等于约105M-1的亲和力或Ka(即，特定结合相互作用的以1/M为单位的平衡缔合常数)与抗原结合或缔合。
“高亲和力”结合是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更高的结合。可替代地，亲和力可以被定义为特定结合相互作用的以M为单位的平衡解离常数(KD)(例如，10-5M至10-13M或更小)。在一些实施例中，特异性结合意指抗体以小于或等于约10-5M、小于或等于约10-6M、小于或等于约10-7M、小于或等于约10-8M或小于或等于约10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或更小的KD与抗原结合。抗体对抗原的结合亲和力可以使用常规技术容易地测定，例如通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)、平衡透析、通过使用表面等离子共振(SPR)技术(例如BIAcore 2000仪器，使用制造商概述的通用程序)；通过放射免疫测定等。
如本文所使用的，术语“框架”当用于提及抗体可变区时旨在意指抗体可变区内CDR区之外的所有氨基酸残基。可变区框架通常是长度介于约100-120个氨基酸之间的不连续氨基酸序列，但旨在仅指CDR之外的氨基酸。如本文所使用的，术语“框架区”旨在意指由CDR分隔的框架的每个结构域。
“母体Ig多肽”是包括氨基酸序列的多肽，其缺乏如本文所述的醛标记恒定区。母体多肽可以包括天然序列恒定区，或者可以包括具有预先存在的氨基酸序列修饰(如添加、缺失和/或取代)的恒定区。
在Ig多肽的上下文中，术语“恒定区”是本领域众所周知的，并且是指Ig重链或Ig轻链的C末端区域。Ig重链恒定区包含CH1、CH2和CH3结构域(以及CH4结构域，其中重链是μ或ε重链)。在天然Ig重链中，CH1、CH2、CH3(以及，如果存在的话，CH4)结构域紧接着重链可变(VH)区(C末端)之后开始，并且各自长度为约100个氨基酸至约130个氨基酸。在天然Ig轻链中，恒定区紧接着轻链可变(VL)区(C末端)之后开始，并且长度为约100个氨基酸至120个氨基酸。
“表位”是抗原上与抗体结合的位点。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的折叠(例如三级折叠)并置的非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含处于线性或空间构象中的至少3个并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包含例如x射线晶体学和2维核磁共振。参见例如，《分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)》中的《表位作图指南(Epitope Mapping Protocols)》,第66卷,GlennE.Morris编辑(1996)。一些商业实验室提供表位作图服务。与膜相关抗原具有免疫反应性的抗体结合的表位可以驻留在细胞表面(例如，跨膜蛋白的细胞外区域中)上，使得此类表位被认为是细胞表面可及的、溶剂可及的和/或细胞表面暴露的。
如参考多肽、肽或蛋白质的氨基酸序列使用的，“可基因编码”是指所述氨基酸序列由能够通过编码所述氨基酸序列的核酸的转录和翻译产生的氨基酸残基构成，其中转录和/或翻译可以在细胞中或在无细胞的体外转录/翻译系统中发生。
术语“控制序列”是指促进可操作地连接的编码序列在特定表达系统，例如哺乳动物细胞、细菌细胞、无细胞合成等中的表达的DNA序列。适用于原核生物系统的控制序列例如包含启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。真核细胞系统可以利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当核酸被放置成与另一核酸序列处于功能关系中时，所述核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位成便于开始翻译，则其与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导的情况下是连续的并且处于阅读框中。连接是通过连结或通过扩增反应来完成的。根据常规实践，合成寡核苷酸衔接子或接头可以用于连接序列。
如本文所使用的，术语“表达盒”是指可以(例如，通过使用与到所关注构建体中的连接相容的限制位点，或通过同源重组到所关注构建体中或宿主细胞基因组中)插入到核酸中的核酸(通常为DNA)的片段。通常，核酸片段包括编码所关注多肽的多核苷酸，并且盒和限制位点被设计为促进将盒插入适当的阅读框中用于转录和翻译。表达盒还可以包括促进编码所关注多肽的多核苷酸在宿主细胞例如哺乳动物宿主细胞中的表达的元件。这些元件可以包含但不限于：启动子、最小启动子、增强子、应答元件、终止子序列、多腺苷酸化序列等。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中鉴定、分离和/或回收的多肽。其自然环境中的污染物组分是会干扰抗体诊断或治疗用途的材料，并且可以包含酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，抗体将被纯化达到(1)按劳里法(Lowry method)测定的以抗体重量计的大于90％、大于95％或大于98％，例如超过99重量％，(2)使用旋转杯测序仪足以获得至少15个N末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(3)使用考马斯蓝(Coomassie blue)或银染色，在还原或非还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)达到均质。被分离的抗体包含在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境中的至少一种组分将不存在。在一些实例中，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
术语“天然抗体”是指其中抗体的重链和轻链已由多细胞生物体的免疫系统制造和配对的抗体。脾脏、淋巴结、骨髓和血清是产生天然抗体的组织的实例。例如，由从用抗原免疫的第一动物中分离出的抗体产生细胞产生的抗体是天然抗体。
术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”是指含有一个或多个已被来自人抗体的对应地进行定位的氨基酸所取代的氨基酸(例如，在框架区、恒定区或CDR中)的非人(例如，小鼠或兔)抗体。一般来说，与同一抗体的非人源化版本相比，人源化抗体在人宿主中产生减少的免疫应答。可以使用本领域已知的多种技术将抗体人源化，包含例如CDR-移植、饰面或表面重修、链改组等。在某些实施例中，通过对CDR和框架残基的相互作用进行建模来鉴定框架取代，以鉴定对抗原结合具有重要意义的框架残基，并进行序列比较以鉴定特定位置处的异常框架残基。因此，上述抗体可以使用本领域公知的方法进行人源化。
在某些实施例中，本文所公开的抗体分子包含重链，所述重链包括如本文所提供的可变重链区和具有UniProt:P01857-1,版本1中所示的氨基酸序列序列的人IgG1恒定区。在某些实施例中，本文所公开的抗体分子包含包括如本文所提供的可变轻链区和人轻链恒定区的轻链。在某些实施例中，人轻链恒定区是具有UniProtKB/Swiss-Prot:P01834.2中所示的氨基酸的人κ轻链恒定区。在某些实施例中，存在于主题抗体中的人IgG1重链恒定区可以包含突变，例如调节Fc功能的取代。例如，可以引入LALAPG效应子功能突变(L234A、L235A和P329G)或N297A突变以减少抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。取代的编号基于EU编号系统。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU指数”(例如，以下中报告的EU指数：Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》,第5版马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的公共卫生署(Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.)(1991))。“Kabat的EU指数”是指人IgG 1EU抗体的残基编号。
术语“嵌合抗体”是指其轻链和重链基因通常通过基因工程已经从属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因构建的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变片段可以接合到人恒定片段，如γ1和γ3。治疗性嵌合抗体的实例是由来自小鼠抗体的可变或抗原结合结构域和来自人抗体的恒定或效应结构域组成的杂交蛋白，尽管可以使用来自其它哺乳动物物种的结构域。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物形式。除非另外明确指示，否则“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以包含遗传编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有经修饰的肽主链的多肽。所述术语包含融合蛋白，包含但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合体、含有至少一个N末端甲硫氨酸残基的蛋白质(例如，以促进在重组宿主细胞中产生)；免疫标记的蛋白质等。在抗体的上下文下，显然链或结构域包括多肽。
“天然氨基酸序列”或“亲本氨基酸序列”在本文中可互换使用以指修饰之前多肽的氨基酸序列，以包含经修饰的氨基酸残基。
术语“氨基酸类似物”、“非天然氨基酸”等可以互换使用，并且包含在结构和/或总体形状上与通常在天然存在的蛋白质中发现的一个或多个氨基酸类似的氨基酸样化合物(例如，Ala或A、Cys或C、Asp或D、Glu或E、Phe或F、Gly或G、His或H、Ile或I、Lys或K、Leu或L、Met或M、Asn或N、Pro或P、Gln或Q、Arg或R、Ser或S、Thr或T、Val或V、Trp或W、Tyr或Y)。氨基酸类似物还包含具有经修饰的侧链或主链的天然氨基酸。氨基酸类似物还包含具有与天然存在的D-形式以及L-形式的氨基酸类似物相同的立体化学的氨基酸类似物。在一些情况下，氨基酸类似物共享一个或多个天然氨基酸的主链结构和/或侧链结构，其中差异是分子中的一个或多个经修饰的基团。此类修饰可以包含但不限于用原子(如N)取代相关原子(如S)、添加基团(如甲基或羟基等)或原子(如Cl或Br等)、缺失基团、取代共价键(单键取代双键等)或其组合。例如，氨基酸类似物可以包含α-羟基酸和α-氨基酸等。
术语“氨基酸侧链”或“氨基酸的侧链”等可以用于指与氨基酸残基的α-碳连接的取代基，包含天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。氨基酸侧链还可以包含如在本文所述的经修饰的氨基酸和/或缀合物的上下文中描述的氨基酸侧链。
术语“缀合”通常是指将一个所关注的分子与第二个所关注的分子近端缔合的共价或非共价的化学键，通常是共价的。在一些实施例中，所述药剂选自半衰期延长部分、标记剂和治疗剂。对于半衰期延长，例如，可以任选地修饰本公开的抗体以提供改善的药代动力学特征(例如，通过PEG化、高糖基化等)。可以增强血清半衰期的修饰是所关注的。
术语“碳水化合物”等可用于指单糖、二糖、低聚糖和多糖的单体单元和/或聚合物。术语糖可用于指较小的碳水化合物，如单糖、二糖。术语“碳水化合物衍生物”包含其中所关注的碳水化合物的一个或多个官能团被取代(用任何方便的取代基替代)、修饰(使用任何方便的化学转化为另一个基团)或不存在(例如，被H消除或取代)的化合物。多种碳水化合物和碳水化合物衍生物是可用的，并且可以适于用于主题化合物和缀合物。
如本文所使用的，术语“分离的”意在描述在不同于其中化合物天然存在的环境的环境中的所关注的化合物。“分离的”意在包含基本上富含所关注的化合物和/或其中所关注的化合物被部分地或基本上纯化的样品内的化合物。
如本文所使用的，术语“基本上纯化的”是指从其天然环境中去除并且至少60％不含、至少75％不含、至少80％不含、至少85％不含、至少90％不含、至少95％不含、至少98％不含或大于98％不含与其天然相关的其它组分的化合物。
术语“生理条件”意在涵盖与活细胞相容的那些条件，例如，与活细胞相容的温度、pH、盐度等的主要水性条件。
“反应性配偶体”意指与另一个反应性配偶体特异性反应以产生反应产物的分子或分子部分。示例性反应性配偶体包含硫酸酯酶基序的半胱氨酸或丝氨酸和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)，其反应以形成含有甲酰甘氨酸(fGly)的转化醛标记的反应产物，以代替基序中的半胱氨酸或丝氨酸。其它示例性反应性配偶体包含转化醛标记的fGly残基的醛(例如，活性醛基)和“醛反应反应性配偶体”，其包括醛反应基团和所关注的部分，并且其反应以形成多肽的反应产物，所述多肽具有通过fGly残基缀合到多肽的所关注的部分。
“N末端”是指具有游离胺基的多肽的末端氨基酸残基，非N末端氨基酸残基中的其胺基通常构成多肽的共价主链的一部分。
“C末端”是指具有游离羧基的多肽的末端氨基酸残基，在非C末端氨基酸残基中的其羧基通常构成多肽的共价主链的一部分。
如关于多肽或多肽的氨基酸序列中使用的“内部位点”意指多肽的不在N末端或C末端的区。
如本文所使用的，术语“治疗(treatment、treating)”等是指获得期望药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用而言可以是治疗性的。如本文所使用的，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人类的疾病的任何治疗，并且包含：(a)预防在易患疾病但尚未被诊断为患有疾病的受试者中发生疾病；(b)抑制疾病，例如遏止其发展；和(c)减轻疾病，例如引起疾病消退。
本文中互换地使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包含但不限于鼠类(大鼠、小鼠)、非人灵长类动物、人、犬、猫、有蹄类动物(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊)等。
“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于哺乳动物或其它受试者以治疗疾病时，足以实现对疾病的这种治疗的主题抗体-药物缀合物的量。“治疗有效量”将视抗体、药物、疾病及其严重程度以及所治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
在进一步描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于所描述的特定实施例，因为这些实施例当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
在提供了值范围的情况下，应当理解的是，介于所述范围的上限与下限之间的每个中间值(到下限的单位的十分之一，除非另外明确说明)以及所述范围中的任何其它所陈述或中间值均涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在更小的范围中，并且也涵盖在本发明内，这受制于所陈述的范围中的任何明确排除的限值。在所陈述的范围包含限值中的一个或两个限值的情况下，排除那些被包含在内的限值中的任一个或两个限值的范围也包含在本发明内。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然类似或等效于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文，以结合所引用的所述出版物来公开和描述所述方法和/或材料。
必须注意，除非上下文另外明确指示，否则如在本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。因此，例如，提及“抗体”时包含多个此类抗体并且提及“所述CDR”时包含提及本领域技术人员已知的一种或多种CDR及其等同物等。应当进一步指出的是，权利要求书可以撰写为排除任何可选择的要素。因此，本声明旨在充当对于此类与权利要求要素的叙述相结合的排除性术语(如“单独地”、“仅”等)的使用或“否定型”限制的使用的先行基础。
本文所讨论的出版物仅被提供用于在本申请的提交日之前对其进行公开。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明不能由于现有发明而有权先于此类出版物。另外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，所述实际公开日期可能需要独立地确认。
具体实施方式
本公开提供了抗体缀合物(例如，抗体-药物缀合物(ADC))。本公开还涵盖产生此类缀合物的方法，以及使用所述缀合物的方法。还提供了包含本公开的所述ADC的组合物，所述组合物在一些情况下包含药物组合物。在某些方面，提供了使用所述ADC的方法，所述方法包含向个体施用治疗有效量的本公开的所述ADC。
抗体-药物缀合物
本公开提供了一种缀合物，例如抗体-药物缀合物(ADC)。“缀合物”意指多肽(例如，抗体)共价连接到所关注的部分(例如，药物或活性剂)。如，根据本公开的抗体-药物缀合物包含共价连接到抗体的一种或多种药物或活性剂。在某些实施例中，多肽(例如，抗体)和一种或多种药物或活性剂通过一个或多个官能团和共价键相互结合。例如，一个或多个官能团和共价键可以包含如本文所描述的接头。
在某些实施例中，缀合物是多肽缀合物，其包含缀合到一个或多个其它部分的多肽(例如，抗体)。在某些实施例中，缀合到多肽的一个或多个部分可以各自独立地是多种所关注的部分中的任何部分，如但不限于药物、活性剂、可检测的标记、水溶性聚合物或用于将多肽固定到膜或表面的部分。在某些实施例中，缀合物是药物缀合物，其中多肽是抗体，因此提供了抗体-药物缀合物。例如，缀合物可以是药物缀合物，其中多肽缀合到一种或多种药物或活性剂。多种类型的药物和活性剂可以用于缀合物中，并且在下文中更详细地描述。
所述一种或多种药物或活性剂可以在多肽的任何所期望的位点缀合到多肽(例如，抗体)。因此，本公开提供了例如具有在多肽的C末端处或附近的位点处缀合的药物或活性剂的多肽。其它实例包含具有在多肽的N末端或附近的位置处缀合的药物或活性剂的多肽。实例还包含具有在多肽的C末端与N末端之间的位置处(例如，在多肽的内部位点处)缀合的药物或活性剂的多肽。当多肽缀合到两种或更多种药物或活性剂时，上述组合也是可能的。
在某些实施例中，本公开的缀合物包含缀合到氨基酸残基的α碳处的多肽的氨基酸残基的一种或多种药物或活性剂。换句话说，缀合物包含多肽，其中多肽中的一个或多个氨基酸残基的侧链已被修饰并且连接到一种或多种药物或活性剂(例如，通过如本文所描述的支链接头连接到一种或多种药物或活性剂)。例如，缀合物包含多肽，其中多肽中的一个或多个氨基酸残基的α碳已被修饰并且连接到一种或多种药物或活性剂(例如，通过如本文所描述的接头连接到一种或多种药物或活性剂)。
本公开的实施例包含缀合物，其中多肽缀合到一个或多个部分，如2个部分、3个部分、4个部分、5个部分、6个部分、7个部分、8个部分、9个部分或10个或更多个部分。所述部分可以在多肽中的一个或多个位点处缀合到多肽。例如，一个或多个部分可以缀合到多肽的单个氨基酸残基上。在一些情况下，一个部分缀合到多肽的氨基酸残基。在其它实施例中，两个部分可以缀合到多肽的同一氨基酸残基上。在其它实施例中，第一部分缀合到多肽的第一氨基酸残基，并且第二部分缀合到多肽的第二氨基酸残基。上述组合也是可能的，例如其中多肽在第一氨基酸残基处缀合到第一部分，并在第二氨基酸残基处缀合到另外两个部分。其它组合也是可能的，如但不限于，多肽在第一氨基酸残基处缀合到第一和第二部分，并且在第二氨基酸残基处缀合到第三和第四部分，等等。
缀合到所关注的一个或多个部分的多肽的一个或多个氨基酸残基可以是天然存在的氨基酸、非天然氨基酸或其组合。例如，缀合物可以包含缀合到多肽的天然存在的氨基酸残基的一种或多种药物或活性剂。在其它情况下，缀合物可以包含缀合到多肽的非天然氨基酸残基的一种或多种药物或活性剂。如本文所描述的，一种或多种药物或活性剂可以在单个天然或非天然氨基酸残基处缀合到多肽。多肽中的一个或多个天然或非天然氨基酸残基可以缀合到如本文所述的一个或多个部分。例如，多肽中的两个(或更多个)氨基酸残基(例如，天然或非天然氨基酸残基)可以各自缀合到一个或多个部分，使得多肽中的多个位点缀合到所关注的部分。
在某些实施例中，多肽(例如抗体)和所关注的部分(例如药物或活性剂)通过缀合部分缀合。例如，多肽和所关注的部分可以各自结合(例如共价键合)到缀合部分，从而通过缀合部分间接地将多肽和所关注的部分结合在一起。在一些情况下，缀合部分包含肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基化合物，或肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基化合物的衍生物。例如，以下基本反应方案中示出了通过肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分将所关注的部分偶联到多肽的基本方案。肼基-吲哚基和肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分在本文中也分别被称为肼基-异-皮克泰-斯彭格勒(HIPS)缀合部分和氮杂-肼基-异-皮克泰-斯彭格勒(azaHIPS)缀合部分。
在以上反应方案中，R包含缀合到多肽(例如，通过如本文所述的接头缀合到多肽)的所关注的部分(例如，药物或活性剂)。如以上反应方案中所示，将包含2-甲酰基甘氨酸残基(fGly)的多肽与经修饰以包含缀合部分(例如，肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分)的药物或活性剂进行反应，以产生连接到缀合部分的多肽缀合物，从而通过缀合部分将药物或活性剂连接到多肽。
如本文所描述的，所述部分可以是多种部分中的任何部分，如但不限于化学实体，如可检测的标记或药物或活性剂。R'和R”可以各自独立地是任何所期望的取代基，如但不限于氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。Z可以是CR21、NR22、N、O或S，其中R21和R22各自独立地选自关于以上R'和R”所描述的任何取代基。
其它肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联部分也是可能的，如本文所描述的缀合物和化合物中所示出的。例如，肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联部分可以连接(例如共价连接)到接头。因此，本公开的实施例包含通过接头连接到药物或活性剂的肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分。本文详细描述了可将肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分偶联到药物或活性剂的接头的各种实施例。例如，在一些情况下，接头是可切割接头，如本文所描述的。在其它实施例中，接头是如在本文所描述的不可切割接头。
在某些实施例中，多肽(例如抗体)可以缀合到一个或多个所关注的部分，其中多肽的一个或多个氨基酸残基在缀合到所关注的部分之前被修饰。多肽的一个或多个氨基酸残基的修饰可以产生多肽，所述多肽含有一个或多个合适用于缀合到所关注的部分的反应性基团。在一些情况下，多肽可以包含一个或多个经修饰的氨基酸残基，以提供合适用于缀合到所关注的部分(例如，包含缀合部分的一个或多个部分，如，如上文所描述的肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分)的一个或多个反应性基团。例如，多肽的氨基酸可以被修饰以包含活性醛基(例如，活性醛)。活性醛可以被包含在“醛标记”或“ald-标记”中，如本文所使用的，其是指衍生自硫酸酯酶基序(例如，L(C/S)TPSR)的氨基酸序列，所述硫酸酯酶基序已通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的作用进行转化以含有2-甲酰甘氨酸残基(本文中被称为“fGly”)。由FGE生成的fGly残基也可以被称为“甲酰甘氨酸”。换句话说，术语“醛标记”在本文中用于指代包含“经转化的”硫酸酯酶基序(例如，其中半胱氨酸或丝氨酸残基已通过FGE的作用转化为fGly，例如L(fGly)TPSR的硫酸酯酶基序)的氨基酸序列。经转化的硫酸酯酶基序可以源自包含“未经转化的”硫酸酯酶基序(例如，其中半胱氨酸或丝氨酸残基未通过FGE转化为fGly，但能够被转化的硫酸酯酶基序，例如，序列为：L(C/S)TPSR的未经转化的硫酸酯酶基序)的氨基酸序列。如甲酰甘氨酸生成酶(FGE)对硫酸酯酶基序的作用的上下文中所使用的“转化”是指硫酸酯酶基序中的半胱氨酸或丝氨酸残基的生化修饰成甲酰甘氨酸(fGly)残基(例如，Cys到fGly，或Ser到fGly)。醛标签的另外的方面及其在位点特异性蛋白质修饰中的用途描述于美国专利第7,985,783号和美国专利第8,729,232号中，其中每个美国专利的公开内容通过引用并入本文。
在一些情况下，为了产生缀合物，含有fGly残基的多肽可以通过fGly与化合物(例如，如上文所描述的，含有肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分的化合物)的反应而缀合到所关注的部分。例如，含有fGly的多肽可以在适合于提供药物与多肽的缀合的条件下与含有反应性配偶体的药物接触。在一些情况下，含有反应性配偶体的药物可以包含如上所述的肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分。例如，药物或活性剂可以被修饰以包含肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分。在一些情况下，药物或活性剂通过接头，如，如本文详述的接头，连接到肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基，如共价连接到肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基。
在某些实施例中，本公开的缀合物包含具有至少一个氨基酸残基的多肽(例如，抗体)，所述多肽已经连接到一个或多个所关注的部分(例如，药物或活性剂)。为了制备缀合物，可以对多肽的氨基酸残基进行修饰，并且然后将其偶联到连接到如上文所描述的肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分的一种或多种药物或活性剂。在某些实施例中，多肽的氨基酸残基(例如抗体)是修饰成如上文所描述的fGly残基的半胱氨酸或丝氨酸残基。在某些实施例中，经修饰的氨基酸残基(例如，fGly残基)缀合到含有如上文所描述的肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分的药物或活性剂，以提供本公开的缀合物，其中一种或多种药物或活性剂通过肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分缀合到多肽。如本文所使用的，术语fGly'是指偶联到所关注的部分(例如药物或活性剂)的多肽(例如抗体)的经修饰的氨基酸残基。
在某些实施例中，缀合物包含具有至少一个连接到如本文所描述的接头的氨基酸残基的多肽(例如，抗体)，所述支链接头反过来连接到一种或多种药物或活性剂。例如，缀合物可以包含具有至少一个氨基酸残基(fGly')的多肽(例如抗体)，所述多肽缀合到如上文所描述的所关注的一个或多个部分(例如，一种或多种药物或活性剂)。
本公开的各方面包含式(I)的缀合物：
其中
Z为CR4或N；
R1选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基；
R2和R3各自独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基，或者R2和R3任选地环状连接以形成5元或6元杂环基；
每个R4独立地选自氢、卤素、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基；
L为接头；
W1为药物；并且
W2为抗体。
在某些实施例中，Z是CR4或N。在某些实施例中，Z是CR4。在某些实施例中，Z是N。
在某些实施例中，R1选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。
在某些实施例中，R1使氢。在某些实施例中，R1是烷基或经取代的烷基，如C1-6烷基或C1-6经取代的烷基、或C1-4烷基或C1-4经取代的烷基、或C1-3烷基或C1-3经取代的烷基。在某些实施例中，R1为甲基。在某些实施例中，R1是烯基或经取代的烯基，如C2-6烯基或C2-6经取代的烯基、或C2-4烯基或C2-4经取代的烯基、或C2-3烯基或C2-3经取代的烯基。在某些实施例中，R1是炔基或经取代的炔基，如C2-6烯基或C2-6经取代的烯基、或C2-4烯基或C2-4经取代的烯基、或C2-3烯基或C2-3经取代的烯基。在某些实施例中，R1是芳基或经取代的芳基，如C5-8芳基或C5-8经取代的芳基，如C5芳基或C5经取代的芳基、或C6芳基或C6经取代的芳基。在某些实施例中，R1是杂芳基或经取代的杂芳基，如C5-8杂芳基或C5-8经取代的杂芳基，如C5杂芳基或C5经取代的杂芳基、或C6取代的杂芳基或C6经取代的杂芳基。在某些实施例中，R1是环烷基或经取代的环烷基，如C3-8环烷基或C3-8经取代的环烷基，如C3-6环烷基或C3-6经取代的环烷基、或C3-5环烷基或C3-5经取代的环烷基。在某些实施例中，R1是杂环基或经取代的杂环基，如C3-8杂环基或C3-8经取代的杂环基，如C3-6杂环基或C3-6经取代的杂环基、或C3-5杂环基或C3-5经取代的杂环基。
在某些实施例中，R2和R3各自独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基，或者R2和R3任选地环状连接以形成5元或6元杂环基。
在某些实施例中，R2选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。在某些实施例中，R2是氢。在某些实施例中，R2是烷基或经取代的烷基，如C1-6烷基或C1-6经取代的烷基、或C1-4烷基或C1-4经取代的烷基、或C1-3烷基或C1-3经取代的烷基。在某些实施例中，R2是甲基。在某些实施例中，R2是烯基或经取代的烯基，如C2-6烯基或C2-6经取代的烯基、或C2-4烯基或C2-4经取代的烯基、或C2-3烯基或C2-3经取代的烯基。在某些实施例中，R2是炔基或经取代的炔基。在某些实施例中，R2是烷氧基或经取代的烷氧基。在某些实施例中，R2是氨基或经取代的氨基。在某些实施例中，R2是羧基或羧基酯。在某些实施例中，R2是酰基或酰氧基。在某些实施例中，R2是酰氨基或氨酰基。在某些实施例中，R2是烷基酰胺或经取代的烷基酰胺。在某些实施例中，R2是磺酰基。在某些实施例中，R2是硫代烷氧基或经取代的硫代烷氧基。在某些实施例中，R2是芳基或经取代的芳基，如C5-8芳基或C5-8经取代的芳基，如C5芳基或C5经取代的芳基、或C6芳基或C6经取代的芳基。在某些实施例中，R2是杂芳基或经取代的杂芳基，如C5-8杂芳基或C5-8经取代的杂芳基，如C5杂芳基或C5经取代的杂芳基、或C6取代的杂芳基或C6经取代的杂芳基。在某些实施例中，R2是环烷基或经取代的环烷基，如C3-8环烷基或C3-8经取代的环烷基，如C3-6环烷基或C3-6经取代的环烷基、或C3-5环烷基或C3-5经取代的环烷基。在某些实施例中，R2是杂环基或经取代的杂环基，如C3-6杂环基或C3-6经取代的杂环基、或C3-5杂环基或C3-5经取代的杂环基。
在某些实施例中，R3选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。在某些实施例中，R3是氢。在某些实施例中，R3是烷基或经取代的烷基，如C1-6烷基或C1-6经取代的烷基、或C1-4烷基或C1-4经取代的烷基、或C1-3烷基或C1-3经取代的烷基。在某些实施例中，R3是甲基。在某些实施例中，R3是烯基或经取代的烯基，如C2-6烯基或C2-6经取代的烯基、或C2-4烯基或C2-4经取代的烯基、或C2-3烯基或C2-3经取代的烯基。在某些实施例中，R3是炔基或经取代的炔基。在某些实施例中，R3是烷氧基或经取代的烷氧基。在某些实施例中，R3是氨基或经取代的氨基。在某些实施例中，R3是羧基或羧基酯。在某些实施例中，R3是酰基或酰氧基。在某些实施例中，R3是酰氨基或氨酰基。在某些实施例中，R3是烷基酰胺或经取代的烷基酰胺。在某些实施例中，R3是磺酰基。在某些实施例中，R3是硫代烷氧基或经取代的硫代烷氧基。在某些实施例中，R3是芳基或经取代的芳基，如C5-8芳基或C5-8经取代的芳基，如C5芳基或C5经取代的芳基、或C6芳基或C6经取代的芳基。在某些实施例中，R3是杂芳基或经取代的杂芳基，如C5-8杂芳基或C5-8经取代的杂芳基，如C5杂芳基或C5经取代的杂芳基、或C6取代的杂芳基或C6经取代的杂芳基。在某些实施例中，R3是环烷基或经取代的环烷基，如C3-8环烷基或C3-8经取代的环烷基，如C3-6环烷基或C3-6经取代的环烷基、或C3-5环烷基或C3-5经取代的环烷基。在某些实施例中，R3是杂环基或经取代的杂环基，如C3-8杂环基或C3-8经取代的杂环基，如C3-6杂环基或C3-6经取代的杂环基、或C3-5杂环基或C3-5经取代的杂环基。
在某些实施例中，R2和R3任选地环状连接以形成5元或6元杂环基。在某些实施例中，R2和R3环状连接以形成5元或6元杂环基。在某些实施例中，R2和R3环状连接以形成5元杂环基。在某些实施例中，R2和R3环状连接以形成6元杂环基。
在某些实施例中，每个R4独立地选自氢、卤素、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。
如下更详细地描述了每个R4的各种可能性。在某些实施例中，R4是氢。在某些实施例中，每个R4是氢。在某些实施例中，R4是卤素，如F、Cl、Br或I。在某些实施例中，R4是F。在某些实施例中，R4是Cl。在某些实施例中，R4是Br。在某些实施例中，R4是I。在某些实施例中，R4是烷基或经取代的烷基，如C1-6烷基或C1-6经取代的烷基、或C1-4烷基或C1-4经取代的烷基、或C1-3烷基或C1-3经取代的烷基。在某些实施例中，R4是甲基。在某些实施例中，R4是烯基或经取代的烯基，如C2-6烯基或C2-6经取代的烯基、或C2-4烯基或C2-4经取代的烯基、或C2-3烯基或C2-3经取代的烯基。在某些实施例中，R4是炔基或经取代的炔基。在某些实施例中，R4是烷氧基或经取代的烷氧基。在某些实施例中，R4是氨基或经取代的氨基。在某些实施例中，R4是羧基或羧基酯。在某些实施例中，R4是酰基或酰氧基。在某些实施例中，R4是酰氨基或氨酰基。在某些实施例中，R4是烷基酰胺或经取代的烷基酰胺。在某些实施例中，R4是磺酰基。在某些实施例中，R4是硫代烷氧基或经取代的硫代烷氧基。在某些实施例中，R4是芳基或经取代的芳基，如C5-8芳基或C5-8经取代的芳基，如C5芳基或C5经取代的芳基、或C6芳基或C6经取代的芳基(例如，苯基或经取代的苯基)。在某些实施例中，R4是杂芳基或经取代的杂芳基，如C5-8杂芳基或C5-8经取代的杂芳基，如C5杂芳基或C5经取代的杂芳基、或C6取代的杂芳基或C6经取代的杂芳基。在某些实施例中，R4是环烷基或经取代的环烷基，如C3-8环烷基或C3-8经取代的环烷基，如C3-6环烷基或C3-6经取代的环烷基、或C3-5环烷基或C3-5经取代的环烷基。在某些实施例中，R4是杂环基或经取代的杂环基，如C3-8杂环基或C3-8经取代的杂环基，如C3-6杂环基或C3-6经取代的杂环基、或C3-5杂环基或C3-5经取代的杂环基。
在某些实施例中，W1为药物。药物的进一步描述可见于本文的公开内容。
在某些实施例中，W2为抗体。在某些实施例中，W2包括一个或多个如本文所描述的fGly'残基。在某些实施例中，抗体通过如本文所描述的fGly'残基连接到缀合物的其余部分。可用于主题缀合物的抗体的进一步描述可见于本文的公开内容。
在某些实施例中，式(I)的化合物包含接头L。接头可以用于将缀合部分(例如，肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分)与一个或多个所关注的部分结合。所述接头可以在任何方便的位置与缀合部分(例如，如本文所描述)结合(例如共价键合)。例如，接头可以将肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分连接到药物。肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联部分可以用于将接头(并且因此药物)缀合到多肽，如抗体。例如，缀合部分可以用于将接头(以及因此药物)缀合到多肽的经修饰的氨基酸残基，如抗体的fGly残基。
在某些实施例中，L将缀合部分连接到W1，并且因此缀合部分通过接头L间接键合到W1。如上文所描述的，W1是药物，并且因此L将缀合部分连接到药物，例如，缀合部分通过接头L间接键合到药物。
任何方便的接头都可以用于主题缀合物中。在某些实施例中，L包含选自以下的基团：烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰氨基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。在某些实施例中，L包含烷基或经取代的烷基。在某些实施例中，L包含烯基或经取代的烯基。在某些实施例中，L包含炔基或经取代的炔基。在某些实施例中，L包含烷氧基或经取代的烷氧基。在某些实施例中，L包含氨基或经取代的氨基。在某些实施例中，L包含羧基或羧基酯基团。在某些实施例中，L包含酰氨基。在某些实施例中，L包含烷基酰胺或经取代的烷基酰胺基团。在某些实施例中，L包含芳基或经取代的芳基。在某些实施例中，L包含杂芳基或经取代的杂芳基。在某些实施例中，L包含环烷基或经取代的环烷基。在某些实施例中，L包含杂环基或经取代的杂环基。
在某些实施例中，L包含聚合物。例如，聚合物可以包含聚亚烷基二醇及其衍生物，包含聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、聚乙二醇均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇与丙二醇的共聚物(例如，其中均聚物和共聚物在一端被烷基未取代或取代)、聚乙烯醇、聚乙烯乙醚、聚乙烯吡咯烷酮、其组合等。在某些实施例中，所述聚合物是聚亚烷基二醇。在某些实施例中，所述聚合物是聚乙二醇。其它接头也是可能的，如本文更详细描述的缀合物和化合物中所示。
在一些实施例中，L是通过下式描述的接头：
-(L1)a-(L2)b-(L3)c-(L4)d-(L5)e-(L6)f-，
其中L1、L2、L3、L4、L5和L6各自独立地是接头亚基，并且a、b、c、d、e和f各自独立地是0或1，其中a、b、c、d、e和f的总和是1至6。
在某些实施例中，a、b、c、d、e和f的总和是1。在某些实施例中，a、b、c、d、e和f的总和是2。在某些实施例中，a、b、c、d、e和f的总和是3。在某些实施例中，a、b、c、d、e和f的总和是4。在某些实施例中，a、b、c、d、e和f的总和是5。在某些实施例中，a、b、c、d、e和f的总和是6。在某些实施例中，a、b、c、d、e和f各自是1。在某些实施例中，a、b、c、d和e各自是1，并且f是0。在某些实施例中，a、b、c和d各自是1，并且e和f各自是0。在某些实施例中，a、b和c各自是1，并且d、e和f各自是0。在某些实施例中，a和b各自是1，并且c、d、e和f各自是0。在某些实施例中，a是1，并且b、c、d、e和f各自是0。
在某些实施例中，接头亚基L1连接到肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分(例如，如上式(I)所示)。在某些实施例中，接头亚基L2如果存在的话，连接到药物。在某些实施例中，接头亚基L3，如果存在的话，连接到药物。在某些实施例中，接头亚基L4，如果存在的话，连接到药物。在某些实施例中，接头亚基L5，如果存在的话，连接到药物。在某些实施例中，接头亚基L6，如果存在的话，连接到药物。
任何方便的接头亚基可以用于接头L。所关注的接头亚基包含但不限于聚合物的单元，如聚乙二醇、聚乙烯和聚丙烯酸酯、氨基酸残基、基于碳水化合物的聚合物或碳水化合物残基及其衍生物、多核苷酸、烷基、芳基、杂环基、其组合以及其经取代的版本。在一些实施例中，L1、L2、L3、L4、L5和L6中的每一个(如果存在的话)包括一个或多个独立地选自以下的基团：聚乙二醇、经修饰的聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基以及二胺(例如，包含亚烷基二胺的连接基团)。
在一些实施例中，L1(如果存在的话)包括聚乙二醇、经修饰的聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基或二胺。在一些实施例中，L1包括聚乙二醇。在一些实施例中，L1包括经修饰的聚乙二醇。在一些实施例中，L1包括氨基酸残基。在一些实施例中，L1包括烷基或经取代的烷基。在一些实施例中，L1包括芳基或经取代的芳基。在一些实施例中，L1包括二胺(例如，包括亚烷基二胺的连接基团)。
在一些实施例中，L2(如果存在的话)包括聚乙二醇、经修饰的聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基或二胺。在一些实施例中，L2包括聚乙二醇。在一些实施例中，L2包括经修饰的聚乙二醇。在一些实施例中，L2包括氨基酸残基。在一些实施例中，L2包括烷基或经取代的烷基。在一些实施例中，L2包括芳基或经取代的芳基。在一些实施例中，L2包括二胺(例如，包括亚烷基二胺的连接基团)。
在一些实施例中，L3(如果存在的话)包括聚乙二醇、经修饰的聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基或二胺。在一些实施例中，L3包括聚乙二醇。在一些实施例中，L3包括经修饰的聚乙二醇。在一些实施例中，L3包括氨基酸残基。在一些实施例中，L3包括烷基或经取代的烷基。在一些实施例中，L3包括芳基或经取代的芳基。在一些实施例中，L3包括二胺(例如，包括亚烷基二胺的连接基团)。
在一些实施例中，L4(如果存在的话)包括聚乙二醇、经修饰的聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基或二胺。在一些实施例中，L4包括聚乙二醇。在一些实施例中，L4包括经修饰的聚乙二醇。在一些实施例中，L4包括氨基酸残基。在一些实施例中，L4包括烷基或经取代的烷基。在一些实施例中，L4包括芳基或经取代的芳基。在一些实施例中，L4包括二胺(例如，包括亚烷基二胺的连接基团)。
在一些实施例中，L5(如果存在的话)包括聚乙二醇、经修饰的聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基或二胺。在一些实施例中，L5包括聚乙二醇。在一些实施例中，L5包括经修饰的聚乙二醇。在一些实施例中，L5包括氨基酸残基。在一些实施例中，L5包括烷基或经取代的烷基。在一些实施例中，L5包括芳基或经取代的芳基。在一些实施例中，L5包括二胺(例如，包括亚烷基二胺的连接基团)。
在一些实施例中，L6(如果存在的话)包括聚乙二醇、经修饰的聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、经取代的烷基、芳基、经取代的芳基或二胺。在一些实施例中，L6包括聚乙二醇。在一些实施例中，L6包括经修饰的聚乙二醇。在一些实施例中，L6包括氨基酸残基。在一些实施例中，L6包括烷基或经取代的烷基。在一些实施例中，L6包括芳基或经取代的芳基。在一些实施例中，L6包括二胺(例如，包括亚烷基二胺的连接基团)。
在一些实施例中，L是包括-(L1)a-(L2)b-(L3)c-(L4)d-(L5)e-(L6)f-的接头，其中：
-(L1)a-是-(T1-V1)a-；
-(L2)b-是-(T2-V2)b-；
-(L3)c-是-(T3-V3)c-；
-(L4)d-是-(T4-V4)d-；
-(L5)e-是-(T5-V5)e-；并且
-(L6)f-是-(T6-V6)f-，
其中T1、T2、T3、T4、T5和T6，如果存在的话，是栓系基团；
V1、V2、V3、V4、V5和V6，如果存在的话，是共价键或连接官能团；并且
a、b、c、d、e和f各自独立地是0或1，其中a、b、c、d、e和f的总和是1至6。
如上文所描述的，在某些实施例中，L1连接到肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分(例如，如上式(I)所示)。因此，在某些实施例中，T1连接到肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分(例如，如上式(I)所示)。在某些实施例中，V1连接到药物。在某些实施例中，L2，如果存在的话，连接到药物。因此，在某些实施例中，T2，如果存在的话，连接到药物，或者V2，如果存在的话，连接到药物。在某些实施例中，L3，如果存在的话，连接到药物。因此，在某些实施例中，T3，如果存在的话，连接到药物，或者V3，如果存在的话，连接到药物。在某些实施例中，L4，如果存在的话，连接到药物。因此，在某些实施例中，T4，如果存在的话，连接到药物，或者V4，如果存在的话，连接到药物。在某些实施例中，L5，如果存在的话，连接到药物。因此，在某些实施例中，T5，如果存在的话，连接到药物，或者V5，如果存在的话，连接到药物。在某些实施例中，L6，如果存在的话，连接到药物。因此，在某些实施例中，T6，如果存在的话，连接到药物，或者V6，如果存在的话，连接到药物。
关于栓系基团，T1、T2、T3、T4、T5和T6，任何方便的栓系基团都可以用于主题接头中。在一些实施例中，T1、T2、T3、T4、T5和T6各自包括一个或多个独立地选自以下共价键的基团：(C1-C12)烷基、经取代的(C1-C12)烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基、(EDA)w、(PEG)n、(AA)p、-(CR13OH)m-、4-氨基-哌啶(4AP)、间氨基-苄氧基(MABO)、间氨基-苄氧基羰基(MABC)、对氨基-苄氧基(PABO)、对氨基-苄氧基羰基(PABC)、对氨基苄基(PAB)、对氨基-苄基氨基(PABA)、对氨基-苯基(PAP)、对羟基-苯基(PHP)、缩醛、肼、二硫化物和酯，其中每个w是1至20的整数，每个n是1至30的整数，每个p是1至20的整数，并且每个m是1至12的整数。
在某些实施例中，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和/或T6)包含(C1-C12)烷基或经取代的(C1-C12)烷基。在某些实施例中，(C1-C12)烷基是包含1至12个碳原子，如1至10个碳原子、或1至8个碳原子、或1至6个碳原子、或1至5个碳原子、或1至4个碳原子或1至3个碳原子的直链或支链烷基。在一些情况下，(C1-C12)烷基可以是烷基或经取代的烷基，如C1-C12烷基、或C1-C10烷基、或C1-C6烷基、或C1-C3烷基。在一些情况下，(C1-C12)烷基是C2-烷基。例如，(C1-C12)烷基可以是亚烷基或经取代的亚烷基，如C1-C12亚烷基、或C1-C10亚烷基、或C1-C6亚烷基、或C1-C3亚烷基。在一些情况下，(C1-C12)烷基是C2-亚烷基(例如，CH2CH2)。
在某些实施例中，经取代的(C1-C12)烷基是包含1至12个碳原子，如1至10个碳原子、或1至8个碳原子、或1至6个碳原子、或1至5个碳原子、或1至4个碳原子或1至3个碳原子的直链或支链经取代的烷基。在一些情况下，经取代的(C1-C12)烷基可以是经取代的烷基，如经取代的C1-C12烷基、或经取代的C1-C10烷基、或经取代的C1-C6烷基、或经取代的C1-C3烷基。在一些情况下，经取代的(C1-C12)烷基是经取代的C2-烷基。例如，经取代的(C1-C12)烷基可以是经取代的亚烷基，如经取代的C1-C12亚烷基、或经取代的C1-C10亚烷基、或经取代的C1-C6亚烷基、或经取代的C1-C3亚烷基。在一些情况下，经取代的(C1-C12)烷基是经取代的C2-亚烷基。
在某些实施例中，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和/或T6)包含芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基或经取代的杂环基。在一些情况下，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和/或T6)包含芳基或经取代的芳基。例如，芳基可以是苯基。在一些情况下，经取代的芳基是经取代的苯基。经取代的苯基可以被一个或多个选自以下的取代基取代：(C1-C12)烷基、经取代的(C1-C12)烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。在一些情况下，经取代的芳基是经取代的苯基，其中取代基包含如本文所述的可切割部分(例如，酶促可切割部分，如糖苷或糖苷衍生物)。
在一些情况下，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和/或T6)包含杂芳基或经取代的杂芳基。在一些情况下，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和T6)包含环烷基或经取代的环烷基。在一些情况下，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和T6)包含杂环基或经取代的杂环基。在一些情况下，经取代的杂芳基、经取代的环烷基或经取代的杂环基上的取代基包含如本文所述的可切割部分(例如，酶促可切割部分，如糖苷或糖苷衍生物)。
在某些实施例中，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和/或T6)包含乙二胺(EDA)部分，例如，含有栓系基团的EDA。在某些实施例中，(EDA)w包含一种或多种EDA部分，如其中w是1至50的整数，如1至40、1至30、1至20、1至12、或1至6，如1、2、3、4、5或6)。经连接的乙二胺(EDA)部分可以任选地在一个或多个方便的位置被任何方便的取代基，例如，被烷基、经取代的烷基、酰基、经取代的酰基、芳基或经取代的芳基取代。在某些实施例中，EDA部分通过以下结构描述：
其中y是1至6的整数，并且r是0或1，并且每个R12独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。在某些实施例中，y是1、2、3、4、5或6。在某些实施例中，y是1，并且r是0。在某些实施例中，y是1，并且r是1。在某些实施例中，y是2，并且r是0。在某些实施例中，y是2，并且r是1。在某些实施例中，每个R12独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、芳基以及经取代的芳基。在某些实施例中，EDA的任何两个相邻R12基团可以环状连接，例如以形成哌嗪基环。在某些实施例中，y是1，并且两个相邻R12基团是烷基，环状连接以形成哌嗪基环。在某些实施例中，y是1，并且相邻R12基团选自氢、烷基(例如甲基)和经取代的烷基(例如较低烷基-OH，如乙基-OH或丙基-OH)。
在某些实施例中，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和/或T6)包含4-氨基-哌啶(4AP)部分(在本文中也被称为哌啶-4-氨基，P4A)。4AP部分可以任选地在一个或多个方便的位置被任何方便的取代基，例如，被烷基、经取代的烷基、聚乙二醇部分、酰基、经取代的酰基、芳基或经取代的芳基取代。在某些实施例中，4AP部分通过以下结构描述：
其中R12选自氢、烷基、经取代的烷基、聚乙二醇部分(例如，聚乙二醇或经修饰的聚乙二醇)、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。在某些实施例中，R12是聚乙二醇部分。在某些实施例中，R12是经羧基修饰的聚乙二醇。
在某些实施例中，R12包含通过下式描述的聚乙二醇部分：(PEG)k，其可以通过以下结构表示：
其中k是1至20的整数，如1至18、或1至16、或1至14、或1至12、或1至10、或1至8、或1至6、或1至4、或1或2，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些情况下，k是2。在某些实施例中，R17选自OH、COOH或COOR；其中R选自烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。在某些实施例中，R17是COOH。在某些实施例中，R17是COOCH3。
在某些实施例中，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和/或T6)包含(PEG)n，其中(PEG)n是聚乙二醇或经修饰的聚乙二醇连接单元。在某些实施例中，(PEG)n通过以下结构描述：
其中n是1至50的整数，如1至40、1至30、1至20、1至12、或1至6，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些情况下，n是2。在一些情况下，n是3。在一些情况下，n是6。在一些情况下，n是12。
在某些实施例中，栓系基团(例如T1、T2、T3、T4、T5和/或T6)包含(AA)p，其中AA是氨基酸残基。可以使用任何方便的氨基酸。所关注的氨基酸包含但不限于L-和D-氨基酸；天然存在的氨基酸，如20个主要α-氨基酸和β-丙氨酸中的任何氨基酸；非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物)，如非天然存在的α-氨基酸或非天然存在的β-氨基酸等。在某些实施例中，p是1至50的整数，如1至40、1至30、1至20、1至12、或1至6，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些实施例中，p是1。在某些实施例中，p是2。
在某些实施例中，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和/或T6)包含氨基酸类似物。氨基酸类似物包含在结构和/或总体形状上与通常在天然存在的蛋白质中发现的一个或多个氨基酸类似的化合物(例如，Ala或A、Cys或C、Asp或D、Glu或E、Phe或F、Gly或G、His或H、Ile或I、Lys或K、Leu或L、Met或M、Asn或N、Pro或P、Gln或Q、Arg或R、Ser或S、Thr或T、Val或V、Trp或W、Tyr或Y)。氨基酸类似物还包含具有经修饰的侧链或主链的天然氨基酸。氨基酸类似物还包含具有与天然存在的D-形式以及L-形式的氨基酸类似物相同的立体化学的氨基酸类似物。在一些情况下，氨基酸类似物共享一个或多个天然氨基酸的主链结构和/或侧链结构，其中差异是分子中的一个或多个经修饰的基团。此类修饰可以包含但不限于用原子(如N)取代相关原子(如S)、添加基团(如甲基或羟基等)或原子(如Cl或Br等)、缺失基团、取代共价键(单键取代双键等)或其组合。例如，氨基酸类似物可以包含α-羟基酸和α-氨基酸等。氨基酸类似物的实例包含但不限于磺基丙氨酸等。
在某些实施例中，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和/或T6)包含通过式-(CR13OH)m-描述的部分，其中m是0或n是1至50的整数，如1至40、1至30、1至20、1至12、或1至6，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，R13选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。在某些实施例中，R13是氢。在某些实施例中，R13是烷基或经取代的烷基，如C1-6烷基或C1-6经取代的烷基、或C1-4烷基或C1-4经取代的烷基、或C1-3烷基或C1-3经取代的烷基。在某些实施例中，R13是烯基或经取代的烯基，如C2-6烯基或C2-6经取代的烯基、或C2-4烯基或C2-4经取代的烯基、或C2-3烯基或C2-3经取代的烯基。在某些实施例中，R13是炔基或经取代的炔基。在某些实施例中，R13是烷氧基或经取代的烷氧基。在某些实施例中，R13是氨基或经取代的氨基。在某些实施例中，R13是羧基或羧基酯。在某些实施例中，R13是酰基或酰氧基。在某些实施例中，R13是酰氨基或氨酰基。在某些实施例中，R13是烷基酰胺或经取代的烷基酰胺。在某些实施例中，R13是磺酰基。在某些实施例中，R13是硫代烷氧基或经取代的硫代烷氧基。在某些实施例中，R13是芳基或经取代的芳基，如C5-8芳基或C5-8经取代的芳基，如C5芳基或C5经取代的芳基、或C6芳基或C6经取代的芳基。在某些实施例中，R13是杂芳基或经取代的杂芳基，如C5-8杂芳基或C5-8经取代的杂芳基，如C5杂芳基或C5经取代的杂芳基、或C6取代的杂芳基或C6经取代的杂芳基。在某些实施例中，R13是环烷基或经取代的环烷基，如C3-8环烷基或C3-8经取代的环烷基，如C3-6环烷基或C3-6经取代的环烷基、或C3-5环烷基或C3-5经取代的环烷基。在某些实施例中，R13是杂环基或经取代的杂环基，如C3-8杂环基或C3-8经取代的杂环基，如C3-6杂环基或C3-6经取代的杂环基、或C3-5杂环基或C3-5经取代的杂环基。
在某些实施例中，R13选自氢、烷基、经取代的烷基、芳基以及经取代的芳基。在这些实施例中，烷基、经取代的烷基、芳基以及经取代的芳基如上文关于R13所述。
在某些实施例中，栓系基团(例如，T1、T2、T3、T4、T5和/或T6)包含间氨基-苄氧基(MABO)、间氨基-苄氧基羰基(MABC)、对氨基-苄氧基(PABO)、对氨基-苄氧基羰基(PABC)、对氨基苄基(PAB)、对氨基-苄基氨基(PABA)、对氨基-苯基(PAP)或对羟基-苯基(PHP)。
在一些实施例中，栓系包含通过以下结构描述的MABO基团：
在一些实施例中，栓系包含通过以下结构描述的MABC基团：
在一些实施例中，栓系包含通过以下结构描述的PABO基团：
在一些实施例中，栓系包含通过以下结构描述的PABC基团：
在一些实施例中，栓系包含通过以下结构描述的PAB基团：
在一些实施例中，栓系包含通过以下结构描述的PABA基团：
在一些实施例中，栓系包含通过以下结构描述的PAP基团：
在一些实施例中，栓系包含通过以下结构描述的PHP基团：
在某些实施例中，每个R14独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。
在某些实施例中，R14是氢。在某些实施例中，每个R14是氢。在某些实施例中，R14是烷基或经取代的烷基，如C1-6烷基或C1-6经取代的烷基、或C1-4烷基或C1-4经取代的烷基、或C1-3烷基或C1-3经取代的烷基。在某些实施例中，R14是烯基或经取代的烯基，如C2-6烯基或C2-6经取代的烯基、或C2-4烯基或C2-4经取代的烯基、或C2-3烯基或C2-3经取代的烯基。在某些实施例中，R14是炔基或经取代的炔基。在某些实施例中，R14是烷氧基或经取代的烷氧基。在某些实施例中，R14是氨基或经取代的氨基。在某些实施例中，R14是羧基或羧基酯。在某些实施例中，R14是酰基或酰氧基。在某些实施例中，R14是酰氨基或氨酰基。在某些实施例中，R14是烷基酰胺或经取代的烷基酰胺。在某些实施例中，R14是磺酰基。在某些实施例中，R14是硫代烷氧基或经取代的硫代烷氧基。在某些实施例中，R14是芳基或经取代的芳基，如C5-8芳基或C5-8经取代的芳基，如C5芳基或C5经取代的芳基、或C6芳基或C6经取代的芳基。在某些实施例中，R14是杂芳基或经取代的杂芳基，如C5-8杂芳基或C5-8经取代的杂芳基，如C5杂芳基或C5经取代的杂芳基、或C6取代的杂芳基或C6经取代的杂芳基。在某些实施例中，R14是环烷基或经取代的环烷基，如C3-8环烷基或C3-8经取代的环烷基，如C3-6环烷基或C3-6经取代的环烷基、或C3-5环烷基或C3-5经取代的环烷基。在某些实施例中，R14是杂环基或经取代的杂环基，如C3-8杂环基或C3-8经取代的杂环基，如C3-6杂环基或C3-6经取代的杂环基、或C3-5杂环基或C3-5经取代的杂环基。
在以上示出的MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP和PHP栓系结构的一些实施例中，苯基环可以被一个或多个另外的选自以下的基团取代：卤素、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。
在接头L的某些实施例中，栓系基团T1、T2、T3、T4、T5或T6中的一个或多个各自任选地被糖苷或糖苷衍生物取代。在某些实施例中，所述糖苷或糖苷衍生物选自葡糖苷酸、半乳糖苷、葡萄糖苷、甘露糖苷、岩藻糖苷、O-GlcNAc和O-GalNAc。
在某些实施例中，以上示出的MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP和PHP栓系结构可以被一个或多个另外的选自糖苷和糖苷衍生物的基团取代。例如，在以上示出的MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP和PHP栓系结构的一些实施例中，苯基环可以被一个或多个另外的选自糖苷和糖苷衍生物的基团取代。在某些实施例中，所述糖苷或糖苷衍生物选自葡糖苷酸、半乳糖苷、葡萄糖苷、甘露糖苷、岩藻糖苷、O-GlcNAc和O-GalNAc。
例如，在一些实施例中，所述糖苷或糖苷衍生物可以选自以下结构：
关于连接官能团，V1、V2、V3、V4、V5和V6，任何方便的连接官能团都可以用于接头L。所关注的连接官能团包含但不限于氨基、羰基、酰氨基、氧羰基、羧基、磺酰基、亚砜、磺酰基氨基、氨基磺酰基、硫代、氧基、磷、磷酰胺、硫代磷酸酯等。在一些实施例中，V1、V2、V3、V4、V5和V6各自独立地选自共价键、-CO-、-NR15-、-NR15(CH2)q-、-NR15(C6H4)-、-CONR15-、-NR15CO-、-C(O)O-、-OC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NR15-、-NR15SO2-和-P(O)OH-，其中q是1至6的整数。在某些实施例中，q是1至6的整数(例如，1、2、3、4、5或6)。在某些实施例中，q是1。在某些实施例中，q是2。在某些实施例中，q是3。在某些实施例中，q是4。在某些实施例中，q是5。在某些实施例中，q是6。
在一些实施例中，每个R15独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。
在某些实施例中，R15是氢。在某些实施例中，每个R15是氢。在某些实施例中，R15是烷基或经取代的烷基，如C1-6烷基或C1-6经取代的烷基、或C1-4烷基或C1-4经取代的烷基、或C1-3烷基或C1-3经取代的烷基。在某些实施例中，R15是烯基或经取代的烯基，如C2-6烯基或C2-6经取代的烯基、或C2-4烯基或C2-4经取代的烯基、或C2-3烯基或C2-3经取代的烯基。在某些实施例中，R15是炔基或经取代的炔基。在某些实施例中，R15是烷氧基或经取代的烷氧基。在某些实施例中，R15是氨基或经取代的氨基。在某些实施例中，R15是羧基或羧基酯。在某些实施例中，R15是酰基或酰氧基。在某些实施例中，R15是酰氨基或氨酰基。在某些实施例中，R15是烷基酰胺或经取代的烷基酰胺。在某些实施例中，R15是磺酰基。在某些实施例中，R15是硫代烷氧基或经取代的硫代烷氧基。在某些实施例中，R15是芳基或经取代的芳基，如C5-8芳基或C5-8经取代的芳基，如C5芳基或C5经取代的芳基、或C6芳基或C6经取代的芳基。在某些实施例中，R15是杂芳基或经取代的杂芳基，如C5-8杂芳基或C5-8经取代的杂芳基，如C5杂芳基或C5经取代的杂芳基、或C6取代的杂芳基或C6经取代的杂芳基。在某些实施例中，R15是环烷基或经取代的环烷基，如C3-8环烷基或C3-8经取代的环烷基，如C3-6环烷基或C3-6经取代的环烷基、或C3-5环烷基或C3-5经取代的环烷基。在某些实施例中，R15是杂环基或经取代的杂环基，如C3-8杂环基或C3-8经取代的杂环基，如C3-6杂环基或C3-6经取代的杂环基、或C3-5杂环基或C3-5经取代的杂环基。
在某些实施例中，每个R15独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、羧基、羧基酯、酰基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。在这些实施例中，烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、羧基、羧基酯、酰基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基如上文关于R15所述。
在某些实施例中，栓系基团包含缩醛基、二硫化物、肼或酯。在一些实施例中，栓系基团包含缩醛基。在一些实施例中，栓系基团包含肼。在一些实施例中，栓系基团包含二硫化物。在一些实施例中，栓系基团包含酯。
如上所述，在一些实施例中，L是包括-(T1-V1)a-(T2-V2)b-(T3-V3)c-(T4-V4)d-(T5-V5)e-(T6-V6)f-的接头，其中a、b、c、d、e和f各自独立地是0或1，其中a、b、c、d、e和f的总和是1至6。
在一些实施例中，在接头L中：
T1选自(C1-C12)烷基和经取代的(C1-C12)烷基；
T2、T3、T4、T5和T6各自独立地选自(C1-C12)烷基、经取代的(C1-C12)烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基、(EDA)w、(PEG)n、(AA)p、-(CR13OH)m-、4-氨基-哌啶(4AP)、MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP、PHP、缩醛基、二硫化物、肼和酯；并且
V1、V2、V3、V4、V5和V6各自独立地选自共价键、-CO-、-NR15-、-NR15(CH2)q-、-NR15(C6H4)-、-CONR15-、-NR15CO-、-C(O)O-、-OC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NR15-、-NR15SO2-和-P(O)OH-，其中q是1至6的整数；
其中：
(PEG)n为其中n为1至30的整数；
EDA为具有以下结构的乙二胺部分：
其中y为1至6的整数，并且r为0或1；
4-氨基-哌啶(4AP)是
AA是氨基酸残基，其中p是1至20的整数；并且
每个R12独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、聚乙二醇部分、芳基以及经取代的芳基，其中任意两个相邻R12基团能够环状连接以形成哌嗪基环；
每个R13独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、芳基以及经取代的芳基；并且
每个R15独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、羧基、羧基酯、酰基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。
在某些实施例中，T1、T2、T3、T4、T5和T6以及V1、V2、V3、V4、V5和V6选自以下：
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2为-CO-；
T3为(C1-C12)烷基，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
T4为(AA)p，并且V4不存在；并且
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CONH-；
T2为(PEG)n，并且V2为-CO-；
T3为(AA)p，并且V3不存在；
T4为PABC，并且V4不存在；并且
e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为氨基酸类似物，并且V2为-NH-；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；
T4为(AA)p，并且V4不存在；
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0。
例如，在某些实施例中，式(I)的接头L具有选自以下的结构：
在某些实施例中，由波浪线表示的接头L的左手侧分别在吲哚基或吡咯基氮处连接到肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分。在某些实施例中，由星号(*)表示的接头L的右手侧连接到药物W1。例如，接头L的右手侧可以通过酰胺键连接到药物W1。
在某些实施例中，式(I)的缀合物具有选自以下的结构：
以及
在某些实施例中，缀合物是抗体-药物缀合物，其中抗体和药物通过如上文所描述的接头(L)连接在一起。在一些情况下，接头是不可切割接头。
在其它情况下，接头是可切割接头。可切割接头是包含一个或多个可切割部分的接头，其中可切割部分包含一个或多个在某些条件下可以解离的键，从而将可切割接头分离成两个或更多个可分离部分。例如，可切割部分可以包含一个或多个共价键，所述一个或多个共价键在某些条件下可以解离或分解，以将可切割接头分离成两个或更多个部分。因此，可切割接头可以包含在抗体-药物缀合物中，使得在适当的条件下，可切割接头切割，以在药物所期望的靶向作用位点处将药物从抗体中分离或释放。
在一些情况下，可切割接头包含两个可切割部分，如第一可切割部分和第二可切割部分。可切割部分可以被配置，使得需要切割两个可切割部分，以便在药物的所需的靶向作用位点处将药物从抗体中分离或释放。例如，可切割接头的切割可以通过首先切割两个可切割部分中的一个，并且然后切割两个可切割部分中的另一个来实现。在某些实施例中，可切割接头包含第一可切割部分和阻碍第一可切割部分的切割的第二可切割部分。“阻碍切割”意指未切割的第二可切割部分的存在降低了第一可切割部分的切割的可能性或基本上抑制了第一可切割部分的切割，从而大大减少了可切割接头的切割的量或阻止了可切割接头的切割。例如，未切割的第二可切割部分的存在可以阻碍第一可切割部分的切割。由第二可切割部分的存在而对第一可切割部分的切割的阻碍反过来大大减少了药物从抗体中释放的量或阻止药物从抗体中释放。例如，可以大大减少或阻止药物从抗体中过早释放，直到抗体-药物缀合物处于或接近药物所期望的靶向作用位点。
在一些情况下，由于第二可切割部分阻碍了第一可切割部分的切割，因此可以通过首先切割第二可切割部分，并且然后切割第一可切割部分来实现可切割接头的切割。第二可切割部分的切割可以减少或消除对第一可切割部分的切割的阻碍，从而允许第一可切割部分被切割。第一可切割部分的切割可导致可切割接头解离或分离成如上文所描述的两个或更多个部分，以将药物从抗体-药物缀合物中释放。在一些情况下，在存在未切割的第二可切割部分的情况下，第一可切割部分的切割基本上不会发生。基本上意指，在存在未切割的第二可切割部分的情况下，第一可切割部分发生约10％或更少的切割，如在存在未切割的第二可切割部分的情况下，第一可切割部分发生约9％或更低、或约8％或更低、或约7％或更低、或约6％或更低、或约5％或更少、或约4％或更少、或约3％或更低、或约2％或更少、或约1％或更低、或约0.5％或更少、或约0.1％或更少的切割。
换句话说，第二可切割部分可以保护第一可切割部分免受切割。例如，未切割的第二可切割部分的存在可以保护第一可切割部分免受切割，并且从而大大减少或阻止药物从抗体中过早释放，直到抗体-药物缀合物处于或接近药物所期望的靶向作用位点。因此，第二可切割部分的切割暴露了第一可切割部分(例如，使第一可切割部分脱保护)，从而允许第一可切割部分被切割，这导致可切割接头的切割，这反过来又在如上文所描述的药物所期望的靶向作用位点将药物从抗体中分离或释放。在某些情况下，第二可切割部分的切割使第一可切割部分暴露给随后的切割，但第二可切割部分本身并不导致可切割接头的切割(例如，仍然需要切割第一可切割部分以切割可切割接头)。
可切割接头中包含的可切割部分可以各自是酶促可切割部分。例如，第一可切割部分可以是第一种酶促可切割部分，并且第二可切割部分可以是第二种酶促可切割部分。酶促可切割部分是可以通过酶的酶促作用分离成如上文所描述的两个或更多个部分的可切割部分。酶促可切割部分可以是可以通过酶，如但不限于肽、糖苷等的酶促作用切割的任何可切割部分。在一些情况下，切割酶促可切割部分的酶存在于所期望的靶向作用位点，如要从抗体-药物缀合物中释放的药物所期望的靶向作用位点。在一些情况下，切割酶促可切割部分的酶在其它面积(如全血，血浆或血清中)中不大量存在。因此，可以控制酶促可切割部分的切割，使得在所期望的作用位点发生大量切割，而在其它面积或抗体-药物缀合物到达所期望的作用位点之前，不会显著发生切割。
例如，如本文所述，本公开的抗体-药物缀合物可以用于治疗癌症，如用于将癌症治疗药物递送到存在癌细胞的所期望的作用位点。在一些情况下，酶，如蛋白酶组织蛋白酶B，可以成为癌细胞中过度表达的癌症的生物标志物。某些酶在癌症中的过表达以及因此的定位可用于本公开的抗体-药物缀合物的可切割接头中包含的酶促可切割部分的上下文中，以在所期望的作用位点(例如癌(和过表达的酶)的位点)特异性释放药物。因此，在一些实施例中，酶促可切割部分是可以被癌细胞中过表达的酶切割的可切割部分(例如肽)。例如，所述酶可以是蛋白酶组织蛋白酶B。因此，在一些情况下，酶促可切割部分是可以被如组织蛋白酶B等蛋白酶切割的可切割部分(例如，肽)。
在某些实施例中，酶促可切割部分是肽。肽可以是任何适合用于可切割接头的肽，并且所述肽可以通过酶的酶促作用切割。可以用作酶可切割部分的肽的非限制性实例包含例如Val-Ala、Phe-Lys等。例如，以上描述的第一可切割部分(例如，受第二可切割部分保护免受过早切割的可切割部分)可以包含肽。未切割的第二可切割部分的存在可以保护第一可切割部分(肽)免受蛋白酶(例如组织蛋白酶B)的切割，并且从而大大减少或阻止药物从抗体中过早释放，直到抗体-药物缀合物处于或接近药物所期望的靶向作用位点。在一些情况下，包括第一可切割部分的肽的氨基酸残基之一连接到取代基或包含取代基，其中取代基包括第二可切割部分。在一些情况下，第二可切割部分包含糖苷。
在一些实施例中，酶促可切割部分是糖部分，如糖苷(或乙糖基)。在一些情况下，与不包含糖苷的可切割接头相比，糖苷可以促进可切割接头的亲水性的增加。糖苷可以是任何适合用于可切割接头的糖苷或糖苷衍生物，并且所述糖苷或糖苷衍生物可以通过酶的酶促作用切割。例如，第二可切割部分(例如，保护第一可切割部分免受过早切割的可切割部分)可以是糖苷。例如，在一些实施例中，第一可切割部分包含肽，并且第二可切割部分包含糖苷。在某些实施例中，第二可切割部分是选自葡糖苷酸、半乳糖苷、葡萄糖苷、甘露糖苷、岩藻糖苷、O-GlcNAc和O-GalNAc的糖苷或糖苷衍生物。在一些情况下，第二可切割部分是葡糖苷酸。在一些情况下，第二可切割部分是半乳糖苷。在一些情况下，第二可切割部分是葡萄糖苷。在一些情况下，第二可切割部分是甘露糖苷。在一些情况下，第二可切割部分是岩藻糖苷。在一些情况下，第二可切割部分是O-GlcNAc。在一些情况下，第二可切割部分是O-GalNAc。
糖苷可以通过糖苷键连接(例如共价键合)到可切割接头。糖苷键可以通过各种类型的键，如但不限于O-糖苷键(O-糖苷)、N-糖苷键(糖胺)、S-糖苷键(硫糖苷)或C-糖苷键(C-糖苷或C-糖基)将糖苷与可切割接头连接。在一些情况下，糖苷键是O-糖苷键(O-糖苷)。在一些情况下，糖苷可以通过酶(例如，通过酶促介导的糖苷键的水解)从其连接的可切割接头中切割。糖苷可以通过任何方便的能够对将糖苷连接到可切割接头的糖苷键进行切割(水解)的酶从可切割接头中去除或切割。可以用于介导将糖苷连接到可切割接头的糖苷键的切割(水解)的酶的实例是葡萄糖醛酸酶、糖苷酶，如半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶等。其它合适的酶也可用于介导将糖苷连接到可切割接头的糖苷键的切割(水解)。在一些情况下，用于介导将糖苷连接到可切割接头的糖苷键的切割(水解)的酶可见于抗体-药物缀合物的药物的所期望的作用位点处或附近。例如，酶可以是在抗体-药物缀合物的药物的所期望的作用位点处或附近的细胞中发现的溶酶体酶，如溶酶体糖苷酶。在一些情况下，酶是在其中发现介导第一可切割部分的切割的酶的靶位点处或附近发现的酶。
说明书中所示的化学实体、药物、接头和偶联部分以及本文所描述的结构中的任何一者可以适用于主题缀合物。
关于肼基-吲哚基和肼基-吡咯并-吡啶基化合物和用于生产缀合物的方法的另外的公开内容可见于美国专利第9,310,374号和美国专利第9,493,413号，所述美国专利中的每一个的公开内容通过引用并入本文。与可切割接头相关的另外的公开内容可见于于2020年1月22日提交的PCT公开第WO 2020/154437号以及于2021年11月19日提交的美国申请第17/531,343号，所述文献中的每一个的公开内容通过引用并入本文。
抗体-药物缀合物(ADC)通常包含与药物(如细胞毒性小分子)连接的抗体，并且靶向非健康细胞。由于靶抗原有时在非健康细胞以及健康细胞上表达，因此在体内，有效载荷(例如，药物或活性剂)可以卸载到任一类型的细胞上。在这种情况下，ADC可以靶向与非健康细胞表达相同抗原的脱靶细胞或健康细胞。这可能会导致临床上可检测到的所谓交叉反应性。例如，向受试者施用ADC可能引起与ADC的靶介导的交叉反应性相关的毒性。毒性可能意味着可以施用于受试者的剂量有限，无论ADC本身的特异性或功效如何。因此，在一些情况下，可能期望降低由ADC与表达靶抗原的健康细胞的交叉反应性引起的毒性。
在一些情况下，当将ADC施用于受试者时，本公开的ADC具有降低的与ADC的靶介导的交叉反应性相关的毒性。例如，与当向受试者施用非式(I)的ADC时由交叉反应性引起的毒性相比，本文所描述的式(I)的ADC可以具有由受试者中的靶介导的交叉反应性引起的减少的或降低的毒性。减少或降低毒性意指与受试者的毒性相关的参数中的一个或多个参数的减少或降低。例如，参数可以基于临床观察进行评分，并且可以对应于受试者的身体区域或功能、生理或行为方面。通过降低毒性，本公开的ADC基于受试者的每个身体区域或生理或行为方面的临床评分降低或减少受试者的反应参数的发生、强度、严重程度和/或持续时间。与受试者的毒性相关的参数可以包含但不限于活动水平/无端行为、引发行为、运动/神经、呼吸、姿势、身体状况、皮肤状况、眼睛状况、肿瘤或感染(与疾病指示无关)、体重等和其组合。
在一些情况下，如本文所使用的，除式(I)之外的ADC是指其中接头-有效载荷在结构上或功能上或两者上不同于如本文所公开的式(I)的ADC的ADC。在一些情况下，除式(I)之外的ADC不被本公开的式(I)涵盖。例如，除式(I)之外的ADC可以指与具有与式(I)相比不同结构的接头的药物连接的抗体。
在一些实施例中，当向受试者施用式(I)的ADC时，受试者中的靶标介导的交叉反应性降低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更高。在一些实施例中，当向受试者施用式(I)的ADC时，通过减少上文所描述的特定参数或参数组合的临床观察的次数、严重程度和/或持续时间，减少受试者中的靶标介导的交叉反应性。
在一些实施例中，当向受试者施用式(I)的ADC时，与当向受试者施用除式(I)之外的ADC并且靶抗原相同时相比，ADC的体内稳定性增加。
在一些实施例中，如上文所讨论的，式(I)的ADC包含具有第一和第二可切割部分的可切割接头，其中未切割的第二可切割部分的存在保护第一可切割部分免于切割，并且因此显著减少或防止药物从ADC释放。例如，在一些实施例中，式(I)的ADC包含可切割接头，其中第二可切割部分(例如，保护第一可切割部分免于过早切割的可切割部分)是糖苷或糖苷衍生物，并且第一可切割部分包含肽。在一些实施例中，与ADC靶向的非健康细胞相比，受试者在健康细胞中可能具有葡萄糖醛酸酶或糖苷酶的差异表达。例如，与ADC靶向的非健康细胞相比，健康细胞可能表达较少的葡萄糖醛酸酶或糖苷酶。在一些情况下，当ADC与表达靶抗原的健康细胞存在靶介导的交叉反应性时，健康细胞的葡萄糖醛酸酶或糖苷酶表达的减少可能引起减少或防止接头的第二可切割部分的切割，并且因此减少或防止药物从健康细胞位置的ADC释放。进而，在一些实施例中，这可能引起由ADC与表达靶抗原的健康细胞的靶介导的交叉反应性引起的毒性降低。
可用于产生缀合物的化合物
本公开提供了可用于产生本文所描述的缀合物的肼基-吲哚基和肼基-吡咯并-吡啶基化合物。在某些实施例中，肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基化合物可以是用于缀合多肽(例如，抗体)和药物或活性剂(例如，喜树碱或喜树碱衍生物)的缀合部分。例如，肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基化合物可以与多肽(抗体)结合，并且也可以与药物或活性剂结合，从而将多肽(抗体)和药物间接结合在一起。
在某些实施例中，所述化合物是式(III)的化合物：
其中
Z为CR4或N；
R2和R3各自独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基，或者R2和R3任选地环状连接以形成5元或6元杂环基；
每个R4独立地选自氢、卤素、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基；
L为接头；并且
W1为药物。
关于式(III)的化合物，取代基Z、R2、R3、R4、L和W1如上文关于式(I)的缀合物所描述。类似地，关于式(III)的接头L，T1、T2、T3、T4、T5、T6、V1、V2、V3、V4、V5和V6取代基如上文关于式(I)的缀合物所描述。
例如，在式(III)的化合物的一些情况下，T1、T2、T3、T4、T5和T6以及V1、V2、V3、V4、V5和V6选自以下：
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2为-CO-；
T3为(C1-C12)烷基，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
T4为AA，并且V4不存在；并且
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CONH-；
T2为(PEG)n，并且V2为-CO-；
T3为AA，并且V3不存在；
T4为PABC，并且V4不存在；并且
e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为氨基酸类似物，并且V2为-NH-；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；
T4为AA，并且V4不存在；
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0。
例如，在某些实施例中，式(III)的接头L具有选自以下的结构：
在某些实施例中，由波浪线表示的接头L的左手侧分别在吲哚基或吡咯基氮处连接到肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分。在某些实施例中，由星号(*)表示的接头L的右手侧连接到药物W1。例如，接头L的右手侧可以通过酰胺键连接到药物W1。
式(III)的化合物可以用于本文所描述的缀合反应中，其中连接到肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基缀合部分的药物或活性剂缀合到多肽(例如，抗体)以形成抗体-药物缀合物。
在某些实施例中，式(III)的化合物具有选自以下的结构：
以及
上述结构中示出的任何化学实体、接头和缀合部分均可适于用于主题化合物和缀合物。
抗体
如上所述，主题缀合物可以包括抗体作为取代基W2，其中所述抗体的氨基酸序列已被修饰成包含2-甲酰基甘氨酸(fGly)残基。如本文所使用的，氨基酸可以通过其标准名称、其标准三个字母缩写和/或其标准一个字母缩写来指代，如：丙氨酸或Ala或A；半胱氨酸或Cys或C；天冬氨酸或Asp或D；谷氨酸或Glu或E；苯丙氨酸或Phe或F；甘氨酸或Gly或G；组氨酸或His或H；异亮氨酸或Ile或I；赖氨酸或Lys或K；亮氨酸或Leu或L；甲硫氨酸或Met或M；天冬酰胺或Asn或N；脯氨酸或Pro或P；谷氨酰胺或Gln或Q；精氨酸或Arg或R；丝氨酸或Ser或S；苏氨酸或Thr或T；缬氨酸或Val或V；色氨酸或Trp或W；以及酪氨酸或Tyr或Y。
本公开的抗体可以与特定靶组织(例如癌组织)结合并且可以示出与正常组织不结合(例如，如通过免疫组织化学测量的不显著的结合或通过免疫组织化学不可检测的结合)。例如，本文所描述的抗体可以与具有癌细胞的人胃、乳腺和/或肺组织结合，同时未示出与不具有癌细胞的人胃、乳腺和/或肺组织的可检测的结合。
所述抗体可用于各种研究、诊断和治疗应用，包含用于执行美国申请公开第2012/0141375号和第2016/0145343号中描述的方法中的任何方法，所述美国申请公开中的每一个的公开内容通过引用并入本文。
主题抗体表现出与其特定靶标的高亲和力结合。例如，主题抗体可以以至少约10- 7M、至少约10-8M、至少约10-9M、至少约10-10M、至少约10-11M或至少约10-12M或大于10-12M的亲和力结合。例如，主题抗体可以以约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10-11M或约10-11M至约10-12M或大于10-12M的亲和力与表位结合。
如本文所使用的，术语“免疫球蛋白”是指由基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。识别的人免疫球蛋白基因包含κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因；以及许多免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链(约25kD或214个氨基酸)由N末端处的可变区基因(约110个氨基酸)和C末端处的κ或λ恒定区编码。全长免疫球蛋白重链(约50kD或446个氨基酸)由N末端处的可变区基因(约116个氨基酸)和C末端处的其它上述恒定区基因之一编码，例如，γ(编码约330个氨基酸)。在一些实施例中，主题抗体包括全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链。
在一些实施例中，主题抗体不包括全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链，而是包括全长免疫球蛋白重链和全长免疫球蛋白轻链的抗原结合片段。在一些实施例中，抗原结合片段包含在单独的多肽链上；在其它实施例中，抗原结合片段包含在单个多肽链内。术语“抗原结合片段”是指能够与靶标特异性结合的全长抗体的一个或多个片段，如上文所描述的。结合片段的实例包含(i)Fab片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段)；(ii)F(ab')2片段(包括通过铰链区处二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)；(iii)Fd片段(由VH和CH1结构域组成)；(iv)Fv片段(由抗体单臂的VH和VL结构域组成)；(v)dAb片段(由VH结构域组成)；(vi)分离的CDR；(vii)单链Fv(scFv)(由使用重组方法通过合成接头连接的抗体单臂的VH和VL结构域组成，使得VH和VL结构域配对形成单价分子)；(viii)双功能抗体(由两个scFv组成，其中VH和VL结构域连接，使得它们不会配对形成单价分子；scFv中的每个scFv的VH与另一个scFv的VL结构域配对，以形成二价分子)；(ix)双特异性抗体(由至少两个抗原结合区域组成，每个区域与不同的表位结合)。在一些实施例中，主题抗体片段是Fab片段。在一些实施例中，主题抗体片段是单链抗体(scFv)。
在一些实施例中，主题抗体是重组或经修饰的抗体，例如嵌合的、人源化的、去免疫的或体外产生的抗体。如本文所使用的术语“重组”或“经修饰的”抗体旨在包含所有通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体，如(i)使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；(ii)从重组的组合人抗体文库中分离的抗体；(iii)从对人免疫球蛋白基因而言是转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体；或(iv)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体包含人源化的、CDR移植的、嵌合的、去免疫的和体外产生的抗体；并且可以任选地包含源自人种系免疫球蛋白序列的恒定区。
全长双特异性抗体可以例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)，通过在每个半分子的重链CH3界面处引入取代以有利于在体外无细胞环境中或使用共表达形成具有不同特异性的两个抗体半分子的异二聚体来产生。Fab臂交换反应是CH3结构域的二硫键异构化反应和解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体铰链区的重链二硫键减少。所得亲本单特异性抗体之一的游离半胱氨酸与第二个亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，并且同时亲本抗体的CH3结构域通过解离-缔合释放和重新形成。Fab臂的CH3结构域可以被工程化成有利于异二聚化而不是同二聚化。所得产物是具有各自与不同的表位结合的两个Fab臂或半分子的双特异性抗体。
“杵臼(knob-in-hole)”策略(参见例如PCT国际公开第WO 2006/028936号)可以用于产生全长双特异性抗体。简而言之，形成人IgG中CH3结构域界面的选定氨基酸可以在影响CH3结构域相互作用的位置处突变，以促进异二聚体形成。将具有小侧链(臼)的氨基酸引入与第一抗原特异性结合的抗体的重链中，并且将具有大侧链(杵)的氨基酸引入与第二抗原特异性结合的抗体的重链中。两种抗体共表达后，由于带有“臼”的重链与带有“杵”的重链优先相互作用，形成异二聚体。形成杵和臼的示例性CH3取代对是(表示为第一重链的第一CH3结构域中的经修饰的位置/第二重链的第二CH3结构域中的经修饰的位置)：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T3945/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S/L368A/Y407V。
可以使用其它策略，如通过取代一个CH3表面处的带正电残基和第二个CH3表面处的带负电残基，使用静电相互作用促进重链异二聚化，如美国申请公开第2010/0015133号；第2009/0182127号；第2010/028637号；和第2011/0123532号中所描述的。在其它策略中，异二聚化可以通过以下取代来促进(表示为第一重链的第一CH3结构域中的经修饰的位置/第二重链的第二CH3结构域中的经修饰的位置)：L351Y/F405A/Y407V/T394W、T366I/K392M/T394W/F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W/F405A/Y407V、L351Y/Y407A/T366A/K409F、L351Y/Y407A/T366V/K409F、Y407A/T366A/K409F或T350V/L351Y/F405A/Y407V、T350V/T366L/K392L/T394W，如美国申请公开第2012/0149876号或美国申请公开第2013/0195849号中所描述的。
还提供了单链双特异性抗体。在一些实施例中，本公开的单链双特异性抗体是双特异性scFv。主题抗体可以是人源化的。如果存在，则恒定区也可以基本上或全部来自人免疫球蛋白。
制备人源化抗体的方法在本领域中是已知的。将小鼠CDR取代到人可变结构域框架中可以引起保留其正确的空间取向，其中例如人可变结构域框架采用与CDR源自的小鼠可变框架相同或类似的构象。这可以通过从人抗体获得人可变结构域来实现，所述人抗体的框架序列与衍生CDR的鼠类可变框架结构域表现出高度的序列同一性。重链和轻链可变框架区可以衍生自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列，或者也可以是几种人抗体的共有序列。
鉴定出鼠类供体免疫球蛋白和适当的人受体免疫球蛋白的互补决定区后，下一步是确定这些组分中的哪些残基(如果有的话)应该被取代，以优化所得人源化抗体的特性。通常，应该最小化用鼠类氨基酸残基取代人氨基酸残基，因为鼠类残基的引入会增加抗体在人体中引发人抗小鼠抗体(HAMA)应答的风险。可以执行本领域公认的确定免疫应答的方法来监测特定患者或临床试验期间的HAMA应答。施用人源化抗体的患者可以在所述疗法的施用开始时和整个过程中被给予免疫原性评估。例如，使用本领域人员已知的方法，包含表面等离子共振技术(BIACORE)和/或固相ELISA分析，通过检测来自患者的血清样品中针对人源化治疗试剂的抗体来测量HAMA应答。在许多实施例中，主题人源化抗体基本上不会在人类受试者中引发HAMA应答。
基于对CDR构象和/或与抗原结合的可能影响，选择来自人可变区框架残基的某些氨基酸进行取代。鼠类CDR区与人可变框架区的非天然并置可能引起非天然的构象限制，除非通过某些氨基酸残基的取代来纠正，否则会导致结合亲和力的损失。用于取代的氨基酸残基的选择可以部分地通过计算机建模来确定。用于产生免疫球蛋白分子三维图像的计算机硬件和软件在本领域是已知的。通常，分子模型是从免疫球蛋白链或其结构域的已解析结构开始产生的。将待建模的链与已解析的三维结构的链或结构域进行氨基酸序列相似性比较，并且选择示出最大序列相似性的链或结构域作为构建分子模型的起点。选择共享至少50％序列同一性的链或结构域用于建模，并且优选地选择共享至少60％、70％、80％、90％或更多序列同一性的链或结构域用于建模。修改已解析的起始结构以允许建模的免疫球蛋白链或结构域中的实际氨基酸与起始结构中的氨基酸之间存在差异。然后将经修饰的结构组装成复合免疫球蛋白。最终，通过能量最小化和验证所有原子彼此是否在合适的距离内以及键长和角度是否在化学上可接受的限度内，来完善所述模型。
当如Kabat所定义的框架残基构成如Chothia所定义的结构环残基时，可以选择存在于小鼠抗体中的氨基酸来取代到人源化抗体中。“与CDR区相邻”的残基包含紧邻人源化免疫球蛋白链一级序列中的CDR中的一个或多个CDR的位置中(例如紧邻如Kabat所定义的CDR或如Chothia所定义的CDR的位置中)的氨基酸残基(参见例如Chothia和Lesk JMB 196:901(1987))。这些氨基酸特别有可能与CDR中的氨基酸相互作用，并且如果从受体中选择，则会扭曲供体CDR并降低亲和力。此外，相邻的氨基酸可以直接与抗原相互作用(Amit等人,《科学(Science)》,233:747(1986))，并且从供体中选择这些氨基酸可能是期望的，以保持在原始抗体中提供亲和力的所有抗原接触。
在一些实施例中，主题抗体包括scFv多聚体。例如，在一些实施例中，主题抗体是scFv二聚体(例如，包括两个串联scFv(scFv2))、scFv三聚体(例如，包括三个串联scFv(scFv3))、scFv四聚体(例如，包括四个串联scFv(scFv4))，或者是超过四个scFv(例如串联)的多聚体。scFv单体可以通过长度为约2个氨基酸至约10个氨基酸的接头串联连接，例如长度为2aa、3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa或10aa。合适的接头包含例如(Gly)x，其中x是2至10的整数、甘氨酸-丝氨酸聚合物等。
在一些实施例中，主题抗体包括免疫球蛋白的恒定区(例如，Fc区)。Fc区(如果存在的话)可以是人Fc区。如果存在恒定区，则抗体可以同时含有轻链恒定区和重链恒定区。本文所描述的抗体包含具有所有类型恒定区的抗体，包含IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。合适的重链Fc区的实例是人同种型IgG1 Fc。轻链恒定区可以是λ或κ。主题抗体(例如，主题人源化抗体)可以包括来自多于一种类别或同种型的序列。抗体可以表达为含有两条轻链和两条重链的四聚体；单独的重链、轻链，如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv；或其中重链和轻链可变域的单链抗体通过间隔子连接的单链抗体。
在一些实施例中，本公开的抗体可以包含在Fc区中引入的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，所述一个或多个氨基酸取代可以位于Fc区的位置239、298、326、330和332处。在一些实施例中，本公开的抗体可以包含在Fc区中引入的以下氨基酸取代中的一个或多个氨基酸取代：I332E；S239D/A330L/I332E；S239D/S298A/I332E；S239D/K326T/I332E；S239D/S298A/K326T/I332E；或S239D/A330L/I332E/D356E/L358M。
在一些实施例中，主题抗体包括一个或多个非天然存在的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包括羰基、乙酰基、氨基氧基、肼基团、酰肼基团、氨基脲基团、叠氮基团或炔烃基团。包含非天然存在的氨基酸可以提供与聚合物、第二多肽、支架等的连接。此类非天然存在的氨基酸的实例包含但不限于N-乙酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
本公开还提供了具有连接的所关注部分的抗体，例如可检测标记、药物、半衰期延长部分等。抗体的修饰可以通过多种合成和/或重组方法来完成。连接到抗体的一个或多个部分可以提供多种功能或特征中的一种或多种。示例性部分包含可检测标记(例如，染料标记(例如，发色团、荧光团)、生物物理探针(自旋标记、核磁共振(NMR)探针)、荧光共振能量转移(FRET)型标记(例如，FRET对的至少一个成员，包含荧光团/淬灭剂对的至少一个成员)、生物发光共振能量转移(BRET)型标记(例如，BRET对中的至少一个成员)、免疫可检测标签(例如，FLAG、His(6)等)；水溶性聚合物(例如PEG化)；纯化标签(例如，促进通过亲和色谱法分离(例如，FLAG表位的连接；膜定位结构域(例如，脂质或糖磷脂酰肌醇(GPI)型锚))；固定标签(例如，促进多肽连接到表面，包含选择性连接)；药物(例如，促进药物靶向，例如通过将药物连接到抗体)等。
主题抗体可以被糖基化，例如主题抗体可以包括共价连接的碳水化合物或多糖部分。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。向抗体添加糖基化位点便利地通过改变氨基酸序列以使得它含有N-连接的或O-连接的糖基化位点来完成。类似地，糖基化位点的去除可以通过抗体天然糖基化位点内的氨基酸改变来完成。
在一些实施例中，主题抗体将包括“不透射线”标记，例如可以使用例如x射线容易地可视化的标记。不透射线材料是本领域技术人员所熟知的。最常见的不透射线材料包含碘盐、溴盐或钡盐。其它不透射线材料也是已知的，并且包含但不限于有机铋衍生物、不透射线多聚氨酯、有机铋复合物、不透射线钡多聚体络合物等。
用于修饰抗体的方法
本公开的抗体缀合物可以包含：1)与所关注的部分缀合的Ig重链恒定区；和与所关注的部分缀合的Ig轻链恒定区；2)与所关注的部分缀合的Ig重链恒定区；和未与所关注的部分缀合的Ig轻链恒定区；或3)未与所关注的部分缀合的Ig重链恒定区；和与所关注的部分缀合的Ig轻链恒定区。主题抗体缀合物还可以包含与所关注的部分缀合的VH和/或VL结构域。
在一个实例中，抗体可以被修饰成包含2-甲酰甘氨酸残基，其可以用作连接异源部分的化学手柄。例如，本公开的抗体的重链和/或轻链恒定区可以被修饰成包含硫酸酯酶基序的氨基酸序列，所述硫酸酯酶基序能够通过2-甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的作用被转化为含有2-甲酰甘氨酸(fGly)。这种硫酸酯酶基序在本文中也可以被称为FGE修饰位点。FGE的作用以序列特异性方式进行，因为FGE作用于定位于免疫球蛋白多肽内的硫酸酯酶基序处。提供所关注的部分作为反应性配偶体的组分，用于与标记的Ig多肽的转化的醛标签的fGly残基的醛反应。多种可商购获得的试剂可以用于完成所关注的部分与醛标记的Ig多肽的fGly残基的连接。例如，许多所关注的部分的氨基氧基、酰肼或氨基硫脲衍生物是合适的反应性配偶体，并且容易获得或可以使用标准化学方法产生。
如上所述，抗体的氨基酸序列可以被修饰成包含含有丝氨酸或半胱氨酸残基的硫酸酯酶基序，所述基序能够通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的作用在体内(例如，在细胞中翻译含醛标记的蛋白质时)或体外(例如，通过在无细胞系统中将含醛标记的蛋白质与FGE接触)转化(氧化)成2-甲酰甘氨酸(fGly)残基。这种硫酸酯酶基序在本文中也可以被称为FGE修饰位点。
硫酸酯酶基序
醛标记的最小硫酸酯酶基序的长度通常是5或6个氨基酸残基，长度通常不超过6个氨基酸残基。Ig多肽中提供的硫酸酯酶基序是至少5或6个氨基酸残基，并且可以是例如，长度是5至16个、6-16个、5-15个、6-15个、5-14个、6-14个、5-13个、6-13个、5-12个、6-12个、5-11个、6-11个、5-10个、6-10个、5-9个、6-9个、5-8个或6-8个氨基酸残基，以限定长度少于16、15、14、13、12、11、10、9、8或7个氨基酸残基的硫酸酯酶基序。
在某些实施例中，所关注的多肽包含其中一个或多个氨基酸残基，如2个或更多个、或3个或更多个、或4个或更多个、或5个或更多个、或6个或更多个、或7个或更多个、或8个或更多个、或9个或更多个、或10个或更多个、或11个或更多个、或12个或更多个、或13个或更多个、或14个或更多个、或15个或更多个、或16个或更多个、或17个或更多个、或18个或更多个、或19个或更多个、或20个或更多个氨基酸残基相对于天然氨基酸序列已经被插入、缺失、取代(替代)以提供多肽中的硫酸酯酶基序的序列的那些多肽。在某些实施例中，多肽包含氨基酸序列的少于20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个氨基酸残基相对于多肽的天然氨基酸序列的修饰(插入、添加、缺失和/或取代/替代)。在对于多肽(例如，抗体)天然的氨基酸序列含有所需的硫酸酯酶基序的一个或多个残基的情况下，可以减少残基的修饰的总数，例如，通过对侧接天然氨基酸残基的氨基酸残基进行位点特定修饰(插入、添加、缺失、取代/替换)，以提供所需的硫酸酯酶基序的序列。在某些实施例中，使靶多肽的天然氨基酸序列的修饰的程度最小化，以便使插入、删除、取代(替代)或添加(例如，到N端或C末端)的氨基酸残基的数量最小化。使靶多肽的氨基酸序列修饰的程度最小化可以最大限度地减少这种修饰可能对功能和/或结构的影响。
应当注意的是，虽然具体所关注的醛标签是包括至少最小硫酸酯酶基序(也被称为“共识硫酸酯酶基序”)的那些标记，但很容易理解的是，更长的醛标签被本公开所设想并且涵盖，并且可以见到在本公开的组合物和方法中的用途。因此，醛标签可以包括5或6个残基的最小硫酸酯酶基序，或者可以更长并且包括最小的硫酸酯酶基序，所述基序可以通过另外的氨基酸残基在基序的N末端和/或C末端侧接。例如，考虑了5个或6个氨基酸残基的醛标签，以及超过5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸残基的较长氨基酸序列。
醛标记可以存在于Ig重链的C末端处或附近；例如，醛标记可以存在于天然野生型Ig重链的C末端的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸内。醛标记可以存在于Ig重链的CH1结构域中。醛标记可以存在于Ig重链的CH2结构域中。醛标记可以存在于Ig重链的CH3结构域中。醛标记可以存在于Ig轻链恒定区中，例如，存在于κ轻链恒定区或λ轻链恒定区中。
在某些实施例中，所使用的硫酸酯酶基序可以通过下式描述：
X1Z1X2Z2X3Z3(SEQ ID NO:13)(I')，其中
Z1是半胱氨酸或丝氨酸(其可以通过(C/S)来表示)；
Z2是脯氨酸或丙氨酸残基(其可以通过(P/A)来表示)；
Z3是碱性氨基酸(例如精氨酸(R)，并且可以是赖氨酸(K)或组氨酸(H)，通常是赖氨酸)；或脂肪族氨基酸(丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或脯氨酸(P)，通常是A、G、L、V或I；
X1存在或不存在，并且当存在时，可以是任何氨基酸，但通常是脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，通常是L、M、V、S或T，更通常是L、M、S或V，条件是当硫酸酯酶基序位于靶多肽的N末端时，X1存在；并且
X2和X3独立地可以是任何氨基酸，尽管通常是脂肪族氨基酸、极性、不带电荷的氨基酸或含硫氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如S、T、A、V、G或C；例如S、T、A、V或G。在一个实例中，醛标签具有式L(C/S)TPSR(SEQ ID NO:14)，例如LCTPSR(SEQID NO:15)或LSTPSR(SEQ ID NO:16)。因此，本公开提供了包含醛标记的Ig重链和/或醛标记的Ig轻链的抗体，其中醛标记的Ig抗体包括含有此硫酸酯酶基序的重链和/或轻链的Ig恒定区氨基酸序列。
例如，在一些实施例中，抗体重链和/或轻链的氨基酸序列可以被修饰，以提供式X1Z1X2Z2X3Z3的至少5种氨基酸的序列，其中
Z1是半胱氨酸或丝氨酸；
Z2是脯氨酸或丙氨酸残基；
Z3是脂肪族氨基酸或碱性氨基酸；
X1存在或不存在，并且当存在时，是任何氨基酸，条件是当异源硫酸酯酶基序位于多肽的N末端时，X1存在；
X2和X3各自独立地是任何氨基酸，
其中所述序列位于Ig恒定区的溶剂可及的环区内或邻近其，并且其中所述序列不在Ig重链的C末端处。
通常选择硫酸酯酶基序以便能够通过选定的FGE，例如，存在于其中表达醛标记的多肽的宿主细胞中的FGE，或通过无细胞体外方法将其与醛标记的多肽接触的FGE进行转化。
例如，其中FGE是真核FGE(例如，哺乳动物FGE，包含人FGE)，硫酸酯酶基序可以具有下式：
X1CX2PX3Z3 (I")
其中
X1可以存在或不存在，并且当存在时，可以是任何氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如L、M、S或V，条件是当硫酸酯酶基序位于靶多肽的N末端时，X1存在；
X2和X3独立地可以是任何氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如S、T、A、V、G或C，例如S、T、A、V或G；并且
Z3是碱性氨基酸(例如精氨酸(R)，并且可以是赖氨酸(K)或组氨酸(H)，例如赖氨酸)；或脂肪族氨基酸(丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或脯氨酸(P)，例如A、G、L、V或I。
硫酸酯酶基序的具体实例包含LCTPSR(SEQ ID NO:17)、MCTPSR(SEQ ID NO:18)、VCTPSR(SEQ ID NO:19)、LCSPSR(SEQ ID NO:20)、LCAPSR(SEQ ID NO:21)、LCVPSR(SEQ IDNO:22)、LCGPSR(SEQ ID NO:23)、ICTPAR(SEQ ID NO:24)、LCTPSK(SEQ ID NO:25)、MCTPSK(SEQ ID NO:26)、VCTPSK(SEQ ID NO:27)、LCSPSK(SEQ ID NO:28)、LCAPSK(SEQ ID NO:29)、LCVPSK(SEQ ID NO:30)、LCGPSK(SEQ ID NO:31)、LCTPSA(SEQ ID NO:32)、ICTPAA(SEQID NO:33)、MCTPSA(SEQ ID NO:34)、VCTPSA(SEQ ID NO:35)、LCSPSA(SEQ ID NO:36)、LCAPSA(SEQ ID NO:37)、LCVPSA(SEQ ID NO:38)和LCGPSA(SEQ ID NO:39)。
含fGly的序列
通常，用于促进靶多肽的醛标签的硫酸酯酶基序中的半胱氨酸或丝氨酸转化为fGly的FGE是根据醛标签中存在的硫酸酯酶基序来选择的。FGE可以是其中表达醛标记的多肽的宿主细胞所固有的，或者宿主细胞可以被基因修饰以表达适当的FGE。在一些实施例中，可能期望使用与人FGE相容的硫酸酯酶基序并且在表达FGE的人细胞中或在经基因修饰以表达人FGE的宿主细胞(通常是哺乳动物细胞)中表达醛标记的蛋白质。通常，适合用于生成fGly修饰的抗体的FGE可以从天然存在的来源获得或合成产生。例如，合适的FGE可以来源于自然产生FGE的生物来源，或者经过基因修饰以表达编码FGE的重组基因的生物来源。编码许多FGE的核酸在本领域是已知的并且容易获得。
FGE对硫酸酯酶基序作用后，Z1被氧化生成2-甲酰甘氨酸(fGly)残基。此外，在FGE介导的转化和与包括所关注的部分的反应性配偶体的反应之后，上式中Z1处的fGly位置共价结合到所关注的部分(例如，可检测标记、水溶性聚合物、多肽、药物、活性剂等)。因此，本公开提供了具有修饰成包括fGly部分的氨基酸序列的抗体。
在FGE对抗体重链和/或轻链的作用下，硫酸酯酶基序中的丝氨酸或半胱氨酸被修饰成fGly。因此，含fGly的硫酸酯酶基序可以具有下式：
X1(fGly)X2Z2X3Z3(SEQ ID NO:40) (I"')
其中
fGly是甲酰甘氨酸残基；
Z2是脯氨酸或丙氨酸残基(其可以通过(P/A)来表示)；
Z3是碱性氨基酸(例如精氨酸(R)，并且可以是赖氨酸(K)或组氨酸(H)，通常是赖氨酸)；或脂肪族氨基酸(丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或脯氨酸(P)，例如A、G、L、V或I；
X1可以存在或不存在，并且当存在时，可以是任何氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如L、M、V、S或T，例如L、M或V，条件是当硫酸酯酶基序位于靶多肽的N末端时，X1存在；并且
X2和X3独立地可以是任何氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如S、T、A、V、G或C，例如S、T、A、V或G。
如上文所描述的，为了产生缀合物，含有fGly残基的多肽可以通过fGly与连接到药物或活性剂的接头的反应性部分(例如，如上文所描述的，肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联部分)的反应而缀合到药物或活性剂以产生含fGly'的硫酸酯酶基序。如本文所使用的，术语fGly'是指通过本文所描述的接头偶联到药物或活性剂的硫酸酯酶基序的氨基酸残基。因此，本公开提供了一种抗体缀合物。
在某些实施例中，抗体缀合物包括下式的含fGly'的硫酸酯酶基序：
X1(fGly')X2Z2X3Z3(SEQ ID NO:41)(II)
其中
fGly'是通过如本文所描述的接头偶联到药物或活性剂的氨基酸残基；
Z2是脯氨酸或丙氨酸残基(其可以通过(P/A)来表示)；
Z3是碱性氨基酸(例如精氨酸(R)，并且可以是赖氨酸(K)或组氨酸(H)，通常是赖氨酸)；或脂肪族氨基酸(丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或脯氨酸(P)，例如A、G、L、V或I；
X1可以存在或不存在，并且当存在时，可以是任何氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如L、M、V、S或T，例如L、M或V，条件是当硫酸酯酶基序位于靶多肽的N末端时，X1存在；并且
X2和X3独立地可以是任何氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如S、T、A、V、G或C，例如S、T、A、V或G。
在某些实施例中，式(II)的序列定位于抗体的重链恒定区的C末端处。在一些实施例中，所述重链恒定区包括以下式(II)的序列：
X1(fGly')X2Z2X3Z3(II)
其中
fGly'是通过如本文所描述的接头偶联到药物或活性剂的氨基酸残基；
Z2是脯氨酸或丙氨酸残基(其可以通过(P/A)来表示)；
Z3是碱性氨基酸(例如精氨酸(R)，并且可以是赖氨酸(K)或组氨酸(H)，通常是赖氨酸)；或脂肪族氨基酸(丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或脯氨酸(P)，例如A、G、L、V或I；
X1可以存在或不存在，并且当存在时，可以是任何氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如L、M、V、S或T，例如L、M或V，条件是当硫酸酯酶基序位于靶多肽的N末端时，X1存在；
X2和X3独立地可以是任何氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如S、T、A、V、G或C，例如S、T、A、V或G；并且
其中所述序列是氨基酸序列QKSLSLSPGK的C末端，并且其中所述序列可以包含天然野生型重Ig链恒定区中不存在的1、2、3、4、5或5至10个氨基酸。
在某些实施例中，重链恒定区包括Ig重链的C末端处的序列SLSLSPGSL(fGly')TPSRGS(SEQ ID NO:42)，例如代替天然SLSLSPGK(SEQ ID NO:43)序列。
在某些实施例中，与药物或活性剂偶联的氨基酸残基(fGly')定位于抗体的轻链恒定区。在某些实施例中，轻链恒定区包括以下式(II)的序列：
X1(fGly')X2Z2X3Z3(II)
其中
fGly'是通过如本文所描述的接头偶联到药物或活性剂的氨基酸残基；
Z2是脯氨酸或丙氨酸残基(其可以通过(P/A)来表示)；
Z3是碱性氨基酸(例如精氨酸(R)，并且可以是赖氨酸(K)或组氨酸(H)，通常是赖氨酸)；或脂肪族氨基酸(丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或脯氨酸(P)，例如A、G、L、V或I；
X1可以存在或不存在，并且当存在时，可以是任何氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如L、M、V、S或T，例如L、M或V，条件是当硫酸酯酶基序位于靶多肽的N末端时，X1存在；
X2和X3独立地可以是任何氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如S、T、A、V、G或C，例如S、T、A、V或G；并且
其中所述序列是氨基酸序列KVDNAL(SEQ ID NO:44)的C末端和/或氨基酸序列QSGNSQ(SEQ ID NO:45)的N末端。
在某些实施例中，轻链恒定区包括序列KVDNAL(fGly')TPSRQSGNSQ(SEQ ID NO:46)。
在某些实施例中，与药物或活性剂偶联的氨基酸残基(fGly')定位于抗体的重链CH1区。在某些实施例中，重链CH1区包括以下式(II)的序列：
X1(fGly')X2Z2X3Z3(II)
其中
fGly'是通过如本文所描述的接头偶联到药物或活性剂的氨基酸残基；
Z2是脯氨酸或丙氨酸残基(其可以通过(P/A)来表示)；
Z3是碱性氨基酸(例如精氨酸(R)，并且可以是赖氨酸(K)或组氨酸(H)，通常是赖氨酸)；或脂肪族氨基酸(丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或脯氨酸(P)，例如A、G、L、V或I；
X1可以存在或不存在，并且当存在时，可以是任何氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如L、M、V、S或T，例如L、M或V，条件是当硫酸酯酶基序位于靶多肽的N末端时，X1存在；
X2和X3独立地可以是任何氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(例如，除了芳香族氨基酸或带电氨基酸之外)，例如S、T、A、V、G或C，例如S、T、A、V或G；并且
其中所述序列是氨基酸序列SWNSGA(SEQ ID NO:47)的C末端和/或氨基酸序列GVHTFP(SEQ ID NO:48)的N末端。
在某些实施例中，重链CH1区包括序列SWNSGAL(fGly')TPSRGVHTFP(SEQ ID NO:49)。
图16A描绘了示出用于产生醛标记的Ig多肽的可能的修饰位点的位点图。上部序列是IgG1轻链多肽(SEQ ID NO:1)的保守区的氨基酸序列，并且示出了Ig轻链中可能的修饰位点；下部序列是Ig重链多肽(SEQ ID NO:2)(GenBank登录号AAG00909)的保守区的氨基酸序列，并且示出了Ig重链中可能的修饰位点。重链和轻链编号基于全长重链和轻链。
图16B-16C描绘了IgG1(SEQ ID NO:3；GenBank P01857.1)、IgG2(SEQ ID NO:4；GenBank P01859.2)、IgG3(SEQ ID NO:5；GenBank P01860.2)、IgG4(SEQ ID NO:6；GenBankAAB59394.1)与IgA(SEQ ID NO:7；GenBank AAT74070)的智人免疫球蛋白重链恒定区的比对，示出了可以在免疫球蛋白重链中提供醛标签的修饰位点。重链和轻链编号基于全重链和轻链。
图16D描绘了免疫球蛋白轻链恒定区的比对，示出了可以在免疫球蛋白轻链中提供醛标签的修饰位点。Seq1＝智人κ轻链恒定区；GenBank CAA75031.1；SEQ ID NO:8。Seq2＝智人κ轻链恒定区；GenBank BAC0168.1；SEQ ID NO:9。Seq3＝智人λ轻链恒定区；GenBankCAA75033；SEQ ID NO:10。Seq4＝小家鼠轻链恒定区；GenBank AAB09710.1；SEQ ID NO:11。Seq5＝褐家鼠轻链恒定区；GenBank AAD10133；SEQ ID NO:12。
在一些实施例中，硫酸酯酶基序位于除了Ig多肽重链的C末端之外或另外的位置。分离的醛标记的多肽可以包括经修饰以包含如本文所描述的硫酸酯酶基序的重链恒定区氨基酸序列，其中硫酸酯酶基序位于或邻近多肽重链恒定区的表面可接近环区。
IgG1重链的示例性表面可及环区包含：1)ASTKGP；2)KSTSGGT；3)PEPV；4)NSGALTSG；5)NSGALTSGVHTFPAVLQSSGL；6)QSSGL；7)VTV；8)QTY；9)TQTY；10)HKPSN；11)EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG；12)FPPKP；13)ISRTP；14)DVSHEDPEV；15)SHEDPEV；16)DG；17)DGVEVHNAK；18)HNA；19)QYNST；20)VLTVL；21)GKE；22)NKALPAP；23)SKAKGQPRE；24)KAKGQPR；25)PPSRKELTKN；26)YPSDI；27)NGQPENN；28)TPPVLDSDGS；29)HEALHNHYTQKSLSLSPGK；和30)SLSPGK。
IgG2重链的示例性表面可及环区包含1)ASTKGP；2)PCSRSTSESTAA；3)FPEPV；4)SGALTSGVHTFP；5)QSSGLY；6)VTV；7)TQT；8)HKP；9)DK；10)VAGPS；11)FPPKP；12)RTP；13)DVSHEDPEV；14)DGVEVHNAK；15)FN；16)VLTVV；17)GKE；18)NKGLPAP；19)SKTKGQPRE；20)PPS；21)MTKNQ；22)YPSDI；23)NGQPENN；24)TPPMLDSDGS；25)GNVF；和26)HEALHNHYTQKSLSLSPGK。
IgG3重链的示例性表面可及环区包含1)ASTKGP；2)PCSRSTSGGT；3)FPEPV；4)SGALTSGVHTFPAVLQSSG；5)V；6)TQT；7)HKPSN；8)RVELKTPLGD；9)CPRCPKP；10)PKSCDTPPPCPRCPAPELLGG；11)FPPKP；12)RTP；13)DVSHEDPEV；14)DGVEVHNAK；15)YN；16)VL；17)GKE；18)NKALPAP；19)SKTKGQPRE；20)PPSREEMTKN；21)YPSDI；22)SSGQPENN；23)TPPMLDSDGS；24)GNI；25)HEALHNR；和26)SLSPGK。
IgG4重链的示例性表面可及环区包含1)STKGP；2)PCSRSTSESTAA；3)FPEPV；4)SGALTSGVHTFP；5)QSSGLY；6)VTV；7)TKT；8)HKP；9)DK；10)YG；11)CPAPEFLGGPS；12)FPPKP；13)RTP；14)DVSQEDPEV；15)DGVEVHNAK；16)FN；17)VL；18)GKE；19)NKGLPSS；20)SKAKGQPREP；21)PPSQEEMTKN；22)YPSDI；23)NG；24)NN；25)TPPVLDSDGS；26)GNVF；和27)HEALHNHYTQKSLSLSLGK。
IgA重链的示例性表面可及环区包含1)ASPTSPKVFPLSL；2)QPDGN；3)VQGFFPQEPL；4)SGQGVTARNFP；5)SGDLYTT；6)PATQ；7)GKS；8)YT；9)CHP；10)HRPA；11)LLGSE；12)GLRDASGV；13)SSGKSAVQGP；14)GCYS；15)CAEP；16)PE；17)SGNTFRPEVHLLPPPSEELALNEL；18)ARGFS；19)QGSQELPREKY；20)AV；21)AAED；22)HEAL；和23)IDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY。
Ig轻链(例如人κ轻链)的示例性表面可及环区包含：1)RTVAAP；2)PPS；3)Gly(参见例如图8C中所描绘的人κ轻链序列的位置150处的Gly)；4)YPREA；5)PREA；6)DNALQSGN；7)TEQDSKDST；8)HK；9)HQGLSS；和10)RGEC。
Igλ轻链的示例性表面可及环区包含QPKAAP、PPS、NK、DFYPGAV、DSSPVKAG、TTP、SN、HKS、EG和APTECS。
如本文所公开的抗体的HC的恒定区可以选自以下序列中的一个序列：
CT标记的(醛标签–粗体)
在上述序列中，重链恒定区的C末端处的斜体残基替换标准IgG1重链C末端处的赖氨酸残基。斜体残基中的粗体残基(LCTPSR)构成醛标签，其中C在重链表达后被FGE转化为fGly残基。fGly可以转化为fGly'。fGly'是指与所关注的部分(例如药物)偶联的抗体的氨基酸残基。斜体残基中的非粗体残基是与标准IgG1重链序列不同的另外残基。
58Q-1(醛标签–粗体并且将“EEM”替换为“DEL”)
61G-1(醛标签–粗体并且将“EEM”替换为“DEL”)
91N-1(醛标签–粗体并且将“EEM”替换为“DEL”)
116E-1(醛标签–粗体并且用“DEL”取代“EEM”)
58Q-2(醛标签–粗体)
61G-2(醛标签–粗体)
91N-2(醛标签–粗体)
116E-2(醛标签–粗体)
58Q-3(醛标签–粗体并且用“KRV”取代“KKV”并用“DEL”取代“EEM”)
61G-3(醛标签–粗体并且用“KRV”取代“KKV”并用“DEL”取代“EEM”)
91N-3(醛标签–粗体并且用“KRV”取代“KKV”并用“DEL”取代“EEM”)
116E-3(醛标签–粗体并且用“KRV”取代“KKV”并用“DEL”取代“EEM”)
58Q-4(醛标签–粗体并且将“KKV”替换为“KRV”)
61G-4(醛标签–粗体并且将“KKV”替换为“KRV”)
91N-4(醛标签–粗体并且将“KKV”替换为“KRV”)
116E-4(醛标签–粗体并且将“KKV”替换为“KRV”)
粗体残基(LCTPSR)构成醛标签，其中C在重链表达后被FGE转化为fGly残基。fGly可以转化为fGly'。fGly'是指与所关注的部分(例如药物)偶联的抗体的氨基酸残基。
药物
在一些情况下，本公开的抗体具有与抗体的重链和/或轻链共价连接的药物(例如，本文所描述的式(I)的缀合物和式(III)化合物中的W1)。例如，本公开的抗体缀合物可以包含作为取代基W1的药物或活性剂。许多药物中的任何药物都适合使用，或者可以被修饰以使得适合使用，作为缀合到抗体的反应性配偶体。“药物”包含小分子药物、肽药物、毒素(例如细胞毒素)等。
如本文所使用的“小分子药物”是指化合物，例如有机化合物，其表现出所关注的药物活性，并且其通常具有不大于约800Da或不大于2000Da的分子量，但可以涵盖至多5kDa，并且可以大至约10kDa的分子。小的无机分子是指不含碳原子的分子，而小的有机分子是指含有至少一个碳原子的化合物。
在某些实施例中，药物或活性剂可以是美登素。“美登素”、“美登素部分”、“美登素活性剂部分”和“美登醇”是指美登素及其类似物和衍生物，以及药学活性美登素部分和/或其部分。缀合到多肽的美登素可以是多种美登醇部分中的任何美登醇部分，如但不限于，如本文所述的美登素及其类似物和衍生物(例如，脱酰基美登素)。
在某些实施例中，药物或活性剂可以是澳瑞他汀(auristatin)或其类似物或衍生物，或药学活性澳瑞他汀部分和/或其部分。缀合到多肽的澳瑞他汀可以是多种澳瑞他汀部分中的任何澳瑞他汀部分，如但不限于，如本文所述的澳瑞他汀及其类似物和衍生物。见到在本文所述的缀合物和化合物中的用途的药物的实例包含但不限于澳瑞他汀或澳瑞他汀衍生物，如单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、其衍生物等。在某些实施例中，药物是MMAE。
在某些实施例中，药物或活性剂可以是多卡霉素(duocarmycin)或其类似物或衍生物，或药学活性多卡霉素部分和/或其部分。缀合到多肽的多卡霉素可以是多种多卡霉素部分中的任何多卡霉素部分，如但不限于，如本文所述的多卡霉素及其类似物和衍生物。见到在本文所述的缀合物和化合物中的用途的药物的实例包含但不限于多卡霉素或多卡霉素衍生物，如多卡霉素A、多卡霉素B1、多卡霉素B2、多卡霉素C1、多卡霉素C2、多卡霉素D、多卡霉素SA以及CC-1065、其衍生物等。在一些实施例中，多卡霉素是多卡霉素类似物，如但不限于阿多来新(adozelesin)、比折来新(bizelesin)或卡折来新(carzelesin。
在某些实施例中，药物或活性剂可以是拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱或其类似物或衍生物，或药学活性喜树碱部分和/或其部分。与主题抗体缀合的喜树碱可以是多种喜树碱部分中的任何喜树碱部分，如但不限于喜树碱和其类似物和衍生物，如于2022年1月13日提交的美国申请第17/575,481号中所描述的，所述美国申请的公开内容通过引用并入本文。可用于本文所描述的缀合物的拓扑异构酶抑制剂的另外实例包含但不限于喜树碱或喜树碱衍生物，如SN-38、贝洛替康(Belotecan)、依喜替康(Exatecan)、9-氨基喜树碱(9-AC)、其衍生物等。
在某些实施例中，药物选自细胞毒素、激酶抑制剂、免疫刺激剂、toll样受体(TLR)激动剂、寡核苷酸、适配体、细胞因子、类固醇和肽。
例如，细胞毒素可以包含任何导致细胞死亡(例如坏死或凋亡)或细胞活力降低的化合物。
激酶抑制剂可以包含但不限于阿达沃替尼(Adavosertib)、阿法替尼(Afatinib)、阿西替尼(Axitinib)、博舒替尼(Bosutinib)、西妥昔单抗(Cetuximab)、考比替尼(Cobimetinib)、克唑替尼(Crizotinib)、卡博替尼(Cabozantinib)、达克替尼(Dacomitinib)、达沙替尼(Dasatinib)、恩曲替尼(Entrectinib)、厄达替尼(Erdafitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、福斯塔替尼(Fostamatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、依鲁替尼(Ibrutinib)、伊马替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、乐伐替尼(Lenvatinib)、莫布里替尼(Mubritinib)、尼罗替尼(Nilotinib)、培唑帕尼(Pazopanib)、培加他尼(Pegaptanib)、鲁索替尼(Ruxolitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、图卡替尼(Tucatinib)、凡德他尼(Vandetanib)、威罗非尼(Vemurafenib)等。
免疫刺激剂可以包含但不限于疫苗(例如细菌或病毒疫苗)、集落刺激因子、干扰素、白细胞介素等。TLR激动剂包含但不限于咪喹莫特(imiquimod)、雷西莫特(resiquimod)等。
寡核苷酸药物包含但不限于福米韦森(fomivirsen)、哌加他尼(pegaptanib)、米泊美森(mipomersen)、依替普利森(eteplirsen)、去纤苷(defibrotide)、诺西那生钠(nusinersen)、戈洛迪森(golodirsen)、维托拉森(viltolarsen)、沃拉索森(volanesorsen)、伊诺特森(inotersen)、托弗森(tofersen)、托米纳森(tominersen)等。
适配体药物包含但不限于哌加他尼、AS1411、REG1、ARC1779、NU172、ARC1905、E10030、NOX-A12、NOX-E36等。
细胞因子包含但不限于白蛋白干扰素α(Albinterferon Alfa)-2B、阿地白介素(Aldesleukin)、ALT-801、阿那白带素(Anakinra)、安塞司亭(Ancestim)、阿伏特明(Avotermin)、毕鲁格司亭(Balugrastim)、苯培加德白介素(Bempegaldesleukin)、伯纳特金(Binetrakin)、辛特德金贝舒多托克斯(Cintredekin Besudotox)、CTCE-0214、达依泊汀α(Darbepoetin alfa)、去尼介素地夫替托(Denileukin diftitox)、杜拉乐明(Dulanermin)、埃度白介素α(Edodekin alfa)、恩非勒明(Emfilermin)、依泊汀δ(Epoetindelta)、促红细胞生成素、人白细胞介素-2、干扰素α、干扰素α-2c、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素alfacon-1、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ-1b、干扰素κ、白细胞介素-1α、白细胞介素-10、白细胞介素-7，来格司亭(Lenograstim)、勒瑞斯亭(Leridistim)、利培非格司亭(Lipegfilgrastim)、罗如克夫斯卡α(Lorukafusp alfa)，Maxy-G34，甲氧基聚乙二醇-依泊汀β、莫拉司亭(Molgramostim)、莫来司亭(Muplestim)、纳格瑞斯特本(Nagrestipen)、奥普瑞白介素(Oprelvekin)、培非格司亭(Pegfilgrastim)、佩格勒德克金(Pegilodecakin)、聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b、聚乙二醇干扰素β-1a、聚乙二醇干扰素λ-1a、重组CD40-配体，瑞拉司亭(Regramostim)、罗米司亭(Romiplostim)、沙格司亭(Sargramostim)、血小板生成素、图科妥珠单抗西莫白介素(Tucotuzumabcelmoleukin)、病毒巨噬细胞炎症蛋白等等。
类固醇药物包含但不限于泼尼松龙(prednisolone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、地夫可特(deflazacort)等。
如本文所使用的，“肽药物”是指含有氨基酸的聚合化合物，并且意指涵盖天然存在的和非天然存在的肽、寡肽、环肽、多肽和蛋白质，以及肽模拟物。肽药物可以通过化学合成获得，或者从基因编码的来源(例如，重组来源)生产。肽药物的分子量可以变化，并且可以具有200Da至10kDa或更高的分子量。合适的肽包含但不限于细胞毒性肽；血管生成肽；抗血管生成肽；激活B细胞的肽；激活T细胞的肽；抗病毒肽；抑制病毒融合的肽；增加一个或多个淋巴细胞群产生的肽；抗菌肽；生长因子；生长激素释放因子；血管活性肽；抗炎肽；调节葡萄糖代谢的肽；抗血栓形成肽；抗疼痛感觉性肽；血管扩张肽；血小板聚集抑制剂；镇痛药；等等。
见到在本文所述的缀合物和化合物中的用途的药物的另外的实例包含但不限于托布鲁斯(Tubulysin)M、卡奇霉素(Calicheamicin)、STAT3抑制剂、α-鹅膏菌素(alpha-Amanitin)、极光激酶抑制剂、贝洛替康和蒽环霉素(anthracycline)。
在一些情况下，药物是毒素，例如细胞毒素。核糖体失活蛋白(RIP)，高等植物中普遍存在的一类蛋白质，是此类细胞毒素的实例。合适的细胞毒素包含但不限于蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、假单胞菌属外毒素(Pseudomonas exotoxin)(例如PE35、PE37、PE38、PE40等)、皂草素、白树毒素、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、肉毒杆菌毒素、苔藓素、苦瓜定和波甘宁(bouganin)。
在一些情况下，药物是癌症化疗剂。癌症化疗剂包含减少癌细胞的增殖的非肽(例如非蛋白质)化合物，并且涵盖细胞毒性剂和细胞抑制剂。化疗剂的非限制性实例包含烷基化剂、亚硝基脲、抗代谢剂、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱和类固醇激素。也可以使用肽化合物。
合适的癌症化疗剂包含多拉司他汀(dolastatin)和其活性类似物和衍生物；以及澳瑞他汀和其活性类似物和衍生物。合适的癌症化疗剂还包含美登醇和其活性类似物和衍生物；以及多卡霉素和其活性类似物和衍生物。
本领域已知并广泛使用用于减少细胞增殖的药剂。此类药剂包含烷基化剂，如氮芥、亚硝基脲、亚乙基胺衍生物、烷基磺酸盐和三氮烯，包含但不限于甲氯乙胺、环磷酰胺(环磷酰胺(CytoxanTM))、麦法仑(L-肉溶素)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、塞莫司汀(甲基CCNU)、链脲佐菌素、氯佐菌素、乌拉莫司汀、氯甲烷、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢药剂包含叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包含但不限于阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)、氟尿嘧啶(floxuridine)(FudR)、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤(6-MP)、戊甾烷、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤、10-丙炔基-5,8-二脱氧叶酸(PDDF，CB3717)，5,8-二氮杂四氢叶酸(DDATHF)、亚叶酸、磷酸氟达拉宾、喷司他丁和吉西他滨。
合适的天然产物及其衍生物(例如，长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)，包含但不限于Ara-C、紫杉醇(paclitaxel)多西他赛(docetaxel)脱氧柯福霉素(deoxycoformycin)、丝裂霉素-C(mitomycin-C)、L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)、硫唑嘌呤(azathioprine)；布喹那(brequinar)；生物碱，例如，长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)等；鬼臼毒素(podophyllotoxin)，例如，依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)等；抗生素，例如，蒽环霉素、盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)(柔红霉素(daunomycin)、红比霉素(rubidomycin)、正定霉素(cerubidine))、依达比星(idarubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)和吗啉代衍生物等；苯氧酮双环肽，例如放线菌素(dactinomycin)；碱性糖肽，例如博来霉素(bleomycin)；蒽醌糖苷，例如普卡霉素(plicamycin)(光神霉素(mithramycin))；蒽二酮(anthracenedione)，例如米托蒽醌(mitoxantrone)；阿际吡咯吲哚二酮(azirinopyrrolo indoledione)，例如丝裂霉素(mitomycin)；大环免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporine)、FK-506(他克莫司(tacrolimus)、普乐可复(prograf))、雷帕霉素(rapamycin)等；等等。
其它抗增殖细胞毒性剂是萘维本、CPT-11、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨(capecitabine)、瑞洛沙芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛沙芬(droloxafine)。
具有抗增殖活性的微管影响剂也适于使用，并且包含但不限于别秋水仙碱(allocolchicine)(NSC 406042)、软海绵素B(Halichondrin B)(NSC 609395)、秋水仙碱(colchicine)(NSC 757)、秋水仙碱衍生物(例如，NSC 33410)、海兔毒素(dolstatin)10(NSC 376128)、美登素(NSC 153858)、根瘤菌素(rhizoxin)(NSC 332598)、紫杉醇衍生物、多西他赛硫代秋水仙碱(NSC 361792)、三苯甲基半胱氨酸、硫酸长春花碱、硫酸长春新碱、天然和合成埃博霉素(epothilone)，包含但不限于埃博霉素A、埃博霉素B、圆皮海绵内酯(discodermolide)；雌莫司汀(estramustine)、诺考达唑(nocodazole)等。
适于使用的激素调节剂和类固醇(包含合成类似物)包含但不限于肾上腺皮质类固醇，例如，泼尼松(prednisone)、地塞米松等；雌激素和孕激素，例如己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、雌二醇(estradiol)、克罗米芬(clomiphene)、他莫昔芬(tamoxifen)等；以及肾上腺皮质抑制剂，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)；17α-乙炔雌二醇(17α-ethinylestradiol)；己烯雌酚(diethylstilbestrol)、睾酮(testosterone)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、丙酸屈莫司酮(dromostanolone propionate)、睾酮内酯(testolactone)、甲基泼尼松龙、甲基-睾酮(methyl-testosterone)、泼尼松龙、曲安奈德(triamcinolone)、氯烯雌醚(chlorotrianisene)、羟孕酮(hydroxyprogesterone)、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林(leuprolide)、氟他胺(Flutamide)(德罗根尼奥公司(Drogenil))、托瑞米芬(Toremifene)(法乐通公司(Fareston))和雌激素刺激增殖和分化，因此与雌激素受体结合的化合物用于阻断这种活性。
其它合适的化疗剂包含金属络合物，例如顺铂(cisplatin)(顺式DDP)、卡铂(carboplatin)等；尿素，例如羟基脲(hydroxyurea)；以及肼，例如N-甲基肼；表鬼臼毒素(epidophyllotoxin)；拓扑异构酶(topoisomerase)抑制剂；丙卡巴肼(procarbazine)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；替加氟(tegafur)；等。其它所关注的抗增殖剂包含免疫抑制剂，例如麦考酚酸(mycophenolic acid)、沙利度胺(thalidomide)、去氧精胍菌素(desoxyspergualin)、氮杂孢菌素、来氟米特(leflunomide)、咪唑立滨(mizoribine)、氮杂螺烷(azaspirane)(SKF 105685)；(ZD 1839，4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)；等等。
紫杉烷是适于使用的。“紫杉烷”包含紫杉醇，以及任何活性紫杉烷衍生物或前药。“紫杉醇”(其在本文应理解为包含类似物、调配物和衍生物，如，多西他赛、TAXOLTM、TAXOTERETM(多西他赛的调配物)、紫杉醇的10-脱乙酰基类似物以及紫杉醇的3'N-去苯甲酰基-3'N-叔丁氧羰基类似物)可以利用本领域技术人员已知的技术容易地制备(还参见WO94/07882、WO 94/07881、WO 94/07880、WO 94/07876、WO 93/23555、WO 93/10076；美国专利第5,294,637号；第5,283,253号；第5,279,949号；第5,274,137号；第5,202,448号；第5,200,534号；第5,229,529号；以及EP 590,267)，或者从多种商业来源获得，包含例如，密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)(T7402来自短叶红豆杉(Taxus brevifolia)；或T-1912来自云南红豆杉(Taxus yannanensis))。
紫杉醇应理解为不仅指常见的化学可用形式的紫杉醇，还指类似物和衍生物(例如，TAXOTERETM多西紫杉醇，如上所述)以及紫杉醇缀合物(例如，紫杉醇-PEG、紫杉醇-葡聚糖或紫杉醇-木糖)。
术语“紫杉烷”还包含多种已知衍生物，包含亲水衍生物和疏水衍生物两者。紫杉烷衍生物包含但不限于半乳糖和甘露糖衍生物；哌嗪和哌嗪衍生物。
本公开的实施例包含缀合物，其中抗体缀合到两个或更多个药物部分，如3个药物部分、4个药物部分、5个药物部分、6个药物部分、7个药物部分、8个药物部分、9个药物部分、10个药物部分、11个药物部分、12个药物部分、13个药物部分、14个药物部分、15个药物部分、16个药物部分、17个药物部分、18个药物部分、19个药物部分或20个或更多个药物部分。如本文所描述的，药物部分可以在抗体中的一个或多个位点处缀合到抗体。在某些实施例中，缀合物的平均药物与抗体比率(DAR)(摩尔比)的范围是0.1至20、或0.5至20、或1至20，如1至19、或1至18、或1至17、或1至16、或1至15、或1至14、或1至13、或1至12、或1至11、或1至10、或1至9、或1至8、或1至7、或1至6、或1至5、或1至4、或1至3、或1至2。在某些实施例中，缀合物的平均DAR是1至10，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些实施例中，缀合物的平均DAR是1至10。在某些实施例中，缀合物的平均DAR是1至5。在某些实施例中，缀合物的平均DAR是5至10。平均意指算术平均值。
待缀合到多肽的药物可以被修饰以掺入用于与多肽反应的反应性配偶体。当药物是肽药物时，反应性部分(例如，氨基氧基或酰肼)可以定位在N末端区、N末端、C末端区、C末端处或在肽内部的位置处。例如，方法的实例涉及合成具有氨基氧基的肽药物。在此实例中，肽由受Boc保护的前体合成。肽的氨基可以与包括羧酸基团和氧-N-Boc基团的化合物反应。例如，肽的氨基与3-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)丙酸反应。包括羧酸基团和氧-N-保护基团的化合物上的其它变体可以包含亚烷基接头中的不同数量的碳和亚烷基接头上的取代基。肽的氨基与包括羧酸基团和氧-N-保护基团的化合物之间的反应通过标准肽偶联化学发生。可使用的肽偶联试剂的实例包含但不限于DCC(二环己基碳化二亚胺)、DIC(二异丙基碳化二亚胺)、二对甲苯酰基碳化二亚胺、BDP(1-苯并三唑二乙基磷酸酯-1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳化二亚胺)、EDC(1-(3-二甲基氨基丙基-3-乙基-碳化二亚胺盐酸盐)、氰尿氟化物、氰尿氯化物、TFFH(四甲基氟代甲酰胺六氟磷酸盐)、DPPA(二苯基叠氮膦酸酯)、BOP(苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)六氟磷酸膦)、HBTU(O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基六氟磷酸脲)、TBTU(O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基四氟硼酸脲)、TSTU(O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基四氟硼酸脲)、HATU(N-[(二甲基氨基)-1-H-1,2,3-三唑并[4,5,6]-吡啶-1-基亚甲基]-N-氧化物-N-甲基甲胺六氟磷酸盐)、BOP-Cl(双(2-氧代-3-噁唑烷基)氯化膦)、PyBOP((1-H-1,2,3-苯并三唑-1-基氧基)-三(吡咯烷)四氟磷酸膦)、BrOP(溴三(二甲基氨基)六氟磷酸膦)、DEPBT(3-(二乙氧基磷酸氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮)、PyBrOP(溴三(吡咯烷)六氟磷酸膦)。作为非限制性实例，HOBt和DIC可以用作肽偶联试剂。
对包括N-保护基团的肽进行脱保护以暴露氨基-氧官能团。例如，N-氧代琥珀酰亚胺基团的脱保护发生根据环酰胺基团的标准脱保护条件进行。脱保护条件可见于Greene和Wuts,《有机化学中的保护基团(Protective Groups in Organic Chemistry)》,第3版,1999,纽约的约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,NY以及Harrison等人。某些脱保护条件包含肼试剂、氨基试剂或硼氢化钠。Boc保护基团的脱保护可以用TFA进行。其它用于脱保护的试剂包含但不限于肼、甲肼、苯肼、硼氢化钠和甲胺。产物和中间体可以通过常规方法进行纯化，如HPLC纯化。
普通技术人员将理解如pH和空间位阻(例如，氨基酸残基与所关注的反应性配偶体反应的可及性)等因素是重要的。改变反应条件以提供最佳缀合条件是普通技术人员熟知的，并且在本领域中是常规的。当进行与活细胞中或上存在的多肽的缀合时，选择条件以使生理上相容。例如，pH可以暂时下降足以允许反应发生的时间，但在细胞允许的时间内(例如，约30分钟至1小时)。在细胞表面对多肽进行修饰的生理条件可以类似于在酮-叠氮化物反应中用于修饰携带细胞表面叠氮化物的那些生理条件(参见例如，美国6,570,040)。
含有或修饰以含有α-亲核基团的小分子化合物，其与本文所公开的化合物或缀合物作为反应性配偶体，也被考虑用作本公开的多肽-药物缀合物中的药物。本领域已知用于可用于合成所关注的化合物的化学合成方案和条件的一般方法(参见例如，Smith和March,《March的高级有机化学：反应、机制和结构(March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure)》,第五版,威利国际科学出版公司(Wiley-Interscience),2001；或Vogel,《实用有机化学教科书，包含定性有机分析(A Textbook ofPractical Organic Chemistry,Including Qualitative Organic Analysis)》,第四版,纽约朗文出版社(Longman),1978)。
产生抗体的方法
主题抗体可以通过任何已知的方法产生，例如用于蛋白质合成的常规合成方法；重组DNA方法等。
当主题抗体是单链多肽时，可以使用标准化学肽合成技术来合成所述主题抗体。当多肽是化学合成的时，合成可以通过液相或固相进行。固相多肽合成(SPPS)是用于主题抗体的化学合成的合适方法的实例，在所述SPPS中，序列的C末端氨基酸与不溶性支持物连接，随后依次添加序列中的剩余氨基酸。各种形式的SPPS，如Fmoc和Boc，可用于合成主题抗体。
标准重组方法可以用于产生主题抗体。例如，将编码轻链和重链可变区(任选地与恒定区连接)的核酸插入表达载体中。轻链和重链可以克隆到相同或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的DNA片段可操作地连接到确保免疫球蛋白多肽的表达的表达载体中的控制序列。表达控制序列包含但不限于启动子(例如天然相关的或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。表达控制序列可以是能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)的载体中的真核启动子系统。一旦载体被掺入到适当的宿主中，宿主就被维持在适于高水平表达核苷酸序列以及收集和纯化抗体的条件下。
由于密码的简并性，多种核酸序列可以编码每种免疫球蛋白氨基酸序列。期望的核酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过聚合酶链式反应(PCR)诱变期望的多核苷酸的早期制备的变体来产生。
合适的表达载体通常可以在宿主生物中作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以允许检测用期望的DNA序列转化的那些细胞。
大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆编码主题抗体的多核苷酸的原核宿主细胞的实例。适合于使用的其它微生物宿主包含杆菌(如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))和其它肠杆菌科(如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和各种假单胞菌(Pseudomonas)属)。如酵母等其它微生物也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母属(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的实例。
除了微生物之外，哺乳动物细胞(例如，在体外细胞培养物中生长的哺乳动物细胞)也可以用于表达和产生本发明的多肽(例如，编码免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。合适的哺乳动物宿主细胞包含CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系和转化的B细胞或杂交瘤。针对这些细胞的表达载体可以包含如复制起点、启动子和增强子等表达控制序列和如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷化位点和转录终止子序列等必需的处理信息位点。合适的表达控制序列的实例是源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。
一旦合成(化学或重组)，完整抗体、其二聚体、单独的轻链和重链、或其它形式的主题抗体(例如，scFv等)可以根据本领域的标准程序进行纯化，包含铵硫酸盐沉淀、亲和柱、柱色谱法、高效液相色谱法(HPLC)纯化、凝胶电泳等(通常参见Scopes,《蛋白纯化(Protein Purification)》纽约的施普林格出版公司(Springer-Verlag,N.Y.),(1982))。主题抗体可以是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的、至少约85％至90％纯的、至少约90％至95％纯的、或98％至99％或更高纯的，例如不含污染物，如除主题抗体之外的细胞碎片、大分子等。
组合物
本公开的缀合物可以多种不同方式进行调配。通常，在缀合物是多肽-药物缀合物(例如抗体-药物缀合物)的情况下，缀合物以与缀合到多肽的药物、抗体、要治疗的病症和要使用的施用途径相容的方式进行调配。
在一些实施例中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本公开的任何缀合物以及药学上可接受的赋形剂。
缀合物(例如，抗体-药物缀合物)可以任何合适的形式，例如，以药学上可接受的盐的形式提供，并且可以被调配用于任何合适的施用途径，例如口服、局部或肠胃外施用。在缀合物作为可注射的液体提供(如在其中所述缀合物被静脉内或直接施用到组织中的那些实施例中)的情况下，缀合物可以作为即用型剂型，或者作为由药学上可接受的载剂和赋形剂构成的可重构的储存稳定的粉末或液体提供。
调配缀合物的方法可以从那些易得方法进行调整。例如，缀合物可以在包括治疗有效量的缀合物和药学上可接受的载剂(例如盐水)的药物组合物中提供。药物组合物可以任选地包含其它添加剂(例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂等)。在一些实施例中，调配物适合用于向哺乳动物施用，如适合向人施用的那些调配物。
例如，本公开提供了一种包括主题抗体缀合物的组合物。除主题抗体缀合物外，主题抗体缀合物组合物还可以包括以下的一种或多种：盐，例如，NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等；缓冲剂，例如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等；增溶剂；去污剂，例如非离子去污剂，如Tween-20等；蛋白酶抑制剂；甘油等。
在某些实施例中，本公开提供了包括主题抗体缀合物的组合物，所述组合物包含药物组合物。通常，调配物包括有效量的主题抗体缀合物。“有效量”是指足以产生期望结果(例如减少癌细胞数量)的剂量。在一些情况下，期望的结果是与对照相比至少减少恶性肿瘤的症状。
调配物
在主题方法中，可以使用能够产生期望的治疗效果或诊断效果的任何方便的方式将主题抗体缀合物施用于宿主。因此，可以将抗体缀合物掺入到用于治疗性施用的各种调配物中。更具体地，主题抗体缀合物可以通过与适当的药学上可接受的载剂或稀释剂组合调配成药物组合物，并且可以调配成固体、半-固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气溶胶。
在药物剂型中，主题抗体缀合物可以以其药学上可接受的盐的形式施用，或者所述主题抗体缀合物也可以单独使用或以适当的缔合以及组合形式与其它药学活性化合物一起使用。以下方法和赋形剂仅是示例性的并且决不是限制性的。
对于口服制剂，主题抗体缀合物可以单独使用或以组合形式与适当的添加剂一起使用，以制备片剂、粉剂、颗粒或胶囊，例如，与常规添加剂(如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉)一起使用；与粘合剂(如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶)一起使用；与崩解剂(如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠)一起使用；与润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)一起使用；并且如果期望，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂一起使用。
主题抗体缀合物可以通过以下来调配成用于注射的制剂：将所述主题抗体缀合物溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂如植物油或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇中；并且如果期望的话，使用常规添加剂，如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂与防腐剂一起。
包括主题抗体缀合物的药物组合物通过将具有期望纯度的抗体缀合物与任选的生理学上可接受的载剂、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张力剂混合来制备。可接受的载剂、赋形剂和/或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包含：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸和柠檬酸；防腐剂(如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸，如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合；单糖、二糖和其它碳水化合物；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如明胶或血清白蛋白；螯合剂，如EDTA；糖，如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子表面活性剂，如Tween、Brij Pluronics、Triton-X或聚乙二醇(PEG)。
药物组合物可以是液体形式、冻干形式或从冻干形式重构的液体形式，其中在施用之前用无菌溶液重构冻干制剂。用于重构冻干组合物的标准程序是加回一定体积的纯水(通常相当于冻干期间移除的体积)；然而，包括抗菌剂的溶液可以用于产生用于肠胃外施用的药物组合物。
主题药物组合物中的示例性抗体缀合物浓度可以在约1mg/mL至约200mg/ml、或约50mg/mL至约200mg/mL、或约150mg/mL至约200mg/mL的范围内。
可以在pH缓冲溶液中，例如，在约4.0到约7.0、或约5.0到约6.0、或可替代地约5.5的pH范围下，制备抗体缀合物的水性调配物。适合于此范围内pH的缓冲液的实例包含磷酸盐-、组氨酸-、柠檬酸盐-、琥珀酸盐-、乙酸盐-缓冲液和其它有机酸缓冲液。缓冲液浓度可以为约1mM到约100mM、或约5mM到约50mM，这取决于例如缓冲液和调配物的所需张力。
还可以添加冻干保护剂以保护不稳定的活性成分(例如蛋白质)免受冻干期间不稳定条件的影响。例如，已知的冻干保护剂包含糖(包含葡萄糖和蔗糖)；多元醇(包含甘露醇、山梨醇和甘油)；和氨基酸(包含丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。可以包含约10nM到500nM的量的冻干保护剂。
在一些实施例中，主题调配物包含主题抗体缀合物和一种或多种药剂(例如，表面活性剂、缓冲液、稳定剂、张力剂)，并且基本上不含一种或多种防腐剂，如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯铵和其组合。在其它实施例中，调配物中包含防腐剂，例如，以约0.001到约2％(w/v)的浓度范围。
例如，主题调配物可以是适于肠胃外施用的液体或冻干调配物，并且可以包括：约1mg/mL至约200mg/mL的主题抗体缀合物；约0.001％至约1％的至少一种表面活性剂；约1mM至约100mM的缓冲液；任选地约10mM至约500mM的稳定剂；和约5mM至约305mM的张力剂；并且pH为约4.0至约7.0。
作为另一实例，主题胃肠外调配物是液体或冻干调配物，其包括约1mg/mL至约200mg/mL主题抗体缀合物；0.04％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和250mM蔗糖；并且pH为5.5。
如本文所使用的，术语“单位剂型”是指适合作为用于人类和动物受试者的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的本公开的抗体缀合物以及药学上可接受的稀释剂、载剂或媒剂，所述预定量的量经计算足以产生期望的效果。主题抗体缀合物的规格可以取决于所使用的特定抗体缀合物和要实现的效果，以及与宿主中的每种抗体缀合物相关的药效学。
主题抗体缀合物可以作为可注射调配物施用。通常，可注射组合物被制备为液体溶液或悬浮液；还可以制备适于在注射前在液体媒剂中形成溶液或悬浮液的固体形式。制剂也可被乳化或将抗体缀合物封装在脂质体媒剂中。
药学上可接受的赋形剂，如媒剂、佐剂、载剂或稀释剂，是公众可容易获得的。此外，药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等，对于公众来说是容易获得的。
在一些实施例中，主题抗体缀合物被调配在控释调配物中。缓释制剂可以使用本领域熟知的方法来制备。缓释制剂的适合的实例包含含有抗体缀合物的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质采用定型物品例如薄膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包含聚酯、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、水凝胶、聚乳酸、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。通过使用适当的添加剂、通过控制水分含量和通过开发特定的聚合物基质组合物，可以防止缓释制剂中包括的抗体的生物活性的可能损失和免疫原性的可能变化。
物理系统包含但不限于具有速率控制膜的储库系统，如微囊化、大囊化和膜系统；没有速率控制膜的储库系统，如中空纤维、超微孔三乙酸纤维素以及多孔聚合物基材和泡沫；单片系统，包含物理溶解于无孔、聚合物或弹性体基质中的系统(例如，不可侵蚀的、可侵蚀的、环境剂侵入的和可降解的)，以及物理分散于无孔、聚合物或弹性体基质中的材料(例如，不可侵蚀的、可侵蚀的、环境剂侵入的和可降解的)；层状结构，包含化学上与外控制层类似或不同的储库层；以及其它物理方法，如吸附到渗透泵或离子交换树脂。
化学系统包含但不限于聚合物基质的化学侵蚀(例如，异质或均质侵蚀)或聚合物基质的生物侵蚀(例如，异质或均质)。
剂量
合适的剂量可以由主治医师或其它合格的医务人员基于各种临床因素确定。如在医学领域众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包含患者的大小、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、患者的性别、时间和施用途径、总体健康状况和同时施用的其它药物。主题抗体缀合物可以以每剂介于1ng/kg体重与20mg/kg体重之间的量施用，例如介于0.1mg/kg体重至10mg/kg体重，例如介于0.5mg/kg体重至5mg/kg体重之间；然而特别是考虑到上述因素，可以预见低于或高于此示例性范围的剂量。如果方案是连续输注，也可以在每分钟每公斤体重1μg至10mg的范围内。
技术人员将容易理解，剂量水平可以随具体抗体缀合物、症状的严重程度和受试者对副作用的敏感性而变化。本领域技术人员可通过多种方式容易地确定给定化合物的优选剂量。
施用途径
使用任何适于药物递送的可用方法和途径，包含体内和离体方法，以及全身和局部施用途径，将主题抗体缀合物施用于个体。
常规的和药学上可接受的施用途径包含鼻内、肌肉内、气管内、皮下、皮内、局部施用、静脉内、动脉内、直肠、鼻、口服和其它肠内和肠胃外施用途径。如果期望，可以组合施用途径，或根据抗体缀合物和/或期望效果进行调整。主题抗体缀合物组合物可以以单剂量或多剂量施用。在一些实施例中，主题抗体缀合物组合物是口服施用的。在一些实施例中，主题抗体缀合物组合物是通过吸入途径施用的。在一些实施例中，主题抗体缀合物组合物是鼻内施用的。在一些实施例中，主题抗体缀合物组合物是局部施用的。在一些实施例中，主题抗体缀合物组合物是颅内施用的。在一些实施例中，主题抗体缀合物组合物是静脉内施用的。
可以使用适于递送常规药物的任何可用的常规方法和途径，包含全身或局部途径，将抗体缀合物施用于宿主。通常，本发明考虑的施用途径包含但不一定限于肠内、肠胃外或吸入途径。
除吸入施用之外的肠胃外施用途径包含但不一定限于局部、透皮、皮下、肌肉内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、肝内和静脉内途径，例如，除通过消化道外的任何施用途径。可以进行肠胃外施用以实现主题抗体的全身或局部递送。在需要全身递送的情况下，施用通常涉及药物制剂的侵入性或全身吸收的局部或粘膜施用。
主题抗体缀合物也可以通过肠内施用递送到受试者。肠内施用途径包含但不一定限于口服和直肠(例如，使用栓剂)递送。
治疗意指与困扰宿主的病理病状相关的症状的至少改善，其中改善在广义上用于指参数的量值的至少减小，例如与正在治疗的病理病状(如乳腺癌、胰腺癌或肺癌)相关的症状。因此，治疗还包含病理病状或至少与其相关的症状被完全抑制(例如，防止发生)或停止(例如，终止)，使得宿主不再患有所述病理病状或至少表征所述病理病状的症状的情况。
在一些实施例中，主题抗体缀合物通过注射施用，例如用于全身递送(例如静脉内输注)或递送到局部部位。
多种宿主(其中术语“宿主”在本文中与术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用)可根据主题方法治疗。总体上，此类宿主为“哺乳动物”或“哺乳动物类”，其中这些术语广泛用于描述哺乳动物类内的生物体，包含食肉动物(例如狗和猫)、啮齿目动物(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长类动物(例如人类、黑猩猩和猴子)。在一些实施例中，宿主将是人。
治疗方法
本公开提供了治疗恶性肿瘤的方法，所述恶性肿瘤包含实体瘤或血液系统恶性肿瘤，所述方法通常涉及向有需要的个体(例如，患有恶性肿瘤的个体)施用有效量的主题抗体缀合物，单独地施用(例如，在单一疗法中)或与一种或多种另外的治疗剂组合(例如，在组合疗法中)。
恶性肿瘤包含例如HCC、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、肛门癌、阑尾癌、胆道癌(例如胆管癌)、膀胱癌、脑瘤、乳腺癌、子宫颈癌、肠癌、原发性不明癌(CUP)、食道癌、眼癌、输卵管癌、胃肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺疾病、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌等。
在一些实施例中，主题抗体缀合物的有效量是当以一个或多个剂量单独施用(例如，在单一疗法中)或与一种或多种另外的治疗剂组合施用(例如，在组合疗法中)时，与未用抗体缀合物治疗的情况下个体中的癌细胞数量相比，将个体中的癌细胞数量有效减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的量。
在一些情况下，乳腺癌的雌激素、孕酮和HER2呈三阴性。在一些情况下，三阴性乳腺癌是转移性三阴性乳腺癌。在一些情况下，三阴性乳腺癌是一种复发性或难治性三阴性乳腺癌。在一些情况下，三阴性乳腺癌是一种复发性或难治性转移性三阴性乳腺癌。
本公开的方面包含将药物递送到受试者体内的靶位点的方法。所述方法包含向受试者施用包括根据本公开的缀合物的药物组合物，其中所述施用有效地在所述受试者体内的所述靶位点处将治疗有效量的药物从缀合物中释放。
在一些实施例中，施用多个剂量的抗体-药物缀合物。抗体-药物缀合物的施用频率可以根据多种因素中的任何因素(例如，症状的严重程度，受试者的病状等)而变化。例如，在一些实施例中，抗体-药物缀合物每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周、每周一次(qwk)、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天、每天(qd/od)、每天两次(bds/bid)或每天三次(tds/tid)等进行施用。
组合疗法
在一些实施例中，治疗恶性肿瘤的主题方法涉及施用主题抗体缀合物和一种或多种另外的治疗剂。合适的另外的治疗剂包含但不限于癌症化疗剂(如上文所描述的)。
在一些实施例中，治疗方法可以包含向受试者施用治疗有效量的免疫调节治疗剂。免疫调节治疗剂可以是免疫检查点抑制剂或白介素。免疫检查点抑制剂可以抑制A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、CD277、IDO、KIR、PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT或VISTA。抑制PD-1信号传导的免疫检查点抑制剂可以是抗PD-1抗体。抗PD-1抗体可以是纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)或阿维鲁单抗(avelumab)。抑制CTLA-4的免疫检查点抑制剂可以是抗CTLA-4抗体。抗CTLA-4抗体可以是伊匹单抗(ipilimumab)。
适于治疗的受试者
多种受试者适合用主题方法进行治疗。合适的受试者包含任何个体，例如患有恶性肿瘤的；已被诊断患有恶性肿瘤的；患有恶性肿瘤并且有恶性肿瘤复发风险的；已用除主题抗体缀合物之外的药剂治疗恶性肿瘤(例如，已用癌症化疗剂治疗)并且对所述药剂没有应答的；或已用除主题抗体缀合物之外的药剂治疗恶性肿瘤(例如，已用癌症化疗剂治疗)并最初对所述药剂有应答但随后停止应答的(例如，复发)人。
实施例
在下文列出的条款中描述了本公开的某些实施例。这些实施例仅是说明性的，而不旨在限制范围。
1.一种式(I)的缀合物：
其中
Z为CR4或N；
R1选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基；
R2和R3各自独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基，或者R2和R3任选地环状连接以形成5元或6元杂环基；
每个R4独立地选自氢、卤素、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基；
L为接头；
W1为药物；并且
W2为抗体。
2.根据条款1所述的缀合物，其中L包括：
-(T1-V1)a-(T2-V2)b-(T3-V3)c-(T4-V4)d-(T5-V5)e-(T6-V6)f-，
其中
a、b、c、d、e和f各自独立地为0或1，其中a、b、c、d、e和f的总和为1至6；
T1、T2、T3、T4、T5和T6各自独立地选自共价键、(C1-C12)烷基、经取代的(C1-C12)烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基和经取代的杂环基、(EDA)w、(PEG)n、(AA)p、-(CR13OH)m-、4-氨基-哌啶(4AP)、间氨基-苄氧基(MABO)、间氨基-苄氧基羰基(MABC)、对氨基-苄氧基(PABO)、对氨基-苄氧基羰基(PABC)、对氨基苄基(PAB)、对氨基-苄基氨基(PABA)、对氨基苯基(PAP)、对羟基苯基(PHP)、缩醛、肼、二硫化物以及酯，其中EDA为乙二胺部分，PEG为聚乙二醇，并且AA为氨基酸残基或氨基酸类似物，其中每个w为1至20的整数，每个n为1至30的整数，每个p为1至20的整数，并且每个m为1至12的整数；
V1、V2、V3、V4、V5和V6各自独立地选自由以下组成的组：共价键、-CO-、-NR15-、-NR15(CH2)q-、-NR15(C6H4)-、-CONR15-、-NR15CO-、-C(O)O-、-OC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NR15-、-NR15SO2-和-P(O)OH-，其中每个q为1至6的整数；
每个R13独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、芳基以及经取代的芳基；
每个R15独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、羧基、羧基酯、酰基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。
3.根据条款2所述的缀合物，其中：
T1选自(C1-C12)烷基和经取代的(C1-C12)烷基；
T2、T3、T4、T5和T6各自独立地选自共价键、(C1-C12)烷基、经取代的(C1-C12)烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基和经取代的杂环基、(EDA)w、(PEG)n、(AA)p、-(CR13OH)m-、4-氨基-哌啶(4AP)、MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP、PHP、缩醛基、肼以及酯；并且
V1、V2、V3、V4、V5和V6各自独立地选自由以下组成的组：共价键、-CO-、-NR15-、-NR15(CH2)q-、-NR15(C6H4)-、-CONR15-、-NR15CO-、-C(O)O-、-OC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NR15-、-NR15SO2-以及-P(O)OH-；
其中：
(PEG)n为其中n为1至30的整数；
EDA为具有以下结构的乙二胺部分：
其中y为1至6的整数，并且r为0或1；
4-氨基-哌啶(4AP)为并且
每个R12独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、聚乙二醇部分、芳基以及经取代的芳基，其中任意两个相邻R12基团能够环状连接以形成哌嗪基环。
4.根据条款2至3中任一项所述的缀合物，其中MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP以及PHP各自任选地被糖苷取代。
5.根据条款4所述的缀合物，其中所述糖苷选自葡糖苷酸、半乳糖苷、葡萄糖苷、甘露糖苷、岩藻糖苷、O-GlcNAc以及O-GalNAc。
6.根据条款2至5中任一项所述的缀合物，
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2为-CO-；
T3为(C1-C12)烷基，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
T4为(AA)p，并且V4不存在；并且
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CONH-；
T2为(PEG)n，并且V2为-CO-；
T3为(AA)p，并且V3不存在；
T4为PABC，并且V4不存在；并且
e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为氨基酸类似物，并且V2为-NH-；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；
T4为(AA)p，并且V4不存在；
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0。
7.根据条款1至6中任一项所述的缀合物，其中所述接头L具有选自以下的结构：
其中表示式(I)中的L与N的连接，并且*表示L与W1的连接。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其中所述药物为单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
9.根据条款1至8中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物选自由以下组成的组：
以及
10.根据条款1至9中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为IgG1抗体。
11.根据条款10所述的缀合物，其中所述抗体为IgG1κ抗体。
12.根据条款1至11中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包括具有fGly'的序列，其中fGly'为通过所述接头与所述药物偶联的氨基酸残基。
13.根据条款1至12中任一项所述的缀合物，其中所述序列定位于所述抗体的重链恒定区的C末端处。
14.根据条款1至12中任一项所述的缀合物，其中所述序列定位于所述抗体的轻链恒定区中。
15.根据条款1至12中任一项所述的缀合物，其中所述序列定位于所述抗体的重链CH1区中。
16.根据条款1至12中任一项所述的缀合物，其中所述序列定位于所述抗体的重链CH2区中。
17.根据条款1至12中任一项所述的缀合物，其中所述序列定位于所述抗体的重链CH3区中。
18.一种式(III)的化合物：
其中
Z为CR4或N；
R2和R3各自独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基，或者R2和R3任选地环状连接以形成5元或6元杂环基；
每个R4独立地选自氢、卤素、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基；
L为接头；并且
W1为药物。
19.根据条款18所述的化合物，其中L包括：
-(T1-V1)a-(T2-V2)b-(T3-V3)c-(T4-V4)d-(T5-V5)e-(T6-V6)f-，
其中
a、b、c、d、e和f各自独立地为0或1，其中a、b、c、d、e和f的总和为1至6；
T1、T2、T3、T4、T5和T6各自独立地选自共价键、(C1-C12)烷基、经取代的(C1-C12)烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基和经取代的杂环基、(EDA)w、(PEG)n、(AA)p、-(CR13OH)m-、4-氨基-哌啶(4AP)、间氨基-苄氧基(MABO)、间氨基-苄氧基羰基(MABC)、对氨基-苄氧基(PABO)、对氨基-苄氧基羰基(PABC)、对氨基苄基(PAB)、对氨基-苄基氨基(PABA)、对氨基苯基(PAP)、对羟基苯基(PHP)、缩醛、肼、二硫化物以及酯，其中EDA为乙二胺部分，PEG为聚乙二醇，并且AA为氨基酸残基或氨基酸类似物，其中每个w为1至20的整数，每个n为1至30的整数，每个p为1至20的整数，并且每个m为1至12的整数；
V1、V2、V3、V4、V5和V6各自独立地选自由以下组成的组：共价键、-CO-、-NR15-、-NR15(CH2)q-、-NR15(C6H4)-、-CONR15-、-NR15CO-、-C(O)O-、-OC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NR15-、-NR15SO2-和-P(O)OH-，其中每个q为1至6的整数；
每个R13独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、芳基以及经取代的芳基；
每个R15独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、羧基、羧基酯、酰基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。
20.根据条款19所述的化合物，其中：
T1选自(C1-C12)烷基和经取代的(C1-C12)烷基；
T2、T3、T4、T5和T6各自独立地选自共价键、(C1-C12)烷基、经取代的(C1-C12)烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基和经取代的杂环基、(EDA)w、(PEG)n、(AA)p、-(CR13OH)m-、4-氨基-哌啶(4AP)、MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP、PHP、缩醛基、肼以及酯；并且
V1、V2、V3、V4、V5和V6各自独立地选自由以下组成的组：共价键、-CO-、-NR15-、-NR15(CH2)q-、-NR15(C6H4)-、-CONR15-、-NR15CO-、-C(O)O-、-OC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NR15-、-NR15SO2-以及-P(O)OH-；
其中：
(PEG)n为其中n为1至30的整数；
EDA为具有以下结构的乙二胺部分：
其中y为1至6的整数，并且r为0或1；
4-氨基-哌啶(4AP)为并且
每个R12独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、聚乙二醇部分、芳基以及经取代的芳基，其中任意两个相邻R12基团能够环状连接以形成哌嗪基环。
21.根据条款19至20中任一项所述的化合物，其中MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP以及PHP各自任选地被糖苷取代。
22.根据条款21所述的化合物，其中所述糖苷选自葡糖苷酸、半乳糖苷、葡萄糖苷、甘露糖苷、岩藻糖苷、O-GlcNAc以及O-GalNAc。
23.根据条款19至22中任一项所述的化合物，
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2为-CO-；
T3为(C1-C12)烷基，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
T4为AA，并且V4不存在；并且
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CONH-；
T2为(PEG)n，并且V2为-CO-；
T3为AA，并且V3不存在；
T4为PABC，并且V4不存在；并且
e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为氨基酸类似物，并且V2为-NH-；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；
T4为AA，并且V4不存在；
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0。
24.根据条款18至23中任一项所述的化合物，其中所述接头L具有选自以下的结构：
其中表示式(I)中的L与N的连接，并且*表示L与W1的连接。
25.根据条款18至24中任一项所述的化合物，其中所述药物为MMAE。
26.根据条款18至25中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的组：
以及
27.一种药物组合物，其包括：
根据条款1至17中任一项所述的缀合物；以及
药学上可接受的赋形剂。
28.一种方法，其包括：
向受试者施用有效量的根据条款1至17中任一项所述的缀合物。
29.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用治疗有效量的根据条款27所述的药物组合物，其中所述施用对治疗所述受试者的癌症是有效的。
30.根据条款29所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、肺癌或胃癌。
31.一种向受试者体内的靶位点递送药物的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用根据条款27所述的药物组合物，其中所述施用对向所述受试者体内的所述靶位点递送治疗有效量的所述药物是有效的。
实例
提出以下实例以便向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制诸位发明人考虑作为其发明的范围，也不旨在表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。虽然已经做出了努力以确保关于使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是一些实验误差和偏差应当被计算在内。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是以摄氏度为单位，并且压力是在大气压下或接近大气压。可以使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹腔内；s.c.，皮下；等等。除非另有说明，否则实例中提及的可商购获得的试剂均根据制造商的说明使用。实例和整个说明书中通过ECACC登录号鉴定的细胞的来源是英国索尔兹伯里(Salisbury,England)的欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。下文描述了示例性方法和材料，但是与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试。材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在限制范围。
实例1
材料和方法
概述
合成试剂购买自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)、奥豪斯公司(Acros)、AK科技公司(AK Scientific)或其它商业来源，并且未经纯化即可使用。无水溶剂获得自密封瓶中的商业来源。在所有情况下，溶剂使用配备有Buchi V-700真空泵的Buchi旋转蒸发仪R-114在减压下去除。使用Biotage色谱法系统进行柱色谱法。制备型HPLC纯化使用配备有菲罗门(Phenomenex)Kinetex 5μm EVO C18 150×21.2mm柱的沃特世(Waters)制备型HPLC单元进行。HPLC分析在配备有G1322A型脱气器、G1311A型四分之一泵、G1329A型自动进样器、G1314型可变波长检测器、安捷伦(Agilent)Poroshell 120SB C18、4.6mm×50mm柱的安捷伦1100系列分析性HPLC上，使用10-100％梯度的水和含有0.05％三氟乙酸的乙腈，在室温下进行。HPLC在254或205nm处进行监测。低分辨率质谱(LRMS)在配备有安捷伦1260无限HPLC系统、G1314可变波长检测器和安捷伦Poroshell 120SB C18、4.6mm×50mm柱的安捷伦科技(Agilent Technology)6120四极LC/MS上，使用10-100％梯度的水和含有0.1％甲酸的乙腈，在室温下获得。
MMAE构建体的合成
研究中使用的MMAE化合物1-5的结构如下所示。化合物1先前在Harpel等人,《抗体(Antibodies)》2019,8,54中进行了报道。化合物2和3先前在Chuprakov等人,《生物缀合化学(Bioconjugate Chem.)》2021,32,4,746–754中进行了报道。合成中间体6、8和11商业获得自上海美迪西公司(Shanghai Medicilon)，并且未经纯化而使用。单甲基奥瑞斯他汀E 9购自BroadPharm公司(BroadPharm)并按原样使用。
MMAE构建体4的合成
1,2-二甲基2-((1-(3-氧代-3-((2-(2-(3-氧代3-(全氟苯氧基)丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)丙基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)甲基)肼-1-甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(7)的制备
在20mL闪烁小瓶中将化合物6(56mg，87μmol)、五氟苯酚(18mg，98μmol)，35μLDIPEA和1mL EtOAc合并。将所得混合物用19mg(122μmol)的EDC处理，并且在室温下搅拌3天。将反应混合物用DCM稀释并用1M HCl水溶液洗涤，随后用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，过滤，并且在减压下浓缩。将残留物在高真空下干燥以得到呈白色固体的59mg PFP酯7(73μmol，84％产率)，将其在不进行进一步纯化的情况下使用。
LRMS(ESI):m/z 810.7，即以下的[M+H]+计算值：C41H40F5N5O7 m/z 810.8。
(2S,3R,4S,5S,6S)-三乙酸-2-(2-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基酯(10)的制备
在烘箱干燥的20mL玻璃闪烁小瓶中将MMAE作为TFA盐(9，150mg，0.18mmol)和PNP碳酸盐8(160mg，0.16mmol)在2mL的无水DMF中混合。用84uL(0.48mmol)的DIPEA处理此混合物，并且使其在室温下反应2小时。在真空下去除DIPEA，用32uL(0.32mmol)的哌啶在0℃下处理残留溶液7小时，并且然后通过反相制备型HPLC(C18，乙腈-水5-95％梯度，含0.05％TFA)进行纯化。将纯级分冻干以得到呈白色粉末的160mg(0.12mmol，经2个步骤75％产率)的标题化合物10。
LRMS(ESI):m/z 1369.8，即以下的[M+H]+计算值：C68H104N8O21 m/z 1369.7。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)-2-((2S,5S)-19-(2-((1,2-二甲基肼基)甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,17-三氧代-10,13-二氧杂-3,6,16-三氮杂癸酰胺)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酸(4)的制备
在玻璃小瓶中，将化合物10(20mg，15μmol)和PFP酯7(14mg，17μmol)在0.5mL的无水DMF中合并。用DIPEA(7μL)和HOAt(1mg)处理所得混合物，并且在室温下搅拌1小时。将反应混合物在真空下浓缩，在2.5mL的MeOH中重构。将溶液冷却到0℃，用1.5mL 1M LiOH水溶液处理，使其温热到室温，并且搅拌2小时。通过添加1M HCl中和反应混合物，在真空中除去甲醇，并且通过反相制备型HPLC(C18，10-60％乙腈-水/0.05％TFA)将残留物纯化。将纯级分合并并冻干以得到呈白色粉末的12mg(7μmol，经2个步骤47％产率)的化合物4。
LRMS(ESI):m/z 1633.9，即以下的[M+H]+计算值：C81H125N13O22 m/z 1633.9。
MMAE构建体5的合成
(R)-2-(3-(2-((2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-1,2-二甲基肼基)甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-1-基)丙酰胺基)-3-氧代-3-((2-(2-(3-氧代-3-(全氟苯氧基)丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)丙烷-1-磺酸(12)的制备
将甲酸11(1.33g，1.67mmol)与五氟苯酚(1.23g，6.68mmol)在6.5mL的无水DMF中合并。此混合物在室温下用EDCI-HCl(0.64g，3.34mmol)一次性处理，并且搅拌20小时，直到通过HPLC分析判断11完全消耗。将反应混合物通过反相色谱法(C18柱，0-80％含0.05％TFA的乙腈-水)直接纯化。将纯级分合并，在真空下浓缩直到浑浊，并且冻干以得到呈棕褐色粉末的PFP酯12(1.40g，1.46mmol，87％产率)。
LRMS(ESI):m/z 961.2，即以下的[M+H]+计算值：C44H45F5N6O11S m/z 961.3。
(2S,3R,4S,5S,6S)-三乙酸-2-(2-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基酯(13)的制备
在20mL玻璃小瓶中，在室温下将单甲基奥瑞斯他汀A9(720mg，1.0mmol)、5mL的无水DMF和0.35mL的DIPEA(2.0mmol)合并。将所得混合物搅拌并用呈少量固体形式的PNP碳酸盐8(1014mg，1.0mmol)处理，随后在室温下一次性添加HOAt(136mg，1.0mmol)。将反应混合物搅拌6小时直到判断反应完成(HPLC)。将反应混合物倒入30mL的水中，并且通过旋转分离并收集所得沉淀物，用5mL的水洗涤，并且在高真空下短暂干燥以得到呈微黄色固体的1.87g粗产物13，所述粗产物在不进行纯化的情况下进入下一步骤。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酸(14)的制备
将粗化合物13(1.87g)于15mL的THF中的溶液在冰浴中冷却到0℃，并且用1M氢氧化锂水溶液(3mL)缓慢处理。将反应混合物在0℃下搅拌3小时，然后温热到环境温度，用3mL的1M氢氧化锂水溶液处理，并且用3mL的甲醇稀释。将所得混合物在室温下搅拌3小时，直到水解完成(HPLC)，然后通过添加1M HCl水溶液到pH7来淬灭。然后将反应混合物在减压下浓缩并用10mL的MTBE洗涤。将水层通过反相色谱法(C18柱，0-40％含0.05％TFA的乙腈-水)进行纯化。将纯产物级分合并，在减压下浓缩，并且冻干以得到呈白色粉末的化合物14(735mg，0.60mmol，经2个步骤60％产率)。
LRMS(ESI):m/z 1229.7，即以下的[M+H]+计算值：C61H96N8O18 m/z 1229.7。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(5-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)-2-((2S,5S,18R)-22-(2-((1,2-二甲基肼基)甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,17,20-四氧代-18-(磺甲基)-10,13-二氧杂-3,6,16,19-四氮杂二十二烷酰胺)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酸(5)的制备
在室温下向化合物14(735mg，0.60mmol)于3mL的无水DMA中的搅拌的溶液中添加DIPEA(0.21mL，1.2mmol)和PFP酯12(575mg，0.60mmol)于2mL的DMA中的溶液，随后添加HOAt(84mg，0.60mmol)。将所得混合物搅拌30分钟，直到判断偶联完成(HPLC分析)，然后在室温下用1.2mL的哌啶直接处理。15分钟后，将反应混合物通过反相色谱法(C18柱，0-40％乙腈-水梯度)进行纯化。将纯级分合并，在减压和室温下浓缩，然后冻干以得到呈白色蓬松粉末的化合物5(808mg，0.45mmol，75％产率)。LRMS(ESI):m/z 1783.9，即以下的[M+H]+计算值：C84H130N14O26S m/z 1783.9。
实例2：生物缀合、纯化和HPLC分析
醛标记的抗体的HIPS缀合
将携带一个醛标签的抗体(15mg/mL)分别以1.1mM与接头-有效载荷缀合。将反应在37℃下在含有0.85-2.5％DMA的20mM柠檬酸钠、50mM NaCl pH 5.5(20/50缓冲液)中进行72小时。缀合后，将游离药物使用30kD MWCO 0.5mL Amicon旋转浓缩器去除。将样品添加到旋转浓缩器中，以15,000x g离心，持续7分钟，然后用450μL 20mM柠檬酸钠、50mM NaCl pH5.5稀释，并再次离心。将此过程重复10次。为了确定最终产物的DAR，通过使用HIC(Tosoh(东曹公司)#14947)或PLRP-RP(安捷伦公司PL1912-1802 1000A，8um，50x 2.1mm)柱通过分析色谱法检查ADC。HIC分析使用流动相A：1.5M硫酸铵，25mM磷酸钠pH 7.0，以及流动相B：25％异丙醇，18.75mM磷酸钠pH 7.0。PLRP分析使用流动相A：含0.1％三氟乙酸的水，以及流动相B：含0.1％三氟乙酸的乙腈。在PLRP分析之前，添加50mM DTT、4M胍HCl(最终浓度)并在37℃下加热，持续30分钟使样品变性。为了确定聚集，使用分析尺寸排阻色谱法(SEC；东曹公司#08541)分析样品，流动相为300mM NaCl，25mM磷酸钠pH6.8和5％异丙醇。
未标记(野生型)抗体的马来酰亚胺缀合
在PBS，pH 8.0，1mM DTPA中，在37℃下使用2.5摩尔当量的TCEP还原抗体(5mg/mL)，持续90分钟。去除TCEP，并且使用切向流过滤将蛋白质交换成PBS，pH 7.4，1mM DTPA。将还原的抗体(3mg/mL)与10摩尔当量的马来酰亚胺-valcit-MMAE在冰上缀合60分钟。去除游离药物，并且使用切向流过滤将最终的ADC交换成PBS，pH7.4。
实例3：毒性研究
用于单剂量大鼠毒性研究中的ADC
单剂量非GLP大鼠毒理学研究
雄性斯普拉格-道利(Sprague-Dawley)大鼠(研究开始时8-9周大，5只动物/组)静脉内给药单独的媒剂或非交叉反应性泊洛妥珠单抗(抗CD79b)缀合物。ADC以20mg/kg(DAR约为4的贝多汀缀合物)或40mg/kg(所有其他DAR约为2的缀合物)给药以实现各组间相同的有效载荷给药水平。给药发生在第1天，随后是11天的观察时段。在第5天和第12天收集所有动物的血液用于临床病理学，并且在给药后8小时和第4天、第7天和第12天收集血液用于毒代动力学分析。每天进行临床观察。
单剂量非GLP大鼠毒理学结果：在大鼠研究中，比较了通过五种不同的接头类型缀合的携带MMAE的泊洛妥珠单抗ADC在同等有效载荷给药水平下的耐受性。在对造血细胞群体和肝功能测试(AST和ALT)的影响方面，携带化合物5接头-有效载荷的缀合物优于所有其它ADC(最像媒剂对照处理的动物)。
图2示出了给药后第5天大鼠体内的淋巴细胞群体的图。
图3示出了给药后第5天大鼠体内的循环天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平的图。
图4示出了给药后第5天大鼠体内的循环丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的图。
图5示出了给药后第5天大鼠体内的红细胞计数的图。
图6示出了给药后第5天大鼠体内的血红蛋白水平的图。
图7示出了给药后第5天大鼠体内的血细胞比容水平的图。
第一次Granta异种移植物研究中使用的ADC
接头-有效载荷 抗体 DAR 单体％
化合物1 重链CT标记的泊洛妥珠单抗 1.64 95.7
化合物4 重链CT标记的泊洛妥珠单抗 1.82 94.0
化合物3 重链CT标记的泊洛妥珠单抗 1.75 96.4
化合物5 重链CT标记的泊洛妥珠单抗 1.81 95.8
贝多汀 野生型泊洛妥珠单抗 3.5 99.0
图8示出了在第7天用单剂量的ADC进行的第一次Granta异种移植物研究的图。
第一次Granta异种移植物研究结果：在Granta 519异种移植物研究中，比较了通过五种不同接头类型(包含贝多汀和CT醛标记的HIPS缀合物)缀合的携带MMAE的泊洛妥珠单抗ADC在同等有效载荷剂量水平下的功效。所有缀合物在单剂量后均显示出优异的功效，其中贝多汀和化合物5缀合物显示出最长的肿瘤生长抑制。
第二次Granta异种移植物研究中使用的ADC
接头-有效载荷 抗体 DAR 单体％
化合物5 重链CT标记的泊洛妥珠单抗 1.85 95.8
化合物5 重链58Q标记的泊洛妥珠单抗 1.83 95.8
化合物5 重链91N标记的泊洛妥珠单抗 1.66 94.3
贝多汀 野生型泊洛妥珠单抗 3.45 95.2
图9示出了在第0天用单次2mg/kg剂量的ADC进行的第二次Granta异种移植物研究的图。与贝多汀缀合物相比，使用内部标签58Q和91N在DAR的一半时提供了优越的功效。
第二次Granta异种移植物研究结果：在Granta 519异种移植物研究中，比较在不同标签位点(包含CT、58Q和91N)处与贝多汀或化合物5缀合的泊洛妥珠单抗ADC在同等抗体给药水平下的功效。所有缀合物在单次2mg/kg剂量后显示出优异的功效，其中化合物5内部标记的缀合物58Q和91N显示出最长的肿瘤生长抑制。尽管两种缀合物仅携带50％的细胞毒性有效载荷剂量，但与贝多汀缀合物相比，这两种缀合物显示出优越的功效(例如，将3.45DAR的贝多汀与1.66DAR的91N ADC进行比较)。与两种选择的内部标签相比，在同等抗体剂量下，CT标记的ADC的功效与贝多汀缀合物相比非常弱。这种差异突出了将特定标签位点与特定接头-有效载荷组合以实现最佳结果的重要性。
用于多剂量大鼠毒性研究1号的ADC
接头-有效载荷 抗体 DAR 单体％
化合物5 重链CH1/CT标记的泊洛妥珠单抗 3.87 96.7
贝多汀 野生型泊洛妥珠单抗 3.47 95.2
多剂量非GLP大鼠毒理学研究1号
雄性斯普拉格-道利大鼠(研究开始时8-9周大，5只动物/组)静脉内给药单独的媒剂或非交叉反应性泊洛妥珠单抗(抗CD79b)贝多汀或醛标记的HIPS缀合物，每种具有约4的DAR。每周进行给药，总共4次给药(第1天、第8天、第15天和第22天)。动物在最后一次给药后观察7天。记录四次体重/周。给药后四天收集血液用于临床病理学(对于所有剂量)。每天进行临床观察。
多剂量非GLP大鼠毒理学研究1号结果：在多剂量大鼠研究中，比较在CH1/CT标签位点处与贝多汀或化合物5缀合的泊洛妥珠单抗ADC在同等有效载荷/同等抗体给药水平下的耐受性。在数周的时段内，给药化合物5ADC的大鼠显示出与媒剂对照组相似的结果，而给药贝多汀缀合物的大鼠表现出显著的骨髓抑制，其中白细胞和红细胞参数在第一次给药后明显降低，并且随时间的推移而恶化。
图10示出了重复给药媒剂或ADC的大鼠体内的循环嗜中性粒细胞计数的图。
图11示出了重复给药媒剂或ADC的大鼠体内的循环单核细胞计数的图。
图12示出了重复给药媒剂或ADC的大鼠体内的红细胞计数的图。
图13示出了重复给药媒剂或ADC的大鼠体内的血红蛋白水平的图。
图14示出了重复给药媒剂或ADC的大鼠体内的血细胞比容水平的图。
用于多剂量大鼠毒性研究2号的ADC
多剂量非GLP大鼠毒理学研究2号
雄性斯普拉格-道利大鼠(研究开始时8-9周大，5只动物/组)静脉内给药单独的媒剂或使用携带大鼠交叉反应性抗体可变区的抗体维恩妥尤单抗制备的粘连蛋白-4缀合物。测试的ADC是粘连蛋白-4贝多汀和粘连蛋白-4CH1/CT化合物5。每周以10mg/kg进行给药，总共4次给药(第1天、第8天、第15天和第22天)。动物在最后一次给药后观察7天。记录四次体重/周。在第5天、第12天、第19天和第26天收集所有动物的血液用于临床病理学，并且在给药后8小时以及第4天和第7天收集血液用于毒代动力学分析(对于所有剂量)。每天进行临床观察。临床观察评分系统评分范围为0(正常)至3(重度)，在表1中示出。
表1.临床观察评分系统
多剂量非GLP大鼠毒理学研究2号结果：
在多剂量大鼠研究中，比较在CH1/CT标签位点处与贝多汀或化合物5缀合的维恩妥尤单抗ADC在同等有效载荷/同等抗体给药水平下的耐受性。此研究中最突出的观察结果之一是贝多汀给药组的大量临床观察结果。大多数观察结果与皮肤损伤有关。相反，在化合物5给药组中没有观察到临床观察结果(图15)。考虑到贝多汀和化合物5ADC都释放相同的有效载荷(游离MMAE)，在化合物5组中缺乏临床观察结果是出乎意料的。以前认为化合物5接头赋予的改进的耐受性主要与循环中改进的稳定性有关，从而降低脱靶毒性。然而，此研究的结果表明，当在健康组织(如皮肤)中具有靶抗原表达的ADC中使用时，化合物5接头也可以赋予另外的耐受性改进。此发现新颖、出乎意料，并且具有潜在的治疗效用。
图15示出了重复给药大鼠交叉反应性粘连蛋白-4ADC的大鼠体内的临床观察结果的图。箭头表示给药天数。在给药化合物5缀合物的动物体内没有观察结果，而贝多汀给药组的临床观察结果在第17天平均为2.5，并且以动物的死亡而告终。
实例4：功效研究
方法
具有粘连蛋白-4ADC的NCI-H1781异种移植物
使用雌性BALB/c裸小鼠(5只小鼠/组)进行研究。用于50％PBS/50％Matrigel中的2000万个细胞在动物的侧面皮下接种。当肿瘤达到220mm3的平均体积时，用单次静脉内剂量的单独的媒剂或2.5或7.5mg/kg的ADC治疗动物。每周监测两次动物的体重和肿瘤大小。当肿瘤达到2000mm3时，对动物实施安乐死。在研究中观察到ADC的剂量应答性功效。
具有CD30 ADC的L-82异种移植物
使用雌性NOD/SCID小鼠(8只小鼠/组)进行研究。用于50％PBS/50％Matrigel中的1000万个细胞在动物的侧面皮下接种。当肿瘤达到100mm3的平均体积时，所有动物都用单次10mg/kg静脉内剂量的人IgG进行治疗(第0天)。然后，在第1天，用单独的媒剂、用未缀合的抗体(3mg/kg)或用1.5或3mg/kg的ADC治疗动物。每周监测两次动物的体重和肿瘤大小。当肿瘤达到2000mm3时，对动物实施安乐死。ADC在此研究中非常有效。
图17示出了在第0天用单次静脉内剂量的所列出的抗CD30 ADC进行的L-82异种移植物研究的图。VH4/VL4化合物8(RED-601)使用内部91N标签，并且与安适利相比递送一半的有效载荷剂量。在50％ADC给药(1.5mg/kg)和同等给药(3mg/kg)下，与安适利相比，VH4/VL4化合物8同等有效，所有组显示出8只小鼠/组中有8个完全应答。单独的VH4/VL4抗体具有最小活性。
图18示出了在第0天用单次静脉内剂量的所列出的抗CD30 ADC进行的Karpas299异种移植物研究的图。VH4/VL4化合物8(RED-601)使用内部91N标签，并且与安适利相比递送一半的有效载荷剂量。在50％ADC给药(1.5mg/kg)和同等给药(3mg/kg)时，与安适利相比，VH4/VL4化合物8给出5/6和6/6完全应答，所述安适利给出6/6完全应答，尽管与VH4/VL4化合物8相比有效载荷量是其有效载荷量的2倍。单独的VH4/VL4抗体具有最小活性。
图19示出了在第0天用单次2.5或7.5mg/kg静脉内剂量的所列出的抗粘连蛋白-4ADC进行的NCI-H1781异种移植物研究的图。VH4/VL1化合物8(RED-601)和VH4/VL5化合物8两者都使用内部91N标签，并且与Padcev相比递送一半的有效载荷剂量。同种型对照ADC具有最低活性。
实例5：毒代动力学样品分析
方法
总抗体和总ADC浓度通过ELISA进行定量，如先前所描述的和图20所示。对于总抗体，用抗人IgG特异性抗体捕获缀合物，并用HRP缀合的抗人Fc特异性抗体检测。对于总ADC，用抗人Fab特异性抗体捕获缀合物，并用小鼠抗美登素初级抗体检测，随后用HRP缀合的抗小鼠IgG亚类1-特异性二级抗体检测。使用Ultra-TMB一步ELISA底物(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))检测结合的二级抗体。在用硫酸淬灭反应后，通过在配备有SoftMax Pro软件的分子装置公司(Molecular Devices)Spectra Max M5酶标仪上测量450nm处的吸光度来读取信号。使用GraphPad Prism和Microsoft Excel软件分析数据。
结果：在多剂量非GLP大鼠毒理学研究2号中对来自动物的血浆样品的毒代动力学分析证实了给药水平和暴露，并且证明了与贝多汀ADC相比，化合物5缀合物的稳定性得到了改进(图20)。
虽然已经参照其具体实施例描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，可以在不脱离本发明的真正精神和范围的情况下进行各种改变并且可以替换等价物。另外，可以作出许多修改以使特定情形、材料、物质的组合、过程、一个或多个处理步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有此类修改均旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (31)

1.一种式(I)的缀合物：
其中
Z为CR4或N；
R1选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基；
R2和R3各自独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基，或者R2和R3任选地环状连接以形成5元或6元杂环基；
每个R4独立地选自氢、卤素、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基；
L为接头；
W1为药物；并且
W2为抗体。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中L包括：
-(T1-V1)a-(T2-V2)b-(T3-V3)c-(T4-V4)d-(T5-V5)e-(T6-V6)f-，
其中
a、b、c、d、e和f各自独立地为0或1，其中a、b、c、d、e和f的总和为1至6；
T1、T2、T3、T4、T5和T6各自独立地选自共价键、(C1-C12)烷基、经取代的(C1-C12)烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基和经取代的杂环基、(EDA)w、(PEG)n、(AA)p、-(CR13OH)m-、4-氨基-哌啶(4AP)、间氨基-苄氧基(MABO)、间氨基-苄氧基羰基(MABC)、对氨基-苄氧基(PABO)、对氨基-苄氧基羰基(PABC)、对氨基苄基(PAB)、对氨基-苄基氨基(PABA)、对氨基苯基(PAP)、对羟基苯基(PHP)、缩醛、肼、二硫化物以及酯，其中EDA为乙二胺部分，PEG为聚乙二醇，并且AA为氨基酸残基或氨基酸类似物，其中每个w为1至20的整数，每个n为1至30的整数，每个p为1至20的整数，并且每个m为1至12的整数；
V1、V2、V3、V4、V5和V6各自独立地选自由以下组成的组：共价键、-CO-、-NR15-、-NR15(CH2)q-、-NR15(C6H4)-、-CONR15-、-NR15CO-、-C(O)O-、-OC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NR15-、-NR15SO2-和-P(O)OH-，其中每个q为1至6的整数；
每个R13独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、芳基以及经取代的芳基；
每个R15独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、羧基、羧基酯、酰基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。
3.根据权利要求2所述的缀合物，其中：
T1选自(C1-C12)烷基和经取代的(C1-C12)烷基；
T2、T3、T4、T5和T6各自独立地选自共价键、(C1-C12)烷基、经取代的(C1-C12)烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基和经取代的杂环基、(EDA)w、(PEG)n、(AA)p、-(CR13OH)m-、4-氨基-哌啶(4AP)、MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP、PHP、缩醛基、肼以及酯；并且
V1、V2、V3、V4、V5和V6各自独立地选自由以下组成的组：共价键、-CO-、-NR15-、-NR15(CH2)q-、-NR15(C6H4)-、-CONR15-、-NR15CO-、-C(O)O-、-OC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NR15-、-NR15SO2-以及-P(O)OH-；
其中：
(PEG)n为其中n为1至30的整数；
EDA为具有以下结构的乙二胺部分：
其中y为1至6的整数，并且r为0或1；
4-氨基-哌啶(4AP)为并且
每个R12独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、聚乙二醇部分、芳基以及经取代的芳基，其中任意两个相邻R12基团能够环状连接以形成哌嗪基环。
4.根据权利要求2至3中任一项所述的缀合物，其中MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP以及PHP各自任选地被糖苷取代。
5.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述糖苷选自葡糖苷酸、半乳糖苷、葡萄糖苷、甘露糖苷、岩藻糖苷、O-GlcNAc以及O-GalNAc。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的缀合物，
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2为-CO-；
T3为(C1-C12)烷基，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
T4为(AA)p，并且V4不存在；并且
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CONH-；
T2为(PEG)n，并且V2为-CO-；
T3为(AA)p，并且V3不存在；
T4为PABC，并且V4不存在；并且
e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为氨基酸类似物，并且V2为-NH-；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；
T4为(AA)p，并且V4不存在；
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中所述接头L具有选自以下的结构：
其中表示式(I)中的L与N的连接，并且*表示L与W1的连接。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其中所述药物为单甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物选自由以下组成的组：
以及
10.根据权利要求1至9中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为IgG1抗体。
11.根据权利要求10所述的缀合物，其中所述抗体为IgG1κ抗体。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包括具有fGly'的序列，其中fGly'为通过所述接头与所述药物偶联的氨基酸残基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中所述序列定位于所述抗体的重链恒定区的C末端处。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中所述序列定位于所述抗体的轻链恒定区中。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中所述序列定位于所述抗体的重链CH1区中。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中所述序列定位于所述抗体的重链CH2区中。
17.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中所述序列定位于所述抗体的重链CH3区中。
18.一种式(III)的化合物：
其中
Z为CR4或N；
R2和R3各自独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基，或者R2和R3任选地环状连接以形成5元或6元杂环基；
每个R4独立地选自氢、卤素、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、经取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基；
L为接头；并且
W1为药物。
19.根据权利要求18所述的化合物，其中L包括：
-(T1-V1)a-(T2-V2)b-(T3-V3)c-(T4-V4)d-(T5-V5)e-(T6-V6)f-，
其中
a、b、c、d、e和f各自独立地为0或1，其中a、b、c、d、e和f的总和为1至6；
T1、T2、T3、T4、T5和T6各自独立地选自共价键、(C1-C12)烷基、经取代的(C1-C12)烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基和经取代的杂环基、(EDA)w、(PEG)n、(AA)p、-(CR13OH)m-、4-氨基-哌啶(4AP)、间氨基-苄氧基(MABO)、间氨基-苄氧基羰基(MABC)、对氨基-苄氧基(PABO)、对氨基-苄氧基羰基(PABC)、对氨基苄基(PAB)、对氨基-苄基氨基(PABA)、对氨基苯基(PAP)、对羟基苯基(PHP)、缩醛、肼、二硫化物以及酯，其中EDA为乙二胺部分，PEG为聚乙二醇，并且AA为氨基酸残基或氨基酸类似物，其中每个w为1至20的整数，每个n为1至30的整数，每个p为1至20的整数，并且每个m为1至12的整数；
V1、V2、V3、V4、V5和V6各自独立地选自由以下组成的组：共价键、-CO-、-NR15-、-NR15(CH2)q-、-NR15(C6H4)-、-CONR15-、-NR15CO-、-C(O)O-、-OC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NR15-、-NR15SO2-和-P(O)OH-，其中每个q为1至6的整数；
每个R13独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、芳基以及经取代的芳基；
每个R15独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、羧基、羧基酯、酰基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基以及经取代的杂环基。
20.根据权利要求19所述的化合物，其中：
T1选自(C1-C12)烷基和经取代的(C1-C12)烷基；
T2、T3、T4、T5和T6各自独立地选自共价键、(C1-C12)烷基、经取代的(C1-C12)烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基和经取代的杂环基、(EDA)w、(PEG)n、(AA)p、-(CR13OH)m-、4-氨基-哌啶(4AP)、MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP、PHP、缩醛基、肼以及酯；并且
V1、V2、V3、V4、V5和V6各自独立地选自由以下组成的组：共价键、-CO-、-NR15-、-NR15(CH2)q-、-NR15(C6H4)-、-CONR15-、-NR15CO-、-C(O)O-、-OC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NR15-、-NR15SO2-以及-P(O)OH-；
其中：
(PEG)n为其中n为1至30的整数；
EDA为具有以下结构的乙二胺部分：
其中y为1至6的整数，并且r为0或1；
4-氨基-哌啶(4AP)为并且
每个R12独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、聚乙二醇部分、芳基以及经取代的芳基，其中任意两个相邻R12基团能够环状连接以形成哌嗪基环。
21.根据权利要求19至20中任一项所述的化合物，其中MABO、MABC、PABO、PABC、PAB、PABA、PAP以及PHP各自任选地被糖苷取代。
22.根据权利要求21所述的化合物，其中所述糖苷选自葡糖苷酸、半乳糖苷、葡萄糖苷、甘露糖苷、岩藻糖苷、O-GlcNAc以及O-GalNAc。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的化合物，
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2为-CO-；
T3为(C1-C12)烷基，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
d、e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为4AP，并且V2不存在；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；并且
T4为AA，并且V4不存在；并且
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CONH-；
T2为(PEG)n，并且V2为-CO-；
T3为AA，并且V3不存在；
T4为PABC，并且V4不存在；并且
e和f各自为0；或者
其中：
T1为(C1-C12)烷基，并且V1为-CO-；
T2为氨基酸类似物，并且V2为-NH-；
T3为(PEG)n，并且V3为-CO-；
T4为AA，并且V4不存在；
T5为PABC，并且V5不存在；并且
f为0。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的化合物，其中所述接头L具有选自以下的结构：
其中表示式(I)中的L与N的连接，并且*表示L与W1的连接。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的化合物，其中所述药物为MMAE。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的组：
以及
27.一种药物组合物，其包括：
根据权利要求1至17中任一项所述的缀合物；以及
药学上可接受的赋形剂。
28.一种方法，其包括：
向受试者施用有效量的根据权利要求1至17中任一项所述的缀合物。
29.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述施用对治疗所述受试者的癌症是有效的。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、肺癌或胃癌。
31.一种向受试者体内的靶位点递送药物的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述施用对向所述受试者体内的所述靶位点递送治疗有效量的所述药物是有效的。
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