RO120848B1 - PROCEDEU DE PREPARARE A UNEI POLIPEPTIDE CU ACTIVITATE DE ANTICORP ANTI-IgE, MOLECULĂ DE ANTICORP, COMPOZIŢIE FARMACEUTICĂ ŞI UTILIZAREA ACESTEIA - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la un procedeu de preparare a unei polipeptide cu activitate de anticorp anti-Ig, care nu prezintă activitate de dezactivare prin izomerizarea resturilor aspartil şi care are afinitate pentru o moleculă ţintă, reprezentată de IgE, egală sau mai mare faţă de polipeptida modificată, la molecula de anticorp obţinută prin procedeu, la molecula de acid nucleic care codifică anticorpul, la o compoziţie farmaceutică administrată în tratamentul unei afecţiuni mediate de IgE, la un mamifer, şi la utilizarea unei molecule deanticorp pentru fabricarea unui medicament pentrureducerea sau prevenirea producţiei de histamină mediată de IgE, la un mamifer.

Description

Prezenta invenție se referă la un procedeu de preparare a unei polipeptide cu activitate de anticorp anti-lg, care nu prezintă activitate de dezactivare prin izomerizarea resturilor aspartil și care are afinitate pentru o moleculă țintă reprezentată de IgE, egală sau mai mare față de polipeptida modificată, la molecula de anticorp obținută prin procedeu, la molecula de acid nucleic care codifică anticorpul și la o compoziție farmaceutică cu acesta.

Este cunoscut faptul că imunoglobulinele de tip IgE fac parte din familia imunoglobulinelor care mediază răspunsurile alergice precum astmul, alergiile la alimente, hipersensibilitatea de tip I și inflamația sinusurilor cu agregare familială, afecțiuni larg răspândite.

Imunoglobulinele IgE sunt secretate de celulele B sau limfocitele B și sunt exprimate pe suprafața acestor celule. IgE se leagă la celulele B (precum și la monocite, eozinofile și plachete) prin intermediul regiunii Fc a imunoglobulinei, care se atașează la un receptor pentru IgE, cu afinitate joasă, cunoscut ca FcsRII. în urma expunerii unui mamifer la un alergen, celulele B care exprimă pe suprafața lor anticorpi IgE specifici pentru antigenul respectiv sunt activate și se transformă în celule plasmatice secretoare de IgE. IgE secretate, specifice pentru alergenul respectiv, sunt puse în circulație și ajung cu fluxul sanguin la celulele mastocitare din țesuturi și la bazofilele din sânge, legându-se de suprafața acestora prin intermediul receptorilor cu afinitate înaltă FceRI. Mastocitele și bazofilele devin astfel sensibilizate la alergenul respectiv. Expunerea ulterioară la același alergen determină o legare încrucișată la receptorii celulari FceRI ai bazofilelor și mastocitelor, în urma căreia se eliberează histamină, leucotriene și factori de activare a trombocitelor, factori chemotactici pentru eozinofile și neutrofile și citokinele IL-3, IL-4, IL-5 și GM-CSF, substanțe răspunzătoare de manifestările clinice ale hipersensibilității și anafilaxiei.

Hipersensibilitatea ca stare patologică se caracterizează prin apariția unui răspuns imun exagerat la un alergen sau la alergeni, însoțit de modificări tisulare semnificative dacă alergenul este prezent în cantități relativ mari sau dacă starea de imunitate celulară și tumorală a individului este la un nivel ridicat de activitate.

Modificările fiziologice întâlnite în hipersensibilitatea de tip anafilactic sunt bronhoconstricția intensă atât la nivelul bronhiilor, cât și la nivelul bronhiolelor, contracția mușchilor netezi și dilatația capilarelor. Predispoziția pentru hipersensibilitatea de tip anafilactic este determinată de interacțiunea între factorii genetici și factorii de mediu. Alergenii comuni din mediu, care induc hipersensibilitatea de tip anafilactic, se găsesc în polen, alimente, acarienii din praful de casă, în blana animalelor, sporii de ciuperci și veninul insectelor. Alergia atopică se asociază cu hipersensibilitatea de tip anafilactic și este reprezentată de afecțiuni precum astmul, rinita alergică și conjuctivita alergică (febra fânului), eczema, urticaria și alergiile alimentare. Cu toate acestea, șocul anafilactic, reacție anafilactică ce pune în pericol viața, este provocat de obicei de înțepături ale insectelor sau de medicație parenterală.

A fost studiată recent o strategie terapeutică pentru hipersensibilitatea de tip I sau hipersensibilitatea de tip anafilactic, care constă în blocarea legării IgE la receptorii cu afinitate înaltă (FceRI) de pe suprafața bazofilelor și mastocitelor, prevenindu-se astfel eliberarea de histamină și de alți factori anafilactici, care are loc în condiții patologice.

în WO 93/04173, publicat în 4 martie 1993, sunt descrise himere lgE/lgG1 umane, în care resturile IgE analoage sunt substituite cu resturi lgG1. în cererea complementară a solicitanților USSN 08/405.617, sunt descriși anticorpi anti-lgE umanizați, în care s-a utilizat un anticorp de tip murină sintetizat împotriva IgE umană (MaE11), care furnizează regiunile CDR ce se substituie în scheletul structural al imunoglobulinei lgG1 (rhu MaE25). Tehnica de umanizare este descrisă de Reichman L. și colab., (1988) în Nature 332: 323 și de Jones P.T. și colab. (1986) în Nature 32J: 522.

RO 120848 Β1

Deși s-au obținut prin umanizarea anticorpilor de tip murină, molecule anti-lgE cu1 afinitate pentru IgE similară cu cea a murinei MaE11, fără să prezinte însă și răspunsul imunogen determinat de aceasta (Shields și colab., (1995) Int. Arch. Allergy Immunol. 107:308-3

312), încă nu s-a obținut sinteza unor anticorpi anti-lgE cu afinitate pentru IgE care să fie în mod evident mai bună decât cea a MaE11 sau a anticorpilor anti-lgE, de tip murină.5

Anticorpii monoclonali recombinanți sunt supuși la reacții de degradare care afectează structura tuturor polipeptidelor sau a proteinelor, cum arfi izomerizarea acidului aspar- 7 tic și a resturilor de asparagină. Așa cum se observă în fig. 11A de mai jos, resturile de aspartat (I) din secvențele -Asp-Gly- pot fi izomerizate la izoaspartat (III) prin intermediul unui 9 intermediar de tip imidă ciclică (II). (Geiger & Clarke, J. Biol. Chem. 262: 785 - 794 (1989)) (1987)). Catena secundară de tip acid carboxilic a acidului aspartic (I) reacționează cu 11 atomul de azot de tip amidă al glicinei adiacente, formându-se un intermediar de tip acid aspartic ciclic (II), din care se formează apoi un rest de tip acid izoaspartic-glicină (III). 13 Echilibrul, viteza și dependența de pH ale acestei reacții au fost studiate la peptide model, separate prin cromatografie în lichid de performanță înaltă, cu fază inversă (Oliyai & 15

Borchardt, Pharm. Res. 10, 95 - 102 (1993)). De asemenea, se presupune că tendința la izomerizare depinde de flexibilitatea locală a porțiunii moleculei ce conține secvența -Asp- 17 Gly- (Geiger & Clarke, de mai sus).

Un exemplu de anticorpi cunoscuți, ce suferă izomerizarea acidului aspartic, sunt anticorpii anti-lgE, anticorpi potenți cunoscuți ca rhuMabE-25 (E-25). 25

Izomerizarea poate apare spontan, dar poate fi și indusă prin incubarea E-25 la 37’C, timp de 21 de zile. Rezultatul final constă în inserția unei grupări metil suplimentare în axul 27 polipeptidic al anticorpului, ceea ce poate determina modificări structurale și reducerea afinității de legare. în urma unui studiu al E-25 cu variante -c-Asp-Gly- și -izo-Asp-Gly- în poziția 29

VL 32-33, s-a observat că deși se poate reduce la minim riscul izomerizării prin substituția restului VL-32 cu alanină sau acid glutamic, această substituție în sine reduce de trei ori ca- 31 pacitatea de legare a anticorpilor, Cacia și colab., de mai sus.

Astfel, apare necesitatea sintezei unor polipeptide îmbunătățite, inclusiv anticorpi, 33 care să nu fie dezactivate prin izomerizarea grupărilor aspartil și care să aibă afinitate pentru moleculele țintă (de exemplu, antigen), egală sau mai mare decât afinitatea polipeptidelor 35 neîmbunătățite.

Prezenta invenție se referă la o metodă de ameliorare a unui polipeptid cu afinitate 37 pentru o anumită moleculă țintă, metoda constând într-o combinație de etape reprezentate de: (1) identificarea resturilor aspartil susceptibile la izomerizare; (2) substituția cu resturi 39 alternative și analiza mutanților rezultați, din punct de vedere al afinității pentru molecula țintă. într-o variantă preferată, metoda de substituție a resturilor constă în maturația afinității 41 cu ajutorul prezentării la nivelul fagilor (AMPD). Conform cu o altă variantă preferată, polipeptida este un anticorp, iar molecula țintă este un antigen. 43 în conformitate cu o altă variantă preferată, anticorpul este anti-lgE, iar molecula țintă este IgE. 45

O altă variantă preferată a invenției se referă la o metodă de ameliorare a afinității anticorpilor anti-lgE E-25, prin înlocuirea restului 32 Asp din VL CDR-L1 cu Glu, concomitent 47 cu modificarea resturilor 27 Gin, 28 Ser și 31 Tyr din VL CDR-L1 cu Lys, Pro și respectiv Gly.

RO 120848 Β1 în conformitate cu o variantă, de asemenea, preferată a invenției, anticorpii anti-lgE E-25 prezintă următoarele modificări suplimentare la nivelul VH CDR2:53 Thr cu Lys, 55 Asp cu Ser, 57 Ser cu Glu și 59 Asn cu Lys.

Conform unei alte variante, invenția se referă la anticorpi anti-lgE cu afinitate față de IgE îmbunătățită.

într-o variantă preferată, anticorpii anti-lgE cuprind resturi de lanțuri grele și ușoare, care conțin fragmentele notate cu e27 și e26 în fig. 2. în mod alternativ, anticorpii anti-lgE cuprind secvențele cu lungime completă ale lanțurilor grele și ușoare, notate cu E27șiE26 în fig.12.

Prezenta invenție se referă, de asemenea, la o compoziție farmaceutică ce conține anticorpi anti-lgE cu afinitate ameliorată sau fragmente funcționale ale acestora. Prezenta invenție se referă și la un produs de fabricație care conține un anticorp anti-lgE cu afinitate ameliorată.

Conform unei alte variante a prezentei invenții, se prezintă o metodă de reducere sau de inhibare a producției de histamină mediată de IgE.

Conform unei alte variante, invenția se referă, de asemenea, la o metodă de tratament al tulburărilor mediate de IgE, prin administrarea anticorpilor acestei invenții sau prin administrarea de fragmente funcționale ale acestora. Celelalte aspecte ale invenției reies din descrierea detaliată și din revendicările care urmează.

Referințele, cererile de brevet și brevetele menționate pe parcursul acestei cereri de brevet sunt incluse în textul descrierii, prin referință.

Termenii utilizați pe parcursul acestei descrieri au un sens obișnuit pentru specialiștii în domeniu. Cu toate acestea, solicitanții doresc ca termenii următori să fie definiți astfel:

Termenii de proteină și de polipeptidă se vor utiliza cu același sens. Se referă la un lanț de doi (2) sau mai mulți aminoacizi, care sunt legați împreună prin legături de tip peptid sau amidă, indiferent de modificările posttraducere (de exemplu, glicozilare sau fosforilare). Anticorpii sunt cuprinși în mod specific în această definiție.

Polipeptidele acestei invenții pot conține mai mult de o subunitate, fiecare subunitate fiind codificată de o secvență separată de ADN.

Expresia în mod considerabil identică referitoare la o secvență polipeptidică de anticorp semnifică faptul că anticorpul respectiv prezintă o identitate a secvenței de cel puțin 70, preferabil 80 sau chiar 90%, în cel mai bun caz 95%, cu secvența polipeptidică de referință. Atunci când se referă la o secvență de acizi nucleici, termenul reprezintă o secvență de nucleotide care are o identitate a secvenței de cel puțin 85, preferabil 90 sau chiar 95%, în cel mai bun caz de 97%, cu secvența de acizi nucleici de referință. Pentru polipeptide, lungimea secvențelor care se compune va fi în general de cel puțin 25 de aminoacizi. Pentru acizii nucleici, lungimea secvenței va fi în general de cel puțin 75 de nucleotide.

Termenul de identitate sau caracter omolog va fi înțeles ca procentul de resturi de aminoacizi din secvența comparată, care sunt identici cu resturile unei secvențe corespunzătoare, cu care aceasta se compară, în urma alinierii secvențelor și introducerii de spații, dacă este necesar, pentru obținerea identității procentuale maxime, pentru întreaga secvență, neluându-se în considerare nici o substituție conservatoare ca făcând parte din identitatea secvenței. Nici capetele N-sau C-terminal, nici inserțiile nu vor fi interpretate în sensul reducerii identității sau a caracterului omolog. Metodele și programele computerizate de aliniere sunt bine cunoscute în domeniu. Identitatea secvenței poate fi măsurată prin analiza computerizată a secvențelor (de exemplu, Sequence analysis Software Package Genetics Computer Group, Universitatea din cadrul Centrului de Biotehnologie din Wisconsin, 1710, University Ave., Madison, Wl 53705). Acest software potrivește secvențe similare, evaluând gradul de identitate al secvențelor ce prezintă diverse substituții, deleții și alte modificări.

RO 120848 Β1

Termenul anticorp se utilizează în sensul său cel mai larg și în mod specific se re- 1 feră la anticorpi monoclonali reprezentați de anticorpi monoclonali cu lungime completă), anticorpi policlonali, anticorpi multispecifici (de exemplu, anticorpi bispecifici) și fragmente 3 de anticorpi (de exemplu, F(ab')₂ și Fv) atât timp cât ei prezintă activitatea biologică dorită. Anticorpii (Ab) și imunoglobulinele (Ig) sunt glicoproteine cu aceleași caracteristici structu- 5 rale. în timp ce anticorpii prezintă specificitate de legare, imunoglobulinele cuprind atât anticorpi, cât și molecule de tip anticorp care nu au specificitate pentru antigen. Polipeptidele de 7 ultimul tip sunt, de exemplu, produse în cantități mici de sistemul limfatic și în cantități crescute în cazul mieloamelor. 9

Anticorpii și imunoglobulinele native sunt de obicei glicoproteine heterotetramere de aproximativ 150000 de daltoni, compuse din două lanțuri ușoare identice (L) și două lanțuri 11 grele, de asemenea, identice (H). Fiecare lanț ușor este legat de unul din lanțurile grele printr-o legătură covalentă disulfurică, numărul de legături disulfurice fiind variabil la lanțurile 13 grele ale diferitelor izotipuri de imunoglobuline. Fiecare lanț greu și ușor are de asemenea punți disulfurice intracatenare distanțate. Fiecare lanț greu are la unul din capete un domeniu 15 variabil (VH) urmat de un număr de domenii constante. Fiecare lanț ușor are un domeniu variabil la unul din capete (VL) și un domeniu constant la celălalt capăt. Domeniul constant 17 al lanțului ușor este aliniat cu primul domeniu constant al lanțului greu, iar domeniul variabil al lanțului ușor este aliniat cu domeniul variabil al lanțului greu. Se presupune că interfața 19 dintre domeniile variabile ale lanțului greu și ușor este alcătuită din anumite resturi de aminoacizi (Clothia și colab., J. Mol. Biol.186, 651-66,1985); Novotny și Haber, Proc. Natl. 21 Acad. Sci. USA 82, 45 92 -4596 (1985).

Un anticorp izolat reprezintă un anticorp identificat și separat și/sau recuperat dintr- 23 o componentă a mediului în care a fost produs. Componentele contaminante ale mediului său de producție sunt substanțele care pot interfera cu utilizarea diagnostică sau terapeutică 25 a anticorpilor, acestea putând fi enzime, hormoni și alte substanțe dizolvate, de natură proteică sau non-proteică. în conformitate cu variante preferate ale invenției, anticorpii se 27 purifică astfel încât să aibă o puritate măsurabilă prin cel puțin trei metode diferite; 1) mai mare de 95% în greutate, determinată prin metoda Lowry, preferabil, mai mare de 99% în 29 greutate; 2) într-un grad suficient pentru obținerea a cel puțin 15 resturi de aminoacizi dintr-o secvență internă sau N-terminală, utilizând un dispozitiv de secvențializare cu centrifugă; 31 sau 3) până la omogenitate prin SDS-PAGE în condiții reducătoare sau non-reducătoare, utilizând albastru Coomasie sau, preferabil, colorație argintie. Anticorpul izolat este repre- 33 zentat de anticorpul in situ din interiorul celulelor recombinante, deoarece în acest caz, cel puțin unul din componentele mediului natural al anticorpului nu este prezent. De obicei, 35 anticorpul izolat se va prepara utilizând cel puțin o etapă de purificare.

Un anticorp cu specificitate de specie, de exemplu, un anticorp anti-lgE umană 37 sintetizat de mamifere, este un anticorp care are o afinitate de legare la un antigen de la o primă specie de mamifere, mai mare decât față de un omolog al antigenului respectiv de la 39 o a doua specie de mamifere. în mod normal, anticorpul cu specificitate de specie se leagă specific la un antigen uman (adică are o valoare a afinității de legare (kd) nu mai mare de 41 aproximativ 1 x 10^,,7M, preferabil, nu mai mare de aproximativ 1 χ 10⁸ și, în mod deosebit, nu mai mare de aproximativ 1 x 10⁹M), dar are o afinitate de legare față de un omolog al 43 antigenului respectiv de la o altă specie de mamifere, cu excepția omului, care este de cel puțin 50 de ori mai slabă, sau de cel puțin 500 de ori mai slabă, sau de cel puțin 1000 de ori 45 mai slabă decât capacitatea sa de legare la antigenul uman. Anticorpii cu specificitate de specie pot fi reprezentați de oricare dintre diversele tipuri de anticorpi, conform definiției de 47 mai sus, dar este preferabil un anticorp uman sau umanizat.

RO 120848 Β1

Termenul de anticorp mutant se referă la o variantă de secvență de aminoacizi, a unui anticorp în care unul sau mai multe resturi de aminoacizi au fost modificate. Un astfel de mutant are în mod necesar o identitate sau o similaritate a secvenței mai mică de 100% față de secvența de aminoacizi care are o identitate sau similaritate a secvenței de cel puțin 75% cu secvența de aminoacizi a domeniului variabil al lanțului greu sau ușor, mai preferată fiind o identitate de cel puțin 80, de cel puțin 85, de cel puțin 90%, cea mai preferată valoare a identității fiind de cel puțin 95%. Deoarece metoda invenției se aplică în mod egal atât la polipeptide, cât și la anticorpi și la fragmente ale acestora, acești termeni sunt utilizați câteodată în mod convertibil.

Termenul variabil, în contextul domeniului variabil al anticorpilor, se referă la faptul că anumite porțiuni ale domeniilor variabile ale anticorpilor diferă în mod considerabil ca secvență și sunt utilizate la legarea și specificitatea fiecărui anticorp în parte, față de antigenul său corespunzător. Totuși, variabilitatea nu este distribuită uniform la nivelul domeniilor variabile ale anticorpilor.

Este concentrată în trei segmente, denumite regiuni determinante ale complementarității (CDR), cunoscute și ca regiuni hipervariabile atât în domeniile variabile ale lanțurilor ușoare, cât și în cele ale lanțurilor grele. Există cel puțin două tehnici de determinare a regiunilor CDR: (1) o abordare bazată pe variabilitatea secvenței la specii încrucișate (și anume Kabat și colab., Sequences ofProteins of Immunological Interest - Institutul Național al Sănătății Bethesda, MD 1987); și (2) o abordare bazată pe studii cristalografice ale complexelor antigen-anticorp (Chothia C. și colab. (1989), Nature 342: 877). în ceea ce privește anticorpul anti-lgE descris de solicitanți, au fost definite anumite regiuni CDR prin combinarea metodelor lui Kabat și colab. și ale lui Chothia și colab. Porțiunile mult mai conservate ale domeniilor variabile sunt numite schelet structural (FR). Domeniile variabile ale lanțurilor ușoare și grele native conțin fiecare câte patru regiuni FR, adoptând în mare o configurație p plană, în unele cazuri făcând chiar parte din aceasta. Regiunile CDR din fiecare lanț sunt unite prin regiunile FR și împreună cu regiunile CDR de la celălalt lanț, participă la formarea situsului de legare a antigenului din structura anticorpilor (vezi Kabat și colab.). Domeniile constante nu sunt implicate în mod direct în legarea anticorpului la antigen, dar prezintă diverse funcții efectoare precum participarea anticorpului la citotoxicitatea dependentă de anticorpi.

Termenul fragment de anticorp se referă la o parte din anticorpul cu lungime completă, aceasta fiind în general regiunea variabilă sau situsul de legare a antigenului. Exemple de fragmente de anticorpi sunt reprezentate de fragmentele Fab, Fab', F(ab')₂ și Fv. Prin digestia cu papaină a anticorpilor se obțin două fragmente identice, care leagă antigenul, denumite fragmente Fab, având fiecare câte un singur situs de legare a antigenului și un fragment rezidual Fc, denumit astfel datorită capacității sale de a cristaliza rapid. Prin tratare cu pepsină se obține un fragment F(ab')₂ care are două fragmente ce leagă antigenul, capabile de legare încrucișată a antigenului, și un alt fragment rezidual (denumit pFc'). Alte fragmente sunt reprezentate de diacorpi, anticorpi liniari, molecule de anticorpi cu lanț unic și anticorpi multispecifici formați din fragmente de anticorpi. Așa cum este utilizat în prezenta invenție, termenul de fragment funcțional, referitor la anticorpi, cuprinde fragmentele Fv, F(ab) și F(ab')₂.

Un fragment Fv este fragmentul minim de anticorp, care conține un situs complet de recunoaștere și legare a antigenului. Această regiune este formată dintr-un dimer alcătuit dintr-un domeniu variabil al lanțului greu și unul al lanțului ușor, strâns legate printr-o legătură necovalentă (dimer V_H - V_L). în această configurație, cele trei regiuni CDR ale fiecărui domeniu variabil interacționează, formând situsul de legare a antigenului la suprafața dimerului V_H- V_L. în mod colectiv, cele șase regiuni CDR conferă specificitate anticorpului pentru un

RO 120848 Β1 anumit antigen. Cu toate acestea, chiar și un singur domeniu variabil (sau jumătate dintr-un 1 fragment Fv ce conține doar trei regiuni CDR specifice pentru antigen) este capabil să recunoască și să lege antigenul, cu o afinitate mai mică însă decât cea a întregului situs de 3 legare.

Fragmentul Fab [denumit și F(ab)j conține și domeniul constant al lanțului ușor și 5 primul domeniu constant (CH1) al lanțului greu. Fragmentele Fab' diferă de fragmentele Fab prin adiția a câtorva resturi la capătul carboxi terminal al domeniului CH1 al lanțului greu, re- 7 prezentate de una sau mai multe resturi de cisteină de la regiunea balama a anticorpului.

Fab'-3H reprezintă fragmentul Fab' în care restul (resturile) de cisteină ale domeniilor 9 constante au o grupare tiol liberă. Fragmentele F(ab') sunt produse prin scindarea legăturii disulfurice de la nivelul resturilor de cisteină din regiunea balama ale produsului de digestie 11 cu pepsină F(ab')₂. Specialiștii în domeniu cunosc și alte reacții chimice de cuplare a fragmentelor de anticorpi. 13

Lanțurile ușoare ale anticorpilor (imunoglobulinelor) de la orice specie de vertebrate pot fi încadrate într-unul din cele două tipuri distincte, denumite kappa (k) și lambda (A), în 15 funcție de secvențele de aminoacizi ale domeniului lor constant.

în funcție de secvențele de aminoacizi ale domeniului constant al lanțurilor grele, 17 imunoglobulinele pot fi încadrate în clase diferite. Există cel puțin cinci (5) clase principale de imunoglobuline: IgA, IgD, IgE, IgG și IgM și câteva dintre acestea pot fi la rândul lor 19 împărțite în subclase (izotipuri), de exemplu, lgG-1, lgG-2, lgG-3 și lgG-4; lgA-1 și lgA-2. Domeniile constante ale lanțurilor grele, care corespund diverselor clase de imunoglobuline, 21 sunt numite a, 5, e,Y și respectiv u. Structura subunităților și configurația tridimensională a diverselor clase de imunoglobuline sunt bine cunoscute. Imunoglobulinele preferate pentru 23 a fi utilizate conform prezentei invenții sunt imunoglobulinele E.

Termenul anticorp monoclonal, așa cum este utilizat în această descriere, se referă 25 la un anticorp obținut dintr-o populație de anticorpi, în mod considerabil omogenă, și anume anticorpii individuali care alcătuiesc populația respectivă sunt identici, cu excepția unor 27 anticorpi cu mutații posibile, care apar în mod natural și care pot fi prezenți în cantități mici. Anticorpii monoclonali sunt foarte specifici, fiind orientați către un singur situs antigenic. Mai 29 mult, spre deosebire de preparatele convenționale de anticorpi (policlonale), care cuprind în mod caracteristic anticorpi diferiți sintetizați împotriva unor determinanți (epitopi) diferiți, 31 fiecare anticorp monoclonal este orientat împotriva unui singur determinant de la nivelul antigenului. în plus față de specificitatea lor, anticorpii monoclonali sunt avantajoși prin faptul 33 că sunt sintetizați în culturi de celule hibridoma, necontaminate cu alte imunoglobuline. Termenul monoclonal arată calitatea anticorpului de a fi obținut dintr-o populație de anti- 35 corpi în mod considerabil omogenă și nu trebuie interpretat ca necesitând o anumită metodă pentru producția de anticorpi. De exemplu, anticorpii monoclonali care se utilizează conform 37 invenției, pot fi sintetizați prin metoda hibridomului, descrisă pentru prima dată de Kohler și Milstein, Nature 256,495 (1975), sau se pot obține prin metode de recombinare, de exemplu, 39 așa cum se descrie în brevetul US 4816567. Anticorpii monoclonali destinați utilizării conform prezentei invenții pot fi de asemenea izolați din colecții de anticorpi fagici, utilizând tehnicile 41 descrise în Clackson și colab., Nature 352,: 624 - 628 (1991), precum și în Marks și colab., J. Mol. Biol. 222: 581 - 597)1991). 43

Anticorpii monoclonali menționați în prezenta invenție sunt reprezentați în mod specific de anticorpi himerici (imunoglobuline himerice) în care o porțiune a lanțului greu 45 și/sau ușor este identică sau omoloagă față de secvențele corespunzătoare de la anticorpi derivați de la o anumită specie sau aparținând unei anumite clase sau subclase de anticorpi, 47 în timp ce restul lanțului (lanțurilor) este identic cu secvențele omoloage sau corespunzătoare de la anticorpi ce provin de la o altă specie sau care aparțin unei alte clase sau 49

RO 120848 Β1 subclase de anticorpi, precum și fragmente de astfel de anticorpi, atât timp cât acestea prezintă activitatea biologică dorită (US 4816567); Morrison și colab. Proc. Natl. Acad. Sci. 81,6851-6855(1984).

Formele umanizate de anticorpi care nu sunt umani (de exemplu, murina), sunt imunoglobuline himere, lanțuri de imunoglobuline sau fragmente ale acestora (precum Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ sau alte secvențe de anticorpi care au capacitate de legare a antigenului) care conțin o secvență minimă derivată de la o imunoglobulină ce nu este de proveniență umană. în majoritatea cazurilor, anticorpii umanizați sunt imunoglobuline umane cu rol de anticorp gazdă, la care resturile de aminoacizi de la o regiune determinantă a complementarității (CDR) anticorpului gazdă sunt înlocuite cu resturi de la regiunea CDR a unei specii non-umane (anticorp donor) precum șoarece, șobolan sau iepure, care are specificitatea, afinitatea și capacitatea dorită. în câteva cazuri, resturile de aminoacizi ale scheletului structural Fv de la imunoglobulină umană sunt înlocuite cu resturi de aminoacizi corespunzătoare, de proveniență non-umană. Mai mult, anticorpii umanizați pot conține resturi care nu se găsesc nici în anticorpul gazdă nici în secvențele de import al regiunilor CDR sau ale scheletului structural. Aceste modificări se fac în scopul perfecționării funcției anticorpilor. în general, anticorpii umanizați vor conține în esență cel puțin unul și în mod caracteristic două domenii variabile, în care toate sau în mare parte toate regiunile CDR corespund celor unei imunoglobuline non-umane și toate sau majoritatea regiunilor FR sunt cele ale unei secvențe consens a unei imunoglobuline umane. Anticorpul umanizat va conține de asemenea, în mod optim, cel puțin a porțiune a regiunii constante a unei imunoglobuline (F_c), în mod caracteristic o porțiune a regiunii constante a unei imunoglobuline umane. Pentru mai multe detalii, a se vedea: Jones și colab., Nature 321,522 - 525 (1986); Reichmann și colab., Nature 332, 323 - 329 (1988) și Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593 - 596 (1992).

Fragmentele de anticorp Fv cu lanț unic sau sFv se referă la domeniile VH și VL ale unui anticorp, atunci când acestea sunt prezente într-un singur lanț polipeptidic. în general, polipeptidei Fv îi mai conține și un linker polipeptidic între domeniile VH și VL, cu ajutorul căruia fragmentul sFv formează structura dorită, destinată legării antigenului. Pentru trecerea în revistă a fragmentelor sFv, a se vedea Pluckthun în The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, voi. 113, Rosenburg și More, ediția Springer-Verlag, New York, pg. 269-315(1994).

Termenul de diacorpi se referă la mici fragmente de anticorpi cu două situsuri de legare a antigenului, aceste fragmente fiind alcătuite dintr-un domeniu variabil al lanțului greu (VH) conectat la un domeniu variabil al unui lanț ușor (VL). Utilizând un linker care este prea scurt ca să permită împerecherea celor două domenii la nivelul aceluiași lanț, acestea sunt forțate să se împerecheze cu domeniile complementare de la nivelul altui lanț, creând astfel două situsuri de legare pentru antigen. Anticorpii sunt descriși mai amănunțit, de exemplu, în brevetul european EP 404097, WO 93/11161 și de Hollinger și colab. în Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 - 6448 (1993).

Expresia fragment sau analog funcțional al unui anticorp reprezintă un compus cu activitate biologică comună cu cea a unui anticorp cu lungime completă. De exemplu, un fragment sau analog funcțional al unui anticorp anti-lgE este un compus capabil să se lege la o imunoglobulină IgE, astfel încât să prevină sau să reducă în mod considerabil capacitatea acestei molecule de a se lega la receptorii cu afinitate înaltă FceRI.

Termenul de aminoacid și aminoacizi se referă la L-a-aminoacizii existenți sub această formă în mod natural. Aminoacizii sunt identificați conform descrierii ulterioare, la paragraful A. Prepararea anticorpilor: (iv) Obținerea de anticorpi mutanți. Termenul de variantă de aminoacid se referă la molecule ce prezintă câteva diferențe în secvențele lor de aminoacizi comparativ cu secvența nativă de aminoacizi.

RO 120848 Β1

Variantele de substituție sunt acelea care prezintă înlocuirea a cel puțin unui rest 1 de aminoacid dintr-o secvență nativă cu un alt aminoacid inserat în aceeași poziție. Substituțiile pot fi unice, atunci când se substituie doar un singur aminoacid în moleculă, sau pot 3 fi multiple atunci când se substituie doi sau mai mulți aminoacizi în aceeași moleculă. Variantele de inserție sunt acelea în care se inserează unul sau mai mulți aminoacizi în po- 5 ziția imediat adiacentă unui aminoacid aflat într-o anumită poziție în secvența nativă. Inserția în poziția imediat adiacentă unui aminoacid înseamnă legarea noului aminoacid fie la 7 gruparea funcțională α-carboxil, fie la gruparea funcțională α-amino a aminoacidului din secvența nativă. Variante de deleție sunt acelea în care se înlătură unul sau mai mulți 9 aminoacizi din secvența nativă de aminoacizi. De obicei, în variantele de deleție se înlătură unul sau doi aminoacizi dintr-o anumită regiune a moleculei. 11

Termenii de celulă, linie celulară sau cultură celulară se utilizează în mod convertibil și toți includ în sensul lor și descendenți. Se înțelege, de asemenea, că descendenții13 pot să nu aibă toți un conținut absolut identic de ADN, datorită mutațiilor deliberate sau întâmplătoare. Sunt luați în considerare descendenții mutanți care au aceeași funcție sau 15 aceleași proprietăți biologice ca și celulele inițiale transformate.

Celule gazdă utilizate în prezenta invenție sunt în general celule procariote sau eu-17 cariote. Exemple de celule gazdă adecvate sunt descrise în paragraful B. Vectori, celule gazdă și metode de recombinare: (vii) Selecția și transformarea celulelor gazdă.19

Transformarea constă în introducerea de ADN într-un organism, astfel încât ADN-ul să aibă capacitate de replicare, fie ca element extracromozomial, fie integrat în cromozomi. 21

Transfecția se referă la absorbția unui vector de expresie într-o celulă gazdă în care secvențele codante respective sunt sau nu, oricum exprimate.23

Termenii de celulă gazdă transfectată și transformată se referă la introducerea de ADN în celulă. Celula este denumită celulă gazdă și poate fi procariotă sau eucariotă. 25 Celule gazdă tipice de proveniență procariotă sunt diverse tulpini de E. coli. Celule gazdă tipice de proveniență eucariotă sunt reprezentate de celule de mamifer precum celulele 27 ovariene de hamster chinezesc sau celule de origine umană. Secvența ADN introdusă poate proveni de la aceeași specie cu cea care furnizează celulele gazdă, poate proveni de la o 29 specie diferită sau poate fi o secvență de ADN hibrid ce conține ADN omolog și ADN străin.

Termenii vector de expresie replicabil și vector de expresie se referă la un frag- 31 ment de ADN, de obicei dublu catenar, care poate conține un fragment de ADN străin inserat în structura sa. ADN-ul străin este definit ca ADN heterolog, care este un ADN ce nu se 33 găsește în mod natural în celula gazdă. Vectorul este utilizat pentru transportul ADN-ului străin sau heterolog într-o celulă gazdă adecvată. Odată ce a fost introdus în celula gazdă, 35 vectorul se poate replica în mod independent de ADN-ul cromozomial al gazdei și pot rezulta câteva copii ale vectorului și ale ADN-ului (străin) inserat prin intermediul acestuia. 37

Termenul vector semnifică o structură ADN ce conține o secvență ADN care este legată în mod funcțional de o secvență adecvată de control, capabilă să realizeze expresia 39 ADN-ului într-o gazdă adecvată.

Astfel de secvențe de control pot include un promotor pentru efectuarea transcrierii, 41 o secvență operatoare opțională pentru controlul transcrierii respective, o secvență ce codifică locurile adecvate de legare a ARN_m de la nivelul ribozomului, și secvențe care 43 controlează terminarea transcrierii și traducerii. Vectorul poate fi o plasmidă, o particulă fagică sau un simplu fragment de inserție potențial genomic. După ce a fost transformat într- 45 o gazdă adecvată, vectorul se poate replica și poate funcționa în mod independent de genomul gazdei sau poate în unele cazuri să se integreze în genomul respectiv. în această 47 descriere, plasmidă ” și vectorul pot fi utilizate uneori cu același sens, deoarece plasmidă este cel mai comun tip de vector utilizat în prezent. Totuși, invenția cuprinde în descrierea 49

RO 120848 Β1 sa și alte forme de vectori care au funcție echivalentă și care sunt sau devin cunoscuți în domeniu. Vectori de expresie caracteristici pentru expresia în culturile de celule de mamifere sunt de exemplu vectori pe bază de pRK5 (EP 307247), pSV16B (WO 91/08291) și pVL 1392 (Pharmigen).

Un lipozom este o mică veziculă compusă din diverse tipuri de lipide, fosfolipide și/sau surfactant, care este utilă pentru eliberarea unui medicament (precum anticorpii mutanți descriși în prezenta și, în mod opțional, un agent chimioterapeutic) la un mamifer. Componentele lipozomului sunt de obicei așezate în dublu strat, în mod similar cu lipidele din structura membranelor biologice.

Expresia secvențe de control se referă la secvențe de ADN necesare pentru expresia unei secvențe codante legată în mod funcțional, din organismul unei anumite gazde. Secvențele de control adecvate pentru procariote sunt, de exemplu, reprezentate de un promotor, în mod opțional, o secvență operatoare și un sediu de legare ribozomal. Celulele eucariote sunt cunoscute ca celule care utilizează promotori, semnale de poliadenilare și enhanceri.

O moleculă izolată de acid nucleic este o moleculă care este identificată și separată de cel puțin o moleculă de acid nucleic contaminantă, cu care se asociază de obicei în sursa naturală de acid nucleic al anticorpului. O moleculă izolată de acid nucleic este o moleculă ce se găsește sub altă formă sau în altă stare decât cea naturală. Prin urmare, moleculele izolate de acid nucleic se deosebesc de moleculele de acid nucleic existente în celulele naturale. Cu toate acestea, o moleculă izolată de acid nucleic este și molecula de acid nucleic conținută în celulele care exprimă de obicei anticorpul, având însă, de exemplu, o localizare cromozomială diferită față de cea din celulele naturale.

Acidul nucleic este legat în mod funcțional atunci când se găsește în relație funcțională cu o altă secvență de acid nucleic. Aceasta poate fi o secvență (secvențe) genică sau de reglare, conectată astfel încât să permită expresia genei atunci când se leagă la secvența (secvențele) de reglare, molecule adecvate (de exemplu, proteine de activare a transcrierii). De exemplu, ADN-ul ce codifică o presecvență sau o secvență de stimulare a secreției este legat în mod funcțional la ADN-ul ce codifică un polipeptid, dacă este exprimat ca preproteină ce participă la secreția polipeptidului; un promotor sau un agent de creștere este legat în mod funcțional la o secvență codantă, dacă afectează transcrierea secvenței respective; sau un sediu ribozomal de legare este legat în mod funcțional la o secvență codantă dacă afectează transcrierea secvenței respective; sau un sediu ribozomal de legare este legat în mod funcțional la o secvență codantă dacă este poziționat astfel încât să faciliteze traducerea, în general, legat în mod funcțional înseamnă că secvențele ADN care sunt legate, sunt învecinate, iar în cazul unei secvențe de stimulare a secreției sunt învecinate și în fază de lectură. Cu toate acestea, agenții de creștere nu trebuie să fie neapărat învecinați. Legarea se realizează la nivelul unor sedii convenabile de restricție. Dacă astfel de sedii de restricție nu există, se utilizează conform practicii convenționale, adaptori sau linkeri oligonucleotidici sintetici.

Tratamentul se referă atât la măsurile terapeutice, cât și la cele profilactice și preventive. Cei ce au nevoie de tratament sunt atât cei la care boala se manifestă, cât și cei la care se intenționează prevenirea bolii.

O boală este orice afecțiune care poate beneficia de pe urma tratamentului cu polipeptidă. Aceasta poate fi reprezentată de boli sau afecțiuni cronice sau acute, incluzând și acele stări patologice care predispun mamiferul la boala considerată.

RO 120848 Β1

Termenul de agent imunosupresor, așa cum se utilizează în prezenta, ca agent 1 terapeutic auxiliar, se referă la substanțe care deprimă sau maschează sistemul imun al gazdei la care s-a realizat transplantul unei grefe. Aceste substanțe sunt reprezentate de 3 substanțe care inhibă producția de citokine, substanțe care inhibă sau realizează supresia exprimării antigenelor proprii sau maschează antigenele CMH (complexului major de histo-5 compatibilitate). Exemple de astfel de agenți sunt pirimidinele 2-amino-5-aril-5-substituite (vezi brevetul US 4665077), azatioprina (sau ciclofosfamida în caz de reacție adversă la aza-7 tioprina); bromocriptina; glutaraldehida (care maschează antigenele CMH conform descrierii brevetului US 4120649); anticorpii antiidiotipici pentru antigenele CMH și fragmentele CNH;9 ciclosporină A; steroizii precum glucocorticosteroizii, de exemplu, prednison, metilprednison și dexametazonă; antagoniști ai citokinelor sau ai receptorilor pentru citokine reprezentați de 11 antiinterferon-γ, anticorpi p sau a; anticorpi antifactor de necroză tumorală oc; anticorpi antifactor de necroză tumorală β; anticorpi antiinterleukină 2 și anticorpi antireceptori pentru 13 IL-2; anticorpi anti-L3T4; globulină heteroloagă antilimfocitară; anticorpi pan-T, preferabil anti-CD3 sau anti-CD4/CD4a; peptid solubil ce conține un domeniu de legare LFA-3 15 (WO 90/08187, publicat în 26 iulie 1990); streptokinază; TGF-β; streptodornază; ARN sau ADN de la gazdă; FK506; RS-61443; dezoxispergualină; rapamicină; receptori pentru 17 celulele T (US 5114721); fragmente de receptori pentru celulele T (Offner și colab., Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; și WO 91/01133); și anticorpi antireceptori ai celulelor 19 T (EP 340109) precum T10B9. Acești agenți se administrează concomitent sau separat față de anticorpul CD11a și se utilizează în doze similare sau mai mici față de cele stabilite în 21 domeniu. Alegerea agentului imunosupresor auxiliar preferat depinde de mai mulți factori precum felul bolii care se tratează, tipul transplantului care se efectuează, precum și istoricul 23 pacientului, preferându-se în general un agent selectat dintre ciclosporină A, un glucocorticoid (preferabil, prednison sau metilprednisolon), anticorpi monoclonali OKT-3, aza- 25 tioprină, bromocriptină, globulină heterologă antilimfocitară sau un amestec al acestora.

Termenul cancer sau canceros se referă la, sau descrie starea fiziologică a mami- 27 ferelor, caracterizată prin creștere celulară neregulată. Exemple de cancer sunt printre altele, cancerul cu celule scuamoase, cancerul pulmonar cu celule mici, cancerul pulmonar cu 29 celule de alt tip decât cel cu celule mici, cancerul gastrointestinal, cancerul pancreatic, glioblastomul, cancerul de col uterin, cancerul ovarian, cancerul hepatic, cancerul de vezică 31 urinară, hepatomul, cancerul de sân, cancerul de colon, cancerul colorectal, carcinonul endometrial, carcinomul glandei salivare, cancerul renal, cancerul rinichiului, cancerul de prostată, 33 cancerul vulvar, cancerul de tiroidă, carcinomul hepatic și diverse tipuri de cancer ale capului și gâtului. 35

Mamiferele care sunt tratate astfel, pot fi orice animale clasificate ca mamifere, incluzând omul, animalele domestice și de fermă, primatele și animalele destinate sportului 37 sau animalele de casă precum câinii, caii, pisicile, vacile etc.

Termenul semnalat unui determinant antigenic, așa cum se folosește în prezenta, 39 se referă la o polipeptidă semnal al epitopului. Polipeptida semnal are destule resturi de aminoacizi pentru a furniza un epitop împotriva căruia să fie sintetizat un anticorp și este în 41 același timp destul de scurt pentru a nu interfera cu activitatea polipeptidei.

Semnalul epitopului este în mod preferabil unic, astfel încât anticorpul sintetizat îm- 43 potriva sa să nu reacționeze încrucișat cu alți epitopi. O polipeptidă semnal adecvată are în mod preferabil cel puțin 6 resturi de aminoacizi în structura sa, de obicei, având între aproxi- 45 mativ 8 și 50 de resturi de aminoacizi (preferabil, între aproximativ 9 și 30 de resturi). Exemple de astfel de polipeptide sunt polipeptida semnal fiu HA și anticorpul său 12CA5 47 (Field și colab., Mod. Cell. Biol. 8: 2159 - 2165 (1988)); semnalul c-mycși anticorpii săi 8F9,

RO 120848 Β1

3CF, GE10, G4, B7 și 9E10 (Evan și colab., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)); și determinantul glicoproteinei D(gD) a virusului herpes simplex și anticorpul său (Paborsky și colab., Protein Engineering 3(6); 547 - 553(1990). în câteva variante ale invenției, semnalul epitopului este un epitop de legare la receptorii de salvare”.

Așa cum se utilizează în prezenta, termenul epitop de legare la receptorii de salvare se referă la un epitop al regiunii Fc a unei molecule IgG (de exemplu, lgG1, lgG2, lgG3 sau lgG4), care este responsabil de creșterea duratei medii de viață a moleculei IgG în ser in vivo.

Termenul agent citotoxic se referă conform descrierii la o substanță care inhibă sau previne funcția celulelor și/sau determină distrugerea celulelor. Semnificația acestui termen cuprinde izotopi radioactivi (de exemplu, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ și Re¹⁸⁶), agenți chimioterapeutici și toxine precum toxine cu activitate enzimatică, de origine bacteriană, fungică, vegetală sau animală, sau fragmente ale acestora.

Un agent chimioterapeutic este un compus chimic util în tratamentul cancerului. Exemple de agenți chimioterapeutici sunt Adriamicină, Doxorubicină, 5-Fluorouracil, Citozină, arabinozid (Ara-C), Ciclofosfamidă, tiotepa, Taxoter (docetaxel), Bulsulfan, Citoxin, Taxol, Metotrexat, Cisplatiniu, Melfalan, Vinblastină, Bleomicină, Etopozid, Ifosfamidă, Mitomicină C, Mitoxantronă, Vincristină, Vinorelbină, Carboplatiniu, Tenipozid, Daunomicină, Carminomicină, Aminopterină, Dactinomicină, Mitomicină, Esperamicine (vezi US 4675187), Melfalan și alte muștaruri cu azot înrudite.

Termenul de promedicament conform acestei descrieri se referă la un precursor sau la un derivat al unei substanțe active din punct de vedere farmaceutic, care are un efect mai puțin citotoxic asupra celulelor tumorale, comparativ cu medicamentul de origine, și care poate fi activat sau convertit enzimatic la forma de origine mult mai activă. Vezi, de exemplu, Wilman, Prodrugs in Cancer Chemotherapy, Biochemical SocietyTransactions, 14 pg. 375 - 382, 615 Meeting, Belfast (1986) și Stella și colab. (Ed), Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchard și colab, (ed.), pg.247 - 267, Human Press (1985). Promedicamentele acestei invenții sunt reprezentate printre altele, de promedicamente ce conțin fosfat, promedicamente ce conțin tiofosfat, promedicamente ce conțin sulfat, promedicamente ce conțin peptide, promedicamente D-aminoacid modificate, promedicamente glicozilate, promedicamente ce conțin β-lactam, promedicamente ce conțin fenoxiacetamidă în mod opțional substituită, promedicamente ce conțin fenilacetamidă în mod opțional substituită, promedicamente de tip 5-fluorcitozină sau 5-fluoruridină care pot fi convertite la medicamentul liber mult mai citotoxic. Exemple de medicamente citotoxice ce pot proveni din forme promedicamentoase și care pot fi utilizate conform acestei invenții sunt reprezentate printre altele de acei agenți chimioterapeutici descriși mai sus.

Cuvântul marcat, așa cum se utilizează în prezenta, se referă la un compus sau la o compoziție detectabilă, conjugat(ă) direct sau indirect cu anticorpul. Markerul însuși poate fi detectabil (de exemplu, radioizotopii sau markerii fluorescenți) sau în cazul unui marker enzimatic, acesta poate cataliza degradarea chimică a unui compus sau a unei compoziții cu rol de substrat, acesta fiind detectabil.

Așa cum se utilizează în prezenta, faza solidă semnifică o matrice non-apoasă la care anticorpul prezentei invenții poate adera. Exemple de faze solide, cuprinse în această definiție, sunt cele formate parțial sau complet din sticlă (de exemplu, sticlă cu dimensiune controlată a porilor), polizaharide (de exemplu, agaroză), poliacrilamide, polistiren, alcool polivinilic și siliconi. în câteva variante, în funcție de context, faza solidă poate fi reprezentată de cavitatea unei plăci de analiză; în altele, poate fi o coloană de purificare (de exemplu, o coloană cromatografică de afinitate). Acest termen include de asemenea și faza solidă discontinuă de particule discrete, conform celor descrise în brevetul US 4275149.

RO 120848 Β1

Așa cum se utilizează în prezenta, anticorpul anti-lgE umană este un anticorp care 1 se leagă la IgE umană, astfel încât inhibă sau reduce în mod considerabil capacitatea de legare a IgE la receptorii cu afinitate înaltă, FceRI. Preferabil, acest anticorp anti IgE este 3 E-25.

Așa cum se utilizează în prezenta, prin termenul afecțiune mediată de IgE se în- 5 țelege o tulburare sau o boală caracterizată prin supraproducția de și/sau hipersensibilitatea la imunoglobulina IgE. în mod specific, se poate interpreta ca fiind o afecțiune reprezentată 7 de stările asociate cu hipersensibilitate anafilactică și alergii atopice, cum arfi, de exemplu: astmul, rinita alergică și conjunctivita alergică (febra fânului), eczema, urticaria și alergiile aii- 9 mentare. Totuși, acest termen cuprinde în sensul lui și starea fiziologică gravă, reprezentată de șocul anafilactic, cauzat de obicei de înțepătura de albine, de mușcătura de șarpe sau de 11 medicația parenterală.

Așa cum se utilizează în prezenta, maturația afinității prin intermediul prezentării la 13 nivelul fagilor (AMPD) se referă la un procedeu descris de Lowman și colab. în Biochimia 30(45): 10832 - 10838(1991), a se vedea de asemenea și Hawkins și colab., J. Mol. Biol. 15

254: 889 - 896 (1992). Nefiind strict limitat la următoarea descriere, acest procedeu poate fi prezentat pe scurt, astfel: câteva situsuri ale regiunii hipervariabile (de exemplu, 6-7 17 situsuri) suferă mutații pentru a se realiza toate substituțiile de aminoacizi posibile la nivelul fiecărui situs. Anticorpii mutanți, astfel obținuți, sunt prezentați sub formă monovalentă de 19 particule fagice sub formă de filamente, ca produși de fuziune cu produsul genei III din M13, împachetați în fiecare particulă. Expresia la nivelul fagilor, a diverșilor mutanți, poate fi repe- 21 tată periodic, în cadrul unor cicluri de selecție a capacității de legare, urmată de izolarea și secvențializarea acelor mutanți care prezintă afinitate înaltă. Metoda este, de asemenea, 23 descrisă în WO 92/09690, publicată în 11 iunie 1992. Un procedeu modificat, care utilizează prezentarea comună a afinității, este descris de Cunningham, B.C. și colab., EMBO J. 25 13(11), 2508-2515(1994).

Metoda furnizează un procedeu de selecție a unor polipeptide noi, cu capacitate de 27 legare, acest procedeu constând în: a) sinteza unui vector de expresie replicabil, care să conțină o primă genă ce codifică o polipeptidă, o a doua genă ce codifică cel puțin o porțiune 29 a unei proteine de înveliș a unui fag natural sau de tip sălbatic, prima și a doua genă fiind heteroloage, și un element de reglare a transcrierii, legat în mod funcțional de prima și a 31 doua genă, formând astfel o fuziune genică ce codifică o proteină de fuziune: b) mutația vectorului la nivelul uneia sau a mai multor poziții din cadrul primei gene, formându-se astfel 33 o familie de plasmide înrudite; c) transformarea celulelor gazdă adecvate cu plasmidele respective; d) infectarea celulelor gazdă transformate cu un fag helper care are o genă ce 35 codifică proteina de înveliș a fagului; e) cultivarea celulelor gazdă transformate și infectate în condiții adecvate pentru formarea de particule de fagemid recombinant, care conțin cel 37 puțin o porțiune a plasmidului și sunt capabile de a transforma celula gazdă, condițiile fiind adaptate, astfel încât particulele de fagemid care prezintă pe suprafața lor mai mult de o 39 copie a proteinei de fuziune, să se găsească într-o cantitate nesemnificativă; f) punerea în contact a particulelor de fagemid cu o moleculă țintă, astfel încât cel puțin o porțiune a 41 particulelor de fagemid să se lege la molecula țintă; și g) separarea particulelor de fagemid care au capacitate de legare, de cele care nu au. în mod preferabil, metoda mai conține și 43 o etapă de transformare a celulelor gazdă adecvate, cu particule de fagemid recombinante care se leagă la molecula țintă, repetându-se etapele de la d) la g) încă o dată sau de mai 45 multe ori.

în mod alternativ, metoda se referă la polipeptide alcătuite din mai multe subunități, 47 în care vectorul replicabil de expresie, care conține un element de reglare a transcrierii legat în mod funcțional la ADN-ul ce codifică subunitatea de interes, este fuzionat la proteina de 49 înveliș a fagului.

RO 120848 Β1

Așa cum se utilizează în prezenta, termenul de colecție de fagi pentru anticorpi se referă la o colecție de fagi utilizată în procedeul de maturație a afinității descris mai sus, în Hawkins și colab., J. Mol. Biol. 254: 889 - 896 (1992) și în Lowman și colab., Biochimia 30 (45): 10832 - 19838(1991). Fiecare colecție conține o regiune hipervariabilă (de exemplu, 6-7 situsuri), pentru care se realizează toate substituțiile posibile de aminoacizi. Anticorpii mutanți, astfel generați, sunt prezentați sub formă monovalentă la nivelul particulelor fagice sub formă de filamente, ca produși de fuziune cu produsul genei III din M13, împachetat în fiecare particulă și exprimat la suprafața fagului.

Așa cum se utilizează în prezenta, temperatura camerei sau a mediului este cuprinsă între 23 și 25°C.

Conform acestei descrieri, o polipeptidă cu capacitate de legare înseamnă orice polipeptidă care se leagă la o moleculă țintă având o afinitate selectivă. în mod preferabil, polipeptidă este o proteină, care, în cazul cel mai preferat, conține mai mult de 100 de resturi de aminoacizi.

în mod caracteristic, polipeptidă este un hormon sau un anticorp, sau un fragment al acestora.

Conform acestei descrieri, afinitate înaltă semnifică o constantă de afinitate (Kd) <10'⁵M și preferabil <10'⁷M în condiții fiziologice.

Conform acestei descrieri, o moleculă țintă este orice moleculă, nu neapărat proteină, împotriva căreia se dorește realizarea unui anticorp sau a unui ligand. Cu toate acestea, o moleculă țintă preferată este o proteină și cea mai preferată țintă este un antigen. Totuși, în semnificația acestui termen se pot include și receptori, cum sunt receptorii hormonali.

Conform prezentei descrieri, numărătoarea resturilor de aminoacizi din structura imunoglobulinelor, inclusiv a peptidelor corespunzătoare unor porțiuni specifice ale moleculelor de IgE, de IgE mutante și de IgE himere, care se utilizează în descriere, se realizează conform sistemului de numărare a resturilor de aminoacizi din structura imunoglobulinelor, descris de Kabat și colab. în Sequences of Proteins of Immunological Interest (Institutul Național al Sănătății, Bethesda, MD 1987).

Metode de aplicare a invenției

I. Metodă de îmbunătățire a afinității unei molecule țintă

A. Identificarea resturilor de aspartil susceptibile de izomerizare în cursul punerii în practică a prezentei invenții, identificarea resturilor de aspartil care sunt predispuse la izomerizare, se poate realiza prin orice tehnică cunoscută în domeniu. De exemplu, Cacia și colab., în Biochimia 35, 1897-1903 (1996), descriu un procedeu în care se incubează anticorpii anti-lgE E25 (care conțin resturi -Asp-Gly-) la 37’0, timp de 21 de zile. Identificarea grupărilor -Asp-Gly- izomerizate s-a realizat prin cromatografie și prin analiza spectrului de masă la fragmente netratate și tratate cu protează. Deoarece s-a observat că izomerizarea survine la resturile asparaginil (T. Geiger și S. Clarke, J. Biol. Chem. 262 (2), 785 - 794 (1987), această invenție se poate, de asemenea, aplica în mod preferabil și la evaluarea și ameliorarea sistemitică a polipeptidelor ce conțin resturi de asparaginil.

B. Selecția de resturi alternative care ameliorează afinitatea moleculei țintă

Se cunosc multe tehnici în domeniu, prin care se optimizează afinitatea pentru receptori. în mod caracteristic, toate aceste tehnici implică substituția de resturi de aminoacizi la nivelul situsului în cauză, urmată de o analiză de screening a afinității polipeptidului mutant pentru receptori. O tehnică preferată, care se poate utiliza în conformitate cu prezenta invenție, este maturația afinității prin intermediul prezentării la nivelul fagilor (Hawkins și colab., J. Mol. Biol. 254: 889 - 896 (1992); Lowman și colab., Biochimia 30 (45): 10832 10838 (1991)). Pe scurt, se realizează mutația câtorva situsuri din regiunea hipervariabilă

RO 120848 Β1 (de exemplu, 6-7 situsuri), realizându-se toate substituțiile de aminoacizi posibile la nivelul 1 fiecărui situs. Anticorpii mutanți, astfel obținuți, sunt prezentați sub formă monovalentă la nivelul unor particule fagice sub formă de filamente, ca produși de fuziune cu produsul genei 3 III din M13, împachetați în fiecare particulă. Expresia diverșilor mutanți la nivelul fagilor se poate repeta periodic, pe parcursul mai multor cicluri de selecție a capacității de legare, 5 urmată de izolarea și secvențializarea acelor mutanți care prezintă afinitate înaltă.

Metoda de selecție a unor polipeptide noi cu capacitate de legare utilizează în mod 7 preferabil o colecție de polipeptide cu structură înrudită. Colecția de polipeptide cu structură înrudită, fuzionate la o proteină de înveliș a fagului, este produsă prin mutageneză și este 9 preferabil ca la suprafața particulei de fagemid, care conține ADN-ul ce codifică polipeptida respectivă, să fie prezentată o singură copie a fiecărei polipeptide înrudite. Aceste particule 11 de fagemid sunt puse apoi în contact cu o moleculă țintă și se separă particulele care au cea mai înaltă afinitate pentru țintă de cele cu afinitate mai scăzută. Elementele cu capacitate 13 mare de legare sunt apoi amplificate prin infecția unei gazde bacteriene și se repetă etapa de legare competitivă. Procedeul se repetă până ce se obțin polipeptidele care au afinitate 15 dorită.

în mod alternativ, se pot utiliza fagi multivalenți (Mc Cafferty și colab. (1990), Nature 17 348,552 - 554; Clackson și colab. (1991), Nature 352,624 - 628) pentru a exprima mutațiile în poziții întâmplătoare (generate prin utilizarea unei ADN-polimeraze predispuse la erori), 19 obținându-se o colecție de fragmente de anticorpi fagici, care poate fi apoi analizată din punct de vedere al afinității față de antigen. Hawkins și colab. (1992), J. Mol. Biol 254: 21

889 - 896.

în mod preferabil, în timpul procesului de maturație, vectorul de expresie replicabil 23 este strict controlat de elementul de reglare a transcrierii, iar condițiile de cultură sunt adaptate astfel încât cantitatea sau numărul de particule de fagemid, care prezintă mai mult de 25 o copie a proteinei de fuziune pe suprafața lor, este sub aproximativ 1%. De asemenea, în mod preferabil, cantitatea de particule de fagemid, care prezintă mai mult de o copie a pro- 27 teinei de fuziune, este mai mică de 10% din cantitatea particulelor de fagemid care prezintă o singură copie a proteinei de fuziune. Cel mai preferabil, cantitatea acestora este sub 20%. 29 în mod caracteristic, conform metodei acestei invenții, vectorul de expresie va mai conține secvențe semnal pentru secreție, fuzionate la ADN-ul ce codifică fiecare subunitate 31 a polipeptidei, iar elementul de reglare a transcrierii va fi un sistem promotor. Sisteme preferate de tip promotor sunt selectate dintre: promotorii LacZ, Ă_PL, TC, polimeraza T7, triptofan 33 și fosfataza alcalină, și combinații ale acestuia.

De asemenea, în mod caracteristic, prima genă va codifica o proteină de mamifer, 35 preferabil, aceasta fiind un anticorp anti-lgE. Alte tipuri de anticorpi sunt specificați în secțiunea II.A. Prepararea anticorpului (vi) anticorpi multispecifici (trebuie să ținem seama 37 de faptul că totuși nu este necesar ca anticorpii să fie multispecifici). Alte polipeptide sunt hormonul uman de creștere (GH), hormonul uman de creștere N-metionil, hormonul bovin 39 de creștere, hormonul paratiroidian, tiroxina, lanțul A al insulinei, lanțul B al insulinei, proinsulina, lanțul A al relaxinei, lanțul B al relaxinei, prorelaxina, hormonii glicoproteici precum 41 hormonul foliculostimulant (FSH), hormonul de stimulare tiroidiană (TSH) și hormonul luteinizant (LH), receptori ai hormonilor glicoproteici, calcitonină, glucogonul, factorul VIII, 43 surfactantul pulmonar, urokinaza, streptokinaza activatorul tisular al plasminogenului uman (t-PA), bombesina, factorul IX, trombina, factorul de creștere hematopoietică, factorul de 45 necroză tumorală -alfa și -beta, encefalinaza, albumina serică umană, substanță inhibitoare mulleriană, peptid asociat cu gonadotropina la șoarece, o proteină microbiană, precum β- 47 lactamaza, proteina factorului tisular, inhibina, activina, factorul de creștere a endoteliului

RO 120848 Β1 vascular, receptori pentru hormoni și factori de creștere, integrina, trombopoietina, proteina A sau D, factori reumatoizi, factori de creștere a nervilor precum NGF-P, factor de creștere plachetară, factori transformanți de creștere (TGF) precum TGF-a/fa și TGF-befa, factori de creștere insulin like I și II, proteine de legare a factorilor de creștere insulin-like, CD-4, DNază, peptid asociat cu latența, eritropoietina, factori osteoinductori, interferoni precum interferon -alfa, -beta și -gama, factori de stimulare a coloniilor (CSF) precum M-CSF, GMCSF și G-CSF, interleukine (IL) precum IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, dismutaza superoxidică, factorul de accelerare a degradării, antigene virale, proteinele anvelopei HIV precum GP 120, GP 140, peptidele natriuretice atriale A, B sau C, imunoglobuline, și fragmente ale oricărei proteine enumerate mai sus.

în mod preferabil, prima genă va codifica o polipeptidă a uneia sau a mai multor subunități care conțin mai mult de 100 de resturi de aminoacizi și vor fi multiplicate pentru a forma o multitudine de structuri secundare rigide, care prezintă o multitudine de aminoacizi capabili să interacționeze cu ținta. în mod preferabil, prima genă va suferi o mutație la codonii ce corespund doar aminoacizilor capabili să interacționeze cu ținta, astfel încât integritatea structurilor secundare rigide va fi păstrată.

în mod normal, metoda acestei invenții va folosi un fag helper, selectat dintre: M13KO7, M13R408, M13-VCS, și Phi X 174. Fagul helper preferat este M13KO7, iar proteina de înveliș preferată este proteina de înveliș exprimată de gena II a fagului M13. Gazda preferată este E. coli și tulpinile E. coli cu deficit de pretează. Au fost detectate noi variante hGH, selectate prin metoda prezentei invenții. Vectorii de expresie în fagemid au fost sintetizați, astfel încât să conțină un codon stop supresibil localizat în mod funcțional între acizii nucleici ce codifică polipetidul și proteina de înveliș a fagului.

1. Alegerea polipeptidelor pentru a fi prezentate pe suprafața unui fag

Se utilizează cicluri repetate de selecție a polipetidelor, în scopul alegerii celor cu capacitate de legare din ce în ce mai mare, realizându-se o selecție cu fagemid, a polipeptidelor cu modificări ale unor aminoacizi, care se desfășoară pe parcursul mai multor cicluri de selecție. După un prim ciclu de selecție cu fagemid, care se desfășoară într-o primă regiune de selecție a aminoacizilor în polipeptidul de tip ligand sau anticorp, se realizează alte cicluri de selecție cu fagemid în alte regiuni sau la alți aminoacizi din structura ligandului. Ciclurile de selecție cu fagemid se repetă până ce se obține afinitatea dorită. Pentru ilustrarea acestui procedeu, prezentarea la nivelul fagului din exemplul 4 a fost realizată în cicluri. Afinitatea combinată, combinație de mutații de la regiuni CDR diferite etc.

Din cele menționate mai sus, se poate observa că resturile de aminoacizi care formează domeniul de legare al polipeptidei nu vor fi legate secvențial și pot să se afle în subunități diferite ale polipeptidei. De aici rezultă că domeniul de legare participă la situsul de legare cu structura sa secundară și nu cu cea primară. Astfel că, în general, mutațiile se vor realiza la nivelul codonilor ce codifică aminoacizi din cadrul structurii secundare, în situsuri orientate spre exteriorul polipeptidei, având astfel posibilitatea de a interacționa cu ținta.

Totuși, nu este necesar ca polipeptidă aleasă ca ligand sau anticorp al unei molecule țintă să se lege în mod normal la aceasta. Astfel, de exemplu, se poate alege un hormon glicoproteic precum TSH, ca ligand pentru receptorii TSH, iar în cursul acestei metode să se utilizeze o colecție de molecule TSH mutante, în scopul producerii unor posibile medicamente noi.

Această invenție studiază orice polipeptidă care se leagă la o moleculă țintă, în mod specific, anticorpi. Polipeptide preferate sunt acelea care sunt utile din punct de vedere farmaceutic. Exemple de anticorpi sunt enumerate în paragraful II.A. Prepararea anticorpilor (iV) anticorpi multispecifici (a se ține seama de faptul că nu este necesar ca anticorpii să fie

RO 120848 Β1 muItispecifici). Polipeptide mai preferate sunt reprezentate de hormonul de creștere, inclusiv 1 hormonul uman de creștere, hormonul uman de creștere des-N-metionil și hormonul bovin de creștere; hormonul paratiroidian; hormonul de stimulare tiroidiană; tiroxina, lanțul A al 3 insulinei; lanțul B al insulinei; prorelaxina; peptida asociată cu gonodotropina la șoarece; o proteină microbiană precum β-lactamaza, proteina factorului tisular; inhibina, activina; 5 factorul de creștere a endoteliului vascular; receptori pentru hormoni sau factori de creștere; integrină, trombopoietină; proteina A sau D; factori reumatoizi; factor de creștere a nervului 7 precum NGF-β; factor de creștere derivat din plachete; factor fibroblastic de creștere precum aFGF și βΡΩΡ, factor de creștere epidermală, factor transformant de creștere (TGF) precum 9

TGF-a/fa și TGF-befa; factori de creștere asemănători insulinei de tip I și II; proteine de legare a factorilor de creștere asemănători insulinei; CD-4; DNază; peptida asociată cu la- 11 tenta; eritropoietina; factori osteoinductori; antigene virale precum, de exemplu, o porțiune a anvelopei HIV; imunoglobuline; și fragmente ale oricărei proteine enumerate mai sus. în 13 plus, se poate realiza substituția, inserția sau deleția unuia sau mai multor resturi prestabilite de aminoacizi din polipeptidă, obținându-se produși cu proprietăți biologice perfecționate. 15 Mai departe, sunt luate în considerare și fragmente ale acestor polipeptide, în special, fragmentele active din punct de vedere biologic. Polipeptide și mai preferate ale acestei in- 17 venții sunt factorul uman de creștere și peptidele natriuretice atriale A, B și C, endotoxina, subtilizina, tripsina și alte proteaze serice. 19

De asemenea, sunt preferați hormonii polipeptidici, care pot fi definiți ca fiind orice secvență de aminoacizi produsă într-o primă celulă, care se leagă specific la un receptor al 21 aceluiași tip de celulă (hormoni autocrini) sau al unui alt tip de celulă (hormoni non-autocrini) și care determină un răspuns fiziologic caracteristic, la nivelul celulei care poartă receptorul 23 respectiv. Printre astfel de hormoni polipeptidici se numără citokinele, limfokinele, hormonii neurotrofici și hormonii polipeptidici adenohipofizari precum hormonul de creștere, prolactină, 25 lactogenul placentar, hormonul luteinizant) hormonul foliculostimulant, β-lipotropina, y-lipotropina și endorfinele; hormonii hipotalaemici inhibitori și stimulatori precum factorii de eli- 27 beratori de corticotropină, hormonul inhibitor/stimulator al hormonului de creștere; factorul eliberator de hormon de creștere; și alți hormoni polipeptidici precum peptidele natriuretice 29 atriale A, B sau C.

2. Obținerea unei prime gene (gena 1) care să codifice polipeptidă dorită 31

Gena care codifică polipeptidă dorită (de exemplu, un anticorp) poate fi obținută prin metode cunoscute în domeniu (vezi Sambrook și colab., Molecular Biology: A Laborator 33 Manual, Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, New York, (1989)). Dacă secvența genei este cunoscută, ADN-ul care codifică gena poate fi sintetizat pe cale chimică 35 (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149(1963)). Dacă secvența genei nu se cunoaște sau gena nu a mai fost izolată, ea poate fi donată dintr-o colecție de ADNc (realizat din ARN 37 obținut de la un țesut adecvat în care gena dorită este exprimată) sau dintr-o colecție adecvată de ADN genomic. Gena este apoi izolată cu ajutorul unei sonde corespunzătoare. 39 Pentru colecțiile de ADNc, sondele adecvate sunt reprezentate de anticorpi monoclonali sau policlonali (cu condiția ca acea colecție de ADNc să fie o colecție de expresie), oligonucleo- 41 tide și ADNc omolog sau complementar, sau fragmente ale acestora. Sondele care pot fi utilizate la izolarea genei de interes din colecțiile de ADN genomic pot fi ADNc sau fragmente 43 ale acestora care codifică aceeași genă sau o genă similară, ADN-uri genomice omoloage sau fragmente de ADN omoloage și oligonucleotide. Alegerea colecției de ADNc sau de ADN 45 genomic cu sonda aleasă este realizată conform procedeelor standard, așa cum sunt descrise în capitolele 10-12 de Sambrook și colab., de mai sus. 47

RO 120848 Β1

Un alt mijloc de izolare a genei ce codifică polipeptida dorită (de exemplu, anticorpul), este reprezentat de utilizarea metodei PCR (reacția de polimerizare în lanț), conform descrierii lui Sambrook și colab., de mai sus. Această metodă necesită utilizarea nucleotidelor care vor hibridiza, obținându-se gena dorită, astfel că trebuie cunoscută cel puțin o parte din secvența ADN a acestei gene, pentru a genera oligonucleotidele.

După ce această genă a fost izolată, poate fi inserată într-un vector adecvat (preferabil o plasmidă) pentru amplificare, conform descrierii lui Sambrook și colab., de mai sus.

3. Sinteza vectorilor replicabili de expresie

Există câțiva vectori care sunt disponibili și pot fi utilizați la aplicarea acestei invenții, vectorii preferați fiind reprezentați totuși de plasmide, acestea putând fi create relativ ușor și putând fi rapid amplificate. în general, vectorii plasmidici conțin o varietate de componente, și anume un promotor, secvențe semnal, gene de selecție fenotipică, situsuri ale originii de replicare și alte componente necesare, cunoscute în domeniu.

Cei mai utilizați promotori ai vectorilor pentru procariote sunt sistemul promotor lac Z, promotorul pho A al fosfatazei alcaline, promotorul bacteriofagic ĂPL (un promotor sensibil la temperatură), promotorul tac (un promotor hibrid trp-lac care este reglat de represorul lac), promotorul triptofan și promotorul bacteriofagic T7. Pentru descrierea generală a promotorilor, a se vedea paragraful 17 din Sambrook și colab., de mai sus. Aceștia sunt cei mai utilizați promotori, dar se pot folosi și alți promotori microbieni adecvați.

Promotorii preferați pentru a fi utilizați la aplicarea acestei invenții sunt aceia care pot fi strict reglați, astfel încât expresia genei de fuziune să fie controlată. Dacă expresia nu este controlată și se obțin copii multiple ale proteinei de fuziune pe suprafața fagemidului, acesta se poate atașa la țintă prin mai multe puncte. Se crede că această atașare la molecula țintă prin mai multe puncte, denumită și aviditate sau efect chelator, determină selecția de polipeptide cu capacitate de legare fals crescută, datorată copiilor multiple ale proteinei de fuziune, care sunt prezentate la suprafața particulei de fagemid în raporturi strânse de vecinătate și care au efect de chelare a moleculei țintă. Când apare legarea la situsuri multiple, Kd aparentă sau efectivă poate fi la fel de mare ca produsul constantelor Kd individuale ale fiecărei copii ale proteinei de fuziune prezentate.

Prin reglarea strictă a expresiei proteinei de fuziune, astfel încât să nu apară decât o cantitate nesemnificativă, și anume mai puțin de aproximativ 1%, de particule de fagemid care să conțină copii multiple ale proteinei de fuziune, efectul chelator este prevenit și selecția polipeptidelor cu afinitate înaltă se realizează în mod corect. Astfel, în funcție de promotor, se adaptează condițiile de cultură ale gazdei, astfel încât numărul de particule de fagemid care conțin o copie unică a proteinei de fuziune să fie maxim, iar numărul celor care conțin copii multiple ale proteinei de fuziune să fie minim.

Promotorii preferați, utilizați la aplicarea acestei invenții, sunt promotorul lac Z și promotorul pho A. Promotorul lac Z este reglat de proteina lac supresoare lac i și astfel se poate controla transcrierea genei de fuziune prin adaptarea nivelului de proteină lac supresoare. De exemplu, se cultivă fagemidul ce conține promotorul lac Z într-o tulpină celulară care conține o copie a genei supresoare lac i, care este un agent supresor al promotorului lac Z. Ca exemple de tulpini celulare care conțin gena lac i, se pot enumera JM 101 și XL-1 albastru. în mod alternativ, celula gazdă poate fi cotransfectată cu o plasmidă care să conțină atât supresorul lac i, cât și promotorul lac Z. în mod ocazional, tehnicile de mai sus pot fi utilizate simultan, și anume particulele de fagemid care conțin promotorul lac Z se cultivă în tulpini celulare care conțin gena lac i, și se realizează cotransfecția tulpinilor celulare cu o plasmidă care conține ambele gene lac i și lac Z. în mod normal, atunci când se dorește

RO 120848 Β1 expresia unei gene, se poate adăuga, la gazda transfectată de mai sus, un inductor, cum ar1 fi izopropiltiogalactozidul (IPTG). în prezenta invenție, această etapă este totuși omisă, pentru (a) a reduce riscul expresiei fuziunilor genice III la numărul de fagemide și pentru (b) a3 preveni împachetarea slabă sau inadecvată a fagemidului, determinată de inductorii de tipul IPTG, chiar și în concentrații scăzute. în mod caracteristic, atunci când nu se adaugă induc-5 tori, numărul de proteine de fuziune la o particulă de fagemid este mai mare de 0,1 (numărul total de proteine de fuziune/numărul de particule de fagemid). Cel mai preferat promotor 7 utilizat la aplicarea prezentei invenții este pho A. Se crede că acest promotor este reglat de nivelul fosfatului anorganic în celulă, acțiunea fosfatului constând în inhibarea activității pro- 9 motorului. Astfel că, prin scăderea concentrației fosfatului în celule, se poate stimula activitatea promotorului. Rezultatul dorit se obține prin cultivarea celulelor în mediu îmbogățit cu 11 fosfat precum 2YT sau LB, controlându-se astfel expresia fuziunii genei III.

O altă componentă utilă a vectorilor utilizați la aplicarea prezentei invenții este sec- 13 vența semnal. Această secvență este localizată în mod caracteristic în sens 5' imediat lângă gena care codifică proteina de fuziune și va fi deci transcrisă la capătul amino-terminal al 15 proteinei de fuziune. Totuși, în anumite cazuri, s-a demonstrat că secvența semnal este localizată în alte poziții decât în poziția 5' față de gena ce codifică proteina ce va fi secretată. 17

Această secvență semnalează proteina la care se atașează, din membrana internă a celulei bacteriene. ADN-ul care codifică secvența semnal se poate obține ca fragment de restricție 19 cu endonuclează, din orice genă care codifică o proteină ce are o secvență semnal. Secvențe semnal adecvate pentru procariote pot fi obținute din gene care codifică, de exemplu, 21 LamB sau OmpF (Wong și Colab. Gene 68; 193 (1983)), MalE, PhoA și din alte gene. O secvență semnal pentru procariote, care se preferă în cursul aplicării acestei invenții, este 23 secvența semnal pentru enterotoxina termostabilă lla E. coli. (ST II), conform descrierii lui Chang și colab., Gene 55:189 (1987)). 25

O altă componentă utilă a vectorilor utilizați la aplicarea prezentei invenții sunt genele de selecție fenotipică. Gene caracteristice de selecție fenotipică sunt acelea care codifică 27 proteine ce conferă celulei gazdă rezistență la antibiotice. De exemplu, se utilizează rapid în acest scop, genele pentru rezistență la ampicilină (amp) și pentru rezistență la tetraciclină 29 (tet).

Sinteza vectorilor adecvați, care conțin componentele menționate mai sus, precum 31 și sinteza genei ce codifică polipeptida descrisă (gena 1) se realizează prin metode standard ce utilizează ADN recombinant, descrise în Sambrook și colab., de mai sus. Fragmentele 33 izolate de ADN, care vor fi combinate pentru a alcătui vectorul, sunt scindate, ajustate și legate împreună, într-o ordine și orientare specifică, obținându-se vectorul dorit. 35

ADN-ul este scindat, utilizând o enzimă sau enzime adecvate de restricție, într-o soluție tampon corespunzătoare. în general, se utilizează fragmente de ADN sau de 37 plasmidă de aproximativ 0,2...1 pg, cu aproximativ 1...2 unități de enzimă corespunzătoare de restricție, în aproximativ 20 pl de soluție tampon. Soluțiile tampon adecvate, concentrațiile 39 de ADN, timpul de incubare și temperaturile de incubare sunt specificate de producătorii enzimelor de restricție. în general, timpul de incubare adecvat este de aproximativ una sau 41 două ore, la 37°C, deși unele enzime necesită temperaturi mai înalte. După incubare, se îndepărtează enzimele și alți contaminanți prin extracția soluției de digestie cu un amestec 43 de fenol și cloroform, iar ADN-ul este recuperat din fracția apoasă prin precipitare cu etanol.

Pentru ca fragmentele ADN să poată fi ligate pentru a forma un vector funcțional, 45 capetele fragmentelor trebuie să fie compatibile. în unele cazuri, capetele sunt compatibile imediat după digestia cu endonuclează. Cu toate acestea, poate fi uneori necesară efec- 47 tuarea inițială a transformării capetelor aderente, obținute de obicei în urma digestiei cu

RO 120848 Β1 endonuclează, în capete retezate, pentru a putea deveni compatibile pentru ligare. Pentru a reteza capetele, se tratează ADN-ul într-o soluție tampon adecvată, timp de cel puțin 15 min, la 15’C, cu 10 unități de fragment Klenow al ADN-polimerlazei I (Klenow), în prezența trifosfaților celor patru dezoxinucleotide. ADN-ul este apoi purificat prin extracție cu fenol-cloroform și prin precipitare cu etanol.

Fragmentele de ADN scindate pot fi separate și selectate, în funcție de dimensiune, prin electroforeza ADN-ului în gel. Electroforeza ADN-ului se poate realiza fie pe matrice de agaroză, fie de poliacrilamidă. Selecția matricei va depinde de dimensiunea fragmentelor ADN care trebuie separate. După electroforeză, ADN-ul este extras din matrice prin electroeluare sau, dacă s-a utilizat agaroză cu punct de topire scăzut, prin topirea agarozei și extragerea ADN-ului conform descrierii din paragrafele 6.30-6.33 ale lui Sambrook și colab., de mai sus.

Fragmentele de ADN care trebuie ligate (digerate în prealabil cu enzime de restricție adecvate, astfel încât capetele fiecărui fragment să devină compatibile) sunt puse în soluție în cantități aproximativ echimolare. Soluția va mai conține și ATP, soluție tampon pentru ligază și o ligază, cum ar fi ADN-ligaza T4 în cantitate de aproape 10 unități la 0,5 pg de ADN. Dacă fragmentul de ADN va fi ligat într-un vector, vectorul trebuie mai întâi să devină liniar, prin excizie cu endonuclează (endonucleaze) adecvată (adecvate) de restricție. Vectorul liniar este apoi tratat cu fosfatază alcalină sau cu fosfatază intestinală de vițel. Tratarea cu fosfatază previne autoligaturarea vectorului în cursul etapei de ligaturare.

După ligare, vectorul în care s-a inserat gena străină este transformat într-o celulă gazdă adecvată. Pentru această invenție, se preferă, ca celule gazdă, procariotele. Celule procariote adecvate sunt reprezentate de tulpina E. coli M101, tulpina E. coli K12 294 (număr ATCC 31.446), tulpina E. coli W3110 (număr ATCC 27.325), tulpina E. coliX 1776 (număr ATCC 31.537), tulpina E. coliXL-Ί Albastru (Stratagen), și E. coli precum HB 101, NM 522, NM 538, NM 539, precum și multe alte specii și genuri de procariate. Pe lângă tulpinile de E. coli enumerate mai sus, se pot utiliza ca gazde și bacili precum Bacillus Subtilis, alte enterobacterii precum Salmonella typhimurium sau Serratia marcesans și diverse specii de Pseudomonas.

Transformarea celulelor procariote se realizează rapid prin metoda cu clorură de calciu descrisă în paragraful 1.82 din Sambrook și colab., de mai sus. în mod alternativ, se poate utiliza pentru transformarea acestor celule, electroporația (Neumann și colab., EMBO J. 1:841 (1982)). Celulele transformate sunt selectate prin creștere pe mediu cu antibiotic, de obicei tetraciclină (tet) sau ampicilină (amp), față de care acestea au devenit rezistente prin prezența genelor tet și/sau amp în vector. După selecția celulelor transformate, acestea sunt cultivate și se izolează apoi din culturi ADN-ul plasmidic (sau al altui tip de vector care are inserată în structura sa gena străină). ADN-ul plasmidic se poate izola utilizând metode cunoscute în domeniu. Două metode adecvate sunt prepararea ADN-ului la scară redusă și prepararea ADN-ului la scară largă, conform descrierilor din paragrafele 1.25 - 1.33 din Sambrook și colab., de mai sus. ADN-ul izolat poate fi purificat prin metode cunoscute în domeniu precum cele descrise în paragraful 1.40 din Sambrook și colab., de mai sus. Acest ADN plasmidic purificat este apoi analizat prin realizarea hărții de restricție și/sau prin secvențializarea ADN. Secvențializarea ADN se realizează de obicei, fie conform metodei lui Messing și colab., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981), fie prin metoda lui Maxam și colab., Meth. Enzymol. 65: 499(1980).

RO 120848 Β1

4. Fuziunea genei 1

Etapa afinității față de fag a prezentei invenții constă în fuzionarea genei ce codifică polipeptida dorită (gena 1) la o a doua genă (gena 2), această fuziune fiind realizată în cursul 3 transcrierii. Gena 2 este în mod caracteristic o genă care codifică o proteină de înveliș a unui fag, preferabil fiind proteina de înveliș corespunzătoare genei III a fagului M13, sau un frag- 5 ment al acesteia. Fuziunea genelor 1 și 2 se poate realiza prin inserția genei 2 într-un anumit situs din structura unei plasmide care conține gena 1, sau prin inserția genei 1 într-un anumit 7 situs din structura unei plasmide care conține gena 2.

Inserția unei gene într-o plasmidă necesită ca plasmida să fie excizată la nivelul unei 9 poziții precise în care trebuie inserată gena. Deci la nivelul acestei poziții trebuie să existe un situs pentru endonuclează de restricție (preferabil un situs unic, astfel încât plasmida să 11 fie excizată doar într-un singur loc în cursul digestiei cu endonuclează de restricție). Plasmida este digerată, tratată cu fosfatază și purificată, așa cum s-a descris mai sus. Gena este 13 apoi inserată în această plasmidă, devenită liniară, prin ligarea celor două fragmente de ADN. Ligarea se poate realiza dacă capetele plasmidei sunt compatibile cu capetele genei 15 ce trebuie inserată. Dacă se utilizează aceeași enzimă de restricție atât pentru excizia plasmidei, cât și pentru izolarea genei ce trebuie inserată, atunci cele două fragmente de 17 ADN pot fi ligate direct cu ajutorul unei ligaze precum ADN-ligaza T4 de proveniență bacteriofagă, incubând amestecul la 160‘C, timp de 1 ...4 h, în prezența ATP-ului și a soluției tam- 19 pon pentru ligază, conform descrierii din paragraful 1.68 din Sambrook și colab., de mai sus.

Dacă capetele nu sunt compatibile, ele trebuie mai întâi retezate cu ajutorul fragmentului 21 Klenow al ADN-polimerazei I sau cu ajutorul ADN-polimerazei T4 de proveniență bacteriofagică, ambele necesitând trifosfații celor patru dezoxiribonucleotide, pentru a completa 23 capetele monocatenare libere ale ADN-ului digerat. în mod alternativ, capetele pot fi retezate cu ajutorul unei nucleaze, cum este nucleaza S1 sau nucleaza unei specii de fasole, ambele 25 acționând prin scurtarea capetelor libere de ADN monocatenar. ADN-ul este apoi ligat din nou cu ajutorul unei ligaze conform descrierii de mai sus. în unele cazuri, nu este posibilă 27 retezarea capetelor genei destinate inserției, deoarece se alterează cadrul de citire al regiunii codante. Pentru a preveni această problemă, se pot utiliza linkeri oligonucleotidici. Linkerii 29 vor servi ca punte de legătură între plasmidă și gena destinată inserției. Acești linkeri pot fi sintetici, sub formă de ADN dublu catenar sau monocatenar, fabricați prin metode standard. 31 Linkerii au unul din capete compatibil cu capetele genei destinate inserției; linkerii sunt mai întâi ligați la această genă prin metodele de ligare descrise mai sus. Celălalt capăt al lin- 33 kerilor este creat astfel încât să fie compatibil cu plasmida, în scopul legării la aceasta.

Atunci când se concep linkerii, trebuie avută în vedere păstrarea cadrului de citire al genei 35 destinate inserției sau a cadrului de citire al genei conținute de plasmidă. în câteva cazuri, poate fi necesară conceperea linkerilor, astfel încât să codifice o parte a unui aminoacid sau 37 astfel încât să codifice unul sau mai mulți aminoacizi.

Se poate insera ADN-ul ce codifică un codon stop între gena 1 și gena 2, astfel de 39 codoni fiind UAG (amber), UAA (ochre) și UGA (opal), Microbiology, Davis și colab., Harper & Row, New York, 1980, pg.237,245 - 47 și 274). Codonul stop, exprimat într-o celulă gazdă 41 de tip sălbatic, determină sinteza produsului proteic al genei 1, fără a fi atașat de proteina codificată de gena 2. Cu toate acestea, cultivarea într-o celulă gazdă supresoare determină 43 sinteza unor cantități detectabile de proteină fuzionată. Astfel de celule gazdă supresoare conțin un ARNt modificat în sensul introducerii unui aminoacid în poziția codonului stop al 45 ARN_m, ceea ce duce la producția de cantități detectabile de proteină fuzionată. Celule gazdă supresoare de acest fel sunt bine cunoscute și descrise, cum ar fi tulpina supresoare de E. 47 coli (Bullack și colab., Biotechnologies 5,376 - 379 (1987)). Se poate utiliza orice metodă cunoscută pentru introducerea unui astfel de codon stop în structura ARN_m ce codifică 49 polipeptidul fuziune.

RO 120848 Β1

Codonul supresibil poate fi introdus între prima genă ce codifică o polipeptidă și o a doua genă ce codifică cel puțin o porțiune a unei proteine de înveliș a fagului. în mod alternativ, codonul stop supresibil poate fi inserat în poziția adiacentă situsului de fuziune, prin înlocuirea ultimului triplet de aminoacizi din polipeptidă sau a primului aminoacid din structura proteinei de înveliș a fagului. Atunci când fagemidul care conține codonul supresibil este cultivat într-o celulă gazdă supresoare, atunci apare producția detectabilă a unei polipeptide de fuziune care conține polipeptidă și proteina de înveliș. Dacă fagemidul este cultivat într-o celulă gazdă nesupresoare, atunci polipeptidă se sintetizează în esență fără a fi fuzionat cu proteina de înveliș a fagului, datorită terminării la nivelul tripletului supresibil inserat care codifică UAG, UAA sau UGA. în celula nesupresoare polipeptidă este sintetizată și secretată din celula gazdă, datorită absenței fuziunii cu proteina de înveliș a fagului, care l-ar fi ancorat la celula gazdă.

5. Alterarea (mutația) genei 1 în poziții selecționate

Gena 1 care codifică polipeptidă dorită poate fi alterată la nivelul unuia sau mai multor codoni selectați. Cu toate acestea, codonul care corespunde restului izomerizabil de aspartil trebuie schimbat. Alterarea se definește ca fiind o substituție, deleție sau inserție a unui sau mai multor codoni în gena care codifică polipeptidă, ceea ce duce la schimbarea secvenței de aminoacizi a polipeptidei, comparativ cu secvența nativă nemodificată a aceleiași polipeptide. în mod preferabil, alterările se vor realiza prin substituția a cel puțin unui aminoacid cu un alt aminoacid, într-una sau mai multe regiuni ale moleculei. Alterările pot fi realizate prin diverse metode cunoscute în domeniu. Aceste metode sunt reprezentate, printre altele, de mutageneza mediată de oligonucleotide și mutageneza la nivelul casetei.

A. Mutageneza mediată de oligonucleotide

Mutageneza mediată de oligonucleotide reprezintă metoda preferată de realizare a substituției, deleției și inserției la nivelul genei 1. Această tehnică este bine cunoscută în domeniu, fiind descrisă de Zoller și colab., Nucleic Acids Res. 10:6487 - 6504(1987). Pe scurt, gena 1 se modifică prin hibridizarea unei oligonucleotide ce codifică mutația dorită, cu o matriță ADN, matrița fiind forma monocatenară a plasmidei ce conține secvența ADN nativă sau nealterată, a genei 1. După hibridizare, se utilizează o ADN-polimerază pentru sinteza unei a doua catene complete, complementare matriței, care va include astfel primerul oligonucleotidic și va codifica varianta mutantă dorită a genei 1.

în general, se utilizează oligonucleotide cu lungime de cel puțin 25 de nucleotide. O oligonucleotidă optimă va avea între 12 și 15 nucleotide, care sunt absolut complementare cu matrița, situate de fiecare parte a nucleotidei (nucleotidelor) care codifică mutația. Acest fapt asigură o hibridizare corectă a oligonucleotidei, la molecula matriță de ADN monocatenar. Oligonucleotidele sunt rapid sintetizate prin tehnici cunoscute în domeniu precum cele descrise de Crea și colab., Proc. Natl. Acad, Sci., USA 75: 5765(1978).

Matrița de ADN poate fi generată doar de acei vectori care derivă din vectorii M13 de proveniență bacteriofagică (sunt adecvați vectorii M13mp18 și M13mp19, în mod obișnuit disponibili) sau de acei vectori care conțin o origine a replicării monocatenară de proveniență fagică, conform descrierii lui Viera și colab., Meth. Enzymol. 153: 3 (1987). Astfel că ADN-ul care va suferi mutația, se va insera într-unul din acești vectori, pentru a se obține o matriță monocatenară. Obținerea matriței monocatenare este descrisă în paragrafele 4.21 -4,41 din Sambrook și colab., de mai sus.

Pentru modificarea secvenței native de ADN se hibridizează oligonucleotidă la matrița monocatenară în condiții adecvate de hibridizare.

RO 120848 Β1

Se adaugă apoi o enzimă de polimerizare a ADN-ului, de obicei fragmentul Klenow 1 al ADN-polimerazei I, pentru a se realiza sinteza catenei complementare matriței, utilizând oligonucleotida ca primer pentru sinteză. Se formează astfel o moleculă dublă heterogenă, 3 în care o catenă de ADN codifică forma mutantă a genei 1, iar cealaltă catenă (matrița originală) codifică secvența nativă nealterată a genei 1. Această moleculă heterogenă este apoi 5 transformată într-o celulă gazdă adecvată, de obicei o procariotă precum E. coli JM-101.

După ce au fost cultivate, celulele se întind pe plăci de agaroză și se realizează selecția 7 acestora cu oligonucleotida primer marcat radioactiv cu ³²Fosfat, în scopul identificării coloniilor bacteriene care conțin ADN-ul mutant. 9

Metoda descrisă mai sus poate fi modificată, astfel încât în molecula dublă heterogenă creată, ambele catene ale plasmidei să conțină mutația (mutațiile). Se realizează urmă- 11 toarele modificări: oligonucleotida monocatenară este refăcută la matrița monocatenară, așa cum s-a descris mai sus. Un amestec de trei dezoxiribonucleotide, dezoxiriboadenozină 13 (dATP), dezoxiriboguanozină (dGTP) și dezoxiribotimidină (dTTP), se combină cu o tiodezoxiribocitozină modificată, denumită dCTP-(aS) (Amersham). Acest amestec se adaugă 15 la complexul matriță-oligonucleotidă. Prin adăugarea ADN-polimerazei la acest amestec, se obține o catenă de ADN identică cu matrița, cu excepția bazelor mutante. în plus, această 17 nouă catenă de ADN va conține dCTP-(aS) în loc de dCTP, care are rol protector față de digestia cu endonucleaza de restricție. După ce catena matriță a moleculei duble heterogene 19 dublu catenare este tratată cu o enzimă de restricție adecvată, poate fi digerată cu nuclează

Exolll sau cu o altă nuclează adecvată, dincolo de regiunea care conține situsul (situsurile) 21 care vorfi supuse mutației. Reacția este apoi oprită, obținându-se o moleculă parțial monocatenară. Se formează apoi un homoduplex de ADN dublu catenar complet, utilizând ADN- 23 polimerază, în prezența trifosfaților tuturor celor patru dezoxiribonucleotide, ATP și ADNligază. Această moleculă homoduplex poate fi apoi transformată într-o celulă gazdă adecvată 25 precum E. coli JM101, conform descrierii de mai sus.

Se pot obține mutanți cu mai mulți aminoacizi substituiți, prin câteva metode. Dacă 27 aminoacizii sunt localizați în apropiere unul de celălalt în lanțul polipeptidic, mutația lor se poate realiza simultan, utilizând o oligonucleotidă care codifică toate substituțiile de amino- 29 acizi dorite. Dacă aminoacizii sunt localizați totuși la o oarecare distanță unul de celălalt (separați prin mai mult de zece aminoacizi) este mai dificil să se realizeze o singură nucleo- 31 tidă care să codifice toate schimbările dorite. Se pot utiliza în schimb una sau două metode alternative. 33 în prima metodă, se realizează câte o oligonucleotidă separat, pentru fiecare aminoacid care va fi substituit. Oligonucleotidele sunt apoi atașate la matrița de ADN monocatenar 35 simultan și se sintetizează cea de-a doua catenă de ADN complementară cu matrița și care va codifica toate substituțiile dorite de aminoacizi. Metoda alternativă implică două sau mai 37 multe cicluri de mutageneză pentru obținerea mutantului dorit. Primul ciclu se desfășoară așa cum s-a descris la mutanții unici: se utilizează ca matriță ADN de tip sălbatic și se atașează 39 la acest ADN oligonucleotidul care codifică prima substituție (substituții) de aminoacizi dorită și se obține apoi o moleculă de ADN heteroduplex. în cel de-al doilea ciclu de mutageneză 41 se utilizează ca matriță ADN-ul care a suferit mutația în prima rundă de mutageneză. Deci această matriță conține deja una sau mai multe mutații. Oligonucleotidul care codifică 43 substituția (substituțiile) de aminoacizi dorită este apoi atașat la această matriță, catena de

ADN rezultată codificând mutațiile realizate atât în prima, cât și în a doua rundă de muta- 45 geneză. ADN-ul rezultat poate fi utilizat ca matriță într-un al treilea ciclu de mutageneză și așa mai departe. 47

RO 120848 Β1

B. Mutageneză la nivelul casetei

Această metodă este, de asemenea, o metodă preferată de preparare a variantelor de substituție, de deleție și de inserție ale genei 1. Metoda are la bază descrierea lui Wells și colab., Gene 34:315(1985). Materia primă este reprezentată de plasmida (sau alt vector) care conține gena 1, și anume gena care va suferi mutația. Se identifică codonul (codonii) din structura genei 1 care vor fi supuși mutației. Trebuie să existe un singur situs pentru endonucleaza de restricție, de fiecare parte a situsului (situsurilor) care va fi supus mutației. Dacă nu există astfel de situsuri de restricție, ele pot fi create prin metoda descrisă mai sus, și anume prin mutageneză mediată de oligonucleotidă, introducând aceste situsuri în pozițiile corespunzătoare din structura genei 1. După introducerea situsurilor de restricție în plasmidă, se excizează plasmida la nivelul acestor situsuri, pentru a deveni liniară. Se sintetizează prin procedeu standard o oligonucleotidă dublu catenară, care codifică secvența de ADN cuprinsă între situsurile de restricție, dar care conține mutația/mutațiile dorite. Cele două catene se sintetizează separat și apoi se hibridizează împreună, utilizând tehnici standard. Această oligonucleotidă dublu catenară poartă numele de casetă. Această casetă este concepută astfel încât să aibă capetele 3' și 5' compatibile cu capetele plasmidei liniare și să poată fi deci ligată direct la plasmidă. Această plasmidă conține acum secvența mutantă de ADN a genei 1.

6. Obținerea ADN-ului ce codifică proteina dorită într-o variantă alternativă a acestei invenții, se studiază producerea de variante ale unei proteine dorite, care conțin una sau mai multe subunități. Fiecare subunitate este codificată în mod caracteristic de câte o genă separată. Fiecare genă care codifică o subunitate a proteinei, se poate obține prin metode cunoscute în domeniu (a se vedea, de exemplu, paragraful II). în unele cazuri, poate fi necesară obținerea genelor care codifică diversele subunități ale proteinei, utilizând tehnici separate, alese dintre metodele descrise în paragraful II.

Atunci când se creează un vector replicabil de expresie, pentru o proteină care conține mai multe subunități, toate subunitățile pot fi reglate de același promotor, localizat în mod caracteristic 5' față de ADN-ul care codifică subunitatea, sau pot fi reglate separat de același promotor localizat în mod caracteristic 5' față de ADN-ul care codifică subunitățile, sau pot fi reglate fiecare de alt promotor, orientat în mod adecvat în structura vectorului, astfel încât fiecare promotor să fie legat în mod funcțional la secvența ADN pe care o reglează. Selecția promotorilor se realizează conform descrierii din paragraful III de mai sus.

Construcția unui vector replicabil de expresie, care conține ADN-ul ce codifică proteina de interes cu mai multe subunități, este ilustrată în fig. 11, în care se prezintă, în scop explicativ, diagrama unui vector care prezintă ADN-ul ce codifică fiecare unitate a unui fragment de anticorp. Această figură arată că, în general, una din subunitățile proteinei de interes va fi fuzionată la o proteină de înveliș a unui fag, cum ar fi gena III a lui M13. în general, această fuziune genică va conține propria sa secvență semnal. O genă separată codifică cealaltă subunitate (subunități) și este evident că fiecare subunitate are în general propria sa secvență semnal. Fig. 11 arată, de asemenea, că un singur promotor poate regla expresia ambelor subunități. în mod alternativ, fiecare subunitate poate fi reglată în mod independent de câte un promotor diferit. Fuziunea dintre proteina de interes și proteina de înveliș a fagului se poate realiza conform descrierii din paragraful IV de mai sus.

Atunci când se prepară o familie de variante ale proteinei dorite cu multe subunități se poate realiza mutația ADN-ului din structura vectorului ce codifică fiecare subunitate în una sau mai multe poziții, la nivelul fiecărei subunități. Când se realizează variante de anticorpi cu mai multe subunități, situsurile preferate de mutageneză corespund la codoni care

RO 120848 Β1 codifică resturi de aminoacizi localizați în regiunile determinante ale complementarității1 (CDR) fie ale lanțului ușor, fie ale lanțului greu, fie la nivelul ambelor lanțuri. Regiunile CDR sunt denumite de obicei regiuni hipervariabile. Metodele de mutageneză a ADN-ului ce3 codifică fiecare subunitate a proteinei de interes, se desfășoară în esență conform descrierii din paragraful V de mai sus.5

7. Prepararea unei molecule țintă și legarea prin intermediul fagemidului

Se pot izola din surse naturale proteine țintă, ca de exemplu receptori, sau se pot 7 prepara prin metode de recombinare cunoscute în domeniu. în scop ilustrativ, se pot prepara receptori pentru hormoni glicoproteici prin tehnica descrisă de McFarland și colab., Science 9 245:494:499 (1989), forme neglicozilate exprimate la E. coli fiind descrise de Fuh și colab., J. Biol. Chem. 265:3111-3115(1990). Se pot prepara și alți receptori, prin metode standard. 11

Proteina țintă purificată poate fi atașată la o matrice adecvată precum bile de agaroză, bile de acrilamidă, bile de sticlă, celuloză, diverși copolimeri acrilici, geluri de metacrilat 13 de hidroxialchil, copolimeri poliacrilici și polimetcrilic, nylon, materiale de suport ionice și neutre și altele de acest gen. Atașarea proteinei țintă la matrice se poate realiza prin metodele 15 descrise în Methods in Enzymol. 44(1976), sau prin alte mijloace cunoscute în domeniu.

După atașarea proteinei țintă la matrice, moleculele țintă imobilizate sunt puse în 17 contact cu o colecție de particule de fagemid, în condiții adecvate pentru legarea a cel puțin unei porțiuni a particulelor de fagemid la moleculele țintă imobilizate. în mod normal, condi- 19 țiile, și anume pH-ul, concentrația ionilor, temperatura etc., vor fi asemănătoare condițiilor fiziologice. 21

Particulele de fagemid legate (particule cu capacitate de legare) care au afinitate mare pentru moleculele țintă imobilizate, se separă prin spălare de cele cu afinitate scăzută 23 (care nu se leagă deci la moleculele țintă). Particulele cu capacitate de legare pot fi disociate de moleculele țintă prin diverse metode. Aceste metode pot fi reprezentate de disocierea cu 25 ligandul de tip sălbatic, modificarea pH-ului și/sau a concentrației ionice și alte metode cunoscute în domeniu. 27

Se infectează celule gazdă adecvate cu particule cu capacitate de legare și cu fagi helper și se cultivă în condiții adecvate pentru amplificarea particulelor de fagemid. Parti- 29 culele de fagemid sunt apoi colectate și se repetă procesul de selecție încă o dată sau de mai multe ori, până ce sunt selectate particulele cu capacitate de legare, care au afinitatea 31 dorită fată de molecula tintă.

I 1 în mod opțional, colecția de particule de fagemid poate fi pusă în contact în mod 33 succesiv, cu mai multe tipuri de molecule țintă imobilizate, pentru a ameliora selectivitatea pentru o anumită moleculă țintă. De exemplu, se întâmplă deseori ca un ligand precum hGH 35 să aibă mai multe tipuri de receptori naturali. în cazul hGH, acesta se leagă atât la receptorii săi, cât și la receptorii pentru prolactină. Se poate dori deci ameliorarea selectivității hGH 37 pentru proprii săi receptori, față de receptorii prolactinei. Aceasta se poate realiza prin punerea în contact a colecției de particule de fagemid, mai întâi cu receptorii imobilizați ai pro- 39 lactinei, eluând acele particule cu afinitate scăzută față de receptorii prolactinei (și anume mai mică decât cea a tipului sălbatic de hGH), urmată de punerea în contact a particulelor 41 cu afinitate scăzută sau nulă față de receptorii prolactinei, cu receptorii imobilizați ai hormonului de creștere, selectând de data aceasta particulele cu afinitate înaltă față de acești 43 receptori. în acest caz, un hGH mutant cu afinitate mai scăzută pentru receptorii prolactinei va fi util din punct de vedere terapeutic chiar dacă afinitatea pentru receptorii săi va fi relativ 45 mai scăzută comparativ cu tipul sălbatic de hormon de creștere uman. Se poate utiliza aceeași strategie și la ameliorarea selectivității unui anumit hormon sau a unei anumite pro- 47 teine față de receptorii pentru funcția ei primară, în detrimentul afinității pentru receptorii săi de clearance. 49

RO 120848 Β1 într-o altă variantă a acestei invenții, se poate obține o secvență ameliorată de aminoacizi cu rol de substrat. Acestea pot fi utile pentru sinteza unor situsuri de excizie mai bune pentru linkerii proteinelor, sau pentru inhibitori sau substrate mai bune ale proteazelor. în această variantă, se realizează fuziunea unui receptor al unei molecule imobilizabile (de exemplu, hGH), biotină-avidină sau una capabilă de legare covalentă la o matrice, cu gena III prin intermediul unui linker. Linkerul va fi format în mod preferabil din 3 până la 10 aminoacizi și va funcționa ca substrat pentru o protează. Se va construi un fagemid conform descrierii de mai sus, în care ADN-ul ce codifică regiunea linker suferă mutații întâmplătoare, obținându-se astfel o colecție variabilă de particule de fagemid cu diferite secvențe de aminoacizi, la nivelul situsului de legare. Colecția de particule de fagemid este apoi imobilizată pe o matrice și expusă la proteaza dorită. Particulele de fagemid cu secvențe de aminoacizi în regiunea liniară, preferate sau mai bune pentru proteaza dorită, vor fi eluate, obținându-se mai întâi un amestec îmbogățit de particule de fagemid ce codifică linkeri, preferat. Aceste particule de fagemid sunt apoi supuse aceluiași tratament de încă câteva ori, obținându-se un amestec îmbogățit de particule ce codifică secvența (secvențe) consens.

II. Producerea de anticorpi

Anticorpul inițial poate fi preparat prin tehnici cunsocute în domeniu. Metode reprezentative de producere a anticorpilor sunt descrise în detaliu în paragrafele următoare.

Anticorpul este sintetizat împotriva antigenului dorit. în mod preferabil, antigenul este un polipeptid important din punct de vedere biologic, iar administrarea anticorpului la un mamifer care suferă de o boală sau de o tulburare poate avea ca rezultat un beneficiu terapeutic pentru mamiferul respectiv. Sunt studiați totuși și anticorpii sintetizați împotriva antigenelor de altă origine decât polipeptidică (precum antigenele glicolipidice asociate tumorilor; vezi US 5091178).

Atunci când antigenul este un polipeptid, el poate fi o moleculă transmembranară (de exemplu, receptor) sau un ligand, cum este de exemplu un factor de creștere. Antigene reprezentative pot fi molecule precum renina; hormonul de creștere, inclusiv hormonul de creștere uman și hormonul de creștere bovin; factorul eliberator de hormon de creștere; parathormonul; glucagonul, factori de coagulare precum proteina C; factorul natriureticatrial; surfactantul pulmonar; un activator al plasminogenului precum urokinaza sau urina umană sau activatorul tisular al plasminogenului (tPA); bombesina; trombina; factorul de creșterehematopoietic; factorul de necroză tumorală -alfa și -beta; enkefalinaza; RANTES (activator controlat exprimat și secretat în mod normal de celule T; proteina inflamatorie din macrofagele umane (ΜΙΡ-1-a/fa); o albumină serică precum albumina serică umană; substanța de inhibiție mulleriană; lanțul A al relaxinei; lanțul B al relaxinei; prorelaxina; peptidul asociat gonadotropinei de la șoarece; o proteină microbiană precum betalactamaza; DNaza; IgE; un antigen asociat limfocitelorT citotoxice (CTLA) precum CTLA-4; inhibina; activina; factori de creștere a endoteliului vascular (VEGF); receptori pentru hormoni sau pentru factori de creștere; proteina A sau D; factori reumatoizi; un factor neurotrofic precum factorul neurotrofic derivat din țesut osos (PDNF), neurotrofina -3, -4, -5 sau -6 (NT-3, NT-4, NT-5 sau NT-6), sau un factor de creștere a nervului precum NGF-β; un factor de creștere plachetar(PDGF); factori fibroblastici de creștere precum aFGF și bFGF; un factor de creștere epidermală (EGF); factor transformant de creștere (TGF) precum TGF - alfa și TGF-befa, inclusiv TGFβ1, TGFP2, TGFȘ3, ΤΟΕβ4 sau ΤΰΡβδ; factori de creștere asemănători insulinei I și II (IGF-I și IGF-II) des(1-3)-IGF-l(IGF-l cerebral), proteina de legare a factorilor de creștere asemănători insulinei; proteine CD precum CD3, CD4, CD8, CD19 și CD20; eritropoietină; factori osteoinductori; imunotoxine; o proteină morfogenetică osoasă (BMP); un interferon precum interferon-a/fa, -beta, și -gama; factori de stimulare a coloniilor (CSF), de exemplu, M-CSF,

RO 120848 Β1

GM-CSF și G-CSF; interleukine (IL), de exemplu, de la IL-1 la IL-10; dismutaza superoxidică;1 receptori ai celulelor T; proteine membranare de suprafață; receptori homing; adresine; proteine de reglare; integrine precum CD11a, CD11b, CD11c, CD18 și ICAM, VLA-4 și VCAM;3 un antigen tumoral precum receptorul HER2, HER3 sau HER4; și fragmente ale oricăreia dintre polipeptidele enumerate mai sus.5

Molecule țintă preferate pentru anticorpi și care sunt cuprinse în domeniul prezentei invenții sunt reprezentate de proteinele CD precum CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 și CD34;7 membrii familiei de receptori ErbB precum receptorii EGF, receptorii HER2, HER3 sau HER4; moleculele de adeziune celulară precum LFA-1, Maci 2, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM și 9 integrina av/B3 fie cu subunitatea a, fie cu subunitatea β ale acestora (de exemplu, anticorpi anti-CD11a, anti-CD18 sau anti-CD11b); factori de creștere precum VEGF; IgE; antigen de 11 grup sanguin; receptorii flk2/flk3; receptorii obezității (OB); receptorii mpl; CTLA-4; proteina

C, etc. O țintă, în special, preferată, este IgE. 13

Anticorpul este sintetizat împotriva unui antigen care derivă de la o primă specie de mamifer. Este preferabil ca prima specie de mamifer să fie omul. Se pot lua în considerare 15 totuși și alte mamifere precum animale de fermă, de casă sau de la zoo, de exemplu, atunci când se intenționează ca anticorpii să fie utilizați la tratarea acestor animale. Antigenul de 17 la prima specie de mamifer se poate izola dintr-o sursă naturală a acestuia, în scopul sintetizării anticorpilor corespunzători. Se pot utiliza totuși ca imunogene pentru fabricarea anti- 19 corpilor celule care conțin antigenul, conform descrierii de mai jos. în alte variante, antigenul se poate obține prin recombinare sau prin alte metode de sinteză. Anticorpul selectat are în 21 mod normal o afinitate suficient de mare pentru antigenul respectiv. De exemplu, anticorpul poate lega antigenul provenit de la prima specie de mamifer cu o valoare a afinității de legare 23 (Kd) de cel mult 1 x 10'⁷M, preferabil de cel mult 1 x W⁸, și în cel mai bun caz de cel mult x 10‘⁹M. Afinitatea anticorpului se poate determina de exemplu, prin legarea până la satu- 25 rație, prin ELISA și prin teste de competiție (de exemplu, RIA).

De asemenea, anticorpul poate fi supus și altor teste de analiză a activității biologice, 27 în scopul evaluării eficacității sale terapeutice. Astfel de teste sunt cunoscute în domeniu și se aleg în funcție de antigenul țintă și de utilizarea dorită a anticorpului. Ca exemple, se pot 29 enumera testul de adeziune în strat unic a keratinocitelor și testul răspunsului mixt al limfocitelor (MFR) pentru CD11a (descris fiecare în exemplul de mai jos); teste de inhibiție a creș- 31 terii tumorale (conform descrierii WO 89/06692, de exemplu); teste de citotoxicitate celulară dependentă de anticorp (ADCC) și de citotoxicitate mediată de complement (CDC) 33 (US 5500362) și teste de activitate agonistă sau de hematopoieză (vezi WO 95/27062).

Pentru selecția anticorpilor care se leagă la un anumit epitop din structura antigenului 35 de interes (de exemplu, aceia care blochează legarea anticorpului MHM24), se poate realiza un test obișnuit de blocare încrucișată precum cel descris în Antibodies, A Laboratory 37 Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow și David Lane (1988). în mod alternativ, se poate realiza harta epitopilor, de exemplu, conform descrierii lui Champe și colab., J. Biol. 39 Chem. 270:1388 -1394(1995), pentru a determina dacă anticorpul se leagă la un epitop de interes. 41

Se determină apoi dependența de specie a anticorpului. Se evaluează afinitatea de legare a anticorpului față de un omolog al antigenului care a fost utilizat la sinteza anticor- 43 pului (omologul provenind de la o a doua specie de mamifer), utilizând tehnici în conformitate cu cele descrise mai sus. în variante preferate, a doua specie de mamifer este un alt mamifer 45 decât omul, căruia i se administrează anticorpul în cursul studiilor preclinice. Prin urmare, cea de a doua specie de mamifer poate fi o primată precum maimuța rhesus, cynomolgus, 47 babuin, cimpanzeu și macac. în alte variante, cea de-a doua specie de mamifere poate fi,

RO 120848 Β1 de exemplu, un rozător, pisică sau câine. Anticorpii dependenți de specie vor avea în mod normal o afinitate de legare față de antigenul provenit de la cea de-a doua specie de mamifere non-umană, de aproape cel puțin 50 de ori sau de aproape cel puțin 500 de ori sau de aproape cel puțin 100 de ori mai slabă decât afinitatea sa de legare față de antigenul provenit de la prima specie de mamifere. Această afinitate de legare va fi în mod normal de așa natură, încât anticorpul cu specificitate de specie nu poate fi utilizat în mod eficient în studiile preclinice realizate pe cea de-a doua specie de mamifer.

în timp ce metoda preferată a acestei invenții, de determinare a dependenței de specie (și de evaluare a anticorpilor mutanți cu proprietăți îmbunătățite; a se vedea mai jos), este reprezentată la cuantificarea afinității de legare a anticorpului, în alte variante ale invenției, se evaluează una sau mai multe proprietăți biologice ale anticorpilor și ale anticorpilor mutanți dependenți de specie, pe lângă determinarea afinității de legare sau în locul acesteia. Teste biologice, reprezentative în acest sens, sunt descrise mai sus. Astfel de teste sunt utile, în special, când furnizează un indiciu în ceea ce privește eficacitatea terapeutică a anticorpului. în mod normal, deși nu neapărat, anticorpii care prezintă proprietăți îmbunătățite la aceste teste, vor avea și o afinitate de legare crescută. Astfel, într-o variantă a acești invenții, în care testul de elecție este un test de evaluare a activității biologice, altul decât un test de evaluare a afinității de legare, anticorpul cu specificitate de specie va avea în mod normal o activitate biologică în condițiile utilizării unui material (de exemplu, antigen, celulă, țesut, organ sau întregul animal) de la cea de-a doua specie de mamifer, care este de aproape cel puțin 500 de ori sau de aproape cel puțin 1000 de ori mai puțin eficientă decât activitatea sa biologică evaluată într-un test corespunzător, utilizând reactivi provenind de la prima specie de mamifer.

Anticorpul cu specificitate de specie este apoi modificat, astfel încât să se obțină un anticorp mutant care are o afinitate de legare față de antigenul provenit de la cea de-a doua specie de mamifer, mai puternică decât anticorpul cu specificitate de specie. Anticorpul mutant are în mod preferabil o afinitate de legare față de antigenul provenit de la mamiferul non-uman, care este de aproximativ cel puțin 10 ori mai mare, preferabil de aproape cel puțin 20 de ori mai mare și mai preferabil de aproape cel puțin 50 de ori mai mare și câteodată de aproape cel puțin 100 de ori sau de 200 de ori mai mare, decât afinitatea de legare a anticorpului cu specificitate de specie față de antigen. Creșterea dorită sau necesară a afinității de legare va depinde de afinitatea de legare inițială a anticorpului cu specificitate de specie. Se utilizează totuși un test de evaluare a activității biologice, preferându-se ca anticorpul mutant să aibă o activitate biologică în testul ales, de aproape cel puțin 10 ori mai bună, preferabil, de aproape cel puțin 20 de ori mai bună, mai preferabil, de aproape cel puțin 50 de ori mai bună, și câteodată, de aproape cel puțin 100 de ori sau 200 de ori mai bună decât activitatea biologică a anticorpului cu specificitate de specie, evaluată în același test.

Pentru obținerea anticorpului mutant, se realizează una sau mai multe modificări ale aminoacizilor (de exemplu, substituții) la nivelul resturilor de aminoacizi din regiunea scheletului structural, în structura anticorpului cu specificitate de specie, care determină o ameliorare a afinității de legare a anticorpului mutant față de antigenul de la cea de-a doua specie de mamifer. Exemple de resturi de aminoacizi din regiunea scheletului structural, care pot fi modificate, sunt reprezentate de acelea care leagă direct antigenul prin legături necovalente (Amitși colab., Science 233:747 - 753 (1986)); care interacționează cu conformația unei regiuni CDR sau care participă la aceasta (Chothia și colab., J. Mol. Biol. 196: 901 - 917 (1987)); și/sau participă la interfața VL-VH (EP 239 400 B1).

RO 120848 Β1 în unele cazuri, prin modificarea unuia sau mai multor resturi de aminoacizi ale unei 1 astfel de regiuni a scheletului structural, se obține o creștere a afinității de legare a anticorpului față de antigenul provenit de la cea de-a doua specie de mamifer. De exemplu, conform 3 acestei variante a invenției, se pot modifica de la unul până la aproximativ cinci resturi de aminoacizi ale scheletului structural. Câteodată poate fi suficient pentru obținerea unui anti- 5 corp mutant care să poată fi folosit în experimentele preclinice, chiar și acolo unde nu a fost modificat nici unul dintre resturile de aminoacizi ale regiunii hipervariabile. în mod normal, 7 anticorpul mutant va conține însă modificări suplimentare ale regiunii hipervariabile.

Resturile de aminoacizi ale regiunii hipervariabile care vor fi modificate pot fi schim- 9 bate în mod aleator, în special, atunci când afinitatea inițială de legare a anticorpului cu specificitate de specie față de antigenul provenit de la cea de-a doua specie de mamifere 11 este de așa natură, încât anticorpii mutanți, produși astfel, în mod aleator, să poată fi rapid selectați. 13

Tehnicile de obținere a anticorpilor care pot fi dependenți de specie, necesitând deci modificări conform metodelor prezentate în descriere, constau în: 15

A. Prepararea anticorpului (i) Prepararea antigenului 17

Se pot utiliza, ca imunogen pentru producerea anticorpilor, antigene solubile sau fragmente ale acestora, conjugate în mod opțional cu alte molecule. în cazul moleculelor trans- 19 membranare precum receptorii, se pot utiliza ca imunogene fragmente ale acestora (de exemplu, domeniul extracelular al unui receptor). în mod alternativ, se pot utiliza, ca imuno- 21 gene, celule care exprimă molecula transmembranară. Astfel de celule pot proveni dintr-o sursă naturală (de exemplu, linii de celule canceroase) sau pot fi celule care au fost transfer- 23 mate prin tehnici de recombinare, astfel încât să exprime proteina transmembranară. Specialiștii în domeniu vor remarca posibilitatea utilizării și a altor antigene și forme ale acestora, 25 utile pentru prepararea anticorpilor.

(ii) Anticorpi policlonali 27

Anticorpii policlonali sunt sintetizați, în mod preferabil, la mamifere non-umane, prin injecții subcutanate (SC) sau intraperitoneale (ip) multiple, cu antigenul respectiv, împreună 29 cu un adjuvant. Poate fi utilă conjugarea antigenului respectiv la o proteină care are capacitate imunogenă la speciile care vor fi imunizate, de exemplu, hemocianina unei specii de 31 moluscă, albumina serică, tiroglobulina bovină, sau inhibitorul tripsinei de soia, utilizând un agent de derivare sau bifuncțional, de exemplu, ester sulfosuccinimidic de maleimidobenzoil 33 (conjugare prin intermediul resturilor de cisteină), N-hidroxisuccinimidă (prin intermediul resturilor de lizină), glutaraldehidă, anhidridă succinică, clorură de tionil sau R¹N=C=CR, în 35 care R și R¹ sunt grupări alchil diferite.

Animalele sunt imunizate împotriva antigenului, împotriva conjugatelor sau derivatelor 37 imunogene, prin combinarea, de exemplu, a 100 sau 5 pg de proteină sau conjugat (pentru iepuri sau respectiv șoarece) cu 3 volume de adjuvant complet Freund și injectarea intra- 39 dermică a soluției în locuri multiple. După o lună de zile, sunt stimulate cu 1/5 până la 1/10 din cantitatea inițială de peptidă sau conjugat în adjuvant complet Freund, prin injecții sub- 41 cutanate în locuri multiple. După 7 până la 14 zile, se recoltează sânge de la animale și se evaluează titrul anticorpilor în ser. Animalele sunt stimulate până ce titrul anticorpilor atinge 43 faza de platou. în mod preferabil, animalul este stimulat cu conjugatul aceluiași antigen, dar conjugat la o proteină diferită și/sau prin intermediul unui reactiv diferit de legare încrucișată. 45 Conjugatele se pot prepara și din fuziuni proteice din culturi celulare recombinante. De asemenea, se pot folosi, pentru intensificarea răspunsului imun, agenți adecvați de agregare 47 precum alaun. Anticorpul de mamifer selectat va avea în mod normal o afinitate de legare

RO 120848 Β1 a antigenului suficient de puternică. De exemplu, anticorpul poate lega antigenul uman antiIgE, cu o afinitate de legare (kd) având o valoare de cel mult 1 x 10'⁷ M, preferabil cel mult 1 x 10'⁸ M și cel mai preferabil o valoare de cel mult 1 x 10'⁹ M. Se poate determina afinitatea anticorpilor prin legare până la saturație, prin test ELISA și prin teste de competiție (de exemplu, RIA).

în vederea selecției anticorpilor umani anti-lgE din punct de vedere al capacității de legare, se poate realiza un test obișnuit de legare încrucișată precum cel descris în Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator, Ed Harlow și David Lane (1988). în mod alternativ, se poate realiza harta epitopilor, de exemplu, conform descrierii lui Champe și colab., J. Biol. Chem. 270:1388 -1394 (1995). în timp ce metoda preferată de determinare a eficienței polipeptidei sau anticorpului este cuantificarea afinității de legare a anticorpului, alte variante prevăd evaluarea uneia sau a mai multor proprietăți biologice în plus față de determinarea afinității de legare sau în locul acesteia. Astfel de teste sunt utile, în special, atunci când furnizează un indiciu legat de eficiența terapeutică a anticorpului. în mod normal, deși nu este necesar, anticorpii care prezintă proprietăți îmbunătățite în urma evaluării prin aceste teste, vor avea și o afinitate de legare crescută.

(iii) Anticorpi monoclonali

Anticorpii monoclonali sunt anticorpi care recunosc un singur situs antigenic. Datorită specificității lor uniforme, anticorpii monoclonali sunt mult mai utili decât anticorpii policlonali care conțin de obicei anticorpi ce recunosc o varietate de situsuri antigenice diferite.

Anticorpii monoclonali pot fi sintetizați prin metoda hibridoma descrisă pentru prima dată de Kohler și colab., Nature, 256: 495 (1975), sau prin metode de recombinare ADN (US 4816567).

în metoda hibridoma, se realizează imunizarea unui animal adecvat, de exemplu, șoarece, hamster sau macac, conform descrierii de mai sus, astfel încât să se stimuleze proliferarea limfocitelor care produc sau care sunt capabile să producă anticorpi ce se leagă specific la proteina utilizată pentru imunizare. în mod alternativ, limfocitele pot fi imunizate in vitro. Se realizează apoi fuziunea limfocitelor cu celule de mielom, cu ajutorul unui agent adecvat de fuziune, cum ar fi polietilenglicolul, obținându-se o celulă de hibridom (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, pg.590 -103 (Academic Press, 1986)).

Celulele hibridoma, astfel preparate, sunt însămânțate și cultivate într-un mediu de cultură corespunzător, care conține, în mod preferat, una sau mai multe substanțe care inhibă creșterea sau supraviețuirea celulelor inițiale de mielom care nu au fuzionat. De exemplu, dacă celulelor de mielom parentale le lipsește enzima hipoxantin-guanin-fosforibozil transferaza (HGPRT sau HPRT), mediul de cultură pentru hibridoma va conține în mod caracteristic hipoxantină, aminopterină și timidină (mediu HAT), aceste substanțe prevenind creșterea celulelor deficitare în HGPRT.

Celule de mielom preferate sunt acelea care fuzionează în mod eficient, asigură o producție de anticorpi la un nivel înalt și stabil de către celulele producătoare de anticorpi selectate și sunt sensibile la un mediu de tipul mediului HAT. Printre aceste linii celulare de mielom preferate sunt liniile de mielom de tip murină precum cele ce provin din tumorile de șoarece MOPC-21 și MPC-11, ce se pot procura de la Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA și celule SP-2 sau X63-Ag8-653, ce se pot procura de la Colecția Americană de Tipuri de Celule, Rockville, Maryland, SUA. Au fost, de asemenea, descrise ca producătoare de anticorpi umani monoclonali și celulele de mielom uman precum și celulele de mielom heterogen de la om și șoarece (Kozbar, J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeurși colab., Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, pg.51 -63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

RO 120848 Β1

Mediul de cultură în care se cultivă celulele hibridoma se analizează din punct de 1 vedere al producției de anticorpi monoclonali sintetizați împotriva antigenului. în mod preferabil, se determină specificitatea de legare a anticorpilor monoclonal produși de celulele 3 hibridoma, prin imunoprecipitare sau printr-un test de legare in vitro precum RIAsau ELISA.

După identificarea celulelor hibridoma care produc anticorpi cu specificitatea, afini- 5 tatea și/sau activitatea dorită, clonele pot fi subclonate prin limitarea procedurilor de diluție și pot fi cultivate prin metode standard (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and 7 Practice, pg. 59 - 103, Academic Press, 1986)). Mediile de cultură adecvate pentru acest scop sunt reprezentate, de exemplu, de mediul D-MEM sau RPMI-1640. în plus, celulele 9 hibridoma mai pot fi cultivate și in vivo, ca tumori cu lichid de ascită ale unui animal.

Anticorpii monoclonali, secretați de subclone, se separă în mod corespunzător din 11 mediul de cultură, din lichidul de ascită sau din ser, prin procedee convenționale de purificare a imunoglobulinelor precum, de exemplu, proteina A-Sefaroză, cromatografie pe hidroxi- 13 apatită, electroforeză în gel, dializă sau cromatografie de afinitate.

ADN-ul ce codifică anticorpii monoclonali este rapid izolat și secvențializat prin pro- 15 cedee standard (de exemplu, utilizând sonde oligonucleotidice care sunt capabile să se lege specific la gene care codifică lanțurile grele și ușoare ale anticorpilor monoclonali). Celulele 17 hibridoma sunt o sursă preferată de astfel de ADN. După izolarea sa, ADN-ul poate fi introdus în vectori de expresie, care sunt apoi transferați în celule gazdă precum celule E. 19 coli, celule COS de maimuță, celule ovariene de hamster chinezesc (CHO) sau celule de mielom care nu produc de obicei proteine de tip imunoglobulină, obținându-se astfel sinteza 21 anticorpilor monoclonali în celulele gazdă recombinante. Producția recombinantă de anticorpi va fi prezentată în detaliu, mai jos. 23

Conform unei alte variante, se pot izola anticorpi sau fragmente de anticorpi de la colecții de fagi produse prin tehnicile descrise de Mc Cafferty și colab., Nature 348:522- 25

554(1990). Clackson și colab., Nature 352: 624 - 628 (1991) și Marks și colab., J. Mol. Biol. 222:581 - 597(1991) descriu izolarea anticorpilor umani și respectiv a anticorpilor de tip mu- 27 rină, cu ajutorul colecțiilor de fagi. Publicații ulterioare descriu producția de anticorpi umani cu afinitate înaltă (de ordinul nM), prin amestecarea lanțurilor (Marks și colab., Biotechno- 29 logy 10:779 - 783 (1992)), precum și prin infecția combinată și prin recombinarea in vivo, ca strategii de obținere a unor colecții de fagi de mare amploare (Waterhouse și colab., Nuc. 31 Acids Res. 2V. 2265 - 2266(1993)). Aceste tehnici reprezintă deci alternative viabile la tehnicile tradiționale de producere de anticorpi monoclonali cu ajutorul celulelor hibridoma 33 și de izolare a acestora.

ADN-ul poate fi, de asemenea, modificat, de exemplu, prin substituția cu domeniile 35 constante ale lanțurilor grele și ușoare, în locul secvențelor omoloage din structura anticorpilor de tip murină (US 4816567; Morrison și colab., Proc Natl. Acad. Sci. USA 81; 37

6851(1984), sau prin legarea covalentă la polipeptida de tip imunoglobulină.

în mod caracteristic, în aceste polipeptide, care nu sunt de tip imunoglobulină, se 39 realizează substituția cu domeniile variabile ale unui situs de legare a antigenului, din structura unui anticorp, obținându-se astfel un anticorp himeric bivalent, care conține un situs de 41 legare a antigenului care are specificitate pentru un antigen și un alt situs de legare a antigenului care este specific pentru un alt antigen diferit. 43 (iv) Obținerea de anticorpi mutanți

După identificarea și izolarea anticorpului cu specificitate de specie, acesta se utili- 45 zează deseori la obținerea unei variante de anticorp sau a unui anticorp mutant, în care se modifică unul sau mai multe resturi de aminoacizi, la nivelul uneia sau mai multora dintre 47 regiunile hipervariabile ale anticorpului de mamifer. în mod alternativ sau pe lângă aceasta, se pot realiza una sau mai multe modificări (de exemplu, substituții) la nivelul resturilor de 49 aminoacizi ale catenei structurale a anticorpului de mamifer, determinând astfel o îmbunătățire a afinității de legare a anticorpului mutant față de IgE umană. Exemple de resturi de 51

RO 120848 Β1 aminoacizi, ale regiunii scheletului structural, care pot fi modificate, sunt reprezentate de acelea care leagă antigenul direct prin legături necovalente (Amit și colab., Science 233: 747 - 753 (1986)); care interacționează cu conformația regiunilor CDR sau participă la aceasta (Chothia și colab. J. Mol. Biol. 196: 901 - 917 (1987)); și/sau care participă la interfața VL-VH (EP 239 400 B1). Conform unor anumite variante, prin modificarea unuia sau a mai multor astfel de resturi de aminoacizi din structura catenei structurale, se obține o creștere a afinității de legare a anticorpului, față de antigenul uman. De exemplu, conform acestei variante a invenției, se pot modifica unul până la aproximativ cinci resturi de aminoacizi din structura scheletului structural. Câteodată, acest lucru este suficient pentru obținerea unui anticorp mutant adecvat utilizării în studiile preclinice, chiar și atunci când nu a fost modificată niciuna dintre regiunile hipervariabile. în mod normal, anticorpul mutant va conține totuși modificări suplimentare ale regiunii hipervariabile.

Resturile de aminoacizi ale regiunii hipervariabile, care vor fi modificate, pot fi schimbate în mod aleator, în special, atunci când afinitatea de legare inițială a anticorpului cu specificitate de specie este de așa natură, încât să se poată realiza selecția rapidă a anticorpilor mutanți, obținuți în mod aleator.

Un procedeu util de obținere a anticorpilor mutanți este cunsocut sub numele de mutageneză prin explorare cu alanină (Cunningham, B.C. și Wells, J.A., Science 244:1081 1085 (1989); Cunningham, B.C. și Wells, J.A., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84 - 6434 - 6437 (1991)). Conform acestui procedeu, se înlocuiesc unul sau mai multe resturi de aminoacizi ale regiunii hipervariabile cu resturi de alanină sau de polialanină, pentru a modifica interacțiunea aminoacizilor cu antigenul provenit de la cea de-a doua specie de mamifer. Acele resturi de aminoacizi ale regiunii hipervariabile, care dovedesc sensibilitate funcțională la substituții, sunt apoi îmbunătățite prin introducerea unor mutații suplimentare sau a altor mutații la nivelul situsurilor de substituție sau în locul acestora. Astfel că, în timp ce situsul în care se realizează o variație a secvenței de aminoacizi este prestabilit, natura mutației în sine nu trebuie să fie neapărat prestabilită. Mutanții -Ala obținuți în acest mod sunt selectați din punct de vedere al proprietății dorite, care se datorează prezenței resturilor de scanare.

Invenția se mai referă și la o metodă mai sistematică de identificare a resturilor de aminoacizi care se modifică. Conform acestei metode, se identifică resturile regiunilor hipervariabile din structura anticorpului cu specificitate de specie, care sunt implicate în legarea antigenului provenit de la prima specie de mamifer și acele resturi de aminoacizi ale regiunilor hipervariabile care sunt implicate în legarea unui antigen omolog provenit de la cea de-a doua specie de mamifer. în acest scop, se poate realiza o explorare cu alanină, a resturilor de aminoacizi ale regiunii hipervariabile ale anticorpului cu specificitate de specie, analizându-se fiecare mutant -Ala din punct de vedere al capacității de legare a antigenelor de la prima și de la cea de-a doua specie de mamifere. Se identifică apoi resturile de aminoacizi ale regiunii hipervariabile, implicate în legarea antigenului provenit de la prima specie de mamifer (de exemplu, de la om) și acelea implicate în legarea antigenului omolog provenit de la cea de-a doua specie de mamifer (de exemplu, de la o specie non-umană). în mod preferabil, se aleg pentru modificare acele resturi de aminoacizi care sunt implicate în mod considerabil în legarea antigenului provenit de la cea de-a doua specie de mamifer (de exemplu, o specie non-umană) și nu acelea implicate în legarea antigenului provenit de la prima specie de mamifer (de exemplu, omul). Conform unei alte variante, sunt selectate, în scopul modificării, acele resturi de aminoacizi care sunt implicate în legarea ambelor antigene, provenite atât de la prima, cât și de la cea de-a doua specie de mamifer. Conform unei alte variante, mai puțin preferate însă, se selectează, pentru modificare, acele resturi de aminoacizi implicate în legarea antigenului reprezentat de IgE umană și nu a antigenului omolog reprezentat de IgE de la un alt mamifer (non-uman). O astfel de modificare poate consta în deleția restului de aminoacid sau în inserția unuia sau a mai multor resturi de aminoacizi în vecinătatea restului de aminoacid de interes. în mod normal, modificarea constă totuși în substituția restului de aminoacid cu altul.

RO 120848 Β1 în mod caracteristic, se poate începe cu o substituție conservatoare precum cele prezentate în tabelul A de mai jos, sub titlul de “substituții preferate. Dacă aceste substituții determină o modificare a activității biologice (de exemplu, a afinității de legare), atunci se realizează modificări mai importante, denumite “substituții reprezentative în tabelul A sau în descrierea de mai jos, referitor la clasele de aminoacizi, și apoi se realizează selecția produșilor.

Tabelul A

Substituții conservatoare ale resturilor de aminoacizi

Restul de aa inițial	Substituții reprezentative	Substituții preferate	Codoni ADN
Ala(A)	val, leu, ile	val	GCA, GCC, GCG, GCU
Arg®)	lys, gin, asn	lys	AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
Asn(N)	gin, his, lys, arg	gin	AAC, AAU
Asp(D)	glu	glu	GAC, GAU
Cys(C)	ser	ser	UGC, UGU
Gln(Q)	asn	asn	CAA, CAG
Glu(E)	asp	asp	GAA, GAG
Gly(G)	pro, ala	ala	GGA, GGC, GGG, GGU
His(H)	asn, gin, lys, arg	arg	CAC, CAU
lie(l)	leu, val, met, ala, phe, norleucine	leu	AUA, AUC, AUU
Leu(L)	norleucine, ile, val, met, ala, phe	ile	UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
Lys(K)	arg, gin, asn	arg	AAA, AAG
Met(M)	leu, phe, ile	leu	AUG
Restul de aa inițial	Substituții reprezentative	Substituții preferate	Codoni ADN
Phe(F)	leu, val, ile, ala, tyr	leu	IIC, UUU
Pro(P)	ala	ala	CCA, CCC, CCG, CCU
Ser(S)	thr	thr	AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
Thr(T)	ser	ser	ACA, ACC, ACG, ACU
Trp(W)	tyr, phe	tyr	UGG
Tyr(Y)	trp, phe, thr, ser	phe	UAC, UAU
Val(V)	ile, leu, met, phe	leu	GUA, GUC, GUG, GUU

RO 120848 Β1

Se pot realiza și modificări mai considerabile ale proprietăților biologice ale anticorpilor, prin selecția substituțiilor care diferă în mod semnificativ din punct de vedere al efectului lor asupra păstrării: (a) structurii axului polipeptidic în zona de substituție, de exemplu, configurația plană sau helicoidală; (b) asupra păstrării sarcinii sau a caracterului hidrofob al moleculei la nivelul situsului țintă sau (c) asupra păstrării mărimii catenei secundare. Resturile de aminoacizi care există în mod natural, se pot împărți în grupe, pe baza proprietăților comune ale catenei secundare:

(1) hidrofobe: norleucină, met, ala, val, leu, ile;

(2) neutre hidrofile: cys, ser, thr, asn, gin;

(3) acide: asp, glu;

(4) bazice: his, lys, arg;

(5) resturi care influențează orientarea lanțului: gly, pro, și (6) aromatice: trp, tyr, phe.

Prin substituții reconservatoare, se poate ca un membru al uneia dintre aceste clase să devină membru al altei clase.

Se prepară molecule de acid nucleic ce codifică secvențe de aminoacizi mutante, prin diverse metode cunoscute în domeniu. Aceste metode sunt reprezentate printre altele, de mutageneză mediată de oligonucleotid (sau orientată situs), mutageneza PCR și mutageneza la nivelul casetei, a unui mutant preparat sau a unei variante nemutante, ale anticorpului cu specificitate de specie. Metoda preferată de obținere a mutanților este mutageneza orientată în situs (vezi Kunkel) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82: 488 (1985)).

Conform anumitor variante, anticorpul mutant va avea un singur rest de aminoacid substituit la nivelul regiunii hipervariabile, și anume de la două până la aproape cincisprezece substituții în regiunea hipervariabilă.

De obicei, anticorpul mutant cu proprietăți biologice ameliorate va avea o secvență de aminoacizi identică sau similară în proporție de cel puțin 75% cu secvența de aminoacizi a domeniului variabil fie de la nivelul lanțului ușor, fie de la nivelul lanțului greu, din structura unui anticorp anti-lgE umană, produs de un mamifer, în mod preferabil, în proporție de cel puțin 80%, și mai preferabil, în proporție de cel puțin 85% și chiar mai mult, în proporție de 90%, cazul cel mai preferat fiind acela în care identitatea are o valoare procentuală de cel puțin 95%. Referitor la această secvență, identitatea sau similaritatea este definită prin procentul de resturi de aminoacizi din secvența analizată care sunt identice (și anume același rest) sau similare (adică rest de aminoacid care face parte din același grup, pe baza proprietăților comune ale catenei secundare, prezentate mai sus) cu resturile de aminoacizi din structura anticorpului cu specificitate de specie, după alinierea secvențelor și introducerea spațiilor, dacă este necesar, pentru obținerea procentului maxim de identitate a secvenței.

în mod alternativ, se pot obține anticorpi mutanți prin mutații sistematice ale regiunilor CDR ale lanțurilor grele și ușoare din structura anticorpului anti-lgE. Procedeul preferat de obținere a unor astfel de anticorpi mutanți implică utilizarea maturației afinității cu ajutorul prezentării la nivelul fagilor (Hawkins și colab., J. Mol. Biol. 254:889 - 896 (1992) și Lowman și colab., Biochimia 30 (45):10832 -10838 (1991)). Fuziunile cu proteina de înveliș a bacteriofagului (Smith, Science 228:1315 (1985); Scott și Smith, Science 249: 386 (1990); Cwirla și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA &: 309 (1990); Devlin și colab., Science 249: 404 (1990=; revăzută de Wells și Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 597 (1992); brevet US 5223409) sunt cunoscute ca fiind utile pentru asocierea fenotipului proteinelor sau peptidelor prezentate cu genotipul particulelor de bacteriofag care le codifică. Au fost prezentate la nivelul fagilor și domeniile F(ab) ale anticorpilor (Mc Cafferty și colab., Nature 348: 552 (1990); Barbas și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 7978 (1991); Garrard și colab., Biotechnol. 9: 1373 (1991)).

RO 120848 Β1

Prezentarea monovalentă la nivelul fagului constă în prezentarea unui grup de va- 1 riante ale proteinei, sub formă de fuziuni la o proteină de înveliș a bacteriofagului, astfel încât prezentarea variantelor să se limiteze la o singură copie corespunzătoare câtorva particule 3 fagice (Bass și colab., Proteins &: 309 (1990)). S-a realizat anterior maturația afinității sau ameliorarea echilibrului afinității de legare a diverselor proteine, prin aplicări succesive ale 5 mutagenezei, prezentare monovalentă la nivelul fagilor, analiza funcțională și adăugarea de mutații preferate, așa cum s-a explicat în cazul hormonului uman de creștere (Lowman & 7

Wells, J. Mol. Biol. 234: 564 - 578 (1993); US 55346(7), precum și în cazul domeniilor F(ab) ale anticorpilor (Barbas și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809 (1994); Yang și colab., 9

J. Mol. Biol. 254: 392 (1995).

Se pot elabora colecții care să cuprindă multe variante de proteine (10⁶) diferite la ni- 11 velul unor poziții definite din structura secvențelor, pe particule de bacteriofag, fiecare dintre acestea conținând ADN-ul ce codifică varianta respectivă a proteinei. După mai multe cicluri 13 de purificare a afinității, cu ajutorul unui antigen imobilizat, se izolează clone individuale de bacteriofag și se deduce, din ADN-ul lor, secvența de aminoacizi a proteinei pe care o 15 prezintă.

(a) Anticorpi umani și umanizați 17

Umanizarea este o tehnică de obținere a unui anticorp himeric în care s-a substituit o porțiune, în mod considerabil, mai mică decât domeniul variabil uman intact, cu secvența 19 corespunzătoare de la o specie non-umană. Un anticorp umanizat are unul sau mai multe resturi de aminoacizi în structura sa, care au fost introduse de la o sursă de proveniență non- 21 umană. Aceste resturi de aminoacizi de proveniență non-umană sunt denumite deseori resturi de import, fiind luate în mod caracteristic din structura unui domeniu variabil de 23 import. Umanizarea se poate realiza în esență conform metodei lui Winter și colaboratorii (Jones și colab., Nature 321: 522 - 525 (1986); Riechman și colab., Nature 332: 323 - 327 25 (1988) Verhoeyen și colab., Science 239: 1534 -1536 (1988)), prin substituția secvențelor regiunilor de determinare a complementarității (CDR) din structura unui anticorp uman, cu 27 secvențele corespunzătoare de la un rozător. Prin urmare anticorpii umanizați sunt anticorpi himerici (US 4816567) în care se substituie o porțiune în mod considerabil mai mică 29 decât domeniul variabil uman intact, cu o secvență corespunzătoare de la o specie nonumană. Conform cu aplicarea acestei invenții, anticorpii IgE umanizați au câteva resturi de 31 aminoacizi din regiunea CDR și posibil câteva din regiunea FR, substituite cu resturi de aminoacizi din poziții analoage din structura anticorpilor de tip murină. 33

Alegerea domeniilor variabile umane atât de la nivelul lanțurilor grele, cât și ușoare, pentru fabricarea anticorpilor umanizați, este deosebit de importantă pentru reducerea 35 caracterului antigenic. Conform cu metoda numită și cea mai bună potrivire, se analizează secvența domeniului variabil al unui anticorp de rozător, în raport cu toată colecția de sec- 37 vențe de domeniu variabil uman, cunoscute. Secvența umană care se apropie cel mai mult cu cea provenită de la rozător este acceptată ca fiind catena structurală de origine umană 39 pentru anticorpul umanizat (Sims și colab., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia și colab.,

J. Mol. Biol. 196: 901 (1987)). O altă metodă utilizează o anumită catenă structurală care 41 provine din secvența consens a tuturor anticorpilor umani ce aparțin unui anumit subgrup de lanțuri ușoare sau grele. Se poate utiliza aceeași catenă structurală pentru câțiva anticorpi 43 umanizați diferiți (Carter și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta și colab., J. Immunol. 151: 2623 (1993)): 45

Este, de asemenea, important, ca anticorpii după umanizare să-și păstreze afinitatea înaltă față de antigen, precum și alte proprietăți biologice favorabile. în acest scop, conform 47 unei metode preferate, se prepară anticorpii printr-un procedeu de analiză a secvențelor parentale și a mai multor produși umanizați posibili, utilizând modele tridimensionale pentru 49 secvențele parentale și umanizate.

RO 120848 Β1

Pentru anumite domenii ale anticorpului, cum ar fi domeniile VH și L, se construiesc modele, separat de secvențele consens pe bază de structuri F (ab), cu secvențe similare. Specialiștii în domeniu sunt familiarizați cu modelele tridimensionale de imunoglobuline. Sunt, de asemenea, disponibile programe computerizate, care ilustrează și prezintă structuri conformaționale tridimensionale ale secvențelor de imunoglobuline selectate care se analizează. Prin observarea acestora, se poate analiza rolul probabil al resturilor de aminoacizi în realizarea funcției secvenței de imunoglobulină analizată de a lega antigenul corespunzător. De exemplu, pentru realizarea unui model al fragmentului F(ab)-12 din exemplul 2, s-a utilizat murina MAE 11, ca matriță pentru alegerea resturilor de aminoacizi din CDR și din scheletul structural, care vor fi modificate în asociere cu realizarea modelului molecular, pentru obținerea secvenței mutant.

Un alt exemplu poate fi reprezentat de anticorpul martor Mab4d5. în acest caz, s-au construit modele, pornindu-se de la câteva structuri Fab din banca de proteine Brookhaven (identificate ca IFB4, 2RHE, 2MCP, 3FAB, 1FBJ, 2HFL și 1REI). Au fost suprapuse apoi pe această structură, fragmentul F(ab) KOL (Marquart, M. și colab., J. Mol. Biol. 141: 369 - 391 (1980) ca matriță de elecție pentru domeniile VL și VH, și alte structuri, utilizând coordonatele atomilor lanțului lor principal (programul INSIGHT, BiosymTechnologies). Pentru modelarea anticorpului dorit se utilizează programe și tehnici similare.

O analiză caracteristică, ce utilizează modelarea moleculară, se poate desfășura, astfel: se calculează pentru poziția fiecărui rest de aminoacid dat, distanța de la Ca din matriță până la Ca din analogul din fiecare structură suprapusă. în general, daca toate (sau aproape toate) distanțele Ca-Ca pentru un rest de aminoacid dat sunt <1 Â, atunci această poziție este inclusă în structura consens. în unele cazuri, resturile de aminoacizi ale catenei structurale în configurație plană β satisface aceste criterii, în timp ce buclele CDR pot să nu le satisfacă. Se calculează, pentru fiecare dintre aceste resturi de aminoacizi selectate, coordonatele medii pentru atomii N, Ca, C, O și C6 și apoi se corectează deviațiile ce rezultă din geometria neconvențională a legăturilor, prin 50 de cicluri de reducere a energiei, utilizând un program comercial precum programul DISCOVER Biosym Technologies) cu câmpul forțe AMBER (Weiner, S.J. și colab., J. Amer. Chem. Soc. 106: 765. 784 (1984)) și se stabilesc coordonatele Ca. Se introduc apoi, în structura consens rezultată, catenele secundare cu resturi de aminoacizi bine conservate, cum sunt, de exemplu, resturile de cisteină ce formează punți disulfurice. Se introduc apoi secvențele domeniilor VL și VH ale anticorpului respectiv, începând cu resturile de aminoacizi ale CDR și utilizând, ca ghid, prezentarea sub formă de tabele a conformațiilor CDR, conform descrierii lui Chothia și colab. (Chothia C. și colab., Nature 342: 877 - 883 (1989)). Conformațiile catenelor secundare se aleg în funcție de structurile cristaline ale Fab, în funcție de colecțiile de rotameri (Pander, J.W. & Richards, F.M., J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)) și în funcție de condițiile de împachetare. Deoarece VH-CDR3 pot să nu fie estimabile cu ajutorul criteriilor de mai sus, se pot crea modele prin căutarea unor bucle cu dimensiuni similare, utilizând programul INSIGHT, luând în considerare expunerea la solvent și împachetarea, sau pot fi create, utilizând alte tehnici comerciale de rutină. Se preferă ca modelul să fie supus la 5000 de cicluri de reducere energetică.

în acest mod se pot selecta și continua resturi de aminoacizi din scheletul structural al secvențelor gazdei și din secvențele de import, astfel încât să se obțină caracteristicile dorite ale anticorpului precum afinitatea crescută față de antigenul (antigenii) țintă. în general, resturile de aminoacizi CDR sunt implicate direct și în mod considerabil în influențarea legării antigenului. S-a utilizat această tehnică la crearea F(ab)-12 din exemplul 2, utilizânduse o combinație de resturi CDR de la murină, în asociație cu modelarea moleculară, în scopul obținerii unui fragment de anticorp anti-lgE de tip murină umanizat.

RO 120848 Β1 în mod alternativ, este acum posibilă producerea de animale transgenice (de exem- 1 piu, șoareci), care sunt capabile să producă prin imunizare un repertoriu complet de anticorpi umani, în absența producției de imunoglobuline endogene. De exemplu, s-a descris că prin 3 deleția homozigotă a genei care codifică regiunea de articulație (JH) a lanțului greu din structura anticorpului, la șoareci obținuți din mutanți himerici și linii embrionare mutante, se 5 soldează cu inhibiția completă a producției endogene de anticorpi. Prin transferul sistemului genic uman al imunoglobulinelor liniilor embrionare la astfel de șoareci derivați din linii em- 7 brionare mutante, se va obține producția de anticorpi umani în urma stimulării antigenice. Jakobovits și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits și colab., Nature 9 362; 255 - 258 (1993); Bruggermann și colab., Yearin Immunol. 7:33 (1993); și Duchosal și colab., Nature 355: 258 (1992). Se pot obține anticorpi umani și prin prezentare în colecțiile 11 de fagi (Hoogenboom și colab., J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks și colab., J. Mol. Biol. 222: 581 - 597 (1991); Vaughan și colab., Nature Biotech. 14: 309 (1996)). 13 (b) Modificări suplimentare

După producția anticorpului mutant, se determină activitatea biologică a acestei mo- 15 lecule, comparativ cu anticorpul cu specificitate de specie. Așa cum s-a menționat mai sus, aceasta poate consta în determinarea afinității de legare și/sau a altor proprietăți biologice 17 ale anticorpului. Conform unei variante preferate a invenției, se prepară conform descrierii de mai sus o serie de anticorpi mutanți și se selectează din punct de vedere al afinității de 19 legare față de antigenul de la cea de-a doua specie de mamifer. Unul sau mai mulți anticorpi mutanți, selectați în urma acestei prime selecții, sunt supuși, în mod opțional, unuia sau mai 21 multor teste suplimentare de evaluare a activității biologice, pentru confirmarea utilității în studii preclinice, a anticorpului (anticorpilor) mutant (mutanți) cu afinitate crescută de legare. 23 Conform unor variante preferate, anticorpul mutant păstrează capacitatea de legare a antigenului provenit de la prima specie de mamifer, având o afinitate de legare similară cu 25 cea a anticorpului cu specificitate de specie. Aceasta se poate realiza prin evitarea intervenției la nivelul resturilor de aminoacizi ale regiunii hipervariabile care sunt implicate în lega- 27 rea antigenului, de la anticorpul antiuman. Conform altor variante, anticorpul mutant poate avea o afinitate de legare față de prima specie de mamifer în mod semnificativ modificată 29 (de exemplu, afinitatea de legare la antigenul respectiv este în mod preferabil mai bună, dar poate fi și mai slabă decât cea manifestată de anticorpul cu specificitate de specie). 31

Anticorpii mutanți, astfel selectați, pot fi supuși unor modificări ulterioare, care depind deseori de utilizarea propusă pentru anticorp. Astfel de modificări pot fi reprezentate de mo- 33 dificarea suplimentară a secvenței de aminoacizi, fuziunea la o polipeptidă heteroloagă (la polipeptide heteroloage) și/sau modificări covalente precum cele propuse mai jos. De exem- 35 piu, se pot, de asemenea, substitui orice resturi de cisteină care nu sunt implicate în păstrarea conformației corecte a anticorpului mutant, în general, cu serină, ameliorându-se stabili- 37 tatea la oxidare a moleculei și prevenindu-se legarea încrucișată aberantă. Invers, se pot adăuga resturi de cisteină în structura anticorpului, pentru ameliorarea stabilității sale (în 39 special, când anticorpul este un fragment de anticorp precum un fragment Fv). Un alt tip de aminoacid mutant prezintă un model modificat de glicozilare. Poate fi obținut prin deleția 41 unuia sau mai multor fragmente de hidrocarbonat din structura anticorpului și/sau prin adăugarea unuia sau mai multor situsuri de glicozilare care nu sunt prezente în structura anticor- 43 pului. Glicozilarea anticorpilor se face în mod tipic printr-o legătură -N sau -O. Legătura -N se referă la atașarea fragmentului hidrocarbonat la catena secundară a asparaginei. Astfel, 45 prezența oricăreia dintre aceste secvențe tripeptidice din structura polipeptidului creează un posibil situs de glicozilare. Glicozilarea prin legătură -O se referă la atașarea unui zahăr prin 47 intermediul unui atom de oxigen eteric. De exemplu, se pot utiliza N-acetilgalactozamină,

RO 120848 Β1 galactoză, fucoză sau xilază, legate la un aminoacid, cel mai probabil serină sau treonină, deși se pot utiliza și 5-hidroxiprolină sau 5-hidroxilizină. Adăugarea situsurilor de glicozilare la structura anticorpului se realizează în mod convenabil prin modificarea secvenței de aminoacizi, astfel încât să conțină una sau mai multe dintre secvențele tripeptidice descrise mai sus (pentru situsurile de glicozilare relegate). Modificarea se poate, de asemenea, realiza prin adăugarea sau prin substituția cu unul sau mai multe resturi de serină sau treonină, în secvența anticorpului original (pentru situsurile de glicozilare O-legate).

(v) Fragmente de anticorpi

Se pot crea diverse tehnici pentru producția de fragmente de anticorpi. în mod tradițional, aceste fragmente se obțin prin digestia proteolitică a anticorpilor intacți (vezi, de exemplu, Morimoto și colab., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) și Brennan și colab., Science 229: 81 (1985)). Totuși, aceste fragmente pot fi acum produse direct de celule gazdă recombinante. De exemplu, fragmentele de anticorpi se pot izola din colecțiile de anticorpi fagici prezentate mai sus. în mod alternativ, fragmentele F (ab’)2-SH pot fi recuperate direct din celulele de E. coli și cuplate pe cale chimică, pentru a forma fragmente F(ab')₂ (Carter și colab., Biotechnology 10:163-167 (1992)). Conform unei alte abordări, fragmentele F(ab') pot fi izolate direct de la culturile de celule gazdă recombinante. Specialiștii în domeniu pot lua în considerare și alte tehnici adecvate pentru producția de fragmente de anticorpi. Conform altor variante, anticorpul de selecție este un fragment Fv monocatenar (scFv). (cererea de brevet PCT WO 93/16185).

(vi) Anticorpi multispecifici

Anticorpii multispecifici au specificitate de legare pentru cel puțin doi antigeni diferiți. Cu toate că acest tip de molecule leagă în mod normal doar doi antigeni (și anume anticorpii bispecifici BsAbs), sunt cuprinși în sensul acestei expresii și anticorpii cu specificitate pentru mai mulți antigeni cum ar fi anticorpii trispecifici. Exemple de BsAbs sunt reprezentate de anticorpii care au un braț orientat împotriva unui antigen al unei celule tumorale și celălalt braț orientat împotriva unei molecule trigger citotoxice precum anti -FcvRI/anti-CD15, antip185^HER2/FcYRNI (CD16), anti-CD3/anti-celule B maligne (1D10), anti-CD3/anti-p185^HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anticarcinom de celule renale, anti-CD3/anti-OVCAR-3, antiCD3/L-D1 (anticarcinom de colon), anti-CD3/antianalog al hormonului de stimulare a melanocitelor, antireceptori EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3(anti-CD19, antiCD3/MoV18, antimolecula de adeziune a celulelor neurale (NCAM)/anti-CD3, antiproteina care leagă folați (FBP)/anti-CD3, antiantigenul asociat tuturor formelor de carcinom (AMOC31 )/anti-CD3. Anticorpi bispecifici care au un braț care se leagă specific la un antigen tumoral, iar celălalt braț se leagă la o toxină precum anti-saporină/anti-ld-1, anti-CD22/anti-saporină, anti-CD7/anti-saporină, anti-CD38/anti-saporină, anti-CEA/antilanțul A al ricinei, antiinterferon-α (IFN-a)/antiidiotip hibridoma, anti-CEA/antialcaloid vinca; anticorpi bispecifici destinați conversiei promedicamentelor activate enzimatic precum anti-CD30/antifosfatază alcalină (care catalizează conversia promedicamentului fosfat de mitomicină la mitomicină alcoolică); anticorpi bispecifici care pot fi utilizați ca agenți fibrinolitici precum antifibrină/antiactivator tisular al plasminogenului (tPA), antifibrină/antiactivator al plasminogenului de tip urokinază (uPA), anticorpi bispecifici care orientează complexele minime la receptorii suprafeței celulare precum antilipoproteina cu densitate joasă (LDL)/antireceptor Fc (de exemplu, FcyRI, FcyRM sau FcyRIII); anticorpi bispecifici care se utilizează în tratamentul bolilor infecțioase precum anti-CD3/antivirus herpes simplex (HSV), antireceptori ai celulelor T: complex CD3/antivirus gripal, anti-FcYR/anti-HIV, anticorpi bispecifici pentru detectarea tumorilor in vitro sau in vivo precum anti-CEA(anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, antip185^HER2/anti-haptenă; anticorpi bispecifici utilizați ca adjuvanți în vaccinuri; și anticorpi

RO 120848 Β1 bispecifici cu rol de instrumente de diagnostic precum anti-lgG de iepure/anti-feritină, anti- 1 peroxidază de hrean (HRP)/ antihormon, anti-somatostatină/antisubstanță P, anti-HRP/antiFITC, anti-CEA/anti-(3-galactozidază. Exemple de anticorpi trispecifici sunt reprezentate de 3 anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 și anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37.

Anticorpii bispecifici se pot prepara sub formă de anticorpi cu lungimea completă sau frag- 5 mente de anticorpi (de exemplu, anticorpi bispecifici F(ab')2).

Metodele de preparare a anticorpilor bispecifici sunt cunoscute în domeniu. în mod 7 tradițional, producția de anticorpi bispecifici cu lungime completă se bazează pe coexpresia a două perechi de lanțuri grele și ușoare de imunoglobulină, cele două lanțuri având specifi- 9 cități diferite (Millstein și colab., Nature 305:537 - 539 (1983)). Deoarece împerecherea lanțurilor grele și ușoare ale imunoglobulinei se realizează întâmplător, aceste hibridoame (cva- 11 droame) produc un amestec posibil de 10 molecule diferite de anticorp, dintre care numai una are structura bispecifică corectă. Purificarea moleculei corecte, care se realizează de 13 obicei prin etape de cromatografie de afinitate, este destul de grea și are randament scăzut. Procedee similare sunt descrise în WO 93/08829 și în Traunecker și colab., EMBO J. IV: 15

3655-3659(1991).

în conformitate cu o altă abordare, se realizează fuziunea domeniilor variabile ale 17 anticorpului, care au specificitățile dorite de legare (situsuri de combinare antigen-anticorp), cu secvențele domeniilor constante ale imunoglobulinei. Fuziunea se face în mod preferabil 19 cu un domeniu constant al lanțului greu al imunoglobulinei, care conține cel puțin o parte a regiunii balama și regiunile CH2 și CH3. Se preferă ca prima regiune constantă a lanțului 21 greu (CH1) să conțină situsul necesar legării lanțului ușor, prezent în cel puțin una dintre fuziuni. Se inserează, în vectori separați de expresie, ADN-urile ce codifică fuziunile lanțurilor 23 grele ale imunoglobulinelor și, dacă se dorește, și lanțul ușor al imunoglobulinei, și sunt apoi contransfectate într-un organism gazdă adecvat. Aceasta asigură o flexibilitate mare de 25 adaptare a proporțiilor reciproce ale celortrei fragmente polipeptidice, în varianta în care randamentul maxim se obține prin utilizarea celor trei lanțuri de polipeptidă, în proporții inegale. 27 Este posibilă totuși, inserția secvențelor codante a două sau a tuturor celor trei lanțuri polipeptidice, într-un singur vector de expresie, atunci când expresia a cel puțin două lanțuri poli- 29 peptidice în proporții egale determină obținerea unui randament maxim, sau atunci când proporțiile nu au o semnificație deosebită. 31

Conform unei variante preferate a acestei abordări, anticorpii bispecifici sunt compuși dintr-un lanț greu de imunoglobulină hibrid, care prezintă o primă specificitate de legare la 33 nivelul unui braț și dintr-o pereche formată din lanț ușor -lanț greu hibrid de imunoglobulină (care asigură o a doua specificitate de legare) în celălalt braț. S-a observat că această struc- 35 tură asimetrică facilitează separarea compusului bispecific dorit, de combinații nedorite de lanțuri de imunoglobulină, deoarece prezența unui lanț ușor de imunoglobulină, la nivelul 37 unei singure jumătăți a moleculei bispecifice, asigură o separare mai ușoară. Acest mod de abordare este descris în WO 94/04690. Pentru detalii suplimentare în ceea ce privește obți- 39 nerea de anticorpi specifici, a se vedea, de exemplu, Suresh și colab., Methods in Enzymo/ogyVIV. 210(1986). 41

Conform unui alt mod de abordare, descris în WO 96/27011, se poate prelucra interfața dintre o pereche de molecule de anticorp, astfel încât să se recupereze procentul maxim 43 de heterodimeri din culturile de celule recombinante. Interfața preferată conține cel puțin o parte a domeniului CH3 al unui domeniu constant al anticorpului. în această metodă, se înlo- 45 cuiesc una sau mai multe catene secundare mici de aminoacizi, de la nivelul interfeței primei molecule de anticorp, cu catene secundare mari (de exemplu, sirozină sau triptofan). Se 47 creează cavități compensatoare de dimensiune identică sau similară cu catena (cafenele)

RO 120848 Β1 secundară mare, la interfața celei de-a doua molecule de anticorp, prin înlocuirea catenelor secundare mari de aminoacizi, cu unele mai mici (de exemplu, alanină sau treanină). Aceasta asigură un mecanism de creștere a producției de heterodimeri, față de alți produși finali nedoriți precum homodimerii.

Anticorpii bispecifici includ anticorpii legați încrucișat sau heteroconjugați. De exemplu, unul dintre anticorpii din heteroconjugat poate fi cuplat la avidină, iar celălalt la biotină. Acest tip de anticorpi se poate utiliza, de exemplu, la orientarea celulelor sistemului imun către celulele nedorite (US 4676980) și la tratarea infecției HIV (WO 92/299373 și EP 03089). Anticorpii heteroconjugați se pot obține utilizând orice metodă convenabilă de legare încrucișată. Agenți adecvați de legare încrucișată sunt bine cunoscuți în domeniu și sunt descriși în brevetul US 4676980, împreună cu o serie de tehnici de legare încrucișată.

S-au descris în literatură și tehnici de obținere a anticorpilor bispecifici din fragmente de anticorp. De exemplu, se pot obține anticorpi bispecifici, utilizând legături chimice. Brennan și colab., Science 229:81(1985), descriu un procedeu de generare a fragmentelor F(ab')2 prin scindarea proteolitică a anticorpilor intacți. Aceste fragmente sunt reduse în prezența arsenitului de sodiu, agent de complexare a ditiolului, pentru a stabiliza grupările ditiol vincinale și pentru a preveni formarea de punți disulfurice intermoleculare. Fragmentele F(ab') obținute sunt apoi transformate în derivați de tionitrobenzoat (TNB). Unul din derivații Fab'-TNB este apoi reconvertit la Fab'-tiol prin reducere cu mercaptoetilamină și se amestecă cu o cantitate echimolară din celălalt derivat Fab'-TNB, obținându-se anticorpul bispecific. Anticorpii bispecifici obținuți pot fi utilizați ca agenți de blocare selectivă a enzimelor.

Progrese recente au facilitat recuperarea directă a fragmentelor Fab'-SH de la E. coli, care pot fi cuplate pe cale chimică, în scopul obținerii de anticorpi bispecifici. Shalaby și colab., J. Exp. Med. M5: 217 - 225 (1992), descriu producția unei molecule F(ab')₂ de anticorp bispecific, complet umanizată. Fiecare fragment Fab' a fost secretat separat de E. coli și a fost apoi supus cuplării chimice directe in vitro, obținându-se anticorpul bispecific. Anticorpul bispecific, astfel format, a fost capabil să se lege la celule care supraexprimă receptorii ErbB2 și la celule T umane normale, și să declanșeze activitatea litică a limfocitelor citotoxice umane împotriva celulelor tumorilor de sân umane.

Au fost, de asemenea, descrise diverse tehnici de obținere și izolare a fragmentelor de anticorp bispecific, direct din culturile de celule recombinate. De exemplu, au fost produși anticorpi bispecifici, utilizând structurile de leucină de tip fermoar. Kostelny și colab., J. Immunol. 148 (5): 1547 - 1553 (1992). Peptidele cu structuri de leucină de tip fermoar, din proteinele Fos și Jun, au fost legate prin fuziune genică, la porțiunile Fab' ce aparțin a doi anticorpi diferiți. Homodimerii de anticorpi au fost reduși la nivelul regiunii balama, obținânduse monomeri și apoi au fost reoxidați, formându-se heterodimerii de anticorp. Această metodă poate fi utilizată și la producția de homodimeri de anticorp. Tehnologia diacorpilor, descrisă de Hollinger și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 - 6448 (1993), a furnizat un mecanism de obținere a fragmentelor de anticorp bispecific. Fragmentele conțin un domeniu variabil al lanțului greu (VH) conectat la un domeniu variabil al lanțului ușor (VL), prin intermediul unui linker care este prea scurt să permită împerecherea celor două domenii la nivelul aceluiași lanț. Prin urmare, domeniile VH și VL ale unui fragment sunt forțate să se împerecheze cu domeniile VL și VH complementare ale unui alt fragment, formându-se astfel două situsuri de legare a antigenului. S-a descoperit și o altă strategie de obținere de fragmente de anticorp bispecific, prin utilizarea de dimeri cu lanț unic Fv (sFv). Vezi Gruger și colab., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

Sunt studiați și anticorpi cu mai mult de două valențe. De exemplu, se pot prepara și anticorpi trispecifici. Tutt și colab., J. Immunol. 147: 60(1991).

RO 120848 Β1 (vii) Tehnologia funcției efectoare 1

Se poate dori modificarea funcției efectoare a anticorpului din prezenta invenție, astfel încât să crească eficacitatea de legare a anticorpului, la IgE, de exemplu. Se pot introduce, 3 de exemplu, rest(uri) de cisteină în regiunea Fc, permițându-se astfel formarea legăturilor disulfurice intercatenare în această regiune. Anticorpul homodimeric, astfel obținut, poate 5 avea o capacitate îmbunătățită de internalizare și/sau creștere a citotoxicității mediate de complement și a citotoxicității celulare dependente de anticorp. (ADCC). A se vedea, Caron 7 și colab., J. Exp. Med. 176:1191 -1195(1992) și Shopes B., J. Immunol. U8: 2918-2922 (1993). în mod alternativ, se poate realiza un anticorp care să aibă regiuni Fc duble, pre- 9 zentând astfel o creștere a capacității de liză a complementului și a capacităților ADCC. A se vedea, Stevenson și colab., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989). 11 (viii) Imunoconjugate

Invenția se referă, de asemenea, și la imunoconjugate alcătuite din anticorpul descris 13 în prezenta, conjugat cu un agent citotoxic precum un agent de chimioterapie, cu o toxină (de exemplu, toxină activă enzimatic de origine bacteriană, vegetală, fungică sau animală, 15 sau fragmente ale acesteia), sau cu un izotop radioactiv (adică un conjugat radioactiv).

Agenții chimioterapeutici utili pentru obținerea unor astfel de imunoconjugate au fost 17 descriși mai sus. Toxinele active enzimatic și fragmentele acestora, care se pot utiliza în acest scop, sunt reprezentate de lanțul A al toxinei difterice, fragmente active fără capacitate 19 de legare ale toxinei difterice, lanțul A al exotoxinei (de la Pseudomonas aeruginosa), lanțul A al ricinei, lanțul A al abrinei, lanțul A al modecinei, a/fa-sarcina, proteinele Aleurites fordii, 21 proteinele diantine, proteinele Phytolaca americana (PAPI, PAPII și PAP-S), momordica, inhibitor al charantiei, curina, crotină, inhibitor al Saponaria officinalis, gelonină, mitrogelină, 23 restrictocină, fenomicină, enomicină și tricotecenele. Se pot utiliza diverși radionuclizi pentru producerea de anticorpi conjugați radioactiv. De exemplu, se pot utiliza ²¹²Bi, ¹³¹l, ¹³¹ln, θθΥ 25 și ¹⁸⁶Re.

Prepararea conjugatelor de anticorp și agent citotoxic se realizează utilizând diverse 27 proteine bifuncționale cu rol de agenți de cuplare precum N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), derivați bifuncționali de imidoesteri (precum adipimidat 29 dimetilic HCL), esteri activi (precum suberat de disuccinimidil), aldehide (precum glutaraldehidă), compuși bi-azido (precum bi-p-(azidobenzoil)hexandiamină), derivați de bi- 31 diazoniu (precum bi-p(diazoniubenzoil)-etilendiamină), diizocianați (precum 2,6-diizocianat de toluen) și compuși cu fluor bi-activi (precum 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). De exemplu, 33 se poate prepara o imunotoxină de tip ricină, conform descrierii lui Vitetta și colab., Science 238:1098 (1987). Un agent reprezentativ de chelare, pentru conjugarea anticorpului la radio- 35 nucleotid, este acidul 1-izotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminopentaacetic (MX-DTPA) cu carbon marcat. Vezi, WO 94/11026. 37

Conform unei alte variante, anticorpul poate fi conjugat la un receptor (precum streptavidina) în scopul utilizării la preorientarea antitumorală, conjugatul anticorp-receptor 39 fiind administrat pacientului, după care se înlătură din circulație conjugatul nelegat, cu ajutorul unui agent de clearance, administrându-se apoi un ligand (de exemplu, avidina) 41 conjugat cu un agent citotoxic (de exemplu, un radionucleotid).

(ix) Imunolipozomi 43

Anticorpii mutanți descriși în prezenta pot fi formulați și ca imunolipozomi. Lipozomii care conțin anticorpul se prepară prin metode cunoscute în domeniu, precum cele descrise 45 de Epstein și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang și colab., Proc.Natl.

Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); și brevetele US 4485045 și 4544545. Lipozomii cu tipul de 47 circulație crescut sunt descriși în US 5013556.

RO 120848 Β1

Lipozomi deosebit de utili se pot obține prin metoda evaporării cu fază inversă, dintr-o compoziție lipidică alcătuită din fosfatidilcolină, colesterol, și fosfatidiletanolamină derivată din PEG (PEG-PE). Lipozomii sunt extrudați prin filtre cu dimensiune stabilită a porilor, obținându-se lipozomi cu diametrul dorit. Fragmentele Fab' ale anticorpului prezentei invenții pot fi conjugate la lipozomi conform descrierii lui Martin și colab., J. Biol. Chem. 257:286 288 (1982) prin reacția de interschimbare disulfurică. în mod opțional, lipozomul poate conține și un agent chimioterapeutic (precum Doxorubicină). A se vedea, Gabizon și colab., J. Național Cancer Inst. 81 (19): 1484(1989).

(x) Terapie cu promedicament, mediată enzimatic de o enzimă dependentă de anticorp (ADEPT)

Anticorpul prezentei invenții poate fi utilizat și în ADEPT, prin conjugarea anticorpului cu o enzimă de activare a unui promedicament care realizează conversia acestuia (de exemplu, un agent chimioterapeutic de tip peptidil, a se vedea, WO 81/01145), la un medicament activ anticanceros. A se vedea, de exemplu, WO 88/07378 și US 4975278.

Componenta enzimatică a imunoconjugatului util pentru ADEPT este reprezentată de orice enzimă capabilă să realizeze conversia promedicamentului într-o formă mai activă, citotoxică.

Enzime utile, care pot fi utilizate în cadrul acestei metode, sunt reprezentate printre altele, de fosfataza alcalină, utilă pentru conversia promedicamentelor de tip fosfat în forma lor liberă; arilsulfataza, utilă pentru conversia promedicamentelor de tip sulfat în forme libere; citozin-dezaminaza, utilă la conversia 5-fluorocitozinei netoxice în medicamentul anticanceros corespunzător, 5 fluorouracil; proteaza precum proteaza serratia, termolizina, subtilizina, carboxipeptidaze și catepsine (precum catepsine B și L), utile pentru conversia promedicamentelor de tip peptidicîn substanțe libere; D-alanilcarboxilpeptidaze, utile pentru conversia promedicamentelor ce conțin substituenți D-aminoacizi; enzime de scindare a hidrocarbonaților precum β-galactozidaza și neuraminidaza, utile pentru conversia promedicamentelor glicozilate în substanțe libere; β-lactamaza, utilă la conversia medicamentelor cu grupări β-lactam în substanțe libere; și penicilin amidaze precum amidaza penicilinei V sau amidaza penicilinei G, utile la conversia în forme libere a medicamentelor care au grupări fenoxiacetil și respectiv fenilacetil la atomul de azot al grupării amino. în mod alternativ, se pot utiliza anticorpii cu activitate enzimatică, cunoscuți în domeniu ca abzime la conversia promedicamentelor acestei invenții, în formă liberă, activă (Massey, Nature 328: 457 -458 (1987)). Se pot prepara conjugate anticorp-abzimă conform acestei descrieri, pentru eliberarea abzimei la nivelul unei populații de celule tumorale.

Enzimele acestei invenții pot fi legate covalent la anticorpul mutant, prin tehnici bine cunoscute în domeniu, cum ar fi prin utilizarea reactivilor de legare încrucișată, heterobifuncționali, prezentați mai sus. în mod alternativ, se pot sintetiza, utilizând tehnici de ADN recombinant bine cunoscute în domeniu, proteine de fuziune ce conțin un fragment de anticorp conform invenției, ce cuprinde cel puțin regiunea de legare a antigenului, legată la un fragment alcătuit din cel puțin o porțiune activă, funcțională, a unei enzime din această invenție (Neuberger și colab., Nature 312: 604 - 608(1984)).

(xi) Fuziuni anticorp-epitop, cu capacitate de legare la receptorii de salvare

Conform unor variante ale invenției, se poate dori utilizarea unui fragment de anticorp în loc de anticorpul intact, în scopul creșterii capacității de penetrare în tumori. în acest caz, se dorește modificarea fragmentului de anticorp, astfel încât să crească timpul său de înjumătățire în ser. Aceasta se poate realiza, de exemplu, prin introducerea în structura fragmentului de anticorp, a unui epitop cu capacitate de legare la receptorii de salvare (de exemplu, prin mutația regiunii adecvate din fragmentul de anticorp sau prin introducerea epitopului întro peptidă semnal, care fuzionează apoi cu fragmentul de anticorp fie la capăt, fie la mijloc, de exemplu, prin sinteză ADN sau peptidică).

RO 120848 Β1

Epitopul cu capacitate de legare la receptorii de salvare se formează în mod prefe- 1 rabil dintr-o regiune în care unul sau mai multe resturi de aminoacizi, dintr-una sau din două bucle ale unui domeniu Fc, sunt transferate în poziții analoage ale fragmentului de anticorp. 3 O variantă mai preferată este reprezentată de transferul a trei sau a mai multor resturi de aminoacizi dintr-una sau din două bucle ale domeniului Fc. Mai preferat este cazul în care 5 epitopul provine din domeniul CH2 al regiunii Fc (de exemplu, a unei IgG) și este transferat în regiunea CH1, CH3 sau VH sau în mai multe regiuni de acest fel, ale anticorpului. în mod 7 alternativ, epitopul provine din domeniul CH2 al regiunii Fc și este transferat în regiunea CL sau VL, sau în ambele, la nivelul fragmentului de anticorp. 9 (xii) Alte modificări covalente ale anticorpului

Domeniul acestei invenții cuprinde și modificări covalente ale anticorpului. Acestea 11 se pot realiza prin sinteză chimică sau prin scindare enzimatică sau chimică a anticorpului, dacă este posibil. Alte tipuri de modificări covalente ale anticorpului sunt introduse în mo- 13 leculă cu ajutorul reacției unor resturi de aminoacizi țintiți din structura anticorpului, cu un agent organic de formare de derivați, care este capabil să reacționeze cu catenele secun- 15 dare selectate sau cu resturile N- sau C-terminal.

De obicei, se realizează reacția dintre resturile cisteină și α-halogenoacetați (și ami- 17 dele corespunzătoare) precum acid cloracetic sau cloracetamida, obținându-se derivați de carboximetil sau de carboxiamidometil. Se formează, de asemenea, și derivați ai resturilor 19 cisteinei cu bromtrifluoracetonă, acid a-brom-P-(5-imidazoil)propionic, fosfat de cloracetil, N-alchilmaleimide, disulfură de 3-nitro-2-piridil, disulfură de metil-2-piridil, p-clormercuri- 21 benzoat, 2-clormercura-4-nitrofenol, sau clor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Obținerea derivaților de resturi histidil se realizează prin reacția cu dietilpirocarbonat 23 la pH 5,5...7,0, deoarece acest agent este relativ specific pentru lanțul secundar histidil. Este utilă, de asemenea, bromura de p-bromfenacil; reacția se realizează în mod preferabil în 25 cacodilat de sodiu 0,1 M la pH 6,0.

Resturile lizinil și amino-terminal reacționează cu anhidridă succinică sau cu alte 27 anhidride ale acizilor carboxilici. Prin reacția cu acești agenți se inversează sarcina resturilor lizinil. Se pot utiliza și alți agenți adecvați pentru formarea de derivați la nivelul resturilor de 29 aminoacizi cu grupări 2-amino precum imidoesteri, cum ar fi picolinimidat de metil, fosfat de piridoxal, clorborohidrură de piridoxal, acid trinitrobenzensulfonic, O-metilizouree, 2,4- 31 pentandionă și reacția cu glioxilat catalizată de transaminază.

Resturile arginil se modifică prin reacția cu unul sau cu câțiva reactivi convenționali, 33 printre care fenilglioxal, 2,3-butandionă, 1,2-ciclohexandionă și ninhidrină. Obținerea de derivați la nivelul resturilor de arginină necesită condiții alcaline de desfășurare a reacției dato- 35 rită valorii mari a pKa a grupării funcționale guanidină. Mai mult, acești reactivi pot reacționa cu grupările lizinei, precum și cu gruparea ε-amino a argininei. 37

Modificarea specifică a grupărilor tirozil se poate realiza în scopul introducerii unor markeri spectrali în grupările tirozil, prin reacție cu compuși aromatici de tip diazoniu sau cu 39 tetranitrometan. Cel mai frecvent se utilizează N-acetilimidizol și tetranitrometan, obținânduse derivați de tip O-acetiltirozil și respectiv β-nitro. Resturile de tirozil se iodurează cu ¹²⁵l sau 41 ¹³¹l în scopul preparării de proteine marcate radioactiv, ce se utilizează în testul RIA.

Grupările carboxil secundare (aspartil sau glutamil) sunt modificate în mod selectiv 43 prin reacție cu carbodiimide (R-N=C=C-R‘), unde R și R' sunt grupări alchil diferite precum 1 -ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimidă sau 1-etil-3-(4-azoniu-4,4-dimetilpentil) carbo- 45 diimidă. Mai departe, se realizează conversia resturilor aspartil și glutamil la resturi asparaginil și glutaminil prin reacție cu ioni de amoniu. 47

RO 120848 Β1

Resturile glutaminil și asparaginil sunt frecvent dezamidate la resturile corespunzătoare glutamil și respectiv aspartil. Dezamidarea se desfășoară în condiții neutre sau bazice. Forma dezamidată a acestor resturi face parte din domeniul invenției.

Alte modificări sunt reprezentate de hidroxilarea pralinei și lizinei, fosforilarea grupărilor hidroxil ale resturilor serii sau treonil, metilarea grupărilor α-amino ale lanțurilor secundare de lizină, arginină și histidină (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, \N. H. Freeman & Co; San Francisco, pg.79 - 86 (1983)), acetilarea aminei N-terminale și amidarea oricărei grupări carboxil C-terminale.

Un alt tip de modificare covalentă constă în cuplarea pe cale chimică sau enzimatică a glicozidelor la anticorp. Aceste metode sunt avantajoase, deoarece nu este necesar ca producția anticorpului să se desfășoare într-o celulă gazdă care să fie capabilă de glicozilare la -N sau -O. în funcție de metoda de cuplare utilizată, zaharidele se pot atașa la: (a) arginină și histidină: (b) grupări carboxil libere; (c) grupări sulfhidril libere precum cele ale cisteinei; (d) grupări hidroxil libere precum cele din serină, treonină sau hidroxiprolină; (e) resturi aromatice precum cele ale fenilalaninei, ale tirozinei sau ale triptofanului; sau (f) gruparea amidă din glutamidă. Aceste metode sunt descrise în WO 87/05330, publicat în 11 septembrie 1987 și în Aplin și Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pg.259 - 306 (1981).

îndepărtarea oricăror fragmente hidrocarbonate prezente în structura anticorpului se poate realiza pe cale chimică sau enzimatică. Deglicozilarea chimică necesită expunerea anticorpului la acid trifluormetan sulfonic sau la un compus echivalent. Prin acest tratament se scindează majoritatea sau toate zaharidele, cu excepția zaharidului de legătură (Nacetilglucozamină sau N-acetilgalactozamină), anticorpul rămânând intact. Deglicozilarea chimică este descrisă de Hakimuddin și colab., Arch. Biochem Biophys. 259:52 (1987) și de Edge și colab., Anal. Biochem. 118:131 (1981). Scindarea enzimatică a fragmentelor hidrocarbonate ale anticorpilor se poate realiza prin utilizarea a diverse endo- și exo- glicozidaze, conform descrierii lui Thotakura și colab., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).

Un alt tip de modificare covalentă îl constituie legarea anticorpului la unul dintre diversele tipuri de polimeri non-proteici, ca de exemplu, polietilenglicol, polipropilenglicol sau polioxialchilene, prin metoda descrisă în brevetele US 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 sau 4179337.

B. Vectori, celule gazdă și metode de recombinare

Invenția se referă, de asemenea, și la acidul nucleic izolat, care codifică un anticorp mutant conform descrierii, la vectori și la celule gazdă, care conțin acidul nucleic respectiv, și la tehnici de recombinare pentru producția anticorpului mutant.

Pentru producția prin recombinare a anticorpului mutant, se izolează acidul nucleic care îl codifică și se inserează într-un vector replicabil, pentru a fi apoi donat (amplificare ADN) sau pentru a fi exprimat. ADN-ul care codifică anticorpul mutant monoclonal se izolează rapid și se secvențializează conform metodelor standard (de exemplu, prin utilizarea sondelor oligonucleotidice capabile să se lege specific la genele care codifică lanțurile grele și ușoare ale anticorpului mutant). Există o mulțime de vectori disponibili pentru acest scop. Componentele vectorilor sunt reprezentate printre altele de: o secvență semnal, o origine a replicării, una sau mai multe gene marker, un element amplificator, un promotor și o secvență de terminare a transcrierii.

(i) Secvență semnal

Anticorpul mutant al acestei invenții poate fi produs prin recombinare, nu numai direct, ci și ca polipeptidă de fuziune cu o polipeptidă heteroloagă, care este în mod preferabil o secvență semnal sau alt polipeptid, având un situs specific de scindare la capătul Nterminal al polipeptidului sau proteinei mature. Secvența semnal heteroloagă aleasă este de

RO 120848 Β1 preferință o secvență care este recunoscută și prelucrată și anume scindată de peptidaza 1 semnal de celula gazdă. în cazul celulelor procariote care nu recunosc și nu prelucrează secvența semnal a anticorpului nativ, secvența semnal se substituie cu una de origine pro- 3 cariotă, selectată, de exemplu, din grupul format din secvențele leader pentru fosfataza alcalină, penicilinază, Ipp sau enterotoxina II termostabilă. Pentru secreția de drojdie se substi- 5 tuie secvența semnal nativă cu secvența leader pentru invertaza drojdiei, secvența leader a factorului a (inclusiv secvențele leader ale factorului a din Saccharomyces și 7 Kluyveromyces) sau cu secvența leader a fosfatazei acide, a glucomilazei C. albicans sau cu secvența semnal descrisă în WO 90/13646. Pentru expresie în celulele mamiferelor, se 9 pot utiliza secvențe semnal ale mamiferelor, precum și secvențe leader ale secreției virale, de exemplu, secvența semnal gD a virusului herpes simplex.11

ADN-ul corespunzător unei astfel de regiuni precursoare este ligat în cadrul de citire al ADN-ului ce codifică anticorpul mutant.13 (ii) Originea replicării

Atât vectorii de donare, cât și cei de expresie conțin o secvență de acid nucleic care15 permite vectorului să se replice într-una sau mai multe celule gazdă selectate. în general, în vectorii de donare această secvență este o secvență care îi conferă vectorului capacitatea17 de replicare independentă de ADN-ul cromozomial al gazdei și este reprezentată de origini de replicare sau de secvențe ce se replică autonom. Se cunosc astfel de secvențe pentru 19 o varietate de bacterii, drojdii și virusuri. Originea replicării de la plasmida pBR22 este adecvată pentru majoritatea bacteriilor Gram-negative, originea replicării ce provine de la o 21 plasmidă cu dimensiunea de 2 μ este adecvată pentru drojdie, iar pentru donarea vectorilor în celule de mamifere, sunt utile diverse origini virale (SV40, polioma, adenovirus, VSV sau 23 BPV). în general, vectorii de expresie la mamaifere nu necesită origine de replicare (poate fi utilizată în mod caracteristic originea SV40, doar datorită promotorului precoce pe care îl 25 conține).

(iii) Selecția genei componente 27

Vectorii de donare și de expresie pot conține o genă de selecție, denumită și marker de selecție. Genele caracteristice de selecție codifică proteine care (a) conferă rezistență la 29 antibiotice sau la alte toxine, de exemplu, la ampicilină, neomicină, metotrexat sau tetraciclină, (b) completează deficiențele trofice, sau (c) asigură elemente nutritive esențiale care 31 nu pot fi procurate din medii complexe, cum este, de exemplu, gena care codifică racemaza D-alaninei din Bacillus. 33

Un exemplu de schemă de selecție constă în utilizarea unui medicament care să stopeze creșterea celulei gazdă. Acele celule la care transformarea s-a realizat cu succes, 35 primind o genă heteroloagă ce produce o proteină care conferă celulei rezistență la medicamentul respectiv, vor supraviețui regimului de selecție. Exemple de astfel de selecții domi- 37 nante sunt reprezentate de selecția cu neomicină, acid micofenolic și higromicină.

Un alt exemplu de markeri de selecție adecvată, pentru celulele de mamifere, este 39 reprezentat de markerii care permit identificarea celulelor capabile să primească acidul nucleic ce codifică anticorpul, și anume DHFR, timidin kinoza, metalotionina -1 și - II, pre- 41 ferabil genele ce codifică metalotionina la primate, dezaminaza adenozinei, decarboxilaza ornitinei etc. 43

De exemplu, celulele transformate cu gena de selecție DHFR sunt identificate mai întâi prin cultivarea tuturor transformanților într-un mediu de cultură ce conține metotrexat 45 (Mtx), un antagonist competitiv al DHFR. Atunci când se utilizează DHFR de tip sălbatic, o celulă gazdă adecvată este reprezentată de linia de celule din ovarul de hamster chinezesc 47 (OHO), deficitară în ceea ce privește activitatea DHFR.

RO 120848 Β1 în mod alternativ, celule gazdă (în special, de tip sălbatic, ce conțin DHFR endogenă) transformate sau cotransformate cu secvențe de ADN ce codifică anticorpul, proteina DHFR și un alt marker de selecție precum 3'-fosfotransferaza aminoglicozidică (APH) pot fi selectate prin cultivare în mediu ce conține un agent de selecție corespunzător markerului de selecție respectiv, și anume un antibiotic de tip aminoglicozidic precum kanamicina, neomicina sau G418 (US 4965199).

O genă adecvată de selecție, care se poate utiliza la drojdie, este gena trp 1, prezentă în plasmida drojdiei Yrp7 (Stinchcomb și colab., Nature 282: 39(1979)). Gena trp 1 furnizează un marker de selecție, pentru o tulpină de drojdie mutantă căreia îi lipsește capacitatea de a crește în mediu cu triptofan, de exemplu, tulpina identificată în ATCC cu nr. 44076 sau PEP 4 -1. Jones, Genetics 85:12(1977). Prezența trp 1 în genomul celulei gazdă de drojdie asigură un mijloc eficient de detecție a transformării, prin cultivare în absența triptofanului. în mod similar, se completează tulpinile de drojdie cărora le lipsește Leu 2, cu ajutorul unor plasmide cunoscute care poartă gena Leu 2.

în plus, se pot utiliza, la transformarea tulpinilor de drojdie Kluyveromyces, vectorii derivați din plasmida circulară pKD1, de 1,6 um. în mod alternativ, s-a descris utilizarea unui sistem de expresie pentru producția la scară largă a chimozinei recombinante bovine, de către K. lactis. Van den Berg, Biotechnology 8:135(1990). S-au descris, de asemenea, vectori stabili pentru expresia de copii multiple, utilizați pentru secreția de albumină serică recombinantă, umană, matură, de către tulpini industriale de Kluyveromyces, Flee și colab., Biotechnology 9:968 - 975(1991).

(iv) Promotorul

Vectorii de expresie și de donare conțin de obicei un promotor care este recunoscut de organismul gazdă și care este legat în mod funcțional la acidul nucleic ce codifică anticorpul. Promotori adecvați pentru utilizare în celule gazdă de origine procariotă sunt reprezentați de promotorul pho A, sistemele promotoare β-lactamază și lactoză, fosfatază alcalină, un sistem promotor pentru triptofan (trp) și promotori hibrizi precum promotorul tac. Sunt adecvați totuși și alți promotori bacterieni cunoscuți. Promotorii care se utilizează în sistemele bacteriene vor conține de asemenea și o secvență Shine-Dalgamo (S.D.) legată în mod funcțional la ADN-ul ce codifică anticorpul.

Se cunosc și secvențe promotor utilizabile la eucariote. în mod teoretic, toate genele de proveniență eucariotă au o regiune bogată în AT, localizată la aproximativ 25-30 de baze distanță în amonte de situsul unde se inițiază transcrierea. O altă secvență, ce se află la o distanță de 70 - 80 de baze mai sus de startul transcrierii în structura multor gene, este o regiune CNCAAT în care N poate fi o nucleotidă. La capătul 3' al majorității genelor de origine eucariotă se găsește o secvență AATAAA, care poate fi semnalul de legare a capătului poly A la capătul 3' al secvenței codante. Toate aceste secvențe se inserează în mod adecvat în vectori de expresie la eucariote.

Exemple de secvențe promotor, adecvate pentru utilizare la gazde de tipul drojdiei, sunt reprezentate de promotorii pentru 3-fosfoglicerat kinază sau alte enzime glicolitice precum enolaza, gliceraldehidă-3-fosfatdehidrogenaza, hexokinaza, piruvatdecarboxilaza, fosfofructokinaza, glucozo-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triozofosfat izomeraza, fosfoglucozo-izomeraza și glucokinaza.

Alți promotori utilizați la drojdie, și anume promotori inductibili ce au avantajul suplimentar de a avea transcrierea controlată de condițiile de cultură, sunt regiunile promotoare pentru alcool dehidrogenaza 2, izocitocromul C, acid fosfatază, enzime de degradare implicate în metabolismul azotului, metalotioneină, gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenaza și enzime responsabile de utilizarea maltozei și galactozei. Vectorii și promotorii adecvați pentru expresia la drojdie sunt în continuare descriși în EP 73657. Sunt, de asemenea, utilizați în mod avantajos, împreună cu promotorii pentru drojdie și amplificatorii.

RO 120848 Β1

Transcrierea anticorpului de la vectori la celule gazdă de mamifere este controlată, 1 de exemplu, de promotori obținuți din genoamele virusurilor precum polioma virus, fowlpox virus, adenovirus (precum adenovirusul 2), papiloma virusul bovin, virusul sarcomului la 3 păsări, citomegalovirus, un retrovirus, virusul hepatitei B, cel mai preferat fiind virusul simian 40 (SV40), promotori heterologi de la mamifere, de exemplu, promotorul pentru actină sau 5 un promotor pentru imunoglobulină, promotori pentru șoc termic, cu condiția ca acești promotori să fie compatibili cu sistemele celulei gazdă. 7

Promotorii precoce și tardivi ai virusului SV40 se obțin în mod convenabil sub formă de fragment de restricție al SV40, care mai conține și originea replicării virusului SV40. Pro- 9 motorul precoce rapid al citomegalovirusului uman se obține în mod convenabil sub formă de fragment de restricție HindIIIE. Este descris un sistem de expresie a ADN-ului la mami- 11 fere, utilizând papiloma virusul bovin, în brevetul US 4601978. în mod alternativ, s-a realizat expresia ADN_C a β-interferonului uman în celule de șoarece, controlată de promotorul pentru 13 timidin kinază de la virusul herpes simplex. în mod alternativ, se poate utiliza ca promotor secvența repetitivă terminală lungă a virusului sarcomului rous. 15 (v) Elementul amplificator

Transcrierea ADN-ului ce codifică anticorpul acestei invenții, realizată de eucariote 17 evoluate, se poate deseori intensifica prin introducerea unei secvențe amplificator în vector.

Se cunosc multe secvențe amplificator de la genele de mamifere (globină, elastază, albu- 19 mină, a-fetoproteină și insulină). Se utilizează totuși, în mod caracteristic, un amplificator de la un virus al celulelor eucariote. 21

Exemplele sunt reprezentate de amplificatorul SV40 situat după sfârșitul originei de replicare (p.b. 100 - 270), amplificatorul promotorului precoce al citomegalovirusului, amplifi- 23 catorul de la polioma virus, situat după sfârșitul originii de replicare și amplificatori ai adenovirusurilor. A se vedea, de asemenea, și Yaniv, Nature 297:17 -18 (1982) în legătură cu ele- 25 mentele amplificator pentru activarea promotorilor eucariotici. Amplificatorul poate fi introdus în vectorul respectiv, într-o poziție situată 5' sau 3' față de secvența ce codifică anticorpul, 27 preferabil, însă, într-un situs localizat 5' față de promotor.

(vi) Componenta de terminare a transcrierii 29

Vectorii de expresie utilizați în celule gazdă eucariote (celule de drojdie, fungi, insecte, plante, animale, om sau celule nucleate de la alte organisme pluricelulare) vor conține 31 și secvențe necesare pentru terminarea transcrierii și pentru stabilizarea ARN_m. Astfel de secvențe se pot procura de obicei de la regiunile 5' și ocazional 3' netraduse ale ADN-ului 33 sau ADN_c-ului viral sau eucariotic. Aceste regiuni conțin segmente nucleotidice transcrise ca fragmente poliadenilate în porțiunea netradusă a ARN_m ce codifică anticorpul. O com- 35 ponentă utilă de terminare a transcrierii este regiunea de poliadenilare a hormonului bovin de creștere. A se vedea, WO 94/11026 și vectorul de expresie descris în acesta. 37 (vii) Selecția și transformarea celulelor gazdă

Celule gazdă adecvate pentru donarea sau expresia ADN-ului vectorilor conform 39 invenției sunt celulele procariote, celulele de drojdie sau celulele eucariote evoluate, descrise mai sus. Procariote adecvate acestui scop sunt reprezentate de eubacterii precum orga- 41 nismele Gram-negative sau Gram-pozitive, de exemplu, euterobacterii precum Escherichia, de exemplu E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, de exemplu, 43 Salmonella typhimurium, Serratia, de exemplu, Serratia marcescans și Shigella, precum și bacili precum B. subtilis și B. licheniformis (de exemplu, β. licheniformis 41P, descris în DD 45 266710, publicat în 12 aprilie 1989), Pseudomonas precum P. aerjuginosa și Streptomyces.

O gazdă de donare de tip E. coli preferată este E. coli 294 (ATCC 31.446), deși sunt 47 adecvate și alte tulpini precum E. coli Β, E. coli X1776 (ATCC 31.537) și E. coli W3110 (ATCC 27.325). Aceste exemple nu au rol de limitare a domeniului invenției, ci doar scop 49 explicativ.

RO 120848 Β1 în afară de procariote, mai sunt adecvați, ca gazde de expresie sau donare pentru vectorii ce codifică anticorpul, și organisme de origine eucariotă precum fungi filamentoase sau drojdie. Cea mai utilizată gazdă este Saccharomyces cerevisiae sau drojdia pentru fabricarea pâinii, alături de alte microorganisme mai puțin evoluate. Sunt totuși disponibile și utile și alte genuri, specii și tulpini precum Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces ca de exemplu, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgahcus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, și K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces occidentalis; și fungi filamentoși, ca de exemplu, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium și Aspergillus precum A. nidulans și A. niger.

Celule gazdă adecvate pentru expresia anticorpilor glicozilați provin din organisme pluricelulare. Este adecvată în general orice cultură de celule eucariote, fie de la vertebrate fie de la nevertebrate. Exemple de celule de la nevertebrate sunt reprezentate de celulele vegetale și celulele de insectă, Luckow și colab., Biotechnology6, 47 - 55 (1988); Miller și colab., Genetic Egineering, Setlow și colab., eds. voi. 8, pg. 277 - 279 (Plenam publishing 1986); Mseda și colab., Nature 3A5,592-594 (1985). S-au identificat numeroase tulpini baculovirale și variante ale acestora, celule gazdă de la insecte permisive pentru acestea, celule ce provin de la Spadoptera frugipeda (omidă), Aedes aegypti (țânțar), Aedes albopictus (țânțar), Drosophila melanogaster (musculița de fructe) și Bombyx mori. O linie celulară în mod special preferată este linia celulară sf9 de la insecte. Există o mulțime de tulpini virale utile pentru transfecție, de exemplu, varianta L-1 a Autographa californica NPV și tulpina Bm5 de Bombyx mori NPV, aceste tipuri de virusuri putând fi utilizate conform invenției, în special pentru transfecția celulelor de Spadoptera frugiperda. Mai mult, se pot utiliza ca gazde culturi de celule vegetale, de bumbac, cartof, soia, petunii, tomate și tutun.

Cu toate acestea, celulele de vertebrate prezintă un interes mai mare, iar multiplicarea celulelor de vertebrate în culturi (culturi de țesut) a devenit un procedeu de rutină. A se vedea, Tissue Culture, academic Press, Kruse și Patterson, eds. (1973). Exemple de linii celulare de mamifere utile ca gazde sunt linia de celule renale de maimuță CV1, transformate cu SV40 (COS-7, ATCC CRL1651); linia de celule renale embrionare umane (293 sau celule 293 subclonate în scopul cultivării în suspensii de cultură, Graham și colab., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); celule renale de pui de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celule ovariene de hamster chinezesc -DHFR (CHO, Urlaub și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7. 4216 (1980)); celule sertoli de la șoarece (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); celule renale de maimuță (CN1 ATCC CCL 70); celule de maimuță verde africană (VERO-76, ATCC CRL-1587); celule de carcinom de col uterin uman (HELA, ATCC CCL 2); celule renale de câine (MDCK, ATCC CCL 34); celule hepatice de șobolan (BRL 3A, ATTC CRL 1442); celule pulmonare umane (W138. ATCC CCL 75); celule hepatice umane (Hep G2, HB 8065); celule de tumoră mamară de șoarece (MMT 060562, ATTC CCL51); celule TRI (Mather și colab., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); celule MRC 5; celule FS4; și linia celulară de hepatom uman (Hep G2).

Celulele gazdă sunt transformate cu vectorii de expresie sau de donare descriși mai sus, în scopul producției de anticorpi, și sunt cultivate pe medii nutritive convenționale, modificate corespunzător pentru inducția promotorilor, selecția transformanților sau amplificarea genelor ce codifică secvențele dorite.

RO 120848 Β1 (viii) Cultivarea celulelor gazdă 1

Celulele gazdă utilizate pentru producția anticorpului mutant al acestei invenții pot fi cultivate pe o varietate de tipuri de mediu. Mediile ce pot fi procurate din comerț precum 3 mediul F10 al lui Ham (Sigma), mediul minim esențial (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), și mediul Eagle modificat al lui Dulbecco (DMEM, Sigma) sunt medii adecvate pentru cui- 5 tivarea celulelor gazdă. Pe lângă acestea, poate fi utilizat ca mediu de cultură pentru celulele gazdă oricare dintre mediile descrise de Ham și colab., Meth. Enzymol. 58:44 (1979), Barnes 7 și colab., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), brevetele US 4767704, 4657866, 4927762, 4560655 sau 5122469; WO 87/00195 sau brevetul US Re. 30985. Oricare dintre aceste 9 medii poate fi suplimentat, dacă este necesar, cu hormoni și/sau alți factori de creștere (precum insulina, transferina sau factor de creștere epidermală), săruri (precum X-cloruri, 11 unde X este sodiu, calciu, magneziu; și fosfați), soluții tampon (precum HEPES), nucleotide (precum adenozină și timidină), antibiotice (precum GENTAMYCIN^(R>), urme de elemente (și 13 anume compuși anorganici care se găsesc de obicei în concentrații finale de ordin micromolar) și glucoza sau o sursă echivalentă de energie. Se pot utiliza și alți compuși necesari, 15 în concentrații adecvate, cunoscuți de către specialiști.

(ix) Purificarea anticorpului 17

Prin utilizarea tehnicilor de recombinare, anticorpul mutant poate fi produs intracelular în spațiul pericitoplasmatic sau poate fi secretat direct în mediu. Dacă anticorpul mutant este 19 produs intracelular, într-o primă etapă, se înlătură detritusul de particule, alcătuit fie din celule gazdă, fie din fragmente lizate, de exemplu, prin centrifugare sau ultrafiltrare. Carter 21 și colab., Biotechnology 10: 163 - 167 (1992) descriu o metodă de izolare a anticorpilor secretați cu spațiul pericitoplasmatic la E. coli. Pe scurt, pasta celulară este înmuiată în pre- 23 zență de acetat de sodiu (pH 3,5), EDTA, și fenilmetilsulfonilfluorură (PMSF), timp de aproximativ 30 min. Detritusul celular se poate îndepărta prin centrifugare. Dacă anticorpul mutant 25 se secretă în mediu, se concentrează mai întâi supernatanții ce provin din astfel de sisteme de expresie, cu ajutorul unui filtru de concentrare a proteinelor, procurabil din comerț, de 27 exemplu, o unitate de ultrafiltrare Amicon sau Millipore Pellicon. Se poate utiliza în oricare dintre etapele precedente, un inhibitor al proteazei precum PMSF, pentru a inhiba protealiza 29 și, de asemenea, se poate utiliza și un antibiotic pentru a preveni creșterea celulelor contaminante apărute accidental. 31

Compoziția de anticorpi preparată din aceste celule poate fi purificată, utilizând, de exemplu, cromatografia în hidroxiapatită, electroforeza în gel, dializa, cromatografia de 33 afinitate, aceasta din urmă fiind tehnica preferată de purificare. Utilitatea proteinei A, ca ligand de afinitate, depinde de specia și de izotipul oricărui domeniu Fc de imunoglobulină, 35 prezent în anticorpul mutant. Proteina A poate fi utilizată la purificarea anticorpilor pe bază de lanțuri grele umane v1, v2 sau y4 (Lindmark și colab., J. Immunol. Meth. 62: 1 - 13 37 (1983)). Proteina G se recomandă pentru toate izotipurile de la șoarece și pentru izotipul uman v3 (Guss și colab., EMBO J. 5: 1567 - 1575(1986)). Matricea la care se atașează 39 ligandul de afinitate este cel mai adesea agaroză, dar se pot utiliza și alte matrice. Prin utilizarea matricelor stabile din punct de vedere mecanic precum sticla cu pori de dimensiune 41 controlată sau poli(stirendivinil)benzenul, se obțin viteze mai mari ale fluxului și timp mai scurt de prelucrare decât în cazul agarozei. Când anticorpul mutant conține un domeniu 43 CH3, se poate utiliza pentru purificare rășina Bakerbond ABX^<R> (J. T. Baker, Phillipsburg, NY). Se pot utiliza și alte tehnici de purificare a proteinelor precum fracționarea într-o coloană 45 schimbătoare de ioni, precipitarea în etanol, HPLC cu fază inversă, cromatografie pe dioxid de siliciu, cromatografie pe heparin SEPHAROSE^(R), cromatografie pe o rășină schimbătoare 47 de anioni sau de cationi (precum o coloană de acid poliaspartic), cromatofocalizare, SDSPAGE și precipitare în sulfat de amoniu, în funcție de anticorpul mutant care se purifică. 49

RO 120848 Β1

După etapele preliminare de purificare, amestecul ce conține anticorpul de interes și contaminanții poate fi supus cromatografiei de interacție hidrofobă la pH scăzut, utilizând o soluție tampon de eluare la un pH cuprins între aproximativ 2,5 și 4,5, desfășurată în mod preferabil în condițiile unor concentrații scăzute a sărurilor (de exemplu, 0 - 0,25 M sare)

C. Formulări farmaceutice

Se prepară formulări terapeutice de polipeptid sau de anticorp, destinate păstrării sub formă de preparate liofilizate sau de soluții apoase, prin amestecarea polipeptidului cu gradul dorit de puritate cu materiale de suport opționale, acceptabile din punct de vedere farmaceutic, excipienți sau agenți de stabilizare utilizați de obicei în domeniu (denumiți cu toții excipienți), de exemplu, agenți de tamponare, agenți de stabilizare, conservanți, agenți de menținere a caracterului izoton, detergenți neionici, antioxidanți și alți aditivi diverși (A se vedea, Remington's Pharmaceutical Sciences, a 16-a ediție, a. Osol, Ed. (1980)). Acești aditivi trebuie să fie netoxici pentru gazde, la dozele și în concentrațiile utilizate.

Agenții de tamponare ajută la menținerea pH-ului în intervalul corespunzător condițiilor fiziologice. Sunt prezenți în mod preferabil în concentrații cuprinse între aproximativ 2 și aproximativ 50 mM. Agenți adecvați de tamponare, care se utilizează conform acestei invenții, sunt reprezentați atât de acizi organici, cât și anorganici, precum și săruri ale acestora, cum sunt de exemplu agenții de tamponare de tip citrat (de exemplu, amestec de citrat monosodic-citrat disodic, (amestec de acid citric-citrat trisodic, amestec de acid citric-citrat monosodic etc.), agenți de tamponare de tip succinat (de exemplu, amestec de acid succinicsuccinat monosodic, amestec de acid succinic-hidroxid de sodiu, amestec de acid succinicsuccinat disodic etc.), agenți de tamponare de tip tartrat (de exemplu, amestec de acid tartric-tartrat de sodiu, amestec de acid tartric-tartrat de potasiu, amestec de acid tartrichidroxid de sodiu etc.), agenți de tamponare de tip fumarat (de exemplu, amestec de acid fumaric-fumarat monosodic, amestec de acid fumăric-fumarat disodic, amestec de fumarat monosodic-fumarat disodic etc.), agenți de tamponare de tip gluconat (de exemplu, amestec de acid gluconic-gluconat de sodiu, amestec de acid gluconic-hidroxid de sodiu, amestec de acid gluconic-gluconat de potasiu etc.), agenți de tamponare de tip oxalat (de exemplu, amestec de acid oxalic-oxalat de sodiu, amestec de acid oxalic-hidroxid de sodiu, amestec de acid oxalic-oxalat de potasiu etc.), agenți de tamponare de tip lactat (de exemplu, amestec de acid lactic-lactat de sodiu, amestec de acid lactic-hidroxid de sodiu, amestec de acid lactic-lactat de potasiu etc. și agenți de tamponare de tip acetat (de exemplu, amestec de acid acetic-acetat de sodiu, amestec de acid acetic-hidroxid de sodiu etc.). în plus, se pot menționa agenți tampon de tip fosfat, de tip histidină și săruri de trimetilamină precum Tris.

Se adaugă conservanți care întârzie dezvoltarea microbiană, în cantități cuprinse între 0,2 și 1% (gr./vol.). Conservanți adecvați utilizării conform acestei invenții sunt reprezentați de fenol, alcool benzilic, meta-crezol, metil paraben, propil paraben, clorură de octadecildimetilbenzilamoniu, halogenuri de benzalconiu (de exemplu, clorură, bromură, iodură), clorură de hexametoniu, alchil parabeni precum metil sau propil paraben, catecol, rezorcinol, ciclohexanol și 3-pentanol.

Agenții de păstrare a caracterului izotonic, cunoscuți câteodată și ca stabilizatori, au rol de a asigura caracterul izotonic al compozițiilor lichide ale prezentei invenții și sunt reprezentați de alcooli polihidroxilici ai zaharidelor, preferabil trihidroxilici sau cu număr mai mare de grupări hidroxil, precum glicerina, eritriolul, arabitolul, xilitolul, sorbitolul și manitolul. Alcoolii polihidroxilici pot fi prezenți într-o cantitate cuprinsă între 0,1 și 25% în greutate, preferabil, între 1 și 5% în greutate, luând în considerare cantitățile relative ale celorlalți ingredienți.

RO 120848 Β1

Agenții de stabilizare se referă la o largă categorie de excipienți, care pot varia în 1 funcție de la agenți de volum până la aditivi care solubilizează agentul terapeutic sau ajută la prevenirea denaturării sau aderenței la pereții recipientului. Agenții tipici de stabilizare pot 3 fi alcooli polihidroxilici ai zaharidelor (enumerați mai sus); aminoacizi precum arginina, lizina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, α-leucina, 2-fenilalanina, acid glu- 5 tamic, treonina etc., zaharuri organice sau alcooli zaharidici precum lactoza, trehaloza, stachioza, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinizitol, salactitol, glicerol și alții de acest gen, in- 7 clusiv alcooli ciclici precum inozitol; polietilen glicol; polimeri de aminoacizi precum polivinilpirolidonă; monozaharide precum xiloză, manoză, fructoză, glucoză; dizaharide precum 9 lactoză, maltoză, sucroză; și trizaharide precum rafinoza; polizaharide ca de exemplu dextran. Agenții de stabilizare sunt prezenți în raport de 0,1 - 10.000:1 în greutate, față de 11 proteina activă.

Surfactanții sau detergenții neionici (cunoscuți și ca agenți de umectare) au rol de 13 a facilita solubilizarea agentului terapeutic, precum și rol de protecție a proteinei terapeutice împotriva agregării determinate de agitarea flaconului, ceea ce permite, de asemenea, ca 15 preparatul farmaceutic să fie supus tensiunilor superficiale de forfecare, fără ca proteina din compoziția sa să se denatureze. Surfactanți neionici adecvați sunt reprezentați de polisorbați 17 (20,80 etc.), polioxameri (184,188, etc), Pluronic^(R), polioli, monoeteri sorbitan polioxietilenă (Tween^(R) - 20, Tween^(R) - 80 etc.). Surfactanții neionici se găsesc în concentrații cuprinse 19 între aproximativ 0,05 și aproximativ 1,0 mg/ml, preferabil cuprinsă între aproximativ 0,07 și aproximativ 0,2 mg/ml. 21

Alți diverși excipienți pot fi agenți de volum (de exemplu, amidon), agenți de chelare (de exemplu, EDTA), antioxidanți (de exemplu, acid ascorbic, metionină, vitamina E), și 23 cosolvenți.

Această formulare farmaceutică poate să conțină, de asemenea, mai mulți compuși 25 activi, dacă afecțiunea tratată o impune, preferabil compuși cu acțiuni complementare care nu interacționează în mod nedorit unul cu celălalt. De exemplu, se poate dori adăugarea a 27 încă unui agent supresor. Aceste molecule se vor găsi în mod corespunzător în combinație, în cantități care sunt eficiente pentru scopul propus. 29

Ingredienții activi pot fi, de asemenea, încapsulați în microcapsule preparate, de exemplu, prin tehnici de conservare sau prin polimerizare interfacială, ca în cazul micro- 31 capsulelor de gelatină sau hidroximetilceluloză și respectiv în cazul microcapsulelor de poli (metilmetacilat) în sisteme de eliberare a medicamentului sub formă coloidală (de exemplu, 33 lipozomi, microsfere de albumină, microemulsii, nanoparticule și nanocapsule) sau în macroemulsii. Aceste tehnici sunt descrise în Remington's Pharmaceutical Sciences, a 16 a ediție. 35 A. Osal, Ed.(1980).

Formulările destinate administrării in vivo trebuie să fie sterile. Aceasta se realizează 37 rapid, de exemplu, prin filtrare prin membrane sterile de filtrare.

Se pot realiza preparate cu eliberare de lungă durată. Exemple de preparate cu 39 eliberare de lungă durată sunt reprezentate de matrice semipermeabile de polimeri hidrofobi solizi, care conțin anticorpul mutant, aceste matrice fiind sub formă de produse finisate 41 precum pelicule sau microcapsule. Exemple de matrice utilizate pentru eliberarea de lungă durată a substanței medicamentoase sunt reprezentate de poliesteri, hidrogeluri (de exem- 43 piu, poli(2-hidroxietilmetacrilat)sau alcool polivinilic, polilactide (US 3773919), copolimeride acid L-glutamic și L-glutamat de etil, de etilen-acetat de vinii nedegradabili, copolimeri degra- 45 dabili de acid lactic-acid glicolic precum LUPRON DEPOT^(R)(microsfere injectabile compuse din copolimer de acid lactic-acid glicolic și acetat de leuprolidă), și acid poli-D-(-)-3-hi- 47 droxibutiric. în timp ce polimerii de tipul etilen-acetat de vinii și acid lactic-acid glicolic sunt

RO 120848 Β1 capabili să elibereze molecule timp de peste 100 de zile, unele hidrogeluri eliberează proteine pentru perioade mai scurte de timp. Când anticorpii încapsulați rămân în organism pentru o perioadă mai lungă de timp, ei se pot denatura sau agrega datorită expunerii la umiditate la 37’C, ceea ce duce la scăderea activității lor biologice și la apariția unor posibile schimbări ale caracterului imunogen. Se pot imagina strategii logice de stabilizare, în funcție de mecanismul implicat. De exemplu, dacă mecanismul de agregare constă în formarea de legături S-S intermoleculare prin conversie tiol-disuIfură, atunci stabilizarea se realizează prin modificarea resturilor sulfhidril, prin liofilizare din soluții acide, prin controlul umidității, cu ajutorul unor aditivi corespunzători și prin crearea de matrice polimerice cu compoziții specifice.

Cantitatea eficientă de polipeptidă, anticorp sau fragment al acestora, care se utilizează în scop terapeutic pentru o anumită afecțiune sau tulburare, va depinde de natura afecțiunii sau tulburării și se poate determina prin metode clinice standard. Dacă este posibil, se preferă înainte de testarea la om, determinarea curbei doză-răspuns pentru compozițiile farmaceutice ale invenției, mai întâi in vitro și apoi la animale experimentale reprezentative. Totuși, pe baza cunoștințelor în domeniu, o compoziție farmaceutică eficientă pentru favorizarea supraviețuirii neuronilor senzitivi poate asigura o concentrație locală a agentului terapeutic cuprinsă între aproximativ 5 și 20 ng/ml, preferabil cuprinsă între aproximativ 10 și 20 ng/ml. Conform unei alte variante specifice a invenției, o compoziție farmaceutică eficientă pentru favorizarea creșterii și supraviețuirii neuronilor din retină poate asigura o concentrație locală a agentului terapeutic cuprinsă între aproximativ 10 și 100 ng/ml.

Conform unei variante preferate, se administrează prin injecție subcutanată o soluție apoasă de polipeptid, anticorp sau fragment al acestora, cu rol terapeutic. Fiecare doză poate fi cuprinsă între aproximativ 0,5 și aproximativ 50 pg/kg de greutate corporală, mai preferabil între aproximativ 3 și aproximativ 30 pg/kg corp.

Posologia pentru administrarea subcutanată poate varia de la o dată pe săptămână până la administrare zilnică, în funcție de o serie de factori clinici, reprezentați de tipul bolii, de gravitatea și de sensibilitatea subiectului la agentul terapeutic folosit.

D. Utilizări neterapeutice ale anticorpului mutant

Anticorpii mutanți ai prezentei invenții pot fi utilizați ca agenți de purificare a afinității, în acest caz, anticorpii sunt imobilizați pe un material solid precum rășina Sephadex sau pe hârtie de filtru, utilizând metode bine cunoscute în domeniu. Anticorpul mutant imobilizat este pus apoi în contact cu o probă ce conține antigenul care trebuie purificat și apoi se spală suportul cu un solvent adecvat, care va îndepărta în esență tot materialul conținut de proba respectivă, cu excepția antigenului care trebuie purificat și care s-a legat la anticorpul mutant imobilizat. în final se spală suportul cu un alt solvent adecvat, ca de exemplu, soluție tampon de glicină la pH 5,0, care eliberează antigenul din complexul antigen-anticorp mutant.

Anticorpii mutanți se pot utiliza și în teste de diagnostic, de exemplu, pentru detectarea expresiei unui anumit antigen în celule specifice, în țesuturi sau în ser.

în cazul aplicațiilor în scop diagnostic, anticorpul mutant va fi marcat în mod caracteristic cu un fragment detectabil. Se pot utiliza numeroși markeri grupați, în general, în următoarele categorii:

(a) Radioizotopi precum ³⁶S, ¹⁴C, ¹²⁵1,³H și ¹³¹l. Anticorpul mutant poate fi marcat cu radioizotopi prin metodele descrise, de exemplu, în Current Protocols in Immunology, voi. 1-2, Coligen și colab, ed. Wiley-lnterscience, New York, Pubs.(1991), după care se măsoară radioactivitatea prin numărarea scintilațiilor.

Markeri fluorescenți precum chelați de pământuri rare (chelați de europiu) sau fluoresceină și derivații săi, rodamina și derivații săi; dansil; Lissamină, ficoeritrină și Texas Red. Markerii fluorescenți pot fi conjugați cu anticorpul mutant, utilizând tehnici descrise, de exemplu, în Current Protocols in Immunology, prezentat mai sus. Fluorescenta se poate cuantifica cu fluorimetrul.

RO 120848 Β1

Markeri reprezentați de substrate pentru diverse enzime, o parte a acestora fiind tre- 1 cută în revistă de brevetul US 4275149. în general, enzima catalizează o modificare chimică a substratului cromogen, care se măsoară prin diverse metode. De exemplu, enzima poate 3 cataliza o reacție de schimbare a culorii substratului, care se poate măsura spectrofotometric. în mod alternativ, enzima poate modifica fluorescența sau chemiluminescența sub- 5 stratului. Tehnicile de cuantificare a schimbătorilor de fluorescență sunt menționate mai sus. Substratul chemiluminescent poate fi excitat electronic printr-o reacție chimică și poate emite 7 lumină care se măsoară (de exemplu, cu chemiluminometrul sau poate ceda energia unui acceptor fluorescent. Exemple de markeri enzimatici sunt reprezentați de luciferaze (de 9 exemplu, luciferaza licuriciului sau o luciferază bacteriană; brevet US 4737456), luciferină, 2,3-dihidroftalazindione, malat dehidrogenază, urează, peroxidază precum peroxidaza din 11 hrean (HRPO), fosfatază alcalină, β-galactozidază, glucoamilază, lizozim, oxidaze ale zaharidelor (de exemplu, oxidazaglucozei, oxidaza galactozei și glucoza-6-fosfat dehidrogenază), 13 oxidaze heterociclice (precum uricaza și xantin oxidaza), lactoperoxidaza, microperoxidaza și altele de acest fel. Metode de conjugare a enzimelor cu anticorpi sunt descrise de 15 O'SuIlivan și colab., în Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, din Methods in Enzym. (Ed.J. Langone & H.Van Vunakis), 17 Academic Press, New York, 73:147-166 (1981).

Exemple de combinații de substrat-enzimă sunt reprezentate de exemplu, de:19 (i) peroxidaza de hrean (HRPO) cu peroxidază acidă ca substrat, aceasta oxidând un precursor colorat (de exemplu, ortofenilen diamină (OPD) sau clorhidrat de 3,3', 5,5'-21 tetrametilbenzidină (TMB));

(ii) fosfatază alcalină (AP) cu fosfat de p-nitrofenil ca substrat cromogen; și23 (iii) β-d-galactozidază (β-D-Gal) cu un substrat cromogen (de exemplu, p-nitrofenil-β-

D-galactozidază) sau cu un substrat fluorescent 4-metilumbeliferil-P-D-galactozidază.25

Se cunosc multe alte combinații enzimă-substrat de către specialiștii în domeniu. Pentru o trecere generală în revistă a acestora, a se vedea brevetele US 4275149 și 27 4318980.

Câteodată, markerul este conjugat indirect la anticorpul mutant. De exemplu, anti- 29 corpul mutant poate fi conjugat cu biotină, iar markerul care poate face parte din oricare dintre cele trei categorii largi descrise mai sus, poate fi conjugat cu avidină sau viceversa. 31 Biotina se leagă în mod selectiv la avidină și astfel markerul se conjugă cu anticorpul în mod indirect. în mod alternativ, pentru realizarea conjugării indirecte a markerului la anticorpul 33 mutant, se conjugă anticorpul mutant cu o haptenă mică (de exemplu, digloxină) și unul dintre tipurile de marker menționate se conjugă cu un anticorp mutant antihaptenă (de exemplu, 35 anticorp antidigloxină). Astfel se poate obține conjugarea indirectă a anticorpului mutant cu markerul respectiv. 37

Conform unei alte variante a invenției, nu este necesară marcarea anticorpului mutant, iar prezența acestuia poate fi detectată utilizând un anticorp marcat care are capacitate 39 de legare la anticorpul mutant.

Anticorpii prezentei invenții se pot utiliza în orice metodă de analiză cunoscută pre- 41 cum testele de legare competitivă, testele sandvici directe și indirecte și testele de imunoprecipitare. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pg.147-158 (CRC Press, 43

Inc. 1987).

Testele de legare competitivă se bazează pe capacitatea unui compus standard 45 marcat de a intra în competiție cu proba testată la legarea unei cantități limitate de anticorp mutant. Cantitatea de antigen din proba testată este invers proporțională cu cantitatea de 47 compus standard care va fi legat la anticorpi. Pentru a facilita determinarea cantității de

RO 120848 Β1 compus standard legat, în general, anticorpii sunt transformați în formă insolubilă, înainte sau după competiție. Ca rezultat, se pot separa în mod convenabil compușii standard legați de cei nelegați, precum și antigenul testat care s-a legat la anticorpi, de cel care a rămas nelegat.

Testele sandvici implică utilizarea a doi anticorpi capabili fiecare de a se lega la o porțiune imunogenă diferită sau la epitopi diferiți, de la nivelul proteinei care trebuie detectată, în testul sandvici, proba care se analizează se va lega la un prim anticorp imobilizat pe un suport solid, după care este expusă la un al doilea anticorp, care se leagă și el la aceasta, formându-se astfel un complex cu trei componente. A se vedea, de exemplu, brevetul US 4376110. Al doilea anticorp poate fi el însuși marcat cu un fragment detectabil (test sandvici direct) sau poate fi măsurat utilizând un anticorp anti-imunoglobulină, marcat cu un fragment detectabil (test sandvici indirect). De exemplu, un tip de test sandvici este testul ELISA, în cazul căruia, fragmentul detectabil este o enzimă.

Pentru analiză imunolustochimică, proba de tumoră poate fi proaspătă sau congelată sau poate fi inclusă în parafină și fixată cu un conservant precum formalina, de exemplu.

Anticorpii pot fi, de asemenea, utilizați pentru teste de diagnostic in vivo. în general, anticorpul mutant este marcat cu un radionucleotid (precum ¹¹¹ln, Te, ¹⁴C, ¹³¹1,³H, ³²P sau ³⁵S), astfel încât se poate localiza tumora prin imunoscintilație.

E. Truse de diagnostic

Din motive de comoditate, polipeptidă sau anticorpul prezentei invenții poate fi furnizat într-o trusă, care conține o combinație de reactivi în cantități prestabilite, cu instrucțiuni de realizare a testului diagnostic. Când anticorpul mutant este marcat cu o enzimă, trusa va conține substrate și cofactori necesari enzimei respective (de exemplu, un precursor al substratului care furnizează cromoforul sau fluoroforul detectabil). în plus, pot conține și alți aditivi precum agenți de stabilizare, detamponare (de exemplu, o soluție tampon de blocare sau de liză) și alții de acest gen. Cantitățile relative de reactivi pot varia într-un interval larg, asigurând concentrații ale reactivilor în soluție, care să îmbunătățească considerabil sensibilitatea testului. în particular, reactivii se pot prezenta sub formă de pulberi uscate, de obicei liofilizate, conținând excipienți care prin dizolvare formează o soluție de reactiv cu concentrația corespunzătoare.

F. Utilizări in vivo ale polipeptidei sau anticorpului

Anticorpii prezentei invenții se pot utiliza la tratarea unui mamifer. Conform unei variante, anticorpul se administrează, de exemplu, la un mamifer non-uman, în scopul obținerii de date preclinice. Mamifere reprezentative non-umane, care pot fi tratate astfel, sunt reprezentate de primate, câini, pisici, rozătoare și alte animale cu care se realizează studii preclinice. Aceste mamifere pot fi utilizate ca modele pentru o boală ce se dorește a fi tratată cu anticorpul respectiv, sau pot fi utilizate pentru studiul toxicității acestui anticorp. în fiecare din aceste cazuri, se realizează pe mamifere, studii cu doze crescătoare.

Anticorpul sau polipeptidul se administrează pe cale convenabilă, parenteral, subcutanat, intraperitoneal, intrapulmonar sau intranazal, iar dacă se dorește tratament imunosupresiv local, se administrează intralezional. Injecțiile parenterale includ administrarea intramusculară, intravenoasă, intraarterială, intraperitoneală sau subcutanată. în plus, anticorpul mutant se administrează în mod adecvat prin injectare discontinuă, preferabil cu doze din ce în ce mai mici de anticorp mutant. în mod preferabil, doza se administrează prin injectare, în special prin injecții intravenoase sau subcutanate, în funcție de tipul administrării, pentru o perioadă scurtă de timp sau cronică.

RO 120848 Β1

Pentru prevenirea sau tratamentul unei boli, dozarea adecvată a anticorpului sau 1 polipeptidei va depinde de tipul bolii care se tratează, de gravitatea și evoluția bolii, de scopul în care se administrează anticorpul mutant, preventiv sau terapeutic, de terapia anterioară, 3 de istoricul clinic al pacientului și de răspunsul pacientului la anticorpul mutant respectiv, precum și de decizia medicului care conduce tratamentul. Anticorpul anti-lgE umană se 5 administrează în mod adecvat pacientului, în cursul unui tratament sau de-a lungul unor serii de tratamente. 7 în funcție de tipul și de gravitatea bolii, intervalul de dozaj propus pentru administrarea anticorpului sau polipeptidului la un pacient este de la aproximativ 1 pg/kg la 150 mg/kg9 (de exemplu 0,1... 20 mg/kg), administrându-se fie într-una sau mai multe doze separate, fie prin perfuzie. Un interval de dozaj zilnic tipic poate fi cuprins între aproximativ 1 pg/kg și11

100 mg/kg sau mai mult, în funcție de factorii menționați mai sus. în cazul administrărilor repetate pe parcursul câtorva zile sau mai mult, în funcție de afecțiune, tratamentul se men-13 ține până ce se observă o regresie a simptomelor bolii. Totuși, pot fi utile și alte regimuri de dozare. Progresul acestei terapii este monitorizat cu ușurință prin metode și teste conven- 15 ționale. Un interval reprezentativ de dozare pentru un anticorp anti-LFA-1- sau anti-ICAM-1 este descris în WO 94/04188. 17

Compoziția ce conține anticorpul mutant va fi formulată, dozată și administrată, conform practicii medicale corecte. în acest sens, se iau în considerare factori reprezentați de 19 boala ce se tratează, mamiferul care se tratează, starea clinică a individului tratat, cauza bolii, locul de eliberare a agentului, metoda de administrare, programul administrării și alți 21 factori cunoscuți de medici. Cantitatea de anticorp mutant, eficientă din punct de vedere terapeutic, care se administrează, va depinde de factorii considerați mai sus și reprezintă 23 cantitatea minimă necesară, pentru prevenirea, ameliorarea sau tratarea unei boli sau a unei tulburări. Anticorpul mutant poate fi formulat în mod opțional, deși nu este necesar, în corn- 25 binație cu unul sau mai mulți agenți utilizați în mod curent la prevenirea sau tratarea bolii în cauză. Cantitatea eficientă de astfel de agenți depinde de cantitatea de anti-lgE umană pre- 27 zentă în formulare, de tipul bolii sau de tipul tratamentului și de alți factori discutați mai sus.

Aceștia sunt de obicei utilizați în aceleași doze și administrați pe aceleași căi cu cele utilizate 29 în descriere sau în doze ce reprezintă aproximativ 1...99% din dozele utilizate mai sus în prezenta descriere. 31

G. Produse de fabricație într-o altă variantă a invenției, se prezintă un produs de fabricație, ce conține 33 substanțe utile pentru tratamentul bolilor descrise mai sus. Acesta este format dintr-un recipient și o etichetă. Recipientele adecvate sunt reprezentate, de exemplu, de sticluțe, 35 fiole, seringi și eprubete test. Recipientele pot fi produse din diverse materiale precum sticlă sau plastic. Recipientul conține o compoziție care este eficientă pentru tratarea afecțiunii 37 respective și poate avea un orificiu steril de acces (de exemplu, recipientul poate fi o pungă sau o fiolă ce conține soluție pentru administrare intravenoasă, care poate fi prevăzută cu 39 un dop ce poate fi înțepat cu un ac de injectare hipodermică). Agentul activ în compoziția respectivă este anticorpul mutant. Eticheta de pe recipient indică afecțiunea de elecție care 41 se poate trata cu compoziția respectivă. Produsul de fabricație mai poate cuprinde și un al doilea recipient, ce conține o soluție tampon acceptabilă din punct de vedere farmaceutic 43 precum ser fiziologic tamponat cu fosfat, soluție Ringer sau dextroză. Mai poate include și alte materiale necesare din punct de vedere comercial și din punct de vedere al utilizatorului, 45 reprezentate de alte soluții tampon, diluanți, filtre, ace, seringi și instrucțiuni de folosire.

RO 120848 Β1 în continuare, se prezintă 4 exemplele de realizare a invenției, în legătură cu formulele, care reprezintă:

- fig. 1 reprezintă o comparație a domeniilor VH și VL la anticorpii de tip murină MAE11, secvențele consens umane ale subgrupului III al lanțului greu (bum III) și ale subgrupului I al lanțului ușor k (humkl) și fragmentul F(ab)-2, un fragment de anticorp uman modificat cu resturi de CDR și câteva resturi ale scheletului structural modificate la murină;

- fig. 2 reprezintă o comparație a secvențelor din punct de vedere al diferențelor între domeniile CDR ale lanțurilor grele și ușoare, între rhuMabe25, e426 și secvențele e26 și e27. Numărătoarea resturilor în acest caz este consecutivă, spre deosebire de cea a lui Kabat și colab. Trebuie menționat, de asemenea, că aceste secvențe sunt de fapt doar fragmente și nu lanțurile ușoare și grele cu lungimea lor completă;

- fig. 3 reprezintă un grafic al unei analize pe bază de FACS, care indică capacitatea anticorpului testat de a inhiba legarea IgE conjugată cu FITC la lanțul a al receptorilor FceRI cu afinitate înaltă, exprimați pe suprafața celulelor CHO 3D10. Este reprezentată inhibiția procentuală realizată de murină AbMaE11 (□), de martorul negativ mAb4D5 umanizat (), de F(ab)-2 (O), F(ab)-9 (·), F(ab)-11 (A) și de F(ab)-12 (A). Punctele reprezintă media a trei experimente, cu excepția mAb4D5 a cărui valoare a rezultat dintr-un singur experiment. Rezultatele indică faptul că MaE11 și fragmentele F(ab) testate blochează legarea complexelor FlTC-lgE la suprafața celulelor CHO 3D10 ce exprimă lanțul a al FceRI;

- fig. 4 reprezintă un grafic al unei analize pe bază de FACS, care măsoară legarea anticorpilor testați la IgE legată de subunitatea a a receptorilor FceRI cu afinitate înaltă, exprimați pe celulele CHO 3D10. Este reprezentată valoarea procentuală a legării pentru murină mAb MaE11 (O), varianta 12 umanizată (A), martorul pozitiv murină mAb MaE1(#), martorul negativ anticorpul de tip murină MOPC21 (A) și martorul negativ mAb 4D5 umanizată (□). Pe o scară aritmetică/liniară, valorile fluorescenței medii la 0,1/ig/ml au fost 7,3, pentru MPOC21, 32,1 pentru MaE1, 6,4 pentru MaE11, 4,7 pentru hu4D5 și 4,6 pentru huMaE11. Toate cele trei feluri de mAb de tip murină au fost izotip lgG1 de tip murină și ambii Ab umanizați au fost izotip lgG1 uman. Punctele reprezintă media a trei experimente. Rezultatele indică faptul că MaE11 și F(ab)-12 nu se leagă la IgE atașată la celulele CHO3D10 ce exprimă lanțul a al FceRI;

- fig. 5 reprezintă un grafic al raportului molar al anticorpilor anti-lgE față de valoarea procentuală a inhibiției eliberării de histamină indusă de rugină (Senecio jacobala). Sunt prezentate E-25 (·) și e-26(O). Rezultatele indică faptul că forma F(ab) a e-26 inhibă mai puternic eliberarea de histamină indusă de rugină, în funcție de doză, cu un raport molar al inhibiției având o valoare egală cu jumătate din valoarea maximă de 40:1 (anti-lgE:RSIgE);

- fig. 6 este o reprezentare grafică a ameliorării afinității după mai multe cicluri de selecție a afinității descrise în partea a I l-a exemplului 4. Se prezintă raportul creșterii capacității de legare, pentru fiecare grup experimental, față de cea a tipului sălbatic (Emut/Ewt). Rezultatele indică faptul că colecțiile VL (reprezentate de a&b) au prezentat ameliorări succesive până la de 10 ori mai mult decât tipul sălbatic, după 5-6 cicluri de ameliorare. Mai mult, colecțiile VH (c și d) au prezentat o îmbunătățire de 3 ori mai mare după aproximativ trei cicluri. Trebuie avut în vedere că a corespunde colecției Fab-fag care a suferit mutații la resturile 27,28, 30 și 31 din VL CDR-1, în timp ce b corespunde mutațiilor în pozițiile 30, 31,32 & 34 iarc și d sunt colecții F(ab) independente cu mutații la resturile 101,102,103, 105 & 107;

- fig. 7 reprezintă un grafic al densității optice observate față de concentrația de anticorpi competitivi cu IgE, într-un studiu ELISA competitiv, cu fagi, care are ca obiect variantele finale, rezultate din combinații ale mutațiilor VL CDR1 în e26, cu mutațiile VH CDR2, în clonele 235 - 5,1, 235 - 5,2, 235 - 5,3 și 235 - 5,4, redenumite e27, e695, e696 și respectiv e697, descrise în partea a V-a a exemplului 4;

RO 120848 Β1

- fig. 8 reprezintă grafic absorbția la 490 nm a mai multor niveluri de concentrație a 1 anticorpilor anti-lgE e25, e26 și e27, în testul pe placă cu biotină descris în partea a Vl-a a exemplului 4; 3

- fig. 9 indică afinitatea aparentă de legare a F(ab) de la e25, e26 și e27, măsurată cu un sistem de rezonanță a plasmonului de suprafață BIAcore TM-2000. S-au injectat soluții 5 de fragmente F(ab) de anticorpi diluate în serie de 1,5 ori, pe suporturi cu IgE în soluție tampon PBS/Tween (0,05% Tween -20 în soluție salină tamponată cu fosfat) la 25’C, utilizând 7 o viteză a fluxului de 20 ^Al/min. Constantele de disociere la echilibru (Kd) prezentate au fost calculate din raportul Kon/Koff, observat pentru fiecare variantă Fab; 9

- fig.10 este o listă de secvențe a plasmidei p426, care a fost utilizată ca matriță pentru sinteza matrițelor stop cu specificitate de colecție, din exemplul 4; 11

- fig.11 A, o diagramă a inserției plasmidei pDH188, conținând ADN-ul ce codifică lanțul ușor și lanțul greu (domeniul 1 variabil și constant) ale anticorpului umanizat Fab, 13 orientat spre receptorul HER-2. VL și VH sunt regiunile variabile ale lanțurilor ușoare și respectiv grele. C_k este regiunea constantă a lanțului ușor kappa de la om. CH1_G1 este prima 15 regiune constantă a lanțului uman gama 1. Ambele regiuni codante încep cu secvența semnal bacteriană st II; 17

- fig. 11B, o diagramă schematică a întregii plasmide pDH188, care conține inserția descrisă la 11 A. După transformarea plasmidei în celule SR101 E. coli și după adăugarea 19 de fagi helper, plasmida este împachetată în particule fagice. O parte dintre aceste particule prezintă fuziunea Fab-plll (în care pili este proteina codificată de ADN-ul genei III din M13); 21

- fig. 12 reprezintă resturile lanțurilor ușoare și grele, cu lungime completă, ale anticorpilor anti-lgE E25, E26 și E27; 23

- fig. 13 reprezintă fragmentele F(ab) ale anticorpilor e26 și e27;

- fig. 14 reprezintă fragmentele sFV ale anticorpilor anti-lgE e26 și e27; 25

- fig. 15 reprezintă fragmentele F(ab)'2 ale anticorpilor anti-lgE e26 și e27.

Secv. ID. nr.1 reprezintă secvența plasmidei de expresie e426, utilizată în invenție, 27 prezentată, de asemenea, în fig. 10.

Secv. ID. nr. 2 reprezintă secvența variabilă a lanțului greu al MAE 11, indicată 29 în fig. 1.

Secv. ID. nr. 3 reprezintă secvența variabilă a lanțului greu al F(ab)-2, indicată în 31 fig. 1Secv. ID. nr. 4 reprezintă secvența variabilă a lanțului greu al hum III, indicată în 33 fig.1.

Secv. ID. nr. 5 reprezintă secvența variabilă a lanțului ușor al MaE 11, indicată în 35 fig. 1Secv. ID. nr. 6 reprezintă secvența variabilă a lanțului ușor al F(ab)-2, indicată în 37 fig. 1Secv. ID. nr. 7 reprezintă secvența variabilă a lanțului ușor al hum III, indicată în 39 fig. 1

Secv. ID. nr. 8 reprezintă secvența variabilă a lanțului ușor al e26 și e27, indicate 41 în fig. 2.

Secv. ID. nr. 9 reprezintă secvența variabilă a lanțului ușor al e426, indicată în fig. 2.43

Secv. ID. nr. 10 reprezintă secvența variabilă a lanțului ușor al e25, indicată în fig. 2.

Secv. ID. nr. 11 reprezintă secvența variabilă a lanțului greu al e27, indicată în fig. 2.45

Secv. ID. nr. 12 reprezintă secvența variabilă a lanțului greu al e25, e26 și e426, indicate în fig. 2.47

Secv. ID. nr. 13 reprezintă secvența variabilă a lanțului ușor cu lungime completă al e25, așa cum se observă în fig. 12.49

Secv. ID. nr. 14 reprezintă secvența lanțului greu cu lungime completă al e25, așa cum se observă în fig. 12.51

Secv. ID. nr. 15 reprezintă secvența lanțului ușor cu lungime completă al e26, așa

RO 120848 Β1 cum se observă în fig. 12.

Secv. ID. nr. 16 reprezintă secvența lanțului greu cu lungime completă al e26, așa cum se observă în fig. 12.

Secv. ID. nr. 17 reprezintă secvența lanțului ușor cu lungime completă al e27, așa cum se observă în fig. 12.

Secv. ID. nr. 18 reprezintă secvența lanțului greu cu lungime completă al e27, așa cum se observă în fig. 12.

Secv. ID. nr. 19 reprezintă fragmentul Fab variabil al lanțului ușor de la e26 și e27, așa cum se observă în fig. 13.

Secv. ID. nr. 20 reprezintă fragmentul Fab variabil al lanțului greu cu lungime completă al e26, așa cum se observă în fig. 13.

Secv. ID. nr. 21 reprezintă fragmentul Fab variabil al lanțului greu cu lungime completă al e27, așa cum se observă în fig. 13.

Secv. ID. nr. 22 reprezintă fragmentul sFv al e26, așa cum se observă în fig. 14.

Secv. ID. nr. 23 reprezintă fragmentul sFv al e27, așa cum se observă în fig. 14.

Secv. ID. nr. 24 reprezintă fragmentul F(ab)'2 variabil al lanțului ușor pentru e26 și e27, așa cum se observă în fig. 15.

Secv. ID. nr. 25 reprezintă fragmentul F(ab)'2 variabil al lanțului greu pentru e26, așa cum se observă în fig. 15.

Secv. ID. nr. 26 reprezintă fragmentul F(ab)'2 variabil al lanțului ușor pentru e27, așa cum se observă în fig. 15.

Exemplul 1. Prepararea de anticorpi monoclonali anti-lgE

S-au preparat opt anticorpi monoclonali (MAE10-MAE17) cu capacitate de a bloca legarea IgE la FceRL. Anticorpii monoclonali anti-lgE au fost preparați din supenatanții celulelor U266B1 (ATCC TIB196), utilizând cromatografia de afinitate cu un anticorp anti-lgE izolat (Genetech MAE1). Pentru MAE12, au fost imunizați, prin injectare în lăbuțe, cinci șoareci femelă BALB/c, în vârstă de șase săptămâni, cu 10 pg de IgE purificată, în adjuvant Ribi. S-au realizat apoi injecții în același mod, la o săptămână și la trei săptămâni de la imunizările inițiale. La trei zile după ultima injecție, s-au scos ganglionii limfatici inghinali și din zona poplitee, s-au amestecat și s-a realizat o suspensie celulară unică prin trecerea țesutului printr-o sită de oțel. Celulele au fost fuzionate în raport de 4:1 cu celule de mielom de șoarece P3 X63-Ag8. 653 (ATCC CRL 1580) în mediu cu nivel ridicat de glucoză (DMEM), conținând 50% gr/vol polietilen glicol 4000. Pentru MAE 14, MAE 15 și MAE 13, imunizările s-au realizat în același mod, cu excepția faptului că, pentru MAE 13 s-au utilizat 30 pg de IgE pe injecție și s-a analizat un fragment IgE 315 - 347 (Kabat) ca un stimulator de prefuziune. Pentru MAE 10 și MAE 11, injecțiile s-au făcut subcutanat, în două doze de 100 pg și o doză finală de stimulare de 50 pg, utilizându-se pentru fuziuni celule splenice.

Celulele fuzionate au fost apoi însămânțate pe plăci de cultură cu 96 de godeuri, cu o densitate de 2 x 10⁵ celule/godeu. După 24 h s-a adăugat mediu selectiv HAT (hipoxantină/aminopterină/simidină, sigma, # H0262). 1440 de șoareci BALB/c, femele în vârstă de șase săptămâni, au fost injectați în lăbuțe cu 10 pg de IgE purificată în adjuvant Ribi. S-au realizat apoi injecții în același mod, la o săptămână și la trei săptămâni de la imunizările inițiale. La trei zile după ultima injecție, s-au scos ganglionii limfatici inghinali și din zona poplitee, s-au amestecat și s-a realizat o suspensie celulară unică prin trecerea țesutului printr-o sită de oțel. Celulele au fost fuzionate în raport de 4:1 cu celule de mielom de șoarece P3 X63-Ag8. 653 (ATCC CRL 1580) în mediu cu nivel ridicat de glucoză (DMEM), conținând 50% gr/vol polietilen glicol 4000. Pentru MAE 14, MAE 15 și MAE 13, imunizările s-au realizat în același mod, cu excepția faptului că, pentru MAE 13 s-au utilizat 30 pg de IgE pe injecție și s-a analizat un fragment lgE315 - 347 (Kabat) ca un stimulator de prefuziune. Pentru MAE 10 și MAE 11, injecțiile s-au făcut subcutanat în două doze de 100 pg și o doză

RO 120848 Β1 finală de stimulare de 50 pg, utilizându-se pentru fuziuni celule splenice. 1

Celulele fuzionate au fost apoi însămânțate pe plăci de cultură cu 96 de godeuri, cu o densitate de 2 x 10⁵ celule/godeu. După 24 h s-a adăugat mediu selectiv HAT (hipoxan- 3 tină/aminopterină/simidină, sigma, # H0262). Din 1440 de godeuri însămânțate, doar în 365 s-a observat creșterea celulară după selecția cu HAT. 5

La cincisprezece zile după fuziune, s-au analizat supernatanții din punct de vedere al prezenței anticorpilor specifici pentru IfE umană, utilizând testul ELISA. Testul ELISA s-a 7 desfășurat, după cum urmează, toate incubațiile fiind efectuate la temperatura camerei.

Plăcile testate (Imunoplăci Nune) au fost acoperite timp de 2 h cu anticorpi anti-lgG de șoa- 9 rece sintetizați de șobolan (Boehringer Mannheim, #605 - 500) în concentrație de 1 pg/ml, în soluție tampon de carbonat de sodiu 50 MM, pH 9,6, după care au fost blocate cu albu- 11 mină serică bovină 0,5% în ser fiziologic tamponat cu fosfat (PBS), timp de 30 min, după care s-au spălat de patru ori cu PBS, conținând Tween 20 0,05% (PBST). S-au adăugat 13 supernatanții destinați analizei și s-au incubat timp de două ore, agitându-se, după care s-au spălat de patru ori cu PBST. S-a adăugat IgE umană (purificată de la celule U266 conform 15 descrierii de mai sus) în concentrație de 0,5 g/ml și s-au incubat plăcile timp de o oră, agitându-se, după care s-au spălat de patru ori cu PPST. S-au adăugat anticorpi de copie anti- 17 IgE umană, conjugați cu peroxidaza de hrean (Kirkegarrd & Perry Labs, # (4-10-04. 0,5 mg/ml), la o diluție de 1: 2500, și s-au incubat timp de o oră, după care au fost spălate de 19 patru ori cu PBST. S-au adăugat în plăci câte 100 μΙ/godeu de soluție ce conține 10 mg de clorhidrat de o-fenilendiamină (sigma # P8287) și 10 pl de soluție de apă oxigenată 30% în 21 25 ml de tampon citrat, fosfat, pH 5,0 și s-au incubat plăcile, timp de 15 min. Reacția a fost oprită prin adăugare de acid sulfuric 2,5M 100 ul/cavitate. S-au cules datele prin citirea 23 plăcilor la un dispozitiv automat de citire a plăcilor ELISA, la o absorbție de 490 nm. Pentru

MAE12, s-au testat 365 de supernatanți și 100 au fost specifici pentru IgF umană. O frec- 25 vență similară a specificității s-a obținut și la analiza altor anticorpi. Toți anticorpii monoclonali, descriși în prezenta, au fost de izotip IgG 1, cu excepția lui MAE 17, care a fost lgG2b, 27 și a lui MAE 14, care a fost lgG2a.

Fiecare dintre anticorpii specifici pentru IgE au fost testați în continuare în teste pe 29 plăci și pe bază de celule, pentru selecția anticorpilor care se leagă la IgE, astfel încât să inhibe legarea IgE la FceR1 și care nu sunt capabili să se lege la IgE legată de FCEH. 31 Rezultatele acestor teste sunt prezentate în tabelele 1 și 2 de mai jos.

Tabelul 1

Rezumatul caracteristicilor anticorpilor monoclonați anti-lgE umană, de tip murină 35

Anticorp monoclonal	Imunogen	Nr.doze/ doză(g)	Sursă de celule B	Izotip	Legarea Ig legată la FceRI1	Eliberare de histamină PBL2 (EC50)	Cantitatea care blochează FcRP (EC50)
MaE1	Ps IgE	3x50	ganglion limfatic	igGi	0,05	1 g/ml	0,3 g
MaE10	U266 IgE	2x 100, 1 x 50	splină	IgGI	nu se leagă la 10 g/ml	>100 g/ml	2,5 g
MaE11	U266 IgE	2x100, 1 x 50	splină	igGi	nu se leagă la 10 g/ml	>100 g/ml	0,6 g

RO 120848 Β1

Tabelul 1 (continuare)

Anticorp monoclonal	Imunogen	Nr.doze/ doză(g)	Sursă de celule B	Izotip	Legarea Ig legată la FceRI’	Eliberare de histamină PBL2 (EC50)	Cantitatea care blochează FcRP (EC50)
MaE12	U266 IgE	3x30	ganglion	IgGl	nu se leagă la 10 g/ml	>100 g/ml	0,8 g
MaE13	U266 IgE	5x30	ganglion	igci	nu se leagă la 10 g/ml	>10 g/ml	0,6 g
MaE14	U266 IgE	5x50	ganglion limfatic	lgG2a	nu se leagă la 10 g/ml	>100 g/ml	2,5 g
MaE15	U266 IgE	5x1	ganglion limfatic	IgGl	nu se leagă la 10 g/ml	>100 g/ml	0,6 g
MaE16	rHIgE aa315-547	5x1	ganglion limfatic	IgGl	nu se leagă la 10 g/ml	>100 g/ml	0,7 g
MaE17	rHIgE aa315-547	5x1	ganglion limfatic	lgG2b	nu se leagă la 10 g/ml	>100 g/ml	>5,0 g

Tabelul 2

Rezumatul caracteristicilor anticorpilor monoclonali anti-lgE umană, de tip murină (continuare)

Anticorp monoclonal	Legarea la IgE membranară de pe celule U266BL (EC 50)4	Legarea IgE la FceRII (CD23)IM9 (EC50)5	Cantitatea care blochează legarea 1 pg de IgE la FcsRII (EC50)5	Inhibiția sintezei de IgE in vitro	Constanta de afinitate pentru lgE8 (kd)
MaE1	0,4 pg/ml	0,05 pg/ml	>100 pg	(-)	5,4x109
MaE10	0,5 pg/ml	nu se leagă la 10 pg/ml	2,5 pg	(-)	7 x 10 '9
MaE11	0,15 pg/ml	nu se leagă la 10 pg/ml	0,6 pg	(+)	3x 105
MaE12	>10 pg/ml	1 pg/ml	5,0 pg	(-)	4x 107
MaE13	1 pg/ml	nu se leagă	0,7 pg/ml	(++)	5x W8

RO 120848 Β1

Tabelul 2 (continuare) 1

Anticorp monoclonal	Legarea la IgE membranară de pe celule U266BL (EC 50)4	Legarea IgE la FceRII (CD23)IM9 (EC50)5	Cantitatea care blochează legarea 1 pg de IgE la FceRII (EC50)5	Inhibiția sintezei de IgE in vitro	Constanta de afinitate pentru lgE8 (kd)
MaE14	6 pg/ml	nu se leagă la 10 pg/ml	2,5 pg/ml	(±)	1,4 x 10‘5
MaE15	6 pg/ml	nu se leagă la 10 pg/ml	0,6 pg/ml	(±)	7 x 105
MaE 16	10 pg/ml	<0,05 pg/ml	5pg	(+)	ND
MaE 17	10 pg/ml	nu se leagă la 10 pg/ml	5pg	(++)	ND

1. Teste pe bază de FACS pentru analiza anticorpilor monoclonali de tip murină anti- 19 IgE umană. Analiza legării anticorpilor monoclonali de tip murină anti-lgE umană de IgE pe CHO 3D10(FceRla+). 21

a. Se incubează celule CHO3D10 (transfectanți stabili cu lanțul alfa al FceRI, HaKimi și colab., J. Biol. Chem. 25: 22079), în concentrație de 5 x 10⁵ celule/probă, standard IgE 23 U266 (lot nr. 13968-46), în concentrație de 10 pg/ml în 100 pl de tampon FACS (0,1% BSA, azidă de sodiu 10 mM în PBS, pH 7,4), timp de 30 min, la 4°C, urmată de o spălare cu tam- 25 pon FACS. Cantitatea de IgE care se leagă se determină prin incubarea unei mostre de celule încărcate cu IgE și o IgG anti-umană de șoarece conjugată cu FITC policlonală 27 (Accurate Chem. Co.AXL-457F, lot nr. 16) în concentrație de 50 pg/ml, timp de 30 min, la 4°C, urmată de trei spălări cu tampon FACS. 29

b. Celulele încărcate cu IgE sunt incubate cu 100 pl de supernatant de la hibridom

IgE antiumană de tip murină (concentrația IgG de tip murină cuprinsă între 1 și 20 pg/ml), 31 timp de 30 min, la 4°C, urmată de o spălare cu tampon FACS. Se utilizează ca martor pozitiv al legării a IgE antiumană monoclonală de la Genentech (MAE1) în concentrație de 10 pg/ml, 33 iar ca martor negativ se utilizează IgE antiumană monoclonală de la Genentech (MAD6P), care nu recunoaște IgE în concentrație de 10 pg/ml. 35

c. Se detectează legarea anticorpilor monoclonali la IgE pe celule CHO, prin incubarea celulelor cu IgG de capră, antișoarece, F(ab')2 purificat prin cromatografie de afinitate 37 și conjugat cu FITC (Organon Teknica, # 10711 - 0081), timp de 30 min, la 4°C, urmată de trei spălări cu tampon FACS. Se adaugă celulele în 400 pl de tampon ce conține 2 pg/ml 39 iodură de propidin (Sigma # P4170) pentru colorarea celulelor moarte.

d. Se analizează celulele cu un citometru de flux Becton Dickinson. Se stabilesc 41 fasciculele de dispersie a luminii, anterior și lateral, la 90°, pentru a analiza o populație omogenă de celule. Celulele moarte, care s-au colorat cu iodură de propidin, sunt excluse de la 43 analiză. Supernatanții hibridomului, care nu au capacitatea de a lega IgE de pe celulele CH03D10, se vor supune în continuare analizei. 45

RO 120848 Β1

2. Eliberarea de histamină din bazofilele din sângele periferic. Se recoltează sânge de la donori de sânge normali și se heparinizează, după care se diluează 1:4 într-o soluție tampon modificată Tyrodes (25 mM Tris, 150 mM NaCI, 10 mM CaCI₂, MgCI₂, 0,3 mg/mIHSA, pH 7,35), după care se incubează cu IgE umană 1nM (ND) la 4’C, timp de 60 min. Se adaugă apoi celulele în soluție tampon Tyrodes, care conține fie anticorpii monoclonali de tip murină anti-lgE( 10 mg/ml), fie anticorpi policlonali antiser uman, ca martor pozitiv, și se incubează la 37’C, timp de 30 min. Celulele se decantează, se acetilează histamina din supernatant și se determină conținutul ei cu o trusă RIA (AMAC, Inc. Wesbrook, Main). S-a determinat histamina totală de la celulele supuse câtorva cicluri de congelaredecongelare.

3. Blocarea legării IgE conjugate cu FITC la lanțul alfa al FcsRI. S-a studiat efectul anticorpilor asupra legării IgE, prin preincubarea IgE marcată cu FITC, cu diverși anticorpi MaE la 37’C, timp de 30 min, în PBS conținând 0,1% BSA și azidă de sodiu 10 mM, pH 7,4, după care se incubează complexul cu 5 χ 10⁵ celule 3D10 la 4’C, timp de 30 min. Celulele au fost apoi spălate de trei ori și s-a măsurat fluorescența medie la 475 nm. S-a utilizat ca martor un anticorp anti-lgE umană monoclonal de tip murină (MaE1), care nu blochează legarea IgE la lanțul alfa al receptorilor FcsRI.

4. Analiza legării anticorpului anti-lgE umană de tip murină la membrana celulelor B de tip U266, IqE pozitive.

a. S-au cultivat celule B1 de tip U266 (cu membrane IgE pozitive) în mediu de bază suplimentat cu ser fetal de vițel inactivat 15% (Hyclone, # A -1111 - L), penicilină, streptomicină (100 μ/ml) L - glutamină (2 mM).

b. S-au incubat celule (5 x 10⁵/probă) în soluție 100 pl soluție tampon FACS care conține anticorpi monoclonali anti-lgE umană, de tip murină, în concentrații de 10; 5; 1; 0,5 și 0,1 pg/ml, timp de 30 min, pe gheață, în plăci microtitru cu fund rotund, cu 96 de godeuri, după care s-au spălat de două ori cu soluție tampon FACS. S-a utilizat ca martor pozitiv anticorpul monoclonal MAE1 de la Genentech.

c. S-au incubat celule în 100 pl soluție tampon FACS care conține 50 pg/ml (stoc de 1:20) de anticorp de capră anti-lgE de șoarece, purificați prin cromatografie de afinitateF(ab')₂ (Organon Teknika, #1711 - 0084), timp de 30 min, pe gheață, după care s-au spălat de trei ori cu soluție tampon FACS. S-au adăugat celulele în 400 pl de soluție tampon FACS ce conține iodură de propidin într-o concentrație de 2 pg/ml, pentru colorarea celulelor moarte.

5. Teste de legare pe bază de FACS, la celule B IM9 care exprimă FcsRII(CD23).

a. S-a menținut un mielom de celule B umane IM9 (ATCC CCL159, Am. N. Y. Acad. Sci. 190: 221 - 234 (1972) în mediu de bază GIF cu ser fetal bovin inactivat la cald 10%, penicilină, streptomicină (100 unități/ml) și L- glutamină (2 mM).

b. S-au incubat celule (5 x 10⁵/probă) în 100 pl de soluție tampon FACS ce conține U 266 IgE standard la 2 pg/ml, timp de 30 de min, la 4°C, pe plăci microtitru cu 96 de godeuri, după care s-au spălat de 2 ori cu soluție tampon FACS. La martor, s-au incubat celulele doar în soluție tampon sau în soluție tampon ce conține 2 pg/ml de lgG1 umană (Behring Diagnostigs Cat. nr. 400112, lot. nr. 801024).

c. Au fost apoi incubate celulele cu anticorpi monoclonali anti Ig - E umană de tip murină la 0,1...10 pg/ml, timp de 30 min, pe gheață. S-a utilizat ca martor pozitiv MAE 1 monoclonal Genentech.

d. Celulele au fost apoi incubate în 100 μΙ de soluție tampon FACS ce conține anticorp de capră anti-lgG de șoarece (F(ab')2, conjugat cu FITC, la o concentrație de 50 pg/ml (Organon Teknika, #1711 -0084), timp de 30 min, la 4°C, după care s-au spălat de 3 ori cu soluție tampon FACS. Celulele au fost apoi adăugate în 400 μΙ de soluție tampon ce conține iodură de propidin 2 pg/ml, pentru colorarea celulelor moarte.

RO 120848 Β1

f. S-au analizat celulele cu un citometru de flux FACSCAN Becton Dickenson. S-au 1 stabilit fasciculele de dispersie a luminii, anterior și lateral, la 90‘C, pentru a analiza o populație omogenă de celule; celulele moarte, care s-au colorat cu iodură de propidin, fiind ex- 3 cluse de la analiză. S-au analizat celulele FITC pozitive (care au legat IgE) față de celulele fixate doar cu FITC de iepure anti-lgE umană. 5

g. S-a folosit ca martor pozitiv, pentru determinarea nivelului de CD23 la suprafața celulelor IM9 în fiecare experiment, o probă de celule care a fost fixată cu Leu 20 (anti-CD23) 7 monoclonal de tip murină Becton Dickinson, la o concentrație de 10 pg/ml, timp de 30 min, la 4°C, după care s-au spălat de 2 ori. Au fost apoi incubate celulele cu anticorpi de capră 9 anti-lgG de tip murină, purificați prin afinitate F(ab’)2, conjugați cu FITC, la o concentrație de 50 pg/ml. 11

6. Blocarea cu anticorpi, a legării IgE conjugate cu FITC, la receptorii IgE de afinitate joasă. 13

S-a analizat legarea a 40 nM de IgE marcată cu FITC la receptorii de afinitate joasă ai IgE (CD33 sau FceRI) exprimați pe limfoblaștii B IM-9, prin citometrie în flux, cu un cito- 15 metru de flux FACSCAN. S-a studiat efectul anticorpilor asupra legării FlTC-lgE prin preincubarea FlTC-lgE cu anticorpi anti-umani de tip murină, 0,1 ...10 pg/ml himere, la 37”C, 17 timp de 30 min, în PBS conținând 0,1% BSAși azidă de sodiu 10 mM, pH 7,4, după care se incubează complexul cu 5x 10⁵ celule la 4°C, timp de 30 min. Celulele au fost apoi spălate 19 de trei ori și s-a măsurat fluorescența la 475 nM.

7. Protocol de analiză IgE in vitro21

a. S-au separat celule mononucleare din sângele periferic recoltat de la donori normali.23

b. Celulele au fost spălate bine cu PBS, pentru a se îndepărta cât mai multe plachete posibile.25

c. S-au numărat celulele mononucleare și au fost apoi resuspendate în medii de cultură, 1 x 10⁶ celule/ml. Mediile au fost reprezentate de un amestec de DMEM cu penicilină 27 și streptomicină, ser de cal 15%, IL - 2 (2SU/ml) și IL - 4 (20 pg/ml).

d. S-au incubat culturile pe plăci de cultură pentru țesuturi, de tip Falcon, cu 24 de 29 godeuri, timp de 14 zile.

e. S-au incubat culturile pe plăci de cultură pentru țesuturi, de tip Falcon, cu 24 de 31 godeuri, timp de 14 zile.

f. în ziua a 14-a s-au îndepărtat supernatanții și s-au analizat din punct de vedere al 33 concentrațiilor de IgE, printr-un test ELISA specific pentru IgE.

8. S-a determinat constanta de afinitate (Kd) a anticorpilor monoclonali de tip murină, 35 pentru IgE, prin analiza legării la echilibru.

a) IgE (alotipuri ND și PS) au fost iodurate prin metoda cu cloramină T și au fost 37 separate de ¹²⁵INa cu o coloană G25 de Sephadex PD10 (Pharmacia, #17 - 0851 - 01) în tampon RIA: PBS, albumină serică bovină 0,5% (Sigma, # A - 7888), 0,05% Tween 20 39 (Sigma, #P -1379), timerozol 0,01% (Sigma, #T -5125), pH 7,4. S-au precipitat aproximativ

78... 95% din cantitățile rezultate după separarea în coloană, cu acid tricloracetic 50%, iar 41 activitatea specifică a preparatelor IgE iodurate a variat între 1,6 și 13 pCi/ug, luând în considerare o eficiență de 70% a numărătorii. 43

b. S-a adăugat o concentrație fixă de ¹²⁵l (aproximativ 5 x 10⁴ cpm), la concentrațiile variabile de IgE nemarcată, într-un volum final de tampon RIA 0,1 ml, în eprubete test de 45 polipropilenă 12 x 75 mm. S-au adăugat apoi anticorpi monoclonați anti-lgE umană de tip murină (concentrație finală 20 mM) în 0,1 ml tampon RIA, obținându-se un volum final de 47 analiză de 0,2 ml.

RO 120848 Β1

c. Probele au fost incubate 16...18 h, la 25’C, agitând continuu.

d. S-a separat ¹²⁵l-lgE legată sau liberă, prin adăugarea a 0,3 ml de amestec de anticorpi de capră anti IgG de șoarece, purificați prin afinitate (Boehringer Mannheim, # IPA300) în tampon RIA și s-au incubat 1 până la 2 h, la 25’C, agitându-se continuu. S-a adăugat apoi tampon RIA (ml), după care s-au centrifugat eprubetele, 5 min, la 400 xg. S-a realizat apoi numărătoarea probelor. Supernatanții au fost apoi aspirați cu o pipetă fină Pasteur, s-a repetat numărătoarea probelor și s-a calculat raportul IgE legată față de cea liberă.

e. S-a realizat analiza Scatchard cu un program Fortran pe baza programului Ligand compus de P. Munson la NIH. Acesta utilizează o ecuație a acțiunii de masă, care exprimă compusul legat ca funcție din cantitatea totală, cu ajutorul analizei regresiei de tip Rodbard.

Exemplul 2. Prepararea de MaEII umanizat

Introducere

Exemplul următor descrie diverse preparate de MaE11 umanizat, în care s-au modificat, prin mutageneză orientată în situs, unele resturi de aminoacizi, obținându-se 12 variante MaE11 anti IgE [F(ab)1-12j. Resturile lui F(ab)12 au fost utilizate ca matriță pentru crearea rhu Ma E25 sau E25, un anticorp anti-lgE foarte puternic, descris în cererea PCT/US 92/06860, înregistrată în 14 august 1992.

Metode

Anticorpul monoclonal anti-lgE umană de tip murină, prezentat în fig. 1, a fost modificat prin mutageneză orientată în situs (Kunkel, T. A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 488) dintr-o matriță conținând dezoxiuridină, ce conține lanțul ușor k al subgrupului I uman și lanțul greu al subgrupului III uman (VH -CH1) într-o plasmidă de tip pUC 119, pAK2 (Carter și colab. (1992), Proc. Natl. Aca. Sci. USA - 89:4285), obținându-se varianta F(ab)-1. F(ab)-2 a fost construit din matrița F(ab) -1 și toate celelalte variante F(ab) umanizate au fost construite dintr-o matriță de F(ab)-2. Plasmidele au fost transformate în tulpina E. coli YM101, pentru prepararea de ADN mono- și dublu catenar (Mesring, J. (1979), Recomb. DNA Tech. Bull 2: 43, Ansuble și colab.,Current Protocols in Molecular Biology, Unit 1 (1997)). S-a realizat secvențializarea ambelor lanțuri ușoare și grele, cu ajutorul metodei didezoxinucleotidului. S-a subclonat apoi ADN-ul ce codifică lanțurile ușoare și grele într-un derivat al plasmidinei de expresie F(ab) în E. coli, pAK19 (Carter și colab. (1992), Biotechnology 1_0: 163). Din derivatul respectiv au lipsit cisteinele de la nivelul regiunii balama, care formează legături disulfurice intercatenare la nivelul lanțurilor grele din fragmentele F(ab')2. Fragmentele F(ab), spre deosebire de anticorpii IgG cu lungime completă, au facilitat analiza unui număr relativ mare de variante, deoarece se poate utiliza mai degrabă expresia în E. coli decât în culturi de celule de mamifere. Aceste variante individuale sunt descrise în cererea de brevet WO 93/04173, publicată în 4 martie 1993. După determinarea celei mai bune variante, se subclonează apoi într-o plasmidă ce codifică o IgG 1 umană cu lungime completă (a se vedea, mai jos).

Plasmidele de expresie au fost transformate în tulpina de E. coli MM294 (Meselon M și R. Yuan (1968), Nature 2T7: 1110) și s-a cultivat o singură colonie în 5 ml de mediu 2YT-carbenicilină (100 pg/ml), timp de 5...8 h, la 37°C. S-a adăugat apoi cultura (5 ml) în 100 ml de mediu AP5 carbenicilină (100 pg/ml), după care a fost lăsată să crească timp de 16 h, într-un balon de 500 ml cu agitator, la 37°C. S-a centrifugat cultura la 4000 x g și s-a înlăturat supernatantul. După congelare timp de o oră, s-au resuspendat celulele în 5 ml de amestec rece de 10 mM Tris, 1 mM EDTA și 50 pl de benzamidină 0,1 M (Sigma, St. Louis), ultimul compus fiind adăugat pentru a inhiba proteoliza. După agitare ușoară timp de o oră pe gheață, proba a fost centrifugată la 10000 x g, timp de 15 min. Supernatantul a fost pus într-o coloană de proteină A-Sepharoze CL - 4B (Pharmacia) (volumul stratului de 0,5 ml), după care s-a spălat cu 10 ml de soluție de clorură de potasiu 3M/100 ml Tris, pH 8,0 și apoi s-a eluat cu acid acetic 100 mM (2,5 ml), pH 2,8 în Tris 1M, pH 8,0 (0,5 ml).

RO 120848 Β1

S-a schimbat apoi soluția tampon F(ab) cu PBS, utilizând un Centricon - 30 (Amicon) 1 și s-a concentrat la un volum final de 0,5 ml. S-au realizat analize în gel SDS - PAGE, pentru fiecare fragment F(ab), pentru constatarea purității. S-au determinat concentrațiile F(ab), utili- 3 zând o e280 0,1 % de 1,0. S-a determinat coeficientul de extincție, utilizând concentrația proteinei dintr-o analiză a aminoacizilor, a F(ab)-2 purificat și A280 pentru aceeași probă. 5

S-au analizat fragmentele F(ab) selectate direct prin cromatografie în lichid/spectrometrie de masă, pentru a confirma greutatea lor moleculară. Probele au fost injectate într-un 7 sistem de cromatografie în lichid, capilar, împachetat (Henzel. W. Y. și colab., (1990), Anal. Biochem. 1_87: 228) și au fost analizate direct cu un spectrometru de masă Sciex API3. 9

Stările cu încărcare cea mai mare, ale hormonului de creștere uman (m.w. 22.256,2), obținute utilizând aceiași parametri ai instrumentului ca cei utilizați pentru probe, au fost folosite 11 pentru calibrare.

Pentru obținerea versiunilor lgG1 umane complete ale MaE11 umanizate, s-au sub- 13 donat separat lanțurile grele și ușoare, în plasmidele pRK descrise anterior (Gorman, CM.

și colab. (1990), DNA Protein Eng. Tech. 2: 3). Plasmidele ce conțin lanțul ușor sau greu 15 adecvat (în funcție de modificările de secvență dorite) au fost cotransfectate într-o linie celulară de rinichi embrionar uman, transformată cu adenovirus, cunoscută și ca 293 (Graham, 17 F. L. și colab. (1977), J. Gen. Virol. 36: 59), utilizându-se un procedeu foarte eficient (Graham și colab., Supra & Gorman, CM., Science 221:551). Mediul a fost schimbat cu unul 19 fără ser și s-au recoltat zilnic, timp de 5 zile. S-au purificat anticorpii din amestecul de supernatanți, utilizând proteină A - Sepharose CL - 4B (Pharmacia). Anticorpul eluat a fost 21 tamponat în PBS prin filtrare în gel G25, a fost concentrat prin ultrafiltrare, utilizând Centriprep-30 sau Centricon -100 (Millipore) și a fost păstrat la 4°C. S-a determinat 23 concentrația anticorpului, utilizând testul ELISA de legare a IgG totale. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4. 25

Testul receptorilor solubili

S-a acoperit o placă de analiză cu 96 de godeuri (Nune), cu 0,05 ml de receptor 27 himeric, pentru lanțul a al IgG FceRI, în soluție tampon (50 mM carbonat, bicarbonat) pH 9,6), timp de 12 h, la 4... 8’C. S-a aspirat conținutul godeurilor și s-au adăugat 250 pl de 29 soluție tampon de blocare (PBS, BSA 1%, pH 7,2) și s-au incubat timp de 1 h, la 4’C. S-au titrat într-o placă de analiză separată, probele și murina MaEM de referință, de la 200 la 31 0,001 pg/ml, prin diluții 1:4 cu tampon de analiză (BSA 0,5% și Tween 20 0,05%, PBS, pH 7,2) și s-a adăugat un volum egal de IgE biotinilată 10 pg/ml (O-Shannesey D. J. și colab. 33 (1984), Immunol. Let. 8:273), după care s-a incubat placa, timp de 2...3 h, la 25°C. S-au spălat godeurile acoperite cu FceRI de trei ori cu PBS și Tween 20 0,05% (Sigma) și s-au 35 transferat 50 μΙ din godeuri, după care s-au incubat agitându-se timp de 30 min, la 255°C.

S-a adăugat o soluție de streptavidină-HRP (500 pg/ml, Sigma) diluată 1:5000 în soluție 37 tampon de analiză, 50 μΙ/godeu, urmată de incubarea plăcii, timp de 15 min, agitându-se, apoi a fost spălată așa cum s-a descris mai sus. S-au adăugat 50 μΙ/godeu de substrat de 39 tip Microwell Peroxidase (laboratoarele Kirkgaard & Perry) și s-a dezvoltat culoarea, timp de min. Reacția a fost oprită, prin adăugarea unui volum egal de acid clorhidric 1N și s-a 41 măsurat absorbția la 450 nm. S-a calculat concentrația la o inhibiție de 50%, prin reprezentarea grafică a inhibiției procentuale față de concentrația anticorpului blocant și adaptarea la 43 o curbă neliniară cu patru parametri, utilizând analiza Kaleidagraph a datelor (Synergy Software). Rezultatele sunt prezentate în tabelul 3. 45

Teste de legare pe bază de FACS

S-a determinat prin citometrie în flux capacitatea anticorpului de a inhiba legarea IgE- 47 conjugată cu FITC (Goding, J. W. (1976), J. Immunol. Methods 13:215) la lanțul alfa al receptorilor cu afinitate înaltă FceRI, exprimați pe suprafața celulelor CHO3D10 (Hakimi, J. 49

RO 120848 Β1 și colab. (1990), J. Biol. Chem. 265: 22079). IgE-conjugată cu FITC a fost preincubată cu anticorpul (0,3 -1,0 x 10⁶M) la 37*0, timp de 30 min, în soluție tampon FACS (PBS, BSA 0,1% și azidă de sodiu 10 mM, pH 7,4). Complexul a fost apoi incubat cu 5 χ 10⁵ celule CHOCD10 la 4‘C, timp de 30 min. Celulele au fost spălate de trei ori cu soluție tampon FACS și s-a măsurat fluorescența medie la 475 nm, cu un citometru de flux FACScan (Becton Dickinson). S-a utilizat ca martor pozitiv MaE1, un anticorp monoclonal anti-lgE umană, de tip murină, care nu blochează legarea IgE la lanțul alfa al FcsRI și ca martor negativ MOPC21 (Cappel), un anticorp monoclonal de tip murină, care nu recunoaște IgE. Rezultatele sunt descrise în fig. 3.

Legarea anticorpilor la complexele IgE-FcsRI

S-a incubat anticorpul cu capacitate de legare la IgE umană asociată cu subunitatea alfa a FcsRI exprimați pe celulele CHO 3D10 cu 10 pg/ml de IgE, timp de 30 min, la 4’C. Sau spălat celulele de trei ori, după care au fost incubate timp de 30 min, cu concentrații variabile de anticorpi monoclonali de tip murină anti-lgE umană, MaE1 sau MaE11, sau cu varianta 12 a anticorpului uman monoclonal unionizat [F(ab)12]. S-a utilizat MOPC21 (lgG1 murină) ca martor pentru anticorpii de tip murină, iar anticorpul monoclonal umanizat 4D5 (Carter și co\ab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), lgG1 umană) a fost utilizat ca martor pentru F(ab)12. S-a detectat legarea anticorpilor monoclonali de tip murină cu F(ab')2 de capră anti-lgE de șoarece conjugat cu FITC (10 pg/ml). Legarea anticorpului monoclonal umanizat a fost detectată cu F(ab')₂ de capră anti-lgG umană conjugat cu FITC (50 ug/ml), care a fost purificat prin cromatografie de afinitate într-o coloană de IgE, pentru a reduce riscul reacției încrucișate cu IgE. Rezultatele sunt descrise în fig. 4.

Modele grafice computerizate, pentru F(ab') de la murină și de la anticorpi umanizați

S-au utilizat secvențele domeniilor VL și VH ale F(ab) din fig. 1, pentru a realiza un model grafic computerizat al domeniilor VL - VH ale murinei MaE11. Acest model a fost utilizat ulterior la determinarea resturilor de aminoacizi ale scheletului structural, care trebuie introduse într-un anticorp umanizat, rezultând astfel F(ab) -2. S-au elaborat, de asemenea, modele pentru variantele umanizate, pentru a verifica selecția corectă a resturilor scheletului structural al murinei. Construcția modelelor a fost realizată conform descrierii lui Carter și colab. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285; Eigenbrat C. și colab. (1993), J. Mol. Biol. 229: 969.

Rezultate

Structura anticorpilor umanizați MaE11 în acest studiu al anticorpilor umanizați, s-a utilizat o secvență consens umană, spre deosebire de alte tehnici de umanizare în care s-au utilizat secvențe apropiate de Ig de tip murină dorită. Shearman C.W. și colab. (1991), J. Immunol. 147: 4366; Kettleborough CA. și colab. (1991), Protein eng. 4: 773; Tempest P.R. și colab (1991), Biotechnology 9: 266; Co, M.S. și colab. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869; Routledge E.G. (1991), Eur. J. Immunol. 21; 2717. Această secvență umană consens a fost alcătuită dintr-un schelet structural, ce provine din subgrupul III al VH uman și subgrupul I al Vlk, conform descrierii lui Kabat și colab.(1991), Sequences ofProteins of Immunological Interest, a cincea ediție, Institutul Național al Sănătății, Bethesda, MD: F(ab) -1 a fost creat prin grefarea celor șase regiuni CDR într-un schelet structural de lgG1 umană, conform descrierii lui Kabat, supra. Toate resturile aminoacizilor din scheletul structural au fost păstrate, fiind de proveniență umană. Această variantă ar putea fi descrisă cel mai bine ca un Schimb direct de CDR. F(ab) -1 nu a inhibat în mod detectabil legarea IgE la receptori (tabelul 3). Eșecul unor astfel de variante de schimb CDR, care sunt incapabile să lege la propriilor antigene, a fost deja semnalată, Carter și colab., de mai sus; Tempest și colab., de mai sus. Trebuie observat că secvența exactă a F(ab)-1 nu este descrisă în tabelul 3, însă ea poate fi dedusă prin substituția cu resturile CDR din murină MaE11 (Kabat) (indicate în paranteze), în locul resturilor umane corespunzătoare. Fig. 1 prezintă regiunile CDR Kabat prin paranteze drepte și stângi,

RO 120848 Β1 în timp ce regiunile CDR Chothia sunt indicate prin subliniere. 1

Pentru facilitarea interpretării și pentru a reduce confuzia, resturile umane sunt scrise cu caractere normale, iar cele de murină sunt scrise cu caractere italice. Acolo unde sunt 3 indicate substituțiile resturilor, primul rest indicat este cel ce trebuie înlocuit, iar al doilea rest este cel care se introduce în locul primului, iar numărul este numărul corespunzător din sec- 5 vența nativă conform numărătorii Kabat.

Varianta F(ab)-2 a avut la bază un model molecular. în această moleculă, s-au 7 introdus câteva resturi ale scheletului structural al murinei în scheletul structural uman. La F(ab)-2 s-a utilizat definiția regiunilor CDR dată de Kabat și colab., supra (care se bazează 9 pe variabilitatea secvențelor între specii), cu excepția CDR - H1 și CDRH2.

Definițiile CDR - H1 pe baza variabilității secvenței (Kabat și al., de mai sus) față de 11 cea bazată pe studii cristalografice ale complexelor antigen-anticorp (Chothia C. și colab.

(1989); Nature 342: 877) diferă în mod considerabil (fig. 1). Prin urmare, CDR - H1 a fost 13 redefinită astfel încât să fie cuprinse ambele definiții, și anume resturile 26 - 35.

Regiunea CDR - H2 definită pe baza variabilității secvenței (Kabat și colab.) conține 15 mai multe resturi decât cea definită pe baza structurilor cristaline ale complexelor antigen anticorp (Chothia și colab.) [vezi fig. 1: Regiunile CDR definite de Kabat sunt în paranteză, 17 iar cele definite de Chothia sunt subliniate]. Deoarece nu s-a descoperit nici o structură cristalină care să indice că complexul antigen-anticorp se formează la resturile umane 60-65 19 ale anticorpului, s-a modificat definiția CDR - H2, astfel încât să includă ambele definiții, și anume resturile umane 50 - 58. Prin urmare, s-a utilizat în F(ab)-2 o versiune mai scurtă a 21

CDR - H2 comparativ cu F(ab)-1.

Prin urmare, F(ab)-2 a fost creat cu un număr minim de modificări ale resturilor 23 umane de aminoacizi din structura murinei, care se pare că sunt necesare pentru păstrarea capacității de legare. S-au creat încă 10 variante, pentru a testa efectele resturilor îngropate 25 în conformațiile CDR, precum și pentru a evalua efectul predictiv al modelării moleculare a resturilor semnificative din scheletul structural și pentru a examina alte resturi de interes. 27

Pentru testarea efectelor resturilor de aminoacizi îngropate în conformații CDR, s-au construit fragmentele de la F(ab)-3 până la F(ab)-7, în care s-au înlocuit înapoi resturile de 29 murină cu cele umane. Conform indicațiilor din tabelul 4 (F(ab)-3 & (F(ab)-4), cafenele secundare la VL4 și VL33 au efect minim asupra capacității de legare și probabil asupra 31 conformației CDR - L1 în anticorpul umanizat.

Modelarea a sugerat că restul VH24 al scheletului structural ar putea afecta confor- 33 mația CDR - L1, iar VH37 ar putea afecta interfața VL - VH. Totuși, prin substituția restului uman în VH24 [F(ab)-5] sau în VH37 [F(ab)-7] s-a obținut o scădere minimă a legării. 35 Modelele sugerează că acest rest influențează conformația CDR-H1 și/sau CDR-H2.

în cazul F(ab)-9 până la F(ab)-12 se examinează înlocuirea resturilor umane cu 37 murină. Toate aceste patru variante prezintă o ameliorare substanțială a legării comparativ cu F(ab)-2 (a se vedea tabelele 3, 4 și fig. 3). în F(ab)-9, care a prezentat o ameliorare a 39 legării de 5X față de F(ab)-2, s-au schimbat două resturi în CDR - H2 (conform definiției lui Kabat și colab., supra) cu resturi de murină: Ala VH60 Asn și AspH61 Pro. Substituția cu Pro 41 poate altera conformația și/sau rigiditatea CDR -H2, iar AsnH60 se anticipează să fie îngropată la nivelul interfeței VL - VH, posibil în interacțiune cu AspVL.1. 43

F(ab)-10, care a prezentat o capacitate de legare în mod considerabil ameliorată comparativ cu F(ab)-2, este o variantă în care toate resturile îngropate (definite ca resturi cu 45 suprafață accesibilă mai mică de 5% din suprafața unui aminoacid liber) din ambele domenii VL și VH au fost cele ale murinei MaE11. în esență, F(ab)-10 poate fi imaginat ca murină 47 MaE11, în care numai resturile non-CDR, expuse din VL și VH, au fost schimbate cu resturi umane. 49

RO 120848 Β1

Pentru a determina dacă ameliorarea capacității de legare a F(ab)-10 s-a datorat unuia sau câtorva resturi de aminoacizi, s-au creat variante F(ab)-11 și F(ab)-12. S-a utilizat ca matriță F(ab)-9 în loc de F(ab)-2, deoarece a prezentat o capacitate de legare de cinci ori mai mare după ameliorare. Modelele au sugerat că lanțurile secundare de la VH63 și VH67 pot afecta conformația regiunii CDR - H2. Conform definiției lui Kabat și colab., supra, VH63 este considerat ca făcând parte din CHR - H2, dar nu și conform definiției lui Chothia și colab., supra. VH67 este considerat rest al scheletului structural în ambele definiții. în F(ab) -11, VH63 și VH67 au fost resturi de murină, Leu și respectiv lle în F(ab)-12, doar VH67 a fost schimbat cu lle din murină.

în ambele analize ale receptorilor solubili (tabelul 4) și cea pe bază de celule (tabelul 4, fig. 3), ambele variante F(ab) -11 și F(ab) -12 au prezentat o capacitate de legare cel puțin la fel de bună ca a lui F(ab)-10 și mai bună decât a lui F(ab) - 9, ceea ce sugerează că ameliorarea capacității de legare a fragmentului F(ab) -10 nu s-a datorat reîmpachetării porțiunii interne a domeniului VH cu resturi de murină, ci s-a datorat efectului substituției unui singur rest, și anume VH67.

F(ab) - 8 a fost construit prin înlocuirea restului uman Glu VL55 cu Gly de la murină, precum și prin substituții similare la VL57, înlocuindu-se Gly cu Glu. în F(ab)-2 s-au utilizat resturile umane, iar în F(ab)- 8 s-au substituit resturile de murină în aceste poziții. După cum se poate observa rapid din tabelul 3, substituția acestor resturi nu a influențat capacitatea de legare la receptori.

Tabelul 3

Variante de Mac 11, umanizate

Variantă	Modificări la F(ab)-2(a)	Concentrația la inh. 50% (ng/ml) dev. std. medie(b)	F(ab)-X F(ab)-2	FiabFX MaE11
VL	VH
F(ab)-1	Leu 4 Met Arg 24 Lys Glu 55 Gly Gly 57 Glu	Val 24 Ala lle 37 Val Thr 57 Ser Ala 60 Asn Val 63 Leu Gly 65 Asn Phe 78 Leu	> 100,000	> 16,0 (c)	>560
F(ab)-2	-	-	6083,1279	1,0	34
F(ab)-3	Leu 4 Met Met 33 Leu	-	9439,508	1,6	53
F(ab)-4	Leu 4 Met	-	6770,349	1,1	3,8
F(ab)-5	-	Val 24 Ala	9387,733	1,6	52
F(ab)-6	-	Phe 78 Leu	17,537,4372	2,9	24
F(ab)-7	-	lle 37 Val	8622,107	1,4	48
F(ab)-8	Glu 55 Gly Gly 57 Glu	-	5799,523	1,0	32

RO 120848 Β1

Tabelul 3 (continuare) 1

Variantă	Modificări la F(ab)-2(a)	Concentrația la inh. 50% (ng/ml) dev. std. medie(b)	F(ab)-X F(ab)-2	F(ab)-X MaE11
VL	VH
F(ab)-9	-	Ala 60 Asn Asp 61 Pro	1224,102	0,20	6,8
F(ab)-10	Ala 13 Val Val 19 Ala Val 58 lle Leu 78 Val Val 104 Leu	Val 48 Met Ala 49 Gly Ala 60 Asn Val 63 Leu Phe 67 lle lle 69 Val Met 82 Leu Leu 82c Ala	842,130	0,14	4,7
F(ab)-11		Ala 60 Asn Asp 61 Pro Val 63 Leu Phe 67 lle	416,66	0,07	2,3
F(ab)-12	-	Ala 60 Asn Asp 61 Pro Phe 67 lle	501,84	0,08	2,8
MaE11	-	-	179,63	0,03	1,0

(a) Resturile de murină sunt scrise cu caractere italice, numerele resturilor corespund25 numărătorii Kabat și colab.

(b) Deviația standard și medie a trei teste pentru receptorii solubili.27 (c) un raport F(ab)X/F(ab) -2 >16 semnifică faptul că această variantă nu a prezentat capacitate de legare nici la cele mai mari concentrații de F(ab) utilizate.29

Variantele F(ab), care au prezentat capacitate de legare apropiată cu cea a murinei

MaE11, și anume F(ab)-2, F(ab)-9, F(ab)-10 și F(ab)-12, au fost utilizate pentru obține- 31 rea de molecule lgG1 cu lungime completă. Capacitatea de legare a acestor molecule comparativ cu varianta F(ab) - 2 sau MaE11 a fost comparabilă cu cea prezentată de fragmentele 33

F8ab). Aceste rezultate sunt prezentate în tabelul 4.

Tabelul 4 35

Variante de lgG1 MaE11, umanizate

Variante de lgG1 MaE11, umanizate

Varianta cu lungime completă	Concentrația la inh. 50% (ng/ml) dev. std. medie(a)	Varianta X lgG1-2(b)	Varianta X MaE11
lgG1-2	7569,1042	1,0	16,9
lgG1-9	3493,1264	0,46	7,8
lgG1-10	1118,172	0,15	2,5
lgG1-12	1449,226	0,19	3,2
MaE11	449,53	0,06	1,0

RO 120848 Β1

Legarea MaE11 la complexele IgE-FcsRI

Murina MaE11 previne legarea IgE liberă FceRI. Așa cum se arată în fig. 4, atât murina MaE11, cât și varianta 12 umanizată (lgG1 -12), precum și martorul negativ al izotipului reprezentat de anticorpul MOPC21 și martorul negativ al izotipului reprezentat de anticorpul umanizat 4D5 (Carter și colab., de mai sus) nu s-au legat la complexele IgE - FceRI de pe celulele CHO3D10. în schimb, murina MaE1, care se leagă la IgE, dar nu împiedică legarea IgE la FceRI, s-a legat la complexele IgE - FceRI. Spre deosebire de martorul lgG1 umană (4D5 umanizat), izotipul IgG 1 al murinei (reprezentat de MOPC21) prezintă o legare fundamentală nespecifică, de aproximativ 10%, la nivelul acestor celule. MaE11 nu s-a fixat mai mult decât martorul MOPC21, iar varianta umanizată 12 nu s-a fixat mai mult decât martorul 4D5 umanizat (fig. 4).

Explorarea parțială cu alanină a resturilor CDR importante în legarea IgE

Secvențele regiunilor CDR ale MaE11 indică o preponderență a resturilor de aminoacizi încărcate (fig. 1). CDR-L1 conține trei resturi Asp, în timp ce CDR - L3 are resturi His, Glu și Asp. CDR - H3 are trei resturi His. Modelele de murină și MaE 11 umanizat ilustrează apropierea spațială a tuturor acestor resturi încărcate (nu se arată). în schimb, Asp 54 din CDR - H2 este separat de celelalte resturi încărcate. Fiecare dintre aceste resturi încărcate au fost substituite cu alanină prin mutageneză situs-orientată (Kunkel, T. A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488), obținându-se variante. în CDR - L1, modificarea unuia dintre cele trei resturi, Asp, Asp VL32b, a anulat efectiv capacitatea de legare la IgE, în timp ce substituția celorlalte resturi Asp a avut un efect minim [F(ab) - 14; F(ab) - 15]. Prin modificarea simultană a Glu VL93 și Asp VL94, înlocuindu-le cu alanină în CDR - L3 [F(ab) -17; tabelul 5], s-a redus de asemenea capacitatea de legare, deși nu în aceeași măsură ca în cazul înlocuirii la poziția VL32b. în urma substituțiilor individuale ale celor trei resturi His din CDR - H3 cu Ala, s-a obținut fie o ușoară creștere a capacității de legare [F(ab) - 21], fie o reducere de 3X a acesteia [F(ab) - 20 & F(ab) - 22]. Totuși, modificarea simultană a tuturor celor trei resturi His a anulat capacitatea de legare [F(ab) -19]. Deși, nu se poate determina rapid dacă resturile încărcate sunt implicate în legarea directă la IgE sau în stabilitatea conformațională a regiunilor lor CDR respective, variantele de la F(ab) -13 până la F(ab) - 22 arată că CDR - L1 și CDR - H3 sunt determinanți importanți ai capacității de legare la IgE.

Tabelul 5

Variantă	Modificări la F(ab)-2<a)	Concentrația la inh. 50% (ng/ml) dev. std. medie(b)	F(ab)-X F(ab)-2
VL	VH
F(ab)-2	-	-	6083,1279	1.0
F(ab)-13	Asp 30 Ala Asp 32 Ala Asp 32b Ala		> 100,000	> 16,0(c)
F(ab)-14	Asp 30 Ala	-	3452,183	0,57
F(ab)-15	Asp 32 Ala	-	6384,367	1,0
F(ab)-16	Asp 32b Ala	-	> 100,000	> 16,0

RO 120848 Β1

Tabelul 5 (continuare)

Variantă	Modificări la F(ab)-2(a)	Concentrația la inh. 50% (ng/ml) dev. std. medie(b)	F(ab)-X F(ab)-2
VL	VH
F(ab)-17	Glu 93 Ala Asp 94 Ala	-	17,456,7115	2,9
F(ab)-18	-	Asp 54 Ala	2066,174	0,34
F(ab)-19		His 97 Ala His 100a Ala His 100c Ala	> 100,000	> 16,0
F(ab)-20	-	His 97 Ala	19,427,8360	3,2
F(ab)-21	-	His 100a Ala	2713,174	0,45
F(ab)-22	-	His 100c Ala	15,846,8128	2,6

(a) Resturile de murină sunt scrise cu caractere italice, nr. resturilor corespund numărătorii Kabat și colab.

(b) Deviația standard și medie a trei teste pentru receptorii solubili.

(c) Un raport F(ab)X/F(ab) - 2 > 16 semnifică faptul că această variantă nu a prezentat capacitate de legare nici la cele mai mari concentrații de F(ab) utilizate.

Rezumat și concluzii

Crearea unui anticorp funcțional anti-lgE de tip murină, umanizat, din MaE11, implică substituția câtorva resturi de aminoacizi din scheletul structural uman cu resturi ale scheletului structural al murinei. în plus, cartarea resturilor CDR încărcate a arătat că unele dintre acestea sunt importante în formarea complexului anticorp-lgE.

în conformitate cu studiile anterioare (Carter și colab., de mai sus; Shearman C.W. și colab. (1991), J. Immunol. 147:4366; Kettteborough CA și colab. (1991), Protein Eng. 4: 773; Tempest P.R. (1991), BiotechnologyO: (266), variantele de la F(ab) -1 la F(ab) -12 indică faptul că unele resturi ale scheletului structural pot avea o influență semnificativă asupra funcției anticorpului. Acest lucru este evident în special în cazul F(ab)-1 în care se realizează o schimbare CDR directă, cele șase CDR ale murinei fiind transferate în locul resturilor corespunzătoare din scheletul structural uman. O posibilă explicație pentru aceasta se referă la CDR-H2. Resturile hidrofobe îngropate, din pozițiile VH63 și VH67, pot afecta conformații CDR - H2. S-au creat variante care conțin patru combinații în pozițiile VH63 și H67, și anume Leu și respectiv //edin murină [MaE N și F(ab)-11], Val și Phe [F(ab)-2], Leu și Phe [F(ab)-1] și Val și lle [F(ab)-2], Se deduce în mod evident, din datele referitoare la capacitatea de legare ale acestor patru variante, că restul important este VH67, care trebuie să fie lle din murină, pentru a se obține o afinitate comparabilă cu cea a murinei MaE11. La F(ab) - 1, acest rest a fost Phe umană.

RO 120848 Β1

Din 12 resturi ale F(ab) -1 păstrate, de origine umană [comparativ cu F(ab) - 2], s-au modificat separat 8 cu resturi de murină, obținându-se alte variante. Trei modificări nu au avut efect asupra capacității de legare VL4[F(ab) - 4]; VL55 și VL57 [F(ab) - 8], Două substituții, VH60 și VH61 [F(ab) - 9], au ameliorat capacitatea de legare, în timp ce trei au redus-o, VH24[F(ab) - 5]; VH37[F(ab) - 7] și VH78[F(ab) - 6],

Varianta F(ab) -10 a fost concepută conform ipotezei sugerate de Padlan (Padlan E. A (1991), Mol. Immunol. 28:489), care a afirmat că se poate reduce caracterul imunogen al anticorpului de tip murină, prin modificarea doar a resturilor expuse ale scheletului său structural. Conform acestei ipoteze, varianta creată a fost murină MaE11, în care s-au modificat în secvența umană, doar resturile expuse ale VL și VH din scheletul structural. Deși F(ab) -10 a prezentat o capacitate de legare apropiată de cea a murinei MaE11, aceeași ameliorare s-a obținut și prin substituția unui singur aminoacid VH67 din secvența umană cu unul din secvența murinei [F(ab) -12, lgG1-12].

Varianta umanizată, ce prezintă capacitatea de legare comparabilă cu cea a murinei MaE11, care a necesitat și ea câteva schimbări, a fost F(ab) -12. în această variantă s-au înlocuit doar 5 resturi ale scheletului structural uman cu murină (VL4, VH24, VH37, VH67 și VH78). Patru dintre acestea au fost determinate prin modelare moleculară. Cel de-al cincilea VH67, precum și resturile CDR - H2, VH60 și VH61 au fost descoperite prin modele moleculare utilizate pentru ameliorarea capacității de legare a variantei inițiale F(ab) - 2.

Exemplul 3. Testul eliberării de histamină

Introducere

Acesta este un test ce utilizează eliberarea histaminei din mastocitele de șobolan (RMCHA) și care evaluează cantitativ activitatea biologică a unui anticorp anti-lgE monoclonal umanizat recombinant, pe baza capacității anticorpului de a bloca eliberarea de histamină din celule RBL 48 sensibilizate la alergen. în continuare, această determinare se realizează în condiții fiziologice similare cu cele din organismul uman. Linia de celule RBL 48 derivă din linia parentală de mastocite de șobolan RBL 2H3, care a fost transfectată cu subunitatea a a receptorului cu afinitate înaltă pentru IgE umană (FceRI). Gilfillan A. M. și colab., J. Immunol. 149(7): 2445 - 2451 (1992).

Metode

S-au cultivat celule RBL48 (Gilfillan și colab., de mai sus) în mediu sIMDM, Iscove modificat Dulbecco, suplimentat cu ser fetal de vițel 10%, glutamină 2 mM și 500 pg/ml de geneticină activă (Gibco, #860 -1811), într-un flacon destinat culturilortisulare T175 (Falcon # 3028), la 37°C, într-un incubator cu 5% CO₂ umidificat (Fischer, model #610). Celulele au fost recoltate prin expunere la 4 ml de soluție de PBS/tripsină 0,05%/EDTA 0,53 mM, timp de 2 min, la 37°C, urmată de centrifugare (400 x g, 10 min) și resuspendare în sIMDM proaspăt. S-au numărat celulele din suspensie cu un hemocitometru (Reichert - Jung), adaptânduse densitatea lor la 0,4 x 10⁶ celule/ml. Celulele au fost apoi însămânțate 100 pl/godeu (40000 de celule/godeu) în cele 60 de godeuri din interiorul unei plăci de cultură tisulară cu 96 de godeuri, în formă de U(Linbro) și au fost cultivate timp de 24 h, la 37’C, în incubator, cu 5% CO₂ umidificat. După o spălare cu sIMDM 20 pl/godeu (prin aspirare), celulele au fost preincubate timp de 30 min, cu o soluție de diluant de analiză, 90 pl/godeu (sIMDM, 3U/ml Na-heparină) cu IgE specifice pentru rugină (RSIgE, 10 ng/ml, 23,48 ng/ml IgE totală, 1,43% plasmă umană specifică pentru rugină) North american Biological, lot# 42 - 365054).

După perioada de preincubare s-au adăugat la celule 10 pl/cavitate, fie de anticorp anti-lgE (diluat în soluție de diluare pentru analiză, 0,06... 39,4 pg/ml), fie de diluant pentru analiză (pentru martorii eliberării totale de histamină, de fond și de rugină) și placa a fost incubată timp de 24 de h, în incubator, la 37’C, în prezență de CO₂ 5%. După incubare,

RO 120848 Β1 celulele au fost aspirate și spălate de trei ori cu 200 pl/godeu, de sIDIDM. După spălare, 1 celulele au fost incubate cu 100 μΙ/godeu, fie de (1) soluție triton 0,5% (pentru eliberarea totală de histamină), fie de (2) soluție tampon pentru eliberarea de histamină (HRB, D₂O 50%, 3

NaCI 0,8%, CaCI₂1,3 mM, sIMDM), fie din (3) antigenul ruginei (NIH#A - 601 - 903A -185, 0,1 pg/ml în HRB) la 37°C, timp de 30 min, după care s-a oprit reacția cu gheață (D₂O 5 100% = 100% D₂O, 0,8% NaCI, 1,3 mM CaCI₂).

S-a centrifugat placa, timp de 5 min, la 900 x g (2460 rpm) la 4*C și s-au colectat și 7 diluat supernatanții 1/80 în PBS (1/1000 în PBS în cazul martorului eliberării total de histamină) în scopul determinării histaminei cu ajutorul trusei de imunotest enzimatic al histaminei 9 (Immunotech # 1153). S-au transferat supernatanții (100 μΙ/cavitate) în eprubete de acilare ce conțin pudră de acilare (per trusă) și s-a realizat reacția lor cu 50 pl de soluție tampon de 11 acilare (per trusă), timp de 30 min, la temperatura mediului. Histamina acilată (50 μΙ/cavitate) a fost apoi tranferată pe o placă de conjugare (per trusă) și incubată cu 200 μΙ/cavitate de 13 complex histamină-acetilcolinesterază (per trusă), timp de 18 h, la 40*C.

După această incubare, cavitățile au fost fixate și spălate, pentru a elimina complexul 15 nelegat prin spălare de patru ori cu 300 μΙ/godeu de soluție tampon de spălare (trusă Immunotech #1153). S-a adăugat substratul cromatogen (acetilcolina, ditionitrobenzoat 200 17 ul/godeu, per trusă) și s-a incubat la întuneric, la temperatura mediului, timp de 30 min.

Reacția a fost apoi oprită prin adăugare de soluție de stopare a reacției (50 μΙ/godeu per 19 trusă) și s-a determinat absorbția la 405 nm, cu o referință de 620 nm, cu ajutorul unui dispozitiv de citire a plăcii SLT 340 ATTC. Intensitatea absorbției este invers proporțională 21 cu concentrația de histamină (exprimată ca nM), care se determină din curba standard a histaminei (obținută cu trusa imunotest enzimatic, AMAC). Procentul eliberării totale a 23 histaminei a fost calculat din valorile concentrației histaminei, iar inhibiția procentuală s-a calculat ca 100% eliberare totală de histamină. Rezultatele sunt prezentate în fig. 5. 25

Rezumat și concluzii

Graficul raportului molar al anti-lgE față de inhibiția procentuală a eliberării de 27 histamină indusă de rugină arată că forma F(ab) a anticorpului e26 are proprietăți superioare referitoare la eliberarea histaminei indusă de rugină decât forma F(ab) a anticorpului e25. 29

E26 inhibă eliberarea de histamină indusă de rugină, într-un mod dependent de doză, având un raport al inhibiției semimaximale de 44:1 (anti-lgE: RSIgE). în schimb e25 inhibă elibe- 31 rarea de histamină indusă de rugină, având o valoare a raportului foarte mare (între 200:1 și 1550:1 anti-lgE: RSIgE). Raportul molar al inhibiției semimaximale pentru curba e25 poate 33 fi estimat ca fiind cuprins între 400:1 și 500:1. Prin urmare, conform datelor furnizate de raportul molar al inhibiției semimaximale, care este o măsură a afinității de legare a unei mole- 35 cule, se poate constata că e26 se leagă la RSIgE de aproximativ 10 ori mai bine decât e25.

Exemplul 4. Prezentare la nivelul fagilor 37

Introducere

Acest exemplu descrie anticorpi specifici anti-lgE cu afinitate ameliorată, obținut prin 39 prezentare monovalentă la nivelul fagilor, și selecția fragmentelor F(ab) provenite de la anticorpul anti-lgE umanizat E25 (Presta și colab., J. Immunol. 5: 2623(1993). 41

Metode

I. Construcția de colecții de fagi ce prezintă F(ab) monovalent 43

S-au construit câteva colecții F(ab). S-a realizat fuziunea unei variante e25 ce conține substituția D32E în VL (pentru a înlătura izomerizarea IzoAsp) cu domeniul C-terminal al pro- 45 teinei genei 3 a bacteriofagului M13, prin tehnici cunoscute, a se vedea, de exemplu, Bass și colab., Proteins 8: 309(1990). Această plasmidă care se cunoaște sub denumirea p426, 47 apare în fig. 10. Mai întâi, s-a utilizat ca matriță stop cu specificitate de colecție, tipul

RO 120848 Β1 sălbatic de F(ab) - fag, p426. Prin introducerea de codoni stop (TAA sau TGA) se inactivează molecula originală, scăzându-i astfel efectele de bază și polarizarea specifică (hibridizare) în etapele de mutageneză din cursul construcției colecției (Lowman & Wells, Methods: Comp. Methods Enzymol. 3: 205 (1991)). Aceste matrițe au fost construite utilizând mutageneză matriței monocatenare (Kunkel și colab., Methods Enzymol. 204:125(1991)), cu oligonucleotidele listate în tabelul 10.

Ulterior, s-au utilizat aceste matrițe stop într-un al doilea ciclu de mutageneză, utilizând oligonucleotidele listate în tabelul 11, obținându-se colecții pentru fiecare dintre regiunile CDR indicate. S-au utilizat codonii NNS de degenerare, pentru a obține toți cei douăzeci de aminoacizi, în fiecare dintre regiunile CDR indicate (bazele nucleotidice sunt indicate prin nomenclatura IUPAC cu o singură literă; N = A, G, C sau T; S = G sau C). Codonii NNS de degenerare au fost utilizați pentru a obține toți cei douăzeci de aminoacizi în fiecare dintre pozițiile aleatorii, utilizând 32 de codoni diferiți posibili. Un codon stop amber (TAG) codifică Glu în sistemul supresor utilizat în acest caz; și anume supresorul supE al tulpinii XL-1 Blue; Bullack și colab., Biotechniques 5, 376(1987). Prezența unui codon amber, între domeniul lanțului greu al anticorpului și între domeniul g3p de la nivelul fagului, permite expresia proteinei de fuziune la suprafața fagului, doar în tulpinile amber supresoare ale E. coli, în timp ce proteina F(ab) solubilă, cu aceeași structură, se poate obține de la tulpinile nesupresoare de E. coli (Lowmann și colab., Biochemistry 30: 10832 (1991); Lowman și Wells, Methods Comp. Methods. Enzymol. 3: 205 (1991); Hoogenboom și colab., Nuci. Acids. Res. 1 9: 4133(1991). Se pot utiliza totuși și alți codoni stop pentru sistemele de expresie în E. coli, evidenți pentru specialiștii în domeniu.

Produșii obținuți prin mutageneză întâmplătoare au fost transformați în celule de E. coli. (Stratagene XL-1 Blue) prin electroporație și au fost amplificați prin cultivare peste noapte la 37”C cu fagi helper M13K07 (Viera și Messing, Methods Enzymol. 153: (1987)).

Tabelul 10

Oligonucelotide matriță-stop pentru primul ciclu de mutageneză

Secvență oligo nr.	Regiune	Secvență
HL-208	VLl	ACC TGC CGT GCC AGI TAA TAA GTC TAA TAA GAA GGT GAT AGC TAC
HL-209	vru	GCC AGT CAG AGC GTC TAA TAA TAA GGT TGA AGC TAC CTG AAC TGG T
HL-210	VHÎ	TGT GCT CGA GGC AGC TAA TAA TAA GGT TAA TGG TAA TTC GCC GTG TGG GG
UL-220	VL2	G ΑΛΑ CT A CTG A ΓΤ TAC ΤΛΑ ΙΑΛ TAA TAA CTG GAG TCT GGA GTC
HL-221	VL3	CT TAT TAC TGT CAG CAA aGT TAA TAA ΤΛΑ CCG TAA ACA TTT GGA CAG GGT ACC j
UL-222	VH1	G TCC TGT CCA GTT TCT TAA TAA TAA TAA ΤΛΛ TCC GGA TaC AGC TGG
HL-223	VHÎ	GCC TAC TCC A IC ACC TAA TAA ΤΑΛ AGC TGA AAC TGG ATC CGT CAG
HL-224	VH2	GG G1T GCA TCG ΑΓΓ ΤΛΑ ΓΑΑ TAA GGA TAA ACT TAA TAT MC CCT AGC CTC AAG
HL-22Î	VLl	AAG CCG GTC GAC AGG ΤΛΛ TAA GAT TAA TAC TAA AAC TGG TAT CAA CAG

RO 120848 Β1

Tabelul 11

Oligonucleotidele de degenerare, cu specificitate de colecție, pentru al doilea ciclu de mutageneză

HL-212	VL1	ACC TGC CGT GCC AGT NNS NNS GTC NNS NNS GAA GOT GAT AGC TAC
HL-213	VH3	GCC AGT CAG AGC GTC NNS NNS NSS GGT NNS AGC TAC CTG AAC TGG
KL-214	VH3	TGT GCT CGA GGC AGC NNS NNS NNS GGT NNS TGG NNS TTC GCC GTG TGG GG
UL-231	VL2	G AAA CI A CTG ATT TAC NNS NNS NNS NNS CTG GAG TCT GGA GTC
HL-232	VL3	CT ΤΛΤ TAC TGT CAG CAA AGT NNS NNS NNS CCG NNS ACA ΠΤ GGA CAG GGT ACC
HL-233	VH1	G TCC TGT GCA GTT TCT NNS NNS NNS NNS NNS TCC GGA TAC AGC TGG
HL-234	VH1	GTT TCT GGC TAC TCC ATC ACC NNS NNS NNS AGC NNS AAC TGG ATC CGT CAG
HL-235	VHi	GG GTT GCA TCG ATT NNS NNS NNS GGA NNS ACT NNS TAT AAC CCT AGC GTC AAG
HL-236	VLI	AAG CCG GTC GAC AGG NNS NNS GAT NNS TAC NNS AAC TGG TAT CAA CAG

II. Selecții ale capacității de legare la fagi în scopul selecțiilor de afinitate ale particulelor fagice ce prezintă variante F(ab), s-au preparat fagi prin precipitare cu clorură de sodiu/polietilen glicol (NaCI/PEG) din supernatanții culturilor de E. coli. Fagii au fost suspendați în soluție tampon PBS, după care au fost diluați în ser de cal (nr. catalog A - 3311 - D, Hyclone, Logon, UT) ce conține Tween® - 20 0,05% procedându-se la fel și cu un fag care nu prezintă nici un fragment și care are rol de martor negativ. Ca martor pozitiv s-a utilizat un amestec de fagi - F(ab) e426 de tip sălbatic cu fagi neprezentatori, care a fost supus unor selecții false.

S-au acoperit plăci de plastic cu 96 de godeuri Maxisorp(Nunc) cu 2 pg/ml IgE (IgE umană; Genentech lot # 9957 - 36) în soluție tampon de carbonat de sodiu 50 mM, pH 9,6, în cursul nopții, la 40°C. S-a îndepărtat apoi soluția de IgE și s-au incubat plăcile cu o soluție de blocare de ser de cal (fără Tween^(R) - 20), timp de 2 h, la temperatura mediului.

S-a îndepărtat soluția de blocare și s-a incubat soluția de fagi pe plăci, timp de 1 h, la temperatura camerei. După aceea s-a îndepărtat soluția de fagi și plăcile s-au spălat de 10 ori cu tampon PBS/Tween - 20 (0,05%). S-au umplut cavitățile cu PBS/Tween și s-au incubat încă 10 min, după care s-au spălat din nou de zece ori.

Particulele F(ab)-fag rămase legate la placă s-au eluat cu acid clorhidric 20 mM, s-au neutralizat cu Tris - HCI, pH 8 și s-au propagat cu fagi helper, conform descrierii de mai sus. S-a diluat în serie o probă de fagi, s-a amestecat cu celule proaspete XL-1 Blue, s-a însămânțat pe plăci cu antibiotic adecvat și s-au numărat CFU (unități formatoare de colonii) de fagi care prezintă F(ab) (rezistente la carbenicilină; CFUa) sau care nu prezintă (rezistențe la cloramfenicol; CFUc) eluate. S-a calculat îmbogățirea (Emut) cu fagi prezentatori de Fcab) față de cei neprezentatori, la fiecare ciclu de selecție, prin raportul (CFUa/CFUc) pentru amestecul eluat împărțit la raportul (CFUa/CFUc) pentru amestecul inițial. îmbogățirea pentru fagul martor de tip sălbatic (Ewt) s-a calculat în același mod.

RO 120848 Β1

S-au realizat cicluri ulterioare de selecție, conform descrierii de mai sus, cu excepția faptului că perioada de incubație de după primele 10 spălări a fost crescută la fiecare ciclu de selecție. Pentru compararea eficienței de selecție a fagilor de la un ciclu la altul, în condiții de strictețe din ce în ce mai mare, s-a normalizat factorul de îmbogățire la fiecare ciclu, la cel al martorului de tip sălbatic. Raportul îmbogățirii afinității de legare pentru fiecare amestec față de tipul sălbatic (Emut/Ewt) este prezentat în fig. 6. Deoarece la echilibru există o proporție mai mare de variantă cu afinitate înaltă, care s-a legat la placa-lgE, decât varianta cu afinitate joasă, variantele cu afinități mai mari pot fi recuperate mai eficient și prezintă deci îmbogățiri relative mai mari. într-adevăr, colecțiile VL1 au prezentat îmbogățiri relative succesiv ameliorate, până la de 10 ori mai mari decât în cazul tipului sălbatic, după 5-6 cicluri de selecție. Prin această măsurătoare, colecțiile VL 1 au prezentat o ameliorare mai mare a afinității față de tipul sălbatic, decât colecțiile VH3. Inegalitatea rezultatelor între cele două seturi de colecții CDR poate reflecta o contribuție energetică mai mare a VL1 la legarea antigenului. în mod alternativ, CDR din VH3 al e25 poate fi deja mai ameliorat în ceea ce privește legarea IgE decât CDR din VL1, ceea ce determină posibilitatea unei ameliorări suplimentare a legării prin substituții la cafenele secundare din VL 1.

Prin secvențializarea ADN s-a observat că majoritatea variantelor F(ab)-fac din prima colecție VLCDR1 (modificând aleator pozițiile 27, 28, 39 și 31) au conservat restul D30 al tipului sălbatic, având mutații preferabil în Y31G (tabelul 15, în care clonele din ciclul 3 sunt indicate prin 212 -3.X, iar cele din ciclul 6, prin 212 - 6.X). Deși s-au realizat substituții diverse în pozițiile Q27 și S28, o clonă ce conține Q27K și S28P a fost predominantă în amestecul de fagi după 6 cicluri de selecție. Această clonă a conținut de asemenea și resturile preferate D30 și G31, ceea ce sugerează că această combinație de catene secundare ar putea fi optimă pentru legarea IgE.

în a doua colecție de VLCDR1 (mutații în pozițiile 30, 31, 32 și 34), majoritatea selectanților au conservat resturile D30 și E32 de tip sălbatic; s-a observat doar D34 de tip sălbatic printre clonele secvențializate. în această colecție, s-a observat la Y31 o diversitate de tipuri de resturi. în plus, mutația falsă G335 s-a observat în două dintre clone, 213 - 6.7 și 213-6.8 (tabelul 15).

Prin analiza secvențelor clonelor din colecția VH CDR3 după trei cicluri de selecție, s-a observat că această colecție s-a dezvoltat în esență în sensul unei singure clone, și anume 214 - 3.1, cu resturi de tip sălbatic în pozițiile 101 -103, și cu substituțiile H105T și H107Y (tabelul 15).

IV. Analiza ELISA a fagilor, pentru clonele F(ab) selectate

Pentru evaluarea rezultatelor selecției capacității de legare la fagi, aceștia au fost transfectați în celule E. coli XL-1 blue și s-au cultivat în culturi lichide sau s-au însămânțat pe plăci cu antibiotic. S-au ales la întâmplare clone de pe aceste plăci, în scopul analizei secvențelor și a capacității de legare prin analiză ELISA competitivă pentru fagi.

(Cunningham și colab., EMBOJ. 13:2508 (1994); Lowman, capitolul 24, în Methods in Molecular Biology, voi. 87, S.Cabilly (ed.), Humana Press Inc., Totawa, NJ (1997).

Pentru evaluarea afinităților relative de legare a IgE, s-au titrat fagii pe o placă acoperită cu IgE, așa cum s-a descris mai sus, pentru a normaliza concentrațiile de F(ab) prezentate. Fagii au fost preamestecați cu diluții în serie de IgE, au fost apoi adăugați pe o placă acoperită cu IgE și au fost incubați timp de o oră, la temperatura camerei. Plăcile au fost apoi spălate de zece ori cu PBS/Tween și s-a adăugat o soluție de anticorpi de iepure antifagi amestecați cu peroxidază de hrean conjugată cu anticorpi de capră antiiepure. După o oră de incubație la temperatura camerei, plăcile au fost developate cu un substrat cromogen, ofenilendiamină (sigma). S-a oprit reacția prin adăugare de acid sulfuric 2,5M, 0,5 volume.

RO 120848 Β1

S-a măsurat densitatea optică la 490 nm, pe un dispozitiv spectrofotometric de citire a plă- 1 cilor. S-a determinat IC50, pentru fiecare variantă, prin adaptarea unei curbe cu patru parametri la fiecare set de date (Lowman, Methods in Mol. Biol., de mai sus). S-a determinat 3 afinitatea relativă de legare a fiecărei variante de fag donat, sub formă de raport al valorii sale IC50 la IC50 a fagului inițial, e426 (tabelele 15-16). 5 în unele cazuri, amestecurile de fagi rezultate într-o anumită rundă de selecție s-au testat în masă, pentru a obține o estimare a afinității relative medii [IC50(wt)/IC50 (mutant)] 7 pentru IgE. De exemplu, în colecția VL CDR1 cu mutații la resturile 32, 33, 35 și 37, s-a observat o ameliorare a afinității de 3,6X față de e426, după 5 cicluri de selecție, deși varianta 9 de origine a acestei colecții (e26) a avut o afinitate de 25 de ori ameliorată. Prin urmare, colecția VL - CDR1, cu mutații la aceste resturi de aminoacizi, nu a mai fost folosită în conți- 11 nuare. Pe de altă parte, amestecul de fagi VH CDR 2 a prezentat o afinitate ameliorată de 6,2X față de fagul său de origine e426. 13

S-au creat și colecții de fagi pentru domeniile VL CDR2, resturile 54 - 57, și VL CDR3, resturile 96 - 98, 99 & 100. Totuși, substituțiile de aminoacizi în aceste poziții nu au condus 15 la nici o îmbogățire față de e426. S-a realizat o colecție de fagi pentru VHCDR1, resturile 26 30, care nici ea nu a prezentat nici o îmbogățire față de e26, și în care s-a descoperit predo- 17 minanța fagului contaminant e26. Acest fapt sugerează că nu au fost prezente alte variante cu afinitate mai mare decât e26, în colecțiile inițiale. 19

Colecțiile de fagi pentru domeniile CDR reprezentate de VL CDR, resturile 27,28,30,

31,32, 34, precum și VH CDR1, resturile 101,102,103,105 & 107, sunt prezentate în tabe- 21 Iul 15, în timp ce colecția apentru VH CDR2 este prezentată în tabelul 16. Colecțiile de clone din tabelele 15 și 16, care nu au prezentat o afinitate mult mai mare decât cea a e26, nu au 23 mai fost utilizate în continuare și nu s-a determinat pentru acestea factorul de ameliorare a capacității de legare. 25

Tabelul 15

Clone de fagi - F(ab), rezultate din cicluri de selecție a capacității de legare la IgE

Clone de fagi - F(ab), rezultate din cicluri de selecție a capacității de legare la IgE

Clonă de fag	Rest VL CDR1	Rest VL CDR3	Ameliorarea legării (ELISA fag) (n ori)
27	28	30	31	32	34	101	102	103	105	107
e426	Q	S	D	Y	E	D	H	Y	F	H	H	-1-
212-3.1 (x2)	M	R	Y	G	-	-	-	-	-	-	-	nedeterminată
212-3.2	A	Y	N	G	-	-	-	-	-	-	-	3.5
212-3.3	G	G	Y	G	-	-	-	-	-	-	-	6.9
212-3.5	M	G	E	A	-	-	-	-	-	-	-	nedeterminată
212-6.1	E	Q	D	W	-	-	-	-	-	-	-	23
212-6.2	E	R	E	S	-	-	-	-	-	-	-	nedeterminată
212-6.4	E	H	D	W	-	-	-	-	-	-	-	23
212-6.5	S	N	S	G	-	-	-	-	-	-	-	nedeterminată
212-6.6	K	E	D	S	-	-	-	-	-	-	-	nedeterminată

RO 120848 Β1

Tabelul 15 (continuare)

Clonă de fag	Rest VL CDR1	Rest VL CDR3	Ameliorarea legării (ELISA fag) (n ori)
27	28	30	31	32	34	101	102	103	105	107
212-6.7 (x8) (e26)	K	P	D	G								25
212-6.15	R	P	D	T	-	-	-	-	-	-	-	nedeterminată
212-6.16	R	S	D	G	-	-	-	-	-	-	-	nedeterminată
212-6.17	V	T	H	S	-	-	-	-	-	-	-	nedeterminată
213-3.1	-	-	D	D	c	D	-	-	-	-	-	nedeterminată
213-3.2	-	-	H	D	s	D	-	-	-	-	-	nedeterminată
213-3.3	-	-	D	W	Q	D	-	-	-	-	-	8.8
213-3.4	-	-	G	D	H	D	-	-	-	-	-	3.7
213-6.1	-	-	E	R	W	D	-	-	-	-	-	nedeterminată
213-6.3 (x2)	-	-	D	T	E	D	-	-	-	-	-	14
213-6.4	-	-	D	w	E	D	-	-	-	-	-	20
213-6.7 G33S	-	-	H	N	E	D	-	-	-	-	-	nedeterminată
213-6.8 G33S	-	-	Y	S	N	D	-	-	-	-	-	14
213-6.9	-	-	W	G	E	D	-	-	-	-	-	nedeterminată
213-6.11	-	-	Y	S	E	D	-	-	-	-	-	nedeterminată
213-6.12	-	-	E	R	D	D	-	-	-	-	-	nedeterminată
213-6.13	-	-	H	E	E	D	-	-	-	-	-	nedeterminată
213-6.14	-	-	D	K	K	D	-	-	-	-	-	nedeterminată
213-6.15	-	-	D	R	Q	D	-	-	-	-	-	15
214-3.1 (x5)	-	-	-	-	-	-	H	Y	F	T	Y	2.7
214-3.6	-	-	-	-	-	-	H	Y	F	s	R	nedeterminată

RO 120848 Β1

Tabelul 16

Clone de fagi VHCDR2

Clonă de fag	Rest VL CDR2	Ameliorarea legării (n ori)
53	54	55	57	59
e426	T	Y	D	S	N	-1-
235-5.1	K	Y	S	E	K	nedeterminată
235-5.2	K	W	H	E	M	nedeterminată*
235-5.3	K	W	W	E	A	nedeterminată*
235-5.4	H	Y	A	R	K	nedeterminată*
235-5.5	K	Y	H	G	A	nedeterminată*

Notă: afinitatea relativă medie a populației de fagi a fost estimată ca fiind de 6,2X ameliorată față de e426.

V. Mutații combinate pentru selecția fagilor

Mutații la diferite situsuri din structura proteinei au adesea un efect și asupra funcției acesteia (Wells, Biochemistry29: (1990). Prin urmare s-a realizat o combinație a unora dintre mutațiile colecțiilor inițiale de fagi, descrise mai sus, în scopul ameliorării capacității de legare la IgE.

Pentru a reduce riscul creșterii caracterului imunogen al anticorpului anti-lgE, a fost necesară minimizarea numărului de mutații la E-25. Prin urmare s-au utilizat doar mutații de la variantele de fagi care au prezentat cea mai mare ameliorare a afinității măsurate în mod independent. în plus, frecvența cu care s-a observat o anumită clonă de fag poate avea legătură cu nivelul de expresie și/sau cu stabilitatea la proteoliză (Lowman & Wells, 1991, de mai sus). S-a ales o anumită clonă de colecție VL1.212 -6, 7, redenumită e26, deoarece a prezentat o afinitate de 25 de ori mai bună față de e426, în urma analizelor ELISA pentru fagi (tabelul 17).

Și colecția VH CDR2 a prezentat ameliorări ale afinității față de e426, deși au fost doar6,2X mai mari, măsurate pentru amestecul de fagi. Afinitatea amestecului de fagi a fost ameliorată cel puțin în cazul unora dintre membrii amestecului, nefiind necesară măsurarea afinității tuturor membrilor, separat. Utilizarea amestecului de fagi permite de asemenea identificarea gradului de creștere a afinității după fiecare ciclu de selecție, putându-se decide dacă să se continue sau nu selecția (adică atunci când amestecul a atins afinitatea maximă este improbabil ca aceasta să se amelioreze prin cicluri suplimentare de selecție). Deci utilizarea afinității amestecului este un instrument util de screening.

S-a observat că mutațiile din regiunea VH CDR2 pot acționa cumulativ cu cele din VL CDR1, deoarece bucla VH CDR2 se află la distanță de bucla VL CDR1 atât în modelul molecular, cât și în modelul structurii cristaline. Deoarece însă unele combinații ale acestor mutații pot fi incompatibile, s-au testat patru combinații diferite de mutanți: e26 combinat cu mutațiile descoperite în clonele 235 - 5.1,235 - 5.2, 235 - 5.3 și 235 - 5.4 (tabelul 17). Aceste structuri s-au realizat prin mutageneza Kunkel (Kunkel și cola., Methods Enzymol. 204:125 (1991)), utilizând F(ab) - fagul e26 ca matriță, cu oligonucleotide mutagene ce codifică mutațiile ZH2.

RO 120848 Β1

S-au utilizat analize ELISA pentru fagi (Lowman, Methods in Molecular Biology, voi. 87, Cabilly (ed), Humana PressInc.Totawa, NY (1997)) pentru compararea variantelor finale ale combinațiilor de mutații din VLCDR1 în e26 cu mutațiile VHCDR2 în clonele 235 - 5.1, 235 - 5.2,235 - 5.3 și 235 - 5.4. S-au preparat, de asemenea, proteine E(ab) solubile și s-au comparat într-o analiză pe placă acoperită cu IgE-biotină, fiind reprezentate în tabelul 17 și în fig. 7.

Tabelul 17

Fragment F(ab)	IC50 (nm)	Afinitate relativă (ameliorată de n ori)
e426	1,5	-1-
e26	0,17	8,9
e27 (e26+235-5,1)	0,040	38
e695 (e26+235-5,2)	0,050	31
e696 (e26+235-5,3)	0,063	24
e697 (e26+235-5,4)	0,066	23

VI. Testul pe placă cu biotină (test de competiție pentru himera IgG - FcsRI)

Introducere: Scopul acestui exemplu constă în compararea competiției pentru legare la IgE umană biotinilată în soluție, dintre fragmente diferite de F(ab) de anti-lgE și o himeră IgG imobilizată la receptorii de afinitate înaltă pentru IgE, complexele IgE-biotină și fragmentele F(ab) anti IgE fiind adăugate simultan pe o placă acoperită cu himera receptorului IgE. Pe măsură ce crește concentrația de fragmente F(ab) anti-lgE, cantitatea de IgE-biotină care se leagă la receptorii de pe placă scade, observându-se o scădere a densității optice măsurate cu spectrofotometrul. S-au acoperit plăci Maxisorp Nune (nr. catalog F76) cu FcsRI - IgG 100 ng/cavitate (Haak - Frendsho și colab., J. Immunol. 151, 352 (1993), (Genentech lot # 2148 - 74 (6,4 mg/ml)), utilizându-se o probă de 100 pl dintr-o soluție de rezervă cu concentrație de 1 ug/ml în soluție tampon de carbonat de sodiu 50nM (pH 9,6), timp de 12...24 h, la 40°C. S-au spălat plăcile de 3 ori cu soluție tampon de spălare pentru ELISA (0,05% polisorbat 20 (Sigma) în PBS (7,4)) și s-au blocat prin incubare cu 200 μΙ de soluție tampon de analiză ELISA (ser fiziologic tamponat cu Tris, pH 4,45, cu albumină serică bovină de tip RIA 0,5%, Sigma; 0,05% polisorbat 20 și EDTA 4 mM), timp de 60 min. După trei spălări cu tampon de spălare, s-au realizat diluții în serie de 2x a 100 ui de F(ab) anti-lgE în tampon de analiză, la o concentrație inițială de 200 nM și s-au adăugat pe placa ELISA în triplicat. S-au realizat diluțiile, utilizând o pipetă cu mai multe canale Titertek^(R). S-a adăugat, în toate cavitățile, IgE biotinilată în soluție tampon de analiză (100 μΙ, diluție 1/500 a unei rezerve de 0,5 mg/ml) și s-a incubat amestecul într-un mixer miniorbital (Bellco), timp de 60 min, la 25“C. S-a purificat IgE prin cromatografie de afinitate a supernatantului culturilor de celule U266B1 de mielom (ATCC TIB 196) și s-a biotinilat cu hidrazidă de biocitină (O'Shannessy și colab., Immunol. Lett. 8: 273 (1984); Pierce Chemical). S-au spălat aceste probe de 5 ori cu tampon de spălare și s-a detectat IgE legată cu 100 ui de streptavidină conjugată cu peroxidază (2 ymed), 1:3000, timp de 90 min. Probele au fost din nou spălate de 6 ori cu tampon de spălare, după care s-au adăugat 100 μΙ de soluție de substrat (400 pg/ml diclorhidrat de o-fenilendiamină și H₂O₂ 4mM în PBS) și s-au incubat timp de 6 min. S-a oprit apoi

RO 120848 Β1 reacția cu acid sulfuric 4,5M (100 ui) și s-a citit absorbția la 490 nm, pe un dispozitiv de citire 1 a microplăcii U_vmax (dispozitive moleculare). S-a reprezentat grafic absorbția pentru diverse concentrații ale fragmentelor - (ab) ale anticorpilor e25, e26 și e27, în fig. 8. 3

Concluzie: Graficele din fig. 8 arată că atât E26, cât și E27 au afinitate mai mare decât E25, pentru receptorii de afinitate înaltă, iar E27 a prezentat afinitatea cea mai mare. 5

VII. Teste BIAcore pentru proteinele F(ab) solubile

S-au calculat afinitățile de legare la receptori pentru câteva fragmente F(ab) (Lofas 7 & Johnson, J. Chem. Soc. Commun. 21, 1526 - 1528 (1990)), din constantele ratei de cuplare și de disociere, măsurate cu un sistem de rezonanță a plasmonului de suprafață 9 BIAcore TM-2000 (BIAcore, Inc.). Conform instrucțiunilor producătorului BIAcore, se activează un biosenzor la cuplarea covalentă a IgE, utilizând clorhidrat de N-etil-N'-(3-dimetil- 11 aminopropil)-carbodiimidă (EDC) și N-hidroxisuccinimidă (NHS). S-a diluat IgE cu soluție tampon de acetat de sodiu 10 nM (pH 4,5), care a fost apoi diluată la aproximativ 30 ug/ml 13 și injectată în biosenzor, obținându-se un semnal de 800 -12400 de unități de răspuns (Ru) pentru produsul imobilizat. Deoarece semnalul exprimat în Ru este proporțional cu masa 15 produsului imobilizat, acesta reprezintă un interval al densităților IgE imobilizate pe matrice, de aproximativ 0,4...6,5 pmol/cm². în final s-a injectat etanolamină IM ca agent de blocare. 17 Regenerările s-au desfășurat cu MgCI₂ 4,5 M.

Pentru efectuarea de măsurători ale dinamicii, s-au injectat diluții în serie 1,5X de 19 fragmente de anticorp F(ab) pe suportul IgE în tampon PB/Tween (0,05% Tween - 20 în ser fiziologic tamponat cu fostat) la 25°C, utilizând o viteză a fluxului de 20 ul/min [fig. 9], 21

Datele de disociere s-au introdus într-un model one-site, pentru a obține Koff+/-s.d. (deviația standard a măsurătorilor). Pseudoconstantele de echilibru ale disocierii (Kd), pentru 23 legarea Fab:lgE, s-au calculat din măsurători SPR ca rapoarte Koff/Kon. De asemenea, deoarece constanta de disociere la echilibru, Kd, este invers proporțională cu Koff, se poate 25 estima ameliorarea afinității, considerând viteza de cuplare (Kon) ca fiind constantă pentru toate variantele. Vitezele de disociere, împreună cu timpul de înjumătățire calculat pentru 27 disociere, sunt prezentate în tabelul 18.

Tabelul 18

Dinamica disocierii 31

F(ab)	Koffx10^	ti/2(min)	Ameliorare (n ori)
e25	22 ±4	5,3	-1-
e26	3,6 ±0,2	41	7,7
e27 (e26+235-5,1)	0,98	118	22
e695 (e26+235-5,2)	0,94	122	23
e696 (e26+235-5,3)	1,4	83	16
e697(e26+235-5,4)	1,5	77	15

RO 120848 Β1

VIII. Expresia și purificarea F(ab)

S-au exprimat în tulpina 34b8 de E. coli F(ab) de anti-lgE E25 (Presta și colab., J. Immunol. 151: 2623 - 2632 (1993)) și variante ale acestuia în fagemide derivate din p426 (fig. 10). S-au incubat culturi (10 ml) în mediu 2YT cu carbenicilină 50 pg/ml, timp de 8 h, la 37°C, după care s-au transferat în 1 I de AP - 5 modificat, ce conține carbenicilinază 50 pg/ml, incubându-se încă 24 h, la 37°C. Culturile au fost apoi centrifugate în sticle de 500 ml, la 7000 rpm, timp de 15 min, la 40’C. Suspensia a fost congelată la -20’C, timp de cel puțin 3 h, după care fiecare suspensie din sticlele de 500 ml a fost suspendată în 12,5 ml de zaharoză rece 25%, în Tris 50MM, pH 8,0, ce conține benzamidină 1mM (Sigma) la40°C. S-a dizolvat suspensia prin agitare la 40’C, timp de 3 h. Suspensia a fost apoi centrifugată la 18000 rpm, timp de 15 min, la 40°C, după care s-au purificat fragmentele F(ab) exprimate în supernatant prin cromatografie de afinitate cu proteină G (Pharmacia). S-a spălat coloana cu o soluție de Tris 10 mM (pH 7,6) și EDTA 1mM (pH 8,0), iar fragmentele F(ab) au fost evaluate cu 2,5 x volumul coloanei, de acid acetic 100 mM (pH 3,0) și aduse imediat la pH neutru cu 0,5 volume de Tris 1,0 M, pH 8,0. S-au concentrat elementele și s-a realizat tamponarea cu PBS într-un centricon 30 (Amicon). S-a determinat concentrația proteinei prin absorbție la 280 nm cu un spectrofotometru (Beckman DU 64) și s-a evaluat puritatea unei mostre de 4 geluri SDS+PAGE 20% Wovex) în condiții reducătoare, cu β-mercaptoetanol 5%.

IX. Rezultate și concluzii

Rezultatele experimentelor ELISA de competiție arată că complexul fag - F(ab) e26 a avut o afinitate ameliorată de 9 ori față de e426, în timp ce variantele combinate e695, e696 și e697 au prezentat o afinitate ameliorată de 20...40 de ori față de fagul e426. Și alte combinații de mutații la nivelul fagilor pot duce la obținerea de variante de anticorpi cu afinități în mod similar îmbunătățite.

Prin testarea proteinelor solubile F(ab) într-un test pe placă cu IgE-biotină, s-a observat o ameliorare de 10 și de 30 de ori mai mare decât e25, în cazul F(ab) e26 și respectiv F(ab) e27, în ceea ce privește legarea IgE la FceRI - IgG. în particular, e26 și e27 au prezentat o viteză de disociere de 7,7 și respectiv de 22 de ori mai mică decât e25. Prelungirea timpului de îmbunătățire semnifică ocuparea IgE pentru mai mult timp, devenind astfel incapabilă de a se lega la receptorii de afinitate înaltă, agentul terapeutic anti-lgE având deci o putere mai mare.

Astfel, atât datele legării la echilibru, cât și ale dinamicii de legare susțin concluzia că fragmentele F(ab) ale e26 și e27 leagă IgE de aproximativ 10 ori și respectiv 30 de ori mai strâns decât e25. Se poate deduce că anticorpii (IgG) cu lungime completă, ce conțin mutațiile F(ab) respective, vor prezenta afinități relative similare față de IgG e25.

Lista de secvențe (1) Informații generale (i) Solicitant: Genentech. Inc.

(ii) Titlul invenției: Procedeu pentru prepararea unei polipeptide cu activitate antilgE, moleculă de acid nucleic și compoziție farmaceutică cu această proteină (iii) Numărul de secvențe: 26 (iv) Adresă de corespondență:

(A) Destinatar: Genentech, Inc., (B) Strada: 1 DNAWay (C) Oraș: South San Francisco (D) Stat: California (E) Țara: USA

RO 120848 Β1 (F) Cod: 94080 (v) Forma citibilă pe computer:

(A) Tip de mediu: Dischetă 1,44 Mb, 8,9 cm (B) Computer: Compatibil IBM (C) Sistem de operare: pc-dos/ms-dos (D) Softwere: WinPatin (Genentech) (vi) Date despre cerere:

(A) Număr de cerere:

(B) Data de înregistrare: 22-OCT-1997 (C) Clasificare (viii) Informații mandatar/agent:

(A) Nume: Svoboda Craig G., (B) Număr înregistrare: 39.044 (C) Număr referință: P1123PCT (ix) Informații de telecomunicații:

(A) telefon: 650/225-1489 (B) telefax: 650/952-988131 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 1 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 6127 perechi de baze (B) Tip: acid nucleic (C) Catenă: dublă (D) Topologie: circulară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 1

<4ΑΑΓΓΧ·.ΑΑΓ7Γ	TCTCCATACT	TTGCATAAiHl	AAATACAftAC	AT<iAAAAAT€	50
	GrrToxrAi-n	AAUCnOCCC	AAAAAOAJttJA	/ΛτΛςΓΓσσΑΛΤ	1U0
CAACT-STGTC	CCCACCTACA	ACCTTTGCAC	ATTATCGTCA	CTGCAATGCT	iac
TCCCAATATG	GCGCAAAATG	ACCAACAGCG	GTTGATTGAT	CAGGTAGAGG	JOO
ΟίΙύΠΧΤΧΓΓΛ		ΓΠ’ίίΛΙΊλΤΛ		e<iJM-<iATAC«
	GCUATTACtfT	AAAGAAQTTA	TT’JAAQCA'TC	CTCCFTCAUTA	joc
AAAAC'M ΛΑ-Τ	r'îTT'rCAA^A	âCWTCA-WUk		eiCCGAcSACT*?	3S0-
AFAi./r*-AK‘TT	ΊΧΓΓΤΤΤΤΑ’ΓΓ	ΤΓΤΓΑΑΊΟΤΑ	rrivjrAAerA	^AATTCGAGC	40C
•ΣίΜίλίΧΜ	OG U Al CC ‘I*J 1		•IfUAnT'.’AT	(JAAA/iAGAA?	αυν
ATCQCATTTC	TTCTTGCATC	Uk.L. I CCTT		<TTACJLAACC-C	500
<GTA»“>.'CTGAT	ATi'X'ZTCA	crcAGTcrrr	GA OC TCC CTf.	τ c rcr*: tvtg	«i5C
•n-i - ·< JA'TAC	rj»Tr*/u'»'ATe	acctv;· '«‘utu	iVMîTVA&at;	τα-η'Μ-Αΐ'ΤΑ.Γ	ΛΟΟ
CÎAJW-XS'FGATA	OCTAjCCTUAA	CTGGTTATÎJAA	1 'AGAAA.’ C AG»	UiAAAAGC’TCC	650
	a r ttaojc<K3	CCTCOTAZCT	CK5A75TCT G<JA	crrccc-rTCTC	70 0
	--· ‘	. ;a-vt	U' rr.A· ·	-·*—» *.< .> a>
•.·ι*λ·α··λ···.·λ?»	AÂMACriVJ'.	McriArrAC	l’J'r-JAijr.-AAA		tf'J tt
rc c crr acac a	TîT-joACAaa	<JTAjCC AAJCH	UGAOATCMA	C’JAACTG-rtiG	«*>C
V'T’.'rAi.T ΑΤΓ	'Τ’.ΙΤ'ΤΤΆΤ·'	—rrrr-w.'A-r	ΓΑΤΤΛα’Α	GrVMA'Tf ·	iot
,ΑΛ. ’r.^-FT	i Tu7--1..-7UT» --	ιΛΤιΖΤ,.ΛΛί	7iA».-rrcTATc	<· * A .»At.» Ai «.iit	'4 5 f
ΆΑΛ/4ΤΛ·.· AG		ATAATUUT< 'f	. v’AATi:xi»>:4T	AAi’T* V'CAiiU	—
AGA C7T <7T<1A£	7vG A1C 7*5 C AC	AGCATUGÎtL· 7<	:.>C AC CTA C7LJ
Λ - < ·:-·. ./ν.:'ι··Γ	Ί' A b VdiÂi'k'	ΛΤΛί'-.Ά»	AAACAi?AAA.i		; 1 «Ί r
	CAT/AWCCC	rL'AGCTC'JLC	L’CTL’ACAJWU;	AGCTTCAACA	. lbL
•XJCGACAGTC	TT AAC ΓΤ ΟΛΤ	-ÎITGTArSCC	ggaggcatcq	tggccctagt	13 0 3
A.Ci-A ACTTr	ar cttaaaaj-.î;	GGTÂTri-aCA	!Ζ2'ΓΤ3Λ^Γ7ΤΓ1	ΑΤΤΓ'Γ ΑΤΎ1Λ.Α	1 ··-
Λ.ΑΑί+ΑΛ Τ*ΤΓ	>-ΆΤ*ΓΊΥΓΓν'	τγλ-ατγτατ	Ρ?ΤίΓΓΓ-ΓΓ	·?ΓΤΑΤΓ«.Τ*	înr

RO 120848 Β1

CAAACGCG*fA	CGCTGAQGTT	CACCTGGTGQ	AGTCTWXXX	TGGCCTGGTC	l 35C
CAOCOMKMXI	GCTCACTCCG	TTTGTCCTW	acAcrrrrcTa	GCTACTCCAT	l 400
GACCTCCGGA	TACAGCTGGA	ACTGGATCCG	TCAcccccaa	GGTAACGGCC	1450
TGGAATVJGT	'rccATcoArr	AOG1ATGACG	GATCGACTAA	CTAIAACCC?	1500
AQCQICAAOO	GCCOTATCAC	TATAAOTCOC	GACOAITCCA	ΑΑΑΑΟΛΤΑΤΓ	IGuQ
	ATGAACAGGC	TGGG1GGTGA	GGACAGTGGC	GXCXATXAX'J	LfeOC
OIOCTCGAQG	CAGCCACTAT	TTCGGTCACT	GGCACTTCGC	CGTGTCGWI	1650
CAACGAACCC	occtcaccgt	ciecTccccc	TreACCAAOG	ccccatccct	l 700
crrrcccc-TA	gcaccctvct	CCAAGAOCAC	cTCTGoxkxr	ACAGCGOCCC	1 750
TG^KirCTOCCT	CKÎTCAA'WAC	TMTTTCccca	AATCGKJTCMMZ	GOTOTCSTOK»	1 ftOO
AAC1CAG<GCG	CCCTGACCAG	CGGCGTGCAC	ACC7TOCCOG	CTGKXTACA	1850
GTCCXAGGA	CTCTACTCCC	TCAGCÂSCGT	GGTGAOCGTO	CCCTCCAGCA	1*00
GcTIUCiiCAC	CCAGAC<*TA£	AIClGcAAtxi	'TCAA'TVACAA	iXx.'LACCAAC	1350
ACCAMHTTOG	ΑΤΑΑ<*ΑΑΑ(ΤΓ	TOAGCCCAAA	TCTTGTOACA	AAACTCACAC	7000
CT ACfrAtFT* JOC	<SGT<JttCTCTI»	liTTCCTKiTtiA	TTTTCpATTAT	gaaaagatxm*	7050
caaacgctaa	ΤΑΑαααααστ	ATGACCOAAA	ATGCTOATOA	AMACeCOCTA	2100
CAGTCTGACO	CTAAAGOCAA	ACTTGATTCT	GTCGCTACTG	ATTACGGTGC	215 0
tgctatcgat	GGT7TCATTG	G1VÎACGTTTC	cGGccrroer	AATCXÎTAATG	7200
<77<TTTACTCG	tga rrTTurr	GGCTCTAATT	CCeAAATCklC	τγαατγγογγγ	775C
GACÎ>CîT<îA*TA	attcac-cttt	AATGAATAA'T	TTCCRTCAAT	ACTIACCTrC	2300
CCTCCXTCAA	’tcggttoaat	GTCGCCCTTT	WTCTTTM1C	GCTGGTAAAC	2350
CATATGAATT	ttctattgat	TGTGACAAAA	TAAACTTATr	CCGTGGTGTC	2400
rrrcaz’^pc	ΤΤΓΤΛΤΑΤσΤ	TOCTAÎXTT?	ATG7ATGTAT	TTTCTAGtrr?	2450
TOC7AACATA	CTGCOTAATA	A&SAiTFCTTA	ATCATGCCACÎ	TTCTTTTCGC	2SOO
TAGCacCOCC	CTATA^îTTG	TCTOCCTCCC	CGCGT’KK’ilT	CaCGGTGCA’r	2 350
i^ACKX'GGGC	CAT^TTîWC	TGAAWGAAO	CCGGCGCCAC	CTCGCTAXCa	2*CC
GATICACCAC	TCCAAUAATT	G-GAGCCAATC	JUC7CTTGCG	GAGAACTGOXÎ	265C
AATGGGCAAA	CCAACCCrXG	GCAGAACATA	TCCA7CGGG2	CCGCCATCTC	2 700
CAGCAGGCGC	ACGCGG-CGCA	TCTCSGGCAG	CG^TGGGTCC	TGGCCACGGG	2 JSO
ΤΓ-ΤΓ,ΓΛ’ΧΪΑΤ	<:στίχτΓ<χ:τχΐ	«ΤαΠΠ’/ΑίΧίΑ	CX-CGGCTA-;»	1 ”A κΚ’-<η.ι<λ/?
tgccttactg	GTTAGCAGAA	TGAATCACCC	ATACGCGAGC	GAACGTCAAG	«î!î5 0
cgactcctgc	TGCAAAACGT	CTOCGASCTG	AGC AAC AAG A	TGAATCGTLT	2*00
TTknTTCCG	TCrCrcrAA	.AX-r 4Γ k.	CCCCXiAACrC	A-u^*. _Λ- C ·-. C.A.
A <*λ :τλ >:τ	:·';' j.ac'C	<·ΛΎ<' JAi.t A	-η>··.->'	Μ*. Ί.7-.	V*. * c
a ac λ: <·~'Α«.;α	·?'. ÎTATVAA.	ΓίΫΑΑ-Μ Î2/7XI	OCATCi/V *C	: · ΪΑχ5Τ«ΑΤΓ	< u<·
Τ ICTCTGJTC	CCUCCA'AX	CATA-XGCCA	G FTGT'TTACC	riCAC«\ACGG	.c:c
Τ.“Ά.7ΤΛΛ>.~	.^^A-‘Tr7C	ΑΤΛΊΓΓ AGTA	ACCCCTAT		i: s c
< · γ·:’ r όνττ·	a-re >-rrvr a	TT7.c-< . Α-	;aacâ.	' ··:' .rec: iu	» -· ' c
,Χ-.ι> .Ai.w ’ΛΤ	<'αα·;·γ;α·ά	ΛΑΤΑ 3.ΑΆΑΑ	AAC'G’« · r:·	Λ A· ATC. ,i . C	« .· ' lj
GGFX ;aicag	AAw Λ2Δ2Α	T ΧΛΛ2 G-C TT'~	Γ G_« AG AA/CT	•J AA_’G«XJC Σ ’G	_ c

RO 120848 Β1

GACGCCCATC	AACACCCAliA	CAICTCTGAA	TccerrcAOc	ACCACOCTCA	3350
toagctttac	raCAOGATCC	ολαλαττοτα	AACGTTAATA	TTTTOTTAAA	5400
ΑΤΓΓΠΤίΓΤΤΑ	AATTTTTGTT	ΧΛΛΤΓΑΠΓΤΓ	ATTTTTTAAC	CAATACJGece	3450	5
AAAIOGGCAA	AATocrrrAT	AAATCAAAAS	AATAGACCGA	GATAOGGTTG	1500	7
jvmnirnc	CAUXTXOQAA	OAAGAOICCA	CTATTAAAOA	ACXJÎOOACTC	»30
CAACJTCAAA	aaaauAAAAA	CCGTCTATCA	GGQCTATYXiC	CCACTACGTG	3600	9
AACCATCACC	CTAATCAA3T	ϊτττταοοοτ	COAGOTOCCa	TAAAOCACTA	J65C
AATC3GAACC	CTAAAGOGAG	i-tr-ccoArrr	AGAGCTTGAC	aaaGAAAGCC	3700	11
«GCGAACGIW	GCCAUAAASQ	AA0XKÂAA3AA	AGCGAAAGOA	«csoGOGerA	47JC
cgccoctmc	AAGT<in JU&CG	GTCACGCTGC	GOGTAACCAC	CACACCCGCC	j«oo	13
ococrrAATG	COCCOCTACA	aoacacoTCc	GOATCCT«XC	TcacocGTTr	J85C
CSGTSATOAC	aaraMJUiec	tctoacacat	GCAGCTCCCG	aASACOGTCA	J»OE	15
cAUL-ifvfer	UTAAGCtfUAT	LAXUUUAiJtA	UACAAGCieaJ	TK'ALAXATmA*	3950
TCAoacoora	ττοοοΜοτα	TcxxioQcacA	GCCATOACCC	AOTCAOGTACI	40QC	17
QGAJMKXXXA	GTttTAXACTG	acrriwciAx	CCOGCATCAG	AOCAGATZOT	40S0
ACT^AQA^KI	CAOCATATQC	^TiyiXiAAAl	ACCOCACAflA	XMCOTAAGGA	4X00	19
viAAAATACCG	C ATCAjKJCOC	TCTTCCGCTT	CCTCOCTCAC	TOACTCGCTU	4150
CGCTZGCXJa	7TTLXKrTGOG	'JiSSADCCOTA	TCAGCTCAC7	CAAABOCOOT	4280	21
AATACGGTTA	TCCAOAOAAT	CAOOQOATAA	COCAOGAAAa	AXCATOTOAG	4J5 0
CfiAMMCCA	GCAAAAGGCC	AQGAACC9TA	AAAAQCCCQC	GTTGCTOGCQ	4300	23
ΤΓΠ TOCATA	agcTcc<rccc	CCCTGACGAO	CATCACAAAA	ATCQACGCTC	4 «0	25
AACTCACAGG	TCWCXÎAAAeC	CGACAGGACT	ATAAAGATAC	CAGOCCTTTC	4400
CCCCȚCGAAG	ercoarroGTG	COCTOTC CTS	ttccgaîîcct	aacocTTAce	445C	27
GOATACr^NTT	ccnccrrrcT	crrTrcoacA	AncGTGcxrx:	rrrcrcATAG	4500
cKAiwxr	AGGTAICTCA	aTrcrxnsTA	GCFTCGTXîGC	TCC-AAGC-aNX»	4550	29
a-TTGTGTGC A	CtZAATCCCCC	gttcagcîxî·	ACCGCTGCGC	cttatcc-oct	4600
aactatcctc	'TTCA^CChA	CCCCCTAACA	CACGACTTAT	cceeAcroex:	465C	31
A5CA3CCACT	GGT AAC AÎ>C*A	TTAGCACAGC	GJbGGTATGTA	□<aC3CTCCTA	4?0C
CAGAOTTCTT	Γ.ΛΛ-.ΤΓΤίΤΤ.-ΧΤ	C*CTAACTACG	GCTACACTAG	ΑΛβΟΛΓΑσΤΑ	4 ?50	33
‘rrnAJTA'rcr	cîcxK^rc'.^cT	iSAAGCCAGTr	ACCTTCiXiAA	AAAUAOTTCG	4900
ΤΛίΧ TC *’·ΜΑ	?rr-îirjuibc	MAcrAfrcr	TG*^ACCiX7T	ccrrmrrc	4«5C	35
ΤΤΤΟΛΜΓΖ*	Ο*Λ0Α?ΤΑΓΟ	-CTA^AAAAA	AACCATCTCA	AOAACAT-CT	46*0
ΤΤ-ΊΑΤΓ—T“	i“TA“«55<X3*·?	ΤΛΑΤ··-Γ,“Τ-ΑΓ·	ΤίΧΪΑΆΓ^ΛΑΑ	A-^r-ArrTTA	44‘C	37
Λ-·.;.-‘T-.-TG	rr vr - A- · at	TA’·· ΆΑΛ ΑΛΓ,	ί'ΑΤΟΠ/'ΛΓΓ	TAG ΑΤΓΓΤΤΤ	t
’Γ ΑΑΑ ΖΤΑΑΛΑ	at»;aa->tttt	ΑΛΛΤ. aa ;v :	AAAJTATA-A	AAACT	53 = 0	39
T^JICTOACA	^T'.’ACJAAKJ	CTIAATCACT	Cr AC <0“l A	rerzAJc-3AT	s;.c
Τ-..7Χ+-		7A7TT<X‘ ·*ΤΤ,	ACTCCC-GTC	:t:ta*ataa	5: * c	41
• ’ Γζ<: »A*jv <;	·>♦'♦*. λαλΊΤΑ	*« AT.·» '..'	! CAuT> T.4-	ΛΑΤ »Λ ΓΑ ‘'.i	5 ?: c	43
’. . »<* λ &Μ. 4 i >Μ	*' **·' **'*	;«·?·A'iAr ;ta	ίΛ .Alm AA - A A	Αν <. Al*· AiX’	s / > o
	r.hn.-cr κτ,κ. A	*·**^ZJ*?<” ** ·*Υζ«Γ	AATTTTAT^r	vrrrrATcr	ț n

RO 120848 Β1

AGTCTATTAA	TTGTTGCCGG	GAAGCTAGAG	TAAGTAGTTC	GCCAGTTAAT	5350
AGTITGCGCA	ACGTTGTTGC	CATTGCTGCA	GGCATCGTCG	TGTCACGCTC	540 0
gtcctttggt	ATGGCTTCAT	TCAGCTCCGG	TTCCCAACGA	TCAACGCGAG	5450
TTACATGATC	CCCCATGTTG	TGCAAAAAAG	CGGTTAGCTC	CTTCGGTCC1	5500
CC<JATC<JTT<J	TCAGAAGTAA	GTKKJCCOCA	QT<JTTATCAC	TCATWTTAT	iii a
COCAGCACTG	CATAATTCTC	TTACTCTCAT	CCCATCCGTA	AGATCCTTTT	5600
CIOTGACTGG	TGACTACTCA	ACCAAGTCAT	TCTGAGAATA	GTGTATGCGG	5650
CGACCGAGTT	GCTCTTGCCC	GGCGTCAACA	CGGGATAATA	CCGCGCCACA	5700
TAGCAGAACT	TTAAAAOTGC	TCATCATTGG	AAAACGTTCT	TCGGGOCGAA	5750
AACTCTCAAG	gatcttaccg	CTGTTGAGAT	CCAGTTCGAT	GT AAC CC ACT	5800
CGTGCACCCA	ACTCATCTTC	AGCATCTm	ACTTTCACCA	GCGTTTCTGG	585 0
GTGAGCAAAA	ACAGGAAGGC	AAAATGCCGC	AAAAAAGGGA	ATAAGGGCGA	5900
CACGGAJIATG	'TTCAATACTC	ATAcrciTee	tttc'tcaata	TTATTUAAGc	595 0
ATTTATCAGG	GTTATTGTCT	CATGAGCGGA	TACATATTTG	AATGTATTTA	6000
GAAAAATAAA	CAAATAGGGG	TTCCGCGCAC	ATTTCCCCGA	AAAGTGCCAC	«05 0
CTCACGTCTA	AGAAACCATT	ATTATCATGA	CATTAACCTA	TAAAAATAGG	6100
CGTATCJKCGA	GGCCCTTTCG	TCTTCAA			6127

(2) Informații pentru Secv. ID. nr. 2 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 121 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 2

1

Vnl

(\\ i4

fiih

G. J

Bei

Xy

T.y ; -f

Vai

’-r»

Fr -

••r Ij

’i 1 r»

f:-T

Ale

*'P

f-er

'în 1

l’S

Tyr

γ··γ

11 n

‘0

• «r

Τ¥ί·

Ttt<

A·* Trp·

Γ.Φ

Ari

51 O

Fi O

ty* Î5

-et:

,1·-

Γ:· î

··» - y

-e- .Le

rtc

. y r

ke.-· 55

ji.y

..»ei

Ae îi

i L!

ÎLU

-''Vi

*~Y» ** 5

Ae:*

Xli

'el

Tht

TliL

S*x

ulr

Αλτ.

»>r

:*i :,γ»

An

.-«r

Ala

rtr

fc i *

AXf %r

hx

Kh

T:<î

T'W L

~y-

y κ A_ a

*31 f

«<t4

K.»

r.y*

Fr.e

Fie

¥ t -

? t-s

Λ. 4

V4 1

Ti

Λ, *

Ti.»

Va *

* »1

v <».

r-:

* <31

RO 120848 Β1 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 31 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 121 aminoacizi3 (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară5 (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 3

Glu

Voi

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cya

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Sar

lle

Thr

9

20

25

10

Eer

Gly

Tyr

Eer

Trp

Ann

Trp

lle

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lya

Gly

11

15

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

11«

Thr

Tyr

Asp

Gly

Sar

Thr

Asn

Tyr

13

SC

ss

60

Ala

Acp

Sar

Val

Lyu

Gly

Arq

Phe

Thr

lle

Ser

Arq

Aep

Asp

Ser

15

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Pbe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

17

ac

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

Mia

Tyr

Phe

Gly

Hls

19

95

100

105

Ttp

HlB

?he

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

•rhr

Leu

val

Thr

val

ser

21

110

115

120

sex (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 4 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 121 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 4

Glu 1

Val Gin Leu

Val S

Glu Ser

Gly Gly Gly Leu 10

Val Gin

?ro

Gly 15

Gly

Cer

Leu

Ar j

Leu

Ser

Cy»

Ala

Ala

Cer

Gly

Phe

Thr

i’he

Χαα

20

25

30

Ser

Acp

Tyr

Ala

“et

Sor

Trp

Val

Ar<?

Gin

Al*

Pro

Gly

Lye

Gly

35

10

•15

Lew

Vl'.i

Trp

Val

Ala

7-;

U~

ler

Asn

GLy

•>?r

Asp

l’.-.r

l'yr

iyr

50

55

60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

i?he

thr

: le

Ser

Arq

Aap

Aep

Ser

65

10

75

Lys

Asn

Tiu

Leu

Lyi

Leu

Gin

Met

A-faii

Ser

Leu

Al<j

Ala

Glu

Asp

aa

ÎS

90

rhr

Ala

VaI

Tyr

:yr

•'yn

Al A

Arg

Af p

r.nr

Arg

Phe

Ph r

Xm

Χ.1Λ

95

:·Μ

1 35

Xaa

Xaa

Xaa

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

-eu

Val

’Xhz

val

ser

i m

: lr>

120

Ser

121

RO 120848 Β1 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 5 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 111 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 5

Άβρ 1

lle

Gin

Leu Thr 5

Gin

ser Pro

Ala Ser 10

Leu

Ala

Val

ser

Leu 15

Gly

Gin

Arg

Ala

Thr

lle

Ser

Cya

Lye

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

20

25

30

e.yr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Ly«

Pro

Gly

35

40

45

Gin

Pro

Pro

lle

Leu

txeu

lle

Tyr

Ala

Ale

Ser

Tyr

Leu

Gly

Ser

50

55

60

Glu

lle

Pro

Al a

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Anp

Phe

63

70

75

Thr

Leu

Asn

lle

His

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Phe

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

95

100

135

Thr

Lys

Leu

Glu

lle

Lye

110 111 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 6 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 111 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: Secv. ID. nr. 6

Λ*ρ 1

ile

«Ir.

Leu

Thr 5

Pro

Ser 10

Leu

Ser

Ale

sotr

vel 15

Gly

Asp

Ara

Val

Thr

lle

ΊΗΓ

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Aap

7 0

75

30

Tyr

Asp

Gly

Ast>

Ser

Tyr

»sn

Tr p

Ty.

Gl n

G 1 n

T.ys

Pi n

Gly

40

45

Lys

Ala

Prc

Lys

Leu

Leu

lle

Tyr

Ala

Ala

Ser

Îyr

Leu

Ser

50

55

60

Gly

Vai

1’1 c

Sci

Arg

Phe

Set

Gly

Ser

Gly

Sar

Gly

Thi

Asp

phe

65

70

75

Thr

Thr

Un

înr

I.fîd

ol ΓΊ

Pro

CE

Asp

Thn

Λ l.i

Thr

Tyr

e o

B5

90

Tyr

Cyc

«Ir.

Gin

Ser

Hic

Glu

Ar.p

Pro

*?yr

Thr

ίΨιΛ

Gly

n

Gly

95

'.00

1 35

T!ir Ly = Val Glu I le Lya

110 111

RO 120848 Β1 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 71 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 111 aminoacizi3 (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: liniară5 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: Secv. ID. nr. 7

Aep Tle Gin 1

Het

Thr 5

Gin Set

Pto Ger

Set 10

Leu Ser

Ala Ser Val 1A

9

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Aap

29

25

30

11

11·

Ser

Xaa

Xaa

Ser

Tyr

Leii

Am

Trp Tyr

Gin

Gin

Ly«

Pro

Gly

35

40

45

13

Lys

Ala

Pro

Lya

Leu

Leu

11·

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Glu

Ser

59

55

eo

15

Gly

v«l

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

GLy

Thr

Aap

Phe

65

70

75

17

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

19

Tyr Cye

GLn

Gin

Tyr

Aen

Ser

Leu

Pr<>

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr Lys Val Glu Tle Lye

11« 111 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 8 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 114 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 8

Aep l

Ile

Gi n

Leu

Thr 5

C1 n

fer

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

£sr

Val 15

33

Gly

Aap

Arg

Val

Ihx 23

11«

Cys

Arg

Al« zb

i«r

-y·

Pre

Val

Aap 30

35

G.y

Glu

G r y

Aap

5«r J 5

Tyr

A«n

- rP

Tyr 40

Tir.

Gin

Lye

Tro

Gly 45

37

:.yi

Al *

Pi C

•ν'

L— 1

' -«1

1

Ty;

A la

A'i «

5 r* î

Tyr

L ’-ti

·. *: .)

;%#— i

bO

39

G.y

Vel

Pro

Ser

Arg

Ph*

5 *t

Sly

Gly

S*r

Sly

Thr

A*p

Ph*

«5

^0

75

41

Ti:

Le·-

Thr

Ile

5’·ί

3 in

ro

G. u

Ai>p

?t'.“

A La

Thr

Tyr

<1

43

ryr

_y£

-ilr.

jln

->«r i'i

.i 1«

Asp

Tyt ::a

rhr

Λ»

a ~ fi

45

Tur

. y»

Val

Glu

1 le

Akj

Thr

>’a_

l O

lî Λ

RO 120848 Β1 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 9 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 114 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 9

A»p 1

Tlw

Gin

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Sar

Val ÎS

Gly

Aap

Arg

val

Thr 20

£1·

Thr

Cyo

Arg

Ala 25

Ser

Gin

s«r

Val

Asp 30

Tyr

Asp

Gly

Acp

Ser 35

Tyr

Met

Αεη.

Trp

Tyr 40

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 4S

Lys

Ale

Pro

Lys

Leii so

Leu

lle

Tyr

Ala

Ala 55

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser ¢0

Gly

Val

Pro

Ser

Arg 6$

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly 70

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 75

Thr Leu

i Thr

lle

Sec δο

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu 85

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr 90

Tyr cy«

Gin

Gin

•Ser 95

Hlc

G1U

A«p

Pro

Tyr 100

Tbr

Gly Gin Gly 105

Thr Ly«

Val

Glu

11· 110

Lya

Arg

Thr

Val 114

(2) Informații pentru Secv. ID. nr. 10 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 114 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 10

Asp 1

11«

Gin

Leu

Thr Gin 5

Ser

Pro

Ser

Ser xa

Leu

Ser

Ala

Ser

val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr lle 20

Thr

Cye

Arg

Ala 2S

Ser

Gin

Ser

Val

Asp 30

Tyr

Anp

Gly

AJSp

Ser Tyr 3 5

r-fet.

Acn

Trp

Tyr <0

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 4 S

Lys

Ala

Pro

by*j

laCU 50

Ile

Tyr

Ala

Ala 55

Sex

Tyr

Leu

Glu

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arq Pha 65

Sc r

Gly

Ser

Gly 70

5Î r

Gly

Thr

Ar,p

Phe 75

Th v

Leu

Thr

I le

Ser uc

L-rn:

Gin

Fro

Clu GS

pl-e

ZkIjl

Thr

Tyr & G

Tyr

Gin

Gin

Ser His SS

Glu

Ακρ

Pro

Tyr 100

Thr

phe

Gly

GLn

Gly 105

Πιι

Lys

Val

Glu

lle Gye no

Arg

Thr

Val 114

RO 120848 Β1 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 11 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 114 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 11

Glu

V

el Gin :

Leu

Val

Glu

Ser

Gly G1

y Qly L·

au v

'al Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

s

Lou .

Ac g

Luii

Ser

Cys

Aia Va

1 δθί G

Ly Tyr

Sar

lle

Thr

20

25

30

Ser

Αβρ

lle

Gin

Leu

Thr

Gin

Cer

Pro

Ser

Ser

Leu

Cer

Ala

Ser

Val

1

5

10

15

Leu

aiy

A», μ

Axg

Val

Thr

11«

Tlll

Cy*

Ar q

Ala

8*1

a li.

3*1

Val

Abp

20

25

30

Aen

l

Tyr

Asp

Gly

Aep

Ser

Tyr

Met

ÂMll

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lye

Pro

Gly

35

40

45

Lys

J

Lya

Ala

Pro

Lya

Leu

Leu

11*

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Lau

Glu

Ser

50

55

60

Thi

1

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Aep

Phe

«5

70

7S

Trp

l

Thr

Leu

Thr

lle

Sar

Ser

Leu

Gin

Pro

Clu

Aep

Phe

Ala

Thr

lyr

so

05

90

Tyr

cya

Gin

Gin

Ser

Hi*

Glu

A*p

Pro

Tyr

Tht-

Ph*

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Tle

Lye

Arg

Thr

Val

110

114

(2) Informații pentru Secv. ID. nr. 12 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 114 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 12

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu

Val Gin

Pro

Gly 15

33

1

5

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu.

Ser

cye

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Sar

lle

Thr

35

20

25

10

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Aen

Trp

lle

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lya

Gly

37

J'j

•10

45

Leu

Glu

Tip

Val

Ala

Set

11c

Thr

Tyr

Αερ

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyt

39

50

55

Si

Asn

LJrc·

Ser

val

Lys

Gly

Arg

lle

Thr

lle

Ser

Arg

Asp

Aep

Ser

41

S5

70

75

Lyi.

AhiJ

Thr

PllH

Ty:

Lini

Glii

tteL

Ala II

3ot

Lwu

Ai g

Ala

•31.1

Ai.p

43

îl

B5

9C

Tht

Ala

Val

Tyr

Tyr

GyH

Ala

Arg

Gly

Set

His

Tyr

Phe

Gly

Hia

45

95

100

’ 05

Trp

Hia

Phe

Alo

Val 110

Trp

Gly

Gin

Gly 114

47

RO 120848 Β1 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 13 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 218 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 13

Aap 1

11« Gin Leu Thr 5

Gin Ser

Pro

6<r 6<r to

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

A»p

Arg

val

ThL'

II*

Thr

Cy·

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Aip

20

25

30

Tyt

Atp

Gly

ΛΚ»

Sar

Tyr

Mat

Λκη

Trp

Tyr

Gin

Gin

I.y*

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

«0

Gly

val

Pro

aer

Arg

Phe

ser

Gly

ser

Gly

ser

Gly

Thr

Aep

phe

«5

70

75

Thr

Leu

Thr

ile

5 or

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Aep

ILe

Ala

Thr

Tyr

80

«5

90

Tyr

Cyn

Cin

Cin

Ser

Hin

C lu

Asp

Pro

Tyr

Th Γ-

Plw

Gly

Cin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Va L

Glu

I le

Lya

Arg

Thr

Val

Ala

Αία

Pro

Spi

Val

Phe

110

1L5

120

Ile

Phe

Pro

Pro

5 ar

Asp

Glu

Gin

Leu

Lyo

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

125

130

135

val

val

cye

Leu

Leu

Aen

Aen

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

140

145

150

Gin

Trp

Lya

Val

Aap

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

155

160

165

Sec

Val

Thr

Glu

Sin

Asp

Ser

Lys

As p

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

1 70

175

iao

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lya

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lya

Hie

Lys

Val

190

195

Tyr

A Ia

Cya

GLu

Val

Thr

His

Gin

Cly

Leu

Ser

r

Pm

Va 1

Thr

200

205

210

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cyc

215

218

(2) Informații pentru Secv. ID. nr. 14 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 451 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 14

RO 120848 Β1

Glu 1

Val

Cin

I,4*u Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gin

Pro Gly 15

Gly

far

Iau

Ax 9

Iau 20

Am

Cy.

Ala

Val

5«r 25

aiy

Tyr

Sar

11«

Thr 30

3

Cer

Cly

Tyr

Ger

Trp 35

han

Trp

ILe

Arg

Gin 43

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 45

5

L«U

Gla

Trp

val

Ala r>a

car

11*

Thr

Tyr

Α·Ρ

Ql¥

ser

Thr

Α·η

Tyr ao

7

Ase

Pro

âei

Val

Lya fră

Oly

Aig

ILe

Tha

Ile 70

Sex

Axg

Aup

Aap

Sex 75

Lye

Ah ti

Thr

Phe

Tyr ftO

Leu

□ 1U

«*<.

Aen

tot AS

Leu

Arg

Ala

Glu

Aap Ί0

9

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr »3

Cye

Ala

Gly

sar 100

Kxc

Tyr

Pha>

Gly

Hia 105

11

Trp

lila

Phe

Ala

Val 110

Ixp

Gly

GLa

Gly

Thr 115

Leu

Val

Thr

V*L

Ser 120

13

fiar

Ala

λ<»[

Thr

Lyu 125

Gly

Pro

Sat

Val

Vha 133

Pro

Leu

Ala

Pro

Sar 135

s«r

uya

£ar

‘Ihar

Cas 1 40

Gly

cLy

The

Ala

Ala 145

L«U

Gly

aya

uau

Val 150

15

Lye

Aap

Tyr

Ptie

Pro 155

Glu

Pro

Val

Thr

Val 160

Ger

Trp

Aen

ter

Gly 145

17

*1«

Thr

sar

Gly 170

val

Hi*

Thr

Pha

Pts 175

Ala

Val

L*»u

G1T»

Sar 180

19

•fier

Gly

Leit

Tyr

fier m

I.em

Ser

Ser

Val

Va! 19)

Thr

Val

Pro

Swr

fier 135

fiw

ΪΑΜ1

Gly

Thr

Gin 200

Tht.

Tyr

TVa

Cyw

h*sn 205

Val

Ahh

Hla

T.yw

Pi o 210

21

5bi

Aan

The

Eya

Val 215

Aap

Lya

Ly*

Val

Glu 220

Pro

Lya

Ser

cy*

Asp 225

23

Lye

Thr

Hxn

Thr

Cys 230

Pro

Pro

Cys

Pro

al a 235

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly 240

25

Gly

Fio

Sar

Val

Fha 245

L«u

Phe

Pro

PiO

Ly» 250

Pro

Lya

Aep

The

Leu *55

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

□ lu

Val

Thr

Cys 265

Vel

Va 1

Val

Asp

Val 270

27

Sex

lila

Glu

Αί μ

Pic Z 75

Glu

val

Lye

Phe

Aha 2flJ

Txp

Tyr

Va!

Aep

Gly <•65

29

vei

Glu

Val

H la

AUU 2 ¢-3

Ala

Uy*

Thr

Lyo

Fr q

Arg

Glu

w 1 u

Gin

Tyr 330

31

As&

Sex

Thx

Tyr

Arg 3 0·»

Val

Val

Sex

Val

Leu 11 0

Thr

Val

Leu

Hxs

Glu 5

33

Aap

Trp

LftU

Αβη

Giy 320

vy»

Q1U

Tyr

uya

aya 325

Uya

Val

Sar

A«n

i.ys 310

Ala

Leu

Frc

Ala

Pro

11D

Tiu

Lya

Thr

11a 1-10

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly 345

35

Gin

*ro

Arq

Glu

?ro 3 50

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu J5>

Pro

Prî

Ser

Ar τ

Glu 3*0

37

'v-

Thr

I ya

A»n f <':'i

.,) r.

va..

-*r

Ι,ίΠ

!T. r 1 f ί

f

:.u>u

·’ Λ .

i.yt

»; i y 1 .· >

Ph e

tyr

hr o

fi*· r

Α”Ρ

i le

Al a

val

C,)n

lr-

..1.:

-.-r

ΛΚ1

‘-•*y

<J' π 3 40

39

PL-3

Jiu Asn

Asa

-yr

Lys

Thr

Thr

?r =

“ro

Val

Leu

Acp

Cer

Aap

fi 3

400

•13^

43

•η î

Ser Phv

The

Leu

Tyr

Ler

Jye

Leu

Thr

Va 1

.\sp

Lys

Cer

Arg

4 10

415

4 2-:

Trp

Gin Gin

dy

A^n

Val

Pha

s»r

Cy»

Sur

Vul

H*s

Ci u

Ala

45

<25

43'

1 3?

-VJ

dl« Aai«

Hi ί

Tyt 140

Tiu

‘21a

-ya

îcr

4 4t'

ϋ«4

M?U

Sat

£*i j

âly •toc

47

Lys

RO 120848 Β1 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 15 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 218 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 15

Aap 1

11«

cin

L-OU

Thr 5

Gin

cor

Pro

cer

COX’ 10

LOU

ser

Ala

SOL-

va] 13

Gly

Λ&ρ

Ar<j

Val

Thr

I le

Thr

Cye

Axg

Ala

Ser

Lyn

Pro

VaL

Aap

14

Gly

Glu

Gly

Aap

Ser

Tyr

Xet

Αβπ

Trp

lyr

Gin

Gin

Lye

Pro

Gly

35

40

45

i.yt

Ala

Pro

l-ye

Lou

Lou

lle

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

lou

Glu

Sar

50

55

6C

Gly

Val

Pro

for

Arg

Phe

fer

Gly

ier

Gly

Ser

Gly

Thr

Aep

Phe

65

70

75

Thr

L«u

Tbr

JlO

Sor

Set

Lou

Cin

Pro

CU

Aep

Phe

AU

Thr

Tyr

60

85

90

L’yr

Cye

Gin

Gin.

Sor

Ηίε

gLu

Atp

Prc

Tyr

Thr

l'ho

Gly

Gin

Gly

93

IOC

103

Thr

Ly«

Val

Ci u

11«

T.ya

Arg

Thr

Vai

Ala

AU

Pro

Ser

v«l

Phe

110

115

120

11 s

Fhe

Pro

Pro

ser

Asp

Glu

Gin

C«ru

Lye

Sar

Gly

Thr

Ala

Ser

iis

130

103

Val

Val

Cye

Leu

Leu

A an

Atn

Fise

Tyr

Pro

Ar «2

Glu

Ala

Lys

Val

140

145

150

<31 n

Ttp

Lye

Val

A6p

Aan

Ala

Gin

Ser

Gly

A an

Ser

Gin

Glu

155

160

165

5er

Va 1

Thr

SI u

Πίπ

Asp

Sar

Î.ye

Asp.

Se r

Thr

Tyr

Sar

Lau

Ser

170

175

:ao

ihr

Lsu

Titr

L«U

ier

Ly»

ala

A»p

lyr

ji-V

l?h

rlH

Lyu

val

105

190

195

Tyi

Ala

Cyu

Glu

Val

TI iv

«Ls

d η

Gly

Sat

Swr

PlD

Val

Thr

1W

3 5

«.'10

Lys

Ser

phr

Asn

Arg

Gly

Cri U

Cya

L 15

i i s

(2) Informații pentru Secv. ID. nr. 16 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 451 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: Secv. ID. nr. 16

RO 120848 Β1

Glu Vel 1

Gin Leu Val Glu 5

Ser Gly Gly Gly Leu 10

val Tyr

Gin Pro

Gly 15 Thr 10

3 5

Ser

lle

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu Sex 20

Cye

Ala

Val

Ser 25

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp 35

Asn

Tip

Ile

Arg

Gin 40

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 45

7

Leu

Glu

Trp

Val

Ala 50

Sex

11·

Thr

Tyr

Asp 55

Gly

Sar

Thr

Aen

Tyr 60

9

Asn

Pro

Set

Val

I.ya ¢5

Gly

Arg

Tle

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Aep

Asp

Ser 75

11

Lyu

At»n

Thr

Phe

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Aon

Ser 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Aap 90

13

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cya

Ala

Arg

Gly

Ser îoo

Hie

Tyr

Phe

Gly

111b 105

15

Trp

tlie

Phe

Ala

Val 110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 115

Leu

Val

Thr

Val

Ser 120

17

sar

Al Λ

Ser

Thr

Lys 1 25

Gly

Pro

hsr

val

PhA 1 30

Pro

han

Ala

Pro

,SAE 135

19

ser

Lys

Ser

Thr

Ser L-i 0

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala 145

Leu

Gly

Cye

Leu

Val 150

21

Ly·

A»p

Tyr

Phe

Pro 155

Glu

Pro

Val

Thr

Val 160

5»r

Trp

Asn

Ser

Gly 165

23

Ala

Leu

Thr

ser

Gly 170

val

Hi*

Thr

Phe

pro 175

Ala

val

Leu

Gin

Ser 100

25

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser 1 85

Leu

Ser

Ser

val

Val 190

Ttir

Val

Pro

Ser

Ser 195

27

ser

Leu

Gly

Thr

Gin 200

Thr

Tyr

Ile

cya

Aar> 205

Val

Aen.

lila

Lye

Pro 210

29

Ssr

Aen

Thr

Lys

Val 215

Αερ

Lys

Lyc

Val

Glu 220

Pro

Lyn

Ser

Cya

Aap 225

Lye

111L

Hie

Th ι-

Cys- 2 111

Pro

Pxo

Cye

Pro

ALa 2 <->

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly 2 40

31

< î 1 y

Pro

Ser

να 1

Phe 245

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys 253

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu 255

33

Mcî

Ile

Ser

Arg

Thr 260

Pro

Glu

Val

Thr

Cye 265

Val

Val

Val

Aop

Val 270

35

RO 120848 Β1

6ex

Hi» Glu

Aap Pro 275

Glu Val

Lye Phe

Aen Trp 280

Tyr Val Aep Gly 285

val

Cilu

Val

Hi·

Λ·η

Ala

Ly·

Thr

Ly·

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

290

295

300

Aan

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

I.ei i

Thr

Val

Leu

Hia

Gin

ias

310

31S

Aep

Trp

Leu

Auri

Gly

Lye

Glu

Tyr

Lya

Cye

Lye

Val

Ser

Aan

Lya

720

325

330

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lya

Thr

Ile

Ser

Ly·

Ala

Lya

Gly

335

340

345

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

350

355

360

Glu

Met

Thr

Ly·

Im

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cy»

Leu

V«1

Ly·

Gly

365

370

375

Fhe

Tyr

Pro

ser

Aap

Ile

Ala

val

G1U

Trp

GlU

ser

Asn

Gly

Gin

390

385

390

Pro

Glu

Aan

Aan

Tyr

Lya

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Aap

Ser

Aap

3 95

400

405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Ly»

Leu

Thr

Val

Asp

Ly»

Ser

Arg

410

415

420

Trp

Gin

Cin

Gly

A an

Val

Phe

Ser

Cye

Ser

Val

Met

rlia

Glu

Ala

425

430

4 35

Leu

llifi

Aen

Hi, Λ

Tyr

Thr

Gin

Lya

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

440

443

430

Lya

51 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 17 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 218 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 17

Aup 1

TI e

Gir.

T.eU

Thr 5

G1 n

Ser

Pro

Se r

Swr i J

Γ.Μ11

S«r

Ala

Ser

Va l 15

Gly

Λκρ

Ar g

VaJ.

Thr

Tle

Thr

Cye

Arg

ALe

Swr

I.ya

Prc

Va 1

Aa;>

20

25

3 0

Giy

Glu

Gly

Λκρ

Sur

Tyr

Met

Aan

Trp

7yr

Gin

Gin

y«

?r =

Giy

35

4 3

45

Lya

Ala

Pt L

Lyu

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Str

Tyr

Leu

GLu

£-_-r

50

55

6 0'

Gly

Val·

Ptc

Ser

Aiq

Phe

Sur

Gly

Ser

Cly

Si'i

Gly

Thr

Aup

Phe

65

r0

! 5

RO 120848 Β1

Thr

Thr

lle

fier 80

fier

Îi«u Gin

Pro Glu 85

Anp Ph«

Ala Thr

Tyr »0

3

Tyi·

Cyt>

Ol n

«111

Snr

Hi a

Glu

Anp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Oly

Gin

Gly

95

100

105

5

Thr

Lye

val

Glu

lle

Lye

Arg

Tnr

Val

Ala

Ala

pro

ser

val

Phe

1 1 0

1 15

120

7

11*

vho

Pro

Pro

6«

Aep

Glu

Gin

Leu

Lya

sar

Gly

Thr

Ala

Ser

1 25

130

135

Q

Val

Val

Cye

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

y

140

145

150

Gin

Trp

Lya

Val

Aap

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

11

155

160

165

Ser

Val

Thr

Glu

GLn

Aep

Ser

Lye

Aep

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

ser

13

170

175

100

Sec

îfcx

Leu

Thr

Leu

Sex

Lys

Ala

Asp

Tyx

Glu

Lys

Hia

Lya

Val

15

1S5

190

195

<Iyr

Ala

Cya

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Va 1

Thr

•1 7

200

205

210

Ί (

Lye

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cye

215

216

19

(2) Informații pentru Secv. ID. nr. 18 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 451 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 18

Glu 1

Val

Gin

Leu

Val E a

Glu

Ser

Gly Gly Gly Leu Val 10

Gin

Pro

Gly 15

31

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

vel

Ser

Gly

Tyr

Ser

ii·

Thr

33

20

25

39

Ser

Gly

rT*y ț*

Ser

Trp

Asn

Trp

lle

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

35

40

45

Leu

Gin

Trp

V.al

Al a

Ser

1 le

Lya

Tyr

Se ί-

Gly

Glu

Thr

Lys

ryr

37

ο □

6 9

Aer

Pro

fier

Val

Lye 6 b

Gly

Arq

lle

Thr

lle /0

Ser

Arq

Aap

Aep

ser 35

39

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Jln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Aep

41

8 0

E5

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cye

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

1C0

135

43

Trp

Itin

Phr-

Al a

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Tem.

Val

Thr

Va 1

Ser

ί IC

115

120

45

RO 120848 Β1

1

Ser

Ala

Ser

Thr

Lye

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

125

130

135

3

ser

Lye

ser

rrhr

ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

cya

Leu

val

140

145

150

5

T.ys

Aap

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Aen

Set

Gly

155

160

165

7

Aia

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

Hie

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

170

175

180

9

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

181

190

195

11

ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lle

cye

A«n

val

Aen

Hi»

Lye

Pro

200

205

210

13

Ser

Asn

Thr

Ly.

Val

Aep

Ly.

Lys

Val

Glu

Pro

Ly»

Ser

Cy»

Asp

215

220

225

15

Lye

Thr

Hie

Thr

Cya

Pre

Pro

Cye

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

233

235

240

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

17

245

250

255

Met

lle

Ser

Arg

Thr

Pre

Glu

Val

Thr

Cye

Val

Val

Val

Aep

Val

19

260

265

2 70

Ser

Mie

Glu

Aep

Pro

Glu

Val

Lye

Phe

Aen

Trp

Tyr

Val

Aap

Gly

21

275

280

285

Val

Glu

Val

His

Aen

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

23

293

295

300

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

305

3ia

315

25

Aip

Trp

Leu

Aen

Gly

Lye

Glu

Tyr

Lya

Cya

Lye

Val

5 ar

Aan

Lye

320

325

330

27

Ala

Lec

Pre

Ala

Pro

lle

Glu

Lye

Thr

Tle

Ser

i.ye

Z. la

Ly a

Gly

29

335

340

345

Gin

Pro

Axg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pi O

Pro

Sur

Arg

Glu

353

355

360

31

Glu

Met

Thr

I.yH

Aen

Gin

Val

Ser

Leu

Tht

Cya

Leu

Val

Lye

Gly

3b5

3 70

375

33

Pha

Tyr

Pro

Cor

A op

lle

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

393

365

390

35

Pro

Clu

Asn

Aen

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

?rc

Val

Lou

Ar.p

£er

Anp

395

4011

4 0 >

37

Gly

~er

Phe

Phe

leu

Tyr

ser

Lys

‘l'hr

7 nl

Aap

Lya

_-er

Ai-g

410

415

4 20

39

Trp

Gin

G In

Gly

• Asn

Vai

î'ho

Snr

C.yfl

Car

Vnl

Μ t.

3 i ti

Γ.1-.1

A! a

425

i jC

4 35

41

Lou

Hi 5

Asn

His

Iyr

Thr

Gin

Lyc

Sor

Lou

5cr

Lyj

5cr

?ro

• Gly

440

44 5

4 5fi

Lyv

451

RO 120848 Β1 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 19 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 218 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 19

Aep 1 Gly

Tle Gin Leu

Thr 5 •rnr 20

Gin 116

Ser Thr

Pro Ser

Ser io Aia 25

Leu ser

Ser Lya

Ala pre

Set vai

Val 15 Afip 30

9 11

A£p

Arg

val

cya

Arg

Gly

Glu

Gly

A«p

Sar 35

Tyr

Leu

Aen

Trp

Tyr 40

Gin

Gin

Ly·

Pro

Gly 43

13

Ly.

Ala

Pro

Ly»

Lsu 50

Leu

11*

Tyr

Ala

Ale 55

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser 60

15

Gly

Val

Pro

Sar

Arg 65

Pha

Sar

Gly

Sat

Gly 70

Sar

Gly

Thr

Acp

Pha 75

17

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser ao

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu 85

Anp

Phe

Ala

Thr

Tyr 90

19

Tyr

Cyo

Gin

Gin

Ser 95

Hi»

Glu

Aep

Pro

Tyr 100

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly 105

21

Thr

Lys

Val

Glu

11a 110

Lys

Arg

Thr

Val

Ala 115

Ala

Pro

Sar

Val

Phe 120

23

11«

Ph»

Pro

Pro

5«c 125

A«p

Glu

Gin

Leu

Lye 1 30

Ser

GLy

Thr

Ala

Ser 135

25

Val

Val

Cys

Leu

Leu 140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro 145

Arg

Glu

Ala

Lys

Val 150

27

Gin

Trp

Lys

Val

Acp 155

Ar>n

Ala

Leu

Gin

Ser 160

Gly

Aen

Sar

Gin

Glu 165

29

Ser

Val

Tiu

Glu

Gin 170

Aop

Ser

Lye

Asp

Ser 175

Ttir

Tyr

5er

Leu

Ser 1 BC

31

ser

Thr

Leu

Thr

Leu 135

Ser

Lye

Ala

Aap

Tyr 190

Glu

Lya

iile

Lys

Val 195

33

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val 200

Thr

Hie

Gin

Gly

Leu 205

Ser

Ser

Pre

Val

Thr 210

Lye Se- Phe Aaa Atg Gly Glu Cye 215 218	37
(2) Informații pentru Secv. ID. nr. 20	39
(i) Caracteristici de secvență:
(A) Lungime: 229 aminoacizi	41
(B) Tip: aminoacid
(D) Topologie: liniară	43

(xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 20

RO 120848 Β1

Clu Val Cin Leu Val

Glu Ger Gly

Gly

Gly Leu Val Cin 10

Pro

Gly 15

1

5

Gly

Ser

Leu Arg

Leu

Ser Cya

Ala

Val

Ser Gly Tyr

Ser

Ile Thr

20

25

JO

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Lou

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Thr

Tyr

Acp

Gly

Ser

Thr

Acn

Tyr

50

55

50

Afcu

Pto

3et

Val

Lya

Gly

Aty

Ile

Thl

Ile

3ol

Aig

Aep

Atp

Ser

65

70

75

Lye

Aen

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Aer.

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

90

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cya

Ala

Arg

Gly

Ser

llia

Tyr

Phe

Gly

Hla

95

100

105

Trp

Hia

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

Ser

Ala

Set

Thr

Lyt>

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

125

130

135

Ser

Ly.

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

L«U

Gly

Cy*

Leu

Val

140

145

150

Lys

Asp Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Aon

Sec

Gly

155

160

165

Ala

Leu

Thr

cer

Gly

Val

Hia

Jhr

Phe

Pr«

Λ1*

Val

Leu

vin

sar

170

175

130

ser

Gly

l-eu

Tyr

ser

Leu

ser

ser

val

val

Thr

Val

Pro

ser

Ser

195

190

195

Ser

Leu

GLy

Tbr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

H1b

Lye

Pro

200

205

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lye

Ser

Cys

Asp

215

220

225

Lys Thr His Thr

229 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 21 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 229 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 21

100

RO 120848 Β1

Glu

Val

Cin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

3

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Ar g

Leu

Ser

Cye

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

lle

Thr

5

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Se ι-

Trp

Aen

Trp

Tle

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

7

35

40

45

Leu

Glu

Trp

να 1

Ala

Set

lle

Lye

Tyr

Ser

Gly

Glu

Thr

Lys

Tyr

9

50

55

60

11

Aer.

Pro

Ser

Val

Lye

Gly

Arg

lle

Thr

lle

Ser

Arg

Aap

Aap

Ser

65

70

75

13

A*n

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

M*t

Ath

S»r

L*U

Arg

Ala

G1U

Aep

ao

85

90

15

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cye

Ala

Arg

Gly

Ser

HI a

Tyr

Phe

Gly

Hi«

95

100

105

17

Trp

Hle

Phe

Ala

val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

val

Thr

val

Ser

110

115

120

19

Ser

Ala

Ser

Thr

Lya

Gly

Pro

ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

125

130

135

21

Ser

Lye

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

AU

Ala

Leu

Gly

Cye

Leu

Val

140

145

150

23

Lya

Aap

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

A an

Ser

Gly

1 55

160

165

25

Aia

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

Hîb

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

170

173

180

27

Sar

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

29

185

190

195

Sar

Leu

Gly

Thr

Cin

Thr

Tyr

Ilw

Cys

Amu

Val

Abil

Hia

Lya

Pro

Q4

200

205

210

Ol

Ser

Αβπ

Thr

Lys

Val

Asp

Lya

Ly®

Val

Glu

Pro

Ly®

Sar

Cyo

Aep

33

215 220 22S

Lya îhî Hie Thr 35

229 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 22 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 248 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 22

101

RO 120848 Β1

Glu Val 1

Gin Leu Val 5

Glu

Ser Gly Gly Gly 10

Leu

Val

Gin

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Val

Ser 25

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr 30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp 35

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin 40

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 45

I.nu

Glu

Trp

Va 1

Ala 50

Set

I le

Thr

Tyr

Ar.p 55

Gly

Sni

Tht

Ann

Tyr 60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys «5

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser 75

Lys

A»r.

Thr

Phe

Tyr Θ0

Leu

Gin

Met

Asn

Car 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser 100

His

Tyr

Phe

Gly

His 105

Trp

Hi b

Phe

Al a

Val 110

Trp

Gly

Gin

G1y

Thr 115

Leu

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Glu

Gly

Gly

Gly 125

Ser

Glu

Gly

Gly

Gly 130

Ser

Glu

Gly

Gly

Gly 135

Ser

Aep

Ile

Gin

Leu 140

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser 145

Ser

Lau

Sex

Ala

Ser 150

Val

Gly

Asp

Arg

Val 155

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg 180

Ala

Ser

Lys

Pro

Val 165

Asp

Gly

Glu

Gly

Aep 170

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp 175

Tyr

Gin

Gin

Lya

Pro ISC

Gly

Lya

Ale

Pro

Lyo 185

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala 190

Ala

Ser

Tyr

teu

Glu 195

Gly

val

Pro

Ser 200

Arg

Phe

ser

Gly

Ser 205

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 210

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 215

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro 220

Glu

Aap

Phe

Ala

Thr 225

Tyu

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Hn

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

230 235 240

Gly Thr Lya Val Glu Ile Lys Arg

245 248 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 23 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 248 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 23

G ί n

1

Cin

T.en

Va 1

C lt<

Ser

Cly

Cly

C.ty

T..«wi i

Va 1

Clr>

n-n

1

5

10

1 5

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

cy«

Al Λ

Va 1

Ser

Gly

Tyr

Ser

I le

Th r

20

25

3 0

Sex

Gly

Tyr

Ser

Txp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Sly

.15

40

4 r>

102

RO 120848 Β1

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

’Ty r

Ser

Gly

Glu

Thr

Lye

Tyr

1

50

55

60

o

Aen

Pro

Ser

Val

Lye

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Aep

Aep

Ser

ς

es

70

75

u

Lye

Aen

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Aen

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

7

80

85

90

/

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

Mie

Tyr

Phe

Gly

Hie

g

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Cin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

11

110

115

120

Ser

Glu

Gly

Gly

Gly

Ser

Glu

Gly

Gly

Gly

ser

Glu

Gly

Gly

Gly

13

125

130

135

Ser

Asp

Ile

Gin

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

15

140

145

150

Val

Gly

A ap

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

LyB

Pro

Val

17

15b

160

165

Asp

Gly

Glu

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Fro

19

170

175

180

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

21

185

190

195

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

23

200

205

210

Phe

Thr

Leu

Thr

ile

Ser

ser

Leu

Gin

pro

Glu

Aep

Phe

Ala

Thr

25

215

220

225

Tyr

Tyr

Cye

Gin

Gin

Ser

H1b

Glii

Λκρ

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

27

230

235

240

Gly

Thr

Lye

Val

Glu

Ile

Lya

Arg

29

245

248

(2) Informații pentru Secv. ID. nr. 24 (i) Caracteristici de secvență:35 (A) Lungime: 218 aminoacizi (B) Tip: aminoacid37 (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 2439

103

RO 120848 Β1

Aep 1

Ile

Gin

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Aap

Arg

Va 1

Tiu

Tle

Tiu

Cye

Arg

Ala

Set

Lyn

Pi o

Val

Asp

20

25

30

Gly

Glu.

Gly

Aep

Sar

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lya

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ăla

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ăla

Ăla

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Set

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Aep

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

GLn

Pro

Glu

Aep

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

SO

Tyr

Cye

Gin

Gin

Ser

Hi»

Glu

Aop

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lye

Val

GLu

Tle

Lye

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

L1 0

115

120

He

phe

Pro

Pro

ser

Aflp

Glu

Gin

Leu

Lye

ser

Gly

Thr

Ala

ser

125

130

135

Val

Val

Cye

Leu

Leu

Asn

Afin

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lye

Vai

140

145

150

Gin

Trp

Lya

Val

Λ ap

Acn

Aia

L.*U

Gin

ânr

Gly

Aen

cer

Cin

cilu

155

160

165

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Aep

Ser

Ly»

A»p

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

6er

170

175

1BO

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Ly»

Ala

A»p

Tyr

Glu

Ly»

Mi»

Ly»

Val

135

190

195

Tyr

Ala

Cy*

Glu

Vel

Thi

Hi»

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Va 1

Thr

200

2Q5

210

Lys

Ser

Phe

Arg

Gly

Glu

Cya

215

218

(2) Informații pentru Secv. ID. nr. 25 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 151 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 25

104

RO 120848 Β1

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

4

l

5

10

15

1

Gly

Sar

Lau

Arg

Lau

S«t

Cye

Ale

Val

Ser

Gly

Tyr

Sat

lle

Thr

20

25

30

3

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

A»n

Trp

lle

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lya

Gly

35

40

45

5

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

lle

Thr

Tyr

Aep

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

50

55

60

7

Aen

pro

ser

val

Lya

Gly

Arg

lle

Thr

lle

ser

Arg

Aep

Αβρ

ser

65

70

75

9

Lya

Aer.

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Aen

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Aap

80

85

90

11

Thr

Al Λ

Val

Tyr

Tyr

Cye

Ala

Arg

Gl y

ser

Hi h

Tyr

Phe

<;ly

Hi fi

95

100

105

13

Trp

Hie

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

US

120

ser

Ala

ser

rhr

Lye

Gly

pro

set

val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

ser

15

125

130

135

Sar

Lya

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cye

Leu

Val

17

14U

145

150

Lyo

Aep

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Aer

Trp

Aen

Ser

Gly

19

155

160

165

Alo Leu Thr

Ser

Gly

Val

ti ie

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu Gin Ser

21

170

175

100

Ser Gly Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Vel

Vel

Thr

Val

Pro Ser Ser

23

185

190

195

Set Leu Gly

nu

□ lu

Tiu

Tyr

lle

Cy«.

Atu

Val

Atu

Mia Lys Piu

25

200

205

210

Ser Aan Thr

Lye

Val

Asp

Lye

Lye

Val

Glu

Pro

I.yfi

Ser Cy:

3 Asp

27

215

220

225

Lye Thr 1

£ie

Thr

Cya

Pro

Pro

Cya

29

230 233 (2) Informații pentru Secv. ID. nr. 26 (i) Caracteristici de secvență:

(A) Lungime: 233 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (D) Topologie: liniară (xi) Descriere secvență: Secv. ID. nr. 26

G lu 1

Vei!

Cin

LrC'J

Val 5

Glu

Ser

<;ly

Cly

Gly 13

L^u

Vel

G In

i’ro

<;ly 15

Gly

S«r

Arq

L««u

Ser

Cys

Ala

Val

5«r

Gly

Tyr

Sur

11«

Thr

75

IC

Smr

Gly

Tyr

â«r

Ti?

Ακη

Trp

11«

Arg

Gin

Ai ft

Fro

□ ly

:.y<

Gly

33

13

13

Glu

~rp

Vrt 1

Ah

g* r

71“

Lys

Tyr

Ge-r

Gly

G lu

Thr

r.y-j

Tyr

53

55

SC

Aen

Pro

Val

Lys

Gly

Arg

lle

Thr

lle

Ser

Arg

Aep

Aep

S«c

65

73

75

Lye

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin.

Mei:

Asn

Ser

Leu

Arq

Ala

Glu

Aep

aa

85

9 0

105

RO 120848 Β1

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cye Ala Arq

Gly Ser Hie 100

Tyr Phe

Gly

Hie 105

Trp

lila

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Iau

Val

Thr

Val

Ser

1 10

115

120

Cor

Ala

Car

Thr

Lye

Gly

Pro

Sar

Val

Phe

Pro

Lou

Ala

Pro

Cer

125

130

135

Sex

Lye

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cye

Leu

Val

140

145

150

Lys

Asp

Tyr

Phe

MO

Glu

Pro

vel

Thr

Val

ser

Trp

Aan

ser

Gly

155

160

165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

Hie

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

170

175

180

Ser

Cly

Leu

Tyr

Ser

Leu

fier

Ser

Val

Val

Tlir

Val

P ro

Ser

fier

185

190

195

Ser

Leu

GLy

Thr

Gin

Thr

Tyr

lle

Cyc

Asn

Val

Aan

Hin

Lye

Pro

200

205

210

Ser

Acn

Thr

Lyc

vel

Λκρ

Ly<

Lye

Vâl

Glu

Pro

Lyt

Ser

Cy«

Asp

215

220

225

Ly*

Thr

Hi*

Thr

Cys

PlO

Pro

cys

30 233

Claims (17)

1. Revendicări

   1. Procedeu de preparare a unei polipeptide modificate, care este un anticorp anti-lgE care nu prezintă activitate de dezactivare, prin izomerizarea resturilor aspartil, și care are afinitate pentru o moleculă țintă, reprezentată de IgE, egală sau mai mare față de polipeptida nemodificată, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde următoarele etape:

   a) identificarea resturilor de aspartil, predispuse la izomerizare,

   b) substituția cu resturi alternative și selecția mutantelor rezultate, pe baza afinității pentru molecula țintă, prin maturizarea afinității, utilizând prezentarea la nivelul fagilor, acest procedeu cuprinzând, în mod suplimentar:

   i) substituția, deleția sau inserția unuia sau mai multor codoni în structura genei care codifică polipeptida, ceea ce determină o modificare a secvenței de aminoacizi a polipeptidei, preparându-se astfel o bibliotecă de polipeptide cu structură înrudită, fuzionate la o proteină a învelișului fagului, ii) prezentarea unei singure copii din fiecare polipeptidă înrudită la suprafața particulei de fagemid care conține ADN-ul care codifică polipeptida respectivă, și

   c) selecția peptidelor modificate, în care s-a înlocuit un rest aspartil, și care au o afinitate pentru molecula țintă, egală sau mai mare decât peptidă nemodificată.
2. 2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că anticorpul nemodificat are secvența denumită Έ25 din fig. 12 (Secv. ID. nr. 13 - 14).
3. 3. Procedeu conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că resturile substituite sunt Asp32Glu, Gln27Lys și Ser28Pro, de la nivelul regiunii variabile CDR1 a lanțului ușor.
4. 4. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că resturile substituite, în mod suplimentar, sunt resturile Thr53Lys, Asp55Ser, Ser57Glu și Asn59Lys, de la nivelul regiunii variabile CDR2 a lanțului greu.
5. 5. Moleculă de anticorp, caracterizată prin aceea că are o secvență a lanțului ușor și o secvență a lanțului greu, care prezintă o identitate a secvenței de cel puțin 70% cu secvența lanțului ușor și cu secvența lanțului greu e26 din fig. 13 (Secv. ID. nr. 19 și 20) și care conține resturile 32 Glu, 27 Lys și 28 Pro ale regiunii variabile CDR1 a lanțului ușor.

   106

   RO 120848 Β1
6. 6. Moleculă de anticorp, conform revendicării 5, caracterizată prin aceea că are1 proprietăți îmbunătățite de inhibare a eliberării de histamină indusă de rugină.
7. 7. Moleculă de anticorp, conform revendicării 5, caracterizată prin aceea că aceasta3 conține o secvență e26, selectată din grupul format din: fragment F(ab) (Secv. ID. nr. 19-20), fragment sFv (Secv. ID. nr. 22), F(ab)'₂ (Secv. ID. nr. 24-25) sau secvența e26 din fig. 125 (Secv. ID. nr. 15 și 16).
8. 8. Moleculă de anticorp, conform revendicării 5, caracterizată prin aceea că are o7 secvență a lanțului ușor și o secvență a lanțului greu, care prezintă o identitate a secvenței de cel puțin 70% cu secvența lanțului ușor și cu secvența lanțului greu e26 din fig. 139 (Secv. ID. nr. 19 și 21) și care conține resturile 32 Glu, 27 Lys și 28 Pro ale regiunii variabile CDR1 a lanțului ușor.11
9. 9. Moleculă de anticorp, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că aceasta conține o secvență e27, selectată din grupul format din: fragment F(ab) (Secv. ID. nr. 19-21),13 fragment sFv (Secv. ID. nr. 23), F(ab)’₂ (Secv. ID. nr. 24-26) sau secvența e27 din fig. 12 (Secv. ID. nr. 17 și 18).15
10. 10. Moleculă de acid nucleic, care are o secvență care prezintă o identitate de secvență de cel puțin 85%, cu o secvență care codifică e26 din fig. 13 (Secv. ID. nr. 1917 și 21), caracterizată prin aceea că aceasta codifică o moleculă de anticorp care conține resturile 32 Glu, 27 Lys și 28 Pro ale regiunii variabile CDR1 a lanțului ușor.19
11. 11. Moleculă de acid nucleic, conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că are o secvență care codifică un fragment de anticorp e26, selectat din grupul format din:21

    F(ab) (Secv. ID. nr. 19 și 20), sFv (Secv. ID. nr. 22), F(ab)'₂ (Secv. ID. nr. 24-25) sau secvența e26 din fig. 12 (Secv. ID. nr. 15 și 16).23
12. 12. Moleculă de acid nucleic, care prezintă o identitate de secvență de cel puțin 85%, cu o secvență care codifică e27 din fig. 13 (Secv. ID. nr. 19 și 21), caracterizată prin 25 aceea că molecula respectivă de acid nucleic codifică o moleculă de anticorp care conține resturile 32 Glu, 27 Lys și 28 Pro ale regiunii variabile CDR1 a lanțului ușor. 27
13. 13. Moleculă de acid nucleic, conform revendicării 12, caracterizată prin aceea că are o secvență care codifică un fragment de anticorp e27, selectat din grupul format din: 29

    F(ab) (Secv. ID. nr. 19 și 21), sFv (Secv. ID. nr. 23) sau F(ab)'₂ (Secv. ID. nr. 24 și 26) sau secvența e27 din fig. 12 (Secv. ID. nr. 17 și 18). 31
14. 14. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde mole- cula de anticorp, definită în oricare dintre revendicările 5...9, în amestec cu excipient(ți) 33 acceptabil(i) din punct de vedere farmaceutic.
15. 15. Compoziție farmaceutică, utilă în tratarea unei afecțiuni mediate de IgE, care 35 cuprinde un anticorp definit în oricare din revendicările 5...9.
16. 16. Utilizare a unei molecule de anticorp, definită în oricare din revendicările 5...9,37 pentru fabricarea unui medicament pentru reducerea sau prevenirea producției de histamină mediată de IgE, la un mamifer.39
17. 17. Utilizare a unei molecule de anticorp, definită în oricare din revendicările 5...9, pentru fabricarea unui medicament util pentru tratarea unei afecțiuni mediate de IgE.41