TWI233946B

TWI233946B - Improved anti-IgE antibodies and method of improving antibodies and compositions containing the improved anti-IgE antibodies

Info

Publication number: TWI233946B
Application number: TW087110696A
Authority: TW
Inventors: Henry B Lowman; Leonard G Presta; Paula M Jardieu; John Lowe
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-07-02
Filing date: 1998-07-02
Publication date: 2005-06-11
Also published as: BRPI9810654C1; WO1999001556A3; IL133973A; EP0996728A2; PT996728E; KR20010014422A; NO996551L; CN1268176A; JP2009055902A; CA2295540A1; HUP0002474A3; EP0996728B1; CZ300724B6; BR9810654B8; AR060038A2; HK1027833A1; BR9810654B1; US20030149244A1; CN1260357C; TW570976B

Description

1233946 A7 B7 經淖部中#'摞準局消贽合竹私印來五、發明説明（1 發明背景本發明係關於免疫球蛋白E (IgE)、IgE拮抗劑、能夠與人類IgE結合之抗-IgE抗體，以及改良多肽的方法，包括抗-IgE抗體。

IgE爲免疫球蛋白家族的成員，其調節諸如氣喘、食物過敏、第1型過敏之類的過敏反應，以及廣泛罹患之普通的竇狀炎症。IgE係由B-細胞或B_淋巴球分泌，並在表面上表現。IgE經由其F c區與B-細胞（還有單核球、嗜伊紅性球和血小板）之低親和力的IgE受體結合，已知。當哺乳動物暴露在過敏原下時，帶有與表面結合、對該抗原有專一性之IgE抗體的B-細胞被，’激活，，，而發展成分泌_ IgE的漿細胞。然後所得的過敏原·專一性通過血流循環，並通過高親和力之受體，亦已知爲FceRI，在組織中與肥大細胞的表面結合，並在血液中與嗜鹼性球結合。藉此使肥大細胞和嗜鹼性球變成對該過敏原敏感化的。該過敏原的後續暴露引起嗜鹼性球與肥大細胞iFceRi的交聯作用，其導致組織胺、白三晞素和血小板激活因子、嗜伊紅性球和嗜中性球之趨化因子，以及細胞分裂素il_3、 IL-4、IL-5和GM-CSF的釋放，它們成爲臨床過敏性和過敏性反應的原因。病理學狀況過敏性的特徵爲對過敏原（群）的過量免疫反應，如果該過敏原出現相當大量，或如果體液和心：疫狀態是在昇高的程度，則產生顯著的組織變化。在過敏性反應中的生理學變化，可白了匕括肺臟細支氣管和本紙張尺度剌巾酬家鱗（CNS)A4im ( 210x1^^7 ITAw~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1233946 B7 五、發明説明（2 ) 支氣管的強烈緊縮、平滑肌收縮和毛細血管的擴張。然而，該狀,況傾向於似乎是因爲遺傳和環境因素之間的交互作用所致。在花粉、食物、房屋塵蜗、動物皮屑、眞菌孢子和昆蟲毒液中找到引起過敏性反應的普通環境過敏原。將異位性過敏與過敏性反應聯想在一起，並包括例如氣喘、過敏性鼻炎和結膜炎（乾草熱）、濕疹、蓴麻疹和食物過敏的疾病。然而，過敏性休克、危及生命狀況的過敏反應，通常是由昆蟲螫刺或非經腸之藥物所引起的。目前已經從事第1型過敏性或過敏反應的治療策略，企圖阻斷IgE與在嗜鹼性球和肥大細胞上發現之高親和力受體（Fc ε RI)的結合，並藉此防止組織胺和其他產生病理學狀況之過敏性因子的釋放。在3月4日發表之W0 93/04173，描述了人類IgE/IgGl嵌合體，其中IgGl殘基被同類的IgE殘基所取代。申請者同在申請中的申請案USSN 08/405,617，描述人類化之抗-IgE 抗體，其中使用直接對抗人類IgE的老鼠抗體（MaEll )來提供CDR區，其被取代而成爲IgGl免疫球蛋白骨架 (rhuMaE25 )。人類化作用的技術，描述於Reichman，L.等人，（1988) Nature 332: 323，和 Jones，Ρ·Τ·等人，（1986) Nature 321: 522 中 0 當已經建立老鼠抗體之人類化作用，以便提供抗-IgE分子，其提供與老鼠MaEl 1同樣的親加力，但沒有由後者謗發之免疫原反應（Shields 人，（1995) Int. Arch. Allergy Immunol. 107: 308-312 )時，仍然不能產生帶有IgE之親和 -5- 本紙張尺度適用中國國家標蜂(CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） --------#! (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經淖部中决掠卑局貝X消贽合竹社印來經Μ部中决標準局工消合竹社印¥ 1233946 ^ A7 B7 -------~_________________ 五、發明説明（4 ) 的研究，顯示藉著以丙胺酸或穀胺酸取代殘基VL32，可減少同分異構化之事件，該取代作用本身導致結合作用減少三倍。Cacia等人，在前。因此，極爲需要創造出改良之多肽，包括抗體，其不僅未顯示天冬胺醯基同分異構作用的”失活”事件，還顯示出相當於或超過未改良之多肽親和力的對標靶分子（例如抗原）之親和力。發明概述本發明係關於籍著下列步驟之組合，來改良對標革巴分子具有親和力之多肽的方法：（1 )確認有同分異構化傾向的天冬胺醯基殘基；（2 )任選殘基的取代作用，並就對抗該革巴分子之親和力來師選所得的突變種。在較佳的具體實施例中，取代殘基的方法爲親和力爲利用噬菌體表現的親和力突變（AMPD)。在更佳的具體實施例中，該多肽爲抗體且該標靶分子爲抗原。在更佳的具體實施例中，該抗體爲抗-IgE且該標雜分子爲IgE。在更佳的具體實施例中’本發明係關於藉著以Giu來置換VL_CDR_L1殘基32Asp，連同分別將VL CDR-L1殘基27 Gin、28 Ser和3 1 Tyr修改成Lys、Pro和Gly，來改良抗_

IgE抗體E-25的方法。在更佳的具體實施例中，該E_25抗_ IgE抗體在殘基VH CDR2處具有額外的修改：53 Thr改成

Lys ’ 55 Asp 改成 Ser ’ 57 Ser 改成 Glu，和 59 Asn 改成

Lys 0 在其他的具體實施例中，本發明係關於具有對igE之改本紙張人度適用中國國象標準（（、NS ) Λ4規格（21 Ox 29*7公着）訂------~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 A7 ______________ B7 _ 五、發明説明（11 ) 酸化作用）。特別企圖將抗體包括在該定義的範圍内。本發明之多肽可包括一個以上的亞單元，其中每個亞單元是由個別的DNA序列來編碼的。關於抗體多肽序列之”大體上相同的”片語，將可解釋成顯示出至少70%，較佳的是80%，更佳的是90%，而最佳的是95%的序列，與所提及之多肽序列相同的抗體。與核酸序列有關之名詞，將可解釋成顯示出至少大約85%，較佳的是90%，更佳的是95%，而最佳的是97%的序列，與所提及之核酸序列相同的核甞酸序列。就多肽而言，比較序列的長度通常將是至少25個胺基酸。就核酸而言，長度通常將是至少75個核甞酸。 ’’同一性••或"同種性” 一詞，應解釋爲在候選者序列中之胺基酸殘基的百分比，與進行比較之相對應序列的殘基相同，如果需要就完整序列達到最大的同一性百分比，且不將任何保留性置換視爲序列同一性的一部份，在使該序列排成一直線並導入缺口之後再進行比較。沒有N_或c_終端的延伸也沒有插入作用，將被解釋爲減少同一性或同種性。排列成一直線的方法和電腦程式是此項技藝中已熟知的。可利用序列分析軟體（例如Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave.? Madison, WI 53 705 )來測定序列同一性。該軟體藉著指、定有關各種取代、刪除和其他修改之同種性的程度，找到與類似序列相配的東西。 -14- 本纸張尺度ill财關料_ ( CNS ) Λ4規格（210X297公釐)— '~~— ----------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 A7 B7 五 1233946 、發明説明（12 ) 以最廣泛的意義來使用"抗體"一詞，牿| ^ w別涵盍单株抗體 (匕括全長的單株抗體）、多株抗體、多重專一性之抗髀 (例如兩種專一性之抗體）和抗體片段（例如Fab、F(ab^=

Fv)，只要它們顯示出想要的生物活性。抗體（Abs)和2免硬球蛋白（Igs)是具有相同結構特徵的糖蛋白。抗體顯^ 出對固定抗原的結合專一性，而免疫球蛋白包括抗體和其他類似抗體但缺少抗原專一性的分子。例如，屬於後者的多月太由淋巴系統以低量產生，並藉著骨髓細胞瘤增加其含量〇天然的抗體和免疫球蛋白通常是具有大約15〇,〇〇〇道爾呑的異四聚體的（heterotetrameric)糖蛋白，由兩個相同的輕（L )鏈和兩個相同的重（η )鏈所構成。每個輕鏈分別藉著一個共價二硫鍵與重鏈連接，二硫鍵連接的數目在不同免疫球蛋白同型物的重鏈一間有所改變。每個重和輕鏈亦以鏈内二硫橋適當地隔開。每個重鏈在一末端具有一個可變功能郅位（V Η )，隨後是一些恒定的功能部位。每個輕鏈在一末端具有一個可變功能部份（V L )，而恒定功能部位在其另一端。輕鏈的恒定功能部位與重鏈的第一個恒定功能部位一致，且輕鏈的可變功能部位與重鏈之可變功能部位一致。咸相信在輕鏈和重鏈的可變功能部位之間有特定的胺基酸殘基形成介面（Clothia等人，J. Mol. Biol. 1Μ，

651-66，（1985); Novotny 和 Haber，Proc. Natl. Acad· Sci. USA il，4592-4596 (1985))。 ••分離"抗體爲一種已經確認出，並從產生其之環境的成 -15 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 訂 f A7 1233946 五、發明説明（13 ) 份中分離及/或回收的抗體。其產生環境之污染成份爲將會干擾該’抗體之珍斷或治療用途的物質，並可包括酵素、荷爾蒙及其他蛋白質的或非蛋白質的溶質。在較佳的具體實施例中，該抗體將藉著至少三種不同的方法，以可測定之方式純化：1 )藉著洛里（Lowry )法定出大於9 5重量％的抗體，最好是大於99重量％ ; 2)足以藉著使用自旋杯順序分析儀獲得至少1 5個N·終端或内部胺基酸序列之殘基的私度；或3 )藉著SDS-PAGE在還原或非還原的條件下’使用考馬斯（Coomasie)藍或較佳的鍍銀染色，成爲均一性。分離抗體包括在重組細胞中就地的抗體，因爲該抗體之天然裱境中的至少一種成份將不出現。然而，分離抗體通常將藉著至少一個純化步驟來製備之。物種-依賴性抗體"，例如哺乳動物抗_人類IgE抗體，是對於得自第一個哺乳動物物種之抗原，比得自第二個哺乳動物物種之抗原的同系物，具有更強之結合親和力的抗通#物種-依賴性抗體"專一性地結合”人類抗原（也就疋具有不起過大約1 x 1 〇 7 M，較佳的是不超過大約1 X ^ g Μ :而最佳的是不超過1Χ 1(Γ9Μ的結合親和力（Kd)値），但疋對於知自第二種非_人類之哺乳動物物種的抗原同系物，具有比其對於人類抗原之結合親和力，弱至少大約 5 0L，或至少大約500倍，或至少大約1〇⑻倍的結合親和力。物種·依賴性抗體可以是任何如同上文'定義之各種類型的抗體，但最好是人類化或人類的抗體。抗敝大交種” 一詞意指其中一或多個胺基酸殘基已經經 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ΦΙ. M湞部中次標準局负J·-消費含竹社印¥ ^漬部中次#準局貞,τ消资合竹社印¥ 1233946 A7 B7五、發明説明（Μ ) 過修改之抗體的胺基酸序列變種。這類突變種當然與具有與該抗體之重或輕鍵可變功能邵位之胺基酸序列有至少 7 5 %胺基酸序列同一性或類似物，較佳的是至少8 0 %，更佳的是至少85%，再佳的是至少90%，而最佳的是至少 95%之胺基酸序列，有低於100%的序列同一性或類似性。因此本發明之方法同等地應用多肽、抗體及其片段兩者，這些名詞有時可交互使用。在抗體之可變功能部位的上下文關聯中，”可變的”一詞意指在該抗體内的序列中，可變功能部位的某些部份有極大的差異，並使用在每個特定抗體與其特定抗原的結合和專一性上。然而，可變性並不是平均地分布在整個抗體的可變功能部位上。它集中在叫做互補決定區（CDRs )，亦稱爲高可變區的三個斷片上，其係在輕鏈和重鏈的可變功能部位上。至少有兩種技術可檢測CDRs ;( 1 )以交叉-物種序列可變性爲基礎的方法（也就是Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institute of Health，Bethesda，MD 1987);以及以抗原·抗體複合物之結晶學研究爲基礎的方法（Chothia，C·等人，（1989)，Nature 342: 877 )。關於申請者的抗-IgE抗體，藉著混合Kabat等人和Chothia等人的方法定義出了某些CDRs。可變功能部位中高度保存的邵份被稱爲骨架（FR)。天然重和輕鏈的可變功能部位分別由四個F R構成，大部份採用卢_板之構型，藉著三個形成環連接的CDRs連接，且在一些案例中形成一部份;5 -板的結構。在每個鏈中藉著F R區將CDRs與 -17- 國家標率（( 2^97公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 訂 :¾¾•部中决掠卑局兵工消贽合竹社印¥ 1233946 A7 *—〜_________ B7 五、發明説明（15 ) 知自其他鏈的CDRs非常接近地支持在一起，促成抗體之抗原結舍部位的形成（參見Kabat等人）。恒定功能部位未直接涉及及抗體對抗原的結合，但顯示各種效應的功能，像是抗體參與抗體-依賴性的細胞毒素。抗體片段•’一詞意指全長抗體的一部份，通常是抗原結合或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab，、？(讣，)2和 F v片段。以木瓜酵素消化抗體，產生兩個相同的抗原結合片段’稱爲Fab片段，分別帶有單一的抗原結合位置，剩下的”Fc”片段，因爲其易於結晶的能力而如此稱呼之。以胃蛋白酶處理產生F(ab，)2片段，其具有兩個抗原結合片段，能夠與抗原交聯，並剩下另一個片段（命名爲pFc，）。其他的片段可包括由抗體片段形成的中間抗體 (diabodies)、直線抗體、單鏈的抗體分子和多重專一性的抗體。當在本文中使用，，功能片段，，時，係關於F v、F(ab) 和 F(ab’)2 0 ”Fv”片段是最小的抗體片段，其含有完整的抗原辨認和結合位置。該區域由一個重鏈和一個輕鏈可變功能部位的二聚體，以緊密、非·共價的聯合所構成（Vh_Vl二聚體）。在該構型中，各個可變功能部位的三個Cdrs交互作用，將抗原結合位置限定在該Vh-Vl:聚體的表面上。這六個 CDRs集體將抗原結合的專一性賦與該抗體。然而，即使單一的可變功能部位（或半個！^，僅由三御對抗原有專一性之CDRs構成）亦具有辨認並結合抗原的能力，雖然是比完整結合位置更低的親和力。 -18- 度適月ί中國國家標啤l‘ CNS ) Λ4規格（210^^17 (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 ______ — B7 五、發明説明（16 )

Fab片段[亦稱爲F(ab)]也含有輕鏈之恒定功能部位和重鏈的第n個恒定功能部位（CH1 )。Fab’片段與Fab片段的差異爲在重鏈CH1功能部位的叛基終端處加入一些殘基，包括一或多個得自抗體鉸鏈區的半胱胺酸。Fab，_SH是在本文中關於其中恒定功能部位之半胱胺酸殘基（群）具有自由硫醇基之Fab’的稱呼。F(ab，）片段係藉著切開在F(ab，)2f 蛋白酶產物之鉸鏈半胱胺酸處的二硫鍵而產生。熟諳此藝者已知額外的抗體片段之化學偶聯。得自任何脊椎動物物種的抗體（免疫球蛋白）之輕鏈，可被指定成兩種明顯不同類型中的一種，以其恒定功能部位之胺基序列爲基礎而稱爲卡巴〇)和蘭達（凡）。依據其重鏈之恒定功能部位的胺基酸序列，可將”免疫球蛋白"指定成不同的種類。有至少五（5 )個主要的免疫球蛋白種類：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其這些之中有數種可再分成亞類（同型物），例如IgG-1、lgG-2、IgG-3 和IgG-4 ; IgA-1和IgA-2。符合不同種類之免疫球蛋白的重鏈恒定功能部位分別叫做α、/?、ε、r和W。已熟知不同種類之免疫球蛋白的亞單元結構和三·度空間構型。本發明使用之較佳的免疫球蛋白爲免疫球蛋白E。當在本文中使用”單株抗體” 一詞時，意指獲自一群大體上均一之抗體的抗體，也就是説構成該族群的個別抗體，除了以最低量存在之可能自然發生的突變之外是相同的。單株抗體是高度專一性地針對單一的抗原部位。此外，與通常包括針對不同決定位（抗原決定位）之不同抗體的傳統 -19- 本紙張尺度適用中國國家標·（ rNS ) Λ4規格（210X297公釐）一 ------訂------^— (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 A7 B7 五、發明説明（π ) (多株）抗體製品相反，每個單株抗體係針對在抗原上的單一決定位。除了它們的專一性之外，單株抗體有利的是它們係藉著融合瘤的培養來合成，不會被其他的免疫球蛋白所污染。修飾語"單株的”代表抗體的特徵，表示抗體的特徵如得自一群大體上均一之抗體，而不是被解釋成需要藉著任何特定方法來產生抗體。例如，根據本發明所使用之單株抗體可藉著融合療法來製造，首先由Kohler和 Milstein，Nature 495 (1975)，或可藉著重組方法來製造’例如，如同在美國專利第4,816,567號中的描述。本發明所使用之單株抗體亦可使用在clacks〇n等人，Nature ill: 624_628 (1991)以及在 Marks 等人，J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)中描述的技術，從噬菌抗體庫中分離。在本文中單株抗體特別包括了，，嵌合型，，抗體（免疫球蛋白），其中一部份重鏈及/或輕鏈與衍生自特定物種，或屬於特定抗體種類或亞類之抗體中的相對應序列相同或是同源的，而其他的鏈（群）則與衍生自其他物種或屬於其他抗體種類或亞類之抗體中相對應序列相同或是同源的，以及這類抗體的片段，只要它們顯示出想要的生物活性（美國專利笫 4,816,567 號）；Morrison等人，Proc. Natl。Acad. Sci. 肚，6851-6855 (1984) 〇非人類（例如老鼠）抗體之，，人類化，，形式爲嵌合型的免疫球蛋白’免疫球蛋白鏈或其片段（像是F ν、、Fab、Fab，、 F(ab )2或其他與抗原結合之抗體亞序列），其含有衍生自非·人類免疫球蛋白的最小序列。大部份人類化的抗體是 -20 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} Φ 、11 本紙張尺度埏州T _囤冢標率（rNS ) μ規& 210X 297 公釐） 1233946 A7 B7 五、發明説明（18 ) 其中得自接受者之互補決定區（CDR )的殘基被得自非人類物種（損贈者抗體），如老鼠、大鼠或兔子，具有想要的專一性、親和力和效能之CDR的殘基置換的人類免疫球蛋白（接受者抗體）。在一些案例中，藉著相對應之非-人類殘基來置換人類免疫球蛋白的F v骨架殘基。此外，人類化抗體亦可包括不是在接受者抗體中也不是在引進之CDR 或骨架序列中找到的殘基。進行這些修改以便更進一步改良抗體效能並充份運用之。一般而言，人類化之抗體大體上將包括至少一個，通常是兩個可變功能部位的全部，其中全部或大體上全部的CDR區與非-人類之免疫球蛋白的那些相符合，且全部或大體上全部的FR區爲人類免疫球蛋白一致序列的那些。最佳的人類化抗體將包含至少一部份免疫球蛋白恒定區（Fc)，通常是人類免疫球蛋白的。關於進一步的細節參見：Jones等人，Nature 321： 522-525 (1986) ; Reichmann 等人，Nature 332· 323-329 (1988)和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2_，593-596 (1992) 0 ”單-鏈Fv"或丨丨sFv”抗體片段包括抗體的VH和VL功能部位，其中這些功能部位係以單一多肽鏈之形式存在。一般而言，Fv多肽更包括了在VH和VL功能部位之間的多肽交聯劑，其使sFv能夠爲了與抗原結合而形成想要的結構。關於sFv的回顧，參見Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 册，Rosenbiirg 和 Moore 編輯，Springer_Verlag，New York，第 269-315 頁（1994) 〇 n中間抗體n —詞意指帶有兩個抗原-結合位置的小抗體 -21 - 呆紙張尺度適Α中國國家標,（CNS ) Γ4規格（210X 297公釐） ------訂------^~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經淖部中决椋卑局員二消贽告竹社印¥ 1233946 A7 __________ B7 五、發明説明（19 ) 片段，該片段包括在相同多肽鏈中與輕鏈可變功能部位 (VL)連择之重鏈可變功能部位（Vh)(VH-VL)。藉著使用太短的交聯劑，以致於不容許在相同鏈上的兩個功能部位之間配對，強迫該功能部位與其他鏈的互補功能部位配對，產生兩個抗原-結合位置。在例如歐洲專利404,097 號；WO 93/11161 和 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA姐：6444-6448 (1993)中更完整地描述了中間抗體。抗體之"功能片段或類似物”片語，爲具有與全長抗體在性質上相同之生物活性的化合物。例如抗_IgE抗體的功能片段或類似物，爲能夠與IgE免疫球蛋白，以能夠防止或大體上降低這類分子具有與高親和力受體Fc ε RI結合之能力的方式結合者。 ••胺基酸”和”胺基酸群’’ 一詞意指所有天然存在的L-沒-胺基酸。確認該胺基酸如同在下文中，在Α段，抗體製備：（iv)突變抗體的產生之下的描述。”胺基酸變體”意指與天然胺基酸序列相比較，在其胺基酸序列中帶有一些差異。 π取代的”變體是那些在天然序列中有至少一個胺基酸殘基的移除，並在相同的位置，在其位置上插入不同的胺基酸殘基。取代作用可以是單一的，在該分子中僅有一個胺基酸被取代，或是多重的，在相同的分子上已經有兩或多個胺基酸被取代。”插入的"變體是那些在天然序列中，在緊鄰著特定位置的胺基酸處插入胺基酸。緊鄰著胺基酸意指與該胺基酸之心羧基或^ -胺基官能基連接。，，刪除的 -22- ϋ張I度適用中國國家標率(CNS ) Λ4規格（2丨0'〆297公釐） ---------------1Τ------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 Α7 Β7 五、發明説明（2〇 ) "變體是那些在天然胺基酸序列中移除一或多個胺基酸。通常’刪着變體在分子的特定區域中將會刪除一或兩個胺基酸。、、’田胞、”細胞株”和’'細胞培養物"一詞可交互使用，且所有這類的名稱都包括後代。亦明瞭所有的後代，在 DNA内容物方面可能不是精確地相同，係因爲故意或無思的突變所致。篩選最初轉化的細胞，亦包括具有相同功能或生物特性的後代。在本發明中使用的”宿主細胞”通常是原核生物或眞核生物宿主。適當宿主細胞的實例描述在B段，載體、宿主細胞和重組方法：（vii)宿主細胞的選擇和轉化中。 ”轉化’’意指將DNA導入生物内，使得該DNA以染色體外要素之形式或藉著染色體整合作用而成爲可複製的。 ”轉移感染”意指由宿主細胞來搭載表現載體，無論事實上表現任何密碼序列。轉移感染的宿主細胞”和”轉化的"意指將DNA導入細胞中。該細胞叫做”宿主細胞”，且其可以是原核生物或眞核生物的。代表性的原核生物宿主細胞包括各種品系的大腸桿菌。代表性的眞核生物宿主細胞是哺乳動物，像是中國倉鼠卵巢細胞或人類來源的細胞。被導入的DNA序列可以得自與宿主細胞相同的物質，或是與宿主細胞不同的物種，或者它可以是雜交的DNA序列，、含有一些外來和一些同源的DNA。 ”可複製的表現載體，，和，，表現載體"一詞意指一段 -23- 本紙張尺度述用中國國家標率（>NS ) Λ4規格（210X 297公釐） IT— (謂先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 Μ Β7 經淖部中次標卑局β,τ.消贽合啊社印？^ 五、發明説明（21 DNA，通常是雙股的，它可能已經被一段外來的DNA插入其中 '外來的DNA被定義爲異源性的DNA，是在宿主、細胞中當然無法發現的DNA。使用載體來運送外來或異源性DNA至適當的宿主細胞内。一旦在宿主細胞中，載體可不依賴宿主的染色體DNA來複製，便可產生該载體的數個副本及其插入（外來的）DNA。 ”載體”一詞意指DNA構築體，其含有以可操作之方式與能夠影響該DNA在適當宿主中表現之適當控制序列連接的DNA序列。這類控制序列包括影響轉錄的啓動基因、控制這類轉錄的任意操縱子序列、編碼適當mRNA核糖體結合位置的序列，以及控制轉錄和轉譯終止的序列。載體可以是質體、噬菌體顆粒，僅只是潛在的基因組插入序列。一旦轉化至適當的宿主内，載體可複製並具有不依賴宿主基因組的功能，或可能在一些案例中，整合到它自己的基因組内。在本説明書中，"質體"和"載體•，有時可交互使用’因爲質體是目前載體最常使用的形式。然而，本發明企圖包括其他形式、能提供相同功能的載體，並爲或成爲此項技藝中已熟知的。供哺乳動物細胞培養物表現之代表性表現載體，是例如以pRK5 (歐洲專利3〇7 247號）、 PSV16B (W0 91/08291)和 pVL1392 (pharmingen)爲基礎者。，•微脂粒”是由各種類型之脂質、磷脂及/或表面活性劑構成的小囊泡，可用來遞送藥物（像是在本文中揭示的抗體突變種’並可視需要還有化學治療劑）至哺乳動物。微 24- 本紙張尺度適用中國國象標蜂(（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） ---------------訂------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Α7 Β7 1233946 五、發明説明（22 ) 脂粒的成份通常以雙層結構來排列，類似生物膜的脂質排表現”控制序列"意指表現所需的DNA序列，在特定宿主生物中以可操作之方式與密碼序列連接。適用於原核生物的控制序列，例如包括啓動基因，可視需要還有操縱子序列’和核糖體結合位置。已知眞核生物的細胞使用啓動基因、聚腺嘗酸化的信號和促進子。 ”經過分離的”核酸分子，爲經過確認並從至少一個與其在一起之污染核酸分子中分離出的核酸分子，它通常與天然來源的抗體核酸聯合。經過分離的核酸分子與其在自然界中發現的形式或配置不同。因此可區別經過分離之核酸分子與在天然細胞中存在之形式的該核酸分子。然而，經過分離的核酸分子包括在通常會表現抗體之細胞中所含有的核酸分子，例如該核酸分子係在與天然細胞不同之染色體位置上。 •’以可操作之方式連接”的核酸，此時係將其放在其他核酸序列之有功能的關係位置内。這可以是基因和調節序列 (群），其以如此之方式連接，使得在適當分子（例如轉錄活化劑蛋白質）與該調節序列（群）結合時容許該基因表現。例如，如果以參與多肽之分泌的前導蛋白質 (preprotein)來表現’則將前導序列（presequence)或分泌引導子之NDA以可操作之方式與該多肽的DNA連接；如果要影響序列的轉錄，則將啓動基因或促進子以可操作之方式與密碼序列連接；或如果要影響序列的轉錄，則將核 -25- 本紙張人展通川中國國家標嘩（rNS ) Λ4規格（2】〇χ 297公釐）訂 ^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經潢部中次楞準局β,τ-消资告必社印¥ A7 1233946 五、發明説明（23 ) — 糖體結合位置以可操作之方式與密碼序列連接；或是若要將其定位;以便促進轉譯，則將核糖體結合位置以可操作之方式與密碼序列連接。一般而言，”以可操作之方式連接 π意指要連接之DNA序列是相鄰的，並且在分泌引導子的案例中是相鄰的且在閱讀相中。然而，促進子不必是相鄭的。藉著在合適的限制位置連接來完成連結。如果不存在這類位置，根據傳統的慣例使用合成的寡核嘗酸接合_ < 連接子。 ’·處理’'意指治療性處理和預防或阻礙的方法。需要處理的那些包括已經罹患失調和需要預防失調的那些。 ”失調"爲從利用該多肽的治療中獲益的任何狀況。包括慢性和急性的失調，或包括那些使哺乳動物易患正在討論中之失調的那些病理狀況的疾病。當在本文中使用’’免疫抑制劑”來修飾治療時，意指該物質係擔任抑制或掩蔽在其中移殖入移殖物之宿主的免疫系統之工作。主要將包括抑制細胞分裂素的產生、向下調節或抑制自我-抗原的表現，或掩蔽MHC抗原。這類製劑的實例包括2-胺基-5-芳基-5-經取代的嘧啶（參見美國專利第 4,665,077號）、（硝基）咪唑硫嘌呤（或環磷醯胺，在與（硝基）咪咬硫螺呤相反反應的案例中）；溴隱素（bromocryptine); 戊二醛（其掩蔽MHC抗原，如同在美國專利第4,120,649號中的描述）；MHC抗原和NHC片段的抗-遺傳性型之抗體；環孢靈A ;諸如糖皮質類固醇之類的類固醇，例如脱氫可的松、甲基脱氫可的松和地塞米松；細胞分裂素或細 -26- 冢ϋ度適用中國國家標埤（( 210X 297^1 ) " '~' —I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 f 1233946 經淖部中决«準局員_τ消贽合竹私印來 A7 B7 五、發明説明（24 ) 胞分裂素受體拮抗劑，包括抗·干擾素_ r、_p或^抗體；抗·臛瘤壞死因子-α抗體；抗_腫瘤壞死因子_卢抗體；抗-介白素-2抗體和抗_IL_2受體抗體；抗丄3Τ4抗體；異源性抗-淋巴球之球蛋白；泛_丁抗體，較佳的是抗_ CD3或抗-CD4/CD4a抗體；含有LFA_3結合功能部位的可落性肽（在1990年7月26日公告的w〇 9〇/〇8187);鏈激酶；TGFj ;鏈球菌脱氧核糖核酸酶（strept〇d〇mase);得自宿主的RNA或DNA ; FK 506 ; rs-61443 ;脱氧斯普格林（de0χySper_gUlin);納巴黴素；τ_細胞受體（美國專利第 5，114,721 號）；T-細胞受體片段（〇ffner等人，Science 251： 430-432 (1991) ; WO 90/11294 和臀〇 91/01133);以及諸如 T10B9之類的T-細胞受體抗體（歐洲專利34〇，1〇9號）。這些製劑可在與CD 11 a抗體相同的時間或分開的時間投予，並可使用與在此項技藝中之陳述相同或較低的劑量。較佳的輔助免疫抑制劑將依據許多因素待處理之失調的類型、包括待進行之移殖的種類，以及患者的病史，但大體上通常較好是從環孢靈A、糖皮質類固醇（最好是脱氫可的松或甲基脱氫可的松）、OKT-3單株抗體、（硝基）咪唑硫嘌呤、溴隱素、異源性抗-淋巴球之球蛋白，或其混合物中選出該製劑。 ’’癌症"和”癌症的” 一詞意指或描述哺乳動物的生理狀況’通常其特徵爲不規則的細胞生長。癌症的實例包括但不限於癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤或白血病。這類癌症較特別的實例包括鱗狀細胞瘤、小細胞肺癌、非_小細胞 -27- 本紙張尺度適用中國國家標蜂（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） --------Φ------1T------Φ— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 1233946 五、發明説明（25 ) A7 B7 :癌、胃腸道的癌症、胰臟癌、神經膠質母細_ 痗踢、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、钍呂二、結直腸癌、子官内膜癌、唾液腺癌、腎臟：腸 =腺癌、陰道癌、甲狀腺癌、肝癌和各種„的=部適：處理的"哺乳動物”意指任何分類爲哺乳動物，匕括人類、家百和農場動物、非人類的靈長類，以動物園、運動用和寵物類的動物，像是狗、馬、 ^ 等。 .輪、牛等當在本文中使用”以抗原決定位標記” 一詞時，意指多肽與一個”抗原決定位標記"融合。抗原決定位標記^二具有足以提供抗原決定位的殘基，可對其製造出針對它的抗體，但又是足夠的短，使其不致於干擾該多肽之活性。^ 抗原決定位標記最好亦是相當的獨特，使得針對其的抗= 大體上不會與其他的抗原決定交叉-反應。適當的標記多肤通常具有至少6個胺基酸殘基，且通常是在8_5〇個胺基酸殘基之間（較佳的是在大約9-30個殘基之間）。實例包括 flu HA標記多肽及其抗體12CA5 (Field等人，M〇1 cdl BiolUl59-2165 (1988)) ; c-myc 標記和針對它的 8F9、 3C7、6E10、G4、B7和 9E10 抗體（Evan 等人，Mol Cell· Biol· i (12): 3610-3616 (1985));以及單純疱疹病毒糖蛋白 D (gD)標記及其抗體（pab〇rsky 等人，Proteiti Engineering (6): 547-553 (199〇))。在某些具體實施例中，抗原決定位標記爲”補救受體結合之抗原決定位”。 ,28 - ’本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 1233946 A7 B7 經湞部中次標卑局員J-消贽告社印來五、發明説明（26 ) 當在本文中使用”補救受體結合之抗原決定位”意指IgG 分子（例如IgGi、IgGs、IgG3或IgG4)之F c區的抗原決定位，其爲在活體内使IgG分子之血清半衰期增加的原因。當在本文中使用”細胞毒性劑”時意指一種抑制或阻斷細胞功能並/或引起細胞破壞的物質。該名詞企圖包括放射性同位素（例如I131、I125、Y9。和Re186)，化學治療劑和毒素，像是細菌、眞菌、植物或動物來源的具有酵素活性之毒素，或其片段。 π化學治療劑"爲用來治療癌症的化學化合物。化學治療劑的實例包括亞德里亞徽素、阿徽素（Doxorubicin )、5 -氣尿嘧啶、阿拉伯糖胞甞（"Ara-C")、環磷醯胺、硫化三（環氮丙基）磷（thiotepa)、塔松特（Taxotere)(德西塔喜 (docetaxel))、布爾蘇分（Bulsulfan)、塞特素（Cytoxin)、紫杉醇（Taxol)、胺甲碟呤、氯氨鉑（cisplatin)、苯丙胺酸氮芥、長春花鹼、博菜黴素、鬼臼乙叉貳（Etoposide)、依弗絲醯胺（Ifosfamide)、絲裂黴素C、米多薩東 (Mitoxantrone)、長春新鹼、菲諾瑞比（vinorelbine)、碳銘（Carboplatin )、表鬼臼毒p塞吩糖嘗（Teniposide )、道語黴素、洋紅黴素、胺基蝶呤、放線菌素D、絲裂黴素、艾斯普米斯（Esperamicins)(參見美國專利第4,675，187號）、苯丙胺酸氮芥及其他相關的氮芥。當在本申請案中使用”前藥” 一詞時，意指來自具有藥學活性之物質的前驅物或衍生物，與親代藥物相比其對腫瘤細胞具有較低的細胞毒性，並能夠以酵素方式激活或轉變 -29- 本紙張尺度適州中國國家標嘩（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） (誚先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 套· A7 1233946 B7 五、發明説明（27 ) 成較具活性的親代形式。參見例如Wilman，"Prodrugs in Cancer Chemotherapy”，Biochemical Society Transactions， M，第 375-382 頁，615 Meeting，Belfast (1986)和 Stella 等人 (編輯），’’Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery’’，Directed Drug Delivery, Borchardt 等人（編輯），第247-267頁，Human Press (1985)。本發明之前藥包括但不限於含有磷酸鹽的前藥、含有硫代硫酸鹽的前藥、含有硫酸鹽的前藥、含有肽的前藥、D-胺基酸經過修改的前藥、糖基化的前藥、含有内醯胺的前藥、含有可視需要經取代之苯氧基乙醯胺的前藥，或含有可視需要經取代之苯基乙醯胺的前藥、5 -氟胞喊淀和其他的5 -氟尿喊淀前藥，其可轉變爲更具活性之細胞毒性的自由藥物。在本發明中用來將具有細胞毒性之藥物衍生成前藥形式的實例，包括但不限於那些在上文中描述的化學治療劑。當在本文中使用”標記” 一字時，意指可檢測的化合物或組合物，其與抗體直接或間接地連結。該標記本身是可檢測的（例如放射性同位素標記或螢光標記），或是在酵素標記的案例中，其可催化可檢測之受酶質化合物或化合物的化學變化。當在本文中使用”固相”時，意指本發明之抗體可附接於其上的非液態基質。包括在本文中之固相的實例包括部份或全部由玻璃（例如經過控制的多孔玻璃、多醣類（例如瓊脂糖）、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和矽酮形成的那些。在某些具體實施例中，依據上下文，固相可由試 -30- 本紙張尺度適州中國國家標準（（、NS ) ΛΑ規格（210X 297公釐）訂 ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經满部中决掠準局员.Π消贽合竹社印¥ 1233946 A7 _________ ______ B7 五、發明説明（28 ) 一驗板的孔所構成；在其他的具體實施例中則爲純化管柱 (例如師力層析管柱）。該名詞亦包括個別顆粒的不連續固相，如同在美國專利第4,275，149號中描述的那些。當在本文中使用"抗-人類IgE抗體"時，意指該抗體與人類IgE，以抑制或大體上減少這類IgE與高親和力受體〜£幻 I結合的方式來結合。該抗-IgE抗體最好是E_25。 S在本文中使用"IgE-調節之疾病”時，意指其特徵爲免疫球蛋白IgE之過度產生及/或對其過敏的病況或疾病。特足而言，應解釋爲包括與過敏性過敏和異位性過敏有關聯的病況，包括例如：氣喘、過敏性鼻炎&結膜炎（乾草熱）、濕疹、蓴麻疹和食物過敏。然而，一連串過敏性休克的生理狀況’通常是由蜜蜂或蛇螫咬或非經腸投藥引起的，亦包括在該名詞的範園下。當在本文中使用”使用噬菌體表現的親和力突變"（ampd) 時’意指在 Lowman 等人，Biochemistry 30(45): 10832· IO838 (1"1)中描述的方法，亦可參見Hawkins等人，j Mol· Biol· 2M: 889_896 (1"2)。對下列的説明並無嚴格的限制，可簡單地描述該方法：使數個高變區位置（例如6_7 個位置）突變，在每個位置產生所有可能的胺基酸取代作用。從絲狀的噬菌體顆粒中，以單價之方式，表現與包裝在每個顆粒中之M13的基因III產物融合之如此所產生的抗體突變種。可使表現各種突變種之噬菌體周而復始地通過結合選擇的循環，接著分離並定出顯示出高親和力之那些突變種的序列。該方法亦描述在1992年6月1 1日發布之 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 1233946 A7 經满部中决掠率局只工消贽合竹社印¥ 五、發明説明（29 ) wo 92/09690 中。在 Cunningham，B.C.等人，EMB〇 J 13 (11)，250—2515 (1994)中描述了涉及聯合親和力表現的f 改程序。 > 提供選擇新穎結合多肽之方法的方法包括：“建構包括編碼多肽心第一個基因，編碼至少一部份天然或野外型噬菌體外殼蛋白質之第二個基因的可複製表現載體，其中第一個和第二個基因是異源性的，並將轉錄調節要素以可操作之方式與第一個和第二個基因連接，藉此形成編碼融合蛋白質之基因融合；b)使該載體在第一個基因内之一或多個選定的位置出發生突變，藉此形成一群相關的質體，二)利用該質體來轉化適當的宿主細胞；d)以具有編㈣菌版外设蛋白質之基因的輔助噬菌體感染經過轉化的宿主細胞；e)在適合形成含有至少一部份質體並能夠轉化該宿主之重組噬菌體質體顆粒的條件下培養該經過轉化感染的宿主細胞，調整該條件使其不超過在該顆粒表面上2現超過一個融合蛋白質副本之最低含量的噬菌體質體顆粒；〇使=噬菌體質體顆粒與標靶分子接觸，使得至少份的噬菌體質體顆粒與該標靶分子結合；並§)從那些未結合的中分離出結合的噬菌體質體顆粒。較佳的是，該方法更 =括=用與該標齡子結合的m菌體質體顆粒轉化適當的宿主細胞，並重複步驟d)到g) 一或多次。另外，孩万法亦包括由一個亞單元以上所構成的多肽，其中使包括以可操作之方式與編碼感興趣之亞單元的 DNA連接之轉錄調節要素的可複製表現載體，與噬菌體 -32- 紙張尺度“巾關幻婢（rNS ) M規格—（21GX 297公釐）

Aw,1T------AW~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經清—部中次標卑局萸_τ消贽合社印繁 1233946 A7 ______________ B7 五、發明説明（3〇 ) 外殼蛋白質融合。當在本文中使用”抗體噬菌體庫” 一詞時，意指在上文和 Hawkins 等人，J· Mol. Biol. 254: 889-896 (1992)以及在 Lowman 等人，Biochemistry 30(45): 10832-10838 (1991)中描述之親和力突變方法中所使用的嗟菌體庫。每個嗤菌體庫分別包括一個鬲變區（例如6-7位置），對其產生所有可能的胺基酸取代。從絲狀的噬菌體顆粒中，以單價模式表現包裝在每個顆粒中與M13之基因ΙΠ產物融合的如此所產生之抗體突變種，並在該噬菌體外側表現之。當在本文中使用”室溫，，或，，周圍溫度，，時，應爲23t 25 。(：。當在本文中使用"結合多肽”時，意指任何以可選擇之親和力與標革巴分子結合的多肽。較佳的是該多肽將是蛋白質’其最好是含有超過大約100個胺基酸殘基。通常該多肽將是荷爾蒙或抗體或片段。當在本文中使用"高親和力”時，意指在生理條件下，具有< 1〇_5 Μ的親和力常數（Kd)，而較好是< 1〇-7 Μ。當在本文中使用”標靶分子，，一詞時，意指任何分子，不走疋蛋白曳’想要對它產生抗體或配體。然而，較佳的標靶將是蛋白質，而最佳的標靶將是抗原。然而，特別應邊將諸如荷爾蒙受體之類的受體包含在該名詞的範圍内。當在本文中使用所有的免疫球蛋白胺基酸殘基之編號時，包括符合IgE、突變種IgE分子和嵌合型IgE分子之特定冲伤之肽的胺基酸編號，在本文中顯然是根據Kabat等 _____ _ -33- 土紙張尺度 1¾ _ 家標準（CNS ) ---- 訂------~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經滅部中"#尊局員-τ消费合竹^印^^ 1233946 A7 B7 五、發明説明（31 ) 人， Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health，Bethesda，MD 1987)的免疫球蛋白胺基酸殘基編號系統來進行。實行本發明的方法 I. 改良標靶分子親和力的方法 A. 確認可同分異構化的天冬胺醯基在實行本發明時，可藉著任何熟諳此藝者已知的技術來完成確認有同分異構化傾向之可同分異構化的天冬胺醯基殘基。例如，Cacia 等人，Biochemistry 35，1897-1903 (1996)，描述其中在37X：下培養抗-IgE抗體E-25 (其含有-Asp-Gly-殘基）2 1天的方法。藉著層析或質譜分析未處理和以蛋白酶處理之片段，完成異構化之-Asp-Gly-的確認。因爲也已經報告過利用天冬醯胺醯基殘基使同分異構化作用發生（T· Geiger 和 S· Clarke，J· Biol. Chem· 262(2). 785-794 (1987)，所以本發明亦可較佳地實行系統性的評估並改良含有天冬醯胺醯基殘基的多肽。 B. 選擇改良標靶分子親和力的任意殘基對一個熟諳此藝者而言可使用許多容許將受體親和力發揮最大效用的技術。通常，這些技術均涉及在感興趣之位置處各種胺基酸殘基的取代作用，接著是篩選突變多肽的受體親和力。供本發明使用的較佳技術是使用噬菌體表現的親和力突變（Hawkins 等人，J。Mol· Biol· 254： 889-896 (1992) ; Lowman 等人，Biochemistry 30(45、: 10832-10838 (1991))。簡言之，使數個高變區位置（例如6-7位置）突 -34- ϋ張尺家㈤(CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 A7 B7 經满部中决標導局员X消费合竹社印則本五、發明説明（32 ) 變，在每個位置產生所有可能的胺基酸取代。從絲狀噬菌體顆粒中，以單價之方式，表現與包裝在每個顆粒内之 M13的基因III產物融合、如此所產生的抗體突變種。可使表現各種突變種之噬菌體通過結合選擇的循環，接著分離並定出那些表現出高親和力之突變種的序列。選擇新穎結合多肽的方法，最好是使用在結構上與多肽相關的表現庫。藉著突變生成作用，產生在結構上與多肽相關的表現庫，與噬菌體外殼蛋白質融合，且最好是在含有編碼該多肽之DNA的噬菌體質體顆粒的表面上表現每個相關多肽的單一副本。然後使這些噬菌體質體顆粒與標靶分子接觸，並從具有較低親和力的那些中分離出對該標靶具有最高親和力的那些顆粒。然後藉著感染細菌宿主擴大高親和力的結合者，並重覆競爭性結合步驟。重覆該方法直到獲得具有想要之親和力的多肽。另外，亦可使用多價的噬菌體（McCafferty等人（1990)， Nature 348· 552-554 ; Clackson 等人（1991)，Nature 352. 624-628)來表現隨機的點突變（藉著使用有錯誤傾向之DNA聚合酶來產生），產生噬菌體抗體片段庫，然後可藉著對抗原的親和力來篩選之。Hawkins等人，（1992) J/ Mol. Biol. 354: 889-896 〇最好是在親和力突變過程中，可複製的表現載體是在轉錄調節要素的嚴格控制之下，並調整培養條件，使得在該顆粒表面上展現超過一個融合蛋白質副本的噬菌體質體之含量或數目低於大約1%。更佳的是，展現超過一個融合 -35- 玉紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) Λ4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 1233946 A7 五、發明説明（33 ) 蛋白質副本的嗟菌體質體顆粒之含量，低於展現單一融人蛋白質副'本的嗟菌體質體顆粒之含量的㈣。最佳的是: 量低於20%。 "" ”通常，在本發明的方法中，該表現載體將更含有分泌信唬序列，其與編碼每個多肽亞單元之dna融合，以及將成爲啓動基因系統的轉錄調節要素。較佳的啓動基因系統係選自：LacZ、几孔、1^、丁7聚合酶、色胺酸和鹼性磷酸酶啓動基因，及其混合物。再者，通常第一個基因將編碼哺乳動物的蛋白質，較佳的是該蛋白質將是抗_IgE抗體。在第π· Α·段，抗體製備， (vi)多專一性之抗體中舉例説明額外的抗體（然而注意到抗體沒有是多專一性的必要）。額外的抗體包括人類生長激素（hGH )、N-甲硫胺醯基人類生長激素、牛生長激素、副甲狀腺激素、甲狀腺素、胰島素A_鏈、胰島素心鏈、胰島素原、恥骨鬆弛激素A_鏈、恥骨鬆弛激素B-鏈、恥骨鬆弛激素原、諸如濾泡刺激激素（FSH)、甲狀腺刺激素 (TSH )和促黃體生成激素（LH )之類的糖蛋白荷爾蒙，糖蛋白激素受體、降鈣素、胰增血糖激素、因子VIII、肺表面作用劑、尿激酶、鏈激酶、人類組織_型之血纖維蛋白溶酶原激活劑（t-PA )、娃皮素（bombesin)、因子IX、凝血酶、造血生長因子、腫瘤壞死因子- π和->5、腦裤肽酶 (enkephalinase)、人類血清白蛋白、抑制-苗勒氏管 (mullerian)之物質、與老鼠促性腺激素有關的肽、微生物蛋白質，像是万内醯胺酶、組織因子蛋白質、抑制素、激 -36- 本紙張尺度適國國家標率（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） IT------^— (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 A7 __________________ B7_五、發明説明（34 ) 活素（activin)、血管内皮生長因子、荷爾蒙或生長因子的受體、整合素（integrin)、促血小板生成素、蛋白質A或 D、類風濕因子、神經生長因子，如NGF-a、血小板_生長因子、轉化生長因子（TGF)，如TGF_“和tgfj、類腺島素生長因子-I和-II、類-胰島素生長因子結合蛋白質、 CD_4、DNA酶、與潛伏有關聯的肽、促紅血球生長素、骨謗導（osteoinductive)因子、干擾素、如干擾素_“、_广和，、菌落刺激因子（CSFs)，如M_CSF、GM_CSF和匕 CSF、介白素（Ils)，如比-l、IL-2、IL-3、IL_4、超氧物岐化酶、衰變促進因子、病毒抗原、HIV被膜蛋白質，如 GP120、GP140、心房利尿肽Α、Β或c、免疫球蛋白，以及任何上文·列舉之蛋白質的片段。較佳的是，第一個基因將編碼含有超過大約1〇〇個胺基酸殘基之一或多個亞單元的多肽，並將被折疊形成複數的堅固二級結構，展現大多數能夠與標靶交互作用的胺基酸。最好是第一個基因在符合唯一能夠與標靶交互作用之胺基酸的密碼處發生突變，而得以保存該堅固二級結構的完整。通系本發明的方法將使用一個輔助嗤菌體，選自： Μ13Κ07、M13R408、M13-VCS 和 PhiX 174。較佳的輔助噬菌體爲M13K07，而較佳的外殼蛋白質爲M13噬菌體基因Π之外殼蛋白質。較佳的宿主爲大腸桿菌、，和大腸捍菌之蛋白酶有缺陷的品系。已經檢測出藉著本發明方法來選擇的新穎hGH變體。建構噬菌體質體表現載體，其含有位 ______— ·— -37- 本紙張尺度目_料（210X297^# ) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .蠡·

、1T f I -- - I— ·

• 1 1 SI 1233946 A7 五、發明説明（35 B7 經Μ部中决標率局β,τ-消贽合竹ίί印來在編碼該多肽和嗤菌體外殼蛋白質的核酸之間可权正終止密碼子。 I選擇在禮菌體表面上表現的多肽藉著多重胺基酸變化之嗟菌體質體選擇作用的"多肽”選擇循環爽^二、選擇較咼親和力的結合7开，亦符有 ?擇的循ί衣來選擇。在第一輪涉及在配體或抗體多肽 Γ區胺基酸選擇的_體質體之選擇後，在該配體港、他區域或胺基酸上經營另一輪的嗟菌體質體選擇。重覆嗟菌體質體選擇的循環，直到達到想要的親和力特性。 =釋該過程，循環地經營實例4之_體表現。共同管理硯和力、得自不同CDRS之突變組合等等。中二曉形成多肽之結合功能部位的胺基酸殘基將連接，並可能歸屬於多肽的不同亞單元。也就是、、。合功能部位追縱帶有特定二級結構的結合位置，因此，通常將突變導入編碼不在多肽内部得它們將可具有與標乾交互作用=…碼子内，配！而二不需要以正規地與標把結合之針對標把分子之配粗或柷體的形式來選擇多肽。因此，受體的配體形式來選出諸如TSH之類的糖二：針：TSH 在本發明方法中使用突變TSH分子庫 =爾豕，並選者。單產生新穎的藥物候因此，本發明意圖包括任何與標靶分予鈐人別是抗體。較佳的多肽是具有藥學實用性^那二肤在有功能的使用重覆其係藉著而使特第 ------1T------^_ (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標蜂;· -38 1233946 A7 經淖部中次標卑局消费合竹社印剩五、發明説明（36 ) 工1.Α·節抗體製備（iv)多重專一性之抗體中詳述了實例抗體 (压意到杬體並不需要是多重專一性的）。更佳的多肽包括：生長激素，包括人類生長激素、脱_N_甲硫胺醯基之人類生長激素，和牛生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺刺激素，甲狀腺素，胰島素八_鏈；胰島素B —鏈；耳心骨鬆弛激素原；與老鼠促性腺激素·有關的肽；微生物蛋白質，如卢内醯胺酶；組織因子蛋白質；抑制素；激活素；血管内皮生長因子；荷爾蒙或生長因子之受體；整合素；促血小板生成素；蛋白質A或D ;類風濕因子；神經生長因子，如NGF-/?，·血小板-衍生之生長因子；纖維母細胞生長因子，如aFGF和bFGF，上皮細胞生長因子；轉化生長因子 (TGF)，如TGF-從和TGFj ;類·胰島素生長因子]和屯；類胰島素生長因子結合蛋白質；CD-4 ; DNA酶；與潛伏有關聯的肽；促紅血球生長素；骨謗導（〇ste〇inductive)因子；像是例如HIV被膜的一部份；免疫球蛋白；以及任何上文·列舉之多肽的片段。此外，可取代、插入或刪除在該多肽上一或多個預定的胺基酸殘基，例如產生具有改良生物特性的產物。而且亦包括這些多肽的片段，特別是具有生物活性的片段。本發明最佳的多肽爲人類生長激素，以及心房利尿肽A、B和C、内毒素、枯草桿菌蛋白酶 (subtilisin )、胰蛋白酶及其他絲胺酸蛋白酶。並且最好是像多肽荷爾蒙，可限定爲任何在第一個細胞中產生的胺基酸序列’其與在相同細胞類型上（自體分泌的荷爾蒙）或與在第二種細胞類型上（非·自體分泌）的受體 •39- 心張尺度適用中國國家標率（CTNS ) Λ4%# ( 210X297^1 ) " -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •春· 訂 f 1233946 A7 B7 五、發明説明（37 ) 專一性地結合，並引起攜帶受體之細胞獨特的生理學反應。在這些多肽荷爾蒙中的爲細胞分裂素、淋巴細胞活素、神經營養荷爾蒙和腺垂體的多肽荷爾蒙，像是生長激素、催乳激素、胎盤催乳激素、促黃體生長激素、促濾泡激素、/?-脂肪動用激素、r -脂肪動用激素和腦内啡；下視丘釋放-抑制激素，如促腎上腺皮質激素釋放因子、生長荷爾蒙釋放-抑制荷爾蒙、生長荷爾蒙·釋放因子；以及其他的多肽荷爾蒙，像是心房利尿肽A、B或C。 2. 獲得編碼想要多肽的第一個基因（基因1 ) 藉著此項技藝中已知的方法（通常參見Sambrook等人， Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York, (1989))，獲得編碼想要多肽（例如抗體）的基因。若該基因之序列爲已知的，可以化學方式來合成編碼該基因的DNA (Merrifield，J· Am· Chem. Soc. Μ: 2149 (1963))。如果該基因之序列是未知的，或如果該基因先前未曾被分離出，則可從cDNA庫（從獲自在其中表現想要基因之適當組織的RNA來製造）中，或從適當的基因組DNA庫中選殖。然後使用適當的探針來分離該基因。關於cDNA庫，適當的探針包括單株或多株的抗體（其限制條件爲該cDNA庫是表現庫）、寡核甞酸，以及互補或同源的cDNA，或其片段。從基因組DNA 庫中用來分離感興趣之基因的探針，包括編碼相同或類似基因之cDNA或其片段、同源的基因組DNA庫或DNA片段，以及寡核嘗酸。使用如同在Sambrook等人，在前的第 -40- 暴紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）訂 ^_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 A7 B7 經Μ部中决標卑局员-J.消贽告竹社印f 五、發明説明（38 ) HM2章中描述的標準程序，以選出的探針來經營cDNA或基因組庫;的篩選。另一種分離編碼感興趣之多肽（例如抗體）之基因的方法’係使用如同在Sambrook等人，在前的第14節中描述的聚合酶連鎖反應方法學（PCR)。該方法需要使用寡核甞版’其將與感興趣之基因雜交，因此該基因之DNA序列中至少有一些必須是已知的，以便產生寡核苷酸。在已經分離出基因之後，爲了擴大作用，可將其插入適當的載體内，如同在Sambrook等人，在前中的普通説明。 3 · 建構可複製之表現載體有數種類型的載體是有效的，並可用來實行本發明，對於在本文中使用而言，質體載體是較佳的，因爲它們可利用相關的案例來建構，並可迅速地擴大。質體載體通常含有各種成份，包括啓動基因、信號序列、表現型選擇基因、複製位置之起點，以及其他熟諳此藝者已知的必要成最常使用在原核生物載體中的啓動基因包括lacZ啓動系統、驗性磷酸酶pho A啓動基因、嗤菌體；I PL啓動基因（對溫度敏感的啓動基因）、tac啓動基因（由1^阻遏物調節的雜交trp-lac啓動基因）、色胺酸啓動基因和嗟菌體T7啓動基因。關於啓動基因的共同説明’參見Sambrook等人，在前的第17節。有最常使用的啓動基因，但、也可以使用其他適當的微生物啓動基因。實行本發明的較佳啓動基因，是可以嚴格管理而得以控 -41 - (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •鲁· 、-口 t 本紙張尺度適州中國國家標率（（、NS ) Λ4規格（2l〇X 297公釐） 1233946 ΚΙ Β7 - -— ---- ---— _ _______-__-—- 五、發明説明（39 ) 制融合基因之表現的那些。若無法控制表現，導致在嗤菌體質體的表面上有融合蛋白質的複數副本，則可能使噬菌體質體與標靶以多點附接。相信該多點附接，也叫做”抗體親抗原性"或π螯合效應”，導致選出假的，，高親和力”多肽，係因爲在嗤菌體質體顆粒上展現之融合蛋白質的多重副本，非常接近另一個，也可以説是”螯合”該標靶所致。當發生多點附接時，有效的或表面的Kd値，可能像經過表現之融合蛋白質的每個副本所產生的個別K d値一樣南。經由嚴格調節融合蛋白質的表現，使得不超過最少含量’也就是低於大約1 %的噬菌體質體顆粒含有融合蛋白質的多重副本，克服”螯合效應"而容許眞正的選出高親和力之多肽。因此，依據啓動基因，調整宿主的培養條件’使得含有融合蛋白質之單一副本的噬菌體質體顆粒的數目增加到極限，並使含有融合蛋白質之多重副本的噬菌體質體顆粒的數目減到最少。經潢部中次摞卑局萸二消於合竹私印來 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) f 實行本發明所使用之較佳啓動基因爲_ Z啓動基因和 Bka A啓動基因。_ z啓動基因係由且遏物質蛋白質 i來調節，並因此可藉著操縱且遏物蛋白質之含量來控制融合基因的轉錄。經由解釋，使含有Z啓動基因的嗟菌體質體在含有該kz啓動基因之阻遏物，lac i P且遏物基因之副本的細胞品系中生長。含有应i基因的代表性細胞品系包括JM 101和XL-1 blue。另外，亦可以含有阻遏物kt i和& Z啓動基因兩者的質體來共同轉移感染宿 —__一 _一_ -42- ί、紙張尺度制巾目®家鱗(;了/\4規格（210X297公釐） " 經满部中欢核準局员X消費合作；^印繁 1233946 kl __________ B7 五、發明説明（4〇 ) 主細胞。有時可同時使用上文的兩種技術，也就是使含有 Z啓動基因的噬菌體質體顆粒，在含有_ i基因的細胞品系上生長，並以含有z和Lat i基因的質體來共同轉移感染該細胞品系。通常當希望表現一基因時，將會在上文轉移感染的宿主中加入諸如異丙基硫代半乳糖甞（IPTG) 之類的謗導物。然而，在本發明中省略該步驟，以便（a) 使基因in融合每個噬菌體質體的數目到最少，並（b)預防由諸如IPTG之類謗導物引起之噬菌體質體不良或錯誤的包裝’即使是在低濃度下。通常在不加入謗導物時，每個嗟菌體質體顆粒的融合蛋白質數目爲01以上（噬菌體質體顆粒之大邵份融合蛋白質數目的數量）。實行本發明所使用的最佳啓動基因爲_ A。相信該啓動基因係由在細胞中之典機磷鹽的含量來調節，其中該磷酸鹽的作用爲向下調節該啓動基因之活性。因此，藉著用盡細胞的磷酸鹽，可增強該啓動基因的活性。藉著使細胞在富含磷酸鹽的培養基中生長，像是2 YT或L B，達到想要的結果，藉此來控制基因III融合的表現。用來實行本發明之載體的其他有用成份爲信號序列。該序列通常位在緊鄰編碼融合蛋白質之基因的5，，並因此在該融合蛋白質之胺基終端被轉綠出來。然而，在某些案例中，已經證實仏號序列係位在編碼待分泌之蛋白質之基因的5,以外的地方。該序列瞄準蛋白質，其七過細菌細胞的内膜而附接t。可伙任何編碼具有信號序列之蛋白質的基因中，獲得核酸内切限制酶片段之形式、編碼信號序列的 -43- 本紙張尺度適州中國國家標學（CNS ) Λ4規格（21〇X29^Jy 訂 ^^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經满部中泱標準局员二消贽合竹社印¥ 1233946 A7 ------- B7 五、發明説明（41 )~ 一一"^ ' DNA。可從編碼例如LamB或OmpF ( Wong等人，Gene 68.; W3 (1983))、MalE、PhoA之基因，以及其他基因中獲得適當的原核生物信號序列。實行蛋白質之較佳的原核生物信號序列爲大腸样菌熱穩定之腸毒素„ (STn)信號序列’如同由Chang等人，Gene ϋ: I89 (1987)所描述的。用來實行本發明之載體的其他有用成份爲表現型選擇基因。代表性之表現型選擇基因是編碼賦與與宿主細胞抗生素抗藥性之蛋白質的那些。經由説明，爲了此一目的可容易地使用氨爷青黴素抗藥性基因(amp、和四環素抗藥性基因（趾）。利用“準的重組DNA程序’如同在Sambrook等人，在前中的描述，來製備包括上文提及之成份，以及編碼所描述之夕肤的基因（基因i )之適當載體的構築體。混合經過分離的DNA片段，形成載體，將其切開、缝製，並以特定的順序和方位連接在一起，產生想要的載體。使用適當的限制酵素或酵素群，在適當的緩衝溶液中切開DNA。一般而言，大約〇.2_1微克的質體或DNA片段，在大約2 0微升的緩衝溶液中使用大約丨_2個單位的適當限制酵素。由限制酵素的製造者指定適當的緩衝溶液、 DNA濃度和培養時間與溫度。通常在37χ：下大約一或兩小時的培養時間是適當的，雖然有數種酵素需要較高的溫度。在培養之後，藉著以酚和氣仿的混合轫來萃取消化溶液’移除酵素和其他污染物，並藉著使用乙醇的沉澱作用’從含水的溶離份中回收DNA。 ____ __________ __ - 44 - 本纸張人度述用对國國豕標牟（CNS ) Λ4規格（21 Οχ 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 五、發明説明（42 ) 欲將DNA片段連接在一起形成有功能的載體，該〇να片段的末端必須是彼此可相容的。在一些案例中，在核酸内切酶的消化作用之後，末端將是可直接相容的。然而，可能需要先將通常由核酸内切酶消化所產生之黏狀末端轉變成平端，而使其成爲就連接作用而言是可相容的。欲弄鈍末端’在15°C下，在四個脱氧核甞酸三磷酸的存在下，在適當的緩衝溶液中以1 〇單位的DNA聚合酶I之Klenow片段 (Klenow )處理該DNA至少1 5分鐘。然後藉著酚氯仿萃取和乙醇沉澱作用來純化該DNA。可以大小-分離切開的DNA片段，並利用DNA凝膠電泳選擇之。可使DNA通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺基質來進行電泳。基質的選擇係依據待分離之DNA片段的大小而定。在電泳之後，從基質中藉著電子洗脱作用來萃取 DNA，或如果使用低溶點之瓊脂糖作爲基質，藉著將該壤月曰糖溶化’並從其中萃取該DNA，如同在Sambrook等人，在前的第6.30-6.33節中的描述。將連接在一起的DNA片段（之前以適當的限制酵素消化，使得每個待連接之片段的末端是可相容的），以等莫耳的量放入溶液中。該溶液亦將含有ATP、連接酶緩衝溶液和連接酶，如T4 DNA連接酶，以每0· 5微克DNA大約 1 0個單位的量。如果欲將DNA片段連接到載體内，先藉著以適當之核酸内切限制酶（群）切開將該載體弄直。然後以鹼性磷酸酶或牛小腸磷酸酶處理弄直的載體。在連接步驟期間，磷酸酶的作用防止了載體的自我·連接。 -45- 本紙張尺廋適用中-「NS ) Λ4規格（210Χ 297公釐） '~ IT------ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 A7 B7 經碘部中劣摞準局貝二消资告竹社印4'i本五、發明説明（43 ) 在連接之後，馬上將帶有外來基因的載體插入，以便轉化適當的宿主細胞。對本發明而言’原核生物是較佳的宿主細胞。適當的原核生物宿主細胞包括大腸桿菌品系 M101、大腸桿菌K12品系294 ( ATCC第31，446號）、大腸样菌品系W3110 (ATCC第27,325號）、大腸桿菌X1776 (ATCC 第 31，537 號）、大腸桿菌 XL-1 Blue (stratagene)和大腸桿菌B ;然而，也可以使用許多其他的大腸样菌品系，像是HB101、NM522、NM538、NM539，以及原核生物許多其他的種和屬。除了上文列舉的大腸桿菌品系之外，桿菌，如枯草桿菌（Bacillus subtilis)，其他的腸細菌科，如鼠傷寒沙門氏样菌（Salmonella typhimurium)或垂萎样菌 (Serratia marcesans )，以及各種假單孢菌（Pseudomonas ) 屬，均可用來作爲宿主。使用氯化#5法，如同在Sambrook等人，在前的第1.82節中的描述，可輕易地完成原核生物細胞的轉化。另外，亦可使用電穿透作用（Neumann等人，EMBO J. 1·· 841 (1982)) 來轉化這些細胞。藉著使經過轉化的細胞在抗生素上生長來篩選之，通常是使用四環素（tet)或氨芊青黴素（amp)，它們係因爲在載體上有及/或amp抗藥性基因的存在而表現出抗藥性。在選出經過轉化的細胞之後，使這些細胞在培養上生長，然後分離質體DNA (或帶有插入之外來基因的其他載體）。可使用此項技藝中已知的方法來分離質體DNA。兩個適當的方法是小規模的DNA製備及大規模的DNA製備 -46- 本紙張尺度適用中國國家標時（rNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -Φ. 訂 f 經满部中少標準局β〈,τ消贽告竹社印繁 1233946 A7 _________— B7 五、發明説明（44 ) ~ 則描述於Sambrook等人第1.25-1.33節中。分離質體以^之純化可藉由習知之方法，如Sambrook等人第1 4〇節中的描述來完成。然後藉著限制舆圖及/或DNA定序來分析經過純化的質體DNA。DNA定序通常是藉著Messing等人， Nucleic Acids Res· £·· 309 (1981)的方法，或 Maxam 等人， Meth· Enzymol·拉：499 (1980)的方法來完成。 4. 基因融合本發明之噬菌體親和力的步驟，企圖將編碼想要多肽的基因（基因1)與第二個基因（基因2)融合，使得在轉錄期間產生融合的基因。基因2通常是噬菌體的外殼蛋白質基因，且最好是噬菌體M13基因III外殼蛋白質，或其片段。基因1和2的融合，可藉著將基因2插入在含有基因1之質體上的特定位置，或藉著將基因丨插入在含有基因2之質體上的特定位置來完成之。將基因插入質體’需要在待插入該基因之精確位置處將該質體切開。因此，在該位置必需要有核酸内切限制酶位置（最好是獨特的位置，使得該質體在核酸内切限制酶消化期間，僅在單一之處被切開）。然後藉著將兩個DNA連接在一起’將該基因插入直線化的質體内。如果質體的末端與基因之末端是可相容的，便可完成連接作用。如果切開質體和分離待插入的基因都使用相同的限制酵素，則可使用諸如遂齒體T4 DNA連接酶之類的連接g每直接將dna 連接在一起’並在16C下’在ATP和連接酶緩衝溶液的存在下培養該混合物1_4小時，如同在sambrook等人，在前 -47- 本紙張尺度適州中國國家標,（("NS ) Λ4規格（210X]97公釐） ~'' 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 五、發明説明（45 的第1.68節中的描述。若支迪丁 σ 禾崎不疋可相容的，首先必須藉著使用DNA聚合酶I或噬菌髀 ^ 固T4 DNA聚合酶的Klenow片 ^和匕們#魏，k兩者都需要四種脱氧核糖核嘗酸三麟故來填滿已消化之DNA伸出的單_股末端。另夕卜，亦可使用諸如核酸酶S 1或綠豆枋龄故、』，核I酶 < 類的核酸酶將末端弄鈍，這兩種㈣酶係藉著修剪DNA伸出的單股而產生功能。然後按照上述利用連接酶來轉移DNA。在一些案例中’不可能弄純待插入之基因的末端，因爲將會改變密碼區的密碼。欲克服該問題，可使用寡核甞酸連接子。連接子擔任連接質體與待插入之基因的橋之聯責。這些連接子可利用標準方法，以合成方式來製造雙股或單股的 DNA。該連接子具有一個可與待插入基因相容的末端；先利用上述的連接方法將該連接子與該基因連接。爲了連接，將該連接子的另一端設計成可與質體相容。在設計連接子時，必須非常小心，不能破壞待插入之基因的密碼，或疋質體上所含有的密碼。在一些案例中，可能需要設計能夠編碼一部份胺基酸的連接子，或是能夠編碼一或多個胺基酸的連接子。在基因1和基因2之間，可以插入編碼終止密碼子之 DNA，這類終止密碼子爲UAG (號拍）、UAA (赭石）UGA (蛋白石），（Microbiology，Davis 等人，Harper & Row, New

York，1980，第237、245-247和274頁）。在野外型宿主細胞中表現終止密碼，導致基因1蛋白質產物的合成，而沒有附帶基因2蛋白質。然而，在抑制性宿主細胞中生長， -48 本紙張尺度用中國rNS ) Λ4規格（21 〇X 297公釐） IT------^— (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經淖部中决標率局β.τ.消於合竹社印f 1233946 A7 ----------------- B7 五、發明説明（46 ) 導致可檢測含量之融合蛋白質的合成。這類抑制性宿主細胞，含有;tRNA修改，以便在„^^^八的終止密碼子位置插入一個胺基酸，藉此導致可檢測含量之融合蛋白質的產生。已熟知並描述了這類抑制性宿主細胞，如大腸桿菌抑制者品系（BUll〇ck 等人，BioTechn〇1〇gies 5, 376 379 ㈦987》。可使用任何可接受的方法，將終止密碼子放在編碼融合多肽之的mRNA内。可在編碼多肽的第一個基因，與編碼至少—部份噬菌體外殼蛋白質的第二個基因之間，插入可校正密碼子。另外’亦可藉著置換該多肽中最後—個胺基酸三聯體，或是在嗤菌體外殼蛋白質中第-個胺基酸，在鄰近融合位置處插入可杈正終止密碼子。當含有可校正密碼子之韻體質體在抑制性宿主細胞中生長時，導致可檢測之含有該多肤和外殼蛋白質之融合多肽的產生。當該噬菌體質體在非_ 抑制I·生宿王細胞中生長時，合成大體上沒有與嗟菌體外殼蛋白質融合的多肽，係因爲在編碼UAG、uaa或uga之被插入的可校正三聯體處的終止。在非_抑制性細胞中合成多肽，並從該宿主細胞中分泌，是因爲缺少融合的噬菌體外殼蛋白質，其另外固定在宿主細胞上。 5· 基因1在選出位置處的改變（突變）可在一或多個選出的密碼子處改變編碼想要之多肽的基因1然而，必、須改變符合可同分異構化之天冬胺酸基殘基之密碼子。改變被定義爲在編碼多肽的基因中，取代、刪除或插人-或多個密碼子，與相同多肽之未改變或天然 _____— -49- 本紙張尺度剌? (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經滅部中决標準局員工消贽合竹社印來 1233946 A7 B7 五、發明説明（47 ) 的序列相比較，導致該多肽之胺基酸序列的變化。較佳的是，該改變係在該分子的一或多個區域中，藉著以任何其他的胺基酸來取代至少一個胺基酸。可藉著各種此項技藝中已熟知的方法產生改變。這些方法包括但不限於以寡核嘗酸-調節的突變生成和卡匣突變。 a. 寡核#酸-調節的突變生成寡核甞酸-調節的突變生成，是製備基因1之取代、刪除和插入變體的較佳方法。該技術是此項技藝中已知的，並由 Zoller 等人，Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504 (1987)描述。簡言之，藉著使編碼想要之突變的寡核誓酸與DNA 模板雜交，使基因1改變，其中該模板是含有基因1未改變或天然DNA序列之質體的單股形式。在雜交之後，使用DNA聚合酶來合成該模板之完整的第二個互補股，因此它將併入寡核甞酸引子，並將編碼基因1之選出的改 0 一般而言，使用具有至少25個核苷酸之長度的寡核甞酸。最佳的寡核甞酸將具有1 2到1 5個核甞酸，其對於在編碼該突變之核替酸兩側上的模板是完全互補的。這確保該寡核苷酸將正確地與單股DNA模板分子雜交。利用此項技藝中已知的技術，像是由Crea等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 2i_: 5765 (1978)描述的，迅速地合成寡核甞酸。 DNA模板僅可由那些衍生自噬菌體M13載體（一般可使用的（M13mpl8和M13mpl9是適當的），或是含有單股噬菌體起點或複製，如同Viera等人，Meth，Enzymol. 153: 3 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（21 OX 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部^^榜率局员工消费合俏如印象 1233946 kl ________ B7 五、發明説明（48 ) 〜 (1987)描述的那些載體所產生。因此，待突變的DNA必須被插入這些載體其中之一内，以便產生單股的模板。在 Sambrook等人，在前的第4.21-4.41節中描述了單股模板的產製。欲改變天然的DNA序列，在適當的雜交條件下，使寡核甞酸與單股的模板雜交。然後將DNA聚合酵素，通常是 DNA聚合酶的Klenow片段加入，使用作爲合成引子之寡核嘗酸來合成模板的互補股。如此形成異形雙螺旋鍵分子，一股DNA編碼基因1的突變形式，另一股（原始模板）則編碼基因1之天然的、未改變的序列。然後將該異形雙螺旋鏈分子轉化到適當的宿主細胞中，通常是諸如大腸桿菌JM-101之類的原核生物。在使細胞生長之後，將它們平舖在瓊脂糖板上，並利用以磷酸鹽標示的寡核嘗酸引子來篩選，以便確認含有突變DNA之細菌菌落。可修改上文描述的方法來產生同形雙螺旋鏈分子，其中質體的兩股都含有突變（群）。修改方式如下：使單股的寡核苷酸退火，成爲如同上述的單股模板。將三個脱氧核糖核甞酸：脱氧核糖腺:酸（dATP)、脱氧核糖鳥甞酸 (dGTP )和脱氧核糖胸腺核甞（dTTP )與經過修改的硫代-脱氧核糖胞甞酸，稱爲dCTP_(aS) (Amersham)混合。將該混合物加至模板-寡核嘗酸的複合物中。當將DNA聚合酶加至該混合物中時，產生一股除了突變鹼基乏外，確認爲模板的DNA。此外，該新股DNA將含有代體dCTP的dCTP-(aS)，係用來保護它免於核酸内切限制酶的消化。在利用 -51 - 本紙張尺度適州中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (謂先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 Ψ A7 B7 [233946 發明説明（伯）適當的限制酵素將雙股的昱形镡艘、 . 叉 J $雙螺旋鏈 < 模板股作出刻痕 ^後，可利用ΕχοΙΙΙ核酸酶或其他適當的核酸酶，越過含待致突變之位置的區域來消化該模板股。然後停止該反 j ’留下只是部份單股的分子。然後在全部四種脱氧核糖核甞酸三磷酸、ATP和DNA連接酶的存在下，使用dna聚合酶形成完整雙股DNA之同形雙螺旋鏈。然後如同上述，將該同形雙螺旋鏈分子轉化到諸如大腸桿菌JMi〇ii 類的適當宿主細胞中。可利用數種方式的其中一種，產生帶有一個以上胺基酸被取代的突變種。如果在多肽鏈中，胺基酸的位置緊靠在一起，可利用一個編碼所有想要之胺基酸取代的寡核甞酸使其同時突變。然而，如果胺基酸的位置彼此之間有一段距離（由超過大約1 〇個胺基酸分隔開），則較不易產生編碼所想要之變化的單一寡核甞酸。可改而使用一或兩個其他的方法。在第一個方法中，爲了每個待取代之胺基酸產生個別的寡核甞酸。然後使寡核甞酸退火，同時成爲單股的模板 DNA，而從該模板合成的第二股〇ΝΑ將編碼所有想要的胺基酸取代。另一種方法涉及二或多輪的突變生成，以便產生想要的突變種。第一輪按照有關於單一突變的描述·· 使用野外型DNA作爲模板，並使編碼第一個想要之胺基酸取代（群）的寡核甞酸對該模板退火，然後產生異形雙螺旋鏈的DNA分子。第二輪的突變則使用在第一輪突變中產生的突變DNA作爲模板。因此，該模板已經含有一或 -52- 本紙張尺度讁用中國國家標準（「NS ) Λ4規格（210X 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 參· 訂 f 1233946 ------------^ 五、發明説明（50 ) ~ 多個突變。然後使編碼另外想要之胺基酸取代（群）的寡核荅酸對譎模板退火，所得的DNA股現在編碼得自第_和第二輪突變生成作用的突變。可在第三輪突變生成作用中，使用所得的DNA作爲模板，等等。 b. 卡匣突變生成作用該方法亦是製備基因1之取代、刪除和插入變體的較佳方法。該方法係以Wells等人，Gene 34： 315 (1985)的描述爲基礎。起始物質爲包含基因1，待突變之基因的質體 (或其他載體）。確認在基因1中要突變的密碼子（們）。在已經確認之突變位置（們）的每一側都必須有一個獨特的核酸内切限制酶位置。若是沒有這類限制位置存在，則使用上述的寡核苷酸-調節之突變生成方法來產生之，以便將其導入基因1的適當位置。在已經將限制位置導入該質體内之後，在這些位置切開該質體，並將其弄直。利用標準程序合成編碼在該限制位置之間，但含有想要的突變（群）之DNA序列的雙股寡核苷酸。分別合成兩股，然後利用標準程序使其雜交在一起。將這個雙股的寡核甞酸稱爲卡匣。該卡匣被設計成具有與弄直之質體可相容的5,和3, 端，使得它們可以直接與該質體連接。現在該質體含有基因之經過突變的DNA序列。

6 · 獲得編碼想要蛋白質之DNA 在另外的具體實施例中，本發明企圖產製含有一或多個亞單元之想要蛋白質的變體。每個亞單元通常由個別的基因編碼。可藉著此項技藝中已知的方法（參見例如第11節） -53- 本紙張尺度適用中國國家標蜂（(^ )/\4規格（210父297公釐） *~ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 B7 51 經滅部中决標率局员二消贽合竹社印％ 1233946 五、發明説明（獲得編碼每個亞單元的各個基因。在一些實例中，可能需要使用選自任何在第II節中描述之方法的不同技術，獲得編碼各種亞單元的基因。當建構其中感興趣之蛋白質含有一個以上亞單元的可複製表現載體時，所有的亞單元均可由相同的啓動基因調節’通常是位在編碼亞單元之DNA的5,端，或是分別由相同的啓動基因調節，通常是位在編碼亞單元們之DNA的5，端’或者分別由在載體中適當定位的不同啓動基因調節，使得每個啓動基因均以可操作之方式，與它們企圖去調節的DNA連接。按照在上文第in節中的描述來進行啓動基因的選擇。在建構含有編碼感興趣並具有多重亞單元之蛋白質的 DNA的可複製表現載體時，讀者參考圖u，其中經由解釋，以圖解説明載體，顯示編碼抗體片段中每個亞單元的 DNA。該圖顯示通常感興趣之本發明的一個亞單元與諸如M13基因III之類的噬菌體外殼蛋白質融合。該基因融合通常將包含它自己的信號序列。編碼其他亞單元或亞單元群的個別基因，顯然每個亞單元通常都具有它自己的信號序列。圖1 1亦顯示單一的啓動基因可調節兩種亞單元的表現。另外，每個亞單元也可獨立地由不、同的啓動基因來調節。可按照在上文第IV節中的描述來製造感興趣之蛋白質亞單元·噬菌體外殼蛋白質融合構築體g 當建構-群想要多重-亞單元蛋白質的；體時，可使在載體中編碼每個亞單元的DNA在每個亞單元的一或多個 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

54 1233946 A7 B7 五、發明説明（52 )

位置處突變。當建構多重_亞單元之抗體變體時，突變生成的較佳位置相當於編碼位在輕鏈、重鏈或兩種鏈之互補 -決疋區（CDRs )上之胺基酸殘基的密碼子。cdrs通常也稱爲高變區。使編碼感興趣蛋白質之每個亞單元的dNA 發生犬’4的方法，大體上按照在上文第v節中的描述來經營。 7·製備標靶分子並與噬菌體質體結合標靶分子，像是受體，可從天然的來源中分離，或藉著此項技藝中已知的程序，藉著重組方法來製備，經由解釋’糖蛋白荷爾蒙受體可藉著在McFarland等人，Science Mi: 494-499 (1989)中描述的技術來製備，在大腸样菌中表現的非糖蛋白形式則藉著Fuh等人，j Bi〇1 Chem組： 3111-3115 (1990)中的描述來製備。其他的受體可藉著標準方法來製備。 M漓部中次標缚局員,τ消贽告竹社印f (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 可將經過純化的標靶蛋白質附接到適當的基質上，像是瓊脂糖小球、丙缔醯胺小珠、玻璃珠、纖維素、各種丙烯共聚物、異丁烯酸羥烷基酯凝膠、聚丙烯酸和聚異丁晞酸共聚物、尼龍（nylon)、中性和離子性之載劑及其類似物。將該標靶蛋白質附接到基質上的作用，可藉著在 Methods in Enzymol. 44 (1976)中描述的方法，或藉著其他此項技藝中已知的方法來完成。將該標靶蛋白質附接到基質上之後，使固、定之標靶與噬菌體質體顆粒，在適合至少一部份噬菌體質體顆粒與固定標靶結合的條件下接觸。通常包括pH値、離子強度、溫 ___— -55- 石紙張尺度‘用~中國國家標率（CNS ) ^4規格（2】GX297公釐)' ----- 1233946 經消部中决摞準局KJ-消費告竹社印40水 A7 -—---—----— _二五、發明説明（53 ) -- 度及其類似者的條件將模仿生理條件。藉著冲;洗從具有低親和力（因此未與標靶結合）的那些中刀離出對固足標革巴有高親和力之已結合的噬菌體質體顆粒 (二結合者"）。藉著各種方法使結合者從固定標靶上解離。，些方法包括藉著各種方法從固定標靶上的競爭性解離。 k些万法包括使用野外型配體，改變pH値及/或離子強度，以及此項技藝中已知之方法的競爭性解離作用。以結合者和輔助噬菌體來感染適當的宿主細胞，並在適合擴大該噬菌體質體顆粒的條件下培養該宿主細胞。然後收集噬菌體質體顆粒，並重覆選擇過程一或多次，直到結合者對選出之標乾分子具有想要的親和力爲止。士可視需要使噬菌體質體顆粒庫與一種以上的固定標靶連續接觸，來改良對特定標靶的選擇性。例如，經常是在配體的案例中，像是hGH，具有一個以上的自然受體。在 hGH的案例中，生長激素受體和催乳激素受體兩者都與 hGH配體結合。可能想要改良hGH的選擇性，使其對生長激素受體的選擇性勝過對催乳激素受體的。這可藉著首先使噬菌體質體顆粒庫與固定的催乳激素受體接觸，洗脱對催乳激素具有低親和力者（也就是比野外型hGH更低的），然後使低親和力之催乳激素”結合者”或未·結合者與固定的生長激素受體接觸’並選出高親和力之生長激素受體系士合者而達成。在該案例中，對催乳激素受體具有低親和力之hGH突變種將具有治療利用性，即使其對生長激素受體的親和力有時比野外型hGH更低。可使用相同的策略來改 -56- 紙張尺度適用中國國家標率（(、NS ) Λ4規格（210X—297公釐）— --- (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經‘部中决桴準局员-J-消贽合竹、社印來 1233946 A7 ---------------B7 五、發明説明（54 ) '~~一- . - 良特疋何爾家或蛋白質對其主要功能受體的選擇性，使其勝過它的，清除受體。八在&本發明的其他具體實施財，可獲得改良的受酶質胺基酸序列。每可用來製造蛋白質連接子之較佳的”切開位置或較佳的蛋白質酶受酶質/抑制劑。在該具體實施例中，使固足的分子（例如hGH)受體、生物素·抗生物素蛋白，或能夠與基質共價連接著，通過連接子與基因卬融奋。忒連接子的長度最好是從3到丨〇個胺基酸，並將擔任蛋白酶的受酶質。將按照上述來建構噬菌體質體，其中使編碼連接子區域的DNA任意地突變，產生在連接位置處帶有不同胺基酸序列的噬菌體質體顆粒的隨意庫。然後將邊噬菌體質體顆粒庫固定在基質上，並暴露在想要的蛋白酶下。將洗脱出在直線區對於想要的蛋白酶具有較佳或較好受酶質之胺基酸序列的噬菌體質體顆粒，首先產生編碼較佳連接子的噬菌體質體之豐富聯合體，然後使這些噬菌體質體顆粒再循環數次，產生編碼一致序列（群）的顆粒之豐富聯合體。 Π·抗體的產製可利用自此項技藝中可獲得的技術來製備起始抗體，或產生這類的抗體。產生抗體的代表性方法，在下列的章節中有更詳細的描述。抗體係針對感興趣的抗原。較佳的是，抗原爲在生物學上很重要的多肽，將抗體投予患有該疾病或失調之哺乳動物，可在該哺乳動物中產生治療的利益。然而，亦企圖包 -57- 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) Λ4規格（2】〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 訂 A7 1233946 五、發明説明（55 ) ^^- 括對抗非多肽抗原（像是與腫瘤有關之瓊脂抗原；表見美國專利第，5,091，178號）之抗體。夕在抗原爲多肽之處，它可以是穿透膜的分子（例如受體）或配體，像是生長因子。代表性的抗原包括諸如腎浩^^之類的分子；生長激素，包括人類生長激素和牛生長激素生長激素釋放因子；副甲狀腺激素；胰增血糖激素；凝固因子，如蛋白質C ;心房利尿因子；肺表面作用劑；^纖維蛋白溶酶原激活素（tPA);蛙皮素；凝血酶；血球生成的生長因子；腫瘤壞死因子_仪和_卢；腦啡肽酶； RANTES (調節τ-細胞表現和分泌之正常激活作用人類巨=細胞炎症性蛋白質;血清白蛋白，如人類血清白蛋白；苗勒氏管-抑制物質；恥骨鬆弛激素八_鏈；恥骨鬆弛激素B-鏈；恥骨鬆弛激素原；老鼠與促性腺激素有關的肽；微生物蛋白質；像是/?_内醯胺酶；DNA酶； IgE ;與殺手T_淋巴球有關的抗體（CTLA)，如cTLA_4 ; 抑制素，激活素；血管内皮生長因子（VEGF );荷爾蒙或生長因子的受體；蛋白質A或D ;類風濕因子；神經營養因子如牛-竹生之神經營養因子（BDNF )、神經營養因子 3、 4、 5 或 6 (NT-3、NT_4、NT-5 或 NT-6)，或神經生長因子’如NGF—卢、血小板-衍生之生長因子（PDGF); 纖維母細胞生長因子，如aFGF和bFGF ;上皮生長因子 (EGF);轉化生長因子（TGF)，如TGF_a * TGF-yS，包括 TGF-/5 1、TGF-0 2、TGF-y3 3、TGF-A4 或 TGF-y55 ;類- 騰島素生長因子和(IGIM和IGF_n) (腦 ____________ _ 58 - 本紙張尺度 (7^7^-21_GX 297—)- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 t 經Μ部中次摞率扃βχ消費合竹社印來 ΑΊ 1233946 Β7 五、發明説明（66 ) IGF-I)、類-胰島素生長因子結合蛋白質；CD蛋白質，如 CD3、CD4、CD8、CD19和CD20 ;促紅血球生成素；骨謗導因子；免疫毒素；骨形態發生的蛋白質（BMP);干擾素，如干擾素、-0和-r ;菌落刺激因子（CSFs )，如M-CSF、GM-CSF 和 G-CSF、介白素（IIs)，如 IL-1 至 IL-10 ; 超氧物歧化酶；T-細胞受體；表面膜蛋白質；回家 (homing)受體；安垂斯素（adressins);調節蛋白質；整合素，如 CDlla、CDllb、CDllc、CD18 和 ICAM、VLA-4 和 VCAM ;與腫瘤有關的抗原，如HER2、HER3或HER4受體；以及任何上文-列舉之肽類的片段。本發明包含之抗體的較佳分子標靶，包括CD蛋白質，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20 和 CD34 ; ErbB受體家族之成員，如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；細胞黏連分子、如 LFA-1、Macl2、pl50、95、VLA-4、 ICAM-1、VCAM和整合素，包括其仪和亞單元 (例如抗-CDlla、抗-CD18或抗-CDllb抗體）；生長因子，如VEGF ; IgE ;血型抗原；flk2/flk3受體；肥胖（〇B)受體；mpl受體；CTLA-4 ;蛋白質C等等。特佳的標靶爲 IgE。抗體對衍生自第一個哺乳動物物質之抗原昇高。較佳的第一個哺乳動物物種爲人類。然而，亦可包含其他的哺乳動物，如農場動物、寵物或動物園的動物，、例如在企圖以該抗體來治療這類動物之處。爲了產生針對該抗原的抗體，可從其天然來源中分離得自第一個哺乳動物物種的抗 -59· ^紙張尺度適用净(frNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經淆部中决標洋局員,τ消贽合竹私印來 1233946 A7 B7 經淖部中次標卑局員工消贽合竹社印來五、發明説明（57 ) 原。然而，如同下文提及的，可使用包含該抗原之細胞作爲製造抗體的免疫原。在其他的具體實施例中，以重組方式產製或使用其他的合成方法來製造抗原。通常選擇對該抗原具有足夠強之結合親和力的抗體。例如，與得自第一個哺乳動物物種之抗原結合的抗體，具有不超過大約1 X 10_7 Μ的結合親和力（Kd)値，較佳的是不超過大約1 X 1(Γ 8 Μ，而最佳的是不超過大約1 X 10_9 Μ。可藉著例如飽和結合作用；酵素連結之免疫吸附作用（ELISA)和競爭性試驗（例如RIA)來定出抗體的親和力。亦可使抗體接受其他的生物活性試驗，例如爲了評估其作爲治療劑的效力。這類試驗是此項技藝中已知的，並依據標靶抗原和企圖使用之抗體而定。實例包括角化細胞單層黏附試驗，和CDlla之混合淋巴球反應（MFR)試驗（分別在下文的實例中描述）；腫瘤生長抑制試驗（例如，如同在W0 89/06692中的描述）；抗體依賴性細胞胞毒（ADCC) 和補體-調節的胞毒（CDC)試驗（美國專利第5,500,362 號）；以及激動劑活性或造血試驗（參見WO 95/27062 )。欲篩選與在感興趣之抗原上的特定抗原決定位結合的抗體，例如阻斷MHM24抗體之結合的那些，可執行例如的交叉-阻斷試驗，如同在 Antibodies，A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory，編者 Harlow 和 David Lane (1988)。另外，可進行抗原決定位的緣圖，例如，在 Champe 等人，J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995)中的描述，決定抗體是否與感興趣的抗原決定位結合。 -60- i紙張尺度適用中國國家標埤（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 ________ _________ B7 五、發明説明（58 ) 一然後決定抗體的物種依賴性。利用諸如上述的那些技術來評估抗體對於用來產製該抗體之抗原同系物的結合親和力（其中該同系物係得自”第二種哺乳動物物種，，）。在較佳的具體實施例中，第二種哺乳動物物種爲非人類的哺乳動物’在臨床前的研究中將對其投予抗體。因此，第二種哺乳動物物種可以是非人類的靈長類，像是恒河猴、獼猴類的一種（cyn〇m〇lgus)、狒狒、黑猩猩和獼猴。在其他的具體實施例中，第二種哺乳動物物種可以是例如噶齒類、貓或狗。物種_依賴性之抗體通常將對得自第二種非人類之哺乳動物物種的抗原具有結合親和力，比其對得自第一種哺乳動物物種之抗原的結合親和力，弱至少大約5〇倍，或至少大約500倍，或至少大約1〇〇倍。結合親和力通常將使得物種-依賴性之抗體不能有效地使用在臨床前研究中的第二種哺乳動物物種上。決定物種-依賴性（並評估具有改良特性之抗體突變種；參見下文）之本發明的較佳方法，{定量抗體的結合親和力，在本發明的其他具體實施例中，評估該物種依賴性之抗體和抗體突變種的一或多個生物學特性，除此之外或改而結合親和力的決定。代表性的這類生物試驗爲上文描述的。在其作爲抗體之治療效力的指標時，這類試驗是特別有用的。通常，雖然不是-定的，在這類試驗中顯示出改艮特性的抗體亦將具有增強的結合親和力、。因此，在本發明的-個具體實施例中，選擇試驗是與結合親和力試驗不同的生物活性試驗，物種.依賴性之抗體，在使用得自 ________ -61 - 本紙張尺廋適用:學7⑶S「Λ4規格（210x37^7 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 ________________ B7_ 五、發明説明（59 ) 第二種哺乳動物物種之”物質"（例如抗原、細胞、組織、器官或整隻動物）時所具有的生物活性，其效力通常比其在使用得自第一種哺乳動物物種之試劑的相對應試驗中的生物活性，低至少大約50-倍，或至少大約5〇〇倍，或至少大約1000倍。然後改變物種·依賴性抗體，使得所產生的抗體突變種，對得自第二種哺乳動物物種的抗原，具有比該物種_ 依賴性抗體更多的結合親和力。該抗體突變種對於得自非人類之哺乳動物抗原的結合親和力，較好是具有比該物種 -依賴性抗體對該抗原之結合親和力，強至少大約1 〇倍，較佳的是強至少大約2 0倍，更佳的是強至少大約500倍，而有時是強至少大約100或200-倍。想要或需要的結合親和力的增強，將依據物種-依賴性抗體最初的結合親和力而定。然而，使用的試驗爲生物活性試驗，抗體突變體在選擇試驗中最好具有生物活性，其比物種-依賴性抗體在该試驗中之生物活性，至少大約好1 〇〇倍，較佳的是至少大約好2 0倍，更佳的是至少大約好5 0倍，而有時至少大約好100倍或200倍。經满部中决標率局消贽合竹社印¥ 欲產生抗體突變體，可將一或多個骨架區殘基的胺基變化（例如取代）導入物種·依賴性抗體，產生在抗體突變體對自第二個哺乳動物物種之抗原的結合親和力上的改良。修改骨架區殘基的實例包括非共價直接結合抗原（Amit等人，Scirence 211: 747-753 (1986));交互作用 /影響 CDR 的構型（Chothia等人 ’ J· Mo. Bi〇i 196: 901-917 (1987));並/ -62· 本紙張尺CNS ) A4^m ΓΙκ)^ 297^1 )~" 1233946 經淖部中决標導局負Τ,消fr合竹如印繁 A7 ---------------- --- B7 五、發明説明（60 ) ~ ^ ^ 或參與VL-VH介面（歐洲專利239 400 B1號）。在某些具體實施例中’這類骨架區殘基的一或多個修改，導致抗體對知自第二個哺乳動物物種之抗原之結合親和力的增強。例如’在本發明的具體實施例中，可改變從大約1到大約5 個目未殘基。有時，這樣足以產生適用於臨床前試驗之抗體突變種，即使未改變任何一個高變區的殘基。然而，抗體突變種通常將包括額外的高變區之改變。被改變的高變區殘基可任意地變化，特別是在物種-依賴性抗體對得自第二種哺乳動物物種的起始結合親和力之處，以便能夠輕易地篩選這類任意產生的抗體突變種。產製抗體的技術，它可能是物種-依賴性的，因此需要根據在本文中詳細陳述的技術，如下來修改之： A·抗體製備 (i)抗原製備可利用可視需要與其他分子連結的可溶性抗原或其片段’作爲產製抗體的免疫原。關於穿透膜分子，像是受體其片段（例如受體的細胞外之功能部位）亦可用來作爲免疫原。另外’亦可利用表現穿透膜分子之細胞作爲免疫原。這類細胞可衍生自天然的來源（例如癌症細胞株），或可能已經藉著重組技術轉化細胞，來表現穿透膜分子。熟諳此藝者將知曉其他可用來製備抗體的抗原及其形式。 (ϋ)多株抗體多株抗體較好是在非-人類的哺乳動物中，藉著多次皮下（SC )或腹腔内（ip )注射有關的抗原和佐劑而使其昇高。 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS—) Λ4規格（21〇ί 297公釐） —〜' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

1233946 A7 — ---— ----------— B 7 五、發明説明（61 ) 利用兩種功能或衍生之製劑，例如順丁晞二酿亞胺基苯甲醯基磺基琥珀醯亞胺酯（經由半胱胺酸殘基連結）、n_羥基號ί白醯亞胺（經由離胺酸殘某彳 Λ — 狀敗汊丞）、戊一醛、琥珀肝、亞硫醯氣或R^CR’其中糾是不同的烷基基團，將有關的抗原與對將要免疫之物種而言爲免疫原性的蛋白質連結可能是有用的’例如鎖孔貝血藍質、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。藉著將例如100微克或5微克的蛋白質或共軛物（分別爲兔或老鼠）與3份體積的弗瑞德（Freund，s)完全佐劑混合，並在複數個位置處皮内注射該溶液，使動物對該抗原、免疫原共軛物或衍生物免疫。在一個月之後，以1/5到 I原始含量的肽，或是在弗瑞德完全佐劑中的共軛物，在複數個位置處藉著皮下注射來補強動物。7到丨4天之後，將動物採血，並測試血清的抗體力價。補強動物直到達到力價高原爲止。最好是利用具有相同抗原，但是與不同的蛋白質結合，並/或經由不同的交聯試驗結合之共軛物來補強動物。亦可在重組的細胞培養之蛋白質融合作用中製造該共軛物。此外，諸如明礬之類的聚集劑亦適合用來增強免疫反應。選出之哺乳動物抗體通常將對該抗原具有足夠強的結合親和力。例如，可結合人類抗_IgE抗原之抗體，帶有不超過大約1 χ10_7 Μ之結合親和力（Kd)値，較佳的是不超過大約1 X 1〇-8，而最佳的是不超過大約1 x 10-9 M。可藉著飽和結合作用定出抗體親和力：酵素連結之免疫吸附試驗 -64- 本纸張尺度诚用中國國家標準（（、奶）/\4規格（210父297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T f 1233946 Δ7 Α7 Β7 五、發明説明（62 ) (ELIS A );以及競爭性試驗（例如放射性免疫試驗）。欲篩選，人類抗-IgE抗體，可進行例行的交聯試驗，如同在 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，編輯Harlow 和 David Lane (1988)中的描述。另夕卜，可進行抗原決定位的作圖，例如按照在Champe等人，J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995)中的描述，來測定結合作用。決定多肽或抗體之效力的較佳方法，是經由抗體結合親和力的定量，其他的具體實施例想像評估該抗體的一或多種生物學特性，或改爲結合親和力的測定。這類試驗在提供抗體之治療效力的指標時是特別有用的。通常，雖然不是必要的，在這類試驗中顯示出改良特性之抗體，亦將具有增強的結合親和力。 (iii)單株抗體經消部中决掠準局貝,τ消贽合竹ii印來 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 單株抗體爲辨認單一抗原位置的抗體。它們獨特的專一性使得單株抗體比通常含有辨認各種不同抗原位置之抗體的多株抗體更加地有用。可思考首先由Kohler等人， Nature，256： 495 (1975)描述的融合瘤方法，或藉著重組 DNA法（美國專利第4,816,567號）來製造單株抗體。在融合瘤方法中，按照在上文中的描述將老鼠或其他適當的宿主動物免疫，如倉鼠或獼猴，謗發產生或能夠產生抗體的淋巴球，該抗體將會專一地與用來免疫的蛋白質結合。另外，可在活體外免疫淋巴球。然後使用適當的融合劑將淋巴球與骨髓瘤細胞融合，如聚乙二醇，形成融合瘤 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準（ΓΝ8 ) Λ4規格（210X297公釐） 1233946 A7 B7 經Μ部中决標率局β〈_τ消贽合竹私印繁五、發明説明（63 ) 細胞（Goding， Monoclonal Antibodies: Principals and Practice ’ 第 590-103 頁（Academic Press，1986))。將如此製備之融合瘤細胞播種到適當的培養基中並使其生長’該培養基最好是含有一或多種抑制未融合之親代骨聽瘤細胞生長或存活的物質。例如，若親代骨髓瘤細胞缺少酵素次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶（HGPRT或 HPRT )，則融合瘤的培養基通常將包含次黃嘌呤、胺基蝶呤和胸腺嘧啶（HAT培養基），該物質阻礙缺乏-HGPRT細胞的生長。較佳的骨髓瘤細胞是有效地融合，藉著選定產製抗體的細胞支持穩定高-含量之抗體產製，並對諸如HAT培養基之類培養基有感受性的那些。在這些之中，較佳的骨髓瘤細胞株爲老鼠骨髓瘤細胞株，像是衍生自從Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego，California USA 獲得之 MOPC-21和MPC-11老鼠腫瘤的那些，以及衍生自從 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA 獲得之SP-2或X-63-Ag8-653細胞的那些。爲了產製人類單株抗體，已經描述了人類骨髓瘤和老鼠-人類異種骨髓瘤細胞株（Kozbar，J. Immunol. 133: 3001 (1984) ; Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 51-63 頁（Marcel Dekker，Inc，New York， 1987)” 分析使融合瘤細胞在其中生長的培養基，有關針對抗原之單株抗體的產生。較佳的是，藉著免疫沉澱法或藉著在 -66- 本紙張尺度適用中國國家標嘩（（、NS ) Λ4規格（21〇X 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ

、1T 1233946 A7 B7 五、發明説明（64 ) 活體外的結合試驗，如放射性免疫試驗（RIA)或酵素連結之免疫吸附試驗（ELISA )，定出由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合專一性。在確認融合瘤細胞產生具有想要專一性、親和力及/或活性的抗體之後，藉著限制稀釋程序將該純種系繼代，並藉著標準方法使其生長（Goding，Monoclonal Antibodies: Principals and Practice ，第 59-103 頁，Academic Press， 1986)。適合此一目的的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，也可使融合瘤細胞在活體内生長，像是在動物中的腹水腫瘤。從培養基、腹水液體或血清中，藉著傳統的免疫球蛋白純化程序，像是例如蛋白質A·瓊脂糖、羥磷灰石層析法、凝膠電泳法、透析法或親和力層析法，適當地分離由繼代純種系分泌的單株抗體。使用傳統的程序（例如藉著使用能夠專一性結合編碼該單株抗體之重鏈和輕鏈之基因的寡核甞酸引子），可輕易地分離編碼該單株抗體之DNA，並定序之。融合瘤細胞最好是擔任這類DNA的來源。一旦分離出來，可將該 DNA置於表現載體内，然後將其轉移至不另外產生免疫球蛋白蛋白質，諸如大腸桿菌、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢（CH0 )細胞，或骨髓瘤細胞之類的宿主細胞中，在重組的宿主細胞中獲得單株抗體的合成。在卞文中將更詳細地描述單株抗體的重組產製方法。在較佳的具體實施例中，可從使用在McCafferty等人， -67- 本紙張尺度適用中ΐί國家標埤（rNS ) Λ4規格（210'乂 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7五、發明説明（65 ) Nature 348.： 552-554 (1990)中描述之技術產製的抗體噬菌體庫來分離抗體或抗體片段。Clackson等人，Nature m: 624-628 (1991)和 Marks 等人，J. Mol· Biol. 222： 581-597 (1991)分別描述利用噬菌體庫來分離老鼠和人類的抗體。後續的出版物描述藉著將鏈移來移去（chain shuffling) (Marks等人，Bio/Technologyi£: 779-783 (1992))，以及組合式感染和在活體内的重組作用，如同建構非常大之噬菌體庫時的策略（Waterhouse 等人，Nuc. Acids. Res. 21_: 2265· 2266 (1993))來產製高親和力（nM範圍）的人類抗體。因此，這類技術是傳統單株抗體融合瘤技術以外，另一種可實行之分離單株抗體的方法。亦可修改DNA，例如藉著取代人類重鏈和輕鏈恒定功能部位的密碼，代替同源的老鼠序列（美國專利第4,816,567 號；Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 紅：6851 (1984))，或藉著共價連接免疫球蛋白多肽。通常，這類非-免疫球蛋白的多肽，可用抗體的恒定功能部位取代，或用抗體的一個抗原-混合位置之可變功能部位來取代，產生嵌合型二價抗體，其包括一個對抗原具有專一性的抗原-混合位置，以及另一個對不同抗原具有專一性的抗原-混合位置。 (iv)突變抗體的產生一旦已經確認並分離出物種-依賴性之抗體，通常可用來產製各種不同的抗體或突變種，其中在哺乳動物抗體的一或多個高變區中有一或多個胺基酸殘基的改變。另外， -68- 呆紙張尺度適州中國國家標缚（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） ---------------訂------ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經¾‘部中次標導局员T消贽合竹私印繁 1233946 A7 五、發明説明（66 ) 或除此之外，亦可將一或多個骨架殘基的改變（例如取代作用）導入哺乳動物抗體中，這些結果導致抗體突變體對人類IgE之結合親和力的改變。修改骨架區殘基的實例包括非-共價地直接結合抗原（Amit等人，Science 233: 747-753 (1986);交互作用/影響CDR的構型（Chothia等人，J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987);及 / 或參與 VL-VH 介面（歐洲專利239 400 B1號）的那些。在某些具體實施例中，一或多個這類骨架殘基的修改，導致該抗體對人類抗原之結合親和力的增強。例如，在本發明的具體實施例中，可改變從大約一到大約五個骨架殘基。有時，這樣足以產生適合用於臨床前試驗的抗體突變種，即使其中未曾改變任何一個高變區的殘基。然而，通常抗體突變種將包含額外的高變區之改變。可任意更改要改變的高變區殘基，特別是在物種-依賴性抗體的起始結合親和力之處，使得能夠輕易地篩選任意產生的抗體突變種。一種產製抗體突變種的有效程序，是已知爲’’丙胺酸掃描突變生成 ’’（Cunningham，B.C。和 Wells，J.A·，Science 244: 1081-1085 (1989); Cunningham，B.C·和 Wells, J.A.，Proc. Natl· Acad. Sci. USA M: 6434-6437 (1991))。在這裏藉著丙胺酸或聚丙胺酸殘基（群）來置換一或多個高變區殘基 (群），影響胺基酸與得自第二種哺乳動物物種之抗原的交互作用。然後藉著在取代位置導入更多或其他的突變，來改善證明在功能上對該取代作用有感受性的那些高變區殘 -69 - ^紙張尺度i用中國國家標蜂（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） --------Φ------1T------Φ— (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中决楞率局员_τ消贽合竹社印f 1233946 A7 _____ B7 一^__ 一 _ τ____________—__ —— - _ 五、發明説明（67 ) 基（群）。因此，預先決定導入胺基酸序列變化的位置，不需要預先決定突變本身的性質。如同在本文中的描述，篩選以此方式產生之ala-突變種的生理活性。依據由掃描殘基所給與的想要性質，利用其他的胺基酸嘗試類似的取代作用。本發明亦提供更多確認要修改之胺基酸殘基的系統方法。根據該方法，在物種-依賴性抗體中辨認出一個高變區殘基，其涉及與第一個哺乳動物物種的結合，且那些高變區殘基涉及得自第二個哺乳動物物種之抗原同系物的結合。欲達成此工作，可進行物種-依賴性抗體之高變區殘基的丙胺酸掃描，將測試每個ala-突變種對第一個和第二個哺乳動物物種的結合。藉此來確認涉及與得自第一個哺乳動物物種（例如人類）之抗原結合的高變區殘基，和涉及與知自第一個哺乳動物物種（例如非人類）之抗原同系物結合的那些。較佳的是，選出明顯涉及與得自第二個哺乳動物物種（例如非人類的哺乳動物）之抗原結合，但不與得自第一個哺乳動物物種（例如人類）之抗原結合的那些殘基 (群）來作爲修改的候選者。在其他的具體實施例中，選出明顯涉及與得自第一個和第二個哺乳動物物種兩者之抗原結合的那些殘基（群）來進行修改。在更進一步，但並非較佳得的具體實施例中，選出涉及與得自人類IgE之抗原結合，但不與同源的哺乳動物（非-人類）IgE結合的那些殘基來修改。這類修改可能涉及殘基的删除，或是在感興趣的殘基附近插入一或多個殘基。然而，通常修改作用涉及 _______ -70- 呆紙張尺度1¾ A中國國家標哗(CNsTm^ ( 210X297^f ) 一 "— ---~- --------Φ------IT------φ— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} ~---— 1233946 A7

B 五、發明説明（69 )

Leu (L) 正亮胺酸，ile，val，met， ala, phe ile UUA，UUG， CUA，CUC， CUG，CUU Lys (κ) arg，gln，asn arg AAA, AAG Met (Μ) leu，phe，ile leu AUG Phe (F) leu, val，ile，ala，tyr leu UUC，UUU Pro (P) ala ala CCA，CCC, CCG，CCU Ser (S) the thr AGC，AGU， UCA，UCC， UCG，UCU Thr(T) ser ser ACA，ACC， ACG，ACU Trp (W) tyr, phe tyr UGG Tyr (Y) trp, phe，thr，ser phe UAC，UAU Val (V) ile, leu, met, phe, ala, 正亮胺酸 leu GUA，GUC， GUG，GUU (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經Μ部中次掠卑局貝,τ消贽合竹社印f 即使藉著選擇取代作用在抗體的生物特性中完成更重大的修改，在其對於維持（a )在取代區之多肽骨架的結構，例如像是片狀或螺旋構型；（b)該分子在標靶位置處的電荷或忌水性，或（c)側鏈的大小的影響上有顯著差異。以共同的側鏈特性爲基礎，將天然存在之殘基分類： (1) 忌水性的：正亮胺酸、met、ala、val、leu、ile ; (2) 中性忌水性的：cys、ser、thr、asn、gin ; (3) 酸性的：asp、glu ; -72- 本紙張尺度適用中國國家標率（rNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明説明（70 (4) 鹼性的：his、lyS、arg ; (5) 影響鏈方位的殘基：gly、ρΓ〇 ;以及 (6) 芳香族的：bp、tyr、phe。非保留性置換將引起這些類型中的一個成員與其他類型交換。可藉著此項技藝中已知的各種方法來製備編碼胺基酸序列犬變種的核酸分子。這些方法包括但不限於稍早製備之突變種，或非_突變版本之物種依賴性抗體的寡核甞酸_調即（或指足位置）之突變生成、pCR突變生成，和卡匣突變生成。製造突變種的較佳方法爲指定位置之突變生成（參見 Kunkel，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 拉：488 (1985))。在某些具體實施例中，抗體突變種僅有單一的高變區殘基被取代’例如從大約兩個到大約十五個高變區取代。一般而1： ’具有改良之生物特性的抗體突變種將具有與胺基酸序列，或哺乳動物抗-人類IgE抗體之重鏈或輕鏈可變功能部位，有至少75%胺基酸序列同一性或類似性的胺基酸序列，較佳的是至少80%，更佳的是至少85%，再佳的是至少90%，而最佳的是至少95%。關於該序列的同一性或類似性，在本文中被定義爲在候選序列中胺基酸殘基’在排成一直線並如果需要導入缺口之後，與物種-依賴性抗體殘基相同（也就是相同的殘基）或類似（也就是胺基殘基係得自以前文中共同侧鍵之特性爲基礎的同類）的百分比，達到最高百分比的序列同一性。另外，亦可藉著抗-IgE抗體之重鏈和輕鏈之CDR區的系 -73- 本紙張尺度適用中國國家標净（rNS ) Λ4規格（2ι〇'χ297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 A7 B7五、發明説明（71 ) 統性突變，產生抗體突變種。產生這類抗體突變種的較佳程序，涉及使用嗤菌體表現的親和力突變（Hawkins等人， J. Mol. Biol. 254: 889-896 (1992)和 Lowman 等人， Biochemistry 3 0(45): 10832-10838 (1991))。已知嗤菌體外殼-蛋白質的融合作用（Smith，Science 228: 1315 (1985))； Scott 和 Smith，Science 249: 386 (1990) ; Cwirla 等人，Proc· Natl. Acad. Sci. USA 及：309 (1990) ; Devlin 等人，Science 249: 404 (1990);由 Wells 和 Lowman，Curr. Opin. Struct· Biol· 1: 597 (1992)回顧；美國專利第5,223,409號）可用來將表現蛋白質或肽的表現型與編碼其之噬菌體顆粒的基因型連接。亦已經在噬菌體上表現抗體之F(ab)功能部位 (McCafferty 等人，Nature 341： 552 (1990) ; Darbas 等人， Proc· Natl. Acad. Sci· USA Μ: 7978 (1991) ; Garrard 等人， Biotechnol·泛· 1373 (1991)) 〇單價的噬菌體表現包括以與噬菌體外殼蛋白質融合的方式表現一組蛋白質變體，如此可限制該變體的表現，每數個噬菌體顆粒僅有一個副本（Bass等人，Proteins 309 (1990)。先前已經經由連續應用突變生成、單價噬菌體表現、功能分析並加入優惠突變，達成親和力突變或各種蛋白質之改良平衡的結合親和力，例如在人類生長激素 (Lowman & Wells, J. Mol. Biol. 234： 564-578 (1993);美國專利第5,534,617號），以及抗體之F(ab)功能部位（Barbas 等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA £1: 3809 (1994) ; Yang 等人，J· Mol. Biol· 254： 392 (1995))的案例中。 -74- 本紙張尺度適用中國國家標率（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） --------#------、玎------f (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) MM部中决標準局MJ·.消贽合竹衫印¥ 1233946 A7 ________________B7 五、發明説明（73 ) 之序列，篩選嚅齒類抗體的可變功能部位之序列。然後接納最接近嚅齒類之人類序列作爲人類化抗體的人類骨架 (Sims 等人，J. Immunol. 1ϋ： 2296 (1993) ; Chothia 等人，J. Mol· Biol. 1M: 901 (1987))。其他的方法則使用特定的骨架，其衍生自具有特定亞組之輕或重鏈的所有人類抗體的一致序列。對於數個不同的人類化抗體，可使用相同的骨架（Carter 等人 ’ Proc· Natl. Acad· Sci. USA 89.: 4285 (1992) ; Presta 等人，J. Immunol. 151: 2623 (1993))。更重要的是，被人類化的抗體保有對抗原的高親和力，以及其他有利的生物特性。欲達成該目標，根據較佳的方法，藉著親代序列和各種概念的人類化產物的分析方法，使用親代和人類化序列的立體模型來製備人類化的抗體。可從以具有類似序列之F(ab)結構爲基礎的一致序列，分別建構特定抗體功能部位，例如VH和VL功能部位的模型。立體的免疫球蛋白模型是共同可利用的，並爲熟諳此藝者所熟知的。可利用電腦程式，其解釋並展示所選出之候選免疫球蛋白序列可能的立體構型結構。檢查這些展示，容許分析該殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中可能的角色。也就是分析殘基影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力。例如，在實例2中以片段F(ab)-12作爲模型，使用老鼠MAE11作爲模板，以便吸入CDR，並連同分子模型一起修改骨架殘基，達到突變的序列。、如同其他的實例，可能提及對照組抗體Mab4d5。在這裏以數個得自Brookhaven蛋白質資料銀行（登記爲1FB4、 -76- 孓紙張尺度▲用中國國家標準（cns ) mm ( ---"— -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 0 、-口經湞部中泱椋準局员J-消费合竹社印f 1233946 A7五、發明説明（74 ) 2RHE、2MCP、3FAB、1FBJ、2HFL 和 1RHI)的 Fab 結構爲基礎來建構模型。首先選擇F(ab)片段KOL (Marquart，M. 等人，J. Mol. Biol. MI： 369-391 (1980))作爲 VL 和 VH 功能部位的模板，然後利用它們的主鏈原子配位（INSIGHT程式，Biosym Technologies)，將額外的結構附加在該結構上。利用類似的程式和技術設計出想要抗體的模型。可如下建構使用分子模型的代表性分析：就每個特定的殘基位置，計算出在每個附加結構中從模板C α到類似物 C α的距離。一般而言，如果所有的（或將近所有的）特定殘基之C從-C α距離S 1埃，此時該位置包含在一致結構中。在一些案例中，板骨架殘基將滿足這些條件，但是 CDR環則否。對每個選出的殘基，計算個別的N、C從、 C、Ο和C 0原子的平均配位，然後藉著5 0次能量減至最少的循環，使用可購得的程式，如DISCOVER程式 (Biosym Technologies)，利用 AMBER 力場（Weiner，S_J·等人，J. Amer. Chem· Soc· 106: 765-784 (1984))並固定 C 汉配位，來修正得自非-標準鍵結幾何學的結果偏差。然後將高度保存之殘基的側鏈，像是二硫-橋聯的半胱胺酸殘基，併入所得的一致結構中。接著從CDR殘基開始，並使用得自 Chothia 等人（Chothia，C·等人，Nature 342: 877-883 (1989))之CDR構型的圖表作爲指導，併入特定抗體VL和 VH功能部位的序列。以Fab結晶結構、螺旋異構體庫 (Ponder, J.W. & Richards, F.M., J. Mol. Biol. 191： 775-791 (1987))和填充考量爲基礎來選擇侧鏈構型。因爲VH- -77 $紙張尺度用中國國家標埤（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T t 1233946 A7 五、發明説明（*75 ) CDR3可能無法利用上文的標準來分派，可使用INSIGHT 程式，從搜尋類似大小的環中產生模型，使用填充和溶劑暴露考量來衍生，或使用其他例行或可購得的技術來產生之。最好是使該模型接受5000次能量減至最少的循環。以此方式，可從接受者和進口序列中選出骨架殘基並混合之，以便能夠達到想要的抗體特徵，如對標靶抗原（群）增加親和力。通常，CDR殘基直接且最實際地涉及對抗原結合作用的影響。在實例2中用來產生F(ab)-12的技術，其中使用組合的老鼠CDR殘基，連同分子模型一起，產生人類化的老鼠抗_IgE抗體片段。另外，現在亦可能產生導入外來基因的動物（例如老鼠），這在免疫作用上能夠在缺乏内源性免疫球蛋白的產生之下，產生人類抗體的完全項目。例如，已經描述在嵌合型和胚源突變的老鼠中，抗體重鏈連接區（m)基因之同種接合子的刪除，導致完全抑制了内源性抗體的產生。在這類胚源突變的老鼠中，人類胚源免疫球蛋白基因的轉移導致在抗原挑戰時，將會有人類抗體的產生。 Jakobovits 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90_: 2551 (1993) ； Jakobovits 等人，Nature 362: 255-258 (1993); Bruggermann 等人，Year in Immunol. Z: 33 (1993);和 Duchosal 等人，Nature 355: 258 (1992)。人類抗體亦可衍生自嗤菌體-表現庫（Hoogenboom等人，J. Mol. Biol. 227: 381 (1991) ; Marks 等人，J. Mol· Biol. 222: 581-597 (1991); Vaughan 等人，Nature Biotech· JU: 309 (1996))。 -78- 本紙張尺ϋ川中國®家標缚（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） --------Φ------IT------f (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 五、發明説明（ A7 B7 76 部 ψ -央標準 j 消 fc 合竹社印 (b) 額外的修改之在、t生抗體突變種之後，$出與物種-依賴性抗體有關的生物活性。如同上文所提及的，這可能涉及決定 :::結合親和力及/或其他的生物活性。在本發明的較 ::組實施例巾，製備上文之抗體突變種的方格，並篩選二種哺乳動物物種之抗原的結合親和力。從最初的夕選出一或多個抗體突變種，可視需要使其接受一更多種的生物活性試驗，以便證實該具有增強結合親和勺柷敝犬變種確實是有用的，例如臨床前研究。在較佳 ^體實施例中，保留與得自第一個哺乳動物物種之抗原 :的能力的抗體突變種，具有類似物種_依賴性抗體的合覜和力。這可藉著使改變的高變區殘基避免涉及抗原 t —人類抗體結合而達成。在其他的具體實施例中，抗突變種可具有與第一個哺乳動物物種不同，明顯改變的奋親和力（例如，對抗原的結合力是較佳的，但可能比種-依賴性抗體差）。如此選出的抗體突變種（群）可接受更多的修改，經常賴抗體的想要用途。這類修改可涉及更多胺基酸序列的變，與異源性多肽（群）融合及/或共價修改，像是在下中精心設計的那些。關於胺基酸序列的改變，代表性的改在上文中陳述。例如，亦可取代任何未涉及維持該抗之適當構型的半胱胺酸殘基，通常是利用絲胺酸，以便良分子的氧化穩走性並防止異常的交聯作用。相反的，將（一個）半胱胺敗鍵結（群）加至該抗體中，以便改良其或力的結結與體結物依改文修體改可穩 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} Φ

、1T >φι. -79 本紙張尺度過川中國囤家標_ ( CNS ) Λ4規格（ 210X297 公釐）好渋部中次¾準局員J.消和合竹社印來 1233946 A7 _______ B7 ^ 一^ 〜一 ________________ 五、發明説明（77 ) 一定性（特別是在該抗體爲諸如Fv片段之類的抗體片段處）°其他類型的胺基酸突變種具有改變的糖基化圖型。這可藉#刪除一或多個在該抗體中找到的碳水化合物部伤’並/或加入一或多個未出現在該抗體中的糖基化作用位置來達成。抗體的糖基化作用通常是N_連結或〇_連結的。N-連結意指將該碳水化合物部份附接到天冬醯胺殘基的側鏈上。三肽序列，天冬醯胺絲胺酸和天冬醯胺-χ_ 蘇胺酸，其中X爲脯胺酸以外的任何胺基酸，是碳水化合物部份以酵素附接到天冬醯胺側鏈上時的辨識序列。因此’這些三肽序列出現在多肽中，產生潛在的糖基化作用位置。0-連結的糖基化作用意指糖經由氧的附接作用；例如，Ν-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、炭藻糖或木糖結合到羥胺基酸上，最常見的是絲胺酸或蘇胺酸，雖然也可以使用 5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。在抗體中加入糖基化作用位置，係藉著改變胺基酸序列，使其含有一或多個上述的三肽序列（有關Ν-連結的糖基化作用位置）而便利地完成。亦可藉著在原始的抗體序列中加入或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基（關於0-連結的糖基化作用位置）來進行改變0 (ν) 抗體片段已經發展出各種產製抗體片段的技術。在傳統上，係經由完整抗體之蛋白水解的消化作用而衍生出這些片段（參見例如 Morimoto 等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24： l〇7_l 17 (1992)和 Brennan 等人， -80- 本紙張尺度ί川中國國家標缚（rNS ) Λ4規格（210xi7公釐) ~~ 訂 ~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 A7 B7 五、發明説明（78

Science 21£: 81 (I985))。然而，目前這些片段可直接藉著重組的宿;主細胞來產生。例如，可從上文討論的抗體嗟菌體庫中分離出抗體片段。另外，也可從大腸桿菌中直接回收F(ab*)2-SH片段，並以化學方式偶聯，形成F(ab，)2片段 (Carter等人，Bio/Technology 163-167 (1992))。根據其他的方法，可直接從重組的宿主細胞培養物中分離F(abf) 片段。對熟練的從業者而言，將知曉其他產製抗體片段的技術。在其他的具體實施例中，選出的抗體爲單鏈的F v 片段（scFv)(PCT 專利申請案 WO 93/16185 )。 (vi)多重抗體多重抗體具有對至少兩個不同抗原的結合專一性。而這類分子通常將僅結合兩個抗原（也就是雙重專一性的抗體，BsAbs)，具有額外專一性的抗體，如三重專一性的抗體，當在本文中使用時，亦包括在該説法中。BsAbs的實例包括那些具有針對腫瘤細胞抗原的一臂，以及針對胞毒觸發分子的一臂，像是抗-Fc r RI/抗-CD15、抗· P185HER2/ FcrRII (CD16)、抗<03/抗·惡性 B 細胞（1D10)、抗-CD3/抗-pl85HER2、抗-CD3/抗-ρ97、抗-CD3/抗·腎細胞癌、抗-CD3 / 抗-OVCAR-3、抗-CD3/L-D1 (抗·結腸癌）、抗-CD3 /抗·促黑色素細胞激素類似物、抗_E(jf受體 / 抗-CD3、抗 _CD3/抗-CAMA1、抗-CD3/抗-CD19、抗-CD3/MoV18、抗神經細胞黏附分子（ncAm)/抗-CD3、抗-葉酸結合蛋白質（FBP)/抗-CD3、抗-所有與癌症有關的抗原（AMOC-3 1 ) /抗-CD3 ;具有與腫瘤抗原專一性結合 -81 ϋ張尺度適用中國國家標蜂（（、NS ) Λ4規格（2】OX 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 1233946 部樣 Π j. 消 fc 竹社印 kl B7 五、發明説明（79 ) 的一臂，以及與毒素結合的一臂的BsAbs，如抗·皀角尊/ 抗_Id-l、j-CD22/抗·皀角苷、抗-CD7/抗-皀角甞、抗· CD38/抗-皂角甞、抗-CEA/抗蓖麻蛋白A鏈、抗-CD22/ 抗-皀角甞、抗-CD7/抗-皀角苷、抗_CD38/抗-皀角替、抗-CEA/抗-蓖麻蛋白A鏈、抗-干擾素-從（IFN-從）/抗-融合瘤遺傳性型、抗-CEA/抗長春花生物鹼；轉變酵素激活前藥的BsAbs，像是抗-CD30/抗鹼性嶙酸酶（其催化絲裂黴素磷酸鹽前藥轉變爲絲裂黴素醇）；可用來作爲血纖維蛋白溶解劑的BsAbs，如抗-血纖維蛋白/抗-組織血纖維蛋白溶酶原活化劑（tP A )、抗·血纖維蛋白/抗·尿激酶-型的血纖維蛋白溶酶原活化劑（uPA)，使免疫複合物瞄準細胞表面受體的BsAbs，如抗-低密度脂蛋白（LDL)/抗_Fc受體（例如FcrRI、FcrRII或FcrRIII);用來治療傳染病的 BsAbs，如抗-CD3-抗-單純疱疹病毒（Hsv)、抗·τ_細胞受月豆，CD3複合物/抗流行性感冒、抗^尺/抗_hiv，在活體外或在活體内用於腫瘤檢測的BsAbs，如抗_Cea/抗一 EOTUBE、抗-CEA/抗-DPTA、抗·卩⑻酿2/抗附著素；作爲疫苗佐劑的BsAbs ;以及作爲診斷工具的BsAbs，如抗-免IgG/抗-鐵蛋白、抗-辣根過氧化酶（HRp)^ 荷爾篆 k -生長激素釋放抑制因子/抗-物質P、抗-JJRP /抗_ FITC、抗-CEA/抗·;3-半乳糖苷酶。三重專一性之抗體的貝例包括抗-CD3A_CD4/抗-CD37、抗 _CIj3/抗·CD5w_ CD37和杭-CD3/抗-CD8/抗_CD37。雙重專一性的抗體，可以全長抗體或抗體片段之形式來製備（例如F(ab，）2之雙 -82 本紙張尺度场川中國囤家標蟑（（、NS ) Λ4規格（ 210X 297 公釐） (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 Μ _______________ Β7 五、發明説明（80 ) ~~—一重專一性的抗體）。製造雙重專一性抗體的方法，是此項技藝中已知的。全長雙重專一性之抗體的傳統產製方法，是以兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共同表現爲基礎，其中兩個鏈具有不同的專一性（Millstein 等人，Nature 305.: 537-539 (1983))。因爲任意配合免疫球蛋白的重和輕鏈，這些融合瘤（四融合瘤（quadromas))產生具有1〇種不同抗體分子的可能混合物，其中僅有一個具有正確的雙重專一性結構。正確分子的純化’通^疋精著親和力層析步驟來進行，該步驟是不方便的，且產物的產量很低。在W0 93/08829和Traunecker 等人，EMBO J· Μ: 3655-3659 (1991)中揭示了類似的程序。根據不同的方法，將具有想要之結合專一性（抗體-抗原混合位置）的抗體可變功能部位，與免疫球蛋白恒定功能部位序列融合。該融合最好是利用免疫球蛋白重鏈恒定功能部位，包括至少一部份鉸鏈區CH2和CH3區，較好是具有第一個重鏈恒定區（CH1 )，其含有與輕鏈結合必需的位置，出現在至少一個融合之中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合作用’如果需要還有免疫球蛋白輕鏈的DNA，插入不同的表現載體内，並共同轉移感染到適當的宿主生物中。這在建構作用中使用不相等比例的三個多肽鏈，來提供最佳產量的具體實施例中，對於調節三個多肽片段的相互比例，提供了相當大的彈性。然而，當以等比例表現至少兩個肽鏈，而導致高產量，或該比例不是特別重要時，有可 -83- 本紙張尺度速川中國國家標坪（ΓΝδ ) Λ4規格（210 X 297公釐1 — --------Φ------1Τ------Τ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 1233946 A7 B7 五、發明説明（81 部標卑局 ί) j. 消 f：合竹社印月b在一個表現載體中插入兩個或全部三個多肽鏈的密碼序列。在該方法的較佳具體實施例中，雙重專一性的抗體由一個在一臂中帶有第一個結合專一性的雜交免疫球蛋白重鍵’和在另一臂上的一個雜交的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對 (知:供第二個結合專一性）所構成。發現這個不對稱的結構’使得從不想要的免疫球蛋白鏈組合中，更容易分離出想要的雙重專一性之化合物，因爲免疫球蛋白輕鏈僅出現在半個雙重專一性的分子上，提供了簡便的分離方法。該方法揭示在WO 94/04690中。關於產製雙重專一性抗體的更多細節，參見例如Suresh等人，Methods in Enzymology 121: 210 (1986)。根據在WO 96/27011中描述的其他方法，可將在抗體分子對之間的介面，設計成從重組的細胞培養物中回收它們時，異種二聚體的百分比達到最高。較佳的介面包括抗體恒定功能部位至少一部份的CH3功能部位。在該方法中，以大的側鏈（例如酪胺酸或色胺酸）來置換一或多個得自第一個抗體分子之介面的小胺基酸侧鏈。在第二個抗體分子上，藉著以較小的側鏈（例如丙胺酸或蘇胺酸）來置換大的胺基酸側鏈，產生與大側鏈（群）相同或類似的代償性'•凹窩，•。這提供了使異種二聚體的產量增加，超過其他不想要之終-產物，如同種二聚體的機制。 ' 雙重專一性之抗體包括交聯或"異種結合”的抗體。例如，在異種結合中，一個抗體可以是抗生物素蛋白，而另 84 ( 210x 297公策）

Aw1T------^— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 kl 五、發明説明（82 ) — 一個是生物素。例如，已經提出對標靶免疫系統細胞到不想要之細胞的這類抗體（美國專利第4,676,980號），並用來治療HIV感染（WO 91/00360、W0 92/200373和歐洲專利〇3〇89號）。可使用任何適宜的交聯方法來製造異種結合的抗體。適當的交聯劑爲此項技藝中已熟知的，並連同一些交聯技術一起，揭示在美國專利第4,676,980號中。亦已經在文獻中描述了從抗體片段來產製雙重專一性抗體的技術。例如可使用化學聯接作用來製備雙重專一性的抗體。Brennan 等人，Science 229: 81 (1985)描述的程序，其中以蛋白水解方式切開完整的抗體，產生F(ab，)2片段。在二硫紛配位劑亞坤酸鈉的存在下，將這些片段還原，以便穩定蠶豆嘧啶葡糖甞二硫酚，並保護分子間的二硫鍵形式。然後將產生的F(ab’）片段轉變爲硫代硝基苯甲酸酯 (TNB )衍生物。然後將一個Fab’-TNB衍生物，藉著利用巯基乙胺的還原作用再轉變爲Fab’-硫醇，並與等莫耳量的其他Fab'-TNB衍生物混合，形成雙重專一性的抗體。可使用所產生的雙重專一性抗體作爲酵素選擇性固定作用之製劑0 部

I J. 消 t: 竹目前的進展已經使得從大腸桿菌中直接回收FaV-SH片段更爲容易，其可以化學方式偶聯，形成雙重專一性的抗體。Shalaby 等人，J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)描述完整人類化之雙重專一性抗體F(abf)2分子的產製。由大腸桿菌分別分泌每個Fab·片段，並在活體外接受直接化學偶聯作用，形成雙重專一性之抗體。如此形成的雙重專一性抗 -85- 本紙張尺廋適用中國國家標碑（rNS ) Λ4規格（210X297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明説明（83 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 體能夠與過度表現ErbB2受體的細胞，以及正常人類T細胞結合，並謗發人類胞毒淋巴球對人體乳房腫瘤標靶的溶解活性。亦已經描述了各種從重組的細胞培養物中直接製造和分離雙重專一性抗體片段的方法。例如，已使用亮胺酸拉鏈來產製雙重專一性抗體。Kostelny人，J. Immunol. 148.(5): 1547-1553 (1992)。可藉著基因融合將得自Fos和Jun蛋白質之亮胺酸拉鏈肽與兩個不同抗體的Fab'部份連接。在鉸鏈區減少抗體的同種二聚體，形成單體，然後再氧化，形成抗體的異種二聚體。亦可利用該方法來產生抗體的同種二聚體。由 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 业: 6444-6448 (1993)描述的”中間抗體”技術，已經提供了製造雙重專一性抗體的另一種機制。該片段由藉著連接子與輕鏈可變功能部位（VL)連接的重鏈可變功能部位（VH)所組成，它太短以致於不容許在相同鏈的兩個功能部位之間配對。因此，一個片段的VH和VL功能部位，利用其他片段的互補VL和VH功能部位強迫配對，藉此形成兩個抗原-結合位置。亦已經報告了藉著使用單-鏈Fv (sFv)二聚體的其他製造雙重專一性抗體片段之策略。參見Gmger等人， J. Immunol. 152: 5368 (1994) 0 企圖包括具有兩價以上的抗體。例如，可製備三重專一性的抗體。Tutt 等人，J. Immunol. 147: 60 (1991) 0 (vii) 效應物功能設計可能想要就效應物的功能來修改本發明之抗體，例如以 -86- 本紙張尺度適用((、吣）/\4規格（210'/ 297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明说明（84 ) 便促進該抗體與IgE結合效力。例如，可將半胱胺酸殘基 (群）導入F c區中。藉此容許在該區域中形成鏈間的二硫鍵。如此產生的同種二聚體可改良内部化作用的能力，並 /或增加補體調節的細胞殺死和細胞依賴性之胞毒作用 (ADCC)。參見 Caron 等人，J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)和 Shopes，B.，J. Immunol. 148： 2918-2922 (1993)。另外，亦可將抗體設計成具有二元的F c區，並可藉此增加補體溶解和ADCC能力。參見Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 2_: 219-230 (1989) 0 (viii)免疫共軏物本發明亦附帶有免疫共軛物，其包括與諸如化學治療劑之類的胞毒製劑、毒素（例如以酵素方式活化的細菌、眞菌、植物或動物來源之毒素，或其片段），或放射性同位素（例如放射性共軛物）結合的在本文中描述之抗體。在上文中已經描述了可用來產製這類免疫共軛物的化學治療劑。可使用之以酵素方式活化的毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之未結合的活性片段、外毒素A鏈（得自綠膿样菌）、蓖麻蛋白A鏈、難母球毒蛋白A鏈、瑪德素 (modeccin )A 鏈、以·帚曲菌素、光桐（Aleurites fordii )蛋白質、石竹素（dianthin)蛋白質、美國商陸（Phytolaca americana)蛋白質（PAPI 、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜 (momordica charantia)抑制劑、箭毒素、巴豆毒蛋白、皂草（sapaonaria officinalis)抑制劑、葛龍寧（gelonin)、米托格林（mitogellin )、局限曲菌素、驗黴素、伊#黴素和單 -87- 木紙張尺度適川中國國家標_((、奶）八4規格（210'/ 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 1233946 A7 B7 五、發明説明（ 85 端孢菌素（tricothecenes )。可利用各種放射性核素來產製放射性共軛物抗體。實例包括2i2Bi、^工、

In Y和 186

Re 掠消合竹社印可利用各種雙重功能的蛋白質偶聯劑來製造抗體與胞毒製劑的共軛物，如N-琥珀醯亞胺基_3-(2-吡啶基二硫醇）丙酸酯（SPDP )、亞胺基硫羥烷（Ιτ )、亞胺基酯雙重功能的衍生物（如己二醯亞胺酸二甲酯HCL )、活化酯（如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯）、醛類（如戊二醛）、雙_疊氮化合物 (如雙-對_(疊氮苯甲醯基）己烷二胺）、雙-重氮衍生物（如雙-對-(重氮苯甲醯基）-乙二胺）、二異氰酸鹽（如亞甲代苯基2,6-二異氰酸鹽），以及雙·活性之氟化合物（如i，5•二氟· 2,4_二硝基苯）。例如，可按照在viteUa等人，Science 238^. 1098 (1987)中的描述來製備蓖麻蛋白免疫毒素。以碳·14 不之1-異硫氰酸芊基_3_甲基二伸乙基三胺基五乙酸 (MX-DTPA )，爲放射性核素與抗體之結合作用的代表性螯合劑。參見WO 94/11026。在其他的具體實施例中，爲了在腫瘤的預先瞄準中使用，可將抗體與’’受體"（如鏈黴菌抗生物素蛋白）結合，其中將抗體-受體共軛物投予患者，接著從循環中利用清除劑移除未結合的共軛物，然後投予與胞毒製劑（例如放射性核素）結合的”配體”（例如抗生物素蛋白）。 (ix) 免疫微脂粒 ' 亦可知在本文中揭示之抗體突變種調製成免疫微脂粒。藉著此項技藝中已知的方法來製備含有該抗體的微脂粒， -88- (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

本紙張尺度適川中國囤家標碑（rNS )Λ4規格（210X 297公釐） A7 1233946 B7 五、發明説明（86 ) 像是在 Epstein 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8^.: 3688 (1985) ; Hwang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77： 4030 (1980);以及美國專利第4,485,045號和4,544,545號中的描述。增加循環時間的微脂粒揭示在美國專利第5,013,556號中 0 可藉著逆相蒸發法，利用含有卵磷脂、膽固醇和PEG-衍生之磷脂醯乙醯胺（PEG-PE )的脂質組合物來產製特別有用的微脂粒。通常限定孔隙大小的濾紙擠出微脂粒，產生具有想要直徑的微脂粒。可按照在Martin等人，J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)中的描述，經由二硫鍵交換反應，將本發明抗體的Fab'片段與微脂粒結合。可視需要在該微脂粒中含有化學治療劑。參見Gabizon等人，J. National Cancer Inst. MX19): 1484 (1989)。 (χ) 抗體依賴性酵素調節之前藥治療（ADEPT ) 亦可在ADEPT中使用本發明之抗體，係藉著將抗體與使前藥活化之酵素結合，其將前藥（例如肽基化學治療劑，參見WO 81/01145 )轉變爲具有活性的抗癌藥物。參見例如WO 88/073 78和美國專利4,975,278號。供ADEPT使用之免疫共軛物的酵素成份，包括任何能夠以將前藥轉變爲其較具活性之胞毒形式的方式，作用在該前藥上的酵素。可用於本發明方法中的酵素包括但不限於鹼性磷酸酶，可用來將含有磷酸酯之前藥轉變爲自由的藥物；芳基硫酸酯酶，可用來將含有硫酸酯之前藥轉變爲自由的藥物；胞 -89 - 本紙張尺度適川中國围家標碑（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） --------L^w------訂------^— (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 部標局 j 消 fc 合竹社 1233946 A7 B7 五、發明説明（ 87 嘧哫脱胺酶，可用來將無毒性的5_氟胞嘧啶轉藥物5-氟尿喃淀；蛋白酶，像是沙雷菌（_tia)蛋白几癌嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織 (如組織蛋白酶B*L)，可用來將含有肽的前藥轉變由的藥物，· D-丙胺醯基羧肽酶，可用來轉變含有d_胺基酸取代基的前藥；切開碳水化合物的酵素n半乳酶和神經胺糖苷酸酶，可用來將糖基化的前藥轉變爲自由的藥物^内醯胺酶，可用來將利用^ •内醯胺衍生之藥物轉變爲自由的藥物；以及青黴素醯胺酶，如青黴素v醯胺酶或青黴素G醯胺酶，可用來將在其胺的氮上，利用苯氧基乙醯基或苯基乙醯基衍生的藥物，分別轉變爲自由的藥物。另外，帶有酵素活性的抗體，在此項技藝中亦已知爲 "抗體酶"，可用來將本發明之前藥轉變爲自由的活性藥物（Massey，Nature m: 457_458 (1987))。可按照在本文中的描述來製備抗體·抗體酶共軛物，以便將抗體酶遞送至腫瘤細胞群中。可藉著此項技藝中已熟知的技術，將本發明之酵素與抗犬’全種共價結合，如使用在上文中討論的異種雙重功的交聯試劑。另外，可利用此項技藝中已熟知的重 DNA技術，來建構由至少一個本發明抗體之抗原結區，與本發明酵素之至少一個具有功能的活性部份連接所構成的融合蛋白質（Neuberger等人，Nature 312: 604-608 (1984)) 0 (xi)抗體-補救受體結合之抗原決定位的融合作用

I 頁訂能組合

-90 - 本國 210 X 297/>tT

V 1233946 Α7 Β7 五、發明説明（88 部 Ψ 樣

消合 H 印 V 在本發明的某些具體實施例中，可能想要使用抗體片段而不是整個抗體，例如，以便增加腫瘤的通透性。在該案例中，可能想要修改抗體片段以便增加其在血清中的半衰期。這類修改可藉著將補救受體結合之抗原決定位併入該抗體片段中（例如，藉著在該抗體片段之適當區域中的突變，藉著將該抗原決定位併入肽標記内，然後在另一端或在中間’將其與該抗體片段融合）而達成。補救受體結合之抗原決定位，最好是包含一個區域，其 ^將任何得自Fe功能部位之-或兩個環的_或多個胺基酸殘基，移至该抗體片段的類似位置。更佳的是轉移三或更多得自Fc功能部位之一或兩個環的殘基。再佳的是二從Fc區的CH2功能部位中取得抗原決定位（例如ig(}的），並移至該抗體的CHI、CH3或¥11區，或一個以上的這類區域。另外，從Fc區之CH2功能部位中取得抗原決定位，並移至抗體的4區或义區，或兩者之上。(xii)抗體的其他共價修改作用抗體的共價修改作用亦包括在本發明的範園内。如果合適了藉著化子合成，或藉著抗體的酵素或化學切開作用來進行。其他類型的抗體之共價修改，可藉著使該抗體的標靶胺基酸殘基與能夠與選定之侧鏈，或冰或^終端殘基反應的有機衍生物反應，將其導入分子内。半胱胺醯基殘基是最常用與^由乙酸鹽〇和相對應的胺類）反應’像是氣乙酸或氣乙醯胺’得到叛甲基或羧醯胺基甲基衍生物。亦可藉著與溴三氟丙酮、心溴_卢_(5_咪唑 ΦII (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T f 91 - 本紙張尺廋適川中國國家標埤（（、NS ) 5規格（ 210X 297 公釐） 1233946 Α7 Β7 五、發明説明（89 ) 基）丙酸、氯乙醯磷酸鹽、N_烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-p比淀，基二硫化物、甲基2_p比淀基二硫化物、對-氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基酚，或氯-7-硝基苯幷-2-哼-1，3-二峰反應來衍生半胱胺醯基殘基。可藉著在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應來衍生組胺醯基殘基，因爲該試劑對組胺醯基側鏈相對上具有較高的專一性。亦可使用對-溴苯甲醯甲基溴；該反應最好是在 pH 6.0下，在〇· 1 μ的二甲胂酸鈉中進行。使離胺醯基和胺基-終端殘基與琥珀酸或其他羧酸酐反應。利用這些試劑的衍生作用，具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的作用。其他適合用來衍生含有^胺基之殘基的試劑，包括亞胺酸酯，如甲基吡啶亞胺酸甲酯、嶙酸吡吟醛、吡哆醛、硼氫化氯、三硝基苯磺酸、〇_甲基異脉、 2,4_戊二酮，以及利用乙酸酸鹽之轉胺基酶-催化反應。藉著與一或數個傳統的試劑反應，來修改精胺醯基殘基，這些試劑包括苯基乙二醛、2,3·丁二酮、1，2·環己二酮和（水合）茚三酮。精胺醯基殘基的衍生作用，需要在驗性的環境中進行反應，因爲胍官能基的高pKa値。此外，這些試劑亦可與離胺酸基團和精胺酸ε-胺基反應。可進行酪胺醯基的特定修改，特別有興趣藉著與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應，將光譜標記導入酪胺醯基殘基内。最常見的是使用Ν_乙醯基咪峻和四确基甲燒，分別形成0-乙醯基酪胺醯基物種和3·硝基衍生物。可矛】％ 1251或1311將絡胺酿基殘基破化’製備在放射性免疫試驗中 -92- 本( (，NS ) Μ規桔（210X 297公釐） ~~〜一~^ --------------訂------·~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 A7 ____ ——__一 _ B7 五、發明説明（9〇 ) 使用之經過標示的蛋白質。藉著與磲化二亞胺（R-N=C=C-R，）反應，選擇性地修改羧基側的基團（天冬胺醯基和穀胺醯基），其中R和R’爲不同的烷基基團，如1·環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基）碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鑕_4,4_甲戊基）碳化二亞胺。此外，亦可藉著與銨離子反應將天冬胺醯基和穀胺醯基殘基轉變爲天冬醯胺醯基和穀胺醯胺醯基殘基。經常將穀胺醯胺醯基和天冬醯胺醯基殘基分別脱醯胺，成爲相對應的穀胺醯基和天冬醯基殘基。這些殘基在中性或驗性的條件下脱醯胺化。這些殘基經過脱醯胺化的形式，亦在本發明的範園内。其他修改包括脯胺酸和離胺酸的羥基化作用，絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基基團的磷酸化作用，離胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈之α -胺基基團的甲基化作用（TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.

Freeman & Co. San Francisco，第 79_86 頁（ 1983))，N_終端胺的乙醯基化作用和任何C-終端羧基基團的醯胺化作用。其他類型的共價修改涉及以化學或酵素方式將糖甞偶聯到抗體上。這些程序對於不需要在具有有關N 或〇_連接之糖基化作用之糖基化能力的宿主細胞中產生抗體是有利的。依據所使用的偶聯模式，可將糖（群）附接到：（a)精胺酸和組胺酸；（b)自由的羧基；（C)自由的硫氫基，如半胱胺酸的那些；（d)自由的羥基，如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸的那些；（e)芳香族殘基，如苯丙胺酸、酪胺 ~*--- --------Φ------1T------Φ— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ____— · 93 - 1233946 A7 部樣卑局 ϊ\ 消合竹印 Β7五、發明説明（91 ) 酸或色胺酸的那些；或（f)穀胺醯胺的醯胺基團。這些方法描述於1987年9月1 1日公告的W0 87/05330，以及在 Aplin 和 Wriston，CRC Crit· Rev. Biochem.，第 259-306 頁 (1981)。可藉著化學或酵素方式完成在抗體上出現之任何碳水化合物部份的移除。化學脱糖基化作用需要將抗體暴露在化合物三氟甲烷磺酸或相等的化合物之下。這個處理導致大部份或全部的糖的切開，除了連接的糖（Ν-乙醯基葡糖胺或Ν-乙醯基半乳糖胺）之外，而留下完整的抗體。化學脱糖基化作用由 Hakimuddin 等人，Arch· Biochem. Biophys. 259: 52 (1987)和 Edge 等人，Anal. Biochem· 118: 131 (1981) 描述。在抗體上之碳水化合物的酵素切開作用，可藉著使用各種内或外-糖甞酶來完成，如同Thotakura等人， Meth. Enzymol. 138.： 350 (1987)的描述。其他類型的抗體之共價修改，包括以在美國專利第 4,640,835 號；4,496,689 號；4,301，144 號；4,670,417 號； 4,791，192號或4，179,337號中陳述的方法，將該抗體連接到各種非蛋白質的聚合物其中之一上，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯類。 B. 載體、宿主細胞和重組的方法本發明亦提供編碼如同在本文中所揭示之抗體突變種的分離核酸，包括該核酸之載體和宿主細胞，、以及產製該抗體突變種的重組技術。爲了重組產製抗體突變種，分離編碼其之核酸，並將其 94- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 、1Τ Τ 本紙張尺度適川中國®家標峰(（、NS ) Μ規格（210X 297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明説明令2 部 it j 消竹插入可複製的載體内，以便進一步選殖（DNA的擴大作用）或表現之；。輕易地分離出編碼單株抗體突變種的DNA，並利用傳統的程序（例如藉著使用能夠與編碼該抗體突變種之重和輕鏈的基因專一性結合的寡核甞酸探針）來定序。許多載體是可利用的。載體成份通常包括但不限於一或多個下列的序列：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、促進子要素、啓動基因和轉錄終止序列。 (i)信號序列成份不僅了直接以重組方式來產製本發明的抗體突變種，還可以帶有異源性多肽之融合多肽的形式來產製，最好是信號肽或其他多肽，在成熟蛋白質或多肽的Ν·終端處，具有特定的切開位置。異源性信號肽序列，最好是選擇可由宿主細胞辨認和處理（也就是由信號肽酶切開）者。對原核生物宿主細胞而言，其無法辨認並處理天然的抗體信號序列’可藉著例如選自包括鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱-穩定的腸毒素Π前導序列的原核生物信號序列來取代該信號序列。對酵母分泌而言，可藉著例如酵母轉化酶前導序列、α -因子前導序列（包括酵母菌屬（gaccharomyces ) 和克魯維酵母屬（Kluy veromyces ) 因子前導序列），或酸性磷酸酶前導序列，白色念珠菌（C· albicans)葡糖澱粉酶前導序列，或在W0 90/13646中描述的信號，來取代天然的信號序列。在哺乳動物細胞表現時，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌的前導序列，例如單純疱疹病毒gD 信號。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4

、1T 0 •95- 本紙張尺度適用屮國國家標峰(rNS ) Λ4規格（210X 297公釐） .^逆部屮^<樣^^员_1'.消贽合竹ii印則个 1233946 A7 --------___________________ Β7 五、發明説明（93 ) 將這類前驅物區域的DNA連接到編碼抗體突變種之DNA 的密碼中；。 (ii) 複製起點成份表現和選殖載體兩者都含有使該載體得以在一或多個選出之宿主細胞中複製的核酸序列。一般而言，在選殖載體中，該序列爲使該載體得以不依賴宿主的染色體dna來、复製並包括複製起點或自動複製序列者。已熟知有關各種細菌、酵母菌和病毒的這類序列。得自質體pBR322的複製起點，適用於大部份的革蘭氏陰性細菌，2"質體起點適用於酵母菌，而各種病毒起點（SV4〇、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用來在哺乳動物細胞中選殖載體。通常，哺乳動物表現載體並不需要複製起點成份（通常僅使用S V40起點，因爲它含有早期啓動基因）。 (iii) 選擇基因成份、表現和選殖載體可含有選擇基因，亦稱作可選擇標記。代，性選擇基因所編碼出的蛋白質（a)賦與對抗生素或其他^素的抗藥性，例如氨爷青黴t、新#素、胺甲碟吟或 =環素，（b)補充需要特殊營養因子之缺陷，或（c)供給無法得自複雜培養基的重要營養，例如，對样菌屬 (Bacilli)而言，爲編碼〇-丙胺酸消旋酶的基因。選擇計劃的一個實例係使用阻礙宿主細胞生長的藥物。成功地以產生賦與藥物抗藥性之蛋白質的異'源性基因來轉胞：並因此在選擇的管理中存活下來。這類優勢選擇所使用藥物的實例爲新黴素、㈣酸和潮黴素。 —_____ — - 96 - 本紙張尺度ιϊ财g _:辦(rNS ) Λ4規格（21〇>^7讀^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 五、發明説明（94 ) 通合哺乳動物細胞之可選擇標記的其它實例，爲能夠證 :細胞足以搭載抗體核酸的那些，像是DHFR、胸腺核苷激酶、金屬硫肽-I和-II，較佳的是靈長類金屬硫肽基因、腺苷酸脱胺酶、鳥胺酸脱羧基酶等等。例如，首先藉著在含有胺甲碟呤（Mtx)，DHFR之競爭 1*生尨杬劑的培養基中培養所有的轉化物，來確認以DHFR 選擇基因轉化的細胞。當使用野外型DHFR時，適當的宿王細胞爲缺乏DHFR活性的中國倉鼠卵巢（CH〇 )細胞株。另外，可藉著使細胞在含有適用於可選擇標記之選擇製劑，像疋胺基糖苷抗生素，例如康黴素、新黴素或G418 的培養基中生長，來選擇以編碼抗體、野外型DhFr蛋白質及其他諸如胺基糖甞3磷酸轉移酶（ΑΡΗ )之類可選擇標圮的DNA序列來轉化或共同轉化的宿主細胞（美國專利第 4,965，199 號）。在酵母菌中使用的適當選擇基因，爲出現在酵母菌質體 Yrp7 中的 trpl 基因（Stinchcomb 等人，Nature 282: 39 (1979))。ti*pl基因對缺乏在色胺酸中生長之能力的酵母菌突變品系，例如ATCC 44076號或PEP4-1，提供了選擇標記。Jones，Genetics以·· 12 (1977)。trpl病變出現在酵母菌宿主細胞基因組中，此時藉著在缺少色胺酸下生長而對檢測轉化作用提供了有效的環境。同樣地，可藉著已知帶有 Leu2基因的質體，補足缺少-Leu2的酵母、菌品系（ATCC 20,622 或 38,626 號）。此外，可利用衍生自1·6 環狀質體PKD1的載體來轉 -97 - 本纸張尺度‘川中國丨5!家標埤（) ϋ格（210X 297公釐1 '

1233946 A7 _______ _B7 五、發明説明（95 ) 化克魯維酵母屬的酵母。另外，亦對乳酸克魯維酵母菌 (K. lactis;)報告了大規模產製重組牛凝乳酶的表現系統。 Van den Berg，Bio/Technology 及：135 (1990)。亦已經揭示藉著克魯維酵母菌屬的工業用品系，分泌成熟重組人類血清白蛋白之穩定多重副本的表現載體。Fleer等人， Bio/Technology 殳：968-975 (1991) 〇 (iv) 啓動基因成份表現和選殖載體通常含有可由宿主生物辨認，並以可操作方式與抗體核酸連接的啓動基因。適合原核生物宿主使用的啓動基因，包括phoA啓動基因、/?_内醯胺酶和乳糖啓動基因系統，鹼性磷酸酶、色胺酸（trp)啓動基因系統，以及雜交的啓動基因，如tac啓動基因。然而，其他已知的細菌啓動基因也是適合的。在細菌系統中使用的啓動基因亦將包含以可操作之方式，與編碼抗體之DNA連結的具有聚標呤AGGAGG之序列（Shine-Dalgarno序列） (S.D·序列）。已知供眞核細胞使用的啓動基因序列。幾乎所有的眞核生物基因都在開始轉錄之位置上游大約2 5到3 0個鹼基之處，具有富含- AT的區域。在許多基因開始轉錄之上游7 0 到8 0個鹼基處發現其他的序列，爲CNCAAT區，其中N可以是任何核甞酸。在大部份眞核生物基因的3，端爲 AATAAA序列，這可能是在密碼序列的3，端添加聚A尾的信號。所有的這些序列都可適當地插入眞核生物表現載體内0 -98- 本紙張尺度▲川中國K家標埤（CNS ) ϋ^7^〇χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 五、發明説明（ 96 it 消合竹 a 印適合酵母菌宿主使用之啓動基因序列的實例包括3_嶙酸甘油酸激酶或其他糖原酵解之酵素的啓動基因，如晞醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氫酶、己糖激酶、丙酮酸去羧化酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡萄糖激酶。其他的酵母啓動基因，爲具有由生長條件控制轉錄之額外優點的可謗導啓動基因，其爲有關乙醇脱氳酶2、同族細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關之降解酵素、金屬硫肽、甘油醛-3-磷酸脱氫酶和負責麥芽糖與半乳糖之利用的酵素有關的啓動基因區。在歐州專利73，657號中更進一步地描述了酵母表現時所使用的適當載體和啓動基因。酵母促進子亦可與酵母啓動基因一起有利地使用。可藉著例如獲自諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（如腺病母2 )、牛乳頭狀瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、逆轉錄酶病毒、B型肝炎病毒和最常見之猿病毒4〇 (SV40)之類病毒基因組的啓動基因，得自異源性哺乳動物之啓動基因，例如肌動蛋白啓動基因或免疫球蛋白啓動基因，得自熱休克啓動基因·其限制條件爲這類啓動基因與該宿主細胞系統是可相容的，來控制在哺乳動物宿主細胞中從載體來轉錄抗體。可便利地以SV40限制片段之形式獲得sV4〇病毒的早期和晚期啓動基因，其亦含有SV40病毒複製起點。可便利地以HindlllE限制片段之形式獲得人類細胞巨大病毒的速 -99 本紙張尺度诚川中國围家標碑（（，NS ) Λ4規格（210X29?公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) f 1233946 A7 —一_— B7 -一 ----— — _ 五、發明説明（97 ) '—~' ' 早心動基因。在美國專利第4,419,446號中揭示了在哺乳動物袷主中’使用牛乳頭狀瘤病毒作爲載體來表現DNA的系統。在美國專利第4,601，978號中揭示了該系統的修改。另外，亦已經在得自單純疱疹病毒之胸腺核芬激酶啓動基因的挺制之下，在老鼠細胞中表現人類卢_干擾素cDna。另外，亦可使用勞氏肉瘤病毒的長終端重複段作爲啓動基因。 (v) 促進子要素成份通常藉著將促進子序列插入載體内，來增加經由高等眞核生物的編碼本發明抗體之DNA的轉錄作用。目前已知許多得自哺乳動物基因（血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α -胎兒蛋白質和胰島素）的促進子序列。然而，通常將使用得自眞核生物細胞病毒的促進子。實例包括在複製起點後側的SV40促進子（鹼基對100_270)，細胞巨大病毒早期啓動基因促進子，在複製起點後側的多瘤病毒促2 子，以及腺病毒促進子。亦參見Yaniv，Nature尬17 18 (1982)，活化眞核生物啓動基因的促進要素。可在編碼抗體之序列的5,或3,位置，將促進子接合到載體内，但最好是在啓動基因的5，位置處。 (vi) 轉錄終止成份在眞核生物宿主細胞（酵母菌、眞菌、昆蟲、植物、動物、人類或得自其他多細胞生物的有核細胞）中使用的表現載體，亦將含有終止轉錄並使mRNA穩定所需的序列。這類序列通常獲自眞核生物或病毒DNAs或cDNAs的5，# -100- 本紙張尺度诮用中國國家標嘩（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） ' (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) II ; H9 In ffm a

、1T f 1233946 A7 B7 五、發明説明（98 ) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 未轉譯區，偶爾得自V端。這些區域在編碼抗體之mRNA 的未轉譯部份中，含有以聚腺甞酸化片段之形式轉錄的核 I酸斷片。一個有用的轉錄終止成份是牛生長激素聚腺甞酸化作用的區域。參見W0 94/11026以及在本文中揭示的表現載體。 ··! (vii)宿主細胞的選擇和轉化作用適合選殖或表現在本文中之載體中的DNA的宿主細胞是上述的原核生物、酵母菌或高等的眞核生物細胞。適合該目的的原核生物包括眞細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如諸如艾歇利希菌屬（Escherichia)之類的腸細菌，例如大腸样菌、大腸菌（Enterobacter)、歐文氏菌屬 (Erwinia )、克雷白桿菌屬（Klebsiella )、變形菌屬（Proteus )、沙門桿菌屬（Salmonella )，如鼠傷寒沙門氏桿菌（Salmonella typhimurium) 、鋸样菌屬（Serratia) ，如萎垂样菌 (Serratia marcescans )和志賀桿菌屬（Shigella )，以及諸如枯草桿菌（B· Subtilis)和地衣芽孢桿菌（B. Licheniformis) 之類的桿菌屬（Bacilli)(例如在1989年4月12日公告之DD 266,710中揭示的地衣芽孢样菌41P)、假單孢菌屬 (Pseudomonas)，如綠膿桿菌（P. aeruginosa)，以及鏈黴菌 (Streptomyces )。較佳的大腸桿菌選殖宿主爲大腸桿菌294 (ATCC 31，446號），雖然其他的品系，如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776 (ATCC 31，537號）以及大腸样菌W3110 (ATCC 27,325號）也是適合的。除了原核生物之外，諸如絲狀眞菌或酵母菌之類的眞核 -101 - 本紙張尺度適州中i國家標缚（ΓΝ8 ) Λ4規格（210X^97公釐）一 1233946 A7 B7 五、發明説明（"）經滅部中-Φ.:標準局MT消贽合竹社印繁 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 微生物，對編碼抗體的載體而言也是適合的選殖和表現宿主。酒_母菌（Saccharomyces cerevisiae)或普通的啤酒酵母，是最常使用的低等眞核生物宿主微生物。然而，在本文中可獲得並使用許多其他的屬、種和品系，如稷酒裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces pombe);克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)宿主，像是例如乳酸克魯維酵母菌（K. lactis)、脆壁克魯維酵母菌（K. fragilis)(ATCC 12,424 號）、保加利亞克魯維酵母菌（K. bulgaricus)(ATCC 16,045 號）、威克克魯維酵母菌（K. wickeramii)(ATCC 24，178 號）、瓦提克魯維酵母菌（K. waltii)(ATCC 56,500號）、果德克魯維酵母菌（K· drosophilarum) ( ATCC 36,906 號）、耐熱克魯維酵母菌（K. thermotolerans)和馬克斯克魯維酵母菌（K. marxianus);蓍草（yorrowia)(歐洲專利 402,226 號）；巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)(歐洲專利183,070 號）；念珠菌屬（Candida);瑞斯木黴（Trichoderma ressia)(歐洲專利244,234號）；粗糖脈孢菌（Neurospora crassa);許旺酵母菌屬（Schwanniomyces)，如許旺酵母菌 (Schwanniomyces occidentalis);以及絲狀眞菌，像是例如脈孢菌（Neurospora)、青黴菌屬（Penicillium)、多立普克雷迪菌屬（Tolypocladium)和麴菌屬（Aspergillus )宿主，如小巢狀题菌（A· Nidulans )和黑麴菌（A. niger )。適合表現糖基化抗體的宿主，係衍生自多、細胞生物。原則上，無論是得自脊椎動物或無脊椎動物培養物者，任何高等眞核生物細胞培養物都是可行的。無脊椎動物細胞的 -102- 本紙張尺度適川中國國家標埤（rNS ) Λ4規格（210X297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明说明（100) 實例包括植物和昆蟲細胞，Luckow等人，Bio/Technology 色：47_55 (1988) ; Miller 等人，Genetic Engineering, Setlow 等人編輯，第8册，第227-279頁（Plenam 1986年出版）； Mseda 等人，Nature 592-594 (1985)。已經確認許多样狀病毒品系和變種，以及相對應的許可昆蟲宿主細胞，該宿主係得自諸如草地黏蟲（Spodoptera frugiperda )(毛蟲）、埃及斑蚊（Aedes aegypti)(蚊子）、白斑蚊（Aedes albopictus ) (蚊子）、黃獲獲果繩（Drosophila melanogaster)(果繩）和家蠶（Bombyx mori)之類的宿主。特別感興趣的細胞株是昆蟲細胞株sf9。各種供轉移感染用的病毒品系是可公開取得的，例如，苜稽尺墣（Autographa californica) NPV和家蠶NPV的Bm-5品系，並可在本文中使用這類病毒作爲根據本發明之病毒，特別是用來轉移感染草地黏蟲細胞。此外，亦可利用棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牵牛、蕃茄和於草之植物細胞培養物作爲宿主。經满部中决掠準局兵T消贽合竹社印來 (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) f 然而，對脊雀動物細胞最感興趣，而且脊椎動物細胞在培養時（組織培養）的繁殖已經成爲例行的程序。參見 Tissue Culture，Academic Press，Kruse and Patterson，編輯 (1973)。有用的哺乳動物宿主細胞株之實例爲由SV40轉化的猴腎CV1細胞株（COS-7，ATCC CRL 1651);人類胚腎細胞株（293，或在懸浮培養基中生長之繼代的293細胞，Graham 等人，J. Gen· Virol· 59 (1977));幼倉鼠腎臟細胞（BHK，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: -103- 本紙張尺度適州中國國家標缚（（、NS ) Λ4規格（2lOX 297公釐） 1233946 經满部中决掠卑局員J·.消贽合竹社印來 A7 B7 五、發明説明（1〇1 ) 4216 (1980));老鼠賽托利細胞（TM4，Mather，Biol· RePr〇d.駐：243-251 (1980));猴腎細胞（CV1，ATCC CCL 70);非洲綠猴細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587);人類子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);狗腎細胞 (MDCK，ATCC CCL 3 4);牛鼠肝細胞（BRL 3A， ATCC CRL 1442);人類肺臟細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝臟細胞（Hep G2，HB 8065 );老鼠乳房腫瘤 (MMT 060562 ; ATCC CCL 51) ; TRI 細胞（Mather 等人， Annals. N.Y. Acad. Sci. 381： 44-68 (1982) ; MRC 5 細胞； FS4細胞；以及人類的肝癌細胞株（Hep G2 )。爲了產製抗體，以上述的表現或選殖載體來轉化宿主細胞，並將其培養在經過適當修改以便謗發啓動基因、選擇轉化物或擴大編碼想要序列之基因的傳統營養培養基中。 (viii)培養宿主細胞可在各種培養基中培養用來產製本發明之抗體突變種的宿主細胞。適合用來培養宿主細胞之可購得的培養基，如 Ham’s F10 (Sigma)、Minimal Essential Medium (MEM， Sigma)，RPMI-1640 (Sigma)和 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM，Sigma)。此外，任何在 Ham 等人，Meth. Enzymol. 5_8: 44 (1979)，Barnes 等人，Anal· Biochem· 102: 255 (l98〇)，美國專利第 4,767,704 號；4,657,866 號； 4,927,762 號；4,560,655 號；5，122,469 號；或 WO 87/00195 或美國專利登記第30,985號中描述的培養基，均可用來作爲宿主細胞的培養基。任何的這些培養基均可按照需要補 -104- 尿紙張尺國家標靖((、NS ) Λ4規格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 1233946 A7 B7 五、發明説明（1〇2 恕成部中欢摞津局β,τ消费合β私印f 充荷爾蒙及/或其他的生長因子（如胰島素、鐵傳遞蛋白，或表皮的生長因子）、鹽類（如X-氯化物，其中χ爲納、鈣、鎂；和磷酸鹽）、緩衝溶液（如HEPES)、核素（如腺嘌呤核甞和胸腺核苷）、抗生素（如健大黴素TM)、微量元素 (疋義爲無機化合物，通常以毫莫耳之範圍的終濃度存在），以及葡萄糖或相當的能量來源。亦可以適當的濃度包含任何其他必需的添加物，這將是熟諳此藝者已知的^ 諸如溫度、pH値及其類似物之類的培養條件，是先前選擇宿主細胞之表現時所使用的那些，並將是熟諳此藝者所知曉的。 (ix) 抗體純化在使用重組技術時，可在細胞内、近㈣隙中產生抗體大欠種或直接分泌到培養基内。如果在細胞内產製抗體突變種，按照第-個步驟移除顆粒狀的碎屑，包括宿主細胞或溶解的片段’例如藉著離心或超音波㈣。⑽等人’ B1〇/TeChn〇l0gy过：⑹心7 (1"2)描述分離分泌至大腸桿菌之近膜間隙中之抗體的程序。簡言之，在大約3。分鐘内’在醋酸鋼（pH3.5)、耐人和苯甲基續酷氣 MSF )的存在下將細胞漿融解。可藉著離心移除細胞碎 =。在抗體突變種被分泌至培養基中時，通常首先藉著可 2得的蛋白質濃_紙，例如Ami㈣或刪φ阶pem⑽ 過遽单7C，濃縮得自這類表現系統的上清液。在任何前 ^ 0步驟中可含有諸如pMSF之類的蛋白酶抑制劑，以便 P制蛋白水解作用，並可包含抗生素，以便防止污染 (¾先閱讀背面之注意事项再填寫本頁) -Ξ6

•I ......I J !— - · • m 105- 本紙張尺度制巧 (210X297公釐） 1233946 A7 B7 .¾满部十女摞莩局妇T-消於合介私印¥ 五、發明説明（103 物的生長。從細胞，製備之抗體組合物，可使用例如羥磷灰石層析法、凝膠電泳、透析和親和力層析法來純化之，而親和力層析法是較佳的技術。i白質A作爲親和力配體的適合性，係依據出現在該抗體突變種中任何免疫球蛋白能部位的種類和同型物。可使用蛋白質八來純化抗體，其以人類r 1、r 2或r 4重鏈爲基礎（Lindmark等人，L Immunol Meth.紅：；ι_13 (1983))。對所有的老鼠同型物和人類r3，則推薦蛋白質G(Guss等人，emb〇j i567 i575 (1986))。親和力配體所附接的基質，最常見的是瓊脂 =，但其他基質也是有用的。以機械方式使其穩定的基質，如控制孔隙的玻璃或聚（苯乙烯二乙烯基）苯，容許達到比瓊脂糖更快的流速和更短的處理時間。在抗體突變種包含CH3功能邵位之處，使用Bakerb〇nd ΑΒχτΜ樹脂（了 τ Baker，Phillipsburg，NJ)純化。依據待回收的抗體突變種，亦可使用其他的蛋白質純化技術。如在離子_交換管柱上的分級分離、乙醇沉澱法、逆相HpLC、在矽膠上的層析法在肝素瓊脂糖TM上的層析法、在陰離子或陽離子交換树知上的層析法（像是聚天冬胺酸管柱）、色譜集中法、 SDS-PAGE和硫酸銨沉澱法。依據任何初步的純化步驟（群），可使包括感興趣之抗體犬i種和冷染物的混合物接受低p Η値之忌、水性交互作用層析法’使用pH値在大約2.5-4.5之間的洗脱緩衝溶液，最好是在低鹽濃度（例如從大約〇_〇 25 Μ的鹽）下進行。 -106- 尺及4’/种Ηϋ家彳㈣(（，NS ) μ規格（21。297公釐) ~ '

1233946 A7 B7 五、發明説明！〇4 ) 經淖部中次標卑局MJ.消合仍社印來 c. 藥學調配物藉著料有想要純度之多肽與在此料藝中經常使用、任意的"在藥學上可接受之"载劑、賦形劑或穩定劑（它們全都叫做賦形劑）混合，來製備以冷康乾燥調配物或本水溶液之形式儲存的多肽或抗體之治療用調配物。例如：衝溶液、穩定劑、防腐劑、等張促進劑、非·離子性的清潔劑、抗氧化劑和其他雜七雜八的添加物。（參見Re—_ tern’s Pharmaceutical Sciences，第 1 6 版，A 〇s〇i 編輯 (1980))。這類添加物在儲存和濃縮使用時，對接受者而言必需是無毒性的。又、緩=溶液協助將PH値維持在接近生理條件的範園内。它們最好是以大約2 mM到大約50 mM的濃度範園存在。適合本發明使用的缓衝溶液包括有機和無機酸類及其鹽類，像是檸檬酸鹽緩衝溶液（例如檸檬酸單鈉_檸檬酸二= 的混合物、檸檬酸_檸檬酸三鈉的混合物、檸檬酸_檸檬" 單鈉的混合物等等），琥珀酸鹽緩衝溶液（例如琥珀7酸^ 珀酸單鈉混合物、琥珀酸_氫氧化鈉混合物、琥珀酸_琥酸二鈉混合物等等），酒石酸鹽緩衝溶液（例如石鉍鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸_氫氧化鈉混合物等等）、反丁烯二酸鹽緩衝溶液（例如反丁埽=化 -反丁埽二酸單鈉混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二納合物、反丁晞二酸單鈉_反丁烯二酸二鈉混合物等等）、萄糖酸鹽緩衝溶液（例如葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混入萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等酸琥珀酒酸混葡葡 (讀先閱讀背面之注意事項再填{馬本頁〕 - -107- 本紙張尺度適州中國國^^17^7^4規格（210'/ 297公釐） 1233946 A7 —-—— ^B7 一·〜_ u 丨-―·ι,… ，_—i — 五、發明説明（105 ) 等）、草酸鹽緩衝溶液（草酸_草酸鈉混合物、草酸_氫氧化鈉混合物^草酸·草酸鉀混合物等等）' 乳酸鹽緩衝溶液 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} (例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸_ 乳酸鉀混合物等等），以及乙酸鹽缓衝溶液（例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸_氫氧化鈉混合物等等）。此外，可能提及嶙酸鹽緩衝溶液、組胺酸緩衝溶液和三甲胺鹽類，像是 Tris。加入防腐劑可減緩微生物的生長，並以從〇 2%_1% (重量/體積）的含量範圍來添加。供本發明使用之適當防腐劑包括驗、本甲醇、間-甲驗、對幾苯甲酸甲酯、對經苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苄銨、_化（例如氣、溴、硪）+可寧（benzalconium)、氣化己燒雙胺、對經苯甲酸燒基醋，如對羥苯甲酸甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇和3-戊醇。經淖部中决摞绛局負J-消资合竹社印來等張促進劑有時稱爲”穩定劑"，用來確保本發明之液體組合物的等張性，並包括多烴的糖醇類，較佳的是三烴的或更高碳的糖醇類，像是甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。考量其他成份之相對含量，多烴的醇類可以〇. 1重量％到2 5重量％之間的含量存在，較佳的是1 %到5 %。穩定劑意指廣泛種類的賦形劑，其功能範圍從促進治療劑溶解或協助預防變性或黏附於容器壁的填充劑到添加物。代表性的穩定劑可以是多烴的糖醇類（上文列舉的）；胺基酸’如精胺酸、離胺酸、甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯 -108- ____ ---------------- .. | + 警 ____ ___ ϋ張尺度適川中國园家標嘩17^Τλ4規格（210X297公釐）經滅部屮决標準局貝工消费合竹心印f 1233946 A7 B7 五、發明説明（106 ) "" ~ ---- 胺、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L_亮胺酸、2_苯丙胺酸、穀胺酸 '蘇胺酸等等；有機糖類或糖醇，如乳糖、海藻糖、菜豆糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油及其類似物；包括環多醇，如肌醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫之還原劑，如尿素、穀胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸鈉、硫代甘油、^ _單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量的多肽（也就是<1〇個殘基）；蛋白質，如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮單醣類，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二醣類，如乳糖、麥芽糖、蔗糖，以及三醣類，如植物蜜糖；多醣類，如葡聚糖。移定劑以從每份活性蛋白質重量的〇」到1〇,〇〇〇之重量的^ 園存在。非-離子性表面活性劑或清潔劑（也叫做”濕潤劑"）的存在，有助於促進治療劑的溶解，並使治療用蛋白質避免由攪拌引起的凝集，其亦容許在將該調配物暴露在切割表面的壓力下時，不會引起該蛋白質的變性。適當的非-離子性表面活性劑包括多乙氧基醚（20、80等）、聚氧物 (p〇lyoxame〇(l84、188 等）、Pluronic®多元醇、聚氧乙烯山梨聚糖單醚（吐溫®·2〇、吐溫®-80等）。非·離子性表面活性劑以大約0·〇5毫克/亳升到大約1.0毫克/亳升的範圍存在，較佳的是大約〇·〇7毫克/毫升到大約〇·2毫克/毫升。其他各式各樣的賦形劑包括填充劑（例如澱粉）、螯合劑 (例如EDTA )、抗氧化劑（例如抗壞血酸、甲硫胺酸、維他 _ -109- 本紙張尺度1¾ 中關家料（（、NS ) Μ規格（210X 297公釐1 '~ (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 1233946 kl —---—----------- ---- 五、發明説明（1〇7 ) 命E )和助溶劑。按照待處理之特定適應症的需要，在本文中調配物亦▼ 含有-種以上的活性成份，較佳的是具有互補活性，此之間沒有不利影響的那些。例如，可能想要進一步提俾免後抑制劑。這類分子在該組合中，以對想要之目效之含量存在。 > 5F可使活性成份陷入微膠囊中，例如藉著凝聚技術或藉著介面聚合作用，例如，羥甲基纖維素或明膠_微膠囊和聚-(甲基異丁烯酸鹽）微膠囊，分別在例如膠體藥物遞送系統（例如，微脂粒、白蛋白中心體、亳微_顆粒和毫微膠囊），或在粗滴乳劑中。參見在Remingt〇n,s pharmaceutical

Sciences，第 1 6 版，A. 〇sal，編輯（1980)。用來在活體内投藥的調配物必須是無菌的。這可藉著例如通過無菌之過濾膜過濾而輕易地完成。可製備延遲釋放的製品。延遲釋放之製品的適當實例包括含有抗體突變種之固體忌水性聚合物的半通透性基質，孩基質爲具有形狀之物品的形式，例如薄膜或微膠囊。延遲釋放之基質的實例包括聚酯類、水膠體（例如聚（2_羥乙基-異丁烯酸鹽）或聚（乙烯醇））、聚交酯類（美國專利第 3,773,919號）、L_穀胺酸和乙基-L_穀胺酸鹽的共聚物、非 -可降解之乙缔_乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOT™ (注射用的中心體、，包括乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸脯胺醯胺酸（leUpr〇lide)，以及聚 3-羥基丁酸。諸如乙烯_乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之類的 -110- 本紙張尺度制巾關料㈣（（、NS ) Λ4規格（210X29ϋ ' ~ ' 2f先閱讀背面之注意事项再填寫本頁〕

¾¾部中^<樣洋^打(_1.消贽合竹衫印繁 1233946 A7 —-----—______B7 五、發明説明（108 ) '〜— 聚合物，能夠在100天内釋放分子，而某些水膠體在短的時間内釋，放蛋白質。當包膠的抗體殘留在體内一段長時間時，它可能因爲暴露在37。0的潮濕之下而導致變性或二集，結果喪失了生物活性並可能變成具有免疫原性。爲^ 穩足作用，依據所涉及之機制想出合理的策略。例如，如果發現凝集機制是經由硫代二硫鍵之交換形成分子間的^ S键，則可藉著修改硫氫基殘基，從酸性的溶液中冷凍乾燥、控制濕度含量、使用適當的添加物，並發展特定的多肽基質組合物，來達成穩定作用。在治療特足疾病或病況上有效之治療性多肽、抗體或其片段的含量，將依據疾病或病況之性質，可由標準臨床技術決定。有可能想要定出劑量·反應曲線，並在人類身上試驗之前，先將本發明之醫藥組合物在活體外試驗，然後在有用的動物模式系統上試驗。然而，以此項技藝中的共同知識爲基礎，可有效促進感覺神經元存活的醫藥組合物，可提供在大約5到2 0毫微克/毫升之間的局部治療劑濃度，較佳的是在大約1〇到20毫微克/亳升之間。在本發明額外特殊的具體實施例中，有效促進視網末神經元生長和存活的醫藥組合物可提供在大約i 〇毫微克/亳升到1〇() 毫微克/毫升之間的局部治療劑濃度。在較佳的具體實施例中，藉著皮下注射投予治療性多肽、抗體或其片段的含水溶液。每個劑量範圍可從每公斤體重大約0 · 5微克到大約5 0微克，更佳的是從每公斤體重大約3微克到大約3 0微克。 -111 - 度適州中-國家標蜱（（、NS ) Λ4Μ^. ( 210X 297^* ) 一~- (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 ΑΊ 一'一一— ——--------- -—Β 7 五、發明説明（109 ) 皮下投藥的劑量計劃可從一週一次變化至一天一次，依據許多臨床因素而定，包括疾病的類型、疾病的嚴重性，以及患者對治療劑的敏感性。〇· 抗體突變種的非-治療性用途本發明之抗體突變種亦可用來作爲親和力純化作用試劑。在該方法中，使用此項技藝中已熟知的方法，將抗體固走在諸如文聯葡聚糖或遽紙之類的固相上。使已經固定的抗體突變種與含有待純化之抗原的試樣接觸，之後以適當的溶劑沖洗支撑物，大體上將會移除試樣中除了待純化之抗原以外的所有物質，該等純化之抗原已經與固定抗體突變種結合。最後，以另一種適當的溶劑沖洗該支撐物，如甘胺酸緩衝溶液，pH 5.0，其使抗原從抗體突變種中釋放出來。亦可在診斷試驗中使用突變的抗體，例如，爲了檢測感興趣之抗原在特定細胞、組織或血清中的表現。關於診斷應用，通常以可檢測之部份來標示該抗體突變種。許多可利用的標記通常分成下列數種： (a) 放射性同位素，如36S、14C、125I、3H和1311。可利用在 Current Protocols in Immunology，第 1_2 册，Coligen 等人編輯，Wiley_Interscience，New York，Pubs (1991)中描述的技術，以放射性同位素來標示抗體突變種，例如可使用閃爍計數器來測量放射性。、 (b) 螢光標記，如希土金屬螯合劑（銪螯合劑）或螢光素及其衍生物，若丹明（rhodamine)及其衍生物，丹續醯 -112- 本紙張尺度述用中國國家標蜂(CNS ) Λ4規格（ —210X297公釐) " * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 五、發明説明（11〇) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 基，麗絲胺（Lissamine)，藻紅蛋白和德州紅（Texas Red) 都是有用的。可利用例如在Current Protocols in Immunology，在前，中描述的技術，使螢光標記與抗體突變種結合。可使用螢光計來定量螢光。 (c) 可利用各種酵素-受酶質標記，且美國專利第 4,275，149號提供一些這些標記的回顧。酵素通常催化可使用各種技術測量之色原受酶質的化學變化。例如，酵素可催化在受酶質中的顏色變化，其可利用分光光度計來測量。另外，酵素可改變受酶質的螢光或化學發光。定量螢光變化之技術如同上述。藉著化學反應以電謗發化學發光受酶質，然後放出可被測量的光（例如使用化學發光計），或捐贈能量給螢光接受者。酵素標計的實例包括蟲螢光素酶（例如螢光蟲蟲螢光素酶和細菌蟲螢光素酶；美國專利第4,737,456號）、蟲螢光素、2,3-二氫二氮雜莕二酮、蘋果酸脱氫酶、尿素酶、過氧化酶，如辣根過氧化酶 (HRPO)、鹼性嶙酸酶、/5-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶（例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氫酶）、雜環氧化酶（像是尿酸酶和黃嘌呤氧化酶）、乳過氧化酶、微小過氧化酶及其類似物。將酵素與抗體連結的技術，描述在CVSullivan等人，Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay，in Methods in Enzym.(編輯 J. Langone & H. Van Vunakis) 9 Academic press, New York, 73: 147-166 (1981)。 -113- 本紙張尺度適川中國國家標埤（C’NS ) Λ4規格（2l〇X 297公釐） !233946 A7 B7 五、發明説明（111 ) 酵素-受酶質組合的實例包括例如： (1) 辣根過化酶（HRPO )，以過氧化氫酶作爲受酶質，其中過氧化氫酶氧化染料前驅物（例如鄰苯二胺（〇PD )或 3,3’，5,5'-四甲聯苯胺氫氣化物（丁]^〇)); (ii) 鹼性磷酸酶（AP)，以對-硝苯基磷酸鹽作爲色原受酶質；和 (iii) -D-半乳糖甞酶（y? _D_Gal)，帶有色原受酶質（例如對-硝苯基j-D-半乳糖甞酶）或螢光團受酶質_4_甲基繳形基（umbemferyl)->5_D-半乳糖苷酶。熟諳此藝者可利用許多其他的酵素-受酶質組合。關於這些的一般回顧’參見美國專利第4,275，149號和 4,318,980 號。有時該標記間接地與抗體突變種連結。熟練的技師將知曉達成孩工作的各種技術。例如，可將抗體突變種與生物素連結，並可將上文提及之三大類標記中的任一種與抗生物素蛋白連結，或反之亦可。生物素選擇性地與抗生素蛋白結合，並因此以間接之方式將標記與抗體突變種連結。另外，欲達成標記與抗體突變種的間接連結，將抗體突變種與小的半抗原（例如毛地黃毒菩）連結，並將一個上文提及之不同種類的標記與抗·半抗原的抗體突變種（例如抗· 毛地黃毒旬連結。因此可達成標記與抗體突變種的間接連接。在本發明其他的具體實施例中，不需要標示抗體突變種，並可利用與該抗體突變種結合之經過標示的抗體來檢本紙張尺度適则，®家標$ ( rNS ) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T f -114 1233946 A7 ------_______—______^ 五、發明説明（112 ) 一 — 測它的存在。可在任何已知的分析方法中使用本發明之抗體，像是競爭性結合分析’直接或間接三明治分析，以及免疫沉澱分析。Zola，Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques，第 147-158 頁（CRC Press，Inc. 1987)。競爭性結合分析依賴經標示之標準物與受試試樣競爭與限定含量之抗體突變種結合的能力。在受試試樣中抗原的含量’與抗體結合之標準物的含量成反比。欲便利地定出已經結合之標準物的含量，該抗體通常在競爭作用之前或之後都是不可溶的。結果，與該抗體結合的標準物和受試試樣’可便利地與仍保持未結合之標準物和受試試樣分離。二明治分析涉及使用兩種抗體，分別能夠與不同的免疫原邵份或抗原決定位，或待檢測之蛋白質結合。在三明治分析中，藉著固定在固體支撑物上的一級抗體來結合待分析心受試試樣，隨後使二級抗體與受試試樣結合，如此形成不可溶的三個-部份的複合物。參見例如美國專利第 4,376，11〇號。二級抗體可利用可檢測的部份來標示自己 (直接的三明治分析），或可利用以可檢測部份標示之抗_ 免疫球蛋白抗體來測定之（間接的三明治分析）。例如，一類二明治分析爲ELISA分析，在該案例中可檢測部份爲酵素。、關於免疫組織化學，腫瘤試樣可以是新鮮的或冷凍的，或可以包埋在石躐中，並以諸如福馬林之類的防腐劑固 -115- 本紙張尺度適用中國國Λ4規格（210x197公釐） — (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 f 1233946 A7 B7 五、發明説明（113 ) 定。亦可在（舌體内的診斷分析中使用該抗體。一般而士，以放射性核素（像是 U1ln、99Tc、14c、131I、3H、32?或35§) 來標示該抗體突變種，以便能夠使用免疫閃爍照相來定出腫瘤的位置。 E. 診斷工具組爲了方便，可在工具組中提供本發明之多肽或抗體，也就是預定含量之試劑經過包裝的組合，並附帶有進行該診斷分析的指導。其中以酵素來標示抗體突變種的工具組，將包含受酶質和該酵素所需的輔因子（例如受酶質的前驅物，其提供可檢測的發色團或螢光團）。此外，亦可包括其他的添加物，如穩定劑、緩衝溶液（例如阻斷緩衝溶液或溶解緩衝溶液）及其類似物。可廣泛地變化各種製備的相對含量，以便提供在製劑溶液中的濃度，大體上最適合該分析的敏感性。特定而言，可以乾燥散劑之形式提供製劑’通常是冷凍乾燥的散劑，包括賦形劑，使其在溶解時將能提供具有適當濃度的製劑溶液。 F·多肽或抗體在活體内的用途意圖使本發明之多肽或抗體可用來治療哺乳動物。在一個具體實施例中，例如爲了獲得臨床前的資料，可將抗體投予非人類的哺乳動物。代表性的待治療之非人類哺物包括非人類的靈長類、狗、貓、嚅齒類和其他哺乳動物，在其中進行臨床前的研究。這類哺乳動物可建立利用該抗體來治療之疾病的動物模式，或用來研究感興趣之抗 -116- ^紙張尺度適W中g國家標缚（（、NS ) A4%^( 210X 297^1 ) (謂先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

1233946 五、發明説明（114 體的毒性。在這些具體實施例的每一個中，進行劑量;昇高的研究。 °對哺乳動物藉著任何適合的方式來投予抗體或多肽，包皮下、腹腔内、肺臟内和鼻内，且若有局部二疫:=:療的需要，還有病變内的投藥。非經腸的輸液包括肌肉内·、、靜脈内、動脈内、腹腔内或皮下投藥。此外，二、 J岸晋考^脈種f 式輸液適當地投予抗體突變種’特別是利用抗體突變種的遞減劑量。較佳的是藉著注射來投藥，最好是靜脈内或皮下注射，一部份依據投藥是否是短暫的或長期的。關於預防或治療疾病，抗體或多肽的適當劑量將依據待治療之疾病的類型、疾病的嚴重程度和過程、抗體突變種是否爲了預防或治療之目的投予、先前之治療、患者的臨床病歷和對該抗體突變種的反應，以及主治醫師的判斷而定。抗-人類IgE抗體適合一次或在連續的治療期間投予。依據疾病的種類和嚴重程度，大約1微克/公斤到15〇毫克/公斤（例如0.1-20毫克/公斤）的抗體或多肽爲投予患者的最初候選劑量，無論是如何藉著一或多次分開的投藥或藉著連續的輸液。典型的每日劑量可能是從大約1微克/公斤到100毫克/公斤或更多，係依據上文提及的因素。關於在數天或更長期間内的重複投藥，依據狀況持續治療，直到出現想要的疾病症狀之抑制爲止。然而，也可以使用其他的劑量攝生法。藉著傳統的技術和試驗可輕易地監視治療的進展。關於抗-LFA_1或抗-ICAM-1抗體的典型劑量攝生法，揭示在WO 94/04188中。 117 本紙張尺廋珀川中國國家標嘩（CNS ) Λ4規格（210X297公釐）

1233946 A7 B7 五、發明説明（115 ) 將以符合良好醫學慣例之方式來調配、訂定劑量並投予抗體突變，種的組合物。在上下文關聯中，考量的因素包括待治療之特定疾病、待治療的特定哺乳動物、個別患者的臨床狀況、疾病的原因、製劑遞送的部位、投藥的方法、投藥的汁劃，以及其他開業醫師已知的因素。待投予之抗體突變種之具有治療效力的含量”，將由這類的考量來決定，並爲預防、改善或治療疾病或失調所需的最低含量。抗體突變種不需要，但可視需要與一或多種目前用來預防或治療正在討論之疾病的製劑一起調配。這類其他製劑之有效含量，依據抗-人類IgE出現在該調配物中的量、待處理之疾病的種類，以及上文討論的其他因素而定。通常以相同的劑量使用’並利用如同在前文中使用的投藥途徑，或迄今使用之劑量的約從1到99%。 G. 製造的物件在本發明的其他具體實施例中，提供包括用來處理上述疾病之物質的製造物件。製造物件包括容器和標記。適當的容器包括例如瓶子、小瓶、注射筒和試管。可由各種材料，如玻璃或塑膠形成容器。裝有組合物的容器，其在處理條件下是有效的，並可具有無菌的通路汽門（例如該容器可以是靜脈内溶液袋或具有可由皮下注射針頭貫穿之夷子的小瓶）。在該組合物中的活性劑爲抗體突變種。在容器上或與其聯結的標記，指示使用該組合物的選定之處理條件。製造物件可進一步包括第二個容器，包括在藥學上可接受的緩衝溶液，如磷酸-缓衝的生理食鹽水、林格氏 -118 - ^ J1] m ( rNS ) Μ 規格（210X 297 公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、11 f 1233946 A7 B7 五、發明説明（116 ) 液和右旋糖溶液。更可以包含在其他商業上和使用者之觀點上想要的物質，包括其他緩衝溶液、稀釋劑、滤器、針頭、注射筒和在工業使用上的包裝插入物。爲了解釋之目的提供下列的實例，而非限制之意。實例實例1 製備IgE之單株抗體經消部屮决掠準局KJT-消費合竹社印^ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 製備八個能夠阻斷IgE與FcsRI結合的單株抗體（MAE10-MAE17)。從U266B1細胞（ATCC TIB 196)的上清液，利用對已分離之抗-IgE抗體（Genentech MAE1 )的親和力層析法來製備對IgE的單株抗體。關於MAE12，利用在Ribi’s佐劑中1 0微克經過純户的IgE，在五隻六週齡之BALB/c雌鼠的腳蟄上免疫。在最初的免疫之後三週，以相同的方式再進行一次後續的注射。在最後一次注射之後三天，移出腹股溝和膝後窩的淋巴結並集中，並藉著使組織通過鋼紗來製造單一細胞的懸浮液。在含有50%重量/體積之聚乙二醇 4000的高葡萄糖（DMEM)中，以4:1之比例將細胞與老鼠骨髓瘤 P3X63_Ag8.653 (ATCC CRL 1580)融合。關於 MAE14、MAE15和MAE13，以類似之方式進行免疫作用，除了 MAE13是使用每次注射3 0微克IgE，並試驗IgE 片段315·347 (Kabat)，作爲融合前的補強；關於MAE10和 MAE11，以皮下注射提供兩次100微克的劑量，最後以5 0 微克補強，並使用脾臟細胞來進行融合。然後在9 6孔的組織培養盤中，以每孔2 X 105個細胞的密 -119- 本紙張尺度適州中國國家標缚（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）經淖部中决標缚^KJ.消资合竹$印繁 1233946 A7 ___________ B7 五、發明説明（117) — 度將融合細胞平放。在2 4小時之後加入hat選擇性择養基（次黃，呤/胺基蝶呤/胸腺核菩，Signia #H〇262 )。在 1440個放置細胞的孔中，在HAT選擇作用後，有365含有正在生長的細胞。在融合之後1 5天，利用酵素-連結免疫吸附試驗（EUsa) 來測試上清液中對人類IgE有專一性之抗體的存在。如下進行ELISA，所有的培養都在室溫下進行。利用在5〇 mM 碳酸鈉緩衝溶液，pH 9·6中的1微克/毫升之兔抗·老藏IgG (Boehringer Mannheim，#605_500)來塗覆受試的培養盤 (Nunc Immunoplate) 2小時，然後以在磷酸緩衝之生理食鹽水（PBS)中的0.5%牛血清白蛋白封阻3 0分鐘，然後以含有0.05%吐溫20的PBS (PBST)沖洗四次。加入受試的上清液並培養2小時，同時振盪之，然後以PBST沖洗四次。以 0.5微克/毫升加入人類IgE (如同上述從U266細胞中純化），並培養1小時，同時振盪之，然後以PBST沖洗四次。以1:2500之稀釋度加入與山羊抗人類IgE結合的辣根過氧化酶（Kirkegarrd & Perry Labs，#14_10·04，0.5 毫克 / 毫升），然後以PBST沖洗四次。藉著加入100微升/孔的含有10毫克鄰-苯二胺二氫氯化物（Sigma，#P8287 )和1 0微升在25微升磷酸檸檬酸缓衝溶液，pH 5.0中之30%的過氧化氫溶液，並培養15分鐘，使培養盤展開。藉著加入100 微升/孔的2.5 Μ硫酸使該反應中止。藉著在自動ELISA盤讀取器上，在490毫微米處讀取該培養盤的吸光度而獲得資料。關於MAE12，測試365個上清液，有100個對人類 -120- 本紙張尺度用中國國^^ ( rNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 f 1233946 A7

7 B 五、發明説明（118 ) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

IgE有專一性。當篩選其他的抗體時，獲得類似頻率的IgE 專一性。所有在本文中描述的單株抗體都是IgGl同型物，除了 MAE17，其爲IgG2b，以及MAE14，其爲IgG2a以外0 每一種專一於IgE之抗體皆進一步以細胞-基礎及平盤分析方法測試，以篩選可與IgE結合之抗體，而可抑制IgE與 Fes RI之結合，且其無法與FCEH-結合IgE結合。結果顯示於如下所示表1及2中。表1 老鼠抗-HuIgE mAb的特徵概述 mAb 免疫原計劃/劑量(微克） B-細胞來源同型物使 Fc ε RI 與已結合之 IgE結合1 PBL組胺酸釋放2 (EC50) 阻斷Fc ε R1 的量3 (EC50) MaEl PSIgE 3x50 淋巴結 IgGl 0.05微克/毫升 1微克/ 毫升 0.3微克 MaElO U266 IgE 2x100, 1x50 脾臟 IgGl 在10微克/毫升下未結合 >100 微克/毫升 2.5微克 MaEll U266 IgE 2x100, 1x50 脾臟 IgGl 在10微克/毫升下未結合 >100 微克/毫升 0.6微克 MaE12 U266 IgE 3x30 淋巴結 IgGl 在10微克/毫升下未結合 >100 微克/毫升 0.8微克 MaE13 U266 IgE 3x30 淋巴結 IgGl 在10微克/毫升下未結合 >100 微克/毫升 0.6微克 MaE14 U266 IgE 5x50 淋巴結 IgG2a 在10微克/毫升下未結合 >100 微克/毫升 2.5微克 MaE15 U266 IgE 5x50 淋巴結 IgGl 在10微克/毫升下未結合 >100 辫克/毫升 0.6微克 MaE16 rfflgE aa315-547 5x1 淋巴結 IgGl 在10微克/毫升下未結合 >100 微克/毫升 0.7微克 MaE17 rfflgE aa315-547 5x1 淋巴結 IgG2b 在10微克/毫升下未結合 > 100 微克/毫升 > 5.0微克 -121 - 本紙張尺度適用中國國家標噑（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1233946 A7 _______B7 五、發明説明（119 ) 表2 老鼠抗_HuIgE Η的概述（續）

mAb 與在U266BL 上的膜IgE 結合(EC50)4 與在Fc ε RH (CD23)_ 上的IgE結合 (EC50)5 阻斷1微克IgE 與Fc ε RII 結合的量 (EC50)6 抑制在活體外之IgE的合成對IgE8之親和力常數 (Kd) MaEl 0.4微克/亳升 0.05微克/毫升 > 100微克㈠ 5.4xl〇·8 MaElO 0.5微克/毫升在10微克/毫升下未結合 2.5微克 (-) 7xl〇·9 MaEll 0.15微克/亳升在10微克/亳升下未結合 0.6微克㈩ 3xl〇·8 MaE12 >10微克/亳升 1微克/亳升 5.0微克 (-) 4xl〇·7 MaE13 1微克/毫升在10微克/亳升下未結合 0.7微克 (++) 5xl0'8 MaE14 6微克/毫升在10微克/亳升下未結合 2.5微克 (土） 1.4xl0-8 MaE15 6微克/毫升在10微克/亳升下未結合 0.6微克 (土） 7xl0-8 MaE16 10微克/亳升 <0.05微克/亳升 5微克 _ (+) ND MaE17 10微克/亳升在10微克/亳升下未結合 5微克 (++) ND (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1·以FACg爲基礎的試t，用來生立斤老鼠抗-人類lgE單株抗體。在CHO 3D10 (FcsRi從+ )上筛選老鼠抗-人類IgE之單株抗體。 a. 在4 C下，以每份試樣5χι〇5個細胞，將CHO 3D10 細胞（FceRI α鏈穩定的轉移感染物，Hakimi等人，J· Biol· Chem. 21: 22079)，與1〇微克/毫升，在100微升FACS緩衝溶液（0.1% BSA，10 mM在pBS中之疊氮化鈉，pH 7.4)中 -122- 呆紙張尺度通用中國國家標率（(ns ) 一"" 1233946 Α7 Β7 五、發明説明（12〇) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的U266 IgE標準物一起培養3 0分鐘，隨後以FACS缓衝溶液沖洗一次。藉著在4 °C下，將一等份裝載IgE的細胞與 5 0微克/毫升已經與兔抗-人類IgG結合的多株FITC (Accurate Chem· Co. AXL-475F，分類第 16 號）一起培養 30 分鐘，隨後以FACS緩衝溶液沖洗三次，定出IgE結合的量0 b. 在4°C下，將裝載了 IgE的細胞與100微升老鼠抗-人類IgE融合瘤上清液（老鼠IgG之濃度範園從1到2 0微克/毫升）一起培養30分鐘，隨後以FACS緩衝溶液沖洗一次。使用10微克/毫升之Genentech單株抗人類IgE (MaEl)作爲結合作用的陽性對照組。使用1 0微克/毫升不能辨認 IgE的Genentech單株抗體（MAD 6P )作爲陰性對照組。 c. 藉著在4°C下，將細胞與20微克/毫升結合了 FITC 之經過親和力純化的F(ab’)2山羊抗老鼠IgG (Organon Teknica，#10711-0081 ) — 起培養3 0 分鐘，隨後以 FACS 緩衝溶液沖洗三次，來檢測單株抗體在CHO細胞上與人類 IgE的結合作用。在細胞中加入400微升含有2微克/毫升碘化丙錠（propidium iodide) (Sigma，#P4170)的緩衝溶液，來染色死掉的細胞。 d. 在 Becton Dickinson FACSCAN 流動細胞計（flow cytometer )上分析細胞。放置向前之光散射和側向9 0度之散射的閘門，來分析均質的細胞族群。以碘化丙錠染色死掉的細胞，並排除於分析之外。將未與在CHO 3D10細胞上之IgE結合的融合瘤上清液視爲進一步篩選的候選者。 -123 - 本紙張尺度诚州中國國家標净（CNS ) Μ規格（210X297公釐） ¾¾部中决掠準局Μ工消费合竹社印f 1233946 A7 _______—— B7 五、發明説明（121 ) — 2· 周團血％之嗜鹼性球中釋放組胺醢。從正常的捐

贈者中獲彳于以肝素抗凝的血液，並以經過修改的泰洛德斯 (Tyrodes)緩衝溶液（25mMTris，15〇mMNaa，i〇mM

CaCU ’ MgCl2 ’ 0.3 毫克 / 毫升 HSA，pH 7.35 )稀釋成 1:4，然後在4°C下與1 nM人類IgE (ND) —起培養60分鐘。然後將細胞加至含有老鼠單株抗_IgE Abs ( i 〇毫克/毫升）或作爲陽性對照組之多株抗人類抗血清的泰洛德斯緩衝溶液中，並在3 7 C下培養3 0分鐘。使細胞形成小球，將在上清液中的組胺酸乙醯基化，並利用RIA工具組（AmAC，Inc. Wesbrook，Main)定出組胺酸的含量。從經歷數次冷凍.融解循環的細胞中定出組胺酸總量。 3· 里„斷與IgE結合之Fite對Fc ε RI以鐘的結合作用。藉著在37°C下，在含有〇·!% BSA和10 mM疊氮化鈉，pH 7.4 的PBS中’將以Fite標示之IgE與各種MaE抗體一起預先培養30分鐘’然後在4°C下將該複合物與5χ1〇5個3D10細胞一起培養3 0分鐘，來研究抗體對IgE結合作用的影響。然後沖洗該細胞三次，並在475毫微米處測量平均通道螢光。使用不能阻斷IgE與Fc ε RI從鏈之結合的老鼠人類igE mAb (Mael)作爲對照組。 4· 全析老鼠抗·人類IgE與膜IgE陽性之Β細胞U266的結合作用 a. 在補充有15%熱失活之胎牛血清（Hyclone，#A-1111-L)、青黴素、鏈黴素（100單位/毫升）和l·穀胺醯胺 (2 mM)的鹼性培養基中培養U266 B1細胞（膜IgE+)。 -124- 本紙張尺度適州中國國家標埤（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）訂 ~ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1233946 A7 B7 五、發明説明（122 ) b. 在冰上，在9 6孔的圓底微量滴定盤中，在含有 10、5、1、0.5和〇_1微克/毫升之老鼠抗人類IgE單株抗體的100微升FACS緩衝溶液中，培養細胞（5xl05/—等份） 3 0分鐘，隨後以FACS緩衝溶液沖洗兩次。使用Genentech 單株抗體MAE1作爲陽性對照組。 c. 在冰上，在含有50微克/亳升（1:20之母液）與FITC 結合之F(ab，）2親和力純化之山羊抗老鼠IgE (Organon Teknika，#1711-0084)的100微升FACS緩衝溶液中培養該細胞3 0分鐘，隨後以FACS缓衝溶液沖洗三次。在細胞中加入含有2微克/毫升碘化丙錠之400微升FACS緩衝溶液來染色死掉的細胞。 5. 對FceRII (CD23)+B細胞IM9之以FACS爲基礎的結驗 a. 將 IM9人類B 細胞融合瘤（ATCC CCL 159，Ann. Ν·Υ· Acad. Sci. 190： 221-234 (1972))維持在帶有10%熱失活之胎牛血清、青黴素、鏈黴素（100單位/毫升）和L-穀胺醯胺（2 mM)的GIF鹼性培養基中。 b. 在4°C下，在96孔微量滴定盤中，將細胞（5xl〇5個細胞一等份）培養在含有2微克/毫升U266 IgE標準物的1〇〇微升FACS緩衝溶液中3 0分鐘，接著以FACS緩衝溶液沖洗兩次。至於對照組，則在單獨的緩衝溶液中，或含有2微克 / Φ 升人類 IgGl (Behring Diagnostics ’ 目錄弟 400112 號，登記第801024號）之緩衝溶液中培養細胞。 C. 然後在冰上將細胞與〇. 1到1 0微克/毫升之老鼠抗- ________ - 125-_ ___ 本紙張尺度珀州中國國家標縛（（、NS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 kl 1233946 B7 五、發明説明（123 ) 人類IgE單株抗體一起培養3 0分鐘。使用Genentech單株抗體MAE1作爲陽性對照組。 d. 然後在4°C下，在含有5 0微克/毫升與FITC結合之 F(ab 丨)2 山羊抗-老鼠 IgG ( Organon Teknika，#1711-0084)的 100微升FACS缓衝溶液中培養細胞3 0分鐘，接著以FACS 緩衝溶液沖洗3次。 e. 然後在細胞中加入400微升含有2微克/毫升碘化丙錠的緩衝溶液，來染色死掉的細胞。 f. 在Becton Dickenson FACSCAN流動細胞計上分析細胞。放置向前之光散射和側向9 0度之散射的閘門，來分析均質的細胞族群，並以碘化丙錠染色死掉的細胞，將其排斥於分析之外。分析FITC陽性細胞（與IgE結合），與僅以FITC兔抗人類IgE染色之細胞的相關性。 g. 至於在每個實驗中，決定在IM9細胞表面上之CD23 含量的陽性對照組，在4 °C下以1 0微克/毫升之Becton Dickinson老鼠單株的Leu 20 (抗-CD23 )抗體來染色一等份的細胞3 0分鐘，接著沖洗2次。然後將細胞與5 0微克/毫升與FITC結合之F(ab’)2親和力純化的山羊抗-老鼠IgE—起培養。 6. 抗體阻斷與FITC結合之IgE對低親和力之IgE受體的結合作用

藉著流動細胞計數，在FACSCAN流動細Μ計上分析在B 淋巴母細胞ΙΜ-9上表現的40 ηΜ以FITC標示之IgE與低親和力IgE受體（CD23或FceRI)的結合作用。藉著在37°C -126- 本紙張尺度中國S家標缚（（、NS ) Μ規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 #! 1233946 A7 B7 五、發明説明（124 ) 下，將FITC IgE與老鼠抗·人類抗體以0· 1到i 〇微克/毫升之敗合體之形式’在含有0.1% B S A和1 〇 mM疊氮化鈉pH 7·4的PBS中一起預先培養30分鐘，然後在4°C下將該複合物與5x105個細胞一起培養3 0分鐘，來研究抗體對FITC IgE結合作用的影響。然後沖洗細胞三次，並在475毫微米處測量平均通道螢光。 7. IgE在活體外的分析草案 a. 從正常捐贈者中分離出周園血液單核球。 b. 以PBS廣泛地沖洗細胞，以便儘可能地移除血小板。 c* 計數單核球細胞，並以lxl06個細胞/毫升懸浮於培養基中。培養基爲帶有青黴素和鏈黴素、15%馬血清、IL-2 (25單位/毫升）和IL-4 (20亳微克/毫升）之DMEM的混合物。 d· 在第〇、5和8天時加入適當濃度的抗體。 e· 在2 4孔的Falcon組織培養盤中培養該培養物1 4 天。 f. 在弟1 4天時’移出上清液並藉著igE專*一性的 ELIS A草案來分析IgE的濃度。 8. 薇著平衡結合（查卡斯德（Scatchard))分析定出人類 IgE之老鼠mAb的親和力常數（kd、 a· 精者氣胺T法將IgE (NI)和PS同種異型物（allotype) 破化，並利用PD10交聯葡聚糖G25管柱（卩1^〇1^(^，#17-0851-01 )，在RIA緩衝溶液中：PBS，0.5%牛血清白蛋白 -127- 本纸張尺度ϋ中國囤家標埤（rNS ) Λ4規格（2l0X29T^jy 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1233946 -次標準局Π,!-消贽合竹社印繁 A7 B7 五、發明説明（125 ) (Sigma，#Α-7888)、〇·〇5% 吐溫 2 Ο (Sigma，#P-1379)、 0.01%乙基汞硫代水楊酸鈉（Sigma，#T_5125) pH 7.4從自由的125I Na中分離之。以50%三氣乙酸使大約78-95%的管柱後總數沉澱，並將範圍在從1.6到13微居里/微克的碘化 IgE製品之專一性活性，假定爲具有70%的計數效力。 b· 在12 X 75毫米的聚丙烯試管中，將固定濃度的1251 (大約5 X 104 cpm )加至在終體積0· 1毫升RIA緩衝溶液中的各種濃度之未標記IgE (1至200 nM)中。然後加入在0.1毫升RIA緩衝溶液中之老鼠抗-人類IgE mAB’s ( 20 mM終濃度），最後的分析體積爲0.2毫升。 c. 在25°C下培養試樣16·18小時，並連續攪摔之。 d· 藉著加入0.3毫升在RIA緩衝溶液中、與CNBr活化之瓊脂糖4 B ( Pharmacia，#17-0430-01 )偶聯的親和力純化之山羊抗老鼠 IgG ( Boehringer Mannheim，#605-208 )和載劑蛋白質A瓊脂糖（Repligen，#IPA300)的混合物，在25°C 下培養1到2小時，並連續地攪拌，來分離已經結合和自由的125I IgE。然後加入RIA緩衝溶液（1毫升），並以400 xg離心該試管5分鐘。然後計算試樣以便定出總量。利用拉細的巴斯德吸移管吸出上清液，再計算試樣，並算出已結合對自由的計數。 e. 利用以Ρ· Munson在NIH所寫之配體程式爲基礎的 Fortran程式（掃描作圖）來完成斯卡查德分析。掃描作圖利用質量作用公式，適當的結合者作爲總量的函數，使用 Rodbard型的回歸分析。 -128- 本紙張尺度適用中國國家標绛（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T .ΦΙ. 1233946 Α7 Β7 五、發明説明（126) 實例2 製備人類化的MaEll 簡介：下列的實例描述人類化之MaEl 1的各種製備方法，其中經由指定位置之突變生成來修改殘基，獲得1 2個抗-IgE MaEll變體[F(ab)l-12]。使用殘基F(ab)12作爲模板，產生 rhuMaE25或E25，在1992年8月14曰提出申請的申請案 PCT/US92/06860中描述了極有潛力的抗-IgE抗體。方法：經湞部中欢標準局员-.Τ-消贽告竹社印來 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 藉著指定位置之突變生成（Kunkel，Τ·Α· (1985)，Pro c. Natl. Acad· Sci. USA脸：488)，從在以pUC119_爲基礎之質體 p AK2中含有人類x _亞組I輕鏈和人類亞組III重鏈（VH-CH1)的含脱氧尿替模板（Carter等人（1992 )，Proc· Natl. Aca· Sci· USA 4285 )來修改圖1所示之老鼠抗人類IgE mAb MaEll，獲得變體F(ab)_l。從F(ab)-1模板來建構 F(ab)-2，而從模板F(ab)-2來建構所有其他的人類化F(ab) 變體。爲了製備雙-和單股的DNA，將質體轉化到大腸桿菌品系 JM101 内（Messing，J· (1979)，Recomb· DNA Tech· Bull. 2: 43 Ausuble ψ A ? Current Protocols in Molecular Biology，單元1 (1997))。使用雙脱氧核苷酸法，完全定出輕鏈和重量的殘基。然後將編碼輕鏈和重鏈的DNA繼代選殖到大腸桿菌F(ab)表現載體的衍生、物，pAK19中 (Carter 等人（1992 )，Biotechnology !〇.: 163)。衍生物缺乏鉸鏈半胱胺酸，其在F(ab]2片段中形成重鏈間的二硫鏈。 -129- 本紙張尺度適用中國國家標绛（CNS ) 21〇Χ 297^ΐΊ 1233946 A7 B7 經Μ部中次標卑局β(_.τ.消贽合竹；^印來五、發明説明（127 ) 該F(ab)片與與全長的IgG抗體相反，有助於頗爲大量之變體的分析；，因爲可能使用大腸样菌的表現而非哺乳動物細胞培養之技術。在1993年3月4日公告之申請案W0 93/04173中描述這些個別的變體。一旦決定了最佳的變體，隨後將其繼代選殖到編碼全長之人類IgGl的質體内 (參見下文）。將表現質體轉化到大腸桿菌品系MM294 (Meselon，Μ和R· Yuan (1968), Nature 217: 1110)内，並使單一的菌落在 37°C 下生長在5毫升2YT培養基·羧芊青黴素（100微克/毫升）中 5-8小時。然後將培養物（5毫升）加至100毫升AP5培養基-羧苄青黴素（100微克/毫升）中，並容許其在37°C的500毫升振盪燒瓶中生長1 6小時。以4,000 xg離心該培養物，並移除上清液。在冷凍1小時之後，將小球再懸浮於5毫升冰冷的10 mM Tris、1 mM EDTA和50微升0.1 Μ芊脒 (Sigma，St· Louis )中，加入後者以便抑制蛋白水解作用。在冰上溫和的振盪1小時之後，以1〇,〇〇〇 xg離心該試樣1 5 分鐘。將上清液裝入蛋白質A-瓊脂糖CL-4B (Pharmacia)管柱（0.5毫升柱床體積）中，然後以1〇毫升3M氯化鉀/100 毫升Tris，pH 8。0的溶液沖洗，接著以1〇〇 mM醋酸（2·5毫升），pH 2.8 變成 1 M Tris，pH 8.0 (0.5 毫升）洗脱。然後利用Centricon-30 (Amicon)將F(ab)緩衝溶液交換成 PBS，並濃縮至〇·5毫升的終體積。執行每個F(ab)片段的 SDS-PAGE凝膠，以便確定純度。藉著使用〇 1〇/〇 ε 28〇定出 F(ab)濃度爲1·〇。藉著使用得自經純化之F(ab)-2之胺基酸 -130- 孓紙張尺度適，石中國Ul0X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本百〇訂 •I. 1233946 經淖部中决標準局β_1'.消贽合竹社印¥ A7 B7 五、發明説明（128) 分析的蛋白質濃度，以及相同試樣的A280定出消光系數。藉著液體層析法/質譜分析直接分析選出的F(ab)片段，證實它們的分子量。將試樣注射到填充毛細液體層析系統 (Henzel，W.J.等人（1990)，Anal. Biochem· 187: 228)内，並利用Sciex API 3質譜分析儀直接分析之。利用與試樣所使用之那些相同的儀器參數，獲得人類生長激素之較高電荷狀態（分子量22,256.2)，用來校準刻度。爲了產生人類化MaEl 1之全長人類IgGl譯本，分別將重鏈和輕鏈繼代選殖到先前描述的pRK質體（Gorman，C.M. 等人（1990)，DNA Protein Eng. Tech，2_: 3)内。利用高效率程序（Graham 等人，在前 & Gorman，C.M·，Science 221: 551)，將適當的重鏈和輕鏈質體（依據想要改變的序列）共同轉移感染到以腺病毒-轉化的人類胚腎細胞株，已知爲 293 (Graham，F.L.等人（ 1977)，J. Gen. Virol· 59)内。將培養基換成不含血清的，並每天收穫，最多至第5天。利用蛋白質瓊脂糖CL-4B (Pharmacia)，從收集到的上清液中純化抗體。藉著G25凝膠過濾法，將洗脱出的抗體之缓衝溶液換成PBS，藉著超過濾，利用Centriprep-30或 Centricon_100 (Millipore)濃縮，並儲存在4°C下。使用總 IgG-結合ELISA定出抗體的濃度。結果描述在表4中。可溶性受體分析：在4-8°C下，利用〇.〇5毫升在塗覆緩衝溶液（50 mM碳酸鹽、碳酸氫鹽，pH 9.6)中之Fes RIa-鏈IgG嵌合性受體，來塗覆96-孔的分析培養盤（Nunc) 1 2小時。抽乾各孔，並 -131 - 本紙張尺度適用中國國家標峰（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 t 經Μ部中次標卑局兵_τ消贽合竹社印來 1233946 A7 B7 五、發明説明（129) 加入250微升阻斷缓衝溶液（PBS，1% BSA，pH 7.2)，並在4°C下埽養1小時。在個別的分析盤中，藉著以分析缓衝溶液（0.5% BSA和0.05%吐溫20，PBS，pH 7.2)稀釋成 1:4，滴定從200到0.001微克/毫升的試樣和參考的老鼠 MaEl 1，加入等體積的1 0毫微克/毫升生物素基化之IgE (O-Shannessy，D.J.等人（1984)，Immunol. Let·及：273)。接著在25°C下培養該盤2-3小時。以PBS和0.05%吐溫20 (Sigma)沖洗Fc ε RI-塗覆的孔三次，並將得自試樣孔的5 0 微升移入其中，在25°C下培養3 0分鐘並加以攪摔。以5 0 微升/孔加入以分析緩衝溶液稀釋成1:5000的鏈黴菌抗生物素蛋白-HRP (500微克/毫升，Sigma)，接著培養該盤 1 5分鐘並加以攪拌，然後按照先前的描述沖洗。加入5 0 微升/孔的微孔過氧化酶受酶質（Microwell Peroxidase Substrate )(Kirkgaard & Perry Laboratories)，而在 30 分鐘内有顏色展開。藉著加入等體積的IN HC1使反應中止，並在450毫微米處測定吸光度。藉著以適用於Kaleidagraph 資料分析應用之非線性四-參數曲線（Synergy Software )，作出抑制百分比對阻斷抗體濃度的圖，來計算抑制50%的濃度。在表3中報告了結果。以FACS爲基礎的結合分析：藉著流動細胞計數，定出抗體抑制與FITC結合（Goding， JLW。（1976)，J· Immunol. Methods U: 215)之 IgE 與在 CHO 3D10 細胞（Hakimi，J·等人（1990)，J. Biol· Chem. 265.： 22079) 上表現之高親和力Fes RI受體之鏈結合的能力。將與 -132- 本紙張尺度過用中國國家標啤（rNS ) A4規格（210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 -次標津局tH-ι·.消贽合仞.社印來五、發明説明（13〇 ) FITC 結合之IgE (40 nM)與抗體（0.3-1.0 X 1〇 6 M)在 37°C 下，在FACS緩衝溶液（PBS、0.1% BSA和1〇 mM疊氮化鈉，pH 7.4)中一起預先培養30分鐘。然後在4°C下，將複合物與5 X 105個CHO CD10細胞一起培養3〇分鐘。以FACS 缓衝溶液沖洗細胞三次，並在FACScan流動細胞計（Becton Dickinson)上，在475毫微米處測定平均通道螢光。使用不能阻斷IgE與Fc ε RI心鏈結合之老鼠抗·人類IgE mAb作爲陽性對照組，並使用不能辨認IgE的M0PC21 (Cappel)，老鼠單株抗體作爲陰性對照組，結果描述於圖3中。抗體與裝載有IgE之FcsRI的結合作用: 在4°C下，將與聯合了人類IgE，並在CHO 3D10細胞上表現的FceRI之亞單元結合的抗體與10微克/毫升的人類IgE —起培養3 0分鐘。沖洗細胞三次，接著與各種濃度的老鼠抗-人類IgE mAbs MaEl或MaEl 1，或人類化之mAb 變體12[F(ab)12] —起培養30分鐘。使用M0PC21 (老鼠 IgGl )作爲老鼠mAbs的對照組，同時使用人類化之 4D5mAb (Carter 等人，Proc. Natl· Acad· Sci. USA ^9.: 4285 (1992)，人類IgGl )作爲F(ab)12的對照組。利用與FITC結合之F(ah〇2山羊抗-老鼠IgE (10微克/毫升）檢測老鼠mAbs 的結合。利用與FITC結合之F(ab')2山羊抗·人類IgG (50微克/毫升）來檢測人類化之mAb的結合，已經在IgE管柱上以親和力純化，以便將其對IgE的交互-反應、性減至最少。結果描述在圖4中。老鼠和人類化之F(abYs的電腦作圖模式： -133- 本紙張尺度適用中國國家標埤（ΓΝ8 ) Λ4規格（210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

X 1233946 A7 B7 五、發明説明〇31 ) 利用圖1之F(ab) VL·和VH功能部位的序列，來建構老鼠 MaEl 1 功能部位的電腦作圖模式。隨後使用該模式來決定應該合併到人類化抗體内，導致產生F(ab)-2的骨架殘基。亦可建構人類化變體的模式，以便證實老鼠骨架殘基的正確選擇。如同在Carter等人（1992) ’ Proc. Natl. Acad· Sci. USA 四：4285 ; Eigenbrot，C.等人（1993)，J· Mol· Biol. 229： 969中的描述來進行模式的建構。結果：設計人類化的MaEl 1抗體·· 人類化抗體目前的研究，係使用人類的一致序列。這與其他已經使用接近感興趣之老鼠Ig的人類序列之人類化技術顯然有另1J。Shearman，C.W.等人（1991)，J· Immunol. 147: 4366; Kettleborough，C.A.等人（1991)，Protein Eng. 4: 773 ; Tempest，P.R·等人（1991)，Biotechnology 芝：266 ; Co，M.S. 等人（1991)，Proc· Natl· Acad· Sci· USA M: 2869 ; Routledge， E.G. (1991)，Eur· J. Immunol· 21: 2717。該人類的一致序列包括以人類V Η亞組III和VL %亞組I爲基礎之骨架，如同在 Kabat 等人（1991) ，Sequences of Proteins of

Immunological Imterest ，第 5 版，National Institute of Health, Bethesda，MD中的定義。藉著將六個CDR，s，如同在Kabat，在前的定義，移殖到人類IgGl骨架上，產生 F(ab)-1。所有的骨架殘基均保留像人類的一樣。最好是以平直的”CDR交換"來描述該變體。F(ab)-1顯示無法檢測到對IgE與受體之結合的抑制作用（表3 )。先前已經報告了 -134- 本紙張尺度適州中國國家標碑（（、NS ) Λ4規格（210X297公釐) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 f 1233946 A7 B7 五、發明説明（132 ) 這類nCDR交換π變體無法與其抗原結合。Carter等人，在前；Tempest等人，在前。注意到在表3中並未描述F(ab)-1的精確序列，然而，可藉著以相對應的人類殘基來取代老鼠Kabat CDR殘基（以括弧表示）來推論出該序列。圖1 藉著右方和左方的括弧來表示Kabat CDRs，同時以下標線來表示 Chothia CDRs。爲了幫助解釋並減少混亂，以正常的型式寫出人類殘基，同時以斜體顯示老鼠的殘基。在指示殘基的取代之處，第一個殘基是被置換者，第二個是被插入者，且編號爲天然序列的Kabat名稱。 F(ab)_2變體係以分子模型爲基礎。在該分子中，將數個老鼠骨架殘基合併到人類的骨架内。在F(ab)-2中，除了 CDR-H1和CDR-H2以外，使用由Kabat等人，在前（其係以特殊序列之間的可變性爲基礎）提供的CDR’s限定。 CDR-H1的限定以序列的可變性爲基礎（Kabat等人，在前），其在以抗原抗體複合物的結晶學研究（Chothia，C. 等人（1989)，Nature 342: 877)爲基礎而有顯著不同（圖1)者之間。因此，CDR-H1再度被定義爲包括兩種限定，也就是人類殘基26-35。 CDR-H2的限定亦以序列可變性爲基礎（Kabat等人），其含有一個以上、以抗體·抗原晶體結構爲基礎的殘基 (Chothia等人）[參見圖1 :藉著括弧限定Kabat CDR’s，藉著下標線限定Chothia]。因爲沒有發現代表抗體-抗原接觸抗體人類殘基60-65的晶體結構，所以修改CDR-H2使其 -135- 本紙張尺度適用中國國家標缚（C'NS ) Λ4規格（210X29*7公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 五、發明説明（133 ) 包含兩種限定的雜交，以就是人類殘基50-58。結果，在 F(ab)-2中，使用較短的CDR_H2譯本與F(ab)-1作比較。結果，利用從人類到老鼠殘基之最低量的變化，產生了 F(ab)-2，咸相信在維持結合作用時需要它。爲了測試隱藏殘基CDR構型的影響，產生另外1 0個變體，並評估重要骨架殘基之分子模型預知的影響，和檢查其他感興趣的殘基。欲測試隱藏殘基對CDR構型的影響，建構F(ab)-3到 F(ab)-7，其中將老鼠殘基變回人類的殘基。如同在表4中所示（藉著F(ab)-3 & F(ab)-4)，在VL4和VL33之側鏈對於結合作用，以及在人類化抗體中CDR-L1可能的構型有最小的影響。設計模型暗示骨架殘基VH24可能影響CDR-L1構型，且 VH37可能影響VL-VH介面。然而，在VH24[F(ab)-5]或 VH37[F(ab)-7]處取代人類的殘基顯示在結合作用中有最低限度的減少。相反的，在骨架位置VH78處以人類的 Leu[F(ab)_6]置換老鼠的Phe，引起結合作用的明顯減少。該模型暗示該殘基正影響CDR_H1及/或CDR-H2的構型。 F(ab)-9到F(ab)-12檢查以老鼠的來置換人類殘基。與 F(ab)-2相比較，這四個變體在結合作用上均顯示出實際上的改良（參見表3、4和圖3)。在F(ab)-9中，其顯示出勝過F(ab)-2五倍改善的結合作用，係將在CDR-H2 (如同由 Kabat等人，在前限定的）中的兩個殘基改變成老鼠的殘基；Ala VH60 Asn和Asp H61 Pro。該Pro取代作用已經改 -136 - 本紙張尺度適州士國國家標缚（rNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 五、發明説明（彳34 ) 變了 CDR-H2的構型及/或硬度，並預期Asn H60隱藏在VL-VH介面，而可能與Asp VL1有交互作用。 F(ab)-10，相對於F(ab)-2其展示出實際上改良的結合，是其中所有在VL和VH功能部位中的隱藏殘基（限定爲其帶有之可使用表面積低於自由胺基酸之5 %的殘基）都是老鼠MaEll的那些的變體。在本質上，可將F(ab)_10視作老鼠的MaEll，其中僅將露出的、VL和VH中之非- CDR殘基更改成人類殘基。欲確定F(ab)-10的改良結合是否是因爲一或數個殘基，創造出變體F(ab)_ll和 F(ab)-12。代替F(ab)-2，使用 F(ab)_ 9作爲基本模板，從其中製備這些變體，因爲其顯示出五倍改良的結合作用。設計模型暗示在VH63和VH67處的側鏈，可能影響CDR-H2的構型。按照Kabat等人，在前的定義，將VH63視爲是CDR-H2的一部份，但未按照Chothia 等人，在前之定義。VH67在兩種定義中均被視爲是骨架殘基。在F(ab)-ll中，VH63和VH67分別爲老鼠殘基Leu和 lie。在F(ab)-12中，僅將VH67變更爲老鼠的lie。在可溶性受體（表4 )和以細胞爲基礎的分析（表4，圖3 ) 兩者中，變體F(ab)-11和F(ab)-12顯示出至少像F(ab)-10 — 樣好，並且比F(ab)_9更佳的結合。這暗示F(ab)-10改良的結合作用，並不是因爲以老鼠的殘基來再包裝内部的VH 功能部位，而是只因爲單一殘基，也就是VH67的影響。以老鼠Gly來置換人類VL 55殘基Glu，並以Glu在VL 57 處之Gly進行類似的取代，來建構F(ab)-8。F(ab)-2使用人 -137- 本紙張尺度適用中國國家標峰（（'NS ) Λ4規格（210X 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 五、發明説明（135 類的殘基，而在這些位置以老鼠殘基來取代F(ab)-8。可由表3中輕易地推測，這些殘基的取代並不影響受體的結合作用。表3 : 人類化的Maell變體變體從F(ab)-2來的改變(a) 在抑制50%時的 FrabVX FfabVX 濃度(毫微克/毫升)平均値標準 F(ab)-2 MaEll VL VH 偏差⑻ F(ab)-1 Leu 4 Met Arg 24 Lys GIu 55 Gly Gly 57 Glu Val 24 Ala lie 37 Val Thr 57 Ser Ala 60 Asn Val 63 Leu Gly 65 Asn Phe 78 Leu > 100,000 > 16.0 (c) >560 F(ab)-2 - - 6083, 1279 1.0 34 F(ab)-3 Leu 4 Met Met 33 Leu - 9439, 508 1.6 53 F(ab)-4 Leu 4 Met — 6770, 349 1.1 3.8 F(ab>5 — Val 24 Ala 9387, 733 1.6 52 F(ab)-6 — Phe 78 Leu 17,537, 4372 2.9 24 F(ab)-7 — lie 37 Val 8622, 107 1.4 48 F(ab)-8 Glu 55 Gly Gly 57 Glu 一 5799, 523 1.0 32 F(ab)-9 Ala 60 Asn Asp 61 Pro 1224,102 0.20 6.8 F(ab)-10 Ala 13 Val Val \9Ala Val 58 lie Val 48 Met Ala 49 Gly Ala 60 Asn 842, 130 0.14 4.7 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T f -138- 本紙張尺度適用中國國家標缚（rNS ) Λ4規格（2lOX297公釐） 1233946 A 7 B7 五、發明説明（136 ) 丨 Leu 78 Val Val 104 Leu Val 63 Leu Phe 67 lie lie 69 Val Met 82 Leu Leu 82c Ala F(ab)-ll -- Ala 60 Asn Asp 61 Pro Val 63 Leu Phe 67 He 416,66 0.07 2.3 F(ab)-12 - Ala 60 Asn Asp 61 Pro Phe 67 lie 501,84 0.08 2.8 MaEll — 一 179, 63 0.03 1.0 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (a) 老鼠殘基爲斜體字；殘基編碼係根據Kabat等人 (b) 三個可溶性受體分析的平均値和標準偏差 (e) F(ab)X/F(ab)-2之比例>16，意指即使是使用最高的F(ab) 濃度，該變體亦未顯示有結合作用定出與老鼠MaEl 1有最緊密之結合的F(ab)變體，叫做 F(ab)-2、F(ab)-9、F(ab)_10 和 F(ab)_12，使用它們來產生全長的IgGl分子。將這些分子相對於變體F(ab)-2或MaEl 1 的結合作用，可與由F(ab)片段顯示的結合作用相比擬。在表4中報告這些結果。、1Τ •Γ 4? Μ部屮决榡準局T,消於合竹社印繁 -139- 本紙張尺度適川中國國家標嘩（rNS ) Λ4規格（2】0X297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明説明（137 ) 表4 人類化MaEl 1 IgGl變體全長的變體 50%抑制之濃度（毫微克/毫升）平均値，標準偏差⑷ 變體X IgGl-2(b) 變體X MaEll IgGl-2 7569, 1042 1.0 16.9 IgGl-9 3493, 1264 0.46 7.8 IgGl-10 1118, 172 0.15 2.5 IgGl-12 1449, 226 0.19 3.2 MaEll 449, 53 0.06 1.0 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經"·部中决#導局员-1-消费"β^來

MaEl 1對裝載IgE Fc ε RI的結合作用老鼠MaEll阻止自由IgE與在肥大細胞上之FcsRI的結合作用，但不能藉著與裝載IgE之Fc ε RI的結合作用來謗發組胺酸的釋放。如同在圖4中所示，老鼠MaEl 1和人類化變體12 (IgGl-12)兩者，以及陰性同型物對照抗體 M0PC21 ，和陰性同型物對照人類化之4D5 ( Carter等人，在前）不能與在CHO 3D10細胞上裝載IgE的Fc ε RI結合。相反的，老鼠MaEl抗體，其與IgE結合但不能阻止IgE與 FcsRI的結合、與裝載IgE之FcsRI結合。不像人類的IgGl 對照組（人類化4D5 )，老鼠IgGl同型物（以M0PC21表示）在這些細胞上顯示出大約10%非專一性的背景結合。 MaEl 1不能提供在MOPC21對照組上的染色、，而人類化變體1 2也不能提供在人類化4D5對照組上的染色（圖4 )。局部丙胺酸掃描在IgE結合作用中重要的CDR殘基： -140- 呆纸張尺度適用中國國家標率（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明説明（138 )

MaEl 1 CDR’s之序列指出帶電殘基的優勢（圖1 )。CDR-L1含有彡個Asp殘基，而CDR-L3具有His、Glu和Asp。 CDR-H3具有三個His殘基。老鼠和人類化MaEl 1的模型，説明了所有這些帶電殘基在空間上很接近（未顯示）。相反的，在CDR-H2中單獨的Asp 54，在空間上與其他帶電殘基分開。關於這些帶電殘基，每個都藉著位置指定之突變生成（Kunkel，T.A. (1985)，Proc· Natl· Acad. Sci. USA 拉: 488 )來取代丙胺酸。而產生變體。在CDR-L1中，改變三個Asp殘基中的一個，Asp VL32b，有效地廢除了 IgE結合 [F(ab)-16 ;表5]，而取代其他的Asp殘基則有最低限度的影響[F(ab)-14 ; F(ab)_15]。同時將在 CDR-L3 中之 Glu VL93和Asp VL94改變成兩胺酸[Fa(ab)-17 ;表5 ]，亦降低了結合作用，雖然不能達到置換VL32b的相同程度。以 Ala個別地取代在CDR-H3中的三個His殘基，產生輕微改善的結合[F(ab)-21]，或減少三倍的結合[F(ab)-20 & F(ab)-22]。然而，同時改變全部三個His殘基卻廢止了結合作用 [F(ab)-19]。雖然不能輕易地決定是否帶電殘基涉及IgE的直接結合，或對其各別的CDR’s提供一些構型穩定性，但是變體F(ab)-13到F(ab)-22顯示在IgE的結合作用中，CDR-L1和CDR-H3是重要的決定因素。 -141 - 本紙張尺度適用中國國家標缚（rNS ) Μ規格（210X 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ f 1233946 Α7 Β7 五、發明説明（139 ) 表5人類化Mael 1 F(ab) CDR殘基變體變體從F(ab>2來的改變(a) 在抑制50%時的濃度(毫微克/毫升)平均値標準 FfabVX F(ab>2 VL VH 偏差(b) F(ab)-2 — — 6083,1279 1.0 F(ab>13 Asp 30 Ala Asp 32 Ala Asp 32b Ala - > 100,000 > 16.0(c) F(ab>14 Asp 30 Ala - 3452,183 0.57 F(ab>15 乂s/7 32 Ala 一 6384,367 1.0 F(ab)-16 Asp 32b Ala ·· > 100,000 > 16.0 F(ab>17 GIu 93 Ala Asp 94 Ala - 17,456, 7115 2.9 F(ab)-18 一 Asp 54 Ala 2066, 174 0.34 F(ab>19 一 His 97 Ala His 100a Ala His 100c Ala > 100,000 >16.0 F(ab)-20 - His 97 Ala 19,427, 8360 3.2 F(ab)-21 — His 100a Ala 2713, 174 0.45 F(ab)-22 - His 100c Ala 15,846,8128 2.6 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ f (a)老鼠殘基爲斜體字；殘基編碼係根據Kabat等人

本紙張尺度適川中國囤家標涛（) Μ規格（210X 297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明説明（14〇 ) (b) 三個可溶性受體分析的平均値和標準偏差 (c) F(ab)X/;F(ab)-2之比例>16，意指即使是使用最高的F(ab) 濃度，該變體亦未顯示有結合作用摘要與結論從MaEl 1產生有功能、人類化的老鼠抗-IgE抗體’涉及取代數個老鼠骨架殘基成爲人類骨架。此外，繪製帶電 CDR殘基的興圖，指出這些之中有些在抗體-IgE交互作用中最很重要的。細'::(^部屮决榡準局IhcJ.消贽合竹社印f (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 與先前的研究（Carter等人，在前；Shearman，C.W·等人 (1991)，J. Immunol. 147: 4366 ; Kettleborough，C.A·等人 (1991) ^ Protein Eng. 4: 773 ； Tempest, P.R. (1991) ^ Biote-chnology £: 266 ) — 致，變體 F(ab)-1 到 F(ab)-12 代表對抗體功能有顯著影響的骨架殘基。特別強調當考量F(ab)-1 時，它是平直的CDR交換，其中僅有六個老鼠的CDR’s被移殖到人類的骨架殘基上。關於此點可能的解釋涉及 CDR-H2。在位置VH63和VH67處隱藏的忌水性殘基，可影響CDR-H2的構型。創造出在位置VH63和VH67處含有四種組合的變體，也就是分別爲老鼠Leu和lie [MaEl 1和 F(ab)-ll]、Val 和 Phe[F(ab)_2]、Leu 和 Phe[F(ab)-l]，以及 Val和Ile[F(ab)-12]。得自這四個變體之結合資料的明確結論，指出重要的殘基爲VH67，它必須是老鼠的lie，以便提供可與老鼠MaEll相比擬的親和力。在F(ab)-1中，該殘基爲人類的Phe。在F(ab)-1中以人類形式保留的1 2個殘基[與F(ab)-2比 -143- 本紙張尺度適州中國囤家標蜂（（，NS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1233946 五、發明説明（141 A7 B7

部屮 4\ 樣 j- 消 IV 合竹 H 印 V & ]’在其他變體中將其中8個更改爲老鼠的。三個改變對於結合作用無影響：VL4[F(ab)-4] ; VL55和VL57[F(ab)-8] °兩個殘基的取代：VH60和VH61 [F(ab)-9]改良了結合作用，但有三個降低了結合作用：VH24[F(ab)-5]; VH37[F(ab)-7]和 VH78[F(ab)_6]。利用由 Padlan (Padlan，Ε·A. (1991)，Mol. Immunol.丛：489) 提出之假設來設計變體F(ab)-10，他提出可僅藉著改變露出的骨架殘基來降低老鼠抗體的免疫原性。在該變體中， V L和V Η功能部位的忌水性内部，換句話説，該變體爲老鼠的MaEll，其中只有在VL和VH中露出的骨架殘基被更改成人類序列。雖然F(ab)-10顯示出接近老鼠MaEll的結合作用，但是在單一胺基酸功能部爲VH67處，由人類的改變成老鼠的，在結合作用上引起相同的改良F(ab)-12， IgGl-12]。顯示出可與老鼠MaEl 1相比擬之結合作用的人類化抗體，其亦需要最少的改變，爲F(ab)-12。該變體僅在5個人類骨架殘基上以老鼠的置換（VL4、VH24、VH37、 VH67和VH78 )。藉著分子模型定出這些殘基之中的四個。第五個VH67，以及CDR-H2殘基VH60和VH61，藉著利用分子模型將其包括在内，努力去改良原始變體F(ab)-2的結合作用。實例3 組胺酸釋放分析簡介： -144- 度適州中國®家標磾（rNS ) Λ4規格（210x 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ f 1233946 A7 ________*________B7 五、發明説明（142 ) 這是大鼠肥大細胞之組胺酸分析（RMCHA)，其以抗體阻斷組胺酸從過敏原敏化之RBL 48細胞中釋放的能力爲基礎，來定量測量重組人類化之單株抗-IgE抗體的生物活性。此外，在類似人體的生理狀況下進行該測量。RBL 48細胞株係衍生自親代的大鼠肥大細胞株RBL 2H3，隨後以高親和力之人類IgE受體（Fc ε RI)的α -亞單元轉移感染之。Gilfillan Α·Μ·等人，J. Immunol. 149(7): 2445-2451 (1992)。方法: 使RBL 48細胞（Gilfillan等人，在前），在37°C，潮濕的 5% C02恒溫箱（Fischer，#610型）中，在T175組織培養燒瓶（Falcon #3028 )中生長在補充有10%胎牛血清、2 mM穀胺醯胺和500微克/毫升有活性之選擇試劑（geneticin) (Gibco，#860-1811 )的sIMDM，Iscove’s modified Dulbecco’s 培養基中。藉著在37°C下，與4毫升PBS/0.05%胰蛋白酶/ 0.53 mM EDTA的溶液接觸2小時，接著離心（400 xg，1 0 分鐘）來收穫細胞，並再懸浮於新鮮的si M D Μ中。以血球計數器（Reichert-Jmig)計算在懸浮液中的細胞，並將密度調整爲0.4 X 106個細胞/毫升。然後將細胞以100微升/孔 (每孔40,000個細胞）播種到96-孔、U_型組織培養盤 (Linbro )的内側6 0個孔中，並在37°C下，在潮濕的5% C〇2 恒溫箱中培養2 4小時。在以200微升/孔的sIMDM沖洗一次（經由抽吸作用）之後，將細胞與9 0微升/孔，帶有豬草 -專一性之IgE (RSIgE，10毫微克/毫升，23.48毫微克/毫 -145- 本紙張尺度適州中國囤家標蜂（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1233946 A7 _________________ B7_ 五、發明説明（143 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 升總IgE ’ 1 ·43%諸草-專一性之人類血漿，North American Biological，，登記編號#42·365〇54)之分析稀釋劑溶液 (sIMDM，3單位/亳升鈉-肝素）預先培養3〇分鐘。在預先培養的期間之後，1 0微升/孔的抗-IgE抗體（以分析稀釋劑稀釋，0.06-39.4微克/毫升）或分析稀釋劑（關於總組胺酸釋放，背景和豬草對照組）加至細胞中，並在5% C02，在3 7°C的恒溫箱中培養該培養盤2 4小時。在培養之後，抽吸細胞並以200微升/孔sIMDM沖洗3次。在沖洗之後，在37°C下將細胞與1〇〇微升/孔的（1) 0.5%三通溶液（關於總組胺酸釋放），（2)組胺酸釋放緩衝溶液（HRB，50% D20，0.8%NaCl，1.3mMCaCl2，sIMDM)，或（3)豬草抗原（1111^#八-601_903八-185,0.1微克/毫升，在111^中）一起培養3 0分鐘，並藉著放在冰上使該反應中止。（1〇〇% D20 = 100%D20，0.8%NaCl，1.3mMCaCl2”

•I 在4°C下以900 xg (2460 rpm)離心該盤5分鐘，收集上清液並以PBS稀釋成1/8〇 (以PBS稀釋成1/1000以供組胺酸釋放之對照組），關於組胺酸的測定，使用組胺酸酵素免疫分析工具組（Immunotech #1153 )。將上清液（100微升/孔）移至含有醯化散劑的醯化試管（每個工具組）中，並在周圍溫度下與5 0微升醯化緩衝溶液（每個工具組）反應3 0分鐘。然後將醯化組胺酸（5 0微升/孔）移至結合盤（每個工具組）上，並在4°C下與200微升/孔的組胺酸醯基膽鹼酯酶共軛物（每個工具組）一起培養1 8小時。在這次培養之後，將小孔點上墨跡，並藉著以300微升/ -146- 本紙張尺度適州中國國家標蜂（rNS ) Λ4規格（210X297公釐) 一 ' 1233946 A7 ------_一____·— B7 五、發明説明（144 ) 孔的沖洗緩衝溶液（Ilnmunotech工具組，#1153)沖洗4次，將其清洗，以便移除未結合的共軛物。加入色原受酶質（乙酿基硫代膽汁素，二硫代硝基苯甲酸鹽，2〇〇微升/孔，每個工具組），並在周圍溫度的暗處培養30分鐘。藉著加入中止溶液（5 〇微升/孔，每個工具組）使該反應中止，並在 SLT 340 ATTC培養盤讀取器上測定在405毫微米處的吸光度’並以620毫微米處的吸光度作爲參考。吸光度的強度與由組胺酸標準曲線（得自酵素免疫工具組，AMAC )定出的組胺酸濃度（以nM表示）成反比。由組胺酸濃度的資料計算出總組胺酸釋放的百分比，並藉著1〇〇%-總組胺酸釋放來計算抑制百分比。掏要和結論：抗-IgE之莫耳百分比對豬草·謗發之組胺酸釋放的圖，指出e26抗體之F(ab)形式，比起e25抗體之F(ab)形式具有更優異的豬草-謗發之組胺酸釋放性質。E26以劑量依賴性 < 方式抑制豬草_謗發之組胺酸釋放，具有44: i之抑制半-最大値的莫耳比例（抗·IgE : ESIgE )。相反的。e25僅在非常咼的莫耳比例處（在2〇〇:1到155〇:1之間的抗·igE : RsigE)才能抑制豬草_謗發之組胺酸釋放。e25曲線之抑制半最大値的莫耳比例可能建立在4〇〇·丨到5〇〇:丨之間。因此，以測量分子之結合親和力而得的抑制半-最大値之莫耳比例的貪料爲基礎。e26分子與RsigE之結合，大約比e25分子更好1〇倍。 -147- _ --m ιι ____. 本紙張尺Zii用:規格-(2^ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 f 封淖部中决¾卑局UCJ'.消於合竹社印來 1233946 A7 _____—___ B7 五、發明説明（146 ) 簡併密碼子來產生全部的二十個胺基酸。（以單一字母的 IUPAC命，名法來表示核甞酸鹼基；N = A、G、C或T ; S = G或C )。在任意的位置，利用NNS簡併密碼子來產生全部的二十個胺基酸，使用3 2個不同可能的密碼子。在本文中使用之抑制基因中，安伯中止密碼子（TAG)編碼 Gin ;也就是supE抑制基因品系XL_1 Blue ; Bullock等人，Biotechnique 5_: 376 (1987)。在重鏈抗體功能部位和嗤菌體上的g3p功能部位之間出現安伯密碼子，容許僅在大腸样菌之安伯抑制基因品系中表現禮菌體-表現之融合蛋白質，而利用相同的構築體，可在非抑制基因品系的大腸桿菌中獲得可溶的F(ab)蛋白質（Lowman等人， Biochemistry 30.: 10832 (1991) ; Lowman 等 Wells, Methods Comp. Methods. Enzymol 1; 205 (1991) ; Hoogenboom 等人， Nucl. Acids Res· i£: 4133 (1991))。然而，熟諳此藝者亦知曉使用於其他大腸桿菌噬菌體表現系統的其他中止密碼子。藉著電穿透作用，將任意突變生成反應的產物轉化到大腸桿菌細胞（Stratagene，XL-1 Blue )中，並藉著在37°C下與M13K07輔助噬菌體一起生長過夜來擴大之（Vierra和 Messing, Methods Enzymol. 153: (1987)) 0 -149- 本紙張尺度適川中國囤家標缚（（，NS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 ΑΊ _________ Β7 五、發明説明（147 ) 表10 第一輪突;變生成作用的中止·模板寡核甞酸

寡核苷酸序列編號區域岸列 HL-208 VL1 ACC TGC CGT GCC AGT TAA TAA GTC TAA TAA GAA GGT GAT AGC TAC HL-209 VH3 GCC AGT CAG AGC GTC TAA TAA TAA GGT TGA AGC TAC CTG AAC TGG T HL-210 VH3 TGT GCT CGA GGC AGC TAA TAA TAA GGT TAA TGG TAA TTC GCC GTG TGG GG HL-220 VL2 G AAA CTA CTG ATT TAC TAA TAA TAA TAA CTG GAG TCT GGA GTC HL-221 VL3 CT TAT TAC TGT CAG CAA AGT TAA TAA TAA CCG TAA ACA TTT GGA CAG GGT ACC HL-222 VHI G TCC TGT GCA GTT TCT TAA TAA TAA TAA TAA TCC GGA TAC AGC TGG HL-223 VH1 GCC TAC TCC ATC ACC TAA TAA TAA AGC TGA AAC TGG ATC CGT CAG HL-224 VH2 GG GTT GCA TCG ATT TAA TAA TAA GGA TAA AC丁 TAA TA丁 AAC CCT AGC CTCAAG HL-225 VL1 AAG CCG GTC GAC AGG TAA TAA GAT TAA TAC TAA AAC TGG TAT CAA CAG -150- 本紙張尺度適川中國囤家標缚（（、NS ) Λ4規格（210X297公釐）訂 AW~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本貢) 1233946 A7 B7 五、發明説明（149 ) 噬菌體混合，並接受模擬-選擇，作爲陽性對照組。 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在4°C下，利用在50 mM碳酸鈉緩衝溶液，pH 9.6中之2 微克/毫升的IgE (人類IgE ; Genentech登記編號#9957-36 ) 來塗覆Maxisorp 96_孔塑膠培養盤（Nunc )過夜。然後移出 IgE溶液，並將該盤與馬血清之阻斷溶液（不含吐溫TM-20 ) 一起在周圍溫度下培養2小時。移出阻斷溶液，在室溫下培養在該盤上的噬菌體溶液1 小時。隨後移出噬菌體溶液，並以PBS/吐溫ΤΜ·20 (0.05%) 缓衝溶液沖洗該盤1 0次。將小孔裝入PBS /吐溫，並容許再培養1 0分鐘，然後再沖洗該盤1 〇次。以利用Tris-HCl，pH 8中和的20 mM HC1洗脱出仍與該培養盤結合的F(ab)·噬菌體，並按照上述以輔助噬菌體繁殖。將一等份的噬菌體連續稀釋，與新鮮的XL-1 Blue細胞混合，置於適當的抗生素培養盤上，並計算F(ab)_表現型（羧苄青黴素-抗藥性，CFUa)或非·表現型（氯黴素·抗藥性，CFUc)之洗脱噬菌體的CFUs數目。按照洗脱集合物的（CFUa/CFUc )除以起始集合物的（CFUa/CFUc )，來計算每一輪F(ab)-表現型勝過非-表現型噬菌體的增強作用 (Emut)。以相同之方式計算野外型對照組噬菌體（Ewt)的增強作用。如同上述進行後續的親和力選擇，除了在每一輪中增加在培養之前先沖洗1 0次的步驟之外。爲了'比較在逐漸增加嚴格性之循環條件中每一輪的噬菌體選擇效力，將每一輪的增強作用因素標準化成野外型對照組的。在圖6中顯 152- 本紙張尺度適州中國國家標缚（（’NS ) Λ4規格（210X297公釐） 1233946 經淖部中泱掠洋局β〈_τ消贽告竹私印來 A7 五、發明説明（150) 丁每種集合物之結合增強作用對野外型的比例（Em价/e加）。 =爲在平；衡時，高親和力的變體將會比具有較低親和力之變體有更多的溶離份與IgE培養盤結合，而更有效率地回收較高親和力的變體，並因此顯示相對上較大的增強作用。確實，VL1庫成功地顯示出相對上改良的增強作用，在第5-6輪的選擇之後，有高達大約1〇_倍相對上較高的增強作用。經由此種測量，VL1庫顯示出比VH3庫勝過野外型更多的親和力改良。在這兩組CDR庫之間的不同結果，可能反映出藉著VL1而對抗原結合有較多的能力學貢獻。另外’ e25的VH3 CDR可能已經比vli CDR更密切地使IgE 的結合發揮最大效用，因此容許在結合交互作用中，由 VL1經由側鏈取代，貢獻相對上較大的改良。 DNA序列顯示大部份得自第一個vl CDR1庫（任意位置 27、28、29、39和3 1)之F(ab)·嗤菌體變體，已經保存了野外型殘基D30，和優先突變的Y31G (表1 5，其中得自第 3輪的純種系被命名爲212_3χ，而得自第6輪的那些被命名爲212.6.Χ.)。雖然在位置Q27和S28處觀察到各種取代作用，但是在第6輪的選擇之後，一個含有Q27K和S28P 的純種系在噬菌體集合物中佔有優勢。該純種系亦含有較佳的殘基D30和G31，暗示該種側鏈組合可能有最佳的 IgE-結合作用。在第二個VL CDR1庫（任意位置3 0、3 1、3 2和3 4 )中，大部份的選擇物在D30和E32處保存了野外型殘基；只有在定序列的純種系中觀察到野外型D34。在該表現庫中， -153- 本紙張尺度適用中國國家標缚((、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） ' ^ ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 f 1233946 A7 B7 五、發明説明（151 ) 在Y31處觀察到各種殘基類型。在兩個純種系213-6.7和 213-6.8中觀察到額外的、雜種突變G33S (表1 5 )。在第3輪的選擇之後，得自VH CDR3之純種系妁序列分析顯示，該庫本質上集中於單一的純種系，也就是214-3.1，具有在位置101-103處以H105和H107Y取代的野外型殘基（表1 5 )。 IV.選出之F(ab)純種系的噬菌體-ELISA分析欲評估噬菌體-結合選擇的結果，將噬菌體轉移戚染到大腸桿菌XL-1 Blue細胞内，並在液體培養基中繁殖，或放置在含有抗生素的培養盤上。從這些培養盤中隨機挑選純種系，用來定序列並進行藉著競爭性-噬菌體-ELISA的結合分析。(Cunningham 等人，EMBO J. 13.: 2508 (1994); Lowman，第 24 章，在 Methods in Molecular Biology，第 87 册，S. Cabilly (編輯），Humana Press Inc.，Totawa，NJ (1997)中。經淖部中次標準局員J-消费合β社印來 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 欲評估相關的IgE結合親和力，在按照上述利用IgE塗覆的培養盤上滴定嗤菌體，將表現之F(ab)的濃度標準化。將噬菌體預先與連續稀釋之IgE混合，然後加至IgE-塗覆的培養盤中，並在室溫下培養1小時。然後以PBS /吐溫沖洗該盤1 0次，並加入與馬辣根過氧化酶之山羊-抗-兔共軏物混合的兔抗-噬菌體抗體的溶液。在室溫下培養1小時之後，利用色原受酶質，鄰-苯二胺（Signia)使該培養盤展開。藉著加入1/2體積之2.5 M H2S04使該反應中止。在分光光度計培養盤讀取器上測定在490毫微米處的光密 -154- i紙張尺度適用中國國家標哗（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明説明（154 ) 213-3.1 - — D D C D — - - — — 未測定 213-3.2 -· 一 Η D S D 一 — 一未測定 213-3.3 - D W Q D — -- - - 8.8 213-3.4 G D Η D — — 一 - ·· 3.7 213-6.1 - - Ε R W D - ·· 一 - 未測定 213-6.3 (x2) 一一 D Τ Ε D — - — 一 - 14 213-6.4 一 ·· D W Ε D — — - 一一 20 213-6.7 G33S 一 Η Ν Ε D 一 — - — - 未測定 213-6.8 G33S - ~ Υ S Ν D — 一 - 一 14 213-6.9 — - W G Ε D - - - 一未測定 213-6.11 一 - Y S Ε D - 一 — 一未測定 213-6-12 — — Ε R D D - - — 一未測定 213-6.13 - — Η Ε Ε D - — — — ·· 未測定 213-6.14 _· - D Κ Κ D — - ~ - - 未測定 213-6.15 D R Q D — — — 一、 - 15 214-3.1 (x5) Η Υ F Τ Υ 2.7 214-3.6 - Η Υ F S R 未測定 --------i! (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 -157- 本紙張尺度適川中國S家標缚（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明説明（157 ) CDR2突變之組合的最後變體。亦製備可溶性F(ab)蛋白質，並在生物素-IgE培養盤分析中進行比較，報告在下文的表17和圖7中。表1 7 F(ab)片段 IC50 (nm) 相對的親和力（改良倍率） e426 1.5 -1- e26 0.17 8.9 e27 (e26+235-5.1) 0.040 38 e695 (e26+235-5.2) 0.050 31 e696 (e26+235-5.3) 0.063 24 e697 (e26+235-5.4) 0.066 23 VI. 生物素培養盤分析（FcERI-IgG嵌合體競爭分析）簡介：該實例之目的是比較不同的抗-IgE F(ab)s如何與固定之高親和力IgE受體IgG嵌合體，在溶液相中競爭對生物素基化之人類IgE的結合，此時同時將抗-IgE F(ab)和生物素-IgE加至以IgE受體嵌合體塗覆的培養盤中。因爲抗-IgE F(ab)濃度增加，使能夠與在培養盤上之受體結合的生物素IgE之含量減少，導致由分光光度計測量到較低的光密度値。在4°C下，藉著將在50 nM碳酸鈉缓衝溶液（pH 9.6)中1 微克/毫升的母液等分成100微升，以100毫微克/孔的Fes RI - IgE (Haak-Frendsho 等人，J. Immunol· 151: 352 (1993)， Genentech，登記編號#2148-76 (6.4毫克/毫升））塗覆Nunc -160- 本紙張尺度適川中國围家標蟫（rNS ) Λ4規格（2丨0X 297公釐） (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 f 1233946 A7 __ B7 五、發明説明（159 ) 結論：在圖8中的圖指出E26和E27兩者對於高親和力受體，具有比E25更高的親和力，且E27顯示出最高的親和力。 VII. 可溶性F(ab)蛋白質之BIA核心分；^ 從利用BIA核心TM-2000表面質粒基因組共振系統 (BIAcore，Inc·)測量的缔合和解離率常數，來計算數個 F(ab)片段的受體-結合親和力（Lofas & Johnson，J. Chem. Soc· Commun· 2Jj 1526-1528 (1990))。根據製造者（BIAcore) 的指導，爲了共價偶聯IgE，利用N-乙基_Ν，·(3-二甲胺基丙基）-碳化二亞胺氫氣化物（EDC)和Ν-羥基琥珀醯亞胺 (NHS )將生物感應器的小片活化。在i 〇 mM乙酸鈉缓衝溶液（pH 4·5)中稀釋IgE，再進一步稀釋成大約3〇微克/毫升，並，主射至小片之上，獲得8〇〇到i2,4〇〇反應單位（ru) 之固疋物質的仏號。因爲以RU計之信號與固定物質之質量成比例，這代表在基質上之固定IgE密度的範園約爲〇 4 到6.5微微莫耳/平方公分。最後，注射丨M乙醇鈉作爲阻斷劑。利用4·5 M MgCh進行再生作用。關於動力學的測量，在25。(：下利用2〇微升/分鐘之流速，在IgE小片上注射以PBS/吐溫緩衝溶液（在磷酸緩衝溶液生理鹽水中的〇.〇5%吐溫_2〇)連續稀釋丨5倍之抗體片段[圖9 ]。使解離資料配合單—_位置之模式，得到k〇ff+/_標準偏差（測量値的標準偏差）。料個綠合曲線計算出假一級比例常數（ks) ’並對蛋白質濃度的函數作圖，得到kon+/_ __________ -162- 本紙張尺糾财, (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 (1)共同資訊五、發明説明（163 序列一覽表 (i) + 請者：Genentech，Inc· (ϋ) 發明標題：改良之抗-IgE抗體及改良多肽的方法 (iii) 序列數目：26 (iv) 通信地址： (A)收件人：Genentech，Inc. (b5 街道：1 DNA Way 成市：South San Francisco (D) 州：California

(E) 國家：USA (F〗郵迤區域：94080 (v) 電腦可讀形式： (A) 媒體類型：3·5吋，1.44 Mb軟碟 (B) 電腦·· IBM PC可相容的

(C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 叔體：WinPatin (Genentech) (vi) 最近的+請資# : (A) 申請編號： (B) 建檔日期： (C) 分類； (vii) 律師/代理人之資訊： (A) 姓名·· SvoSoda，Craig G. (B) 註册號碼：39,044

(C) 委託案件/文件編號：P1123PCT (ix) 電ί專資訊； (Α)電話：650/225-1489 (Β5 傳眞：650/952-9881 (2)關於序列識別1號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：6127個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：雙股 (D) 拓撲學：環狀 (xi)序列説明：序列識別1號： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T f ATGAAAAATC 50 AGAGTCGAAT 100 CTGCAATGCT 150 CAGGTAGAGG 200 CGACGATACG 250 CTCGTCAGTA 300 GCCGAGACTT 350

GAATTCAACT TCATTGCTGA GAACTGTGTG TCGCAATATG GGGCGCTGTA GAGCTGCTGC AAAAGTTAAT

TCTCCATACT GTTGTTATTT CGCAGGTAGA GCGCAAAATG CGAGGTAAAG GCGATTACGT CTTTTCAACA

TTGGATAAGG AAGCTTGCCC AGCTTTGGAG ACCAACAGCG CCCGATGCCA AAAGAAGTTA GCTGTCATAA

AAATACAGAC AAAAAGAAGA ATTATCGTCA GTTGATTGAT GCATTCCTGA TTGAAGCATC AGTTGTCACG -166- 本紙張尺度適州中國囤家標_ ( rNS ) Λ4規格（2lOX297公釐） 1233946 A7 — B7 五、發明説明（164 ) ATAGTCGCTT TGTTTTTATT TTTTAATGTA TTTGTAACTA GAATTCGAGC 400 TCGGTACCCG GGGATCCTCT CGAGGTTGAG GTGATTTTAT GAAAAAGAAT 450 ATCGCATTTC TTCTTGCATC TATGTTCGTT TTTTCTATTG CTACAAACGC 500 GTACG;CTGAT ATCCAGCTGA CCCAGTCCCC GAGCTCCCTG TCCGCCTCTG 550 TGGGCGATAG GGTCACCATC ACCTGCCGTG CCAGTCAGAG CGTCGATTAC 600 GAAGGTGATA GCTACCTGAA CTGGTATCAA CAGAAACCAG GAAAAGCTCC 650 GAAACTACTG ATTTACGCGG CCTCGTACCT GGAGTCTGGA GTCCCTTCTC 700 GCTTCTCTGG ATCCGGTTCT GGGACGGATT TCACTCTGAC CATCAGCAGT 750 CTGCAGCCAG AAGACTTCGC AACTTATTAC TGTCAGCAAA GTCACGAGGA 800 TCCGTACACA TTTGGACAGG GTACCAAGGT GGAGATCAAA CGAACTGTGG 850 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT 900 GGAACTGCTT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC 950 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG 1000 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC 1050 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG 1100 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA 1150 GGGGAGAGTG TTAAGCTGAT CCTCTACGCC GGACGCATCG TGGCCCTAGT 1200 ACGCAAGTTC ACGTAAAAAG GGTATCTAGA GGTTGAGGTG ATTTTATGAA 1250 AAAGAATATC GCATTTCTTC TTGCATCTAT GTTCGTTTTT TCTATTGCTA 1300 CAAACGCGTA CGCTGAGGTT CAGCTGGTGG AGTCTGGCGG TGGCCTGGTG 1350 CAGCCAGGGG GCTCACTCCG TTTGTCCTGT GCAGTTTCTG GCTACTCCAT 1400 CACCTCCGGA TACAGCTGGA ACTGGATCCG TCAGGCCCCG GGTAAGGGCC 1450 TGGAATGGGT TGCATCGATT ACGTATGACG GATCGACTAA CTATAACCCT 1500 AGCGTCAAGG GCCGTATCAC TATAAGTCGC GACGATTCCA AAAACACATT 1550 CTACCTGCAG ATGAACAGCC TGCGTGCTGA GGACACTGCC GTCTATTATT 1600 GTGCTCGAGG CAGCCACTAT TTCGGTCACT GGCACTTCGC CGTGTGGGGT 1650 CAAGGAACCC TGGTCACCGT CTCCTCGGCC TCCACCAAGG GCCCATCGGT 1700 CTTCCCCCTA GCACCCTCCT CCAAGAGCAC CTCTGGGGGC ACAGCGGCCC 1750 TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG 1800 AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA 1850 GTCCTCAGGA CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA 1900 -167- 本紙張尺度適用中國囤家標蜱（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 五、發明説明（165 ) ΑΊ Β7 GCTTGGGCAC CCAGACCTAC ATCTGCAACG TGAATCACAA GCCCAGCAAC 1950 ACCAAGGTGG ACAAGAAAGT TGAGCCCAAA TCTTGTGACA AAACTCACAC 2000 CTAGAGTGGC GGTGGCTCTG GTTCCGGTGA TTTTGATTAT GAAAAGATGG 2050 CAAACGCTAA TAAGGGGGCT ATGACCGAAA ATGCCGATGA AAACGCGCTA 2100 CAGTCTGACG CTAAAGGCAA ACTTGATTCT GTCGCTACTG ATTACGGTGC 2150 TGCTATCGAT GGTTTCATTG GTGACGTTTC CGGCCTTGCT AATGGTAATG 2200 GTGCTACTGG TGATTTTGCT GGCTCTAATT CCCAAATGGC TCAAGTCGGT 2250 GACGGTGATA ATTCACCTTT AATGAATAAT TTCCGTCAAT ATTTACCTTC 2300 CCTCCCTCAA TCGGTTGAAT GTCGCCCTTT TGTCTTTAGC GCTGGTAAAC 2350 CATATGAATT TTCTATTGAT TGTGACAAAA TAAACTTATT CCGTGGTGTC 24 00 TTTGCGTTTC TTTTATATGT TGCCACCTTT ATGTATGTAT TTTCTACGTT 2450 TGCTAACATA CTGCGTAATA AGGAGTCTTA ATCATGCCAG TTCTTTTGGC 2500 TAGCGCCGCC CTATACCTTG TCTGCCTCCC CGCGTTGCGT CGCGGTGCAT 2550 GGAGCCGGGC CACCTCGACC TGAATGGAAG CCGGCGGCAC CTCGCTAACG 2600 GATTCACCAC TCCAAGAATT GGAGCCAATC AATTCTTGCG GAGAACTGTG 2650 AATGCGCAAA CCAACCCTTG GCAGAACATA TCCATCGCGT CCGCCATCTC 2700 CAGCAGCCGC ACGCGGCGCA TCTCGGGCAG CGTTGGGTCC TGGCCACGGG 2750 TGCGCATGAT CGTGCTCCTG TCGTTGAGGA CCCGGCTAGG CTGGCGGGGT 2800 TGCCTTACTG GTTAGCAGAA TGAATCACCG ATACGCGAGC GAACGTGAAG 2850 CGACTGCTGC TGCAAAACGT CTGCGACCTG AGCAACAACA TGAATGGTCT 2900 TCGGTTTCCG TGTTTCGTAA AGTCTGGAAA CGCGGAAGTC AGCGCCCTGC 2950 ACCATTATGT TCCGGATCTG CATCGCAGGA TGCTGCTGGC TACCCTGTGG 3000 AACACCTACA TCTGTATTAA CGAAGCGCTG GCATTGACCC TGAGTGATTT 3050 TTCTCTGGTC CCGCCGCATC CATACCGCCA GTTGTTTACC CTCACAACGT 3100 TCCAGTAACC GGGCATGTTC ATCATCAGTA ACCCGTATCG TGAGCATCCT 3150 CTCTCGTTTC ATCGGTATCA TTACCCCCAT GAACAGAAAT TCCCCCTTAC 3200 ACGGAGGCAT CAAGTGACCA AACAGGAAAA AACCGCCCTT AACATGGCCC 3250 GCTTTATCAG AAGCCAGACA TTAACGCTTC TGGAGAAACT CAACGAGCTG 3300 GACGCGGATG AACAGGCAGA CATCTGTGAA TCGCTTCACG ACCACGCTGA 3350 TGAGCTTTAC CGCAGGATCC GGAAATTGTA AACGTTAATA TTTTGTTAAA 34 00 ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC ATTTTTTAAC CAATAGGCCG 34 50 -168- 本紙張尺度適用中國國家標碑（CNS ) Λ4規枯（2lOX 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 消 fi 竹印

1233946 A7 ___________ ___ B7 五、發明説明（166 ) AAATCGGCAA AATCCCTTAT' AAATCAAAAG AATAGACCGA GATAGGGTTG 3500 AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC 3550 CAACGTCAAA GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCTATGGC CCACTACGTG 3600 AACCATCACC CTAATCAAGT TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA 3650 AATCGGAACC CTAAAGGGAG CCCCCGATTT AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC 3700 GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA GCGGGCGCTA 3750 GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC GCGTAACCAC CACACCCGCC 3800 GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTCC GGATCCTGCC TCGCGCGTTT 3850 CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 3900 CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG 3950 TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCGCA GCCATGACCC AGTCACGTAG 4000 CGATAGCGGA GTGTATACTG GCTTAACTAT GCGGCATCAG AGCAGATTGT 4050 ACTGAGAGTG CACCATATGC GGTGTGAAAT ACCGCACAGA TGCGTAAGGA 4100 GAAAATACCG CATCAGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG 4150 CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT 4200 AATACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG 4250 CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG 4300 TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG CATCACAAAA ATCGACGCTC 4350 AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC 4400 CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC 4450 GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCATAG 4500 CTCACGCTGT AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG 4550 GCTGTGTGCA CGAACCCCCC GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT 4600 AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT CGCCACTGGC 4650 AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA GGCGGTGCTA 4700 CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA 4750 TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG 4800 TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG 4850 TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAA?IA AAGGATCTCA AGAAGATCCT 4900 TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA ACTCACGTTA 4950 AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT 5000 -169- 本紙張尺度適州中國國家標蜂（CNS ) Λ4規枱（2l〇X 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 經淖部中次掠準局u〔Jr.消贽合竹社印象 A7 B7 五、發明説明（167 ) TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT 5050 TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT 5100 CTGTCTATTT CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA 5150 CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG 5200 CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA ACCAGCCAGC 5250 CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC GCCTCCATCC 5300 AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT 5350 AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTGCA GGCATCGTGG TGTCACGCTC 5400 GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG 5450 TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT 5500 CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC TCATGGTTAT 5550 GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT 5600 CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG 5650 CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAACA CGGGATAATA CCGCGCCACA 5700 TAGCAGAACT TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA 5750 AACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT 5800 CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA GCGTTTCTGG 5850 GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA 5900 CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC 5950 ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA 6000 GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC 6050 CTGACGTCTA AGAAACCATT ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG 6100 CGTATCACGA GGCCCTTTCG TCTTCAA 6127 (2)關於序列識別2號之資訊： (i)序列特徵： (A) 矣度：121個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別2號：

Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15

Gin Ser Leu Ser Leu Ala Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser He Thr 2〇 25 30 -170- 本紙張尺度適用中國國家標绛（CNS ) Μ規格（210X297公釐） --------i! (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1233946 A7 B7 五、發明説明（168 ) Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys 35 40 45 Leu Glu Trp Met Gly Ser lie Thr Tyr Asp Gly Ser Ser Asn Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg lie Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Gin Asn Gin Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105 Trp His Phe Ala Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser 121 (2)關於序列識別3號之資訊： (i)办列#破： (A) 長度：121個胺基酸 (B) 類型··胺基酸 (D)拓撲學··直線 (xi)序列説明··序列識別3號：

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30 Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Ala Ser lie Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser 65 Ί0 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105 Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 ' 120 Ser 121 (2)關於序列識別4號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：121個胺基酸 (B) 類型··胺基酸-171 - 本紙張尺度適用中國國家標_( CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) L·. 1233946 A7 B7 五、發明説明（169 ) (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別4號：

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa 20 25 30

Ser Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45

Leu Glu Trp Val Ala Val lie Ser Asn Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr 50 55 60

Ala Asd Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser ‘ 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Arg Phe Phe Xaa Xaa 95 100 105

Xaa Xaa Xaa Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu. Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser 121 (2)關於序列識別5號之資訊： (i)序列特徵·· (A) 長度：111個胺基酸 (B) 類型··胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別5號：

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15

Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Gin Pro Pro lie Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Gly Ser 50 55 60

Glu lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr'Asp Phe 65 Ί0 75

Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Phe 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly 95 100 105

Thr Lys Leu Glu lie Lys -172- 本紙張尺度適州中國國家標缚（rNS ) Λ4規招（210X 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 #Γ 1233946 五、發明説明（170 標卑 .灼 j 消 %：合竹 H 印 A7 B7 (2)關於序列識別6號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：111個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別6號：

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 4 5

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu lie Lys 110 111 (2)關於序列識別7號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：111個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 .(xi)序列説明丄序列識別7號：

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30 lie Ser Xaa Xaa Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90 -173- 本紙張尺度適州中國國家標缚（（'NS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經淖部中决掠準局β_τ.消贽合β社印f !233946

五、發明説明（171 )

Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu He Lys 110 111 (2)關於序列識別8號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：114個胺基酸 (B) 類型··胺基酸 (D)拓撲學··直線 (xi)序列説明：序列識別8號：

Asp He Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val Asp 20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val 110 114 (2)關於序列識別9號之資訊： ⑴鼻列： (A) 長度：114個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學··直線 (xi)序列説明：序列識別9號：

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 ' 30

Tyr Glu Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 -174- 本紙張尺度適州中國國家標冷(（’NS ) M規格（210X297公釐） --------i! (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11

233946 五、發明説明（π )

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr £ys Val Glu He Lys Arg Thr Val 110 114 (2)關於序列識別10號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：114個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學··直線 (xi)序列説明：序列誠別10號：

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin Ser Kis Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val 110 114 (2)關於序列識別11號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：114個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列誠別11號：

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 ' 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30

Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp He Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45

Leu Glu Trp Val Ala Ser He Lys Tyr Ser Gly Glu Thr Lys Tyr -175- 本紙張尺度適用中國國家標净（（、NS ) Λ4規格（210X297公釐） (謂先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 1233946 A7 B7 經淖部中次標準局RT消贽合竹社印繁五、發明説明（173 ) 50 55 60

Asn Pro Ser Val Lys Giy Arg He Thr He Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp ; 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105

Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly 110 114 (2)關於序列識別12號之資訊： (i) 序列特徵： (A) 長度：114個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別12號：

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Giy Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30

Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp He Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45

Leu Glu Trp Val Ala Ser lie Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60

Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105

Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly 110 114 (2)關於序列識別13號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度·· 218個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別13號：

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30 -176- ^紙張尺度‘州( (、NS ) Λ4規格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 tr 1233946 經滅部中次樣缘局5消贽合竹社印來 A7 B7 五、發明説明（174 )

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 140 145 150

Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 185 190 195

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 218 (2)關於序列識別14號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：451個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別14號：

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 ' 30

Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45

Leu Glu Trp Val Ala Ser lie Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60

Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75 -177- 本紙張尺度適川中國囤家標缚（（、NS ) Λ4規格（2l0X 297公釐） --------#! (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1233946 A7 B7 五、發明説明（175 )

Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105

Trp His Fhe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 170 175 180

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190 195

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 230 . 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 320 325 330

Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys A^a Lys Gly 335 340 345

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 350 355 360

Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 365 370 375

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin -178- 本紙張尺廋適用中國1¾家標缚（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 五、發明説明（176 ) 380 385 390 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 395 400 405 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg ； 410 415 420 Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 425 430 435 Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445 450 Lys 451 (2)關於序列識別15號之資訊： ⑴庠列#破： (A) 長度：218個胺基酸 (B) 類型··胺基酸 (D)拓撲學··直線 (xi)序列説明：序列識別15號： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經滅部中决«準局β,τ消贽合竹社印來

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Lys- Pro Val Asp 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 50 55 60 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105 Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 \ Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 140 145 150 Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165 Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 -179- 本紙張尺度適用中國國家標碑（rNS ) M規格（2〗0X 297公釐）、1Τ mr 1233946 A7 B7 五、發明説明（177 ) Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 185 190 195 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210 Lys! Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 218 經滅部中决掠卑局员J-消贽合竹社印來 (2)關於序列識別16號之資訊： ⑴岸列#徵： (A) 長度：451個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別16號： Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser He Thr 20 25 30 Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Ala Ser He Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg lie Thr He Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105 Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 170 175 ' 180 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190 195 Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225 -180· 本纸張尺度適用中國國家標缚（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T Ρ 1233946 A7 B7 五、發明説明（178 )

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255

Met !，Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 320 325 330

Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 335 340 345

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 350 355 360

Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 365 370 375

Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 380 385 390

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 395 400 405

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 410 415 420

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 425 430 435

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445 450

Lys 451 (2)關於序列識別17號之資訊： (i) 序列特徵： (A) 長度：218個胺基酸 (B) 類型··胺基酸 ' (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別17號：

Asp He Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val Asp 181 - 本紙張尺度適州中國1¾家標璋（（、NS ) Λ杉見格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} i.

、1T 1233946 A7 B7 五、發明説明（179) 20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 丨 50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 140 145 150

Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 185 190 195

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 218 (2)關於序列識別18號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：451個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別18號：

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 ί

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30

Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45

Leu Glu Trp Val Ala Ser lie Lys Tyr Ser Gly Glu Thr Lys Tyr 50 55 60 -182- 本紙張尺度適川中國國家標埤（（、NS ) Λ4規格（210X297公釐） --------i! (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 1233946 A7 B7 經淖部中决掠準局員_T消贽合竹社印f 五、發明説明（18〇

Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg He Thr He Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105

Trp His Fhe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 170 175 180

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190 195

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 320 325 { 330

Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 335 340 345

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 350 355 360

Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 365 370 375 183- 本紙張尺度適用中國國家標淨（rNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 五、發明説明（181 ) Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 380 385 390 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 395 400 405 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 410 415 420 Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 425 430 435 Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445 450 Lys 451 (2)關於序列識別19號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：218個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學··直線 (xi)序列説明：序列識別19號： --------i! (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經淖部中决標準局员h消費告竹私印f

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val Asp 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 50 55 60 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105 Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 ' 135 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 140 145 150 Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165 Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser -184-

、1T 本紙張尺度適用中國國家標蹲（rNS ) 規格（210X 297公釐） 1233946A7 B7 五、發明説明（182 ) 170 175 180 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 185 190 195 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210 Lys Ser Phe Asn Arg Giy Glu Cys 215 218 (2)關於序列識別20號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：229個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別20號：經淖部中决標準局貝-T-消贽合竹社印％

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30 Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Ala Ser He Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg He Thr He Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105 Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165 \ Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 170 175 180 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190 195 Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210 185- --------4—丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

，1T 本紙張尺度i|用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2]0X297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明説明（183 ) 經淖部中决標準局β〈_τ消贽合竹社印f

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225 Lys Thr His Thr 229 (2) >關於序列識別21號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：229個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明：序列識別21號： Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30 Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Ala Ser lie Lys Tyr Ser Gly Glu Thr Lys Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105 Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 170 175 180 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Prp Ser Ser 185 190 195 Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225

Lys Thr His Thr 229 186- 本紙張尺度適用中國國家標蟫（rNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1233946 A7 B7 五、發明説明（彳84 ) (2)關於序列識別22號之資訊：(〇岸列#徵： (A) 長度：248個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線(xi)序列説明：序列_別22號：經消部中决掠準局舄_τ消贽合竹私印來

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30 Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Ala Ser lie Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105 Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly 125 130 135 Ser Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 140 145 150 Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val 155 160 165 Asp Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 170 175 180 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu 185 190 195 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 200 205 210 Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr 215 220 225 Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin 230 235 240 Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 245 248 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Li.

、1T -187- I —I— I - I I · 本纸張尺度適用中國國家標蜂（rNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1233946 經消部中决掠準局舄_τ消贽告竹社印％ A7 B7 五、發明説明（185 ) (2)關於序列識別23號之資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：248個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説明··序列識別23號：

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30

Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45

Leu Glu Trp Val Ala Ser lie Lys Tyr Ser Gly Glu Thr Lys Tyr 50 55 60

Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105

Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly 125 130 135

Ser Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 140 145 150

Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val 155 160 165

Asp Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 170 175 180

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu 185 190 195

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 200 205 210

Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr 215 220 225

Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin 230 235 240

Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 245 248 (2)關於序列識別24號之資訊： (i)序列特徵： -188 - 本紙張尺度適用中國國家標嘩（rNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 Ψ 1233946 A7 B7 五、發明説明（186 ) (A) 長度·· 218個胺基酸 (B) 類型··胺基酸 (D)拓撲學：直線 (XI)序列説明··序列誠別24號： Asp 116 Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val Asp 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 50 55 60 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105 Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 140 145 150 Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165 Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 185 190 195 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210 M滴部中决掠準局兵h消贽合竹社印來

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 218 (2)關於序列識別25號之資訊： (i)庠列#徵 (A)長度 233個胺基酸 (B)類型：胺基酸 (D)拓撲學·· K (xi)序列説明··序列識別25號：

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 -189- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本纸張尺度適用中國國家標準（rNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1233946 A7 B7 五、發明説明（187 )

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30

Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp He Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45

Leu dlu Trp Val Ala Ser lie Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60

Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg lie Thr He Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105

Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 170 175 180

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190 195

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 230 233 (2)關於序列識別26號之資訊： (i)序列特徵·· (A) 長度：233個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：直線 (xi)序列説确··序列诚別26號：

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30

Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly -190- 本紙張尺度適用中國國家標率（rNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •4R. 訂 #1. 1233946 A7 B7 五、發明説明（188) 35 40 45 Leu Glu Trp Val Ala Ser lie Lys Tyr Ser Gly Glu Thr Lys Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105 Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 170 175 180 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190 195 Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 230 233 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經M部中^<標準局兵JT-消贽合竹私印來 91

本紙張尺度適用中國國家標缚（rNS ) Λ4規格（210X297公釐）

Claims

总輸！弟〇8711(j)696號專利 9a 12. 1 4 年 β !. 申請案修正j ::二 11^八功m來甲支申請專利範圍替換@$军12 iy ---—----^___上申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 1· 種改良可表現天冬胺酸異構化之抗-I g E抗體之方法，包括： a) 於未改良之抗_ igE抗體或抗體片段確認有同分異構化作用傾向的天冬胺醯基殘基； b) 藉由嗟菌體表現（a Μ P D )的親和力突變取代任選的殘基以製造候選分子，並就對抗丨g Ε之親和力來篩選所得之候選分子；及 c )選擇表現相當或相較於未改良抗_ j g e抗體具較高親和力之候選分子。 2·根據申請專利範圍第1項之方法，其中未改良抗體係為包含由SEQ ID NOs 13及14所組成之輕鏈及重鏈序列之E25抗體。 3· —種改良抗-1 g E抗體，其係由申請專利範圍第1或2項之方法所製得’其特徵在於（丨）於經取代殘基上不表現天冬胺醯基異構化；（2)相對於未改良抗體，其對於IgE 具有相當或更大之親和性及阻斷致敏性rBL48細胞釋出組織胺。 4· 一種抗體’其係由申請專利範圍第2項之方法所製得，其中取代殘基為可變輕鏈CDR1殘基Asp32Glu， Gln27Lys和Ser28Pro，其特徵在於於經取代殘基上不表現天冬胺醯基異構化；（2 )相對於未改良抗體，其對於I g E具有相當或更大之親和性及（3 )阻斷致敏性 R B L 4 8細胞釋出組織胺。 5.根據申請專利範圍第4項之抗體，其中額外取代之殘基 53695-93I2i4.DOC -1 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) 1233946

為可，义重鏈 CDR2 殘基 Thr53Lys，Asp55Ser，Ser57Glu 和 Asn58Lys 〇 6. —種抗體分子，其係包括分別由s e q i d N 0 s 1 5及1 6 所定義之可變重鏈及輕鏈序列。 7· —種抗體分子，其包括一抗體片段，其係由選自 F(ab)(SEQ ID NOs : 19 及 20)，sFv(SEQ ID NO · 22)及 F(ab’）2(SEQ ID NOs : 24 及 25)之序列所定義。 8·根據申請專利範圍第6或7項之抗體分子，其係與藥學上可接受足賦形劑混合以用於減少或預防哺乳動物中經由 I g E _調節所產生的組織胺。 9· 一種抗體分子，其係包括分別由s e q I n Ν Ο s 1 7及1 8 所定義之可變重鏈及輕鏈序列。 10· —種抗體分子，其包括一抗體片段，其係由選自 F(ab)(SEQ IN NOs : 19 及 21) ; sFv(SEQ ID NO : 23)及 F(ab’）2(SEQ ID NOs : 24 及 26)之序列所定義。 11·根據申請專利範圍第9或丨〇項之抗體分子，其係與藥學上可接文之賦形劑混合以用於減少或預防哺乳動物中經由I g E -碉節所產生的組織胺。 12· —種核酸分子，其編碼如申請專利範圍第i、6、7、9 或1 〇項之抗體。 13· —種用於降低或預防哺乳動物中lgE調節組胺酸產生之、、且口物’其包括至少一種醫療有效量之E 2 6抗體，該 -2- 1233946

E26抗體包括分別由SEQ ID N0s :丨5及10所定義之 E 2 6重鏈及輕鏈之序列。 14· 一種用於降低或預防哺乳動物中lgE調節組胺酸產生之組合物，其包括至少一種醫療有效量之E26抗體，該 E26抗體包括一序列，係選自F(ab)[SEQ IN NOs : 19-20]、sFv[SEQ ID N〇 : 22]和 F(ab)、 [SEQ ID N 0 s : 24-25 ]所組之群。 15. —種用於降低或預防哺乳動物中IgE調節組胺酸產生之組合物，其包括至少一種醫療有效量之E27抗體，該 E27抗體包括分別*SEq id Nos I7及I8所定義之 E 2 7重鏈及輕鏈之序列。 16· —種用於降低或預防哺乳動物中IgE調節組胺酸產生之組合物’其包括至少一種醫療有效量之E 2 7抗體，該 E 2 7抗體包括一序列，係選自F(ab) [seq id NOs : 19 & 21]、sFv[SEQ ID NO : 23]和 F(ab)，2 [SEQ ID N 0 s ·· 24 & 26 ]之組成之群。 17· —種用於降低或預防哺乳動物中調節組胺酸產生之組合物’其包括由SEQ ID NOs : 17及18所定義之 E 2 7重鏈及輕鏈之序列。 18· —種用於降低或預防哺乳動物中IgE調節組胺酸產生之組合物，其包括抗體片段，其係選自F(ab)[SEQ IN NOS : 19 及 21]、sFv[SEQ ID NO : 23 號]和 F(ab)，2 [SEQ ID NOs : 24 及 26]所組之群。 -3 - 本紙張尺度適用中國國家標準((：!]^3) A4規格(210X297公釐）