KR20140103140A

KR20140103140A - 치료용 키메릭 항-cd37 항체 hh1

Info

Publication number: KR20140103140A
Application number: KR1020147018915A
Authority: KR
Inventors: 로이 에이치. 라센; 조스테인 달
Original assignee: 노르딕 나노벡터 에이에스
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2014-08-25
Also published as: AU2012354140B2; EP3272364B1; PL3272364T3; WO2013088363A1; EP3272364A1; RU2014125320A; CA2858964A1; AU2012354140A1; US20140348745A1; IL233084A; MX2014006998A; CN109276713A; SG11201403134PA; HK1203372A1; PH12014501338A1; US20180194852A1; RU2658438C2; IL233084A0; EP2790740A1; NZ626188A

Abstract

본 발명은 마우스 모노클로날 항체 HH1 유래의 키메릭 또는 인간화된 항체에 관한 것이다. 본 발명의 적용은 본 발명의 항체 또는 이의 방사성면역결합제를를 포함하는 약제학적 조성물이 B 세포 악성종양을 치료하기 위하여 이용되는 치료목적의 적용을 포함한다.

Description

치료용 키메릭 항-CD37 항체 HH1{Chimeric Therapeutic Anti-CD37 Antibody HH1}

본 발명은 다양한 항체의 적용 뿐만 아니라, 예상치 못하게 높은 독성을 갖는 키메릭 또는 인간화된 항체를 이용한 혈핵학적 암의 면역치료 및 방사성면역치료에 관한 것이다.

본 발명은 키메릭 및 인간화된 항-CD37 항체의 생산 및 이의 적용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 B 세포 제거에 기초한 면역치료 및 방사성면역치료에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 B 세포 악성 종양 및 자가면역 상태의 치료 목적을 위한 항-CD37 항체 분자에 관한 것이다. 모노클로날 항체(mAB)를 이용한 면역치료는 암 및 다른 질병에 대한 안전하고 선택적인 방법으로 대두되고 있다. 특히, B 세포 제거, 예컨대 B 세포 악성종양에 기초한 치료에서 단일항체의 역할은 B 세포 표면 상의 CD20 항원에 대한 항체인 리툭시맙(rituximab)의 도입 이후로 점차 중요하게 되었다.

CD37 항원은 B 세포 항원 CD20과 동일한 정도로 B 세포 악성종양에 대한 타겟으로서 고려되지 않았던 세포 표면 항원이다. CD37은 테트라스파닌(tetraspanin) 수퍼패밀리의 일종이고, 4개의 막관통성 도메인 및 2개의 외세포 루프를 갖는 아주 많이 글라이코실레이션된 세포이다. CD37의 발현은 정상 B 세포,

외투세포 림프종(mantle cell lymphoma, MCL)을 포함하는 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL), 버키트 림프종(Burkitts Lymphoma, BL), 소림프구 림프종(small lymphocytic lymphoma, SLL), 여포성 림프종(follicular lymphoma, FL), 마지날 존 림프종(marginal zone lymphoma, MZL), 미만성 큰B세포 림프종(Diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), 림프아구성림프종(lymphoblastic lymphoma, LL) 및 만성 림프구 백혈병(chronic lymphoid leukemia, CLL)에서 발견된다. 상기 발현 패턴은 CD37을 항체-매개 암치료를 위한 매력적인 타겟으로 만든다. CD37은 1986에 최초로 설명되었고 뮤린 모노클로날 항체 MB-1에 의하여 특성이 규명되었다(Link et al, 1986). CD37의 생리학적인 역할은 알려지지 않았다. CD37에 특이적인 항체의 항암 세포에 대한 결합은 다양한 작용 메커니즘을 촉발시킬 수 있다. 첫째로, 항체가 CD37 항원의 외세포성 도메인에 결합한 후, 이 항체는 보체 활성화 경로(complement cascade)를 활성화 시키고 표적화된 세포를 용해시킬 수 있다. 둘째로, 항-CD37 항체는 항체 의존성 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)를 매개할 수 있고, 이것은 결합된 항체의 F_c영역이 면역 시스템의 세포독성 세포에 대한 적절한 수용기로 인지된다. 셋째로, 항체는 항원 또는 다른 자극에 대해 반응하기 위한 B 세포의 능력을 바꿀 수 있다. 마지막으로, 항-CD37 항체는 세포예정사(apotosis)를 개시할 수 있다. 항-CD37 모노클로날 항체는 B-NHL 환자(B-cell non-Hodgkin's lymphoma; Press et al., 1989; Kaminski et al., 1992)에 대해 두 개의 면역치료 시도에서 평가되었다. 또한, 다른 것들은 잠재력(예컨대, WO 2009/019312 by Heider et al. and WO 2011/092295 by the present inventors) 을 보여준 항-CD37 항체를 개시하였지만, CD37이 B 세포 악성 종양을 치료하기 위한 CD20의 이상적인 대안으로 입증되기에는 갈 길이 아직 멀다.

결론적으로, CD37 항원이 다수의 인간 B 세포 악성종양에서 종양세포 및 성숙한 정상 B 림프구 상에서 자주 발현된다는 것이 보고되었고, 항-CD37에 기초한 치료법은 B 세포 악성 종양으 치료를 위한 유망한 접근방법이 될 수 있다는 것이 보고되어 왔다. 상술한(예컨대, MB-1) 항-CD37 항체 또는 항체-유사 분자가 B 세포 악성종양 및 CD37을 표적화하는 잠재력에서 항-종양 효능을 나타냈을 지라도, 대안책으로서의 항-CD37 항체가 B 세포 제거에 기초한 치료를 개선하는 것이 필요하다. 따라서, 개선된 항-CD37 항체는 B 세포 악성 종양에 대한 새로운 치료를 추구하기 위한 장점이 있을 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 목적은 마우스 모노클로널 항체 HH1 유래의 키메릭 또는 인간화된 항체를 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 키메릭 또는 인간화된 항체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 마우스 모노클로날 항체 HH1 유래의 인간화된 또는 키메릭 항체를 제공한다.

인간화된 또는 키메릭 항체는 비인간 종 유래의 항체이고, 상기 항체의 단백질 서열은 인간에서 자연상 생산되는 항체 변종과의 유사성을 증가시키기 위하여 변형되었다.

본 발명에서, 용어“인간화(humaniztion)"의 과정은 대개 인간에 투여하기 위하여 개발된 모노클로날 항체에 적용된다.

인간화는 비인간 면역 시스템(예컨대, 마우스의 면역 시스템)에서 특이적인 항체를 개발하는 과정이 세대와 관련되어 있을 경우 필수적일 수 있다. 상기 방법으로 생산된 항체의 단백질 서열은 인간에가 자연 발생하는 상동 항체와 부분적으로 구분되므로, 잠재적으로 인간 환자에게 투여할 경우 면역성이 있다. 많은 치료법이 단기 개입이기 때문에, 인간에게 투여를 위하여 고안된 모든 항체는 인간화를 필요로 하는 것은 아니다. 인간화는 대개 마우스-인간 항체 키메라의 생성과는 대개 구분되는 것으로 보인다. 따라서, 항체 키메라의 생성은 보통 더 인간-유사 항체를 달성하기 위하여 처리된다(항체의 마우스 F_c영역을 인간의 F_c영역을 대체함으로써 처리). 상기 유형의 단순한 키메라는 대개 인간화된 것으로 간주되지 않는다. 오히려, 인간화된 항체의 단백질 서열은 타겟 항체에 항원에 결합하는 항체의 능력을 담당하는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 단편이 비인간 기원 단편임에도 불구하고, 인간 변종의 것과 필수적으로 동일하다.

그러나, 본 명세서에서, 용어“키메릭 항체” 및 “인간화 항체”는 유전공학적으로 변형된 항체로 간주되었을 경우 혼용되어 사용되고, 마우스 모노클로날 항체 HH1으로부터 유래된다.

모노클로날 항체 HH1으로부터 유래된 키메릭 또는 인간화된 항체

면역글로블린 중쇄(IgH) 는 항체(면역글로블린)의 큰 폴리펩타이드 서브유닛이다. 일반적인 항체는 두 개의 면역글로블린(Ig) 중쇄 및 두 개의 경쇄로 구성되어 있다. 항체의 종류 또는 아이소타입을 한정하는 다수의 중쇄의 서로 다른 유형이 존재한다. 상기 중쇄 유형은 서로 다른 동물에 따라 다양하다. 면역글로블린 경쇄는 항체(면역글로블린)의 작은 폴리펩타이드 서브유닛이다. 인간(기타 포유동물에서에 마찬가지)에서 두가지 유형의 경쇄가 존재하는데, 카파(kappa, κ) 사슬은 2번 염색체상에서 면역글로블린 카파 유전자위에 의하여 암호화되고, 람다 사슬(lambda, λ)은 22번 염색체 상에 면역글로블린 람다 유전자위에 의하여 암호화된다.

항체는 B 림프구에 의하여 생산되고, 각각은 단일 종류의 경쇄를 발현한다. 한번 시작되면, 경쇄 종류는 B 림프구의 일생 동안 고정된다. 신생물(neoplasm)의 아주 다양한 비율의 지표인 자유 경쇄를 측정하는 경우, 건강한 개체에서, 전체 카파와 람다 체인의 비율은 혈청에서 2:1 또는 1:1.5이다. 카파와 람다의 정확한 정상 비율은 0.26 내지 1.65의 범위이다. 카파 및 람다 사슬 모두 정상 비율을 유지하면서 비율적으로 증가할 수 있다. 마우스 모노클로날 항체 HH1 유래의 키메릭 또는 인간화된 항체에서 다양하고 일정한 사슬은 공지의 서열과 다를 수 있다. 상기 변이의 예시들은 현재 개시된 것으로부터 명백하고, 효과기 기능을 조절하기 위한 일정한 사슬, 다양한 사슬의 유전적 변이 및 F_c 도메인의 변이의 선별을 포함한다.

본 발명자들은 마우스 모노클로날 항체 HH1 유래의 유전공학적으로 변형된 키메릭 및 인간화된 항체를 개발하였다.

상기 항체는 B 세포와 관련된 악성종양의 최적화된 치료를 탐구하는데 현저한 효과를 나타낸다. 상기 효과를 본 발명에서 개시된 실험에서 나타내었다.

따라서, 본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 인간 CD37에 결합하는 항체 분자이다. 상기 항체 분자는 i) 서열목록 제1서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 뮤린 모노클로날 항체; 및 ii) 서열목록 제3서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역로 정의되는 뮤린 모노클로날 항체로 정의되는 뮤린 모노클로날 항체, 또는

(b) (a) 단계에서 정의된 항체로서 인간 CD37의 동일한 에피토프 또는 상기 에피토프와 유사하거나 겹치는 에프토프를 인지하는 비인간 항체로부터 유래된 항체, 여기서 상기 항체 분자는 키메릭 또는 인간화 항체이다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 i) 서열목록 제 1 서열로 표시되는 아미노산을 포함하는 중쇄 가변영역;

ii) 서열목록 제 3 서열로 표시되는 아미노산을 포함하는 경쇄 가변영역;

iii) 인간 기원의 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역으로 정의되는 항체이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 i) 중쇄 가변영역이 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 중쇄 가변영역 및 ii) 경쇄 가변영역은 카파 또는 람다 사슬인 항체로 정의되는 키메릭 항체이다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 것으로 정의되는 중쇄 불변 사슬이다:

i) 중쇄 불변 사슬은 서열목록 제 5 서열, 서열목록 제 6 서열 및 서열목록 제 7 서열로 표시되는 아미노산 서열 및

ii) 경쇄 불변 사슬은 서열목록 제 9 서열로 표시되는 아미노산 서열.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 것으로 정의되는 불변 사슬이다:

i) 중쇄 불변 사슬은 서열목록 제 11 서열 및/또는 서열목록 제 14 서열로 표시되는 아미노산 서열 및

ii) 경쇄 불변 사슬은 서열목록 제 13 서열로 표시되는 아미노산 서열.

돌연변이된 전장 중쇄를 갖는 서열목록 DNA chHH1.3 F_c 서열은 서열목록 제10서열로 나타낼 수 있다.

돌연변이된 전장 경쇄를 갖는 아미노산 chHH1.3 F_c 서열은 서열목록 제11서열로 나타낼 수 있다.

돌연변이된 전장 중쇄를 갖는 서열목록 아미노산 DNA chHH1.3 F_c 서열은 서열목록 제12서열로 나타낼 수 있다.

돌연변이된 전장 중쇄를 갖는 서열목록 아미노산 DNA chHH1.3 F_c 서열은 서열목록 제13서열로 나타낼 수 있다.

돌연변이 없는 chHH1.3 F_c 서열(불변영역)은 서열목록 제14서열로 나타낼 수 있다.

본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자

인간화 과정은 포유동물 세포 배양에서 발현될 수 있는 구출물을 생성하기 위한 모노클로날 항체의 생산가 재조합 DNA를 이용하여 성취될 수 있다 장점이 있다. 즉, 항체를 생산할 수 있는 유전자 단편은 분리되고 탱크에서 배양될 수 있는 세포 내로 클로닝이 된다. 이렇게 클로닝된 유전자 DNA로부터 생산된 항체 단백질은 대량으로 수득될 수 있다.

재조합 DNA와 관련된 단계는 발현된 항체의 단백질 서열을 변형시키기 위하여 쉽게 이용될 수 있는 개입 지점을 제공한다. 따라서, 인간화 과정에서 성취될 수 있는 항체 구조의 변형은 모두 DNA 수준에서의 기술들을 통하여 유발된다.

따라서, 본 발명의 일양태에서, 본 발명은 본 발명의 인간화된 또는 키메릭 항체를 암호화하는 DNA 분자이다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 본 발명의 인간화된 항체 또는 키메릭 항체의 중쇄 가변영역을 암호화하는 DNA 분자이다.

본 발명의 또 다른 일구현예에서, 본 발명은 인간 기원의 중쇄 불변영역을 암호화하는 영역과 융합하는 영역을 암호화하는 중쇄 가변영역 영역이다.

상기 인간의 중쇄 가변영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 IgG1은 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열로 표시되는 서열로 암호화된다. .

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 IgG3의 중쇄는 서열목록 제10서열로 표시되는 서열로 암호화된다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 IgG3의 경쇄는 서열목록 제12서열로 표시되는 서열로 암호화된다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 H435 치환 돌연변이를 갖는 IgG3는 서열목록 제12서열로 표시되는 서열로 암호화된다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명은 F_c영역에서 하나 이상의 인간의 중쇄 불변 사슬을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 키메릭 항체 또는 인간화된 항체를 암호화하는 영역을 포함하는 DNA 분자이다.

상기 경쇄 가변영역은 인간 기원의 경쇄 불변영역을 암호화하는 영역과 융합될 수 있다.

경쇄 불변영역은 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 사슬일 수 있다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 서열목록 제9서열로 표시되는 서열에 의하여 암호화되는 카파 경쇄이다.

DNA 분자는 타겟 세포에서의 발현을 위하여 구축되고 최적화될 수 있다.

발현 구축물로서 알려진 것과는 달리, 발현 벡터는 일반적으로 특이적인 유전자(본 명세서에서 본 발명의 DNA 분자)를 타겟 세포 내로 도입시키기 위하여 이용되는 플라스미드이다.

발현 벡터가 한번 세포 내에 존재하면, 유전자에 의하여 암호화되는 단백질은 세포내 전사 및 변역 과정 리보솜 복합체에 의하여 생산된다.

플라스미드는 흔히 인헨서(enhance) 및 프로모터 영역으로 작용하는 조절 서열을 포함하고 발현 벡터에서 운반된 유전자의 효율적인 전사를 유도하도록 유전공학적으로 변형된다.

잘 고안된 발현 벡터의 목표는 많은 양의 안정한 mRNA 및 이의 단백질의 생산이다.

발현 벡터는 생물공학 및 단백질, 예컨대 당뇨병 같은 특이적인 질병의 의학적 치료를 위하여 중요한 인슐린 생산을 위한 기본적인 도구이다.

유전자 산물의 발현 후, 단백질의 정제가 필요하다. 그러나, 벡터가 숙주 세포에 도입된 후, 관심 있는 단백질은 숙주 세포 단백질로부터 정제되어야 한다. 따라서, 정제 과정을 용이하게 하기 위하여, 클로닝된 유전자는 태그(tag)를 가져야 한다. 상기 태그는 히스티딘(His) 또는 임의의 다른 마커 펩타이드일 수 있다.

따라서, 본 발명의 일양태에서, 본 발명은 상술한 DNA 분자를 포함하는 발현벡터이다.

본 발명의 항체를 포함하고 암호화하는 세포

상술한 DNA 분자 또는 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 세포는 하이브리도마(hybridoma) 기술을 통하여 키메릭 또는 인간화된 항체를 생산하는 무한증식 세포(immortalized cell)가 된다. 하이브리도마 기술은 조직 배양으로 배양할 수 있는 능력을 위하여 항체 사슬 합성 없이 골수종(myeloma, B 세포 암) 세포와 특이적인 항체-생산 B 세포가 융합함으로써 하이브리드 세포주(이하 하이브리도마라고 함)를 형성하는 기술이다.

하이브리도마에 의하여 생산된 항체는 모두 단일 특이성을 가지므로 모노클로날 항체이다(폴리클로날 항체와 대조적임).

따라서, 본 발명의 일양태에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 벡터를 수반하는 숙주 세포 또는 DNA 분자이다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 HH1의 중쇄 가변영역을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터를 수반하는 숙주세포이고, 본 발명의 경쇄 가변영역을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 두 번재 발현 벡터를 수반하는 숙주 세포이다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 숙주세포는 포유동물 세포이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 세포는 하이브리도마 세포이다.

본 발명의 항체를 생산하는 방법

본 발명의 키메릭 또는 인간화된 항체는 다양한 방법으로 생산될 수 있다. 상기 항체를 생산하기 위한 한 방법은 본 발명의 하나 이상의 항체를 포유동물의 숙주세포에 감염시키는 단계; 호스트를 배양하는 단계; 및 항체 분자를 회복시키고 정제하는 단계를 포함한다.

하이브리도마 세포의 구축물을 포함하는 상기 항체를 생산하는 또 다른 방법은 본 발명의 키메릭 또는 인간화된 항체를 생산하는 방법이다.

서열 동일성(Sequence identity)

통상 사용되는 “동일성(identity)”은 본 명세서에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산 수준에서 각각 유전자 또는 단백질간의 서열 동일성으로 정의된다.

따라서, 본 명세서에서 “서열 동일성”은 아미노산 수준에서 단백질간의 동일성의 판단 수단이고, 뉴클레오타이드 수준에서 핵산간의 동일성의 판단 수단이다.

단백질의 서열 동일성은 서열이 얼라인먼트(alignment)가 되었을 때, 각각의 서열에 있어서의 주어진 위치에서 아미노산 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.

유사하게, 핵산 서열 동일성은 서열이 얼라인먼트(alignment)가 되었을 때, 각각의 서열에 있어서의 주어진 위치에서 뉴클레이다이드 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.

두 개의 핵산 서열 도는 두 개의 아미노산의 서열 동일성 백분율을 측정하기 위하여, 상기 서열을 최적의 비교 목적을 위하여 얼라인먼트를 수행하였다(예컨대, 갭은 최초 아미노산 또는 핵산 서열과 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적의 얼라인먼트). 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 위치에서의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 잔기를 이후 비교하였다.

최초 서열에서의 위치가 두 번째 서열에서 상응하는 위체와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드 서열에 의하여 점유되었을 경우, 이후 상기 분자는 같은 위치에서 동일성이 있다. 두 서열간의 서열 동일성 백분율은 서열로 공유된 서열 동일성 위치의 수의 함수이다(즉, 서열 동일성(%) = 서열이 동일한 위치의 수 / 전체 서열 위치의 수(예컨대, 겹치는 위치) x 100). 본 발명의 일구현예에서, 두 개의 서열은 동일한 길이이다.

서열의 얼라인먼트는 수동적으로 수행될 수 될 수 있고 동일한 핵산 또는 아미노산의 수가 계산될 수도 있다. 다른 방법으로, 서열 동일성 백분율의 결정을 위한 두 서열의 얼라인먼트는 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 상기 알고리즘은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램내로 통합된다. BLAST 뉴클레오타이드 서치는 NBLAST 프로그램(스코어 = 100, 단어길이 =12)으로 수행될 수 있고, 본 발명의 핵산 분자와 상동성이 있는 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 서치는 XBLAST 프로그램(스코어 = 50, 단어길이 = 3)으로 수행될 수 있고, 본 발명의 핵산 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 수득할 수 있다.

비교 목적을 위하여 갭이 있는 얼라인먼트를 수득하기 위하여, Gapped BLAST를 이용하였다. 다른 방법으로, PSI-Blast가 분자간 유연관계를 조사하기 위하여 반복 서치를 수행하는데 이용될 수 있다. NBLAST, XBLAST 및 Gapped BLAST를 이용하는 경우, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 이용될 수 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 참조). 다른 방법으로, 서열 동일성은 EMBL 데이터베이스에서 서열이 BLAST 프로그램에 의하여 얼라인먼트가 된 후 계산될 수 있다(www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST 참조).

일반적으로, 예컨대, “스코링 매트릭스(scoring matrix)” 및 “갭 페널티(gap penalty)”와 관련된 디폴트 세팅이 얼라인먼트를 위하여 이용될 수 있다. 본 명세서에서, BLASTN and PSI BLAST 디폴트 세팅이 장점이 될 수 있다.

두 서열간의 서열 동일성 백분율은 갭을 허용하거나 허용하지 않고 상술한 것과 유사한 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 서열 동일성 백분율을 계산함에 있어서, 유일하게 정확한 매치를 계산하였다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 HH1 항체 VH 서열(서열목록 제2서열) 및/또는 VL 서열(서열목록 제4서열)을 이용한 80% 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 HH1 항체 VH 서열(서열목록 제2서열) 및/또는 VL 서열(서열목록 제4서열)을 이용한 최소 90%의 서열 동일성, 예컨대, 90 % 서열 동일성, 91 % 서열 동일성, 92 % 서열 동일성, 93 % 서열 동일성, 94 % 서열 동일성, 95 % 서열 동일성, 96 % 서열 동일성, 97 % 서열 동일성, 98 % 서열 동일성 또는 99 % 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 HH1 항체 VH 서열(서열목록 제1서열) 및/또는 VL 서열(서열목록 제3서열)을 갖는 80% 서열 동일성을 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 HH1 항체 VH 서열(서열목록 제1서열) 및/또는 VL 서열(서열목록 제3서열)을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 HH1 항체 VH 서열(서열목록 제1서열) 및/또는 VL 서열(서열목록 제3서열)을 이용한 최소 90%의 서열 동일성, 예컨대, 90 % 서열 동일성, 91 % 서열 동일성, 92 % 서열 동일성, 93 % 서열 동일성, 94 % 서열 동일성, 95 % 서열 동일성, 96 % 서열 동일성, 97 % 서열 동일성, 98 % 서열 동일성 또는 99 % 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열을 공유하는 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체 HH1 유래의 키메릭 또는 인간화된 항체이다.

유전적 변이(Genetic variation)

유전적 변이는 유전자에서 뉴클레오타이드의 염기의 순서상의 변이가 원인이 된다. 상기 변이는 유전자의 변이를 야기하고, 이어서 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 변이를 야기한다.

상기 돌연변이는 센스(sense) 또는(missense) 미스센스 돌연변이 또는 치환일 수 있다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 최소 50, 예컨대, 20, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1의 센스 돌연변이를 포함하는 분리된 HH1 모노클로날 항체 VH 사슬의 핵산 서열(서열목록 제2서열) 및/또는 VL 사슬(서열목록 제4서열)이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 0-50, 예컨대 1-50, 0-20, 1-20, 0-10, 1-10, 0-5, 1-5, 3 또는 1의 센스 돌연변이를 포함하는 HH1 모노클로날 항체 VH 사슬(서열목록 제2서열) 및/또는 VL 사슬(서열목록 제4서열)의 분리된 핵산 서열이다.

미스센스 돌연변이(비유사 돌연변이의 일종)는 단일 뉴클레오타이드가 변화된 점 돌연변이이고, 서로 다른 아미노산을 암호화하는 코돈을 야기한다(아미노산을 종결 코돈으로 변화시키는 돌연변이는 미스센스 돌연변이라기 보다는 넌센스 돌연변이로 봄). 미스센스 돌연변이는 결과적으로 단백질을 비기능적이도록 만들 수 있다. 그러나, 모든 미세센스 돌연변이가 주목할 만한 단백질 변화를 야기하는 것은 아니다. 하나의 아미노산은 매우 유사한 화학적 특성을 갖는 아미노산으로 대체될 수 있고, 이 경우 상기 단백질은 여전히 정상적으로 기능을 할 수 있으므로, 이것은 중성, 즉 “조용한” 또는 보존적 돌연변이라고 불린다.

그 대신에, 아미노산 치환은 단백질의 2차 구조 또는 기능에 유의하게 영향을 주지 않는 단백질 영역에서 발생한다. 아미노산이 하나 이상의 코돈에 의하여 암호화될 수 있는 경우(소위 “암호화의 축퇴화(degenerate coding)"), 코돈에서의 돌연변이는 번역에 있어서 임의의 변화를 생성하지 못할 수도 있다. 이것은 미스센스 돌연변이가 아니라, 동일 돌변변이(synonymous mutation)가 될 수 있다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 최소 50, 예컨대, 20, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1의 미스센스 돌연변이를 포함하는 분리된 HH1 모노클로날 항체 VH 사슬의 폴리펩타이드 서열(서열목록 제2서열) 및/또는 VL 사슬(서열목록 제4서열)을 포함하는 항체이다.

본 발명의 구현예에서, 본 발명은 0-50, 예컨대 1-50, 0-20, 1-20, 0-10, 1-10, 0-5, 1-5, 3 또는 1의 미스센스 돌연변이를 포함하는 HH1 모노클로날 항체 VH 사슬(서열목록 제2서열) 및/또는 VL 사슬(서열목록 제4서열)의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체이다.

보존적 치환은 일반적으로 유사한 특성을 갖는 아미노산으로의 치환이어서 전반적인 기능이 심각하게 영향을 받지 않을 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예에서, 미스센스 돌연변이는 보존적 또는 치환 돌연변이다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명은 HH1의 중쇄 가변영역(서열목록 제1서열) 및/또는 VL 서열(서열목록 제3서열)과 80 % 서열 동일성을 갖는 분리된 핵산 서열 또는 폴리펩타이드 서열이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 서열 동일성은 80 %의 동일성, 예컨대, 90%의 동일성, 91 %의 동일성, 92 %의 동일성, 93 %의 동일성, 94 % 의 동일성, 95 %의 동일성, 96 %의 동일성, 97 %의 동일성, 98 %의 동일성, or 99 %의 동일성이고, 그리고 서열변이는 보존적 치환이다.

방사성 표지된 단계를 개선시키기 위하여, 여분의 라이신(lysine)을 예컨대, 본 발명의 키메릭 또는 인간화된 항체의 F_c 부분으로 도입하는 것이 이익이 될 수 있다. 이것은 라이신 결합 킬레이터를 항체에서 항원 결합 위치 내로 부착시키는 가능성을 감소시킨고, 그렇게 함으로써 방사성 표지 동안 면역 반응성을 절충하는 위험성을 감소시킨다.

라이신을 HH1의 F_c부분 내로 도입시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Hemminki et al., 1995.).

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 방사성 면역결합제는 HH1의 F_c부분에서 10번째 라이신, 예컨대, 8번째 라이신, 6번째 라이신, 5번째 라이신, 4번째 라이신, 3번째 라이신, 2번째 라이신 또는 1번째 라이신에서 변형되었다.

본 발명의 항체의 F_c부분의 다른 변이는 하나 이상의 효과기 기능을 최적화하거나 조절하기 위하여 선택될 수 있다. 이러한 효과기 기능의 조절은 예컨대, 항체-의존적 세포-매개성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)을 증가시키기 위하여 수행된다. 상기 F_c부분의 변이는 당업계에 알려져 있다.

따라서, 본 발명의 일양태에서, 본 발명은 하나 이상의 효과기 기능을 조절하는 F_c도메인에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체이다.

면역결합제(Immonoconjugate)

면역성 결합제는 2차 분자, 대개 독소, 방서성동위원소 또는 표지에 결합하는 항체이다. 키메릭 및 인간화된 HH1의 면역성 결합제는 모두 본 발명의 양태들이다.

한 유형은 킬레이팅 링커와 연결되거나 결합된 본발명의 키메릭 및 인간화된 HH1이다.

킬레이팅 링커는 상술된 방사성 결합제 및 킬레이팅 링커에 관한 하기 섹션에서 논의되고, 그 안에서 설명된 킬레이팅 링커는 모두 킬레이팅 링커에 연결되거나 결합된 본 발명의 키메릭 또는 인간화된 HH1을 포함하는 면역성 결합제에 유용하게 고려된다.

방사성 면역결합제(Radioimmonoconjugate)

본 발명의 일양태에서, 본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체 HH1으로부터 유래된 키메릭 또는 인간화된 항체를 포함하는 인간의 CD37, 링커 및 (c) ²¹¹At, ²¹³Bi, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²5Ac, ²²⁷Th, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ¹⁹⁴Ir, ¹⁶⁶Ho, ¹⁵⁹Gd, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴²Pr, ¹¹¹Ag, ¹⁰⁹Pd, ⁷⁷As, ⁶⁷Cu, ⁴⁷Sc 및 ¹⁷⁷Lu으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방사성핵종(radionuclide)에 결합하는 방사성 면역결합제이다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 링커는 킬레이팅 링커이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방사성핵종은 ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac,²²⁷Th 및 ⁹⁰Y로 구성된 군으로부터 선택된 방사성핵종이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방사성핵종은 ¹⁷⁷Lu이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방사성핵종은 ²¹²Pb이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방사성핵종은 베타 방사체(beta-emitter) 또는 알파 방사체(alpha-emitter)이다.

방사성핵종은 이기능성(bifunctional) 킬레이터, 예컨대, p-SCN-bn-DOTA (Macrocyclics, Tx, USA)를 항체와 처음으로 반응시킴으로써 결합될 수 있고, 이후 임의의 비결합된 방사성핵종을 제거하기 위하여 정제된다.

그 대신에, 킬레이터 및 방사성핵종은 처음으로 결합될 수 있고 이후 항체에 결합될 수 있다. 예컨대, p-SCN-bn-DOTA와 같은 킬레이팅 링커는 ¹⁷⁷Lu에 묘사된 것과 유사한 방법으로 HH1 유래된 항체를 다른 금속 방사성핵종과 결합하는 데 이용될 수 있다.

충분한 복합체 형성 능력을 갖는 임의의 종류의 링커 및 단백질 또는 펩타이드와 직간접적인 결합을 허여하는 기능기가 이용될 수 있다.

예컨대, 링커는 예컨대, 이 문헌((e.g. Brechbiel, 2008; Liu, 2008)에서 묘사된다. 일부 유용한 예는 p-SCN-bn-DOTA, DOTA-NHS-ester, p-SCN-Bn-TCMC와 같은 이기능성 고리형 킬레이터이다.

구체적으로, 본 발명의 방사성핵종은 이기능성 킬레이터를 이용함으로서 표적화하는 분자에 결합될 것이다.

이것은 고리형, 선형 또는 가지형 킬레이터가 될 수 있다. 특별한 비교물질은 질소 백본에 결합된 산성 작용기(예컨대, 카복시알킬기)를 갖는 선형, 고리형 또는 가지형 폴리아자알케인 백본을 포함하는 폴리아미노폴리산(polyaminopolyacid) 킬레이터로 제조될 수 있다.

예컨대, 적절한 킬레이터는 DOTA 유도체, 예컨대,

p-이소티오시안아도벤질-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(p-SCN-Bz-DOTA) 또는 S-2-(4-이소티오시안아토벤질)-1,4,7,10-테트라(2-카보모일메틸)사이클로도데칸 및 DTPA 유도체, 예컨대, p-이소티오시안아토벤질-디에틸렌트리아민펜타아세트산(p-SCN-Bz-DTPA), 전자는 고리형 킬레이터, 후자는 선형 킬레이터를 포함한다.

복합체 부위의 금속결합(metallation)은 표적화한 부위와 복합체 부위의 결합 전후에 실행될 수 있다.

방사성 표지 절차는 일반적으로 킬레이터가 방사성 표지가 일어나기 전에 항체에 결합되는 경우, 이용된 시간의 면에서 수행될 수 있다.

항체에 결합하는 킬레이터를 이용하는 방사성 표지된 결합제를 제조하는 방법상의 원칙은 문헌(예컨대, Liu, 2008)에서 넓게 설명된다.

따라서, HH1 유래의 키메릭 또는 인간화된 항체는 방사능 특성 및 효율적인 반감기에서의 차이를 이용한 방사성 면역결합제를 제조하기 위하여 이용될 수 있다.

예컨대, 본 발명의 모노클로날 항체 HH1 유래의 키메릭 또는 인간화된 항체로 구성되는 항-CD37 방사성 면역결합제, 킬레이팅 링커 및, 베타 또는 알파 방출 방사성핵종(예컨대, ¹⁷⁷Lu, ²¹¹At, ²¹³Bi, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²⁷Th, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ¹⁹⁴Ir, ¹⁶⁶Ho, ¹⁵⁹Gd, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴²Pr, ¹¹¹Ag, ¹⁰⁹Pd, ⁷⁷As, ⁶⁷Cu 및 ⁴⁷Sc를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 제조될 수 있고 약제학적 제제를 제조하기 위하여 이용될 수 있으며 치료를 위한 적용에 이용될 수 있다.

면역독소(Immunotoxin)

면역독소는 독소에 결합되는 표적화된 부위로 구성되는 인간에서 생성되는 단백질이다. 상기 단백질이 세포에 결합하는 경우, 엔토사이토시스(endocytosis)를 통하여 흡수되고, 독신은 세포를 살해한다.

면역독소는 일종의 암 치료제 및 바이러스성 감염로서 이용된다. 상기 면역독소 단백질은 대개 변형된 항체 또는 항체 단편으로 이루어져 있고, 독소의 단편에 결합된다.

표적화된 부위는 특이적인 세포 유형을 표적화하는 항체의 F_v부위로 구성되어 있다. 독소는 대개 박테리아성 도는 식물 단백질 유래의 세포독성 단백질이고, 상기 단백질 유래의 자연적 결합 도메인이 제거되고 F_v는 독소를 표적 세포 상의 항원에 보낸다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 독소는 화학치료법적 분자, 예컨대 알킬레이팅 제제(시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 메클로에타민, 사이클로포스포아마이드, 클로람부실, 이포스프아마이드), 항-대사물질(아자티오프린, 머캅토퓨린, 피리미딘), 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 시노렐빈, 빈데신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드, 테니포시드), 토포아이소머레이즈 억제제(irinotecan, topotecan, amascrine, etoposide, teniposide) 및 세포독성 항생체(악티노마이신, 독소루비신 다우노마이신, 칼루비신, 이다루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 플리카마이신, 마이토마이신)이나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 독소루비신은 가교결합제 SMCC-하이드라자이드(4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1 카복시하이드라자이드)를 통하여 항체에 결합된다.

면역독소는 표적 세포 상의 항원에 결합하는 항체에 의하여 작용하고 이후 독소는 세포 내로 들어가 세포를 살해한다.

따라서, 본 발명의 일양태에서, 본 발명의 면역독소는 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함한다.

약제학적 조성물

항체는 대개 약제학적 조성물에서 제조된 질병의 치료에 적용된다.

상기 조성물은 생리학적 내인성 및 반감기와 같은 파라미터에 최적화되어 있다.

따라서, 본 발명의 일양태에서, 본 발명의 약제학제 조성물은 유효성분으로서 본 발명(즉, 키메릭 또는 인간화된 항체 유래의 HH1 또는 이의 단편)의 하나 이상의 항-CD37 항체 분자 및 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함한다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 상술한 약제학적 조성물이고, 또한 하나 이상이 추가적인 치료제를 포함한다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 추가적인 치료제는 CD37 보다는 다른 B 세포 항원을 표적화하는 제제로부터 선택된 치료제이다.

상기 항원은 B 세포 항원 CD20일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 치료제는 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 제제로부터 선택된 치료제이다.

키메릭 또는 인간화된 HH1에 기초한 방사성 면역치료 생성물은 일반적으로 상당한 정도로 방사성 면역결합제의 화학적 견실성을 유지하고 생리학적으로 환자에게 투여가 허용 가능한 완충 용액에 용해된 키메릭 또는 인간화된 항체 HH1에 대한 킬레이터를 통하여 상술한 방사성핵종으로 구성된 약제학적 조성물로 제공될 수 있다.

따라서, 본 발명의 일양태에서, 본 발명의 방사성 면역결합제를 포함하는 약제학적 조성물이고, 약제학적으로 수용가능한 담체 및/또는 첨가제이다.

수용가능한 약제학적 담체는 비독성 완충액, 충전제 및 등장액 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 약제학적 담체는 정상 살린(0.9 %), 반정상 살린, 링거 락테이트(Ringer’s lactate), 5 % 덱스트로오스, 3.3 % 덱스트로오스/0.3 % 살린일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생리학적으로 수용가능한 담체는 저장 및 보관 동안 방사성약제의 견실성을 보호하는 방사성 분해 안정제, 예컨대 아스코르빅산을 포함할 수 있다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 약제학적 조성물 및 하나 이상의 추가적인 항체 또는 방사성 면역결합제를 포함한다. 항체는 리투시맙(Rituximab), 에프라투주맙(Epratuzumab), L19, F8, F16, 갈릭시맙(Galiximab), 토랄리주맙(Toralizumab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 벨투주맙(Veltuzumab), 아푸투주맙(Afutuzumab), 토시투모맙(Tositumomab), 레디툭스(Reditux), 이브리투모맙(Ibritumomab), K7153A, 37.1 및 HH1을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

방사성 면역결합제는 제발린(Zevalin), 벡사(Bexxar) 및 베탈루틴(Betalutin)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 CD37 항원을 발현하는 B 세포 악성종양 세포를 치료하기 위한 약제학적 조성물이다.

본 발명의 일구현예에서, 약제학적 조성물은 B 세포 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL), B 세포 만성 림프구 백혈병(chronic lymphoid leukemia, CLL), 모발성 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 작은 림포플라스마사이틱 림프종(small lymphoplasmacytic lymphoma) 및 다발성 골수종(multiple myeloma)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 B 세포 악성 종양을 치료하기 위한 약제학적 조성물이다.

치료

본 발명의 약제학적 용액의 치료 용도는 CD37 항원을 발현하는 악성종양 세포에 대한 치료 용도일 수 있다. 상기 CD37 항원은 B 세포 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL), B 세포 만성 림프구 백혈병(chronic lymphoid leukemia, CLL), 모발성 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 림포플라스마사이틱 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma) 및 다발성 골수종(multiple myeloma)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 B 세포 악성 종양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 용도는 자가면역 질환의 치료 및 이식 관련 효과의 치료일 수 있다.

상기 치료법은 베타-입자-방사능, 알파-입자-방사능 또는 이의 조합에 기초한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 치료법은 단독 치료 또는 다른 치료, 구체적으로 표준 치료와의 조합으로 투여될 수 있다. 상기 다른 치료법은 전치료, 수술, 항암화학요법(독소루비신, 빈블라스틴 및 젬시타빈을 포함함), 면역 치료법, 광역동 치료(photodynamic therapy), 프로티아좀 억제제(보르테조밉(bortezomib) 포함), 히스톤 디아세틸레이즈 억제제(보리노스탯(vorinostat) 및 수버로일아닐라이드(suberoylanilide) 하이드록삼산), 비타민 D3 및 비타민 D3 유도체, 세포 주기 체크 억제제(UCN-01 및 2-(4-(4-클로로페녹시)페닐)-1H-벤지미다졸-5-카복사마이드), 혈중 산소 감소된 세포의 방사선증감제(메트로니다졸 및 미소니다졸), 세포사멸 유도체(위타페린 A) 방사선증감제, 방사성면역치료법 또는 이의 둘 이상의 조합일 수 있다.

상기 투여는 정맥내 투여 또는 정맥 주사를 의미한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 형광 면역결합제는 공기색전증(air embolism)을 예방하고 환자에게 추정 유속을 허여하는 점적 챔버와 결합되어 있는 주변부 카눌라(peripheral cannula)에 의하여 정맥에 직접 투여될 수 있다.

본 발명의 일구현예에서, 방사성 면역결합제는 반복적인 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 방사성 면역결합제는 반복적인 방법으로 투여될 수 있지만, 그러나 서로 다른 방사성 핵종, 예컨대, 베타-방사능면역치료법은 알파-방사성면역치료법 또는 그 반대가 가능할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 방사성 면역결합제의 용도는 B 세포 악성조양의 치료 용도이다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 방사성 면역결합의 용도는 다른 치료법과 조합 또는 부가하여 투여된다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 다른 치료법은 전치료, 화학치료, 모노클로날 항체 치료, 수술, 방사성치료 및/또는 광역동진단 치료로부터 선택되는 치료법이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 다른 치료법은 골수 이식 또는 줄기 세포 이식 및/또는 치료법이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방사성 면역결합제를 이용한 치료 이전에 항-CD20 및/또는 항-CD37 모노클로날 항체를 이용한 전치료를 포함한다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 키메릭 항체의 투여단계에 의하여 수행된 전치료는 이후 HH1의 키메릭 항체의 방사성 면역결합제 또는 HH1 항체의 방사성 면역결합제에 의하여 수행된다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 B 세포 악성종양의 치료를 위한 방법이다.

본 발명의 일양태에서, 본 발명은 B 세포 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL), B 세포 만성 림프구 백혈병(chronic lymphoid leukemia, CLL), 모발성 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 림포플라스마사이틱 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma) 및 다발성 골수종(multiple myeloma)으로 구성된 군으로부터 선택된 B 세포 악성 종양의 치료 방법이다.

본 발명의 일양태에서, 본 발명은 in vitro 또는 exvivo에서 수행된 본 발명의 치료의 용도 및 방법이다.

본 발명의 일양태에서, 본 발명의 항체 투여량은 환자당 1-1000 mg, 보다 구체적으로 환자당 5-50 mg, ¹⁷⁷Lu의 총액 1-200 MB MBq/kg, 보다 구체적으로 10-100 MBq/kg의 체중량이다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 용도 및 치료방법은 in vitro 또는 exvivo에서 수행된다.

본 발명의 키메릭 또는 인간화된 항체를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 이들의 표면상에 CD37을 발현하는 B 세포를 제거하는데 이용될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 B 세포 악성종양의 치료에 이용될 수 있다.

상기 B 세포 악성종양은 B 세포 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL), B 세포 만성 림프구 백혈병(chronic lymphoid leukemia, CLL), 모발성 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 림포플라스마사이틱 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma) 및 다발성 골수종(multiple myeloma)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일구현예에서, 본 발명은 병리학에 있어서의 B 세포에 관여하는 자가면역 또는 항염증성 질병의 치료에 있어서의 용도를 위한 본 발명의 키메릭 항체 또는 인간화된 항체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 세포 집단으로부터 B 세포를 발현하는 CD37을 제거하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 환자에게 본 발명의 키메릭 또는 인간화된 항체에 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 B 세포 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL), B 세포 만성 림프구 백혈병(chronic lymphoid leukemia, CLL), 모발성 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 작은 림포플라스마사이틱 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma) 및 다발성 골수종(multiple myeloma)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 B 세포 악성 종양을 격고 있는 환자를 치료하는 방법이다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 키메릭 또는 인간화된 HH1은 방사성 표지되거나 또는 면역독소 버전의 뮤린, 키메릭 또는 인간화된 HH1을 이용한 치료 이전에 환자에게 투여되어, 정상 조직 세포를 막고 종양 흡수를 개선시킨다.

약물투여량은 정상 조직 흡수를 방해하기에 충분하여야 하고, 투여량이 종양 흡수를 줄일 정도로 과도하여서는 안된다. 예컨대, 키메릭 또는 인간화된 HH1은 환자당 0 mg, 5 mg 및 1 g의 투여량으로 제공되어야 한다.

예컨대, 약물투여는 방사성 면역결합제의 투여 전, 예컨대 일주일 전 및/또는 1-5 시간 전에 제공될 수 있다.

키트

본 발명의 일양태에서, 본 발명은 두 개 이상의 바이알(vial)을 포함하는 방사성 면역결합제의 생산용 키트로서, 여기서 하나의 바이알은 뮤린 모노클로날 항체 HH1에 결합하는 킬레이터를 포함하는 결합제를 포함하고, 두 번째 바이알은 방사성핵종을 포함한다.

키트는 일부 절차, 예컨대, 투입 전에 방사성 표지 및/또는 정제가 수행될 필요가 있다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 본 발명의 키트는 하나 또는 다수의 바이알이 감압하에 동결건조되거나 또는 용액에서 존재한다.

방사성 면역결합제를 생성시키기 위하여 두 개의 바이알의 함량을 혼합함으로써, 최종 생성물이 나타날 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구현예에서, 방사성 면역결합제는 두 개의 바이알의 함량을 혼합함으로써 생성된다.

상기 생성물은 사용 이전에 정제를 필요로 할 수 있다.

본 명세서에 기재된 구현예 및 특징은 또한 본 발명의 다른 양태에 적용된다는 것은 자명하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 마우스 모노클로널 항체 HH1 유래의 키메릭 또는 인간화된 항체를 제공한다.

(b) 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 방사성면역결합제를를 포함하는 약제학적 조성물이 B 세포 악성종양을 치료하기는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 Daudi 세포의 통문(gating)에 대한 유세포 분석기 점 그래프; 항-CD37 chHH1.1(IgG1 아이소타입) 및 항-NIP 항체(음성 대조군)의 무결합에 대한 히스토그램을 나타낸 도이다. 도 1은 유의성 있는 chHH1 항원 결합을 나타낸다.
도 2는 Daudi 림프종 세포의 chHH1.1의 세포성 결합을 나타낸 도이다. 이것은 타겟에 빠르고 효율적인 결합을 나타낸다.
도 3은 소수의 항원 chHH1.1이 리툭시맙(rituximab)과 유사한 ADCC를 갖는다는 것을 나타낸 도이다.
도 4는 효과기 세포로서 IL-2로 자극 받은 PBMC 및 타겟 세포로서의 REC-1 세포를 갖는 ADCC를 타겟 세포에 대해 3가지 다른 비율로 나타낸 도이다.
도 5는 뮤린 HH1, 리투시맙(rituximab)으로 표지된 Rec-1 세포에 대한 3가지 개체로부터의 10% 혈청을 갖는 CDC를 나타낸 도이다.
도 6은 주입한 지 24시간 및 48시간 후 암컷 누드 마우스에서 ¹²⁵I-chHH1.3의 생물 분류(% I.D./g)를 나타낸 도이다.
도 7은 NK 세포를 갖는 Daudi 세포에서 ADCC에 의하여 특이적인 용해 백분율을 나타낸 도이다. 혈액을 두 개체로부터 취득하였고 하나의 실험을 1 Daudi 세포당 10개의 NK 세포의 비율로 수행하였고 다른 실험은 1 Daudi 세포당 15개의 NK 세포 비율로 수행하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 키메릭 항체의 생성

HH1 항체의 키메릭 버전은 V-영역 유전자를 위한 발현 벡터를 이용하여 제조되었다.

상기 벡터는 PCR에 의하여 수득된 V_H 및 V_L 사슬 유전자를 얻었다. 이후 V-영역 유전자를 시퀀싱을 수행하였고, 인간 IgG 항체 불변영역 유전자 (Cγ3, Cγ1 및 CH1γ3)를 포함하는 pLNOH2 내로 클로닝을 수행하기 전에 V-영역 유전자를 증폭하기 위하여 새로운 특이적 프라이머를 고안하였다.

불변영역 IgG1CH1(서열목록 제5서열), IgG1CH2(서열목록 제6서열) 및 IgG1CH3(서열목록 제7서열)을 포함하는 pLNOH2 벡터를 서열목록 제8서열로 나타내었다.

pLNOH2 벡터의 중쇄 및 경쇄(서열목록 제5서열) 및 pLNOκ를 조합하여 조합 벡터 pLNOH2 / κ aCD37를 제조하였다. 완전한 경쇄 유전자(서열목록 제9서열), CMV 프로모터 및 αCD37의 폴리A 시그널을 pLNOH2 hIgG1 αCD37로 서브클로닝을 수행하였다.

조합 벡터에서, 중쇄 및 경쇄를 자신의 CMV 프로모터로부터 발현하였다.

불변영역의 확인

pLNOH2 서열에서의 불변영역을 IMGT 데이터베이스(접근번호: Z1370)에서 인간 IgG1의 서열로부터 확인하였다.

chHH1 항 CD-37 항체의 가변영역의 유전자 및 단백질 서열을 하기와 같이 나타내었다.

VH αCD37(아미노산 서열: 서열목록 제1서열 및 핵산 서열: 서열목록 제2서열)

핵산서열(서열목록 제2서열)

gagatccagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaaggtatcctgcaaggcttctggttactcattcactgactacaacatgtactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggatatattgatccttacaatggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgttgacaagtcctccagcacagccttcatccatctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatccccttatggtcactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca

아미노산 서열(서열목록 제2서열):

EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMYWVKQSHGKSLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAFIHLNSLTSEDSAVYYCARSPYGHYAMDYWGQGTSVTVSS

VL αCD37(아미노산 서열: 서열목록 제3서열 및 핵산 서열: 서열목록 제4서열)

핵산 서열(서열목록 제4서열)

gacattgtgatgacccagtctcacaaactcttgtccacatcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgagtactgctgtagactggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaactactgattaactgggcatccacccggcacactggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagtatgcaggctgaagacctggcactttattactgtcgacaacattatagcactccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa

아미노산 서열(서열목록 제3서열):

DIVMTQSHKLLSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVDWYQQKPGQSPKLLINWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSMQAEDLALYYCRQHYSTPFTFGSGTKLEIK

실시예 2. 항원 결합의 평가를 위한 유세포 분석(flow cyrometry)

Daudi 세포를 발현하는 CD37에 결합하는 hchIgG1 ααCD37 b(chHH1)의 분석

세포 염색 및 세포 고정

구축된 chHH1을 유세포 분석기에 의하여 표적 결합에 대하여 분석하였다. Daudi 세포는 CD37을 발현하고, 상기 세포를 chHH1 또는 hIgG1 αNIP로 염색하였다. 왼쪽 패널에서 손상되지 않은 Daudi 세포를 선별하였고, 오른쪽 패널에서 상기 세포의 형광 히스토그램을 도 1에 나타내었다: CD37을 발현하는 Daudi 세포(고체형 세포주)에 결합하는 chHH1(실선) 및 키메릭 αNIP IgG₁₍점선).

실시예 3. 키메릭 HH1의 방사성 표지(radiolabeling)

요오드화(Iodination)

항체를 IODOGEN 전-코팅 요오드화 튜브(Pierce, Rockford, IL)를 제조자의 매뉴얼에 따라 간접적인 요오드화를 통해서 ¹²⁵I을 이용하여 표지하였다.

¹ ¹¹ In 및 ¹⁷⁷ Lu을 이용한 표지

항체를 먼저 킬레이터(p-SCN-Bn-DTPAorp-SCN-Bn-DOTA)와 반응시켰다.

DTPA 또는 DOTA 킬레이터를 0.05 M HCl에 용해시켰고, 이후 항체를 첨가하였다. 상기 항체를 5:1 비율의 탄산염으로 세척함으로써 약 pH8.5로 pH를 조절하였다. pH를 다시 체크하였고, 필요하면 다시 pH를 조절하였다. 상기 용액을 상온에서 60분 동안 교반하였고, 이후 상기 반응을 200 mM 글라이신 용액(항체당 mg) 50 를 첨가함으로써 종결시켰다.

자유 킬레이터를 제거하기 위하여, 항체를 4-5번 PBS(PAA)로 세척하였고, 이후 암모늄 아세테이트로 세척함으로써 pH5로 조절하였다. 이후, ¹¹¹In 또는 ¹⁷⁷Lu(Perkin Elmer, Boston, Ma, USA)를 0.5 mg DOTA-Ab에 첨가하였고, 42℃에서 한 시간 동안 교반하였다.

마지막으로, 생성물을 젤 여과 칼럼, 예컨대, Sephadex G-25 PD10 (GE health) 또는 유사 칼럼 상에서 용출(elution)에 의하여 정제하였다. 전반적인 표지 수율은 17 % 내지 63 %의 범위로 다양하였다.

방사성 면역결합제(radioimmunoconjugate)의 품질을 림프종 세포 및 변형 린드모 방법(modified Lindmo method)를 이용하여 측정하였다(실시예 4).

실시예 4. 면역반응성(Immunoreactivity)

배경

면역반응성 분석을 항원-양성적 표적 세포에 결합하는 항체의 능력을 측정하기 위하여 이용하였다.

방법

약 0.3 ml에서 5, 10, 40, 100 및 300 세포(백만 세포 / ml)의 두 개의 벼행 실험을 이용하였다.

튜브의 절반에 0.5 mg/ml의 농도가 되도록 비표지된 항체를 첨가하였고, 항원을 블로킹하기 위하여 15 분 동안 배양하였다. 이후, 5-20 ng/ml의 방사성 면역결합제를 모든 튜브에 첨가하였고, 상기 현탁액을 약 2 시간 동안 쉐이커를 이용하여 4℃에서 배양하였다.

이후 모든 튜브를 원심분리하였고, 상등액을 제거하고 카운팅(counting)을 위하여 저장하였다. 펠렛을 1 ml PBS로 리서스펜션(resuspension)을 수행하였고 원심분리하였다. 상기 세척 절차를 두 번 반복 하였고, 상등액을 수득하였다. 펠렛 또는 수득된 상등액을 포함하는 튜브를 감마 카운터(gamma counter) 상에서 그 수를 세었다.

특이적 결합 활성(specific bound activity)을 다음을 이용하여 계산하였다:

블로킹되지 않은 펠렛 수(Pellet counts nonblocked, PCN), 조합된 상등액 수(combined supernatant counts, CSC) 및 각각의 샘플에 전체 적용(total applied, TA).

특이적 결합(Specific binding, SB)은 하기와 같이 계산하였다:

[SB = (PCN/TA) (블로킹된 (PCN/TA)) ]

SB값을 각각의 세포 농도를 위하여 계산하였고, 2중역비례선(double reciprocal plot)으로 함수를 구하고, 무한 항원 접근(infinite antigen access)에서 면역반응성 분획물을 린드모의 문헌(Lindmo et al., J Immunol Methods. 1984 Aug 3;72(1):77-89)에 기재된 방법에 따라 측정하였다.

실험결과

⁷⁷Lu로 표지된 키메릭 HH1의 두 배치(batch)의 측정은 48.1% 및 84.5%의 면역반응성를 나타내었다. ¹²⁵I로 표지된 키메릭 HH1의 하나의 배치는 67.6%의 면역반응성을 주었다. 결론적으로, 상기 실험데이터는 뮤린 HH1에서 전형적으로 발견되는 것과 유효한 일치성을 나타내고, 키메릭 HH1은 연관된 항원-표지화 능력을 갖는다는 것을 보여주었다.

실시예 5. In vitro에서 종양 세포에의 결합

서론

결합 어세이를 chHH1의 결합 평형상수(equilibrium binding constant, K_d), Daudi 세포 상의 평균 항원 수(B_max) 및 chHH1의 결합율 상수(k_a)를 측정하기 위하여 수행하였다(Dahleetal., 2007).

실험재료 및 방법

chHH1를 ¹²⁵I을 이용하여 표지하였다(실시예 3). 04. ml 배지에서 5oo만개 세포/ml를 튜브에 서스펜션을 수행하였다. 하나의 병행실험의 세포들을 ¹²⁵I로 표지된 chHH1을 첨가하기 전에 0.5mg/ml의 비표지된 chHH1으로 15분 동안 블로킹을 수행하였다. 다른 하나의 병행실험의 세포들은 블로킹을 하지 않았다. 두 병생실험 세포들을 100, 1000, 5000 및 10000 ng/ml의 ¹²⁵I-HH1과 같이 배양하였다. 상기 세포들을 5분, 10분, 20분, 30분, 1시간, 1.5시간 및 2시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS 및 5% 우태혈청(fetal calf serum)으로 세척하였다. 세포, 상등액 및 세척액을 감마 카운터에서 그 수를 세었다. 상기 실험을 세 번 반복하였다.

실험결과

전형적인 결합 곡선을 도 2에 나타내었다. chHH1의 K_d는 3.0 ± 0.3, Daudi 세포의 B_max는 330000 ± 4000 (항원/세포)이었고, chHH1의 k_a는 0.36 ± 0.03 nM/h이었다. 상기 실험데이터는 뮤린 HH1(K_d= 2.7 ± 0.3, B_max= 340000 ± 5000 CD37 (항원/세포) 및 k_a=0.72 ± 0.03 nM/h)와 유사하였다.

실시예 6. 마우스에서 생물분류(Biodistribution) 및 종양 표적화

¹⁷⁷Lu로 표지된 키메릭 HH1의 생물분류를 수컷 누드 Balb/C 마우스에서 연구하였다.

실험재료 및 방법

방사성 표지를 항체에 방사성핵종과 복합체를 형성하는 이기능(bifunctional) 킬레이팅 시약으로서 p-SCN-Bn-DOTA를 이용하여 수행하였다(실시예 3 참조). 제조방법은 각각의 동물에 꼬리정맥으로 100 을 주사에 의하여 투입되었다.

21-25 g의 체중량을 갖는 수컷 누드 Balb/C 마우스를 이용하였다. 120 kBq의 활성을 각각의 동물에 주입하였다. 다섯 마리의 동물을 각각의 시점에 이용하였다.

부검(Autopsy)을 주입 후 다양한 시점에서 경추 파열법(cervical dislocation)의 시행 후 수행하였다. 각각의 조직 샘플의 중량을 측정하였고, ¹¹¹In을 눈금이 매겨진 감마 디텍터((Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA)dp 의하여 측정하였다. 주입물 샘플을 측정 절차에 대한 참고문헌들에 따라 이용하였다.

실험결과

주입 후 1시간, 20시간 및 6일째에 ¹⁷⁷Lu-표지된 키메릭 HH1의 생물분류를 하기 표 1에 나타내었다.

¹⁷⁷Lu-표지된 키메릭 HH1의 생물분류

조직	1시간	20시간	6일
혈액	25.0 ± 2.9	15.2 ± 1.0	8.9 ± 3.5
폐	7.0 ± 1.1	5.2 ± 0.9	2.9 ± 0.7
심장	7.8 ± 0.8	5.8 ± 1.5	3.0 ± 1.0
간	10.8 ± 2.3	4.9 ± 0.1	3.9 ± 0.2
비장	9.6 ± 3.4	4.7 ± 0.2	4.8 ± 1.1
신장	8.0 ± 1.6	5.0 ± 0.4	3.3 ± 1.0
대퇴골	4.5 ± 2.4	2.8 ± 0.6	1.7 ± 0.3
위장	1.3 ± 0.5	1.0 ± 0.3	1.0 ± 0.5
소장	3.1 ± 0.7	1.7 ± 0.1	1.3 ± 0.3
대장	1.4 ± 0.3	1.4 ± 0.2	0.9 ± 0.2
뇌	0.7 ± 0.1	0.3 ± 0.3	0.3 ± 0.1

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실험데이터는 상기 항체가 방사성 표지된 리툭시맙(rituximab)으로 관찰된 것과 유사하게 연관된 생물분류를 갖는다는 것을 보여준다(Dahleetal,2006NuclMedBiol,33,271-279). 결론적으로, 방사성 표지된 키메릭 HH1의 생물분류는 상기 항체가 in vivio 이용에 있어서 연관된 특성을 갖는다는 것을 나타낸다.

실시예 7. 유세포 분석기 생존능력 측정을 이용한 in vitro ADCC 어세이

배경

키메릭 HH1 항체의 ADCC 특성을 NK 세포(Natural killer cell) 및 Daudi 림프종 세포를 이용하여 평가하였다.

실험방법

인간 혈액을 자원자로부터 수득하였고 Lymphoprep^TM및 다이나비드(Dynabead)를 이용하여 처리하였고 분리된 NK 세포를 수득하였다. Daudi 세포를 DiOC18을 이용하여 처리하여 세포를 염색하였다.

Daudi 표적 세포를 37℃에서 30분 동안 배양함으로써 DiOC18 / 106 (표적세포/ml)로 표지하였다. 세포를 PBS를 이용하여 2번 세척하였고, 세포배양 배지에서 1ml로 리서스펜션을 수행하였다.

DiOC18로 처리된 Daudi 세포를 키메릭 HH1을 첨가함으로써 또는 비교물질인 10 μg/m의 리툭시맙으로 항체로 표지하였고, 비결합된 항체를 제거하기 위하여 원심분리 및 리서스펜션 전에 얼음에서 15분 동안 배양하였다.

다양한 양의 NK 세포를 4x10⁵/ml(40:1), 2x10⁵/ml(20:1), 1x10⁵/ml(10:1) 및 5x10⁴/ml(5:1)의 농도가 되도록 희석하였다. 세포 배양배지에서, 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide, PI) 대조염색을 준비하여, 40μL의 PI/ml의 배양배지를 첨가하여 대조염색 용액을 만들었다.

표지된 Daudi 세포를 배양 배지에서 10⁴/ml로 희석하였다. 상기 어세이를 50 μL의 효과기 및 50 μL의 Daudi 세포를 반응 튜브내에 혼합함으로써 시작하였다. 반응 튜브에 50 μL의 PI 용액을 첨가하였다. 37℃에서 2시간 배양 후, 생존한 Daudi 세포의 백분율을 유세포 분석기를 이용하여 평가하였다.

Daudi 세포의 chHH1 11 %가 ADCC에 의하여 죽는 반면, 리툭시맙 15%의 세포는 ADCC에 의하여 죽었다. ADCC의 유도 백분율은 2개의 항체에 대하여 유의하게 다르지 않았다(도 3 참조).

실시예 8. IL-자극된 PBMC를 이용한 In vitro ADCC 세포 어세이

배경

mAb HH1의 뮤린 및 키메릭 버전의 ADCC 활성을 Cr51 방출 어세이에 의하여 평가하였다.

실험재료 및 실험방법

항체 의존성 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)을 매개하는 뮤린 HH1 및 키메릭 HH1의 능력을 Daudi 세포 및 IL-2 자극성 인간 PBMC를 효과기 세포로서 이용하여 평가하였다.

Daudi 세포(인간 버키트 림프종 세포주)를 10% 열-불활성화된 소태아 혈청(fetal bovine serum), 1 mM 피르브산 나트륨, 2 mM L-글루타민 및 1% Pen/Strep로 보충된 RPMI-1640을 이용한 조직 배양 플라스크(175 cm²)에서 배양하였다.

배양을 새로운 배양 배지를 일주일에 2-3번 계대배양에 의하여 3×10⁵및 1.5×10⁶/ml 사이의 농도로 유지하였다. 0.5×10⁶/ml 및 1.0×10⁶/ml 사이의 세포 밀도에서 세포 배양의 부분표본을 5분 동안 1200 RPM에서 원심분리를 하였다. 세포를 세척 완충액(DPBS with 2 % FCS) 및 펠렛을 이용하여 한번 세척하였다. 세포 펠렛을 어세이 배지[RPMI w/HEPES, 10% FCS]에서 리서스펜션을 하였고, 세포 수를 결정하였다. 세포 농도를 크롬(chromium)-51을 이용한 표지를 이용하여 1×10⁶/ml로 조절하였다.

EDTA 유리 상에 끌린 건강한 기부자로부터 수득된 대략 30-50 ml의 전체 혈액을 PBMC의 분리를 위하여 이용하였다. 전체 혈액을 50 ml 튜브에서 DPBS를 이용하여 1:1로 희석하였다(Hanks' Balanced Salt Solution w/o calcium and magnesium).

희석된 전체 혈액을 Lymphoprep^TM(Medinor)의 최상 부분에 50 ml 튜브에서 2:1의 비율로 쌓아 놓았고, 느린 제동으로 20분 동안 1000×g에서 원심분리를 하였다.

인터페이스로부터 수득된 단핵세포를 흡입하였고 DPBS로 두 번 세척하였다(300×g, 10 min).

펠렛으로된 세포를 배양 배지(10% 열-불활성화된 소태아혈청이 포함된 RPMI-1640, 1% Pen/Strep)에서 피펫을 이용하여 부드럽게 리서스펜션을 하였고 세포 수를 세포 카운터에서 측정하였다.

PBMC 농도를 5×10⁵/ml로 조절하였고 25ng/ml IL-2(eBiosciences)로 보충된 배양배지에서 유지지하였고, 37℃, CO₂ 배양기에서 3일 동안 6웰 배양 디쉬에서 배양하였다. IL-2로 자극된 PBMC를 수득하였고, 카운팅을 하였으며, 1.5×10⁶/ml의 농도의 어세이 배지[RPMI w/HEPES, 10% FCS]에서 리서스펜션을 수행하였다.

1×10⁶의Daudi 세포를 1시간 동안 37℃에서 1ml의 부피로 3,7 MBq의 크롬-51을 이용하여 표지하였다. 표지된 세포를 2 % FCS를 이용한 DPBS에서 원심분리법(2000 rpm, 5 분)에 의하여 3번 세척하였다.

표적 세포를 이용한 효과기 세포의 공배양을 96웰 라운드-바닥 마이크로티터 플레이트에서 최종 부피가 200 μl가 되도록 3개의 복제체에서 수행하였다.

처음의 100 μ의 부피에서 10000 표적 세포를 어세이 배지에서 플레이팅을 수행하였고, 이후 서로 다른 농도에서 100 μ의 부피에서 효과기 세포로 효과기:표적 비율을 달성하였다.

대조군으로, 표적 세포를 어세이 배지에서 단독으로 배양(spontaneous lysis)하거나 또는 1% 트리톤(Triton) X-100으로 보충된 어세이 배지(maximal lysis)에서 배양하였다.

공배양물을 37℃, 건조한 CO₂배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 세포독성 효과를 상등액으로의 Cr-51 방출에 의하여 측정하였다. 배양 말기에서, 세포를 원심분리(1500 rpm, 5 min)에 의하여 배양 배지로부터 상온에서 제거하였다. 세포가 없는 상등액(100 μl/well)을 96웰에 상응하는 0.2 ml 마이크로 튜브로 옮겼다. Cr-51 방출량을 Packard Cobra II 감마 카운터에서 카운팅을 수행함으로써 측정하였다.

실험결과

상기 실험의 결과들을 하기 표 2에 나타내었다.

효과기 대 표적 비율	키메릭 HH1(% 용해)		뮤린 HH1(% 용해)
효과기 대 표적 비율	평균	범위	평균	범위
40:1	159.2%	122.6-208.9%	106.5%	99.4-111.8%
10:1	177.9%	133.8-235.5%	105.5%	100.7-111.3%

3개의 개체로부터의 효과기. 데이터는 100%로 선택된 항체 없이 측정된 세포 용해에 대하여 노말화되었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 키메릭 HH1으로 전처리된 Daudi 세포의 용해는 모든 3개의 혈액 제공자에 대하여 유의하였다.

소결

in vitro에서 인간의 PBMC를 이용하여 분석하였을 경우, 키메릭 HH1은 n vitro 림프종의 세포 용해의 관점에서 유의한 ADCC를 야기하는 반면에, 뮤린 HH1은 아무 처리도 하지 않는 것과 비교하여 유의한 세포 용해를 전혀 나타내지 못한다.

실시예 9. 키메릭 및 뮤린 HH1 사이의 결합 비교

키메릭 HH1은 항원 및 에피토프 결합 능력을 보유하는 지를 평가하기 위하여, 세포를 키메릭 및 뮤린 HH1으로 포화시켰고 이후 방사성 표지된 HH1의 결합을 블로킹하기 위한 능력을 평가하였다.

실험재료 및 실험방법

Daudi 세포의 현탁액을 각각의 튜브에 0.2 ml의 PBS에 1.7 백만개의 세포로 6 튜브에 배분하였다. 튜브 1 및 2는 블로팅이 되지 않은채로 유지하였고, 튜브 3 및 4는 5 에서 3 의 HH1을 첨가함으로서 블로킹을 하였으며, 튜브 5 및 6은 5 에서 3 의 키메릭 HH1을 첨가하였다.

튜브를 10분 동안 배양하였고, 이후 2 ng의 ¹²⁵I로 표지된 HH1을 첨가하였고 추가로 40분 동안 상온에서 세포 쉐이커를 이용하여 배양하였다.

각각의 튜브에서 전체 활성을 LKB 감마 카운터를 이용하여 측정하였고 이후 세포를 0.5% BSA 및 1 mM DTPA를 포함한 1 ml PBS로 3번 세척하였다. 최종 펠렛을 세포에 결합된 활성을 측정하기 위하여 방사성 활성을 카운팅하였다.

실험결과

블로킹이 되지 않는 세포는 42.7%의 활성(42.7%-42.7%의 범위)을 보유한다는 것을 확인하였다. HH1으로 블로킹을 한 세포는 1.6%의 활성(1.4%-1.8%의 범위)을 보유하였다. 키메릭 HH1으로 블로킹을 한 세포는 1.3%의 활성(1.1%-1.5%의 범위)을 보유하였다.

결론적으로, 방사성 표지된 뮤린 HH1의 결합은 키메릭 HH1으로 아주 효과적으로 블로킹되고, 뮤린 HH1을 이용한 블로킹 효과와 동일하였다. 이것은 항원 및 에피토프 결합 능력이 HH1의 키메릭 버전에서 유지된다는 것을 나타낸다.

또한, 이것은 HH1의 방사성 면역결합제 또는 면역독소 버전을 이용한 치료 전에 키메릭 HH1이 정상 조직에서 CD37 항원을 블로킹하기 위한 전처리로서 유용할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 10. 표적 세포로서 REC-1 세포를 갖는 chHH1.1를 위한 ADCC

실험재료 및 실험방법

혈액을 3 명의 건강한 개인으로부터 EDTA 유리에 수득하였고 말초혈액 단액세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)의 분리를 위하여 이용하였다. 전체 혈액을 DPBS(DPBS, Hyclone, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 50 ml 튜브에서 1:1로 희석하였다. 희석된 전체 혈액을 Lymphoprep(Medinor, Norway)의 최상 부위에 50 ml 튜브에 2:1의 비율로 놓았고, 1000×g로 20분 동안 느린 제동으로 원심분리를 하였다.

인터페이스로부터 단핵세포를 흡입하였고, DPBS로 두 번 세척하였다(300×g, 10 min). 펠렛 세포를 부드럽게 배양 배지(10% 열-불활성화된 소태아 혈청이 포함된 RPMI-1640)에서 리서스펜션을 피펫을 이용하여 수행하였고 세포 수를 세포 카운터에서 측정하였다. PBMC를 25 ng/ml의 인간 재조합 IL-2(eBiosciences)를 이용하여 3일 동안 자극하였다.

Rec-1 맨틀 세포 림프종 세포(LG Standards, Boras, Sweden)를 세포독성 어세이에서 표적 세포로 이용하였다. 상기 세포를 조직 배양 플라스크(175 cm²)에서 10% 열-불활성화된 소태아 혈청(PAA,ThermoScientific,USA)이 포함된 RPMI-1640(Hyclone, ThermoScientific, USA)를 이용하여 배양하였다.

세포 펠렛을 어세이 배지(RPMI, 10% FCS)에서 리서스펜션을 수행하였고 세포 수를 측정하였다. 세포 농도를 크롬-51을 이용하여 표지하기 위하여 5×10⁶/ml로 조절하였다.

5×10⁶세포를 37°C에서 1 ml의 부피로 3,7 MBq 크롬-51(PerkinElmer, Netherlands)를 이용하여 표지하였다. 표지된 세포를 20 μg/ml의 뮤린 HH1; 20 μg/ml의 리툭시맙; 20 μg/ml chHH1.1(IgG1 아이소타입); 또는 항체가 전혀 없는 대조군을 포함하는 20 μg/ml의 리툭시맙 및 20 μg/ml chHH1.1의 조합의 결합을 위하여 동일 부피로 나누었다. 모든 샘플을 37℃에서 10분 동안 배양하였고, DPBS에서 2% FCS로 원심분리(2000 rpm, 5분)에 의하여 2번 세척하였다.

효과기 세포를 96웰 라운드-바닥 마이크로티터 플레이트에서 40:1, 20:1 또는 10:1의 비율로 최종 부피가 200 μl가 되도록 표적 세포를 이용하여

배양하였다. 처음의 100 μ의 부피에서 10000 표적 세포를 어세이 배지에서 플레이팅을 수행하였고, 이후 100 μl 부피의 인간 PBMC로 플레이팅을 수행하였다. 대조군으로, 표적 세포를 어세이 배지에서 단독으로 배양(spontaneous lysis)하거나 또는 1% 트리톤(Triton) X-100으로 보충된 어세이 배지(maximal lysis)에서 배양하였다.

모든 샘플을 3개의 복제체에서 수행하였다. 공배양물을 37℃, 건조한 CO₂배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 세포독성 효과를 상등액으로의 Cr-51 방출에 의하여 측정하였다. 배양 말기에서, 세포를 원심분리(1500 rpm, 5분)에 의하여 배양 배지로부터 상온에서 제거하였다. 세포가 없는 상등액(100 μl/웰)을 96웰에 상응하는 0.2 ml 마이크로 튜브로 옮겼다. Cr-51 방출량을 감마 카운터(CobraII, Packard, land)에서 카운팅을 수행함으로써 측정하였다.

특이적 용해 백분율(%)을 하기 방정식으로 계산하였다:

[100 x (실험적 방출 자발적 방출) / (실험적 방출 자발적 방출)]

실험적 방출은 복제체의 샘플 처리의 평균값이 된다. 자발적 방출 및 전체 방출에 대한 3개 복제체 샘플을 각각의 항체 처리군에 대하여 수행하였고, 평균값을 각각의 항체 처리의 실험적 샘플을 위하여 이용하였다.

실험결과

도 4에 나타낸 바와 같이, chHH1.1는 Rec-1 세포에서 ADCC에 의한 특이적 용해를 유도하는데 있어서 리툭시맙과 동일하게 유효하였고, 뮤린 HH1 보다 약간 더 효과적이었다. chHH1 및 리툭시맙의 조합은 두 개의 항체 단독 처리 보다 약간 더 특이적 용해를 보여주었다.

소결

ADCC는 Rec-1 세포에서 chHH1.1에 대한 활성 작용 메커니즘이다. 리툭시맙 및 chHH1.1을 이용한 조합 처리는 항체 단독 보다 약간 더 높은 ADCC를 보여주었다.

실시예 11. 표적 세포로서 REC-1 세포를 갖는 chHH1.1를 위한 CDC

실험재료 및 실험방법

혈액을 3명의 개인으로부터 수득하였고 혈청을 원심분리에 의하여 분리하였다. Rec-1 맨틀 세포 림프종 세포(LG Standards, Boras, Sweden)를 세포독성 어세이에서 표적 세포로 이용하였다. 상기 세포를 조직 배양 플라스크(175 cm²)에서 10% 열-불활성화된 소태아 혈청(PAA, ThermoScientific, USA)이 포함된 RPMI-1640(Hyclone, ThermoScientific, USA)를 이용하여 배양하였다.

표적 세포를 96웰 라운드-바닥 마이크로티터 플레이트에서 최종 부피가 200 μl가 되도록 표적 세포를 이용하여 배양하였다. 대조군으로, 표적 세포를 어세이 배지에서 단독으로 배양(spontaneous lysis)하거나 또는 1% 트리톤(Triton) X-100으로 보충된 어세이 배지(maximal lysis)에서 배양하였다.

특이적 용해 백분율(%)을 하기 방정식으로 계산하였다:

실험결과

도 5에 나타낸 바와 같이, chHH1.1는 CDC 메커니즘 단독으로 작용하지 않지만, chHH1.1 및 리툭시밥은 모두 리툭시맙 및 chHH1.1 단독으로 첨가된 효과 보다 특이적 용해에 대하여 더 큰 효과를 가지고 있었다.

소결

CDC는 chHH1.1 단독에 대한 활성 작용 메커니즘이 아니다. 그러나, chHH1.1 및 리툭시맙을 이용한 병용 처리는 시너지 효과를 보여주었다.

실시예 12. ¹²⁵ I-chHH1.3의 라모스(Ramos) 세포에의 결합

실험재료 및 실험방법

아이소타입 IgG3(chHH1.3) 및 뮤린 HH1(mHH1)을 요오드화 튜브(Pierce, UK)로 제조자의 매뉴얼에 따른 간접적인 요오드화를 이용하여 ¹²⁵I로 형광 표지하였다. 한 실험에서, 20mg의 chHH1.3 또는 mHH1로 블로킹을 하였고, 비특이적 결합을 측정하기 위하여 ¹²⁵I-chHH1.3로 방사성 표지를 하였다.

또 다른 실험에서, 라모스 세포를 20 mg chHH1.3, mHH1 또는 chHH1.1로 블로킹을 수행하였고, 이후 비특이적 결합을 측정하기 위하여 ¹²⁵I-mHH1으로 방사성 표지를 하였다. 블로킹되지 않은 세포에 대한 결합은 두 실험 보두에서 전체 결합을 측정하기 위하여 이용되었다.

돌연변이 전장 중쇄를 갖는 DNA chHH1.3 Fc 서열은 서열목록 제10서열로 나타낼 수 있다.

돌연변이 전장 중쇄를 갖는 chHH1.3 Fc의 아미노산 서열은 서열목록 제11열로 나타낼 수 있다.

돌연변이 전장 중쇄를 갖는 DNA chHH1.3 Fc 서열은 서열목록 제12서열로 나타낼 수 있다.

돌연변이 전장 중쇄를 갖는 chHH1.3 Fc의 아미노산 서열은 서열목록 제13서열로 나타낼 수 있다.

돌연변이가 없는 chHH1.3 Fc의 서열(불변영역)은 서열목록 제14서열로 나타낼 수 있다.

실험결과

블로킹을 하지 않은 라모스 세포를 ¹²⁵I-chHH1.3를 이용하여 형광 표지한 경우, 전체 결합은 81%였고, 라모스 세포를 ¹²⁵I-mHH으로 방사성 표지를 하였을 경우, 전체 결합은 77%였다. 그러나, chHH1.3 또는 mHH1으로 블로킹된 세포를 ¹²⁵I-chHH1.3으로 방사성 표지를 하였을 경우, 비특이적 결합은 각각 0.8% 및 44%였다. 이것은 chHH1.3이 CD37 항원에 대하여 mHH1 보다 더 높은 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, chHH1.3, mHH1 또는 mHH1.1으로 블로킹이 된 세포를 ¹²⁵I- mHH1으로 방사성 표지를 한 경우, 비특이적 결합은 각각 0.3%, 0.5% 및 0.7%이었다. 이것은 3개의 항체가 CD37 항원의 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다.

라모스 세포에 대한 ¹²⁵I-chHH1.3 및 125I-mHH1의 결합

RIC	블로킹되지 않음	20 μg/ml의 차가운 항체로 블로킹
RIC	블로킹되지 않음	mHH1	chHH1.1	chHH1.3
²⁵I-chHH1.3	81 %	44 %	수행 안함	0.8 %
¹²⁵I-mHH1	77 %	0.5 %	0.7 %	0.3 %

소결

상기 실험결과는 mHH1, chHH1.1 및 chHH1.3이 CD37의 동일한 에피토프와 결합한다는 것을 나타내었다. 예상치 못하게, chHH1.3의 친화도는 mHH1에 대한 것 보다 더 높았다.

실시예 13. 누드 마우스에서 ¹²⁵ I-chHH1.3의 생물분류

실험재료 및 실험방법

아이소타입 IgG3(chHH1.3)을 이용한 키메릭 HH1을 요오드화 튜브(Pierce, UK)로 제조자의 매뉴얼에 따른 간접적인 요오드화를 이용하여 ¹²⁵I로 형광 표지하였다. 제조방법은 각각의 동물에 꼬리정맥으로 100 을 주사에 의하여 투입되었다. 600 kBq의 활성을 마우스당 주입하였다. 두 마리의 동물을 각각의 시점에 이용하였다.

부검(Autopsy)을 주입 후 다양한 시점에서 경추 파열법(cervical dislocation)의 시행 24시간 후 수행하였다. 각각의 조직 샘플의 중량을 측정하였고, 각각의 조직 샘플에서의 ¹²⁵I의 활성을 눈금이 매겨진 감마 디텍터((Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA)에 의하여 측정하였다. 주입물 샘플을 측정 절차에 대한 참고문헌들에 따라 이용하였다. 조직 g 당 주입된 투여량의 부패 수정 백분율(% I.D./g)를 각각의 시점에서 계산하였다.

실험결과

chHH1.3는 누드 마우스에서 연관된 생물분류를 나타내었다(도 6). 도 6은 암컷 누드 마우스에서의 ¹²⁵I-chHH1.3 의 생물분류(% I.D./g)를 나타낸다.

실시예 14. Daudi 세포에 대한 chHH1.3의 ADCC 및 CDC 활성

실험재료 및 실험방법

ADCC 및 CDC 실험을 CDC 어세이를 위하여 상업적으로 이용 가능한 혈청을 이용하는 것과 실시예 7에 설명된 것과 동일한 어세이를 이용하여, NK 세포의 분리 전에 25 ng/ml의 인간 재조합 IL-2(eBiosciences)를 이용하여 PBMC를 하룻밤 동안 자극하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 10 및 11에서 설명한 것과 동일한 절차를 이용하여 수행하였다. PBMC의 분리를 위하여, 혈액을 두 개체에서 EDTA 튜브로 뽑아내었다.

Daudi 림프종 세포(LG standards, Boras, Sweden) (target cells)를 세포독성 어세이에서 표적 세포로 이용하였다. 상기 세포를 조직 배양 플라스크(175 cm²)에서 10% 열-불활성화된 소태아 혈청(PAA,ThermoScientific,USA)이 포함된 RPMI-1640(Hyclone, ThermoScientific, USA)를 이용하여 배양하였다.

5×10⁶개의 Daudi 세포를 37°C에서 1 ml의 부피로 3,7 MBq 크롬-51(PerkinElmer, Netherlands)를 이용하여 표지하였다. 표지된 세포를 DPBS에서 2% FCS로 원심분리(2000 rpm, 5분)에 의하여 2번 세척하였다. 표지된 세포를 20 μg/ml의 뮤린 HH1; 20 μg/ml의 리툭시맙; 20 μg/ml chHH1.1(IgG1 아이소타입); 또는 항체가 전혀 없는 대조군을 포함하는 20 μg/ml의 리툭시맙 및 20 μg/ml chHH1.1의 조합의 결합을 위하여 동일 부피로 나누었다. 모든 샘플을 37℃에서 10분 동안 배양하였고, 이후 DPBS에서 2% FCS로 원심분리(2000 rpm, 5분)에 의하여 2번 세척하였다.

CDC 어세이를 위하여, Daudi 표적 세포를 96웰 라운드-바닥 마이크로티터 플레이트에서 최종 부피가 200 μl가 되도록 10% 및 30% 혈철을 이용하여 배양하였다.

ADCC를 위하여, NK 효과기 세포를 96웰 라운드-바닥 마이크로티터 플레이트에서 10:1(개체 1) 또는 15:1(개체 2) 비율로 최종 부피가 200 μl가 되도록 표적 세포를 이용하여 배양하였다.

모든 샘플을 3개의 복제체에서 수행하였다. 공배양물을 37℃, 건조한 CO₂배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 세포독성 효과를 상등액으로의 Cr-51 방출에 의하여 측정하였다. 배양 말기에서, 세포를 원심분리(1500 rpm, 5분)에 의하여 배양 배지로부터 상온에서 제거하였다. 세포가 없는 상등액(150 μl/웰)을 96웰에 상응하는 0.2 ml 마이크로 튜브로 옮겼다. Cr-51 방출량을 감마 카운터(CobraII, Packard, land)에서 카운팅을 수행함으로써 측정하였다.

특이적 용해 백분율(%)을 하기 방정식으로 계산하였다:

실험결과

도 7에 나타낸 바와 같이, chHH1.3 항체는 CDC 메커니즘에 의하여 Daudi B 림프종 세포에서 특이적 용해를 유도하지 못하였다. 그러나, chHH1.3 항체는 Daudi B 림프종 세포에서 특이적 용해에 대하여 현저한 효과를 나타내었다.

소결

CDC는 활성 작용 메커니즘이 아닌 반면에, ADCC는 Daudi 세포를 표적으로 이용하는 chHH1.3에 대한 활성 작용 메커니즘이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Nordic Nanovector AS <120> Chimeric Therapeutic Anti-CD37 Antibody HH1 <130> PI-140004 <150> US 61/569981 <151> 2011-12-13 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(119) <223> Anti-CD37 antibody VH <400> 1 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Ile His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Tyr Gly His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> gene <222> (1)..(357) <223> HH1 antibody VH <400> 2 gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacaaca tgtactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggatat attgatcctt acaatggtga tactacctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240 atccatctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatcccct 300 tatggtcact atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(107) <223> Anti-CD37 antibody VL <400> 3 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Leu Leu Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Asn Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 4 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> gene <222> (1)..(321) <223> HH1 antibody VL <400> 4 gacattgtga tgacccagtc tcacaaactc ttgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag actggtatca acagaaacca 120 ggacaatctc ctaaactact gattaactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatactctca ccatcagcag tatgcaggct 240 gaagacctgg cactttatta ctgtcgacaa cattatagca ctccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa a 321 <210> 5 <211> 294 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(294) <223> IgG1CH1 constant region <400> 5 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttg 294 <210> 6 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc 60 tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc 120 ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc 180 cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc 240 aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc 300 ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag 330 <210> 7 <211> 320 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(320) <223> IgG1CH3 constant region <400> 7 ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga 60 accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt 120 gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg 180 acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga 240 acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc 300 tctccctgtc tccgggtaaa 320 <210> 8 <211> 8778 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid <400> 8 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattaattg catgaagaat 180 ctgcttaggg ttaggcgttt tgcgctgctt cgcgatgtac gggccagata tacgcgttga 240 cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca 300 tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 360 gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 420 ttccattgac gtcaatgggt ggactattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 480 gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 540 cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 600 gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg 660 tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg 720 caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 780 ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctctctggct aactagagaa 840 cccactgctt actggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac ccaagctagc 900 ttggtaccgg gacctcacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc 960 tacaggtaag gggctcacag tagcaggctt gaggtctgga catatatatg ggtgacaatg 1020 acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tgcattccca ggtccaattg cagcagcctg 1080 gggctgagct tgtgaagcct ggggcttcag tgaagctgtc ctgcaaggct tctggctaca 1140 ccttcaccag ctactggatg cactgggtga agcagaggcc tggacgaggc cttgagtgga 1200 ttggaaggat tgatcctaat agtggtggta ctaagtacaa tgagaagttc aagagcaagg 1260 ccacactgac tgtagacaaa ccctccagca cagcctacat gcagctcagc agcctgacat 1320 ctgaggactc tgcggtctat tattgtgcaa gatacgatta ctacggtagt agctactttg 1380 actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcagg tgagttaacg tacgctagca 1440 agctttctgg ggcaggccag gcctgacctt ggctttgggg cagggagggg gctaaggtga 1500 ggcaggtggc gccagccagg tgcacaccca atgcccatga gcccagacac tggacgctga 1560 acctcgcgga cagttaagaa cccaggggcc tctgcgccct gggcccagct ctgtcccaca 1620 ccgcggtcac atggcaccac ctctcttgca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 1680 ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 1740 gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 1800 cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 1860 gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 1920 aacaccaagg tggacaagaa agttggtgag aggccagcac agggagggag ggtgtctgct 1980 ggaagccagg ctcagcgctc ctgcctggac gcatcccggc tatgcagccc cagtccaggg 2040 cagcaaggca ggccccgtct gcctcttcac ccggaggcct ctgcccgccc cactcatgct 2100 cagggagagg gtcttctggc tttttcccca ggctctgggc aggcacaggc taggtgcccc 2160 taacccaggc cctgcacaca aaggggcagg tgctgggctc agacctgcca agagccatat 2220 ccgggaggac cctgcccctg acctaagccc accccaaagg ccaaactctc cactccctca 2280 gctcggacac cttctctcct cccagattcc agtaactccc aatcttctct ctgcagagcc 2340 caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc 2400 gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc 2460 agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctcagc acctgaactc ctggggggac 2520 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 2580 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 2640 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 2700 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 2760 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 2820 aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag ggccacatgg acagaggccg gctcggccca 2880 ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa 2940 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 3000 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 3060 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 3120 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 3180 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 3240 ggtaaatgag tgcgacggcc ggcaagcccc cgctccccgg gctctcgcgg tcgcacgagg 3300 atgcttggca cgtaccccct gtacatactt cccgggcgcc cagcatggaa ataaagcacc 3360 cagcgctgcc ctgggcccct gcgagactgt gatggttctt tccacgggtc aggccgagtc 3420 tgaggcctga gtggcatgag ggaggcagag cgggtcccac tgtccccaca ctggcccagg 3480 ctgtgcaggt gtgcctgggc cccctagggt ggggctcagc caggggctgc cctcggcagg 3540 gtgggggatt tgccagcgtg gccctccctc cagcagcacc tgccctgggc tgggccacgg 3600 gaagccctag gagcccctgg ggacagacac acagcccctg cctctgtagg agactgtcct 3660 gttctgtgag cgcccctgtc ctcccgacct ccatgcccac tcgggggcat gcctagtcca 3720 tgtgcgtagg gacaggccct ccctcaccca tctaccccca cggcactaac ccctggctgc 3780 cctgcccagc ctcgcacccg catggggaca caaccgactc cggggacatg cactctcggg 3840 ccctgtggag ggactggtgc agatgcccac acacacactc agcccagacc cgttcaacaa 3900 accccgcact gaggttggcc ggccacacgg ccaccacaca cacacgtgca cgcctcacac 3960 acggagcctc acccgggcga actgcacagc acccagacca gagcaaggtc ctcgcacacg 4020 tgaacactcc tcggacacag gcccccacga gccccacgcg gcacctcaag gcccacgagc 4080 ctctcggcag cttctccaca tgctgacctg ctcagacaaa cccagccctc ctctcacaag 4140 ggtgcccctg cagccgccac acacacacag gggatcacac accacgtcac gtccctggcc 4200 ctggcccact tcccagtgcc gcccttccct gcagacggat ccactagtaa cggccgccag 4260 tgtgctggaa ttctgcagat atccatcaca ctggcggccg ctcgagcatg catctagagg 4320 gccctattct atagtgtcac ctaaatgcta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt 4380 ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 4440 ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 4500 gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 4560 atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct 4620 ggggctctag ggggtatccc cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 4680 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 4740 tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcggggca 4800 tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 4860 gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 4920 agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 4980 cggtctattc ttttgattta taagggattt tggggatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 5040 agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 5100 tggaaagtcc ccaggctccc caggcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt 5160 cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc 5220 atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc 5280 cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg 5340 ccgaggccgc ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc 5400 taggcttttg caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat tttcggatct gatcaagaga 5460 caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg 5520 cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg 5580 ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt 5640 ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg 5700 gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat 5760 tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat 5820 ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg 5880 accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg 5940 atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc 6000 tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc 6060 cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg 6120 tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg 6180 gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca 6240 tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac 6300 cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga 6360 aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga 6420 tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 6480 ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc aaattctagt 6540 tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc 6600 tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 6660 attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 6720 agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 6780 tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 6840 tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 6900 tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 6960 aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 7020 tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 7080 tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 7140 cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 7200 agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 7260 tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 7320 aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 7380 ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 7440 cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 7500 accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 7560 ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 7620 ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 7680 gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 7740 aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 7800 gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 7860 gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 7920 cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 7980 gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 8040 gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 8100 ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 8160 tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 8220 ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 8280 cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 8340 accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 8400 cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 8460 tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 8520 cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 8580 acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 8640 atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 8700 tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 8760 aaagtgccac ctgacgtc 8778 <210> 9 <211> 319 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg 60 aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg 120 gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag 180 caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 240 acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag 300 cttcaacagg ggagagtgt 319 <210> 10 <211> 1479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric <400> 10 gaattcgccg ccaccatggg atggagctgt atcatcctct tcttggtagc aacagctaca 60 ggtgtccact ccgagatcca gctgcagcag tctggacctg agctggtgaa gcctggggct 120 tcagtgaagg tatcctgcaa ggcttctggt tactcattca ctgactacaa catgtactgg 180 gtgaagcaga gccatggaaa gagccttgag tggattggat atattgatcc ttacaatggt 240 gatactacct acaaccagaa gttcaagggc aaggccacat tgactgttga caagtcctcc 300 agcacagcct tcatccatct caacagcctg acatctgagg actctgcagt ctattactgt 360 gcaagatccc cttatggtca ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 420 gtctcctcag ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 480 acccctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660 acccagacct acacctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 720 gttgagctca aaaccccact tggtgacaca actcacacat gcccacggtg cccagagccc 780 aaatcttgtg acacacctcc cccatgccca cggtgcccag cacctgaact cctgggagga 840 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggataccc ttatgatttc ccggacccct 900 gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaagtgg 960 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 1020 agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 1080 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1140 aaaaccaaag gacagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1200 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1260 gccgtggagt gggagagcag cgggcagccg gagaacaact acaacaccac gcctcccatg 1320 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1380 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1440 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgaaagctt 1479 <210> 11 <211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric <400> 11 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Phe Ile His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Tyr Gly His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Pro Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys Thr 225 230 235 240 Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys 245 250 255 Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu 260 265 270 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 275 280 285 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 290 295 300 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val 305 310 315 320 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 325 330 335 Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 340 345 350 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 355 360 365 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 370 375 380 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 385 390 395 400 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 405 410 415 Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr 420 425 430 Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 435 440 445 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 450 455 460 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 465 470 475 480 Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 12 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric <400> 12 gaattcgccg ccaccatggg atggagctgt atcatcctct ttttggttgc aacagctaca 60 ggtgtccact ccgacattgt gatgacccag tctcacaaac tcttgtccac atcagtagga 120 gacagggtca gcatcacctg caaggccagt caggatgtga gtactgctgt agactggtat 180 caacagaaac caggacaatc tcctaaacta ctgattaact gggcatccac ccggcacact 240 ggagtccctg atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag attatactct caccatcagc 300 agtatgcagg ctgaagacct ggcactttat tactgtcgac aacattatag cactccattc 360 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttgaaag 720 ctt 723 <210> 13 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric <400> 13 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Leu Leu Ser Thr 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 35 40 45 Ser Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Asn Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Met Gln Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Arg Gln His Tyr Ser 100 105 110 Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 14 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric <400> 14 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375

Claims

(a) i) 서열목록 제1서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 뮤린 모노클로날 항체; 및 ii) 서열목록 제3서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역으로 정의되는 뮤린 모노클로날 항체로 정의되는 뮤린 모노클로날 항체로부터 유래되거나 또는
(b) (a) 단계에서 정의된 항체로서 인간 CD37의 동일한 에피토프 또는 상기 에피토프와 유사하거나 겹치는 에프토프를 인지하는 비인간 항체로부터 유래된 인간 CD37에 결합하는 항체로서, 상기 항체 분자는 키메릭 항체 또는 인간화된 항체.
제 1 항에 있어서, 상기 키메릭 항체는
i) 서열목록 제 1 서열로 표시되는 아미노산을 포함하는 중쇄 가변영역;
ii) 서열목록 제 3 서열로 표시되는 아미노산을 포함하는 경쇄 가변영역;
iii) 인간 기원의 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역으로 정의되는 항체.
제 2 항에 있어서, i) 중쇄 가변영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 중쇄 가변영역 및 ii) 경쇄 가변영역은 카파 또는 람다 사슬인 항체.
제 3 항에 있어서, 다음을 포함하는 항체:
i) 중쇄 불변 사슬은 서열목록 제 5 서열, 서열목록 제 6 서열, 서열목록 제 7 서열 및/또는 서열목록 제 11 서열로 표시되는 아미노산 서열 및
ii) 경쇄 불변 사슬은 서열목록 제 9 서열 또는 서열목록 제 13 서열로 표시되는 아미노산 서열.
제 1 내지 제 4항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 가변영역을 암호화하는 영역을 포함하는 DNA 분자.
제 5 항에 있어서, 중쇄 가변영역을 암호화하는 영역은 인간 기원의 중쇄 불변영역을 암호화하는 영역과 융합하고, 상기 중쇄 불변 사슬은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 불변 사슬인 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
제 6 항에 있어서, IgG1은 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및/또는 서열목록 제7서열이고, 그리고 IgG3는 서열목록 제10서열 및/또는 서열목록 제12서열로 표시되는 서열에 의하여 암호화되는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 하나의 항체의 경쇄 가변영역을 암호화하는 영역을 포함하는 DNA 분자.
제 7 항 및/또는 제 8 항의 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 9 항의 하나 이상의 벡터를 수반하는 숙주 세포.
다음을 포함하는 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항체를 생산하는 방법:
(a) 포유동물의 숙주 세포에 제 9 항의 하나 이상의 숙주 세포를 감염시키는 단계;
(b) 호스트를 배양하는 단계; 및
(c) 항체 분자를 회복시키고 정제하는 단계.
제 1 항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 하나 이상의 항-CD37 항체 분자 및 약제학적으로 수용 가능한 담체를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물.
세포 집단에 제 1항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항체 분자 또는 제 12 항의 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 세포 집단으로부터 B 세포를 발현하는 CD37을 제거하는 방법.
다음을 포함하는 인간 CD37에 결합하는 방사성 면역결합제:
(a) 제 1 항 내지 제 4 항의 항체; (b) 링커; 및 (c) ²¹¹At, ²¹³Bi, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²5Ac, ²²⁷Th, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ¹⁹⁴Ir, ¹⁶⁶Ho, ¹⁵⁹Gd, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴²Pr, ¹¹¹Ag, ¹⁰⁹Pd, ⁷⁷As, ⁶⁷Cu, ⁴⁷Sc 및 ¹⁷⁷Lu으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방사성핵종(radionuclide).
제 14 항에 있어서, 방사성 면역결합제 및 약제학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제 11 항 또는 제 15 항에 있어서, B 세포 악성종양을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제 11 항 및 제 15 항에 있어서, B 세포 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL), B 세포 만성 림프구 백혈병(chronic lymphoid leukemia, CLL), 모발성 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 림포플라스마사이틱 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma) 및 다발성 골수종(multiple myeloma)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 B 세포 악성 종양의 치료 방법.
제 14항에 있어서, 두 개 이상의 바이알(vial)을 포함하는 방사성 면역결합제의 생산용 키트로서, 여기서 하나의 바이알은 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항체에 결합된 킬레이터를 포함하는 결합제를 포함하고, 두 번째 바이알은 방사성핵종을 포함한다.
B 세포 악성종양의 전처리를 위한 키메릭 또는 인간화된 HH1 항체의 주사용 제조방법으로서, 여기서 CD37은 HH1의 방사능으로 표지되거나 항체독소 버전을 이용한 방사성 면역치료 전에 정상 조직에서 블로킹된다.
제 19 항에 있어서, HH1 항체의 양은 1 g 이상이 아니고, 최소 0.5 mg인 제조방법.