BR112014014258A2

BR112014014258A2 - molécula de anticorpo que se liga a cd37 humano; anticorpo; molécula de dna; vetor de expressão; célula hospedeira; método para produzir um anticorpo; composição farmacêutica; método de esgotamento de células b que expressam cd37 dentre uma população de células; radioimunoconjugado que se liga a cd37 humano; método de tratamento de uma malignidade de célula b; kit para a produção do radioimunoconjugado; e preparação injetável de anticorpo hh1 quimérico ou humanizado para uso no pré-tratamento de uma malignidade de célula b

Info

Publication number: BR112014014258A2
Application number: BR112014014258-0A
Authority: BR
Inventors: Roy H. Larsen; Jostein Dahle
Original assignee: Nordic Nanovector As.
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2020-10-27
Also published as: US20140348745A1; ES2827787T3; SG11201403134PA; HK1203372A1; AU2012354140A1; EP3272364B1; WO2013088363A1; EP3272364A1; MX358502B; AU2012354140B2; CA2858964A1; NZ626188A; KR20140103140A; CN104114192A; RU2014125320A; IL233084A; CN109276713A; EP2790740A1; IL233084A0; PL3272364T3

Abstract

  MOLÉCULA DE ANTICORPO QUE SE LIGA A CD37 HUMANO; ANTICORPO; MOLÉCULA DE DNA; VETOR DE EXPRESSÃO; CÉLULA HOSPEDEIRA; MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO; COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA; MÉTODO DE ESGOTAMENTO DE CÉLULAS B QUE EXPRESSAM CD37 DENTRE UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS; RADIOIMUNOCONJUGADO QUE SE LIGA A CD37 HUMANO; MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA MALIGNIDADE DE CÉLULA B; KIT PARA A PRODUÇÃO DO RADIOIMUNOCONJUGADO; E PREPARAÇÃO INJETÁVEL DE ANTICORPO HH1 QUIMÉRICO OU HUMANIZADO PARA USO NO PRÉ- TRATAMENTO DE UMA MALIGNIDADE DE CÉLULA B. A presente invenção refere-se a anticorpos quiméricos ou humanizados derivados do anticorpo monoclonal de camundongo HH1. As aplicações da presente invenção incluem aplicações terapêuticas nas quais composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos da presente invenção ou radioimunoconjugados das mesmas são utilizadas para tratar malignidades de células B.

Description

MOLÉCULA DE ANTICORPO QUE SE LIGA A CD37 HUMANO; ANTICORPO; MOLÉCULA DE DNA; VETOR DE EXPRESSÃO; CÉLULA HOSPEDEIRA; MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO; COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA; MÉTODO DE ESGOTAMENTO DE CÉLULAS B QUE EXPRESSAM CD37 DENTRE UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS; RADIOIMUNOCONJUGADO QUE SE LIGA A CD37 HUMANO; MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA MALIGNIDADE DE CÉLULA B; KIT PARA A PRODUÇÃO DO RADIOIMUNOCONJUGADO; E PREPARAÇÃO INJETÁVEL DE ANTICORPO HHl QUIMÉRICO OU HUMANIZADO PARA USO NO PRÉ-

TRATAMENTO DE UMA MALIGNIDADE DE CÉLULA B CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à imunoterapia e radioimunoterapia de câncer hematológico com um anticorpo quimérico ou humanizado com uma citotoxicidade inesperadamente alta, bem como diversas aplicações dos anticorpos.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-CD37 quiméricos e humanizados, bem como à produção e aplicações dos mesmos.

[003] A presente invenção, além disso, refere- se a imunoterapias e radioimunoterapias que são baseadas em esgotamento de células B.

[004] Em particular, a presente invenção refere-se a moléculas de anticorpos anti-CD37 para uso em tais terapias, por exemplo, no tratamento de malignidades e condições autoimunes.

[005] A imunoterapia utilizando anticorpos monoclonais (mAbs) tem surgido como um método seguro e seletivo para o tratamento de câncer e outras doenças.

[006] Em particular, o papel de anticorpos monoclonais nas terapias que são baseadas em esgotamento de células B, por exemplo, no tratamento de malignidades de células B, tem expandido, uma vez que a introdução de rituximabe, um anticorpo que é direcionado contra o antígeno CD20 na superfície da célula B.

[007] O antígeno CD37 é um antígeno de superfície de célula que não tem sido considerado um alvo para malignidades de células B na mesma medida que o antígeno de células B CD20.

[008] O CD37, um membro da superfamília de tetraspanina, é uma molécula de superfície celular altamente glicosilada com quatro domínios de transmembrana e duas alças extracelulares.

[009] A expressão de CD37 é observada em células B normais, linfoma não-Hodgkin (NHL), incluindo linfoma de células do manto (MCL), linfoma de Burkitt (BL), linfoma linfocítico pequeno (SLL) e linfoma folicular (FL), linfoma de zona marginal (MZL), linfoma de células B grandes difusas (DLBCL), linfoma linfoblástico (LL), e leucemia linfoide crônica (CLL).

[010] Este padrão de expressão torna o CD37 um alvo atraente para terapia do câncer mediada por anticorpos.

[011] O CD37 foi descrito pela primeira vez em 1986 e caracterizado pelo anticorpo monoclonal murino MB-1 (Link et al, 1986).

[012] (o) papel fisiológico do CD37 é desconhecido.

[013] A ligação de um mAb específico a CD37 a células cancerosas pode disparar diversos mecanismos de ação:

Primeiro, após o anticorpo se ligar ao domínio extracelular do antígeno de CD37, ele pode ativar a cascata do complemento e lisar a célula-alvo.

[014] Em segundo lugar, um anticorpo anti-CD37 pode mediar a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) à célula-alvo, Oo que ocorre após a porção de Fc do anticorpo ligado ser reconhecida por receptores apropriados em células citotóxicas do sistema imunológico.

[015] Em terceiro lugar, o anticorpo pode alterar a capacidade das células B de responder a antígeno ou outros estímulos.

[016] Finalmente, o anticorpo anti-CD37 pode iniciar a morte celular programada (apoptose).

[017] O mAb anti-CD37 MB-1 foi avaliado em dois ensaios de radioimunoterapia em pacientes com B-NHL (linfoma não-Hodgkin de células B; Press et al., 1989; Kaminski et al., 1992).

[018] Outros também revelaram mMABS que apresentam potencial (por exemplo, WO 2009/019312 por Heider et al. e WO 2011/092295 pelos presentes inventores) mas ainda há um longo caminho a percorrer antes do CD37 ser comprovado como a alternativa ideal a CD20 para tratar malignidades de células B.

[019] Em conclusão, foi demonstrado que oO antígeno CD37 é frequentemente expresso em células tumorais em diversas malignidades de células B humanas e em linfócitos B normais maduros e que a terapia baseada em anti-CD37 pode ser uma abordagem promissora para tratar malignidades de célula B.

[020] Embora os anticorpos anti-CD37 ou as moléculas semelhantes a anticorpos descritas acima (por exemplo, MB-1) tenham apresentado eficácia anti-tumor em malignidades de células B e o potencial de ter CD37 como alvo, há uma necessidade por anticorpos anti-CD37 alternativos para melhorar as terapias com base no esgotamento de células B.

[021] Assim, um anticorpo anti-CD37 melhorado seria vantajoso na busca por novos tratamentos contra malignidades de células B.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[022] Um objeto da presente invenção refere-se a um anticorpo quimérico ou humanizado derivado do anticorpo monoclonal de camundongo HH1.

[023] Em particular, é um objeto da presente invenção a provisão de um anticorpo quimérico ou humanizado.

[024] Um aspecto da presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo que se liga a CD37 humano e que é derivada de a) um anticorpo monoclonal murino que é definido por 1) uma cadeia pesada variável caracterizada por compreender a sequência de aminoácidos mostrada no SEQ ID Nº: 1; e ii) uma cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada no SEQ ID Nº: 3, ou de b) um anticorpo não humano que reconhece o mesmo epítopo de CD37 humano como o anticorpo definido em a) ou reconhece um epítopo que está próximo ou se sobrepõe ao dito epítopo; em que a dita molécula de anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado.

[025] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma molécula de DNA codificando os anticorpos da presente invenção.

[026] Ainda, outro aspecto da presente invenção refere-se a uma célula hospedeira portando uma ou mais moléculas de DNA codificando os anticorpos da presente invenção.

[027] Ainda, outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para produzir um anticorpo da presente invenção, compreendendo a transfecção de uma célula hospedeira de mamífero com um ou mais vetores codificando os anticorpos da presente invenção, a cultura da célula hospedeira e a recuperação e a purificação da molécula de anticorpo.

[028] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, um ou mais anticorpos da presente invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[029] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para uso no tratamento de malignidades de células B.

[030] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para tratar um paciente que sofre de uma malignidade de células B selecionada do grupo que consiste em um linfoma não-Hodgkin de células B, leucemia linfocítica crônica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma linfoplasmocitário e mielonma múltiplo, compreendendo a administração ao dito paciente de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da presente invenção.

[031] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um radioimunoconjugado que se liga a CD37 humano compreendendo a) um anticorpo da presente invenção, b) um ligante, e c) um radionuclídeo selecionado do grupo que consiste em “at, “Bi, 2ºBi, 2ºPb, PSAc, Tn, vv, Re, Re, Au, Ir, Ho, Ga, sm, *ºPm, Pr, "ag, Pd, "as, “Cu, “Sc, e “Lu.

[032] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um radioimunoconjugado conforme descrito acima.

[033] Outro aspecto da presente invenção refere-se à composição farmacêutica descrita acima para uso no tratamento de uma malignidade de células B selecionada do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin de células B, leucemia linfocítica crônica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma linfoplasmocitário e mieloma múltiplo.

[034] Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um método para o tratamento de uma malignidade de células B selecionada do grupo que consiste em linfoma não- Hodgkin de células B, leucemia linfocítica crônica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma linfoplasmocitário e mieloma múltiplo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da presente invenção.

[035] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit para a produção do radioimunoconjugado da presente invenção, compreendendo dois ou mais frascos, em que um frasco contém um conjugado compreendendo um quelante ligado a um anticorpo da presente invenção; e um segundo frasco contém um radionuclídeo.

[036] Também é um aspecto o uso do anticorpo quimérico para bloquear antígeno CD37 em tecidos normais utilizando HHl para terapia.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[037] A Figura 1 mostra o gráfico de pontos da citometria de fluxo para modulação nas células Daudi e o histograma para ligação de um chHHl.1 anti-CD37 (isotipo Ig6el) e nenhuma ligação de anticorpo anti-NIP (controle negativo). A Figura l1 mostra uma ligação a antígeno significativa de chHH1.1.

[038] A Figura 2 mostra a ligação celular de chHH1.1 contra células de linfoma Daudi. Ela mostra uma ligação rápida e eficiente ao alvo.

[039] A Figura 3 mostra que chHHl.1 possui um ADCC similar a rituximabe apesar de menos antígenos e uma internalização significativa de CD37 nas células-alvo de linfoma Daudi.

[040] A Figura 4 mostra ADCC com PBMC estimuladas por IL-2 como células efetoras e células Rec-1l como células-alvo em três relações diferentes de células efetoras para células-alvo. Média e desvio padrão de três indivíduos.

[041] A Figura 5 mostra CDC com 10% de soro de três indivíduos em células Rec-l marcadas com HHl murino, rituximabe, chHH1l.1 ou uma combinação de rituximabe e chHH1.1.

[042] A Figura 6 mostra biodistribuição (& I1.D./g) de ““I-chHH1.3 em camundongos nus fêmeas 24 e 48 horas após injeção.

[043] A Figura 7 mostra lise específica a porcentagem por ADCC em células Daudi com células NK como efetoras. O sangue foi coletado de dois indivíduos e um experimento foi feito com uma relação de 10 células NK para 1 célula Daudi e o outro experimento com uma relação de 15: 1.

[044] A presente invenção será agora descrita em maiores detalhes a seguir.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[045] A presente invenção refere-se a anticorpos humanizados ou quiméricos derivados do anticorpo monoclonal de camundongo HH1.

[046] Os anticorpos humanizados ou quiméricos são anticorpos de espécies não humanas cujas sequências de proteína foram modificadas para aumentar sua similaridade a variantes de anticorpos produzidos naturalmente em humanos.

[047] O processo de “humanização” é geralmente aplicado a anticorpos monoclonais desenvolvidos para administração a humanos.

[048] A humanização pode ser necessária quando o processo de desenvolvimento de um anticorpo específico envolver a geração em um sistema imunológico não humano (tal como o de camundongos).

[049] As sequências de proteínas de anticorpos produzidos desta maneira são parcialmente distintas de anticorpos homólogos que ocorrem naturalmente em humanos, e são, portanto, potencialmente imunogênicas quando administradas a pacientes humanos.

[050] Nem todos os anticorpos monoclonais projetados para administração em humanos precisam ser humanizados, uma vez que muitas terapias são intervenções de curto prazo.

[051] A humanização é geralmente vista como sendo distinta da criação de uma quimera de anticorpo de camundongo-humano.

[052] Então, embora a criação de uma quimera de anticorpo seja normalmente realizada para atingir um anticorpo mais semelhante a humano (substituindo a região Fc de camundongo do anticorpo com a de humanos), quimeras simples deste tipo não são geralmente consideradas humanizadas.

[053] Em vez disso, a sequência de proteínas de um anticorpo humanizado é essencialmente idêntica à de uma variante humana, apesar da origem não humana de alguns de seus segmentos de região determinação de complementaridade (CDR) responsáveis pela capacidade do anticorpo para ligar a seu antígeno alvo.

[054] Entretanto, no presente contexto, o termo anticorpo quimérico e anticorpo humanizado é utilizado intercambiavelmente se referindo a um anticorpo que foi projetado geneticamente e é derivado do anticorpo monoclonal de camundongo HH1.

ANTICORPOS QUIMÉRICOS OU HUMANIZADOS DERIVADOS DO ANTICORPO MONOCLONAL HH1l

[055] A cadeia pesada de imunoglobulina (IgH) é a grande subunidade de polipeptídeo de um anticorpo (imunoglobulina).

[056] Um anticorpo típico é compósito de duas cadeias pesadas de imunoglobulina (Ig) e duas cadeias leves de Ig.

[057] Diversos tipos diferentes de cadeia pesada existem, os quais definem a classe ou o isotipo de um anticorpo.

[058] Estes tipos de cadeia pesada variam entre diferentes animais.

[059] A cadeia leve de imunoglobulina é a pequena subunidade de polipeptídeo de um anticorpo (imunoglobulina).

[060] Há dois tipos de cadeia leve em humanos (como em outros mamíferos), cadeia kappa (x), codificada pelo locus kappa de imunoglobulina no cromossomo 2 e a cadeia lambda (A), codificada pelo locus lambda de imunoglobulina no cromossomo 10.

[061] os anticorpos são produzidos por linfócitos B, cada um expressando apenas uma classe de cadeia leve.

[062] Uma vez definida, a classe de cadeia leve permanece fixa pelo período de vida do linfócito B.

[063] Em um indivíduo saudável, o a relação de kappa para lambda total é em torno de 2:1 em soro (medindo anticorpos inteiros intactos) ou 1:1,5 medindo cadeias leves livres, com uma relação altamente divergente indicativa de neoplasma.

[064] A relação normal exata de kappa para lambda varia de 0,26 a 1,65.

[065] Ambas as cadeias kappa e lambda podem aumentar proporcionalmente, mantendo uma relação normal.

[066] Ambas as cadeias variável e constante em um anticorpo quimérico ou humanizado derivado do anticorpo monoclonal de camundongo HHl podem diferir de sequências conhecidas.

[067] Exemplos de tais variações são claros na presente revelação e incluem a seleção de cadeias constantes, variação genética de cadeias variáveis e variações do domínio Fc para modular as funções efetoras.

[068] os presentes inventores projetaram geneticamente anticorpos quiméricos humanizados derivados do anticorpo monoclonal de camundongo HH1.

[069] Estes anticorpos mostram um efeito promissor na busca por tratamento ideal de malignidades relacionadas a células B.

[070] Estes efeitos são mostrados nos experimentos da presente revelação.

[071] Assim, um aspecto da presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo que se liga a cd37 humano e que é derivada de a) um anticorpo monoclonal murino que é definido por i) uma cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada no SEQ ID Nº: 1; e ii) uma cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada no SEQ ID Nº: 3, ou de b) um anticorpo não humano que reconhece o mesmo epítopo de CD37 humano como o anticorpo definido em a) ou reconhece um epítopo que está próximo ou se sobrepõe ao dito epítopo; em que a dita molécula de anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado.

[072] Em uma realização da presente invenção, O anticorpo quimérico é definido por i) uma cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada no SEQ ID Nº: 1; ii) uma cadeia leve variável caracterizada por compreender a sequência de aminoácidos mostrada no SEQ ID Nº: 3, iii) cadeias pesadas e leves constantes que são de origem humana.

[073] Em outra realização da presente invenção, o anticorpo quimérico é definido por i) cadeia pesada constante ser selecionada do grupo que consiste em cadeia IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, e ii) a cadeia leve constante é uma cadeia kappa ou lambda.

[074] Em uma realização adicional da presente invenção, a cadeia pesada constante é definida por i1) compreendendo a sequência de aminoácido mostrada no SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 6 e/ou SEQ ID Nº: 7 e em que à cadeia leve constante ii) compreende a sequência de aminoácido mostrada no SEQ ID Nº: 9.

[075] Em uma realização adicional da presente invenção, a cadeia pesada constante é definida por 1) compreendendo a sequência de aminoácido mostrada no SEQ ID Nº: 11 e/ou SEQ ID Nº: 14 e em que a cadeia leve constante ii) compreende a sequência de aminoácido mostrada no SEQ ID Nº: 13.

[076] A sequência de Fc de chHH1.3 de DNA com mutação de cadeia pesada de comprimento total pode ser vista como SEQ ID Nº: 10.

[077] A sequência de Fc de chHH1.3 de aminoácido com mutação de cadeia leve de comprimento total pode ser vista como SEQ ID Nº: 11.

[078] A sequência de Fc de chHH1.3 de DNA com mutação de cadeia pesada de comprimento total pode ser vista como SEQ ID Nº: 12.

[079] A sequência de Fc de chHH1.3 de aminoácido com mutação de cadeia leve de comprimento total pode ser vista como SEQ ID Nº: 13.

[080] A sequência de Fc de chHH1.3 sem mutação (região constante) pode ser vista como SEQ ID Nº: 14.

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO CODIFICANDO OS ANTICORPOS DA PRESENTE INVENÇÃO

[081] Os processos de humanização se aproveitam do fato de que a produção de anticorpos monoclonais pode se realizada utilizando DNA recombinante para criar construtos capazes de expressão em cultura de células de mamíferos.

[082] Isto é, segmentos de genes capazes de produzir anticorpos são isolados e clonados em células que podem ser cultivadas em um tanque, de modo que as proteínas de anticorpos produzidas a partir do DNA dos genes clonados possam ser colhidas em massa.

[083] A etapa envolvendo DNA recombinante provê um ponto de intervenção que pode ser prontamente explorado para alterar a sequência de proteínas do anticorpo expresso.

[084] As alterações à estrutura do anticorpo que são atingidas no processo de humanização são, portanto, todas efetuadas através de técnicas no nível do DNA.

[085] Assim, um aspecto da presente invenção refere-se a uma molécula de DNA codificando os anticorpos humanizados ou quiméricos da presente invenção.

[086] Em uma realização da presente invenção, a molécula de DNA codifica uma região codificando a cadeia pesada variável de um anticorpo humanizado ou quimérico da presente invenção.

[087] Em outra realização da presente invenção, esta região de codificação de cadeia pesada variável é fundida a uma região codificando uma cadeia pesada constante de origem humana.

[088] Tal cadeia pesada constante humana pode ser selecionada do grupo que consiste em IgGl, IgG2, IgG3 e I19G4.

[089] Em uma realização da presente invenção, a IgGl é codificada pela sequência mostrada no SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 6 e/ou SEQ ID Nº: 7

[090] Em uma realização da presente invenção, a cadeia pesada de IgG3 é codificada pela sequência mostrada no SEQ ID Nº: 10.

[091] Em uma realização da presente invenção, a cadeia leve de IgG3 é codificada pela sequência mostrada no SEQ ID Nº: 12.

[092] Em uma realização da presente invenção, a Ig63 com mutação de substituição de H435 é codificada pela sequência mostrada no SEQ ID Nº: 12.

[093] Em uma realização adicional da presente invenção, a cadeia pesada constante humana compreende uma Ou mais substituições na região Fc.

[094] Outra realização da presente invenção refere-se a uma molécula de DNA compreendendo uma região codificando a cadeia leve variável do anticorpo quimérico ou humanizado da presente invenção.

[095] Tal região de codificação de cadeia leve variável pode ser fundida a uma região codificando uma cadeia leve constante de origem humana.

[096] A cadeia leve constante pode ser uma cadeia kappa ou lambda.

[097] Em uma realização da presente invenção, a cadeia leve kappa é codificada por uma sequência mostrada no SEQ ID Nº: 9.

[098] As moléculas de DNA podem ser construídas e otimizadas para expressão em uma célula-alvo.

[099] Um vetor de expressão, também chamado de construto de expressão, é geralmente um plasmídeo que é utilizado para introduzir um gene específico (no presente contexto, a molécula de DNA da presente invenção) em uma célula-alvo.

[0100] Uma vez que o vetor de expressão estiver dentro da célula, a proteína que é codificada pelo gene é produzida pelos complexos ribossomais de maquinário de transcrição celular e tradução.

[0101] O plasmídeo é frequentemente projetado para conter sequências reguladoras que atuam como regiões potenciadoras e promotoras e levam à transcrição eficiente do gene realizada no vetor de expressão.

[0102] O objetivo de um vetor de expressão bem projetado é a produção de grandes quantidades de RNA mensageiro estável, e, portanto, proteínas.

[0103] Vetores de expressão são ferramentas básicas para biotecnologia e a produção de proteínas como insulina, que são importantes para tratamentos de doenças específicas, como a diabetes.

[0104] Após a expressão do produto do gene, a purificação da proteína é necessária; mas uma vez que o vetor é introduzido a uma célula hospedeira, a proteína de interesse deve ser purificada das proteínas da célula hospedeira.

[0105] Portanto, para tornar o processo de purificação fácil, o gene clonado deve ter um marcador. Este marcador poderia ser marcador de histidina (His) ou qualquer outro peptídeo marcador.

[0106] Assim, um aspecto da presente invenção, portanto, refere-se a um vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA descrita acima.

CÉLULAS COMPREENDENDO E EXPRESSANDO OS ANTICORPOS DA PRESENTE INVENÇÃO

[0107] As moléculas de DNA ou os vetores de expressão acima descritos podem ser introduzidos em células hospedeiras.

[0108] Tais células podem, através de tecnologia de hibridoma, se tornar células imortalizadas que produzem os anticorpos quiméricos ou humanizados.

[0109] A tecnologia de hibridoma é uma tecnologia de formação de linhas celulares (chamadas hibridomas) fundindo uma célula B produtora de anticorpo específico com uma célula de mieloma (câncer de células B) que é selecionada por sua capacidade de crescer em cultura de tecido e por uma ausência de síntese de cadeia de anticorpo.

[0110] Os anticorpos produzidos pelo hibridoma são todos de uma única especificidade e são, portanto, anticorpos monoclonais (em contraste a anticorpos policlonais).

[0111] Assim, um aspecto da presente invenção refere-se a uma célula hospedeira portando um ou mais vetores ou moléculas de DNA da presente invenção.

[0112] Uma realização da presente invenção refere-se a uma célula hospedeira portando um vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA codificando a cadeia pesada variável de HHl, e um segundo vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA codificando a cadeia leve variável da presente invenção.

[0113] Em uma realização da presente invenção, a célula hospedeira é uma célula de mamífero.

[0114] Em outra realização da presente invenção, a célula é uma célula de hibridoma.

MÉTODOS PARA PRODUZIR OS ANTICORPOS DA PRESENTE INVENÇÃO

[0115] Os anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser produzidos por diversos métodos.

[0116] Um método para produzir tais anticorpos compreende a transfecção de uma célula hospedeira de mamífero com um ou mais vetores da presente invenção, a cultura da célula hospedeira e a recuperação e purificação da molécula de anticorpo.

[0117] Outro método para produzir tais anticorpos compreende a construção de células de hibridoma que produzem os anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção.

IDENTIDADE DE SEQUÊNCIA

[0118] Conforme comumente definida, “identidade” é definida aqui como uma identidade de sequência entre genes ou proteínas no nível de nucleotídeo ou de aminoácido, respectivamente.

[0119] Assim, no presente contexto, “identidade de sequência” é uma medida de identidade entre proteínas no nível de aminoácido e uma medida de identidade entre ácidos nucleicos em um nível de nucleotídeo.

[0120] A identidade de sequência de proteína pode ser determinada pela comparação da sequência de aminoácidos em uma determinada posição em cada sequência quando as sequências estiverem alinhadas.

[0121] Da mesma forma, a identidade de sequência de ácido nucleico pode ser determinada comparando a sequência de nucleotídeos em uma determinada posição em cada sequência quando as sequências estiverem alinhadas.

[0122] Para determinar o percentual de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de dois aminoácidos, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ideal (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas na sequência de um primeiro aminoácido ou sequência de ácido nucleico para alinhamento ideal com uma segunda sequência de aminoácido ou ácido nucleico). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são, em seguida comparados.

[0123] Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então, as moléculas são idênticas nessa posição. O percentual de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, &% identidade = nº de posições idênticas/nº total de posições

(por exemplo, posições sobrepostas) x 100). Em uma realização, as duas sequências são do mesmo comprimento.

[0124] Pode-se alinhar manualmente as sequências e contar o número de ácidos nucleicos ou aminoácidos idênticos. Alternativamente, o alinhamento de duas sequências para a determinação do percentual de identidade pode ser realizado utilizando um algoritmo matemático. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST. As buscas de nucleotídeos BLAST pode ser realizada com o programa NBLAST, pontuação = 100, tamanho de palavra = 12 para obter sequências nucleotídicas homólogas a moléculas de ácido nucleico da invenção. Buscas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, tamanho de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma molécula de proteína da invenção.

[0125] Para obter alinhamentos com lacunas para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado. Alternativamente, PSI-Blast pode ser utilizado para realizar uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas. Ao utilizar os programas NBLAST, XBLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas podem ser utilizados. Vide http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Alternativamente, a identidade de sequência pode ser calculada após as sequências terem sido alinhadas, por exemplo, pelo programa BLAST, no banco de dados EMBL (www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST).

[0126] Em geral, as configurações padrão em relação a, por exemplo, “matriz de pontuação” e “penalidade de lacuna” podem ser utilizadas para alinhamento. No contexto da presente invenção, as configurações padrão de BLASTN e PSI BLAST podem ser vantajosas.

[0127] O percentual de identidade entre duas sequências pode ser determinado utilizando técnicas similares às descritas acima, com ou sem a permissão de lacunas. No cálculo do percentual de identidade, apenas correspondências exatas são contadas.

[0128] Uma realização da invenção refere-se a um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico compartilhando 80% de identidade de sequência com a sequência VH de anticorpo HHl1 (SEQ ID Nº: 2) e/ou sequência VL (SEQ ID Nº: 4).

[0129] Uma realização da invenção refere-se a um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico com a sequência VH de anticorpo HHl1 (SEQ ID Nº: 2) e/ou sequência VL (SEQ ID Nº: 4).

[0130] Em outra realização da invenção, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de ácido nucleico compartilhando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência VH de anticorpo HH1 (SEQ ID Nº: 2) e/ou sequência VL (SEQ ID Nº: 4), tal como 90% de identidade, 91% de identidade, 92% de identidade, 93% de identidade, 94% de identidade, 95% de identidade, 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade, ou 99% de identidade.

[0131] Outra realização da invenção refere-se a um anticorpo compreendendo uma sequência polipeptídica compartilhando 80% de identidade de sequência com a sequência VH de anticorpo HHl (SEQ ID Nº: 1) e/ou sequência VL (SEQ ID Ne: 3).

[0132] Outra realização da invenção refere-se a um anticorpo compreendendo uma sequência polipeptídica com a sequência VH de anticorpo HHl1 (SEQ ID Nº: 1) e/ou sequência VL (SEQ ID Nº: 3).

[0133] Em outra realização da presente invenção, o anticorpo compreende uma sequência polipeptídica compartilhando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência VH de anticorpo HHl1 (SEQ ID Nº: 1) e/ou sequência VL (SEQ ID Nº: 3), tal como 90% de identidade, 91% de identidade, 92% de identidade, 93% de identidade, 94% de identidade, 95% de identidade, 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade, ou 99% de identidade.

[0134] Em uma realização preferida da presente invenção, estes anticorpos são um anticorpo quimérico ou humanizado derivado do anticorpo monoclonal HH1.

VARIAÇÃO GENÉTICA

[0135] A variação genética é causada pela variação na ordem de bases nos nucleotídeos em genes. Esta variação causa mutações nos genes e posteriormente, nas proteínas que tais genes codificam.

[0136] Estas mutações podem ser mutações Ou substituições sense ou missense.

[0137] Uma realização da presente invenção refere-se à sequência de ácido nucleico isolada da cadeia VH de anticorpo monoclonal HHl (SEQ ID Nº: 2) e/ou cadeia VL (SEQ ID Nº: 4) que compreende pelo menos 50, tal como 20, tal como 10, tal como 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2, tal como 1 mutações sense.

[0138] Outra realização da presente invenção refere-se à sequência de ácido nucleico isolada da cadeia VH de anticorpo monoclonal HHl (SEQ ID Nº: 2) e/ou cadeia VL (SEQ ID Nº: 4) que compreende 0-50, tal como 1-50, tal como 0-20, tal como 1-20, tal como 0-10, tal como 1-10, tal como 0-5, tal como 1-5, tal como 3, tal como 1 mutaçõessense.

[0139] Uma mutação missense (um tipo de mutação não-sinônima) é uma mutação de ponto na qual um único nucleotídeo é alterado, resultando em um códon que codifica um aminoácido diferente (mutações que mudam um aminoácido a um códon de parada são consideradas mutações sem sentido, em vez de mutações missense). Uma mutação missense pode tornar a proteína resultante não-funcional.

[0140] Entretanto, nem todas as mutações missense levam a mudanças de proteína detectáveis. Um aminoácido pode ser substituído por um aminoácido de propriedades químicas muito similares, neste caso, a proteína pode ainda funcionar normalmente; isto é chamado de uma mutação neutra, “silenciosa”, ou conservadora.

[0141] Alternativamente, a substituição de aminoácido poderia ocorrer em uma região da proteína que não afeta significativamente a estrutura ou função secundária da proteína. Quando um aminoácido puder ser codificado por mais de um códon (chamado de “codificação degenerada”), uma mutação em um códon pode não produzir nenhuma mudança em tradução; esta seria uma mutação sinônima (uma forma de mutação silenciosa) e não uma mutação missense.

[0142] Uma realização da presente invenção refere-se a um anticorpo compreendendo uma sequência polipeptídica da cadeia VH de anticorpo monoclonal HHl (SEQ ID Nº: 2) e/ou cadeia VL (SEQ ID Nº: 4) que compreende pelo menos 50, tal como 20, tal como 10, tal como 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2, tal como 1 mutações missense.

[0143] Uma realização da presente invenção refere-se a um anticorpo compreendendo — uma sequência polipeptídica da cadeia VH de anticorpo monoclonal HHl (SEQ ID Nº: 2) e/ou cadeia VL (SEQ ID Nº: 4) que compreende 0-50, tal como 1-50, tal como 0-20, tal como 1-20, tal como 0-10 tal como 1-10, tal como 0-5, tal como 1-5, tal como 3, tal como 1 mutações missense.

[0144] Uma substituição conservadora é uma substituição de um aminoácido por outro com propriedades geralmente similares, de modo que o funcionamento geral provavelmente não será afetado seriamente.

[0145] Em outra realização da presente invenção, as mutações missense são mutações ou substituições conservadoras.

[0146] Uma realização adicional da presente invenção refere-se a uma sequência de ácido nucleico Ou sequência polipeptídica isolada com 80% de identidade de sequência às sequências de cadeia pesada variável (SEQ ID Nº: 1) e/ou cadeia leve variável (SEQ ID Nº: 3) de HHl, em que à variação de sequência são substituições conservadoras.

[0147] Em outra realização da presente invenção, a identidade sequência é de 80% de identidade, tal como 90% de identidade, 91% de identidade, 92% de identidade, 93% de identidade, 94% de identidade, 95% de identidade, 96% de identidade, 97% de identidade, 98% de identidade, ou 99% de identidade e a variação de sequência são substituições conservadoras.

[0148] Para melhorar a etapa de radiomarcação, pode ser benéfico introduzir mais lisina, por exemplo, na porção Fc do anticorpo quimérico ou humanizado da presente invenção.

[0149] Isto poderia reduzir a probabilidade de fixar quelantes de ligação à lisina aos sítios de combinação de antígeno no anticorpo, reduzindo, assim, o risco de comprometer a imunorreatividade durante a radiomarcação.

[0150] Métodos para introduzir lisina, por exemplo, na porção Fc de HHl são conhecidos na técnica, por exemplo, em Hemminki et al., 1995.

[0151] Uma realização da presente invenção refere-se ao radioimunoconjugado da presente invenção que foi modificado por 10 Lys na porção Fc de HHl, tal como 8 Lys, tal como 6 Lys, tal como 5 Lys, tal como 4 Lys, tal como 3 Lys, tal como 2 Lys, tal como 1 Lys.

[0152] Outras variações da porção Fc dos anticorpos da presente invenção podem ser escolhidas para otimizar ou modular uma ou mais funções efetoras.

[0153] Estas modulações de funções efetoras são feitas, por exemplo, para aumentar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC).

[0154] Tais variações da porção Fc são conhecidas na técnica.

[0155] Assim, um aspecto da presente invenção refere-se a um anticorpo da presente invenção que possui uma ou mais mutações no domínio Fc que modulam uma ou mais funções efetoras.

IMUNOCONJUGADOS

[0156] Imunoconjugados são anticorpos conjugados (unidos) a uma segunda molécula, geralmente uma toxina, um radioisótopo ou um marcador.

[0157] Tais imunoconjugados de HHl quimérico e humanizado são todos aspectos da presente invenção.

[0158] Um tipo é o HHl quimérico e humanizado da presente invenção conectado ou associado a um ligante quelante.

[0159] Ligantes quelantes são discutidos na seção abaixo referente a radioimunoconjugados e os ligantes nela descritos são, portanto, todos considerados úteis para imunoconjugados compreendendo HHl quimérico e humanizado da presente invenção conectado ou associado a um ligante quelante.

RADIOIMUNOCONJUGADOS

[0160] Um aspecto da presente invenção refere-se a um radioimunoconjugado que se liga a CD37 humano compreendendo um anticorpo quimérico ou humanizado derivado do anticorpo monoclonal HHl de acordo com a presente invenção, um ligante, e um radionuclídeo selecionado do grupo que consiste em 2Vat, Bi, 2”2Bi, 2!ºPb, ***AC, Th, y, Re, Re, "au, Ir, Ho, “Ga, Ásm, PPM, UCºPr, “Ag, "Pd, "As, cu,"Se, e “Lu.

[0161] Em uma realização da presente invenção, oO ligante é um ligante quelante.

[0162] Em outra realização da presente invenção, o radionuclídeo é selecionado do grupo que consiste em "'Lu, 225nc, 2Th e *v.

[0163] Em outra realização da presente invenção, o radionuclídeo é “Lu.

[0164] Em outra realização da presente invenção, o radionuclídeo é “Pb.

[0165] Em ainda outra realização, o radionuclídeo é outro beta-emissor ou um alfa-emissor.

[0166] O radionuclídeo pode ser fixado ao anticorpo reagindo primeiramente com um quelante bifuncional, por exemplo, p-SCN-bn-DOTA (Macrocyclics, Tx, EUA), com o anticorpo, seguido pela purificação para remover quelante não conjugado, e, em seguida, reação do conjugado de anticorpo quelante com o radionuclídeo, seguido por purificação para remover qualquer radionuclídeo não conjugado.

[0167] Alternativamente, o quelante e o radionuclídeo podem ser combinados primeiramente e posteriormente conjugados ao anticorpo.

[0168] Ligantes quelantes como, por exemplo, p- SCN-bn-DOTA, podem ser utilizados para conjugar outros radionuclídeos de metal a anticorpos derivados de HHl de maneira similar à descrita para “Lu.

[0169] Qualquer tipo de ligante com capacidade de complexação suficiente e um grupo funcional permitindo conjugação direta ou indireta a uma proteína ou um peptídeo pode ser utilizado.

[0170] Exemplos de tais ligantes são descritos na literatura (por exemplo, Brechbiel, 2008; Liu, 2008). Alguns exemplos úteis incluem quelantes cíclicos bifuncionais como p-SCN-bn-DOTA, DOTA-NHS-éster, p-SCN-Bn-TCMC; quelantes lineares bifuncionais como p-SCN-Bn-DTPA e CHX-A”-DTPA.

[0171] Os radionuclídeos na presente invenção preferivelmente serão conjugados a uma molécula de direcionamento utilizando quelantes bifuncionais.

[0172] Estes podem ser quelantes cíclicos, lineares ou ramificados. Referência específica pode ser feita aos quelantes de poliaminopoliácidos que compreendem uma espinha dorsal de poliazaalcano cíclico ou ramificado com grupos ácidos (por exemplo, carboxialquila) fixados a nitrogênios da espinha dorsal.

[0173] Exemplos de quelantes adequados incluem derivados de DOTA, tal como ácido p-isotiocianatobenzil- 1,4,7, 1l0-tetraazaciclododecano- 1,4,7, 1l0-tetracético (p- SCN-Bz-DOTA) ou S-2- (4-Isotiocianatobenzil)-1,4,7,10-tetra(2- carbamoilmetil)ciclododecano e derivados de DTPA, tal como ácido p-isotiocianatobenzil-dietilenotriaminapentacético (p- SCN-Bz-DTPA), os primeiros sendo quelantes cíclicos, OS últimos sendo quelantes lineares.

[0174] A metalação da fração complexante pode ser realizada antes ou após conjugação da fração complexante à fração de direcionamento.

[0175] O procedimento de radiomarcação será, em geral, mais conveniente em termos de tempo utilizado, etc., se o quelante for conjugado ao anticorpo antes da radiomarcação ocorrer.

[0176] os princípios de preparação dos conjugados radiomarcados utilizando quelantes fixados à anticorpos são descritos mais amplamente, por exemplo, em Liu, 2008.

[0177] Assim, os anticorpos quiméricos ou humanizados derivados de HHl podem ser utilizados para preparar radioimunoconjugados com diferenças em propriedades de radiação e meias-vidas eficazes.

[0178] Por exemplo, o radioimunoconjugado anti- CcD37 de um anticorpo quimérico ou humanizado derivado do anticorpo monoclonal HHl de acordo com a presente invenção, um ligante quelante e um radionuclídeo beta- ou alfa-emissor incluindo, entre outros, “Lu, “at, “Bi, 2ºBi, 2?Pb, “Pac 27h, ºy, Re, 5 "Re, 274, 1977, 66 Ho, 2%, sm, Dm, 1ºpr, “ag, OÓPda, Uas, cu, “Sc pode ser preparado e utilizado para preparar preparações farmacêuticas e utilizado em aplicações terapêuticas.

IMUNOTOXINAS

[0179] Uma imunotoxina é uma proteína humana que consiste em uma porção de direcionamento ligada a uma toxina. Quando a proteína se liga a essa célula, ela é absorvida através de endocitose, e a toxina mata a célula.

[0180] Elas são geralmente utilizadas para o tratamento de alguns tipos de câncer e algumas infecções virais.

[0181] Estas proteínas são geralmente feitas de um anticorpo ou fragmento de anticorpo modificado, fixadas a um fragmento de uma toxina.

[0182] A porção de direcionamento é composta da porção Fv de um anticorpo que tem como alvo um tipo de célula específico.

[0183] A toxina é geralmente uma proteína citotóxica derivada de uma proteína bacteriana ou vegetal, da qual o domínio de ligação natural foi removido, de modo que o Fv direcione a toxina ao antígeno na célula-alvo.

[0184] Em outra realização da invenção, a toxina é uma molécula quimioterápica, incluindo, entre outras, agentes alquilantes (cisplatina, carboplatina, oxaliplatina,

mecloretamina, cisfosfamida, clorambucil, ifosfamida), anti- metabólitos (azatioprina, mercaptopurina, pirimidinas) alcaloides (vincristina, vinblastina, cinorelbina, vindesina, paclitaxel, docetaxel, etopósido, tenipósido), inibidores de topoisomerase (irinotecano, topotecano, amascrina, etopósido, tenipósido) =) antibióticos citotóxicos (actinomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, calrubicina, idarrubicina, epirrubicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina).

[0185] Em uma realização da invenção, doxorrubicina é conjugada ao anticorpo através do reticulante SMCC-hidrazida (4- [N-maleimidometil]ciclohexano-1 carboxilhidrazida).

[0186] A imunotoxina funciona pelo anticorpo (ou outra fração de direcionamento) se ligando a um antígeno na célula-alvo seguido por toxina que entra e mata a célula.

[0187] Assim, um aspecto da presente invenção refere-se a uma imunotoxina que compreende o anticorpo da presente invenção ou um fragmento do mesmo.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0188] Anticorpos são geralmente aplicados no tratamento de doenças formuladas em composições farmacêuticas.

[0189] Tais composições são otimizadas para parâmetros como a tolerância fisiológica e vida-de- prateleira.

[0190] Assim, um aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo, como O ingrediente ativo, uma ou mais moléculas de anticorpo anti- CD37 da presente invenção (isto é, o anticorpo quimérico ou humanizado derivado de HHl ou um fragmento do mesmo), e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0191] Uma realização da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica conforme descrita acima, adicionalmente compreendendo um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

[0192] Em uma realização da presente invenção, os ditos um ou mais agentes terapêuticos adicionais são selecionados dentre agentes que têm como alvo um antígeno de célula B que não CD37.

[0193] Tal antígeno pode ser o antígeno de célula B CD20.

[0194] Em outra realização da presente invenção, os ditos um ou mais agentes terapêuticos adicionais são selecionados dentre agentes que induzem apoptose.

[0195] Um produto radioimunoterapêutico com base no HHl quimérico ou humanizado tipicamente seria provido como uma composição farmacêutica consistindo em um radionuclídeo, de acordo com a descrição acima, ligado através de um quelante ao anticorpo quimérico ou humanizado HHl dissolvido em uma solução de tampão, que, em um grau substancial, mantém a integridade química do radioimunoconjugado e está sendo fisiologicamente aceitável para infusão em pacientes.

[0196] Assim, um aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um radioimunoconjugado da presente invenção, e um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0197] Veículos farmacêuticos aceitáveis incluem, entre outros, tampões não tóxicos, enchimentos, soluções isotônicas, etc. Mais especificamente, o veículo farmacêutico pode, mas não é limitado a solução salina normal (0,9%), meia solução salina normal, solução de Ringer com lactato, Dextrose 5%, Dextrose 3,3%/Solução salina 0,3%. O veículo fisiologicamente aceitável pode conter um estabilizante radiolítico, por exemplo, ácido ascórbico, que protege a integridade do radiofarmacêutico durante armazenamento e transporte.

[0198] Uma realização da presente invenção compreende a composição farmacêutica da presente invenção e um ou mais anticorpos ou radioimunoconjugados adicionais. Anticorpos incluem, entre outros, Rituximabe, Epratuzumabe, L19, F8, Fl6, Galiximabe, Toralizumabe, Alemtuzumabe, Ofatumumabe, Veltuzumabe, Afutuzumabe, Tositumomabe, Reditux, Ibritumomabe, K7153A, 37.1 e HH1l.

[0199] Radioimunoconjugados incluem, entre outros, Zevalin, Bexxar e Betalutin.

[0200] Em outra realização da presente invenção, um ou mais anticorpos ou radioimunoconjugados adicionais têm CD20 como alvo. Anticorpos incluem, entre outros, Rituximabe, Veltuzumabe, Ofatumumabe, Afutuzumabe, Tositumomabe, Reditux e Ibritumomabe. Radioimunoconjugados incluem, entre outros, Zevalin e Bexxar.

[0201] Uma realização da presente invenção refere-se à uma composição farmacêutica da presente invenção para tratar células malignas a células B expressando o antígeno CD37.

[0202] Em uma realização da presente invenção, a composição farmacêutica é para o tratamento de uma malignidade de células B selecionada do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin de células B, leucemia linfocítica crônica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma pequeno linfoblástico e mieloma múltiplo.

TRATAMENTO

[0203] o uso terapêutico de uma solução farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser para o tratamento contra células malignas expressando o antígeno CD37, incluindo, entre outros, uma malignidade de células B selecionada do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin de célula B, leucemia linfocítica crônica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma linfoplasmocitário e mieloma múltiplo.

[0204] Outros usos poderiam ser o tratamento de doenças autoimunes e o tratamento de efeitos relacionados a transplantes.

[0205] A terapia poderia ser baseada, entre outros, em radiação de partículas beta ou radiação de partículas alfa ou uma combinação destes.

[0206] A terapia poderia ser administrada como uma monoterapia ou em combinação com outras terapias preferencialmente tratamentos padrão. Tais outras terapias podem ser pré-tratamento, cirurgia, quimioterapia (incluindo doxurrubicina, Vvinblastina e gencitabina), imunoterapia, terapia fotodinâmica, inibidor de proteassoma (incluindo bortezomibe), inibidores de histona-deacetilase (incluindo vorinostat e ácido suberoilanilida hidroxâmico), vitamina D3 e análogos de vitamina D3, inibidores de pontos de checagem de ciclo celular (incluindo UCN-01 e 2-(4- (4 Clorofenoxi) fenil)-lH-benzimidazol-5-carboxamida), radiossensibilizantes de células hipóxicas (incluindo metronidazol e misonidazol), radiossensibilizantes indutores de apoptose (incluindo withaferin A), radioimunoterapia Ou uma combinação de dois ou mais destes.

[0207] Entende-se por administrado(a) a infusão ou intravenosa ou injeção intravenosa. Mais especificamente, o radioimunoconjugado da presente invenção pode ser administrado diretamente em uma veia por uma cânula periférica conectada a uma câmara de gotejamento que impede a embolia do ar e permite uma estimativa de vazão ao paciente.

[0208] Em uma realização, o radioimunoconjugado pode ser administrado de maneira repetida.

[0209] Em outra realização da presente invenção, o radioimunoconjugado poderia ser administrado de maneira repetida, mas com diferentes radionuclídeos, por exemplo, a beta-radioimunoterapia poderia ser seguida por alfa- radioimunoterapia ou vice-versa.

[0210] Um aspecto da presente invenção refere-se ao uso do radioimunoconjugado da presente invenção para o tratamento de malignidades de células B.

[0211] Uma realização da presente invenção refere-se ao uso do radioimunoconjugado da presente invenção administrado em combinação com ou em adição a outra terapia.

[0212] Em uma realização da presente invenção, as outras terapias são selecionadas dentre pré-tratamento, quimioterapia, terapia de anticorpos monoclonais, cirurgia, radioterapia, e/ou terapia fotodinâmica.

[0213] Em outra realização da presente invenção, as outras terapias incluem transplante de medula óssea Ou transplante e/ou terapia de transplante de células-tronco.

[0214] Outra realização da presente invenção compreende pré-tratamento terapêutico utilizando anticorpo monoclonal anti-CD20 e/ou anti-CD37 antes do tratamento com o radioimunoconjugado da presente invenção.

[0215] Em uma realização da presente invenção, O pré-tratamento é feito pela administração do anticorpo quimérico da presente invenção seguida por tratamento por radioimunoconjugados do anticorpo quimérico de HHl ou radioimunoconjugados do anticorpo HHl.

[0216] Um aspecto da presente invenção refere-se a um método para o tratamento de uma malignidade de células B selecionada do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin de células B, leucemia linfocítica crônica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma linfoplasmocitário e mieloma múltiplo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica da presente invenção.

[0217] Em uma realização da presente invenção, os usos e métodos de tratamento da presente invenção são realizados in vitro ou ex vivo.

[0218] Em uma realização da presente invenção, a dosagem de anticorpos é 1 a 1000 mg por paciente, mais preferivelmente, 5 a 50 mg por paciente, e "Lu no montante de 1 a 200 MBqa/kg, mais preferivelmente, 10-100 MBq/kg de peso corporal.

[0219] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendendo o anticorpo quimérico ou humanizado da presente invenção podem ser utilizadas no esgotamento de células B que expressam CD37 em sua superfície.

[0220] Tais composições farmacêuticas podem ser utilizadas no tratamento de malignidades de células B.

[0221] Estas malignidades de células B podem ser selecionadas do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin de células B, leucemia linfocítica crônica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma linfoplasmocitário e mieloma múltiplo.

[0222] Uma realização da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo O anticorpo quimérico ou humanizado da presente invenção para uso no tratamento de doenças autoimunes ou inflamatórias que envolvem células B em sua patologia.

[0223] Outra realização da presente invenção refere-se a um método de esgotamento de células B que expressam CD37 de uma população de células, compreendendo a administração à dita população de células de uma molécula de anticorpo da presente invenção ou uma composição farmacêutica contendo tal molécula de anticorpo.

[0224] Ainda outra realização da presente invenção refere-se a um método para tratar um paciente que sofre de uma malignidade de células B selecionada do grupo que consiste em um linfoma não-Hodgkin de células B, leucemia linfocítica crônica de células B e mielona múltiplo compreendendo a administração ao dito paciente de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo quimérico ou humanizado da presente invenção.

[0225] Em uma realização especial, um HH1l quimérico ou humanizado é administrado a um paciente, antes de terapia com uma versão radiomarcada ou de imunotoxina de HH1l murino, quimérico ou humanizado, para bloquear células de tecido normais e melhorar a absorção de tumor.

[0226] A dosagem deve ser suficiente para bloquear absorção de tecido normal mas não excessiva, uma vez que isto reduziria a absorção de tumor. Por exemplo, o HH1l quimérico ou humanizado deve ser dado em uma dosagem entre 0,5 mg e 1 g por paciente.

[0227] Ele poderia ser dado, por exemplo, uma semana antes e/ou 1 a 5 horas antes da administração do radioimunoconjugado.

KITS

[0228] Um aspecto da presente invenção refere-se a um kit para a produção do radioimunoconjugado da presente invenção, compreendendo dois ou mais frascos, em que um frasco contém um conjugado compreendendo um quelante ligado a um anticorpo monoclonal murino HHl1; e um segundo frasco contém um radionuclídeo.

[0229] Um kit pode exigir que alguns procedimentos sejam realizados, por exemplo, radiomarcação e/ou purificação realizados antes da infusão.

[0230] Uma realização da presente invenção refere-se a um kit da presente invenção, em que o conteúdo de um ou diversos dos frascos está liofilizado ou em uma solução.

[0231] Ao misturar o conteúdo dos dois frascos para gerar o radioimunoconjugado, o produto final aparecerá. Assim, em outra realização da presente invenção, o radioimunoconjugado é gerado misturando o conteúdo dos dois frascos.

[0232] Este produto pode precisar de purificação antes do uso.

[0233] Deve ser observado que realizações e características descritas no contexto de um dos aspectos da presente invenção podem também se aplicar aos outros aspectos da invenção.

[0234] Todas as referências patentárias e não patentárias citadas no presente pedido de patente são incorporadas a este documento por referência na íntegra.

[0235] A invenção será agora descrita em maiores detalhes nos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 GERAÇÃO DE ANTICORPO QUIMÉRICO

[0236] Uma versão quimérica do anticorpo HHl foi feita utilizando vetores de expressão para o gene de região V.

[0237] Os vetores aceitam genes de cadeia VH e VL obtidos por RT-PCR.

[0238] Os genes V foram, em seguida, sequenciados e novos iniciadores específicos foram projetados para amplificar os genes V antes de serem clonados no vetor PLNOH2 contendo os genes de região constante de anticorpo de IgG humana (Cy3, Cyl e CHly3).

[0239] O vetor pL NOH2 incluindo as regiões constantes IgGlICHl (SEQ ID Nº 5), IgGlICH2 (SEQ ID Nº 6), IgGlICH3 (SEQ ID Nº 7) é mostrado no SEQ ID Nº 8.

[0240] A cadeia pesada e a cadeia leve dos vetores pLNOH2 (SEQ ID Nº 5) e pLNOK foram combinadas para fazer o vetor combi pLNOH2yl/xK aCD37. O gene de cadeia leve completo (SEQ ID Nº: 9), o promotor de CMV e o sinal polyA de PLNOK aCD37 foram subclonados para pLNOH2 hlgGl aCD37.

[0241] No vetor combi, as cadeias pesadas e leves são expressas a partir de seu próprio promotor de CMV.

IDENTIFICAÇÃO DE DOMÍNIO CONSTANTE

[0242] os domínios constantes na sequência PpPLNOH2 foram identificados na sequência de uma IgGl humana no banco de dados IMGT (número de acesso: 217370).

[0243] O gene e a sequência de proteínas das regiões variáveis do anticorpo anti-CD37 chHHl são conforme a seguir:

[0244] VH acCD37 (sequência de aminoácidos: SEQ ID Nº: 1 e uma sequência de ácido nucleico: SEQ ID Nº: 2)

[0245] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID Nº: 2):

[0246] gagatccagctgcagcagtctggacctgagctagtgaagec tggggetteagtgaaggtatectgcaaggettetggttacteatteactgactacaacato tactgggtgaagcagagccatggaaagagcettgagtggattaggatatattgatcettaca atggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgttgacaagte ctcecagceacagectteatecateteaacagectgacatetgaggactetgcagtetattac tgtgcaagatcecettatggteactatgcetataggactactggggteaaggaacctcagtea cegtetectea

[0247] Sequência de aminoácidos (SEQ ID Nº: 1):

[0248] EIQLOQSGPELVKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMYWVKQOSH

GKSLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAFIHLNSLTSEDSAVYYCARSPYG HYAMDYWGQOGTSVTVSS

[0249] VL aCD37 (sequência de aminoácidos: SEQ ID Nº: 3 e uma sequência de ácido nucleico: SEQ ID Nº: 4)

[0250] Sequência de ácido nucleico (SEQ ID Nº: 4):

[0251] gacattgtgatgacccagtctcacaaactettgtecacate agtaggagacagggtcagcatcaccetgcaaggecagteaggatgtgagtactgctgtagac tggtatcaacagaaaccaggacaatetectaaactactgattaactgggcatecacecgge acactggagtcccetgategetteacaggeagtggatetaggacagattatacteteaceat cagcagtatgcaggctgaagacetggeactttattactgtegacaacattatagecacteca ttcacgttcggeteggggacaaagttggaaataaaa

[0252] Sequência de aminoácidos (SEQ ID Nº: 3):

[0253] DIVMTOSHKLLSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVDWYQQOKPG

QSPKLLINWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSMQÇQAEDLALYYCROHYSTPFTFGSGT

KLEIK EXEMPLO 2 CITOMETRIA DE FLUXO PARA AVALIAR LIGAÇÃO

DE ANTÍGENO ANÁLISE DE LIGAÇÃO DE hchlgGl aacbD37 b(chHHl) A CÉLULAS DAUDI EXPRESSANDO CD37 CÉLULAS CORADAS E FIXADAS.

[0254] O chHHl construído foi analisado quanto à ligação ao alvo por citometria de fluxo. Células Daudi expressam CD37, e as células foram coradas com chHH1 ou h1gG1 aNIP. No painel esquerdo, as células Daudi intactas são selecionadas, e no painel direito, o histograma de fluorescência destas células coradas são mostradas. chHH1 se ligou às células Daudi que expressam CD37 (linha sólida) enquanto aNIP IgG; quimérico não (linha pontilhada).

EXEMPLO 3 RADIOMARCAÇÃO DE HH1l QUIMÉRICO

[0255] TIodação: Os anticorpos foram marcados com ***T através de iodação indireta utilizando tubos de iodação pré-revestidos IODOGEN (Pierce, Rockford, IL), de acordo com a descrição do fabricante.

[0256] Marcação com “In e Lu: Os anticorpos primeiro reagiram com um quelante (p-SCN-Bn-DTPA ou p-SCN-Bn- DOTA) .

[0257] O quelante DTPA ou DOTA foi dissolvido em HCl 0,05 M, e em seguida adicionado ao anticorpo, que teve pH ajustado a aproximadamente 8,5 por lavagem com tampão de carbonato, em uma proporção 5: l. o pH foi, em seguida, verificado novamente e, se necessário, ajustado. A solução foi agitada em 60 min a temperatura ambiente, e em seguida, a reação foi interrompida pela adição de 50 1pl de solução de glicina 200 mM (por mg de anticorpo).

[0258] Para remover o quelante livre, o anticorpo conjugado foi lavado 4-5 vezes com PBS (PAA), e em seguida, ajustado a pH 5 por lavagem com acetato de amônio. Vith ou Lu (Perkin Elmer, Boston, Ma, EUA) foi, em seguida, adicionado a DOTA-Ab 0,5 mg, e agitado por uma hora a 42 “C.

[0259] Finalmente, o produto foi purificado por eluição em uma coluna de filtração em gel, por exemplo, Sephadex G-25 PDIO (GE health) ou similar. O rendimento de marcação geral variou de 17% a 63%.

[0260] A qualidade dos radioimunoconjugados foi medida utilizando células de linfoma e um método de Lindmo modificado (Exemplo 4).

EXEMPLO 4 IMUNORREATIVIDADE

[0261] Histórico: A análise de imunorreatividade foi utilizada para medir a capacidade do anticorpo de se ligar a células-alvo antígeno-positivas.

[0262] Métodos: Dois paralelos de 5, 10, 40, 100 ou 300 milhões de células por ml em aproximadamente 0,3 ml foram utilizados.

[0263] Metade dos tubos receberam anticorpo não marcado a uma concentração de 0,5 mg/ml e incubados por 15 min. para bloquear o antígeno.

[0264] Em seguida, radioimunoconjugado 5-20 ng/ml foi adicionado a todos os tubos e a suspensão incubada a 4 ºC utilizando um agitador por aprox. 2 horas.

[0265] Em seguida, os tubos foram centrifugados e o sobrenadante removido e armazenado para contagem. As pelotas foram ressuspensas em PBS 1 ml e centrifugadas. Este procedimento de lavagem foi repetido duas vezes e os sobrenadantes agrupados. Os tubos contendo as pelotas ou os sobrenadantes agrupados foram contados em um contador gama.

[0266] A atividade de ligação específica foi calculada utilizando o seguinte: Contagens de pelotas não bloqueadas (PCN), contagens de sobrenadantes combinadas (CSC) e o total aplicado (TA) para cada amostra. A ligação específica (SB) foi calculada conforme a seguir: (PCN/TA)- (PCN/TA) bloqueado = SB.

[0267] Os valores de SB foram calculados para cada concentração de células e plotados em um gráfico recíproco duplo e a fração imunorreativa em acesso de antígeno infinito foi determinada de acordo com Lindmo et al (J Immunol Methods. 1984 3 de Ago;72(1) :77-89).

[0268] Resultados: As medições de dois lotes de HH1l quimérico marcado com “Lu forneceram imunorreatividades de 48,1% e 84,5%, respectivamente. Um lote de HHl quimérico marcado com “*I produziu uma imunorreatividade de 67,6%. Em conclusão, estes dados estão em bom acordo com os tipicamente encontrados para o HHl murino e que mostram que o HH1l quimérico tem uma capacidade de direcionamento a antígeno relevante.

EXEMPLO 5 LIGAÇÃO A CÉLULAS TUMORAIS IN VITRO

[0269] Introdução: Um ensaio de ligação foi realizado para determinar a constante de ligação de equilíbrio (Kg) de chHHl, o número médio de antígenos em células Daudi (Brmax) €& a constante de taxa de associação (k.) de chHHl (Dahle et al., 2007).

[0270] Materiais e métodos: chHHl foi marcado com ***I (exemplo 3). 5 milhões de células por ml em 0,4 ml de meio foram suspensas em tubos. Um paralelo de células foi bloqueado com chHHl não marcado 0,5 mg/ml por 15 minutos antes de adicionar chHHl marcado com *ºI. Um paralelo de células não foi bloqueado. Ambos os paralelos foram incubados com ***I-HH1 a 100, 1000, 5000 e 10000 ng/ml. As células foram incubadas por 5, 10, 20, 30 minutos e 1, 1,5 e 2 horas. Após incubação, as células foram lavadas com PBS com soro fetal de vitelo 5%. As células e o sobrenadante e as lavagens foram contados em um contador gama. O experimento foi repetido três vezes.

[0271] Resultados: Curvas de ligação típicas são mostradas na figura 2. A Ka de chHHl foi 3,0 +0,3, o Bmax de células Daudi foi 330000 + 4000 de antígenos de CD37 por célula e a k, de chHHl foi 0,36 + 0,03 nM/h. Os dados foram similares para HHl murino (Ka = 2,7 +0,3, Bmax = 340000 + 5000 CD37 antígenos por célula e k. 0,72 + 0,03 nM/h).

EXEMPLO 6 BIODISTRIBUIÇÃO E DIRECIONAMENTO AO TUMOR

EM CAMUNDONGOS

[0272] A biodistribuição de HH1l quimérico marcado com “Lu foi estudada em camundongos Balb/C nus machos.

[0273] Materiais e métodos: A radiomarcação foi realizada utilizando p-SCN-Bn-DOTA como um agente quelante bifuncional para complexar o radionuclídeo ao anticorpo (vide Exemplo 3). A preparação foi administrada por injeção na veia caudal de 100 ul de solução a cada animal.

[0274] Camundongos Balb/C nus machos com um peso corporal de 21 a 25 g foram utilizados.

[0275] Uma atividade de 120 kBq foi injetada em cada animal. Cinco animais foram utilizados por ponto no tempo. Autópsias foram realizadas após o deslocamento cervical em diversos pontos no tempo após injeção. O peso de cada amostra de tecido foi determinado, e “In foram medidos por um detector gama calibrado (detector auto-gama Cobra II, Packard Instrument Company, Meriden, CT, EUA). Amostras dos injetados foram utilizadas como referências nos procedimentos de medição.

[0276] Resultados: A biodistribuição de HHl MLu-quimérico em 1 hora, 20 horas e seis dias após injeção é apresentada na Tabela l1. Os dados mostram que o anticorpo possui uma biodistribuição relevante similar à observada com rituximabe radiomarcado (Dahle et al, 2006 Nucl Med Biol, 33, 2711-279). Em conclusão, a biodistribuição de HHl quimérico radiomarcado indica que o anticorpo possui propriedades relevantes para uso in vivo.

[0277] Tabela 1 Biodistribuição de HHl1 quimérico marcado com “Lu em camundongos Balb/C nus machos como porcentagem de dose injetada por grama t desvio padrão.

Baço 9,6 + 3,4 4,7 + 0,2 Intestino 3,1 + 0,7 1,7 + 0,1 1,3 + 0,3 smart Intestino 1,4 + 0,3 1,4 + 0,2 0,9 + 0,2 EXEMPLO 7 ENSAIO DE ADCC IN VITRO UTILIZANDO

MEDIÇÕES DE VIABILIDADE DE CITOMETRIA DE FLUXO

[0278] Histórico: A propriedade de ADCC de anticorpo HHl quimérico foi avaliada utilizando células exterminadoras naturais (NK) e células de linfoma Daudi.

[0279] Métodos: Sangue humano foi colhido de voluntários e tratado com Lymphoprep e Dynabeads para obter células NK isoladas. As células Daudi foram tratadas com DiOCl18 para corar as células.

[0280] Células-alvo Daudi foram marcadas com 10puL de DiOCl8 por 106 células-alvo/ml incubando por 30 minutos a 37ºC. As células foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas a 1 ml em meio de cultura de células.

[0281] As células Daudi tratadas com DiOC18 foram marcadas com anticorpo pela adição de HHl quimérico ou como um rituximabe de comparação em uma concentração de 10 g/ml e incubadas por 15 minutos em gelo antes de centrifugação e ressuspensão para remover o anticorpo não ligado.

[0282] Diversas quantidades de células NK foram diluídas para produzir concentrações de 4xl10º/ml (40: 1), 2x10º/ml (20: 1), lx10º/ml (10: 1) e 5x10º/ml (5: 1) em meio de cultura de células. Contracorante de Iodeto de Propídio foi preparado pela adição de 40 ul de meio de cultura para fazer a solução contracorante.

[0283] Células Daudi marcadas foram diluídas a 10º/ml em meio de cultura. O ensaio foi iniciado pela mistura de 50 ul de células efetoras e 50 ul de células Daudi em um tubo de reação.

[0284] Ao tubo de reação, foi adicionado 50upL de solução de PI. Após duas horas de incubação a 37 “C, a porcentagem de células Daudi sobreviventes foi avaliada utilizando citometria de fluxo.

[0285] Para chHH1, 11% das células Daudi morreram por ADCC, enquanto que para rituximabe, 15% das células morreram por ADCC. O percentual de indução de ADCC não foi significativamente diferente para os dois anticorpos (ver figura 3).

EXEMPLO 8 ENSAIO DE CÉLULAS DE ADCC IN VITRO

UTILIZANDO PBMC ESTIMULADAS POR INTERLEUCINA

[0286] Histórico: A atividade de ADCC de versões murinas e quiméricas de mAb HH1l foi avaliada por ensaio de liberação de Cr51.

[0287] Materiais e Métodos: A capacidade de HH1 murino e HHl quimérico de mediar a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) foi avaliada utilizando células Daudi como células-alvo e PBMCs humanas estimuladas por IL2 como células efetoras.

[0288] Células Daudi (linha celular de linfoma de Burkitt Humano) foram cultivadas em frascos de cultura de tecido (175 cm?) utilizando RPMI-1640, suplementadas com soro bovino fetal inativado por calor 10%, piruvato de sódio 1mM, L-glutamina 2 mM e Pen/Strep 1%. As culturas foram mantidas em uma concentração de células entre 3 x 10º e 1,5 x 10º/ml por sub-cultura com meio de cultura fresco 2 a 3 vezes por semana. Uma alíquota da cultura de células em uma densidade de células entre 0,5x10º/ml e 1,0x10º/ml é centrifugada (1200 rpm) por 5 min.

[0289] As células foram lavadas uma vez com tampão de lavagem (DPBS com FCS 2%) e peletizadas (1200 rpm; min). A pelota de células foi ressuspensa em meio de ensaio [RPMI c/ HEPES, FCS 10%) e a contagem de células foi determinada. A concentração de células foi ajustada a 1 x 10º/ml para marcação com cromo-51.

[0290] Aproximadamente 30 a 50 ml de sangue total coletado em vidro EDTA de doadores saudáveis foram utilizados para a isolação de PBMC. O sangue total foi diluído 1: 1 com DPBS (solução salina balanceada de Hanks sem cálcio e magnésio) em um tubo de 50 ml.

[0291] O sangue inteiro diluído foi disposto sobre Lymphoprep (Medinor) em uma proporção 2: 1 em um tubo de 50 ml e centrifugado a 1000xg por 20 min com frenagem lenta. As células mononucleares da interface foram aspiradas e lavadas duas vezes com DPBS (300x9g9, 10 min).

[0292] As células peletizadas foram gentilmente ressuspensas em meio de cultura (RPMI-1640 com soro bovino fetal inativado por calor 10%, Pen/Strep 1%) utilizando uma pipeta e a contagem de células foi determinada no contador de células.

[0293] A concentração de PBMC foi ajustada a 5 x 10º/ml e mantida em meio de cultura suplementado com IL-2 a 25ng/ml (eBiosciences) e foram cultivadas em prato de cultura de 6 poços a 37ºC em incubadora de CO; por 3 dias. As PBMC estimuladas por IL-2 foram coletadas, contadas e ressuspensas em meio de ensaio [RPMI c/ HEPES, FCS 10%) em uma concentração de 1,5 x 10º/ml.

[0294] 1 x 10º células Daudi foram marcadas com cromo-51 (Cr51) 3,7 MBg em um volume de 1 ml a 37 ºC por 1 hora.

[0295] As células marcadas foram lavadas em DPBS com FCS 2% três vezes por centrifugação (2000 rpm em 5 min).

[0296] As células marcadas foram aliquotadas em volumes iguais para ligação de HHl murino e quimérico incluindo um controle sem anticorpo presente. Todas as amostras foram incubadas a 37º C por 10 min, e em seguida, lavadas duas vezes em DPBS com FCS 2% três vezes por centrifugação (2000 rpm em 5 min).

[0297] O co-cultivo de células efetoras com células-alvo foi realizado em triplicatas em placas de microtitulação de fundo redondo de 96 poços em um volume final de 200 ul.

[0298] Primeiro, 10.000 células-alvo em um volume de 100 ul em meio de ensaio foram revestidas, seguido por células efetoras em um volume de 100 ul em diferentes concentrações para atingir as proporções de células efetoras:alvo ensaiadas.

[0299] Como um controle, as células-alvo foram cultivadas em meio de ensaio sozinho (lise espontânea) ou em meio de ensaio suplementado com Triton %X*X-100 1% (lise máxima).

[0300] A co-cultura foi incubada a 37º C em uma incubadora de CO, úmida por 4 horas. O efeito citotóxico foi medido por liberação de Cr51 no sobrenadante. No final da incubação, as células foram removidas do meio de cultura por centrifugação (1500 rpm; 5 min) em temperatura ambiente). Os sobrenadantes livres de células (100 ul /poço) foram transferidos em 96 microtubos de 0,2 ml correspondentes. A quantidade de liberação de Cr51 foi medida pela contagem em um contador gama Packard Cobra II.

[0301] Resultados: Os resultados do experimento são apresentados na Tabela 2. Conforme mostrado, a lise celular de células Daudi pré-tratadas com HHl quimérico foi significativa para todos os três doadores de sangue.

[0302] O pré-tratamento com HHl murino não pareceu causar nenhuma lise significativa comparado com células Daudi não pré-tratadas com anticorpo.

[0303] Tabela 2. Lise celular in vitro após tratamento com células efetoras PBMC estimuladas com interleucina versus células-alvo de linfoma de Daudi com pré- tratamento com anticorpo anti-CD37.

Proporção HH1 quimérico (& de | HH1l murino (% de lise) 40: 1 159,2% 122,6- 106,5% 99,4- E e |

10: 1 177,9% 133,8- 105,5% 100,7-

FE EEE

[0304] Células efetoras de três indivíduos. Os dados foram normalizados à lise celular medida sem anticorpo, o que foi escolhido como 100%.

[0305] Conclusão: Quando ensaiado utilizando PBMC humanas in vitro, o HHl quimérico causa uma ADCC significativa em termos de lise celular em células de linfoma in vitro enquanto HHl murino não afetou nenhum efeito de lise celular significativo comparado com nenhum tratamento.

EXEMPLO 9 COMPARAÇÃO DE LIGAÇÃO ENTRE HH1 QUIMÉRICO

E MURINO

[0306] Para avaliar se o HHl quimérico tinha retido a capacidade de ligação de antígeno e epítopo, as células foram saturadas com HHl quimérico e murino e, em seguida, a capacidade de bloquear a ligação de HHl radiomarcado foi avaliada.

[0307] Materiais e métodos: Uma suspensão de células Daudi foi distribuída dentre 6 tubos com 1,7 milhão de células em 0,2 ml de PBS em cada tubo. Os tubos 1 e 2 foram mantidos sem bloqueio, os tubos 3 e 4 foram bloqueados por adição de 3 ug de HHl1 em 5 ul e os tubos 5 e 6 receberam 3 ug de HH1 quimérico em 5 ul.

[0308] Os tubos foram incubados por 10 minutos e, em seguida, receberam 2 ng de HHl marcado com 1251 e adicionalmente incubados por 40 minutos a temperatura ambiente utilizando um agitador de células.

[0309] A atividade total em cada tubo foi medida utilizando um contador gama LKB e, em seguida, as células foram lavadas três vezes com 1 ml de PBS com BSA 0,5% e DTPA

1 mM. As pelotas finais foram contadas quanto à radioatividade para determinar a atividade ligada à célula.

[0310] Resultados: Foi descoberto que as células não bloqueadas retiveram 42,7% da atividade (intervalo de 42,7%-42,7%). As células bloqueadas com HH1 retiveram 1,6% da atividade (intervalo 1,4%-1,8%). As células bloqueadas com HHl quimérico retiveram 1,3% da atividade (intervalo 1,1%- 1,5%).

[0311] Em conclusão, a ligação de HHl murino é bloqueada de maneira altamente eficiente com HHl1 quimérico e igual ao bloqueio com HHl murino, indicando que a capacidade de ligação de antígeno e epítopo é mantida para a versão quimérica de HH1.

[0312] Isto também indica que o HHl quimérico poderia ser útil como pré-tratamento para bloqueio de antígeno CD37 em tecidos normais antes de terapia com versões de radioimunoconjugado ou imunotoxina de HH1l.

EXEMPLO 10: ADCC PARA ChHH1.1 COM CÉLULAS REC-1 COMO CÉLULAS-ALVO

[0313] Materiais e métodos:

[0314] Sangue foi coletado de três indivíduos saudáveis em vidros de EDTA e utilizado para isolação de células mononucleares de sangue periférico (PBMC). O sangue total foi diluído 1:1 com DPBS (DPBS, Hyclone, Thermo Scientific, EUA) em um tubo de 50 ml. O sangue inteiro diluído foi disposto sobre Lymphoprep (Medinor, Noruega) em uma proporção 2: 1 em um tubo de 50 ml e centrifugado a 1000xg por 20 min com frenagem lenta.

[0315] As células mononucleares da interface foram aspiradas e lavadas duas vezes com DPBS (300xg, 10 min). As células peletizadas foram gentilmente ressuspensas em meio de cultura (RPMI-1640 com soro bovino fetal inativado por calor 10%) utilizando uma pipeta e a contagem de células foi determinada no contador de células.

[0316] As PBMC foram estimuladas com IL-2 recombinante humano de 25 ng/ml (eBiosciences) por 3 dias.

[0317] Células de linfoma de células do manto Rec-l (LG Standards, Boras, Suécia) foram utilizadas como células-alvo no ensaio de citotoxicidade. Elas foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos (175 em?) utilizando RPMI-1640 (Hyclone, Thermo Scientific, EUA), suplementadas com soro bovino fetal inativado por calor 10% (PAA, Thermo Scientific, EUA).

[0318] A pelota de células foi ressuspensa em meio de ensaio (RPMI, FCS 10%) e a contagem de células foi determinada. A concentração de células foi ajustada a 5 x 10º/ml para marcação com cromo-51.

[0319] 5 x 10º células foram marcadas com cromo- 51 (Cr) (PerkinElmer, Países Baixos) 3,7 MBq em um volume de 1 ml a 37 ºC por 1 hora. As células marcadas foram lavadas três vezes em DPBS com FCS 2% três vezes por centrifugação (2000 rpm em 5 min).

[0320] As células marcadas foram aliquotadas em volumes iguais para ligação de HHl murino 20 g/ml, rituximabe g/ml, chHH1.1 20 g/ml (isotipo IgGl) ou uma combinação de rituximabe 20 g/ml e chHHl.1 20 g/ml incluindo um controle sem anticorpo presente. Todas as amostras foram incubadas a 37º C por 10 min, e em seguida, lavadas duas vezes em DPBS com FCS 2% três vezes por centrifugação (2000 rpm em 5 min).

[0321] As células efetoras foram cultivadas com células-alvo em uma relação de 40: 1, 20: 1 ou 10: 1 em placas de microtitulação de fundo redondo de 96 poços em um volume final de 200 pl. Primeiro, 10.000 células-alvo em um volume de 100 ul em meio de ensaio são revestidas, seguido por PBMC humanas em um volume de 100 ul. Como controles, as células-alvo foram cultivadas em meio de ensaio sozinho (lise espontânea) e em meio de ensaio suplementado com Triton X-100 1% (lise máxima; liberação total).

[0322] Todas as amostras foram executadas em triplicatas. A co-cultura foi incubada a 37º C em uma incubadora de CO; úmida por 4 horas. O efeito citotóxico foi medido por liberação de “Cr no sobrenadante. No final da incubação, as células foram removidas do meio de cultura por centrifugação (1500 rpm; 5 min) em temperatura ambiente). Os sobrenadantes livres de células (150 ul /poço) foram transferidos em 96 microtubos de 0,2 ml correspondentes. A quantidade 51Cr liberada foi medida por um contador gama (Cobra II, Packard, land).

[0323] A porcentagem de lise foi calculada com a seguinte equação: 100 x (liberação experimental - liberação espontânea) / (liberação total - liberação espontânea).

[0324] A liberação experimental sendo o valor médio das réplicas de um mesmo tratamento. Amostras em triplicada para liberação espontânea e liberação total foram executadas para cada grupo de tratamento com anticorpo, e os valores médios foram utilizados para as amostras experimentais do respectivo tratamento com anticorpo.

[0325] Resultados:

[0326] A Figura 4 mostra que chHHl1.1 foi tão bom quanto rituximabe e ligeiramente melhor que o HHl murino na indução de lise específica por ADCC em células Rec-l. A combinação de chHHl e rituximabe produz uma lise específica mais alta do que o tratamento com os dois anticorpos sozinhos.

[0327] Conclusão:

[0328] A ADCC é um mecanismo de ação ativo para chHH1.1 em células Rec-l. O tratamento em combinação com rituximabe e chHHl.1 forneceu ADCC ligeiramente mais alto que qualquer anticorpo sozinho.

EXEMPLO 11: CDC PARA ChHH1.1 COM CÉLULAS REC-1 COMO CÉLULAS-ALVO

[0329] Materiais e métodos:

[0330] Sangue foi coletado de três indivíduos saudáveis e o soro foi isolado por centrifugação.

[0331] Células de linfoma de células do manto Rec-l (LG Standards, Boras, Suécia) foram utilizadas como células-alvo no ensaio de citotoxicidade. Elas foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos (175 cm?) utilizando RPMI-1640 (Hyclone, Thermo Scientific, EUA) suplementadas com soro bovino fetal inativado por calor 10% (PAA, Thermo Scientific, EUA).

[0332] A pelota de células foi ressuspensa em meio de ensaio (RPMI, FCS 10%) e a contagem de células foi determinada. A concentração de células foi ajustada a 5 x 10º/ml para marcação com cromo-51.

[0333] 5 x 10º células foram marcadas com cromo- 51 (PCcr) (PerkinElmer, Países Baixos) 3,7 MBq em um volume de 1 ml a 37 ºC por 1 hora. As células marcadas foram lavadas três vezes em DPBS com FCS 2% três vezes por centrifugação (2000 rpm em 5 min). As células marcadas foram aliquotadas em volumes iguais para ligação de HH1 murino 20 g/ml, rituximabe ug/ml, chHH1.1 20 g/ml (isotipo IgGl) ou uma combinação de rituximabe 20 g/ml e chHHl1.1 20 g/ml incluindo um controle sem anticorpo presente. Todas as amostras foram incubadas a 37º C por 10 min, e em seguida, lavadas duas vezes em DPBS com FCS 2% três vezes por centrifugação (2000 rpm em 5 min).

[0334] As células-alvo foram cultivadas com soro 10% em placas de microtitulação de fundo redondo de 96 poços em um volume final de 200 ul. Como controles, as células-alvo foram cultivadas em meio de ensaio sozinho (lise espontânea) e em meio de ensaio suplementado com Triton X-100 1% (lise máxima; liberação total).

[0335] Todas as amostras foram executadas em triplicatas. A co-cultura foi incubada a 37º C em uma incubadora de CO, úmida por 2 horas. O efeito citotóxico foi medido por liberação de 51Cr no sobrenadante. No final da incubação, as células foram removidas do meio de cultura por centrifugação (1500 rpm; 5 min) em temperatura ambiente). Os sobrenadantes livres de células (150 ul/poço) foram transferidos em 96 microtubos de 0,2 ml correspondentes. A quantidade “*'Cr liberada foi medida por um contador gama (Cobra II, Packard, land).

[0336] A porcentagem de lise foi calculada com a seguinte equação: 100 x (liberação experimental - liberação espontânea) / (liberação total - liberação espontânea).

[0337] A liberação experimental é o valor médio das réplicas de um tratamento de amostra. Amostras em triplicada para liberação espontânea e liberação total foram executadas para cada grupo de tratamento com anticorpo, e os valores médios foram utilizados para as amostras experimentais do respectivo tratamento com anticorpo.

[0338] Resultados:

[0339] A Figura 5 mostra que chHH1.1 não funciona através de um mecanismo de CDC sozinho, mas chHH1.1 e rituximabe juntos tiveram um maior efeito em lise específica do que o efeito somado de rituximabe e chHH1l.1 sozinhos.

[0340] Conclusão:

[0341] CDC não é um mecanismo de ação ativo para chHH1.1 sozinho. Houve, entretanto, um efeito sinérgico de co-tratamento com chHH1.1 e rituximabe.

EXEMPLO 12: LIGAÇÃO DE ºI-ChHH1.3 A CÉLULAS RAMOS

[0342] Materiais e métodos:

[0343] HH1l quimérico com isotipo IgG3 (chHH1.3) e HHl murino (mHHl) foram radiomarcados com ST utilizando método de iodação indireta de acordo com o método fornecido pelo fabricante de tubos de iodação (Pierce, Reino Unido). Em um experimento, células Ramos foram bloqueadas com 20 mg de chHH1.3 ou mHHl e radiomarcadas com “I-chHHl.3 para medir a ligação não específica.

[0344] Em outro experimento, células Ramos foram bloqueadas com 20 mg de chHHl.3, mHHl ou chHHl.l e radiomarcadas com “I-mHHl para medir a ligação não específica. A ligação a células não bloqueadas foi utilizada em ambos os experimentos para medir a ligação total.

[0345] A sequência de Fc de chHH1.3 de DNA com mutação de cadeia pesada de comprimento total pode ser vista como SEQ ID Nº: 10.

[0346] A sequência de Fc de chHH1.3 de aminoácido com mutação de cadeia leve de comprimento total pode ser vista como SEQ ID Nº: 11.

[0347] A sequência de Fc de chHH1.3 de DNA com mutação de cadeia pesada de comprimento total pode ser vista como SEQ ID Nº: 12.

[0348] A sequência de Fe de chHH1.3 de aminoácido com mutação de cadeia leve de comprimento total pode ser vista como SEQ ID Nº:13.

[0349] A sequência de Fc de chHH1.3 sem mutação (região constante) pode ser vista como SEQ ID Nº: 14.

[0350] Resultados:

[0351] Quando células Ramos não bloqueadas foram radiomarcadas com “I-chHH1.3, a ligação total foi 81%, e quando células Ramos foram radiomarcadas com (“I-mHHl, a ligação total foi 77%. Entretanto, quando células bloqueadas com chHH1.3 ou mHHl foram radiomarcadas com "ST-ChHH1.3, a ligação não específica foi 0,8% e 44%, respectivamente, indicando que chHH1.3 possui maior afinidade do que mHHl para o antígeno CD37. Além disso, quando células bloqueadas com chHH1.3, mHHl ou chHHl.1 foram radiomarcadas com 1ST-mHH1, a ligação não específica foi 0,3%, 0,5% e 0,7%, respectivamente, indicando que os três anticorpos se ligam ao mesmo epítopo no antígeno CD37.

[0352] Tabela 3. Ligação de ST-ChHH1.3 e 1251- mHH1 a células Ramos RIC Não Bloqueadas com anticorpo frio 20

[0353] Conclusão:

[0354] Os resultados indicaram que mHH1, chHH1l.1 e chHH1.3 se ligam ao mesmo epítopo de CD37. Inesperadamente, a afinidade de chHH1.3 foi mais alta que para mHH1.

EXEMPLO 13: BIODISTRIBUIÇÃO DE *“I-chHHl.3 EM

CAMUNDONGOS NUS

[0355] Materiais e métodos:

[0356] HHl quimérico com isotipo IgG3 (chHH1l.3 foi radiomarcado com (“II utilizando método de iodação indireta de acordo com o método fornecido pelo fabricante de tubos de iodação (Pierce, Reino Unido).

[0357] As preparações foram administradas por injeção na veia caudal de 100 ul de solução a cada animal. Uma atividade de 600 kBq foi injetada por camundongo. Dois animais foram utilizados por ponto no tempo. Autópsias foram realizadas após o deslocamento cervical 24 horas e 48 horas após injeção. O peso de cada amostra de tecido foi determinado, e a atividade de **T em cada amostra de órgão foi medida por um detector gama calibrado (detector auto-gama Cobra II, Packard Instrument Company, Meriden, CT, EUA). Amostras dos injetados foram utilizadas como referências nos procedimentos de medição. As porcentagens corrigidas por decaimento da dose injetada por grama de tecido (%ID/g) foram calculadas para cada ponto no tempo.

[0358] Resultados e conclusão:

[0359] o anticorpo chHH1.3 apresentou uma distribuição relevante em camundongos nus (Figura 6).

[0360] Figura 6. Biodistribuição (% I.D./g) de "T-chHH1.3 em camundongos nus fêmeas 24 e 48 horas após injeção.

EXEMPLO 14: ATIVIDADE DE ADCC E CDC DE chHHl1.3 EM

CÉLULAS DAUDI

[0361] Materiais e métodos:

[0362] Experimentos de ADCC e CDC foram realizados utilizando os mesmos procedimentos descritos nos Exemplos 10 e 11, exceto que um soro comercialmente disponível foi utilizado para o ensaio de CDC e que as PBMC foram estimuladas durante a noite com IL-2 recombinante humano a 25 ng/ml (eBiosciences) antes de isolação de células exterminadoras naturais utilizando o mesmo ensaio descrito no Exemplo 7. Para isolação de PBMC, o sangue foi coletado de dois indivíduos em tubos de EDTA.

[0363] Células de linfoma Daudi (LG standards, Boras, Suécia) (células-alvo) foram utilizadas como células- alvo no ensaio de citotoxicidade. Elas foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos (175 em?) utilizando RPMI-1640 (Hyclone, Thermo Scientific, EUA), suplementadas com soro bovino fetal inativado por calor 10% (PAA, Thermo Scientific, EUA).

[0364] A pelota de células foi ressuspensa em meio de ensaio (RPMI, FCS 10%) e a contagem de células foi determinada. A concentração de células foi ajustada a 5 x 10º/ml para marcação com cromo-51.

[0365] 5 x 10º células Daudi foram marcadas com cromo-51 (Cr) (PerkinElmer, Países Baixos) 4 MBq em um volume de 1 ml a 37 ºC por 1 hora. As células marcadas foram lavadas três vezes em DPBS com FCS 2% três vezes por centrifugação (2000 rpm em 5 min). As células marcadas foram aliquotadas em volumes iguais para ligação de anticorpo chHH1.3 a 20 mg/ml ou uma combinação de chHH1.3 e rituximabe, ambos 20 mg/ml, e um controle sem anticorpo. Todas as amostras foram incubadas a 37º C por 10 min, e em seguida, lavadas duas vezes em DPBS com FCS 2% três vezes por centrifugação (2000 rpm em 5 min).

[0366] Para o ensaio de CDC, as células-alvo Daudi foram cultivadas com soro 10 e 30% em placas de microtitulação de fundo redondo de 96 poços em um volume final de 200 pl. Para ADCC, as células efetoras NK foram cultivadas com células-alvo Daudi em uma proporção de 10: 1 (indivíduo 1) ou 15: 1 (indivíduo 2) em placas de microtitulação de fundo redondo de 96 poços em um volume final de 200 ul.

[0367] Como controles, as células-alvo foram cultivadas em meio de ensaio sozinho (lise espontânea) e em meio de ensaio suplementado com Triton X-100 1% (lise máxima; liberação total).

[0368] Todas as amostras foram executadas em triplicatas. A co-cultura foi incubada a 37º C em uma incubadora de CO, úmida por 2 horas. O efeito citotóxico foi medido por liberação de “Cr no sobrenadante. No final da incubação, as células foram removidas do meio de cultura por centrifugação (1500 rpm; 5 min) em temperatura ambiente). Os sobrenadantes livres de células (150 ul /poço) foram transferidos em 96 microtubos de 0,2 ml correspondentes. A quantidade “Cr liberada foi medida por um contador gama (Cobra II, Packard, land).

[0369] A porcentagem de lise foi calculada com a seguinte equação: 100 x (liberação experimental - liberação espontânea) /(liberação total - liberação espontânea).

[0370] A liberação experimental é o valor médio das réplicas de um tratamento de amostra. Amostras em triplicada para liberação espontânea e liberação total foram executadas para cada grupo de tratamento com anticorpo, e os valores médios foram utilizados para as amostras experimentais do respectivo tratamento com anticorpo.

[0371] Resultados:

[0372] O anticorpo chHHl.3 não induziu lise específica em células de linfoma B Daudi pelo mecanismo de CDC. Houve, entretanto, um claro efeito do anticorpo chHH1.3 em lise específica em células Daudi pelo mecanismo de ADCC (Figura 7).

[0373] Conclusão:

[0374] CDC não é um mecanismo ativo, enquanto ADCC é um mecanismo ativo para chHH1.3 com células Daudi como alvo.

Claims

ESCLARECIMENTOS referentes ao pedido de patente brasileiro BR 11 2014 014258 O, apresentado na fase nacional em 11 de junho de 2014, sob petição nº 860140092091, intitulado: “MOLÉCULA DE ANTICORPO QUE SE LIGA A CD37 HUMANO; ANTICORPO; MOLÉCULA DE DNA; VETOR DE EXPRESSÃO; CÉLULA HOSPEDEIRA; MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO; COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA; MÉTODO DE ESGOTAMENTO DE CÉLULAS B QUE EXPRESSAM CD37 DENTRE UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS; RADIOIMUNOCONJUGADO QUE SE LIGA A CD37 HUMANO; MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA MALIGNIDADE DE CÉLULA B; KIT PARA A PRODUÇÃO DO RADIOIMUNOCONJUGADO; E PREPARAÇÃO INJETÁVEL DE ANTICORPO HH QUIMÉRICO OU HUMANIZADO PARA USO NO PRÉ-TRATAMENTO DE UMA MALIGNIDADE DE CÉLULA B”, depositado por NORDIC NANOVECTOR AS.

De acordo com os artigos 216 e 32 da Lei nº 9.279, de 14 de maio de 1996, e de acordo com a Instrução Normativa IN 31/2013, de 04 de dezembro de 2013, a Requerente vem informar que o presente pedido tem NOVO procurador, tal como se comprova pelo documento procuratório em anexo, e apresentar, tempestivamente, os seguintes documentos: 1) Procuração em nome de NORDIC NANOVECTOR AS. conferindo poderes à agente de propriedade industrial LEONOR MAGALHÃES PERES GALVÃO DE BOTTON, para representar a titular em relação ao pedido em epígrafe; e 2) Novo quadro reivindicatório contendo 20 reivindicações Nesse sentido, solicita a Requerente que, em todas as demais publicações do caso e no banco de dados do sítio eletrônico do INPI, passe a constar o nome da referida procuradora nomeada pelo instrumento de procuração anexo.

LEONOR MAGALHÃES PERES GALVÃO DE BOTTON API No. 2194

DECLARAÇÃO DE AUTENTICIDADE Eu, LEONOR MAGALHÃES PERES GALVÃO DE BOTTON, portuguesa, divorciada, agente da propriedade industrial inscrita sob o nº 2194, portadora da cédula de identidade de estrangeiro RNE nº V366343-5, expedida pelo CIMCRE/CGPMAF, inscrita no CPF/MF sob o nº 227.825.808-76, domiciliada e residente no Rio de Janeiro, com escritório na Praia de botafogo, 228, ala a, 16 andar, 22250-145 — Rio de Janeiro/RJ, declaro, sob as penas da lei, que a(s) cópia(s) nesta oportunidade apresentada(s) ao Instituto Nacional da Propriedade Industrial constituilem) reprodução fidedigna do(s) documento(s) original(is) do(s) qual(is) foi(ram) extraída(s).

LEONOR MAGALHÃES PERES GALVÃO DE BOTTON API nº 2194