BRPI0608927A2 - anticorpo que se liga a cd38 humano, peptìdeo, anticorpo monoclonal humano isolado, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, hibridoma, transfectoma, célula hospedeira eucarióptica ou procarióptica, imunoconjugado, molécula bi-especìfica ou multi-especìfica, composição farmacêutica, uso de um peptìdeo, imunoconjugado, composição farmacêutica ou um vetor de expressão, método in vitro para detectar a presença de antìgeno de cd38, ou uma célula que expresse cd38, em uma amostra, kit, anticorpo anti-idiotìpico, e, uso de um anticorpo anti-idiotìpico - Google Patents

anticorpo que se liga a cd38 humano, peptìdeo, anticorpo monoclonal humano isolado, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, hibridoma, transfectoma, célula hospedeira eucarióptica ou procarióptica, imunoconjugado, molécula bi-especìfica ou multi-especìfica, composição farmacêutica, uso de um peptìdeo, imunoconjugado, composição farmacêutica ou um vetor de expressão, método in vitro para detectar a presença de antìgeno de cd38, ou uma célula que expresse cd38, em uma amostra, kit, anticorpo anti-idiotìpico, e, uso de um anticorpo anti-idiotìpico Download PDF

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Abstract

ANTICORPO QUE SE LIGA A CD38 HUMANO, PEPTìDEO, ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO, áCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSãO, HIBRIDOMA, TRANSFECTOMA, CéLULA HOSPEDEIRA BUCARIOPTICA OU PROCARJóPTICA, IMUNOCONJUGADO, MOLéCULA BI-ESPECìFICA OU MULTI-ESPECìFICA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, USO DE UM PEPTìDEO, IMUNOCONJUGADO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA OU UM VETOR DE EXPRESSãO, METODO IN VITRO PARA DETECTAR A PRESENçA DE ANTìGENO DE CD38, OU UMA CéLULA QUE EXPRESSE CD38, EM UMA AMOSTRA, KIT, ANTICORPO ANTI-IDIOTìPICO, E, USO DE UM ANTICORPO ANTI- IDIOTìPICO Anticorpos monoclonais humanos isolados que se ligam aCD38 humano, e composições e moléculas com base em anticorpo relacionadas, são divulgados. Também divulgados são composições farmacêuticas que compreendam os anticorpos humanos, e métodosterapêuticos e de diagnóstico para usar os anticorpos humanos.

Description

"ANTICORPO QUE SE LIGA A CD38 HUMANO, PEPTÍDEO,ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO, ÁCIDONUCLEICO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, HIBRIDOMA,TRANSFECTOMA, CÉLULA HOSPEDEIRA EUCARIÓPTICA OUPROCARIÓPTICA, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULA BI-ESPECÍFICAOU MULTI-ESPECÍFICA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DEUM PEPTÍDEO, IMUNOCONJUGADO, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA OU UM VETOR DE EXPRESSÃO, MÉTODO INVITRO PARA DETECTAR A PRESENÇA DE ANTÍGENO DE CD38, OUUMA CÉLULA QUE EXPRESSE CD38, EM UMA AMOSTRA, KIT,ANTICORPO ANTI-IDIOTÍPICO, E, USO DE UM ANTICORPO ANTI-IDIOTÍPICO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito aos anticorpos que ligamCD38, anticorpos estes que têm características específicas e que são úteis paratratar inter alia mieloma múltiplo.
FUNDAMENTOS
O mieloma múltiplo é uma malignidade de célula Bcaracterizada pelo acúmulo latente na medula óssea de células plasmáticassecretoras com um índice proliferativo baixo e um período de vidaprolongado. A doença basicamente ataca ossos e medula óssea, resultando emtumores múltiplos e lesões por todo o sistema esqueletal.
Aproximadamente 1 % de todos os cânceres eaproximadamente mais do que 10 % de todas as malignidades hematológicas,podem ser atribuídas ao mieloma múltiplo (MM). A incidência de MMaumenta na população envelhecida, com a idade média no momento dodiagnóstico sendo de cerca de 61 anos.
As terapias correntemente disponíveis para mieloma múltiploincluem quimioterapia, transplante de célula tronco, Thalomid® (talidomida),Velcade® (bortezomib), Aredia® (pamidronato) e Zometa® (ácidozoledrônico). Os protocolos de tratamento correntes, que incluem umacombinação de agentes quimioterapêuticos tais como vincristina, BCNU,melfalan, ciclofosfamida, adriamicina e prednisona ou dexametasona, produzuma taxa de remissão completa de apenas cerca de 5 % e a sobrevivênciamédia é de aproximadamente 36 a 48 meses a partir do momento dodiagnóstico. Avanços recentes usando quimioterapia de alta dose seguida pelotransplante autológo de medula óssea ou célula mononuclear de sangueperiférico têm aumentado a taxa de remissão completa e a duração daremissão. Contudo a sobrevivência global tem sido apenas levementeprolongada e nenhuma evidência quanto a uma cura foi obtida. Por fim, todosos pacientes MM reincidem, mesmo sob a terapia de manutenção cominterferon-alfa (EFN-α) sozinho ou em combinação com esteróides.
A eficácia dos regimes de tratamento quimioterapêuticodisponível para MM é limitada pela taxa de proliferação de célula baixa edesenvolvimento de resistência a multi-medicamento. Para mais do que 90 %dos pacientes MM, a doença torna-se quimioresistente. Como um resultado,regimes de tratamento alternativos dirigidos aos antígenos de superfíciealvejando a imunoterapia adotiva em células plasmáticas estão sendoprocurados.
CD38 é um exemplo de um antígeno expressado em taiscélulas plasmáticas malignas e é expressado em uma variedade de doençashematológicas malignas, incluindo mas não restritas a mieloma múltiplo,leucemia linfocítica crônica de célula B, leucemia linfocítica aguda de célulaB, macroglobulinemia de Waldenstrõm, amiloidose sistêmica primária,linfoma de célula do manto, leucemia prolinfocítica/ mielocítica, leucemiamielóide aguda, leucemia mielóide crônica, linfoma folicular, leucemia decélula NK e leucemia de célula plasmática. A expressão de CD38 foi descritaem células epiteliais/endoteliais de origem diferente, incluindo o epitélioglandular na próstata, células das ilhotas no pâncreas, epitélio dutal nasglândulas, incluindo a glândula parótida, células epiteliais brônquicas, célulasem testículos e ovário e epitélio tumoral no adenocarcinoma colorretal.Doenças, onde a expressão de CD38 pode estar envolvida, incluem mas nãosão restritas a carcinomas bronco-epiteliais do pulmão, câncer de mama (queevolui da proliferação maligna de revestimento epitelial em dutos e lóbulos damama), tumores pancreáticos, que evoluem das células b (insulinomas),tumores que evoluem do epitélio no intestino (por exemplo, adenocarcinomae carcinoma de célula escamosa). No CNS, os neuroblastomas expressamCD38. Outras doenças incluem carcinoma na glândula prostática, seminomasnos testículos e cânceres ovarianos.
Normalmente, CD38 é expressado pelas célulashematopoiéticas e em tecidos sólidos. Com respeito às célulashematopoiéticas, a maioria de timócitos medulares são CD38 as células T eB em repouso e circulantes são CD38" e as células ativadas são CD38+. CD38também é expressado em aproximadamente 80 % das células NK em repousoe monócitos e em linfoblastos do centro germinal de linfonodo, células Bplasmáticas e algumas células intrafoliculares. CD38 também pode serexpressado pelas células dendríticas. Uma proporção significante de célulasda medula óssea normais, células precursoras particulares, expressam CD38.
Além disso, 50 a 80 % de células sangüíneas do cordão umbilical são CD38+ epermanecem assim no sangue humano durante os primeiros dois a três anosde vida. Além das células precursoras de linfóide, CD38 também éexpressado em eritrócitos e em plaquetas.
Com respeito aos tecidos sólidos, CD38 é expressado nointestino pelas células intra-epiteliais e linfócitos da lâmina própria, pelascélulas de Purkinje e emaranhados neurofibrilares no cérebro, pelas célulasepiteliais na próstata, células β no pâncreas, osteoclastos no osso, célulasretinais no olho e sarcolema de músculos liso e estriado.
As funções atribuídas ao CD38 incluem tanto a mediação dereceptor nos eventos de adesão e sinalização e atividade (ecto-) enzimática.Como uma ectoenzima, CD38 usa NAD + como substrato para a formação deADP-ribose cíclica (cADPR) e ADPR, mas também de nicotinamida e ácidonicotínico-adenina dinucleotídeo fosfato (NAADP). cADPR foi mostradoatuar como segundo mensageiro para a mobilização de Ca a partir doretículo endoplasmático. Além da sinalização por intermédio de Ca2+, asinalização de CD38 ocorre por intermédio da conversa cruzada comcomplexos de antígeno-receptor nas células T e B ou outros tipos decomplexos de receptor, por exemplo, as moléculas MHC e está deste modoenvolvida em diversas respostas celulares, mas também na comutação esecreção de IgGl.
Os anticorpos anti-CD38 são descritos na literatura, porexemplo em Lande R, et ai, Cell Immunol. 220(1), 30-8 (2002), AusielloCM, et ai, Tissue Antigens. 56(6), 53947 (2000) e Cotner T, et ai, Int JImmunopharmacol. 3(3), 255-68 (1981). CD38 tem várias funções, quepodem ser ativadas ou não por uma molécula que se liga o CD38. Porexemplo o anticorpo anti-CD38 de camundongo IB4 tem propriedadesagonísticas em relação o CD38. IB4 é mostrado induzir a ativação de célula Tcomo indicado pela mobilização de Ca em células Jukart (Zubiaur M, et ai.,J Immunol. 159(1), 193-205 (1997), induzir proliferação significante decélulas mononucleares do sangue periférico (PBMCs), induzir a liberação deníveis significantes de IL-6 e induzir a liberação de níveis de IFN-γdetectáveis (Lande, Zubiaur Morra, Ansiello supra).
SUMÁRIO DA INVENÇÃOA presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano codificado por
(i) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6,respectivamente;
(ii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16,respectivamente;
(iii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26,respectivamente; ou
(iv) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis, que são modificações da seqüência conservativa das seqüênciascomo apresentado em (i), (ii) ou (iii).
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano que compreende uma CDR3 de Vh tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 10.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma CDR3 de Vl tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 5 e uma CDR3 de Vh tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 10.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende regiões variáveis de cadeia leve humana ecadeia pesada humana, em que a região variável de cadeia levecompreendendo uma CDRl de Vl tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 3, uma CDR2 de Vl tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 4 e uma CDR3 de Vl tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 5 e a região variável de cadeia pesada compreendendo umaCDRl de Vh tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 8, umaCDR2 de Vh tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 9 e umaCDR3 de Vh tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 10.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vl tendo a seqüência deaminoácido como apresentada na SEQ ID No: 2.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vl tendo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido com a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 2.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh tendo a seqüência deaminoácido como apresentada na SEQ ID No: 7.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh que compreende a seqüênciade aminoácido que vai da região CDRl de Vh até a CDR3 de Vh da SEQ IDNo: 7.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh tendo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido com a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 7 ou com aregião que vai da CDRl de Vh até a CDR3 de Vh da SEQ ID No: 7.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh tendo de 1 a 5, tal como de 1a 3 substituições, deleções ou adições de aminoácido comparada com aseqüência como apresentada na SEQ ID No: 7 ou com a região que vai daCDRl de Vh até a CDR3 de Vh da SEQ ID No: 7.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vl como definida acima e umaregião Vh como definida acima.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma CDR3 de Vh tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 20.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma CDR3 de Vl tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 15 e uma CDR3 de Vh tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 20.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende regiões variáveis de cadeia leve humana ecadeia pesada humana, em que a região variável de cadeia levecompreendendo uma CDRl de Vl tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 13, uma CDR2 de Vl tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 14 e uma CDR3 de Vl tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 15 e a região variável de cadeia pesada compreendendo umaCDRl de Vh tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 18, umaCDR2 de Vh tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 19 e umaCDR3 de Vh tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 20.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vl tendo a seqüência deaminoácido como apresentada na SEQ ID No: 12.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vl tendo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido com a seqüência de acordo com a SEQ ID No: 12.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh tendo a seqüência deaminoácido como apresentada na SEQ ID No: 17.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh que compreende a seqüênciade aminoácido que vai da região CDRl de Vh até a CDR3 de Vh da SEQ IDNo: 17.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh tendo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido com a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 17 ou com aregião que vai da CDRl de Vh até a CDR3 de Vh da SEQ ID No: 17.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh tendo de 1 a 5, tal como de 1a 3 substituições, deleções ou adições de aminoácido comparada com aseqüência como apresentada na SEQ ID No: 17 ou com a região que vai daCDRl de Vh até a CDR3 de Vh da SEQ ID No: 17.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vl como definida acima e umaregião Vh como definida acima.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma CDR3 de Vh tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 30.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma CDR3 de Vl tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 25 e uma CDR3 de Vh tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 30.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende regiões variáveis de cadeia leve humana ecadeia pesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreendeuma CDRl de Vl tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 23,uma CDR2 de Vl tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 24 euma CDR3 de Vl tendo a seqüência como apresentado na SEQ ID No: 25 e aregião variável de cadeia pesada compreendendo uma CDRl de Vh tendo aseqüência como apresentada na SEQ ID No: 28, uma CDR2 de Vh tendo aseqüência como apresentada na SEQ ID No: 29 e uma CDR3 de Vh tendo aseqüência como apresentada na SEQ ID No: 30.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vl tendo a seqüência deaminoácido como apresentada na SEQ ID No: 22.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vl tendo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido com a seqüência de acordo com a SEQ ID No: 22.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh tendo a seqüência deaminoácido como apresentada na SEQ ID No: 27.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh que compreende a seqüênciade aminoácido que vai da região CDRl de Vh até a CDR3 de Vh da SEQ IDNo: 27.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh tendo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido com a seqüência de acordo com a SEQ ID No: 27 ou com aregião que transpõem de CDRl de Vh a CDR3 de Vh da SEQ ID No: 27.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vh tendo de 1 a 5, tal como de 1a 3 substituições, deleções ou adições de aminoácido comparada com aseqüência como apresentada na SEQ ID No: 27 ou com a região que vai daCDRl de Vh até a CDR3 de Vh da SEQ ID No: 27.
A presente invenção fornece um anticorpo que se liga aoCD38 humano, que compreende uma região Vl como definida acima e umaregião Vh como definida acima.
A presente invenção fornece um peptídeo que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31) e que não se ligam a um CD38 humano mutante,em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31).
A presente invenção fornece um peptídeo como definidoacima, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante,em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 %, tal como menor do que10 %, menor do que 5 % ou menor do que 1 % da EC50 da ligação do peptídeoao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
A presente invenção fornece um peptídeo que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31) e que não se ligam a um CD38 humano mutante,em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduode arginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31).
A presente invenção fornece um peptídeo como definidoacima, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante,em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduode arginina (SEQ ID No: 33), é menor do que 50 %, tal como menor do que10 %, menor do que 5 % ou menor do que 1 % da EC5O da ligação do peptídeoao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
A presente invenção fornece um peptídeo como definidoacima, em que o dito peptídeo liga-se a um CD38 humano mutante, em que oresíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina(SEQ ID No: 32), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ IDNo: 31).
A presente invenção fornece um peptídeo como definidoacima, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante,em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduode alanina (SEQ ID No: 32) corresponde de 75 % a 125 % da EC50 da ligaçãodo peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
A presente invenção fornece um peptídeo que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31), em que o peptídeo possui as seguintescaracterísticas de ligação: (i) liga-se a um CD38 humano mutante, em que oresíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31), (ii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que oresíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo dearginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano(SEQ ID No: 31) e (iii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduode treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQID No: 32), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
A presente invenção fornece um peptídeo que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31), em que o peptídeo possui as seguintescaracterísticas de ligação: (i) não se liga a um CD38 humano mutante, em queo resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31), (ii) não se liga a um CD38 humano mutante, emque o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo dearginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano(SEQ ID No: 31), (iii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduode treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQID No: 32), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
A presente invenção fornece um peptídeo como definidoacima, em que a EC5O é determinada pelo uso de um ELISA como descrito noExemplo 17 do relatório descritivo.
A presente invenção fornece um peptídeo que compete comum anticorpo de acordo com a forma de realização (i) acima quanto à ligaçãoao CD38. Em uma forma de realização a competição é determinada pelo usode um ELISA como descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo, emque a competição é definida por um sinal de pelo menos 90 % como avaliadopela absorção ou pelo uso de medições de reticulação como descrito noExemplo 7 do relatório descritivo, em que a competição é definida por umsinal de pelo menos 90 % como avaliado pela fluorescência.
A presente invenção fornece um peptídeo que especificamentese liga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamenteligado por um anticorpo como definido acima.
A presente invenção fornece um peptídeo que especificamentese liga à região SKRNIQFSCKNIYR e à região EKVQTLEAWVIHGG doCD38 humano (SEQ ID No: 31).
A presente invenção fornece um peptídeo tendosubstancialmente as mesmas características de ligação específicas para aligação ao CD38 humano como um anticorpo como definido acima.
A presente invenção fornece um peptídeo que se liga ao CD38humano, anticorpo este que possui uma ou mais das seguintes características:
(i) atua como um antagonista de CD38;
(ii) não induz proliferação significante de célulasmononucleares do sangue periférico como determinada pelo método descritono Exemplo 18 do relatório descritivo;(iii) não induz a liberação de IL-6 significante pelos monócitoshumanos ou de células mononucleares do sangue periférico comodeterminada pelo método descrito no Exemplo 19 do relatório descritivo;
(iv) não induz a liberação de IFN-γ detectável pelas células Thumanas ou células mononucleares do sangue periférico como determinadapelo método descrito no Exemplo 20 do relatório descritivo;
(v) é internalizada pelas células que expressam CD38; talcomo internalizada pelas células CHO-CD38 dentro de 5 a 15 minutos a 37°Cpelo método como descrito no Exemplo 12 do relatório descritivo;
(vi) induz ADCC; tal como com um valor de EC5O abaixo de15 ng/ml, tal como abaixo de 10 ng/ml em células Daudi-Iuc e com um valorEC5O abaixo de 75 ng/ml, tal como abaixo de 50 ng/ml, 30 ng/ml ou 10 ng/mlem células MM como determinada pelo método descrito no Exemplo 5 dorelatório descritivo;
(vii) induz CDC na presença de complemento; tal como comum valor EC5O abaixo de 5 μg/ml, tal como abaixo de 1 μg/ml em célulasdaudi-luc ou CD38-CHO pelo método descrito no Exemplo 6 do relatóriodescritivo;
(viii) inibe a síntese de cGDPR;
(ix) inibe a síntese de cADPR;
(x) liga-se ao CD38 humano com uma afinidade (Kd) abaixode 10" M, tal como na faixa de 10" M a 10" M, por exemplo na faixa de 7 χIO"9 M a IO"10 M, como determinada pela ressonância de plasma de superfíciecomo descrito no Exemplo 20 do relatório descritivo.
A presente invenção fornece um peptídeo como definidoacima, que inibe a síntese de cGDPR em pelo menos 25 %, tal como pelomenos 30 % depois de 90 minutos a uma concentração de 3 μg/ml comodeterminado pelo método espectrofotométrico descrito no Exemplo 24 dorelatório descritivo.A presente invenção fornece um peptídeo como definidoacima, que inibe a síntese de cADPR em pelo menos 25 %, tal como pelomenos 30 % depois de 90 minutos a uma concentração de 3 μ§/ηι1 comodeterminado pelo método de HPLC descrito em Munshi et al., J. Biol. Chem.275,21566-21571 (2000).
Em uma forma de realização o peptídeo como definido acimaé um anticorpo monoclonal humano.
A presente invenção fornece um anticorpo como definidoacima, caracterizado em que o mesmo é um anticorpo de IgGl, IgG2, IgG3,IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM de tamanho natural, tal como um anticorpoIgGl, preferivelmente um anticorpo IgGl.K ou um anticorpo IgM,preferivelmente um anticorpo IgM.K.
A presente invenção fornece um anticorpo monoclonalhumano isolado que compreende
(i) uma seqüência de aminoácido da região variável de cadeiapesada derivada de uma seqüência da linha germinativa Hvl263/3M28 (VhI)humana e uma seqüência de aminoácido da região variável de cadeia levederivada de uma seqüência da linha germinativa humano Ll5 (VKI), em queo anticorpo humano liga-se ao CD38 humano; ou
(ii) uma seqüência de aminoácido da região variável de cadeiapesada derivada de uma seqüência da linha germinativa humana VH3-DP-47N3-23 (VhIII) e uma seqüência de aminoácido da região variável de cadeialeve derivada de uma seqüência da linha germinativa L6 (VKI) humana, emque o anticorpo humano liga-se ao CD38 humano.
A presente invenção fornece um peptídeo como definidoacima, em que o peptídeo é glicosilado em uma célula eucarióptica.
Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com ainvenção é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.
A presente invenção fornece um peptídeo como definidoacima, que compreende ainda um ligador quelador para ligar um radioisótopo.
A presente invenção fornece um peptídeo como definidoacima, que está em uma forma substancialmente isolada.
A presente invenção fornece um ácido nucleico isolado quecodifica um peptídeo como definido acima.
A presente invenção fornece um vetor de expressão quecompreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo comodefinido acima.
A presente invenção fornece um vetor de expressão quecompreende
(i) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 1,
(ii) uma seqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 6,
(iii) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 1 e umaseqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 6;
(iv) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 11;
(v) uma seqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 16;
(vi) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: lieuma seqüência de nucleotídeo Vh da SEQID No: 16;
(vii) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 21;
(viii) uma seqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 26; ou
(ix) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 21 euma seqüência de nucleotídeo Vh da SEQID No: 26.
A presente invenção fornece um vetor de expressão comodefinido acima, que compreende ainda uma seqüência de nucleotídeo quecodifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeiastanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano.
A presente invenção fornece um vetor de expressão comodefinido acima, em que a seqüência de nucleotídeo que codifica a regiãoconstante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tanto levesquanto pesadas de um anticorpo humano codifica um anticorpo IgGl.
A presente invenção fornece um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende
(i) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveiscomo apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6, respectivamente;
(ii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveiscomo apresentado na SEQ ID No: lie SEQ ID No: 16, respectivamente;
(iii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveiscomo apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26, respectivamente; ou
(iv) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis,que são modificações da seqüência conservativa das seqüências apresentadasem (i), (ii) ou (iii).
A presente invenção fornece um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeiapesada e de cadeia leve humanas que compreendem
(i) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humanacomo apresentada na SEQ ID No: 2 e a seqüência de aminoácido variável dacadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 7;
(ii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humanacomo apresentada na SEQ ID No: 12 e a seqüência de aminoácido variável dacadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 17;
(iii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humanacomo apresentada na SEQ ID No: 22 e a seqüência de aminoácido variável dacadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 27; ou(iv) modificações das seqüências conservativas das seqüênciasde aminoácido variáveis da cadeia leve humana e cadeia pesada humanacomo apresentado em (i), (ii) ou (iii).
A presente invenção fornece um tranfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende
(i) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6,respectivamente;
(ii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16,respectivamente;
(iii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26,respectivamente; ou
(iv) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis, que são modificações da seqüência conservativa das seqüênciasapresentadas em (i), (ii) ou (iii).
A presente invenção fornece um transfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeiapesada e de cadeia leve humanas que compreendem
(i) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humanacomo apresentada na SEQ ID No: 2 e a seqüência de aminoácido variável dacadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 7;
(ii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humanacomo apresentada na SEQ ID No: 12 e a seqüência de aminoácido variável dacadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 17;
(iii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humanacomo apresentada na SEQ ID No: 22 e a seqüência de aminoácido variável dacadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 27; ou
(iv) modificações das seqüências conservativas das seqüênciasde aminoácido variáveis da cadeia leve humana e cadeia pesada humanacomo apresentado em (i), (ii) ou (iii).
A presente invenção fornece uma célula hospedeiraeucarióptica ou procarióptica que produz um peptídeo como definido acima.
A presente invenção fornece uma célula hospedeiraeucarióptica ou procarióptica contendo um vetor de expressão como definidoacima.
A presente invenção fornece um animal não humano ou plantatransgênicos que compreendem ácidos nucleicos que codificam uma cadeiapesada humana e uma cadeia leve humana, em que o animal ou plantaproduzem uma quantidade detectável de um peptídeo como definido acima.
A presente invenção fornece um imunoconjugado quecompreende um peptídeo como definido acima ligado a um agente citotóxico,um radioisótopo ou um medicamento.
A presente invenção fornece um imunoconjugado quecompreende um peptídeo como definido acima, em que o peptídeo é umanticorpo IgM monomérico ligado a um agente citotóxico, um radioisótopoou um medicamento.
A presente invenção fornece uma molécula biespecífica oumultiespecífica que compreende um peptídeo como definido acima e umaespecificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana.
A presente invenção fornece uma molécula biespecífica oumultiespecífica que compreende um peptídeo como definido acima e umaespecificidade de ligação para CD3, CD4, CD13 8, IL-15R, ligada àmembrana ou ligada ao receptor TNF-α, um receptor de Fc humano ou ligadaà membrana ou ligada ao receptor IL-15.
A presente invenção fornece uma composição farmacêuticaque compreende um peptídeo como definido acima ou um imunoconjugadocomo definido acima e um carreador farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção fornece uma composição farmacêuticacomo definida acima que compreende uma ou mais outros agentesterapêuticos.
A presente invenção fornece um método de inibir ocrescimento e/ou proliferação de uma célula que expresse CD38, quecompreende a administração de um peptídeo como definido acima, umimunoconjugado como definido acima, uma composição farmacêutica comodefinida acima ou um vetor de expressão como definido acima, tal que ocrescimento e/ou proliferação da célula sejam inibidos.
A presente invenção fornece um método de tratar uma doençaou distúrbio que envolva células que expressam CD38 em um paciente,método este que compreende a administração de um peptídeo como definidoacima, um imunoconjugado como definido acima, uma composiçãofarmacêutica como definida acima ou um vetor de expressão como definidoacima a um paciente em necessidade deste.
A presente invenção fornece um método de prevenir umadoença ou distúrbio que envolvam células que expressam CD38 em umpaciente, método este que compreende a administração de um peptídeo comodefinido acima, um imunoconjugado como definido acima, uma composiçãofarmacêutica como definida acima ou um vetor de expressão como definidoacima a um paciente em necessidade deste.
Em uma forma de realização a doença ou distúrbio é a artritereumatóide.Em uma forma de realização a doença ou distúrbio é omieloma múltiplo.
Em uma forma de realização o método compreende aadministração de um ou mais outros agentes terapêuticos ao paciente.
Em uma forma de realização o um ou mais outros agentesterapêuticos são selecionados de um agente quimioterapêutico, um agenteanti-inflamatório ou um agente imunossupressivo e/ou imunomodulatório.
Em uma forma de realização o um ou mais outros agentesterapêuticos são selecionados de um grupo que consiste de cisplatina,gefitinib, cetuximab, rituximab, bevacizumab, erlotinib, bortezomib,talidomida, pamidronato, ácido zoledrônico, clodronato, risendronato,ibandronato, etidronato, alendronato, tiludronato, trióxido de arsênico,lenalidomida, filgrastim, pegfilgrastim, sargramostim, suberoilanilida ácidohidroxâmico e SCIO-469.
A presente invenção fornece um método in vitro para detectara presença de antígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em umaamostra que compreende:
a) contatar a amostra com um peptídeo como definido acimasob condições que permitam a formação de um complexo entre o peptídeo eCD38; e
b) detectar a formação de um complexo.
A presente invenção fornece um kit para detectar a presença deantígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em uma amostra quecompreenda um peptídeo como definido acima.
A presente invenção fornece um método in vivo para detectarantígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em um paciente quecompreende:
a) administrar o peptídeo como definido acima sob condiçõesque permitam a formação de um complexo entre o peptídeo e CD38; eb) detectar o complexo formado.
A presente invenção fornece um anticorpo anti-idiotípico quese liga a um anticorpo como definido acima.
Em uma forma de realização o anticorpo anti-idiotípico éusado para detectar o nível de um anticorpo como definido acima em umaamostra.
Em uma forma de realização o anti anti-idiotípico é usado paradetectar o nível de anticorpo monoclonal humano contra CD38 em umaamostra.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura IA mostra a ligação de -003, -005 e do anticorpo decontrole de isótipo HuMab-KLH às células CHO transfectadas com CD38(CHO-CD38) como medido pela citometria de fluxo. O cenário experimentalestá descrito no Exemplo 4.
A Figura IB mostra a ligação de -024 e HuMab-KLH àscélulas CHO transfectadas com CD38 (CHO-CD38) como medido pelacitometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 4.
A Figura 2A mostra a ligação de -003, -005 e HuMab-KLH àscélulas Daudi como medido pela citometria de fluxo. O cenário experimentalestá descrito no Exemplo 4.
A Figura 2B mostra a ligação de -024 e HuMab-KLH àscélulas Daudi como medido pela citometria de fluxo. O cenário experimentalestá descrito no Exemplo 4.
A Figura 3 mostra a ligação de -003, -005, -024 e HuMab-KLH às células de mieloma múltiplo. O cenário experimental está descrito noExemplo 4.
A Figura 4A mostra a capacidade de -003 e -005 para induzir aIise de células Daudi pela ADCC quando comparada com rituximab eHuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5.A Figura 4B mostra a capacidade de -024 para induzir a Iise decélulas Daudi pela ADCC quando comparada com HuMab-KLH. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 5.
A Figura 5A mostra a capacidade de -003, -005 e -024 parainduzir a Iise de células de tumor de mieloma múltiplo frescas pela ADCCquando comparada com HuMab-KLH. O cenário experimental está descritono Exemplo 5.
A Figura 5B mostra a capacidade de -003, -005 e -024 parainduzir a Iise de células de tumor da leucemia em células plasmática frescapela ADCC quando comparada com HuMab-KLH. O cenário experimentalestá descrito no Exemplo 5.
A Figura 6 mostra a capacidade de -003 e -005 para induzir aIise de JK6L (uma linhagem de célula de mieloma múltiplo) pela ADCCquando comparada com HuMab-KLH. O cenário experimental está descritono Exemplo 5.
A Figura 7 mostra a capacidade de -003 e -005 para induzir aIise de AMO-I (uma linhagem de célula de mieloma múltiplo) pela ADCCquando comparada com HuMab-KLH. O cenário experimental está descritono Exemplo 5.
A Figura 8 mostra a Iise mediada por CDC de células Daudi-Iuc induzidas por -003 e -005 comparada a HuMab-KLH. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 6.
A Figura 9A mostra a Iise mediada por CDC de células CHO-CD38 induzidas por -003 e -005 comparada a HuMab-KLH. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 6.
A Figura 9B mostra a Iise mediada por CDC de células CHO-CD38 induzida por -024 comparada com HuMab-KLH. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 6.
A Figura 10A mostra a Iise mediada por CDC de células detumor refratárias a 3 % na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 6.
A Figura IOB mostra a Iise mediada por CDC de células detumor refratárias a 9 % na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 6.
A Figura 10C mostra a Iise mediada por CDC de células detumor de 30 a 40 % na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 6.
A Figura 10D mostra a Iise mediada por CDC de células detumor a 70 % na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 6.
A Figura 10E mostra a Iise mediada por CDC de células demieloma múltiplo na presença de -024 e HuMab-KLH. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 6.
A Figura 11 mostra que -003 e -005 não bloqueiam cruzado aligação o CD38. O cenário experimental está descrito no Exemplo 7.
A Figura 12A mostra o tingimento imunoistológico demacrófagos, linfócitos e células B plasmáticas com -003. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 10.
A Figura 12B mostra o tingimento imunoistológico do epitéliobrônquico com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
A Figura 12C mostra o tingimento imunoistológico demiócitos com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
A Figura 12D mostra o tingimento imunoistológico de tecidolinfóide de cinomolgos com -003. O cenário experimental está descrito noExemplo 10.
A Figura 13A mostra o tingimento imunoistológico demacrófagos, linfócitos e células B plasmáticas com -005. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 10.A Figura 13B mostra o tingimento imunoistológico de epitéliobrônquico com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
A Figura 13C mostra o tingimento imunoistológico demiócitos com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
A Figura 13D mostra o tingimento imunoistológico de tecidolinfóide de cinomolgos com -005. O cenário experimental está descrito noExemplo 10.
A Figura 14A mostra o tingimento imunoistológico doendotélio hepático com CD31. O cenário experimental está descrito noExemplo 10.
A Figura 14B mostra o tingimento imunoistológico deendotélio hepático com νWF. O cenário experimental está descrito noExemplo 10.
A Figura 14C mostra o tingimento imunoistológico deendotélio hepático com anti-KLH. O cenário experimental está descrito noExemplo 10.
A Figura 14D mostra o tingimento imunoistológico deendotélio hepático com -003. O cenário experimental está descrito noExemplo 10.
A Figura 14E mostra o tingimento imunoistológico deendotélio hepático com -005. O cenário experimental está descrito noExemplo 10.
A Figura 15A mostra a reatividade cruzada de -003 e -005comparada a HuMab-KLH em linfócitos cinomolgos como medido pelacitometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 11.
A Figura 15B mostra a reatividade cruzada de -003 e -005comparada a HuMab-KLH em monócitos cinomolgos como medido pelacitometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 11.
A Figura 15C mostra a reatividade cruzada de -003 e -005comparada a HuMab-KLH em PBMCs de macaco Rhesus como medido pelacitometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 11.
A Figura 16A mostra a internalização de -003 como medidopela extinção de EtBr. O cenário experimental está descrito no Exemplo 12.
A Figura 16B mostra a internalização de -005 como medidopela extinção de EtBr. O cenário experimental está descrito no Exemplo 12.
A Figura 17A mostra a inibição causada por -003 e -005comparada a um anticorpo monoclonal anti-CD20 (rituximab) e HuMab-KLHdo crescimento de células de tumor em um cenário preventivo como medidopela formação de imagem por SCID luciferase in vivo. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 13.
A Figura 17B mostra a inibição causada por -003 e -005comparada a um anticorpo monoclonal anti-CD20 (rituximab) e HuMab-KLHdo crescimento de células de tumor em cenário terapêutico I como medidopela formação de imagem pela SCID luciferase in vivo. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 13.
A Figura 17C mostra a inibição causada por -003 e -005comparada a um anticorpo monoclonal anti-CD20 (rituximab) e HuMab-KLHdo crescimento de células de tumor em cenário terapêutico II como medidopela formação de imagem pela SCID luciferase in vivo. O cenárioexperimental está descrito no Exemplo 13.
A Figura 17D mostra a inibição do crescimento de célula detumor por -003 e -024 comparada a HuMab-KLH em cenário terapêutico IIIcomo medido pela formação de imagem pela SCID luciferase in vivo. Ocenário experimental está descrito no Exemplo 13.
A Figura 18 mostra a indução da apoptose por -003 e -005comparada a um anticorpo monoclonal anti-CD20 (rituximab) e HuMab-KLHcom ou sem reticulação. O cenário experimental está descrito no Exemplo 14.
A Figura 19 mostra a contagem histológica para célulaspositivas em CD38 em xenoenxertos em camundongo RA-SCID implantadosno dia 14, depois do tratamento com anti-KLH (HuMab-KLH) ou -005. Osmétodos são descritos no Exemplo 15.
A Figura 20 mostra a contagem histológica quanto às célulaspositivas em CDl 38 em xenoenxertos em camundongo RA-SCIDimplantados no dia 14, depois do tratamento com anti-KLH ou -005. Osmétodos são descritos no Exemplo 15.
A Figura 21 mostra o tingimento com CD38 de células B emxenoenxertos antes da implantação (A) ou depois do tratamento com anti-KLH (B) ou -005 (C). Os métodos são descrito no Exemplo 15.
A Figura 22 mostra o tingimento com CDl38 de células B emxenoenxertos antes da implantação (A) ou depois do tratamento com anti-KLH (B) ou -005 (C). Os métodos são descritos no Exemplo 15.
A Figura 23 mostra a ligação de -003 e -005 ao tipo selvageme mutante CD38 humano como medido pelo ELISA. 23A: Ligação de -003 e -005 ao mutante T237A CD38 humano. 23B: Ligação de -003 e -005 aomutante Q272R CD38 humano. 23 C: Ligação de -003 e -005 ao mutanteS274F CD38 humano. Os métodos são descritos no Exemplo 17.
A Figura 24 mostra o efeito de -003 e -005 comparado aHuMab-KLH na proliferação (A), produção de IL-6 (B) e produção de IFN-γ(C) de PBMCs humanas. Os métodos são descritos nos Exemplos 18, 19 e 20,respectivamente.
A Figura 25 mostra a produção enzimática de cGDPribose napresença de várias concentrações de -003 (B), -005 (C), -024 (D) ou anti-KLH(A). Os métodos são descritos no Exemplo 23.
A Figura 26 mostra a comparação entre -003, -005 e anticorpode Morphosys TH-3079 em CDC de células CHO-CD38 (26A), CDC decélulas Daudi (26B) e ADCC de células Daudi (26C).
As seqüências da invenção são mostradas na listagem deseqüências anexa.
A SEQ ID No: 1 é a seqüência de nucleotídeo da região Vl doanticorpo -003.
A SEQ ID No: 2 é a seqüência de aminoácido da região Vl doanticorpo -003.
A SEQ ID No: 3 é a seqüência de aminoácido da CDRl de Vldo anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID No: 2.
A SEQ ID No: 4 é a seqüência de aminoácido da CDR2 de Vldo anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID No: 2.
A SEQ ID No: 5 é a seqüência de aminoácido da CDR3 de Vldo anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID No: 2.
A SEQ ID No: 6 é a seqüência de nucleotídeo da região Vh doanticorpo -003.
A SEQ ID No: 7 é a seqüência de aminoácido da região Vh doanticorpo -003.
A SEQ ID No: 8 é a seqüência de aminoácido da CDRl de Vhdo anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID No: 7.
A SEQ ID No: 9 é a seqüência de aminoácido da CDR2 de Vhdo anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 50 a 66 da SEQ ID No: 7.
A SEQ ID No: 10 é a seqüência de aminoácido da CDR3 deVh do anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 99 a 109 da SEQ IDNo: 7.
A SEQ ID No: 11 é a seqüência de nucleotídeo da região Vldo anticorpo -005.A SEQ ID No: 12 é a seqüência de aminoácido da região Vldo anticorpo -005.
A SEQ ID No: 13 é a seqüência de aminoácido da CDRl deVl do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 24 a 34 da SEQ IDNo: 12.
A SEQ ID No: 14 é a seqüência de aminoácido da CDR2 deVl do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 50 a 56 da SEQ IDNo: 12.
A SEQ ID No: 15 é a seqüência de aminoácido da CDR3 deVl do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 89 a 97 da SEQ IDNo: 12.
A SEQ ID No: 16 é a seqüência de nucleotídeo da região Vhdo anticorpo -005.
A SEQ ID No: 17 é a seqüência de aminoácido da região Vhdo anticorpo-005.
A SEQ ID No: 18 é a seqüência de aminoácido da CDRl deVh do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 31 a 35 da SEQ IDNo: 17.
A SEQ ID No: 19 é a seqüência de aminoácido da CDR2 deVh do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 50 a 66 da SEQ IDNo: 17.
A SEQ ID No: 20 é a seqüência de aminoácido da CDR3 deVh do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 99 a 111 da SEQ IDNo: 17.
A SEQ ID No: 21 é a seqüência de nucleotídeo da região Vldo anticorpo -024.
A SEQ ID No: 22 é a seqüência de aminoácido da região Vldo anticorpo -024.
A SEQ ID No: 23 é a seqüência de aminoácido da CDRl deVl do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 24 a 34 da SEQ IDNo: 22.
A SEQ ID No: 24 é a seqüência de aminoácido da CDR2 deVl do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 50 a 56 da SEQ IDNo: 22.
A SEQ ID No: 25 é a seqüência de aminoácido da CDR3 deVl do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 89 a 97 da SEQ IDNo: 22.
A SEQ ID No: 26 é a seqüência de nucleotídeo da região Vhdo anticorpo -024.
A SEQ ID No: 27 é a seqüência de aminoácido da região Vhdo anticorpo -024.
A SEQ ID No: 28 é a seqüência de aminoácido da CDRl deVh do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 31 a 35 da SEQ IDNo: 27.
A SEQ ID No: 29 é a seqüência de aminoácido da CDR2 deVh do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 50 a 66 da SEQ IDNo: 27.
A SEQ ID No: 30 é a seqüência de aminoácido da CDR3 deVh do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 99 a 111 da SEQ IDNo: 27.
A SEQ ID No: 31 é a seqüência de CD38 humano.
A SEQ ID No: 32 é a seqüência de um CD38 humano mutante,em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduode alanina.
A SEQ ID No: 33 é a seqüência de um CD38 humano mutante,em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduode arginina.
A SEQ ID No: 34 é a seqüência de um CD38 humano mutante,em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece peptídeos de ligação de CD38("CD38BPs"), que podem ser úteis no tratamento, diagnóstico e prevenção deuma variedade de distúrbios que envolvam as células que expressam CD38,tais como no mieloma múltiplo.
Em uma forma de realização, um CD38BP da invenção é oanticorpo -003. -003 é um anticorpo de IgGl monoclonal humano tendo umaregião Vl que consiste da seqüência da SEQ ID No: 2 e uma região Vh queconsiste da seqüência da SEQ ID No: 7.
Em uma forma de realização, um CD38BP da invenção é oanticorpo -005. -005 é um anticorpo de IgGl monoclonal humano tendo umaregião Vl que consiste da seqüência da SEQ ID No: 12 e uma região Vh queconsiste da seqüência da SEQ ID No: 17.
Em uma forma de realização, um CD38BP da invenção é oanticorpo -024. -024 é um anticorpo de IgGl monoclonal humano tendo umaregião Vl que consiste da seqüência da SEQ ID No: 22 e uma região Vh queconsiste da seqüência da SEQ ID No: 27.
Os anticorpos interagem com antígenos alvos primariamenteatravés dos resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis regiõesdeterminadoras de complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). poresta razão, as seqüências de aminoácido dentro das CDRs são mais diversasentre anticorpos individuais do que as seqüências fora das CDRs. Porque asseqüências de CDR são responsáveis pela maioria das interações deanticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitemas propriedades de anticorpos que ocorrem naturalmente específicos pelaconstrução dos vetores de expressão que incluem seqüências de CDR doanticorpo que ocorre naturalmente específico enxertado nas seqüências deestrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver porexemplo Riechmann, L. et al., Nature 332, 323-327 (1998), Jones, P. et al,Nature 321, 522-525 (1986) e Queen, C. et al., PNAS USA 86, 10029-10033(1989)).
Visto que é bem conhecido na técnica que os domínios CDR3da pesada cadeia de anticorpo desempenham um papel particularmenteimportante na especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo quanto aum antígeno (Ditzel H J, et al., J Immunol. 157(2), 739-49 (1996), Barbas SMet al., J. Am. Chem. Soe. 116, 2161-2162 (1994) e Barbas SM et al., ProcNatl Acad Sci USA 92(7), 2529-33 (1995), os CD38BPs da invenção podemcompreender as CDR3s de pesada cadeia de -003 ou -005 ou -024. OsCD38BPs da invenção também podem compreender as CDR3s de cadeiapesada e leve de -003 ou -005 ou -024. Os CD38BPs da invenção podemcompreender ainda as CDR2s de -003 e -005 e -024, respectivamente. OsCD38BPs da invenção podem compreender ainda as CDRls de -003 e -005 e-024, respectivamente.
A presente invenção fornece CD38BPs, que competem com -003 quanto à ligação ao CD38.
A presente invenção fornece CD38BPs, que competem com -005 quanto à ligação ao CD38.
A presente invenção fornece CD38BPs, que competem com -024 quanto à ligação ao CD38.
Em uma forma de realização, a competição é determinada pelouso de um ELISA como descrito na seção de Exemplos.
Em uma forma de realização, a competição é determinada pelouso de um FAGS como descrito na seção de exemplos.
A presente invenção fornece um CD38BP que especificamentese liga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamenteligado por -003 ou -005 ou -024.A presente invenção fornece um CD38BP tendosubstancialmente as mesmas características de ligação específicas para aligação ao CD38 humano como -003 ou -005 ou -024.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDRl de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 3.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR2 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 4.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 5.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 5 e uma CDRlde Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 3.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 5 e uma CDR2de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 4.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 5 e uma CDR2de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 4 e uma CDRl de Vl queconsiste essencialmente da SEQ ID No: 3.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDRl de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 9.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 10.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 10 e umaCDRl de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 10 e umaCDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 9.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 10 e umaCDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 9 e uma CDRl deVh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDRl de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR2 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 14.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 15.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 15 e umaCDRl de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 15 e umaCDR2 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 14.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 15 e umaCDR2 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 14 e uma CDRl deVl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDRl de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 19.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 20.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 20 e umaCDRl de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 20 e umaCDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 19.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 20 e umaCDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 19 e uma CDRl deVh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDRl de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR2 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 24.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQID No: 25.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 25 e umaCDRl de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 25 e umaCDR2 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 24.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 25 e umaCDR2 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 24 e uma CDRl deVl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDRl de Vh que consiste essencialmente da SEQ ED No: 28.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 29.A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 30.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 30 e umaCDRl de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 28.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 30 e umaCDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 29.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma CDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 30 e umaCDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 29 e uma CDRl deVh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 28.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreende
(a) uma primeira região Vl que compreende três CDRs de VL,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ IDNo: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5; e
(b) uma primeira região Vh que compreende três CDRs de VH,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ IDNo: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10. A presente invenção fornece umCD38BP que compreende
(c) uma primeira região Vl que compreende três CDRs de VL,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ IDNo: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No: 15; e
(d) uma primeira região Vh que compreende três CDRs de VH,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ IDNo: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No: 20. A presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma primeira região Vl que compreende três CDRsde VL, que independentemente uma da outra consistem essencialmente daSEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25; e(e) uma primeira região Vh que compreende três CDRs de VH,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ IDNo: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30. Em uma forma de realização, aregião V-Lea região Vh estão presentes na mesma cadeia no peptídeo.
Em uma outra forma de realização, a região Vl e a região Vhsão separadas por um ligador flexível.
Em uma forma de realização, a região Vl e a região Vh estãopresentes nas cadeias separadas no peptídeo.
Em uma outra forma de realização, a região Vl e a região Vhestão presentes nas cadeias separadas no peptídeo no contexto de umaproteína dobrada de imunoglobulina.
Em uma forma de realização, a primeira região Vl e a primeiraregião Vh são orientadas tal que as três CDRs na região Vl e as três CDRs naregião Vh cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modoseletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38 humano.
Em uma outra forma de realização, o peptídeo compreendendouma segunda região Vl idêntica à primeira região Vl e uma segunda regiãoVh idêntica à primeira região VH, onde a segunda região Vl e a segundaregião Vh cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modoseletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38 humano.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma região Vl que é uma variante funcional da região Vl de -003 ou -005 ou-024.
Em uma forma de realização, a região Vl do CD38BP consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelomenos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelomenos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido auma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ IDNo: 22, respectivamente. Em uma forma de realização, o CD38BP tem pelomenos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %,pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de95 % das características de ligação de epítopo de -003 ou -005 ou -024,respectivamente.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendeuma região Vh que é uma variante funcional da região Vh de -003 ou -005 ou -024.
Em uma forma de realização, a região Vh do peptídeo consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelomenos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelomenos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido auma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ IDNo: 27, respectivamente. Em uma forma de realização, o CD38BP tem pelomenos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %,pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de95 % das características de ligação de epítopo de -003 ou -005 ou -024,respectivamente.
A presente invenção fornece um CD38BP que compreendepelo menos uma CDR que é uma variante funcional de uma CDR de -003 ou -005 ou -024.
Em uma forma de realização, pelo menos uma das CDRs dopeptídeo consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cercade 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menoscerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4,SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No: 10 ou de acordocom a SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 18, SEQID No: 19 ou SEQ ID No: 20 ou de acordo com a SEQ ID No: 23, SEQ IDNo: 24, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 ou SEQ ID No: 30,respectivamente. Em uma forma de realização, o CD38BP tem pelo menoscerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelomenos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95% das características de ligação de epítopo de -003 ou -005 ou -024,respectivamente.
Em uma forma de realização, o CD38BP tem pelo menos cercade 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menoscerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % daafinidade, avidez ou especificidade de -003 ou -005 ou -024.
Em uma forma de realização, o CD38BP compete com -003 ou-005 ou -024 quanto à ligação ao CD38. Em uma outra forma de realização, acompetição é determinada pelo uso de um ELISA como descrito na seção deexemplos. Em uma outra forma de realização adicional, a competição édeterminada pelo uso de um FACS como descrito na seção de Exemplos.
Em uma forma de realização, o CD38BP especificamente seliga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamenteligado por -003 ou -005 ou -024.
Em uma forma de realização, o CD38BP liga-se ao CD38humano com afinidade maior do que -003 ou -005 ou -024.
Em uma forma de realização, o CD38BP tem substancialmenteas mesmas características de ligação de CD38 específicas como -003 ou -005ou -024.
Em uma forma de realização, o CD38BP é substancialmentelivre de outros peptídeos de ligação de CD38.
Em uma forma de realização, um CD38BP da presenteinvenção é um anticorpo. Em uma outra forma de realização, o CD38BP é umanticorpo humano. Em uma outra forma de realização adicional, o CD38BP éum anticorpo humanizado. Em uma outra forma de realização adicional, oCD38BP é um anticorpo quimérico.
Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invençãoé um anticorpo monoclonal.
Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invençãoé um anticorpo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM. Em umaoutra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo IgGl. Em uma outraforma de realização, o anticorpo é um anticorpo IgGl.k. Em uma outra formade realização adicional, o anticorpo é um anticorpo IgM. Em uma outra formade realização, o anticorpo é um anticorpo IgM.K.
Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invençãoé um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.
Em uma forma de realização, o CD38BP é glicosilado em umacélula eucarióptica.
Em uma forma de realização, o CD38BP compreende aindaum ligador quelador para ligar um radioisótopo.
Em uma forma de realização, o CD38BP está em uma formasubstancialmente isolada.
A presente invenção fornece um ácido nucleico isolado quecodifica um CD38BP da presente invenção.
A presente invenção fornece um vetor de expressão quecompreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um CD38BP dapresente invenção.
Em uma forma de realização, o vetor de expressãocompreende uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 1, umaseqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 6 ou uma seqüência denucleotídeo Vl da SEQ ID No: 1 e uma seqüência de nucleotídeo Vh da SEQID No: 6.Em uma forma de realização, o vetor de expressãocompreende uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 11, umaseqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 16 ou uma seqüência denucleotídeo Vl da SEQ ID No: lie uma seqüência de nucleotídeo Vh daSEQ ID No: 16.
Em uma forma de realização, o vetor de expressãocompreende uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 21, umaseqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 26 ou uma seqüência denucleotídeo Vl da SEQ ID No: 21 e uma seqüência de nucleotídeo Vh daSEQ ID No: 26.
Em uma outra forma de realização, o vetor de expressãocompreende ainda uma seqüência de nucleotídeo que codifica a regiãoconstante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tanto levesquanto pesadas de um anticorpo humano.
Em uma outra forma de realização, a seqüência de nucleotídeoque codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada oucadeias tanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano codifica umanticorpo IgGl.
A presente invenção fornece um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüênciasde nucleotídeo na região de cadeia leve variável como apresentado na SEQ IDNo: 1 ou modificações da seqüência conservativa desta e seqüências denucleotídeo na região de cadeia pesada variável como apresentado na SEQ IDNo: 6 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma derealização, os ácidos nucleicos da cadeia leve humana que compreende umaseqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 1 e os ácidosnucleicos da cadeia pesada humana que compreende uma seqüência denucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 6.A presente invenção fornece um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeiapesada e de cadeia leve humanas que compreendem a seqüência deaminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No:2 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência deaminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No:7 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma derealização, a região variável da cadeia leve humana compreendendo umaseqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 2 e a regiãovariável da cadeia pesada humana compreendendo uma seqüência deaminoácido como apresentada na SEQ ID No: 7.
A presente invenção fornece um transfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve humana variável como apresentada na SEQ ID No: 1 oumodificações da seqüência conservativa desta e ácidos nucleicos da cadeiapesada humana como apresentados na SEQ ID No: 6 ou modificações daseqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD38 monoclonal humano é codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia levevariável humana como apresentada na SEQ ID No: 1 e ácidos nucleicos dacadeia pesada humana como apresentada SEQ ID No: 6.
A presente invenção fornece um transfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis da cadeialeve e cadeia pesada humanas que compreendem a seqüência de aminoácidovariável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 2 oumodificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácidovariável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 7 oumodificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, acadeia leve humana compreendendo a seqüência de aminoácido variável dacadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 2 e a cadeia pesadahumana compreendendo a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesadahumana como apresentada na SEQ ID No: 7.
A presente invenção fornece um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende asseqüências de nucleotídeo na região de cadeia leve variável como apresentadana SEQ ID No: 11 ou modificações da seqüência conservativa desta eseqüências de nucleotídeo na região de cadeia pesada variável comoapresentada na SEQ ID No: 16 ou modificações da seqüência conservativadesta. Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos da cadeia levehumana que compreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentadana SEQ ID No: 11 e os ácidos nucleicos da cadeia pesada humana quecompreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ IDNo: 16.
A presente invenção fornece um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeiapesada e de cadeia leve humanas que compreendem a seqüência deaminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No:12 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência deaminoácido de cadeia leve variável humano como apresentada na SEQ ID No:17 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma derealização, a região variável da cadeia leve humana que compreende umaseqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 12 e a regiãovariável da cadeia pesada humana que compreende uma seqüência deaminoácido como apresentada na SEQ ID No: 17.
A presente invenção fornece um transfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 11 oumodificações da seqüência conservativa desta e ácidos nucleicos da cadeiapesada humana como apresentada na SEQ ID No: 16 ou modificações daseqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD38 monoclonal humano é codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia levevariável humana como apresentada na SEQ ID No: lie ácidos nucleicos dacadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 16.
A presente invenção fornece um transfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo as regiões variáveis de cadeialeve e cadeia pesada humanas que compreendem a seqüência de aminoácidovariável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 12 oumodificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácidovariável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 17 oumodificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, acadeia leve humana compreende a seqüência de aminoácido variável dacadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 12 e a cadeia pesadahumana compreende a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesadahumana como apresentada na SEQ ID No: 17.
A presente invenção fornece um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüênciasde nucleotídeo na região de cadeia leve variável como apresentado na SEQ IDNo: 21 ou modificações da seqüência conservativa desta e seqüências denucleotídeo na região de cadeia pesada variável como apresentada na SEQ IDNo: 26 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma derealização, os ácidos nucleicos da cadeia leve humana compreendem umaseqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 21 e os ácidosnucleicos da cadeia pesada humana compreendem uma seqüência denucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 26.
A presente invenção fornece um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeiapesada e de cadeia leve humanas que compreendem a seqüência deaminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No:22 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência deaminoácido de cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No:27 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma derealização, a região variável da cadeia leve humana compreende umaseqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 22 e a regiãovariável da cadeia pesada humana compreende uma seqüência de aminoácidocomo apresentada na SEQ ID No: 27.
A presente invenção fornece um transfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 21 oumodificações da seqüência conservativa desta e ácidos nucleicos da cadeiapesada humana como apresentada na SEQ ID No: 26 ou modificações daseqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD38 monoclonal humano é codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia levevariável humana como apresentada na SEQ ID No: 21 e ácidos nucleicos dacadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 26.
A presente invenção fornece um transfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo as regiões variáveis de cadeialeve e cadeia pesada humanas que compreendem a seqüência de aminoácidovariável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 22 oumodificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácidovariável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 27 oumodificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, acadeia leve humana compreende a seqüência de aminoácido variável dacadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 22 e a cadeia pesadahumana compreende a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesadahumana como apresentada na SEQ ID No: 27.A presente invenção fornece uma célula hospedeiraeucarióptica ou procarióptica que produz um CD38BP da presente invenção.
A presente invenção fornece uma célula hospedeiraeucarióptica ou procarióptica contendo um vetor de expressão da presenteinvenção.
A presente invenção fornece um animal não humano ou plantatransgênicos que compreendem ácidos nucleicos que codificam uma cadeiapesada humana e uma cadeia leve humana, em que o animal ou plantaproduzem uma quantidade detectável de um CD38BP da presente invenção.
A presente invenção fornece um imunoconjugado quecompreende um CD38BP da presente invenção ligado a um agente citotóxico,um radioisótopo ou um medicamento. Em uma forma de realização, opeptídeo é um anticorpo IgM monomérico ligado a um agente citotóxico, umradioisótopo ou um medicamento.
A presente invenção fornece uma molécula biespecífica oumultiespecífica que compreende um CD38BP da presente invenção e umaespecificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana. Em uma formade realização, a especificidade de ligação quanto a uma célula efetora humanaé uma especificidade de ligação a CD3, CD4, CD138, IL-15R, ligada àmembrana ou ligada ao receptor TNF-α, um receptor Fc humano ou ligada àmembrana ou ligada ao receptor IL-15.
A presente invenção fornece um anticorpo anti-idiotípico quese liga a um CD38BP da presente invenção.
A presente invenção fornece o uso de um anticorpo anti-idiotípico da presente invenção para detectar o nível de anticorpo monoclonalhumano contra CD38 em uma amostra.
O que segue é uma lista de formas de realização selecionadasda presente invenção.
Forma de realização 1: Um anticorpo que se liga ao CD38humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeiapesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6,respectivamente ou modificações da seqüência conservativa desta.
Forma de realização 2: Um anticorpo que se liga ao CD38humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeiapesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo nas suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6,respectivamente.
Forma de realização 3: Um anticorpo que se liga ao CD38humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeiapesada humana que compreende as seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16,respectivamente ou modificações da seqüência conservativa desta.
Forma de realização 4: Um anticorpo que se liga ao CD38humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeiapesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16,respectivamente.
Forma de realização 5: Um anticorpo que se liga ao CD38humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeiapesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26,respectivamente ou modificações da seqüência conservativa desta.
Forma de realização 6: Um anticorpo que se liga ao CD38humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeiapesada humana que compreende as seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26,respectivamente.Forma de realização 7: Um peptídeo que compete com umanticorpo de acordo com a forma de realização 2 quanto à ligação ao CD38.
Forma de realização 8: Um peptídeo de acordo com a forma derealização 7, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISAcomo descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo.
Forma de realização 9: Um peptídeo de acordo com a forma derealização 7, em que a competição é determinada pelo uso de medições dereticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
Forma de realização 10: Um peptídeo que especificamente seliga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamenteligado por um anticorpo de acordo com a forma de realização 2.
Forma de realização 11: Um peptídeo tendo substancialmenteas mesmas características de ligação específica para a ligação ao CD38humano como um anticorpo de acordo com a forma de realização 2.
Forma de realização 12: Um peptídeo que compreende umaCDRl de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 3.
Forma de realização 13: Um peptídeo que compreende umaCDR2 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 4.
Forma de realização 14: Um peptídeo que compreende umaCDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 5.
Forma de realização 15: Um peptídeo de acordo com a formade realização 14, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vlque consiste essencialmente da SEQ ID No: 3.
Forma de realização 16: Um peptídeo de acordo com a formade realização 14, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de Vlque consiste essencialmente da SEQ ID No: 4.
Forma de realização 17: Um peptídeo de acordo com a formade realização 16, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vlque consiste essencialmente da SEQ ID No: 3.Forma de realização 18: Um peptídeo que compreende umaCDRl de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
Forma de realização 19: Um peptídeo que compreende umaCDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 9.
Forma de realização 20: Um peptídeo que compreende umaCDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 10.
Forma de realização 21: Um peptídeo de acordo com a formade realização 20, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vhque consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
Forma de realização 22: Um peptídeo de acordo com a formade realização 20, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de Vhque consiste essencialmente da SEQ ID No: 9.
Forma de realização 23: Um peptídeo de acordo com a formade realização 22, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vhque consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
Forma de realização 24: Um peptídeo que compreende
(a) uma primeira região Vl que compreende três CDRs de VL,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ IDNo: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5; e
(b) uma primeira região Vh que compreende três CDRs de VH,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ IDNo: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10.
Forma de realização 25: Um peptídeo de acordo com a formade realização 24, em que a região VLea região Vh estão presentes na mesmacadeia no peptídeo.
Forma de realização 26: Um peptídeo de acordo com a formade realização 25, em que a região Vl e a região Vh são separadas por umligador flexível.
Forma de realização 27: Um peptídeo de acordo com a formade realização 24, em que a região Vl e a região Vh estão presentes nas cadeiasseparadas no peptídeo.
Forma de realização 28: Um peptídeo de acordo com a formade realização 27, em que a região VLea região Vh estão presentes nas cadeiasseparadas no peptídeo no contexto de uma proteína dobrada deimunoglobulina.
Forma de realização 29: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 24 a 28, em que a primeira região Vl e aprimeira região Vh são orientadas tal que as três CDRs na região Vl e as trêsCDRs na região Vh cooperativamente associadas para contribuírem na ligaçãode modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38humano.
Forma de realização 30: Um peptídeo de acordo com a formade realização 29, em que o peptídeo que compreende uma segunda região Vlidêntica à primeira região Vl e uma segundo região Vh idêntica à primeiraregião VH, onde a segundo região Vl e a segunda região Vh cooperativamenteassociam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico deum determinante antigênico no CD38 humano.
Forma de realização 31: Um peptídeo que compreende umaregião Vl que é uma variante funcional da região Vl de um anticorpo daforma de realização 2.
Forma de realização 32: Um peptídeo de acordo com a formade realização 31, em que a região Vl do peptídeo consiste essencialmente deuma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelomenos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %,pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordocom a SEQ ID No: 2.
Forma de realização 33: Um peptídeo que compreende umaregião Vh que é uma variante funcional da região Vh de um anticorpo daforma de realização 2.
Forma de realização 34: Um peptídeo de acordo com a formade realização 33, em que a região Vh do peptídeo consiste essencialmente deuma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelomenos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %,pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordocom a SEQ ID No: 7.
Forma de realização 35: Um peptídeo que compreende pelomenos uma CDR que é uma variante funcional de uma CDR de um anticorpoda forma de realização 2.
Forma de realização 36: Um peptídeo de acordo com a formade realização 35, em que pelo menos uma das CDRs do peptídeo consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelomenos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelomenos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido auma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5,SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No: 10.
Forma de realização 37: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 31 a 36, em que o peptídeo tem pelo menoscerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelomenos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95% das características de ligação de epítopo de um anticorpo da forma derealização 2.
Forma de realização 38: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 31 a 36, em que o peptídeo tem pelo menoscerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelomenos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95% da afinidade, avidez ou especificidade de um anticorpo da forma derealização 2.
Forma de realização 39: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 12 a 38, peptídeo este que especificamenteligo CD38 humano.
Forma de realização 40: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 12 a 39, peptídeo este que compete com umanticorpo de acordo com a forma de realização 2 quanto à ligação ao CD38.
Forma de realização 41: Um peptídeo de acordo com a formade realização 40, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISAcomo descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo.
Forma de realização 42: Um peptídeo de acordo com a formade realização 7, em que a competição é determinada pelo uso de medições dereticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
Forma de realização 43: Um peptídeo de acordo com a formade realização 39, peptídeo este que especificamente se liga a um epítopo deCD38, epítopo este que também é especificamente ligado por um anticorpo deacordo com a forma de realização 2.
Forma de realização 44: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 39 a 43, em que o peptídeo liga-se ao CD38humano com afinidade maior do que um anticorpo de acordo com a forma derealização 2.
Forma de realização 45: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 39 a 43, em que o peptídeo temsubstancialmente as mesmas características de ligação de CD38 específicascomo um anticorpo de acordo com a forma de realização 2.
Forma de realização 46: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 39 a 45, em que a ligação do peptídeo deCD38 é substancialmente isento de outros peptídeos de ligação de CD38.
Forma de realização 47: Um peptídeo que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31) e que não se liga a um CD38 humano mutante, emque o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina (SEQ ID No: 34) com o mesmo grau que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 48: Um peptídeo de acordo com a formade realização 47, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC5O daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 49: Um peptídeo de acordo com a formade realização 48, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC5O daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 50: Um peptídeo de acordo com a formade realização 49, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 5 % da EC5O daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 51: Um peptídeo de acordo com a formade realização 50, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 1 % da EC5O daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 52: Um peptídeo que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31) e que não se liga a um CD38 humano mutante- emque o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo dearginina (SEQ ID No: 33) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 53: Um peptídeo de acordo com a formade realização 52, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC50 daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 54: Um peptídeo de acordo com a formade realização 53, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC50 daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 55: Um peptídeo de qualquer uma dasformas de realização de 47 a 51 que não se liga a um CD38 humano mutante,em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduode arginina (SEQ ID No: 33) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano(SEQ ID No: 31).
Forma de realização 56: Um peptídeo de acordo com a formade realização 55, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC5O daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 57: Um peptídeo de acordo com a formade realização 56, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC5O daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 58: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 47 a 57, em que o dito peptídeo liga-se a umCD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foisubstituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) com o mesmo grauque se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 59: Um peptídeo de acordo com a formade realização 58, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com umresíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 75 % da EC50 da ligaçãodo peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 60: Um peptídeo de acordo com a formade realização 59 em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com umresíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 85 % da EC5O da ligaçãodo peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 61: Um peptídeo de acordo com a formade realização 60, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com umresíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 90 % da EC5O da ligaçãodo peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 62: Um peptídeo de acordo com a formade realização 61, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com umresíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 95 % da EC5O da ligaçãodo peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 63: Um peptídeo que compete com um anticorpo de acordo com a forma de realização 4 quanto à ligação ao CD38.
Forma de realização 64: Um peptídeo de acordo com a formade realização 63, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISAcomo descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo.
Forma de realização 65: Um peptídeo de acordo com a formade realização 63, em que a competição é determinada pelo uso de medições dereticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
Forma de realização 66: Um peptídeo que especificamente seliga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamenteligado por um anticorpo de acordo com a forma de realização 4.
Forma de realização 67: Um peptídeo tendo substancialmenteas mesmas características de ligação específica para a ligação ao CD38humano como um anticorpo de acordo com a forma de realização 4.
Forma de realização 68: Um peptídeo que compreende umaCDRl de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
Forma de realização 69: Um peptídeo que compreende umaCDR2 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 14.
Forma de realização 70: Um peptídeo que compreende umaCDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 15.
Forma de realização 71: Um peptídeo de acordo com a formade realização 70, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vlque consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
Forma de realização 72: Um peptídeo de acordo com a formade realização 70, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de Vlque consiste essencialmente da SEQ ID No: 14.
Forma de realização 73: Um peptídeo de acordo com a formade realização 72, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vlque consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
Forma de realização 74: Um peptídeo que compreende umaCDRl de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
Forma de realização 75: Um peptídeo que compreende umaCDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 19.
Forma de realização 76: Um peptídeo que compreende umaCDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 20.Forma de realização 77: Um peptídeo de acordo com a formade realização 76, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vhque consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
Forma de realização 78: Um peptídeo de acordo com a formade realização 76, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de Vhque consiste essencialmente da SEQ ID No: 19.
Forma de realização 79: Um peptídeo de acordo com a formade realização 78, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vhque consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
Forma de realização 80: Um peptídeo que compreende
(a) uma primeira região Vl que compreende três CDRs de VL,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ IDNo: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No: 15; e
(b) uma primeira região Vh que compreende três CDRs de VH,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ IDNo: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No: 20.
Forma de realização 81: Um peptídeo de acordo com a formade realização 80, em que a região VLea região Vh estão presentes na mesmacadeia no peptídeo.
Forma de realização 82: Um peptídeo de acordo com a formade realização 81, em que a região Vl e a região Vh são separadas por umligador flexível.
Forma de realização 83: Um peptídeo de acordo com a formade realização 80, em que a região VLea região Vh estão presentes nas cadeiasseparadas no peptídeo.
Forma de realização 84: Um peptídeo de acordo com a formade realização 83, em que a região VLea região Vh estão presentes nas cadeiasseparadas no peptídeo no contexto de uma proteína dobrada deimunoglobulina.Forma de realização 85: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização 80 a 84, em que a primeira região Vl e aprimeira região Vh são orientadas tal que as três CDRs na região Vl e as trêsCDRs na região Vh cooperativamente associam-se para contribuir na ligaçãode modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38humano.
Forma de realização 86: Um peptídeo de acordo com a formade realização 85, em que o peptídeo que compreende uma segunda região Vlidêntica à primeira região Vl e uma segunda região Vh idêntica à primeiraregião VH, onde a segunda região Vl e a segunda região Vh cooperativamenteassociam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico deum determinante antigênico no CD38 humano.
Forma de realização 87: Um peptídeo que compreende umaregião Vl que é um variante funcional da região Vl de um anticorpo da formade realização 4.
Forma de realização 88: Um peptídeo de acordo com a formade realização 87, em que a região Vl do peptídeo consiste essencialmente deuma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelomenos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %,pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordocom a SEQ ID No: 12.
Forma de realização 89: Um peptídeo que compreende umaregião Vh que é uma variante funcional da região Vh de um anticorpo da forma de realização 4.
Forma de realização 90: Um peptídeo de acordo com a formade realização 89, em que a região Vh do peptídeo consiste essencialmente deuma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelomenos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %,pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordocom a SEQ ID No: 17.
Forma de realização 91: Um peptídeo que compreende pelomenos uma CDR que é uma variante funcional de um CDR de um anticorpoda forma de realização 4.
Forma de realização 92: Um peptídeo de acordo com a formade realização 91, em que pelo menos uma das CDRs do peptídeo consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelomenos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelomenos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido auma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No:15, SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 ou SEQ ID No: 20.
Forma de realização 93: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 87 a 92, em que o peptídeo tem pelo menoscerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelomenos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95% das características de ligação de epítopo de um anticorpo da forma derealização 4.
Forma de realização 94: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 87 a 92, em que o peptídeo tem pelo menoscerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelomenos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95% da afinidade, avidez ou especificidade de um anticorpo da forma derealização 4.
Forma de realização 95: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 68 a 94, peptídeo este que especificamenteliga o CD38 humano.Forma de realização 96: Um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 68 a 95, peptídeo este que compete com umanticorpo de acordo com a forma de realização 4 quanto à ligação ao CD38.
Forma de realização 97: Um peptídeo de acordo com a formade realização 96, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISAcomo descrito nos Exemplos 8 ou 9 do relatório descritivo.
Forma de realização 98: Um peptídeo de acordo com a formade realização 96, em que a competição é determinada pelo uso de medições dereticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
Forma de realização 99: Um peptídeo de acordo com a formade realização 95, peptídeo este que especificamente se liga a um epítopo deCD38, epítopo este que também é especificamente ligado por um anticorpo deacordo com a forma de realização 4.
Forma de realização 100: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 95 a 99, em que o peptídeo liga-seao CD38 humano com afinidade maior do que um anticorpo de acordo com aforma de realização 4.
Forma de realização 101: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 95 a 99, em que o peptídeo temsubstancialmente as mesmas características de ligação de CD38 específicascomo um anticorpo de acordo com a forma de realização 4.
Forma de realização 102: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 95 a 101, em que o peptídeo deligação de CD38 é substancialmente isento de outros peptídeos de ligação de CD38.
Forma de realização 103: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 63 a 102, que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31) e que não se ligam a um CD38 humano mutante,em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina (SEQ ID No: 34) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQID No: 31).
Forma de realização 104: Um peptídeo de acordo com a formade realização 103, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC50 daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 105: Um peptídeo de acordo com a formade realização 104, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC50 daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 106: Um peptídeo de acordo com a formade realização 105, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 5 % da EC50 daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 107: Um peptídeo de acordo com a formade realização 106, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 1 % da EC50 daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 108: Um peptídeo que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31) e que não se liga a um CD38 humano mutante, emque o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo dearginina (SEQ ID No: 33) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano(SEQ ID No: 31).
Forma de realização 109: Um peptídeo de acordo com a formade realização 108, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC50 daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 110: Um peptídeo de acordo com a formade realização 109, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC5O da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 111: Um peptídeo de qualquer uma dasformas de realização de 103 a 107 que não se liga a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído comum resíduo de arginina (SEQ ID No: 33) com o mesmo grau que se liga aoCD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 112: Um peptídeo de acordo com a formade realização 111, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC5O daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 113: Um peptídeo de acordo com a formade realização 112, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC5O daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 114: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização 103 to 113, em que o dito peptídeoliga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) com omesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 115: Um peptídeo de acordo com a formade realização 114, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com umresíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 75 % da EC50 da ligaçãodo peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 116: Um peptídeo de acordo com a formade realização 115 em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com umresíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 85 % da EC50 da ligaçãodo peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 117: Um peptídeo de acordo com a formade realização 116, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com umresíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 90 % da EC50 da ligaçãodo peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 118: Um peptídeo de acordo com a formade realização 117, em que a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com umresíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 95 % da EC50 da ligaçãodo peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Forma de realização 119: Um peptídeo que compete com umanticorpo de acordo com a forma de realização 6 quanto à ligação ao CD38.
Forma de realização 120: Um peptídeo de acordo com a formade realização 119, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISAcomo descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo.
Forma de realização 121: Um peptídeo de acordo com a formade realização 119, em que a competição é determinada pelo uso de mediçõesde reticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
Forma de realização 122: Um peptídeo que especificamente seliga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamenteligado por um anticorpo de acordo com a forma de realização 6.
Forma de realização 123: Um peptídeo tendo substancialmenteas mesmas características de ligação específicas para a ligação ao CD38humano como um anticorpo de acordo com a forma de realização 6.
Forma de realização 124: Um peptídeo que compreende umaCDRl de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
Forma de realização 125: Um peptídeo que compreende umaCDR2 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 24.
Forma de realização 126: Um peptídeo que compreende umaCDR3 de Vl que consiste essencialmente da SEQ ID No: 25.
Forma de realização 127: Um peptídeo de acordo com a formade realização 126, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vlque consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
Forma de realização 128: Um peptídeo de acordo com a formade realização 126, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de Vlque consiste essencialmente da SEQ ID No: 24.
Forma de realização 129: Um peptídeo de acordo com a formade realização 128, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vlque consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
Forma de realização 130: Um peptídeo que compreende umaCDRl de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 28.
Forma de realização 131: Um peptídeo que compreende umaCDR2 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 29.
Forma de realização 132: Um peptídeo que compreende umaCDR3 de Vh que consiste essencialmente da SEQ ID No: 30.
Forma de realização 133: Um peptídeo de acordo com a formade realização 132, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vhque consiste essencialmente da SEQ ID No: 28.
Forma de realização 134: Um peptídeo de acordo com a formade realização 132, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de Vhque consiste essencialmente da SEQ ID No: 29.
Forma de realização 135: Um peptídeo de acordo com a formade realização 134, peptídeo este que compreende também uma CDRl de Vhque consiste essencialmente da SEQ ID No: 28.
Forma de realização 136: Um peptídeo que compreende
(a) uma primeira região Vl que compreende três CDRs de VL,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ IDNo: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25; e
(b) uma primeira região Vh que compreende três CDRs de VH,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ IDNo: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30.
Forma de realização 137: Um peptídeo de acordo com a formade realização 136, em que a região VLea região Vh estão presentes na mesmacadeia no peptídeo.
Forma de realização 138: Um peptídeo de acordo com a formade realização 137, em que a região Vl e a região Vh são separadas por umligador flexível.
Forma de realização 139: Um peptídeo de acordo com a formade realização 136, em que a região Vl e a região Vh estão presentes nascadeias separadas no peptídeo.
Forma de realização 140: Um peptídeo de acordo com a formade realização 139, em que a região Vl e a região Vh estão presentes nascadeias separadas no peptídeo no contexto de uma proteína dobrada deimunoglobulina.
Forma de realização 141: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 136 a 140, em que a primeiraregião Vl e a primeira região Vh são orientadas tal que as três CDRs na regiãoVl e as três CDRs na região Vh cooperativamente associam-se para contribuirna ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico noCD38 humano.
Forma de realização 142: Um peptídeo de acordo com a formade realização 141, em que o peptídeo que compreende uma segunda região Vlidêntica à primeira região Vl e uma segunda região Vh idêntica à primeiraregião VH, onde a segunda região Vl e a segunda região Vh cooperativamenteassociam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico deum determinante antigênico no CD38 humano.
Forma de realização 143: Um peptídeo que compreende umaregião Vl que é uma variante funcional da região Vl de um anticorpo daforma de realização 6.
Forma de realização 144: Um peptídeo de acordo com a formade realização 143, em que a região Vl do peptídeo consiste essencialmente deuma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelomenos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %,pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordocom a SEQ ID No: 22.
Forma de realização 145: Um peptídeo que compreende umaregião Vh que é uma variante funcional da região Vh de um anticorpo daforma de realização 6.
Forma de realização 146: Um peptídeo de acordo com a formade realização 145, em que a região Vh do peptídeo consiste essencialmente deuma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelomenos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %,pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordocom a SEQ ID No: 27.
Forma de realização 147: Um peptídeo que compreende pelomenos uma CDR que é uma variante funcional de uma CDR de um anticorpoda forma de realização 6.
Forma de realização 148: Um peptídeo de acordo com a formade realização 147, em que pelo menos uma das CDRs do peptídeo consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelomenos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelomenos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido auma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24, SEQID No:25, SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 ou SEQ ID No: 30.
Forma de realização 149: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 143 a 148, em que o peptídeo tempelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cercade 95 % das características de ligação de epítopo de um anticorpo da forma derealização 6.
Forma de realização 150: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 143 a 148, em que o peptídeo tempelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cercade 95 % da afinidade, avidez ou especificidade de um anticorpo da forma derealização 6.
Forma de realização 151: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 124 a 150, peptídeo este queespecificamente liga CD38 humano.
Forma de realização 152: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 124 a 151, peptídeo este quecompete com um anticorpo de acordo com a forma de realização 6 quanto àligação ao CD38.Forma de realização 153: Um peptídeo de acordo com a formade realização 152, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISAcomo descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo.
Forma de realização 154: Um peptídeo de acordo com a formade realização 152, em que a competição é determinada pelo uso de mediçõesde reticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
Forma de realização 155: Um peptídeo de acordo com a formade realização 151, peptídeo este que especificamente se liga a um epítopo deCD38, epítopo este que também é especificamente ligado por um anticorpo deacordo com a forma de realização 6.
Forma de realização 156: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 151 a 155, em que o peptídeo liga-se ao CD38 humano com afinidade maior do que um anticorpo de acordo coma forma de realização 6.
Forma de realização 157: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 151 a 155, em que o peptídeo temsubstancialmente as mesmas características de ligação de CD38 específicascomo um anticorpo de acordo com a forma de realização 6.
Forma de realização 158: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 151 a 157, em que o peptídeo deligação de CD38 é substancialmente isento de outros peptídeos de ligação deCD38.
Forma de realização 159: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 158, em que o peptídeo não éum agonista de CD38.
Forma de realização 160: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 159, em que o peptídeo nãoinduz proliferação significante de células mononucleares do sangueperiférico.Forma de realização 161: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 160, em que o peptídeo nãoinduz a liberação de IL-6 significante pelos monócitos humanos ou célulasmononucleares do sangue periférico.
Forma de realização 162: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 161, em que o peptídeo nãoinduz a liberação de IFN-γ detectável pelas células T humanas ou célulasmononucleares do sangue periférico.
Forma de realização 163: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 7 a 162, em que o peptídeo é umanticorpo.
Forma de realização 164: Um anticorpo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou 163, anticorpo este que éum anticorpo humano.
Forma de realização 165: Um anticorpo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou 163, anticorpo este que éum anticorpo humanizado.
Forma de realização 166: Um anticorpo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou 163, anticorpo este que éum anticorpo quimérico.
Forma de realização 167: Um anticorpo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou de 163 a 166, anticorpoeste que é um anticorpo monoclonal.
Forma de realização 168: Um anticorpo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou de 163 a 166,caracterizado em que o mesmo é um anticorpo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD,IgA, IgE ou IgM.
Forma de realização 169: Um anticorpo de acordo com aforma de realização 168, caracterizado em que o mesmo é um anticorpo IgGl.Forma de realização 170: Um anticorpo de acordo com aforma de realização 169, em que o anticorpo é um anticorpo IgGl.k.
Forma de realização 171: Um anticorpo de acordo com aforma de realização 168, caracterizado em que o mesmo é um anticorpo deIgM.
Forma de realização 172: Um anticorpo de acordo com aforma de realização 171, em que o anticorpo é um anticorpo IgM.k.
Forma de realização 173: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 2 a 172, em que o peptídeo églicosilado em uma célula eucarióptica.
Forma de realização 174: Um anticorpo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou de 163 a 173, que é umfragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.
Forma de realização 175: Um peptídeo ou anticorpo de acordocom qualquer uma das formas de realização de 1 a 173, que compreendeainda um ligador quelador para ligar um radioisótopo.
Forma de realização 176: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 175, que está em uma formasubstancialmente isolada.
Forma de realização 177: Um ácido nucleico isolado quecodifica um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realizaçãode 1 a 175.
Forma de realização 178: Um vetor de expressão quecompreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo deacordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 175.
Forma de realização 179: Um vetor de expressão quecompreende uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 1, umaseqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 6 ou uma seqüência denucleotídeo Vl da SEQ ID No: 1 e uma seqüência de nucleotídeo Vh da SEQID No: 6.
Forma de realização 180: Um vetor de expressão quecompreende uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 11, umaseqüência de nucleotídeo Vh da SEQ LD No: 16 ou uma seqüência denucleotídeo Vl da SEQ ID No: lie uma seqüência de nucleotídeo Vh daSEQ ID No: 16.
Forma de realização 181: Um vetor de expressão de acordocom a forma de realização 179 ou forma de realização 180, que compreendeainda uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante de umacadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tanto leves quanto pesadas de umanticorpo humano.
Forma de realização 182: Um vetor de expressão de acordocom a forma de realização 181, em que a seqüência de nucleotídeo quecodifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeiastanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano codifica um anticorpoIgGl.
Forma de realização 183: Um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende asseqüências de nucleotídeo na região de cadeia leve variável como apresentadona SEQ ID No: 1 ou modificações da seqüência conservativa desta eseqüências de nucleotídeo na região de cadeia pesada variável comoapresentado na SEQ ID No: 6 ou modificações da seqüência conservativadesta.
Forma de realização 184: Um hibridoma de acordo com aforma de realização 183, em que os ácidos nucleicos da cadeia leve humanacompreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ IDNo: 1 e os ácidos nucleicos da cadeia pesada humana compreendem umaseqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 6.Forma de realização 185: Um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeiapesada e de cadeia leve humanas que compreendem a seqüência deaminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No:2 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência deaminoácido de cadeia leve variável humana como apresentado na SEQ ID No:7 ou modificações da seqüência conservativa desta.
Forma de realização 186: Um hibridoma de acordo com aforma de realização 185, em que a região variável da cadeia leve humanacompreende uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No:2 e a região variável da cadeia pesada humana compreende uma seqüência deaminoácido como apresentada na SEQ ID No: 7.
Forma de realização 187: Um transfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 1 oumodificações da seqüência conservativa desta e ácidos nucleicos da cadeiapesada humana como apresentada na SEQ ID No: 6 ou modificações daseqüência conservativa desta.
Forma de realização 188: Um transfectoma de acordo com aforma de realização 187, em que o anticorpo anti-CD38 monoclonal humanoé codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve variável humana comoapresentada na SEQ ID No: 1 e ácidos nucleicos da cadeia pesada humanacomo apresentada na SEQ ID No: 6.
Forma de realização 189: Um transfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo as regiões variáveis de cadeialeve e cadeia pesada humanas que compreendem a seqüência de aminoácidovariável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: oumodificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácido dacadeia pesada humana variável como apresentada na SEQ ID No: 7 oumodificações da seqüência conservativa desta.
Forma de realização 190: Um transfectoma de acordo com aforma de realização 189, em que a cadeia leve humana compreende aseqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentadana SEQ ID No: 2 e a cadeia pesada humana compreende a seqüência deaminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ IDNo: 7.
Forma de realização 191: Um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende asseqüências de nucleotídeo na região de cadeia leve variável como apresentadona SEQ ID No: 11 ou modificações da seqüência conservativa desta eseqüências de nucleotídeo na região de cadeia pesada variável comoapresentado na SEQ ID No: 16 ou modificações da seqüência conservativadesta.
Forma de realização 192: Um hibridoma de acordo com aforma de realização 191, em que os ácidos nucleicos da cadeia leve humanacompreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ IDNo: 11 e os ácidos nucleicos da cadeia pesada humana compreendem umaseqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 16.
Forma de realização 193: Um hibridoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeiapesada e de cadeia leve humanas que compreendem a seqüência deaminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No:12 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência deaminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ IDNo: 17 ou modificações da seqüência conservativa desta.
Forma de realização 194: Um hibridoma de acordo com aforma de realização 193, em que a região variável da cadeia leve humanacompreende uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No:12 e a região variável da cadeia pesada humana compreende uma seqüênciade aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 17.
Forma de realização 195: Um transfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 11 oumodificações da seqüência conservativa desta e ácidos nucleicos da cadeiapesada humana como apresentada na SEQ ID No: 16 ou modificações daseqüência conservativa desta.
Forma de realização 196: Um transfectoma de acordo com aforma de realização 195, em que o anticorpo anti-CD38 monoclonal humanoé codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve variável humana comoapresentada na SEQ ID No: lie ácidos nucleicos da cadeia pesada humanacomo apresentada na SEQ ID No: 16.
Forma de realização 197: Um transfectoma que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo as regiões variáveis de cadeialeve e cadeia pesada humanas que compreendem a seqüência de aminoácidovariável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 12 oumodificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácidovariável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 17 oumodificações da seqüência conservativa desta.
Forma de realização 198: Um transfectoma de acordo com aforma de realização 197, em que a cadeia leve humana que compreende aseqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentadana SEQ ID No: 12 e a cadeia pesada humana que compreende a seqüência deaminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ IDNo: 17.
Forma de realização 199: Uma célula hospedeira eucariópticaou procarióptica que produza um peptídeo de acordo com qualquer uma dasformas de realização de 1 a 175.
Forma de realização 200: Uma célula hospedeira eucariópticaou procarióptica contendo um vetor de expressão de acordo com a forma derealização 178.
Forma de realização 201: Um animal não humano ou plantatransgênicos que compreendam ácidos nucleicos que codifiquem uma cadeiapesada humana e uma cadeia leve humana, em que o animal ou plantaproduzem uma quantidade detectável de um peptídeo de acordo com qualqueruma das formas de realização de 1 a 175.
Forma de realização 202: Um imunoconjugado quecompreende um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas derealização de 1 a 174 ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo ou ummedicamento.
Forma de realização 203: Um imunoconjugado quecompreende um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas derealização de 1 a 168 ou formas de realização de 171 a 174, em que opeptídeo é um anticorpo IgM monomérico ligado a um agente citotóxico, umradioisótopo ou um medicamento.
Forma de realização 204: Uma molécula biespecífica oumultiespecífica que compreende um peptídeo de acordo com qualquer umadas formas de realização de 1 a 175 e uma especificidade de ligação quanto auma célula efetora humana.
Forma de realização 205: Uma molécula biespecífica oumultiespecífica que compreende um peptídeo de acordo com qualquer umadas formas de realização de 1 a 175 e uma especificidade de ligação for CD3,CD4, IL-15R, ligada à membrana ou ligada ao receptor TNF-α, um receptorFc humano ou ligada à membrana ou ligada ao receptor IL-15.
Forma de realização 206: Uma composição farmacêutica quecompreende um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas derealização de 1 a 176 ou um imunoconjugado de acordo com qualquer umadas formas de realização de 202 a 205 e um carreador farmaceuticamenteaceitável.
Forma de realização 207: Uma composição farmacêutica deacordo com a forma de realização 206 que compreende um ou mais outrosagentes terapêuticos.
Forma de realização 208: Um método de inibir crescimentoe/ou proliferação de uma célula que expresse CD38, que compreende aadministração de um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas derealização de 1 a 176, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma dasformas de realização de 202 a 205, uma composição farmacêutica de acordocom a forma de realização 206 ou 207 ou um vetor de expressão de acordocom qualquer uma das formas de realização de 178 a 182, tal que ocrescimento e/ou proliferação da célula sejam inibidos.
Forma de realização 209: Um método de tratar uma doença oudistúrbio que envolva células que expresse CD38 em um paciente, métodoeste que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realizaçãode 1 a 176, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas derealização de 202 a 205, uma composição farmacêutica de acordo com asformas de realização 206 ou 207 ou um vetor de expressão de acordo comqualquer uma das formas de realização de 178 a 182 a um paciente emnecessidade deste.
Forma de realização 210: Um método de prevenir uma doençaou distúrbio que envolvam células que expressam CD38 em um paciente,método este que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um peptídeo de acordo com qualquer uma dasformas de realização de 1 a 176, um imunoconjugado de acordo com qualqueruma das formas de realização de 202 a 205, uma composição farmacêutica deacordo com as formas de realização 206 ou 207 ou um vetor de expressão deacordo com qualquer uma das formas de realização de 178 a 182 a umpaciente em necessidade deste.
Forma de realização 211: Um método de acordo com a formade realização 209 ou forma de realização 210, em que a doença ou distúrbio éa artrite reumatóide.
Forma de realização 212: Um método de acordo com a formade realização 209 ou forma de realização 210, em que a doença ou distúrbio éo mieloma múltiplo.
Forma de realização 213: Um método de acordo com qualqueruma das formas de realização de 209 a 212, em que o método compreende aadministração de um ou mais outros agentes terapêuticos ao paciente.
Forma de realização 214: Um método de acordo com a formade realização 213, em que o um ou mais outros agentes terapêuticos sãoselecionados de um agente quimioterapêutico, um agente anti-inflamatório ouum agente imunossupressivo e/ou imunomodulatório.
Forma de realização 215: Um método de acordo com a formade realização 213, em que o um ou mais outros agentes terapêuticos sãoselecionados de um grupo que consiste de cisplatina, gefitinib, cetuximab,rituximab, bevacizumab, erlotinib, bortezomib, talidomida, pamidronato,ácido zoledrônico, clodronato, risendronato, ibandronato, etidronato,alendronato, tiludronato, trióxido de arsênico, lenalidomida, filgrastim,pegfilgrastim, sargramostim, suberoilanilida, ácido hidroxâmico e SCIO-469.
Forma de realização 216: Um método in vitro para detectar apresença de antígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em umaamostra que compreende:
(a) contatar a amostra com um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 176 sob condições quepermitam a formação de um complexo entre o anticorpo e CD38; e(b) detectar a formação de um complexo.
Forma de realização 217: Um método in vitro de acordo com aforma de realização 216, em que o dito peptídeo é um anticorpo.
Forma de realização 218: Um kit para detectar a presença deantígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em uma amostra quecompreende um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas derealização de 1 a 176.
Forma de realização 219: Um método in vivo para detectarantígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em um paciente quecompreende:
a) administrar o peptídeo de acordo com qualquer uma dasformas de realização de 1 a 176 sob condições que permitam a formação deum complexo entre o anticorpo e CD38; e
b) detectar o complexo formado.
Forma de realização 220: Um método in vitro de acordo com aforma de realização 219, em que o dito peptídeo é um anticorpo.
Forma de realização 221: Um anticorpo anti-idiotípico que seliga a um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização 2, 4ou de 163 a 174.
Forma de realização 222. O uso de um anticorpo anti-idiotípico de acordo com a forma de realização 221 para detectar o nível deum peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização 2, 4 ou de163 a 174 em uma amostra.
Forma de realização 223. O uso de um anticorpo anti-idiotípico de acordo com a forma de realização 221 para detectar o nível deanticorpo monoclonal humano contra CD38 em uma amostra.
Os termos "CD38" e "antígeno de CD38" são usadosintercambiavelmente aqui e incluem quaisquer variantes, isoformas e espécieshomólogas de CD38 humano, que são naturalmente expressadas pelas célulasou são expressadas nas células transfectadas com o gene de CD38. Ossinônimos de CD38, como reconhecido na técnica, incluem ADP ribosilciclase 1, cADPr hidrolase 1, Cd38-rsl, ADP-ribose cíclica hidrolase 1,1-19,antígeno NIM-R5.
O termo peptídeo com respeito tanto a peptídeos de ligação deCD38 quanto peptídeos que não de CD38 aqui descritos incluem qualquerpeptídeo adequado e podem ser usado como sinônimo com os termospolipeptídeo e proteína, a menos que de outro modo estabelecido oucontradito pelo contexto; contanto que o leitor reconheça que cada tipo demolécula respectiva contendo polímero de aminoácido possam ser associadascom diferenças significantes e deste modo formam formas de realizaçãoindividuais da presente invenção (por exemplo, um peptídeo tal como umanticorpo, que é composto de cadeias polipeptídicas múltiplas, ésignificantemente diferente, por exemplo, de um anticorpo de cadeia única,uma imunoadesina de peptídeo ou peptídeo de cadeia imunogênica única).Portanto, o termo peptídeo aqui no geral deve ser entendido como referindo-se a qualquer peptídeo adequado de qualquer tamanho e composiçãoadequados (com respeito ao número de aminoácidos e o número de cadeiasassociadas em uma molécula de proteína). Além disso, os peptídeos nocontexto dos métodos e composições da invenção aqui descritos podemcompreender resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente e/ou nãoL, a menos que de outro modo estabelecido ou contradito pelo contexto.
Como será mais debatido aqui, a menos que de outro modoestabelecido ou contradito pelo contexto, o termo peptídeo (e se debatidocomo formas de realização individuais do(s) termo(s) polipeptídeo e/ouproteína) também abrange moléculas de peptídeo derivatizadas. Em resumo,no contexto da presente invenção, um derivado é um peptídeo em que um oumais dos resíduos de aminoácido do peptídeo foram quimicamentemodificados (por exemplo pela alquilação, acilação, formação de éster ouformação de amida) ou associados com um ou mais substituintes que nãoaminoácidos, orgânicos e/ou inorgânicos, atômicos ou moleculares (porexemplo um grupo polietileno glicol (PEG), um substituinte lipofílico (queopcionalmente pode ser ligado à seqüência de aminoácido do peptídeo por umresíduo ou grupo espaçadores tal como β-alanina, ácido γ-aminobutírico(GABA), ácido L/D-glutâmico, ácido succínico e outros), um fluoróforo,biotina, um radionuclídeo, etc.) e também pode ou alternativamentecompreende resíduos de aminoácido não essenciais, que não ocorremnaturalmente e/ou não L, a menos que de outro modo estabelecido oucontradito pelo contexto (entretanto, deve ser mais uma vez reconhecido quetais derivados, neles ou deles próprios, podem ser considerados característicasindependentes da presente invenção e a inclusão de tais moléculas dentro dosignificado de peptídeo é feito por motivo de conveniência na descrição dapresente invenção ao invés de implicar qualquer tipo de equivalência entrepeptídeos nus e tais derivados). Os exemplos não limitantes de tais resíduosde aminoácido incluem por exemplo ácido 2-aminoadípico, ácido 3-amino-adípico, 6-alanina, ácido 6-aminopropiônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-aminoeptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiônico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina,aloidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina,aloisoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, 6-N-metilisina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina e aminoácidos halogenados deestatina.
Os peptídeos de ligação de antígeno se refere a qualquerpeptídeo que especificamente se liga a uma porção de um dado antígeno sobcondições celulares e/ou fisiológicas quanto a uma quantidade de temposuficiente para induzir, promover, realçar e/ou de outro modo estabelecidomodular um efeito fisiológico associado com o antígeno; para permitirdetecção pelo ELISA, Western blot ou outra técnica de ligação de proteínasimilarmente adequada aqui descrita e/ou conhecida na técnica e/ou para deoutro modo estabelecido ser detectavelmente ligado a esta depois de umperíodo relevante de tempo (por exemplo pelo menos de cerca de 15 minutos,pelo menos de cerca de 30 minutos, pelo menos de cerca de 45 minutos, pelomenos de cerca de 1 hora, pelo menos de cerca de 2 horas, pelo menos decerca de 4 horas, pelo menos de cerca de 6 horas, pelo menos de cerca de 12horas, cerca de 1 a 24 horas, cerca de 1 a 36 horas, cerca de 1 a 48 horas,cerca de 1 a 72 horas, cerca de uma sema ou mais tempo).
Um peptídeo de ligação de CD38 ou CD38BP, é um peptídeode ligação de antígeno que especificamente se liga ao antígeno CD38. Emuma forma de realização, a ligação do CD38BP a CD38 é medido pelo uso dométodo descrito no Exemplo 4.
O termo imunoglobulina refere-se a uma classe deglicoproteínas estruturalmente relacionadas que consiste de dois pares decadeias polipeptídicas, um par de cadeias leves de peso molecular baixo (L) eum par de cadeias pesadas (H), todas as quatro inter-conectadas pelas ligaçõesde dissulfeto. A estrutura das imunoglobulinas foi bem caracterizada. Ver porexemplo Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press,N.Y. (1989)). Em resumo, cada cadeia pesada tipicamente é compreendida deuma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma regiãoconstante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada tipicamente écompreendida de três domínios, Ch 1, CH2 e Ch3. Cada cadeia levetipicamente é compreendida de uma região variável de cadeia leve (aquiabreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A regiãoconstante de cadeia leve tipicamente é compreendida de um domínio, CL. Asregiões Vh e Vl podem ser ainda subdivididas em regiões dehipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis que podem ser hipervariáveis naseqüência e/ou forma de alças estruturalmente definidas), também chamadasde regiões determinadoras de complementaridade (CDRs), intercaladas comregiões que são mais conservadas, chamadas de regiões estruturais (FRs).
Cada Vh e Vl é tipicamente composta de três CDRs e quatroFRs, dispostas do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem:FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (ver também Chothia e Lesk J.Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Tipicamente, a numeração dos resíduos deaminoácido nesta região é realizada pelo método descrito em Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (frases tais comonumeração de resíduo do domínio variável como em Kabat ou de acordo comKabat aqui referem-se a este sistema de numeração para domínios variáveisde cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve). Usando este sistemade numeração, a seqüência de aminoácido linear real de um peptídeo podeconter menos ou aminoácidos adicionais que correspondam a umencurtamento ou inserção de uma FR ou CDR do domínio variável. Porexemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único insertode aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) depois resíduo 52 daCDR2 de Vh e resíduos inseridos (por exemplo resíduos 82a, 82b e 82c, etc.de acordo com Kabat) depois o resíduo FR de cadeia pesada 82. A numeraçãode Kabat de resíduos pode ser determinada quanto a um anticorpo dado peloalinhamento nas regiões de homologia da seqüência do anticorpo com umaseqüência numerada por Kabat "padrão".
O termo anticorpo (Ab) no contexto da presente invençãorefere-se a uma molécula de imunoglobulina, um fragmento de uma moléculade imunoglobulina ou um derivado de cada um destes, que têm a capacidadepara ligar-se especificamente a um antígeno sob condições fisiológicas típicaspor períodos significantes de tempo tais como pelo menos de cerca de 30minutos, pelo menos de cerca de 45 minutos, pelo menos de cerca de umhora, pelo menos de cerca de dois horas, pelo menos de cerca de four horas,pelo menos de cerca de 8 horas, pelo menos de cerca de 12 horas, cerca de 24horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias,etc. ou qualquer outro período funcionalmente definido relevante (tal comoum tempo suficiente para induzir, promover, realçar e/ou modular umaresposta fisiológica associada com o anticorpo que se liga ao antígeno).
As regiões variáveis das cadeias pesada e leve da molécula deimunoglobulina contêm um domínio de ligação que interatua com umantígeno. As regiões constantes dos anticorpos (Abs) podem mediar a ligaçãoda imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias célulasdo sistema imune (tais como células efetoras) e os primeiros componente(Clq) do sistema de complemento clássico.
Um anticorpo anti-CD38 pode ser um anticorpo biespecífico,diacorpo ou molécula similar (ver por exemplo PNAS USA 90(14), 6444-8(1993) quanto a uma descrição de diacorpos).
De fato, os anticorpos, diacorpos e outros biespecíficos,fornecidos pela presente invenção podem ligar qualquer alvo adequado alémde uma porção de CD38.
Como indicado acima, o termo anticorpo aqui, a menos que deoutro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto, incluifragmentos de um anticorpo que retenham a capacidade para ligarespecificamente a um antígeno. Foi mostrado que a função de ligação deantígeno de um anticorpo pode ser realizada pelos fragmentos de umanticorpo de tamanho natural. Os exemplos de fragmentos de ligaçãoabrangidos dentro do termo "anticorpo" incluem (i) um fragmento Fab, umfragmento monovalente que consiste dos domínios VL, Cl e ChI ; (ii)fragmentos F(ab)2 e F(ab')2, fragmentos bivalentes que compreendem doisfragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça;(iii) um fragmento Fd que consiste essencialmente dos domínios Vh e CHI;(iv) um fragmento Fv que consiste essencialmente dos domínios Vl e Vh deum único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature341, 544-546 (1989)), que consiste essencialmente de um domínio VH; (vi)uma região isolada determinadora de complementaridade (CDR) e (vii) umacombinação de duas ou mais CDRs isoladas que podem ser opcionalmenteunidas por um ligador sintético. Além disso, embora os dois domínios dofragmento Fv, Vl e VH, sejam codificados por genes separados, estes podemser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligador sintético quepossibilite que os mesmos sejam fabricados como uma única cadeia deproteína em que as regiões Vl e Vh se emparelham para formar moléculasmonovalentes (conhecidas como anticorpos de cadeia única ou Fv de cadeiaúnica (scFv), ver por exemplo Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) eHuston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeiaúnica estão abrangidos dentro do termo anticorpo a menos que de outro modoestabelecido mencionado ou claramente indicado pelo contexto. Outrasformas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos são incluídosdentro do termo anticorpo. Embora tais fragmentos sejam no geral incluídosdentro do significado de anticorpo, estes coletivamente e cada umindependentemente são características únicas da presente invenção, exibindopropriedades biológicas e utilidades diferentes. Estes e outros fragmentos deanticorpo úteis no contexto da presente invenção são ainda debatidos aqui.
Também deve ser entendido que o termo anticorpo também nogeral inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs),polipeptídeos equivalentes a anticorpo, tais como anticorpos quiméricos eanticorpos humanizados, anticorpos anti-idiotípico (anti-Id) para anticorpos efragmento de anticorpos que retenham a capacidade para ligarespecificamente ao antígeno (fragmentos de ligação de antígeno) fornecidospor qualquer técnica conhecida, tal como a clivagem enzimática, síntese depeptídeo e técnicas recombinantes. Um anticorpo como gerado pode possuirqualquer isótipo.
Um anticorpo anti-CD38 é um anticorpo como descrito acima,que se liga especificamente ao antígeno CD38.
O termo "epítopo" significa um determinante de proteínacapaz de ligação específica a um anticorpo. Os epítopos usualmenteconsistem de agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculastais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têmcaracterísticas estruturais tridimensionais específicas, assim comocaracterísticas de carga específicas. Os epítopos conformacionais e nãoconformacionais são distinguidos em que a ligação ao primeiro mas não aoúltimo é perdida na presença de solventes desnaturantes. O epítopo podecompreender resíduos de aminoácido diretamente envolvidos na ligação(também chamados de componente imunodominante do epítopo) e outrosresíduos de aminoácido, que não estão diretamente envolvidos na ligação, taiscomo resíduos de aminoácido que são eficazmente bloqueados pelo peptídeode ligação de antígeno específico (em outras palavras, o resíduo deaminoácido está dentro da pegada do peptídeo de ligação de antígenoespecífico).
O termo "molécula biespecífica" é intencionado a incluirqualquer agente, tal como uma proteína, peptídeo ou proteína ou complexo depeptídeo, que tem duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, amolécula pode ligar a ou interage com, (a) uma antígeno de superfície celulare (b) um receptor de Fc na superfície de uma célula efetora. O termo"molécula multiespecífica" é intencionada a incluir qualquer agente, porexemplo uma proteína, peptídeo ou proteína ou complexo de peptídeo, quetem mais do que duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, amolécula pode ligar a ou interagir com, (a) um antígeno de superfície celular,(b) um receptor de Fc na superfície de um célula efetora e (c) pelo menos umoutro componente. Conseqüentemente, a presente invenção inclui, mas não élimitada a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas e outrasmultiespecíficas que são direcionadas a CD38 e a outros antígenos desuperfície celular ou alvos, tais como receptores Fc nas células efetoras.
O termo "anticorpos biespecíficos" é intencionado a incluirqualquer anticorpo anti-CD38, que é uma molécula biespecífica. O termo"anticorpos biespecíficos" também incluem diacorpos. Os diacorpos sãobivalentes, anticorpos biespecíficos em que os domínios Vh e Vl sãoexpressados em uma única cadeia de polipeptídeo, mas usando um ligadorque é muito curto para permitir para emparelhar entre os dois domínios namesma cadeia, deste modo forçando os domínios para emparelhar comdomínios complementares de uma outra cadeia e criar dois sítios de ligação deantígeno (ver por exemplo Holliger, P. et ai., PNAS USA 90, 6444-6448(1993), Poljak, R. J. et al., Structure 2, 1121-1123 (1994)).
Como aqui usado, o termo "célula efetora" refere-se a umacélula imune que está envolvido na fase efetora de uma resposta imune, comooposto às fases cognitivas e de ativação de uma resposta imune. As célulasimunes exemplares incluem uma célula de uma origem mielóide ou linfóide,por exemplo linfócitos (tais como células B e células T incluindo células Tcitolíticas (CTLs)), células matadoras, células matadoras naturais,macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares,granulócitos, mastóides e basófilos. Algumas células efetoras expressamreceptores Fc específicos e realizam funções imunes específicas. Em algumasformas de realização, uma célula efetora é capaz de induzir a citotoxicidadecelular dependente de anticorpo (ADCC), tal como um neutrófilo capaz deinduzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, que expressam FcRestão envolvidos na matança específica de células alvo e apresentamantígenos a outros componentes do sistema imune ou que se liga às célulasque apresentam antígenos. Em algumas formas de realização, uma célulaefetora pode fagocitar um antígeno alvo, célula alvo ou microorganismo. Aexpressão de uma FcR particular em uma célula efetora pode ser reguladapelos fatores humorais tais como citocinas. Por exemplo, a expressão deFcyRI foi descoberta ser super-regulada pelo interferon γ (IFN-γ) e/ou G-CSF. Esta expressão realçada aumenta a atividade citotóxica de células quecarregam FcyRI contra alvos. Uma célula efetora pode fagocitar ou lisar umantígeno alvo ou uma célula alvo.
O termo "anticorpo humano", como aqui usado, éintencionado a incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantesderivadas das seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Osanticorpos humanos da presente invenção podem incluir resíduos deaminoácido não codificados pelas seqüências de imunoglobulina da linhagerminativa humana (por exemplo mutações introduzidas pela mutagênesealeatória ou específica de sítio in vitro ou pela mutação somática in vivo).Entretanto, o termo "anticorpo humano", como aqui usado, não éintencionado a incluir anticorpos em que as seqüências de CDR derivadas dalinha germinativa de uma outra espécie de mamífero, tal como umcamundongo, foi enxertado nas seqüências da estrutura humana.
Como aqui usado, um anticorpo humano é "derivado de" umaseqüência da linha germinativa particular se o anticorpo é obtido de umsistema usando seqüências de imunoglobulina humana, por exemplo pelaimunização de um camundongo transgênico que carrega genes daimunoglobulina humana ou pela triagem de uma biblioteca de gene daimunoglobulina humana e em que o anticorpo humano selecionado é pelomenos 90 %, tal como pelo menos 95 %, por exemplo pelo menos 96 %, talcomo pelo menos 97 %, por exemplo pelo menos 98 % ou tal como pelomenos 99 % idêntica na seqüência de aminoácido à seqüência de aminoácidocodificado pelo segmento de gene da região variável Vh ou Vl da linhagerminativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma seqüênciado segmento de gene da região variável particular Vh ou Vl da linhagerminativa humana demonstrarão não mais do que 10 diferenças deaminoácido, tal como não mais do que 5, por exemplo não mais do que 4, 3, 2ou 1 diferença de aminoácido da seqüência de aminoácido codificada pelogene da imunoglobulina da linha germinativa.
Um anticorpo quimérico é um anticorpo que contém uma oumais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou mais outrosanticorpos derivados de uma outra espécie. Um anticorpo quiméricomonovalente é um dímero (HL)) formado por uma cadeia H quiméricaassociada através de pontes de dissulfeto com uma cadeia L quimérica. Umanticorpo quimérico divalente é o tetrâmero (H2L2) formado pelos doisdímeros HL associados através de pelo menos uma ponte de dissulfeto. Umanticorpo quimérico polivalente também pode ser produzido, por exemplo,pela utilização de uma região CH que oligomeriza (por exemplo a partir deuma cadeia H ou cadeia μ de IgM). Tipicamente, um anticorpo quiméricorefere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve éidêntica com ou homóloga às seqüências correspondentes em anticorposderivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclassede anticorpo particular, embora o resto da(s) cadeia(s) seja(m) idêntica(s) comou homóloga(s) às seqüências correspondentes em anticorpos derivados deuma outra espécie ou pertencentes a uma outra classe ou subclasse deanticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que os mesmosexibam a atividade biológica desejada (ver por exemplo a US 4.816.567 eMorrison et al, PNAS USA 81, 6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricossão produzidos pelos processos recombinantes bem conhecidos na técnica(ver por exemplo Cabilly et al, PNAS USA 81, 3273-3277 (1984), Morrisonet al, PNAS USA 81, 6851-6855 (1984), Boulianne et al., Nature 312, 643-646 (1984), EP125023, Neuberger et al, Nature 314, 268-270 (1985),EPl71496, EP173494, W086/01533, EP184187, Sahagan et al, J. Immunol.137, 1066-1074 (1986), W087/02671, Liu et al, PNAS USA 84, 3439-3443(1987), Sun et al, PNAS USA 84, 214-218 (1987), Better et al, Science 240,1041-1043 (1988) e Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)).
Um anticorpo humanizado é um anticorpo que é derivado deuma espécie não humana, em que certos aminoácidos na estrutura e domíniosconstantes das cadeias pesadas e leves foram mutados de modo a evitar ouanular uma resposta imune em seres humanos. As formas humanizadas deanticorpos não humanos (por exemplo murino) são anticorpos quiméricos quecontêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para amaior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas(anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região hipervariável doreceptor são substituídas pelos resíduos de uma região hipervariável de umaespécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ouprimata não humano tendo as características de ligação de antígeno desejadastais como especificidade e afinidade. Em alguns casos, os resíduos da regiãode estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelosresíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorposhumanizados podem compreender resíduos que não são encontrados noanticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas paraotimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. No geral, um anticorpohumanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um etipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todasdas alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina nãohumana e todas ou substancialmente todas das regiões FR são aquelas de umaseqüência de imunoglobulina humana. Um anticorpo humanizadoopcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma regiãoconstante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulinahumana. Para mais detalhes, ver Jones et al, Nature 321, 522-525 (1986),Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2, 593-596 (1992).
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição deanticorpo monoclonal" como aqui usados referem-se a uma preparação demoléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição deanticorpo monoclonal demonstra uma única especificidade e afinidade deligação quanto a um epítopo particular. Conseqüentemente, o termo"anticorpo monoclonal humano" se refere a anticorpos que demonstram umaúnica especificidade de ligação que têm regiões variáveis e constantesderivadas de seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Osanticorpos monoclonais humanos podem ser gerados por um hibridoma queinclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgênico outranscromossômico, tal como um camundongo transgênico, tendo um genomaque compreenda um transgene da cadeia pesada humana e um transgene dacadeia leve, fundido a uma célula imortalizada. Um anticorpo monoclonalpode ser abreviado como mAb.
O termo "anticorpo humano recombinante", como aqui usado,inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressados, criadosou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados apartir de um animal (tal como um camundongo) que seja transgênico outranscromossômico para genes da imunoglobulina humana ou um hibridomapreparado a partir destes (descrito ainda em outro lugar aqui), (b) anticorposisolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar oanticorpo, tal como a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados apartir de uma biblioteca de anticorpo humano recombinante, combinatória e(d) anticorpos preparados, expressados, criados ou isolados por qualqueroutro meio que envolva a união de seqüências de gene da imunoglobulinahumana a outras seqüências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantestêm regiões variável e constantes derivadas das seqüências de imunoglobulinada linha germinativa humana. Em certas formas de realização, entretanto, taisanticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos à mutagênese invitro (ou, quando um animal transgênico para seqüências Ig humanas é usado,a mutagênese in vivo somática) e assim as seqüências de aminoácido dasregiões Vh e Vl dos anticorpos recombinantes são seqüências que, emboraderivadas da e relacionadas com as seqüências Vh e Vl da linha germinativahumana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linhagerminativa do anticorpo humano in vivo.
Como aqui usado, um "anticorpo heterólogo" é definido emrelação ao organismo não humano transgênico que produz um tal anticorpo.
Este termo refere-se a um anticorpo tendo uma seqüência de aminoácido quecorresponde àquela encontrada em um organismo que não consiste do animalnão humana e no geral de uma espécie outra que não aquela do animal nãohumano transgênico.
Um "anticorpo isolado," como aqui usado, é intencionado a sereferir a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpostendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo um anticorpoisolado que especificamente se liga ao CD38 é substancialmente isento deanticorpos que especificamente ligam antígenos outros que não CD38). Umanticorpo isolado que especificamente se liga a um epítopo, isoforma ouvariante de CD38 humano, entretanto, pode ter reatividade cruzada a outrosantígenos relacionados, por exemplo de outra espécie (tal como espécieshomólogas CD38). Além disso, um anticorpo isolado pode sersubstancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos. Emuma forma de realização da presente invenção, uma combinação deanticorpos monoclonais "isolados" tendo especificidades diferentes écombinada em uma composição bem definida.
Como aqui usado, "ligação específica" refere-se a um peptídeode ligação de antígeno, tal como um anticorpo, que se liga a um antígeno prédeterminado. Tipicamente, o peptídeo de ligação de antígeno, tal como umanticorpo, liga-se com uma afinidade que corresponde a um KD de cerca de10-7 M ou menos, tal como cerca de 10" M ou menos, tal como cerca de 10"M ou menos, cerca de IO"10 M ou menos ou cerca de IO"11 M ou ainda menosquando determinada pela tecnologia de ressonância de plasma de superfície(SPR) em um instrumento BlAcore 3000 usando CD38 recombinante como oligando e o anticorpo como o analito. O peptídeo de ligação de antígeno podeligar-se ao antígeno pré determinado com uma afinidade que corresponde aum KD que é pelo menos dez vezes mais baixo, tal como pelo menos 100vezes mais baixo, por exemplo pelo menos 1000 vezes mais baixo, tal comopelo menos 10.000 vezes mais baixo, por exemplo pelo menos 100.000 vezesmais baixo do que a sua afinidade quanto à ligação a um antígeno nãoespecífico (por exemplo, BSA, caseína) outro que não o antígeno prédeterminado ou um antígeno intimamente relacionado. A quantidade com quea afinidade é mais baixa é dependente do KD do peptídeo de ligação deantígeno, de modo que quando o KD do peptídeo de ligação de antígeno émuito baixo (isto é, o peptídeo de ligação de antígeno é altamente específico),então a quantidade com que a afinidade para o antígeno é mais baixa do que aafinidade quanto a um antígeno não específico pode ser de pelo menos 10.000vezes. As frases "um peptídeo de ligação de antígeno que reconhece umantígeno" e "um peptídeo de ligação de antígeno específico quanto a umaantígeno" são usados intercambiavelmente aqui com o termo "um peptídeo deligação de antígeno que se liga especificamente a um antígeno". Do mesmomodo, as frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpoespecífico quanto a um antígeno" são usados aqui intercambiavelmente com otermo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".
O termo "Icd" (s"1), como aqui usado, é intencionado a se referirà constante da taxa da constante de equilíbrio de dissociação de uma interaçãode anticorpo-antígeno particular. O dito valor também é aludido como o valorkoff.O termo "ka" (M"1 χ s"1), como aqui usado, é intencionado areferir-se à taxa da constante de equilíbrio de associação de uma interação deanticorpo-antígeno particular.
O termo "KD" (M), como aqui usado, é intencionado a referir-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular.
O termo "KA" (M"1), como aqui usado, é intencionado areferir-se à constante de equilíbrio de associação de uma interação deanticorpo-antígeno particular e é obtida dividindo-se o ka pelo Icd.
Como aqui usado, "isótipo" se refere à classe de anticorpo (porexemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM) que é codificadopelos genes da região constante de cadeia pesada.
Como aqui usado, "comutação de isótipo" se refere aofenômeno pelo qual a classe ou isótipo, de um anticorpo muda de uma classede imunoglobulina para uma das outras classes de imunoglobulina.
Como aqui usado, "isótipo não comutado" se refere à classeisotípica de cadeia pesada que é produzida quando nenhuma comutação deisótipo ocorreu; o gene CH que codifica o isótipo não comutado é tipicamenteo primeiro gene CH imediatamente a jusante do gene VDJ funcionalmenterearranjado. A comutação de isótipo foi classificada como comutação deisótipo. A comutação de isótipo clássica ocorre pelos eventos derecombinação que envolvem pelo menos uma comutação da região deseqüência no transgene. A comutação de isótipo não clássica pode ocorrer,por exemplo, pela recombinação homóloga entre σμ humano e Σμ humano(deleçãoô-associada). Os mecanismos de comutação não clássica alternativa,tais como a recombinação intertransgene e/ou intercromossômica, entreoutros, podem ocorrer e efetuar a comutação de isótipo.
Como aqui usado, o termo "seqüência comutadora" se refereàquelas seqüências de DNA responsáveis pela recombinação comutadora.Uma seqüência "doadora comutadora", tipicamente uma região comutadoraμ, estará 5' (isto é, a montante) da região de construção a ser deletada durantea recombinação comutadora. A região "aceitadora comutadora" estará entre aregião de construção a ser deletada e a região constante de substituição (porexemplo γ, ε, etc.). Como não existe nenhum sítio específico onde arecombinação sempre ocorre, a seqüência de gene final tipicamente não seráprognosticável a partir da construção.
Como aqui usado, "padrão de glicosilação" é definido como opadrão de unidades de carboidrato que são covalentemente ligadas a umaproteína, mais especificamente a uma proteína da imunoglobulina (anticorpo).
Um padrão de glicosilação de um anticorpo heterólogo pode ser caracterizadocomo sendo substancialmente similar aos padrões de glicosilação queocorrem naturalmente nos anticorpos produzidos pela espécie do animaltransgênico não humano, quando uma pessoa de habilidade comum na técnicareconheceria o padrão de glicosilação do anticorpo heterólogo como sendomais similares ao dito padrão de glicosilação na espécie do animaltransgênico não humana do que para a espécie a partir da qual os genes CH dotransgene foram derivados.
O termo "que ocorrem naturalmente" como aqui usado quandoaplicado a um objeto se refere ao fato de que um objeto pode ser encontradona natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou seqüência de polinucleotídeoque estão presentes em um organismo (incluindo vírus) que podem serisolados de uma fonte na natureza e que não foram intencionalmentemodificados pelo homem no laboratório é que ocorrem naturalmente.
O termo "rearranjado" como aqui usado refere-se a umaconfiguração de um local de imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leveem que um segmento V é posicionado imediatamente adjacente a umsegmento D-J ou J em uma conformação que codifica essencialmente umdomínio Vh ou Vl completo, respectivamente. Um local de gene daimunoglobulina (anticorpo) rearranjado pode ser identificado pelacomparação com o DNA da linha germinativa; um local rearranjado terá pelomenos um elemento de homologia de heptâmero/nonâmero recombinado.
O termo "não rearranjado" ou "configuração da linhagerminativa" como aqui usado em referência a um segmento V se refere àconfiguração em que o segmento V não é recombinado de modo a serimediatamente adjacente a um segmento D ou J.
O termo "molécula de ácido nucleico", como aqui usado, éintencionado a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Umamolécula de ácido nucleico pode ser de filamento único ou de filamentoduplo, mas é preferivelmente DNA de filamento duplo. Os ácidos nucleicospodem estar presentes em células integrais, em um lisado de célula ou emuma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura.
Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmentepuro" quando purificado de outros componentes celulares ou outroscontaminantes, tais como outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, pelastécnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/ SDS, formação de faixa deCsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bemconhecidas no ramo. Ver, F. Ausubel et al., ed. Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience Nova Iorque(1987).
Um ácido nucleico é "operavelmente ligado" quando o mesmoé colocado em uma relação funcional com uma outra seqüência de ácidonucleico. Por exemplo, um promoter ou realçador são operavelmente ligadosa uma seqüência codificadora se os mesmos afetam a transcrição daseqüência. Com respeito à transcrição de seqüências reguladoras,operavelmente ligado significa que as seqüências de DNA que estão ligadassão contíguas e, onde necessário unir duas proteínas que codificam regiões,contíguas e na matriz de leitura. Para as seqüências comutadoras,operavelmente ligado indica que as seqüências são capazes de efetuar arecombinação comutadora.
Como aqui usado, o termo "inibe o crescimento" (por exemploquando da alusão às células) é intencionado incluir qualquer diminuiçãomensurável no crescimento da célula quando contatada com um CD38BP, talcomo um anticorpo anti-CD38, quando comparado ao crescimento dasmesmas células que não em contato com um CD38BP, tal como um anticorpoanti-CD38, por exemplo uma inibição de crescimento de uma cultura celularem pelo menos de cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80%, 90 %, 99 % ou 100 %.
Como aqui usado, os termos "inibe a ligação" e "bloqueia aligação" (por exemplo quando da alusão à inibição/bloqueio de ligação de umparceiro de ligação de CD38 ao CD38) são usados intercambiavelmente eabrangem a inibição/bloqueio tanto parcial quanto completa. Ainibição/bloqueio de ligação de um parceiro de ligação de CD38 ao CD38podem reduzir ou alterar o nível normal ou tipo de sinalização celular queocorre quando um parceiro de ligação de CD38 se liga ao CD38 sem inibiçãoou bloqueio. Inibição e bloqueio também são intencionados a incluir qualquerdiminuição mensurável na afinidade de ligação de um parceiro de ligação deCD38 ao CD38 quando em contato com um CD38BP, tal como um anticorpoanti-CD38, quando comparado com o ligando que não em contato com umCD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, por exemplo um bloqueio deligação de um parceiro de ligação de CD38 ao CD38 em pelo menos de cercade 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % ou 100 %.
"Célula alvo" deve significar qualquer célula indesejável emum paciente (por exemplo um ser humano ou animal) que pode ser alvejadopor uma composição (que compreende por exemplo um CD38BP, tal comoum anticorpo anti-CD38 monoclonal humano e/ou uma molécula biespecíficaou uma multiespecífica direcionada contra CD38) da presente invenção. Emalgumas formas de realização, a célula alvo é uma célula que expressa ou quesuperexpressa CD38. As células que expressam CD38 tipicamente incluemcélulas hematopoiéticas, tais como timócitos medulares, células TeBativadas, 80 % de células e monócitos de NK latente, linfoblastos centraisgerminais de linfonodo, células B plasmáticas e algumas célulasintrafoliculares, células dendríticas, células da medula óssea normais, célulasprecursoras particulares, 50 a 80 % de células sangüíneas do cordãoumbilical, eritrócitos e plaquetas. O CD38 também pode ser expressado pelascélulas não hematopoiéticas, tais como células intra-epiteliais e linfócitos dalâmina própria no intestino, pelas células de Purkinje e emaranhadosneurofibrilares no cérebro, pelas células epiteliais da próstata, células β nopâncreas, osteoclastos no osso, células retinais no olho e sarcolema demúsculo liso e estriado. Nas células malignas, CD38 é expressado em umavariedade de doenças hematológicas malignas, incluindo mas não restritas aomieloma múltiplo, leucemia de célula plasmática primária ou secundária,leucemia linfocítica crônica de célula B, leucemia linfocítica aguda de célulaB, macroglobulinemia de Waldenstrõm, amiloidose sistêmica primária,linfoma de célula do manto, leucemia prolinfocítica/ mielocítica, leucemiamielóide aguda, leucemia mielóide crônica, linfoma folicular e leucemia decélula NK.
O termo "vetor," como aqui usado, é intencionado a se referira uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácidonucleico ao qual o mesmo foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", quese refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular no qual segmentosde DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetorviral, em que segmentos de DNA adicionais podem estar ligados no genomaviral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célulahospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo vetores bacterianostendo uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissômicos).Outros vetores (tais como vetores mamíferos não epissômicos) podem serintegrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célulahospedeira e deste modo são replicados juntos com o genoma hospedeiro.Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aosquais eles são operativamente ligados. Tais vetores são aqui aludidos como"vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "os vetores deexpressão"). No geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas deDNA recombinantes estão freqüentemente na forma de plasmídeos. Napresente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usadosintercambiavelmente visto que o plasmídeo é a forma de vetor maishabitualmente usada. Entretanto, a presente invenção é intencionada a incluirtais outras formas dos vetores de expressão, tais como vetores virais (taiscomo retrovírus defeituosos de replicação, adenovírus e vírusadenoassociados), que servem para funções equivalentes.
O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente"célula hospedeira"), como aqui usado, é intencionado a se referir a umacélula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido, deve serentendido que tais termos são intencionados a se referirem não apenas àscélulas objeto particulares mas à progênie de uma tal célula. Porque certasmodificações podem ocorrer nas gerações que se sucedem devido à mutaçãoou influências ambientais, tal progênie, de fato, pode não ser idêntica à célulaprecursora, mas ainda estão incluídas dentro do escopo do termo "célulahospedeira" como aqui usado. As células hospedeiras recombinantes incluem,por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células NS/0 e célulaslinfocíticas.
O termo "seqüência reguladora" é intencionado a incluirpromotores, realçadores e outros elementos de controle de expressão (porexemplo sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou traduçãodos genes da cadeia de anticorpo. Tais seqüências reguladoras são descritas,por exemplo, em Goeddel5 Gene Expression Technology. Methods inEnzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Será avaliadopor aqueles habilitados na técnica que o planejamento do vetor de expressão,incluindo a seleção de seqüências reguladoras pode depender de fatores taiscomo a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressãoda proteína desejada, etc. Os exemplos de seqüências reguladoras para aexpressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais quedirecionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, taiscomo promotores e/ou realçadores derivados de citomegalovírus (CMV),Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardioprincipal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Alternativamente, asseqüências reguladoras não virais podem ser usadas, tais como o promotor daubiquitina ou o promotor da β-globina. Como aqui usado, o termo "paciente"inclui qualquer animal humano ou não humano. O termo "animal nãohumano" inclui todos os vertebrados, por exemplo mamíferos e nãomamíferos, tais como os primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas,anfíbios, répteis, etc.
As várias formas do termo "transfecção" são intencionadas aabranger uma ampla variedade de técnicas habitualmente usadas para aintrodução de DNA exógenos em uma célula hospedeira procarióptica oueucarióptica, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio,transfecção com DEAE-dextrano, transfecção com lipofectina e outros.
O termo "transfectoma", como aqui usado, inclui célulashospedeiras eucariópticas recombinantes que expressem o anticorpo, taiscomo células CHO, células NS/0, células HEK293, células vegetais oufungicas, incluindo células de levedura.
O termo "animal não humano" inclui todos vertebrados, porexemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos,ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc. O termo "animal nãohumano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e nãomamíferos, tais como os primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas,anfíbios, répteis, etc. O termo "animal não humano" inclui todos osvertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como os primatasnão humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
O termo "animal não humano, transgênico" refere-se a umanimal não humano tendo um genoma que compreenda um ou maistransgenes ou transcromossomas de cadeia pesada e/ou leve humanos(integrados ou não integrados no DNA genômico natural do animal) e que écapaz de expressar anticorpos humanos completos. Por exemplo, umcamundongo transgênico pode ter uma transgene de cadeia leve humano e umtransgene de cadeia pesada humano ou transcromossoma de cadeia pesadahumano, tal que o camundongo produza anticorpos anti-CD38 humanosquando imunizados com antígeno de CD38 e/ou células que expressam CD38.
O transgene de cadeia pesada humano pode ser integrado no DNAcromossômico do camundongo, como é o caso para os camundongostransgênicos, por exemplo camundongos HuMAb, tais como camundongosHCo7 ou Hco 12 ou o transgene de cadeia pesada humano pode ser mantidoextracromossomicamente, como é o caso para os camundongostranscromossômicos KM como descrito na W002/43478. Tais camundongostransgênicos e transcromossômicos (coletivamente aqui aludidos como"camundongos transgênicos") são capazes de produzir isótipos múltiplos deanticorpos monoclonais humanos para um dado antígeno (tal como IgG, IgA,IgM, IgD e/ou IgE) submetendo-se à recombinação V-D-J e comutação deisótopo. O animal não humano transgênico também pode ser usado para aprodução de anticorpos contra um antígeno específico pela introdução degenes que codificam tais anticorpos específicos, por exemplo ligando-seoperativamente os genes a um gene que seja expressado no leite do animal.
O termo especificidade aqui se refere à capacidade de umpeptídeo de ligação de CD38, tal como um anticorpo anti-CD38, parareconhecer um epítopo dentro de CD38, enquanto se tem apenas pouca ounenhuma reatividade detectável com outras porções de CD38 (incluindooutros epítopos que são ligados por outros CD38BPs, tal como o anticorposanti-CD38). A especificidade pode ser relativamente determinada pelosensaios de competição como aqui descritos. A especificidade pode ser maisparticularmente determinada por qualquer uma das técnicas deidentificação/caracterização de epítopo aqui descritas ou seus equivalentesconhecidos na técnica.
Um anticorpo específico quanto a um determinante antigênicoparticular não obstante pode reagir cruzado com outras biomoléculas quepodem estar presentes em algum contexto biológico com CD38. Maistipicamente, um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, pode reagircruzado com homólogos de CD38 de outra espécie. Em cada um ou emambos os contextos, tipicamente tais anticorpos reativos cruzados sãoseletivos quanto ao CD38 humano com respeito à estrutura relevante e/oufatores ambientais.
O termo seletividade aqui se refere à ligação preferencial deum CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, quanto a uma regiãoparticular, alvo ou peptídeo; tipicamente uma região ou epítopo em CD38,como oposto a uma ou mais outras moléculas biológicas, estruturas, células,tecidos, etc. Em uma forma de realização, um CD38BP, tal como umanticorpo anti-CD38, da presente invenção é seletivo quanto a uma porção deCD38 no contexto das células de câncer do cólon (isto é, o anticorpo anti-CD38 ligar-se-á seletivamente à porção de CD38 em relação a outroscomponentes de uma célula de câncer de cólon).
As CD38BPs da presente invenção são tipicamente usadas efornecidos em uma forma pelo menos substancialmente isolada. Umamolécula substancialmente isolada é uma molécula que é a espéciepredominante na composição em que é encontrada com respeito à classe demoléculas à qual a mesma pertence (isto é, a mesma compõem pelo menoscerca de 50 % do tipo de molécula na composição e tipicamente comporá pelomenos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %,pelo menos de cerca 90 %, pelo menos de cerca de 95 % ou mais da espéciede molécula, por exemplo, peptídeo, na composição (por exemplo, acomposição exibirá pelo menos cerca de 98 %, 98 % ou 99 % dehomogeneidade quanto ao CD38BP no contexto de todas as espécies depeptídeo presentes)).
Uma molécula isolada refere-se a uma molécula que não estáassociada com níveis significantes (tais como mais do que cerca de 1 %, maisdo que cerca de 2 %, mais do que cerca de 3 % ou mais do que cerca de 5 %)de quaisquer fatores fisiológicos estranhos e indesejáveis, tais comobiomoléculas de ligação que não CD38 (ou moléculas de ligação de CD38que possam interferir com a ligação e/ou atividade de um CD38BP dapresente invenção) contidos dentro de uma célula ou animal em que oCD38BP é produzido. Uma molécula isolada também se refere a qualquermolécula que tenha passado através de um tal estágio de pureza devido àintervenção humana (seja automático, manual ou ambos). Em muitas dasvárias composições fornecidas pela presente invenção, tal como em umacomposição que compreenda um ou mais carreadores farmaceuticamenteaceitáveis, um CD38BP pode estar presente em quantidades relativamentepequenas em termos de números de espécie molecular total na composição(por exemplo no caso de uma composição que compreenda uma quantidadegrande de um carreador, estabilizador e/ou conservante farmaceuticamenteaceitáveis). Em alguns casos peptídeos adicionais, tais como BSA, podem serincluídos em uma tal composição com um CD38BP anteriormente purificado.
Entretanto, contanto que tais constituintes adicionais da composição sejamaceitáveis para a aplicação intencionada do CD38BP, uma tal composiçãopode ser descrita ainda como compreendendo um CD38BP isolado.
Os CD38BPs da presente invenção são de modo tipicamentesubstancial isentos de outros CD38BPs, tais como CD38BPs tendo diferentesespecificidades antigênicas. Entretanto, a presente invenção também forneceuma composição que compreende vários CD38BPs com diferentesespecificidades e características (por exemplo a presente invenção fornece um"coquetel" de CD38BPs tendo características de especificidade e/ouseletividade diferentes).
"Tratamento" significa a administração de uma quantidadeeficaz de um composto terapeuticamente ativo da presente invenção com opropósito de abrandamento, melhora ou erradicação (cura) de sintomas ouestados de doença.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma região Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 2.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma região Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 6.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma região Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 2 e uma região Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 6.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDRl de Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 3.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR2 de Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 4.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR3 de Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 5.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDRl de Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 8.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR2 de Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 9.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR3 de Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 10.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende CDRs de Vl (CDR1 de VL, CDR2 e CDR3) queconsistem essencialmente da SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5,respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende CDRs de Vh (CDR1 de VH, CDR2 e CDR3) queconsistem essencialmente da SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10,respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende
(a) três CDRs de VL, que independentemente consistemessencialmente da SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5 emproximidade imediata entre si (por exemplo, próximo do espaçamento dasCDRs de Vl em um anticorpo anti-CD38 do-tipo selvagem) no CD38BP e
(b) três CDRs de Vh que independentemente consistemessencialmente da SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10 emproximidade imediata entre si (por exemplo, o espaçamento próximo dasCDRs de Vh em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP.Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece um CD38BP que compreende um ligador flexível posicionado entre aregião Vl e região Vh do CD38BP. Em uma outra forma de realizaçãoadicional, a presente invenção fornece um CD38BP, em que as regiões Vl eVHs são apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteínadobrada de imunoglobulina e orientadas tal que a CDRl, CDR2, CDR3 de Vle CDRl, CDR2 e CDR3 de Vh cooperativamente associam-se para contribuirna ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico noCD38. Em uma outra forma de realização adicional, a presente invençãofornece um CD38BP que compreende dois conjuntos de variáveis de domínio(conjuntos de domínios Vl e Vh associados nas cadeias separadas associadas),tal que o CD38BP que compreende dois sítios de ligação de determinanteantigênico idênticos.
Qualquer um de tais CD38BPs descritos neste parágrafo sãoesperados, pelo menos em parte, terem especificidade de epítopo, seletividadee outras características similares como um anticorpo tendo região Vl quecompreenda a seqüência da SEQ ID No: 2 e uma região Vh que compreenda aseqüência da SEQ ID No: 7, e, conseqüentemente, pode ser útil no tratamentode mieloma múltiplo.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma região Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 12.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma região Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 17.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma região Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 12 e uma região Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 17.Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDRl de Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 13.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR2 de Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 14.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR3 de Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 15.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDRl de Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 18.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR2 de Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 19.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR3 de Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 20.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende CDRs de Vl (CDR1, CDR2 e CDR3 de VL) queconsistem essencialmente da SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No:15, respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende CDRs de Vh (CDR1, CDR2 e CDR3 de VH) queconsistem essencialmente da SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No:20, respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende
(a) três CDRs de VL, que independentemente consistemessencialmente da SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No: 15 emproximidade imediata entre si (por exemplo, próximo ao espaçamento dasCDRs de Vl em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP e
(b) três CDRs de Vh que independentemente consistemessencialmente da SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No: 20 emproximidade imediata entre si (por exemplo, próximo ao espaçamento dasCDRs de Vh em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP.
Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece um CD38BP que compreende um ligador flexível posicionado entre aregião Vl e a região Vh do CD38BP. Em uma outra forma de realizaçãoadicional, a presente invenção fornece um CD38BP, em que as regiões Vl eVh são apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteínadobrada de imunoglobulina e orientadas tal que a CDRl, CDR2, CDR3 de Vle CDRl, CDR2, CDR3 de Vh cooperativamente associam-se para contribuirna ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico noCD38. Em uma outra forma de realização adicional, a presente invençãofornece um CD38BP que compreende dois conjuntos de domínios variáveis(conjuntos de domínios Vl e Vh associados em cadeias separadas associadas),tal que o CD38BP que compreende dois sítios de ligação determinantesantigênicos idênticos.
Qualquer um de tais CD38BPs descritos neste parágrafo sãoesperados, pelo menos em parte, ter especificidade de epítopo, seletividade eoutras características similares como um anticorpo tendo região Vl quecompreenda a seqüência da SEQ ID No: 12 e uma região Vh que compreendaa seqüência da SEQ ID No: 17, e, conseqüentemente, pode ser útil notratamento de mieloma múltiplo.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma região Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 22.Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma região Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQID No: 27.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma região Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 22 e uma região Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 27.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDRl de Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 23.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR2 de Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 24.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR3 de Vl que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 25.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDRl de Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 28.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR2 de Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 29.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR3 de Vh que consiste essencialmente daseqüência da SEQ ID No: 30.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende CDRs de Vl (CDR1, CDR2 e CDR3 de VL) queconsiste essencialmente da SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25,respectivamente.Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende CDRs de Vh (CDR1, CDR2, CDR3 de VH) queconsiste essencialmente da SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30,respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende (a) três CDRs de VL, que independentementeconsistem essencialmente da SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No:25 em proximidade imediata entre si (por exemplo, próximo ao espaçamentodas CDRs de Vl em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP e(b) três CDRs de Vh que independentemente consistem essencialmente daSEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30 em proximidade imediataentre si (por exemplo, próximas ao espaçamento das CDRs de Vh em umanticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP.
Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece um CD38BP que compreende um ligador flexível posicionado entre aregião Vl e região Vh do CD38BP. Em uma outra forma de realizaçãoadicional, a presente invenção fornece um CD38BP, em que as regiões Vl eVh são apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteínadobrada de imunoglobulina e orientadas tal que a CDRl, CDR2, CDR3 de Vle CDRl, CDR2, CDR3 de Vh cooperativamente associem-se para contribuirna ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico noCD38. Em uma outra forma de realização adicional, a presente invençãofornece um CD38BP que compreende dois conjuntos de domínios variáveis(conjuntos de domínios Vl e Vh associados em cadeias separadas associadas),tal que o CD38BP compreenda dois sítios de ligação de determinanteantigênico idênticos.
Qualquer um de tais CD38BPs descritos neste parágrafo sãoesperados, pelo menos em parte, ter especificidade de epítopo, seletividade eoutras características similares como um anticorpo tendo região Vl quecompreenda seqüência da SEQ ID No: 22 e uma região Vh que compreendaseqüência da SEQ ID No: 27, e, conseqüentemente, podem ser úteis notratamento de mieloma múltiplo.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDRl de Vl que consiste essencialmente deuma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 13 ou SEQ IDNo: 23, em que o resíduo de terminal N e/ou um, dois ou três dos resíduos deresíduos de aminoácido de terminal C são perdidos.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR2 de Vl que consiste essencialmente deuma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 4 ou SEQ ID No: 14 ou SEQ IDNo: 24, em que um ou dois dos resíduos de terminal N e/ou um, dois ou trêsdos resíduos de terminal C são perdidos.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR3 de Vl que consiste essencialmente deuma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 5 ou SEQ ID No: 15 ou SEQ IDNo: 25, em que o resíduo de terminal N e/ou um, dois, três ou quatro dosresíduos de terminal C são perdidos.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDRl de Vh que consiste essencialmente deuma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 8 ou SEQ ID No: 18 ou SEQ IDNo: 28, em que um, dois, três ou quatro dos resíduos de terminal N e/ou um,dois, três ou quatro resíduos de terminal C são perdidos.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR2 de Vh que consiste essencialmente deuma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No: 19 ou SEQ IDNo: 29, em que um, dois, três, quatro ou cinco dos aminoácidos de terminal Ndestes e/ou um, dois, três, quatro, cinco ou seis dos aminoácidos de terminalC destes são perdidos.Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR3 de Vh que consiste essencialmente deuma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 10 ou SEQ ID No: 20 ou SEQID No: 30, em que um, dois ou três resíduos de aminoácido do terminal Ne/ou um, dois, três ou quatro resíduos de aminoácido do terminal C sãoperdidos.
A presente invenção também fornece CD38BPs em que estasseqüências de CDR "truncadas" são combinadas entre si e/ou outrasseqüências de CDR aqui descritas.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende
(a) três CDRs de VL, que independentemente consistemessencialmente da SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5 emproximidade imediata entre si no CD38BP (por exemplo, próximo aoespaçamento das CDRs de Vl em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem)e
(b) três CDRs de Vh que independentemente consistemessencialmente da SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10 emproximidade imediata entre si (por exemplo, próximo ao espaçamento dasCDRs de Vh em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP. Emuma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP quecompreende um ligador flexível posicionado entre a região VLea região Vhdo CD38BP.
Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece um CD38BP em que as regiões Vl e Vh são apresentadas em cadeiasseparadas no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina eorientadas tal que a CDRl, CDR2, CDR3 de Vl e a CDRl, CDR2, CDR3 deVh cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivoe/ou específico de um determinante antigênico no CD38. Em uma outra formade realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende doisconjuntos de domínios variáveis (conjuntos de domínios Vl e Vh associadosnas cadeias separadas associadas), tal que o CD38BP compreende dois sítiosde ligação de determinante antigênico idênticos. Qualquer de tais CD38BPsdescritos neste parágrafo são esperados, pelo menos em parte, terespecificidade de epítopo, seletividade e outras características similares comum anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 e uma seqüência Vhda SEQ ID No: 7.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende três CDRs de VL, que independentementeconsistem essencialmente da SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No:15 em proximidade imediata entre si no CD38BP (por exemplo, próximo aoespaçamento das CDRs de Vl em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem)e três CDRs de Vh que independentemente consistem essencialmente da SEQID No: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No: 20 em proximidade imediata entresi (por exemplo, próximo ao espaçamento das CDRs de Vh em um anticorpoanti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP. Em uma outra forma de realização,a presente invenção fornece um CD38BP que compreende um ligador flexívelposicionado entre a região Vl e região Vh do CD38BP.
Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece um CD38BP em que as regiões Vl e Vh são apresentadas em cadeiasseparadas no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina eorientadas tal que a CDRl, CDR2, CDR3 de Vl e CDRl, CDR2, CDR3 deVh cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivoe/ou específico de um determinante antigênico no CD38. Em uma outra formade realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende doisconjuntos de domínios variáveis (conjuntos de domínios Vl e Vh associadosnas cadeias separadas associadas), tal que o CD38BP compreende dois sítiosde ligação de determinante antigênico idênticos. Qualquer de tais CD38BPsdescritos neste parágrafo são esperados, pelo menos em parte, terespecificidade de epítopo, seletividade e outras características similares comum anticorpo tendo uma Vl seqüência da SEQ ID No: 12 e uma Vh seqüênciada SEQ ID No: 17.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende
(a) três CDRs de VL, que independentemente consistemessencialmente da SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25 emproximidade imediata entre si no CD38BP (por exemplo, próximo aoespaçamento das CDRs de Vl em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem)e três CDRs de Vh que independentemente consistem essencialmente da SEQID No: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30 em proximidade imediata entresi (por exemplo, próximo ao espaçamento das CDRs de Vh em um anticorpoanti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP.
Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece um CD38BP que compreende um ligador flexível posicionado entre aregião VLea região Vh do CD38BP.
Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece um CD38BP em que as regiões Vl e Vh são apresentadas em cadeiasseparadas no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina eorientadas tal que a CDRl, CDR2, CDR3 de Vl e CDRl, CDR2, CDR3 deVh cooperativamente associem-se para contribuir na ligação de modo seletivoe/ou específico de um determinante antigênico no CD38. Em uma outra formade realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende doisconjuntos de domínios variáveis (conjuntos de domínios Vl e Vh associadosnas cadeias separadas associadas), tal que o CD38BP compreenda dois sítiosde ligação de determinante antigênico idênticos. Qualquer um de taisCD38BPs descritos neste parágrafo são esperados, pelo menos em parte, terespecificidade de epítopo, seletividade e outras características similares comum anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vhda SEQ ID No: 27.
A presente invenção também fornece CD38BPs quecompreendem variantes funcionais da região Vl, região Vh ou uma ou maisCDRs dos anticorpos dos exemplos. Uma variante funcional de uma VL, Vhou CDR usada no contexto de um CD38BP permite ainda o CD38BP reterpelo menos uma proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %,70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) da afinidade/ avidez e/ouespecificidade/seletividade do anticorpo precursor e em alguns casos um talCD38BP pode estar associado com afinidade, seletividade e/ou especificidademaiores do que no anticorpo precursor.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma variante Vl que consiste essencialmente deuma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, tal como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal como pelo menos de cercade 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, tal como pelo menos decerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90 %, tal como pelomenos de cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a umaseqüência de acordo com a SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No:22, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelomenos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) dascaracterísticas de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma seqüênciavariante Vl da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22,respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ IDNo: 2 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 7 e um anticorpo tendo umaseqüência Vl da SEQ ID No: 12 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 e umanticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vh daSEQ ID No: 27, respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDRl de Vl variante que consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, talcomo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal comopelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, talcomo pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90%, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer uma da SEQ ID No: 3ou SEQ ID No: 13 ou SEQ ID No: 23, em que o CD38BP tem pelo menosuma proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %,90 %, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de umanticorpo tendo uma variante CDRl de seqüência Vl da SEQ ID No: 3 ouSEQ ID No: 13 ou SEQ ID No: 23, respectivamente, tal como um anticorpotendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No:22, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQID No: 2 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 7 ou um anticorpo tendo umaseqüência Vl da SEQ ID No: 12 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 ouum anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vhda SEQID No: 27, respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma variante CDR2 de Vl que consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, talcomo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal comopelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, talcomo pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90%, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer uma das SEQ ID Nos: 4ou 14, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelomenos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) dascaracterísticas de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma varianteCDR2 de seqüência Vl da SEQ ID No: 4 ou SEQ ID No: 14 ou SEQ ID No:24, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22, respectivamente, tal comoum anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 e uma seqüência Vhda SEQ ID No: 7 ou um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 12e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 ou um anticorpo tendo uma seqüênciaVl da SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 27,respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR3 de Vl variante que consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, talcomo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal comopelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, talcomo pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90%, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer um da SEQ ID No: 5 ouSEQ ID No: 15 ou SEQ ID No: 25, em que o CD38BP tem pelo menos umproporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90%, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpotendo uma CDR3 de seqüência Vl variante da SEQ ID No: 5 ou SEQ ID No:15 ou SEQ ID No: 25, respectivamente, tal como um anticorpo tendo umaseqüência Vl da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22,respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ IDNo: 2 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 7 ou um anticorpo tendo umaseqüência Vl da SEQ ID No: 12 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 ouum anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vhda SEQ ID No: 27, respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma Vh variante que consiste essencialmente deuma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, tal como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal como pelo menos de cercade 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, tal como pelo menos decerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90 %, tal como pelomenos de cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a umaseqüência de acordo com qualquer um da SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17ou SEQ ID No: 27, em que o CD38BP tem pelo menos um proporçãosubstancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oumais) das características de ligação de epítopo de um anticorpo tendo umaseqüência Vh variante da SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No:27, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência Vh da SEQID No: 7 e uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 ou um anticorpo tendo umaseqüência Vh da SEQ ID No: 17 e uma seqüência Vl da SEQ ID No: 12 ouum anticorpo tendo uma seqüência Vh da SEQ ID No: 27 e uma seqüência Vlda SEQ ID No: 22, respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDRl de Vh variante que consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, talcomo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal comopelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, talcomo pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90%, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer um da SEQ ID No: 8 ouSEQ ID No: 18 ou SEQ ID No: 28, em que o CD38BP tem pelo menos umproporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90%, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpotendo uma CDRl de seqüência Vh variante da SEQ ID No: 8 ou SEQ ID No:18 ou SEQ ID No: 28, respectivamente, tal como um anticorpo tendo umaseqüência Vh da SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 27,respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência Vh da SEQ IDNo: 7 e uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 ou um anticorpo tendo umaseqüência Vh da SEQ ID No: 17 e uma seqüência Vl da SEQ ID No: 12 ouum anticorpo tendo uma seqüência Vh da SEQ ID No: 27 e uma seqüência Vlda SEQ ID No: 22, respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende um CDR2 de Vh variante que consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, talcomo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal comopelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, talcomo pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90%, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer um da SEQ ID No: 9 ouSEQ ID No: 19 ou SEQ ID No: 29, em que o CD38BP tem pelo menos umaproporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90%, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpotendo uma CDR2 de seqüência Vh variante da SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No:19 ou SEQ ID No: 29, respectivamente, tal como um anticorpo tendo umaseqüência Vh da SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 27,respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência Vh da SEQ IDNo: 7 e uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 ou um anticorpo tendo umaseqüência Vh da SEQ ID No: 17 e uma seqüência Vl da SEQ ID No: 12 ouum anticorpo tendo uma seqüência Vh da SEQ ID No: 27 e uma seqüência Vlda SEQ ID No: 22, respectivamente.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compreende uma CDR3 de Vh variante que consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, talcomo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal comopelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, talcomo pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90%, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência deaminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer um da SEQ ID No: 10ou SEQ ID No: 20 ou SEQ ID No: 30, em que o CD38BP tem pelo menosuma proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %,90 %, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de umanticorpo tendo uma CDR3 de seqüência Vh variante da SEQ ID No: 10 ouSEQ ID No: 20 ou SEQ ID No: 30, respectivamente, tal como um anticorpotendo uma seqüência Vh da SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No:27, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência Vh da SEQID No: 7 e uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 ou um anticorpo tendo umaseqüência Vh da SEQ ID No: 17 e uma seqüência Vl da SEQ ID No: 12 ouum anticorpo tendo uma seqüência Vh da SEQ ID No: 27 e uma seqüência Vlda SEQ ID No: 22, respectivamente.
A identidade percentual entre duas seqüências é uma funçãodo número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é, %de homologia = # de posições idênticas/ # total de posições χ 100), levando-seem consideração o número de intervalos e o comprimento de cada intervalo,que necessitam ser introduzidos para alinhamento ótimo das duas seqüências.
A comparação das seqüências e determinação da identidade percentual entreas duas seqüências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático,como descrito nos exemplos não limitantes abaixo.
A identidade percentual entre as duas seqüências denucleotídeo pode ser determinada usando o programa GAP no pacote desoftware GCG (disponível no http://www.gcg.com), usando uma matrizNWSgapdna.CMP e um peso de intervalo de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um pesode comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A identidade percentual entre doisnucleotídeo ou seqüências de aminoácido também pode ser determinadausando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17(1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando umatabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de tamanho de intervalode 12 e uma penalidade de intervalo de 4. Além disso, a identidade percentualentre duas seqüências de aminoácido pode ser determinada usando oalgoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)) que foiincorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível nahttp://www.gcg.com), usando uma matriz Blossum 62 ou uma matrizPAM250 e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso decomprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
As seqüências de ácido nucleico e proteína da presenteinvenção podem ser ainda usados como uma "seqüência dúvida" para realizaruma pesquisa contra bases de dados públicas, por exemplo, para identificarseqüências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando osprogramas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul et ai, J. Mol. Biol.215, 403-10 (1990). As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem serrealizadas com o programa NBLAST, contagem = 100, comprimento depalavra =12 para se obter seqüências de nucleotídeo homólogas às moléculasde ácido nucleico da presente invenção. A pesquisa por proteína BLAST podeser realizada com o programa XBLAST, contagem = 50, comprimento depalavra = 3 para se obter as seqüências de aminoácido homólogas àsmoléculas de proteína da presente invenção. Para se obter alinhamentos deintervalo com propósitos de comparação, BLAST de intervalo pode serutilizado como descrito em Altschul et ai., Nucleic Acids Res. 25(17), 3389-3402 (1997). Quando da utilização dos programas BLAST e BLAST deIntervalo, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo,XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver http://www.ncbi.nlm. nih.gov.
A seqüência de variantes de CDR podem diferir da seqüênciada CDR das seqüências de anticorpo precursoras através de substituições namaior parte conservativas; por exemplo pelo menos de cerca de 35 %, decerca de 50 % ou mais, de cerca de 60 % ou mais, de cerca de 70 % ou mais,de cerca de 75 % ou mais, de cerca de 80 % ou mais, de cerca de 85 % oumais, de cerca de 90 % ou mais, de cerca de 95 % ou mais (por exemplo, decerca de 65 a 99 %) das substituições na variante são substituições de resíduode aminoácido conservativas. No contexto da presente invenção, assubstituições conservativas podem ser definidas pelas substituições dentro dasclasses de aminoácidos refletidas em uma ou mais das seguintes três tabelas:
Classes de resíduo de aminoácido para as substituições conservativas
<table>table see original document page 121</column></row><table>
Classes de substituição de resíduo de aminoácido conservativoalternativo
<table>table see original document page 121</column></row><table>
Classificações Físicas e Funcionais Alternativas de Resíduosde Aminoácido
<table>table see original document page 121</column></row><table>
Os agrupamentos de substituições mais conservativas incluem:valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valinae asparagina-glutamina. Grupos funcionais de aminoácidos também podemser formulados usando os princípios descritos, por exemplo, em Creighton(1984) Proteins: structure and Molecular Properties (2a Ed. 1993), W. H.Freeman and Company.
Em uma forma de realização da presente invenção, aconservação em termos das propriedades hidropáticas/hidrofílicas epeso/tamanho do resíduo também é substancialmente retido em uma CDRvariante quando comparada a uma CDR de um anticorpo dos exemplos (porexemplo, a classe de peso, contagem hidropática ou ambas das seqüências sãopelo menos de cerca de 50 %, pelo menos de cerca de 60 %, pelo menos decerca de 70 %, pelo menos de cerca de 75 %, pelo menos de cerca de 80 %,pelo menos de cerca de 85 %, pelo menos de cerca de 90 %, pelo menos decerca de 95 % ou mais (por exemplo, de cerca de 65 a 99 %) retidas). Porexemplo, as substituições de resíduo conservativas também podem ser oualternativamente são fundamentadas na substituição de forte ou fraco combase no peso com base nos grupos de conservação, que são conhecidos natécnica.
A retenção de resíduos similares também pode ser oualternativamente é medida por uma contagem de similaridade, comodeterminada pelo uso de um programa BLAST (por exemplo, BLAST 2.2.8disponível através da NCBI). As variantes adequadas tipicamente exibem pelomenos cerca de 45 %, tal como pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cercade 65 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menoscerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou mais (por exemplo, de cerca de70 a 99 %) de similaridade com o peptídeo precursor.
As mudanças substanciais na função podem ser feitas pelaseleção das substituições que são menos conservativas do que aquelasmostradas nos grupos definidos, acima. Por exemplo, substituições nãoconservativas podem ser fabricadas que mais significantemente afetam aestrutura do peptídeo na área da alteração, por exemplo, a estrutura alfa-helicoidal ou estrutura de folha beta; a carga ou hidrofobicidade da moléculano sítio alvo; ou o volume da cadeia lateral. As substituições que no geral sãoesperadas produzem as mudanças maiores nas propriedades dos peptídeos sãoaquelas onde 1) um resíduo hidrofílico, por exemplo, serila ou treonila, ésubstituído no lugar de (ou por) um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucila,isoleucila, fenilalanila, valila ou alanila; 2) uma cisteína ou prolina sãosubstituídos no lugar de (ou por) qualquer outro resíduo; 3) um resíduo tendouma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisila, arginila ou histidila, ésubstituído no lugar de (ou por) um resíduo eletronegativo, por exemplo,glutamila ou aspartila; ou 4) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa,por exemplo, fenilalanina, é substituído no lugar de (ou por) um resíduo quenão tem uma cadeia lateral, por exemplo, glicina. Conseqüentemente, estas eoutras substituições não conservativas podem ser introduzidas em variantespeptídicas onde mudanças signifícantes na função/estrutura é desejada e taismudanças evitadas onde a conservação da estrutura/ função é desejada.
Um modo conveniente para gerar variantes de substituição é amaturação de afinidade usando fago usando métodos conhecido na técnica.
De modo a identificar sítios da região hipervariável candidatos para amodificação, a mutagênese de varredura de alanina também pode serrealizada para identificar resíduos da região hipervariável que contribuemsignificantemente para a ligação de antígeno. Alternativa ou adicionalmente,pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo de antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno.
Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos adequadosprováveis para a substituição.
Onde inserções na região hipervariável são feitas para gerarum anticorpo variante, a faixa típica de comprimentos da região hipervariávelem questão em anticorpos conhecidos deve ser levada em consideração. Porexemplo, para a primeira região hipervariável de um domínio de cadeia levevariável, inserções podem ser introduzidas na CDRl de seqüência Vl de umanticorpo precursor enquanto se retém um tamanho apropriadosubstancialmente similar e deste modo esperado, que de acordo com Kabat etal., supra, por exemplo, tipicamente tem um total de cerca de 9 a 20 (porexemplo, de cerca de 10 a 17) resíduos. Similarmente, a CDR2 de Vltipicamente tem um comprimento total de cerca de 5 a 10 resíduos; CDR3 deVl tipicamente tem um comprimento de cerca de 7 a 20 resíduos; a CDRl deVh tipicamente tem um comprimento de cerca de 10 a 15 resíduos; a CDR2de Vh tipicamente tem um comprimento de cerca de 15 a 20 resíduos; e aCDR3 de Vh tipicamente tem um comprimento de cerca de 6 a 30 resíduos(por exemplo, de 3 a 25 resíduos). As inserções na região Vh tipicamente sãofeitas na CDR3 de Vh e tipicamente próximo ao terminal C do domínio, talcomo de cerca de 97 a 102 resíduos da CDR3 de Vh precursora (por exemploadjacente a ou no terminal C na seqüência em relação ao resíduo número 100da CDR3 de seqüência Vh precursora) usando o alinhamento e numeraçãocomo descrito em Kabat. As variantes de anticorpo com resíduo(s) deaminoácido inserido(s) em uma região hipervariável destes podem serpreparadas aleatoriamente, especialmente onde a afinidade de ligação departida do anticorpo precursor para o antígeno alvo é tal que variantes deanticorpo aleatoriamente produzidas podem ser facilmente tríadas. Porexemplo, a demonstração de fago fornece um método conveniente de triagemde tais variantes aleatórias.
No planejamento, construção e/ou avaliação de variantes deCDR atenção pode ser prestada para o fato de que as regiões de CDR podemser alteradas para permitir uma melhor ligação ao epítopo. CDRs de anticorpotipicamente operam pelo fornecimento de uma superfície complementar,possivelmente incluindo dedos que podem projetar-se na superfície daproteína do antígeno ou outra estrutura de parátopo, sobre a qual o epítopo seajusta. Se o epítopo não é firmemente ajustado, o anticorpo pode não oferecera melhor afinidade. Entretanto, como com epítopos, freqüentemente existemuns poucos resíduos chave em uma estrutura de parátopo que sejamresponsáveis pela maioria destas ligações. Assim, as seqüências de CDRpodem variar no comprimento e composição significantemente entreanticorpos para o mesmo peptídeo. O técnico habilitado reconhecerá quecertos resíduos, tais como resíduos de tirosina (por exemplo, no contexto deCDR3s de seqüência VH), que são freqüentemente contribuidoressignificantes para tal ligação de epítopo, são tipicamente retidos em umavariante de CDR.
Variantes da região de CDR também podem aumentar ocontato de aminoácido entre o antígeno e uma variante de anticorpo, quandocomparado com o contato de aminoácido entre o antígeno e o anticorpoprecursor, pela introdução de um ou mais resíduos de aminoácido (pelasubstituição ou inserções) que aumentam o contato ou interaçõesenergeticamente favoráveis entre um ou mais resíduos de aminoácidopresentes em um antígeno e um ou mais resíduos de aminoácido presentes noanticorpo. As interações de aminoácido de interesse podem ser selecionadosde interações de ligação de hidrogênio, interações de van der Waals einterações iônicas.
Aqueles habilitados na técnica estarão cientes de princípiosadicionais úteis no planejamento e seleção de CD38BP que compreendevariantes de CDR dos anticorpos da presente invenção.
No contexto de variantes de CDR, que são variantes das CDRsdos anticorpos dos exemplos, particularmente no contexto de CDR varianteem anticorpos anti-CD38 ou fragmentos destes, resíduos requeridos parasustentar e/ou orientar as estrutura(s) da alça estrutural de CDR podem sertipicamente retidos; os resíduos que caem dentro de cerca de 10 ângstroms deuma alça estrutura de CDR (mas opcionalmente apenas resíduos nesta áreaque também possuem uma superfície acessível a solvente aquoso de cerca de5 ângstroms2 ou mais) podem ser tipicamente não modificados oumodificados apenas pelas substituições de resíduo de aminoácidoconservativas; e/ou a seqüência de aminoácido pode ser tipicamentesubmetida apenas a um número limitado de inserções e/ou deleções (sealguma), tal que as estruturas equivalentes à alça estrutural de CDR sejamretidas na variante (uma descrição de técnicas relacionadas e princípiosrelevantes é fornecida por exemplo em Schiweck et al, J Mol Biol. 268(5),934-51 (1997), Morea, Biophys Chem. 68(1-3), 9-16 (1997), Shirai et al.,FEBS Lett. 399(1-2), 1-8 (1996), Shirai et al., FEBS Lett. 455(1-2), 188-97(1999), Reckzo et al., Protein Eng. 8(4), 389-95 (1995) e Eigenbrot et al, JMol Biol. 229(4), 969-95 (1993). Ver também a WO 03/048185, WO03/070747 e WO 03/027246.
As técnicas adicionais que podem ser usadas para geraranticorpos variantes incluem a evolução direcionada e outras técnicas degeração de variante descrita por exemplo na US 20040009498, Marks et al.,Methods Mol Biol. 248, 327-43 (2004), Azriel-Rosenfeld et al., J Mol Biol.335(1), 177-92 (2004), Park et al., Biochem Biophys Res Commun. 275(2),553-7 (2000), Kang et al., Proc Natl Acad Sci USA. 88(24), 11120-3 (1991),Zahnd et al., J Biol Chem. 279(18), 18870-7 (2004), Xu et al., Chem Biol.9(8), 933-42 (2002), Border et al., Proc Nat) Acad Sci USA. 97(20), 10701-5 (2000), Crameri et al., Nat Med. 2(1), 100-2 (1996) e como mais no geraldescrito por exemplo na WO 03/048185.
As variantes de anticorpo geradas podem ser submetidas aqualquer técnica de triagem adequada e os anticorpos com propriedadessuperiores adequadas e desejáveis em um ou mais ensaios relevantes podemser selecionados para desenvolvimento adicional.
As CD38BPs que compreendem seqüências de CDR comodescrito acima podem compreender qualquer número adequado e combinaçãode tais CDRs de Vl e Vh enquanto retém pelo menos uma proporçãosubstancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oumais) da afinidade/avidez e/ou especificidade/ seletividade de um anticorpotendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 e uma seqüência Vh da SEQ IDNo: 7 e/ou um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 12 e umaseqüência Vh da SEQ ID No: 17 e/ou um anticorpo tendo uma seqüência Vlda SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 27, masopcionalmente diferindo em outras características, tais como imunogenicidadeem um paciente humano, afinidade para o epítopo, meia-vida aumentada, etc.
Em alguns casos um tal CD38BP pode estar associado com afinidade,seletividade e/ou especificidade maiores do que a do anticorpo precursor. Emuma forma de realização, menos do que um conjunto completo de CDRs deVl e/ou CDRs de Vh estão presentes em um CD38BP da presente invenção.
Em uma forma de realização todas das CDRs de Vl e CDRs de Vh estãopresentes.
Os exemplos de outras propriedades funcionais de anticorpos,que podem ser alteradas ou retidas nas variantes de CD38BPs da presenteinvenção quando comparada a -003 e -005 e -024, são:
(1) ligação de alta afinidade ao CD38;
(2) taxa de dissociação baixa de CD38
(3) inibição ou bloqueio de ligação de CD38 ao CD38 alvo;
(4) eliminação de células T ou células B que expressem CD38;
(5) indução de um alto nível de CDC de células negativas emCD55/59 ou positivas em CD55/59;
(6) translocação em balsas de lipídeo na ligação ao CD38;
(7) tolerância de células T;
(8) inibição da proliferação de células T ou B que expressemCD38;
(9) internalização de CD38;
(10) inibição ou indução da atividade enzimática de CD38;(11) inibição ou indução da transdução de sinal induzida pelo CD38;
(12) indução ou inibição da produção de citocina;
(13) indução ou bloqueio da diferenciação de célula T ou célula Β;
(14) indução de ou resgate da apoptose;
(15) atenuação ou aumento da indução de Iise pelas células NK;
(16) indução ou inibição da produção de insulina pelas células B no pâncreas;
(17) sobrevivência prolongada de um paciente tendo células detumor que expressam CD38; e/ou
(18) indução de ADCC de CD38 alvos quando misturados comcélulas efetoras apropriadas. A presente invenção também fornece CD38BPsque são caracterizadas com respeito à sua capacidade para competir (inibircompetitivamente) ou competir cruzado (isto é, inibir de modo relativamenteparcial a ligação de epítopo) com um anticorpo tendo uma seqüência Vl daSEQ ID No: 2 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 7 (tal como o anticorpo -003) ou um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 12 e umaseqüência Vh da SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) ou um anticorpotendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vh da SEQ IDNo: 27, (tal como o anticorpo -024), quanto à ligação ao CD38.
Um tal CD38BP pode ser, por exemplo, um fragmento Fab,derivado de um anticorpo que se liga a um epítopo idêntico a ou que sesobrepõem com um epítopo ligado por um anticorpo tendo uma seqüência Vlda SEQ ID No: 2 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 7 ou um anticorpotendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 12 e uma seqüência Vh da SEQ IDNo: 17 ou um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 e umaseqüência Vh da SEQ ID No: 27. Um tal fragmento Fab, devido ao seutamanho relativamente pequeno comparado com as moléculas mAb, podemnão competir significantemente com os ditos anticorpos quanto à ligação aoCD38 embora o anticorpo a partir do qual o mesmo deriva o faça. Nãoobstante, um tal CD38BP pode ser útil em alvejar similarmente regiõespróximas de CD38 (por exemplo, no contexto de alvejar uma citotoxina,radionuclídeo ou semelhante no contexto de um CD38BP imunoconjugado).
Portanto, tais CD38BPs podem ser úteis no contexto dos métodos da presenteinvenção e, conseqüentemente, também são fornecidos pela presenteinvenção.
A competição quanto à ligação ao CD38 ou uma porção deCD38 por dois ou mais CD38BPs pode ser determinada por qualquer técnicaadequada. Em uma forma de realização, a competição é determinada porexemplo como descrito nos Exemplos 7, 8 e 9.
A competição no contexto da presente invenção se refere aqualquer redução detectavelmente significante na propensão quanto a umamolécula particular para ligar um parceiro de ligação particular na presençade uma outra molécula que liga o parceiro de ligação. Tipicamente,competição significa uma redução de pelo menos cerca de 10 %, tal comouma redução de pelo menos cerca de 15 % ou uma de pelo menos cerca de 20% na ligação entre um CD3 8BP e
(a) uma forma de CD38 (por exemplo, CD38 "processado","maduro", "não elaborado", "não processado" ou "imaturo");
(b) uma forma de CD38 livre (por exemplo, um fragmento deCD38 produzido pelo processamento in vivo);
(c) um peptídeo heterodimérico composto de um outropeptídeo associado com CD38, tal como um CD31 e CD38;
(d) um complexo de CD38 e um ou mais substratos, tais comocAMP, NAD+ e/ou cADPR;
(e) um dímero dimerizado, associado e/ou processado deCD38 com um ligando solúvel, tal como CD31; ou
(f) uma porção de CD38,
causada pela presença de um outro CD38BP comodeterminado, por exemplo, pela análise de ELISA ou análise de FACS (comodescrito na seção de exemplos) usando quantidades suficientes das duas oumais moléculas de CD38BPs e CD38 em competição. Também pode ser ocaso que a competição possa existir entre CD38BPs com respeito a mais doque um de CD38 e/ou uma porção de CD38, por exemplo, em um contextoonde as propriedades de ligação de anticorpo de uma região particular deCD38 são retidos em seus fragmentos, tal como no caso de um epítopo linearbem apresentado localizado em vários fragmentos testados ou um epítopoconformacional que é apresentado em fragmentos de CD38 suficientementegrandes assim como no CD38.
Avaliar a competição tipicamente envolve uma avaliação daligação inibidora relativa usando uma primeira quantidade de uma primeiramolécula; uma segunda quantidade de uma segunda molécula; e uma terceiraquantidade de uma terceira molécula (ou um padrão determinado pelosestudos de ligação que podem ser razoavelmente comparados com os novosdados de ligação com respeito à primeira e segundo moléculas como umsubstituto para os dados contemporâneos reais), em que a primeira, segunda eterceira quantidades todas são suficientes para fabricar uma comparação quecomunique informação a cerca da seletividade e/ou especificidade dasmoléculas em disputa com respeito às outras moléculas presentes. A primeira,segunda e terceira quantidades podem variar com a natureza do CD38BP ealvos potenciais portanto em disputa. Por exemplo, para as avaliações porELISA, similares àquelas descritas na seção de exemplos, cerca de 5 a 50 μg(por exemplo, cerca de 10 a 50 μg, cerca de 20 a 50 μg, cerca de 5 a 20 μg,cerca de 10 a 20 μg, etc.) de CD38BP e/ou alvos de CD38 são requeridos paraavaliar se a competição existe. As condições também devem ser adequadaspara a ligação. Tipicamente, condições fisiológicas ou quase fisiológicas (porexemplo, temperaturas de cerca de 20 a 40°C, pH de cerca de 7 a 8, etc.) sãoadequadas para a ligação de CD38BP:CD38.
Freqüentemente a competição é mascada por uma inibiçãosignificantemente maior do que cerca de 5 % como determinado pelo ELISAe/ou análise de FACS. Pode ser desejável ajustar um patamar mais alto deinibição relativa como um critério/determinante do que seja um níveladequado de competição em um contexto particular (por exemplo, onde aanálise de competição é usada para selecionar ou triar quanto a novosanticorpos planejados com a função intencionada de bloquear a ligação de umoutro peptídeo ou molécula que se liga ao CD38 (por exemplo, os parceirosde ligação natural de CD38 tais como CD31, também chamado de antígeno deCD31, EndoCAM, GPIIA', PECAMl, molécula de adesão de plaqueta/célulaendotelial ou anticorpo anti-CD38 que ocorre naturalmente)). Assim, porexemplo, é possível ajustar um critério para a competitividade em que pelomenos cerca de 10 % de inibição relativa seja detectada; pelo menos cerca de15 % de inibição relativa seja detectada; ou pelo menos cerca de 20 % deinibição relativa seja detectada antes que um anticorpo seja consideradosuficientemente competitivo. Em casos onde epítopos pertencentes aosanticorpos competidores estão intimamente localizados em um antígeno, acompetição pode ser acentuada em mais do que cerca de 40 % de inibiçãorelativa da ligação de CD38 (por exemplo, pelo menos cerca de 45 % deinibição, tal como pelo menos cerca de 50 % de inibição, por exemplo pelomenos cerca de 55 % de inibição, tal como pelo menos cerca de 60 % deinibição, por exemplo pelo menos cerca de 65 % de inibição, tal como pelomenos cerca de 70 % de inibição, por exemplo pelo menos cerca de 75 % deinibição, tal como pelo menos cerca de 80 % de inibição, por exemplo pelomenos cerca de 85 % de inibição, tal como pelo menos cerca de 90 % deinibição, por exemplo pelo menos cerca de 95 % de inibição ou nível maisalto de inibição relativa).
A competição pode ser considerada o inverso de reatividadecruzada entre uma molécula e dois parceiros de ligação potenciais. Em certasformas de realização, um CD38BP da presente invenção especificamente seliga a um ou mais resíduos ou regiões no CD38 mas também não reagemcruzado com outros peptídeos, regiões ou moléculas peptídicas, por exemplo,a presente invenção fornece um anticorpo anti-CD38 que não reage cruzadocom proteínas com homologia ao CD38, tal como BST-I (antígeno-1 decélula estrômica da medula óssea) e Mo5, também chamado de CDl57; ouanticorpos anti-CD38 que não reagem cruzado com CD38 no contexto detecido normal, tal como tecidos não envolvidos no mieloma múltiplo.
Tipicamente, uma falta de reatividade cruzada significa menos do que cercade 5 % de inibição competitiva relativa entre as moléculas quando avaliadapelo ELISA e/ou análise de FACS usando quantidades suficientes dasmoléculas sob condições de ensaio adequadas.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compete com um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ IDNo: 2 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 7, tal como o anticorpo -003,quanto à ligação ao CD38 ou um porção destes.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compete com um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ IDNo: 12 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17, tal como o anticorpo -005,quanto à ligação ao CD38 ou uma porção destes.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que compete com um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ IDNo: 22 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 27, tal como o anticorpo -024,quanto à ligação ao CD38 ou um porção destes.
Como debatido em outro lugar aqui, a menos que de outromodo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto, referências àligação de um CD38BP ao CD38 são intencionadas a se referir à ligação emqualquer contexto adequado, tal como em um contexto conformacional onde aestrutura de CD38 está presente; ou em um contexto de epítopo linear.
Naturalmente, a ligação em um subconjunto limitado de tal(is) contexto(s)pode ser uma característica importante com respeito a qualquer CD38BPfornecido pela presente invenção.
Os métodos adicionais para determinar a especificidade deCD38BP pela inibição competitiva podem ser encontrados por exemplo emHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan et al., eds.,Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e WileyInterScience N.Y., (1992, 1993) e Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601(1983)).
CD38 humano que compreende vários epítopos diferentes, quepodem incluir (1) peptídeos determinantes antigênicos que são compreendidosdentro de cadeias de peptídeo únicas dentro do CD38 humano; (2)determinantes antigênicos conformacionais que consistem de um ou maisaminoácidos não contíguos em uma cadeia e/ou aminoácidos particularespresentes em cadeias de peptídeo espacialmente contíguas mas separadas(tipicamente onde as respectivas seqüências de aminoácido das cadeias sãolocalizadas separadamente ao longo da seqüência de polipeptídeo da CD38humano); (3) determinantes antigênicos pós traducionais que consistem, notodo ou parte, de estruturas moleculares covalentemente ligadas ao CD38humano, tais como grupos de carboidrato; ou (4) combinações de (1) a (3).
Um epítopo no contexto da presente invenção inclui qualquerpeptídeo ou determinante derivado de peptídeo capazes de ligação específicaa uma imunoglobulina. Um epítopo pode compreender qualquer número deaminoácidos adequado, em qualquer posição adequada (com respeito àseqüência linear de CD38), orientação (com respeito ao CD38 dobrado ou umfragmento destes), composição de aminoácido (e conseqüentemente, pelomenos em parte, a carga).
Assim, por exemplo, um epítopo pode ser composto de cercade 3 a 10 aminoácidos, tipicamente de 3 a 8 aminoácidos, em uma ou maislocalizações contíguas ou não contíguas com respeito à seqüência primária deCD38 (por exemplo um epítopo pode consistir essencialmente de 2, 3, 4, 5, 6,7 ou 8 resíduos de aminoácido distribuídos em 1, 2, 3, 4 ou 5 localizações nãocontíguas no CD38). Alternativamente, por exemplo, um epítopo pode serconsiderado ser definido por uma região de cerca de 5 a 40 resíduos deaminoácido contíguos (por exemplo, de cerca de 7 a 30 resíduos deaminoácido, cerca de 5 a 20 resíduos de aminoácido ou cerca de 3 a 15resíduos de aminoácido) em CD38 (isoladamente ou em combinação comuma porção de um domínio de CD38 adjacente). Em alguns epítopos pode sero caso que apenas um resíduo de aminoácido ou apenas uns poucos resíduosde aminoácido são críticos para o reconhecimento de CDR ou CDR(s) (edeste modo o mais importante para a afinidade e avidez de CD38BP:antígenode CD38). Como tal, um epítopo pode ser caracterizado com base em um oumais de tais resíduos críticos, com o reconhecimento de que outros resíduostambém podem fazer contribuição um pouco menor ao epítopo. No caso deum epítopo definido por uma região de aminoácidos, pode ser que um ou maisaminoácidos na região façam apenas uma contribuição menor ou aindacontribuição negligenciável para a ligação de anticorpo, tal que o resíduopossa ser submetido à substituição com um resíduo apropriado diferente semque resulte em "uma perda" do epítopo para pelo menos alguns CD38BPsespecíficos para o mesmo.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, que especificamente se liga a umepítopo de CD38 que também é especificamente ligado por um anticorpotendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 e uma seqüência Vh da SEQ IDNo: 7 (tal como o anticorpo -003) ou um anticorpo tendo uma seqüência Vlda SEQ ID No: 12 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 (tal como oanticorpo -005) ou um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 euma seqüência Vh da SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024). E possívelque CD38BPs tendo uma ou mais CDRs que diferem das CDRs de umanticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 e uma seqüência Vh daSEQ ID No: 7 ou as CDRs de um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQID No: 12 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 ou as CDRs de umanticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vh daSEQ ID No: 27, podem ser ainda específicas para o mesmo epítopo como umanticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 e uma seqüência Vh daSEQ ID No: 7 e um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 12 euma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 e um anticorpo tendo uma seqüência Vlda SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 27, respectivamente.
Em alguns de tais sais, o CD38BP em questão pode reconhecer ou ser maisespecífico/seletivo quanto ás estruturas ou regiões particulares do epítopo doque o anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 e uma seqüênciaVh da SEQ ID No: 7 e o anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No:12 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 e o anticorpo tendo uma seqüênciaVl da SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 27respectivamente.
Um epítopo de CD38 ligado por um anticorpo tendo umaseqüência Vl da SEQ ID No: 2 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 7 (talcomo o anticorpo -003) ou um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ IDNo: 12 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) ouum anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vhda SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024), podem ser identificados porintermédio do mapeamento padrão e técnicas de caracterização, refinamentoadicional do qual pode ser identificado por qualquer técnica adequada,exemplos numerosos dos quais estão disponíveis ao técnico habilitado. Estastécnicas também podem ser usadas para identificar e/ou caracterizar epítopospara CD38BPs no geral. Como um exemplo de tais métodos de mapeamento/caracterização, um epítopo para um anticorpo anti-CD38 pode serdeterminado pela "impressão digital" do epítopo usando a modificaçãoquímica das aminas/carboxilas expostas na proteína CD38. Um exemploespecífico de uma tal técnica de pegada é o uso de HXMS (mudança dedeutério para hidrogênio detectada pela espectrometria de massa) em que umamudança de hidrogênio/deutério de prótons da amida de proteína receptora eligando, a ligação e a retro mudança ocorrem, em que os grupos amida daestrutura que participam na ligação da proteína são protegidos da retromudança e portanto permanecerão deuterados. As regiões relevantes podemser identificadas neste ponto pela proteólise péptica, separação pelacromatografia líquida de alto desempenho de microperfuração rápida e/ouespectrometria de massa de ionização por eletropulverização. Ver, porexemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, 267(2) 252-259 (1999) e/ouEngen, J. R. e Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Um outroexemplo de uma técnica de identificação de epítopo adequada é omapeamento de epítopo pela ressonância magnética nuclear (RMN), ondetipicamente a posição dos sinais em espectros de RMN bidimensionais doantígeno livre e do antígeno complexado com o peptídeo de ligação deantígeno, tal como um anticorpo, é comparada. O antígeno tipicamente érotulado de modo seletivamente isotópico com 15N de modo que apenassinais que correspondem ao antígeno e nenhum sinal do peptídeo de ligaçãode antígeno são observados no espectro de RMN. Os sinais de antígeno que seoriginam dos aminoácidos envolvidos na interação com o peptídeo de ligaçãode antígeno tipicamente mudarão de posição nos espectros do complexocomparados com os espectros do antígeno livre e os aminoácidos envolvidosna ligação podem ser identificados deste modo. Ver por exemplo ErnstSchering Res Found Workshop. (44), 149-67 (2004), Huang et ai., Journal ofMolecular Biology 281(1), 61-67 (1998) e Saito e Patterson, Methods. 9(3),516-24(1996).
O mapeamento/caracterização de epítopo também pode serrealizada usando métodos de espectrometria de massa. Ver por exemploDownward, J Mass Spectrom. 35(4), 493-503 (2000) e Kiselar e Downard,Anal Chem. 71(9), 1792-801 (1999).
As técnicas de digestão da protease também podem ser úteisno contexto de mapeamento e identificação de epítopo. As regiões/seqüências determinantes antigênicas relevantes podem ser determinadas peladigestão com protease, por exemplo, usando-se tripsina em uma razão decerca de 1:50 para CD38 na digestão durante a noite (O/N) a 37°C e pH 7 a 8,seguido pela análise de espectrometria de massa (MS) para a identificação depeptídeo. Os peptídeos protegidos da clivagem com tripsina pelo CD38BPpodem ser subseqüentemente identificados pela comparação de amostrassubmetidas à digestão com tripsina e amostras incubadas com CD38BP edepois submetidos à digestão por exemplo, pela tripsina (deste modorevelando uma pegada para o aglutinante). Outras enzimas comoquimiotripsina, pepsina, etc. Também ou alternativamente podem ser usadosem um método de caracterização de epítopo similar. Um CD38BP que dásignificantemente o mesmo resultado como um anticorpo tendo umaseqüência Vl da SEQ ID No: 2 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 7 (talcomo o anticorpo -003) ou um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ IDNo: 12 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) ouum anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vhda SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024) nestas medições são julgadosser um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo tendo umaseqüência Vl da SEQ ID No: 2 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 7 (talcomo o anticorpo -003) ou um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ IDNo: 12 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) ouum anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 e uma seqüência Vhda SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024), respectivamente. Ver porexemplo Manca, Ann Ist Super Sanita. 27(1), 15-9 (1991) quanto a um debatede técnicas similares.
O mapeamento de epítopo pela ligação competitiva ao CD38com dois anticorpos onde um é biotinilado é um outro método para identificarregiões de determinantes antigênicos relevantes.
A ligação de anticorpos aos peptídeos lineares e em alça deCD38 por um imuno ensaio ligado a enzima com base em PEPSCAN é umoutro método para identificar regiões de determinantes antigênicos relevantes,ver por exemplo Slootstra-JW et al. Mol-Divers. 1, 87-96 (1996).
A mutagênese direcionada ao sítio é um outro método paraidentificar regiões de determinante antigênico relevantes, ver por exemploPoliak e Deans, Blood 99, 3956-3962 (2002).
Várias técnicas de demonstração de fago também podem serusadas para identificar epítopos. Ver por exemplo Wang e Yu, Curr DrugTarget. 5(1), 1-15 (2004), Burton, Imunotechnology. 1(2), 87-94 (1995 Aug),Cortese et al., Imunotechnology. 1(2), 87-94 (1995) e Irving et al., Curr OpinChem Biol. 5(3), 314-24 (2001). Os epítopos de consenso também podem seridentificados através de técnicas relacionadas com a demonstração de fagomodificada (ver, http://www.cs.montana.edut-mumey/papers/jcb03.pdf) paradebate.
Outros métodos potencialmente úteis no mapeamento deepítopos incluem técnicas de cristalografia, técnicas de difração de raios X(tais como as técnicas de estudo de difração de raio X/seqüênciadesenvolvidas por Poijak e outros nos idos de 1970 a 1980) e a aplicação daTecnologia de Síntese de Peptídeo de Multipino. Os métodos com base emcomputador tais como a análise de seqüência e análise de estruturatridimensional e ancoragem também pode ser usado para identificardeterminantes antigênicos. Por exemplo, um epítopo também pode serdeterminado pela modelagem molecular usando uma estrutura de CD38 comancoragem da estrutura do fragmento Fab do anticorpo monoclonalindividual. Estes e outros métodos de mapeamento são debatidos no EpitopeMapping A Practical Approach (Westwood e Hay Eds.) 2001 OxfordUniversity Press.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP tendo substancialmente as mesmas características de ligação deCD38 específicas de um ou mais mAbs selecionados de um anticorpo tendouma seqüência Vl da SEQ ID No: 2 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 7(tal como o anticorpo -003), um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQID No: 12 e uma seqüência Vh da SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005)e um anticorpo tendo uma seqüência Vl da SEQ ID No: 22 e uma seqüênciaVh da SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024).
Os estudos de mapeamento têm indicado que diversosanticorpos monoclonais incitados contra o CD38 humano ligam-se a epítoposna região de terminal C de CD38 (220-296) (Hoshino et ai. e Ferrero et ai.).Dentro desta região três diferenças de aminoácido foram encontradas entre aseqüência de CD38 humana e a de cinomolgo: T237, Q272 e S274 nos sereshumanos correspondem a A238, R273 e F275 no cinomolgo. -005 não se ligaao tecido de cinomolgo (mostrado nos Exemplos 10 e 11). Um númerolimitado de diferenças de aminoácido existe entre a seqüência de CD38humana e a de macaco, por exemplo na parte de terminal carbóxi da proteína,por exemplo as seguintes três diferenças de aminoácido entre a seqüência deCD38 humana e do cinomolgo : T237, Q272 e S274 no CD38 humanocorresponde a A238, R273 e F275 no CD38 de macaco cinomolgo (comparara SEQ ID No. 21 e SEQ ID No. 22). -005 não se liga a uma proteína huCD38mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 da SEQ ID No: 31 foisubstituído com um resíduo de arginina (Q272R) ou a uma proteína huCD38mutante, em que o resíduo de serina da posição 274 da SEQ ID No: 31 foisubstituída com um resíduo de fenilalanina (S274F) (mostrado no Exemplo17) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano do tipo selvagem. Aligação de -005 é particularmente anulada pela substituição de aminoácido naposição S274F.
Conseqüentemente, a presente invenção fornece peptídeos, quese ligam ao CD38 humano (SEQ ID No: 31) e que não se ligam a um CD38humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foisubstituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No. 33) com o mesmo grauque se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
A presente invenção também fornece peptídeos, que se ligamao CD38 humano (SEQ ID No: 31) e que não se ligam a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No. 34) com o mesmo grau que se liga aoCD38 humano (SEQ ID No: 31).
O termo "ao mesmos grau" deve ser interpretado de modo quea ligação do peptídeo ao CD38 humano mutante seja significantemente maisbaixa do que a ligação do peptídeo para o CD38 humano do tipo selvagem. Aligação de um peptídeo para as moléculas de CD38 (tipo selvagem e mutante)pode ser determinada de vários modos e está dentro do conhecimento geralcomum de uma pessoa habilitada na técnica para determinar se a ligação aomutante é "significantemente mais baixa" do que a ligação ao tipo selvagem.
Um grande número de técnicas diferentes para a determinação da ligação deum peptídeo a um outro peptídeo estão disponíveis para a pessoa dehabilidade na técnica, por exemplo ELISA, radioimunoensaio, BIAcore oucitometria de fluxo.
Um método de determinar a ligação é determinando-se a EC5Oda ligação do peptídeo à proteína mutante e à proteína do tipo selvagem edepois comparando os valores obtidos. Um outro método de determinar aligação é examinando-se a magnitude da ligação na concentração de saturação(por exemplo o platô de sinal de ligação) ou pela determinação das constantesda razão cinética ko e koff por exemplo pelo BIAcore.
Em uma forma de realização, a ligação do peptídeo em questãoàs proteínas de CD38 (mutante ou tipo selvagem) é pelo uso de um ELISAcomo descrito no Exemplo 17.
Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo aum CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foisubstituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que50 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Emuma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com umresíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC50 daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma derealização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, emque o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 5 % da EC5O da ligação dopeptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma de realização, aEC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduode serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQID No: 34), é menor do que 1 % da EC5O da ligação do peptídeo ao CD38humano (SEQ ID No: 31).
Em uma forma de realização, a EC5O da ligação do peptídeo aum CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foisubstituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), é menor do que 50% da EC5O da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Emuma forma de realização, a EC5O da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído comum resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), é menor do que 10 % da EC50 daligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Em uma forma de realização, um peptídeo de acordo com ainvenção liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treoninana posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32)com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em umaforma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humanomutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com umresíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 75 % da EC5O da ligaçãodo peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma de realização,a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduode treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQID No: 32) é mais do que 85 % da EC5O da ligação do peptídeo ao CD38humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma de realização, a EC50 da ligação dopeptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina naposição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) émais do que 90 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ IDNo: 31). Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a umCD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foisubstituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 95 %da EC5O da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
Para identificar regiões antigênicas determinantes provávelmais específica em CD38, vários métodos analíticos preditivos podem seraplicados. Em um primeiro método analítico, CD38 pode ser analisado quanto(1) às regiões altamente hidropáticas (usando o método Kyte-Doolittle); (2) àantigenicidade como medida pelo método do índice Protrusão; (3) àantigenicidade como determinada pelo método de Parker; (4) à antigenicidadecomo determinada pelo método de Hopp/Woods; e (5) hidrofilicidade comomedido pelo métodos de Goldman, Engleman e Steitz. As seqüênciasvariando de 10 a 40 aminoácidos no comprimento podem ser selecionadoscom base na exibição de uma ou mais destas propriedades. A lógica para estemétodo é o consenso geral que muitos epítopos de célula B ideal sãoseqüências hidrofílicas, orientadas na superfície e flexíveis de cerca de 8 a 10aminoácidos no comprimento.
A presente invenção fornece CD38BPs específicos para asregiões de CD38 de CD38 identificados em uma tal maneira. Além disso, osterminais destas seqüências podem ser comparadas com os determinantesantigênicos de regiões prognosticadas localizadas através das outras análisesaqui descritas para fornecer regiões contendo determinante antigênicaprováveis específicas adicional. Outras comparações similares podem serfacilmente fabricados para fornecer regiões antigênicas determinantesprováveis adicionais, onde CD38BPs que se liga a estas regiões antigênicasdeterminantes podem ser consideradas uma outra característica da presenteinvenção.
Em uma forma de realização, o CD38BP da presente invençãoé um anticorpo. Os exemplos não limitantes de moléculas de imunoglobulinaque ligam CD38 fornecidos pela presente invenção incluem (a) uma moléculade imunoglobulina completa funcional, que compreende: (i) duas cadeiaspesadas quiméricas idênticas que compreendem uma região variável com umaespecificidade ao antígeno de superfície de célula B humana e regiãoconstante humana e (ii) duas cadeias leves humanas totalmente idênticas (istoé não quiméricas); (b) uma molécula de imunoglobulina completa, funcional,que compreende: (i) duas cadeias pesadas quiméricas idênticas quecompreendem uma região variável como indicada e uma região constantehumana e (ii) duas cadeias leves não humanas totalmente idênticas (isto é nãoquiméricas); (c) um anticorpo monovalente, isto é, uma molécula deimunoglobulina completa, funcional que compreende: (i) duas cadeiaspesadas idênticas quiméricas que compreendem um região variável comoindicada e uma região constante humana e (ii) duas cadeias leves diferentes,apenas uma das quais tem a mesma especificidade como a região variável dascadeias pesadas. A molécula de anticorpo resultante liga-se apenas a umaextremidade destas e é portanto incapaz de ligação bivalente. Como uma outrailustração, pode-se dizer que os peptídeos relacionados com a imunoglobulinafornecidos pela presente invenção incluem o seguinte: (a) uma molécula deimunoglobulina inteira; (b) um scFv; (c) um anticorpo monoclonal; (d) umanticorpo humano; (e) um anticorpo quimérico; (f) um anticorpo humanizado;(g) um fragmento Fab; (h) um fragmento Fab'; (i) um fragmento F(ab')2; G)uma molécula Fv; e (k) uma molécula Fv ligada a dissulfeto.
Em uma forma de realização, o CD38BP da presente invençãoé um anticorpo policlonal. Em uma forma de realização, o CD38BP dapresente invenção é um anticorpo monoclonal. Em uma outra forma derealização, o CD38BP da presente invenção é um anticorpo monoclonalhumano. Em uma outra forma de realização adicional, o CD38BP da presenteinvenção é um anticorpo humanizado. Em uma outra forma de realizaçãoadicional, o CD38BP da presente invenção é um anticorpo quimérico. Emuma outra forma de realização adicional, o CD38BP da presente invenção éum anticorpo monoclonal que se origina totalmente de uma espécie demamífero diferente dos seres humanos. Em uma outra forma de realização, oCD38BP da presente invenção é um anticorpo monoclonal totalmente demurino.
Um anticorpo monoclonal refere-se a uma composição quecompreende uma população de anticorpo homogênea tendo uma estrutura eespecificidade uniformes. Tipicamente um anticorpo monoclonal é umanticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmentehomogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a populaçãosão idênticos exceto quanto as mutações que ocorre naturalmente possíveisque podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorposmonoclonais são altamente específicos e cada anticorpo monoclonal étipicamente direcionado contra um único epítopo, que está em contraste comas preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentesanticorpos direcionados contra diferentes epítopos. Que um anticorpo émonoclonal não deve ser interpretado como requerendo a produção doanticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorposmonoclonais da presente invenção podem ser produzidos pelo método dohibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) oupode ser produzido pelos métodos de DNA recombinantes. Os anticorposmonoclonais também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpode fago usando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al., Nature352, 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991).
Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir dequalquer fonte adequada. Assim, por exemplo, os anticorpos monoclonaispodem ser obtidos a partir de hibridomas preparados a partir de células Besplênicas de murino obtidas a partir de camundongos imunizados com umantígeno de interesse, por exemplo na forma de células que expressam oantígeno na superfície ou um ácido nucleico que codifica um antígeno deinteresse. Os anticorpos monoclonais também podem ser obtidos a partir dehibridomas derivados de células que expressa, anticorpo de seres humanosimunizados ou mamíferos não humanos tais como ratos, cães, primatas, etc.
Alternativamente, os genes de anticorpo clonados podem serexpressados em outros sistemas de expressão, incluindo célulasprocariópticas, tais como microorganismos, tais como E. coli, para a produçãode anticorpos Fv de cadeia única, algas, assim como células de inseto. Alémdisso, os anticorpos podem ser produzidos em animais transgênicos nãohumanos, tais como no leite de ovelha e coelhos ou em ovos de galinhas ouem plantas transgênicas. Ver por exemplo Verma, R., et al., J. Immunol.Meth. 216, 165-181 (1998); Pollock, et al., J. Immunol. Meth. 231, 147-157(1999); e Fischer, R., et al., Biol.Chem. 380, 825-839 (1999).
Em uma forma de realização, os anticorpos monoclonaishumanos direcionados contra CD38 podem ser gerados usando camundongostransgênicos ou transcromossômicos que carregam partes do sistema imunehumano ao invés do sistema de camundongo. Tais camundongos transgênicose transcromossômicos incluem camundongos aqui aludidos comocamundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente e sãocoletivamente aqui aludidos como "camundongos transgênicos". Umanticorpo monoclonal humano gerado em tais camundongos pode serabreviado como HuMab.
O camundongo HuMAb contém um minilocal de gene daimunoglobulina humana que codifica as seqüências da imunoglobulina dacadeia pesada humano (μ e γ) e cadeia leve κ desarranjadas, junto commutações alvejadas que inativam os locais de cadeia μ e κ endógenos(Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Conseqüentemente, oscamundongos exibem a expressão reduzida de camundongos IgM ou K e emresposta à imunização, os transgene de cadeias pesada e leve humanasintroduzidos, passam pela comutação de classe e mutação somática para geraranticorpos monoclonais IgG,K humanos de alta afinidade (Lonberg, N. et al.(1994), supra; revisado em Lonberg, N. Handbook of ExperimentalPharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. e Huszar, D., Intern. Rev.Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) e Harding, F. e Lonberg, Ν. Ann. N.Y. Acad.Sci 764 536-546 (1995)). A preparação de camundongos HuMAbs estádescrita em detalhes em Tailor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993),Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Tailor, L. et al.,International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., NatureBiotechnology 14, 845-851 (1996). Ver também US 5.545.806, US5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.789.650, US 5.877.397, US5.661.016, US 5.814.318, US 5.874.299, US 5.770.429, US 5.545.807, WO98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO01/09187.
Os camundongos HCo7 têm uma interrupção JKD em seusgenes de cadeia leve (capa) endógenos (como descrito em Chen et al., EMBOJ. 12, 821-830 (1993)), uma interrupção CMD em seus genes de cadeiapesada endógenos (como descrito no Exemplo 1 da WO 01/14424), umtransgene de cadeia leve capa humana KCo5 (como descrito em Fishwild etal., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)) e um transgene de cadeiapesada humana HCo7 (como descrito na US 5.770.429).
Os camundongos HCo 12 têm um rompimento JKD nos seusgenes da cadeia leve (capa) endógenos (como descrito em Chen et al., EMBOJ. 12, 821-830 (1993)), um rompimento CMD em seus genes de cadeia pesadaendógenos (como descrito no Exemplo 1 da WO 01/14424), um transgene decadeia leve capa humana KCo5 (como descrito em Fishwild et al., NatureBiotechnology 14, 845-851 (1996)) e um transgene de cadeia pesada humanaHCo 12 (como descrito no Exemplo 2 da WO 01/14424). Na cepa decamundongo KM, o gene de cadeia leve capa de camundongo endógeno foihomozigoticamente rompido como descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foihomozigoticamente rompido como descrito no Exemplo 1 da WO 01/09187.Esta cepa de camundongo carrega um transgene de cadeia leve capa humano,KCo5, como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851(1996). Esta cepa de camundongo também carrega um transcromossoma decadeia pesada humana composto do fragmento 14 de cromossoma hCF(SC20) como descrito na WO 02/43478.
O camundongo KM contém um transcromossoma de cadeiapesada humana e um transgene de ser cadeia leve capa humana. Os genes dascadeias pesada e leve de camundongo endógenos também foram rompidosnos camundongos KM tal que a imunização dos camundongos leva àprodução de imunoglobulinas humanas ao invés de imunoglobulinas decamundongo. A construção de camundongos KM e seu uso para incitarimunoglobulinas humanas está descrita em detalhes na WO 02/43478.
Os esplenócitos destes camundongos transgênicos podem serusados para gerar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanosde acordo com técnicas bem conhecidas. Tais mamíferos transgênicos,mamíferos que compreendem uma seqüência de ácido nucleico operável quecodifica a expressão de um CD38BP, mamíferos estavelmente transfectadoscom uma ou mais seqüências de ácido nucleico que codificam CD38 e outros,são características adicionais da presente invenção.
Os anticorpos monoclonais ou policlonais humanos dapresente invenção ou anticorpos da presente invenção que se originam deoutra espécie também podem ser gerados transgenicamente através da geraçãode um outro mamífero não humano ou planta que seja transgênico para asseqüências de cadeias pesada e leve da imunoglobulina de interesse e aprodução do anticorpo em uma forma recuperável a partir destas. Em conexãocom a produção transgênica em mamíferos, anticorpos podem ser produzidose recuperados do leite de cabras, vacas ou outros mamíferos. Ver por exemploa US 5.827.690, US 5.756.687, US 5.750.172 e US 5.741.957.
Além disso, os anticorpos humanos da presente invenção ouanticorpos da presente invenção de outra espécie podem ser gerados atravésde tecnologias do tipo demonstração, incluindo, sem limitação, ademonstração de fago, a demonstração retroviral, a demonstração ribossômicae outras técnicas, usando técnicas bem conhecidas no ramo e as moléculasresultantes podem ser submetidas à maturação adicional, tal como amaturação por afinidade, visto que tais técnicas são bem conhecidas no ramo(ver por exemplo Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991)(demonstração de fago), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996)(demonstração de fago), Hanes e Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997)(demonstração de ribossômica), Parmley e Smith, Gene 73, 305-318 (1988)(demonstração de fago), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNASUSA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hoogenboom et al., lmmunol. Reviews 130, 43-68 (1992),Chiswell e McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992) e US 5.733.743). Se astecnologias de demonstração são utilizadas para produzir anticorpos que nãosejam humanos, tais anticorpos podem ser humanizados, por exemplo comodescrito aqui em algum lugar.
Os anticorpos monoclonais humanizados da presente invençãopodem ser gerados fundindo-se os domínios constantes de um anticorpohumano aos domínios variáveis de uma espécie não humana. Os exemplos decomo fabricar anticorpos humanizados pode ser encontrado por exemplo naUS 6.054.297, US 5.886.152 e US 5.877.293. Um anticorpo humanizado éplanejado para ter maior homologia a uma imunoglobulina humana do que osanticorpos monoclonais derivados de animal. Os resíduos de aminoácido nãohumanos de um domínio variável "importado" (animal) tipicamente sãotransfectados em uma "estrutura" humana. A humanização pode seressencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Joneset al., Nature 321, 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323-327(1988), Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)), substituindo-se asregiões determinadoras de complementaridade ("CDRs") ou seqüências deCDR de roedor no lugar de seqüências de um anticorpo humanocorrespondentes. Conseqüentemente, em tais anticorpos "humanizados", asporções de CDR do domínio variável humano foram substituídas pelaseqüência correspondente de uma espécie não humana. Assim, anticorposhumanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos deCDR e possivelmente alguns resíduos da estrutura são substituídos pelosresíduos de sítios análogos no anticorpo de roedor. A escolha de domíniosvariáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem usados na fabricaçãode anticorpos humanizados é importante para reduzir a antigenicidade. Deacordo com o chamado de método "best-fit", a seqüência do domínio variávelde um anticorpo de roedor é tríada contra a biblioteca inteira de seqüências dedomínio variável humanas conhecidas. A seqüência humana que estiver maispróxima a esta do rodente é então aceita como a estrutura humana (FR) para oanticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993), Chothia etal., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Um outro método usa uma estruturaparticular derivada da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanosde um subgrupo particular de cadeias leve ou pesada. A mesma estrutura podeser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al.,PNAS USA 89, 4285 (1992), Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)).
E tipicamente importante também que os anticorposhumanizados retenham alta afinidade para o antígeno e outras propriedadesbiológicas favoráveis. Para se alcançar esta meta, os anticorpos humanizadospodem ser preparados por um processo de análise das seqüências precursorase vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionaisdas seqüências precursoras e humanizadas. Os modelos de imunoglobulinatridimensionais são habitualmente disponíveis e são familiares àqueleshabilitados na técnica. Os programas de computador são disponíveis queilustram e demonstram estruturas conformacionais tridimensionais prováveisde seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destasdemonstrações permite a análise do papel provável de certos resíduos nofuncionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise deresíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para ligarao seu antígeno. Deste modo, os resíduos de FR podem ser selecionados ecombinados a partir das seqüências receptoras e importadas de modo que ascaracterísticas de anticorpo desejadas, tais como afinidade aumentada parao(s) antígeno(s) alvo(s), é maximizada, embora sejam os resíduos de CDRque diretamente e mais substancialmente influenciam a ligação de antígeno.
Os anticorpos de murino ou anticorpos de outra espécie podemser humanizados ou primatizados usando quaisquer técnicas adequadas, váriastécnicas adequadas já sendo bem conhecidas na técnica (ver por exemploWinter e Harris Immunol Today 14, 43-46 (1993) e Wright et al., Crit.Reviews in Immunol. 125-168 (1992)). O anticorpo de interesse pode serengendrado pelas técnicas de DNA recombinantes para substituir os domíniosde dobradiça Ch 1, CH2, Ch3 e/ou o domínio de estrutura com a seqüênciahumana correspondente (ver a WO 92/02190 e US 5.530.101, US 5.585.089,US 5.693.761, US 5.693.792, US 5.714.350 e US 5.777.085).
A humanização de anticorpos também pode ser realizadaseguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988), Verhoeyen et al.,Science 239, 1534-1536 (1988)), substituindo-se as CDRs ou seqüências deCDR de roedor no lugar das seqüências correspondentes de um anticorpohumano. Conseqüentemente, tais anticorpos "humanizados" são, em umsentido, anticorpos quiméricos (US 4.816.567), em que substancialmentemenos do que um domínio variável humano inteiro foi substituído pelaseqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, osanticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que algunsresíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos pelosresíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor.
Também, o uso de cDNA de Ig para a construção de genesquiméricos da imunoglobulina é conhecido na técnica (ver por exemplo Liu etal., PNAS USA 84, 3439 (1987) e J. Immunol. 139, 3521 (1987)). O mRNA éisolado de um hibridoma ou outra célula que produza o anticorpo e usado paraproduzir cDNA. O cDNA de interesse pode ser amplificado pela reação dacadeia da polimerase usando iniciadores específicos (US 4.683.195 e US4.683.202). Alternativamente, uma biblioteca é fabricada e tríada para isolar aseqüência de interesse. A seqüência de DNA que codifica a região variável doanticorpo é depois fundida às seqüências da região constante humanas. Asseqüências das regiões constantes humanas (assim como das regiõesvariáveis) podem ser encontradas em Kabat et al., (1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest, publicação N.I.H. no. 91-3242 e dadosmais recentes e relacionados podem ser acessados nohttp://www.biochem.ucl. ac.uld-martin/abs/GeneralInfo.html. A escolha deisótipo tipicamente será guiada pelas funções efetoras desejadas, tais comofixação de complemento ou atividade na citotoxicidade celular dependente deanticorpo. Os isótipos exemplares são IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Cada umadas regiões constantes da cadeia leve humana, capa ou lambda, podem serusadas. O anticorpo quimérico, humanizado pode ser depois expressado pelosmétodos convencionais.
Os CD38BPs da presente invenção podem estar em qualquerforma adequada com respeito à multimerização. Os anticorpos anti-CD38 e osfragmentos de anticorpo podem estar pelo menos na forma heterotrimérica senão em formas multiméricas superiores tais como aquelas associadas comanticorpos IgM. Em outras formas de realização, um CD38BP pode serapresentado como um dímero ou monômero. As CD38BPs monoméricas dapresente invenção podem ser, por exemplo, modificadas por qualquer técnicaadequada de modo a formar composições peptídicas multiméricas.
Se desejado, a classe de um anticorpo anti-CD38 da presenteinvenção pode ser mudada pelos métodos conhecidos. Por exemplo, umanticorpo da presente invenção que foi originalmente IgM pode ser mudadode classe para um anticorpo IgG da presente invenção.
Além disso, as técnicas de mudança de classe podem serusadas para converter uma subclasse de IgG para uma outra, por exemplo deIgGl para IgG2. Assim, a função efetora dos anticorpos da presente invençãopodem ser mudados pela comutação de isótopo, por exemplo, para umanticorpo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM para vários usosterapêuticos.
Em uma forma de realização um anticorpo da presenteinvenção é um anticorpo IgGl, por exemplo um isótipo IgGl5K ou IgGl^.
Em uma outra forma de realização um anticorpo da presente invenção é umanticorpo IgG3, por exemplo um isótipo IgG3,K ou IgG3,X. Em uma outraforma de realização um anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgG4,por exemplo um isótipo IgG4,K ou IgG4,À. Em uma outra forma de realizaçãoum anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgAl ou IgA2. Em umaoutra forma de realização um anticorpo da presente invenção é um anticorpoIgM.
Anticorpos anti-CD38 podem ser recuperados a partir debibliotecas de anticorpo combinatórias recombinantes, tais como umabiblioteca de demonstração de fago scFv, que pode ser fabricada com cDNAsde Vl e Vh humanos preparados a partir de mRNA derivado de linfócitoshumanos. Os métodos para preparar e triar tais bibliotecas são conhecidos natécnica. Existem vários kits comercialmente disponíveis para gerar bibliotecasde demonstração de fago. Existem também outros métodos e reagentes quepodem ser usados na geração e triagem de bibliotecas de demonstração defago (ver por exemplo a US 5.223.409, WO 92/18619, WO 91/17271, WO92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690,Fuchs et al., Bio/Technology 9, 1370-1372 (1991), Hay et al., Hum. Antibod.Hybridomas 3, 81-85 (1992), Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989),McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990), Griffiths et al., EMBO J 12,725-734 (1993), Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992), Clacksonet al., Nature 352, 624-628 (1991), Gram et al., PNAS USA 89, 3576-3580(1992), Garrad et al., Bio/Technology 9, 1373-1377 (1991), Hoogenboom etal., Nucl Acid Res 19, 4133-4137 (1991) e Barbas et al., PNAS USA 88,7978-7982 (1991)). As seqüências Vl e Vh adequadas de ácidos nucleicospodem ser selecionadas usando qualquer método apropriado. Por exemplo,ácidos nucleicos Vl e Vh podem ser selecionados pela utilização dos métodosde impressão de epítopo descritos na WO 93/06213. As bibliotecas deanticorpo, tais como bibliotecas de scFv podem ser preparadas e tríadasusando métodos conhecidos e adequados (com peptídeos contendo CD38humano como antígeno(s)), tais como aqueles descritos por exemplo naW092/01047, McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990) e Griffiths etal., EMBO J 12, 725-734 (1993). Tais bibliotecas de anticorpo e outrascombinações de CD38BPs (bibliotecas, agrupamentos, etc.) sãocaracterísticas da presente invenção que podem ser usadas terapeuticamentepara fornecer uma resposta imune mais compreensiva; como ferramentas emmétodos de triagem quanto a peptídeos imunogênicos, moléculas pequenas,outros anticorpo anti-CD38 (por exemplo, por via de ensaios de competição) eoutros; e/ou em métodos e composições de diagnóstico (por exemplo, um chipde imunoensaio que compreenda um painel de tais anticorpos opcionalmenteem associação com outros anticorpos pode ser preparado pelas técnicaspadrão). Uma vez que os segmentos Vl e Vh humanos iniciais sãoselecionados, experimentos de "mistura e emparelhamento", em que paresdiferentes dos segmentos Vl e Vh inicialmente selecionados são triadosquanto a ligação de peptídeo contendo CD38, podem ser realizados paraselecionar combinações de pares VL/VH desejáveis. Por exemplo, areatividade dos peptídeos pode ser determinada pelo ELISA ou outrosmétodos de análise de epítopo adequados (ver por exemplo Scott, J. K. eSmith, G. P. Science 249, 386-390 (1990), Cwirla et al., PNAS USA 87,6378-6382 (1990), Felici et al, J. Mol. Biol. 222, 301-310 (1991) e Kuwabaraet al., Nature Biotechnology 15, 74-78 (1997) para debate de tais técnicas eprincípios). Os anticorpos podem ser selecionados pela sua afinidade quantoao antígeno e/ou pelas suas cinéticas de dissociação (ojf-rate) de antígeno (verpor exemplo Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992)).Para melhorar ainda mais a qualidade e/ou diversidade deanticorpos anti-CD38, os segmentos Vl e Vh de par(es) VL/VH podem seraleatoriamente mutado, por exemplo dentro da região de CDR3 de Vh e/ouVL, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivoresponsável pela maturação por afinidade de anticorpos durante uma respostaimune natural. Esta maturação por afinidade in vitro pode ser realizadaamplificando-se as regiões Vh e Vl usando iniciadores de PCRcomplementares à CDR3 de Vh ou CDR3 de VL, respectivamente, iniciadoresestes que tipicamente são "reforçados" com uma mistura aleatória das quatrobases de nucleotídeo em certas posições, tal que os produtos de PCRresultantes codifiquem segmentos Vh e Vl dentro dos quais as mutaçõesaleatórias foram introduzidas nas regiões Vh e/ou Vl de CDR3. Estessegmentos de Vh e Vl aleatoriamente mutados podem ser re-triados quanto àligação aos peptídeos contendo CD38.
A seguir da triagem, o ácido nucleico que codifica umanticorpo selecionado pode ser recuperado do pacote de demonstração (porexemplo, do genoma de fago) e subclonado em um vetor apropriado pelastécnicas de DNA recombinante padrão. Se desejado, um tal ácido nucleicoque codifica anticorpo pode ser manipulados ainda para criar outras formas deanticorpo ou CD38BPs. Para expressar um anticorpo recombinante isoladopela triagem de uma biblioteca combinatória, tipicamente um ácido nucleicoque compreende uma seqüência que codifica o anticorpo é clonado em umvetor de expressão recombinante e introduzido nas células hospedeirasapropriadas (células de mamífero, células de levedura, etc.) sob condiçõesadequadas para a expressão do ácido nucleico e produção do anticorpo.
Os peptídeos de anticorpo de alta afinidade, tais comofragmentos de anticorpo Fv (scFv) e Fab de cadeia única humana, tambémpodem ser isolados a partir de tais bibliotecas usando uma técnica de panningem que o antígeno de interesse é imobilizado em uma superfície sólida, talcomo placas ou pérolas de microtítulo (ver por exemplo Barbas e Burton,Trends. Biotechnol. 14, 230-234 (1996) e Aujame et ai, Hum. Antibodies 8,155-68 (1997). A demonstração de fago de bibliotecas ingênuas grandestambém torna possível isolar anticorpos humanos diretamente semimunização (ver por exemplo, Haard et ai., J. Biol. Chem. 274(26), 18218-18230(1999)).
Em uma forma de realização, a presente invenção forneceanticorpos anti-CD38 variantes. Um anticorpo anti-CD38 "variante" é umanticorpo que difere de um anticorpo precursor (tipicamente gerado pelaimunização) em uma ou mais alterações de resíduo de aminoácido adequadas,isto é substituições, deleções, inserções ou adições de seqüência ao terminal,nas CDRs ou outras seqüências Vh e/ou Vl (contanto que pelo menos umaquantidade substancial das características de ligação de epítopo do anticorpoprecursor sejam retidas, se não melhoradas, por tais mudanças).
As variações em uma variante de anticorpo podem ser feitasem cada uma das regiões da estrutura, o domínio constante e/ou as regiõesvariáveis (ou qualquer uma ou mais CDRs destes) em um único anticorpovariante. Alternativamente, as variações podem ser feitas apenas em uma dasregiões de estrutura, as regiões variáveis (ou CDR única destes) ou o domínioconstante em um anticorpo. As técnicas de mutagênese de varredura dealanina, tais como descritas por Cunningham e Wells, Science 244, 1081-1085 (1989), podem ser usados para identificar resíduos adequados para asubstituição ou deleção na geração de CD38BPs que compreendemseqüências variantes de VL, Vh ou CDR particular, embora outras técnicas demutagênese adequadas também possam ser aplicadas. As substituições deaminoácido múltiplas também podem ser feitas e testadas usando métodosconhecidos de mutagênese e triagem, tais como aqueles divulgados porReidhaar-Olson e Sauer, Science 241, 53-57 (1988) ou Bowie e Sauer, PNASUSA 86,2152-2156(1989).Assim, por exemplo, em uma variante de anticorpo um oumais resíduos de aminoácido podem ser introduzidos ou inseridos ouadjacentes a uma ou mais das regiões hipervariáveis de um anticorpoprecursor, tal como em uma ou mais CDRs. Uma variante de anticorpo anti-CD38 pode compreender qualquer número de resíduos de aminoácidoinseridos, contanto que mais uma vez pelo menos uma quantidade substancialdas características de ligação de epítopo do anticorpo precursor sejam retidas.
Uma variante de anticorpo anti-CD38 da presente invenção por exemplopodem compreender de cerca de 1 a 30 resíduos de aminoácido inseridos, porexemplo de cerca de 1 a 10, tal como por exemplo de cerca de 2 a 10, porexemplo de 2 a 5 ou tal como de cerca de 1 a 5 resíduos de aminoácidoinseridos. Do mesmo modo, uma variante de anticorpo anti-CD38 da presenteinvenção por exemplo pode compreender de cerca de 1 a 30 resíduos deaminoácido deletados, por exemplo de cerca de 1 a 10, tal como por exemplode cerca de 2 a 10, por exemplo de 2 a 5 ou tal como de cerca de 1 a 5resíduos de aminoácido deletados. Do mesmo modo, uma variante deanticorpo anti-CD38 da presente invenção por exemplo pode compreender decerca de 1 a 30 resíduos de aminoácido substituídas, por exemplo de cerca de1 a 10, tal como por exemplo de cerca de 2 a 10, por exemplo de 2 a 5 ou talcomo de cerca de 1 a 5 resíduos de aminoácido substituídos. Do mesmomodo, uma variante de anticorpo anti-CD38 da presente invenção porexemplo pode compreender de cerca de 1 a 30 adições de resíduo deaminoácido da seqüência terminal, por exemplo de cerca de 1 a 10, tal comopor exemplo de cerca de 2 a 10, por exemplo de 2 a 5 ou tal como de cerca de1 a 5 adições de resíduo de aminoácido de seqüência terminal. Uma variantede anticorpo da presente invenção também pode compreender umacombinação de dois ou mais de tais inserções, deleções, substituições eadições de resíduo de aminoácido de seqüência terminal, contanto que avariante possua pelo menos uma proporção substancial da afinidade,especificidade e/ou seletividade dos precursores do anticorpo com respeito aum ou mais epítopos de CD38.
Considerações na seleção das variantes de anticorpo (porexemplo, conservação das características funcionais do resíduo deaminoácido, conservação de resíduos de aminoácido com base nascaracterísticas hidropáticas e/ou conservação dos resíduos de aminoácido combase no peso/tamanho), são descrito aqui em outro lugar. Tipicamente, asalterações de seqüência de aminoácido, tais como variações de substituiçãoconservativa, desejavelmente não mudam substancialmente as característicasestruturais da seqüência precursora (por exemplo, uma substituição deaminoácido não deve tender a romper a estrutura secundária que caracteriza afunção da seqüência precursora). Exemplos de estruturas secundárias eterciárias de polipeptídeo reconhecidas na técnica são descritos, por exemplo,em Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H.Freeman e Company, Nova Iorque (1984)), Introduction to Protein Structure(C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova Iorque, N.Y. (1991))e Thornton et al., Nature 354, 105 (1991). Os princípios adicionais relevantespara o planejamento e construção de variantes peptídicas é debatido porexemplo em Collinet et al., J Biol Chem 275(23), 17428-33 (2000).
As variantes de seqüência de aminoácido de um anticorpopodem ser obtidas pela introdução de mudanças de nucleotídeo apropriadasno ácido nucleico que codifica anticorpo (por exemplo, pela mutagênesedirecionada ao sítio) ou pela síntese química de peptídeo. Tais variantesincluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições e/ou adiçõesde seqüência terminal de resíduos dentro das seqüências de aminoácido dosanticorpos dos exemplos aqui. Qualquer combinação de deleções, inserções esubstituições pode ser feita para chegar a uma variante desejada, contanto quea variante possua pelo menos uma proporção substancial de características deligação de epítopo do anticorpo precursor. As mudanças de seqüência deaminoácido, com respeito a um anticorpo precursor, também podem alterar osprocessos pós traducionais do anticorpo variante com respeito a um anticorpoprecursor, tal como pela mudança do número ou posição de sítios deglicosilação.
Os anticorpos variantes da presente invenção podemcompreender alterações na região hipervariável, tais como nas CDRs. Osexemplos de CD38BPs que compreendem tais variantes de CDR são descritosaqui em outro lugar, e, como descrito acima, tais CD38BPs podem seranticorpos.
Os anticorpos variantes da presente invenção podemcompreender alterações estruturais (FR), que estão fora da regiãohipervariável, por exemplo na região Fc, alterações estas que podem estarassociadas com propriedades vantajosas, tais como a mudança daspropriedades funcionais ou farmacocinéticas dos anticorpos. Por exemplo,uma substituição ou outra modificação (inserção, deleção, adições deseqüência terminal ou combinação de qualquer destes) em uma região deestrutura ou de domínio constante podem estar associadas com um aumentona meia-vida do anticorpo variante com respeito ao precursor de anticorpo oupode ser fabricado para alterar a imunogenicidade do anticorpo variante comrespeito ao anticorpo precursor, para fornecer um sítio para a ligaçãocovalente ou não covalente a uma outra molécula ou para alterar taispropriedades como fixação de complemento, por exemplo resultando em umadiminuição ou aumento da ligação Clq e CDC ou de ligação de FcyR ecitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). As substituições porexemplo podem ser fabricadas em um ou mais dos resíduos de aminoácido234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 da região constante de cadeia pesada,causando deste modo uma alteração em uma função efetora enquanto retém aligação ao antígeno quando comparado com o anticorpo não modificado, cf.US 5.624.821 e US 5.648.260. Referência adicional pode ser feita à WO00/42072 que divulga anticorpos com regiões Fc alteradas que aumentamADCC e à WO 94/29351 que divulga anticorpos tendo mutações na região determinal N do domínio CH2 que alteram a capacidade dos anticorpos paraligar-se ao FcRI e deste modo diminui a capacidade dos anticorpos para aligação a Clq que por sua vez diminui a capacidade dos anticorpos para fixarcomplemento. Além disso, Shields et ai., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604(2001) divulgam variantes de combinação, que melhoram a ligação deFcyRIII, por exemplo T256A/S298A, S298A/E333A eS298A/E333A/K334A.
A meia-vida in vivo dos anticorpos também pode sermelhorada modificando-se o epítopo receptor de recuperação do domínioconstante de Ig ou um domínio constante equivalente a Ig tal que a moléculanão compreenda um domínio CH2 intacto ou uma região Fc de Ig intacta, cf.US 6.121.022 e US 6.194.551. A meia-vida in vivo além disso pode seraumentada fazendo-se mutações na região Fc, por exemplo, substituindo-se atreonina no lugar da leucina na posição 252, treonina no lugar da serina naposição 254 ou treonina no lugar da fenilalanina na posição 256, cf. a US6.277.375.
Em uma forma de realização, a presente invenção forneceanticorpos anti-CD38 variantes em que os epítopos de célula T potenciais noanticorpo foram reduzidos ou eliminados através do planejamento de análiseracional. Assim, por exemplo, em uma forma de realização a presenteinvenção fornece um anticorpo anti-CD38 "desimunizado" em que osepítopos de célula T potenciais foram eliminados. O planejamento econstrução de anticorpos anti-CD38 desimunizados podem ser realizados porqualquer técnica conhecida adequada (ver por exemplo a W09852976 comrespeito aos métodos para preparar anticorpos desimunizados). Espera-se quea imunogenicidade em seres humanos seja eliminada ou substancialmentereduzida quando tais CD38BPs (por exemplo, anticorpos anti-CD38variantes) são administrados de acordo com a presente invenção.
Outras mutações de estrutura podem incluir mudanças deseqüência que podem reduzir a suscetibilidade para a proteólise, reduzir asuscetibilidade para a oxidação e/ou conferir ou modificar outras propriedadesfisicoquímicas ou funcionais no anticorpo variante associado.
As variações de seqüência de aminoácido na estrutura tambémpodem resultar em um padrão de glicosilação alterado no anticorpo variantecom respeito a um anticorpo precursor. Por alteração é intencionado deletaruma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo precursor e/ouadicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes noanticorpo precursor. A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada em Nou ligada em O. Ligado em N se refere à ligação da porção de carboidrato àcadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeoasparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácidoexceto prolina, são seqüências de reconhecimento comuns para a ligaçãoenzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, apresença de cada um destas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeopode criar um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação ligada em O serefere à ligação de açúcares tais como N-acetilgalactosamina, galactose ouxilose a um hidroxiaminoácido, o mais habitualmente serina ou treonina,embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas. Aadição de sítios de glicosilação ao anticorpo pode ser convenientementerealizada alterando-se a seqüência de aminoácido tal que a mesma contenhauma ou mais das seqüências de tripeptídeo descrita acima (para os sítios deglicosilação ligados em Ν). A alteração também pode ser feita pela adição de,ou substituição em, um ou mais resíduos de serina ou treonina na seqüênciado anticorpo original (para os sítios de glicosilação ligados em O).
Os anticorpos também podem ser expressados em umtransfectoma que não adicionam a unidade de fucose normalmente ligada aocarboidrato ligado a Asn na posição 297 de Fc de modo a realçar a afinidadede Fc para FcyRIII que por sua vez resultará em um ADCC aumentado dosanticorpos na presença de células NK5 cf. Shield et al., J. Biol. Chem. 277,26733 (2002). Outros métodos de modificar na glicosilação com foco nafucosilação estão descritos na WO 00/61739 concedida a Kyowa. Além disso,a modificação da galactosilação pode ser feita de modo a modificar a CDC.Referência adicional pode ser feita à WO 99/54342 e Umana et al., Nat.Biotechnol. 17, 176 (1999) que divulgam uma linhagem de célula CHOengendrada para expressar GntIII resultando na expressão de anticorposmonoclonais com glicoformas alteradas e atividade de ADCC melhorada.
Outras técnicas potenciais adequadas para preparar novosanticorpos anti-CD38 incluem mutagênese ambulante de CDR,embaralhamento de cadeia de anticorpo, "mutagênese parcimoniosa" (Balint eLarrick, Gene 137, 109-118 (1993)) e outras técnicas de maturação porafinidade (ver por exemplo Wu et al., PNAS USA 95, 6037-42 (1998)). Orepertório de procedimentos de clonagem também pode ser útil na produçãode anticorpos variantes (ver por exemplo a WO 96/33279).
Existem várias técnicas conhecidas para gerar variantes,qualquer técnica adequada ou combinação destas que possam ser usadas nocontexto da presente invenção para gerar variantes de CDR das CDRs dosanticorpos dos exemplos. Os exemplos de tais técnicas incluem a remoção deresíduos não essenciais como descrito em Studnicka et al., ProteinEngineering 7, 805-814 (1994) (ver também Soderlind et al.,Immunotechnology. 4(3-4), 279-85 (1999), a mutagênese ambulante de CDRe outras técnicas de maturação por afinidade artificiais (ver por exemplo Yanget al, Journal of Molecular Biology 254(3), 392-403 (1995), as técnicas deembaralhamento de CDR em que tipicamente as CDRs são amplificadas apartir de um conjunto diverso de padrões de gene opcionalmentecompreendendo oligonucleotídeos sintéticos, as regiões constantes das VL, Vhe/ou CDRs são amplificadas e os vários fragmentos misturados (no formatode filamento único ou de filamento duplo) e montados pela reação da cadeiada polimerase (PCR) para produzir um conjunto de anticorpo-fragmento quecodifica produtos de gene que carregam CDR embaralhada introduzida naestrutura mestra, que é amplificada usando iniciadores externos que recozemaos sítios além dos sítios de restrição inseridos para garantir a produção deprodutos de tamanho natural, que são inseridos em um vetor de escolha eusados para expressar proteínas contendo CDR variantes. A estrutura pode serdeterminada pela sobreposição das estruturas variante/ miméticas e aquelasdas seqüências precursoras, por exemplo, pela comparação de estruturas desolução de RMN. Os métodos úteis para o planejamento racional de variantesde seqüência de CDR são descritos por exemplo na WO 91/09967 e WO93/16184. Os exemplos adicionais de tais métodos são fornecidos aqui emoutro lugar.
A presente invenção também fornece fragmentos de anticorpos(incluindo anticorpos variantes) da presente invenção, fragmentos estes quetêm a capacidade para ligar ao CD38 (fragmentos de ligação de CD38). AsCD38BPs incluem assim moléculas equivalentes de anticorpo quecompreendem menos do que a estrutura tetramérica completa associada comanticorpos que ocorrem naturalmente. Um fragmento de anticorpo pode serqualquer peptídeo que compreenda uma porção de um anticorpo de tamanhonatural, no geral a ligação de antígeno ou região variável destes (isto inclui,por exemplo, fragmentos de anticorpos humanizados que compreendemCDRs de um anticorpo da presente invenção, variantes destes ou outras CDRsque possibilitem ao fragmento de antígeno competir com um anticorpo dapresente invenção quanto a ligação de CD38). Em uma forma de realização,um fragmento de anticorpo refere-se a um peptídeo que consisteessencialmente ou consiste apenas de uma porção de uma molécula deanticorpo. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umfragmento de anticorpo que compreende pelo menos uma porção de umdomínio variável de cadeia pesada contendo uma ou mais CDRs de Vh de umanticorpo da presente invenção e opcionalmente também um domínio variávelde cadeia leve que compreenda uma ou mais CDRs de Vl de um anticorpo dapresente invenção, em que o domínio variável de cadeia pesada eopcionalmente o domínio variável de cadeia leve, opcionalmente é (são)fundido(s) a uma porção adicional, tal como um domínio constante deimunoglobulina. As seqüências de domínio constante podem ser adicionadasà(s) seqüência(s) de cadeia pesada e/ou cadeia leve para formar espécie comcadeias pesada e/ou leve de comprimento parcial. As regiões constantes ouporções destas, de qualquer isótipo de anticorpo podem ser usadas para estepropósito, incluindo as regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
Os exemplos de fragmentos de anticorpo de ligação de CD38incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. Um fragmento de anticorpo nocontexto da presente invenção também pode incluir um peptídeo quecompreenda uma CDR e outros. Em uma forma de realização, a presenteinvenção fornece um fragmento de anticorpo que compreende uma primeiracadeia de polipeptídeo que compreende qualquer uma das CDRs de cadeiapesada aqui descritas e uma segunda cadeia de polipeptídeo que compreendequalquer uma das CDRs de cadeia leve aqui descritas, em que as duas cadeiasde polipeptídeo são covalentemente ligadas por uma ou mais ligações dedissulfeto intercadeia. Em uma forma de realização, a presente invençãofornece um fragmento de anticorpo de duas cadeias tendo tais característicasem que o fragmento de anticorpo é selecionado dos fragmentos Fab, Fab',Fab'-SH, Fv e/ou F(ab')2.
Os anticorpos podem ser fragmentados usando técnicasconvencionais e os fragmentos triados quanto a utilidade da mesma maneiracomo descrito acima para os anticorpos inteiros. Por exemplo, fragmentosF(ab')2 podem ser gerados tratando-se o anticorpo com pepsina. O fragmentode F(ab')2 resultante pode ser tratado para reduzir as pontes de dissulfeto paraproduzirem fragmentos Fab'. Os fragmentos Fab podem ser obtidos tratando-se um anticorpo IgG com papaína; os fragmentos de Fab' podem ser obtidoscom a digestão com pepsina de anticorpo IgG. Um fragmento Fab' tambémpode ser produzido pela ligação de Fab' descrita abaixo por intermédio deuma ligação de tioéter ou uma ligação de dissulfeto. Um fragmento Fab' é umfragmento de anticorpo obtido cortando-se uma ligação de dissulfeto daregião de dobradiça do F(ab')2. Um fragmento Fab' pode ser obtido tratando-se um fragmento F(ab')2 com um agente redutor, tal como ditiotreitol. Ospeptídeos de fragmento de anticorpo também podem ser gerados pelaexpressão de ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos em célulasrecombinantes (ver por exemplo Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38(1995)). Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma porção de umfragmento F(ab*)2 pode incluir seqüências de DNA que codificam o domínioChI e região de dobradiça da cadeia H, seguido por um códon de parada detradução para produzir uma tal molécula de fragmento de anticorpo truncada.
Os CD38BPs também incluem anticorpos univalentes eanticorpos de cadeia única. Os anticorpos de cadeia única são peptídeos emque as regiões Fv de cadeia pesada e leve são conectadas. Em uma forma derealização, a presente invenção fornece um Fv de cadeia única (scFv) em queas cadeias pesada e leve no Fv de um anticorpo anti-CD38 da presenteinvenção são unidas com um ligador peptídico flexível (tipicamente de cercade 10, 12, 15 ou mais resíduos de aminoácido) em uma única cadeia depeptídeo. Os métodos de produzir tais anticorpos são descritos por exemplona US 4.946.778, Pluckthun em The Pharmacology of MonoclonalAntibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque,pp. 269-315 (1994), Bird et al, Science 242, 423-426 (1988), Huston et al.,PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) e McCafferty et al., Nature 348, 552-554(1990). 0 anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, se apenas umaúnica Vh e Vl são usadas, bivalente, se duas Vh e Vl são usadas oupolivalente, se mais do que duas Vh e Vl são usadas.
Em uma forma de realização da presente invenção, umCD38BP pode ser derivatizado ou ligado a uma outra molécula funcional, porexemplo um outro peptídeo ou proteína (tal como um fragmento Fab') paragerar uma molécula biespecífica ou multiespecífica que se liga a sítios deligação múltiplos ou epítopos alvo. Por exemplo, um anticorpo da presenteinvenção pode estar funcionalmente ligado (por exemplo pela ligaçãoquímica, fusão genética, associação não covalente ou de outro modoestabelecido) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tais como um outroanticorpo, peptídeo ou mimético de ligação. Em uma forma de realização, oCD38BP é um anticorpo da presente invenção.
Conseqüentemente, a presente invenção inclui moléculasbiespecíficas e multiespecíficas que compreendem pelo menos uma primeiraespecificidade de ligação para CD38 e uma segunda especificidade de ligaçãopara um segundo epítopo alvo. Em uma forma de realização da presenteinvenção, o segundo epítopo alvo é um receptor de Fc, por exemplo, FcyRIhumano (CD64) ou um receptor de Fca humano (CD89) ou um receptor decélula T, por exemplo, CD3. Em uma forma de realização, a presenteinvenção fornece moléculas biespecíficas e multiespecíficas capazes deligação tanto ao FcyR, FcaR ou FcsR que expresse células efetoras (porexemplo, monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)) ealvejar células que expressam CD38. Estas moléculas alvo CD38 biespecíficae multiespecífica que expressam células para a célula efetora e deflagram asatividades de célula efetora mediadas pelo receptor de Fc, tais comofagocitose de células que expressam CD38, citotoxicidade celular dependentede anticorpo (ADCC), liberação de citocina ou geração de ânion superóxido.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presenteinvenção podem incluir ainda uma terceira especificidade de ligação, além deuma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-CD38. Em uma forma de realização, a terceira especificidade de ligação éuma porção do fator anti-realce (EF), por exemplo, uma molécula que se ligaa uma proteína de superfície envolvida na atividade citotóxica e deste modoaumenta a resposta imune contra a célula alvo. A "porção do fator anti-realce"pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligando quese liga a uma dada molécula, por exemplo, um antígeno ou um receptor edeste modo resulta em um realce do efeito da ligação determinantes para oreceptor Fc ou antígeno de célula alvo. A "porção do fator anti-realce" podeligar-se a um receptor de Fc ou um antígeno de célula alvo. Alternativamente,a porção de fator anti-realce pode ligar-se a uma entidade que seja diferenteda entidade para a qual a primeira e segunda especificidades de ligação seligam. Por exemplo, a porção de fator anti-realce pode ligar-se a uma célula Tcitotóxica (por exemplo, por intermédio de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4,CD40, ICAM-I ou outra célula imune que resulte em uma resposta imuneaumentada contra a célula alvo).
Em uma forma de realização, as moléculas biespecíficas emultiespecíficas da presente invenção compreendem como umaespecificidade de ligação pelo menos um outro anticorpo, incluindo, porexemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv ou um scFv. O outro anticorpo tambémpode ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada ou qualquer fragmentomínimo destes tais como um Fv ou uma construção de cadeia única comodescrito em Ladner et al., na US 4.946.778. O anticorpo também pode ser umdomínio de ligação da proteína de fusão de imunoglobulina como divulgadona US 2003/0118592 e US 2003/ 0133939.
Em uma forma de realização, a especificidade de ligaçãoquanto a um receptor de Fc é fornecida por um anticorpo monoclonalhumano, a ligação do qual não é bloqueada pela imunoglobulina G humana(IgG). Como aqui usado, o termo "receptor de IgG" se refere a qualquer umdos oito genes de cadeia γ localizados no cromossoma 1. Estes genescodificam um total de doze isoformas de transmembrana ou receptor solúvelque são agrupadas em três classes de receptor Fc*: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) e FcyRIII (CD 16). Em uma forma de realização, o receptor de Fcy éum FcyRI de alta afinidade humano. A produção e caracterização destesanticorpos monoclonais são descritos por Fanger et al., na WO 88/00052 e naUS 4.954.617. Estes anticorpos se ligam a um epítopo de FcyRI, FcyRII ouFcyRIII em um sítio que é distinto do sítio de ligação de Fcy do receptor e,assim, a sua ligação não é bloqueada substancialmente pelos níveisfisiológicos de IgG. Os anticorpos anti-FcyRI específicos úteis na presenteinvenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. Em outrasformas de realização, o anticorpo receptor anti-Fcy é uma forma humanizadade mAb 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 estãodescritas em Graziano, R. F. et al., J. Immunol. 155(10), 4996-5002 (1995) eWO 94/10332. A linhagem de célula que produz o anticorpo H22 foidepositada no American Type Culture Collection em 4 de Novembro de 1992sob a designação HA022CL1 e tem o No. de acesso CRL 11177.
Em uma forma de realização, a especificidade de ligaçãoquanto a um receptor Fc é fornecida por um anticorpo que se liga a umreceptor de IgA humano, por exemplo, um receptor Fca (FcaI (CD89)), aligação do qual em uma forma de realização não é bloqueada pelaimunoglobulina human A (IgA). O termo "receptor de IgA" é intencionado aincluir o produto de gene de um gene α (FcaRI) localizado no cromossoma19. Este gene é conhecido codificar diversas isoformas de transmembranaalternativamente unidas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) é constitutivamenteexpressado em monócitos/ macrófagos, granulócitos eosinofílico eneutrofílico, mas não em populações de célula não efetora. FcaRI temafinidade média tanto para IgAl quanto lgA2, que é aumentada na exposiçãoàs citocinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H. C. et al., CriticaiReviews in Immunology 16, 423-440 (1996)). Quatro anticorpos monoclonaisespecíficos de FcaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligama FcaRI fora do domínio de ligação de ligando de IgA5 foram descritos(Monteiro, R. C. et ai, J. Immunol. 148, 1764 (1992)).
FcaRI, FcyRI, FcyRII e FcyRIII, especialmente FcyRII eFcyRIII, são exemplos de receptores deflagradores para o uso na presenteinvenção porque eles (1) são expressados primariamente em células efetorasimunes, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2)são expressados em altos níveis (por exemplo 5.000 a 100.000 por célula); (3)são mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo ADCC, fagocitose); e(4) medeia a apresentação de antígeno realçada de antígenos, incluindo auto-antígenos, alvejados a eles.
Em uma forma de realização, um CD38BP da presenteinvenção é um anticorpo anti-CD38 multiespecífico ou molécula equivalentea anticorpo, um exemplo particular da qual é um anticorpo biespecífico quecompreende pelo menos um par de cadeias da seqüência Vh e seqüência Vlespecífico quanto a um epítopo compreendido pelo menos em parte no CD38e um segundo pelo menos um par de cadeias das seqüências Vh e Vlespecífico quanto a um segundo epítopo. As seqüências Vh e Vl em umanticorpo biespecífico podem compreender as seqüências de Vh e Vlcompletas que correspondem à região Vh e VLanti-CD38, seqüências Vh e/ouVl variantes ou porções adequadas das regiões Vh e/ou VL, tais como umacombinação adequada de seqüências de CDR e outras seqüências suficientespara fornecer ligação aos epítopos de interesse.
As moléculas de anticorpo biespecíficas exemplarescompreendem (i) dois anticorpos um com uma especificidade para CD38 eum outro a um segundo alvo que são conjugados entre si, (ii) um únicoanticorpo que tenha uma cadeia específica para CD38 e uma segunda cadeiaespecífica a uma segunda molécula e (iii) um anticorpo de cadeia única quetenha especificidade para CD38 e uma segunda molécula. Tipicamente, osegundo alvo/segunda molécula é uma molécula outra que não CD38. Emuma forma de realização, a segunda molécula é um antígeno docâncer/antígeno associado a tumor tal como o antígeno carcinoembriônico(CEA), antígeno específico da próstata (PSA), RAGE (antígeno renal), a-fetoproteína, CAMEL (antígeno reconhecido por CTL em melanoma),antígenos de CT (tais como MAGE-B5, -B6, -C2, -C3 e D; Mage-12; CT10;NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE e SAGE), antígenos de mucina(por exemplo, MUC1, mucina-CA125, etc.), antígenos de gangliosídeos,tirosinase, gp75, C-myc, Marti, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7 e Ep-CAM. Em uma forma de realização, a segunda molécula é umaintegrina associada com câncer, tal como a integrina α5β3. Em uma forma derealização, a segunda molécula é um fator angiogênico ou outro fator decrescimento associado com o câncer, tal como um fator de crescimentoendotelial vascular (VEGF), um fator de crescimento de fibroblasto (FGF),fator de crescimento epidérmico (EGF), receptor do fator de crescimentoepidérmico (EGFR), angiogenina e receptores destes, particularmentereceptores associados com a progressão do câncer (por exemplo um dosreceptores de HERl a HER4). Outras proteínas associadas com a progressãodo câncer aqui debatidas também podem ser adequadas para moléculassecundárias. Em uma forma de realização, a segunda molécula é umamolécula expressada na superfície de células de mieloma múltiplo tais comoCD138.
Em uma forma de realização, um anticorpo biespecífico dapresente invenção é um diacorpo.
Os anticorpos biespecíficos também incluem anticorposreticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos em umheteroconjugado pode ser ligado à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos,por exemplo, foram propostos alvejar células do sistema imune às células nãodesejadas (ver por exemplo a US 4.676.980). os anticorpos heteroconjugadospodem ser fabricados usando quaisquer métodos de reticulação convenientes.Os agentes e técnicas de reticulação de peptídeo adequados são bemconhecidos na técnica e exemplos de tais agentes e técnicas são divulgadospor exemplo na US 4.676.980.
Assim, embora o debate aqui possa focalizar nos anticorpos,deve ser entendido que as formas de realização e características dosanticorpos podem ser igualmente aplicadas aos fragmentos de anticorpo, taiscomo fragmentos Fab, fragmentos Fab' e peptídeos scFv, peptídeos comoanticorpo (peptídeos que compreendem um CDR), anticorpos bi- e multi-específicos e outros CD38BPs, como apropriado, contanto que o CD38BP dapresente invenção retenha pelo menos uma proporção substancial daspropriedades de ligação de antígeno do anticorpo completo correspondente.Em alguns casos, os fragmentos de anticorpo podem estar associados com aafinidade de ligação de antígeno mais baixa, mas podem oferecer outrascaracterísticas vantajosas que podem compensar quanto a qualquer uma de talperda na afinidade.
Os CD38BPs da presente invenção e particularmente osanticorpos anti-CD38 podem ser selecionados com base na sua capacidadepara fornecer a capacidade de fixação de complemento ou não. Existem váriosisótipos de anticorpos que são capazes de fixação de complemento e CDC,incluindo, sem limitação, os seguintes: IgM de murino, IgG2a de murino,IgG2b de murino, IgG3 de murino, IgM humano, IgGl humano e IgG3humano. Aqueles isótipos que não incluem, sem limitação, IgG2 humano eIgG4 humano. A determinação de isótipo e outros métodos para modificar afixação de complemento e características funcionais de CDC de anticorpossão conhecidos na técnica.
Os CD38BPs da presente invenção também incluemimunoadesinas, que são moléculas em que uma ou mais CDRs de umanticorpo anti-CD38 são covalentemente ou não covalentemente associadoscom a molécula. Uma imunoadesina pode incorporar a(s) CDR(s) como partede uma cadeia de polipeptídeo mais larga, pode ligar covalentemente a(s)CDR(s) a uma outra cadeia de polipeptídeo ou podem incorporar a(s) CDR(s)não covalentemente. As CDRs permitem que as imunoadesinaespecificamente se liguem a um CD38.
A presente invenção também fornece proteínas de fusão deCD38BP. As proteínas de fusão de CD38BP podem compreender qualquerseqüência de aminoácido adequada ou combinação das seqüências que sãoespecíficas e/ou seletivas para pelo menos um domínio que é pelo menosparcialmente compreendido dentro do CD38 (por exemplo, um anticorpodomínio de Vh, domínio de Vl anti-CD38 ou CDRs particulares destes) e pelomenos uma seqüência de aminoácido não homóloga e típica esubstancialmente não similar (por exemplo, menor do que cerca de 40 %,menor do que cerca de 35 %, menor do que cerca de 30 %, menor do quecerca de 25 % ou menor do que cerca de 20 % de identidade da seqüência deaminoácido para a seqüência específica/seletiva de CD38) que comunica umafunção e/ou característica biológica detectáveis à proteína de fusão que nãopodem ser isoladamente atribuídas à seqüência específica/seletiva de CD38(por exemplo, meia-vida in vivo aumentada, fluorescência, alvejamentoaumentado a um tipo particular de célula, etc.). As seqüências funcionais deuma tal proteína de fusão pode ser separada pelo(s) ligador(es) flexível(is).A(s) seqüência(s) secundária(s) também pode(m) ser derivada(s) de peptídeoscitotóxicos ou apoptóticos. As seqüências secundárias também podemconferir propriedades de diagnóstico. Os exemplos de tais seqüências incluemaquelas derivadas de enzimas facilmente visualizadas tais como a rábanoperoxidase.
As proteínas de fusão de CD38BP também podem sercaracterizadas por compreender um rótulo de epítopo. Uma seqüência derótulo de epítopo é uma seqüência de aminoácido tendo resíduos suficientespara fornecer um epítopo contra o qual um anticorpo pode ser feito, nocontexto do CD38BP, embora seja curto o suficiente tal que não interfirasubstancialmente com a atividade (seletividade, especificidade, afinidade e/ouatividade biológicas) do CD38BP (quando comparado a um CD38BPprecursor que careça do rótulo de epítopo). Um rótulo de epítopo de mododesejável é suficientemente único de modo que o anticorpo anti-rótulo deepítopo substancialmente não reaja cruzado com outros epítopos. Ospolipeptídeos de rótulo adequados no geral têm pelo menos cerca de 6resíduos de aminoácido e usualmente entre cerca de 8 a 50 resíduos deaminoácido (por exemplo, de cerca de 9 a 30 resíduos). Os exemplos derótulos de epítopo incluem o polipeptídeo de rótulo flu HA e seu anticorpo12CA5 (Field et al, Mol. CelL BioL 8, 2159-2165 (1988)); o rótulo c-myc eos anticorpos para este 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (Evan et al., Mol.CelL BioL 5(12), 3610-3616 (1985)) e o rótulo da glicoproteína D do vírusSimples do Herpes (gD) e seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Engineering3(6), 547-553 (1990)). Em certas formas de realização, o rótulo de epítopo éum "epítopo de ligação de receptor de recuperação". Como aqui usado, otermo "epítopo de ligação de receptor de recuperação" refere-se a um epítopoda região Fc de uma molécula IgG (por exemplo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4)que é responsável quanto ao aumento da meia-vida sérica in vivo da moléculade IgG.
Os CD38BPs da presente invenção também incluem derivadosde CD38BP. Um derivado é um peptídeo em que um ou mais dos resíduos deaminoácido do peptídeo foram quimicamente modificados (por exemplo, pelaalquilação, acilação, formação de éster ou formação de amida) oucovalentemente associados com um ou mais substituintes heterólogos (porexemplo, um substituinte lipofílico, uma porção PEG, uma cadeia lateralpeptídica ligada por um ligador de porção orgânica adequado, etc.). Opeptídeo também pode ser conjugado a uma porção terapêutica, tal como umacitotoxina, um medicamento quimioterapêutico, um imunossupressor ou umradioisótopo (um chamado de imunoconjugado). No geral, os CD38BPs aquidescritos podem ser modificados pela inclusão de qualquer número adequadade tais aminoácidos e/ou associações modificados com tais substituintesconjugados. A adequabilidade neste contexto geral é determinada pelacapacidade para reter pelo menos substancialmente a seletividade e/ouespecificidade de CD38 associada com o CD38BP precursor não derivatizado.
A inclusão de um ou mais aminoácidos modificados pode ser vantajosa, porexemplo, em (a) aumento da meia-vida sérica do polipeptídeo, (b) redução daantigenicidade do polipeptídeo ou (c) aumento da estabilidade naarmazenagem do polipeptídeo. O(s) aminoácido(s) são modificado(s), porexemplo, co-traducional ou pós-traducionalmente durante a produçãorecombinante (por exemplo, a glicosilação ligada em N nos motivos N-X-S/Tdurante a expressão em células de mamífero) ou modificados por meiossintéticos. Os exemplos não limitantes de um aminoácido modificado incluemum aminoácido glicosilado, um aminoácido sulfatado, um aminoácidoprenilado (por exemplo, farnesilado, geranilgeranilado), um aminoácidoacetilado, um aminoácido acilado, um aminoácido PEGuilado, umaminoácido biotinilado, um aminoácido carboxilado, um aminoácidofosforilado e outros. As referências adequadas para orientar uma pessoahabilitada na modificação de aminoácidos são repletas por todo a literatura.
Os protocolos de exemplo são encontrados em Walker (1998) ProteinProtocols On CdRom, Humana Press, Towata, NJ. O aminoácido modificadopode ser selecionado de um aminoácido glicosilado, um aminoácidoPEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, umaminoácido biotinilado, um aminoácido / conjugado a uma porção lipídica eum aminoácido conjugado a um agente de orgânico de derivatização.
Adicionalmente, os anticorpos podem ser quimicamentemodificados pela conjugação covalente a um polímero por exemplo paraaumentar a sua meia vida em circulação. Os polímeros exemplares e métodospara ligá-los aos peptídeos, são ilustrados por exemplo na US 4.766.106, US4.179.337, US 4.495.285 e US 4.609.546. os polímeros ilustrativos adicionaisincluem polióis polioxietilados e polietileno glicol (PEG) (por exemplo, umPEG com um peso molecular entre cerca de 1.000 e cerca de 40.000, tal comoentre cerca de 2.000 e cerca de 20.000, por exemplo, cerca de 3.000 a12.000).
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que é conjugado a uma segunda molécula que é selecionada de umradionuclídeo, uma enzima, um substrato de enzima, um cofator, ummarcador fluorescente, um marcador quimioluminescente, um rótulo depeptídeo ou uma partícula magnética. Em uma forma de realização, umCD38BP pode ser conjugado a um ou mais fragmentos de anticorpo, ácidosnucleicos (oligonucleotídeos), nucleases, hormônios, imuno-moduladores,queladores, compostos de boro, agentes fotoativos, corantes e outros. Estes eoutros agentes adequados podem ser ligados direta ou indiretamente àsCD38BPs da presente invenção. Um exemplo de ligação indireta de umsegundo agente é a ligação por uma porção espaçadora. Estes espaçadores,por sua vez, podem ser insolúveis ou solúveis (ver por exemplo Diener et al.,Science 231, 148 (1986)) e podem ser selecionados para possibilitar aliberação de medicamento do CD38BP a um sítio alvo e/ou sob condiçõesparticulares. Os exemplos adicionais de agentes terapêuticos que podem serligados aos CD38BPs incluem lectinas e peptídeos fluorescentes.
Em uma forma de realização, derivados de CD38BP quecompreendem um ou mais aminoácidos radiorrotulados são fornecidos. UmCD38BP radiorrotulado pode ser usado tanto para propósitos de diagnóstico eterapêuticos (conjugação às moléculas radiorrotuladas é uma outracaracterística possível). Os exemplos não limitantes de rótulos parapolipeptídeos incluem, mas não são limitados a 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y5 99Tc5125I, 131I e 186Re. Os métodos para preparar aminoácidos radiorrotulados ederivados peptídieo são conhecidos na técnica (ver por exemplo Junghans etal., em Câncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edição, Chafiier eLongo, eds., Lippincott Raven (1996)) e US 4.681.581, US 4.735.210, US5.101.827, US 5.102.990 (US RE35.500), US 5.648.471 e US 5.697.902. Porexemplo, um radioisótopo pode ser conjugado por um método da cloramina T.
Os radionuclídeos vantajosos nos contextos de diagnóstico sãoisótopos de índio e no contexto de aplicações terapêuticas isótopos de ítrio,que são citotóxicos. Os radioisótopos que emitem fóton, no geral, sãovantajosos em métodos de diagnóstico (radioimunocintigrafia (RIS)). Oselétrons Auger têm um caminho de comprimento muito curto (5 a 10 nm) enecessitam ser internalizados para serem citotóxicos (ver por exemploAdelstein et al., Nucl. Med. Biol. 14, 165-169 (1987)). Conseqüentemente, ospeptídeos conjugados a tais isótopos podem ser úteis em métodos dediagnóstico, mas apenas peptídeos que são internalizados devem serconsiderados para radioisótopos que emitem elétrons Auger em contextosterapêuticos. As partículas alfa necessitam estar próximos de uma célula(dentro de 3 a 4 diâmetros celulares) para serem eficazes como agentesterapêuticos (Vriesendorp et al., "Radioimmunoglobulin therapy," em HighDose Câncer Therapy Armitage et al., (eds). (Williams & Wilkins, Baltimore,Md. 1992)). Tanto os elétrons Auger quanto os emissores alfa podem serconsiderados ter alta seletividade porque a sua emissão de faixa curtatipicamente não irradiará as células normais vizinhas.
Os radiometais 111In e 80Y são, respectivamente, um emissor γpuro e um emissor β puro. O Iodo-125, o emissor mais habitualmente usadode elétrons Auger, tem uma meia-vida de cerca de 60 dias e freqüentemente éliberado por imunoconjugados in vivo (devido à desalogenação). Os emissoresalfa mais habitualmente considerados para o uso clínico, astatina-211 ebismuto-212, têm meias-vidas relativamente curtas (7,2 h e 1,0 h,respectivamente) e o enfraquecimento em isótopos radioativos que não podemser retidos pelo imunoconjugado depois da primeira emissão alfa (Wilbur,Antibiot. Immunoconjug. Radiopharm. 4, 5-97 (1991)). Para aplicações dediagnóstico, CD38BPs rotulados com índio-111 ou tecnécio-99m podem serusados. Ambos destes isótopos emitem raios gama dentro da faixa de energiaapropriada para a formação de imagem, (100-250 keV). As energias abaixodesta faixa tipicamente não são penetrantes o bastante para atingir umdispositivo de formação de imagem externo. Níveis de energia mais altos sãodifíceis de colimar e fornece imagens de diagnóstico com resoluçãodeficiente. A meia vida curta do 99Tc tipicamente restringe o seu uso paraimunoconjugados com captação de tumor rápida.
Em uma forma de realização, os primeiro e segundo CD38BPsconjugados com os primeiro e segundo radioisótopos são fornecidos. Em umaoutra forma de realização, um único CD38BP conjugado com doisradioisótopos é fornecido. Uma vantagem de usar dois radioisótoposseparados, por exemplo, um para a formação de imagem e um para terapia, éque isto facilita o tratamento do paciente de ambulatório. A quantidade baixade radioatividade usada diagnosticamente não representa um perigo deradiação, enquanto que a radiação emitida por um isótopo terapêutico, talcomo um emissor β puro, tipicamente será amplamente absorvido navicinidade das células alvejadas.
Os radioisótopos podem ser ligados direta ou indiretamente aum CD38BP. Os radioisótopos 125I, 131I 99Tc 186Re e 188Re podem ser, porexemplo, covalentemente ligados às proteínas (incluindo anticorpos) atravésde grupos funcionais de aminoácido. Para o iodo radioativo o mesmo éusualmente através do grupo fenólico encontrado na tirosina. Existemnumerosos métodos para realizar isto: cloramina-T (ver por exemploGreenwood et al., Biochem J. 89, 114-123 (1963) e Iodogen (Salacinski et al.,Anal. Biochem. 117, 136-146 (1981)). Isótopos de Tc e Re podem sercovalentemente ligados através do grupo sulfidrila de cisteína (ver porexemplo Griffiths et al., Câncer Res. 51, 4594-4602 (1991)). Entretanto, taiscomposições podem ser relativamente melhor adaptadas com propósitos dediagnóstico visto que o corpo freqüentemente pode romper estas ligaçõescovalentes, liberando os radioisótopos para o sistema circulatório.
Um CD38BP também pode ser rotulado com enzimas que sãoúteis para a detecção, tais como rábano peroxidase, β-galactosidase,luciferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase e outros. Um CD38BP tambémpode ser rotulado com biotina e conseqüentemente detectado através damedição indireta da ligação de avidina ou estreptavidina. Um CD38BPtambém pode ser rotulado com um epítopo de polipeptídeo pré determinadoreconhecido por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par dezíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios deligação de metal, rótulos de epítopo, etc.). Os exemplos adicionais decandidatos de conjugado de enzima incluem malato desidrogenase, nucleaseestafilocócica, esteróide delta-V isomerase, levedura álcool desidrogenase, a-glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, asparaginase, glicoseoxidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenase,glicoamilase e acetilcolinesterase.
As porções de rotulação exemplares adicionais no geralincluem, mas não são limitadas a moléculas rotuladas com spin e outrasporções de rotulação de valor em diagnóstico.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornecederivados de CD38BP reticulados. Por exemplo, uma tal derivado deCD38BP pode ser produzido pela reticulação de dois ou mais anticorpos, pelomenos um dos quais é específico/seletivo para CD38 (do mesmo tipo ou detipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Osreticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendodois grupos reativos distintos separados por um espaçador apropriado (porexemplo, o éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ouhomobifuncional (por exemplo, suberato de dissuccinimidila). Tais ligadoressão disponíveis da Pierce Chemical Company, Rockford, 111.
Os CD38BPs também podem ser conjugados com qualquertipo adequado de grupo químico, tal como polietileno glicol (PEG), um grupometila ou etila ou um grupo carboidrato. Estes e outros grupos conjugadosadequados podem ser usados para melhorar as características biológicas doCD38BP, por exemplo, para aumentar a meia-vida sérica, a solubilidade e/oua ligação de tecido.
Os derivados de CD38BP podem ser produzidos conjugando-se quimicamente um radioisótopo, proteína ou outro agente/porção/composto(a) ao lado do terminal N ou lado do terminal C do CD38BP ou subunidadesdeste (por exemplo, uma cadeia de anticorpo anti-CD38 H, cadeia L oufragmentos específicos/seletivos anti-CD38 destes) um grupo substituinteapropriado ou cadeia lateral ou (b) uma cadeia de açúcar no CD38BP (ver,por exemplo, Antibody Engineering Handbook, editado por OsamuKanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Os derivados tambémpodem ser gerados pela conjugação em resíduos internos ou açúcares, ondeapropriado.
Os CD38BPs também podem ser derivatizados com um agentede detecção, por exemplo compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína,isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-l-naftalenossulfonila, lantanídeos fosforescentes e outros. Os exemplosadicionais de rótulos fluorescentes adequados incluem um rótulo de ,ZJEu, umrótulo de isotiocianato, um rótulo de fcoeritrina, um rótulo de ficocianina, umrótulo de aloficocianina, um rótulo de o-ftaldeído, um rótulo defluorescamina, etc. Os exemplos de rótulos quimioluminescentes incluemrótulos luminais, rótulos isoluminal, rótulos de éster de acridínio aromático,rótulos de imidazol, rótulos de sal de acridínio, rótulos de éster de oxalato, umrótulo de luciferina, rótulos de luciferase, rótulos de Equorina, etc.
Em uma forma de realização, um derivado de CD38BP quecompreende um ácido nucleico conjugado ou molécula associada a ácidonucleico. Em uma tal faceta da presente invenção, o ácido nucleico conjugadoé uma ribonuclease citotóxica. Em uma forma de realização, o ácido nucleicoconjugado é um ácido nucleico de anti-sentido (por exemplo uma molécula deanti-sentido alvejada a SIOOA10, que também pode ser um componenteindependente em uma composição de combinação ou método deadministração de combinação da presente invenção - ver por exemplo Zhanget al., J Biol Chem. 279(3), 2053-62 (2004)). Em uma forma de realização, oácido nucleico conjugado é uma molécula de RNA inibitória (por exemplo,uma molécula de siRNA). Em uma forma de realização, o ácido nucleicoconjugado é um ácido nucleico imunoestimulador (por exemplo, umamolécula de DNA contendo motivo de CpG imunostimulador). Em umaforma de realização, o ácido nucleico conjugado é um cassete de expressãoque codifica a expressão de um gene supressor de tumor, vacina anticâncer,citocina anticâncer ou agente apoptótico. Tais derivados também podemcompreender a conjugação de um ácido nucleico que codifica a expressão deuma ou mais proteínas citotóxicas, tais como toxinas vegetais e bacterianas.
Em uma forma de realização, um CD38BP é conjugado a umamolécula de ácido nucleico funcional. Os ácidos nucleicos funcionais incluemmoléculas de anti-sentido, moléculas de ácido nucleico interferentes (porexemplo, moléculas de siRNA), aptâmeros, ribozimas, moléculas que formamtriplex e seqüências guia externas. As moléculas de ácido nucleico funcionaispodem atuar como simuladores, inibidores, moduladores e estimuladores deuma atividade específica possuída por uma molécula alvo ou as moléculas deácido nucleico funcionais podem possuir uma atividade de novo independentede qualquer outra molécula. Uma amostra representativa de métodos etécnicas que ajudam no planejamento e uso de moléculas de anti-sentido podeser encontrada na seguinte lista não limitante de Patentes US: US 5.135.917,US 5.294.533, US 5.627.158, US 5.641.754, US 5.691.317, US 5.780.607,US 5.786.138, US 5.849.903, US 5.856.103, US 5.919.772, US 5.955.590,US 5.990.088, US 5.994.320, US 5.998.602, US 6.005.095, US 6.007.995,US 6.013.522, US 6.017.898, US 6.018.042, US 6.025.198, US 6.033.910,US 6.040.296, US 6.046.004, US 6.046.319 e US 6.057.437.
Em uma forma de realização, um CD38BP é conjugado a umaptâmero. Os aptâmeros são moléculas que interagem com uma moléculaalvo, por exemplo em uma maneira específica. Tipicamente os aptâmeros sãoácidos nucleicos pequenos que variam de 15 a 50 bases no comprimento quese dobram em estruturas secundárias e terciárias definidas, tais como haste-alças ou quartetos G. Os aptâmeros podem ligar moléculas pequenas, taiscomo ATP (US 5.631.146) e teofilina (US 5.580.737), assim como moléculasgrandes, tais como a transcriptase reversa (US 5.786.462) e trombina (US5.543.293). Os exemplos representativos de como fabricar e usar aptâmerospara ligar uma variedade de moléculas alvo diferentes podem ser encontradosna seguinte lista não limitante das patentes US: US 5.476.766, US 5.503.978,US 5.631.146, US 5.731.424, US 5.780.228, US 5.792.613, US 5.795.721,US 5.846.713, US 5.858.660, US 5.861.254, US 5.864.026, US 5.869.641,US 5.958.691, US 6.001.988, US 6.011.020, US 6.013.443, US 6.020.130,US 6.028.186, US 6.030.776 e US 6.051.698.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que é conjugado a uma ribozima. As ribozimas são moléculas deácido nucleico que são capazes de catalisar uma reação química,intramolecular ou intermolecularmente. As ribozimass são assim ácidosnucleicos catalíticos. Existem vários tipos diferente de ribozimas quecatalisam as reações tipo nuclease ou polimerase de ácido nucleico que sãofundamentados nas ribozimas encontradas em sistemas naturais, tais como (a)as ribozimas de cabeça de martelo, (descritas por exemplo nas US 5.334.711,US 5.436.330, US 5.616.466, US 5.633.133, US 5.646.020, US 5.652.094,US 5.712.384, US 5.770.715, US 5.856.463, US 5.861.288, US 5.891.683,US 5.891.684, US 5.985.621, US 5.989.908, US 5.998.193, US 5.998.203,WO 9858058, WO 9858057 e WO 9718312), (b) as ribozimas de grampo decabelo (descritas por exemplo nas US 5.631.115, US 5.646.031, US5.683.902, US 5.712.384, US 5.856.188, US 5.866.701, US 5.869.339 e US6.022.962) e (c) as ribozimas de tetraimena (descritas por exemplo nas US5.595.873 e US 5.652.107). Existem também várias ribozimas que não sãoencontradas em sistemas naturais, mas que foram engendradas para catalisarreações específicas de novo (exemplos das quais são descritas por exemplonas US 5.580.967, US 5.688.670, US 5.807.718 e US 5.910.408). Asribozimass tipicamente clivam substratos RNA ou DNA e mais habitualmenteclivam substratos de RNA. As ribozimass tipicamente clivam substratos deácido nucleico através do reconhecimento e ligação do substrato alvo comclivagem subseqüente. Este reconhecimento é freqüentemente fundamentadoem grande parte em interações de pares de bases canônicas ou não canônicas.Esta propriedade torna as ribozimas particularmente bons candidatos para aclivagem específica de alvo de ácidos nucleicos porque o reconhecimento dosubstrato alvo está fundamentado na seqüência de substratos alvos. Osexemplos representativos de como fabricar e usar as ribozimas para catalisaruma variedade de reações diferentes podem ser encontrados na seguinte listanão limitante de patentes US: US 5.646.042, US 5.693.535, US 5.731.295,US 5.811.300, US 5.837.855, US 5.869.253, US 5.877.021, US 5.877.022,US 5.972.699, US 5.972.704, US 5.989.906 e US 6.017.756.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que é conjugado a um ácido nucleico com função formadora detriplex. Tais moléculas de ácido nucleico podem interagir com ácido nucleicode filamento duplo ou de filamento único. Quando as moléculas triplexinteragem com uma região alvo, uma estrutura chamada de um triplex éformada, em que três filamentos de DNA formam um complexo dependentetanto do emparelhamento de Watson-Crick quanto de Hoogsteen. Asmoléculas triplex podem se ligar às regiões alvo com alta afinidade eespecificidade. Os exemplos representativos de como fabricar e usar asmoléculas que formam triplex para ligar uma variedade de moléculas alvodiferentes podem ser encontrados na seguinte lista não limitante de PatentesUS: US 5.176.996, US 5.645.985, US 5.650.316, US 5.683.874, US5.693.773, US 5.834.185, US 5.869.246, US 5.874.566 e US 5.962.426.
Em uma forma de realização, um CD38BP é conjugado a umaseqüência guia externa. As seqüências guias externas (EGSs) são moléculasque se ligam a uma molécula de ácido nucleico formando um complexo que éreconhecido pela RNase P, que cliva a molécula alvo. As EGSs podem serplanejadas para alvejar especificamente uma molécula de RNA de escolha. ARNAse P ajuda no processamento de RNA transferidor (tRNA) dentro de umacélula. A RNAse P bacteriana pode ser recrutada para clivar virtualmentequalquer seqüência de RNA pelo uso de um EGS que faz com que ocomplexo de RNA:EGS alvo imitem o substrato de tRNA natural (ver porexemplo a WO 92/03566 e Forster e Altman, Science 238, 407-409 (1990)para debate). Os exemplos representativos de como fabricar e usar moléculasde EGS para facilitar a clivagem de uma variedade de moléculas alvodiferentes são fornecidos na seguinte lista não limitante de Patentes US: US5.168.053. US 5.624.824. US 5.683.873. US 5.728.521. US 5.869.248 e US5.877.162.
Em uma forma de realização, um CD38BP é conjugado a umamolécula de ácido nucleico interferente, tal como um siRNA ou outramolécula de RNAi (por exemplo, uma molécula de RNA de filamento duplo(ds) inibidora de cerca de 20 a 25 nucleotídeos), que é alvejado para interferircom a ação de um produto de expressão do gene alvo, tal como um produto deexpressão de gene envolvido em uma doença ou condição mediada por CD38.Os métodos para a produção e o uso de moléculas de ácido nucleicointerferentes são fornecidos por exemplo em Nishikura, Cell. 107(4), 415-8(2001), Fjose et al., Biotechnol Annu Rev. 7, 31-57 (2001), Hanon, Nature418, 244-51 (2002), Brantl, Biochim Biophys Acta. 1575(1-3), 15-25 (2002),Tuschl, Chembiochem. 2(4), 239-45 (2001), Caplen, Expert Opin Blot Ther.3(4), 575-86 (2003), Lu et al., Curr Opin Mol Ther. 5(3), 225-34 (2003),Shuey et al., Drug Discov Today. 7(20), 1040-6 (2002), Shi, Trends Genet.19(1), 9-12 (2003), Kovar et al., Semin Câncer Biol. 13(4), 275-81 (2003),Lavrey et al., Curr Opin Drug Discov Devei. 6(4), 561-9 (2003), Clewey,Commun Dis Public Health. 6(2), 162-3 (2003), Duxbury et al., J Surg Res.117(2), 339-44 (2004), Caplen et al., Ann N Y Acad Sei. 1002, 56-62 (2003),WO 01/75164, US 6.506.559, US 20040086884, US 20040077574, US20040063654, US 20040033602, US 20030167490, US 20030157030, US20030114409, US 20030108923, US 20040014113 e US 20020132788.
Em uma forma de realização, um CD38BP é conjugado a umpeptídeo ou molécula de domínio que alveja tumor. Em uma forma derealização, um CD38BP é conjugado a uma seqüência de fator VII que alveja tumor.
Qualquer método conhecido na técnica para conjugar oCD38BP à(s) molécula(s) conjugada(s), tal como aqueles descritos acima,pode ser utilizado, incluindo aqueles métodos descritos por Hunter et al,Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain etal, J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) e Nygren, J. Histochem. and Cytochem.30, 407 (1982). A ligação/conjugação pode ser realizada em qualquer modoadequado. Por exemplo, uma ligação covalente pode tomar a forma de umaligação de dissulfeto (se necessário e adequado, um CD38BP pode serengendrado para conter um códon de cisteína extra, que desejavelmente nãointerferem com a atividade de ligação de CD38 da molécula. Uma moléculade toxina, derivatizada com um grupo reativo de sulfidrila com a cisteína doCD38BP modificado, pode formar um imunoconjugado com o peptídeo deCD38BP. Alternativamente, um grupo sulfidrila pode ser introduzidodiretamente a um CD38BP usando técnicas de polipeptídeo de fase sólida. Porexemplo, a introdução de grupos sulfidrila em peptídeos é descrita porHiskey, Peptides 3, 137 (1981). A introdução de grupos sulfidrila emproteínas está descrito em Maasen et ai., Eur. J. Biochem. 134, 32 (1983).
Uma vez que os grupos sulfidrila corretos estão presentes, a citotoxina eCD38BP podem ser purificados, ambos os grupos de enxofre reduzidos; acitotoxina e o ligando misturados (por exemplo em uma razão de cerca de 1:5a 1:20); e a formação da ligação de sulfidrila possibilitou que se processasseaté a conclusão (no geral de cerca de 20 a 30 minutos) na temperaturaambiente. A mistura pode ser depois dialisada contra solução salinatamponada com fosfato ou submetida à cromatografia em uma resina tal comoSephadex para remover moléculas de ligando e toxina rearranjadas.
Numerosos tipos de compostos citotóxicos podem ser unidosàs proteínas através do uso de um grupo reativo no composto citotóxico ouatravés do uso de um agente de reticulação. Um grupo reativo comum queformarão uma ligação covalente estável in vivo com uma amina é oisotiocianato (Means et al., Chemical Modifications of Proteins (Holden-Day,San Francisco 1971) pp. 105-110). Este grupo preferencialmente reage com ogrupo ε-amina da lisina. A maleimida é um grupo reativo habitualmenteusado para formar uma ligação covalente in vivo estável com o gruposulfidrila na cisteína (Ji., Methods Enzymol 91, 580-609 (1983)). Osanticorpos monoclonais tipicamente são incapazes de formar ligaçõescovalentes com íons radiometálicos, mas estes podem ser ligados ao anticorpoindiretamente através do uso de agentes queladores que são covalentementeligados aos anticorpos. Os agentes queladores podem ser ligados através deaminas (Meares et al, Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984)) e grupos sulfhidral(Koyama, Chem. Abstr. 120, 217262t (1994)) de resíduos de aminoácido etambém através de grupos de carboidrato (Rodwell et al., PNAS USA 83,2632-2636 (1986), Quadri et al., Nucl. Med. Biol. 20, 559-570 (1993)). Vistoque estes agentes queladores contêm dois tipos de grupos funcionais, um paraligar íons metálicos e o outro para unir o quelato ao anticorpo, eles sãohabitualmente aludidos como agentes queladores bifuncionais (Sundberg etal, Nature 250, 587-588 (1974)).
Os agentes reticuladores que têm dois grupos funcionaisreativos são classificados como sendo homo ou heterobifuncionais. Osexemplos de agentes de reticulação homobifimcionais incluembismaleimidoexano (BMH) que é reativo com grupos sulfidrila (Chen et al., JBiol Chem 266, 18237-18243 (1991)) e etileno glicolbis[succinato desuccinimidila] (EGS) que é reativo com grupos amino (Browning et al, J.Immunol. 143, 1859-1867 (1989)). Um exemplo de um reticuladorheterobifuncional é o éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida(MBS) (Myers et al, J. Immunol. Meth, 121, 129-142 (1989)). Estasmetodologias são simples e são habitualmente utilizados.
Um agente terapêutico ou de diagnóstico também oualternativamente pode ser ligado na região de dobradiça de um componentede anticorpo reduzido por intermédio da formação de ligação de dissulfeto.Como uma alternativa, tais peptídeos podem ser ligados ao componente deanticorpo usando um reticulador heterobifuncional, tal como 3-(2-piridilditio)proprionato de N-succinila (SPDP). Yu et al, Int. J. Câncer 56,244 (1994). As técnicas gerais para tal conjugação são bem conhecidas noramo. Ver, por exemplo, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation AndCross-Linking (CRC Press 1991), Upeslacis et al, "Modification ofAntibodies by Chemicals Methods," Em Monoclonal Antibodies: PrincipiesAnd Applications, Birch et al, (eds.) (Wiley-Liss, Inc. 1995), Price,"Production and Characterization of Syntheties Peptide-Derived Antibodies,"em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering And ClinicaiApplication, Ritter et ai., (eds.) (Cambridge University Press 1995).
Em algumas formas de realização, rótulos ou outrossubstituintes conjugados são ligados à seqüência de aminoácido de CD38BPpelos braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimentoestérico potencial.
O(s) CD38BP(s) não rotulado(s) podem ser usados emcombinação com outros anticorpos rotulados (anticorpos secundários) que sãoreativos com o(s) CD38BP(s), tais como os anticorpos específicos para asregiões constantes de imunoglobulina humana que se ligam ao mAbs anti-CD38. Alternativamente, um CD38BP pode ser diretamente rotulado. Umaampla variedade de rótulos pode ser utilizada para a rotulação direta ouindireta de CD38BPs, tal como a rotulação com radionuclídeos, fluorescentes,enzimas, substratos de enzima, cofatores de enzima, inibidores de enzima,ligandos (particularmente haptenos), etc.
As inserções de seqüência de aminoácido incluem fusões determinal amino e/ou carboxila variando no comprimento de um resíduo apolipeptídeos contendo uma centena ou mais resíduos, assim como inserçõesintrasseqüência de resíduos de aminoácido únicos ou múltiplos. Os exemplosde inserções de terminal incluem um anticorpo com um resíduo de metionilano terminal N ou o anticorpo fundido a um rótulo de epítopo. Outras variantesde inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão aos términos N ou C doanticorpo de uma enzima ou um polipeptídeo ou PEG que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo. Tais proteínas de fusão de anticorpo anti-CD38 eproteínas de fusão similares que compreendem seqüências de CD38BP sãouma outra característica da presente invenção.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornecemoléculas que compreendem um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38humano, da presente invenção conjugado a uma porção terapêutica, tal comouma citotoxina, um medicamento quimioterapêutico, um imunossupressor ouum radioisótopo. Tais conjugados são aqui aludidos como"imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou maiscitotoxinas são aludidos como "imunotoxinas".
Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agenteque seja nocivo (por exemplo, que mate) as células. Para uma descrição destasclasses de medicamentos que são bem conhecidos na técnica e seusmecanismos de ação, ver Goodman et ai., Goodman e Gilman's ThePharmacological Basis Of Therapeutics, 8a Ed., Macmillan Publishing Co.,1990. As técnicas adicionais relevantes para a preparação de imunotoxinas deanticorpo são fornecidas por exemplo em Vitetta, Immunol. Today 14, 252(1993) e US 5.194.594.
Os agentes terapêuticos adequados para formarimunoconjugados da presente invenção incluem taxol, citochalasina B,gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida,tenoposida, vincristina, vinblastina, coichicina, doxorrubicina,daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína,propranolol e puromicina, antimetabolitos (tais como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracila,decarbazina, hidroxiuréia, asparaginase, gencitabina, cladribina), agentesalquilantes (tais como mecloretamina, tioepa, clorambucila, melfalan,carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan,dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina,mitomicina C, cisplatina e outros derivados da platina, tais comocarboplatina), antibióticos (tais como dactinomicina (antigamenteactinomicina), bleomicina, daunorrubicina (antigamente daunomicina),doxorrubicina, idarrubicin, mitramicina, calicheamicina, mitomicina,mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), toxina da difteria emoléculas relacionadas (tais como cadeia A da difteria e fragmentos ativosdesta e moléculas híbridas), toxina da ricina (tal como ricina A ou uma toxinada cadeia de ricina A desglicosilada), toxina da cólera, uma toxinaequivalente a Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxinaShiga, toxina da coqueluche, toxina do tétano, inibidor da protease deBowman-Birk da soja, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina,modeccina, gelanina, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas dePhytolacca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da momordieacharantia, curcina, crotina, inibidor da saponaria offieinalis, gelonina,mitogelina, restrictocina, fenomicina e toxinas da enomicina. Os agentesterapêuticos, que podem ser administrados em combinação com um CD38BPda presente invenção como descrito aqui em outro lugar, também podem sercandidatos para porções terapêuticas úteis para a conjugação a um CD38BPda presente invenção.
Por exemplo, a porção medicamentosa pode ser umaproteína ou polipeptídeo que possua uma atividade biológica desejada. Taisproteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa oufragmento ativo destes, tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonasou toxina da difteria; uma proteína tal como fator de necrose de tumor ouinterferon-γ; ou, modificadores de resposta biológica tais como, por exemplo,linfocinas, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6),fator estimulador de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF), fatorestimulador de colônia de granulócito (G-CSF) ou outros fatores decrescimento e proteína indutora apoptóptica isolada de mitocôndria.
Em uma forma de realização, o agente citotóxico écalicheamicina, 90Y, 125Ie 131I.
Outros exemplos de citotoxinas terapêuticas que podem serconjugadas a um CD38BP da presente invenção incluem calicheamicinas eduocarmicinas. Como indicado acima, a porção medicamentosa não precisaser interpretada como limitada aos agentes terapêuticos químicos clássicos.
Por exemplo, a porção medicamentosa pode ser uma proteína ou polipeptídeoque possua uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir,por exemplo, um agente ativo na superfície celular, tal como enzimas defosfolipase, por exemplo, fosfolipase C.
A porção lisadora de uma toxina tipicamente pode serfacilmente unida ao fragmento Fab de um anticorpo ou fragmento deanticorpo da presente invenção. Outras moléculas conjugadas adequadasincluem ribonuclease (RNase), DNase 1, enterotoxina estafilocócica A,proteína antiviral da erva-dos-cancros, toxina da difteria e endotoxina dePseudomonas. Ver, por exemplo, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) eGoldenberg, Calif. A Câncer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). As toxinasadicionais adequadas para o uso na presente invenção são conhecidas poraqueles de habilidade na técnica (ver por exemplo a US 6.077.499).
Conjugados de CD38BPs, tais como os anticorpos e taisporções citotóxicas podem ser fabricados usando uma variedade de agentes deligação de proteína bifimcionais. Os exemplos de tais reagentes incluemSPDP, IT3 derivados bifimcionais de imidoésteres um tal adipimidato dedimetila HCl, ésteres ativos tais como suberato de dissuccinimidila, aldeídostais como glutaraldeído, compostos de bis-azido tais como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina, derivados de bis-diazônio tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina, diisocianatos tais como 2,6-diisocianato detolileno e compostos de flúor bis-ativos tais como l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina, vinblastina,docetaxel, paclitaxel e vinorelbina).
As técnicas para conjugar tais porções terapêuticas aosCD38BPs, tais como os anticorpos, são bem conhecidas, ver por exemploArnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCâncer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeldet al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985), Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.),Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987), Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", emMonoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, Pincheraet al., (eds.), pp. 475-506 (1985), "Analysis, Results, And Future ProspectiveOf The Therapeutic Use Of Radiolabeles Antibody In Câncer Therapy", emMonoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al.,(eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al., "The PreparationAnd Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev.62, 119-58(1982).
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que é conjugado a uma toxina misturada. Uma molécula de toxinamisturada é uma molécula derivada de duas toxinas diferentes (tipicamentepolipeptídeo). No geral, as toxinas de peptídeo compreendem um ou maisdomínios responsáveis pela ligação de célula eucarióptica generalizada, pelomenos um domínio enzimaticamente ativo e pelo menos um domínio detranslocação. Os domínios de ligação e translocação são requeridos para oreconhecimento de célula e entrada de toxina respectivamente. As proteínasque ocorrem naturalmente que são conhecidas por terem um domínio detranslocação incluem a toxina da difteria, a exotoxina A de Pseudomonas epossivelmente outras toxinas de peptídeo. Os domínios de translocação datoxina da difteria e a exotoxina A de Pseudomonas são bem caracterizadas(ver por exemplo Hoch et al., PNAS USA 82, 1692 (1985), Colombatti et al.,J. Biol. Chem. 261, 3030 (1986) e Deleers et al., FEBS Lett. 160, 82 (1983)) ea existência e localização de um tal domínio em outras moléculas podem serdeterminadas pelos métodos tais como aqueles utilizados por Hwang et al.,Cell 48, 129 (1987) e Gray et al., PNAS USA 81 2645 (1984). Em vistadestas técnicas, uma molécula híbrida de toxina misturada útil pode serformada, por exemplo, fundindo-se a subunidade A enzimaticamente ativa datoxina equivalente a Shiga de E. coli (Calderwood et al., PNAS USA 84,4364 (1987)) ao domínio de translocação (resíduos de aminoácido 202 até460) da toxina da difteria e a uma molécula que alveja um tipo de célulaparticular, como descrito na US 5.906.820. A porção alvejadora do híbrido detrês partes pode fazer com que a molécula se ligue especificamente às célulasalvejadas e a porção de translocação da toxina da difteria pode atuar parainserir a subunidade A enzimaticamente ativa da toxina equivalente a Shigaem uma célula alvejada. A porção enzimaticamente ativa da toxinaequivalente a Shiga, como a toxina da difteria, atua no mecanismo da síntesede proteína da célula para impedir a síntese de proteína, matando assim acélula alvejada.
Os imunoconj ugados de acordo com a presente invençãotambém podem compreender um radioisótopo, por exemplo, iodo-131, ítrio-90 ou índio-111, para gerar produtos radiofarmacêuticos para tratar umdistúrbio relacionado com o CD38, tal como mieloma múltiplo.
Em uma forma de realização, os CD38BPs, tais como osanticorpos humanos da presente invenção são ligados a um quelador ligador,por exemplo, tiuxetan, que permite que o anticorpo seja conjugado a umradioisótopo.
Adicionalmente, os substituintes conjugados úteis incluemretinóides anticâncer. Conjugados de taxano (ver por exemplo Jaime et al.,Anticancer Res. 21(2A), 1119-28 (2001), conjugados de cisplatina,conjugados de tapsigargina, conjugados de ácido linoléico, conjugados decalicheamicina (ver por exemplo Damle et al., Curr Opin Pharmacol. 3(4),386-90 (2003), conjugados de doxorrubicina, conjugados de geldanamicina eoutros, também podem ser úteis na promoção do tratamento de câncer (ver, nogeral, Trail et al., Câncer Immunol Immunother. 52(5), 328-37 (2003)).Em uma forma de realização, a presente invenção forneceanticorpo secundários e anti-idiotípicos incitados contra anticorpos anti-CD38da presente invenção. Um anticorpo secundário refere-se a um anticorpoespecífico para e tipicamente incitado contra, um anticorpo anti-CD38. Umanticorpo anti-idiotípico (Id) é um anticorpo que reconhece determinantesúnicos no geral associados com o sítio de ligação de antígeno de umanticorpo. Um anticorpo Id pode ser preparado imunizando-se um animal damesma espécie e tipo genético como a fonte de um mAb anti-CD38 com omAb ao qual um anti-Id está sendo preparado. O animal imunizadotipicamente pode reconhecer e responder aos determinantes idiotípicos doanticorpo imunizante pelos quais produzem um anticorpo para estesdeterminantes idiotípicos (o anticorpo anti-Id). Tais anticorpos são descritospor exemplo na US 4.699.880. Tais anticorpos são ainda características dapresente invenção.
Um anticorpo anti-Id também pode ser usado como um"imunógeno" para induzir uma resposta imune mesmo em um outro animal,que produzem um chamado anticorpo anti-anti-Id. Um anti-antild pode serepitopicamente idêntico ao mAb original, que induziu o anti-Id. Assim, pelouso de anticorpos aos determinantes idiotípicos de um mAb, é possívelidentificar outros clones que expressem anticorpos de especificidade idêntica.Os anticorpos anti-Id podem ser variados (produzindo deste modo variantesde anticorpo anti-Id) e/ou derivatizados por qualquer técnica adequada, taiscomo aquelas descritas aqui em outro lugar com respeito a anticorpos anti-CD38 e outros CD38BPs da presente invenção. Por exemplo, os mAbs anti-Idpodem ser ligados a um carreador tal como hemocianina do lapa buraco defechadura (KLH) e usados para imunizar camundongos BALB/c. Os sorosdestes camundongos tipicamente conterão anticorpos anti-anti-Id que têm aspropriedades de ligação similares se não idênticas a um anticorpo de CD38original/precursor.Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umácido nucleico que codifica um CD38BP. Um ácido nucleico que codificaCD38BP pode ter qualquer característica adequada e compreendem qualquercaracterística adequada ou combinação destas. Assim, por exemplo, um ácidonucleico que codifica CD38BP pode estar na forma de DNA, RNA ou umhíbrido destes e pode incluir bases que não ocorrem naturalmente, umaestrutura modificada (por exemplo, uma estrutura de fosfotioato que promovea estabilidade do ácido nucleico) ou ambas. O ácido nucleico vantajosamentecompreendendo as características que promovem a expressão, replicação e/ouseleção na(s) célula(s) hospedeira(s) alvo desejadas. Os exemplos de taiscaracterísticas incluem um componente de origem de replicação, umcomponente de gene de seleção, um componente promotor, um componentede elemento realçador, uma componente de seqüência de poliadenilação, umcomponente de terminação e outros.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umvetor que compreende um ácido nucleico que codifica CD38BP. Um vetorrefere-se a um veículo de liberação que promove a expressão de um ácidonucleico que codifica CD38BP, a produção de um peptídeo de CD38BP, atransfecção/transformação de células alvos, a replicação do ácido nucleicoque codifica CD38BP, promove a estabilidade do ácido nucleico, promove adetecção do ácido nucleico e/ou células transformadas/transfectadas ou deoutro modo estabelecido comunica função biológica vantajosa ao ácidonucleico que codifica CD38BP. Um vetor no contexto da presente invençãopode ser qualquer vetor adequado, incluindo vetores de ácido nucleico decromossoma, não cromossoma e sintéticos (uma seqüência de ácido nucleicoque compreende um conjunto adequado de elementos de controle deexpressão). Os exemplos de tais vetores incluem derivados de SV40,plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura,vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago e vetores deácido nucleico viral (RNA ou DNA). Em uma forma de realização, um ácidonucleico que codifica CD38BP é compreendido em um vetor DNA ou RNAnu, incluindo, por exemplo, um elemento de expressão linear (como descritopor exemplo em Sykes e Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), um vetorde ácido nucleico compactado (como descrito por exemplo na US 6.077.835e/ou WO 00/70087), um vetor plasmídico tal como pBR322, pUC 19/18 oupUC 118/119, um vetor de ácido nucleico de tamanho minimamente "midge"(como descrito por exemplo em Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800(2001)) ou como uma construção de vetor de ácido nucleico precipitado, talcomo uma construção precipitada com CaPC>4 (como descrito por exemplo naWO 00/46147, Benvenisty e Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigleret al, Cell 14, 725 (1978) e Coraro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603(1981)). Tais vetores de ácido nucleico e o uso destes são bem conhecidos natécnica (ver por exemplo a US 5.589.466 e US 5.973.972).
Em uma forma de realização, o vetor é adequado para aexpressão do CD38BP em uma célula bacteriana. Os exemplos de tais vetoresincluem, por exemplo, vetores que direcionam a expressão de proteínas defusão de alto nível que são facilmente purificadas (por exemplo clonagem deE. coli multifuncional e os vetores de expressão tais como BlueScript(Stratagene), vetores pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), vetores pET (Novagen, Madison WI) e outros).
Um vetor de expressão também ou alternativamente pode serum vetor adequado para a expressão em um sistema de levedura. Qualquervetor adequado para a expressão em um sistema de levedura pode serutilizado. Os vetores adequados para o uso por exemplo na Saccharomyceseerevisíae incluem, por exemplo, vetores que compreendem promotoresconstitutivos ou indutíveis tais como o fator alfa, a álcool oxidase e PGH(revisada em: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley InterScience Nova Iorque (1987) e Grant et al,Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
Um ácido nucleico e/ou vetor também podem compreenderuma seqüência de ácido nucleico que codifica uma seqüência desecreção/localização, que pode alvejar um polipeptídeo, tal como uma cadeiade polipeptídeo nascente, a um compartimento celular desejado, membrana ouorganela ou que direciona a secreção de polipeptídeo para o espaçoperiplásmico ou no meio de cultura celular. Tais seqüências são conhecidas natécnica e incluem líder de secreção ou peptídeos de sinal, as seqüências quealvejam organela (por exemplo, seqüências de localização nuclear, sinais deretenção de ER, seqüências de trânsito de mitocondria, seqüências de trânsitode cloroplasto), seqüências de localização/âncora de membrana (por exemplo,seqüências de transferência de parada, seqüências de âncora de GPI) e outras.
Os ácidos nucleicos que codificam CD38BP podemcompreender ou estar associados com qualquer promotor, realçador e outroselementos que facilitem a expressão adequados. Os exemplos de taiselementos incluem promotores de expressão fortes (por exemplo,promotor/realçador de CMV IE humano assim como promotores de RSV,SV40, SL3-3, MMTV e fflV LTR), seqüências de terminação poli (a)eficazes, uma origem de replicação para o produto de plasmídeo na E. coli,um gene de resistência a antibiótico como marcador selecionável e/ou umsítio de clonagem conveniente (por exemplo, um poliligador). Os ácidosnucleicos também podem compreender um promotor indutível como oposto aum promotor constitutivo tal como CMV IE (o técnico habilitado reconheceráque tais termos são de fato descritores de um grau de expressão de gene sobcertas condições).
Em uma forma de realização, o ácido nucleico pode serposicionado e/ou liberado à célula hospedeira ou animal hospedeiro porintermédio de um vetor viral. Qualquer vetor viral adequado podem ser usadoa este respeito e diversos são conhecidos na técnica. Um vetor viral podecompreender qualquer número de polinucleotídeos virais, sozinhos ou emcombinação com uma ou mais proteínas virais, que facilitam a liberação,replicação e/ou expressão do ácido nucleico da presente invenção em umacélula hospedeira desejada. O vetor viral pode ser um polinucleotídeo quecompreende todo ou parte de um genoma viral, uma proteína viral/ácidonucleico conjugado, uma partícula semelhante a vírus (VIP), um vetor similaràqueles descritos na US 5.849.586 e WO 97/04748 ou uma partícula viralintacta que compreende ácidos nucleicos virais e o ácido nucleico da presenteinvenção. Um vetor viral de partícula viral pode compreender uma partículaviral do tipo selvagem ou uma partícula viral modificada. O vetor viral podeser um vetor que requeira a presença de um outro vetor ou vírus do tiposelvagem para a replicação e/ou expressão (isto é, este pode ser um vírusdependente de auxiliar), tais como um amplicon viral de adenovetor.
Tipicamente, tais vetores virais consistem essencialmente de uma partículaviral do tipo selvagem ou uma partícula viral modificada na sua proteína e/outeor de ácido nucleico para aumentar a capacidade de transgene ou ajudar natransfecção e/ou expressão do ácido nucleico (os exemplos de tais vetoresincluem o vírus do herpes/ amplicons AAV). Tipicamente, um vetor viral ésimilar a e/ou derivado de um vírus que normalmente infecta seres humanos.
As partículas virais de vetor adequadas a este respeito, incluem, por exemplo,partículas de vetor adenovirais (incluindo qualquer vírus de ou derivado deum vírus do adenoviridaé), as partículas virais de vetor adeno-associadas(partículas de vetor AAV) ou outras partícula de vetor de parvovírus eparvovirais, partículas de vetor papilomavirais, vetores flavivirais, vetoresalfavirais, vetores virais do herpes, vetores do vírus da varíola, vetoresretrovirais, incluindo vetores lentivirais. Os exemplos de tais vírus e vetoresvirais estão por exemplo, em Fields et al., eds., Virology Raven Press, Ltd.,Nova Iorque (3a ed., 1996 e 4a ed., 2001), Encyclopedia of Virology, R. G.Webster et al., eds., Academic Press (2a ed., 1999), Fundamental Virology,Fields et al., eds., Lippincott-Raven (3a ed., 1995), Levine, "Viruses,"Scientific American Library N5 37 (1992), Medicai Virology, D. O. White etal., eds., Acad. Press (2a ed. 1994) e Introduction to Modern Virology,Dimock, N. J. et al., eds., Blackwell Scientific Publications, Ltd. (1994).
Os vetores virais que podem ser utilizados com ospolinucleotídeos da presente invenção e os métodos aqui descritos incluemadenovírus e vetores adeno-associados, como por exemplo em Carter, CurrOpinion Biotech 3, 533-539 (1992) e Muzcyzka, Curr Top MicrobiolImmunol 158, 97-129 (1992). Os tipos e aspectos adicionais de vetores AAVsão descritos por exemplo em Carter, Contrib. Microbiol. 4, 85-86 (2000),Smith-Arica, Curr. Cardiol. Rep. 3(1), 41-49 (2001), Taj, J. Biomed. Sei. 7(4),279-91 (2000), Vigna et al., J. Gene Med. 2(5), 308-16 (2000), Klimatchevaet al., Front. Biosci. 4, D481-96 (1999), Lever et al., Biochem. Soe. Trans.27(6), 841-47 (1999), Snyder, J Gene Med. 1(3), 166-75 (1999), Gerich et al.,Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 5(2), 118-23 (1998) e During, Adv.Drug Deliv. Review 27(1), 83-94 (1997) e US 4.797.368, US 5.139.941, US5.173.414, US 5,614,404, US 5.658.785, US 5.858.775 e US 5.994.136). Osvetores virais adeno-associados podem ser construídos e/ou purificadosusando os métodos apresentados, por exemplo, na US 4.797.368 e Laughlin etal., Gene 23, 65-73 (1983).
Um outro tipo de vetor viral que pode ser utilizado compolinucleotídeos e métodos da presente invenção é um vetor papilomaviral.Os vetores papilomavirais adequados são conhecidos na técnica e descritos,por exemplo, em Hewson, Mol Med Today 5(1), 8 (1999), Etapahens,Biochem J. 248(1), 1-11 (1987) e US 5.719.054. Os exemplos de vetorespapilomavirais são fornecidos por exemplo em WO 99/21979. Os vetores dealfavírus podem ser vetores de liberação de gene em outros contextos. Osvetores de alfavírus são conhecidos na técnica e descritos por exemplo emCarter, Curr Opinion Biotech 3, 533-539 (1992), Muzcyzka, Curr TopMicrobiol Immunol. 158, 97-129 (1992), Schlesinger, Expert Opin Biol Ther.1(2), 177-91 (2001), Polo et al., Dev Biol (Basel). 104, 181-5 (2000),Wahlfors et al., Gene Ther. 7(6), 472-80 (2000), Colombage et al., Virology.250(1), 151-63 (1998) e WO 01/81609, WO 00/39318, WO 01/81553, WO95/07994 e WO 92/10578.
Um outro grupo de vetores virais são vetores virais do herpes.Os exemplos de vetores virais do herpes são descritos por exemplo emLachmann et al., Curr Opin Mol Ther 1(5), 622-32 (1999), Fraefel et al., AdvVírus Res. 55, 425-51 (2000), Huard et al., Neuromuscul 7(5), 299-313(1997), Glorioso et al., Annu Rev Microbiol. 49, 675-710 (1995), Latchman,Mol Biotechnol. 2(2), 179-95 (1994) e Frenkel et al., Gene Ther. 1 (Supl 1),S40-6 (1994), assim como US 6.261.552 e US 5.599.691.
Os vetores retrovirais, incluindo vetores lentivirais, tambémpodem ser veículos de liberação de gene vantajosos em contextos particulares.
Existem numerosos vetores retrovirais conhecidos na técnica. Os exemplos devetores retrovirais são descritos por exemplo em Miller, Curr Top MicrobiolImmunol 158, 1-24 (1992), Salmons e Gunzburg, Human Gene Therapy 4,129-141 (1993), Miller et al., Methods in Enzvmology 217, 581-599 (1994),Weber et al., Curr Opin Mol Ther. 3(5), 439-53 (2001), Hu et al., PharmacolRev. 52(4), 493-511 (2000), Kim et al., Adv Virus Res. 55, 545-63 (2000),Palu et al., Rev Med Virol. 10(3), 185-202 (2000) e Takeuchi et al., Adv ExpMed Biol. 465, 23-35 (2000), assim como US 6.326.195, US 5.888.502, US5.580.766 e US 5.672.510.
Os vetores adenovirais também podem ser vetores viraisadequados para a transferência de gene. Os vetores adenovirais são bemconhecidos na técnica e descritos por exemplo em Graham et al, MolBiotechnol 33(3), 207-220 (1995), Etapahenson, Clin Diagn Virol 10(2-3),187-94 (1998), Jacobs, Clin Sci (Lond). 85(2), 117-22 (1993), US 5.922, 576,US 5.965.358 e US 6.168.941 e W098/22588, W098/56937, W099/15686,W099/54441 e WOOO/32754. Os vetores adenovirais, vetores virais doherpes e vetores virais de Sindbis, úteis na prática da presente invenção, sãodescritos por exemplo em Jolly Câncer Gene Terapia 1, 51-64 (1994),Latchman Malec Biotechnol 2, 179-195 (1994) e Johanning et al., Nucl AcidsRes 23, 1495-1501 (1995).
Outros vetores virais adequados incluem vetores virais davaríola. Os exemplos de tais vetores são debatidos por exemplo na Berencsi etal., J Infect Dis 183(8), 1171-9 (2001), Rosenwirth et al., Vaccine 19(13-14),1661-70 (2001), Kittlesen et al., J Immunol 164(8), 4204-11 (2000), Brown etal., Gene Ther 7(19), 1680-9 (2000), Kanesa-thasan et al., Vaceine 19(4-5),483-91 (2000), Sten, Drua 60(2), 249-71 (2000). Os vetores virais da varíolapodem ser vetores do vírus da varíola. Os exemplos de tais vetores e usosdestes são fornecidos por exemplo em Venugopal et al., Res Vet Sci 57(2),188-193 (1994), Moss Dev Biol Stand 82, 55-63 (1994), Weisz et al., MolCell Biol 43, 137-159 (1994), Mahr e Payne, Immunobiology 184(2-3), 126-146 (1992), Hruby, Clin Microbiol Rev 3(2), 153-170 (1990) e W092/07944,W098/13500 e W089/08716.
Outras características da presente invenção incluem célulasrecombinantes, tais como células de levedura, bacterianas e de mamífero (porexemplo, células de mamífero imortalizadas) que compreendem um tal ácidonucleico, vetor ou combinações de cada um ou ambos destes. Por exemplo,em uma forma de realização, a presente invenção fornece uma célula quecompreende um ácido nucleico estavelmente integrada no genoma celular quecompreende uma seqüência que codifica a expressão de um CD38BP dapresente invenção. Em uma forma de realização, a presente invenção forneceuma célula que compreende um ácido nucleico não integrado, tal como umplasmídeo, cosmídeo, fagomídeo ou elemento de expressão linear, quecompreende uma seqüência que codifica a expressão de um CD38BP.
A presente invenção também fornece peptídeos imunogênicosque compreendem qualquer uma das porções de determinante antigênicodescritas acima de CD38 específicas para os CD38BPs da presente invenção,tais como as porções de determinante antigênico de CD38 específicas para -003 e -005 e -024. Tais imunógenos podem ser usados para evocar umaresposta imune direta em um método que compreenda um regime deimunoterapia ativa. A presente invenção fornece ainda uma proteína de fusãoque compreende um tal imunógeno de CD38 e uma seqüência de parceiro defusão que melhore a meia-vida da proteína de fusão (por exemplo, pelainclusão de uma seqüência de domínio de imunoglobulina); facilita a detecçãoe/ou purificação da proteína de fusão (compreendendo, por exemplo, umaseqüência de peptídeo fluorescente, uma seqüência de enzima repórter, umrótulo de epítopo, uma seqüência de hexa-histidina ou semelhante); promoveo alvejamento da proteína de fusão (por exemplo, compreendendo um ligandoou porção de um ligando específica quanto a um receptor on uma célula alvo);promove a indução de uma resposta imune distinta (por exemplo, correspondea um antígeno canceroso ou um fragmento imunogênico destes); é um agentecitotóxico; ou alcança qualquer combinação destes (por exemplo, um parceirode proteína de fusão de choque térmico pode aumentar uma resposta imunegerada contra uma porção de antígeno não similar, heterólogo de umaproteína de fusão, enquanto também aumenta a meia-vida in vivo de umaproteína de fusão). As proteínas de fusão também podem compreender um oumais sítios de clivagem, particularmente entre domínios.
As variantes de tais peptídeos e derivados de tais peptídeosimunogênicos ou variantes de peptídeo imunogênicas são característicasadicionais da presente invenção (por exemplo, tais derivados de peptídeoimunogênicos de CD38 podem ser modificados pela ligação química, fusãogenética, associação não covalente e outros, a outras entidades molecularestais como os anticorpos, toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos ou agentescitostáticos). Os mimítopos de peptídeo, que compreendem epítopos deseqüência de CD38 também podem, por exemplo, ser úteis como candidatos avacina. Tais peptídeos também podem ser úteis na purificação de anticorposanti-CD38. Além das seqüências de epítopo de célula B aqui descritas, taispeptídeos podem ser engendrados ou selecionados para compreender tambémou alternativamente um ou mais epítopos de célula T anti-CD38. Taisepítopos podem ser identificados por qualquer técnica adequada conhecida noramo (por exemplo, pelas aplicações de software de prognóstico de epítopo decélula T).
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umácido nucleico que codifica um tal peptídeo imunogênico. Um tal ácidonucleico pode ser liberado a um hospedeiro em um vetor adequado, tal comoum vetor alvejado deficiente de replicação (por exemplo, um vetor de ácidonucleico alvejado ou um vetor de adenovírus alvejado deficiente dereplicação). A presente invenção também fornece composições de um ou maisde tais peptídeos imunogênicos e/ou ácidos nucleicos que codificam peptídeoimunogênico.
Os CD38BPs da presente invenção incluem CD38BPs"neutralizantes", tais como anticorpos neutralizantes. Os termos "CD38BPneutralizante" e "anticorpo neutralizante" referem-se a um CD38BP ou umanticorpo que é capaz de inibir ou eliminar substancialmente uma atividadebiológica de um peptídeo associado a CD38. Tipicamente, um CD38BPneutralizante, tal como um anticorpo neutralizante anti-CD38, pode inibir,direta ou indiretamente, a função de CD38, tal como a atividade enzimática,transdução de sinal, indução da expressão de citocina, indução da proliferaçãoou diferenciação ou indução da lise, em um grau que é de cerca de igual oumaior do que a inibição de tais células devido à administração de umaquantidade aproximadamente igual de -003 ou -005 ou -024.
Um CD38BP da presente invenção pode ter qualquer afinidadee/ou avidez adequadas quanto a um ou mais epítopos contidos pelo menosparcialmente no CD38. A afinidade se refere à força de ligação do CD38BP aum tal epítopo. Tipicamente, a afinidade é medida pela constante dedissociação Kd, definida como [Ab] χ [Ag] / [Ab-Ag] onde [Ab-Ag] é aconcentração molar do complexo de anticorpo-antígeno (ou o complexo deCD38BP-antígeno), [Ab] é a concentração molar do anticorpo não ligado (ouCD38BP) e [Ag] é a concentração molar do antígeno não ligado. A constantede afinidade Ka é definida por 1/Kd. Os métodos adequados para determinar aespecificidade e a afinidade pela inibição competitiva podem ser encontradospor exemplo em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colliganet al., eds., Current Protocols em Immunology, Greene Publishing Assoc. andWiley InterScience N.Y., (1992, 1993) e Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601(1983).
Um CD38BP e particularmente anticorpos anti-CD38 dapresente invenção podem ter uma afinidade por pelo menos um epítopo pelomenos parcialmente compreendido no CD38 na faixa de cerca de IO4 a cercade IO10 M"1. O termo imunorreagir aqui tipicamente se refere à ligação de umCD38BP a um epítopo de CD38 com uma constante de dissociação Kd maisbaixa do que cerca de IO"4 M.
Um CD38BP pode ter uma afinidade que é pelo menos tãogrande quanto o CD38 como -003 e -005 e -024 e em algumas formas derealização têm uma afinidade que é pelo menos de cerca de tão grande quanto-003 e -005 e -024. A afinidade pode ser determinada por qualquer um dosmétodos aqui descritos em outro lugar ou seus equivalentes conhecidos natécnica. Um exemplo de um método que pode ser usado para determinar aafinidade é fornecido na análise Scatchard de Munson & Pollard, Anal.Biochem. 107, 220 (1980). A afinidade de ligação também pode serdeterminada pelos métodos de equilíbrio (por exemplo ensaioimunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou radioimunoensaio (RIA)) ouanálise cinética (por exemplo análise BIAÇORE®).
Tipicamente, a constante de dissociação para os CD38BPs, taiscomo o anticorpos anti-CD38, da presente invenção é menor do que cerca de100 nM, menor do que cerca de 50 nM, menor do que cerca de 10 nM, cercade 5 nM ou menos, cerca de 1 nM ou menos, cerca de 0,5 nM ou menos,cerca de 0,1 nM ou menos, cerca de 0,01 nM ou menos ou ainda cerca de0,001 nM ou menos.
Os CD38BPs, tais como os anticorpos anti-CD38, da presenteinvenção podem exibir características funcionais similares como -003 e -005 e-024, tal como pode ser determinado pela citotoxicidade celular dependentede anticorpo (ADCC) e ensaios de citotoxicidade mediada por complemento(CDC) (ver por exemplo a US 5500362).
Em uma forma de realização, um peptídeo de acordo com apresente invenção não atua como um agonista de CD38, mas como umantagonista de CD38. Um agonista de CD38 é uma molécula, que ativa umaou mais das funções atribuídas ao CD38. Tais funções podem incluir amediação de receptor nos eventos de adesão e sinalização e atividade (ecto-)enzimática. Além disso, como uma ectoenzima, CD38 usa NAD + comosubstrato para a formação de ADP-ribose cíclica (cADPR) e ADPR, mastambém de nicotinamida e ácido nicotínico-adenina dinucleotídeo fosfato(NAADP). cADPR mostrou atuar como segundo mensageiro para amobilização de Ca do retículo endoplasmático. Além da sinalização porintermédio de Ca ,a sinalização de CD38 ocorre por intermédio da conversacruzada com complexos de antígeno-receptor em células T e B ou outros tiposde complexos de receptor, por exemplo, as moléculas MHC e está deste modoenvolvido em diversas respostas celulares, mas também na comutação esecreção de IgGl.
Em uma forma de realização, um peptídeo de acordo com apresente invenção não induz a proliferação significante de PBMCs. Em umaforma de realização, um peptídeo de acordo com a presente invenção nãoinduz a liberação de níveis significantes de IL-6. Em uma forma derealização, um peptídeo de acordo com a presente invenção não induz aliberação de níveis detectáveis de IFN-γ. Tais ensaios podem ser medidoscomo descrito em Ausiello et ai., Tissue antigens 56, 538-547 (2000).
Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção, assim comooutros CD38BPs da presente invenção, podem ser preparados pela expressãorecombinante em qualquer tipo adequado de células ou animais.
Os CD38BPs recombinantes, tais como anticorposrecombinantes, tais como anticorpos recombinantes humanos, incluemCD38BPs, tais como os anticorpos, tais como os anticorpos humanos que sãopreparados, expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, taiscomo os CD38BPs, tais como os anticorpos, tais como os anticorpos humanosexpressados usando um vetor de expressão recombinante transfectado emuma célula hospedeira.
Os anticorpos recombinantes, tais como anticorpos humanosrecombinantes também incluem anticorpos isolados de uma biblioteca deanticorpo humano recombinante, combinatória, anticorpos isolados de umanimal, tal como um animal transgênico ou anticorpos preparados,expressados, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a uniãode seqüências de ácido nucleico que codificam a imunoglobulina humana aoutras seqüências de ácido nucleico exógenos para os ácidos nucleicos quecodificam a imunoglobulina humana e genes que codificam a imunoglobulinahumana. Os anticorpos humanos recombinantes tipicamente têm regiõesvariáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina da linhagerminativa humana. Em certas formas de realização, entretanto, taisanticorpos recombinantes humanos são submetidos à mutagênese in vitro (ou,quando um animal transgênico para as seqüências de Ig humana é usado, amutagênese somática in vivo) e, assim, as seqüências de aminoácido dasregiões Vh e Vl dos anticorpos recombinantes podem ser seqüências que,embora derivadas de e relacionadas com as seqüências Vh e Vl da linhagerminativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório dalinha germinativa de anticorpo humano in vivo. Ambos os tipos de anticorposhumanos são fornecidos pela presente invenção.
Os métodos adequados para a produção de proteínarecombinante são conhecidos na técnica, ver por exemplo (Sambrook eRussell (eds.), Molecular cloning, terceira edição, 2001, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, USA.
Do mesmo modo, os métodos adequados para a produção deanticorpo são conhecidos na técnica e incluem aqueles descrito por exemploem Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988), Harlow e Lane: UsingAntibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)), US 4.376.110 e Ausubel et ai, eds., Current Protocols In MolecularBiology, Greene Publishing Assoc. and Wiley InterScience N.Y., (1987,1992). Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados usando o método dohibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) ou poroutros métodos bem conhecidos, subseqüentemente desenvolvidos (ver, porexemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Hibridomas úteis na produção de anticorposanti-CD38 da presente invenção também são fornecidos pela presenteinvenção. Tais hibridomas podem ser formados pela fusão química, fusãoelétrica ou qualquer outra técnica adequada, com qualquer tipo adequado decélula de mieloma, heteromieloma, foblastóide, plasmacitoma ou outrosequivalentes destes e qualquer tipo adequado de célula que expressaanticorpo. As células B imortalizadas transformadas também podem serusadas para produzir eficientemente anticorpos da presente invenção etambém são fornecidos pela presente invenção. Tais células podem serproduzidas pelas técnicas padrão, tais como a transformação com um VírusEpstein Barr ou um gene transformador. (Ver, por exemplo, "ContinuouslyProliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of PredeterminedSpecificity," Zurawaki, V. R. et al., em Monoclonal Antibodies, ed. porKennett R. H. et al., Plenum Press, N.Y. 1980, pp 19-33.)· Assim, anticorpoanti-CD38 estável e contínuo e/ou imortalizado que expressa células elinhagens de célula são uma característica da presente invenção. As célulaseucariópticas e procariópticas (por exemplo, células de levedura, as linhagensde célula de mamífero contínuas e/ou imortalizadas (por exemplo, linhagensde célula derivadas de célula que produzem que produzem anticorpo linfóide),células vegetais, células de inseto e células bacterianas tais como células de E.coli, etc.) que compreendem ácidos nucleicos que codificam CD38BP ou quecodificam fragmento de CD38BP são fornecidos pela presente invenção. Osanimais transgênicos, tais como primatas não humanos, roedores (porexemplo, hamsters, porcos da índia - incluindo cepas modificadas destes taiscomo camundongos imunodeficientes combinados graves (SCID) e outrascepas de animal imunocomprometido), cães, etc., que expressem anticorposanti-CD38 humanos da presente invenção também são fornecidos pelapresente invenção.
As células recombinantes que compreendem ácidos nucleicosexógenos que codificam CD38BPs podem ser preparadas por qualquer técnicaadequada (por exemplo, transfecção/transformação com um vetor deplasmídeo de DNA nu, vetor viral, vetor de célula bacteriana invasiva ououtro vetor de célula inteira, etc., que compreende uma seqüência que codificaCD38BP (ou seqüências) liberadas na célula pela transfecção facilitada pelaprecipitação com fosfato de cálcio, alvejamento e transfecção mediada porreceptor, liberação biolística, eletroporação, transfecção mediada comdextrano, transformação mediada por lipossoma, fusão de protoplasto,microinjeção direta, etc.). Os métodos de transformar/transfectar células sãobem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et ai., MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2aEdição, 1989 e 3a Edição, 2001) e F. Ausubel et al., ed. Current Protocols emMolecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience Nova Iorque(1987). Tais células recombinantes são uma característica da presenteinvenção.
As linhagens de célula disponíveis como hospedeiros para aexpressão de proteína recombinante são bem conhecidas na técnica e incluemmuitas linhagens de célula imortalizadas disponíveis da American TypeCulture Collection (ATCC). Estes incluem, inter alia, células do ovário dohamster chinês (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células renais dohamster bebê (BHK), células renais de macaco (COS), células do carcinomahepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), As células A549 e váriasoutras linhagens de célula. Outras linhagens de célula que podem ser usadassão linhagens de célula de inseto, tais como células Sf9. Quando ácidosnucleicos (ou vetores contendo ácido nucleico) que codificam proteínas, taiscomo CD38BPs (incluindo anticorpos anti-CD38), são introduzidos nascélulas hospedeiras de mamífero, proteínas, tais como CD38BPs, podem serproduzidas cultivando-se as células hospedeiras por um período de temposuficiente para permitir a expressão da proteína, tal como um CD38BP, nascélulas hospedeiras ou pela secreção da proteína, tal como um CD38BP, nomeio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os CD38BPspodem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação deproteína padrão. Os CD38BPs também podem ser recuperados a partir delisados de célula hospedeira quando diretamente expressados sem um sinalsecretor.
Os CD38BPs, tais como os anticorpos anti-CD38, tambémpodem ser produzidos nas células bacterianas e microorganismos unicelulareseucarióticos, tais como levedura. Os CD38BPs produzidos pelas célulasbacterianas, tais como os anticorpos anti-CD38, tipicamente carecem daglicosilação normal e os anticorpos anti-CD38 produzidos pela célulabacteriana podem ser assim mais ou menos deficientes em termos de funçõesADCC e outros aspectos da resposta imune associada com anticorpos anti-CD38 produzidos em células de mamífero e/ou animais (por exemplo, orecrutamento de células NK). Os CD38BPs produzidos pela célula delevedura, tais como os anticorpos anti-CD38 normalmente exibem tiposdiferentes de padrões de glicosilação do que os anticorpos produzidos emcélulas de mamífero. Entretanto, os métodos para produzir anticorpos comglicosilação eficaz em levedura estão correntemente sendo desenvolvidospelas companhias tais como Glicofi, Inc. (Lebanon, NH, USA). Ver tambémWildt S et ai, Nat Rev Microbiol. 3(2), 119-28 (2005).
Quando vetores de expressão recombinantes que codificamgenes de CD38BP (incluindo genes de anticorpo antiCD38) são introduzidosem células hospedeiras de mamífero, os CD38BPs são produzidos cultivando-se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir aexpressão do CD38BP nas células hospedeiras ou para a secreção doanticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivados. Apurificação de anticorpos e outros CD38BPs de culturas celulares, lisadoscelulares e animais (por exemplo, do fluído de ascites de um animaltransgênico que produz anticorpos anti-CD38) pode ser obtida pela aplicaçãode qualquer número de técnicas adequadas conhecidas na técnica incluindo,por exemplo, purificação em coluna de imunoafinidade; precipitação comsulfate; cromatofocalização; SDS-PAGE preparativa e outros.
Os anticorpos monoclonais humanos da presente invençãotambém podem ser produzidos por uma variedade de outras técnicas,incluindo a metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo,a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein,Nature 256, 495 (1975). Outras técnicas para produzir anticorpo monoclonaltambém pode ser utilizada, por exemplo, técnicas de demonstração de fagousando bibliotecas de genes de anticorpo humano. Em uma forma derealização, os anticorpos anti-CD38 da presente invenção produzido pelo usode hibridomas gerados em um sistema de murino. A produção de hibridomano camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolosde imunização e técnicas para a isolação de esplenócitos imunizados para afusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, célulasde mieloma de murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.
Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos paraCD38, camundongos transgênicos ou transcromossômicos contendo genes daimunoglobulina humana (por exemplo, camundongos HCo 12, HCo7 ou KM)podem ser imunizados com uma preparação enriquecida de antígeno de CD38e/ou células que expressam CD38, como descrito, por exemplo, por Lonberget al, (1994), supra, Fishwild et al, (1996), supra e WO 98/24884.
Alternativamente, os camundongos podem ser imunizados com DNA quecodifica o CD38 humano. Os camundongos podem ser de 6 a 16 semanas deidade na primeira infusão. Por exemplo, uma preparação enriquecida (5 a 50μg) do antígeno de CD38 pode ser usada para imunizar os camundongosHuMAbs intraperitonealmente. No evento de que as imunizações usando umapreparação purificada ou enriquecida do antígeno de CD38 não resulta emanticorpos, os camundongos também podem ser imunizados com células queexpressam CD38, por exemplo, uma linhagem de célula, para promoverrespostas imunes.
A experiência acumulativa com vários antígenos tem mostradoque os camundongos transgênicos HuMAbs respondem melhor quandoinicialmente imunizados intraperitonealmente (i.p.) ou subcutaneamente (s.c.)com células que expressam CD38 em adjuvante de Freund completo, seguidopor imunizações i.p. semana sim semana não (até um total de 10) com célulasque expressam CD38 em PBS. A resposta imune pode ser monitorada nocurso do protocolo de imunização com amostras plasmáticas sendo obtidaspelas sangrias retroorbitais. O plasma pode ser triado pela análise de FACS ecamundongos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-CD38podem ser usados para fusões. Os camundongos podem ser reforçadosintravenosamente com células que expressam CD38 por exemplo 4 e 3 diasantes do sacrifício e remoção do baço.
Pára gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonaishumanos ao CD38 humano, esplenócitos e células de linfonodo decamundongos imunizados podem ser isolados e fundidos a uma linhagem decélula imortalizada apropriada, tal como uma linhagem de célula de mielomade camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser depois triados para aprodução de anticorpos específicos de antígeno. Por exemplo, suspensões decélula única de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem serfundidas às células de mieloma de camundongo SP2/0 não secretoras (ATCC,CRL 1581) com 50 % de PEG (p/v). As células podem ser plaqueadas emaproximadamente 1 χ IO5 por reservatório em placa de microtítulo de fundochato, seguido por uma incubação de duas semanas em meio seletivocontendo além dos reagentes usuais 10 % de Soro de Clone fetal, 5 a 10 % defator de clonagem de hibridoma origen (IGEN) e 1 χ HAT (Sigma). Depois deaproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em meio emque o HAT é substituído com HT. Os reservatórios individuais podem serdepois triados pelo ELISA quanto aos anticorpos contendo cadeia leve capahumana e pela análise de FACS usando células que expressam CD38 quanto aespecificidade de CD38. Uma vez que o crescimento de hibridoma extensivoocorra, o meio pode ser observado usualmente depois de 10 a 14 dias. Oshibridomas que secretam anticorpo podem ser replaqueados, triados mais umavez e se ainda positivos quanto à IgG humana, os anticorpos anti-CD38monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes pela diluiçãolimitante. Os subclones estáveis podem ser depois cultivados in vitro paragerar anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.
Os anticorpos humanos da presente invenção também podemser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, porexemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos detransfecção de gene como é bem conhecido na técnica, ver por exemploMorrison, S., Science 229, 1202 (1985).
Por exemplo, para expressar os anticorpos ou fragmentos deanticorpo destes, os DNAs que codificam cadeias leves e pesadas parciais oude tamanho natural, podem ser obtidos pelas técnicas da biologia molecularpadrão (por exemplo amplificação pela PCR, mutagênese direcionada aosítio) e podem ser inseridos nos vetores de expressão tal que os genes sejamoperativamente ligados às seqüências de controle transcricional e traducional.
Neste contexto, o termo "operativamente ligado" é intencionado a significarque um gene de anticorpo é ligado em um vetor tal que as seqüências decontrole transcricional e traducional dentro do vetor sirvam para a sua funçãopretendida de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vetorde expressão e as seqüências de controle de expressão são escolhidas paraserem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene dacadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada de anticorpo podem serinseridas em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes sãoinseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo podem serinseridos no vetor de expressão pelos métodos padrão (por exemplo, ligaçãode sítios de restrição complementares no fragmento de gene do anticorpo eligação de vetor ou extremidade abrupta se nenhum sítio de restrição estiverpresente). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos aquidescritos podem ser usados para criar genes de anticorpo de tamanho naturalde qualquer isótipo de anticorpo inserindo-os nos vetores de expressão que jácodificam as regiões constantes de cadeia pesada e constantes de cadeia levedo isótipo desejado tal que o segmento Vh seja operativamente ligado ao(s)segmento(s) CH dentro do vetor e o segmento Vl seja operativãmente ligadoao segmento CL dentro do vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor deexpressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinal que facilite asecreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da cadeiade anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o peptídeo de sinal seja ligadona matriz ao término amino do gene da cadeia de anticorpo. O peptídeo desinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo desinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína que não daimunoglobulina).
Além dos genes da cadeia de anticorpo, os vetores deexpressão recombinantes da presente invenção carregam seqüênciasreguladoras que permitem e controlam a expressão dos genes da cadeia deanticorpo em uma célula hospedeira.
Além dos genes da cadeia de anticorpo e das seqüênciasreguladoras, os vetores de expressão recombinantes da presente invençãopodem carregar seqüências adicionais, tais como as seqüências que regulam areplicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens dereplicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionávelfacilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (verpor exemplo a US 4.399.216, US 4.634.665 e US 5.179.017). Por exemplo,tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência aosmedicamentos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célulahospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os exemplos de genes marcadoresselecionáveis incluem o gene da diidrofoliato redutase (DHFR) (para o usonas células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação pelo metotrexato) e ogene neo (para a seleção de G418).
Para a expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) deexpressão que codifica(m) as cadeias pesada e leve é/são transfectado(s) emuma célula hospedeira pelas técnicas padrão. As células hospedeiras podemser procariópticas ou eucariópticas, tais como células hospedeiras demamífero. Por exemplo, os fragmentos de ligação de antígeno podem serexpressados em células hospedeiras procariópticas e anticorpos de tamanhonatural podem ser expressados em células hospedeiras eucariópticas.
Em uma forma de realização os anticorpos são expressados emcélulas eucariópticas, tais como células hospedeiras de mamífero. Osexemplos de células hospedeiras de mamífero para expressar os anticorposrecombinantes da presente invenção incluem células CHO (incluindo célulasdhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, PNAS USA 77, 4216-4220 (1980),usadas com um marcador selecionável DHFR, por exemplo como descrito emR. J. Kaufman e P. A. Sharp, Mol. Biol. 159, 601-621 (1982)), as células demieloma NS/0, células COS, células HEK293 e células SP2,0. Em particularpara o uso com as células de mieloma NS/0, um outro exemplo de um sistemade expressão é o sistema de expressão de gene de GS (glutamina sintetase)divulgado na W087/04462, W089/01036 e EP338 841.
Os genes de CD38BP podem ser expressados em outrossistemas de expressão, incluindo células procariópticas, tais comomicroorganismos, por exemplo, E. coli para a produção de anticorpos descFv, algas, assim como células de inseto. Além disso, os CD38BPs podemser produzidos em animais não humanos transgênicos, tais como no leite deovelhas e coelhos ou ovos de galinhas ou em plantas transgênicas. Ver porexemplo Verma, R. et al, J. Immunol. Meth. 216, 165-181 (1998), Pollock etal, J. Immunol. Meth. 231, 147-157 (1999) e Fischer, R. et al, Biol.Chem.380, 825-839 (1999).
Os CD38BPs biespecíficos e multiespecíficos da presenteinvenção podem ser fabricados usando técnicas químicas (ver por exemplo D.M. Kranz et al., PNAS USA 78, 5807 (1981)), técnicas de "polidoma" (VerUS 4,474,893) ou técnicas de DNA recombinante.
Os anticorpos biespecíficos da presente invenção podem serproduzidos por uma variedade de métodos conhecidos incluindo a fusão dehibridomas ou ligação de fragmentos Fab' (ver por exemplo Songsivilai &Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321 (1990) e Kostelny et al., J.Immunol. 148, 1547-1553 (1992)). Tradicionalmente, a produçãorecombinante de anticorpos biespecíficos está fundamentada na co-expressãode dois pares de cadeia pesada-cadeia leve da imunoglobulina, onde as duascadeias pesadas têm especificidades diferentes (ver por exemplo Milstein eCuello, Nature 305, 537 (1983)). Por causa da seleção aleatória de cadeiaspesadas e leves da imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzemuma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quaisapenas uma tem a estrutura biespecífica correta. Procedimentos similares sãodivulgados na WO 93/08829 e Traunecker et al, EMBO J. 10, 3655 (1991).
De acordo com um método diferente, os domínios variáveis deanticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinaçãode anticorpo-antígeno) são fundidos às seqüências do domínio constante daimunoglobulina pelos métodos recombinantes ou sintéticos. A seqüência dedomínio variável é tipicamente fundida a um domínio constante de cadeiapesada da imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões dedobradiça, CH2 e CH3. Também tipicamente, uma primeira região constantede cadeia pesada (ChI)5 contendo o sítio necessário para a ligação de cadeialeve, também está presente em pelo menos um dos peptídeos de fusão. Em ummais exemplos específicos deste tipo de método, um anticorpo biespecífico éproduzido compreendendo uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida comuma primeira especificidade de ligação em uma braço e um par de cadeiapesada-cadeia leve da imunoglobulina híbrido (fornecendo uma segundaespecificidade de ligação) no outro braço. Uma tal estrutura assimétrica podefacilitar a separação do composto biespecífico desejado de combinações decadeia de imunoglobulina não desejadas (um tal método está descrito na WO94/04690). Para mais detalhes da geração de anticorpos biespecíficos ver, porexemplo, Suresh et ai., Methods in Enzymology 121,210 (1986).
Em um outro método, a interface entre um par de moléculas deanticorpo pode ser engendrada para maximizar a porcentagem deheterodímeros que são recuperados a partir da cultura de célula recombinantede modo a formar uma população de moléculas de anticorpo biespecíficas.Tipicamente, uma tal interface compreendendo pelo menos uma parte dodomínio CH3 de uma região constante de anticorpo. Normalmente em um talmétodo, um ou mais resíduos de aminoácido com cadeias laterais menores dainterface das primeiras moléculas de anticorpo são substituídas com resíduosde aminoácido com cadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano).
As "cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao(s)resíduo(s) de aminoácido de cadeia lateral grande são criadas na interface dasegunda molécula de anticorpo pela substituição de resíduos de cadeia lateralde aminoácido grande com os menores (tal como alanina ou treonina). Istopode fornecer um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímeroem relação a outros produtos finais não desejados tais como homodímeros.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presenteinvenção podem ser preparadas pela conjugação das especificidades deligação constituinte, por exemplo, as especificidades de constituinte ligaçãoanti-FcR e anti-CD38, usando métodos conhecido na técnica. Por exemplo,cada especificidade de ligação da molécula biespecífica e multiespecíficapode ser gerada separadamente e depois conjugadas entre si. Quando asespecificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade deagentes de ligação ou reticulação pode ser usada para a conjugação covalente.
Os exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico)(DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e 4-(N-maleimidometil)cicloexano-l-carboxilato desulfossuccinimidila (sulfo-SMCC), ver por exemplo Karpovsky et al., J. Exp.Med. 160, 1686 (1984), Liu, Μ. Α. et al, PNAS USA 82, 8648 (1985). Emum outro exemplo, Brennan et al., Science 229, 81 (1985) descreve umprocedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados paragerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença doagente complexante de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinaise prevenir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab'gerados podem ser depois convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB).Um dos derivados Fab'-TNB podem ser depois reconvertidos ao Fab'-tiolpela redução com mercaptoetilamina e misturado com uma quantidadeequimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar um anticorpobiespecífico. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992) descreve aprodução de uma molécula de anticorpo F(ab')2 biespecífica totalmentehumanizada, de acordo com uma técnica relacionada. Outros métodosincluem aqueles descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132(1985)) e Glennie et al, J. Immunol. 139, 2367-2375 (1987). Os exemplos deagentes de conjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis da PierceChemicals Co. (Rockford, IL).
Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estespodem ser conjugados por intermédio da ligação de sulfidrila das regiões dedobradiça do terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma forma derealização, a região de dobradiça é modificada para conter um número ímparde resíduos de sulfidrila, por exemplo um, antes da conjugação.
Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podemser codificadas no mesmo vetor e expressadas e montadas na mesma célulahospedeira. Este método é particular útil onde a molécula biespecífica emultiespecífica é uma proteína de fusão de mAb χ mAb, mAb χ Fab, Fab χF(ab')2 ou ligando χ Fab. Uma molécula biespecífica e multiespecífica dapresente invenção, por exemplo, uma molécula biespecífica pode ser umamolécula de cadeia única, tal como um anticorpo de cadeia única biespecífica,uma molécula de cadeia única biespecífica que compreende um anticorpo decadeia única e uma ligação determinante ou uma molécula de cadeia únicabiespecífica que compreende dois determinantes de ligação. As moléculasbiespecíficas e multiespecíficas também podem ser moléculas de cadeia únicaou podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Osmétodos para preparar moléculas bi- e multiespecíficas são descritas porexemplo na US 5.260.203, US 5.455.030, US 4.881.175, US 5.132.405, US5.091.513, US 5.476.786, US 5.013.653, US 5.258.498 e US 5.482.858.
Várias técnicas para fabricar e isolar fragmentos de anticorpobiespecíficos diretamente da cultura de célula recombinante também foramdescritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usandozípers de leucina (ver por exemplo Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547-1553 (1992)). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun podemser ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes pela fusão de gene eos homodímeros de anticorpo resultantes reduzidos na região de dobradiçapara formar monômeros que podem ser re-oxidados para formar osheterodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descrita porHollinger et ai, PNAS USA 90, 6444-6448 (1993) também tem fornecido ummecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticorpo biespecíficos.Uma outra estratégia para fabricar fragmentos de anticorpo biespecíficos pelouso de dímeros de Fv (sFv) de cadeia única também foi relatada. Ver porexemplo Gruber etal, J. Immunol. 152, 5368 (1994).
Além disso, os anticorpos biespecíficos podem ser formadoscomo "diacorpos" (Holliger et al., PNAS USA, 90, 6444-6448 (1993)) ou"Janusins" (Traunecker et al., EMBO J 10, 3655-3659 (1991) e Traunecker etal., Int J Câncer Supl 7, 51-52 (1992)). Os anticorpos biespecíficos, peladefinição, não existem na forma de fragmentos tendo um único sítio deligação (por exemplo, fragmento Fab, Fab' e Fvs, que também são fornecidospela presente invenção).A ligação das moléculas biespecíficas e multiespecíficas a seusalvos específicos pode ser confirmada pelo ensaio imunossorvente ligado àenzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), análise de FACS, umbioensaio (por exemplo, inibição do crescimento) ou um Ensaio de WesternBlot. Cada um destes ensaios no geral detecta a presença de complexos deproteína-anticorpo de interesse particular pela utilização de um reagenterotulado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo deinteresse. Por exemplo, os complexos de FcR-anticorpo podem ser detectadousando por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligados aenzima que reconheçam e especificamente se liguem aos complexos deanticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados usandoqualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, oanticorpo pode ser radioativamente rotulado e usado em um radioimunoensaio(RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The EndocrineSociety, Março, 1986). O isótopo radioativo pode ser detectado por meios taiscomo o uso de um contador γ ou um contador de cintilação ou pelaautorradiografia.
Como estabelecido mais no princípio, os anticorpos interagemcom antígenos alvo primariamente através de resíduos de aminoácido que sãolocalizados nas seis regiões determinadoras de complementaridade de cadeiapesada e leve (CDRs). A presente invenção fornece anticorpos tendo regiõesde CDR idênticas a ou de outro modo estabelecido derivadas das regiões deCDR de -003 ou -005 ou -024. Tais anticorpos podem ser gerados pelaconstrução dos vetores de expressão que incluem seqüências de CDR de -003ou -005 ou -024 enxertados nas seqüências de estrutura de um anticorpodiferente com propriedades diferentes.
Tais seqüências de estrutura podem ser obtidas a partir debases de dados de DNA públicas que incluem as seqüências de gene deanticorpo da linha germinativa. Estas seqüências da linha germinativadiferirão das seqüências de gene de anticorpo maduras porque elas nãoincluirão completamente genes variáveis montados, que são formados pelaunião de V(D)J durante a maturação de célula B. as seqüências de gene dalinha germinativa também diferirão das seqüências de um anticorpo derepertório secundário de afinidade alta que contém mutações por todo o genevariável mas tipicamente agrupado nas CDRs. Por exemplo, as mutaçõessomáticas são relativamente infreqüentes na porção de terminal amino daregião de estrutura 1 e na porção de terminal carbóxi da região de estrutura 4.
Por esta razão, não é necessário obter a seqüência de DNA inteira de umanticorpo particular de modo a recriar um anticorpo recombinante inteirotendo propriedades de ligação similares àquelas do anticorpo original (ver aWO 99/45962). A seqüência de cadeia pesada e leve parcial que vai dasregiões de CDR é tipicamente suficiente para este propósito. A seqüênciaparcial é usada para determinar quais segmentos de gene variáveis e de uniãoda linha germinativa contribuíram para os genes variáveis de anticorporecombinados. A seqüência da linha germinativa é depois usada parapreencher em porções das regiões variáveis perdidas. As seqüências líder decadeia pesada e leve são clivadas durante a maturação da proteína e nãocontribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar seqüênciasperdidas, seqüências de cDNA clonadas podem ser combinadas comoligonucleotídeos sintéticos pela ligação ou amplificação de PCR.
Alternativamente, a região variável inteira pode ser sintetizada como umconjunto de oligonucleotídeos curtos, de sobreposição e combinada pelaamplificação de PCR para criar um clone de região variável totalmentesintético. Este processo tem certas vantagens tais como a eliminação ouinclusão ou sítios de restrição particular ou otimização de códons particulares.
As seqüências de nucleotídeo de transcritos de cadeia pesada eleve de hibridomas são usados para planejar um conjunto de sobreposição deoligonucleotídeos sintéticos para criar seqüências V sintéticas comaminoácido idênticos que codificam as capacidades como as seqüênciasnaturais. As seqüências de cadeia pesada e capa sintéticas podem diferir dasseqüências naturais em três modos: fileiras de bases de nucleotídeo repetidassão interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleotídeo e amplificaçãode PCR; ótimos sítios de início de tradução são incorporados de acordo comas regras de Kozak (Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991); e ossítios HindIII são engendrados a montante dos sítios de início de tradução.
Tanto para a região variável de cadeia pesada quanto leve, asseqüências de filamento codificadoras e não codificadoras otimizadascorrespondentes são quebradas abaixo dos nucleotídeos 30 a 50aproximadamente no ponto intermediário do oligonucleotídeo codificadorcorrespondente. Assim, para cada cadeia, os oligonucleotídeos podem sermontados em conjuntos de filamento duplo sobrepostos que transpõemsegmentos de 150 a 400 nucleotídeos. Os agrupamentos são depois usadoscomo padrões para produzir produtos de amplificação de PCR de 150 a 400nucleotídeos. Tipicamente, um único oligonucleotídeo da região variáveldesignada será decomposto em duas reuniões que são separadamenteamplificados para gerar dois produtos de PCR de sobreposição. Estesprodutos de sobreposição são depois combinados pela amplificação pela PCRpara formar a região variávea. Também pode ser desejável incluir umfragmento de sobreposição da região constante de cadeia pesada ou leve(incluindo o sítio Bbsl da cadeia leve capa ou o sítio AgeI da cadeia pesadagama) na amplificação pela PCR para gerar fragmentos que possam serfacilmente clonada nas construções de vetor de expressão.
As regiões variáveis de cadeia pesada e leve reconstruída sãodepois combinadas com as seqüências promotora, líder, de início de tradução,de região constante, não traduzida 3', de poliadenilação e de término detranscrição, clonadas para formar construções de vetor de expressão. Asconstruções de pesada e expressão de cadeia leve podem ser combinadas emum único vetor, co-transfectadas, transfectadas em série ou transfectadasseparadamente em células hospedeiras que são depois fundidas para formaruma célula hospedeira que expresse ambas as cadeias.
Um procedimento similar pode ser seguido para enxertarnovovas especificidades de antígeno em um anticorpo maduro existente.Tipicamente, um anticorpo aceitador é escolhido que origina do mesmo geneda linha germinativa variável como o doador de CDR-anticorpo, mas outrosanticorpos aceitadores também podem ser escolhidos. Uma ou mais CDRs doanticorpo doador são depois transferidos usando as técnicas descritas acima.
Em uma forma de realização da presente invenção, ascaracterísticas estruturais de -003 e -005 e -024 são usadas para criaranticorpos anti-CD38 estruturalmente relacionados, por exemplo anticorposanti-CD38 humano, que retém pelo menos uma propriedade funcional de -003e -005 e -024, a saber que se liga ao CD38. Mais especificamente, uma oumais regiões CDR de -003 ou -005 e -024 podem ser combinadosrecombinantemente com regiões de estrutura humana conhecidas e CDRspara criar anticorpos anti-CD38 adicionais, recombinantemente engendrados,humanos da presente invenção.
Os plasmídeos exemplares para o uso na construção dosvetores de expressão para IgGK humana são descritos abaixo. Os plasmídeosforam construídos de modo que as seqüências de cDNA de cadeia V capapesada e V capa leve amplificadas pela PCR podem ser usadas parareconstruir os minigenes de cadeia pesada e leve completa. Estes plasmídeospodem ser usados para expressar completamente anticorpos IgGl.K ouIgG4.k humanos. Os plasmídeos similares podem ser construídos para aexpressão de outros isótipos de cadeia pesada ou para a expressão deanticorpos que compreendem cadeias leves lambda.
Os CD38BPs da presente invenção, tais como anticorpos anti-CD38 humanos da presente invenção, podem ser isolados e caracterizados devários modos diferentes. Por exemplo, hibridomas selecionados podem sercultivados em frascos adequados para a purificação de anticorpo monoclonal.Os sobrenadantes podem ser depois filtrados e concentrados antes dacromatografia de afinidade com proteína A-sepharose (para anticorpos deisótipo IgGl) (Pharmacia, Piscataway, NJ) ou sepharose ou proteína G-sepharose revestida com IgG anti-humano no caso de anticorpos de isótipoIgG3. A IgG eluída pode ser checada pela eletroforese em gel e cromatografialíquida de alto desempenho para garantir a pureza. A solução tampão pode sertrocada em PBS e a concentração pode ser determinada pela OD2so usandocoeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem seraliquotados e armazenados a -80°C.
Para determinar se os CD38BPs selecionados, tais como osanticorpos anti-CD38 monoclonais humanos, ligam-se a epítopos únicos, amutagênese direcionada ao sítio ou direcionada ao sítio ao sítio múltiplopodem ser usadas.
Para determinar o isótipo de anticorpos purificados, ELISAsde isótipo podem ser realizadas. Os reservatórios de placas de microtítulopodem ser revestidos com 10 μ§/πι1 de Ig anti-humano durante a noite a 4°C.Depois de bloquear com 5 % de BSA (albumina sérica bovina), as placas sãoreagidas com 10 μg/ml de anticorpos monoclonais ou controles de isótipopurificados, na temperatura ambiente por duas horas. Os reservatórios podemser depois reagidos com IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4, IgE, IgAl, IgA2humanas ou sondas conjugadas à fosfatase alcalina específica de IgMhumana. Depois da lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato depNPP (1 mg/ml) e analisada pela OD a 405 nm.
De modo a demonstrar a presença de anticorpos anti-CD38 nossoros de camundongos imunizados ou a ligação de CD38BPs (incluindoanticorpos anti-CD38) às células vivas que expressam o CD38, a citometriade fluxo pode ser usada. Em resumo, linhagens de célula que expressemCD38 (cultivadas sob condições de crescimento padrão) são misturadas comvárias concentrações de CD38BP em PBS contendo 0,1 % de BSA e 0,02 %de azida de sódio e incubadas a 4°C por 30 minutos. Depois da lavagem, ascélulas são reagidas com anticorpo IgG anti-humano rotulado comfluoresceína sob as mesmas condições como o tingimento de anticorpoprimário. As amostras podem ser analisadas pela citometria de fluxo com umcitômetro de fluxo (por exemplo, Becton Dickinson FACS instrument) usandopropriedades de dispersão de luz e lateral para ativar células únicas, vivas.
Um ensaio alternativo usando a microscopia por fluorescência pode ser usado(além do ou ao invés do) ensaio de citometria de fluxo. As células podem sertingidos exatamente como descrito acima e examinado pela microscopia defluorescência. Este método possibilita a visualização de células individuais,mas pode ter sensibilidade diminuída dependendo da densidade do antígeno.
Os CD38BPs, tais como as IgGs anti-CD38 humanas, podemser ainda testadas quanto a reatividade com antígeno de CD38 pelo Westernblotting. Em resumo, os extratos de célula a partir de células que expressamCD38 podem ser preparados e submetidos à eletroforese em gel em dodecilsulfato de sódio (SDS) poliacrilamida. Depois da eletroforese, os antígenosseparados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueadoscom 20 % de leite desnatado e sondados com os CD38BPs a serem testados.
A ligação de IgG humana pode ser detectada usando fosfatase alcalina de IgGanti-humana e desenvolvida com tabletes de substrato BCIP/NBT (SigmaChem. Co., St. Louis, MO), mas agentes de detecção direcionados a outrasporções específicas do CD38BP também podem ser usados.
Além de ligar especificamente ao CD38, CD38BPs (incluindoanticorpos anti-CD38 humanos) podem ser testados quanto a sua capacidadepara inibir várias atividades de células que expressam CD38, tais como masnão restritas à produção de insulina, liberação de Ca , produção de citocina,indução de lise, diferenciação e proliferação.
Em uma forma de realização, a presente invenção forneceanimais não humanos transgênicos e transcromossômicos, tais comocamundongos transgênicos ou transcromossômicos, que são capazes deexpressar anticorpos humanos que especificamente se ligam a CD38. Em umaforma de realização particular, a presente invenção fornece um camundongotransgênico ou transcromossômico tendo um genoma que compreende umtransgene de cadeia pesada humana, tal que o camundongo produz anticorposanti-CD38 humanos quando imunizados com células que expressam CD38. Otransgene de cadeia pesada humana pode ser integrado no DNAcromossômico do camundongo, como é o caso para o camundongotransgênico, por exemplo, HuMAbs, como descrito em detalhes aqui.
Alternativamente, o transgene de cadeia pesada humana pode ser mantidoextracromossomicamente, como é o caso para os camundongostranscromossômicos (por exemplo, KM) como descrito na WO 02/43478.Tais animais transgênicos e transcromossômicos são capazes de produzirisótipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos para CD38 (porexemplo, IgG, IgA e/ou IgE) submetendo-se à recombinação V-D-JN-J ecomutação de isótopo. O planejamento de um animal não humano transgênicoou transcromossômico que responde à estimulação de antígeno estranho comum repertório de anticorpo heterólogo, requer que os transgenes deimunoglobulina heterólogos contidos dentro da função de animal transgênicocorretamente por todo o caminho do desenvolvimento da célula B. Isto inclui,por exemplo, a comutação de isótopo do transgene de cadeia pesadaheterólogo. Conseqüentemente, os transgenes são construídos de modo que acomutação de isótopo possa ser induzida e uma ou mais das seguintescaracterísticas de genes de anticorpo: (1) expressão específica de alto nível etipo de célula, (2) rearranjo de gene funcional, (3) ativação de e resposta àexclusão alélica, (4) expressão de um repertório primário suficiente, (5)transdução de sinal, (6) hipermutação somática e (7) dominação do local deanticorpo de transgene durante a resposta imune.
Nem todos os critérios precedentes precisam ser atingidos. Porexemplo, naquelas formas de realização em que os locais de imunoglobulinaendógenos do animal transgênico são funcionalmente rompidos, o transgenenão precisa ativar a exclusão alélica. Além disso, naquelas formas derealização em que o transgene que compreende um gene da imunoglobulinade cadeia pesada e/ou leve funcionalmente rearranjada, o segundo critério derearranjo de gene funcional é desnecessário, pelo menos para aqueletransgene que já está rearranjado. Para os fundamentos sobre imunologiamolecular, ver, Fundamental Immunology, 2a edição (1989), Paul William E.,ed. Raven Press, N.Y.
Em certas formas de realização, os animais transgênicos outranscromossômicos não humanos usados para gerar os anticorposmonoclonais humanos da presente invenção contêm transgenes deimunoglobulina de cadeia pesada e leve heterólogos rearranjados, nãorearranjados ou uma combinação de rearranjado e não rearranjado na linhagerminativa do animal transgênico. Cada um dos transgenes de cadeia pesadacompreendendo pelo menos um gene CH. Além disso, o transgene de cadeiapesada pode conter seqüências comutadoras de isótipo funcional, que sãocapazes de suportar a comutação de isótopo de um transgene heterólogo quecodifica genes CH múltiplos nas células B do animal transgênico. Taisseqüências comutadoras podem ser aquelas que ocorrem naturalmente nolocal da imunoglobulina da linha germinativa da espécie que serve como afonte dos genes CH do transgene ou tais seqüência comutadoras podem serderivadas daquelas que ocorrem na espécie que deva receber a construção detransgene (o animal transgênico). Por exemplo, uma construção de transgenehumano que é usada para produzir um camundongo transgênico pode produziruma freqüência mais alta de eventos de comutação de isótopo se estasseqüências comutadoras incorporam similar àquelas que ocorremnaturalmente no local de cadeia pesada de camundongo, comopresumivelmente as seqüências comutadoras de camundongo são otimizadaspara funcionar com o sistema de enzima da recombinase de comutação emcamundongo, ao passo que as seqüências comutadoras humanas não são. Asseqüência comutadoras podem ser isoladas e clonadas pelos métodos declonagem convencionais ou podem ser sintetizados de novo a partir deoligonucleotídeos sintéticos de sobreposição planejados vom base nainformação de seqüência publicada que dizem respeito às seqüências daregião comutadora de imunoglobulina (Mills et al., Nucl. Acids Res. 15,7305-7316 (1991) Sideras et al., Intl. Immunol. 1, 631-642 (1989)). Para cadaum dos animais transgênicos precedentes, os transgenes de imunoglobulina decadeia pesada e leve heterólogos funcionalmente rearranjados são encontradosem uma fração significante das células B do animal transgênico (pelo menos 10%).
Os transgenes usados para gerar os animais transgênicos nãohumanos da presente invenção incluem um transgene de cadeia pesada quecompreende DNA que codifica pelo menos um segmento de gene variável,um segmento de diversidade de gene, um segmento de união de gene e pelomenos um segmento de gene da região constante. O transgene de cadeia leveda imunoglobulina que compreende DNA que codifica pelo menos umsegmento de gene variável, um segmento de união de gene e pelo menos umsegmento de gene da região constante. Os segmentos de gene que codificamos segmentos de gene da cadeia leve e pesada são heterólogos ao animaltransgênico em que eles são derivados de ou correspondem ao DNA quecodifica segmentos de gene de cadeia pesada e leve da imunoglobulina deuma espécie que não consiste do animal não humano transgênico. Em umaforma de realização da presente invenção, o transgene é construído tal que ossegmentos de gene individuais não são rearranjados, isto é, não rearranjado demodo a codificar uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina funcional.Tais transgenes não rearranjados suportam a recombinação dos segmentos degene V, D e J (rearranjo funcional) e podem suportar a incorporação de todaou de uma porção de um segmento de gene da região D na cadeia pesada daimunoglobulina rearranjada resultante dentro do animal transgênico quandoexposto ao antígeno de CD38.
Em uma forma de realização alternativa, os transgenescompreendem um "mini-local" não rearranjado. Tais transgenes tipicamentecompreendem uma porção substancial dos segmentos C, D e J assim comoum subconjunto dos segmentos de gene V. Em tais construções de transgene,as várias seqüências reguladoras, por exemplo, promotores, realçadores,regiões de comutação de classe, as seqüências doadoras de junção eaceitadoras de junção para o processamento de RNA, os sinais derecombinação e outros, compreendem seqüências correspondentes derivadasdo DNA heterólogo. Tais seqüências reguladoras podem ser incorporadas notransgene da mesma ou de uma espécie relacionada do animal não humanousado na presente invenção. Por exemplo, segmentos de gene daimunoglobulina humana podem ser combinados em um transgene com umaseqüência realçadora de imunoglobulina de roedor para o uso em umcamundongo transgênico. Alternativamente, as seqüências reguladorassintéticas podem ser incorporadas no transgene, em que tais seqüênciasreguladoras sintéticas não são homólogas a uma seqüência de DNA funcionalque é conhecida por ocorrer naturalmente nos genomas de mamíferos. Asseqüências reguladoras sintéticas são planejadas de acordo com regras deconsenso, tais como, por exemplo, aquelas que especificam as seqüênciaspermissíveis de um sítio aceitador de junção ou um promotor/motivorealçador. Por exemplo, um minilocal que compreenda uma porção do localda imunoglobulina genâmica tendo pelo menos uma deleção interna (isto é,não em um terminal da porção) de uma porção de DNA não essencial (porexemplo, seqüência interventora; intron ou porção destes) quando comparadacom o local de Ig da linha germinativa que ocorre naturalmente.
Os exemplos de animais não humanos transgênicos etranscromossômicos, tais como camundongos, exibirão a produção daimunoglobulina com um repertório significante, de modo idealmentesubstancial similar a esta de um ser humano depois de ajustar quanto aovolume.
O repertório idealmente aproximar-se-á daquele mostrado emum ser humano quando ajustado quanto ao volume, usualmente com umadiversidade de pelo menos cerca de 10 % tão grande, tal como 25 a 50 % oumais.
No geral, pelo menos cerca de mil imunoglobulinas diferentes(idealmente IgG), tal como IO4 a IO6 ou mais, serão produzidas, dependendodo número de regiões V, J e D diferentes introduzidas no genoma decamundongo e direcionados pela diversidade adicional gerada pelosrearranjos de segmento de gene V(-D-)J e adições de nucleotídeo aleatóriasnas regiões de junção. Tipicamente, as imunoglobulinas exibirão umaafinidade (Kd) para antígenos pré-selecionados abaixo de 10" M, tal comoabaixo de IO"9 Μ, IO"10 M ou IO"11 M ou ainda mais baixo. O animal nãohumano transgênico e transcromossômico, por exemplo, camundongos, comodescritos acima, podem ser imunizados, por exemplo, com células queexpressam CD38. Alternativamente, os animais transgênicos podem serimunizados com DNA que codifica CD38 humano. Os animais depoisproduzirão células B que passam pela comutação de classe por intermédio darecombinação de comutação (comutação eis) e expressam imunoglobulinasreativas com CD38. As imunoglobulinas serão anticorpos humanos (tambémaludidos como "anticorpos da seqüência humana"), em que os polipeptídeosde cadeia pesada e leve são codificados pelas seqüências de transgenehumanas, que podem incluir seqüências derivadas pela mutação somática ejuntas recombinatoriais da região V, assim como seqüências codificadas pelalinha germinativa; estes anticorpos humanos podem ser aludidos como sendosubstancialmente idênticos a uma seqüência de polipeptídeo codificada porum segmento de gene Vl e Jl ou Vh, Dh e Jh humanos, embora outras -seqüências que não da linha germinativa possam estar presentes como umresultado da mutação somática e juntas de recombinação V-J e V-D-Jdiferenciais. As regiões variáveis de cada cadeia de anticorpo são tipicamentepelo menos 80 por cento similares aos segmentos de gene V e J da linhagerminativa humana, e, no caso de cadeias pesadas, segmentos de gene V, D eJ da linha germinativa humana; freqüentemente pelo menos 85 por centosimilar às seqüências da linha germinativa humana presentes no transgene;freqüentemente 90 ou 95 por cento ou mais similares às seqüências da linhagerminativa humana presentes no transgene. Entretanto, visto que asseqüências que não da linha germinativa são introduzidas pela mutaçãosomática e junção VJ e VDJ, os anticorpos da seqüência humanafreqüentemente terá algumas seqüências da região variável que não sãocodificadas pelos segmentos de gene V, D ou J humanos como encontradono(s) transgene(s) humano(s) na linha germinativa dos camundongos.Tipicamente, tais seqüências que não da linha germinativa (ou posições denucleotídeo individuais) formarão grupos nas ou próximos das CDRs ou nas.regiões onde as mutações somáticas são conhecidos por formar grupo.
A presente invenção também fornece células B derivadas deanimais transgênicos ou transcromossômicos não humanos como aquidescritos. As células B podem ser usadas para gerar hibridomas queexpressem anticorpos monoclonais humanos que se ligam com alta afinidade(por exemplo com uma constante de equilíbrio de dissociação (Kd) inferior a10'8 M) ao CD38 humano. Assim, em uma forma de realização, a presenteinvenção fornece um hibridoma que produz um anticorpo humano tendo umaafinidade (Kd) abaixo de IO"8 M, tal como abaixo de IO"9 Μ, IO"10 M ou IO'11M ou mesmo mais baixo quando determinada pela análise de scatchard decélulas que expressam CD38 usando um anticorpo monoclonal radio-ativamente rotulado ou pela determinação da concentração de ligação semi-máxima usando a análise FACS ou pela análise usando a ressonância deplasma de superfície como medido em um instrumento BIAcore.
A presente invenção fornece um anticorpo anti-CD38 quecompreende uma cadeia leve da seqüência humana composta de (1) umaregião variável de cadeia leve tendo uma seqüência de polipeptídeo que ésubstancialmente idêntica a uma seqüência de polipeptídeo codificada por umsegmento de gene Vl humano e um segmento Jl humano e (2) uma regiãoconstante de cadeia leve codificada por um segmento de gene Cl humano; euma cadeia pesada da seqüência humana composta de (1) uma região variávelde cadeia pesada tendo uma seqüência de polipeptídeo que é substancialmenteidêntica a uma seqüência de polipeptídeo codificada por um segmento degene Vh humano, uma região D e um segmento Jh humano e (2) uma regiãoconstante codificada por um segmento de gene Ch humano. Deve sermencionado que os genes D humanos podem ser substancialmente alteradospelos eventos de mutação de recombinação e somática tal que a seqüência dalinha germinativa humana original não possa ser facilmente reconhecida.
O desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos dealta afinidade contra CD38 pode ser facilitado por um método para expandir orepertório de segmentos da região variável de gene humano em um animalnão humano transgênico tendo um genoma que compreende um transgene deimunoglobulina humana integrado, o dito método compreendendo introduzirno genoma um transgene de gene V que compreende segmentos de gene daregião V que não estão presentes no dito transgene da imunoglobulinahumana integrado. Freqüentemente, o transgene da região V é umcromossoma artificial de levedura (YAC) que compreende uma porção deuma série de segmento de gene Vh ou Vl (Vk) de ser humano, como podenaturalmente ocorrer em um genoma humano ou como pode ser unido entre siseparadamente pelos métodos recombinantes, que podem incluir segmentosde gene V fora de ordem ou omitidos. Freqüentemente pelo menos cinco oumais segmentos de gene V funcionais são contidos no YAC. Nesta variação, épossível fabricar um animal transgênico produzido pelo método da expansãode repertório V, em que o animal expressa uma cadeia de imunoglobulina quecompreende uma seqüência da região variável codificada por um segmentosde gene da região V presente no transgene da região V e uma região Ccodificada no transgene Ig humano. Por meio do método da expansão dorepertório V, os animais transgênicos tendo pelo menos 5 genes V distintospodem ser gerados; como o pode os animais contendo pelo menos de cerca de24 genes V ou mais. Alguns segmentos de gene V podem ser não funcionais(por exemplo, pseudogenes e outros); estes segmentos podem ser retidos oupodem ser seletivamente deletados pelos métodos recombinantes disponíveisao técnico habilitado, se desejado.
Uma vez que a linha germinativa de camundongo foiengendrada para conter um YAC funcional tendo um repertório de segmentoV expandido, substancialmente não presentes no transgene de Ig humanocontendo os segmentos de gene J e C, o traço pode ser propagado e cruzadoem outros fundamentos genéticos, incluindo fundamentos onde o YACfuncional tendo um repertório de segmento V expandido é cruzado em umalinha germinativa de animal não humano tendo um transgene de Ig humanodiferente. YACs funcionais múltiplos tendo um repertório de segmento Vexpandido pode ser cruzado em uma linha germinativa para funcionar comum transgene de Ig humano (ou transgenes de Ig humanos múltiplos). Emboraaqui aludidos como transgenes YAC, tais transgenes quando integrados nogenoma podem substancialmente carecer de seqüências de levedura, taiscomo as seqüências requeridas para a replicação autônoma em levedura; taisseqüências podem ser opcionalmente removidas pelo engendramento genético(por exemplo, digestão de restrição e eletroforese em gel de campo pulsadoou outro método adequado) depois da replicação em levedura não é maisnecessário (isto é, antes da introdução em uma célula ES de camundongo ouprozigoto de camundongo). Os métodos de propagar o traço da expressão daseqüência de imunoglobulina humana, incluem crzar um animal transgênicotendo o(s) transgene(s) de Ig humana e opcionalmente também tendo umYAC funcional tendo um repertório de segmento V expandido. Ambos ossegmentos de gene Vh e Vl podem estar presentes no YAC. O animaltransgênico pode ser cruzado em qualquer fundamento desejado pelopraticante, incluindo fundamentos que abrigam outros transgenes humanos,incluindo transgenes de Ig humana e/ou transgenes que codificam outrasproteínas de linfócito humanas. A presente invenção também fornece umaimunoglobulina da seqüência humana de alta afinidade produzida por umcamundongo transgênico tendo um transgene YAC de repertório da região Vexpandida. Embora o precedente descreva uma forma de realização específicado animal transgênico da presente invenção, outras formas de realização sãoconsideradas que foram classificadas em três categorias:
I. Animais transgênicos contendo um transgene deimunoglobulina de cadeia pesada não rearranjada e leve rearranjada;
II. Animais transgênicos contendo um transgene deimunoglobulina de cadeia pesada não rearranjada e leve não rearranjada; e
III. Animal transgênico contendo um transgene deimunoglobulina de cadeia pesada rearranjada e leve não rearranjada.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umacomposição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um CD38BP da presente invenção. As composições farmacêuticaspodem ser formuladas com carreadores farmaceuticamente aceitáveis oudiluentes assim como qualquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos deacordo com técnicas convencionais tais como aquelas divulgadas emRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edição, Gennaro, Ed.,Maek Publishing Co., Easton, PA, 1995.
Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentesassim como qualquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos devem seradequados para o composto escolhido da presente invenção e o modoescolhido de administração. A adequabilidade para carreadores e outroscomponentes de composições farmacêuticas é determinada com base na faltade impacto negativo significante sobre as propriedades biológicas desejadasdo composto escolhido ou composição farmacêutica da presente invenção(por exemplo, menos do que um impacto substancial (10 % ou menos deinibição relativa, 5 % ou menos de inibição relativa, etc.) na ligação deantígeno.
Uma composição farmacêutica da presente invenção tambémpode incluir diluentes, enchedores, sais, tampões, detergentes (por exemplo,um detergente não iônico, tal como Tween80), estabilizadores, estabilizadores(por exemplo, açúcares ou aminoácidos isentos de proteína), conservantes,fixativos de tecido, solubilizadores e/ou outros materiais adequados para ainclusão em uma composição farmacêutica.
Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nascomposições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modoa obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para se obter aresposta terapêutica desejada quanto a um paciente, composição e modo deadministração particulares, sem ser tóxico para o paciente. O nível dedosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatoresfarmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares dapresente invenção utilizada ou do éster, sal ou amida destes, da via deadministração, do tempo de administração, da taxa de excreção do compostoparticular que é utilizado, da duração do tratamento, outros medicamentos,compostos e/ou materiais usados em combinação com as composiçõesparticulares utilizadas, da idade, sexo, peso, condição, saúde geral e históricomédico anterior do paciente que é tratado e outros fatores bem conhecidos nasartes médicas.
A composição farmacêutica pode ser administrada porqualquer via ou modo adequados. As vias adequadas de administrar umcomposto da presente invenção in vivo e in vitro são bem conhecidos natécnica e podem ser selecionados por aqueles de habilidade comum natécnica.
Os compostos da presente invenção podem ser administradospor intermédio de qualquer via adequada, tal como uma via oral, nasal,inalável, tópica (incluindo bucal, transdérmica e sublingual), retal, vaginale/ou parenteral.
Em uma forma de realização, uma composição farmacêuticada presente invenção é administrada oralmente, por exemplo, com umdiluente inerte ou um carreador comestível assimilável. O ingrediente ativopode ser incluído em uma cápsula de gelatina de casca dura ou mole,comprimido em tabletes ou incorporado diretamente na dieta do paciente. Ascomposições farmacêuticas da presente invenção que são adequadas para aadministração oral incluem tabletes digeríveis, tabletes bucais, pastilhas,cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, óstias e outros contendo carreadorestais como são conhecidos na técnica como sendo apropriados. Paraadministrar um composto da presente invenção pela administração oral, podeser necessário revestir o composto com ou co-administrar o composto com,um material para prevenir a sua inativação.
Em uma forma de realização, uma composição farmacêuticada presente invenção é nasalmente administrada. As composiçõesfarmacêuticas da presente invenção que são adequadas para a administraçãonasal são conhecidas na técnica e tipicamente incluem pulverizações, gotasnasais e inalantes.Em uma forma de realização, uma composição farmacêuticada presente invenção é administrada topicamente. As composiçõesfarmacêuticas da presente invenção que são adequadas para a administraçãotópica ou transdérmica incluem pós, pulverizações, ungüentos, pastas, cremes,loções, géis, soluções, emplastros e inalantes contendo carreadores tais comosão conhecidos na técnica como sendo apropriados.
Em uma forma de realização, uma composição farmacêuticada presente invenção é retalmente administrada. As composiçõesfarmacêuticas da presente invenção que são adequadas para a administraçãoretal são conhecidas na técnica e incluem géis, pastas, formulações depulverização, supositórios.
Em uma forma de realização, uma composição farmacêuticada presente invenção é administrada vaginalmente. As composiçõesfarmacêuticas da presente invenção que são adequadas para a administraçãovaginal incluem pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ouformulações de pulverização contendo carreadores tais como são conhecidosna técnica como sendo apropriados.
Em uma forma de realização, uma composição farmacêuticada presente invenção é administrada parenteralmente.
As frases "administração parenteral" e "parenteralmenteadministrado" como aqui usadas significam modos de administração outrosque não a administração enteral e tópica, usualmente por injeção e inclueminjeção e infusão epidérmica, intravenosa, intramuscular, intraarterial,intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica,intraperitoneal, intratendinoso, transtraqueal, subcutânea, subcuticular,intraarticular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinhal, intracraniana,intratoráxica, epidural e intraesternal.
Em uma forma de realização a composição farmacêutica éadministrada pela injeção ou infusão intravenosa ou subcutânea.Em uma forma de realização os compostos da presenteinvenção são administrados em forma cristalina pela injeção subcutânea, cf.Yang et al., PNAS USA 100(12), 6934-6939 (2003).
As composições farmacêuticas podem ser administradas comdispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma forma derealização, uma composição farmacêutica da presente invenção pode seradministrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, talcomo os dispositivos divulgados na US 5.399.163, US 5.383.851, US5.312.335, US 5.064.413, US 4.941.880, US 4.790.824 ou US 4.596.556. Osexemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invençãoincluem: a US 4.487.603, que divulga uma bomba de micro-infusãoimplantável para dispensar medicação a uma razão controlada; a US4.486.194, que divulga um dispositivo terapêutico para a administração demedicamentos através da pele; a US 4.447.233, que divulga uma bomba deinfusão de medicação para liberar medicação a uma razão de infusão precisa;a US 4.447.224, que divulga um aparelho de infusão implantável de fluxovariável para a liberação de medicamento contínuo; a US 4.439.196, quedivulga um sistema de liberação de medicamento osmótico tendocompartimentos de câmara múltipla; e a US 4.475.196, que divulga umsistema de liberação de medicamento osmótico. Muitos outros tais implantes,sistemas de liberação e módulos são conhecidos por aqueles habilitados natécnica.
As composições farmacêuticas da presente invenção podemser formuladas para vias particulares de administração, tais como aadministração oral, nasal, tópica (incluindo bucal, transdérmica e sublingual),retal, vaginal e/ou parenteral. As composições farmacêuticas podem serconvenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem serpreparadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica da farmácia. Aquantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um materialcarreador para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo dopaciente que é tratado e do modo particular de administração. A quantidadede ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador paraproduzir uma forma de dosagem única no geral será aquela quantidade dacomposição que produza um efeito terapêutico. No geral, fora dos cem porcento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 % a cerca de 99 % deingrediente ativo, tal como de cerca de 0,1 % a cerca de 70 %, por exemplo decerca de 1 % a cerca de 30 %.
Independente da via de administração selecionada, oscompostos da presente invenção, que podem ser usados na forma de um salfarmaceuticamente aceitável ou em uma forma hidratada adequada e/ou ascomposições farmacêuticas da presente invenção, são formuladas em formasde dosagem farmaceuticamente aceitáveis pelos métodos convencionaisconhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Um "sal farmaceuticamenteaceitável" refere-se a um sal que retenha a atividade biológica desejada docomposto precursor e não comunique nenhum efeito toxicológico indesejado(ver por exemplo Berge, S. M. et ai, J. Pharm. Sei. 66, 1-19 (1977)). Osexemplos de tais sais incluem os sais de adição de ácido e os sais de adição debase. Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidosinorgânicos não tóxicos, tais como os ácidos clorídrico, nítrico, fosfórico,sulfurico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e outros, assim como de ácidosorgânicos não tóxicos tais como ácidos mono- e di-carboxílicos alifáticos,ácidos alcanóicos substituídos por fenila, ácidos hidróxi alcanóicos, ácidosaromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e outros. Os sais deadição de base incluem aqueles derivados de metais alcalinos terrosos, taiscomo sódio, potássio, magnésio, cálcio e outros, assim como de aminasorgânicas não tóxicas, tais como Ν,Ν'-dibenziletilenodiamina, N-metilglicamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina,procaína e outros.Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluemquaisquer e todos solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentesantibacterianos e antifungicos, agentes de isotonicidade, antioxidantes eagentes retardadores de absorção e outros adequados que são fisiologicamentecompatíveis com um composto da presente invenção.
Os exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequadosque podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presenteinvenção incluem água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato,etanol, dextrose, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietilenoglicol e outros) e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tais como óleo deoliva, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão e óleo degergelim, soluções coloidis de carboximetil celulose, goma de tragacanto eésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila e/ou vários tampões.Outros carreadores são bem conhecidos nas técnicas farmacêuticas.
Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluçõesou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporâneade soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentespara as substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Excetona medida em que qualquer meio ou agente convencionais sejamincompatíveis com o composto ativo, o uso destes nas composiçõesfarmacêuticas da presente invenção é considerado.
A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo usode materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanhode partícula requerido no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos.
As composições farmacêuticas da presente invenção tambémpodem compreender antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis por exemplo
(1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridreto decisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e outros;
(2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila,hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiatode propila, alfa-tocoferol e outros; e (3) agentes queladores de metal, taiscomo ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácidotartárico, ácido fosfórico e outros.
As composições farmacêuticas da presente invenção tambémpodem compreender agentes de isotonicidade, tais como açúcares, poliálcooistais como manitol, sorbitol, glicerol ou cloreto de sódio nas composições.
Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluçãosalina e soluções tampão aquosas.
As composições farmacêuticas da presente invenção tambémpodem conter um ou mais adjuvantes apropriados para a via escolhida deadministração tais como conservantes, agentes de umectação, agentes deemulsificação, agentes de dispersão, conservantes ou tampões, que podemrealçar a vida de prateleira ou a eficácia da composição farmacêutica. Oscompostos da presente invenção por exemplo podem ser misturados comlactose, sacarose, pós (por exemplo, pó de amido), ésteres de celulose deácidos alcanóicos, ácidos esteáricos, talco, estearato de magnésio, óxido demagnésio, sais de sódio e cálcio de ácidos fosfórico e sulfurico, acácia,gelatina, alginato de sódio, polivinilpirrolidina e/ou álcool polivinílico. Outrosexemplos de adjuvantes são QS21, GM-CSF, SRL-172, dicloridreto dehistamina, timocartina, Tio-TEPA, composições de monofosforil-lipídeo AJmicobactérias, alúmem, adjuvante de Freund incompleto, montanide ISA,sistema de adjuvante ribi, adjuvante TiterMax, formulações de adjuvantesyntex, complexos estimuladores do sistema imune (ISCOMs), adjuvantegerbu, oligodesoxinucleotídeos CpG, lipopolissacarídeo e ácidopoliinosínico ipolicitidílico.
A prevenção da presença de microorganismos pode sergarantida tanto pelos procedimentos de esterilização quanto pela inclusão devários agentes antibacterianos e antifungicos, por exemplo, parabeno,clorobutanol, fenol, ácido sórbico e outros. Além disso, a absorçãoprolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada pela inclusãode agentes que retardem a absorção tais como monoestearato de alumínio egelatina.
As composições farmacêuticas da presente invenção quecompreendem um composto da presente invenção também podem incluir umsal adequado para este. Qualquer sal adequado, tal como um sal de metalalcalino terroso em qualquer forma adequada (por exemplo, um sal detampão), podem ser usados na estabilização do composto da presenteinvenção. Os sais adequados tipicamente incluem cloreto de sódio, succinatode sódio, sulfato de sódio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, sulfato demagnésio e cloreto de cálcio. Em uma forma de realização, um sal dealumínio é usado para estabilizar um composto da presente invenção em umacomposição farmacêutica da presente invenção, sal de alumínio este quetambém pode servir como um adjuvante quando uma tal composição éadministrada a um paciente.
As composições farmacêuticas de acordo com a presenteinvenção podem estar em uma variedade de formas adequadas. Tais formasincluem, por exemplo, as formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas,tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis),dispersões ou suspensões, emulsões, microemulsões, géis, cremes, grânulos,pós, tabletes, pílulas, pós, lipossomas, dendrímeros e outras nanopartículas(ver por exemplo Baek et ai., Methods Enzymol. 362, 240-9 (2003),Nigavekar et al., Pharm Res. 21(3), 476-83 (2004), micropartículas esupositórios.
A forma ótima depende do modo escolhido de administração,da natureza da composição e da aplicação do produto terapêutico. Asformulações podem incluir, por exemplo, pós, pastas, ungüentos, gelatinas,ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeo (catiônico ou aniônico),conjugados de DNA, pastas de absorção anidra, emulsões de óleo em água eágua em óleo, emulsões de carbocera (polietileno glicóis de vários pesosmolecular), géis semi-sólidos e misturas semi-sólidas contendo carbowax.Qualquer um dos precedentes pode ser apropriado nos tratamentos e terapiasde acordo com a presente invenção, contanto que o ingrediente ativo nacomposição farmacêutica não seja inativada pela formulação e a formulação éfisiologicamente compatível e tolerável com a via de administração. Vertambém por exemplo Powell et ai., "Compendium of excipients for pareteralformulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52, 238-311 (1998) e as citaçõesnesta quanto a informações relacionadas adicionais com excipientes ecarreadores bem conhecidos pelos químicos farmacêuticos.
Os compostos da presente invenção podem ser preparados comcarreadores que protegerão o composto contra a liberação rápida, tal comouma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastrostransdérmicos e sistemas de liberação microencapsuladas. Tais carreadorespodem incluir gelatina, monoestearato de glicerila, diestearato de glicerila,biodegradável, polímeros biocompatíveis tais como vinil acetato de etileno,polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláticosozinho ou com uma cera ou outros materiais bem conhecidos na técnica. Osmétodos para a preparação de tais formulações são no geral conhecidos poraqueles habilitados na técnica. Ver por exemplo, Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc.,Nova Iorque, 1978.
Para administrar as composições da presente invenção porcertas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com ouco-administrar o composto com, um material para prevenir a sua inativação.Por exemplo, o composto da presente invenção pode ser administrado a umpaciente em um carreador apropriado, por exemplo, lipossomas ou umdiluente. Os lipossomas incluem emulsões CGF de água em óleo em águaassim como lipossomas convencionais (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27(1984)).
Dependendo da via de administração, o composto ativo podeser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos eoutras condições naturais que possam inativar o composto. Por exemplo, ocomposto pode ser administrado a um paciente em um carreador apropriado,por exemplo, lipossomas. Os lipossomas incluem emulsões de CGF de águaem óleo em água assim como lipossomas convencionais (Strejan et al., J.Neuroimmunol. 7, 27 (1984)).
Em uma forma de realização, os compostos da presenteinvenção podem ser formulados para garantir a distribuição apropriada invivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitoscompostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticosda presente invenção cruzem a BBB (se desejado), estes podem serformulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricarlipossomas, ver por exemplo a US 4.522.811, US 5.374.548 e US 5.399.331.Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que sãoseletivamente transportadas em células ou órgãos específicos, realçam assim aliberação de medicamento alvejada (ver por exemplo V. V. Ranade J. Clin.Pharmacol. 29, 685 (1989)). As porções alvejadores exemplares incluemfoliato ou biotina (ver por exemplo a US 5.416.016), mannosides (Umezawaet al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 1038 (1988)), anticorpos (P. G.Bloeman et al., FEBS Lett. 357, 140 (1995), M. Owais et al, Antimicrob.Agents Quimiother. 39, 180 (1995)), receptor da proteína A tensoativa(Briscoe et al., Am. J. Physiol. 1233, 134 (1995)), espécie diferente da qualpode compreender as composições farmacêuticas da presente invenção, assimcomo componentes das moléculas inventadas, pl20 (Schreier et al., J. Biol.Chem. 269, 9090 (1994)), ver também K. Keinanen, M. L. Laukkanen, FEBSLett. 346, 123 (1994) e J. J. Killion, I. J. Fidler, Immunomethods 4, 273(1994).
Em uma forma de realização da presente invenção, oscompostos da presente invenção são formulados em lipossomas. Em umaoutra forma de realização, os lipossomas incluem uma porção alvejadora. Emuma outra forma de realização, os compostos nos lipossomas são liberadospela injeção de bolo a um sítio próximo à área desejada, por exemplo, o sítiode inflamação ou infecção ou o sítio de um tumor. A composição deve serfluida até o grau em que seringabilidade fácil exista. A mesma deve serestável sob as condições de fabricação e armazenagem e deve ser preservadacontra a ação contaminadora de microorganismos tal como bactérias e fungos.
Em uma forma de realização, os compostos da presenteinvenção podem ser formulados para impedir ou reduzir o seu transporteatravés da placenta. Isto pode ser feito pelos métodos conhecidos na técnica,por exemplo, pela PEGuilação dos compostos ou pelo uso de fragmentosF(ab')2. Outras referências podem ser feitas a Cunningham-Rundles C et al., JImmunol Methods. 152, 177-190 (1992) e a Landor M., Ann Allergy AsthmaImmunol 74, 279-283 (1995).
Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para aadministração parenteral incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis epós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersõesinjetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para as substânciasfarmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em quequalquer meio ou agente convencionais sejam incompatíveis com o compostoativo, o uso destes nas composições farmacêuticas da presente invenção éconsiderado. Os compostos ativos suplementares também podem serincorporados nas composições.
As composições farmacêuticas para injeção devem sertipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem.A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão,lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para a concentração demedicamento alta. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersãoaquoso ou não aquoso contendo por exemplo água, etanol, polióis (tais comoglicerol, propileno glicol, polietileno glicol e outros) e misturas adequadasdestes, óleos vegetais, tais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis,tais como oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo,pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanhode partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Emmuitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo,açúcares, poliálcoois tais como glicerol, manitol, sorbitol ou cloreto de sódiona composição. A absorção prolongada da composições injetável pode serrealizada pela inclusão na composição de um agente que retarde a absorção,por exemplo, sais de monostearato e gelatina. As soluções injetáveis estériespodem ser preparadas incorporando-se o composto ativo na quantidaderequerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação deingredientes por exemplo, como enumerado acima, como requerido, seguidopela microfiltração de esterilização. No geral, as dispersões são preparadaspela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contenha ummeio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos por exemplo,daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação desoluções injetáveis estéreis, os exemplos de métodos de preparação sãosecagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produz umpó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de umasolução destes previamente filtrada estéril.
As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pelaincorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solventeapropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima,como requerido, seguido pela microfiltração de esterilização. No geral, asdispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em umveículo estéril que contenha um meio de dispersão básico e os outrosingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreispara a preparação de soluções injetáveis estéreis, os exemplos de métodos depreparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização)que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicionaldesejado de uma solução destes previamente filtrada estéril.
A composição farmacêutica da presente invenção pode conterum composto da presente invenção ou uma combinação de compostos dapresente invenção. Assim, em uma forma de realização, uma composiçãofarmacêutica da presente invenção inclui uma combinação de compostosmúltiplos (por exemplo, dois ou mais) da presente invenção que atuam pormecanismos diferentes, por exemplo, um composto que predominantementeatua pela indução CDC em combinação com um outro composto quepredominantemente atua pela indução da apoptose.
Os CD38BPs (incluindo anticorpos anti-CD38, imuno-conjugados, moléculas biespecíficas/multiespecíficas, composições e outrosderivados aqui descritos) da presente invenção têm numerosas utilidades dediagnóstico e terapêuticas in vitro e in vivo que envolvem o diagnóstico etratamento de distúrbios que envolvem células que expressam CD38. Porexemplo, os anticorpos podem ser administrados às células em cultura, porexemplo, in vitro ou ex vivo ou aos pacientes humanos, por exemplo, in vivo,para tratar, prevenir e diagnosticar uma variedade de distúrbios. Como aquiusado, o termo "paciente" é intencionado a incluir ser humano e animal nãohumano que respondem ao CD38BP. Os pacientes por exemplo podem incluirpacientes humanos tendo distúrbios que podem ser corrigidos ou melhoradospela inibição da função CD38, tal como a atividade enzimática, transdução desinal, indução da expressão de citocina, indução da proliferação oudiferenciação e/ou indução de Iise e/ou eliminação/redução do número decélulas que expressam CD38.Por exemplo, os CD38BPs podem ser usados para evocar umaou mais das seguintes atividades biológicas in vivo ou in vitro: inibição dafunção de CD38 (tal como atividade enzimática, transdução de sinal, induçãoda expressão de citocina, indução da proliferação ou diferenciação e/ouindução de lise), matar uma célula que expresse CD38, mediar a fagocitose ouADCC de uma célula que expresse CD38 na presença de células efetorashumanas e pela mediação de CDC a partir de uma célula que expresse CD38na presença de complemento ou pela morte de células que expressam CD38pela apoptose.
Qualquer composição que compreenda CD38BPs da presenteinvenção tendo sítios de ligação de complemento, tais como porções de IgGl,-2 ou -3 ou IgM que ligam complemento, também pode ser usada na presençade complemento. Em uma forma de realização, o tratamento ex vivo de umapopulação de células que compreende células alvo com um CD38BP dapresente invenção e células efetoras apropriadas pode ser suplementado pelaadição de complemento ou complemento contendo soro. A fagocitose ou lisede células alvo revestidas com um CD38BP da presente invenção pode sermelhorada pela ligação de proteínas de complemento. Em uma forma derealização células alvo revestidas com os CD38BPs da presente invençãotambém podem ser lisadas pelo complemento. Em uma forma de realização,os CD38BPs da presente invenção não ativam complemento.
Os CD38BPs da presente invenção também podem seradministrados junto com complemento. Conseqüentemente, dentro do escopoda presente invenção estão composições que compreendem CD38BPs comsoro ou complemento. Nestas composições o complemento está localizado emproximidade imediata aos CD38BPs, por exemplo pela conjugação ou podemser adaptados para a administração simultânea. Alternativamente, osCD38BPs e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente.
Os CD38BPs da presente invenção também podem ser usadospara alvejar células que expressam FcyR ou CD38, por exemplo para rotulartais células. Para tal uso, o CD38BP pode ser ligado a uma molécula que podeser detectada. Assim, a presente invenção fornece métodos para localizarcélulas que expressam receptores Fc ex vivo ou in vitro, tais como FcyR ouCD38. O rótulo detectável pode ser, por exemplo, um radioisótopo, umcomposto fluorescente, uma enzima ou um co-fator de enzima.
As células efetoras específicas de alvo, por exemplo, célulasefetoras ligadas a um CD38BP da presente invenção também podem serusadas como agentes terapêuticos. As células efetoras para alvejar podem serleucócitos humanos tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outrascélulas incluem eosinófilos, células matadoras naturais e outras células quecarregam receptor de IgG ou IgA. Se desejado, as células efetoras podem serobtidas do paciente a ser tratado. As células efetoras específicas de alvo,podem ser administradas como uma suspensão de células em uma soluçãofisiologicamente aceitável. O número de células administradas pode estar naordem de 10 a 10 mas variará dependendo do propósito terapêutico. Nogeral, a quantidade será suficiente para obter a localização na célula alvo, porexemplo, uma célula de tumor que expresse CD38 e para matar eficazmente acélula, por exemplo, pela fagocitose ou Iise.
A terapia com células efetoras específicas de alvo pode serrealizada em conjunção com outras técnicas para a remoção de célulasalvejadas. Por exemplo, a terapia anti-tumor usando os CD38BPs da presenteinvenção e/ou as células efetoras munidas com estas composições podem serusadas em conjunção com quimioterapia. Adicionalmente, a imunoterapia decombinação pode ser usada para direcionar duas populações efetorascitotóxicas distintas contra a rejeição de célula de tumor. Por exemplo,CD38BP ligado ao anti-FcyRI ou anti-CD3 pode ser usado em conjunção comagentes específicos de ligação de IgG ou IgA. As moléculas biespecíficas emultiespecíficas da presente invenção também podem ser usadas paramodular níveis de FcaR ou FcyR nas células efetoras, tais como peloencapuzamento e eliminação de receptores na superfície celular. As misturasde receptores anti-Fc também podem ser usadas para este propósito.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornecemétodos para detectar a presença de antígeno de CD38 em uma amostra oumedir a quantidade de antígeno de CD38, que compreende contatar a amostrae uma amostra de controle, com um CD38BP que especificamente se liga aoCD38, sob condições que permitam a formação de um complexo entre oCD38BP ou porção deste e CD38. A formação de um complexo é depoisdetectada, em que uma diferença de formação de complexo entre a amostracomparada com a amostra de controle é indicativa da presença de antígeno deCD38 na amostra. Os exemplos de métodos para detectar imunoensaiosincluem, sem limitação, um ELISA, um RIA, ensaios FAC S, ensaios deressonância de plasma, ensaios cromatográficos, imunoistoquímica de tecido,Western blot e/ou imunoprecipitação.
Em uma forma de realização, CD38BPs da presente invençãopodem ser usados para detectar níveis de CD38 circulantes ou níveis decélulas que contêm CD38 na sua superfície de membrana, níveis estes quepodem estar ligados a certos sintomas de doença. Alternativamente, osCD38BPs podem ser usados para esgotar ou interagir com a função de célulasque expressam CD38, implicando deste modo estas células como mediadoresimportantes da doença. Isto pode ser obtido contatando-se uma amostra e umaamostra de controle com o anticorpo anti-CD38 sob condições que permitama formação de um complexo entre o anticorpo e CD38. Quaisquer complexosformados entre o anticorpo e CD38 são detectados e comparados na amostra eno controle.
Os CD38BPs da presente invenção podem ser inicialmentetestados quanto a atividade de ligação associada com o uso terapêutico ou emdiagnóstico in vitro. Por exemplo, os CD38BPs podem ser testados usandoensaios citométricos de fluxo. Além disso, a atividade dos CD38BPs emdeflagrar pelo menos uma atividade da célula efetora mediada por efetor podeser ensaiada. Por exemplo, a capacidade de anticorpos anti-CD38 da presenteinvenção para deflagrar CDC e/ou apoptose pode ser ensaiada. Os protocolospara ensaiar quanto a CDC5 adesão homotípica, formação de agrupamentomolecular ou apoptose são bem conhecidos na técnica.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para detectar a presença ou quantificar a quantidade de células queexpressam CD38 in vivo ou in vitro. O método compreendendo (i) administrara um paciente um CD38BP da presente invenção conjugado a um marcadordetectável; (ii) expor o paciente a um meio para detectar o marcador ditomarcador detectável para identificar áreas contendo células que expressamCD38.
Em uma forma de realização, imunoconjugados da presenteinvenção podem ser usados para alvejar compostos (por exemplo, agentesterapêuticos, rótulos, citotoxinas, imunossupressores, etc.) às células que têmCD38 ligado à sua superfície usando-se tais compostos alvo como as porçõesterapêuticas em imunoconjugados da presente invenção.
Em uma forma de realização, a presente invenção tambémfornece métodos para localizar células ex vivo ou in vitro que expressemCD38 (por exemplo, com um rótulo detectável, tal como um radioisótopo, umcomposto fluorescente, uma enzima ou um co-fator de enzima).
Em uma forma de realização, a presente invenção fornecemétodos para matar células que têm CD38 ligado à sua superfície pelaadministração de imunotoxinas da presente invenção.
A presente invenção fornece métodos para tratar ou prevenirum distúrbio que envolva células que expressam CD38 em um paciente,método este que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção a um pacienteem necessidade destes. Tais CD38BPs são usados para inibir as atividadesinduzidas por CD38 associadas com certos distúrbios ou para eliminar oureduzir o número de células que expressam CD38.
Um tal método envolve administrar a um paciente umacomposição de CD38BP da presente invenção em uma quantidade eficaz paratratar ou prevenir o distúrbio. A composição de CD38BP pode seradministrada sozinha ou junto com um outro agente terapêutico, tal como estádescrito aqui em outro lugar que atue em conjunção com ou sinergisticamentecom a composição de CD38BP para tratar ou prevenir as doenças queenvolvem células que expressam CD38. Alternativamente, imunoconjugadospodem ser usados para matar células que têm CD38 expressado na suasuperfície pelo alvejamento de citotoxinas ou radiotoxinas para CD38.
Em uma forma de realização da presente invenção, o distúrbioque envolve células que expressam CD38 pode ser um distúrbiotumorigênico, tal como um distúrbio caracterizado pela presença de células detumor que expressem CD38 incluindo, por exemplo, linfoma de célula B,malignidades de célula plasmática, linfoma de célula T/NK e malignidadesmielóides.
Os exemplos de tais doenças tumorigênicas incluemlinfoma/leucemias de célula B incluindo leucemia linfoblástica/linfoma decélula B precursora e linfomas que não de Hodgkin de célula B; leucemiapromielocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda e neoplasmas de célula Bmadura, tais como leucemia linfocítica crônica de célula B (CLL)/linfomalinfocítico pequeno (SLL), leucemia linfocítica aguda de célula B, leucemiaprolinfocítica de célula B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de célula domanto (MCL), linfoma folicular (FL), incluindo FL de grau baixo, de grauintermediário e de grau alto, linfoma do centro folicular cutâneo, linfoma decélula B da zona marginal (tipo MALT, nodal e tipo esplênico), leucemia decélula pilosa, linfoma de célula B grande difusa, linfoma de Burkitt,plasmacitoma, mieloma de célula plasmática, leucemia de célula plasmática,distúrbio linfoproliferativo pós transplante, macroglobulinemia deWaldenstrõm, leucemias de célula plasmática e linfoma de célula grandeanaplástica (ALCL).
Em uma forma de realização, o distúrbio que envolve célulasque expressam CD38 é o mieloma múltiplo.
Os exemplos de linfomas que não Hodgkin de célula B sãogranulomatose linfomatóide, linfoma de efusão primária, linfoma de célula Bgrande intravascular, linfoma de célula B grande mediastinal, doenças decadeia pesada (incluindo doenças γ, μ e α doença), linfomas induzidos pelaterapia com agentes imunossupressivos, tais como linfoma induzido porciclosporina e linfoma induzido por metotrexato.
Em uma forma de realização da presente invenção, o distúrbioque envolve células que expressam CD38 pode ser o linfoma de Hodgkin.
Os exemplos de um distúrbio que envolve células queexpressam CD38 podem ser uma malignidade derivada de células T e NKincluindo: célula T madura e neoplasmos de célula NK incluindo leucemia decélula prolinfocítica T, leucemia linfocítica de granular grande de célula T,leucemia de célula NK agressiva, leucemia/linfoma de célula T adulta,linfoma de célula NKfT extranodal, tipo nasal, linfoma de célula T tipoenteropatia, linfoma de célula T hepatoesplênico, linfoma de célula Tequivalente à paniculite subcutânea, linfoma de célula NK blástica, Fungóidesde Micose /Síndrome de Sêzary, distúrbios linfoproliferativos de célula Tpositivas em CD30 cutâneo primário (linfoma de célula grande anaplásticacutânea primária C-ALCL, papulose linfomatóide, lesões limítrofes), linfomade célula T angioimunoblástica, linfoma de célula T periférica nãoespecificada e linfoma de célula grande anaplástica.
Os exemplos de malignidades derivadas de células mielóidesincluem leucemia mielóide aguda, incluindo leucemia promielocítica aguda edoenças mieloproliferativas crônicas, incluindo leucemia mielóide crônica.
Em uma forma de realização da presente invenção, o distúrbioque envolve células que expressam CD38 podem ser distúrbios imunes emque CD38 que expressam células B, células plasmáticas, monócitos e célulasT estão envolvidos
Os exemplos de distúrbios imunes em que células B queexpressam CD38, células plasmáticas, monócitos e células T são envolvidasincluem distúrbios autoimunes, tais como psoríase, artrite psoriática,dermatite, escleroderma sistêmico e esclerose, doença do intestinoinflamatório (IBD), doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome da angústiarespiratória, meningite, encefalite, uveíte, glomerulonefrite, eczema, asma,aterosclerose, deficiência da adesão de leucócito, esclerose múltipla, síndromede Raynaud, síndrome de Sjõgren, diabete de início juvenil, doença de Reiter,doença de Behget, nefrite de complexo imune, nefropatia de IgA,polineuropatias de IgM, trombocitopenias mediada por imune, tal comopúrpura trombocitopênica idiopática aguda e púrpura trombocitopênicaidiopática crônica, anemia hemolítica, miastenia grave, Iupo nefrite, Iupoeritematoso sistêmico, artrite reumatóide (RA), dermatite atópica, pênfigo,doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, granulomatose Wegener,síndrome de Omenn, insuficiência renal crônica, mononucleose infecciosaaguda, esclerose múltipla, doenças associadas com HIV e vírus do herpes.Outros exemplos são síndrome da angústia respiratória aguda severa ecoreoretinite. Além disso, outras doenças e distúrbios são incluídos tais comoaqueles causados ou mediados pela infecção de células B com vírus, tal comoo vírus de Epstein-Barr (EBV).
Em uma forma de realização, o distúrbio que envolve célulasque expressam CD38 é a artrite reumatóide.
Outros exemplos de distúrbios inflamatórios, imunes e/ouautoimunes em que autoanticorpos e/ou a atividade de linfócito BeTexcessiva são proeminentes e que podem ser tratados de acordo com apresente invenção incluem os seguintes:
vasculites e outros distúrbios de vaso, tais como poliangiítemicroscópica, síndrome de Churg-Strauss e outras vasculites associadas aANCA, poliarterite nodosa, vasculite crioglobulinêmica essencial, angiíteleucocitoclástica cutânea, doença de Kawasaki, arterite de Takayasu, artrite decélula gigante, púrpura de Henoch-Schõnlein, angiíte cerebral primária ouisolada, eritema nodoso, tromboangiíte obliterativa, púrpura trombocitopênicatrombóptica (incluindo síndrome urêmica hemolítica) e vasculitessecundárias, incluindo vasculite leucocitoclástica cutânea (por exemplo,secundários à hepatite B, hepatite C, macroglobulinemia de Waldenstriim,neoplasias de célula B, artrite reumatóide, síndrome de Sjogren ou Iupoeritematoso sistêmico); outros exemplos são eritema nodoso, vasculitealérgica, paniculite, doença de Weber-Christian, púrpura hiperglobulinêmica edoença de Buerger;
distúrbios de pele, tais como dermatite de contato, dermatosede IgA linear, vitiligo, pioderma gangrenoso, epidermólise bolhosa adquirida,pênfigo vulgar (incluindo penfigóide cicatricial e penfigóide bolhoso),alopecia areata (incluindo alopecia universal e alopecia total), dermatiteherpetiforme, eritema multiforme e urticária autoimune crônica (incluindoedema angioneurótico e vasculite urticarial);
citopenias imuno-mediadas, tais como neutropenia autoimunee aplasia de célula vermelha pura;
distúrbios do tecido conectivo, tal como Iupo CNS, Iupoeritematoso discóide, síndrome de CREST, doença do tecido conectivo misto,polimiosite/dermatomiosite, miosite de corpo de inclusão, amiloidosesecundária, crioglobulinemia tipo I e tipo II, fibromialgia, síndrome doanticorpo fosfolipídico, hemofilia secundária, policondrite recorrente,sarcoidose, síndrome do homem duro e febre reumática; um outro exemplo éfasciíte eosinofílica;
artrites, tais como espondilite ancilosante, artrite crônicajuvenil, doença de Still do adulto e síndrome de SAPHO; outros exemplos sãosacroileíte, artrite reativa, doença de Still e gota;
distúrbios hematológicos, tais como anemia aplástica, anemiahemolítica primária (incluindo síndrome da aglutinina fria), anemiahemolítica secundária a CLL ou Iupo eritematoso sistêmico; síndrome dePOEMS, anemia perniciosa e púrpura de Waldemstrõm hiperglobulinêmica;outros exemplos são agranulocitose, neutropenia autoimune, doença deFranklin, doença de Seligmann, doença da cadeia pesada gama, síndromeparaneoplástica secundária a timoma e linfomas, an, síndrome paraneoplásticasecundária à formação de timoma e linfomas e inibidor de factor VIII;
endocrinopatias, tais como poliendocrinopatia e doença deAddison; outros exemplos são hipoglicemia autoimune, hipotireoidismoautoimune, síndrome da insulina autoimune, tireoidite de Quervain eresistência à insulina mediada pelo anticorpo receptor de insulina;
distúrbios hepato-gastrointestinais, tais como doença celíaca,doença de Whipple, cirrose biliar primária, hepatite ativa crônica e colangiíteesclerosante primária; um outro exemplo é a gastrite autoimune;
nefropatias, tais como glomerulonefrite progressiva rápida,nefrite pós estreptocócica, síndrome de Goodpasture, glomerulonefritemembranosa e nefrite crioglobulinêmica; um outro exemplo é a doença demudança mínima;
distúrbios neurológicos, tais como neuropatias autoimunes,mononeurite múltipla, síndrome mistênica de Lambert-Eaton, coréia deSydenham, ataxia locomotriz progressiva e síndrome de Guillain-Barre;outros exemplos são mielopatia/ paraparese espástica tropical, miasteniagrave, polineuropatia desmielinante inflamatória aguda e polineuropatiadesmielinante inflamatória crônica; esclerose múltipla;distúrbios cardíacos e pulmonares, tais como COPD, alveolitefibrosante, bronquiolite obliterativa, aspergilose alérgica, fibrose cística,síndrome de Lõffler, miocardite e pericardite; outros exemplos sãopneumonite e síndrome paraneoplástica secundárias ao câncer de pulmão;
distúrbios alérgicos, tais como asma brônquica e síndrome dehiper-IgE; um outro exemplo é amaurose fugaz;
distúrbios oftalmológicos, tais como corioretinite idiopática;
doenças infecciosas, tais como infecção POR parvovírus B(incluindo a síndrome de hands-and-socks);
distúrbios ginecológicos-obstétricos, tais como abortorecorrente, perda fetal recorrente e retardo de crescimento uterino; um outroexemplo é a síndrome paraneoplástica secundária aos neoplasmosginecológicos;
distúrbios reprodutivos masculinos, tais como síndromeparaneoplástica secundária aos neoplasmos testiculares; e
distúrbios derivados de transplante, tais como rejeição dealoenxerto e xenoenxerto e doença do enxerto versus hospedeiro.
O anticorpo também pode ser administrado profilaticamente demodo a reduzir o risco de desenvolvimento de câncer, tal como um distúrbiotumorigênico como descrito acima, retardar o início da ocorrência de umevento em tal progressão de câncer e/ou reduzir o risco de recorrência quandoum tal câncer está em remissão. Isto pode ser especialmente útil em pacientesem que é difícil localizar um tumor que é conhecido estar presente devido aoutros fatores biológicos.
As composições da presente invenção podem incluir uma"quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamenteeficaz" de um CD38BP. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-sea uma quantidade eficaz, nas dosagens e por períodos de tempo necessários,para se obter um resultado terapêutico desejado. Uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um CD38BP pode variar de acordo com fatorestais como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidadedo CD38BP para evocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidadeterapeuticamente eficaz também é uma em que nenhum dos efeitos tóxicos ounocivos do anticorpo ou porção de anticorpo são preponderantes aos efeitosterapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e por períodos de temponecessários, para se obter o resultado profilático desejado (por exemplo, umaredução na probabilidade de desenvolver um distúrbio, uma redução naintensidade ou disseminação de um distúrbio, um aumento na probabilidadede sobrevivência durante um distúrbio iminente, uma demora no início deuma condição de doença, etc.). Tipicamente, porque uma dose profilática éusada em pacientes antes ou em um estágio mais no princípio da doença, aquantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidadeterapeuticamente eficaz.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" para a terapia detumor também pode ser medida pela sua capacidade para estabilizar aprogressão da doença. A capacidade de um composto para inibir câncer podeser avaliada em um sistema de animal modelo preditivo da eficácia emtumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composiçãopode ser avaliada examinando-se a capacidade do composto para inibir ocrescimento da célula ou induzir a apoptose pelos ensaios in vitro conhecidospelo técnico habilitado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de umcomposto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor ou de outro modoestabelecido melhorar os sintomas em um paciente. Uma pessoa de habilidadecomum na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base emtais fatores como o tamanho do paciente, a gravidade dos sintomas dopaciente e a composição particular ou via de administração selecionadas.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" para a artritereumatóide pode resultar em uma Definição Preliminar de Melhora de pelomenos ACR20 nos pacientes, tal como em pelo menos uma DefiniçãoPreliminar de Melhora ACR50, por exemplo pelo menos uma DefiniçãoPreliminar de Melhora ARC70.
Definição Preliminar de Melhora ACR20 é definida como:> 20 % de melhora em: Contagem de Junta Mole (TJC) eContagem de Junta Intumescida (SJC)
e > 20 % de melhora em 3 das seguintes 5 avaliações:Avaliação de Dor do Paciente (VAS), Avaliação Global do Paciente (VAS),Avaliação Global do Médico (VAS), Incapacidade Auto-Avaliada Patente(HAQ), Reagente de Fase Aguda (CRP ou ESR).
ACR50 e ACR70 são definidos do mesmo modo com melhoras> 50 % e > 70 %, respectivamente, para mais detalhes ver Felson et ai., emAmerican College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvementin Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism 38, 727-735 (1995).
Alternativamente, uma quantidade terapeuticamente eficazpara a artrite reumatóide pode ser medida pela DAS (contagem de atividadede doença), incluindo DAS28 e/ou DAS56, como definido por EULAR.
Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a respostadesejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, umbolo único pode ser administrado, diversas doses divididas podem seradministradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzidaou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. Ascomposições parenterais podem ser formuladas na forma unitária de dosagempara facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A formaunitária de dosagem como aqui usada se refere às unidades fisicamenteseparadas adaptadas como dosagens unitárias para os pacientes a seremtratados; cada unidade contém uma quantidade pré determinada de compostoativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação como carreador farmacêutico requerido. A especificação para as formas unitáriasde dosagem da presente invenção são ditadas por e diretamente dependentes(a) das características únicas do composto ativo e do efeito terapêuticoparticular a ser obtido e (b) das limitações inerentes na técnica de combinarum tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.
As dosagens eficientes e os regimes de dosagem para osCD38BPs da presente invenção dependem da doença ou condição a seremtratadas e podem ser determinadas pelas pessoas habilitadas na técnica. Umafaixa exemplar, não limitante quanto a uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um composto da presente invenção é de cerca de 0,1 a 100 mg/kg,tal como cerca de 0,1 a 50 mg/kg, por exemplo de cerca de 0,1 a 20 mg/kg, talcomo de cerca de 0,1 a 10 mg/kg, por exemplo de cerca de 0,5, de cerca de talcomo 0,3, de cerca de 1 ou cerca de 3 mg/kg.
Um médico ou veterinário tendo habilidade comum na técnicapode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composiçãofarmacêutica requerida. Por exemplo, o médico ou veterinário pode começarcom doses dos CD38BPs da presente invenção utilizados na composiçãofarmacêutica em níveis mais baixos do que aqueles requeridos de modo aobter o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumentar a dosagem atéque o efeito desejado seja obtido. No geral, uma dose diária adequada de umacomposição da presente invenção será aquela quantidade do composto que é adose eficaz mais baixa para produzir um efeito terapêutico. Uma tal doseeficaz no geral dependerá dos fatores descritos acima. A administração podeser intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea e por exemploadministrada próximo ao sítio do alvo. Se desejado, a dose diária eficaz deuma composição farmacêutica pode ser administrada como duas, três, quatro,cinco, seis ou mais sub-doses administradas separadamente em intervalosapropriados por todo o dia, opcionalmente, nas formas de dosagem unitária.Embora seja possível para um composto da presente invenção seradministrado sozinho, é preferível administrar o composto como umacomposição farmacêutica como descrito acima.
Em uma forma de realização, os CD38BPs da presenteinvenção podem ser administrados pela infusão em uma dosagem semanal deIOa 500 mg/m , tal como de 200 a 400 mg/m . Tal administração pode serrepetida, por exemplo, de 1 a 8 vezes, tal como de 3 a 5 vezes. Aadministração pode ser realizada pela infusão contínua em um período de 2 a24 horas, tal como de 2 a 12 horas.
Em uma forma de realização, os CD38BPs da presenteinvenção podem ser administrados pela infusão contínua em um períodolongo, tal como mais do que 24 horas, de modo a reduzir os efeitos colateraistóxicos.
Em uma forma de realização os CD38BPs da presenteinvenção pode ser administrado em uma dosagem semanal de 250 mg a 2000mg, tal como por exemplo 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg ou2000 mg, por até 8 vezes, tal como de 4 a 6 vezes. A administração pode serrealizada pela infusão contínua em um período de 2 a 24 horas, tal como de 2a 12 horas. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes como necessário,por exemplo, depois de 6 meses ou 12 meses. A dosagem pode serdeterminada ou ajustada medindo-se a quantidade de composto da presenteinvenção no sangue na administração por exemplo coletando-se uma amostrabiológica e usando-se anticorpos anti-idiotípicos que alvejem a região deligação de antígeno dos CD38BPs da presente invenção.
Em uma forma de realização, os CD38BPs da presenteinvenção podem ser administrados pela terapia de manutenção, tal como, porexemplo, uma vez por semana por um período de 6 meses ou mais.
Em uma forma de realização, os CD38BPs da presenteinvenção podem ser administrados por um regime incluindo uma infusão deum CD38BP da presente invenção seguido por uma infusão de um CD38BPda presente invenção conjugado a um radioisótopo. O regime pode serrepetido, por exemplo, 7 a 9 dias mais tarde.
Como exemplos não limitantes, o tratamento de acordo com apresente invenção pode ser fornecido como uma dosagem diária de umcomposto da presente invenção em uma quantidade de cerca de 0,1 a 100mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70,80, 90 ou 100 mg/kg, por dia, em pelo menos um de dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25,26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 ou alternativamente, pelo menos umada semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20depois do início de tratamento ou qualquer combinação destes, usando dosesúnicas ou divididas a cada 24, 12, 8, 6, 4 ou 2 horas ou qualquer combinaçãodestes.
As composições farmacêuticas da presente invenção tambémpodem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas comoutros agentes terapêuticos relevantes para a doença ou condição a ser tratada.Tal administração pode ser simultânea, separada ou seqüencial. Para aadministração simultânea os agentes podem ser administrados como umacomposição ou como composições separadas, como apropriado.
Conseqüentemente, a presente invenção fornece métodos paratratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 como descritoacima, método este que compreende a administração de um CD38BP dapresente invenção combinada com um ou mais agentes terapêuticos adicionaiscomo descrito abaixo.
A presente invenção também fornece o uso de um CD38BP dapresente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a seradministrada com pelo menos um agente quimioterapêutico quanto a umdistúrbio que envolva células que expressam CD38 como descrito acima.Em uma forma de realização, a terapia de combinação podeincluir a administração de uma composição da presente invenção junto compelo menos um agente quimioterapêutico, pelo menos um agente anti-inflamatório ou pelo menos um agente imunossupressivo e/ouimunomodulatório.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 emum paciente, método este que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e pelo menosum agente quimioterapêutico a um paciente em necessidade deste
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP dapresente invenção e pelo menos um agente quimioterapêutico a um pacienteem necessidade deste.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ouso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de umacomposição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agentequimioterapêutico para tratar mieloma múltiplo.
Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêuticopode ser selecionado de um antimetabólito, tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracila,decarbazina, hidroxiuréia, asparaginase, gencitabina, cladribina e agentessimilares.
Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêuticopode ser selecionado de um agente alquilante, tal como mecloretamina,tioepa, clorambucila, meifalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU),ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina(DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina,tal como carboplatina e agentes similares.
Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêuticopode ser selecionado de um antibiótico, tal como dactinomicina (antigamenteactinomicina), bleomicina, daunorrubicina (antigamente daunomicina),doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona,plicamicina, antramicina (AMC) e agentes similares.
Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêuticopode ser selecionado de um agente anti-mitótico, tal como taxanos, porexemplo docetaxel e paclitaxel e alcalóides vinca, por exemplo vindesina,vincristina, vinblastina e vinorrelbina.
Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêuticopode ser selecionado de um inibidor de topoisomerase, tal como topotecano.
Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêuticopode ser selecionado de um inibidor do fator de crescimento, tal como uminibidor de ErbBl (EGFR) (tal como gefitinib (Iressa®), cetuximab(Erbitux®), erlotinib (Tarceva®), HuMax-EGFr (2F8 divulgado na WO2002/100348) e agentes similares), um inibidor de ErbB2 (Her2/neu) (talcomo trastuzumab (Herceptina®) e agentes similares) e agentes similares. Emuma forma de realização, um tal inibidor do fator de crescimento pode ser uminibidor da farnesil transferase, tal como SCH66336 e Rl 15777. Em umaforma de realização, um tal inibidor do fator de crescimento pode ser uminibidor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), tal comobevacizumab (Avastie).
Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêuticopode ser um inibidor da tirosina quinase, tal como imatinib (Glivec, GleevecSTI571), lapatinib, PTK787/ZK222584 e agentes similares.
Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêuticopode ser um inibidor da histona desacetilase. Os exemplos de tais inibidoresda histona desacetilase incluem compostos polares híbridos com base noácido hidroxâmico, tais como SAHA (ácido suberoilanilida hidroxâmico).
Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêuticopode ser um inibidor da P38a MAP quinase, tal como SCIO-469.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 emum paciente, método este que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e pelo menosum inibidor de angiogênese, neovascularização e/ou outra vascularização aum paciente em necessidade deste
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP dapresente invenção e de pelo menos um inibidor de angiogênese,neovascularização e/ou outra vascularização a um paciente em necessidadedeste.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ouso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de umacomposição farmacêutica a ser administrado com pelo menos um inibidor deangiogênese, neovascularização e/ou outra vascularização para tratar mielomamúltiplo.
Os exemplos de tais inibidores de angiogênese são inibidoresda uroquinase, inibidores da metaloprotease de matriz (tal como marimastat,neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 e agentes similares),inibidores da migração e proliferação de célula endotelial (tal como TNP-470,esqualamina, 2-metoxiestradiol, combretastatinas, endostatina, angiostatina,penicilamina, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), Rl 15777(Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) e agentes similares), antagonistasde fatores de crescimento angiogênico (tal como ZD6474, SU6668,anticorpos contra agentes angiogênicos e/ou seus receptores (tais comoVEGF, bFGF e angiopoietina-1), talidomida (Thalomid®), análogos datalidomida (tais como CC-5013 (lenalidomida, ReVLimid®) e CC4047(Actimid®), Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogênica (tal comoangiozima), interferon α (tal como interferon a2a), suramin e agentessimilares), inibidores da VEGF-R quinase e outros inibidores da tirosinaquinase anti-angiogênicos (tais como SUOl 1248), inibidores da sinalização deintegrina/sobrevivência endotelial-específica (tal como vitaxin e agentessimilares), antagonistas/queladores de cobre (tais como tetratiomolibdato,captopril e agentes similares), carboxiamida-triazol (CAI), ABT-627, CMl01,interleucina-12 (IL-12), IM862, PNU145156E assim como moléculas denucleotídeo para inibir a angiogênese (tal como anti-sentido-VEGF-cDNA,cDNA que codifica angiostatina, cDNA que codifica p53 e cDNA quecodifica o receptor-2 de VEGF deficiente) e agentes similares.
Outros exemplos de tais inibidores de angiogênese,neovascularização e/ou outra vascularização são derivados de heparina anti-angiogênicos e moléculas relacionadas (por exemplo, heperinase III),temozolomida, NK4, fator inibidor da migração de macrófago (MIF),inibidores da ciclooxigenase-2, inibidores do fator 1 indutível da hipoxia,isoflavonas da soja anti-ahgiogênica, oltipraz, fumagilina e análogos destes,análogos de somatostatina, polissulfato de pentosano, tecogalan sódico,dalteparin, tunstatina, trombospondina, NM-3, combrestatina, canstatina,avastatina, anticorpos contra outros alvos relevantes (tais como anti-alfa-v/beta-3 integrina e anti-quininostatina mAbs) e agentes similares.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ouso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de umacomposição farmacêutica a ser administrada com talidomida (Thalomid®),análogos de talidomida (tal como CC-5013 (lenalidomida, ReVjJmid®) e/ouCC4047 (Actimid®). Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de umacomposição farmacêutica a ser administrada com talidomida.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ouso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de umacomposição farmacêutica a ser administrada com um anticorpo anti-CD20, talcomo rituximab (Rituxan , Mabthera®), um anticorpo anti-CD20 monoclonalhumano como divulgado na WO 2004/035607, tal como 11 B8, 2F2 ou 7D8.
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser um inibidor de proteassoma, talcomo bortezomib (Velcade®).
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser um corticosteróide, tal comoprednisona, prednisolona, dexametasona, etc.
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser um corticosteróide, tal comoprednisona, prednisolona, dexametasona, etc.
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser um imunógeno anticâncer, tal comoum antígeno de câncer/ antígeno associado a tumor (por exemplo, moléculade adesão de célula epitelial (EpCAMyTACSTDI), mucina 1 (MUC1),antígeno carcinoembriônico (CEA), glicoproteína associada a tumor 72(TAG-72), gplOO, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, vacinas viraisassociadas a câncer (por exemplo, vacinas do papilomavírus humano),proteínas de choque térmico derivadas de tumor e agentes similares. Váriosoutros antígenos de câncer / associados a tumor aqui descritos em outro lugare moléculas similares conhecidas na técnica também ou alternativamentepodem ser usados em tais formas de realização. Os peptídeos imunogênicosanticâncer também incluem "vacinas" anti-idiotípicas tais como anticorposanti-idiotípicos BEC2, Mitumomab, CeaVac e anticorpos antiidiotípicosrelacionados, anticorpo anti-idiotípico para anticorpo MG7 e outrosanticorpos antiidiotípico anticâncer (ver por exemplo Birebent et al, Vaccine.21(15), 1601-12 (2003), Li et al., Chin Med J (Engl). 114(9), 962-6 (2001),Schmitt et al, Hybridoma. 13(5), 389-96 (1994), Maloney et al., Hybridoma.4(3), 191-209 (1985), Raychardhuri et al, J Immunol. 137(5), 1743-9 (1986),Pohl et al., Int J Câncer. 50(6), 958-67 (1992), Bohlen et al, Cytokines MolTher. 2(4), 231-8 (1996) e Maruyama, J Immunol Methods. 264(1-2), 121-33(2002)). Tais Abs anti-idiotípicos podem ser opcionalmente conjugados a umcarreador, que podem ser uma molécula carreadora sintética (tipicamenteinerte), uma proteína (por exemplo hemocianina do lapa buraco de fechadura(KLH) (ver por exemplo Ochi et al., Eur J Immunol. 17(11), 1645-8 (1987))ou uma célula (por exemplo uma célula sangüínea vermelha - ver porexemplo Wi et al., J Immunol Methods. 122(2), 227-34 (1989)).
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser um bisfosfonato. Os exemplos debifosfonatos potencialmente adequados são pamidronato (Aredia®), ácidozoledrônico (Zometa®), clodronato (Ossofos®), risendronato (Actonel®),ibandronato (Boniva®), etidronato (Didronel®), alendronato (Fosamax®),tiludronato (Skelid®), incadronato (Yamanouchi Pharmaceutical) eminodronato (YM529, Yamanouchi).
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima podem ser um fator estimulador de colônia.
Os exemplos de fatores estimuladores de colônia adequados são fatoresestimuladores de colônia de granulócito (G-CSF), tais como filgrastim(Neupogen®) e pegfilgrastim (Neulasta®) e fatores estimuladores de colôniade granulócito macrófago (GM-CSF) tais como sargramostim (Leucinae®).
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima podem ser um agente eritropoiético. Osexemplos de agentes eritropoiéticos adequados são eritropoietina (EPO), talcomo epoetina alfa (por exemplo Procrit®, Epogen® e Eprex®) e epoetinabeta (por exemplo NeoRecormon®) e proteínas estimuladoras de eritropoiese(por exemplo Aranesp®).
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser uma citocina anticâncer, quimiocinaou combinação destas. Os exemplos de adequada citocinas e fatores decrescimento incluem IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15,IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (por exemplo,INFa2b), IFNl3, GM-CSF, CD40L, ligando Flt3, fator de célula tronco,ancestim e TNFa. As quimiocinas adequadas podem incluir quimiocinasnegativas em Glu-Leu-Arg (ELR) tais como IP-10, MCP-3, MIG e SDF-Iadas famílias de quimiocina CXC e C-C humanas. As citocinas adequadasincluem derivados de citocina, variantes de citocina, fragmentos de citocina eproteínas de fusão de citocina.
Estes e outros métodos ou usos que envolvam ácidos nucleicosque codificam peptídeo que ocorre naturalmente aqui podem ser alternativaou adicionalmente realizados pela "ativação de gene" e técnicas de supra-regulagem de gene de recombinação homólogo, tais como são descritas na US5.968.502, US 6.063.630 e US 6.187.305 e EP 0505500.
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser um agente que module, porexemplo, realce ou iniba, a expressão ou atividade de receptores Fca ou Fcy.Os exemplos de agentes adequados para este uso incluem interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulador de colônia degranulócito (G-CSF), tal como filgrastim (Neupogen®) e pegfilgrastim(Neulasta®) e fatores estimuladores de colônia de granulócito macrófago(GM-CSF) tais como sargramostim (Leucinae®), interferon-γ (IFN-γ) e fatorde necrose de tumor (TNF).
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser um regulador do controle do ciclocelular/apoptose (ou "agente regulador"). Um regulador do controle do ciclocelular/apoptose pode incluir moléculas (i) que alvejam e modulamreguladores do controle do ciclo celular/apoptose tais como cdc-25 (tal comoNSC 663284), (ii) quinases dependentes de ciclina que super estimulam ociclo celular (tal como flavopiridol (L868275, HMRl 275), 7-hidroxiestaurosporina (UCN-01, KW-2401) e roscovitina (R-roscovitina,CYC202)) e (iii) moduladores da telomerase (tais como BIBRl532, SOT-095, GRNl63 e composições descritas por exemplo na US 6.440.735 e US6.713.055). Os exemplos não limitantes de moléculas que interferem com oscaminhos apoptóticos incluem ligando indutor da apoptose relacionada com oTNF (TRAIL)/apoptose-2 (Apo-2L), agentes indutores do bloqueio de NF-KB levando à inibição da produção de IL-6, anticorpos que ativam receptoresTRAIL, IFNs, Bcl-2 e AS2O3 anti-sentido (trióxido de arsênico, Trisenox®).
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser um agente regulador hormonal, taiscomo agentes úteis para a terapia anti-androgênica e anti-estrogênica. Osexemplos de tais agentes reguladores hormonais são tamoxifeno, idoxifeno,fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilestilbestrol, etinilestradiol/estinil, um antiandrogênio (tal como flutaminda/eulexin), umaprogestina (tal como caproato de hidróxi-progesterona,medroxiprogesterona/provera, acepato de megestrol/ megace), umadrenocorticosteróide (tal como hidrocortisona, prednisona), hormônioliberador do hormônio luteinizante (e análogos destes e outros agonistas deLHRH tais como buserelina e goserelina), um inibidor de aromatase (tal comoanastrazol/arimidex, amino-glutetimida/citraden, exemestano), um inibidor dehormônio (tal como octreotide/- sandostatina) e agentes similares.
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser um agente anti-anérgico (porexemplo compostos de molécula pequena, proteínas, glicoproteínas ouanticorpos que rompem a tolerância aos antígenos de tumor e câncer). Osexemplos de tais compostos são moléculas que bloqueiam a atividade deCTLA-4, tal como MDX-OlO (Phan et ai, PNAS USA 100, 8372 (2003)).
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser um ácido nucleico ou vetorcontendo gene supressor de tumor tal como um adenovírus deficiente emreplicação que codifica p53/SCH58500 do tipo selvagem recombinantehumano, etc.; ácidos nucleicos anti-sentido alvejados aos oncogenes, genesmutados ou desregulados; ou siRNA alvejado aos genes mutados oudesregulados. Os exemplos de alvos supressores de tumor incluem, porexemplo, BRCAl, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLHl e DCC.
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser um ácido nucleico anticâncer, talcomo genasense (augmerosen/G3139), LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503,OGX-Oll (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON (oligonucleotídeo de anti-sentido c-raf encapsulado em lipossoma/ISIS-5132), MG98 e outros ácidosnucleicos anti-sentido que alvejam PKCa, clusterina, IGFBPs, proteínaquinase A, ciclina Dl ou Bcl-2h.
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser uma molécula de RNA inibidoraanticâncer (ver por exemplo Lin et al., Curr Câncer Drug Targets. 1(3), 241-7(2001), Erratum em: Curr Câncer Drug Targets. 3(3), 237 (2003), Lima et al.,Câncer Gene Ther. 11(5), 309-16 (2004), Grzmil et al., Int J Oncol. 4(1), 97-105 (2004), Collis et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Supl), S144(2003), Yang et al., Oncogene. 22(36), 5694-701 (2003) e Zhang et al.,Biochem Biophys Res Commun. 303(4), 1169-78 (2003)).
As composições e métodos de administração de combinaçãoda presente invenção também incluem a administração de vacinas de ácidonucleico, tais como vacinas de DNA nu que codificam tais antígenos decâncer/antígenos associados a tumor (ver por exemplo a US 5.589.466, US5.593.972, US 5.703.057, US 5.879.687, US 6.235.523 e US 6.387.888). Emuma forma de realização, o método de administração de combinação e/ou acomposição de combinação que compreendem uma composição de vacinaautóloga. Em uma forma de realização, a composição de combinação e/ou ométodo de administração de combinação que compreende uma vacina decélula inteira ou célula que expresse citocina (por exemplo um fibroblastorecombinante que expresse IL-2, célula dendrítica recombinant que expressecitocina e outros) (ver por exemplo Kowalczyk et al., Acta Biochim Pol.50(3), 613-24 (2003), Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002) eTirapu et al., Curr Gene Ther. 2(1), 79-89 (2002). Um outro exemplo de umtal método de célula autóloga que pode ser útil em métodos de combinação dapresente invenção é o método de Imunoterapia MyVax® Personalizada(anteriormente aludido como GTOP-99) (Genitope Corporation - RedwoodCity, CA, USA).
Em uma forma de realização, a presente invenção fornececomposições de combinação e métodos de administração de combinação emque um CD38BP é combinado ou co-administrado com um vírus, proteínasvirais e outros. Os vírus deficientes em replicação, que no geral são capazesde uma ou apenas umas poucas rodadas de replicação in vivo e que sãoalvejados à células de tumor, por exemplo podem ser componentes úteis detais composições e métodos. Tais agentes virais podem compreender ou estarassociados com ácidos nucleicos que codificam imunoestimulantes, tais comoGM-CSF e/ou IL-2. Tanto os vírus naturalmente oncolíticos quanto tais vírusoncolíticos recombinantes (por exemplo vírus do HSV-1, reovírus, adenovírusdeficiente de replicação e sensível à replicação, etc.) podem ser componentesúteis de tais métodos e composições. Conseqüentemente, em uma forma derealização, a presente invenção fornece composições de combinação emétodos de administração de combinação em que um CD38BP é combinadoou co-administrado com um vírus oncolítico. Os exemplos de tais vírusincluem adenovírus oncolíticos e vírus do herpes, que podem ser vírusmodificados ou não (ver por exemplo Shah et al., J Neurooncol. 65(3), 203-26(2003), Stiles et al, Surgery. 134(2), 357-64 (2003), Sunarmura et ai,Pancreas. 28(3), 326-9 (2004), Teshigahara et ai, J Surg Oncol. 85(1), 42-7(2004), Varghese et al., Câncer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002), Wildner etal, Câncer Res. 59(2), 410-3 (1999), Yamanaka, Int J Oncol. 24(4), 919-23(2004) e Zwiebel et al, Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001).
As composições de combinação e métodos de administraçãode combinação da presente invenção também podem envolver métodos deimunoterapia de "célula inteira" e "adotiva". Por exemplo, tais métodospodem compreender infusão ou re-infusão de células do sistema imune (porexemplo linfócitos que infiltram tumor (TILs), tais como células T CD4 + e/ouCD8 + (por exemplo células T expandidas com antígenos específicos de tumore/ou realces genéticos), as células B que expressam anticorpo ou outrascélulas que produzem/apresentam anticorpo, células dendríticas (por exemplo,células dendríticas recombinantes que expressam anti-citocina, célulasdendríticas cultivadas com um agente de expansão de DC tal como GM-CSFe/ou Flt3-L e/ou células dendríticas carregadas com antígeno associadas comtumor), células NK anti-tumor, chamadas de células híbridas ou combinaçõesdestas. Os lisados de célula também podem ser úteis em tais métodos ecomposições. As "vacinas" celulares em testes clínicos que podem ser úteisem tais aspectos incluem Canvaxin®, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96(Antigenics) e lisados de célula Melacine®. Antígenos vertidos de célulascancerosas e misturas destes (ver por exemplo Bystryn et al., Clinicai CâncerResearch Vol. 7, 1882-1887, Julho de 2001), opcionalmente misturados comadjuvantes tais como alúmem, também podem ser componentes em taismétodos e as composições de combinação.
Em uma forma de realização, um CD38BP da presenteinvenção pode ser liberado a um paciente em combinação com a aplicação deum método de vacinação interna. A vacinação interna se refere à mortecelular induzida por tumor ou câncer, tal como a morte celular induzida pormedicamento ou induzida por radiação de células de tumor, em um paciente,que tipicamente leva à evocação de uma resposta imune direcionada contra (i)as células de tumor como um todo ou (ii) partes das células de tumorincluindo (a) proteínas, glicoproteínas ou outros produtos secretados, (b)proteínas ou glicoproteínas associadas à membrana ou outros componentesassociados com ou inseridos em membranas e/ou (c) proteínas intracelularesou outros componentes intracelulares. Uma resposta imune induzida pelavacinação interna pode ser humoral (isto é anticorpo - mediado porcomplemento) ou mediado por célula (por exemplo, o desenvolvimento e/ouaumento de linfócitos T citotóxicos endógenos que reconhecem as células detumor internalmente mortas ou partes destas). Além da radioterapia, exemplosnão limitantes de medicamentos e agentes que podem ser usados para induzira dita morte de célula de tumor e vacinação interna são agentesquimioterapêuticos convencionais, inibidores do ciclo celular, medicamentosanti-angiogênese, anticorpos monoclonais, agentes indutores da apoptose einibidores da transdução de sinal.
Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem serrelevantes como agentes terapêuticos para o uso na combinação com osCD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acimasão agentes indutores da diferenciação, ácido retinóico e análogos do ácidoretinóico (tais como ácido retinóico todo trans, ácido 13-eis retinóico eagentes similares), análogos de vitamina D (tais como seocalcitol e agentessimilares), inibidores de ErbB3, ErbB4, IGF-IR, receptor de insulina,PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2, Flt4, FGFRl, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA,TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 e agentessimilares.
Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem serrelevantes como agentes terapêuticos para o uso na combinação com osCD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acimasão catepsina B, atividade de desidrogenase dos moduladores de catepsina D,glutationa-S-transferase (tal como glutacilcisteína sintetase e lactatodesidrogenase) e agentes similares.
Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem serrelevantes como agentes terapêuticos para o uso na combinação com osCD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acimasão estramustina e epirrubicina.
Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem serrelevantes como agentes terapêuticos para o uso na combinação com osCD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acimasão um inibidor de HSP90 como 17-alil amino geld-anamicina, anticorposdirecionados contra um antígeno de tumor tal como PSA, CA125, KSA, etc.,integrinas como integrina βΐ, inibidores de VCAM e agentes similares
Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem serrelevantes como agentes terapêuticos para o uso na combinação com osCD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acimasão inibidores de calcineurina (tais como valspodar, PSC 833 e outrosinibidores de MDR-I ou p-glicoproteína), inibidores de TOR (tais comosirolimus, everolimus e rapamicina). e inibidores de mecanismos de "linfócitoresidente" (tais como FTY720) e agentes com efeitos sobre a sinalizaçãocelular tais como inibidores da molécula de adesão (por exemplo anti-LFA, etc.)
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 emum paciente, método este que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e radioterapia aum paciente em necessidade deste.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP dapresente invenção e radioterapia a um paciente em necessidade deste.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ouso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de umacomposição farmacêutica a ser administrada com radioterapia para tratarmieloma múltiplo.
A radioterapia pode compreender radiação ou a administraçãoassociada de produtos radiofarmacêuticos a um paciente é fornecida. A fontede radiação pode ser externa ou interna em relação ao paciente que é tratado(o tratamento por radiação, por exemplo, pode estar na forma de terapia deradiação por feixe externo (EBRT), braquiterapia (BT) ou radioterapiaalvejada ao esqueleto). Os elementos radioativos que podem ser usados naprática de tais métodos incluem, por exemplo, rádio, césio-13 7, irídio-192,amerício-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodo-123, iodo-131 e índio-111.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 emum paciente, método este que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção a um pacienteem necessidade deste combinada com célula tronco periférica autóloga outransplante de medula óssea.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP dapresente invenção a um paciente em necessidade deste combinada com célulatronco periférica autóloga ou transplante de medula óssea.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ouso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de umacomposição farmacêutica a ser administrada com célula tronco periféricaautóloga ou transplante de medula óssea para tratar mieloma múltiplo.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 emum paciente, método este que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção a um pacienteem necessidade deste combinada com intervenção ortopédica.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ouso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de umacomposição farmacêutica a ser administrada com célula tronco periféricaautóloga ou transplante de medula óssea para tratar mieloma múltiplo.
As intervenções ortopédicas podem ser usadas no tratamentode um distúrbio que envolva células que expressam CD38, tal como mielomamúltiplo, para ajudar a controlar a dor ou reter a função ou mobilidade. Taisintervenções podem incluir terapia física, engessamento de ossos para impedirou tratar fraturas ou procedimentos cirúrgicos (menor ou maior) para repararfraturas.
Em uma forma de realização, um CD38BP da presenteinvenção pode ser administrado em conexão com a liberação de um ou maisagentes que promovam acesso do CD38BP ou composição de combinação aointerior de um tumor. Tais métodos por exemplo podem ser realizados emassociação com a liberação de uma relaxina, que é capaz de abrandar umtumor (ver por exemplo a US 6.719.977). Em uma forma de realização, umCD38BP da presente invenção pode ser ligado a um peptídeo que penetre acélula (CPP). Os peptídeos que penetram a célula e peptídeos relacionados(tais como anticorpos que penetram a célula engendrados) são descritos porexemplo em Zhao et al., J lmmunol Methods. 254(1-2), 137-45 (2001), Honget al., Câncer Res. 60(23), 6551-6 (2000). Lindgren et al., Biochem J. 377(Pt1), 69-76 (2004), Buerger et al., J Câncer Res Clin Oncol. 129(12), 669-75(2003), Pooga et al., FASEB J. 12(1), 67-77 (1998) e Tseng et al., MolPharmacol. 62(4), 864-72 (2002).
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 emum paciente, método este que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e pelo menosum agente anti-inflamatório a um paciente em necessidade deste.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP dapresente invenção e pelo menos um agente anti-inflamatório a um pacienteem necessidade deste.Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ouso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de umacomposição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agente anti-inflamatório para tratar mieloma múltiplo.
Em uma forma de realização uma tal agente anti-inflamatóriopode ser selecionado de um medicamento esteroidal e um NSAID(medicamento anti-inflamatório não esteroidal).
Em uma forma de realização uma tal agente anti-inflamatóriopode ser selecionado de aspirina e outros salicilatos, inibidores de Cox-2 (taiscomo rofecoxib e celecoxib), NSAIDs (tais como ibuprofeno, fenoprofeno,naproxeno, sulindac, diclofenaco, piroxicam, cetoprofeno, diflunisal,nabumetona, etodolac, oxaprozin e indometacina), anticorpos anti-IL6R,anticorpos anti-IL8, anticorpos anti-IL15, anticorpos anti-IL15R, anticorposanti-CD4, anticorpos anti-CDlla (por exemplo, efalizumab), anticorpos deintegrina anti-alfa-4/beta-l (VLA4) (por exemplo, natalizumab), CTLA4-Igpara o tratamento de doenças inflamatórias, prednisolona, prednisona,medicamentos antirreumáticos modificadores de doença (DMARDs) tal comometotrexato, hidroxicloroquina, sulfasalazina, inibidores da síntese depirimidina (tal como leflunomida), agentes bloqueadores do receptor de IL-I(tal como anaquinra), agentes bloqueadores de TNF-α (tais como etanercept,infliximab e adalimumab) e agentes similares.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar um distúrbio que envolva células que expressem CD38 emum paciente, método este que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e pelo menosum agente imunosupressivo e/ou imuno-modulatório a um paciente emnecessidade deste.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP dapresente invenção e pelo menos um agente imuno-supressivo e/ouimunomodulatório a um paciente em necessidade deste.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ouso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de umacomposição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agenteimunossupressivo e/ou imunomodulatório para tratar mieloma múltiplo.
Em uma forma de realização, um tal agente imuno-supressivoe/ou imunomodulatório pode ser selecionado de ciclosporina, azatioprina,ácido micofenólico, micofenolato de mofetila, corticosteróides tais comoprednisona, metotrexato, sais de ouro, sulfasalazina, antimalariais, brequinar,leflunomida, mizoribina, 15-desoxispergualina, 6-mercaptopurina,ciclofosfamida, rapamicina, tacrolimus (FK-506), OKT3, antitimócitoglobulina, timopentina, timosina-α e agentes similares.
Em uma forma de realização, um tal agente imuno-supressivoe/ou imunomodulatório pode ser selecionado de anticorposimunossupressivos, tais como os anticorpos que se ligam a p75 do receptor deIL-2 ou anticorpos que se ligam por exemplo a MHC, CD2, CD3, CD4, CD7,CD28, B7, CD40, CD45, IFNy, TNF-α, LL-4, IL-5, IL-6R, IL-6; IGF, IGFRl,IL-7, IL-8, IL-10, CDlla ou CD58 ou anticorpos que se ligam a seusligandos.
Em uma forma de realização, um tal agente imuno-supressivoe/ou imunomodulatório pode ser selecionados de IL-15R, EL-10 solúveis,moléculas B7 (B7-1, B7-2, variantes destas e fragmentos destas), ICOS e0X40, um inibidor de um regulador de célula T negativo (tal como umanticorpo contra CTLA4) e agentes similares.
Em uma forma de realização, os CD38BPs da presenteinvenção podem ser administrados em combinação com dois ou mais agentesimunossupressivos e/ou imunomodulatórios, tais como em combinação comprednisona e ciclosporina; prednisona, ciclosporina e azatioprina; ouprednisona, ciclosporina e micofenolato de mofetila.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar um distúrbio que envolva células que expressem CD38 emum paciente, método este que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e um anticorpoanti-C3b(i) a um paciente em necessidade deste
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP dapresente invenção e um anticorpo anti-C3b(i) a um paciente em necessidadedeste.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ouso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de umacomposição farmacêutica a ser administrada com um anticorpo anti-C3b(i)para tratar mieloma múltiplo.
Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o usona combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar osdistúrbios como descritos acima pode ser selecionado de inibidores da histonadesacetilase (por exemplo butirato de fenila) e/ou agentes de reparo de DNA(por exemplo enzimas de reparo de DNA e composições relacionadas taiscomo dimericina).
Os métodos da presente invenção para tratar um distúrbiocomo descrito acima que compreende a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção também podecompreender a terapia fotodinâmica direcionada a anticâncer (por exemploterapia a laser anticâncer - que opcionalmente pode ser praticada com o usode agente fotossensibilizante, ver, por exemplo Zhang et ai., J ControlRelease. 93(2), 141-50 (2003)), terapias de onda sonora e onda de choqueanticâncer (ver por exemplo Kambe et al., Hum Cell. 10(1), 87-94 (1997))e/ou terapia nutracêutica anticâncer (ver por exemplo Roudebush et al., VetClin North Am Small Anim Pract. 34(1), 249-69, viii (2004) e Rafi, Nutrition.20(1), 78-82 (2004). Do mesmo modo, um CD38BP da presente invençãopode ser usado para a preparação de uma composição farmacêutica para tratarum distúrbio como descrito acima a ser administrada com a terapiafotodinâmica direcionada a anticâncer (por exemplo terapia a laser anticâncer- que opcionalmente pode ser praticada com o uso de agentefotossensibizante, terapias de onda sonora e onda de choque anticâncer e/outerapia nutracêutica anticâncer.
Como descrito acima, uma composição farmacêutica dapresente invenção pode ser administrada em terapia de combinação, isto é,combinada com um ou mais agentes relevantes para a doença ou condição aser tratada como composições farmacêuticas separadas ou com um compostoda presente invenção co-formulado com um ou mais agentes terapêuticosadicionais como descrito acima. Tais terapias de combinação podem requererdosagens mais baixas do composto da presente invenção e/ou dos agentes co-administrados, evitando assim toxicidades ou complicações possíveisassociadas com as várias monoterapias.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umCD38BP que é conjugado a um imunomodulador, tal como uma citocinaimunomoduladora, fator de crescimento de célula tronco, linfotoxina (talcomo um TNF tal como TNFa) ou um fator hematopoiético. Os exemplos detais moléculas que podem ser úteis como conjugados incluem IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 e IL-21, fatores estimuladores de colônia (taiscomo fatores estimuladores de colônia de granulócito (G-CSF) e fatorestimulador de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF)), interferons(tais como IFNa, IFNP e IFNy) o fator de crescimento de célula troncodesignado "fator SI," eritropoietina e trombopoietina, fragmentos ativosdestes, derivados destes, variantes destes ou uma combinação de qualquer umdestes.
Em uma forma de realização, os CD38BPs da presenteinvenção podem ser usados in vivo ou in vitro para diagnosticar doenças emque as células ativada que expressam CD38 desempenham um papel ativo napatogênese pelos níveis de detecção de CD38 ou níveis de células que contêmCD38 na sua superfície de membrana. Isto pode ser obtido, por exemplo,contatando-se uma amostra a ser testada, opcionalmente junto com umaamostra de controle, com o CD38BP sob condições que permitam a formaçãode um complexo entre o anticorpo e CD38. A formação de complexo é depoisdetectada (por exemplo, usando um ELISA). Quando do uso de uma amostrade controle junto com a amostra de teste, o complexo é detectado em ambasas amostras e qualquer diferença estatisticamente significante na formação decomplexos entre as amostras é indicativa da presença de CD38 na amostra deteste.
Mais especificamente, a presente invenção fornece métodospara a identificação de e diagnóstico de células e tecidos invasivos e outrascélulas alvejadas pelos CD38BPs da presente invenção e para a monitoraçãodo progresso de tratamentos terapêuticos, situação depois do tratamento, riscode desenvolver câncer, progressão de câncer e outros.
Em um exemplo de um tal ensaio de diagnóstico, a presenteinvenção fornece um método de diagnosticar o nível de células invasivas emum tecido que compreende formar um imunocomplexo entre um CD38BP eCD38 potencial contendo tecidos e detectar a formação do imunocomplexo,em que a formação do imunocomplexo correlaciona-se com a presença decélulas invasivas no tecido. O contatar pode ser realizado in vivo, usandoanticorpos isolados rotulados e técnicas de produção de imagem padrão oupode ser realizada in vitro em amostras de tecido.
Os CD38BPs podem ser usados para detectar peptídeos efragmentos de peptídeo contendo CD38 em qualquer amostra biológicaadequada por qualquer técnica adequada. Os exemplos de imunoensaiosconvencionais fornecidos pela presente invenção incluem, sem limitação, umELISA, um RIA, ensaios FACS, ensaios de ressonância de plasma, ensaioscromatográfica, imunoistoquímica de tecido, Western blot e/ouimunoprecipitação usando um CD38BP. Os anticorpos anti-CD38 da presenteinvenção podem ser usados para detectar CD38 e fragmentos CD38 de sereshumanos. Os rótulos adequados para o CD38BP e/ou anticorpos secundáriosusados em tais técnicas incluem, sem limitação, várias enzimas, gruposprotéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiaisradioativos. Os exemplos de enzimas adequadas incluem rábano peroxidase,fosfatase alcalina, p-galactosidase ou acetilcolinesterase; os exemplos decomplexos de grupo protético adequado incluem estreptavidina/biotina eavidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluemumbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina,diclorotriazinil-amina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; umexemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de materialradioativo adequado incluem 1251, 1311, 35S e 3H.
Os CD38BPs também podem ser ensaiados em uma amostrabiológica por um imunoensaio de competição utilizando peptídeo de CD38padrão rotulado com uma substância detectável e um CD38PB não rotulado,tal como um anticorpo anti-CD38 não rotulado, por exemplo. Em um talensaio, a amostra biológica, o(s) peptídeo(s) rotulado(s) de CD38 padrão e oCD38BP são combinados e a quantidade de CD38 padrão rotulado ligado aoCD38BP não rotulado é determinada. A quantidade de peptídeo de CD38 naamostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão CD38rotulado ligado ao CD38BP.
Os CD38BPs são particularmente úteis na formação deimagem in vivo de tumores. A formação de imagem in vivo de tumoresassociados com CD38 pode ser realizada por qualquer técnica adequada. Porexemplo, rotulação com 99Tc ou rotulação com um outro isótopo que imiteraio gama pode ser usado para rotular anticorpos anti-CD38 em tumores oucomplexos secundários rotulados CD38BP:CD38 (por exemplo, FITCrotulado) de tumores e formados em imagem com uma câmera de cintilaçãogama (por exemplo, um dispositivo Elscint Apex 409ECT), tipicamenteusando energia baixa, colimador de alta resolução ou um colimador de baixaenergia com várias finalidades. Os tecidos tingidos podem ser depoisavaliados quanto a contagem de radioatividade como um indicador daquantidade de peptídeos associados com CD38 no tumor. As imagens obtidaspelo uso de tais técnicas podem ser usadas para avaliar a biodistribuição deCD38 em um paciente, mamífero ou tecido, por exemplo no contexto de usarCD38 ou fragmentos de CD38 como um biomarcador quanto a presença decélulas cancerosas invasivas. As variações desta técnica podem incluir o usode formação de imagem pela ressonância magnética (MRI) para melhorar aformação da imagem em relação às técnicas de câmara gama. Os métodos eprincípios da imunocintigrafia similares são descritos, por exemplo, emSrivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging AndTherapy (Plenum Press 1988), Chase, "Medicai Applications ofRadioisotopes," em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição,Gennaro et ai, (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990) e Brown,"Clinicai Use of Monoclonal Antibodies," em Biotechnology And Pharmacy227-49, Pezzuto et ai., (eds.) (Chapman & Hall 1993). Tais imagens tambémpodem ser usadas para a liberação alvejada de outros agentes anticâncer, osexemplos das quais são aqui descritos (por exemplo, agentes apoptóticos,toxinas ou composições de quimioterapia CHOP). Além disso, tais imagenstambém podem ou alternativamente servem como a base para técnicascirúrgicas para remover tumores. Além disso, tais técnicas de formação deimagem in vivo podem permitir a identificação e localização de um tumor emuma situação onde um paciente é identificado como tendo um tumor (devido àpresença de outros biomarcadores, metástases, etc.), mas o tumor não podeser identificado pelas técnicas analíticas tradicionais. Todos estes métodos sãocaracterísticas da presente invenção.
A formação de imagem in vivo e outros métodos dediagnóstico fornecidos pela presente invenção são particularmente úteis nadetecção de micrometastases em um paciente humano (por exemplo, umpaciente não anteriormente diagnosticado com câncer ou um paciente em umperíodo de recuperação/remissão de um câncer). As células cancerosas decarcinoma, que podem compor até 90 % de todas as células cancerosas, porexemplo, demonstraram tingir muito bem com composições conjugadas deanticorpo anti-CD38. A detecção com anticorpos anti-CD38 monoclonais eoutros CD38BPs aqui descritos pode ser indicativa da presença de carcinomasque são agressivas/invasivas e também ou alternativamente fornecem umaindicação da praticabilidade de usar anticorpo anti-CD38 monoclonalrelacionado, CD38BP ou tratamentos com composição relacionada contra taismicrometastases. Além disso, os anticorpos anti-CD38 monoclonais que estãoassociados com células cancerosas são vantajosamente capazes de distinguirtais tecidos e células associados com o câncer de células normais com queoutras formas de CD38 podem estar associadas.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece ummétodo de formação de imagem in vivo em que um CD38BP, tal como umanticorpo anti-CD38, da presente invenção é conjugado a um agente radio-opaco que promova a detecção, o anticorpo conjugado é administrado a umhospedeiro, tal como pela injeção na corrente sangüínea e a presença elocalização do anticorpo rotulado no hospedeiro é ensaiada. Através destatécnica e qualquer outro método de diagnóstico aqui fornecido, a presenteinvenção fornece um método para triar quanto a presença de célulasrelacionadas com doença em um paciente humano ou uma amostra biológicatirada de um paciente humano.
Para a formação de imagem de diagnóstico, radioisótopospodem ser ligados a um CD38BP direta ou indiretamente usando-se um grupofuncional intermediário. Os grupos funcionais intermediários úteis incluemqueladores, tais como ácido etilenodiaminotetraacético e ácidodietilenotriaminopentaacético (ver por exemplo a US 5.057.313). Em taisensaios de diagnóstico que envolvam CD38BPs conjugados a radioisótopo, adosagem de peptídeo conjugado liberado ao paciente tipicamente é mantidoem um nível tão baixo quanto possível através da escolha de isótopo para amelhor combinação de meia-vida mínima, retenção mínima no corpo equantidade mínima de isótopo, que permitirá a detecção e medição precisa.
Além de radioisótopos e agentes radio-opacos, os métodos dediagnóstico podem ser realizados usando CD38BPs que são conjugados aoscorantes (tal como com o complexo de biotina-estreptavidina), agentes decontraste, compostos fluorescentes ou moléculas e agentes realçadores (porexemplo, íons paramagnéticos) para a formação de imagem de ressonânciamagnética (MRI) (ver, por exemplo, a Pat. US N- 6.331.175, que descrevetécnicas de MRI e a preparação de anticorpos conjugados a um agente querealça MRI). Tais agentes de diagnóstico/detecção podem ser selecionados deagentes para o uso na formação de imagem de ressonância magnética ecompostos fluorescentes. De modo a carregar um CD38BP, tal como umanticorpo, componente com metais radioativos ou íons paramagnéticos, podeser necessário reagi-lo com um reagente tendo uma cauda longa à qual sãoligados uma multiplicidade de grupos queladores para a ligação dos íons.
Uma tal cauda pode ser um polímero tal como uma polilisina, polissacarídeoou outra cadeia derivatizada ou derivatizável tendo grupos pendentes aosquais podem ser ligados grupos queladores tais como, por exemplo,porfirinas, poliaminas, éteres coroa, bistiossemicarbazonas, polioximas egrupos equivalentes conhecidos por serem úteis para este propósito. Osquelatos podem ser ligados aos CD38BPs usando as químicas padrão. Umquelato é normalmente ligado a um CD38BP, tal como um mAB anti-CD38,por um grupo, que possibilite a formação de uma ligação à molécula comperda mínima de imunorreatividade e agregação e/ou reticulação internamínimas. Outros, menos usuais, métodos e reagentes para conjugar quelatosaos anticorpos são divulgados por exemplo na US 4.824.659. Os exemplos decombinações de metal-quelato potencialmente úteis incluem 2-benzil-DTPA eseus análogos monometílicos e cicloexílicos, usados com isótopos dediagnóstico na faixa de energia geral de 60 a 4.000 keV, tal como 125I, 123I,124I, 62Cu, 64Cu, 18F, 111In, 67Ga, 67Ga, 99Tc, 94Tc, 11C, 13H, 15O e 78Br, para aformação de radio-imagem. Estes quelatos e quelatos similares, quandocomplexados com metais não radioativos, tais como manganês, ferro egadolínio podem ser úteis para métodos de diagnóstico MRI em conexão comCD38BPs. Os quelatos macrocíclicos tais como NOTA, DOTA e TETA sãode uso com uma variedade de metais e radiometais, o mais particularmentecom radionuclídeos de gálio, ítrio e cobre, respectivamente. Tais complexosde metal-quelato podem ser feitos muito estáveis ajustando-se o tamanho doanel ao metal de interesse. Outros quelatos do tipo anel tal como poliéteresmacrocíclico, que são de interesse para nuclídeos de ligação estável, tal como223Rapara RAIT também podem ser adequados em métodos de diagnóstico.
Assim, a presente invenção fornece conjugados de CD38BP dediagnóstico, em que o CD38BP é conjugado a um agente de contraste (talcomo para a formação de imagem pela ressonância magnética, tomografiacomputadorizada ou agente realçador de contraste por ultra-som) ou umradionuclídeo que pode ser, por exemplo, um isótopo que emita gama, beta,alfa, elétron Auger ou pósitron. Os CD38BPs conjugados úteis adicionais sãodescritos aqui em outro lugar, que também podem ser úteis em métodos ecomposições de diagnóstico (por exemplo, kits de diagnóstico) fornecidospela presente invenção.Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umkit para o diagnóstico de câncer que compreende um recipientecompreendendo um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 e um ou maisreagentes para detectar a ligação do CD38BP a um peptídeo de CD38. Osreagentes podem incluir, por exemplo, rótulos fluorescentes, rótulosenzimáticos ou outros rótulos detectáveis. Os reagentes também podemincluir anticorpos secundários ou terciários ou reagentes para as reaçõesenzimáticas, em que as reações enzimáticas produzem um produto que podeser visualizado. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umkit de diagnóstico que compreende um ou mais CD38BPs, tais como osanticorpos anti-CD38, da presente invenção na forma rotulada ou não rotuladaem recipiente(s) adequado(s), reagentes para as incubações para um ensaioindireto e substratos ou agentes derivatizantes para a detecção em uma talensaio, dependendo da natureza do rótulo. 0(s) reagente(s) de controle e asinstruções para o uso também podem ser incluídos.
Os kits de diagnóstico também podem ser fornecidos para ouso com um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 conjugado/rotulado,para a detecção de uma atividade celular ou para detectar a presença depeptídeos de CD38 em uma amostra de tecido ou hospedeiro. Em tais kits dediagnóstico, assim como em kits para os usos terapêuticos aqui descritos emoutro lugar, um CD38BP tipicamente pode ser fornecido em uma formaliofilizada em um recipiente, sozinho ou em conjunção com anticorposadicionais específicos para uma célula ou peptídeo alvos. Tipicamente, umcarreador farmaceuticamente aceitável (por exemplo, um diluente inerte) e/oucomponentes destes, tal como um tampão de Tris, fosfato ou carbonato,estabilizadores, conservantes, biocidas, biocidas, proteínas inertes, porexemplo, albumina sérica ou semelhante, também são incluídos (tipicamenteem um recipiente separado para mistura) e reagentes adicionais (tambémtipicamente em recipiente(s) separado(s)). Em certos kits, um anticorposecundário capaz de ligar-se ao anticorpo anti-CD38 ou outro CD38BP, quetipicamente está presente em um recipiente separado, também é incluído. Osegundo anticorpo é tipicamente conjugado a um rótulo e formulado namaneira similar ao anticorpo anti-CD38 ou outro CD38BP da presenteinvenção.
Usando os métodos descritos acima e aqui em outro lugarCD38BPs podem ser usados para definir subconjuntos de célulascancerosas/de tumor e caracterizar tais células e tecidos/crescimentosrelacionados.
Em um exemplo, um CD38BP ou anticorpo anti-CD38, podemser adicionados a nitrocelulose ou outro suporte sólido que é capaz deimobilizar células, partículas de célula ou proteínas solúveis. O suporte podeser depois lavado com tampões adequados seguido pelo tratamento com opeptídeo ou anticorpo de CD38 detectavelmente rotulado. O suporte de fasesólida pode ser depois lavado com o tampão uma segunda vez para removerpeptídeo ou anticorpo não ligados. A quantidade de rótulo ligado no suportesólido pode ser depois detectado por etapas de método conhecidas.
As enzimas ligadas que reagem com um substrato expostopodem ser usadas para gerar uma porção química que pode ser detectada, porexemplo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou por meiosvisuais, no contexto de um conjugado e/ou proteína de fusão de CD38BP. Asenzimas que podem ser usadas para rotular detectavelmente CD38BPs eanticorpos anti-CD38 incluem a malato desidrogenase, estafilococo nuclease,delta-5-esteróide isomerase, levedura álcool desidrogenase, alfa-glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, rábano peroxidase,fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidase,ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glicoamilase eacetilcolinesterase. Também é possível rotular um CD38BP com umcomposto fluorescente. Quando o anticorpo rotulado fluorescente é exposto àluz do comprimento de onda apropriado, a sua presença pode ser detectadadevido à fluorescência. Entre os compostos de rotulação fluorescente maishabitualmente usados estão o isotiocianato de fluoresceína, rodamina,ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamina.
Os CD38BPS, tais como os anticorpos anti-CD38, tambémpodem ser detectavelmente rotulados usando metais que emitem fluorescênciatais como 152Eu ou outros da série dos lantanídeos. Estes metais podem serligados a um anticorpo anti-CD38, por exemplo, usando tais gruposqueladores de metal como ácido dietilenotriamino-pentaacético (DTPA) ouácido etilenodiaminotetraacético (EDTA).
Os CD38BPs e anticorpos anti-CD38 também podem serdetectavelmente rotulados pela ligação a um composto quimioluminescente.
A presença do CD38-BP quimioluminescentemente rotulado é depoisdeterminado detectando-se a presença de luminescência que surge durante ocurso de uma reação química. Os exemplos de compostos de rotulaçãoquimioluminescentes particularmente úteis são luminol, isoluminol, ésterteromatic de acridínio, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.
Do mesmo modo, um composto bioluminescente pode serusado para rotular um CD38BP. A bioluminescência é um tipo dequimioluminescência encontrada em sistemas biológicos em que uma proteínacatalítica aumenta a eficiência da reação quimioluminescente. A presença deuma proteína bioluminescente é determinada pela detecção da presença deluminescência. Compostos bioluminescentes importantes para os propósitosde rotulação são luciferina, luciferase e aequorina.
A detecção de um peptídeo ou anticorpo rotulado, fragmentode anticorpo ou derivado pode ser realizada por um contador de cintilação,por exemplo, se o rótulo detectável é um emissor gama radioativo ou por umfluorômetro, por exemplo, se o rótulo é um material fluorescente. No caso deum rótulo de enzima, a detecção pode ser realizada pelos métodoscolorimétricos que utilizam um substrato para a enzima. A detecção tambémpode ser realizada pela comparação visual do grau de reação enzimática deum substrato em comparação com padrões similarmente preparados.
Estas e outras técnicas de diagnóstico podem ser usadas paratriar qualquer material adequado para os peptídeos CD38 ou fragmentosCD38. Os exemplos de materiais que podem ser triados incluem, porexemplo, sangue, soro, linfa, urina, exudado inflamatório, fluidocerebrospinal, fluido amniótico, um extrato de tecido ou homogenado eoutros. Entretanto, a presente invenção não é limitada aos ensaios usandoapenas estas amostras, sendo possível para uma pessoa de habilidade comumna técnica determinar condições adequadas que permitam o uso de outrasamostras.
A detecção in situ pode ser realizada pela remoção de umespécimen histológico de um paciente e fornecendo a combinação deCD38BPs rotulados, tais como os anticorpos anti-CD38, da presente invençãoa um tal espécimen. O CD38BP, anticorpo anti-CD38 (ou fragmento) dapresente invenção pode ser fornecido aplicando-se ou sobrepondo-se oCD38BP rotulado, tal como um anticorpo anti-CD38 rotulado (ou fragmento),da presente invenção a uma amostra biológica. Através do uso de uma talprocedimento, é possível determinar não apenas a presença de CD38 oufragmento de CD38 mas também a distribuição de tais peptídeos no tecidoexaminado (por exemplo, no contexto de avaliar a disseminação de célulascancerosas). Usando a presente invenção, aqueles de habilidade comumfacilmente perceberão que qualquer de uma ampla variedade de métodoshistológicos (tais como procedimentos de tingimento) podem ser modificadosde modo a obter tal detecção in situ.
A presente invenção fornece ainda método de promover avenda e/ou o uso de um CD38BP da presente invenção, que compreendedistribuir informação (tal como por materiais impressos que são distribuídos,enviados pelo correio, etc., pela sinalização de propaganda, pelos programas epropagandas de televisão, pelos programas e propagandas de rádio, peladistribuição em sítio da internet, por e-mail, por telemarqueting, pelacomercialização de porta a porta ou pessoa a pessoa, pelas conferências definanciadas e/ou hosting, painéis, fóruns, etc., pela utilização e/ou contrataçãopara os serviços de vendedor e/ou propagandistas médicos/científicos, pelaspesquisas e publicações científicas financiadas e/ou patrocinadas epublicações relacionadas com tais usos, etc.) relacionadas com o uso docomposto na prevenção ou tratamento de qualquer condição ou combinaçãode condições como descrito aqui em outro lugar a qualquer pessoa ouentidade de interesse potencial (tais como cadeias farmacêuticas,administradores de fórmulas, companhias de segurança, HMOs, hospitais ecadeias de hospital, outras companhias de cuidado de saúde, administradoresde benefício de farmácia, pacientes potenciais, pacientes com câncer,pacientes com câncer precedentes, pacientes em remissão, médicos decuidados primários, enfermeiras, doutores de farmácia e/ou líderes de opiniãochave).
A presente invenção também fornece kits que compreendemuma composição farmacêutica de um composto da presente invenção einstruções para o uso. O kit pode conter ainda um ou mais agentes adicionais,tais como um reagente imunossupressivo, um reagente quimioterapêutico, umagente anti-inflamatório ou um agente radiotóxico como descrito acima ou umou mais CD38BPs adicionais da presente invenção (tal como um CD38BPtendo uma atividade complementar). Um kit da presente invenção tambémpode incluir agentes de diagnóstico e/ou outros agentes terapêuticos. Em umaforma de realização, um kit da presente invenção inclui um CD38BP dapresente invenção e um agente de diagnóstico que possa ser usado em ummétodo de diagnóstico para diagnosticar o estado ou existência de umdistúrbio que envolva células que expressem CD38 em um paciente. Em umaforma de realização, o kit inclui um CD38BP da presente invenção em umaforma altamente estável (tal como em uma forma liofilizada) em combinaçãocom carreador(es) farmaceuticamente aceitável(is) que pode(m) sermisturado(s) com a composição altamente estável para forma umacomposição injetável.
Todas as referências, incluindo publicações, pedidos depatente e patentes, aqui citadas são por meio deste incorporadas por referênciaao mesmo grau como se cada referência fosse individual e especificamenteindicada como estando incorporada por referência e fosse apresentada aquiem sua totalidade.
Todos os cabeçalhos e sub-cabeçalhos são aqui usados apenaspor conveniência e não devem ser interpretados como limitando a presenteinvenção de nenhum modo.
Qualquer combinação dos elementos descritos acima em todasas variações possíveis destes é abrangida pela presente invenção a menos quede outro modo estabelecido aqui indicado ou de outro modo estabelecidoclaramente contradito pelo contexto.
O uso dos termos "um" e "uma" e "o" e "a" e referentessimilares no contexto de descrever a presente invenção devem serinterpretados para abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que deoutro modo estabelecido aqui indicado ou claramente contradito pelocontexto.
A recitação de faixas de valores aqui é meramenteintencionada a servir como um método resumido de aludir individualmente acada valor separado que caia dentro da faixa, a menos que de outro modoestabelecido aqui indicado e cada valor separado é incorporado no relatóriodescritivo como se fossem individualmente aqui relatado. A menos que deoutro modo estabelecido, todos os valores exatos são aqui fornecidosrepresentativos dos valores aproximados correspondentes (por exemplo, todosos valores exemplares exatos fornecidos com respeito a um fator ou medidaparticular pode ser considerada fornecer também uma medida aproximadacorrespondente, modificada por "cerca de," onde apropriado).
Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados emqualquer ordem adequada a menos que de outro modo estabelecido aquiindicado ou de outro modo estabelecido claramente contradito pelo contexto.
O uso de qualquer e de todos os exemplos ou linguagemexemplar (por exemplo, "tal como") aqui fornecidos, é intencionadomeramente a esclarecer melhor a presente invenção e não propõem umalimitação do escopo da presente invenção a menos que de outro modoestabelecido indicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve serinterpretada como indicando que qualquer elemento seja essencial para aprática da presente invenção a menos que outro tanto for explicitamenteestabelecido.
A citação e incorporação de documentos de patente aqui é feitaapenas por conveniência e não refletem qualquer aspecto da validade,patenteabilidade e/ou obrigatoriedade de tais documentos de patente.
A descrição aqui de qualquer forma de realização da presenteinvenção usando termos tais como "que compreende", "tendo," "incluindo,"ou "contendo" com referência a um elemento ou elementos é intencionada afornecer suporte quanto a uma forma de realização similar da presenteinvenção que "consiste de", "consiste essencialmente de" ou"substancialmente compreendendo" que elemento ou elementos particulares,a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelocontexto (por exemplo, uma composição aqui descrita como compreendendoum elemento particular deve ser entendido como também descrevendo umacomposição que consiste daquele elemento, a menos que de outro modoestabelecido ou claramente contradito pelo contexto).
A presente invenção inclui todas as modificações eequivalentes da matéria objeto declarada nas formas de realização aquiapresentadas ao grau máximo permitido pela lei aplicável.
Todas as patentes, pedidos de patente pendentes e outraspublicações aqui citados são por meio deste incorporados por referência emsua totalidade.
A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintesexemplos que não devem ser interpretados como limitantes.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1
Fabricação de células transfectadas com luciferase (Daudi-Iuc)
A cultura de células Daudi (que se originam do linfoma deBurkitt) foi cultivada em meio de cultura de RPMI 1640 suplementado com10 % de FCS (Optimum C241, Wisent Inc., St. Bruno, QC, Canadá), 2 mMde L-glutamina, 100 IU/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 1mM de piruvato de sódio (todos derivados da Gibco BRL, Life Technologies,Paisley, Escócia). O meio foi renovado duas vezes por semana. Antes datransfecção, as células foram divididas e semeadas de 1 a 1,5 χ 106 células/mlpara garantir a viabilidade e crescimento ótimo.
Transfecção de Luciferase
8,2 χ IO6 células CD38 + Daudi foram coletadas em 350 μΐ deRPMI (suplementado com 10 % de dFCS, Gibco BRL) e transferidas a umacubeta de eletroporação (Biorad, Hemel Hempstead, Herts, UK). Depois, 40μg de gWIZ luciferase da GTS (Aldevron, Fargo, ND, USA) e 10 μg de vetorpPur (BD Biosciences, Alfen a/d Rijn, Países Baixos), que confere resistênciaà puromicina, foram adicionados. Depois de repousar as células em gelo por10 minutos, as células foram eletroporadas (250 V, 950 NF; Gene Pulser H,Biorad Laboratories GmbH, Munchen, Alemanha). As células foram maisuma vez repousadas em gelo e coletadas em 40 ml de RPMI (suplementadocom 10 % de FCS). Depois, as células foram plaqueadas em placas de culturade tecido de 96 reservatórios (100 μΐ por reservatório). Depois de 48 horas,puromicina (concentração final: 1 μ§/ηι1; Sigma-Aldrich Chemie BV,Zwijndrecht, Países Baixos) foi adicionada. Os clones resistentes àpuromicina foram cultivados ainda em placas de cultura de tecido de 24reservatórios.
Determinação da atividade de luciferase
A atividade de luciferase das células foi determinada usando oSistema de Ensaio de Luciferase (#E4030, Promega, Madison, WI, USA). 1 χIO6 células foram centrifugadas (13.500 rpm, 1 min) em uma centrífugaeppendorf e a pelota foi lavada em 100 μΐ de PB S. Depois da centrifugação(13.500 rpm, 1 min), a pelota foi lisada com 20 μΐ de Tampão de LiseRepórter (Promega), congelados e descongelados. Depois da centrifugação(13.500 rpm, 1 min), os 20 μΐ de sobrenadante foram descartados e 100 μΐ dereagente de ensaio de luciferase foram adicionados (em tubos de luminômetroespeciais, Promega). A luminescência foi medida (10 s) em um luminômetro(LB9507, Berthold, Vilvoorde, Bélgica).
EXEMPLO 2
Imunização de camundongos e geração de hibridomasProtocolo de imunização para -003
Camundongos HCo 12 foram imunizados a cada quinzena com20 μg de HA-CD38 purificado. A primeira imunização foi realizada i.p. napresença de 100 μΐ de PBS, misturados com 100 μΐ de adjuvante de Freundcompleto (CFA). Depois desta primeira imunização, reforços subseqüentes(13x) com HA-CD38 purificado foram realizados na presença de 100 μΐ dePBS, misturados com 100 μΐ de adjuvante de Freund incompleto (IFA)alternando s.c. e i.p. Depois do desenvolvimento do título, os camundongosforam reforçados com 20 μg de HA-CD38 em PBS, i.v.
Protocolo de imunização para -005 e -024
Camundongos HCo 12 foram imunizados a cada quinzena com20 μ§ de HA-CD38 purificado alternando com células transfectadas comNIH-3T3-CD38. A primeira imunização foi realizada com 5 χ IO6 células em100 μΐ de PBS, misturados com 100 μΐ de CFA, i.p., a segunda imunização eas seguintes com HA-CD38 s.c., na presença de 100 μΐ de PBS, misturadoscom 100 μΐ de IFA. As imunizações seguintes com células transfectadasforam realizadas na presença de 200 μΐ de PBS. Depois do desenvolvimentodo título, os camundongos foram reforçados com 20 μg de HA-CD38 emPBS, i.v.
Generação de Hibridomas Que Produzem Anticorpos
Monoclonais Humanos para CD38
Os esplenócitos de camundongo foram isolados a partir decamundongos HCo 12 e fundidos com PEG em uma linhagem de célula demieloma de camundongo com base em protocolos padrão. Os hibridomasresultantes foram depois triados quanto a produção de anticorpo humano peloELISA e quanto a especificidade de CD38 usando células NS/0 transfectadascom CD38 humano pela análise de FACS e ligação de proteína HA-CD38recombinante pelo ELISA. Três linhagens de célula de hibridoma foramselecionadas que expressam os anticorpos anti-CD38 monoclonais humanos, -003, -005 e -024, respectivamente.
EXEMPLO 3
Transfecção de células NIH com CD38
O vetor (pclpuroCD38) para produzir células NIH-3T3-CD38foi obtido do Prof. M. Glennie (Tenovus Research Laboratory, SouthamptonGeneral Hospital, Southampton, UK). As células NIH-3T3 (DSMZ, ACC 59;150.000 células/reservatório; 0,5 ml; placas de fundo chato de 96reservatórios, Greiner) foram cultivadas e DMEM (suplementado com glicose[4,5 g/l de FCS a 10 %, L-glutamina, Na-piruvato; BioWhittaker) por 24 h.
Depois, DNA (0,8 μg) e lipofectamina (Invitrogen, Breda, Países Baixos)foram diluídos em DMEM e misturados (20 min, temperatura ambiente).Depois disso, a mistura (100 μΐ) foi adicionada a cada reservatório e incubada(durante a noite, 37°C).
Triagem quanto à expressão de CD38
Células NIH-3T3-CD38 foram lavadas (em 1 ml de PBS) etripsinizadas (200 μΐ, tripsina-EDTA, BioWhittaker). Depois, 1 ml de DMEMfoi adicionado e a mistura pipetada em tubos FACS. Depois da centrifugação(1200 rpm, 5 min), as células foram lavadas em Tampão de FACS (FB; PBS,0,05 % de BSA, 0,02 % de NaNs) e recolocadas em suspensão em 1 ml deFB. Depois da centrifugação (1200 rpm, 5 min), o sobrenadante foi removidoe PE anti-CD38 humano de camundongo foi adicionado (diluição 1/50,Sanquin, Amsterdam, Países Baixos). Depois de lavar as células duas vezesem FB5 as células foram recolocadas em suspensão em FB para a aquisiçãopela citometria de fluxo.
Expansão e seleção
Depois do tratamento com tripsina, as células foramtransferidas para frascos T25 (Greiner) em DMEM (suplementado comglicose 4,5 g/l, 2 mM de L-glutamina e puromicina (2 μg/ml) BioWhittaker).
As células resistentes a puromicina foram testadas quanto a expressão deCD38 estável pela citometria de fluxo depois de duas semanas em meiocontendo puromicina. As células NIH-3T3-CD38 selecionadas foramsubclonadas pela diluição limitante. Depois de expandir estas células, todos os15 clones NIH-3T3-CD38 foram triados quanto à expressão de CD38. Ascélulas NIH-3T3-CD38 de CD38 alto foram congeladas em nitrogênio líquido(-80°C) até o uso.
Cultura de células NIH-3T3-CD38
As células são cultivadas em DMEM (suplementado comglicose (4,5 g/l), 10 % de FCS, 2 mM de L-glutamina, Na-piruvato,penicilina, estreptomicina). As células são passadas duas vezes por semanapelo uso de tripsina/EDTA e semeadas em uma concentração de 1 χ IO6células/frasco T75. As células NIH-3T3-CD38 com CD38alto foramcongeladas em nitrogênio líquido (-80°C) até o uso.
Purificação de antígeno HA de CD38
Sepharose 4B (Amersham Bioscience, Uppsala, Suécia) foiligado com anticorpo anti-CD38 (Serotec, Oxford, UK). A coluna (tubo decoluna HR5/20 foi empacotado até 12 cm de altura de leito, volume da coluna2,4 ml; taxa de fluxo máxima 0,5 ml/min) foi equilibrada com pelo menos 5volumes da coluna (CV) de PBS. A amostra foi filtrada e carregada na coluna. A coluna foi lavada com PBS até que o sinal retornou para areferência (aproximadamente 3 CV). A eluição foi realizada com 0,1 M deglicina no pH 2. As Frações eluídas foram neutralizadas com 1 % (v/v) deTris-HCl 2 M, pH 9.
Purificação de anticorpos anti-CD38
Os anticorpos anti-CD38 humanos foram purificados a partirde sobrenadantes de cultura de tecido. Primeiro, os sobrenadantes foramfiltrados em filtro sem saída de 0,20 μΜ. Depois, o sobrenadante foicarregado em uma coluna de 5 ml de Proteína A (rProteína A FF, AmershamBioscience) e eluído com ácido cítrico 0,1 M-NaOH, pH 3. O eluído foiimediatamente neutralizado com 2 M de Tris-HCl, pH 9 e dialisado O/N a12,6 mM de fosfato de sódio, 140 mM de NaCl, pH 7,4 (B. Braun, Oss,Países Baixos). Depois as amostras de diálise foram filtradas estéreis em filtrosem saída de 0,20 μΜ.
Purificação de lotes de His-CD38
A proteína está presente em sobrenadante de cultura de célulade células His que expressam CD38, com uma construção de DNA contendoa seqüência para o domínio extracelular de CD38. Uma seqüência de rótulopoli-His adicional é incluída nas construções e presente no terminal N daproteína. Este rótulo possibilita a purificação com cromatografia de afinidadede metal imobilizada. Neste processo, um quelador fixo na resinacromatográfica é carregado com cátions Co2+. Particularmente, uma seqüênciaque inclui 6 aminoácidos de histidina liga Co fortemente. Portanto asproteínas CD38 rotuladas com His ligam-se fortemente a uma tal coluna,enquanto que as outras proteínas presentes no sobrenadante de cultura fluiráatravés da coluna ou será retirada por lavagem. As proteínas CD38 rotuladascom His fortemente ligadas são depois eluídas com um tampão contendoimidazol, que compete com a ligação de His ao Co . Quando suficiente His-CD38 é purificado, o eluente é removido da proteína pela troca de tampão emuma coluna de dessalinização.
EXEMPLO 4
Ligação de -003, -005 e -024 às células CHO transfectadascom CD38 (CHO-CD38), às células Daudi-Iuc e às células de tumor demieloma múltiplo (MM) frescas
Depois da colheita e contagem, as células Daudi-luc, as célulasCHO transfectadas com CD38 e as células CHO de controle foramrecolocadas em suspensão em PBS (1 χ IO6 células/ml). Depois, as célulasforam colocadas em placas de fundo V em 96 reservatórios (100μΐ/reservatório) e lavadas duas vezes em PBS-BSA (PBS suplementado com0,1 % de BSA e 0,02 % de Na-azida). Depois disso, 50 μΐ de solução deanticorpo em PBS-BSA foram adicionados às células (4°C, 30 min). Depoisde lavar três vezes em PBS-BSA, 50 μΐ (diluição de 1:400) de IgG-FITC anti-humano de coelho em PBS-BSA foram adicionados (4°C no escuro, 30 min).
As células foram lavadas três vezes e a ligação específica de CD38-anticorposà CHO-CD38 e células Daudi-luc foi detectada pela citometria de fluxo.HuMabKLH (um anticorpo monoclonal humano contra KLH (hemocianinado lapa buraco de fechadura) gerada pela Genmab B.V., Utrecht, PaísesBaixos pelo uso dos protocolos de imunização descritos aqui em outro lugar)foi usado como um controle. As Figuras 1 e 2 mostram que -003, -005 e -024ligam-se às células CHO-CD38 e às células Daudi-luc, se bem que com EC5Qdiferentes (Tabela 1). Nenhuma ligação às células CHO de controle éobservada (dados não mostrados).
As células de tumor MM frescas foram obtidas do Dr.Lokhorst (University Medicai Center Utrecht, Utrecht, Países Baixos. Ascélulas de tumor foram isoladas da medula óssea de pacientes com mielomamúltiplo pela centrifugação de gradiente Ficoll (Bio Whittaker; meio deseparação de linfócito, cat 17-829E). Depois da colheita e contagem, ascélulas MM (100.000 células/reservatório) foram recolocadas em suspensãocom 25 μΐ de anticorpos específicos de CD38 rotulados com FITC e 25 μΐ deCD138. Depois da incubação (4°C, 30 min), as células foram lavadas emPBS-BSA e IgG anti-camundongo de cabra rotulada com de PE (1:200;Jackson ImmunoResearch Europe Ltd. Soham, UK) foi adicionada. Depois daincubação (4°C, 30 min) e lavagem das células em PBS-BSA, a fluorescênciafoi medida pela citometria de fluxo.
A Figura 3 mostra que -003, -005 e -024 ligam as células MM.
Tabela 1 - valores EC50S da ligação de anticorpos anti CD38 em células CHO-CD38, células Daudi-Iuc e células de tumor de MM frescas.
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EXEMPLO 5
Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo
As células Daudi-luc, células de tumor múltiplo de mielomafrescas, células de tumor de Leucemia de Célula Plasmática frescas e ascélulas de mieloma múltiplo JK6L e AMO-I foram coletadas (5 χ IO6 células)em RPMI (meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10 % de soro debezerro cósmico (HyClone, Logan, UT5 USA)), aos quais 100 pCi de 51Cr(Cromo-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, PaísesBaixos) foram adicionados e a mistura foi incubada em um banho de água a37°C por 1 hora. Depois de lavar as células (duas vezes em PBS5 1500 rpm, 5min), as células foram recolocadas em suspensão em RPMI+ + e contadas pelaexclusão em azul de tripan. As células foram levadas à concentração de 1 χIO5 células/ml.
Preparação de células efetoras
As células mononucleares do sangue periférico frescas(voluntários saudáveis, UMC Utrecht, Utrecht, Países Baixos) foram isoladasde 40 ml de sangue heparinizado pelo Ficoll (Bio Whittaker; meio deseparação de linfócito, cat 17-829E) de acordo com as instruções dofabricante. Depois de recolocar em suspensão as células em RPMjTh", ascélulas foram contadas pela exclusão em azul de tripano e levadas àconcentração de 1 χ 10 células/ml.
Ajuste ADCC
50 μΐ de células alvo rotuladas com 51Cr foram pipetadas emplacas de 96 reservatórios e 50 μΐ de anticorpo foram adicionados, diluídosem RPMI+ + (concentrações finais 10, 1, 0,1, 0,01 μg/ml). As células foramincubadas (temperatura ambiente, 15 min) e 50 μΐ de células efetoras foramadicionados, resultando em uma razão de alvejamento efetor de 100:1 (para adeterminação de Iise máxima, 100 μΐ de Triton-XlOO a 5 % foramadicionados ao invés das células efetoras; para a determinação da Iiseespontânea, 50 μΐ de células alvo e 100 μΐ de RPMI+* foram usados). Ascélulas foram giradas (500 rpm, 5 min) e incubadas (37°C, 5 % de CO2, 4horas). Depois de girar as células (1500 rpm, 5 min), 100 μΐ de sobrenadanteforam colhidos em tubos micrônicos e contados em contador gama. Aporcentagem de Iise específica foi calculada como segue:
(cpm amostra - cpm células alvos apenas)/(cpm Iise máxima - cpmcélulas alvos apenas) em que cpm é contagem por minuto.
Em células Daudi-Iuc (Figura 4 e Tabela 2) -003, -005 e -024induzem a Iise pela ADCC e -003 e -005 desempenham levemente melhor doque rituximab (mAb anti-CD20). Interessantemente, também quando célulasde tumor de mieloma múltiplo frescas (obtidas do Dr. H. Lokhorst, UMCU,Países Baixos) são usadas como células alvo, ADCC é induzida por -003, -005 e -024 (Figura 5A e Tabela 2).
Tabela 2 - Valores de EC50 de anticorpos específicos de CD38 obtidos em ADCC
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Enriquecimento de células mononucleares do sangueperiférico human Erlangen
Sangue humano de voluntários humanos (University Erlangen,Erlangen, Alemanha) foi diluído duas vezes em RPMI 1640 e as célulassangüíneas foram dispostas em camadas em Ficoll (Meio de separação delinfócito 1077 g/ml, 710 g, temperatura ambiente, 20 min; BioWhittaker,Cambrex Bio Science Verviers, Verviers, Bélgica, cat. 17-829E, lote no. 014832). As células mononucleares de sangue periférico (MNCs) foram coletadasda interfase, lavadas e recolocadas em suspensão em meio de cultura deRPMI 1640 suplementado com 10 % de FCS, 2 mM de L-glutamina, 5 U/mlde penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina (todas derivadas de BioWhittaker)ao qual 25 mM de HEPES (BioWhittaker) foi adicionado.
Ajuste ADCC II
As células B alvo (células de tumor de leucemia de célulaplasmática frescas, linhagens de célula B JK6L e AMO-1, obtidas do Dr. T.Valerius, University of Erlangen, Erlangen, Alemanha) foram rotuladas com20 μΟ de 51Cr (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) por 2 horas. Depoisde lavagem extensiva em RPMI-10, as células foram ajustadas a 1 χ IO5células/ml. MNCs (50 μΐ), anticorpos sensibilizadores (50 μΐ) e RPMI-10 (50μΐ) foram adicionados às placas de microtítulo de fundo redondo (GreinerBio-A GmbH, Frickenhausen, Alemanha). Os ensaios foram iniciados pelaadição de células de tumor de leucemia de célula plasmática frescas, célulasJK6L ou AMO-I (50 μΐ) dando um volume final de 200 μΐ. Uma razão deefetor para alvejador (E:T) de 40:1 foi usada. Depois da incubação (3 horas,37°C), os ensaios foram interrompidos pela centrifugação e a liberação de51Cr a partir de triplicatas foi medida em contagens por minuto (cpm) em umcontador de cintilação. A porcentagem de citotoxicidade celular foi calculadausando a seguinte fórmula:
% de Iise específica = (cpm experimental - cpm basal)/(cpmmáximo - cpm basal) χ 100
com a liberação de 51Cr máxima determinada pela adição deácido perclórico (3 % da concentração final) para alvejar as células e aliberação basal foi medida na ausência de anticorpos sensibilizantes e célulasefetoras.
Em ambas as linhagens de célula de mieloma múltiplo (isto éJK6L e AMO-1), a Iise é induzida tanto com -003 quanto com -005 (Figuras 6e 7), mesmo quando a expressão de CD38 é baixa (linhagem de célula AMO-1).
-003, -005 e -024 induzem ADCC de células de tumorprimário de leucemia de célula plasmática (Figura 5B).
EXEMPLO 6
Citotoxicidade dependente de complemento
Depois da colheita e contagem de células Daudi-luc, aviabilidade das células deve ser de 90 %. Depois da lavagem (PBS), as célulassão recolocadas em suspensão a 2,0 χ IO6 células/ml em RPMI-B (RPMIsuplementado com 1 % de BSA). Depois disso, as células são colocadas emplacas de fundo redondo de 96 reservatórios a 1 χ IO5 células/reservatório (50μΐ/reservatório). Depois, 50 μΐ de anticorpos são adicionados aosreservatórios (faixa de concentração final entre 0 e 100 μ&/ηι1 (diluições emRPMI-B)). Depois da incubação (temperatura ambiente, 15 min), 11 μΐ desoro humano reunido (reunião de 18 doadores saudáveis) foram adicionados acada reservatório (37°C, 45 min). Os reservatórios foram recolocados emsuspensão uma vez e 120 μΐ foram transferidos para tubos FACS (Greiner).Depois, 10 μΐ de iodeto de propídio (PI; Sigma-Aldrich Chemie B.V.) foramadicionados (10 ug/ml de solução) a esta suspensão. A Iise foi detectada pelacitometria de fluxo (FACScalibur®, Becton Dickinson, San Diego, CA, USA)pela medição da porcentagem de células mortas (corresponde a célulaspositivas em PI).
A Figura 8 e a Tabela 2 mostram que a Iise de células Daudi-Iuc é induzida por -005 (-60 % de Iise máxima) e que a Iise por -003 é apenasobservada em concentrações de anticorpo muito altas. -024 não induz CDCem células Daudi (dados não mostrados). Em células CHO-CD38, a Iise éinduzida tanto por -003, -005 quanto -024 (Figura 9 e Tabela 3). A Iise por -003 é induzida em concentrações mais altas. Em células de tumor (todasobtidas do Dr. Lokhorst e Dr. Bloem, University Medicai Center Utrecht,Países Baixos), obtidas de pacientes MM diferentes (A: células de tumorrefratárias a 3 %, B: células de tumor refratárias a 9 %, C: células de tumor de30 a 40 % e D: células de tumor a 70 %), a Iise mediada por CDC é observadana presença de -005, mas não na presença de -003 (Figura 10). -024 tambéminduziu a Iise de células de tumor MM (Figura 10E).
Tabela 3 - valores EC50 de anticorpos específicos de CD38 obtidos em CDCanticorpos específicos de CD38 EC50 Daudi-Iuc EC50 CD38-CHO
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EXEMPLO 7
Estudos de bloco cruzado usando FACS
As células CHO-CD38 foram incubadas com um excesso deanticorpo específico de CD38 não rotulado (4°C, 15 min). Depois, as célulasforam incubadas com anticorpos específicos de CD38 rotulados com FITC (aconcentração aproxima-se de EC90, 4°C, 45 min). Depois de lavar duas vezesas células com PBS-BSA, a fluorescência foi medida pela citometria de fluxo.A Figura 11 mostra que -003 não rotulado bloqueia a ligação de -003 rotuladocom FITC, ao passo que a ligação de -005 rotulado com FITC não ébloqueada. Também -005 não rotulado bloqueia a ligação de -005 rotuladocom FITC, ao passo que a ligação de -003 rotulado com FITC não ébloqueado. -003 e -005 liga-se a epítopos diferentes, porque eles nãocompetem quanto à ligação.
EXEMPLO 8
Estudos de bloqueio cruzado usando ELISACD38 humano solúvel é revestido na superfície de uma placade ELISA, revestida com CD38 é incubada com um excesso de anticorposespecíficos de CD38 não rotulado por cerca de 15 minutos esubseqüentemente anticorpos específicos de CD38 biotinilados sãoadicionados (a concentração aproxima-se de EC90, temperatura ambiente, 1hora). Depois de lavar três vezes com PBS/Tween, a estreptavidina conjugadaa rábano peroxidase (HRP) é adicionada e a mistura é incubada por 1 hora natemperatura ambiente. O complexo pode ser detectado pela adição de umasolução de ABTS e a conversão de substrato mediada por HRP é medidausando um leitor de ELISA na OD 405 nm.
EXEMPLO 9
Estudos de bloqueio cruzado usando ELISA intercaladoOs anticorpos específicos de CD38 são revestidos nasuperfície de uma placa de ELISA. Os anticorpos ligados às placas sãoincubados com CD38 solúvel biotinilado na presença de um excesso deanticorpos específicos de CD38 na fase fluídica. Depois de lavar comPBS/Tween, CD38 biotinilado ligado é detectado com estreptavidinaconjugada com HRP por 1 hora na temperatura ambiente. Este complexo podeser detectado pela adição de uma solução de ABTS (depois de lavar comPBS/Tween) e a conversão de substrato mediada por HRP é medida usandouma leitora de ELISA na OD 405 nm.
EXEMPLO 10
Reatividade com um painel de tecidos humanos e reatividadecruzada com tecido cinomolgo pela imunoistoquímica
As seções de tecido humano congelado (obtida do Dr. H.Niessen, Free University Medicai Center, Amsterdam, Países Baixos) outecido de macaco (Inveresk Research, Glasgow, Escócia) foram cortadas às 6pm e secadas ao ar durante a noite. Estas seções criostáticas foram fixadas emacetona (temperatura ambiente, 10 min) e secada ao ar (aprox. 5 min). Depoisdisso, as seções foram incubadas com Ix de tampão de ácido cítrico/fosfatocontendo 0,1 % de H2O2 (pH 5,8; Sigma), para bloquear peroxidase endógena.
Depois de 20 min na temperatura ambiente, as seções foram lavadas duasvezes com PBS e 0,05 % de Tween-20 (PBST, temperatura ambiente, 5 min;Riedel de-Haen, Alemanha). Depois, as seções foram incubadas com avidina(temperatura ambiente, 15 min; DAKO, Glostrup, Dinamarca), lavada duasvezes com PBST e incubadas com biotina (temperatura ambiente, 15 min;DAKO) para bloquear biotina endógena. Depois de lavar as seções duas vezescom PBST, as seções foram pré-incubadas com PBST (PBST suplementadocom 10 % de soro humano normal (NHS, CLB, Amsterdam, Países Baixos) e10 % de soro de cabra normal (NGS; DAKO) (temperatura ambiente, 20min). Depois do manchamento do soro na pre-incubação, as seções foramincubadas com anticorpo primário rotulado com FITC diluído em 2 % dePBST+* nas concentrações indicadas (temperatura ambiente, 60 min). Depoisdisso, as seções foram incubadas com anti-FITC de coelho (1:1000; DAKO)em 2 % de PBSTh" (temperatura ambiente, 30 min). Depois de lavar as seçõescom PBST, as seções foram incubadas com cabra-anti-coelho-biotina (1:400;DAKO) em 2 % de PBST+* (temperatura ambiente, 30 min). Depois, asseções foram lavadas e incubadas com SABC-HRP (1:100; DAKO) em 2 %de PB S Thf (temperatura ambiente, 30 min). Depois de lavar as seções duasvezes em PB ST, estas foram incubadas (temperatura ambiente, 10 min) comamino-etil-carbazol solução de desenvolvimento de (AEC) (50 mM detampão de acetato, pH 4,9, 0,01 % de H2O2; Riedel-de-Haen). Finalmente, asseções foram lavadas em millipore H2O (5 min) e contra tingida comhematoxilina (DAKO). Pelo uso de glicergel (37°C), as seções foram fixadascom lamínulas de cobertura e estudadas pelo microscópio ótico (Axiovision-2; Zeiss, Thornwood, NY, USA).
O epitélio brônquico é tingido com -003 e -005 (Figuras 12B e13B) assim como o músculo estriado (miócitos, Figuras 12C e 13C),macrófagos, linfócitos e células B plasmáticas (Figuras 12A e 13A). -024 temum tingimento similar de músculo estriado e epitélio brônquico, mas otingimento foi menos intenso. Nenhum tingimento de células endoteliais éobservado, nem com -003 (Fig 14D), -005 (14E) nem -024 (dados nãomostrados), ao passo que tingimento evidente foi observado com osanticorpos positivos de controle contra marcadores de célula endotelial CD31(Fig 14A) e νWF (14B). Anti-KLH foi usado como anticorpo de controlenegativo (Fig 14C). -003 (Figura 12D) e -024 (dados não mostrados) mas não-005 (Figura 13D) reagem cruzado com tecido linfóide de macaco cinomolgo.
EXEMPLO 11
Reatividade cruzada com células mononucleares do sangueperiférico (PBMCs) de macaco cinomolgo ou rhesus pela citometria de fluxo
5 ml de sangue periférico de macaco cinomolgo (InvereskResearch) foram lisados pela adição de 4,5 ml de tampão de choque (1,7 mMde NH4Cl, 1 mM de EDTA), 40 ml de H2O e 450 μΐ de KHCO3 a 10 %.Depois da hemólise as células foram centrifugadas (1200 rpm, 10 min) elavadas três vezes em PB S. Depois da contagem das células com azul detripano, as células foram recolocadas em suspensão em PBS-BSA (1 χ IO6células/ml).
17,5 ml de sangue periférico de macaco rhesus (BPRC,Rijswijk, Países Baixos) foram diluídos 1:1 com RPMI 1640 e dispostos emcamadas em Ficoll (1,077 g/ml; BioWhittaker, cat. 17829E, lote no. 0148 32).
Depois da centrifugação (710 g, temperatura ambiente, 20 min), a interfase foicoletada e lavada duas vezes em RPMI. Depois da última lavagem as célulasforam recolocadas em suspensão em RPMI 1640 a uma concentração de 1 χIO5 células/50 μΐ.
As células foram transferidas para placa de 96 reservatórios(100.000 PBMCs/reservatório), lavadas em tampão FACS (PBS, 0,05 % deBSA, 0,02 % de NaN3) e incubadas com os anticorpos primários (4°C, 30min). Depois de lavar em PBS-BSA, 50 μΐ de rb-anti-hlgG rotulado comFITC (DAKO, Glostrup, Dinamarca) foram adicionados (4°C, 30 min).
Finalmente, as células foram coletadas em tubos FACS em um volume totalde 150 μΐ. As amostras foram medidas e analisadas pelo uso de FACScalibur®(Becton Dickinson, San Diego, CA, USA).
Com a citometria de fluxo a reatividade cruzada de -003 emlinfócitos (Figura 15A) e monócitos (Figura 15B) cinomolgos foi mostrada,mas não a de -005. Também em macacos rhesus, a reatividade cruzada de -003 foi observada em células mononucleares, mas não de -005 (Figura 15C).
EXEMPLO 12
Experimentos de Internalização
Células CHO-CD38 foram tingidas com uma concentraçãosaturante de anticorpos específicos de CD38 rotulados com FITC (em gelo, 30min). Depois da lavagem das células (em RPMI1640 suplementado com 10 %de FCS), uma reunião de célula foi aquecida a 37°C para permitir ainternalização e a outra reunião foi deixada em gelo. Em diversos intervalosde tempo (0 a 120 min) alíquotas de célula foram tomadas e transferidas paraPBS-BSA gelado para interromper a internalização. Depois de lavar asamostras duas vezes com PBS-BSA5 EtBr (diluído em PBS-BSA,concentração final de 2 mg/ml) foi adicionada às amostras para extinguir oFITC ligado à membrana. A fluorescência foi medida pela citometria defluxo.
As Figuras 16A e 16B mostram que -003 e -005 sãointernalizadas pelas células CHO-CD38 dentro de 5 minutos a 37°C.
EXEMPLO 13
Experimentos de SCID-Iuciferase In vivo
Neste modelo as células de tumor são transfectadas comluciferase de vaga-lume. Na administração de luciferina (Molecular Probes,Leiden, Países Baixos) aos camundongos as células rotuladas podem serdetectadas in vivo pela formação de imagem bioluminescente usando umacâmera de CCD altamente sensível, cf. Wetterwald et al., American Journalof Pathology 160(3), 1143-1153 (2002).
As células Daudi foram transfectadas com gWIZ luciferase daGene Therapy Systems (San Diego, CA) e cultivadas em RPMI com 10 % deFCS, Pen/Strep, Piruvato de Sódio e 1 μg/ml de puromicina (Sigma). Ascélulas foram analisadas quanto a expressão da luciferase (expressada emRLU/1 χ IO5 células) em um luminômetro e quanto a expressão de CD38 porFAGS. 2,5 χ IO6 células Daudi transfectadas pela luciferase/camundongoforam injetadas i.v. em camundongos SCID. Os camundongos foram tratadoscom -003, -005, anticorpo de controle de isótipo (HuMab-KLH) ou rituximab(anticorpo anti-CD20). Os anticorpos foram injetados intraperitonealmente.
Quatro ajustes de tratamento foram usados (ver a Tabela 4). No cenáriopreventivo, o anticorpo (100 μg/camundongo) e as células foramadministradas simultaneamente. No cenário terapêutico I, o anticorpo (300μg/camundongo) foi administrado 7 dias depois da administração das células.
No cenário terapêutico II, o anticorpo (10 μg/camundongo) foi administrado14 dias depois da administração das células. No cenário terapêutico III, oanticorpo (100 μ§/θΒπιιιη<1οη§ο) foi administrado 7 dias depois daadministração das células. Para a formação de imagem, os camundongosforam anestesiados pela injeção i.p. de uma mistura decetamina/xilazina/atropina. D-Luciferina sintética (sal de sódio, MolecularProbes) foi dada i.p. em uma dose de 25 mg/ml. Os camundongos foramdepois colocados em uma caixa firme leve e depois de 3 min, a formação deimagem foi iniciada usando um detector de CCD esfriado com nitrogêniolíquido VersArray 1300B (Roper Scientific). Os fótons emitidos da luciferaseforam contados em um período de exposição de 5 min. Sob iluminaçãoimagens pretas e brancas foram feitas por referência. O software MetaVue(Universal Imaging Corp) foi usado para a coleta de dados e a análise deimagem. A significância estatística de diferenças entre grupos foi estabelecidausando análise de uma via de variação com um pós teste de Newman-Keulsusando GraphPad PRISM versão 3.02 (Graphpad Software Inc).
Tabela 4 - Cenários de tratamento para os experimentos de luciferase in vivo
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As Figuras 17A e 17B mostram que -003 e -005 inibem ocrescimento de células de tumor no cenário preventivo e no cenárioterapêutico I, similar à inibição observada para o anticorpo anti-CD20. Ambosos anticorpos representaram significantemente melhor do que o anticorpocontrole de isótipo. Também no cenário terapêutico II os anticorpos CD38retardaram o crescimento de células de tumor Daudi-Iuc (Figura 17C). Nocenário terapêutico III, -003 e -024 mostram uma inibição evidente decrescimento da célula de tumor Daudi-Iuc (Figura 17D).
EXEMPLO 14
Apoptose
O ensaio de apoptose foi realizado de acordo com asinstruções do fabricante (Annexin-V Apoptose kit, BD Biosciences, Alfena.d. Rijn, Países Baixos). Em resumo, mAbs de CD38 foram adicionados a2,5 χ IO5 células (células Daudi transfectadas com luciferase, em 0,5 ml deRPMIh" em uma placa de 24 reservatórios), em uma concentração de 5 μg/ml-003 ou -005 ou um anticorpo anti-CD20 sozinho ou na presença debloqueador cruzado rb-anti-hlgG (50 pg/ml).
Depois da incubação (37°C, 5 % de CO2, 20 horas), as célulasforam colhidas cuidadosamente e lavadas com Tampão de Ligação (1200rpm, 4°C, 5 min, BD Biosciences). A pelota foi recolocada em suspensão em100 μΐ de Tampão de Ligação. Depois, 5 μΐ de Annexin-V-FITC (BDBiosciences) e 10 μΐ de PI (BD Biosciences) foram adicionados à suspensão eincubados por 15 minutos na temperatura ambiente. 400 μΐ de Tampão deLigação foram adicionados e as amostras foram medidas (leitura de PI emFL2). Para a análise de células apoptópticas, todas as células positivas emAnnexin-V foram contadas pela citometria de fluxo usando um citômetro defluxo FACScalibur com software CellQuest pro (BD Biosciences). Pelomenos 10.000 eventos foram coletados para a análise. Esta população incluitanto células positivas em PI quanto negativas em PI.
A Figura 18 mostra que -003 e -005 não induzem a apoptose.
Entretanto, depois da reticulação, a apoptose de células alvo é observada. -003induziu a apoptose depois da reticulação que foi similar à apoptose induzidapor um anticorpo anti-CD20 (rituximab). -005 foi menos capaz de induzir aapoptose depois da reticulação. Resultados similares foram obtidos comcélulas RAMOS como células alvo (dados não mostrados).
EXEMPLO 15
Efeito de -005 sobre as células B de enxerto de tecido emmodelo de camundongo RA-SCID
Implantação de tecido sinovial
Os camundongos SLID, cepa C.B.-17/IcrCrl-SCID-bg, macho/ fêmea, 4 a 12 semanas, adquirido da Charles River Laboratories Holanda(Maastricht, Países Baixos) foram mantidos em gaiolas IVC sob condiçõespadrão de temperatura e luz e foram alimentados com ração de laboratório eágua ad libitum. Antes da implantação, os camundongos (três camundongosem cada grupo experimental, dia 0) foram anestesiados pela injeçãointraperitoneal de cetamina (NIMATEK, EuroVet) e xilazina (Rompun,Bayer) na razão de 1:1. Uma incisão pequena da pele foi feita usando tesourascirúrgicas. O tecido sinovial inflamado de um paciente com artrite reumatóideque passa pela cirurgia de substituição da junta foi implantadosubcutaneamente como um grupo de seis fragmentos pequenos (total de 2 a 3mm ) em cada flanco do camundongo. O ferimento foi fechado usando colade cianoacrilato Permacol. No dia 1 do experimento, o tecido sinovialremanescente foi analisado de modo a checar quanto as células B nostransplantes sinoviais inflamados. -005 (12 mg/kg) ou anticorpo de controle(anti-KLH, 30 mg/kg) foram injetados (i.v.), em um volume de 200 μΐ no dia8 do experimento. No final do experimento (dia 14) os camundongos foramsacrificados pela inalação de CO2 e os enxertos sinoviais foram explantados.Um dos enxertos foi subitamente congelado em composto OCT (TecidoTek,Sacura Finetek Europe) para outras análises imunistoquímicas e o outro foicongelado pela imersão em nitrogênio líquido para outra análise de RNA.
lmunoistoquímica
5 μΜ de criosseções em lâminas SuperFrost (Menzel GmbH,Braunschweig) foram preparados usando criostato LEICA CM1900 earmazenados a -80°C. As seções descongeladas foram fixadas em acetona por10 min, secadas na temperatura ambiente e lavadas 3x5 min em PB S. Todasas etapas foram realizadas na temperatura ambiente. A atividade deperoxidase endógena foi bloqueada pela incubação com PBS suplementadocom 0,3 % de peróxido de hidrogênio e 0,1 % de azida de sódio por 20 min.
As lâminas foram lavadas 3x5 min em PBS e incubadas com 10 % de sorohumano normal (NHS) / 10 % de soro de coelho normal (NRbS) em PBS / 1% de BSA por 30 min. Em seguida, anticorpo primário (mAb decamundongo) diluído em PBS suplementado com 1 % de BSA / 10 % deNHS / 10 % de NRbS foi incubado por 60 min. Depois das lavagens 3x2min em PB S, HRP-conjugado (Ig-HRP anti-camundongo de cabra; DAKOP0447) diluído 1:50 em PBS (suplementado com 1 % de BSA / 10 % de NHS/ 10 % de NRbS) foi adicionado por 30 min. o sinal de peroxidase foi realçadousando o sistema ISA® Biotin (Perkin Elmer Life Sciences, NEL700). Aslâminas foram lavadas 3x2 min em PBS e incubadas com biotinil tiramidadiluído 1:1600 em tampão de amplificação por 30 min. Depois das lavagens 3χ 2 min em PBS, estreptavidina-HRP diluído 1:400 em PBS (suplementadocom 1 % de B SA) foi adicionado por 30 min. As lâminas foram lavadas 3x2min em PBS e incubadas com solução de DAB (DAKO Cytomation K3465)por 5 min. A reação de cor foi interrompida com água destilada. Finalmente,as lâminas foram contra-tingidas com hematoxilina (MERCK), lavada comágua corrente e coberta com glicerina de Kaiser e lamínulas de cobertura.
Contagemm da intensidade de tingimento
A contagem de xenoenxertos de tecido sinovial tingidos foirealizada em uma maneira às cegas por duas pessoas treinadas. Primeiro aseção mais forte foi selecionada de uma série de seções e esta seção dereferência foi concedida a pontuação máxima de 8. A intensidade detingimento nas outras seções foi depois classificada em uma escala de 0 a 8,em relação à seção de referência.
Análise estatística
A contagem da intensidade de tingimento foi analisada pelo
Kruskal-Wallis one-way ANOVA seguido pelo teste de comparação múltiplade Dunn usando Graph Pad Prism versão 4.01 (Graph Pad software, Inc., SanDiego, CA, USA).
A Figura 19 e a Figura 21 mostram que os números de célulasplasmáticas anti-CD38-positivas são reduzidas depois do tratamento com -005. O tingimento de células plasmáticas com anti-CD138 confirma que -005resulta em números reduzidos de células plasmáticas (Figuras 20 e 22).
EXEMPLO 16
Seqüenciamento da seqüência codificadora de anticorposhumanos contra CD38
Preparação de RNA
O RNA total foi preparado a partir de 5 χ IO6 células daslinhagens de célula de hibridoma que expressam os anticorpos monoclonais -003, -005 e -024, respectivamente, com o kit RNeasy (Qiagen, Westburg,Leusden, Países Baixos) de acordo com o protocolo do fabricante.
Preparação de cDNA de -003, -005 e -024
O DNA complementar 5'-RACE (cDNA) de RNA foipreparado a partir de 100 ng de RNA total, usando o Kit de Amplificação decDNA SMART RACE (Clontech), seguindo o protocolo do fabricante.
Os iniciadores de oligonucleotídeo foram sintetizados equantificados pela lsogen Bioscience (Maarssen, Países Baixos). Osiniciadores foram dissolvidos em H2O para 100 μηιοΐ/μΐ e armazenados a -20°C. Um resumo de toda a PCR e iniciadores de seqüenciamento estátabulado (Tabela 5). Para a PCR, PfuTurbo® Hotstart DNA polimerase(Stratagene, Amsterdam, Países Baixos; produto # 600322) foi usado deacordo com as instruções do fabricante. Cada mistura de reação conteve 200μΜ de dNTPs misturados (Roche Diagnostics, Almere, Países Baixos;produto # 1814362), 12 μηιοί do iniciador reverso (RACEGIAI para VH3003-005, RACEVHApaI para VH3003-003 e RACEVLBsiWI para V!3003-003 e005), 7,2 μηιοί de UPM-Mix (UPM-Mix: 2 μΜ de ShortUPMH3 e 0,4 μΜ deLongUPMH3), 0,6 μΐ do padrão de 5'RACE cDNA e 1,5 unidade dePfuTurbo® Hotstart DNA polimerase em tampão de reação de PCR(fornecido com a polimerase) em um volume total de 30 μΐ. As reações dePCR foram realizadas com um Termociclador TGradient 96 (WhatmanBiometra, Goettingen, Alemanha; produto # 050-801) usando um programade 35 ciclos: desnaturação a 95°C por 2 min; 35 ciclos de 95°C por 30 s, um55°C por 30 s e 72°C por 1,5 min; extensão final a 72°C por 10 min. Seapropriado, as misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até análise ouprocessamento adicional.
Tabela 5 - Iniciadores
<table>table see original document page 316</column></row><table>
Clonagem de -003-2F5 Vh e Vj_e -005 Vs e -024 Vh e Vi noSistema de Vetor pGEMT II
Os produtos de reação foram separados pela eletroforese emum gel de agarose a 1 % de TAE e tingido com brometo de etídio. As faixasdo tamanho correto foram cortadas a partir dos géis e o DNA foi isolado doagarose usando o kit de extração em gel Qiaexll (Qiagen, cat no 20021).
Os fragmentos de PCR isolados em gel foram de cauda A poruma incubação de 10 min a 72°C com 200 μΜ de dATP e 2,5 unidades deAmplitaq (Perkin Elmer) e purificados usando colunas minielute (Qiagen). Osfragmentos de PCR de cauda A foram clonados no vetor pGEMTeasy(Promega) usando o kit e protocolo do sistema de vetor pGEMT easy II(LJ270, páginas 3/4). 2 μΐ da mistura de ligação foi transformada em OneShotDli5aTlR competent E.Coli (Invitrogen) e plaqueada em placas LB/Amp/IPTG/Xgal.
Seqüenciamento
As regiões V de -003 e -024 e a região Vl de -005 foramseqüenciadas pelo AGOWA (Berlin, Alemanha) depois escolhidasrespectivamente 20 (VH-003), 16 (VL-003), 15 (VL-005) e 6 (VH e Vl -024)colônias brancas, isolação de plasmídeo e seqüenciamento com o iniciadorreverso M13. A região Vh de -005 foi seqüenciada diretamente no produto dePCR usando-se iniciador HCseq5. As seqüências foram analisadas usando oVetor NTI advanced suite (Invitrogen).
Geração dos vetores de expressão para os anticorpos -003, -005, -024 e anticorpo 3079 de Morphosvs
A região que codifica Vh de -003 foi amplificada pela PCR apartir de um clone plasmídico pGemT contendo a região Vh de -003, usandoos iniciadores VH3003-003for e RACEVHApaI, introduzindo sítios derestrição adequados (HindIII e ApaI) para a clonagem em pConGlfO,4 (LonzaBiologics, Slough, UK) e uma seqüência Kozak ideal (GCCGCCACC). Ovetor pConGlfO.4 contém a região constante de cadeia pesada de IgGlhumana. O fragmento de PCR Vh foi inserido, na matriz, no vetorpConGlf0.4 usando HindIII e ApaI. A construção foi checada pela análise deseqüência.
A região que codifica Vh de -005 foi amplificada pela PCR apartir de um clone plasmídico pGemT contendo a região Vh de -005, usandoos iniciadores VH3003-5for e RACEVHApaI, para introduzir sítios derestrição adequados (HindIII e ApaI) para a clonagem em pConGlfO,4 e umaseqüência Kozak ideal. O fragmento de PCR Vh foi inserido, na matriz, novetor pConGlf0.4 usando HindIII e ApaI. A construção foi checada pelaanálise de seqüência.A região que codifica Vh de -024 foi amplificada pela PCR apartir de um clone plasmídico de pGemT contendo a região Vh de -024,usando os iniciadores VH300324exfor e RACEVHApaI, para introduzir sítiosde restrição adequados (HindIII e ApaI) para a clonagem em pConGlfO.4 euma seqüência Kozak ideal. O fragmento de PCR Vh foi inserido, na matriz,no vetor pConGlf0.4 usando HindIII e ApaI. A construção foi checada pelaanálise de seqüência.
A região que codifica Vh de anticorpo 3079 de Morphosys foisintetizada pelo GeneArt (Regensburg, Alemanha), com base nos dadospublicados na patente WO 2005/103083 A2. A região codificadora foiotimizada no códon quanto a expressão em células HEK para realçar os níveisde expressão e os sítios de restrição adequados (HindIII e ApaI) para clonarno pConGlf0.4 e uma seqüência Kozak ideal foi introduzida. O plasmídeocontendo a região Vh sintética foi digerida com ApaI e HindIII e o fragmentoVII foi inserido, na matriz, no vetor pConGlfO.4.
A região codificadora Vl de -005 foi amplificada pela PCR apartir de um clone plasmídico pGemT contendo a região Vl de -005, usandoos iniciadores VL3003-5exfor e RACEVLBsiWI, para introduzir sítios derestrição adequados (HindIII e Pfl23II) para a clonagem no pConKappaO,4(Lonza Biologics) e uma seqüência Kozak ideal. O vetor pConKappa0.4contém a região constante de cadeia leve capa. O fragmento de PCR Vl foiinserido, na matriz, no vetor pConKappa0.4 usando HindIII e Pfl23II. Aconstrução foi checada pela análise de seqüência.
A região codificadora Vl de -003 foi amplificada pela PCR apartir de um clone plasmídico pGemT contendo a região Vl de -003, usandoos iniciadores VL3003-003for e RACEV1BsiWl, para introduzir sítios derestrição adequados (HindIII e Pfl23II) para a clonagem no pConKappa0.4 euma seqüência Kozak ideal. O fragmento de PCR Vl foi inserido, na matriz,no vetor pConKappa0.4 usando HindIII e Pfl23II. A construção foi checadapela análise de seqüência.
A região codificadora Vl de -024 foi amplificada pela PCR apartir de um clone plasmídico pGemT contendo a região Vl de -024, usandoos iniciadores VL3003-24-5exfor e RACEVLBsiWI, para introduzir sítios derestrição adequados (HindIII e Pfl23II) para a clonagem no pConKappa0.4 euma seqüência Kozak ideal. O fragmento de PCR Vl foi inserido, na matriz,no vetor pConKappa0.4 usando HindIII e Pfl23II. A construção foi checadapela análise de seqüência.
A região codificadora Vl de anticorpo 3079 de Morphosys foisintetizado pela GeneArt, com base nos dados publicados na WO2005/103083. A região codificadora foi otimizada no códon quanto aexpressão em células HEK; para realçar níveis de expressão e sítios derestrição adequados (HindIII e Pfl23II) para a clonagem no pConKappa0.4 euma seqüência Kozak ideal foi introduzida. O plasmídeo, contendo a regiãoVl sintética, foi digerido com Pfl 23II e HindIII e o fragmento Vh foi inserido,na matriz, no vetor pConKappa0.4.
Os anticorpos foram transitoriamente expressados em célulasHEK-293F, como descrito no Exemplo 17, pela cotransfecção de seus vetoresde cadeia pesada e cadeia leve.
Geração de linhagens de célula estáveis em células CHO-Kl
Para a geração de linhagens de célula estáveis, os vetores decadeia pesada e leve de -003 ou -005 foram combinados em um único vetorde gene duplo pelas técnicas de clonagem padrão.
Os vetores de gene duplo de -003 ou -005 foram linearizados etransfectados em células CHO-Kl SV (Lonza Biologics), essencialmentecomo descrito pelo fabricante. As linhagens de célula estáveis foramselecionadas pela seleção com 25 μΜ de L-Metionina sulfoximina (MSX)como descrito por Lonza Biologics. Os clones que produzem Top foramselecionados e propagados em CD-CHO (Invitrogen) O meio e os anticorposforam purificados a partir do sobrenadante de cultura de célula como descritono Exemplo 3.
EXEMPLO 17
Mapeamento de epítopo usando a mutagênese direcionada ao sítio
Os iniciadores de oligonucleotídeo foram sintetizados equantificados pela Isogen Bioscience (Maarssen, Países Baixos). Osiniciadores foram dissolvidos em H2O a 1OO μηιοΐ/μΐ e armazenados a -20°C.Um resumo de toda a PCR e iniciadores de seqüenciamento é mostrado naTabela 6. Para a PCR, PfuTurbo® Hotstart DNA polimerase (Stratagene,Amsterdam, Países Baixos) foi usado de acordo com as instruções dofabricante. Cada mistura de reação conteve 200 μΜ de dNTPs misturados(Roche Diagnostics5 Almere, Países Baixos), 10 μιηοΐ tanto do iniciadoravançado quanto reverso, 100 ng de DNA genômico ou 1 ng de DNAplasmídico e 1 unidade de PfuTurbo® Hotstart DNA polimerase em tampãode reação de PCR (fornecidos com a polimerase) em um volume total de 20μl. As reações de PCR foram realizadas com um Termociclador TGradient 96(Whatman Biometra, Goettingen, Alemanha) usando um programa de 32ciclos: desnaturando a 95°C por 2 min; 30 ciclos de 95°C por 30 s, umgradiente de 60 a 70°C (ou uma outra temperatura de recozimento específica)por 30 s e 72°C por 3 min; extensão final a 72°C por 10 min. Se apropriado,as misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até análise ou processamentoadicionais.
A eletroforese em gel de agarose foi realizada de acordo comSambrook (Sambrook, Russell et ai. 2000) usando géis de 50 ml, em 1 χtampão de Tris Acetato EDTA. O DNA foi visualizado pela inclusão debrometo de etídio no gel e as observação sob luz UV. As imagens em gelforam registradas por uma câmera de CCD e um sistema de análise deimagem (GeneGnome; Syngene, por intermédio de Westburg B.V., Leusden,Países Baixos).
A purificação dos fragmentos de PCR desejados foi realizadausando um Kit de Purificação de PCR MinElute (Qiagen, por intermédio deWestburg, Leusden, Países Baixos; produto # 28006), de acordo com asinstruções do fabricante. O DNA isolado foi quantificado pela espectroscopiade UV (ver abaixo) e a qualidade foi avaliada pela eletroforese em gel deagarose.
Alternativamente, a PCR ou os produtos de digestão foramseparados pela eletroforese em gel de agarose (por exemplo quandofragmentos múltiplos estavam presentes) usando um gel de Acetate EDTAagarose a 1 % de Tris. O fragmento desejado foi excisado do gel e recuperadousando o Kit de Extração em Gel QIAEX II (Qiagen; produto # 20051), deacordo com as instruções do fabricante.
A densidade óptica de ácidos nucleicos foi determinadausando um Espectrômetro NanoDrop ND-1000 (Isogen Life Science,Maarssen, Países Baixos) de acordo com as instruções do fabricante. Aconcentração de DNA foi medida pela análise da densidade óptica (OD) a 260nm (um unidade de OD260nm = 50 μg/ml). Para todas as amostras, o tampãoem que os ácidos nucleicos foram dissolvidos foi usado como uma referência.
As enzimas de restrição e suplementos foram obtidos da NewEngland Biolabs (Beverly, MA, USA) ou Fermetas (Vilnius, Lithuania) eüsado de acordo com as instruções do fabricante. O DNA (100 ng) foidigerido com 5 unidades de enzima(s) no tampão apropriado em um volumefinal de 10 μΐ (os volumes de reação foram aumentados como apropriado). Asdigestões foram incubadas na temperatura recomendada quanto a um mínimode 60 min. Para os fragmentos que requerem digestões duplas com enzimasde restrição que envolvem tampões incompatíveis ou exigências detemperatura, as digestões foram realizadas seqüencialmente. Se necessário osprodutos de digestão foram purificados pela eletroforese em gel de agarose eextração em gel.
As ligações de fragmentos de DNA foram realizados com oKit de Ligação Rápida (New England Biolabs) de acordo com as instruçõesdo fabricante. Para cada ligação, o DNA vetorial foi misturado comaproximadamente três vezes o excesso molar de DNA inserido.
O DNA plasmídico (1 a 5 μΐ de solução de DNA, tipicamente2 μl de mistura de ligação de DNA) foi transformado em uma célula de E.coli Shot DH5a-TlR (Invitrogen, Breda, Países Baixos; produto # 12297-016)usando o método do choque térmico, de acordo com as instruções dofabricante. Em seguida, as células foram plaqueadas em placas de ágar deLuria-Bertani (LB) contendo 50 μg/ml de ampicilina. As placas foramincubadas por 16 a 18 h a 37°C até que as colônias bacterianas se tornaramevidentes.
As colônias bacterianas foram tríadas quanto a presença devetores contendo as seqüências desejadas por intermédio da PCR de colôniausando o ThermoStart PCR Master Mix (Abgene, por intermédio deWetsburg, Leusden, Países Baixos; produto # AB-938-DC15/b) e iniciadorespConGlseql e pEE13.4seqrev2 (Tabela 6). As colônias selecionadas foramuniformemente tocadas com uma ponta de pipeta de 20 μΐ e tocadasligeiramente em 2 ml de LB para cultura de escala pequena e depoisrecolocadas em suspensão na mistura de PCR. A PCR foi realizada com umTermociclador TGradient 96 usando um programa de 35 ciclos: desnaturaçãoa 95°C por 15 min; 35 ciclos de 94°C por 30 s, 55°C por 30 s e 72°C por 2min; seguido por uma etapa de extensão final de 10 min a 72°C. Seapropriado, as misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até a análise pelaeletroforese em gel de agarose.
O DNA plasmídico foi isolado das culturas de E. coli usandoos seguinte kits da Qiagen (por intermédio de Westburg, Leusden, PaísesBaixos), de acordo com as instruções do fabricante. Para a preparação deplasmídeo volumosa (50 a 150 ml de cultura), um HiSpeed Plasmídeo MaxiKit (produto # 12663) ou um HiSpeed Plasmídeo Midi Kit (produto # 12643)foi usado. Para a preparação de plasmídeo em escala pequena (± 2 ml decultura) um Qiaprep Spin Miniprep Kit (produto # 27106) foi usado e o DNAfoi eluído em 50 μΐ de tampão de eluição (fornecido com o kit).
Construção de vetor de expressão HA-CD38pEE 13.4HACD3 8
O domínio extracelular de CD38 humano foi amplificado apartir do plasmídeo pClpuroCD38 (obtido do Prof. M. Glennie, TenovusResearch Laboratory, Southampton General Hospital, Southampton, UK)usando iniciadores cd38forha e cd38exrev. Por esta reação de PCR um rótuloHA foi introduzido. Este produto de PCR foi usado como padrão para umasegunda reação de PCR com iniciadores SPHMM38ex e cd38exrev. Por estareação de PCR, o peptídeo de sinal SPHMM, os sítios de restrição e umaseqüência Kozak ideal (GCCGCCACC) para a expressão ótima foramintroduzidos. Depois da purificação, este fragmento de PCR foi clonado emvetor de expressão pEE13.4 (Lonza Biologics) e a seqüência codificadoracompleta foi confirmada pelo Seqüenciamento com iniciadores pConKseql,pEE13.4seqrev, cd38seqlfor e cd38seq2rev (Tabela 6). Esta construção foidenominada pEE 13.4HACD3 8
Mutagênese direcionada ao sítio
Três proteínas mutantes únicas de huCD38 foi construída, emque T foi mutado em uma posição 237 (T237A, SEQ ID No: 32), Q foimutado em R na posição 272 (Q272R, SEQ ID No: 33) ou S foi mutado em Fna posição 274 (S274F, SEQ ID No: 34). A mutagênese direcionada ao sítiofoi realizada usando o Kit de Mutagênese Direcionada ao Sítio QuickChangeII XL (Stratagene, Amsterdam, Países Baixos) de acordo com as instruções dofabricante. Este método incluiu a introdução de um sítio de restrição extrasilencioso ou perda de um sítio de restrição para triar quanto a mutagênesebem sucedida (sítio XbaI extra para T237A mutante, sítio BcgI extra paraQ272R mutante e perda de sítio SspI para S274F mutante). Em resumo, 5 μΐde IOx tampão de reação, 1 μΐ de oligonucleotídeo HACD38T237Afor2,HACD3 8Q272Rfor ou HACD38S274Ffor (100 μηιοΐ/μΐ), 1 μloligonucleotídeo HACD38T237Arev2, HACD38Q272Rrev ouHACD38S274Frev (100 μιηοΐ/μΐ), 1 μΐ de mistura de dNTP, 3 μl deQuicksolution, 1 μΐ de plasmídeo pEE13.4HACD38 (50 ng/μΐ) e 1 μlPfuUltra HF DNA polimerase foram misturados em um volume total de 50 μle amplificada com um Termociclador TGradient 96 (Whatman Biometra,Goettingen, Alemanha; produto # 050-801) usando um programa de 18 ciclos:desnaturando a 95°C por 1 min; 18 ciclos de 95°C por 50 s, 60°C por 50 s e68°C por 10 min. As misturas de PCR foram armazenadas a 4°C atéprocessamento adicional. Em seguida, as misturas de PCR foram incubadascom 1 μl de DpnI por 60 min a 37°C para digerir o vetor pEE13.4HACD38WT e armazenado a 4°C até processamento adicional. A mistura de reação foiprecipitada com 5 μΐ de NaAc 3 M e 125 μΐ de etanol, incubados por 20minutos a -20°C e girados por 20 minutos a 4°C a 14000xg. A pelota de DNAfoi lavada com 70 % de etanol, secada e dissolvida em 4 μΐ de água. Ovolume de reação total de 4 μΐ foi transformado em células de E. coli ShotTop 10DH5aTlR competentes (Invitrogen, Breda, Países Baixos) de acordocom as instruções do fabricante (Invitrogen). Em seguida, as células foramplaqueadas em placas de ágar Luria-Bertani (LB) contendo 50 μg/ml deampicilina. As placas foram incubadas por 16 a 18 h a 37°C até que ascolônias bacterianas se tornaram evidentes. As colônias foram triadas pelaPCR de colônia usando iniciadores pConGlseql e pEE13,4seqrev2 (Tabela 5)e digeridos com as enzimas de restrição relevantes para triar quanto aincorporação do oligonucleotídeo mutagênico. 2 clones positivos para cadaum mutante foram cultivados e o DNA plasmídico foi isolado. A seqüênciaque codifica HACD38 completa foi determinada usando iniciadorescd38seqlfor, pConGlseql e pEE13.4seqrev2 para confirmar a presença dasmutações e a ausência de mutações adicionais indesejáveis.
Seqiienciamento de DNA
As amostras de DNA plasmídico foram enviadas paraAGOWA (Berlin, Alemanha) para a análise de seqüência. As seqüênciasforam analisadas usando o software Vetor NTI advanced (Informax, Oxford,UK).
Expressão transitória em células HEK-293F
As células Freestile® 293-F (um subclone HEK-293 adaptadopara o crescimento de suspensão e quimicamente definido meio Freestile,(HEK-293F)) foram obtidas da Invitrogen e transfectadas compEE13.4HACD38 e com as três construções que carregam as mutaçõesT237A, Q272R e S274F, de acordo com o protocolo do fabricante usando293fectin (Invitrogen). Os sobrenadantes de cultura de células transfectadasforam usadas no ELISA para estudos de ligação anti-CD38.
Ligação de anticorpo anti-CD38
As placas de ELISA (Greiner, # 655092) foram revestidas O/Na 4°C com 1 μg de anticorpo anti-HA (Sigma, # H-9658) e subseqüentementebloqueadas com 2 % de soro de galinha. Os sobrenadantes de cultura decélulas HEK293F transfectadas foram diluídas, aplicadas às placas de ELISAe incubadas por 1 hora na temperatura ambiente. Depois de lavar, as diluiçõesem série de HuMabs -003 e -005 foram adicionadas e incubadas por 1 hora natemperatura ambiente. Os anticorpos ligados foram detectados com anticorposIgG anti-humanos de cabra conjugado com HRP. O ensaio foi desenvolvidocom ABTS (Roche, # 1112597) e a absorbância foi medida a 405 nm usandoum espectrofotômetro.
Como pode ser observado a partir das Figuras 23A-23C, tanto-003 quanto -005 ligam-se ao CD38 humano do tipo selvagem. A ligação de -003 não foi afetada pela introdução de mutações T237A (Figura 23 A), Q272R(Figura 23B) ou S274F (Figura 23C). -005 foi capaz de ligar a mutaçãoT237A que abriga CD38 (Figura 23A), a ligação de -005 a CD38 com amutação Q272R foi severamente afetada (Figura 23B), tanto com respeito aEC50 quanto a capacidade de ligação máxima. -005 não foi capaz de ligar aoCD38 mutante em que a serina na posição 274 foi substituída pelafenilalanina (Figura 23C).
Estes dados mostram que -003 e -005 se ligam a epítoposdiferentes. Além disso estes estudos revelaram que a ligação de -005 a CD38é sensível às mutações nas posições 272 e 274. Particularmente S274 éessencial para -005 que se liga ao CD38.
Tabela 6 - Iniciadores
<table>table see original document page 326</column></row><table>
EXEMPLO 18
Indução da proliferação de PBMC
-003, -005 e -024 foram testados em um ensaio essencialmentecomo descrito em Ausiello et al., Tissue Antigens 56, 538-547 (2000). Emresumo, PBMCs de doadores saudáveis foram cultivadas a 1 χ IO5células/reservatório em placas de 96 reservatórios de fundo chato na presençade anticorpos (concentração final: 1,1-3,3-10-30 μ^ιηΐ) em 200 μΐ deRPMr. A estimulação de células com IL-15 (a 333 ng/ml; Amgen Inc.,Thousand Oaks, CA, USA) foi usada como controle positivo. Depois de umaincubação de 4 dias a 37°C, 30 μΐ de H-timidina (16,7 pCi/ml) foramadicionados e a cultura foi continuada O/N. A incorporação de H-timidina foiavaliada usando um contador gama Packard Cobra (Packard Instruments,Meriden, DT, USA), de acordo com as instruções do fabricante. Os dados sãomostrados como a cpm média (t SEM) de PBMCs obtidas de 10 doadores. Osresultados mostram que -003 e -005 não induzem a proliferação significantede PBMCs (Figura 24A). Também -024 não induz proliferação significante dePBMCs (dados não mostrados).
EXEMPLO 19
Indução de IL-6
-003, -005 e -024 foram testados em um ensaio como descritoem Ausiello et al., Tissue Antigens 56, 538-547 (2000). Em resumo, asPBMCs foram cultivadas a 1 χ IO6 células/reservatório em placas de 48reservatórios na presença de 20 μg/ml de anticorpos e 10 ng/ml de LPS(Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, Países Baixos) em 500 μΐ RPMI + + .Depois de uma incubação O/N a 37°C, o sobrenadante foi colhido earmazenado a -20°C. A concentração de IL-6 foi avaliada pelo ELISA (kit IL-6 ELISA, U-CyTech Biosciences, Utrecht, Países Baixos) de acordo com asinstruções do fabricante. Os dados são mostrados em concentração média empg/ml (± SEM) de 7 doadores. Os resultados mostram que -003 e -005 nãoinduzem a liberação de níveis significantes de IL-6 (Figura 24B). Também -024 não induz a liberação de níveis significantes de IL-6 (dados nãomostrados).
EXEMPLO 20
Indução da liberação de IFN-γ-003, -005 e -024 foram testados em um ensaio como descritoem Ausiello et ai., Tissue Antigens 56, 538-547 (2000). Em resumo, asPBMCs foram cultivadas a 1 χ IO6 células/reservatório em placas de 48reservatórios na presença de 20 μ§/ιη1 de anticorpos e 1 μ^ιηΐ de OKT-3(Sanquin, Amsterdam, Países Baixos) em 500 μΐ de RPMr. Depois de umaincubação O/N a 37°C, o sobrenadante foi colhido e armazenado a -20°C. Aconcentração de IFN-γ foi avaliada pelo ELISA (kit IFN-γ ELISA, U-CyTechBiosciences, Utrecht, Países Baixos) de acordo com as instruções dofabricante. Os dados são mostrados na concentração média em pg/ml (± SEM)de 9 doadores. Os resultados mostram que -003 e -005 não induzem aliberação de níveis de IFN-γ detectáveis (Figura 24C). Também -024 nãoinduz a liberação de níveis de IFN-γ significantes (dados não mostrados).
EXEMPLO 21
Afinidade de ligação de -003 e -005 ao CD38 recombinante
A ligação de -003 e -005 ao CD38 foi testada usando aressonância de plasma de superfície. Em resumo, os anticorpos purificadosforam imobilizados em um chip de sensor CM-5 (Biacore, Uppsala, Suécia)por intermédio de ligação de amina. O CD38 rotulado com HA (ver Exemplo3) foi derramado e a ligação de antígeno a mAb foi detectada por umamudança no índice refrativo na superfície do chip usando um Biacore 3000(Biacore). Os associados e as constantes de taxa para -003 (Tabela 7) e -005(Tabela 8) estão resumidos abaixo, média de 3 experimentos ± DP e mostramque tanto -003 quanto -005 têm uma alta afinidade para CD38.
Tabela 7 - Associação e constantes de taxa a 25°C
<table>table see original document page 328</column></row><table>Tabela 8 - Associação e constantes de taxa a 25°C
<table>table see original document page 329</column></row><table>
EXEMPLO 22
Mapeamento de Epítopo
O mapeamento de epítopo usando o método PEP SCAN
De acordo com procedimentos conhecidos (Geysen et al.1984. O uso da síntese de peptídeo para sondar antígenos virais quanto aepítopos a um resolução de um único aminoácido. Proc Natl Aced Sci USA81:3998; Slootstra et al. 1996. Structural aspects of antibody-antigeninteraction revealed through small random peptide libraries. Mol Divers 1:87;Puijk et al. 2001. Segment synthesis. In PCT, Países Baixos, p.l.), ospepetídeos de sobreposição de 20-mer lineares e 15- mer em alça foramsintetizados abrangendo 138 aminoácidos no término C de CD38 humano.
Além disso, com base na seqüência no término C peptídeos de alça única detamanho diferente foram fabricados abrangendo a regiãoKNIYRPDKFLQCVKNPEDS SCTSEI, região CVHNLQPEKVQTLEAWVIHGG e região CLESIISKRNIQFSAKNIY RC. Além disso, conjuntos extrasforam designados para a reconstrução de regiões de alça dupla que foramcompostas de SKRNIQFSCKNIYR e EKVQTLEAVVVIHGG. As cisteínasnativas foram substituídas pelas alaninas. Os peptídeos foram triados em umensaio de ELISA usando cartões mini-PEPSCAN no formato de cartão decrédito.
Síntese de peptídeos
Os peptídeos foram sintetizados usando a química de Fmocpadrão e desprotegidos usando TFA com descontaminantes.
Subseqüentemente, os peptídeos desprotegidos foram rearranjados namicrossérie com uma solução 0,5 mM de 2,6-bis(bromometil)piridina ou2,4,6- tris(bromometil)mesitileno em bicarbonato de amônio (20 mM, pH7,9), suplementado com acetonitrila (1:1 [volume/volume]). As microssériesforam suavemente agitadas na solução por 30 a 60 min, enquantocompletamente cobertas na solução. Finalmente, as microsséries foramlavadas extensivamente com excesso de Millipore H2O e sonicadas emtampão de rompimento contendo 1 % de dodecilsulfato de sódio, 0,1 % de β-mercaptoetanol, em PBS (pH 7,2) a 70°C por 30 min, seguido pela sonicaçãoem millipore H2O por mais 45 min.
Ensaio de PEPSCAN ELISA
Os cartões de polietileno no formato de cartão de crédito de455 reservatórios, contendo os peptídeos covalentemente ligados, foramincubados com soro (por exemplo, diluído 1:1000 em solução de bloqueio quecontém 5 % de soro de cavalo [volume/volume] e 5 % de ovalbumina[peso/volume]) (4°C, durante a noite). Depois de lavar, os peptídeos foramincubados com Ig peroxidase anti-humano de coelho (diluição 1:1000, 25°C,1 hora) e depois de lavar o substrato de peroxidase (sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolina e 2 μΐ/ml de H2O2 a 3 %) foi adicionado. Depois de umahora, o desenvolvimento de cor foi medido com uma câmera CCD e umsistema de processamento de imagem. A montagem consiste de uma câmeraCCD com uma lente de 55 mm (Sony CCD Video Camera XC-77RR, Nikonmicro-nikkor 55 mm lente f/2,8), um adaptador de câmera (Sony Cameraadaptor DC-77RR) e o pacote de Software de Processamento de ImagemOptimas, versão 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, U.S.A.;Optimas funciona em um sistema de computador pentium II).
Método para a representação de epítopo
Os aminoácidos individuais foram identificados pelos motivosde dipeptídeo que representam as unidades únicas menores na seqüência deaminoácido humana de CD38. Todos os motivos de dipeptídeo presentes emcada um do 1164 peptídeos testados foram outorgados o valor ELISA obtidapara o respectivo peptídeo inteiro. Para graduar os motivos de dipeptídeo deligação forte a deficiente, um sinal relativo foi calculado dividindo-se o valordo ELISA obtido para cada motivo individual pelo valor de ELISA médio detodos os 1164 peptídeos lineares e de alça testados e estes foram classificadosquanto aos valores decrescentes. Desta maneira, as contribuições deaminoácido para os epítopos conformacionais foram consideradas. Para cadaum do mAb testado, todas as contagens de motivos de dipeptídeo acima de2,5 (isto é valores de ELISA de peptídeos contendo estes motivos foram pelomenos 2,5 vezes o valor de ELISA médio daqueles obtidos com todos os 1164peptídeos) foram selecionados. Os dados foram destorcidos em contribuiçõesde aminoácido único representado na seqüência de CD38 linear por umsistema de contagem. Caminhando-se ao longo da seqüência de CD38 linear eusando-se as unidades de dipeptídeo únicas como um ponto de referência, umponto foi concedido cada vez que um aminoácido CD38 estivesse presenteneste conjunto de peptídeos de pontuação alta.
-003, 005 e -024 foram todos descobertos ligar-se às regiõesSKRNIQFSCKNIYR e EKVQTLEAWVIHGG de CD38 humano. -003especialmente reconheceu os motivos RNIQF e WVIH, -005 especialmentereconheceu os motivos KRN e VQTL.
EXEMPLO 23
Atividade Enzimática
A atividade enzimática de CD38 humano foi medida em umensaio essencialmente como descrito em Graeff et ai., J. Biol. Chem. 269,30260-30267 (1994). Em resumo, o substrato NGD + (80 μΜ) foi incubadocom CD38 (0,6 μg/ml de domínio extracelular rotulado com His de CD38humano, ver o Exemplo 3 com respeito à purificação de His-CD38) em umtampão contendo 20 mM de Tris-HCl, pH 7,0. A produção de cGDPR podeser monitorada espectrofotometricamente no comprimento de onda deemissão de 410 nm (excitação a 300 nm). Neste exemplo um filtro deexcitação de 340 ± 60 nm e um filtro de emissão de 430 ± 8 nm foi usado.
Para testar o efeito de -003, -005 e -024 sobre a atividadeenzimática de CD38, a proteína His-CD38 recombinante foi pré-incubada por15 min na temperatura ambiente com várias concentrações (30, 3, 0,3 e 0,03pg/ml) dos anticorpos diferentes antes de adicionar o substrato NGD+. Aprodução de GDP-ribose cíclica (cGDPR) foi registrada em pontos de tempodiferentes depois da adição de anticorpos (3, 6, 9, 12, 30, 45, 60, 75 e 90 min).
A Fig 25B mostra que -005 tem um efeito inibidorpronunciado sobre a produção de cGDPR. Depois de 90 minutos, a adição de30 e 3 μg/ml de -005 resultou em uma produção reduzida em 32 % e 34 % decGDPR (Tabela 9). Resultados similares foram observados em experimentosindependentes usando lotes diferentes de -005.
Nenhum efeito inibidor sobre a produção de cGPDR foiobservado depois da adição de -003 (Figura 25B, Tabela 9), -024 (Figura25D, Tabela 9) ou anti-KLH (Figura 25A, Tabela 9).
Com base nestas descobertas espera-se também que -005 inibaa síntese de ADP-ribose cíclica (cADPR) de NAD A inibição da síntese decADPR pode ser determinada de acordo com o método de HPLC descrito emMunshi et ai, J. Biol. Chem. 275, 21566-21571 (2000).
Tabela 9. Produção de cGDPribose na presença de anticorpos específicos deCD38 ou antiKLH.
<table>table see original document page 332</column></row><table>
EXEMPLO 24
Comparação de -003 e -005 com anticorpo 3079 deMorphosys.
Os anticorpos -003 e -005 foram funcionalmente comparadosao anticorpo 3079 de Morphosys (TH-3079). Os métodos para clonagem eexpressão de anticorpo TH-3079 de Morphosys são descritos no Exemplo 16.Os métodos para CDC são descritos no Exemplo 6. Os métodos para ADCCsão descritos no Exemplo 5. A Figura 26A mostra que -005 e -003 e TH-3079induzem a lise mediada por CDC de células CHO transfectadas com CD38,com lise máxima similar. Quando valores EC50 são comparados, o anticorpo -005 é melhor do que o TH3079 na indução da lise de células CHO-CD38,com EC50 2 vezes mais baixa (ver Tabela 10).
A Figura 26B mostra que -005 é superior ao TH-3079 naindução da lise mediada pelo CDC de células Daudi-luciferase, com Iisemáxima pelo -005 sendo de 2 a 3 vezes mais altas do que pelo TH3079.Quando os valores EC50 são comparados, o anticorpo -005 é similar ao TH-3079 na indução da Iise de células Daudi-luciferase (ver Tabela 10). -003 nãoinduz significantemente a Iise mediada por CDC de células Daudi-luciferase.
A Figura 26C mostra que neste experimento -005, -003 e TH-3079 medeiam a Iise de células Daudi alvo por intermédio de ADCC.Nenhuma diferença foi encontrada em (Iog) EC50 e Iise máxima (Tabela 11, η = 5).
Tabela 10. Lise máxima e valores EC5Q de anticorpos específicos de CD38 em CDC.
<table>table see original document page 333</column></row><table>
Tabela 11. Lise máxima e valores EC50 de anticorpos específicos de CD38 em ADCC.
<table>table see original document page 333</column></row><table>LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA
<110> Genmab A/S
<120> Anticorpos contra CD38 para o tratamento de mieloma múltiplo
<130> P/18.WO
<160> 34
<170> PatentIn versão 3.2
<210> 1
<211> 321
<212> DNA
<213> homo sapiens
<4 00> 1
gacatccaga tgacccagtcatcacttgtc gggcgagtcagagaaagccc ctaagtccctaggttcagcg gcagtggatcgaagattttg caacttattagggaccaagg tggaaatcaa
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<4 00> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg85 90 95
tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gatctatgct gcttccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
ctgccaacag tataatagtt accctcggac gttcggccaa 300
a 321Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 3
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 4
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 5
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr1 5
<210> 6
<211> 366
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 6 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtctcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgctt tcagctgggt gcgacaggcccctggacaag gacttgagtg gatgggaagg gtcatccctt tccttggtat agcaaactccgcacagaaat tccagggcag agtcacaatt accgcggaca aatccacgag cacagcctacatggacctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagatgatatagcagcac ttggtccttt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctcagcctcc
60120180240300360366
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Phe Leu Gly Ile Ala Asn Ser Ala Gln Lys Phe50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asp Asp Ile Ala Ala Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115 120
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 8
Ser Tyr Ala Phe Ser1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 9
Arg Val Ile Pro Phe Leu Gly Ile Ala Asn Ser Ala Gln Lys Phe Gln15 10 15
Gly
<210> 10<211> 11<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 10
Asp Asp Ile Ala Ala Leu Gly Pro Phe Asp Tyr1 5 10
<210> 11
<211> 321
<212> DNA
<213> homo sapiens
<4 00> 11
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 13
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 14
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 15
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe1 5 10
<210> 16
<211> 372
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 16
Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr20 25 30
Gly Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly35 40 45
Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Thr50 55 60
Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr65 70 75 80
Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Thr Thr85 90 95Gly Cys Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys100 105 110
Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala115 120 125
Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys130 135 140
Thr Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala145 150 155 160
Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala Cys Ala Thr Ala165 170 175
Cys Thr Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly180 185 190
Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala195 200 205
Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys210 215 220
Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr225 230 235 240
Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys245 250 255
Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys260 265 270
Gly Gly Cys Cys Gly Thr Ala Thr Ala Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr275 280 285
Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Ala Ala Gly Ala Thr Thr Cys290 295 300
Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys305 310 315 320
Cys Gly Thr Cys Thr Thr Thr Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly325 330 335
Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly340 345 350Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys355 360 365
Cys Thr Cys Cys370
<210> 17
<211> 124
<212> PRT
<213> homo sapiens
<4 00> 17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115 120
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<4 00> 18
Ser Phe Ala Met Ser1 5
<210> 19<211> 17<212> PRT<213> homo sapiens<400> 19
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 20
Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr15 10
<210> 21
<211> 321
<212> DNA
<213> homo sapiens
<4 00> 21
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccgggctcct catctatgat gcttccaaca gggcctctgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<4 00> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gly Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser65
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
70
75
80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85
90
95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100
105
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 23
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala15 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<4 00> 24
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<4 00> 25
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr1 5
<210> 26
<211> 366
<212> DNA
<213> homo sapiens
<4 00> 26
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagcttttcc aactactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctc atgactctga tgccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccttc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacatgta 300gggtggggat cgcggtactg gtacttcgat ctctggggcc gtggcaccct ggtcactgtc 360tcctca 366
<210> 27
<211> 122
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu15 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro His Asp Ser Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Phe Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg His Val Gly Trp Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> homo sapiens
<4 00> 28
Asn Tyr Trp Ile Gly1 5
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> homo sapiens
<4 00> 29
Ile Ile Tyr Pro His Asp Ser Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe GlnGly
<210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> homo sapiens<400> 30 His Val Gly Trp Gly1 5<210> 31 <211> 300 <212> PRT <213> homo sapiens<4 00> 31
10
Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys15 10 15
Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val20 25 30
Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln35 40 45
Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu50 55 60
Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val65 70 75 80
Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys85 90 95
His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu100 105 110
Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile115 120 125
Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr130 135 140
Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys145 150 155 160Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp165 170 175
Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val180 185 190
Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu195 200 205
Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser210 215 220
Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala225 230 235 240
Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp245 250 255
Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln260 265 270
Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val275 280 285
Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile290 295 300
<210> 32
<211> 300
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 32
Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys15 10 15
Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val20 25 30
Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln35 40 45
Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu50 55 60
Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val65 70 75 80Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys85 90 95
His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu100 105 110
Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile115 120 125
Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr130 135 140
Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys145 150 155 160
Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp165 170 175
Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val180 185 190
Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu195 200 205
Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser210 215 220
Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Ala Leu Glu Ala225 230 235 240
Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp245 250 255
Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln260 265 270
Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val275 280 285
Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile290 295 300
<210> 33
<211> 300
<212> PRT
<213> homo sapiens<400> 33
Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys1 5 10 15
Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val20 25 30
Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln35 40 45
Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu50 55 60
Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val65 70 75 80
Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys85 90 95
His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu100 105 110
Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile115 120 125
Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr130 135 140
Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys145 150 " 155 160
Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp165 170 175
Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val180 185 190
Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu195 200 205
Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser210 215 220
Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala225 230 235 240
Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp245 250 255
Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Arg260 265 270
Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val275 280 285
Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile290 295 300
<210> 34<211> 300<212> PRT<213> homo<400> 34
Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys15 10 15
Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val20 25 30
Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln35 40 45
Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu50 55 60
Ala Arg' Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val65 70 75 80
Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys85 90 95
His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu100 105 110
Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile115 120 125
Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr130 135 140
Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys145 150 155 160
Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp165 170 175
Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val180 185 190
Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu195 200 205
Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser210 215 220
Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala225 230 235 240
Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp245 250 255
Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln260 265 270
Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val275 280 285
Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile290 295 300

Claims (85)

1. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que é codificado por(i) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendam seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6,respectivamente;(ii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendam seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: lie SEQ ID No: 16,respectivamente;(iii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendam seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26,respectivamente; ou(iv) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendam seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis, que são modificações de seqüência conservativa dasseqüências como apresentadas na (i), (ii) ou (iii).
2. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende um Vh CDR3 tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 10.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que compreende um Vl CDR3 tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 5 e um Vh CDR3 tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 10.
4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que compreende as regiões variáveis de cadeia leve humana epesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreende um VlCDRl tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 3, um Vl CDR2tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 4 e um Vl CDR3 tendo aseqüência como apresentada na SEQ ID No: 5, e a região variável de cadeiapesada compreende um Vh CDRl tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 8, um Vh CDR2 tendo a seqüência como apresentada na SEQ IDNo: 9 e um Vh CDR3 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No;10.
5. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vl tendo a seqüência de aminoácidocomo apresentada na SEQ ID No: 2.
6. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vl tendo pelo menos cerca de 90 %, talcomo pelo menos cerca de 95 % de identidade de seqüência de aminoácidocom a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 2.
7. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh tendo a seqüência de aminoácidocomo apresentada na SEQ ID No: 7.
8. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh que compreende a seqüência deaminoácido que vai da região Vh CDRl até Vh CDR3 da SEQ ID No: 7.
9. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh tendo pelo menos cerca de 90 %, talcomo pelo menos cerca de 95 % de identidade de seqüência de aminoácidocom a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 7 ou com a região que vaida Vh CDRl até Vh CDR3 da SEQ ID No: 7.
10. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh tendo 1 a 5, tal como 1 a 3substituições, deleções ou adições de aminoácido comparada com a seqüênciacomo apresentada na SEQ ID No: 7 ou com a região que vai da Vh CDRl atéVh CDR3 da SEQID No: 7.
11. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vl como definida na reivindicação 5 euma região Vh como definida na reivindicação 7.
12. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende um Vh CDR3 tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 20.
13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que compreende um Vl CDR3 tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 15 e um Vh CDR3 tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 20.
14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que compreende regiões variáveis de cadeia leve humana e cadeiapesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreende um VlCDRl tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 13, um Vl CDR2tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 14 e um Vl CDR3 tendoa seqüência como apresentada na SEQ ID No: 15, e a região variável decadeia pesada compreende um Vh CDRl tendo a seqüência como apresentadana SEQ ID No: 18, um Vh CDR2 tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 19 e um Vh CDR3 tendo a seqüência como apresentada na SEQID No: 20.
15. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vl tendo a seqüência de aminoácidocomo apresentada na SEQ ID No: 12.
16. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vl tendo pelo menos cerca de 90 %, talcomo pelo menos cerca de 95 % de identidade de seqüência de aminoácidocom a seqüência de acordo com a SEQ ID No: 12.
17. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh tendo a seqüência de aminoácidocomo apresentada na SEQ ID No: 17.
18. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh que compreende a seqüência deaminoácido que vai da região Vh CDRl até Vh CDR3 da SEQ ID No: 17.
19. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh tendo pelo menos cerca de 90 %, talcomo pelo menos cerca de 95 % de identidade de seqüência de aminoácidocom a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 17 ou com a região quevai da Vh CDRl até Vh CDR3 da SEQ ID No: 17.
20. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh tendo 1 a 5, tal como 1 a 3substituições, deleções ou adições de aminoácido comparadas com aseqüência como apresentada na SEQ ID No: 17 ou com a região que vai daVh CDRl até Vh CDR3 da SEQ ID No: 17.
21. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vl como definida na reivindicação 15 euma região Vh como definida na reivindicação 17.
22. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende um Vh CDR3 tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 30.
23. Anticorpo de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que compreende um Vl CDR3 tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 25 e um Vh CDR3 tendo a seqüência comoapresentada na SEQ ID No: 30.
24. Anticorpo de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que compreende regiões variáveis de cadeia leve humana e cadeiapesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreende um VlCDRl tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 23, um Vl CDR2tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 24 e um Vl CDR3 tendoa seqüência como apresentada na SEQ ID No: 25e a região variável decadeia pesada compreende um Vh CDRl tendo a seqüência como apresentadana SEQ ID No: 28, um Vh CDR2 tendo a seqüência como apresentada naSEQ ID No: 29 e um Vh CDR3 tendo a seqüência como apresentada na SEQID No: 30.
25. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vl tendo a seqüência de aminoácidocomo apresentada na SEQ ID No: 22.
26. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vl tendo pelo menos cerca de 90 %, talcomo pelo menos cerca de 95 % de identidade de seqüência de aminoácidocom a seqüência de acordo com a SEQ ID No: 22.
27. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh tendo a seqüência de aminoácidocomo apresentada na SEQ ID No: 27.
28. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh compreendendo a seqüência deaminoácido que vai da região Vh CDRl até Vh CDR3 da SEQ ID No: 27.
29. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh tendo pelo menos cerca de 90 %, talcomo pelo menos cerca de 95 % de identidade de seqüência de aminoácidocom a seqüência de acordo com a SEQ ID No: 27 ou com a região que vai daVh CDRl até Vh CDR3 da SEQ ID No: 27.
30. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vh tendo 1 a 5, tal como 1 a 3substituições, deleções ou adições de aminoácido comparada com a seqüênciacomo apresentada na SEQ ID No: 27 ou com a região que vai da Vh CDRlaté Vh CDR3 da SEQ ID No: 27.
31. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que compreende uma região Vl como definida na reivindicação 25 euma região Vh como definida na reivindicação 27.
32. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que se liga a CD38humano (SEQ ID No: 31), e que não se liga a um CD38 humano mutante, emque o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31).
33. Peptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante,em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 %, tal como menor do que 10 %, menor do que 5 % ou menor do que 1 % da EC5O da ligação do peptídeoao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
34. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que se liga a CD38humano (SEQ ID No: 31), e que não se liga a um CD38 humano mutante, emque o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo dearginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano(SEQ ID No: 31).
35. Peptídeo de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante,em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduode arginina (SEQ ID No: 33), é menor do que 50 %, tal como menor do que 10 %, menor do que 5 % ou menor do que 1 % da EC5O da ligação do peptídeoao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
36. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 32 a 35, caracterizado pelo fato de que o dito peptídeo liga-se a um CD38humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituídocom um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), com o mesmo grau que se ligaao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
37. Peptídeo de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante,em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduode alanina (SEQ ID No: 32) corresponde de 75 % a 125 % da EC5O da ligaçãodo peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
38. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que se liga a CD38humano (SEQ ID No: 31), em que o peptídeo possui as seguintescaracterísticas de ligação: (i) liga-se a um CD38 humano mutante, em que oresíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31), (ii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que oresíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo dearginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano(SEQ ID No: 31), e (iii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que oresíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina(SEQ ID No: 32), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ IDNo: 31).
39. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que se liga a CD38humano (SEQ ID No: 31), em que o peptídeo possui as seguintescaracterísticas de ligação: (i) não se liga a um CD38 humano mutante, em queo resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo defenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38humano (SEQ ID No: 31), (ii) não se liga a um CD38 humano mutante, emque o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo dearginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano(SEQ ID No: 31), (iii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduode treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQID No: 32), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No:- 31).
40. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 33, 35 ou 37, caracterizado pelo fato de que o EC5O é determinado pelo uso deum ELISA como descrito no Exemplo 17 do relatório descritivo.
41. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que compete com umanticorpo como definido na reivindicação 1 (i) quanto a ligação a CD38.
42. Peptídeo de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que a competição é determinada pelo uso de um ELISA comodescrito nos Exemplos 8 ou 9 do relatório descritivo, em que a competição édefinida por um sinal de pelo menos 90 % como avaliado pela absorção, oupelo uso de medições de reticulação como descrito no Exemplo 7 do relatóriodescritivo, em que a competição é definida por um sinal de pelo menos 90 %como avaliado pela fluorescência.
43. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que especificamenteliga-se a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamenteligado por um anticorpo como definido na reivindicação 1.
44. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que especificamente seliga à região SKRNIQFSCKNIYR e à região EKVQTLEAWIHGG doCD38 humano (SEQ ID No: 31).
45. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que temsubstancialmente as mesmas características de ligação específicas para aligação a CD38 humano como um anticorpo como definido na reivindicação 1.
46. Peptídeo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelofato de que o peptídeo possui uma ou mais das seguintes características:(i) atua como um antagonista de CD38;(ii) não induz proliferação significante de células mononucleares dosangue periférico como determinada pelo método descrito noExemplo 18 do relatório descritivo;(iii) não induz a liberação de IL-6 signiflcante pelos monócitos humanosou de células mononucleares do sangue periférico comodeterminado pelo método descrito no Exemplo 19 do relatóriodescritivo;(iv) não induz a liberação de IFN-γ detectável pelas células T humanasou de células mononucleares do sangue periférico comodeterminada pelo método descrito no Exemplo 20 do relatóriodescritivo;(v) é internalizada pelas células que expressam CD38; tal comointernalizada pelas células CHO-CD38 dentro de 5 a 15 minutos a-37° C pelo método como descrito no Exemplo 12 do relatóriodescritivo;(vi) induz ADCC; tal como com um valor de EC50 abaixo de 15 ng/ml,tal como abaixo de 10 ng/ml em células Daudi-Iuc e com um valorEC5O abaixo de 75 ng/ml, tal como abaixo de 50 ng/ml, 30 ng/ml ou-10 ng/ml em células MM como determinado pelo método descritono Exemplo 5 do relatório descritivo;(vii) induz CDC na presença de complemento; tal como com um valorEC50 abaixo de 5 μg/ml, tal como abaixo de 1 μg/ml em célulasdaudi-luc ou CD38-CHO pelo método descrito no Exemplo 6 dorelatório descritivo;(viii)inibe a síntese de cGDPR;(ix) inibe a síntese de cADPR;(x) liga-se ao CD38 humano com um afinidade (K0) abaixo de 10" M,tal como na faixa de 10" Ma 10"" M, por exemplo na faixa de 7 χ-10"9Ma IO"10 Μ, como determinada pela ressonância de plasma desuperfície como descrito no Exemplo 20 do relatório descritivo.
47. Peptídeo de acordo com a reivindicação 46, caracterizadopelo fato de que inibe a síntese de cGDPR em pelo menos 25 %, tal comopelo menos 30 % depois de 90 minutos a uma concentração de 3 μ§/ηι1 comodeterminada pelo método espectrofotométrico descrito no Exemplo 24 dorelatório descritivo.
48. Peptídeo de acordo com a reivindicação 46, caracterizadopelo fato de que inibe a síntese de cADPR em pelo menos 25 %, tal comopelo menos 30 % depois de 90 minutos a uma concentração de 3 μg/ml comodeterminado pelo método de HPLC descrito em Munshi et al., J. Biol. Chem. 275,21566-21571 (2000).
49. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 32 a 48, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonalhumano.
50. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 31 ou 49, caracterizado pelo fato de que o mesmo é um anticorpo detamanho natural IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM, tal comoum anticorpo IgGl, preferivelmente um anticorpo IgGl,k ou um anticorpoIgM, preferivelmente um anticorpo IgM,k.
51. Anticorpo monoclonal humano isolado, caracterizado pelofato de que compreende(i) uma seqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesadaderivada de uma seqüência da linha germinativa Hvl263/3M28(VhI) humana e uma seqüência de aminoácido da região variável decadeia leve derivada de uma seqüência da linha germinativa Ll5(Vkl) humana, em que o anticorpo humano liga-se ao CD38humano; ou(ii) uma seqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesadaderivada de uma seqüência da linha germinativa Vh3-DP-47/V3-23(VhIII) humana e uma seqüência de aminoácido da região variávelde cadeia leve derivada de uma seqüência da linha germinativa L6(VkI) humana, em que o anticorpo humano liga-se ao CD38humano.
52. Peptídeo de acordo com qualquer-uma das reivindicaçõesde 1 a 51, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é glicosilado em umacélula eucarióptica.
53. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 31 ou 49 a 51, caracterizado pelo fato de que é um fragmento deanticorpo ou um anticorpo de cadeia única.
54. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 53, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um ligadorquelador para ligar um radioisótopo.
55. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 54, caracterizado pelo fato de que está em uma forma substancialmenteisolada.
56. Acido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de quecodifica um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1a 55.
57. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de quecompreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 56.
58. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de quecompreende(i) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 1,(ii) uma seqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 6,(iii) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 1 e umaseqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 6;(iv) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 11;(v) uma seqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 16;(vi) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 11 e umaseqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 16;(vii) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 21;(viii)uma seqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 26; ou(ix) uma seqüência de nucleotídeo Vl da SEQ ID No: 21 e umaseqüência de nucleotídeo Vh da SEQ ID No: 26.
59. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 57 ou-58, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma seqüência denucleotídeo que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeiapesada ou cadeias tanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano.
60. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 59,caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeo que codifica aregião constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tantoleves quanto pesadas de um anticorpo humano codifica um anticorpo IgGl.
61. Hibridoma, caracterizado pelo fato de que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreendem(i) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6,respectivamente;(ii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: lie SEQ ID No: 16,respectivamente;(iii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26,respectivamente; ou(iv) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis, que são modificações de seqüência conservativa dasseqüências apresentadas em (i), (ii) ou (iii).-
62. Hibridoma, caracterizado pelo fato de que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeiapesada e de cadeia leve humanas que compreendem(i) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana comoapresentada na SEQ ID No: 2, e a seqüência de aminoácido variávelda cadeia pesada humana como apresentadas na SEQ ID No: 7;(ii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana comoapresentada na. SEQ ID No: 12, e a seqüência de aminoácidovariável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ IDNo: 17;(iii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana comoapresentada na SEQ ID No: 22, e a seqüência de aminoácidovariável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ IDNo: 27; ou(iv) modificações de seqüências conservativas das seqüências deaminoácido variáveis da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana como apresentado em (i), (ii) ou (iii).
63. Transfectoma, caracterizado pelo fato de que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicosda cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende(i) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentadas na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6,respectivamente;(ii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentado na SEQ ID No: lie SEQ ID No: 16,respectivamente;(iii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis como apresentadas na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26,respectivamente; ou(iv) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humanaque compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiõesvariáveis, que são modificações de seqüência conservativa dasseqüências apresentadas em (i), (ii) ou (iii).
64. Transfectoma, caracterizado pelo fato de que produz umanticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeiapesada e de cadeia leve humanas que compreende(i) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana comoapresentada na SEQ ID No: 2, e a seqüência de aminoácido variávelda cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 7;(ii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana comoapresentada na SEQ ID No: 12, e a seqüência de aminoácidovariável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ IDNo: 17;(iii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana comoapresentada na SEQ ID No: 22, e a seqüência de aminoácidovariável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ IDNo: 27; ou(iv) modificações de seqüências conservativas das seqüências deaminoácido variáveis da cadeia leve humana e cadeia pesadahumana como apresentado em (i), (ii) ou (iii).
65. Célula hospedeira eucarióptica ou procarióptica,caracterizada pelo fato de que produz um peptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 55.
66. Célula Hospedeira eucarióptica ou procarióptica,caracterizado pelo fato de que contém um vetor de expressão como definidoem qualquer uma das reivindicações de 57 a 60.
67. Imunoconj ugado, caracterizado pelo fato de quecompreende um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 55 ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo, ou uma droga.
68. Imunoconj ugado, caracterizado pelo fato de quecompreende um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 55, em que o peptídeo é um anticorpo IgM monomérico ligado a umagente citotóxico, um radioisótopo, ou uma droga.
69. Molécula bi-específica ou multi-específica, caracterizadapelo fato de que compreende um peptídeo como definido em qualquer umadas reivindicações de 1 a 55 e uma especificidade de ligação quanto a umacélula efetora humana.
70. Molécula bi-específica ou multi-específica, caracterizadapelo fato de que compreende um peptídeo como definido em qualquer umadas reivindicações de 1 a 55 e uma especificidade de ligação quanto a CD3,CD4, CD138, IL-15R, TNF-α ligado à membrana ou ligada ao receptor, umreceptor Fc humano, ou IL-15 ligada à membrana ou ligada ao receptor.
71. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 55 ou um imunoconjugado como definido nas reivindicações 67 ou 68e um carreador farmaceuticamente aceitável.
72. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais outros agentesterapêuticos.
73. Uso de um peptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 55, um imunoconjugado como definido nasreivindicações 67 ou 68, uma composição farmacêutica como definida nasreivindicações 71 ou 72, ou um vetor de expressão como definido emqualquer uma das reivindicações de 57 a 60, caracterizado pelo fato de ser napreparação de um medicamento para inibir crescimento e/ou proliferação deuma célula que expresse CD38
74. Uso de um peptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 55, um imunoconjugado como definido nasreivindicações 67 ou 68, uma composição farmacêutica como definida nasreivindicações 71 ou 72, ou um vetor de expressão como definido emqualquer uma das reivindicações de 57 a 60, caracterizado pelo fato de ser napreparação de um medicamento para tratar uma doença ou distúrbio queenvolvam células que expressam CD38 em um indivíduo.
75. Uso de um peptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 55, um imunoconjugado como definido nasreivindicações 67 ou 68, uma composição farmacêutica como definido nasreivindicações 71 ou 72, ou um vetor de expressão como definido emqualquer uma das reivindicações de 57 a 60, caracterizado pelo fato de ser napreparação de um medicamento para prevenir uma doença ou distúrbio queenvolvam células que expressem CD38 em um indivíduo.
76. Uso de acordo com as reivindicações 74 ou 75,caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é a artrite reumatóide.
77. Uso de acordo com as reivindicações 74 ou 75,caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é o mieloma múltiplo.
78. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 73a 77, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um oumais outros agentes terapêuticos ao indivíduo.
79. Uso de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelofato de que o um ou mais outros agentes terapêuticos são selecionados de umagente quimioterapêutico, um agente anti-inflamatório, ou um agenteimunossupressivo e/ou imunomodulatório.
80. Uso de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelofato de que o um ou mais outros agentes terapêuticos são selecionados de umgrupo que consiste de cisplatina, gefitinib, cetuximab, rituximab,bevacizumab, erlotinib, bortezomib, talidomida, pamidronato, ácidozoledrônico, clodronato, risendronato, ibandronato, etidronato, alendronato,tiludronato, trióxido de arsênico, lenalidomida, filgrastim, pegfilgrastim,sargramostim, ácido suberoilanilida hidroxâmico, e SC10-469.
81. Método ín vitro para detectar a presença de antígeno deCD38, ou uma célula que expresse CD38, em uma amostra, caracterizadopelo fato de que compreende:a) contatar a amostra com um peptídeo de acordo com qualquer umadas reivindicações de 1 a 55 sob condições que possibilitem aformação de um complexo entre o peptídeo e CD38; eb) detectar a formação de um complexo.
82. Kit para detectar a presença de antígeno de CD38, ou umacélula que expresse CD38, em uma amostra, caracterizado pelo fato de quecompreenda um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 55.
83. Anticorpo anti-idiotípico, caracterizado pelo fato de que seliga a um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a-31, 49 a 51 ou 53.
84. Uso de um anticorpo anti-idiotípico como definido nareivindicação 83, caracterizado pelo fato de ser para detectar o nível de umanticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 31, 49 a-51 ou 53 em uma amostra.
85. Uso de um anticorpo anti-idiotípico como definido nareivindicação 83, caracterizado pelo fato de ser para detectar o nível deanticorpo monoclonal humano contra CD38 em uma amostra.
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