BRPI0608927B1 - Anticorpo que se liga a cd38 humano, vetor de expressão, célula hospedeira procariótica, imunoconjugado, molécula bi-específica ou multi-específica, composição farmacêutica, uso de um anticorpo, de um imunoconjugado, de uma composição farmacêutica e de um vetor de expressão, método in vitro para detectar a presença de antígeno de cd38, ou uma célula que expresse cd38, em uma amostra, e, kit - Google Patents

Anticorpo que se liga a cd38 humano, vetor de expressão, célula hospedeira procariótica, imunoconjugado, molécula bi-específica ou multi-específica, composição farmacêutica, uso de um anticorpo, de um imunoconjugado, de uma composição farmacêutica e de um vetor de expressão, método in vitro para detectar a presença de antígeno de cd38, ou uma célula que expresse cd38, em uma amostra, e, kit Download PDF

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Yvo Graus
Judith Oprins
Paul Parren
Jan van de Winkel
Martine van Vugt
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Abstract

anticorpo que se liga a cd38 humano, peptídeo, anticorpo monoclonal humano isolado, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, hibridoma, transfectoma, célula hospedeira eucarióptica ou procarióptica, imunoconjugado, molécula bi-específica ou multi-específica, composição farmacêutica, uso de um peptídeo, imunoconjugado, composição farmacêutica ou um vetor de expressão, método in vitro para detectar a presença de antígeno de cd38, ou uma célula que expresse cd38, em uma amostra, kit, anticorpo anti-idiotípico, e, uso de um anticorpo anti-idiotípico. anticorpos monoclonais humanos isolados que se ligam a cd38 humano, e composições e moléculas com base em anticorpo relacionadas, são divulgados. também divulgados são composições farmacêuticas que compreendam os anticorpos humanos, e métodos terapêuticos e de diagnóstico para usar os anticorpos humanos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção diz respeito aos anticorpos que ligam CD38, anticorpos estes que têm características específicas e que são úteis para tratar inter alia mieloma múltiplo.
FUNDAMENTOS
[002] O mieloma múltiplo é uma malignidade de célula B caracterizada pelo acúmulo latente na medula óssea de células plasmáticas secretoras com um índice proliferativo baixo e um período de vida prolongado. A doença basicamente ataca ossos e medula óssea, resultando em tumores múltiplos e lesões por todo o sistema esqueletal.
[003] Aproximadamente 1 % de todos os cânceres eaproximadamente mais do que 10 % de todas as malignidades hematológicas, podem ser atribuídas ao mieloma múltiplo (MM). A incidência de MM aumenta na população envelhecida, com a idade média no momento do diagnóstico sendo de cerca de 61 anos.
[004] As terapias correntemente disponíveis para mieloma múltiplo incluem quimioterapia, transplante de célula tronco, Thalomid® (talidomida), Velcade® (bortezomib), Aredia® (pamidronato) e Zometa® (ácido zoledrônico). Os protocolos de tratamento correntes, que incluem uma combinação de agentes quimioterapêuticos tais como vincristina, BCNU, melfalan, ciclofosfamida, adriamicina e prednisona ou dexametasona, produz uma taxa de remissão completa de apenas cerca de 5 % e a sobrevivência média é de aproximadamente 36 a 48 meses a partir do momento do diagnóstico. Avanços recentes usando quimioterapia de alta dose seguida pelo transplante autológo de medula óssea ou célula mononuclear de sangue periférico têm aumentado a taxa de remissão completa e a duração da remissão. Contudo a sobrevivência global tem sido apenas levemente prolongada e nenhuma evidência quanto a uma cura foi obtida. Por fim, todos os pacientes MM reincidem, mesmo sob a terapia de manutenção com interferon-alfa (IFN-α) sozinho ou em combinação com esteróides.
[005] A eficácia dos regimes de tratamento quimioterapêutico disponível para MM é limitada pela taxa de proliferação de célula baixa e desenvolvimento de resistência a multi-medicamento. Para mais do que 90 % dos pacientes MM, a doença torna-se quimioresistente. Como um resultado, regimes de tratamento alternativos dirigidos aos antígenos de superfície alvejando a imunoterapia adotiva em células plasmáticas estão sendo procurados.
[006] CD38 é um exemplo de um antígeno expressado em tais células plasmáticas malignas e é expressado em uma variedade de doenças hematológicas malignas, incluindo mas não restritas a mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica de célula B, leucemia linfocítica aguda de célula B, macroglobulinemia de Waldenstrom, amiloidose sistêmica primária, linfoma de célula do manto, leucemia prolinfocítica/ mielocítica, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, linfoma folicular, leucemia de célula NK e leucemia de célula plasmática. A expressão de CD38 foi descrita em células epiteliais/endoteliais de origem diferente, incluindo o epitélio glandular na próstata, células das ilhotas no pâncreas, epitélio dutal nas glândulas, incluindo a glândula parótida, células epiteliais brônquicas, células em testículos e ovário e epitélio tumoral no adenocarcinoma colorretal. Doenças, onde a expressão de CD38 pode estar envolvida, incluem mas não são restritas a carcinomas bronco-epiteliais do pulmão, câncer de mama (que evolui da proliferação maligna de revestimento epitelial em dutos e lóbulos da mama), tumores pancreáticos, que evoluem das células b (insulinomas), tumores que evoluem do epitélio no intestino (por exemplo, adenocarcinoma e carcinoma de célula escamosa). No CNS, os neuroblastomas expressam CD38. Outras doenças incluem carcinoma na glândula prostática, seminomas nos testículos e cânceres ovarianos.
[007] Normalmente, CD38 é expressado pelas células hematopoiéticas e em tecidos sólidos. Com respeito às células hematopoiéticas, a maioria de timócitos medulares são CD38 +, as células T e B em repouso e circulantes são CD38- e as células ativadas são CD38+. CD38 também é expressado em aproximadamente 80 % das células NK em repouso e monócitos e em linfoblastos do centro germinal de linfonodo, células B plasmáticas e algumas células intrafoliculares. CD38 também pode ser expressado pelas células dendríticas. Uma proporção significante de células da medula óssea normais, células precursoras particulares, expressam CD38. Além disso, 50 a 80 % de células sangüíneas do cordão umbilical são CD38+ e permanecem assim no sangue humano durante os primeiros dois a três anos de vida. Além das células precursoras de linfóide, CD38 também é expressado em eritrócitos e em plaquetas.
[008] Com respeito aos tecidos sólidos, CD38 é expressado no intestino pelas células intra-epiteliais e linfócitos da lâmina própria, pelas células de Purkinje e emaranhados neurofibrilares no cérebro, pelas células epiteliais na próstata, células β no pâncreas, osteoclastos no osso, células retinais no olho e sarcolema de músculos liso e estriado.
[009] As funções atribuídas ao CD38 incluem tanto a mediação de receptor nos eventos de adesão e sinalização e atividade (ecto-) enzimática. Como uma ectoenzima, CD38 usa NAD + como substrato para a formação de ADP-ribose cíclica (cADPR) e ADPR, mas também de nicotinamida e ácido nicotínico-adenina dinucleotídeo fosfato (NAADP). cADPR foi mostrado atuar como segundo mensageiro para a mobilização de Ca2+ a partir do retículo endoplasmático. Além da sinalização por intermédio de Ca2+, a sinalização de CD38 ocorre por intermédio da conversa cruzada com complexos de antígeno-receptor nas células T e B ou outros tipos de complexos de receptor, por exemplo, as moléculas MHC e está deste modo envolvida em diversas respostas celulares, mas também na comutação e secreção de IgG1.
[0010] Os anticorpos anti-CD38 são descritos na literatura, por exemplo em Lande R, et al., Cell Immunol. 220(1), 30-8 (2002), Ausiello CM, et al., Tissue Antigens. 56(6), 53947 (2000) e Cotner T, et al., Int J Immunopharmacol. 3(3), 255-68 (1981). CD38 tem várias funções, que podem ser ativadas ou não por uma molécula que se liga o CD38. Por exemplo o anticorpo anti-CD38 de camundongo IB4 tem propriedades agonísticas em relação o CD38. IB4 é mostrado induzir a ativação de célula T como indicado pela mobilização de Ca2+ em células Jukart (Zubiaur M, et al., J Immunol. 159(1), 193-205 (1997), induzir proliferação significante de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), induzir a liberação de níveis significantes de IL-6 e induzir a liberação de níveis de IFN-Y detectáveis (Lande, Zubiaur Morra, Ansiello supra).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano codificado por(i) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6, respectivamente;(ii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16, respectivamente;(iii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26, respectivamente; ou(iv) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis, que são modificações da seqüência conservativa das seqüências como apresentado em (i), (ii) ou (iii).
[0012] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano que compreende uma CDR3 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 10.
[0013] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma CDR3 de VL tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 5 e uma CDR3 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 10.
[0014] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende regiões variáveis de cadeia leve humana e cadeia pesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 3, uma CDR2 de VL tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 4 e uma CDR3 de VL tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 5 e a região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 8, uma CDR2 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 9 e uma CDR3 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 10.
[0015] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VL tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 2.
[0016] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VL tendo pelo menos cerca de 90 %, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido com a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 2.
[0017] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 7.
[0018] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH que compreende a seqüência de aminoácido que vai da região CDR1 de VH até a CDR3 de VH da SEQ ID No: 7.
[0019] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH tendo pelo menos cerca de 90 %, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido com a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 7 ou com a região que vai da CDR1 de VH até a CDR3 de VH da SEQ ID No: 7.
[0020] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH tendo de 1 a 5, tal como de 1 a 3 substituições, deleções ou adições de aminoácido comparada com a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 7 ou com a região que vai da CDR1 de VH até a CDR3 de VH da SEQ ID No: 7.
[0021] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VL como definida acima e uma região VH como definida acima.
[0022] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma CDR3 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 20.
[0023] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma CDR3 de VL tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 15 e uma CDR3 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 20.
[0024] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende regiões variáveis de cadeia leve humana e cadeia pesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 13, uma CDR2 de VL tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 14 e uma CDR3 de VL tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 15 e a região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 18, uma CDR2 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 19 e uma CDR3 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 20.
[0025] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VL tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 12.
[0026] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VL tendo pelo menos cerca de 90 %, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido com a seqüência de acordo com a SEQ ID No: 12.
[0027] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 17.
[0028] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH que compreende a seqüência de aminoácido que vai da região CDR1 de VH até a CDR3 de VH da SEQ ID No: 17.
[0029] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH tendo pelo menos cerca de 90 %, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido com a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 17 ou com a região que vai da CDR1 de VH até a CDR3 de VH da SEQ ID No: 17.
[0030] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH tendo de 1 a 5, tal como de 1 a 3 substituições, deleções ou adições de aminoácido comparada com a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 17 ou com a região que vai da CDR1 de VH até a CDR3 de VH da SEQ ID No: 17.
[0031] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VL como definida acima e uma região VH como definida acima.
[0032] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma CDR3 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 30.
[0033] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma CDR3 de VL tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 25 e uma CDR3 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 30.
[0034] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende regiões variáveis de cadeia leve humana e cadeia pesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreende uma CDR1 de VL tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 23, uma CDR2 de VL tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 24 e uma CDR3 de VL tendo a seqüência como apresentado na SEQ ID No: 25 e a região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 28, uma CDR2 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 29 e uma CDR3 de VH tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 30.
[0035] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VL tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 22.
[0036] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VL tendo pelo menos cerca de 90 %, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido com a seqüência de acordo com a SEQ ID No: 22.
[0037] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 27.
[0038] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH que compreende a seqüência de aminoácido que vai da região CDR1 de VH até a CDR3 de VH da SEQ ID No: 27.
[0039] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH tendo pelo menos cerca de 90 %, tal como pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido com a seqüência de acordo com a SEQ ID No: 27 ou com a região que transpõem de CDR1 de VH a CDR3 de VH da SEQ ID No: 27.
[0040] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VH tendo de 1 a 5, tal como de 1 a 3 substituições, deleções ou adições de aminoácido comparada com a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 27 ou com a região que vai da CDR1 de VH até a CDR3 de VH da SEQ ID No: 27.
[0041] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga ao CD38 humano, que compreende uma região VL como definida acima e uma região VH como definida acima.
[0042] A presente invenção fornece um peptídeo que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31) e que não se ligam a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[0043] A presente invenção fornece um peptídeo como definido acima, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 %, tal como menor do que 10 %, menor do que 5 % ou menor do que 1 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[0044] A presente invenção fornece um peptídeo que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31) e que não se ligam a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[0045] A presente invenção fornece um peptídeo como definido acima, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), é menor do que 50 %, tal como menor do que 10 %, menor do que 5 % ou menor do que 1 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[0046] A presente invenção fornece um peptídeo como definido acima, em que o dito peptídeo liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[0047] A presente invenção fornece um peptídeo como definido acima, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) corresponde de 75 % a 125 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[0048] A presente invenção fornece um peptídeo que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31), em que o peptídeo possui as seguintes características de ligação: (i) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31), (ii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31) e (iii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[0049] A presente invenção fornece um peptídeo que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31), em que o peptídeo possui as seguintes características de ligação: (i) não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31), (ii) não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31), (iii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[0050] A presente invenção fornece um peptídeo como definido acima, em que a EC50 é determinada pelo uso de um ELISA como descrito no Exemplo 17 do relatório descritivo.
[0051] A presente invenção fornece um peptídeo que compete com um anticorpo de acordo com a forma de realização (i) acima quanto à ligação ao CD38. Em uma forma de realização a competição é determinada pelo uso de um ELISA como descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo, em que a competição é definida por um sinal de pelo menos 90 % como avaliado pela absorção ou pelo uso de medições de reticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo, em que a competição é definida por um sinal de pelo menos 90 % como avaliado pela fluorescência.
[0052] A presente invenção fornece um peptídeo que especificamente se liga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamente ligado por um anticorpo como definido acima.
[0053] A presente invenção fornece um peptídeo que especificamente se liga à região SKRNIQFSCKNIYR e à região EKVQTLEAWVIHGG do CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[0054] A presente invenção fornece um peptídeo tendo substancialmente as mesmas características de ligação específicas para a ligação ao CD38 humano como um anticorpo como definido acima.
[0055] A presente invenção fornece um peptídeo que se liga ao CD38 humano, anticorpo este que possui uma ou mais das seguintes características:(i) atua como um antagonista de CD38;(ii) não induz proliferação significante de células mononucleares do sangue periférico como determinada pelo método descrito no Exemplo 18 do relatório descritivo;(iii) não induz a liberação de IL-6 significante pelos monócitos humanos ou de células mononucleares do sangue periférico como determinada pelo método descrito no Exemplo 19 do relatório descritivo;(iv) não induz a liberação de IFN-Y detectável pelas células T humanas ou células mononucleares do sangue periférico como determinada pelo método descrito no Exemplo 20 do relatório descritivo;(v) é internalizada pelas células que expressam CD38; tal como internalizada pelas células CHO-CD38 dentro de 5 a 15 minutos a 37°C pelo método como descrito no Exemplo 12 do relatório descritivo;(vi) induz ADCC; tal como com um valor de EC50 abaixo de 15 ng/ml, tal como abaixo de 10 ng/ml em células Daudi-luc e com um valor EC50 abaixo de 75 ng/ml, tal como abaixo de 50 ng/ml, 30 ng/ml ou 10 ng/ml em células MM como determinada pelo método descrito no Exemplo 5 do relatório descritivo;(vii) induz CDC na presença de complemento; tal como com um valor EC50 abaixo de 5 μ g/ml, tal como abaixo de 1 μ g/ml em células daudi-luc ou CD38-CHO pelo método descrito no Exemplo 6 do relatório descritivo;(viii) inibe a síntese de cGDPR;(ix) inibe a síntese de cADPR;(x) liga-se ao CD38 humano com uma afinidade (KD) abaixo de 10-8 M, tal como na faixa de 10-8 M a 10-11 M, por exemplo na faixa de 7 x 10-9 M a 10-10 M, como determinada pela ressonância de plasma de superfície como descrito no Exemplo 20 do relatório descritivo.
[0056] A presente invenção fornece um peptídeo como definido acima, que inibe a síntese de cGDPR em pelo menos 25 %, tal como pelo menos 30 % depois de 90 minutos a uma concentração de 3 μ g/ml como determinado pelo método espectrofotométrico descrito no Exemplo 24 do relatório descritivo.
[0057] A presente invenção fornece um peptídeo como definido acima, que inibe a síntese de cADPR em pelo menos 25 %, tal como pelo menos 30 % depois de 90 minutos a uma concentração de 3 μ g/ml como determinado pelo método de HPLC descrito em Munshi et al., J. Biol. Chem. 275, 21566-21571 (2000).
[0058] Em uma forma de realização o peptídeo como definido acima é um anticorpo monoclonal humano.
[0059] A presente invenção fornece um anticorpo como definido acima, caracterizado em que o mesmo é um anticorpo de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 1gD, IgA, IgE ou IgM de tamanho natural, tal como um anticorpo IgG1, preferivelmente um anticorpo IgG1.K ou um anticorpo IgM, preferivelmente um anticorpo IgM.K.
[0060] A presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano isolado que compreende(i) uma seqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesada derivada de uma seqüência da linha germinativa Hv1263/3M28 (VHI) humana e uma seqüência de aminoácido da região variável de cadeia leve derivada de uma seqüência da linha germinativa humano L15 (VKI), em que o anticorpo humano liga-se ao CD38 humano; ou(ii) uma seqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesada derivada de uma seqüência da linha germinativa humana VH3-DP- 47N3-23 (VHIII) e uma seqüência de aminoácido da região variável de cadeia leve derivada de uma seqüência da linha germinativa L6 (VKI) humana, em que o anticorpo humano liga-se ao CD38 humano.
[0061] A presente invenção fornece um peptídeo como definido acima, em que o peptídeo é glicosilado em uma célula eucarióptica.
[0062] Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a invenção é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.
[0063] A presente invenção fornece um peptídeo como definido acima, que compreende ainda um ligador quelador para ligar um radioisótopo.
[0064] A presente invenção fornece um peptídeo como definido acima, que está em uma forma substancialmente isolada.
[0065] A presente invenção fornece um ácido nucleico isolado que codifica um peptídeo como definido acima.
[0066] A presente invenção fornece um vetor de expressão que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo como definido acima.
[0067] A presente invenção fornece um vetor de expressão que compreende(i) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 1,(ii) uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 6,(iii) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 1 e uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 6;(iv) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 11;(v) uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 16;(vi) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 11 e uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 16;(vii) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 21;(viii) uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 26; ou(ix) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 21 e uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 26.
[0068] A presente invenção fornece um vetor de expressão como definido acima, que compreende ainda uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano.
[0069] A presente invenção fornece um vetor de expressão como definido acima, em que a seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano codifica um anticorpo IgG1.
[0070] A presente invenção fornece um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende(i) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6, respectivamente;(ii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16, respectivamente;(iii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26, respectivamente; ou(iv) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis, que são modificações da seqüência conservativa das seqüências apresentadas em (i), (ii) ou (iii).
[0071] A presente invenção fornece um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve humanas que compreendem(i) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 2 e a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 7;(ii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 12 e a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 17;(iii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 22 e a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 27; ou(iv) modificações das seqüências conservativas das seqüências de aminoácido variáveis da cadeia leve humana e cadeia pesada humana como apresentado em (i), (ii) ou (iii).
[0072] A presente invenção fornece um tranfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende(i) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6, respectivamente;(ii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16, respectivamente;(iii) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26, respectivamente; ou(iv) ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreendem seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis, que são modificações da seqüência conservativa das seqüências apresentadas em (i), (ii) ou (iii).
[0073] A presente invenção fornece um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve humanas que compreendem(i) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 2 e a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 7;(ii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 12 e a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 17;(iii) a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 22 e a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 27; ou(iv) modificações das seqüências conservativas das seqüências de aminoácido variáveis da cadeia leve humana e cadeia pesada humana como apresentado em (i), (ii) ou (iii).
[0074] A presente invenção fornece uma célula hospedeiraeucarióptica ou procarióptica que produz um peptídeo como definido acima.
[0075] A presente invenção fornece uma célula hospedeiraeucarióptica ou procarióptica contendo um vetor de expressão como definido acima.
[0076] A presente invenção fornece um animal não humano ou planta transgênicos que compreendem ácidos nucleicos que codificam uma cadeia pesada humana e uma cadeia leve humana, em que o animal ou planta produzem uma quantidade detectável de um peptídeo como definido acima.
[0077] A presente invenção fornece um imunoconjugado que compreende um peptídeo como definido acima ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo ou um medicamento.
[0078] A presente invenção fornece um imunoconjugado que compreende um peptídeo como definido acima, em que o peptídeo é um anticorpo IgM monomérico ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo ou um medicamento.
[0079] A presente invenção fornece uma molécula biespecífica ou multiespecífica que compreende um peptídeo como definido acima e uma especificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana.
[0080] A presente invenção fornece uma molécula biespecífica ou multiespecífica que compreende um peptídeo como definido acima e uma especificidade de ligação para CD3, CD4, CD138, IL-15R, ligada à membrana ou ligada ao receptor TNF-α, um receptor de Fc humano ou ligada à membrana ou ligada ao receptor IL-15.
[0081] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um peptídeo como definido acima ou um imunoconjugado como definido acima e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0082] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica como definida acima que compreende uma ou mais outros agentes terapêuticos.
[0083] A presente invenção fornece um método de inibir o crescimento e/ou proliferação de uma célula que expresse CD38, que compreende a administração de um peptídeo como definido acima, um imunoconjugado como definido acima, uma composição farmacêutica como definida acima ou um vetor de expressão como definido acima, tal que o crescimento e/ou proliferação da célula sejam inibidos.
[0084] A presente invenção fornece um método de tratar uma doença ou distúrbio que envolva células que expressam CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de um peptídeo como definido acima, um imunoconjugado como definido acima, uma composição farmacêutica como definida acima ou um vetor de expressão como definido acima a um paciente em necessidade deste.
[0085] A presente invenção fornece um método de prevenir uma doença ou distúrbio que envolvam células que expressam CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de um peptídeo como definido acima, um imunoconjugado como definido acima, uma composição farmacêutica como definida acima ou um vetor de expressão como definido acima a um paciente em necessidade deste.
[0086] Em uma forma de realização a doença ou distúrbio é a artrite reumatóide.
[0087] Em uma forma de realização a doença ou distúrbio é o mieloma múltiplo.
[0088] Em uma forma de realização o método compreende a administração de um ou mais outros agentes terapêuticos ao paciente.
[0089] Em uma forma de realização o um ou mais outros agentes terapêuticos são selecionados de um agente quimioterapêutico, um agente anti-inflamatório ou um agente imunossupressivo e/ou imunomodulatório.
[0090] Em uma forma de realização o um ou mais outros agentes terapêuticos são selecionados de um grupo que consiste de cisplatina, gefitinib, cetuximab, rituximab, bevacizumab, erlotinib, bortezomib, talidomida, pamidronato, ácido zoledrônico, clodronato, risendronato, ibandronato, etidronato, alendronato, tiludronato, trióxido de arsênico, lenalidomida, filgrastim, pegfilgrastim, sargramostim, suberoilanilida ácido hidroxâmico e SCIO-469.
[0091] A presente invenção fornece um método in vitro para detectar a presença de antígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em uma amostra que compreende:a) contatar a amostra com um peptídeo como definido acima sob condições que permitam a formação de um complexo entre o peptídeo e CD38; eb) detectar a formação de um complexo.
[0092] A presente invenção fornece um kit para detectar a presença de antígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em uma amostra que compreenda um peptídeo como definido acima.
[0093] A presente invenção fornece um método in vivo para detectar antígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em um paciente que compreende:a) administrar o peptídeo como definido acima sob condições que permitam a formação de um complexo entre o peptídeo e CD38; eb) detectar o complexo formado.
[0094] A presente invenção fornece um anticorpo anti-idiotípico que se liga a um anticorpo como definido acima.
[0095] Em uma forma de realização o anticorpo anti-idiotípico é usado para detectar o nível de um anticorpo como definido acima em uma amostra.
[0096] Em uma forma de realização o anti anti-idiotípico é usado para detectar o nível de anticorpo monoclonal humano contra CD38 em uma amostra.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0097] A Figura 1A mostra a ligação de -003, -005 e do anticorpo de controle de isótipo HuMab-KLH às células CHO transfectadas com CD38 (CHO-CD38) como medido pela citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 4.
[0098] A Figura 1B mostra a ligação de -024 e HuMab-KLH às células CHO transfectadas com CD38 (CHO-CD38) como medido pela citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 4.
[0099] A Figura 2A mostra a ligação de -003, -005 e HuMab-KLH às células Daudi como medido pela citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 4.
[00100] A Figura 2B mostra a ligação de -024 e HuMab-KLH às células Daudi como medido pela citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 4.
[00101] A Figura 3 mostra a ligação de -003, -005, -024 e HuMab- KLH às células de mieloma múltiplo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 4.
[00102] A Figura 4A mostra a capacidade de -003 e -005 para induzir a lise de células Daudi pela ADCC quando comparada com rituximab e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5.
[00103] A Figura 4B mostra a capacidade de -024 para induzir a lise de células Daudi pela ADCC quando comparada com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5.
[00104] A Figura 5A mostra a capacidade de -003, -005 e -024 para induzir a lise de células de tumor de mieloma múltiplo frescas pela ADCC quando comparada com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5.
[00105] A Figura 5B mostra a capacidade de -003, -005 e -024 para induzir a lise de células de tumor da leucemia em células plasmática fresca pela ADCC quando comparada com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5.
[00106] A Figura 6 mostra a capacidade de -003 e -005 para induzir a lise de JK6L (uma linhagem de célula de mieloma múltiplo) pela ADCC quando comparada com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5.
[00107] A Figura 7 mostra a capacidade de -003 e -005 para induzir a lise de AMO-1 (uma linhagem de célula de mieloma múltiplo) pela ADCC quando comparada com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5.
[00108] A Figura 8 mostra a lise mediada por CDC de células Daudi- luc induzidas por -003 e -005 comparada a HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6.
[00109] A Figura 9A mostra a lise mediada por CDC de células CHO- CD38 induzidas por -003 e -005 comparada a HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6.
[00110] A Figura 9B mostra a lise mediada por CDC de células CHO- CD38 induzida por -024 comparada com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6.
[00111] A Figura 10A mostra a lise mediada por CDC de células de tumor refratárias a 3 % na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6.
[00112] A Figura 10B mostra a lise mediada por CDC de células de tumor refratárias a 9 % na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6.
[00113] A Figura 10C mostra a lise mediada por CDC de células de tumor de 30 a 40 % na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6.
[00114] A Figura 10D mostra a lise mediada por CDC de células de tumor a 70 % na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6.
[00115] A Figura 10E mostra a lise mediada por CDC de células de mieloma múltiplo na presença de -024 e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6.
[00116] A Figura 11 mostra que -003 e -005 não bloqueiam cruzado a ligação o CD38. O cenário experimental está descrito no Exemplo 7.
[00117] A Figura 12A mostra o tingimento imunoistológico de macrófagos, linfócitos e células B plasmáticas com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00118] A Figura 12B mostra o tingimento imunoistológico do epitélio brônquico com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00119] A Figura 12C mostra o tingimento imunoistológico de miócitos com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00120] A Figura 12D mostra o tingimento imunoistológico de tecido linfóide de cinomolgos com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00121] A Figura 13A mostra o tingimento imunoistológico de macrófagos, linfócitos e células B plasmáticas com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00122] A Figura 13B mostra o tingimento imunoistológico de epitélio brônquico com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00123] A Figura 13C mostra o tingimento imunoistológico de miócitos com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00124] A Figura 13D mostra o tingimento imunoistológico de tecido linfóide de cinomolgos com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00125] A Figura 14A mostra o tingimento imunoistológico do endotélio hepático com CD31. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00126] A Figura 14B mostra o tingimento imunoistológico de endotélio hepático com vWF. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00127] A Figura 14C mostra o tingimento imunoistológico de endotélio hepático com anti-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00128] A Figura 14D mostra o tingimento imunoistológico de endotélio hepático com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00129] A Figura 14E mostra o tingimento imunoistológico de endotélio hepático com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10.
[00130] A Figura 15A mostra a reatividade cruzada de -003 e -005 comparada a HuMab-KLH em linfócitos cinomolgos como medido pela citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 11.
[00131] A Figura 15B mostra a reatividade cruzada de -003 e -005 comparada a HuMab-KLH em monócitos cinomolgos como medido pela citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 11.
[00132] A Figura 15C mostra a reatividade cruzada de -003 e -005 comparada a HuMab-KLH em PBMCs de macaco Rhesus como medido pela citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 11.
[00133] A Figura 16A mostra a internalização de -003 como medido pela extinção de EtBr. O cenário experimental está descrito no Exemplo 12.
[00134] A Figura 16B mostra a internalização de -005 como medido pela extinção de EtBr. O cenário experimental está descrito no Exemplo 12.
[00135] A Figura 17A mostra a inibição causada por -003 e -005 comparada a um anticorpo monoclonal anti-CD20 (rituximab) e HuMab-KLH do crescimento de células de tumor em um cenário preventivo como medido pela formação de imagem por SCID luciferase in vivo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 13.
[00136] A Figura 17B mostra a inibição causada por -003 e -005 comparada a um anticorpo monoclonal anti-CD20 (rituximab) e HuMab-KLH do crescimento de células de tumor em cenário terapêutico I como medido pela formação de imagem pela SCID luciferase in vivo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 13.
[00137] A Figura 17C mostra a inibição causada por -003 e -005 comparada a um anticorpo monoclonal anti-CD20 (rituximab) e HuMab-KLH do crescimento de células de tumor em cenário terapêutico II como medido pela formação de imagem pela SCID luciferase in vivo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 13.
[00138] A Figura 17D mostra a inibição do crescimento de célula de tumor por -003 e -024 comparada a HuMab-KLH em cenário terapêutico III como medido pela formação de imagem pela SCID luciferase in vivo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 13.
[00139] A Figura 18 mostra a indução da apoptose por -003 e -005 comparada a um anticorpo monoclonal anti-CD20 (rituximab) e HuMab-KLH com ou sem reticulação. O cenário experimental está descrito no Exemplo 14.
[00140] A Figura 19 mostra a contagem histológica para células positivas em CD38 em xenoenxertos em camundongo RA-SCID implantados no dia 14, depois do tratamento com anti-KLH (HuMab-KLH) ou -005. Os métodos são descritos no Exemplo 15.
[00141] A Figura 20 mostra a contagem histológica quanto às células positivas em CD138 em xenoenxertos em camundongo RA-SCID implantados no dia 14, depois do tratamento com anti-KLH ou -005. Os métodos são descritos no Exemplo 15.
[00142] A Figura 21 mostra o tingimento com CD38 de células B em xenoenxertos antes da implantação (A) ou depois do tratamento com anti- KLH (B) ou -005 (C). Os métodos são descrito no Exemplo 15.
[00143] A Figura 22 mostra o tingimento com CD138 de células B em xenoenxertos antes da implantação (A) ou depois do tratamento com anti- KLH (B) ou -005 (C). Os métodos são descritos no Exemplo 15.
[00144] A Figura 23 mostra a ligação de -003 e -005 ao tipo selvagem e mutante CD38 humano como medido pelo ELISA. 23A: Ligação de -003 e - 005 ao mutante T237A CD38 humano. 23B: Ligação de -003 e -005 ao mutante Q272R CD38 humano. 23C: Ligação de -003 e -005 ao mutante S274F CD38 humano. Os métodos são descritos no Exemplo 17.
[00145] A Figura 24 mostra o efeito de -003 e -005 comparado a HuMab-KLH na proliferação (A), produção de IL-6 (B) e produção de IFN-y (C) de PBMCs humanas. Os métodos são descritos nos Exemplos 18, 19 e 20, respectivamente.
[00146] A Figura 25 mostra a produção enzimática de cGDPribose na presença de várias concentrações de -003 (B), -005 (C), -024 (D) ou anti-KLH (A). Os métodos são descritos no Exemplo 23.
[00147] A Figura 26 mostra a comparação entre -003, -005 e anticorpo de Morphosys TH-3079 em CDC de células CHO-CD38 (26A), CDC de células Daudi (26B) e ADCC de células Daudi (26C).
[00148] As seqüências da invenção são mostradas na listagem de seqüências anexa.
[00149] A SEQ ID No: 1 é a seqüência de nucleotídeo da região VL do anticorpo -003.
[00150] A SEQ ID No: 2 é a seqüência de aminoácido da região VL do anticorpo -003.
[00151] A SEQ ID No: 3 é a seqüência de aminoácido da CDR1 de VL do anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID No: 2.
[00152] A SEQ ID No: 4 é a seqüência de aminoácido da CDR2 de VL do anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID No: 2.
[00153] A SEQ ID No: 5 é a seqüência de aminoácido da CDR3 de VL do anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID No: 2.
[00154] A SEQ ID No: 6 é a seqüência de nucleotídeo da região VH do anticorpo -003.
[00155] A SEQ ID No: 7 é a seqüência de aminoácido da região VH do anticorpo -003.
[00156] A SEQ ID No: 8 é a seqüência de aminoácido da CDR1 de VH do anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID No: 7.
[00157] A SEQ ID No: 9 é a seqüência de aminoácido da CDR2 de VH do anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 50 a 66 da SEQ ID No: 7.
[00158] A SEQ ID No: 10 é a seqüência de aminoácido da CDR3 de VH do anticorpo -003 que compreende os aminoácidos de 99 a 109 da SEQ ID No: 7.
[00159] A SEQ ID No: 11 é a seqüência de nucleotídeo da região VL do anticorpo -005.
[00160] A SEQ ID No: 12 é a seqüência de aminoácido da região VL do anticorpo -005.
[00161] A SEQ ID No: 13 é a seqüência de aminoácido da CDR1 de VL do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID No: 12.
[00162] A SEQ ID No: 14 é a seqüência de aminoácido da CDR2 de VL do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID No: 12.
[00163] A SEQ ID No: 15 é a seqüência de aminoácido da CDR3 de VL do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID No: 12.
[00164] A SEQ ID No: 16 é a seqüência de nucleotídeo da região VH do anticorpo -005.
[00165] A SEQ ID No: 17 é a seqüência de aminoácido da região VH do anticorpo -005.
[00166] A SEQ ID No: 18 é a seqüência de aminoácido da CDR1 de VH do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID No: 17.
[00167] A SEQ ID No: 19 é a seqüência de aminoácido da CDR2 de VH do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 50 a 66 da SEQ ID No: 17.
[00168] A SEQ ID No: 20 é a seqüência de aminoácido da CDR3 de VH do anticorpo -005 que compreende os aminoácidos de 99 a 111 da SEQ ID No: 17.
[00169] A SEQ ID No: 21 é a seqüência de nucleotídeo da região VL do anticorpo -024.
[00170] A SEQ ID No: 22 é a seqüência de aminoácido da região VL do anticorpo -024.
[00171] A SEQ ID No: 23 é a seqüência de aminoácido da CDR1 de VL do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID No: 22.
[00172] A SEQ ID No: 24 é a seqüência de aminoácido da CDR2 de VL do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID No: 22.
[00173] A SEQ ID No: 25 é a seqüência de aminoácido da CDR3 de VL do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID No: 22.
[00174] A SEQ ID No: 26 é a seqüência de nucleotídeo da região VH do anticorpo -024.
[00175] A SEQ ID No: 27 é a seqüência de aminoácido da região VH do anticorpo -024.
[00176] A SEQ ID No: 28 é a seqüência de aminoácido da CDR1 de VH do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID No: 27.
[00177] A SEQ ID No: 29 é a seqüência de aminoácido da CDR2 de VH do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 50 a 66 da SEQ ID No: 27.
[00178] A SEQ ID No: 30 é a seqüência de aminoácido da CDR3 de VH do anticorpo -024 que compreende os aminoácidos de 99 a 111 da SEQ ID No: 27.
[00179] A SEQ ID No: 31 é a seqüência de CD38 humano.
[00180] A SEQ ID No: 32 é a seqüência de um CD38 humano mutante,em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina.
[00181] A SEQ ID No: 33 é a seqüência de um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina.
[00182] A SEQ ID No: 34 é a seqüência de um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00183] A presente invenção fornece peptídeos de ligação de CD38 (“CD38BPs”), que podem ser úteis no tratamento, diagnóstico e prevenção de uma variedade de distúrbios que envolvam as células que expressam CD38, tais como no mieloma múltiplo.
[00184] Em uma forma de realização, um CD38BP da invenção é o anticorpo -003. -003 é um anticorpo de IgG1 monoclonal humano tendo uma região VL que consiste da seqüência da SEQ ID No: 2 e uma região VH que consiste da seqüência da SEQ ID No: 7.
[00185] Em uma forma de realização, um CD38BP da invenção é o anticorpo -005. -005 é um anticorpo de IgG1 monoclonal humano tendo uma região VL que consiste da seqüência da SEQ ID No: 12 e uma região VH que consiste da seqüência da SEQ ID No: 17.
[00186] Em uma forma de realização, um CD38BP da invenção é o anticorpo -024. -024 é um anticorpo de IgG1 monoclonal humano tendo uma região VL que consiste da seqüência da SEQ ID No: 22 e uma região VH que consiste da seqüência da SEQ ID No: 27.
[00187] Os anticorpos interagem com antígenos alvos primariamente através dos resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis regiões determinadoras de complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). por esta razão, as seqüências de aminoácido dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as seqüências fora das CDRs. Porque as seqüências de CDR são responsáveis pela maioria das interações de anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades de anticorpos que ocorrem naturalmente específicos pela construção dos vetores de expressão que incluem seqüências de CDR do anticorpo que ocorre naturalmente específico enxertado nas seqüências de estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver por exemplo Riechmann, L. et al., Nature 332, 323-327 (1998), Jones, P. et al., Nature 321, 522-525 (1986) e Queen, C. et al., PNAS USA 86, 10029-10033 (1989)).
[00188] Visto que é bem conhecido na técnica que os domínios CDR3 da pesada cadeia de anticorpo desempenham um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo quanto a um antígeno (Ditzel H J, et al., J Immunol. 157(2), 739-49 (1996), Barbas SM et al., J. Am. Chem. Soc. 116, 2161-2162 (1994) e Barbas SM et al., Proc Natl Acad Sci USA 92(7), 2529-33 (1995), os CD38BPs da invenção podem compreender as CDR3s de pesada cadeia de -003 ou -005 ou -024. Os CD38BPs da invenção também podem compreender as CDR3s de cadeia pesada e leve de -003 ou -005 ou -024. Os CD38BPs da invenção podem compreender ainda as CDR2s de -003 e -005 e -024, respectivamente. Os CD38BPs da invenção podem compreender ainda as CDR1s de -003 e -005 e -024, respectivamente.
[00189] A presente invenção fornece CD38BPs, que competem com - 003 quanto à ligação ao CD38.
[00190] A presente invenção fornece CD38BPs, que competem com - 005 quanto à ligação ao CD38.
[00191] A presente invenção fornece CD38BPs, que competem com - 024 quanto à ligação ao CD38.
[00192] Em uma forma de realização, a competição é determinada pelo uso de um ELISA como descrito na seção de Exemplos.
[00193] Em uma forma de realização, a competição é determinada pelo uso de um FAGS como descrito na seção de exemplos.
[00194] A presente invenção fornece um CD38BP que especificamente se liga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamente ligado por -003 ou -005 ou -024.
[00195] A presente invenção fornece um CD38BP tendo substancialmente as mesmas características de ligação específicas para a ligação ao CD38 humano como -003 ou -005 ou -024.
[00196] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 3.
[00197] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 4.
[00198] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 5.
[00199] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 5 e uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 3.
[00200] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 5 e uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 4.
[00201] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 5 e uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 4 e uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 3.
[00202] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
[00203] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 9.
[00204] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 10.
[00205] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 10 e uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
[00206] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 10 e uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 9.
[00207] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 10 e uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 9 e uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
[00208] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
[00209] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 14.
[00210] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 15.
[00211] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 15 e uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
[00212] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 15 e uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 14.
[00213] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 15 e uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 14 e uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
[00214] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
[00215] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 19.
[00216] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 20.
[00217] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 20 e uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
[00218] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 20 e uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 19.
[00219] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 20 e uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 19 e uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
[00220] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
[00221] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 24.
[00222] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 25.
[00223] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 25 e uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
[00224] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 25 e uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 24.
[00225] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 25 e uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 24 e uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
[00226] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 28.
[00227] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 29.
[00228] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 30.
[00229] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 30 e uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 28.
[00230] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 30 e uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 29.
[00231] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 30 e uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 29 e uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 28.
[00232] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende
[00233] (a) uma primeira região VL que compreende três CDRs de VL,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5; e
[00234] (b) uma primeira região VH que compreende três CDRs de VH,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10. A presente invenção fornece um CD38BP que compreende
[00235] (c) uma primeira região VL que compreende três CDRs de VL,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No: 15; e
[00236] (d) uma primeira região VH que compreende três CDRs de VH,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No: 20. A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma primeira região VL que compreende três CDRs de VL, que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25; e
[00237] (e) uma primeira região VH que compreende três CDRs de VH,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30. Em uma forma de realização, a região VL e a região VH estão presentes na mesma cadeia no peptídeo.
[00238] Em uma outra forma de realização, a região VL e a região VH são separadas por um ligador flexível.
[00239] Em uma forma de realização, a região VL e a região VH estão presentes nas cadeias separadas no peptídeo.
[00240] Em uma outra forma de realização, a região VL e a região VH estão presentes nas cadeias separadas no peptídeo no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina.
[00241] Em uma forma de realização, a primeira região VL e a primeira região VH são orientadas tal que as três CDRs na região VL e as três CDRs na região VH cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38 humano.
[00242] Em uma outra forma de realização, o peptídeo compreendendo uma segunda região VL idêntica à primeira região VL e uma segunda região VH idêntica à primeira região VH, onde a segunda região VL e a segunda região VH cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38 humano.
[00243] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma região VL que é uma variante funcional da região VL de -003 ou -005 ou -024.
[00244] Em uma forma de realização, a região VL do CD38BP consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22, respectivamente. Em uma forma de realização, o CD38BP tem pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % das características de ligação de epítopo de -003 ou -005 ou -024, respectivamente.
[00245] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma região VH que é uma variante funcional da região VH de -003 ou -005 ou -024.
[00246] Em uma forma de realização, a região VH do peptídeo consisteessencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 27, respectivamente. Em uma forma de realização, o CD38BP tem pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % das características de ligação de epítopo de -003 ou -005 ou -024, respectivamente.
[00247] A presente invenção fornece um CD38BP que compreende pelo menos uma CDR que é uma variante funcional de uma CDR de -003 ou - 005 ou -024.
[00248] Em uma forma de realização, pelo menos uma das CDRs do peptídeo consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No: 10 ou de acordo com a SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 ou SEQ ID No: 20 ou de acordo com a SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 ou SEQ ID No: 30, respectivamente. Em uma forma de realização, o CD38BP tem pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % das características de ligação de epítopo de -003 ou -005 ou -024, respectivamente.
[00249] Em uma forma de realização, o CD38BP tem pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % da afinidade, avidez ou especificidade de -003 ou -005 ou -024.
[00250] Em uma forma de realização, o CD38BP compete com -003 ou -005 ou -024 quanto à ligação ao CD38. Em uma outra forma de realização, a competição é determinada pelo uso de um ELISA como descrito na seção de exemplos. Em uma outra forma de realização adicional, a competição é determinada pelo uso de um FACS como descrito na seção de Exemplos.
[00251] Em uma forma de realização, o CD38BP especificamente se liga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamente ligado por -003 ou -005 ou -024.
[00252] Em uma forma de realização, o CD38BP liga-se ao CD38 humano com afinidade maior do que -003 ou -005 ou -024.
[00253] Em uma forma de realização, o CD38BP tem substancialmente as mesmas características de ligação de CD38 específicas como -003 ou -005 ou -024.
[00254] Em uma forma de realização, o CD38BP é substancialmente livre de outros peptídeos de ligação de CD38.
[00255] Em uma forma de realização, um CD38BP da presente invenção é um anticorpo. Em uma outra forma de realização, o CD38BP é um anticorpo humano. Em uma outra forma de realização adicional, o CD38BP é um anticorpo humanizado. Em uma outra forma de realização adicional, o CD38BP é um anticorpo quimérico.
[00256] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal.
[00257] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM. Em uma outra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo IgG1. Em uma outra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo IgG1.k. Em uma outra forma de realização adicional, o anticorpo é um anticorpo IgM. Em uma outra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo IgM.K.
[00258] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.
[00259] Em uma forma de realização, o CD38BP é glicosilado em uma célula eucarióptica.
[00260] Em uma forma de realização, o CD38BP compreende ainda um ligador quelador para ligar um radioisótopo.
[00261] Em uma forma de realização, o CD38BP está em uma forma substancialmente isolada.
[00262] A presente invenção fornece um ácido nucleico isolado que codifica um CD38BP da presente invenção.
[00263] A presente invenção fornece um vetor de expressão que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um CD38BP da presente invenção.
[00264] Em uma forma de realização, o vetor de expressão compreende uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 1, uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 6 ou uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 1 e uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 6.
[00265] Em uma forma de realização, o vetor de expressão compreende uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 11, uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 16 ou uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 11 e uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 16.
[00266] Em uma forma de realização, o vetor de expressão compreende uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 21, uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 26 ou uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 21 e uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 26.
[00267] Em uma outra forma de realização, o vetor de expressão compreende ainda uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano.
[00268] Em uma outra forma de realização, a seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano codifica um anticorpo IgG1.
[00269] A presente invenção fornece um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo na região de cadeia leve variável como apresentado na SEQ ID No: 1 ou modificações da seqüência conservativa desta e seqüências de nucleotídeo na região de cadeia pesada variável como apresentado na SEQ ID No: 6 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos da cadeia leve humana que compreende uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 1 e os ácidos nucleicos da cadeia pesada humana que compreende uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 6.
[00270] A presente invenção fornece um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve humanas que compreendem a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 2 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 7 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, a região variável da cadeia leve humana compreendendo uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 2 e a região variável da cadeia pesada humana compreendendo uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 7.
[00271] A presente invenção fornece um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana variável como apresentada na SEQ ID No: 1 ou modificações da seqüência conservativa desta e ácidos nucleicos da cadeia pesada humana como apresentados na SEQ ID No: 6 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, o anticorpo anti- CD38 monoclonal humano é codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 1 e ácidos nucleicos da cadeia pesada humana como apresentada SEQ ID No: 6.
[00272] A presente invenção fornece um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis da cadeia leve e cadeia pesada humanas que compreendem a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 2 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 7 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, a cadeia leve humana compreendendo a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 2 e a cadeia pesada humana compreendendo a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 7.
[00273] A presente invenção fornece um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende as seqüências de nucleotídeo na região de cadeia leve variável como apresentada na SEQ ID No: 11 ou modificações da seqüência conservativa desta e seqüências de nucleotídeo na região de cadeia pesada variável como apresentada na SEQ ID No: 16 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos da cadeia leve humana que compreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 11 e os ácidos nucleicos da cadeia pesada humana que compreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 16.
[00274] A presente invenção fornece um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve humanas que compreendem a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 12 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácido de cadeia leve variável humano como apresentada na SEQ ID No: 17 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, a região variável da cadeia leve humana que compreende uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 12 e a região variável da cadeia pesada humana que compreende uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 17.
[00275] A presente invenção fornece um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 11 ou modificações da seqüência conservativa desta e ácidos nucleicos da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 16 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, o anticorpo anti- CD38 monoclonal humano é codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 11 e ácidos nucleicos da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 16.
[00276] A presente invenção fornece um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada humanas que compreendem a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 12 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 17 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, a cadeia leve humana compreende a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 12 e a cadeia pesada humana compreende a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 17.
[00277] A presente invenção fornece um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo na região de cadeia leve variável como apresentado na SEQ ID No: 21 ou modificações da seqüência conservativa desta e seqüências de nucleotídeo na região de cadeia pesada variável como apresentada na SEQ ID No: 26 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos da cadeia leve humana compreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 21 e os ácidos nucleicos da cadeia pesada humana compreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 26.
[00278] A presente invenção fornece um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve humanas que compreendem a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 22 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácido de cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 27 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, a região variável da cadeia leve humana compreende uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 22 e a região variável da cadeia pesada humana compreende uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 27.
[00279] A presente invenção fornece um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 21 ou modificações da seqüência conservativa desta e ácidos nucleicos da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 26 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, o anticorpo anti- CD38 monoclonal humano é codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 21 e ácidos nucleicos da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 26.
[00280] A presente invenção fornece um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada humanas que compreendem a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 22 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 27 ou modificações da seqüência conservativa desta. Em uma forma de realização, a cadeia leve humana compreende a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 22 e a cadeia pesada humana compreende a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 27.
[00281] A presente invenção fornece uma célula hospedeiraeucarióptica ou procarióptica que produz um CD38BP da presente invenção.
[00282] A presente invenção fornece uma célula hospedeiraeucarióptica ou procarióptica contendo um vetor de expressão da presente invenção.
[00283] A presente invenção fornece um animal não humano ou planta transgênicos que compreendem ácidos nucleicos que codificam uma cadeia pesada humana e uma cadeia leve humana, em que o animal ou planta produzem uma quantidade detectável de um CD38BP da presente invenção.
[00284] A presente invenção fornece um imunoconjugado que compreende um CD38BP da presente invenção ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo ou um medicamento. Em uma forma de realização, o peptídeo é um anticorpo IgM monomérico ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo ou um medicamento.
[00285] A presente invenção fornece uma molécula biespecífica ou multiespecífica que compreende um CD38BP da presente invenção e uma especificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana. Em uma forma de realização, a especificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana é uma especificidade de ligação a CD3, CD4, CD138, IL-15R, ligada à membrana ou ligada ao receptor TNF-α, um receptor Fc humano ou ligada à membrana ou ligada ao receptor IL-15.
[00286] A presente invenção fornece um anticorpo anti-idiotípico que se liga a um CD38BP da presente invenção.
[00287] A presente invenção fornece o uso de um anticorpo anti- idiotípico da presente invenção para detectar o nível de anticorpo monoclonal humano contra CD38 em uma amostra.
[00288] O que segue é uma lista de formas de realização selecionadas da presente invenção.
[00289] Forma de realização 1: Um anticorpo que se liga ao CD38 humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6, respectivamente ou modificações da seqüência conservativa desta.
[00290] Forma de realização 2: Um anticorpo que se liga ao CD38 humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo nas suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 6, respectivamente.
[00291] Forma de realização 3: Um anticorpo que se liga ao CD38 humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende as seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16, respectivamente ou modificações da seqüência conservativa desta.
[00292] Forma de realização 4: Um anticorpo que se liga ao CD38 humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16, respectivamente.
[00293] Forma de realização 5: Um anticorpo que se liga ao CD38 humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26, respectivamente ou modificações da seqüência conservativa desta.
[00294] Forma de realização 6: Um anticorpo que se liga ao CD38 humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende as seqüências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID No: 21 e SEQ ID No: 26, respectivamente.
[00295] Forma de realização 7: Um peptídeo que compete com um anticorpo de acordo com a forma de realização 2 quanto à ligação ao CD38.
[00296] Forma de realização 8: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 7, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISA como descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo.
[00297] Forma de realização 9: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 7, em que a competição é determinada pelo uso de medições de reticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
[00298] Forma de realização 10: Um peptídeo que especificamente se liga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamente ligado por um anticorpo de acordo com a forma de realização 2.
[00299] Forma de realização 11: Um peptídeo tendo substancialmente as mesmas características de ligação específica para a ligação ao CD38 humano como um anticorpo de acordo com a forma de realização 2.
[00300] Forma de realização 12: Um peptídeo que compreende uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 3.
[00301] Forma de realização 13: Um peptídeo que compreende uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 4.
[00302] Forma de realização 14: Um peptídeo que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 5.
[00303] Forma de realização 15: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 14, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 3.
[00304] Forma de realização 16: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 14, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 4.
[00305] Forma de realização 17: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 16, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 3.
[00306] Forma de realização 18: Um peptídeo que compreende uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
[00307] Forma de realização 19: Um peptídeo que compreende uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 9.
[00308] Forma de realização 20: Um peptídeo que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 10.
[00309] Forma de realização 21: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 20, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
[00310] Forma de realização 22: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 20, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 9.
[00311] Forma de realização 23: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 22, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 8.
[00312] Forma de realização 24: Um peptídeo que compreende
[00313] (a) uma primeira região VL que compreende três CDRs de VL,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5; e
[00314] (b) uma primeira região VH que compreende três CDRs de VH,que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10.
[00315] Forma de realização 25: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 24, em que a região VL e a região VH estão presentes na mesma cadeia no peptídeo.
[00316] Forma de realização 26: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 25, em que a região VL e a região VH são separadas por um ligador flexível.
[00317] Forma de realização 27: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 24, em que a região VL e a região VH estão presentes nas cadeias separadas no peptídeo.
[00318] Forma de realização 28: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 27, em que a região VL e a região VH estão presentes nas cadeias separadas no peptídeo no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina.
[00319] Forma de realização 29: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 24 a 28, em que a primeira região VL e a primeira região VH são orientadas tal que as três CDRs na região VL e as três CDRs na região VH cooperativamente associadas para contribuírem na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38 humano.
[00320] Forma de realização 30: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 29, em que o peptídeo que compreende uma segunda região VL idêntica à primeira região VL e uma segundo região VH idêntica à primeira região VH, onde a segundo região VL e a segunda região VH cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38 humano.
[00321] Forma de realização 31: Um peptídeo que compreende uma região VL que é uma variante funcional da região VL de um anticorpo da forma de realização 2.
[00322] Forma de realização 32: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 31, em que a região VL do peptídeo consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 2.
[00323] Forma de realização 33: Um peptídeo que compreende uma região VH que é uma variante funcional da região VH de um anticorpo da forma de realização 2.
[00324] Forma de realização 34: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 33, em que a região VH do peptídeo consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 7.
[00325] Forma de realização 35: Um peptídeo que compreende pelo menos uma CDR que é uma variante funcional de uma CDR de um anticorpo da forma de realização 2.
[00326] Forma de realização 36: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 35, em que pelo menos uma das CDRs do peptídeo consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No: 10.
[00327] Forma de realização 37: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 31 a 36, em que o peptídeo tem pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % das características de ligação de epítopo de um anticorpo da forma de realização 2.
[00328] Forma de realização 38: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 31 a 36, em que o peptídeo tem pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % da afinidade, avidez ou especificidade de um anticorpo da forma de realização 2.
[00329] Forma de realização 39: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 12 a 38, peptídeo este que especificamente ligo CD38 humano.
[00330] Forma de realização 40: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 12 a 39, peptídeo este que compete com um anticorpo de acordo com a forma de realização 2 quanto à ligação ao CD38.
[00331] Forma de realização 41: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 40, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISA como descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo.
[00332] Forma de realização 42: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 7, em que a competição é determinada pelo uso de medições de reticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
[00333] Forma de realização 43: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 39, peptídeo este que especificamente se liga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamente ligado por um anticorpo de acordo com a forma de realização 2.
[00334] Forma de realização 44: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 39 a 43, em que o peptídeo liga-se ao CD38 humano com afinidade maior do que um anticorpo de acordo com a forma de realização 2.
[00335] Forma de realização 45: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 39 a 43, em que o peptídeo tem substancialmente as mesmas características de ligação de CD38 específicas como um anticorpo de acordo com a forma de realização 2.
[00336] Forma de realização 46: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 39 a 45, em que a ligação do peptídeo de CD38 é substancialmente isento de outros peptídeos de ligação de CD38.
[00337] Forma de realização 47: Um peptídeo que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31) e que não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00338] Forma de realização 48: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 47, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00339] Forma de realização 49: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 48, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00340] Forma de realização 50: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 49, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 5 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00341] Forma de realização 51: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 50, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 1 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00342] Forma de realização 52: Um peptídeo que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31) e que não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00343] Forma de realização 53: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 52, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00344] Forma de realização 54: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 53, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00345] Forma de realização 55: Um peptídeo de qualquer uma das formas de realização de 47 a 51 que não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00346] Forma de realização 56: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 55, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00347] Forma de realização 57: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 56, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00348] Forma de realização 58: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 47 a 57, em que o dito peptídeo liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00349] Forma de realização 59: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 58, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 75 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00350] Forma de realização 60: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 59 em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 85 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00351] Forma de realização 61: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 60, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 90 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00352] Forma de realização 62: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 61, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 95 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00353] Forma de realização 63: Um peptídeo que compete com um anticorpo de acordo com a forma de realização 4 quanto à ligação ao CD38.
[00354] Forma de realização 64: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 63, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISA como descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo.
[00355] Forma de realização 65: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 63, em que a competição é determinada pelo uso de medições de reticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
[00356] Forma de realização 66: Um peptídeo que especificamente se liga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamente ligado por um anticorpo de acordo com a forma de realização 4.
[00357] Forma de realização 67: Um peptídeo tendo substancialmente as mesmas características de ligação específica para a ligação ao CD38 humano como um anticorpo de acordo com a forma de realização 4.
[00358] Forma de realização 68: Um peptídeo que compreende uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
[00359] Forma de realização 69: Um peptídeo que compreende uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 14.
[00360] Forma de realização 70: Um peptídeo que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 15.
[00361] Forma de realização 71: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 70, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
[00362] Forma de realização 72: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 70, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 14.
[00363] Forma de realização 73: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 72, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 13.
[00364] Forma de realização 74: Um peptídeo que compreende umaCDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
[00365] Forma de realização 75: Um peptídeo que compreende uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 19.
[00366] Forma de realização 76: Um peptídeo que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 20.
[00367] Forma de realização 77: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 76, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
[00368] Forma de realização 78: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 76, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 19.
[00369] Forma de realização 79: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 78, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 18.
[00370] Forma de realização 80: Um peptídeo que compreende(a) uma primeira região VL que compreende três CDRs de VL, que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No: 15; e(b) uma primeira região VH que compreende três CDRs de VH, que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No: 20.
[00371] Forma de realização 81: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 80, em que a região VL e a região VH estão presentes na mesma cadeia no peptídeo.
[00372] Forma de realização 82: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 81, em que a região VL e a região VH são separadas por um ligador flexível.
[00373] Forma de realização 83: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 80, em que a região VL e a região VH estão presentes nas cadeias separadas no peptídeo.
[00374] Forma de realização 84: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 83, em que a região VL e a região VH estão presentes nas cadeias separadas no peptídeo no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina.
[00375] Forma de realização 85: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização 80 a 84, em que a primeira região VL e a primeira região VH são orientadas tal que as três CDRs na região VL e as três CDRs na região VH cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38 humano.
[00376] Forma de realização 86: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 85, em que o peptídeo que compreende uma segunda região VL idêntica à primeira região VL e uma segunda região VH idêntica à primeira região VH, onde a segunda região VL e a segunda região VH cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38 humano.
[00377] Forma de realização 87: Um peptídeo que compreende uma região VL que é um variante funcional da região VL de um anticorpo da forma de realização 4.
[00378] Forma de realização 88: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 87, em que a região VL do peptídeo consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 12.
[00379] Forma de realização 89: Um peptídeo que compreende uma região VH que é uma variante funcional da região VH de um anticorpo da forma de realização 4.
[00380] Forma de realização 90: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 89, em que a região VH do peptídeo consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 17.
[00381] Forma de realização 91: Um peptídeo que compreende pelo menos uma CDR que é uma variante funcional de um CDR de um anticorpo da forma de realização 4.
[00382] Forma de realização 92: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 91, em que pelo menos uma das CDRs do peptídeo consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 ou SEQ ID No: 20.
[00383] Forma de realização 93: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 87 a 92, em que o peptídeo tem pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % das características de ligação de epítopo de um anticorpo da forma de realização 4.
[00384] Forma de realização 94: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 87 a 92, em que o peptídeo tem pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % da afinidade, avidez ou especificidade de um anticorpo da forma de realização 4.
[00385] Forma de realização 95: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 68 a 94, peptídeo este que especificamente liga o CD38 humano.
[00386] Forma de realização 96: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 68 a 95, peptídeo este que compete com um anticorpo de acordo com a forma de realização 4 quanto à ligação ao CD38.
[00387] Forma de realização 97: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 96, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISA como descrito nos Exemplos 8 ou 9 do relatório descritivo.
[00388] Forma de realização 98: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 96, em que a competição é determinada pelo uso de medições de reticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
[00389] Forma de realização 99: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 95, peptídeo este que especificamente se liga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamente ligado por um anticorpo de acordo com a forma de realização 4.
[00390] Forma de realização 100: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 95 a 99, em que o peptídeo liga-se ao CD38 humano com afinidade maior do que um anticorpo de acordo com a forma de realização 4.
[00391] Forma de realização 101: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 95 a 99, em que o peptídeo tem substancialmente as mesmas características de ligação de CD38 específicas como um anticorpo de acordo com a forma de realização 4.
[00392] Forma de realização 102: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 95 a 101, em que o peptídeo de ligação de CD38 é substancialmente isento de outros peptídeos de ligação de CD38.
[00393] Forma de realização 103: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 63 a 102, que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31) e que não se ligam a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00394] Forma de realização 104: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 103, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00395] Forma de realização 105: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 104, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00396] Forma de realização 106: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 105, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 5 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00397] Forma de realização 107: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 106, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 1 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00398] Forma de realização 108: Um peptídeo que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31) e que não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00399] Forma de realização 109: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 108, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00400] Forma de realização 110: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 109, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00401] Forma de realização 111: Um peptídeo de qualquer uma das formas de realização de 103 a 107 que não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00402] Forma de realização 112: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 111, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00403] Forma de realização 113: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 112, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00404] Forma de realização 114: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização 103 to 113, em que o dito peptídeo liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00405] Forma de realização 115: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 114, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 75 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00406] Forma de realização 116: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 115 em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 85 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00407] Forma de realização 117: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 116, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 90 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00408] Forma de realização 118: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 117, em que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 95 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00409] Forma de realização 119: Um peptídeo que compete com um anticorpo de acordo com a forma de realização 6 quanto à ligação ao CD38.
[00410] Forma de realização 120: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 119, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISA como descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo.
[00411] Forma de realização 121: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 119, em que a competição é determinada pelo uso de medições de reticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
[00412] Forma de realização 122: Um peptídeo que especificamente se liga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamente ligado por um anticorpo de acordo com a forma de realização 6.
[00413] Forma de realização 123: Um peptídeo tendo substancialmente as mesmas características de ligação específicas para a ligação ao CD38 humano como um anticorpo de acordo com a forma de realização 6.
[00414] Forma de realização 124: Um peptídeo que compreende uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
[00415] Forma de realização 125: Um peptídeo que compreende uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 24.
[00416] Forma de realização 126: Um peptídeo que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 25.
[00417] Forma de realização 127: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 126, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
[00418] Forma de realização 128: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 126, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 24.
[00419] Forma de realização 129: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 128, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da SEQ ID No: 23.
[00420] Forma de realização 130: Um peptídeo que compreende umaCDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 28.
[00421] Forma de realização 131: Um peptídeo que compreende uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 29.
[00422] Forma de realização 132: Um peptídeo que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 30.
[00423] Forma de realização 133: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 132, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 28.
[00424] Forma de realização 134: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 132, peptídeo este que compreende também uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 29.
[00425] Forma de realização 135: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 134, peptídeo este que compreende também uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da SEQ ID No: 28.
[00426] Forma de realização 136: Um peptídeo que compreende(a) uma primeira região VL que compreende três CDRs de VL, que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25; e(b) uma primeira região VH que compreende três CDRs de VH, que independentemente uma da outra consistem essencialmente da SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30.
[00427] Forma de realização 137: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 136, em que a região VL e a região VH estão presentes na mesma cadeia no peptídeo.
[00428] Forma de realização 138: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 137, em que a região VL e a região VH são separadas por um ligador flexível.
[00429] Forma de realização 139: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 136, em que a região VL e a região VH estão presentes nas cadeias separadas no peptídeo.
[00430] Forma de realização 140: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 139, em que a região VL e a região VH estão presentes nas cadeias separadas no peptídeo no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina.
[00431] Forma de realização 141: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 136 a 140, em que a primeira região VL e a primeira região VH são orientadas tal que as três CDRs na região VL e as três CDRs na região VH cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38 humano.
[00432] Forma de realização 142: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 141, em que o peptídeo que compreende uma segunda região VL idêntica à primeira região VL e uma segunda região VH idêntica à primeira região VH, onde a segunda região VL e a segunda região VH cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38 humano.
[00433] Forma de realização 143: Um peptídeo que compreende uma região VL que é uma variante funcional da região VL de um anticorpo da forma de realização 6.
[00434] Forma de realização 144: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 143, em que a região VL do peptídeo consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 22.
[00435] Forma de realização 145: Um peptídeo que compreende uma região VH que é uma variante funcional da região VH de um anticorpo da forma de realização 6.
[00436] Forma de realização 146: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 145, em que a região VH do peptídeo consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 27.
[00437] Forma de realização 147: Um peptídeo que compreende pelo menos uma CDR que é uma variante funcional de uma CDR de um anticorpo da forma de realização 6.
[00438] Forma de realização 148: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 147, em que pelo menos uma das CDRs do peptídeo consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 ou SEQ ID No: 30.
[00439] Forma de realização 149: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 143 a 148, em que o peptídeo tem pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % das características de ligação de epítopo de um anticorpo da forma de realização 6.
[00440] Forma de realização 150: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 143 a 148, em que o peptídeo tem pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % da afinidade, avidez ou especificidade de um anticorpo da forma de realização 6.
[00441] Forma de realização 151: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 124 a 150, peptídeo este que especificamente liga CD38 humano.
[00442] Forma de realização 152: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 124 a 151, peptídeo este que compete com um anticorpo de acordo com a forma de realização 6 quanto à ligação ao CD38.
[00443] Forma de realização 153: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 152, em que a competição é determinada pelo uso de um ELISA como descrito no Exemplo 8 ou 9 do relatório descritivo.
[00444] Forma de realização 154: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 152, em que a competição é determinada pelo uso de medições de reticulação como descrito no Exemplo 7 do relatório descritivo.
[00445] Forma de realização 155: Um peptídeo de acordo com a forma de realização 151, peptídeo este que especificamente se liga a um epítopo de CD38, epítopo este que também é especificamente ligado por um anticorpo de acordo com a forma de realização 6.
[00446] Forma de realização 156: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 151 a 155, em que o peptídeo ligase ao CD38 humano com afinidade maior do que um anticorpo de acordo com a forma de realização 6.
[00447] Forma de realização 157: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 151 a 155, em que o peptídeo tem substancialmente as mesmas características de ligação de CD38 específicas como um anticorpo de acordo com a forma de realização 6.
[00448] Forma de realização 158: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 151 a 157, em que o peptídeo de ligação de CD38 é substancialmente isento de outros peptídeos de ligação de CD38.
[00449] Forma de realização 159: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 158, em que o peptídeo não éum agonista de CD38.
[00450] Forma de realização 160: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 159, em que o peptídeo nãoinduz proliferação significante de células mononucleares do sangue periférico.
[00451] Forma de realização 161: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 160, em que o peptídeo não induz a liberação de IL-6 significante pelos monócitos humanos ou células mononucleares do sangue periférico.
[00452] Forma de realização 162: Um peptídeo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 161, em que o peptídeo não induz a liberação de IFN-Y detectável pelas células T humanas ou células mononucleares do sangue periférico.
[00453] Forma de realização 163: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 7 a 162, em que o peptídeo é um anticorpo.
[00454] Forma de realização 164: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou 163, anticorpo este que é um anticorpo humano.
[00455] Forma de realização 165: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou 163, anticorpo este que é um anticorpo humanizado.
[00456] Forma de realização 166: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou 163, anticorpo este que é um anticorpo quimérico.
[00457] Forma de realização 167: Um anticorpo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou de 163 a 166, anticorpoeste que é um anticorpo monoclonal.
[00458] Forma de realização 168: Um anticorpo de acordo comqualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou de 163 a 166,caracterizado em que o mesmo é um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM.
[00459] Forma de realização 169: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 168, caracterizado em que o mesmo é um anticorpo IgG1.
[00460] Forma de realização 170: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 169, em que o anticorpo é um anticorpo IgG1.k.
[00461] Forma de realização 171: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 168, caracterizado em que o mesmo é um anticorpo de IgM.
[00462] Forma de realização 172: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 171, em que o anticorpo é um anticorpo IgM.k.
[00463] Forma de realização 173: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 2 a 172, em que o peptídeo é glicosilado em uma célula eucarióptica.
[00464] Forma de realização 174: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 6 ou de 163 a 173, que é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.
[00465] Forma de realização 175: Um peptídeo ou anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 173, que compreende ainda um ligador quelador para ligar um radioisótopo.
[00466] Forma de realização 176: Um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 175, que está em uma forma substancialmente isolada.
[00467] Forma de realização 177: Um ácido nucleico isolado que codifica um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 175.
[00468] Forma de realização 178: Um vetor de expressão que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 175.
[00469] Forma de realização 179: Um vetor de expressão que compreende uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 1, uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 6 ou uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 1 e uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 6.
[00470] Forma de realização 180: Um vetor de expressão que compreende uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 11, uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 16 ou uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 11 e uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 16.
[00471] Forma de realização 181: Um vetor de expressão de acordo com a forma de realização 179 ou forma de realização 180, que compreende ainda uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano.
[00472] Forma de realização 182: Um vetor de expressão de acordo com a forma de realização 181, em que a seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano codifica um anticorpo IgG1.
[00473] Forma de realização 183: Um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende as seqüências de nucleotídeo na região de cadeia leve variável como apresentado na SEQ ID No: 1 ou modificações da seqüência conservativa desta e seqüências de nucleotídeo na região de cadeia pesada variável como apresentado na SEQ ID No: 6 ou modificações da seqüência conservativa desta.
[00474] Forma de realização 184: Um hibridoma de acordo com a forma de realização 183, em que os ácidos nucleicos da cadeia leve humana compreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 1 e os ácidos nucleicos da cadeia pesada humana compreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 6.
[00475] Forma de realização 185: Um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve humanas que compreendem a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 2 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácido de cadeia leve variável humana como apresentado na SEQ ID No: 7 ou modificações da seqüência conservativa desta.
[00476] Forma de realização 186: Um hibridoma de acordo com a forma de realização 185, em que a região variável da cadeia leve humana compreende uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 2 e a região variável da cadeia pesada humana compreende uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 7.
[00477] Forma de realização 187: Um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 1 ou modificações da seqüência conservativa desta e ácidos nucleicos da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 6 ou modificações da seqüência conservativa desta.
[00478] Forma de realização 188: Um transfectoma de acordo com a forma de realização 187, em que o anticorpo anti-CD38 monoclonal humano é codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 1 e ácidos nucleicos da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 6.
[00479] Forma de realização 189: Um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada humanas que compreendem a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácido da cadeia pesada humana variável como apresentada na SEQ ID No: 7 ou modificações da seqüência conservativa desta.
[00480] Forma de realização 190: Um transfectoma de acordo com a forma de realização 189, em que a cadeia leve humana compreende a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 2 e a cadeia pesada humana compreende a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 7.
[00481] Forma de realização 191: Um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve humana e cadeia pesada humana que compreende as seqüências de nucleotídeo na região de cadeia leve variável como apresentado na SEQ ID No: 11 ou modificações da seqüência conservativa desta e seqüências de nucleotídeo na região de cadeia pesada variável como apresentado na SEQ ID No: 16 ou modificações da seqüência conservativa desta.
[00482] Forma de realização 192: Um hibridoma de acordo com a forma de realização 191, em que os ácidos nucleicos da cadeia leve humana compreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 11 e os ácidos nucleicos da cadeia pesada humana compreendem uma seqüência de nucleotídeo como apresentada na SEQ ID No: 16.
[00483] Forma de realização 193: Um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve humanas que compreendem a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 12 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 17 ou modificações da seqüência conservativa desta.
[00484] Forma de realização 194: Um hibridoma de acordo com a forma de realização 193, em que a região variável da cadeia leve humana compreende uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 12 e a região variável da cadeia pesada humana compreende uma seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 17.
[00485] Forma de realização 195: Um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 11 ou modificações da seqüência conservativa desta e ácidos nucleicos da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 16 ou modificações da seqüência conservativa desta.
[00486] Forma de realização 196: Um transfectoma de acordo com a forma de realização 195, em que o anticorpo anti-CD38 monoclonal humano é codificado pelos ácidos nucleicos da cadeia leve variável humana como apresentada na SEQ ID No: 11 e ácidos nucleicos da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 16.
[00487] Forma de realização 197: Um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada humanas que compreendem a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 12 ou modificações da seqüência conservativa desta e a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 17 ou modificações da seqüência conservativa desta.
[00488] Forma de realização 198: Um transfectoma de acordo com a forma de realização 197, em que a cadeia leve humana que compreende a seqüência de aminoácido variável da cadeia leve humana como apresentada na SEQ ID No: 12 e a cadeia pesada humana que compreende a seqüência de aminoácido variável da cadeia pesada humana como apresentada na SEQ ID No: 17.
[00489] Forma de realização 199: Uma célula hospedeira eucarióptica ou procarióptica que produza um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 175.
[00490] Forma de realização 200: Uma célula hospedeira eucarióptica ou procarióptica contendo um vetor de expressão de acordo com a forma de realização 178.
[00491] Forma de realização 201: Um animal não humano ou planta transgênicos que compreendam ácidos nucleicos que codifiquem uma cadeia pesada humana e uma cadeia leve humana, em que o animal ou planta produzem uma quantidade detectável de um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 175.
[00492] Forma de realização 202: Um imunoconjugado que compreende um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 174 ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo ou um medicamento.
[00493] Forma de realização 203: Um imunoconjugado que compreende um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 168 ou formas de realização de 171 a 174, em que o peptídeo é um anticorpo IgM monomérico ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo ou um medicamento.
[00494] Forma de realização 204: Uma molécula biespecífica ou multiespecífica que compreende um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 175 e uma especificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana.
[00495] Forma de realização 205: Uma molécula biespecífica ou multiespecífica que compreende um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 175 e uma especificidade de ligação for CD3, CD4, IL-15R, ligada à membrana ou ligada ao receptor TNF-α, um receptor Fc humano ou ligada à membrana ou ligada ao receptor IL-15.
[00496] Forma de realização 206: Uma composição farmacêutica que compreende um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 176 ou um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização de 202 a 205 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00497] Forma de realização 207: Uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 206 que compreende um ou mais outros agentes terapêuticos.
[00498] Forma de realização 208: Um método de inibir crescimento e/ou proliferação de uma célula que expresse CD38, que compreende a administração de um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 176, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização de 202 a 205, uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 206 ou 207 ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das formas de realização de 178 a 182, tal que o crescimento e/ou proliferação da célula sejam inibidos.
[00499] Forma de realização 209: Um método de tratar uma doença ou distúrbio que envolva células que expresse CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 176, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização de 202 a 205, uma composição farmacêutica de acordo com as formas de realização 206 ou 207 ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das formas de realização de 178 a 182 a um paciente em necessidade deste.
[00500] Forma de realização 210: Um método de prevenir uma doença ou distúrbio que envolvam células que expressam CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 176, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização de 202 a 205, uma composição farmacêutica de acordo com as formas de realização 206 ou 207 ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das formas de realização de 178 a 182 a um paciente em necessidade deste.
[00501] Forma de realização 211: Um método de acordo com a forma de realização 209 ou forma de realização 210, em que a doença ou distúrbio é a artrite reumatóide.
[00502] Forma de realização 212: Um método de acordo com a forma de realização 209 ou forma de realização 210, em que a doença ou distúrbio é o mieloma múltiplo.
[00503] Forma de realização 213: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização de 209 a 212, em que o método compreende a administração de um ou mais outros agentes terapêuticos ao paciente.
[00504] Forma de realização 214: Um método de acordo com a forma de realização 213, em que o um ou mais outros agentes terapêuticos são selecionados de um agente quimioterapêutico, um agente anti-inflamatório ou um agente imunossupressivo e/ou imunomodulatório.
[00505] Forma de realização 215: Um método de acordo com a forma de realização 213, em que o um ou mais outros agentes terapêuticos são selecionados de um grupo que consiste de cisplatina, gefitinib, cetuximab, rituximab, bevacizumab, erlotinib, bortezomib, talidomida, pamidronato, ácido zoledrônico, clodronato, risendronato, ibandronato, etidronato, alendronato, tiludronato, trióxido de arsênico, lenalidomida, filgrastim, pegfilgrastim, sargramostim, suberoilanilida, ácido hidroxâmico e SCIO-469.
[00506] Forma de realização 216: Um método in vitro para detectar a presença de antígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em uma amostra que compreende:(a) contatar a amostra com um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 176 sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e CD38; e(b) detectar a formação de um complexo.
[00507] Forma de realização 217: Um método in vitro de acordo com a forma de realização 216, em que o dito peptídeo é um anticorpo.
[00508] Forma de realização 218: Um kit para detectar a presença de antígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em uma amostra que compreende um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 176.
[00509] Forma de realização 219: Um método in vivo para detectar antígeno de CD38 ou uma célula que expresse CD38, em um paciente que compreende:a) administrar o peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização de 1 a 176 sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e CD38; eb) detectar o complexo formado.
[00510] Forma de realização 220: Um método in vitro de acordo com a forma de realização 219, em que o dito peptídeo é um anticorpo.
[00511] Forma de realização 221: Um anticorpo anti-idiotípico que se liga a um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização 2, 4 ou de 163 a 174.
[00512] Forma de realização 222. O uso de um anticorpo anti- idiotípico de acordo com a forma de realização 221 para detectar o nível de um peptídeo de acordo com qualquer uma das formas de realização 2, 4 ou de 163 a 174 em uma amostra.
[00513] Forma de realização 223. O uso de um anticorpo anti- idiotípico de acordo com a forma de realização 221 para detectar o nível de anticorpo monoclonal humano contra CD38 em uma amostra.
[00514] Os termos “CD38” e “antígeno de CD38” são usados intercambiavelmente aqui e incluem quaisquer variantes, isoformas e espécies homólogas de CD38 humano, que são naturalmente expressadas pelas células ou são expressadas nas células transfectadas com o gene de CD38. Os sinônimos de CD38, como reconhecido na técnica, incluem ADP ribosil ciclase 1, cADPr hidrolase 1, Cd38-rs1, ADP-ribose cíclica hidrolase 1, I-19, antígeno NIM-R5.
[00515] O termo peptídeo com respeito tanto a peptídeos de ligação de CD38 quanto peptídeos que não de CD38 aqui descritos incluem qualquer peptídeo adequado e podem ser usado como sinônimo com os termos polipeptídeo e proteína, a menos que de outro modo estabelecido ou contradito pelo contexto; contanto que o leitor reconheça que cada tipo de molécula respectiva contendo polímero de aminoácido possam ser associadas com diferenças significantes e deste modo formam formas de realização individuais da presente invenção (por exemplo, um peptídeo tal como um anticorpo, que é composto de cadeias polipeptídicas múltiplas, é significantemente diferente, por exemplo, de um anticorpo de cadeia única, uma imunoadesina de peptídeo ou peptídeo de cadeia imunogênica única). Portanto, o termo peptídeo aqui no geral deve ser entendido como referindo- se a qualquer peptídeo adequado de qualquer tamanho e composição adequados (com respeito ao número de aminoácidos e o número de cadeias associadas em uma molécula de proteína). Além disso, os peptídeos no contexto dos métodos e composições da invenção aqui descritos podem compreender resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente e/ou não L, a menos que de outro modo estabelecido ou contradito pelo contexto.
[00516] Como será mais debatido aqui, a menos que de outro modo estabelecido ou contradito pelo contexto, o termo peptídeo (e se debatido como formas de realização individuais do(s) termo(s) polipeptídeo e/ou proteína) também abrange moléculas de peptídeo derivatizadas. Em resumo, no contexto da presente invenção, um derivado é um peptídeo em que um ou mais dos resíduos de aminoácido do peptídeo foram quimicamente modificados (por exemplo pela alquilação, acilação, formação de éster ou formação de amida) ou associados com um ou mais substituintes que não aminoácidos, orgânicos e/ou inorgânicos, atômicos ou moleculares (por exemplo um grupo polietileno glicol (PEG), um substituinte lipofílico (que opcionalmente pode ser ligado à seqüência de aminoácido do peptídeo por um resíduo ou grupo espaçadores tal como β-alanina, ácido Y—aminobutírico (GABA), ácido L/D-glutâmico, ácido succínico e outros), um fluoróforo, biotina, um radionuclídeo, etc.) e também pode ou alternativamente compreende resíduos de aminoácido não essenciais, que não ocorrem naturalmente e/ou não L, a menos que de outro modo estabelecido ou contradito pelo contexto (entretanto, deve ser mais uma vez reconhecido que tais derivados, neles ou deles próprios, podem ser considerados características independentes da presente invenção e a inclusão de tais moléculas dentro do significado de peptídeo é feito por motivo de conveniência na descrição da presente invenção ao invés de implicar qualquer tipo de equivalência entre peptídeos nus e tais derivados). Os exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem por exemplo ácido 2-aminoadípico, ácido 3-amino- adípico, 6-alanina, ácido 6-aminopropiônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4- aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-aminoeptanóico, ácido 2- aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2,2’-diaminopimélico, ácido 2,3- diaminopropiônico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, aloidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, aloisoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, 6-N-metilisina, N- metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina e aminoácidos halogenados de estatina.
[00517] Os peptídeos de ligação de antígeno se refere a qualquer peptídeo que especificamente se liga a uma porção de um dado antígeno sob condições celulares e/ou fisiológicas quanto a uma quantidade de tempo suficiente para induzir, promover, realçar e/ou de outro modo estabelecido modular um efeito fisiológico associado com o antígeno; para permitir detecção pelo ELISA, Western blot ou outra técnica de ligação de proteína similarmente adequada aqui descrita e/ou conhecida na técnica e/ou para de outro modo estabelecido ser detectavelmente ligado a esta depois de um período relevante de tempo (por exemplo pelo menos de cerca de 15 minutos, pelo menos de cerca de 30 minutos, pelo menos de cerca de 45 minutos, pelo menos de cerca de 1 hora, pelo menos de cerca de 2 horas, pelo menos de cerca de 4 horas, pelo menos de cerca de 6 horas, pelo menos de cerca de 12 horas, cerca de 1 a 24 horas, cerca de 1 a 36 horas, cerca de 1 a 48 horas, cerca de 1 a 72 horas, cerca de uma sema ou mais tempo).
[00518] Um peptídeo de ligação de CD38 ou CD38BP, é um peptídeo de ligação de antígeno que especificamente se liga ao antígeno CD38. Em uma forma de realização, a ligação do CD38BP a CD38 é medido pelo uso do método descrito no Exemplo 4.
[00519] O termo imunoglobulina refere-se a uma classe de glicoproteínas estruturalmente relacionadas que consiste de dois pares de cadeias polipeptídicas, um par de cadeias leves de peso molecular baixo (L) e um par de cadeias pesadas (H), todas as quatro inter-conectadas pelas ligações de dissulfeto. A estrutura das imunoglobulinas foi bem caracterizada. Ver por exemplo Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Em resumo, cada cadeia pesada tipicamente é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada tipicamente é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve tipicamente é compreendida de uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve tipicamente é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis que podem ser hipervariáveis na seqüência e/ou forma de alças estruturalmente definidas), também chamadas de regiões determinadoras de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, chamadas de regiões estruturais (FRs).
[00520] Cada VH e VL é tipicamente composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (ver também Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Tipicamente, a numeração dos resíduos de aminoácido nesta região é realizada pelo método descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (frases tais como numeração de resíduo do domínio variável como em Kabat ou de acordo com Kabat aqui referem-se a este sistema de numeração para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve). Usando este sistema de numeração, a seqüência de aminoácido linear real de um peptídeo pode conter menos ou aminoácidos adicionais que correspondam a um encurtamento ou inserção de uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único inserto de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) depois resíduo 52 da CDR2 de VH e resíduos inseridos (por exemplo resíduos 82a, 82b e 82c, etc. de acordo com Kabat) depois o resíduo FR de cadeia pesada 82. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada quanto a um anticorpo dado pelo alinhamento nas regiões de homologia da seqüência do anticorpo com uma seqüência numerada por Kabat “padrão”.
[00521] O termo anticorpo (Ab) no contexto da presente invenção refere-se a uma molécula de imunoglobulina, um fragmento de uma molécula de imunoglobulina ou um derivado de cada um destes, que têm a capacidade para ligar-se especificamente a um antígeno sob condições fisiológicas típicas por períodos significantes de tempo tais como pelo menos de cerca de 30 minutos, pelo menos de cerca de 45 minutos, pelo menos de cerca de um hora, pelo menos de cerca de dois horas, pelo menos de cerca de four horas, pelo menos de cerca de 8 horas, pelo menos de cerca de 12 horas, cerca de 24 horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias, etc. ou qualquer outro período funcionalmente definido relevante (tal como um tempo suficiente para induzir, promover, realçar e/ou modular uma resposta fisiológica associada com o anticorpo que se liga ao antígeno).
[00522] As regiões variáveis das cadeias pesada e leve da molécula de imunoglobulina contêm um domínio de ligação que interatua com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos (Abs) podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (tais como células efetoras) e os primeiros componente (Clq) do sistema de complemento clássico.
[00523] Um anticorpo anti-CD38 pode ser um anticorpo biespecífico, diacorpo ou molécula similar (ver por exemplo PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) quanto a uma descrição de diacorpos).
[00524] De fato, os anticorpos, diacorpos e outros biespecíficos, fornecidos pela presente invenção podem ligar qualquer alvo adequado além de uma porção de CD38.
[00525] Como indicado acima, o termo anticorpo aqui, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto, inclui fragmentos de um anticorpo que retenham a capacidade para ligar especificamente a um antígeno. Foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada pelos fragmentos de um anticorpo de tamanho natural. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo “anticorpo” incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, CL e CH1; (ii) fragmentos F(ab)2 e F(ab’)2, fragmentos bivalentes que compreendem dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste essencialmente dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste essencialmente dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste essencialmente de um domínio VH; (vi) uma região isolada determinadora de complementaridade (CDR) e (vii) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas que podem ser opcionalmente unidas por um ligador sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, estes podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligador sintético que possibilite que os mesmos sejam fabricados como uma única cadeia de proteína em que as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como anticorpos de cadeia única ou Fv de cadeia única (scFv), ver por exemplo Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) e Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única estão abrangidos dentro do termo anticorpo a menos que de outro modo estabelecido mencionado ou claramente indicado pelo contexto. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos são incluídos dentro do termo anticorpo. Embora tais fragmentos sejam no geral incluídos dentro do significado de anticorpo, estes coletivamente e cada um independentemente são características únicas da presente invenção, exibindo propriedades biológicas e utilidades diferentes. Estes e outros fragmentos de anticorpo úteis no contexto da presente invenção são ainda debatidos aqui.
[00526] Também deve ser entendido que o termo anticorpo também no geral inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), polipeptídeos equivalentes a anticorpo, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, anticorpos anti-idiotípico (anti-Id) para anticorpos e fragmento de anticorpos que retenham a capacidade para ligar especificamente ao antígeno (fragmentos de ligação de antígeno) fornecidos por qualquer técnica conhecida, tal como a clivagem enzimática, síntese de peptídeo e técnicas recombinantes. Um anticorpo como gerado pode possuir qualquer isótipo.
[00527] Um anticorpo anti-CD38 é um anticorpo como descrito acima, que se liga especificamente ao antígeno CD38.
[00528] O termo “epítopo” significa um determinante de proteína capaz de ligação específica a um anticorpo. Os epítopos usualmente consistem de agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos em que a ligação ao primeiro mas não ao último é perdida na presença de solventes desnaturantes. O epítopo pode compreender resíduos de aminoácido diretamente envolvidos na ligação (também chamados de componente imunodominante do epítopo) e outros resíduos de aminoácido, que não estão diretamente envolvidos na ligação, tais como resíduos de aminoácido que são eficazmente bloqueados pelo peptídeo de ligação de antígeno específico (em outras palavras, o resíduo de aminoácido está dentro da pegada do peptídeo de ligação de antígeno específico).
[00529] O termo “molécula biespecífica” é intencionado a incluir qualquer agente, tal como uma proteína, peptídeo ou proteína ou complexo de peptídeo, que tem duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar a ou interage com, (a) uma antígeno de superfície celular e (b) um receptor de Fc na superfície de uma célula efetora. O termo “molécula multiespecífica” é intencionada a incluir qualquer agente, por exemplo uma proteína, peptídeo ou proteína ou complexo de peptídeo, que tem mais do que duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar a ou interagir com, (a) um antígeno de superfície celular, (b) um receptor de Fc na superfície de um célula efetora e (c) pelo menos um outro componente. Conseqüentemente, a presente invenção inclui, mas não é limitada a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas e outras multiespecíficas que são direcionadas a CD38 e a outros antígenos de superfície celular ou alvos, tais como receptores Fc nas células efetoras.
[00530] O termo “anticorpos biespecíficos” é intencionado a incluir qualquer anticorpo anti-CD38, que é uma molécula biespecífica. O termo “anticorpos biespecíficos” também incluem diacorpos. Os diacorpos são bivalentes, anticorpos biespecíficos em que os domínios VH e VL são expressados em uma única cadeia de polipeptídeo, mas usando um ligador que é muito curto para permitir para emparelhar entre os dois domínios na mesma cadeia, deste modo forçando os domínios para emparelhar com domínios complementares de uma outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno (ver por exemplo Holliger, P. et al., PNAS USA 90, 6444-6448 (1993), Poljak, R. J. et al., Structure 2, 1121-1123 (1994)).
[00531] Como aqui usado, o termo “célula efetora” refere-se a uma célula imune que está envolvido na fase efetora de uma resposta imune, como oposto às fases cognitivas e de ativação de uma resposta imune. As células imunes exemplares incluem uma célula de uma origem mielóide ou linfóide, por exemplo linfócitos (tais como células B e células T incluindo células T citolíticas (CTLs)), células matadoras, células matadoras naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulócitos, mastóides e basófilos. Algumas células efetoras expressam receptores Fc específicos e realizam funções imunes específicas. Em algumas formas de realização, uma célula efetora é capaz de induzir a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), tal como um neutrófilo capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, que expressam FcR estão envolvidos na matança específica de células alvo e apresentam antígenos a outros componentes do sistema imune ou que se liga às células que apresentam antígenos. Em algumas formas de realização, uma célula efetora pode fagocitar um antígeno alvo, célula alvo ou microorganismo. A expressão de uma FcR particular em uma célula efetora pode ser regulada pelos fatores humorais tais como citocinas. Por exemplo, a expressão de FcyRI foi descoberta ser super-regulada pelo interferon y (IFN-Y) e/ou G- CSF. Esta expressão realçada aumenta a atividade citotóxica de células que carregam FcyRI contra alvos. Uma célula efetora pode fagocitar ou lisar um antígeno alvo ou uma célula alvo.
[00532] O termo “anticorpo humano”, como aqui usado, é intencionado a incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas das seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da presente invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo mutações introduzidas pela mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou pela mutação somática in vivo). Entretanto, o termo “anticorpo humano”, como aqui usado, não é intencionado a incluir anticorpos em que as seqüências de CDR derivadas da linha germinativa de uma outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foi enxertado nas seqüências da estrutura humana.
[00533] Como aqui usado, um anticorpo humano é “derivado de” uma seqüência da linha germinativa particular se o anticorpo é obtido de um sistema usando seqüências de imunoglobulina humana, por exemplo pela imunização de um camundongo transgênico que carrega genes da imunoglobulina humana ou pela triagem de uma biblioteca de gene da imunoglobulina humana e em que o anticorpo humano selecionado é pelo menos 90 %, tal como pelo menos 95 %, por exemplo pelo menos 96 %, tal como pelo menos 97 %, por exemplo pelo menos 98 % ou tal como pelo menos 99 % idêntica na seqüência de aminoácido à seqüência de aminoácido codificado pelo segmento de gene da região variável VH ou VL da linha germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma seqüência do segmento de gene da região variável particular VH ou VL da linha germinativa humana demonstrarão não mais do que 10 diferenças de aminoácido, tal como não mais do que 5, por exemplo não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido da seqüência de aminoácido codificada pelo gene da imunoglobulina da linha germinativa.
[00534] Um anticorpo quimérico é um anticorpo que contém uma ou mais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou mais outros anticorpos derivados de uma outra espécie. Um anticorpo quimérico monovalente é um dímero (HL)) formado por uma cadeia H quimérica associada através de pontes de dissulfeto com uma cadeia L quimérica. Um anticorpo quimérico divalente é o tetrâmero (H2L2) formado pelos dois dímeros HL associados através de pelo menos uma ponte de dissulfeto. Um anticorpo quimérico polivalente também pode ser produzido, por exemplo, pela utilização de uma região CH que oligomeriza (por exemplo a partir de uma cadeia H ou cadeia μ de IgM). Tipicamente, um anticorpo quimérico refere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, embora o resto da(s) cadeia(s) seja(m) idêntica(s) com ou homóloga(s) às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencentes a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que os mesmos exibam a atividade biológica desejada (ver por exemplo a US 4.816.567 e Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos são produzidos pelos processos recombinantes bem conhecidos na técnica (ver por exemplo Cabilly et al., PNAS USA 81, 3273-3277 (1984), Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984), Boulianne et al., Nature 312, 643646 (1984), EP125023, Neuberger et al., Nature 314, 268-270 (1985), EP171496, EP173494, W086/01533, EP184187, Sahagan et al., J. Immunol. 137, 1066-1074 (1986), W087/02671, Liu et al., PNAS USA 84, 3439-3443 (1987), Sun et al., PNAS USA 84, 214-218 (1987), Better et al., Science 240, 1041-1043 (1988) e Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)).
[00535] Um anticorpo humanizado é um anticorpo que é derivado de uma espécie não humana, em que certos aminoácidos na estrutura e domínios constantes das cadeias pesadas e leves foram mutados de modo a evitar ou anular uma resposta imune em seres humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídas pelos resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo as características de ligação de antígeno desejadas tais como especificidade e afinidade. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. No geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas das alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas das regiões FR são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. Um anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al, Nature 321, 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992).
[00536] Os termos “anticorpo monoclonal” ou “composição de anticorpo monoclonal” como aqui usados referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal demonstra uma única especificidade e afinidade de ligação quanto a um epítopo particular. Conseqüentemente, o termo “anticorpo monoclonal humano” se refere a anticorpos que demonstram uma única especificidade de ligação que têm regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgênico ou transcromossômico, tal como um camundongo transgênico, tendo um genoma que compreenda um transgene da cadeia pesada humana e um transgene da cadeia leve, fundido a uma célula imortalizada. Um anticorpo monoclonal pode ser abreviado como mAb.
[00537] O termo “anticorpo humano recombinante”, como aqui usado, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados a partir de um animal (tal como um camundongo) que seja transgênico ou transcromossômico para genes da imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir destes (descrito ainda em outro lugar aqui), (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, tal como a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpo humano recombinante, combinatória e (d) anticorpos preparados, expressados, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a união de seqüências de gene da imunoglobulina humana a outras seqüências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variável e constantes derivadas das seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certas formas de realização, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para seqüências Ig humanas é usado, a mutagênese in vivo somática) e assim as seqüências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que, embora derivadas da e relacionadas com as seqüências VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha germinativa do anticorpo humano in vivo.
[00538] Como aqui usado, um “anticorpo heterólogo” é definido em relação ao organismo não humano transgênico que produz um tal anticorpo. Este termo refere-se a um anticorpo tendo uma seqüência de aminoácido que corresponde àquela encontrada em um organismo que não consiste do animal não humana e no geral de uma espécie outra que não aquela do animal não humano transgênico.
[00539] Um “anticorpo isolado,” como aqui usado, é intencionado a se referir a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo um anticorpo isolado que especificamente se liga ao CD38 é substancialmente isento de anticorpos que especificamente ligam antígenos outros que não CD38). Um anticorpo isolado que especificamente se liga a um epítopo, isoforma ou variante de CD38 humano, entretanto, pode ter reatividade cruzada a outros antígenos relacionados, por exemplo de outra espécie (tal como espécies homólogas CD38). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos. Em uma forma de realização da presente invenção, uma combinação de anticorpos monoclonais “isolados” tendo especificidades diferentes é combinada em uma composição bem definida.
[00540] Como aqui usado, “ligação específica” refere-se a um peptídeo de ligação de antígeno, tal como um anticorpo, que se liga a um antígeno pré determinado. Tipicamente, o peptídeo de ligação de antígeno, tal como um anticorpo, liga-se com uma afinidade que corresponde a um KD de cerca de 10-7 M ou menos, tal como cerca de 10-8 M ou menos, tal como cerca de 10-9 M ou menos, cerca de 10-10 M ou menos ou cerca de 10-11 M ou ainda menos quando determinada pela tecnologia de ressonância de plasma de superfície (SPR) em um instrumento BlAcore 3000 usando CD38 recombinante como o ligando e o anticorpo como o analito. O peptídeo de ligação de antígeno pode ligar-se ao antígeno pré determinado com uma afinidade que corresponde a um KD que é pelo menos dez vezes mais baixo, tal como pelo menos 100 vezes mais baixo, por exemplo pelo menos 1000 vezes mais baixo, tal como pelo menos 10.000 vezes mais baixo, por exemplo pelo menos 100.000 vezes mais baixo do que a sua afinidade quanto à ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) outro que não o antígeno pré determinado ou um antígeno intimamente relacionado. A quantidade com que a afinidade é mais baixa é dependente do KD do peptídeo de ligação de antígeno, de modo que quando o KD do peptídeo de ligação de antígeno é muito baixo (isto é, o peptídeo de ligação de antígeno é altamente específico), então a quantidade com que a afinidade para o antígeno é mais baixa do que a afinidade quanto a um antígeno não específico pode ser de pelo menos 10.000 vezes. As frases “um peptídeo de ligação de antígeno que reconhece um antígeno” e “um peptídeo de ligação de antígeno específico quanto a uma antígeno” são usados intercambiavelmente aqui com o termo “um peptídeo de ligação de antígeno que se liga especificamente a um antígeno”. Do mesmo modo, as frases “um anticorpo que reconhece um antígeno” e “um anticorpo específico quanto a um antígeno” são usados aqui intercambiavelmente com o termo “um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno”.
[00541] O termo “kd” (s-1), como aqui usado, é intencionado a se referir à constante da taxa da constante de equilíbrio de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular. O dito valor também é aludido como o valor koff.
[00542] O termo “ka” (M-1 x s-1), como aqui usado, é intencionado a referir-se à taxa da constante de equilíbrio de associação de uma interação de anticorpo-antígeno particular.
[00543] O termo “KD” (M), como aqui usado, é intencionado a referir- se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação de anticorpo- antígeno particular.
[00544] O termo “KA” (M-1), como aqui usado, é intencionado a referir-se à constante de equilíbrio de associação de uma interação de anticorpo-antígeno particular e é obtida dividindo-se o ka pelo kd.
[00545] Como aqui usado, “isótipo” se refere à classe de anticorpo (por exemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM) que é codificado pelos genes da região constante de cadeia pesada.
[00546] Como aqui usado, “comutação de isótipo” se refere ao fenômeno pelo qual a classe ou isótipo, de um anticorpo muda de uma classe de imunoglobulina para uma das outras classes de imunoglobulina.
[00547] Como aqui usado, “isótipo não comutado” se refere à classe isotípica de cadeia pesada que é produzida quando nenhuma comutação de isótipo ocorreu; o gene CH que codifica o isótipo não comutado é tipicamente o primeiro gene CH imediatamente a jusante do gene VDJ funcionalmente rearranjado. A comutação de isótipo foi classificada como comutação de isótipo. A comutação de isótipo clássica ocorre pelos eventos de recombinação que envolvem pelo menos uma comutação da região de seqüência no transgene. A comutação de isótipo não clássica pode ocorrer, por exemplo, pela recombinação homóloga entre ou humano e ∑μ humano (deleçãoδ-associada). Os mecanismos de comutação não clássica alternativa, tais como a recombinação intertransgene e/ou intercromossômica, entre outros, podem ocorrer e efetuar a comutação de isótipo.
[00548] Como aqui usado, o termo “seqüência comutadora” se refere àquelas seqüências de DNA responsáveis pela recombinação comutadora. Uma seqüência “doadora comutadora”, tipicamente uma região comutadora μ , estará 5’ (isto é, a montante) da região de construção a ser deletada durante a recombinação comutadora. A região “aceitadora comutadora” estará entre a região de construção a ser deletada e a região constante de substituição (por exemplo Y, ε, etc.). Como não existe nenhum sítio específico onde a recombinação sempre ocorre, a seqüência de gene final tipicamente não será prognosticável a partir da construção.
[00549] Como aqui usado, “padrão de glicosilação” é definido como o padrão de unidades de carboidrato que são covalentemente ligadas a uma proteína, mais especificamente a uma proteína da imunoglobulina (anticorpo). Um padrão de glicosilação de um anticorpo heterólogo pode ser caracterizado como sendo substancialmente similar aos padrões de glicosilação que ocorrem naturalmente nos anticorpos produzidos pela espécie do animal transgênico não humano, quando uma pessoa de habilidade comum na técnica reconheceria o padrão de glicosilação do anticorpo heterólogo como sendo mais similares ao dito padrão de glicosilação na espécie do animal transgênico não humana do que para a espécie a partir da qual os genes CH do transgene foram derivados.
[00550] O termo “que ocorrem naturalmente” como aqui usado quando aplicado a um objeto se refere ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou seqüência de polinucleotídeo que estão presentes em um organismo (incluindo vírus) que podem ser isolados de uma fonte na natureza e que não foram intencionalmente modificados pelo homem no laboratório é que ocorrem naturalmente.
[00551] O termo “rearranjado” como aqui usado refere-se a uma configuração de um local de imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leve em que um segmento V é posicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J em uma conformação que codifica essencialmente um domínio VH ou VL completo, respectivamente. Um local de gene da imunoglobulina (anticorpo) rearranjado pode ser identificado pela comparação com o DNA da linha germinativa; um local rearranjado terá pelo menos um elemento de homologia de heptâmero/nonâmero recombinado.
[00552] O termo “não rearranjado” ou “configuração da linha germinativa” como aqui usado em referência a um segmento V se refere à configuração em que o segmento V não é recombinado de modo a ser imediatamente adjacente a um segmento D ou J.
[00553] O termo “molécula de ácido nucleico”, como aqui usado, é intencionado a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de filamento único ou de filamento duplo, mas é preferivelmente DNA de filamento duplo. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células integrais, em um lisado de célula ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura.
[00554] Um ácido nucleico é “isolado” ou “tornado substancialmente puro” quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, tais como outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, pelas técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/ SDS, formação de faixa de CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas no ramo. Ver, F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience Nova Iorque (1987).
[00555] Um ácido nucleico é “operavelmente ligado” quando o mesmo é colocado em uma relação funcional com uma outra seqüência de ácido nucleico. Por exemplo, um promoter ou realçador são operavelmente ligados a uma seqüência codificadora se os mesmos afetam a transcrição da seqüência. Com respeito à transcrição de seqüências reguladoras, operavelmente ligado significa que as seqüências de DNA que estão ligadas são contíguas e, onde necessário unir duas proteínas que codificam regiões, contíguas e na matriz de leitura. Para as seqüências comutadoras, operavelmente ligado indica que as seqüências são capazes de efetuar a recombinação comutadora.
[00556] Como aqui usado, o termo “inibe o crescimento” (por exemplo quando da alusão às células) é intencionado incluir qualquer diminuição mensurável no crescimento da célula quando contatada com um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, quando comparado ao crescimento das mesmas células que não em contato com um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, por exemplo uma inibição de crescimento de uma cultura celular em pelo menos de cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % ou 100 %.
[00557] Como aqui usado, os termos “inibe a ligação” e “bloqueia a ligação” (por exemplo quando da alusão à inibição/bloqueio de ligação de um parceiro de ligação de CD38 ao CD38) são usados intercambiavelmente e abrangem a inibição/bloqueio tanto parcial quanto completa. A inibição/bloqueio de ligação de um parceiro de ligação de CD38 ao CD38 podem reduzir ou alterar o nível normal ou tipo de sinalização celular que ocorre quando um parceiro de ligação de CD38 se liga ao CD38 sem inibição ou bloqueio. Inibição e bloqueio também são intencionados a incluir qualquer diminuição mensurável na afinidade de ligação de um parceiro de ligação de CD38 ao CD38 quando em contato com um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, quando comparado com o ligando que não em contato com um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, por exemplo um bloqueio de ligação de um parceiro de ligação de CD38 ao CD38 em pelo menos de cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % ou 100 %.
[00558] “Célula alvo” deve significar qualquer célula indesejável em um paciente (por exemplo um ser humano ou animal) que pode ser alvejado por uma composição (que compreende por exemplo um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano e/ou uma molécula biespecífica ou uma multiespecífica direcionada contra CD38) da presente invenção. Em algumas formas de realização, a célula alvo é uma célula que expressa ou que superexpressa CD38. As células que expressam CD38 tipicamente incluem células hematopoiéticas, tais como timócitos medulares, células T e B ativadas, 80 % de células e monócitos de NK latente, linfoblastos centrais germinais de linfonodo, células B plasmáticas e algumas células intrafoliculares, células dendríticas, células da medula óssea normais, células precursoras particulares, 50 a 80 % de células sangüíneas do cordão umbilical, eritrócitos e plaquetas. O CD38 também pode ser expressado pelas células não hematopoiéticas, tais como células intra-epiteliais e linfócitos da lâmina própria no intestino, pelas células de Purkinje e emaranhados neurofibrilares no cérebro, pelas células epiteliais da próstata, células β no pâncreas, osteoclastos no osso, células retinais no olho e sarcolema de músculo liso e estriado. Nas células malignas, CD38 é expressado em uma variedade de doenças hematológicas malignas, incluindo mas não restritas ao mieloma múltiplo, leucemia de célula plasmática primária ou secundária, leucemia linfocítica crônica de célula B, leucemia linfocítica aguda de célula B, macroglobulinemia de Waldenstrom, amiloidose sistêmica primária, linfoma de célula do manto, leucemia prolinfocítica/ mielocítica, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, linfoma folicular e leucemia de célula NK.
[00559] O termo “vetor,” como aqui usado, é intencionado a se referir a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual o mesmo foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem estar ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissômicos). Outros vetores (tais como vetores mamíferos não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeira e deste modo são replicados juntos com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são aqui aludidos como “vetores de expressão recombinantes” (ou simplesmente, “os vetores de expressão”). No geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinantes estão freqüentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados intercambiavelmente visto que o plasmídeo é a forma de vetor mais habitualmente usada. Entretanto, a presente invenção é intencionada a incluir tais outras formas dos vetores de expressão, tais como vetores virais (tais como retrovírus defeituosos de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem para funções equivalentes.
[00560] O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira”), como aqui usado, é intencionado a se referir a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. deve ser entendido que tais termos são intencionados a se referirem não apenas às células objeto particulares mas à progênie de uma tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer nas gerações que se sucedem devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie, de fato, pode não ser idêntica à célula precursora, mas ainda estão incluídas dentro do escopo do termo “célula hospedeira” como aqui usado. As células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células NS/0 e células linfocíticas.
[00561] O termo “seqüência reguladora” é intencionado a incluir promotores, realçadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes da cadeia de anticorpo. Tais seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Será avaliado por aqueles habilitados na técnica que o planejamento do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências reguladoras pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. Os exemplos de seqüências reguladoras para a expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou realçadores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Alternativamente, as seqüências reguladoras não virais podem ser usadas, tais como o promotor da ubiquitina ou o promotor da β-globina. Como aqui usado, o termo “paciente” inclui qualquer animal humano ou não humano. O termo “animal não humano” inclui todos os vertebrados, por exemplo mamíferos e não mamíferos, tais como os primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
[00562] As várias formas do termo “transfecção” são intencionadas a abranger uma ampla variedade de técnicas habitualmente usadas para a introdução de DNA exógenos em uma célula hospedeira procarióptica ou eucarióptica, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano, transfecção com lipofectina e outros.
[00563] O termo “transfectoma”, como aqui usado, inclui células hospedeiras eucariópticas recombinantes que expressem o anticorpo, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293, células vegetais ou fúngicas, incluindo células de levedura.
[00564] O termo “animal não humano” inclui todos vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc. O termo “animal não humano” inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como os primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc. O termo “animal não humano” inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como os primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
[00565] O termo “animal não humano, transgênico” refere-se a um animal não humano tendo um genoma que compreenda um ou mais transgenes ou transcromossomas de cadeia pesada e/ou leve humanos (integrados ou não integrados no DNA genômico natural do animal) e que é capaz de expressar anticorpos humanos completos. Por exemplo, um camundongo transgênico pode ter uma transgene de cadeia leve humano e um transgene de cadeia pesada humano ou transcromossoma de cadeia pesada humano, tal que o camundongo produza anticorpos anti-CD38 humanos quando imunizados com antígeno de CD38 e/ou células que expressam CD38. O transgene de cadeia pesada humano pode ser integrado no DNA cromossômico do camundongo, como é o caso para os camundongos transgênicos, por exemplo camundongos HuMAb, tais como camundongos HCo7 ou Hco12 ou o transgene de cadeia pesada humano pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para os camundongos transcromossômicos KM como descrito na WO02/43478. Tais camundongos transgênicos e transcromossômicos (coletivamente aqui aludidos como “camundongos transgênicos”) são capazes de produzir isótipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos para um dado antígeno (tal como IgG, IgA, IgM, IgD e/ou IgE) submetendo-se à recombinação V-D-J e comutação de isótopo. O animal não humano transgênico também pode ser usado para a produção de anticorpos contra um antígeno específico pela introdução de genes que codificam tais anticorpos específicos, por exemplo ligando-se operativamente os genes a um gene que seja expressado no leite do animal.
[00566] O termo especificidade aqui se refere à capacidade de um peptídeo de ligação de CD38, tal como um anticorpo anti-CD38, para reconhecer um epítopo dentro de CD38, enquanto se tem apenas pouca ou nenhuma reatividade detectável com outras porções de CD38 (incluindo outros epítopos que são ligados por outros CD38BPs, tal como o anticorpos anti-CD38). A especificidade pode ser relativamente determinada pelos ensaios de competição como aqui descritos. A especificidade pode ser mais particularmente determinada por qualquer uma das técnicas de identificação/caracterização de epítopo aqui descritas ou seus equivalentes conhecidos na técnica.
[00567] Um anticorpo específico quanto a um determinante antigênico particular não obstante pode reagir cruzado com outras biomoléculas que podem estar presentes em algum contexto biológico com CD38. Mais tipicamente, um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, pode reagir cruzado com homólogos de CD38 de outra espécie. Em cada um ou em ambos os contextos, tipicamente tais anticorpos reativos cruzados são seletivos quanto ao CD38 humano com respeito à estrutura relevante e/ou fatores ambientais.
[00568] O termo seletividade aqui se refere à ligação preferencial de um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, quanto a uma região particular, alvo ou peptídeo; tipicamente uma região ou epítopo em CD38, como oposto a uma ou mais outras moléculas biológicas, estruturas, células, tecidos, etc. Em uma forma de realização, um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, da presente invenção é seletivo quanto a uma porção de CD38 no contexto das células de câncer do cólon (isto é, o anticorpo anti- CD38 ligar-se-á seletivamente à porção de CD38 em relação a outros componentes de uma célula de câncer de cólon).
[00569] As CD38BPs da presente invenção são tipicamente usadas e fornecidos em uma forma pelo menos substancialmente isolada. Uma molécula substancialmente isolada é uma molécula que é a espécie predominante na composição em que é encontrada com respeito à classe de moléculas à qual a mesma pertence (isto é, a mesma compõem pelo menos cerca de 50 % do tipo de molécula na composição e tipicamente comporá pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos de cerca 90 %, pelo menos de cerca de 95 % ou mais da espécie de molécula, por exemplo, peptídeo, na composição (por exemplo, a composição exibirá pelo menos cerca de 98 %, 98 % ou 99 % de homogeneidade quanto ao CD38BP no contexto de todas as espécies de peptídeo presentes)).
[00570] Uma molécula isolada refere-se a uma molécula que não está associada com níveis significantes (tais como mais do que cerca de 1 %, mais do que cerca de 2 %, mais do que cerca de 3 % ou mais do que cerca de 5 %) de quaisquer fatores fisiológicos estranhos e indesejáveis, tais como biomoléculas de ligação que não CD38 (ou moléculas de ligação de CD38 que possam interferir com a ligação e/ou atividade de um CD38BP da presente invenção) contidos dentro de uma célula ou animal em que o CD38BP é produzido. Uma molécula isolada também se refere a qualquer molécula que tenha passado através de um tal estágio de pureza devido à intervenção humana (seja automático, manual ou ambos). Em muitas das várias composições fornecidas pela presente invenção, tal como em uma composição que compreenda um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, um CD38BP pode estar presente em quantidades relativamente pequenas em termos de números de espécie molecular total na composição (por exemplo no caso de uma composição que compreenda uma quantidade grande de um carreador, estabilizador e/ou conservante farmaceuticamente aceitáveis). Em alguns casos peptídeos adicionais, tais como BSA, podem ser incluídos em uma tal composição com um CD38BP anteriormente purificado. Entretanto, contanto que tais constituintes adicionais da composição sejam aceitáveis para a aplicação intencionada do CD38BP, uma tal composição pode ser descrita ainda como compreendendo um CD38BP isolado.
[00571] Os CD38BPs da presente invenção são de modo tipicamente substancial isentos de outros CD38BPs, tais como CD38BPs tendo diferentes especificidades antigênicas. Entretanto, a presente invenção também fornece uma composição que compreende vários CD38BPs com diferentes especificidades e características (por exemplo a presente invenção fornece um “coquetel” de CD38BPs tendo características de especificidade e/ou seletividade diferentes).
[00572] “Tratamento” significa a administração de uma quantidade eficaz de um composto terapeuticamente ativo da presente invenção com o propósito de abrandamento, melhora ou erradicação (cura) de sintomas ou estados de doença.
[00573] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma região VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 2.
[00574] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma região VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 6.
[00575] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma região VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 2 e uma região VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 6.
[00576] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 3.
[00577] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 4.
[00578] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 5.
[00579] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 8.
[00580] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 9.
[00581] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 10.
[00582] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende CDRs de VL (CDR1 de VL, CDR2 e CDR3) que consistem essencialmente da SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5, respectivamente.
[00583] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende CDRs de VH (CDR1 de VH, CDR2 e CDR3) que consistem essencialmente da SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10, respectivamente.
[00584] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende(a) três CDRs de VL, que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5 em proximidade imediata entre si (por exemplo, próximo do espaçamento das CDRs de VL em um anticorpo anti-CD38 do-tipo selvagem) no CD38BP e(b) três CDRs de VH que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10 em proximidade imediata entre si (por exemplo, o espaçamento próximo das CDRs de VH em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP.
[00585] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende um ligador flexível posicionado entre a região VL e região VH do CD38BP. Em uma outra forma de realização adicional, a presente invenção fornece um CD38BP, em que as regiões VL e VHs são apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina e orientadas tal que a CDR1, CDR2, CDR3 de VL e CDR1, CDR2 e CDR3 de VH cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38. Em uma outra forma de realização adicional, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende dois conjuntos de variáveis de domínio (conjuntos de domínios VL e VH associados nas cadeias separadas associadas), tal que o CD38BP que compreende dois sítios de ligação de determinante antigênico idênticos.
[00586] Qualquer um de tais CD38BPs descritos neste parágrafo são esperados, pelo menos em parte, terem especificidade de epítopo, seletividade e outras características similares como um anticorpo tendo região VL que compreenda a seqüência da SEQ ID No: 2 e uma região VH que compreenda a seqüência da SEQ ID No: 7, e, conseqüentemente, pode ser útil no tratamento de mieloma múltiplo.
[00587] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma região VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 12.
[00588] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma região VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 17.
[00589] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma região VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 12 e uma região VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 17.
[00590] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 13.
[00591] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 14.
[00592] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 15.
[00593] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 18.
[00594] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 19.
[00595] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 20.
[00596] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende CDRs de VL (CDR1, CDR2 e CDR3 de VL) que consistem essencialmente da SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No: 15, respectivamente.
[00597] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende CDRs de VH (CDR1, CDR2 e CDR3 de VH) que consistem essencialmente da SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No: 20, respectivamente.
[00598] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende(a) três CDRs de VL, que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No: 15 em proximidade imediata entre si (por exemplo, próximo ao espaçamento das CDRs de VL em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP e(b) três CDRs de VH que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No: 20 em proximidade imediata entre si (por exemplo, próximo ao espaçamento das CDRs de VH em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP.
[00599] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende um ligador flexível posicionado entre a região VL e a região VH do CD38BP. Em uma outra forma de realização adicional, a presente invenção fornece um CD38BP, em que as regiões VL e VH são apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina e orientadas tal que a CDR1, CDR2, CDR3 de VL e CDR1, CDR2, CDR3 de VH cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38. Em uma outra forma de realização adicional, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende dois conjuntos de domínios variáveis (conjuntos de domínios VL e VH associados em cadeias separadas associadas), tal que o CD38BP que compreende dois sítios de ligação determinantes antigênicos idênticos.
[00600] Qualquer um de tais CD38BPs descritos neste parágrafo são esperados, pelo menos em parte, ter especificidade de epítopo, seletividade e outras características similares como um anticorpo tendo região VL que compreenda a seqüência da SEQ ID No: 12 e uma região VH que compreenda a seqüência da SEQ ID No: 17, e, conseqüentemente, pode ser útil no tratamento de mieloma múltiplo.
[00601] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma região VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 22.
[00602] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma região VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 27.
[00603] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma região VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 22 e uma região VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 27.
[00604] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 23.
[00605] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 24.
[00606] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 25.
[00607] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 28.
[00608] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 29.
[00609] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente da seqüência da SEQ ID No: 30.
[00610] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende CDRs de VL (CDR1, CDR2 e CDR3 de VL) que consiste essencialmente da SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25, respectivamente.
[00611] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende CDRs de VH (CDR1, CDR2, CDR3 de VH) que consiste essencialmente da SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30, respectivamente.
[00612] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende (a) três CDRs de VL, que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25 em proximidade imediata entre si (por exemplo, próximo ao espaçamento das CDRs de VL em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP e (b) três CDRs de VH que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30 em proximidade imediata entre si (por exemplo, próximas ao espaçamento das CDRs de VH em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP.
[00613] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende um ligador flexível posicionado entre a região VL e região VH do CD38BP. Em uma outra forma de realização adicional, a presente invenção fornece um CD38BP, em que as regiões VL e VH são apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina e orientadas tal que a CDR1, CDR2, CDR3 de VL e CDR1, CDR2, CDR3 de VH cooperativamente associem-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38. Em uma outra forma de realização adicional, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende dois conjuntos de domínios variáveis (conjuntos de domínios VL e VH associados em cadeias separadas associadas), tal que o CD38BP compreenda dois sítios de ligação de determinante antigênico idênticos.
[00614] Qualquer um de tais CD38BPs descritos neste parágrafo são esperados, pelo menos em parte, ter especificidade de epítopo, seletividade e outras características similares como um anticorpo tendo região VL que compreenda seqüência da SEQ ID No: 22 e uma região VH que compreenda seqüência da SEQ ID No: 27, e, conseqüentemente, podem ser úteis no tratamento de mieloma múltiplo.
[00615] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VL que consiste essencialmente de uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 13 ou SEQ ID No: 23, em que o resíduo de terminal N e/ou um, dois ou três dos resíduos de resíduos de aminoácido de terminal C são perdidos.
[00616] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VL que consiste essencialmente de uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 4 ou SEQ ID No: 14 ou SEQ ID No: 24, em que um ou dois dos resíduos de terminal N e/ou um, dois ou três dos resíduos de terminal C são perdidos.
[00617] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL que consiste essencialmente de uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 5 ou SEQ ID No: 15 ou SEQ ID No: 25, em que o resíduo de terminal N e/ou um, dois, três ou quatro dos resíduos de terminal C são perdidos.
[00618] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VH que consiste essencialmente de uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 8 ou SEQ ID No: 18 ou SEQ ID No: 28, em que um, dois, três ou quatro dos resíduos de terminal N e/ou um, dois, três ou quatro resíduos de terminal C são perdidos.
[00619] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR2 de VH que consiste essencialmente de uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No: 19 ou SEQ ID No: 29, em que um, dois, três, quatro ou cinco dos aminoácidos de terminal N destes e/ou um, dois, três, quatro, cinco ou seis dos aminoácidos de terminal C destes são perdidos.
[00620] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH que consiste essencialmente de uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 10 ou SEQ ID No: 20 ou SEQ ID No: 30, em que um, dois ou três resíduos de aminoácido do terminal N e/ou um, dois, três ou quatro resíduos de aminoácido do terminal C são perdidos.
[00621] A presente invenção também fornece CD38BPs em que estas seqüências de CDR “truncadas” são combinadas entre si e/ou outras seqüências de CDR aqui descritas.
[00622] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende(a) três CDRs de VL, que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5 em proximidade imediata entre si no CD38BP (por exemplo, próximo ao espaçamento das CDRs de VL em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) e(b) três CDRs de VH que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10 em proximidade imediata entre si (por exemplo, próximo ao espaçamento das CDRs de VH em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP. Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende um ligador flexível posicionado entre a região VL e a região VH do CD38BP.
[00623] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP em que as regiões VL e VH são apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina e orientadas tal que a CDR1, CDR2, CDR3 de VL e a CDR1, CDR2, CDR3 de VH cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38. Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende dois conjuntos de domínios variáveis (conjuntos de domínios VL e VH associados nas cadeias separadas associadas), tal que o CD38BP compreende dois sítios de ligação de determinante antigênico idênticos. Qualquer de tais CD38BPs descritos neste parágrafo são esperados, pelo menos em parte, ter especificidade de epítopo, seletividade e outras características similares com um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7.
[00624] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende três CDRs de VL, que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No: 15 em proximidade imediata entre si no CD38BP (por exemplo, próximo ao espaçamento das CDRs de VL em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) e três CDRs de VH que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No: 20 em proximidade imediata entre si (por exemplo, próximo ao espaçamento das CDRs de VH em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP. Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende um ligador flexível posicionado entre a região VL e região VH do CD38BP.
[00625] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP em que as regiões VL e VH são apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina e orientadas tal que a CDR1, CDR2, CDR3 de VL e CDR1, CDR2, CDR3 de VH cooperativamente associam-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38. Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende dois conjuntos de domínios variáveis (conjuntos de domínios VL e VH associados nas cadeias separadas associadas), tal que o CD38BP compreende dois sítios de ligação de determinante antigênico idênticos. Qualquer de tais CD38BPs descritos neste parágrafo são esperados, pelo menos em parte, ter especificidade de epítopo, seletividade e outras características similares com um anticorpo tendo uma VL seqüência da SEQ ID No: 12 e uma VH seqüência da SEQ ID No: 17.
[00626] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende(a) três CDRs de VL, que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25 em proximidade imediata entre si no CD38BP (por exemplo, próximo ao espaçamento das CDRs de VL em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) e três CDRs de VH que independentemente consistem essencialmente da SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30 em proximidade imediata entre si (por exemplo, próximo ao espaçamento das CDRs de VH em um anticorpo anti-CD38 do tipo selvagem) no CD38BP.
[00627] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende um ligador flexível posicionado entre a região VL e a região VH do CD38BP.
[00628] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP em que as regiões VL e VH são apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteína dobrada de imunoglobulina e orientadas tal que a CDR1, CDR2, CDR3 de VL e CDR1, CDR2, CDR3 de VH cooperativamente associem-se para contribuir na ligação de modo seletivo e/ou específico de um determinante antigênico no CD38. Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende dois conjuntos de domínios variáveis (conjuntos de domínios VL e VH associados nas cadeias separadas associadas), tal que o CD38BP compreenda dois sítios de ligação de determinante antigênico idênticos. Qualquer um de tais CD38BPs descritos neste parágrafo são esperados, pelo menos em parte, ter especificidade de epítopo, seletividade e outras características similares com um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27.
[00629] A presente invenção também fornece CD38BPs que compreendem variantes funcionais da região VL, região VH ou uma ou mais CDRs dos anticorpos dos exemplos. Uma variante funcional de uma VL, VH ou CDR usada no contexto de um CD38BP permite ainda o CD38BP reter pelo menos uma proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) da afinidade/ avidez e/ou especificidade/seletividade do anticorpo precursor e em alguns casos um tal CD38BP pode estar associado com afinidade, seletividade e/ou especificidade maiores do que no anticorpo precursor.
[00630] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma variante VL que consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, tal como pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal como pelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, tal como pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90 %, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com a SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma seqüência variante VL da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 e um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 e um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27, respectivamente.
[00631] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VL variante que consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, tal como pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal como pelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, tal como pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90 %, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer uma da SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 13 ou SEQ ID No: 23, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma variante CDR1 de seqüência VL da SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 13 ou SEQ ID No: 23, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27, respectivamente.
[00632] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma variante CDR2 de VL que consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, tal como pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal como pelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, tal como pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90 %, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer uma das SEQ ID Nos: 4 ou 14, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma variante CDR2 de seqüência VL da SEQ ID No: 4 ou SEQ ID No: 14 ou SEQ ID No: 24, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27, respectivamente.
[00633] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VL variante que consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, tal como pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal como pelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, tal como pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90 %, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer um da SEQ ID No: 5 ou SEQ ID No: 15 ou SEQ ID No: 25, em que o CD38BP tem pelo menos um proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma CDR3 de seqüência VL variante da SEQ ID No: 5 ou SEQ ID No: 15 ou SEQ ID No: 25, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27, respectivamente.
[00634] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma VH variante que consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, tal como pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal como pelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, tal como pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90 %, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer um da SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 27, em que o CD38BP tem pelo menos um proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma seqüência VH variante da SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 27, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 ou um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 ou um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 27 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 22, respectivamente.
[00635] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR1 de VH variante que consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, tal como pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal como pelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, tal como pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90 %, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer um da SEQ ID No: 8 ou SEQ ID No: 18 ou SEQ ID No: 28, em que o CD38BP tem pelo menos um proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma CDR1 de seqüência VH variante da SEQ ID No: 8 ou SEQ ID No: 18 ou SEQ ID No: 28, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 27, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 ou um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 ou um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 27 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 22, respectivamente.
[00636] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende um CDR2 de VH variante que consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, tal como pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal como pelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, tal como pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90 %, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer um da SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No: 19 ou SEQ ID No: 29, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma CDR2 de seqüência VH variante da SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No: 19 ou SEQ ID No: 29, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 27, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 ou um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 ou um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 27 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 22, respectivamente.
[00637] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compreende uma CDR3 de VH variante que consiste essencialmente de uma seqüência tendo pelo menos de cerca de 50 %, tal como pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos de cerca de 70 %, tal como pelo menos de cerca de 75 %, por exemplo pelo menos de cerca de 80 %, tal como pelo menos de cerca de 85 %, por exemplo pelo menos de cerca de 90 %, tal como pelo menos de cerca de 95 % de identidade da seqüência de aminoácido a uma seqüência de acordo com qualquer um da SEQ ID No: 10 ou SEQ ID No: 20 ou SEQ ID No: 30, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma CDR3 de seqüência VH variante da SEQ ID No: 10 ou SEQ ID No: 20 ou SEQ ID No: 30, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 27, respectivamente, tal como um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 ou um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 ou um anticorpo tendo uma seqüência VH da SEQ ID No: 27 e uma seqüência VL da SEQ ID No: 22, respectivamente.
[00638] A identidade percentual entre duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é, % de homologia = # de posições idênticas/ # total de posições x 100), levando-se em consideração o número de intervalos e o comprimento de cada intervalo, que necessitam ser introduzidos para alinhamento ótimo das duas seqüências. A comparação das seqüências e determinação da identidade percentual entre as duas seqüências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não limitantes abaixo.
[00639] A identidade percentual entre as duas seqüências de nucleotídeo pode ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível no http://www.gcg.com), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de intervalo de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A identidade percentual entre dois nucleotídeo ou seqüências de aminoácido também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de tamanho de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas seqüências de aminoácido pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível na http://www.gcg.com), usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250 e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[00640] As seqüências de ácido nucleico e proteína da presente invenção podem ser ainda usados como uma “seqüência dúvida” para realizar uma pesquisa contra bases de dados públicas, por exemplo, para identificar seqüências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-10 (1990). As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, contagem = 100, comprimento de palavra = 12 para se obter seqüências de nucleotídeo homólogas às moléculas de ácido nucleico da presente invenção. A pesquisa por proteína BLAST pode ser realizada com o programa XBLAST, contagem = 50, comprimento de palavra = 3 para se obter as seqüências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína da presente invenção. Para se obter alinhamentos de intervalo com propósitos de comparação, BLAST de intervalo pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17), 33893402 (1997). Quando da utilização dos programas BLAST e BLAST de Intervalo, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver http://www.ncbi.nlm. nih.gov.
[00641] A seqüência de variantes de CDR podem diferir da seqüência da CDR das seqüências de anticorpo precursoras através de substituições na maior parte conservativas; por exemplo pelo menos de cerca de 35 %, de cerca de 50 % ou mais, de cerca de 60 % ou mais, de cerca de 70 % ou mais, de cerca de 75 % ou mais, de cerca de 80 % ou mais, de cerca de 85 % ou mais, de cerca de 90 % ou mais, de cerca de 95 % ou mais (por exemplo, de cerca de 65 a 99 %) das substituições na variante são substituições de resíduo de aminoácido conservativas. No contexto da presente invenção, as substituições conservativas podem ser definidas pelas substituições dentro das classes de aminoácidos refletidas em uma ou mais das seguintes três tabelas:
[00642] Classes de resíduo de aminoácido para as substituições conservativas
Figure img0001
[00643] Classes de substituição de resíduo de aminoácido conservativoalternativo
Figure img0002
[00644] Classificações Físicas e Funcionais Alternativas de Resíduosde Aminoácido
Figure img0003
[00645] Os agrupamentos de substituições mais conservativas incluem: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina. Grupos funcionais de aminoácidos também podem ser formulados usando os princípios descritos, por exemplo, em Creighton (1984) Proteins: structure and Molecular Properties (2a Ed. 1993), W. H. Freeman and Company.
[00646] Em uma forma de realização da presente invenção, aconservação em termos das propriedades hidropáticas/hidrofílicas e peso/tamanho do resíduo também é substancialmente retido em uma CDR variante quando comparada a uma CDR de um anticorpo dos exemplos (por exemplo, a classe de peso, contagem hidropática ou ambas das seqüências são pelo menos de cerca de 50 %, pelo menos de cerca de 60 %, pelo menos de cerca de 70 %, pelo menos de cerca de 75 %, pelo menos de cerca de 80 %, pelo menos de cerca de 85 %, pelo menos de cerca de 90 %, pelo menos de cerca de 95 % ou mais (por exemplo, de cerca de 65 a 99 %) retidas). Por exemplo, as substituições de resíduo conservativas também podem ser ou alternativamente são fundamentadas na substituição de forte ou fraco com base no peso com base nos grupos de conservação, que são conhecidos na técnica.
[00647] A retenção de resíduos similares também pode ser ou alternativamente é medida por uma contagem de similaridade, como determinada pelo uso de um programa BLAST (por exemplo, BLAST 2.2.8 disponível através da NCBI). As variantes adequadas tipicamente exibem pelo menos cerca de 45 %, tal como pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou mais (por exemplo, de cerca de 70 a 99 %) de similaridade com o peptídeo precursor.
[00648] As mudanças substanciais na função podem ser feitas pela seleção das substituições que são menos conservativas do que aquelas mostradas nos grupos definidos, acima. Por exemplo, substituições não conservativas podem ser fabricadas que mais significantemente afetam a estrutura do peptídeo na área da alteração, por exemplo, a estrutura alfa- helicoidal ou estrutura de folha beta; a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo; ou o volume da cadeia lateral. As substituições que no geral são esperadas produzem as mudanças maiores nas propriedades dos peptídeos são aquelas onde 1) um resíduo hidrofílico, por exemplo, serila ou treonila, é substituído no lugar de (ou por) um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucila, isoleucila, fenilalanila, valila ou alanila; 2) uma cisteína ou prolina são substituídos no lugar de (ou por) qualquer outro resíduo; 3) um resíduo tendo uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisila, arginila ou histidila, é substituído no lugar de (ou por) um resíduo eletronegativo, por exemplo, glutamila ou aspartila; ou 4) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, é substituído no lugar de (ou por) um resíduo que não tem uma cadeia lateral, por exemplo, glicina. Conseqüentemente, estas e outras substituições não conservativas podem ser introduzidas em variantes peptídicas onde mudanças significantes na função/estrutura é desejada e tais mudanças evitadas onde a conservação da estrutura/ função é desejada.
[00649] Um modo conveniente para gerar variantes de substituição é a maturação de afinidade usando fago usando métodos conhecido na técnica. De modo a identificar sítios da região hipervariável candidatos para a modificação, a mutagênese de varredura de alanina também pode ser realizada para identificar resíduos da região hipervariável que contribuem significantemente para a ligação de antígeno. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo de antígeno- anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos adequados prováveis para a substituição.
[00650] Onde inserções na região hipervariável são feitas para gerar um anticorpo variante, a faixa típica de comprimentos da região hipervariável em questão em anticorpos conhecidos deve ser levada em consideração. Por exemplo, para a primeira região hipervariável de um domínio de cadeia leve variável, inserções podem ser introduzidas na CDR1 de seqüência VL de um anticorpo precursor enquanto se retém um tamanho apropriado substancialmente similar e deste modo esperado, que de acordo com Kabat et al., supra, por exemplo, tipicamente tem um total de cerca de 9 a 20 (por exemplo, de cerca de 10 a 17) resíduos. Similarmente, a CDR2 de VL tipicamente tem um comprimento total de cerca de 5 a 10 resíduos; CDR3 de VL tipicamente tem um comprimento de cerca de 7 a 20 resíduos; a CDR1 de VH tipicamente tem um comprimento de cerca de 10 a 15 resíduos; a CDR2 de VH tipicamente tem um comprimento de cerca de 15 a 20 resíduos; e a CDR3 de VH tipicamente tem um comprimento de cerca de 6 a 30 resíduos (por exemplo, de 3 a 25 resíduos). As inserções na região VH tipicamente são feitas na CDR3 de VH e tipicamente próximo ao terminal C do domínio, tal como de cerca de 97 a 102 resíduos da CDR3 de VH precursora (por exemplo adjacente a ou no terminal C na seqüência em relação ao resíduo número 100 da CDR3 de seqüência VH precursora) usando o alinhamento e numeração como descrito em Kabat. As variantes de anticorpo com resíduo(s) de aminoácido inserido(s) em uma região hipervariável destes podem ser preparadas aleatoriamente, especialmente onde a afinidade de ligação de partida do anticorpo precursor para o antígeno alvo é tal que variantes de anticorpo aleatoriamente produzidas podem ser facilmente triadas. Por exemplo, a demonstração de fago fornece um método conveniente de triagem de tais variantes aleatórias.
[00651] No planejamento, construção e/ou avaliação de variantes de CDR atenção pode ser prestada para o fato de que as regiões de CDR podem ser alteradas para permitir uma melhor ligação ao epítopo. CDRs de anticorpo tipicamente operam pelo fornecimento de uma superfície complementar, possivelmente incluindo dedos que podem projetar-se na superfície da proteína do antígeno ou outra estrutura de parátopo, sobre a qual o epítopo se ajusta. Se o epítopo não é firmemente ajustado, o anticorpo pode não oferecer a melhor afinidade. Entretanto, como com epítopos, freqüentemente existem uns poucos resíduos chave em uma estrutura de parátopo que sejam responsáveis pela maioria destas ligações. Assim, as seqüências de CDR podem variar no comprimento e composição significantemente entre anticorpos para o mesmo peptídeo. O técnico habilitado reconhecerá que certos resíduos, tais como resíduos de tirosina (por exemplo, no contexto de CDR3s de seqüência VH), que são freqüentemente contribuidores significantes para tal ligação de epítopo, são tipicamente retidos em uma variante de CDR.
[00652] Variantes da região de CDR também podem aumentar o contato de aminoácido entre o antígeno e uma variante de anticorpo, quando comparado com o contato de aminoácido entre o antígeno e o anticorpo precursor, pela introdução de um ou mais resíduos de aminoácido (pela substituição ou inserções) que aumentam o contato ou interações energeticamente favoráveis entre um ou mais resíduos de aminoácido presentes em um antígeno e um ou mais resíduos de aminoácido presentes no anticorpo. As interações de aminoácido de interesse podem ser selecionados de interações de ligação de hidrogênio, interações de van der Waals e interações iônicas.
[00653] Aqueles habilitados na técnica estarão cientes de princípios adicionais úteis no planejamento e seleção de CD38BP que compreende variantes de CDR dos anticorpos da presente invenção.
[00654] No contexto de variantes de CDR, que são variantes das CDRs dos anticorpos dos exemplos, particularmente no contexto de CDR variante em anticorpos anti-CD38 ou fragmentos destes, resíduos requeridos para sustentar e/ou orientar as estrutura(s) da alça estrutural de CDR podem ser tipicamente retidos; os resíduos que caem dentro de cerca de 10 ângstroms de uma alça estrutura de CDR (mas opcionalmente apenas resíduos nesta área que também possuem uma superfície acessível a solvente aquoso de cerca de 5 ângstroms2 ou mais) podem ser tipicamente não modificados ou modificados apenas pelas substituições de resíduo de aminoácido conservativas; e/ou a seqüência de aminoácido pode ser tipicamente submetida apenas a um número limitado de inserções e/ou deleções (se alguma), tal que as estruturas equivalentes à alça estrutural de CDR sejam retidas na variante (uma descrição de técnicas relacionadas e princípios relevantes é fornecida por exemplo em Schiweck et al, J Mol Biol. 268(5), 934-51 (1997), Morea, Biophys Chem. 68(1-3), 9-16 (1997), Shirai et al., FEBS Lett. 399(1-2), 1-8 (1996), Shirai et al., FEBS Lett. 455(1-2), 188-97 (1999), Reckzo et al., Protein Eng. 8(4), 389-95 (1995) e Eigenbrot et al, J Mol Biol. 229(4), 969-95 (1993). Ver também a WO 03/048185, WO 03/070747 e WO 03/027246.
[00655] As técnicas adicionais que podem ser usadas para gerar anticorpos variantes incluem a evolução direcionada e outras técnicas de geração de variante descrita por exemplo na US 20040009498, Marks et al., Methods Mol Biol. 248, 327-43 (2004), Azriel-Rosenfeld et al., J Mol Biol. 335(1), 177-92 (2004), Park et al., Biochem Biophys Res Commun. 275(2), 553-7 (2000), Kang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 88(24), 11120-3 (1991), Zahnd et al., J Biol Chem. 279(18), 18870-7 (2004), Xu et al., Chem Biol. 9(8), 933-42 (2002), Border et al., Proc Nat) Acad Sci U S A. 97(20), 107015 (2000), Crameri et al., Nat Med. 2(1), 100-2 (1996) e como mais no geral descrito por exemplo na WO 03/048185.
[00656] As variantes de anticorpo geradas podem ser submetidas a qualquer técnica de triagem adequada e os anticorpos com propriedades superiores adequadas e desejáveis em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.
[00657] As CD38BPs que compreendem seqüências de CDR como descrito acima podem compreender qualquer número adequado e combinação de tais CDRs de VL e VH enquanto retém pelo menos uma proporção substancial (pelo menos de cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) da afinidade/avidez e/ou especificidade/ seletividade de um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 e/ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 e/ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27, mas opcionalmente diferindo em outras características, tais como imunogenicidade em um paciente humano, afinidade para o epítopo, meia-vida aumentada, etc. Em alguns casos um tal CD38BP pode estar associado com afinidade, seletividade e/ou especificidade maiores do que a do anticorpo precursor. Em uma forma de realização, menos do que um conjunto completo de CDRs de VL e/ou CDRs de VH estão presentes em um CD38BP da presente invenção. Em uma forma de realização todas das CDRs de VL e CDRs de VH estão presentes.
[00658] Os exemplos de outras propriedades funcionais de anticorpos, que podem ser alteradas ou retidas nas variantes de CD38BPs da presente invenção quando comparada a -003 e -005 e -024, são:(1) ligação de alta afinidade ao CD38;(2) taxa de dissociação baixa de CD38(3) inibição ou bloqueio de ligação de CD38 ao CD38 alvo;(4) eliminação de células T ou células B que expressem CD38;(5) indução de um alto nível de CDC de células negativas em CD55/59 ou positivas em CD55/59;(6) translocação em balsas de lipídeo na ligação ao CD38;(7) tolerância de células T;(8) inibição da proliferação de células T ou B que expressem CD38;(9) internalização de CD38;(10) inibição ou indução da atividade enzimática de CD38;(11) inibição ou indução da transdução de sinal induzida pelo CD38;(12) indução ou inibição da produção de citocina;(13) indução ou bloqueio da diferenciação de célula T ou célula B;(14) indução de ou resgate da apoptose;(15) atenuação ou aumento da indução de lise pelas células NK;(16) indução ou inibição da produção de insulina pelas células β no pâncreas;(17) sobrevivência prolongada de um paciente tendo células de tumor que expressam CD38; e/ou(18) indução de ADCC de CD38 alvos quando misturados com células efetoras apropriadas. A presente invenção também fornece CD38BPs que são caracterizadas com respeito à sua capacidade para competir (inibir competitivamente) ou competir cruzado (isto é, inibir de modo relativamente parcial a ligação de epítopo) com um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 (tal como o anticorpo - 003) ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27, (tal como o anticorpo -024), quanto à ligação ao CD38.
[00659] Um tal CD38BP pode ser, por exemplo, um fragmento Fab, derivado de um anticorpo que se liga a um epítopo idêntico a ou que se sobrepõem com um epítopo ligado por um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27. Um tal fragmento Fab, devido ao seu tamanho relativamente pequeno comparado com as moléculas mAb, podem não competir significantemente com os ditos anticorpos quanto à ligação ao CD38 embora o anticorpo a partir do qual o mesmo deriva o faça. Não obstante, um tal CD38BP pode ser útil em alvejar similarmente regiões próximas de CD38 (por exemplo, no contexto de alvejar uma citotoxina, radionuclídeo ou semelhante no contexto de um CD38BP imunoconjugado). Portanto, tais CD38BPs podem ser úteis no contexto dos métodos da presente invenção e, conseqüentemente, também são fornecidos pela presente invenção.
[00660] A competição quanto à ligação ao CD38 ou uma porção de CD38 por dois ou mais CD38BPs pode ser determinada por qualquer técnica adequada. Em uma forma de realização, a competição é determinada por exemplo como descrito nos Exemplos 7, 8 e 9.
[00661] A competição no contexto da presente invenção se refere a qualquer redução detectavelmente significante na propensão quanto a uma molécula particular para ligar um parceiro de ligação particular na presença de uma outra molécula que liga o parceiro de ligação. Tipicamente, competição significa uma redução de pelo menos cerca de 10 %, tal como uma redução de pelo menos cerca de 15 % ou uma de pelo menos cerca de 20 % na ligação entre um CD38BP e(a) uma forma de CD38 (por exemplo, CD38 “processado”, “maduro”, “não elaborado”, “não processado” ou “imaturo”);(b) uma forma de CD38 livre (por exemplo, um fragmento de CD38 produzido pelo processamento in vivo);(c) um peptídeo heterodimérico composto de um outro peptídeo associado com CD38, tal como um CD31 e CD38;(d) um complexo de CD38 e um ou mais substratos, tais como cAMP, NAD+ e/ou cADPR;(e) um dímero dimerizado, associado e/ou processado de CD38 com um ligando solúvel, tal como CD31; ou(f) uma porção de CD38,causada pela presença de um outro CD38BP como determinado, por exemplo, pela análise de ELISA ou análise de FACS (como descrito na seção de exemplos) usando quantidades suficientes das duas ou mais moléculas de CD38BPs e CD38 em competição. Também pode ser o caso que a competição possa existir entre CD38BPs com respeito a mais do que um de CD38 e/ou uma porção de CD38, por exemplo, em um contexto onde as propriedades de ligação de anticorpo de uma região particular de CD38 são retidos em seus fragmentos, tal como no caso de um epítopo linear bem apresentado localizado em vários fragmentos testados ou um epítopo conformacional que é apresentado em fragmentos de CD38 suficientemente grandes assim como no CD38.
[00662] Avaliar a competição tipicamente envolve uma avaliação da ligação inibidora relativa usando uma primeira quantidade de uma primeira molécula; uma segunda quantidade de uma segunda molécula; e uma terceira quantidade de uma terceira molécula (ou um padrão determinado pelos estudos de ligação que podem ser razoavelmente comparados com os novos dados de ligação com respeito à primeira e segundo moléculas como um substituto para os dados contemporâneos reais), em que a primeira, segunda e terceira quantidades todas são suficientes para fabricar uma comparação que comunique informação a cerca da seletividade e/ou especificidade das moléculas em disputa com respeito às outras moléculas presentes. A primeira, segunda e terceira quantidades podem variar com a natureza do CD38BP e alvos potenciais portanto em disputa. Por exemplo, para as avaliações por ELISA, similares àquelas descritas na seção de exemplos, cerca de 5 a 50 μ g (por exemplo, cerca de 10 a 50 μ g, cerca de 20 a 50 μ g, cerca de 5 a 20 μ g, cerca de 10 a 20 μ g, etc.) de CD38BP e/ou alvos de CD38 são requeridos para avaliar se a competição existe. As condições também devem ser adequadas para a ligação. Tipicamente, condições fisiológicas ou quase fisiológicas (por exemplo, temperaturas de cerca de 20 a 40°C, pH de cerca de 7 a 8, etc.) são adequadas para a ligação de CD38BP:CD38.
[00663] Freqüentemente a competição é mascada por uma inibição significantemente maior do que cerca de 5 % como determinado pelo ELISA e/ou análise de FACS. Pode ser desejável ajustar um patamar mais alto de inibição relativa como um critério/determinante do que seja um nível adequado de competição em um contexto particular (por exemplo, onde a análise de competição é usada para selecionar ou triar quanto a novos anticorpos planejados com a função intencionada de bloquear a ligação de um outro peptídeo ou molécula que se liga ao CD38 (por exemplo, os parceiros de ligação natural de CD38 tais como CD31, também chamado de antígeno de CD31, EndoCAM, GPIIA’, PECAM1, molécula de adesão de plaqueta/célula endotelial ou anticorpo anti-CD38 que ocorre naturalmente)). Assim, por exemplo, é possível ajustar um critério para a competitividade em que pelo menos cerca de 10 % de inibição relativa seja detectada; pelo menos cerca de 15 % de inibição relativa seja detectada; ou pelo menos cerca de 20 % de inibição relativa seja detectada antes que um anticorpo seja considerado suficientemente competitivo. Em casos onde epítopos pertencentes aos anticorpos competidores estão intimamente localizados em um antígeno, a competição pode ser acentuada em mais do que cerca de 40 % de inibição relativa da ligação de CD38 (por exemplo, pelo menos cerca de 45 % de inibição, tal como pelo menos cerca de 50 % de inibição, por exemplo pelo menos cerca de 55 % de inibição, tal como pelo menos cerca de 60 % de inibição, por exemplo pelo menos cerca de 65 % de inibição, tal como pelo menos cerca de 70 % de inibição, por exemplo pelo menos cerca de 75 % de inibição, tal como pelo menos cerca de 80 % de inibição, por exemplo pelo menos cerca de 85 % de inibição, tal como pelo menos cerca de 90 % de inibição, por exemplo pelo menos cerca de 95 % de inibição ou nível mais alto de inibição relativa).
[00664] A competição pode ser considerada o inverso de reatividade cruzada entre uma molécula e dois parceiros de ligação potenciais. Em certas formas de realização, um CD38BP da presente invenção especificamente se liga a um ou mais resíduos ou regiões no CD38 mas também não reagem cruzado com outros peptídeos, regiões ou moléculas peptídicas, por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-CD38 que não reage cruzado com proteínas com homologia ao CD38, tal como BST-1 (antígeno-1 de célula estrômica da medula óssea) e Mo5, também chamado de CD157; ou anticorpos anti-CD38 que não reagem cruzado com CD38 no contexto de tecido normal, tal como tecidos não envolvidos no mieloma múltiplo. Tipicamente, uma falta de reatividade cruzada significa menos do que cerca de 5 % de inibição competitiva relativa entre as moléculas quando avaliada pelo ELISA e/ou análise de FACS usando quantidades suficientes das moléculas sob condições de ensaio adequadas.
[00665] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compete com um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7, tal como o anticorpo -003, quanto à ligação ao CD38 ou um porção destes.
[00666] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compete com um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17, tal como o anticorpo -005, quanto à ligação ao CD38 ou uma porção destes.
[00667] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que compete com um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27, tal como o anticorpo -024, quanto à ligação ao CD38 ou um porção destes.
[00668] Como debatido em outro lugar aqui, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto, referências à ligação de um CD38BP ao CD38 são intencionadas a se referir à ligação em qualquer contexto adequado, tal como em um contexto conformacional onde a estrutura de CD38 está presente; ou em um contexto de epítopo linear. Naturalmente, a ligação em um subconjunto limitado de tal(is) contexto(s) pode ser uma característica importante com respeito a qualquer CD38BP fornecido pela presente invenção.
[00669] Os métodos adicionais para determinar a especificidade de CD38BP pela inibição competitiva podem ser encontrados por exemplo em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e Wiley InterScience N.Y., (1992, 1993) e Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601 (1983)).
[00670] CD38 humano que compreende vários epítopos diferentes, que podem incluir (1) peptídeos determinantes antigênicos que são compreendidos dentro de cadeias de peptídeo únicas dentro do CD38 humano; (2) determinantes antigênicos conformacionais que consistem de um ou mais aminoácidos não contíguos em uma cadeia e/ou aminoácidos particulares presentes em cadeias de peptídeo espacialmente contíguas mas separadas (tipicamente onde as respectivas seqüências de aminoácido das cadeias são localizadas separadamente ao longo da seqüência de polipeptídeo da CD38 humano); (3) determinantes antigênicos pós traducionais que consistem, no todo ou parte, de estruturas moleculares covalentemente ligadas ao CD38 humano, tais como grupos de carboidrato; ou (4) combinações de (1) a (3).
[00671] Um epítopo no contexto da presente invenção inclui qualquer peptídeo ou determinante derivado de peptídeo capazes de ligação específica a uma imunoglobulina. Um epítopo pode compreender qualquer número de aminoácidos adequado, em qualquer posição adequada (com respeito à seqüência linear de CD38), orientação (com respeito ao CD38 dobrado ou um fragmento destes), composição de aminoácido (e conseqüentemente, pelo menos em parte, a carga).
[00672] Assim, por exemplo, um epítopo pode ser composto de cerca de 3 a 10 aminoácidos, tipicamente de 3 a 8 aminoácidos, em uma ou mais localizações contíguas ou não contíguas com respeito à seqüência primária de CD38 (por exemplo um epítopo pode consistir essencialmente de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos de aminoácido distribuídos em 1, 2, 3, 4 ou 5 localizações não contíguas no CD38). Alternativamente, por exemplo, um epítopo pode ser considerado ser definido por uma região de cerca de 5 a 40 resíduos de aminoácido contíguos (por exemplo, de cerca de 7 a 30 resíduos de aminoácido, cerca de 5 a 20 resíduos de aminoácido ou cerca de 3 a 15 resíduos de aminoácido) em CD38 (isoladamente ou em combinação com uma porção de um domínio de CD38 adjacente). Em alguns epítopos pode ser o caso que apenas um resíduo de aminoácido ou apenas uns poucos resíduos de aminoácido são críticos para o reconhecimento de CDR ou CDR(s) (e deste modo o mais importante para a afinidade e avidez de CD38BP:antígeno de CD38). Como tal, um epítopo pode ser caracterizado com base em um ou mais de tais resíduos críticos, com o reconhecimento de que outros resíduos também podem fazer contribuição um pouco menor ao epítopo. No caso de um epítopo definido por uma região de aminoácidos, pode ser que um ou mais aminoácidos na região façam apenas uma contribuição menor ou ainda contribuição negligenciável para a ligação de anticorpo, tal que o resíduo possa ser submetido à substituição com um resíduo apropriado diferente sem que resulte em “uma perda” do epítopo para pelo menos alguns CD38BPs específicos para o mesmo.
[00673] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, que especificamente se liga a um epítopo de CD38 que também é especificamente ligado por um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 (tal como o anticorpo -003) ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024). É possível que CD38BPs tendo uma ou mais CDRs que diferem das CDRs de um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 ou as CDRs de um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 ou as CDRs de um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27, podem ser ainda específicas para o mesmo epítopo como um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 e um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 e um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27, respectivamente. Em alguns de tais sais, o CD38BP em questão pode reconhecer ou ser mais específico/seletivo quanto ás estruturas ou regiões particulares do epítopo do que o anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 e o anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 e o anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27 respectivamente.
[00674] Um epítopo de CD38 ligado por um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 (tal como o anticorpo -003) ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024), podem ser identificados por intermédio do mapeamento padrão e técnicas de caracterização, refinamento adicional do qual pode ser identificado por qualquer técnica adequada, exemplos numerosos dos quais estão disponíveis ao técnico habilitado. Estas técnicas também podem ser usadas para identificar e/ou caracterizar epítopos para CD38BPs no geral. Como um exemplo de tais métodos de mapeamento/ caracterização, um epítopo para um anticorpo anti-CD38 pode ser determinado pela “impressão digital” do epítopo usando a modificação química das aminas/carboxilas expostas na proteína CD38. Um exemplo específico de uma tal técnica de pegada é o uso de HXMS (mudança de deutério para hidrogênio detectada pela espectrometria de massa) em que uma mudança de hidrogênio/deutério de prótons da amida de proteína receptora e ligando, a ligação e a retro mudança ocorrem, em que os grupos amida da estrutura que participam na ligação da proteína são protegidos da retro mudança e portanto permanecerão deuterados. As regiões relevantes podem ser identificadas neste ponto pela proteólise péptica, separação pela cromatografia líquida de alto desempenho de microperfuração rápida e/ou espectrometria de massa de ionização por eletropulverização. Ver, por exemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, 267(2) 252-259 (1999) e/ou Engen, J. R. e Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Um outro exemplo de uma técnica de identificação de epítopo adequada é o mapeamento de epítopo pela ressonância magnética nuclear (RMN), onde tipicamente a posição dos sinais em espectros de RMN bidimensionais do antígeno livre e do antígeno complexado com o peptídeo de ligação de antígeno, tal como um anticorpo, é comparada. O antígeno tipicamente é rotulado de modo seletivamente isotópico com 15N de modo que apenas sinais que correspondem ao antígeno e nenhum sinal do peptídeo de ligação de antígeno são observados no espectro de RMN. Os sinais de antígeno que se originam dos aminoácidos envolvidos na interação com o peptídeo de ligação de antígeno tipicamente mudarão de posição nos espectros do complexo comparados com os espectros do antígeno livre e os aminoácidos envolvidos na ligação podem ser identificados deste modo. Ver por exemplo Ernst Schering Res Found Workshop. (44), 149-67 (2004), Huang et al., Journal of Molecular Biology 281(1), 61-67 (1998) e Saito e Patterson, Methods. 9(3), 516-24 (1996).
[00675] O mapeamento/caracterização de epítopo também pode ser realizada usando métodos de espectrometria de massa. Ver por exemplo Downward, J Mass Spectrom. 35(4), 493-503 (2000) e Kiselar e Downard, Anal Chem. 71(9), 1792-801 (1999).
[00676] As técnicas de digestão da protease também podem ser úteis no contexto de mapeamento e identificação de epítopo. As regiões/ seqüências determinantes antigênicas relevantes podem ser determinadas pela digestão com protease, por exemplo, usando-se tripsina em uma razão de cerca de 1:50 para CD38 na digestão durante a noite (O/N) a 37°C e pH 7 a 8, seguido pela análise de espectrometria de massa (MS) para a identificação de peptídeo. Os peptídeos protegidos da clivagem com tripsina pelo CD38BP podem ser subseqüentemente identificados pela comparação de amostras submetidas à digestão com tripsina e amostras incubadas com CD38BP e depois submetidos à digestão por exemplo, pela tripsina (deste modo revelando uma pegada para o aglutinante). Outras enzimas como quimiotripsina, pepsina, etc. Também ou alternativamente podem ser usados em um método de caracterização de epítopo similar. Um CD38BP que dá significantemente o mesmo resultado como um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 (tal como o anticorpo -003) ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024) nestas medições são julgados ser um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 (tal como o anticorpo -003) ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) ou um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024), respectivamente. Ver por exemplo Manca, Ann 1st Super Sanita. 27(1), 15-9 (1991) quanto a um debate de técnicas similares.
[00677] O mapeamento de epítopo pela ligação competitiva ao CD38 com dois anticorpos onde um é biotinilado é um outro método para identificar regiões de determinantes antigênicos relevantes.
[00678] A ligação de anticorpos aos peptídeos lineares e em alça de CD38 por um imuno ensaio ligado a enzima com base em PEPSCAN é um outro método para identificar regiões de determinantes antigênicos relevantes, ver por exemplo Slootstra-JW et al. Mol-Divers. 1, 87-96 (1996).
[00679] A mutagênese direcionada ao sítio é um outro método para identificar regiões de determinante antigênico relevantes, ver por exemplo Poliak e Deans, Blood 99, 3956-3962 (2002).
[00680] Várias técnicas de demonstração de fago também podem ser usadas para identificar epítopos. Ver por exemplo Wang e Yu, Curr Drug Target. 5(1), 1-15 (2004), Burton, Imunotechnology. 1(2), 87-94 (1995 Aug), Cortese et al., Imunotechnology. 1(2), 87-94 (1995) e Irving et al., Curr Opin Chem Biol. 5(3), 314-24 (2001). Os epítopos de consenso também podem ser identificados através de técnicas relacionadas com a demonstração de fago modificada (ver, http://www.cs.montana.edut-mumey/papers/jcb03.pdf) para debate.
[00681] Outros métodos potencialmente úteis no mapeamento de epítopos incluem técnicas de cristalografia, técnicas de difração de raios X (tais como as técnicas de estudo de difração de raio X/seqüência desenvolvidas por Poijak e outros nos idos de 1970 a 1980) e a aplicação da Tecnologia de Síntese de Peptídeo de Multipino. Os métodos com base em computador tais como a análise de seqüência e análise de estrutura tridimensional e ancoragem também pode ser usado para identificar determinantes antigênicos. Por exemplo, um epítopo também pode ser determinado pela modelagem molecular usando uma estrutura de CD38 com ancoragem da estrutura do fragmento Fab do anticorpo monoclonal individual. Estes e outros métodos de mapeamento são debatidos no Epitope Mapping A Practical Approach (Westwood e Hay Eds.) 2001 Oxford University Press.
[00682] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP tendo substancialmente as mesmas características de ligação de CD38 específicas de um ou mais mAbs selecionados de um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 2 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 7 (tal como o anticorpo -003), um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 12 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) e um anticorpo tendo uma seqüência VL da SEQ ID No: 22 e uma seqüência VH da SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024).
[00683] Os estudos de mapeamento têm indicado que diversos anticorpos monoclonais incitados contra o CD38 humano ligam-se a epítopos na região de terminal C de CD38 (220-296) (Hoshino et al. e Ferrero et al.). Dentro desta região três diferenças de aminoácido foram encontradas entre a seqüência de CD38 humana e a de cinomolgo: T237, Q272 e S274 nos seres humanos correspondem a A238, R273 e F275 no cinomolgo. -005 não se liga ao tecido de cinomolgo (mostrado nos Exemplos 10 e 11). Um número limitado de diferenças de aminoácido existe entre a seqüência de CD38 humana e a de macaco, por exemplo na parte de terminal carbóxi da proteína, por exemplo as seguintes três diferenças de aminoácido entre a seqüência de CD38 humana e do cinomolgo : T237, Q272 e S274 no CD38 humano corresponde a A238, R273 e F275 no CD38 de macaco cinomolgo (comparar a SEQ ID No. 21 e SEQ ID No. 22). -005 não se liga a uma proteína huCD38 mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 da SEQ ID No: 31 foi substituído com um resíduo de arginina (Q272R) ou a uma proteína huCD38 mutante, em que o resíduo de serina da posição 274 da SEQ ID No: 31 foi substituída com um resíduo de fenilalanina (S274F) (mostrado no Exemplo 17) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano do tipo selvagem. A ligação de -005 é particularmente anulada pela substituição de aminoácido na posição S274F.
[00684] Conseqüentemente, a presente invenção fornece peptídeos, que se ligam ao CD38 humano (SEQ ID No: 31) e que não se ligam a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No. 33) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00685] A presente invenção também fornece peptídeos, que se ligam ao CD38 humano (SEQ ID No: 31) e que não se ligam a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No. 34) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00686] O termo “ao mesmos grau” deve ser interpretado de modo que a ligação do peptídeo ao CD38 humano mutante seja significantemente mais baixa do que a ligação do peptídeo para o CD38 humano do tipo selvagem. A ligação de um peptídeo para as moléculas de CD38 (tipo selvagem e mutante) pode ser determinada de vários modos e está dentro do conhecimento geral comum de uma pessoa habilitada na técnica para determinar se a ligação ao mutante é “significantemente mais baixa” do que a ligação ao tipo selvagem. Um grande número de técnicas diferentes para a determinação da ligação de um peptídeo a um outro peptídeo estão disponíveis para a pessoa de habilidade na técnica, por exemplo ELISA, radioimunoensaio, BIAcore ou citometria de fluxo.
[00687] Um método de determinar a ligação é determinando-se a EC50 da ligação do peptídeo à proteína mutante e à proteína do tipo selvagem e depois comparando os valores obtidos. Um outro método de determinar a ligação é examinando-se a magnitude da ligação na concentração de saturação (por exemplo o platô de sinal de ligação) ou pela determinação das constantes da razão cinética k0 e koff por exemplo pelo BIAcore.
[00688] Em uma forma de realização, a ligação do peptídeo em questão às proteínas de CD38 (mutante ou tipo selvagem) é pelo uso de um ELISA como descrito no Exemplo 17.
[00689] Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 5 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 1 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00690] Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), é menor do que 50 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído com um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), é menor do que 10 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00691] Em uma forma de realização, um peptídeo de acordo com a invenção liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 75 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 85 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 90 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31). Em uma forma de realização, a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído com um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) é mais do que 95 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
[00692] Para identificar regiões antigênicas determinantes provável mais específica em CD38, vários métodos analíticos preditivos podem ser aplicados. Em um primeiro método analítico, CD38 pode ser analisado quanto (1) às regiões altamente hidropáticas (usando o método Kyte-Doolittle); (2) à antigenicidade como medida pelo método do Índice Protrusão; (3) à antigenicidade como determinada pelo método de Parker; (4) à antigenicidade como determinada pelo método de Hopp/Woods; e (5) hidrofilicidade como medido pelo métodos de Goldman, Engleman e Steitz. As seqüências variando de 10 a 40 aminoácidos no comprimento podem ser selecionados com base na exibição de uma ou mais destas propriedades. A lógica para este método é o consenso geral que muitos epítopos de célula B ideal são seqüências hidrofílicas, orientadas na superfície e flexíveis de cerca de 8 a 10 aminoácidos no comprimento.
[00693] A presente invenção fornece CD38BPs específicos para as regiões de CD38 de CD38 identificados em uma tal maneira. Além disso, os terminais destas seqüências podem ser comparadas com os determinantes antigênicos de regiões prognosticadas localizadas através das outras análises aqui descritas para fornecer regiões contendo determinante antigênica prováveis específicas adicional. Outras comparações similares podem ser facilmente fabricados para fornecer regiões antigênicas determinantes prováveis adicionais, onde CD38BPs que se liga a estas regiões antigênicas determinantes podem ser consideradas uma outra característica da presente invenção.
[00694] Em uma forma de realização, o CD38BP da presente invenção é um anticorpo. Os exemplos não limitantes de moléculas de imunoglobulina que ligam CD38 fornecidos pela presente invenção incluem (a) uma molécula de imunoglobulina completa funcional, que compreende: (i) duas cadeias pesadas quiméricas idênticas que compreendem uma região variável com uma especificidade ao antígeno de superfície de célula B humana e região constante humana e (ii) duas cadeias leves humanas totalmente idênticas (isto é não quiméricas); (b) uma molécula de imunoglobulina completa, funcional, que compreende: (i) duas cadeias pesadas quiméricas idênticas que compreendem uma região variável como indicada e uma região constante humana e (ii) duas cadeias leves não humanas totalmente idênticas (isto é não quiméricas); (c) um anticorpo monovalente, isto é, uma molécula de imunoglobulina completa, funcional que compreende: (i) duas cadeias pesadas idênticas quiméricas que compreendem um região variável como indicada e uma região constante humana e (ii) duas cadeias leves diferentes, apenas uma das quais tem a mesma especificidade como a região variável das cadeias pesadas. A molécula de anticorpo resultante liga-se apenas a uma extremidade destas e é portanto incapaz de ligação bivalente. Como uma outra ilustração, pode-se dizer que os peptídeos relacionados com a imunoglobulina fornecidos pela presente invenção incluem o seguinte: (a) uma molécula de imunoglobulina inteira; (b) um scFv; (c) um anticorpo monoclonal; (d) um anticorpo humano; (e) um anticorpo quimérico; (f) um anticorpo humanizado; (g) um fragmento Fab; (h) um fragmento Fab’; (i) um fragmento F(ab’)2; (j) uma molécula Fv; e (k) uma molécula Fv ligada a dissulfeto.
[00695] Em uma forma de realização, o CD38BP da presente invenção é um anticorpo policlonal. Em uma forma de realização, o CD38BP da presente invenção é um anticorpo monoclonal. Em uma outra forma de realização, o CD38BP da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano. Em uma outra forma de realização adicional, o CD38BP da presente invenção é um anticorpo humanizado. Em uma outra forma de realização adicional, o CD38BP da presente invenção é um anticorpo quimérico. Em uma outra forma de realização adicional, o CD38BP da presente invenção é um anticorpo monoclonal que se origina totalmente de uma espécie de mamífero diferente dos seres humanos. Em uma outra forma de realização, o CD38BP da presente invenção é um anticorpo monoclonal totalmente de murino.
[00696] Um anticorpo monoclonal refere-se a uma composição que compreende uma população de anticorpo homogênea tendo uma estrutura e especificidade uniformes. Tipicamente um anticorpo monoclonal é um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto quanto as mutações que ocorre naturalmente possíveis que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos e cada anticorpo monoclonal é tipicamente direcionado contra um único epítopo, que está em contraste com as preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes epítopos. Que um anticorpo é monoclonal não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) ou pode ser produzido pelos métodos de DNA recombinantes. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991).
[00697] Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de qualquer fonte adequada. Assim, por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de hibridomas preparados a partir de células B esplênicas de murino obtidas a partir de camundongos imunizados com um antígeno de interesse, por exemplo na forma de células que expressam o antígeno na superfície ou um ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse. Os anticorpos monoclonais também podem ser obtidos a partir de hibridomas derivados de células que expressa, anticorpo de seres humanos imunizados ou mamíferos não humanos tais como ratos, cães, primatas, etc.
[00698] Alternativamente, os genes de anticorpo clonados podem ser expressados em outros sistemas de expressão, incluindo células procariópticas, tais como microorganismos, tais como E. coli, para a produção de anticorpos Fv de cadeia única, algas, assim como células de inseto. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animais transgênicos não humanos, tais como no leite de ovelha e coelhos ou em ovos de galinhas ou em plantas transgênicas. Ver por exemplo Verma, R., et al., J. Immunol. Meth. 216, 165-181 (1998); Pollock, et al., J. Immunol. Meth. 231, 147-157 (1999); e Fischer, R., et al., Biol.Chem. 380, 825-839 (1999).
[00699] Em uma forma de realização, os anticorpos monoclonais humanos direcionados contra CD38 podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos que carregam partes do sistema imune humano ao invés do sistema de camundongo. Tais camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos aqui aludidos como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente e são coletivamente aqui aludidos como “camundongos transgênicos”. Um anticorpo monoclonal humano gerado em tais camundongos pode ser abreviado como HuMab.
[00700] O camundongo HuMAb contém um minilocal de gene da imunoglobulina humana que codifica as seqüências da imunoglobulina da cadeia pesada humano (μ e y) e cadeia leve K desarranjadas, junto com mutações alvejadas que inativam os locais de cadeia μ e K endógenos (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Conseqüentemente, os camundongos exibem a expressão reduzida de camundongos IgM ou K e em resposta à imunização, os transgene de cadeias pesada e leve humanas introduzidos, passam pela comutação de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgG,K humanos de alta afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado em Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. e Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) e Harding, F. e Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)). A preparação de camundongos HuMAbs está descrita em detalhes em Tailor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 62876295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Tailor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ver também US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.789.650, US 5.877.397, US 5.661.016, US 5.814.318, US 5.874.299, US 5.770.429, US 5.545.807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO 01/09187.
[00701] Os camundongos HCo7 têm uma interrupção JKD em seus genes de cadeia leve (capa) endógenos (como descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), uma interrupção CMD em seus genes de cadeia pesada endógenos (como descrito no Exemplo 1 da WO 01/14424), um transgene de cadeia leve capa humana KCo5 (como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)) e um transgene de cadeia pesada humana HCo7 (como descrito na US 5.770.429).
[00702] Os camundongos HCo12 têm um rompimento JKD nos seus genes da cadeia leve (capa) endógenos (como descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), um rompimento CMD em seus genes de cadeia pesada endógenos (como descrito no Exemplo 1 da WO 01/14424), um transgene de cadeia leve capa humana KCo5 (como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)) e um transgene de cadeia pesada humana HCo12 (como descrito no Exemplo 2 da WO 01/14424). Na cepa de camundongo KM, o gene de cadeia leve capa de camundongo endógeno foi homozigoticamente rompido como descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 811820 (1993) e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi homozigoticamente rompido como descrito no Exemplo 1 da WO 01/09187. Esta cepa de camundongo carrega um transgene de cadeia leve capa humano, KCo5, como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de camundongo também carrega um transcromossoma de cadeia pesada humana composto do fragmento 14 de cromossoma hCF (SC20) como descrito na WO 02/43478.
[00703] O camundongo KM contém um transcromossoma de cadeia pesada humana e um transgene de ser cadeia leve capa humana. Os genes das cadeias pesada e leve de camundongo endógenos também foram rompidos nos camundongos KM tal que a imunização dos camundongos leva à produção de imunoglobulinas humanas ao invés de imunoglobulinas de camundongo. A construção de camundongos KM e seu uso para incitar imunoglobulinas humanas está descrita em detalhes na WO 02/43478.
[00704] Os esplenócitos destes camundongos transgênicos podem ser usados para gerar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanos de acordo com técnicas bem conhecidas. Tais mamíferos transgênicos, mamíferos que compreendem uma seqüência de ácido nucleico operável que codifica a expressão de um CD38BP, mamíferos estavelmente transfectados com uma ou mais seqüências de ácido nucleico que codificam CD38 e outros, são características adicionais da presente invenção.
[00705] Os anticorpos monoclonais ou policlonais humanos da presente invenção ou anticorpos da presente invenção que se originam de outra espécie também podem ser gerados transgenicamente através da geração de um outro mamífero não humano ou planta que seja transgênico para as seqüências de cadeias pesada e leve da imunoglobulina de interesse e a produção do anticorpo em uma forma recuperável a partir destas. Em conexão com a produção transgênica em mamíferos, anticorpos podem ser produzidos e recuperados do leite de cabras, vacas ou outros mamíferos. Ver por exemplo a US 5.827.690, US 5.756.687, US 5.750.172 e US 5.741.957.
[00706] Além disso, os anticorpos humanos da presente invenção ou anticorpos da presente invenção de outra espécie podem ser gerados através de tecnologias do tipo demonstração, incluindo, sem limitação, a demonstração de fago, a demonstração retroviral, a demonstração ribossômica e outras técnicas, usando técnicas bem conhecidas no ramo e as moléculas resultantes podem ser submetidas à maturação adicional, tal como a maturação por afinidade, visto que tais técnicas são bem conhecidas no ramo (ver por exemplo Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (demonstração de fago), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (demonstração de fago), Hanes e Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (demonstração de ribossômica), Parmley e Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (demonstração de fago), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 10811085 (1993), Hoogenboom et al., lmmunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell e McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992) e US 5.733.743). Se as tecnologias de demonstração são utilizadas para produzir anticorpos que não sejam humanos, tais anticorpos podem ser humanizados, por exemplo como descrito aqui em algum lugar.
[00707] Os anticorpos monoclonais humanizados da presente invenção podem ser gerados fundindo-se os domínios constantes de um anticorpo humano aos domínios variáveis de uma espécie não humana. Os exemplos de como fabricar anticorpos humanizados pode ser encontrado por exemplo na US 6.054.297, US 5.886.152 e US 5.877.293. Um anticorpo humanizado é planejado para ter maior homologia a uma imunoglobulina humana do que os anticorpos monoclonais derivados de animal. Os resíduos de aminoácido não humanos de um domínio variável “importado” (animal) tipicamente são transfectados em uma “estrutura” humana. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)), substituindo-se as regiões determinadoras de complementaridade (“CDRs”) ou seqüências de CDR de roedor no lugar de seqüências de um anticorpo humano correspondentes. Conseqüentemente, em tais anticorpos “humanizados”, as porções de CDR do domínio variável humano foram substituídas pela seqüência correspondente de uma espécie não humana. Assim, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos da estrutura são substituídos pelos resíduos de sítios análogos no anticorpo de roedor. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem usados na fabricação de anticorpos humanizados é importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado de método “best-fit”, a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é triada contra a biblioteca inteira de seqüências de domínio variável humanas conhecidas. A seqüência humana que estiver mais próxima a esta do rodente é então aceita como a estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Um outro método usa uma estrutura particular derivada da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., PNAS USA 89, 4285 (1992), Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)).
[00708] É tipicamente importante também que os anticorpos humanizados retenham alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para se alcançar esta meta, os anticorpos humanizados podem ser preparados por um processo de análise das seqüências precursoras e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das seqüências precursoras e humanizadas. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais são habitualmente disponíveis e são familiares àqueles habilitados na técnica. Os programas de computador são disponíveis que ilustram e demonstram estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas demonstrações permite a análise do papel provável de certos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para ligar ao seu antígeno. Deste modo, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências receptoras e importadas de modo que as características de anticorpo desejadas, tais como afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo(s), é maximizada, embora sejam os resíduos de CDR que diretamente e mais substancialmente influenciam a ligação de antígeno.
[00709] Os anticorpos de murino ou anticorpos de outra espécie podem ser humanizados ou primatizados usando quaisquer técnicas adequadas, várias técnicas adequadas já sendo bem conhecidas na técnica (ver por exemplo Winter e Harris Immunol Today 14, 43-46 (1993) e Wright et al., Crit. Reviews in Immunol. 125-168 (1992)). O anticorpo de interesse pode ser engendrado pelas técnicas de DNA recombinantes para substituir os domínios de dobradiça CH1, CH2, CH3 e/ou o domínio de estrutura com a seqüência humana correspondente (ver a WO 92/02190 e US 5.530.101, US 5.585.089, US 5.693.761, US 5.693.792, US 5.714.350 e US 5.777.085).
[00710] A humanização de anticorpos também pode ser realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321, 522525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)), substituindo-se as CDRs ou seqüências de CDR de roedor no lugar das seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüentemente, tais anticorpos “humanizados” são, em um sentido, anticorpos quiméricos (US 4.816.567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano inteiro foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos pelos resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor.
[00711] Também, o uso de cDNA de Ig para a construção de genes quiméricos da imunoglobulina é conhecido na técnica (ver por exemplo Liu et al., PNAS USA 84, 3439 (1987) e J. Immunol. 139, 3521 (1987)). O mRNA é isolado de um hibridoma ou outra célula que produza o anticorpo e usado para produzir cDNA. O cDNA de interesse pode ser amplificado pela reação da cadeia da polimerase usando iniciadores específicos (US 4.683.195 e US 4.683.202). Alternativamente, uma biblioteca é fabricada e triada para isolar a seqüência de interesse. A seqüência de DNA que codifica a região variável do anticorpo é depois fundida às seqüências da região constante humanas. As seqüências das regiões constantes humanas (assim como das regiões variáveis) podem ser encontradas em Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, publicação N.I.H. no. 91-3242 e dados mais recentes e relacionados podem ser acessados no http://www.biochem.ucl. ac.uld-martin/abs/GeneralInfo.html. A escolha de isótipo tipicamente será guiada pelas funções efetoras desejadas, tais como fixação de complemento ou atividade na citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Os isótipos exemplares são IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cada uma das regiões constantes da cadeia leve humana, capa ou lambda, podem ser usadas. O anticorpo quimérico, humanizado pode ser depois expressado pelos métodos convencionais.
[00712] Os CD38BPs da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada com respeito à multimerização. Os anticorpos anti-CD38 e os fragmentos de anticorpo podem estar pelo menos na forma heterotrimérica se não em formas multiméricas superiores tais como aquelas associadas com anticorpos IgM. Em outras formas de realização, um CD38BP pode ser apresentado como um dímero ou monômero. As CD38BPs monoméricas da presente invenção podem ser, por exemplo, modificadas por qualquer técnica adequada de modo a formar composições peptídicas multiméricas.
[00713] Se desejado, a classe de um anticorpo anti-CD38 da presente invenção pode ser mudada pelos métodos conhecidos. Por exemplo, um anticorpo da presente invenção que foi originalmente IgM pode ser mudado de classe para um anticorpo IgG da presente invenção.
[00714] Além disso, as técnicas de mudança de classe podem ser usadas para converter uma subclasse de IgG para uma outra, por exemplo de IgG1 para IgG2. Assim, a função efetora dos anticorpos da presente invenção podem ser mudados pela comutação de isótopo, por exemplo, para um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM para vários usos terapêuticos.
[00715] Em uma forma de realização um anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgG1, por exemplo um isótipo IgG1,K ou IgG1,À. Em uma outra forma de realização um anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgG3, por exemplo um isótipo IgG3,K ou IgG3,À. Em uma outra forma de realização um anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgG4, por exemplo um isótipo IgG4,K ou IgG4,À. Em uma outra forma de realização um anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgA1 ou IgA2. Em uma outra forma de realização um anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgM.
[00716] Anticorpos anti-CD38 podem ser recuperados a partir de bibliotecas de anticorpo combinatórias recombinantes, tais como uma biblioteca de demonstração de fago scFv, que pode ser fabricada com cDNAs de VL e VH humanos preparados a partir de mRNA derivado de linfócitos humanos. Os métodos para preparar e triar tais bibliotecas são conhecidos na técnica. Existem vários kits comercialmente disponíveis para gerar bibliotecas de demonstração de fago. Existem também outros métodos e reagentes que podem ser usados na geração e triagem de bibliotecas de demonstração de fago (ver por exemplo a US 5.223.409, WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690, Fuchs et al., Bio/Technology 9, 1370-1372 (1991), Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3, 81-85 (1992), Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989), McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990), Griffiths et al., EMBO J 12, 725-734 (1993), Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992), Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), Gram et al., PNAS USA 89, 3576-3580 (1992), Garrad et al., Bio/Technology 9, 1373-1377 (1991), Hoogenboom et al., Nucl Acid Res 19, 4133-4137 (1991) e Barbas et al., PNAS USA 88, 7978-7982 (1991)). As seqüências VL e VH adequadas de ácidos nucleicos podem ser selecionadas usando qualquer método apropriado. Por exemplo, ácidos nucleicos VL e VH podem ser selecionados pela utilização dos métodos de impressão de epítopo descritos na WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpo, tais como bibliotecas de scFv podem ser preparadas e triadas usando métodos conhecidos e adequados (com peptídeos contendo CD38 humano como antígeno(s)), tais como aqueles descritos por exemplo na WO92/01047, McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990) e Griffiths et al., EMBO J 12, 725-734 (1993). Tais bibliotecas de anticorpo e outras combinações de CD38BPs (bibliotecas, agrupamentos, etc.) são características da presente invenção que podem ser usadas terapeuticamente para fornecer uma resposta imune mais compreensiva; como ferramentas em métodos de triagem quanto a peptídeos imunogênicos, moléculas pequenas, outros anticorpo anti-CD38 (por exemplo, por via de ensaios de competição) e outros; e/ou em métodos e composições de diagnóstico (por exemplo, um chip de imunoensaio que compreenda um painel de tais anticorpos opcionalmente em associação com outros anticorpos pode ser preparado pelas técnicas padrão). Uma vez que os segmentos VL e VH humanos iniciais são selecionados, experimentos de “mistura e emparelhamento”, em que pares diferentes dos segmentos VL e VH inicialmente selecionados são triados quanto a ligação de peptídeo contendo CD38, podem ser realizados para selecionar combinações de pares VL/VH desejáveis. Por exemplo, a reatividade dos peptídeos pode ser determinada pelo ELISA ou outros métodos de análise de epítopo adequados (ver por exemplo Scott, J. K. e Smith, G. P. Science 249, 386-390 (1990), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Felici et al., J. Mol. Biol. 222, 301-310 (1991) e Kuwabara et al., Nature Biotechnology 15, 74-78 (1997) para debate de tais técnicas e princípios). Os anticorpos podem ser selecionados pela sua afinidade quanto ao antígeno e/ou pelas suas cinéticas de dissociação (off-rate) de antígeno (ver por exemplo Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992)).
[00717] Para melhorar ainda mais a qualidade e/ou diversidade de anticorpos anti-CD38, os segmentos VL e VH de par(es) VL/VH podem ser aleatoriamente mutado, por exemplo dentro da região de CDR3 de VH e/ou VL, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação por afinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural. Esta maturação por afinidade in vitro pode ser realizada amplificando-se as regiões VH e VL usando iniciadores de PCR complementares à CDR3 de VH ou CDR3 de VL, respectivamente, iniciadores estes que tipicamente são “reforçados” com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleotídeo em certas posições, tal que os produtos de PCR resultantes codifiquem segmentos VH e VL dentro dos quais as mutações aleatórias foram introduzidas nas regiões VH e/ou VL de CDR3. Estes segmentos de VH e VL aleatoriamente mutados podem ser re-triados quanto à ligação aos peptídeos contendo CD38.
[00718] A seguir da triagem, o ácido nucleico que codifica um anticorpo selecionado pode ser recuperado do pacote de demonstração (por exemplo, do genoma de fago) e subclonado em um vetor apropriado pelas técnicas de DNA recombinante padrão. Se desejado, um tal ácido nucleico que codifica anticorpo pode ser manipulados ainda para criar outras formas de anticorpo ou CD38BPs. Para expressar um anticorpo recombinante isolado pela triagem de uma biblioteca combinatória, tipicamente um ácido nucleico que compreende uma seqüência que codifica o anticorpo é clonado em um vetor de expressão recombinante e introduzido nas células hospedeiras apropriadas (células de mamífero, células de levedura, etc.) sob condições adequadas para a expressão do ácido nucleico e produção do anticorpo.
[00719] Os peptídeos de anticorpo de alta afinidade, tais como fragmentos de anticorpo Fv (scFv) e Fab de cadeia única humana, também podem ser isolados a partir de tais bibliotecas usando uma técnica de panning em que o antígeno de interesse é imobilizado em uma superfície sólida, tal como placas ou pérolas de microtítulo (ver por exemplo Barbas e Burton, Trends. Biotechnol. 14, 230-234 (1996) e Aujame et al., Hum. Antibodies 8, 155-68 (1997). A demonstração de fago de bibliotecas ingênuas grandes também torna possível isolar anticorpos humanos diretamente sem imunização (ver por exemplo, Haard et al., J. Biol. Chem. 274(26), 1821818230 (1999)).
[00720] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-CD38 variantes. Um anticorpo anti-CD38 “variante” é um anticorpo que difere de um anticorpo precursor (tipicamente gerado pela imunização) em uma ou mais alterações de resíduo de aminoácido adequadas, isto é substituições, deleções, inserções ou adições de seqüência ao terminal, nas CDRs ou outras seqüências VH e/ou VL (contanto que pelo menos uma quantidade substancial das características de ligação de epítopo do anticorpo precursor sejam retidas, se não melhoradas, por tais mudanças).
[00721] As variações em uma variante de anticorpo podem ser feitas em cada uma das regiões da estrutura, o domínio constante e/ou as regiões variáveis (ou qualquer uma ou mais CDRs destes) em um único anticorpo variante. Alternativamente, as variações podem ser feitas apenas em uma das regiões de estrutura, as regiões variáveis (ou CDR única destes) ou o domínio constante em um anticorpo. As técnicas de mutagênese de varredura de alanina, tais como descritas por Cunningham e Wells, Science 244, 10811085 (1989), podem ser usados para identificar resíduos adequados para a substituição ou deleção na geração de CD38BPs que compreendem seqüências variantes de VL, VH ou CDR particular, embora outras técnicas de mutagênese adequadas também possam ser aplicadas. As substituições de aminoácido múltiplas também podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese e triagem, tais como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, Science 241, 53-57 (1988) ou Bowie e Sauer, PNAS USA 86, 2152-2156 (1989).
[00722] Assim, por exemplo, em uma variante de anticorpo um ou mais resíduos de aminoácido podem ser introduzidos ou inseridos ou adjacentes a uma ou mais das regiões hipervariáveis de um anticorpo precursor, tal como em uma ou mais CDRs. Uma variante de anticorpo anti- CD38 pode compreender qualquer número de resíduos de aminoácido inseridos, contanto que mais uma vez pelo menos uma quantidade substancial das características de ligação de epítopo do anticorpo precursor sejam retidas. Uma variante de anticorpo anti-CD38 da presente invenção por exemplo podem compreender de cerca de 1 a 30 resíduos de aminoácido inseridos, por exemplo de cerca de 1 a 10, tal como por exemplo de cerca de 2 a 10, por exemplo de 2 a 5 ou tal como de cerca de 1 a 5 resíduos de aminoácido inseridos. Do mesmo modo, uma variante de anticorpo anti-CD38 da presente invenção por exemplo pode compreender de cerca de 1 a 30 resíduos de aminoácido deletados, por exemplo de cerca de 1 a 10, tal como por exemplo de cerca de 2 a 10, por exemplo de 2 a 5 ou tal como de cerca de 1 a 5 resíduos de aminoácido deletados. Do mesmo modo, uma variante de anticorpo anti-CD38 da presente invenção por exemplo pode compreender de cerca de 1 a 30 resíduos de aminoácido substituídas, por exemplo de cerca de 1 a 10, tal como por exemplo de cerca de 2 a 10, por exemplo de 2 a 5 ou tal como de cerca de 1 a 5 resíduos de aminoácido substituídos. Do mesmo modo, uma variante de anticorpo anti-CD38 da presente invenção por exemplo pode compreender de cerca de 1 a 30 adições de resíduo de aminoácido da seqüência terminal, por exemplo de cerca de 1 a 10, tal como por exemplo de cerca de 2 a 10, por exemplo de 2 a 5 ou tal como de cerca de 1 a 5 adições de resíduo de aminoácido de seqüência terminal. Uma variante de anticorpo da presente invenção também pode compreender uma combinação de dois ou mais de tais inserções, deleções, substituições e adições de resíduo de aminoácido de seqüência terminal, contanto que a variante possua pelo menos uma proporção substancial da afinidade, especificidade e/ou seletividade dos precursores do anticorpo com respeito a um ou mais epítopos de CD38.
[00723] Considerações na seleção das variantes de anticorpo (por exemplo, conservação das características funcionais do resíduo de aminoácido, conservação de resíduos de aminoácido com base nas características hidropáticas e/ou conservação dos resíduos de aminoácido com base no peso/tamanho), são descrito aqui em outro lugar. Tipicamente, as alterações de seqüência de aminoácido, tais como variações de substituição conservativa, desejavelmente não mudam substancialmente as características estruturais da seqüência precursora (por exemplo, uma substituição de aminoácido não deve tender a romper a estrutura secundária que caracteriza a função da seqüência precursora). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeo reconhecidas na técnica são descritos, por exemplo, em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman e Company, Nova Iorque (1984)), Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova Iorque, N.Y. (1991)) e Thornton et al., Nature 354, 105 (1991). Os princípios adicionais relevantes para o planejamento e construção de variantes peptídicas é debatido por exemplo em Collinet et al., J Biol Chem 275(23), 17428-33 (2000).
[00724] As variantes de seqüência de aminoácido de um anticorpo podem ser obtidas pela introdução de mudanças de nucleotídeo apropriadas no ácido nucleico que codifica anticorpo (por exemplo, pela mutagênese direcionada ao sítio) ou pela síntese química de peptídeo. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições e/ou adições de seqüência terminal de resíduos dentro das seqüências de aminoácido dos anticorpos dos exemplos aqui. Qualquer combinação de deleções, inserções e substituições pode ser feita para chegar a uma variante desejada, contanto que a variante possua pelo menos uma proporção substancial de características de ligação de epítopo do anticorpo precursor. As mudanças de seqüência de aminoácido, com respeito a um anticorpo precursor, também podem alterar os processos pós traducionais do anticorpo variante com respeito a um anticorpo precursor, tal como pela mudança do número ou posição de sítios de glicosilação.
[00725] Os anticorpos variantes da presente invenção podem compreender alterações na região hipervariável, tais como nas CDRs. Os exemplos de CD38BPs que compreendem tais variantes de CDR são descritos aqui em outro lugar, e, como descrito acima, tais CD38BPs podem ser anticorpos.
[00726] Os anticorpos variantes da presente invenção podem compreender alterações estruturais (FR), que estão fora da região hipervariável, por exemplo na região Fc, alterações estas que podem estar associadas com propriedades vantajosas, tais como a mudança das propriedades funcionais ou farmacocinéticas dos anticorpos. Por exemplo, uma substituição ou outra modificação (inserção, deleção, adições de seqüência terminal ou combinação de qualquer destes) em uma região de estrutura ou de domínio constante podem estar associadas com um aumento na meia-vida do anticorpo variante com respeito ao precursor de anticorpo ou pode ser fabricado para alterar a imunogenicidade do anticorpo variante com respeito ao anticorpo precursor, para fornecer um sítio para a ligação covalente ou não covalente a uma outra molécula ou para alterar tais propriedades como fixação de complemento, por exemplo resultando em uma diminuição ou aumento da ligação C1q e CDC ou de ligação de FcyR e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). As substituições por exemplo podem ser fabricadas em um ou mais dos resíduos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 da região constante de cadeia pesada, causando deste modo uma alteração em uma função efetora enquanto retém a ligação ao antígeno quando comparado com o anticorpo não modificado, cf. US 5.624.821 e US 5.648.260. Referência adicional pode ser feita à WO 00/42072 que divulga anticorpos com regiões Fc alteradas que aumentam ADCC e à WO 94/29351 que divulga anticorpos tendo mutações na região de terminal N do domínio CH2 que alteram a capacidade dos anticorpos para ligar-se ao FcRI e deste modo diminui a capacidade dos anticorpos para a ligação a C1q que por sua vez diminui a capacidade dos anticorpos para fixar complemento. Além disso, Shields et al., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604 (2001) divulgam variantes de combinação, que melhoram a ligação de FcyRIII, por exemplo T256A/S298A, S298A/E333A eS298A/E333A/K334A.
[00727] A meia-vida in vivo dos anticorpos também pode ser melhorada modificando-se o epítopo receptor de recuperação do domínio constante de Ig ou um domínio constante equivalente a Ig tal que a molécula não compreenda um domínio CH2 intacto ou uma região Fc de Ig intacta, cf. US 6.121.022 e US 6.194.551. A meia-vida in vivo além disso pode ser aumentada fazendo-se mutações na região Fc, por exemplo, substituindo-se a treonina no lugar da leucina na posição 252, treonina no lugar da serina na posição 254 ou treonina no lugar da fenilalanina na posição 256, cf. a US 6.277.375.
[00728] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-CD38 variantes em que os epítopos de célula T potenciais no anticorpo foram reduzidos ou eliminados através do planejamento de análise racional. Assim, por exemplo, em uma forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo anti-CD38 “desimunizado” em que os epítopos de célula T potenciais foram eliminados. O planejamento e construção de anticorpos anti-CD38 desimunizados podem ser realizados por qualquer técnica conhecida adequada (ver por exemplo a WO9852976 com respeito aos métodos para preparar anticorpos desimunizados). Espera-se que a imunogenicidade em seres humanos seja eliminada ou substancialmente reduzida quando tais CD38BPs (por exemplo, anticorpos anti-CD38 variantes) são administrados de acordo com a presente invenção.
[00729] Outras mutações de estrutura podem incluir mudanças de seqüência que podem reduzir a suscetibilidade para a proteólise, reduzir a suscetibilidade para a oxidação e/ou conferir ou modificar outras propriedades fisicoquímicas ou funcionais no anticorpo variante associado.
[00730] As variações de seqüência de aminoácido na estrutura também podem resultar em um padrão de glicosilação alterado no anticorpo variante com respeito a um anticorpo precursor. Por alteração é intencionado deletar uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo precursor e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo precursor. A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada em N ou ligada em O. Ligado em N se refere à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são seqüências de reconhecimento comuns para a ligação enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de cada um destas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo pode criar um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação ligada em O se refere à ligação de açúcares tais como N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, o mais habitualmente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas. A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando-se a seqüência de aminoácido tal que a mesma contenha uma ou mais das seqüências de tripeptídeo descrita acima (para os sítios de glicosilação ligados em N). A alteração também pode ser feita pela adição de, ou substituição em, um ou mais resíduos de serina ou treonina na seqüência do anticorpo original (para os sítios de glicosilação ligados em O).
[00731] Os anticorpos também podem ser expressados em um transfectoma que não adicionam a unidade de fucose normalmente ligada ao carboidrato ligado a Asn na posição 297 de Fc de modo a realçar a afinidade de Fc para FCYRIII que por sua vez resultará em um ADCC aumentado dos anticorpos na presença de células NK, cf. Shield et al., J. Biol. Chem. 277, 26733 (2002). Outros métodos de modificar na glicosilação com foco na fucosilação estão descritos na WO 00/61739 concedida a Kyowa. Além disso, a modificação da galactosilação pode ser feita de modo a modificar a CDC. Referência adicional pode ser feita à WO 99/54342 e Umana et al., Nat. Biotechnol. 17, 176 (1999) que divulgam uma linhagem de célula CHO engendrada para expressar GntIII resultando na expressão de anticorpos monoclonais com glicoformas alteradas e atividade de ADCC melhorada.
[00732] Outras técnicas potenciais adequadas para preparar novos anticorpos anti-CD38 incluem mutagênese ambulante de CDR, embaralhamento de cadeia de anticorpo, “mutagênese parcimoniosa” (Balint e Larrick, Gene 137, 109-118 (1993)) e outras técnicas de maturação por afinidade (ver por exemplo Wu et al., PNAS USA 95, 6037-42 (1998)). O repertório de procedimentos de clonagem também pode ser útil na produção de anticorpos variantes (ver por exemplo a WO 96/33279).
[00733] Existem várias técnicas conhecidas para gerar variantes, qualquer técnica adequada ou combinação destas que possam ser usadas no contexto da presente invenção para gerar variantes de CDR das CDRs dos anticorpos dos exemplos. Os exemplos de tais técnicas incluem a remoção de resíduos não essenciais como descrito em Studnicka et al., Protein Engineering 7, 805-814 (1994) (ver também Soderlind et al., Immunotechnology. 4(3-4), 279-85 (1999), a mutagênese ambulante de CDR e outras técnicas de maturação por afinidade artificiais (ver por exemplo Yang et al., Journal of Molecular Biology 254(3), 392-403 (1995), as técnicas de embaralhamento de CDR em que tipicamente as CDRs são amplificadas a partir de um conjunto diverso de padrões de gene opcionalmente compreendendo oligonucleotídeos sintéticos, as regiões constantes das VL, VH e/ou CDRs são amplificadas e os vários fragmentos misturados (no formato de filamento único ou de filamento duplo) e montados pela reação da cadeia da polimerase (PCR) para produzir um conjunto de anticorpo-fragmento que codifica produtos de gene que carregam CDR embaralhada introduzida na estrutura mestra, que é amplificada usando iniciadores externos que recozem aos sítios além dos sítios de restrição inseridos para garantir a produção de produtos de tamanho natural, que são inseridos em um vetor de escolha e usados para expressar proteínas contendo CDR variantes. A estrutura pode ser determinada pela sobreposição das estruturas variante/ miméticas e aquelas das seqüências precursoras, por exemplo, pela comparação de estruturas de solução de RMN. Os métodos úteis para o planejamento racional de variantes de seqüência de CDR são descritos por exemplo na WO 91/09967 e WO 93/16184. Os exemplos adicionais de tais métodos são fornecidos aqui em outro lugar.
[00734] A presente invenção também fornece fragmentos de anticorpos (incluindo anticorpos variantes) da presente invenção, fragmentos estes que têm a capacidade para ligar ao CD38 (fragmentos de ligação de CD38). As CD38BPs incluem assim moléculas equivalentes de anticorpo que compreendem menos do que a estrutura tetramérica completa associada com anticorpos que ocorrem naturalmente. Um fragmento de anticorpo pode ser qualquer peptídeo que compreenda uma porção de um anticorpo de tamanho natural, no geral a ligação de antígeno ou região variável destes (isto inclui, por exemplo, fragmentos de anticorpos humanizados que compreendem CDRs de um anticorpo da presente invenção, variantes destes ou outras CDRs que possibilitem ao fragmento de antígeno competir com um anticorpo da presente invenção quanto a ligação de CD38). Em uma forma de realização, um fragmento de anticorpo refere-se a um peptídeo que consiste essencialmente ou consiste apenas de uma porção de uma molécula de anticorpo. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um fragmento de anticorpo que compreende pelo menos uma porção de um domínio variável de cadeia pesada contendo uma ou mais CDRs de VH de um anticorpo da presente invenção e opcionalmente também um domínio variável de cadeia leve que compreenda uma ou mais CDRs de VL de um anticorpo da presente invenção, em que o domínio variável de cadeia pesada e opcionalmente o domínio variável de cadeia leve, opcionalmente é (são) fundido(s) a uma porção adicional, tal como um domínio constante de imunoglobulina. As seqüências de domínio constante podem ser adicionadas à(s) seqüência(s) de cadeia pesada e/ou cadeia leve para formar espécie com cadeias pesada e/ou leve de comprimento parcial. As regiões constantes ou porções destas, de qualquer isótipo de anticorpo podem ser usadas para este propósito, incluindo as regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
[00735] Os exemplos de fragmentos de anticorpo de ligação de CD38 incluem os fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv. Um fragmento de anticorpo no contexto da presente invenção também pode incluir um peptídeo que compreenda uma CDR e outros. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um fragmento de anticorpo que compreende uma primeira cadeia de polipeptídeo que compreende qualquer uma das CDRs de cadeia pesada aqui descritas e uma segunda cadeia de polipeptídeo que compreende qualquer uma das CDRs de cadeia leve aqui descritas, em que as duas cadeias de polipeptídeo são covalentemente ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto intercadeia. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um fragmento de anticorpo de duas cadeias tendo tais características em que o fragmento de anticorpo é selecionado dos fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, Fv e/ou F(ab’)2.
[00736] Os anticorpos podem ser fragmentados usando técnicas convencionais e os fragmentos triados quanto a utilidade da mesma maneira como descrito acima para os anticorpos inteiros. Por exemplo, fragmentos F(ab’)2 podem ser gerados tratando-se o anticorpo com pepsina. O fragmento de F(ab’)2 resultante pode ser tratado para reduzir as pontes de dissulfeto para produzirem fragmentos Fab’. Os fragmentos Fab podem ser obtidos tratando- se um anticorpo IgG com papaína; os fragmentos de Fab’ podem ser obtidos com a digestão com pepsina de anticorpo IgG. Um fragmento Fab’ também pode ser produzido pela ligação de Fab’ descrita abaixo por intermédio de uma ligação de tioéter ou uma ligação de dissulfeto. Um fragmento Fab’ é um fragmento de anticorpo obtido cortando-se uma ligação de dissulfeto da região de dobradiça do F(ab’)2. Um fragmento Fab’ pode ser obtido tratando- se um fragmento F(ab’)2 com um agente redutor, tal como ditiotreitol. Os peptídeos de fragmento de anticorpo também podem ser gerados pela expressão de ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos em células recombinantes (ver por exemplo Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma porção de um fragmento F(ab1)2 pode incluir seqüências de DNA que codificam o domínio CH1 e região de dobradiça da cadeia H, seguido por um códon de parada de tradução para produzir uma tal molécula de fragmento de anticorpo truncada.
[00737] Os CD38BPs também incluem anticorpos univalentes e anticorpos de cadeia única. Os anticorpos de cadeia única são peptídeos em que as regiões Fv de cadeia pesada e leve são conectadas. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um Fv de cadeia única (scFv) em que as cadeias pesada e leve no Fv de um anticorpo anti-CD38 da presente invenção são unidas com um ligador peptídico flexível (tipicamente de cerca de 10, 12, 15 ou mais resíduos de aminoácido) em uma única cadeia de peptídeo. Os métodos de produzir tais anticorpos são descritos por exemplo na US 4.946.778, Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) e McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). O anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, se apenas uma única VH e VL são usadas, bivalente, se duas VH e VL são usadas ou polivalente, se mais do que duas VH e VL são usadas.
[00738] Em uma forma de realização da presente invenção, um CD38BP pode ser derivatizado ou ligado a uma outra molécula funcional, por exemplo um outro peptídeo ou proteína (tal como um fragmento Fab’) para gerar uma molécula biespecífica ou multiespecífica que se liga a sítios de ligação múltiplos ou epítopos alvo. Por exemplo, um anticorpo da presente invenção pode estar funcionalmente ligado (por exemplo pela ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo estabelecido) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tais como um outro anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação. Em uma forma de realização, o CD38BP é um anticorpo da presente invenção.
[00739] Conseqüentemente, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas que compreendem pelo menos uma primeira especificidade de ligação para CD38 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Em uma forma de realização da presente invenção, o segundo epítopo alvo é um receptor de Fc, por exemplo, FCYRI humano (CD64) ou um receptor de Fcα humano (CD89) ou um receptor de célula T, por exemplo, CD3. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece moléculas biespecíficas e multiespecíficas capazes de ligação tanto ao FcyR, FcαR ou FcεR que expresse células efetoras (por exemplo, monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)) e alvejar células que expressam CD38. Estas moléculas alvo CD38 biespecífica e multiespecífica que expressam células para a célula efetora e deflagram as atividades de célula efetora mediadas pelo receptor de Fc, tais como fagocitose de células que expressam CD38, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), liberação de citocina ou geração de ânion superóxido.
[00740] As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção podem incluir ainda uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti- CD38. Em uma forma de realização, a terceira especificidade de ligação é uma porção do fator anti-realce (EF), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida na atividade citotóxica e deste modo aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A “porção do fator anti-realce” pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligando que se liga a uma dada molécula, por exemplo, um antígeno ou um receptor e deste modo resulta em um realce do efeito da ligação determinantes para o receptor Fc ou antígeno de célula alvo. A “porção do fator anti-realce” pode ligar-se a um receptor de Fc ou um antígeno de célula alvo. Alternativamente, a porção de fator anti-realce pode ligar-se a uma entidade que seja diferente da entidade para a qual a primeira e segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção de fator anti-realce pode ligar-se a uma célula T citotóxica (por exemplo, por intermédio de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imune que resulte em uma resposta imune aumentada contra a célula alvo).
[00741] Em uma forma de realização, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um outro anticorpo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv ou um scFv. O outro anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada ou qualquer fragmento mínimo destes tais como um Fv ou uma construção de cadeia única como descrito em Ladner et al., na US 4.946.778. O anticorpo também pode ser um domínio de ligação da proteína de fusão de imunoglobulina como divulgado na US 2003/0118592 e US 2003/ 0133939.
[00742] Em uma forma de realização, a especificidade de ligação quanto a um receptor de Fc é fornecida por um anticorpo monoclonal humano, a ligação do qual não é bloqueada pela imunoglobulina G humana (IgG). Como aqui usado, o termo “receptor de IgG” se refere a qualquer um dos oito genes de cadeia Y localizados no cromossoma 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas de transmembrana ou receptor solúvel que são agrupadas em três classes de receptor Fc*: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16). Em uma forma de realização, o receptor de Fcy é um FcyRI de alta afinidade humano. A produção e caracterização destes anticorpos monoclonais são descritos por Fanger et al., na WO 88/00052 e na US 4.954.617. Estes anticorpos se ligam a um epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII em um sítio que é distinto do sítio de ligação de Fcy do receptor e, assim, a sua ligação não é bloqueada substancialmente pelos níveis fisiológicos de IgG. Os anticorpos anti-FcYRI específicos úteis na presente invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. Em outras formas de realização, o anticorpo receptor anti-Fcy é uma forma humanizada de mAb 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 estão descritas em Graziano, R. F. et al., J. Immunol. 155(10), 4996-5002 (1995) e WO 94/10332. A linhagem de célula que produz o anticorpo H22 foi depositada no American Type Culture Collection em 4 de Novembro de 1992 sob a designação HA022CL1 e tem o No. de acesso CRL 11177.
[00743] Em uma forma de realização, a especificidade de ligação quanto a um receptor Fc é fornecida por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humano, por exemplo, um receptor Fcα (FcαI (CD89)), a ligação do qual em uma forma de realização não é bloqueada pela imunoglobulina human A (IgA). O termo “receptor de IgA” é intencionado a incluir o produto de gene de um gene α (FcαRI) localizado no cromossoma 19. Este gene é conhecido codificar diversas isoformas de transmembrana alternativamente unidas de 55 a 110 kDa. FcαRI (CD89) é constitutivamente expressado em monócitos/ macrófagos, granulócitos eosinofílico e neutrofílico, mas não em populações de célula não efetora. FcαRI tem afinidade média tanto para IgA1 quanto lgA2, que é aumentada na exposição às citocinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H. C. et al., Critical Reviews in Immunology 16, 423-440 (1996)). Quatro anticorpos monoclonais específicos de FcαRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a FcαRI fora do domínio de ligação de ligando de IgA, foram descritos (Monteiro, R. C. et al., J. Immunol. 148, 1764 (1992)).
[00744] FcαRI, FCYRI, FCYRII e FCYRIII, especialmente FcyRII eFcyRIII, são exemplos de receptores deflagradores para o uso na presente invenção porque eles (1) são expressados primariamente em células efetoras imunes, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2) são expressados em altos níveis (por exemplo 5.000 a 100.000 por célula); (3) são mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo ADCC, fagocitose); e (4) medeia a apresentação de antígeno realçada de antígenos, incluindo auto- antígenos, alvejados a eles.
[00745] Em uma forma de realização, um CD38BP da presente invenção é um anticorpo anti-CD38 multiespecífico ou molécula equivalente a anticorpo, um exemplo particular da qual é um anticorpo biespecífico que compreende pelo menos um par de cadeias da seqüência VH e seqüência VL específico quanto a um epítopo compreendido pelo menos em parte no CD38 e um segundo pelo menos um par de cadeias das seqüências VH e VL específico quanto a um segundo epítopo. As seqüências VH e VL em um anticorpo biespecífico podem compreender as seqüências de VH e VL completas que correspondem à região VH e VL anti-CD38, seqüências VH e/ou VL variantes ou porções adequadas das regiões VH e/ou VL, tais como uma combinação adequada de seqüências de CDR e outras seqüências suficientes para fornecer ligação aos epítopos de interesse.
[00746] As moléculas de anticorpo biespecíficas exemplares compreendem (i) dois anticorpos um com uma especificidade para CD38 e um outro a um segundo alvo que são conjugados entre si, (ii) um único anticorpo que tenha uma cadeia específica para CD38 e uma segunda cadeia específica a uma segunda molécula e (iii) um anticorpo de cadeia única que tenha especificidade para CD38 e uma segunda molécula. Tipicamente, o segundo alvo/segunda molécula é uma molécula outra que não CD38. Em uma forma de realização, a segunda molécula é um antígeno do câncer/antígeno associado a tumor tal como o antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno específico da próstata (PSA), RAGE (antígeno renal), α- fetoproteína, CAMEL (antígeno reconhecido por CTL em melanoma), antígenos de CT (tais como MAGE-B5, -B6, -C2, -C3 e D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE e SAGE), antígenos de mucina (por exemplo, MUC1, mucina-CAl25, etc.), antígenos de gangliosídeos, tirosinase, gp75, C-myc, Marti, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA- B7 e Ep-CAM. Em uma forma de realização, a segunda molécula é uma integrina associada com câncer, tal como a integrina α5β3. Em uma forma de realização, a segunda molécula é um fator angiogênico ou outro fator de crescimento associado com o câncer, tal como um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), um fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), angiogenina e receptores destes, particularmente receptores associados com a progressão do câncer (por exemplo um dos receptores de HER1 a HER4). Outras proteínas associadas com a progressão do câncer aqui debatidas também podem ser adequadas para moléculas secundárias. Em uma forma de realização, a segunda molécula é uma molécula expressada na superfície de células de mieloma múltiplo tais como CD138.
[00747] Em uma forma de realização, um anticorpo biespecífico da presente invenção é um diacorpo.
[00748] Os anticorpos biespecíficos também incluem anticorpos reticulados ou “heteroconjugados”. Por exemplo, um dos anticorpos em um heteroconjugado pode ser ligado à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos alvejar células do sistema imune às células não desejadas (ver por exemplo a US 4.676.980). os anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Os agentes e técnicas de reticulação de peptídeo adequados são bem conhecidos na técnica e exemplos de tais agentes e técnicas são divulgados por exemplo na US 4.676.980.
[00749] Assim, embora o debate aqui possa focalizar nos anticorpos, deve ser entendido que as formas de realização e características dos anticorpos podem ser igualmente aplicadas aos fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos Fab, fragmentos Fab’ e peptídeos scFv, peptídeos como anticorpo (peptídeos que compreendem um CDR), anticorpos bi- e multi- específicos e outros CD38BPs, como apropriado, contanto que o CD38BP da presente invenção retenha pelo menos uma proporção substancial das propriedades de ligação de antígeno do anticorpo completo correspondente. Em alguns casos, os fragmentos de anticorpo podem estar associados com a afinidade de ligação de antígeno mais baixa, mas podem oferecer outras características vantajosas que podem compensar quanto a qualquer uma de tal perda na afinidade.
[00750] Os CD38BPs da presente invenção e particularmente os anticorpos anti-CD38 podem ser selecionados com base na sua capacidade para fornecer a capacidade de fixação de complemento ou não. Existem vários isótipos de anticorpos que são capazes de fixação de complemento e CDC, incluindo, sem limitação, os seguintes: IgM de murino, IgG2a de murino, IgG2b de murino, IgG3 de murino, IgM humano, IgG1 humano e IgG3 humano. Aqueles isótipos que não incluem, sem limitação, IgG2 humano e IgG4 humano. A determinação de isótipo e outros métodos para modificar a fixação de complemento e características funcionais de CDC de anticorpos são conhecidos na técnica.
[00751] Os CD38BPs da presente invenção também incluem imunoadesinas, que são moléculas em que uma ou mais CDRs de um anticorpo anti-CD38 são covalentemente ou não covalentemente associados com a molécula. Uma imunoadesina pode incorporar a(s) CDR(s) como parte de uma cadeia de polipeptídeo mais larga, pode ligar covalentemente a(s) CDR(s) a uma outra cadeia de polipeptídeo ou podem incorporar a(s) CDR(s) não covalentemente. As CDRs permitem que as imunoadesina especificamente se liguem a um CD38.
[00752] A presente invenção também fornece proteínas de fusão de CD38BP. As proteínas de fusão de CD38BP podem compreender qualquer seqüência de aminoácido adequada ou combinação das seqüências que são específicas e/ou seletivas para pelo menos um domínio que é pelo menos parcialmente compreendido dentro do CD38 (por exemplo, um anticorpo domínio de VH, domínio de VL anti-CD38 ou CDRs particulares destes) e pelo menos uma seqüência de aminoácido não homóloga e típica e substancialmente não similar (por exemplo, menor do que cerca de 40 %, menor do que cerca de 35 %, menor do que cerca de 30 %, menor do que cerca de 25 % ou menor do que cerca de 20 % de identidade da seqüência de aminoácido para a seqüência específica/seletiva de CD38) que comunica uma função e/ou característica biológica detectáveis à proteína de fusão que não podem ser isoladamente atribuídas à seqüência específica/seletiva de CD38 (por exemplo, meia-vida in vivo aumentada, fluorescência, alvejamento aumentado a um tipo particular de célula, etc.). As seqüências funcionais de uma tal proteína de fusão pode ser separada pelo(s) ligador(es) flexível(is). A(s) seqüência(s) secundária(s) também pode(m) ser derivada(s) de peptídeos citotóxicos ou apoptóticos. As seqüências secundárias também podem conferir propriedades de diagnóstico. Os exemplos de tais seqüências incluem aquelas derivadas de enzimas facilmente visualizadas tais como a rábano peroxidase.
[00753] As proteínas de fusão de CD38BP também podem ser caracterizadas por compreender um rótulo de epítopo. Uma seqüência de rótulo de epítopo é uma seqüência de aminoácido tendo resíduos suficientes para fornecer um epítopo contra o qual um anticorpo pode ser feito, no contexto do CD38BP, embora seja curto o suficiente tal que não interfira substancialmente com a atividade (seletividade, especificidade, afinidade e/ou atividade biológicas) do CD38BP (quando comparado a um CD38BP precursor que careça do rótulo de epítopo). Um rótulo de epítopo de modo desejável é suficientemente único de modo que o anticorpo anti-rótulo de epítopo substancialmente não reaja cruzado com outros epítopos. Os polipeptídeos de rótulo adequados no geral têm pelo menos cerca de 6 resíduos de aminoácido e usualmente entre cerca de 8 a 50 resíduos de aminoácido (por exemplo, de cerca de 9 a 30 resíduos). Os exemplos de rótulos de epítopo incluem o polipeptídeo de rótulo flu HA e seu anticorpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)); o rótulo c-myc e os anticorpos para este 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12), 3610-3616 (1985)) e o rótulo da glicoproteína D do vírus Simples do Herpes (gD) e seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547-553 (1990)). Em certas formas de realização, o rótulo de epítopo é um “epítopo de ligação de receptor de recuperação”. Como aqui usado, o termo “epítopo de ligação de receptor de recuperação” refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula IgG (por exemplo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável quanto ao aumento da meia-vida sérica in vivo da molécula de IgG.
[00754] Os CD38BPs da presente invenção também incluem derivados de CD38BP. Um derivado é um peptídeo em que um ou mais dos resíduos de aminoácido do peptídeo foram quimicamente modificados (por exemplo, pela alquilação, acilação, formação de éster ou formação de amida) ou covalentemente associados com um ou mais substituintes heterólogos (por exemplo, um substituinte lipofílico, uma porção PEG, uma cadeia lateral peptídica ligada por um ligador de porção orgânica adequado, etc.). O peptídeo também pode ser conjugado a uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, um medicamento quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisótopo (um chamado de imunoconjugado). No geral, os CD38BPs aqui descritos podem ser modificados pela inclusão de qualquer número adequada de tais aminoácidos e/ou associações modificados com tais substituintes conjugados. A adequabilidade neste contexto geral é determinada pela capacidade para reter pelo menos substancialmente a seletividade e/ou especificidade de CD38 associada com o CD38BP precursor não derivatizado. A inclusão de um ou mais aminoácidos modificados pode ser vantajosa, por exemplo, em (a) aumento da meia-vida sérica do polipeptídeo, (b) redução da antigenicidade do polipeptídeo ou (c) aumento da estabilidade na armazenagem do polipeptídeo. O(s) aminoácido(s) são modificado(s), por exemplo, co-traducional ou pós-traducionalmente durante a produção recombinante (por exemplo, a glicosilação ligada em N nos motivos N-X-S/T durante a expressão em células de mamífero) ou modificados por meios sintéticos. Os exemplos não limitantes de um aminoácido modificado incluem um aminoácido glicosilado, um aminoácido sulfatado, um aminoácido prenilado (por exemplo, farnesilado, geranilgeranilado), um aminoácido acetilado, um aminoácido acilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido carboxilado, um aminoácido fosforilado e outros. As referências adequadas para orientar uma pessoa habilitada na modificação de aminoácidos são repletas por todo a literatura. Os protocolos de exemplo são encontrados em Walker (1998) Protein Protocols On CdRom, Humana Press, Towata, NJ. O aminoácido modificado pode ser selecionado de um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido / conjugado a uma porção lipídica e um aminoácido conjugado a um agente de orgânico de derivatização.
[00755] Adicionalmente, os anticorpos podem ser quimicamente modificados pela conjugação covalente a um polímero por exemplo para aumentar a sua meia vida em circulação. Os polímeros exemplares e métodos para ligá-los aos peptídeos, são ilustrados por exemplo na US 4.766.106, US 4.179.337, US 4.495.285 e US 4.609.546. os polímeros ilustrativos adicionais incluem polióis polioxietilados e polietileno glicol (PEG) (por exemplo, um PEG com um peso molecular entre cerca de 1.000 e cerca de 40.000, tal como entre cerca de 2.000 e cerca de 20.000, por exemplo, cerca de 3.000 a 12.000).
[00756] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que é conjugado a uma segunda molécula que é selecionada de um radionuclídeo, uma enzima, um substrato de enzima, um cofator, um marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente, um rótulo de peptídeo ou uma partícula magnética. Em uma forma de realização, um CD38BP pode ser conjugado a um ou mais fragmentos de anticorpo, ácidos nucleicos (oligonucleotídeos), nucleases, hormônios, imuno-moduladores, queladores, compostos de boro, agentes fotoativos, corantes e outros. Estes e outros agentes adequados podem ser ligados direta ou indiretamente às CD38BPs da presente invenção. Um exemplo de ligação indireta de um segundo agente é a ligação por uma porção espaçadora. Estes espaçadores, por sua vez, podem ser insolúveis ou solúveis (ver por exemplo Diener et al., Science 231, 148 (1986)) e podem ser selecionados para possibilitar a liberação de medicamento do CD38BP a um sítio alvo e/ou sob condições particulares. Os exemplos adicionais de agentes terapêuticos que podem ser ligados aos CD38BPs incluem lectinas e peptídeos fluorescentes.
[00757] Em uma forma de realização, derivados de CD38BP que compreendem um ou mais aminoácidos radiorrotulados são fornecidos. Um CD38BP radiorrotulado pode ser usado tanto para propósitos de diagnóstico e terapêuticos (conjugação às moléculas radiorrotuladas é uma outra característica possível). Os exemplos não limitantes de rótulos parapolipeptídeos incluem, mas não são limitados a H, C, N, S, Y, Tc, 125I, 131I e 186Re. Os métodos para preparar aminoácidos radiorrotulados e derivados peptídico são conhecidos na técnica (ver por exemplo Junghans et al., em Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edição, Chafner e Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) e US 4.681.581, US 4.735.210, US 5.101.827, US 5.102.990 (US RE35.500), US 5.648.471 e US 5.697.902. Por exemplo, um radioisótopo pode ser conjugado por um método da cloramina T.
[00758] Os radionuclídeos vantajosos nos contextos de diagnóstico são isótopos de índio e no contexto de aplicações terapêuticas isótopos de ítrio, que são citotóxicos. Os radioisótopos que emitem fóton, no geral, são vantajosos em métodos de diagnóstico (radioimunocintigrafia (RIS)). Os elétrons Auger têm um caminho de comprimento muito curto (5 a 10 nm) e necessitam ser internalizados para serem citotóxicos (ver por exemplo Adelstein et al., Nucl. Med. Biol. 14, 165-169 (1987)). Conseqüentemente, os peptídeos conjugados a tais isótopos podem ser úteis em métodos de diagnóstico, mas apenas peptídeos que são internalizados devem ser considerados para radioisótopos que emitem elétrons Auger em contextos terapêuticos. As partículas alfa necessitam estar próximos de uma célula (dentro de 3 a 4 diâmetros celulares) para serem eficazes como agentes terapêuticos (Vriesendorp et al., “Radioimmunoglobulin therapy,” em High Dose Cancer Therapy Armitage et al., (eds). (Williams & Wilkins, Baltimore, Md. 1992)). Tanto os elétrons Auger quanto os emissores alfa podem ser considerados ter alta seletividade porque a sua emissão de faixa curta tipicamente não irradiará as células normais vizinhas.
[00759] Os radiometais 111In e 80Y são, respectivamente, um emissor Y puro e um emissor β puro. O Iodo-125, o emissor mais habitualmente usado de elétrons Auger, tem uma meia-vida de cerca de 60 dias e freqüentemente é liberado por imunoconjugados in vivo (devido à desalogenação). Os emissores alfa mais habitualmente considerados para o uso clínico, astatina-211 e bismuto-212, têm meias-vidas relativamente curtas (7,2 h e 1,0 h, respectivamente) e o enfraquecimento em isótopos radioativos que não podem ser retidos pelo imunoconjugado depois da primeira emissão alfa (Wilbur, Antibiot. Immunoconjug. Radiopharm. 4, 5-97 (1991)). Para aplicações de diagnóstico, CD38BPs rotulados com índio-111 ou tecnécio-99m podem ser usados. Ambos destes isótopos emitem raios gama dentro da faixa de energia apropriada para a formação de imagem, (100-250 keV). As energias abaixo desta faixa tipicamente não são penetrantes o bastante para atingir um dispositivo de formação de imagem externo. Níveis de energia mais altos são difíceis de colimar e fornece imagens de diagnóstico com resolução deficiente. A meia vida curta do 99Tc tipicamente restringe o seu uso para imunoconjugados com captação de tumor rápida.
[00760] Em uma forma de realização, os primeiro e segundo CD38BPs conjugados com os primeiro e segundo radioisótopos são fornecidos. Em uma outra forma de realização, um único CD38BP conjugado com dois radioisótopos é fornecido. Uma vantagem de usar dois radioisótopos separados, por exemplo, um para a formação de imagem e um para terapia, é que isto facilita o tratamento do paciente de ambulatório. A quantidade baixa de radioatividade usada diagnosticamente não representa um perigo de radiação, enquanto que a radiação emitida por um isótopo terapêutico, tal como um emissor β puro, tipicamente será amplamente absorvido na vicinidade das células alvejadas.
[00761] Os radioisótopos podem ser ligados direta ou indiretamente a um CD38BP. Os radioisótopos 125I, 131I, 99Tc, 186Re e 188Re podem ser, por exemplo, covalentemente ligados às proteínas (incluindo anticorpos) através de grupos funcionais de aminoácido. Para o iodo radioativo o mesmo é usualmente através do grupo fenólico encontrado na tirosina. Existem numerosos métodos para realizar isto: cloramina-T (ver por exemplo Greenwood et al., Biochem J. 89, 114-123 (1963) e Iodogen (Salacinski et al., Anal. Biochem. 117, 136-146 (1981)). Isótopos de Tc e Re podem ser covalentemente ligados através do grupo sulfidrila de cisteína (ver por exemplo Griffiths et al., Cancer Res. 51, 4594-4602 (1991)). Entretanto, tais composições podem ser relativamente melhor adaptadas com propósitos de diagnóstico visto que o corpo freqüentemente pode romper estas ligações covalentes, liberando os radioisótopos para o sistema circulatório.
[00762] Um CD38BP também pode ser rotulado com enzimas que são úteis para a detecção, tais como rábano peroxidase, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase e outros. Um CD38BP também pode ser rotulado com biotina e conseqüentemente detectado através da medição indireta da ligação de avidina ou estreptavidina. Um CD38BP também pode ser rotulado com um epítopo de polipeptídeo pré determinado reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, rótulos de epítopo, etc.). Os exemplos adicionais de candidatos de conjugado de enzima incluem malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, esteróide delta-V isomerase, levedura álcool desidrogenase, α- glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, asparaginase, glicose oxidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glicoamilase e acetilcolinesterase.
[00763] As porções de rotulação exemplares adicionais no geral incluem, mas não são limitadas a moléculas rotuladas com spin e outras porções de rotulação de valor em diagnóstico.
[00764] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece derivados de CD38BP reticulados. Por exemplo, uma tal derivado de CD38BP pode ser produzido pela reticulação de dois ou mais anticorpos, pelo menos um dos quais é específico/seletivo para CD38 (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Os reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos reativos distintos separados por um espaçador apropriado (por exemplo, o éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ou homobifuncional (por exemplo, suberato de dissuccinimidila). Tais ligadores são disponíveis da Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.
[00765] Os CD38BPs também podem ser conjugados com qualquer tipo adequado de grupo químico, tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metila ou etila ou um grupo carboidrato. Estes e outros grupos conjugados adequados podem ser usados para melhorar as características biológicas do CD38BP, por exemplo, para aumentar a meia-vida sérica, a solubilidade e/ou a ligação de tecido.
[00766] Os derivados de CD38BP podem ser produzidos conjugando- se quimicamente um radioisótopo, proteína ou outro agente/porção/composto (a) ao lado do terminal N ou lado do terminal C do CD38BP ou subunidades deste (por exemplo, uma cadeia de anticorpo anti-CD38 H, cadeia L ou fragmentos específicos/seletivos anti-CD38 destes) um grupo substituinte apropriado ou cadeia lateral ou (b) uma cadeia de açúcar no CD38BP (ver, por exemplo, Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Os derivados também podem ser gerados pela conjugação em resíduos internos ou açúcares, onde apropriado.
[00767] Os CD38BPs também podem ser derivatizados com um agente de detecção, por exemplo compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1- naftalenossulfonila, lantanídeos fosforescentes e outros. Os exemplos adicionais de rótulos fluorescentes adequados incluem um rótulo de 125Eu, um rótulo de isotiocianato, um rótulo de fcoeritrina, um rótulo de ficocianina, um rótulo de aloficocianina, um rótulo de o-ftaldeído, um rótulo de fluorescamina, etc. Os exemplos de rótulos quimioluminescentes incluem rótulos luminais, rótulos isoluminal, rótulos de éster de acridínio aromático, rótulos de imidazol, rótulos de sal de acridínio, rótulos de éster de oxalato, um rótulo de luciferina, rótulos de luciferase, rótulos de Equorina, etc.
[00768] Em uma forma de realização, um derivado de CD38BP que compreende um ácido nucleico conjugado ou molécula associada a ácido nucleico. Em uma tal faceta da presente invenção, o ácido nucleico conjugado é uma ribonuclease citotóxica. Em uma forma de realização, o ácido nucleico conjugado é um ácido nucleico de anti-sentido (por exemplo uma molécula de anti-sentido alvejada a S100A10, que também pode ser um componente independente em uma composição de combinação ou método de administração de combinação da presente invenção - ver por exemplo Zhang et al., J Biol Chem. 279(3), 2053-62 (2004)). Em uma forma de realização, o ácido nucleico conjugado é uma molécula de RNA inibitória (por exemplo, uma molécula de siRNA). Em uma forma de realização, o ácido nucleico conjugado é um ácido nucleico imunoestimulador (por exemplo, uma molécula de DNA contendo motivo de CpG imunostimulador). Em uma forma de realização, o ácido nucleico conjugado é um cassete de expressão que codifica a expressão de um gene supressor de tumor, vacina anticâncer, citocina anticâncer ou agente apoptótico. Tais derivados também podem compreender a conjugação de um ácido nucleico que codifica a expressão de uma ou mais proteínas citotóxicas, tais como toxinas vegetais e bacterianas.
[00769] Em uma forma de realização, um CD38BP é conjugado a uma molécula de ácido nucleico funcional. Os ácidos nucleicos funcionais incluem moléculas de anti-sentido, moléculas de ácido nucleico interferentes (por exemplo, moléculas de siRNA), aptâmeros, ribozimas, moléculas que formam triplex e seqüências guia externas. As moléculas de ácido nucleico funcionais podem atuar como simuladores, inibidores, moduladores e estimuladores de uma atividade específica possuída por uma molécula alvo ou as moléculas de ácido nucleico funcionais podem possuir uma atividade de novo independente de qualquer outra molécula. Uma amostra representativa de métodos e técnicas que ajudam no planejamento e uso de moléculas de anti-sentido podeser encontrada na seguinte lista não limitante de Patentes US: US 5.135.917, US 5.294.533, US 5.627.158, US 5.641.754, US 5.691.317, US 5.780.607,US 5.786.138, US 5.849.903, US 5.856.103, US 5.919.772, US 5.955.590,US 5.990.088, US 5.994.320, US 5.998.602, US 6.005.095, US 6.007.995,US 6.013.522, US 6.017.898, US 6.018.042, US 6.025.198, US 6.033.910,US 6.040.296, US 6.046.004, US 6.046.319 e US 6.057.437.
[00770] Em uma forma de realização, um CD38BP é conjugado a um aptâmero. Os aptâmeros são moléculas que interagem com uma molécula alvo, por exemplo em uma maneira específica. Tipicamente os aptâmeros são ácidos nucleicos pequenos que variam de 15 a 50 bases no comprimento que se dobram em estruturas secundárias e terciárias definidas, tais como haste- alças ou quartetos G. Os aptâmeros podem ligar moléculas pequenas, tais como ATP (US 5.631.146) e teofilina (US 5.580.737), assim como moléculasgrandes, tais como a transcriptase reversa (US 5.786.462) e trombina (US 5.543.293). Os exemplos representativos de como fabricar e usar aptâmeros para ligar uma variedade de moléculas alvo diferentes podem ser encontrados na seguinte lista não limitante das patentes US: US 5.476.766, US 5.503.978,US 5.631.146, US 5.731.424, US 5.780.228, US 5.792.613, US 5.795.721,US 5.846.713, US 5.858.660, US 5.861.254, US 5.864.026, US 5.869.641,US 5.958.691, US 6.001.988, US 6.011.020, US 6.013.443, US 6.020.130,US 6.028.186, US 6.030.776 e US 6.051.698.
[00771] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que é conjugado a uma ribozima. As ribozimas são moléculas de ácido nucleico que são capazes de catalisar uma reação química, intramolecular ou intermolecularmente. As ribozimass são assim ácidos nucleicos catalíticos. Existem vários tipos diferente de ribozimas que catalisam as reações tipo nuclease ou polimerase de ácido nucleico que são fundamentados nas ribozimas encontradas em sistemas naturais, tais como (a) as ribozimas de cabeça de martelo, (descritas por exemplo nas US 5.334.711,US 5.436.330, US 5.616.466, US 5.633.133, US 5.646.020, US 5.652.094,US 5.712.384, US 5.770.715, US 5.856.463, US 5.861.288, US 5.891.683,US 5.891.684, US 5.985.621, US 5.989.908, US 5.998.193, US 5.998.203,WO 9858058, WO 9858057 e WO 9718312), (b) as ribozimas de grampo de cabelo (descritas por exemplo nas US 5.631.115, US 5.646.031, US 5.683.902, US 5.712.384, US 5.856.188, US 5.866.701, US 5.869.339 e US 6.022.962) e (c) as ribozimas de tetraimena (descritas por exemplo nas US 5.595.873 e US 5.652.107). Existem também várias ribozimas que não são encontradas em sistemas naturais, mas que foram engendradas para catalisar reações específicas de novo (exemplos das quais são descritas por exemplo nas US 5.580.967, US 5.688.670, US 5.807.718 e US 5.910.408). As ribozimass tipicamente clivam substratos RNA ou DNA e mais habitualmente clivam substratos de RNA. As ribozimass tipicamente clivam substratos de ácido nucleico através do reconhecimento e ligação do substrato alvo com clivagem subseqüente. Este reconhecimento é freqüentemente fundamentado em grande parte em interações de pares de bases canônicas ou não canônicas. Esta propriedade torna as ribozimas particularmente bons candidatos para a clivagem específica de alvo de ácidos nucleicos porque o reconhecimento do substrato alvo está fundamentado na seqüência de substratos alvos. Os exemplos representativos de como fabricar e usar as ribozimas para catalisar uma variedade de reações diferentes podem ser encontrados na seguinte lista não limitante de patentes US: US 5.646.042, US 5.693.535, US 5.731.295, US 5.811.300, US 5.837.855, US 5.869.253, US 5.877.021, US 5.877.022, US 5.972.699, US 5.972.704, US 5.989.906 e US 6.017.756.
[00772] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que é conjugado a um ácido nucleico com função formadora de triplex. Tais moléculas de ácido nucleico podem interagir com ácido nucleico de filamento duplo ou de filamento único. Quando as moléculas triplex interagem com uma região alvo, uma estrutura chamada de um triplex é formada, em que três filamentos de DNA formam um complexo dependente tanto do emparelhamento de Watson-Crick quanto de Hoogsteen. As moléculas triplex podem se ligar às regiões alvo com alta afinidade e especificidade. Os exemplos representativos de como fabricar e usar as moléculas que formam triplex para ligar uma variedade de moléculas alvo diferentes podem ser encontrados na seguinte lista não limitante de Patentes US: US 5.176.996, US 5.645.985, US 5.650.316, US 5.683.874, US 5.693.773, US 5.834.185, US 5.869.246, US 5.874.566 e US 5.962.426.
[00773] Em uma forma de realização, um CD38BP é conjugado a uma seqüência guia externa. As seqüências guias externas (EGSs) são moléculas que se ligam a uma molécula de ácido nucleico formando um complexo que é reconhecido pela RNase P, que cliva a molécula alvo. As EGSs podem ser planejadas para alvejar especificamente uma molécula de RNA de escolha. A RNAse P ajuda no processamento de RNA transferidor (tRNA) dentro de uma célula. A RNAse P bacteriana pode ser recrutada para clivar virtualmente qualquer seqüência de RNA pelo uso de um EGS que faz com que o complexo de RNA:EGS alvo imitem o substrato de tRNA natural (ver por exemplo a WO 92/03566 e Forster e Altman, Science 238, 407-409 (1990) para debate). Os exemplos representativos de como fabricar e usar moléculas de EGS para facilitar a clivagem de uma variedade de moléculas alvo diferentes são fornecidos na seguinte lista não limitante de Patentes US: US 5.168.053. US 5.624.824. US 5.683.873. US 5.728.521. US 5.869.248 e US 5.877.162.
[00774] Em uma forma de realização, um CD38BP é conjugado a uma molécula de ácido nucleico interferente, tal como um siRNA ou outra molécula de RNAi (por exemplo, uma molécula de RNA de filamento duplo (ds) inibidora de cerca de 20 a 25 nucleotídeos), que é alvejado para interferir com a ação de um produto de expressão do gene alvo, tal como um produto de expressão de gene envolvido em uma doença ou condição mediada por CD38. Os métodos para a produção e o uso de moléculas de ácido nucleico interferentes são fornecidos por exemplo em Nishikura, Cell. 107(4), 415-8 (2001), Fjose et al., Biotechnol Annu Rev. 7, 31-57 (2001), Hanon, Nature 418, 244-51 (2002), Brantl, Biochim Biophys Acta. 1575(1-3), 15-25 (2002), Tuschl, Chembiochem. 2(4), 239-45 (2001), Caplen, Expert Opin Blot Ther. 3(4), 575-86 (2003), Lu et al., Curr Opin Mol Ther. 5(3), 225-34 (2003), Shuey et al., Drug Discov Today. 7(20), 1040-6 (2002), Shi, Trends Genet. 19(1), 9-12 (2003), Kovar et al., Semin Cancer Biol. 13(4), 275-81 (2003), Lavrey et al., Curr Opin Drug Discov Devel. 6(4), 561-9 (2003), Clewey, Commun Dis Public Health. 6(2), 162-3 (2003), Duxbury et al., J Surg Res. 117(2), 339-44 (2004), Caplen et al., Ann N Y Acad Sci. 1002, 56-62 (2003), WO 01/75164, US 6.506.559, US 20040086884, US 20040077574, US 20040063654, US 20040033602, US 20030167490, US 20030157030, US 20030114409, US 20030108923, US 20040014113 e US 20020132788.
[00775] Em uma forma de realização, um CD38BP é conjugado a um peptídeo ou molécula de domínio que alveja tumor. Em uma forma de realização, um CD38BP é conjugado a uma seqüência de fator VII que alveja tumor.
[00776] Qualquer método conhecido na técnica para conjugar o CD38BP à(s) molécula(s) conjugada(s), tal como aqueles descritos acima, pode ser utilizado, incluindo aqueles métodos descritos por Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) e Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). A ligação/conjugação pode ser realizada em qualquer modo adequado. Por exemplo, uma ligação covalente pode tomar a forma de uma ligação de dissulfeto (se necessário e adequado, um CD38BP pode ser engendrado para conter um códon de cisteína extra, que desejavelmente não interferem com a atividade de ligação de CD38 da molécula. Uma molécula de toxina, derivatizada com um grupo reativo de sulfidrila com a cisteína do CD38BP modificado, pode formar um imunoconjugado com o peptídeo de CD38BP. Alternativamente, um grupo sulfidrila pode ser introduzido diretamente a um CD38BP usando técnicas de polipeptídeo de fase sólida. Por exemplo, a introdução de grupos sulfidrila em peptídeos é descrita por Hiskey, Peptides 3, 137 (1981). A introdução de grupos sulfidrila em proteínas está descrito em Maasen et al., Eur. J. Biochem. 134, 32 (1983). Uma vez que os grupos sulfidrila corretos estão presentes, a citotoxina e CD38BP podem ser purificados, ambos os grupos de enxofre reduzidos; a citotoxina e o ligando misturados (por exemplo em uma razão de cerca de 1:5 a 1:20); e a formação da ligação de sulfidrila possibilitou que se processasse até a conclusão (no geral de cerca de 20 a 30 minutos) na temperatura ambiente. A mistura pode ser depois dialisada contra solução salina tamponada com fosfato ou submetida à cromatografia em uma resina tal como Sephadex para remover moléculas de ligando e toxina rearranjadas.
[00777] Numerosos tipos de compostos citotóxicos podem ser unidos às proteínas através do uso de um grupo reativo no composto citotóxico ou através do uso de um agente de reticulação. Um grupo reativo comum que formarão uma ligação covalente estável in vivo com uma amina é o isotiocianato (Means et al., Chemical Modifications of Proteins (Holden-Day, San Francisco 1971) pp. 105-110). Este grupo preferencialmente reage com o grupo ε-amina da lisina. A maleimida é um grupo reativo habitualmente usado para formar uma ligação covalente in vivo estável com o grupo sulfidrila na cisteína (Ji., Methods Enzymol 91, 580-609 (1983)). Os anticorpos monoclonais tipicamente são incapazes de formar ligações covalentes com íons radiometálicos, mas estes podem ser ligados ao anticorpo indiretamente através do uso de agentes queladores que são covalentemente ligados aos anticorpos. Os agentes queladores podem ser ligados através de aminas (Meares et al., Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984)) e grupos sulfhidral (Koyama, Chem. Abstr. 120, 217262t (1994)) de resíduos de aminoácido e também através de grupos de carboidrato (Rodwell et al., PNAS USA 83, 2632-2636 (1986), Quadri et al., Nucl. Med. Biol. 20, 559-570 (1993)). Visto que estes agentes queladores contêm dois tipos de grupos funcionais, um para ligar íons metálicos e o outro para unir o quelato ao anticorpo, eles são habitualmente aludidos como agentes queladores bifuncionais (Sundberg et al., Nature 250, 587-588 (1974)).
[00778] Os agentes reticuladores que têm dois grupos funcionais reativos são classificados como sendo homo ou heterobifuncionais. Os exemplos de agentes de reticulação homobifuncionais incluem bismaleimidoexano (BMH) que é reativo com grupos sulfidrila (Chen et al., J Biol Chem 266, 18237-18243 (1991)) e etileno glicolbis[succinato de succinimidila] (EGS) que é reativo com grupos amino (Browning et al., J. Immunol. 143, 1859-1867 (1989)). Um exemplo de um reticulador heterobifuncional é o éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBS) (Myers et al., J. Immunol. Meth, 121, 129-142 (1989)). Estas metodologias são simples e são habitualmente utilizados.
[00779] Um agente terapêutico ou de diagnóstico também ou alternativamente pode ser ligado na região de dobradiça de um componente de anticorpo reduzido por intermédio da formação de ligação de dissulfeto. Como uma alternativa, tais peptídeos podem ser ligados ao componente de anticorpo usando um reticulador heterobifuncional, tal como 3-(2- piridilditio)proprionato de N-succinila (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer 56, 244 (1994). As técnicas gerais para tal conjugação são bem conhecidas no ramo. Ver, por exemplo, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation And Cross-Linking (CRC Press 1991), Upeslacis et al., “Modification of Antibodies by Chemicals Methods,” Em Monoclonal Antibodies: Principles And Applications, Birch et al., (eds.) (Wiley-Liss, Inc. 1995), Price, “Production and Characterization of Synthetics Peptide-Derived Antibodies,” em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering And Clinical Application, Ritter et al., (eds.) (Cambridge University Press 1995).
[00780] Em algumas formas de realização, rótulos ou outros substituintes conjugados são ligados à seqüência de aminoácido de CD38BP pelos braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.
[00781] O(s) CD38BP(s) não rotulado(s) podem ser usados em combinação com outros anticorpos rotulados (anticorpos secundários) que são reativos com o(s) CD38BP(s), tais como os anticorpos específicos para as regiões constantes de imunoglobulina humana que se ligam ao mAbs anti- CD38. Alternativamente, um CD38BP pode ser diretamente rotulado. Uma ampla variedade de rótulos pode ser utilizada para a rotulação direta ou indireta de CD38BPs, tal como a rotulação com radionuclídeos, fluorescentes, enzimas, substratos de enzima, cofatores de enzima, inibidores de enzima, ligandos (particularmente haptenos), etc.
[00782] As inserções de seqüência de aminoácido incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila variando no comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo uma centena ou mais resíduos, assim como inserções intrasseqüência de resíduos de aminoácido únicos ou múltiplos. Os exemplos de inserções de terminal incluem um anticorpo com um resíduo de metionila no terminal N ou o anticorpo fundido a um rótulo de epítopo. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão aos términos N ou C do anticorpo de uma enzima ou um polipeptídeo ou PEG que aumenta a meia- vida sérica do anticorpo. Tais proteínas de fusão de anticorpo anti-CD38 e proteínas de fusão similares que compreendem seqüências de CD38BP são uma outra característica da presente invenção.
[00783] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece moléculas que compreendem um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 humano, da presente invenção conjugado a uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, um medicamento quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisótopo. Tais conjugados são aqui aludidos como “imunoconjugados”. Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são aludidos como “imunotoxinas”.
[00784] Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja nocivo (por exemplo, que mate) as células. Para uma descrição destas classes de medicamentos que são bem conhecidos na técnica e seus mecanismos de ação, ver Goodman et al., Goodman e Gilman’s The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8a Ed., Macmillan Publishing Co., 1990. As técnicas adicionais relevantes para a preparação de imunotoxinas de anticorpo são fornecidas por exemplo em Vitetta, Immunol. Today 14, 252 (1993) e US 5.194.594.
[00785] Os agentes terapêuticos adequados para formar imunoconjugados da presente invenção incluem taxol, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, coichicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, actinomicina D, 1- desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina, antimetabolitos (tais como metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracila, decarbazina, hidroxiuréia, asparaginase, gencitabina, cladribina), agentes alquilantes (tais como mecloretamina, tioepa, clorambucila, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados da platina, tais como carboplatina), antibióticos (tais como dactinomicina (antigamente actinomicina), bleomicina, daunorrubicina (antigamente daunomicina), doxorrubicina, idarrubicin, mitramicina, calicheamicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), toxina da difteria e moléculas relacionadas (tais como cadeia A da difteria e fragmentos ativos desta e moléculas híbridas), toxina da ricina (tal como ricina A ou uma toxina da cadeia de ricina A desglicosilada), toxina da cólera, uma toxina equivalente a Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina da coqueluche, toxina do tétano, inibidor da protease de Bowman-Birk da soja, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modeccina, gelanina, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa- sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da momordica charantia, curcina, crotina, inibidor da saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina e toxinas da enomicina. Os agentes terapêuticos, que podem ser administrados em combinação com um CD38BP da presente invenção como descrito aqui em outro lugar, também podem ser candidatos para porções terapêuticas úteis para a conjugação a um CD38BP da presente invenção. Por exemplo, a porção medicamentosa pode ser uma proteína ou polipeptídeo que possua uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento ativo destes, tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria; uma proteína tal como fator de necrose de tumor ou interferon-Y; ou, modificadores de resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulador de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF), fator estimulador de colônia de granulócito (G-CSF) ou outros fatores de crescimento e proteína indutora apoptóptica isolada de mitocôndria.
[00786] Em uma forma de realização, o agente citotóxico é calicheamicina, 90Y, 125I e 131I.
[00787] Outros exemplos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas a um CD38BP da presente invenção incluem calicheamicinas e duocarmicinas. Como indicado acima, a porção medicamentosa não precisa ser interpretada como limitada aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção medicamentosa pode ser uma proteína ou polipeptídeo que possua uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, um agente ativo na superfície celular, tal como enzimas de fosfolipase, por exemplo, fosfolipase C.
[00788] A porção lisadora de uma toxina tipicamente pode ser facilmente unida ao fragmento Fab de um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção. Outras moléculas conjugadas adequadas incluem ribonuclease (RNase), DNase 1, enterotoxina estafilocócica A, proteína antiviral da erva-dos-cancros, toxina da difteria e endotoxina de Pseudomonas. Ver, por exemplo, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) e Goldenberg, Calif. A Câncer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). As toxinas adicionais adequadas para o uso na presente invenção são conhecidas por aqueles de habilidade na técnica (ver por exemplo a US 6.077.499).
[00789] Conjugados de CD38BPs, tais como os anticorpos e tais porções citotóxicas podem ser fabricados usando uma variedade de agentes de ligação de proteína bifuncionais. Os exemplos de tais reagentes incluem SPDP, IT, derivados bifuncionais de imidoésteres um tal adipimidato de dimetila HCl, ésteres ativos tais como suberato de dissuccinimidila, aldeídos tais como glutaraldeído, compostos de bis-azido tais como bis (p- azidobenzoil) hexanodiamina, derivados de bis-diazônio tais como bis-(p- diazoniobenzoil)-etilenodiamina, diisocianatos tais como 2,6-diisocianato de tolileno e compostos de flúor bis-ativos tais como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina, vinblastina, docetaxel, paclitaxel e vinorelbina).
[00790] As técnicas para conjugar tais porções terapêuticas aos CD38BPs, tais como os anticorpos, são bem conhecidas, ver por exemplo Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985), Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987), Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, em Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985), “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeles Antibody In Cancer Therapy”, em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62, 119-58 (1982).
[00791] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que é conjugado a uma toxina misturada. Uma molécula de toxina misturada é uma molécula derivada de duas toxinas diferentes (tipicamente polipeptídeo). No geral, as toxinas de peptídeo compreendem um ou mais domínios responsáveis pela ligação de célula eucarióptica generalizada, pelo menos um domínio enzimaticamente ativo e pelo menos um domínio de translocação. Os domínios de ligação e translocação são requeridos para o reconhecimento de célula e entrada de toxina respectivamente. As proteínas que ocorrem naturalmente que são conhecidas por terem um domínio de translocação incluem a toxina da difteria, a exotoxina A de Pseudomonas e possivelmente outras toxinas de peptídeo. Os domínios de translocação da toxina da difteria e a exotoxina A de Pseudomonas são bem caracterizadas (ver por exemplo Hoch et al., PNAS USA 82, 1692 (1985), Colombatti et al., J. Biol. Chem. 261, 3030 (1986) e Deleers et al., FEBS Lett. 160, 82 (1983)) e a existência e localização de um tal domínio em outras moléculas podem ser determinadas pelos métodos tais como aqueles utilizados por Hwang et al., Cell 48, 129 (1987) e Gray et al., PNAS USA 81 2645 (1984). Em vista destas técnicas, uma molécula híbrida de toxina misturada útil pode ser formada, por exemplo, fundindo-se a subunidade A enzimaticamente ativa da toxina equivalente a Shiga de E. coli (Calderwood et al., PNAS USA 84, 4364 (1987)) ao domínio de translocação (resíduos de aminoácido 202 até 460) da toxina da difteria e a uma molécula que alveja um tipo de célula particular, como descrito na US 5.906.820. A porção alvejadora do híbrido de três partes pode fazer com que a molécula se ligue especificamente às células alvejadas e a porção de translocação da toxina da difteria pode atuar para inserir a subunidade A enzimaticamente ativa da toxina equivalente a Shiga em uma célula alvejada. A porção enzimaticamente ativa da toxina equivalente a Shiga, como a toxina da difteria, atua no mecanismo da síntese de proteína da célula para impedir a síntese de proteína, matando assim a célula alvejada.
[00792] Os imunoconjugados de acordo com a presente invenção também podem compreender um radioisótopo, por exemplo, iodo-131, ítrio- 90 ou índio-111, para gerar produtos radiofarmacêuticos para tratar um distúrbio relacionado com o CD38, tal como mieloma múltiplo.
[00793] Em uma forma de realização, os CD38BPs, tais como os anticorpos humanos da presente invenção são ligados a um quelador ligador, por exemplo, tiuxetan, que permite que o anticorpo seja conjugado a um radioisótopo.
[00794] Adicionalmente, os substituintes conjugados úteis incluem retinóides anticâncer. Conjugados de taxano (ver por exemplo Jaime et al., Anticancer Res. 21(2A), 1119-28 (2001), conjugados de cisplatina, conjugados de tapsigargina, conjugados de ácido linoléico, conjugados de calicheamicina (ver por exemplo Damle et al., Curr Opin Pharmacol. 3(4), 386-90 (2003), conjugados de doxorrubicina, conjugados de geldanamicina e outros, também podem ser úteis na promoção do tratamento de câncer (ver, no geral, Trail et al., Cancer Immunol Immunother. 52(5), 328-37 (2003)).
[00795] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece anticorpo secundários e anti-idiotípicos incitados contra anticorpos anti-CD38 da presente invenção. Um anticorpo secundário refere-se a um anticorpo específico para e tipicamente incitado contra, um anticorpo anti-CD38. Um anticorpo anti-idiotípico (Id) é um anticorpo que reconhece determinantes únicos no geral associados com o sítio de ligação de antígeno de um anticorpo. Um anticorpo Id pode ser preparado imunizando-se um animal da mesma espécie e tipo genético como a fonte de um mAb anti-CD38 com o mAb ao qual um anti-Id está sendo preparado. O animal imunizado tipicamente pode reconhecer e responder aos determinantes idiotípicos do anticorpo imunizante pelos quais produzem um anticorpo para estes determinantes idiotípicos (o anticorpo anti-Id). Tais anticorpos são descritos por exemplo na US 4.699.880. Tais anticorpos são ainda características da presente invenção.
[00796] Um anticorpo anti-Id também pode ser usado como um “imunógeno” para induzir uma resposta imune mesmo em um outro animal, que produzem um chamado anticorpo anti-anti-Id. Um anti-antiId pode ser epitopicamente idêntico ao mAb original, que induziu o anti-Id. Assim, pelo uso de anticorpos aos determinantes idiotípicos de um mAb, é possível identificar outros clones que expressem anticorpos de especificidade idêntica. Os anticorpos anti-Id podem ser variados (produzindo deste modo variantes de anticorpo anti-Id) e/ou derivatizados por qualquer técnica adequada, tais como aquelas descritas aqui em outro lugar com respeito a anticorpos anti- CD38 e outros CD38BPs da presente invenção. Por exemplo, os mAbs anti-Id podem ser ligados a um carreador tal como hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH) e usados para imunizar camundongos BALB/c. Os soros destes camundongos tipicamente conterão anticorpos anti-anti-Id que têm as propriedades de ligação similares se não idênticas a um anticorpo de CD38 original/precursor.
[00797] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um ácido nucleico que codifica um CD38BP. Um ácido nucleico que codifica CD38BP pode ter qualquer característica adequada e compreendem qualquer característica adequada ou combinação destas. Assim, por exemplo, um ácido nucleico que codifica CD38BP pode estar na forma de DNA, RNA ou um híbrido destes e pode incluir bases que não ocorrem naturalmente, uma estrutura modificada (por exemplo, uma estrutura de fosfotioato que promove a estabilidade do ácido nucleico) ou ambas. O ácido nucleico vantajosamente compreendendo as características que promovem a expressão, replicação e/ou seleção na(s) célula(s) hospedeira(s) alvo desejadas. Os exemplos de tais características incluem um componente de origem de replicação, um componente de gene de seleção, um componente promotor, um componente de elemento realçador, uma componente de seqüência de poliadenilação, um componente de terminação e outros.
[00798] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica CD38BP. Um vetor refere-se a um veículo de liberação que promove a expressão de um ácido nucleico que codifica CD38BP, a produção de um peptídeo de CD38BP, a transfecção/transformação de células alvos, a replicação do ácido nucleico que codifica CD38BP, promove a estabilidade do ácido nucleico, promove a detecção do ácido nucleico e/ou células transformadas/transfectadas ou de outro modo estabelecido comunica função biológica vantajosa ao ácido nucleico que codifica CD38BP. Um vetor no contexto da presente invenção pode ser qualquer vetor adequado, incluindo vetores de ácido nucleico de cromossoma, não cromossoma e sintéticos (uma seqüência de ácido nucleico que compreende um conjunto adequado de elementos de controle de expressão). Os exemplos de tais vetores incluem derivados de SV40, plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago e vetores de ácido nucleico viral (RNA ou DNA). Em uma forma de realização, um ácido nucleico que codifica CD38BP é compreendido em um vetor DNA ou RNA nu, incluindo, por exemplo, um elemento de expressão linear (como descrito por exemplo em Sykes e Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), um vetor de ácido nucleico compactado (como descrito por exemplo na US 6.077.835 e/ou WO 00/70087), um vetor plasmídico tal como pBR322, pUC 19/18 ou pUC 118/119, um vetor de ácido nucleico de tamanho minimamente “midge” (como descrito por exemplo em Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)) ou como uma construção de vetor de ácido nucleico precipitado, tal como uma construção precipitada com CaPO4 (como descrito por exemplo na WO 00/46147, Benvenisty e Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978) e Coraro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Tais vetores de ácido nucleico e o uso destes são bem conhecidos na técnica (ver por exemplo a US 5.589.466 e US 5.973.972).
[00799] Em uma forma de realização, o vetor é adequado para a expressão do CD38BP em uma célula bacteriana. Os exemplos de tais vetores incluem, por exemplo, vetores que direcionam a expressão de proteínas de fusão de alto nível que são facilmente purificadas (por exemplo clonagem de E. coli multifuncional e os vetores de expressão tais como BlueScript (Stratagene), vetores pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 55035509 (1989), vetores pET (Novagen, Madison WI) e outros).
[00800] Um vetor de expressão também ou alternativamente pode ser um vetor adequado para a expressão em um sistema de levedura. Qualquer vetor adequado para a expressão em um sistema de levedura pode ser utilizado. Os vetores adequados para o uso por exemplo na Saccharomyces cerevisiae incluem, por exemplo, vetores que compreendem promotores constitutivos ou indutíveis tais como o fator alfa, a álcool oxidase e PGH (revisada em: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience Nova Iorque (1987) e Grant et al, Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
[00801] Um ácido nucleico e/ou vetor também podem compreender uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma seqüência de secreção/localização, que pode alvejar um polipeptídeo, tal como uma cadeia de polipeptídeo nascente, a um compartimento celular desejado, membrana ou organela ou que direciona a secreção de polipeptídeo para o espaço periplásmico ou no meio de cultura celular. Tais seqüências são conhecidas na técnica e incluem líder de secreção ou peptídeos de sinal, as seqüências que alvejam organela (por exemplo, seqüências de localização nuclear, sinais de retenção de ER, seqüências de trânsito de mitocondria, seqüências de trânsito de cloroplasto), seqüências de localização/âncora de membrana (por exemplo, seqüências de transferência de parada, seqüências de âncora de GPI) e outras.
[00802] Os ácidos nucleicos que codificam CD38BP podem compreender ou estar associados com qualquer promotor, realçador e outros elementos que facilitem a expressão adequados. Os exemplos de tais elementos incluem promotores de expressão fortes (por exemplo, promotor/realçador de CMV IE humano assim como promotores de RSV, SV40, SL3-3, MMTV e HIV LTR), seqüências de terminação poli (a) eficazes, uma origem de replicação para o produto de plasmídeo na E. coli, um gene de resistência a antibiótico como marcador selecionável e/ou um sítio de clonagem conveniente (por exemplo, um poliligador). Os ácidos nucleicos também podem compreender um promotor indutível como oposto a um promotor constitutivo tal como CMV IE (o técnico habilitado reconhecerá que tais termos são de fato descritores de um grau de expressão de gene sob certas condições).
[00803] Em uma forma de realização, o ácido nucleico pode ser posicionado e/ou liberado à célula hospedeira ou animal hospedeiro por intermédio de um vetor viral. Qualquer vetor viral adequado podem ser usado a este respeito e diversos são conhecidos na técnica. Um vetor viral pode compreender qualquer número de polinucleotídeos virais, sozinhos ou em combinação com uma ou mais proteínas virais, que facilitam a liberação, replicação e/ou expressão do ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira desejada. O vetor viral pode ser um polinucleotídeo que compreende todo ou parte de um genoma viral, uma proteína viral/ácido nucleico conjugado, uma partícula semelhante a vírus (VIP), um vetor similar àqueles descritos na US 5.849.586 e WO 97/04748 ou uma partícula viral intacta que compreende ácidos nucleicos virais e o ácido nucleico da presente invenção. Um vetor viral de partícula viral pode compreender uma partícula viral do tipo selvagem ou uma partícula viral modificada. O vetor viral pode ser um vetor que requeira a presença de um outro vetor ou vírus do tipo selvagem para a replicação e/ou expressão (isto é, este pode ser um vírus dependente de auxiliar), tais como um amplicon viral de adenovetor. Tipicamente, tais vetores virais consistem essencialmente de uma partícula viral do tipo selvagem ou uma partícula viral modificada na sua proteína e/ou teor de ácido nucleico para aumentar a capacidade de transgene ou ajudar na transfecção e/ou expressão do ácido nucleico (os exemplos de tais vetores incluem o vírus do herpes/ amplicons AAV). Tipicamente, um vetor viral é similar a e/ou derivado de um vírus que normalmente infecta seres humanos. As partículas virais de vetor adequadas a este respeito, incluem, por exemplo, partículas de vetor adenovirais (incluindo qualquer vírus de ou derivado de um vírus do adenoviridae), as partículas virais de vetor adeno-associadas (partículas de vetor AAV) ou outras partícula de vetor de parvovírus e parvovirais, partículas de vetor papilomavirais, vetores flavivirais, vetores alfavirais, vetores virais do herpes, vetores do vírus da varíola, vetores retrovirais, incluindo vetores lentivirais. Os exemplos de tais vírus e vetores virais estão por exemplo, em Fields et al., eds., Virology Raven Press, Ltd., Nova Iorque (3a ed., 1996 e 4a ed., 2001), Encyclopedia of Virology, R. G. Webster et al., eds., Academic Press (2a ed., 1999), Fundamental Virology, Fields et al., eds., Lippincott-Raven (3a ed., 1995), Levine, “Viruses,” Scientific American Library No 37 (1992), Medical Virology, D. O. White et al., eds., Acad. Press (2a ed. 1994) e Introduction to Modern Virology, Dimock, N. J. et al., eds., Blackwell Scientific Publications, Ltd. (1994).
[00804] Os vetores virais que podem ser utilizados com os polinucleotídeos da presente invenção e os métodos aqui descritos incluem adenovírus e vetores adeno-associados, como por exemplo em Carter, Curr Opinion Biotech 3, 533-539 (1992) e Muzcyzka, Curr Top Microbiol Immunol 158, 97-129 (1992). Os tipos e aspectos adicionais de vetores AAV são descritos por exemplo em Carter, Contrib. Microbiol. 4, 85-86 (2000), Smith-Arica, Curr. Cardiol. Rep. 3(1), 41-49 (2001), Taj, J. Biomed. Sci. 7(4), 279-91 (2000), Vigna et al., J. Gene Med. 2(5), 308-16 (2000), Klimatcheva et al., Front. Biosci. 4, D481-96 (1999), Lever et al., Biochem. Soc. Trans. 27(6), 841-47 (1999), Snyder, J Gene Med. 1(3), 166-75 (1999), Gerich et al., Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 5(2), 118-23 (1998) e During, Adv. Drug Deliv. Review 27(1), 83-94 (1997) e US 4.797.368, US 5.139.941, US 5.173.414, US 5.614.404, US 5.658.785, US 5.858.775 e US 5.994.136). Os vetores virais adeno-associados podem ser construídos e/ou purificados usando os métodos apresentados, por exemplo, na US 4.797.368 e Laughlin et al., Gene 23, 65-73 (1983).
[00805] Um outro tipo de vetor viral que pode ser utilizado com polinucleotídeos e métodos da presente invenção é um vetor papilomaviral. Os vetores papilomavirais adequados são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Hewson, Mol Med Today 5(1), 8 (1999), Etapahens, Biochem J. 248(1), 1-11 (1987) e US 5.719.054. Os exemplos de vetores papilomavirais são fornecidos por exemplo em WO 99/21979. Os vetores de alfavírus podem ser vetores de liberação de gene em outros contextos. Os vetores de alfavírus são conhecidos na técnica e descritos por exemplo em Carter, Curr Opinion Biotech 3, 533-539 (1992), Muzcyzka, Curr Top Microbiol Immunol. 158, 97-129 (1992), Schlesinger, Expert Opin Biol Ther. 1(2), 177-91 (2001), Polo et al., Dev Biol (Basel). 104, 181-5 (2000), Wahlfors et al., Gene Ther. 7(6), 472-80 (2000), Colombage et al., Virology. 250(1), 151-63 (1998) e WO 01/81609, WO 00/39318, WO 01/81553, WO 95/07994 e WO 92/10578.
[00806] Um outro grupo de vetores virais são vetores virais do herpes. Os exemplos de vetores virais do herpes são descritos por exemplo em Lachmann et al., Curr Opin Mol Ther 1(5), 622-32 (1999), Fraefel et al., Adv Vírus Res. 55, 425-51 (2000), Huard et al., Neuromuscul 7(5), 299-313 (1997), Glorioso et al., Annu Rev Microbiol. 49, 675-710 (1995), Latchman, Mol Biotechnol. 2(2), 179-95 (1994) e Frenkel et al., Gene Ther. 1 (Supl 1), S40-6 (1994), assim como US 6.261.552 e US 5.599.691.
[00807] Os vetores retrovirais, incluindo vetores lentivirais, também podem ser veículos de liberação de gene vantajosos em contextos particulares. Existem numerosos vetores retrovirais conhecidos na técnica. Os exemplos de vetores retrovirais são descritos por exemplo em Miller, Curr Top Microbiol Immunol 158, 1-24 (1992), Salmons e Gunzburg, Human Gene Therapy 4, 129-141 (1993), Miller et al., Methods in Enzvmology 217, 581-599 (1994), Weber et al., Curr Opin Mol Ther. 3(5), 439-53 (2001), Hu et al., Pharmacol Rev. 52(4), 493-511 (2000), Kim et al., Adv Virus Res. 55, 545-63 (2000), Palu et al., Rev Med Virol. 10(3), 185-202 (2000) e Takeuchi et al., Adv Exp Med Biol. 465, 23-35 (2000), assim como US 6.326.195, US 5.888.502, US 5.580.766 e US 5.672.510.
[00808] Os vetores adenovirais também podem ser vetores virais adequados para a transferência de gene. Os vetores adenovirais são bem conhecidos na técnica e descritos por exemplo em Graham et al, Mol Biotechnol 33(3), 207-220 (1995), Etapahenson, Clin Diagn Virol 10(2-3), 187-94 (1998), Jacobs, Clin Sci (Lond). 85(2), 117-22 (1993), US 5.922, 576, US 5.965.358 e US 6.168.941 e WO98/22588, WO98/56937, WO99/15686, WO99/54441 e WO00/32754. Os vetores adenovirais, vetores virais do herpes e vetores virais de Sindbis, úteis na prática da presente invenção, são descritos por exemplo em Jolly Cancer Gene Terapia 1, 51-64 (1994), Latchman Malec Biotechnol 2, 179-195 (1994) e Johanning et al., Nucl Acids Res 23, 1495-1501 (1995).
[00809] Outros vetores virais adequados incluem vetores virais da varíola. Os exemplos de tais vetores são debatidos por exemplo na Berencsi et al., J Infect Dis 183(8), 1171-9 (2001), Rosenwirth et al., Vaccine 19(13-14), 1661-70 (2001), Kittlesen et al., J Immunol 164(8), 4204-11 (2000), Brown et al., Gene Ther 7(19), 1680-9 (2000), Kanesa-thasan et al., Vaccine 19(4-5), 483-91 (2000), Sten, Drua 60(2), 249-71 (2000). Os vetores virais da varíola podem ser vetores do vírus da varíola. Os exemplos de tais vetores e usos destes são fornecidos por exemplo em Venugopal et al., Res Vet Sci 57(2), 188-193 (1994), Moss Dev Biol Stand 82, 55-63 (1994), Weisz et al., Mol Cell Biol 43, 137-159 (1994), Mahr e Payne, Immunobiology 184(2-3), 126146 (1992), Hruby, Clin Microbiol Rev 3(2), 153-170 (1990) e WO92/07944, WO98/13500 e WO89/08716.
[00810] Outras características da presente invenção incluem células recombinantes, tais como células de levedura, bacterianas e de mamífero (por exemplo, células de mamífero imortalizadas) que compreendem um tal ácido nucleico, vetor ou combinações de cada um ou ambos destes. Por exemplo, em uma forma de realização, a presente invenção fornece uma célula que compreende um ácido nucleico estavelmente integrada no genoma celular que compreende uma seqüência que codifica a expressão de um CD38BP da presente invenção. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece uma célula que compreende um ácido nucleico não integrado, tal como um plasmídeo, cosmídeo, fagomídeo ou elemento de expressão linear, que compreende uma seqüência que codifica a expressão de um CD38BP.
[00811] A presente invenção também fornece peptídeos imunogênicos que compreendem qualquer uma das porções de determinante antigênico descritas acima de CD38 específicas para os CD38BPs da presente invenção, tais como as porções de determinante antigênico de CD38 específicas para - 003 e -005 e -024. Tais imunógenos podem ser usados para evocar uma resposta imune direta em um método que compreenda um regime de imunoterapia ativa. A presente invenção fornece ainda uma proteína de fusão que compreende um tal imunógeno de CD38 e uma seqüência de parceiro de fusão que melhore a meia-vida da proteína de fusão (por exemplo, pela inclusão de uma seqüência de domínio de imunoglobulina); facilita a detecção e/ou purificação da proteína de fusão (compreendendo, por exemplo, uma seqüência de peptídeo fluorescente, uma seqüência de enzima repórter, um rótulo de epítopo, uma seqüência de hexa-histidina ou semelhante); promove o alvejamento da proteína de fusão (por exemplo, compreendendo um ligando ou porção de um ligando específica quanto a um receptor on uma célula alvo); promove a indução de uma resposta imune distinta (por exemplo, corresponde a um antígeno canceroso ou um fragmento imunogênico destes); é um agente citotóxico; ou alcança qualquer combinação destes (por exemplo, um parceiro de proteína de fusão de choque térmico pode aumentar uma resposta imune gerada contra uma porção de antígeno não similar, heterólogo de uma proteína de fusão, enquanto também aumenta a meia-vida in vivo de uma proteína de fusão). As proteínas de fusão também podem compreender um ou mais sítios de clivagem, particularmente entre domínios.
[00812] As variantes de tais peptídeos e derivados de tais peptídeos imunogênicos ou variantes de peptídeo imunogênicas são características adicionais da presente invenção (por exemplo, tais derivados de peptídeo imunogênicos de CD38 podem ser modificados pela ligação química, fusão genética, associação não covalente e outros, a outras entidades moleculares tais como os anticorpos, toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos ou agentes citostáticos). Os mimítopos de peptídeo, que compreendem epítopos de seqüência de CD38 também podem, por exemplo, ser úteis como candidatos a vacina. Tais peptídeos também podem ser úteis na purificação de anticorpos anti-CD38. Além das seqüências de epítopo de célula B aqui descritas, tais peptídeos podem ser engendrados ou selecionados para compreender também ou alternativamente um ou mais epítopos de célula T anti-CD38. Tais epítopos podem ser identificados por qualquer técnica adequada conhecida no ramo (por exemplo, pelas aplicações de software de prognóstico de epítopo de célula T).
[00813] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um ácido nucleico que codifica um tal peptídeo imunogênico. Um tal ácido nucleico pode ser liberado a um hospedeiro em um vetor adequado, tal como um vetor alvejado deficiente de replicação (por exemplo, um vetor de ácido nucleico alvejado ou um vetor de adenovírus alvejado deficiente de replicação). A presente invenção também fornece composições de um ou mais de tais peptídeos imunogênicos e/ou ácidos nucleicos que codificam peptídeo imunogênico.
[00814] Os CD38BPs da presente invenção incluem CD38BPs “neutralizantes”, tais como anticorpos neutralizantes. Os termos “CD38BP neutralizante” e “anticorpo neutralizante” referem-se a um CD38BP ou um anticorpo que é capaz de inibir ou eliminar substancialmente uma atividade biológica de um peptídeo associado a CD38. Tipicamente, um CD38BP neutralizante, tal como um anticorpo neutralizante anti-CD38, pode inibir, direta ou indiretamente, a função de CD38, tal como a atividade enzimática, transdução de sinal, indução da expressão de citocina, indução da proliferação ou diferenciação ou indução da lise, em um grau que é de cerca de igual ou maior do que a inibição de tais células devido à administração de uma quantidade aproximadamente igual de -003 ou -005 ou -024.
[00815] Um CD38BP da presente invenção pode ter qualquer afinidade e/ou avidez adequadas quanto a um ou mais epítopos contidos pelo menos parcialmente no CD38. A afinidade se refere à força de ligação do CD38BP a um tal epítopo. Tipicamente, a afinidade é medida pela constante de dissociação Kd, definida como [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag] onde [Ab-Ag] é a concentração molar do complexo de anticorpo-antígeno (ou o complexo de CD38BP-antígeno), [Ab] é a concentração molar do anticorpo não ligado (ou CD38BP) e [Ag] é a concentração molar do antígeno não ligado. A constante de afinidade Ka é definida por 1/Kd. Os métodos adequados para determinar a especificidade e a afinidade pela inibição competitiva podem ser encontrados por exemplo em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan et al., eds., Current Protocols em Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley InterScience N.Y., (1992, 1993) e Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601 (1983).
[00816] Um CD38BP e particularmente anticorpos anti-CD38 da presente invenção podem ter uma afinidade por pelo menos um epítopo pelo menos parcialmente compreendido no CD38 na faixa de cerca de 104 a cerca de 1010 M-1. O termo imunorreagir aqui tipicamente se refere à ligação de um CD38BP a um epítopo de CD38 com uma constante de dissociação Kd mais baixa do que cerca de 10-4 M.
[00817] Um CD38BP pode ter uma afinidade que é pelo menos tão grande quanto o CD38 como -003 e -005 e -024 e em algumas formas de realização têm uma afinidade que é pelo menos de cerca de tão grande quanto -003 e -005 e -024. A afinidade pode ser determinada por qualquer um dos métodos aqui descritos em outro lugar ou seus equivalentes conhecidos na técnica. Um exemplo de um método que pode ser usado para determinar a afinidade é fornecido na análise Scatchard de Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980). A afinidade de ligação também pode ser determinada pelos métodos de equilíbrio (por exemplo ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou radioimunoensaio (RIA)) ou análise cinética (por exemplo análise BIACORE®).
[00818] Tipicamente, a constante de dissociação para os CD38BPs, tais como o anticorpos anti-CD38, da presente invenção é menor do que cerca de 100 nM, menor do que cerca de 50 nM, menor do que cerca de 10 nM, cerca de 5 nM ou menos, cerca de 1 nM ou menos, cerca de 0,5 nM ou menos, cerca de 0,1 nM ou menos, cerca de 0,01 nM ou menos ou ainda cerca de 0,001 nM ou menos.
[00819] Os CD38BPs, tais como os anticorpos anti-CD38, da presente invenção podem exibir características funcionais similares como -003 e -005 e -024, tal como pode ser determinado pela citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e ensaios de citotoxicidade mediada por complemento (CDC) (ver por exemplo a US 5500362).
[00820] Em uma forma de realização, um peptídeo de acordo com a presente invenção não atua como um agonista de CD38, mas como um antagonista de CD38. Um agonista de CD38 é uma molécula, que ativa uma ou mais das funções atribuídas ao CD38. Tais funções podem incluir a mediação de receptor nos eventos de adesão e sinalização e atividade (ecto-) enzimática. Além disso, como uma ectoenzima, CD38 usa NAD + como substrato para a formação de ADP-ribose cíclica (cADPR) e ADPR, mas também de nicotinamida e ácido nicotínico-adenina dinucleotídeo fosfato (NAADP). cADPR mostrou atuar como segundo mensageiro para a mobilização de Ca2+ do retículo endoplasmático. Além da sinalização por intermédio de Ca2+, a sinalização de CD38 ocorre por intermédio da conversa cruzada com complexos de antígeno-receptor em células T e B ou outros tipos de complexos de receptor, por exemplo, as moléculas MHC e está deste modo envolvido em diversas respostas celulares, mas também na comutação e secreção de IgG1.
[00821] Em uma forma de realização, um peptídeo de acordo com a presente invenção não induz a proliferação significante de PBMCs. Em uma forma de realização, um peptídeo de acordo com a presente invenção não induz a liberação de níveis significantes de IL-6. Em uma forma de realização, um peptídeo de acordo com a presente invenção não induz a liberação de níveis detectáveis de IFN-Y- Tais ensaios podem ser medidos como descrito em Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000).
[00822] Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção, assim como outros CD38BPs da presente invenção, podem ser preparados pela expressão recombinante em qualquer tipo adequado de células ou animais.
[00823] Os CD38BPs recombinantes, tais como anticorpos recombinantes, tais como anticorpos recombinantes humanos, incluem CD38BPs, tais como os anticorpos, tais como os anticorpos humanos que são preparados, expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como os CD38BPs, tais como os anticorpos, tais como os anticorpos humanos expressados usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira.
[00824] Os anticorpos recombinantes, tais como anticorpos humanos recombinantes também incluem anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano recombinante, combinatória, anticorpos isolados de um animal, tal como um animal transgênico ou anticorpos preparados, expressados, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a união de seqüências de ácido nucleico que codificam a imunoglobulina humana a outras seqüências de ácido nucleico exógenos para os ácidos nucleicos que codificam a imunoglobulina humana e genes que codificam a imunoglobulina humana. Os anticorpos humanos recombinantes tipicamente têm regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certas formas de realização, entretanto, tais anticorpos recombinantes humanos são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para as seqüências de Ig humana é usado, a mutagênese somática in vivo) e, assim, as seqüências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes podem ser seqüências que, embora derivadas de e relacionadas com as seqüências VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha germinativa de anticorpo humano in vivo. Ambos os tipos de anticorpos humanos são fornecidos pela presente invenção.
[00825] Os métodos adequados para a produção de proteína recombinante são conhecidos na técnica, ver por exemplo (Sambrook e Russell (eds.), Molecular cloning, terceira edição, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, USA.
[00826] Do mesmo modo, os métodos adequados para a produção de anticorpo são conhecidos na técnica e incluem aqueles descrito por exemplo em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988), Harlow e Lane: Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)), US 4.376.110 e Ausubel et al., eds., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley InterScience N.Y., (1987, 1992). Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados usando o método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) ou por outros métodos bem conhecidos, subseqüentemente desenvolvidos (ver, por exemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59103 (Academic Press, 1986)). Hibridomas úteis na produção de anticorpos anti-CD38 da presente invenção também são fornecidos pela presente invenção. Tais hibridomas podem ser formados pela fusão química, fusão elétrica ou qualquer outra técnica adequada, com qualquer tipo adequado de célula de mieloma, heteromieloma, foblastóide, plasmacitoma ou outros equivalentes destes e qualquer tipo adequado de célula que expressa anticorpo. As células B imortalizadas transformadas também podem ser usadas para produzir eficientemente anticorpos da presente invenção e também são fornecidos pela presente invenção. Tais células podem ser produzidas pelas técnicas padrão, tais como a transformação com um Vírus Epstein Barr ou um gene transformador. (Ver, por exemplo, “Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity,” Zurawaki, V. R. et al., em Monoclonal Antibodies, ed. por Kennett R. H. et al., Plenum Press, N.Y. 1980, pp 19-33.). Assim, anticorpo anti-CD38 estável e contínuo e/ou imortalizado que expressa células e linhagens de célula são uma característica da presente invenção. As células eucariópticas e procariópticas (por exemplo, células de levedura, as linhagens de célula de mamífero contínuas e/ou imortalizadas (por exemplo, linhagens de célula derivadas de célula que produzem que produzem anticorpo linfóide), células vegetais, células de inseto e células bacterianas tais como células de E. coli, etc.) que compreendem ácidos nucleicos que codificam CD38BP ou que codificam fragmento de CD38BP são fornecidos pela presente invenção. Os animais transgênicos, tais como primatas não humanos, roedores (por exemplo, hamsters, porcos da Índia - incluindo cepas modificadas destes tais como camundongos imunodeficientes combinados graves (SCID) e outras cepas de animal imunocomprometido), cães, etc., que expressem anticorpos anti-CD38 humanos da presente invenção também são fornecidos pela presente invenção.
[00827] As células recombinantes que compreendem ácidos nucleicos exógenos que codificam CD38BPs podem ser preparadas por qualquer técnica adequada (por exemplo, transfecção/transformação com um vetor de plasmídeo de DNA nu, vetor viral, vetor de célula bacteriana invasiva ou outro vetor de célula inteira, etc., que compreende uma seqüência que codifica CD38BP (ou seqüências) liberadas na célula pela transfecção facilitada pela precipitação com fosfato de cálcio, alvejamento e transfecção mediada por receptor, liberação biolística, eletroporação, transfecção mediada com dextrano, transformação mediada por lipossoma, fusão de protoplasto, microinjeção direta, etc.). Os métodos de transformar/transfectar células são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2a Edição, 1989 e 3a Edição, 2001) e F. Ausubel et al., ed. Current Protocols em Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience Nova Iorque (1987). Tais células recombinantes são uma característica da presente invenção.
[00828] As linhagens de célula disponíveis como hospedeiros para a expressão de proteína recombinante são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens de célula imortalizadas disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC). Estes incluem, inter alia, células do ovário do hamster chinês (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células renais do hamster bebê (BHK), células renais de macaco (COS), células do carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), As células A549 e várias outras linhagens de célula. Outras linhagens de célula que podem ser usadas são linhagens de célula de inseto, tais como células Sf9. Quando ácidos nucleicos (ou vetores contendo ácido nucleico) que codificam proteínas, tais como CD38BPs (incluindo anticorpos anti-CD38), são introduzidos nas células hospedeiras de mamífero, proteínas, tais como CD38BPs, podem ser produzidas cultivando-se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão da proteína, tal como um CD38BP, nas células hospedeiras ou pela secreção da proteína, tal como um CD38BP, no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os CD38BPs podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrão. Os CD38BPs também podem ser recuperados a partir de lisados de célula hospedeira quando diretamente expressados sem um sinal secretor.
[00829] Os CD38BPs, tais como os anticorpos anti-CD38, também podem ser produzidos nas células bacterianas e microorganismos unicelulares eucarióticos, tais como levedura. Os CD38BPs produzidos pelas células bacterianas, tais como os anticorpos anti-CD38, tipicamente carecem da glicosilação normal e os anticorpos anti-CD38 produzidos pela célula bacteriana podem ser assim mais ou menos deficientes em termos de funções ADCC e outros aspectos da resposta imune associada com anticorpos anti- CD38 produzidos em células de mamífero e/ou animais (por exemplo, o recrutamento de células NK). Os CD38BPs produzidos pela célula de levedura, tais como os anticorpos anti-CD38 normalmente exibem tipos diferentes de padrões de glicosilação do que os anticorpos produzidos em células de mamífero. Entretanto, os métodos para produzir anticorpos com glicosilação eficaz em levedura estão correntemente sendo desenvolvidos pelas companhias tais como Glicofi, Inc. (Lebanon, NH, USA). Ver também Wildt S et al., Nat Rev Microbiol. 3(2), 119-28 (2005).
[00830] Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de CD38BP (incluindo genes de anticorpo antiCD38) são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os CD38BPs são produzidos cultivando- se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do CD38BP nas células hospedeiras ou para a secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivados. A purificação de anticorpos e outros CD38BPs de culturas celulares, lisados celulares e animais (por exemplo, do fluído de ascites de um animal transgênico que produz anticorpos anti-CD38) pode ser obtida pela aplicação de qualquer número de técnicas adequadas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, purificação em coluna de imunoafinidade; precipitação com sulfate; cromatofocalização; SDS-PAGE preparativa e outros.
[00831] Os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção também podem ser produzidos por uma variedade de outras técnicas, incluindo a metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein, Nature 256, 495 (1975). Outras técnicas para produzir anticorpo monoclonal também pode ser utilizada, por exemplo, técnicas de demonstração de fago usando bibliotecas de genes de anticorpo humano. Em uma forma de realização, os anticorpos anti-CD38 da presente invenção produzido pelo uso de hibridomas gerados em um sistema de murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos de imunização e técnicas para a isolação de esplenócitos imunizados para a fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.
[00832] Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para CD38, camundongos transgênicos ou transcromossômicos contendo genes da imunoglobulina humana (por exemplo, camundongos HCo12, HCo7 ou KM) podem ser imunizados com uma preparação enriquecida de antígeno de CD38 e/ou células que expressam CD38, como descrito, por exemplo, por Lonberg et al., (1994), supra, Fishwild et al., (1996), supra e WO 98/24884. Alternativamente, os camundongos podem ser imunizados com DNA que codifica o CD38 humano. Os camundongos podem ser de 6 a 16 semanas de idade na primeira infusão. Por exemplo, uma preparação enriquecida (5 a 50 μ g) do antígeno de CD38 pode ser usada para imunizar os camundongos HuMAbs intraperitonealmente. No evento de que as imunizações usando uma preparação purificada ou enriquecida do antígeno de CD38 não resulta em anticorpos, os camundongos também podem ser imunizados com células que expressam CD38, por exemplo, uma linhagem de célula, para promover respostas imunes.
[00833] A experiência acumulativa com vários antígenos tem mostrado que os camundongos transgênicos HuMAbs respondem melhor quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (i.p.) ou subcutaneamente (s.c.) com células que expressam CD38 em adjuvante de Freund completo, seguido por imunizações i.p. semana sim semana não (até um total de 10) com células que expressam CD38 em PBS. A resposta imune pode ser monitorada no curso do protocolo de imunização com amostras plasmáticas sendo obtidas pelas sangrias retroorbitais. O plasma pode ser triado pela análise de FACS e camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-CD38 podem ser usados para fusões. Os camundongos podem ser reforçados intravenosamente com células que expressam CD38 por exemplo 4 e 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço.
[00834] Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos ao CD38 humano, esplenócitos e células de linfonodo de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos a uma linhagem de célula imortalizada apropriada, tal como uma linhagem de célula de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser depois triados para a produção de anticorpos específicos de antígeno. Por exemplo, suspensões de célula única de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem ser fundidas às células de mieloma de camundongo SP2/0 não secretoras (ATCC, CRL 1581) com 50 % de PEG (p/v). As células podem ser plaqueadas em aproximadamente 1 x 105 por reservatório em placa de microtítulo de fundo chato, seguido por uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo além dos reagentes usuais 10 % de Soro de Clone fetal, 5 a 10 % de fator de clonagem de hibridoma origen (IGEN) e 1 x HAT (Sigma). Depois de aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em meio em que o HAT é substituído com HT. Os reservatórios individuais podem ser depois triados pelo ELISA quanto aos anticorpos contendo cadeia leve capa humana e pela análise de FACS usando células que expressam CD38 quanto a especificidade de CD38. Uma vez que o crescimento de hibridoma extensivo ocorra, o meio pode ser observado usualmente depois de 10 a 14 dias. Os hibridomas que secretam anticorpo podem ser replaqueados, triados mais uma vez e se ainda positivos quanto à IgG humana, os anticorpos anti-CD38 monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes pela diluição limitante. Os subclones estáveis podem ser depois cultivados in vitro para gerar anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.
[00835] Os anticorpos humanos da presente invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene como é bem conhecido na técnica, ver por exemplo Morrison, S., Science 229, 1202 (1985).
[00836] Por exemplo, para expressar os anticorpos ou fragmentos de anticorpo destes, os DNAs que codificam cadeias leves e pesadas parciais ou de tamanho natural, podem ser obtidos pelas técnicas da biologia molecular padrão (por exemplo amplificação pela PCR, mutagênese direcionada ao sítio) e podem ser inseridos nos vetores de expressão tal que os genes sejam operativamente ligados às seqüências de controle transcricional e traducional. Neste contexto, o termo “operativamente ligado” é intencionado a significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor tal que as seqüências de controle transcricional e traducional dentro do vetor sirvam para a sua função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle de expressão são escolhidas para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridas em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo podem ser inseridos no vetor de expressão pelos métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene do anticorpo e ligação de vetor ou extremidade abrupta se nenhum sítio de restrição estiver presente). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos aqui descritos podem ser usados para criar genes de anticorpo de tamanho natural de qualquer isótipo de anticorpo inserindo-os nos vetores de expressão que já codificam as regiões constantes de cadeia pesada e constantes de cadeia leve do isótipo desejado tal que o segmento VH seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) CH dentro do vetor e o segmento VL seja operativamente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinal que facilite a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o peptídeo de sinal seja ligado na matriz ao término amino do gene da cadeia de anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína que não da imunoglobulina).
[00837] Além dos genes da cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da presente invenção carregam seqüências reguladoras que permitem e controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira.
[00838] Além dos genes da cadeia de anticorpo e das seqüências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da presente invenção podem carregar seqüências adicionais, tais como as seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver por exemplo a US 4.399.216, US 4.634.665 e US 5.179.017). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência aos medicamentos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem o gene da diidrofoliato redutase (DHFR) (para o uso nas células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação pelo metotrexato) e o gene neo (para a seleção de G418).
[00839] Para a expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias pesada e leve é/são transfectado(s) em uma célula hospedeira pelas técnicas padrão. As células hospedeiras podem ser procariópticas ou eucariópticas, tais como células hospedeiras de mamífero. Por exemplo, os fragmentos de ligação de antígeno podem ser expressados em células hospedeiras procariópticas e anticorpos de tamanho natural podem ser expressados em células hospedeiras eucariópticas.
[00840] Em uma forma de realização os anticorpos são expressados em células eucariópticas, tais como células hospedeiras de mamífero. Os exemplos de células hospedeiras de mamífero para expressar os anticorpos recombinantes da presente invenção incluem células CHO (incluindo células dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, PNAS USA 77, 4216-4220 (1980), usadas com um marcador selecionável DHFR, por exemplo como descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp, Mol. Biol. 159, 601-621 (1982)), as células de mieloma NS/0, células COS, células HEK293 e células SP2,0. Em particular para o uso com as células de mieloma NS/0, um outro exemplo de um sistema de expressão é o sistema de expressão de gene de GS (glutamina sintetase) divulgado na WO87/04462, WO89/01036 e EP338 841.
[00841] Os genes de CD38BP podem ser expressados em outros sistemas de expressão, incluindo células procariópticas, tais como microorganismos, por exemplo, E. coli para a produção de anticorpos de scFv, algas, assim como células de inseto. Além disso, os CD38BPs podem ser produzidos em animais não humanos transgênicos, tais como no leite de ovelhas e coelhos ou ovos de galinhas ou em plantas transgênicas. Ver por exemplo Verma, R. et al., J. Immunol. Meth. 216, 165-181 (1998), Pollock et al., J. Immunol. Meth. 231, 147-157 (1999) e Fischer, R. et al., Biol.Chem. 380, 825-839 (1999).
[00842] Os CD38BPs biespecíficos e multiespecíficos da presente invenção podem ser fabricados usando técnicas químicas (ver por exemplo D. M. Kranz et al., PNAS USA 78, 5807 (1981)), técnicas de “polidoma” (Ver US 4,474,893) ou técnicas de DNA recombinante.
[00843] Os anticorpos biespecíficos da presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos incluindo a fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab’ (ver por exemplo Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321 (1990) e Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)). Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos está fundamentada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve da imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes (ver por exemplo Milstein e Cuello, Nature 305, 537 (1983)). Por causa da seleção aleatória de cadeias pesadas e leves da imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. Procedimentos similares são divulgados na WO 93/08829 e Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655 (1991).
[00844] De acordo com um método diferente, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpo-antígeno) são fundidos às seqüências do domínio constante da imunoglobulina pelos métodos recombinantes ou sintéticos. A seqüência de domínio variável é tipicamente fundida a um domínio constante de cadeia pesada da imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. Também tipicamente, uma primeira região constante de cadeia pesada (CH1), contendo o sítio necessário para a ligação de cadeia leve, também está presente em pelo menos um dos peptídeos de fusão. Em um mais exemplos específicos deste tipo de método, um anticorpo biespecífico é produzido compreendendo uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em uma braço e um par de cadeia pesada-cadeia leve da imunoglobulina híbrido (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Uma tal estrutura assimétrica pode facilitar a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina não desejadas (um tal método está descrito na WO 94/04690). Para mais detalhes da geração de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
[00845] Em um outro método, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser engendrada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura de célula recombinante de modo a formar uma população de moléculas de anticorpo biespecíficas. Tipicamente, uma tal interface compreendendo pelo menos uma parte do domínio CH3 de uma região constante de anticorpo. Normalmente em um tal método, um ou mais resíduos de aminoácido com cadeias laterais menores da interface das primeiras moléculas de anticorpo são substituídas com resíduos de aminoácido com cadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano). As “cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao(s) resíduo(s) de aminoácido de cadeia lateral grande são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo pela substituição de resíduos de cadeia lateral de aminoácido grande com os menores (tal como alanina ou treonina). Isto pode fornecer um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero em relação a outros produtos finais não desejados tais como homodímeros.
[00846] As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção podem ser preparadas pela conjugação das especificidades de ligação constituinte, por exemplo, as especificidades de constituinte ligação anti-FcR e anti-CD38, usando métodos conhecido na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica e multiespecífica pode ser gerada separadamente e depois conjugadas entre si. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de ligação ou reticulação pode ser usada para a conjugação covalente. Os exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N- succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5’-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) e 4-(N-maleimidometil)cicloexano-1-carboxilato de sulfossuccinimidila (sulfo-SMCC), ver por exemplo Karpovsky et al., J. Exp. Med. 160, 1686 (1984), Liu, M. A. et al., PNAS USA 82, 8648 (1985). Em um outro exemplo, Brennan et al., Science 229, 81 (1985) descreve um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab’)2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab’ gerados podem ser depois convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab’-TNB podem ser depois reconvertidos ao Fab’-tiol pela redução com mercaptoetilamina e misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab’-TNB para formar um anticorpo biespecífico. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula de anticorpo F(ab’)2 biespecífica totalmente humanizada, de acordo com uma técnica relacionada. Outros métodos incluem aqueles descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132 (1985)) e Glennie et al., J. Immunol. 139, 2367-2375 (1987). Os exemplos de agentes de conjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis da Pierce Chemicals Co. (Rockford, IL).
[00847] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estes podem ser conjugados por intermédio da ligação de sulfidrila das regiões de dobradiça do terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma forma de realização, a região de dobradiça é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, por exemplo um, antes da conjugação.
[00848] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressadas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particular útil onde a molécula biespecífica e multiespecífica é uma proteína de fusão de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2 ou ligando x Fab. Uma molécula biespecífica e multiespecífica da presente invenção, por exemplo, uma molécula biespecífica pode ser uma molécula de cadeia única, tal como um anticorpo de cadeia única biespecífica, uma molécula de cadeia única biespecífica que compreende um anticorpo de cadeia única e uma ligação determinante ou uma molécula de cadeia única biespecífica que compreende dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas e multiespecíficas também podem ser moléculas de cadeia única ou podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Os métodos para preparar moléculas bi- e multiespecíficas são descritas por exemplo na US 5.260.203, US 5.455.030, US 4.881.175, US 5.132.405, US 5.091.513, US 5.476.786, US 5.013.653, US 5.258.498 e US 5.482.858.
[00849] Várias técnicas para fabricar e isolar fragmentos de anticorpo biespecíficos diretamente da cultura de célula recombinante também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zípers de leucina (ver por exemplo Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 15471553 (1992)). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun podem ser ligados às porções Fab’ de dois anticorpos diferentes pela fusão de gene e os homodímeros de anticorpo resultantes reduzidos na região de dobradiça para formar monômeros que podem ser re-oxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. A tecnologia de “diacorpo” descrita por Hollinger et al., PNAS USA 90, 6444-6448 (1993) também tem fornecido um mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticorpo biespecíficos. Uma outra estratégia para fabricar fragmentos de anticorpo biespecíficos pelo uso de dímeros de Fv (sFv) de cadeia única também foi relatada. Ver por exemplo Gruber et al, J. Immunol. 152, 5368 (1994).
[00850] Além disso, os anticorpos biespecíficos podem ser formados como “diacorpos” (Holliger et al., PNAS USA, 90, 6444-6448 (1993)) ou “Janusins” (Traunecker et al., EMBO J 10, 3655-3659 (1991) e Traunecker et al., Int J Cancer Supl 7, 51-52 (1992)). Os anticorpos biespecíficos, pela definição, não existem na forma de fragmentos tendo um único sítio de ligação (por exemplo, fragmento Fab, Fab’ e Fvs, que também são fornecidos pela presente invenção).
[00851] A ligação das moléculas biespecíficas e multiespecíficas a seus alvos específicos pode ser confirmada pelo ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), análise de FACS, um bioensaio (por exemplo, inibição do crescimento) ou um Ensaio de Western Blot. Cada um destes ensaios no geral detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo de interesse particular pela utilização de um reagente rotulado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos de FcR-anticorpo podem ser detectado usando por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligados a enzima que reconheçam e especificamente se liguem aos complexos de anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados usando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser radioativamente rotulado e usado em um radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Março, 1986). O isótopo radioativo pode ser detectado por meios tais como o uso de um contador Y ou um contador de cintilação ou pela autorradiografia.
[00852] Como estabelecido mais no princípio, os anticorpos interagem com antígenos alvo primariamente através de resíduos de aminoácido que são localizados nas seis regiões determinadoras de complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). A presente invenção fornece anticorpos tendo regiões de CDR idênticas a ou de outro modo estabelecido derivadas das regiões de CDR de -003 ou -005 ou -024. Tais anticorpos podem ser gerados pela construção dos vetores de expressão que incluem seqüências de CDR de -003 ou -005 ou -024 enxertados nas seqüências de estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes.
[00853] Tais seqüências de estrutura podem ser obtidas a partir de bases de dados de DNA públicas que incluem as seqüências de gene de anticorpo da linha germinativa. Estas seqüências da linha germinativa diferirão das seqüências de gene de anticorpo maduras porque elas não incluirão completamente genes variáveis montados, que são formados pela união de V(D)J durante a maturação de célula B. as seqüências de gene da linha germinativa também diferirão das seqüências de um anticorpo de repertório secundário de afinidade alta que contém mutações por todo o gene variável mas tipicamente agrupado nas CDRs. Por exemplo, as mutações somáticas são relativamente infreqüentes na porção de terminal amino da região de estrutura 1 e na porção de terminal carbóxi da região de estrutura 4. Por esta razão, não é necessário obter a seqüência de DNA inteira de um anticorpo particular de modo a recriar um anticorpo recombinante inteiro tendo propriedades de ligação similares àquelas do anticorpo original (ver a WO 99/45962). A seqüência de cadeia pesada e leve parcial que vai das regiões de CDR é tipicamente suficiente para este propósito. A seqüência parcial é usada para determinar quais segmentos de gene variáveis e de união da linha germinativa contribuíram para os genes variáveis de anticorpo recombinados. A seqüência da linha germinativa é depois usada para preencher em porções das regiões variáveis perdidas. As seqüências líder de cadeia pesada e leve são clivadas durante a maturação da proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar seqüências perdidas, seqüências de cDNA clonadas podem ser combinadas com oligonucleotídeos sintéticos pela ligação ou amplificação de PCR. Alternativamente, a região variável inteira pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucleotídeos curtos, de sobreposição e combinada pela amplificação de PCR para criar um clone de região variável totalmente sintético. Este processo tem certas vantagens tais como a eliminação ou inclusão ou sítios de restrição particular ou otimização de códons particulares.
[00854] As seqüências de nucleotídeo de transcritos de cadeia pesada e leve de hibridomas são usados para planejar um conjunto de sobreposição de oligonucleotídeos sintéticos para criar seqüências V sintéticas com aminoácido idênticos que codificam as capacidades como as seqüências naturais. As seqüências de cadeia pesada e capa sintéticas podem diferir das seqüências naturais em três modos: fileiras de bases de nucleotídeo repetidas são interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleotídeo e amplificação de PCR; ótimos sítios de início de tradução são incorporados de acordo com as regras de Kozak (Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991); e os sítios HindIII são engendrados a montante dos sítios de início de tradução.
[00855] Tanto para a região variável de cadeia pesada quanto leve, as seqüências de filamento codificadoras e não codificadoras otimizadas correspondentes são quebradas abaixo dos nucleotídeos 30 a 50 aproximadamente no ponto intermediário do oligonucleotídeo codificador correspondente. Assim, para cada cadeia, os oligonucleotídeos podem ser montados em conjuntos de filamento duplo sobrepostos que transpõem segmentos de 150 a 400 nucleotídeos. Os agrupamentos são depois usados como padrões para produzir produtos de amplificação de PCR de 150 a 400 nucleotídeos. Tipicamente, um único oligonucleotídeo da região variável designada será decomposto em duas reuniões que são separadamente amplificados para gerar dois produtos de PCR de sobreposição. Estes produtos de sobreposição são depois combinados pela amplificação pela PCR para formar a região variávea. Também pode ser desejável incluir um fragmento de sobreposição da região constante de cadeia pesada ou leve (incluindo o sítio Bbsl da cadeia leve capa ou o sítio AgeI da cadeia pesada gama) na amplificação pela PCR para gerar fragmentos que possam ser facilmente clonada nas construções de vetor de expressão.
[00856] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve reconstruída são depois combinadas com as seqüências promotora, líder, de início de tradução, de região constante, não traduzida 3’, de poliadenilação e de término de transcrição, clonadas para formar construções de vetor de expressão. As construções de pesada e expressão de cadeia leve podem ser combinadas em um único vetor, co-transfectadas, transfectadas em série ou transfectadas separadamente em células hospedeiras que são depois fundidas para formar uma célula hospedeira que expresse ambas as cadeias.
[00857] Um procedimento similar pode ser seguido para enxertar novovas especificidades de antígeno em um anticorpo maduro existente. Tipicamente, um anticorpo aceitador é escolhido que origina do mesmo gene da linha germinativa variável como o doador de CDR-anticorpo, mas outros anticorpos aceitadores também podem ser escolhidos. Uma ou mais CDRs do anticorpo doador são depois transferidos usando as técnicas descritas acima.
[00858] Em uma forma de realização da presente invenção, as características estruturais de -003 e -005 e -024 são usadas para criar anticorpos anti-CD38 estruturalmente relacionados, por exemplo anticorpos anti-CD38 humano, que retém pelo menos uma propriedade funcional de -003 e -005 e -024, a saber que se liga ao CD38. Mais especificamente, uma ou mais regiões CDR de -003 ou -005 e -024 podem ser combinados recombinantemente com regiões de estrutura humana conhecidas e CDRs para criar anticorpos anti-CD38 adicionais, recombinantemente engendrados, humanos da presente invenção.
[00859] Os plasmídeos exemplares para o uso na construção dos vetores de expressão para IgGK humana são descritos abaixo. Os plasmídeos foram construídos de modo que as seqüências de cDNA de cadeia V capa pesada e V capa leve amplificadas pela PCR podem ser usadas para reconstruir os minigenes de cadeia pesada e leve completa. Estes plasmídeos podem ser usados para expressar completamente anticorpos IgG1.K ou IgG4.k humanos. Os plasmídeos similares podem ser construídos para a expressão de outros isótipos de cadeia pesada ou para a expressão de anticorpos que compreendem cadeias leves lambda.
[00860] Os CD38BPs da presente invenção, tais como anticorpos anti- CD38 humanos da presente invenção, podem ser isolados e caracterizados de vários modos diferentes. Por exemplo, hibridomas selecionados podem ser cultivados em frascos adequados para a purificação de anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser depois filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sepharose (para anticorpos de isótipo IgG1) (Pharmacia, Piscataway, NJ) ou sepharose ou proteína G- sepharose revestida com IgG anti-humano no caso de anticorpos de isótipo IgG3. A IgG eluída pode ser checada pela eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para garantir a pureza. A solução tampão pode ser trocada em PBS e a concentração pode ser determinada pela OD280 usando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.
[00861] Para determinar se os CD38BPs selecionados, tais como os anticorpos anti-CD38 monoclonais humanos, ligam-se a epítopos únicos, a mutagênese direcionada ao sítio ou direcionada ao sítio ao sítio múltiplo podem ser usadas.
[00862] Para determinar o isótipo de anticorpos purificados, ELISAs de isótipo podem ser realizadas. Os reservatórios de placas de microtítulo podem ser revestidos com 10 μ g/ml de Ig anti-humano durante a noite a 4°C. Depois de bloquear com 5 % de BSA (albumina sérica bovina), as placas são reagidas com 10 μ g/ml de anticorpos monoclonais ou controles de isótipo purificados, na temperatura ambiente por duas horas. Os reservatórios podem ser depois reagidos com IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, IgE, IgA1, IgA2 humanas ou sondas conjugadas à fosfatase alcalina específica de IgM humana. Depois da lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato de pNPP (1 mg/ml) e analisada pela OD a 405 nm.
[00863] De modo a demonstrar a presença de anticorpos anti-CD38 nos soros de camundongos imunizados ou a ligação de CD38BPs (incluindo anticorpos anti-CD38) às células vivas que expressam o CD38, a citometria de fluxo pode ser usada. Em resumo, linhagens de célula que expressem CD38 (cultivadas sob condições de crescimento padrão) são misturadas com várias concentrações de CD38BP em PBS contendo 0,1 % de BSA e 0,02 % de azida de sódio e incubadas a 4°C por 30 minutos. Depois da lavagem, as células são reagidas com anticorpo IgG anti-humano rotulado com fluoresceína sob as mesmas condições como o tingimento de anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas pela citometria de fluxo com um citômetro de fluxo (por exemplo, Becton Dickinson FACS instrument) usando propriedades de dispersão de luz e lateral para ativar células únicas, vivas. Um ensaio alternativo usando a microscopia por fluorescência pode ser usado (além do ou ao invés do) ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser tingidos exatamente como descrito acima e examinado pela microscopia de fluorescência. Este método possibilita a visualização de células individuais, mas pode ter sensibilidade diminuída dependendo da densidade do antígeno.
[00864] Os CD38BPs, tais como as IgGs anti-CD38 humanas, podem ser ainda testadas quanto a reatividade com antígeno de CD38 pelo Western blotting. Em resumo, os extratos de célula a partir de células que expressam CD38 podem ser preparados e submetidos à eletroforese em gel em dodecil sulfato de sódio (SDS) poliacrilamida. Depois da eletroforese, os antígenos separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com 20 % de leite desnatado e sondados com os CD38BPs a serem testados. A ligação de IgG humana pode ser detectada usando fosfatase alcalina de IgG anti-humana e desenvolvida com tabletes de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO), mas agentes de detecção direcionados a outras porções específicas do CD38BP também podem ser usados.
[00865] Além de ligar especificamente ao CD38, CD38BPs (incluindo anticorpos anti-CD38 humanos) podem ser testados quanto a sua capacidade para inibir várias atividades de células que expressam CD38, tais como mas não restritas à produção de insulina, liberação de Ca2+, produção de citocina, indução de lise, diferenciação e proliferação.
[00866] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece animais não humanos transgênicos e transcromossômicos, tais como camundongos transgênicos ou transcromossômicos, que são capazes de expressar anticorpos humanos que especificamente se ligam a CD38. Em uma forma de realização particular, a presente invenção fornece um camundongo transgênico ou transcromossômico tendo um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humana, tal que o camundongo produz anticorpos anti-CD38 humanos quando imunizados com células que expressam CD38. O transgene de cadeia pesada humana pode ser integrado no DNA cromossômico do camundongo, como é o caso para o camundongo transgênico, por exemplo, HuMAbs, como descrito em detalhes aqui. Alternativamente, o transgene de cadeia pesada humana pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para os camundongos transcromossômicos (por exemplo, KM) como descrito na WO 02/43478. Tais animais transgênicos e transcromossômicos são capazes de produzir isótipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos para CD38 (por exemplo, IgG, IgA e/ou IgE) submetendo-se à recombinação V-D-JN-J e comutação de isótopo. O planejamento de um animal não humano transgênico ou transcromossômico que responde à estimulação de antígeno estranho com um repertório de anticorpo heterólogo, requer que os transgenes de imunoglobulina heterólogos contidos dentro da função de animal transgênico corretamente por todo o caminho do desenvolvimento da célula B. Isto inclui, por exemplo, a comutação de isótopo do transgene de cadeia pesada heterólogo. Conseqüentemente, os transgenes são construídos de modo que a comutação de isótopo possa ser induzida e uma ou mais das seguintes características de genes de anticorpo: (1) expressão específica de alto nível e tipo de célula, (2) rearranjo de gene funcional, (3) ativação de e resposta à exclusão alélica, (4) expressão de um repertório primário suficiente, (5) transdução de sinal, (6) hipermutação somática e (7) dominação do local de anticorpo de transgene durante a resposta imune.
[00867] Nem todos os critérios precedentes precisam ser atingidos. Por exemplo, naquelas formas de realização em que os locais de imunoglobulina endógenos do animal transgênico são funcionalmente rompidos, o transgene não precisa ativar a exclusão alélica. Além disso, naquelas formas de realização em que o transgene que compreende um gene da imunoglobulina de cadeia pesada e/ou leve funcionalmente rearranjada, o segundo critério de rearranjo de gene funcional é desnecessário, pelo menos para aquele transgene que já está rearranjado. Para os fundamentos sobre imunologia molecular, ver, Fundamental Immunology, 2a edição (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.
[00868] Em certas formas de realização, os animais transgênicos ou transcromossômicos não humanos usados para gerar os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção contêm transgenes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve heterólogos rearranjados, não rearranjados ou uma combinação de rearranjado e não rearranjado na linha germinativa do animal transgênico. Cada um dos transgenes de cadeia pesada compreendendo pelo menos um gene CH. Além disso, o transgene de cadeia pesada pode conter seqüências comutadoras de isótipo funcional, que são capazes de suportar a comutação de isótopo de um transgene heterólogo que codifica genes CH múltiplos nas células B do animal transgênico. Tais seqüências comutadoras podem ser aquelas que ocorrem naturalmente no local da imunoglobulina da linha germinativa da espécie que serve como a fonte dos genes CH do transgene ou tais seqüência comutadoras podem ser derivadas daquelas que ocorrem na espécie que deva receber a construção de transgene (o animal transgênico). Por exemplo, uma construção de transgene humano que é usada para produzir um camundongo transgênico pode produzir uma freqüência mais alta de eventos de comutação de isótopo se estas seqüências comutadoras incorporam similar àquelas que ocorrem naturalmente no local de cadeia pesada de camundongo, como presumivelmente as seqüências comutadoras de camundongo são otimizadas para funcionar com o sistema de enzima da recombinase de comutação em camundongo, ao passo que as seqüências comutadoras humanas não são. As seqüência comutadoras podem ser isoladas e clonadas pelos métodos de clonagem convencionais ou podem ser sintetizados de novo a partir de oligonucleotídeos sintéticos de sobreposição planejados vom base na informação de seqüência publicada que dizem respeito às seqüências da região comutadora de imunoglobulina (Mills et al., Nucl. Acids Res. 15, 7305-7316 (1991) Sideras et al., Intl. Immunol. 1, 631-642 (1989)). Para cada um dos animais transgênicos precedentes, os transgenes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve heterólogos funcionalmente rearranjados são encontrados em uma fração significante das células B do animal transgênico (pelo menos 10 %).
[00869] Os transgenes usados para gerar os animais transgênicos não humanos da presente invenção incluem um transgene de cadeia pesada que compreende DNA que codifica pelo menos um segmento de gene variável, um segmento de diversidade de gene, um segmento de união de gene e pelo menos um segmento de gene da região constante. O transgene de cadeia leve da imunoglobulina que compreende DNA que codifica pelo menos um segmento de gene variável, um segmento de união de gene e pelo menos um segmento de gene da região constante. Os segmentos de gene que codificam os segmentos de gene da cadeia leve e pesada são heterólogos ao animal transgênico em que eles são derivados de ou correspondem ao DNA que codifica segmentos de gene de cadeia pesada e leve da imunoglobulina de uma espécie que não consiste do animal não humano transgênico. Em uma forma de realização da presente invenção, o transgene é construído tal que os segmentos de gene individuais não são rearranjados, isto é, não rearranjado de modo a codificar uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina funcional. Tais transgenes não rearranjados suportam a recombinação dos segmentos de gene V, D e J (rearranjo funcional) e podem suportar a incorporação de toda ou de uma porção de um segmento de gene da região D na cadeia pesada da imunoglobulina rearranjada resultante dentro do animal transgênico quando exposto ao antígeno de CD38.
[00870] Em uma forma de realização alternativa, os transgenes compreendem um “mini-local” não rearranjado. Tais transgenes tipicamente compreendem uma porção substancial dos segmentos C, D e J assim como um subconjunto dos segmentos de gene V. Em tais construções de transgene, as várias seqüências reguladoras, por exemplo, promotores, realçadores, regiões de comutação de classe, as seqüências doadoras de junção e aceitadoras de junção para o processamento de RNA, os sinais de recombinação e outros, compreendem seqüências correspondentes derivadas do DNA heterólogo. Tais seqüências reguladoras podem ser incorporadas no transgene da mesma ou de uma espécie relacionada do animal não humano usado na presente invenção. Por exemplo, segmentos de gene da imunoglobulina humana podem ser combinados em um transgene com uma seqüência realçadora de imunoglobulina de roedor para o uso em um camundongo transgênico. Alternativamente, as seqüências reguladoras sintéticas podem ser incorporadas no transgene, em que tais seqüências reguladoras sintéticas não são homólogas a uma seqüência de DNA funcional que é conhecida por ocorrer naturalmente nos genomas de mamíferos. As seqüências reguladoras sintéticas são planejadas de acordo com regras de consenso, tais como, por exemplo, aquelas que especificam as seqüências permissíveis de um sítio aceitador de junção ou um promotor/motivo realçador. Por exemplo, um minilocal que compreenda uma porção do local da imunoglobulina genâmica tendo pelo menos uma deleção interna (isto é, não em um terminal da porção) de uma porção de DNA não essencial (por exemplo, seqüência interventora; intron ou porção destes) quando comparada com o local de Ig da linha germinativa que ocorre naturalmente.
[00871] Os exemplos de animais não humanos transgênicos e transcromossômicos, tais como camundongos, exibirão a produção da imunoglobulina com um repertório significante, de modo idealmente substancial similar a esta de um ser humano depois de ajustar quanto ao volume.
[00872] O repertório idealmente aproximar-se-á daquele mostrado em um ser humano quando ajustado quanto ao volume, usualmente com uma diversidade de pelo menos cerca de 10 % tão grande, tal como 25 a 50 % ou mais.
[00873] No geral, pelo menos cerca de mil imunoglobulinas diferentes (idealmente IgG), tal como 104 a 106 ou mais, serão produzidas, dependendo do número de regiões V, J e D diferentes introduzidas no genoma de camundongo e direcionados pela diversidade adicional gerada pelos rearranjos de segmento de gene V(-D-)J e adições de nucleotídeo aleatórias nas regiões de junção. Tipicamente, as imunoglobulinas exibirão uma afinidade (KD) para antígenos pré-selecionados abaixo de 10-8 M, tal como abaixo de 10-9 M, 10-10 M ou 10-11 M ou ainda mais baixo. O animal não humano transgênico e transcromossômico, por exemplo, camundongos, como descritos acima, podem ser imunizados, por exemplo, com células que expressam CD38. Alternativamente, os animais transgênicos podem ser imunizados com DNA que codifica CD38 humano. Os animais depois produzirão células B que passam pela comutação de classe por intermédio da recombinação de comutação (comutação cis) e expressam imunoglobulinas reativas com CD38. As imunoglobulinas serão anticorpos humanos (também aludidos como “anticorpos da seqüência humana”), em que os polipeptídeos de cadeia pesada e leve são codificados pelas seqüências de transgene humanas, que podem incluir seqüências derivadas pela mutação somática e juntas recombinatoriais da região V, assim como seqüências codificadas pela linha germinativa; estes anticorpos humanos podem ser aludidos como sendo substancialmente idênticos a uma seqüência de polipeptídeo codificada por um segmento de gene VL e JL ou VH, DH e JH humanos, embora outras - seqüências que não da linha germinativa possam estar presentes como um resultado da mutação somática e juntas de recombinação V-J e V-D-J diferenciais. As regiões variáveis de cada cadeia de anticorpo são tipicamente pelo menos 80 por cento similares aos segmentos de gene V e J da linha germinativa humana, e, no caso de cadeias pesadas, segmentos de gene V, D e J da linha germinativa humana; freqüentemente pelo menos 85 por cento similar às seqüências da linha germinativa humana presentes no transgene; freqüentemente 90 ou 95 por cento ou mais similares às seqüências da linha germinativa humana presentes no transgene. Entretanto, visto que as seqüências que não da linha germinativa são introduzidas pela mutação somática e junção VJ e VDJ, os anticorpos da seqüência humana freqüentemente terá algumas seqüências da região variável que não são codificadas pelos segmentos de gene V, D ou J humanos como encontrado no(s) transgene(s) humano(s) na linha germinativa dos camundongos. Tipicamente, tais seqüências que não da linha germinativa (ou posições de nucleotídeo individuais) formarão grupos nas ou próximos das CDRs ou nas regiões onde as mutações somáticas são conhecidos por formar grupo.
[00874] A presente invenção também fornece células B derivadas de animais transgênicos ou transcromossômicos não humanos como aqui descritos. As células B podem ser usadas para gerar hibridomas que expressem anticorpos monoclonais humanos que se ligam com alta afinidade (por exemplo com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) inferior a 10-8 M) ao CD38 humano. Assim, em uma forma de realização, a presente invenção fornece um hibridoma que produz um anticorpo humano tendo uma afinidade (KD) abaixo de 10-8 M, tal como abaixo de 10-9 M, 10-10 M ou 10-11 M ou mesmo mais baixo quando determinada pela análise de scatchard de células que expressam CD38 usando um anticorpo monoclonal radioativamente rotulado ou pela determinação da concentração de ligação semi- máxima usando a análise FACS ou pela análise usando a ressonância de plasma de superfície como medido em um instrumento BIAcore.
[00875] A presente invenção fornece um anticorpo anti-CD38 que compreende uma cadeia leve da seqüência humana composta de (1) uma região variável de cadeia leve tendo uma seqüência de polipeptídeo que é substancialmente idêntica a uma seqüência de polipeptídeo codificada por um segmento de gene VL humano e um segmento JL humano e (2) uma região constante de cadeia leve codificada por um segmento de gene CL humano; e uma cadeia pesada da seqüência humana composta de (1) uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de polipeptídeo que é substancialmente idêntica a uma seqüência de polipeptídeo codificada por um segmento de gene VH humano, uma região D e um segmento JH humano e (2) uma região constante codificada por um segmento de gene CH humano. Deve ser mencionado que os genes D humanos podem ser substancialmente alterados pelos eventos de mutação de recombinação e somática tal que a seqüência da linha germinativa humana original não possa ser facilmente reconhecida.
[00876] O desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos de alta afinidade contra CD38 pode ser facilitado por um método para expandir o repertório de segmentos da região variável de gene humano em um animal não humano transgênico tendo um genoma que compreende um transgene de imunoglobulina humana integrado, o dito método compreendendo introduzir no genoma um transgene de gene V que compreende segmentos de gene da região V que não estão presentes no dito transgene da imunoglobulina humana integrado. Freqüentemente, o transgene da região V é um cromossoma artificial de levedura (YAC) que compreende uma porção de uma série de segmento de gene VH ou VL (VK) de ser humano, como pode naturalmente ocorrer em um genoma humano ou como pode ser unido entre si separadamente pelos métodos recombinantes, que podem incluir segmentos de gene V fora de ordem ou omitidos. Freqüentemente pelo menos cinco ou mais segmentos de gene V funcionais são contidos no YAC. Nesta variação, é possível fabricar um animal transgênico produzido pelo método da expansão de repertório V, em que o animal expressa uma cadeia de imunoglobulina que compreende uma seqüência da região variável codificada por um segmentos de gene da região V presente no transgene da região V e uma região C codificada no transgene Ig humano. Por meio do método da expansão do repertório V, os animais transgênicos tendo pelo menos 5 genes V distintos podem ser gerados; como o pode os animais contendo pelo menos de cerca de 24 genes V ou mais. Alguns segmentos de gene V podem ser não funcionais (por exemplo, pseudogenes e outros); estes segmentos podem ser retidos ou podem ser seletivamente deletados pelos métodos recombinantes disponíveis ao técnico habilitado, se desejado.
[00877] Uma vez que a linha germinativa de camundongo foi engendrada para conter um YAC funcional tendo um repertório de segmento V expandido, substancialmente não presentes no transgene de Ig humano contendo os segmentos de gene J e C, o traço pode ser propagado e cruzado em outros fundamentos genéticos, incluindo fundamentos onde o YAC funcional tendo um repertório de segmento V expandido é cruzado em uma linha germinativa de animal não humano tendo um transgene de Ig humano diferente. YACs funcionais múltiplos tendo um repertório de segmento V expandido pode ser cruzado em uma linha germinativa para funcionar com um transgene de Ig humano (ou transgenes de Ig humanos múltiplos). Embora aqui aludidos como transgenes YAC, tais transgenes quando integrados no genoma podem substancialmente carecer de seqüências de levedura, tais como as seqüências requeridas para a replicação autônoma em levedura; tais seqüências podem ser opcionalmente removidas pelo engendramento genético (por exemplo, digestão de restrição e eletroforese em gel de campo pulsado ou outro método adequado) depois da replicação em levedura não é mais necessário (isto é, antes da introdução em uma célula ES de camundongo ou prozigoto de camundongo). Os métodos de propagar o traço da expressão da seqüência de imunoglobulina humana, incluem crzar um animal transgênico tendo o(s) transgene(s) de Ig humana e opcionalmente também tendo um YAC funcional tendo um repertório de segmento V expandido. Ambos os segmentos de gene VH e VL podem estar presentes no YAC. O animal transgênico pode ser cruzado em qualquer fundamento desejado pelo praticante, incluindo fundamentos que abrigam outros transgenes humanos, incluindo transgenes de Ig humana e/ou transgenes que codificam outras proteínas de linfócito humanas. A presente invenção também fornece uma imunoglobulina da seqüência humana de alta afinidade produzida por um camundongo transgênico tendo um transgene YAC de repertório da região V expandida. Embora o precedente descreva uma forma de realização específica do animal transgênico da presente invenção, outras formas de realização são consideradas que foram classificadas em três categorias:
[00878] I. Animais transgênicos contendo um transgene de imunoglobulina de cadeia pesada não rearranjada e leve rearranjada;
[00879] II. Animais transgênicos contendo um transgene deimunoglobulina de cadeia pesada não rearranjada e leve não rearranjada; e
[00880] III. Animal transgênico contendo um transgene deimunoglobulina de cadeia pesada rearranjada e leve não rearranjada.
[00881] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção. As composições farmacêuticas podem ser formuladas com carreadores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes assim como qualquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais tais como aquelas divulgadas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.
[00882] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes assim como qualquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos devem ser adequados para o composto escolhido da presente invenção e o modo escolhido de administração. A adequabilidade para carreadores e outros componentes de composições farmacêuticas é determinada com base na falta de impacto negativo significante sobre as propriedades biológicas desejadas do composto escolhido ou composição farmacêutica da presente invenção (por exemplo, menos do que um impacto substancial (10 % ou menos de inibição relativa, 5 % ou menos de inibição relativa, etc.) na ligação de antígeno.
[00883] Uma composição farmacêutica da presente invenção também pode incluir diluentes, enchedores, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um detergente não iônico, tal como Tween80), estabilizadores, estabilizadores (por exemplo, açúcares ou aminoácidos isentos de proteína), conservantes, fixativos de tecido, solubilizadores e/ou outros materiais adequados para a inclusão em uma composição farmacêutica.
[00884] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para se obter a resposta terapêutica desejada quanto a um paciente, composição e modo de administração particulares, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção utilizada ou do éster, sal ou amida destes, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular que é utilizado, da duração do tratamento, outros medicamentos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares utilizadas, da idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente que é tratado e outros fatores bem conhecidos nas artes médicas.
[00885] A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer via ou modo adequados. As vias adequadas de administrar um composto da presente invenção in vivo e in vitro são bem conhecidos na técnica e podem ser selecionados por aqueles de habilidade comum na técnica.
[00886] Os compostos da presente invenção podem ser administrados por intermédio de qualquer via adequada, tal como uma via oral, nasal, inalável, tópica (incluindo bucal, transdérmica e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral.
[00887] Em uma forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um carreador comestível assimilável. O ingrediente ativo pode ser incluído em uma cápsula de gelatina de casca dura ou mole, comprimido em tabletes ou incorporado diretamente na dieta do paciente. As composições farmacêuticas da presente invenção que são adequadas para a administração oral incluem tabletes digeríveis, tabletes bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, óstias e outros contendo carreadores tais como são conhecidos na técnica como sendo apropriados. Para administrar um composto da presente invenção pela administração oral, pode ser necessário revestir o composto com ou co-administrar o composto com, um material para prevenir a sua inativação.
[00888] Em uma forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é nasalmente administrada. As composições farmacêuticas da presente invenção que são adequadas para a administração nasal são conhecidas na técnica e tipicamente incluem pulverizações, gotas nasais e inalantes.
[00889] Em uma forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada topicamente. As composições farmacêuticas da presente invenção que são adequadas para a administração tópica ou transdérmica incluem pós, pulverizações, ungüentos, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros e inalantes contendo carreadores tais como são conhecidos na técnica como sendo apropriados.
[00890] Em uma forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é retalmente administrada. As composições farmacêuticas da presente invenção que são adequadas para a administração retal são conhecidas na técnica e incluem géis, pastas, formulações de pulverização, supositórios.
[00891] Em uma forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada vaginalmente. As composições farmacêuticas da presente invenção que são adequadas para a administração vaginal incluem pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações de pulverização contendo carreadores tais como são conhecidos na técnica como sendo apropriados.
[00892] Em uma forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada parenteralmente.
[00893] As frases “administração parenteral” e “parenteralmente administrado” como aqui usadas significam modos de administração outros que não a administração enteral e tópica, usualmente por injeção e incluem injeção e infusão epidérmica, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinoso, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinhal, intracraniana, intratoráxica, epidural e intraesternal.
[00894] Em uma forma de realização a composição farmacêutica é administrada pela injeção ou infusão intravenosa ou subcutânea.
[00895] Em uma forma de realização os compostos da presente invenção são administrados em forma cristalina pela injeção subcutânea, cf. Yang et al., PNAS USA 100(12), 6934-6939 (2003).
[00896] As composições farmacêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgados na US 5.399.163, US 5.383.851, US 5.312.335, US 5.064.413, US 4.941.880, US 4.790.824 ou US 4.596.556. Os exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: a US 4.487.603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação a uma razão controlada; a US 4.486.194, que divulga um dispositivo terapêutico para a administração de medicamentos através da pele; a US 4.447.233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para liberar medicação a uma razão de infusão precisa; a US 4.447.224, que divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para a liberação de medicamento contínuo; a US 4.439.196, que divulga um sistema de liberação de medicamento osmótico tendo compartimentos de câmara múltipla; e a US 4.475.196, que divulga um sistema de liberação de medicamento osmótico. Muitos outros tais implantes, sistemas de liberação e módulos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
[00897] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas para vias particulares de administração, tais como a administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal, transdérmica e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica da farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do paciente que é tratado e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem única no geral será aquela quantidade da composição que produza um efeito terapêutico. No geral, fora dos cem por cento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 % a cerca de 99 % de ingrediente ativo, tal como de cerca de 0,1 % a cerca de 70 %, por exemplo de cerca de 1 % a cerca de 30 %.
[00898] Independente da via de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que podem ser usados na forma de um sal farmaceuticamente aceitável ou em uma forma hidratada adequada e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis pelos métodos convencionais conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Um “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a um sal que retenha a atividade biológica desejada do composto precursor e não comunique nenhum efeito toxicológico indesejado (ver por exemplo Berge, S. M. et al., J. Pharm. Sci. 66, 1-19 (1977)). Os exemplos de tais sais incluem os sais de adição de ácido e os sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como os ácidos clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e outros, assim como de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos mono- e di-carboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos substituídos por fenila, ácidos hidróxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e outros. Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e outros, assim como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N’-dibenziletilenodiamina, N- metilglicamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e outros.
[00899] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer e todos solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de isotonicidade, antioxidantes e agentes retardadores de absorção e outros adequados que são fisiologicamente compatíveis com um composto da presente invenção.
[00900] Os exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, etanol, dextrose, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e outros) e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão e óleo de gergelim, soluções coloidis de carboximetil celulose, goma de tragacanto e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila e/ou vários tampões. Outros carreadores são bem conhecidos nas técnicas farmacêuticas.
[00901] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para as substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencionais sejam incompatíveis com o composto ativo, o uso destes nas composições farmacêuticas da presente invenção é considerado.
[00902] A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos.
[00903] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis por exemplo (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e outros; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol e outros; e (3) agentes queladores de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e outros.
[00904] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender agentes de isotonicidade, tais como açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, glicerol ou cloreto de sódio nas composições.
[00905] Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina e soluções tampão aquosas.
[00906] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem conter um ou mais adjuvantes apropriados para a via escolhida de administração tais como conservantes, agentes de umectação, agentes de emulsificação, agentes de dispersão, conservantes ou tampões, que podem realçar a vida de prateleira ou a eficácia da composição farmacêutica. Os compostos da presente invenção por exemplo podem ser misturados com lactose, sacarose, pós (por exemplo, pó de amido), ésteres de celulose de ácidos alcanóicos, ácidos esteáricos, talco, estearato de magnésio, óxido de magnésio, sais de sódio e cálcio de ácidos fosfórico e sulfúrico, acácia, gelatina, alginato de sódio, polivinilpirrolidina e/ou álcool polivinílico. Outros exemplos de adjuvantes são QS21, GM-CSF, SRL-172, dicloridreto de histamina, timocartina, Tio-TEPA, composições de monofosforil-lipídeo A/ micobactérias, alúmem, adjuvante de Freund incompleto, montanide ISA, sistema de adjuvante ribi, adjuvante TiterMax, formulações de adjuvante syntex, complexos estimuladores do sistema imune (ISCOMs), adjuvante gerbu, oligodesoxinucleotídeos CpG, lipopolissacarídeo e ácido poliinosínico:policitidílico.
[00907] A prevenção da presença de microorganismos pode ser garantida tanto pelos procedimentos de esterilização quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e outros. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada pela inclusão de agentes que retardem a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
[00908] As composições farmacêuticas da presente invenção que compreendem um composto da presente invenção também podem incluir um sal adequado para este. Qualquer sal adequado, tal como um sal de metal alcalino terroso em qualquer forma adequada (por exemplo, um sal de tampão), podem ser usados na estabilização do composto da presente invenção. Os sais adequados tipicamente incluem cloreto de sódio, succinato de sódio, sulfato de sódio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio e cloreto de cálcio. Em uma forma de realização, um sal de alumínio é usado para estabilizar um composto da presente invenção em uma composição farmacêutica da presente invenção, sal de alumínio este que também pode servir como um adjuvante quando uma tal composição é administrada a um paciente.
[00909] As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem estar em uma variedade de formas adequadas. Tais formas incluem, por exemplo, as formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, emulsões, microemulsões, géis, cremes, grânulos, pós, tabletes, pílulas, pós, lipossomas, dendrímeros e outras nanopartículas (ver por exemplo Baek et al., Methods Enzymol. 362, 240-9 (2003), Nigavekar et al., Pharm Res. 21(3), 476-83 (2004), micropartículas e supositórios.
[00910] A forma ótima depende do modo escolhido de administração, da natureza da composição e da aplicação do produto terapêutico. As formulações podem incluir, por exemplo, pós, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeo (catiônico ou aniônico), conjugados de DNA, pastas de absorção anidra, emulsões de óleo em água e água em óleo, emulsões de carbocera (polietileno glicóis de vários pesos molecular), géis semi-sólidos e misturas semi-sólidas contendo carbowax. Qualquer um dos precedentes pode ser apropriado nos tratamentos e terapias de acordo com a presente invenção, contanto que o ingrediente ativo na composição farmacêutica não seja inativada pela formulação e a formulação é fisiologicamente compatível e tolerável com a via de administração. Ver também por exemplo Powell et al., “Compendium of excipients for pareteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52, 238-311 (1998) e as citações nesta quanto a informações relacionadas adicionais com excipientes e carreadores bem conhecidos pelos químicos farmacêuticos.
[00911] Os compostos da presente invenção podem ser preparados com carreadores que protegerão o composto contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de liberação microencapsuladas. Tais carreadores podem incluir gelatina, monoestearato de glicerila, diestearato de glicerila, biodegradável, polímeros biocompatíveis tais como vinil acetato de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático sozinho ou com uma cera ou outros materiais bem conhecidos na técnica. Os métodos para a preparação de tais formulações são no geral conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Ver por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.
[00912] Para administrar as composições da presente invenção por certas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com ou co-administrar o composto com, um material para prevenir a sua inativação. Por exemplo, o composto da presente invenção pode ser administrado a um paciente em um carreador apropriado, por exemplo, lipossomas ou um diluente. Os lipossomas incluem emulsões CGF de água em óleo em água assim como lipossomas convencionais (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27 (1984)).
[00913] Dependendo da via de administração, o composto ativo pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que possam inativar o composto. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um paciente em um carreador apropriado, por exemplo, lipossomas. Os lipossomas incluem emulsões de CGF de água em óleo em água assim como lipossomas convencionais (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27 (1984)).
[00914] Em uma forma de realização, os compostos da presente invenção podem ser formulados para garantir a distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticos da presente invenção cruzem a BBB (se desejado), estes podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricar lipossomas, ver por exemplo a US 4.522.811, US 5.374.548 e US 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas em células ou órgãos específicos, realçam assim a liberação de medicamento alvejada (ver por exemplo V. V. Ranade J. Clin. Pharmacol. 29, 685 (1989)). As porções alvejadores exemplares incluem foliato ou biotina (ver por exemplo a US 5.416.016), mannosides (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 1038 (1988)), anticorpos (P. G. Bloeman et al., FEBS Lett. 357, 140 (1995), M. Owais et al., Antimicrob. Agents Quimiother. 39, 180 (1995)), receptor da proteína A tensoativa (Briscoe et al., Am. J. Physiol. 1233, 134 (1995)), espécie diferente da qual pode compreender as composições farmacêuticas da presente invenção, assim como componentes das moléculas inventadas, p120 (Schreier et al., J. Biol. Chem. 269, 9090 (1994)), ver também K. Keinanen, M. L. Laukkanen, FEBS Lett. 346, 123 (1994) e J. J. Killion, I. J. Fidler, Immunomethods 4, 273 (1994).
[00915] Em uma forma de realização da presente invenção, os compostos da presente invenção são formulados em lipossomas. Em uma outra forma de realização, os lipossomas incluem uma porção alvejadora. Em uma outra forma de realização, os compostos nos lipossomas são liberados pela injeção de bolo a um sítio próximo à área desejada, por exemplo, o sítio de inflamação ou infecção ou o sítio de um tumor. A composição deve ser fluida até o grau em que seringabilidade fácil exista. A mesma deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenagem e deve ser preservada contra a ação contaminadora de microorganismos tal como bactérias e fungos.
[00916] Em uma forma de realização, os compostos da presente invenção podem ser formulados para impedir ou reduzir o seu transporte através da placenta. Isto pode ser feito pelos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, pela PEGuilação dos compostos ou pelo uso de fragmentos F(ab’)2. Outras referências podem ser feitas a Cunningham-Rundles C et al., J Immunol Methods. 152, 177-190 (1992) e a Landor M., Ann Allergy Asthma Immunol 74, 279-283 (1995).
[00917] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para a administração parenteral incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para as substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencionais sejam incompatíveis com o composto ativo, o uso destes nas composições farmacêuticas da presente invenção é considerado. Os compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[00918] As composições farmacêuticas para injeção devem sertipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para a concentração de medicamento alta. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão aquoso ou não aquoso contendo por exemplo água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e outros) e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como glicerol, manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada da composições injetável pode ser realizada pela inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monostearato e gelatina. As soluções injetáveis estéries podem ser preparadas incorporando-se o composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes por exemplo, como enumerado acima, como requerido, seguido pela microfiltração de esterilização. No geral, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contenha um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos por exemplo, daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os exemplos de métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução destes previamente filtrada estéril.
[00919] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido pela microfiltração de esterilização. No geral, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contenha um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os exemplos de métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução destes previamente filtrada estéril.
[00920] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter um composto da presente invenção ou uma combinação de compostos da presente invenção. Assim, em uma forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção inclui uma combinação de compostos múltiplos (por exemplo, dois ou mais) da presente invenção que atuam por mecanismos diferentes, por exemplo, um composto que predominantemente atua pela indução CDC em combinação com um outro composto que predominantemente atua pela indução da apoptose.
[00921] Os CD38BPs (incluindo anticorpos anti-CD38, imuno- conjugados, moléculas biespecíficas/multiespecíficas, composições e outros derivados aqui descritos) da presente invenção têm numerosas utilidades de diagnóstico e terapêuticas in vitro e in vivo que envolvem o diagnóstico e tratamento de distúrbios que envolvem células que expressam CD38. Por exemplo, os anticorpos podem ser administrados às células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo ou aos pacientes humanos, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir e diagnosticar uma variedade de distúrbios. Como aqui usado, o termo “paciente” é intencionado a incluir ser humano e animal não humano que respondem ao CD38BP. Os pacientes por exemplo podem incluir pacientes humanos tendo distúrbios que podem ser corrigidos ou melhorados pela inibição da função CD38, tal como a atividade enzimática, transdução de sinal, indução da expressão de citocina, indução da proliferação ou diferenciação e/ou indução de lise e/ou eliminação/redução do número de células que expressam CD38.
[00922] Por exemplo, os CD38BPs podem ser usados para evocar uma ou mais das seguintes atividades biológicas in vivo ou in vitro: inibição da função de CD38 (tal como atividade enzimática, transdução de sinal, indução da expressão de citocina, indução da proliferação ou diferenciação e/ou indução de lise), matar uma célula que expresse CD38, mediar a fagocitose ou ADCC de uma célula que expresse CD38 na presença de células efetoras humanas e pela mediação de CDC a partir de uma célula que expresse CD38 na presença de complemento ou pela morte de células que expressam CD38 pela apoptose.
[00923] Qualquer composição que compreenda CD38BPs da presente invenção tendo sítios de ligação de complemento, tais como porções de IgG1, -2 ou -3 ou IgM que ligam complemento, também pode ser usada na presença de complemento. Em uma forma de realização, o tratamento ex vivo de uma população de células que compreende células alvo com um CD38BP da presente invenção e células efetoras apropriadas pode ser suplementado pela adição de complemento ou complemento contendo soro. A fagocitose ou lise de células alvo revestidas com um CD38BP da presente invenção pode ser melhorada pela ligação de proteínas de complemento. Em uma forma de realização células alvo revestidas com os CD38BPs da presente invenção também podem ser lisadas pelo complemento. Em uma forma de realização, os CD38BPs da presente invenção não ativam complemento.
[00924] Os CD38BPs da presente invenção também podem ser administrados junto com complemento. Conseqüentemente, dentro do escopo da presente invenção estão composições que compreendem CD38BPs com soro ou complemento. Nestas composições o complemento está localizado em proximidade imediata aos CD38BPs, por exemplo pela conjugação ou podem ser adaptados para a administração simultânea. Alternativamente, os CD38BPs e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente.
[00925] Os CD38BPs da presente invenção também podem ser usados para alvejar células que expressam FcyR ou CD38, por exemplo para rotular tais células. Para tal uso, o CD38BP pode ser ligado a uma molécula que pode ser detectada. Assim, a presente invenção fornece métodos para localizar células que expressam receptores Fc ex vivo ou in vitro, tais como FCYR ou CD38. O rótulo detectável pode ser, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator de enzima.
[00926] As células efetoras específicas de alvo, por exemplo, células efetoras ligadas a um CD38BP da presente invenção também podem ser usadas como agentes terapêuticos. As células efetoras para alvejar podem ser leucócitos humanos tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células matadoras naturais e outras células que carregam receptor de IgG ou IgA. Se desejado, as células efetoras podem ser obtidas do paciente a ser tratado. As células efetoras específicas de alvo, podem ser administradas como uma suspensão de células em uma solução fisiologicamente aceitável. O número de células administradas pode estar na ordem de 108 a 109 mas variará dependendo do propósito terapêutico. No geral, a quantidade será suficiente para obter a localização na célula alvo, por exemplo, uma célula de tumor que expresse CD38 e para matar eficazmente a célula, por exemplo, pela fagocitose ou lise.
[00927] A terapia com células efetoras específicas de alvo pode ser realizada em conjunção com outras técnicas para a remoção de células alvejadas. Por exemplo, a terapia anti-tumor usando os CD38BPs da presente invenção e/ou as células efetoras munidas com estas composições podem ser usadas em conjunção com quimioterapia. Adicionalmente, a imunoterapia de combinação pode ser usada para direcionar duas populações efetoras citotóxicas distintas contra a rejeição de célula de tumor. Por exemplo, CD38BP ligado ao anti-FcYRI ou anti-CD3 pode ser usado em conjunção com agentes específicos de ligação de IgG ou IgA. As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção também podem ser usadas para modular níveis de FcαR ou FCYR nas células efetoras, tais como pelo encapuzamento e eliminação de receptores na superfície celular. As misturas de receptores anti-Fc também podem ser usadas para este propósito.
[00928] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece métodos para detectar a presença de antígeno de CD38 em uma amostra ou medir a quantidade de antígeno de CD38, que compreende contatar a amostra e uma amostra de controle, com um CD38BP que especificamente se liga ao CD38, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o CD38BP ou porção deste e CD38. A formação de um complexo é depois detectada, em que uma diferença de formação de complexo entre a amostra comparada com a amostra de controle é indicativa da presença de antígeno de CD38 na amostra. Os exemplos de métodos para detectar imunoensaios incluem, sem limitação, um ELISA, um RIA, ensaios FACS, ensaios de ressonância de plasma, ensaios cromatográficos, imunoistoquímica de tecido, Western blot e/ou imunoprecipitação.
[00929] Em uma forma de realização, CD38BPs da presente invenção podem ser usados para detectar níveis de CD38 circulantes ou níveis de células que contêm CD38 na sua superfície de membrana, níveis estes que podem estar ligados a certos sintomas de doença. Alternativamente, os CD38BPs podem ser usados para esgotar ou interagir com a função de células que expressam CD38, implicando deste modo estas células como mediadores importantes da doença. Isto pode ser obtido contatando-se uma amostra e uma amostra de controle com o anticorpo anti-CD38 sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e CD38. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e CD38 são detectados e comparados na amostra e no controle.
[00930] Os CD38BPs da presente invenção podem ser inicialmente testados quanto a atividade de ligação associada com o uso terapêutico ou em diagnóstico in vitro. Por exemplo, os CD38BPs podem ser testados usando ensaios citométricos de fluxo. Além disso, a atividade dos CD38BPs em deflagrar pelo menos uma atividade da célula efetora mediada por efetor pode ser ensaiada. Por exemplo, a capacidade de anticorpos anti-CD38 da presente invenção para deflagrar CDC e/ou apoptose pode ser ensaiada. Os protocolos para ensaiar quanto a CDC, adesão homotípica, formação de agrupamento molecular ou apoptose são bem conhecidos na técnica.
[00931] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para detectar a presença ou quantificar a quantidade de células que expressam CD38 in vivo ou in vitro. O método compreendendo (i) administrar a um paciente um CD38BP da presente invenção conjugado a um marcador detectável; (ii) expor o paciente a um meio para detectar o marcador dito marcador detectável para identificar áreas contendo células que expressam CD38.
[00932] Em uma forma de realização, imunoconjugados da presente invenção podem ser usados para alvejar compostos (por exemplo, agentes terapêuticos, rótulos, citotoxinas, imunossupressores, etc.) às células que têm CD38 ligado à sua superfície usando-se tais compostos alvo como as porções terapêuticas em imunoconjugados da presente invenção.
[00933] Em uma forma de realização, a presente invenção também fornece métodos para localizar células ex vivo ou in vitro que expressem CD38 (por exemplo, com um rótulo detectável, tal como um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator de enzima).
[00934] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece métodos para matar células que têm CD38 ligado à sua superfície pela administração de imunotoxinas da presente invenção.
[00935] A presente invenção fornece métodos para tratar ou prevenir um distúrbio que envolva células que expressam CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção a um paciente em necessidade destes. Tais CD38BPs são usados para inibir as atividades induzidas por CD38 associadas com certos distúrbios ou para eliminar ou reduzir o número de células que expressam CD38.
[00936] Um tal método envolve administrar a um paciente uma composição de CD38BP da presente invenção em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir o distúrbio. A composição de CD38BP pode ser administrada sozinha ou junto com um outro agente terapêutico, tal como está descrito aqui em outro lugar que atue em conjunção com ou sinergisticamente com a composição de CD38BP para tratar ou prevenir as doenças que envolvem células que expressam CD38. Alternativamente, imunoconjugados podem ser usados para matar células que têm CD38 expressado na sua superfície pelo alvejamento de citotoxinas ou radiotoxinas para CD38.
[00937] Em uma forma de realização da presente invenção, o distúrbio que envolve células que expressam CD38 pode ser um distúrbio tumorigênico, tal como um distúrbio caracterizado pela presença de células de tumor que expressem CD38 incluindo, por exemplo, linfoma de célula B, malignidades de célula plasmática, linfoma de célula T/NK e malignidades mielóides.
[00938] Os exemplos de tais doenças tumorigênicas incluem linfoma/leucemias de célula B incluindo leucemia linfoblástica/linfoma de célula B precursora e linfomas que não de Hodgkin de célula B; leucemia promielocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda e neoplasmas de célula B madura, tais como leucemia linfocítica crônica de célula B (CLL)/linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia linfocítica aguda de célula B, leucemia prolinfocítica de célula B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de célula do manto (MCL), linfoma folicular (FL), incluindo FL de grau baixo, de grau intermediário e de grau alto, linfoma do centro folicular cutâneo, linfoma de célula B da zona marginal (tipo MALT, nodal e tipo esplênico), leucemia de célula pilosa, linfoma de célula B grande difusa, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de célula plasmática, leucemia de célula plasmática, distúrbio linfoproliferativo pós transplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemias de célula plasmática e linfoma de célula grande anaplástica (ALCL).
[00939] Em uma forma de realização, o distúrbio que envolve células que expressam CD38 é o mieloma múltiplo.
[00940] Os exemplos de linfomas que não Hodgkin de célula B são granulomatose linfomatóide, linfoma de efusão primária, linfoma de célula B grande intravascular, linfoma de célula B grande mediastinal, doenças de cadeia pesada (incluindo doenças y, μ e α doença), linfomas induzidos pela terapia com agentes imunossupressivos, tais como linfoma induzido por ciclosporina e linfoma induzido por metotrexato.
[00941] Em uma forma de realização da presente invenção, o distúrbio que envolve células que expressam CD38 pode ser o linfoma de Hodgkin.
[00942] Os exemplos de um distúrbio que envolve células que expressam CD38 podem ser uma malignidade derivada de células T e NK incluindo: célula T madura e neoplasmos de célula NK incluindo leucemia de célula prolinfocítica T, leucemia linfocítica de granular grande de célula T, leucemia de célula NK agressiva, leucemia/linfoma de célula T adulta, linfoma de célula NKfT extranodal, tipo nasal, linfoma de célula T tipo enteropatia, linfoma de célula T hepatoesplênico, linfoma de célula T equivalente à paniculite subcutânea, linfoma de célula NK blástica, Fungóides de Micose /Síndrome de Sêzary, distúrbios linfoproliferativos de célula T positivas em CD30 cutâneo primário (linfoma de célula grande anaplástica cutânea primária C-ALCL, papulose linfomatóide, lesões limítrofes), linfoma de célula T angioimunoblástica, linfoma de célula T periférica não especificada e linfoma de célula grande anaplástica.
[00943] Os exemplos de malignidades derivadas de células mielóides incluem leucemia mielóide aguda, incluindo leucemia promielocítica aguda e doenças mieloproliferativas crônicas, incluindo leucemia mielóide crônica.
[00944] Em uma forma de realização da presente invenção, o distúrbio que envolve células que expressam CD38 podem ser distúrbios imunes em que CD38 que expressam células B, células plasmáticas, monócitos e células T estão envolvidos
[00945] Os exemplos de distúrbios imunes em que células B que expressam CD38, células plasmáticas, monócitos e células T são envolvidas incluem distúrbios autoimunes, tais como psoríase, artrite psoriática, dermatite, escleroderma sistêmico e esclerose, doença do intestino inflamatório (IBD), doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome da angústia respiratória, meningite, encefalite, uveíte, glomerulonefrite, eczema, asma, aterosclerose, deficiência da adesão de leucócito, esclerose múltipla, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, diabete de início juvenil, doença de Reiter, doença de Behget, nefrite de complexo imune, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, trombocitopenias mediada por imune, tal como púrpura trombocitopênica idiopática aguda e púrpura trombocitopênica idiopática crônica, anemia hemolítica, miastenia grave, lupo nefrite, lupo eritematoso sistêmico, artrite reumatóide (RA), dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, granulomatose Wegener, síndrome de Omenn, insuficiência renal crônica, mononucleose infecciosa aguda, esclerose múltipla, doenças associadas com HIV e vírus do herpes. Outros exemplos são síndrome da angústia respiratória aguda severa e coreoretinite. Além disso, outras doenças e distúrbios são incluídos tais como aqueles causados ou mediados pela infecção de células B com vírus, tal como o vírus de Epstein-Barr (EBV).
[00946] Em uma forma de realização, o distúrbio que envolve células que expressam CD38 é a artrite reumatóide.
[00947] Outros exemplos de distúrbios inflamatórios, imunes e/ou autoimunes em que autoanticorpos e/ou a atividade de linfócito B e T excessiva são proeminentes e que podem ser tratados de acordo com a presente invenção incluem os seguintes:vasculites e outros distúrbios de vaso, tais como poliangiíte microscópica, síndrome de Churg-Strauss e outras vasculites associadas a ANCA, poliarterite nodosa, vasculite crioglobulinêmica essencial, angiíte leucocitoclástica cutânea, doença de Kawasaki, arterite de Takayasu, artrite de célula gigante, púrpura de Henoch-Schonlein, angiíte cerebral primária ou isolada, eritema nodoso, tromboangiíte obliterativa, púrpura trombocitopênica trombóptica (incluindo síndrome urêmica hemolítica) e vasculites secundárias, incluindo vasculite leucocitoclástica cutânea (por exemplo, secundários à hepatite B, hepatite C, macroglobulinemia de Waldenstriim, neoplasias de célula B, artrite reumatóide, síndrome de Sjogren ou lupo eritematoso sistêmico); outros exemplos são eritema nodoso, vasculite alérgica, paniculite, doença de Weber-Christian, púrpura hiperglobulinêmica e doença de Buerger;distúrbios de pele, tais como dermatite de contato, dermatose de IgA linear, vitiligo, pioderma gangrenoso, epidermólise bolhosa adquirida, pênfigo vulgar (incluindo penfigóide cicatricial e penfigóide bolhoso), alopecia areata (incluindo alopecia universal e alopecia total), dermatite herpetiforme, eritema multiforme e urticária autoimune crônica (incluindo edema angioneurótico e vasculite urticarial);citopenias imuno-mediadas, tais como neutropenia autoimune e aplasia de célula vermelha pura;distúrbios do tecido conectivo, tal como lupo CNS, lupo eritematoso discóide, síndrome de CREST, doença do tecido conectivo misto, polimiosite/dermatomiosite, miosite de corpo de inclusão, amiloidose secundária, crioglobulinemia tipo I e tipo II, fibromialgia, síndrome do anticorpo fosfolipídico, hemofilia secundária, policondrite recorrente, sarcoidose, síndrome do homem duro e febre reumática; um outro exemplo é fasciíte eosinofílica;artrites, tais como espondilite ancilosante, artrite crônica juvenil, doença de Still do adulto e síndrome de SAPHO; outros exemplos são sacroileíte, artrite reativa, doença de Still e gota;distúrbios hematológicos, tais como anemia aplástica, anemia hemolítica primária (incluindo síndrome da aglutinina fria), anemia hemolítica secundária a CLL ou lupo eritematoso sistêmico; síndrome de POEMS, anemia perniciosa e púrpura de Waldemstrom hiperglobulinêmica; outros exemplos são agranulocitose, neutropenia autoimune, doença de Franklin, doença de Seligmann, doença da cadeia pesada gama, síndrome paraneoplástica secundária a timoma e linfomas, an, síndrome paraneoplástica secundária à formação de timoma e linfomas e inibidor de factor VIII;endocrinopatias, tais como poliendocrinopatia e doença de Addison; outros exemplos são hipoglicemia autoimune, hipotireoidismo autoimune, síndrome da insulina autoimune, tireoidite de Quervain e resistência à insulina mediada pelo anticorpo receptor de insulina;distúrbios hepato-gastrointestinais, tais como doença celíaca, doença de Whipple, cirrose biliar primária, hepatite ativa crônica e colangiíte esclerosante primária; um outro exemplo é a gastrite autoimune;nefropatias, tais como glomerulonefrite progressiva rápida, nefrite pós estreptocócica, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite membranosa e nefrite crioglobulinêmica; um outro exemplo é a doença de mudança mínima;distúrbios neurológicos, tais como neuropatias autoimunes, mononeurite múltipla, síndrome mistênica de Lambert-Eaton, coréia de Sydenham, ataxia locomotriz progressiva e síndrome de Guillain-Barre; outros exemplos são mielopatia/ paraparese espástica tropical, miastenia grave, polineuropatia desmielinante inflamatória aguda e polineuropatia desmielinante inflamatória crônica; esclerose múltipla;distúrbios cardíacos e pulmonares, tais como COPD, alveolite fibrosante, bronquiolite obliterativa, aspergilose alérgica, fibrose cística, síndrome de Loffler, miocardite e pericardite; outros exemplos são pneumonite e síndrome paraneoplástica secundárias ao câncer de pulmão;distúrbios alérgicos, tais como asma brônquica e síndrome de hiper-IgE; um outro exemplo é amaurose fugaz;distúrbios oftalmológicos, tais como corioretinite idiopática;doenças infecciosas, tais como infecção POR parvovírus B (incluindo a síndrome de hands-and-socks); distúrbios ginecológicos-obstétricos, tais como aborto recorrente, perda fetal recorrente e retardo de crescimento uterino; um outro exemplo é a síndrome paraneoplástica secundária aos neoplasmos ginecológicos;distúrbios reprodutivos masculinos, tais como síndrome paraneoplástica secundária aos neoplasmos testiculares; edistúrbios derivados de transplante, tais como rejeição de aloenxerto e xenoenxerto e doença do enxerto versus hospedeiro.
[00948] O anticorpo também pode ser administrado profilaticamente de modo a reduzir o risco de desenvolvimento de câncer, tal como um distúrbio tumorigênico como descrito acima, retardar o início da ocorrência de um evento em tal progressão de câncer e/ou reduzir o risco de recorrência quando um tal câncer está em remissão. Isto pode ser especialmente útil em pacientes em que é difícil localizar um tumor que é conhecido estar presente devido a outros fatores biológicos.
[00949] As composições da presente invenção podem incluir uma “quantidade terapeuticamente eficaz” ou uma “quantidade profilaticamente eficaz” de um CD38BP. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e por períodos de tempo necessários, para se obter um resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do CD38BP para evocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma em que nenhum dos efeitos tóxicos ou nocivos do anticorpo ou porção de anticorpo são preponderantes aos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” refere- se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e por períodos de tempo necessários, para se obter o resultado profilático desejado (por exemplo, uma redução na probabilidade de desenvolver um distúrbio, uma redução na intensidade ou disseminação de um distúrbio, um aumento na probabilidade de sobrevivência durante um distúrbio iminente, uma demora no início de uma condição de doença, etc.). Tipicamente, porque uma dose profilática é usada em pacientes antes ou em um estágio mais no princípio da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[00950] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” para a terapia de tumor também pode ser medida pela sua capacidade para estabilizar a progressão da doença. A capacidade de um composto para inibir câncer pode ser avaliada em um sistema de animal modelo preditivo da eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando-se a capacidade do composto para inibir o crescimento da célula ou induzir a apoptose pelos ensaios in vitro conhecidos pelo técnico habilitado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor ou de outro modo estabelecido melhorar os sintomas em um paciente. Uma pessoa de habilidade comum na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em tais fatores como o tamanho do paciente, a gravidade dos sintomas do paciente e a composição particular ou via de administração selecionadas.
[00951] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” para a artrite reumatóide pode resultar em uma Definição Preliminar de Melhora de pelo menos ACR20 nos pacientes, tal como em pelo menos uma Definição Preliminar de Melhora ACR50, por exemplo pelo menos uma Definição Preliminar de Melhora ARC70.
[00952] Definição Preliminar de Melhora ACR20 é definida como:> 20 % de melhora em: Contagem de Junta Mole (TJC) e Contagem de Junta Intumescida (SJC)e > 20 % de melhora em 3 das seguintes 5 avaliações: Avaliação de Dor do Paciente (VAS), Avaliação Global do Paciente (VAS), Avaliação Global do Médico (VAS), Incapacidade Auto-Avaliada Patente (HAQ), Reagente de Fase Aguda (CRP ou ESR).
[00953] ACR50 e ACR70 são definidos do mesmo modo com melhoras > 50 % e > 70 %, respectivamente. para mais detalhes ver Felson et al., em American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism 38, 727-735 (1995).
[00954] Alternativamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz para a artrite reumatóide pode ser medida pela DAS (contagem de atividade de doença), incluindo DAS28 e/ou DAS56, como definido por EULAR.
[00955] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. As composições parenterais podem ser formuladas na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem como aqui usada se refere às unidades fisicamente separadas adaptadas como dosagens unitárias para os pacientes a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade pré determinada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido. A especificação para as formas unitárias de dosagem da presente invenção são ditadas por e diretamente dependentes (a) das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser obtido e (b) das limitações inerentes na técnica de combinar um tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.
[00956] As dosagens eficientes e os regimes de dosagem para os CD38BPs da presente invenção dependem da doença ou condição a serem tratadas e podem ser determinadas pelas pessoas habilitadas na técnica. Uma faixa exemplar, não limitante quanto a uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção é de cerca de 0,1 a 100 mg/kg, tal como cerca de 0,1 a 50 mg/kg, por exemplo de cerca de 0,1 a 20 mg/kg, tal como de cerca de 0,1 a 10 mg/kg, por exemplo de cerca de 0,5, de cerca de tal como 0,3, de cerca de 1 ou cerca de 3 mg/kg.
[00957] Um médico ou veterinário tendo habilidade comum na técnica pode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica requerida. Por exemplo, o médico ou veterinário pode começar com doses dos CD38BPs da presente invenção utilizados na composição farmacêutica em níveis mais baixos do que aqueles requeridos de modo a obter o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumentar a dosagem até que o efeito desejado seja obtido. No geral, uma dose diária adequada de uma composição da presente invenção será aquela quantidade do composto que é a dose eficaz mais baixa para produzir um efeito terapêutico. Uma tal dose eficaz no geral dependerá dos fatores descritos acima. A administração pode ser intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea e por exemplo administrada próximo ao sítio do alvo. Se desejado, a dose diária eficaz de uma composição farmacêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas separadamente em intervalos apropriados por todo o dia, opcionalmente, nas formas de dosagem unitária. Embora seja possível para um composto da presente invenção ser administrado sozinho, é preferível administrar o composto como uma composição farmacêutica como descrito acima.
[00958] Em uma forma de realização, os CD38BPs da presente invenção podem ser administrados pela infusão em uma dosagem semanal de 10 a 500 mg/m2, tal como de 200 a 400 mg/m2. Tal administração pode ser repetida, por exemplo, de 1 a 8 vezes, tal como de 3 a 5 vezes. A administração pode ser realizada pela infusão contínua em um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas.
[00959] Em uma forma de realização, os CD38BPs da presente invenção podem ser administrados pela infusão contínua em um período longo, tal como mais do que 24 horas, de modo a reduzir os efeitos colaterais tóxicos.
[00960] Em uma forma de realização os CD38BPs da presente invenção pode ser administrado em uma dosagem semanal de 250 mg a 2000 mg, tal como por exemplo 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg ou 2000 mg, por até 8 vezes, tal como de 4 a 6 vezes. A administração pode ser realizada pela infusão contínua em um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes como necessário, por exemplo, depois de 6 meses ou 12 meses. A dosagem pode ser determinada ou ajustada medindo-se a quantidade de composto da presente invenção no sangue na administração por exemplo coletando-se uma amostra biológica e usando-se anticorpos anti-idiotípicos que alvejem a região de ligação de antígeno dos CD38BPs da presente invenção.
[00961] Em uma forma de realização, os CD38BPs da presente invenção podem ser administrados pela terapia de manutenção, tal como, por exemplo, uma vez por semana por um período de 6 meses ou mais.
[00962] Em uma forma de realização, os CD38BPs da presente invenção podem ser administrados por um regime incluindo uma infusão de um CD38BP da presente invenção seguido por uma infusão de um CD38BP da presente invenção conjugado a um radioisótopo. O regime pode ser repetido, por exemplo, 7 a 9 dias mais tarde.
[00963] Como exemplos não limitantes, o tratamento de acordo com a presente invenção pode ser fornecido como uma dosagem diária de um composto da presente invenção em uma quantidade de cerca de 0,1 a 100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg, por dia, em pelo menos um de dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 ou alternativamente, pelo menos uma da semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 depois do início de tratamento ou qualquer combinação destes, usando doses únicas ou divididas a cada 24, 12, 8, 6, 4 ou 2 horas ou qualquer combinação destes.
[00964] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes terapêuticos relevantes para a doença ou condição a ser tratada. Tal administração pode ser simultânea, separada ou sequencial. Para a administração simultânea os agentes podem ser administrados como uma composição ou como composições separadas, como apropriado.
[00965] Conseqüentemente, a presente invenção fornece métodos para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 como descrito acima, método este que compreende a administração de um CD38BP da presente invenção combinada com um ou mais agentes terapêuticos adicionais como descrito abaixo.
[00966] A presente invenção também fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agente quimioterapêutico quanto a um distúrbio que envolva células que expressam CD38 como descrito acima.
[00967] Em uma forma de realização, a terapia de combinação pode incluir a administração de uma composição da presente invenção junto com pelo menos um agente quimioterapêutico, pelo menos um agente anti- inflamatório ou pelo menos um agente imunossupressivo e/ou imunomodulatório.
[00968] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e pelo menos um agente quimioterapêutico a um paciente em necessidade deste
[00969] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e pelo menos um agente quimioterapêutico a um paciente em necessidade deste.
[00970] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agente quimioterapêutico para tratar mieloma múltiplo.
[00971] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um antimetabólito, tal como metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracila, decarbazina, hidroxiuréia, asparaginase, gencitabina, cladribina e agentes similares.
[00972] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um agente alquilante, tal como mecloretamina, tioepa, clorambucila, meifalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina, tal como carboplatina e agentes similares.
[00973] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um antibiótico, tal como dactinomicina (antigamente actinomicina), bleomicina, daunorrubicina (antigamente daunomicina), doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC) e agentes similares.
[00974] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um agente anti-mitótico, tal como taxanos, por exemplo docetaxel e paclitaxel e alcalóides vinca, por exemplo vindesina, vincristina, vinblastina e vinorrelbina.
[00975] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um inibidor de topoisomerase, tal como topotecano.
[00976] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um inibidor do fator de crescimento, tal como um inibidor de ErbB1 (EGFR) (tal como gefitinib (Iressa®), cetuximab (Erbitux®), erlotinib (Tarceva®), HuMax-EGFr (2F8 divulgado na WO 2002/100348) e agentes similares), um inibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como trastuzumab (Herceptina®) e agentes similares) e agentes similares. Em uma forma de realização, um tal inibidor do fator de crescimento pode ser um inibidor da farnesil transferase, tal como SCH66336 e R115777. Em uma forma de realização, um tal inibidor do fator de crescimento pode ser um inibidor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), tal como bevacizumab (Avastie).
[00977] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser um inibidor da tirosina quinase, tal como imatinib (Glivec, Gleevec STI571), lapatinib, PTK787/ZK222584 e agentes similares.
[00978] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser um inibidor da histona desacetilase. Os exemplos de tais inibidores da histona desacetilase incluem compostos polares híbridos com base no ácido hidroxâmico, tais como SAHA (ácido suberoilanilida hidroxâmico).
[00979] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser um inibidor da P38a MAP quinase, tal como SCIO-469.
[00980] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e pelo menos um inibidor de angiogênese, neovascularização e/ou outra vascularização a um paciente em necessidade deste
[00981] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e de pelo menos um inibidor de angiogênese, neovascularização e/ou outra vascularização a um paciente em necessidade deste.
[00982] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrado com pelo menos um inibidor de angiogênese, neovascularização e/ou outra vascularização para tratar mieloma múltiplo.
[00983] Os exemplos de tais inibidores de angiogênese são inibidores da uroquinase, inibidores da metaloprotease de matriz (tal como marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 e agentes similares), inibidores da migração e proliferação de célula endotelial (tal como TNP-470, esqualamina, 2-metoxiestradiol, combretastatinas, endostatina, angiostatina, penicilamina, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) e agentes similares), antagonistas de fatores de crescimento angiogênico (tal como ZD6474, SU6668, anticorpos contra agentes angiogênicos e/ou seus receptores (tais como VEGF, bFGF e angiopoietina-1), talidomida (Thalomid®), análogos da talidomida (tais como CC-5013 (lenalidomida, ReVLÍmid®) e CC4047 (Actimid®), Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogênica (tal como angiozima), interferon α (tal como interferon α2a), suramin e agentes similares), inibidores da VEGF-R quinase e outros inibidores da tirosina quinase anti-angiogênicos (tais como SU011248), inibidores da sinalização de integrina/sobrevivência endotelial-específica (tal como vitaxin e agentes similares), antagonistas/queladores de cobre (tais como tetratiomolibdato, captopril e agentes similares), carboxiamida-triazol (CAI), ABT-627, CM101, interleucina-12 (IL-12), IM862, PNU145156E assim como moléculas de nucleotídeo para inibir a angiogênese (tal como anti-sentido-VEGF-cDNA, cDNA que codifica angiostatina, cDNA que codifica p53 e cDNA que codifica o receptor-2 de VEGF deficiente) e agentes similares.
[00984] Outros exemplos de tais inibidores de angiogênese, neovascularização e/ou outra vascularização são derivados de heparina anti- angiogênicos e moléculas relacionadas (por exemplo, heperinase III), temozolomida, NK4, fator inibidor da migração de macrófago (MIF), inibidores da ciclooxigenase-2, inibidores do fator 1 indutível da hipoxia, isoflavonas da soja anti-angiogênica, oltipraz, fumagilina e análogos destes, análogos de somatostatina, polissulfato de pentosano, tecogalan sódico, dalteparin, tunstatina, trombospondina, NM-3, combrestatina, canstatina, avastatina, anticorpos contra outros alvos relevantes (tais como anti-alfa- v/beta-3 integrina e anti-quininostatina mAbs) e agentes similares.
[00985] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com talidomida (Thalomid®), análogos de talidomida (tal como CC-5013 (lenalidomida, ReVLÍmid®) e/ou CC4047 (Actimid®). Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com talidomida.
[00986] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com um anticorpo anti-CD20, tal como rituximab (Rituxan®, Mabthera®), um anticorpo anti-CD20 monoclonal humano como divulgado na WO 2004/035607, tal como 11 B8, 2F2 ou 7D8.
[00987] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um inibidor de proteassoma, tal como bortezomib (Velcade®).
[00988] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um corticosteróide, tal como prednisona, prednisolona, dexametasona, etc.
[00989] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um corticosteróide, tal como prednisona, prednisolona, dexametasona, etc.
[00990] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um imunógeno anticâncer, tal como um antígeno de câncer/ antígeno associado a tumor (por exemplo, molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM/TACSTDI), mucina 1 (MUC1), antígeno carcinoembriônico (CEA), glicoproteína associada a tumor 72 (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, vacinas virais associadas a câncer (por exemplo, vacinas do papilomavírus humano), proteínas de choque térmico derivadas de tumor e agentes similares. Vários outros antígenos de câncer / associados a tumor aqui descritos em outro lugar e moléculas similares conhecidas na técnica também ou alternativamente podem ser usados em tais formas de realização. Os peptídeos imunogênicos anticâncer também incluem “vacinas” anti-idiotípicas tais como anticorpos anti-idiotípicos BEC2, Mitumomab, CeaVac e anticorpos antiidiotípicos relacionados, anticorpo anti-idiotípico para anticorpo MG7 e outros anticorpos antiidiotípico anticâncer (ver por exemplo Birebent et al., Vaccine. 21(15), 1601-12 (2003), Li et al., Chin Med J (Engl). 114(9), 962-6 (2001), Schmitt et al., Hybridoma. 13(5), 389-96 (1994), Maloney et al., Hybridoma. 4(3), 191-209 (1985), Raychardhuri et al., J Immunol. 137(5), 1743-9 (1986), Pohl et al., Int J Cancer. 50(6), 958-67 (1992), Bohlen et al., Cytokines Mol Ther. 2(4), 231-8 (1996) e Maruyama, J Immunol Methods. 264(1-2), 121-33 (2002)). Tais Abs anti-idiotípicos podem ser opcionalmente conjugados a um carreador, que podem ser uma molécula carreadora sintética (tipicamente inerte), uma proteína (por exemplo hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH) (ver por exemplo Ochi et al., Eur J Immunol. 17(11), 1645-8 (1987)) ou uma célula (por exemplo uma célula sangüínea vermelha - ver por exemplo Wi et al., J Immunol Methods. 122(2), 227-34 (1989)).
[00991] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um bisfosfonato. Os exemplos de bifosfonatos potencialmente adequados são pamidronato (Aredia®), ácido zoledrônico (Zometa®), clodronato (Ossofos®), risendronato (Actonel®), ibandronato (Boniva®), etidronato (Didronel®), alendronato (Fosamax®), tiludronato (Skelid®), incadronato (Yamanouchi Pharmaceutical) e minodronato (YM529, Yamanouchi).
[00992] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima podem ser um fator estimulador de colônia. Os exemplos de fatores estimuladores de colônia adequados são fatores estimuladores de colônia de granulócito (G-CSF), tais como filgrastim (Neupogen®) e pegfilgrastim (Neulasta®) e fatores estimuladores de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF) tais como sargramostim (Leucinae®).
[00993] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima podem ser um agente eritropoiético. Os exemplos de agentes eritropoiéticos adequados são eritropoietina (EPO), tal como epoetina alfa (por exemplo Procrit®, Epogen® e Eprex®) e epoetina beta (por exemplo NeoRecormon®) e proteínas estimuladoras de eritropoiese (por exemplo Aranesp®).
[00994] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser uma citocina anticâncer, quimiocina ou combinação destas. Os exemplos de adequada citocinas e fatores de crescimento incluem IFN% IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (por exemplo, INFa2b), IFN13, GM-CSF, CD4OL, ligando Flt3, fator de célula tronco, ancestim e TNFα. As quimiocinas adequadas podem incluir quimiocinas negativas em Glu-Leu-Arg (ELR) tais como IP-10, MCP-3, MIG e SDF-1α das famílias de quimiocina CXC e C-C humanas. As citocinas adequadas incluem derivados de citocina, variantes de citocina, fragmentos de citocina e proteínas de fusão de citocina.
[00995] Estes e outros métodos ou usos que envolvam ácidos nucleicos que codificam peptídeo que ocorre naturalmente aqui podem ser alternativa ou adicionalmente realizados pela “ativação de gene” e técnicas de supra- regulagem de gene de recombinação homólogo, tais como são descritas na US 5.968.502, US 6.063.630 e US 6.187.305 e EP 0505500.
[00996] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um agente que module, por exemplo, realce ou iniba, a expressão ou atividade de receptores Fcα ou FCY. Os exemplos de agentes adequados para este uso incluem interleucina-1 (IL- 1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulador de colônia de granulócito (G-CSF), tal como filgrastim (Neupogen®) e pegfilgrastim (Neulasta®) e fatores estimuladores de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF) tais como sargramostim (Leucinae®), interferon-Y (IFN-Y) e fator de necrose de tumor (TNF).
[00997] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um regulador do controle do ciclo celular/apoptose (ou “agente regulador”). Um regulador do controle do ciclo celular/apoptose pode incluir moléculas (i) que alvejam e modulam reguladores do controle do ciclo celular/apoptose tais como cdc-25 (tal como NSC 663284), (ii) quinases dependentes de ciclina que super estimulam o ciclo celular (tal como flavopiridol (L868275, HMR1275), 7- hidroxiestaurosporina (UCN-01, KW-2401) e roscovitina (R-roscovitina, CYC202)) e (iii) moduladores da telomerase (tais como B1BR1532, SOT- 095, GRN163 e composições descritas por exemplo na US 6.440.735 e US 6.713.055). Os exemplos não limitantes de moléculas que interferem com os caminhos apoptóticos incluem ligando indutor da apoptose relacionada com o TNF (TRAIL)/apoptose-2 (Apo-2L), agentes indutores do bloqueio de NF- KB levando à inibição da produção de IL-6, anticorpos que ativam receptores TRAIL, IFNs, Bcl-2 e AS2O3 anti-sentido (trióxido de arsênico, Trisenox®).
[00998] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um agente regulador hormonal, tais como agentes úteis para a terapia anti-androgênica e anti-estrogênica. Os exemplos de tais agentes reguladores hormonais são tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilestilbestrol, etinil estradiol/estinil, um antiandrogênio (tal como flutaminda/eulexin), uma progestina (tal como caproato de hidróxi-progesterona, medroxiprogesterona/provera, acepato de megestrol/ megace), um adrenocorticosteróide (tal como hidrocortisona, prednisona), hormônio liberador do hormônio luteinizante (e análogos destes e outros agonistas de LHRH tais como buserelina e goserelina), um inibidor de aromatase (tal como anastrazol/arimidex, amino-glutetimida/citraden, exemestano), um inibidor de hormônio (tal como octreotide/- sandostatina) e agentes similares.
[00999] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um agente anti-anérgico (por exemplo compostos de molécula pequena, proteínas, glicoproteínas ou anticorpos que rompem a tolerância aos antígenos de tumor e câncer). Os exemplos de tais compostos são moléculas que bloqueiam a atividade de CTLA-4, tal como MDX-010 (Phan et al., PNAS USA 100, 8372 (2003)).
[001000] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um ácido nucleico ou vetor contendo gene supressor de tumor tal como um adenovírus deficiente em replicação que codifica p53/SCH58500 do tipo selvagem recombinante humano, etc.; ácidos nucleicos anti-sentido alvejados aos oncogenes, genes mutados ou desregulados; ou siRNA alvejado aos genes mutados ou desregulados. Os exemplos de alvos supressores de tumor incluem, por exemplo, BRCA1, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLH1 e DCC.
[001001] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um ácido nucleico anticâncer, tal como genasense (augmerosen/G3139), LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON (oligonucleotídeo de anti- sentido c-raf encapsulado em lipossoma/ISIS-5132), MG98 e outros ácidos nucleicos anti-sentido que alvejam PKCa, clusterina, IGFBPs, proteína quinase A, ciclina D1 ou BcI-2h.
[001002] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser uma molécula de RNA inibidora anticâncer (ver por exemplo Lin et al., Curr Cancer Drug Targets. 1(3), 241-7 (2001), Erratum em: Curr Cancer Drug Targets. 3(3), 237 (2003), Lima et al., Cancer Gene Ther. 11(5), 309-16 (2004), Grzmil et al., Int J Oncol. 4(1), 97- 105 (2004), Collis et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Supl), S144 (2003), Yang et al., Oncogene. 22(36), 5694-701 (2003) e Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. 303(4), 1169-78 (2003)).
[001003] As composições e métodos de administração de combinação da presente invenção também incluem a administração de vacinas de ácido nucleico, tais como vacinas de DNA nu que codificam tais antígenos de câncer/antígenos associados a tumor (ver por exemplo a US 5.589.466, US 5.593.972, US 5.703.057, US 5.879.687, US 6.235.523 e US 6.387.888). Em uma forma de realização, o método de administração de combinação e/ou a composição de combinação que compreendem uma composição de vacina autóloga. Em uma forma de realização, a composição de combinação e/ou o método de administração de combinação que compreende uma vacina de célula inteira ou célula que expresse citocina (por exemplo um fibroblasto recombinante que expresse IL-2, célula dendrítica recombinant que expresse citocina e outros) (ver por exemplo Kowalczyk et al., Acta Biochim Pol. 50(3), 613-24 (2003), Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002) e Tirapu et al., Curr Gene Ther. 2(1), 79-89 (2002). Um outro exemplo de um tal método de célula autóloga que pode ser útil em métodos de combinação da presente invenção é o método de Imunoterapia MyVax® Personalizada (anteriormente aludido como GTOP-99) (Genitope Corporation - Redwood City, CA, USA).
[001004] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece composições de combinação e métodos de administração de combinação em que um CD38BP é combinado ou co-administrado com um vírus, proteínas virais e outros. Os vírus deficientes em replicação, que no geral são capazes de uma ou apenas umas poucas rodadas de replicação in vivo e que são alvejados à células de tumor, por exemplo podem ser componentes úteis de tais composições e métodos. Tais agentes virais podem compreender ou estar associados com ácidos nucleicos que codificam imunoestimulantes, tais como GM-CSF e/ou IL-2. Tanto os vírus naturalmente oncolíticos quanto tais vírus oncolíticos recombinantes (por exemplo vírus do HSV-1, reovírus, adenovírus deficiente de replicação e sensível à replicação, etc.) podem ser componentes úteis de tais métodos e composições. Conseqüentemente, em uma forma de realização, a presente invenção fornece composições de combinação e métodos de administração de combinação em que um CD38BP é combinado ou co-administrado com um vírus oncolítico. Os exemplos de tais vírus incluem adenovírus oncolíticos e vírus do herpes, que podem ser vírus modificados ou não (ver por exemplo Shah et al., J Neurooncol. 65(3), 203-26 (2003), Stiles et al., Surgery. 134(2), 357-64 (2003), Sunarmura et al., Pancreas. 28(3), 326-9 (2004), Teshigahara et al., J Surg Oncol. 85(1), 42-7 (2004), Varghese et al., Cancer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002), Wildner et al, Cancer Res. 59(2), 410-3 (1999), Yamanaka, Int J Oncol. 24(4), 919-23 (2004) e Zwiebel et al., Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001).
[001005] As composições de combinação e métodos de administração de combinação da presente invenção também podem envolver métodos de imunoterapia de “célula inteira” e “adotiva”. Por exemplo, tais métodos podem compreender infusão ou re-infusão de células do sistema imune (por exemplo linfócitos que infiltram tumor (TILs), tais como células T CD4 + e/ou CD8 + (por exemplo células T expandidas com antígenos específicos de tumor e/ou realces genéticos), as células B que expressam anticorpo ou outras células que produzem/apresentam anticorpo, células dendríticas (por exemplo, células dendríticas recombinantes que expressam anti-citocina, células dendríticas cultivadas com um agente de expansão de DC tal como GM-CSF e/ou Flt3-L e/ou células dendríticas carregadas com antígeno associadas com tumor), células NK anti-tumor, chamadas de células híbridas ou combinações destas. Os lisados de célula também podem ser úteis em tais métodos e composições. As “vacinas” celulares em testes clínicos que podem ser úteis em tais aspectos incluem Canvaxin®, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96 (Antigenics) e lisados de célula Melacine®. Antígenos vertidos de células cancerosas e misturas destes (ver por exemplo Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, Julho de 2001), opcionalmente misturados com adjuvantes tais como alúmem, também podem ser componentes em tais métodos e as composições de combinação.
[001006] Em uma forma de realização, um CD38BP da presente invenção pode ser liberado a um paciente em combinação com a aplicação de um método de vacinação interna. A vacinação interna se refere à morte celular induzida por tumor ou câncer, tal como a morte celular induzida por medicamento ou induzida por radiação de células de tumor, em um paciente, que tipicamente leva à evocação de uma resposta imune direcionada contra (i) as células de tumor como um todo ou (ii) partes das células de tumor incluindo (a) proteínas, glicoproteínas ou outros produtos secretados, (b) proteínas ou glicoproteínas associadas à membrana ou outros componentes associados com ou inseridos em membranas e/ou (c) proteínas intracelulares ou outros componentes intracelulares. Uma resposta imune induzida pela vacinação interna pode ser humoral (isto é anticorpo - mediado por complemento) ou mediado por célula (por exemplo, o desenvolvimento e/ou aumento de linfócitos T citotóxicos endógenos que reconhecem as células de tumor internalmente mortas ou partes destas). Além da radioterapia, exemplos não limitantes de medicamentos e agentes que podem ser usados para induzir a dita morte de célula de tumor e vacinação interna são agentes quimioterapêuticos convencionais, inibidores do ciclo celular, medicamentos anti-angiogênese, anticorpos monoclonais, agentes indutores da apoptose e inibidores da transdução de sinal.
[001007] Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima são agentes indutores da diferenciação, ácido retinóico e análogos do ácido retinóico (tais como ácido retinóico todo trans, ácido 13-cis retinóico e agentes similares), análogos de vitamina D (tais como seocalcitol e agentes similares), inibidores de ErbB3, ErbB4, IGF-IR, receptor de insulina, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 e agentes similares.
[001008] Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima são catepsina B, atividade de desidrogenase dos moduladores de catepsina D, glutationa-S-transferase (tal como glutacilcisteína sintetase e lactato desidrogenase) e agentes similares.
[001009] Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima são estramustina e epirrubicina.
[001010] Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima são um inibidor de HSP90 como 17-alil amino geld-anamicina, anticorpos direcionados contra um antígeno de tumor tal como PSA, CAl25, KSA, etc., integrinas como integrina β1, inibidores de VCAM e agentes similares
[001011] Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima são inibidores de calcineurina (tais como valspodar, PSC 833 e outros inibidores de MDR-1 ou p-glicoproteína), inibidores de TOR (tais como sirolimus, everolimus e rapamicina). e inibidores de mecanismos de “linfócito residente” (tais como FTY720) e agentes com efeitos sobre a sinalização celular tais como inibidores da molécula de adesão (por exemplo anti-LFA, etc.).
[001012] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e radioterapia a um paciente em necessidade deste.
[001013] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e radioterapia a um paciente em necessidade deste.
[001014] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com radioterapia para tratar mieloma múltiplo.
[001015] A radioterapia pode compreender radiação ou a administração associada de produtos radiofarmacêuticos a um paciente é fornecida. A fonte de radiação pode ser externa ou interna em relação ao paciente que é tratado (o tratamento por radiação, por exemplo, pode estar na forma de terapia de radiação por feixe externo (EBRT), braquiterapia (BT) ou radioterapia alvejada ao esqueleto). Os elementos radioativos que podem ser usados na prática de tais métodos incluem, por exemplo, rádio, césio-137, irídio-192, amerício-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodo-123, iodo- 131 e índio-111.
[001016] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção a um paciente em necessidade deste combinada com célula tronco periférica autóloga ou transplante de medula óssea.
[001017] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção a um paciente em necessidade deste combinada com célula tronco periférica autóloga ou transplante de medula óssea.
[001018] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com célula tronco periférica autóloga ou transplante de medula óssea para tratar mieloma múltiplo.
[001019] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção a um paciente em necessidade deste combinada com intervenção ortopédica.
[001020] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com célula tronco periférica autóloga ou transplante de medula óssea para tratar mieloma múltiplo.
[001021] As intervenções ortopédicas podem ser usadas no tratamento de um distúrbio que envolva células que expressam CD38, tal como mieloma múltiplo, para ajudar a controlar a dor ou reter a função ou mobilidade. Tais intervenções podem incluir terapia física, engessamento de ossos para impedir ou tratar fraturas ou procedimentos cirúrgicos (menor ou maior) para reparar fraturas.
[001022] Em uma forma de realização, um CD38BP da presente invenção pode ser administrado em conexão com a liberação de um ou mais agentes que promovam acesso do CD38BP ou composição de combinação ao interior de um tumor. Tais métodos por exemplo podem ser realizados em associação com a liberação de uma relaxina, que é capaz de abrandar um tumor (ver por exemplo a US 6.719.977). Em uma forma de realização, um CD38BP da presente invenção pode ser ligado a um peptídeo que penetre a célula (CPP). Os peptídeos que penetram a célula e peptídeos relacionados (tais como anticorpos que penetram a célula engendrados) são descritos por exemplo em Zhao et al., J lmmunol Methods. 254(1-2), 137-45 (2001), Hong et al., Cancer Res. 60(23), 6551-6 (2000). Lindgren et al., Biochem J. 377(Pt 1), 69-76 (2004), Buerger et al., J Cancer Res Clin Oncol. 129(12), 669-75 (2003), Pooga et al., FASEB J. 12(1), 67-77 (1998) e Tseng et al., Mol Pharmacol. 62(4), 864-72 (2002).
[001023] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio que envolva células que expressam CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e pelo menos um agente anti-inflamatório a um paciente em necessidade deste.
[001024] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e pelo menos um agente anti-inflamatório a um paciente em necessidade deste.
[001025] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agente anti- inflamatório para tratar mieloma múltiplo.
[001026] Em uma forma de realização uma tal agente anti-inflamatório pode ser selecionado de um medicamento esteroidal e um NSAID (medicamento anti-inflamatório não esteroidal).
[001027] Em uma forma de realização uma tal agente anti-inflamatório pode ser selecionado de aspirina e outros salicilatos, inibidores de Cox-2 (tais como rofecoxib e celecoxib), NSAIDs (tais como ibuprofeno, fenoprofeno, naproxeno, sulindac, diclofenaco, piroxicam, cetoprofeno, diflunisal, nabumetona, etodolac, oxaprozin e indometacina), anticorpos anti-IL6R, anticorpos anti-IL8, anticorpos anti-IL15, anticorpos anti-IL15R, anticorpos anti-CD4, anticorpos anti-CD11a (por exemplo, efalizumab), anticorpos de integrina anti-alfa-4/beta-1 (VLA4) (por exemplo, natalizumab), CTLA4-Ig para o tratamento de doenças inflamatórias, prednisolona, prednisona, medicamentos antirreumáticos modificadores de doença (DMARDs) tal como metotrexato, hidroxicloroquina, sulfasalazina, inibidores da síntese de pirimidina (tal como leflunomida), agentes bloqueadores do receptor de IL-1 (tal como anaquinra), agentes bloqueadores de TNF-α (tais como etanercept, infliximab e adalimumab) e agentes similares.
[001028] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio que envolva células que expressem CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e pelo menos um agente imunosupressivo e/ou imuno-modulatório a um paciente em necessidade deste.
[001029] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e pelo menos um agente imuno-supressivo e/ou imunomodulatório a um paciente em necessidade deste.
[001030] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agente imunossupressivo e/ou imunomodulatório para tratar mieloma múltiplo.
[001031] Em uma forma de realização, um tal agente imuno-supressivo e/ou imunomodulatório pode ser selecionado de ciclosporina, azatioprina, ácido micofenólico, micofenolato de mofetila, corticosteróides tais como prednisona, metotrexato, sais de ouro, sulfasalazina, antimalariais, brequinar, leflunomida, mizoribina, 15-desoxispergualina, 6-mercaptopurina, ciclofosfamida, rapamicina, tacrolimus (FK-506), OKT3, antitimócito globulina, timopentina, timosina-α e agentes similares.
[001032] Em uma forma de realização, um tal agente imuno-supressivo e/ou imunomodulatório pode ser selecionado de anticorpos imunossupressivos, tais como os anticorpos que se ligam a p75 do receptor de IL-2 ou anticorpos que se ligam por exemplo a MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFNY, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-6; IGF, IGFR1, IL-7, IL-8, IL-10, CD11a ou CD58 ou anticorpos que se ligam a seus ligandos.
[001033] Em uma forma de realização, um tal agente imuno-supressivo e/ou imunomodulatório pode ser selecionados de IL-15R, IL-10 solúveis, moléculas B7 (B7-1, B7-2, variantes destas e fragmentos destas), ICOS e OX40, um inibidor de um regulador de célula T negativo (tal como um anticorpo contra CTLA4) e agentes similares.
[001034] Em uma forma de realização, os CD38BPs da presente invenção podem ser administrados em combinação com dois ou mais agentes imunossupressivos e/ou imunomodulatórios, tais como em combinação com prednisona e ciclosporina; prednisona, ciclosporina e azatioprina; ou prednisona, ciclosporina e micofenolato de mofetila.
[001035] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio que envolva células que expressem CD38 em um paciente, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e um anticorpo anti-C3b(i) a um paciente em necessidade deste
[001036] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar mieloma múltiplo, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção e um anticorpo anti-C3b(i) a um paciente em necessidade deste.
[001037] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um CD38BP da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com um anticorpo anti-C3b(i) para tratar mieloma múltiplo.
[001038] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para o uso na combinação com os CD38BPs da presente invenção para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser selecionado de inibidores da histona desacetilase (por exemplo butirato de fenila) e/ou agentes de reparo de DNA (por exemplo enzimas de reparo de DNA e composições relacionadas tais como dimericina).
[001039] Os métodos da presente invenção para tratar um distúrbio como descrito acima que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um CD38BP da presente invenção também pode compreender a terapia fotodinâmica direcionada a anticâncer (por exemplo terapia a laser anticâncer - que opcionalmente pode ser praticada com o uso de agente fotossensibilizante, ver, por exemplo Zhang et al., J Control Release. 93(2), 141-50 (2003)), terapias de onda sonora e onda de choque anticâncer (ver por exemplo Kambe et al., Hum Cell. 10(1), 87-94 (1997)) e/ou terapia nutracêutica anticâncer (ver por exemplo Roudebush et al., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 34(1), 249-69, viii (2004) e Rafi, Nutrition. 20(1), 78-82 (2004). Do mesmo modo, um CD38BP da presente invenção pode ser usado para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar um distúrbio como descrito acima a ser administrada com a terapia fotodinâmica direcionada a anticâncer (por exemplo terapia a laser anticâncer - que opcionalmente pode ser praticada com o uso de agente fotossensibizante, terapias de onda sonora e onda de choque anticâncer e/ou terapia nutracêutica anticâncer.
[001040] Como descrito acima, uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada em terapia de combinação, isto é, combinada com um ou mais agentes relevantes para a doença ou condição a ser tratada como composições farmacêuticas separadas ou com um composto da presente invenção co-formulado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais como descrito acima. Tais terapias de combinação podem requerer dosagens mais baixas do composto da presente invenção e/ou dos agentes co- administrados, evitando assim toxicidades ou complicações possíveis associadas com as várias monoterapias.
[001041] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um CD38BP que é conjugado a um imunomodulador, tal como uma citocina imunomoduladora, fator de crescimento de célula tronco, linfotoxina (tal como um TNF tal como TNFα) ou um fator hematopoiético. Os exemplos de tais moléculas que podem ser úteis como conjugados incluem IL-1, IL-2, IL- 3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 e IL-21, fatores estimuladores de colônia (tais como fatores estimuladores de colônia de granulócito (G-CSF) e fator estimulador de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF)), interferons (tais como IFNα, IFNβ e IFNY) o fator de crescimento de célula tronco designado “fator S1,” eritropoietina e trombopoietina, fragmentos ativos destes, derivados destes, variantes destes ou uma combinação de qualquer um destes.
[001042] Em uma forma de realização, os CD38BPs da presente invenção podem ser usados in vivo ou in vitro para diagnosticar doenças em que as células ativada que expressam CD38 desempenham um papel ativo na patogênese pelos níveis de detecção de CD38 ou níveis de células que contêm CD38 na sua superfície de membrana. Isto pode ser obtido, por exemplo, contatando-se uma amostra a ser testada, opcionalmente junto com uma amostra de controle, com o CD38BP sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e CD38. A formação de complexo é depois detectada (por exemplo, usando um ELISA). Quando do uso de uma amostra de controle junto com a amostra de teste, o complexo é detectado em ambas as amostras e qualquer diferença estatisticamente significante na formação de complexos entre as amostras é indicativa da presença de CD38 na amostra de teste.
[001043] Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos para a identificação de e diagnóstico de células e tecidos invasivos e outras células alvejadas pelos CD38BPs da presente invenção e para a monitoração do progresso de tratamentos terapêuticos, situação depois do tratamento, risco de desenvolver câncer, progressão de câncer e outros.
[001044] Em um exemplo de um tal ensaio de diagnóstico, a presente invenção fornece um método de diagnosticar o nível de células invasivas em um tecido que compreende formar um imunocomplexo entre um CD38BP e CD38 potencial contendo tecidos e detectar a formação do imunocomplexo, em que a formação do imunocomplexo correlaciona-se com a presença de células invasivas no tecido. O contatar pode ser realizado in vivo, usando anticorpos isolados rotulados e técnicas de produção de imagem padrão ou pode ser realizada in vitro em amostras de tecido.
[001045] Os CD38BPs podem ser usados para detectar peptídeos e fragmentos de peptídeo contendo CD38 em qualquer amostra biológica adequada por qualquer técnica adequada. Os exemplos de imunoensaios convencionais fornecidos pela presente invenção incluem, sem limitação, um ELISA, um RIA, ensaios FACS, ensaios de ressonância de plasma, ensaios cromatográfica, imunoistoquímica de tecido, Western blot e/ou imunoprecipitação usando um CD38BP. Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção podem ser usados para detectar CD38 e fragmentos CD38 de seres humanos. Os rótulos adequados para o CD38BP e/ou anticorpos secundários usados em tais técnicas incluem, sem limitação, várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Os exemplos de enzimas adequadas incluem rábano peroxidase, fosfatase alcalina, p-galactosidase ou acetilcolinesterase; os exemplos de complexos de grupo protético adequado incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinil-amina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S e 3H.
[001046] Os CD38BPs também podem ser ensaiados em uma amostra biológica por um imunoensaio de competição utilizando peptídeo de CD38 padrão rotulado com uma substância detectável e um CD38PB não rotulado, tal como um anticorpo anti-CD38 não rotulado, por exemplo. Em um tal ensaio, a amostra biológica, o(s) peptídeo(s) rotulado(s) de CD38 padrão e o CD38BP são combinados e a quantidade de CD38 padrão rotulado ligado ao CD38BP não rotulado é determinada. A quantidade de peptídeo de CD38 na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão CD38 rotulado ligado ao CD38BP.
[001047] Os CD38BPs são particularmente úteis na formação de imagem in vivo de tumores. A formação de imagem in vivo de tumores associados com CD38 pode ser realizada por qualquer técnica adequada. Por exemplo, rotulação com 99Tc ou rotulação com um outro isótopo que imite raio gama pode ser usado para rotular anticorpos anti-CD38 em tumores ou complexos secundários rotulados CD38BP:CD38 (por exemplo, FITC rotulado) de tumores e formados em imagem com uma câmera de cintilação gama (por exemplo, um dispositivo Elscint Apex 409ECT), tipicamente usando energia baixa, colimador de alta resolução ou um colimador de baixa energia com várias finalidades. Os tecidos tingidos podem ser depois avaliados quanto a contagem de radioatividade como um indicador da quantidade de peptídeos associados com CD38 no tumor. As imagens obtidas pelo uso de tais técnicas podem ser usadas para avaliar a biodistribuição de CD38 em um paciente, mamífero ou tecido, por exemplo no contexto de usar CD38 ou fragmentos de CD38 como um biomarcador quanto a presença de células cancerosas invasivas. As variações desta técnica podem incluir o uso de formação de imagem pela ressonância magnética (MRI) para melhorar a formação da imagem em relação às técnicas de câmara gama. Os métodos e princípios da imunocintigrafia similares são descritos, por exemplo, em Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988), Chase, “Medical Applications of Radioisotopes,” em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, Gennaro et al., (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990) e Brown, “Clinical Use of Monoclonal Antibodies,” em Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto et al., (eds.) (Chapman & Hall 1993). Tais imagens também podem ser usadas para a liberação alvejada de outros agentes anticâncer, os exemplos das quais são aqui descritos (por exemplo, agentes apoptóticos, toxinas ou composições de quimioterapia CHOP). Além disso, tais imagens também podem ou alternativamente servem como a base para técnicas cirúrgicas para remover tumores. Além disso, tais técnicas de formação de imagem in vivo podem permitir a identificação e localização de um tumor em uma situação onde um paciente é identificado como tendo um tumor (devido à presença de outros biomarcadores, metástases, etc.), mas o tumor não pode ser identificado pelas técnicas analíticas tradicionais. Todos estes métodos são características da presente invenção.
[001048] A formação de imagem in vivo e outros métodos de diagnóstico fornecidos pela presente invenção são particularmente úteis na detecção de micrometastases em um paciente humano (por exemplo, um paciente não anteriormente diagnosticado com câncer ou um paciente em um período de recuperação/remissão de um câncer). As células cancerosas de carcinoma, que podem compor até 90 % de todas as células cancerosas, por exemplo, demonstraram tingir muito bem com composições conjugadas de anticorpo anti-CD38. A detecção com anticorpos anti-CD38 monoclonais e outros CD38BPs aqui descritos pode ser indicativa da presença de carcinomas que são agressivas/invasivas e também ou alternativamente fornecem uma indicação da praticabilidade de usar anticorpo anti-CD38 monoclonal relacionado, CD38BP ou tratamentos com composição relacionada contra tais micrometastases. Além disso, os anticorpos anti-CD38 monoclonais que estão associados com células cancerosas são vantajosamente capazes de distinguir tais tecidos e células associados com o câncer de células normais com que outras formas de CD38 podem estar associadas.
[001049] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método de formação de imagem in vivo em que um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, da presente invenção é conjugado a um agente radio- opaco que promova a detecção, o anticorpo conjugado é administrado a um hospedeiro, tal como pela injeção na corrente sangüínea e a presença e localização do anticorpo rotulado no hospedeiro é ensaiada. Através desta técnica e qualquer outro método de diagnóstico aqui fornecido, a presente invenção fornece um método para triar quanto a presença de células relacionadas com doença em um paciente humano ou uma amostra biológica tirada de um paciente humano.
[001050] Para a formação de imagem de diagnóstico, radioisótopos podem ser ligados a um CD38BP direta ou indiretamente usando-se um grupo funcional intermediário. Os grupos funcionais intermediários úteis incluem queladores, tais como ácido etilenodiaminotetraacético e ácido dietilenotriaminopentaacético (ver por exemplo a US 5.057.313). Em tais ensaios de diagnóstico que envolvam CD38BPs conjugados a radioisótopo, a dosagem de peptídeo conjugado liberado ao paciente tipicamente é mantido em um nível tão baixo quanto possível através da escolha de isótopo para a melhor combinação de meia-vida mínima, retenção mínima no corpo e quantidade mínima de isótopo, que permitirá a detecção e medição precisa.
[001051] Além de radioisótopos e agentes radio-opacos, os métodos de diagnóstico podem ser realizados usando CD38BPs que são conjugados aos corantes (tal como com o complexo de biotina-estreptavidina), agentes de contraste, compostos fluorescentes ou moléculas e agentes realçadores (por exemplo, íons paramagnéticos) para a formação de imagem de ressonância magnética (MRI) (ver, por exemplo, a Pat. US No 6.331.175, que descreve técnicas de MRI e a preparação de anticorpos conjugados a um agente que realça MRI). Tais agentes de diagnóstico/detecção podem ser selecionados de agentes para o uso na formação de imagem de ressonância magnética e compostos fluorescentes. De modo a carregar um CD38BP, tal como um anticorpo, componente com metais radioativos ou íons paramagnéticos, pode ser necessário reagi-lo com um reagente tendo uma cauda longa à qual são ligados uma multiplicidade de grupos queladores para a ligação dos íons. Uma tal cauda pode ser um polímero tal como uma polilisina, polissacarídeo ou outra cadeia derivatizada ou derivatizável tendo grupos pendentes aos quais podem ser ligados grupos queladores tais como, por exemplo, porfirinas, poliaminas, éteres coroa, bistiossemicarbazonas, polioximas e grupos equivalentes conhecidos por serem úteis para este propósito. Os quelatos podem ser ligados aos CD38BPs usando as químicas padrão. Um quelato é normalmente ligado a um CD38BP, tal como um mAB anti-CD38, por um grupo, que possibilite a formação de uma ligação à molécula com perda mínima de imunorreatividade e agregação e/ou reticulação interna mínimas. Outros, menos usuais, métodos e reagentes para conjugar quelatos aos anticorpos são divulgados por exemplo na US 4.824.659. Os exemplos de combinações de metal-quelato potencialmente úteis incluem 2-benzil-DTPA e seus análogos monometílicos e cicloexílicos, usados com isótopos de diagnóstico na faixa de energia geral de 60 a 4.000 keV, tal como 125I, 123I, 124I 62C 64C 18F 111I 67G 67G 99T 94T 11C 13H 15O 78BI, Cu, Cu, F, In, Ga, Ga, Tc, Tc, C, H, O e Br, para a formação de radio-imagem. Estes quelatos e quelatos similares, quando complexados com metais não radioativos, tais como manganês, ferro e gadolínio podem ser úteis para métodos de diagnóstico MRI em conexão com CD38BPs. Os quelatos macrocíclicos tais como NOTA, DOTA e TETA são de uso com uma variedade de metais e radiometais, o mais particularmente com radionuclídeos de gálio, ítrio e cobre, respectivamente. Tais complexos de metal-quelato podem ser feitos muito estáveis ajustando-se o tamanho do anel ao metal de interesse. Outros quelatos do tipo anel tal como poliéteres macrocíclico, que são de interesse para nuclídeos de ligação estável, tal como 223Rapara RAIT também podem ser adequados em métodos de diagnóstico.
[001052] Assim, a presente invenção fornece conjugados de CD38BP de diagnóstico, em que o CD38BP é conjugado a um agente de contraste (tal como para a formação de imagem pela ressonância magnética, tomografia computadorizada ou agente realçador de contraste por ultra-som) ou um radionuclídeo que pode ser, por exemplo, um isótopo que emita gama, beta, alfa, elétron Auger ou pósitron. Os CD38BPs conjugados úteis adicionais são descritos aqui em outro lugar, que também podem ser úteis em métodos e composições de diagnóstico (por exemplo, kits de diagnóstico) fornecidos pela presente invenção.
[001053] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um kit para o diagnóstico de câncer que compreende um recipiente compreendendo um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 e um ou mais reagentes para detectar a ligação do CD38BP a um peptídeo de CD38. Os reagentes podem incluir, por exemplo, rótulos fluorescentes, rótulos enzimáticos ou outros rótulos detectáveis. Os reagentes também podem incluir anticorpos secundários ou terciários ou reagentes para as reações enzimáticas, em que as reações enzimáticas produzem um produto que pode ser visualizado. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um kit de diagnóstico que compreende um ou mais CD38BPs, tais como os anticorpos anti-CD38, da presente invenção na forma rotulada ou não rotulada em recipiente(s) adequado(s), reagentes para as incubações para um ensaio indireto e substratos ou agentes derivatizantes para a detecção em uma tal ensaio, dependendo da natureza do rótulo. O(s) reagente(s) de controle e as instruções para o uso também podem ser incluídos.
[001054] Os kits de diagnóstico também podem ser fornecidos para o uso com um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 conjugado/rotulado, para a detecção de uma atividade celular ou para detectar a presença de peptídeos de CD38 em uma amostra de tecido ou hospedeiro. Em tais kits de diagnóstico, assim como em kits para os usos terapêuticos aqui descritos em outro lugar, um CD38BP tipicamente pode ser fornecido em uma forma liofilizada em um recipiente, sozinho ou em conjunção com anticorpos adicionais específicos para uma célula ou peptídeo alvos. Tipicamente, um carreador farmaceuticamente aceitável (por exemplo, um diluente inerte) e/ou componentes destes, tal como um tampão de Tris, fosfato ou carbonato, estabilizadores, conservantes, biocidas, biocidas, proteínas inertes, por exemplo, albumina sérica ou semelhante, também são incluídos (tipicamente em um recipiente separado para mistura) e reagentes adicionais (também tipicamente em recipiente(s) separado(s)). Em certos kits, um anticorpo secundário capaz de ligar-se ao anticorpo anti-CD38 ou outro CD38BP, que tipicamente está presente em um recipiente separado, também é incluído. O segundo anticorpo é tipicamente conjugado a um rótulo e formulado na maneira similar ao anticorpo anti-CD38 ou outro CD38BP da presente invenção.
[001055] Usando os métodos descritos acima e aqui em outro lugar CD38BPs podem ser usados para definir subconjuntos de células cancerosas/de tumor e caracterizar tais células e tecidos/crescimentos relacionados.
[001056] Em um exemplo, um CD38BP ou anticorpo anti-CD38, podem ser adicionados a nitrocelulose ou outro suporte sólido que é capaz de imobilizar células, partículas de célula ou proteínas solúveis. O suporte pode ser depois lavado com tampões adequados seguido pelo tratamento com o peptídeo ou anticorpo de CD38 detectavelmente rotulado. O suporte de fase sólida pode ser depois lavado com o tampão uma segunda vez para remover peptídeo ou anticorpo não ligados. A quantidade de rótulo ligado no suporte sólido pode ser depois detectado por etapas de método conhecidas.
[001057] As enzimas ligadas que reagem com um substrato exposto podem ser usadas para gerar uma porção química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou por meios visuais, no contexto de um conjugado e/ou proteína de fusão de CD38BP. As enzimas que podem ser usadas para rotular detectavelmente CD38BPs e anticorpos anti-CD38 incluem a malato desidrogenase, estafilococo nuclease, delta-5-esteróide isomerase, levedura álcool desidrogenase, alfa- glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, rábano peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glicoamilase e acetilcolinesterase. Também é possível rotular um CD38BP com um composto fluorescente. Quando o anticorpo rotulado fluorescente é exposto à luz do comprimento de onda apropriado, a sua presença pode ser detectada devido à fluorescência. Entre os compostos de rotulação fluorescente mais habitualmente usados estão o isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamina.
[001058] Os CD38BPS, tais como os anticorpos anti-CD38, também podem ser detectavelmente rotulados usando metais que emitem fluorescência tais como 152Eu ou outros da série dos lantanídeos. Estes metais podem ser ligados a um anticorpo anti-CD38, por exemplo, usando tais grupos queladores de metal como ácido dietilenotriamino-pentaacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA).
[001059] Os CD38BPs e anticorpos anti-CD38 também podem ser detectavelmente rotulados pela ligação a um composto quimioluminescente. A presença do CD38-BP quimioluminescentemente rotulado é depois determinado detectando-se a presença de luminescência que surge durante o curso de uma reação química. Os exemplos de compostos de rotulação quimioluminescentes particularmente úteis são luminol, isoluminol, éster teromatic de acridínio, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.
[001060] Do mesmo modo, um composto bioluminescente pode ser usado para rotular um CD38BP. A bioluminescência é um tipo de quimioluminescência encontrada em sistemas biológicos em que uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reação quimioluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada pela detecção da presença de luminescência. Compostos bioluminescentes importantes para os propósitos de rotulação são luciferina, luciferase e aequorina.
[001061] A detecção de um peptídeo ou anticorpo rotulado, fragmento de anticorpo ou derivado pode ser realizada por um contador de cintilação, por exemplo, se o rótulo detectável é um emissor gama radioativo ou por um fluorômetro, por exemplo, se o rótulo é um material fluorescente. No caso de um rótulo de enzima, a detecção pode ser realizada pelos métodos colorimétricos que utilizam um substrato para a enzima. A detecção também pode ser realizada pela comparação visual do grau de reação enzimática de um substrato em comparação com padrões similarmente preparados.
[001062] Estas e outras técnicas de diagnóstico podem ser usadas para triar qualquer material adequado para os peptídeos CD38 ou fragmentos CD38. Os exemplos de materiais que podem ser triados incluem, por exemplo, sangue, soro, linfa, urina, exudado inflamatório, fluido cerebrospinal, fluido amniótico, um extrato de tecido ou homogenado e outros. Entretanto, a presente invenção não é limitada aos ensaios usando apenas estas amostras, sendo possível para uma pessoa de habilidade comum na técnica determinar condições adequadas que permitam o uso de outras amostras.
[001063] A detecção in situ pode ser realizada pela remoção de um espécimen histológico de um paciente e fornecendo a combinação de CD38BPs rotulados, tais como os anticorpos anti-CD38, da presente invenção a um tal espécimen. O CD38BP, anticorpo anti-CD38 (ou fragmento) da presente invenção pode ser fornecido aplicando-se ou sobrepondo-se o CD38BP rotulado, tal como um anticorpo anti-CD38 rotulado (ou fragmento), da presente invenção a uma amostra biológica. Através do uso de uma tal procedimento, é possível determinar não apenas a presença de CD38 ou fragmento de CD38 mas também a distribuição de tais peptídeos no tecido examinado (por exemplo, no contexto de avaliar a disseminação de células cancerosas). Usando a presente invenção, aqueles de habilidade comum facilmente perceberão que qualquer de uma ampla variedade de métodos histológicos (tais como procedimentos de tingimento) podem ser modificados de modo a obter tal detecção in situ.
[001064] A presente invenção fornece ainda método de promover a venda e/ou o uso de um CD38BP da presente invenção, que compreende distribuir informação (tal como por materiais impressos que são distribuídos, enviados pelo correio, etc., pela sinalização de propaganda, pelos programas e propagandas de televisão, pelos programas e propagandas de rádio, pela distribuição em sítio da internet, por e-mail, por telemarqueting, pela comercialização de porta a porta ou pessoa a pessoa, pelas conferências de financiadas e/ou hosting, painéis, fóruns, etc., pela utilização e/ou contratação para os serviços de vendedor e/ou propagandistas médicos/científicos, pelas pesquisas e publicações científicas financiadas e/ou patrocinadas e publicações relacionadas com tais usos, etc.) relacionadas com o uso do composto na prevenção ou tratamento de qualquer condição ou combinação de condições como descrito aqui em outro lugar a qualquer pessoa ou entidade de interesse potencial (tais como cadeias farmacêuticas, administradores de fórmulas, companhias de segurança, HMOs, hospitais e cadeias de hospital, outras companhias de cuidado de saúde, administradores de benefício de farmácia, pacientes potenciais, pacientes com câncer, pacientes com câncer precedentes, pacientes em remissão, médicos de cuidados primários, enfermeiras, doutores de farmácia e/ou líderes de opinião chave).
[001065] A presente invenção também fornece kits que compreendem uma composição farmacêutica de um composto da presente invenção e instruções para o uso. O kit pode conter ainda um ou mais agentes adicionais, tais como um reagente imunossupressivo, um reagente quimioterapêutico, um agente anti-inflamatório ou um agente radiotóxico como descrito acima ou um ou mais CD38BPs adicionais da presente invenção (tal como um CD38BP tendo uma atividade complementar). Um kit da presente invenção também pode incluir agentes de diagnóstico e/ou outros agentes terapêuticos. Em uma forma de realização, um kit da presente invenção inclui um CD38BP da presente invenção e um agente de diagnóstico que possa ser usado em um método de diagnóstico para diagnosticar o estado ou existência de um distúrbio que envolva células que expressem CD38 em um paciente. Em uma forma de realização, o kit inclui um CD38BP da presente invenção em uma forma altamente estável (tal como em uma forma liofilizada) em combinação com carreador(es) farmaceuticamente aceitável(is) que pode(m) ser misturado(s) com a composição altamente estável para forma uma composição injetável.
[001066] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes, aqui citadas são por meio deste incorporadas por referência ao mesmo grau como se cada referência fosse individual e especificamente indicada como estando incorporada por referência e fosse apresentada aqui em sua totalidade.
[001067] Todos os cabeçalhos e sub-cabeçalhos são aqui usados apenas por conveniência e não devem ser interpretados como limitando a presente invenção de nenhum modo.
[001068] Qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis destes é abrangida pela presente invenção a menos que de outro modo estabelecido aqui indicado ou de outro modo estabelecido claramente contradito pelo contexto.
[001069] O uso dos termos “um” e “uma” e “o” e “a” e referentes similares no contexto de descrever a presente invenção devem ser interpretados para abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que de outro modo estabelecido aqui indicado ou claramente contradito pelo contexto.
[001070] A recitação de faixas de valores aqui é meramente intencionada a servir como um método resumido de aludir individualmente a cada valor separado que caia dentro da faixa, a menos que de outro modo estabelecido aqui indicado e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fossem individualmente aqui relatado. A menos que de outro modo estabelecido, todos os valores exatos são aqui fornecidos representativos dos valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exemplares exatos fornecidos com respeito a um fator ou medida particular pode ser considerada fornecer também uma medida aproximada correspondente, modificada por “cerca de,” onde apropriado).
[001071] Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que de outro modo estabelecido aqui indicado ou de outro modo estabelecido claramente contradito pelo contexto.
[001072] O uso de qualquer e de todos os exemplos ou linguagem exemplar (por exemplo, “tal como”) aqui fornecidos, é intencionado meramente a esclarecer melhor a presente invenção e não propõem uma limitação do escopo da presente invenção a menos que de outro modo estabelecido indicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando que qualquer elemento seja essencial para a prática da presente invenção a menos que outro tanto for explicitamente estabelecido.
[001073] A citação e incorporação de documentos de patente aqui é feita apenas por conveniência e não refletem qualquer aspecto da validade, patenteabilidade e/ou obrigatoriedade de tais documentos de patente.
[001074] A descrição aqui de qualquer forma de realização da presente invenção usando termos tais como “que compreende”, “tendo,” “incluindo,” ou “contendo” com referência a um elemento ou elementos é intencionada a fornecer suporte quanto a uma forma de realização similar da presente invenção que “consiste de”, “consiste essencialmente de” ou “substancialmente compreendendo” que elemento ou elementos particulares, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto (por exemplo, uma composição aqui descrita como compreendendo um elemento particular deve ser entendido como também descrevendo uma composição que consiste daquele elemento, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto).
[001075] A presente invenção inclui todas as modificações e equivalentes da matéria objeto declarada nas formas de realização aqui apresentadas ao grau máximo permitido pela lei aplicável.
[001076] Todas as patentes, pedidos de patente pendentes e outras publicações aqui citados são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade.
[001077] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitantes.
EXEMPLOSEXEMPLO 1 Fabricação de células transfectadas com luciferase (Daudi-luc)
[001078] A cultura de células Daudi (que se originam do linfoma de Burkitt) foi cultivada em meio de cultura de RPMI 1640 suplementado com 10 % de FCS (Optimum C241, Wisent Inc., St. Bruno, QC, Canadá), 2 mM de L-glutamina, 100 IU/m1 de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio (todos derivados da Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Escócia). O meio foi renovado duas vezes por semana. Antes da transfecção, as células foram divididas e semeadas de 1 a 1,5 x 106 células/ml para garantir a viabilidade e crescimento ótimo.Transfecção de Luciferase
[001079] 8,2 x 106 células CD38 + Daudi foram coletadas em 350 μ l deRPMI (suplementado com 10 % de dFCS, Gibco BRL) e transferidas a uma cubeta de eletroporação (Biorad, Hemel Hempstead, Herts, UK). Depois, 40 μ g de gWIZ luciferase da GTS (Aldevron, Fargo, ND, USA) e 10 μ g de vetor pPur (BD Biosciences, Alfen a/d Rijn, Países Baixos), que confere resistência à puromicina, foram adicionados. Depois de repousar as células em gelo por 10 minutos, as células foram eletroporadas (250 V, 950 NF; Gene Pulser H, Biorad Laboratories GmbH, Munchen, Alemanha). As células foram mais uma vez repousadas em gelo e coletadas em 40 ml de RPMI (suplementado com 10 % de FCS). Depois, as células foram plaqueadas em placas de cultura de tecido de 96 reservatórios (100 μ l por reservatório). Depois de 48 horas, puromicina (concentração final: 1 μ g/ml; Sigma-Aldrich Chemie BV, Zwijndrecht, Países Baixos) foi adicionada. Os clones resistentes à puromicina foram cultivados ainda em placas de cultura de tecido de 24 reservatórios.Determinação da atividade de luciferase
[001080] A atividade de luciferase das células foi determinada usando o Sistema de Ensaio de Luciferase (#E4030, Promega, Madison, WI, USA). 1 x 106 células foram centrifugadas (13.500 rpm, 1 min) em uma centrífuga eppendorf e a pelota foi lavada em 100 μ l de PBS. Depois da centrifugação (13.500 rpm, 1 min), a pelota foi lisada com 20 μ l de Tampão de Lise Reporter (Promega), congelados e descongelados. Depois da centrifugação (13.500 rpm, 1 min), os 20 μ l de sobrenadante foram descartados e 100 μ l de reagente de ensaio de luciferase foram adicionados (em tubos de luminômetro especiais, Promega). A luminescência foi medida (10 s) em um luminômetro (LB9507, Berthold, Vilvoorde, Bélgica).
EXEMPLO 2Imunização de camundongos e geração de hibridomasProtocolo de imunização para -003
[001081] Camundongos HCo12 foram imunizados a cada quinzena com 20 μ g de HA-CD38 purificado. A primeira imunização foi realizada i.p. na presença de 100 μ l de PBS, misturados com 100 μ l de adjuvante de Freund completo (CFA). Depois desta primeira imunização, reforços subseqüentes (13x) com HA-CD38 purificado foram realizados na presença de 100 μ l de PBS, misturados com 100 μ l de adjuvante de Freund incompleto (IFA) alternando s.c. e i.p. Depois do desenvolvimento do título, os camundongos foram reforçados com 20 μ g de HA-CD38 em PBS, i.v.Protocolo de imunização para -005 e -024
[001082] Camundongos HCo12 foram imunizados a cada quinzena com 20 μ g de HA-CD38 purificado alternando com células transfectadas com NIH-3T3-CD38. A primeira imunização foi realizada com 5 x 106 células em 100 μ l de PBS, misturados com 100 μ l de CFA, i.p., a segunda imunização e as seguintes com HA-CD38 s.c., na presença de 100 μ l de PBS, misturados com 100 μ l de IFA. As imunizações seguintes com células transfectadas foram realizadas na presença de 200 μ l de PBS. Depois do desenvolvimento do título, os camundongos foram reforçados com 20 μ g de HA-CD38 em PBS, i.v.Generação de Hibridomas Que Produzem Anticorpos Monoclonais Humanos para CD38
[001083] Os esplenócitos de camundongo foram isolados a partir de camundongos HCo12 e fundidos com PEG em uma linhagem de célula de mieloma de camundongo com base em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes foram depois triados quanto a produção de anticorpo humano pelo ELISA e quanto a especificidade de CD38 usando células NS/0 transfectadas com CD38 humano pela análise de FACS e ligação de proteína HA-CD38 recombinante pelo ELISA. Três linhagens de célula de hibridoma foram selecionadas que expressam os anticorpos anti-CD38 monoclonais humanos, - 003, -005 e -024, respectivamente.
EXEMPLO 3Transfecção de células NIH com CD38
[001084] O vetor (pclpuroCD38) para produzir células NIH-3T3-CD38 foi obtido do Prof. M. Glennie (Tenovus Research Laboratory, Southampton General Hospital, Southampton, UK). As células NIH-3T3 (DSMZ, ACC 59; 150.000 células/reservatório; 0,5 ml; placas de fundo chato de 96 reservatórios, Greiner) foram cultivadas e DMEM (suplementado com glicose [4,5 g/l de FCS a 10 %, L-glutamina, Na-piruvato; BioWhittaker) por 24 h. Depois, DNA (0,8 μ g) e lipofectamina (Invitrogen, Breda, Países Baixos) foram diluídos em DMEM e misturados (20 min, temperatura ambiente). Depois disso, a mistura (100 μ l) foi adicionada a cada reservatório e incubada (durante a noite, 37°C).Triagem quanto à expressão de CD38
[001085] Células NIH-3T3-CD38 foram lavadas (em 1 ml de PBS) e tripsinizadas (200 μ l, tripsina-EDTA, BioWhittaker). Depois, 1 ml de DMEM foi adicionado e a mistura pipetada em tubos FACS. Depois da centrifugação (1200 rpm, 5 min), as células foram lavadas em Tampão de FACS (FB; PBS, 0,05 % de BSA, 0,02 % de NaN3) e recolocadas em suspensão em 1 ml de FB. Depois da centrifugação (1200 rpm, 5 min), o sobrenadante foi removido e PE anti-CD38 humano de camundongo foi adicionado (diluição1/50, Sanquin, Amsterdam, Países Baixos). Depois de lavar as células duas vezes em FB, as células foram recolocadas em suspensão em FB para a aquisição pela citometria de fluxo.
Expansão e seleção
[001086] Depois do tratamento com tripsina, as células foram transferidas para frascos T25 (Greiner) em DMEM (suplementado com glicose 4,5 g/l, 2 mM de L-glutamina e puromicina (2 μ g/ml) BioWhittaker). As células resistentes a puromicina foram testadas quanto a expressão de CD38 estável pela citometria de fluxo depois de duas semanas em meio contendo puromicina. As células NIH-3T3-CD38 selecionadas foram subclonadas pela diluição limitante. Depois de expandir estas células, todos os 15 clones NIH-3T3-CD38 foram triados quanto à expressão de CD38. As células NIH-3T3-CD38 de CD38 alto foram congeladas em nitrogênio líquido (-80°C) até o uso.Cultura de células NIH-3T3-CD38
[001087] As células são cultivadas em DMEM (suplementado com glicose (4,5 g/l), 10 % de FCS, 2 mM de L-glutamina, Na-piruvato, penicilina, estreptomicina). As células são passadas duas vezes por semana pelo uso de tripsina/EDTA e semeadas em uma concentração de 1 x 106 células/frasco T75. As células NIH-3T3-CD38 com CD38alto foram congeladas em nitrogênio líquido (-80°C) até o uso.Purificação de antígeno HA de CD38
[001088] Sepharose 4B (Amersham Bioscience, Uppsala, Suécia) foi ligado com anticorpo anti-CD38 (Serotec, Oxford, UK). A coluna (tubo de coluna HR5/20 foi empacotado até 12 cm de altura de leito, volume da coluna 2,4 ml; taxa de fluxo máxima 0,5 ml/min) foi equilibrada com pelo menos 5 volumes da coluna (CV) de PBS. A amostra foi filtrada e carregada na c oluna. A coluna foi lavada com PBS até que o sinal retornou para a referência (aproximadamente 3 CV). A eluição foi realizada com 0,1 M de glicina no pH 2. As Frações eluídas foram neutralizadas com 1 % (v/v) de Tris-HCl 2 M, pH 9.Purificação de anticorpos anti-CD38
[001089] Os anticorpos anti-CD38 humanos foram purificados a partir de sobrenadantes de cultura de tecido. Primeiro, os sobrenadantes foram filtrados em filtro sem saída de 0,20 μ M. Depois, o sobrenadante foi carregado em uma coluna de 5 ml de Proteína A (rProteína A FF, Amersham Bioscience) e eluído com ácido cítrico 0,1 M-NaOH, pH 3. O eluído foi imediatamente neutralizado com 2 M de Tris-HCl, pH 9 e dialisado O/N a 12,6 mM de fosfato de sódio, 140 mM de NaCl, pH 7,4 (B. Braun, Oss, Países Baixos). Depois as amostras de diálise foram filtradas estéreis em filtro sem saída de 0,20 μ M.Purificação de lotes de His-CD38
[001090] A proteína está presente em sobrenadante de cultura de célula de células His que expressam CD38, com uma construção de DNA contendo a seqüência para o domínio extracelular de CD38. Uma seqüência de rótulo poli-His adicional é incluída nas construções e presente no terminal N da proteína. Este rótulo possibilita a purificação com cromatografia de afinidade de metal imobilizada. Neste processo, um quelador fixo na resina cromatográfica é carregado com cátions Co2+. Particularmente, uma seqüência que inclui 6 aminoácidos de histidina liga Co2+ fortemente. Portanto as proteínas CD38 rotuladas com His ligam-se fortemente a uma tal coluna, enquanto que as outras proteínas presentes no sobrenadante de cultura fluirá através da coluna ou será retirada por lavagem. As proteínas CD38 rotuladas com His fortemente ligadas são depois eluídas com um tampão contendo imidazol, que compete com a ligação de His ao Co2+. Quando suficiente His- CD38 é purificado, o eluente é removido da proteína pela troca de tampão em uma coluna de dessalinização.
EXEMPLO 4Ligação de -003, -005 e -024 às células CHO transfectadas com CD38 (CHO- CD38), às células Daudi-luc e às células de tumor de mieloma múltiplo (MM) frescas
[001091] Depois da colheita e contagem, as células Daudi-luc, as células CHO transfectadas com CD38 e as células CHO de controle foram recolocadas em suspensão em PBS (1 x 106 células/ml). Depois, as células foram colocadas em placas de fundo V em 96 reservatórios (100 μ l/reservatório) e lavadas duas vezes em PBS-BSA (PBS suplementado com 0,1 % de BSA e 0,02 % de Na-azida). Depois disso, 50 μ l de solução de anticorpo em PBS-BSA foram adicionados às células (4°C, 30 min). Depois de lavar três vezes em PBS-BSA, 50 μ l (diluição de 1:400) de IgG-FITC anti- humano de coelho em PBS-BSA foram adicionados (4°C no escuro, 30 min). As células foram lavadas três vezes e a ligação específica de CD38-anticorpos à CHO-CD38 e células Daudi-luc foi detectada pela citometria de fluxo. HuMabKLH (um anticorpo monoclonal humano contra KLH (hemocianina do lapa buraco de fechadura) gerada pela Genmab B.V., Utrecht, Países Baixos pelo uso dos protocolos de imunização descritos aqui em outro lugar) foi usado como um controle. As Figuras 1 e 2 mostram que -003, -005 e -024 ligam-se às células CHO-CD38 e às células Daudi-luc, se bem que com EC50 diferentes (Tabela 1). Nenhuma ligação às células CHO de controle é observada (dados não mostrados).
[001092] As células de tumor MM frescas foram obtidas do Dr. Lokhorst (University Medical Center Utrecht, Utrecht, Países Baixos. As células de tumor foram isoladas da medula óssea de pacientes com mieloma múltiplo pela centrifugação de gradiente Ficoll (Bio Whittaker; meio de separação de linfócito, cat 17-829E). Depois da colheita e contagem, as células MM (100.000 células/reservatório) foram recolocadas em suspensão com 25 μ l de anticorpos específicos de CD38 rotulados com FITC e 25 μ l de CD138. Depois da incubação (4°C, 30 min), as células foram lavadas em PBS-BSA e IgG anti-camundongo de cabra rotulada com de PE (1:200; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd. Soham, UK) foi adicionada. Depois da incubação (4°C, 30 min) e lavagem das células em PBS-BSA, a fluorescência foi medida pela citometria de fluxo.
[001093] A Figura 3 mostra que -003, -005 e -024 ligam as células MM. Tabela 1 - valores EC50s da ligação de anticorpos anti CD38 em células CHO- CD38, células Daudi-luc e células de tumor de MM frescas.
Figure img0004
EXEMPLO 5Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo
[001094] As células Daudi-luc, células de tumor múltiplo de mieloma frescas, células de tumor de Leucemia de Célula Plasmática frescas e as células de mieloma múltiplo JK6L e AMO-1 foram coletadas (5 x 106 células) em RPMI (meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10 % de soro de bezerro cósmico (HyClone, Logan, UT, USA)), aos quais 100 pCi de 51Cr (Cromo-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Países Baixos) foram adicionados e a mistura foi incubada em um banho de água a 37°C por 1 hora. Depois de lavar as células (duas vezes em PBS, 1500 rpm, 5 min), as células foram recolocadas em suspensão em RPMI + + e contadas pela exclusão em azul de tripan. As células foram levadas à concentração de 1 x 105 células/ml.Preparação de células efetoras
[001095] As células mononucleares do sangue periférico frescas (voluntários saudáveis, UMC Utrecht, Utrecht, Países Baixos) foram isoladas de 40 ml de sangue heparinizado pelo Ficoll (Bio Whittaker; meio de separação de linfócito, cat 17-829E) de acordo com as instruções do fabricante. Depois de recolocar em suspensão as células em RPMI++, as células foram contadas pela exclusão em azul de tripano e levadas à concentração de 1 x 107 células/ml.
Ajuste ADCC
[001096] 50 μ l de células alvo rotuladas com 51Cr foram pipetadas emplacas de 96 reservatórios e 50 μ l de anticorpo foram adicionados, diluídos em RPMI + + (concentrações finais 10, 1, 0,1, 0,01 μ g/ml). As células foram incubadas (temperatura ambiente, 15 min) e 50 μ l de células efetoras foram adicionados, resultando em uma razão de alvejamento efetor de 100:1 (para a determinação de lise máxima, 100 μ l de Triton-X100 a 5 % foram adicionados ao invés das células efetoras; para a determinação da lise espontânea, 50 μ l de células alvo e 100 μ l de RPMI++ foram usados). As células foram giradas (500 rpm, 5 min) e incubadas (37°C, 5 % de CO2, 4 horas). Depois de girar as células (1500 rpm, 5 min), 100 μ l de sobrenadante foram colhidos em tubos micrônicos e contados em contador gama. A porcentagem de lise específica foi calculada como segue:
[001097] (cpm amostra - cpm células alvos apenas)/(cpm lise máxima - cpm células alvos apenas) em que cpm é contagem por minuto.
[001098] Em células Daudi-luc (Figura 4 e Tabela 2) -003, -005 e -024 induzem a lise pela ADCC e -003 e -005 desempenham levemente melhor do que rituximab (mAb anti-CD20). Interessantemente, também quando células de tumor de mieloma múltiplo frescas (obtidas do Dr. H. Lokhorst, UMCU, Países Baixos) são usadas como células alvo, ADCC é induzida por -003, - 005 e -024 (Figura 5A e Tabela 2).Tabela 2 - Valores de EC50 de anticorpos específicos de CD38 obtidos emADCC
Figure img0005
Enriquecimento de células mononucleares do sangue periférico human Erlangen
[001099] Sangue humano de voluntários humanos (University Erlangen, Erlangen, Alemanha) foi diluído duas vezes em RPMI 1640 e as células sangüíneas foram dispostas em camadas em Ficoll (Meio de separação de linfócito 1077 g/ml, 710 g, temperatura ambiente, 20 min; BioWhittaker, Cambrex Bio Science Verviers, Verviers, Bélgica, cat. 17-829E, lote no. 0148 32). As células mononucleares de sangue periférico (MNCs) foram coletadas da interfase, lavadas e recolocadas em suspensão em meio de cultura de RPMI 1640 suplementado com 10 % de FCS, 2 mM de L-glutamina, 5 U/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina (todas derivadas de BioWhittaker) ao qual 25 mM de HEPES (BioWhittaker) foi adicionado.
Ajuste ADCC II
[001100] As células B alvo (células de tumor de leucemia de célula plasmática frescas, linhagens de célula B JK6L e AMO-1, obtidas do Dr. T. Valerius, University of Erlangen, Erlangen, Alemanha) foram rotuladas com 20 μ Ci de 51Cr (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) por 2 horas. Depois de lavagem extensiva em RPMI-10, as células foram ajustadas a 1 x 105 células/ml. MNCs (50 μ l), anticorpos sensibilizadores (50 μ l) e RPMI-10 (50 μ l) foram adicionados às placas de microtítulo de fundo redondo (Greiner Bio-A GmbH, Frickenhausen, Alemanha). Os ensaios foram iniciados pela adição de células de tumor de leucemia de célula plasmática frescas, células JK6L ou AMO-1 (50 μ l) dando um volume final de 200 μ l. Uma razão de efetor para alvejador (E:T) de 40:1 foi usada. Depois da incubação (3 horas, 37°C), os ensaios foram interrompidos pela centrifugação e a liberação de 51Cr a partir de triplicatas foi medida em contagens por minuto (cpm) em um contador de cintilação. A porcentagem de citotoxicidade celular foi calculada usando a seguinte fórmula:% de lise específica = (cpm experimental - cpm basal)/(cpm máximo - cpm basal) x 100com a liberação de 51Cr máxima determinada pela adição de ácido perclórico (3 % da concentração final) para alvejar as células e a liberação basal foi medida na ausência de anticorpos sensibilizantes e células efetoras.
[001101] Em ambas as linhagens de célula de mieloma múltiplo (isto é JK6L e AMO-1), a lise é induzida tanto com -003 quanto com -005 (Figuras 6 e 7), mesmo quando a expressão de CD38 é baixa (linhagem de célula AMO- 1).
[001102] -003, -005 e -024 induzem ADCC de células de tumorprimário de leucemia de célula plasmática (Figura 5B).
EXEMPLO 6Citotoxicidade dependente de complemento
[001103] Depois da colheita e contagem de células Daudi-luc, a viabilidade das células deve ser de 90 %. Depois da lavagem (PBS), as células são recolocadas em suspensão a 2,0 x 106 células/ml em RPMI-B (RPMI suplementado com 1 % de BSA). Depois disso, as células são colocadas em placas de fundo redondo de 96 reservatórios a 1 x 105 células/reservatório (50 μ l/reservatório). Depois, 50 μ l de anticorpos são adicionados aos reservatórios (faixa de concentração final entre 0 e 100 μ g/ml (diluições em RPMI-B)). Depois da incubação (temperatura ambiente, 15 min), 11 μ l de soro humano reunido (reunião de 18 doadores saudáveis) foram adicionados a cada reservatório (37°C, 45 min). Os reservatórios foram recolocados em suspensão uma vez e 120 μ l foram transferidos para tubos FACS (Greiner). Depois, 10 μ l de iodeto de propídio (PI; Sigma-Aldrich Chemie B.V.) foram adicionados (10 ug/ml de solução) a esta suspensão. A lise foi detectada pela citometria de fluxo (FACScalibur®, Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) pela medição da porcentagem de células mortas (corresponde a células positivas em PI).
[001104] A Figura 8 e a Tabela 2 mostram que a lise de células Daudi- luc é induzida por -005 (~60 % de lise máxima) e que a lise por -003 é apenas observada em concentrações de anticorpo muito altas. -024 não induz CDC em células Daudi (dados não mostrados). Em células CHO-CD38, a lise é induzida tanto por -003, -005 quanto -024 (Figura 9 e Tabela 3). A lise por - 003 é induzida em concentrações mais altas. Em células de tumor (todas obtidas do Dr. Lokhorst e Dr. Bloem, University Medical Center Utrecht, Países Baixos), obtidas de pacientes MM diferentes (A: células de tumor refratárias a 3 %, B: células de tumor refratárias a 9 %, C: células de tumor de 30 a 40 % e D: células de tumor a 70 %), a lise mediada por CDC é observada na presença de -005, mas não na presença de -003 (Figura 10). -024 também induziu a lise de células de tumor MM (Figura 10E).Tabela 3 - valores EC50 de anticorpos específicos de CD38 obtidos em CDCanticorpos específicos de CD38 EC50 Daudi-luc EC50 CD38-CHO
Figure img0006
EXEMPLO 7Estudos de bloco cruzado usando FACS
[001105] As células CHO-CD38 foram incubadas com um excesso de anticorpo específico de CD38 não rotulado (4°C, 15 min). Depois, as células foram incubadas com anticorpos específicos de CD38 rotulados com FITC (a concentração aproxima-se de EC90, 4°C, 45 min). Depois de lavar duas vezes as células com PBS-BSA, a fluorescência foi medida pela citometria de fluxo. A Figura 11 mostra que -003 não rotulado bloqueia a ligação de -003 rotulado com FITC, ao passo que a ligação de -005 rotulado com FITC não é bloqueada. Também -005 não rotulado bloqueia a ligação de -005 rotulado com FITC, ao passo que a ligação de -003 rotulado com FITC não é bloqueado. -003 e -005 liga-se a epítopos diferentes, porque eles não competem quanto à ligação.
EXEMPLO 8Estudos de bloqueio cruzado usando ELISA
[001106] CD38 humano solúvel é revestido na superfície de uma placa de ELISA. revestida com CD38 é incubada com um excesso de anticorpos específicos de CD38 não rotulado por cerca de 15 minutos e subseqüentemente anticorpos específicos de CD38 biotinilados são adicionados (a concentração aproxima-se de EC90, temperatura ambiente, 1 hora). Depois de lavar três vezes com PBS/Tween, a estreptavidina conjugada a rábano peroxidase (HRP) é adicionada e a mistura é incubada por 1 hora na temperatura ambiente. O complexo pode ser detectado pela adição de uma solução de ABTS e a conversão de substrato mediada por HRP é medida usando um leitor de ELISA na OD 405 nm.
EXEMPLO 9Estudos de bloqueio cruzado usando ELISA intercalado
[001107] Os anticorpos específicos de CD38 são revestidos na superfície de uma placa de ELISA. Os anticorpos ligados às placas são incubados com CD38 solúvel biotinilado na presença de um excesso de anticorpos específicos de CD38 na fase fluídica. Depois de lavar com PBS/Tween, CD38 biotinilado ligado é detectado com estreptavidina conjugada com HRP por 1 hora na temperatura ambiente. Este complexo pode ser detectado pela adição de uma solução de ABTS (depois de lavar com PBS/Tween) e a conversão de substrato mediada por HRP é medida usando uma leitora de ELISA na OD 405 nm.
EXEMPLO 10Reatividade com um painel de tecidos humanos e reatividade cruzada com tecido cinomolgo pela imunoistoquímica
[001108] As seções de tecido humano congelado (obtida do Dr. H. Niessen, Free University Medical Center, Amsterdam, Países Baixos) ou tecido de macaco (Inveresk Research, Glasgow, Escócia) foram cortadas às 6 pm e secadas ao ar durante a noite. Estas seções criostáticas foram fixadas em acetona (temperatura ambiente, 10 min) e secada ao ar (aprox. 5 min). Depois disso, as seções foram incubadas com 1x de tampão de ácido cítrico/fosfato contendo 0,1 % de H2O2 (pH 5,8; Sigma), para bloquear peroxidase endógena. Depois de 20 min na temperatura ambiente, as seções foram lavadas duas vezes com PBS e 0,05 % de Tween-20 (PBST, temperatura ambiente, 5 min; Riedel de-Haen, Alemanha). Depois, as seções foram incubadas com avidina (temperatura ambiente, 15 min; DAKO, Glostrup, Dinamarca), lavada duas vezes com PBST e incubadas com biotina (temperatura ambiente, 15 min; DAKO) para bloquear biotina endógena. Depois de lavar as seções duas vezes com PBST, as seções foram pré-incubadas com PBST’ (PBST suplementado com 10 % de soro humano normal (NHS, CLB, Amsterdam, Países Baixos) e 10 % de soro de cabra normal (NGS; DAKO) (temperatura ambiente, 20 min). Depois do manchamento do soro na pre-incubação, as seções foram incubadas com anticorpo primário rotulado com FITC diluído em 2 % de PBST++ nas concentrações indicadas (temperatura ambiente, 60 min). Depois disso, as seções foram incubadas com anti-FITC de coelho (1:1000; DAKO) em 2 % de PBST++ (temperatura ambiente, 30 min). Depois de lavar as seções com PBST, as seções foram incubadas com cabra-anti-coelho-biotina (1:400; DAKO) em 2 % de PBST++ (temperatura ambiente, 30 min). Depois, as seções foram lavadas e incubadas com SABC-HRP (1:100; DAKO) em 2 % de PBST++ (temperatura ambiente, 30 min). Depois de lavar as seções duas vezes em PBST, estas foram incubadas (temperatura ambiente, 10 min) com amino-etil-carbazol solução de desenvolvimento de (AEC) (50 mM de tampão de acetato, pH 4,9, 0,01 % de H2O2; Riedel-de-Haen). Finalmente, as seções foram lavadas em millipore H2O (5 min) e contra tingida com hematoxilina (DAKO). Pelo uso de glicergel (37°C), as seções foram fixadas com lamínulas de cobertura e estudadas pelo microscópio ótico (Axiovision- 2; Zeiss, Thornwood, NY, USA).
[001109] O epitélio brônquico é tingido com -003 e -005 (Figuras 12B e 13B) assim como o músculo estriado (miócitos, Figuras 12C e 13C), macrófagos, linfócitos e células B plasmáticas (Figuras 12A e 13A). -024 tem um tingimento similar de músculo estriado e epitélio brônquico, mas o tingimento foi menos intenso. Nenhum tingimento de células endoteliais é observado, nem com -003 (Fig 14D), -005 (14E) nem -024 (dados não mostrados), ao passo que tingimento evidente foi observado com os anticorpos positivos de controle contra marcadores de célula endotelial CD31 (Fig 14A) e vWF (14B). Anti-KLH foi usado como anticorpo de controle negativo (Fig 14C). -003 (Figura 12D) e -024 (dados não mostrados) mas não -005 (Figura 13D) reagem cruzado com tecido linfóide de macaco cinomolgo. EXEMPLO 11Reatividade cruzada com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de macaco cinomolgo ou rhesus pela citometria de fluxo
[001110] 5 ml de sangue periférico de macaco cinomolgo (InvereskResearch) foram lisados pela adição de 4,5 ml de tampão de choque (1,7 mM de NH4Cl, 1 mM de EDTA), 40 ml de H2O e 450 μ l de KHCO3 a 10 %. Depois da hemólise as células foram centrifugadas (1200 rpm, 10 min) e lavadas três vezes em PBS. Depois da contagem das células com azul de tripano, as células foram recolocadas em suspensão em PBS-BSA (1 x 106 células/ml).
[001111] 17,5 ml de sangue periférico de macaco rhesus (BPRC,Rijswijk, Países Baixos) foram diluídos 1:1 com RPMI 1640 e dispostos em camadas em Ficoll (1,077 g/ml; BioWhittaker, cat. 17829E, lote no. 0148 32). Depois da centrifugação (710 g, temperatura ambiente, 20 min), a interfase foi coletada e lavada duas vezes em RPMI. Depois da última lavagem as células foram recolocadas em suspensão em RPMI 1640 a uma concentração de 1 x 105 células/50 μ l.
[001112] As células foram transferidas para placa de 96 reservatórios (100.000 PBMCs/reservatório), lavadas em tampão FACS (PBS, 0,05 % de BSA, 0,02 % de NaN3) e incubadas com os anticorpos primários (4°C, 30 min). Depois de lavar em PBS-BSA, 50 μ l de rb-anti-hIgG rotulado com FITC (DAKO, Glostrup, Dinamarca) foram adicionados (4°C, 30 min). Finalmente, as células foram coletadas em tubos FACS em um volume total de 150 μ l. As amostras foram medidas e analisadas pelo uso de FACScalibur® (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA).
[001113] Com a citometria de fluxo a reatividade cruzada de -003 em linfócitos (Figura 15A) e monócitos (Figura 15B) cinomolgos foi mostrada, mas não a de -005. Também em macacos rhesus, a reatividade cruzada de - 003 foi observada em células mononucleares, mas não de -005 (Figura 15C). EXEMPLO 12
Experimentos de Internalização
[001114] Células CHO-CD38 foram tingidas com uma concentração saturante de anticorpos específicos de CD38 rotulados com FITC (em gelo, 30 min). Depois da lavagem das células (em RPMI1640 suplementado com 10 % de FCS), uma reunião de célula foi aquecida a 37°C para permitir a internalização e a outra reunião foi deixada em gelo. Em diversos intervalos de tempo (0 a 120 min) alíquotas de célula foram tomadas e transferidas para PBS-BSA gelado para interromper a internalização. Depois de lavar as amostras duas vezes com PBS-BSA, EtBr (diluído em PBS-BSA, concentração final de 2 mg/ml) foi adicionada às amostras para extinguir o FITC ligado à membrana. A fluorescência foi medida pela citometria de fluxo.
[001115] As Figuras 16A e 16B mostram que -003 e -005 são internalizadas pelas células CHO-CD38 dentro de 5 minutos a 37°C.
EXEMPLO 13Experimentos de SCID-luciferase In vivo
[001116] Neste modelo as células de tumor são transfectadas com luciferase de vaga-lume. Na administração de luciferina (Molecular Probes, Leiden, Países Baixos) aos camundongos as células rotuladas podem ser detectadas in vivo pela formação de imagem bioluminescente usando uma câmera de CCD altamente sensível, cf. Wetterwald et al., American Journal of Pathology 160(3), 1143-1153 (2002).
[001117] As células Daudi foram transfectadas com gWIZ luciferase da Gene Therapy Systems (San Diego, CA) e cultivadas em RPMI com 10 % de FCS, Pen/Strep, Piruvato de Sódio e 1 μ g/ml de puromicina (Sigma). As células foram analisadas quanto a expressão da luciferase (expressada em RLU/1 x 105 células) em um luminômetro e quanto a expressão de CD38 por FAGS. 2,5 x 106 células Daudi transfectadas pela luciferase/camundongo foram injetadas i.v. em camundongos SCID. Os camundongos foram tratados com -003, -005, anticorpo de controle de isótipo (HuMab-KLH) ou rituximab (anticorpo anti-CD20). Os anticorpos foram injetados intraperitonealmente. Quatro ajustes de tratamento foram usados (ver a Tabela 4). No cenário preventivo, o anticorpo (100 μ g/camundongo) e as células foram administradas simultaneamente. No cenário terapêutico I, o anticorpo (300 μ g/camundongo) foi administrado 7 dias depois da administração das células. No cenário terapêutico II, o anticorpo (10 μ g/camundongo) foi administrado 14 dias depois da administração das células. No cenário terapêutico III, o anticorpo (100 μ g/camundongo) foi administrado 7 dias depois da administração das células. Para a formação de imagem, os camundongos foram anestesiados pela injeção i.p. de uma mistura de cetamina/xilazina/atropina. D-Luciferina sintética (sal de sódio, Molecular Probes) foi dada i.p. em uma dose de 25 mg/ml. Os camundongos foram depois colocados em uma caixa firme leve e depois de 3 min, a formação de imagem foi iniciada usando um detector de CCD esfriado com nitrogênio líquido VersArray 1300B (Roper Scientific). Os fótons emitidos da luciferase foram contados em um período de exposição de 5 min. Sob iluminação imagens pretas e brancas foram feitas por referência. O software MetaVue (Universal Imaging Corp) foi usado para a coleta de dados e a análise de imagem. A significância estatística de diferenças entre grupos foi estabelecida usando análise de uma via de variação com um pós teste de Newman-Keuls usando GraphPad PRISM versão 3.02 (Graphpad Software Inc).Tabela 4 - Cenários de tratamento para os experimentos de luciferase in vivo
Figure img0007
[001118] As Figuras 17A e 17B mostram que -003 e -005 inibem o crescimento de células de tumor no cenário preventivo e no cenário terapêutico I, similar à inibição observada para o anticorpo anti-CD20. Ambos os anticorpos representaram significantemente melhor do que o anticorpo controle de isótipo. Também no cenário terapêutico II os anticorpos CD38 retardaram o crescimento de células de tumor Daudi-luc (Figura 17C). No cenário terapêutico III, -003 e -024 mostram uma inibição evidente de crescimento da célula de tumor Daudi-luc (Figura 17D).
EXEMPLO 14Apoptose
[001119] O ensaio de apoptose foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (Annexin-V Apoptose kit, BD Biosciences, Alfen a.d. Rijn, Países Baixos). Em resumo, mAbs de CD38 foram adicionados a 2,5 x 105 células (células Daudi transfectadas com luciferase, em 0,5 ml de RPMI++ em uma placa de 24 reservatórios), em uma concentração de 5 μ g/ml -003 ou -005 ou um anticorpo anti-CD20 sozinho ou na presença de bloqueador cruzado rb-anti-hlgG (50 pg/ml).
[001120] Depois da incubação (37°C, 5 % de CO2, 20 horas), as células foram colhidas cuidadosamente e lavadas com Tampão de Ligação (1200 rpm, 4°C, 5 min, BD Biosciences). A pelota foi recolocada em suspensão em 100 μ l de Tampão de Ligação. Depois, 5 μ l de Annexin-V-FITC (BD Biosciences) e 10 μ l de PI (BD Biosciences) foram adicionados à suspensão e incubados por 15 minutos na temperatura ambiente. 400 μ l de Tampão de Ligação foram adicionados e as amostras foram medidas (leitura de PI em FL2). Para a análise de células apoptópticas, todas as células positivas em Annexin-V foram contadas pela citometria de fluxo usando um citômetro de fluxo FACScalibur com software CellQuest pro (BD Biosciences). Pelo menos 10.000 eventos foram coletados para a análise. Esta população inclui tanto células positivas em PI quanto negativas em PI.
[001121] A Figura 18 mostra que -003 e -005 não induzem a apoptose. Entretanto, depois da reticulação, a apoptose de células alvo é observada. -003 induziu a apoptose depois da reticulação que foi similar à apoptose induzida por um anticorpo anti-CD20 (rituximab). -005 foi menos capaz de induzir a apoptose depois da reticulação. Resultados similares foram obtidos com células RAMOS como células alvo (dados não mostrados).
EXEMPLO 15Efeito de -005 sobre as células B de enxerto de tecido em modelo de camundongo RA-SCIDImplantação de tecido sinovial
[001122] Os camundongos SLID, cepa C.B.-17/IcrCrl-SCID-bg, macho / fêmea, 4 a 12 semanas, adquirido da Charles River Laboratories Holanda (Maastricht, Países Baixos) foram mantidos em gaiolas IVC sob condições padrão de temperatura e luz e foram alimentados com ração de laboratório e água ad libitum. Antes da implantação, os camundongos (três camundongos em cada grupo experimental, dia 0) foram anestesiados pela injeção intraperitoneal de cetamina (NIMATEK, EuroVet) e xilazina (Rompun, Bayer) na razão de 1:1. Uma incisão pequena da pele foi feita usando tesouras cirúrgicas. O tecido sinovial inflamado de um paciente com artrite reumatóide que passa pela cirurgia de substituição da junta foi implantado subcutaneamente como um grupo de seis fragmentos pequenos (total de 2 a 3 mm3) em cada flanco do camundongo. O ferimento foi fechado usando cola de cianoacrilato Permacol. No dia 1 do experimento, o tecido sinovial remanescente foi analisado de modo a checar quanto as células B nos transplantes sinoviais inflamados. -005 (12 mg/kg) ou anticorpo de controle (anti-KLH, 30 mg/kg) foram injetados (i.v.), em um volume de 200 μ l no dia 8 do experimento. No final do experimento (dia 14) os camundongos foram sacrificados pela inalação de CO2 e os enxertos sinoviais foram explantados. Um dos enxertos foi subitamente congelado em composto OCT (TecidoTek, Sacura Finetek Europe) para outras análises imunistoquímicas e o outro foi congelado pela imersão em nitrogênio líquido para outra análise de RNA.
Imunoistoquímica
[001123] 5 μ M de criosseções em lâminas SuperFrost (Menzel GmbH,Braunschweig) foram preparados usando criostato LEICA CM1900 e armazenados a -80°C. As seções descongeladas foram fixadas em acetona por 10 min, secadas na temperatura ambiente e lavadas 3 x 5 min em PBS. Todas as etapas foram realizadas na temperatura ambiente. A atividade de peroxidase endógena foi bloqueada pela incubação com PBS suplementado com 0,3 % de peróxido de hidrogênio e 0,1 % de azida de sódio por 20 min. As lâminas foram lavadas 3 x 5 min em PBS e incubadas com 10 % de soro humano normal (NHS) / 10 % de soro de coelho normal (NRbS) em PBS / 1 % de BSA por 30 min. Em seguida, anticorpo primário (mAb de camundongo) diluído em PBS suplementado com 1 % de BSA / 10 % de NHS / 10 % de NRbS foi incubado por 60 min. Depois das lavagens 3 x 2 min em PBS, HRP-conjugado (Ig-HRP anti-camundongo de cabra; DAKO PO447) diluído 1:50 em PBS (suplementado com 1 % de BSA / 10 % de NHS / 10 % de NRbS) foi adicionado por 30 min. o sinal de peroxidase foi realçado usando o sistema ISA® Biotin (Perkin Elmer Life Sciences, NEL700). As lâminas foram lavadas 3 x 2 min em PBS e incubadas com biotinil tiramida diluído 1:1600 em tampão de amplificação por 30 min. Depois das lavagens 3 x 2 min em PBS, estreptavidina-HRP diluído 1:400 em PBS (suplementado com 1 % de BSA) foi adicionado por 30 min. As lâminas foram lavadas 3 x 2 min em PBS e incubadas com solução de DAB (DAKO Cytomation K3465) por 5 min. A reação de cor foi interrompida com água destilada. Finalmente, as lâminas foram contra-tingidas com hematoxilina (MERCK), lavada com água corrente e coberta com glicerina de Kaiser e lamínulas de cobertura.Contagemm da intensidade de tingimento
[001124] A contagem de xenoenxertos de tecido sinovial tingidos foi realizada em uma maneira às cegas por duas pessoas treinadas. Primeiro a seção mais forte foi selecionada de uma série de seções e esta seção de referência foi concedida a pontuação máxima de 8. A intensidade de tingimento nas outras seções foi depois classificada em uma escala de 0 a 8, em relação à seção de referência.
Análise estatística
[001125] A contagem da intensidade de tingimento foi analisada pelo Kruskal-Wallis one-way ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn usando Graph Pad Prism versão 4.01 (Graph Pad software, Inc., San Diego, CA, USA).
[001126] A Figura 19 e a Figura 21 mostram que os números de células plasmáticas anti-CD38-positivas são reduzidas depois do tratamento com - 005. O tingimento de células plasmáticas com anti-CD138 confirma que -005 resulta em números reduzidos de células plasmáticas (Figuras 20 e 22).EXEMPLO 16Seqüenciamento da seqüência codificadora de anticorpos humanos contra CD38Preparação de RNA
[001127] O RNA total foi preparado a partir de 5 x 106 células das linhagens de célula de hibridoma que expressam os anticorpos monoclonais - 003, -005 e -024, respectivamente, com o kit RNeasy (Qiagen, Westburg, Leusden, Países Baixos) de acordo com o protocolo do fabricante.Preparação de cDNA de -003, -005 e -024
[001128] O DNA complementar 5’-RACE (cDNA) de RNA foi preparado a partir de 100 ng de RNA total, usando o Kit de Amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech), seguindo o protocolo do fabricante.
[001129] Os iniciadores de oligonucleotídeo foram sintetizados e quantificados pela lsogen Bioscience (Maarssen, Países Baixos). Os iniciadores foram dissolvidos em H2O para 100 μ mol/μ l e armazenados a - 20°C. Um resumo de toda a PCR e iniciadores de seqüenciamento está tabulado (Tabela 5). Para a PCR, PfuTurbo® Hotstart DNA polimerase (Stratagene, Amsterdam, Países Baixos; produto # 600322) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Cada mistura de reação conteve 200 μ M de dNTPs misturados (Roche Diagnostics, Almere, Países Baixos; produto # 1814362), 12 μ mol do iniciador reverso (RACEGIAI para VH3003- 005, RACEVHApaI para VH3003-003 e RACEVLBsiWI para V13003-003 e 005), 7,2 μ mol de UPM-Mix (UPM-Mix: 2 μ M de ShortUPMH3 e 0,4 μ M de LongUPMH3), 0,6 μ l do padrão de 5’RACE cDNA e 1,5 unidade de PfuTurbo® Hotstart DNA polimerase em tampão de reação de PCR (fornecido com a polimerase) em um volume total de 30 μ l. As reações de PCR foram realizadas com um Termociclador TGradient 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Alemanha; produto # 050-801) usando um programa de 35 ciclos: desnaturação a 95°C por 2 min; 35 ciclos de 95°C por 30 s, um 55°C por 30 s e 72°C por 1,5 min; extensão final a 72°C por 10 min. Se apropriado, as misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até análise ou processamento adicional.Tabela 5 - Iniciadores
Figure img0008
Clonagem de -003-2F5 VH e VI. e -005 Vs e -024 VH e V no Sistema deVetor pGEMT II
[001130] Os produtos de reação foram separados pela eletroforese em um gel de agarose a 1 % de TAE e tingido com brometo de etídio. As faixas do tamanho correto foram cortadas a partir dos géis e o DNA foi isolado do agarose usando o kit de extração em gel Qiaexll (Qiagen, cat no 20021).
[001131] Os fragmentos de PCR isolados em gel foram de cauda A por uma incubação de 10 min a 72°C com 200 μ M de dATP e 2,5 unidades de Amplitaq (Perkin Elmer) e purificados usando colunas minielute (Qiagen). Os fragmentos de PCR de cauda A foram clonados no vetor pGEMTeasy (Promega) usando o kit e protocolo do sistema de vetor pGEMT easy II (LJ270, páginas 3/4). 2 μ l da mistura de ligação foi transformada em OneShot Dli5aT1R competent E.Coli (Invitrogen) e plaqueada em placas LB/ Amp/IPTG/Xgal.
Seqüenciamento
[001132] As regiões V de -003 e -024 e a região VL de -005 foram seqüenciadas pelo AGOWA (Berlin, Alemanha) depois escolhidas respectivamente 20 (VH-003), 16 (VL-003), 15 (VL-005) e 6 (VH e VL -024) colônias brancas, isolação de plasmídeo e seqüenciamento com o iniciador reverso M13. A região VH de -005 foi seqüenciada diretamente no produto de PCR usando-se iniciador HCseq5. As seqüências foram analisadas usando o Vetor NTI advanced suite (Invitrogen).Geração dos vetores de expressão para os anticorpos -003, -005, -024 e anticorpo 3079 de Morphosys
[001133] A região que codifica VH de -003 foi amplificada pela PCR a partir de um clone plasmídico pGemT contendo a região VH de -003, usando os iniciadores VH3003-003for e RACEVHApaI, introduzindo sítios de restrição adequados (HindIII e ApaI) para a clonagem em pConG1f0,4 (Lonza Biologics, Slough, UK) e uma seqüência Kozak ideal (GCCGCCACC). O vetor pConG1f0.4 contém a região constante de cadeia pesada de IgG1 humana. O fragmento de PCR VH foi inserido, na matriz, no vetor pConG1f0.4 usando HindIII e ApaI. A construção foi checada pela análise de seqüência.
[001134] A região que codifica VH de -005 foi amplificada pela PCR a partir de um clone plasmídico pGemT contendo a região VH de -005, usando os iniciadores VH3003-5for e RACEVHApaI, para introduzir sítios de restrição adequados (HindIII e ApaI) para a clonagem em pConG1f0,4 e uma seqüência Kozak ideal. O fragmento de PCR VH foi inserido, na matriz, no vetor pConG1f0.4 usando HindIII e ApaI. A construção foi checada pela análise de seqüência.
[001135] A região que codifica VH de -024 foi amplificada pela PCR a partir de um clone plasmídico de pGemT contendo a região VH de -024, usando os iniciadores VH300324exfor e RACEVHApaI, para introduzir sítios de restrição adequados (HindIII e ApaI) para a clonagem em pConG1f0.4 e uma seqüência Kozak ideal. O fragmento de PCR VH foi inserido, na matriz, no vetor pConG1f0.4 usando HindIII e ApaI. A construção foi checada pela análise de seqüência.
[001136] A região que codifica VH de anticorpo 3079 de Morphosys foi sintetizada pelo GeneArt (Regensburg, Alemanha), com base nos dados publicados na patente WO 2005/103083 A2. A região codificadora foi otimizada no códon quanto a expressão em células HEK para realçar os níveis de expressão e os sítios de restrição adequados (HindIII e ApaI) para clonar no pConG1f0.4 e uma seqüência Kozak ideal foi introduzida. O plasmídeo contendo a região VH sintética foi digerida com ApaI e HindIII e o fragmento VII foi inserido, na matriz, no vetor pConG1f0.4.
[001137] A região codificadora VL de -005 foi amplificada pela PCR a partir de um clone plasmídico pGemT contendo a região VL de -005, usando os iniciadores VL3003-5exfor e RACEVLBsiWI, para introduzir sítios de restrição adequados (HindIII e Pf123II) para a clonagem no pConKappa0,4 (Lonza Biologics) e uma seqüência Kozak ideal. O vetor pConKappa0.4 contém a região constante de cadeia leve capa. O fragmento de PCR VL foi inserido, na matriz, no vetor pConKappa0.4 usando HindIII e Pf123II. A construção foi checada pela análise de seqüência.
[001138] A região codificadora VL de -003 foi amplificada pela PCR a partir de um clone plasmídico pGemT contendo a região VL de -003, usando os iniciadores VL3003-003for e RACEVLBsiW1, para introduzir sítios de restrição adequados (HindIII e Pf123II) para a clonagem no pConKappa0.4 e uma seqüência Kozak ideal. O fragmento de PCR VL foi inserido, na matriz, no vetor pConKappa0.4 usando HindIII e Pf123II. A construção foi checada pela análise de seqüência.
[001139] A região codificadora VL de -024 foi amplificada pela PCR a partir de um clone plasmídico pGemT contendo a região VL de -024, usando os iniciadores VL3003-24-5exfor e RACEVLBsiWI, para introduzir sítios de restrição adequados (HindIII e Pf123II) para a clonagem no pConKappa0.4 e uma seqüência Kozak ideal. O fragmento de PCR VL foi inserido, na matriz, no vetor pConKappa0.4 usando HindIII e Pf123II. A construção foi checada pela análise de seqüência.
[001140] A região codificadora VL de anticorpo 3079 de Morphosys foi sintetizado pela GeneArt, com base nos dados publicados na WO 2005/103083. A região codificadora foi otimizada no códon quanto a expressão em células HEK; para realçar níveis de expressão e sítios de restrição adequados (HindIII e Pf123II) para a clonagem no pConKappa0.4 e uma seqüência Kozak ideal foi introduzida. O plasmídeo, contendo a região VL sintética, foi digerido com Pf123II e HindIII e o fragmento VH foi inserido, na matriz, no vetor pConKappa0.4.
[001141] Os anticorpos foram transitoriamente expressados em células HEK-293F, como descrito no Exemplo 17, pela cotransfecção de seus vetores de cadeia pesada e cadeia leve.Geração de linhagens de célula estáveis em células CHO-K1 SV
[001142] Para a geração de linhagens de célula estáveis, os vetores de cadeia pesada e leve de -003 ou -005 foram combinados em um único vetor de gene duplo pelas técnicas de clonagem padrão.
[001143] Os vetores de gene duplo de -003 ou -005 foram linearizados e transfectados em células CHO-K1 SV (Lonza Biologics), essencialmente como descrito pelo fabricante. As linhagens de célula estáveis foram selecionadas pela seleção com 25 μ M de L-Metionina sulfoximina (MSX) como descrito por Lonza Biologics. Os clones que produzem Top foram selecionados e propagados em CD-CHO (Invitrogen) O meio e os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura de célula como descrito no Exemplo 3.
EXEMPLO 17Mapeamento de epítopo usando a mutagênese direcionada ao sítio
[001144] Os iniciadores de oligonucleotídeo foram sintetizados e quantificados pela Isogen Bioscience (Maarssen, Países Baixos). Os iniciadores foram dissolvidos em H2O a 100 μ mol/μ l e armazenados a -20°C. Um resumo de toda a PCR e iniciadores de seqüenciamento é mostrado na Tabela 6. Para a PCR, PfuTurbo® Hotstart DNA polimerase (Stratagene, Amsterdam, Países Baixos) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Cada mistura de reação conteve 200 μ M de dNTPs misturados (Roche Diagnostics, Almere, Países Baixos), 10 μ mol tanto do iniciador avançado quanto reverso, 100 ng de DNA genômico ou 1 ng de DNA plasmídico e 1 unidade de PfuTurbo® Hotstart DNA polimerase em tampão de reação de PCR (fornecidos com a polimerase) em um volume total de 20 μ l. As reações de PCR foram realizadas com um Termociclador TGradient 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Alemanha) usando um programa de 32 ciclos: desnaturando a 95°C por 2 min; 30 ciclos de 95°C por 30 s, um gradiente de 60 a 70°C (ou uma outra temperatura de recozimento específica) por 30 s e 72°C por 3 min; extensão final a 72°C por 10 min. Se apropriado, as misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até análise ou processamento adicionais.
[001145] A eletroforese em gel de agarose foi realizada de acordo com Sambrook (Sambrook, Russell et al. 2000) usando géis de 50 ml, em 1 x tampão de Tris Acetato EDTA. O DNA foi visualizado pela inclusão de brometo de etídio no gel e as observação sob luz UV. As imagens em gel foram registradas por uma câmera de CCD e um sistema de análise de imagem (GeneGnome; Syngene, por intermédio de Westburg B.V., Leusden, Países Baixos).
[001146] A purificação dos fragmentos de PCR desejados foi realizada usando um Kit de Purificação de PCR MinElute (Qiagen, por intermédio de Westburg, Leusden, Países Baixos; produto # 28006), de acordo com as instruções do fabricante. O DNA isolado foi quantificado pela espectroscopia de UV (ver abaixo) e a qualidade foi avaliada pela eletroforese em gel de agarose.
[001147] Alternativamente, a PCR ou os produtos de digestão foram separados pela eletroforese em gel de agarose (por exemplo quando fragmentos múltiplos estavam presentes) usando um gel de Acetate EDTA agarose a 1 % de Tris. O fragmento desejado foi excisado do gel e recuperado usando o Kit de Extração em Gel QIAEX II (Qiagen; produto # 20051), de acordo com as instruções do fabricante.
[001148] A densidade óptica de ácidos nucleicos foi determinada usando um Espectrômetro NanoDrop ND-1000 (Isogen Life Science, Maarssen, Países Baixos) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida pela análise da densidade óptica (OD) a 260 nm (um unidade de OD260nm = 50 μ g/ml). Para todas as amostras, o tampão em que os ácidos nucleicos foram dissolvidos foi usado como uma referência.
[001149] As enzimas de restrição e suplementos foram obtidos da New England Biolabs (Beverly, MA, USA) ou Fermetas (Vilnius, Lithuania) e usado de acordo com as instruções do fabricante. O DNA (100 ng) foi digerido com 5 unidades de enzima(s) no tampão apropriado em um volume final de 10 μ l (os volumes de reação foram aumentados como apropriado). As digestões foram incubadas na temperatura recomendada quanto a um mínimo de 60 min. Para os fragmentos que requerem digestões duplas com enzimas de restrição que envolvem tampões incompatíveis ou exigências de temperatura, as digestões foram realizadas sequencialmente. Se necessário os produtos de digestão foram purificados pela eletroforese em gel de agarose e extração em gel.
[001150] As ligações de fragmentos de DNA foram realizados com o Kit de Ligação Rápida (New England Biolabs) de acordo com as instruções do fabricante. Para cada ligação, o DNA vetorial foi misturado com aproximadamente três vezes o excesso molar de DNA inserido.
[001151] O DNA plasmídico (1 a 5 μ l de solução de DNA, tipicamente 2 μ l de mistura de ligação de DNA) foi transformado em uma célula de E. coli Shot DH5a-T1R (Invitrogen, Breda, Países Baixos; produto # 12297-016) usando o método do choque térmico, de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, as células foram plaqueadas em placas de ágar de Luria-Bertani (LB) contendo 50 μ g/ml de ampicilina. As placas foram incubadas por 16 a 18 h a 37°C até que as colônias bacterianas se tornaram evidentes.
[001152] As colônias bacterianas foram triadas quanto a presença de vetores contendo as seqüências desejadas por intermédio da PCR de colônia usando o ThermoStart PCR Master Mix (Abgene, por intermédio de Wetsburg, Leusden, Países Baixos; produto # AB-938-DC15/b) e iniciadores pConG1seq1 e pEE13.4seqrev2 (Tabela 6). As colônias selecionadas foram uniformemente tocadas com uma ponta de pipeta de 20 μ l e tocadas ligeiramente em 2 ml de LB para cultura de escala pequena e depois recolocadas em suspensão na mistura de PCR. A PCR foi realizada com um Termociclador TGradient 96 usando um programa de 35 ciclos: desnaturação a 95°C por 15 min; 35 ciclos de 94°C por 30 s, 55°C por 30 s e 72°C por 2 min; seguido por uma etapa de extensão final de 10 min a 72°C. Se apropriado, as misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até a análise pela eletroforese em gel de agarose.
[001153] O DNA plasmídico foi isolado das culturas de E. coli usando os seguinte kits da Qiagen (por intermédio de Westburg, Leusden, Países Baixos), de acordo com as instruções do fabricante. Para a preparação de plasmídeo volumosa (50 a 150 ml de cultura), um HiSpeed Plasmídeo Maxi Kit (produto # 12663) ou um HiSpeed Plasmídeo Midi Kit (produto # 12643) foi usado. Para a preparação de plasmídeo em escala pequena (± 2 ml de cultura) um Qiaprep Spin Miniprep Kit (produto # 27106) foi usado e o DNA foi eluído em 50 μ l de tampão de eluição (fornecido com o kit).Construção de vetor de expressão HA-CD38 pEE13.4HACD38
[001154] O domínio extracelular de CD38 humano foi amplificado a partir do plasmídeo pClpuroCD38 (obtido do Prof. M. Glennie, Tenovus Research Laboratory, Southampton General Hospital, Southampton, UK) usando iniciadores cd38forha e cd38exrev. Por esta reação de PCR um rótulo HA foi introduzido. Este produto de PCR foi usado como padrão para uma segunda reação de PCR com iniciadores SPHMM38ex e cd38exrev. Por esta reação de PCR, o peptídeo de sinal SPHMM, os sítios de restrição e uma seqüência Kozak ideal (GCCGCCACC) para a expressão ótima foram introduzidos. Depois da purificação, este fragmento de PCR foi clonado em vetor de expressão pEE13.4 (Lonza Biologics) e a seqüência codificadora completa foi confirmada pelo Seqüenciamento com iniciadores pConKseq1, pEE13.4seqrev, cd38seq1for e cd38seq2rev (Tabela 6). Esta construção foi denominada pEE13.4HACD38
Mutagênese direcionada ao sítio
[001155] Três proteínas mutantes únicas de huCD38 foi construída, em que T foi mutado em uma posição 237 (T237A, SEQ ID No: 32), Q foi mutado em R na posição 272 (Q272R, SEQ ID No: 33) ou S foi mutado em F na posição 274 (S274F, SEQ ID No: 34). A mutagênese direcionada ao sítio foi realizada usando o Kit de Mutagênese Direcionada ao Sítio QuickChange II XL (Stratagene, Amsterdam, Países Baixos) de acordo com as instruções do fabricante. Este método incluiu a introdução de um sítio de restrição extra silencioso ou perda de um sítio de restrição para triar quanto a mutagênese bem sucedida (sítio XbaI extra para T237A mutante, sítio BcgI extra para Q272R mutante e perda de sítio SspI para S274F mutante). Em resumo, 5 μ l de 10x tampão de reação, 1 μ l de oligonucleotídeo HACD38T237Afor2, HACD38Q272Rfor ou HACD38S274Ffor (100 μ mol/μ l), 1 μ l oligonucleotídeo HACD38T237Arev2, HACD38Q272Rrev ou HACD38S274Frev (100 μ mol/μ l), 1 μl de mistura de dNTP, 3 μ l de Quicksolution, 1 μ l de plasmídeo pEE13.4HACD38 (50 ng/μ l) e 1 μ l PfuUltra HF DNA polimerase foram misturados em um volume total de 50 μ l e amplificada com um Termociclador TGradient 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Alemanha; produto # 050-801) usando um programa de 18 ciclos: desnaturando a 95°C por 1 min; 18 ciclos de 95°C por 50 s, 60°C por 50 s e 68°C por 10 min. As misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até processamento adicional. Em seguida, as misturas de PCR foram incubadas com 1 μ l de DpnI por 60 min a 37°C para digerir o vetor pEE13.4HACD38 WT e armazenado a 4°C até processamento adicional. A mistura de reação foi precipitada com 5 μ l de NaAc 3 M e 125 μ l de etanol, incubados por 20 minutos a -20°C e girados por 20 minutos a 4°C a 14000xg. A pelota de DNA foi lavada com 70 % de etanol, secada e dissolvida em 4 μ l de água. O volume de reação total de 4 μ l foi transformado em células de E. coli Shot Top 10DH5aT1R competentes (Invitrogen, Breda, Países Baixos) de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Em seguida, as células foram plaqueadas em placas de ágar Luria-Bertani (LB) contendo 50 μ g/ml de ampicilina. As placas foram incubadas por 16 a 18 h a 37°C até que as colônias bacterianas se tornaram evidentes. As colônias foram triadas pela PCR de colônia usando iniciadores pConG1seq1 e pEE13,4seqrev2 (Tabela 5) e digeridos com as enzimas de restrição relevantes para triar quanto a incorporação do oligonucleotídeo mutagênico. 2 clones positivos para cada um mutante foram cultivados e o DNA plasmídico foi isolado. A seqüência que codifica HACD38 completa foi determinada usando iniciadores cd38seq1for, pConGlseq1 e pEE13.4seqrev2 para confirmar a presença das mutações e a ausência de mutações adicionais indesejáveis.
Seqüenciamento de DNA
[001156] As amostras de DNA plasmídico foram enviadas para AGOWA (Berlin, Alemanha) para a análise de seqüência. As seqüências foram analisadas usando o software Vetor NTI advanced (Informax, Oxford, UK).Expressão transitória em células HEK-293F
[001157] As células Freestile® 293-F (um subclone HEK-293 adaptado para o crescimento de suspensão e quimicamente definido meio Freestile, (HEK-293F)) foram obtidas da Invitrogen e transfectadas com pEE13.4HACD38 e com as três construções que carregam as mutações T237A, Q272R e S274F, de acordo com o protocolo do fabricante usando 293fectin (Invitrogen). Os sobrenadantes de cultura de células transfectadas foram usadas no ELISA para estudos de ligação anti-CD38.Ligação de anticorpo anti-CD38
[001158] As placas de ELISA (Greiner, # 655092) foram revestidas O/N a 4°C com 1 μ g de anticorpo anti-HA (Sigma, # H-9658) e subseqüentemente bloqueadas com 2 % de soro de galinha. Os sobrenadantes de cultura de células HEK293F transfectadas foram diluídas, aplicadas às placas de ELISA e incubadas por 1 hora na temperatura ambiente. Depois de lavar, as diluições em série de HuMabs -003 e -005 foram adicionadas e incubadas por 1 hora na temperatura ambiente. Os anticorpos ligados foram detectados com anticorpos IgG anti-humanos de cabra conjugado com HRP. O ensaio foi desenvolvido com ABTS (Roche, # 1112597) e a absorbância foi medida a 405 nm usando um espectrofotômetro.
[001159] Como pode ser observado a partir das Figuras 23A-23C, tanto -003 quanto -005 ligam-se ao CD38 humano do tipo selvagem. A ligação de - 003 não foi afetada pela introdução de mutações T237A (Figura 23A), Q272R (Figura 23B) ou S274F (Figura 23C). -005 foi capaz de ligar a mutação T237A que abriga CD38 (Figura 23A). a ligação de -005 a CD38 com a mutação Q272R foi severamente afetada (Figura 23B), tanto com respeito a EC50 quanto a capacidade de ligação máxima. -005 não foi capaz de ligar ao CD38 mutante em que a serina na posição 274 foi substituída pela fenilalanina (Figura 23C).
[001160] Estes dados mostram que -003 e -005 se ligam a epítopos diferentes. Além disso estes estudos revelaram que a ligação de -005 a CD38 é sensível às mutações nas posições 272 e 274. Particularmente S274 é essencial para -005 que se liga ao CD38.Tabela 6 - Iniciadores
Figure img0009
EXEMPLO 18Indução da proliferação de PBMC
[001161] -003, -005 e -024 foram testados em um ensaio essencialmentecomo descrito em Ausiello et al., Tissue Antigens 56, 538-547 (2000). Em resumo, PBMCs de doadores saudáveis foram cultivadas a 1 x 105 células/reservatório em placas de 96 reservatórios de fundo chato na presença de anticorpos (concentração final: 1,1 - 3,3 - 10 - 30 μ g/ml) em 200 μ l de RPMr. A estimulação de células com IL-15 (a 333 ng/ml; Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, USA) foi usada como controle positivo. Depois de uma incubação de 4 dias a 37°C, 30 μ l de 3H-timidina (16,7 pCi/ml) foram adicionados e a cultura foi continuada O/N. A incorporação de 3H-timidina foi avaliada usando um contador gama Packard Cobra (Packard Instruments, Meriden, DT, USA), de acordo com as instruções do fabricante. Os dados são mostrados como a cpm média (t SEM) de PBMCs obtidas de 10 doadores. Os resultados mostram que -003 e -005 não induzem a proliferação significante de PBMCs (Figura 24A). Também -024 não induz proliferação significante de PBMCs (dados não mostrados).
EXEMPLO 19Indução de IL-6
[001162] -003, -005 e -024 foram testados em um ensaio como descritoem Ausiello et al., Tissue Antigens 56, 538-547 (2000). Em resumo, as PBMCs foram cultivadas a 1 x 106 células/reservatório em placas de 48 reservatórios na presença de 20 μ g/ml de anticorpos e 10 ng/ml de LPS (Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, Países Baixos) em 500 μ l RPMI + + . Depois de uma incubação O/N a 37°C, o sobrenadante foi colhido e armazenado a -20°C. A concentração de IL-6 foi avaliada pelo ELISA (kit IL- 6 ELISA, U-CyTech Biosciences, Utrecht, Países Baixos) de acordo com as instruções do fabricante. Os dados são mostrados em concentração média em pg/ml (± SEM) de 7 doadores. Os resultados mostram que -003 e -005 não induzem a liberação de níveis significantes de IL-6 (Figura 24B). Também - 024 não induz a liberação de níveis significantes de IL-6 (dados não mostrados).
EXEMPLO 20Indução da liberação de IFN-Y
[001163] -003, -005 e -024 foram testados em um ensaio como descritoem Ausiello et al., Tissue Antigens 56, 538-547 (2000). Em resumo, as PBMCs foram cultivadas a 1 x 106 células/reservatório em placas de 48 reservatórios na presença de 20 μ g/ml de anticorpos e 1 μ g/ml de OKT-3 (Sanquin, Amsterdam, Países Baixos) em 500 μ l de RPMr. Depois de uma incubação O/N a 37°C, o sobrenadante foi colhido e armazenado a -20°C. A concentração de IFN-Y foi avaliada pelo ELISA (kit IFN-Y ELISA, U-CyTech Biosciences, Utrecht, Países Baixos) de acordo com as instruções do fabricante. Os dados são mostrados na concentração média em pg/ml (± SEM) de 9 doadores. Os resultados mostram que -003 e -005 não induzem a liberação de níveis de IFN-Y detectáveis (Figura 24C). Também -024 não induz a liberação de níveis de IFN-Y significantes (dados não mostrados).
EXEMPLO 21Afinidade de ligação de -003 e -005 ao CD38 recombinante
[001164] A ligação de -003 e -005 ao CD38 foi testada usando a ressonância de plasma de superfície. Em resumo, os anticorpos purificados foram imobilizados em um chip de sensor CM-5 (Biacore, Uppsala, Suécia) por intermédio de ligação de amina. O CD38 rotulado com HA (ver Exemplo 3) foi derramado e a ligação de antígeno a mAb foi detectada por uma mudança no índice refrativo na superfície do chip usando um Biacore 3000 (Biacore). Os associados e as constantes de taxa para -003 (Tabela 7) e -005 (Tabela 8) estão resumidos abaixo, média de 3 experimentos ± DP e mostram que tanto -003 quanto -005 têm uma alta afinidade para CD38.Tabela 7 - Associação e constantes de taxa a 25°C
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Tabela 8 - Associação e constantes de taxa a 25°C
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EXEMPLO 22Mapeamento de EpítopoO mapeamento de epítopo usando o método PEPSCAN
[001165] De acordo com procedimentos conhecidos (Geysen et al. 1984. O uso da síntese de peptídeo para sondar antígenos virais quanto a epítopos a um resolução de um único aminoácido. Proc Natl Aced Sci USA 81:3998; Slootstra et al. 1996. Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries. Mol Divers 1:87; Puijk et al. 2001. Segment synthesis. In PCT, Países Baixos, p.1.), os pepetídeos de sobreposição de 20-mer lineares e 15- mer em alça foram sintetizados abrangendo 138 aminoácidos no término C de CD38 humano. Além disso, com base na seqüência no término C peptídeos de alça única de tamanho diferente foram fabricados abrangendo a região KNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI, região CVHNLQPEKVQTLEAWV IHGG e região CLESIISKRNIQFSAKNIY RC. Além disso, conjuntos extras foram designados para a reconstrução de regiões de alça dupla que foram compostas de SKRNIQFSCKNIYR e EKVQTLEAVVVIHGG. As cisteínas nativas foram substituídas pelas alaninas. Os peptídeos foram triados em um ensaio de ELISA usando cartões mini-PEPSCAN no formato de cartão de crédito.
Síntese de peptídeos
[001166] Os peptídeos foram sintetizados usando a química de Fmoc padrão e desprotegidos usando TFA com descontaminantes. Subseqüentemente, os peptídeos desprotegidos foram rearranjados na microssérie com uma solução 0,5 mM de 2,6-bis(bromometil)piridina ou 2,4,6- tris(bromometil)mesitileno em bicarbonato de amônio (20 mM, pH 7,9), suplementado com acetonitrila (1:1 [volume/volume]). As microsséries foram suavemente agitadas na solução por 30 a 60 min, enquanto completamente cobertas na solução. Finalmente, as microsséries foram lavadas extensivamente com excesso de Millipore H2O e sonicadas em tampão de rompimento contendo 1 % de dodecilsulfato de sódio, 0,1 % de β- mercaptoetanol, em PBS (pH 7,2) a 70°C por 30 min, seguido pela sonicação em millipore H2O por mais 45 min.Ensaio de PEPSCAN ELISA
[001167] Os cartões de polietileno no formato de cartão de crédito de 455 reservatórios, contendo os peptídeos covalentemente ligados, foram incubados com soro (por exemplo, diluído 1:1000 em solução de bloqueio que contém 5 % de soro de cavalo [volume/volume] e 5 % de ovalbumina [peso/volume]) (4°C, durante a noite). Depois de lavar, os peptídeos foram incubados com Ig peroxidase anti-humano de coelho (diluição 1:1000, 25°C, 1 hora) e depois de lavar o substrato de peroxidase (sulfonato de 2,2’-azino- di-3-etilbenztiazolina e 2 μ l/ml de H2O2 a 3 %) foi adicionado. Depois de uma hora, o desenvolvimento de cor foi medido com uma câmera CCD e um sistema de processamento de imagem. A montagem consiste de uma câmera CCD com uma lente de 55 mm (Sony CCD Video Camera XC-77RR, Nikon micro-nikkor 55 mm lente f/2,8), um adaptador de câmera (Sony Camera adaptor DC-77RR) e o pacote de Software de Processamento de Imagem Optimas, versão 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, U.S.A.; Optimas funciona em um sistema de computador pentium II).
Método para a representação de epítopo
[001168] Os aminoácidos individuais foram identificados pelos motivos de dipeptídeo que representam as unidades únicas menores na seqüência de aminoácido humana de CD38. Todos os motivos de dipeptídeo presentes em cada um do 1164 peptídeos testados foram outorgados o valor ELISA obtida para o respectivo peptídeo inteiro. Para graduar os motivos de dipeptídeo de ligação forte a deficiente, um sinal relativo foi calculado dividindo-se o valor do ELISA obtido para cada motivo individual pelo valor de ELISA médio de todos os 1164 peptídeos lineares e de alça testados e estes foram classificados quanto aos valores decrescentes. Desta maneira, as contribuições de aminoácido para os epítopos conformacionais foram consideradas. Para cada um do mAb testado, todas as contagens de motivos de dipeptídeo acima de 2,5 (isto é valores de ELISA de peptídeos contendo estes motivos foram pelo menos 2,5 vezes o valor de ELISA médio daqueles obtidos com todos os 1164 peptídeos) foram selecionados. Os dados foram destorcidos em contribuições de aminoácido único representado na seqüência de CD38 linear por um sistema de contagem. Caminhando-se ao longo da seqüência de CD38 linear e usando-se as unidades de dipeptídeo únicas como um ponto de referência, um ponto foi concedido cada vez que um aminoácido CD38 estivesse presente neste conjunto de peptídeos de pontuação alta.
[001169] -003, 005 e -024 foram todos descobertos ligar-se às regiõesSKRNIQFSCKNIYR e EKVQTLEAWVIHGG de CD38 humano. -003 especialmente reconheceu os motivos RNIQF e WVIH, -005 especialmente reconheceu os motivos KRN e VQTL.
EXEMPLO 23Atividade Enzimática
[001170] A atividade enzimática de CD38 humano foi medida em um ensaio essencialmente como descrito em Graeff et al., J. Biol. Chem. 269, 30260-30267 (1994). Em resumo, o substrato NGD + (80 μ M) foi incubado com CD38 (0,6 μ g/ml de domínio extracelular rotulado com His de CD38 humano, ver o Exemplo 3 com respeito à purificação de His-CD38) em um tampão contendo 20 mM de Tris-HCl, pH 7,0. A produção de cGDPR pode ser monitorada espectrofotometricamente no comprimento de onda de emissão de 410 nm (excitação a 300 nm). Neste exemplo um filtro de excitação de 340 ± 60 nm e um filtro de emissão de 430 ± 8 nm foi usado.
[001171] Para testar o efeito de -003, -005 e -024 sobre a atividade enzimática de CD38, a proteína His-CD38 recombinante foi pré-incubada por 15 min na temperatura ambiente com várias concentrações (30, 3, 0,3 e 0,03 pg/ml) dos anticorpos diferentes antes de adicionar o substrato NGD+. A produção de GDP-ribose cíclica (cGDPR) foi registrada em pontos de tempo diferentes depois da adição de anticorpos (3, 6, 9, 12, 30, 45, 60, 75 e 90 min).
[001172] A Fig 25B mostra que -005 tem um efeito inibidor pronunciado sobre a produção de cGDPR. Depois de 90 minutos, a adição de 30 e 3 μ g/ml de -005 resultou em uma produção reduzida em 32 % e 34 % de cGDPR (Tabela 9). Resultados similares foram observados em experimentos independentes usando lotes diferentes de -005.
[001173] Nenhum efeito inibidor sobre a produção de cGPDR foi observado depois da adição de -003 (Figura 25B, Tabela 9), -024 (Figura 25D, Tabela 9) ou anti-KLH (Figura 25A, Tabela 9).
[001174] Com base nestas descobertas espera-se também que -005 iniba a síntese de ADP-ribose cíclica (cADPR) de NAD +. A inibição da síntese de cADPR pode ser determinada de acordo com o método de HPLC descrito em Munshi et al., J. Biol. Chem. 275, 21566-21571 (2000).Tabela 9. Produção de cGDPribose na presença de anticorpos específicos de CD38 ou antiKLH.
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EXEMPLO 24Comparação de -003 e -005 com anticorpo 3079 de Morphosys.
[001175] Os anticorpos -003 e -005 foram funcionalmente comparados ao anticorpo 3079 de Morphosys (TH-3079). Os métodos para clonagem e expressão de anticorpo TH-3079 de Morphosys são descritos no Exemplo 16. Os métodos para CDC são descritos no Exemplo 6. Os métodos para ADCC são descritos no Exemplo 5. A Figura 26A mostra que -005 e -003 e TH-3079 induzem a lise mediada por CDC de células CHO transfectadas com CD38, com lise máxima similar. Quando valores EC50 são comparados, o anticorpo - 005 é melhor do que o TH3079 na indução da lise de células CHO-CD38, com EC50 2 vezes mais baixa (ver Tabela 10).
[001176] A Figura 26B mostra que -005 é superior ao TH-3079 na indução da lise mediada pelo CDC de células Daudi-luciferase, com lise máxima pelo -005 sendo de 2 a 3 vezes mais altas do que pelo TH3079. Quando os valores EC50 são comparados, o anticorpo -005 é similar ao TH- 3079 na indução da lise de células Daudi-luciferase (ver Tabela 10). -003 não induz significantemente a lise mediada por CDC de células Daudi-luciferase.
[001177] A Figura 26C mostra que neste experimento -005, -003 e TH- 3079 medeiam a lise de células Daudi alvo por intermédio de ADCC. Nenhuma diferença foi encontrada em (log) EC50 e lise máxima (Tabela 11, n = 5).Tabela 10. Lise máxima e valores EC50 de anticorpos específicos de CD38 em CDC.
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Tabela 11. Lise máxima e valores EC50 de anticorpos específicos de CD38 em ADCC.
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Claims (54)

1. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelo fato de que compreende as regiões variáveis de cadeia leve humana e pesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreende um VL CDR1 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 3, um VL CDR2 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 4 e um VL CDR3 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 5, e a região variável de cadeia pesada compreende um VH CDR1 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 8, um VH CDR2 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 9 e um VH CDR3 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 10.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VL tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 2.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VH tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 7.
4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VH que compreende a seqüência de aminoácido que vai da região VH CDR1 até VH CDR3 da SEQ ID No: 7.
5. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VL como definida na SEQ ID NO: 2 e uma região VH como definida na SEQ ID NO: 7.
6. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelo fato de que compreende regiões variáveis de cadeia leve humana e cadeia pesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreende um VL CDR1 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 13, um VL CDR2 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 14 e um VL CDR3 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 15, e a região variável de cadeia pesada compreende um VH CDR1 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 18, um VH CDR2 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 19 e um VH CDR3 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 20.
7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VL tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 12.
8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VH tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 17.
9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VH que compreende a seqüência de aminoácido que vai da região VH CDR1 até VH CDR3 da SEQ ID No: 17.
10. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VL como definida na SEQ ID NO: 12 e uma região VH como definida na SEQ ID NO: 17.
11. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelo fato de que compreende regiões variáveis de cadeia leve humana e cadeia pesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreende um VL CDR1 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 23, um VL CDR2 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 24 e um VL CDR3 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 25, e a região variável de cadeia pesada compreende um VH CDR1 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 28, um VH CDR2 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 29 e um VH CDR3 tendo a seqüência como apresentada na SEQ ID No: 30.
12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VL tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 22.
13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VH tendo a seqüência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No: 27.
14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VH compreendendo a seqüência de aminoácido que vai da região VH CDR1 até VH CDR3 da SEQ ID No: 27.
15. Anticorpo que se liga a CD38 humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VL como definida na SEQ ID NO: 22 e uma região VH como definida na SEQ ID NO: 27.
16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 6 a 10, caracterizado pelo fato de que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), e que não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído com um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50 %, tal como menor do que 10 %, menor do que 5 % ou menor do que 1 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 6 a 10, caracterizado pelo fato de que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), e que não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
19. Anticorpo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), é menor do que 50 %, tal como menor do que 10 %, menor do que 5 % ou menor do que 1 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
20. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que o dito peptídeo liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
21. Anticorpo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a EC50 da ligação do peptídeo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) corresponde de 75 % a 125 % da EC50 da ligação do peptídeo ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
22. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), em que o peptídeo possui as seguintes características de ligação: (i) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31), (ii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31), e (iii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
23. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 6 a 10 caracterizado pelo fato de que o peptídeo possui as seguintes características de ligação: (i) não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31), (ii) não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31), (iii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), com o mesmo grau que se liga ao CD38 humano (SEQ ID No: 31).
24. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações17, 19 ou 21, caracterizado pelo fato de que o EC50 é determinado pelo uso de um ELISA.
25. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que especificamente se liga à região SKRNIQFSCKNIYR e à região EKVQTLEAWVIHGG do CD38 humano (SEQ ID No: 31).
26. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo possui uma ou mais das seguintes características:(i) atua como um antagonista de CD38;(ii) não induz proliferação significante de células mononucleares do sangue periférico;(iii) não induz a liberação de IL-6 significante pelos monócitos humanos ou de células mononucleares do sangue periférico;(iv) não induz a liberação de IFN-Y detectável pelas células T humanas ou de células mononucleares do sangue periférico;(v) é internalizada pelas células que expressam CD38; tal como internalizada pelas células CHO-CD38 dentro de 5 a 15 minutos a 37° C; (vi) induz ADCC; tal como com um valor de EC50 abaixo de 15 ng/ml, tal como abaixo de 10 ng/ml em células Daudi-luc e com um valor EC50 abaixo de 75 ng/ml, tal como abaixo de 50 ng/ml, 30 ng/ml ou 10 ng/ml em células MM;(vii) induz CDC na presença de complemento; tal como com um valor EC50 abaixo de 5 μ g/ml, tal como abaixo de 1 μ g/ml em células daudi-luc ou CD38-CHO;(viii) inibe a síntese de cGDPR;(ix) inibe a síntese de cADPR;(x) liga-se ao CD38 humano com um afinidade (KD) abaixo de 10-8 M, tal como na faixa de 10-8 M a 10-11 M, por exemplo na faixa de 7 x 109 M a 10-10 M, como determinada pela ressonância de plasma de superfície.
27. Anticorpo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que inibe a síntese de cGDPR em pelo menos 25 %, tal como pelo menos 30 % depois de 90 minutos a uma concentração de 3 μ g/ml.
28. Anticorpo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que inibe a síntese de cADPR em pelo menos 25 %, tal como pelo menos 30 % depois de 90 minutos a uma concentração de 3 μ g/ml.
29. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 28, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal humano.
30. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15 e 29, caracterizado pelo fato de que o mesmo é um anticorpo de tamanho natural IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM, tal como um anticorpo IgG1, preferivelmente um anticorpo IgG1,k ou um anticorpo IgM, preferivelmente um anticorpo IgM,k.
31. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é glicosilado em uma célula eucarióptica.
32. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 28 e 31, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.
33. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 32, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um ligador quelador para ligar um radioisótopo.
34. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 33, caracterizado pelo fato de que está em uma forma substancialmente isolada.
35. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende(i) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 1,(ii) uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 6,(iii) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 1 e uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 6;(iv) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 11;(v) uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 16;(vi) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 11 e uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 16;(vii) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 21;(viii) uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 26; ou(ix) uma seqüência de nucleotídeo VL da SEQ ID No: 21 e uma seqüência de nucleotídeo VH da SEQ ID No: 26.
36. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano.
37. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou cadeias tanto leves quanto pesadas de um anticorpo humano codifica um anticorpo IgG1.
38. Célula hospedeira procariótica, caracterizado pelo fato de que contém um vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações de 35 a 37.
39. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 34 ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo, ou uma droga.
40. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 34, em que o anticorpo é um anticorpo IgM monomérico ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo, ou uma droga.
41. Molécula bi-específica ou multi-específica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 34 e uma especificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana.
42. Molécula bi-específica ou multi-específica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 34 e uma especificidade de ligação quanto a CD3, CD4, CD138, IL-15R, TNF-α ligado à membrana ou ligada ao receptor, um receptor Fc humano, ou IL-15 ligada à membrana ou ligada ao receptor.
43. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 34 ou um imunoconjugado como definido na reivindicação 39 ou 40 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
44. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais outros agentes terapêuticos.
45. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 35, um imunoconjugado como definido nas reivindicações 39 ou 40, uma composição farmacêutica como definida nas reivindicações 43 ou 44, ou um vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações de 35 a 37, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para inibir crescimento e/ou proliferação de uma célula que expresse CD38
46. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 34, um imunoconjugado como definido nas reivindicações 39 ou 40, uma composição farmacêutica como definida nas reivindicações 43 ou 44, ou um vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações de 35 a 37, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar uma doença ou distúrbio que envolvam células que expressam CD38 em um indivíduo.
47. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 34, um imunoconjugado como definido nas reivindicações 39 ou 40, uma composição farmacêutica como definido nas reivindicações 43 ou 44, ou um vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações de 35 a 37, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para prevenir uma doença ou distúrbio que envolvam células que expressem CD38 em um indivíduo.
48. Uso de acordo com as reivindicações 46 ou 47, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é a artrite reumatóide.
49. Uso de acordo com as reivindicações 46 ou 47, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é o mieloma múltiplo.
50. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 49, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um ou mais outros agentes terapêuticos ao indivíduo.
51. Uso de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o um ou mais outros agentes terapêuticos são selecionados de um agente quimioterapêutico, um agente anti-inflamatório, ou um agente imunossupressivo e/ou imunomodulatório.
52. Uso de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o um ou mais outros agentes terapêuticos são selecionados de um grupo que consiste de cisplatina, gefitinib, cetuximab, rituximab, bevacizumab, erlotinib, bortezomib, talidomida, pamidronato, ácido zoledrônico, clodronato, risendronato, ibandronato, etidronato, alendronato, tiludronato, trióxido de arsênico, lenalidomida, filgrastim, pegfilgrastim, sargramostim, ácido suberoilanilida hidroxâmico, e SC10-469.
53. Método IN VITRO para detectar a presença de antígeno de CD38, ou uma célula que expresse CD38, em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:a) contatar a amostra com um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 34 sob condições que possibilitem a formação de um complexo entre o peptídeo e CD38; eb) detectar a formação de um complexo.
54. Kit para detectar a presença de antígeno de CD38, ou uma célula que expresse CD38, em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreenda um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 34.
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