CN110536695B - 包括去免疫化的志贺毒素a亚基效应子和cd8+ t细胞表位的细胞靶向分子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了细胞靶向分子，其能够将CD8+T细胞表位货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径。本发明的细胞靶向分子可用于将几乎任何CD8+T细胞表位从细胞外空间递送至靶细胞的MHC I类途径，所述靶细胞可以是恶性细胞和/或非免疫细胞。然后，靶细胞能够在细胞表面上展示与MHC I分子复合的递送的CD8+T细胞表位。本发明的细胞靶向分子具有这样的用途，其包括在细胞类型的混合物内(包括在脊索动物内)靶向标记和/或杀伤特定细胞类型，以及刺激有益的免疫应答。本发明的细胞靶向分子可用于治疗多种疾病、障碍和病症，包括癌症、肿瘤、生长异常、免疫障碍和微生物感染。
Description
技术领域
本发明涉及细胞靶向分子，其各自包含(1)用于细胞靶向的结合区域，(2)用于亚细胞递送(subcellular delivery)的志贺毒素A亚基效应子多肽，和(3)一个或更多个与志贺毒素A亚基效应子多肽异源的CD8+ T细胞表位；其中细胞靶向分子能够将至少一个异源CD8+ T细胞表位递送至靶标细胞(例如诸如恶性细胞)的MHC I类呈递途径。本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽组分包含相对于野生型志贺毒素序列的突变组合，其提供(1)去免疫化，(2)降低蛋白酶敏感性，和/或(3)嵌入的T细胞表位；其中每个志贺毒素效应子多肽保留一种或更多种志贺毒素功能，例如刺激细胞内化，指导细胞内发送(intracellular routing)和/或有效的细胞毒性。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够将异源CD8+ T细胞表位递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，其中异源CD8+ T细胞表位直接地或间接地连接在志贺毒素A亚基效应子多肽的志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端的羧基端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子可用于向脊索动物施用，例如，当有以下需要时：(1)减少或消除由所施用的分子引起的某些免疫应答，(2)减少或消除由所施用的分子引起的非特异性毒性，(3)在体内特异性杀死靶细胞，和/或(4)将有益免疫应答靶向靶标细胞类型、包含靶标细胞类型的肿瘤块、和/或包含靶标细胞类型的组织部位(tissue locus)，例如通过刺激脊索动物的CD8+ T细胞与靶标细胞类型的细胞间接合。本发明的细胞靶向分子具有多种用途，例如，用于将特异性CD8+ T细胞表位从细胞外位置递送至靶细胞的MHC I类呈递途径；具有MHC I类展示的CD8+ T细胞表位的靶细胞的细胞表面标记；在其他细胞存在下选择性杀死特定细胞类型；在体内刺激有益免疫应答；诱导细胞毒性T淋巴细胞对靶细胞的应答；在体内抑制有害免疫应答；记忆免疫细胞的产生，以及各种疾病、障碍和病症的诊断和治疗，例如癌症、肿瘤、其他生长异常、免疫障碍和微生物感染。
背景技术
以下包括可用于理解本文所述发明的信息。这并不是承认这里提供的任何信息都是现有技术或与目前描述或要求保护的发明相关，或者这里具体或隐含引用的任何出版物或文献都是现有技术。
利用免疫系统的能力以治疗癌症的构思已有一百多年的历史(参见例如WiemannB，Starnes C，Pharmacol Ther 64:529-64(1994))。例如，William Coley使用患者对灭活传染剂的反应来提高他们对癌症的免疫防御。通过触发类似感染的免疫反应，患者的免疫系统受到刺激并显示出改善的癌细胞免疫监视，这通常会导致疾病缓解。通过使用靶向治疗剂和通过将免疫反应限制或聚焦到局部区域，例如通过适应性免疫系统的精确特异性，可以改进该构思。靶向治疗可以用于靶向患者体内的癌细胞和/或癌组织部位，用来接收高免疫原性的外源表位(例如，来自传染剂)，以便局部激活多种有益免疫应答，并且具体地使用比患者中癌细胞已经展示的任何表位更具免疫原性的表位将癌细胞标记为外来的。此外，通过诱导对大量靶向癌细胞的感染状态的模仿，可以系统地刺激患者的免疫系统，例如诸如包括增加全面免疫监视和免疫细胞活性，但是免疫系统的精确特异性可以将免疫应答限制或集中到确定的组织位置、细胞类型或甚至单个外来表位。这种方法通常可以以系统方式(例如，如Coley毒素、细胞因子疗法、免疫检查点抑制剂和癌症疫苗所示)激活免疫系统，同时以局部方式(例如，如过继嵌合抗原受体工程化T细胞(CAR-T)和肿瘤靶向单克隆抗体疗法所示)将有益免疫应答聚焦到特定组织和细胞。
主要组织相容性(MHC)I类系统通过提供细胞内抗原的表位呈递在免疫系统中起重要作用(Cellular and Molecular Immunology(Abbas A编辑，Saunders，第8版，2014))。该过程被认为是适应性免疫系统的重要部分，该系统主要在脊索动物中进化以抵御细胞内病原体以及表达细胞内抗原的恶性细胞，例如诸如癌细胞。例如，涉及细胞内病原体的人感染只能通过MHC I类和II类系统的联合作用来克服(参见例如Chiu C，Openshaw P，NatImmunol 16:18-26(2015))。MHC I类系统的贡献是基于细胞内抗原的识别来识别和杀死恶性细胞。
MHC I类系统在脊椎动物的任何有核细胞中起作用以呈递细胞内(或内源)抗原，而MHC II类途径在专职抗原呈递细胞(APC)中起作用以呈递细胞外(或外源性)抗原(Neefjes J等，Nat Rev Immunol 11：823-36(2011))。由MHC I类系统识别的细胞内或“内源”表位通常是细胞内质网(ER)的胞质溶胶或腔中遇到的分子片段，这些分子通常由胞质溶胶中的蛋白酶体和/或另一种蛋白酶进行蛋白水解处理。当存在于ER中时，这些内源性表位被加载到MHC I类分子上并作为肽-MHC I类分子复合物(pMHC I)呈递在细胞表面上。相反，MHC II类系统仅在特定细胞中起作用以识别源自细胞外遇到的分子的外源性表位，所述分子仅在特定的内体区室中处理，例如晚期内体、溶酶体、吞噬体和吞噬溶酶体，并且包括存在于内吞细胞器的细胞内病原体。
通过脊索动物中的有核细胞呈递与MHC I类分子复合的特定表位-肽在刺激和维持对细胞内病原体、肿瘤和癌症的免疫应答中起主要作用。CD8+ T细胞与呈递特定表位-MHC I类复合物的细胞的细胞间CD8+ T淋巴细胞(T细胞)接合启动保护性免疫应答，该应答能够导致呈递细胞的排斥，即由于一种或更多种细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞毒活性导致的呈递细胞死亡。这种细胞间接合的特异性由多种因素决定。CD8+ T细胞通过其TCR识别另一细胞的细胞表面上的pMHC I。CD8+ T细胞表达不同的T细胞受体(TCR)，该TCR对不同的同源pMHC I具有不同的结合特异性。CD8+ T细胞特异性取决于每个单独的T细胞的特异性TCR和该TCR对呈递的表位-MHC复合物的结合亲和力以及对呈递细胞的整体TCR结合占据。此外，MHC I类分子的多种变体至少以两种方式影响细胞间CD8+ T细胞识别：通过影响加载和展示的肽(即pMHC I库)的特异性和通过影响参与表位识别的TCR和pMHC I之间的接触区域。
与MHC I类分子复合的某些表位的呈递可以使呈递细胞对通过裂解、诱导的细胞凋亡和/或坏死的靶向杀伤敏感。pMHC I-呈递细胞的CTL杀伤主要通过细胞溶解活性发生，其中所述细胞溶解活性由通过细胞毒性颗粒将穿孔素和/或颗粒酶递送到呈递细胞介导(参见例如Russell J，Ley T，Annu Rev Immunol 20：323-70(2002)；Cullen S，Martin S，Cell Death Diff 15：251-62(2008))。其他CTL介导的靶细胞杀伤机制涉及通过TNF信号传导诱导呈递细胞中的细胞凋亡，例如通过FasL/Fas和TRAIL/TRAIL-DR信号传导(参见例如Topham D等，J Immunol 159：5197-200(1997)；Ishikawa E等，J Virol 79：7658-63(2005)；Brincks E等，J Immunol 181：4918-25(2008)；Cullen S，Martin S，Cell DeathDiff 15：251-62(2008))。此外，激活的CTL可以不加选择地杀死识别的pMHC I-呈递细胞附近的其他细胞，而不管其他附近细胞所呈递的肽-MHC I类复合物库(Wiedemann A等，ProcNatl Acad Sci USA 103：10985-90(2006))。此外，激活的CTL可以释放免疫刺激细胞因子、白细胞介素和其他分子，从而影响微环境的免疫激活。
这种MHC I类和CTL免疫监视系统可以被某些疗法可靠地利用来引导受试者的适应性免疫系统拒绝并特异性地杀死某些细胞类型。特别地，MHC I类呈递途径可以被各种治疗分子利用，以促使某些靶细胞在细胞表面上展示某些表位，从而诱导所需的免疫应答，包括提高的免疫检测和由免疫细胞杀死特异性靶向的细胞。可以设计治疗性分子，其特异性地将CD8+ T细胞表位递送至MHC I类途径以供恶性细胞(例如肿瘤或感染细胞)呈递，以便表示其自身的破坏，并且可能以便在聚集体中引发免疫系统的更广泛的刺激。此外，可以设计治疗性分子，其还刺激或增加靶细胞中的MHC呈递活性。
当外源施用时，希望细胞靶向分子能够将CD8+ T细胞表位递送至所选靶细胞的MHC I类呈递途径，其中表位可以选自多种表位，例如诸如选自常见的传染剂，并且靶细胞可以选自多种细胞，例如恶性和/或感染的细胞，特别是像树突状细胞这样的专职APC以外的细胞。相对于健康细胞，优先靶向恶性细胞的这种细胞靶向分子可以施用于脊索动物，用于体内递送CD8+ T细胞表位，用于由靶细胞(例如，感染的、肿瘤或其他恶性细胞)进行MHCI类呈递。此外，在某些情况下可能需要具有这样的细胞靶向分子，其也通过基于非免疫系统的机制直接杀死靶细胞。此外，期望具有这样的细胞靶向分子，其在施用于脊索动物后也表现出低抗原性、低免疫原性、高稳定性和/或低非特异性毒性。
发明内容
本发明提供了细胞靶向分子及其组合物的各种实施方案，其中每个细胞靶向分子包含1)至少一个志贺毒素A亚基效应子多肽，其源自志贺毒素家族至少一个成员的A亚基，2)至少一个能够特异性结合至少一个细胞外靶生物分子的结合区域，和3)至少一个CD8+ T细胞表位-肽货物；其中，每个细胞靶向分子能够从细胞外位置将至少一个CD8+ T细胞表位-肽递送至细胞的MHC I类呈递途径。对于本发明的每个细胞靶向分子，至少一个结合区域与志贺毒素A亚基效应子多肽是异源的。对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，至少一个志贺毒素效应子多肽(i)具有含有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生区域，(ii)包含至少一个内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位区域的破坏，和(iii)在A1片段衍生区域的羧基末端处包含破坏的弗林蛋白酶切割基序。对于本发明的每个细胞靶向分子，至少一个CD8+T细胞表位-肽货物(i)与志贺毒素A亚基效应子多肽是异源的，和(ii)未嵌入或插入到志贺毒素A1片段区域和/或志贺毒素A亚基效应子多肽中(参见例如图1，其描绘了本发明的细胞靶向分子的示例性实施方案的说明性实施例)。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，在将细胞靶向分子施用于细胞时导致(i)细胞靶向分子被细胞内化和(ii)细胞在细胞表面上呈递与MHC I类分子复合的CD8+T细胞表位-肽货物。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，在将细胞靶向分子施用于细胞时(所述细胞与由细胞靶向分子的结合区域结合的细胞外靶生物分子物理偶联)，导致细胞在细胞表面呈递与MHC I类分子复合的CD8+ T细胞表位-肽货物。在某些另外的实施方案中，在免疫细胞存在下具有细胞或放置细胞进一步导致反式免疫细胞应答，免疫细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)与所述细胞的细胞间接合，和/或通过免疫细胞的细胞间作用诱导的细胞死亡。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，在将细胞靶向分子施用于脊索动物时(所述脊索动物包含与细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，其中所述细胞外靶生物分子由细胞靶向分子的结合区域结合)，导致至少一些所述细胞在细胞表面上呈递与MHC I类分子复合的CD8+ T细胞表位-肽货物。在某些另外的实施方案中，结果还包括反式免疫细胞应答，例如，通过免疫细胞的至少一些所述细胞的细胞间接合和/或通过免疫细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)的细胞间作用诱导的细胞死亡。
本发明的细胞靶向分子可用于将各种CD8+ T细胞表位靶向递送至脊索动物内的任何有核的靶细胞，以使得递送的CD8+ T细胞表位-肽货物被呈递在与MHC I类分子复合的靶细胞表面上。靶细胞可以是各种类型，例如肿瘤细胞、感染细胞、携带细胞内病原体的细胞和其他不需要的细胞，并且靶细胞可以被本发明的细胞靶向分子在体外或体内靶向。此外，本发明提供了各种细胞靶向分子，其包含具有蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽，所述志贺毒素效应子多肽能够将异源CD8+ T细胞表位细胞内递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，同时改善这些细胞靶向分子的细胞外、体内耐受性。由于在给定剂量下产生非特异性毒性的可能性降低，本发明的某些细胞靶向分子对于作为治疗剂和/或诊断剂向脊索动物的给药具有改进的有用性。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，CD8+ T细胞表位-肽货物直接或间接地与志贺毒素A亚基效应子多肽和/或结合区域融合。在本发明的细胞靶向分子的某些另外的实施方案中，CD8+ T细胞表位-肽货物通过肽键直接或间接地与志贺毒素A亚基效应子多肽和/或结合区域融合。在某些另外的实施方案中，CD8+ T细胞表位-肽货物通过肽键直接或间接地与志贺毒素A亚基效应子多肽和/或结合区域融合，作为遗传融合。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有结合区域、志贺毒素效应子多肽和CD8+ T细胞表位-肽货物的多肽。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有两条或更多条多肽链的结合区域，并且CD8+ T细胞表位-肽货物与包含志贺毒素效应子多肽和所述两条或更多条多肽链中的一条的多肽融合。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，CD8+ T细胞表位-肽货物位于志贺毒素A1片段衍生区的羧基末端的羧基端。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含与志贺毒素A亚基效应子多肽的羧基末端相关联的分子部分。在某些另外的实施方案中，分子部分包括结合区域。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含与志贺毒素A亚基效应子多肽的羧基末端相关联的分子部分，其中所述分子部分具有细胞毒性。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有至少一个氨基酸的分子部分，并且志贺毒素A亚基效应子多肽与所述分子部分的至少一个氨基酸残基连接。在某些另外的实施方案中，分子部分和志贺毒素A亚基效应子多肽融合形成连续多肽。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，志贺毒素A亚基效应子多肽除了将CD8+ T细胞表位-肽货物递送至细胞的MHC I类分子以外，还能够表现出一种或更多种志贺毒素效应子功能。对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，志贺毒素A亚基效应子多肽除了将CD8+ T细胞表位-肽货物从细胞的早期内体区室(志贺毒素效应子多肽存在于其中)递送至细胞的MHC I类分子以外，还能够表现出一种或更多种志贺毒素效应子功能。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，志贺毒素A亚基效应子多肽能够表现出核糖体抑制活性，半数最大抑制浓度(IC50)值为10,000皮摩尔或更低。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素A亚基效应子多肽包含相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基的一个或更多个突变，所述突变改变志贺毒素A亚基效应子多肽的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。对于某些另外的实施方案，相对于天然存在的A亚基的突变改变志贺毒素A亚基效应子多肽的酶活性，降低或消除没有突变的志贺毒素A亚基效应子多肽表现出的细胞毒性。
以下参考编号为#1-20的实施方案组描述本发明的细胞靶向分子的不同实施方案。
实施方案组#1-包含去免疫化的志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子，志贺毒素
效应子多肽包含嵌入或插入的、异源T细胞表位和非重叠的去免疫化的子区
本发明提供了细胞靶向分子，每个分子包括(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域和(ii)实施方案组#1的去免疫化的志贺毒素效应子多肽(参见例如图1，其描绘了该实施方案组#1的细胞靶向分子的四个示例性实施方案的说明性实施例)。例如，组#1的某些实施方案是细胞靶向分子，其包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域和(ii)去免疫化的志贺毒素效应子多肽，所述志贺毒素效应子多肽包含至少一个插入的或嵌入的异源表位(a)和至少一个破坏的、内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位区域(b)，其中异源表位不与嵌入或插入的异源T细胞表位重叠。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在所述多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞(cytostasis)和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，异源T细胞表位是CD8+T细胞表位，例如诸如关于人免疫系统。对于某些另外的实施方案，异源T细胞表位能够由细胞的MHC I类分子呈递。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞、引起细胞死亡、和/或将嵌入或插入的异源T细胞表位递送至MHC I类分子，用于在细胞表面上呈递。对于某些另外的实施方案，与参考分子(例如诸如，由所述细胞靶向分子组成的第二细胞靶向分子，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分每个包含野生型志贺毒素A1片段)相比，细胞靶向分子在被引入细胞时能够展示相当或更好的细胞毒性。
对于实施方案组#1的某些实施方案，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。
对于实施方案组#1的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在被引入脊索动物中时与参考分子相比(例如诸如，第二细胞靶向分子，其由所述细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分每个包含野生型志贺毒素A1片段和/或其A1片段区域的羧基末端处的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)能够展示改善的体内耐受性和/或稳定性。在某些另外的实施方案中，志贺毒素效应子多肽不具有细胞毒性，并且分子部分具有细胞毒性。
在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽直接或间接地连接在一起。
在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域包含多肽，所述多肽包含免疫球蛋白型结合区域。在某些另外的实施方案中，结合区域包含选自由以下各项组成的组的多肽：自主VH结构域、单结构域抗体片段(sdAb)、纳米抗体、来源于骆驼科的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变片段(scFv)、抗体可变片段(Fv)、互补决定区3片段(CDR3)、受约束的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段、小模块化免疫药物(SMIP)结构域、抗原结合片段(Fab)、犰狳重复多肽(ArmRP)、纤连蛋白来源的第10纤连蛋白III型结构域(10Fn3)、肌腱蛋白III型结构域(TNfn3)、锚蛋白重复基序结构域、低密度脂蛋白受体来源的A结构域(LDLR-A)、脂质运载蛋白(anticalin)、Kunitz结构域、蛋白A来源的Z结构域、γ-B晶状体蛋白来源的结构域、泛素来源的结构域(affilin)、Sac7d来源的多肽(affitin)、Fyn来源的SH2结构域、微蛋白(miniprotein)、C型凝集素样结构域支架、工程化的抗体模拟物、以及保留结合功能性的任何前述的经遗传操作的对应物，例如诸如，其中重链和轻链的相对取向或顺序被反转或翻转。
对于实施方案组#1的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够表现出(i)与野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应子多肽相当的催化活性水平，(ii)核糖体抑制活性，半数最大抑制浓度(IC50)值为10,000皮摩尔或更低，和/或(iii)显著水平的志贺毒素催化活性。
对于实施方案组#1的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子和/或其志贺毒素效应子多肽能够表现出与包含野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应子多肽的参考细胞靶向分子相当的亚细胞发送效率，和/或能够表现出从细胞的内体起始位置到内质网和/或胞质溶胶的显著水平的细胞内发送活性。
对于实施方案组#1的某些实施方案，通过将本发明的细胞靶向分子施用于与细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，所述细胞靶向分子能够导致细胞死亡。在某些另外的实施方案中，将本发明的细胞靶向分子施用于两种不同的细胞类型群体(其在细胞外靶生物分子的存在或水平方面不同)，相比于针对没有与细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型的CD50，所述细胞靶向分子能够以至少三倍或更低的CD50导致与细胞毒性细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型的细胞死亡。对于某些实施方案，通过将本发明的细胞靶向分子施用于第一细胞群(其成员与细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联)和第二细胞群(其成员不与结合区域的任何细胞外靶生物分子物理偶联)，相对于所述第二细胞群的成员，细胞靶向分子对所述第一细胞群的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，通过将本发明的细胞靶向分子施用于第一细胞群(其成员与细胞靶向分子的结合区域的大量细胞外靶生物分子物理偶联)和第二细胞群(其成员不与结合区域的大量任何细胞外靶生物分子物理偶联)，相对于所述第二细胞群的成员，细胞靶向分子对所述第一细胞群的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，通过将本发明的细胞靶向分子施用于第一靶生物分子阳性细胞群和第二细胞群(其成员在细胞表面不表达细胞靶向分子的结合区域的大量靶生物分子)，相对于第二细胞群的成员，细胞靶向分子对第一细胞群的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。
对于实施方案组#1的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出半数最大抑制浓度(CD50)值为300nM或更低的的细胞毒性，和/或能够表现出显著水平的志贺毒素细胞毒性。
对于实施方案组#1的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入或插入的异源CD8+ T细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径，用于由MHC I类分子结合的表位的细胞表面呈递。
在实施方案组#1的某些实施方案中，细胞靶向分子包含与志贺毒素效应子多肽的羧基末端相关联的分子部分。在某些实施方案中，分子部分包含结合区域或由结合区域组成。在某些实施方案中，分子部分包含至少一个氨基酸，并且志贺毒素效应子多肽与分子部分的至少一个氨基酸残基连接。在某些另外的实施方案中，分子部分和志贺毒素效应子多肽融合形成连续多肽。
在实施方案组#1的某些实施方案中，细胞靶向分子还包含与志贺毒素效应子多肽的羧基末端相关联的细胞毒性分子部分。对于某些实施方案，细胞毒性分子部分是细胞毒性剂，例如诸如技术人员已知的和/或本文描述的小分子化学治疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性抗生素、烷化剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。对于某些另外的实施方案，细胞毒性分子部分在小于10,000、5,000、1,000、500或200pM的浓度下具有细胞毒性。
在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域能够结合选自由以下各项组成的组的细胞外靶生物分子：CD20、CD22、CD40、CD74、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前列腺特异性膜抗原、Cripto、CDCP1、内皮糖蛋白、成纤维细胞活化蛋白、Lewis-Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1或NTRKR1)、碳酸酐酶IX、叶酸结合蛋白、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂Lewis-Y2、VEGFR、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、Erb3、c-MET、IGFIR、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANK、FAP、肌腱蛋白、CD64、间皮素、BRCA1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE6、SART-1、PRAME、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原、人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶、EphA2、HER3/ErbB-3、MUC1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶相关抗原、HPV-E7、EB病毒(Epstein–Barr病毒)抗原、Bcr-Abl、α-甲胎蛋白抗原、17-A1、膀胱肿瘤抗原、SAIL、CD38、CD15、CD23、CD45(蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型)、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305、C3AR、FceRIa、半乳糖凝集素-9、IL-1R(白细胞介素-1受体)、mrp-14、NKG2D配体、程序性死亡-配体1(PD-L1)、Siglec-8、Siglec-10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT-3、半乳糖凝集素-3、CD11a-c、GITRL、MHC I类分子、MHC II类分子(任选与肽复合)、CD284(TLR4)、CD107-Mac3、CD195(CCR5)、HLA-DR、CD16/32、CD282(TLR2)、CD11c以及任何前述的任何免疫原性片段。
在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域通过至少一个不是二硫键的共价键直接或间接连接到志贺毒素效应子多肽。在某些另外的实施方案中，结合区域直接或间接地与志贺毒素效应子多肽的羧基末端融合，以形成单个连续的多肽。在某些另外的实施方案中，结合区域是免疫球蛋白型结合区域。
在实施方案组#1的某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序相对于野生型志贺毒素A亚基在最小的弗林蛋白酶切割位点包含一个或更多个突变。在某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序不是与最小的弗林蛋白酶切割位点的至少一个氨基酸残基的部分或全部重叠的序列的氨基端截短。在某些实施方案中，在最小的弗林蛋白酶切割位点中的突变是R/Y-x-x-R弗林蛋白酶切割基序中的至少一个氨基酸残基的氨基酸缺失、插入和/或置换。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含至少一个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，该突变改变了天然位于以下位置的区域中的至少一个氨基酸残基：1)在志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO:1-2和4-6)的248-251处，或2)在志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3和7-18)的247-250处，或任何志贺毒素A亚基中的等同氨基酸序列位置处。在某些另外的实施方案中，突变是不带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的氨基酸残基置换。
在实施方案组#1的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出与参考分子的细胞毒性相当的细胞毒性，参考分子为例如诸如第二细胞靶向分子，其由细胞靶向分子组成，除了其所有其志贺毒素效应子多肽组分每个包含野生型志贺毒素A1片段。
在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域包含SEQ ID NO:39-245中任一个所示的肽或多肽。
在实施方案组#1的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:252-255和288-748中任一个所示的多肽，或基本上由其组成，并且任选地细胞靶向分子包含氨基端硫氨酸残基。
在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。
在实施方案组#1的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分包括结合区域。
在实施方案组#1的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些另外的实施方案中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#1的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性和/或细胞内发送)。
在实施方案组#1的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如诸如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可。
在实施方案组#1的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域在细胞靶向分子中，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。对于某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出比第三细胞靶向分子更大的细胞毒性，所述第三细胞靶向分子具有氨基末端并且包含结合区域和不位于或不接近第三细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽。对于某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如，与第三细胞靶向分子的细胞毒性相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。对于某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第三细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高。在某些另外的实施方案中，第三细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端的内质网保留/回收信号基序。
在实施方案组#1的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域在细胞靶向分子内，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。对于某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且当被引入细胞时，相比于第三细胞靶向分子的细胞毒性，能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率，所述第三细胞靶向分子具有氨基末端并且包含结合区域和不位于或不接近第三细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽。在某些另外的实施方案中，第三细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。
在实施方案组#1的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域在细胞靶向分子内，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。对于某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出低细胞毒性效力(即，当被引入某些阳性靶标细胞类型时，在1000nM、500nM、100nM、75nM或50nM的细胞靶向分子浓度下，不能表现出细胞群大于1％的细胞死亡的细胞毒性)，并且当被引入细胞时，相比于第三细胞靶向分子的细胞毒性，能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率，所述第三细胞靶向分子具有氨基末端并且包含结合区域和不位于或不接近第三细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽。在某些另外的实施方案中，第三细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。
在实施方案组#1的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其多肽组分包含KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序。对于某些另外的实施方案，羧基端内质网保留/回收信号基序选自由以下各项组成的组：KDEL(SEQ ID NO:750),HDEF(SEQ ID NO:751),HDEL(SEQ ID NO:752),RDEF(SEQ ID NO:753),RDEL(SEQ ID NO:754),WDEL(SEQ IDNO:755),YDEL(SEQ ID NO:756),HEEF(SEQ ID NO:757),HEEL(SEQ ID NO:758),KEEL(SEQID NO:759),REEL(SEQ ID NO:760),KAEL(SEQ ID NO:761),KCEL(SEQ ID NO:762),KFEL(SEQ ID NO:763),KGEL(SEQ ID NO:764),KHEL(SEQ ID NO:765),KLEL(SEQ ID NO:766),KNEL(SEQ ID NO:767),KQEL(SEQ ID NO:768),KREL(SEQ ID NO:769),KSEL(SEQ ID NO:770),KVEL(SEQ ID NO:771),KWEL(SEQ ID NO:772),KYEL(SEQ ID NO:773),KEDL(SEQ IDNO:774),KIEL(SEQ ID NO:775),DKEL(SEQ ID NO:776),FDEL(SEQ ID NO:777),KDEF(SEQID NO:778),KKEL(SEQ ID NO:779),HADL(SEQ ID NO:780),HAEL(SEQ ID NO:781),HIEL(SEQ ID NO:782),HNEL(SEQ ID NO:783),HTEL(SEQ ID NO:784),KTEL(SEQ ID NO:785),HVEL(SEQ ID NO:786),NDEL(SEQ ID NO:787),QDEL(SEQ ID NO:788),REDL(SEQ ID NO:789),RNEL(SEQ ID NO:790),RTDL(SEQ ID NO:791),RTEL(SEQ ID NO:792),SDEL(SEQ IDNO:793),TDEL(SEQ ID NO:794),SKEL(SEQ ID NO:795),STEL(SEQ ID NO:796)和EDEL(SEQID NO:797)。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出比第四细胞靶向分子的细胞毒性更大的细胞毒性，第四细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与参考分子(例如诸如第四细胞靶向分子)相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第四细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高。
实施方案组#2-包含羧基末端内质网保留/回收信号基序和志贺毒素效应子多肽
的细胞靶向分子，所述志贺毒素效应子多肽包含嵌入或插入的异源T细胞表位
本发明提供细胞靶向分子，每个分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)包含插入或嵌入的异源表位的志贺毒素效应子多肽；(iii)羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(a)能够特异性结合至少一个细胞外靶生物分子的结合区域；(b)包含嵌入或插入的异源表位的志贺毒素效应子多肽；(c)KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，异源T细胞表位是CD8+ T细胞表位，例如诸如关于人免疫系统。对于某些另外的实施方案，异源T细胞表位能够由细胞的MHC I类分子呈递。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞、引起细胞死亡和/或将嵌入或插入的异源T细胞表位递送至MHC I类分子，用于在细胞表面上呈递。
在实施方案组#2的某些实施方案中，羧基末端内质网保留/回收信号基序选自由以下各项组成的组：KDEL(SEQ ID NO:750),HDEF(SEQ ID NO:751),HDEL(SEQ ID NO:752),RDEF(SEQ ID NO:753),RDEL(SEQ ID NO:754),WDEL(SEQ ID NO:755),YDEL(SEQ ID NO:756),HEEF(SEQ ID NO:757),HEEL(SEQ ID NO:758),KEEL(SEQ ID NO:759),REEL(SEQ IDNO:760),KAEL(SEQ ID NO:761),KCEL(SEQ ID NO:762),KFEL(SEQ ID NO:763),KGEL(SEQID NO:764),KHEL(SEQ ID NO:765),KLEL(SEQ ID NO:766),KNEL(SEQ ID NO:767),KQEL(SEQ ID NO:768),KREL(SEQ ID NO:769),KSEL(SEQ ID NO:770),KVEL(SEQ ID NO:771),KWEL(SEQ ID NO:772),KYEL(SEQ ID NO:773),KEDL(SEQ ID NO:774),KIEL(SEQ ID NO:775),DKEL(SEQ ID NO:776),FDEL(SEQ ID NO:777),KDEF(SEQ ID NO:778),KKEL(SEQ IDNO:779),HADL(SEQ ID NO:780),HAEL(SEQ ID NO:781),HIEL(SEQ ID NO:782),HNEL(SEQID NO:783),HTEL(SEQ ID NO:784),KTEL(SEQ ID NO:785),HVEL(SEQ ID NO:786),NDEL(SEQ ID NO:787),QDEL(SEQ ID NO:788),REDL(SEQ ID NO:789),RNEL(SEQ ID NO:790),RTDL(SEQ ID NO:791),RTEL(SEQ ID NO:792),SDEL(SEQ ID NO:793),TDEL(SEQ ID NO:794),SKEL(SEQ ID NO:795),STEL(SEQ ID NO:796)和EDEL(SEQ ID NO:797)。
在实施方案组#2的某些实施方案中，嵌入或插入的异源T细胞表位破坏内源B细胞和/或T细胞表位区域，所述内源B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：(i)SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQID NO:1-18中任一个的53-66，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；(ii)SEQ IDNO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；和(iii)SEQ ID NO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#2的某些另外的实施方案中，异源表位是能够由细胞的MHC I类分子呈递的CD8+ T细胞表位。在某些另外的实施方案中，异源表位被嵌入并取代野生型志贺毒素多肽区域中相等数量的氨基酸残基，使得志贺毒素效应子多肽与其所来源的野生型志贺毒素多肽区域具有相同的氨基酸残基总数。在任何上述的某些另外的实施方案中，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种选自以下的志贺毒素效应子功能：指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体和细胞毒性。
在实施方案组#2的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出大于第五细胞靶向分子的细胞毒性的细胞毒性，第五细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成的，除了它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如，与第五细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第五细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高。
对于实施方案组#2的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入或插入的异源CD8+ T细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径，用于由MHC I类分子结合的表位的细胞表面呈递。
在实施方案组#2的某些实施方案中，由于嵌入或插入的异源表位，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考分子(例如诸如，由所述细胞靶向分子组成的第六细胞靶向分子，除了它缺少所述细胞靶向分子中存在的一个或更多个嵌入或插入的表位)相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。
对于实施方案组#2的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如第五细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
实施方案组#3-包含志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子，所述志贺毒素效应子
多肽包括(i)嵌入或插入的异源T细胞表位和ii)破坏的弗林蛋白酶切割基序
本发明提供了细胞靶向分子，每个分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)包含插入或嵌入的异源表位的志贺毒素效应子多肽；(iii)破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)志贺毒素效应子多肽，其包含(a)插入或嵌入的异源表位；(b)具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生区域；(c)位于A1片段区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，异源T细胞表位是CD8+ T细胞表位，例如诸如关于人免疫系统。对于某些另外的实施方案，异源T细胞表位能够由细胞的MHC I类分子呈递。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞、引起细胞死亡、和/或将嵌入或插入的异源T细胞表位递送至MHC I类分子，用于在细胞表面上呈递。对于某些另外的实施方案，与参考分子相比(例如诸如，由所述细胞靶向分子组成的第二细胞靶向分子，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分包括位于A1片段区域羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)，细胞靶向分子在被引入细胞时能够展示相当或更好的细胞毒性。
在实施方案组#3的某些实施方案中，嵌入或插入的异源T细胞表位破坏内源B细胞和/或T细胞表位区域，所述内源B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：(i)SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQID NO:1-18中任一个的53-66，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；(ii)SEQ IDNO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；和SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；和(iii)SEQ IDNO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；和SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#3的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个突变，该突变改变了天然位于以下位置的区域中的至少一个氨基酸残基：在志贺毒素(SEQ ID NO:1-2和4-6)的A亚基的248-251处，在志贺样毒素2(SEQ ID NO:3和7-18)的A亚基的247-250处，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小的弗林蛋白酶切割位点包含一个或更多个突变。在某些另外的实施方案中，最小的弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#3的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#3的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。
在实施方案组#3的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分包括结合区域。
在实施方案组#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些另外的实施方案中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#3的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性和/或细胞内发送)。
在实施方案组#3的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如诸如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可。
在实施方案组#3的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序中包含氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基置换是选自由以下各项组成的组的不带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#3的某些实施方案中，当细胞靶向分子被引入细胞时能够表现出与第七细胞靶向分子的细胞毒性相当的细胞毒性，所述第七细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分每个包含野生型志贺毒素A1片段和/或在其A1片段区域的羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出在第七细胞靶向分子所表现出的细胞毒性的从0.1倍、0.5倍或0.75倍至1.2倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍或5倍的范围内的细胞毒性。
在实施方案组#3的某些实施方案中，与第七细胞靶向分子的体内耐受性相比，细胞靶向分子在被引入到脊索动物时能够表现出改善的体内耐受性。
在实施方案组#3的某些实施方案中，由于嵌入或插入的异源表位，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考分子(例如诸如，由所述细胞靶向分子组成的第八细胞靶向分子，除了其缺少细胞靶向分子中存在的一个或更多个嵌入或插入的表位)相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。
在实施方案组#3的某些实施方案中，由于弗林蛋白酶切割基序的破坏，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与第九细胞靶向分子相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性，第九细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有志贺毒素效应子多肽组分由野生型志贺毒素A1片段组成。
实施方案组#4～包含位于或接近氨基末端的志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分
子，其中志贺毒素效应子多肽包含嵌入或插入的异源T细胞表位
本发明提供细胞靶向分子，每个分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)包含插入或嵌入的异源表位的志贺毒素效应子多肽，其中志贺毒素效应子多肽位于或接近多肽的氨基末端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域，(ii)多肽组分，和(iii)包含插入或嵌入的异源表位的志贺毒素效应子多肽；其中志贺毒素效应子多肽位于或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域在细胞靶向分子内，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，异源T细胞表位是CD8+ T细胞表位，例如诸如关于人免疫系统。对于某些另外的实施方案，异源T细胞表位能够由细胞的MHC I类分子呈递。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞、引起细胞死亡和/或将嵌入或插入的异源T细胞表位递送至MHC I类分子，用于在细胞表面上呈递。
在实施方案组#4的某些实施方案中，与第十细胞靶向分子相比，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出更大的细胞毒性，第十细胞靶向分子具有氨基末端，并且包含结合区域和不位于或不接近第十细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽区域。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与第十细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第十细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。
对于实施方案组#4的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入或插入的异源CD8+ T细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径，用于通过MHC I类分子结合的表位的细胞表面呈递。
在实施方案组#4的某些实施方案中，由于嵌入或插入的异源表位，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考分子(例如诸如，由所述细胞靶向分子组成的第十一细胞靶向分子，除了其缺少细胞靶向分子中存在的一个或更多个嵌入或插入的表位)相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。
对于实施方案组#4的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子没有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如第十细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入到细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
实施方案组#5-包含去免疫化的志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子，去免疫化
的志贺毒素效应子多肽包含破坏的弗林蛋白酶切割基序
本发明提供细胞靶向分子，每个分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域和(ii)包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的去免疫化的志贺毒素效应子多肽。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域和(ii)去免疫化的志贺毒素效应子多肽，其包含(a)具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生区域；(b)位于A1片段区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序，和(c)至少一个破坏的内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位和/或表位区域。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。对于某些另外的实施方案，与参考分子(例如诸如，由所述细胞靶向分子组成的第二细胞靶向分子，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分包括位于其A1片段区域的羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)相比，细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出相当或更好的细胞毒性。
在实施方案组#5的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，志贺毒素效应子多肽包含在B细胞和/或T细胞表位区域中的突变，所述B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66；SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ IDNO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；SEQ IDNO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，没有以下破坏：与至少一个破坏的内源B细胞和/或T细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#5的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个突变，该突变改变了天然位于以下位置的区域中的至少一个氨基酸残基：在志贺毒素(SEQ ID NO:1-2和4-6)的A亚基的248-251处，在志贺样毒素2(SEQ ID NO:3和7-18)的A亚基的247-250处，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点包含一个或更多个突变。在某些另外的实施方案中，最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#5的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#5的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。
在实施方案组#5的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分包含结合区域。
在实施方案组#5的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些另外的实施方案中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#5的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性和/或细胞内发送)。
在实施方案组#5的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如诸如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可。
在实施方案组#5的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序中包含氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基置换是选自由以下各项组成的组的不带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#5的某些实施方案中，当细胞靶向分子被引入细胞时能够表现出与参考分子(例如诸如，由所述细胞靶向分子组成的第十二细胞靶向分子，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分每个包含野生型志贺毒素A1片段和/或在其A1片段区域的羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)的细胞毒性相当的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出在第十二细胞靶向分子所表现出的细胞毒性的从0.1倍、0.5倍或0.75倍至1.2倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍或5倍的范围内的细胞毒性。
在实施方案组#5的某些实施方案中，与第十二细胞靶向分子的体内耐受性相比，细胞靶向分子在被引入脊索动物时能够表现出改善的体内耐受性。
在实施方案组#5的某些实施方案中，由于弗林蛋白酶切割基序的破坏，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考细胞靶向分子(由所述细胞靶向分子组成，除了弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有志贺毒素效应子多肽组分由野生型志贺毒素A1片段组成，例如诸如，第十二细胞靶向分子)相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。
在实施方案组#5的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:252-255，259-271，274-278和288-748中任一所示的多肽或基本上由其组成，任选地，细胞靶向分子包含氨基端甲硫氨酸残基。
实施方案组#6-包含羧基端内质网保留/回收信号基序和去免疫化的志贺毒素效
应子多肽的细胞靶向分子
本发明提供了细胞靶向分子，每个分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)去免疫化的志贺毒素效应子多肽；和(iii)羧基端的内质网保留/回收信号基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)去免疫化的志贺毒素效应子多肽，其包含至少一个破坏的内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位和/或表位区域；和(iii)KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞)和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。
在实施方案组#6的某些实施方案中，羧基端内质网保留/回收信号基序选自由以下各项组成的组：KDEL(SEQ ID NO:750),HDEF(SEQ ID NO:751),HDEL(SEQ ID NO:752),RDEF(SEQ ID NO:753),RDEL(SEQ ID NO:754),WDEL(SEQ ID NO:755),YDEL(SEQ ID NO:756),HEEF(SEQ ID NO:757),HEEL(SEQ ID NO:758),KEEL(SEQ ID NO:759),REEL(SEQ IDNO:760),KAEL(SEQ ID NO:761),KCEL(SEQ ID NO:762),KFEL(SEQ ID NO:763),KGEL(SEQID NO:764),KHEL(SEQ ID NO:765),KLEL(SEQ ID NO:766),KNEL(SEQ ID NO:767),KQEL(SEQ ID NO:768),KREL(SEQ ID NO:769),KSEL(SEQ ID NO:770),KVEL(SEQ ID NO:771),KWEL(SEQ ID NO:772),KYEL(SEQ ID NO:773),KEDL(SEQ ID NO:774),KIEL(SEQ ID NO:775),DKEL(SEQ ID NO:776),FDEL(SEQ ID NO:777),KDEF(SEQ ID NO:778),KKEL(SEQ IDNO:779),HADL(SEQ ID NO:780),HAEL(SEQ ID NO:781),HIEL(SEQ ID NO:782),HNEL(SEQID NO:783),HTEL(SEQ ID NO:784),KTEL(SEQ ID NO:785),HVEL(SEQ ID NO:786),NDEL(SEQ ID NO:787),QDEL(SEQ ID NO:788),REDL(SEQ ID NO:789),RNEL(SEQ ID NO:790),RTDL(SEQ ID NO:791),RTEL(SEQ ID NO:792),SDEL(SEQ ID NO:793),TDEL(SEQ ID NO:794),SKEL(SEQ ID NO:795),STEL(SEQ ID NO:796)和EDEL(SEQ ID NO:797)。
在实施方案组#6的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，志贺毒素效应子多肽包含在B细胞和/或T细胞表位区域中的突变，所述B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66；SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ IDNO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；SEQ IDNO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，没有以下破坏：与至少一个破坏的内源B细胞和/或T细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#6的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出比第十三细胞靶向分子的细胞毒性更强的细胞毒性，第十三细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与第十三细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第十三细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更强。
对于实施方案组#6的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如第十三细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
实施方案组#7-包含去免疫化的志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子，其中去免
疫化的志贺毒素效应子多肽位于或接近细胞靶向分子的氨基末端
本发明提供细胞靶向分子，每个分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)去免疫化的志贺毒素效应子多肽，其中志贺毒素效应子多肽位于或接近氨基末端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)多肽组分；(iii)去免疫化的志贺毒素效应子多肽，其包含至少一个破坏的内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位和/或表位区域，其中志贺毒素效应子多肽位于或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子中物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域在细胞靶向分子内，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。
在实施方案组#7的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，志贺毒素效应子多肽包含在B细胞和/或T细胞表位区域中的突变，所述B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的11-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66；SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ IDNO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；SEQ IDNO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，没有以下破坏：与至少一个破坏的内源B细胞和/或T细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#7的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出比第十四细胞靶向分子的细胞毒性更强的细胞毒性，其中所述第十四细胞靶向分子具有氨基末端，并且包含结合区域和不位于或不接近第十四细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽区域。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与第十四细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第十四细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。
对于实施方案组#7的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如第十四细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
在实施方案组#7的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:252-255，259-271，274-278和288-748中任一所示的多肽或基本上由其组成，任选地，细胞靶向分子包含氨基端的甲硫氨酸残基。
实施方案组#8-包含羧基末端内质网保留/回收信号基序和志贺毒素效应子多肽
的细胞靶向分子，其中志贺毒素效应子多肽包含破坏的弗林蛋白酶切割基序
本发明提供细胞靶向分子，每个分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽；和(iii)羧基端内质网保留/回收信号基序。本发明提供细胞靶向分子，每个分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽；(iii)KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。对于某些另外的实施方案，与参考分子(例如诸如，由所述细胞靶向分子组成的第二细胞靶向分子，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分包括位于其A1片段区域羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)相比，细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出相当或更好的细胞毒性。
在实施方案组#8的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个突变，该突变改变了天然位于以下位置的区域中的至少一个氨基酸残基：在志贺毒素(SEQ ID NO:1-2和4-6)的A亚基的248-251处，在志贺样毒素2(SEQ ID NO:3和7-18)的A亚基的247-250处，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点包含一个或更多个突变。在某些另外的实施方案中，最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#8的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#8的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。
在实施方案组#8的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分包含结合区域。
在实施方案组#8的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些另外的实施方案中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#8的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性和/或细胞内发送)。
在实施方案组#8的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如诸如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可
在实施方案组#8的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序中包含氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基置换是选自由以下各项组成的组的不带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#8的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出比第十五细胞靶向分子的细胞毒性更强的细胞毒性，其中第十五细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与第十五细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第十五细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。
在实施方案组#8的某些实施方案中，与第十六细胞靶向分子的体内耐受性相比，细胞靶向分子在被引入脊索动物时能够表现出改善的体内耐受性，其中第十六细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分每个包含野生型志贺毒素A1片段和/或在其A1片段区域的羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#8的某些实施方案中，由于弗林蛋白酶切割基序的破坏，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考细胞靶向分子(由所述细胞靶向分子组成，除了弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有志贺毒素效应子多肽组分由野生型志贺毒素A1片段组成，例如诸如第十六细胞靶向分子)相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。
对于实施方案组#8的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如，第十五细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入到细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
实施例组#9-包含弗林蛋白酶切割抗性志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子，其
中志贺毒素效应子多肽位于或接近细胞靶向分子的氨基末端
本发明提供细胞靶向分子，每个分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域和(ii)志贺毒素效应子多肽，其包含在其志贺毒素A1片段区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序的；其中志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)具有氨基末端的志贺毒素效应子多肽和具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生区域；和(iii)位于A1片段区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域位于细胞靶向分子内，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。对于某些另外的实施方案，与参考分子(例如诸如，由所述细胞靶向分子组成的第十七细胞靶向分子，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分包括位于其A1片段区域羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)相比，细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出相当或更好的细胞毒性。
在实施方案组#9的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个突变，该突变改变了天然位于以下位置的区域中的至少一个氨基酸残基：在志贺毒素(SEQ ID NO:1-2和4-6)的A亚基的248-251处，或在志贺样毒素2(SEQ ID NO:3和7-18)的A亚基的247-250处，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点包含一个或更多个突变。在某些另外的实施方案中，最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#9的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#9的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。
在实施方案组#9的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分包含结合区域。
在实施方案组#9的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些另外的实施方案中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#9的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性和/或细胞内发送)。
在实施方案组#9的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可。
在实施方案组#9的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序中包含氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基置换是选自由以下各项组成的组的不带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#9的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出比第十八细胞靶向分子的细胞毒性更强的细胞毒性，其中第十八细胞靶向分子具有氨基末端，并且包含结合区域和不位于或不接近第十八细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽区域。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与第十八细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第十八细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。
在实施方案组#9的某些实施方案中，与第十九细胞靶向分子的体内耐受性相比，细胞靶向分子在被引入脊索动物时能够表现出改善的体内耐受性，其中第十九细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分每个包含野生型志贺毒素A1片段和/或在其A1片段区域的羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#9的某些实施方案中，由于弗林蛋白酶切割基序的破坏，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考细胞靶向分子(由所述细胞靶向分子组成，除了弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有志贺毒素效应子多肽组分由野生型志贺毒素A1片段组成，例如诸如，第十九细胞靶向分子)相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。
对于实施方案组#9的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如，第十九细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入到细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
在实施方案组#9的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:252-255，259-271，274-278和288-748中任一所示的多肽或基本上由其组成，任选地，细胞靶向分子包含氨基端甲硫氨酸残基。
实施方案组#10-细胞靶向分子，其包含羧基端内质网保留/回收信号基序和位于
或接近细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽
本发明提供细胞靶向分子，每个分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)羧基端内质网保留/回收信号基序；和(iii)志贺毒素效应子多肽；其中志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序；(iii)多肽组分；和(iv)志贺毒素效应子多肽；其中志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域位于细胞靶向分子内，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。
对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。
在实施方案组#10的某些实施方案中，羧基端内质网保留/回收信号基序选自由以下各项组成的组：KDEL(SEQ ID NO:750),HDEF(SEQ ID NO:751),HDEL(SEQ ID NO:752),RDEF(SEQ ID NO:753),RDEL(SEQ ID NO:754),WDEL(SEQ ID NO:755),YDEL(SEQ ID NO:756),HEEF(SEQ ID NO:757),HEEL(SEQ ID NO:758),KEEL(SEQ ID NO:759),REEL(SEQ IDNO:760),KAEL(SEQ ID NO:761),KCEL(SEQ ID NO:762),KFEL(SEQ ID NO:763),KGEL(SEQID NO:764),KHEL(SEQ ID NO:765),KLEL(SEQ ID NO:766),KNEL(SEQ ID NO:767),KQEL(SEQ ID NO:768),KREL(SEQ ID NO:769),KSEL(SEQ ID NO:770),KVEL(SEQ ID NO:771),KWEL(SEQ ID NO:772),KYEL(SEQ ID NO:773),KEDL(SEQ ID NO:774),KIEL(SEQ ID NO:775),DKEL(SEQ ID NO:776),FDEL(SEQ ID NO:777),KDEF(SEQ ID NO:778),KKEL(SEQ IDNO:779),HADL(SEQ ID NO:780),HAEL(SEQ ID NO:781),HIEL(SEQ ID NO:782),HNEL(SEQID NO:783),HTEL(SEQ ID NO:784),KTEL(SEQ ID NO:785),HVEL(SEQ ID NO:786),NDEL(SEQ ID NO:787),QDEL(SEQ ID NO:788),REDL(SEQ ID NO:789),RNEL(SEQ ID NO:790),RTDL(SEQ ID NO:791),RTEL(SEQ ID NO:792),SDEL(SEQ ID NO:793),TDEL(SEQ ID NO:794),SKEL(SEQ ID NO:795),STEL(SEQ ID NO:796)和EDEL(SEQ ID NO:797)。
在实施方案组#10的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出比第二十细胞靶向分子和/或第二十一细胞靶向分子的细胞毒性更强的细胞毒性，其中第二十细胞靶向分子具有氨基末端，并且包含结合区域和不位于或不接近第二十细胞靶向分子的氨基末端志贺毒素效应子多肽区域，其中第二十一细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，第二十细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与参考分子(例如诸如，第二十和/或第二十一细胞靶向分子)相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第二十和/或第二十一细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。
对于实施方案组#10的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如，第二十和/或第二十一细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
本发明的多价细胞靶向分子
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子是多价的。在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含两个或更多个结合区域，其中每个结合区域能够特异性结合相同细胞外靶生物分子的细胞外部分。对于某些另外的实施方案，在将多价细胞靶向分子施用于与靶生物分子物理偶联的细胞群时(所述细胞具有被多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域结合的细胞外部分)，导致这样的细胞毒性作用：所述细胞毒性作用比在在相同条件下将等同量、质量或摩尔浓度的多价细胞靶向分子的单价靶标结合分子组分施用于相同靶标阳性细胞群所引起的细胞毒性作用大2、2.5、3、4、5、7.5、10倍，或大于所述单价靶标结合分子组分和多价细胞靶向分子之间的靶标结合的倍数变化，如解离常数(KD)所测量的。
实施方案组#11-包含去免疫化的志贺毒素效应子多肽的多价细胞靶向分子，其中
志贺毒素效应子多肽包含嵌入或插入的异源T细胞表位和非重叠的去免疫化的子区域
本发明提供多价细胞靶向分子，其包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合相同靶生物分子的细胞外部分，和(ii)至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽。例如，组#11的某些实施方案是多价细胞靶向分子，其包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合相同的细胞外靶生物分子，和(ii)至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽，其包含至少一个插入或嵌入的异源表位(a)和至少一个破坏的内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位区域(b)，其中异源表位不与嵌入或插入的异源T细胞表位重叠。对于某些另外的实施方案，所述至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。对于某些另外的实施方案，以相当于5％、10％、20％、35％、50％、65％、75％和/或80％的细胞表面占有率的多价细胞靶向分子浓度，将多价细胞靶向分子施用于与两个或更多个结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的多个细胞后(所述细胞具有被两个或更多个结合区域结合的细胞外部分)，在适合于细胞的生理温度下和/或在约37摄氏度下，在约15小时、10小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更短时间内，大多数多价细胞靶向分子内化到多个细胞中。在某些另外的实施方案中，异源T细胞表位是CD8+ T细胞表位，例如诸如关于人免疫系统。对于某些另外的实施方案，异源T细胞表位能够由细胞的MHC I类分子呈递。对于某些另外的实施方案，本发明的多价细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞、引起胱天蛋白酶活化、导致细胞死亡和/或将嵌入或插入的异源T细胞表位递送至MHC I类分子，用于在细胞表面上呈递。对于某些另外的实施方案，多价细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出与被引入相同类型细胞的参考分子的细胞毒性相当或更高的细胞毒性。参考分子的非限制性实例包括第二细胞靶向分子，例如诸如，(1)单价第二细胞靶向分子，其仅包含感兴趣的多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域中的一个，以及多价细胞靶向分子的一个或更多个相同的志贺毒素效应子多肽组分，和/或(2)由所述多价细胞靶向分子组成的多价第三细胞靶向分子，除了其所有其志贺毒素效应子多肽组分每个包含野生型志贺毒素A1片段。
所述至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽中的每一个都具有氨基末端，无论是关于多肽区域边界和/或物理多肽末端。
在某些实施方案中，所述至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽包含具有羧基末端的志贺毒素A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域。在某些实施方案中，所述至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽包含具有羧基末端的志贺毒素A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域。在某些另外的实施方案中，多价细胞靶向分子的所有志贺毒素效应子多肽组分各自包含具有羧基末端的志贺毒素A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域。
在实施方案组#11的某些实施方案中，多价细胞靶向分子包含位于至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端的羧基端的分子部分。
对于实施方案组#11的某些实施方案，与参考分子(例如诸如，由多价细胞靶向分子组成的第四细胞靶向分子，除了第四细胞靶向分子的至少一个志贺毒素效应子多肽组分包含野生型志贺毒素A1片段和/或位于其A1片段区域或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点)相比，本发明的多价细胞靶向分子在被引入脊索动物时能够表现出改善的体内耐受性和/或稳定性。对于某些另外的实施方案，(1)位于分子部分氨基端的所有去免疫化的志贺毒素效应子多肽不具有细胞毒性，(2)分子部分具有细胞毒性。
在实施方案组#11的某些实施方案中，两个或更多个结合区域中的至少一个与至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽直接或间接连接在一起，例如诸如，融合以形成连续多肽(参见例如图1)。在某些另外的实施方案中，所有两个或更多个结合区域各自直接或间接连接至多价细胞靶向分子的去免疫化的志贺毒素效应子多肽组分(参见例如图1)。在某些另外的实施方案中，所有两个或更多个结合区域与所有去免疫化的志贺毒素效应子多肽直接或间接连接在一起，例如诸如，融合以形成连续多肽(参见例如图1)。
在实施方案组#11的某些实施方案中，两个或更多个结合区域中的至少一个包含含有免疫球蛋白型结合区域的多肽。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域中的至少一个包含选自由以下各项组成的组的多肽：自主VH结构域、单结构域抗体片段(sdAb)、纳米抗体、来源于骆驼科的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变片段(scFv)、抗体可变片段(Fv)、互补决定区3片段(CDR3)、受约束的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段、小模块化免疫药物(SMIP)结构域、抗原结合片段(Fab)、犰狳重复多肽(ArmRP)、纤连蛋白来源的第10纤连蛋白III型结构域(10Fn3)、肌腱蛋白III型结构域(TNfn3)、锚蛋白重复基序结构域、低密度脂蛋白受体来源的A结构域(LDLR-A)、脂质运载蛋白(anticalin)、Kunitz结构域、蛋白A来源的Z结构域、γ-B晶状体蛋白来源的结构域、泛素来源的结构域、Sac7d来源的多肽(affitin)、Fyn来源的SH2结构域、微蛋白、C型凝集素样结构域支架、工程化的抗体模拟物、以及保留结合功能性的任何前述的经遗传操作的对应物。在某些实施方案中，多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域中的每一个包含含有免疫球蛋白型结合区域的多肽和/或选自由以下各项组成的组的多肽：自主VH结构域、单结构域抗体片段(sdAb)、纳米抗体、来源于骆驼科的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变片段(scFv)、抗体可变片段(Fv)、互补决定区3片段(CDR3)、受约束的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段、小模块化免疫药物(SMIP)结构域、抗原结合片段(Fab)、犰狳重复多肽(ArmRP)、纤连蛋白来源的第10纤连蛋白III型结构域(10Fn3)、肌腱蛋白III型结构域(TNfn3)、锚蛋白重复基序结构域、低密度脂蛋白受体来源的A结构域(LDLR-A)、脂质运载蛋白(anticalin)、Kunitz结构域、蛋白质A来源的Z结构域、γ-B晶状体蛋白来源的结构域、泛素衍生的结构域、Sac7d来源的多肽(affitin)、Fyn来源的SH2结构域、微蛋白、C型凝集素样结构域支架、工程化的抗体模拟物、以及保留结合功能性的任何前述的经遗传操作的对应物。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含两个或更多个蛋白质组分(例如蛋白质亚基)，其中每个蛋白质组分包含(a)两个或更多个结合区域中的至少一个，和任选地，(b)至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽中的一个或更多个。在某些另外的实施方案中，每个蛋白质组分包含(1)两个或更多个结合区域中的仅一个和(2)仅一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽。在某些另外的实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子恰好包含两个蛋白质组分。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含两个或更多个组分，其中至少一个组分通过一种或更多种非共价相互作用与多价细胞靶向分子相关联。在某些另外的实施方案中，至少一个组分是蛋白质的。在某些另外的实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含通过一种或更多种非共价相互作用直接或间接地彼此相关联的两个或更多个蛋白质组分。在某些另外的实施方案中，每个蛋白质组分包含(1)两个或更多个结合区域中的至少一个和(2)至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽中的至少一个。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含两个或更多个志贺毒素效应子多肽，无论是去免疫化的还是未去免疫化的。在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含两个或更多个蛋白质组分(例如蛋白质亚基)，其中每个蛋白质组分包含(a)两个或更多个结合区域中的至少一个，和任选地，(b)一个或更多个志贺毒素效应子多肽。在某些另外的实施方案中，每个蛋白质组分包含(1)两个或更多个结合区域中的仅一个和(2)仅一个志贺毒素效应子多肽。在某些另外的实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含两个或更多个组分(例如蛋白质组分)，其中至少一个组分通过一种或更多种非共价相互作用与多价细胞靶向分子相关联。在某些另外的实施方案中，每个蛋白质组分包含(1)两个或更多个结合区域中的至少一个和(2)至少一个志贺毒素效应子多肽。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽组分包含具有羧基末端的志贺毒素A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域。在某些另外的实施方案中，多价细胞靶向分子的所有志贺毒素效应子多肽组分各自包含具有羧基末端的志贺毒素A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域。
对于实施方案组#11的某些实施方案，本发明的多价细胞靶向分子能够表现出(i)与野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应子多肽相当的催化活性水平，(ii)半数最大抑制浓度(IC50)值为10,000皮摩尔或更低的核糖体抑制活性，和/或(iii)显著水平的志贺毒素催化活性。
对于实施方案组#11的某些实施方案，本发明的多价细胞靶向分子和/或其至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽能够表现出与参考细胞靶向分子(其包含野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应子多肽)相当的亚细胞发送效率，和/或能够表现出从细胞的内体起始位置到内质网和/或胞质溶胶的显著水平的细胞内发送活性。
对于实施方案组#11的某些实施方案，通过将本发明的多价细胞靶向分子施用于与多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，所述多价细胞靶向分子能够引起细胞死亡。对于某些另外的实施方案，将本发明的多价细胞靶向分子施用于两种不同的细胞类型群(其在物理偶联的细胞外靶生物分子的存在或水平方面不同)，相比于针对不与多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型的CD50，所述多价细胞靶向分子能够以至少三倍或更低的CD50导致与多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型的细胞死亡。对于某些实施方案，通过将本发明的多价细胞靶向分子施用于第一细胞群(其成员与多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联)和第二细胞群(其成员不与两个或更多个结合区域的任何细胞外靶生物分子物理偶联)，相对于第二细胞群的成员，多价细胞靶向分子对所述第一细胞群的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，通过将本发明的多价细胞靶向分子施用于第一细胞群(其成员与多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域的大量细胞外靶生物分子物理偶联)和第二细胞群(其成员不与两个或更多个结合区域的大量任何细胞外靶生物分子物理偶联)，相对于第二细胞群的成员，多价细胞靶向分子对所述第一细胞群的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，通过将本发明的多价细胞靶向分子施用于第一靶生物分子阳性细胞群和第二细胞群(其成员在细胞表面不表达多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域的大量靶生物分子)，相对于第二细胞群的成员，多价细胞靶向分子对第一细胞群的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。
对于实施方案组#11的某些实施方案，本发明的多价细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出半数最大抑制浓度(CD50)值为300纳摩尔(nM)或更低的细胞毒性，和/或能够表现出显著水平的志贺毒素细胞毒性。
对于实施方案组#11的某些实施方案，本发明的多价细胞靶向分子能够将嵌入或插入的异源CD8+ T细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径，用于由MHC I类分子结合的表位的细胞表面呈递。
在实施方案组#11的某些实施方案中，多价细胞靶向分子包含与至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的羧基末端相关联的分子部分。在某些实施方案中，分子部分包含两个或更多个结合区域或由其组成。在某些实施方案中，分子部分包含至少一个氨基酸，并且至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽直接或间接地连接至分子部分的至少一个氨基酸残基。在某些另外的实施方案中，分子部分和至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽直接或间接地融合，形成连续多肽。在某些另外的实施方案中，分子部分各自直接或间接地与至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽融合，以形成连续多肽。
在实施方案组#11的某些实施方案中，多价细胞靶向分子还包含与至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的羧基末端相关联的细胞毒性分子部分。在某些实施方案中，细胞毒性分子部分是细胞毒性剂，例如诸如本领域技术人员已知的和/或在此描述的小分子化学治疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性抗生素、细胞毒性抗感染剂、烷化剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。在某些另外的实施方案中，细胞毒性分子部分在小于10,000、5,000、1,000、500或200皮摩尔(pM)的浓度下具有细胞毒性。
对于实施方案组#11的某些实施方案，两个或更多个结合区域各自能够结合选自由以下各项组成的组的细胞外靶生物分子：CD20、CD22、CD40、CD74、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前列腺特异性膜抗原、Cripto、CDCP1、内皮糖蛋白、成纤维细胞活化蛋白、Lewis-Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1或NTRKR1)、碳酸酐酶IX、叶酸结合蛋白、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂Lewis-Y2、VEGFR、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、Erb3、c-MET、IGFIR、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANK、FAP、肌腱蛋白、CD64、间皮素、BRCA1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE6、SART-1、PRAME、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原、人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶、EphA2、HER3/ErbB-3、MUC1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶相关抗原、HPV-E7、EB病毒抗原、Bcr-Abl、α-甲胎蛋白抗原、17-A1、膀胱肿瘤抗原、SAIL、CD38、CD15、CD23、CD45(蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型)、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305、C3AR、FceRIa、半乳糖凝集素-9、IL-1R(白细胞介素-1受体)、mrp-14、NKG2D配体、程序性死亡-配体1(PD-L1)、Siglec-8、Siglec-10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT-3、半乳糖凝集素-3、CD11a-c、GITRL、MHC I类分子、MHC II类分子(任选与肽复合)、CD284(TLR4)、CD107-Mac3、CD195(CCR5)、HLA-DR、CD16/32、CD282(TLR2)、CD11c以及任何前述的任何免疫原性片段。
在实施方案组#11的某些实施方案中，两个或更多个结合区域中的一个或更多个通过至少一个不是二硫键的共价键直接或间接地连接到至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽中的至少一个。在某些另外的实施方案中，多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域中的一个或更多个直接或间接地与至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的羧基末端融合，以形成单个连续多肽。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域中的至少一个包含免疫球蛋白型结合区域。在某些另外的实施方案中，多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域中的所有各自包含免疫球蛋白型结合区域。
在实施方案组#11的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在最小弗林蛋白酶切割位点包含一个或更多个突变。在某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序不是与最小弗林蛋白酶切割位点的至少一个氨基酸残基的部分或全部重叠的序列的氨基端截短。在某些实施方案中，在最小弗林蛋白酶切割位点的突变是R/Y-x-x-R弗林蛋白酶切割基序中的至少一个氨基酸残基的氨基酸缺失、插入和/或置换。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含至少一个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，该突变改变了天然位于以下位置的区域中的至少一个氨基酸残基：在志贺毒素(SEQ ID NO:1-2和4-6)的A亚基的248-251处，在志贺样毒素2(SEQ ID NO:3和7-18)的A亚基的247-250处，或任何志贺毒素A亚基中的等同氨基酸序列位置处。在某些另外的实施方案中，突变是不带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的氨基酸残基置换。
在实施方案组#11的某些实施方案中，两个或更多个结合区域中的至少一个包含SEQ ID NO:39-245中任一个所示的肽或多肽。
在实施方案组#11的某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含SEQ IDNO:252-255和288-748中任一个所示的多肽。在某些另外的实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含两个蛋白或基本上由其组成，每个蛋白选自SEQ ID NO:252-255和288-748中所示的任何一个多肽，并且任选地，每个蛋白还包含氨基端甲硫氨酸残基。
在实施方案组#11的某些实施方案中，所述两个或更多个结合区域中的至少一个在空间上覆盖至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽中的至少一个的A1片段区域或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域中的至少一个在空间上覆盖多价细胞靶向分子中存在的所有志贺毒素效应子多肽组分的A1片段区域或A1片段衍生区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，存在于多价细胞靶向分子中的每个志贺毒素效应子多肽组分的A1片段区域或A1片段衍生区域的每个羧基末端都被两个或更多个结合区域中的至少一个在空间上覆盖。
在实施方案组#11的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽中的至少一个的A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分包含两个或更多个结合区域中的至少一个。
在实施方案组#11的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽中的至少一个的A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分在空间上覆盖多价细胞靶向分子中存在的所有志贺毒素效应子多肽组分的A1片段区域或A1片段衍生区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，存在于多价细胞靶向分子中的每个志贺毒素效应子多肽组分的A1片段区域或A1片段衍生区域的每个羧基末端被至少一个分子部分在空间上覆盖。在某些另外的实施方案中，存在于多价细胞靶向分子中的每个分子部分都包含两个或更多个结合区域中的至少一个。
在实施方案组#11的某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含位于至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端的羧基端的两个或更多个结合区域中的至少一个和/或分子部分。在某些另外的实施方案中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含两个或更多个结合区域和/或分子部分，其在多价细胞靶向分子内位于至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端的羧基端。
在实施方案组#11的某些实施方案中，多价细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要多价细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性、细胞内发送和/或细胞内化动力学参数)。在实施方案组#11的某些实施方案中，两个或更多个结合区域具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的组合质量(combined mass)，只要多价细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性、细胞内发送和/或细胞内化动力学参数)。在某些另外的实施方案中，多价细胞靶向分子的两个或更多个结合区域中的每一个包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要多价细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性、细胞内发送和/或细胞内化动力学参数)。
在实施方案组#11的某些实施方案中，所述两个或更多个结合区域中的至少一个包含在相对大的分子部分内，例如诸如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要多价细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可。
在实施方案组#11的某些实施方案中，相对于两个或更多个结合区域中的任何一个，至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽更接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于该多肽链内包含的至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽，包含至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的多价细胞靶向分子的组分的相同多肽链内包含的两个或更多个结合区域中没有一个接近该多肽链的氨基末端。在某些实施方案中，至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，存在于多价细胞靶向分子中的所有志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域和至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽在多价细胞靶向分子内物理排列或定向，使得相对于志贺毒素效应子多肽组分的羧基末端，两个或更多个结合区域中没有一个接近至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于至少一个志贺毒素效应子多肽组分，两个或更多个结合区域中没有一个接近多价细胞靶向分子的任何氨基末端。在某些实施方案中，两个或更多个结合区域在多价细胞靶向分子内连接，更接近至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的羧基末端，而不是该去免疫化的志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些实施方案中，相对于包含在该多肽组分的相同多肽链中的两个或更多个结合区域中的任一个，所有去免疫化的志贺毒素效应子多肽组分更接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域和至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽在多价细胞靶向分子内物理排列或定向，使得相对于志贺毒素效应子多肽组分的羧基末端，两个或更多个结合区域中没有一个接近任何去免疫化的志贺毒素效应子多肽组分的氨基末端。在某些实施方案中，相对于包含在该多肽组分的相同多肽链内的两个或更多个结合区域中的任一个，所有志贺毒素效应子多肽组分更接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域在多价细胞靶向分子内物理排列或定向，使得相对于志贺毒素效应子多肽组分的羧基末端，两个或更多个结合区域中没有一个接近任何志贺毒素效应子多肽组分的氨基末端。对于某些另外的实施方案，本发明的多价细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出比参考分子的细胞毒性更强的细胞毒性，其中参考分子为例如诸如第五细胞靶向分子或第六细胞靶向分子，其中第五细胞靶向分子包含具有氨基末端的多肽组分，并且包含相同的两个或更多个结合区域和相同的去免疫化的志贺毒素效应子多肽(其不位于或不接近第五细胞靶向分子的多肽组分的物理氨基末端)，作为多价细胞靶向分子的第六细胞靶向分子包含相同的两个或更多个结合区域和相同的志贺毒素效应子多肽组分，其中相对于所有志贺毒素效应子多肽组分，两个或更多个结合区域中的至少一个更接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。对于某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与第四细胞靶向分子的细胞毒性相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性。对于某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第五和/或第六细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。在某些另外的实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与第五和/或第六细胞靶向分子的亚细胞发送效率相比，当被引入细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。在某些另外的实施方案中，第五和/或第六细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。
在实施方案组#11的某些实施方案中，至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，存在于多价细胞靶向分子中的所有志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于两个或更多个结合区域中的任何一个，至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽更接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于该多肽链内包含的至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽，包含至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的多价细胞靶向分子的多肽组分的相同多肽链内包含的两个或更多个结合区域中没有一个接近该多肽链的氨基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域和至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽在多价细胞靶向分子内物理排列或定向，使得相对于志贺毒素效应子多肽组分的羧基末端，两个或更多个结合区域中没有一个接近至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于至少一个志贺毒素效应子多肽组分，两个或更多个结合区域中没有一个接近多价细胞靶向分子的任何氨基末端。在某些实施方案中，两个或更多个结合区域在多价细胞靶向分子内连接，更靠近至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的羧基末端，而不是该去免疫化的志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于至少一个志贺毒素效应子多肽组分，两个或更多个结合区域中没有一个接近多价细胞靶向分子的任何氨基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域在多价细胞靶向分子内连接，更接近至少一个志贺毒素效应子多肽的羧基末端，而不是该志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些实施方案中，相对于包含在该多肽组分的相同多肽链中的两个或更多个结合区域中的任一个，所有去免疫化的志贺毒素效应子多肽组分更接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域和至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽在多价细胞靶向分子内物理排列或定向，使得相对于志贺毒素效应子多肽组分的羧基末端，两个或更多个结合区域中没有一个接近任何去免疫化的志贺毒素效应子多肽组分的氨基末端。在某些实施方案中，相对于包含在该多肽组分的相同多肽链内的两个或更多个结合区域中的任一个，所有志贺毒素效应子多肽组分更接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域在多价细胞靶向分子内物理排列或定向，使得相对于志贺毒素效应子多肽组分的羧基末端，两个或更多个结合区域中没有一个接近任何志贺毒素效应子多肽组分的氨基末端。对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与参考分子的细胞毒性相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性，参考分子为例如例如作为多价细胞靶向分子的第七多价细胞靶向分子，其具有氨基末端并且包含相同的两个或更多个结合区域和相同的志贺毒素效应子多肽组分，其中没有志贺毒素效应子多肽组分位于和/或接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。对于某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第七细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。在某些另外的实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与第七细胞靶向分子的亚细胞发送效率相比，当被引入细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。在某些另外的实施方案中，第七细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。
在实施方案组#11的某些实施方案中，相对于至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽，两个或更多个结合区域不接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域和志贺毒素效应子多肽在多价细胞靶向分子内物理排列或定向，使得两个或更多个结合区域不接近至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于该多肽链内包含的至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽，包含至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的多价细胞靶向分子的组分的相同多肽链内包含的两个或更多个结合区域中没有一个接近该多肽链的氨基末端。在某些另外的实施方案中，至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，存在于多价细胞靶向分子中的所有志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域和至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽在多价细胞靶向分子内物理排列或定向，使得相对于志贺毒素效应子多肽组分的羧基末端，两个或更多个结合区域中没有一个接近至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于至少一个志贺毒素效应子多肽组分，两个或更多个结合区域中没有一个接近多价细胞靶向分子的任何氨基末端。在某些实施方案中，两个或更多个结合区域在多价细胞靶向分子内连接，更接近至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽的羧基末端，而不是该去免疫化的志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些实施方案中，相对于包含在该多肽组分的相同多肽链中的两个或更多个结合区域中的任一个，所有去免疫化的志贺毒素效应子多肽组分更接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域和至少一个去免疫化的志贺毒素效应子多肽在多价细胞靶向分子内物理排列或定向，使得相对于志贺毒素效应子多肽组分的羧基末端，两个或更多个结合区域中没有一个接近任何去免疫化的志贺毒素效应子多肽组分的氨基末端。在某些实施方案中，相对于包含在该多肽组分的相同多肽链内的两个或更多个结合区域中的任一个，所有志贺毒素效应子多肽组分更接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域在多价细胞靶向分子内物理排列或定向，使得相对于志贺毒素效应子多肽组分的羧基末端，两个或更多个结合区域中没有一个接近任何志贺毒素效应子多肽组分的氨基末端。对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如，与参考分子的细胞毒性相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性，其中参考分子为例如诸如作为多价细胞靶向分子的第八多价细胞靶向分子，其包含具有氨基末端的多肽组分，并且包含相同的两个或更多个结合区域和相同的志贺毒素效应子多肽组分，其中相对于所有志贺毒素效应子多肽组分中的每一个，两个或更多个结合区域中的至少一个接近多价细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与第八细胞靶向分子的亚细胞发送效率相比，当被引入细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。在某些另外的实施方案中，第八细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。
在实施方案组#11的某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子和/或其多肽组分包含KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，羧基端内质网保留/回收信号基序选自由以下各项组成的组：KDEL(SEQ ID NO:750),HDEF(SEQID NO:751),HDEL(SEQ ID NO:752),RDEF(SEQ ID NO:753),RDEL(SEQ ID NO:754),WDEL(SEQ ID NO:755),YDEL(SEQ ID NO:756),HEEF(SEQ ID NO:757),HEEL(SEQ ID NO:758),KEEL(SEQ ID NO:759),REEL(SEQ ID NO:760),KAEL(SEQ ID NO:761),KCEL(SEQ ID NO:762),KFEL(SEQ ID NO:763),KGEL(SEQ ID NO:764),KHEL(SEQ ID NO:765),KLEL(SEQ IDNO:766),KNEL(SEQ ID NO:767),KQEL(SEQ ID NO:768),KREL(SEQ ID NO:769),KSEL(SEQID NO:770),KVEL(SEQ ID NO:771),KWEL(SEQ ID NO:772),KYEL(SEQ ID NO:773),KEDL(SEQ ID NO:774),KIEL(SEQ ID NO:775),DKEL(SEQ ID NO:776),FDEL(SEQ ID NO:777),KDEF(SEQ ID NO:778),KKEL(SEQ ID NO:779),HADL(SEQ ID NO:780),HAEL(SEQ ID NO:781),HIEL(SEQ ID NO:782),HNEL(SEQ ID NO:783),HTEL(SEQ ID NO:784),KTEL(SEQ IDNO:785),HVEL(SEQ ID NO:786),NDEL(SEQ ID NO:787),QDEL(SEQ ID NO:788),REDL(SEQID NO:789),RNEL(SEQ ID NO:790),RTDL(SEQ ID NO:791),RTEL(SEQ ID NO:792),SDEL(SEQ ID NO:793),TDEL(SEQ ID NO:794),SKEL(SEQ ID NO:795),STEL(SEQ ID NO:796)和EDEL(SEQ ID NO:797)。在某些另外的实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出比参考分子的细胞毒性更强的细胞毒性，参考分子为例如诸如第九细胞靶向分子，其由细胞靶向分子组成，除了它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与参考分子(例如诸如第九细胞靶向分子)相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第九细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。
对于某些另外的实施方案，本发明的多价细胞靶向分子表现出低细胞毒性效力(即，在1000nM、500nM、100nM、75nM或50nM的细胞靶向分子浓度下，当被引入某些靶标阳性细胞类型时不能表现出细胞群中大于1％的细胞死亡的细胞毒性)，并且与第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和/或第九细胞靶向分子的亚细胞发送效率相比，当被引入细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网/胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
实施方案组#12-包含羧基端内质网保留/回收信号基序和志贺毒素效应子多肽的
多价细胞靶向分子，其中志贺毒素效应子多肽包含嵌入或插入的异源T细胞表位
本发明提供多价细胞靶向分子，每个分子包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合相同靶生物分子的细胞外部分；(ii)包含插入或嵌入的异源表位的志贺毒素效应子多肽；(iii)羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合细胞外靶生物分子；(ii)包含嵌入或插入的异源表位的志贺毒素效应子多肽；(iii)KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些实施方案中，异源表位是CD8+ T细胞表位，例如诸如关于人免疫系统。对于某些另外的实施方案，异源CD8+ T细胞表位能够由细胞的MHC I类分子呈递。对于实施方案组#12的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或更多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞、引起细胞死亡和/或将嵌入或将插入的异源T细胞表位递送到MHC I类分子，以在细胞表面上呈递。
在实施方案组#12的某些实施方案中，羧基端内质网保留/回收信号基序选自由以下各项组成的组：KDEL(SEQ ID NO:750),HDEF(SEQ ID NO:751),HDEL(SEQ ID NO:752),RDEF(SEQ ID NO:753),RDEL(SEQ ID NO:754),WDEL(SEQ ID NO:755),YDEL(SEQ ID NO:756),HEEF(SEQ ID NO:757),HEEL(SEQ ID NO:758),KEEL(SEQ ID NO:759),REEL(SEQ IDNO:760),KAEL(SEQ ID NO:761),KCEL(SEQ ID NO:762),KFEL(SEQ ID NO:763),KGEL(SEQID NO:764),KHEL(SEQ ID NO:765),KLEL(SEQ ID NO:766),KNEL(SEQ ID NO:767),KQEL(SEQ ID NO:768),KREL(SEQ ID NO:769),KSEL(SEQ ID NO:770),KVEL(SEQ ID NO:771),KWEL(SEQ ID NO:772),KYEL(SEQ ID NO:773),KEDL(SEQ ID NO:774),KIEL(SEQ ID NO:775),DKEL(SEQ ID NO:776),FDEL(SEQ ID NO:777),KDEF(SEQ ID NO:778),KKEL(SEQ IDNO:779),HADL(SEQ ID NO:780),HAEL(SEQ ID NO:781),HIEL(SEQ ID NO:782),HNEL(SEQID NO:783),HTEL(SEQ ID NO:784),KTEL(SEQ ID NO:785),HVEL(SEQ ID NO:786),NDEL(SEQ ID NO:787),QDEL(SEQ ID NO:788),REDL(SEQ ID NO:789),RNEL(SEQ ID NO:790),RTDL(SEQ ID NO:791),RTEL(SEQ ID NO:792),SDEL(SEQ ID NO:793),TDEL(SEQ ID NO:794),SKEL(SEQ ID NO:795),STEL(SEQ ID NO:796)和EDEL(SEQ ID NO:797)。
在实施方案组#12的某些实施方案中，插入或嵌入的异源T细胞表位破坏内源B细胞和/或T细胞表位区域，所述内源B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：(i)SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；(ii)SEQID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；和(iii)SEQ IDNO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
对于实施方案组#12的某些另外的实施方案，异源表位是能够由细胞的MHC I类分子呈递的CD8+ T细胞表位。在某些另外的实施方案中，异源表位被嵌入并取代野生型志贺毒素多肽区域中相等数量的氨基酸残基，使得志贺毒素效应子多肽与其所来源的野生型志贺毒素多肽区域具有相同的氨基酸残基总数。对于任何上述的某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种选自以下的志贺毒素效应子功能：指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体和细胞毒性。
在实施方案组#12的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出大于第五细胞靶向分子的细胞毒性的细胞毒性，第五细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成的，除了它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如，与第五细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第五细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高。
对于实施方案组#12的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入或插入的异源CD8+ T细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径，用于由MHC I类分子结合的表位的细胞表面呈递。
对于实施方案组#2的某些实施方案，由于嵌入或插入的异源表位，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考分子(例如诸如，由所述细胞靶向分子组成的第六细胞靶向分子，除了它缺少所述细胞靶向分子的一个或更多个志贺毒素效应子多肽组分中存在的一个或更多个嵌入或插入的表位)相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。
对于实施方案组#12的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如，第五细胞靶向分子)的亚细胞发送效率相比，当被引入细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
实施方案组#13-包含志贺毒素效应子多肽的多价细胞靶向分子，所述志贺毒素效
应子多肽包含(i)嵌入或插入的异源T细胞表位和(ii)位于A1片段衍生区域羧基末端的破
坏的弗林蛋白酶切割基序
本发明提供多价细胞靶向分子，每个分子包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合相同靶生物分子的细胞外部分；(ii)包含插入或嵌入的异源表位的志贺毒素效应子多肽；和(iii)破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)志贺毒素效应子多肽，其包含(a)插入或嵌入的异源表位；(b)具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生区域；和(c)位于A1片段衍生区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)志贺毒素效应子多肽，其包含(a)插入或嵌入的异源表位；(b)具有羧基末端的志贺毒素A1片段区域；和(c)位于A1片段区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，异源表位是CD8+ T细胞表位，例如诸如关于人免疫系统。对于某些另外的实施方案，异源T细胞表位能够由细胞的MHCI类分子呈递。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一个或多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞、引起细胞死亡和/或将嵌入或插入的异源T细胞表位递送到MHC I类分子，用于在细胞表面上呈递。对于某些另外的实施方案，当细胞靶向分子被引入细胞时能够表现出与参考分子相当或更好的细胞毒性，其中参考分子为例如第二细胞靶向分子，其由细胞靶向分子组成，除了其至少一个志贺毒素效应子多肽组分包括位于其A1片段区域羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。对于某些另外的实施方案，细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出与第二细胞靶向分子相当或更好的细胞毒性，其中第二细胞靶向分子由细胞靶向分子组成的，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分包含位于其A1片段区域羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#13的某些实施方案中，插入或嵌入的异源表位破坏内源B细胞和/或T细胞表位区域，所述内源B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：(i)SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ IDNO:1-18中任一个的53-66，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；(ii)SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；和SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；和(iii)SEQ ID NO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；和SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#13的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个突变，该突变改变了天然位于以下位置的区域中的至少一个氨基酸残基：在志贺毒素(SEQ ID NO:1-2和4-6)的A亚基的248-251处，或在志贺样毒素2(SEQ ID NO:3和7-18)的A亚基的247-250处，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点包含一个或更多个突变。在某些另外的实施方案中，最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#13的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#13的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端。
在实施方案组#13的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分包含结合区域。
在实施方案组#13的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些另外的实施方案中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#13的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性和/或细胞内发送)。
在实施方案组#13的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如诸如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可。
在实施方案组#13的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序中包含氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基置换是选自由以下各项组成的组的不带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#13的某些实施方案中，当细胞靶向分子被引入细胞时能够表现出与第七细胞靶向分子的细胞毒性相当的细胞毒性，所述第七细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或其A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出在第七细胞靶向分子所表现出的细胞毒性的从0.1倍、0.5倍或0.75倍至1.2倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍或5倍的范围内的细胞毒性。
在实施方案组#13的某些实施方案中，与第七细胞靶向分子的体内耐受性相比，细胞靶向分子在被引入脊索动物时能够表现出改善的体内耐受性。对于分子部分无毒并且分子部分包含结合区域的实施方案，只有当细胞靶向分子的所有结合区域直接或间接地与位于该志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段区域和/或志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端的羧基端的志贺毒素效应子多肽相关联或连接时，与第七细胞靶向分子的体内耐受性相比，细胞靶向分子在被引入脊索动物时才能够表现出改善的体内耐受性。
在实施方案组#13的某些实施方案中，由于嵌入或插入的异源表位，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考分子(例如诸如，由细胞靶向分子组成的第八细胞靶向分子，除了它缺少细胞靶向分子中存在的一个或更多个嵌入或插入的表位)相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。
在实施方案组#13的某些实施方案中，由于弗林蛋白酶切割基序的破坏，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与第九细胞靶向分子相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性，其中第九细胞靶向分子由细胞靶向分子组成，除了弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有志贺毒素效应子多肽组分由野生型志贺毒素A1片段组成。
实施方案组#14-包含位于或接近氨基末端的志贺毒素效应子多肽的多价细胞靶
向分子，并且其中志贺毒素效应子多肽包含嵌入或插入的异源T细胞表位
本发明提供多价细胞靶向分子，每个分子包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合相同靶生物分子的细胞外部分；(ii)包含插入或嵌入的异源表位的志贺毒素效应子多肽；其中志贺毒素效应子多肽位于或接近多肽的氨基末端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)多肽组分；和(iii)包含插入或嵌入的异源表位的志贺毒素效应子多肽；其中志贺毒素效应子多肽位于或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域位于细胞靶向分子内，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，异源表位是CD8+ T细胞表位，例如诸如关于人免疫系统。对于某些另外的实施方案，异源T细胞表位能够由细胞的MHC I类分子呈递。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞、引起细胞死亡和/或将嵌入或插入的异源T细胞表位递送到MHC I类分子，用于在细胞表面上呈递。
在实施方案组#14的某些实施方案中，与第十细胞靶向分子相比，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出更大的细胞毒性，其中第十细胞靶向分子具有氨基末端，并且包含结合区域和不位于或不接近第十细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽区域。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与第十细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第十细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。
对于实施方案组#14的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入或插入的异源CD8+ T细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径，用于由MHC I类分子结合的表位的细胞表面呈递。
在实施方案组#14的某些实施方案中，由于嵌入或插入的异源表位，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考分子(例如诸如，由所述细胞靶向分子组成的第十一细胞靶向分子，除了它缺少细胞靶向分子中存在的一个或更多个嵌入或插入的表位)相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。
对于实施方案组#14的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子没有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如，第十细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入到细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
实施方案组#15-包含去免疫化的志贺毒素效应子多肽的多价细胞靶向分子，其中
志贺毒素效应子多肽包含破坏的弗林蛋白酶切割基序
本发明提供多价细胞靶向分子，每个分子包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合相同靶生物分子的细胞外部分，和(ii)包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的去免疫化的志贺毒素效应子多肽。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域和(ii)去免疫化的志贺毒素效应子多肽，其包含(a)具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生区域，(b)位于A1片段区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序，和(c)至少一个破坏的内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位和/或表位区域。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。对于某些另外的实施方案，当细胞靶向分子被引入细胞时能够表现出与参考分子相当或更好的细胞毒性，其中参考分子为例如诸如第二细胞靶向分子，其由细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分包含位于其A1片段区域羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#15的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，志贺毒素效应子多肽包含在B细胞和/或T细胞表位区域中的突变，所述B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66；SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ IDNO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；和SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；SEQID NO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；和SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，没有以下破坏：与至少一个破坏的内源B细胞和/或T细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#15的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个突变，该突变改变了天然位于以下位置的区域中的至少一个氨基酸残基：在志贺毒素(SEQ ID NO:1-2和4-6)的A亚基的248-251处，或在志贺样毒素2(SEQ ID NO:3和7-18)的A亚基的247-250处，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点包含一个或更多个突变。在某些另外的实施方案中，最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#15的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#15的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。
在实施方案组#15的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分包含结合区域。
在实施方案组#15的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些另外的实施方案中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#15的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性和/或细胞内发送)。
在实施方案组#15的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如诸如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可。
在实施方案组#15的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序中包含氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基置换是选自由以下各项组成的组的不带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#15的某些实施方案中，当细胞靶向分子被引入细胞时能够表现出与参考分子的细胞毒性相当的细胞毒性，参考分子为例如诸如第十二细胞靶向分子，其由所述细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分每个包含野生型志贺毒素A1片段和/或在其A1片段区域的羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出在第十二细胞靶向分子所表现出的细胞毒性的从0.1倍、0.5倍或0.75倍至1.2倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍或5倍的范围内的细胞毒性。
在实施方案组#15的某些实施方案中，与第十二细胞靶向分子的体内耐受性相比，细胞靶向分子在被引入脊索动物时能够表现出改善的体内耐受性。
在实施方案组#15的某些实施方案中，由于弗林蛋白酶切割基序的破坏，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考细胞靶向分子相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性，其中参考细胞靶向分子由细胞靶向分子组成，除了弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有志贺毒素效应子多肽组分由野生型志贺毒素A1片段组成，例如诸如，第十二细胞靶向分子。
在实施方案组#15的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含两种蛋白质，其中所述两种蛋白质选自SEQ ID NO:252-255，259-271，274-278和288-748中任一所示的多肽中的任一个，并且细胞靶向分子任选地包含氨基端的甲硫氨酸残基。
实施方案组#16-包含羧基端内质网保留/回收信号基序和去免疫化的志贺毒素效
应子多肽的多价细胞靶向分子
本发明提供多价细胞靶向分子，每个分子包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合相同靶生物分子的细胞外部分；(ii)去免疫化的志贺毒素效应子多肽；和(iii)羧基末端内质网保留/回收信号基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)去免疫化的志贺毒素效应子多肽，其包含至少一个破坏的内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位和/或表位区域；和(iii)KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一个或多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。
在实施方案组#16的某些实施方案中，羧基端内质网保留/回收信号基序选自由以下各项组成的组：KDEL(SEQ ID NO:750),HDEF(SEQ ID NO:751),HDEL(SEQ ID NO:752),RDEF(SEQ ID NO:753),RDEL(SEQ ID NO:754),WDEL(SEQ ID NO:755),YDEL(SEQ ID NO:756),HEEF(SEQ ID NO:757),HEEL(SEQ ID NO:758),KEEL(SEQ ID NO:759),REEL(SEQ IDNO:760),KAEL(SEQ ID NO:761),KCEL(SEQ ID NO:762),KFEL(SEQ ID NO:763),KGEL(SEQID NO:764),KHEL(SEQ ID NO:765),KLEL(SEQ ID NO:766),KNEL(SEQ ID NO:767),KQEL(SEQ ID NO:768),KREL(SEQ ID NO:769),KSEL(SEQ ID NO:770),KVEL(SEQ ID NO:771),KWEL(SEQ ID NO:772),KYEL(SEQ ID NO:773),KEDL(SEQ ID NO:774),KIEL(SEQ ID NO:775),DKEL(SEQ ID NO:776),FDEL(SEQ ID NO:777),KDEF(SEQ ID NO:778),KKEL(SEQ IDNO:779),HADL(SEQ ID NO:780),HAEL(SEQ ID NO:781),HIEL(SEQ ID NO:782),HNEL(SEQID NO:783),HTEL(SEQ ID NO:784),KTEL(SEQ ID NO:785),HVEL(SEQ ID NO:786),NDEL(SEQ ID NO:787),QDEL(SEQ ID NO:788),REDL(SEQ ID NO:789),RNEL(SEQ ID NO:790),RTDL(SEQ ID NO:791),RTEL(SEQ ID NO:792),SDEL(SEQ ID NO:793),TDEL(SEQ ID NO:794),SKEL(SEQ ID NO:795),STEL(SEQ ID NO:796)和EDEL(SEQ ID NO:797)。
在实施方案组#16的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，志贺毒素效应子多肽包含在B细胞和/或T细胞表位区域中的突变，所述B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66；SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ IDNO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；SEQ IDNO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，没有以下破坏：与至少一个破坏的内源B细胞和/或T细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#16的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出大于第十三细胞靶向分子的细胞毒性的细胞毒性，第十三细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成的，除了它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如，与第十三细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第十三细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高。
对于实施方案组#16的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如第十三细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入到细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高非亚细胞发送效率。
实施方案组#17-包含位于或接近细胞靶向分子的氨基末端的去免疫化的志贺毒
素效应子多肽的多价细胞靶向分子
本发明提供多价细胞靶向分子，每个分子包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合相同靶生物分子的细胞外部分；(ii)去免疫化的志贺毒素效应子多肽；其中志贺毒素效应子多肽位于或接近氨基末端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)多肽组分；(iii)去免疫化的志贺毒素效应子多肽，其包含至少一个破坏的内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位和/或表位区域；其中志贺毒素效应子多肽位于或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些进一步的实施方案中，结合区域在细胞靶向分子内，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一个或多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。
在实施方案组#17的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，志贺毒素效应子多肽包含在B细胞和/或T细胞表位区域中的突变，所述B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66；SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ IDNO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；SEQ IDNO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，没有以下破坏：与至少一个破坏的内源B细胞和/或T细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#17的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出大于第十四细胞靶向分子的细胞毒性的细胞毒性，其中所述第十四细胞靶向分子具有氨基末端，并且结合区域和不位于或不接近第十四细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽区域。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如，与第十四细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第十四细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高。
对于实施方案组#17的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如第十四细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入到细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
在实施方案组#17的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含两种蛋白质，其中所述两种蛋白质选自SEQ ID NO:252-255，259-271，274-278和288-748中任一所示的多肽中的任一个，并且细胞靶向分子任选地包含氨基端的甲硫氨酸残基。
实施方案组#18-包含羧基端内质网保留/回收信号基序和志贺毒素效应子多肽的
多价细胞靶向分子，其中志贺毒素效应子多肽包含破坏的弗林蛋白酶切割基序
本发明提供多价细胞靶向分子，每个分子包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合相同靶生物分子的细胞外部分；(ii)包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽；(iii)羧基端内质网保留/回收信号基序。本发明提供细胞靶向分子，每个分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽；(iii)KDEL家族成员的羧基末端内质网保留/回收信号基序。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一个或多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。对于某些另外的实施方案，当细胞靶向分子被引入细胞时能够表现出与参考分子相当或更好的细胞毒性，其中参考分子为例如诸如第二细胞靶向分子，其由细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分包含位于其A1片段区域羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#18的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个突变，该突变改变了天然位于以下位置的区域中的至少一个氨基酸残基：在志贺毒素(SEQ ID NO:1-2和4-6)的A亚基的248-251处，或在志贺样毒素2(SEQ ID NO:3和7-18)的A亚基的247-250处，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点包含一个或更多个突变。在某些另外的实施方案中，最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#18的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#18的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。
在实施方案组#18的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分包含结合区域。
在实施方案组#18的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些另外的实施方案中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#18的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性和/或细胞内发送)。
在实施方案组#18的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如诸如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可。
在实施方案组#18的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序中包含氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基置换是选自由以下各项组成的组的不带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#18的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出比第十五细胞靶向分子的细胞毒性更强的细胞毒性，其中第十五细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与第十五细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第十五细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。
在实施方案组#18的某些实施方案中，与第十六细胞靶向分子的体内耐受性相比，细胞靶向分子在被引入脊索动物时能够表现出改善的体内耐受性，其中第十六细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分每个包含野生型志贺毒素A1片段和/或在其A1片段区域的羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#18的某些实施方案中，由于弗林蛋白酶切割基序的破坏，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考细胞靶向分子(由所述细胞靶向分子组成，除了弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有志贺毒素效应子多肽组分由野生型志贺毒素A1片段组成，例如诸如，第十六细胞靶向分子)相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。
对于实施方案组#18的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如，第十五细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入到细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
实施方案组#19-包含弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽的多价细胞靶
向分子，其中志贺毒素效应子多肽位于或接近细胞靶向分子的氨基末端
本发明提供多价细胞靶向分子，每个分子包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合相同靶生物分子的细胞外部分，和(ii)志贺毒素效应子多肽，其包含在其志贺毒素A1片段区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域，(ii)志贺毒素效应子多肽，其具有氨基末端和具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生区域，和(iii)位于A1片段区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域位于细胞靶向分子内，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。对于某些另外的实施方案，细胞靶向分子被引入细胞时能够表现出与参考分子相当或更好的细胞毒性，其中参考分子为例如诸如第十七细胞靶向分子，其由细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分包含位于其A1片段区域羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#19的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个突变，该突变改变了天然位于以下位置的区域中的至少一个氨基酸残基：在志贺毒素(SEQ ID NO:1-2和4-6)的A亚基的248-251处，或在志贺样毒素2(SEQ ID NO:3和7-18)的A亚基的247-250处，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点包含一个或更多个突变。在某些另外的实施方案中，最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#19的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#19的某些实施方案中，结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。
在实施方案组#19的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分包含结合区域。
在实施方案组#19的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些另外的实施方案中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#19的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性和/或细胞内发送)。
在实施方案组#19的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可。
在实施方案组#19的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序中包含氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基置换是选自由以下各项组成的组的不带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#19的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出比第十八细胞靶向分子的细胞毒性更强的细胞毒性，其中第十八细胞靶向分子具有氨基末端，并且包含结合区域和不位于或不接近第十八细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽区域。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与第十八细胞靶向分子相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第十八细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。
在实施方案组#19的某些实施方案中，与第十九细胞靶向分子的体内耐受性相比，细胞靶向分子在被引入脊索动物时能够表现出改善的体内耐受性，其中第十九细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分每个包含野生型志贺毒素A1片段和/或在其A1片段区域的羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#19的某些实施方案中，由于弗林蛋白酶切割基序的破坏，细胞靶向分子被去免疫化。在某些另外的实施方案中，与参考细胞靶向分子(由所述细胞靶向分子组成，除了弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有志贺毒素效应子多肽组分由野生型志贺毒素A1片段组成，例如诸如，第十九细胞靶向分子)相比，细胞靶向分子能够表现出较低的相对抗原性和/或相对免疫原性。
对于实施方案组#19的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如，第十九细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入到细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
在实施方案组#19的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含两种蛋白质，其中所述两种蛋白质选自SEQ ID NO:252-255，259-271，274-278和288-748中任一所示的多肽中的任一个，细胞靶向分子任选地包含氨基末端的甲硫氨酸残基。
实施例组#20-包含羧基端内质网保留/回收信号基序和志贺毒素效应子多肽的多
价细胞靶向分子，其中志贺毒素效应子多肽位于或接近细胞靶向分子的氨基末端
本发明提供多价细胞靶向分子，每个分子包含(i)两个或更多个结合区域，每个结合区域能够特异性结合相同靶生物分子的细胞外部分，(ii)羧基末端内质网保留/回收信号基序，和(iii)志贺毒素效应子多肽；其中志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域，(ii)KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序，(iii)多肽组分，和(iv)志贺毒素效应子多肽；其中志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域位于细胞靶向分子内，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。
对于某些另外的实施方案，志贺毒素效应子多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应子功能，例如诸如，指导细胞内发送至其中存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促灭活核糖体、引起白细胞郁滞和/或引起细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够进行以下一种或多种：进入细胞、抑制核糖体功能、引起白细胞郁滞和/或引起细胞死亡。
在实施方案组#20的某些实施方案中，羧基端内质网保留/回收信号基序选自由以下各项组成的组：KDEL(SEQ ID NO:750),HDEF(SEQ ID NO:751),HDEL(SEQ ID NO:752),RDEF(SEQ ID NO:753),RDEL(SEQ ID NO:754),WDEL(SEQ ID NO:755),YDEL(SEQ ID NO:756),HEEF(SEQ ID NO:757),HEEL(SEQ ID NO:758),KEEL(SEQ ID NO:759),REEL(SEQ IDNO:760),KAEL(SEQ ID NO:761),KCEL(SEQ ID NO:762),KFEL(SEQ ID NO:763),KGEL(SEQID NO:764),KHEL(SEQ ID NO:765),KLEL(SEQ ID NO:766),KNEL(SEQ ID NO:767),KQEL(SEQ ID NO:768),KREL(SEQ ID NO:769),KSEL(SEQ ID NO:770),KVEL(SEQ ID NO:771),KWEL(SEQ ID NO:772),KYEL(SEQ ID NO:773),KEDL(SEQ ID NO:774),KIEL(SEQ ID NO:775),DKEL(SEQ ID NO:776),FDEL(SEQ ID NO:777),KDEF(SEQ ID NO:778),KKEL(SEQ IDNO:779),HADL(SEQ ID NO:780),HAEL(SEQ ID NO:781),HIEL(SEQ ID NO:782),HNEL(SEQID NO:783),HTEL(SEQ ID NO:784),KTEL(SEQ ID NO:785),HVEL(SEQ ID NO:786),NDEL(SEQ ID NO:787),QDEL(SEQ ID NO:788),REDL(SEQ ID NO:789),RNEL(SEQ ID NO:790),RTDL(SEQ ID NO:791),RTEL(SEQ ID NO:792),SDEL(SEQ ID NO:793),TDEL(SEQ ID NO:794),SKEL(SEQ ID NO:795),STEL(SEQ ID NO:796)和EDEL(SEQ ID NO:797)。
在实施方案组#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出比第二十细胞靶向分子和/或第二十一细胞靶向分子的细胞毒性更强的细胞毒性，其中第二十细胞靶向分子具有氨基末端，并且包含结合区域和不位于或不接近第二十细胞靶向分子的氨基末端志贺毒素效应子多肽区域，其中第二十一细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，除了它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，第二十细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与参考分子(例如诸如，第二十和/或第二十一细胞靶向分子)相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第二十和/或第二十一细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。
对于实施方案组#20的某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子(例如诸如，第二十和/或第二十一细胞靶向分子)的细胞毒性相比，当被引入细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率。
实施方案组#1-#20的另外的实施方案
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽货物直接或间接地与志贺毒素效应子多肽和/或结合区域融合。在某些另外的实施方案中，细胞靶向分子包括含有结合区域、志贺毒素效应子多肽和异源CD8+ T细胞表位-肽货物的单链多肽。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域包含两条或更多条多肽链，并且异源CD8+ T细胞表位-肽货物直接或间接地与多肽融合，其中该多肽包含志贺毒素效应子多肽和结合区域的两条或更多条多肽链之一。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含异源CD8+T细胞表位-肽货物，所述异源CD8+ T细胞表位-肽货物在细胞靶向分子内定位于志贺毒素效应子多肽和/或结合区域的羧基端。在某些另外的实施方案中，细胞靶向分子包含在细胞靶向分子内定位于志贺毒素效应子多肽和/或结合区域的羧基端的两个、三个、四个、五个或更多个异源CD8+ T细胞表位-肽货物。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，细胞靶向分子包含羧基端异源CD8+ T细胞表位-肽货物。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，将细胞靶向分子施用于与结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的靶细胞时，细胞靶向分子能够通过CD8+免疫细胞引起靶细胞的细胞间接合。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，将本发明的细胞靶向分子施用于与结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的靶细胞时，细胞靶向分子能够通过CD8+免疫细胞引起靶细胞的细胞间接合。对于某些另外的实施方案，将本发明的细胞靶向分子施用于与结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的靶细胞时，细胞靶向分子能够引起靶细胞死亡。对于某些另外的实施方案，将本发明的细胞靶向分子施用于其成员与结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的第一细胞群和其成员未与结合区域的任何细胞外靶生物分子物理偶联的第二细胞群时，相对于所述第二细胞群的成员，细胞靶向分子对所述第一细胞群的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。在某些另外的实施方案中，细胞靶向分子包含SEQ ID NO:252-255，259-278和288-748中任一个的多肽或基本上由其组成。在某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基的突变，该突变改变志贺毒素效应子多肽的酶活性，该突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。在某些另外的实施方案中，突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换，其减少或消除毒素效应子多肽的细胞毒性。在某些实施方案中，结合区域包含异源CD8+ T细胞表位货物，无论CD8+表位-肽相对于结合区域是自体的还是异源的。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽直接或间接地与结合区域融合，例如诸如通过技术人员已知的接头。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生区域，并且还包含位于A1片段区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够表现出(i)与野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应子多肽相当的催化活性水平，(ii)半数最大抑制浓度(IC50)值为10,000皮摩尔或更低的核糖体抑制活性，和/或(iii)显著水平的志贺毒素催化活性。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出半数最大抑制浓度(CD50)值为300nM或更低的细胞毒性，和/或能够表现出显著水平的志贺毒素细胞毒性。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出低细胞毒性效力(即，在1000nM、500nM、100nM、75nM或50nM的细胞靶向分子浓度下，当被引入某些阳性靶标细胞类型时不能表现出细胞群大于1％的细胞死亡的细胞毒性)。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其多肽组分包含KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序。对于某些另外的实施方案，羧基端内质网保留/回收信号基序选自由以下各项组成的组：KDEL(SEQ ID NO:750),HDEF(SEQ IDNO:751),HDEL(SEQ ID NO:752),RDEF(SEQ ID NO:753),RDEL(SEQ ID NO:754),WDEL(SEQID NO:755),YDEL(SEQ ID NO:756),HEEF(SEQ ID NO:757),HEEL(SEQ ID NO:758),KEEL(SEQ ID NO:759),REEL(SEQ ID NO:760),KAEL(SEQ ID NO:761),KCEL(SEQ ID NO:762),KFEL(SEQ ID NO:763),KGEL(SEQ ID NO:764),KHEL(SEQ ID NO:765),KLEL(SEQ ID NO:766),KNEL(SEQ ID NO:767),KQEL(SEQ ID NO:768),KREL(SEQ ID NO:769),KSEL(SEQ IDNO:770),KVEL(SEQ ID NO:771),KWEL(SEQ ID NO:772),KYEL(SEQ ID NO:773),KEDL(SEQID NO:774),KIEL(SEQ ID NO:775),DKEL(SEQ ID NO:776),FDEL(SEQ ID NO:777),KDEF(SEQ ID NO:778),KKEL(SEQ ID NO:779),HADL(SEQ ID NO:780),HAEL(SEQ ID NO:781),HIEL(SEQ ID NO:782),HNEL(SEQ ID NO:783),HTEL(SEQ ID NO:784),KTEL(SEQ ID NO:785),HVEL(SEQ ID NO:786),NDEL(SEQ ID NO:787),QDEL(SEQ ID NO:788),REDL(SEQ IDNO:789),RNEL(SEQ ID NO:790),RTDL(SEQ ID NO:791),RTEL(SEQ ID NO:792),SDEL(SEQID NO:793),TDEL(SEQ ID NO:794),SKEL(SEQ ID NO:795),STEL(SEQ ID NO:796)和EDEL(SEQ ID NO:797)。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子在被引入细胞时能够表现出比参考分子的细胞毒性更强的细胞毒性，参考分子为例如诸如第二十二细胞靶向分子，其由所述细胞靶向分子组成，除了它不包含KDEL家族的任何羧基末端内质网保留/回收信号基序。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与参考分子(例如诸如，第二十二细胞靶向分子)相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更强的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第二十二细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽还包含至少一个插入或嵌入的异源表位。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽还包含至少一个、两个或三个破坏的内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位区域。在某些另外的实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含至少一个、两个或三个内源B细胞和/或T细胞表位和/或表位区域的破坏。在某些另外的实施方案中，志贺毒素效应子多肽还包含至少一个破坏的内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位区域，所述破坏的内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位区域不与至少一个插入或嵌入的异源表位重叠。
在实施方案#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽的氨基末端位于和/或接近细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端。在某些另外的实施方案中，相对于志贺毒素效应子多肽，结合区域不接近细胞靶向分子的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽在细胞靶向分子内物理排列或定向，使得结合区域不接近志贺毒素效应子多肽的氨基末端。在某些另外的实施方案中，结合区域位于细胞靶向分子内，相比于志贺毒素效应子多肽的氨基末端更接近志贺毒素效应子多肽的羧基末端。对于某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子不具有细胞毒性，并且与参考分子的细胞毒性相比，当被引入细胞时能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率，其中参考分子为例如诸如第二十三细胞靶向分子，其具有氨基末端，并且包含结合区域和不位于或不接近第二十三细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽。对于某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出具有更好的优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如诸如与第二十三细胞靶向分子的细胞毒性相比，4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。对于某些另外的实施方案，本发明的细胞靶向分子对靶标阳性细胞群的细胞毒性(通过CD50值测定)是第二十三细胞靶向分子对第二靶标阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍，、9倍、10倍或更高。在某些另外的实施方案中，第二十三细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽还包含B细胞和/或T细胞表位区域中的破坏，所述B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQID NO:1-18中任一个的53-66；SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些另外的实施方案中，没有以下破坏：与至少一个破坏的内源B细胞和/或T细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，志贺毒素效应子多肽还包含B细胞免疫原性氨基酸残基中的突变，其中所述氨基酸残基选自以下天然定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基的组：L49、D197、D198、R204和R205。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，嵌入或插入的异源T细胞表位破坏内源B细胞和/或T细胞表位区域，所述内源B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：(i)SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；(ii)SEQID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；和(iii)SEQ IDNO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，志贺毒素效应子多肽包含B细胞和/或T细胞表位区域中的突变，所述B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：(i)SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ IDNO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中没有以下破坏：与至少一个破坏的表位区域的部分或全部重叠的序列的氨基端截短；(ii)SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；和SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中没有以下破坏：与至少一个破坏的表位区域的部分或全部重叠的序列的氨基端截短。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含至少一个内源表位区域的破坏，所述内源表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基的组：(ii)SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；和SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽不包含异源MHC I类限制性T细胞表位。MHC I类限制性T细胞表位是本领域已知的或可由技术人员预测。术语异源是指不天然存在于野生型志贺毒素A亚基(例如诸如，与目的志贺毒素效应子多肽最密切相关的野生型志贺毒素A亚基)中的MHC I类限制性T细胞表位。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含至少四个、五个、六个、七个、八个或更多个内源B细胞和/或T细胞表位区域的破坏。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，一个或更多个破坏包括相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，一个或更多个内源B细胞和/或T细胞表位区域包含相对于野生型志贺毒素A亚基的多个氨基酸残基置换。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，至少一个、两个、三个或四个破坏包含内源B细胞和/或T细胞表位区域中的相对于野生型志贺毒素A亚基的多个氨基酸残基置换。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，至少一个破坏包含相对于野生型志贺毒素A亚基的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个氨基酸残基置换，并且任选地，其中至少一个置换发生在选自下组的天然定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基上，该组由以下组成：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的4；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的6；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的8；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的11；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的12；SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的45；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的46；SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的47；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的53；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的54；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的55；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的56；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58；SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的84；SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的88；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的104；SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的105；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的107；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的108；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的111；SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的112；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的141；SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的154；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180；SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的181；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的189；SEQ ID NO:3的197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的247；SEQ ID NO:3的247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248；SEQ ID NO:3的250；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的264；SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的265；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的286；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同氨基酸残基。在某些另外的实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，至少两个破坏各自包含至少一个选自下组的氨基酸残基置换，该组由以下组成：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的4；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的8；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的11；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的47；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的53；SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的55；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60；SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的112；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的147；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181；SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的189；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的247；SEQ ID NO:3的247；SEQ ID NO:3的250；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的264；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的265；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的286；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同氨基酸残基。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含选自下组的至少三个内源B细胞和/或T细胞表位区域的破坏，该组由以下组成：(i)SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中没有以下破坏：与至少一个破坏的内源B细胞和/或T细胞表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的氨基端截短；(ii)SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的205；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中没有以下破坏：与至少一个破坏的内源B细胞和/或T细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含至少两个内源B细胞和/或T细胞表位区域的破坏，其中每个破坏包含一个或更多个氨基酸残基置换，并且其中内源B细胞和/或T细胞表位区域选自由以下组成的天然定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ IDNO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，嵌入或插入的异源T细胞表位不破坏本文所述的任何内源B细胞和/或CD4+ T细胞表位区域。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，至少一个破坏包含选自下组的相对于野生型志贺毒素A亚基的一个或更多个氨基酸残基置换，该组由以下组成：D置换为A，D置换为G，D置换为V，D置换为L，D置换为I，D置换为F，D置换为S，D置换为Q，D置换为M，D置换为R，E置换为A，E置换为G，E置换为V，E置换为L，E置换为I，E置换为F，E置换为S，E置换为Q，E置换为N，E置换为D，E置换为M，E置换为R，F置换为A，F置换为G，F置换为V，F置换为L，F置换为I，G置换为A，G置换为P，H置换为A，H置换为G，H置换为V，H置换为L，H置换为I，H置换为F，H置换为M，I置换为A，I置换为V，I置换为G，I置换为C，K置换为A，K置换为G，K置换为V，K置换为L，K置换为I，K置换为M，K置换为H，L置换为A，L置换为V，L置换为G，L置换为C，N置换为A，N置换为G，N置换为V，N置换为L，N置换为I，N置换为F，P置换为A，P置换为G，P置换为F，R置换为A，R置换为G，R置换为V，R置换为L，R置换为I，R置换为F，R置换为M，R置换为Q，R置换为S，R置换为K，R置换为H，S置换为A，S置换为G，S置换为V，S置换为L，S置换为I，S置换为F，S置换为M，T置换为A，T置换为G，T置换为V，T置换为L，T置换为I，T置换为F，T置换为M，T置换为S，V置换为A，V置换为G，Y置换为A，Y置换为G，Y置换为V，Y置换为L，Y置换为I，Y置换为F，Y置换为M和Y置换为T。在某些另外的实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基的一个或更多个氨基酸残基置换置换选自下组：D置换为A，D置换为G，D置换为V，D置换为L，D置换为I，D置换为F，D置换为S，D置换为Q，E置换为A，E置换为G，E置换为V，E置换为L，E置换为I，E置换为F，E置换为S，E置换为Q，E置换为N，E置换为D，E置换为M，E置换为R，G置换为A，H置换为A，H置换为G，H置换为V，H置换为L，H置换为I，H置换为F，H置换为M，K置换为A，K置换为G，K置换为V，K置换为L，K置换为I，K置换为M，K置换为H，L置换为A，L置换为G，N置换为A，N置换为G，N置换为V，N置换为L，N置换为I，N置换为F，P置换为A，P置换为G，P置换为F，R置换为A，R置换为G，R置换为V，R置换为L，R置换为I，R置换为F，R置换为M，R置换为Q，R置换为S，R置换为K，R置换为H，S置换为A，S置换为G，S置换为V，S置换为L，S置换为I，S置换为F，S置换为M，T置换为A，T置换为G，T置换为V，T置换为L，T置换为I，T置换为F，T置换为M，T置换为S，Y置换为A，Y置换为G，Y置换为V，Y置换为L，Y置换为I，Y置换为F和Y置换为M。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，至少一个破坏包含选自下组的相对于野生型志贺毒素A亚基的一个或更多个氨基酸残基置换置换：K1置换为A、G、V、L、I、F、M和H；T4置换为A、G、V、L、I、F、M和S；D6置换为A、G、V、L、I、F、S、Q和R；S8置换为A、G、V、I、L、F和M；T9置换为A、G、V、I、L、F、M和S；S9置换为A、G、V、L、I、F和M；K11置换为A、G、V、L、I、F、M和H；T12置换为A、G、V、I、L、F、M、S和K；S12置换为A、G、V、I、L、F和M；S33置换为A、G、V、L、I、F、M和C；S43置换为A、G、V、L、I、F和M；G44置换为A或L；S45置换为A、G、V、L、I、F和M；T45置换为A、G、V、L、I、F和M；G46置换为A和P；D47置换为A、G、V、L、I、F、S、M和Q；N48置换为A、G、V、L、M和F；L49置换为A、V、C和G；Y49置换为A、G、V、L、I、F、M和T；F50置换为A、G、V、L、I和T；A51；D53置换为A、G、V、L、I、F、S和Q；V54置换为A、G、I和L；R55置换为A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；G56置换为A和P；I57置换为A、G、V和M；L57置换为A、V、C、G、M和F；D58置换为A、G、V、L、I、F、S和Q；P59置换为A、G和F；E60置换为A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、T和R；E61置换为A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M和R；G62置换为A；R84置换为A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；V88置换为A和G；I88置换为A、V、C和G；D94置换为A、G、V、L、I、F、S和Q；S96置换为A、G、V、I、L、F和M；T104置换为A、G、V、L、I、F、M；和N；A105置换为L；T107置换为A、G、V、L、I、F、M和P；S107置换为A、G、V、L、I、F、M和P；L108置换为A、V、C和G；S109置换为A、G、V、I、L、F和M；T109置换为A、G、V、I、L、F、M和S；G110置换为A；S112置换为A、G、V、L、I、F和M；D111置换为A、G、V、L、I、F、S、Q和T；S112置换为A、G、V、L、I、F和M；D141置换为A、G、V、L、I、F、S和Q；G147置换为A；V154置换为A和G。R179置换为A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；T180置换为A、G、V、L、I、F、M和S；T181置换为A、G、V、L、I、F、M和S；D183置换为A、G、V、L、I、F、S和Q；D184置换为A、G、V、L、I、F、S和Q；L185置换为A、G、V和C；S186置换为A、G、V、I、L、F和M；G187置换为A；R188置换为A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S189置换为A、G、V、I、L、F和M；D197置换为A、G、V、L、I、F、S和Q；D198置换为A、G、V、L、I、F、S和Q；R204置换为A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R205置换为A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S247置换为A、G、V、I、L、F和M；Y247置换为A、G、V、L、I、F和M；R248置换为A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R250置换为A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R251置换为A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；D264置换为A、G、V、L、I、F、S和Q；G264置换为A；T286置换为A、G、V、L、I、F、M和S。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，与参考分子相比，本发明的细胞靶向分子在被引入脊索动物时能够表现出改善的体内耐受性和/或稳定性，参考分子为例如诸如第二十四细胞靶向分子，其由细胞靶向分子组成，除了其所有志贺毒素效应子多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或位于其A1片段区域羧基末端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。在某些另外的实施方案中，志贺毒素效应子多肽不具有细胞毒性，并且分子部分具有细胞毒性。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域和志贺毒素效应子多肽直接或间接地连接在一起。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域包含至少一个肽和/或多肽。在某些另外的实施方案中，结合区域是或包含免疫球蛋白型结合区域。在某些另外的实施方案中，结合区域包含选自下组的多肽：自主VH结构域、单结构域抗体片段(sdAb)、纳米抗体、来源于骆驼科的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变片段(scFv)、抗体可变片段(Fv)、互补决定区3片段(CDR3)、受约束的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段、小模块化免疫药物(SMIP)结构域、抗原结合片段(Fab)、犰狳重复多肽(ArmRP)、纤连蛋白来源的第10纤连蛋白III型结构域(10Fn3)、肌腱蛋白III型结构域(TNfn3)、锚蛋白重复基序结构域、低密度脂蛋白受体来源的A结构域(LDLR-A)、脂质运载蛋白(anticalin)、Kunitz结构域、蛋白A来源的Z结构域、γ-B晶状体蛋白来源的结构域、泛素来源的结构域、Sac7d衍生的多肽(affitin)、Fyn来源的SH2结构域、微蛋白、C型凝集素样结构域支架、工程化的抗体模拟物、以及保留结合功能性的任何前述的经遗传操作的对应物。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够表现出(i)与野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应子多肽相当的催化活性水平，(ii)半数最大抑制浓度(IC50)值为10,000皮摩尔或更低的核糖体抑制活性，和/或(iii)显著水平的志贺毒素催化活性。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子和/或其志贺毒素效应子多肽能够表现出与包含野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应子多肽的参考细胞靶向分子相当的亚细胞发送效率，和/或能够表现出显著水平的从细胞的内体起始位置到内质网和/或胞质溶胶的细胞内发送活性。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，通过将本发明的细胞靶向分子施用于与细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，细胞靶向分子能够导致细胞死亡。在某些另外的实施方案中，将本发明的细胞靶向分子施用于两种不同的细胞类型群体(其在细胞外靶标生物分子的存在或水平方面不同)，相比于针对不与细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型的CD50，所述细胞靶向分子能够以至少三倍或更低的CD50导致与细胞毒性细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型的细胞死亡。对于某些实施方案，通过将本发明的细胞靶向分子施用于第一细胞群(其成员与细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联)和第二细胞群(其成员不与结合区域的任何细胞外靶生物分子物理偶联)，相对于所述第二细胞群的成员，细胞靶向分子对所述第一细胞群的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，通过将本发明的细胞靶向分子施用于第一细胞群(其成员与细胞靶向分子的结合区域的大量细胞外靶生物分子物理偶联)和第二细胞群(其成员不与结合区域的大量的任何细胞外靶生物分子物理偶联)，相对于所述第二细胞群的成员，细胞靶向分子对所述第一细胞群的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。对于某些实施方案，通过将本发明的细胞靶向分子施用于第一靶生物分子阳性细胞群和第二细胞群(其成员在细胞表面不表达细胞靶向分子的结合区域的大量靶生物分子)，相对于第二细胞群的成员，细胞靶向分子对第一细胞群的成员的细胞毒性作用为至少3倍高。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时能够表现出半数最大抑制浓度(CD50)值为300nM或更低的的细胞毒性，和/或能够表现出显著水平的志贺毒素细胞毒性。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入或插入的异源CD8+ T细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径，用于由MHC I类分子结合的表位的细胞表面呈递。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，细胞靶向分子包含与志贺毒素效应子多肽的羧基末端相关联的分子部分。在某些实施方案中，分子部分包含结合区域或由结合区域组成。在某些实施方案中，分子部分包含至少一个氨基酸，并且志贺毒素效应子多肽与分子部分的至少一个氨基酸残基连接。在某些另外的实施方案中，分子部分和志贺毒素效应子多肽融合形成连续多肽。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，细胞靶向分子还包含与志贺毒素效应子多肽的羧基末端相关联的细胞毒性分子部分。对于某些实施方案，细胞毒性分子部分是细胞毒性剂，例如诸如技术人员已知的和/或在此描述的小分子化学治疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性抗生素、烷化剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。对于某些另外的实施方案，细胞毒性分子部分在小于10,000、5,000、1,000、500或200pM的浓度下具有细胞毒性。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域能够结合选自由以下各项组成的组的细胞外靶生物分子：CD20、CD22、CD40、CD74、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前列腺特异性膜抗原、Cripto、CDCP1、内皮糖蛋白、成纤维细胞活化蛋白、Lewis-Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1或NTRKR1)、碳酸酐酶IX、叶酸结合蛋白、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂Lewis-Y2、VEGFR、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、Erb3、c-MET、IGFIR、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANK、FAP、肌腱蛋白、CD64、间皮素、BRCA1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE6、SART-1、PRAME、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原、人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶、EphA2、HER3/ErbB-3、MUC1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶相关抗原、HPV-E7、EB病毒抗原、Bcr-Abl、α-甲胎蛋白抗原、17-A1、膀胱肿瘤抗原、SAIL、CD38、CD15、CD23、CD45(蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型)、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305、C3AR、FceRIa、半乳糖凝集素-9、IL-1R(白细胞介素-1受体)、mrp-14、NKG2D配体、程序性死亡-配体1(PD-L1)、Siglec-8、Siglec-10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT-3、半乳糖凝集素-3、CD11a-c、GITRL、MHC I类分子、MHC II类分子(任选与肽复合)、CD284(TLR4)、CD107-Mac3、CD195(CCR5)、HLA-DR、CD16/32、CD282(TLR2)、CD11c以及任何前述的任何免疫原性片段。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域通过至少一个不是二硫键的共价键直接或间接连接到志贺毒素效应子多肽。在某些另外的实施方案中，结合区域直接或间接地与志贺毒素效应子多肽的羧基末端融合，以形成单个连续的多肽。在某些另外的实施方案中，结合区域是免疫球蛋白型结合区域。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序在最小弗林蛋白酶切割位点包含一个或更多个突变。在某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序不是与最小弗林蛋白酶切割位点的至少一个氨基酸残基的部分或全部重叠的序列的氨基端截短。在某些实施方案中，在最小弗林蛋白酶切割位点的突变是R/Y-x-x-R弗林蛋白酶切割基序中的至少一个氨基酸残基的氨基酸缺失、插入和/或置换。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含至少一个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，该突变改变了天然位于以下位置的区域中的至少一个氨基酸残基：在志贺毒素(SEQ ID NO:1-2和4-6)的A亚基的248-251处，或在志贺样毒素2(SEQ ID NO:3和7-18)的A亚基的247-250处，或任何志贺毒素A亚基中的相等氨基酸序列位置处。在某些另外的实施方案中，突变是不带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子在引入细胞时表现出与参考分子的细胞毒性相当的细胞毒性，所述参考分子为例如诸如，由细胞靶向分子组成的第二十五细胞靶向分子，除了其所有其志贺毒素效应子多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，一个或更多个结合区域包含SEQ IDNO:39-245中任一个所示的肽或多肽。
在实施方案组#11至#20的某些实施方案中，两个或更多个结合区域包含SEQ IDNO:39-245中任一个所示的肽或多肽。在实施方案组#11至#20的某些另外的实施方案中，两个或更多个结合区域各自包含SEQ ID NO:39-245中任一个所示的相同的肽或多肽。
本发明的细胞靶向分子的某些实施方案包括SEQ ID NO:19-255，259-278和288-748中的任一个。
本发明的细胞靶向分子的某些实施方案包含SEQ ID NO:252-255，259-278和288-748中任一所示的氨基酸序列表示的多肽或基本上由其组成。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，至少一个结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基末端。在某些另外的实施方案中，分子部分包括结合区域。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些另外的实施方案中，结合区域和/或分子部分的质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，细胞靶向分子包含质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的结合区域，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可(例如，细胞毒性和/或细胞内发送)。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包含例如诸如质量为至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的分子部分，只要细胞靶向分子保留适当水平的本文所述的志贺毒素生物活性即可。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出低细胞毒性效力(即，在1000nM、500nM、100nM、75nM或50nM的细胞靶向分子浓度下，当被引入某些阳性靶标细胞类型时不能表现出细胞群大于1％的细胞死亡的细胞毒性)，并且当被引入细胞时，与参考分子的细胞毒性相比，能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更高的亚细胞发送效率，其中参考分子例如诸如为第二十六细胞靶向分子，其具有氨基末端并且包含结合区域和不位于或不接近第二十六细胞靶向分子的氨基末端的志贺毒素效应子多肽。在某些另外的实施方案中，第二十六细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/回收信号基序。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，在某些另外的实施方案中，分子部分包含来源于天然存在的志贺毒素的志贺毒素A2片段的肽和/或多肽。
本发明的实施方案不旨在涵盖任何天然存在的志贺全毒素或志贺毒素A亚基。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含天然存在的志贺毒素B亚基。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含任何包含天然志贺毒素B亚基的功能性结合结构域或基本上由其组成的多肽。相反，在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素A亚基衍生区域在功能上与异源结合区域相关联以实现细胞靶向。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子受限于以下条件，即对于实施方案组#1至#20的上述所有变化，异源CD8+ T细胞表位-肽货物不包含SEQID NO:25中所示多肽或不由所示多肽组成。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子受限于以下条件，即对于实施方案组#1至#20的上述所有变化，本发明的细胞靶向分子不包含含有嵌入SLT-1A(SEQ ID NO:1)的天然位置53中的CD8+ T细胞表位-肽GILGFVFTL(SEQ ID NO:25)的志贺毒素效应子多肽。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子受限于以下条件，即对于实施方案组#1至#20的上述所有变化，本发明的细胞靶向分子不包含SEQ ID NO:25所示的多肽。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子受限于以下条件，即对于实施方案组#1至#20的上述所有变化，本发明的细胞靶向分子不包含任何含有任何嵌入或插入的CD8+ T细胞表位的志贺毒素效应子多肽。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子受限于以下条件，即对于实施方案组#1至#20的上述所有变化，本发明的细胞靶向分子不包含SEQ ID NO:247中所示的接头，其中该接头直接或间接地在结合区域和志贺毒素效应子多肽之间融合，并且其中结合区域位于志贺毒素效应子多肽的氨基端。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子受限于以下条件，即对于实施方案组#1至#20的上述所有变化，本发明的细胞靶向分子不包含SEQ ID NO:247中所示的接头，其中该接头在结合区域和志贺毒素效应子多肽之间融合。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子受限于以下条件，即对于实施方案组#1至#20的上述所有变化，本发明的细胞靶向分子不包含SEQ ID NO:259-278和287中的任一个所示的多肽或不是基本上由其组成。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含融合在结合区域和志贺毒素效应子多肽之间的任何异源CD8+ T细胞表位-肽货物，其中结合区域位于志贺毒素效应子的氨基端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含融合在结合区域和志贺毒素效应子多肽之间的任何异源CD8+ T细胞表位-肽货物。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，靶细胞不是专职抗原呈递细胞，例如树突细胞类型。对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，结合区域的细胞外靶生物分子不由专职抗原呈递细胞表达。对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，结合区域的细胞外靶生物分子不与专职抗原呈递细胞以显著的量在物理上相关联。对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，结合区域的细胞外靶生物分子不与专职抗原呈递细胞在物理上相关联。对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，结合区域的靶生物分子不在待治疗的脊索动物受试者内的任何专职抗原呈递细胞的细胞表面上以显著的量表达。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽货物不与志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段衍生区域的任何氨基酸残基直接关联。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽货物不与志贺毒素效应子多肽的任何内部氨基酸残基直接关联，意指志贺毒素效应子多肽的氨基-或羧基-末端氨基酸残基可以与异源CD8+ T细胞表位-肽货物直接连接。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域不包含对应于氨基酸残基19-183的人CD4的片段。在某些另外的实施方案中，结合区域不包含人CD4的片段，I型跨膜糖蛋白。在某些另外的实施方案中，结合区域不包含人免疫细胞表面共同受体的片段。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含含有免疫细胞表面受体片段的羧基端结合区域。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含至少两个嵌入或插入的异源表位。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽不包含选自下组的相对于野生型志贺毒素A亚基的一组氨基酸残基置换：(1)R248H和R251H；(2)R248G和R251G；(3)A246G、S247A、A253G和S254A；和(4)A246G、S247A、R248G、R251G、A253G和S254A。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽不包含天然定位于野生型志贺毒素A亚基中247-252的区域的缺失。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽不包含天然位于野生型志贺毒素A亚基中245-247和253-255的区域的缺失。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基的一个或更多个突变，该突变改变志贺毒素效应子多肽的酶活性，该突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。在某些另外的实施方案中，相对于天然存在的A亚基的突变减少或消除了志贺毒素效应子多肽的细胞毒性活性，但志贺毒素效应子多肽保留了至少一个其他志贺毒素效应子功能，例如诸如促进细胞内化和/或指导细胞内发送至某一个或某些亚细胞区室。在某些另外的实施方案中，相对于天然存在的A亚基的突变选自至少一个氨基酸残基置换，例如诸如SEQ ID NO:1-18中的A231E、N75A、Y77S、Y114S、E167D、R170A、R176K、W202A和/或W203A。
对于实施方案组#1至#20的某些实施方案，志贺毒素效应子多肽能够：(i)发送至其中存在志贺毒素效应子多肽的细胞的亚细胞区室，所述亚细胞区室选自：胞质溶胶、内质网和溶酶体；(ii)将表位-货物从早期内体区室细胞内递送至其中存在志贺毒素效应子多肽的细胞的蛋白酶体；和/或(iii)将表位从其中存在志贺毒素效应子多肽的细胞的早期内体区室细胞内递送至MHC I类分子。在某些另外的实施方案中，志贺毒素效应子多肽能够细胞内递送CD8+ T细胞表位，以通过MHC I类分子呈递在其中存在志贺毒素效应子多肽的细胞表面上。
在某些实施方案中，本发明的分子在志贺毒素效应子多肽的羧基端位置和/或志贺毒素A1片段区域的羧基末端不包含代表抗原和/或异源CD8+ T细胞表位-肽货物的任何另外的外源物质。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域不包含配体。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域不包含趋化因子或TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)，也不包含其受体结合片段。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域不包含人趋化因子或人TRAIL，也不包含其受体结合片段。在实施方案组#1至#20的实施方案中，免疫球蛋白型结合区域不包含配体或其受体结合片段。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，免疫球蛋白型结合区域不包含趋化因子或TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)，也不包含其受体结合片段。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域不包含人CC趋化因子或其受体结合片段。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域不包含人CC趋化因子CCL2(参见Bose S等，Arch Pharm Res 36：1039-50(2013))。在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，结合区域不包含人CC趋化因子CCL2，也不包含其受体结合片段，以及由StxA的氨基酸75-247组成的羧基端志贺毒素效应子多肽。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域不包含与由StxA(SEQ ID NO:2)的氨基酸75-247组成的羧基端志贺毒素效应子多肽融合的人CC趋化因子CCL2，也不包含其受体结合片段。在实施方案组#1至#20的实施方案中，结合区域不包含人TRAIL或其受体结合片段。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO:252-255，259-278和288-748中任一个的多肽或基本上由其组成。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:247。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含SEQ ID NO:287或不基本上由其组成。
在实施方案组#1至#20的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子受限于以下条件，即对于实施方案组#1至#20的上述所有变化，本发明的细胞靶向分子不包含SEQ ID NO:287所示的多肽或不基本上由其组成。
本发明还提供药物组合物，其包含本发明的细胞靶向分子和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体；以及提供这种细胞靶向分子或包含它的组合物在本文进一步描述的本发明的方法中的用途。本发明的某些实施方案是药物组合物，其包含本发明的任何细胞靶向分子；和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
在本发明的某些实施方案中是诊断组合物，其包含本发明的上述细胞靶向分子的任一种，和用于收集信息(例如关于细胞类型、组织、器官、疾病、障碍、病症和/或患者的诊断上有用的信息)的检测促进剂。某些另外的实施方案是本发明的细胞靶向分子，其中检测促进剂是异源表位-肽货物，并且细胞靶向分子包含异源表位-肽货物。
除了本发明的细胞靶向分子和组合物之外，能够编码本发明的细胞靶向分子或其蛋白组分的多核苷酸，以及包含本发明的多核苷酸的表达载体和包含本发明的表达载体的宿主细胞，也在本发明的范围内。包含表达载体的宿主细胞可以用于例如通过重组表达产生本发明的细胞靶向分子或其蛋白组分或片段的方法中。
本发明还包括固定在固体基质上的本发明物质的任何组合物。本发明的物质组合物的这种排列可用于例如如如本文所述的筛选分子的方法中。
在本发明的某些实施方案中，是将能够由细胞的MHC I类分子呈递的CD8+ T细胞表位-肽货物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞接触本发明的细胞靶向分子和/或其组合物(例如，本发明的药物组合物或诊断组合物)的步骤。
在本发明的某些实施方案中，是诱导细胞呈递与MHC I类分子复合的外源施用的CD8+ T细胞表位-肽货物的方法，该方法包括以下步骤：使细胞在体外或在体内接触包含CD8+ T细胞表位的本发明的细胞靶向分子和/或其组合物(例如，包含本发明的这种细胞靶向分子的本发明的药物组合物或诊断组合物)。
在本发明的某些实施方案中，是通过CD8+ T细胞表位MHC I类分子复合物诱导免疫细胞介导的对靶细胞的应答的方法，该方法包括使靶细胞在体外或在体内接触包含作为货物的CD8+ T细胞表位的本发明的细胞靶向分子和/或其组合物(例如，包含本发明的这种细胞靶向分子的本发明的药物或诊断组合物)的步骤。对于某些另外的实施方案，免疫应答选自由以下组成的组：CD8+免疫细胞分泌细胞因子、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导的靶细胞生长停滞、CTL诱导的靶细胞坏死、CTL诱导的靶细胞凋亡，免疫细胞介导的靶细胞以外的细胞的细胞杀死。
在本发明的某些实施方案中，是引起CD8+免疫细胞与靶细胞的细胞间接合的方法，该方法包括以下步骤：在存在CD8+免疫细胞条件下使靶细胞与本发明的细胞靶向分子接触，或者随后使靶细胞与一个或更多个CD8+免疫细胞接触的步骤。对于某些实施方案，接触步骤在体外发生。对于某些另外的实施方案，接触步骤在体内发生，例如诸如通过将细胞靶向分子施用于脊索动物、脊椎动物和/或哺乳动物。对于某些实施方案，细胞间接合在体外发生。对于某些实施方案，细胞间接合发生在体内。
在本发明的某些实施方案中，是包含本发明的细胞靶向分子的组合物，其用于在脊索动物内“接种”组织部位(tissue locus)。
对于某些实施方案，本发明的方法用于在脊索动物内“接种”组织部位，该方法包括以下步骤：向脊索动物施用本发明的细胞靶向分子、本发明的药物组合物和/或本发明的诊断组合物。对于某些另外的实施方案，该方法用于在脊索动物内“接种”组织部位，该组织部位包括恶性的、患病的和/或发炎的组织。对于某些另外的实施方案，该方法用于在脊索动物内“接种”组织部位，该组织部位包含选自下组的组织，该组由以下各项组成：患病组织、肿瘤块、癌生长、肿瘤、感染组织或异常细胞团。对于某些实施方案，在脊索动物内“接种”组织部位的方法包括以下步骤：向脊索动物施用包含选自由以下各项组成的组的异源CD8+ T细胞表位-肽货物的本发明的细胞靶向分子：不天然由细胞靶向分子的靶细胞呈递在MHC I类复合物中的肽、不天然存在于靶细胞表达的任何蛋白质中的肽、不天然存在于靶细胞的转录组和/或蛋白质组中的肽、不天然存在于待接种部位的细胞外微环境中的肽、以及不天然存在于待靶向的肿瘤块或感染组织部位中的肽。
另外，本发明提供杀死细胞的方法，包括使细胞与本发明的细胞靶向分子或包含本发明的细胞靶向分子的药物组合物接触的步骤。对于某些实施方案，接触细胞的步骤在体外发生。对于某些另外的实施方案，接触细胞的步骤在体内发生。对于另外的细胞杀伤方法的实施方案，当接触细胞混合物时，该方法能够优先于其他细胞和/或细胞类型选择性地杀死细胞和/或细胞类型，这些细胞的差别在于细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子的细胞外存在和/或表达水平。
本发明进一步提供治疗有需要的患者的疾病、障碍和/或病症的方法，包括向有此需要的患者施用治疗有效量的包含本发明的细胞靶向分子或药物组合物的组合物的步骤。对于某些实施方案，使用本发明的该方法待治疗的疾病、障碍或病症选自：癌症、肿瘤、生长异常、免疫障碍或微生物感染。对于该方法的某些实施方案，待治疗的癌症选自由以下组成的组：骨癌、乳腺癌、中枢/外周神经系统癌、胃肠癌、生殖细胞癌、腺癌、头颈癌、血液学癌症、肾-泌尿道癌、肝癌、肺/胸膜癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌和子宫癌。对于该方法的某些实施方案，待治疗的免疫障碍是与选自下组的疾病相关的免疫障碍，该组由以下各项组成：淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、桥本氏甲状腺炎、溶血性尿毒综合征、HIV相关疾病、红斑狼疮、多发性硬化、结节性多动脉炎、多发性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、感染性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。
在本发明的某些实施方案中，是包含本发明的细胞靶向分子的组合物，其用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫障碍或微生物感染。在本发明的某些实施方案中，是本发明的物质组合物在制备用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫障碍或微生物感染的药物中的用途。
本发明的任何组合物用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常和/或免疫障碍的用途都在本发明的范围内。
本发明的某些实施方案包括使用免疫疗法治疗患者的癌症的方法，该方法包括向有此需要的患者施用本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物的步骤。
本发明物质的任何组合物用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常和/或免疫障碍的用途都在本发明的范围内。在本发明的某些实施方案中，是本发明的细胞靶向分子和/或其药物组合物，用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫障碍和/或微生物感染。在本发明的某些实施方案中，是本发明的细胞靶向分子和/或其药物组合物在制备用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫障碍或微生物感染的药物中的用途。
在本发明的某些实施方案中，是包含本发明的细胞靶向分子的组合物，其用于将一个或更多个另外的外源物质递送到与本发明的细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞中。本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可用于将一个或更多个另外的外源物质递送到与本发明的细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞中。另外，本发明提供了将外源物质递送至细胞内部的方法，包括使细胞在体外或在体内与本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物接触。本发明进一步提供了将外源物质递送至有此需要的患者的细胞内部的方法，该方法包括向患者施用本发明的细胞靶向分子的步骤，其中靶细胞与本发明的细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联。
本发明的任何组合物(例如细胞靶向分子、药物组合物或诊断组合物)用于疾病、障碍和/或病症的诊断、预后和/或表征的用途在本发明的范围内。
在本发明的某些实施方案中，是使用本发明的细胞靶向分子和/或诊断组合物检测细胞的方法，包括使细胞与所述细胞靶向分子和/或诊断组合物接触并检测所述细胞靶向分子和/或诊断组合物的存在的步骤。对于某些实施方案，接触细胞的步骤在体外发生。对于某些实施方案，接触细胞的步骤在体内发生。对于某些实施方案，检测细胞的步骤在体外发生。对于某些实施方案，检测细胞的步骤在体内发生。
例如，本发明的诊断组合物可用于通过向脊索动物受试者施用包含本发明的细胞靶向分子的组合物(所述组合物包含检测促进剂)，然后在体外或在体内检测本发明的细胞靶向分子和/或异源CD8+ T细胞表位-肽货物的存在。
本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可用于将另外的外源物质递送到与本发明的细胞靶向分子的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞中。另外，本发明提供了用于将外源物质递送至细胞内部的方法，包括使细胞在体外或在体内与本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物接触。本发明进一步提供了将外源物质递送至患者细胞内部的方法，该方法包括向患者施用本发明的细胞靶向分子(具有或不具有细胞毒活性)的步骤，其中靶细胞与细胞靶向分子的细胞外靶生物分子物理偶联。
在本发明的某些实施方案中，是将能够由细胞的MHC I类分子呈递的T细胞表位-肽货物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞与本发明的细胞靶向分子接触的步骤，该细胞靶向分子与异源T细胞表位-肽货物和/或其组合物(例如，本发明的药物或诊断组合物)相关联。
在本发明的某些实施方案中，是在脊索动物内“接种”组织部位的方法，该方法包括以下步骤：向脊索动物施用本发明的细胞靶向分子、本发明的药物组合物本发明和/或本发明的诊断组合物。在某些另外的实施方案中，用于“接种”组织部位的本发明的方法用于“接种”包含恶性的、患病的或发炎组织的组织部位。在某些另外的实施方案中，用于“接种”组织部位的本发明的方法用于“接种”组织部位，所述组织部位包含选自下组的组织，该组由以下各项组成：患病组织、肿瘤块、癌生长、肿瘤、感染组织、或异常细胞团。在某些另外的实施方案中，用于“接种”组织部位的本发明的方法包括向脊索动物施用本发明的细胞靶向分子、本发明的药物组合物或本发明的诊断组合物，其包含选自下组的异源T细胞表位-肽货物，该组由以下各项组成：不天然由细胞靶向分子的靶细胞呈递在MHC I类复合物中的肽、不天然存在于靶细胞表达的任何蛋白质中的肽、不天然存在于靶细胞的蛋白质组中的肽、不天然存在于待接种部位的细胞外微环境中的肽、以及不天然存在于待靶向的肿瘤块或感染组织部位的肽。
本发明物质的任何组合物用于疾病、障碍和/或病症的诊断、预后和/或表征的用途都在本发明的范围内。在本发明的某些实施方案中是这样的方法：使用本发明的细胞靶向分子(包含检测促进剂)和/或本发明的组合物(例如诊断组合物)，用于收集对诊断、预后或表征疾病、障碍或病症有用的信息。在本发明的某些实施方案中，是使用本发明的细胞靶向分子和/或诊断组合物检测细胞(或其亚细胞区室)的方法，该方法包括使细胞与细胞靶向分子和/或诊断组合物接触并检测所述细胞靶向分子和/或诊断组合物的存在的步骤。在某些实施方案中，接触细胞的步骤在体外发生。在某些实施方案中，接触细胞的步骤在体内发生。在某些实施方案中，检测细胞的步骤在体外发生。在某些实施方案中，检测细胞的步骤在体内发生。在某些另外的实施方案中，该方法包括在将细胞靶向分子施用于生物体后，使用一种或更多种成像方法检测生物体中细胞靶向分子的位置。例如，掺入如本文所述的检测促进剂的本发明的细胞靶向分子可用于表征可能通过本发明的相关药物组合物治疗的疾病。例如，本发明的某些细胞靶向分子及其组合物(例如本发明的药物组合物和诊断组合物)和本发明的方法可用于确定患者是否属于响应于本发明的药物组合物的组。例如，本发明的某些细胞靶向分子及其组合物可用于鉴定在细胞表面上呈递递送的异源表位-肽货物的细胞和/或鉴定含有呈递由本发明的细胞靶向分子递送的异源表位-肽货物的细胞的受试者。
在本发明的某些实施方案中，是制备本发明的分子的方法，该方法包括使用细菌细胞壁蛋白结构域相互作用(例如来自P.magnus的蛋白L或其衍生物和结合结构域片段)纯化本发明的分子或其多肽组分的步骤。在某些另外的实施方案中，该方法的纯化步骤涉及志贺毒素效应子多肽，其包含SEQ ID NO:29-38中所示的任何一个多肽或基本上由其组成。
在本发明的某些实施方案中，是试剂盒，其包含本发明的物质组合物，和任选地使用说明书、其他一种或多种试剂和/或一种或多种药物递送装置。试剂盒可以进一步包含用于检测样品或受试者中的细胞类型(例如肿瘤细胞)的试剂和其他工具。
参考以下描述、所附权利要求和附图，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点。本发明的上述要素可以单独地组合或自由地移除，以产生本发明的其他实施例，而无需在下文中有反对这种组合或移除的任何陈述。
附图说明
图1A和图1B描绘了包含异源CD8+ T细胞表位-肽货物(显示为菱形)的示例性细胞靶向分子。这些示例性细胞靶向分子各自包含具有以下特征组合的志贺毒素效应子多肽：去免疫化的突变(显示为水平条纹区域)、嵌入的异源CD8+ T细胞表位(显示为垂直条纹区域)和有时是破坏或缺失的蛋白酶位点(用虚线显示)。“N”和“C”分别表示细胞靶向分子的多肽组分的氨基末端和羧基末端。这些示例性细胞靶向分子有时包含志贺毒素效应子多肽，所述志贺毒素效应子多肽具有在用垂直的灰色虚线描绘的A1片段衍生区域羧基末端处的破坏的弗林蛋白酶切位点的第三特征。
图1A和图1B中的示例性分子的描绘是用于说明本发明的有限实施方案组的结构特征的某些通常布置。应理解，这些示例性分子并不旨在也不应被解释为完全确定本发明分子的任何结构特征和/或组分的布置。图1A和图1B的示意图中所示的相对尺寸、位置或特征数量已被简化。例如，嵌入的异源表位的相对位置和内源表位区域的破坏不是固定的。类似地，嵌入的异源表位和内源表位区域的破坏的总数不是固定的。本发明分子的某些实施方案包括单个志贺毒素效应子多肽中的多个破坏的内源表位区域，例如诸如四个、五个、六个、七个、八个、九个或更多个区域的破坏；其中这些破坏的内源表位区域可以分布在整个志贺毒素效应子多肽中，包括与志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端区域的弗林蛋白酶切割基序重叠或在其内的破坏(参见例如WO 2016/196344)。本发明的某些实施方案包括内源性表位区域的破坏，所述表位区域位于志贺毒素A1片段或其衍生物的羧基末端的羧基端，例如诸如，在任何破坏的弗林蛋白酶切割位点基序的羧基端的位置。图1A和图1B中的示意图不旨在准确地描绘关于本发明的任何实施方案中的分子结构的相对尺寸的任何信息。
图2图示了示例性细胞靶向分子SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)对两种不同细胞类型表现出与“对照”细胞靶向分子SLT-1A-DI-FR::scFv-1(SEQ ID NO:258)相当的细胞毒性。将每种细胞类型的靶标阳性细胞的存活力百分比关于施用于各细胞的细胞靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。
图3图示了与阴性对照相比，与MHC I类分子复合的细胞靶向分子递送的异源CD8+T细胞表位-肽通过靶标阳性癌细胞的细胞表面呈递。图3显示了用本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)或阴性对照细胞靶向分子SLT-1A-DI-FR::scFv1(SEQ ID NO:258)(其缺少任何C2表位-肽货物)处理的细胞组的TCR-STARTM测定结果的叠加(overlay)和流式细胞术分析。将靶标阳性细胞的FACS细胞计数关于来自PE-STARTM多聚体试剂的光信号(以相对光单位(RLU)，表示细胞表面MHC I类分子(人HLA-A2)展示的C2表位-肽(SEQ ID NO:21)复合物的存在)绘图。用本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)处理的靶标阳性细胞显示C2表位-肽(SEQ ID NO:21)复合到它们细胞表面上的MHC I类分子(上图)，而用亲本细胞靶向分子SLT-1A-DI-FR::scFv1(SEQ ID NO:258)处理的靶标阳性细胞在细胞表面上未显示C2表位-肽(SEQ ID NO:21)(下图)。
图4图示了通过尺寸排阻色谱(SEC)分析的SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ IDNO:252)的样品制剂中存在的分子的大小和比例。对于SEC分析，将流过SEC柱后洗脱的材料在波长为280纳米(nm)的紫外光的吸光度以毫吸光度单位(mAU)关于以毫升(mL)计的分数体积(fraction volume)绘图。使用软件识别280nm迹线(trace)中的各个峰和每个峰在280nm处的紫外光的最大吸光度的分数体积。
图5显示了用于在还原条件下凝胶上样而制备的SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQID NO:252)的样品制剂在电泳后的考马斯染色的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)。图5显示还原的SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)的大小为约55千道尔顿(kDa)。
图6图示了异源CD8+ T细胞表位-肽与志贺毒素A亚基衍生的细胞靶向分子的融合不显著损害细胞靶向分子对靶标阳性细胞的细胞毒性活性。相对于蛋白质浓度的以10为底的对数，对细胞的存活力百分比绘图。图6图示了细胞杀伤测定的结果，其中SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)显示出与亲代细胞靶向分子SLT-1A::scFv1(SEQ ID NO:280)(其缺乏任何异源CD8+ T细胞表位-肽)的细胞毒性相似的细胞毒性。
图7图示了细胞杀伤测定的结果，其中示例性细胞靶向分子SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)的细胞毒活性在一定浓度范围内对靶标阳性细胞具有特异性。相对于蛋白质浓度的以10为底的对数，对细胞的存活力百分比绘图。在如图6所示的用于准确测量SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)对靶标阳性细胞的CD50值的分子浓度范围内，SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)不杀死结合区域scFv2的靶生物分子的细胞表面表达为阴性的细胞(约100％细胞存活力)。
图8图示了与阴性对照相比，通过靶标阳性癌细胞，与MHC I类分子复合的、细胞靶向分子递送的异源CD8+ T细胞表位-肽的细胞表面呈递。图8显示了用阴性对照、细胞靶向分子SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)或细胞靶向分子SLT-1A::scFv2(SEQ ID NO:281)处理的细胞组的TCR-STARTM测定，流式细胞术分析的结果的叠加。将靶标阳性细胞的荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞术细胞计数对来自PE-STARTM多聚体试剂的、以相对光单位(RLU)表示的光信号绘图，该光信号表示细胞表面MHC I类分子(人HLA-A2)显示的C2表位-肽(SEQ ID NO:21)复合物的存在。用本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)处理的靶标阳性细胞在其细胞表面上显示与MHC I类分子复合的C2表位-肽(SEQ ID NO:21)(上图)，而用相关细胞靶向分子SLT-1A::scFv2(SEQ ID NO:281)处理的靶标阳性细胞未在细胞表面显示C2表位-肽(SEQ ID NO:21)(下图)。
图9图示了与阴性对照相比，通过靶标阳性癌细胞，与MHC I类分子复合的、细胞靶向分子递送的异源CD8+ T细胞表位-肽的细胞表面呈递。在图9中，绘制了对应于接受不同处理的细胞组的PE-STARTM多聚体试剂的指数化平均荧光强度(以RLU表示)(“iMFI”，阳性群体的荧光乘以阳性百分比)。图9显示了用外源C2肽(SEQ ID NO:21)对照、“无活性SLT-1A::scFv”(SEQ ID NO:282)或细胞靶向分子“无活性SLT-1A::scFv2::C2”(SEQ ID NO:270)处理的细胞的TCR-STAR测定TM，流式细胞术分析的结果。外源施用的C2肽((SEQ ID NO:21)，如上所述)与肽加载增强剂(“PLE”，Altor Bioscience Corp.，Miramar，FL，U.S.)组合。与肽加载增强剂(PLE)处理组合的C2肽(SEQ ID NO:21)提供阳性对照，其中外源施用的C2肽(SEQ ID NO:21)可以加载到细胞表面MHC I类分子上而不进入细胞。用本发明的示例性细胞靶向分子“无活性SLT-1A::scFv2::C2”(SEQ ID NO:270)处理的靶标阳性细胞在其细胞表面上显示与MHC I类分子复合的C2表位-肽(SEQ ID NO:21)，而仅用外源C2表位肽(SEQID NO:21)或亲本细胞靶向分子“无活性SLT-1A::scFv2”(SEQ ID NO:282)处理的相同细胞没有在细胞表面上显示C2表位-肽(SEQ ID NO:21)。
图10图示了与阴性对照相比，经不同的温育时间(4小时或16小时)，通过靶标阳性癌细胞，与MHC I类分子复合的、细胞靶向分子递送的异源CD8+ T细胞表位-肽通过靶标阳性癌细胞的细胞表面呈递。图10显示了用细胞靶向分子SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)或阴性对照处理的细胞组的TCR-STARTM测定，流式细胞术分析结果的叠加。将靶标阳性细胞的FACS细胞计数对来自PE-STARTM多聚体试剂的、以相对光单位(RLU)表示的光信号绘图，该光信号表示细胞表面MHC I类分子(人HLA-A2)显示的C2表位-肽(SEQ ID NO:21)复合物的存在。用本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)处理的靶标阳性细胞经4小时(4hr)(上图)或16小时(16hr)(下图)温育持续时间后在其细胞表面上显示与MHC I类分子复合的C2表位-肽(SEQ ID NO:21)。
图11图示了与阴性对照相比，通过靶标阳性癌细胞，与MHC I类分子复合的、细胞靶向分子递送的异源CD8+ T细胞表位-肽的细胞表面呈递。图11显示了用阴性对照、细胞靶向分子SLT-1A::scFv5::C2(SEQ ID NO:274)或细胞靶向分子SLT-1A::scFv5(SEQ ID NO:283)处理的细胞组的TCR-STARTM测定，流式细胞术分析结果的叠加。将靶标阳性细胞的FACS细胞计数对来自PE-STARTM多聚体试剂的、以相对光单位(RLU)表示的光信号绘图，该光信号表示细胞表面MHC I类分子(人HLA-A2)显示的C2表位-肽(SEQ ID NO:21)复合物的存在。用本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A::scFv5::C2(SEQ ID NO:274)处理的靶标阳性细胞在其细胞表面上显示与MHC I类分子复合的C2表位-肽(SEQ ID NO:21)(上图)，而用亲本细胞靶向分子SLT-1A::scFv5(SEQ ID NO:283)处理的靶标阳性细胞在细胞表面上未显示C2表位-肽(SEQ ID NO:21)(下图)。
图12图示了与阴性对照相比，通过靶标阳性癌细胞，与MHC I类分子复合的、细胞靶向分子递送的异源CD8+ T细胞表位-肽的细胞表面呈递。图12显示了用阴性对照、细胞靶向分子SLT-1A::scFv7::C2(SEQ ID NO:277)或细胞靶向分子SLT-1A::scFv7(SEQ ID NO:286)处理的细胞组的TCR-STARTM测定，流式细胞术分析结果的叠加。将靶标阳性细胞的FACS细胞计数对来自PE-STARTM多聚体试剂的、以相对光单位(RLU)表示的光信号绘图，该光信号表示细胞表面MHC I类分子(人HLA-A2)显示的C2表位-肽(SEQ ID NO:21)复合物的存在。用本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A::scFv7::C2(SEQ ID NO:277)处理的靶标阳性细胞在其细胞表面上显示与MHC I类分子复合的C2表位-肽(SEQ ID NO:21)(上图)，而用亲本细胞靶向分子SLT-1A::scFv7(SEQ ID NO:286)处理的靶标阳性细胞在细胞表面上未显示C2表位-肽(SEQ ID NO:21)(下图)。
图13图示了干扰素γELIspot测定的结果，其中对每种测试条件绘制了斑点或分泌细胞的数量。对于每个样品，用细胞靶向分子或阴性对照预处理靶标阳性人癌细胞，然后在进行ELISPOT测定前，与人PBMC(HLA-A2血清型)温育24小时。图13显示用本发明的示例性细胞靶向分子“无活性SLT-1A::scFv2::C2”(SEQ ID NO:270)处理的靶标阳性细胞通过PBMC促进分泌细胞因子，而用亲本细胞靶向分子“无活性SLT-1A::scFv2”(SEQ ID NO:282)处理仅导致背景水平的干扰素-γ分泌，与“仅缓冲液”的阴性对照处理的水平大致相同。符号“靶标阳性细胞系G+PBMC“表明所示的所有样品都涉及细胞系G的肿瘤细胞与PBMC的共培养。
图14图示了来自细胞间T淋巴细胞(T细胞)活化测定的结果，其中对于每种测试条件以RLU为单位绘制荧光素酶活性。对于每个样品，用细胞靶向分子或阴性对照预处理靶标阳性人癌细胞，然后与人J76 T细胞一起温育18小时，其中，人J76 T细胞表达特异性识别细胞表面呈递的人MHC I类分子(HLA-A2)F2表位(SEQ ID NO:25)复合物的人T细胞受体(TCR)，并且包含驱动荧光素酶表达的活化T细胞核因子(NFAT)转录应答元件(荧光素酶-报告子转染的)。使用One-GloTM荧光素酶测定系统试剂根据制造商的说明书测量样品中的荧光素酶活性，其表明T细胞中的NFAT活性。图14显示用本发明的示例性细胞靶向分子“无活性SLT-1A::scFv6::F2”(SEQ ID NO:276)预处理的靶标阳性肿瘤细胞通过TCR识别和NFAT信号传导以T细胞活化形式刺激分子间应答；然而，用亲本细胞靶向分子“无活性SLT-1A::scFv6”(SEQ ID NO:285)处理靶标阳性细胞仅导致背景水平的光信号，与“仅缓冲液”的阴性对照处理的水平大致相同。符号“靶标阳性细胞系F+报告T细胞”表示所有显示的样品都涉及细胞系G的肿瘤细胞与如上所述的荧光素酶报告子转染的J76 T细胞(HLA-A2血清型)的共培养。
图15图示了IFN-γELISA测定的结果，其中数据来自“仅缓冲液”样品(黑色)和细胞靶向分子处理的样品(灰色)。沿Y轴是来自共培养实验的上清液中存在的IFN-γ的定量，以皮克每mL(pg/mL)报告。共培养的细胞由富含C2限制性PBMC的人PBMC和人肿瘤细胞组成。使用的肿瘤细胞是细胞系I，并用“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)预处理。图15显示与细胞靶向分子“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)但不与“仅缓冲液”温育后，共培养PBMC和靶标阳性肿瘤细胞导致诱导人IFN-γ分泌，指示PBMC中活化的T细胞。
图16图示了来自共培养实验的CellTiter-发光细胞存活力测定的结果，其中数据来自“仅缓冲液”样品(黑色)和细胞靶向分子处理的样品(灰色)。沿Y轴是粘附细胞存活力的定量，其表示为以RLU表示的“仅缓冲液”阴性对照的百分比。共培养的细胞由富含C2限制性PBMC的人PBMC和人肿瘤细胞组成。使用的肿瘤细胞是细胞系I，并用“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)预处理。图16显示与细胞靶向分子“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)但不与“仅缓冲液”温育后，共培养PBMC和靶阳性肿瘤细胞导致肿瘤细胞杀伤，如通过粘附肿瘤细胞的存活力百分比的大幅降低所证明的。
图17图示了在140小时共培养实验的不同时间点期间聚集的免疫细胞的数量，其中数据来自“仅缓冲液”样品(黑色)和来自细胞靶向分子处理的样品(灰色)。使用如本文所述进行的IncuS3活细胞成像测定对细胞计数。共培养的细胞由富含C2限制性PBMC的人PBMC和人肿瘤细胞组成。使用的肿瘤细胞是细胞系I，并用“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)预处理。所涉及的细胞数量和超过100微米的PBMC簇的数量指示共培养中发生的免疫细胞活化。细胞和簇的数量随时间的变化(免疫细胞成簇行为的持续性)也指示共培养中发生的免疫细胞活化。
图18图示了IFN-γELISA测定的结果，其中数据来自用三种不同浓度的本发明的示例性细胞靶向分子(SEQ ID NO:254)处理的三种不同肿瘤细胞类型(以灰色显示)，和来自使用缺乏任何C2表位-肽货物的细胞靶向分子(SEQ ID NO:256)用于递送的对照处理的数据(以黑色显示)。沿Y轴是以pg/mL报告的共培养实验中上清液中存在的IFN-γ的定量。x轴显示四种不同的实验条件：没有PBMC共培养，在共培养之前“仅缓冲液”处理肿瘤细胞，用100nM分子处理肿瘤细胞，以及用500nM分子处理肿瘤细胞。共培养的细胞由富含C2限制性PBMC的人PBMC和人肿瘤细胞组成。使用的肿瘤细胞是细胞系I，J或K，并用“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2”(SEQ ID NO:254)或“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8”(SEQ ID NO:256)预处理。随着本发明的示例性细胞靶向分子在处理中的浓度从0增加到100和500nM，共培养物中分泌的人IFN-γ的量增加(例如，达到高于约400或600pg/mL)。结果显示，“仅缓冲液”或缺乏C2表位-肽(SEQ ID NO:21)的密切相关参比细胞靶向分子“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8”(SEQ ID NO:256)在共培养后48小时后均不能够诱导IFN-γ分泌。符号“+PBMCs”表示所示样品涉及肿瘤细胞和PBMC的共培养。
图19图示了来自共培养实验的CellTiter-发光细胞存活力测定的结果，其中数据来自用三种不同浓度的本发明的示例性细胞靶向分子(SEQ ID NO:254)处理的三种不同肿瘤细胞类型(以灰色显示)，和数据来自使用缺少任何C2表位-肽货物的细胞靶向分子(SEQ ID NO:256)用于递送的对照处理(以黑色显示)。沿Y轴是以RLU表示的粘附细胞存活力的量化。x轴显示四种不同的实验条件：没有PBMC共培养，在共培养之前“仅缓冲液”处理肿瘤细胞，用100nM分子处理肿瘤细胞，以及用500nM分子处理肿瘤细胞。共培养的细胞由富含C2限制性PBMC的人PBMC和人肿瘤细胞组成。使用的肿瘤细胞是细胞系I，J或K，并用“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2”(SEQ ID NO:254)或“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8”(SEQ IDNO:256)预处理。随着本发明的示例性细胞靶向分子“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2”(SEQ ID NO:254)的浓度在处理中从0上升至100和500nM，粘附细胞存活力下降到50％以下。结果显示，“仅缓冲液”或缺乏C2表位-肽(SEQ ID NO:21)的密切相关参考细胞靶向分子“无活性SLT-1A-DI-FR::scFv8”(SEQ ID NO:256)均不能够在96小时的共培养期间引起显著的靶细胞死亡。符号“+PBMCs”表示所示样品涉及肿瘤细胞和PBMC的共培养。
图20图示了共培养实验的IFN-γELISA和CellTiter-发光细胞存活力测定的结果，其中用本发明的示例性细胞靶向分子(SEQ ID NO:255)预处理肿瘤细胞(以灰色显示)，和来自使用缺乏任何C2表位-肽货物的催化活性细胞靶向分子(SEQ ID NO:257)用于递送的对照处理的数据(以黑色显示)。共培养的细胞由富含C2限制性PBMC的人PBMC和人肿瘤细胞组成。使用的肿瘤细胞是细胞系I，并用催化活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2(SEQ IDNO:255)或催化活性对照分子SLT-1A-DI-1::scFv8(SEQ ID NO:257)预处理。对于左侧的图，Y轴显示以pg/mL报告的共培养实验的上清液中存在的IFN-γ的定量。对于右侧的图，Y轴显示以RLU表示的粘附细胞存活力的定量。对于两个图，x轴显示四种不同的实验条件：没有PBMC共培养，在共培养之前“仅缓冲”处理肿瘤细胞，用30nM分子处理肿瘤细胞，以及用100nM分子处理肿瘤细胞。随着本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A-DI-1::scFv8::C2(SEQ ID NO:255)在治疗中的浓度从零上升至30和100nM，共培养物中分泌的人IFN-γ的量上升到高于200pg/mL，并且与用缺少任何C2表位-肽(SEQ ID NO:21)货物的密切相关催化活性细胞靶向分子SLT-1A-DI-1::scFv8(SEQ ID NO:257)处理相比，粘附细胞存活力降低更多。对照分子在共培养中不通过PBMC诱导任何人IFN-γ分泌，并且不像本发明的示例性分子对于给定分子处理浓度那样随时间降低肿瘤细胞存活力。符号“+PBMCs”表示所示样品涉及肿瘤细胞和PBMC的共培养。
具体实施方式
在下文中使用说明性、非限制性实施方案并参考附图更全面地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应该被解释为限于下面阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开更透彻并且将本发明的范围传递给本领域技术人员。为了更容易理解本发明，下面定义某些术语。另外的定义可以在本发明的详细描述中找到。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另外清楚地指明，术语“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及两个种类A和B时，术语“和/或”是指A和B中的至少一个。如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及超过两个种类诸如A、B和C时，术语“和/或”是指A、B、或C中的至少一个，或A、B、或C的任何组合中的至少一个(每个种类具有单数或复数可能性)。
贯穿本说明书，词语“包含”或变体诸如“包括”或“含有”应理解为暗示包括所述的整数(或组分)或整数(或组分)的组，但是不排除任何其它整数(或组分)或整数(或组分)的组。
贯穿本说明书，术语“包括”用于指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
术语“氨基酸残基”或“氨基酸”包括对掺入蛋白质、多肽和/或肽中的氨基酸的提及。术语“多肽”包括氨基酸或氨基酸残基的任何聚合物。术语“多肽序列”表示在物理上构成多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基。“蛋白质”是包含一个或更多个多肽或多肽“链”的大分子。“肽”是尺寸小于总共约15-20个氨基酸残基的小多肽。术语“氨基酸序列”表示一系列氨基酸或氨基酸残基，其根据长度在物理上包括肽或多肽。除非另有说明，本文中公开的多肽和蛋白序列从左至右书写，代表它们从氨基末端至羧基末端的顺序。
术语“氨基酸”、“氨基酸残基”、“氨基酸序列”或多肽序列包括天然存在的氨基酸(包括L和D异构体)，并且除非另有限制，还包括能够以与天然存在的氨基酸类似方式起作用的天然氨基酸的已知类似物，例如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、羟脯氨酸8-羟-2,7,10-三氨基癸酸(hydroxyprolinehypusine)、焦谷氨酸和硒代甲硫氨酸(参见例如Young T，Schultz P，J Biol Chem 285：11039-44(2010)；DavisL，Chin J，Nat Rev Mol Cell Biol 13：168-82(2012)；Bohike N，Budisa N，FEMSMicrobiol Lett 35：133-44(2014)；Chin J，Annu Rev Biochem 83：379-408(2014)；Nagata K等，Bioinformatics 30：1681-9(2014)；Pott M等，ACS Chem Biol 9：2815-22(2014)；Ho J等，ACS Synth Biol 5：163-71(2016)；Wang Y，Tsao M，Chembiochem 17：2234-9(2016))。本文提及的氨基酸通过如下表A中的简写名称描述：
表A.氨基酸命名法
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关于肽、肽区域、多肽区域、蛋白质或分子的氨基酸残基的短语“保守置换”是指肽、肽区域、多肽区域、蛋白质或分子的氨基酸组成的变化，所述改变基本上不改变整个肽、肽区域、多肽区域、蛋白或分子的功能和结构(参见Creighton，Proteins：Structures andMolecular Properties(W.H.Freeman and Company，New York(第2版，1992)))。
就本发明的目的而言，当提及多肽或多肽区时，短语“来源于”意指多肽或多肽区域包含最初在“亲本”蛋白中发现的高度相似的氨基酸序列，并且其现在可包含相对于原始多肽或多肽区域的某些氨基酸残基添加、缺失、截短、重排或其他改变，只要“亲本”分子的某些功能和结构实质上是保守的。技术人员将能够使用本领域已知的技术(例如蛋白序列比对软件)鉴定多肽或多肽区域所源自的亲本分子。
就本发明的目的而言，关于多肽区域的术语“末端”、“氨基末端”或“羧基末端”是指该区域的区域边界，无论是否通过该区域之外的肽键连接了额外的氨基酸残基。换句话说，多肽区域的末端无论该区域是否与其他肽或多肽融合。例如，包含两个蛋白质区域的融合蛋白(例如，包含肽或多肽和志贺毒素效应子多肽的结合区域)可以具有志贺毒素效应子多肽区域，其具有在志贺毒素效应子多肽区域的氨基酸残基251处终止的羧基末端，尽管肽键参与残基251与位置252处的氨基酸残基(代表另一个蛋白质区例如结合区的开始)的肽键。在该实施例中，志贺毒素效应子多肽区域的羧基末端是指残基251，其不是融合蛋白的末端，而是代表内部区域边界。因此，对于多肽区域，术语“末端”、“氨基末端”和“羧基末端”用于指多肽区域的边界，无论边界是物理末端还是嵌入到较大连续多肽链的内部位置。
就要求保护的发明的目的而言并且关于志贺毒素多肽序列或志贺毒素衍生多肽，术语“野生型”通常是指在活的物种(例如诸如，致病细菌)中发现的天然存在的志贺毒素蛋白质序列，其中志贺毒素蛋白质序列是最常出现的变体之一。这与不常出现的志贺毒素蛋白质序列形成对比，这些序列虽然仍然是天然存在的，但在对至少包含一种志贺毒素蛋白变体的该物种的统计学上有效数量的天然存在的个体生物体进行取样时，在给定物种的个体生物体的不到1％中发现。天然分离物在其天然环境之外的克隆扩增(无论分离物是否是包含生物序列信息的生物体或分子)不会改变天然存在的需求，只要克隆扩增不引入该物种的天然存在的群体中未出现的新序列变体和/或不改变序列变体相对于彼此的比例即可。
关于要求保护的发明的术语“相关联的”、“进行关联”、“连接的”或“进行连接”是指分子的两个或更多个组分被接合、附接、连接或以其他方式偶联以形成单个分子的状态，或者通过在两个分子之间产生关联、键合、附接和/或任何其他连接以使两个分子彼此关联以形成单个分子的行为。例如，术语“连接的”可以指通过一个或多个原子相互作用关联的两个或更多个组分，使得形成单个分子，其中原子相互作用可以是共价的和/或非共价的。两个组分之间共价关联的非限制性实例包括肽键和半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。两个分子组分之间的非共价关联的非限制性实例包括离子键。
出于本发明的目的，术语“连接的”是指通过一个或多个原子相互作用关联的两个或更多个分子组分，使得形成单个分子，并且其中原子相互作用包括至少一个共价键。出于本发明的目的，术语“进行连接”是指产生如上所述的连接分子的行为。
出于本发明的目的，术语“融合”是指两个或更多个蛋白质组分通过至少一个共价键关联，所述共价键是肽键，无论肽键是否涉及羧酸基团的碳原子参与或是否涉及另一个碳原子，例如诸如α-碳，β-碳，γ-碳，σ-碳等。融合在一起的两个蛋白质组分的非限制性实例包括例如，通过肽键与多肽融合的氨基酸、肽或多肽，使得所得分子是单个连续多肽。出于本发明的目的，术语“融合”是指产生如上所述的融合分子的行为，例如诸如，由遗传区域的重组融合而产生的融合蛋白，其在翻译时产生单个蛋白质分子。
符号“::”表示在它之前和之后的多肽区域物理地连接在一起以形成连续多肽。
贯穿本说明书，术语“双特异性”将被理解为包括结合不同细胞外靶生物分子或在两个或更多个不同表位结合相同的细胞外靶生物分子的分子，无论是非重叠或重叠表位(例如二价二互补位(biparatopic)分子)。
如本文所用，术语“表达的”、“进行表达”或“表达”及其语法变体是指多核苷酸或核酸翻译成蛋白。表达的蛋白可以保留在细胞内，成为细胞表面膜的组分或者被分泌到细胞外空间中。
如本文所用，在至少一个细胞表面表达显著量的细胞外靶生物分子的细胞是“靶标阳性细胞”或“靶+细胞”，并且是与特定的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞。下面定义了显著量的靶标生物分子。
如本文所用，符号“α”是能够与该符号后的生物分子结合的免疫球蛋白型结合区域的简写。符号“α”用于表示免疫球蛋白型结合区域的功能特性，这基于它与该符号后的生物分子结合的能力，其具有10-5或更低的解离常数(KD)所述的结合亲和力。
如本文所用，术语“重链可变(VH)结构域”或“轻链可变(VL)结构域”分别指任何抗体VH或VL结构域(例如人VH或VL结构域)及其至少保留相应天然抗体的定性抗原结合能力的任何衍生物(例如，来源于天然鼠VH或VL结构域的人源化VH或VL结构域)。VH或VL结构域由被三个CDR或ABR中断的“框架”区域组成。所述框架区域用于对齐CDR或ABR用于特异性结合抗原的表位。从氨基末端到羧基末端，VH和VL结构域均包含以下框架(FR)和CDR区域或ABR区域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4；或类似地，FR1、ABR1、FR2、ABR2、FR3、ABR3和FR4。如本文所用，术语“HCDR1”、“HCDR2”或“HCDR3”分别用于指VH结构域中的CDR1、2或3，以及术语“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”分别用于指VL结构域中的CDR1、2或3。如本文所用，术语“HABR1”、“HABR2”或“HABR3”分别用于指VH结构域中的ABR1、2或3，以及术语“LABR1”、“LABR2”或“LABR3”分别用于指VL结构域中的ABR1、2或3。对于骆驼科VHH片段、软骨鱼的IgNAR、VNAR片段、某些单结构域抗体及其衍生物，存在包含相同基本排列的单个重链可变结构域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。如本文所用，术语“HCDR1”、“HCDR2”或“HCDR3”可分别用于指单个重链可变结构域中的CDR1、2或3。
就本发明的目的而言，术语“效应子”是指提供生物活性，诸如细胞毒性、生物信号传导、酶促催化、亚细胞发送、和/或导致变构效应和/或一个或更多个因子的募集的分子间结合。例如，志贺毒素效应子多肽提供存在于志贺毒素、志贺毒素组分和/或其片段中的一种或更多种生物活性。
就本发明的目的而言，短语“志贺毒素效应子多肽”、“志贺毒素效应子多肽区域”和“志贺毒素效应子区域”是指来源于志贺毒素家族成员的至少一个志贺毒素A亚基的多肽或多肽区域，其中多肽或多肽区域能够表现出至少一种志贺毒素功能。
就本发明的目的而言，描述结合区域的术语“异源”是指结合区域来自与天然存在的志贺毒素不同的来源，例如，作为多肽的异源结合区域是并非天然发现作为任何天然志贺毒素的一部分的多肽。
就本发明的目的而言，描述CD8+ T细胞表位的术语“异源”是指CD8+ T细胞表位来自与以下不同的来源：(1)天然存在的志贺毒素的A亚基，例如异源多肽不是天然发现作为天然志贺毒素的任何A亚基的一部分，和(2)现有技术的志贺毒素效应子多肽。例如，在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，关于CD8+ T细胞表位-肽的术语“异源”是指最初不在待修饰的细胞靶向分子(亲本分子)中出现的但是被加入到该分子中(无论是通过本文所述的嵌入、融合、插入和/或氨基酸取代的过程添加，还是通过任何其他工程化手段来添加以产生修饰的细胞靶向分子)的肽序列，。结果是包含CD8+ T细胞表位-肽的修饰的细胞靶向分子，所述CD8+ T细胞表位-肽对于原始的未经修饰的细胞靶向分子是外源的，即未经修饰的细胞靶向分子(亲本分子)中不存在CD8+ T细胞表位。相对于结合区域，“异源”CD8+ T细胞表位可以是自体的或异源的。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位对于细胞靶向分子的结合区域组分也是异源的，例如，异源表位是结合区域的结合活性不需要的表位，并且不是提供结合区域的结合活性的最小结合区域结构的结构部分。例如，免疫球蛋白中不天然存在的CD8+ T细胞表位与来源于该免疫球蛋白的免疫球蛋白型结合区域是异源的，如果它不是免疫球蛋白型结合区域的结合活性所必需的，并且不是提供免疫球蛋白型结合区域的结合活性的最小结合区结构的结构部分。
就要求保护的发明的目的而言，描述CD8+ T细胞表位的术语“异源”是指与(1)天然存在的志贺毒素的A亚基和(2)包含异源组分的细胞靶向分子的结合区域不同的来源。本发明的细胞靶向分子的异源CD8+ T细胞表位-肽是野生型志贺毒素A1片段、天然存在的志贺毒素A1片段和/或用作细胞靶向分子的组分的现有技术志贺毒素效应子多肽中尚不存在的CD8+ T细胞表位-肽。
就要求保护的发明的目的而言，CD8+免疫细胞的短语“细胞间接合”是指CD8+免疫细胞以指示CD8+免疫细胞的免疫应答的激活的方式对不同细胞应答(例如，通过感测另一个显示一个或更多个pMHC I)，例如，涉及杀死其他细胞、募集和激活其他免疫细胞(如细胞因子分泌)CD8+免疫细胞的成熟，CD8+免疫细胞的激活等的应答。
如本文所用，在描述分子的功能活性时，术语“CD8+ T细胞表位递送”是指分子提供在细胞内定位至亚细胞区室的生物活性，所述亚细胞区室能够导致包含CD8+ T细胞表位-肽的分子的蛋白质部分的蛋白酶体切割。分子的“CD8+ T细胞表位递送”功能可以通过观察外源施用该分子的细胞的细胞表面上的分子的CD8+ T细胞表位-肽货物的MHC呈递来测定，或者从在其一个或更多个内体区室中含有该分子的细胞开始该测定。通常，可以测定分子将CD8+ T细胞表位递送至蛋白酶体的能力，其中“CD8+ T细胞表位递送”分子的初始位置是细胞的早期内体区室，然后，根据经验表明，分子将表位-肽递送至细胞的蛋白酶体。然而，还可以测定“CD8+ T细胞表位递送”能力，其中分子在细胞外位置开始并且根据经验直接或间接地表明，将表位递送到细胞内和细胞的蛋白酶体。例如，某些“CD8+ T细胞表位递送”分子穿过细胞的内体区室，例如诸如在内吞进入该细胞后。或者，可以观察到从细胞外位置开始的分子的“CD8+ T细胞表位递送”活性，由此该分子不进入细胞的任何内体区室-而是“CD8+ T细胞表位递送”分子进入细胞并且将T细胞表位-肽递送到细胞的蛋白酶体，推测是因为“CD8+ T细胞表位递送”分子指导其自身发送至亚细胞区室，以导致其CD8+ T细胞表位-肽组分的蛋白酶体切割。
就本发明的目的而言，志贺毒素效应子功能是由来源于志贺毒素A亚基的多肽区域赋予的生物学活性。志贺毒素效应子功能的非限制性实例包括促进细胞进入；脂质膜变形；促进细胞内化；刺激网格蛋白介导的内吞作用；指导细胞内发送至各种细胞内区室，例如诸如高尔基体、内质网和胞质溶胶；指导货物的细胞内发送；抑制核糖体功能；催化活性，例如诸如N-糖苷酶活性和催化抑制核糖体；减少蛋白合成；诱导胱天蛋白酶活化；激活效应子胱天蛋白酶；实现细胞抑制作用和细胞毒性。志贺毒素催化活性包括，例如，核糖体失活、蛋白质合成抑制、N-糖苷酶活性、多核苷酸:腺苷糖苷酶活性、RNA酶活性和DNA酶活性。志贺毒素是核糖体失活蛋白(RIP)。RIP能够对核酸，多核苷(polynucleoside)，多核苷酸，rRNA，ssDNA，dsDNA，mRNA(和聚A)和病毒核酸脱嘌呤(参见例如Barbieri L等,Biochem J 286:1-4(1992)；Barbieri L等,Nature 372:624(1994)；Ling J等,FEBS Lett345:143-6(1994)；Barbieri L等,Biochem J 319:507-13(1996)；Roncuzzi L,Gasperi-Campani A,FEBSLett 392:16-20(1996)；Stirpe F等,FEBS Lett 382:309-12(1996)；Barbieri L等,Nucleic Acids Res 25:518-22(1997)；Wang P,Tumer N,Nucleic Acids Res 27:1900-5(1999)；Barbieri L等,Biochim Biophys Acta 1480:258-66(2000)；Barbieri L等,JBiochem 128:883-9(2000)；Brigotti M等,Toxicon 39:341-8(2001)；Brigotti M等,FASEB J 16:365-72(2002)；Bagga S等,J Biol Chem 278:4813-20(2003)；Picard D等,JBiol Chem 280:20069-75(2005))。一些RIP显示出抗病毒活性和超氧化物歧化酶活性(Erice A等,Antimicrob Agents Chemother 37:835-8(1993)；Au T等,FEBS Lett 471:169-72(2000)；Parikh B,Tumer N,Mini Rev Med Chem 4:523-43(2004)；Sharma N等,Plant Physiol 134:171-81(2004))。已经在体外和体内观察到志贺毒素催化活性。用于志贺毒素效应子活性的测定的非限制性实例测量各种活性，例如诸如蛋白质合成抑制活性、脱嘌呤活性、白细胞郁滞、细胞毒性、超螺旋DNA松弛活性和核酸酶活性。
如本文所用，志贺毒素效应子功能的保留是指，在相同条件下，能够表现出一定水平的志贺毒素功能活性，如通过具有可重复性的适当定量测定法所测量的，所述活性与野生型志贺毒素效应子多肽对照(例如，志贺毒素A1片段)或包含野生型志贺毒素效应子多肽(例如志贺毒素A1片段)的细胞靶向分子相当。对于核糖体失活或核糖体抑制的志贺毒素效应子功能，保留的志贺毒素效应子功能在体外环境中表现出10,000皮摩尔(pM)或更低的IC50，例如诸如通过使用技术人员已知的和/或本文描述的测定法。对于靶标阳性细胞杀伤测定中的志贺毒素效应子细胞毒性功能，保留的志贺毒素效应子功能表现出1,000纳摩尔(nM)或更低的CD50，这取决于细胞类型及其适当的细胞外靶标生物分子的表达，例如，如通过使用技术人员已知的和/或本文描述的测定法所显示的。
就要求保护的发明的目的而言，关于核糖体抑制的术语“等同”是指经验性测量的核糖体抑制活性水平，如通过具有再现性的适当定量测定法所测量的，其在相同条件下可再现地在参考分子(例如，第二细胞靶向分子或第三细胞靶向分子)活性的10％或更低的范围内。
就要求保护的发明的目的而言，关于细胞毒性的术语“等同”是指经验性测量的细胞毒性水平，如通过具有可再现性的适当定量测定法所测量的，其在相同条件下可再现地在参考分子(例如，第二细胞靶向分子或第三细胞靶向分子)活性的10％或更低的范围内。
如本文所用，关于细胞毒性的术语“减弱的”是指分子所显示的CD50为参考分子在相同条件下所显示的CD50的10倍至100倍。
对于某些样本，IC50或CD50的准确值可能无法获得，因为无法收集精确曲线拟合所需的数据点。例如，理论上，如果在给定样品的浓度系列中没有出现分别不超过50％的核糖体抑制或细胞死亡，则不能确定IC50和CD50。如示例性志贺毒素效应子功能测定(例如实施例中描述的测定)的数据分析中所述的不足以精确拟合曲线的数据不应被视为代表实际志贺毒素效应子功能。
未能检测志贺毒素效应子功能的活性可能是由于不当的表达、多肽折叠和/或多肽稳定性，而不是缺乏细胞进入、亚细胞发送和/或酶活性。对志贺毒素效应子功能的测定可能不需要太多的本发明的细胞靶向分子来测量显著量的志贺毒素效应子功能活性。在某种程度上根据经验确定效应子功能低或无效的潜在原因与蛋白质表达或稳定性有关，本领域技术人员能够使用本领域已知的蛋白质化学方法和分子工程技术来补偿这些因素，从而可以恢复和测量志贺毒素功能效应子活性。例如，通过使用不同的表达对照序列可以补偿不适当的基于细胞的表达；不适当的多肽折叠和/或稳定性可受益于使末端序列稳定，或使蛋白三维结构稳定的非效应子区域中的补偿性突变等。当针对个体志贺毒素功能的新测定可用时，可以分析志贺毒素效应子区域或多肽的任何水平的那些志贺毒素效应子功能，例如在野生型志贺毒素效应子多肽的某一倍数活性内。有意义的活性差异的实例是，例如，志贺毒素效应子区域的活性是野生型志贺毒素效应子多肽活性的1000倍或100倍或更低；或者与功能性敲减或敲除的志贺毒素效应子多肽相比具有3倍至30倍或更高的活性。
某些志贺毒素效应子功能不容易测量，例如，亚细胞发送功能。例如，没有常规的定量测定来区分志贺毒素效应子多肽具有细胞毒性和/或递送异源CD8+ T细胞表位的失败是否是由于不适当的亚细胞发送，但是在测试可用的时候，则与适当的野生型志贺毒素效应子多肽相比，可以分析志贺毒素效应子多肽的任何显著水平的亚细胞发送。然而，如果本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽组分显示出与野生型志贺毒素A亚基构建体相当或等同的细胞毒性，则推断至少在测试条件下，亚细胞发送活性水平分别与野生型志贺毒素A亚基构建体的亚细胞发送活性水平相当或等同。
当针对单个志贺毒素功能的新测定可用时，可分析志贺毒素效应子多肽和/或包含志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子的那些志贺毒素效应子功能的任何水平，例如野生型志贺毒素效应子多肽活性的1000倍或100倍或更低，或者与功能性敲除的志贺毒素效应子多肽相比，表现出3倍至30倍或更高的活性。
足够的亚细胞发送可能只能通过在细胞毒性测定中观察细胞靶向分子的志贺毒素细胞毒性活性水平来推断，例如基于T细胞表位呈递或基于涉及胞质溶胶和/或内质网定位的靶底物的志贺毒素效应子功能的细胞毒性测定。
如本文所用，“显著的”志贺毒素效应子功能的保留是指能够表现出志贺毒素功能活性水平，如通过具有再现性的适当的定量测定法所测量的，所述活性水平与野生型志贺毒素效应子多肽对照(例如志贺毒素A1片段)相当。对于体外核糖体抑制，显著的志贺毒素效应子功能表现出300pM或更低的IC50，这取决于测定中使用的核糖体的来源(例如细菌、古细菌或真核生物(藻类、真菌、植物或动物)来源)。与催化破坏的SLT-1A1-251双突变体(Y77S/E167D)的大约为100,000pM的IC50相比，这是显著更强的抑制。对于在实验室细胞培养中的靶标阳性细胞杀伤测定中的细胞毒性，显著的志贺毒素效应子功能表现出100、50、30nM或更低的CD50，这取决于结合区域的靶生物分子和细胞类型，特别是细胞类型的表达和/或适当的细胞外靶生物分子的细胞表面呈递和/或被评估的分子所靶向的细胞外表位。与没有细胞靶向结合区域的单独的志贺毒素A亚基(或野生型志贺毒素A1片段)(CD50为100-10,000nM，取决于细胞系)相比，这对适当的靶标阳性细胞群的细胞毒性显著更高。
就本发明的目的而言和关于本发明分子的志贺毒素效应子功能，术语“合理的活性”是指表现出与包含天然存在的志贺毒素的分子相关的、如本文所定义的至少中等水平(例如在11倍至1,000倍之内)的志贺毒素效应子活性，其中志贺毒素效应子活性选自由以下组成的组：内化效率、至胞质溶胶的亚细胞发送效率、通过靶细胞递送的表位呈递、核糖体抑制和细胞毒性。对于细胞毒性，合理水平的志贺毒素效应子活性包括在野生型志贺毒素构建体的1,000倍以内，例如当野生型志贺毒素构建体(例如，包含野生型志贺毒素A1片段的细胞靶向分子)表现出0.5nM的CD50时，其表现出500nM或更低的CD50。
就本发明的目的而言和关于本发明分子的细胞毒性，术语“最佳”是指志贺毒素催化结构域介导的细胞毒性水平是在包含野生型志贺毒素A1片段(例如志贺毒素A亚基或其某些截短的变体)的分子和/或天然存在的志贺毒素的细胞毒性的2、3、4、5、6、7、8、9或10倍之内。
应当注意，即使志贺毒素效应子多肽的细胞毒性相对于野生型志贺毒素A亚基或其片段降低，实际上，使用生物活性减弱的志贺毒素效应子多肽的应用可能与使用野生型志贺毒素效应子多肽同样有效或更有效，因为最高效力变体可能表现出在细胞毒性效力降低的变体中被最小化或降低的不期望的作用。野生型志贺毒素是非常有效的，只有一个毒素分子到达中毒细胞的胞质溶胶后或者可能只有四十个毒素分子被内化到中毒细胞后就能杀死一个中毒细胞。与野生型志贺毒素效应子多肽相比，具有显著降低的志贺毒素效应子功能(例如亚细胞发送或细胞毒性)的志贺毒素效应子多肽对于实际应用仍然足够有效，例如涉及靶向细胞杀伤、异源表位递送和/或特定细胞及其亚细胞区室的检测的应用。另外，某些活性降低的志贺毒素效应子多肽可特别适用于将货物(例如另外的外源物质或T细胞表位)递送至靶细胞的某些细胞内位置或亚细胞区室。
关于分子的细胞毒活性的术语“选择性细胞毒性”是指生物分子靶标阳性细胞群(例如靶向细胞类型)和非靶向旁观者细胞(bystander cell)群(例如生物分子靶标阴性细胞类型)之间的细胞毒性的相对水平，其可以表示为靶向细胞类型的半数最大细胞毒性浓度(CD50)与非靶向细胞类型的CD50的比率，以提供细胞毒性选择性的度量，或相对于非靶向细胞杀死靶向细胞的优先性的指示。
给定细胞外靶生物分子(或给定靶生物分子的细胞外表位)的细胞表面呈递和/或密度可以影响本发明的某些细胞靶向分子最适合使用的应用。细胞之间给定靶生物分子的细胞表面呈递和/或密度的差异可以定量和定性地改变本发明的给定细胞靶向分子的细胞内化效率和/或细胞毒性效力。给定靶生物分子的细胞表面呈递和/或密度在靶生物分子阳性细胞之间或甚至在细胞周期或细胞分化中的不同点处的相同细胞上可以变化很大。给定靶生物分子和/或给定靶生物分子的某些细胞外表位在特定细胞或细胞群上的总细胞表面呈递可以使用技术人员已知的方法确定，例如涉及荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞术的方法。
就本发明的目的而言，短语“天然存在于细胞表面上的靶生物分子”是指细胞使用其自身的内部机制表达靶生物分子，并使用其自身的内部机制将靶生物分子定位于细胞表面，这样，靶生物分子与所述细胞物理偶联，并且至少一部分靶生物分子可从细胞外空间，即在细胞表面上获得。
如本文所用，关于多肽区域或多肽内特征的术语“破坏的”、“破坏”及其语法变体是指对该区域内或构成破坏的特征的至少一个氨基酸的改变。氨基酸改变包括各种突变，例如改变多肽氨基酸序列的缺失、倒位、插入或置换。氨基酸改变还包括化学变化，例如氨基酸官能团中一个或更多个原子的改变或氨基酸官能团中一个或更多个原子的添加。
如本文所用，“去免疫化”是指与参考分子(例如野生型肽区域、多肽区域或多肽)相比，在施用于脊索动物后降低的抗原性和/或免疫原性潜力。这包括与参考分子相比，尽管引入了一个或更多个从头抗原性和/或免疫原性表位，但总体的抗原性和/或免疫原性潜力降低。对于某些实施方案，“去免疫化”是指与其来源于的“亲本”分子(例如野生型志贺毒素A1分段)相比，在施用于哺乳动物后分子表现出降低的抗原性和/或免疫原性。在某些实施方案中，与参考分子相比，本发明的去免疫化的志贺毒素效应子多肽能够表现出相比于参考分子的相对抗原性，其在相同条件下通过相同测定法(例如，技术人员已知的和/或本文所述的测定，如定量ELISA或Western印迹分析)测量时，比参考分子的抗原性降低10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。在某些实施方案中，与参考分子相比，本发明的去免疫化的志贺毒素效应子多肽能够表现出相比于参考分子的相对免疫原性，其在相同条件下通过相同测定法(例如技术人员已知和/或在本文中描述的的测定法，如在给定时间点接受分子的肠胃外施用后在哺乳动物中产生的抗分子抗体的定量测量)测量时，比参考分子的免疫原性降低10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，99％或更多。示例性细胞靶向分子的相对免疫原性可以在重复肠胃外施用数天，数周和/或数月后，使用对细胞靶向分子的适应性免疫反应(例如体内抗体应答)或先天免疫反应的测定来确定。
在许多时期内重复肠胃外施用后，使用对细胞靶向分子的体内抗体应答的测定来确定示例性细胞靶向分子的相对免疫原性。
就本发明的目的而言，短语“CD8+ T细胞超免疫化”是指当存在于活的脊索动物内的有核脊索细胞内时，关于CD8+ T细胞抗原性或免疫原性，当与缺乏任何异源CD8+ T细胞表位-肽的相同分子相比时，细胞靶向分子具有增加的抗原性和/或免疫原性潜力。
关于多肽的T细胞表位或T细胞表位-肽组分的术语“嵌入的”及其语法变体是指用不同的氨基酸在多肽区域内部替换一个或更多个氨基酸，从而产生具有与起始多肽区域相同的总氨基酸残基数的新多肽序列。因此，术语“嵌入的”不包括任何另外的氨基酸、肽或多肽组分与起始多肽的任何外部的末端融合，也不包括任何另外的氨基酸残基的任何另外的内部插入，而是仅包括对现有氨基酸的置换。内部替换可以仅通过氨基酸残基置换或通过一系列置换、缺失、插入和/或倒位来完成。如果使用插入一个或更多个氨基酸，那么必须在插入旁边删除相等数量的邻近氨基酸以产生嵌入的T细胞表位。这与相对于本发明多肽中包含的T细胞表位使用术语“插入”相反，插入是指在多肽内部插入一个或更多个氨基酸，产生与起始多肽相比，氨基酸残基数量增加的新多肽。
关于多肽中包含的T细胞表位的术语“插入的”及其语法变体是指在多肽内插入一个或更多个氨基酸，产生与起始多肽相比，氨基酸残基数量增加的新多肽序列。
就本发明的目的而言，关于本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽区域的位置的短语“接近氨基末端”是指志贺毒素效应子多肽区域的至少一个氨基酸残基位于细胞靶向分子的氨基末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个(例如多达18-20个)氨基酸残基内的距离，只要细胞靶向分子能够表现出本文所述的适当水平的志贺毒素效应子功能活性(例如，一定水平的细胞毒性效力)。因此，对于本发明的某些实施方案，与志贺毒素效应子多肽氨基端融合的任何氨基酸残基不应降低任何志贺毒素效应子功能(例如，通过空间阻碍志贺毒素效应子多肽区域的氨基末端附近的结构)使得志贺毒素效应子多肽的功能活性降低至低于本文所需的适当活性水平。
就本发明的目的而言，与另一组分(例如，靶向细胞的结合区域、分子部分和/或另外的外源材料)相比，关于本发明的细胞靶向分子中的志贺毒素效应子多肽区域的位置的短语“更接近氨基末端”是指与其他参考组分相比，志贺毒素效应子多肽的氨基末端的至少一个氨基酸残基更接近本发明的细胞靶向分子的线性多肽组分的氨基末端的位置。
就本发明的目的而言，短语“来源于志贺毒素家族成员的一个A亚基的活性酶结构域”是指具有通过催化核糖体失活机制来抑制蛋白合成的能力。天然存在的志贺毒素的酶活性可以通过使用技术人员已知的测定的抑制蛋白质翻译的能力来定义，所述测定例如涉及在不存在活细胞的情况下的RNA翻译的体外测定或涉及在活细胞中的RNA翻译的体内测定。使用技术人员已知的和/或本文所述的测定法，志贺毒素酶活性的效力可以通过观察针对核糖体RNA(rRNA)的N-糖苷酶活性(例如核糖体切口测定法)直接评估，和/或通过观察核糖体功能和/或蛋白质合成的抑制间接评估。
就本发明的目的而言，术语“志贺毒素A1片段区域”是指基本上由志贺毒素A1片段组成的和/或来源于志贺毒素的志贺毒素A1片段的多肽区域。
就本发明的目的而言，关于细胞靶向分子的术语“末端”、“氨基末端”或“羧基末端”通常是指细胞靶向分子的多肽链(例如，单个连续的多肽链)的最后氨基酸残基。细胞靶向分子可以包含多于一个的多肽或蛋白，因此，本发明的细胞靶向分子可以包含多个氨基末端和羧基末端。例如，细胞靶向分子的“氨基末端”可以由代表多肽的氨基末端的多肽链的第一个氨基酸残基定义，其通常以起始氨基酸残基为特征，所述起始氨基酸残基不具有与任何氨基酸残基的肽键，所述肽键涉及起始氨基酸残基的伯氨基或涉及起始氨基酸残基(其是N-烷基化α氨基酸残基类的成员)的等价氮。类似地，细胞靶向分子的“羧基末端”可以由代表多肽的羧基末端的多肽链的最后一个氨基酸残基限定，其通常以最终的氨基酸残基为特征，该最终的氨基酸残基不具有通过肽键与其伯羧基的α-碳连接的任何氨基酸残基。
就本发明的目的而言，短语“志贺毒素A1片段衍生区域”是指志贺毒素效应子多肽的全部或部分，其中该区域由与天然存在的志贺毒素A1片段同源的多肽或其截短组成，例如，包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)的氨基酸75-239、StxA(SEQ ID NO:2)的75-239或(SEQ IDNO:3)的77-238或由其组成的多肽或志贺毒素家族成员的另一个A亚基中的等同区域。相对于天然存在的志贺毒素A1片段，“志贺毒素A1片段衍生区域”的羧基末端定义为：(1)以与天然存在的志贺毒素A1片段具有同源性的羧基端氨基酸残基结束；(2)在A1片段和A2片段的连接处结束；(3)以弗林蛋白酶切位点或破坏的弗林蛋白酶切割位点结束；和/或(4)以志贺毒素A1片段的羧基端截短结束，即羧基端氨基酸残基与天然存在的志贺毒素A1片段具有同源性。
就本发明的目的而言，短语“志贺毒素A1片段的羧基末端区域”是指来源于天然存在的志贺毒素A1片段的多肽区域，该区域以疏水残基开始(例如，StxA-A1和SLT-1A1的V236，以及SLT-2A1的V235)，其后是疏水残基，并且该区域以在志贺毒素A1片段多肽中保守的弗林蛋白酶切割位点结束，并且在天然志贺毒素A亚基中的A1片段和A1片段之间的连接处结束。就本发明的目的而言，志贺毒素A1片段的羧基端区域包括来源于志贺毒素A1片段多肽的羧基末端的肽区域，例如包含志贺毒素A1片段的羧基末端或基本上由其组成的肽区域。来源于志贺毒素A1片段的羧基末端的肽区域的非限制性实例包括：在志贺毒素A亚基变体(SEQ ID NO:1-2和4-6)中天然位于位置236至位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248，249、250或251的氨基酸残基序列；和在SLT-2A变体(SEQ ID NO:3和7-18)中从位置235到位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250的氨基酸残基序列。
就本发明的目的而言，关于连接的分子部分和/或结合区域的短语“接近A1片段多肽的羧基末端”是指在限定志贺毒素A1片段多肽的最后残基的氨基酸残基的1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基以内。
就本发明的目的而言，短语“在空间上覆盖A1片段衍生区域的羧基末端”包括与A1片段衍生区域的羧基末端的氨基酸残基连接和/或融合的、大小为4.5kDa或更大的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)，例如，所述氨基酸残基来源于天然位于志贺毒素变体(SEQ ID NO:1-2和4-6)中236至251位中任何一个位置的氨基酸残基或SLT-2A变体(SEQID NO:3和7-18)中235至250的氨基酸残基。就本发明的目的而言，短语“在空间上覆盖A1片段衍生区域的羧基末端”还包括与A1片段衍生区域的羧基末端的氨基酸残基连接和/或融合的、大小为4.5kDa或更大的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)，例如，所述氨基酸残基在最后一个氨基酸A1片段衍生区域和/或志贺毒素效应子多肽的羧基端。就本发明的目的而言，短语“在空间上覆盖A1片段衍生区域的羧基末端”还包括物理上阻止A1片段衍生区域的羧基末端的细胞识别的(例如，通过真核细胞的ERAD机制识别)、大小为4.5kDa或更大的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)。
就本发明的目的而言，结合区域，例如免疫球蛋白型结合区域，其包含含有至少40个氨基酸的多肽并且与包含A1片段衍生区域的志贺毒素效应子多肽区域的羧基末端连接(例如，融合)，是“在空间上覆盖A1片段衍生区域的羧基末端”的分子部分。
就本发明的目的而言，结合区域，例如免疫球蛋白型结合区域，其包含含有至少40个氨基酸的多肽并且与包含A1片段衍生区域的志贺毒素效应子多肽区域的羧基末端连接(例如，融合)，是“阻碍A1片段衍生区域的羧基末端”的分子部分。
就本发明的目的而言，术语“志贺毒素家族成员的A1片段”是指在志贺毒素A亚基中保守的、位于野生型志贺毒素A亚基中A1片段和A2片段之间的弗林蛋白酶切割位点被弗林蛋白酶蛋白水解后的志贺毒素A亚基的剩余氨基末端片段。
就要求保护的发明的目的而言，短语“A1片段区域羧基末端的弗林蛋白酶切割基序”是指在志贺毒素A亚基中保守的特异性弗林蛋白酶切割基序，其桥接在天然存在的志贺毒素A亚基中的A1片段和A2片段之间的接合。
就本发明的目的而言，短语“接近A1片段区域羧基末端的弗林蛋白酶切割位点”是指任何可鉴定的弗林蛋白酶切割位点，其具有距离限定A1片段区域或A1片段衍生区域中最后一个氨基酸残基的氨基酸残基的小于1、2、3、4、5、6、7或更多个氨基酸残基的氨基酸残基，包括位于A1片段区域或A1片段衍生区域羧基末端的弗林蛋白酶切割基序，例如，在靠近A1片段衍生区域与分子的另一组分(例如，本发明的细胞靶向分子的分子部分)的连接部位的位置。
就本发明的目的而言，短语“破坏的弗林蛋白酶切割基序”是指(i)如本文所述的特异性弗林蛋白酶切割基序和(ii)，与参考分子相比，其包含可赋予分子降低的弗林蛋白酶切割的突变和/或截短，例如，与在相同条件下在相同测定中观察到的参考分子的弗林蛋白酶切割相比，可重复地观察到弗林蛋白酶切割降低30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或更少(包括100％不进行切割)。与参考分子相比，弗林蛋白酶切割的百分比可以表示为目标分子的切割的:未切割的材料除以参考分子的切割的:未切割的材料的比例(参见例如WO 2015/191764；US2016/0177284)。合适的参考分子的非限制性实例包括含有如本文所述的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割基序和/或弗林蛋白酶切割位点的某些分子和/或以下实施例中使用的分子。
就本发明的目的而言，短语“弗林蛋白酶切割抗性”是指分子或其特定多肽区域可重复地表现出比以下更少的弗林蛋白酶切割：(i)野生型志贺毒素A亚基中志贺毒素A1片段的羧基末端，或(ii)构建体的志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端，其中位于A1和A2片段之间的连接处的天然存在的弗林蛋白酶切割位点未被破坏；其通过对技术人员任何可用的方法进行测定，包括使用本文所述的方法。
就本发明的目的而言，短语“来源于志贺毒素家族成员的A亚基的活性酶结构域”是指具有通过基于志贺毒素酶活性的核糖体的催化失活来抑制蛋白合成的能力的多肽结构。分子结构表现出蛋白合成抑制活性和/或核糖体催化失活的能力可以使用技术人员已知的各种测定来观察，所述测定例如涉及在没有活细胞的情况下的RNA翻译测定的体外测定，或涉及活细胞核糖体的体内测定。例如，使用技术人员已知的测定法，基于志贺毒素酶活性的分子的酶活性可以通过观察针对核糖体RNA(rRNA)的N-糖苷酶活性(例如核糖体切口测定法)直接评估，和/或通过观察核糖体功能、RNA翻译和/或蛋白合成的抑制间接评估。
关于志贺毒素效应子多肽，如本文所用，“组合”描述包含两个或更多个亚区的志贺毒素效应子多肽，其中每个亚区包含以下中的至少一个：(1)在内源性表位或表位区域中的破坏，和(2)在志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端处的破坏的弗林蛋白酶切割基序。
如本文所用，关于细胞靶向分子的术语“多价”是指包含两个或更多个高亲和力结合域的单个靶结合分子或多个靶结合分子，例如，包含两个或更多个结合区域的蛋白，其中每个单独的结合区域具有针对靶生物分子的细胞外部分的10-5至10-12摩尔/升的解离常数。
如本文所用，关于描述蛋白和/或蛋白质分子的术语“单体”是指仅包含一个多肽组分的分子，该多肽组分由单个连续多肽组成，无论其二级或三级结构如何，其可以通过核糖体从单个多核苷酸模板合成，包括随后形成环状结构的连续线性多肽。相反，多聚体分子包含两个或更多个多肽(例如亚基)，它们不一起形成可以通过核糖体从单个多核苷酸模板合成的单个连续多肽。
如本文所用，关于描述蛋白和/或蛋白质分子的术语“多聚体”是指包含两个或更多个关联在一起和/或连接在一起的单独的多肽组分的分子，例如，由两个组分组成的分子，其中每个组分其自身是连续多肽。例如，分子的组分之间的关联或键合可包括1)一个或更多个非共价相互作用；2)一个或更多个翻译后的共价相互作用；3)一个或更多个共价化学缀合；和/或4)一个或更多个共价相互作用，其产生包含非线性多肽(例如由两个或更多个多肽组分排列产生的支链或环状多肽结构)的单个分子，。包含由核糖体从单个多核苷酸模板合成的单个连续多肽中的一个或更多个肽键的蛋白水解切割而产生的两个非连续多肽的分子是“多聚体”而不是“单体”。
以下使用说明性、非限制性的实施方案并参考附图更全面地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应该被解释为限于下面阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开更透彻并且将本发明的范围传递给本领域技术人员。
介绍
通过特异性地通过使用来自感染剂的高免疫原性外来表位特异性地诱导针对患者体内恶性细胞(例如肿瘤细胞)和/或恶性组织部位(例如肿瘤)的感染样免疫反应，以局部激活多种有益的免疫应答，并通过诱导模拟感染状态特异性地将靶细胞(例如肿瘤细胞)标记为外来的，可以利用免疫系统的能力。或者，该方法可以使用高免疫原性的新表位(来源于感染剂或非感染剂)，或来源于非感染剂(例如肿瘤特异性抗原，肿瘤相关抗原)和来自植物、真菌等的分子的高免疫原性非自身表位。
本发明利用志贺毒素A亚基衍生多肽的能力来驱动它们自身的亚细胞发送，以便将高免疫原性CD8+ T细胞抗原(例如肽-表位)递送到脊索动物细胞的MHC I类呈递系统。本发明提供了各种示例性的志贺毒素A亚基衍生构建体，其能够将异源CD8+ T细胞表位递送至靶细胞的MHC I类系统，导致所递送表位的细胞表面呈递，其中志贺毒素效应子多肽组分包含突变的组合，其提供(1)去免疫化，(2)蛋白酶敏感性的降低，和/或(3)嵌入的T细胞表位。在细胞表面上与MHC I类分子以复合物形式呈递的某些肽-表位可以向CD8+效应子T细胞发信号以杀伤呈递细胞以及刺激局部区域中的其他免疫应答。因此，本发明提供了志贺毒素A亚基衍生的细胞靶向分子，其杀伤特定的靶细胞，例如通过MHC I类途径呈递某些CD8+ T细胞表位-肽。本发明的细胞靶向分子可用作例如细胞杀伤分子、细胞毒性治疗剂、治疗递送剂和诊断分子。
I.本发明的细胞靶向分子的一般结构
本发明的细胞靶向分子各自包含1)细胞靶向结合区域，2)志贺毒素A亚基效应子多肽，和3)CD8+ T细胞表位-肽，其未嵌入或插入志贺毒素A1片段区域中并且与志贺毒素A亚基和该分子的结合区域是异源的。该系统是模块化的，因为任何数量的不同的CD8+ T细胞表位-肽都可以用作货物，用于通过本发明的细胞靶向分子递送至靶细胞的MHC I类呈递途径。
A.本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽组分的一般结构
本发明的志贺毒素效应子多肽和细胞靶向分子包含至少一个来源于野生型志贺毒素A亚基的志贺毒素效应子多肽，但包含一个或更多个结构修饰，例如截短和/或氨基酸残基置换之类的突变。对于某些实施方案，本发明涉及改进的志贺毒素A亚基效应子多肽的工程改造，所述多肽包含两个或更多个以下志贺毒素效应子多肽亚区的组合：(1)去免疫化的亚区，(2)志贺毒素A1片段区域的羧基末端附近的蛋白酶切割抗性亚区，和(3)嵌入或插入T细胞表位-肽的亚区。
本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽是来源于志贺毒素家族的志贺毒素A亚基成员的多肽，其能够表现出一种或更多种志贺毒素功能。有许多适用于本发明的志贺毒素效应子多肽或用作通过使用本领域已知技术修饰成本发明的志贺毒素效应子多肽的亲本多肽(参见例如Cheung M等，Mol Cancer 9:28(2010)；WO 2014/164693；WO 2015/113005；WO2015/113007；WO 2015/138452；WO 2015/191764)。志贺毒素功能包括例如促进细胞进入，提高细胞内化，指导逆行运输，指导亚细胞发送，指导从内体区室至胞质溶胶的亚细胞发送，避免细胞内降解，催化灭活核糖体，实现细胞毒性和实现细胞抑制作用。
蛋白质毒素的志贺毒素家族由结构和功能相关的各种天然毒素组成，例如志贺毒素、志贺样毒素1和志贺样毒素2(Johannes L，W，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。志贺毒素家族的全毒素成员含有靶向结构域，其优先结合存在于一些宿主细胞的表面上的特定鞘糖脂，和能够在细胞内永久灭活核糖体的酶结构域(Johannes L，/>W，Nat Rev Microbiol8：105-16(2010))。志贺毒素家族的成员具有相同的总体结构和作用机制(Engedal N等，Microbial Biotech 4：32-46(2011))。例如，Stx、SLT-1和SLT-2在无细胞系统中显示出难以区分的酶活性(Head S等，J Biol Chem266：3617-21(1991)；Tesh V等，Infect Immun 61：3392-402(1993)；Brigotti M等，Toxicon 35：1431-7(1997))。
志贺菌毒素家族包括从痢疾志贺菌(S.dysenteriae)血清型1中分离的真志贺菌毒素(Stx)，从肠出血性大肠杆菌(E.coli)的血清型分离的志贺样毒素1变体(SLT1或Stx1或SLT-1或Slt-I)，以及从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素2变体(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1与Stx仅一个氨基酸残基不同，并且二者都被称为维罗细胞毒素(Verocytotoxin)或vero细胞毒素(Verotoxin)(VT)(O’Brien A,Curr Top MicrobiolImmunol 180:65-94(1992))。尽管SLT1和SLT2变体在一级氨基酸序列水平上彼此仅有约53-60％的相似性，但是它们享有志贺菌毒素家族成员共有的酶活性和细胞毒性的机制(Johannes L,W,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。已经描述了超过39种不同的志贺菌毒素，如定义的亚型Stx1a，Stx1c，Stx1d，Stx1e，Stx2a-g和Stx2dact(Scheutz F等,J Clin Microbiol 50:2951-63(2012)；Probert W等,J Clin Microbiol 52:2346-51(2014))。志贺菌毒素家族成员并不天然地限于任何细菌物种，因为编码志贺菌毒素的基因可以经由水平基因转移在细菌物种之间扩散(Strauch E等,Infect Immun 69:7588-95(2001)；Bielaszewska M等,Appl Environ Micrbiol 73:3144-50(2007)；Zhaxybayeva O,Doolittle W,Curr Biol.21:R242-6(2011)；Kruger A,Lucchesi P,Microbiology 161:451-62(2015))。作为物种间转移的实例，在从患者中分离的溶血不动杆菌(A.haemolyticus)的菌株中发现了志贺菌毒素(Grotiuz G等人,J Clin Microbiol 44:3838-41(2006))。一旦编码志贺菌毒素的多核苷酸进入新的亚种或物种，则假定志贺菌毒素氨基酸序列能够由于遗传漂变和/或选择压力形成轻微的序列变化而同时仍然保持志贺菌毒素家族成员共有的细胞毒性的机制(参见Scheutz F等,J Clin Microbiol 50:2951-63(2012))。
1.去免疫化的志贺毒素A亚基效应多肽
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽是去免疫化的，例如，与野生型志贺毒素、野生型志贺毒素多肽和/或仅包含野生型多肽序列的志贺毒素效应子多肽相比。本发明的去免疫化的志贺毒素效应子多肽各自包含至少一个推定的内源表位区域的破坏，以便在向脊索动物施用多肽后降低志贺毒素效应子多肽的抗原性和/或免疫原性潜力。志贺毒素效应子多肽和/或志贺毒素A亚基多肽，无论是否天然存在，可通过本文所述的、描述于WO 2015/113005，WO 2015/113007和/或WO 2016/196344中的和/或技术人员已知的方法去免疫化，其中所得分子保留一种或更多种志贺毒素A亚基功能。
本发明的志贺毒素效应子多肽包含来源于从其任何形式的天然志贺毒素B亚基解离的志贺毒素A亚基的多肽或基本上由其组成。本发明的志贺毒素效应子多肽不包含志贺毒素B亚基的细胞靶向结构域。原型志贺毒素通过志贺毒素B亚基天然地靶向人细胞表面受体球形三酰神经酰胺(globotriaosylceramide)(Gb3，Gb3Cer或CD77)和球形四酰神经酰胺(globotetraosylceramide)(Gb4或Gb4Cer)，其通过限制靶向细胞类型和可能不需要的血管内皮细胞，某些肾上皮细胞和/或呼吸上皮细胞的靶向严格限制了潜在的应用(Tesh V等,Infect Immun 61:3392-402(1993)；Ling H等,Biochemistry 37:1777-88(1998)；BastD等,Mol Microbiol 32:953-60(1999)；Rutjes N等,Kidney Int 62:832-45(2002)；Shimizu T等,Microb Pathog 43:88-95(2007)；Pina D等,Biochim Biophys Acta 1768:628-36(2007)；Shin I等,BMB Rep 42:310-4(2009)；Zumbrun S等,Infect Immun 4488-99(2010)；Engedal N等,Microb Biotechnol 4:32-46(2011)；Gallegos K等,PLoS ONE 7:e30368(2012)；A等,PLoS Pathog 11:e1004619(2015))。Gb3和Gb4是存在于各种健康细胞类型的细胞膜的细胞外小叶上的常见中性鞘脂，例如多形核白细胞和来自各种血管床的人内皮细胞。本发明的细胞靶向分子不包含任何包含天然志贺毒素B亚基的功能性结合结构域或基本上由其组成的多肽。相反，本发明的志贺毒素效应子多肽可以与异源结合区域功能性地结合以实现细胞靶向。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽可包含全长志贺毒素A亚基(例如SEQ ID NO:1-18中的任一个)或基本上由其组成，注意到天然存在的志贺毒素A亚基可以包含在其氨基末端含有约22个氨基酸的信号序列(其被除去以产生成熟的志贺毒素A亚基并且对技术人员来说可识别的)的前体形式。在其他实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，所述截短的志贺毒素A亚基短于全长志贺毒素A亚基，例如本领域已知的截短(参见例如，WO2014/164693；WO 2015/113005；WO2015/113007；WO 2015/138452；WO 2015/191764)。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含内源性表位或表位区域(例如B细胞和/或CD4+ T细胞表位)的破坏。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含本文所述的至少一个内源性表位区域的破坏，其中在给脊索动物施用所述多肽后所述破坏降低志贺毒素效应子多肽的抗原性和/或免疫原性潜力，并且其中志贺毒素效应子多肽能够表现出一种或更多种志贺毒素A亚基功能，例如显著水平的志贺毒素细胞毒性。
本文关于表位区域使用的术语“破坏的”或“破坏”是指表位区域中至少一个氨基酸残基的缺失，两个或更多个氨基酸残基的倒位(其中至少一个倒位的氨基酸残基位于表位区域中)，表位区域中至少一个氨基酸的插入，以及表位区域中至少一个氨基酸残基的置换。通过突变的表位区域破坏包括用非标准氨基酸和/或非天然氨基酸的氨基酸置换。或者，表位区域可被突变破坏，所述突变包括通过添加共价连接的化学结构修饰氨基酸，所述化学结构掩蔽表位区域中的至少一个氨基酸，参见例如聚乙二醇化(参见Zhang C等，BioDrugs 26：209-15(2012)，小分子佐剂(Flower D，Expert Opin Drug Discov 7：807-17(2012)，和位点特异性白蛋白质化(Lim S等，J Control Release 207-93(2015))。
本文通过参考序列表中提供的天然志贺毒素A亚基的特定氨基酸位置指示某些表位区域和破坏，注意到天然存在的志贺毒素A亚基可包含在其氨基末端含有约22个氨基酸的信号序列(其被去除以产生成熟的志贺毒素A亚基并且对技术人员来说是可识别的)的前体形式。此外，本文通过参考天然存在于天然志贺毒素A亚基内的特定位置的特定氨基酸(例如S表示丝氨酸残基)来指示某些表位区域破坏(例如，S33表示氨基末端33位的丝氨酸残基)，然后是在所讨论的特定突变中置换该残基的氨基酸(例如，S33I表示在氨基末端的氨基酸残基33处异亮氨酸对丝氨酸的氨基酸置换)。
在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应子多肽包含WO 2015/113005，WO 2015/113007和/或WO 2016/196344中描述的至少一个表位区域的破坏。
在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应子多肽包含全长志贺毒素A亚基(例如SLT-1A(SEQ ID NO:1)，StxA(SEQ ID NO:2)或SLT-2A(SEQ ID NO:3)或其变体(例如SEQ ID NO:4-18))或基本上由其组成，其包含选自由以下组成的天然定位的氨基酸组的氨基酸序列的至少一个破坏：SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的1-15；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的3-14；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的26-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的27-37；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的39-48；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的42-48；和SEQ ID NO:1-18中任一个的53-66；SEQ ID NO:1-18中任何一个的94-115；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的141-153；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的140-156；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的179-190；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的179-191；SEQ ID NO:3的204；SEQ IDNO:1-2和4-6中任一个的205；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的210-218；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的240-260；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的243-257；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的254-268；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的262-278；SEQ ID NO:3和7-18中任一个的281-297；SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的285-293，或志贺毒素A亚基多肽、保守志贺毒素效应子多肽亚区和/或非天然的志贺毒素效应子多肽序列中的等同区域。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成。志贺毒素A亚基的截短可能导致整个表位区域的缺失而不影响志贺毒素效应子功能。显示出显著酶活性的最小的志贺毒素A亚基片段是由StxA的残基75-247组成的多肽(Al-Jaufy A等，Infect Immun 62：956-60(1994))。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的羧基末端截短至氨基酸1-251去除了两个预测的B细胞表位区域，两个预测的CD4阳性(CD4+)T细胞表位和预测的不连续的B细胞表位。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基末端截短至75-293去除了至少三个预测的B细胞表位区域和三个预测的CD4+ T细胞表位。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基末端和羧基末端截短至75-251删除了至少5个预测的B细胞表位区域；四个推定的CD4+ T细胞表位；和一个预测的不连续的B细胞表位。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽可包含在提供的表位区域中具有至少一个突变(例如，缺失、插入、倒位或置换)的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成。在某些另外的实施方案中，多肽包含破坏，其包含表位区域内至少一个氨基酸的缺失。在某些另外的实施方案中，多肽包含破坏，其包含在表位区域内插入至少一个氨基酸。在某些另外的实施方案中，多肽包含破坏，其包含氨基酸的倒位，其中至少一个倒位的氨基酸位于表位区域内。在某些另外的实施方案中，多肽包含破坏，所述破坏包含突变，例如氨基酸置换为非标准氨基酸或具有化学修饰侧链的氨基酸。在下面的实施例中提供了单氨基酸置换的许多实施例。
在某些实施方案中，与天然序列相比，本发明的志贺毒素效应子多肽可包含具有一个或更多个突变的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，其包含至少一个选自下组的氨基酸置换置换：A，G，V，L，I，P，C，M，F，S，D，N，Q，H和K。在某些另外的实施方案中，与天然序列相比，多肽可包含具有单个突变的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，其中置换选自由以下组成的组：D置换为A，D置换为G，D置换为V，D置换为L，D置换为I，D置换为F，D置换为S，D置换为Q，E置换为A，E置换为G，E置换为V，E置换为L，E置换为I，E置换为F，E置换为S，E置换为Q，E置换为N，E置换为D，E置换为M，E置换为R，G置换为A，H置换为A，H置换为G，H置换为V，H置换为L，H置换为I，H置换为F，H置换为M，K置换为A，K置换为G，K置换为V，K置换为L，K置换为I，K置换为M，K置换为H，L置换为A，L置换为G，N置换为A，N置换为G，N置换为V，N置换为L，N置换为I，N置换为F，P置换为A，P置换为G，P置换为F，R置换为A，R置换为G，R置换为V，R置换为L，R置换为I，R置换为F，R置换为M，R置换为Q，R置换为S，R置换为K，R置换为H，S置换为A，S置换为G，S置换为V，S置换为L，S置换为I，S置换为F，S置换为M，T置换为A，T置换为G，T置换为V，T置换为L，T置换为I，T置换为F，T置换为M，T置换为S，Y置换为A，Y置换为G，Y置换为V，Y置换为L，Y置换为I，Y置换为F，和Y置换为M。
在某些实施方案中，与天然氨基酸残基序列相比，本发明的志贺毒素效应子多肽包含具有一个或更多个突变的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，其包含免疫原性残基的和/或表位区域内的至少一个氨基酸置换，其中至少一个置换发生在天然定位的氨基酸组中，所述氨基酸选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的4；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的8；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的11；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中的33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的46；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的47；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的53；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的54；SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的55；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的56；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的57；SEQ IDNO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的62；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的84；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的88；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的104；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的105；SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的107；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的108；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的111；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的112；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141；SEQ ID NO:1，SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的154；SEQ ID NO:1，SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的185；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的189；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:3的241；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的247；SEQ ID NO:3的247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248；SEQ IDNO:3的250；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的251；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的264；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的265；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的286。
在某些另外的实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，其具有免疫原性残基的和/或表位区域内的至少一个置换，其中相对于天然存在的氨基酸，至少一个氨基酸置换是置换为非保守氨基酸(参见例如，表B，见下文)，其位于以下天然位置之一：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的1；SEQ ID NO:1，SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的4；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的8；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的9；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的11；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的44；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的46；SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的47；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的48；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的51；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的53；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的55；SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的56；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的57；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的58；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的59；SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的62；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的84；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的88；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的94；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的96；SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的104；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的105；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的107；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的108；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的111；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的112；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的141；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的154；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的181；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的183；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的184；SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的185；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的186；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的188；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的189；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的198；SEQ ID NO:3的204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的205；SEQ ID NO:3的241；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的242；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的247；SEQ ID NO:3的247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的248；SEQ ID NO:3的250；SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的251；SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的264；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的265；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的286。
在某些另外的实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，其具有至少一个选自下组的氨基酸置换：K1置换为A，G，V，L，I，F，M和H；T4置换为A，G，V，L，I，F，M和S；D6置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；S8置换为A，G，V，I，L，F和M；T8置换为A，G，V，I，L，F，M和S；T9置换为A，G，V，I，L，F，M和S；S9置换为A，G，V，L，I，F和M；K11置换为A，G，V，L，I，F，M和H；T12置换为A，G，V，I，L，F，M和S；S33置换为A，G，V，L，I，F和M；S43置换为A，G，V，L，I，F和M；G44置换为A和L；S45置换为A，G，V，L，I，F和M；T45置换为A，G，V，L，I，F和M；G46置换为A和P；D47置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；N48置换为A，G，V，L和M；L49置换为A或G；F50；A51置换为V；D53置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；V54置换为A，G和L；R55置换为A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；G56置换为A和P；I57置换为A，G，M和F；L57置换为A，G，M和F；D58置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；P59置换为A，G和F；E60置换为A，G，V，L，I，F，S，Q，N，D，M和R；E61置换为A，G，V，L，I，F，S，Q，N，D，M和R；G62置换为A；D94置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；R84置换为A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；V88置换为A和G；I88置换为A，G和V；D94；S96置换为A，G，V，I，L，F和M；T104置换为A，G，V，I，L，F，M和S；A105置换为L；T107置换为A，G，V，I，L，F，M和S；S107置换为A，G，V，L，I，F和M；L108置换为A，G和M；S109置换为A，G，V，I，L，F和M；T109置换为A，G，V，I，L，F，M和S；G110置换为A；D111置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；S112置换为A，G，V，L，I，F和M；D141置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；G147置换为A；V154置换为A和G；R179置换为A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；T180置换为A，G，V，L，I，F，M和S；T181置换为A，G，V，L，I，F，M和S；D183置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；D184置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；L185置换为A，G和V；S186置换为A，G，V，I，L，F和M；G187置换为A；R188置换为A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；S189置换为A，G，V，I，L，F和M；D197置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；D198置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；R204置换为A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R205置换为A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；C242置换为A，G，V和S；S247置换为A，G，V，I，L，F和M；Y247置换为A，G，V，L，I，F和M；R248置换为A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R250置换为A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R251置换为A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；C262置换为A，G，V和S；D264置换为A，G，V，L，I，F，S和Q；G264置换为A；和T286置换为A，G，V，L，I，F，M和S。
在某些另外的实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，其具有至少一个下列氨基酸置换K1A，K1M，T4I，D6R，S8I，T8V，T9I，S9I，K11A，K11H，T12K，S33I，S33C，S43N，G44L，S45V，S45I，T45V，T45I，G46P，D47M，D47G，N48V，N48F，L49A，F50T，A51V，D53A，D53N，D53G，V54L，V54I，R55A，R55V，R55L，G56P，I57F，I57M，D58A，D58V，D58F，P59A，P59F，E60I，E60T，E60R，E61A，E61V，E61L，G62A，R84A，V88A，D94A，S96I，T104N，A105L，T107P，L108M，S109V，T109V，G110A，D111T，S112V，D141A，G147A，V154A，R179A，T180G，T181I，D183A，D183G，D184A，D184A，D184F，L185V，L185D，S186A，S186F，G187A，G187T，R188A，R188L，S189A，D198A，R204A，R205A，C242S，S247I，Y247A，R248A，R250A，R251A，or D264A，G264A，T286A，和/或T286I。这些表位破坏性置换可以组合形成去免疫化的志贺毒素效应子多肽，其中每个表位区域具有多个置换和/或多个表位区域被破坏，同时仍保留志贺毒素效应子功能。例如，天然定位于K1A，K1M，T4I，D6R，S8I，T8V，T9I，S9I，K11A，K11H，T12K，S33I，S33C，S43N，G44L，S45V，S45I，T45V，T45I，G46P，D47M的置换，D47G，N48V，N48F，L49A，F50T，A51V，D53A，D53N，D53G，V54L，V54I，R55A，R55V，R55L，G56P，I57F，I57M，D58A，D58V，D58F，P59A，P59F，E60I，E60T，E60R，E61A，E61V，E61L，G62A，R84A，V88A，D94A，S96I，T104N，A105L，T107P，L108M，S109V，T109V，G110A，D111T，S112V，D141A，G147A，V154A，R179A，T180G，T181I，D183A，D183G，D184A，D184A，D184F，L185V，L185D，S186A，S186F，G187A，G187T，R188A，R188L，S189A，D198A，R204A，R205A，C242S，S247I，Y247A，R248A，R250A，R251A或D264A，G264A，T286A和/或T286I的置换，在可能的情况下，可以与天然定位残基K1A，K1M，T4I，D6R，S8I，T8V，T9I，S9I，K11A，K11H，T12K，S33I，S33C，S43N，G44L，S45V，S45I，T45V，T45I，G46P，D47M，D47G，N48V，N48F，L49A，F50T，A51V，D53A，D53N，D53G，V54L，V54I，R55A，R55V，R55L，G56P，I57F，I57M，D58A，D58V，D58F，P59A，P59F，E60I，E60T，E60R，E61A，E61V，E61L，G62A，R84A，V88A，D94A，S96I，T104N，A105L，T107P，L108M，S109V，T109V，G110A，D111T，S112V，D141A，G147A，V154A，R179A，T180G，T181I，D183A，D183G，D184A，D184A，D184F，L185V，L185D，S186A，S186F，G187A，G187T，R188A，R188L，S189A，D198A，R204A，R205A，C242S，S247I，Y247A，R248A，R250A，R251A或D264A，G264A，T286A和/或T286I处的置换组合，以产生本发明的去免疫化的志贺毒素效应子多肽。
本文所述的任何去免疫化的志贺毒素效应子多肽亚区和/或表位破坏性突变可单独使用，或与本发明的每个单独的实施方案(包括本发明的方法)组合使用。
2.蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应子多肽
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含(1)具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生区域和(2)位于志贺毒素A1片段区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。提高志贺毒素组分与细胞靶向分子的其他组分(例如靶向细胞的结合区域)之间的连接稳定性，可以通过降低由连接破坏和细胞靶向的丧失(例如，由于蛋白质水解作用)引起的非特异性毒性，来改善它们在施用于生物体后的毒性特征。
志贺毒素家族成员的志贺毒素A亚基在其对志贺毒素功能重要的A1片段区的羧基端包含保守的弗林蛋白酶切割位点。弗林蛋白酶切割位点基序和弗林蛋白酶切割位点可由技术人员使用标准技术和/或通过使用本文的信息来鉴定。
志贺毒素细胞毒性的模型是，在中毒细胞中通过弗林蛋白质对志贺毒素A亚基进行细胞内蛋白质水解加工对于以下是必不可少的：1)从志贺全毒素的其余部分释放A1片段，2)通过在A1片段的羧基末端暴露疏水结构域而使A1片段从内质网中逃逸，和3)A1片段的酶促活化(参见Johannes L，W，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。在中毒细胞的内质网中，从A2片段和志贺全毒素的其余成分中有效释放志贺毒素A1片段，对于到胞质溶胶的有效细胞内发送，最大酶活性，有效核糖体失活和实现最佳细胞毒性(即与野生型志贺毒素相当)是必不可少的(参见例如WO2015/191764和其中的参考文献)。
在志贺毒素中毒期间，A亚基在保守精氨酸残基(例如StxA和SLT-1A变体中第251位的精氨酸残基，和Stx2A和SLT-2A变体中第250位的精氨酸残基)的羧基键处被弗林蛋白酶蛋白质水解切割。志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割发生在内体和/或高尔基体区室中。弗林蛋白酶是一种特殊的丝氨酸内切蛋白酶，其由在所有检查的人组织中的多种细胞类型和大多数动物细胞表达。弗林蛋白酶切割包含可接近基序的多肽，所述基序通常集中在最小的二碱基共有基序R-x-(R/K/x)-R上。志贺毒素家族成员的A亚基包含保守的表面暴露的延伸环结构(例如StxA和SLT-1A中的242-261，以及SLT-2中的241-260)，其具有被弗林蛋白酶切割的保守的S-R/Y-x-x-R基序。位于StxA中的氨基酸残基242-261的表面暴露的延伸环结构是弗林蛋白酶诱导的StxA切割所必需的，包括位于最小的弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R侧翼的特征。
志贺毒素A亚基和志贺毒素效应子多肽中的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点可由技术人员使用标准方法和/或通过使用本文的信息鉴定。弗林蛋白酶切割最小的共有基序R-x-x-R(Schalken J等，J Clin Invest 80：1545-9(1987)；Bresnahan P等，JCell Biol 111：2851-9(1990)；Hatsuzawa K等，J Biol Chem 265：22075-8(1990)；Wise R等，Proc Natl Acad Sci USA 87：9378-82(1990)；Molloy S等，J Biol Chem 267：16396-402(1992))。与此一致，许多弗林蛋白酶抑制剂包含含有基序R-x-x-R的肽。弗林蛋白酶的合成抑制剂的实例是包含肽R-V-K-R的分子(Henrich S等，Nat Struct Biol 10：520-6(2003))。通常，可以预测包含表面可接近的二元氨基酸基序的肽或蛋白质，其具有被两个氨基酸残基隔开的两个带正电荷的氨基酸，对弗林蛋白酶切割敏感，其中在基序中最后一个碱性氨基酸的羧基键处发生切割。
已经鉴定了具有一定程度特异性的由弗林蛋白酶切割的底物中的共有基序。已经描述了弗林蛋白酶切割位点基序，其包含20个连续的氨基酸残基的区域，其使用SchechterI，Berger，A，Biochem Biophys Res Commun32：898-902(1968)中描述的命名法可以标记为P14至P6'(Tian S等，Int J Mol Sci 12：1060-5(2011))。根据这个命名法，弗林蛋白酶切位点位于指定为P1的氨基酸残基的羧基键上，并且沿着从该参考P1残基朝向氨基末端的方向，弗林蛋白酶切割基序的氨基酸残基编号为P2，P3，P4等。从P1参考残基朝向羧基末端延伸的基序的氨基酸残基用撇符号P2'，P3'，P4'等编号。使用该命名法，P6至P2'区域描绘了被弗林蛋白酶的酶结构域结合的弗林蛋白酶切割基序的核心底物。两个侧翼区P14至P7和P3'至P6'通常富含极性氨基酸残基，以增加位于它们之间的核心弗林蛋白酶切割位点的可及性。
一般的弗林蛋白酶切割位点通常由共有基序R-x-x-R描述，其对应于P4-P3-P2-P1；其中“R”代表精氨酸残基(参见上表A)，短划线“-”代表肽键，小写“x”代表任何氨基酸残基。然而，其他残基和位置可能有助于进一步定义弗林蛋白酶切割基序。稍微更精细的弗林蛋白酶切割位点的共有基序通常被报道为共有基序R-x-[K/R]-R(其中正斜杠“/”表示“或”并且在相同位置划分备选氨基酸残基)，这对应于P4-P3-P2-P1，因为观察到弗林蛋白酶对切割含有该基序的底物具有强烈的偏好性。
除了最小的弗林蛋白酶切割位点R-x-x-R之外，已经描述了在某些位置具有某些氨基酸残基偏好性的较大弗林蛋白酶切割基序。通过比较各种已知的弗林蛋白酶底物，已经表征了20个氨基酸残基长的弗林蛋白酶切割位点基序中的氨基酸残基的某些物理化学性质。弗林蛋白酶切割基序的P6至P2'区域描绘了核心弗林蛋白酶切割位点，其与弗林蛋白酶的酶促结构域物理地相互作用。两个侧翼区域P14至P7和P3'至P6'通常是亲水性的，富含极性氨基酸残基，以增加位于它们之间的核心弗林蛋白酶切割位点的表面可及性。
通常，从P5到P1位的弗林蛋白酶切割基序区域倾向于包含具有正电荷和/或高等电点的氨基酸残基。特别地，标记弗林蛋白酶蛋白质水解位置的P1位通常被精氨酸占据，但是在该位置可能出现其他带正电荷的氨基酸残基。P2和P3位倾向于被柔性氨基酸残基占据，特别是P2倾向于被精氨酸、赖氨酸占据，或者有时被非常小且柔性的氨基酸残基如甘氨酸占据。P4位倾向于被弗林蛋白酶底物中带正电的氨基酸残基占据。然而，如果P4位被脂族氨基酸残基占据，那么缺少带正电荷的官能团可以通过位于P5和/或P6位的带正电荷的残基来补偿。P1'和P2'位通常被脂族和/或疏水氨基酸残基占据，其中P1'位最常被丝氨酸占据。
两个亲水的侧翼区域倾向于被极性的、亲水性并且具有较小的氨基酸官能团氨基酸残基占据；然而，在某些经验证的弗林蛋白酶底物中，侧翼区域不含任何亲水性氨基酸残基(参见Tian S，Biochem Insights 2：9-20(2009))。
在天然志贺毒素A亚基中志贺毒素A1片段和A2片段之间的连接处发现的二十个氨基酸残基、弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点在某些志贺毒素中得到充分表征。例如，在StxA(SEQ ID NO:2)和SLT-1A(SEQ ID NO:1)中，该弗林蛋白酶切割基序天然地位于L238至F257，并且在SLT-2A(SEQ ID NO:3)中，弗林蛋白酶切割基序天然地位于V237至Q256。基于本文所述的氨基酸同源性、实验和/或弗林蛋白酶切割测定，技术人员可以鉴定其他天然志贺毒素A亚基或志贺毒素效应子多肽中的弗林蛋白酶切割基序，其中该基序是实际的弗林蛋白酶切割基序，或者预计在真核细胞内弗林蛋白酶切割这些分子后会导致产生A1和A2片段。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含(1)具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生多肽和(2)位于志贺毒素A1片段衍生多肽的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。技术人员可以通过使用本领域已知的技术鉴定志贺毒素A1片段衍生多肽的羧基末端，例如通过使用蛋白质序列比对软件鉴定(i)天然存在的志贺毒素保守的弗林蛋白酶切割基序，(ii)天然存在的志贺毒素保守的表面暴露的延伸环，和/或(iii)主要是疏水性的一段氨基酸残基(即疏水性“补丁”)，其可被ERAD系统识别。
本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽(1)可以在其志贺毒素A1片段区域的羧基末端完全缺乏任何弗林蛋白酶切割基序和/或(2)在其志贺毒素A1片段区域的羧基末端和/或来源于志贺毒素A1片段的羧基末端的区域包含破坏的弗林蛋白酶切割基序。弗林蛋白酶切割基序的破坏包括弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的各种改变，例如翻译后修饰、氨基酸官能团中一个或更多个原子的改变、向氨基酸官能团添加一个或更多个原子、与非蛋白质部分相关联和/或与氨基酸残基、肽、肽的连接，例如产生支链蛋白质结构。
可以使用本文所述的、在WO 2015/191764和WO 2016/196344中描述的和/或技术人员已知的方法，从志贺毒素效应子多肽和/或志贺毒素A亚基多肽(无论是天然存在的还是非天然存在的)产生蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽，其中所得分子仍保留一种或更多种志贺毒素A亚基功能。
就本发明的目的而言，关于弗林蛋白酶切割位点或弗林蛋白酶切割基序，术语“破坏”或“破坏的”是指天然存在的弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序的改变，例如突变，与野生型志贺毒素A亚基或来源于仅包含野生型多肽序列的野生型志贺毒素A亚基的多肽的弗林蛋白酶切割相比，该突变导致志贺毒素A1片段区域或其衍生的可识别区域的羧基末端附近的弗林蛋白酶切割减少。弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的改变包括弗林蛋白酶切割基序中的突变，例如弗林蛋白酶切割基序的缺失、插入、倒位、置换和/或羧基末端截短，以及翻译后修饰，例如，作为糖基化、白蛋白质化等的结果，其涉及将分子与氨基酸残基的官能团缀合或连接。因为弗林蛋白酶切割基序由大约20个氨基酸残基组成，理论上，涉及这20个位置中的任何一个的一个或更多个氨基酸残基的改变、修饰、突变、缺失、插入和/或截短可能导致弗林蛋白酶切割敏感性的降低(Tian S等，Sci Rep 2：261(2012))。弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序的破坏可以或可以不增加对其他蛋白酶(例如哺乳动物的血管系统中常见的胰蛋白酶和细胞外蛋白酶)的切割的抗性。给定破坏对给定蛋白酶的切割敏感性的影响可以由技术人员使用本领域已知的技术测试。
就本发明的目的而言，“破坏的弗林蛋白酶切割基序”是弗林蛋白酶切割基序，其包含对来源于20个氨基酸残基区域的一个或更多个氨基酸残基的改变，该区域代表在志贺毒素A1片段和A2片段区域之间的连接处的天然志贺毒素A亚基中发现的保守的弗林蛋白酶切割基序，并且定位使得志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割导致产生A1和A2片段；其中，与包含与足够大的羧基末端多肽融合以监测弗林蛋白酶切割的野生型志贺毒素A1片段区域的参考分子相比，使用技术人员已知的和/或本文所述的适当测定，破坏的弗林蛋白酶切割基序以实验上可重复的方式表现出减少的弗林蛋白酶切割。
可以破坏弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序的突变类型的实例是氨基酸残基缺失、插入、截短、倒位和/或置换(包括用非标准氨基酸和/或非天然氨基酸的置换)。此外，弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序可以通过包含通过添加共价连接结构的氨基酸修饰的突变来破坏，所述共价连接结构掩蔽位点或基序中的至少一个氨基酸，例如，作为PEG化，小分子佐剂的偶联和/或位点特异性的白蛋白质化的结果。
如果弗林蛋白酶切割基序已被突变和/或非天然氨基酸残基的存在破坏，则某些破坏的弗林蛋白酶切割基序可能不易被识别为与任何弗林蛋白酶切割基序相关；然而，志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端将是可识别的，并且将定义弗林蛋白酶切割基序在未被破坏的情况下将位于何处。例如，与志贺毒素A亚基和/或志贺毒素A1片段相比，由于羧基末端截短，破坏的弗林蛋白酶切割基序可包含弗林蛋白酶切割基序的少于二十个的氨基酸残基。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含(1)具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生多肽和(2)在志贺毒素A1片段多肽区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中，与参考分子相比(例如包含A1片段的羧基末端和/或A1和A2片段之间的保守的弗林蛋白酶切割基序的野生型志贺毒素多肽)，志贺毒素效应子多肽(和包含它的任何细胞靶向分子)更具弗林蛋白酶切割抗性。例如，与参考分子相比，一个分子的弗林蛋白酶切割的减少可以使用以下实施例中描述的体外弗林蛋白酶切割测定来确定，使用相同的条件进行，然后定量由切割产生的任何片段的带密度，以定量地测量弗林蛋白酶切割的变化。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，志贺毒素效应子多肽在体外和/或体内对弗林蛋白酶切割更具抗性。
通常，本发明的细胞靶向分子的蛋白酶切割敏感性通过将其与利用包含志贺毒素A1片段的野生型志贺毒素效应子多肽替换其弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽的相同分子进行比较来测试。在某些实施方案中，与包含在其羧基末端与肽或多肽融合的野生型志贺毒素A1片段的参考分子(例如在下面的实施例中描述的参考分子SLT-1A-WT::scFv1::C2(SEQ ID NO:278))相比，包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的本发明分子表现出的体外弗林蛋白酶切割减少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％或更高。
已经描述了几种弗林蛋白酶切割基序破坏。例如，在最小R-x-x-R基序中，两个保守精氨酸突变为丙氨酸完全阻断了弗林蛋白酶和/或弗林蛋白酶样蛋白酶的处理(参见例如Duda A等，J Virology 78：13865-70(2004))。因为弗林蛋白酶切割位点基序由约20个氨基酸残基组成，理论上，涉及这20个氨基酸残基位置中的任何一个的一个或更多个的某些突变可能会消除弗林蛋白酶切割或降低弗林蛋白酶切割效率(参见例如Tian S等，Sci Rep2：261(2012))。
在某些实施方案中，本发明的分子包含来源于志贺毒素家族成员的至少一个A亚基的志贺毒素效应子多肽，其中志贺毒素效应子多肽包含来自志贺毒素A亚基的保守的、高度可及的、蛋白酶切割敏感环的一个或更多个氨基酸的破坏。例如，在StxA和SLT-1A中，这种高度可及的蛋白酶敏感环天然定位于氨基酸残基242至261之间，而在SLT-2A中，该保守环天然定位于氨基酸残基241至260之间。基于多肽序列同源性，技术人员可以在其他志贺毒素A亚基中鉴定这种保守的、高度可及的环结构。该环中氨基酸残基的某些突变可以降低环内某些氨基酸残基对蛋白质水解切割的可及性，这可能降低弗林蛋白酶切割敏感性。
在某些实施方案中，本发明的分子包含含有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在志贺毒素A亚基中保守的表面暴露的蛋白酶敏感环中的突变。在某些另外的实施方案中，本发明的分子包含含有破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含志贺毒素A亚基的该蛋白酶敏感环中的突变，该突变降低该环内某些氨基酸残基的表面可及性，使得弗林蛋白酶切割敏感性降低。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽的破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在共有氨基酸残基P1和P4(例如，最小弗林蛋白酶切割基序R/Y-x-x-R的1和4位的氨基酸残基)中的一个或两个的存在、位置或官能团方面的破坏。例如，将最小弗林蛋白酶共有位点R-x-x-R中的两个精氨酸残基中的一个或两个突变为丙氨酸将破坏弗林蛋白酶切割基序并防止该位点处的弗林蛋白酶切割。类似地，将最小弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R中的一个或两个精氨酸残基氨基酸残基置换为技术人员已知的任何非保守氨基酸残基将降低基序的弗林蛋白酶切割敏感性。特别地，将精氨酸氨基酸残基置换为任何缺乏正电荷的非碱性氨基酸残基，例如A、G、P、S、T、D、E、Q、N、C、I、L、M、V、F、W和Y，将导致弗林蛋白酶切割基序的破坏。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽的破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在共有氨基酸残基P4和P1之间的间隔中的破坏，其中介入的氨基酸残基的数量不是两个，因此，将P4和/或P1改变到不同的位置并消除P4和/或P1的命名。例如，最小弗林蛋白酶切割位点的弗林蛋白酶切割基序或核心弗林蛋白酶切割基序内的缺失将降低弗林蛋白酶切割基序的弗林蛋白酶切割敏感性。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或更多个氨基酸残基置换，例如，对于StxA和SLT-1A衍生的志贺毒素效应子多肽，天然定位的氨基酸残基R248被任意非带正电荷的氨基酸残基置换，和/或R251被任意非带正电荷的氨基酸残基置换；对于SLT-2A衍生的志贺毒素效应子多肽，天然定位的氨基酸残基Y247被任意非带正电荷的氨基酸残基置换，和/或R250被任意非带正电荷的氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含未破坏的最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R，但是包含破坏的侧翼区域，例如天然定位于例如241-247和/或252-259的弗林蛋白酶切割基序侧翼区域中的一个或更多个氨基酸残基的氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含位于弗林蛋白酶切割基序的P1-P6区域中的一个或多更个氨基酸残基的置换；将P1'突变成大的氨基酸，例如R、W、Y、F和H；并将P2'突变为极性和亲水性氨基酸残基；用一个或更多个大的且疏水性氨基酸残基置换位于弗林蛋白酶切割基序的P1'-P6'区域中的一个或更多个氨基酸残基。
在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序的破坏包括弗林蛋白酶切割基序内的至少一个氨基酸残基的缺失、插入、倒位和/或突变。在某些实施方案中，本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽可包含天然位于以下位置的氨基酸序列的破坏：志贺毒素A亚基(SEQ ID NO:1-2和4-6)的248-251、志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3和7-18)的247-250，或保守的志贺毒素效应子多肽和/或非天然志贺毒素效应子多肽序列的等同位置。在某些另外的实施方案中，蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽包含破坏，该破坏包含弗林蛋白酶切割基序内的至少一个氨基酸的缺失。在某些另外的实施方案中，蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽包含破坏，该破坏包括在蛋白酶切割基序区域内的至少一个氨基酸的插入。在某些另外的实施方案中，蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽包含破坏，其包含氨基酸的倒位，其中至少一个倒位的氨基酸在蛋白酶基序区内。在某些另外的实施方案中，蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽包含破坏，该破坏包含突变，例如氨基酸置换为非标准氨基酸或具有化学修饰的侧链的氨基酸。在下面的实施例中提供了单个氨基酸置换的实施例。
在本发明分子的某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含弗林蛋白酶切割基序内的九个、十个、十一个或更多个羧基末端氨基酸残基的缺失。在这些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序将不包含弗林蛋白酶切割位点或最小弗林蛋白酶切割基序。换句话说，某些实施方案在A1片段区域的羧基末端缺少弗林蛋白酶切割位点。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或更多个氨基酸残基缺失和置换，例如对于StxA和SLT-1A衍生的志贺毒素效应子多肽，天然定位的氨基酸残基R248被任意非带正电荷的氨基酸残基置换和/或R251被任意非带正电荷的氨基酸残基置换；对于SLT-2A衍生的志贺毒素效应子多肽，天然定位的氨基酸残基Y247被任意非带正电荷的氨基酸残基置换和/或R250被任何非带正电荷的氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换以及羧基末端截短。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或更多个氨基酸残基缺失和置换，例如对于StxA和SLT-1A衍生的志贺毒素效应子多肽，天然定位的氨基酸残基R248被任意非带正电荷的氨基酸残基置换和/或R251被任意非带正电荷的氨基酸残基置换；对于SLT-2A衍生的志贺毒素效应子多肽，天然定位的氨基酸残基Y247被任意非带正电荷的氨基酸残基置换和/或R250被任何非带正电荷的氨基酸残基置换。
在某些另外的实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的氨基酸置换和羧基末端截短，例如，对于StxA和SLT-1A衍生的志贺毒素效应子多肽，截短结束于天然氨基酸位置249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291或更大，并且包括天然定位的氨基酸残基R248和/或R251，其在适当的位置被任意非带正电荷的氨基酸残基置换；对于SLT-2A衍生的志贺毒素效应子多肽，截短结束于天然氨基酸位置248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291或更大，包括天然定位的氨基酸残基Y247和/或R250，其在适当的位置被任意非带正电荷的氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个氨基酸残基的插入，只要插入的氨基残基不产生新的弗林蛋白酶切位点。在某些实施方案中，一个或更多个氨基酸残基的插入破坏了最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R中的精氨酸残基之间的天然间隔，例如包含在249或250处并因此在R248和R251之间插入一个或更多个氨基酸残基的StxA和SLT-1A衍生多肽；或包含在248或249处因此在Y247和R250之间插入一个或更多个氨基酸残基的SLT-2A衍生多肽。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和羧基末端截短。在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和氨基酸残基置换。在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和氨基酸残基缺失。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、氨基酸残基插入和氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、插入、置换和羧基末端截短。
在某些实施方案中，包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应子多肽通过肽键直接融合至包含氨基酸、肽和/或多肽的分子部分，其中所述融合结构涉及单个连续的多肽。在这些融合实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序之后的氨基酸序列不应在融合连接处产生新的弗林蛋白酶切割位点。
任何上述蛋白酶切割抗性的、志贺毒素效应子多肽破坏的弗林蛋白酶切割基序可以单独使用或与本发明的每个单独的实施方案(包括本发明的方法)组合使用。
3.T细胞超免疫化的志贺毒素A亚基效应子多肽
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含嵌入或插入的表位-肽。在某些另外的实施方案中，表位-肽是异源T细胞表位-肽，例如被认为与志贺毒素A亚单位异源的表位。在某些另外的实施方案中，表位-肽是CD8+ T细胞表位。在某些另外的实施方案中，CD8+ T细胞表位-肽对MHC I类分子具有结合亲和力，其特征在于10-4摩尔或更低的解离常数(KD)，和/或所得的MHC I类表位-肽复合物对T细胞受体(TCR)具有结合亲和力，其特征在于解离常数(KD)为10-4摩尔或更低。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含嵌入或插入的异源T细胞表位，例如人CD8+ T细胞表位。在某些另外的实施方案中，嵌入或插入异源T细胞表位，以破坏天然存在的志贺毒素多肽或衍生本发明的志贺毒素效应子多肽的亲本志贺毒素效应子多肽中可识别的内源表位或表位区域(例如B细胞表位和/或CD4+ T细胞表位)。
对于本发明的某些实施方案，志贺毒素效应子多肽(和包含它的任何细胞靶向分子)是CD8+ T细胞超免疫化的，例如，与野生型志贺毒素多肽相比。本发明的CD8+ T细胞超免疫化的志贺毒素效应子多肽各自包含T细胞表位-肽。使用本文所述的、在WO 2015/113007中描述的和/或技术人员已知的方法，可以由志贺毒素效应子多肽和/或志贺毒素A亚基多肽(无论是否天然存在)产生超免疫化的志贺毒素效应子多肽，其中所得分子仍保留一种或更多种志贺毒素A亚基功能。
就要求保护的发明的目的而言，T细胞表位是由抗原肽包含的分子结构，并且可以由线性氨基酸序列表示。通常，T细胞表位是大小为8至11个氨基酸残基的肽(Townsend A，Bodmer H，Annu Rev Immunol 7：601-24(1989))；然而，某些T细胞表位-肽的长度小于8个或大于11个氨基酸(参见例如Livingstone A，Fathman C，Annu Rev Immunol 5：477-501(1987)；Green K等，Eur J Immunol 34：2510-9(2004))。在某些实施方案中，嵌入或插入的表位的长度为至少7个氨基酸残基。在某些实施方案中，嵌入或插入的表位被TCR结合，如使用Stone J等，Immunology 126：165-76(2009)中的公式计算的，其结合亲和力的特征在于KD小于10mM(例如1-100μM)。然而，应当注意，MHC表位和TCR之间给定范围内的结合亲和力可能与抗原性和/或免疫原性不相关(参见例如Al-Ramadi B等，J Immunol 155：662-73(1995))，例如由于MHC-肽-TCR复合物稳定性、MHC-肽密度和TCR辅助因子如CD8的MHC非依赖性功能等因素(Valitutti S等，J Exp Med 183：1917-21(1996))；Baker B等，Immunity13：475-84(2000)；Hornell T等，J Immunol 170：4506-14(2003)；Faroudi M等，Proc NatlAcad Sci USA 100：14145-50(2003)；Woolridge L等，J Immunol 171：6650-60(2003)；Purbhoo M等，Nat Immunol 5：524-30(2004))。
异源T细胞表位是在以下各项中尚未存在的表位：野生型志贺毒素A亚基；天然存在的志贺毒素A亚基；和/或用作源多肽的亲本志贺毒素效应子多肽，其通过本文所述的、在WO 2015/113007和/或WO 2016/196344中描述的和/或技术人员已知的方法进行修饰。
可以通过技术人员已知的许多方法将异源T细胞表位-肽掺入源多肽中，包括例如在源多肽内产生一个或更多个氨基酸置换、将一个或更多个氨基酸融合到源多肽、将一个或更多个氨基酸插入源多肽、将肽与源多肽连接的方法，和/或前述方法的组合。这种方法的结果是产生源多肽的修饰变体，其包含一个或更多个嵌入或插入的异源T细胞表位肽。
可以从许多源分子中选择或衍生T细胞表位以用于本发明。可以从各种天然存在的蛋白质产生或衍生T细胞表位。T细胞表位可以由对于哺乳动物来说是外来的的各种天然存在的蛋白质产生或衍生，例如微生物蛋白质。T细胞表位可以由突变的人蛋白质和/或恶性人细胞异常表达的人蛋白质产生或衍生。T细胞表位可以合成产生或衍生自合成分子(参见例如Carbone F等，J Exp Med 167：1767-9(1988)；Del Val M等，J Virol 65：3641-6(1991)；Appella E等，Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1：177-84(1995)；Perez S等，Cancer 116：2071-80(2010))。
尽管预期任何T细胞表位-肽用作本发明的异源T细胞表位，但可基于所需特性选择某些表位。本发明的一个目的是产生施用于脊椎动物的CD8+ T细胞超免疫化的志贺毒素效应子多肽，这意味着异源T细胞表位具有高度免疫原性，并且当与细胞表面的MHC I类分子复合展示时，可在体内引发强烈的免疫应答。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽包含一个或更多个嵌入或插入的异源T细胞表位，其是CD8+ T细胞表位。包含异源CD8+ T细胞表位的本发明的志贺毒素效应子多肽被认为是CD8+ T细胞超免疫化的志贺毒素效应子多肽。
可以从已知能够引发脊椎动物免疫应答的许多来源分子中选择或衍生本发明的T细胞表位组分。T细胞表位可以来源于脊椎动物外来的各种天然存在的蛋白质，例如病原微生物的蛋白质和非自身的癌症抗原。特别是，感染性微生物可含有许多具有已知抗原性和/或免疫原性的蛋白质。此外，感染性微生物可含有许多具有已知抗原性和/或免疫原性亚区或表位的蛋白质。
例如，具有哺乳动物宿主的细胞内病原体的蛋白质是T细胞表位的来源。存在许多细胞内病原体，例如病毒、细菌、真菌和单细胞真核生物，其具有充分研究的抗原蛋白质或肽。T细胞表位可以从人病毒或其他细胞内病原体中选择或鉴定，例如，如分枝杆菌之类的细菌、如弓形虫之类的真菌以及如锥虫之类的原生生物。
例如，存在许多来自对人具有感染性的病毒的病毒蛋白质的免疫原性病毒肽组分。已经将许多人T细胞表位定位于来自甲型流感病毒的蛋白质内的肽，例如在蛋白质HA糖蛋白质FE17，S139/1，CH65，C05、血凝素1(HA1)、血凝素2(HA2)、非结构蛋白质1和2(NS1和NS2)、基质蛋白质1和2(M1和M2)、核蛋白质(NP)、神经氨酸酶(NA)中的肽，这些肽有许多已被证明可引发人体免疫应答，例如通过使用离体试验。类似地，已经将许多人T细胞表位定位于来自人巨细胞病毒(HCMV)的蛋白质的肽组分，例如蛋白质pp65(UL83)、UL128-131、立即早期(immediate-early)1(IE-1；UL123)、糖蛋白质B、外皮蛋白质中的肽，这些肽有许多已被证明可引发人免疫应答，例如通过使用离体试验。
另一个例子是人体中存在许多免疫原性癌症抗原。技术人员可以使用本领域已知的技术鉴定癌症和/或肿瘤细胞抗原的CD8+ T细胞表位，例如差异基因组学，差异蛋白质组学，免疫蛋白质组学，预测然后验证和如反向遗传转染之类的遗传方法(参见例如Admon A等，Mol Cell Proteomics 2：388-98(2003)；Purcell A，Gorman J，Mol Cell Proteomics3：193-208(2004)；Comber J，Philip R，Ther Adv Vaccines 2：77-89(2014))。已经鉴定或预测了在人癌和/或肿瘤细胞中存在许多抗原性和/或免疫原性T细胞表位。例如，已经在通常在肿瘤细胞中突变或过表达的人蛋白质中预测了T细胞表位，例如ALK、CEA、N-乙酰葡糖胺基转移酶V(GnT-V)、HCA587、HER-2/neu、MAGE、Melan-A/MART-1、MUC-1、p53和TRAG-3(参见例如，van der Bruggen P等，Science 254：1643-7(1991)；Kawakami Y等，J Exp Med180：347-52(1994)；Fisk B等，J Exp Med 181：2109-17(1995)；Guilloux Y等，J Exp Med183：1173(1996)；Skipper J等，J Exp Med 183：527(1996)；Brossart P等，93：4309-17(1999)；Kawashima I等，Cancer Res 59：431-5(1999)；Papadopoulos K等，Clin CancerRes 5：2089-93(1999)；Zhu B等，Clin Cancer Res 9：1850-7(2003)；Li B等，Clin ExpImmunol 140：310-9(2005)；Ait-Tahar K等，Int J Cancer 118：688-95(2006)；Akiyama Y等，Cancer Immunol Immunother 61：2311-9(2012))。此外，已经产生了来自人癌细胞的T细胞表位的合成变体(参见例如，Lazoura E，Apostolopoulos V，Curr Med Chem 12：629-39(2005)；Douat-Casassus C等，J Med Chem 50：1598-609(2007))。
虽然任何T细胞表位可用于本发明的多肽和分子中，但某些T细胞表位可基于其已知和/或根据经验确定的特征而是优选的。例如，在许多物种中，其基因组中的MHC等位基因编码多种MHC-I分子变体。因为MHC I类蛋白质多态性可以影响CD8+ T细胞的抗原-MHC I类复合物识别，所以可以基于关于某些MHC I类多态性的知识和/或某些抗原-MHC I类复合物被具有不同基因型的T细胞识别的能力选择T细胞表位用于本发明。
存在已知是免疫原性的、MHC I类限制性和/或与特定人白细胞抗原(HLA)变体匹配的明确定义的肽-表位。对于在人或涉及人靶细胞中的应用，技术人员可以使用本领域已知的标准技术选择或鉴定HLA-I类限制性表位。肽结合人MHC I类分子的能力可用于预测推定的T细胞表位的免疫原性潜力。可以使用软件工具对肽结合人MHC I类分子的能力进行评分。基于在某些人群中更普遍的等位基因编码的HLA变体的肽选择性，可以选择T细胞表位用作本发明的异源T细胞表位组分。例如，由于个体之间的HLA基因的不同等位基因，人群对于MHC I类分子的α链是多态性的。在某些实施方案中，特定HLA分子可以更有效地呈递T细胞表位，例如由HLA-A等位基因群HLA-A2和HLA-A3编码的常见HLA变体。
当选择T细胞表位用作本发明的异源T细胞表位组分时，可以考虑多种因素，这些因素可以影响表位的产生和向接受性MHC I类分子的转运，例如，靶细胞中以下因子的存在和表位特异性：蛋白酶体、ERAAP/ERAP1、tapasin和TAP。
当选择用作本发明的异源T细胞表位组分的T细胞表位时，可以选择与待靶向的细胞类型或细胞群体中存在的MHC I类分子最匹配的表位。不同的MHC I类分子表现出对特定肽序列的优先结合，并且特定肽-MHC I类变体复合物被效应T细胞的T细胞受体(TCR)特异性识别。技术人员可以使用关于MHC I类分子特异性和TCR特异性的知识来优化本发明中使用的异源T细胞表位的选择。
此外，用于MHC I类呈递的多个免疫原性T细胞表位可以嵌入本发明的相同志贺毒素效应子多肽中，例如用于同时靶向递送多个T细胞表位。包含多个CD8+ T细胞表位的本发明细胞靶向分子的实例是SEQ ID NO:253。
4.志贺毒素效应子多肽中的位点特异性缀合位点
在本发明分子的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含独特的氨基酸残基，例如半胱氨酸、赖氨酸、硒代半胱氨酸或吡咯啉-羧基-赖氨酸残基，其可任选地直接或间接地与用于靶向递送的试剂或货物连接，包括例如细胞靶向分子改变剂，其在施用于哺乳动物时赋予包含志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子所需的性质(参见例如WO 2018/106895)。包含此类志贺毒素效应子多肽的分子可以配备有位点特异性位置，例如分子中独特的氨基酸残基，用于连接其他分子同时保留志贺毒素功能，例如刺激细胞内化、指导有效的细胞内发送和/或有效的细胞毒性。在某些另外的实施方案中，志贺毒素效应子多肽通过独特的氨基酸残基直接或间接地与另一部分，试剂和/或货物缀合，例如通过独特氨基酸的官能团(参见例如WO2018/106895)。
B.用于递送的异源CD8+ T细胞表位-肽货物
本发明的细胞靶向分子各自包含一个或更多个CD8+ T细胞表位-肽，其与它们各自的志贺毒素效应子多肽和结合区域是异源的，并且未嵌入或插入在志贺毒素效应子多肽组分中。
就要求保护的发明的目的而言，CD8+ T细胞表位(也称为MHC I类表位或MHC I类肽)是由抗原肽所包含的分子结构，并且可以由线性氨基酸序列表示。通常，CD8+ T细胞表位是大小为8至11个氨基酸残基的肽(Townsend A，Bodmer H，Annu Rev Immunol 7：601-24(1989))；然而，某些CD8+ T细胞表位的长度小于8或大于11个氨基酸长(参见例如Livingstone A，Fathman C，Annu Rev Immunol 5：477-501(1987)；Green K等，Eur JImmunol 34：2510-9(2004))。
CD8+ T细胞表位是可由至少一个个体的免疫系统识别的分子结构，即抗原肽。本发明的细胞靶向分子的异源CD8+ T细胞表位-肽货物几乎可以选自任何CD8+ T细胞表位。在某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽货物对MHC I类分子具有结合亲和力，其特征在于解离常数(KD)为10-4摩尔或更低，和/或所得的MHC I类表位-肽复合物对T细胞受体(TCR)具有结合亲和力，其特征在于解离常数(KD)为10-4摩尔或更低。
如上所述，T细胞表位可以通过结合亲和力进行经验表征。可以使用技术人员已知的测定法鉴定并进一步分析T细胞表位的关键结构元件，例如丙氨酸扫描诱变和结合亲和力实验的组合，其也可以考虑晶体学或其他经验结构数据。在一些情况下，可以估计或计算表位-肽中的一些或所有氨基酸残基对表位-MHC复合物和/或表位-MHC-TCR复合物的能量贡献。某些残基/位置可以被认为或归类为对结合亲和力是决定性的或中性的。此外，决定性的残基/位置/结构可进一步分类为接触决定、特异性决定和/或亲和力决定(参见例如Langman R，Mol Immunol 37：555-61(2000)；Greenspan N，Adv Cancer Res 80：147-87(2001)；Cohn M，Mol Immunol 42：651-5(2005))。某些CD8+ T细胞表位可以由共有氨基酸序列表示，其允许氨基酸同一性和/或定位的一些变化。
在本发明的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽的长度为至少7个氨基酸残基。在本发明的某些实施方案中，CD8+ T细胞表位-肽被TCR结合，其结合亲和力的特征在于KD小于10毫摩尔(mM)(例如1-100μM)，如使用Stone J等，Immunology 126：165-76(2009)中的公式所计算的。然而，应当注意，例如由于诸如MHC I-肽-TCR复合物稳定性、MHC I-肽密度和TCR辅助因子如CD8的MHC非依赖性功能之类的因素(Baker B等，Immunity 13：475-84(2000))；Hornell T等，J Immunol 170：4506-14(2003)；Woolridge L等，J Immunol 171：6650-60(2003))，MHC表位和TCR之间给定范围内的结合亲和力可能与抗原性和/或免疫原性不相关(参见例如Al-Ramadi B等，J Immunol 155：662-73(1995))。
可以从许多源分子中选择或衍生T细胞表位以用于本发明。可以从各种天然存在的蛋白质产生或衍生T细胞表位。T细胞表位可以由哺乳动物外来的各种天然存在的蛋白质产生或衍生，例如微生物蛋白质。T细胞表位可以由突变人蛋白质和/或恶性人细胞异常表达的人蛋白质产生或衍生。T细胞表位可以合成产生或来源于合成分子(参见例如CarboneF等，J Exp Med 167：1767-9(1988)；Del Val M等，J Virol 65：3641-6(1991)；Appella E等，Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1：177-84(1995)；Perez S等，Cancer116：2071-80(2010))。
本发明的细胞靶向分子的CD8+ T细胞表位-肽可以选自各种已知的抗原，例如来自人病原体的充分表征的免疫原性表位，通常是最常见的致病病毒和细菌。
可通过技术人员已知的反向免疫学方法鉴定CD8+ T细胞表位，例如遗传方法、文库筛选和从显示MHC I类分子的细胞洗脱肽并通过质谱法对它们进行测序(参见例如VanDer Bruggen P等，Immunol Rev 188：51-64(2002))。
另外，已经开发了基于肽对于给定的MHC I类等位基因稳定三元MHC-肽复合物的能力的测量的其他MHC I-肽结合测定，作为与已知对照的比较，(例如，来自ProImmune，Inc.，Sarasota，FL，US的MHC I-肽结合测定)。这些方法可以帮助预测推定的CD8+ T细胞表位-肽的有效性，或证实关于已知CD8+ T细胞表位的经验证据。
尽管预期任何CD8+ T细胞表位可用作本发明的异源CD8+ T细胞表位，但可基于所需特性选择某些CD8+ T细胞表位。一个目标是产生CD8+ T细胞超免疫化的细胞靶向分子，这意味着异源CD8+ T细胞表位肽具有高度免疫原性，因为当它与细胞表面上的MHC I类分子复合展示时，它可在体内引发强烈的免疫应答。
CD8+ T细胞表位可以来源于许多已知能够引发脊椎动物免疫应答的源分子。CD8+T细胞表位可以来源于脊椎动物外来的各种天然存在的蛋白质，例如病原微生物的蛋白质和非自身的癌症抗原。特别是，感染性微生物可含有许多具有已知抗原性和/或免疫原性的蛋白质。此外，感染性微生物可含有许多具有已知抗原性和/或免疫原性亚区或表位的蛋白质。CD8+ T细胞表位可以来源于突变的人蛋白和/或由恶性人细胞异常表达的人蛋白，例如癌细胞表达的突变蛋白(参见例如Sjoblom T等，Science 314：268-74(2006)；Wood L等，Science 318：1108-13(2007)；Jones S等，Science321：1801-6(2008)；Parsons D等，Science 321：1807-12(2008)；Wei X等，Nat Genet 43：442-6(2011)；Govindan R等，Cell150：1121-34(2012)；Vogelstein B等，Science 339：1546-58(2013)；Boegel S等，Oncoimmunology3：e954893(2014))。
CD8+ T细胞表位可以选自或来源于已知能够引发哺乳动物免疫应答的许多源分子，包括肽、蛋白质的肽组分和来源于蛋白质的肽。例如，具有哺乳动物宿主的细胞内病原体的蛋白质是CD8+ T细胞表位的来源。存在许多细胞内病原体，例如病毒、细菌、真菌和单细胞真核生物，其具有充分研究的抗原蛋白质或肽。CD8+ T细胞表位可以从人类病毒或其他细胞内病原体中选择或鉴定，例如，如分枝杆菌之类的细菌，如弓形虫之类的真菌和如锥虫之类的原生生物。
例如，存在许多来自感染人的病毒的病毒蛋白质的已知免疫原性病毒肽组分。已经将许多人CD8+ T细胞表位定位于来自甲型流感病毒的蛋白质内的肽，例如蛋白质HA糖蛋白质FE17，S139/1，CH65，C05、血凝素1(HA1)、血凝素2(HA2)、非结构蛋白质1和2(NS1和NS2)、基质蛋白质1和2(M1和M2)、核蛋白质(NP)、神经氨酸酶(NA)中的肽，这些肽有许多已被证明可引发人免疫应答，例如通过使用离体测定(参见例如Assarsson E等，J Virol 82：12241-51(2008)；Alexander J等，Hum Immunol 71：468-74(2010)；Wang M等，PLoS One 5：e10533(2010)；Wu J等，Clin Infect Dis 51：1184-91(2010)；Tan P等，Human Vaccin 7：402-9(2011)；Grant E等，Immunol Cell Biol 91：184-94(2013)；Terajima M等，Virol J10：244(2013))。类似地，许多人CD8+ T细胞表位已被定位于来自人巨细胞病毒(HCMV)的蛋白质的肽组分，例如蛋白质pp65(UL83)、UL128-131、立即早期1(IE-1；UL123)、糖蛋白质B、外皮蛋白质中的肽，这些肽有许多已被证明可引发人免疫应答，例如通过使用离体测定(Schoppel K等，J Infect Dis 175：533-44(1997)；Elkington R等，J Virol 77：5226-40(2003)；Gibson L等，J Immunol 172：2256-64(2004)；Ryckman B等，J Virol 82：60-70(2008)；Sacre K等，J Virol 82：10143-52(2008))。
另一个例子是人体中存在许多免疫原性癌症抗原。技术人员可以使用本领域已知的技术鉴定癌症和/或肿瘤细胞抗原的CD8+ T细胞表位，例如差异基因组学，差异蛋白质组学，免疫蛋白质组学，预测然后验证和如反向遗传转染之类的遗传方法(参见例如Admon A等，Mol Cell Proteomics 2：388-98(2003)；Purcell A，Gorman J，Mol Cell Proteomics3：193-208(2004)；Comber J，Philip R，Ther Adv Vaccines 2：77-89(2014))。已经鉴定或预测了在人癌和/或肿瘤细胞中存在许多抗原性和/或免疫原性T细胞表位。例如，已经在通常在肿瘤细胞中突变或过表达的人蛋白质中预测了T细胞表位，例如ALK、CEA、N-乙酰葡糖胺基转移酶V(GnT-V)、HCA587、HER-2/neu、MAGE、Melan-A/MART-1、MUC-1、p53和TRAG-3(参见例如，van der Bruggen P等，Science 254：1643-7(1991)；Kawakami Y等，J Exp Med180：347-52(1994)；Fisk B等，J Exp Med 181：2109-17(1995)；Guilloux Y等，J Exp Med183：1173(1996)；Skipper J等，J Exp Med 183：527(1996)；Brossart P等，93：4309-17(1999)；Kawashima I等，Cancer Res 59：431-5(1999)；Papadopoulos K等，Clin CancerRes 5：2089-93(1999)；Zhu B等，Clin Cancer Res 9：1850-7(2003)；Li B等，Clin ExpImmunol 140：310-9(2005)；Ait-Tahar K等，Int J Cancer 118：688-95(2006)；Akiyama Y等，Cancer Immunol Immunother 61：2311-9(2012))。此外，已经产生了来自人癌细胞的T细胞表位的合成变体(参见例如，Lazoura E，Apostolopoulos V，Curr Med Chem 12：629-39(2005)；Douat-Casassus C等，J Med Chem 50：1598-609(2007))。
本文使用关于异源CD8+ T细胞表位的术语“货物”表示异源CD8+ T细胞表位未嵌入或插入到志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段衍生区域内，或未嵌入或插入到志贺毒素效应子多肽组分内(参见例如WO2015/113005)。因此，本发明的细胞靶向分子可以包含多个异源CD8+ T细胞表位，但只有一个是货物，因为其他异源CD8+ T细胞表位被嵌入或插入到细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽组分的志贺毒素A1片段区域内。
虽然任何异源CD8+ T细胞表位可用于本发明的组合物和方法，但某些CD8+ T细胞表位可基于其已知的和/或根据经验确定的特征而是优选的。已经描述了和/或可以使用技术人员已知的技术鉴定引发人CD8+ T细胞应答的免疫原性肽表位(参见例如Kalish R，JInvest Dermatol 94：108S-111S(1990)；Altman J等，Science 274：94-6(1996)；Callan M等，J Exp Med 187：1395-402(1998)；Dunbar P等，Curr Biol 8：413-6(1998)；Sourdive D等，J Exp Med 188：71-82(1998)；Collins E等，J Immunol 162：331-7(1999)；Yee C等，JImmunol 162：2227-34(1999)；Burrows S等，J Immunol 165：6229-34(2000)；Cheuk E等，JImmunol 169：5571-80(2002)；Elkington R等，J Virol 77：5226-40(2003)；Oh S等，Cancer Res 64：2610-8(2004)；Hopkins L等，Hum Immunol 66：874-83(2005)；AssarssonE等，J Virol 12241-51(2008)；Semeniuk C等，AIDS 23：771-7(2009)；Wang X等，J VisExp 61：3657(2012)；Song H等，Virology 447：181-6(2013)；Chen L等，J Virol 88：11760-73(2014))。
在许多物种中，MHC基因编码多个MHC-I分子变体。因为MHC I类蛋白质多态性可以影响CD8+ T细胞的抗原-MHC I类复合物识别，所以可以基于关于某些MHC I类多态性的知识和/或某些抗原-MHC I类复合物被不同基因型的T细胞识别的能力来选择异源T细胞表位。
存在已知是免疫原性的、MHC I类限制性和/或与特定人白细胞抗原(HLA)变体匹配的明确定义的肽-表位。对于在人或涉及人靶细胞中的应用，技术人员可以使用本领域已知的标准技术选择或鉴定HLA-I类限制性表位。肽结合人MHC I类分子的能力可用于预测推定的CD8+ T细胞表位的免疫原性潜力。可以使用软件工具对肽结合人MHC I类分子的能力进行评分。基于在某些人群中更普遍的等位基因编码的HLA变体的肽选择性，可以选择CD8+T细胞表位用作本发明的异源CD8+ T细胞表位组分。例如，人群对于MHC I类分子的α链是多态性的，并且可变等位基因由HLA基因编码。某些T细胞表位可以由特定的HLA分子更有效地呈递，例如由HLA-A等位基因群HLA-A2和HLA-A3编码的常见HLA变体。
当选择CD8+ T细胞表位用作本发明的细胞靶向分子的异源CD8+ T细胞表位-肽组分时，这些因素可以选择与待靶向的细胞类型或细胞群体中存在的MHC I类分子最匹配的CD8+表位。不同的MHC I类分子表现出对特定肽序列的优先结合，并且特定肽-MHC I类变体复合物被效应T细胞的TCR特异性识别。技术人员可以使用关于MHC I类分子特异性和TCR特异性的知识来优化本发明中使用的异源T细胞表位的选择。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽包含在异源多肽内，例如抗原或抗原性蛋白质。在某些另外的实施方案中，异源多肽不大于27kDa，28kDa，29kDa或30kDa。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含两个或更多个异源CD8+ T细胞表位-肽。在某些另外的实施方案中，所有异源CD8+ T细胞表位-肽的组合大小不大于27kDa，28kDa，29kDa或30kDa。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与标准蛋白酶体相比，异源CD8+ T细胞表位-肽在具有更多免疫蛋白酶体、中间蛋白酶体和/或胸腺蛋白酶体的细胞中被更好地处理；然而，在其他实施方案中，情况正好相反。
当选择CD8+ T细胞表位-肽用作本发明的细胞靶向分子的异源CD8+ T细胞表位-肽组分时，MHC I类呈递系统中的多个因素可被认为是可影响CD8+ T细胞表位的产生和向接受性MHC I类分子的转运，例如靶细胞中以下因子的表位特异性：蛋白酶体、ERAAP/ERAP1、tapasin和TAP(参见例如Akram A，Inman R，Clin Immunol 143：99-115(2012))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽仅通过中间蛋白酶体以完整形式进行蛋白水解处理(参见例如Guillaume B等，Proc Natl Acad SciUSA 107：18599-604(2010)；Guillaume B等，J Immunol 189：3538-47(2012))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽不被标准蛋白酶体、免疫蛋白酶体、中间蛋白酶体和/或胸腺蛋白酶体破坏，其也可能取决于细胞类型、细胞因子环境、组织位置等(参见例如，Morel S等，Immunity 12：107-17(2000)；Chapiro J等，J Immunol 176：1053-61(2006)；Guillaume B等，Proc Natl Acad Sci USA107：18599-604(2010)；Dalet A等，Eur J Immunol 41：39-46(2011)；Basler M等，JImmunol 189：1868-77(2012)；Guillaume B等，J Immunol 189：3538-47(2012))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽被认为是“弱的”表位，例如，在体内，在给定的受试者或基因型组或上述来源的细胞中引发CD8+CTL应答是“弱的”(参见例如Cao W等，J Immunol 157：505-11(1996))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽是肿瘤细胞表位，例如NY-ESO-1 157-165A(参见例如Jager E等，J Exp Med 187：265-70(1998))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽已被修饰为在其氨基末端具有庞大的或带电的残基，以增加泛素化(参见例如，Grant E等，JImmunol 155：3750-8(1995)；Townsend A等，J Exp Med168：1211-24(1998)；Kwon Y等，Proc Natl Acad Sci USA 95：7898-903(1998))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽已被修饰为在其羧基末端具有疏水性氨基酸残基，以增加蛋白水解切割概率(参见例如，Driscoll J等，Nature 365：262-4(1993)；Gaczynska M等，Nature 365：264-7(1993))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽是Tregitope。Tregitope在功能上被定义为能够诱导免疫抑制结果的表位-肽。天然存在的Tregitope的实例包括人免疫球蛋白G重链恒定区(Fcs)和Fab的亚区(参见例如Sumida T等，Arthritis Rheum 40：2271-3(1997)；Bluestone J，Abbas A，Nat Rev Immunol 3：253-7(2003)；Hahn B等，J Immunol175：7728-37(2005)；Durinovic-BellóI等，Proc Natl AcadSci USA 103：11683-8(2006)；Sharabi A等，Proc Natl Acad Sci USA 103：8810-5(2006)；De Groot A等，Blood 112：3303-11(2008)；Sharabi A等，J Clin Immunol 30：34-4(2010)；Mozes E，Sharabi A，Autoimmun Rev 10：22-6(2010))。
然而，本发明的细胞靶向分子的异源CD8+ T细胞表位-肽的位置通常不受限制。在本发明的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽在与志贺毒素A1片段衍生区域的羧基端的位置与细胞靶向分子连接。
在某些实施方案中，细胞靶向分子包含两个或更多个异源CD8+ T细胞表位-肽。在某些另外的实施方案中，多个异源CD8+ T细胞表位-肽来自不同物种，例如不同的微生物物种。在某些另外的实施方案中，两个或更多个异源CD8+ T细胞表位肽来自细菌和病毒或两个或更多个不同的细菌物种(参见例如Engelhorn M等，Mol Ther 16：773-81(2008))。在某些另外的实施方案中，两个或更多个异源CD8+ T细胞表位肽来自微生物和人癌细胞。
C.细胞靶向结合区域
本发明的细胞靶向分子包含能够特异性结合细胞外靶生物分子的细胞靶向结合区域。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域是细胞靶向组分，例如，能够以高亲和力特异性结合靶生物分子(例如细胞外靶生物分子)的细胞外部分的结构域、分子部分或试剂。存在技术人员已知的或者技术人员可以使用本领域已知的技术发现的许多类型的结合区域。例如，在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，任何表现出本文所述必需的结合特征的细胞靶向组分可用作结合区域。
靶生物分子的细胞外部分是指当分子与细胞物理偶联时(例如，当靶生物分子被细胞表达在细胞表面时)，暴露于细胞外环境的其结构的部分。在这种情况下，暴露于细胞外环境意味着靶生物分子的部分可由例如抗体或小于抗体的至少一个结合部分(例如单结构域抗体结构域、纳米抗体、源自骆驼科动物或软骨鱼类的重链抗体结构域、单链可变片段、或免疫球蛋白的任何数量的工程化备选支架(见下文))来接近。技术人员可以使用本领域熟知的方法根据经验确定与细胞物理偶联的靶生物分子的部分暴露于细胞外环境或其可接近性。
本发明的细胞靶向分子的结合区域可以是例如配体、肽、免疫球蛋白型结合区域、单克隆抗体、工程化抗体衍生物或抗体的工程化替代物。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域是能够以高亲和力特异性结合靶生物分子的细胞外部分的蛋白质部分。本发明的细胞靶向分子的结合区域可包含一个或更多个不同肽或多肽部分，例如随机产生的肽序列、天然存在的配体或其衍生物、免疫球蛋白衍生的结构域，作为免疫球蛋白结构域的替代物的合成的工程化支架等等(参见例如WO2005/092917；WO 2007/033497；Cheung M等，Mol Cancer 9:28(2010)；US2013/196928；WO 2014/164693；WO 2015/113005；WO 2015/113007；WO2015/138452；WO 2015/191764)。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含结合区域，所述结合区域包含一个或更多个能够选择性和特异性结合细胞外靶生物分子的多肽。
本领域已知有许多结合区域，它们可用于通过其结合特征将分子靶向特定的细胞类型，例如某些配体、单克隆抗体、工程化抗体衍生物和抗体的工程化替代物。
根据一个具体的但非限制性的方面，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含天然存在的配体或其衍生物，其保留与细胞外靶生物分子(通常为细胞表面受体)的结合功能。例如，本领域已知的各种细胞因子、生长因子和激素可用于将本发明的细胞靶向分子靶向表达同源细胞因子受体、生长因子受体或激素受体的特定细胞类型的细胞表面。配体的某些非限制性实例包括(替代名称在括号中表示)血管生成素、B细胞活化因子(BAFF，APRIL)、集落刺激因子(CSF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、干扰素、白细胞介素(如IL-2、IL-6和IL-23)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子、转化生长因子(TGF)和肿瘤坏死因子(TNF)。
根据本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案，结合区域包含能够结合细胞外靶生物分子的合成配体(参见例如Liang S等，J Mol Med 84：764-73(2006)；Ahmed S等，Anal Chem 82：7533-41(2010)；Kaur K等，Methods Mol Biol 1248：239-47(2015))。
在某些实施方案中，结合区域包含肽模拟物，例如AA肽、γ-AA肽和/或磺基-γ-AA肽(参见例如Pilsl L，Reiser O，Amino Acids 41：709-18(2011)；Akram O等，Mol CancerRes 12：967-78(2014)；Wu H等，Chemistry21：2501-7(2015)；Teng P等，Chemistry 2016 3月4日))。
根据一个具体的但非限制性的方面，结合区域可包含免疫球蛋白型结合区域。如本文所用的术语“免疫球蛋白型结合区域”是指能够结合一个或更多个靶生物分子(例如抗原或表位)的多肽区域。结合区域可以通过它们结合靶分子的能力在功能上定义。免疫球蛋白型结合区域通常源自抗体或抗体样结构；然而，在该术语的范围内，考虑来自其他来源的替代支架。
免疫球蛋白(Ig)具有称为Ig结构域的结构域。Ig结构域的长度范围为约70-110个氨基酸残基，并具有特征性的Ig折叠，其中通常7至9个反平行β链排列成两个β折叠，形成三明治状结构。Ig折叠通过三明治的内表面上的疏水氨基酸相互作用和链中半胱氨酸残基之间高度保守的二硫键来稳定。Ig结构域可以是可变的(IgV或V-组)、恒定的(IgC或C-组)或中间的(IgI或I-组)。一些Ig结构域可以与互补决定区(CDR)相关，也称为“互补决定区”，其对于抗体与其表位结合的特异性是重要的。Ig-样结构域也存在于非免疫球蛋白中，并且在此基础上被分类为蛋白质Ig超家族的成员。HUGO基因命名委员会(HGNC)提供了含Ig-样结构域家族的成员列表。
免疫球蛋白型结合区域可以是抗体或其抗原结合片段的多肽序列，其中氨基酸序列不同于天然抗体或非免疫球蛋白的Ig样结构域，例如通过分子工程或通过文库筛选进行选择。由于重组DNA技术和体外文库筛选在免疫球蛋白型结合区域的产生中的相关性，可以重新设计抗体以获得所需的特征，例如更小的尺寸、细胞进入或用于体内和/或治疗应用的其他改进。可能的变化很多，并且可以从仅仅一个氨基酸的变化到例如可变区的完全重新设计。通常，将改变可变区，以改善抗原结合特征、改善可变区稳定性或降低免疫原性应答的可能性。
有许多免疫球蛋白型结合区域被认为是本发明的组分。在某些实施方案中，免疫球蛋白型结合区域来源于免疫球蛋白结合区域，例如能够结合细胞外靶生物分子的抗体互补位(antibody paratope)。在某些其他实施方案中，免疫球蛋白型结合区域包含工程化多肽，其不是源自任何免疫球蛋白结构域，但通过提供与细胞外靶生物分子的高亲和力结合而起到类似免疫球蛋白结合区域的功能。该工程化多肽可任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含来自如本文所述的免疫球蛋白的互补决定区或基本上由其组成。
现有技术中还存在许多结合区域，其可用于通过其高亲和力结合特征将多肽靶向特定细胞类型。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域包含选自下组的免疫球蛋白结构域，该组包括自主VH结构域、单结构域抗体结构域(sdAbs)、源自骆驼科动物的重链抗体结构域(VHH片段或VH结构域片段)、源自骆驼科动物VHH片段或VH结构域片段的重链抗体结构域、源自软骨鱼类的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变(scFv)片段、纳米抗体、由重链和CH1结构域组成的Fd片段、抗体可变结构域(Fv)片段、重排列的(permutated)Fv(pFv)、单链Fv-CH3微抗体、二聚体CH2结构域片段(CH2D)、Fc抗原结合结构域(Fcabs)、分离的互补决定区3(CDR3)片段、受约束的框架区3、CDR3、框架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模块免疫药物(SMIP)结构域、scFv-Fc融合体、单臂单链Fab构建体、多聚化scFv片段(双抗体、三抗体、四抗体)、二硫键稳定的抗体可变(Fv)片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的二硫键稳定的抗原结合(Fab)片段、二价纳米抗体、二价微抗体、二价F(ab')2片段(Fab二聚体)、双特异性串联VHH片段、双特异性串联scFv片段、双特异性纳米抗体、双特异性微抗体、单臂单链Fab异二聚体双特异性构建体，以及保留其结合功能的前述结构域的经任何遗传操作的对应物(Brinkmann U等，J Mol Biol 268：107-17(1997)；A，Plückthun A，J Mol Biol 305：989-1010(2001)；Xu L等，Chem Biol9：933-42(2002)；Wikman M等，Protein Eng Des Sel 17：455-62(2004)；Binz H等，NatBiotechnol 23：1257-68(2005)；Hey T等，Trends Biotechnol 23：514-522(2005)；Holliger P，Hudson P，Nat Biotechnol 23：1126-36(2005)；Gill D，Damle N，Curr OpinBiotech 17：653-8(2006)；Koide A，Koide S，Methods Mol Biol 352：95-109(2007)；BylaP等，J Biol Chem 285：12096(2010)；Zoller F等，Molecules 16：2467-85(2011)；Alfarano P等，Protein Sci 21：1298-314(2012)；Madhurantakam C等，Protein Sci 21：1015-28(2012)；Varadamsetty G等，J Mol Biol 424：68-87(2012)；Reichen C等，JStruct Biol185：147-62(2014)；Schanzer J等，J Biol Chem 289：18693-706(2014))。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域选自下组，该组包括自主VH结构域(例如，来自骆驼科动物、鼠科动物或人来源)、单结构域抗体结构域(sdAbs)、源自骆驼科动物的重链抗体结构域(VHH片段或VH结构域片段)、源自骆驼科动物VHH片段或VH结构域片段的重链抗体结构域、源自软骨鱼类的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变(scFv)片段、纳米抗体、包含VH结构域的“骆驼化”支架、由重链和CH1结构域组成的Fd片段、单链Fv-CH3微抗体、二聚体CH2结构域片段(CH2D)、Fc抗原结合结构域(Fcabs)、分离的互补决定区3(CDR3)片段，受约束的框架区3、CDR3、框架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽，小模块化免疫药物(SMIP)结构域、scFv-Fc融合体、多聚化scFv片段(双抗体、三抗体、四抗体)、二硫键稳定的抗体可变(Fv)片段(dsFv)、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的二硫键稳定的抗原结合(Fab)片段、包含二硫键稳定的重链和轻链(sc-dsFvs)单链可变区片段、二价纳米抗体、二价微抗体，二价F(ab')2片段(Fab二聚体)、双特异性串联VHH片段、双特异性串联scFv片段、双特异性纳米抗体、双特异性微抗体以及保留其互补位和结合功能的前述结构域的任何经遗传操作的对应物(参见Ward E等，Nature 341：544-6(1989))；Davies J，Riechmann L，Biotechnology(NY)13：475-9(1995)；Reiter Y等，Mol Biol 290：685-98(1999)；Riechmann L，Muyldermans S，J Immunol Methods 231：25-38(1999)；Tanha J等，J Immunol Methods 263：97-109(2002)；Vranken W等，Biochemistry 41：8570-9(2002)；Dottorini T等，Biochemistry 43：622-8(2004)；Jespers L等，J Mol Biol337：893-903(2004)；Jespers L等，Nat Biotechnol 22：1161-5(2004)；Spinelli S等，FEBS Lett 564：35-40(2004)；To R等，J Biol Chem 280：41395-403(2005)；Tanha J等，Protein Eng Des Sel 19：503-9(2006)；Saerens D等，Curr Opin Pharmacol 8：600-8(2008)；Dimitrov D，MAbs 1：26-8(2009)；Chen I等，Mol Biosyst 6：1307-15(2010)；Huang Y等，J Biol Chem 285：7880-91(2010)；Lee等，Biochem Biophys Res Commun 411：348-53(2011)；Ahmad Z等，Clin Dev Immunol 2012：980250(2012)；Baral T等，PLoS One7：e30149(2012)；Weiner L，Cell 148：1081-4(2012))。
在某些实施方案中，本发明分子的结合区域是多价和双特异性的，但特异性是针对单个靶，即双特异性是由于不同的结合区域结合存在于相同或单个细胞外靶生物分子上的不同细胞外表位(参见例如Schanzer J等，Antimicrob Agents Chemother 55：2369-78(2011))。
通过添加或去除半胱氨酸残基和/或二硫键和/或修饰其他残基，可以修饰免疫球蛋白结构域和/或片段，以用作本发明的细胞靶向分子中的细胞靶向部分(参见例如YoungN等，FEBS Lett 377：135-9(1995)；Wirtz P，Steipe B，Protein Sci 8：2245-50(1999)；Barthelemy P等，J Biol Chem 283：3639-54(2008)；Arabi-Ghahroudi M等，Protein EngDes Sel 22：59-66(2009)；Zhao J等，Int J Mol Sci 12：1-11(2010)；Duan Y等，MolImmunol 51：188-96(2012)；Kim D等，Protein Eng Des Sel 25：581-9(2012)；Gil D，Schrum A，Adv Biosci Biotechnol 4：73-84(2013))。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含免疫球蛋白型结合区域，所述免疫球蛋白型结合区域包含免疫球蛋白结构域和/或具有域内二硫键的Ig-折叠结构，例如天然存在于某些免疫球蛋白的B和Fβ链之间的二硫键，和/或免疫球蛋白的或由其来源的重链和轻链之间的二硫键。然而，在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，即使它们不包含域内二硫键或在一个或更多个免疫球蛋白型结合区域内不包含任何域内二硫键，这些分子也非常稳定(参见例如Proba K等，Biochemistry 37：13120-7(1998)；A，PlückthunA，Biochemistry 37：13120-7(1998)；/>A，Plückthun A，FEBS Lett 427：357-61(1998)；Ramm K等，J Mol Biol 290：535-46(1999)；Tanaka T，Rabbitts T，J Mol Biol376：749-57(2008))。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含源自免疫球蛋白的免疫球蛋白型结合区域，其已经用某些骆驼科VHH“四分体”突变进行工程化改造以改善溶解度，改善稳定性，和/或以其他方式将结合区域“骆驼化”(参见例如Vincke C等，J Biol Chem 284：3273-84(2009)；Perchiacca J等，Proteins 79：2637-47(2011)；Gil D，Schrum A，Adv BiosciBiotechnol 4：73-84(2013))。
技术人员可以使用本领域已知的许多方法来最小化和/或防止包含免疫球蛋白结构域和/或片段的或者包含源自免疫球蛋白的组分的分子的聚集(参见例如Jespers L等，Nat Biotechnol 22：1161-5(2004)；Daugherty A，Mrsny R，Adv Drug Deliv Rev 58：686-706(2006)；Christ D等，Protein Eng Des Sel 20：413-6(2007)；Wang W等，J Pharma Sci96：1-26(2007)；Famm K等，J Mol Biol 376：926-31(2008)；Arabi-Ghahroudi M等，Protein Eng Des Sel 22：59-66(2009)；Wang X等，MAbs 1：254-267(2009)；Dudgeon K等，Proc Natl Acad Sci USA 109：10879-84(2012)；Kim D等，Methods Mol Biol911：355-72(2012)；Perchiacca J等，Protein Eng Des Sel 25：591-601(2012)；Schaefer J，Plückthun A，J Mol Biol 417：309-335(2012)；Buchanan A等，MAbs 5：255-62(2013)；Lee C等，Trends Biotechnol 31：612-20(2013)；Tiller T等，MAbs 5：445-470(2013)；Kim D等，Biochim Bi ophys Acta 1844：1983-2001(2014)；Perchiacca J等，Protein Eng Des Sel27：29-39(2014)；Rouet R等，FEBS Lett 588：269-77(2014)；Swift J等，Protein Eng DesSel 27：405-9(2014)；Enever C等，Protein Eng Des Sel 28：59-68(2015))。
技术人员可以添加或维持分子间二硫键来稳定本发明的细胞靶向分子的某些结合区域(参见例如Glockshuber R等，Biochemistry 29：1362-7(1990)；Stanfield R等，Science 305：1770-3(2004)；Hagihara Y等，J Biol Chem 282：36489-95(2007)；Chan P等，Biochemistry 47：11041-54(2008)；Saerens D等，J Mol Biol 478-88(2008)；HussackG等，PLoS One 6：e28218(2011)；Govaert J等，J Biol Chem 287：1970-9(2012)；Kim D等，Protein Eng Des Sel 25：581-9(2012)；Gil D，Schrum A，Adv Biosci Biotechnol4：73-84(2013)；McConnell A等，Protein Eng Des Sel 25：581-9(2013)；Feige M等，Proc NatlAcad Sci USA 111：8155-60(2014)；Hagihara Y，Saerens D，Biochim Biophys Acta1844：2016-2023(2014)；Kim D等，Mabs 6：219-35(2014))。
例如，在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子被工程化以最小化不需要的分子间相关联、多聚体和/或聚集体的形成，例如通过使用二硫键稳定的scFv、Fv片段或Fab(参见例如Reiter Y等，J Biol Chem 269：18327-31(1994)；Kuan C，Pastan I，Biochemistry 35：2872-7(1996)；Almog O等，Proteins 31：128-38(1998)；Schoonjans R等，J Immunol 165：7050-7(2000)；Olafsen T等，Protein Eng Des Sel 17：21-7(2004)；Gil D，Schrum A，Adv Biosci Biotechnol 4：73-84(2013)；US 20120283418)；碱基环连接(base loop connection)(参见例如Brinkmann U等，J Mol Biol 268：107-17(1997))；和/或其他修饰，例如加入带电荷的残基、聚糖和/或免疫球蛋白结构域截短(参见例如Gong R等，Mol Pharm 10：2642-52(2013)；Lee C等，Trends Biotechnol 31：612-20(2013)；Goldman E等，Protein Expr Purif 95：226-32(2014))。
在本发明的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含免疫球蛋白型结合区域，其是工程化的不聚集的scFv，例如通过使用较短的接头(通常小于12个氨基酸残基)和/或连接scFv的重链和轻链区域的二硫键稳定的接头(参见例如，Brinkmann U等，Proc NatlAcad Sci USA 90：7538-42(1993)；Whitlow M等，Protein Engineering 6：989-95(1993)；Reiter Y等，Biochemistry 33：5451-9(1994)；Gong R等，Molecular Pharmaceutics 10：2642-52(2013))。
存在多个包含源自免疫球蛋白恒定区的多肽的结合区域，其可以用作本发明的细胞靶向分子的结合区域，例如工程化的二聚体Fc结构域、单体Fc(mFc)、scFv-Fc、VHH-Fc、CH2结构域、单体CH3s结构域(mCH3s)、合成重编程的免疫球蛋白结构域、和/或免疫球蛋白结构域与配体的杂合融合体(Hofer T等，Proc Natl Acad Sci USA 105：12451-6(2008)；XiaoJ等，J Am Chem Soc 131：13616-8(2009)；Xiao X等，Biochem Biophys Res Commun387：387-92(2009)；Wozniak-Knopp G等，Protein Eng Des Sel 23289-97(2010)；Gong R等，PLoS ONE 7：e42288(2012)；Wozniak-Knopp G等，PLoS ONE 7：e30083(2012)；Ying T等，JBiol Chem 287：19399-408(2012)；Ying T等，J Biol Chem 288：25154-64(2013)；ChiangM等，J Am Chem Soc 136：3370-3(2014)；Rader C，Trends Biotechnol 32：186-97(2014)；Ying T等，Biochimica Biophys Acta 1844：1977-82(2014))。
根据某些其他实施方案，结合区域包含免疫球蛋白结构域，其不来自传统免疫球蛋白，而是来自作为免疫系统的一部分发挥作用的细胞膜结合受体。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的细胞靶向结合区域包含单链T细胞受体可变片段(scTv)、单链TCR(scTCR)、二硫键稳定的T细胞受体可变片段(dsTv)和/或T细胞受体可变片段二硫键稳定的Fv异二聚体(TCR dsFv异二聚体)或基本上由其组成。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的细胞靶向结合区域是可溶性单链T细胞受体可变片段(可溶性scTv)和/或TCR dsFv异二聚体(参见例如Novotny J等，ProcNatl Acad Sci USA 88：8646-50(1991)；Soo Hoo，W等，Proc Natl Acad Sci USA 89：4759-63(1992)；Shusta E等，J Mol Biol 292：949-56(1999)；Holler P等，Proc NatlAcad Sci USA 97：5387-92(2000)；Boulter J等，Protein Eng 16：707-11(2003)；Li Y等，Nat Biotechnol 23：349-54(2005)；Weber K等，Proc Natl Acad Sci USA 102：19033-8(2005)；Dunn S等，Protein Sci 15：710-21(2006)；Richman S，Kranz D，Biomol Eng24：361-73(2007)；Varela-Rohena A等，Nat Med 14：1390-5(2008)；Sadelain M等，Curr OpinImmunol 21：215-23(2009)；Aggen D等，Protein Eng Des Sel 24：361-72(2011)；WO1999060120；WO2001057211；WO2003020763；US7,329,731)。与大多数免疫球蛋白不同，天然存在的scTv通常以中等亲和力结合表位-肽-MHC蛋白质复合物。虽然scTv单独与这些细胞表面靶标结合(即细胞外靶生物分子与细胞以pMHC的形式物理偶联)，但scTv在与效应分子(如毒素蛋白质)融合后也可保留其对细胞靶向的结合特异性(参见例如Epel M等，Cancer Immunol Immunother 51：563-73(2002))。虽然这种scTv可以被设计为以高亲和力结合、特异性和选择性识别新靶标，但靶标通常是展示在脊椎动物细胞的表面上的MHC蛋白质-非自身表位-肽复合物。然而，在胸腺选择期间已经缺失的天然存在的TCR通常以高亲和力结合自身表位-MHC复合物。此外，scTv可以在其可变结构域中突变以改善所需结合相互作用的亲和力和/或稳定性(参见例如Shusta E等，Nat Biotechnol 18：754-9(2000)；Richman S等，Mol Immunol 46：902-16(2009))。在scTCR中引入增加溶解度的突变和/或在TCR不变区中引入非天然二硫键以制备dsTCR，可以极大地增加scTv的稳定性和折叠特征(参见例如Molloy P等，Curr Opin Pharmacol 5：438-43(2005)；WO2003020763)。此外，它可以通过将scTCR的结构域定向在Vα结构域-接头-Vβ结构域的氨基-羧基取向上来改善scTv的稳定性和制备(Loset G等，Protein Eng Des Sel 20：461-72(2007)；Richman S等，Mol Immunol 46：902-16(2009))。引入各种突变也可以改善在宿主细胞系统中(例如在酵母细胞中)的表达(参见例如Richman S等，Mol Immunol 46：902-16(2009))。根据某些其他实施方案，结合区域包含针对免疫球蛋白结构域的工程化替代支架。工程化替代性支架在本领域是已知的，其表现出与免疫球蛋白衍生结构相似的功能特征，例如靶生物分子的高亲和力和特异性结合，并且可以为某些免疫球蛋白结构域提供改善的特征，例如更高的稳定性或降低的免疫原性。通常，免疫球蛋白的替代支架小于20千道尔顿(kDa)，由单个多肽链组成，缺乏半胱氨酸残基，并且表现出相对高的热力学稳定性。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，免疫球蛋白型结合区域选自下组，该组包括工程化的犰狳重复多肽(ArmRP)；工程化的纤连蛋白来源的第10纤连蛋白III型(10Fn3)结构域(单体，AdNectinsTM或AdNexinsTM)；工程化的肌腱蛋白来源的肌腱蛋白III型结构域(CentrynsTM)；工程化的含有锚蛋白重复基序的多肽(DARPinsTM)；工程化的低密度脂蛋白受体来源的A结构域(LDLR-A)(AvimersTM)；脂质运载蛋白(anticalin)；工程化的蛋白酶抑制剂来源的Kunitz结构域；工程化的、蛋白A来源的Z结构域(AffibodiesTM)；工程化的、γ-B晶状体蛋白来源的支架或工程化的、泛素来源的支架(Affilins)；Sac7d来源的多肽(或affitins)；工程化的、Fyn来源的SH2结构域/>和工程化的抗体模拟物，以及保留其结合功能的前述各项的任何经遗传操作的对应物(/>A，Plückthun A，J Mol Biol 305：989-1010(2001)；Xu L等，Chem Biol 9：933-42(2002)；Wikman M等，Protein Eng Des Sel 17：455-62(2004)；Binz H等，Nat Biotechnol 23：1257-68(2005)；Hey T等，Trends Biotechnol 23：514-522(2005)；Holliger P，Hudson P，Nat Biotechnol 23：1126-36(2005)；Gill D，Damle N，Curr Opin Biotech 17：653-8(2006)；Koide A，Koide S，Methods Mol Biol 352：95-109(2007)；Byla P等，J Biol Chem285：12096(2010)；Zoller F等，Molecules 16：2467-85(2011)；Alfarano P等，ProteinSci 21：1298-314(2012)；Madhurantakam C等，Protein Sci 21：1015-28(2012)；Varadamsetty G等，J Mol Biol 424：68-87(2012))。
例如，存在工程化的Fn3(CD20)结合区域支架，其表现出与CD20表达细胞的高亲和力结合(Natarajan A等，Clin Cancer Res 19：6820-9(2013))。
例如，已经鉴定了许多与细胞外受体HER2结合的替代支架(参见例如Wikman M等，Protein Eng Des Sel 17：455-62(2004)；Orlova A等，Cancer Res 66：4339-8(2006)；Ahlgren S等，Bioconjug Chem 19：235-43(2008)；Feldwisch J等，J Mol Biol 398：232-47(2010)；美国专利5,578,482；5,856,110；5,869,445；5,869,445；5,985,553；6,333,169；6,987,088；7,019,017；7,282,365；7,306,801；7,435,797；7,446,185；7,449,480；7,560,111；7,674,460；7,815,906；7,879,325；7,884,194；7,993,650；8,241,630；8,349,585；8,389,227；8,501,909；8,512,967；8,652,474；和美国专利申请20110059090)。除了替代抗体形式之外，非蛋白质化合物可赋予类抗体结合能力，例如寡聚体、RNA分子、DNA分子、碳水化合物和糖萼杯芳烃(glycocalyxcalixarene)(参见例如Sansone F，Casnati A，Chem SocRev 42：4623-39(2013))或部分蛋白质化合物，例如与肽和杯芳烃-肽组合物偶联的酚-甲醛环状低聚物(参见例如US 5,770,380)。
在某些实施方案中，优选使用蛋白酶抗性免疫球蛋白结构域和/或合成的稳定化的scFv片段，例如以避免在储存期间或施用后但在到达靶细胞之前的不稳定性(参见例如Ewert S等，Methods 34：184-99(2004)；Honegger等，Protein Eng Des Sel 22：135-47(2009)；Miller等，Protein Eng Des Sel 23：549-57(2010)；Hussack G等，Protein EngDes Sel 27：191-8(2014))。
任何上述结合区域结构可以用作本发明的细胞靶向分子的组分，只要结合区域组分对细胞外靶生物分子具有10-5至10-12摩尔/升，优选小于200纳摩尔(nM)的解离常数。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含与能够特异性结合靶生物分子的细胞外部分或细胞外靶生物分子的结合区域连接和/或融合的本发明的志贺毒素效应子多肽。可基于许多标准选择细胞外靶生物分子，例如本文所述的标准。
被结合区域结合的细胞外靶生物分子。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含能够特异性结合靶生物分子的细胞外部分或细胞外靶生物分子的蛋白质区域，其优选物理偶联于目的细胞类型的表面，例如癌细胞、肿瘤细胞、浆细胞、感染细胞或携带细胞内病原体的宿主细胞。优选地，靶细胞类型将表达MHC I类分子。被本发明的细胞靶向分子的结合区域结合的靶生物分子可以包括过量的或专门存在于癌细胞、免疫细胞和/或由细胞内病原体(例如病毒、细菌真菌、朊病毒或原生动物)感染的细胞上的生物标记物。
术语“靶生物分子”是指生物分子，通常是蛋白质分子或通过翻译后修饰(例如糖基化)而修饰的蛋白质，其被本发明的细胞靶向分子的结合区域结合，导致细胞靶向分子靶向多细胞生物体内的特定细胞、细胞类型和/或位置。
就本发明的目的而言，关于靶生物分子的术语“细胞外”是指其结构的至少一部分暴露于细胞外环境的生物分子。技术人员可以使用本领域熟知的方法凭经验确定与细胞偶联的靶生物分子的一部分暴露于细胞外环境或其可接近性。细胞外靶生物分子的非限制性实例包括细胞膜组分、跨膜跨越蛋白、细胞膜锚定的生物分子、细胞表面结合的生物分子和分泌的生物分子。
关于本发明，当用于描述靶生物分子时，短语“物理偶联”是指共价和/或非共价的分子间相互作用将靶生物分子或其一部分偶联到细胞外，例如，靶生物分子和细胞之间的多个非共价相互作用，其中每个单一相互作用的能量在至少约1-5千卡的量级(例如，静电键、氢键、离子键、范德华相互作用、疏水力等)。可以发现所有的整合膜蛋白以及外周膜蛋白与细胞膜物理偶联。例如，细胞外靶生物分子可以包含跨膜跨越区域、脂质锚、糖脂锚，和/或与包含上述任一项的因子非共价关联(例如通过非特异性疏水相互作用和/或脂质结合相互作用)。
靶生物分子的细胞外部分可包括各种表位，包括未修饰的多肽、通过添加生物化学官能团修饰的多肽，和糖脂(参见例如US 5,091,178；EP2431743)。
可以基于许多标准设计或选择本发明的细胞靶向分子的结合区域，例如其靶生物分子的细胞类型特异性表达，其靶生物分子针对特定细胞类型的物理定位，和/或其靶生物分子的特性。例如，本发明的某些细胞靶向分子包含能够结合细胞表面靶生物分子的结合区域，所述细胞表面靶生物分子仅由物种的一种细胞类型或多细胞生物中的仅一种细胞类型表达在细胞表面上。期望但非必要的是，细胞外靶生物分子可本身内化或在与本发明的细胞靶向分子相互作用时易于内化。
技术人员将理解，任何期望的靶生物分子可用于设计或选择与志贺毒素效应子多肽相关联和/或偶联的合适结合区域，以产生本发明的细胞靶向分子。
本发明的细胞靶向分子的一般结构是模块化的，因为各种不同的细胞靶向结合区域可以与各种志贺毒素效应子多肽和CD8+ T细胞表位-肽一起使用，以提供将各种表位以不同形式靶向和递送至不同靶细胞类型的MHC I类系统。任选地，本发明的细胞靶向分子(例如蛋白质)可以进一步包含羧基末端内质保留/回收信号基序，例如，在细胞靶向分子的蛋白质组分的羧基末端的氨基酸KDEL(SEQ ID NO:750)(参见例如PCT/US2015/19684)。
D.连接本发明的细胞靶向分子的组分的键合
本发明的细胞靶向分子的单个细胞靶向结合区域、志贺毒素效应子多肽、CD8+ T细胞表位货物和/或其他组分可以通过本领域熟知的和/或本文描述的一个或更多个接头适当地相互连接。(参见例如WO 2014/164693；WO 2015/113005；WO 2015/113007；WO 2015/138452；WO 2015/191764)。结合区域的单个多肽亚组分，例如，重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、CDR和/或ABR区，可以通过本领域熟知的和/或本文描述的一个或更多个接头适当地相互连接。本发明的蛋白质组分，例如多链结合区域，可以通过本领域熟知的一个或更多个接头适当地彼此连接或与本发明的其它多肽组分连接。本发明的肽组分，例如异源CD8+T细胞表位-肽货物，可以通过一个或更多个接头(例如，本领域熟知的蛋白质接头)与本发明的另一个组分适当地连接。
合适的接头通常是允许本发明的每个多肽组分以三维结构折叠的那些接头，所述三维结构非常类似于单独产生的多肽组分，而没有任何接头或与其相关联的其他组分。合适的接头包括单个氨基酸、肽、多肽和缺少前述任一项的接头，例如各种非蛋白质碳链，无论是支链的还是环状的(参见例如Alley S等，Bioconjug Chem 19：759-65(2008)；DucryL，Stump B，Bioconjug Chem 21：5-13(2010))。
合适的接头可以是蛋白质的，并且包含一个或更多个氨基酸、肽和/或多肽。蛋白质接头适用于重组融合蛋白质和化学连接的缀合物。蛋白质性接头通常具有约2至约50个氨基酸残基，例如约5至约30个或约6至约25个氨基酸残基。所选择的接头的长度取决于多种因素，例如，选择接头的所需性质。在某些实施方案中，接头是蛋白质的并且连接在本发明的蛋白质组分的末端附近，通常在末端的约20个氨基酸内。通常，合适的蛋白质接头包含一段甘氨酸和/或丝氨酸，用于与一个或更多个带电残基组合的柔性，例如用于溶解度的谷氨酸和/或赖氨酸残基(参见例如Whitlow M等，Protein Engineering 6：989-95(1993))。
合适的接头可以是非蛋白质的，例如，化学接头。
用于本发明的细胞靶向分子的组分的键合的合适方法可以通过本领域目前已知的用来实现这些的任何方法，只要该附接基本上不妨碍细胞靶向结合区域的结合能力，和/或在适当时，通过适当的测定法(包括本文所述的测定法)测量所需的志贺毒素效应子功能。例如，二硫键和硫醚键可用于连接本发明的细胞靶向分子的两个或更多个蛋白质组分。
就本发明的细胞靶向分子的目的而言，除非约定，否则组分的特定顺序或取向不固定。除非特别说明，否则志贺毒素效应子多肽、异源CD8+ T细胞表位货物、结合区域和任何任选的接头相对于彼此或相对于整个细胞靶向分子的排列不固定(参见例如图1)。通常，本发明的细胞靶向分子的组分可以以任何顺序排列，条件是不消除结合区域、志贺毒素效应子多肽和异源CD8+ T细胞表位的所需活性。
Ⅱ.本发明的细胞靶向分子的特定结构变化的实例
本发明的细胞靶向分子包含志贺毒素A亚基效应子多肽、细胞靶向结合区域和异源CD8+ T细胞表位肽货物，该货物未嵌入或插入志贺毒素中A1片段区域和/或志贺毒素A亚基效应子多肽中。原则上，通过将任何异源CD8+ T细胞表位-肽与细胞靶向结合区域和志贺毒素A亚单位效应子多肽的任何组合连接，可以产生具有将CD8+ T细胞表位货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径的能力的细胞靶向分子，只要得到的细胞靶向分子具有至少由志贺毒素效应子、细胞靶向部分或者它们的结构组合一起提供的细胞内化能力(例如，通过内吞作用)，并且只要志贺毒素效应子多肽组分或细胞靶向分子结构作为整体，一旦在靶细胞内，就提供足够的亚细胞发送到亚细胞区室，用于将T细胞表位-肽递送到靶细胞的MHC I类呈递途径，例如，到胞质溶胶或内质网(ER)。
本发明的细胞靶向分子各自包含至少一个志贺毒素A亚基效应子多肽，该效应子多肽源自志贺毒素家族成员的至少一个A亚基。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽包含截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成。志贺毒素A亚基的截短可能导致整个表位和/或表位区域、B细胞表位、CD4+ T细胞表位和/或弗林蛋白酶切割位点的缺失，而不影响志贺毒素效应子功能，例如催化活性和细胞毒性。已被证明表现出完全酶活性的最小志贺毒素A亚基片段是由Slt1A的残基1-239组成的多肽(LaPointe P等，JBiol Chem 280：23310-18(2005))。已被证明表现出显著酶活性的最小志贺毒素A亚基片段是由StxA的残基75-247组成的多肽(Al-Jaufy A等，Infect Immun 62：956-60(1994))。尽管本发明的志贺毒素效应子多肽通常可以小于全长的志贺毒素A亚基，但是本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽可能需要保留氨基酸77至239位(SLT-1A(SEQ ID NO:1)的多肽区域或StxA(SEQ ID NO:2))或志贺毒素家族成员的其他A亚基中的等同物(例如(SEQID NO:3和7-18)的77至238)。例如，在本发明分子的某些实施方案中，源自志贺毒素的本发明的志贺毒素效应子多肽可包含由选自SEQ ID NO:1-2和4-6中任一个的氨基酸75至251、1至241、1至251和1至261的氨基酸序列表示的多肽，或基本上由其组成。类似地，源自志贺毒素2的志贺毒素效应子多肽可包含由选自SEQ ID NO:3和7-18中任一个的氨基酸75至250、1至241、1至250和1至260的氨基酸序列表示的多肽，或基本上由其组成。
尽管源自野生型志贺毒素A亚基多肽，但对于本发明分子的某些实施方案，志贺毒素效应子多肽与天然存在的志贺毒素A亚基差异多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多个氨基酸残基(但不超过保留至少85％、90％、95％、99％或更高的氨基酸序列同一性的数量)。
本发明进一步提供了本发明的细胞靶向分子的变体，其中，志贺毒素效应子多肽与天然存在的志贺毒素A亚基差异仅有或多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多个氨基酸残基(但不超过保留至少85％、90％、95％、99％或更高的氨基酸序列同一性的数量)。因此，源自志贺毒素家族成员的A亚基的本发明分子可包含来自原始序列的添加、缺失、截短或其他改变，只要与天然存在的志贺毒素A亚基保持至少85％、90％、95％、99％或更高的氨基酸序列同一性，例如，其中在志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端存在破坏的弗林蛋白酶切割基序。
因此，在某些实施方案中，本发明分子的志贺毒素效应子多肽包含相对于天然存在的志贺毒素A亚基(例如，SEQ ID NO:1-18中的任何一个)具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％的总体序列同一性的氨基酸序列，或基本上由其组成，例如，其中在志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端存在破坏的弗林蛋白酶切割基序。
任选地，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽的全长或截短形式，其中与天然存在的志贺毒素A亚基相比，志贺毒素衍生多肽包含一个或更多个突变(例如置换、缺失、插入或倒位)。在本发明的某些实施方案中，优选志贺毒素效应子多肽与野生型志贺毒素A亚基具有足够的序列同一性，以在进入细胞后保持细胞毒性，这可通过众所周知的宿主细胞转化、转染、感染或诱导的方法，或通过与志贺毒素效应子多肽连接的细胞靶向结合区域介导的内化来实现。用于酶活性的志贺毒素A亚基的最关键区域是活性位点，其位于氨基酸残基137/138至209/210附近(取决于变体)，例如SEQ ID NO:1-18中的任一个。志贺毒素A亚基中对于酶活性和/或细胞毒性的最关键残基已经定位于以下残基位置：天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170和精氨酸-176等(Di R等，Toxicon 57：525-39(2011))。在本发明的任何一个实施方案中，志贺毒素效应子多肽可以优选但不一定在以下位置保留一个或更多个保守氨基酸，例如在StxA，SLT-1A中的77、167、170和176位发现的那些，或志贺毒素家族其他成员中的等同保守位置，这些位置通常是强效细胞毒活性所必需的。本发明的细胞毒性细胞靶向分子引起细胞死亡的能力，例如，其细胞毒性，可以使用本领域熟知的许多测定中的任何一种或更多种来测量。
应当注意，与野生型志贺毒素效应子多肽相比，亚细胞发送的志贺毒素效应子功能显著降低的、包含志贺毒素效应子多肽的本发明的细胞靶向分子仍然能够将其异源CD8+T细胞表位-肽货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，例如，以足够量以诱导涉及CD8+免疫细胞的细胞间接合的免疫应答和/或检测特定细胞类型的某些亚细胞区室，因为即使呈递单个pMHC I复合物也足以通过用于细胞溶解的CTL进行呈递细胞的细胞间接合(Sykulev Y等，Immunity 4：565-71(1996))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含(1)具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生多肽和(2)在志贺毒素A1片段衍生多肽的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。技术人员可以通过使用本领域已知的技术鉴定志贺毒素A1片段衍生多肽的羧基末端，例如，通过使用蛋白质序列比对软件鉴定(i)天然存在的志贺毒素保守的弗林蛋白酶切割基序，(ii)天然存在的志贺毒素保守的表面暴露的延伸环，和/或(iii)主要是疏水性的一段氨基酸残基(即疏水性“补丁”)，其可被ERAD系统识别。
本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽(1)可以在其志贺毒素A1片段区域的羧基末端完全缺乏任何弗林蛋白酶切割基序和/或(2)在其志贺毒素A1片段区域的羧基末端和/或源自志贺毒素A1片段的羧基末端的区域包含破坏的弗林蛋白酶切割基序。弗林蛋白酶切割基序的破坏包括弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的各种改变，例如翻译后修饰、氨基酸官能团中一个或更多个原子的改变、向氨基酸官能团添加一个或更多个原子、与非蛋白质部分相关联和/或与氨基酸残基、肽、肽的键合，例如产生支链蛋白质结构。例如，与缺乏连接的表位-肽货物的参考分子相比，异源CD8+ T细胞表位-肽货物与野生型志贺毒素效应多肽的志贺毒素A1片段区域羧基末端的键合可导致志贺毒素效应子多肽的弗林蛋白酶切割降低。
可以使用本文所述的、在WO 2015/191764中描述的和/或技术人员已知的方法，从志贺毒素效应子多肽和/或志贺毒素A亚基多肽(无论是天然存在的还是非天然存在的)产生蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽，其中所得分子仍保留一种或更多种志贺毒素A亚基功能。
就本发明的目的而言，关于弗林蛋白酶切割位点或弗林蛋白酶切割基序，术语“破坏”或“破坏的”是指天然存在的弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序的改变，例如突变，与野生型志贺毒素A亚基或源自仅包含野生型多肽序列的野生型志贺毒素A亚基的多肽的弗林蛋白酶切割相比，该突变导致志贺毒素A1片段区域或其衍生的可识别区域的羧基末端附近的弗林蛋白酶切割减少。弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的改变包括弗林蛋白酶切割基序中的突变，例如弗林蛋白酶切割基序的缺失、插入、倒位、置换和/或羧基末端截短，以及翻译后修饰，例如，作为糖基化、白蛋白质化等的结果，其涉及将分子与氨基酸残基的官能团缀合或连接。因为弗林蛋白酶切割基序由大约20个氨基酸残基组成，理论上，涉及这20个位置中的任何一个的一个或更多个氨基酸残基的改变、修饰、突变、缺失、插入和/或截短可能导致弗林蛋白酶切割敏感性的降低(Tian S等，Sci Rep 2：261(2012))。
就本发明的目的而言，“破坏的弗林蛋白酶切割基序”是弗林蛋白酶切割基序，其包含对源自20个氨基酸残基区域的一个或更多个氨基酸残基的改变，该区域代表在志贺毒素A1片段和A2片段区域之间的连接处的天然志贺毒素A亚基中发现的保守的弗林蛋白酶切割基序，并且定位使得志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割导致产生A1和A2片段；其中，与包含与足够大的羧基末端多肽融合以监测弗林蛋白酶切割的野生型志贺毒素A1片段区域的参考分子相比，使用技术人员已知的和/或本文所述的适当测定，破坏的弗林蛋白酶切割基序以实验上可重复的方式表现出减少的弗林蛋白酶切割。
可以破坏弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序的突变类型的实例是氨基酸残基缺失、插入、截短、倒位和/或置换(包括用非标准氨基酸和/或非天然氨基酸的置换)。此外，弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序可以通过包含通过添加共价连接结构的氨基酸修饰的突变来破坏，所述共价连接结构掩蔽位点或基序中的至少一个氨基酸，例如，作为PEG化，小分子佐剂的偶联和/或位点特异性的白蛋白质化的结果。
如果弗林蛋白酶切割基序已被突变和/或非天然氨基酸残基的存在破坏，则某些破坏的弗林蛋白酶切割基序可能不易被识别为与任何弗林蛋白酶切割基序相关；然而，志贺毒素A1片段衍生区域的羧基末端将是可识别的，并且将定义弗林蛋白酶切割基序在未被破坏的情况下将位于何处。例如，与志贺毒素A亚基和/或志贺毒素A1片段相比，由于羧基末端截短，破坏的弗林蛋白酶切割基序可包含弗林蛋白酶切割基序的少于二十个的氨基酸残基。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含(1)具有羧基末端的志贺毒素A1片段衍生多肽和(2)在志贺毒素A1片段多肽区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中，与参考分子相比(例如，仅包含野生型志贺毒素多肽组分或仅包含在A1和A2片段之间具有保守的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应多肽组分的相关分子)，细胞靶向分子具有更强的弗林蛋白酶切割抗性。例如，与参考分子相比，一个分子的弗林蛋白酶切割的减少可以使用WO 2015/191764中描述的体外弗林蛋白酶切割测定来确定，使用相同的条件进行，然后定量由切割产生的任何片段的带密度，以定量地测量弗林蛋白酶切割的变化。
通常，本发明的细胞靶向分子的蛋白酶切割敏感性通过将其与利用包含志贺毒素A1片段的野生型志贺毒素效应子多肽组分替换其弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽组分的相同分子进行比较来测试。在某些实施方案中，与包含在其羧基末端与肽或多肽融合的野生型志贺毒素A1片段的参考分子相比，包含破坏的弗林蛋白酶切割基序的本发明分子表现出的体外弗林蛋白酶切割减少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％或更高。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含源自志贺毒素A亚基的保守的、高度可及的、蛋白酶切割敏感环的一个或更多个氨基酸的破坏。在某些另外的实施方案中，志贺毒素效应子多肽包含破坏的弗林蛋白酶切割基序，该破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在志贺毒素A亚基中保守的表面暴露的蛋白酶敏感环中的突变。在某些另外的实施方案中，突变降低该环内某些氨基酸残基的表面可及性，使得弗林蛋白酶切割敏感性降低。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽的破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在共有氨基酸残基P1和P4(例如，最小弗林蛋白酶切割基序R/Y-x-x-R的1和4位的氨基酸残基)中的一个或两个的存在、位置或官能团方面的破坏。例如，将最小弗林蛋白酶共有位点R-x-x-R中的两个精氨酸残基中的一个或两个突变为丙氨酸将通过减少或消除该位点的弗林蛋白酶切割而破坏弗林蛋白酶切割基序。例如，将一个或两个精氨酸残基突变为组氨酸将导致弗林蛋白酶切割减少。类似地，将最小弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R中的一个或两个精氨酸残基氨基酸残基置换为技术人员已知的任何非保守氨基酸残基将降低基序的弗林蛋白酶切割敏感性。特别地，将精氨酸氨基酸残基置换为任何缺乏正电荷的非碱性氨基酸残基，例如A、G、P、S、T、D、E、Q、N、C、I、L、M、V、F、W和Y，将导致弗林蛋白酶切割基序的破坏。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应子多肽的破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在共有氨基酸残基P4和P1之间的间隔中的破坏，其中介入的氨基酸残基的数量不是两个，因此，将P4和/或P1改变到不同的位置并消除P4和/或P1的命名。例如，最小弗林蛋白酶切割位点的弗林蛋白酶切割基序或核心弗林蛋白酶切割基序内的缺失将降低弗林蛋白酶切割基序的弗林蛋白酶切割敏感性。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或更多个氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或更多个氨基酸残基置换，例如，对于StxA和SLT-1A衍生的志贺毒素效应子多肽，天然定位的氨基酸残基R248被任意非带正电荷的氨基酸残基置换，和/或R251被任意非带正电荷的氨基酸残基置换；以及对于SLT-2A衍生的志贺毒素效应子多肽，天然定位的氨基酸残基Y247被任意非带正电荷的氨基酸残基置换，和/或R250被任意非带正电荷的氨基酸残基置换。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含未破坏的最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R，但是包含破坏的侧翼区域，例如天然定位于例如241-247和/或252-259的弗林蛋白酶切割基序侧翼区域中的一个或更多个氨基酸残基的氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含位于弗林蛋白酶切割基序的P1-P6区域中的一个或多更个氨基酸残基的置换；将P1'突变成大的氨基酸，例如R、W、Y、F和H；并将P2'突变为极性和亲水性氨基酸残基；并用一个或更多个大的且疏水性氨基酸残基置换位于弗林蛋白酶切割基序的P1'-P6'区域中的一个或更多个氨基酸残基。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，破坏的弗林蛋白酶切割基序包括弗林蛋白酶切割基序内的至少一个氨基酸残基的缺失、插入、倒位和/或置换。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含天然位于以下位置的氨基酸序列的破坏：志贺毒素A亚基(SEQ ID NO:1-2和4-6)的248-251、志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO:3和7-18)的247-250，或保守的志贺毒素效应子多肽和/或非天然志贺毒素效应子多肽序列的等同位置。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含破坏，该破坏包含突变，例如氨基酸置换为非标准氨基酸或具有化学修饰的侧链的氨基酸。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含破坏，该破坏包含弗林蛋白酶切割基序内的至少一个氨基酸的缺失。在某些另外的实施例方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含弗林蛋白酶切割基序内九个、十个、十一个或更多个羧基末端氨基酸残基的缺失。在这些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序将不包含弗林蛋白酶切割位点或最小弗林蛋白酶切割基序。换句话说，某些实施方案在A1片段区域的羧基末端缺少弗林蛋白酶切割位点。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换以及羧基末端截短。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或更多个氨基酸残基缺失和置换。
在本发明的细胞靶向分子的实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的氨基酸置换和羧基末端截短，例如，对于StxA和SLT-1A衍生的志贺毒素效应子多肽，截短结束于天然氨基酸位置249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291或更大，并且包括天然定位的氨基酸残基R248和/或R251，其在适当的位置被任意非带正电荷的氨基酸残基置换；对于SLT-2A衍生的志贺毒素效应子多肽，截短结束于天然氨基酸位置248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291或更大，包括天然定位的氨基酸残基Y247和/或R250，其在适当的位置被任意非带正电荷的氨基酸残基置换。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换。在某些另外的实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R中的一个或更多个氨基酸残基缺失和置换。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、氨基酸残基插入、氨基酸残基置换和/或羧基末端截短。
本发明的细胞靶向分子各自包含一个或更多个异源CD8+ T细胞表位-肽货物，其未嵌入或插入任何志贺毒素效应子多肽组分的志贺毒素A1片段区域中。在某些实施方案中，CD8+ T细胞表位-肽是人的抗原性和/或免疫原性表位。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的CD8+ T细胞表位-肽组分包含8-11个氨基酸长的肽，或基本上由其组成，所述肽源自感染人类的微生物病原体的分子，例如，来自感染人类的病毒的抗原。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子的CD8+ T细胞表位-肽组分包含SEQ ID NO:19-28中所示的任何一个肽，或基本上由其组成。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽货物通过硫醇键(例如二硫键)连接至细胞靶向分子。在某些另外的实施方案中，硫醇键是半胱氨酸与半胱氨酸的二硫键。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，异源CD8+ T细胞表位-肽货物通过涉及细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽组分的半胱氨酸残基官能团的二硫键与细胞靶向分子连接，例如SLT-2A(SEQ ID NO:3)的C241，或StxA(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ IDNO:1)的242。在某些另外的实施方案中，半胱氨酸残基位于志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端(例如，SLT-2A(SEQ ID NO:3)的半胱氨酸残基C260，或StxA(SEQ ID NO:2)或SLT-1A(SEQ ID NO:1)的C261)。
本发明的细胞靶向分子包含至少一个细胞靶向结合区域。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域源自免疫球蛋白型多肽，该多肽经选择用于特异性和高亲和力结合癌或肿瘤细胞的细胞表面上的表面抗原，其中该抗原的表达被限制在癌细胞上(参见Glokler J等，Molecules 15：2478-90(2010)；Liu Y等，Lab Chip 9：1033-6(2009))。根据其他实施方案。选择结合区域，用于以特异性和高亲和力结合癌细胞的细胞表面上的表面抗原，其中，与非癌细胞相比，该抗原由癌细胞过度表达或优先表达。一些代表性的靶生物分子包括但不限于以下列举的与癌和/或特定免疫细胞类型相关联的的靶标。
以高亲和力结合与癌细胞相关联的细胞外表位的许多免疫球蛋白型结合区域是本领域技术人员已知的，例如结合以下任何一个靶生物分子的结合区域：膜联蛋白质AI，B3黑素瘤抗原，B4黑色素瘤抗原，CD2，CD3，CD4，CD19，CD20(B淋巴细胞抗原蛋白CD20)，CD22，CD25(白细胞介素-2受体IL2R)，CD30(TNFRSF8)，CD37，CD38(环状ADP核糖水解酶)，CD40，CD44(透明质烷(hyaluronan)受体)，ITGAV(CD51)，CD56，CD66，CD70，CD71(转铁蛋白质受体)，CD73，CD74(HLA-DR抗原相关恒定链)，CD79，CD98，内皮糖蛋白(END，CD105)，CD106(VCAM-1)，CD138，趋化因子受体4型(CDCR-4，融合蛋白，CD184)，CD200，胰岛素样生长因子1受体(CD221)，粘蛋白1(MUC1，CD227，CA6，CanAg)，基底细胞粘附分子(B-CAM，CD239)，CD248(内皮唾液酸蛋白，TEM1)，肿瘤坏死因子受体10b(TNFRSF10B，CD262)，肿瘤坏死因子受体13B(TNFRSF13B，TACI，CD276)，血管内皮生长因子受体2(KDR，CD309)，上皮细胞粘附分子(EpCAM，CD326)，人表皮生长因子受体2(HER2，Neu，ErbB2，CD340)，癌抗原15-3(CA15-3)，癌抗原19-9(CA 19-9)，癌抗原125(CA125，MUC16)，CA242，癌胚抗原相关细胞粘附分子(例如CEACAM3(CD66d)和CEACAM5)，癌胚抗原蛋白(CEA)，胆碱转运蛋白样蛋白4(SLC44A4)，硫酸软骨素蛋白多糖4(CSP4，MCSP，NG2)，CTLA4，δ样蛋白质(如DLL3，DLL4)，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶蛋白(如ENPP3)，内皮素受体(ETBR)，表皮生长因子受体(EGFR，ErbB1)，叶酸受体(FOLR，例如FRα)，G-28，神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，HLA-Dr10，HLA-DRB，人表皮生长因子受体1(HER1)，HER3/ErbB-3，肝配蛋白B型受体2(EphB2)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，成纤维细胞活化蛋白(FAP/seprase)，鸟苷酸环化酶c(GCC)，胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)，白细胞介素2受体(IL-2R)，白细胞介素6受体(IL-6R)，整合素α-Vβ-3(αVβ3)，整合素α-Vβ-5(αvβ5)，整合素α-5β-1(α5β1)，L6，锌转运蛋白(LIV-1)，MPG，黑色素瘤相关抗原1蛋白(MAGE-1)，黑色素瘤相关抗原3(MAGE-3)，间皮素(MSLN)，金属还原酶STEAP1，MPG，MS4A，NaPi2b，结合素(例如，结合素-4)，p21，p97，脊髓灰质炎病毒受体样4(PVRL4)，蛋白酶激活受体(如PAR1)，前列腺特异性膜抗原蛋白(PSMA)，SLIT和NTRK样蛋白(如SLITRK6)，Thomas-Friedenreich抗原，跨膜糖蛋白(GPNMB)，滋养层糖蛋白(TPGB，5T4，WAIF1)和肿瘤相关钙信号转导物(TACSTD，例如Trop-2，EGP-1等)(参见例如Lui B等，Cancer Res 64：704-10(2004)；Novellino L等，Cancer Immunol Immunother 54：187-207(2005)；Bagley R等，Int J Oncol 34：619-27(2009)；Gerber H等，mAbs 1：247-53(2009)；Beck A等，Nat RevImmunol 10：345-52(2010)；Andersen J等，J Biol Chem 287：22927-37(2012)；Nolan-Stevaux O等，PLoS One 7：e50920(2012)；Rust S等，Mol Cancer 12:11(2013))。该靶生物分子列表旨在是非限制性的。技术人员将理解，与癌细胞或其他所需细胞类型相关联的任何所需靶生物分子可用于设计或选择适合用作本发明的细胞靶向分子的组分的结合区域。
与癌细胞强烈相关联并且被已知免疫球蛋白型结合区域以高亲和力结合的其他靶生物分子的实例包括BAGE蛋白(B黑素瘤抗原)，基底细胞粘附分子(BCAM或Lutheran血型糖蛋白)，膀胱肿瘤抗原(BTA)，SAIL(C16orf54)，癌-睾丸抗原NY-ESO-1，癌-睾丸抗原LAGE蛋白，CD19(B淋巴细胞抗原蛋白CD19)，CD21(补体受体-2或补体3d)受体)，CD26(二肽基肽酶-4，DPP4或腺苷脱氨酶复合蛋白2)，CD33(唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素-3)，CD52(CAMPATH-1抗原)，CD56，CS1(SLAM家族7号或SLAMF7)，细胞表面A33抗原蛋白(gpA33)，EB病毒抗原蛋白，GAGE/PAGE蛋白(黑素瘤相关癌/睾丸抗原)，肝细胞生长因子受体(HGFR或c-Met)，MAGE蛋白，被T细胞1蛋白识别的黑素瘤抗原(MART-1/MelanA，MARTI)，粘蛋白，优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)蛋白，前列腺特异性抗原蛋白(PSA)，前列腺干细胞抗原蛋白(PSCA)，晚期糖基化终产物受体(RAGE)，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，血管内皮生长因子受体(VEGFRs)和Wilms肿瘤抗原。
与癌细胞强烈相关联的其他靶生物分子的实例是碳酸酐酶IX(CA9/CAIX)，密封蛋白蛋白质(CLDN3，CLDN4)，肝配蛋白A型受体3(EphA3)，叶酸结合蛋白(FBP)，神经节苷脂GM2，胰岛素样生长因子受体，整合素(如CD11a-c)，核因子κB受体激活因子(RANK)，受体酪氨酸蛋白激酶erB-3，肿瘤坏死因子受体10A(TRAIL-R1/DR4)，肿瘤坏死因子受体10B(TRAIL-R2)，肌腱蛋白C和CD64(FcγRI)(参见Hough C等，Cancer Res 60：6281-7(2000)；Thepen T等，Nat Biotechnol 18：48-51(2000)；Pastan I等，Nat Rev Cancer 6：559-65(2006)；Pastan，Annu Rev Med 58：221-37(2007)；Fitzgerald D等，Cancer Res 71：6300-9(2011)；Scott A等，Cancer Immun 12：14-22(2012))。该靶生物分子列表旨在是非限制性的。
此外，对于靶生物分子，还有许多其他预期的靶生物分子的实例，例如ADAM金属蛋白酶(例如ADAM-9，ADAM-10，ADAM-12，ADAM-15，ADAM-17)，ADP-核糖基转移酶(ART1，ART4)，抗原F4/80，骨髓基质抗原(BST1，BST2)，断点簇区域-c-abl致癌基因(BCR-ABL)蛋白，C3aR(补体成分3a受体)，CD7，CD13，CD14，CD15(Lewis X或阶段特异性胚胎抗原1)，CD23(FCεRII)，CD45(蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型)，CD49d，CD53，CD54(细胞间粘附分子1)，CD63(四跨膜蛋白)，CD69，CD80，CD86，CD88(补体成分5a受体1)，CD115(集落刺激因子1受体)，IL-1R(白细胞介素-1受体)，CD123(白细胞介素-3受体)，CD129(白细胞介素9受体)，CD183(趋化因子受体CXCR3)，CD191(CCR1)，CD193(CCR3)，CD195(趋化因子受体CCR5)，CD203c，CD225(干扰素诱导的跨膜蛋白1)，CD244(自然杀伤细胞受体2B4)，CD282(Toll样受体2)，CD284(Toll样受体4)，CD294(GPR44)，CD305(白细胞相关免疫球蛋白样受体1)，肝配蛋白A型受体2(EphA2)，FceRIa，半乳凝集素-9，甲胎蛋白抗原17-A1蛋白，人天冬氨酰(天冬酰胺)β-羟化酶(HAAH)，免疫球蛋白样转录物ILT-3，溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1(LPGAT1/IAA0205)，溶酶体相关膜蛋白(LAMP，如CD107)，黑素细胞蛋白PMEL(gp100)，骨髓相关蛋白-14(mrp-14)，NKG2D配体(例如，MICA，MICB，ULBP1，ULBP2，UL-16结合蛋白，H-60s，Rae-1s，及其同源物)，受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3，SART蛋白，清道夫受体(如CD64和CD68)，Siglecs(唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素)，多配体蛋白聚糖(如SDC1或CD138)，酪氨酸酶，酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)，酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)，酪氨酸酶相关抗原(TAA)，APO-3，BCMA，CD2，CD3，CD4，CD8，CD18，CD27，CD28，CD29，CD41，CD49，CD90，CD95(Fas)，CD103，CD104，CD134(OX40)，CD137(4-1BB)，CD152(CTLA-4)，趋化因子受体，补体蛋白，细胞因子受体，组织相容性蛋白，ICOS，干扰素-α，干扰素-β，c-myc，骨保护素，PD-1，RANK，TACI，TNF受体超家族成员(TNF-R1，TNFR-2)，Apo2/TRAIL-R1，TRAIL-R2，TRAIL-R3，和TRAIL-R4(参见Scott A等，CancerImmunity 12：14(2012)；Cheever M等，Clin Cancer Res 15：5323-37(2009))，并注意其中描述的靶生物分子是非限制性实例)。
在某些实施方案中，结合区域包含能够以高亲和力特异性结合免疫系统的细胞类型的细胞表面的免疫球蛋白型结合区域，或基本上由其组成。例如，与免疫细胞表面因子结合的免疫球蛋白型结合结构域是已知的，例如CD1，CD2，CD3，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8，CD9，CD10，CD11，CD12，CD13，CD14，CD15，CD16，CD17，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD31，CD33，CD34，CD35，CD36，CD37，CD38，CD40，CD41，CD56，CD61，CD62，CD66，CD95，CD117，CD123，CD235，CD146，CD326，白细胞介素-1受体(IL-1R)，白细胞介素-2受体(IL-2R)，核因子κB受体激活剂(RANKL)，SLAM相关蛋白(SAP)和TNFSF18(肿瘤坏死因子配体18或GITRL)。
对于设想用于本发明分子的靶生物分子和结合区域的其他实例，参见WO 2005/92917，WO 2007/033497，US2009/156417，JP4339511，EP1727827，DE602004027168，EP1945660，JP4934761，EP2228383，US2013/196928，WO2014/164680，WO2014/164693，WO2015/138435，WO2015/138452，WO2015/113005，WO2015/113007，WO2015/191764，US2015/259428，62/168,758，62/168,759，62/168,760，62/168,761，62/168,762，62/168,763和PCT/US2016/016580。
本发明的细胞靶向分子的某些实施方案是细胞毒性的、细胞靶向的融合蛋白质。某些另外的实施方案是包含SEQ ID NO:19-255和288-748中所示多肽之一或基本上由其组成的细胞靶向分子。某些另外的实施方案是包含SEQ ID NO:252-255和288-748中所示多肽之一或基本上由其组成的细胞靶向分子。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子是融合蛋白，例如，免疫毒素或配体-毒素融合体。本发明的细胞靶向分子的某些实施方案是细胞毒性降低的或非细胞毒性的细胞靶向融合蛋白。某些实施方案是包含SEQ ID NO:252-255和288-748中所示多肽之一或基本上由其组成的细胞靶向分子，其进一步包含志贺毒素效应子多肽组分中的一个或更多个氨基酸置换，该置换改变选自下组的天然定位的残基：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3中的A231E，N75A，Y77S，Y114S，E167D，R170A，R176K和/或W203A，或志贺毒素A亚基中的等同氨基酸残基。某些另外的实施方案是包含SEQ ID NO:258,260,268,270和278中所示多肽之一或基本上由其组成的细胞靶向分子。
为了在施用于脊索动物后改变本发明的细胞靶向分子的半衰期，可以使用技术人员已知的标准技术将聚乙二醇分子、免疫球蛋白Fc区、免疫球蛋白恒定结构域、灭活Fc区、和/或补救受体结合表位掺入分子中(参见例如US 5,739,277；US 7,083,784；US 7,348,004；US2008/422112；WO2010/033279；WO2013/012733；US 9,790,268)。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，两个或更多个结合区域与志贺毒素效应子多肽相关联，以产生本发明的多价细胞靶向分子，其中每个结合区域能够结合相同靶生物分子的细胞外部分。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或22个单独的结合区域。
本发明的多价细胞靶向分子可包含各种多价结构。例如，可以使用共价和/或非共价相互作用将各种组分关联在一起以产生多价结构，从而形成本发明的多价细胞靶向分子。在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子是两个或更多个蛋白质亚基的多聚体复合物，例如，二聚体，三聚体，四聚体，双抗体，三抗体，四抗体等。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含两个或更多个结合区域，因为多价细胞靶向分子的两个或更多个组分化学连接或缀合在一起。例如，化学接头可用于将两个或更多个靶标结合蛋白缀合在一起以形成多价细胞靶向分子(参见例如Wolff E等，Cancer Res 53：2560-5(1993)；Ghetie M等，Proc Natl Acad Sci USA 94：7509-14(1997)；Ghetie M等，Blood97：1392-8(2001))。
本发明的多价细胞靶向分子的某些实施方案包括含有两个或更多个组分分子的多聚体结构，所述组分分子可以是相同的或不同的。如本文所用，命名法(X)n是指包含整数(n)个组分(X)的拷贝或由其组成的分子。例如，包含两个相同的单价靶标结合多肽亚基的二聚体蛋白质可以称为同型二聚体或(靶标结合单体)2。另一个实例是多价蛋白质的混合物，每个蛋白质包含三个或更多个相同的多肽“X”亚基，在本文中称为(X)2+n，其中“n”表示正整数且“2+n”的值表示存在的蛋白质分子的每个蛋白质中结合区域的数量，因此描述了存在于单一蛋白质组合物中的多种不同的多价蛋白质种类。
本发明的多价细胞靶向分子的某些实施方案是多聚体，由两个或更多个靶标结合分子组成，例如同型二聚体、同型三聚体和同型四聚体等。例如，可以组合两个或更多个单价靶标结合多肽，以形成本发明的多价细胞靶向分子。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含两个或更多个组分，每个组分包含多价细胞靶向分子的至少一个结合区域，因为由两个或更多个组分之间的结构域交换产生非共价的分子间关联，这导致产生具有多聚体结构的多价细胞靶向分子(参见例如图1B)。例如，可以工程化和优化免疫球蛋白结构域之间的蛋白质结构域交换作为产生精确多聚体结构的机制(参见例如Holliger P等，Proc Natl Acad Sci USA 90：6444-8(1993)；Arndt K等，Biochemistry 37：12918-26(1998))。
技术人员可以使用各种基于scFv的多肽相互作用来工程化本发明的多聚体多价细胞靶向分子，例如，基于scFv的二聚体、三聚体、四聚体复合物等。例如，scFv中接头的长度可以影响基于非共价的多聚体多价结构的自组装。通常，通过有利于分子间结构域交换胜过链内结构域配对，12个氨基酸或更少的接头(包括不存在任何接头)，会促进包含scFv的多肽或蛋白质多聚化成更高分子量的物质(参见例如Huston J等，Methods Enzymol203：46-88(1991)；Holliger P等，Proc Natl Acad Sci USA 90：6444-8(1993)；Stemmer W等，Biotechniques 14：256-65(1993)；Whitlow M等，Protein Eng 6：989-95(1993)；Desplancq D等，Protein Eng 7：1027-33(1994)；Whitlow M等，Protein Eng 7：1017-26(1994)；Alfthan K等，Protein Eng 8：725-31(1995)；Iliades P等，FEBS Lett 409：437-41(1997)；Kortt A等，Biomol Eng 18：95-108(2001)；Todorovska A等，J ImmunolMethods248：47-66(2001)；Tomlinson I，Holliger P等，Methods Enzymol 326：461-79(2001)；Dolezal O等，Protein Eng 16:47-56(2003))。然而，完全没有接头的的scFv或具有15个氨基酸残基的示例性长度的接头可以多聚化(Whitlow M等，Protein Eng 6：989-95(1993)；Desplancq D等，Protein Eng7：1027-33(1994)；Whitlow M等，Protein Eng 7,1017-26(1994)；Alfthan K等，Protein Eng 8：725-31(1995))。技术人员可以使用本领域已知的和/或本文描述的技术鉴定产生的和/或纯化的多聚体结构。
此外，具有额外共价键的工程化结构可用于稳定自组装的多聚体结构(参见例如Glockshuber R等，Biochemistry 29：1362-7(1990))。例如，在特定位置引入半胱氨酸残基可用于产生二硫键稳定的结构，如Cys-双抗体(diabodies)，scFv'多聚体，VHH多聚体，VNAR多聚体和IgNAR多聚体，例如通过添加以下氨基酸残基：GGGGC(SEQ ID NO:799)和SGGGGC(SEQ ID NO:800)(Tai M等，Biochemistry 29：8024-30(1990)；Caron P等，J Exp Med176：1191-5(1992)；Shopes B，J Immunol 148：2918-22(1992)；Adams G等，Cancer Res53：4026-34(1993)；McCartney J等，Protein Eng 18：301-14(1994)；Perisic O等，Structure 2：1217-26(1994)；George A等，Proc Natl Acad Sci USA 92：8358-62(1995)；Tai M等，Cancer Res(Suppl)55：5983-9(1995)；Olafsen T等，Protein Eng Des Sel 17：21-7(2004))。因此，技术人员可以使用二硫键和/或通过在某些位置添加或去除半胱氨酸残基以控制某些二硫键的位置，来产生或稳定本发明的多价细胞靶向分子。
在某些实施方案中，本发明的靶标结合分子的多价结构包含两个或更多个结合相同靶生物分子的细胞外部分的免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子可包含单个连续多肽链或由其组成。例如，单链二价scFv(有时称为串联scFv(taFv))，单链双抗体(scDb)和串联双抗体(tanDb或Tandab)，代表由单个连续多肽产生的多价结合蛋白质(参见例如Mack M等，Proc Natl Acad Sci USA 92：7021-5(1995)；Kipriyanov S等，J Mol Biol 293：41-56(1999)；Cochlovius，B等，Cancer Res 60：4336-41(2000)；T等，Protein Eng 14：815-23(2001)；Jendreyko N等，J Biol Chem278：47812-9(2003)；Kipriyanov S等，J Mol Biol 330：99-111(2003)；Miller K等，JImmunol 170：4854-61(2003)；Meng R等，Clin Cancer Res 10：1274-81(2004)；SchlerethB等，Cancer Res 65：2882-9(2005)；Huang T，Morrison S，J Pharmacol Exp Ther 316：983-91(2006)；Liu X等，Int Immunopharmacol 6：791-9(2006)；Shen J等，J Biol Chem281：10706-14(2006)；Shen J等，J Immunol Methods 318：65-74(2007)；Wu C等，NatBiotech 25：1290-7(2007)；Li B等，Cancer Res 68：2400-8(2008))。/>
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含两个或更多个结合区域之间的接头以及结合区域的组分之间的一个或更多个二硫键(无论是在接头的近端还是远端)，例如两个免疫球蛋白区域之间的二硫键，其需要在这两个免疫球蛋白区域之间的免疫球蛋白结构域交换缔合(参见例如Glockshuber R等，Biochemistry.29：1362-7(1990))。
或者，可以使用彼此自缔合或多聚化的肽和/或多肽结构域将两条或更多条多肽链连接在一起(参见例如US 6,329,507；Wang L等，Protein Eng Des Sel 26：417-23(2013))。例如，添加羧基末端多聚化结构域已用于构建包含免疫球蛋白结构域(例如scFv，自主VH结构域，VHH，VNAR和IgNAR)的多价蛋白质。技术人员已知的自缔合结构域的实例包括免疫球蛋白恒定结构域(例如凸起-进入-孔洞(knobs-into-holes)，静电转向和IgG/IgA链交换)，免疫球蛋白Fab链(例如(Fab-scFv)2和(Fab'scFv)2)，免疫球蛋白Fc结构域(例如(sc双抗体-Fc)2，(scFv-Fc)2和scFv-Fc-scFv)，免疫球蛋白CHX结构域，免疫球蛋白CH1-3区域，免疫球蛋白CH3结构域(例如(sc双抗体-CH3)2，LD微抗体和Flex-微抗体)，免疫球蛋白CH4结构域，CHCL结构域，两亲性螺旋束(例如scFv-HLX)，螺旋-转角-螺旋结构域(例如scFv-dHlx)，包含亮氨酸拉链和软骨寡聚体基质蛋白的卷曲螺旋结构和(如scZIP)，与A激酶锚蛋白(AKAP)锚定结构域(AD)(也被称作“入坞并锁定”或“DNL”)组合的cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)二聚化和入坞结构域(DDD)，链霉抗生物素蛋白，vero毒素B多聚化结构域，来自p53的四聚化区域，和芽孢杆菌RNA酶-芽孢杆菌RNA酶抑制剂相互作用结构域(Pack P,PlückthunA,Biochemistry 31:1579-84(1992)；Holliger P等,Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-8(1993)；Kipriyanov S等,Hum Antibodies Hybridomas 6:93-101(1995)；de Kruif J,Logtenberg T,J Biol Chem 271:7630-4(1996)；Hu S等,Cancer Res 56:3055-61(1996)；Kipriyanov S等,Protein Eng 9:203-11(1996)；Rheinnecker M等,J Immunol 157:2989-97(1996)；Tershkikh A等,Proc Natl Acad Sci USA 94:1663-8(1997)；Müller K等,FEBSLett 422:259-64(1998)；Cloutier S等,Mol Immunol 37:1067-77(2000)；Li S等,CancerImmunol Immunother 49:243-52(2000)；Schmiedl A等,Protein Eng13:725-34(2000)；Schoonjans R等,J Immunol 165:7050-7(2000)；Borsi L等,Int J Cancer 102:75-85(2002)；Deyev S等,Nat Biotechnol 21:1486-92(2003)；Wong W,Scott J,Nat Rev MolCell Biol 5:959-70(2004)；Zhang J等,J Mol Biol 335:49-56(2004)；Baillie G等,FEBS Letters 579:3264-70(2005)；Rossi E等,Proc Natl Acad Sci USA 103:6841-6(2006)；Simmons D等,J Immunol Methods 315:171-84(2006)；Braren I等,BiotechnolAppl Biochem47:205-14(2007)；Chang C等,Clin Cancer Res 13:5586–91s(2007)；Liu M等,Biochem J 406:237-46(2007)；Zhang J等,Protein Expr Purif 65:77-82(2009)；Bell A等,Cancer Lett 289:81-90(2010)；Iqbal U等,Br J Pharmacol160:1016-28(2010)；Asano R等,FEBS J 280:4816-26(2013)；Gil D,Schrum A,Adv BiosciBiotechnol 4:73-84(2013))。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子的结构由抗体或Fab片段工程化改造而成。例如，可以使用技术人员已知的方法工程化改造多价细胞靶向分子(参见例如Shuford W等，Science 252：724-7(1991)；Caron P等，J Exp Med 176：1191-5(1992)；Shopes B，J Immunol 148：2918-22(1992)；Wolff E等，Cancer Res 53：2560-5(1993))。
在本发明的多价细胞靶向分子的某些实施方案中，多价细胞靶向分子的所有细胞靶向结合区域是相同的和/或共享相同的结合特异性。在这些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子是单特异性的-意味着它包含以高亲和力结合相同细胞外靶生物分子、相同靶生物分子中的重叠细胞外表位和/或靶生物分子中相同细胞外表位的结合区域。技术人员可以用可用的方法确定两个结合区域是否与靶生物分子的相同细胞外部分结合，例如，根据经验使用竞争性结合测定或预测性地基于已知表位和/或免疫化肽序列的重叠。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子可包含以高亲和力结合不同表位的结合区域，无论是不重叠还是重叠的。本发明的多价细胞靶向分子可包含以高结合亲和力结合非重叠表位的结合区域。可如下制备本发明的多特异性多价细胞靶向分子：使用两个或更多个不同的结合区域，例如双抗体，三抗体，串联形式的两个不同的scFv，VHH，VNAR和/或IgNAR(包括串联的di-scFv，串联的tri-scFv和scFv-Fc串联体)，单链双抗体(scDb)，串联的Fv，双特异性scFv(Bis-scFv)，scFv2，(Fab')3，四聚体(scFv2)2，scFv2-Fc，以及具有不同特异性的scFv，VHH，VNAR和/或IgNAR的组合(Adams G等，Cancer Res 53：4026-34(1993)；Mallender W等，J Biol Chem 269：199-206(1994)；Todorovska A等，J ImmunolMethods 248：47-66(2001)；Korn T等，J Gene Med 6：642-51(2004)；Lu D等，J BiolChem280：19665-72(2005)；Schneider M等，Eur J Immunol 35：987-95(2005)；Wittel U等，Nucl Med Biol 32：157-64(2005)；Semenyuk E等，Biochimie 89：31-8(2007))。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子可包含单个连续多肽组分，其与其自身或另一个蛋白质多聚化以形成多聚体结构。例如，单链二价scFv，有时称为串联的scFv(taFv)，单链双抗体(scDb)和串联的双抗体(tanDb或Tandab)，可被表达为单个连续多肽链(Mack M等，Proc Natl Acad Sci USA 92：7021-5(1995)；Kipriyanov S等，J MolBiol 293：41-56(1999)；Cochlovius，B等，Cancer Res 60：4336-41(2000)；T等，Protein Eng14：815-23(2001)；Kipriyanov S等，J Mol Biol 330：99-111(2003)；Schlereth B等，Cancer Res 65：2882-9(2005))。可以将这些多价结构工程化改造以多聚化为更高级、更高价的结构，例如，四价F(ab')2，(taFv)2和(scDb)2结构(参见Todorovska A等，J Immunol Methods 248：47-66(2001))。
包含两个scFv(其由于可变区域的分子间配对而通过非共价相互作用连接)的结构是技术人员已知的，例如双抗体，微抗体和二价微抗体，所有这些都可以是单特异性的或双特异性的(Holliger,P等,Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-8(1993)；Pack P等,Biotechnology(NY)11:1217-7(1993)；Tai M等,Cancer Res(Suppl)55:5983-9(1995)；Atwell J等,Mol Immunol 33:1301-12(1996)；Rheinnecker M等,J Immunol 157:2989-97(1996)；Schier R等,J Mol Biol 255:28-43(1996)；Adams G等,Br J Cancer 77:1405-12(1998)；Todorovska A等,J Immunol Methods 248:47-66(2001)；Bühler P等,CancerImmunol Immunother 57:43-52(2008))。已观察到许多scFv单体由于自缔合而天然形成多聚体或寡聚体(例如双抗体，三抗体和四聚体)，其中对于包含3-12个氨基酸残基的接头的scFv结构，大部分形式为二聚体(Essig N等,J Mol Biol 234:897-901(1993)；GriffithsA等,EMBO J 12:725-34(1993)；Holliger P等,Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-8(1993)；Whitlow M等,Protein Eng 6:989-95(1993)；Desplancq D等,Protein Eng 7:1027-33(1994)；Whitlow M等,Protein Eng 7,1017–26(1994)；Kortt A等,Protein Eng10:423-33(1997)；Arndt K等,Biochemistry 37:12918-26(1998)；Atwell J等,ProteinEng 12:597–604(1999))。
通常，具有5-10个或更少的氨基酸残基的相对短的接头的scFv结构具有更大的同型二聚化倾向(Arndt K等,Biochemistry 37:12918-26(1988)；Holliger P等,Proc NatlAcad Sci USA 90:6444-8(1993)；Perisic O等,Structure 2:1217-26(1994)；Atwell J等,Mol Immunol 33:1301-12(1996)；Iliades P等,FEBS Lett 409:437-41(1997)；KorttA等,Protein Eng 10:423-33(1997)；Metzger D等,Protein Eng 10:423-33(1997)；Pei X等,Proc Natl Acad Sci USA 94:9637-42(1997)；Atwell J等,Protein Eng 12:597-604(1999)；Denton G等,Cancer Immunol Immunother 48:29-38(1999)；Le Gall F等,FEBSLett 453:164-8(1999)；Atwell J等,Protein Eng 12:597-604(1999)；Dolezal,O等,Protein Eng 13:565-74(2000)；Nielsen U等,Cancer Res 60:6434-40(2000)；Todorovska A等,J Immunol Methods 248:47–66(2001)；Wu A等,Protein Eng 14:1025-33(2001)；Arndt M等,FEBS Lett 578:257-61(2004)；Le Gall F等,J Immunol Methods285:111-27(2004))。相反，具有包含至少12个氨基酸残基的接头的scFv主要形成单体，仅少数部分自发多聚化(Nielsen U等,Cancer Res 60:6434-40(2000)；Denton G等,CancerImmunol Immunother 48:29-38(1999)；Kortt A等,Biomol Eng 18:95-108(2001)；T等,Protein Eng 14:815-23(2001))。
使用三个或更少氨基酸残基的接头可以促进多聚化成大于二聚体形式的更高级结构。如果scFv具有少于3个残基的接头，则可能有利于三聚化(Iliades P等，FEBS Lett409：437-41(1997)；Kortt A等，Biomol Eng 18：95-108(2001)；Todorovska A等，JImmunol Methods 248：47-66(2001)；Arndt M等，FEBS Lett 578：257-61(2004))。此外，具有非常短接头(例如2个或更少氨基酸残基的接头)的scFv，通常形成三聚体和/或三聚体和四聚体的混合物(Pei X等,Proc Natl Acad Sci USA 94:9637-42(1997)；Hudson P,KorttA,J Immunol Methods 231:177-89(1999)；Dolezal O等,Protein Eng 13:565-74(2000)；Power B等,Protein Sci 12:734-47(2003)；Le Gall F等,J Immunol Methods 285:111-27(2004))。在具有短接头的某些排列中，四聚体可能是有利的(Dolezal O等，Protein Eng13：565-74(2003)；Arndt M等，FEBS Lett 578：257-61(2004))。多聚体结构可以由缺少任何接头(即具有零个氨基酸残基的接头长度)的scFv形成。例如，VL在VH之前的可变结构域的直接连接可能有利于四体的形成(Iliades P等，FEBS Lett 409：437-41(1997))，而VH在VL之前可能有利于三聚体(Kortt A等，Protein Eng10：423-33(1997))。
除了接头长度之外，可变结构域的取向可能影响多聚化特征(Huston J等，ProcNatl Acad Sci USA 85,5879-83(1988)；Padlan E，Mol Immunol 31：169-217(1994)；Kortt A等，Protein Eng 10：423-33(1997)；Dolezal，O等，Protein Eng 13：565-74(2000)；Carmichael J等，J Mol Biol 326：341-51(2003)；Arndt M等，FEBS Lett 578：257-61(2004))。已经提出，VL-VH取向比反向取向表现出形成更高分子量的低聚物的更大倾向，因为VL-VH取向受到更多限制(Kortt A等，Protein Eng 10：423-33(1997)；Dolezal，O等，Protein Eng13：565-74(2000)；Plückthun A，Pack P，Immunotechnology 3：83-105(1997))。
取决于VH和VL取向，相同的接头已显示其对scFv多聚化影响的可变性，例如影响二聚体形式与三聚体形式的相对比例(Le Gall F等，FEBS Lett 453：164-8(1999)；Arndt M等，FEBS Lett 578：257-61(2004)；Le Gall F等，J Immunol Methods 285：111-27(2004))。
使用特定铰链和共价连接的多个VHH链(串联)，已经使骆驼科动物VHH免疫球蛋白结构域多聚化(Fraile S等，Mol Microbiol 53：1109-21(2004)；Zhang J等，J Mol Biol335：49-56(2004))。已经使用某些铰链或半胱氨酸介导的二硫键稳定化使来自软骨鱼纲的免疫球蛋白结构域(例如IgNAR)多聚化(参见例如Simmons等，J Immunol Methods 315：171-84(2006))。
因此，包含不同免疫球蛋白结构域的多价细胞靶向分子的产生可以通过共价或非共价的分子工程策略来控制，例如涉及单链串联排列的共价策略，涉及半胱氨酸介导的、二硫键稳定化的多聚体的共价策略，，和/或涉及二聚化结构域、接头选择和/或可变结构域顺序的非共价策略。当产生是本发明的多价细胞靶向分子的结构时，可以组合多个策略(例如，接头相关的非共价多聚化和共价二硫键稳定化)(参见例如Lu D等，J Immunol Methods279：219-32(2003))。
对于某些应用，本发明组合物中多价细胞靶向分子与总细胞靶向分子的相对比例的稳定性对于组合物的有效性可能是重要的。例如，在某些医学应用中，本发明的多价细胞靶向分子与单价细胞靶向分子的相对比例的稳定性可能是重要的。在某些应用中，二价细胞靶向分子与更高价细胞靶向分子的相对比例的稳定性可能是重要的。在某些应用中，二价细胞靶向分子与非二价细胞靶向分子的相对比例的稳定性可能是重要的。
对于某些实施方案，本发明的多价细胞靶向分子的一些或所有组分的受控多聚化的一个或更多个步骤可用于制备本发明的组合物。
对于某些应用，最小化或以其他方式控制细胞靶向分子的不希望的聚集和/或多聚化对于本发明的某些组合物可能是重要的。例如，对于某些蛋白质治疗剂，治疗分子的聚集和/或多聚化在某些情况下可增加蛋白质治疗剂接受者中不希望的免疫应答的风险。特别地，在将某些细胞靶向分子组合物施用于某些接受者后，细胞靶向分子聚集和/或多聚化为更高分子量的复合物可能增加不希望的免疫应答的风险。此外，与其正确折叠的对应物相比，错误折叠的蛋白质和降解的蛋白质产物可表现出增强的免疫原性。
由于所有这些原因并且取决于具体应用，技术人员将理解是否需要考虑1)本发明组合物的多价细胞靶向分子的稳定性和2)存在于本发明组合物中的不同细胞靶向分子的比例的稳定性。例如，在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子及其组合物是受控多聚化和/或某些纯化步骤的结果。类似地，在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子将被工程化以消除或减少某些多聚化可能性。在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子将被设计为避免形成不希望的聚集体，例如在某些储存条件下，例如在8，4，2，-4，-10，-20或-25℃的水溶液中。
对于本发明组合物的某些应用，可能希望在本发明的组合物中最小化以下各项的数量：1)高分子量多价细胞靶向分子(例如大于175，180，190，200或250kDa或更大的分子)；2)非常多价的细胞靶向分子(即包含五个或更多个细胞靶向结合区域的分子)；3)细胞靶向分子的多聚体，该细胞靶向分子是代表#1的高分子量多价细胞靶向分子和/或代表#2的非常多价的细胞靶向分子(例如细胞靶向分子的某些大的非共价多聚体)；3)错误折叠的蛋白质(例如错误折叠的细胞靶向蛋白质或其蛋白质组分)；和/或4)降解产物(例如多价细胞靶向分子的蛋白质组分的不希望的蛋白质片段，例如志贺毒素效应子区域或细胞靶向结合区域的多肽片段)。例如，最小化上面列为#1-#4的任何类型分子的数量的基本原理可能用于医学应用，其中某些量的这些分子的存在可能在本发明组合物的接受者中增加不需要的抗原性反应和/或免疫原性反应的潜力，例如通过揭示新表位的这些分子的存在或通过形成更容易被接受者的免疫系统识别为外来物的重复基序。
技术人员可以使用常规方法来评估本发明的多价细胞靶向分子和/或存在于本发明组合物中的分子的多聚化状态。技术人员可以使用常规方法来最小化本发明组合物中的细胞靶向分子聚集体、高分子量细胞靶向蛋白质多聚体、错误折叠的细胞靶向蛋白质和细胞靶向蛋白质的降解产物的存在或相对比例。
在本发明组合物的某些实施方案中，使多价细胞靶向分子的二价，三价和/或四价形式的相对比例最大化，例如通过进一步纯化除去单价细胞靶向蛋白质、较高分子量的细胞靶向分子、错误折叠的细胞靶向蛋白质和/或蛋白质降解产物。
技术人员可以使用常规方法来产生本发明的多价细胞靶向分子及其组合物。技术人员可以使用常规方法来稳定本发明组合物中某些多价细胞靶向分子与其他分子的相对比例，包括细胞靶向分子的不同多聚体形式的比例，例如共价连接的多聚体多价细胞靶向分子与非共价连接的多聚体多价细胞靶向分子的比例(参见例如Gil D，Schrum A，AdvBiosci Biotechnol 4：73-84(2013)；WO2005000898)。例如，可以控制和/或最小化本发明组合物中细胞靶向分子的多聚化，例如通过选择某些接头来连接和/或缔合存在于本发明组合物中的细胞靶向分子的不同组分和/或亚基。例如，在某些实施方案中，将本发明的多价细胞靶向分子的细胞靶向结合区域工程化以最小化不希望的分子间缔合、多聚体和/或聚集体的形成，例如通过使用二硫键稳定的scFv、Fv片段或Fab(参见例如Reiter Y等，JBiol Chem 269：18327-31(1994)；Kuan C，Pastan I，Biochemistry 35：2872-7(1996)；Almog O等，Proteins 31：128-38(1998)；Schoonjans R等，J Immunol 165：7050-7(2000)；Olafsen T等，Protein Eng Des Sel 17：21-7(2004)；Gil D，Schrum A，Adv BiosciBiotechnol 4：73-84(2013)；US 20120283418)；碱基(base)环连接(参见例如Brinkmann U等，J Mol Biol 268：107-17(1997))；和/或其他修饰，例如添加带电荷的残基、聚糖和/或免疫球蛋白结构域截短(参见例如Gong R等，Mol Pharm 10：2642-52(2013)；Lee C等，Trends Biotechnol 31：612-20(2013))。
在本发明的某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含细胞靶向结合区域，其是被工程化改造为不聚集的scFv，例如通过使用连接scFv的重链和轻链区域的较短接头(通常少于十二个氨基酸残基)和/或二硫键稳定的接头(参见例如，Brinkmann U等，Proc Natl Acad Sci USA 90：7538-42(1993)；Whitlow M等，Protein Engineering 6：989-95(1993)；Reiter Y等，Biochemistry 33：5451-9(1994)；Gong R等，MolecularPharmaceutics 10：2642-52(2013))。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子组合物使化合价大于2的某些多价细胞靶向分子相对于其他细胞靶向分子的比例最小化。在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子组合物包含的化合价大于4的多价细胞靶向分子的相对百分比为，组合物中总细胞靶向分子的15％，10％，7.5％，5％，2％，1％或更低。在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子组合物包含的化合价大于3的细胞靶向分子与其他细胞靶向分子的相对百分比为，所述组合物中总细胞靶向分子的15％，10％，7.5％，5％，2％，1％或更低。在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子组合物包含的化合价大于2的化合物靶向分子的百分比为，组合物中总细胞靶向分子的15％，10％，7.5％，5％，2％，1％或更低。
在某些实施方案中，本发明的组合物使具有恰好两个细胞靶向结合区域的多价细胞靶向分子与总细胞靶向分子的相对比例最大化。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物包含的仅具有两个细胞靶向结合区域的细胞靶向分子的比例为组合物中总细胞靶向分子的80％，85％，88％，90％，92％，93％或更高。
对于某些应用，可能需要维持本发明的多价组合物中的多价细胞靶向分子的稳定性(例如，多价细胞靶向分子的组分和/或亚基之间的缔合和/或连接的稳定性)，例如，以使在配制、储存(例如，在8，4，2，-4，-10，-20或-25℃的水溶液中储存)期间和/或施用于接受者之后的降解最小化。技术人员可以使用众所周知的方法来最小化本发明的多价细胞靶向分子的组分或亚基分离，例如通过使用志贺毒素效应子多肽和结合区域之间的高稳定性连接和/或通过在多价细胞靶向分子的组分、区域或亚区之间或在单价细胞靶向蛋白质之间工程化改造二硫键以产生本发明的多价细胞靶向蛋白质(参见例如Gil D，Schrum A，AdvBiosci Biotechnol 4：73-84(2013))。技术人员可以加入或维持分子间二硫键来稳定本发明的多价细胞靶向分子的某些细胞靶向结合区域(参见例如Glockshuber R等,Biochemistry 29:1362-7(1990)；Stanfield R等,Science 305:1770-3(2004)；HagiharaY等,J Biol Chem 282:36489-95(2007)；Chan P等,Biochemistry 47:11041-54(2008)；Saerens D等,J Mol Biol 478-88(2008)；Hussack G等,PLoS One 6:e28218(2011)；Govaert J等,J Biol Chem 287:1970-9(2012)；Kim D等,Protein Eng Des Sel 25:581-9(2012)；Gil D,Schrum A,Adv Biosci Biotechnol 4:73-84(2013)；McConnell A等,Protein Eng Des Sel 25:581-9(2013)；Feige M等,Proc Natl Acad Sci USA 111:8155-60(2014)；Hagihara Y,Saerens D,Biochim Biophys Acta 1844:2016-2023(2014)；Kim D等,Mabs 6:219-35(2014))。
在某些实施方案中，本发明的多价细胞靶向分子包含细胞靶向结合区域，该细胞靶向结合区域包含免疫球蛋白结构域和/或具有域内二硫键的Ig-折叠结构，例如，天然存在于某些免疫球蛋白的B和Fβ链之间的二硫键和/或免疫球蛋白的或来自免疫球蛋白的其重链和轻链之间的二硫键。然而，在本发明的多价细胞靶向分子的某些实施方案中，即使它们不包含域内二硫键或在一个或更多个细胞靶向结合区域内不包含任何域内二硫键，该分子也非常稳定(参见例如Proba K等，Biochemistry 37：13120-7(1998)；A，Plückthun A，Biochemistry 37：13120-7(1998)；/>A，Plückthun A，FEBS Lett 427：357-61(1998)；Ramm K等，J Mol Biol 290：535-46(1999)；Tanaka T，Rabbitts T，J Mol Biol376：749-57(2008))。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含这样的多价细胞靶向分子：其在不同多肽链的志贺毒素效应子多肽区域内包含的两个或更多个半胱氨酸残基之间具有一个或更多个二硫键。在某些实施方案中，本发明的组合物包含具有五个二硫键的蛋白质二聚体多价细胞靶向分子，例如包含以下部分的二聚体多价细胞靶向分子：1)四个分子内二硫键，其代表每个免疫球蛋白来源的细胞靶向结合区域具有两个二硫键，其中每个二硫键包含一对半胱氨酸残基，其中每对的一个半胱氨酸残基在免疫球蛋白重链来源的结构域内，并且该对的另一个半胱氨酸残基在免疫球蛋白轻链来源的结构域内；2)桥接两个志贺毒素效应子区域的一个分子间二硫键，其中所述二硫键存在于一对半胱氨酸残基之间，其中该对的每个半胱氨酸残基是在志贺毒素效应子区域内，但该志贺毒素效应子区域是在代表本发明多价细胞靶向蛋白质的不同亚基的不同多肽链内。
本发明的多价细胞靶向分子的某些实施方案是细胞毒性的细胞靶向融合蛋白。某些另外的实施方案是细胞靶向分子，其包含SEQ ID NO:252-255，259-278和288-748中所示的两个或更多个多肽，或基本上由其组成。
就本发明的目的而言，志贺毒素效应子多肽和两个或更多个结合区域相对于彼此或者相对于本发明整个多价细胞靶向分子的特定顺序或取向不是固定的。本发明的多价细胞靶向分子的组分可以以任何顺序排列，条件是不消除结合区域和志贺毒素效应子多肽的所需活性，特别是细胞靶向分子结合靶标表达细胞的能力，细胞靶向分子内化到靶细胞中的能力，以及志贺毒素效应子多肽组分将CD8+ T细胞表位-肽货物递送到它所在的细胞的MHC I类途径的能力。其他所需的活性包括给多价细胞靶向分子提供例如快速诱导细胞内化的能力；导致有效的内化；细胞内发送到所需的亚细胞区室；导致白细胞郁滞；引起细胞毒性；选择性杀伤靶标表达细胞；将外源物质递送到细胞内部；诊断疾病、障碍或病症；和/或治疗有此需要的患者的疾病、障碍或病症。
本发明的细胞靶向分子各自包含细胞靶向结合区域，其可以特异性结合至少一个与细胞物理关联的细胞外靶生物分子，例如在细胞表面上表达的靶生物分子。该一般结构是模块化的，因为任何数量的不同细胞靶向部分可用作本发明的细胞靶向分子的结合区域。使用包含对靶生物分子的任何细胞外部分的功能性结合位点，并且甚至更优选能够以高亲和力结合靶生物分子(例如，如KD小于10-9摩尔/升所示)的本发明的细胞靶向分子的片段、变体和/或衍生物也在本发明的范围内。例如，尽管本发明提供了可与人蛋白质结合的多肽序列，但以10-5至10-12摩尔/升，优选小于200nM，的解离常数(KD)结合靶生物分子的细胞外部分的任何结合区域可以替代用于制备本发明的细胞靶向分子和本发明的方法。
Ⅲ.本发明的细胞靶向分子的一般功能
本发明的细胞靶向分子可以用作细胞靶向的细胞毒性分子、治疗分子、细胞标记分子和诊断分子，例如，通过它们基于细胞表面标记物表达、进入靶细胞，将其异源CD8+ T细胞表位-肽货物细胞内递送至MHC I类途径从而导致靶细胞的CD8+ T细胞表位-肽的细胞表面呈递的靶向特定细胞类型的能力。
对于某些实施方案，在施用于脊索动物后，本发明的细胞靶向分子提供以下一种或更多种：1)有效和选择性杀伤靶细胞，例如感染的和/或肿瘤细胞，2)当细胞靶向分子存在于细胞外空间中时，例如在脊索动物的循环系统中，细胞靶向结合区域和志贺毒素效应子多肽组分之间的连接稳定性(参见例如WO 2015/191764)，3)低水平的脱靶细胞死亡和/或不希望的组织损伤(参见例如WO 2015/191764)，和4)细胞靶向递送异源CD8+ T细胞表位货物以通过靶细胞的MHC I类分子进行细胞表面呈递，从而刺激所需的免疫应答，例如，募集CD8+CTL和在组织部位(例如肿瘤块)局部释放免疫刺激细胞因子。此外，靶细胞对递送的异源CD8+ T细胞表位肽的呈递，将那些呈递细胞标记为pMHC I，可以检测这些pMHC I，以收集信息，例如用于诊断信息。
本发明的细胞靶向分子可用于多种应用，包括例如靶向递送CD8+ T细胞表位-货物、免疫应答刺激、靶向细胞杀伤、靶向细胞生长抑制、生物信息收集和/或健康状况的补救。本发明的细胞靶向分子可用作治疗和/或诊断分子，例如作为细胞靶向的无毒递送载体；细胞靶向的细胞毒性治疗分子；和/或细胞靶向的诊断分子；例如，在涉及体内靶向特定细胞类型以诊断或治疗多种疾病(包括癌症、免疫障碍和微生物感染)的应用中。本发明的某些细胞靶向分子可用于通过增强脊索动物的抗肿瘤免疫力(特别是涉及CD8+ T细胞介导的机制)的有效性来治疗患有肿瘤或癌症的脊索动物，(参见例如Ostrand-Rosenberg S，Curr Opin Immunol 6：722-7(1994)；Pietersz G等，Cell Mol Life Sci 57：290-310(2000)；Lazoura E等，Immunology119：306-16(2006))。
取决于实施方案，本发明的细胞靶向分子可具有或提供以下一种或更多种特征或功能：(1)体内刺激CD8+ T细胞免疫应答，(2)去免疫化(参见例如WO 2015/113005，WO2015/113007和WO 2015/191764)，(3)蛋白酶切割抗性(参见例如WO 2015/191764和WO2015/191764)，(4)在某些浓度下的有效细胞毒性，(5)选择性细胞毒性，(6)在某些剂量或用量下在多细胞生物体中的低脱靶毒性(参见例如WO 2015/191764和WO 2015/191764)，和/或(7)细胞内递送由另外的材料(例如核酸或检测促进剂)组成的货物。本发明的细胞靶向分子的某些实施方案是多功能的，因为该分子具有本文所述的两种或更多种特征或功能。本发明的细胞靶向分子的某些另外的实施方案在单个分子中提供所有上述特征和功能。
本发明的治疗性细胞靶向分子的作用机制包括通过志贺毒素效应子功能的直接靶细胞杀伤，通过细胞间免疫细胞介导的过程的间接细胞杀伤，和/或由于“CD8+ T细胞表位接种”，教导接受者的免疫系统排斥某些细胞和组织部位，例如肿瘤块。
A.将异源CD8+ T细胞表位货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径
本发明的细胞靶向分子的主要功能之一是细胞靶向递送一个或更多个异源CD8+T细胞表位-肽，用于通过脊索动物细胞的MHC I类呈递。本发明的细胞靶向分子是模块化支架，用作几乎任何CD8+ T细胞表位货物到几乎任何脊索动物靶细胞的通用递送载体。靶向递送需要细胞靶向分子特异性结合某种靶细胞，进入靶细胞，并将完整的异源CD8+ T细胞表位-肽货物递送至能够进入MHC I类呈递途径的亚细胞区室。使用本发明的细胞靶向分子将CD8+ T细胞表位-肽货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，可用于诱导靶细胞在细胞表面上呈递与MHC类分子相关联的表位-肽。
通过使用免疫原性MHC I类表位，例如来自已知的病毒抗原，作为本发明的细胞靶向分子的异源CD8+ T细胞表位-肽货物，可以实现免疫刺激性抗原的靶向递送和呈递以刺激例如体外的脊索动物免疫细胞的和/或体内的脊索动物免疫系统的有益功能。
在脊索动物中，由MHC I类复合物呈递免疫原性CD8+ T细胞表位可以靶向呈递细胞以通过CTL介导的细胞溶解杀伤呈递细胞，促进免疫细胞改变微环境，并发出募集更多免疫细胞到脊索动物内靶细胞部位的信号。本发明的某些细胞靶向分子能够在生理条件下将其异源CD8+ T细胞表位-肽货物递送至靶脊索细胞的MHC I类途径，以呈递与MHC I类分子复合的所递送的T细胞表位。这可以通过如下来完成：将细胞靶向分子外源性施用到细胞外空间(例如血管腔)中，然后允许细胞靶向分子找到靶细胞，进入细胞，和细胞内递送其CD8+T细胞表位货物。由脊索动物内的靶细胞呈递CD8+ T细胞表位可导致免疫应答，包括直接对靶细胞的应答和/或在脊索动物内靶细胞的组织位置中的一般应答。
本发明的细胞靶向分子的这些CD8+ T细胞表位货物递送和MHC I类呈递功能的应用是广泛的。例如，CD8+表位向细胞的递送和脊索动物内细胞对所递送的表位的MHC I类呈递，可引起CD8+效应T细胞的细胞间接合，并可导致CTL杀伤靶细胞和/或分泌免疫刺激细胞因子。
在外源性施用后，本发明的细胞靶向分子能够递送一个或更多个CD8+ T细胞表位货物，用于通过有核脊索动物细胞的MHC I类呈递。对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够结合与特定细胞类型的细胞表面相关联的细胞外靶生物分子，并进入那些细胞。一旦在靶细胞类型中内化，本发明的细胞靶向分子能够将CD8+ T细胞表位货物递送至MHCI类呈递途径，并且本发明的细胞靶向分子的某些另外的实施方案能够将志贺毒素效应子多肽组分(无论是催化活性的，细胞毒性降低的还是无毒的)引导至细胞的胞质溶胶中。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够从细胞外空间将一个或多更个异源CD8+ T细胞表位-肽货物递送至靶细胞的蛋白酶体。然后可以将递送的CD8+ T细胞表位-肽货物进行蛋白水解处理，并通过靶细胞表面上的MHC I类途径呈递。对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将与细胞靶向分子相关联的异源CD8+ T细胞表位-肽货物递送至细胞的MHC I类分子，用于在细胞表面上通过MHC I类分子呈递表位-肽。对于某些实施方案，在细胞与本发明的细胞靶向分子接触后，细胞靶向分子能够将与细胞靶向分子相关联的异源CD8+ T细胞表位-肽货物递送到细胞的MHC I类分子，用于在细胞表面上通过MHC I类分子呈递表位-肽。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在施用于脊索动物受试者后能够靶向递送一个或更多个异源CD8+ T细胞表位货物，用于在该受试者中通过特定靶细胞进行MHCI类呈递。
原则上，可以选择任何CD8+ T细胞表位-肽用于本发明的细胞靶向分子。因此，本发明的细胞靶向分子可用于利用与您选择的表位-肽复合的MHC I类分子标记靶细胞的表面。
哺乳动物生物体中的每个有核细胞都能够在其与MHC I类分子复合的细胞外表面上进行免疫原性CD8+ T细胞表位肽的MHC I类途径呈递。此外，T细胞表位识别的灵敏度非常高，只需要提供少量MHC-I肽复合物就可以产生免疫应答，例如，即使呈递单个复合物也足以进行CD8+效应T细胞的细胞间接合(Sykulev Y等，Immunity 4：565-71(1996))。本发明的细胞靶向分子的靶细胞几乎可以是任何有核脊索动物细胞类型，并且不需要是免疫细胞和/或专职抗原呈递细胞。专职抗原呈递细胞的实例包括树突细胞，巨噬细胞和具有功能性MHC II类系统的专用上皮细胞。事实上，本发明的细胞靶向分子的优选实施方案不靶向专职抗原呈递细胞。一个原因是由于施用本发明的细胞靶向分子而导致的不良免疫应答将是针对细胞靶向分子本身的体液应答，例如，识别细胞靶向分子中的表位的抗细胞靶向分子抗体。因此，专职抗原呈递细胞和某些免疫细胞类型不是本发明的细胞靶向分子的某些实施方案的靶标，因为这些细胞对本发明的细胞靶向分子的摄取可能导致识别存在于细胞靶向分子中(特别是在志贺毒素效应子多肽组分和/或抗原货物中，但也包括在结合区域中)的CD4+ T细胞和B细胞表位。
通过本发明的细胞靶向分子的某些实施方案递送CD8+ T细胞表位的能力可以在各种条件下并且在非靶向旁观者细胞(例如，离体操作的靶细胞，体外培养的靶细胞，体外培养的组织样品中的靶细胞，或如多细胞生物体内的体内环境中的靶细胞)的存在下完成。
为了使本发明的细胞靶向分子按设计发挥功能，细胞靶向分子必须1)进入靶细胞并且2)将其CD8+ T细胞表位-肽货物定位于能够进入MHC I类途径的亚细胞位置。通常，本发明的细胞靶向分子通过内吞作用实现靶细胞内化，例如，由于涉及由细胞靶向分子结合的细胞外靶生物分子的自然过程。一旦本发明的细胞靶向分子被内化，它通常将存在于早期内体区室中，例如内吞囊泡中，并且注定在溶酶体或晚期内体中被破坏。细胞靶向分子必须避免完全隔离(sequestration)和降解，使得包含T细胞表位-肽货物的至少一部分细胞-靶分子逃逸到另一个亚细胞区室。此外，靶细胞应表达MHC I类分子或能够被诱导表达MHCI类分子。
MHC I类分子的表达不需要是天然的，以便细胞表面呈递与MHC I类分子复合的异源CD8+ T细胞表位-肽(通过本发明的细胞靶向分子作为货物递送)。对于本发明的某些实施方案，可以使用技术人员已知的方法诱导靶细胞表达MHC I类分子，例如通过用IFN-γ处理。
通常，本发明的细胞靶向分子通过将它们的CD8+ T细胞表位-肽货物定位于靶细胞的细胞溶质区室中的蛋白酶体来实现MHC I类途径递送。然而，对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子可以将异源CD8+表位-肽递送至MHC I类呈递途径，而表位-肽不进入细胞溶质区室和/或表位-肽不被蛋白酶体蛋白水解处理。
对于本发明的某些实施方案，可以使用技术人员已知的方法诱导靶细胞表达不同的蛋白酶体亚基和/或蛋白酶体亚型，例如通过用IFN-γ和/或IFN-α处理。这可以改变递送到细胞中的CD8+表位肽的蛋白水解处理的定位和/或相对效率，例如通过改变蛋白酶体和蛋白酶体亚型的肽酶活性的相对水平。
可以通过本领域技术人员已知的和/或本文描述的多种标准方法检测和监测本发明的细胞靶向分子的CD8+ T细胞表位递送功能。例如，可以使用各种体外和体内测定来研究本发明的细胞靶向分子递送CD8+ T细胞表位-肽货物并通过靶细胞的MHC I类系统驱动该肽的呈递的能力，包括例如直接检测/观察MHC I类/肽复合物(pMHC I)，测量T细胞肽与MHC I类分子的结合亲和力，和/或测量靶细胞上pMHC I呈递的功能结果，例如，通过监测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答(参见例如下文的实施例)。
用于监测和定量本发明的细胞靶向分子的CD8+ T细胞表位货物递送功能的某些测定包括在体外或离体直接检测特定的pMHC I。用于直接观察和定量pMHC I的常用方法涉及技术人员已知的各种免疫检测试剂。例如，可开发特异性单克隆抗体以识别特定的pMHCI。类似地，可溶性多聚体T细胞受体，例如TCR-STAR试剂(Altor Bioscience Corp.,Miramar,FL,U.S.)可用于直接观察或定量特异性pMHC I(Zhu X等，J Immunol 176：3223-32(2006)；参见例如下文的实施例)。这些特异性mAb或可溶性多聚体T细胞受体可以与各种检测方法一起使用，包括例如，免疫组织化学、流式细胞术和酶联免疫吸附试验(ELISA)。
用于直接鉴定和定量pMHC的替代方法涉及质谱分析，例如ProPresent抗原呈递测定(ProImmune,Inc.,Sarasota,FL,U.S.)，其中从细胞表面提取肽-MHC I类复合物，然后肽被纯化并通过测序质谱法鉴定(Falk K等，Nature 351：290-6(1991))。
在监测本发明的细胞靶向分子的CD8+ T细胞表位递送和MHC I类呈递功能的某些测定中，涉及监测MHC I类和肽结合和稳定性的计算和/或实验方法。技术人员可使用若干软件程序来预测肽对MHC I类等位基因的结合反应，例如，免疫表位数据库和分析资源(Immune Epitope Database and Analysis Resource)(IEDB)分析资源MHC-I结合预测共识工具(Analysis Resource MHC-I binding prediction Consensus tool)(Kim Y等，Nucleic Acid Res 40：W525-30(2012))。已经常规应用了几种实验测定法，例如用于量化和/或比较结合动力学细胞表面结合测定法和/或表面等离子体共振测定法(Miles K等，Mol Immunol 48：728-32(2011))。
备选地，可以通过监测对特定复合物的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答来进行细胞表面上pMHC I呈递结果的测量。这些测量包括用MHC I类四聚体或五聚体试剂直接标记CTL。四聚体或五聚体直接结合特定特异性的T细胞受体，这由主要组织相容性复合物(MHC)等位基因和肽复合物决定。另外，通常例如通过ELISA或酶联免疫斑点(ELIspot)测定释放的细胞因子比如干扰素γ或白细胞介素的定量，以鉴定特异性CTL应答。CTL的细胞毒性能力可以使用许多测定来测量，包括经典的51铬(Cr)释放测定或备选的非放射性细胞毒性测定(例如，Cyto非放射性试剂盒和CellToxTMCellTiter-/>试剂盒，可购自Promega Corp.,Madison,WI,U.S.)，颗粒酶B ELISpot，胱天蛋白酶活性测定或LAMP-1易位流式细胞术测定。为了特异性地监测靶细胞的杀伤，羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)可用于容易和快速地标记用于体外或体内研究的感兴趣的细胞群，以监测表位特异性CSFE标记的靶细胞的杀伤(Durward M等，J Vis Exp45pii 2250(2010))。
对MHC I类呈递的体内应答之后可以施用MHC I类/抗原促进剂(例如，肽、蛋白质或灭活/减毒病毒疫苗)，然后用活性剂(例如病毒)进行激发，并监测对该试剂的应答，通常与未接种的对照进行比较。可以用类似于先前描述的方法(例如CTL细胞毒性测定和细胞因子释放的定量)监测离体样品的CTL活性。
生物体中的MHC I类呈递后可以进行反向免疫。例如，裂解后使用免疫亲和力(例如，抗MHC I抗体“下拉”纯化)，从利用包含抗原X的本发明的细胞靶向分子中毒的细胞中分离HLA-A、HLA-B和/或HLA-C分子复合物，并从纯化的复合物中回收相关肽(即，被分离的pMHC I结合的肽)。通过测序质谱分析回收的肽。将质谱数据与蛋白质数据库文库进行比较，所述蛋白质数据库文库由人的外源(非自身的)肽(抗原X)的序列和国际蛋白质指数(代表“自身的”或非免疫原性肽)组成。根据概率数据库按重要性对肽进行排序。列出了检测到的抗原性(非自身的)肽序列。通过搜索加扰诱饵数据库来验证数据以减少假命中(参见例如Ma B，Johnson R，Mol Cell Proteomics 11：O111.014902(2012))。结果能够证明来自CD8+ T细胞抗原X的哪些肽被呈递到细胞靶向分子中毒的靶细胞表面上的MHC I复合物中。
B.细胞杀伤：直接靶向志贺毒素的细胞毒性和/或通过招募CTL间接靶向细胞介导
的细胞毒性
本发明的细胞靶向分子可以提供以下细胞类型特异性递送：1)递送CD8+ T细胞表位货物至MHC I类呈递途径，用于呈递和CTL的细胞间接合，以及2)递送强效的志贺毒素细胞毒性至胞质溶胶。这些多种细胞毒性机制可以相互补充，例如通过提供直接(例如志贺毒素催化介导的)靶细胞杀伤和间接(例如CTL介导的)靶细胞杀伤。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在某些浓度下具有细胞毒性。本发明的细胞靶向分子可用于涉及间接(例如通过细胞间CD8+免疫细胞接合)和/或直接细胞杀伤机制(例如通过细胞内毒素效应子活性)的应用。因为志贺毒素适于杀伤真核细胞，使用志贺毒素A亚基衍生多肽设计的细胞毒性细胞靶向分子可显示出有效的细胞杀伤活性。包含活性酶结构域的志贺毒素A亚基及其衍生物一旦在细胞的胞质溶胶中，就可杀伤真核细胞。细胞靶向结合区域和异源CD8+ T细胞表位肽与去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应子多肽的融合可以在不显著降低志贺毒素效应子多肽的催化作用和细胞毒性活性的情况下完成(参见下文实施例)。因此，本发明的某些细胞靶向分子可提供至少两种冗余的靶细胞杀伤机制--(1)由本发明的细胞靶向分子的异源CD8+表位货物递送导致的间接免疫细胞介导的杀伤，和(2)通过本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽组分的功能活性的直接杀伤。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，在接触与分子结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的靶细胞后，细胞靶向分子能够导致靶细胞死亡。细胞杀伤的机制可以是直接的，例如通过志贺毒素效应子多肽的酶活性，或间接的通过免疫细胞介导机制，例如CTL介导的靶细胞细胞溶解，并且可以在靶细胞的不同条件下，例如离体操作的靶细胞、体外培养的靶细胞、体外培养的组织样品中的靶细胞、或体内靶细胞。
靶标生物分子的表达不需要是天然的，以便通过本发明的细胞靶向分子进行靶向细胞杀伤。靶生物分子的细胞表面表达可以是感染、存在病原体和/或存在细胞内微生物病原体的结果。靶生物分子的表达可以是人工的，例如，通过用病毒表达载体(参见例如腺病毒，腺相关病毒和逆转录病毒系统)感染后强制的或诱导的表达。诱导靶生物分子表达的实例是暴露于类视黄醇，如全反式视黄酸和各种合成类视黄醇，或任何视黄酸受体(RAR)激动剂的细胞的CD38表达的上调(Drach J等，Cancer Res 54：1746-52(1994)；Uruno A等，JLeukoc Biol 90：235-47(2011))。在另一个实例中，可以通过将细胞暴露于电离辐射来诱导CD20、HER2和EGFR表达(Wattenberg M等，Br J Cancer 110：1472-80(2014))。此外，响应于雄激素剥夺，PSMA表达上调(参见例如Chang S等，Cancer 88：407-15(2000)；Meller B等，EJNMMI Res 5:66(2015))。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，细胞靶向分子具有细胞毒性，因为分子的异源CD8+ T细胞表位货物的递送导致被递送的表位-肽由靶细胞进行MHC I类呈递以及免疫细胞介导的靶细胞杀伤。
本发明的某些细胞靶向分子可用于涉及间接细胞杀伤机制的应用，例如刺激CD8+免疫细胞介导的靶细胞杀伤。靶细胞的免疫刺激性非自身抗原(例如，具有高免疫原性的已知病毒表位-肽)的呈递可以向其他免疫细胞发信号，以破坏靶细胞并将更多免疫细胞募集到生物体内的靶细胞位点上。在某些条件下，MHC I类复合物靶标的免疫原性CD8+表位-肽的细胞表面呈递模拟免疫系统杀伤呈递细胞，以通过CD8+CTL介导的细胞溶解来杀伤呈递细胞。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，在接触与分子结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞后，细胞靶向分子能够间接导致细胞死亡，例如，通过靶细胞呈递一个或更多个T细胞表位和随后募集CTL。
此外，在脊索动物内，由本发明的细胞靶向分子递送的CD8+ T细胞表位货物的靶细胞的呈递可以向局部区域提供免疫刺激和/或打破对局部区域中和/或整个脊索动物全身的某些恶性细胞的免疫耐受性的额外功能。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，在接触与结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞后，本发明的细胞靶向分子能够直接导致细胞死亡，例如，通过本文所述的志贺毒素效应子多肽或细胞毒性剂的酶活性。在某些条件下，本发明的某些细胞靶向分子具有细胞毒性，因为它们包含具有催化活性的志贺毒素效应子多肽组分，该多肽组分发挥功能如此之快，以至于它阻止了观察到通过细胞靶向分子将任何异源CD8+ T细胞表位-肽递送到MHC I类呈递途径的任何功能性结果；然而，为了包括在要求保护的细胞靶向分子的范围内，这种细胞靶向分子在外源施用后必须能够将异源CD8+ T细胞表位-肽货物从细胞外空间递送至细胞的MHC I类呈递途径。
此外，本领域技术人员可以使用常规方法将表现出基于志贺毒素效应子多肽催化活性的细胞毒性的本发明的细胞毒性细胞靶向分子工程化改造为酶失活变体，以减少或消除基于志贺毒素效应子的细胞毒性。由此产生的“失活的”细胞靶向分子可能具有或可能不具有细胞毒性，因为它能够将异源CD8+ T细胞表位递送至靶细胞的MHC I类系统，并随后由靶细胞表面上的MHC I类分子呈递所递送的CD8+ T细胞表位-肽。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽组分表现出低至零的细胞毒性，因此在本文中称为“非细胞毒性的和/或细胞毒性降低的”。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子表现出低至零的细胞毒性，并且可以称为“非细胞毒性的”和/或“细胞毒性降低的变体”。例如，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案没有表现出显著水平的基于志贺毒素的细胞毒性，其中在小于1,000nM，500nM，100nM，75nM，50nM的剂量下，与合适的参考分子相比，没有显著量的细胞死亡，例如，通过技术人员已知的和/或本文所述的测定法测量。对于某些另外的实施方案，本发明的多价细胞靶向分子在1-100微克(μg)/千克(kg)哺乳动物接受者的剂量下不表现出任何毒性。细胞毒性降低的变体在某些浓度或剂量下仍可能具有细胞毒性，但表现出降低的细胞毒性，例如，在某些情况下不能表现出显著水平的志贺毒素细胞毒性。本发明的某些细胞靶向分子可以具有非细胞毒性或降低的细胞毒性，例如通过添加技术人员已知的一个或更多个氨基酸置换来灭活志贺毒素A亚基和/或志贺毒素效应子多肽，包括本文所述的示例性置换。本发明的细胞靶向分子的非细胞毒性的和细胞毒性降低的变体在某些情况下可能比更高细胞毒性的变体更适合于递送异源CD8+ T细胞表位和/或其他外源物质。
可以通过干扰来利用免疫系统的功效以获得治疗益处，所述干扰特异性地诱导针对患者体内的恶性细胞(例如肿瘤细胞)和/或恶性组织部位(例如肿瘤)的感染样免疫反应，例如，通过使用来自感染剂的高免疫原性外来表位，以局部激活多种有益免疫应答，并通过诱导感染状态的模拟而特异性地将靶细胞(例如肿瘤细胞)标记为外来细胞。或者，该方法可以使用高免疫原性的新表位(源自感染剂或非感染剂)或源自非感染剂的高免疫原性的非自身表位，例如肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原和来自植物、真菌等的分子。此外，可以通过选择表位-肽货物来决定免疫系统刺激哪些细胞或组织。例如，使用内源性非自身肿瘤抗原(参见例如Boon T，van der Bruggen P，J Exp Med 183：725-9(1996)；VonderheideR等，Immunity 10：673-9(1999)；Van Der Bruggen P等，Immunol Rev 188：51-64(2002)；Schreurs M等，Cancer Immunol Immunother 54：703-12(2005)；AdotéviO等，Clin CancerRes 12：3158-67(2006)；Valentino M等，J Immunol Methods 373：111-26(2011))标记靶细胞可以诱导针对显示相同或相关肿瘤表位的非靶向细胞的免疫应答，而使用病毒表位标记未感染癌症患者中的靶向细胞可以限制仅针对那些已经以足够的量和足够的持续时间递送和呈递表位的细胞的免疫应答。此外，可以通过表位-肽货物的选择来决定诱导何种类型的免疫应答。例如，使用内源性非自身肿瘤抗原标记靶细胞可以诱导针对显示相同或相关肿瘤表位的非靶向细胞的抗癌免疫应答，而使用病毒表位标记未感染癌症患者中的靶向细胞可能将抗病毒型免疫应答限制于仅针对那些已经以足够的量和足够的持续时间递送和呈递表位的细胞。
本发明提供免疫治疗方法，其涉及将CD8+ T细胞表位-肽货物递送至脊索动物的靶细胞并引起免疫应答，该方法包括向脊索动物施用本发明的细胞靶向分子或药物组合物的步骤。对于某些另外的实施方案，免疫应答是选自下组的细胞间免疫细胞应答：CD8+免疫细胞分泌细胞因子，靶细胞中CTL诱导的生长停滞，CTL诱导的靶细胞坏死，CTL诱导的靶细胞凋亡，组织部位中的非特异性细胞死亡，分子间表位扩散，破坏对恶性细胞类型的免疫耐受性，以及脊索动物获得对恶性细胞类型的持续免疫(参见例如Matsushita H等，CancerImmunol Res 3：26-36(2015))。可以使用技术人员已知的技术检测和/或定量这些免疫应答。例如，CD8+免疫细胞可以释放免疫刺激细胞因子，例如IFN-γ，肿瘤坏死因子α(TNFα)，巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)和白细胞介素如IL-17，IL-4，IL-22和IL-2(参见例如下文的实施例；Seder R等，Nat Rev Immunol 8：247-58(2008))。IFN-γ可以提高MHC I类分子的表达，并使肿瘤细胞对CTL介导的细胞杀伤敏感(VlkováV等，Oncotarget 5：6923-35(2014))。炎性细胞因子可以刺激旁观者T细胞，该细胞对细胞因子释放细胞具有无关的TCR特异性(参见例如Tough D等，Science 272：1947-50(1996))。活化的CTL可以不加区分地杀伤表位-MHC I类复合物呈递细胞附近的细胞，而不管附近细胞呈递的肽-MHC I类复合物库(Wiedemann A等，Proc Natl Acad Sci USA 103：10985-90(2006))。因此，对于某些另外的实施方案，免疫应答是选自下组的细胞间免疫细胞应答：由免疫细胞介导的附近细胞杀伤，其中附近细胞不显示由本发明的细胞靶向分子递送的任何CD8+ T细胞表位-肽，并且不管是否存在与被杀伤的附近细胞物理偶联的细胞靶向分子的结合区域的任何细胞外靶生物分子。
CTL裂解的细胞(无论是靶细胞还是仅接近靶细胞的细胞)中非自身表位的存在，都可被免疫系统识别并靶向为外来的，包括通过分子间表位扩散机制识别靶细胞中的非自身表位(参见McCluskey J等，Immunol Rev 164：209-29(1998)；Vanderlugt C等，ImmunolRev 164：63-72(1998)；Vanderlugt C，Miller S，Nat Rev Immunol 2：85-95(2002))。附近细胞可包括非肿瘤细胞，例如癌症相关成纤维细胞，间充质干细胞，肿瘤相关内皮细胞和未成熟的骨髓衍生抑制细胞。例如，癌细胞可在编码序列中平均具有25至500个非同义突变(参见例如Fritsch E等，Cancer Immunol Res 2：522-9(2014))。癌症驱动因子和非驱动因子突变都是癌细胞突变情况的一部分，其对应于每个细胞的许多非自身表位，并且平均肿瘤可具有十个或更多个非自身表位(参见例如Segal N等人，Cancer Res 68：889-92(2008))。例如，肿瘤蛋白p53的突变形式可含有非自身表位(参见例如Vigneron N等，Cancer Immun 13：15(2013))。此外，非自身表位(例如突变的自身蛋白)的存在可导致产生对那些新表位特异的记忆细胞。因为本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可以增加靶向组织部位处的树突细胞取样，所以可以增加用细胞内抗原交叉引发(cross-priming)免疫系统的可能性(参见例如Chiang C等，Expert Opin Biol Ther 15：569-82(2015))。因此，作为细胞靶向分子递送异源CD8+ T细胞表位货物和该表位的MHC I类呈递的结果，含有非自身表位的靶细胞和其他附近细胞可被免疫系统排斥，包括通过非自身表位而不是通过本发明的细胞靶向分子递送的表位。这些机制可以例如诱导针对不表达细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子的肿瘤细胞的抗肿瘤免疫。
涉及细胞因子分泌和/或T细胞活化的免疫应答可导致脊索动物内部位的免疫微环境的调节。本发明的方法可用于改变脊索动物内组织部位的微环境，以改变免疫细胞的调节稳态，所述免疫细胞为例如肿瘤相关巨噬细胞，T细胞，T辅助细胞，抗原呈递细胞和自然杀伤细胞。
对于某些实施方案，本发明的方法可用于增强脊索动物受试者中的抗肿瘤细胞免疫力和/或在脊索动物中产生持久的抗肿瘤免疫力，例如，由于记忆T细胞的发育和/或肿瘤微环境的改变。
本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案可用于将非自身的CD8+T细胞表位-肽呈递细胞“接种”在脊索动物内的部位，以便刺激免疫系统以更大的强度监视该部位和/或减轻免疫抑制信号，例如无反应性诱导信号。在本发明的这种“接种”方法的某些另外的实施方案中，所述部位是肿瘤块或感染的组织部位。在本发明的这种“接种”方法的某些实施方案中，非自身CD8+ T细胞表位-肽选自由以下各项组成的组：细胞靶向分子的靶细胞尚未呈递的肽，靶细胞表达的任何蛋白质中不存在的肽，靶细胞的蛋白质组或转录组内不存在的肽，待接种部位的细胞外微环境中不存在的肽，以及待靶向的肿瘤块中或感染组织部位中不存在的肽。
该“接种”方法的功能是利用一个或更多个MHC I类呈递的CD8+ T细胞表位(pMHCI)标记脊索动物内的一个或更多个靶细胞，用于免疫细胞的细胞间识别和下游免疫应答的激活。通过利用本发明的细胞靶向分子的细胞内化、细胞内发送和/或MHC I类表位递送功能，显示所递送的CD8+ T细胞表位的靶细胞可以被脊索动物免疫细胞的免疫监视机制识别，并导致CD8+ T细胞(例如CTL)与呈递靶细胞的细胞间接合。使用本发明的细胞靶向分子的这种“接种”方法可刺激免疫细胞介导的靶细胞杀伤，无论它们是否呈递细胞靶向分子递送的T细胞表位，例如，作为基于内源抗原的呈递而不是人工递送的表位的分子间表位扩散和/或靶细胞免疫耐受的破坏的结果。基于检测被初始T细胞(T cell)识别为外来物和/或已被记忆T细胞识别为非自身(即回忆抗原)的表位，使用本发明的细胞靶向分子的这种“接种”方法可以通过诱导针对接种的微环境(例如，肿瘤块或感染的组织部位)中的细胞的适应性免疫应答来提供疫苗接种效果(新表位暴露)和/或疫苗接种-加强剂量效应(表位再次暴露)。这种“接种”方法还可以外周地或系统地诱导对脊索动物内的靶细胞群、肿瘤块、患病组织部位和/或感染组织部位的免疫耐受性的破坏。
在脊索动物内的位点或部位处存在濒死或坏死的肿瘤细胞可导致局部免疫刺激作用。例如，濒死或坏死的肿瘤细胞可释放因子，例如高迁移率族蛋白和/或ATP，其反过来可刺激免疫细胞的免疫原性成熟。肿瘤部位的接种还可以诱导或增加肿瘤细胞质膜上的ER蛋白(例如，钙网蛋白)的异位表达，这反过来可以促进/增加该位点处的MHC类抗原呈递和肿瘤细胞的吞噬作用。
本发明的某些方法涉及用一个或更多个抗原性和/或免疫原性CD8+ T细胞表位接种脊索动物内的部位，可以与免疫佐剂的施用组合，无论是局部施用还是全身施用，以刺激对某些抗原的免疫应答，例如，本发明的组合物与一个或更多个免疫佐剂如细胞因子、细菌产物或植物皂苷的共同施用。可适用于本发明方法的免疫佐剂的其他实例包括铝盐和油，例如明矾、氢氧化铝、矿物油、角鲨烯、石蜡油、花生油和硫柳汞。
本发明的某些方法涉及在脊索动物中促进初始CD8+ T细胞的免疫原性交叉呈递和/或交叉引发。对于本发明的某些方法，交叉引发作为由本发明的细胞靶向分子引起的靶细胞的死亡和/或死亡方式的结果而发生，这使得促进濒死或死亡靶细胞中的细胞内抗原暴露于免疫监视机制。
因为多个异源CD8+ T细胞表位(作为货物或作为志贺毒素效应子多肽组分的嵌入或插入区域)可以由本发明的单个细胞靶向分子递送，本发明的细胞靶向分子的单个实施方案在具有不同MHC I类分子变体的相同物种的不同个体脊索动物中可以在治疗上是有效的，例如在具有不同HLA等位基因的人中。本发明的某些实施方案的这种能力可以允许基于MHC I类分子多样性和多态性，在单个细胞靶向分子内组合不同的CD8+ T细胞表位-肽，其在受试者的不同亚群中具有不同的治疗效果。例如，人MHC I类分子，HLA蛋白，基于遗传祖先在人类中是不同的，例如非洲人(撒哈拉以南)、美洲印第安人、高加索人、蒙古人、新几内亚人和澳大利亚人、或太平洋岛民。
可以从CMV抗原递送异源CD8+ T细胞表位的本发明的细胞靶向分子可能是特别有效的，因为大多数人群具有特异性的CD8+ T细胞组，其被引发以与CMV抗原反应并且不断抑制慢性CMV感染，使其一生中无症状。此外，由于与CMV相关的适应性免疫系统中与年龄相关的变化，例如可能更集中的针对CMV的免疫监视并且如更多老年人中T细胞抗原受体库的组成和相对CTL水平所示，老年人可能对CMV CD8+ T细胞表位的反应更快更强烈(参见例如Koch S等，Ann NY Acad Sci 1114：23-35(2007)；Vescovini R等，J Immunol 184：3242-9(2010)；Cicin-Sain L等，J Immunol 187：1722-32(2011)；等，Front Immunol 4：271(2013)；Pawelec G，Exp Gerontol 54：1-5(2014))。
C.细胞类型中的选择性细胞毒性
本发明的某些细胞靶向分子可用于在非靶向的旁观者细胞存在下选择性杀伤特定靶细胞。通过靶向免疫原性CD8+ T细胞表位货物到靶细胞的MHC I类途径的递送，所递送的CD8+ T细胞表位的随后呈递和CTL介导的表位呈递靶细胞的细胞溶解的TCR特异性调节可以限制为，在存在非靶向细胞的情况下优先杀伤选择的细胞类型。此外，通过各种志贺毒素效应子多肽的强效细胞毒性活性杀伤靶细胞可以限制为优先杀伤靶细胞，同时递送免疫原性T细胞表位货物和细胞毒性毒素效应子多肽。
对于某些实施方案，在将本发明的细胞靶向分子施用于细胞类型的混合物时，和不与细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型相比，细胞靶向分子能够选择性地杀伤与细胞外靶生物分子物理偶联的那些细胞。
对于某些实施方案，在将本发明的细胞靶向分子施用于细胞类型的混合物时，与不与细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型相比，细胞毒性细胞靶向分子能够选择性地杀伤与细胞外靶生物分子物理偶联的那些细胞。对于某些实施方案，本发明的细胞毒性细胞靶向分子能够选择性地或优先地引起两种或更多种不同细胞类型的混合物中特定细胞类型的死亡。这使得能够相对于不表达靶生物分子的“旁观者”细胞类型，细胞毒性活性以高优先性(例如3倍细胞毒性效应)靶向特定细胞类型，。或者，如果靶生物分子以足够低的量表达和/或以低量与非靶向的细胞类型物理偶联，则结合区域的靶生物分子的表达对一种细胞类型可以是非排他性的。这使得相对于不表达显著量的靶生物分子或不与显著量的靶生物分子物理偶联的“旁观者”细胞类型相比，特定细胞类型的靶向细胞杀伤具有高优先性(例如3倍细胞毒性效应)。
对于某些另外的实施方案，在将细胞毒性细胞靶向分子施用于两种不同的细胞类型群体后，细胞毒性细胞靶向分子能够引起细胞死亡，如由对靶细胞群体(该靶细胞群体的成员表达细胞毒性细胞靶向分子结合区域的细胞外靶生物分子)的半数最大细胞毒性浓度(CD50)所定义的，其剂量是相同细胞毒性细胞靶向分子对细胞群体(该细胞群体的成员不表达细胞毒性细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子)的CD50剂量的至少三倍低。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子针对与细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型群体的细胞毒性活性是针对不与结合区域的任何细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型群体的细胞毒性活性的至少3倍高。根据本发明，选择性细胞毒性可以以比例(a/b)来量化，其中为(a)针对与结合区域的靶生物分子物理偶联的特定细胞类型细胞群的细胞毒性与(b)针对不与结合区域的靶生物分子物理偶联的细胞类型细胞群的细胞毒性的比例。对于某些实施方案，细胞毒性比例指示选择性细胞毒性，对于与结合区域的靶生物分子物理偶联的细胞或细胞类型的群体，与不与结合区域的靶生物分子物理偶联的细胞或细胞类型的群体相比，其为至少3倍，5倍，10倍，15倍，20倍，25倍，30倍，40倍，50倍，75倍，100倍，250倍，500倍，750倍或1000倍高。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子的优先细胞杀伤功能或选择性细胞毒性是由于存在于本发明的细胞靶向分子中的额外外源物质(例如细胞毒性物质)和/或异源CD8+ T细胞表位，并不一定是细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽组分的催化活性的结果。
重要的是要注意，对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，在将细胞靶向分子施用于脊索动物时，细胞靶向分子可能通过享有共同的恶性病症而导致靶细胞附近和/或与靶细胞相关的非靶向细胞的死亡。由脊索动物内的靶细胞呈递某些T细胞表位可导致CTL介导的靶细胞杀伤，并且不呈递递送的表位但在表位呈递细胞附近的其他细胞的杀伤。另外，脊索动物内靶向肿瘤细胞呈递某些T细胞表位可导致分子间表位扩散，将肿瘤微环境重新编程为刺激性条件，从无反应性释放现有免疫细胞或去除对靶细胞或包含它们的受损组织的去敏化，并克服受试者免疫系统对非自身肿瘤抗原耐受的生理状态(参见章节Ⅹ.使用细胞靶向分子的方法等，见下文)。
将本发明的细胞靶向分子施用于脊索动物可以用于在体内“清除”特定细胞类型，例如通过免疫系统作用/刺激，如以靶向特异性-表位限制性CTL的形式杀伤靶细胞类型和/或呈递该表位的其他细胞类型，无论表位是由细胞靶向分子递送还是在施用前已经存在。
D.将额外的外源物质递送到靶细胞内部
除了直接杀伤细胞之外，本发明的细胞靶向分子任选地可以用于将额外的外源物质递送到靶细胞的内部。可以使用额外的外源物质的递送例如，用于细胞毒性，细胞抑制，免疫系统刺激，免疫细胞靶向，信息收集和/或诊断功能。本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的非细胞毒性变体，或任选的毒性变体，可用于将额外的外源物质递送至和/或标记与细胞靶向分子的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞内部。可以通过本发明的细胞靶向分子靶向将靶生物分子表达到至少一个细胞表面的各种类型的细胞和/或细胞群，用于接收外源物质。
因为本发明的细胞靶向分子，包括其无毒形式，能够进入与其结合区域识别的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可以用于将额外的外源物质递送到靶细胞类型的内部。在某种意义上，本发明的整个细胞靶向分子是将进入细胞的外源物质；因此，“额外的”外源物质是与核心细胞靶向分子本身连接的异源物质而不是核心细胞靶向分子本身。包含在某些情况下不刺激CTL介导的细胞杀伤的异源CD8+T细胞表位-肽的本发明的无毒细胞靶向分子，仍然可用于递送“良性”CD8+ T细胞表位肽，该“良性”CD8+ T细胞表位肽在MHC I类呈递时不导致细胞杀伤但允许信息收集，例如关于个体的免疫系统功能、MHC I类变体表达以及某个细胞中MHC I类系统的可操作性。
如本文所用的“额外的外源物质”是指一个或更多个分子，通常通常不存在于天然靶细胞内和/或以不需要的低水平存在，其中本发明的蛋白质可用于将这种物质特异性地转运到细胞内部。额外的外源物质的非限制性实例是细胞毒性剂、肽、多肽、蛋白质、多核苷酸、检测促进剂和小分子化学治疗剂。
在用于递送额外的外源物质的本发明蛋白质的某些实施方案中，额外的外源物质是细胞毒性剂，例如小分子化学治疗剂，细胞毒性抗生素，烷化剂，抗代谢物，拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。细胞毒性剂的非限制性实例包括氮丙啶、顺铂、四嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、长春花生物碱、紫杉烷、喜树碱、依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、阿柔比星、蒽环类抗生素、放线菌素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、多拉司他汀、美登素、多西他赛、阿霉素、加利车霉素(calicheamicin)、奥瑞他汀(auristatin)、吡咯并苯并二氮杂环庚三烯、卡铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、丝裂霉素C、紫杉醇、1,3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(BCNU)、利福平、顺铂、甲氨蝶呤和吉西他滨。
在某些实施方案中，所述额外的外源物质包含含有酶的蛋白或多肽。在某些其它实施方案中，所述额外外源物质是核酸，例如，作为小抑制RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)起作用的核糖核酸。在某些实施方案中，所述额外的外源物质是抗原，诸如从细菌蛋白、病毒蛋白、在癌症中突变的蛋白、在癌症中异常表达的蛋白或T-细胞互补决定区来源的抗原。例如，外源物质包括抗原，诸如被细菌感染的抗原呈递细胞所特有的那些抗原，和能够作为外源抗原发挥作用的T-细胞互补决定区。外源物质的其他实例包括大于抗原肽的多肽和蛋白质，例如酶。
在某些实施方案中，额外的外源物质包括促凋亡肽、多肽或蛋白质，例如，BCL-2、胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-6的片段)、细胞色素、粒酶B、凋亡诱导因子(AIF)、BAX、tBid(截短的Bid)和促凋亡片段或其衍生物(参见例如，Ellerby H等，Nat Med5：1032-8(1999)；Mai J等，Cancer Res 61：7709-12(2001)；Jia L等，Cancer Res 63：3257-62(2003)；Liu Y等，Mol Cancer Ther 2：1341-50(2003)；Perea S等，Cancer Res64：7127-9(2004)；Xu Y等，J Immunol 173：61-7(2004)；等，Cell Death Differ13：576-85(2006)；Wang T等，Cancer Res 67：11830-9(2007)；Kwon M等，Mol Cancer Ther7：1514-22(2008)；Shan L等，Cancer Biol Ther 11：1717-22(2008)；Qiu X等，Mol CancerTher 7：1890-9(2008)；Wang F等，Clin Cancer Res 16：2284-94(2010)；Kim J等，J Virol85：1507-16(2011))。/>
某些活性降低的志贺毒素效应子多肽可特别用于将额外的外源物质递送至靶细胞的某些细胞内位置或亚细胞区室。
E.用于诊断功能的信息收集
本发明的细胞靶向分子可用于信息收集功能。本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可用于使用对pMHC特异性的抗体，而对特异性pMHC I呈递细胞进行成像，该抗体识别在细胞表面与MHC I类分子复合的异源CD8+ T细胞表位-肽(由本发明的细胞靶向分子递送)。此外，本发明的某些细胞靶向分子可用于体外和/或体内检测特定细胞、细胞类型和/或细胞群。在某些实施方案中，本文所述的细胞靶向分子用于诊断和治疗，或单独用于诊断。
将本领域已知的检测促进剂与本发明的各种细胞靶向分子缀合的能力提供了用于检测癌症、肿瘤、生长异常、免疫和感染细胞的有用组合物。本发明的细胞靶向分子的这些诊断实施方案可用于通过本领域已知的各种成像技术和测定收集信息。例如，本发明的细胞靶向分子的诊断实施方案可用于通过对患者或活组织检查样本中的个体癌细胞、免疫细胞或感染细胞的细胞内细胞器(例如内吞区室、高尔基区室、内质网区室和细胞溶质区室)的成像进行信息收集。
可以使用本发明的细胞靶向分子的诊断实施方案收集各种类型的信息，无论是用于诊断用途还是其他用途。该信息可用于例如诊断肿瘤细胞亚型，确定特定细胞类型中的MHC I类途径和/或TAP系统功能，确定特定细胞类型中MHC I类途径和/或TAP系统功能随时间的变化，确定患者疾病的治疗敏感性，测定抗肿瘤治疗随时间的进展，测定免疫调节治疗随时间的进展，测定抗微生物治疗随时间的进展，评估移植材料中感染细胞的存在，评估移植材料中不需要的细胞类型的存在，和/或在手术切除肿瘤块后评估残留肿瘤细胞的存在。
例如，可以使用利用本发明的细胞靶向分子的诊断变体收集的信息来确定患者的亚群，然后可以基于使用那些诊断实施方案所揭示的其独特特征将个体患者分类为亚群。例如，特定药物或治疗的有效性可能是用于定义患者亚群的一种标准。例如，本发明的特定细胞毒性的细胞靶向分子的无毒诊断变体可用于区分哪些患者属于预测对本发明的相同细胞靶向分子的细胞毒性变体呈阳性反应的患者的类别或亚群。因此，使用本发明的细胞靶向分子(包括本发明的细胞毒性细胞靶向分子的无毒变体)进行患者鉴定、患者分级和诊断的相关方法被认为是在本发明的范围内。
Ⅳ.本发明的细胞靶向分子的蛋白质组分的多肽序列中的变化
技术人员将认识到，可以对本发明的上述细胞靶向分子和编码任何前者的多核苷酸进行变化，而不会减少它们的生物活性，例如，通过外源施用于靶细胞后，维持细胞靶向分子在将其异源CD8+ T细胞表位-肽货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径中的总体结构和功能。例如，有些修饰可以促进表达、促进纯化、改善药代动力学性能和/或改善免疫原性。这样的修饰是技术人员众所周知的，且包括，例如，将甲硫氨酸添加在氨基端以提供起始位点，将另外氨基酸放置在任一端上以产生方便地定位的限制位点或终止密码子，和使生化亲和标签与任一端融合以提供方便的检测和/或纯化。一种改善多肽的免疫原性的常见修饰是，在多肽生产以后，除去起始甲硫氨酸残基，所述甲硫氨酸残基可能在细菌宿主系统中生产过程中被甲酰基化，因为，例如，N-甲酰基甲硫氨酸(fMet)的存在可能在脊索动物中诱导不期望的免疫应答。
在本发明的细胞靶向分子的实施方案的某些变化形式中，必须维持结合区域的某些细胞靶向功能，以便显著保留靶生物分子结合的特异性和选择性。在本发明的细胞靶向分子的实施方案的某些变化形式中，可能需要保留志贺毒素效应子多肽的某些生物活性，例如，诱导细胞内化，细胞内发送到某些亚细胞区室(如能够进入MHC I类途径的区室)和/或将外源物质递送至靶细胞的某些亚细胞区室的能力。
在本文中还考虑在氨基端和/或羧基端包括另外的氨基酸残基，诸如生化标签或其它部分的序列。所述另外的氨基酸残基可以用于多种目的，包括，例如，促进克隆、表达、翻译后修饰、合成、纯化、检测和/或施用。生化标签和部分的非限制性例子是：壳多糖结合蛋白结构域、肠肽酶切割位点、因子Xa切割位点、FIAsH标签、FLAG标签、绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶部分、HA标签、麦芽糖结合蛋白结构域、myc标签、聚组氨酸标签、ReAsH标签、strep-标签、strep-标签II、TEV蛋白酶位点、硫氧还蛋白结构域、凝血酶切割位点和V5表位标签。
在某些上述实施方案中，本发明的细胞靶向分子的蛋白质序列或其多肽组分通过引入到蛋白或多肽组分中的一个或更多个保守氨基酸置换而变化，只要在外源施用于靶细胞后细胞靶向分子保留将其异源CD8+ T细胞表位-肽货物递送至靶细胞的MHC I类呈递系统的能力，使得利用技术人员已知的和/或本文描述的测定法可检测递送的CD8+ T细胞表位的递送和/或细胞表面MHC I类呈递。
如本文所用，术语“保守置换”表示一个或更多个氨基酸被另一个生物学上相似的氨基酸残基替换。例子包括具有相似特征(例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水氨基酸和芳族氨基酸)的氨基酸残基的置换(参见，例如，下文的表B)。使用通常不存在于内源哺乳动物肽和蛋白中的残基的保守置换的实例是利用例如鸟氨酸、刀豆氨酸、氨基乙基半胱氨酸或另一种碱性氨基酸对精氨酸或赖氨酸残基的保守置换。关于肽和蛋白中表型沉默置换相关的其它信息，参见，例如，Bowie J等,Science247:1306-10(1990)。
表B.保守氨基酸置换的实例
在上表B的保守取代方案中，示例性的保守氨基酸置换根据物理化学性质进行分组—I：中性的、亲水的；II：酸性和酰胺；III：碱性的；IV：疏水的；V：芳香族的、庞大氨基酸，VI亲水的、不带电荷的，VII脂族不带电荷的，VIII非极性的不带电荷的，IX环烯基相关的、X疏水的，XI极性的，XII小的，XIII允许转角的，和XIV柔性的。例如，保守氨基酸置换包括以下的：1)S可以置换C；2)M或L可以置换F；3)Y可以置换M；4)Q或E可以置换K；5)N或Q可以置换H；和6)H可以置换N。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子(例如细胞靶向融合蛋白)可包含本发明多肽区域的功能片段或变体，与本文所述的多肽序列相比，所述片段或变体最多具有20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个氨基酸残基置换，只要包含它的细胞靶向分子能够将其异源的CD8+ T细胞表位-肽货物递送到靶细胞的MHC I类呈递途径。通过改变一个或更多个氨基酸或缺失或插入一个或更多个氨基酸(例如在结合区域或志贺毒素效应子多肽组分内)来改变本发明的细胞靶向蛋白的多肽组分，以获得所需的性质(例如改变的细胞毒性，改变的细胞抑制作用，改变的免疫原性和/或改变的血清半衰期)，这样得到的本发明的细胞靶向分子的变体在本发明的范围内。本发明的细胞靶向分子或其多肽组分可以进一步具有或不具有信号序列。
因此，在某些实施方案中，当与比对序列相比时(其中，通过本领域已知的计算机同源程序进行比对)，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含与本文所述的或其他已知的结合区域具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，99.5％或99.7％的总体序列同一性的氨基酸序列，或基本上由其组成，只要结合区域作为细胞靶向分子的组分表现出合理量的细胞外靶标生物分子结合特异性和亲和力，例如，对靶生物分子表现出10-5至10-12摩尔/升的KD。
在某些实施方案中，当与比对序列相比时(其中，通过本领域已知的计算机同源程序进行比对)，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽区域包含与天然存在的毒素(例如志贺毒素A亚基，例如SEQ ID NO:1-18中的任一个)具有至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，99.5％或99.7％的总体序列同一性的氨基酸序列或基本上由其组成，只要志贺毒素效应子多肽作为细胞靶向分子的组分保留所需水平的志贺毒素效应子功能，该功能与细胞靶向分子的异源CD8+ T细胞表位-肽货物向至少一种靶细胞类型的MHC I类呈递途径的细胞内递送相关。
在某些实施方案中，可以改变本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽组分，以改变志贺毒素效应子多肽的酶活性和/或细胞毒性，只要志贺毒素效应子多肽作为细胞靶向分子的组分表现出所需水平的志贺毒素效应子功能，该功能与细胞靶向分子的CD8+T细胞表位-肽货物向至少一种靶细胞类型的MHC I类呈递途径的细胞内递送相关。这种变化可能会或可能不会导致志贺毒素效应子多肽或细胞靶向分子的细胞毒性发生变化，其中改变的志贺毒素效应子多肽是该细胞靶向分子的组分。通过突变或截短可以改变、降低或消除志贺毒素酶活性和细胞毒性。可能的改变包括选自下组的志贺毒素效应子多肽的突变：截短、缺失、倒位、插入、重排和取代，只要志贺毒素效应子多肽作为细胞靶向分子的组分保留所需水平的志贺毒素效应子功能，该功能关于将细胞靶向分子的异源CD8+ T细胞表位-肽货物细胞内递送到至少一种靶细胞类型的MHC I类呈递途径。
可以通过突变或截短来改变、降低或消除志贺毒素家族成员的A亚基的细胞毒性。本发明的细胞靶向分子各自包含志贺毒素A亚基效应子多肽区域，该区域为每个细胞靶向分子提供将细胞靶向分子的异源CD8+ T细胞表位-肽货物递送到至少一种靶细胞型的MHCI类呈递途径的能力，无论志贺毒素效应子多肽催化活性如何。如以下实施例中所示，志贺毒素效应子多肽的催化活性和细胞毒性可以与为本发明的细胞靶向分子提供将融合的异源CD8+ T细胞表位递送到靶细胞类型的MHC I类呈递途径的能力所需的其他志贺毒素效应子功能解偶联。因此，在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素效应子多肽组分被工程化，以显示减少或消除的志贺毒素细胞毒性，例如，由于相对于野生型志贺毒素A亚基存在涉及酶活性的一个或更多个关键残基的氨基酸残基突变。这提供了本发明的细胞靶向分子，其不通过细胞毒性的志贺毒素功能直接杀伤靶细胞。本发明的这种缺乏细胞毒性志贺毒素效应子多肽区域的细胞靶向分子可用于1)通过用于靶细胞MHC I类呈递的异源CD8+ T细胞表位-肽的递送实现细胞杀伤，2)通过将异源CD8+ T细胞表位-肽递送至靶细胞的MHC I类系统来刺激对靶细胞的期望的细胞间免疫细胞应答，和/或3)当靶细胞在所需的机制中没有缺陷时，用特异性CD8+ T细胞表位-肽/MHC I类分子复合物标记靶细胞。
可以通过突变或截短来降低或消除志贺毒素家族成员的A亚基的催化和/或细胞毒性活性。志贺毒素A亚基中酶活性和/或细胞毒性的最关键残基已经定位于以下残基位置：天冬氨酸-75，酪氨酸-77，谷氨酸-167，精氨酸-170，精氨酸-176和色氨酸-203等(Di R等，Toxicon 57：525-39(2011))。特别是，含有谷氨酸-E167-至-赖氨酸和精氨酸-176-至-赖氨酸突变的Stx2A双突变构建体完全失活；然而，Stx1和Stx2中的许多单突变显示细胞毒性降低10倍。标记为酪氨酸-77，谷氨酸-167，精氨酸-170，酪氨酸-114和色氨酸-203的位置已证明对Stx、Stx1和Stx2的催化活性是重要的(Hovde C等，Proc Natl Acad Sci USA 85：2568-72(1988)；Deresiewicz R等，Biochemistry 31：3272-80(1992)；Deresiewicz R等，Mol Gen Genet 241：467-73(1993)；Ohmura M等，Microb Pathog 15：169-76(1993)；Cao C等，Microbiol Immunol 38：441-7(1994)；Suhan M，Hovde C，Infect Immun 66：5252-9(1998))。突变谷氨酸-167和精氨酸-170在无细胞核糖体失活测定中消除了Slt-1 A1的酶活性(LaPointe P等，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。在内质网中使用Slt-1 A1的从头表达的另一种方法中，突变谷氨酸-167和精氨酸-170在表达水平消除了Slt-1 A1片段细胞毒性(LaPointe P等，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。
此外，将Stx1A截短至1-239或1-240降低了其细胞毒性，并且类似地，将Stx2A截短至保守的疏水性残基降低了其细胞毒性。在志贺毒素A亚基中结合真核生物核糖体和/或真核核糖体抑制的最关键残基已经定位于以下残基位置：精氨酸-172，精氨酸-176，精氨酸-179，精氨酸-188，酪氨酸-189，缬氨酸-191和亮氨酸-233等(McCluskey A等，PLoS One 7：e31191(2012))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，源自志贺毒素A亚基(例如SEQ IDNO:1-18中任一个)的或包含源自志贺毒素A亚基的组分的志贺毒素A亚基效应子多肽包含来自野生型志贺毒素多肽序列的改变，例如，一个或更多个下列氨基酸残基置换：第75位的天冬酰胺，第77位的酪氨酸，第114位的酪氨酸，第167位的谷氨酸，第170位的精氨酸，第176位的精氨酸，第202位的色氨酸，和/或第203位的色氨酸置换。技术人员基于现有技术已知这种置换的实例，例如第75位的天冬酰胺被置换为丙氨酸，第77位的酪氨酸被置换为丝氨酸，第114位的酪氨酸被置换为丙氨酸，第167位的谷氨酸被置换为天冬氨酸，第170位的精氨酸被置换为丙氨酸，第176位的精氨酸被置换为赖氨酸，和/或第203位的色氨酸被置换为丙氨酸。增强或降低志贺毒素A亚基效应子多肽酶活性和/或细胞毒性的其他突变也在本发明的范围内，并且可以使用本文公开的熟知技术和测定来确定。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其蛋白质组分包含一个或更多个翻译后修饰，例如磷酸化、乙酰化、糖基化、酰胺化、羟基化和/或甲基化(参见例如Nagata K等，Bioinformatics 30：1681-9(2014))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，可以突变、插入或缺失一个或更多个氨基酸残基，以便增加志贺毒素效应子多肽区域的酶活性，只要该细胞靶向分子能够将其异源CD8+ T细胞表位-肽货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径。例如，将Stx1A中的残基位置丙氨酸-231突变成谷氨酸增加其体外酶活性(Suhan M，Hovde C，Infect Immun 66：5252-9(1998))。
本发明的细胞靶向分子可任选地与一个或更多个另外的试剂缀合，所述试剂可包括本领域已知的治疗和/或诊断试剂，包括本文所述的试剂。
V.本发明的细胞靶向分子的生产、制备和纯化
可以使用本领域技术人员熟知的生物化学工程技术生产本发明的细胞靶向分子。例如，本发明的细胞靶向分子和/或其蛋白质组分可以通过标准合成方法，通过使用重组表达系统或通过任何其他合适的方法制备。因此，本发明的某些细胞靶向分子及其蛋白质组分可以以多种方式合成，包括例如，包括以下方法：(1)使用标准的固相或液相方法，逐步或通过片段组装来合成蛋白质的多肽或多肽组分，并分离和纯化最终的多肽或蛋白质化合物产物；(2)在宿主细胞中表达编码本发明细胞靶向分子的多肽或多肽组分的多核苷酸，并从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收表达产物；或(3)无细胞体外表达编码本发明细胞靶向分子的多肽或多肽组分的多核苷酸，并回收表达产物；或通过(1)，(2)或(3)方法的任何组合来获得肽组分的片段，随后结合(例如连接)片段以获得肽组分，并回收肽组分。例如，多肽和/或肽组分可以使用偶联剂连接在一起，例如N,N'-二环己基碳二亚胺和N-乙基-5-苯基-异噁唑鎓-3'-磺酸盐(Woodward试剂K)。
优选通过固相或液相肽合成来合成本发明的细胞靶向分子或细胞靶向分子的蛋白质组分。本发明的细胞靶向分子及其组分可适当地通过标准合成方法制备。因此，肽可以通过例如以下方法来合成，该方法包括通过标准固相或液相方法、逐步或通过片段组装来合成肽，并分离和纯化最终的肽产物。在本文中，可以参考WO1998/11125，或者尤其是Fields G等，Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis(SyntheticPeptides，Grant G编辑，Oxford University Press,U.K.，第二版，2002)及其中的合成实例。
使用本领域熟知的重组技术，可以制备(生产和纯化)作为融合蛋白的本发明的细胞靶向分子。通常，通过培养用包含编码多核苷酸的载体转化或转染的宿主细胞并从细胞培养物中回收蛋白质来制备蛋白质的方法描述于例如，Sambrook J等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,U.S.,1989)；Dieffenbach C等，PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press,N.Y.,U.S.,1995)。任何合适的宿主细胞可用于生产本发明的细胞靶向蛋白或本发明的细胞靶向分子的蛋白质组分。宿主细胞可以是用一个或更多个表达载体稳定或瞬时转染、转化，转导或感染的细胞，所述表达载体驱动本发明的细胞靶向分子和/或其蛋白质组分的表达。另外，本发明的细胞靶向分子可以通过修饰编码本发明的细胞靶向蛋白或本发明的细胞靶向分子的蛋白质组分的多核苷酸来生产，该修饰导致改变一个或更多个氨基酸，或缺失或插入一个或更多个氨基酸，以获得所需的性质，例如改变的细胞毒性，改变的细胞抑制作用和/或改变的血清半衰期。
可以选择多种表达系统来生产本发明的细胞靶向分子。例如，用于表达本发明的细胞靶向蛋白的宿主生物包括原核生物(例如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、真核细胞(例如酵母和丝状真菌(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、泡盛曲霉(A.awamori)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis))、藻类(如莱茵衣藻(C.reinhardtii)))、昆虫细胞系、哺乳动物细胞(如CHO细胞)、植物细胞系和真核生物(如转基因植物(如拟南芥(A.thaliana)和本塞姆氏烟草(N.benthamiana))(见例如，Zarschler K等，Microbial Cell Factories 12：97(2013))。
因此，本发明还提供了根据上述方法制备本发明的细胞靶向分子的方法，该方法使用(i)编码本发明分子或本发明细胞靶向分子的多肽组分的部分或全部的多核苷酸，(ii)包含至少一个本发明的多核苷酸的表达载体，当将其引入合适的宿主细胞或无细胞表达系统时，所述多核苷酸能够编码本发明分子或其多肽组分的的部分或全部，和/或(iii)包含本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
当在宿主细胞或无细胞系统中使用重组技术表达蛋白质时，有利的是将所需蛋白质与其他组分(例如宿主细胞因子)分离(或纯化)以便获得具有高纯度或基本上均质的制剂。纯化可以通过本领域熟知的方法完成，例如离心技术、萃取技术、层析和分馏技术(例如通过凝胶过滤的尺寸分离，通过离子交换柱的电荷分离，疏水相互作用层析法，反相层析法，在二氧化硅或阳离子交换树脂如DEAE等上的层析法，层析聚焦和蛋白A琼脂糖层析法，以除去污染物)和沉淀技术(例如乙醇沉淀或硫酸铵沉淀)。可以使用任何数量的生化纯化技术来提高本发明的细胞靶向分子的纯度。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子可任选地以同源多聚体形式(例如两个或更多个相同的本发明的细胞靶向分子的稳定复合物)或以异多聚体形式(例如两个或更多个不相同的本发明的细胞靶向分子的稳定复合物)纯化。
在以下实施例中描述了用于生产本发明的细胞靶向分子或其多肽组分的方法的非限制性实例，以及用于生产本发明的示例性细胞靶向分子的具体但非限制性方面。
Ⅵ.包含本发明的细胞靶向分子的药物和诊断组合物
本发明提供了细胞靶向分子，其单独地或与一个或更多个另外的治疗剂组合地在药物组合物中用于治疗或预防以下更详细地描述的病症、疾病、障碍或症状(例如癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫障碍和微生物感染)。本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的细胞靶向分子或根据本发明的其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以包含同源多聚体和/或异源多聚体形式的本发明的细胞靶向分子。该药物组合物可用在治疗、改善、或预防以下更详细地描述的疾病、病患、病症或症状的方法中。考虑到根据本发明的药物组合物的用途，每种这样的疾病、病症、障碍或症状被设想为单独的实施方案。本发明还提供了用于至少一种根据本发明的治疗方法中的药物组合物，如下文更详细描述的。
本文中使用的术语“患者”和“受试者”互换使用，指任何生物，通常是脊椎动物，例如人和动物，其呈现至少一种疾病、障碍或病症的症状、体征和/或适应症。这些术语包括哺乳动物，诸如灵长类动物、家畜动物(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、伴侣动物(例如猫、狗等)和实验动物(例如小鼠、兔、大鼠等)的非限制性例子。
本文中使用的“治疗(treat，treating，treatment)”及其语法变体表示用于获得有益的或期望的临床结果的方案。该术语可以表示延缓病症、障碍或疾病的发作或发展速度，减轻或缓解与其有关的症状，产生病症的全部或部分消退，或者以上任何的某种组合。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括、但不限于：症状的减轻或缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定(例如不恶化)、疾病进展的推迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以是指相对于在不接受治疗的情况下预期的存活时间延长存活。因此，需要治疗的受试者(例如人)可以是已经罹患所讨论的疾病或障碍的受试者。术语“治疗”包括相对于不存在治疗的情况抑制或减轻病理学状态或症状的严重性的增加，并且不一定意味着暗示相关疾病、障碍或病症的完全停止。关于肿瘤和/或癌症，治疗包括减少总肿瘤负荷和/或单个肿瘤大小。
本文中使用的术语“预防(prevent，preventing，prevention)”及其语法变体表示用于预防病症、疾病或障碍的发展或者改变病症、疾病或障碍的病理学的方案。因此，“预防”可以表示预防或防止措施。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括、但不限于：预防或减慢疾病的症状、进展或发展，无论是否是可检测的还是不可检测的。因此，需要预防的受试者(例如人)可以是尚未罹患所讨论的疾病或病症的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗的情况减慢疾病的发作，并且不一定意图暗示相关病症、疾病或障碍的永久性预防。因此，在某些情况下，病症的“预防”可以表示降低发展病症的风险，或者预防或延迟与该病症有关的症状的发展。
本文中使用的“有效量”或“治疗有效量”是在受试者中产生至少一种期望的治疗效果的组合物(例如治疗组合物或试剂)的量或剂量，所述治疗效果诸如预防或治疗目标病症或有益地缓解与该病症有关的症状。最理想的治疗有效量是对于有此需要的给定受试者，将产生本领域技术人员选择的特定治疗的所需功效的量。该量将随技术人员理解的多种因素变化，包括但不限于，治疗化合物的特征(包括活性、药代动力学、药效动力学和生物利用度)，受试者的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型、疾病阶段、一般身体状况、对给定剂量的应答性、和药物的类型)，制剂中一种或更多种药学上可接受的载体的性质，和施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对化合物的施用的应答并且相应地调节剂量(参见例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy(Gennaro A编辑,Mack Publishing Co.,Easton,PA,U.S.,第19版,1995))。
本发明的药物组合物任选地包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括精氨酸、精氨酸硫酸盐、柠檬酸、甘油、盐酸、甘露醇、甲硫氨酸、聚山梨醇酯、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖和/或水。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含含水载体和至少一种药学上可接受的赋形剂。在某些其他实施方案中，本发明的药物组合物包含盐和/或粉末，例如冷冻干燥的，冻干的，和/或脱水的组合物，其包含至少一种药学上可接受的赋形剂。在本发明药物组合物的某些实施方案中，赋形剂的作用是降低和/或限制细胞靶向分子的免疫原性和/或免疫原性潜力，例如，在施用于和/或重复施用于哺乳动物后。
本发明的药物组合物可包含一种或更多种佐剂，例如缓冲剂，张力调节剂(等渗剂)、抗氧化剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂、冷冻保护剂、润湿剂和/或分散剂或本领域技术人员熟知的其他添加剂，例如，结合剂。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含含水载体和药学上可接受的佐剂或其他添加剂。在某些其他实施方案中，本发明的药物组合物包含盐和/或粉末，例如冷冻干燥的、冻干的和/或脱水的组合物，其包含药学上可接受的佐剂或其他添加剂。药学上合适的稳定剂的非限制性实例包括人白蛋白和聚山梨醇酯，例如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(聚山梨醇酯20)，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨醇酯40)，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(聚山梨醇酯60)和聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(聚山梨醇酯80)。
本发明的药物组合物可包含一种或更多种药学上可接受的缓冲液。合适的缓冲剂的非限制性实例包括乙酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、组氨酸、磷酸盐、柠檬酸钠和琥珀酸盐缓冲液。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含含水载体，其包含药学上可接受的缓冲液。在某些其他实施方案中，本发明的药物组合物包含盐和/或粉末，例如冷冻干燥的、冻干的和/或脱水的组合物，其包含药学上可接受的缓冲液。
本发明的药物组合物可包含一种或更多种药学上可接受的等渗剂或张力调节剂。合适的等渗剂的非限制性实例包括糖(例如葡萄糖)，糖醇、氯化钠等。合适的糖的其他实例包括二糖如蔗糖和海藻糖。示例性的药学上可接受的糖醇包括甘油、甘露醇和山梨糖醇。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含含水载体和药学上可接受的等渗剂。在某些其他实施方案中，本发明的药物组合物包含盐和/或粉末，例如冷冻干燥的，冻干的和/或脱水的组合物，其包含药学上可接受的等渗剂。
本发明的药物组合物可包含一种或更多种药学上可接受的抗氧化剂。示例性的药学上可接受的抗氧化剂包括水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、甲硫氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含含水载体和药学上可接受的抗氧化剂。在某些其他实施方案中，本发明的药物组合物包含盐和/或粉末，例如冷冻干燥的、冻干的和/或脱水的组合物，其包含药学上可接受的抗氧化剂。
本发明的药物组合物可包含一种或更多种药学上可接受的表面活性剂和/或乳化剂(乳化剂)。合适的表面活性剂和/或乳化剂的非限制性实例包括聚山梨醇酯，例如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨醇酯40)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(聚山梨醇酯60)和(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(聚山梨醇酯80)。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含含水载体和药学上可接受的表面活性剂和/或乳化剂。在某些其它实施方案中，本发明的药物组合物包括盐和/或粉末，例如冷冻干燥的、冻干的和/或脱水的组合物，其包含药学上可接受的表面活性剂和/或乳化剂。在本发明的药物组合物中还可能需要一种或更多种表面活性剂和/或乳化剂，以助于防止本发明的细胞靶向分子聚集。本发明的药物组合物可包含一种或更多种药学上可接受的防腐剂。例如，通过灭菌程序和通过在本发明的组合物中包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)可以确保防止出现微生物。
本发明的药物组合物可包含一种或更多种药学上可接受的冷冻保护剂，也称为低温保护剂。合适的冷冻保护剂的非限制性实例包括乙二醇、甘油、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含含水载体和药学上可接受的冷冻保护剂。在某些其他实施方案中，本发明的药物组合物包含盐和/或粉末，例如冷冻干燥的、冻干的和/或脱水的组合物，其包含药学上可接受的冷冻保护剂。
另外，可以通过包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐、单硬脂酸铝和/或明胶，来延长可注射药物形式的吸收。
另一方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的不同多肽和/或细胞靶向分子中的一种或组合，或前述任一种的酯、盐或酰胺，和至少一种药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物的pH可以用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠，或用含有乙酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、组氨酸、柠檬酸钠、琥珀酸盐、磷酸盐等的缓冲液调节。用于本发明药物组合物的药学上可接受的溶剂或载体的非限制性实例包括含有本发明的细胞靶向分子和缓冲液(例如分别调节到pH 5.0、6.0、7.0或4.0的柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐或琥珀酸盐)的水溶液。本发明的某些实施方案包括含有本发明的上述溶剂和/或载体之一的组合物。
用于皮内或皮下应用的溶液或悬浮液的本发明药物组合物通常包括以下一个或更多个：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、甲硫氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠等；螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸、山梨糖醇、酒石酸和磷酸；表面活性剂，例如聚山梨醇酯；缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲液；和张力调节剂，例如葡萄糖、甘油、甘露醇、氯化钠、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖。这些制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
无菌可注射溶液可以通过将本发明的蛋白质或细胞靶向分子以所需的量掺入适当的溶剂中(根据需要具有上述成分中的一种或组合)，然后进行无菌微滤来制备。可以通过将活性化合物掺入含有分散介质和其他成分(例如上述那些)的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从活性成分和任何其他所需成分的无菌过滤溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含含有山梨糖醇、海藻糖、柠檬酸钠和聚山梨醇酯-20的粉末，并且任选地，还包含甘油和/或甲硫氨酸。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含柠檬酸钠、海藻糖和聚山梨醇酯-20，并且任选地，还包含甘油和/或甲硫氨酸。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含山梨糖醇、柠檬酸钠和聚山梨醇酯-20，并且任选地，还包含白蛋白、甘油和/或甲硫氨酸。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含山梨糖醇、组氨酸和聚山梨醇酯-20，并且任选地，还包含白蛋白、甘油和/或甲硫氨酸。
本发明的药物组合物的制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。以这种形式，将组合物分成含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，该包装含有离散量的制剂，例如，包装的片剂、胶囊和在小瓶或安瓿瓶中的粉剂。单位剂型还可以是胶囊、扁囊剂或片剂本身，或者它可以是适当数量的这些包装形式中的任一种。它可以以单次剂量可注射形式例如以笔的形式提供。可以配制组合物用于任意合适的施用途径和方式。皮下或透皮施用模式可以特别适用于本文描述的药物组合物和治疗分子。
治疗组合物在制造和储存条件下通常是无菌和稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、醇(如乙醇)、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、或任何合适的混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，通过在分散的情况下保持所需的粒度和通过使用根据本领域熟知的配方化学的表面活性剂，可以保持适当的流动性。在某些实施方案中，在组合物中可能需要等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
用于皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包括以下一个或更多个：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和张力调节剂，例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)或含有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐等的缓冲液调节pH。这些制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
无菌可注射溶液可以通过将本发明的细胞靶向分子以所需的量掺入适当的溶剂中(根据需要具有上述成分中的一种或组合)，然后进行无菌微滤来制备。可以通过将活性化合物掺入含有分散介质和其他成分(例如上述那些)的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从活性成分和任何其他所需成分的无菌过滤溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
当治疗有效量的本发明的细胞靶向分子被设计为通过例如静脉、皮肤或皮下注射给药时，结合剂将是无热原的、肠胃外可接受的水溶液形式。考虑到适当的pH、等渗性、稳定性等，制备肠胃外可接受的蛋白质溶液的方法在本领域技术范围内。用于静脉、皮肤或皮下注射的优选药物组合物除了结合剂外还含有等渗媒介物，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液或本领域已知的其它媒介物。本发明的药物组合物还可含有稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂或本领域技术人员熟知的其它添加剂。
如本文其他地方所述，可以用载体制备本发明的细胞靶向分子或其组合物(例如药物或诊断组合物)，所述载体将保护本发明的细胞靶向分子免于快速释放，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法是专利的或本领域技术人员通常已知的(参见例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems(Robinson J编辑，Marcel Dekker,Inc.,NY,U.S.,1978)。
在某些实施方案中，可以配制本发明的组合物(例如药物或诊断组合物)以确保所需的体内分布。例如，血脑屏障排除了许多大的和/或亲水的化合物。为了将本发明的治疗分子或组合物靶向特定的体内位置，可将其配制在例如脂质体中，所述脂质体可以包含一个或更多个选择性转运到特定细胞或器官中的部分，从而增强靶向性药物递送。示例性靶向部分包括叶酸或生物素、甘露糖苷、抗体、表面活性剂蛋白A受体、p120连环蛋白等。
药物组合物包括设计用作植入物或颗粒系统的肠胃外制剂。植入物的实例是由聚合物或疏水组分如乳液、离子交换树脂和可溶性盐溶液组成的贮库制剂。颗粒系统的实例是微球、微粒、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。控释制剂可以使用对离子敏感的聚合物制备，比如例如脂质体、polaxamer407和羟基磷灰石。
可以使用本领域已知的技术生产本发明的药物组合物，使得所生产的组合物包含乳液、脂质体、类脂质体(niosome)、聚合物纳米颗粒和/或固体脂质纳米颗粒(SLN)(参见例如Lakshmi P等，Venereal Leprol 73：157-161(2007)；A Revolution in Dosage FormDesign and Development,Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems(Sezer A编辑，InTech，2012))。
本发明的诊断组合物包含本发明的细胞靶向分子和一个或更多个检测促进剂。本领域已知各种检测促进剂，例如同位素、染料、比色剂、对比增强剂、荧光剂、生物发光剂和磁性剂。这些试剂可以在任何合适的位置掺入本发明的细胞靶向分子中，只要保留必需的功能活性即可。例如，检测促进剂的连接或掺入可以通过本发明的细胞靶向分子的氨基酸残基或通过本领域已知的某种类型的连接，包括通过接头和/或螯合剂。检测促进剂与本发明的诊断组合物的细胞靶向分子的结合是这样的，即在细胞靶向分子内化后能够在筛选、测定、诊断程序和/或成像技术中检测细胞靶向分子和/或其靶细胞的存在。
技术人员已知有许多检测促进剂，其可与本发明的细胞靶向分子可操作地关联或连接，用于信息收集方法，例如用于生物体的疾病、障碍或病症的诊断和/或预后应用。例如，检测促进剂包括图像增强造影剂，例如荧光染料(例如Alexa680、吲哚菁绿和Cy5.5)、同位素和放射性核素(例如11C、13N、15O、18F、32P、51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、73Se、75Br、76Br、82mRb、83Sr、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、110In、111In、120I、123I、124I、125I、131I、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、177Lu、186Re、188Re和223R)；顺磁离子，如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)；金属，如镧(III)、金(III)、铅(II)和铋(III)；超声造影增强剂，如脂质体；不透射线的试剂，如钡、镓和铊化合物。检测促进剂可以通过使用中间官能团直接或间接掺入，例如螯合剂(如2-苄基DTPA、PAMAM、NOTA、DOTA、TETA)、其类似物和任何前述的功能等同物。
本领域技术人员已知有许多成像方法，例如医学领域中常用的非侵入性体内成像技术，例如：计算机断层摄影术成像(CT扫描)、光学成像(包括直接的、荧光的和生物发光的成像)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)、超声和X射线计算机断层摄影术成像。
短语“诊断上足够的量”是指通过所使用的特定测定或诊断技术为信息收集目的提供充分检测和准确测量的量。通常，对于整个生物体体内诊断用途，诊断上足够的量将是每个受试者每千克(kg)受试者0.001mg至1mg连接到细胞靶向分子的检测促进剂的非累积剂量(mg/kg)。然而，对于整个生物体体内诊断用途，诊断上足够的量可以是每个受试者每千克(kg)受试者0.0001mg至10mg连接到细胞靶向分子的检测促进剂的非累积剂量(毫克/千克)。通常，在这些信息收集方法中使用的本发明的细胞靶向分子的量将尽可能低，只要它仍然是诊断上足够的量。例如，对于生物体内的体内检测，施用于受试者的本发明的细胞靶向分子或诊断组合物的量将尽可能低。
Ⅶ.生产或制备包含本发明的细胞靶向分子的药物和/或诊断组合物
本发明的任何细胞靶向分子的药学上可接受的盐或溶剂化物同样在本发明的范围内。
在本发明的上下文中，术语“溶剂化物”是指在溶质(这里指的是根据本发明的细胞靶向分子或其药学上可接受的盐)和溶剂之间形成的限定化学计量的络合物。在这方面，溶剂可以是例如水、乙醇或另一种药学上可接受的通常是小分子的有机物质，例如但不限于乙酸或乳酸。当所述溶剂是水时，这种溶剂化物通常称为水合物。
本发明的细胞靶向分子或其盐可以配制成制备用于储存或施用的药物组合物，其通常在药学上可接受的载体中包含治疗有效量的本发明化合物或其盐。术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体。用于治疗用途的药学上可接受的载体在制药领域中是熟知的，并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.(A.Gennaro编辑，1985))中。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理学上可接受的，即相容的溶剂、分散介质、包衣、抗微生物剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或稀释剂包括用于适于口服、直肠、鼻或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内和透皮)给药的制剂中的那些。示例性的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。可用于本发明药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油，如橄榄油和可注射的有机酯，如乙酸乙酯。例如可以通过使用包衣材料，比如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需要的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。在某些实施方案中，载体适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于所选择的施用途径，蛋白质或其他药物组分可以涂覆以旨在保护化合物免受低pH作用和当通过特定的施用途径给予患者时活性蛋白质可能遇到其他天然灭活条件的材料。
本发明的药物组合物的制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。在这种形式中，将组合物分成含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，该包装含有离散量的制剂，例如包装的片剂、胶囊和小瓶或安瓿中的粉末。单位剂型也可以是胶囊、扁囊剂或片剂本身，或者它可以是适当数量的任何这些包装形式。它可以以单剂量可注射形式提供，例如以笔的形式提供。可以配制组合物用于任何合适的途径和给药方式。皮下或透皮给药方式可特别适用于本文所述的药物组合物和治疗分子。
本发明的药物组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌程序和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)可以确保防止出现微生物。在组合物中的等渗剂(如糖、氯化钠等)也是理想的。此外，通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以延长可注射药物形式的吸收。
本发明的药物组合物还任选地包含药学上可接受的抗氧化剂。示例性的药学上可接受的抗氧化剂是水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)，卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
另一方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的不同细胞靶向分子中的一种或组合，或前述任一种的酯、盐或酰胺，和至少一种药学上可接受的载体。
治疗组合物在制造和储存条件下通常是无菌和稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、醇(如乙醇)、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、或任何合适的混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，通过在分散的情况下保持所需的粒度和通过使用根据本领域熟知的配方化学的表面活性剂，可以保持适当的流动性。在某些实施方案中，在组合物中可能需要等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
用于皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包括以下一个或更多个：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和张力调节剂，例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)或含有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐等的缓冲液调节pH。这些制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
无菌可注射溶液可以通过将本发明的细胞靶向分子以所需的量掺入适当的溶剂中(根据需要具有上述成分中的一种或组合)，然后进行无菌微滤来制备。可以通过将活性化合物掺入含有分散介质和其他成分(例如上述那些)的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从活性成分和任何其他所需成分的无菌过滤溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
当治疗有效量的本发明的细胞靶向分子被设计为通过例如静脉、皮肤或皮下注射给药时，结合剂将是无热原的、肠胃外可接受的水溶液形式。考虑到适当的pH、等渗性、稳定性等，制备肠胃外可接受的蛋白质溶液的方法在本领域技术范围内。用于静脉、皮肤或皮下注射的优选药物组合物除了结合剂外还含有等渗媒介物，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液或本领域已知的另一媒介物。本发明的药物组合物还可含有稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂或本领域技术人员熟知的其它添加剂。
如本文其他地方所述，可以用载体制备本发明的细胞靶向分子或其组合物(例如药物或诊断组合物)，所述载体将保护细胞靶向分子免于快速释放，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法是专利的或本领域技术人员通常已知的(参见例如Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems(Robinson J编辑，Marcel Dekker,Inc.,NY,U.S.,1978)。
在某些实施方案中，可以配制本发明的组合物(例如药物或诊断组合物)以确保所需的体内分布。例如，血脑屏障排除了许多大的和/或亲水的化合物。为了将本发明的治疗性细胞靶向分子或组合物靶向特定的体内位置，可将其配制在例如脂质体中，所述脂质体可以包含一个或更多个选择性转运到特定细胞或器官中的部分，从而增强靶向性药物递送。示例性靶向部分包括叶酸或生物素、甘露糖苷、抗体、表面活性剂蛋白A受体、p120连环蛋白等。
药物组合物包括设计用作植入物或颗粒系统的肠胃外制剂。植入物的实例是由聚合物或疏水组分如乳液、离子交换树脂和可溶性盐溶液组成的贮库制剂。颗粒系统的实例是微球、微粒、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒(参见例如Honda M等，Int J Nanomedicine 8：495-503(2013)；Sharma A等，Biomed Res Int 2013：960821(2013)；Ramishetti S，HuangL，Ther Deliv 3：1429-45(2012))。控释制剂可以使用对离子敏感的聚合物制备，比如例如脂质体、polaxamer 407和羟基磷灰石。
Ⅷ.本发明的多核苷酸、表达载体和宿主细胞
除了本发明的细胞靶向分子和它们的多肽组分之外，编码本发明的多肽和细胞靶向分子或其功能部分的多核苷酸也包括在本发明的范围内。术语“多核苷酸”等同于术语“核酸”，其中每者包括以下一个或更多个：脱氧核糖核酸(DNA)的聚合物、核糖核酸(RNA)的聚合物，这些DNA的类似物或使用核苷酸类似物产生的RNA，及其衍生物、片段和同系物。本发明的多核苷酸可以是单链、双链或三链。这些多核苷酸具体公开为包括能够编码示例性蛋白质的所有多核苷酸，例如，考虑已知在RNA密码子的第三位置耐受的摆动，但编码与不同RNA密码子相同的氨基酸(参见Stothard P,Biotechniques 28:1102-4(2000))。
一方面，本发明提供了编码本发明的细胞靶向分子(例如融合蛋白)或其多肽片段或衍生物的多核苷酸。多核苷酸可包括例如编码多肽的核酸序列，所述多肽与包含该蛋白的氨基酸序列之一的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或者更高的同一性。本发明还包括多核苷酸，其包含在严格条件下与编码本发明的细胞靶向分子或其多肽片段或衍生物的多核苷酸杂交的核苷酸序列，或任何此类序列的反义或互补序列。
本发明的细胞靶向分子的衍生物或类似物尤其包括，具有与本发明的多核苷酸、细胞靶向分子或细胞靶向分子的多肽组分基本上同源的区域的多核苷酸(或多肽)分子，例如相对于相同大小的多核苷酸(或多肽)序列或与通过本领域已知的计算机同源程序进行比对的比对序列相比至少约45％、50％、70％、80％、95％、98％或甚至99％的同一性(优选同一性为80-99％)。示例性程序是GAP程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for UNIX,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison,WI,U.S.)，使用默认设置，其使用Smith T,Waterman M,Adv Appl Math 2:482-9(1981)的算法。还包括能够在严格条件下与编码本发明的细胞靶向分子的序列的互补序列杂交的多核苷酸(参见例如Ausubel F等,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,New York,NY,U.S.,1993))及以下。严格条件是本领域技术人员已知的，并且可以在Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,NY,U.S.,Ch.Sec.6.3.1-6.3.6(1989))中找到。
本发明进一步提供了包含本发明范围内的多核苷酸的表达载体。能够编码本发明的细胞靶向分子或其多肽组分的多核苷酸可以使用本领域熟知的材料和方法插入已知载体，包括细菌质粒、病毒载体和噬菌体载体，以产生表达载体。此类表达载体将包括支持在任何选择的宿主细胞或无细胞表达系统(例如pTxb1和pIVEX2.3)内产生本发明的预期的细胞靶向分子所必需的多核苷酸。包含用于特定类型的宿主细胞或无细胞表达系统的表达载体的特定多核苷酸是本领域普通技术人员所熟知的，可以使用常规实验来确定，或可以购买。
如本文所用的术语“表达载体”是指包含一个或更多个表达单元的线性或环状多核苷酸。术语“表达单元”表示多核苷酸片段，所述多核苷酸片段编码目的多肽，并且能够在宿主细胞中提供核酸片段的表达。表达单元通常包含转录启动子、编码目的多肽的开放阅读框和转录终止子，全部为可操作的构型。表达载体包含一个或更多个表达单元。因此，在本发明的上下文中，编码本发明的细胞靶向分子(例如与T细胞表位-肽融合的志贺毒素效应子多肽遗传重组的scFv)的表达载体包括至少一个用于单多肽链的表达单元，而包含两个或更多个多肽链(一条链包含VL结构域并且第二条链包含与毒素效应子区域连接的VH结构域)的蛋白质包含至少两个表达单元，所述蛋白质的两条多肽链各自一个。为了表达本发明中多链的细胞靶向蛋白，每条多肽链的表达单元也可以分别包含在不同的表达载体上(例如表达可以用单个宿主细胞实现，其中每条多肽链的表达载体都被引入该宿主细胞中)。
能够指导多肽和蛋白质的瞬时或者稳定表达的表达载体是本领域所熟知的。表达载体通常包含但不限于以下一种或更多种：异源信号序列或信号肽、复制起点、一个或更多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，它们各自是本领域所熟知的。可以使用的任选的调节控制序列、整合序列和有用的标志物是本领域所熟知的。
无细胞系统可用于生产本发明的细胞靶向分子(参见例如Jaing X等,FEBS Lett514:290-4(2002)；Kawasaki T等,Eur J Biochem 270:4780-6(2003)；Ali M等,J BiosciBioeng 99:181-6(2005)；Galeffi P等,J Transl Med4:39(2006)；Han Y等,BiotechnolProg 22:1084-9(2006)；Schenk J等,Biochimie 89:1304-11(2007)；Oh I等,BioprocBiosyst Eng 33 127-32(2010)；Merk H等,BioTechniques 53:153-60(2012)；Stech M等,J Biotechnol 164:220-31(2012)；Yin G等,mAbs 4:217-25(2012)；Groff D等,mAbs 6:671-8(2014)；Stech M等,Eng Life Sci 14:387-98(2014)；Stech M,Kubick S,Antibodies 4:12-33(2015)；Thoring L等,Sci Rep 7:11710(2017)；Stech M等,Sci Rep7:12030(2017))。
术语“宿主细胞”是指能够支持表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如酵母、昆虫细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞或哺乳动物细胞)。包含本发明多核苷酸或能够生产本发明的细胞靶向分子或其多肽组分的宿主细胞系的产生和分离，可以使用本领域已知的标准技术完成。
本发明范围内的细胞靶向分子可以是本文所述多肽和蛋白质的变体或衍生物，所述变体或衍生物如下产生：通过改变一个或更多个氨基酸或缺失或插入一个或更多个氨基酸而对编码多肽和/或蛋白质的多核苷酸进行修饰，使其更适合实现所需的特性(如宿主细胞更优化的表达)。
Ⅸ.递送装置和试剂盒
在某些实施例中，本发明涉及一种装置，所述装置包含本发明物质的一个或更多个组合物，例如药物组合物，用于递送至需要其的受试者。因此，包含一个或更多个本发明化合物的递送装置可用于通过各种递送方法向患者施用本发明的物质组合物，包括：静脉注射、皮下注射、肌肉注射或腹腔注射；口服；透皮施用；肺部或经粘膜施用；植入、渗透泵、药筒或微型泵施用；或者通过本领域技术人员认可的其他方式。
同样在本发明范围内的是包含至少一种本发明的物质组合物的试剂盒，以及任选的包装和使用说明书。试剂盒可用于药物施用和/或诊断信息收集。本发明的试剂盒可任选地包含至少一种另外的试剂(例如，标准品、标志物等)。试剂盒通常包括标签，该标签指示试剂盒内容物的预期用途。试剂盒可以进一步包含试剂和其他工具，用于检测样品或受试者中的细胞类型(例如肿瘤细胞)，或用于诊断患者是否属于治疗策略应答组，该治疗策略利用本发明的细胞靶向分子或其组合物，或如本文所述的本发明的相关方法。
Ⅹ.使用本发明的细胞靶向分子及其药物组合物和/或诊断组合物的方法
通常，本发明的目的是提供药理学活性剂，以及包含其的组合物，所述活性剂和组合物可用于预防和/或治疗疾病、障碍和病症，例如本文提到的某些癌症、肿瘤、生长异常、免疫障碍或其它病理状况。因此，本发明提供了使用本发明的细胞靶向分子、药物组合物和诊断组合物用于以下的方法：将CD8+ T细胞表位-肽货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，靶向杀伤特定细胞，用特异性pMHC I和/或靶细胞的特定内部区室标记靶细胞的细胞表面，收集诊断信息以及治疗如本文所述的疾病、障碍和病症。例如，本发明的方法可用作免疫疗法以预防或治疗癌症、癌症起始、肿瘤起始、转移和/或癌症疾病复发。
特别地，本发明的目的是提供药理学活性剂、组合物和/或方法，其与本领域目前已知的药剂、组合物和/或方法相比具有某些优点。因此，本发明提供了使用其特征在于特定蛋白质序列的细胞靶向分子及其药物组合物的方法。例如，SEQ ID NO:4-255，259-278和288-748中的任何多肽序列可以特异性地用作细胞靶向分子的组分，在以下方法中或任何使用技术人员已知的细胞靶向分子的方法中使用，例如，WO 2014/164680，WO2014/164693，WO 2015/138435，WO 2015/138452，WO 2015/113005，WO2015/113007，WO 2015/191764，US2015/259428，US2014/965882，WO2016/196344，WO 2017/019623和WO 2018/106895中描述的各种方法。
本发明提供了向细胞递送CD8+ T细胞表位-肽货物的方法，该方法包括使细胞在体外或体内与本发明的细胞靶向分子或药物组合物接触的步骤。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子在接触步骤后，在体外细胞培养物或在活的脊索动物体内引起细胞与免疫细胞(例如CD8+ T细胞和/或CTL)的细胞间接合。生物体内靶细胞呈递CD8+ T细胞表位可导致激活对靶细胞和/或其在生物体内的通常位置的强烈免疫应答。因此，用于呈递的CD8+ T细胞表位货物的靶向递送可用作在治疗方案和/或疫苗接种策略期间激活CD8+T细胞应答的机制。
本发明提供了向脊索动物细胞的MHC I类呈递途径递送CD8+ T细胞表位-肽的方法，该方法包括使细胞在体外或体内与本发明的诊细胞靶向分子、药物组合物和/或断组合物接触的步骤。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子在接触步骤后，在体外细胞培养物或在脊索动物体内引起细胞与免疫细胞(例如CD8+ T细胞和/或CTL)的细胞间接合。
使用本发明的细胞靶向分子将CD8+ T细胞表位-肽货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，可用于诱导靶细胞在细胞表面呈递与MHC I类分子相关联的表位-肽。在脊索动物中，由MHC I类复合物呈递的免疫原性CD8+ T细胞表位可以使呈递细胞对CTL介导的细胞溶解所致的杀伤变得敏感，诱导免疫细胞改变微环境，并发出用于将更多免疫细胞招募到脊索动物内的靶细胞部位的信号。因此，在使一个或更多个细胞与本发明的细胞靶向分子接触后，本发明的细胞靶向分子及其组合物可用于杀伤特定细胞类型，和/或可用于刺激脊索动物的免疫应答。
通过将MHC I类表位(例如，来自已知的病毒抗原)工程改造成细胞靶向分子，可以使用免疫刺激抗原的靶向递送和呈递来利用和指导脊索动物的免疫细胞(例如体外)和/或体内脊索动物免疫系统的有益功能。这可以通过将细胞靶向分子外源施用到细胞外空间(例如血管腔)中，然后允许细胞靶向分子找到靶细胞，进入细胞并细胞内递送其CD8+ T细胞表位货物来实现。本发明的细胞靶向分子的这些CD8+ T细胞表位货物递送和MHC I类呈递功能的应用是广泛的。例如，CD8+表位货物向细胞的递送和在脊索动物中细胞对所递送的表位的MHC I类呈递可引起CD8+效应T细胞的细胞间接合，并可导致CTL杀伤靶细胞和/或分泌免疫刺激细胞因子。
本发明的某些实施方案是免疫治疗方法，该方法包括将本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物施用于有需要的患者的步骤。在某些另外的实施方案中，免疫治疗方法是通过刺激患者的有益免疫应答来治疗疾病、障碍和/或病症(例如，癌症、肿瘤、生长异常、免疫障碍和/或微生物感染)的方法。
本发明的某些实施方案是治疗癌症的免疫治疗方法，该方法包括将本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物施用于有需要的患者的步骤。在某些另外的实施方案中，该方法包括向患者施用佐剂和/或微生物组改变剂的额外步骤(参见例如Vetizou M等，Science350：1079-84(2015)；Ayelet S等，Science 350：1084-9(2015)；US2015/352206；WO2016/063263)。
本发明提供包括将CD8+ T细胞表位-肽货物递送至脊索动物中的靶细胞并引起免疫应答的免疫治疗方法，该方法包括向脊索动物施用本发明的细胞靶向分子或药物组合物的步骤。对于某些另外的实施方案，免疫应答是选自下组的细胞间免疫细胞应答：CD8+免疫细胞分泌细胞因子，靶细胞中CTL诱导的生长停滞，CTL诱导的靶细胞坏死，CTL诱导的靶细胞凋亡，组织部位中的非特异性细胞死亡，分子间表位扩散，破坏对恶性细胞类型的免疫耐受性，以及脊索动物获得对恶性细胞类型的持续免疫(参见例如Matsushita H等，CancerImmunol Res 3：26-36(2015))。可以使用技术人员已知的技术检测和/或定量这些免疫应答。例如，CD8+免疫细胞可以释放免疫刺激细胞因子(例如IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)和白细胞介素(如IL-17、IL-4、IL-22和IL-2)(参见例如下文的实施例；Seder R等，Nat Rev Immunol 8：247-58(2008))。IFN-γ可以增加MHC I类分子的表达，并使肿瘤细胞对CTL介导的细胞杀伤敏感(VlkováV等，Oncotarget 5：6923-35(2014))。炎性细胞因子可以刺激旁观者T细胞，该细胞对细胞因子释放细胞具有无关的TCR特异性(参见例如Tough D等，Science 272：1947-50(1996))。活化的CTL可以不加区分地杀伤表位-MHC I类复合物呈递细胞附近的细胞，而不管附近细胞的呈递肽-MHC I类复合物库(Wiedemann A等，Proc Natl Acad Sci USA 103：10985-90(2006))。因此，对于某些另外的实施方案，免疫应答是选自下组的细胞间免疫细胞应答：由免疫细胞介导的附近细胞杀伤，其中附近细胞不显示由本发明的细胞靶向分子递送的任何CD8+ T细胞表位-肽，并且不管是否存在与被杀伤的附近细胞物理偶联的细胞靶向分子的结合区域的任何细胞外靶生物分子。
CTL裂解的细胞(无论是靶细胞还是仅接近靶细胞的细胞)中非自身表位的存在，都可被免疫系统识别并靶向为外来的，包括通过分子间表位扩散机制识别靶细胞中的非自身表位(参见McCluskey J等，Immunol Rev 164：209-29(1998)；Vanderlugt C等，ImmunolRev 164：63-72(1998)；Vanderlugt C，Miller S，Nat Rev Immunol 2：85-95(2002))。附近细胞可包括非肿瘤细胞，例如癌症相关成纤维细胞，间充质干细胞，肿瘤相关内皮细胞和未成熟的骨髓衍生抑制细胞。例如，癌细胞可在编码序列中平均具有25至500个非同义突变(参见例如Fritsch E等，Cancer Immunol Res 2：522-9(2014))。癌症驱动因子和非驱动因子突变都是癌细胞突变情况的一部分，其对应于每个细胞的许多非自身表位，并且平均肿瘤可具有十个或更多个非自身表位(参见例如Segal N等人，Cancer Res 68：889-92(2008))。例如，肿瘤蛋白p53的突变形式可含有非自身表位(参见例如Vigneron N等，Cancer Immun 13：15(2013))。此外，非自身表位(例如突变的自身蛋白)的存在可导致产生对那些新表位特异的记忆细胞。因为本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可以增加靶向组织部位处的树突细胞取样，所以可以增加用细胞内抗原交叉引发(cross-priming)免疫系统的可能性(参见例如Chiang C等，Expert Opin Biol Ther 15：569-82(2015))。因此，作为细胞靶向分子递送异源CD8+ T细胞表位货物和该表位的MHC I类呈递的结果，含有非自身表位的靶细胞和其他附近细胞可被免疫系统排斥，包括通过非自身表位而不是通过本发明的细胞靶向分子递送的表位。这些机制可以例如诱导针对不表达细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子的肿瘤细胞的抗肿瘤免疫。
涉及细胞因子分泌和/或T细胞活化的免疫应答可导致脊索动物内部位的免疫微环境的调节。本发明的方法可用于改变脊索动物内组织部位的微环境，以改变免疫细胞的调节稳态，所述免疫细胞为例如，肿瘤相关巨噬细胞，T细胞，T辅助细胞，抗原呈递细胞和自然杀伤细胞。
对于某些实施方案，本发明的方法可用于增强脊索动物受试者中的抗肿瘤细胞免疫力和/或在脊索动物中产生持久的抗肿瘤免疫力，例如，由于记忆T细胞的发育和/或肿瘤微环境的改变。
本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案可用于将非自身的CD8+T细胞表位-肽呈递细胞“接种”在脊索动物内的部位，以便刺激免疫系统以更大的强度监视该部位和/或减轻免疫抑制信号，例如无反应性诱导信号。在本发明的这种“接种”方法的某些另外的实施方案中，所述部位是肿瘤块或感染的组织部位。在本发明的这种“接种”方法的某些实施方案中，非自身CD8+ T细胞表位-肽选自由以下各项组成的组：细胞靶向分子的靶细胞尚未呈递的肽，靶细胞表达的任何蛋白质中不存在的肽，靶细胞的蛋白质组或转录组内不存在的肽，待接种部位的细胞外微环境中不存在的肽，以及待靶向的肿瘤块中或感染组织部位中不存在的肽。
该“接种”方法的功能是利用一个或更多个MHC I类呈递的CD8+ T细胞表位(pMHCI)标记脊索动物内的一个或更多个靶细胞，用于免疫细胞的细胞间识别和下游免疫应答的激活。通过利用本发明的细胞靶向分子的细胞内化、细胞内发送和/或MHC I类表位递送功能，显示所递送的CD8+ T细胞表位的靶细胞可以被脊索动物免疫细胞的免疫监视机制识别，并导致CD8+ T细胞(例如CTL)与呈递靶细胞的细胞间接合。使用本发明的细胞靶向分子的这种“接种”方法可刺激免疫细胞介导的靶细胞杀伤，无论它们是否呈递细胞靶向分子递送的T细胞表位，例如，作为基于内源抗原的呈递而不是人工递送的表位的分子间表位扩散和/或靶细胞免疫耐受的破坏的结果。基于检测被初始T细胞(T cell)识别为外来物和/或已被记忆T细胞识别为非自身(即回忆抗原)的表位，使用本发明的细胞靶向分子的这种“接种”方法可以通过诱导针对接种的微环境(例如，肿瘤块或感染的组织部位)中的细胞的适应性免疫应答来提供疫苗接种效果(新表位暴露)和/或疫苗接种-加强剂量效应(表位再次暴露)。这种“接种”方法还可以外周地或系统地诱导对脊索动物内的靶细胞群，肿瘤块，患病组织部位和/或感染组织部位的免疫耐受性的破坏。
在脊索动物内的位点或部位处存在濒死或坏死的肿瘤细胞可导致局部免疫刺激作用。例如，濒死或坏死的肿瘤细胞可释放因子，例如高迁移率族蛋白和/或ATP，其反过来可刺激免疫细胞的免疫原性成熟。肿瘤部位的接种还可以诱导或增加肿瘤细胞质膜上的ER蛋白(例如，钙网蛋白)的异位表达，这反过来可以促进/增加该位点处的MHC类抗原呈递和肿瘤细胞的吞噬作用。
本发明的某些方法涉及用一个或更多个抗原性和/或免疫原性CD8+ T细胞表位接种脊索动物内的部位，可以与免疫佐剂的施用组合，无论是局部施用还是全身施用，以刺激对某些抗原的免疫应答，例如，本发明的组合物与一个或更多个免疫佐剂如细胞因子、细菌产物或植物皂苷的共同施用。可适用于本发明方法的免疫佐剂的其他实例包括铝盐和油，例如明矾、氢氧化铝、矿物油、角鲨烯、石蜡油、花生油和硫柳汞。
本发明的某些方法涉及在脊索动物中促进初始CD8+ T细胞的免疫原性交叉呈递和/或交叉引发。对于本发明的某些方法，交叉引发作为由本发明的细胞靶向分子引起的靶细胞的死亡和/或死亡方式的结果而发生，这使得促进濒死或死亡靶细胞中的细胞内抗原暴露于免疫监视机制。
因为多个异源CD8+ T细胞表位(作为货物或作为志贺毒素效应子多肽组分的嵌入或插入区域)可以由本发明的单个细胞靶向分子递送，本发明的细胞靶向分子的单个实施方案在具有不同MHC I类分子变体的相同物种的不同个体脊索动物中可以在治疗上是有效的，例如在具有不同HLA等位基因的人中。本发明的某些实施方案的这种能力可以允许基于MHC I类分子多样性和多态性，在单个细胞靶向分子内组合不同的CD8+ T细胞表位-肽，其在受试者的不同亚群中具有不同的治疗效果。例如，人MHC I类分子，HLA蛋白，基于遗传祖先在人类中是不同的，例如非洲人(撒哈拉以南)、美洲印第安人、高加索人、蒙古人、新几内亚人和澳大利亚人、或太平洋岛民。
可以从CMV抗原递送异源CD8+ T细胞表位的本发明的细胞靶向分子可能是特别有效的，因为大多数人群具有特异性的CD8+ T细胞组，其被引发以与CMV抗原反应并且不断抑制慢性CMV感染，使其一生中无症状。此外，由于与CMV相关的适应性免疫系统中与年龄相关的变化，例如可能更集中的针对CMV的免疫监视并且如更多老年人中T细胞抗原受体库的组成和相对CTL水平所示，老年人可能对CMV CD8+ T细胞表位的反应更快更强烈。(参见例如Koch S等，Ann NY Acad Sci 1114：23-35(2007)；Vescovini R等，J Immunol 184：3242-9(2010)；Cicin-Sain L等，J Immunol 187：1722-32(2011)；等，Front Immunol 4：271(2013)；Pawelec G，Exp Gerontol 54：1-5(2014))。/>
本发明提供杀死细胞的方法，包括使细胞体外或体内地与本发明的细胞靶向分子或药物组合物接触的步骤。本发明的细胞靶向分子和药物组合物可以用于在将一个细胞或多个细胞与要求保护的物质组合物相接触后杀死特定细胞类型。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可用于杀死不同细胞类型的混合物中的特定细胞类型，例如包含癌细胞、感染的细胞和/或血液细胞的混合物。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可用于杀死不同细胞类型的混合物中的癌细胞。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可用于杀死不同细胞类型的混合物(例如移植前组织)中的特定细胞类型。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可用于杀死细胞类型混合物(例如用于治疗目的的预施用组织材料)中的特定细胞类型。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可用于选择性杀死被病毒或微生物感染的细胞，或以其他方式选择性杀死表达特定细胞外靶生物分子(例如细胞表面生物分子)的细胞。本发明的细胞靶向分子和药物组合物具有多种应用，包括例如，用于从体外或体内组织中消耗不需要的细胞类型，用作抗病毒剂，用作抗寄生虫剂，以及用于清除移植组织的不需要的细胞类型。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物可用于杀伤不同细胞类型的混合物(例如用于治疗目的的预施用组织材料，例如移植前组织)中的特定细胞类型。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可用于选择性杀伤被病毒或微生物感染的细胞，或以其他方式选择性杀伤表达特定细胞外靶生物分子(例如细胞表面生物分子)的细胞。
本发明提供了在有需要的患者中杀伤细胞的方法，该方法包括向患者施用至少一种本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的步骤。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其药物组合物可用于通过靶向与感染细胞物理偶联的细胞外生物分子来杀伤患者中的感染细胞。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其药物组合物可用于通过靶向与癌症或肿瘤细胞物理偶联的细胞外生物分子杀伤患者中的癌细胞。术语“癌症细胞”或“癌细胞”是指各种肿瘤细胞，它们以异常加速和/或不受调节的方式生长和分裂，并且对于技术人员来说是清楚的。术语“肿瘤细胞”包括恶性和非恶性细胞。通常，癌症和/或肿瘤可以定义为易于治疗和/或预防的疾病、障碍或病症。由可受益于本发明的方法和组合物的癌细胞和/或肿瘤细胞组成的癌症和肿瘤(恶性或非恶性)对于技术人员来说是清楚的。肿瘤细胞通常与以下一个或更多个相关：不受控制的生长、缺乏分化、局部组织侵袭、血管生成和转移。可以受益于本发明的靶向某些癌细胞和/或肿瘤细胞的方法和组合物的癌症和/或肿瘤(恶性或非恶性)引起的疾病、障碍和病症对于技术人员是清楚的。
本发明的细胞靶向分子和组合物的某些实施方案可用于杀伤癌症干细胞、肿瘤干细胞、恶变前的癌症起始细胞和肿瘤起始细胞，这些细胞通常缓慢分裂并且对于癌症治疗方法如化疗和放射疗法具有抵抗性。例如，急性髓性白血病(AML)可以用本发明通过杀伤AML干细胞和/或休眠的AML祖细胞来治疗(参见例如Shlush L等,Blood 120:603-12(2012))。癌症干细胞通常过表达细胞表面靶标，例如CD44，CD200和本文列出的其他靶标，这些靶标可以是本发明的细胞靶向分子的某些实施方案的某些结合区域的靶标(参见例如Biochem Biophys Res Commun 364:778-82(2007)；Reim F等,CancerRes 69:8058-66(2009))
由于基于独特的志贺毒素A亚基的作用机制，本发明的物质的组合物可以更有效地用于涉及它们与其他疗法组合或与其他疗法互补方式的方法，例如，化学疗法、免疫疗法、放射、干细胞移植和免疫检查点抑制剂，和/或有效对抗化学抗性/抗放射和/或静息肿瘤细胞/肿瘤起始细胞/干细胞。类似地，本发明的物质的组合物可以更有效地用于涉及与针对相同疾病、障碍或病症的非重叠或不同靶标上相同表位以外的其他细胞靶向疗法组合的方法。
本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案可用于通过靶向发现与免疫细胞物理偶联的细胞外生物分子来杀伤患者的免疫细胞(无论是健康的还是恶性的)。
以下目的在本发明的范围内：利用本发明的细胞靶向分子或其药物组合物来清除恶性和/或肿瘤细胞的细胞群(例如骨髓)，然后将靶细胞耗尽的物质再输注入有需要的患者体内。
另外，本发明提供治疗患者的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的至少一种本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的步骤。可以使用该方法治疗的预期疾病、障碍和病症包括癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫障碍和微生物感染。施用本发明组合物的“治疗有效剂量”可导致疾病症状严重程度降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或预防由于疾病引起的损伤或残疾。
本发明组合物的治疗有效量将取决于施用途径、所治疗的受试者的类型和所考虑的特定患者的身体特征。这些因素及其与确定该量的关系是医学领域的技术人员所熟知的。可以调整该量和施用方法以获得最佳功效，并且可以取决于诸如体重、饮食、同时用药的因素和其他因素，这些因素是医学领域技术人员公知的。最适合人类使用的剂量大小和给药方案可以由本发明获得的结果指导，并且可以在适当设计的临床试验中确认。有效剂量和治疗方案可以通过常规方法确定，从实验动物中的低剂量开始，然后在监测效果的同时增加剂量，并且还系统地改变剂量方案。当确定给定受试者的最佳剂量时，临床医生可以考虑许多因素。这些考虑因素是技术人员已知的。
可接受的施用途径可以指本领域已知的任何施用途径，包括但不限于气溶胶、肠内、鼻、眼、口服、肠胃外、直肠、阴道或透皮(例如局部施用乳膏、凝胶或软膏，或通过透皮贴剂)。“肠胃外施用”通常与在预期作用部位或与预期作用部位通讯的注射有关，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下腔、包膜下、皮下、透粘膜或经气管内施用。
对于本发明药物组合物的施用，剂量范围通常为0.001至10毫克/千克(mg/kg)，更多地通常为0.001至0.5mg/kg受试者体重。示例性剂量可以是0.01mg/kg体重，0.03mg/kg体重，0.07mg/kg体重，0.09mg/kg体重或0.1mg/kg体重或1至10mg/kg。示例性治疗方案是每日一次或两次施用，或每周一次或两次施用，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每两个月或三个月一次或每三个至6个月一次。可根据需要由熟练的医疗保健专业人员选择和重新调整剂量，以使特定患者的治疗益处最大化。
通常将本发明的药物组合物多次施用给同一患者。单剂量之间的间隔可以是例如2-5天，每周，每月，每两或三个月，每六个月或每年。基于调节受试者或患者中的血液水平或其他标志物，施用之间的间隔也可以是不规则的。本发明组合物的剂量方案包括静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重(其中组合物每两到四周施用六个剂量)，然后每三个月以3mg/kg体重或1mg/kg体重施用。
本发明的药物组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或更多种通过一种或更多种施用途径施用。如本领域技术人员所理解的，施用途径和/或方式将根据所需结果而变化。本发明的细胞靶向分子、药物组合物和诊断组合物的施用途径包括例如静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。对于其他实施方案，本发明的细胞靶向分子、药物组合物和诊断组合物可以通过非肠胃外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内、口服、阴道、直肠、舌下、或局部。
本发明的治疗性细胞靶向分子或其药物组合物可以与本领域已知的多种医疗装置中的一个或更多个一起施用。例如，在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以与无针皮下注射装置一起施用。可用于本发明的众所周知的植入物和模块的实例是本领域的，包括例如，用于受控速率递送的可植入微输注泵；用于通过皮肤施用的装置；用于以精确的输液速度递送的输注泵；用于连续药物递送的可变流量植入式输注装置；和渗透药物递送系统。这些和其他这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，当施用于受试者(例如需要治疗的患者)体外或体内的细胞群时，本发明的细胞靶向分子或药物组合物，单独或与其他化合物或药物组合物组合，可显示出有效的细胞杀伤活性。通过使用高亲和力结合区域将与异源CD8+ T细胞表位货物相关联的志贺毒素效应子多肽靶向递送至特定细胞类型，志贺毒素效应子和/或CD8+ T细胞表位呈递介导的细胞杀伤活性可以被限制为特异性地和选择性地杀伤生物体内的某些细胞类型，例如某些癌细胞、肿瘤细胞、恶性细胞、非恶性肿瘤细胞或感染细胞。
本发明的细胞靶向分子或其药物组合物可以单独施用或与一种或更多种其他治疗剂或诊断剂组合施用。组合疗法可包括本发明的细胞靶向分子或其药物组合物，其与基于待治疗的特定患者、疾病或病症选择的至少一种其他治疗剂组合。其他此类药剂的实例尤其包括细胞毒性抗癌或化学治疗剂、抗炎剂或抗增殖剂、抗微生物剂或抗病毒剂、生长因子、细胞因子、镇痛剂、治疗活性小分子或多肽、单链抗体、经典抗体或其片段、或调节一种或更多种信号传导途径的核酸分子、以及可在治疗或预防性治疗方案中补充或有益的类似调节性治疗分子。
用本发明的细胞靶向分子或药物组合物治疗患者优选导致靶细胞的细胞死亡和/或靶细胞生长的抑制。因此，本发明的细胞靶向分子和包含它们的药物组合物将有用于治疗多种病理性障碍的方法，其中杀伤或消耗靶细胞可能是有益的，尤其例如癌症、肿瘤、生长异常、免疫障碍和感染的细胞。本发明提供了抑制细胞增殖和治疗细胞障碍(包括瘤形成和/或某些细胞类型的不需要的增殖)的方法。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子和药物组合物可用于治疗或预防癌症、肿瘤(恶性和非恶性)、生长异常、免疫障碍和微生物感染。另一方面，上述离体方法可与上述体内方法组合，以提供治疗或预防骨髓移植受者排斥和实现免疫耐受的方法。
另一方面，本发明的细胞靶向分子和药物组合物的某些实施方案是内分泌调节剂-意指它们能够治疗和/或预防由内分泌腺分泌不足、内分泌腺分泌过多和/或内分泌腺肿瘤引起的内分泌障碍的获得、发展或后果。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含结合区域，其是激素或激素类似物。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子用于通过靶向和杀伤内分泌腺细胞来减少内分泌腺分泌过多的方法。本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物可用于治疗内分泌疾病的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子或药物组合物的步骤。在某些另外的实施方案中，待治疗的疾病是甲状腺功能亢进和/或甲状旁腺功能亢进。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子和药物组合物是免疫调节剂-意味着它们能够治疗和/或预防免疫障碍的获得、发展或后果。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含结合细胞外靶生物分子的结合区域，所述细胞外靶生物分子是T细胞受体(TCR)。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含结合区域，该结合区域是MHC I类四聚体。在某些另外的实施方案中，本发明的细胞靶向分子用于降低参与自身免疫病症的特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞的活性和/或存活力的方法中。本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物可用于治疗免疫障碍的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子或药物组合物的步骤。在某些另外的实施方案中，待治疗的病症是CD8+ T淋巴细胞的组织破坏的结果，例如，同种异体移植相关疾病的结果。
本发明的细胞靶向分子和药物组合物通常是抗肿瘤剂-意味着它们能够通过抑制癌或肿瘤细胞的生长和/或导致其死亡来治疗和/或预防肿瘤或恶性细胞的发育、成熟或扩散。在某些实施方案中，本发明提供了治疗哺乳动物受试者(例如人)的恶性肿瘤或肿瘤和其他血细胞相关癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子或药物组合物的步骤。
在另一个方面，本发明的细胞靶向分子和药物组合物的某些实施方案是抗微生物剂-意味着它们能够治疗和/或预防例如由病毒、细菌、真菌、朊病毒或原生动物引起的微生物致病性感染的获得、发展或后果。
本发明的细胞靶向分子和药物组合物可用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物。在本发明方法的某些实施方案中，所治疗的癌症选自由以下组成的组：骨癌(如多发性骨髓瘤或尤文氏肉瘤)，乳腺癌，中枢/外周神经系统癌症(如脑癌，神经纤维瘤病或胶质母细胞瘤)，胃肠癌(如胃癌或结直肠癌)，生殖细胞癌(如卵巢癌和睾丸癌，腺癌(如胰腺癌，甲状旁腺癌，嗜铬细胞瘤，唾液腺癌或甲状腺癌)，头颈癌(如鼻咽癌，口腔癌，或咽癌)，血液学癌症(如白血病，淋巴瘤或骨髓瘤)，肾泌尿道癌症(如肾癌和膀胱癌)，肝癌，肺/胸膜癌(如间皮瘤，小细胞肺癌，或非小细胞肺癌)，前列腺癌，肉瘤(如血管肉瘤，纤维肉瘤，卡波氏肉瘤或滑膜肉瘤)，皮肤癌(如基底细胞癌，鳞状细胞癌或黑色素瘤)以及子宫癌。
本发明的细胞靶向分子和药物组合物可用于治疗免疫障碍的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物。在本发明方法的某些实施方案中，免疫障碍与选自下组的疾病相关的炎症有关，该组由以下各项组成：淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、自闭症、心脏发生、克罗恩病、糖尿病、狼疮、胃炎、移植排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病(Grave’s disease)、桥本氏甲状腺炎、溶血性尿毒综合征、HIV相关疾病、红斑狼疮、淋巴组织增生性疾病、多发性硬化症、重症肌无力、神经炎症、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、感染性休克、舍格伦综合征(syndrome)、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎和血管炎。
在本发明的某些实施方案中，使用本发明的细胞靶向分子作为药物组合物或药物的组分，用于治疗或预防癌症、肿瘤、其他生长异常、免疫障碍和/或微生物感染。例如，可以用这种药物治疗存在于患者皮肤上的免疫障碍以减轻炎症。在另一个实施例中，可以用这种药物治疗皮肤肿瘤，以努力减小肿瘤大小或完全消除肿瘤。
在本发明的某些实施方案中，是使用本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物用于收集关于疾病、病症和/或障碍的信息的方法。例如，本发明的细胞靶向分子可用于使用对某些pMHC I具有特异性的抗体对肿瘤细胞的pMHC I呈递进行成像。在用本发明的细胞靶向分子处理后，检测这种标记的靶细胞，可以提供关于靶细胞类型在抗原处理和MHC I类呈递能力的读数，以及当与来自本发明的细胞靶向分子的诊断变体的读数组合时，此类感受态靶细胞在靶细胞群中的百分比。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物来检测细胞类型的存在以便收集关于疾病、病症和/或障碍的信息的方法。所述方法包括使细胞与诊断上足够量的本发明的细胞靶向分子接触，以通过测定或诊断技术检测分子。短语“诊断上足够的量”是指通过所使用的特定测定或诊断技术为信息收集目的提供充分检测和精确测量的量。通常，对于整个生物体体内诊断用途，诊断上足够的量将是每个受试者每kg受试者0.01至10毫克本发明的检测促进剂连接的细胞靶向分子的非累积剂量。通常，在这些信息收集方法中使用的本发明的细胞靶向分子的量将尽可能低，只要它仍然是诊断上足够的量。例如，对于生物体中的体内检测，施用给受试者的本发明的细胞靶向分子或诊断组合物的量将尽可能低。
本发明的细胞靶向分子的细胞类型特异性靶向与检测促进剂组合提供了对与本发明分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞进行检测和成像的方法。或者，细胞靶向分子递送的异源CD8+ T细胞表位货物的展示可提供一种检测和成像内化了本发明的细胞靶向分子的细胞的方法。使用本发明的细胞靶向分子和诊断组合物对细胞进行成像可以通过本领域已知的任何合适技术在体外或体内进行。可以使用本领域已知的各种方法收集诊断信息，包括生物体的全身成像或使用取自生物体的离体样品。本文使用的术语“样品”是指任何数量的物质，但不限于，诸如血液、尿液、血清、淋巴液、唾液、肛门分泌物、阴道分泌物和精液的液体，以及通过活组织检查程序获得的组织。例如，各种检测促进剂可以通过诸如磁共振成像(MRI)、光学方法(例如直接、荧光和生物发光成像)、正电子发射断层扫描(PET)，单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、超声、X射线计算机断层扫描以及前述的组合(参见，Kaur S等,Cancer Lett 315:97-111(2012)，供参考)的技术用于非侵入性体内肿瘤成像。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物以标记或检测肿瘤细胞和/或免疫细胞类型的内部的方法(参见例如，Koyama Y等，Clin Cancer Res 13：2936-45(2007)；Ogawa M等，Cancer Res 69：1268-72(2009)；Yang L等，Small 5：235-43(2009))。这可能是基于本发明的某些细胞靶向分子进入特定细胞类型并在细胞内通过逆行细胞内转运发送到特定亚细胞区室内的能力，使得特定细胞类型的内部区室被标记用于检测。这可以在患者体内在原位细胞上进行，或者在体外在从生物体移除的细胞和组织(例如活组织检查材料)上进行。
本发明的诊断组合物可用于表征可能通过本发明的相关药物组合物治疗的疾病、障碍或病症。本发明的某些物质的组合物可用于确定患者是否属于对治疗策略有应答的组，该治疗策略利用如本文所述的本发明的细胞靶向分子或其组合物或本发明的相关方法，或非常适合使用本发明的递送装置。
本发明的诊断组合物可以在检测到疾病例如癌症之后使用，以便更好地表征它，例如监测远处转移、异质性和癌症进展阶段。疾病障碍或感染的表型评估可以在治疗决策制定期间帮助预后和预测。在疾病复发中，本发明的某些方法可用于确定是否存在局部或全身问题。
本发明的诊断组合物可用于评估对治疗的应答，而不管治疗类型，例如小分子药物、生物药物或基于细胞的疗法。例如，本发明的诊断组合物的某些实施方案可用于测量肿瘤大小的变化，抗原阳性细胞群的变化(包括数量和分布)，或监测不同于已经施用于患者的疗法靶向的抗原的标志物(参见Smith-Jones P等，Nat.Biotechnol 22：701-6(2004)；Evans M等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108：9578-82(2011))。
本发明的诊断组合物可用于评估靶细胞类型中的MHC I类系统功能。例如，某些恶性细胞，例如感染的、肿瘤或癌细胞，可能表现出对其MHC I类呈递途径的改变、缺陷和扰动。这可以在体外或体内研究。本发明的诊断组合物可用于监测生物体内靶细胞群中的个体细胞中的MHC I类呈递的变化，或用于计数或确定生物体、肿瘤活组织检查等中MHC I类呈递缺陷靶细胞的百分比。
在某些实施方案中，所述方法用于检测细胞类型的存在以收集关于疾病、障碍和病症信息，比如例如骨癌(例如多发性骨髓瘤或尤文氏肉瘤)、乳腺癌、中枢/外周神经系统癌症(如脑癌、神经纤维瘤病、或胶质母细胞瘤)、胃肠癌(如胃癌或结直肠癌)、生殖细胞癌(如卵巢癌和睾丸癌、腺癌(如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、唾液腺癌、或甲状腺癌)、头颈癌(如鼻咽癌、口腔癌、或咽癌)、血液学癌症(如白血病、淋巴瘤、或骨髓瘤)、肾泌尿道癌症(如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(如间皮瘤、小细胞肺癌、或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(如血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波氏肉瘤、或滑膜肉瘤)、皮肤癌(如基底细胞癌、鳞状细胞癌、或黑色素瘤)、子宫癌、AIDS、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、孤独症、心脏发育、克罗恩病、糖尿病、狼疮、胃炎、移植物排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、溶血性尿毒症综合症、HIV相关疾病、红斑狼疮、淋巴组织增生性疾病、多发性硬化、重症肌无力、神经炎症、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、感染性休克、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、血管炎、细胞增生、炎症、白细胞激活、白细胞粘附、白细胞趋化性、白细胞成熟、白细胞迁移、神经元分化、急性淋巴细胞白血病(ALL)、T急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤(ALL)、急性髓细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B细胞幼淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(BL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞白血病(CML-BP)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、血管内大B-细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、自然杀伤细胞白血病、淋巴结边缘B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆细胞白血病、浆细胞瘤、原发性积液淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、小淋巴细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤(TCL)、重链疾病、单克隆丙种球蛋白病、单克隆免疫球蛋白沉积病、骨髓增生异常综合征(MDS)、郁积型多发性骨髓瘤和华氏巨球蛋白血症。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其药物组合物用于诊断和治疗，或单独用于诊断。在一些情况下，在选择本发明的细胞靶向分子用于治疗之前，期望确定或验证受试者(例如需要治疗的患者)和/或来自受试者的患病组织中表达的HLA变体和/或HLA等位基因。在某些情况下，在选择用于本发明方法的细胞靶向分子或其组合物之前，需要为个体受试者确定某些CD8+ T细胞表位的免疫原性。
通过包含上述结构和功能的细胞靶向分子的以下非限制性实例进一步解释本发明，特别是以下功能：细胞外靶向将CD8+ T细胞表位货物递送到特定细胞，和随后将CD8+ T细胞表位货物细胞内递送到MHC I类途径，以在细胞表面上呈递与MHC I类分子复合的、递送的CD8+ T细胞表位货物。
实施例
可以将去免疫化的志贺毒素效应子多肽工程化，以递送免疫原性表位-肽，用于由其中存在这些多肽的细胞呈递。此外，还可以将具有弗林蛋白酶切割抗性的去免疫化的志贺毒素效应子多肽工程化，以递送免疫原性表位-肽，用于由靶细胞呈递。包含这种去免疫化的志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子提供向特定细胞的表位的靶向递送，并且可以用于涉及脊索动物内的免疫刺激性表位的细胞类型特异性呈递的应用中。T细胞免疫原性表位在脊索动物内通过MHC I类系统的呈递靶向表位呈递细胞，用于通过CD8+CTL介导的裂解进行杀伤，并且还可以刺激附近的其他免疫应答。
在实施例中，CD8+ T细胞抗原与包含去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应子多肽的细胞靶向分子融合。所有这些融合多肽涉及向起始多肽支架中添加至少一个肽，并且不需要在志贺毒素效应子多肽组分内部嵌入或插入任何异源CD8+ T细胞表位，尽管其他嵌入或插入的异源CD8+ T细胞表位可以存在于去免疫化的志贺毒素效应子多肽中。因此，在本发明的某些示例性细胞靶向分子中，志贺毒素效应子多肽由去免疫化的志贺毒素多肽组成，所述去免疫化的志贺毒素多肽可进一步具有弗林蛋白酶切割抗性和/或包含一个或更多个嵌入或插入的CD8+ T细胞表位。
以下实施例描述了本发明的示例性细胞靶向分子，其包含(1)用于细胞靶向的免疫球蛋白型结合区域，(2)去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽，和(3)由融合的异源CD8+ T细胞表位-肽组成的货物，其既不嵌入也不插入志贺毒素效应子多肽区域。本发明的这些示例性细胞靶向分子与靶细胞类型表达的靶生物分子结合并进入靶细胞。然后，内化的示例性细胞靶向分子有效地将它们的志贺毒素效应子多肽组分发送至胞质溶胶，并任选地通过核糖体抑制直接杀伤靶细胞。
以下实施例证明示例性细胞靶向分子在靶细胞内将其融合的异源CD8+ T细胞表位-肽货物递送至MHC I类途径，导致T细胞表位-肽在靶细胞的表面上呈递。通过靶细胞进行的、被递送的T细胞表位复合物到MHC I类分子的细胞表面展示能够向CD8+效应T细胞发信号以杀伤表位展示靶细胞以及刺激表位展示靶细胞附近的其他免疫应答。
如以下实施例1中所证明的，本发明的细胞靶向分子在外源施用后能够将异源T细胞表位-肽递送至MHC I类途径，以由靶向的人癌细胞呈递。如以下实施例1-2中进一步证明的，本发明的两种细胞靶向分子能够通过其去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽组分特异性杀伤表达靶标的人癌细胞。以下实施例2中进一步说明，本发明的另外两种细胞靶向分子在人PBMC共培养实验中能够通过免疫细胞的作用杀伤表达靶标的人癌细胞。此外，实施例2证明，与缺乏任何异源CD8+ T细胞表位-货物的催化活性的参考分子相比，本发明的催化活性细胞靶向分子能够杀伤更多的与人PBMC共培养的表达靶标的人癌细胞，这表明，在适当的MHC I类表位特异性限制性T细胞存在下，诱导直接细胞杀伤和间接细胞间T细胞杀伤机制能够实现更大的靶细胞杀伤。
实施例1.包含去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基衍生多肽和融合的T细胞表位-肽的细胞靶向分子
产生并测试了细胞靶向分子，所述细胞靶向分子各自包含1)细胞靶向结合区域，2)去免疫化的志贺毒素效应子多肽，其任选地具有弗林蛋白酶切割抗性，和3)至少一个由融合的异源CD8+ T细胞表位-肽组成的T细胞表位-肽货物，所述货物既不嵌入也不插入志贺毒素效应子多肽区域。先前，志贺毒素A亚基衍生的细胞靶向分子已被构建，并显示其促进细胞内化并指导其志贺毒素效应子多肽组分直接细胞内发送至胞质溶胶(参见例如WO2014/164680，WO2014/164693，WO2015/138435，WO 2015/138452，WO 2015/113005，WO2015/113007，WO 2015/191764，WO 2016/196344和WO 2018/106895)。将T细胞表位-肽与这些去免疫化的和/或弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基衍生的细胞靶向分子的模块化多肽组分融合，以产生新的细胞靶向分子，每个分子具有至少一个T-细胞表位-肽，该T细胞表位-肽既不嵌入也不插入志贺毒素A1片段衍生组分中，并且与志贺毒素A亚基组分是异源的(参见例如WO 2017/019623)。
如下文在该实施例中所证明的，本发明的细胞靶向蛋白在外源施用后能够将异源T细胞表位-肽递送至MHC I类途径，用于由靶向的人癌细胞呈递。如下文在该实施例中所证明的，本发明的细胞靶向蛋白能够通过其去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽组分特异性杀伤表达靶标的人癌细胞。该实施例的示例性细胞靶向蛋白的细胞靶向结合区域能够表现出与物理偶联于特定细胞类型表面的细胞外靶生物分子的高亲和力结合。该实施例的示例性细胞靶向蛋白能够选择性地靶向表达其细胞靶向结合区域的靶生物分子的细胞并内化到这些靶细胞中。
Ⅰ.本发明的示例性细胞靶向分子的构建
使用本领域已知的技术，通过将人CD8+ T细胞表位-肽遗传融合至亲本细胞靶向蛋白的多肽组分的氨基末端(N末端)或羧基末端(C末端)来产生示例性细胞靶向融合蛋白，该亲本细胞靶向蛋白包含1)去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应子多肽和2)由蛋白质接头分开的细胞靶向结合区域多肽。融合的CD8+ T细胞表位货物选自源自通常感染人类的病毒的几种T细胞表位-肽。构建所得到的细胞靶向融合蛋白，使得每个细胞靶向融合蛋白包含单个连续多肽，所述多肽包含细胞靶向结合区域多肽、去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应子多肽，以及融合的异源CD8+ T细胞表位货物。
本发明的细胞靶向分子可包含(1)用于细胞靶向的免疫球蛋白型结合区域，(2)去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽，和(3)由融合的异源CD8+ T细胞表位-肽组成的货物，其既不嵌入也不插入志贺毒素效应子多肽区域。所有三种组分可以选自现有技术或使用技术人员已知的常规方法产生(参见例如WO2014/164680，WO2014/164693，WO2015/138435，WO2015/138452，WO2011/113005，WO2015。/113007，WO 2015/191764，WO 2016/196344和WO 2018/106895)。
免疫球蛋白型结合区域已先前描述在WO 2014/164680，WO2014/164693，WO 2015/138435，WO 2015/138452，WO 2011/113005，WO2011/11007，WO 2015/191764和WO 2016/196344中。
去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽已先前描述在WO2015/113007，WO 2015/191764和WO 2016/196344中。
异源CD8+ T细胞表位-肽已先前描述在WO 2015/113005和WO2016/196344中。
在该实施例中，蛋白质接头选自现有技术以连接组分。
该实施例的细胞靶向分子的所有志贺毒素效应子多肽组分来源于SLT-1A(SEQ IDNO:1)的氨基酸1-251，并且其中一些含有两个或更多个相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换，例如去免疫化置换和/或弗林蛋白酶切割基序破坏的突变的置换(参见例如WO 2015/113007，WO 2015/191764和WO 2016/196344)。本发明的细胞靶向分子的示例性志贺毒素效应子多肽组分是SEQ ID NO:29-38。
在该实施例的实验中测试的所有细胞靶向分子在细菌系统中生产，并使用技术人员已知的技术通过柱色谱法纯化。
在该实施例中生产和测试的本发明的示例性细胞靶向分子是SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)。本发明的这种示例性细胞靶向融合蛋白包含含有单链可变片段组分(scFv1)的细胞靶向结合区域、去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应子多肽组分(SLT-1A-DI-FR)和与结合区域融合的人CD8+ T细胞表位-肽(C2)。免疫球蛋白型结合区域scFv1是单链可变片段，其以高亲和力结合到与某些人癌细胞的表面物理偶联的某些细胞表面靶生物分子。该实施例的细胞靶向分子的志贺毒素效应子多肽组分是SLT-1A-DI-FR(SEQ ID NO:29)。被选作融合货物的表位-肽C2(SEQ ID NO:21)已知具有免疫原性。细胞靶向分子SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)在细菌系统中生产，并使用技术人员已知的技术通过柱色谱法纯化。
纯化后，使用尺寸排阻色谱(SEC)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在变性条件下测试细胞靶向分子SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)的多聚体状态。
使用具有24mL床体积的Superdex 200 30/300柱(GE Healthcare，LittleChalfont，Buckinghamshire，U.K.)通过SEC分析SLT-1A-DI-FR::scFv1蛋白(SEQ ID NO:258)的样品。将样品加载到柱上，并使至少24mL缓冲液流过柱，同时紫外光(UV)检测器通过280nm处的吸光度(报告为毫吸光度单位(mAU))监测蛋白质的洗脱。与较大分子相比，当流过用于尺寸排阻色谱的基质时，具有较小分子量的分子被延迟，因此小分子表现出比大分子更长的尺寸排阻色谱保留时间。利用与参考相同的柱和条件，使用已知分子量蛋白质的洗脱速率进行尺寸排阻色谱，估计SLT-1A-DI-FR::scFv1蛋白质(SEQ ID NO:258)样品在天然条件下的分子量。
分析的SLT-1A-DI-FR::scFv1(SEQ ID NO:258)样品产生对应于13.2mL保留的主峰，基于已知质量的参考蛋白，其对应于约110千道尔顿(kDa)的分子量(图4)，其与110kDa同型二聚体蛋白一致，所述同型二聚体蛋白包含各自具有55kDa质量的两个多肽。通过该SEC分析，SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2蛋白(SEQ ID NO:252)的样品测量为具有大致相同的大小，其看起来与由各自具有55kDa质量的两个多肽组成的约110kDa的分子一致(见下文)。
将SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)和SLT-1A-DI-FR::scFv1(SEQ IDNO:258)的蛋白样品等量加载到4-20％十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶(Lonza，Basel，CH)上，并在变性条件下电泳(图5)。通过考马斯染色分析所得凝胶。加载分子量(MW)标记物(ProSeiveTM QuadColorTM，Lonza，Basel，CH)以指示加载在凝胶上的蛋白的近似分子量。在这些变性条件下，预期任何多聚体蛋白复合物解离成单体多肽。SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2和SLT-1A-DI-FR::scFv1样品均形成表观分子量约为55kDa的条带(图5)，其对应于SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)或SLT-1A-DI-FR::scFv1(SEQ ID NO:258)分别具有508和500个氨基酸的预测的蛋白质量的近似分子量。
Ⅱ.在融合结合区域和T细胞表位-肽后，测试细胞靶向分子的志贺毒素A亚基效应
子多肽组分，以获得志贺毒素功能的保留
在融合异源CD8+ T细胞表位-肽后，测试示例性细胞靶向蛋白，以获得志贺毒素A亚基效应子功能的保留。所分析的志贺毒素A亚基效应子功能是细胞毒性，以及通过推断自我指导亚细胞发送至胞质溶胶。
测试本发明的示例性细胞靶向分子的细胞毒性活性
使用基于组织培养细胞的毒性测定法，测量本发明的示例性细胞靶向分子的细胞毒性活性。对于本发明的某些细胞靶向分子，测定了杀伤同源细胞群中一半细胞的、外源施用的细胞靶向分子的浓度(半数最大细胞毒性浓度)。使用细胞杀伤测定来测试示例性细胞靶向分子的细胞毒性，该细胞杀伤测定涉及相对于每个细胞靶向分子结合区域的靶生物分子的靶生物分子阳性细胞或靶生物分子阴性细胞。
该实施例中使用的靶细胞(细胞系A，B和C)是永生化人癌细胞，可从ATCC(Manassas VA，US)或DSMZ(The Leibniz Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulture)(Braunschweig，DE)获得。
细胞杀伤测定如下进行。将人肿瘤细胞系细胞接种(通常对于粘附细胞，每孔2×103个细胞，在蛋白添加前一天接种，或对于悬浮细胞，每孔7.5×103个细胞，在添加蛋白的同一天接种)在384孔板中的20μL细胞培养基中。在合适的缓冲液中制备一系列10倍稀释的待测蛋白质，并向细胞中加入5μL稀释液或仅作为阴性对照的缓冲液。仅含有细胞培养基的对照孔用于基线校正。将细胞样品与蛋白或仅缓冲液在37℃和5％二氧化碳(CO2)气氛中温育3或5天。使用CellTiter-发光细胞存活力测定法(G7573Promega Madison，WI，U.S.)根据制造商的说明书以相对光单位(RLU)测量，使用发光读数测定总细胞存活率或存活力百分比。
使用以下等式计算实验孔的存活力百分比：(测试RLU-平均培养基RLU)÷(平均细胞RLU-平均培养基RLU)×100。在Prism(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.)中绘制蛋白质浓度的对数相对于存活力百分比的关系图，并且log(抑制剂)相对于响应(3参数)分析用于确定测试蛋白的半数最大细胞毒性浓度(CD50)值。如果可能，计算所测试的每个示例性细胞靶向蛋白的CD50值。
给定细胞靶向分子的细胞毒性活性的特异性通过将针对靶标阳性细胞的细胞杀伤活性与针对靶标阴性细胞的细胞杀伤活性进行比较来确定；其中，靶标阳性细胞表达细胞靶向分子的结合区域的显著量的靶生物分子，靶标阴性细胞不表现出与任何细胞表面物理偶联的细胞靶向分子的结合区域的任何显著量的任何靶生物分子。这通过测定本发明的给定细胞靶向分子针对细胞群(其对所分析的细胞靶向分子的靶生物分子的细胞表面表达是阳性的)的半数最大细胞毒性浓度，然后使用相同的细胞靶向分子浓度范围试图确定针对细胞群(其对细胞靶向分子的靶生物分子的细胞表面表达是阴性的)的半数最大细胞毒性浓度来实现。在一些实验中，与“仅缓冲液”阴性对照相比，用最大量的含有志贺毒素的分子处理的靶标阴性细胞未显示出存活力的任何变化。
使用上述细胞杀伤测定法测试的各种分子的细胞毒性活性水平报告于表1中。如表1所示，在该测定中测试的本发明的示例性细胞靶向蛋白显示出有效的细胞毒性。虽然异源CD8+ T细胞表位-肽与志贺毒素衍生的细胞靶向蛋白的融合可导致细胞毒性没有变化，但一些示例性细胞靶向蛋白与其来源的亲本蛋白相比表现出降低的细胞毒性，该亲本蛋白不包含任何融合的异源表位-肽(表1)。如该实施例中所报道的，CD50值在参考分子测量的CD50值的10倍以内的分子被认为显示出与该参考分子相当的细胞毒性活性。特别地，本发明的任何示例性细胞靶向分子，其对靶标阳性细胞群的CD50值在参考细胞靶向分子对相同细胞类型的CD50值的10倍以内，则将其在本文中称为“与野生型相当”，其中，参考细胞靶向分子包含相同结合区域和野生型志贺毒素效应子多肽(例如SLT-1A-WT(SEQ ID NO:279))，但不包含任何融合的异源T细胞表位-肽。对靶标阳性细胞群的CD50值在参考分子的100倍至10倍以内的细胞靶向分子在本文中称为活性的但是“减毒的”，其中，参考分子包含相同的结合区域和相同的志贺毒素效应子多肽，但不包含任何融合的异源T细胞表位-肽。
表1.包含融合的异源表位-肽的、志贺毒素衍生的细胞靶向蛋白的细胞毒性活性
表1和图2显示SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)对三种不同类型的靶标阳性细胞表现出细胞毒性，其具有与缺乏融合抗原C2的亲本蛋白(SEQ ID NO:258)相似的细胞毒性活性。
Ⅲ.测试表位-肽递送和靶细胞对递送的表位-肽的细胞表面呈递
可以通过检测特定细胞表面的MHC I类分子/表位复合物(pMHC I)来确定T细胞表位的成功递送。为了测试细胞靶向蛋白是否能够将融合的T细胞表位递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，使用检测与特定表位复合的人MHC I类分子的测定。使用流式细胞术方法证明T细胞表位的递送(融合至去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基衍生的细胞靶向蛋白)以及与靶细胞表面上的MHC I类分子复合的、递送的T细胞表位-肽的细胞外展示。该流式细胞术方法利用可溶性人T细胞受体(TCR)多聚体试剂(Soluble T-CellAntigen Receptor STARTM Multimer，Altor Bioscience Corp.，Miramar，FL，US)，各自与不同的表位-人HLA复合物高亲和力结合。
每种STARTM TCR多聚体试剂源自特定T细胞受体，并且允许基于所选TCR识别在特定MHC I类分子背景中呈递的特定肽的能力来检测特定肽-MHC复合物。这些TCR多聚体由已被生物素化并与链霉抗生物素蛋白多聚化的重组人TCR组成。TCR多聚体用藻红蛋白(PE)标记。这些TCR多聚体试剂允许检测呈递在人细胞表面的特定肽-MHC I类复合物，因为每个可溶性TCR多聚体类型在不同条件下识别并稳定结合特定肽-MHC复合物(Zhu X等，J Immunol176：3223-32(2006))。这些TCR多聚体试剂允许通过流式细胞术鉴定和定量呈递在细胞表面上的肽-MHC I类复合物。
在该实施例中使用了TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂(Altor BioscienceCorp.，Miramar，FL，U.S.)。表达HLA-A2的人细胞对人CMV C2肽(NLVPMVATV(SEQ ID NO:21))的MHC I类途径呈递可以用TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂检测，该试剂显示出对与人HLA-A2复合的CMV-pp65表位-肽(残基495-503，NLVPMVATV(SEQ ID NO:21))的高亲和力识别，并用PE标记。
使用本领域已知的标准流式细胞术方法，证实了靶细胞在其细胞表面上表达该实施例中使用的细胞靶向蛋白的HLA-A2 MHC-I类分子和细胞外靶生物分子。在一些实验中，用人干扰素γ(IFN-γ)预处理人癌细胞以增强人HLA-A2的表达。
靶细胞组通过外源施用SLT-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)(包含羧基末端融合的病毒CD8+ T-细胞表位的细胞靶向分子)进行处理，或通过外源施用不包含任何融合的异源病毒表位-肽的阴性对照细胞靶向融合蛋白(SLTA-1A-DI-FR::scFv1(SEQ ID NO:258))进行处理。在这些实验中使用的细胞靶向分子和参考分子都是具有催化活性的细胞毒性细胞靶向分子。考虑到对志贺毒素的细胞类型的特异性敏感性，这些处理是在与其他使用的那些浓度相似的细胞靶向分子浓度下进行(参见例如WO2015/113005)。然后将处理过的细胞在标准条件下温育4-16小时，包括在37℃和含有5％二氧化碳的气氛中，以允许由去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽介导的中毒。然后洗涤细胞并将其与TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂一起温育，以对C2肽-HLA-A2复合物呈递细胞进行“染色”。
作为对照，在三种条件下处理靶细胞组：1)未经任何处理(“未处理”)，意味着仅向细胞添加缓冲液且不添加任何外源分子，2)外源施用CMV C2肽(CMV-pp65，aa495-503：序列NLVPMVATV(SEQ ID NO:21)，由BioSynthesis，Lewisville，TX，U.S.合成)，和/或3)外源施用与肽加载增强剂(“PLE”，Altor Bioscience Corp.，Miramar，FL，U.S.)组合的CMV C2肽((SEQ ID NO:21)，如上所述)。与PLE组合的C2肽(SEQ ID NO:21)处理允许外源肽加载，并用作阳性对照。可迫使显示适当的MHC I类单倍型的细胞从细胞外空间(即，所应用的肽的细胞内化不存在的情况下)或在存在PLE(其是B2-微球蛋白和其他组分的混合物)的情况下加载适当的外源施加的肽。
处理后，洗涤所有细胞组并与TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂在冰上温育1小时。洗涤细胞并使用AccuriTM C6流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA，U.S.)通过流式细胞术测量样品的荧光，从而以相对光单位(RLU)检测与群体中的细胞结合(有时称为“染色”)的任何TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体的存在并定量。
表2和图4-8显示了使用TCR STARTM测定法检测C2表位/HLA-A2MHC I类分子的细胞表面复合物的实验结果。对于每个实验，未处理的对照样品用于通过使用门(gate)来鉴定阳性和阴性细胞群，所述门导致在“阳性”门中来自未处理对照的细胞小于1％(代表背景信号)。然后将相同的门应用于其他样品以表征每个样品的阳性群体。该测定中的阳性细胞是被TCR-CMV-pp65-PE STARTM试剂结合并在上述阳性门中计数的细胞。
在图3中，给出了流式细胞术直方图，其在Y轴上为细胞计数(细胞数或简称“计数”)和X轴上为代表TCR CMV-pp65 STARTM多聚体，PE染色信号的相对荧光单位(RFU)(对数标度)。黑线显示仅未处理细胞样品的结果，灰线显示阴性对照(仅用缺乏任何病毒表位-肽的亲本细胞靶向蛋白处理)，或用本发明的特定示例性细胞靶向蛋白处理的结果。在图3中，上图使用黑线显示了未处理细胞样品的结果和使用灰线显示了用具有融合抗原的细胞靶向分子SLTA-1A-DI-FR::scFv1::C2处理的样品的结果。在图3中，中图使用黑线显示了未处理细胞样品的结果和使用灰线显示了不包含任何融合表位-肽的对照蛋白SLTA-1A-DI-FR::scFv1的结果。在图3中，下图使用黑线显示了用不包含任何融合表位-肽的对照蛋白SLTA-1A-DI-FR::scFv1处理样品的结果和使用灰线显示了用具有融合表位的细胞靶向分子SLTA-1A-DI-FR::scFv1::C2处理样品的结果。
表2.通过细胞靶向蛋白递送C2表位-肽后，细胞表面的MHC I类/C2表位复合物的检测：在中毒的靶细胞表面上检测到的肽-表位C2/MHC I类复合物
如表2和图3所示，用本发明的示例性细胞靶向蛋白(SEQ ID NO:252)处理的细胞样品显示C2-表位/HLA-A2 MHC I类分子复合物在经处理的细胞的表面上的表达。相反，用亲本细胞靶向蛋白SLT-1A-DI-FR::scFv1(SEQ ID NO:258)(其不含任何融合的T细胞表位-肽，作为阴性对照)处理的细胞在处理的细胞群中表现出小于5％的细胞的阳性细胞染色(表2；图3)。由于未测量的处理效率和动力学，在“细胞靶向蛋白”处理样品中在单个时间点检测到的呈递的C2表位/HLA-A2复合物的百分比可能无法准确反映通过本发明给定的示例性细胞靶向蛋白递送后可能的最大量的C2表位/HLA-A2呈递。
在细胞靶向分子处理的靶细胞的细胞表面上检测到与人MHC I类分子复合的T细胞表位C2(SEQ ID NO:21)(C2表位-肽/HLA-A2)，证明了示例性细胞靶向蛋白SLTA-1A-DI-FR::scFv1::C2(SEQ ID NO:252)能够进入靶细胞，进行足够的亚细胞发送，并将足够的C2(SEQ ID NO:21)表位递送至MHC I类途径，用于由靶细胞表面呈递，其中，该细胞靶向蛋白包含该融合的表位-肽C2(SEQ ID NO:21)和去免疫化的、弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应子多肽。
Ⅳ.测试细胞毒性T细胞介导的中毒靶细胞的细胞溶解和由本发明的细胞靶向分
子递送的T细胞表位的MHC I类呈递引发的其他免疫应答
在该实施例中，使用本领域已知的标准测定来研究由本发明的示例性细胞靶向分子递送的T细胞表位的靶细胞的MHC I类呈递的功能性结果。待研究的功能性结果包括CTL活化(例如信号级联诱导)、CTL介导的靶细胞杀伤和CTL的CTL细胞因子释放。
使用基于CTL的细胞毒性测定来评估表位呈递的结果。该测定涉及组织培养的靶细胞和T细胞。如上文第Ⅲ部分-测试表位-肽递送和靶细胞表面呈递等所述，利用本发明的示例性细胞靶向分子使靶细胞中毒。简言之，将靶标阳性细胞在标准条件下与不同的外源施用分子(包括本发明的细胞靶向分子)一起温育20小时。接下来，将CTL添加到经处理的靶细胞中并温育，以允许CTL识别并结合展示表位-肽/MHC I类复合物(pMHC I)的任何靶细胞。然后使用技术人员已知的标准方法研究pMHC I识别的某些功能性结果，包括CTL与靶细胞的结合，通过CTL介导的细胞溶解杀伤呈递表位的靶细胞，以及通过ELISA或ELISPOT的细胞因子如IFN-γ或白细胞介素的释放。
进行技术人员已知的测定，以评估响应于靶向癌细胞的细胞表面表位呈递的、T细胞的细胞间结合的功能性结果，其中所述靶向癌细胞显示由本发明的示例性细胞靶向分子递送的表位。来自体外细胞间免疫细胞接合测定的结果显示，志贺毒素效应子多肽介导的、融合表位-肽向靶标阳性癌细胞的递送以及随后靶向癌细胞对表位的细胞表面呈递可导致具有功能性结果的免疫细胞的细胞间接合，特别是PBMC的IFN-γ分泌。
在通过显示由志贺毒素衍生的细胞靶向分子递送的表位的靶向癌细胞识别细胞表面表位呈递后，进行技术人员已知的常规测定以评估细胞间T细胞活化。该体外T细胞接合测定显示，志贺毒素效应子多肽介导的、融合表位-肽向靶标阳性癌细胞的递送以及随后靶向癌细胞对表位的细胞表面呈递，可导致T-细胞的细胞间接合和T细胞活化的细胞内细胞信号传导特征。
此外，显示表位-肽/MHC I类复合物(pMHC I)的靶细胞对CTL的活化使用市售的CTL应答测定法定量，例如，Cyto非放射性测定(Promega，Madison，WI，U.S.)，Granzyme B ELISpot测定(Mabtech，Inc.，Cincinnati，OH，U.S.)，胱天蛋白酶酶活性测定和LAMP-1易位流式细胞术测定。为了特异性监测CTL介导的靶细胞杀伤，对靶细胞使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)以进行如本领域所述的体外和体内研究(参见例如Durward M等，J Vis Exp 45pii 2250(2010))。
总之，这些结果表明志贺毒素效应子功能，特别是亚细胞发送，可以保持在高水平，即使在羧基末端存在融合的表位-肽并且在提供去免疫化和蛋白酶切割抗性的志贺毒素衍生组分中存在多个突变。此外，几种细胞靶向分子表现出一定水平的表位货物递送，其足以产生一定水平的表位-MHC I类呈递，以刺激与表位-货物-呈递细胞的细胞间T细胞结合。
实施例2.包含志贺毒素A亚基衍生多肽和融合的T细胞表位-肽的细胞靶向分子
产生包括志贺毒素A亚基效应子多肽区域和融合的T细胞表位-肽区域的细胞靶向
融合蛋白
该实施例的细胞靶向融合蛋白包含WO 2015/113005，WO2016/196344和/或PCT/US2016/043902中描述的细胞靶向结合区域多肽、志贺毒素A亚基效应子多肽、蛋白质接头和人CD8+ T细胞表位。
使用本领域已知的技术，通过将人CD8+ T细胞表位-肽遗传融合至亲本细胞靶向蛋白的多肽组分的氨基末端(N-末端)或羧基末端(C-末端)来产生细胞靶向融合蛋白，该亲本细胞靶向蛋白包含1)志贺毒素A亚基效应子多肽和2)由蛋白质接头分开的细胞靶向结合区域多肽。融合的CD8+ T细胞表位选自源自通常感染人类的病毒的蛋白质的几种T细胞表位-肽。构建该实施例的某些细胞靶向融合蛋白，使得每个蛋白包含单个连续多肽，所述多肽包含细胞靶向结合区域多肽、志贺毒素A亚基效应子多肽和融合的异源CD8+ T细胞表位。
在该实施例中制备和测试的本发明的示例性细胞靶向分子是SLT-1A-DI-1::scFv8::C2(SEQ ID NO:256)，“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)，和“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2”(SEQ ID NO:254)。在该实施例中生产和测试的其他细胞靶向分子包括：C2::SLT-1A::scFv2(SEQ ID NO:267)，“无活性C2::SLT-1A::scFv2”(SEQID NO:268)，SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)，SLT-1A::scFv2::C2(SEQ ID NO:269)，“无活性SLT-1A::scFv2::C2”(SEQ ID NO:270)，F2::SLT-1A::scFv2(SEQ ID NO:271)，scFv3::F2::SLT-1A(SEQ ID NO:272)，scFv4::F2::SLT-1A(SEQ ID NO:273)，SLT-1A::scFv5::C2(SEQ ID NO:274)，SLT-1A::scFv6::F2(SEQ ID NO:275)，“无活性SLT-1A::scFv6::F2”(SEQ ID NO:276)，SLT-1A::scFv7::C2(SEQ ID NO:277)，C1::SLT-1A::scFv1(SEQ ID NO:260)，C1-2::SLT-1A::scFv1(SEQ ID NO:261)，C3::SLT-1A::scFv1(SEQ IDNO:262)，C24::SLT-1A::scFv1(SEQ ID NO:263)，SLT-1A::scFv1::C1(SEQ ID NO:268)，SLT-1A::scFv1::C24-2(SEQ ID NO:264)，SLT-1A::scFv1::E2(SEQ ID NO:265)和SLT-1A::scFv1::F3(SEQ ID NO:266)。这些细胞靶向融合蛋白各自包括含有单链可变片段(scFv)的细胞靶向结合区域、来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)的志贺毒素A亚基效应子多肽、以及与结合区域或志贺毒素效应子多肽融合的人CD8+ T细胞表位-肽。
该实施例的细胞靶向分子的所有志贺毒素效应子多肽区域由SLT-1A(SEQ ID NO:1)的氨基酸1-251组成或由其衍生，并且它们中的一些包含两个或更多个相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换，例如，催化结构域失活置换E167D，C242S，和/或导致弗林蛋白酶切割抗性的置换R248A/R251A(参见例如WO 2015/191764；WO 2016/196344)。该实施例的本发明的示例性细胞靶向分子的志贺毒素A亚基效应子多肽组分包括SLT-1A-DI-1(SEQ ID NO:30)，“无活性SLT-1A-DI-1”(SEQ ID NO:35)和“无活性SLT-1A-DI-4”(SEQ IDNO:38)，其可以是催化活性的或经修饰以具有降低的催化活性(参见例如SEQ ID NO:33)。如在该实施例中所使用的，细胞靶向分子命名“无活性”是指仅包含具有E167D置换的那些志贺毒素A亚基效应子多肽组分的分子。这种单个氨基酸残基置换可以减弱志贺毒素A亚基的催化活性，例如，降低10,000倍。
免疫球蛋白型结合区域scFv1、scFv2、scFv3、scFv4、scFv5、scFv6、scFv7和scFv8各自是单链可变片段，其以高亲和力结合与某些人类癌细胞的表面物理偶联的某些细胞表面靶生物分子。scFv1和scFv2均以高亲和力和特异性结合相同的细胞外靶生物分子。scFv3和scFv5均以高亲和力和特异性结合相同的细胞外靶生物分子。scFv6、scFv7和scFv8三者均以高亲和力和特异性结合相同的细胞外靶生物分子。scFv1、scFv3、scFv4和scFv6均不靶向相同的细胞外靶生物分子。
在该实施例的实验中测试的所有细胞靶向分子(包括参考细胞靶向分子)在细菌系统中生产，并使用技术人员已知的技术通过柱色谱法纯化。
在融合结合区域和T细胞表位肽后，测试细胞靶向分子的志贺毒素A亚基效应子多
肽组分，以获得志贺毒素功能的保留
在融合异源CD8+ T细胞表位-肽后，测试细胞靶向蛋白，以获得志贺毒素A亚基效应子功能的保留。分析的志贺毒素A亚基效应子功能是：真核核糖体的催化灭活、细胞毒性、以及通过推断自我指导亚细胞发送至胞质溶胶。至少七个细胞靶向蛋白显示出与未与任何异源T细胞表位-肽或另外的多肽部分融合的野生型志贺毒素效应子多肽相当的催化活性。
1.测试本发明的细胞靶向分子的核糖体抑制能力
使用核糖体抑制测定法测试细胞靶向分子的志贺毒素A亚基衍生的志贺毒素效应子多肽区域的催化活性。
使用快速偶联转录/翻译试剂盒(L1170 Promega Madison，WI，U.S.)，使用无细胞的体外蛋白翻译测定法，测定该实施例的细胞靶向蛋白的核糖体失活能力。该试剂盒包括荧光素酶T7对照DNA(L4821 Promega Madison，WI，U.S.)和/>Quick MasterMix。根据制造商的说明准备核糖体活性反应。在合适的缓冲液中制备一系列10倍稀释的志贺毒素衍生的待测细胞靶向蛋白，并为每种稀释液产生一系列相同的TNT反应混合物组分。将稀释系列中的每个样品与每个TNT反应混合物以及荧光素酶T7对照DNA组合。将测试样品在30摄氏度(℃)下温育1.5小时。温育后，将荧光素酶测定试剂(E1483 Promega，Madison，WI，U.S.)加入到所有测试样品中，并根据制造商的说明通过发光测量荧光素酶蛋白翻译的量。
通过对数转化的总蛋白浓度相比于相对发光单位的非线性回归分析确定翻译抑制水平。使用统计软件(GraphPad Prism，San Diego，CA，US)，在标题剂量-应答-抑制下使用log(抑制剂)对比应答(三个参数)的Prism软件函数[Y＝底部+((顶部–底部)/(1+10^(X–Log IC50)))]计算每个样品的半数最大抑制浓度(IC50)值。计算来自一个或更多个实验的每个志贺毒素衍生的细胞靶向蛋白的IC50值，并以皮摩尔(pM)显示在表3中。表现出在包含野生型志贺毒素效应子多肽(例如SLT-1A-WT(SEQ ID NO:279))的阳性对照分子的10倍以内的IC50的任何细胞靶向分子在本文中被认为表现出与野生型相当的核糖体抑制活性。
表3.与异源表位肽融合的志贺毒素衍生的细胞靶向蛋白的核糖体抑制
如表3中所示，细胞靶向蛋白显示出与阳性对照相当的有效核糖体抑制，该阳性对照为：1)仅包含野生型志贺毒素A亚基多肽序列的“仅SLT-1A-WT”多肽(SEQ ID NO:279)和2)包含SLT-1A衍生的志贺毒素效应子多肽(该多肽与scFv结合区域融合但缺乏任何融合的异源CD8+ T细胞表位肽)的细胞靶向蛋白，例如SLT-1A::scFv1(SEQ ID NO:280)，SLT-1A::scFv2(SEQ ID NO:281)，SLT-1A::scFv5(SEQ ID NO:283)，或SLT-1A::scFv6(SEQ ID NO:284)。
2.测试本发明的细胞靶向分子的细胞毒性活性
使用基于组织培养细胞的毒性测定法，测量细胞靶向分子的细胞毒性活性。对于某些细胞靶向分子，测定了杀伤同源细胞群中一半细胞的、外源施用的细胞靶向分子的浓度(半数最大细胞毒性浓度)。使用细胞杀伤测定来测试示例性细胞靶向分子的细胞毒性，该细胞杀伤测定涉及相对于每个细胞靶向分子结合区域的靶生物分子的靶生物分子阳性细胞或靶生物分子阴性细胞。
细胞杀伤测定如下进行。将人肿瘤细胞系细胞接种(通常对于粘附细胞，每孔2×103个细胞，在蛋白添加前一天接种，或对于悬浮细胞，每孔7.5×103个细胞，在添加蛋白的同一天接种)在384孔板中的20μL细胞培养基中。在合适的缓冲液中制备一系列10倍稀释的待测蛋白质，并向细胞中加入5μL稀释液或仅作为阴性对照的缓冲液。仅含有细胞培养基的对照孔用于基线校正。将细胞样品与蛋白或仅缓冲液在37℃和5％二氧化碳(CO2)气氛中温育3或5天。使用CellTiter-发光细胞存活力测定法(G7573Promega Madison，WI，U.S.)根据制造商的说明书以相对光单位(RLU)测量，使用发光读数测定总细胞存活率或存活力百分比。
使用以下等式计算实验孔的存活力百分比：(测试RLU-平均培养基RLU)÷(平均细胞RLU-平均培养基RLU)×100。在Prism(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.)中绘制蛋白质浓度的对数相对于百分比存活力的关系图，并且log(抑制剂)相对于响应(3参数)分析用于确定测试蛋白的半数最大细胞毒性浓度(CD50)值。如果可能，计算每个测试的细胞靶向蛋白的CD50值。
给定细胞靶向分子的细胞毒性活性的特异性通过将针对靶标阳性细胞的细胞杀伤活性与针对靶标阴性细胞的细胞杀伤活性进行比较来确定；其中，靶标阳性细胞表达细胞靶向分子的结合区域的显著量的靶生物分子，靶标阴性细胞不表现出与任何细胞表面物理偶联的细胞靶向分子的结合区域的任何显著量的靶生物分子。这通过测定给定细胞靶向分子针对细胞群(其对所分析的细胞靶向分子的靶生物分子的细胞表面表达是阳性的)的半数最大细胞毒性浓度，然后使用相同的细胞靶向分子浓度范围试图确定针对细胞群(其对细胞靶向分子的靶生物分子的细胞表面表达是阴性的)的半数最大细胞毒性浓度来实现。在一些实验中，与“仅缓冲液”阴性对照相比，用最大量的含有志贺毒素的分子处理的靶标阴性细胞未显示出生存力的任何变化。
使用上述细胞杀伤测定法测试的各种分子的细胞毒性活性水平报告于表4中。如表4所示，在该测定中测试的细胞靶向蛋白显示出有效的细胞毒性。虽然异源CD8+ T细胞表位-肽与志贺毒素衍生的细胞靶向蛋白的融合可导致细胞毒性没有变化，但一些细胞靶向蛋白与其来源的亲本蛋白相比表现出降低的细胞毒性，该亲本蛋白不包含任何融合的异源表位-肽(表4)。如该实施例中所报道的，CD50值在参考分子测量的CD50值的10倍以内的分子被认为显示出与该参考分子相当的细胞毒性活性。特别地，任何细胞靶向分子，其对靶标阳性细胞群的CD50值在参考细胞靶向分子对相同细胞类型的CD50值的10倍以内，则将其在本文中称为“与野生型相当”，其中，参考细胞靶向分子包含相同结合区域和野生型志贺毒素效应子多肽(例如SLT-1A-WT(SEQ ID NO:279))，但不包含任何融合的异源T细胞表位-肽。对靶标阳性细胞群的CD50值在参考分子的100倍至10倍以内的细胞靶向分子在本文中称为活性的但是“减毒的”，其中，参考分子包含相同的结合区域和相同的志贺毒素效应子多肽，但不包含任何融合的异源T细胞表位-肽。
表4.包含融合的异源表位肽的、志贺毒素衍生的细胞靶向蛋白的细胞毒性活性
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所有测试的细胞靶向蛋白有效地杀伤靶标阳性细胞(表4)，但是在相同剂量下不杀伤相当百分比的靶标阴性细胞(参见例如图6和7)。图6和图7以图形方式显示细胞靶向蛋白SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)的特异性细胞毒性在测试的浓度范围内仅对靶标表达细胞具有特异性(图6)，但对靶标阴性细胞不具有特异性(图7)。无法从测试的细胞靶向蛋白的浓度范围计算细胞靶向蛋白对靶标阴性细胞的CD50值，因为当在最高测试浓度下细胞存活力没有显著降低时，不能产生准确的曲线(参见例如图7)。
测试表位-肽递送和递送的表位-肽的靶细胞表面呈递
可以通过检测特定细胞表面的MHC I类分子/表位复合物(pMHC I)来确定T细胞表位的成功递送。为了测试细胞靶向蛋白是否能够将融合的T细胞表位递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，使用检测与特定表位复合的人MHC I类分子的测定。使用流式细胞术方法证明T细胞表位的递送(融合至志贺毒素A亚基衍生的细胞靶向蛋白)以及与靶细胞表面上的MHCI类分子复合的、递送的T细胞表位-肽的细胞外展示。该流式细胞术方法利用可溶性人T细胞受体(TCR)多聚体试剂(Soluble T-Cell Antigen Receptor STARTM Multimer，AltorBioscience Corp.，Miramar，FL，U.S.)，各自与不同表位-人类HLA复合物高亲和力结合。
每种STARTM TCR多聚体试剂衍生自特定T细胞受体，并且允许基于所选TCR识别在特定MHC I类分子背景中呈递的特定肽的能力来检测特定肽-MHC复合物。这些TCR多聚体由已被生物素化并与链霉抗生物素蛋白多聚化的重组人TCR组成。TCR多聚体用藻红蛋白(PE)标记。这些TCR多聚体试剂允许检测呈递在人细胞表面的特定肽-MHC I类复合物，因为每个可溶性TCR多聚体类型在不同条件下识别并稳定结合特定肽-MHC复合物(Zhu X等，JImmunol 176：3223-32(2006))。这些TCR多聚体试剂允许通过流式细胞术鉴定和定量呈递在细胞表面上的肽-MHC I类复合物。
在该实施例中使用了TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂(Altor BioscienceCorp.，Miramar，FL，U.S.)。表达HLA-A2的人细胞对人CMV C2肽(NLVPMVATV(SEQ ID NO:21))的MHC I类途径呈递可以用TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂检测，该试剂显示出对与人HLA-A2复合的CMV-pp65表位-肽(残基495-503，NLVPMVATV)的高亲和力识别，并用PE标记。
该实施例中使用的靶细胞(靶标阳性细胞系B，D，E，F，G，H，I，J和K)是可从ATCC(Manassas VA，U.S.)或DSMZ(Leibniz Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulture)(Braunschweig，DE)获得的永生化人癌细胞。使用本领域已知的标准流式细胞术方法，证实了靶细胞在其细胞表面上表达该实施例中使用的细胞靶向蛋白的HLA-A2MHC-I类分子和细胞外靶生物分子。在一些实验中，用人干扰素γ(IFN-γ)预处理人癌细胞以增强人HLA-A2的表达。
靶细胞组通过外源施用包含羧基末端融合的病毒CD8+ T-细胞表位的细胞靶向分子：SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)，“无活性SLT-1A::scFv2::C2”(SEQ ID NO:270)，SLT-1A::scFv5::C2(SEQ ID NO:273)和SLT-1A::scFv7::C2(SEQ ID NO:277))进行处理；或通过外源施用不包含任何融合的异源病毒表位-肽的阴性对照细胞靶向融合蛋白(SLT-1A::scFv1(SEQ ID NO280)，SLT-1A::scFv2(SEQ ID NO：282)，“无活性SLT-1A::scFv2”(SEQ ID NO:281)，SLT-1A::scFv5(SEQ ID NO:283)，或SLT-1A::scFv7(SEQ ID NO:286))进行处理。在这些实验中使用的细胞靶向分子和参考分子包括具有催化活性的细胞毒性细胞靶向分子和“无活性”细胞靶向分子-意味着它们的所有志贺毒素效应子多肽组分都包含突变E167D，其严重降低了志贺毒素A亚基和志贺毒素的催化活性。考虑到对志贺毒素的细胞类型特异性敏感性，这些处理是在与其他使用的那些浓度相似的细胞靶向分子浓度下进行(参见例如WO 2015/113005)。然后将处理过的细胞在标准条件下温育4-16小时，包括在37℃和含有5％二氧化碳的气氛中，以允许由志贺毒素效应子多肽介导的中毒。然后洗涤细胞并与TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂一起温育以对C2肽-HLA-A2复合物呈递细胞进行“染色”。
作为对照，在三种条件下处理靶细胞组：1)未经任何处理(“未处理”)，意味着仅向细胞添加缓冲液且不添加任何外源分子，2)外源施用CMV C2肽(CMV-pp65，aa495-503：序列NLVPMVATV(SEQ ID NO:21)，由BioSynthesis，Lewisville，TX，U.S.合成，和/或3)外源施用与肽加载增强剂(“PLE”，Altor Bioscience Corp.，Miramar，FL，U.S.)组合的CMV C2肽((SEQ ID NO:21)，如上所述)。与PLE组合的C2肽(SEQ ID NO:21)处理允许外源肽加载，并用作阳性对照。可迫使显示适当的MHC I类单倍型的细胞从细胞外空间(即，所应用的肽的细胞内化不存在的情况下)或在存在PLE(其是B2-微球蛋白和其他组分的混合物)的情况下加载适当的外源施加的肽。
处理后，洗涤所有细胞组并与TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂在冰上温育1小时。洗涤细胞并使用AccuriTM C6流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA，U.S.)通过流式细胞术测量样品的荧光，从而以相对光单位(RLU)检测与群体中的细胞结合(有时称为“染色”)的任何TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体的存在并定量。
表5和图8-12显示了使用TCR STARTM测定法检测C2表位/HLA-A2MHC I类分子的细胞表面复合物的实验结果。对于每个实验，未处理的对照样品用于通过使用门(gate)来鉴定阳性和阴性细胞群，所述门导致在“阳性”门中来自未处理对照的细胞小于1％(代表背景信号)。然后将相同的门应用于其他样品以表征每个样品的阳性群体。该测定中的阳性细胞是被TCR-CMV-pp65-PE STARTM试剂结合并在上述阳性门中计数的细胞。在图8和图10-12中，给出了流式细胞术直方图，其在Y轴上为计数(细胞数)和X轴上为代表TCR CMV-pp65STARTM多聚体，PE染色信号的相对荧光单位(RFU)(对数标度)。黑线显示仅未处理细胞样品的结果，灰线显示阴性对照(仅用缺乏任何病毒表位-肽的亲本细胞靶向蛋白处理)，或用特定细胞靶向蛋白处理的结果。在图8和图10-12中，上图使用黑线显示了未处理细胞样品的结果和使用灰线显示了用细胞靶向分子处理的样品的结果。在图8、11和12中，下图使用黑线显示了未处理细胞样品的结果和使用灰线显示了不包含任何融合表位-肽的对照蛋白的结果。在图10中，上图显示了温育4小时的结果，下图显示了温育16小时的结果。在表5中，给出了处理组中对C2-表位-肽-HLA-A2 MHC I类分子复合物染色呈阳性的细胞的百分比。表5还显示了每个处理组以RFU表示的相应指数化平均荧光强度(“iMFI”，“阳性群体的荧光乘以阳性百分比”)。
表5.通过细胞靶向蛋白递送C2表位-肽后，细胞表面的MHC I类/C2表位复合物的检测：在中毒的靶细胞表面上检测到的肽-表位C2/MHC I类复合物
如表5和图8-12所示，用示例性细胞靶向蛋白处理的细胞样品在大多数经处理细胞的表面上显示依赖于温育时间的C2-表位/HLA-A2 MHC I类分子复合物的表达。用外源细胞靶向蛋白SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)或“无活性SLT-1A::scFv2::C2”(SEQ IDNO:270)，SLT-1A::scFv5::C2(SEQ ID NO:274)和SLT-1A::scFv7::C2(SEQ ID NO:277)处理的细胞在分析样品中33-95％的细胞上显示细胞表面C2-表位/HLA-A2复合物的阳性信号(表5)。相反，用亲本细胞靶向蛋白(其不含任何融合的T细胞表位-肽，作为阴性对照)处理的细胞在处理的细胞群中显示5％或更少细胞的阳性细胞染色(表5；图8-12)。
虽然用该实施例的细胞靶向蛋白处理的大多数细胞在细胞表面上显示C2-表位/HLA-A2复合物，但“未处理的”细胞群中5％或更少细胞显示对C2-表位/HLA-A2复合物的TCRSTARTM染色(表5；图8；图10)。阳性对照处理显示群体中99％的细胞的强染色，这仅归因于在肽加载增强子存在下仅加载外源C2表位-肽(SEQ ID NO:21)(图9)。由于未测量的处理效率和动力学，在“细胞靶向蛋白”处理样品中在单个时间点检测到的呈递的C2表位/HLA-A2复合物的百分比可能无法准确反映在由给定细胞靶向蛋白递送后可能的最大量的C2表位/HLA-A2呈递。
在用细胞靶向分子处理的靶细胞的细胞表面上检测到与人MHC I类分子复合的T细胞表位C2(SEQ ID NO:21)(C2表位-肽/HLA-A2)，证明了包含该融合表位-肽(C2(SEQ IDNO:21))的细胞靶向蛋白(SLT-1A::scFv1::C2(SEQ ID NO:278)，“无活性SLT-1A::scFv2::C2”(SEQ ID NO:270)，SLT-1A::scFv5::C2(SEQ ID NO:274)和SLT-1A::scFv7::C2(SEQ IDNO:277))能够进入靶细胞，进行足够的亚细胞发送，并将足够的C2(SEQ ID NO:21)表位递送至MHC I类途径，用于通过靶细胞表面的表面呈递。
测试细胞毒性T细胞介导的中毒靶细胞的细胞溶解和由本发明的细胞靶向分子递
送的T细胞表位的MHC I类呈递引发的其他免疫应答
在该实施例中，使用本领域已知的标准测定来研究由示例性细胞靶向分子递送的T细胞表位的靶细胞的MHC I类呈递的功能性结果。待研究的功能性结果包括CTL活化(例如信号级联诱导)、CTL介导的靶细胞杀伤和CTL的CTL细胞因子释放。
使用基于CTL的细胞毒性测定来评估表位呈递的结果。该测定涉及组织培养的靶细胞和T细胞。如本实施例中小节“测试表位-肽递送和靶细胞表面呈递”等所述，利用示例性细胞靶向分子使靶细胞中毒。简言之，将靶标阳性细胞在标准条件下与不同的外源施用分子(包括细胞靶向分子)一起温育20小时。接下来，将CTL添加到经处理的靶细胞中并温育，以允许CTL识别并结合展示表位-肽/MHC I类复合物(pMHC I)的任何靶细胞。然后使用技术人员已知的标准方法研究pMHC I识别的某些功能性结果，包括CTL与靶细胞的结合，通过CTL介导的细胞溶解杀伤呈递表位的靶细胞，以及通过ELISA或ELISPOT的细胞因子如IFN-γ或白细胞介素的释放。
进行测定以评估T细胞响应于细胞表面表位呈递的细胞间接合的功能结果，所述细胞表面表位呈递通过展示由细胞靶向分子递送的表位的靶向癌细胞进行。
图13和表6显示了根据制造商的说明书使用的干扰素γELIspot测定法(Mabtech，Inc.，Cincinnati，OH，U.S.)的结果。该ELISPOT测定法可用于定量IFN-γ分泌，每个斑点表示IFN-γ分泌细胞。简言之，将靶标阳性细胞系G的细胞样品与仅含磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(“仅缓冲液”)，“无活性SLT-1A::scFv2::C2”(SEQ ID NO:270)或参考分子“无活性SLT-1A::scFv2”(SEQ ID NO:282)温育20小时。用PBS洗涤样品，并加入到已装载有来自Cellular Technology Limited(Shaker Heights，OH，美国)的人PBMC(HLA-A2血清型)的ELISPOT平板中。将平板再温育24小时，然后根据干扰素Gamma ELIspot测定法Mabtech试剂盒说明书检测斑点，并使用ELISPOT平板读数器(Zellnet Consulting，Inc.，Fort Lee，NJ，U.S.)定量。
表6.通过与“无活性SLTA-1A::scFv2::C2”一起温育的靶细胞识别表位呈递后，PBMC的干扰素γ分泌
| 蛋白质 | 靶标阳性细胞类型 | 斑点的平均数 | 每个斑点的平均面积 |
| 无活性SLT-1A::scFv2::C2 | 细胞系G | 490 | 2,636,291 |
| 无活性SLT-1A::scFv2 | 细胞系G | 280 | 1,511,726 |
| 仅缓冲液 | 细胞系G | 334 | 2,144,217 |
表6和图13中的结果显示温育细胞系G细胞与细胞靶向分子“无活性SLT-1A::scFv2::C2”(SEQ ID NO:270)产生的PBMC荧光素酶活性信号大于仅使用缓冲液处理的细胞样品检测到的背景信号或来自用参考分子“无活性SLT-1A::scFv2”(SEQ ID NO:282)处理的样品细胞的荧光素酶信号。该体外细胞间免疫细胞接合测定的结果显示，志贺毒素效应子多肽介导的融合表位-肽向靶标阳性癌细胞的递送以及随后由靶癌细胞进行的表位的细胞表面呈递可导致免疫细胞的细胞间接合，其具有功能性后果，特别是PBMC的IFN-γ分泌。
当效应T细胞识别特定表位-MHC-1复合物时，T细胞可以启动细胞内信号级联反应，所述信号级联反应驱动活化T细胞的核因子(NFAT)转录因子从胞质溶胶到细胞核的易位，并能够导致刺激含有NFAT应答元件(RE)的基因的表达(参见例如Macian F，Nat RevImmunol 5：472-84(2005))。经工程改造用于表达特异性识别F2肽/人HLA A2 MHC I类分子复合物的人T细胞受体的J76 T细胞系(Berdien B等，Hum Vaccin Immunother 9：1205-16(2013))是用由NFAT-RE调节的荧光素酶表达载体(pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro]，CAT#E8481，Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)转染。当荧光素酶报告基因转染的J76 TCR特异性细胞识别显示HLA-A2/F2表位-肽(SEQ ID NO:25)复合物的细胞时，则可以通过与表达载体的NFAT-RE结合的NFAT转录因子刺激荧光素酶的表达。转染的J76细胞中的荧光素酶活性水平可以通过添加标准荧光素酶底物然后使用光电探测器读取发光水平来定量。
在通过展示由细胞靶向分子递送的表位的靶向癌细胞识别细胞表面表位呈递后，进行测定以评估细胞间T细胞活化。简言之，将细胞系F的细胞样品与“无活性SLT-1A::scFv6::F2”(SEQ ID NO:276)，参考分子“无活性SLT-1A::scFv6”(SEQ ID NO:285)或仅单独的缓冲液一起温育6小时，然后洗涤。然后，将荧光素酶-报告子转染的J76 T细胞与每个样品混合，并将细胞混合物温育18小时。接下来，使用One-GloTM荧光素酶测定系统试剂(Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)测量荧光素酶活性。图14和表7显示了这种细胞间T细胞接合测定的结果。
表7.通过与“无活性SLTA-1A::scFv6::F2”一起温育的靶细胞识别表位呈递后，由报告细胞中的NFAT应答元件驱动的荧光素酶信号
表7和图14中的结果显示，与细胞靶向分子“无活性SLT-1A::scFv6::F2”(SEQ IDNO:276)一起温育导致荧光素酶活性水平大于使用“仅缓冲液”处理的细胞检测到的背景荧光素酶活性信号或用阴性对照分子“无活性SLT-1A::scFv6”(SEQ ID NO:285)处理的细胞样品的荧光素酶活性。该体外T细胞接合测定显示，志贺毒素效应子多肽介导的融合表位-肽向靶标阳性癌细胞的递送以及随后由靶癌细胞进行的表位的细胞表面呈递可导致T-细胞的细胞间接合和T细胞活化的细胞内细胞信号传导读出特征。
当效应T细胞识别特定表位-MHC-1复合物时，T细胞可以启动细胞内信号级联反应，所述信号级联反应促进效应细胞因子(例如IFN-γ)分泌和/或导致细胞间免疫细胞介导的细胞杀伤，其中该细胞呈递该特定表位MHC-I复合物。在通过展示由细胞靶向分子递送的表位的靶向癌细胞识别细胞表面表位呈递后，进行测定以评估IFN-γ的T细胞分泌和CD8+ T细胞介导的细胞毒性。该测定涉及将用本发明的细胞靶向分子预处理的肿瘤细胞与外周血单核细胞(PBMC)共温育，所述外周血单核细胞包括能够识别特定pMHC I的T细胞，即表达特异性识别另一个呈递细胞表面上的肽-MHC I类分子复合物的T细胞受体的T细胞。
如下进行共温育细胞间T细胞测定，以测量IFN-γ分泌和靶细胞杀伤。将对scFv6结合的细胞外分子呈靶标阳性的细胞系I的细胞与500nM的“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)或单独的PBS(仅“缓冲液”)在37℃和5％CO2的气氛中温育4小时。然后洗涤细胞，并与含有HMC-A02/C2血清阳性的PBMC的培养基组合。在共培养之前，在C2肽(SEQ ID NO:21)存在下，通过1-2周培养扩增使PBMC富集C2限制性T细胞，以获得约1％至5％的C2反应性T细胞的频率(这些PBMC在本文中称为“C2限制性PBMC”)。将靶向的肿瘤细胞和C2限制性PBMC以5个PBMC对一个靶标阳性肿瘤细胞(5:1)的比例在37℃和5％CO2的气氛中共温育24小时。收获上清液，并根据制造商的说明书使用细胞因子特异性IFN-γELISA试剂盒(Biolegend，Inc.，San Diego，CA，U.S.)测量IFN-γ浓度。此外，在收获上清液后，洗涤粘附的靶标阳性肿瘤细胞以除去PBMC，并且根据制造商的说明通过CellTiter-发光细胞存活力测定法(G7573Promega Madison，WI，U.S.)评估剩余粘附细胞的细胞存活力。图15和16显示了细胞靶向分子处理的细胞系I和HLA-A02/C2-肽复合物检测PBMC(C2限制性PBMC)的这些共温育测定的结果，以通过测量IFN-γ分泌和肿瘤细胞的细胞活力来测定细胞间T细胞识别和接合。
图15显示了IFN-γELISA测定的结果。结果显示，与细胞靶向分子“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)而不与“仅缓冲液”温育后，肿瘤靶细胞(细胞系I)与C2限制性PBMC的共培养导致PBMC中T细胞的活化，如通过检测IFN-γ分泌所证明的。
图16显示了以RLU测量的CellTiter-发光细胞存活力测定法的结果。结果显示，与细胞靶向分子“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)而不与“仅缓冲液”温育后，肿瘤靶细胞(细胞系I)与C2限制性PBMC的共培养导致PBMC中细胞毒性T淋巴细胞的活化和靶细胞杀伤，如通过粘附肿瘤靶细胞的存活力百分比的降低所证明的。
来自IFN-γELISA和CellTiter-发光细胞存活力测定法的数据证明，志贺毒素效应子多肽介导的融合表位-肽向靶标阳性肿瘤细胞的递送以及随后肿瘤细胞对表位的细胞表面呈递能够导致特异T细胞的活化，以释放效应细胞因子并导致靶肿瘤细胞死亡(参见图15-16)。
进行另一共培养肿瘤细胞存活力测定，其中E:T比率恒定保持在5:1，并且细胞靶向分子的浓度变化或PBMC富集C2限制性PBMC。使用的细胞如上所述，靶细胞是细胞系I的肿瘤细胞，PBMC是C2限制性的。将结果与仅缓冲液对照进行比较。将靶向肿瘤细胞和C2限制性PBMC在37℃和5％CO2的气氛中共温育24小时。洗涤粘附的靶标阳性肿瘤细胞以除去PBMC，并如上所述进行CellTiter-发光细胞存活力测定。表8显示了该共培养肿瘤细胞存活力测定的结果，其中施用的“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)的经测试浓度以步降方式在2μM，0.5μM和0.125μM中变化。数据表示为粘附细胞存活力百分比的降低，如通过标准化至零时间点(基线存活力)的Incu/>S3活细胞分析系统(EssenBioscience，Ann Arbor，MI，U.S.)所测量的。对于Incu/>S3活细胞成像研究，将细胞接种在标准96孔组织培养板中并在标准条件下培养。通过制造商提供的标准方案，从每孔多达四个图像中获得数据，如通过相位、红色和绿色荧光所读出的。该样品中的比较包括在E:T为5:1时包含PBMC，其在与相关C2肽(SEQ ID NO:253)共培养之前培养扩增一周，或者在与相关C2肽(SEQID NO:21)共培养培养之前扩增一周。
表8.免疫细胞的细胞间接合导致剂量依赖性方式的靶细胞杀伤，该免疫细胞识别与“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”接触的靶细胞的C2表位呈递
表8中的数据表明，由本发明的细胞靶向分子诱导的靶肿瘤细胞死亡的量取决于施用于靶肿瘤细胞的细胞靶向分子的浓度和PBMC的富集。用“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)预处理的靶标阳性肿瘤细胞和C2限制性PBMC的共培养导致粘附的靶肿瘤细胞存活力百分比降低了约35％至65％。在细胞靶向分子浓度低至0.125μM时，超过35％的粘附靶细胞在C2限制性PBMC样品中被杀伤。该效应是剂量依赖性的，因为0.5μM和2μM的细胞靶向分子浓度分别诱导细胞活力降低约50％和65％。表8中的结果表明，施用于靶细胞的细胞靶向分子的浓度影响整体T细胞活化和随后的靶向肿瘤细胞的杀伤。
在上述实验中，PBMC与肿瘤细胞的比例为5比1。进行另外的实验，其中改变该PBMC效应细胞与靶细胞(“E:T”)的比例。将靶肿瘤细胞(细胞系I)与“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)以500nM的浓度在37℃和5％的二氧化碳气氛下温育4小时，然后与PBMC在各种E:T比例下在37℃和5％的二氧化碳气氛中共培养超过三天。表9显示了共培养后80小时该测定的细胞存活力的结果，如通过IncuS3活细胞分析系统中的汇合(confluence)所测量的。数据表示为与测定终点处的仅缓冲液对照相关的百分比存活力。在PBMC与靶细胞的可变E:T比例下(E:T＝5:1、1:1、05:1和0.1:1)，显示了用固定剂量的细胞靶向分子或“仅缓冲液”处理的条件下的情况比较。
表9.识别与“非活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3接触的靶细胞的C2表位呈递的PBMC以E:T依赖性方式导致靶细胞杀伤
表9中的数据表明，由本发明的细胞靶向分子诱导的靶肿瘤细胞死亡的量取决于E:T比例。表9报道了在E:T比为5：1时观察到粘附细胞存活率降低至少60％。因此，80小时后超过60％的粘附靶细胞被杀伤。在更低比例的PBMC下，80小时后杀伤的粘附细胞更少。在测试的较低E:T比率(1:1和0.5:1)下，少于40％的粘附靶细胞被杀伤。对于仅缓冲液对照，在最高E:T比例为5:1时，少于20％的粘附靶细胞被杀伤。表8和9中的结果表明PBMC与靶肿瘤细胞的比例和施用于靶肿瘤细胞的细胞靶向分子的浓度都有助于通过与本发明的细胞靶向分子温育而诱导的肿瘤细胞细胞毒性的机制，其中大量细胞靶向分子和/或PBMC与增加的靶细胞死亡相关。
抗原特异性T细胞活化与增加的与邻近细胞的相互作用和免疫细胞聚集表型相关(参见例如Butz E，Bevan M，Immunity 8：167-75(1998))。为了研究这一点，如下进行另一个共温育细胞间T细胞测定，以测量响应于呈递与MHC I类分子复合的递送的C2表位的靶细胞的淋巴细胞聚集。将靶细胞(细胞系I)与500nM的“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)温育24小时，然后与如上所述的C2限制性PBMC共温育。对于这些实验，PBMC中的PBMC效应子用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)预标记，CFSE是用于追踪培养孔内细胞数量和位置的膜透性染料。在共温育后，使用IncuS3活细胞分析系统(EssenBioscience，Ann Arbor，MI，U.S.)，每4-6小时对培养孔中的各个PBMC成像。使用制造商的方案，通过IncuS3软件套件计算CFSE阳性细胞的总数和CFSE信号的平均强度。在Prism(GraphPadPrism，San Diego，CA，美国)中绘制免疫细胞簇(大于100微米的CFSE阳性细胞簇)，并且这些实验的结果显示在图17中。
图17显示了靶细胞系I细胞和C2限制性PBMC的共温育细胞间接合测定的结果，如通过淋巴细胞聚集所测量的。图17中的结果显示，肿瘤细胞与细胞靶向分子“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)而不是“仅缓冲液”的温育导致PBMC中细胞聚集的激活，如通过细胞聚集成大小大于100微米的簇所测量的。此外，这些PBMC细胞簇显示出延长的持久性，证明用本发明的细胞靶向分子处理可促进共培养时的长期T细胞接合(参见图17，显示至少140小时的持续时间)。
许多先前的实验数据基于示例性细胞靶向分子“无活性SLT-1A-DI-4::scFv6::(C2)3”(SEQ ID NO:253)。这里，报道了测试另一种示例性细胞靶向分子：“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2”(SEQ ID NO:254)的实验结果。
如下进行共温育细胞间T细胞测定，以定量用“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2”(SEQ ID NO:254)处理肿瘤细胞诱导的细胞间T细胞接合(例如靶肿瘤细胞杀伤)的诱导。将细胞系I，J或K的细胞(其各自对被scFv8结合的细胞外分子呈靶标阳性)与100nM或500nM的“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2”(SEQ ID NO:254)或”仅缓冲液“在37℃和5％CO2的气氛中温育4小时。然后洗涤细胞，并与含有“C2限制性PBMC”的培养基组合。将靶向肿瘤细胞和C2限制性PBMC以5个C2限制性PBMC对一个靶标阳性肿瘤细胞(5:1)的比例在37℃和5％CO2的气氛中共温育24小时。收获上清液，并根据制造商的说明使用细胞因子特异性IFN-γELISA试剂盒(Biolegend，Inc.，San Diego，CA，美国)测量IFN-γ浓度。收集上清液后，洗涤粘附的靶标阳性肿瘤细胞以除去PBMC，并根据制造商的说明通过CellTiter-发光细胞存活力测定法(G7573 Promega Madison，WI，美国)以RLU评估剩余粘附细胞的细胞存活力。作为对照，用100nM和500nM的细胞靶向分子“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8(SEQ ID NO:256)进行平行实验，其缺乏任何C2表位(SEQ ID NO:21)组分，但除此之外与“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2”(SEQ ID NO:254)具有100％的同一性。
图18和19显示了使用靶标阳性肿瘤细胞系I，J和K以及使用在不同浓度下测试的细胞靶向分子的这些共温育测定的结果。结果显示，用“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2”(SEQ ID NO:254)温育靶标阳性肿瘤细胞并与C2限制性PBMC共温育导致T细胞活化，如通过IFN-γ分泌所测量的(图18)，并通过PBMC诱导肿瘤细胞杀伤(图19)，两种作用均以细胞靶向分子浓度依赖性方式发生。结果显示，“仅缓冲液”或缺乏C2表位-肽的阴性对照细胞靶向分子“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8”(SEQ ID NO:256)都不能在共培养48小时后诱导IFN-γ分泌(图18)或在共培养96小时期间诱导靶细胞死亡(图19)，无论测试的剂量如何。此外，这些数据证明了本发明的一种示例性细胞靶向分子成功地将用于MHC I呈递的CD8+ T细胞表位递送至一系列不同肿瘤细胞类型的能力，使得呈递通过靶向T细胞的作用导致细胞间T细胞接合和靶细胞的杀伤。
许多先前的实验数据是基于“无活性”形式的本发明的示例性细胞靶向分子。这里，报道了测试“活性形式”的本发明的示例性细胞靶向分子的实验结果。本文实施例中使用的活性细胞靶向分子是指包含具有催化活性的志贺毒素效应子多肽的细胞靶向分子。示例性细胞靶向分子SLT-1A-DI-1::scFv8::C2(SEQ ID NO:255)与“无活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2”(SEQ ID NO:254)紧密相关，因为只有一个氨基酸不同，该氨基酸不同来自于氨基酸置换E168D(所述分子总体上具有99.8％的同一性并且它们的志贺毒素效应子多肽组分之间具有99.6％的同一性)。SLT-1A-DI-1::scFv8::C2(SEQ ID NO:255)在本文中被认为关于其志贺毒素A亚基效应子多肽具有活性，该效应子多肽具有与野生型志贺毒素A1片段相当的催化活性，并且能够杀伤其所存在的细胞。
使用活性SLT-1A-DI-1::scFv8::C2(SEQ ID NO:255)如上所述进行共温育细胞间T细胞测定，以定量通过用本发明的活性细胞靶向分子处理肿瘤细胞诱导的细胞间T细胞接合(例如靶肿瘤细胞杀伤和T细胞活化)。简言之，将细胞系I的细胞与“单独的缓冲液”或30或100nM的细胞靶向分子SLT-1A-DI-1::scFv8::C2(SEQ ID NO:255)一起预温育4小时，然后与C2限制性PBMC在37℃和5％CO2的气氛下共培养48-96小时。作为阴性对照，用30或100nM的细胞靶向分子SLT-1A-DI-1::scFv8(SEQ ID NO:257)进行平行实验，其缺乏任何C2表位(SEQ ID NO:21)组分，但是除此之外与SLT-1A-DI-1::scFv8::C2(SEQ ID NO:255)具有100％的同一性。图20显示了共温育测定的结果。
在共培养48小时后收获上清液，并使用如上所述的细胞因子特异性IFN-γELISA测定法测量IFN-γ浓度。图20显示了IFN-γELISA测定的结果。共培养96小时后，洗涤粘附的靶标阳性肿瘤细胞以除去PBMC，并使用如上所述的CellTiter-发光细胞存活力测定评估剩余粘附细胞的细胞存活力。图20显示了粘附细胞存活力测定的结果，如使用如上所述的Incu/>S3活细胞分析系统通过如RLU中的汇合所测量的。
图20中显示的结果显示，催化活性形式的本发明的细胞靶向分子在促进T细胞活化方面能够起到类似于无活性细胞靶向分子的作用，如通过诱导IFN-γ分泌和超出其更直接的作用机制(通过核糖体抑制和诱导程序性细胞死亡的细胞杀伤)的免疫细胞依赖性靶细胞杀伤所测量的：。这些结果证明了本发明的示例性细胞靶向分子通过至少两种不同的作用机制促进免疫激活和诱导靶肿瘤细胞杀伤的能力，所述作用机制可以协同作用以在MHC I类表位特异性限制性PBMC存在下诱导更多的靶细胞死亡。
此外，显示表位-肽/MHC I类复合物(pMHC I)的靶细胞对CTL的活化使用市售的CTL应答测定法定量，例如，Cyto非放射性测定(Promega，Madison，WI，美国)，Granzyme B ELISpot测定(Mabtech，Inc.，Cincinnati，OH，美国)，胱天蛋白酶活性测定和LAMP-1易位流式细胞术测定。为了特异性监测CTL介导的靶细胞杀伤，羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)用于如本领域所述的靶细胞的体外和体内研究(参见例如Durward M等，J VisExp 45pii 2250(2010))。
实施例3.包含志贺毒素A亚基效应子多肽和CD8+ T细胞表位肽的黑素瘤细胞靶向分子
在该实施例中，志贺毒素效应子多肽来源于如上所述的志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)，其具有赋予去免疫化(参见例如WO 2015/113005；WO2015/113007；WO 2016/196344)、CD8+ T细胞超免疫(参见例如WO2015/113005；WO 2016/196344)和弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换，例如R248A/R251A(WO 2015/191764；WO 2016/196344)。基于MHCI分子结合预测、HLA类型、已经表征的免疫原性和/或如上所述的容易获得的试剂，例如C1-2表位-肽GLDRNSGNY(SEQ ID NO:20)，选择人CD8+ T细胞表位-肽。将蛋白质结合区域插入结合黑素瘤细胞的SLT-1A效应子多肽中(参见例如Cheung M等，Mol Cancer 9:28(2010))。
黑色素瘤细胞靶向融合蛋白的构建和生产
]将志贺毒素效应子多肽和CD8+ T细胞表位融合在一起，以形成单个连续多肽，使得CD8+ T细胞表位未嵌入或插入志贺毒素效应子多肽中。
确定黑素瘤细胞靶向分子的体外特征
通过基于荧光的流式细胞术，确定该实施例的细胞靶向分子对黑素瘤细胞的结合特征。测量该实施例的某些黑素瘤细胞靶向融合蛋白对阳性细胞的Bmax为约50,000-200,000MFI，KD在0.01-100nM范围内。
该实施例的黑素瘤细胞靶向融合蛋白的核糖体失活能力在如上述实施例中所述的无细胞体外蛋白质翻译中确定。该实施例的细胞靶向分子对无细胞蛋白质合成的抑制作用是显著的。对于某些黑素瘤细胞靶向融合蛋白，在该无细胞测定中蛋白质合成的IC50为约0.1-100pM。
确定黑色素瘤细胞靶向分子的CD8+表位-肽货物递送功能
可以通过检测特异性细胞表面的MHC I类分子/表位复合物(pMHC I)来确定T细胞表位的成功递送。为了测试细胞靶向分子是否能够将CD8+ T细胞表位货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，采用检测与特定表位复合的人MHC I类分子的常规测定法，例如，实施例1和2中描述的一个或更多个测定法。
通常在大多数经处理的细胞上，取决于温育持续时间，用黑素瘤细胞靶向融合蛋白处理的黑素瘤细胞显示细胞表面C1-2-表位/MHC I类复合物的阳性信号。在用细胞靶向分子处理的靶细胞的细胞表面上检测到与人MHC I类分子复合的T细胞表位(例如，C1-2(SEQ ID NO:20))表明细胞靶向分子能够进入靶黑素瘤细胞，进行足够的亚细胞发送，并将足够的CD8+ T细胞表位-肽货物递送至MHC I类途径，用于由靶细胞的表面呈递。
使用细胞杀伤测定法，确定黑素瘤细胞靶向分子的细胞毒性
该实施例的黑素瘤细胞靶向融合蛋白的细胞毒性特征通过使用黑素瘤细胞的如上述实施例中所述的一般细胞杀伤试验来确定。取决于细胞系，本实施例的细胞靶向分子对黑素瘤细胞的CD50值为约0.01-100nM。此外，使用技术人员已知和/或本文所述的测定法，研究了呈递所递送的CD8+ T细胞表位的黑素瘤靶细胞的分子间CD8+ T细胞接合和本实施例的黑素瘤细胞靶向融合蛋白的细胞毒性的诱导，以确定通过异源CD8+ T细胞表位递送和呈递导致CTL介导的细胞毒性的间接细胞毒性。
使用动物模型确定黑色素瘤细胞靶向分子的体内作用
使用动物模型确定该实施例的某些黑素瘤细胞靶向融合蛋白对黑素瘤细胞的体内作用(参见例如Cheung M等，Mol Cancer 9:28(2010))。使用各种小鼠品系测试静脉内施用本实施例的黑素瘤细胞靶向融合蛋白对小鼠中人黑素瘤细胞的作用。使用技术人员已知和/或本文所述的测定法，研究了细胞杀伤效应，以确定直接细胞毒性和通过CD8+ T细胞表位递送和呈递导致CTL介导的细胞毒性的间接细胞毒性。任选地，该实施例的细胞靶向分子的“无活性”变体(例如E167D)用于研究在不存在细胞靶向分子的任何志贺毒素效应子多肽组分的催化活性的情况下，通过CD8+ T细胞表位递送的间接细胞毒性。
实施例4.包含志贺毒素A亚基效应子多肽和CD8+ T细胞表位肽的MHC-表位-复合物靶向的细胞靶向分子
在本实施例中，志贺毒素效应子多肽来源于如上所述的志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)，其具有赋予去免疫化(参见例如WO 2015/113005；WO2015/113007；WO 2016/196344)、CD8+ T细胞超免疫(参见例如WO2015/113005；WO 2016/196344)和弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换，例如R248A/R251A(WO 2015/191764；WO 2016/196344)。基于MHCI分子结合预测、HLA类型、已经表征的免疫原性和/或如上所述的容易获得的试剂，例如C1-2表位-肽GLDRNSGNY(SEQ ID NO:20)，选择人CD8+ T细胞表位-肽。蛋白质结合区域来源于对特定表位-肽-MHC分子复合物具有特异性的T细胞受体样抗体，例如WT1 ab1(US2014/294841)，其能够特异性结合与Wilms肿瘤癌基因蛋白(WT1)表位-肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:798)结合的HLA-A0201。HLA-A2-WT1复合物可以由各种癌细胞类型表达，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤(MM)、急性淋巴性白血病(ALL)、急性髓性/骨髓性白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)癌细胞。
MHC-表位-复合物靶向的细胞靶向融合蛋白的构建和生产
免疫球蛋白型结合区域αHLA-WT1、志贺毒素效应子多肽和CD8+ T细胞表位融合在一起形成单个连续多肽，例如“SLT-1A::C1-2::αHLA-WT1”或“SLT-1A::αHLA-WT1::C1-2”，并且任选地，将KDEL(SEQ ID NO:750)加入到所得多肽的羧基末端。
确定MHC-表位-复合物靶向的细胞靶向分子的体外特征
通过基于荧光的流式细胞术，确定本实施例的细胞靶向分子对特定MHC I分子-表位复合物阳性细胞和阴性细胞的结合特征。本实施例的某些MHC-表位-复合物靶向的细胞靶向融合蛋白对阳性细胞的Bmax测量为约50,000-200,000MFI，KD在0.01-100nM范围内，而在该测定中，没有与相应的MHC-表位复合物阴性细胞的显著结合。
如上文在先前实施例中所述，在无细胞的体外蛋白翻译中测定该实施例MHC-表位-复合物靶向的细胞靶向融合蛋白的核糖体失活能力。该实施例的细胞靶向分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。对于某些MHC-表位-复合物靶向的细胞靶向融合蛋白，在该无细胞测定中，蛋白合成的IC50为约0.1-100pM。
确定MHC-表位-复合物靶向的细胞靶向分子的CD8+表位-肽货物递送功能
T细胞表位的成功递送可以通过检测特定细胞表面的MHC I类分子/表位复合物(pMHC I)来确定。为了测试细胞靶向分子是否可以将CD8+ T细胞表位货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，采用检测与特定表位复合的人MHC I类分子的常规测定法，例如，实施例1和2中描述的一个或更多个测定法。
通常在大多数处理的细胞上，取决于温育持续时间，用MHC-表位-复合物靶向的细胞-靶向融合蛋白处理的细胞显示细胞表面C1-2-表位/MHC I类复合物的阳性信号。在细胞靶向分子处理的靶细胞的细胞表面上检测到与人MHC I类分子复合的T细胞表位C1-2(SEQID NO:20)证明了，细胞靶向分子能够进入靶细胞、进行足够的亚细胞发送并将足够的CD8+T细胞表位-肽货物递送至MHC I类途径，用于通过靶细胞的表面呈递。
使用细胞杀伤测定确定靶向MHC-表位-复合物的细胞靶向分子的细胞毒性
通过如上述在先前实施例中所述的一般细胞杀伤测定，使用特定MHC-表位复合物阳性细胞，来确定该实施例的靶向MHC-表位-复合物的细胞靶向融合蛋白的细胞毒性特征。此外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用相应的MHC-表位复合物阴性细胞(作为与适当的MHC表位复合物阳性细胞的比较)，来确定该实施例的相同的靶向MHC-表位-复合物的细胞靶向融合蛋白的选择性细胞毒性特征。取决于细胞系，该实施例的细胞靶向分子对MHC-表位复合物阳性细胞的CD50值约为0.01-100nM。与在细胞表面上表达适当的MHC-表位复合物的细胞相比，该实施例的靶向MHC-表位-复合物的细胞靶向融合蛋白对在细胞表面上不表达适当的MHC-表位复合物的细胞的CD50值是大约10-10,000倍高(细胞毒性更低)。此外，使用技术人员已知和/或本文所述的测定法，研究了C1-2呈递靶细胞的分子间CD8+ T细胞接合和本实施例的靶向MHC-表位-复合物的细胞靶向融合蛋白的细胞毒性的诱导，以确定通过异源CD8+ T细胞表位递送和呈递导致CTL介导的细胞毒性的间接细胞毒性。
使用动物模型确定靶向MHC-表位-复合物的细胞靶向分子的体内作用
使用动物模型确定该实施例的某些靶向MHC-表位-复合物的细胞靶向融合蛋白对肿瘤细胞的体内作用。使用各种小鼠品系测试静脉内施用该实施例的靶向MHC-表位-复合物的细胞靶向融合蛋白对小鼠中特定MHC-表位复合物阳性细胞的作用。使用技术人员已知和/或本文所述的测定法，研究了细胞杀伤效应，以确定直接细胞毒性和通过CD8+ T细胞表位递送和呈递导致CTL介导的细胞毒性的间接细胞毒性。任选地，该实施例的细胞靶向分子的“无活性”变体(例如E167D)用于研究在不存在细胞靶向分子的任何志贺毒素效应子多肽组分的催化活性的情况下，通过CD8+ T细胞表位递送的间接细胞毒性。
实施例5.包含志贺毒素A亚基效应子多肽和CD8+ T细胞表位肽的靶向IL-2R的细胞靶向分子
在该实施例中，志贺毒素效应子多肽来源于如上所述的志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)，其具有赋予去免疫化(参见例如WO 2015/113005；WO2015/113007；WO 2016/196344)、CD8+ T细胞超免疫(参见例如WO2015/113005；WO 2016/196344)和弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换，例如R248A/R251A(WO 2015/191764；WO 2016/196344)。基于MHCI分子结合预测、HLA类型、已经表征的免疫原性和/或如上所述的容易获得的试剂，例如C1-2表位-肽GLDRNSGNY(SEQ ID NO:20)，选择人CD8+ T细胞表位-肽。蛋白质结合区域来源于人白细胞介素2受体(IL-2R)的配体(细胞因子白细胞介素2或IL-2)，其能够特异性结合人IL-2R的细胞外部分。IL-2R是由各种免疫细胞类型如T细胞和天然杀伤细胞表达的细胞表面受体。
靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白的构建和生产
配体型结合区域αIL-2R、志贺毒素效应子多肽和CD8+ T细胞表位融合在一起形成单个连续多肽，例如“C1-2::SLT-1A::IL-2”或“IL-2::C1-2::SLT-1A”，并且任选地，将KDEL(SEQ ID NO:750)加入到所得多肽的羧基末端。
确定靶向IL-2R的细胞靶向分子的体外特征
通过基于荧光的流式细胞术，确定本实施例的细胞靶向分子对特定IL-2R阳性细胞和IL-2R阴性细胞的结合特征。本实施例的某些靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白对阳性细胞的Bmax测量为约50,000-200,000MFI，KD在0.01-100nM范围内，而在该测定中，没有与IL-2R阴性细胞的显著结合。
如上文在先前实施例中所述，在无细胞的体外蛋白翻译中，确定该实施例的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白的核糖体失活能力。该实施例的细胞靶向分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。对于某些靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白，在该无细胞测定中，蛋白合成的IC50为约0.1-100pM。
确定靶向IL-2R的细胞靶向分子的CD8+表位-肽货物递送功能
T细胞表位的成功递送可以通过检测特定细胞表面的MHC I类分子/表位复合物(pMHC I)来确定。为了测试细胞靶向分子是否可以将CD8+ T细胞表位货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，采用检测与特定表位复合的人MHC I类分子的常规测定法，例如，实施例1和2中描述的一个或更多个测定法。
通常在大多数经处理的细胞上，取决于温育持续时间，用靶向IL-2R的细胞-靶向融合蛋白处理的细胞显示细胞表面C1-2-表位/MHC I类复合物的阳性信号。在细胞靶向分子处理的靶细胞的细胞表面上检测到与人MHC I类分子复合的T细胞表位C1-2(SEQ ID NO:20)证明了，细胞靶向分子能够进入靶细胞、进行足够的亚细胞发送并将足够的CD8+ T细胞表位-肽货物递送至MHC I类途径，用于通过靶细胞的表面呈递。
使用细胞杀伤测定确定靶向IL-2R的细胞靶向分子的细胞毒性
通过如上述在先前实施例中所述的一般细胞杀伤测定，使用IL-2R阳性细胞，来确定该实施例的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白的细胞毒性特征。此外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用IL-2R阴性细胞(作为IL-2R阳性细胞的比较)，来确定该实施例的相同的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白的选择性细胞毒性特征。取决于细胞系，该实施例的细胞靶向分子对IL-2R阳性细胞的CD50值约为0.01-100nM。与在细胞表面上表达IL-2R的细胞相比，该实施例的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白对在细胞表面上不表达IL-2R的细胞的CD50值是大约10-10,000倍高(细胞毒性更低)。此外，使用技术人员已知和/或本文所述的测定法，研究了C1-2呈递靶细胞的分子间CD8+ T细胞接合和本实施例的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白的细胞毒性的诱导，以确定通过异源CD8+ T细胞表位递送和呈递导致CTL介导的细胞毒性的间接细胞毒性。
使用动物模型确定靶向IL-2R的细胞靶向分子的体内作用
使用动物模型确定该实施例的某些靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白对肿瘤细胞的体内作用。使用各种小鼠品系测试静脉内施用该实施例的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白对小鼠中IL-2R阳性细胞的作用。使用技术人员已知和/或本文所述的测定法，研究了细胞杀伤效应，以确定直接细胞毒性和通过CD8+ T细胞表位递送和呈递导致CTL介导的细胞毒性的间接细胞毒性。任选地，该实施例的细胞靶向分子的“无活性”变体(例如E167D)用于研究在不存在细胞靶向分子的任何志贺毒素效应子多肽组分的催化活性的情况下，由CD8+ T细胞表位递送引起的间接细胞毒性。
实施例6.包含志贺毒素效应物多肽和异源CD8+ T细胞表位的靶向CEA的细胞靶向分子
成年人中的癌胚抗原(CEA)表达与癌细胞相关，例如乳腺、结肠、肺、胰腺和胃的腺癌。在该实施例中，志贺毒素效应子多肽来源于如上所述的志贺毒素的A亚基(StxA)(SEQID NO:2)，其具有赋予去免疫化(参见例如WO 2015/113005；WO 2015/113007；WO 2016/196344)、CD8+ T细胞超免疫(参见例如WO 2015/113005；WO 2016/196344)和弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换，例如R248A/R251A(WO 2015/191764；WO 2016/196344)。基于MHCI分子结合预测、HLA类型、已经表征的免疫原性和/或如上所述的容易获得的试剂，例如描述于WO 2015/113005和WO 2016/196344中的F3表位ILRGSVAHK(SEQ ID NO:26)，选择人CD8+ T细胞表位-肽。免疫球蛋白型结合区域αCEA，其与人癌胚抗原(CEA)上的细胞外抗原特异性且高亲和性结合，例如如Pirie C等，J Biol Chem 286：4165-72(2011)中所述的第10人纤连蛋白III型结构域衍生的结合区域C743。
靶向CEA的细胞靶向分子的构建、生产和纯化
使用技术人员已知的标准方法将志贺毒素效应子多肽、αCEA结合区域多肽和异源CD8+ T细胞表位-肽可操作地连接在一起，以形成本发明的细胞靶向分子。例如，通过表达编码StxA::αCEA::F3、StxA::F3::αCEA、αCEA::StxA::F3、F3::αCEA::StxA、αCEA::F3::StxA和F3::StxA::αCEA中的一个或更多个(其各自任选地在融合的蛋白质组分之间具有一个或更多个本文所述的蛋白质接头)的多核苷酸来生产融合蛋白。使用如前述实施例中所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统完成这些示例性CEA靶向融合蛋白的表达。
确定示例性靶向CEA的细胞靶向融合蛋白的体外特征
通过基于荧光的流式细胞术，确定本实施例的细胞靶向分子对CEA阳性细胞和CEA阴性细胞的结合特征。StxA::αCEA::F3,StxA::F3::αCEA,αCEA::StxA::F3,F3::αCEA::StxA,αCEA::F3::StxA,和F3::StxA::αCEA对CEA阳性细胞的Bmax各自测量为约50,000-200,000MFI，KD在0.01-100nM范围内，而在该测定中没有与CEA阴性细胞的显著结合。
如上文在先前实施例中所述，在无细胞的体外蛋白翻译中，测定该实施例的融合蛋白的核糖体失活能力。该实施例的细胞毒性融合蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。对于StxA::αCEA::F3,StxA::F3::αCEA,αCEA::StxA::F3,F3::αCEA::StxA,αCEA::F3::StxA和F3::StxA::αCEA，在该无细胞测定中，蛋白合成的IC50各自为约0.1-100pM。
确定靶向CEA的细胞靶向分子的CD8+表位-肽货物递送功能
可以通过检测特定细胞表面的MHC I类分子/表位复合物(pMHC I)来确定T细胞表位的成功递送。为了测试细胞靶向分子是否可以将CD8+ T细胞表位货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，采用检测与特定表位复合的人MHC I类分子的常规测定法，例如，实施例1和2中描述的一个或更多个测定法。
通常在大多数经处理的细胞上，取决于温育持续时间，用靶向CEA的细胞靶向融合蛋白处理的细胞显示细胞表面F3-表位/MHC I类复合物的阳性信号。在细胞靶向分子处理的靶细胞的细胞表面上检测到与人MHC I类分子复合的CD8+ T细胞表位F3(SEQ ID NO:26)证明了，细胞靶向分子能够进入靶细胞，进行足够的亚细胞发送，并将足够的CD8+ T细胞表位-肽货物递送至MHC I类途径，用于通过靶细胞的表面呈递。
使用细胞杀伤试验确定示例性靶向CEA的细胞靶向融合蛋白的细胞毒性
通过如上述在先前实施例中所述的一般细胞杀伤测定，使用CEA阳性细胞，来确定该实施例的细胞靶向分子的细胞毒性特征。此外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用CEA阴性细胞(作为与CEA抗原阳性细胞的比较)，来确定示例性靶向CEA的细胞靶向融合蛋白的选择性细胞毒性特征。取决于细胞系，测量的StxA::αCEA::F3，StxA::F3::αCEA，αCEA::StxA::F3，F3::αCEA::StxA，αCEA::F3::StxA和F3::StxA::αCEA对CEA阳性细胞的CD50值为约0.01-100nM。与在细胞表面上表达CEA的细胞相比，该实施例的靶向CEA的细胞靶向融合蛋白对在细胞表面上不表达CEA的细胞的CD50值为大约10-10,000倍高(细胞毒性较小)。此外，使用技术人员已知和/或本文所述的测定法，研究了F3呈递靶细胞的分子间CD8+ T细胞接合和StxA::αCEA::F3，StxA::F3::αCEA，αCEA::StxA::F3，F3::αCEA::StxA，αCEA::F3::StxA和F3::StxA::αCEA的细胞毒性的诱导，以确定通过异源CD8+ T细胞表位递送和呈递导致CTL介导的细胞毒性的间接细胞毒性。
使用动物模型确定示例性靶向CEA的细胞靶向融合蛋白的体内作用
使用动物模型确定示例性CEA靶向融合蛋白对肿瘤细胞的体内作用。使用各种小鼠品系测试细胞靶向融合蛋白StxA::αCEA::F3,StxA::F3::αCEA,αCEA::StxA::F3,F3::αCEA::StxA,αCEA::F3::StxA和F3::StxA::αCEA在静脉内施用于小鼠后对异种移植肿瘤的作用，其中小鼠被注射了在其细胞表面表达CEA的人肿瘤细胞。使用技术人员已知和/或本文所述的测定法，研究了细胞杀伤，以确定直接细胞毒性和通过CD8+ T细胞表位货物递送和呈递导致CTL介导的细胞毒性的间接细胞毒性。任选地，该实施例的细胞靶向分子的“无活性”变体(例如E167D)用于研究在不存在细胞靶向分子的任何志贺毒素效应子多肽组分的催化活性的情况下，由CD8+ T细胞表位递送引起的的间接细胞毒性。
实施例7.包含志贺毒素效应子多肽和异源CD8+ T细胞表位的靶向HER2的细胞靶向分子
已经在乳腺、结肠直肠、子宫内膜、食道、胃、头颈、肺、卵巢、前列腺、胰腺和睾丸生殖细胞肿瘤细胞中观察到HER2过表达。在该实施例中，志贺毒素效应子多肽来源于如上所述的StxA的A亚基(SEQ ID NO:2)，其具有赋予去免疫化(参见例如WO 2015/113005；WO2015/113007；WO2016/196344)、CD8+ T细胞超免疫(参见例如WO 2015/113005；WO2016/196344)和弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换，例如R248A/R251A(WO 2015/191764；WO2016/196344)。基于MHC I分子结合预测、HLA类型、已经表征的免疫原性和/或如上所述的容易获得的试剂，例如描述于WO 2015/113005和WO 2016/196344中的C3表位GVMTRGRLK(SEQ ID NO:22)，选择人CD8+ T细胞表位-肽。结合人HER2的细胞外部分的结合区域αHER2是通过筛选产生的，或选自技术人员已知的可获得的免疫球蛋白型多肽(参见例如以高亲和力结合HER2的细胞外表位的锚蛋白重复DARPinTM G3(Goldstein R等，Eur J Nucl MedMol Imaging 42：288-301(2015)))。
靶向HER2的细胞靶向分子的构建、生产和纯化
使用技术人员已知的标准方法将志贺毒素效应子多肽、αHER2结合区域多肽和异源CD8+ T细胞表位-肽可操作地连接在一起，以形成本发明的细胞靶向分子。例如，通过表达编码StxA::αHER2::C3、StxA::C3::αHER2、αHER2::StxA::C3、C3::αHER2::StxA、αHER2::C3::StxA和C3::StxA::αHER2中的一个或更多个(其各自任选地在融合的蛋白质组分之间具有一个或更多个本文所述的蛋白质接头)的多核苷酸来产生融合蛋白。使用如先前实施例中所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统完成这些示例性HER2靶向融合蛋白的表达。
确定示例性靶向HER2的细胞靶向融合蛋白的体外特征
通过基于荧光的流式细胞术，测定该实施例的细胞靶向分子对HER2阳性细胞和HER2阴性细胞的结合特征。StxA::αHER2::C3,StxA::C3::αHER2,αHER2::StxA::C3,C3::αHER2::StxA,αHER2::C3::StxA,和C3::StxA::αHER2对HER2阳性细胞的Bmax各自测量为约50,000-200,000MFI，KD在0.01-100nM范围内，而在该测定中没有与HER2阴性细胞的显著结合。
该实施例的融合蛋白的核糖体失活能力在如先前实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中测定。该实施例的细胞毒性融合蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。对于StxA::αHER2::C3,StxA::C3::αHER2,αHER2::StxA::C3,C3::αHER2::StxA,αHER2::C3::StxA和C3::StxA::αHER2，在该无细胞测定中，蛋白合成的IC50各自为约0.1-100pM。
确定靶向HER2的细胞靶向分子的CD8+表位-肽货物递送功能
可以通过检测特定细胞表面的MHC I类分子/表位复合物(pMHC I)来确定T细胞表位的成功递送。为了测试细胞靶向分子是否可以将CD8+ T细胞表位货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，采用检测与特定表位复合的人MHC I类分子的常规测定法，例如，实施例1和2中描述的一个或更多个测定法。
通常在大多数经处理的细胞上，取决于温育持续时间，用靶向HER2的细胞靶向融合蛋白处理的细胞显示细胞表面C3-表位/MHC I类复合物的阳性信号。在细胞靶向分子处理的靶细胞的细胞表面上检测到与人MHC I类分子复合的CD8+ T细胞表位C3(SEQ ID NO:22)证明了，细胞靶向分子能够进入靶细胞，进行足够的亚细胞发送，并将足够的CD8+ T细胞表位-肽货物递送至MHC I类途径，用于通过靶细胞的表面呈递。
使用细胞杀伤试验确定示例性靶向HER2的细胞靶向融合蛋白的细胞毒性
通过如上述在先前实施例中所述的一般细胞杀伤测定，使用HER2阳性细胞，来确定该实施例的细胞靶向分子的细胞毒性特征。此外，通过相同的一般细胞杀伤测定，使用HER2阴性细胞(作为与HER2抗原阳性细胞的比较)，来确定示例性靶向HER2的细胞靶向融合蛋白的选择性细胞毒性特征。取决于细胞系，测量的StxA::αHER2::C3,StxA::C3::αHER2,αHER2::StxA::C3,C3::αHER2::StxA,αHER2::C3::StxA和C3::StxA::αHER2对HER2阳性细胞的CD50值为约0.01-100nM。与在细胞表面上表达HER2的细胞相比，该实施例的靶向HER2的细胞靶向融合蛋白对在细胞表面上不表达HER2的细胞的CD50值为大约10-10,000倍高(细胞毒性较小)。此外，使用技术人员已知和/或本文所述的测定法，研究了C3呈递靶细胞的分子间CD8+ T细胞接合和StxA::αHER2::C3,StxA::C3::αHER2,αHER2::StxA::C3,C3::αHER2::StxA,αHER2::C3::StxA和C3::StxA::αHER2的细胞毒性的诱导，以确定通过异源CD8+ T细胞表位递送和呈递导致CTL介导的细胞毒性的间接细胞毒性。
使用动物模型确定示例性靶向HER2的细胞靶向融合蛋白的体内作用
使用动物模型确定示例性HER2靶向融合蛋白对肿瘤细胞的体内作用。使用各种小鼠品系测试细胞靶向融合蛋白StxA::αHER2::C3,StxA::C3::αHER2,αHER2::StxA::C3,C3::αHER2::StxA,αHER2::C3::StxA和C3::StxA::αHER2在静脉内施用于小鼠后对异种移植肿瘤的作用，其中小鼠被注射了在其细胞表面表达HER2的人肿瘤细胞。使用技术人员已知和/或本文所述的测定法，研究了细胞杀伤，以确定直接细胞毒性和通过CD8+ T细胞表位货物递送和呈递导致CTL介导的细胞毒性的间接细胞毒性。任选地，该实施例的细胞靶向分子的“无活性”变体(例如E167D)用于研究在不存在细胞靶向分子的任何志贺毒素效应子多肽组分的催化活性的情况下，由CD8+ T细胞表位递送引起的的间接细胞毒性。
实施例8.靶向各种细胞类型的细胞靶向分子，每种细胞靶向分子包含志贺毒素A亚基效应子多肽和一个或更多个位于志贺毒素A亚基效应子多肽组分的羧基末端的异源CD8+ T细胞表位-肽
在该实施例中，三种蛋白质结构彼此关联以形成本发明的示例性细胞靶向分子。在该实施例中，志贺毒素效应子多肽来源于如上所述的SLT-1A的A亚基(SEQ ID NO:1)，其具有赋予去免疫化(参见例如WO 2015/113005；WO 2015/113007；WO 2016/196344)、CD8+ T细胞超免疫(参见例如WO2015/113005；WO 2016/196344)和弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换，例如R248A/R251A(WO 2015/191764；WO 2016/196344)。例如，基于MHC I分子结合预测、HLA类型、已经表征的免疫原性和/或如本文所述的容易获得的试剂，选择一个或更多个CD8+ T细胞表位-肽。结合区域组分来源于选自表10第1列的分子的免疫球蛋白结构域，并且其结合表10第2列中所示的细胞外靶生物分子。
使用本领域已知的试剂和技术，三个组分：1)配体或免疫球蛋白衍生的结合区域，2)志贺毒素效应子多肽，和3)CD8+ T细胞表位-肽或包含至少一个异源CD8+ T细胞表位-肽的更大多肽彼此相关联，以形成本发明的细胞靶向分子，并且任选地，CD8+ T细胞表位-肽位于志贺毒素效应子多肽的志贺毒素A1片段区域的羧基末端的羧基端，该志贺毒素效应子多肽任选地包含破坏的弗林蛋白酶切割基序。使用表达合适的细胞外靶生物分子的细胞，如前述实施例中所述测试该实施例的示例性细胞靶向分子。该实施例的示例性细胞靶向分子可用于例如诊断和治疗表10第3列中所示的疾病、病症和/或障碍。
表10.用于细胞靶向的各种结合区域
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虽然已经通过说明的方式描述了本发明的一些实施方案，但是显而易见的是，在不脱离本发明的精神或者不超出权利要求书的范围的情况下，可以通过许多修改、变化和改编以及使用在本领域技术人员的范围内的许多等同物或替代解决方案来实施本发明。
所有公开、专利和专利申请通过引用以其全部内容结合在此，程度如同每个单独的公开、专利或专利申请具体地和单独地指明要通过引用以其整体结合一般。国际专利申请公开WO 2014/164693,WO 2014/164680,WO 2015/138435,WO 2015/138452,WO 2015/113005,WO 2015/113007,WO 2015/191764,WO 2016/196344和WO 2017/019623各自通过引用整体并入本文。美国专利申请公开US 2007/298434,US 2009/156417,US 2013/196928,US 2016/177284,US 2017/143814和US 2017/275382的公开内容各自通过引用整体并入本文。WO 2018/106895的公开内容通过引用整体并入本文。氨基酸和核苷酸序列的来自GenBank(National Center for Biotechnology Information,U.S.)的所有电子可获得的生物学序列信息的完整公开内容均通过引用整体并入本文。
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Claims (21)
1.细胞毒性细胞靶向分子，包括：
i)志贺毒素效应子多肽，其由SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列组成；
ii)特异性结合细胞外靶生物分子的结合区域，其中所述结合区域是单链可变片段或骆驼科VHH片段，其中所述结合区域与所述志贺毒素效应子多肽异源，和
iii)未嵌入或插入所述志贺毒素效应子多肽的异源CD8+ T细胞表位货物，
其中所述结合区域与所述志贺毒素效应子多肽的羧基末端相关联，并且所述CD8+ T细胞表位货物定位于所述志贺毒素效应子多肽和所述结合区域的羧基末端的羧基端。
2.权利要求1的细胞毒性细胞靶向分子，其中，所述异源CD8+ T细胞表位货物与所述结合区域的羧基末端融合。
3.权利要求2所述的细胞毒性细胞靶向分子，其中，所述细胞靶向分子包含含有所述志贺毒素效应子多肽、所述结合区域和所述异源CD8+ T细胞表位货物的单链多肽。
4.权利要求2所述的细胞毒性细胞靶向分子，其中，所述结合区域包含两条或更多条多肽链，并且所述CD8+ T细胞表位货物与包含所述志贺毒素效应子多肽和所述两条或更多条多肽链之一的多肽融合。
5.权利要求1的细胞毒性细胞靶向分子，其中，所述结合区域结合选自由以下各项组成的组的细胞外靶生物分子：
CD20、CD22、CD40、CD74、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前列腺特异性膜抗原、Cripto、CDCP1、内皮糖蛋白、成纤维细胞活化蛋白、Lewis-Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、gpA33、粘蛋白、TAG-72、酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体、碳酸酐酶IX、叶酸结合蛋白、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂Lewis-Y2、VEGFR、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、Erb3、c-MET、IGFIR、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANK、肌腱蛋白、CD64、间皮素、BRCA1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE6、SART-1、PRAME、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原、人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶、EphA2、HER3/ErbB-3、MUC1、酪氨酸酶相关抗原、HPV-E7、EB病毒抗原、Bcr-Abl、α-甲胎蛋白抗原、17-A1、膀胱肿瘤抗原、SAIL、CD38、CD15、CD23、CD45、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305、C3AR、FceRIa、IL-1R、半乳糖凝集素-9、mrp-14、NKG2D、PD-L1、Siglec-8、Siglec-10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT-3、半乳糖凝集素-3、CD11a-c、GITRL、MHC I类分子、MHC II类分子、CD284、CD107-Mac3、CD195、HLA-DR、CD16/32、CD282、CD11c以及前述任一种的任意免疫原性片段。
6.权利要求5的细胞毒性细胞靶向分子，其中，所述结合区域结合PD-L1的细胞外部分。
7.权利要求1的细胞毒性细胞靶向分子，其包含两个、三个、四个或更多个未嵌入或插入所述志贺毒素效应子多肽中的异源CD8+ T细胞表位货物。
8.权利要求7的细胞毒性细胞靶向分子，其中所述两个、三个、四个或更多个异源CD8+T细胞表位货物位于志贺毒素效应子多肽和结合区域的羧基末端的羧基端。
9.权利要求1的细胞毒性细胞靶向分子，其包含SEQ ID NO:246、247、248、249、250和/或251中所示的接头肽。
10.权利要求1的细胞毒性细胞靶向分子，其中所述结合区域由选自SEQ ID NO:39-245中任一项的多肽序列组成。
11.权利要求1的细胞毒性细胞靶向分子，其由以下组成：SEQ ID NO:389-404，407，420-421，425-429，459-473和656任一个的多肽；或进一步包含氨基端甲硫氨酸残基的SEQID NO:389-404，407和656任一个的多肽。
12.权利要求1的细胞毒性细胞靶向分子，其中所述异源CD8+T细胞表位货物具有根据SEQ ID NO:19-27中任一项的氨基酸序列。
13.权利要求1的细胞毒性细胞靶向分子，其为药学上可接受的盐或溶剂化物的形式。
14.药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项的细胞毒性细胞靶向分子和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
15.多核苷酸，其能够编码权利要求1-12中任一项的细胞毒性细胞靶向分子。
16.表达载体，其包含权利要求15的多核苷酸。
17.宿主细胞，其包含权利要求15的多核苷酸和/或权利要求16的表达载体。
18.权利要求1-13中任一项的细胞毒性细胞靶向分子或权利要求14的药物组合物在制备治疗患者的疾病、障碍或病症的药物中的用途；
其中，所述疾病、障碍或病症选自由以下组成的组：靶标阳性癌症、靶标阳性肿瘤、靶标阳性生长异常。
19.权利要求18的用途，其中，所述靶标阳性癌症选自由以下组成的组：
骨癌、乳腺癌、中枢/外周神经系统癌、胃肠癌、生殖细胞癌、腺癌、头颈癌、血液学癌症、肾-泌尿道癌、肝癌、肺/胸膜癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌和子宫癌。
20.包含权利要求1-13中任一项的细胞毒性细胞靶向分子的组合物。
21.权利要求15的多核苷酸、权利要求16的表达载体或权利要求17的宿主细胞在制备用于治疗靶标阳性癌症、靶标阳性肿瘤或靶标阳性生长异常的药物中的用途。
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