CN107936110B - 突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制 - Google Patents

突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制 Download PDF

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Abstract

本发明公开了突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制，用基因重组技术来表达和纯化正常的Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质。然后采用表面等离子共振技术(surface plasmon resonance technology，SPR)测定纯化的Nasp蛋白质结合组蛋白H1，H3，H4和H3/H4四聚体的能力。通过比较正常Nasp蛋白质和变异Nasp蛋白质结合组蛋白的能力，可以判断变异的Nasp蛋白质结合组蛋白的能力是否发生改变。在测定蛋白质相互作用方面，SPR方法非常精确、敏感性高。我们将在体外分析突变的Nasp蛋白质结合组蛋白的能力和对细胞增殖的影响；通过新建四个同类系小鼠模型，体内研究突变基因Nasp对SLE发病的促进作用和效应机制。

Description

突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及 机制
技术领域
本发明涉及基因突变技术领域，具体为突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制。
背景技术
从狼疮性易感基因亚座Sle2c1rec1中发现只有Nasp基因出现外显子碱基突变，其它蛋白质编码基因的外显子碱基序列正常。值得注意的是突变引起Nasp蛋白质中两个连续氨基酸的改变，即Nasp基因突变导致其蛋白质中第254和255位的氨基酸发生了改变，由缬氨酸亮氨酸序列转换为异亮氨酸苯丙氨酸序列，并且位于该蛋白质的近中心部位的关键功能区内。首先需要解决的问题是该基因突变是否导致Nasp蛋白质功能的变化，比如失去活性，活性的增高或降低等。因为蛋白质是基因功能的最终执行者，回答这个问题是澄清该Nasp基因突变是否是参与自身免疫病的先决条件。因此本项课题的第一个研究目标是用体外实验测定突变基因Nasp的蛋白质功能。
为了确认狼疮性小鼠突变基因Nasp在自身免疫病发病中的作用，我们认为还需要解决两方面的问题。首先，虽然在小鼠狼疮性易感基因亚座Sle2c1rec1c中，我们发现只有Nasp基因的外显子发生了碱基突变，造成了该蛋白质内近中心部位连续两个氨基酸的改变。但是，我们不能排除可能存在其它形式的突变基因及其在狼疮性自身免疫病中的作用，例如由于启动子区碱基变异导致基因转录功能的升高或降低，或者由于内含子与外显子剪接部位碱基突变产生了异常的蛋白质异构体。其次，假如突变基因Nasp的确参与自身免疫病的发病，那么它的作用机制是什么，是引起了免疫耐受的破坏或放大自身免疫反应，还是参与了末端器官的炎症反应。因此，回答这些问题是本项课题的第二个研究目标，通过新品系小鼠的创建及其体内实验研究加以实现。
发明内容
本发明的目的在于提供突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制，以解决现有的技术缺陷和不能达到的技术要求。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：用基因重组技术来表达和纯化正常的Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质。然后采用表面等离子共振技术(surface plasmonresonance technology，SPR)测定纯化的Nasp蛋白质结合组蛋白H1，H3，H4和H3/H4四聚体的能力。通过比较正常Nasp蛋白质和变异Nasp蛋白质结合组蛋白的能力，可以判断变异的Nasp蛋白质结合组蛋白的能力是否发生改变。在测定蛋白质相互作用方面，SPR方法非常精确、敏感性高。
用真核细胞表达载体携带正常Nasp cDNA和基因突变的Nasp cDNA进入小鼠T细胞内并进行高表达Nasp蛋白质，然后测定细胞内DNA量的变化和溴化尿嘧啶(BrdU)掺入水平，来检测细胞增殖反应的程度。通过比较细胞内高表达的正常Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质对细胞增殖影响的差异有无或程度，来检验突变的Nasp蛋白质的功能是否发生了改变。
优选的，将狼疮小鼠Nasp基因的突变外显子替代正常B6小鼠的相应外显子，即在B6小鼠的遗传背景上携带狼疮模型小鼠的Nasp突变外显子，产生基因敲入小鼠新品系，称之为B6.ΔNasp品系。将B6.ΔNasp小鼠与B6.lpr小鼠杂交，产生的子代小鼠反复互交，最终获得纯合子的既带有狼疮小鼠的Nasp突变基因又带有lpr基因的小鼠品系，即B6.ΔNasp.lpr小鼠。然后我们将检测B6.ΔNasp.lpr小鼠的淋巴结T细胞表型和肾脏病理。如果B6.ΔNasp.lpr小鼠表现出与B6.Sle2c1rec1c.lpr小鼠相同的免疫病理变化，那么可以确认突变基因Nasp就是模型小鼠系统性红斑狼疮(SLE)发病的致病基因之一。
优选的，如果突变基因Nasp与FcγRIIb缺陷功能互补并呈现乘积效应，则B6.ΔNasp.FcγRIIb-/-小鼠应当表现出比B6.FcγRIIb-/-小鼠更加严重的免疫病理变化，提示突变基因Nasp的功能是促进末端器官炎症反应；如果突变基因Nasp与Yaa基因座呈现互补和乘积效应，引起更严重的自身免疫病理改变，则表示突变基因Nasp的功能是打破免疫耐受。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1.由狼疮性小鼠的Nasp基因突变造成了其蛋白质中近中心部位两个相邻氨基酸的变化是否引起功能性的改变，这将是阐明该Nasp基因突变是否参与自身免疫病的发病或如何发挥作用的重要环节。
2.新模型小鼠品系的建立和对它们自身免疫病理学的检测将确认突变基因Nasp是否是狼疮性易感基因亚座Sle2c1rec1c中的致病基因，以及将阐明它在狼疮性自身免疫病发病中的作用机理。本项研究将有助于阐明人类SLE发病的机制，为寻找有效的治疗手段或研制特效药物提供帮助。
附图说明
图1为发明突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制的Sle2c1rec1c易感基因亚座染色体图谱。
图2为本发明中B6.Sle2.lpr同类系小鼠的异常免疫表型对照图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：用基因重组技术来表达和纯化正常的Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质。然后采用表面等离子共振技术(surface plasmon resonancetechnology，SPR)测定纯化的Nasp蛋白质结合组蛋白H1，H3，H4和H3/H4四聚体的能力。通过比较正常Nasp蛋白质和变异Nasp蛋白质结合组蛋白的能力，可以判断变异的Nasp蛋白质结合组蛋白的能力是否发生改变。在测定蛋白质相互作用方面，SPR方法非常精确、敏感性高。
用真核细胞表达载体携带正常Nasp cDNA和基因突变的Nasp cDNA进入小鼠T细胞内并进行高表达Nasp蛋白质，然后测定细胞内DNA量的变化和溴化尿嘧啶(BrdU)掺入水平，来检测细胞增殖反应的程度。通过比较细胞内高表达的正常Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质对细胞增殖影响的差异有无或程度，来检验突变的Nasp蛋白质的功能是否发生了改变。
优选的，将狼疮小鼠Nasp基因的突变外显子替代正常B6小鼠的相应外显子，即在B6小鼠的遗传背景上携带狼疮模型小鼠的Nasp突变外显子，产生基因敲入小鼠新品系，称之为B6.ΔNasp品系。将B6.ΔNasp小鼠与B6.lpr小鼠杂交，产生的子代小鼠反复互交，最终获得纯合子的既带有狼疮小鼠的Nasp突变基因又带有lpr基因的小鼠品系，即B6.ΔNasp.lpr小鼠。然后我们将检测B6.ΔNasp.lpr小鼠的淋巴结T细胞表型和肾脏病理。如果B6.ΔNasp.lpr小鼠表现出与B6.Sle2c1rec1c.lpr小鼠相同的免疫病理变化，那么可以确认突变基因Nasp就是模型小鼠系统性红斑狼疮(SLE)发病的致病基因之一。
优选的，如果突变基因Nasp与FcγRIIb缺陷功能互补并呈现乘积效应，则B6.ΔNasp.FcγRIIb-/-小鼠应当表现出比B6.FcγRIIb-/-小鼠更加严重的免疫病理变化，提示突变基因Nasp的功能是促进末端器官炎症反应；如果突变基因Nasp与Yaa基因座呈现互补和乘积效应，引起更严重的自身免疫病理改变，则表示突变基因Nasp的功能是打破免疫耐受。
从B6.lpr和B6.Sle2c1rec1小鼠的骨髓细胞提取RNA，用OligdT作为引物在逆转录酶作用下合成cDNA。以cDNA为模板，用PCR技术扩增小鼠的Nasp cDNA产物。将克隆的NaspcDNA插入原核细胞表达载体pET45b(+)，然后将构建的重组体转染大肠杆菌，用IPTG诱导Nasp蛋白质的表达。其表达的蛋白质的氨基端融合了六个组氨酸(6xHis)，因此用His标签蛋白纯化树脂Ni-NTA Resin来纯化，能够获得高纯度的正常和突变的Nasp蛋白质。这项研究内容属于普通的分子生物学，技术成熟。
将B6.lpr和Sle2c1rec1c.lpr小鼠的Nasp cDNA分别插入真核细胞表达载体pEGFP-N1(Clontech)中。构建的重组体表达融合蛋白，氨基端是荧光蛋白EGFP，羧基端是Nasp蛋白。用转染技术，将重组的真核细胞表达载体转染正常小鼠的脾脏细胞或者小鼠T细胞系EL4。将细胞培养在含BrdU的RPMI1640培养液中30小时。细胞经过固定、破膜后，用碘化丙啶(PI)染DNA，用荧光标记的特异性抗体染BrdU。用流式细胞仪进行检测。获取高表达EGFP(即高表达Nasp蛋白质)的细胞，分析S期或G2期细胞和BrdU阳性细胞的比率差异，以此反映突变Nasp蛋白质对细胞增殖周期的影响。我们在以前的实验过程中掌握了相关技术。
采用表面等离子共振技术(surface plasmon resonance technology,SPR)测定纯化的Nasp蛋白质结合组蛋白H1，H3，H4和H3/H4四聚体的能力。将组蛋白连接到CM5传感芯片上，用表面等离子共振仪BIACORE3000测定Nasp蛋白质结合组蛋白的动力学变化。
狼疮性模型小鼠Nasp基因的突变碱基位于其第9个外显子。首先构建打靶载体(Targeting vector)，它包含Nasp基因第9外显子的DNA序列、编码新霉素抵抗的基因(neor)、Nasp基因第10外显子DNA序列和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因。在neor基因两侧存在LoxP序列。重组打靶载体与B6小鼠胚胎干细胞内基因组的靶基因DNA同源重组使得胚胎干细胞存活下来。然后转染表达Cre重组酶(Cre recombinase)，它识别两个LoxP序列并环化、切除neor基因，获得Nasp基因突变敲入的胚胎干细胞。将Nasp基因突变敲入的胚胎干细胞用显微操作技术注入囊胚，后者在假孕小鼠体内发育为小鼠嵌合体。经杂交和反复回交，获得纯合子的Nasp突变基因敲入的B6.ΔNasp小鼠品系。
同类系B6.lpr小鼠将购自南京大学模式动物研究所(即国家遗传工程小鼠资源库(NRCMM))。同类系B6.Yaa小鼠和B6.FcγRIIb-/-小鼠将购自美国Jackson Lab实验动物中心。由于lpr和FcγRIIb基因序列以及Yaa易感基因座不是位于小鼠的第四号染色体上，并且在生殖细胞形成过程中同源染色体分离并自由组合，因此将B6.ΔNasp小鼠与B6.lpr小鼠交配，获得的杂合子F1子代小鼠反复互交。用PCR技术结合DNA测序或者DNA产物大小的电泳方法来检测Nasp基因突变和lpr基因标志。经过反复筛选，将最终获得两个遗传标志均为纯合子的B6.ΔNasp.lpr同类系小鼠。用类似的实验线路，将B6.ΔNasp小鼠与B6.FcγRIIb-/-小鼠交配和互交，最终获得纯合子的B6.ΔNasp.FcγRIIb-/-同类系小鼠。
采用类似方法，将B6.ΔNasp小鼠与B6.Yaa(雄性)小鼠交配和互交，筛选出纯合子的雄性小鼠即为B6.ΔNasp.Yaa同类系小鼠。在B6.ΔNasp.lpr、B6.ΔNasp.FcγRIIb-/-和B6.ΔNasp.Yaa同类系小鼠的成长过程中，我们将定期(1)观察小鼠的外表，注意有无皮肤炎症等皮肤损伤；(2)采集外周血制备血清，用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行IgG和IgM型自身抗体水平的测定；(3)收集尿液，用试纸半定量测定尿蛋白。在实验过程中，分别以B6.lpr、B6.FcγRIIb-/-和B6.Yaa作为对照小鼠。
在5个月龄时，我们将处死小鼠，收集并测定脾脏和淋巴结的总重量；制备细胞悬液，用于细胞免疫表型的分析。采集肾脏并制备冷冻切片，用免疫荧光技术检测肾小球中免疫球蛋白IgG和补体C3成分的沉积与否；同时，用福尔马林固定，石蜡包埋和切片，进行常规苏木素伊红(H-E)染色和糖原染色(PAS)，由肾脏病理学家评价肾脏病理变化的有无或程度。细胞免疫表型分析内容包括T细胞及其亚群、B细胞及其亚群、树突状细胞(DC)、调节性T细胞(Treg)、以及Th1、Th2和Th17亚群。此外，还包括细胞的活化状态。细胞经特异性荧光标记抗体染色后，用流式细胞仪进行检测
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.突变基因Nasp制备用于研究狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制的模型动物的方法，其特征在于：将狼疮小鼠Nasp基因的突变外显子替代正常B6小鼠的相应外显子，即在B6小鼠的遗传背景上携带狼疮模型小鼠的Nasp突变外显子，产生基因敲入小鼠新品系，称之为B6.ΔNasp品系；将B6.ΔNasp小鼠与B6.lpr小鼠杂交，产生的子代小鼠反复互交，最终获得纯合子的既带有狼疮小鼠的Nasp突变基因又带有lpr基因的小鼠品系，即B6.ΔNasp.lpr小鼠；然后检测B6.ΔNasp.lpr小鼠的淋巴结T细胞表型和肾脏病理；通过观察到B6.ΔNasp.lpr小鼠表现出与B6.Sle2c1rec1c.lpr小鼠相同的免疫病理变化，确认突变基因Nasp就是模型小鼠系统性红斑狼疮(SLE)发病的致病基因之一。
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