DE69820450T2

DE69820450T2 - Chimäre vektoren, die die verpackungsregion eines phagengenoms und einen teil des genoms eines eukaryontischen virus enthalten

Info

Publication number: DE69820450T2
Application number: DE69820450T
Authority: DE
Inventors: L. Duncan McVEY; E. Douglas BROUGH; Mohammed Zuber; Imre Kovesdi
Original assignee: Genvec Inc
Current assignee: Genvec Inc
Priority date: 1997-06-09
Filing date: 1998-06-09
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2018-06-10
Also published as: DE69820450D1; WO1998056937A3; WO1998056937A2; EP0996735A2; US7070930B2; US6440728B1; EP0996735B1; AU8067698A; US20030170899A1; ATE256196T1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Vektoren, die in einer prokaryontischen Zelle hergestellt sind, zur Verwendung beim Gentransfer in eukaryontische Zellen, Vektoren, die zur Herstellung eukaryontischer Gentransfervektoren nützlich sind und Verfahren zur Herstellung derselben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Gentransfer in eukaryontische Zellen hat sowohl in vivo wie in vitro-Verwendungen. Wie wohl bekannt ist, kann in vivo-Gentrans in eukaryontische Zellen verwendet werden, um einen Wirt zu immunisieren, für therapeutischen Gentransfer in einen Wirt, und um die Biologie transferierter Gene in vivo zu untersuchen. In vitro-Gentransfer in eukaryontische Zellen kann verwendet werden, um einfache und komplexe biologische Phenomena wie Proteinfunktion, Proteinhalbwärtszeit und Genprotein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Ein bevorzugtes Verfahren zum Transferieren von Genen in eukaryontische Zellen ist die Verwendung rekombinanter eukaryontischer Viren. Obwohl Wissenschaftler oder Kliniker die vielen Vorteile rekombinanter eukaryontischer Viren zum Gentransfer in eukaryontische Zelle schätzen lernten, hat die Schwierigkeit der Herstellung dieser Viren die Geschwindigkeit, mit der neue und nützliche Gentransferexperimente und Protokolle entwickelt wurden, behindert.
Bedingt durch ihre große Größe werden viele rekombinante eukaryontische Viren über homologe Rekombination hergestellt. Konventioneller Weise hat die zur Herstellung großer viraler Vektoren verwendete homologe Rekombination in einer eukaryontischen Wirtszelle stattgefunden, die das Wachstum des rekombinanten Virus erlaubt (siehe, z. B. Berkner, BioTechniques, 6, 616–628 (1988)). Die homologe Rekombination in eukaryontischen Zellen hat jedoch mindestens zwei hauptsächliche Nachteile. Das Verfahren ist zeitaufwendig und viele bevorzugte rekombinante eukaryontische virale Konstruktionen haben einen deutlichen Nachteil gegenüber den vorausgegangenen eukaryonti schen Viren, aus denen sie erhalten wurden. Daher ist ein Fachmann, der versucht, einen neuen rekombinanten Virus durch das langwierige Verfahren der homologen Rekombination in einer rekombinanten Zelle zu kreieren und dahingehend versagt, den gewünschten Virus herzustellen, oft nicht in der Lage, zwischen der Notwendigkeit der Abwandlung der Konstruktionstechnik oder der Möglichkeit, dass der gewünschte Virusvektor nicht in der Wirtszelle lebensfähig ist, zu unterscheiden. Dementsprechend gibt es einen Bedarf an neuen Verfahren zur Herstellung eukaryontischen Gentransfervektoren.
Bisherige Verbesserungen zur Herstellung von Gentransfervektoren umfassten die Verwendung Hefe-basierender Systeme (Ketner et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA, 91, 6168–6190 (1994)), Plasmid-basierender Systeme (Chartier et al., J. Virology, 70, 4805 –4810 (1996); Crouzet et al., WO 96/25506) und Cosmid-basierender Systeme (Miyake et al., Proc. Natl. Acad, Sci. (USA), 93, 1320–1324 (1996)). Während diese Systeme die Herstellung neuer rekombinanter eukaryontischer Viren zulassen, sind eine zusätzliche Flexibilität und ein Selektionsdruck wünschenswert. Die vorliegende Erfindung stellt ein schnelles und flexibles Verfahren zur Herstellung neuer Vektoren zur Verfügung, die zum Gentransfer in eukaryontische Zellen in vitro und in vivo verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung stellt auch Vektoren zur Verfügung, die zur Verwendung im eukaryontischen Gentransfer modifiziert sind sowie Verfahren und Systeme zur Verwendung derselben. Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie zusätzliche erfindungsgemäße Merkmale werden sich aus der hierin zur Verfügung gestellten Beschreibung der Erfindung ergeben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen DNA-Vektor zur Verfügung, umfassend einen Teil eines eukaryontischen viralen Genoms, umfassend einen ITR, ein regulierbares negatives Selektionsgen (NSG) oder ein stringent reguliertes Wachstumsdiskriminierungsgen (SRG) und eine Phagen-Verpackungssignalsequenz. Der vorliegende erfindungsgemäße Vektor umfasst vorzugsweise ein vollständiges eukaryontisches (z. B., adenovirales) Amplikon. Zudem ist das regulierbare negative Selektionsgen oder Wachstumsdiskriminierungsgen vorzugsweise in dem Teils des eukaryontischen viralen Genoms des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors so eingebettet, dass ein Doppelrekombinations vorgang mit einem zweiten DNA-Vektor das regulierbare negative Selektionsgen oder Wachstumsdiskriminierungsgen zur gleichen Zeit entfernt, zu dem eine DNA von Interesse in den vorliegenden erfindungsgemäßen Vektor transferiert wird. In einer anderen Ausführungsform des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors liegt ein positives Selektionsgen proximal zu dem NSG, was eine duale Selektionskassette (DSC) ausbildet. Die Kombination von negativen und positiven Selektionsgenen bildet eine duale Selektionskassette (DSC) aus, die den Fachmann mit einer hervorragenden Kontrolle des homologen Kombinationssystems ausstattet. Das SRG kann entweder einer negativen oder positiven Selektionsfunktion oder beiden dienen. Entsprechend ist es nützlich, ein SRG proximal zu entweder einem PSG oder einem NSG zu haben. SRGs, die benachbart oder proximal zu einem anderen Selektionsgen liegen, werden duale Diskriminierungskassetten genannt. Natürlich kann der vorliegende erfindungsgemäße Vektor auch andere genetische Elemente umfassen, wie ein unabhängiges positives Selektionsgen, das in seiner Position nicht mit dem NSG, DSC oder SRG und einem bakteriellen Replikationsursprung assoziiert ist.
Der vorliegende erfindungsgemäße Vektor umfasst optional zusätzliche vorteilhafte Elemente. Zum Beispiel umfasst der vorliegende erfindungsgemäße Vektor optional einen defizitären oder bedingungsabhängig defizitären lambdoiden Replikationsvorsprung, welcher die Wirksamkeit der doppelten homologen Rekombination verstärkt. Der vorliegende erfindungsgemäße Vektor ist vorzugsweise derart konfiguriert, dass die Phagen-Verpackungssequenz proximal zu einem ITR eines eukaryontischen viralen Amplikons liegt, was die direkte Herstellung eines Amplikons erlaubt, wenn der vorliegende erfindungsgemäße Vektor verkapselt und in eine geeignete eukaryontische Zelle transduziert oder infiziert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Bibliothek zur Verfügung, umfassend oder bestehend aus einer Vielzahl des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors, der eine Vielzahl genetischer Elemente umfasst, die gleich oder verschieden sein können.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein System zur Herstellung von rekombinanten DNA-Vektoren zur Verfügung. Jegliche Ausführungsform des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors kann einen Teil des vorliegenden erfindungsgemäßen Systems darstellen. Die das vorliegende erfindungsgemäße System umfasst mindestens eine zweite DNA, die zwei DNA-Segmente umfasst, von denen jedes eine ausreichende Homologie zum efindungsgemäßen Vektor aufweist, um eine homologe Rekombination zu vermitteln und welche eine DNA flankieren oder umgeben, von der es wünschenswert ist, sie in den vorliegenden erfindungsgemäßen Vektor oder in einen Teil der eukaryontischen viralen DNA oder des Amplikons, das einen Teil des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors darstellt, einzubauen. Bestimmte Ausführungsformen des vorliegenden erfindungsgemäßen Systems umfassen eine dritte DNA, die ein Defizit in einem lambdoiden Replikationsursprung in trans komplementieren kann, und optional eine vierte DNA, die eine Quelle eines Phagenkapsids exprimiert, das intermediäre oder Produktvektoren verkapselt, die den Phagen-Replikationsursprung umfassen. Eine oder beide der dritten und vierten DNAs des erfindungsgemäßen Systems können optional in das Genom einer bakteriellen Zelle eingebracht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung und Verpackung eines DNA-Vektors zur Verfügung. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst das Transfizieren einer bakteriellen Zelle mit zwei DNA-Vektoren, die eine homologe Rekombination durchlaufen, um einen gewünschten DNA-Vektor herzustellen. Ein Vektor umfasst eine Phagen-Verpackungssequenz und ein NSG, DSC oder SRG, die von zwei DNA-Segmenten flankiert ist, die einen doppelten homologen Rekombinationsvorgang mit dem zweiten Vektor, der in dem System eingesetzt wird, vermitteln. Der doppelte homologe Rekombinationsvorgang platziert eine DNA in den ersten Vektor und entfernt gleichzeitig das NSG, DSC oder SRG und führt eine DNA von dem zweiten Vektor in den ersten Vektor ein. Das Verfahren umfasst auch die Verwendung von in vivo-Bedingungen, die das doppelt homolog rekombinierte Produkt in ein Phagenkapsid verkapseln, das eine Phagen-Verpackungssequenz enthält. Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren kann auch das Infizieren des verkapselten Produktvektors in ein Zellpopulation unter solchen Bedingungen umfassen, dass das negative Selektionsgen vor dem Ernten des Produktvektors aus einem Lysat der zweiten Zellen aktiv ist, was der Eliminierung von Zellen dient, die unerwünschte DNA-Konstrukte aus der Zellpopulation enthalten, aus denen der Produktvektor isoliert wird.
Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren setzt optional einen ersten Vektor ein, umfassend einen defizitären oder bedingungsabhängig defizitären lambdoiden Replikationsursprung, ein. In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Defizite in dem lambdoiden Replikationsursprung in trans während des Zeitraums komplementiert, in welchem der homologe Rekombinationsvorgang vorkommt, was die Effizienz des Verfahrens aus verschiedenen Gründen verbessert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein verbessertes Verfahren zum Gentransfer in eukaryontische Zellen zur Verfügung. Dieses verbesserte Verfahren umfasst die Verwendung eines lambdiden Vektors (unten definiert), um neue rekombinante Vektoren herzustellen, einschließlich rekombinanter eukaryontischer viraler Vektoren, die in der Lage sind, Gene in eukaryontische Zellen zu transferieren. Lambdide Vektoren oder Teile davon können auch in eukaryontische Zellen ohne die Hilfe von (eukaryontischen viralen oder Phagen-) Kapsidproteinen transduziert werden. Lambdide Vektoren, die in eukaryontische Zellen transduziert sind, können neue rekombinante eukaryontische virale Vektoren herstellen, die heterologe Genexpression dirigieren oder für andere Zwekke verwendet werden. Zusätzlich können lambdide Vektoren in lambdoide Kapside verkapselt werden, umfassend chimere lambdoide Kapsidproteine, die in der Lage sind, an eukaryontische Zellen zu binden. Diese lambdiden Vektoren, die in ein rekombinantes Kapsid verkapselt sind, können verwendet werden, um eukaryontische Zellen direkt zu transduzieren.
Diese und andere Merkmale der vorliegenden Erfindung werden unten noch weiter beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt den lambdiden Vektor LOI^QVXB (SpeCC).
2 zeigt den lambdiden Vektor LI^QVXB (Spe).
3 zeigt den lambdiden Vektor LGV₁₁VXB.
4 zeigt die Struktur von verschiedenen DNA-Vektoren, die im Kontext der vorliegenden Erfindung nützlich sind, insbesondere L-sel. 4 zeigt auch das Verhältnis der DNA-Konstrukte untereinander, wenn sie in einer Ausführungsform des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden.
5 zeigt den lambdiden Vektor LOI^QVX-Ad_GV-VEGF₁₂₁.10.
Dieser Vektor kann in ein Gen D-modifiziertes Lambdakapsid verkapselt werden, um einen verkapselten DNA-Vektor herzustellen, der einen DNA-Virus umfasst, der eine Expressionskassette für VEGV₁₂₁ trägt. Der verkapselte Vektor kann mit einer eukaryontischen Zelle mit einem Rezeptor oder Liganden in Kontakt gebracht werden, der spezifisch für das chimäre Gen D-Mantelprotein ist. Die eukaryontische Zelle wird dann den verkapselten Vektor aufnehmen. Wenn die eukaryontische Zelle die Replikation des adenoviralen Vektors erlaubt, der ein Teil des verkapselten lambdoiden Vektors ist, dann kann eine Stammlösung von adenoviralen Vektoren aus dieser Zelle erhalten werden. Unabhängig von der Fähigkeit des DNA-Vektors, in der eukaryontischen Zellen zu replizieren, kann das VEGV₁₂₁-Passagiergen trotzdem in der Zelle exprimiert werden.
6 zeigt eine Ausführungsform des Vektors 7, einem lambdiden Vektor der vorliegenden Erfindung.
7 zeigt eine Ausführungsform von Vector 9.
Vektor 8 kann in Kombination mit Vektor 7 verwendet werden (siehe Beispiel 8 unten).
8 zeigt eine Ausführungsform von Vektor 9.
Vektor 9 ist eines der wünschenswerten Produkte, die durch homologe Rekombination zwischen Vektor 7 und Vektor 8 erhalten werden können.
9 zeigt einige der Nebenprodukte der homologen Rekombination zwischen Vektor 7 und Vektor 8. Beispiel 8 illustriert ein nützliches Verfahren zur Herstellung und Isolierung von Vektor 9 aus den Vektoren 7 und 8 und die Vektoren, die in 9 dargestellt werden.
10 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. In 10 durchlaufen ein erster Vektor und ein zweiter Vektor eine doppelte homologe Rekombination um einen Produktvektor auszubilden. Der Produktvektor wird aus den anderen Vektorformen durch die Anwendung positiven und negativen Selektionsdrucks und der Verwendung der Phagenverkapselung und Infektion isoliert.
11 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die in 11 gezeigt wird, ist nahezu identisch mit der Ausführungsform, die in 10 gezeigt wird, außer dass in 11 ein ITR eines eukaryontischen viralen Genoms in dem ersten Vektor residiert und ein anderes ITR eines eukaryontischen Genoms in einem zweiten Vektor residiert und die doppelte homologe Rekombination das ITR des zweiten Vektors in den Produktvektor transferiert, um ein eukaryontisches virales Amplikon herzustellen.
12 zeigt p15E1 (z). p15E1 (z) ist ein zweiter Vektor der vorliegenden Erfindung. Das Plasmid umfasst das p15 ori und ein Kanamycin-Resistenzgen, das aus pACYC177 erhalten wurde. Das bla-Gen aus pACYC177 wurde mit den Ad5-Sequenzen 1 bis 5788 ersetzt. Die adenoviralen Sequenzen 356 bis 3327 wurden mit einer Expressionskassette ersetzt, umfassend den CMV-Promotor, der operabel an das Lac Z-Gen und ein SV40 Polyadenylierungssignal gebunden wurde.
13 zeigt pAdE1 (BN); E310BR und ist ein pSelect der vorliegenden Erfindung. Die Sty I-Sequenz von pBR322 wurde in Pac I geändert. Die Lac I^Q Expressionskassette und eine cos-Stelle wurden in die Pac I-Stelle eingefügt. Benachbart zu der cos-Stelle sind adenovirale Sequenzen 1 bis 35,935, in welchen die Sequenzen 356 bis 4122 mit einem DSC ersetzt werden und die Sequenzen 28,592 bis 30,470 (Xba I bis Xba I) deletiert werden. Der EM-7-Promotor des DSC ist zum linken ITR hin orientiert. Der rechte ITR ist benachbart zu der Pac I-Stelle, die am nächsten zum Tetracyclinresistenzgen liegt.
14 zeigt pAdE1 (Z) E3 (10) BR, welches ein pDesired-Vektor der vorliegenden Erfindung ist.
pAdE1 (Z) E3 (10) BR ist isogen mit pAdE1 (BN) E310BR, außer dass die Lac Z-Expressionskassette von p15E1 (Z) und die adenoviralen Sequenzen 3328 bis 4122 das DSC ersetzt haben.
15 zeigt ein pAdE1 (Z) E3/4 (B) IQCos, welches ein erster Vektor (oder pSelect) der vorliegenden Erfindung ist, der ein SRG umfasst. Dieser Vektor umfasst ein Serotyp 5 adenovirales Genom, das durch (i) das Ersetzen der Koordinaten 356 bis 2,787 mit einer Expressionskassette, umfassend den CMV-Promotor, der an das Lac Z-Gen operativ gebunden ist und eine SV40 Polyadenylierungssequenz und (ii) das Ersetzen der Koordinaten 27,084 bis 35,564 mit einem SRG, modifiziert ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Bestimmte Begriffe werden mit einer bestimmten Bedeutung verwendet oder zum ersten Mal in dieser Beschreibung der vorliegenden Erfindung definiert. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe durch ihre im Stand der Technik akzeptierten Definitionen definiert, wenn solche existieren, außer wenn solche Definitionen mit den unten aufgeführten Definitionen in Konflikt oder teilweise in Konflikt stehen. In dem Fall eines Konflikts in einer Definition wird die Bedeutung der Begriffe zuerst durch die unten aufgeführten Definitionen definiert.
Transfiziert bedeutet jegliches geeignetes Verfahren zum Transfer einer DNA aus dem Äußeren einer Zelle in das Innere einer Zelle, so dass die Zelle biologisch lebensfähig bleibt. Geeignete Verfahren zur Transfektion umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Infektion, chemische Transformation, Elektroportion, Mikropartikelbombardierung und andere auf dem Gebiet bekannte Techniken.
Der Begriff lambdoid ist ein auf dem Gebiet akzeptiertes Adjektiv, das bedeutet, dass der Begriff, den es modifiziert, von einem Phagen stammt, der einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit dem Bakteriophagen Lambda aufweist. Im Gegensatz dazu bezeichnet der Begriff lambdider Vektor bestimmte Ausführungsformen des vorliegenden erfindungsgemäßen DNA-Vektors. Lambdide Vektoren werden so genannt, weil sie ein Operon umfassen, das einen lambdoiden Replikationsursprung umfasst. Eine bevorzugte Ausführungsform eines lambdiden Vektors wird im Detail im Beispiel 8 unten beschrieben.
Ein Amplikon ist ein Vektor, der zur Replikation und zum Verpacktwerden in der Lage ist, wenn jegliche defizitären essenziellen Genfunktionen in trans zur Verfügung gestellt werden. Ein eukaryontisches virales Amplikon umfasst mindestens einen Teil von jedem terminalen Repeat, das notwendig ist, um die Replikation der viralen DNA zu unterstützen und die DNA, die notwendig ist, um das Genom in ein virales Kapsid zu verkapseln. Eukaryontische virale Aplikons umfassen vorzugsweise mindestens 90% der gesamten ITR-Sequenz.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Bakterien aus einem Flüssigkulturmedium auf ein festes Kulturmedium in einer solchen Weise transferiert ("plattiert"), dass individuelle Bakterien wachsen, um klonale Kolonien eines einzelnen Bakteriums aus der Flüssigkultur auszubilden. Der Fachmann weiß, das Kolonien zu verschiedenen Zeiten aufkommen, wenn eine Bakterienmischung plattiert wird und einige Bakterien einen Wachstumsvorteil gegenüber anderen Bakterien in der Kultur aufweisen. Diese Bakterien, die schnell wachsen und sichtbare Kolonien von mindestens 2 mm Durchmesser ausbilden, bevor andere Kolonien aufkommen, werden primäre Kolonien genannt. Kolonien die nicht klar mit dem nackten Auge nach mindestens ungefähr zwölf Stunden und vorzugsweise nach mindestens ungefähr 30 Stunden nach dem eindeutigen Erscheinen primärer Kolonien sichtbar sind, werden als sekundäre Kolonien bezeichnet.
Ein stringenter Promotor ist einer, der nicht durch eine E. coli- oder andere bakterielle Wirts- RNA-Polymerase erkannt wird, sondern eher durch eine Polymerase, die nur eine kleine Familie homologer DNA-Sequenzen erkennt. Stringente Promotoren sind typischerweise Phagenpromotoren, z. B., der T7 Promotor, der T3 Promotor und der sp6 Promotor.
Die Abkürzungen NSG, DSC, SRG, PSG und DDC werden hierin verwendet, um ein negatives Selektionsgen, eine duale Selektionskassette, ein stringent reguliertes Gen, ein positives Selektionsgen und eine duale Diskriminierungskassette zu bezeichnen. Diese Begriffe werden unten definiert.
Der Begriff anti-selektives Gen umfasst NSGs und SRGs, welche im Wesentlichen das Wachstum von Zellen hemmen, die diese umfassen, wenn das Gen aktiviert ist. DSCs umfassen NSGs und umfassen daher auch anti-selektive Gene.
Der Begriff umfassend wird in der Beschreibung der Erfindung und in den Ansprüchen verwendet, um "einschließlich, aber nicht notwendigerweise darauf eingeschränkt" zu bedeuten.
Der Begriff eingebettet, wenn auf DNA-Vektoren angewendet, wird verwendet, um Sequenzen zu bezeichnen, die in oder anstatt der Sequenz, in welche sie eingebettet werden, eingefügt werden. Eingebettete Sequenzen können benachbart zu Spacersequenzen sein. Spacersequenzen, die einen Teil einer eingebetteten Sequenz ausbilden, haben vorzugsweise weniger als ungefähr 250 Basenpaaren in Länge und vorzugsweise kodieren sie nicht für eine biologische Funktion. Der Begriff benachbart, wenn er auf DNA-Vektoren angewendet wird, bezieht sich auf Sequenzen, die durch weniger als ungefähr 30 Basenpaare getrennt sind. Benachbarte Sequenzen sind vorzugsweise durch weniger als ungefähr 12 Basenpaare getrennt.
Die Erfindung
Eine doppelte homologe Rekombination wurde konventioneller Weise verwendet, um große DNA-Vektoren herzustellen. Die vorliegende Erfindung stellt inter alia einen DNA-Vektor und ein System zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Vektors zur Verfügung, das die vorliegende erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, welches die Verwendung einer doppelten homologen Rekombination umfasst, die in Bakterien mit nicht zuvor gekannter Leichtigkeit stattfindet und mit einer Fähigkeit zur bestätigenden Kontrolle der Reaktion, die den gewünschten Vektor herstellt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung und Verpackung eines rekombinanten DNA-Vektors dar. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst das Transfizieren einer bakteriellen Zelle mit zwei DNA-Vektoren, die eine homologe Rekombination durchführen, um einen gewünschten DNA-Vektor auszubilden. Ein Vektor (d. h., der Akzeptor oder erste Vektor) umfasst eine Phagen-Verpackungssignalsequenz und ein antiselektives Gen (ein NSG, SRG, DSC oder DDC), das durch zwei DNA-Segmente flankiert ist, die einen doppelten homologen Rekombinationsvorgang mit dem zweiten Vektor, der im dem System eingesetzt wird, vermitteln. Der doppelte homologe Rekombinationsvorgang produziert einen gewünschten Produktvektor durch das Einführen einer DNA aus dem zweiten Vektor in den ersten Vektor und das gleichzeitige Transferieren des antiselektiven Gens aus dem ersten Vektor in den zweiten Vektor. Der Produktvektor umfasst vorteilhafterweise eine Phagen-Verpackungssequenz. In dieser Hinsicht umfasst das Verfahren vorzugsweise die Verwendung von in vivo Bedingungen, die den Produktvektor, der durch die doppelte homologe Rekombination hergestellt wurde, in ein Phagenkapsid verkapseln. Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren wird durch das Infizieren des verkapselten Produktvektors in eine Zellpopulation unter Bedingungen weitergeführt (wobei die Zellpopulation sich von der Zelle unterscheidet, in welcher die homologe Rekombination vorkommt), so dass das antiselektive Gen vor dem Ernten des Produktvektors aus dem Lysat der zweiten Zelle aktiv ist, was der Eliminierung von Zellen dient, die unerwünschte DNA-Konstrukte aus der Population der Zellen aufweisen, aus denen der Produktvektor isoliert wird.
Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren setzt einen ersten Vektor ein, der einen lambdoiden Replikationsursprung umfassend. Der lambdoide Replikationsursprung ist vorzugsweise ein defizitärer oder bedingungsabhängig defizitärer lambdoider Replikationsursprung. Jedoch wird der Vorteil des lambdoiden Replikationsursprungs hauptsächlich aus seiner Funktion während der doppelten homologen Rekombination des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens abgeleitet. Diese Replikation verstärkt die Effizienz des Verfahrens durch das zur Verfügung stellen einer beschleunigten homologen Rekombinationsgeschwindigkeit und durch das zur Verfügung stellen größerer DNA-Mengen. Diese Defizite in dem lambdoiden Replikationsursprung werden in trans während dem Zeitraum komplementiert, in welchem der homologe Rekombinationsvorgang stattfindet. Verschiedene defizitäre lambdoide Replikationsursprünge sowie Verfahren zur Aktivierung dieser Ursprünge werden hierin hiernach beschrieben. Zudem ist es, wie unten diskutiert, vorteilhaft, die lambdoide Replikation während der verbleibenden Zeit des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens zu verhindern. Entsprechend stellt der Einsatz eines defizitären oder bedingungsabhängig defizitären lambdoiden Replikationsursprung eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
Verschiedene Ausführungsformen und Verbesserungen des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens existieren und sind teilweise von dem Design des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors entweder allein oder in Kombination mit dem Design des zweiten erfindungsgemäßen Vektors abhängig. Andere Ausführungsformen des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens sind abhängig von dem Einsatz eines Helferphagen oder Lysogens und von den Eigenschaften der Zelle oder der Zellpopulation, die verwendet wird, um das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen.
Der vorliegende erfindungsgemäße DNA-Vektor (d. h., der erste oder Akzeptorvektor) umfasst (i) einen Teil eines eukaryontischen viralen Genoms, umfassend ein ITR, (ii) ein regulierbares negatives Selektionsgen (NSG) oder ein stringent reguliertes Wachstumsdiskriminierungsgen (SRG) und (iii) eine Phagen-Verpackungssignalsequenz. Der vorliegende erfindungsgemäße Vektor umfasst vorzugsweise auch mindestens einen Replikationsursprung, der in einer bakteriellen Zelle operativ ist. Dieser Ursprung kann jeder geeignete Ursprung sein, ist jedoch vorzugsweise von Nichtphagenursprung und geringer Kopienzahl, um die Stabilität des Vektors zu verbessern. Ein bevorzugter bakterieller Ursprung ist der pBR322-Ursprung. Andere geeignete Ursprünge umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, p15A, pSC101 und RK2.
Der Teil des eukaryontischen viralen Genoms des ersten Vektors kann auch ein zweites ITR enthalten, welches ein Amplikon, das keine Packungssequenz aufweist, herstellt. Stattdessen oder zusätzlich zu einem zweiten ITR kann der Teil des eukaryontischen viralen Genoms auch eine eukaryontische virale Verpackungssignalsequenz umfassen. Somit enthält der erste Vektor optional ein eukaryontisches virales Amplikon.
Der vorliegende erfindungsgemäße Vektor ist vorzugsweise zirkulär, weil solche Vektoren im Allgemeinen leichter zu vermehren und in Bakterien zu halten sind.
Wie oben gesagt, umfasst der vorliegende erfindungsgemäße Vektor ein antiselektives Gen, welches entweder ein regulierbares NSG oder ein SRG sein kann. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das antiselektive Gen innerhalb des Teils eines eukaryontischen Vektors des ersten Vektors eingebettet. Dieses ist besonders nützlich, wenn ein terminaler Teil der eukaryontischen viralen Genoms nicht durch den doppelten homologen Rekombinationsvorgang ersetzt werden soll, so dass, wenn der doppelte homologe Rekombinationsvorgang stattfindet, das antiselektive Gen aus dem Produktvektor entfernt wird. Jedoch muss das antiselektive Gen nicht innerhalb des eukaryontischen viralen Genoms in solchen Fällen eingebettet sein, in denen eine Region außerhalb des eukaryontischen viralen Genoms des ersten Vektors an der homologen Rekombination teilnimmt. In jeder der Ausführungsformen ist der vorliegende erfindungsgemäße Vektor so konstruiert, dass der doppelte Rekombinationsvorgang mit einem zweiten DNA-Vektor das antiselektive Gen zur gleichen Zeit entfernt, zu der eine DNA von Interesse in den vorliegenden erfindungsgemäßen Vektor transformiert wird, um den Produktvektor auszubilden.
In einer anderen Ausführungsform des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors wird ein positives Selektionsgen (PSG) proximal zu oder benachbart zu dem antiselektiven Gen platziert. Die Kombination von negativen und positiven Selektionsgenen bildet eine doppelte Selektionskassette (DSC), die dem Fachmann eine hervorragenden Kontrolle des homologen Rekombinationssystems zur Verfügung stellt. Zum Beispiel, kann das positive Selektionsgen in dem Verfahren der Ausbildung des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors verwendet werden, um Kolonien von Bakterien zu selektieren, die das PSG enthalten und daher das DSC, dass das NSG umfasst. Zusätzlich kann das PSG des DSC verwendet werden, um selektiven Druck gegen Vektorformen aufzubauen, die falsch rekombinieren oder sich anderweitig verändern, um das NSG zu eliminieren. In jeder dieser Ausführungsformen kann ein SRG gegen ein NSG des DSC substituiert werden.
Natürlich kann der erfindungsgemäße Vektor auch andere genetische Elemente umfassen, wie ein unabhängiges positives Selektionsgen, das nicht positional mit dem NSG, DSC oder SRG und einem bakteriellen Replikationsursprung assoziiert ist. Ein unabhängiges positives Selektionsgen wird nicht aus dem erfindungsgemäßen vorliegenden Vektor durch den doppelten homologen Rekombinationsvorgang entfernt. Vorzugsweise ist das unabhängige PSG nicht innerhalb des Teils des eukaryontischen viralen Genoms eingebettet, der in dem vorliegenden erfindungsgemäßen Vektor vorliegt. Das unabhängige PSG ist inter alia nützlich für das zur Verfügung stellen eines positiver Selektionsdrucks auf Bakterien, die einen gewünschten Produktvektor enthalten, der aus einer homologen Rekombination zwischen einem Vektor, umfassend ein NSG oder DSC und einem anderen Vektor erhalten wird.
Das PSG des DSC (wenn anwendbar) und das unabhängige PSG können jegliches geeignetes Gen sein. Ein PSG umfasst eine DNA, kodierend ein RNA oder ein Protein, das einen selektiven Wachstumsvorteil für Bakterien zur Verfügung stellt, die das positive Selektionsgenprodukt unter definierten Bedingungen exprimieren. Antibiotische Resistenzgene und Auxotrophy-komplementierende Gene sind Beispiele von positiven Selektionsgenen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Geeignete PSGs, die antibiotische Resistenz auf eine Wirtszelle vermitteln, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Kanamycin-, Ampicillin-, Tetracyclin- und Zeocin-Resistenzgene. Tetracyclin- und Zeocin-Gene funktionieren besser als andere PSGs in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und funktionieren so gut wie andere PSG, die in anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung untersucht wurden. Das bedeutet, dass bakterielle Zellen, die DNA-Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten, weniger anfällig dafür sind, mukoidal zu werden und sie sind anfälliger für das NSG, wenn die Gene, die Resistenz gegen Tetracyclin und/oder Zeocin kodieren, in den vorliegenden endungsgemäßen Vektor eingebracht werden, als Gene, die Ampicillin- oder Kanamycin-Resistenz kodieren, wenn diese in den vorliegenden erfindungsgemäßen Vektor eingebracht werden.
Daher ist es oft bevorzugt, Tetracyclin- und Zeocin-Resistenzgene für die PSG(s) der vorliegenden Erfindung zu verwenden.
Der positive Selektionsgenpromotor kann jeglicher geeignete Promotor sein, aber es ist von Bedeutung, dass ein konstitutiver Promotor für viele Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft ist, zumindest dahingehend, dass der Fachmann sich dann nicht um die Funktion des positiven Selektionsgenpromotor kümmern muss. In einem DSC ist der positive Selektionsgenpromotor vorzugsweise so positioniert und/oder orientiert, dass er die Transkription einer RNA nicht unterstützt, die das negative Selektionsgenprodukt kodiert (d. h., er unterstützt die Transkription eines Sense-Stranges der RNA des negativen Selektionsgens nicht). Dieses kann inter alia dadurch erzielt werden, dass die positiven und negativen Genpromotoren in einer 5'- bis 5' (oder Rücken an Rücken)-Orientierung platziert werden, so dass die Transkription bei jedem Promotor beginnt und weg von dem anderen erfolgt, wie es in Beispiel 6 gezeigt wird.
Zusätzlich kann der zweite Vektor der vorliegenden Erfindung ein PSG umfassen. Das PSG des zweiten Vektors unterscheidet sich vorzugsweise von dem DSC-assoziierten PSG (wenn vorhanden) oder dem unabhängigen PSG des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors.
Das NSG der vorliegenden Erfindung umfasst eine DNA, die ein negatives Selektionsgenprodukt kodiert und operativ daran gebunden ist, einen negativen Selektionsgenpromotor sowie andere Elemente, die zur Transkription und Translation (falls vorgesehen) eines negativen Selektionsgenprodukts benötigt werden. Das negative Selektionsgenprodukt ist jegliche RNA oder Protein, die oder das einen starken Wachstumsnachteil für eine Wirtszelle vermitteln kann, die diese exprimiert oder vorzugsweise, die den Tod einer Wirtszelle bewirkt, die dieses unter definierten Bedingungen exprimiert.
Geeignete negative Selektionsgene umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, NP-1, sacB, ccd-Gene (z. B., ccdB), ein Tetracyclingen (tet^R), par-Gene (z. B., parD) und Kid. Geeignete NSGs umfassen auch Fusionsproteine dieser Gene (z. B., Gene, die Teile dieser Gene umfassen, die mit Teilen der Gene, die Thioredoxin, β-Galactosidase, die OmpA-Signalsequenz, Luciferase, Protein A oder andere geeignete Fusionspartner kodieren, fusioniert sind. Geeignete NSGs umfassen auch aktive Varianten der zuvor genannten Gene, die Deletionen, Mutationen und andere Modifikationen umfassen können. Kurz gesagt, ein geeigntes NSG stellt den Tod oder eine substantielle Verringerung der Wachstumsgeschwindigkeit eines Bakteriums zur Verfügung, das dieses exprimiert. Eine Diskussion von NSGs kann in Kapitel 22 von Escherichia coli und Salmonella, 2 Ed., (1996) Niedhardt ed., ASM Press, insbesondere auf den Seiten 2317–2318 gefunden werden.
Im Wege einer weiteren Illustrierung und nicht Einschränkung wird festgestellt, dass die DNA, die ein OmpA FLAG/NP-1 Fusionsprotein kodiert, illustrativ für ein NSG ist, das im Kontext der vorliegenden Erfindung nützlich ist. Das OmpA FLAG/NP-1 Genprodukt ist ein Rattendefensinfusionsprotein, dem es an seiner Erkennungssignalsequenz mangelt und das des Weiteren die OmpA Signalsequenz und einen Flag M1^® oder Flag M2^® Antikörper (Eastman Kodak) umfasst. Die Herstellung eines OmpA FLAG/NP-1 Fusionsproteins in einem Bakterium macht das Bakterium nicht überlebensfähig. Während es nicht vorgesehen ist, an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, ist eine Erklärung für die negative Selektionswirkung von OmpA FLAG/Np-1, dass das OmpA-Signal den NP-1-Teil des Proteins in oder proximal zu einer bakteriellen Membran derart lokalisiert, dass der NP-1-Anteil des Proteins Poren in dieser Membran ausbildet und die Überlebensfähigkeit der Wirtszelle zerstört.
Das sacB-Gen ist illustrativ für ein anderes NSG, das im Kontext der vorliegenden Erfindung nützlich ist. Das sacB-Genprodukt wandelt Sukrose (wenn diese im Wachstumsmedium zur Verfügung gestellt wird) in Triebmittel. Triebmittel ist hoch toxisch für Bakterien. Das sacB-NSG kann durch das zur Verfügung stellen oder Zurückhalten von Sukrose aus einem bakteriellen Wirt reguliert werden, der konstitutiv sacB exprimiert.
Der negative Selektionsgenpromotor kann stark regulierbar sein (d. h., induzierbar, supprimierbar oder sowohl induzierbar wie auch supprimierbar), so dass er eine Kontrolle über den negativen Selektionsdruck zur Verfügung stellt, den das NSG bewirkt. Alternativ dazu, wenn der NSG-Promotor nicht regulierbar ist, dann muss ein geeignetes Mittel zur Verhinderung der Funktion des negativen Selektionsgens verwendet werden. Geeignete Mittel zur Kontrolle der Funktion eines NSG umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, das Zurückhalten oder zur Verfügung stellen eines Substrats, das das NSG-Produkt in ein Toxin umwandelt (z. B., Sucrose für das sacB-Gen) oder das in trans zur Verfügung stellen eines starken Regulators des negativen Selektionsgenprodukts oder Promotors (z. B., T7 RNA-Polymerase).
Der Tac-Promotor (ein Trp- und Lac-Hybridpromotor, der auf dem Gebiet wohl bekannt ist) ist durch das Lac I-Protein reprimierbar und durch IPTG indizierbar und ist für einen geeigneten negativen Selektionsgenpromotor beispielhaft, der besonders nützlich ist, wenn die Aktivität des NSG-Produkts nicht regulierbar ist (z. B., mit OmpA FLAG/NP-1). Um einen ausreichenden Grad der Kontrolle über den Tac-Promotor zu erhalten, ist es bevorzugt, diesen Promotor in Kombination mit einem bakteriellen Stamm zu verwenden, der das Repressorprotein (z. B., ein LacI^Q-Stamm) überexprimiert oder das LacI^Q-Gen auf einem Vektor in der bakteriellen Zelle zur Verfügung stellt.
Der stringente Promotor, der operativ an ein offenes Leseraster gebunden ist, das eine starke Signalsequenz zur Einleitung der Translation umfasst, dient in gleicher Funktion wie das NSG von anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Wenn der stringente Promotor aktiviert wird, z. B., durch das Platzieren desselben in eine Zelle, die eine stringente Polymerase exprimiert, dann bewirkt das stringent regulierte Gen einen starken Druck auf die Wirtszelle. Als Konsequenz werden ausplattierte Kolonien dieser Zelle wesentlich in ihrem Wachstum zurückgehalten. Wenn eine Wirtszelle, die ein aktiviertes stringent reguliertes Gen umfasst, aus einer Kultur plattiert wird, die identische oder fast identische Zellen umfasst, die kein aktives stringent reguliertes Gen umfassen, dann wird diese Wirtszelle entweder keine Kolonien ausbilden oder nur sekundäre Kolonien bilden, die leicht von solchen Zellen abgetrennt werden können, die primäre Kolonien ergeben. Dieses ist Routine für den Fachmann auf dem Gebiet. Zum Beispiel können die primären Kolonien erneut plattiert oder auf einem zweiten festen Wachstumsmedium ausgestrichen werden, so dass individuelle Kolonien auf dem zweiten Wachstumsmedium nur solche Zellen umfassen, die primäre Kolonien ergeben. Optional können zusätzliche Routineschritte durchgeführt werden, um die Wahrscheinlichkeit der Kontaminierung von Kulturen, die primären Kolonien ausbilden, mit Sekundärkolonien-unterstützenden Zellen zu verringen. Dieses Routineverfahren ist besser bekannt als Reinkultivierung.
Vorteilhafterweise kann ein SRG sowohl als ein selektives wie auch antiselektives (als Dualdiskriminierungsgen) fungieren. Zum Beispiel kann ein Gen, das einen EM-7-Promotor umfasst und ein Zeocinresistenzprotein kodiert oder ein lacZ-Zeocinresistenzfusionsprotein kodiert, in den vorliegenden erfindungsgemäßen Vektor aufgenommen werden. Das DNA-Fragment, das den EM-7-Promotor umfasst, enthält tatsächlich zwei Promotoren. Ein Promotor ist ein konstitutiver Promotor, der durch bakterielle Wirtszellpolymerasen erkannt wird. Eingebettet innerhalb des DNA-Fragments, das den EM-7-Promotor umfasst, ist ein T7-Promotor, der nur durch T7-RNA-Polymerase erkannt wird. In einer Zelle, der es an der T7-RNA-Polymerase mangelt, stellt dieses SRG einen starken positiven Selektionsdruck in der Gegenwart von Zeocin oder Zeocinanaloga zur Verfügung. Somit ist das SRG ein PSG. Jedoch bewirkt die SRG-Expression, wenn dieses SRG in eine Zelle platziert wird, die T7-RNA-Polymerase exprimiert, dass die Zelle sehr langsam wächst oder stirbt. T7-Polymerase kann konstitutiv oder induktiv aus dem bakteriellen Genom oder einem Plasmid in der Zelle exprimiert werden oder kann durch Superinfektion mit einem Phagen zur Verfügung gestellt werden. Somit kann dieses SRG verwendet werden, um Zellen zu selektieren, die das SRG umfassen, und zwardurch den Zusatz von Zeocin oder einem Zeocinanalogon zum Wachstumsmedium und es kann verwendet werden, um Zellen zu antiselektieren, die das SRG umfassen, und zwar durch das Sicherstellen, dass T7-RNA-Polymerase in den Zellen exprimiert wird. Während die Anmelder es nicht wünschen, an irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die stringente RNA-Polymerase eine wesentlich höhere Affinität für Nukleotide als die Wirts-RNA-Polymerasen aufweist und dass, wenn die T7-RNA-Polymerase die Exprimierung des SRG dirigiert, die metabolischen Wirtszell prozesse derart ausgelaugt werden, dass die Wachstumsgeschwindigkeit der Zelle stark attenuiert ist. Diese Wirkung scheint noch viel stärker zu sein, wenn das RNA-Transkript der T7-Polymerase die Translation eines wesentlichen offenen Leserasters (open reading frame, ORF) (mindestens ungefähr 15 Aminosäuren in Länge, aber vorzugsweise mehr als ungefähr 30 oder 100 Aminosäuren in Länge) dirigiert, und wenn der ORF eine starke Shine-Dalgarno-Sequenz vorgelagert ist.
Optional können die Ausführungsformen des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors, der eine duale Diskriminierungsstelle (wie das EM-7-lacZ-zeo SRG, das oben diskutiert wurde) umfasst, auch ein PSG oder NSG, das benachbart oder proximal zu dem SRG lokalisiert ist, umfassen, um ein DNA-Segment auszubilden, das analog zu dem oben beschriebenen DSC ist. Wenn ein PSG benachbart zu dem SRG ist, dann kodiert das SRG vorzugsweise ein antiselektives Genprodukt, ein Markergenprodukt oder andere Genprodukte von Interesse, da jegliche positive selektive Wirkungen des SRG lediglich redundant sein würden. Jedoch wird, wenn das SRG ein Genprodukt kodiert, das positiven Selektionsdruck auf eine Zelle ausübt, die es exprimiert, das SRG optimal benachbart zu einem NSG platziert sein, welches verwendet werden kann, um den negativen Selektionsdruck auf Zellen zu verstärken, die das DDC umfassen und exprimieren.
Der vorliegende erfindungsgemäße Vektor und zweite Vektor sind vorzugsweise derart konfiguriert, dass die Phagen-Verpackungssequenz proximal zu einem ITR eines eukaryontischen viralen Amplikons des Produktvektors liegt. In vielen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird dieses leicht durch das Platzieren der Phagen-Verpackungssequenz proximal zu dem (ersten) ITR des ersten (vorliegenden erfindungsgemäßen) Vektors erzielt. Solch eine Konfiguration ermöglicht die direkte Herstellung eines Amplikons, wenn der Produktvektor in ein Phagenkapsid verkapselt wird und in eine geeignete eukaryontische Zelle transduziert oder infiziert wird. Dieses ist wahr, weil viele Phagen DNA, die verpackt werden soll, linearisieren, und weil, wenn ein ITR oder LTR geeignet proximal zu einem freien Terminus einer DNA liegt, die ein eukaryontisches virales Amplikon umfasst, und die lineare DNA an eine eukaryontische Zelle geleitet wird, die die Replikation des eukaryontischen Amplikons erlaubt, dann die Replikation des eukaryontischen viralen Amplikons vorkommen kann. Unter proximal ist innerhalb von ungefähr 250 Basenpaaren zu verstehen, vorzugsweise innerhalb ungefähr 100 Basenpaaren und mehr bevorzugt innerhalb ungefähr 25 Basenpaaren. Mit anderen Worten, die Nähe eines ITR oder LTR zu einer Verpackungssequenz erlaubt die Replikation des eukaryontischen viralen DNA/Vektors in einer eukaryontischen Zellen ohne die Notwendigkeit, die DNA zu linearisieren oder mit Restriktionsenzymen vor der Transfektion in die eukaryontische Zelle zu schneiden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein verbessertes Verfahren zum Gentransfer in eukaryontische Zelle zur Verfügung. Das verbesserte Verfahren umfasst die Verwendung lambdider Vektoren (unten definiert) zur Herstellung neuer rekombinanter Vektoren, einschließlich rekombinanter eukaryontischer viraler Vektoren, die in der Lage sind, Gene in eukaryontische Zellen zu transferieren. Lambdide Vektoren oder Teile davon können auch in eukaryontische Zellen ohne die Hilfe von (eukaryontischen viralen oder Phagen) Kapsidproteinen transduziert werden. Lambdide Vektoren, die in eukaryontische Zellen transduziert werden, können neue rekombinante eukaryontische virale Vektoren generieren, die heterologe Genexpression dirigieren oder für andere Zwecke verwendet werden. Zusätzlich können lambdide Vektoren in lambdoide Kapside, umfassend chimere lambdoide Kapsidproteine, die in der Lage sind, an eukaryontische Zellen zu binden, verkapseln. Diese lambdiden Vektoren, die in rekombinante Kapside verkapselt werden, können verwendet werden, um eukaryontische Zellen direkt zu transduzieren.
Eine Ausführungsform des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Transduzieren eines lambdiden Vektors, der ein negatives Selektionsgen und Vektor 8 (unten definiert) oder eine andere geeignete DNA umfasst, in Bakterien, die für die Infektion durch einen lambdoiden Phagen (z. B. Lambda) anfällig sind, das Kultivieren der transduzierten Bakterien unter Bedingungen, die selektiv für den lambdiden Vektor sind (oder vorzugsweise selektiv für den lambdiden Vektor und Vektor 8 sind) und das Infizieren der Kultur mit einem Helferphagen. Die Vektoren rekombinieren homolog, generieren eine bakterielle Kultur, die Bakterien umfasst, die eine Population von Vektoren trägt, einschließlich der reagierenden Vektoren, der gewünschten Produktvektoren und unerwünschte Produktvektoren. Einige dieser Vektoren (innerhalb der Bakterien) werden in Kapside verpackt. Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren erleichtert die Isolierung solcher Produktvektoren, die wünschenswert sind, durch die Anwendung selektiver Mechanismen (z. B., Resistenz gegen Antibiotika, präferentielle Kapsidverpakkung, etc.). Obwohl die gewünschten Produktvektoren wahrscheinlich nur in einer sehr geringen Menge in jeder Population hergestellt werden, werden Mittel zur automatischen Selektion der gewünschten Vektoren in das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren eingebaut.
Wie zuvor erwähnt, umfasst der vorliegende erfindungsgemäße Vektor optional einen lambdoiden Replikationsursprung, welcher die Wirksamkeit der doppelten homologen Rekombination verstärkt. Wie auch zuvor erwähnt, wurde, ist das Operon, das einen lambdoiden Replikationsursprung umfasst, vorzugsweise bedingungsabhängig inoperativ. Bedingungsabhängige Inoperativität des Replikationsursprungs stellt eine Anzahl von Vorteilen zur Verfügung, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, die Verhinderung einer "überlaufenden" Replikation. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen lambdiden Vektors kann ein DNA-Segment aus einem lambdoiden Phagen entfernt werden und derart modifiziert werden, dass mindestens ein wesentlches Gen, das für die Reaktion des lambdoiden Replikationsursprungs notwendig ist, defizitär ist oder bedingungsabhängig defizitär ist. Die defizitäre wesentliche Genfunktion kann die des Phagen oder des Wirts sein, ist aber vorzugsweise die des Phagens. Zum Beispiel kann das Operon ein Gen enthalten, das für ein wichtiges replikatives Gen kodiert, das zur Funktion des Ursprungs benötigt wird (welches in dem Vektor nicht redundant ist). In diesem Fall kann eine Deletion in einer essentiellen Region der DNA, die eine replikative Genfunktion kodiert, durchgeführt werden oder es kann eine Mutation in der DNA, die die Genfunktion kodiert, durchgeführt werden, die eine Leserahmenmutation in dem amino-terminalen Teil des Genprodukts kodiert. Alternativ dazu kann eine wesentliche Genfunktion derart bedingungsabhängig eliminiert werden, dass der lambdoide Replikationsursprung bedingungsabhängig inoperabel wird. Das defizitäre oder bedingungsabhängig defizitäre Gen ist vorzugsweise eines, das aus dem Phagen abgeleitet ist und am meisten bevorzugt ein replikatives Gen des Phagen (z. B., O oder P von Lambda), so dass das Defizit oder das bedingungsabhängige Defizit den normalen bakteriellen Wirtsmetabolismus, die Vermehrung oder Funktion nicht wesentlich beeinträchtigt. Zu sätzlich, kann, wie unten diskutiert wird, der lambdoide Replikationsursprung bedingungsabhängig durch das Platzieren desselben unter die Kontrolle eines eng und indizierbar regulierbaren Promotors inoperabel gemacht werden.
Wenn es für den lambdoiden Ursprung des lambdiden Vektors wünschenswert ist, funktionell zu sein, kann das Defizit oder das bedingungsabhängige Defizit in der wesentlichen Genfunktion, die zur Funktionalität des Ursprungs benötigt wird, in trans komplementiert werden, induzierbar in cis aus einem getrennten Operon des lambdiden Vektors oder indizierbar in cis innerhalb des Operons (z. B., durch Änderung der Wachstumsbedingungen, wie durch das Ändern der Inkubatortemperatur von restriktiv zu permissiv). Ein Operon im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein aktiver oder aktivierbarer Promotor und die DNA-Sequenzen, die die RNA kodieren, die durch den Promotor transkribiert wird. Die Transkription der RNA ist wichtig, da sie für die geeignete wirksame DNA-Replikation benötigt wird, die von dem lambdoiden Replikationsursprung ausgeht. Jedoch kodiert die aus einem Operon transkribierte RNA nicht notwendigerweise ein Protein.
Der lambdoide Replikationsursprung kann in gleicher Weise aus jedem anderen geeigneten lambdoiden Phagen entnommen werden oder hoch homolog zu demselben sein. Beispielhafte lambdoide Phagen umfassen jegliche der Gruppe mit einer Immunität, die durch die lambdoiden Phagen Lambda 21 ϕ80, ϕ81, 82, 424 und 434 definiert wird. Natürlich kann der Ursprung auch aus jedem dieser prototypischen Phagen selbst entnommen werden. Zusätzlich kann der Replikationsursprung durch Verfahren, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind, synthetisiert werden.
Der lambdoide Replikationsursprung, der zur Verwendung im Kontext der vorliegenden Erfindung geeignet ist, kann aus Lambda sein. Die DNA-Sequenz von Lambda ist öffentlich in der Genbankdatenbasis (Zugangssymbol LAMCG) und woanders verfügbar. Die Koordinaten geeigneter DNA-Fragmente von Lambda umfassen (1) 37951–39591 mit einer Deletion von 38041–38653 (d. h., der P_R-Promotor bis Gen 0, wobei Cro-CII deletiert sind), (2) 38663–39591 (d. h., das gesamte O-Gen und einige flankierende Sequenzen), (3) 39004–39200 (ein relativ kleiner bedingungsabhängiger funktionierender Ursprung) und (4) 39004–39173. Der Fachmann ist sich der O-Proteinbindungsstellen (Iterons), der A/T-reichen Region und der Dyadensymmetriese quenz stromabwärts dieser Stelle bewusst (typischerweise umfasst sie eine Eco RI-Stelle). Man wird zu schätzen wissen, dass eine effizientere Durchführung der vorliegenden Erfindung durch das Aufnehmen eines oder mehrerer Iterons und der Dyadensymmetriesequenz in dem lambdoiden Ursprung erhalten werden kann, obwohl abhängig von dem Kontext des DNA-Konstrukts diese Sequenzen deletiert oder verändert werden können.
Zusätzlich zu der Wildtyp-Ursprungssequenz kann auch eine modifizierte Lambdasequenz verwendet werden. Zum Beispiel können die Koordinaten 39059–39118 deletiert werden, was den Ursprung bedingungsunabhängig inaktiviert. Wenn ein "G" Rest in die deletierte Region eingefügt wird, und der "A" Rest in Position 39076 deletiert wird, wird die Funktionalität des Ursprungs bedingt durch die erste Mutation umgekehrt und ein funtionsfähiger modifizierter Lambda-Replikationsursprung wird erhalten. Mit diesem modifizierten Replikationsursprung, bilden die folgenden DNA-Sequenzen Replikationsursprünge, die im Kontext der vorliegenden Erfindung nützlich sind: (5) 38663–39591 (enthält das gesamte Gen O und einige flankierenden Sequenzen), (6) 39004–39200 (eine kleinere DNA, die die gesamten Bindungsstellen und Symmetriesequenzen des Ursprungs enthalten) und (7) Koordinaten 39004–39,173 (welches ein relativ kleiner Ursprung ist, der die Fähigkeit beibehält, auf O und P zu reagieren).
Andere lambdoide Replikationsursprünge können auch verwendet werden. Zum Beispiel ist eine DNA, umfassend die Koordinaten (8) 3253–5159, wobei die Koordinaten 3355-4148 der Phi80 (Genbankzugangssymbol PB80ER)-Sequenz deletiert wurden, in dem Kontext der vorliegenden Erfindung nützlich. Diese Sequenz enthält den P_R-Promotor bis zum O-Gen, wobei die Sequenzen, die die Cro- bis zu den CII-Genen umfassen, deletiert sind. Nützliche kleinere Fragmente dieser Sequenz umfassen die Koordinaten (9) 4188–5159 (das O-Gen und einige flankierende Sequenzen), (10) 4567–4764 (alle Ursprungsbindungsstellen stellen einige flankierende Sequenzen) und (11) 4567–4727 (welches ein relativ kleines Ursprungsfragment ist). Zusätzlich zu den oben beschriebenen Ursprüngen kann der Ursprung aus Phi82 abgeleitet sein. Zum Beispiel ist die folgende Sequenz (12) von Phi82 und in dem Kontext der vorliegenden Erfindung nützlich.
Zusätzlich sind die Koordinaten (13) 235–467 und (14) 235–432 dieser Sequenz auch im Kontext der vorliegenden Erfindung nützlich. Natürlich illustrieren die Beispiele, die oben gegeben werden, geeigneten Replikationsursprünge der vorliegenden Erfindung, sie sind aber nicht vorgesehen, diese einzuschränken. Zusätzlich umfassen einige dieser Sequenzen den P_R-Promotor, während andere einen Promotor nicht umfassen. Man wird zu schätzen wissen, dass jeder dieser Ursprünge eine Transkription benötigt, um die DNA-Replikation zu unterstützen und dass ein geeigneter Promotor zur Verfügung gestellt werden muss. Weitere Information bezüglich lambdoiden Replikationsursprünge kann aus Moore et al., "Sequence organization of the origins of DNA replication in lambdoid coliphages", Gene, 14, 81–101 (1981); Grosschedl et al., "DNA sequences and structural homologies of the replication origins of lambdoid bacteriophages", Nature, 277, 621 ff, (1979); Moore et al., "Dissection and Comparative Anatomy of the origins of replication of lambdoid phages", Cold Sprina Harbor Symp. Quant. Biol., 43 (pt1), 155– 163 (1979); Rybchin, "Genetics of bacteriophage ϕ80–a review", Gene, 27, 1–11 (1984); und Campbell, "Comparative molecular biology of lambdoid phages", Annu. Rev. Microbiol., 48, 193–222 (1994), erhalten werden.
Die Phagen-Verpackungssignalsequenz der vorliegenden Erfindung kann aus jeglichem Phagen stammen. Der lambdoide Replikationsursprung, wird wenn mitumfasst, vorzugsweise aus dem gleichen Phagen erhalten, wie die Phagen-Verpackungssequenz, kann aber auch aus einem anderen lambdoiden Phagen oder einem nicht-lambdoiden Phagen erhalten werden (z. B., T7). Die Verpackungssignalsequenz kann aus jeglichem Phagen ausgewählt werden, wird aber teilweise ausgewählt, um die Größe des lambdiden Vektors zu akkommodieren. Z. B. verpacken T7-Kapside ein kleineres Genom als Lambda-Kapside. Daher, wenn eine T7-Verpackungssequenz in einen vorliegenden erfindungsgemäßen Vektor eingebracht wird, dann kann ein kleinerer Vektor effizient in das relativ kleinere Kapsid von T7 verpackt werden. Im Vergleich dazu, wenn eine Lambda-Verpackungssequenz in einen vorliegenden erfindungsgemäßen Vektor eingebracht wird, dann kann der lambdide Vektor wesentlich größer sein ohne substantiell die Effizienz der Verpackung zu verringern. Die Lambda-Verpackungsstelle, cos, ist unter solchen Phagen-Verpackungssequenzen im Kontext der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Die Verpackungssequenz kann auch ausgewählt werden, um der Verwendung bestimmter Phagen Kapsidproteine entgegenzukommen. Zum Beispiel können chimere T7-Kapsidproteine mit Affinität zu eukaryontischen Zellen hergestellt werden. Wenn es wünschenswert ist, den vorliegenden endungsgemäßen Vektor in ein Kapsid zu verpacken, das ein chimeres T7-Kapsidprotein umfasst, dann ist es bevorzugt, eine T7-Verpackungssequenz in dem vorliegenden erfindungsgemäßen Vektor zu verwenden. In gleicher Weise diktiert das Einbringen eines chimären Lambdaproteins, das der vorliegende erfindungsgemäße Vektor eine Lambdaverpackungsstelle umfasst.
Ein lambdider Vektor umfasst vorzugsweise nicht alle der strukturellen Gene eines Lambdaphagen und kann keinerlei strukturelle Phagengene enthalten. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die einzigen lambdoiden Sequenzen, die in dem lambdiden Vektor enthalten sind, solche des O-Gens von Lambda, die den Lambda-Replikationsursprung umfassen. In noch weiteren Ausführungsformen sind die einzigen lambdoiden Sequenzen des lambdiden Vektors der lambdoide Replikationsursprung und eine lambdoide Verpackungssequenz. Konsequenterweise hat ein lambdiden Vektor normalerweise die Kapazität, eine wesentliche Menge an nicht-lambdoiden DNA zu tragen und weiterhin effizient in Phagenkapsid verkapselt zu werden.
Im Gegensatz zu anderen Ausführungsformen des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors müssen lambdide Vektoren keinen konstitutiv funktionalen Replikationsursprung aufweisen und können ohne diesen verwendet werden. Jedoch ermöglicht ein konstitutiv funktionaler Replikationsursprung die stabile Aufbewahrung des lambdiden Vektors in einer bakteriellen Zelle. Daher kann eine Quelle der defizitären oder bedingungsabhängig defizitären Genfunktion, die zur Funktionlität des Lambda-Replikationsursprungs notwendig ist, konstitutiv in einem Bakterium zur Verfügung gestellt werden, das den lambdiden Vektor umfasst. Unter solchen Umständen kann der lambdide Vektor in dem Bakterium durch den lambdiden Replikationsursprung aufbewahrt werden. Jedoch können lambdoide Replikationsursprünge instabil sein. Zudem könnte das Ergebnis einer kontinuierlichen Durchführung des lambdoiden Ursprungs eine überlaufende Replikation vermitteln. Diese Wirkungen können vernichtend sein. Daher kann ein lambdoiden Vektor vorteilhafter Weise einen zweiten Replikationsursprung umfassen, der unabhängig von dem lambdoiden Replikationsursprung funktioniert. Vorzugsweise ist der zweite Replikationsursprung von bakteriellem Ursprung.
Eine Bibliothek, die eine Vielzahl der vorliegenden erfindungsgemäßen Vektoren umfasst, kann auch erhalten werden. Die erfindungsgemäße Vektorbibliothek kann aus einer Population von DNA-Sequenzen hergestellt werden, die eine Vielzahl eukaryontischer Genelemente und Amplikons umfasst. Alternativ dazu kann der erfindungsgemäße Lambdidvektor homolog mit einer Population von DNA-Sequenzen rekombiniert werden, wobei jede DNA der Population ein DNA-Segment umfasst, das eine hohe Homologie zu dem lambdiden Vektor aufweist, vorzugsweise mit einer hohen Homologie zu dem eukaryontischen Amplikon. Man wird zu schätzen wissen, dass diese Bibliotheken eine Vielzahl von Verwendungen aufweisen, einschließlich der Untersuchung funktioneller Genomstudien (z. B., die Identifizierung der Funktionen und Identitäten von genomischen und komplementären DNA-Sequenzen), virale Vektorentwicklung, Struktur-Funktionsstudien von individuellen Genen oder Genprodukten und mehr.
Jeglicher geeignete Promotor kann an das DNA-Segment gebunden werden, das den lambdoiden Replikationsursprung umfasst. Beispiele von geeigneten Promotoren umfassen daher den trp-Operonpromotor, den tRNA^tyr-Promotor, den Tet-Promotor, den lac-Operonpromotor, den recA-Promotor, den IexA-Promotor, den T7A3-Promotor und synthetische Promotor (z. B., eine TTGACA-Sequenz in der -35-Region und eine TATAAT-Sequenz in der -10-Region). Diese Promotoren können mit und ohne regulatorische Regionen verwendet werden, die diese normalerweise begleiten.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Operon, das einen lambdoiden Replikationsursprung enthält, der durch den P_R-Promotor von Lambda angetrieben wird (d. h., ungefähr Sequenzkoordinaten 38041 bis 40284 des Genbankzugangssymbols LAMCG). Das R_R-Operon treibt die Transkription des Operons an, das den Replikationsursprung in Wildtyp Lambda umfasst und kann in einem lambdiden Vektor in seiner Gesamtheit eingebracht werden, wird aber vorzugsweise defizitär oder bedingungsabhängig defizitär in mindestens einer Genfunktion gemacht, die zur Funktionalität des Replikationsursprungs benötigt wird. Einige mögliche und bevorzugte Modifikationen des P_R-Operon werden direkt unten diskutiert.
Das P-Protein, das durch das P-Gen des P_R-Operons kodiert wird, wird normalerweise für den Zusammenbau des Phagen-Rekomplikationskomplexes am Lambdaursprung benötigt. Jedoch, wenn es in großen Mengen exprimiert wird, kann P mit dem Wirtgenom und dem Plasmidreplikation interferieren. Zusätzlich kodiert P eine Genfunktion, die zur Funktionalität des lambdoiden Replikationsursprungs benötigt wird. Daher ist ein rekombinanter lambdider Phagen-Vektor, der das P_R-Operon umfasst, vorzugsweise defizitär oder bedingungsabhängig defizitär im mindestens dem Gen, das P kodiert.
Andere Genfunktionen, die in einem lambdiden Vektor defizitär sein können, umfassen das lambdoide Operon, einschließlich der Funktionen von Cro-, CII-, tR-, O- und der Oop-Transkripiton.
Cro autoreguliert den P_R-Promotor. Diese Autoregulation von P_R kann nachteilig sein. Wenn der P_R-Promotor verwendet wird, um die Transkription des lambdiden Operons anzutreiben, das den lambdoiden Replikationsursprung umfasst oder wenn ein lambdoiden Helfer-Phage oder Lysogen (siehe z. B., Beispiel 8) in die bakterielle Wirtszelle eingeführt wird, kann cro P_R des Helferphagen oder Lysogens in trans unterdrücken. Somit sind rekombinante lambdide Vektoren, die P_R umfassen, auch vorteilhafterweise defizitär im Cro-Gen.
CII ist für das Induzieren der Expression von CI verantwortlich. CI reguliert auch P_R runter. Wenn ein zweiter Vektor (z. B., ein Helfer-Phage oder Lysogen), umfassend das CI-Gen, das CII indizierbar ist, in die Zelle eingeführt wird, wird die Expression des CI-Proteins aus dem zweiten Vektor schnell durch das aus dem lambdiden Vektor exprimierte CII induziert und interferiert mit der gewünschten Funktion des P_R-Promotors. Somit ist das Operon, das den Lambda-Replikationsursprung umfasst, vorzugsweise auch bezüglich CII defizitär.
Der P_R-Promotor dirigiert die Transkription durch (in der Reihenfolge) cro, tR₁, CII, O und P. Das O-Gen umfasst den Replikationsursprung. tR₁ terminiert die Transkription von P_R bevor es zum Replikationsursprung kommt, es sei denn, dass Antiterminator-N-Protein wirkt an nutR (N-Verwendungssequenz). Somit könnte tR₁ die Funktion des lambdoiden Replikationsursprungs blockieren oder beeinträchtigen. Daher mangelt es dem Operon vorzugsweise auch an dem tR₁-Transkriptionsterminator oder alternativ dazu wird es zusammen mit einem Helfervirus verwendet, der das N-Gen exprimiert.
Das O-Gen umfasst den Replikationsursprung. Daher, wenn das O-Gen vollständig deletiert wird, muss ein Lambda-Replikationsursprung wieder in das Operon eingefügt werden. Alternativ dazu kann die Produktion des O-Proteins ohne das Deletieren des O-Gens verhindert werden, z. B., durch das Bewirken einer Leserastermutation oder Ähnlichem. Zusätzlich kann die Transkription der Oop-RNA inhibiert werden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Promotor an eine DNA gebunden werden, die einen lambdoiden Replikationsursprung umfasst, wobei das gesamte Operon kein Protein kodiert. Wenn der lambdoide Replikationsursprung aus Lambda ist, müssen O- und P-Protein in trans oder induzierbar von einem anderen Locus des Vektors zur Verfügung gestellt werden, weil der Lambda-Replikationsursprung die Gegenwart von O und P zur Funktion benötigt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Gentransfer zur Verfügung. Jeglicher der vorgenannten lambdiden Vektoren können einen Teil des vorliegenden erfindungsgemäßen Gentransfersystems ausmachen, das nützlich ist für (1) funktionelle Genomstudien (z. B., das Auffinden einer Funktion für ein EST (expressed sequence tag) oder das Identifizieren von bindenden Peptiden aus einer Bibliothek), (2) Therapien (z. B., Neovaskularisierung oder Antisense-RNA-Weiterleitung) und (3) allgemeine Forschung (z. B., positionsgerichtete mutagenesegetriebene Studie der Struktur-Funktionawechselwirkungen eines Steroidrezeptors oder anderen Proteins) und Ähnliches.
Zusätzlich zu den vorliegenden erfindungsgemäßen lambdiden Vektoren umfasst das vorliegende erfindungsgemäße System eine Quelle von Genfunktionen, die notwendig sind, um lambdide Vektoren zu verkapseln und eine Quelle von Genfunktionen, die notwendig sind, um die Defizite oder bedingungsabhängigen Defizite des lambdoiden Re plikationsursprungs zu komplementieren. Diese Quellen werden vorzugsweise durch eine Nukleinsäure kodiert, welche vorzugsweise DNA ist, aber auch RNA sein kann. Zudem können diese Quellen durch eine DNA oder mehrere DNAs kodiert werden. Zum Beispiel kann die defizitäre oder bedingungsabhängige defizitäre Genfunktion, die zur Funktionalität des lambdoiden Replikationsursprungs benötigt wird, in trans durch das Wirtsbakterium zur Verfügung gestellt werden (d. h., das bakterielle Genom oder Plasmide/Episome, die in der Wirtszelle vorliegen), ein Helfer-Phage oder ein Lysogen oder in cis aus einem separaten regulierbarem Promotor, der auf dem lambdiden Vektor lokalisiert ist. Aus Gründen der Einfachheit der Verwendung werden diese Genfunktionen jedoch vorzugsweise durch einen Phagen oder Lysogen zur Verfügung gestellt, der auch die Verkapselung des rekombinierten Lambdids dirigiert. Alternativ dazu können verkapselte Genprodukte (einschließlich mindestens des D-Genprodukts, wenn eine Lamda-Verpackungssequenz verwendet wird und einschließlich mindestens des Gen-10-Proteins, wenn eine T7-Verpackungssequenz verwendet wird) durch einen Helfer-Virus oder Verpackungsextrakt (wie der Gigapack^® Verpackungsextrakt, Stratagene) zur Verfügung gestellt werden. Jedoch sollte verstanden sein, dass lambdide Vektoren ohne Verkapselung verwendet werden können.
In einer Ausführungsform des vorliegenden erfindungsgemäßen Systems, liegt die Quelle der Genprodukte, die lambdoide Replikation und Verpackung des lambdoiden Vektors ermöglichen, in einem nicht-kompetierenden Helfer lambdoiden Phagen. Um die Kompetition mit dem Lambdiden zu verhindern, kann der Helfer-Phage replikationsund/oder verpackungsdefizitär gemacht werden. Zum Beispiel, wenn der lambdide Vektor einen Phagen-Replikationsursprung umfasst, der operativ an den P_R-Promotor gebunden ist und defizitär in dem Gen, das P kodiert, ist, und keiner Genfunktion, die wesentlich für die Replikation des Phagen ist, dann kann der Helfer-Phage P und die Verpackungskomponenten zur Verfügung stellen kann. Wenn der Helfer-Phage Lambda-Phage ist, dann ist er vorzugsweise ein Phage, der klare Plaques produziert. Lambda-Phagen dieses Phenotyps sind auf dem Gebiet als Lambda – klar bekannt und weithin verfügbar. Zur Verringerung der Verpackungseffizienzen kann es dem Helferphagen an einer Verpackungssequenz mangeln. Dieses kann dadurch erreicht werden, dass, z. B., parallele lox-Sequenzen um die Verpackungssequenzen) platziert werden. Daher wird, wenn das System in einer bakteriellen Zellen eingesetzt wird, die cre exprimiert, der Helfer-Phage eine cre-lox-vermittelte Zerstörung seiner Verpackungskapazität eingehen und wird als Quelle für P und Verpackungsproteine für den lambdiden Vektor dienen. Das cre kann in diesem Fall in trans zur Verfügung gestellt werden (z. B., durch einen Co-Transfer eines Plasmids oder induzierbar in cis).
Eine andere Ausführungsform des vorliegenden erfindungsgemäßen Systems setzt Phagen-Verpackungskomponenten ein, die aus einem defekten Lysogen erhalten werden. Ein defizitäres Lysogen kann aus einem Phagengenom durch das Einführen einer Modifikation in das Genom und das Etablieren einer Lysogenie hergestellt werden. Die Modifikation kann z. B. das Iysogene Phagengenom auf weniger als 73% seiner Wildtypgröße verringern. Diese Modifikation macht das Lysogen defizitär in der Verpackung, weil im Allgemeinen Phagengenome zwischen 73 und 110% der Wildtyp-Phagengröße haben müssen. Alternativ dazu kann das defizitäre Lysogen ein Lambdavektor sein, dem eine Verpackungssequenz fehlt. Eine andere alternative Modifikation ist es, eine oder mehrere Temperatur-sensible oder supprimierbare Mutationen in einer wesentlichen Genfunktion des Helferphagen durchzuführen.
Vorzugsweise wird die Temperatur-sensible oder supprimierbare Mutation nicht durch den lambdiden Vektor komplementiert. Ein Weg zur Verhinderung der Komplementierung ist die Verwendung eines lambdiden Vektors mit genetischen Phagenelementen, die aus einem Phagen erhalten wurden, der eine zum Helferphagen unterschiedliche Immunität aufweist.
Ein rekombinantes eukaryontisches virales Amplikon oder Genom, das durch doppelte homologe Rekombination gemäß des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens oder Systems erhalten wurde, kann isoliert, aufgereinigt und in eine eukaryontische Zelle transduziert werden, die das Wachstum des (vollständigen oder replikationsdefizitären) eukaryontischen Virus unabhängig davon, ob sie verkapselt wurde, erlaubt. Dieses ist aus mindestens zwei Gründen vorteilhaft. Der Fachmann kann a' priori wissen, dass ein korrekt konstruiertes eukaryontisches Genom in eine eukaryontische Wirtszelle transduziert wurde. Somit kann sich der Fachmann, wenn ein rekombinanter Virus sich in dieser eukaryontischen Zelle nicht vermehrt, sicher sein, dass das Problem nicht auf einen Mangel eines korrekten Rekombinantionsvorgangs zurückzuführen ist. Zusätzlich können große Menge des eukaryontischeb viralen Genoms vor jeglicher Verwendung einer eukaryontischen Zelle erhalten werden, wodurch die Geschwindigkeit, mit der eukaryontische virale Stammlösungen erhalten werden, beschleunigt wird.
Die Verkapselung des Produktvektors und andere Vektoren der vorliegenden Erfindung erleichtert bestimmte Verwendungen der Vektoren und die Aufbewahrung der Vektoren durch das Schützen der DNA vor der Labor- oder klinischen Umgebung und kann weitere Vorteile zur Verfügung stellen. Weitere Vorteile können durch das Verkapseln des lambdiden Vektors zur Verfügung gestellt werden. Zum Beispiel kann eine Verkapselung verwendet werden, um den lambdiden Vektor (wie oben offenbart) zu linearisieren, was in einem terminalen eukaryontischen viralen ITR oder LTR resultiert, welches (wie oben beschrieben) vorteilhaft ist, wenn das Lambdid in eine eukaryontische Zelle transduziert wird. Zusätzlich ermöglicht die Verkapselung die Einführung eines modifizierten Kapsidproteins in das Kapsid, um das Zielen von Zellen zu ermöglichen, die normalerweise nicht durch das Kapsid transduziert werden (z. B., eukaryontische Zellen).
Ein modifiziertes Kapsidprotein, ähnlich den in US-Patent 5,559,099 (Wickham et al.) und US-Patent 5,712,136 (Wickham et al.), internationale publizierte Patentanmeldung WO 98/07877, US-Patent 5,846,782 (Wickham et al.) und internationale Patentanmeldung WO 97/20051, beschriebenen, kann das Zielen des Phagenpartikels auf eine Zielzelle, wie eine Zelle, die in oder aus einem eukaryontischen Organismus erhalten wurde (z. B., einem Menschen), umdirigieren.
Auf der genetischen Ebene kann das Gen, das das D-Protein (oder ein anderes Phagenkopsidprotein) kodiert, durch das Einfügen von DNA modifiziert werden, die eine nicht-native Aminosequenz kodiert, die spezifisch für eine Zelloberflächenstruktur, einen Rezeptor (einschließlich Zellobertlächen-Polysaccharide und Ähnliche), einen Antikörper oder ein Epitop ist. Für das D-Protein kann das Einfügen der nicht-nativen Sequenz am Amino- und/oder Carboxylterminus (d. h. innerhalb von ungefähr 10, vorzugsweise 3, Aminosäuren an jedem Terminus) sein. Alternativ dazu kann auf der Proteinebene das Lambda D-Kapsidprotein oder andere Phagenkapsidproteine chemisch (d. h., kovalent) oder transient (d. h., durch biologische Wechselwirkungen) durch ein bispezifisches Molekül modifiziert werden. Solche bispezifischen Moleküle haben eine Affinität für das lambdoide Kapsidprotein (ob modifiziert oder nicht) und (i) eine Zelloberflächenstruktur, (ii) einen Rezeptor (einschließlich Zelloberflächen-Liposaccharide und Ähnliche), (iii) einen Antikörper oder (iv) ein Epitop. Das bispezifische Molekül kann den Vektor mit einer Zielzelle vernetzen, wodurch die Aufnahme und Expression erleichtert wird.
Eine Alternative zu dem Lambdakapsid, das ein chimeres D-Protein umfasst, ist das T7-Kapsid und ein chimeres Gen-10-Protein. Ein chimeres Gen-10-Protein hat vorzugsweise eine nicht-native Aminosäure an seinem Carboxyterminus.
Ein verkapselter rekombinanter lambdider Vektor, der durch ein modifiziertes Kapsidprotein auf eine eukaryontische Zelle zielt und ein eukaryontisches genetisches Element umfasst, hat viele Verwendungen, einschließlich einer Verwendung als in vitrooder in vivo-Gentransfervektor. Natürlich muss die Zellwand, wenn die Zelle eine Pflanzenzelle ist, zuerst permeabilisiert werden, vorzugsweise durch Verwendung von Enzymen, die in der Lage sind, die Zellwand zu verdauen. Zum Beispiel kann ein rekombinanter Phage, der solch ein chimäres Kapsidprotein mit einer RGD-Sequenz (oder einer zwingenden RGD-Sequenz) umfasst, verwendet werden, um das Lambdid oder den Phagen-Vektor direkt auf eine Zielstelle mit einem αv-Integrin zu richten.
Das chimere Kapsidprotein vermittelt die Bindung an die Oberfläche der eukaryontischen Zelle und der verkapseltet Lambdidvektor oder das rekombinante Phagengenom wird in ein Endosom internalisiert. Durch den Intemalisierungsprozess wird die verkapselte DNA im Wesentlichen frei von den Kapsidproteinen, die sie umgibt, so dass jedes genetisches Element, das in der Lage ist, in einer eukaryontischen Zelle exprimiert zu werden, transkribiert wird und (wenn geeignet) translatiert wird. Der gezielte Vektor wird vorzugsweise mit einem endosomolytischen Agens internalisiert. Endosomolytische Agenzien induzieren das Aufbrechen von Endosomen und erhöhen die Effizienz der Expression des Vektors, der durch die Endosomen aufgenommen wird, wesentlich. Chloroquin, Kalziumphosphatpartikel, adenovirale Kapsidproteine (einschließlich adenoviraler Virionen) und Adeno-assoziierte virale Kapsidproteine (oder Virionen) sind beispielhaft für nützliche endosomolytische Agenzien.
Der lambdide Vektor kann ein positionsgerichtetes Rekombinationssystem enthalten wie flp-frt oder cre-lox. Unter Verwendung des cre-lox-Systems als Beispiel kann ein Gen, das in der Lage ist, in einer eukaryontischen Zelle exprimiert zu werden (z. B., ein Promotor, der operativ an eine VEGF₁₂₁ cDNA und ein SV40-Polyadenylierungssignal ge bunden ist) benachbart zu einem eukaryontischen episomalen Replikationsursprung platziert werden (z. B., der EBV-latente Replikationsursprung, ori P), welche zusammen durch parallele lox-Sequenzen flankiert werden. Wenn sowohl der Vektor wie auch der endosomolytische Agenskomplex mit einer Zelle in Kontakt kommen, die die Funktion des Ursprungs erlaubt (z. B., eine Zelle, die das EBNA-1 exprimiert, welches für die Funktionalität des EBV Ori P Replikationsursprung in Raji-Zellen benötigt wird) und des cre-Proteins (die Expression von cre kann auch in dem Phagengenom unter geeigneten Bedingungen durchgeführt werden), dann werden sie in ein Endosom internalisiert und der Vektor wird entkapselt. Das Endosom wird durch das endosomolytische Agens lysiert, was es dem entkapselten Vektor ermöglicht, durch das cre-Protein beeinflusst zu werden. Das cre-Protein wirkt auf die positionsgerichteten Rekombinationssequenzen ein und bewirkt das Ausschneiden einer zirkulären DNA, die das genetische Element umfasst, das in der Lage ist, exprimiert zu werden und das EBV on (d. h., eine Episom). In dem Fall des EBV Ori P, erleichtert das innerhalb der Zelle exprimierte EBNA-1 die langfristige Aufbewahrung des Episoms. Natürlich exprimiert das Episom nur die genetischen Elemente, die es trägt (z. B., VEGF₁₂₁). Der Rest des Lambidvektors geht letztendlich aus der Zelle unter der Voraussetzung, dass es ihm an einem funktionellen eukaryontischen Komplikationsursprung mangelt, verloren. Somit kann ausgehend von einem Lambdidvektor der vorliegenden Erfindung eine eukaryontische Zelle (1) spezifische gezielt werden, (2) genetisch modifiziert werden, um ein Episom zu enthalten und (3) dahingehend beeinflusst werden, das Protein zu exprimieren, das durch das Episom in dem Wirt kodiert wird. Wesentlich ist, dass der Gentransfer gemäß diesem Verfahren nicht mit der Expression von Phagen- oder viralen Genprodukten in der gezielten eukaryontischen Zelle einhergehen muss. Daher ist die gezielte Zelle weniger für eine Immunreaktion anfällig und wird auf der genetischen Ebene minimal verändert.
Optional kann ein episomalen Vektor (wie hierin beschrieben) eines oder mehrere DNA-Segmente oder genetische Elemente enthalten, die homolog zu einem eukaryontischen Wirtsgenom sind, so dass die Expressionskassette in das Wirtsgenom durch homologe Rekombination transferiert werden kann. In dem Fall können die Elemente, die die Integration der Expressionskassette in das Genom der eukaryontischen Zelle erlauben, die Notwendigkeit eines Replikationsursprungs überflüssig machen, der in einer eukaryontischen Zelle funktioniert.
Ein lambdider Vektor kann auch verwendet werden, um einen replikationsdefizitären eukaryontischen Virus in einer geeigneten Zelle herzustellen, die nicht für das Replikationsdefizit des eukaryontischen Virus komplementiert und die Replikation des Vektors unterstützt (eine geeignete eukaryontische Zelle für die Herstellung eines replikationsdefizitären Virus eines bestimmten Typs ist jegliche Zelle, die die Herstellung eines Wildtyp- eukaryontischen Virus unterstützt und in diesem Fall das Defizit des replikationsdefizitären Virus nicht komplementiert).
In dieser Ausführungsform umfasst der Lambdidvektor ein Genom eines eukaryontischen Virus, der ein Defizit in mindestens einer (wesentlichen) Genfunktion, die zur Replikation benötigt wird, umfasst. Das replikationsdefizitäre virale Genom umfasst vorzugsweise auch ein Passagiergen von Interesse und zwei ITRs, von denen eins vorzugsweise proximal (innerhalb ungefähr 250 bp, vorzugsweise innerhalb 100 bp, mehr bevorzugt innerhalb 25 bp) von einer Phagen-Verpackungssequenz liegt. Das replikationsdefiztäre eukaryontische virale Genom ist dahingehend definiert, dass es zwischen den ITRs auf dem DNA-Segments liegt, das die eukaryontische virale Verpackungssequenz umfasst. Um die Replikation des eukaryontischen viralen Vektors zu unterstützen, der durch den Lambdidvektor getragen wird, umfasst der Lambdidvektor auch DNA-Sequenzen, die nicht zwischen den ITRs liegen und die in trans Genfunktionen zur Verfügung stellen, die zur Replikation des viralen Vektors notwendig sind, der zwischen den ITRs liegt (und welcher durch die ITRs definiert sind). Der Lambdidvektor kann in einem Bakterium repliziert werden und falls erwünscht in ein Phagenkapsid verkapselt werden, das ein chimäres Kapsidprotein umfasst (wie oben beschrieben). Das chimäre Kapsidprotein vermittelt die Internalisierung des verkapselten Lambdids in die eukaryontische Zelle. Die Sequenzen außerhalb der ITRs komplementieren die Replikationsdefizite des defizitären viralen Genoms, während sie in der eukaryontischen Zelle sind. Der eukaryontische virale Vektor produziert sein eigenes Kapsid und replikationsdefizitäre eukaryontische virale Vektoren werden erhalten. Es ist von Bedeutung, dass dieses Verfahren durch das Sicherstellen, dass keine überlappenden Sequenzen zwischen dem replikationsdefizitären eukaryontischen viralen Vektor und den komplementären genetischen Elementen vorkommen, so ausgestaltet werden kann, dass es keinerlei homologen Rekombinationsvorgang gibt, der (kontaminierende) replikationskompetente eukaryontische Viren generieren würden. Auf diese Weise kann eine Stammlösung an replikationsdefizitären eukaryontischen Viren ohne die Notwendigkeit der Herstellung einer komplementären Zelllinie oder der Verwendung eines Helfervirus hergestellt werden. Ein Lambdidvektor, der diese Ausführungsform illustriert, wird in 5 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein System zur Herstellung von rekombinanten DNA-Vektoren zur Verfügung. Jegliche Ausführungsform des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors kann einen Teil des vorliegenden erfindungsgemäßen Systems darstellen. Das vorliegende erfindungsgemäße System umfasst mindestens eine zweite DNA, die zwei DNA-Segmente umfasst, von denen beide ausreichende Homologie zu dem erfindungsgemäßen Vektor aufweisen, um eine homologe Rekombination zu vermitteln und welche eine DNA flankieren oder umgeben, von der es wünschenswert ist, dass sie in den vorliegenden erfindungsgemäßen Vektor eingebracht wird oder in einen Teil der eukaryontischen viralen DNA oder ein Amplikon, das einen Teil des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors ausmacht. In Ausführungsformen, die einen defizitären oder bedingungsabhängig defizitären lambdoiden Replikationsursprung umfassen, kann das erfindungsgemäße vorliegende System eine dritte DNA umfassen, die in trans die Defizite in einem lambdoiden Replikationsursprung komplementieren kann und optional eine vierte DNA, die eine Quelle an Phagenkapsiden exprimieren kann, die intermediäre oder Produktvektoren verkapseln kann, die den Phagen-Replikationsursprung umfassen. Entweder eines oder beide der dritten und vierten DNAs des erfindungsgemäßen Systems können optional in das Genom einer bakteriellen Zelle eingebracht werden und/oder können durch eine DNA umfasst werden.
Der Fachmann wird zu schätzen wissen, dass jede der vorangegangenen Ausführungsformen des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors bestimmte Ausführungsformen des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht. Die folgenden Beschreibungen werden das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren ausgiebiger illustrieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein DNA-Vektor hergestellt und verpackt werden durch das Transfizieren einer bakteriellen Zelle mit einer jeglichen Ausführungsform des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors und einem zweiten Vektor, der zwei DNA-Segmente aufweist, die ausreichend homolog zu dem ersten Vektor sind, um einen doppelten homologen Rekombinationsvorgang zwischen den Vektoren zu ermöglichen. Vorzugsweise umfassen sowohl der erste wie auch der zweite Vektor mindestens ein positives Selektionsgen (welche vorteilhafter Weise unterschiedlich sind), so dass die Zelle unter Bedingungen wachsen gelassen werden kann, die selektiv für die Aufrechterhaltung von beiden Vektoren in der Zelle sind. Nach dem Aufbewahren der transfizierten bakteriellen Zelle für einen geeigneten Zeitraum in Kultur oder auf einer Platte produziert ein doppelter homologer Rekombinationsvorgang einen Vektor, der eine Phagenverpackungssequenz aufweist und der das regulierbare antiselektives Gen der vorliegenden Erfindung nicht enthält.
Natürlich werden andere Vektorbereiche auch in der Zelle vorhanden sein. Die anderen Vektorbereiche umfassen die Original- oder Anfangsvektoren und das Derivat von Vektor 2, welches das antiselektive Gen umfasst. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die einfache Entfernung oder Eliminierung dieser unerwünschten Vektoren.
Erstens, nur der Produktvektor und der ursprüngliche Vektor enthalten Phagenverpakkungssequenzen. Vektoren, die die Phagenverpackungssequenz nicht enthalten, können durch das Bewirken der Verpackung des vorliegenden erfindungsgemäßen Vektors und des Produktvektors, während sie in der Zelle sind und durch das Infizieren des Phagen in eine zweite Zellpopulation, eliminiert werden.
Jegliche geeignete Technik zur Verkapselung dieser Vektoren in ein Phagenkapsid kann verwendet werden. Zum Beispiel kann die bakterielle Zelle ein Lysogen enthalten, welches aktiviert werden kann. Alternativ dazu kann die bakterielle Zelle mit einem Helferphagen superinfiziert werden. Der Helferphage kann entweder ein Wildtyp-Phage sein oder defizitär in einer wichtigen Phagengenfunktion, z. B., kann es ihm an einem funktionellen Replikationsursprung oder einer Phagenverpackungssequenz mangeln.
Der verkapselte Produktvektor kann aus dem ersten Vektor durch geeignete Gestaltung des ersten Vektors isoliert werden. Zum Beispiel kann der. erste Vektor zu groß oder zu klein gemacht werden, um wirksam in dem Phagenkapsid verkapselt zu werden. Die Art des Phagenkapsids wird natürlich durch die Art der Phagenverpackungssequenz bestimmt, die auf dem ersten Vektor zu finden ist (z. B., wenn der erste Vektor eine cos-Stelle umfasst, dann wird das Kapsid ein lambdoides, vorzugsweise ein Lambdakapsid sein.
Alternativ dazu können die verkapselten Vektoren (d. h., der erste Vektor und der Produktvektor) in eine Population von Zellen unter solchen Bedingungen infiziert oder transfiziert werden, dass das regulierbare antiselektive Gen aktiv wird. Das Verfahren wird dann durch das Wachsenlassen der Zellen (da Zellen, die den ersten Vektor umfassen, einen starken Selektionsnachteil haben oder sterben können) und das Ernten des Produktvektors aus einer primären Kolonie oder einer Zellkultur beendet. Der Fachmann wird erkennen, dass der Wachstumszeitraum ausgewählt wird, um das Erscheinen von Varianten zu vermeiden. Die Varianten werden typischerweise nicht damit beginnen, die Kultur oder Platte für mindestens ungefähr 24 Stunden nach der Induktion des NSG zu kontaminieren. Natürlich kann das Verfahren auch einen Screening- oder Sequenzierschritt umfassen, wenn dieses erwünscht ist.
Der Fachmann wird zu schätzen wissen, wie das antiselektive Gen induziert wird. Zum Beispiel, wenn das NSG ein konstitutiv exprimiertes sacB-Gen ist, dann kann das NSG durch das zur Verfügung stellen von Sukrose im Medium aktiviert werden, was es erlaubt, Triebmittel herzustellen. Eine Plethora von anderen Ausführungsformen sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Wenn ein NSG durch einen kleinen chemischen Induzieren, d. h., Tac-ccdB Gen, reguliert wird, kann es durch das Hinzufügen des Induzierers (z. B., IPTG) zu dem Wachstumsmedium aktiviert werden. Wenn das antiselektive Gen der T7 Promoter ist, der an ein NP-1 Gen gebunden ist, kann dieses NSG einfach durch Infizieren einer Zelle aktiviert werden, die die T7 RNA-Polymerase exprmiert. In gleicher Weise kann, wenn das antiselektive Gen ein SRG ist, z. B., der EM-7 Promoter, der an ein Zeocingen gebunden ist, das SRG einfach durch das Infizieren einer Zelle aktiviert werden, die T7 RNA-Polymerase exprimiert. Vorteilhafterweise kann das SRG, wenn der EM-7 Promoter an eine DNA gebunden ist, die ein positives Selektionsprotein kodiert, zwei Funktionen dienen. In der ersten bakteriellen Zelle wird der konstitutive Promoter des EM-7 Gens eine konstitutive Produktion des positiven Selektionsproteins zur Verfügung stellen. Jedoch wird, wenn das gleiche Gen in einer Zelle ist, die eine geeignete Menge an T7 RNA-Polymerase enthält, dieses ansonsten positive Selektionsgen ein starkes antiselektives Gen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, von der herausgefunden wurde, dass sie genauso gut wie andere Ausführungen funktioniert und besser als einige Ausführungen, umfasst einen ersten (erfindungsgemäßen) Vektor, der ein PSG um fasst, das entweder proximal oder benachbart zu einem NSG und einem unabhängigen positiven Selektionsgen liegt. In dieser Ausführungsform ist das PSG ein Zeocinresistenzgen und das unabhängige positive Selektionsgen ist ein Kanamycinresistenzgen oder noch bevorzugter ein Tetracyclinresistenzgen. Zusätzlich umfasst der erfindungsgemäße Vektor in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung einen pBR322 Replikationsursprung.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erste bakterielle Zelle (in welche die ersten und zweiten Vektoren transfiziert werden) kompetent für eine homologe Rekombination, aber die zweite Population von Zellen, in welche die verkapselten Produkte infiziert werden (oder transfiziert werden), ist defizitär in der Fähigkeit, eine homologe Rekombination zu unterstützen. Dieser Phenotyp kann durch eine Vielzahl geeigneter Mechanismen erhalten werden. Ein Typ einer Zelle, die defizitär in der Fähigkeit ist, eine homologe Rekombination zu unterstützen, ist eine Zelle, der es an recA mangelt. Eine Vielzahl von recA-defizienten Strängen sind öffentlich verfügbar.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzt einen ersten Vektor ein, der einen lambdoiden Replikationsursprung verwendet. Es ist stark bevorzugt, dass der lambdoide Replikationsursprung defizitär oder bedingungsabhängig defizitär ist und dass der Defekt in trans komplementiert werden kann oder anderseits durch Manipulation der zellulären Umgebung bewirkt werden kann. Wie in anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden der ersten und zweite Vektor in eine bakterielle Zelle transfiziert. Jedoch wird in der vorliegenden Ausführungsform der doppelte homologe Rekombinationsvorgang durch das Infizieren (oder Transfizieren) der Zelle mit einem defizitären oder nicht-defizitären Helferphagen oder durch Aktivierung eines defizitären oder nicht-defizitären Lysogens erleichtert. Der Helferphage oder das Lysogen komplementieren den defizitären lambdoiden Replikationsursprung in trans. Als ein Ergebnis beginnt der erste Vektor die lambdoide Replikation, welche höhere Kopienzahlen des ersten Vektors zur Verfügung stellt und wesentlich die Geschwindigkeit der homologen Rekombination verstärkt. Die Helferfunktion kann durch Lambda – Klar zur Verfügung gestellt werden. Die Helferfunktion kann auch durch einen Vektor mit einer Verpakkungssequenz zur Verfügung gestellt werden, die abgestellt oder deletiert wurde. Zum Beispiel kann die Verpackungssequenz des Helfers durch positionsgerichtete homologe Rekombinationsstellen (z. B., lox-Stellen) flankiert sein. Entsprechend wird er, wenn der erste und zweite Vektor ursprünglich in eine Zelle transfiziert werden, die eine geeignete Rekombinase exprimiert (z. B., cre), wenn die Helferphage in die Zelle infiziert wird, nicht in der Lage sein, in Kapside verpackt zu werden und kann nicht mit den späteren Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens interferieren. Sogar wenn der Helferphage verkapselt wird und zum nächsten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens gebracht wird, kann der Helfervektor durch das Platzieren der zweiten Population von Zellen unter solchen Bedingungen eliminiert werde, die selektiv für den Produktvektor und antiselektiv für den Helferphagen sind. Der Fachmann wird zu schätzen wissen, dass auch zusätzliche Permutationen und Kombinationen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Beispiele
Die folgenden Beispiele illustrieren des Weiteren die vorliegende Erfindung, sollten aber nicht dahingehend ausgelegt werden, dass sie in irgendeiner Weise einschränkend sind. Obwohl die Beispiele mit Lambdavektoren und Adenovirus illustriert werden, weiß der Fachmann zu schätzen, dass die folgenden Beispiele auch auf andere lambdoide Vektoren und auf nicht-adenovirale eukaryontische Viren angewendet werden können.
Beispiel 1
Das folgende Beispiel illustriert LOI^QVXB (Spe), einen Vektor, der im Kontext der vorliegenden Erfindung nützlich ist.
Der LQI^QVXB (Spe)-Vektor umfasst ein Lambdaoperon P_R, der die Transkription durch das Gen 0 vorantreibt. In diesem bestimmten Vektor umfassen Cro und CII Mutationen in essentiellen Regionen ihrer kodierenden Sequenzen, wodurch die Cro- und CII-Genfunktionen eliminiert werden. Zum Beispiel ist Cro von den Aminosäuren 15–38 (d. h., α Helices 2 und 3) und CII von den Aminosäuren 6–20 befreit. Protein O wird weiterhin exprimiert.
Der Vektor umfasst auch ein Lac I^Q Operon.
Stromabwärts des Lac I^Q Promoters und Gens ist eine cos-Sequenz. Die Orientierung der cos-Sequenzen bezüglich des P_R Promoters ist die gleiche wie die Orientierung der cos-Stelle bezüglich des P_R, die im Wildtyp Lambda zu finden ist. Jeder der zuvor genannten genetischen Elemente ist in einem DNA-Segment enthalten, das eine Pac I Stelle an jedem Terminus umfasst. Der Vektor umfasst des Weiteren ein Kanamycinresistenzgen und den p15 Replikationsursprung aus pACYC177 (New England Bio-Labs).
Eine erste transgene Expressionskassette (z. B., ein CMV Promoter, der operativ an eine DNA-Sequenz gebunden ist, die das bakterielle Lac Z-Gen kodiert oder alternativ menschliche VEGF₁₂₁ cDNA und eine SV40-Polyadenylierungssequenz) ist benachbart zu dem Ad5 Segment in Position 1–355. Weiterführend von der Transgen – Expressionskassette ist ein DNA-Segment, das Ad5 Sequenzen von Positionen 27,082 bis 32,852 umfasst, bei denen die Sequenzen von 27,860 bis 30,805 deletiert wurden, und welche durch Xba I Verdau von Ad5 erhalten wurden. Die Spe I-Stelle in diesem Vektor ist einzigartig. Das E. coli β-Glucuronidasegen und SV40 frühe Polyadenylierungssignal werden neben die Ad5 Sequenz platziert, die bei Position 32,852 terminiert und in der gleichen Orientierung wie das zuvor genannte Transgen. Ein DNA-Segment, das zu Ad5 in den Positionen 35,565 bis Position 35,935 korrespondiert, liegt benachbart zu der β-Glucuronidasesequenz. Dieses platziert das β-Glucuronidasegen unter die Kontrolle des Ad5 E4 Promoters.
Beispiel 2
Dieses Beispiel illustriert nützliche Modifikationen von LOI^QVXB (Spe).
LOI^QVXB (SpeCC), wie in 1 gezeigt, wird durch eine Deletion hergestellt, die die kodierenden Sequenzen vom Cro – Gen bis zum CII – Gen von LOI^QZXB (Spe) umspannt. Eine Deletion im O-Gen von LOI^QZXB (Spe) produziert LI^QZXB (Spe), das in 2 gezeigt wird. Ein Defizit in dem O-Gen kann durch das Schneiden desselben mit Bgl II und Relegieren des O-Gens hergestellt werden, was in dem Verlust eines kleinen essentiellen Fragments des O-Gens ohne das Aufbrechen des lambdoiden Replikationsurspnings resultiert. Die Deletion von Cro bis CII liegt ungefähr bei den Lambdakoordinaten 38,041 bis 38,653. Diese entfernt auch tR₁.
Beispiel 3
Dieses Beispiel demonstriert die Herstellung von lambdiden Vektoren, die das gesamte adenovirale Genom umfassen, außer den Teilen für die E1-, E3- und E4-Regionen.
Ein Ad5-Virus, der eine Spe I Stelle an Position 3,328 des Wildtypgenoms enthält, wurde durch Standardviruskonstruktionstechniken hergestellt. Verdau mit Spe I ergab das erwartete Fragment von ungefähr 32,7 kBp, welches isoliert wurde. Das isolierte Fragment wurde in LOI^QVXB (Spe) eingefügt, um den lambdiden Vektor LGV₁₁VKB, welcher in 3 gezeigt wird, herzustellen. Durch ein analoges Verfahren kann jeder der Vektoren der Beispiele 1–3 und ähnliche verwendet werden, um einen lambdiden Vektor herzustellen, der einen Adenovirus enthält.
Der lambdide Vektor kann amplifiziert und mit Pac I verdaut werden und das Pac I Segment, das die adenoviralen Sequenzen enthält, kann zu einer eukaryontischen Zelle transferiert werden, die in der Lage ist, das Wachstum des rekombinanten Adenovirus zu unterstützen. In dem vorliegenden Beispiel wären 293/ORF6-Zellen (siehe internationale Patentanmeldung WO 95/34671, Kovesdi et al.) geeignete Zellen, da sie die Defizite in den essentiellen Genfunktionen komplementieren, die aus den E1- und E4-Regionen des adenoviralen Genoms deletiert wurden. Die in dieser Weise hergestellte adenovirale Stammlösung ist frei von replikationskompetenten Adenoviren und Wildtypadenoviren, da keiner von diesen in einen lambdoiden Phagen verpackt werden kann.
Alternativ dazu kann eine bakterielle Zelle, die LGF₁₁VXB umfasst, mit einem Helferphagen infiziert werden (oder ein Lysogen, das es enthält, kann aktiviert werden) werden. Das Vorliegen der Helferphagenfunktionen resultiert in der Lineansierung von LGV₁₁VXB an der cos-Stelle und der Verkapselung des linearisierten Vektors. Wie durch Inspektion gesehen werden kann, resultiert die Linearisierung an der cos-Stelle und generiert einen ITR nahe einem Terminus der DNA. Daher kann der verkapselte, linearisierte Vektor in eine eukaryontische Zelle, die dieses erlaubt, (z. B., 293/ORF6-Zellen) transduziert werden, dem wiederum das Entkapseln des Vektors folgt und die Vermehrung des eukaryontischen viralen Gentransfervektors (d. h., des adenoviralen Vektors).
Beispiel 4
Die Herstellung eines Adenovirus durch Verwendung viraler Arme ist ein zeitaufwändiges Verfahren. Wenn mehrere Regionen des Genoms geändert werden müssen, werden entweder sequenzielle Viruskonstruktionsverfahren eingesetzt oder es sind teilweise komplementierende Arme aus verschiedenen Rekombinationsviren notwendig. Oft sind geeignete Restriktionsschnittstellen nicht frei vertügbar. Des Weiteren kann ein negativer Selektionsdruck bezüglich des gewünschten Adenovirus in einer eukaryontischen Zelle existieren, welcher weiterhin Versuche behindern kann, den gewünschten Vektor zu erhalten. Dieses Beispiel demonstriert eine geeignete Lösung für einen langanhaltenden Bedarf und demonstriert eine erhöhte Geschwindigkeit und Leichtigkeit bei der Generierung verschiedener adenoviraler Vektoren, die aus der Verwendung der vorliegenden efindungsgemäßen Lambdidvektoren und des Systems resultieren können.
Wie oben offenbart, wird das Ersetzen einer gewünschten Region eines Lambdidvektors durch positive und/oder negative Selektion erleichtert. Vorzugsweise werden sowohl positive wie auch negative Selektion zusammen zur optimalen Erleichterung einer Vektorherstellung verwendet. 4 zeigt einen Prozess, worin zwei homologe Rekombinationsschritte verwendet werden, um einen finalen Lambdidvektor herzustellen.
Zuerst wird eine Kassette in die Region eingeführt, die durch homologe Rekombination modifiziert werden soll. Die Kassette enthält ein positives und negatives Selektionsgen und fügt vorzugsweise eine einzigartige Restriktionsschnittstelle ein. Das negative Selektionsgen wird unter die Kontrolle eines regulierbaren Promoters platziert oder kann unter die Kontrolle eines konstitutiven Promoters platziert werden, wenn das negative Selektionsgenprodukt die Umwandlung einer nicht-toxischen Substanz (welche zur Vertügung gestellt oder zurückgehalten werden kann) in einen letalen Metaboliten katalysiert. Der dadurch hergestellte intermediäre Lambdidvektor wird Lambdidselekt (L-sel) genannt. L-sel enthält Gene für sowohl Tetracyclin- wie auch Zeocin-Resistenz, wohingegen kein Vorläufervektor Resistenz gegen beide Antibiotika an ein Bakterium vermittelt, das nur einen der Vektoren enthält.
Ein dritter Vektor, der Sequenzen umfasst, die in den L-sel-Vektor eingeführt werden sollen und homolog zu L-sel an zwei verschiedenen Loci ist, welche das negative Selektions- ("Todes") -Gen flankieren, wird in eine bakterielle Zelle transduziert, die L-sel umfasst. L-sel und der dritte Vektor rekombinieren. Der Rekombinationsvorgang schneidet das negative Selektionsgen aus L-sel zur gleichen Zeit aus, zu dem die gewünschte Sequenz eingeführt wird. Die Reaktion ergibt eine Population von Vektoren, in welchen das gewünschte Produkt unterrepräsentiert ist und daher wird der gewünschte (End-) Lambdidvektor ("gewünschtes Lambdid") durch Aktivierung (z. B., zur Verfügung stellen eines Substrats) oder Induktion des negativen Selektionsgens angereichert. Bakterien, die unerwünschte Reaktanten und Produkte umfassen, vermehren sich nicht. Das gewünschte Produkt wird daher leicht durch Routinescreening identifiziert.
Ampicillin, Kanamycin, Zeocin und Genticin (G418) sind beispielhaft für positive Selektionsantibiotika; die in dem Kontext dieses Beispiels nützlich sind. Ein Tac- (Trp- und Lac-Hybrid-) Promoter, der durch Lac I reprimierbar ist, und operativ an eine DNA gebunden ist, die ein OmpA FLAG/NP-1 Fusionsprotein kodiert, ist beispielhaft für ein negatives Selektionsgen, das im Kontext dieses Beispiels nützlich ist. OmpA FLAG/NP-1 ist ein Rattendefensin, dem die Erkennungssignalsequenz fehlt. Der Tac Promoter ist durch IPTG induzierbar.
Die durch die Selektionskassette in L-sel eingeführte, einzigartige Restriktionsschnittstelle ist nützlich (aber optional) in mindestens zweierlei Weise. Linearisierte DNA mit freien Enden haben erhöhte homologe Rekombinationsgeschwindigkeiten. Das Kombinieren von linearisierten L-sel mit der Ziel-DNA wird höhere Rekombinationsraten ergeben. Die einzigartige Restriktionsschnittstelle ist auch von Nutzen, wenn der Rekombinationsvorgang (dieser Vorgang dimerisiert die Vektoren) zwischen intakten zirkulären DNAs stattfindet und ein einzelner anstatt ein mehrfacher Rekombinationsvorgang vorkommt. In dem Fall können die rekombinanten Vektoren mit dem einzigartigen Restriktionsenzym verdaut werden.
Vorteilhafterweise kann das einzigartige Restriktionsenzym aus einem induzierbaren Gen in vivo exprimiert werden, welches ein kontinuierliches Schneiden der Bereiche zur Verfügung stellt, die die einzigartige Restriktionsenzymschnittstelle umfassen, und verhindert so die Notwendigkeit der Isolierung der DNA zum Restriktionsverdau. Alle diese nicht-rekombinanten und einzelrekombinierten Vektoren werden linearisiert. Gegen diese linearisierten DNAs wird selektiert, wenn sie in Bakterien transferiert werden, da sie nicht stabil in Bakterien transformieren. Der nicht L-sel-Vektor kann durch antibiotische Selektion selektiert werden. Im Gegensatz dazu kann der dimerisierte Vektor eine zweite Runde homologer Rekombination durchlaufen, um das gewünschte Produkt herzustellen. Die Vektorpopulation kann aus den Bakterien aufgereinigt werden, an der einzigartigen Restriktionsschnittstelle verdaut werden und in ein Bakterium retransduziert werden, um die Vektorpopulation um das gewünschte Produkt anzureichern. Die Notwendigkeit der Restriktion kann mit der negativen Selektionskassette in L-sel-Vektoren durch das Induzieren der Expression des "Todes"-Gens in allen nicht-rekombinierten L-sel-Vektoren vermieden werden.
Beispiel 5
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von Adenovirus aus einem lambdiden Vektor.
Der Lambdidvektor LGV₁₁VXB (3) wird in einem bakteriellen Wirt amplifiziert und isoliert. Der Vektor wird mit Pac I verdaut, welches ein DNA-Segment produziert, das mindestens ein Fragment enthält, das hoch homolog zu einer adenoviralen Sequenz ist. Das DNA-Fragment, das das DNA-Segment umfasst, das hoch homolog zu einer adenoviralen Sequenz ist, wird in eine eukaryontische Zellkultur transferiert, die das Wachstum des Adenovirus erlaubt (z. B., 293/ORF6-Zellen). Nach mehreren Passagen wird eine zytopathische Wirkung beobachtet.
Beispiel 6
Diese Beispiel demonstriert die Herstellung des rekombinanten D-Proteins, umfassend eine Sequenz, die das Protein oder ein Phagenkapsid, das das Protein umfasst, auf die Oberfläche einer eukaryontischen Zelle richtet, wodurch seine Aufnahme in Endosomen der eukaryontischen Zelle bewirkt wird.
Ein Plasmid, das die DNA umfasst, die das D-Gen kodiert, das operativ an den Tac-Promoter, pD100, gebunden ist, wird durch konventionelle Techniken hergestellt. Standard – positionsgerichtete Mutagenese wird verwendet, um eine DNA, die entweder die Aminosäuresequenz (a) Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly [SeQ ID NO: 2] oder (b) Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys [SEQ ID NO: 3] kodiert in die kodierende Sequenz von D einzuführen. Die hinzugefügte Aminosäuresequenz wird an den Carboxyterminus des D-Proteins platziert, kann aber auch an den Aminoterminus des D-Proteins platziert werden. Dadurch, dass die Sequenz von SEQ ID NO: 2 mit umfasst ist, wird das D-Protein spezifisch an jegliche Zelle binden, die das ανβ₃-Integrin auf ihrer Zelle exprimiert. Durch das Mitumfassen der Sequenz von SEQ ID NO: 3 wird das D-Protein an eine Zelle binden, die Heparinsulfat auf seiner Oberfläche aufweist.
Das rekombinante D-Protein wird in Bakterien überexprimiert und durch konventionelle Mittel isoliert. Während der Isolierung des rekombinanten D-Proteins wird die bakterielle Kultur durch differentielle Zentrifugation abgetrennt, um Einschlußkörper von dem löslichen Material abzutrennen, falls welche vorhanden sind. Die Menge des löslichen D-Proteins wird von der jeweiligen Platzierung der hinzugefügten Aminosäuresequenz abhängen. Mindestens 20% der Proteinpartitionen des Überstandes zeigen somit die korrekte Faltung des D-Proteins. Die Affinität des D-Proteins für eukaryontische Zellen kann durch Verwendung eines geeigneten Assays bestätigt werden, einschließlich direkter Bindungsmessungen und Inhibierungsassays.
Beispiel 7
Dieses Beispiel illustriert die Verwendung eines modifizierten T7-Vektors zum Gentransfer in eukaryontische Zellen.
Die Expressionskassette CMV-GFP wird direkt 3' von Gen 10 in den Genom von T7 positioniert, so dass sie linksseitig transkribiert wird (in Bezug auf das linearisierte T7 Genom). Die Expressionskassette CMV-GFP besteht im Wesentlichen aus dem CMV intermediären frühen Promoter, einer kodierenden Sequenz für das grüne Fluoreszenzprotein (Gibco BRL Life Technologies) und dem SV40 frühen Polyadenolierungssignal. Die T7 Gen 10 Promoterregion wird aus dem Phagengenom deletiert, was in sehr geringen Mengen seiner Expression resultiert. Jedoch wird ein modifiziertes Gen 10 Produkt (d. h., modifiziertes p10) durch ein Plasmid in trans zur Verfügung gestellt. Seine Ex pression wird durch den Gen 10 Promoter derart reguliert, dass es überexprimiert wird. Aminosäure 344, die letzte Aminosäure von p10A, wird gegen Validin abgeändert und das Stopkodon wird zu Glutaminsäure vor dem Hinzufügen einer RGD-Sequenz geändert. Die 3' terminale kodierende Sequenz und carboxyterminale Aminosäuresequenz des modifizierten Gen 10 Produkts sind, z. B.,
Wenn dieser rekombinante T7-Phage mit eukaryontischen Zellen in Kontakt gebracht wird, die das αν Integrin umfassen, und mit Chloroquin behandelt wird, kann eine GFP-Aktivität in den Zellen 24–48 Stunden später nachgewiesen werden.
Beispiel 8
Dieses Beispiel illustriert ein Geradeausverfahren der Verwendung eines Lambdidvektors zur Generierung eines Produktvektors, wie einem rekombinanten eukaryontischen viralen Vektor, der zur Verwendung im Gentransfer in eukaryontische Zellen geeignet ist. Die durch das vorliegende Verfahren hergestellten Produktvektoren umfassen ein eukaryontisches virales Amplikon. Dieses Beispiel lehrt und illustriert ein allgemeines Verfahren. Jedoch umfasst das Verfahren auch eine spezifische Ausführungsform, um das Verständnis dieses Verfahrens zu unterstützen.
Dieses Verfahren verwendet einen Lambdidvektor, Vektor 7, und eine andere DNA, Vektor B. Eine Ausführungsform von Vektor 7 wird in 6 gezeigt. Eine Ausführungsform von Vektor 8 wird in 7 gezeigt.
Vektor 7
Vektor 7 umfasst ein eukaryontisches virales Amplikon, einen eukaryontischen viralen Vektor oder Sequenzen, die zu einem eukaryontischen viralen Vektor hoch homolog sind (d. h., eine eukaryontische virale DNA). Da dieses Verfahren vorzugsweise Produktvektoren herstellt, die mindestens die genetischen Elemente umfassen, die notwen dig und ausreichend sind, um ein eukaryontisches virales Amplikon auszubilden, umfasst die eukaryontische virale DNA, die von Vektor 7 getragen wird, vorzugsweise die Elemente, die notwendig sind, um ein Amplikon herzustellen. Jedoch können ein oder mehrere Elemente eines Amplikons oder andere geeigneter DNA auf Vektor 7 durch homologe Rekombination mit Vektor 8 transferiert werden. Die jeweilige Ausführungsform von Vektor 7, die in 6 gezeigt wird, trägt einen adenoviralen Vektor, der defizitär in den E1- und E4-Regionen des adenoviralen Genoms ist. 6 zeigt auch zwei terminale ITRs und eine adenovirale Verpackungssequenz, weil diese drei genetischen Elemente notwendig und ausreichend zur Bildung eines adenoviralen Amplikons sind.
Vektor 7 kann (und normalerweise tut er dies auch) zusätzliche Sequenzen eines eukaryontischen viralen Vektors umfassen. Die besondere Ausführungsform von Vektor 7, die in 6 illustriert wird, umfasst einen vollständigen Wildtyp-Adenovirus mit der Ausnahme, dass das meiste der E1-Region (Ad5-Koordinaten 356 bis 3,327) und der E4-Region (Ad5-Koordinaten 32,832 bis 35,564) durch heterologe genetische Elemente ersetzt wurden.
Der Zweck von Vektor 7 (in diesem Beispiel) ist es, die homologe Rekombination in einer Region der eukaryontischen viralen DNA zu erleichtern, die sie trägt. In dieser besonderen hierin illustrierten Ausführungsform umfasst die E1-Region des adenoviralen Vektors entweder ein hochregulierbares negatives Selektionsgen (NSG) oder eine duale Selektionskassette (DSC), welche in eine Region der eukaryontischen viralen DNA eingefügt wird oder an deren Stelle tritt. Die Substitution des NSG oder DSC (welches durch Definition ein NSG umfasst) für die E1-Region in 6 diktiert, dass die E1-Region, oder eine Region, umfassend die E1-Region, durch homologe Rekombination mit Vektor 8 in diesem Verfahren ersetzt wird. Es ist bevorzugt, aber nicht wesentlich, dass Vektor 7 ein DSC anstatt ein NSG umfasst. Nach homologer Rekombination wird das NSG aktiviert sein, um gegen Bakterien zu selektieren, die das NSG umfassen.
In den anfänglichen Schritten dieses Verfahrens werden die Bakterien, die mit Vektoren 7 und 8 transduziert sind, unter Bedingungen wachsen gelassen, die auf Bakterien selektieren, die entweder Vektor 7 oder die Vektoren 7 und 8 enthalten. Vektor 7 hat ein unabhängiges positives Selektionsgen (Kanamycinresistenz in der vorliegenden Ausführungsform) und selektiver Druck auf Vektor 7 kann durch die Zugabe von Kanamycin zu dem Wachstumsmedium erhalten werden. Jedoch kann ein Selektionsdruck für Vektor 7 auch durch Verwendung des positiven Selektionsgens des DSC (Zeocinresistenz in der illustrierten Ausführungsform) erhalten werden. Selektion auf das PSG des DSC ist vorteilhaft, da das PSG und das NSG in dem DSC resident sind und (in Begriffen der Genetik) enger miteinander verbunden sind als mit dem NSG und dem unabhängigen positiven Selektionsgen, bedingt durch deren physikalische Nähe zueinander. Um den höchsten Grad an Effizienz beim Erzielen der gewünschten Vektoren in dem vorliegenden Verfahrens zu erhalten, wird die sogenannte "Hintergrund"-Vermehrung unerwünschter Vektoren vorzugsweise größtmöglich eingeschränkt. Daher ist die Verwendung des positiven Selektionsgens des DSC, um Druck auf Vektor 7 aufrechtzuerhalten, in den anfänglichen Schritten dieses Verfahrens gegenüber der Verwendung des unabhängigen positiven Selektionsgens bevorzugt. Der Fachmann wird natürlich erkennen, dass das Wachstumsmedium derart formuliert werden könnte, um selektiv für beide positive Selektionsgene von Vektor 7 zu sein (z. B. ist es in der illustrierten Ausführungsform so formuliert um sowohl Zeocin wie auch Kanamycin zu enthalten).
Der eukaryontische virale Vektor, der durch Vektor 7 getragen wird, kann andere Modifikationen zusätzlich zu dem Einfügen eines DSC oder eines negativen Selektionsgens oder anstelle einer Region des eukaryontischen viralen Vektors aufweisen. Die illustrierte Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens lehrt dieses durch das Zeigen, dass die E4-Region des adenoviralen Vektors durch einen transkriptionael inerten Abstandshalter (Transcriptionally Inert Spacer, TIS) ersetzt wird. Jedoch wird man zu schätzen wissen, dass viele andere Modifikationen am eukaryontischen viralen Vektor durchgeführt werden können. Das gezeigte TIS ist eine SV40 Polyadenylierungssequenz, der eine bakterielle β-Glucuronidase-kodierenden Sequenz folgt, gefolgt von einer menschlichen β-Globin-Polyadenylierungssequenz. Das TIS-Element wird eingebracht, um die Eigenschaften des adenoviralen Vektors zu verbessern, der in diesem vorliegenden Beispiel hergestellt wird. TIS-Elemente werden eingehender in der internationalen Patentanmeldung WO 97/21826 beschrieben.
Eine wichtige Eigenschaft von Vektor 7 ist, dass er zwei DNA-Segmente (Homologieregionen) enthält, die zu zwei DNA-Segmenten (Homologieregion) von Vektor 8 hoch homolog sind. Diese Homologieregionen der Vektoren 7 und 8 werden verwendet, um die homologe Rekombination zwischen den beiden Vektoren zu vermitteln. In der hierin illu strierten besonderen Ausführungsform sind die adenoviralen Sequenzen der Koordinaten 1 bis 355 und der Koordinaten 3328 bis mindestens ungefähr 5,678 in beiden Vektoren 7 und 8 vorhanden und werden in jeder Figur als gestreifte und gepunktete Kästen dargestellt, um deren Identität zu zeigen.
Vektor 7 hat auch eine Verpackungssequenz, die eine Verkapselung in ein lambdoides Kapsid zur Verfügung stellt (z. B., eine Lambda cos-Stelle). Die lambdoide Verpakkungssequenz ist vorzugsweise proximal zu einem ITR der eukaryontischen viralen DNA, so dass das ITR proximal zu einem (freien) Terminus der DNA nach der Linearisierung des Lambdidvektors liegt, die während der Verkapselung in ein lambdoides Kapsid vorkommt.
Vektor 7, der in 6 gezeigt wird, umfasst auch ein LacI^Q-Gen, eine geringe Kopienzahl, einen bakteriellen Replikationsursprung und ein unabhängiges positives Selektionsgen.
Das LacI^Q-Gen von Vektor 7, das in 6 dargestellt wird, ist optional. In der gezeigten Ausführungsform erlaubt es die genaue Regulierung des Tac-Promoters, der das gezeigte NSG reguliert (in diesem Fall bildet das NSG einen Teil des DSC). Das LacI^Q-Gen überexprimiert den lac-Repressor, welcher wirksam den Tac-Promoter in der Abwesenheit von Galactose oder einem Galactose-Analogon (z. B., IPTG) ruhigstellt. Wenn ein anderer als der Tac-Promoter verwendet wird, um die Expression des NSG voranzutreiben, wenn ein LacI^Q-Stamm verwendet wird, oder wenn andere hochwirksame Mittel zur Kontrolle des negativen Selektionsdrucks des NSG eingesetzt werden, dann kann das LacI^Q-Gen aus dem Vektor 7 ohne Wirkung entfernt werden.
Der Replikationsursprung mit geringer Kopienzahl dient dazu, Vektor 7 in der bakteriellen Zelle stabil aufrechtzuerhalten, wenn der lambdoide Ursprung nicht repariert werden kann. Der in 6 gezeigte Vektor umfasst mehr als 38 kBp. Dementsprechend ist es vorteilhaft, einen Replikationsursprung mit geringer Kopienzahl, wie den p15 Ori, (wie in 6 gezeigt) oder das pBR322 on (nicht gezeigt) einzufügen. Während es nicht wünschenswert ist, an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass Replikationsursprünge mit geringer Kopienzahl helfen, die Integrität von großen autonom-replizierenden DNAs wie großen Lambdidvektoren aufrechtzuerhalten.
Das unabhängige positive Selektionsgen liegt nicht innerhalb der dualen Selektionskassette vor, noch innerhalb einer Region des Lambdidvektors, von dem vorgesehen ist, dass er an der homologen Rekombinationsreaktion mit Vektor 8 teilnimmt. Daher wird das unabhängige positive Selektionsgen von Vektor 7 Teil des gewünschten Produktvektors, Vektor 9 (8), werden.
Nach homologer Rekombination zwischen den Vektoren 7 und 8, werden die Vektoren, die in 9 und 10A–B gezeigt werden, hergestellt werden. Der Vektor von 8 umfasst den gewünschten adenoviralen Vektor, wird aber nicht das positive Selektionsgen der dualen Selektionskassette umfassen (welche in den adenoviralen Vektorsequenzen in 6 liegt). Um auf bakterielle Zellen zu selektieren, die den in 8 gezeigten Vektor umfassen, werden die Zellen in oder auf Medium wachsen gelassen, das selektiv für Zellen ist, die das unabhängige positive Selektionsgen umfassen (das aus Vektor 7 abgeleitet ist). Das in 6 gezeigte unabhängige positive Selektionsgen ist ein Kanamycingen. Im Gegensatz dazu ist das Medium nicht für das PSG des DSC selektiv, da dieses Selektionsgen nun nur in den unerwünschten Produkten vorhanden ist. Entsprechend werden alle transformierten bakteriellen Zellen in diesem jeweiligen Beispiel an diesem Punkt des Verfahrens in der Gegenwart von Kanamycin wachsen gelassen, aber nicht in der Gegenwart von Zeocin.
Vektor 7 umfasst auch einen Lambda-Replikationsursprung. Der Lamda-Replikationsursprung umfasst mindestens zwei Genfunktionen: eine Position zum Zusammensetzen der Replikationsproteine und einen Promoter, der die Transkription durch diese Sequenzen vorantreibt. Der gezeigte Lambda-Ursprung umfasst das P_R-Operon, welches defizitär zumindest bezüglich 0 oder P gemacht wurde. Dieses ist inter alia vorteilhaft, um eine überlaufende Replikation von Vektor 7 zu verhindern.
Vektor 8
Der in 7 gezeigte Vektor umfasst zwei nicht benachbarte Segmente, die zu den Sequenzen in dem adenoviralen Vektor, der durch Vektor 7 umfasst wird, hoch homolog sind. Zwischen diesen beiden nicht benachbarten Sequenzen ist eine Expressionskassette, die eine DNA umfasst, die ein Protein von Interesse kodiert und vorzugsweise daran gebunden ist ein Promoter, der in mindestens einigen eukaryontischen Zellen funktioniert (z. B., eine Zielzelle des adenoviralen Vektors, der durch Vektor 7 oder Vektor 8 umfasst wird). In der gezeigten Ausführungsform umfasst Vektor 8 einen EF-1α Promoter (Uetsiki et al., J. Biol. Chem., 264, 5791–5798 (1989)), der operativ an eine VEGF₁₂₁-kodierende Sequenz gebunden ist, wodurch ein synthetisches VEGF₁₂₁-Gen ausgebildet wird. Das VEGF₁₂₁-Gen wird durch Region mit hoher Homologie zu den adenoviralen Sequenzen in der Ausführungsform von Vektor 7, der in 6 gezeigt wird, flankiert.
Vektor 8 umfasst auch ein optionales positives Selektionsgen (z. B., ein Ampicillinresistenzgen), welches vorzugsweise ein Gen ist, das sich von dem positiven Selektionsgen der dualen Selektionskassette und von dem unabhängigen positiven Selektionsgen von Vektor 7 unterscheidet. Vektor 8 umfasst vorzugsweise keine Phagenverpackungssequenz, die mit der Phagenverpackungssequenz von Vektor 7 kompatibel ist. Das bedeutet, dass in dem Falle, dass Vektor 8 eine Phagenverpackungssequenz umfasst, dass die Phagenverpackungssequenz derart selektiert wird, dass sie nicht die Verkapselung von Vektor 8 in Kapside dirigiert, die in der Lage sind, Vektor 7 zu verkapseln. Alternativ dazu kann Vektor 8 so konstruiert sein, dass er zu groß oder zu klein zur effizienten Verkapselung ist oder eine andere geeignete Störung zur Verkapselung aufweist.
Optional kann Vektor 8 zusätzlich einen lambdoiden Replikationsursprung umfassen.
Die Vektoren der 7 und 8 (d. h., Vektoren 7 und 8), die in einem einzelnen bakteriellen Wirt transformiert wurden, können homolog rekombinieren (durch einen Doppelkreuzübergang), um die in den 9 und 10A–B gezeigten Vektoren herzustellen. Der in 8 gezeigte Vektor ist das gewünschte Produkt. Beide in den 7 und 8 gezeigten Vektoren sind geschlossene zirkuläre DNAs. Diese Tatsache verringert die Effizienz der homologen Rekombination, welches ein Phänomen ist, das selbst unter optimalen Bedingungen bei einer geringen Häufigkeit vorkommt. Zusätzlich wird der in 8 gezeigte Vektor in einer Minderzahl bakterieller Zellen, die in einer Kultur wachsen, zu finden sein. Andere Zellen, die in der gleichen Kultur wachsen, werden einen der Vektoren, die in 7, 8 und 10A–B gezeigt werden, enthalten. Die Kultur der bakteriellen Zellen wird auch einen Vektor umfassen, der durch einen einzelnen Kreuzungsübergang zwischen den Vektoren 7 und 8 hergestellt wurde. Das Produkt eines einzelnen Übergangs durch homologe Rekombination (ein Vektordimer oder Supervektor) wird alle Nukleotide der Vektoren von sowohl 7 und 8 umfassen. Wenn ein zweiter homologer Rekombinationsvorgang unterstützt werden könnte, dann würde dieser Supervektor entweder zu den Vektoren 7 und 8 oder zu den Vektoren von 9 und 10A–B führen. Diese Einschränkungen werden geeigneter Weise durch Infektion der Population von transduzierten Zellen (umfassend Vektoren 7, 8, 9 und Vektoren 10A–B) mit einem Helferphagen (z. B., Lambda – Klar) oder durch Aktivierung eines (Helfer-) Lysogens innerhalb der Zelle kompensiert.
Der Helferphage oder das Lysogen ist vorzugsweise bedingungsabhängig defizitär, so dass seine Gegenwart die lambdoide Replikation und Verkapselung des Lambdidvektors erlaubt, aber selbst nicht verpackt wird. Solch ein Helferphage oder Lysogen kann durch das Eliminieren der Verpackungssequenz oder anderer geeigneter Mechanismen, wie woanders diskutiert wird, erhalten werden. Wenn ein defizitärer Helferphage oder defizitäres Helferlysogen eingesetzt wird, dann kann die Vermehrung des Helfers verhindert werden und die Abtrennung des Helferphagens und Vektor 9 ist leicht zu erreichen. Beispiel 9 ist auf bedingungsabhängig defizitäre Helferphagen und Lysogene gerichtet. Jedoch, um die vorliegende Erfindung deutlicher zu illustrieren, wird im verbleibenden Rest des vorliegenden Beispiels angenommen, dass der Helferphage oder das Lysogen nicht defizitär sind.
Super-Transduktion durch Helferphagen oder Aktivierung eines Lysogens
Der Helferphage oder das aktivierte Lysogen bewirkt, wenn in einer bakteriellen Zelle anwesend, die die in den 7 und 8 gezeigten Vektoren umfassen, dass der Lambdaursprung, der auf Vektor 7 liegt, die lambdoide Replikation vermittelt. Lambdoide Replikation ist dahingehend gut bekannt, dass sie die Geschwindigkeit einer homologen Rekombination verstärkt.
Zusätzlich stellt der Helferphage oder das aktivierte Lysogen alle Genfunktionen zur Verfügung, die notwendig sind, um sich selbst zu replizieren (es sei denn, ein defekter Phage oder Lysogen wird verwendet) und jegliche lambdiden Vektoren, die in der gleichen Zelle vorhanden sind. Als eine Konsequenz davon werden Vektoren geeigneter Größe (d. h., eine Größe zwischen ungefähr 73% und ungefähr 110% des Wildtyp-Phagengenoms), die eine Phagenverpackungssequenz umfassen (z. B., eine Lambdacos-Stelle) in Phagenkapside verpackt.
Der in 7 gezeigte Vektor und Vektoren, die aus dem Gerüst von Vektor 8 abgeleitet sind, haben keine kompatible Phagenverpackungssequenz (d. h., im vorliegenden Beispiel, eine cos-Stelle). Die Vektoren von 7 und 9 haben jedoch eine geeignete Verpackungssequenz und einen Lambda-Replikationsursprung. Sie sind auch dahingehend konstruiert, dass sie ungefähr die gleiche Größe wie die des Wildtyphelferphagens haben (d. h., zwischen 73% und 110% des Lambdagenoms). Somit dirigiert der Helferphage die Verkapselung der Vektoren der 7 und 9 in (Lambda)-Kapside. Jegliche Supervektoren innerhalb der Zelle können auch unter der Voraussetzung, dass sie nicht größer sind als die obere Größengrenze (von ungefähr 110 % eines Wildtypgenoms) zur Verpackung in ein Kapsid, verpackt werden.
Das vorliegende Verfahren wird durch die Gewinnung eines Phagen-artigen Lysats weitergeführt (d. h., ein Lysat von verkapselten Lambdidvektoren und möglicherweise Helferphagen) und das Infizieren einer Kultur von geeigneten Bakterien mit dem Lysat. Diese infizierten Zellen werden primär (1) Helferphagen, (2) Vektor 7 und (3) Vektor 9 umfassen. Die infizierten Bakterien werden unter Bedingungen wachsen gelassen, die (1) selektiv für den gewünschten Produkt-Vektor ("Vektor 9") sind und (2) das negative Selektionsgen (d. h., Bedingungen, die antiselektiv für Vektor 7 und unerwünschte Produktvektoren sind) aktivieren. Da es dem Helferphagen an dem unabhängigen PSG mangelt (z. B., dem Kan-Resistenzgen), wird er antiselektiert. Zudem ist die Zelle vorzugsweise Lysogen, was die Vermehrung des Helferphagen oder des Lysogens verhindert. Der gewünschte Produktvektor, der Vektor 9 ist, wird daher effizient von solchen Produkten abgetrennt, die nicht effizient verkapselt sind.
Diese Bakterien, die eine gemischte Population von Reagenz- und Produktvektoren umfassen, werden klonal isoliert, subkultiviert, untersucht, um deren Identität sicherzustellen, und vermehrt, um einen rekombinanten Lambdidvektor zur Verfügung zu stellen, der einen gewünschten eukaryontischen viralen Vektor (pDesired) umfasst.
Der pDesired-Vektor kann dann verwendet werden, wie mehrmals rezitiert wurde. Zum Beispiel wird der pDesired-Vektor zur Transduktion in eine eukaryontischen Zelle hergestellt. Die Herstellung zur Transduktion in eine eukaryontische Zelle kann die Verpakkung in ein Phagenkapsid (z. B., mittels eines Helferphagen) umfassen. Alternativ dazu kann die Herstellung zur Induktion in eine eukaryontische Zelle die Linearisierung in der Nähe eines ITR des eukaryontischen viralen Vektors umfassen (aber nicht innerhalb des viralen Vektors). Das rekombinante Lambdid, das zur Transduktion in einer eukaryontische Zelle hergestellt wurde, wird dann in eine eukaryontische Zelle transduziert, die die Replikation des eukaryontischen viralen Vektors erlaubt. Die eukaryontische Zelle wird kultiviert und der eukaryontische virale Vektor wird durch ein modifiziertes Hirt-Verfahren oder andere geeignete Verfahren erhalten.
Beispiel 9
Dieses Beispiel illustriert, wie man einen defizitären Helferphagen oder defizitäres Helferlysogen im Kontext von Beispiel 8 macht und verwendet.
In Beispiel 8 wird ein Phagen-artiges Lysat, umfassend die Vektoren 7, 8, 9, 10A und 10B und den Helferphagen/Lysogen efialten und in eine Population von Bakterien transfiziert, in denen der Helferphage nicht wachsen wird. Die Unfähigkeit des Helferphagen/Lysogens, auf dieser Population von Bakterien zu wachsen, kann ein Resultat von entweder dem Helferphagen/Lysogen oder der Zelle sein, in die er transfiziert wird. In Beispiel 8 ist der sekundäre Bakterienstamm ein Lysogen mit der gleichen Immunität wie der Helfer. Somit lysiert eine Infektion mit dem Helfer in Beispiel 8 die Zellen und die Helfer wachsen nicht. Das vorliegende Beispiel ist auf andere Verfahren zur Verhinderung des Wachstums des Helfers gerichtet.
Zum Beispiel kann der Helfer bedingungsabhängig defizitär sein. Ein Beispiel dieser Ausführungsform ist, wenn die erste bakterielle Zelle (d. h., die bakterielle Zelle, die zur Rekombination der Vektoren 7 und 8 verwendet wird) Gen O zur Verfügung stellen kann und der Helfer in der Gen O-Funktion defizitär ist. Somit wird, wenn die zweite bakterielle Population mit dem Phagen-artigen Lysat infiziert wird, das bedingungsabhängige Defizit des Helfers in Gen O nicht komplementiert werden und der Helfer wird nicht wachsen.
Alternativ dazu kann die sekundäre bakterielle Population cro überexprimieren. Cro wird dann an das Helfergenom binden und eine Lysogenie anstatt des lytischen Wachstums des Helfers auslösen.
Eine noch andere Alternative ist es, für den Helferphagen eine Temperatursensibilität zu erhalten, die in der zweiten bakteriellen Zellpopulation nicht komplementiert oder erniedrigt wird.
Man weiß daher zu schätzen, dass jegliches Verfahren, um den Helferphagen oder das Lysogen, das in dem Phagen-artigen Lysat vorhanden ist, an der Vermehrung zu hindern und den lytischen Zyklus in der zweiten Population von Zellen einzugehen, verwendet werden kann, um Vektor 9 von dem Helferphagen oder Lysogen abzutrennen.
Beispiel 10
Dieses Beispiel illustriert eine Ausführungsform des vorliegenden erfinderischen Verfahrens, worin ein erster Vektor und ein zweiter Vektor eine homologe Rekombination durchlaufen, um einen Produktvektor auszubilden. Der erste in diesem Beispiel verwendete Vektor enthält ein DSC und enthält keinen lambdoiden Replikationsursprung.
12 zeigt p15E1 (Z), welches ein zweiter Vektor der vorliegenden Erfindung ist. Dieses Plasmid umfasst das p15 ori und ein Kanamycinresistenzgen, das aus pACYC177 erhalten wurde. Das bla-Gen aus pACYC177 wurde mit den Ad5-Sequenzen 1 bis 5,788 ersetzt. Adenovirale Sequenzen 356 bis 3327 wurden mit einer Expressionskassette ersetzt, die den CMV-Promoter umfasst, der operativ an das Lac Z-Gen und ein SV40-Polyadenylierungssignal gebunden ist. P15E1 (Z) wurde mit pAdE1 (BN) E310ER cotransfiziert, welches in 13 gezeigt wird (und es ist ein pSelect der vorliegenden Erfindung). Die Sty 1-Sequenz von pBR322 wurde in Pac I geändert. Die Lac I^Q Expressionskassette und eine cos-Sequenz wurden in die Pac I-Sequenz eingefügt. Adenovirale Sequenzen 1 bis 35,935, in denen Sequenzen 356 bis 4122 mit einem DSC und Sequenzen 28,592 bis 30,470 (Xba I bis Xba I) entfernt wurden, wurden benachbart zu der cos-Sequenz platziert. Das DSC (von diesem Beispiel) hat die folgende Sequenz (SEQ ID NO: 6)
Diese Sequenz (SEQ ID NO: 6) enthält:
Tabelle 1. Koordinaten des DSC, das in Beispiel 10 wiedergegeben wird.
In dem in 13 gezeigten Vektor ist der EM-7 Promoter des DSC zum linken ITR hin orientiert. Das rechte ITR ist neben der Pac I Sequenz, die am nächsten zum Tetracyclinresistenzengen liegt.
14 zeigt pAdE1 (Z) EB (10) BR, welches ein pDesired-Vektor der vorliegenden Erfindung ist.
PAdE1 (Z) E3 (10) BR ist isogen mit pAdE1 (BN) E310BR, außer, dass die Lac Z Expressionskassette von p15E1 (Z) und die adenoviralen Sequenzen 3323 bis 4122 durch das DSC ersetzt wurden.
PAdE1 (BN) E3 (10) BR wurde in DH5α-Zellen transformiert und auf Ampicillin selektiert. Aus einer gesättigten Kultur wurden 100 Mikroliter, 1 Mikroliter oder 10 Nanoliter auf sowohl Tetracyclin-enthaltendes Medium und Tetracyclin- plus IPTG- enthaltendes Medium platziert. Die Zahl der überlebenden Kolonien wird unten in Tabelle 2 gezeigt:
Tabelle 2. Anfälligkeit von DH5a-Zellen auf antiselektive Wirkungen des DSC.
Es gab ungefähr 5 Millionen Zellen in 100 μl gesättigter Kultur. Dementsprechend ist der selektive Druck, der durch das DSC zur Verfügung gestellt wird, ausreichend, um weniger als eine in 10⁵ Zellen, die das aktivierte DSC umfassen, wachsen zu lassen.
Beispiel 11
Dieses Beispiel illustriert eine Ausführungsform des vorliegenden erfinderischen Verfahrens, worin ein erster Vektor und ein zweiter Vektor eine homologe Rekombination durchlaufen, um einen Produktvektor auszubilden. Der in diesem Beispiel eingesetzte erste Vektor enthält ein DSC und enthält keinen lambdoiden Replikationsursprung.
15 zeigt pAdE1 (Z) E3/4 (B) IQCos, welches ein erster Vektor der vorliegenden Erfindung ist (oder pSelect), der ein SRG umfasst. Dieser Vektor umfasst ein Serotyp 5 adenovirales Genom, das durch (i) das Ersetzen der Koordinaten 356 bis 2,787 mit einer Expressionskassette, die den CMV-Promoter umfasst, der operativ an das Lac Z Gen und eine SV40 Polyadenylierungssequenz gebunden ist, und (ii) das Ersetzen der Koordinaten 27,084 bis 35,564 mit einem SRG, modifiziert ist. Das SRG umfasst einen EM-7 Promoter, der funktional an das Lac Z-sch ble – Gen gebunden ist. Das SRG wird zum rechten ITR des adenoviralen Genoms hin transkribiert. Dieser Vektor umfasst auch einen p15 Replikationsursprung, ein Kanamycin-Resistenzgen, und ein Laq I^Q-Gen, das proximal zur cos-Sequenz lokalisiert ist. Das Laq I^Q-Gen wird zur cos-Sequenz hin transkribiert. Die cos-Stelle ist benachbart zum linken adenoviralen ITR.
Der Vektor pAdE1 (Z) E3/4 (B) IQCos wurde in eine Population von BL21 (DE3)-Zellen in der Gegenwart von Kanamycin transformiert. Die BL21 (DE3) Zelllinie ist eine wohlbekannte Zelllinie, die durch Studier und Moffatt in 1986 hergestellt und beschrieben wurde. BL21 (DE3)-Zellen wurden durch Lysieren von E. coli mit dem Lambda 21 Phagen hergestellt, der eine T7 RNA-Polymerase unter der Kontrolle des LacUV5-Promoters trägt. Entsprechend überexprimieren BL21 (DE3)-Zellen T7 RNA-Polymerase, wenn diese IPTG ausgesetzt werden. Verschiedene Volumen einer gesättigten Kultur von transformierten BL21 (DE3) – Zellen wurden auf eine 10 cm Agaroseplatte plattiert, die Mengen an Kanamycin und IPTG enthält. Nach der Aufrechterhaltung der Zellen bei 37°C für 16 Stunden ergaben 100 Mikroliter der Kultur 50 Kolonien, jedoch ergaben 1 Mikroliter der Kultur nur ungefähr 3 sekundäre und nadelpunktartige Kolonien und 10 Nanoliter der Kultur resultieren in keinerlei Kolonien. Im Gegensatz dazu, wenn nur auf Kanamycin ausplattiert, resultierten 100 Mikroliter Kultur in einem Rasen, 1 Mikroliter resultierte in einzelnen Kolonien, denen es wesentlich an Raum zwischen den Kolonien fehlte (d. h., die Platte war überladen oder voll von Kolonien) und 10 Nanoliter Kultur resultierten in ungefähr 200 Kolonien. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass weniger als ungefähr 1 in 10⁴ Bakterien, die das SRG von pAdE1 (Z) E3/4 (B) IQCos umfassen, in der Lage sind, in der Gegenwart von T7 RNA-Polymerase zu überleben oder effektiv zu wachsen.
Beispiel 12
Dieses Beispiel illustriert, dass das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren ein effizientes und Geradeausverfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Vektors mittels homologer Rekombination zur Verfügung stellt.
Der bakterielle Stamm LE392 wurde mit pAdE1 (BN) E3 (10) BR und p15E1 (Z) cotransformiert und unter selektivem Druck durch Ampicillin und Kanamycin aufbewahrt. Unter Verwendung von Standardtechniken wurde ein Phagenlysat aus der transformierten LE392 Kultur mit Lambda – Klar hergestellt. Ein Teil des Lysats (100 μl) wurde verwendet, um die Zellen von einem ml einer gesättigten Kultur eines DH5α5/Lambda-Lysogens zu infizieren. Serielle Verdünnungen der infizierten Lysogenkulturen wurden unter Selektionsdruck auf Kanamycin oder Ampicillin, Tetracyclin und IPTG plattiert. Tabelle 3 zeigt die Anzahl der Kolonien, die unter der jeweiligen Bedingung erhalten wurden.
Tabelle 3. Zahl der beobachteten Kolonien
Diese Ergebnisse zeigen, dass zwischen ungefähr 0,1% und 0,4% der einzelnen homologen Rekombinationsvorgänge durch einen zweiten homologen Rekombinationsvorgang aufgelöst wurden, um den gewünschten Produktvektor herzustellen. Dieses Ergebnis wurde durch das erneute Ausplattieren der Kolonien bestätigt. Von den erneut ausplattierten Kolonien wurde festgestellt, dass 94% gegenüber Kanamycin sensibel waren und resistent gegen Ampicillin waren. Siebzehn von achtzehn Kolonien hatten das erwartete Muster der DNA-Fragmentierung, wenn isolierte DNA mit Hind III und Pac I restriktionsverdaut wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass die vorliegenden erfindungsgemäßen Vektoren und Verfahren die Herstellung eines rekombinanten DNA-Vektors unter Verwendung einer homologen Rekombination (einzelne und doppelte) ermöglichen, um Produktvektoren mit einer Effizienz von mindestens ungefähr 5% und vorzugsweise mit einer Effizienz von mindestens ungefähr 80 % herzustellen.
All die hierin zitierten Referenzen, einschließlich Patente, Patentanmeldungen und Publikationen, werden hiermit in ihrer Gesamtheit durch Referenzieren aufgenommen.
Während diese Erfindung mit Betonung auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, wird es den Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet naheliegen, dass Variationen der bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden können und dass es vorgesehen ist, dass die Erfindung in anderer Weise als spezifisch hierin beschrieben durchgeführt werden kann. Entsprechend umfasst diese Erfindung alle Modifikationen, die vom Geist und Umfang der Erfindung umfasst sind, so wie er in den folgenden Ansprüchen definiert ist.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zur Herstellung und Verpackung eines DNA-Vektors, welches die folgenden Schritte umfasst: (i) Transduzieren einer ersten bakteriellen Zelle mit einem ersten DNA-Vektor, umfassend (a) einen Teil eines eukaryontischen viralen Genoms, umfassend einen ITR und umfassend ein regulierbares antiselektives Gen, welches von einem ersten DNA-Segment und einem zweiten DNA-Segment flankiert wird, und (b) eine Phagen-Verpackungssignalsequenz, wobei (a) nicht (b) umfasst, und mit einem zweiten DNA-Vektor, umfassend eine zweite DNA von Interesse, welche von einem dritten DNA-Segment und einem vierten DNA-Segmentflankiert wird, welche ausreichend Homologie zu dem ersten DNA-Segment bzw. dem zweiten DNA-Segment aufweisen, um ein doppeltes homologes Rekombinationsereignis mit dem ersten DNA-Vektor zur vermitteln, (ii) Halten der ersten bakteriellen Zelle unter Bedingungen, welche das Auftreten der intermolekularen doppelten homologen Rekombination erlaubt, um einen resultierenden DNA-Vektor herzustellen, welcher die Phagen-Verpackungssignalsequenz umfasst und die DNA von Interesse, welche nicht das regulierbare antiselektive Gen enthält, und (iii) Platzieren des resultierenden DNA-Vektors unter in vivo-Bedingungen, so dass der resultierende DNA-Vektor in ein Phagencapsid verpackt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren weiterhin folgende Schritte umfasst: (iv) Transduzieren des resultierenden DNA-Vektors, welcher in einem Phagencapsid verpackt ist, in eine zweite bakterielle Zelle und Platzieren der zweiten bakteriellen Zelle unter Bedingungen, welche ausreichend sind, um das regulierbare antiselektive Gen zu aktivieren, so dass Zellen, welche das regulierbare antiselektive Gen umfassen, wesentlich am Wachsen gehindert werden, (v) Platzieren der zweiten bakteriellen Zelle unter Bedingungen, welche ausreichen, um die Propagierung der zweiten bakteriellen Zelle und die Replikation des resultierenden DNA-Vektors zur Verfügung zu stellen, und (vi) Isolieren des resultierenden DNA-Vektors, um eine rekombinante DNA zu erhalten.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Teil eines eukaryontischen viralen Genoms einen ersten ITR und einen zweiten ITR umfasst, und das erste DNA-Segment und das zweite DNA-Segment der erste ITR und der zweite ITR sein können oder davon verschieden sein können.
Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Teil eines eukaryontischen viralen Genoms weiterhin ein positives Selektionsgen umfasst, welches proximal zu dem regulierbaren antiselektiven Gen liegt, und dadurch eine duale Selektionskassette bildet, und der zweite DNA-Vektor ein positives Selektionsgen umfasst, welches nicht durch den ersten DNA-Vektor kodiert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das antiselektive Gen einen stringenten Promotor umfasst, welcher funktionell mit einem offenen Leseraster verbunden ist, welcher ein starkes bakterielles Signal für die Initiation der Translation umfasst, und der Teil eines eukaryontischen viralen Genoms das erste DNA-Segment und/oder das zweite DNA-Segment umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Verfahren weiterhin folgende Schritte umfasst: (iv) Transduzieren des resultierenden DNA-Vektors, welcher in ein Phagencapsid verpackt ist, in eine zweite bakterielle Zelle, Ausplattieren der zweiten bakteriellen Zelle auf ein festes Wachstumsmedium, um die Produktion von wenigstens einer primären Kolonie zu ermöglichen, und Platzieren der zweiten bakteriellen Zelle unter Bedingungen, welche ausreichend sind, um den stringenten Promotor zu aktivieren, so dass Zellen, welche den stringenten Promotor umfassen, im Wachstum retardiert sind und keine primären Kolonien bilden, (v) Selektieren einer primären Kolonie, und (vi) Isolieren des resultierenden DNA-Vektors von der primären Kolonie, um eine im Wesentlichen reine DNA zu erhalten.
Das Verfahren gemäß Ansprach 5, wobei der Teil eines eukaryontischen viralen Genoms weiterhin ein positives Selektionsgen umfasst, welches proximal zu dem stringent regulierten Gen liegt und dadurch eine duale Diskriminierungskassette bildet, und der zweite DNA-Vektor ein positives Selektionsgen umfasst, welches nicht durch den ersten DNA-Vektor kodiert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 7, wobei der erste DNA-Vektor weiterhin ein positives Selektionsgen umfasst, welches nicht innerhalb des Teils eines eukaryontischen viralen Genoms enthalten ist und dadurch ein unabhängiges positives Selektionsgen bildet, und in Schritt (v) die zweite bakterielle Zelle unter Bedingungen platziert wird, welche selektiv sind für das unabhängige positive Selektionsgen.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–8, wobei die erste bakterielle Zelle und/oder die zweite bakterielle Zelle defizient ist/sind, in ihrer Fähigkeit, die bakterielle zellgerichtete homologe Rekombination zu unterstützen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die erste bakterielle Zelle und/oder die zweite bakterielle Zelle defizient in recA ist/sind.
Verfahren zur Herstellung einer DNA umfassend ein rekombinantes eukaryontisches virales Amplikon, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Transduzieren einer bakteriellen Zelle mit einer ersten DNA, wobei die erste DNA einen DNA-Vektor umfasst, umfassend (i) einen Teil eines eukaryontischen viralen Genoms umfassend einen ITR, (ii) ein regulierbares Anti-Selektionsgen, welches von einem ersten DNA-Segment und einem zweiten DNA-Segment flankiert wird, (iii) eine Phagen-Verpackungssignalsequenz, und (iv) einen defizienten oder konditional-defizienten lambdoiden Origin of Replication, und mit einer zweiten DNA, welche eine DNA von Interesse umfasst, welche flankiert wird von einem dritten DNA-Segment und einem vierten DNA-Segment mit hoher Homologie zu dem ersten DNA-Segment bzw. dem zweiten DNA-Segment der ersten DNA, und (b) Transduzieren der bakteriellen Zelle mit einem defekten Phagen oder einen nicht-defekten Phagen, oder Aktivieren eines defekten oder nicht-defekten Lysogens innerhalb der Zelle, so dass der defiziente oder konditionaldefiziente lamdoide Origin of Replication betriebsfähig ist und die erste DNA und die zweite DNA einem doppelten homologen Rekombinationsereignis unterzogen werden, um eine DNA zu bilden, welche ein rekombinantes eukaryontisches virales Amplikon, umfassend die DNA von Interesse und nicht umfassend das regulierbare Antiselektionsgen, umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das defekte Lysogen, das nicht-defekte Lysogen, der defekte Phage oder der nicht-defekte Phage Lambda-frei ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das defekte Lysogen, das nicht-defekte Lysogen, der defekte Phage oder der nicht-defekte Phage ein Genom und eine Phagen-Verpackungssignalsequenz aufweist, wobei die Phagen-Verpackungssignalsequenz des defekten Lysogens, des nicht-defekten Lysogens, des defekten Phagens oder des nicht-defekten Phagens fehlt oder nicht funktional gemacht werden kann, ohne das Genom des defekten Lysogens, des nicht-defekten Lysogens, des defekten Phagens oder des nicht-defekten Phagens zu isolieren.
Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Phagen-Verpackungssignalsequenz flankiert wird von Rekombinationsstellen für die parallele ortsgerichtete homologe Rekombination und wobei die bakterielle Zelle eine ortsgerichtete homologe Rekombinase exprimiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Rekombinationsstellen für die ortsgerichtete homologe Rekombination lox-Stellen sind und die ortsgerichtete homologe Rekombinase cre ist.