DE69916005T2

DE69916005T2 - Effizientes Verfahren zum Auffinden von Genfunktionen mittels Bibliotheken zur funktionellen Genomanwendung

Info

Publication number: DE69916005T2
Application number: DE69916005T
Authority: DE
Inventors: Govert Schouten; Ronald Vogels; Abraham Bout; Helmuth Van Es
Original assignee: Galapagos Genomics NV
Current assignee: Galapagos NV
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2019-06-12
Also published as: NZ508995A; US6413776B1; JP2002526031A; AU4294799A; EP1022335B1; US7029848B2; JP3672494B2; CA2301403A1; MXPA00012401A; WO1999064582A3; DE69916005D1; US6340595B1; US20030027170A1; AU756605B2; CA2301403C; WO1999064582A2; ATE263237T1; EP1022335A1

Description

Die Erfindung betrifft Hochdurchsatzverfahren zur Identifikation der Funktion von Nukleinsäureproben und ihrer Produkte. Die Erfindung wird beispielhaft durch die Verwendung der E1-komplementierenden adenoviralen Verpackungszelllinie PER.C6 in Kombination mit einem E1-deletierten, plasmid-basierten Generierungssytem zur Herstellung rekombinanter Adenovirus-Vektoren in einem Hochdurchsatzaufbau dargestellt, um die Funktion des Produkts einer Nukleinsäureprobe zu ermitteln.
Das letztendliche Ziel des Humanen Genom-Projekts ist die Sequenzierung des gesamten humanen Genoms. Das erwartete Ergebnis dieser Bestrebung ist eine präzise Karte der 70.000–100.000 Gene, die im Menschen exprimiert werden. Eine ziemlich vollständige Bestandsaufnahme der humanen kodierenden Sequenzen wird jedoch höchstwahrscheinlich früher öffentlich verfügbar werden. Seit den frühen 1980ern wurde sowohl durch Regierungs- als auch durch private Forschungsorganisationen eine große Zahl von Expressed Sequence Tags (ESTs; partielle DNA Sequenzen, die von den Enden von cDNA Molekülen gelesen werden) erhalten. Ein Kennzeichen dieser Bestrebungen, die mit Hilfe einer Kollaboration zwischen dem Washington University Genome Sequencing Center und Mitgliedern des IMAGE (Integrated Molecular Analysis of Gene Expression)-Konsortiums (http://www-bio.llnl.gov/bbrp/image/image.html) durchgeführt wurde, war die schnelle, öffentlich zugängliche Hinterlegung der Sequenzen und die gleichzeitige Verfügbarkeit der sequenz-markierten ("tagged") cDNA Klone von mehreren Verteilern (Marra et al. (1988) Trends Genet. 14(1): 4–7). Gegenwärtig nimmt man an, dass die Kollektion of cDNAs annähernd 50.000 verschiedene humane Gene repräsentiert, die in einer Vielzahl von Geweben exprmiert werden, einschließlich Leber, Hirn, Milz, B-Zellen, Niere, Muskel, Herz, Verdauungskanal, Retina, und Hypothalamus, und die Zahl wächst täglich.
Neue Initiativen wie die des Cancer Genome Anatomy Projekts unterstüzen eine Bestrebung, bis zum Jahr 1999 vollständige ("full-length") Sequenzen von Klonen im Unigene Set (eine Zusammenstellung von cDNA Klonen, die öffentlich verfügbar ist) zu erhalten. Zur gleichen Zeit schlugen kommerzielle Instanzen vor, bis 1999 40.000 vollständige cDNA Klone zu validieren (resequenzieren), und die einzelnen Klone für jede interessierte Partei verfügbar sein werden. Die Geschwindigkeit, mit der die kodierenden Sequenzen neuer Gene identifiziert werden, steht in scharfem Kontrast zur Rate, mit der die Funktion dieser Gene aufgeklärt wird. Die Zuordnung von Funktionen zu den cDNAs in den Datenbanken, oder funktionelle Genomanalyse ("functional genomics"), ist heute eine große Herausforderung in der Biotechnologie.
Über Jahrzehnte wurden neue Gene als Ergebnis einer Forschung identifiziert, die angelegt war, einen biologischen Prozess oder eine Erbkrankheit zu erklären, und die Funktion des Gens ging seiner Identifikation voraus. Bei der funktionellen Genomanalyse werden die kodierenden Sequenzen der Gene zuerst kloniert und sequenziert, und im Anschluss werden die Sequenzen verwendet, um die Funktionen zu finden. Obwohl andere Organismen, wie zum Beispiel Drosophila, C. elegans und Zebrafisch, für die Analyse grundlegender Gene sehr dienlich sind, sind für komplexe physiologische Eigenschaften von Säugern (Blutzucker, kardiovaskuläre Erkrankung, Entzündung) Tiermodellsysteme unumgänglich. Die niedrige Fortpflanzungsrate und die hohen Kosten für die Unterbringung von Tiermodellen sind jedoch die Hauptlimitierung für die Hochdurchsatz-Funktionsanalyse von Genen. Obwohl arbeitsintensive Bestrebungen unternommen wurden, um in einer Suche nach Phänotypen Bibliotheken von Mauslinien mit chemisch oder genetisch mutierten (markierten) Genen zu etablieren, welche die Aufklärung von Genfunktionen erlauben oder welche mit humanen Erkrankungen zusammenhängen, ist eine systematische Analyse des kompletten Spektrums an Säugergenen, sei es Mensch oder Tier, eine bedeutende Aufgabe.
Um mit dem Umfang an Sequenzdaten Schritt zu halten, bedarf das Gebiet der funktionellen Genomanalyse der Fähigkeit, Hochdurchsatzanalysen der genauen Genfunktion durchzuführen. Kürzlich wurde eine Reihe von Techniken entwickelt, die angelegt sind, um gewebe- und zellspezifische Genexpression mit der Genfunktion zu verbinden. Diese umfassen cDNA-Mikroarrayanalysen und die Genchip-Technologie und differentielles mRNA-Display. Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) oder differentielles Display von messenger-RNA können Gene identifizieren, die in Tumorgewebe exprimiert werden, aber in entsprechendem normalem oder gesundem Gewebe fehlen. Auf diese Weise können potentielle Gene mit regulatorischen Funktionen aus dem Übermaß ubiquitär exprimierter Gene selektiert werden, die eine geringere Wahrscheinlichkeit aufweisen, für das Screening kleiner Arzneimittelsubstanzen oder Gentherapieprojekte dienlich zu sein. Die Genchip-Technologie hat das Potential, die Kontrolle der Genexpression einer großen Zahl von Genen durch Messen der mRNA-Expressionsniveaus in Zellen in nur wenigen Stunden zu ermöglichen. Zellen, die unter einer Vielzahl von Bedingungen kultiviert wurden, können hinsichtlich ihrer mRNA-Expressionsmuster analysiert und verglichen werden. Gegenwärtig werden DNA Mikroarray-Chips mit 40.000 nicht-redundanten humanen Genen hergestellt und es ist geplant, dass sie 1999 auf dem Markt sind (Editorial (1998) Nat. Genet. 18(3): 195–197). Diese Techniken sind jedoch in erster Linie für das Screening von Krebszellen angelegt und nicht für das Screening nach spezifischen Genfunktionen.
Ferner werden Two- oder Three-Hybrid-Systeme verwendet, um funktionelle Daten zu genomischen Datenbanken hinzuzufügen. Diese Verfahren untersuchen Protein/Protein-, Protein/RNA oder Protein/DNA-Wechselwirkungen in Hefe oder Säugetierzellen (Brent & Finley (1997) Annu. Rev. Genet. 31: 663–704). Dieses Verfahren stellt jedoch kein Mittel bereit, um eine große Zahl anderer Genfunktionen zu untersuchen, wie zum Beispiel Differenzierung, Motilität, Signalübertragung, Enzym- und Transportaktivität. Es wurden Hefe-Expressionssysteme entwickelt, die verwendet wurden, um natürlicherweise segregierte sowie Membranproteine von Säugetieren zu screenen (Klein et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(14): 7108–7113). Dieses System ermöglicht es ferner, große Bibliotheken in Bibliotheken mit bestimmten Eigenschaften zu zerlegen, die bei der Identifikation spezifischer Gene und Genprodukte helfen. Ein Nachteil dieses Systems ist es, dass hauptsächlich Gene selektiert werden, die segregierte Proteine kodieren. Zweitens basiert diese Technik auf Hefe als heterologes Expressionssystem, und daher gibt es in nicht geeigneter Weise gefaltete Genprodukte, was eine unausgewogene Bibliothek zur Folge hat.
Andere aktuelle Strategien umfassen die Erzeugung von transgenen Mäusen oder von Knockout-Mäusen. Ein erfolgreiches Beispiel der Entdeckung eines Gens mit Hilfe einer solchen Vorgehensweise ist die Identifikation des Osteoprotegeringens. DNA Datenbanken wurden gescreent, um ESTs mit Merkmalen zu selektieren, welche darauf hindeuten, dass die verwandten Gene segregierte Proteine kodieren. Die biologischen Funktionen dieser Gene wurden beurteilt, indem die entsprechenden vollständigen cDNAs unter die Kontrolle eines leberspezifischen Promotors gebracht wurden. Transgene Mäuse, die mit jedem dieser Konstrukte erzeugt wurden, haben folglich hohe Plasma-Konzentrationen des relevanten Proteins. Anschließend wurden die transgenen Tiere einer Reihe qualitativer und quantitativer phänotypischer Untersuchungen unterzogen. Eines dieser Gene, das in Mäuse transfiziert wurde, führte zu Mäusen mit einer erhöhten Knochendichte, was in der Folge zur Entdeckung eines potenten Anti- Osteoporosefaktors führte (Simonet et al. (1997) Cell 89(2): 309–319). Ein solches Verfahren weist die Nachteile auf, dass es teuer und zeitaufwendig ist.
Die Herausforderung in der funktionellen Genomanalyse ist es, all die oben beschriebenen Techniken zu entwickeln und zu verfeinern und ihre Ergebnisse mit den bestehenden Daten in eine gut entwickelte Datenbank zu integrieren, die für die Entwicklung eines Bildes sorgt, wie die Genfunktion zellulären Metabolismus konstituiert, und eines Mittels für dieses Wissen, um es in der Entwicklung neuer medizinischer Produkte zu verwenden. Die gegenwärtigen Techniken weisen Beschränkungen auf und führen nicht notwendigerweise zu genauen funktionellen Daten. Daher besteht ein Bedarf für ein Verfahren das die direkte Messung der Funktion eines einzelnen Gens aus einer Kollektion von Genen (Genpools oder individuelle Klone) in einem Hochdurchsatzaufbau in geeigneten in vitro Untersuchungssystemen und Tiermodellen ermöglicht.
Die Entwicklung von Hochdurchsatzscreens wird in Jayawickreme und Kost (Curr. Opin. Biotechnol. (1997) 8: 629–634) diskutiert. Ein Hochdurchsatzscreen für selten transkribierte, differentiell exprimierte Gene ist in von Stein et al. (Nucleic Acids Res. (1997) 35: 2598–2602) beschrieben. Hochdurchsatz-Genotypisierung wird in Hall et al. (Genome Res. (1996) 6: 781–790) offenbart. Verfahren zum Screening transdominanter intrazellulärer Effektorpeptide und mRNA-Moleküle sind in Nolan, WO 97/27212 und WO 97/27213, offenbart.
Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung darin zum direkten, schnellen und eindeutigen Messen der Funktion von Nukleinsäureproben in einem Hochdurchsatzaufbau unter Verwendung eines plasmid-basierten, E1-deletierten adenoviralen Vektorsystems und einer E1-komplementierenden Wirtszelle werden bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte der Konstruktion eines Sets von Adapterplasmiden mittels Insertion eines Sets von cDNAs, DNAs, ESTs, Genen, synthetischen Oligonukleotiden oder einer Bibliothek von Nukleinsäuren in E1-deletierte Adapterplasmide, Cotransfektion einer E1-komplementierenden Zelllinie mit dem Set oder der Bibliothek von Adapterplasmiden und eines Plasmids (Plasmiden), das homologe Sequenzen zu Sequenzen in dem Set von Adapterplasmiden aufweist und das ferner alle adenoviralen Gene umfasst, welche nicht von der komplementierenden Zelllinie oder den Adapterplasmide bereitgestellt werden, die für die Replikation und Verpackung notwendig sind, um ein Set oder eine Bibliothek von rekombinanten adenoviralen Vektoren herzustellen, vorzugsweise in einem miniaturisierten Hochdurchsatzaufbau. Zur Identifikation und Zuordnung einer Funktion zu einem Produkt (Produkten), das von den Nukleinsäureproben kodiert wird, wird der Wirt in einem Hochdurchsatzaufbau mit den rekombinanten adenoviralen Vektoren transduziert, die das Produkt(e) der Nukleinsäureproben exprimieren und dadurch einen Phänotyp eines Wirts verändern. Der veränderte Phänotyp wird identifiziert und als Grundlage verwendet, um dem durch die Nukleinsäureproben kodierten Produkt(en) eine Funktion zuzuordnen. Das plasmid-basierte System wird verwendet, um schnell Adenovirusvektor-Bibliotheken herzustellen, die für das Hochdurchsatzscreening vorzugsweise RCA-frei sind. Jeder Schritt des Verfahrens kann in einem Multiwell-Format und automatisiert durchgeführt werden, um die Kapazität des Systems weiter zu verbessern. Dieses Hochdurchsatzsystem erleichtert die Expressionsanalyse einer großen Zahl von Nukleinsäureproben vom Menschen oder anderen Organismen sowohl in vitro als auch in vivo und stellt eine signifikante Verbesserung gegenüber anderen verfügbaren Techniken auf dem Gebiet dar.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Konstruktion von pBS.PGK.PCRI. pBS.PGK.PCRI kodiert den humanen Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor, der operativ mit den Adenovirus 5 (Ad5) E1-Nukleotiden 459–916 verknüpft ist. Um dieses Plasmid zu konstruieren, wurden die Ad5 Nukleotide 459–916 mittels PCR mit den Primern Ea-1 (SEQ ID NO: 27) und Ea-2 (SEQ ID NO: 28) amplifiziert, mit ClaI verdaut und in die ClaI-EcoRV Schnittstellen von pBluescript (Stratagene) kloniert, was in pBS.PCRI resultiert. Der PGK-Promotor wurde aus pTN durch vollständigen Verdau mit ScaI und partiellen Verdau mit EcoRI ausgeschnitten und in die korrespondierenden Schnittstellen von pBS.PCRI kloniert, was pBS.PGK.PCRI ergibt.
2: Konstruktion von pIG.E1A.E1B.X. pIG.E1A.E1B.X kodiert Ad5 Nukleotide 459–5788 (E1A und E1B Regionen), die operativ mit dem humanen PGK-Promotor verknüpft sind. pIG.E1A.E1B.X kodiert ferner das Ad5 pIX Protein. pIG.E1A.E1B.X wurde durch Ersetzen des ScaI-BspEI Fragments von pAT-X/S mit dem entsprechenden Fragment von pBS.PGK.PCR1.
3A: Konstruktion von pAT-PCR2-NEO. Um dieses Plasmid zu konstruieren, wurden der E1B-Promotor und das Initiationscodon (ATG) des 21 kDa E1B Proteins mittels PCR mit den Primern Ea-3 (SEQ ID NO: 29) und Ep-2 (SEQ ID NO: 30) amplifiziert, wobei Ep-2 an der Initiationsstelle des 21 kDa Proteins eine NcoI Schnittstelle (5'-CCATGG) einführt. Das PCR Produkt (PCRII) wurde mit HpaI und NcoI verdaut und in die korrespondierenden Schnittstellen von pAT-X/S ligiert, was pAT-X/S-PCR2 erzeugt. Das NcoI-StuI Fragment von pTN, welches das Neon und einen Teil der HBV Poly(A)-Region enthält, wurde in die NcoI-NruI Schnittstellen von pAT-X/S-PCR2 ligiert, was pAT-PCR2-NEO erzeugt.
3B: Konstruktion von pIG.E1A.NEO. pIG.E1A.NEO kodiert die Ad5 Nukleotide 459-1713, die operativ mit dem humanen PGK-Promotor verknüpft sind. Ebenfalls kodiert ist der E1B-Promotor, der funktionell mit dem Neomycin-Resistenzgen (Neon) und dem Hepatitis B Virus (HBV) Poly(A)-Signal verknüpft ist. In diesem Konstrukt fungiert das AUG Codon des 21 kDA E1B Proteins als das Initiationscodon von Neon. Das HBV Poly(A)-Signal von pAT-PCR2-NEO (siehe 3A) wurde durch Ersetzen des ScaI-SalI Fragments von pAT-PCR2-NEO mit dem entsprechenden Fragment von pTN vervollständigt, was pAT.PCR2.NEO.p(A) erzeugt, und Ersetzen des ScaI-XbaI Fragments von pAT.PCR2.NEO.p(A) mit dem entsprechenden Fragment von pIG.E1A.E1B.X, was pIG.E1A.NEO erzeugt.
4: Konstruktion von pIG.E1A.E1B. pIG.E1A.E1B enthält die Ad5 Nukleotide 459-3510 (E1A und E1B Proteine), die operativ mit dem PGK-Promotor und dem HBV Poly(A)-Signal verknüpft sind. Dieses Plasmid wurde durch PCR-Amplifikation der N-terminalen Aminosäuren des 55 kDA E1B Proteins mit dem Primern Eb-1 (SEQ ID NO: 31) und Eb-2 (SEQ ID NO: 32), welcher eine XhoI Schnittstelle einführt, konstruiert, mit BgIII verdaut und in die BgIII-NruI Schnittstellen von pAT-X/S kloniert, was pAT-PCR3 erzeugt. Das XbaI-XhoI Fragment von pAT-PCR3 wurde mit dem XbaI-SalII Fragment (das die HBV Poly(A)-Stelle enthält) von pIG.E1A.NEO ersetzt, um pIG.E1A.E1B zu erzeugen.
5: Konstruktion von pIG.NEO. pIG.NEO enthält das Neo^R operativ mit dem E1B-Promotor verknüpft. pIG.NEO wurde konstruiert durch Ligation des HpaI-ScaI Fragment von pIG.E1A.NEO, das den E1B-Promotor und Neo^R enthält, in die EcoRV-ScaI Schnittstellen von pBS.
6: Transformation primärer Babyratten-Nierenzellen (BRK) mit Hilfe von Adenovirus-Verpackungskonstrukten. Subkonfluente Schalen mit BRK Zellen wurden mit 1 oder 5 μg von entweder pIG.NEO, pIG.E1A.NEO, pIG.E1A.E1B, pIG.E1A.E1B.X, pAd5XhoIC oder pIG.E1A.NEO plus pDC26, welches das Ad5 E1B Gen unter der Kontrolle des SV40 Early-Promotors exprimiert, transfiziert. Drei Wochen nach Transfektion, Foci waren sichtbar, wurden die Zellen fixiert, mit Giemsa gefärbt und die Fokusse gezählt. Die dargestellten Ergebnisse zeigen die Durchschnittszahl an Foci pro fünf replizierten Schalen.
7: Western Blot-Analyse von mit pIG.E1A.NEO transfizierten A549 Klonen und humanen embryonalen Retinoblasten (HER Zellen), die mit pIG.E1A.E1B transfiziert wurden (PER Klone). Die Expression der Ad5 E1A und E1B 55 kDa und 21 kDa Proteine in den transfizierten A549 und PER Zellen wurde mittels Western Blot mit monoklonalen Maus-Antikörpern (Mab) M73, der E1A Genprodukte erkennt, und Mabs AIC6 und C1G11 bestimmt, welche die E1B 55 kDa bzw. 21 kDa Proteine erkennen. Die Mab-Bindung wurde unter Verwendung eines Meerrettich Peroxidase-markierten Ziege anti-Maus Antikörpers und verstärkter ("enhanced") Chemilumineszenz visualisiert. 293 und 911 Zellen dienten als Kontrollen.
8: Southern Blot-Analyse von 293, 911 und PER Zelllinien. Zelluläre DNA wurde extrahiert, mit HindIII verdaut, mittels Elektrophorese aufgetrennt und auf Hybond N⁺ Membranen (Amersham) transferiert. Die Membranen wurden mit radioaktiv markierten Sonden hybridisiert, welche durch Random Priming des SspI-HindIII Fragments von pAd5.SalB (Ad5 Nukleotide 342–2805) generiert wurden.
9: Transfektionseffizienz von PER.C3, PER.C5, PER.C6 und 911 Zellen. Die Zellen wurden in 6-Well Platten kultiviert und je zweimal mit 5 μg pRSV.lacZ mittels Calciumphosphat-Koprezipitation transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen mit X-Gal gefärbt, und die blauen Zellen wurden gezählt. Die dargestellten Ergebnisse zeigen den mittleren Prozentanteil an blauen Zellen pro Well.
10: Konstruktion des Adenovirusvektors pMLPI.TK. pMLPI.TK wurde so konzipiert, dass er keinen Sequenzüberlapp mit dem Verpackungskonstrukt pIG.E1A.E1B aufweist. pMLPI.TK wurde aus pMLP.TK durch Deletion der Region mit Sequenzüberlapp mit pIG.E1A.E1B und Deletion der nicht kodierenden von lacZ stammenden Sequenzen abgeleitet. Sie SV40 Poly(A)-Sequenzen wurden mittels PCR mit den Primern SV40-1 (SEQ ID NO: 33), der eine BamHI Schnittstelle einführt, und SV40-2 (SEQ ID NO: 34) amplifiziert, welcher eine BgIII Schnittstelle einführt. Die pMLP.TK Ad5 Sequenzen 2496 bis 2779 wurden mittels PCR mit den Primern Ad5-1 (SEQ ID NO: 35), der eine BgIII Schnittstelle einführt, und Ad5-2 (SEQ ID NO: 36) amplifiziert. Beide PCR Produkte wurden mit BgIII verdaut, ligiert und mittels PCR mit den Primern SV40-1 und Ad5-2 amplifiziert. Dieses dritte PCR-Produkt wurde mit BamHI und AflIII verdaut und in die korrespondierenden Schnittstellen von pMLP.TK ligiert, was pMLPI.TK erzeugt.
11A: Das neue Adenovirus-Verpackungskonstrukt pIG.E1A.E1B hat keinen Sequenzüberlapp mit dem neuen Adenovirus-vektor pMLPI.TK. Die Regionen mit Sequenzüberlapp zwischen dem Verpackungskonstrukt pAd5XhoIC, exprimiert in 911 Zellen, und dem Adenovirus-Vektor pMLP.TK sind dargestellt, die eine homologe Rekombination und die Bildung eines replikationskompetenten Adenovirus zur Folge haben können. Im Gegensatz dazu gibt es keine Regionen mit Sequenzüberlapp zwischen dem neuen Verpackungskonstrukt pIG.E1A.E1B, exprimiert in PER.C6 Zellen, und dem neuen Adenovirus-Vektor pMLPI.TK.
11B: Das neue Adenovirus-Verpackungskonstrukt pIG.E1A.NEO hat keinen Sequenzüberlapp mit dem neuen Adenovirusvektor pMLPI.TK. Es gibt keine Region mit Sequenzüberlapp zwischen dem neuen Verpackungskonstrukt pIG.E1A.NEO und dem neuen Adenovirus-Vektor pMLPI.TK, die eine homologe Rekombination und die Bildung eines replikationskompetenten Adenovirus zur Folge haben kann.
12: Generierung des rekombinanten Adenovirus IG.Ad.MLPI.TK. Das rekombinante Adenovirus IG.Ad.MLPI.TK wurde mittels Cotransfektion von 293 Zellen mit SalI-linearisiertem pMLPI.TK und dem rechten Arm der mit ClaI verdauten Wildtyp Ad5-DNA generiert. Homologe Rekombination zwischen dem linearisierten pMLPI.TK und der Wildtyp Ad5-DNA erzeugt IG.Ad.MLPI.TK DNA, die eine E1-Deletion der Nukleotide 459– 3510 enthält. 293 Zellen transkomplementieren das deletierte Ad5 Genom, wodurch die Replikation der IG.Ad.MLPI.TK DNA und deren Verpackung in Viruspartikel ermöglicht wird.
13: Grundprinzip für das Design von adenovirus-abgeleiteten rekombinanten DNA-Molekülen, welche in Zellen duplizieren und replizieren, die Adenovirus-Replikationsproteine exprimieren. Ein Schema des doppelsträngigen Adenovirus DNA-Genoms, das die ungefähren Orte der E1, E2, E3, E4 und L Regionen bezeichnet, ist dargestellt. Das terminale Polypeptid (TP), das an die 5'-Termini angeheftet ist, ist mit geschlossenen Kreisen bezeichnet. Der rechte Arm des Adenovirus-Genoms kann durch Entfernen des linken Arms mittels Restriktionsenzymverdau gereinigt werden. Nach Transfektion des rechten Arms in 293 oder 911 Zellen erzeugt die adenovirale DNA-Polymerase (weißer Pfeil), die auf dem rechten Arm kodiert ist, nur einzelsträngige Formen. Weder die doppelsträngige noch die einzelsträngige DNA können replizieren, da ihnen ein ITR an einem Terminus fehlt. Versorgen der einzelsträngigen DNA mit einer Sequenz, die am 3'-Terminus eine Hairpin (Haarnadel)-Struktur ausbilden kann, welche als Substrat für die DNA Polymerase dienen kann, wird die Hairpin-Struktur entlang der gesamten Länge des Moleküls verlängern. Dieses Molekül kann ebenfalls als Substrat für eine DNA Polymerase dienen, aber das Produkt ist ein dupliziertes Molekül mit ITRs an beiden Termini, welches in der Gegenwart von adenoviralen Proteinen replizieren kann.
14: Adenovirus-Genomreplikation. Das Adenovirus-Genom ist oben links gezeigt. Die Replikationsursprünge ("origins of replication") liegen zwischen den linken und rechten ITRs an den Enden des Genoms. DNA-Replikation erfolgt in zwei Stufen. Die Replikation schreitet von einem ITR voran, wobei sie einen Tochter-Duplex und einen verdrängten elterlichen Einzelstrang generiert, der mit einem Adenovirus DNA-Bindeprotein (DBP, offene Kreise) umgeben ist und durch Hybridisieren der ITR Sequenzen an beiden Termini eine Pfannenstiel-Struktur ("panhandle structure") ausbilden kann. Der Pfannenstiel ist ein Substrat für die DNA-Polymerase (Pol: weiße Pfeile), um doppelsträngige genomische DNA zu erzeugen. Alternativ schreitet die Replikation von beiden ITRs voran, wobei zwei Tochtermoleküle generiert werden, wodurch das Erfordernis einer Pfannenstiel-Struktur vermieden wird.
15: Potentielle Hairpin-Konformation eines einzelsträngigen DNA-Moleküls, das die HP/asp Sequenz (SEQ ID NO: 47) enthält. Asp718I-Verdau von pICLha, das die klonierten Oligonukleotide HP/asp1 und HP/asp2 enthält, ergibt eine lineare doppelsträngige DNA mit einem Ad5 ITR an einem Terminus und der HP/asp Sequenz am anderen Terminus. In zellen, welche die Adenovirus E2-Region exprimieren, wird eine einzelsträngige DNA mit einem Ad5 ITR am 5'-Terminus und der Hairpin-Konformation am 3'-Terminus produziert. Einmal ausgebildet, kann der Hairpin als Primer für eine zelluläre und/oder Adenovirus DNA-Polymerase dienen, um die einzelsträngige DNA in doppelsträngige DNA umzuwandeln.
16: Darstellung von pICLhac. pICLhac enthält all die Elemente von pICL (19), aber enthält zusätzlich in der Asp718I Schnittstelle die HP/asp Sequenz in einer Orientierung, welche die in 15 gezeigte Hairpin-Struktur erzeugt, nachfolgend der Linearisierung durch Asp718 Verdau und Transfektion in Zellen, die Adenovirus E2 Proteine exprimieren.
17: Darstellung von pICLhaw. pICLhaw ist identisch zu pICLhac (16) mit der Ausnahme, dass die inserierte HP/asp Sequenz in der entgegengesetzten Orientierung vorliegt.
18: Schematische Darstellung von pICLI. pICLI enthält all die Elemente von pICL (19) aber zusätzlich in der Asp718I Schnittstelle ein Ad5 ITR.
19: Darstellung von pICL. pICL ist abgeleitet wie folgt: (i) Nukleotide 1-457, Ad5 Nukleotide 1-457 einschließlich des linken ITR, (ii) Nukleotide 458-969, humaner CMV-Enhancer und Immediate Early-Promotor, (iii) Nukleotide 970-1204, SV40 19S Exon und trunkiertes 16/19S Intron, (iv) Nukleotide 1218-2987, Glühwürmchen ("firefly") Luziferase-Gen, (v) Nukleotide 3018-3131, SV40 Tandem-Polyadenylierungssignale des Late-Transkripts, (vi) Nukleotide 3132-5620, pUC12 Sequenzen einschließlich einer Asp718 Schnittstelle und (vii) Ampicillin-Resistenzgen in reverser Orientierung.
20: Zeigt eine schematische Übersicht über die Adenovirus-Fragmente, die in pBR322 (Plasmid) oder pWE15 (Cosmid) abgeleitete Vektoren kloniert wurden. Die obere Linie stellt das vollständige Adenovirus-Genom flankiert von seinen ITRs (gefüllte Rechtecke) und mit einigen bezeichneten Restriktionsschnittstellen dar. Die den Restriktionsschnittstellen folgenden Nummern bezeichnen die ungefähren Verdaustellen (in kb) im Ad5 Genom.
21: Zeichnung des Adapterplasmids pAd/L420-HSA.
22: Zeichnung des Adapterplasmids pAd/Clip.
23: Schematische Darstellung der Generierung rekombinanter Adenoviren unter Verwendung eines plasmidbasierten Systems. Oben ist die Genomorganisation von Ad5 angegeben, wobei gefüllte Boxen die verschiedenen frühen und späten Transkriptionsregionen und die flankierenden ITRs darstellen. In der Mitte sind die beiden DNAs dargestellt, die für eine singuläre homologe Rekombination verwendet wurden und nach Transfektion in Verpackungszellen zum rekombinanten Virus führten (unten dargestellt).
24: Zeichnung des adenoviralen Minimalvektors pMV/L420H.
25: Helferkonstrukt für die Replikation und Verpackung adenoviraler Minimalvektoren. Schematische Darstellung der Klonierungsschritte für die Generierung des Helferkonstrukts pWE/Ad.Δ5'.
26: Beweis für die SV40-LargeT/Ori-vermittelte Replikation großer adenoviraler Konstrukte in COS-1 Zellen.
26A zeigt eine schematische Darstellung des Konstrukts pWE/Ad.Δ5'. Die Lage der SV40 Ori-Sequenz und der Fragmente, die zur Herstellung von Sonden verwendet wurden, sind angegeben. Beweis für die SV40-LargeT/Ori-vermittelte Replikation großer adenoviraler Konstrukte in COS-1 Zellen. 26B zeigt ein Autoradiogramm des Southern-Blots, der mit der Adenovirus Sonde hybridisiert wurde. 26C zeigt ein Autoradiogramm des Southern-Blots, der mit der pWE Sonde hybridisiert wurde. Spur 1, Markerspur: λ DNA, verdaut mit EcoRI und HindIII. Spur 4 ist leer. Die Spuren 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15 und 17 enthalten unverdaute DNA und die Spuren 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 enthalten MboI-verdaute DNA. Alle Spuren enthalten DNA aus COS-1 Zellen, wie im Text beschrieben transfiziert mit: pWE.pac (Spuren 2 und 3), pWE/Ad.Δ5' Konstrukt #1 (Spuren 5 und 6), #5 (Spuren 7 und 8) und #9 (Spuren 9 und 10), pWE/Ad.AflII-rITR (Spuren 11 und 12), pMV/CMV-LacZ (Spuren 13 und 14), pWE.pac verdaut mit PacI (Spuren 15 und 16) oder pWE/Ad.AflII-rITR verdaut mit PacI (Spuren 17 und 18). Pfeile deuten auf das erwartete positive Signal von 1416 bp (26B) und 887 bp (26C).
27: Produktion von E1/E2A-deletierten adenoviralen Vektoren und deren Effizienz in einem miniaturisierten PER.C6/E2A-basierten Produktionssystem (Beispiel 10):
28: Durschnittliche, in einer 96-Well Platte erzeugte Titer, wie gemessen, unter Verwendung eines PER.C6/E2A-basierten Plaque-Assays (Beispiel 11).
29: Genauigkeit des miniaturisierten PER.C6/E2A-basierten Produktionssystems zur Herstellung adenoviraler Vektoren für eine Reihe von Marker und humanen cDNA Transgenen (Beispiel 12).
30: Relative Anzahl an Wells mit CPE nach Transfektion von PER.C6/E2A Zellen mit pCLIP-LacZ, das nach sechs verschiedenen Protokollen gereinigt wurde (Beispiel 13). Qiagen: Standard alkalische Lyse, gefolgt von Qiagen Plasmidreinigung; AlkLys: alkalische Lyse, gefolgt von Isopropanolpräzipitation und Solubilisierung in TE-Puffer; AL+RNase: alkalische Lyse, gefolgt von Isopropanol-Präzipitation und Solubilisierung in TE-Puffer, der 10 μg/ml RNase enthält; AL+R+Phenol: alkalische Lyse, gefolgt von Isopropanolpräzipitation und Solubilisierung in TE-Puffer, der 10 μg/ml RNase enthält, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation; CTAB: Standard CTAB-Plasmidisolation; CTAB+Phenol: Standard CTAB-Plasmidisolation, aber Solubilisierung in TE-Puffer, der 10 μg/ml RNase enthält, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion.
31: Einfluss der Verwendung von verdautem Plasmid ohne Phenol-Chloroform-Reinigung zur Transfektion (Beispiel 14). Die Ergebnisse aller Experimente sind dargestellt und ausgedrückt als Prozentanteil der Wells, die CPE-Bildung zeigen. A) LacZ-Adapter DNA wurde unter Verwendung von sechs verschiedenen Isolationsmethoden isoliert (siehe Beispiel 13); 1: Qiagen, 2: Alkalische Lyse, 3: Alkalische Lyse + RNase-Behandlung, 4: Alkalische Lyse + RNase-Behandlung + P/C Reinigung der DNA vor der Linearisierung, 5: CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid), 6: CTAB + P/C Reinigung der DNA vor der Linearisierung, rITR wurde P/C gereinigt. B) Gereinigte und ungereinigte EGFP- und EYFP-Adapter DNA, rITR wurde P/C gereinigt. C) EGFP-Adapter DNA und rITR wurden gereinigt und ungereinigt getestet; 1: sowohl Adapter als auch rITR gereinigt (Kontrolle), 2: rITR gereinigt, Adapter DNA ungereinigt, 3: rITR und Adapter ungereinigt.
32: Stabilität adenoviraler Vektoren, die in miniaturisiertem Format hergestellt und für bis zu drei Wochen bei drei verschiedenen Temperaturen inkubiert wurden, welche unter Verwendung eines Plaque-bildenden Assays für adenovirale Vektoren gemessen wurde (Beispiel 15).
33: Effizienzen der Virusgenerierung in Prozent CPE nach Virusgenerierung mehrerer Adenoviren (E1 und E2Adeletiert), die cDNAs in antisense Orientierung (AS) enthalten (Beispiel 16).
34A–M: Plasmidkarten adenoviraler Adapterplasmide (Beispiel 17). Diese adenoviralen Adapterplasmide sind insbesondere der Konstruktion von Expressionsbibliotheken in adenoviralen Vektoren dienlich, wie zum Beispiel der gegenstand dieser Anmeldung. Sie haben sehr seltene Restriktionsschnittstellen für die Linearisierung von Adaptern und Bibliotheken von Adaptern (mit inserierten Transgenen) und inaktivieren den Adapter nicht durch Verdau der Inserts.
34M: Das Cosmid, das von pIPspAdapt5- oder pCLIP-IppoI-polynew abstammende adenovirale DNA enthält, kann für in vitro Ligationen verwendet werden. Doppelsträngige Oligonukleotide, die kompatible Überhänge enthalten, werden zwischen die I-CeuI und PI-SceI Schnittstellen, zwischen I-CeuI und PI-PpoI, zwischen I-SceI und PI-SceI und zwischen I-SceI und PI-PpoI ligiert. Anschließend wird die PacI Restriktionsendonuklease nicht nur verwendet, um das Konstrukt nach der Ligation zu linearisieren und dadurch die linken und rechten ITRs freizusetzen, sondern auch um Nicht-Rekombinante zu eliminieren.
34N: relative Anzahl an Wells mit CPE nach Transfektion von PER.C6/E2A zellen mit pCLIP-LacZ und dem Adapterplasmid pIPspAdapt2.
35: (Beispiel 19) Prozentanteil der virusproduzierenden Wells (CPE positiv) in einer 96-Well Platte von CER.C6 Zellen nach propagieren der mittels Frieren/Tauen transfizierten Zelllysaten. Die zur Cotransfektion verwendeten Helfermoleküle waren (1) pWE/Ad.AflII-rITRsp, (2) pWE/Ad.AflII-rITRsp.dE2A, (3) pWE/Ad.AflII-rITRsp.dXba und (4) pWE/Ad.AflII-rITR.
36: (I und II)(Beispiel 20) Schematische Übersicht über die Konstruktion einer adenoviralen cDNA-Expressionsbibliothek in Arrayanordnung.
37: (Beispiel 21) Vergleich der Cotransfektionen verschiedener Adapterplasmide und pWE/Ad.AflII-rITRsp.dE2A auf 384-Well Platten mit Cotransfektionen auf 96-Well Platten.
Gezeigt ist der Prozentanteil der virusproduzierenden Wells (CPE positive Wells), die zu verschiedenen Zeitpunkten, wie angezeigt, nach Propagieren der mittels Frieren/Tauen transfizierten Zellen zu neuen PER.C6/E2A fünf Tage nach Transfektion (oberes Panel) oder sieben Tage nach Transfektion (unteres Panel) gezählt wurden.
38A, B ,C: (Beispiel 22) Prozentanteil der virusproduzierenden Wells (CPE positive Wells), die zu verschiedenen Zeitpunkten, wie angezeigt, nach Wechsel des Mediums der transfizierten Zellen sieben Tage nach Transfektion (A); ohne Mediumwechsel (B) und nach Standard-Propagieren der mittels Frieren/Tauen transfizierten Zellen zu neuen PER.C6/E2A gezählt wurden.
39: (Beispiel 23) Prozentanteil der virusproduzierenden Wells (CPE positive Wells), die nach Propagieren der mittels Frieren/Tauen transfizierten Zellen zu neuen PER.C6/E2A in drei unterschiedlichen Experimenten unter Verwendung von PER.C6/E2A für die Transfektionen, die zum Zeitpunkt der Transfektion die angegebene Konfluenz hatten, gezählt wurden. Die Legende der Figur bezieht sich auf Tabelle 9, in der die absoluten Zellzahlen jeder Flasche in jedem Experiment gezählt wurden. Die Zellen dieser Flaschen wurden verwendet, um 96-Well Platten für die Transfektion mit adenoviralen Adapter- und Helfer-DNA Molekülen auszusäen.
40: Die Verwendung adenoviraler Expressionsvektoren als semi-stabiles Expressionssystem für Assays mit einem verzögerten Auslesen ("readout") des Phänotyps nach Infektion mit einer adenoviralen Expressionsbibliothek (Beispiel 24). Verwendetes Transgen: Green Fluorescent Protein (EGFP, Clontech). Ein PER.C6/E2A Produktionsrohlysat wurde bei einer MOI von etwa 500–1000 verwendet.
41: Die Verwendung von PEI zum Generieren adenoviraler Vektoren in miniaturisiertem Format (Beispiel 25). Transfektionseffizienz, Virusbildung (CPE) und Proliferation (Toxizität) sind dargestellt.
42: Einfluss der Temperatur PEI zum Zeitpunkt der Transfektionen auf die CPE Effizienz (Beispiel 25). W: Warm (Raumtemperatur) und C: Kalt (4°C).
43: Einfluss des PEI Transfektionsvolumens auf die Transfektionseffizienzen (Beispiel 25).
44: Waschen der PER.C6/E2A Zellen mit serumfreiem Medium vor Applikation des Lipofektamin/DNA-Komplexes kann weggelassen werden (Beispiel 26).
In einem Aspekt schafft die Erfindung eine Bibliothek, wie in Anspruch 1 definiert. Ein Vorteil dieser Bibliothek ist es, dass diese Bibliothek sehr effizient in Zellen eingeführt werden kann. Ein weiterer Vorteil dieser Bibliothek ist es, dass sie eine Vielzahl von Kompartimenten umfasst, von denen jedes zumindest eine Nukleinsäure umfasst. Diese Bibliothek kann vorzugsweise verwendet werden, um den Effekt einer exprimierten Nukleinsäure in einer Zelle zu studieren. Eine Bibliothek mit dieser Architektur kann vorzugsweise verwendet werden, um diejenigen Kompartimente schnell zu selektieren, die zumindest eine Nukleinsäure umfassen, welche einen bestimmten Effekt ausübt, wenn sie in Zellen exprimiert ist. Wenn ein Kompartiment nur eine Nukleinsäure umfasst, dann ist bekannt, dass diese Nukleinsäure den Effekt bewirkt. Wenn ein Kompartiment mehr als eine Nukleinsäure umfasst, dann ist bekannt, dass zumindest eine dieser mehr als eine Nukleinsäuren den Effekt bewirkt. Der Vorteil zu wissen, welches Kompartiment die Nukleinsäure umfasst, welche einen bestimmten Effekt ausüben kann, ist größer, wenn dieses Kompartiment relativ wenige verschiedene Nukleinsäuren umfasst, und dieser Effekt ist am größten, wenn dieses Kompartiment nur eine Nukleinsäure umfasst. Es ist weiterhin von Vorteil, die Anzahl an verschiedenen Nukleinsäuren pro Kompartiment genau zu kennen, insbesondere in großen Bibliotheken.
Eine zu exprimierende Nukleinsäure kann eine beliebige exprimierbare Nukleinsäure sein, wie zum Beispiel eine Nukleinsäure, für ein proteinöses Molekül, ein RNA-Molekül oder ein DNA-Molekül kodiert.
Eine Zelle kann jede beliebige Art von Zelle sein. Wenn zum Beispiel die Bibliothek nach dem Vorhandensein von Nukleinsäuren mit potentiell therapeutischem Wert gescreent wird, ist besagte Zelle vorzugsweise eine eukaryontische Zelle, vorzugsweise eine Säugetierzelle.
In einer Ausführungsform umfasst das zumindest eine Kompartiment zumindest zwei adenovirale Vektoren. Speziell bei, aber nicht beschränkt auf große Bibliotheken kann es vorteilhaft werden, die Anzahl der Kompartimente zu reduzieren, um zumindest teilweise die Anzahl von Sreening-Assays, die durchgeführt werden müssen, zu vermindern. Zum Beispiel können in solchen Fällen Bibliotheken bereitgestellt werden, die mehr als einen Vektor umfassen. Wenn anschließend an einen Screening-Assay ein bestimmter Effekt mit einem bestimmten Kompartiment korreliert werden kann, kann der Vektor im besagten Kompartiment getrennt in einem zusätzlichen Screening-Assay analysiert werden, um den Vektor zu selektieren, der Nukleinsäure umfasst, deren Expression den Effekt bewirkt. Auf der anderen Seite kann es jedoch in einem anderen Aufbau vorteilhaft sein, mehr als einen adenoviralen Vektor in einem Kompartiment zu haben, zum Beispiel wenn eine Bibliothek, die einen adenoviralen Vektor pro Kompartiment enthält, nach Nukleinsäuren gescreent wird, die in der Lage sind, einen Effekt in Kombination mit einer bestimmten anderen Nukleinsäure zu bewirken. Die andere Nukleinsäure kann im Anschluss durch Hinzufügen eines Vektors, der die bestimmte andere Nukleinsäure umfasst, zu allen Kompartimenten vor Durchführung des Sreening-Assays der Zelle bereitgestellt werden. In ähnlicher Weise kann der zumindest eine Vektor zumindest zwei Nukleinsäuren umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure, die von einem Adenovirus abgeleitet ist, eine Nukleinsäure, die ein spätes Adenovirus-Protein oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder ein Analog davon umfasst. Ein spätes Adenovirus-Protein, z. B. von Adenovirus Fiber-Protein, kann vorzugsweise verwendet werden, um den zumindest einen Vektor genau zu einer bestimmten Zelle zu führen oder eine verbesserte Zufuhr des zumindest einen Vektors zu dieser Zelle zu induzieren. Vorzugsweise kodiert die von einem Adenovirus abstammende Nukleinsäure im Wesentlichen alle späten Adenovirus-Proteine, welche die Ausbildung des gesamten Adenovirus-Capsids ermöglichen, oder funktionelle Teile, Analoga und/oder Derivate davon. Vorzugsweise umfasst die von einem Adenovirus abstammende Nukleinsäure eine Nukleinsäure, die das Adenovirus E2A oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder ein Analog davon kodiert. Vorzugsweise umfasst die von einem Adenovirus abstammende Nukleinsäure eine Nukleinsäure, die zumindest ein E4-Regionprotein oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder ein Analog davon kodiert, und somit zumindest zum Teil die Replikation einer von einem Adenovirus abstammenden Nukleinsäure in einer Zelle erleichtert.
In einer Ausführungsform umfasst die von einem Adenovirus abgeleitete Nukleinsäure eine Nukleinsäure, die zumindest ein E1-Regionprotein oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder ein Analog davon kodiert. Die Gegenwart einer Adenovirus-Nukleinsäure, die ein E1-Regionporotein kodiert, erleichtert zumindest teilweise die Replikation der Nukleinsäure in einer Zelle. Eine solche Replikationskapazität wird bei bestimmten Anwendungen bevorzugt, zum Beispiel wenn das Screening nach exprimierbaren Nukleinsäuren durchgeführt wird, die in der Lage sind, Tumorzellen auszurotten. In solchen Fällen kann die Replikation einer Adenovirus Nukleinsäure, die zur Amplifikation des Vektors beispielsweise in einem Säugetier führt, welches Tumorzellen umfasst, zur Ausrottung auch von metastasierender Tumorzellen führen. Auf der anderen Seite kann die Gegenwart einer Adenovirus Nukleinsäure, die ein E1-Regionprotein kodiert, zum Beispiel zumindest teilweise die Amplifikation der Nukleinsäure in einer Zelle erleichtern, z. B. die Amplifikation von Vektoren, welche die Adenovirus Nukleinsäure umfassen.
In einer Ausführungsform umfasst der Vektor zusätzlich eine Nukleinsäure, die ein Adeno-assoziiertes Virus Terminal Repeat oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder ein Analog davon umfasst, und somit die Integration der zumindest einen Nukleinsäure in einer Zelle erlaubt.
In einer Ausführungsform umfasst das virale, von einem Adenovirus abgeleitete Element ein Adenoviruscapsid oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder ein Analog davon. Die Biologie von Adenoviren ist vergleichsweise auch auf der molekularen Ebene gut bekannt. Viele Werkzeuge für Adenovirusvektoren wurden und werden entwickelt, und machen damit ein Adenoviruscapsid zu einem bevorzugten Vehikel der Wahl zum Einbau in eine Bibliothek der Erfindung. Ein Adenovirus ist in der Lage, eine Vielzahl von Zellen zu infizieren. Verschieden Adenovirus-Serotypen weisen jedoch verschiedene Präferenzen für Zellen auf. Um die Zielzellpopulation, in die ein Adenoviruscapsid der Erfindung eindringen kann, zu kombinieren und zu erweitern, umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform das Vehikel Adenovirus-Fiberproteine aus zumindest zwei Adenoviren.
In einem weiteren Aspekt schafft die Erfindung ein Verfahren zur Messung der Funktion einer singulären Nukleinsäure (Nukleinsäuren), wie in Anspruch 28 definiert. Gegenwärtig ist eine wachsende Zahl von Nukleinsäuren sequenziert und kloniert. Die Klonierung und Sequenzierung von Nukleinsäuren schreitet in der Tat in solch einer Rate voran, dass von den meisten der neu klonierten und sequenzierten Nukleinsäuren die Funktion nicht bekannt ist. Ferner sind von Nukleinsäuren mit einer bekannten Funktion nicht alle Funktionen bekannt. Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung der Funktion einer Nukleinsäure bereitzustellen. In einem Aspekt stellt die Erfindung daher ein Verfahren zum Sreening einer Bibliothek der Erfindung in einem Screening-Assay bereit, wobei eine Funktion einer Nukleinsäure beurteilt werden kann. In einem derartigen Assay ist die Funktion zentral. Eine Bibliothek der Erfindung wird nach dem Vorhandensein einer exprimierbaren Nukleinsäure gescreent, die in der Lage ist, zumindest teilweise die Funktion zu beeinflussen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Vielzahl an Zellen über eine Anzahl von Kompartimenten verteilt, von denen jedes zumindest einen Vektor umfasst, der zumindest eine Nukleinsäure der Bibliothek umfasst. Die Anzahl der Kompartimente entspricht vorzugsweise der Vielzahl von Kompartimenten der Bibliothek. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zusätzlich die Selektion des Vektors, der eine gewünschte Funktion umfasst.
In einem weiteren Aspekt schafft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek, wie in Anspruch 18 definiert. Für die Expression einer Nukleinsäure ist eine ganze Reihe gut bekannter molekularer Elemente erforderlich und/oder kann verwendet werden, wie beispielsweise aber nicht beschränkt auf Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Translationsstart- und -stoppsignale etc.
Die Rekombination kann durch jedes beliebige Mittel erfolgen, wie zum Beispiel durch die Mittel des molekularen Klonierens und/oder Polymerase-vermittelte Amplifikationstechiken, wie etwa PCR und NASBA. Die Rekombination umfasst jedoch vorzugsweise homologe Rekombination zwischen zumindest teilweise überlappenden Sequenzen in einem Nukleinsäurevehikel und der zumindest einen Nukleinsäure. Besonders für die Generierung großer, von Viren abstammender Nukleinsäuren wird die homologe Rekombination bevorzugt. Vorzugsweise umfasst das Nukleinsäurevehikel und/oder die zumindest eine Nukleinsäure eine Adenovirus Nukleinsäure oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder ein Analog davon. In einem Beispiel umfasst die Adenovirus Nukleinsäure eine Mutation im Wirtsbereich, die es dem Adenovirus ermöglicht, in nicht humanen Primatenzellen zu replizieren.
Die Erfindung stellt ferner die Verwendung einer mittels eines Verfahrens der Erfindung erhältlichen Bibliothek zur Bestimmung zumindest einer Funktion zumindest einer Nukleinsäure bereit, welche in der Bibliothek der Erfindung vorhanden ist.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Amplifikation eines Vehikels bereit, dass in der Bibliothek der Erfindung vorhanden ist, welches umfasst: Versorgen der Zelle mit dem Vehikel, Kultivieren der Zelle, was die Amplifikation des Vehikels ermöglicht, und Ernten der durch die Zelle amplifizierten Vehikel. Vorzugsweise ist die Zelle eine Primatenzelle, und ermöglicht somit die Amplifikation von Vehikeln, die virale Elemente umfasst, welche die Replikation des Nukleinsäurevehikels ermöglichen. Vorzugsweise umfasst die Zelle eine Nukleinsäure, die ein Adenovirus E1-Regionprotein kodiert, und somit unter anderem die Amplifikation von Vehikeln erlaubt, die virale Elemente umfassen, welche von einem Adenovirus abgeleitet sind, der eine Adenovirus Nukleinsäure aufweist, die eine funktionelle Deletion zumindest eines Teils der E1-Region aufweist. Vorzugsweise ist die Zelle eine PER.C6 Zelle (ECACC Hinterlegungsnummer 96022940) oder ein funktionelles Derivat und/oder ein Analog davon. Eine PER.C6 Zelle oder ein funktionelles Derivat und/oder Analog davon ermöglicht die Replikation der Adenovirus Nukleinsäure mit einer Deletion der E1-kodierenden Region ohne gleichzeitige Herstellung eines replikationskompetenten Adenovirus in den Fällen, in denen die Adenovirus Nukleinsäure und die chromosomale Nukleinsäure in der PER.C6 Zelle oder einem funktionellen Derivat und/oder Analog davon keinen Sequenzüberlapp aufweisen, der eine homologe Rekombination zwischen der Adenovirus und chromosomalen Nukleinsäure erlaubt, die zur Ausbildung eines replikationskompetenten Adenovirus führt.
Vorzugsweise umfasst die Zelle zusätzlich eine Nukleinsäure, die Adenovirus E2A und/oder ein Adenovirus E4-Regionprotein oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder ein Analog davon kodiert, und somit die Replikation der Adenovirus Nukleinsäure mit funktionellen Deletionen der Nukleinsäure erlaubt, die Adenovirus E2A und/oder ein Adenovirus E4-Regionprotein kodieren, wodurch die Replikation der Adenovirus Nukleinsäure in einer Zelle inhibiert wird, welche die Nukleinsäure nicht umfasst, die Adenovirus E2A und/oder ein Adenovirus E4-Regionprotein oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder ein Analog davon kodiert, zum Beispiel eine Zelle, die in der Lage ist, eine bestimmte Funktion auszuüben.
In einem Beispiel umfasst das Nukleinsäurevehikel keinen Sequenzüberlapp mit einer anderen, in der Zelle vorhandenen Nukleinsäure, was zur Ausbildung eines Nukleinsäurevehikels führt, das in der Lage ist, bei Fehlen der E1-Region kodierten Proteine zu replizieren.
Die Erfindung stellt weiterhin eine Bibliothek gemäß der Erfindung oder ein Verfahren gemäß der Erfindung bereit, wobei die Vielzahl von Kompartimenten ein Multiwell-Format aufweist. Ein Multiwell-Format ist für die automatisierte Durchführung zumindest eines Teils der Verfahren der Erfindung sehr geeignet.
In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Bibliothek bereit, wobei die zumindest eine Nukleinsäure ein Produkt unbekannter Funktion kodiert.
Die Bibliothek der Erfindung und/oder die Verfahren der Erfindung werden vorzugsweise in einem zumindest im Wesentlichen automatisierten Aufbau verwendet oder durchgeführt.
Die Erfindung stellt zusätzlich eine, Vielzahl von Zellen bereit, die eine Bibliothek gemäß der Erfindung umfassen.
Die Erfindung verwendet die Hochdrucksatzgenerierung rekombinanter adenoviraler Vektor-Bibliotheken, die ein oder mehr Nukleinsäureproben enthalten, gefolgt vom Hochdrucksatzscreening der adenoviralen Vektor-Bibliotheken in einem Wirt, um den Phänotyp eines Wirts zu verändern als ein Mittel der Zuordnung einer Funktion zu einem Expressionsprodukt(en) von Nukleinsäureproben. Bibliotheken von E1-deletierten Adenoviren werden in einem Hochdrucksatzaufbau unter Verwendung von Nukleinsäurekonstrukten und transkomplementären Verpackungszellen generiert. Die Bibliotheken von Nukleinsäureproben können ein Set von verschiedenen definierten oder undefinierten Sequenzen sein oder können ein Pool aus undefinierten oder definierten Sequenzen sein. Das erste Nukleinsäurekonstrukt ist ein relativ kleines und einfach zu manipulierendes Adapterplasmid, dass in einer operablen Konfiguration zumindest ein linkes ITR, ein Verpackungssignal und eine Expressionskassette mit den Nukleinsäureproben enthält. Das zweite Nukleinsäurekonstrukt enthält ein oder mehr Nukleinsäuremoleküle, die partiell miteinander und/oder mit Sequenzen ersten Konstrukts überlappen, und enthält zumindest all diejenigen Adenovirus-Sequenzen, die für die Replikation und Verpackung eines rekombinanten Adenovirus notwendig sind, und die vom Adapterplasmid oder den Verpackungszellen nicht bereitgestellt werden. Das zweite Nukleinsäurekonstrukt ist in E1-Regionsequenzen und optional in anderen E2B-Regionsequenzen, als denen, die für die Virusgenerierung benötigt werden, und/oder E2A-, E3- und/oder E4-Regionsequenzen deletiert. Cotransfektion des ersten und des zweiten Nukleinsäurekonstrukts in die Verpackungszellen führt zur homologen Rekombination zwischen überlappenden Sequenzen im ersten und zweiten Nukleinsälurekonstrukt und innerhalb des zweiten Nukleinsäurekonstrukts, wenn dieses aus mehr als einen Nukleinsäuremolekül besteht. Im Allgemeinen bestehen die überlappenden Sequenzen aus nicht mehr als 5000 bp und beinhalten E2B-Regionsequenzen, die für Virusproduktion essentiell sind. Es wird eine rekombinante virale DNA mit einer E1-Deletion generiert, die in der Lage ist, in den E1-komplementierenden Verpackungszellen zu replizieren und zu propagieren, um eine rekombinante Adenovirus Vektor-Bibliothek zu produzieren. Die Adenovirus Vektor-Bibliothek wird in einem Hochdurchsatzaufbau in einem Wirt eingeführt, der angezogen wurde, um die ausreichende Expression des Produkts (der Produkte) zu gewährleisten, welche von den Nukleinsäureproben kodiert werden, um die Detektion und Analyse seiner biologischen Aktivität zu ermöglichen. Der Wirt können in vitro kultivierte Zellen oder ein Tier oder ein Pflanzenmodell sein. Eine ausreichende Expression des Produkts (der Produkte) welche durch die Nukleinsäureproben kodiert werden, verändert den Phänotyp des Wirts. Unter Verwendung einer beliebigen Anzahl von in vitro oder in vivo Assays für die biologische Aktivität wird der veränderte Phänotyp identifiziert und analysiert und die Funktion dabei dem Produkt (Produkten) der Nukleinsäureproben zugeordnet. Die plasmid-basierten Adenovirus Vektorsysteme, die hier beschrieben sind, sind für die Erzeugung großer Gentransfer-Bibliotheken vorgesehen, die für das Sreening nach neuen, für humane Erkrankungen maßgeblichen in Genen verwendet werden können. Die Identifikation eines nützlichen oder vorteilhaften biologischen Effekts einer bestimmten adenovirus-vermittelten Transduktion kann ein nützliches gentherapeutisches Produkt oder ein Target für ein Arzneimittel bestehend aus einem kleinen Molekül zur Behandlung humaner Erkrankungen zur Folge haben.
Die Erfindung weist gegenüber den gegenwärtig verfügbaren Techniken mehrere Vorteile auf. Der gesamte Prozess eignet sich für die Automatisierung, insbesondere wenn er in einem 96-Well oder anderen Multiwell-Formaten realisiert wird. Das Hochdurchsatzscreening unter Verwendung einer Reihe verschiedener in vitro Assays stellt ein Mittel bereit, um effizient und in relativ kurzer Zeit Funktionsinformationen zu erhalten. Das Mitglied (die Mitglieder) der rekombinanten adenoviralen Bibliotheken, die in einem Wirt in vitro oder in situ einen gewünschten Phänotyp zeigen der indizieren, werden identifiziert, um die Bibliotheken in eine zu handhabende Zahl von rekombinanten Adenovirus-Vektoren oder Klonen zu zerlegen, die in vitro in einem Tiermodell getestet werden können.
Ein weiterer deutlicher Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die Verfahren RCA-freie Adenovirus Bibliotheken erzeugen. Eine RCA-Kontamination in den Bibliotheken könnte ein größeres Hindernis werden, insbesondere wenn die Bibliotheken für die Verwendung in multiplen Screening-Programmen kontinuierlich amplifiziert werden. Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt in der Minimierung der Anzahl der in dem Verfahren involvierten Schritte. Die Verfahren der Erfindung erfordern kein Klonieren jedes einzelnen Adenovirus vor Verwendung in einem Hochdurchsatzscreening-Programm. Andere Systeme schließen einen oder mehrere Schritte in E. coli ein, um eine homologe Rekombination für verschiedene adenovirale Plasmide zu erhalten, die für die Vektorgenerierung notwendig sind (Chartier at al. (1996) J. Virol. 70(7): 4805–4810; Crouzet et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(4): 1414–1419; He et al. (1998) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95(5): 2509–2514). Ein weiteres Plasmidsystem, das für adenovirale Rekombination und die Generierung adenoviraler Vektoren verwendet wurde, und das auf homologer Rekombination in humanen Zellen passiert, ist die pBHG Serie von Plasmiden. Wird diese jedoch in 293 Zellen verwendet, weisen die Plasmide einen Überlapp mit E1-Sequenzen auf, und das Plasmid pBHG enthält zwei eng beieinanderliegende ITRs, was zusammen zur Instabilität des Plasmids führt. All diese Merkmale sind nicht erwünscht und führen zur RCA-Produktion oder einer auf anderer Weise fehlerhaften Produktion von Adenovirus-Vektoren (Bett et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(19): 8802–8806). Die rekombinanten Nukleinsäuren der Erfindung werden konzipiert, um Konstrukte mit diesen unerwünschten Merkmalen zu vermeiden.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt in der Fähigkeit rekombinanter Adenoviren, rekombinante Gene in vitro und in vivo in einer Vielzahl von Säugetierzellen und Geweben effizient zu transferieren und zu exprimieren, was die hohe Expression der transferierten Nukleinsäureproben zur Folge hat. Die Fähigkeit zur produktiven Infektion ruhender Zellen dehnt die Nützlichkeit der rekombinanten Adenovirus Bibliotheken weiter aus. Zusätzlich sichern hohe Expressionsniveaus, dass das Produkt (die Produkte) der Nukleinsäureproben in ausreichenden Mengen produziert werden, um eine Veränderung im Phänotyp eines Wirts zu indizieren, die detektiert werden kann und es erlaubt, die Funktion des (der) von den Nukleinsälureproben kodierten Produkts (Produkte) zu bestimmen.
Die Nukleinsäureproben können genomische DNA, cDNA, früher klonierte DNA, Gene, ESTs, synthetische doppelsträngige Oligonukleotide oder Zufallssequenzen sein, die von einer oder multiplen verwandten oder nicht verwandten Sequenzen abgeleitet sind, und die direkt als Polypeptid, antisense-Nukleinsäure oder genetisches Suppressorelement (GSE) exprimiert werden können. Die Sequenzen der Nukleinsäureproben können von jedem beliebigen Organismus erhalten werden einschließlich Säugetieren (zum Beispiel Mensch, Affe, Maus), Fisch (zum Beispiel Zebrafisch, Kugelfisch, Lachs), Nematoden (zum Beispiel C. elegans), Insekten (zum Beispiel Drosophila), Hefen, Pilze, Bakterien und Pflanzen. Alternativ werden die Nukleinsäureproben unter Verwendung kommerziell verfügbarer DNA-Synthesegeräte und Kits als synthetische Oligonukleotide hergestellt. Der Strang, der den offenen Leserahmen des Polypeptids oder Produkts der Nukleinsäureprobe kodiert, und der komplementäre Strang werden einzeln hergestellt und hybridisiert, um doppelsträngige DNA auszubilden. Spezielle Hybridisierungsbedingungen sind nicht erforderlich. Die Sequenzen der Nukleinsäureproben können durch Mutagenisieren oder Verfahren, welche die Rekombination fördern, verzufälligt werden oder nicht. Die Nukleinsäurproben kodieren für ein Produkt (Produkte), für das eine biologische Aktivität nicht bekannt ist. Der Ausdruck "biologische Aktivität" soll eine Aktivität bezeichnen, die entweder in situ, in vivo oder in vitro detektierbar oder messbar ist. Beispiele einer biologischen Aktivität schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf veränderte Lebensfähigkeit, morphologische Veränderungen, Apoptose-Induktion, DNA Synthese, Tumorentstehung, Prädisposition für Erkrankungen oder Arzneimittel, chemische Empfindlichkeit oder Sekretion und Proteinexpression.
Die Nukleinsäureproben enthalten vorzugsweise kompatible Enden, um die Ligation mit dem Vektor in der korrekten Orientierung zu erleichtern und die Nukleinsäureproben operativ mit einem Promotor zu verknüpfen. Zum Beispiel können bei der Ligation synthetischer doppelsträngiger Oligonukleotide die zum Vektor kompatiblen Enden in den Oligonukleotiden konzipiert sein. Wenn die Nukleinsäureprobe ESTs, genomische DNA, cDNA, Gene oder eine bereits zuvor klonierte DNA darstellt, können die kompatiblen Enden durch Verdau mit Restriktionsenzymen oder die Ligation von Linkern an die DNA, welche die geeigneten Restriktionsenzym-Schnittstellen enthält, ausgebildet werden. Alternativ kann der Vektor durch die Verwendung von Linkern modifiziert werden. Die Schnittstellen für Restriktionsenzyme werden derart ausgewählt, dass die Transkription der Nukleinsäureprobe von dem Vektor das gewünschte Produkt erzeugt, zum Beispiel ein Polypeptid, eine antisense Nukleinsäure oder ein GSE.
Der Vektor, in den die Nukleinsäureproben vorzugsweise eingebracht werden, enthält in operabler Konfiguration ein ITR, zumindest eine Klonierungsstelle oder vorzugsweise eine multiple Klonierungsstelle zur Insertion einer Bibliothek aus Nukleinsäureproben sowie transkriptionelle regulatorische Elemente zur Abgabe an und Expression von Nukleinsäureproben in einem Wirt. Im allgemeinen enthält er keine E1-Regionsequenzen, andere E2B-Regionsequenzen als diejenigen, die für die späte Genexpression benötigt werden, E2A-Regionsequenzen, E3-Regionsequenzen oder E4-Regionsequenzen. Der E1-detektierte Abgabevektor oder das Adapterplasmid wird mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, entweder gleichzeitig oder sequenziell, um die für das gerichtete Klonieren der Nukleinsäureprobe geeigneten Enden zu erzeugen, unabhängig davon ob es sich um doppelsträngige Oligonukleotide, genomische DNA, cDNA, ESTs oder eine zuvor klonierte DNA handelt. Der Verdau mit Restriktionsenzymen wird routinemäßig unter Verwendung kommerziell verfügbarer Reagenzien gemäß den Empfehlungen der Hersteller durchgeführt und variiert entsprechend der ausgewählten Restriktionsenzyme. Eine ausgeprägtes Set oder ein Pool von Nukleinsäureproben wird in das E1-deletierte Adapterplasmid inseriert, um ein entsprechendes Set oder eine Bibliothek von Plasmiden für die Herstellung von Adenovirus-Vektoren zu erzeugen. Ein Beispiel für ein Adapterplasmid ist pMLPI.TK, das aus den Adenovirus Nukleotiden 1-458 besteht, gefolgt vom Adenovirus Major Late-Promotor, der funktionell mit dem Thymidinkinase-Gen des Herpes Simplex-Virus verknüpft ist, und gefolgt von den Adenovirus Nukleotiden 3511-6095. Weitere Beispiele für Adapterplasmide sind pAd/L420-H5A (21) und pAd/Clip (22). pAd/L420-HSA enthält die Adenovirus Nukleotide 1-454, den L420-Promotor, der mit dem Maus HSA-Gen verknüpft ist, ein Poly A-Signal, gefolgt von den Adenovirus Nukleotiden 3511-6095. pAd/CLIP wurde aus pAd/L420-HSA durch Ersetzen der Expressionskassette (L420-HSA) mit dem CMV-Promotor, einer multiplen Klonierungsstelle, einem Intron und einem Poly A-Signal hergestellt.
Nach dem Verdau werden der Vektor und die Nukleinsäureproben mittels Gelelektrophorese gereinigt. Die Nukleinsäuren können aus verschiedenen Gelmatrices zum Beispiel durch Agaraseverdau, Elektroelution, Schmelzen oder Hochsalzextraktionen extrahiert werden. In Kombination mit diesen Verfahren oder alternativ können die verdauten-Nukleinsäuren auch durch Chromatographie (z. B. Quiagen oder äquivalente DNA-bindende Harze) oder Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt werden. Die optimale Reinigungsmethode hängt von der Größe und vom Typ des Vektors und der Nukleinsäureproben ab. Beide können ohne Reinigung verwendet werden. Im Allgemeinen enthalten die Nukleinsäureproben 5'-Phosphatgruppen, und der Vektor wird mit alkalischer Phosphatase behandelt, um Nukleinsäure-Vektor Ligation zu fördern und Vektor-Vektor Ligation zu verhindern. Falls die Nukleinsäureprobe ein synthetisches Oligonukleotid ist, werden 5'-Phosphatgruppen mittels chemischer oder enzymatischer Mittel hinzugefügt. Bei der Ligation reichen die molaren Verhältnisse von Nukleinsäureproben (Insert) zur Vektor-DNA von annähernd 10 : 1 bis 0.1 : 1. Die Ligationsreaktion wird unter Verwendung von T4 DNA-Ligase, oder einem anderen Enzym durchgeführt, das die doppelsträngige DNA-Ligation katalysiert. Reaktionsdauer und -temperatur können von etwa 5 Minuten bis 18 Stunden bzw. von etwa 15°C bis Raumtemperatur variieren.
Das Ausmaß der Expression kann durch Verwendung von Promotoren (CMV Immediately Early-Promotor, SV40-Promotor, Retrovirus LTRs) moduliert werden, die in ihren transkriptionellen Aktivitäten differieren. Operatives Verknüpfen der Nukleinsäureprobe mit einem starken Promotor, wie beispielsweise dem CMV Immediately Early-Promotor, und optional mit einem oder mehreren Enhancer-Elementen hat eine höhere Expression zu Folge, die es erlaubt, eine geringere Infektionsmultiplizität ("multiplicity of infection") zu verwenden, um den Phänotyp eines Wirt zu verändern. Die Option der Verwendung einer geringeren Infektionsmultiplizität erhöht die Anzahl, wie oft eine Bibliothek in situ, in vitro und in vivo verwendet werden kann. Je geringer außerdem die Infektionsmultiplizität der Virusbibliothek und die in den Screening-Programmen, Assays und Tiermodellen verwendeten Dosierungen sind, desto geringer ist die Möglichkeit, im transduzierten Wirt toxische Effekte auszulösen, was wiederum die Zuverlässigkeit des Systems gemäß der Erfindung erhöht. Ein anderer Weg, um mögliche toxische Effekte zu reduzieren, welche die Expression der Bibliothek betreffen, ist die Verwendung eines regulierbaren Promotors, insbesondere eines Promotors, der während der Virusproduktion reprimiert ist, der aber während des-funktionellen Screenings mit der adenoviralen Bibliothek angeschaltet werden kann oder aktiv ist, um eine zeitliche und/oder Zelltyp-spezifische Kontrolle während des Screeningassays bereitzustellen. Auf diese Weise können Nukleinsälureproben, die Mitglieder der Bibliothek sind, und die toxisch oder inhibitorisch für die komplementierende Zelllinie sind oder die in einer anderen Weise mit der Adenovirus Replikation und -produktion interferieren, weiterhin als ein adenoviraler Vektor produziert werden (siehe WO97/20943). Beispiele für diesen Typ von Promotor sind die AP1-abhängigen Promotoren, die durch adenovirale E1-Genprodukte reprimiert werden, was ein Abschalten der Expression der Nukleinsäureproben während der Produktion der adenoviralen Bibliothek zur Folge hat (siehe van Dam et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10(11): 5857–5864). Ein derartiger Promotor kann durch kombinatorische Techniken hergestellt werden oder es können natürliche oder adaptierte Formen von Promotoren eingeschlossen werden. Beispiele für AP1-abhängige Promotoren sind die Promotoren für die Collagenase, c-myc, Monozyten Chemoattractant-Protein (JE oder mcp-1/JE) und Stromelysin Gene (Hagmeyer et al. (1993) EMBO J. 12(9): 3559–3572; Offringa et al. (1990) Cell 62(23): 527–538; Offringa et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16(23): 10973–10984; van Dam et al. (1989) Oncogene 4(10): 1207–1212). Alternativ können andere spezifische, aber stärkere Promotoren verwendet werden, insbesondere wenn komplexe in vitro Screenings durchgeführt werden, oder wenn in vivo Modelle verwendet werden und eine geweberegulierte Expression gewünscht wird. Jedes Promotor/Enhancer-System, das im gewählten Wirt funktionell ist, kann verwendet werden. Beispiele für geweberegulierte Promotoren schließen die Promotoren mit spezifischer Aktivität oder erhöhter Aktivität in Leber ein, wie z. B. den Albumin-Promotor (Tronche et al. (1990) Mol. Biol. Med. 7(2): 173–185). Ein weiterer Ansatz zur Erhöhung der Expression ist die Erhöhung der Halbwertzeit der mRNA, die von den Nukleinsäureproben transk-ribiert wird, durch Einbau von stabilisierenden Sequenzen in die 3'-untranslatierte Region. Ein zweites Nukleinsäurekonstrukt, ein Helferplasmid mit Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in den E1-deletierten Adapterplasmiden sind, das alle notwendigen adenoviralen Gene enthält, die für Replikation und Verpackungen erforderlich sind wird ebenfalls hergestellt. Vorzugsweise weist das Helferplasmid keine komplementierenden Sequenzen auf, die von den Verpackungszellen exprimiert werden, was zur Herstellung eines replikationskompetenten Adenovirus führen würde. Zusätzlich weisen die Helferplasmide, das Adapterplasmid und die Verpackungszelle vorzugsweise keinen Sequenzüberlapp auf, der zu homologer Rekombination und RCA-Bildung führen würde.
Die Region an Sequenzüberlapp, die dem Adapterplasmid und dem Helferplasmid gemeinsam ist, erlaubt homologe Rekombination und die Ausbildung eines E1-deletierten, replikationsdefekten, rekombinanten Adenovirusgenoms. Im Allgemeinen umfasst die Region des Überlapps die E2B-Regionsequenzen, die für die späte Genexpression erforderlich sind. Das Ausmaß des Überlapps, der die höchste Effizienz ohne nennenswerte Verringerung der Größe des Inserts der Bibliothek bereitstellt, kann in empirisch ermittelt werden. Der Sequenüberlapp liegt im Allgemeinen zwischen 10 bp und 5000 bp, vorzugsweise zwischen 200 bp und 3000 bp.
Die Größe der Nukleinsäurproben oder DNA-Inserts in einer gewünschten Adenovirus Bibliothek kann zwischen mehreren Hundert Basenpaaren (zum Beispiel Sequenzen, die Neuropeptide kodieren) bis zu mehr als 30 kbp (etwa Titin) variieren. Die Klonierungskapazität der unter Verwendung von Adapterplasmiden hergestellten adenoviralen Vektoren kann durch Deletion eines zusätzlichen (zusätzlicher) adenoviralen (adenoviraler) Gens (Gene) erhöht werden, welche im Anschluss einfach durch ein Derivat einer E1-komplementierenden Zelllinie komplementiert werden können. Als ein Beispiel umfassen Kandidatengene für die Deletion E2, E3 und/oder E4. Beispielsweise können Regionen, die für die Adenovirus-Replikation und -verpackung essentiell sind, aus den Adapter- und Helferplasmiden deletiert und beispielsweise durch eine komplementierende Zelllinie exprimiert werden. Für E3-Deletionen brauchen für in vitro Modelle Gene in dieser Region nicht in der Verpackungszelle komplementiert zu werden, und für in vivo Modelle kann der Einfluss auf die Immunogenität des rekombinanten Virus auf einer ad hoc Basis beurteilt werden.
Das Set oder die Bibliothek spezifischer Adapterplasmide oder der (die) Pool(s) von Adapterplasmiden werden in ein Set oder einer Bibliothek adenoviraler Vektoren umgewandelt. Die Adapterplasmide, welche die Nukleinsäureproben enthalten, werden linearisiert und in eine E1-komplementierende Zelllinie transfiziert, welche vorzugsweise in Mikrotiter-Gewebekulturplatten mit 96, 384, 1536 oder mehr Wells pro Platte ausgesät wird, zusammen mit Helferplasmiden, welche Sequenzen homolog zu Sequenzen im Adapterplasmid aufweisen und alle adenoviralen Gene enthalten, die für die Replikation und Verpackung notwendig sind. Rekombination zwischen den homologen Sequenzen, welche den Adapter- und Helferplasmiden gemeinsam sind, um ein E1-deletiertes, replikationsdefektes Adenovirusgenom zu generieren, das repliziert und verpackt wird, vorzugsweise in einer E1-komplementierenden Zelllinie. Falls mehr als ein Helferplasmid verwendet wird, hat die Rekombination zwischen den homologen Regionen, die den Helferplasmiden untereinander gemeinsam sind, auf der einen Seite und die homologe Rekombination mit dem Adapterplasmid auf der anderen Seite die Bildung eines replikationsdefekten, rekombinanten Adenovirusgenoms zur Folge. Die Regionen an Sequenzüberlapp zwischen den Adapter- und Helferplasmiden können zwischen einigen Hundert Nukleotiden oder mehr variieren. Die Rekombinationseffizienz erhöht sich durch Erhöhung der Größe des Überlapps.
Die E1-Funktionen, die von der transkomplementierenden Verpackungszelle bereitgestellt werden, erlauben die Replikation und Verpackung des E1-deltierten rekombinierten Adenovirusgenoms. Die Adapter- und/oder Helferplasmide weisen vorzugsweise keinen Sequenzüberlapp untereinander oder mit den komplementierenden Sequenzen in den Verpackungszellen auf, der zur Bildung eines replikationskompetenten Adenovirus (RCA) führen kann. Vorzugsweise ist zumindest eines der ITRs auf den Adapter- und Helferplasmiden von einer Restriktionsenzymerkennungssequenz flankiert, welche in den adenoviralen Sequenzen oder der Expressionskassette nicht vorhanden ist, sodass das ITR durch Verdau der DNA mit diesem Restriktionsenzym aus den Vektorsequenzen freigesetzt wird. Auf diese Weise erfolgt die Initiation der Replikation effizienter. Um die Effizienz der Generierung rekombinanter Adenoviren zu erhöhen, kann ein höherer Durchsatz erhalten werden, indem Mikrotiter-Gewebekulturschalen mit 96, 384 oder 1536 Wells pro Platte anstelle von großen Gewebekulturflaschen oder -schalen verwendet werden. E1-komplementierende Zelllinien werden in Mitrotiterplatten angezogen und mit den Bibliotheken aus Adapterplasmiden und einem Helferplasmid (Helferplasmiden) cotransfiziert. Eine Automatisierung des Verfahrens beispielsweise durch Verwenden von Robotern kann die Anzahl von Adenovirusvektoren, die hergestellt werden können, zusätzlich erhöhen (Hawkins et al., (1997) Science 276 (5320): 1887–9; Houston (1997) Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 19 Suppl. A: 43–5).
Als Alternative zu den Adapterplasmiden können die Nukleinsäureproben in "minimale" Adenovirus Vektorplasmide ligiert werden. Die sogenannten "minimalen" Adenvovirusvektoren gemäß der Erfindung behalten zumindest einen Teil des viralen Genoms zurück, der für die Verpackung des Genoms in Viruspartikel (das Verpackungssignal) erforderlich ist sowie zumindest eine Kopie von zumindest einen funktionellen Teil oder einem Derivat des Inverted Terminal Repeat (ITR), d. h. DNA-Sequenzen, die von den Termini des linearen Adenovirusgenoms abgeleitet sind, und die für die Replikation erforderlich sind. Die minimalen Vektoren werden vorzugsweise für die Generierung und Produktion von Helfer- und RCA-freien Stocks (Beständen) rekombinanter Adenovirusvektoren verwendet und können bis zu 38 kb fremder DNA aufnehmen. Die Helferfunktionen für die minimalen Adenovirusvektoren werden vorzugsweise in trans über verpackungsdefekte, replikationskompetente DNA-Moleküle bereitgestellt, die all die viralen Gene enthalten, welche die erforderliche Genprodukte kodieren, mit Ausnahme derjenigen Gene, die in der komplementierenden Zelle vorhanden sind, oder der Gene, die sich im Vektorgenom befinden.
Die Verpackung des "minimalen" Adenovirusvektors wird durch Cotransfektion einer E1-komplementierenden Zelllinie mit einem Helfervirus oder alternativ mit einem verpackungsdefizienten replizierenden Helfersystems erreicht. Vorzugsweise wird das verpackungsdefiziente replizierende Helfersystem nach der Transfektion amplifiziert und exprimiert die Sequenzen, die für die Replikation und Verpackung der minimalen Adenovirusvektoren erforderlich sind, und die von der Verpackungszelllinie nicht exprimiert werden. Der verpackungsdefiziente replizierende Helfer wird nicht in die Adenoviruspartikel verpackt, da seine Größe die Kapazität des Adenovirusvirions übersteigt und/oder da ihm ein funktionelles Verpackungssignal fehlt. Der verpackungsdefiziente replizierende Helfer, der minimale Adenovirusvektor und die komplementierende Zelle weisen vorzugsweise keine Region an Sequenzüberlapp auf, welche die RCA-Bindung erlaubt.
Das replizierende verpackungsdefiziente Helfermolekül enthält immer alle Adenovirus kodierenden Sequenzen, welche die für die Replikation und Verpackung notwendigen Proteine produzieren mit oder ohne diejenigen, die von der Verpackungszelllinie bereitgestellt werden. Die Replikation des besagten Helfermoleküls selbst kann oder kann nicht durch Adenovirusproteine und ITRs vermittelt werden Helfermoleküle, die über die Aktivität von Adenovirusproteinen replizieren (d. h. E2-Genprodukte, welche zusammen mit zellulären Proteine agieren), enthalten zumindest ein vom Adenovirus abgeleitetes ITR. Die E2-Genprodukte können durch einen E1-abhängigen oder ein E1-unabhängigen Promotor exprimiert werden. Wo nur ein ITR von einem Adenovirus abstammt, enthält das Helfermolekül ebenfalls vorzugsweise eine Sequenz, die in intramolekularer Weise hybridisiert, um eine Hairpin (Haarnadel)-ähnliche Struktur auszubilden.
Nach der Expression des E2-Genprodukts erkennt die Adenovirus DNA-Polymerase das ITR auf dem Helfermolekül und erzeugt eine einzelsträngige Kopie, und der 3'-Terminus hybridisiert intramolekular, wobei eine Hairpin-ähnliche Struktur ausgebildet wird, die als Primer für die Synthese des reversen Strangs dient. Das Produkt der Synthese des reversen Strangs ist ein doppelsträngiger Hairpin mit einem ITR an einem Ende. Dieses ITR wird von der Adenovirus DNA-Polymerase erkannt, die ein doppelsträngiges Molekül mit einem ITR an beiden Enden erzeugt (siehe zum Beispiel 13), das zweimal so lang wird als das transfizierte Molekül (in unserem Beispiel dupliziert es von 35 kb zu 70 kb). Die Duplikation der Helfer-DNA erhöht die Produktion ausreichender Mengen an Adenovirusproteinen. Vorzugsweise übersteigt die Größe des duplizierten Moleküls die Verpackungskapazität des Adenovirusvirions und wird daher nicht in Adenoviruspartikel verpackt. Das Fehlen eines funktionellen Verpackungssignals im Helfermolekül sichert weiterhin, dass das Helfermolekül verpackungsdefizient ist. Die erzeugten adenoviralen Proteine vermitteln Replikation und Verpackung der cotransfizierten oder coinfizierten minimalen Vektoren.
Wenn die Replikation des Helfermoleküls von Adenovirus E2-Proteinen unabhängig ist, enthält das Helferkonstrukt vorzugsweise einen von SV40 abstammenden Origin of Replication. Die Transfektion dieser DNA zusammen mit dem minimalen adenoviralen Vektor in eine E1-enthaltende Verpackungszelllinie, die ferner das SV40 Large T-Protein induzierbar exprimiert oder so viele von SV40 abgeleitete Proteine wie für eine effiziente Replikation notwendig sind, führt zur Replikation des Helferkonstrukts und Expression der adenoviralen Proteine. Diese initiieren dann die Replikation und Verpackung der cotransfizierten oder coinfizierten minimalen adenoviralen Vektoren. Vorzugsweise gibt es keine Regionen an Sequenzüberlapp, die den replikationsdefizienten Verpackungskonstrukten, den minimalen Adenovirusvektoren und komplementierenden Zelllinien gemeinsam sind, die zur Generierung von RCA führen können.
Es ist selbstverständlich, dass während der Propagation der minimalen adenoviralen Vektoren eine Transfektion eines beliebigen der beschriebenen Helfermoleküle einem jeden Amplifikationsschritt in E1-komplementierenden Zellen vorangeht, da die minimalen Vektoren selbst nicht in E1-komplementierenden Zellen replizieren können. Alternativ kann eine Zelllinie verwendet werden, die alle für die Replikation und Verpackung notwendigen adenoviralen Gene stabil im Genom integriert enthält, und die ausgeschnitten und konditional repliziert werden können (Valerio und Einerhand PCT/NL 9800061).
Die Transfektion der Nukleinsäuren in Zellen ist für die Verpackung der rekombinanten Vektoren in Viruspartikel erforderlich und kann von einer Vielzahl von Chemikalien vermittelt werden einschließlich Liposomen, DEAE-Dextran, Polybren und Phosphazenen oder Phosphazenderivaten (WO 97/07226). Liposomen sind von einer Reihe von kommerziellen Herstellern verfügbar und umfassen DOTAP^® (Boehringer-Mannheim), Tfx^®-50, Transfectam^®, ProFection^® (Promega, Madison, WI), und LipofectAmin^®, Lipofectin^®, LipofectAce^®, (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). In Lösung bilden die Lipide Vesikel aus, die mit der Nukleinsäure assoziieren und ihren Transfer in Zellen durch Fusion der Vesikel mit den Zellmembranen oder durch Endocytose erleichtern. Andere Transfektionsverfahren schließen Elektroporation, Kalziumphosphat-Copräzipitation und Mikroinjektion ein. Falls die Transfektionsbedingungen für eine gegebene Zelllinie noch nicht etabliert wurden oder unbekannt sind, können diese empirisch bestimmt werden (Maniatis et al. Moleular Cloning, Seite 16.30–16.55).
Die Ausbeute an rekombinanten Adenovirusvektoren kann durch Denaturieren der doppelsträngigen Plasmid-DNAs vor Transfektion in eine E1-komplementierende Zelllinie erhöht werden. Die Denaturierung kann unter Verwendung verschiedener Verhältnisse von Adapter- und Helferplasmiden, die überlappende Sequenzen aufweisen, durch Schmelzen der doppelsträngigen DNA zum Beispiel bei 95–100°C, gefolgt von schnellem Abkühlen erreicht werden. Ferner kann ein PER.C6 Derivat, welches das E2A- (DNA-bindendes Protein) und/oder E2B-Gen (pTP-Polymerase) stabil oder transient exprimiert, verwendet werden, um mittels Erhöhung der Replikationsrate pro Zelle die Adenovirusproduktion pro Well zu erhöhen. Alternativ kann eine Cotransfektion von Rekombinase-Protein en) oder Rekombinase DNA-Expressionskonstrukt(en), i. e. Rekombinase von Kluyveromyces waltii (Ringrose et al. (1997) Eur. J. Biochem. 248(3): 903–912) oder jedes andere Gen oder Gene, die Faktoren kodieren, welche die Effizienz homologer Rekombination erhöhen, verwendet werden. Die Zugabe von 0.1–100 mM Natriumbutyrat während der Transfektion und/oder Replikation in den Verpackungszellen kann die Virusproduktion erhöhen. Diese Verbesserungen haben eine erhöhte Virusausbeute pro Mikrotiter-Well zur Folge, und somit erhöhen sich Zahl und Typ der Tests, die mit einer einzelnen Bibliothek durchgeführt werden können, und können die Variabilität zwischen den verschiedenen Genen oder Nukleinsäureproben in einer Bibliothek bewältigen.
Die für die Produktion von Adenovirusvektoren, welche die E1-Region Produkte exprimieren, verwendeten Zelllinien schließen zum Beispiel 293 Zellen, PER.C6 (ECACC 96022940) oder 911 Zellen ein. Jede dieser Zelllinien wurde mit Nukleinsäuren transfiziert, welche die Adenovirus E1-Region kodieren. Diese Zellen exprimieren die E1-Region Genprodukte stabil, und es wurde gezeigt, dass sie E1-deletierte rekombinante Adenovirusvektoren verpacken. Die Ausbeuten der in PER.C6 Zellen erhaltenen rekombinanten Adenoviren sind höher als die in 293 Zellen erhaltenen.
Jede dieser Zelllinien schafft die Basis für das Einführen von zum Beispiel E2B- oder E2A-Konstrukten (zum Beispiel ts125E2A und/oder hrE2A) oder E4 etc., welche die Propagation von Adenovirusvektoren erlauben, die Mutationen, Deletionen oder Insertionen in den entsprechenden Genen aufweisen. Diese Zellen können modifiziert werden, um durch die Einführung rekombinanter Nukleinsäuren, welche die geeigneten Adenovirusgene stabil exprimieren, zusätzliche Adenovirusgenprodukte zu exprimieren, oder rekombinante Nukleinsäuren können eingeführt werden welche das (die) geeigneten Gen(e) transient exprimieren, zum Beispiel verpackungsdefiziente replizierende Helfermoleküle oder Helferplasmide.
Alle oder beinahe alle transkomplementierenden Zellen, die in Mikrotiterplatten-Wells (96, 384, 1536 oder mehr Wells) angezogen werden, produzieren nach Transfektion entweder mit dem Adapterplasmid oder der minimalen Adenovirus Plasmidbibliothek und dem (den) geeigneten Helfermolekül(en) rekombinante Adenoviren. Eine große Zahl an Adenovirus-Gentransfervektoren oder eine Bibliothek, jede(r) experimiert ein singuläres Gen, kann somit einfach in einem Maßstab produziert werden, der die Analyse der biologischen Aktivität des bestimmten Genprodukts sowohl in vitro als auch in vivo ermöglicht. Aufgrund des weit reichenden Gewebetropismus adenoviraler Vektoren ist eine große Anzahl an Zell- und Gewebetypen mit einer adenoviralen Bibliothek transduzierbar.
Bibliotheken von Genen oder Nukleinsäureproben werden vorzugsweise unter Verwendung der obigen Verfahren in RCA-freie adenovirale Bibliotheken umgewandelt. Die adenoviralen Bibliotheken von Genen oder Nukleinsäureproben mit unbekannter Funktion werden im Anschluss verwendet, um ein Hochdurchsatzscreening durchzuführen, welches eine Reihe von in vitro Assays einschließt, wie zum Beispiel immunologische Assays einschließlich ELISAs, Proliferationsassays, Arzneimittelresistenzassays, Enzymaktivitätsassays, Organkulturen, Differenzierungsassays und Cytotoxizitätsassays. Adenovirale Bibliotheken können an Geweben oder Gewebesektionen oder an von Geweben abgeleiteten kurzlebigen primären Zellkulturen getestet werden einschließlich primärer endothelialer und Glattmuskelzellkulturen (Wijnberg et al. (1997) Thromb. Haemost. 78(2): 880–886), Koronararterienbypass-Transplantatbibliotheken, (Vassalli et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35(3): 459–469; Fuster and Chesebro (1985) Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. 13: 285–299), Nabelschnurgewebe einschließende HUVEC (Gimbrone (1976) Prog. Hemost. Thromb. 3: 1–28; Striker et al. (1980) Methods Cell. Biol. 21A: 135–151), "couplet" Hepatozyten (Graf et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(20): 6516–6520) und epidermale Kulturen (Fabre (1991) Immunol. Lett. 29(1–2): 161–165; Phillips (1991) Transplantation 51(5): 937–941). Pflanzenzellkulturen einschließlich Suspensionskulturen können ebenfalls als Wirtszellen für adenovirale Bibliotheken verwendet werden, welche eine beliebige DNA-Sequenz tragen einschließlich von Menschen abgeleitete DNA Sequenzen und von Pflanzen abgeleitete Sequenzen (de Vries et al. (1994) Biochem. Soc. Symp. 60: 43–50; Fukada et al. (1994) Int. J. Devel. Biol. 38(2): 287–299; Jones (1983) Biochem. Soc. Symp. 48: 221–232; Kieran et al. (1997) J. Biotechnol. 59(1–2): 39–52; Stanley (1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3(1): 91–96; Taticek et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5(2): 165–174).
Abhängig von der Größe der initialen unselektierten Bibliothek können, wenn eine adenovirale Bibliothek von Genen durch in vitro Assays in einer handhabbare Zahl von Kandidaten zerlegt wurde, die Adenoviren in geeigneten Tiermodellen getestet werden. Beispiele von Tiermodellen, die verwendet werden können, umfassen Modelle für die Alzheimer-Erkrankung, Arteriosklerose, transgene Tiere, die eine veränderte Expression von endogenen oder exogenen Genen aufweisen, einschließlich von Mäusen mit (einem) Gen(en), die inaktiviert wurden, Tiere mit Krebsformen, die an spezifischen Stellen implantiert wurden, Krebsmetastasemodelle, Modelle für die Parkinson-Erkrankung, chimäre Knochenmarksmäuse, wie zum Beispiel NOD-SCID Mäuse und dergleichen. Wenn eine zusätzliche Untersuchung erforderlich ist können die Stocks an Kandidaten-Adenoviren durch Passage der Adenoviren unter geeigneten transkomplementierenden Bedingungen erweitert werden.
Abhängig vom verwendeten Tiermodell können die adenoviralen Vektoren oder die Mischungen vorselektierter Pools adenoviraler Vektoren an geeigneten Stellen im gewünschten Tier eingeflößt oder appliziert oder verabreicht werden, wie zum Beispiel Lunge (Sene et al. (1995) Hum. Gene Ther. 6(12): 1587–1593) in nicht-humanen Primaten, Hirn von normalen und apoE-defizienten Mäusen (Robertson et al. (1998) Neuroscience 82(1): 171–180), für Modelle der Alzheimer-Erkrankung (Walker et al. (1997) Brain Res. Brain Res. Rev. 25(1): 70–84) und Parkinson-Erkrankung (Hockman et al. (1971) Brain Res. 35(2): 613–618; Zigmond and Stricker, (1984) Life Sci. 35(1): 5–18.), injiziert in den Blutstrom (zum Beispiel intravenös) für Modelle von Lebererkrankungen einschließlich Leberversagen und Wilson-Krankheit (Cuthbert (1995) J. Investig. Med. 43(4): 323–336; Karrer et al. (1984) Curr. Surg. 41(6): 464–467) und Tumormodelle einschließlich Metastasemodelle (Esandi et al. (1997) Gene Ther. 4(4): 280–287; Vincent et al. (1996) J. Neurosug. 85(4): 648–654; Vincent et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7(2): 197–205), Injektion ausgewählter adenoviraler Vektoren direkt in das Knochenmark humaner chimerer NOD-SCID Mäuse (Dick et al. (1997) Stem Cells 15 Suppl. 1: 199–203; Mosier et al. (1988) Nature 335(6187): 256–259). Schließlich können ausgewählte Adenoviren lokal zum Beispiel in das erkrankte vaskulare Gewebe von Restenose Tiermodellen appliziert werden (Karas et al. (1992) J. Am. Coll. Cardiol. 20(2): 467–474).
Zusätzlich können die Laboruntersuchungen durch Verwenden einer elektronischen Version der Sequenzdatenbank, auf der die adenovirale Bibliothek aufgebaut ist, ergänzt werden. Dies ermöglicht zum Beispiel die Suche nach Proteinmotiven und damit die Verknüpfung neuer Mitglieder einer Familie zu bekannten Mitgliedern mit bekannter Funktion derselben Familie. Die Verwendung von 'Hidden Markow Modellen' (HMMs) (Eddy (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(4): 1414–1419) ermöglicht die Etablierung neuer Familien durch Herausfiltern essentieller Merkmale einer Familie und Aufbau eines Modells, wie deren Mitglieder aussehen sollten. Schließlich kann dies mit strukturellen Daten unter Verwendung des "roter Faden-Ansatzes" (threading approach) kombiniert werden, der eine bekannte Struktur als den roten Faden (thread) verwendet und versucht, eine mutmaßliche Struktur zu finden ohne die tatsächliche Struktur des neuen Proteins bestimmt zu haben (Rastan and Beeley (1997) Curr. Opin. Genet. Dev. 7(6): 777–783). Naturgemäß bilden die funktionellen Daten, die unter Verwendung der entsprechend der in dieser Anmeldung offenbarten Verfahren hergestellten adenoviralen Bibliotheken erhalten wurden, die Grundlage des Bemühens, neue Gene mit erwarteten oder erwünschten Funktionen zu finden, und stellt den Kern der funktionellen Genomanalyse dar. Schließlich ist es, wenn die Zahl der Adenvirusvektoren ein Niveau erreicht hat, an dem Tierexperimente durchgeführt werden können, eine weitere Ergänzung des Verfahrens dar, die Selektion der Kandidaten-Adenovirusvektoren, welche die Kandidatengene beinhalten, anzuziehen. Daran kann sich dann eine Reinigung der Klone anschließen, beispielsweise durch-Verwenden eines Adenovirus, der in der Hi-Schleife (loop) der knob-Domäne der Fiber markiert ist. Alternativ kann eine HPLC-Analyse im Großmaßstab in einer semipräparativen Art und Weise durchgeführt werden, um partiell gereinigte Adenovirusproben für Tierexperimente oder in vitro Screenings zu erhalten, in denen gereinigtere Adenoviruspräparationen wünschenswert sind. Deshalb ermöglichen das beschriebene Verfahren und die Reagenzien die schnelle Übertragung einer Kollektion von Genen in in vivo Studien an einer begrenzten Zahl von Tieren, die auf andere Weise nicht möglich wären. Die Automatisierung eines jeden Schritts des Verfahren unter Verwendung von Robotern wird die Anzahl von Genen und Nukleinsäureproben, deren Funktion bestimmt werden kann, weiter erhöhen.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Produktion einer rekombinanten Adenovirus Vektorbibliothek bereit, wobei das Verfahren umfasst:
Anziehen einer Zellkultur, die eine Mehrzahl von Zellen enthält, welche Adenovirus E1-komplementierende Sequenzen umfassen mit:

(i) einer Adapterplasmid-Bibliothek, die ein Adapterplasmid umfasst, das basiert auf oder abgeleitet ist von einem Adenovirus, der keine E1-Regionsequenzen aufweist, die mit E1-Regionsequenzen in der Mehrzahl von Zellen überlappen, oder eine rekombinante, in die Verpackungszelle zu inserierende Nukleinsäure und zur Generierung von replikationskompetenten Adenoviren in der Mehrzahl von Zellen führen würde, und keine anderen E2B-Regionsequenzen als essentielle E2B-Sequenzen, keine E2A-Regionsequenzen, keine E3-Regionsequenzen und keine E4-Regionsequenzen, und in operativer Konfiguration ein funktionelles Inverted Terminal Repeat aufweist, ein funktionelles Verpackungssignal und ausreichende adenovirale Sequenzen, welche die homologe Rekombination mit der rekombinanten Nukleinsäure ermöglichen, und eine Bibliothek von Nukleinsäureproben, die in das Adapterplasmid in operativer Verknüpfung mit einem Promoter inseriert sind; und
(ii) eine rekombinante Nukleinsäure, die basiert auf oder abgeleitet ist von einem Adenovirus, wobei die rekombinante Nukleinsäure in operabler Konfiguration ein funktionelles Inverted Terminal Repeat und ausreichende Adenovirussequenzen zur Replikation umfasst, wobei die rekombinante Nukleinsäure partiell mit der Adapterplasmid-Bibliothek überlappt, was eine homologe Rekombination erlaubt und zu einem replikationsdefekten rekombinanten Adenovirus führt;

Vorzugsweise werden zumindest die Adapterplasmid-Bibliothek oder die rekombinante Nukleinsäure hitzedenaturiert, bevor die Mehrzahl von Zellen oder die Vorläufer der Mehrzahl von Zellen transfiziert werden.
Vorzugsweise weisen die Adenovirus E1-komplementierenden Sequenzen, die Adapterplasmid-Bibliothek und die rekombinante Nukleinsäure keine überlappenden Sequenzen auf, die homologe Rekombination ermöglichen und in einer Zelle, in die sie transferiert wurden, zu einem replikationskompetenten Virus führen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Produktion einer rekombinanten Adenovirus Vektorbibliothek bereit, wobei das Verfahren umfasst:
Anziehen einer Zellkultur, die eine Mehrzahl von Zellen enthält, die Adenovirus E1-komplementierende Sequenzen umfassen, mit:

(i) einer rekombinanten Nukleinsäurebibliothek, die eine erste rekombinante Nukleinsäure umfasst, die basiert auf oder abgeleitet ist von einem Adenovirus, die in operativer Konfiguration zwei funktionelle Inverted Terminal Repeats und ein funktionelles Verpackungssignal umfasst, und keine funktionellen Adenovirusgene aufweist, und eine Bibliothek von Nukleinsäureproben, die in die erste rekombinante Nukleinsäure in operativer Verknüpfung zu einem Promoter inseriert sind; und
(ii) eine zweite rekombinante Nukleinsäure, die basiert auf oder abgeleitet ist von einem Adenovirus, die in operativer Konfiguration zwei funktionelle Inverted Terminal Repeats und ausreichende Adenovirussequenzen zur Replikation aufweist, wobei die zweite rekombinante Nukleinsäure eine Deletion von zumindest der E1-Region und dem Verpackungssignal des Adenovirus umfasst;

Vorzugsweise liegt die Zellkultur in einem Multiwell-Format vor.
Vorzugsweise besitzen die Adenovirus E1-komplementierenden Sequenzen, die erste rekombinante Nukleinsäure und die zweite rekombinante Nukleinsäure keine überlappenden Sequenzen, die eine homologe Rekombination ermöglichen und in Zellen, in die sie transferiert wurden, zu einem replikationskompetenten Virus führen.
Vorzugsweise ist die Zellkultur eine PER.C6 Zellkultur. In einem Beispiel enthält das Wachstumsmedium der Zellkultur Natriumbutyrat in einer ausreichenden Menge, um die Produktion der rekombinanten Adenovirus Vektorbibliothek zu steigern.
Vorzugsweise umfasst die Mehrzahl von Zellen zusätzlich zumindest ein Adenovirus präterminales Protein und eine Polymerase-komplementierende Sequenz.
Vorzugsweise umfasst die Mehrzahl der Zellen zusätzlich eine Adenovirus E2-komplementierende Sequenz. Vorzugsweise ist die E2-komplementierende Sequenz eine E2A-komplementierende Sequenz oder eine E2B-komplementierende Sequenz.
In einem Aspekt umfasst die Mehrzahl der Zellen ferner ein Rekombinase-Protein, wobei die homologe Rekombination, die zu rekombinationsdefekten rekombinanten Adenoviren führt, erhöht ist. Vorzugsweise ist das Rekombinase-Protein eine Kluyveromyces waltii Rekombinase.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Mehrzahl von Zellen zusätzlich eine Nukleotidsequenz, die für ein Rekombinase- Protein kodiert. Vorzugsweise ist das Rekombinase-Protein Kluyveromyces waltii Rekombinase.
In einem Aspekt sind die Mitglieder der rekombinanten Adenovirus Vektorbibliothek identisch.
In einem Aspekt ist der Promotor ein induzierbarer Promotor. Vorzugsweise ist der Promotor durch ein Adenvirus E1-Genprodukt reprimiert oder nach unten reguliert. In einem Aspekt umfasst der Promotor einen AP1-abhängigen Promotor. Vorzugsweise ist der AP1-abhängige Promotor von einem Collagenase, einem c-myc, einem Monozyten Chemoattractant-Protein oder einem Stromelysin Gen abgeleitet.
In einem Aspekt kodieren die Nukleinsäureproben für ein Produkt unbekannter Funktion.
In einem weiteren Aspekt werden die Nukleinsäureproben aus der Gruppe ausgewählt, die aus synthetischen Oligonukleotiden, DNAs, cDNAs, Genen, ESTs, antisense Nukleinsäuren oder genetischen Suppressorelementen besteht.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Zuordnung einer Funktion zu Produkten, die von Nukleinsäureproben kodiert werden, bereit, wobei das Verfahren umfasst:
Anziehen einer Wirtszelle, die eine rekombinante Adenovirus Vektorbibliothek enthält, welche gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, wobei die Produkte, die von den Nukleinsäureproben kodiert werden, exprimiert werden, um zumindest einen veränderten Phänotyp in der Wirtszelle zu erzeugen; und
Identifizieren des zumindest einen veränderten Phänotyps, wobei den Produkten, die von den Nukleinsäureproben kodiert werden, eine Funktion zugeordnet wird.
Die Wirtszelle ist vorzugsweise eine Pflanzenzelle oder eine tierische Zelle. Vorzugsweise ist die tierische Zelle eine humane Zelle. In einem Aspekt ist die Wirtszelle ein Mitglied einer Zellkultur. Vorzugsweise liegt die Zellkultur in einem Mulitwell-Format vor.
Vorzugsweise ist das Verfahren der Erfindung automatisiert.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Produktion einer rekombinanten Adenovirus Vektorbibliothek bereit, wobei das Verfahren umfasst:
Anziehen einer Zellkultur, die eine Mehrzahl von Zellen enthält, welche Adenovirus E1-Reionsequenzen exprimieren und ein oder mehr funktionelle Genprodukte exprimieren, welche von zumindest einer Adenovirus Region kodiert werden, die aus der E2A-Region und einer E4-Region ausgewählt wird, mit:

(i) einer Adapterplasmid-Bibliothek, die ein Adapterplasmid umfasst, das basiert auf oder abgeleitet ist von einem Adenovirus, der keine E1-Regionsequenzen aufweist, die mit E1-Regionsequenzen in der Mehrzahl von Zellen überlappen, oder eine rekombinante in die Verpackungszelle zu inserierende Nukleinsäure, und keine anderen E2B-Regionsequenzen als essentielle E2B-Sequenzen, keine E2A-Regionsequenzen, keine E3-Regionsequenzen und keine E4-Regionsequenzen, und in operabler Konfiguration ein funktionelles Inverted Terminal Repeat, ein funktionelles Verpackungssignal und ausreichend adenovirale Sequenzen aufweist, die eine homologe Rekombination mit der rekombinanten Nukleinsäure ermöglichen, und eine Bibliothek von Nukleinsäureproben, welche in das Adapterplasmid operativ verknüpft mit einem Promotor inseriert werden; und
(ii) eine rekombinante Nukleinsäure, die basiert auf oder abgeleitet ist von einem Virus, der keine E1-Regionsequenzen aufweist, die mit E1-Sequenzen in der Mehrzahl von Zellen überlappen, und keine E2A-REgionsequenzen oder E4- Regionsequenzen aufweist, was zur Produktion eines replikationskompetenten Adenovirus führen würde, und in operabler Konfiguration ein funktionelles Adenovirus Inverted Terminal Repeat und ausreichend adenovirale Sequenzen zur Replikation in der Mehrzahl von Zellen aufweist, wobei die rekombinante Nukleinsäure einen ausreichenden Überlapp mit dem Adapterplasmid aufweist, um für eine homologe Rekombination zu sorgen, die zur Herstellung eines rekombinanten Adenovirus in der Verpackungszelle führt;

Vorzugsweise weist die rekombinante Nukleinsäure ferner keine E3-Regionsequenzen auf.
Vorzugsweise exprimiert die Mehrzahl von Zellen zumindest ein funktionelles E2A-Genprodukt.
Vorzugsweise ist das zumindest eine funktionelle E2A-Genprodukt, ein mutiertes Genprodukt. Das mutierte Genprodukt ist vorzugsweise temperatursensitiv.
Vorzugsweise werden zumindest die Adapterplasmid-Bibliothek oder die rekombinante Nukleinsäure vor der Transfektion der Mehrzahl von Zellen oder der Vorläufer der Mehrzahl von Zellen hitzedenaturiert.
Vorzugsweise exprimiert die Mehrzahl von Zellen ein oder mehr funktionelle Genprodukte, die von E2B-Regionsequenzen kodiert werden, wobei die anderen E2B-Regionsequenzen für die funktionellen E2B-Region Genprodukte als diejenigen, die für die Virusgenerierung erforderlich sind, aus der rekombinanten Nukleinsäure deletiert werden, und optional bis zu den vollständigen E2B-Genregionsequenzen aus dem Adapterplasmid deletiert sind.
Die Zellkultur ist vorzugsweise eine PER.C6 Zellkultur. Der Promotor ist vorzugsweise ein induzierbarer Promotor.
In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Mehrzahl von Zellen bereit, die eine rekombinante, replikationsdefekte Adenovirus Vektorbibliothek enthält, wobei die rekombinante replikationsdefekte Adenovirus Vektorbibliothek gemäß einem Verfahren der Erfindung hergestellt ist. Die Mehrzahl der Zellen sind vorzugsweise PER.C6 Zellen.
Die Erfindung stellt ferner eine rekombinante Nukleinsäure bereit, die umfasst:
eine Nukleinsäure, die basiert auf oder abgeleitet ist von einem Adenovirus, der keine E1-Regionsequenzen aufweist, die in einer Verpackungszelle, in welche er eingebracht wurde, zur Produktion replikationskompetenter Adenoviren führen würde, und in operativer Konfiguration ein funktionelles Adenovirus Inverted Terminal Repeat und ausreichende Adenovirussequenzen zur Replikation in der Verpackungszelle aufweist, wobei die Nukleinsäure einen ausreichenden Überlapp mit einem Adapterplasmid aufweist, um für homologe Rekombination zu sorgen, die zur Produktion eines rekombinanten Adenovirus in der Verpackungszelle führt. Vorzugsweise weist die rekombinante Nukleinsäure zumindest entweder keine E2A-Regionsequenzen oder keine E4-Regionsequenzen auf, welche in der Verpackungszelle exprimiert werden und zur Herstellung eines rekombinanten Adenovirus in der Verpackungszelle führen würden. Vorzugsweise weist die rekombinante Nukleinsäure keine anderen E2B-Regionsequenzen auf, als die für die Virusgenerierung essentiellen E2B-Regionsequenzen, die in der Packungszelle exprimiert werden. Vorzugsweise weist die rekombinante Nukleinsäure keine E3-Regionsequenzen auf. Vorzugsweise liegt der ausreichende Überlapp zwischen etwa 10 bp und etwa 5000 bp. Vorzugsweise liegt der ausreichende Überlapp zwischen etwa 2000 bp bis etwa 3000 bp. Vorzugsweise umfasst der ausreichende Überlapp E2B-Regionsequenzen, die für die Virusgenerierung essentiell sind.
Die Erfindung stellt ferner ein Adapterplasmid bereit, das umfasst:
eine Nukleinsäure, die basiert auf oder abgeleitet ist von einem Adenovirus, der keine E1-Regionsequenzen aufweist, die mit E1-REgionsequenzen in einer Verpackungszelle, in welche er eingebracht wird, überlappen und zur Produktion replikationskompetenter Adenoviren führen würde, und keine anderen E2B-Regionsequenzen als die essentiellen E2B-Sequenzen, keine E2A-REgionsequenzen, keine E3-Regionsequenzen und keine E4-Regionsequenzen, die mit einer anderen Nukleinsäure, welche in die Verpackungszelle zu inserieren oder in der Verpackungszelle enthalten ist, aufweist, und in operativer Konfiguration ein funktionelles Inverted Terminal Repeat, ein funktionelles Verpackungssignal und ausreichend adenovirale Sequenzen aufweist, die eine homologe Rekombination mit der anderen Nukleinsäure ermöglichen und zu einem replikationsdefekten rekombinanten Adenovirus führen würde, und eine Klonierungsstelle oder eine multiple Klonierungsstelle. Vorzugsweise ist die Klonierungsstelle oder die multiple Klonierungsstelle operativ mit einem Promotor verknüpft. Vorzugsweise ist der Promotor ein induzierbarer Promotor. Vorzugsweise ist der Promotor durch ein Adenovirus E1-Genprodukt reprimiert oder nach untern reguliert. Vorzugsweise umfasst der Promotor einen AP1-abhängigen Promotor. Vorzugsweise ist der AP1-abhängige Promotor von einem Collagenase Gen, einem c-myc Gen, einem Monozyten Chemoattractant-Protein Gen oder einem Stromelysin Gen abgeleitet. Vorzugsweise wird die Bibliothek von Nukleinsäureproben in die multiple Klonierungsstelle inseriert.
Das Verfahren der Erfindung ist vorzugsweise automatisiert.
BEISPIELE
Beispiel 1
Generierung von Zelllinien, die zur Transkomplementierung von E1-defekten rekombinanten Adenovirusvektoren in der Lage sind
911 Zelllinie
Eine Zelllinie, welche die E1-Sequenzen des Adenovirus Typ 5 enthält und zur Transkomplementierung von E1-deletierten rekombinanten Adenoviren in der Lage ist, wurde hergestellt (Fallaux et al, (1996) Hum. Gene Ther. 7: 215–222). Diese Zelle wurde durch Transfektion diploider humaner embryonaler Retinoblasten (HER) mit pAd5XhoIC erhalten, das die Nt. 80-5788 von Ad 5 enthält; einer der resultierenden Transformanten wurde mit 911-bezeichnet. Es wurde gezeigt, dass diese Zelllinie nützlich für die Propagation eines E1-defekten rekombinanten Adenovirus ist. Es wurde gefunden, dass sie 293 Zellen überlegen ist. Ungleich 239 Zellen fehlt 911 Zellen ein vollständiger transformierter Phänotyp, was höchstwahrscheinlich der Grund für die bessere Eignung als Adenovirus Verpackungszelllinie ist:
Plaque-Assays können schneller durchgeführt werden (4–5 Tage anstelle von 8–14 Tagen bei 293);
Monolayer von 911 Zellen überleben unter einem Agar-Overlay, wie er für Plaque-Assays erforderlich ist, besser;
höhere Amplifikation von E1-deltierten Vektoren.
Ferner wurden 911 Zellen, ungleich 293 Zellen, die mit einer gescherten Adenoviralen DNA transifiziert wurden, unter Verwendung eines definierten Konstrukts transfiziert. Die Transfektionseffizienzen von 911 Zellen sind mit denen von 293 vergleichbar.
Neue Verpackungskonstrukte
Ursprung der Adenovirussequenzen
Die Adenovirussequenzen stammen entweder von pAd5.SalB, das die Nt. 80-9460 des menschlichen Adenovirus Typ 5 (Bernards et al, (1983) Virology 127: 45–53) enthält, oder von Wildtyp Ad5 DNA. pAd5.SalB wurde mit SalI und XhoI verdaut, das große Fragment wurde religiert, und dieser neue Klon wurde mit pAd5.X/S bezeichnet. Das pTN Konstrukt (konstruiert von Dr. R. Vogels, IntroGene, Niederlande) wurde als Ursprung für den humanen PGK-Promotor und das NEO-Gen verwendet.
Humaner PGK Promotor mit NEO^R-Gen
Die Transkription der E1A-Sequenzen in den neuen Verpackungskonstrukten wird vom humanen PGK-Promotor angetrieben (Michelson et al, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 472–476; Singer-Sam et al. (1984) Gene 32: 409–417), der vom Plasmid pTN (erhalten von R. Vogels) stammt, welches pUC119 (Vieira et al, (1987) pp. 3–11: Methods in Enzymology, Acad. Press Inc.) als Grundgerüst verwendet. Dieses Plasmid wurde ebenfalls als Ursprung für das NEO-Gen verwendet, das mit dem Hepatitis B Virus (HBV)-Polyadenylierungssignal fusioniert ist.
Fusion des PGK-Promotors mit E1-Genen (1)
Um die E1-Sequenzen von Ad5 (ITR, Origin of Replication und Verpackungssignal) durch heterologe Sequenzen zu ersetzen, haben wir die E1-Sequenzen (Nt. 459 bis Nt. 960) von Ad5 mittels PCR unter Verwendung der Primer Eal (SEQ ID NO: 27) und Ea2 (SEQ ID NO: 28)(siehe Tabelle I) amplifiziert. Das erhaltene PCR Produkt wurde mit ClaI verdaut und in pBluescript (Strategene) ligiert, welches zuvor mit ClaI und EcoRV verdaut wurde, was das Konstrukt pBS.PCRI ergab.
Vektor pTN wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI (partiell) und ScaI verdaut, und das DNA Fragment, das die PGK Promotorsequenzen enthält, wurde in pBS.PCRI ligiert, das mit ScaI und EcoRI verdaut wurde. Das erhaltene Konstrukt pBS.PGK.PCRI enthält den humanen PGK-Promotor, der operativ mit den Ad5 E1-Sequenzen von Nt. 459 bis Nt. 916 verknüpft ist.
Konstruktion von pIG.E1A.E1B (2)
pIG.E1A.E1B.X enthält E1A und E1B kodierenden Sequenzen unter der Kontrolle des PGK-Promotors. Da die Ad5 Sequenzen von Nt. 459 bis Nt. 4788 in diesem Konstrukt enthalten sind, wird auch das PIX Protein des Adenovirus von diesem Plasmid kodiert. pIG.E1A.E1B.X wurde durch Ersetzen des Scal-BspEI Fragments von pAT-X/S mit dem korrespondierenden Fragment von pBS.PGK.PCRI (das den PGK-Promotor verknüpft mit E1A-Sequenzen enthält) hergestellt.
Konstruktion von PIG.E1A.NEO (3)
Um den vollständigen E1B-Promotor einzubringen und diesen Promotor derart zu fusionieren, dass das AUG Codon von E1B 21 kD exakt als das AUG-Codon von NEO^R fungiert, wurde der E1B-Promotor unter Verwendung der Primer Ea3 (SEQ ID NO: 29) und Ep2 (SEQ ID NO: 30) amplifiziert, wobei Primer Ep2 eine NcoI Schnittstelle in das PCR Fragment einführt. Das resultierende PCR Fragment, das als PCRII bezeichnet wird, wurde mit HpaI und NcoI verdaut und in p.AT-X/S ligiert, welches zuvor mit HpaI und mit NcoI verdaut wurde. Das erhaltene Plasmid wurde als pAT-X/S-PCR2 bezeichnet. Das NcoI-StuI Fragment von pTN, welches das NEO Gen und einen Teil des Hepatitis B Virus (HBV) Polyadenylierungssignals enthält, wurde in pAT-X/S-PCR2 kloniert, welches mit NcoI und NruI verdaut wurde. Das erhaltene Konstrukt war pAT-PCR2.NEO. Das Polyadenylierungssignal wurde durch Ersetzen des ScaI-SalI Fragments von pAT-PCR2.NEO mit dem korrespondierenden Fragment von pTN vervollständigt, was in pRT.PCR2.NEO.p(A) resultiert. Das ScaI-XbaI Fragment von pAT.PCR2.NEO.p(A) wurde mit dem korrespondierenden Fragment von pIG.E1A.E1B-X ersetzt, welches den PGK-Promotor in Verknüpfung mit E1A-Genen enthält. Das erhaltene Konstrukt wurde als pIG.E1A.NEO bezeichnet, und enthält folglich Ad5 E1-Sequenzen (Nt. 459 bis Nt. 1713) unter Kontrolle des humanen PGK-Promotors.
Konstruktion von pIG.E1A.E1B (4)
pIG.E1A.E1B enthält die Nt. 459 bis Nt. 3510 von Ad5, welche die E1A- und E18-Proteine kodieren. Die E1B-Sequenzen werden an der Splice-Akzeptorstelle an Nt. 3511 begrenzt. In diesem Konstrukt sind keine pIX Sequenzen vorhanden.
pIG.E1A.E1B wurde wie folgt hergestellt: Die Sequenzen, welche die N-terminalen Aminosäuren des E1B 55 kD kodieren, wurden unter Verwendung der Primer Eb1 (SEQ ID NO: 31) und Eb2 (SEQ. ID NO: 32), der eine XhoI Schnittstelle einführt, amplifiziert. Das erhaltene PCR Fragment wurde mit BgIII verdaut und in BgIII/NruI von pAT-X/S kloniert, wodurch pAT-PCR3 erhalten wurde. Die HBV Poly (A)-Sequenzen von pIG.E1A.NEO wurden unterhalb (downstream) der E1B-Squenzen von pAT-PCR3 durch Austausch des XbaI-SalI Fragments von pIG.E1A.NEO und des XbaI-XhoI Fragments von pAT.PCR3 eingeführt.
Konstruktion von pIG.NEO (5)
Dieses Konstrukt ist von Nutzen, wenn etablierte Zellen mit E1A.E1B-Konstrukten transfiziert werden und eine NEO-Selektion erforderlich ist. Da die NEO Expression vom E1B-Promotor kontrolliert wird, wird erwartet, dass die NEOresistenten Zellen E1A coexprimieren, was auch für die Erhaltung hoher Expressionslevel von E1A während der Langzeitkultur der Zellen vorteilhaft ist. pIG.NEO wurde erzeugt durch Klonieren des HpaI-ScaI Fragments von pIG.E1A.NEO, welches das NEO-Gen unter der Kontrolle des Ad5 E1B-Promotors enthält, in pBS, das mit EcoRV und ScaI verdaut wurde.
Test der Konstrukte
Die Integrität der Konstrukte pIG.E1A.NEO, pIG.E1A.E1B.X und pIG.E1A.E1B wurde mittels Restriktionsenzymkartierung beurteilt. Weiterhin wurden Teile der Konstrukte, die mittels PCR Analyse erhalten wurden, durch Sequenzanalyse bestätigt. Keine Veränderungen der Nukleotidsequenz wurden gefunden.
Die Konstrukte wurden in primäre BRK (Baby Rat Kidney)-Zellen transfiziert und auf ihre Fähigkeit zur Immortalisierung (pIG.E1A.NEO) oder vollständigen Transformation (pAd5.XhoIC, pIG.E1A.E1B.X und pIG.E1A.E1B) dieser Zellen getestet. Nieren von sechs Tage alten WAG-Rij Ratten wurden isoliert, homogenisiert und trypsiniert. Subkonfluente Schalen (Durchmesser 5 cm) von BRK Zellkulturen wurden mit 1 μg oder 5 μg von pIG.NEO, pIG.E1A.NEO, pIG.E1A.E1B, pIG/E1A.E1B.X, pAdSXhiIC oder mit pIG.E1A.NEO zusammen mit PDC26 (Elsen et al. (1983) Virology 128: 377– 390), welches das Ad5.E1B Gen unter der Kontrolle des SV40 Early-Promoters trägt, transfiziert. Drei Wochen nach Transfektion, wenn Foci sichtbar waren, wurden die Schalen fixiert, mit Giemsa gefärbt, und die Foci wurden gezählt.
Ein Überblick über die erzeugten Adenovirus Verpackungskonstrukte und deren Fähigkeit, BRK zu transformieren, ist in 6 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Konstrukte die pIG.E1A.E1B und pIG.E1A.E1B.X in der Lage sind, BRK Zellen in dosis-abhängiger Weise zu transformieren. Die Transformationseffizienz ist für beide Konstrukte ähnlich und vergleichbar zu dem, was mit dem Konstrukt gefunden wurde, welches zur Herstellung der 911 Zellen verwendet wurde, nämlich pAd5.XhoIC.
Wie erwartet, war pIG.E1A.NEO kaum in der Lage, BRK zu immortalisieren. Eine Cotransfektion eines E1B-Expressionskonstrukts (PDC26) ergab jedoch eine signifikante Erhöhung der Anzahl von Transformatten (18 versus 1), was zeigt, dass E1A, welches von pIG.E1A.NEO codiert wurde, funktionell ist. Wir schlussfolgern daher, dass die neu erzeugten Verpackungskonstrukte für die Generierung neuer Adenovirus Verpackungszelllinien geeignet sind.
Generierung von Zelllinien mit neuen Verpackungskonstrukten, Zelllinien und Zellkultur
Humane A540 bronchiale Karzinomzellen (Shapiro et al. (1978) Biochem. Biophys. Acta 530: 197–207), humane embryonale Retinoplasten (HER), Ad5-E1-transformierte humane embryonale Nierenzellen (HEK)(293; Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36: 59–72) und Ad5-transformierte HER Zellen (911; Fallaux et al. (1996) Hum. Gene. Ther. 7: 215–222) und PER Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und Antibiotika supplementiert war, in einer 5%igen CO₂ Atmosphäre bei 37°C angezogen. Zellkulturmedien, Reagenzien und Seren wurden von Gibco Laboratories (Grand Island, NY) bezogen. Zellkultur-Kunststoffbedarf wurde von Greiner (Nürtingen, Deutschland) und Corning (Corning, NY) bezogen.
Viren und Virentechniken
Die Konstruktion der rekombinanten adenoviralen Vektoren IG.Ad.MLP.nls.lacZ, IG.Ad.MLP.luc, IG.Ad.MLP.TK und IG.Ad.CMV.Tk ist im Detail in der Patentanmeldung EP 95202213 beschrieben. Der rekombinante adenovirale Vektor IG.Ad.MLP.nls.lacZ enthält das E. coli lacZ Gen, das β-Galaktosidase kodiert, unter der Kontrolle des Ad2 Major Late-Promotors (MLP). IG.Ad.MLP.luc enthält das Leuchtkäfer (firefly) Luciferase-Gen, das von Ad2 MLP angetrieben wird, und die adenoviralen Vektoren IG.Ad.MLP.TK und IG.Ad.CMV.TK enthalten das Herpes Simplex Virus Thymidinkinase (TK)-Gen unter der Kontrolle von Ad2 MLP bzw. dem Cytomegalovirus (CMV) Enhancer/Promotor.
Transfektionen
Alle Transfectionen wurden mittels Calciumphosphat DNA-Präzipitation (Graham et al. (1973) Virology 52: 456–467) mit dem GIBCO Calcium Phosphate Transfection System (GIBCO BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.
Western Blot
Subkonfluente Kulturen exponentiell wachsender 293, 911 und Ad5-E1-transformierter A549 und PER Zellen wurden mit PBS gewaschen und in Fos-RIPA Puffer (10 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.01% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1% Na-DOC, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylflurid (PMSF), 0.5 mM Trypsin-Inhibitor, 50 mM NaF und 1 mM Natriumvanadat). Nach 10 min. bei Raumtemperatur wurden die Lysate durch Zentrifugation geklärt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem BioRad Protein Assay Kit gemessen, und 25 μg zelluläres Gesamtprotein wurden auf ein 12.5% SDS-PAA Gel geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrozellulose transferiert (1 Stunde bei 300 mA). Parallel dazu wurden vorgefärbte Standards (Sigma, USA) aufgetrennt. Die Filter wurden mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in TBST (10 mM Tris, pH 8.0, 15 mM NaCl und 0.05% Tween-20) für 1 Stunde geblockt. Primäre Antikörper waren der monoklonale Maus anti-Ad5-E1B-kDA Antikörper A1C6 (Zantema et al., unpubliziert), der monoklonale Ratten anti-Ad5-E1B-221-kDa Antikörper C1G11 (Zantema et al. (1985) Virology 142: 44–58). Der zweite Antikörper war ein Meerrettich Peroxidase-markierter Ziege anti-Maus Antikörper (Promega). Die Signale wurden mittels verstärkter Chemilumineszenz visualisiert (Amersham Corp. UK).
Southern Blot-Analyse
Hochmolekulare DNA wurde isoliert, und 10 μg davon wurden vollständig verdaut und auf einem 0.7% Agarosegel fraktioniert. Southern Blot-Transfer auf Hybond N⁺ (Amersham, UK) wurde mit einer 0.4 M NAOH, 0.6 M NaCl Transfer-Lösung (Church und Gilbert, 1984) durchgeführt. Die Hybridisierung wurde mit einem 2463 Nt. SspI-HindIII Fragment von pAd5.SalB (Bernards et al. (1983) Virology 127: 45–53) durchgeführt. Dieses Fragment besteht aus dem Ad5 bp 342-2805. Das Fragment wurde unter Verwendung von random hexanucleotid-Primern und Klenow DNA-Polymerase mit α^32p-dCTP radioaktiv markiert. Die Southern Blots wurden auf einem Kodak XAR-5 Film bei –80°C und einem Phosphor-Imager Screen exponiert, der mit Hilfe der B&L Systems Molecular Dynamics Software analysiert wurde.
A549
Ad5-E1-transformierte A549 humane bronchiale Karzinomzelllinien wurden mittels Transfektion mit pIG.E1A.NEO und Selektion auf G418-Resistenz generiert. 31 G418-resistente Klone wurden etabliert. Cotransfektion am pIG.E1A.E1B mit pIG.NEO ergab sieben G418-resistente Zellinien.
PER
Ad5-E1-transfomierte humane embryonale Retinazellen (HER) wurden durch Transfektion von primären HER Zellen mit dem Plasmid pIG.E1A.E1B generiert. Transformierte Zellinien wurden von gut separierten Foci etabliert. Wir waren in der Lage, sieben klonale Zellinien zu etablieren, die wir als PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 und PER.C9 bezeichneten. Einer dieser PER Klone, nämlich PER.C6, wurde bei der ECACC mit der Nummer 96022940 hinterlegt.
Expression der Ad5 E1A- und E1B-Gene in transformierten A549 und PER Zellen
Die Expression der Ad5 E1A- und der 55 kDa- und 12 kDa-E1B-Proteine in den etablierten A549 und PER Zellen wurde mittels Western Blot unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern (mAb) untersucht. mAb M73 erkennt die E1A-Produkte, während die mAbs AIC6 und C1G11 gegen die 55 kDa- bzw. 12 kDa-E1B-Proteine gerichtet sind. Die Antikörper erkannten keine Proteine in den Extrakten der elterlichen A549 oder der primären HER Zellen (Daten nicht gezeigt). Keiner der A549 Klone, die mittels Cotransfektion von pIG.NEO und pIG.E1A-E1B generiert wurden, exprimierten detektierbare Mengen der E1A- oder E1B-Proteine (nicht gezeigt). Einige der A549 Klone, die durch Transfektion mit pIG.E1A.NEO erzeugt wurden, exprimierten die Ad5 E1A-Proteine (7), aber die Mengen waren wesentlich geringer als diejenigen, die in Proteinlysaten von 293 Zellen detektiert wurden. Die steadystate (Gleichgewichts) E1A-Spiegel, die in den Proteinextrakten von PER Zellen detektiert wurden, waren wesentlich höher als jene, die in Extrakten von A549-abgeleiteten Zellen detektiert wurden. Alle PER Zelllinien exprimierten ähnliche Niveuas an E1A-Proteinen (7). Die Expression der E1B-Proteine, insbesondere im Fall des E1B 55 kDa, war variabler. Verglichen mit 911 und 293, exprimiert die Mehrheit der PER Klone hohe Spiegel an E1B 55 kDa und 21 kDa. Der steady state-Spiegel von E1B 21 kDa war am höchsten in PER.C3. Keiner der PER Klone zeigte einen Verlust der Expression Ad5 E1-Gene nach wiederholter Passage der Zellen (nicht gezeigt). Wir fanden, dass das E1-Expressionsniveau in PER Zellen für zumindest 100 Verdopplungszeiten der Population konstant blieb. Wir entschieden uns, die PER Klone detaillierter zu charakterisieren.
Southern-Analyse von PER Klonen
Um die Anordnung der Ad5 E1-kodierten Sequenzen in den PER Klonen zu untersuchen, führten wir Southern-Analysen durch. Zelluläre DNA wurde von allen PER Klonen und von 293 und 911 Zellen extrahiert. Die DNA wurde mit HindIII verdaut, welches in der Ad5 E1-Region einmal schneidet. Southern-Hybridisierung der HindIII verdauten DNA unter Verwendung einer radioaktiv markierten Ad5 E1-spezifischen Sonde ergab die Präsenz von mehreren integrierten Kopien von pIG.E1A.E1B im Genom der PER Klone. 8 zeigt das Verteilungsmuster der E1-Sequenzen in der hochmolekularen DNA verschiedener PER Zelllinien. Die Kopien sind in einer einzelnen Bande konzentriert, was suggeriert, dass sie als Tandem Repeats integriert sind. Im Falle von PER.C3, C5, C6 und C9 fanden wir zusätzliche Hybridisierungsbanden mit geringem Molekulargewicht, die das Vorhandensein verkürzter Kopien von pIG.E1A.E1B anzeigen. Die Kopienzahl wurde mit Hilfe eines Phospho-Imagers ermittelt. Wir schätzten, dass PER.C1, C3, C4, C5, C6, C8 bzw. C9 2, 88, 5, 4, 5, 5 bzw. 3 Kopien der Ad5 E1-kodierenden Region enthalten, und dass die 911 bzw. 293 Zellen eine bzw. vier Kopien der Ad5 E1-Sequenzen enthalten.
Transfektionseffizienz
Rekombinate Adenovektoren werden mittels Cotransfektion von Adapterplasmiden und dem großen ClaI-Fragment von Ad5 in 293 Zellen generiert (EP Anmeldung 95202213). Die rekombinante Virus-DNA wird durch homologe Rekombination zwischen den homologen viralen Sequenzen, die in der Plasmid- und der Adenovirus-DNA enthalten sind, ausgebildet. Die Effizienz dieses Verfahrens sowie diejenige alternativer Strategien hängt stark von der Transfektabilität der Helferzellen ab. Daher verglichen wir die Transfektionseffizienz einiger PER Klone mit 911 Zellen unter Verwendung des E. coli β-Galactosidase-kodierenden lacZ Gens als Reporter (9).
Produktion eines rekombinanten Adenovirus
Die Ausbeuten an rekombinanten Adenoviren, welche nach Inokulation von 293, 911, PER.C3, PER.C5 und PER.C6 mit verschiedenen Adenovirusvektoren erhalten wurden, sind in Tabelle II dargestellt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Ausbeuten an rekombinanten Adenovirusvektoren, die mit PER Zellen erhalten wurden, sind zumindest gleich hoch sind als jene, die mit den bestehenden Zelllinien erhalten wurden. Zusätzlich sind die Ausbeuten des neuen Adenovirusvektors IG.Ad.MLPI.TK ähnlich oder höher als die Ausbeuten, die für andere gerade Vektoren in allen getesteten Zelllinien erhalten wurden.
Generierung neuer Adenovirusvektoren (10)
Aus den verwendeten rekombinanten Adenovirusvektoren (siehe Patenanmeldung EP 95202213 ) wurden die E1-Sequenzen von Nt. 459 bis Nt. 3328 deletiert. Da das Konstrukt pE1A.E1B Ad5-Sequenzen zwischen Nt. 459 bis Nt. 3510 enthält, besteht ein Sequenzübrlapp von 183 Nt. zwischen den E1B-Sequenzen in dem Verpackungskonstrukt pIG.E1A.E1B und den rekombinanten Adenoviren, wie zum Beispiel IG.Ad.MLP.TK. Die übrlappenden Sequenzen wurden aus dem neuen Adenovirusvektoren deletiert. Zusätzlich wurden nicht-kodierende, von lacZ abgeleitete Sequenzen, die in den ursprünglichen Konstrukten enthalten sind, ebenfalls deletiert. Dies wurde durch PCR Amplification der SV40 Poly(A)-Sequenzen von pMLP.TK unter Verwendung der Primer SV40-1 (SEQ ID NO: 33)(führt eine BamHI-Schnittstelle ein) und SV40-2 (SEQ ID NO: 34)(führt eine BgIII-Schnittstelle ein) erreicht (siehe 10). Zusätzlich wurden die Ad5-Sequenzen, die in diesem Konstrukt enthalten sind, von Nt. 2496 (Ad5, führt eine BgIII-Schnittstelle ein) bis zu Nt. 2779 (Ad5-2) amplifiziert. Beide PCR Fragmente wurden mit BgIII verdaut und ligiert. Das Ligationsprodukt wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer SV40-1 und Ad5-2 (SEQ ID NO: 36) amplifiziert. Das so erhaltene PCR Produkt wurde mit BamHI und AflII geschnitten und in pMLP.TK ligiert, welches mit den selben Enzymen vorverdaut wurde. Das resultierende Konstrukt, das als pMLPI.TK bezeichnet wird, enthält eine Deletion in dem Adenovirus E1-Sequenzen von Nt. 459 bis Nt. 3510.
Verpackungssystem
Die Kombination des neuen Verpackungskonstrukts pIG.E1A.E1B und des rekombinanten Adenovirus pMLPI.TK, die keinen Sequenzüberlapp aufweisen, sind in 11 dargestellt. In dieser Figur ist auch die ursprüngliche Situation dargestellt, in der ein Sequenzüberlapp angezeigt ist. Das Fehlen überlappender Sequenzen zwischen pIG.E1A.E1B und pMLP.TK (11a) schließt die Möglichkeit homologer Rekombination zwischen dem Verpackungskonstrukt und dem rekombinanten Virus aus und ist daher, verglichen mit der ursprünglichen Situation, eine signifikante Verbesserung in der Produktion rekombinanter Adenoviren.
In 11b ist die Situation für pIG.E1A.NEO und IG.Ad.MLPI.TK dargestellt. Es sollte erwartet werden, dass pIG.E1A.NEO bei Transfektion in etablierte Zellen ausreichend ist, um die Propagation E1-deletierter rekombinanter Adenoviren zu unterstützen. Diese Kombination weist keinerlei Sequenzüberlappung auf, was die Generierung von RCA durch homologe Rekombination verhindert. Zusätzlich erlaubt dieses zweckmäßige Verpackungssystem die Propagation von rekombinanten Adenoviren, bei denen nur die E1A-Sequenzen und nicht die E1B-Sequenzen deletiert wurden.
Rekombinante Adenoviren, die bei Fehlen von E1A E1B exprimieren, sind reizvoll, da das E1B-Protein, insbesondere E1B 19 kDa, in der Lage ist, die Lyse infizierter humaner Zellen durch Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)(Gooding et al. (1991) J. Virol. 65: 3083–3094) zu verhindern.
Generierung rekombinanter Adenoviren, die von pMLPI.TK abgeleitet sind
Ein rekombinantes Adenovirus wurde mittels Cotransfection von 293 Zellen mit SalI linearisierter pMLPI.TK DNA und ClaI linearisierter Ad5 Wildtyp DNA erzeugt. Das Verfahren ist schematisch in 12 dargestellt.
Beispiel 2
Plasmid-basiertes System zur schnellen RCA-freien Generierung rekombinanter adenoviraler Vektoren
Konstruktion von Adenovirus Klonen
pBr/Ad.-Bam-rITR (ECACC Hinterlegungsnummer P97082122)
Um die Klonierung glatter (blunt) Enden von ITR-Sequenzen zu erleichtern, wurde humane Wildtyp Adenovirus Typ 5 (Ad5) DNA mit Klenow-Enzym in der Gegenwart eines Überschusses von dNTPs behandelt. Nach Inaktivierung des Klenow-Enzyms und Reinigung mittels Phenol/Chloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanol-Prezipitation, wurde die DNA mit BamHI verdaut. Diese DNA Präparation wurde ohne weitere Reinigung in einer Ligationsreaktion mit von pBR322 abstammender Vektor-DNA verwendet, welche wie folgt hergestellt wurde: pBR322 DNA wurde mit EcoRV und BamHI verdaut, durch Behandlung mit TSAP Enzym (Life Technologies) dephosphoryliert und auf einem LMP Agarosegel(SeaPlaque GTG) gereinigt. Nach Trsnformation in kompetente E. coli DH5α (Life Technologies) und Analyse Ampicillin-resistenter Kolonien wurde ein Klon selektiert, der ein Restriktionsmuster zeigt, wie es für ein Insert erwartet wird, das sich von der BamHI-Schnittstelle in Ad5 zum rechten ITR erstreckt. Eine Sequenzanalyse der Klonierungsgrenze am rechten ITR zeigte, dass der am meisten 3' stehende G-Rest des ITRs fehlte, das übrige ITR jedoch korrekt war. Der fehlende G-Rest wird durch das andere ITR während der Replikation komplementiert.
pBr/Ad.Sal-rITR (ECACC Hinterlegungsnummer P97082119)
pBr/Ad.Bam-rITR wurde mit BamHI und SalI verdaut. Das Vektorfargment einschließlich des Adenovirus-Inserts wurde aus LMP Agarose (SeaPlaque GTG) isoliert und an ein 4.8 kb SalI-BamHI Fragment ligiert, das von Windtyp Ad5 DNA erhalten und mit dem Geneclean II Kit (Bio 101, Inc.) gereinigt wurde. Ein Klon wurde ausgewählt, und die Integrität der Ad5-Sequenzen wurde mittels Restriktionsenzymanalyse bestimmt. Klon pBr/Ad.Sal-rITR enthält Adeno Typ 5-Sequenzen von der SalI Schnittstelle an bp 16746 bis zu und einschließlich des rITR (wobei der am meisten 3' G Rest fehlt).
pBr/Ad.Cla-Bam (ECACC Hinterlegungsnummer P97082117)
Wildtyp Adeno Typ 5 DNA wurde mit ClaI und BamHI verdaut, und das 20.6 kb Fragment wurde aus dem Gel mittels Elektroelution isoliert. pBR322 wurde mit den gleichen Enzymen verdaut und aus dem Agarosegel mittels Geneclean gereinigt. Beide Fragemente wurden ligiert und in kompetente DH5α Zellen transformiert. Der erhaltene Klon pBr/Ad.Cla-Bam wurde mittels Restriktionsenzym-Verdau analysiert, und es wurde gezeigt, dass er ein Insert mit Adenovirussequenzen von bp 919 bis bp 21566 enthält.
pBr/Ad.AflII-Bam (ECACC Hinterlegungsnummer P97082114)
Klon pBr/Ad.Cla-Bam wurde mit EcoRI linearisiert (in pBR322) und partiell mit AflII verdaut. Nach Hitzeinaktivierung von AflII für 20 Minuten bei 65°C wurden die Enden des Fragments mit Klenow Enzym aufgefüllt. Die DNA wurde im Anschluß an einen doppelsträngigen Oligo-Linker mit glatten Enden ligiert, der eine PacI Schnittstelle (5'-AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-3')(SEQ ID NO: 1) enthält. Dieser Linker wurde durch Hybridisieren der folgenden beiden Oligonukleotide hergestellt: 5'-AATTGTCTTAATTAACCGC-3' (SEQ ID NO: 2) und 5'-AATTGCGGTTAATTAAGAC-3' (SEQ ID NO: 3), gefolgt vom Auffüllen der Enden mit Klenow Enzym. Nach Präzipitation der ligierten DNA, um den Puffer zu wechseln, wurden die Ligationen mit einem Überschuss an PacI Enzym verdaut, um Concatamere des Oligos zu entfernen. Das 22016 bp partielle Fragment, das Ad5-Sequenzen von bp 3534 bis zu bp 21566 und die Vektorsequenzen enthält, wurde in LMP Agarose (SeaPlaque GTG) isoliert, religiert und in kompetente DH5α Zellen transormiert. Ein Klon, bei dem gefunden wurde, dass er die PacI Schnittstelle enthält und das große Adeno-Fragment zurückbehalten hat, wurde selektiert und am 5' Ende sequenziert, um die korrekte Insertion des PacI-Linkers in die (verlorengegangene) AflII Schnittstelle zu verifizieren.
pBr/Ad.Bam-rITRpac#2 (ECACC Hinterlegungsnummer P97082120) und pBr/Ad.Bam-rITR#8 (ECACC Hinterlegungsnummer P97082121)
Um die Insertion einer PacI-Schnittstelle nahe des ITR von Ad5 in Klon pBr/Ad.Bam-rITR zu erlauben, wurden ungefähr 190 Nt. zwischen der ClaI Schnittstelle im pBR322 Grundgerüst und dem Start der ITR-Sequenz entfernt. Dies wurde wie folgt bewerkstelligt: pBr/Ad.Bam-rITR wurde mit ClaI verdaut und für unterschiedliche Zeitperioden (2 min., 5 min., 10 min. und 15 min.) mit der Nuklease Bal31 behandelt. Das Ausmaß der Entfernung von Nukleotiden wurde unter Verwendung identischer Puffer und Bedingungen durch separate Reaktionen mit pBR322 DNA (ebenfalls an der ClaI Schnittstelle verdaut) verfolgt. Das Bal31 Enzym wurde durch Inkubation bei 75°C für 10 Minuten inaktiviert, die DNA wurde präzipitiert und in einem kleineren Volumen TE-Puffer resuspendiert. Um glatte Enden sicherzustellen, wurden die DNAs zusätzlich mit T4 DNA-Polymerase in Gegenwart eines Überschusses an dNTPs behandelt. Nach Verdau der (Kontroll) pBR322 DNA mit SalI wurde in den Proben, die für 10 Minuten oder 15 Minuten behandelt wurden, eine zufriedenstellende Degradation (~150 bp) beobachtet. Die für 10 Minuten oder 15 Minuten behandelten pBr/Ad.Bam-rITR Proben wurden im Anschluss an die oben beschriebenen PacI-Linker mit glatten Enden (siehe pBr/Ad.AflII-Bam) ligiert. Die Ligationen wurden mittels Präzipitaion gereinigt, mit einem Überschuss an PacI verdaut und auf einem LMP Agarosegel von den Linkern getrennt. Nach Religation wurden die DNAs in kompetente DH5α Zellen transformiert und die Kolonien analysiert. Es wurden 10 Klone selektiert, die eine Deletion von ungefähr der erwarteten Länge zeigten, und diese wurden ferner durch T-Track Sequenzierung (T7 Sequencing Kit, Pharmacia Biotech) analysiert. Es wurden zwei Klone gefunden, bei denen der PacI Linker gerade unterhalb (downstream) des rITR inseriert war. Nach Verdau mit PacI wies Klon #2 28 bp und Klon #8 27 bp auf, die an das ITR angeheftet waren.
pWE/Ad.AflII-rITR (ECACC Hinterlegungsstelle P97082116)
Der Cosmid Vektor pWE15 (Clontech) wurde verwendet, um größere Ad5 Inserts zu klonieren. Zunächst wurde ein Linker, der die singuläre PacI Schnittstelle enthält in die EcoRI Schnittstellen von pWE15 inseriert, um pWE.pac zu erzeugen. Dazu wurde das doppelsträngige PacI Oligo, wie für pBr/Ad.AflII-BamHI verwendet, nun aber mit seinen EcoRIüberhängenden Enden. Im Anschluss wurden die folgenden Fragmente mittels Elektroinduktion aus einem Agarosegel isoliert: pWE.pac verdaut mit PacI, pBr/AflII-Bam verdaut mit PacI und BamHI und pBr/Ad.Bam-rITR#2 verdaut mit BamHI und PacI. Diese Fragmente wurden miteinander ligiert und unter Verwendung des λ Phage Packaging Extracts (Stratagene) entsprechend der Herstelleranweisungen verpackt. Nach Infektion von Wirtsbakterien wurden Kolonien auf Platten angezogen und auf Vorhandensein des vollständigen Inserts analysiert. pWE/Ad.AflII-rITR enthält alle Adenovirus Typ 5 Sequenzen von bp 3534 (AflII Schnittstelle) bis zu und einschließlich des rechten ITR (wobei der am meisten 3' stehende G-Rest fehlt).
Wildtyp Adeno 5-DNA wurde mit Klenow Enzym in der Gegenwart eines Überschusses an dNTPs behandelt und anschließend mit SalI verdaut. Zwei der erhaltenen Fragmente, die mit linkes ITR-Sal(9.4) bzw. Sal(16.7)-rechtes ITR bezeichnet wurden, wurden aus LMP Agarose (SeaPlaque GTG) isoliert. pBR322 DNA wurde mit EcoRV und SalI verdaut und mit Phosphatase (Life Technologies) behandelt. Das Vektorfragment wurde mittels des Geneclean-Verfahrens (BIO 101, Inc.) isoliert und an die Ad5 SalI-Fragmente ligiert. Nur die Ligation mit dem 9.4 kb Fragmente ergab Kolonien mit einem Insert. Nach Analyse und Sequenzierung der Klonierungsrenze wurde ein Klon ausgewählt, der die vollständige ITR-Sequenz enthält und sich von der SalI Schnittstelle an bp 9462 erstreckt.
pBr/Ad.lITR-Sal (16.7)(ECACC Hinterlegungsnummer P97082118)
pBr/Ad.lITR-Sal (9.4) wurde mit SalI verdaut und dephosphoryliert (TSAP, Life Technologies). Um diesen Klon bis zur dritten SalI Schnittstelle in Ad5 auszudehnen, wurde pBr/Ad.Cla-Bam mit BamHI linearisiert und partiell mit SalI verdaut. Ein 7.3 kb SalI-Fragment, das Adenovirus-Sequenzen von bp 9462 bis bp 16746 enthält, wurde aus einem LMP Agarose Gel isoliert und an das mit SalI verdaute pBr/Ad.lITR-Sal (9.4)-Vektorfragment ligiert.
pWE/Ad.AflII-EcoRI
pWE.pac wurde mit ClaI verdaut, und die 5' überhängenden Enden wurden mittels Klenow Enzym aufgefüllt. Anschließend wurde DNA mit PacI verdaut und aus einem Agarosegel isoliert. pWE/AflII-rITR wurde mit EcoRI verdaut und nach Behandlung mit Klenow Enzym mit PacI verdaut. Das große 24 kb Fragment, das die adenoviralen Sequenzen enthält, wurde aus einem Agarosegel isoliert und an den mit ClaI verdauten Vektor pWE.pac, dessen Enden aufgefüllt wurden (blunted vector), unter Verwendung des Ligation Express^TM Kit von Clontech ligiert. Nach Transformation ultracompetenter XL10-Gold Zellen von Stratagene wurden Klone identifiziert, welche das erwartete Insert enthielten. pWE/AflII-EcoRI enthält Ad5-Sequenzen von bp 3534 bis bp 27336.
Konstruktion neuer Adapter Plasmide
Das Fehlen eines Sequenzüberlapps zwischen dem rekombinanten Adenovirus und den E1-Sequenzen in der Verpackungszelllinie ist essentiell für eine sichere, RCA-freie Generierung und Propagation neuer rekombinanter Viren. Das Adapterplasmid pMLPI.TK (10) ist ein Beispiel eines Adapterplasmids, das für die Verwendung gemäß der Erfindung in Kombination mit verbesserten Verpackungszellenlinien der Erfindung konzipiert wurde. Dieses Plasmid wurde als Ausgangsmaterial verwendet, um einen neuen Vektor herzustellen, in dem Nukleinsäuremoleküle leicht ausgetauscht werden können, welche spezifische Promotor- und Gensequenzen umfassen.
Zunächst wurde ein PCR Fragment aus pZipΔMo+PyF101(N^–) Template DNA (beschrieben in PCT/NL96/00195) mit den folgenden Primern erzeugt: LTR-1: 5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' (SEQ ID NO: 4) und LTR-2: 5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3' (SEQ ID NO: 5). Pwo DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers mit den folgenden Temperaturzyklen verwendet: einmal 5 Minuten bei 95°C, 3 Minuten bei 55°C, und 1 Minute bei 72°C; und 30 Zyklen bestehend aus 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 60°C, 1 Minute bei 72°C, gefolgt von einmal 10 Minuten bei 72°C. Das PCR Produkt wurde im Anschluß mit BamHI verdaut und in einen pMLP10 Vektor ligiert (Levrero et al. (1991) Gene 101: 195–202), der mit PvuII und BamHI verdaut wurde, wodurch Vektor pLTR10 erzeugt wurde. Dieser Vektor enthält adenovirale Sequenzen von bp 1 bis zu bp 554, gefolgt von einem Promotor, der einen Teil des Mo-MuLV LTR aufweist, in welchem die Wildtyp Enhancer-Sequenzen durch den Enhancer eines mutierten Polyomavirus (PyF101) ersetzt sind. Das Promotorfragment wurde als L420 bezeichnet.
Als nächstes wurde die kodierende Region des Maus HSA-Gens inseriert. pLTR10 wurde mit BstBI verdaut, gefolgt von Klenow-Behandlung und Verdau mit NcoI. Das HSA-Gen wurde mittels PCR Amplifikation aus pUC18-HSA (Kay et al. (1990) J. Immunol. 145: 1952–1959) unter Verwendung der folgenden Primer erhalten: HSA1, 5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3' (SEQ IN NO: 6) und HSA2, 5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3' (SEQ ID NO: 7). Das amplifizierte 259 bp Fragment wurde unter Verwendung der NcoI und BgIII Schnittstellen in einen Shuttle-Vektor subkloniert. Eine Sequenzierung bestätigte den Einbau der korrekten kodierenden Sequenz des HSA-Gens, allerdings mit einer zusätzlichen TAG-Insertion unmittelbar nach dem TAG Stopp-Codon. Die kodierende Region des HSA-Gens einschließlich der TAG-Duplikation wurde anschließend als NcoI(überhängend) (sticky)-SalI(glatt)(blunt) Fragment ausgeschnitten und in das 3.5 kb NcoI(sticky)-SalI(blunt) Fragment von pLTR10 kloniert, was pLTR-HSA10 ergab.
Schließlich wurde pLTR-HSA10 mit EcoRI und BamHI verdaut. Anschließend wurde das Fragment, welches das linke ITR, das Verpackungssignal, den L420-Promotor und das HSA-Gen enthält, in den Vektor pMLPI.TK ligiert, das mit den selben Enzymen verdaut wurde, wobei der Promotor und die Gensequenzen ersetzt wurden. Dies ergab ein neues Adapterplasmid pAd/L420-HSA (19), das zweckmäßige Erkennungssequenzen für verschiedene Restriktionsschnittstellen um die Promotor- und Gensequenzen enthält. SnaBI und AvrII können mit HpaI, NheI, KpnI und HindIII kombiniert werden, um Promotorsequenzen auszutauschen, während die letzeren Schnittstellen mit ClaI oder BamHI Schnittstellen 3' der HSA-kodierenden Region kombiniert werden können, um Gene in diesem Konstrukt zu ersetzen.
Ein weiteres Adapterplasmid, das konzipiert wurde, um den einfachen Austausch von Nucleinsäuremolekülen zu ermöglichen, wurde durch Ersetzen der Promotor-, Gen- und Poly(A)-Sequenzen in pAd/L420-HSA mit dem CMV-Promotor, einer multiplen Klonierungsstelle, einem Intron und einem Poly(A)-Signal hergestellt. Zu diesem Zweck wurde pAd/L240-HSA mit AvrII und BgIII verdaut, gefolgt von einer Behandlung mit Klenow Enzym, um glatte Enden zu erhalten. Das 5.1 kb Fragment mit dem pBR322 Vektor und den adenoviralen Sequenzen wurde isoliert und an ein 1570 bp Fragment mit glatten Enden aus pcDNA1/amp (Invitrogen) ligiert, welches durch Verdau mit HhaI und AvrII, gefolgt von Behandlung mit T4 DNA-Polymerase erhalten wurde. Dieses Adapterplasmid wurde als pCLIP (20) bezeichnet.
Generierung rekombinanter Adenoviren
E1-deletierte Rekombinante Adenoviren mit Wiltyp E3-Sequenzen
Um mit dem neuen plasmid-basierten System E1-deletierte rekombinante Adenoviren zu erzeugen, wurden die folgenden Konstrukte hergestellt: ein Adapterkonstrukt, das die Expressionskassette mit dem interessierenden Gen enthält, welches mit einem Restriktionsenzym linearisiert wurde, das an der 3' Seite des überlappenden adenoviralen Genomfragments schneidet, und vorzugsweise keine pBR322 Vektorsequenzen enthält; und ein komplementierendes adenovirales Genomkonstrukt, pWE/Ad.AflII-rITR, verdaut mit PacI.
Diese beiden DNA-Moleküle werden weiterhin mittels Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt. Cotransfektion dieser Plasmide in eine Adenovirus Verpackungszellinie, vorzugsweise eine Zelllinie gemäß der Erfindung, erzeugt mit Hilfe einer Ein-Schritt homologen Rekombination zwischen dem Adapter- und dem komplementierenden Konstrukt rekombinante replikationsdefekte Adenoviren ( 21). Alternativ können an Stelle von pWE/Ad.AflII-rITR andere Fragmente verwendet werden, zum Beispiel können pBr/Ad.Cla-Bam, verdaut mit EcoRI und BamHI, oder pBr/Ad.AflII-BamHI, verdaut mit PacI und BamHI, mit pBr/Ad.Sal-rITR, verdaut mit SalI, kombiniert werden. In diesem Fall werden drei Plasmide kombiniert und es werden zwei homologe Rekombinationen benötigt, um einen rekombinanten Adenovirus zu erhalten ( 22). Es ist selbstverständlich, dass Fachleute andere Kombinationen aus Adapter- und komplementierenden Plasmiden verwenden können, ohne von der Erfindung abzuweichen.
Ein allgemeines Protokoll, wie unten dargestellt und als nicht limitierendes Beispiel der Erfindung zu verstehen, wurde durchgeführt, um mehrere rekombinante Adenoviren unter Verwendung verschiedener Adapterplasmide und des Ad.AflII-rITR Fragments herzustellen. Adenovirus Verpackungszellen (PER.C6) wurden in ~25 cm² Flaschen ausgesät und am nächsten Tag bei Erreichen von ungefähr 80% Konfluenz mit einem Gemisch aus DNA und Lipofectamin Reagenz (Life Technologies) transfiziert, wie vom Hersteller beschrieben. Routinemäßig wurden 40 μl Lipofectamin, 4 μg Adapterplasmid und 4 μg des komplementierenden Adenovirus Genomfragments AflII-rITR (oder 2 μg aller drei Plasmide für die zweifache homologe Rekombination) verwendet. Unter diesen Bedingungen wurden transiente Transfektioneffizienz von ungefähr 50% (48 Stunden nach Transfektion) erhalten, wie durch Kontrolltransfektionen unter Verwendung eines pAd/CMV-LacZ Adapters bestimmt wurde. Zwei Tage später wurden die Zellen auf ~80 cm² Flaschen passagiert und weiter kultiviert. Ungefähr fünf Tage (für die einzelne homologe Rekombination) bis 11 Tage (für die zweifache homologe Rekombination) später wurde ein cytopathischer Effekt (CPE) beobachtet, was die Ausbildung eines funktionellen Adenovirus anzeigt. Nach Erreichen des vollständigen CPE wurden Zellen und Medium geerntet und das rekombinante Virus durch Frieren-Tauen freigesetzt. Ein zusätzlicher Amplifikationsschritt in einer 80 cm² Flasche wurde routinemäßig durchgeführt, um die Ausbeute zu erhöhen, da in der initialen Phase die Titer trotz Erreichen vollständigen CPE variabel waren. Nach der Amplifikation wurden die Viren geerntet und die Plaques auf PER.C6 Zellen gereinigt. Einzelne Plaques wurden auf Viren mit aktiven Transgenen getestet.
Mit diesen Protokoll wurden vier verschiedene rekombinante Adenoviren hergestellt, die das humane Interleukin 3-Gen (siehe 1, WO 88/04691), das humane endotheliale Stickstoffoxid-Gen (Janssens et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 14519–14522), das Tc1A Transposase-Gen (Vos et al. (1993) Genes Dev. 7: 1244–1253)oder das bakterielle LacZ-Gen (Kalderin et al. (1984) Cell 39: 499–509) enthalten. In allen Fällen wurden funktionelle Adenoviren gebildet, und alle isolierten Plaques enthielten Viren mit einem aktiven Transgen.
E1-deletierte rekombinante Adenoviren mit Modifikationen in dem E3- oder E4 Regionen
Abgesehen von Austauschen in der E1-Region ist es möglich, die E3-Region zu deletieren oder einen Teil der E3-Region im Adenovirus zu ersetzen, da E3-Funktionen für die Replikation, Verpackung und Infektion eines rekombinanten Virus nicht erforderlich sind. Dies bietet die Möglichkeit, ein größeres Insert zu verwenden oder mehr als ein Gen zu inserieren, ohne die maximale verpackbare Größe zu übersteigen (ungefähr 105% der Wildtyp Genomlänge). Dies kann zum Beispiel durch Deletieren eines Teil der E3-Region im pBr/Ad.Bam-rITr Klon durch Verdau mit XbaI und Religation-erreicht werden. Dies entfernt Ad5 Wildtyp Sequenzen 28592 bis 30470 einschließlich aller bekannten E3-kodierenden Regionen. Ein weiteres Beispiel ist der präzise Austausch der kodierenden Region von gp19K in der E3-Region mit einem Polylinker, der die Insertion neuer Sequenzen erlaubt. Dies lässt alle anderen kodierenden Regionen intakt, umgeht den Bedarf für einen heterologen Promotor, weil das Transgen vom E3-Promotor und den pA-Sequenzen angetrieben wird, was mehr Raum für kodierende Sequenzen lässt, und sehr hohe Expressionsraten des Transgens zur Folge hat, zumindest so gut wie in einem Kontroll E1-Austauschvektor.
Dazu wurde das 2.7 kb EcoRI Fragment von Wildtyp Ad5, welches den 5' Teil der E3-Region enthält, in die EcoRI Schnittstelle von pBluescript (KS^–)(Stratagene) kloniert. Als nächstes wurde die HindIII Schnittstelle im Polylinker durch Verdau mit EcoRV und HincII und anschließende Religation entfernt. Der resultierende Klon pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII wurde verwendet, um die gp19K kodierende Region zu deletieren. Primer 1 (5'-GGG TAT TAG GCC AAA GGC GCA-3')(SEQ ID NO: 8) und Primer 2 (5'-GAT CCC ATG GAA GCT TGG GTG GCG ACC CCA GCG-3')(SEQ ID NO: 9) wurden verwendet, um eine Sequenz aus pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII zu amplifizieren, welche der Sequenz 28511 bis 28734 in der Wildtyp Ad5 DNA entspricht. Primer 3 (5'-GAT CCC ATG GGG ATC CTT TAC TAA GTT ACA AAG CTA-3')(SEQ ID NO: 10) und Primer 4 (5'-GTC GCT GTA GTT GGA CTG G-3')(SEQ ID NO: 11) wurden mit der gleichen DNA verwendet, um Ad5-Sequenzen von 29217 bis 29476 zu amplifizieren. Die beiden resultierenden PCR Fragmente wurden mittels der neu eingeführten NcoI Schnittstelle ligiert und anschließend mit XbaI und MunI verdaut. Dieses Fragment wurde im Anschluß in einen pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII Vektor ligiert, der partiell mit XbaI und MunI verdaut wurde, was pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19K erzeugt.
Um die Insertion fremder Gene in die HindIII und BamHI Schnittstellen zu ermöglichen, wurde eine XbaI Deletion in pBS.Eco-Eco/ad5ΔaIII.Δgp19K eingeführt, um die BamHI Schnittstellen im Buescript-Polylinker zu entfernen. Das resultierende Plasmid pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIIIΔgp19KΔXbaI enthält singuläre HindIII und BamHI Schnittstellen, welche den Sequenzen 28733 (HindIII) und 29218 (BamHI) in Ad5 entsprechen. Nach Einbringen eines fremden Gens in diese Schnittstellen wird entweder das deletierte XbaI Fragment wieder eingeführt oder das Insert wird unter Verwendung von HindIII und zum Beispiel MunI in pBS.Eco-Eco/ad5ΔhIII.Δgp19K erneut kloniert. Mit diesem Verfahren haben wir Plasmide erzeugt, die HSV-TK (McKnight (1980) Nucl. Acids Res. 8: 5949–5964 und Vincent et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 197–205), hIL-1α (Esandi et al. (1998) Gene Therapy 5: xxx-yyy), Ratten IL-3β (Esandi et al. (1998) Gene 11242: xxx-yyy), Luciferase (DeWit et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7: 725–737) or LacZ exprimieren. Die singulären SrfI und NotI Schnittstellen im Plasmid pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Dgp19k (mit oder ohne einem inserierten Gen von Interesse) werden verwendet, um die Region, welche das Gen von Interesse enthält in die entsprechende Region von pBR/Ad.Bam-rITR zu transferieren, was zum Konstrukt pBr/Ad.Bam-rITRDgp19K (mit oder ohne einem inserierten Gen von Interesse) führt. Dieses Konstrukt wird wie oben beschrieben verwendet, um rekombinante Adenoviren herzustellen. Im viralen Kontext wird die Expression des Gens von Interesse vom Adenovirus E3-Promotor angetrieben.
Rekombinante Viren, die sowohl E1- als auch E3-deletiert sind, werden mit Hilfe eines Verfahrens mit zweifacher homologer Rekombination wie oben für E1-Austauschvektoren beschrieben unter Verwendung eines plasmid-basierten Systems hergestellt, welches umfasst: Ein Adapterplasmid zum Austausch von E1 gemäß der Erfindung mit oder ohne Insertion eines ersten Gens von Interesse, das PWE/Ad.AflII-EcoRI Fragment und das pBR/Ad.Bam-rITRΔgp19K Plasmid mit oder ohne Insertion eines zweiten Gens von Interesse.
In einem nicht einschränkenden Beispiel beschreiben wir die Erzeugung und Funktionalität eines rekombinanten Adenovirus, welcher das Maus-HSA-Gen in der E1-Region und das Leuchtkäfer (firefly)-Luciferasegen in der gp19K-Region enthält. Das Luciferasegen wurde als ein HindIII-BamHI Konstrukt aus pAd/MLP-Luc (beschrieben in EP 0707071 ) ausgeschnitten und in die HindIII-BamHI Schnittstellen von pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIIIΔgp19KΔXbaI kloniert. Im Anschluss wurde das MscI-MunI Fragment, welches das Luciferasegen enthält, in die korrespondierenden Schnittstellen von pBS.Eco-Eco/ad5Δgp19K kloniert, wodurch pBS.Eco-Eco/ad5Δgp19K.luc erzeugt wird. Dies stellt das Eco-Eco Fragment wieder her, nun aber mit dem Luciferasegen an Stelle von gp19K.
Um die weitere Manipulation zu vereinfachen, wurden die internen EcoRI Schnittstellen im Luciferase-Insert mutiert, ohne die Aminosäuresequenz des Luciferasegens zu verändern. Eine EcoRI Schnittstelle flankierte die HindIII Schnittstelle im 5' nicht-kodierenden Bereich des Luciferase-Inserts, und die andere lag 588 bp 3' des ATG-Starts. Ein 695 bp PCR Produkt wurde mit den folgenden Primern erzeugt: 5'-CGA TAA GCT TAA TTC CTT TGT GTT T-3' (SEQ ID NO: 12) und 5'-CTT AGG TAA CCC AGT AGA TCC AGA GGA GTT CAT-3' (SEQ ID NO: 13) und mit HindIII und BstEIII verdaut. Dieses Fragment wurde anschließend an mit HindIII-BstEII verdautem pBS.Eco-Eco/ad5Δgp19K.luc ligiert, und dadurch das entsprechende Insert in diesem Vektor ersetzt. Das erhaltene Konstrukt wird als pBS.Eco-Eco/ad5Δgp19K.luc² bezeichnet. Das Luciferasegen und ein Teil der E3-Region wurde im Anschluß aus diesem Klon mit SrfI und NotI ausgeschnitten und in die entsprechenden Schnittstellen von pBr/Ad.Bam-rITR eingebracht, wodurch Klon pBr/Ad.Bam-rITRΔgp19K/luc² erzeugt wurde.
Das Adapterplasmid pAd5/51800HSA, das zum Ersetzen von E1 im Virus mit dem zweifachen Insert verwendet wurde, enthält das Maus-HSA-Gen unter Kontrolle eines Retrovirus LTR-basierten Promotors. Dieses Adapterplasmid wurde aus dem nachfolgend beschriebenen Konstrukt pAd5/L420-HSA durch Ersetzen der Promotorsequenz erzeugt. Zunächst wurde unter Verwendung der gleichen Primer wie für die Amplifikation des L420 Promotorfragments (nachfolgend beschrieben) ein PCR Produkt eines retroviralen Vektors erzeugt, welcher auf dem in WO 95/3469 beschriebenen Vektor MFG-S basiert. Diese PCR amplifiziert die Sequenzen, welche dem Basenpaar 453 bis 877 im Vektor MFG-S entsprechen. Der L-420-Promotor in Ad5/L420-HSA (21) wurde im Anschluss unter Verwendung der singulären AvrII und HindIII Schnittstellen gegen das PCR Fragment ausgetauscht. Das erhaltene Konstrukt pAd5/5430-HSA wurde anschließend mit NheI und ScaI verdaut, und das 4504 bp Fragment, welches das HSA-Gen, die pA-Sequenzen, die Ad5-Sequenzen und die Vektorsequenzen bis zur ScaI Schnittstelle im Ampicillingen enthält, wurde isoliert.
Das Konstrukt pAd5/5430-HSA wurde ebenfalls mit XbaI und ScaI verdaut, und das 1252 bp Fragment (dwelches das verbliebene Ampicillingen, das linke ITR und das Verpackungssignal des Adenovirus und den 5' Anteil des S430-Promotors enthält) wurde isoliert. Ein drittes Fragment mit 1576 bp wurde nach XbaI-Verdau von dem MFG-S basierten retroviralen Vektor isoliert und enthält die MFG-S Sequenzen, die den bp 695 bis 2271 entsprechen.
Das Adapterplasmid pAd5/51800-HSA wurde durch Ligieren der drei isolierten Fragmente konstruiert. Das Virus Ad5/51800-HSA.E3luc mit dem doppelten Insert wurde (wie oben beschrieben). durch Transfektion des folgenden DNA-Fragments in PER.C6 Zellen generiert: pAd5/51800-HSA, verdaut mit EcoRI und SalI (2 μg). Bei Vorliegen von CPE wurde das Virus geerntet und durch serielle Passagen in PER.C6 Zellen amplifiziert. Die Aktivität dieses HSA-luc Virus wurde mit ΔE1-Viren mit einzelnem Insert, welche entweder die 51800-HSA oder die CMVluc Transkriptionseinheiten in der E1-Region enthalten, verglichen. A549 Zellen wurden in einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Well ausgesät und 5 Stunden später mit verschiedenen Mengen des Virus infiziert. Zwei Tage später wurde die Expression des Transgens gemessen. Die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung eines Luciferase Assay-Systems (Promega) gemessen, und die Expression des murinen HSA-Gens wurde mittels eines α-HSA Antikörpers (M1/69, Pharmingen) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgelistet.
Dieses Experiment zeigt, dass durch die Verwendung des plasmid-basierten Rekombinationssystems Viren mit zweifachem Insert hergestellt werden können, und dass beide Inserts funktionell sind. Weiterhin ist die Luciferase-Aktivität der Viren mit zweifachem Insert vergleichbar zur CMV-kontrollierten Luciferase-Aktivität des Kontrollvirus. Daraus schließen wir, dass der E3-Promotor in A549 Zellen hochaktiv ist, selbst bei Fehlen von E1A-Proteinen.
Zusätzlich zu Manipulationen in der E3-Region können in pBr/Ad.Bam-rITR einfach Veränderungen von (Teilen) der E4-Region erhalten werden. Die Generierung und Propagation eines derartigen Virus erfordert in einigen Fällen jedoch die Komplementation in trans.
Beispiel 3
Nachweis der Kompetenz einer synthetischen DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine Hairpin-Struktur auszubilden, als Primer zur Synthese des reversen Stranges für die Generierung doppelsträngiger DNA-Moleküle in Zellen zu dienen, welche Adenovirusgene enthalten und exprimieren
Namenskonvention der verwendeten Plasmide:
P: Plasmid
I: ITR (Adenovirus Inverted Terminal Repeat)
C: Cytomegalovirus (CMV) Enhancer/Promotor Kombination
L: Leuchtkäfer (Firefly) Luciferase kodierende Sequenz
hac, haw: potentieller Hairpin, der nach Verdau mit der Restriktionsendenuklease Asp718 in der korrekten beziehungsweise in der reversen Orientierung ausgebildet werden kann (15).
Die Namenskonvention wird an folgendem Beispiel veranschaulicht. pICLhaw ist ein Plasmid, das die Adenovirus ITR, gefolgt vom CMV-kontrollierten Luciferasegen und dem Asp718 Hairpin in der reversen (nicht funktionellen) Orientierung enthält. Die Plasmide pICLhac, pICLhaw, pICLI und pICL wurden mit Hilfe von Standardverfahren erzeugt. Eine schematische Darstellung dieser Plasmide ist in den 16 bis 19 gezeigt.

Das Plasmid pICL stammt von den folgenden Plasmiden ab:

Nt. 1-457:	pMLP10 (Levrero et al. (1991) Gene 101: 195-202)
Nt. 458-1218:	pCMVß (Clontech, EMBL Bank Nr. U02451)
Nt. 1219-3016:	pMLP.luc (IntroGene, unveröffentlicht)
Nt. 3017-5620:	pBLCATS (Stein et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 4531–4534).

Das Plasmid wurde wie folgt konstruiert: Das tet-Gen des Plasmids pMLP10 wurde durch Deletion des BamHI-SalI Fragments inaktiviert, um pBLP10ΔSB zu erzeugen. Unter Verwendung des Primer-Sets PCR/MLP1 (SEQ ID NO: 37) und PCR/MLP3 (SEQ ID NO: 38) und pMLP10-DNA als Template wurde ein 210 bp Fragment amplifiziert, welches das Ad5-ITR flankiert von einer synthetischen SalI Restriktionsschnittstelle enthält. Das PCR Produkt wurde mit den Enzymen EcoRI und SgrAI verdaut, um ein 196 bp Fragment zu erzeugen. Das Plasmid pMLP10ΔSB wurde mit EcoRI und SgrAI verdaut, um das ITR zu entfernen. Dieses Fragment wurde mit dem EcoRI-SgrAI behandelten PCR Fragment ersetzt, um pMLP/SAL zu erzeugen.
Das Plasmid pCMV-Luc wurde mit PvuII vollständig verdaut und rezirkuliert, um das von SV40 abstammende Polyadenylierungssignal und die Ad5-Sequenzen mit Ausnahme des linken Ad5-Terminus zu entfernen. Im erhaltenen Plasmid pCMV-lucΔAd wurde durch Austausch der XmnI-SacII Fragmente das Ad5 ITR durch das mit einer SalI Schnittstelle flankierte ITR von Plasmid pMLP/SAL ersetzt. Aus dem so erhaltenen Plasmid pCMV-lucΔAd/SAL wurden der linke Ad5-Terminus und das CMV-kontrollierte Luciferasegen als SalI-SmaI Fragment isoliert und in das mit SalI und HpaI verdaute Plasmid pBLCATS inseriert, um Plasmid pICL zu bilden. Das Plasmid pICL ist in 19 dargestellt. Seine Sequenz ist in 20 dargestellt.

Das Plasmid pICL enthält die folgenden Merkmale:

Nt. 1-457:	Ad5 left terminus (Sequence 1-457 of human adenovirus type 5)
Nt. 458-969:	Humaner Cytomegalovirus Enhancer und Immediate Early Promotor (Boshart et al. (1985) Cell 41: 521–530)(aus Plasmid pCMVß, Clontech, Palo Alto, USA)
Nt. 970-1204:	SV40 19S Exon and trunkiertes 16/19S Intron (aus Plasmid pCMVß)
Nt. 1218-2987:	Leuchtkäfer Luciferasegen (aus pMLP.luc)
Nt. 3018-3131:	SV40 Tandem Polyadenylierungssignale des späten Transcripts, abgeleitet von Plasmid pBLCAT5)
Nt. 3132-5620:	pUC12 Grundgerüst (abgeleitet von Plasmid pBLCAT5)
Nt. 4337-5191:	β-Lactamasegen (Amp-Resistenzgen, reverse Orientierung)

Plasmide pICLhac und pICLhaw
Die Plasmide pICLhac und pICLhaw wurden von Plasmid pICL durch Verdau von pICL mit dem Restriktionsenzym Asp718 abgeleitet. Das linearisierte Plasmid wurde mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, um die 51 Phosphatgruppen zu entfernen. Die teilweise komplementären synthetischen einzelsträngigen Oligonukleotide Hp/aspI (SEQ ID NO: 39) und Hp/asp2 (SEQ ID NO: 40) wurden hybridisiert und an ihren 5' Enden mit Hilfe von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert.
The phosphorylierten doppelsträngigen Oligomere wurden mit dem dephosphorylierten pICL Fragment gemischt und ligiert. Klone, welche im Plasmid inseriert eine singuläre Kopie des synthetischen Oligonukleotids enthielten, wurden isoliert und mit Hilfe von Restriktionsenzymverdaus charakterisiert. Die Insertion des Oligonukleotids in die Asp718 Schnittstelle erzeugt an einer Grenze erneut eine Asp718 Erkennungsstelle, während die Erkennungsstelle an der anderen Grenze zerstört wird. Die Orientierung und die Integrität des inserierten Oligonukleotids wurden in ausgewählten Klonen mit Hilfe von Sequenzanalysen verifiziert. Ein Klon, der das Oligonukleotid in der korrekten Orientierung (die Asp718 Schnittstelle nahe der 3205 EcoRI Schnittstelle) enthält, wurde als pICLhac bezeichnet. Ein Klon mit dem Oligonukleotid in der reversen Orientierung (die Asp718 Schnittstelle nahe dem von SV40 abgeleiteten Polyadenylierungssignal) wurde als pICLhaw bezeichnet. Die Plasmide pICLhac und pICLhaw sind in den 16 und 17 dargestellt.
Plasmid pICLI wurde aus Plasmid pICL durch Insertion des SalI-SgrAI Fragments aus pICL, welches das Ad5-ITR enthält, in die Asp718 Schnittstelle von pICL erzeugt. Das 194 bp SalI-SgrAI Fragment wurde aus pICL isoliert, und die kohäsiven Enden wurden mit Hilfe von E. coli DNA Polymerase I (Klenow Fragment) und dNTPs in glatte (blunt) Enden umgewandelt. Die Asp718 kohäsiven Enden wurden durch Behandlung mit Nuklease aus Mungbohnen in glatte Enden umgewandelt. Durch Ligation wurden Klone erzeugt, welche das ITR in der Asp718 Schnittstelle des Plasmids pICL enthalten. Ein Klon, welcher das ITR-Fragment in der korrekten Orientierung enthält, wurde mit pICLI bezeichnet (18).
Generierung des Adenovirus Ad-CMV-hcTK. Das rekombinante Adenovirus wurde entsprechend dem Verfahren konstruiert, welches in der Patentanmeldung 95202213 beschrieben ist. Zwei Komponenten sind erforderlich, um ein rekombinantes Adenovirus zu erzeugen. Zunächst ein Adapterplasmid, das den linken Terminus des Adenovirs Genoms enthält, welcher das ITR und das Verpackungssignal, eine Expressionskassette mit dem Gen von Interesse und einen Teil des Adenovirusgenoms enthält, der für die homologe Rekombination verwendet werden kann. Zusätzlich wird Adenovirus DNA für die Rekombination mit dem zuvor erwähnten Adapterplasmid benötigt. Im Falle von Ad-CMV-hcTK wurde das Plasmid pCMV.TK als Basis verwendet. Dieses Plasmid enthält die Nt. 1-455 des Adenovirus Typ 5 Genoms, Nt. 456-1204 abgeleitet von pCMVß (Clontech, das PstI-StuI Fragment, welches den CMV Enhancer/Promotor und das 16S/19S Intron des Simian Virus 40 enthält), das Herpes Simplex Virus Thymidinkinasegen (beschrieben in der Patentanmeldung EP 95202213.5 ) das von SV40 abgeleitete Polyadenylierungssignal (Nt. 2533-2668 der SV40 Sequenz), gefolgt vom BgIII-ScaI Fragment von Ad5 (Nukleotide 3328-6092 der Ad5-Sequenz). Diese Fragmente sind in einem von pMLP10 (Levero et al. (1991) Gene 101: 195-202) abgeleiteten Grundgerüst vorhanden. Um Plasmid pAD-CMVhc-TK zu erzeugen, wurde Plasmid pCMV.TK mit ClaI (die singuläre ClaI Schnittstelle liegt gerade oberhalb des offenen Leserahmens von TK) verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert. Um eine Hairpin-Struktur zu erzeugen, wurden die synthetischen Oligonukleotide HP/clal (SEQ ID NO: 41) und HP/cla2 (SEQ ID NO: 42) hybridisiert und an ihren 5'-OH Gruppen mit T4-Polynukleotidkinase und ATP phosphoryliert. Das doppelsträngige Oligonukleotid wurde mit dem linearisierten Vektorfragment ligiert und zur Transformation des E. coli Strammes SURE verwendet. Die Insertion des Oligonukleotids in die ClaI Schnittstelle zerstört die ClaI Erkennungssequenzen. Das Oligonukleotid enthält eine neue ClaI Schnittstelle nahe einem ihrer Termini. In ausgewählten Klonen wurde die Orientierung und die Integrität des inserierten Oligonukleotids durch Sequenzanalysen verifiziert. Ein Klon, welcher das Oligonukleotid in der korrekten Orientierung (die ClaI Schnittstelle an der ITR-Seite) enthält, wurde als pAd-CMV-hcTK bezeichnet. Dieses Plasmid wurde mit ClaI verdauter Wildtyp Adenovirus Typ 5 DNA in 911 Zellen cotransfiziert. Ein rekombinantes Adenovirus, in dem die CMV-hcTK Expressionskassette die E1-Sequenzen ersetzt, wurde isoliert und mit Hilfe von Standardverfahren propagiert.
Um zu untersuchen, ob der Hairpin als Primer zur Synthese des reversen Stranges am verdrängten Strang verwendet werden kann, nachdem die Replikation am ITR gestartet ist, wurde das Plasmid pICLhac in 911 Zellen eingebracht, i. e. in humane embryonale Retinoblasten, die mit der Adenovirus E1-Region transformiert wurden. Das Plasmid pICLhaw diente als Kontrolle: Es enthält das Oligonukleotidpaar Hp/asp 1 (SEQ ID NO: 39) und 2 (SEQ ID NO: 40) in reverser Orientierung, ist aber ansonsten vollständig identisch zum Plasmid pICLhac. In diese Studien wurden ferner die Plasmide pICLI und pICL eingeschlossen. Im Plasmid pICLI ist der Hairpin durch ein Adenovirus ITR ersetzt. Plasmid pICL enthält weder einen Hairpin noch eine ITR-Sequenz. Diese Plasmide dienten als Kontrollen, um die Effizienz der Replikation aufgrund der terminalen Hairpin-Struktur zu. bestimmen. Um die viralen Produkte außer den E1-Proteinen (diese werden von den 911 Zellen produziert) bereitzustellen, welche für die DNA Replikation erforderlich sind, wurden die Kulturen nach der Transfektion mit dem Virus IG.Ad.MLPI.TK infiziert. Mehrere Parameter wurden untersucht, um die genaue Replikation der transfizierten DNA-Moleküle nachzuweisen. Als erstes wurde die DNA, die aus den Zellkulturen extrahiert wurde, welche mit den zuvor erwähnten Plasmiden transfiziert und dem Virus IG.Ad.MLPI.TK infiziert wurden, mittels Southern Blotting auf das Vorhandensein der erwarteten Replikationsintermediate sowie das Vorhandensein der duplizierten Genome untersucht. Weiterhin wurde aus den transfizierten und mit IG.Ad.MLPI.TK infizierten Zellpopulationen das Virus isoliert, das ein Luciferase-Markergen in Luciferase-negative Zellen transferieren und es exprimieren kann.
Die Plasmid-DNA der Plasmide pICLhac, pICLhaw, pICLI und pICL wurde mit Restriktionsendonuklease SalI verdaut und mit Nuklease aus Mungbohnen behandelt, um die vier Nukleotide lange einzelsträngige Extension des resultierenden DNA Fragments zu entfernen. Auf diese Weise wurde in dem DNA Fragment ein natürlicher Adenovirus 5'ITR-Terminus erzeugt. Anschließend wurde sowohl das Plasmid pICL hac als auch das Plasmid pICL haw mit der Restriktionsendonuklease Asp718 verdaut, um den Terminus zu generieren, der zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur in der Lage ist. Die verdauten Plasmide wurden mittels Standard Kalziumphosphat-Copräzipitation in 911 Zellen eingebracht, und zwar vier Schalen für jedes Plasmid. Während der Transfektion wurden für jedes Plasmid zwei der Kulturen mit dem Virus IG.Ad.MLPI.TK infiziert, und zwar unter Verwendung von 5 infektiösen Partikeln von IG.Ad.MLPI.TK pro Zelle. 24 Stunden nach Transfektion und 48 Stunden nach Transfektion wurde eine der Ad.TK-Virus-infizierten und eine der uninfizierten Kulturen verwendet, um mit Hilfe des von Hirt entwickelten Verfahrens (wie beschrieben in Einerhand et al. (1995) Gene Therapy 2: 336–343) niedermolekulare DNA zu isolieren. Aliquots der isolierten DNA wurden für eine Southern-Analyse verwendet. Nach Verdau der Proben mit der Restriktionsendonuklease EcoRI unter Verwendung des Luciferasegens als Sonde wurde nur in den Proben der Adenovirus-infizierten Zellen, welche mit dem Plasmid pICLhac transfiziert wurden, ein hybridisierendes Fragment von ungefähr 2.6 kb detektiert. Die Größe dieses Fragments stand im Einklang mit der erwarteten Duplikation des Luciferase-Markergens. Dies unterstützt die Schlussfolgerung, dass der inserierte Hairpin in der Lage ist, als Primer zur Synthese des reversen Stranges zu dienen. Das hybridisierende Fragment fehlte, wenn der Virus IG.Ad.MLPI.TK weggelassen wurde, oder wenn das Hairpin-Oligonukleotid in der reversen Orientierung inseriert wurde.
Die Restriktionsendonuklease DpnI erkennt die Tetranukleotid-Sequenz 5'-GATC-3', schneidet aber nur methylierte DNA (das heißt, nur Plasmid-DNA, die propagiert wird in und abstammt von E. coli, nicht aber DNA, die in Säugetierzellen repliziert wurde). Die Restriktionsendonuklease MboI erkennt die gleichen Sequenzen, schneidet aber nur unmethylierte DNA (namentlich DNA, welche in Säugetierzellen propagiert wurde). DNA Proben, die aus den transfizierten Zellen isoliert wurden, werden mit MboI und DpnI inkubiert und mittels Southern-Blots analysiert. Diese Ergebnisse wiesen nach, dass nur in den mit den Plasmiden pICLhac und pICLI transfizierten Zellen große DpnI-resistente Fragmente vorhanden waren, welche in den mit MboI behandelten Proben fehlten. Diese Daten zeigten, dass nur nach Transfektion der Plasmide pICLI und pICLhac Replikation und Duplikation der Fragmente erfolgt.
Diese Daten zeigen, dass in Adenvirus-infizierten Zellen lineare DNA Fragmente, die an einem Terminus ein von einem Adenovirus abgeleitetes Inverted Terminal Repeat (ITR) und am anderen Terminus eine Nukleotidsequenz aufweisen, welche an Sequenzen auf dem gleichen Strang hybridisieren kann, wenn in einzelsträngiger Form vorliegend, und dadurch eine Hairpin-Struktur generieren kann und in Strukturen umgewandelt wird, die Inverted Terminal Repeat-Sequenzen an beiden Enden aufweisen. Die erhaltenen DNA-Moleküle replizieren über den gleichen Mechanismus wie die Wildtyp Adenovirusgenome.
Beispiel 4
Demonstration, dass die DNA-Moleküle, die ein Luciferase-Markergen, eine singuläre Kopie des ITRs, das Verpackungssignal und eine synthetische DNA-Sequenz enthalten, welche zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur in der Lage ist, ausreichend sind, um DNA-Moleküle zu erzeugen, die in Virione verpackt werden können
Um nachzuweisen, dass die in Beispiel 3 erzeugten DNA-Moleküle, die zwei Kopien des CMV-luc Markergens enthalten, in Virione verpackt werden können, wurde das Virus der verbliebenen beiden Kulturen via drei Zyklen des Frieren-Tauen-Aufbrechens (freeze-thaw crushing) geerntet und zur Infektion von Maus-Fibroblasten verwendet. 48 Stunden nach Infektion wurden die infizierten Zellen auf Luciferase-Aktivität untersucht. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Luciferase-Aktivität eher durch den Transfer freier DNA als über die Viruspartikel induziert wurde, wurden die Virusbestände mit DNase I behandelt, um DNA-Kontaminanten zu entfernen. Als zusätzliche Kontrolle wurden weiterhin Aliquots der Virusstocks 60 Minuten bei 56°C inkuziert. Die Hitzebehandlung beeinträchtigt nicht die kontaminierende DNA, inaktiviert aber die Viren. Eine signifikante Luciferase-Aktivität wurde nach Infektion mit den Virusstocks nur in den Zellen gefunden, die von IG.Ad.MLPI.TK-infizierten Zellen abgeleitet waren, welche mit den Plasmiden pICLhac und pICLI transfiziert wurden. Weder in den nicht infizierten Zellen noch in den infizierten Zellen, die mit den Plasmiden pICLhaw und pICL transfiziert wurden, konnte eine signifikante Luciferase-Aktivität nachgewiesen werden. Hitzeinaktivierung, aber nicht DNAse I-Behandlung eliminierte die Luciferase-Expression vollständig, was zeigte, dass Adenoviruspartikel und nicht freie (kontaminierende) DNA-Fragmente für den Transfer des Luciferase-Reportergens verantwortlich waren.
Diese Ergebnisse zeigen, dass diese kleinen viralen Genome in Adenoviruspartikel verpackt werden können, und suggerieren, dass das IPR und das Verpackungssignal für die Verpackung linearer DNA-Fragmente in Adenoviruspartikel ausreichend sind. Diese Adenoviruspartikel können für einen effizienten Gentransfer verwendet werden. Wenn in Zellen eingebracht, die zumindest einige der Adenovirus-Gene (namentlich E1, E2, E4, L und VA) enthalten und exprimieren, haben rekombinante DNA-Moleküle, die zumindest ein ITR, zumindest einen Teil des Verpackungssignals sowie eine synthetischen DNA-Sequenz umfassen, die zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur in der Lage ist, die intrinsische Kapazität, autonom rekombinante Genome zu generieren, die in Virione verpackt werden können. Solche Genome und Vektorsysteme können zum Gentransfer verwendet werden.
Beispiel 5
Nachweis, dass DNA-Moleküle, welche die Nukleotide 3510 bis 35953 (namentlich 9.7–100 map units) des Adenovirus Typ 5 Genoms (dem folglich die E1-Protein kodierenden Regionen, das rechte ITR und die Verpackungssequenzen fehlen) und eine terminale DNA-Sequenz enthalten, welche komplementär zu einem Teil des gleichen Strangs des DNA-Moleküls ist, wenn sie anderes als das ITR in einzelsträngiger Form vorliegt, und als Ergebnis zur Bildung einer Hairpin-Struktur in der Lage ist, in 911 Zellen replizieren können
Um ein replizierendes DNA-Molekül zu entwickeln, das die Adenovirus-Produkte bereitstellen kann, die erforderlich sind, um die Verpackung des oben erwähnten pICLhac Vektorgenoms und ähnlicher minimaler Adenovektoren mit Hilfe von Helferzellen in Adenoviruspartikel zu ermöglichen, wurde der adenovirale Vektor Ad-CMV-hcTK entwickelt. Zwischen der CMV Enhancer/Promoter-Region und dem Thymidinkinasegen wurde das hybridisierte Oligonukleotidpaar (Tabelle I) HP/clal und 2 inseriert. Der Vektor Ad-CMV-hcTK wurde mit Hilfe von Standardverfahren in 911 Zellen propagiert und produziert. Dieser Vektor wurde exklusiv als DNA Quelle für die Transfektion angezogen und propagiert. Die DNA des Adenvirus Ad-CMV-hcTK wurde aus Viruspartikeln isoliert, die unter Verwendung von CsC1 Dichtegradienten-Zentrifugation mit Hilfe von Standardverfahren gereinigt wurden. Die Virus-DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease ClaI verdaut. Die verdaute DNA wurde auf einem 0.7%igen Agarosegel der Größe nach fraktioniert, und das große Fragment wurde isoliert und für weitere Experimente verwendet. Kulturen aus 911 Zellen wurden mit dem großen ClaI-Fragment der Ad-CMV-hcTK DNA unter Verwendung von Standard-Calciumphosphat-Gopräzipitationsverfahren transfiziert. Sehr ähnlich den vorangegangenen Experimenten mit dem Plasmid pICLhac repliziert Ad-CMV-hc ausgehend vom rechten ITR. Ist der 1-Strang einmal verdrängt, kann am linken Terminus des Fragments ein Hairpin ausgebildet werden. Dies erleichtert die DNA-Polymerase Elongation der Kette hin zur rechten Seite. Der Prozess schreitet voran, bis der verdrängte Strang vollständig in seine doppelsträngige Form überführt ist. Schließlich wird wiederum das rechte ITR ausgebildet, und an dieser Stelle erfolgt normalerweise die Adenovirus Replikationsinitiation und -Elongation. Die Polymerase liest über den Hairpin, wodurch das Molekül dupliziert wird. Das DNA-Ausgangsmolekül von 33250 bp, das auf der einen Seite eine Adenovirus ITR-Sequenz und auf der anderen Seite eine DNA-Sequenz aufweist, welche die Kapazität zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur besitzt, wird dupliziert, sodass beide Enden eine ITR-Sequenz enthalten. Das resultierende DNA-Molekül besteht aus einer Palindrom-Struktur von ungefähr 66500 bp.
Diese Struktur wird in niedermolekularer DNA, die aus transfizierten Zellen extrahiert wurde, mit Hilfe einer Southern-Analyse detektiert. Die palindromische Natur des DNA Fragments kann durch Verdau der niedermolekularen DNA mit geeigneten Restriktionsendonukleasen und Southern Blot mit dem HSV-TK-Gen als Sonde nachgewiesen werden. Dieses Molekül kann sich aufgrund der Adenovirus-Genprodukte, welche in den Zellen vorhanden sind, in den transfizierten Zellen selbst replizieren. Zum Teil werden die Adenovirus-Gene von Templates exprimiert, die im Genom der Zielzellen integriert sind (namentlich die E1-Genprodukte), die anderen Gene sitzen im replizierenden DNA-Fragment selbst. Dieses lineare DNA-Fragment kann nicht in Virione verpackt werden. Ihm fehlen nicht nur alle DNA-Sequenzen, die zur Verpackung notwendig sind, sondern seine Größe ist auch viel zu groß zur Verpackung.
Beispiel 6
Nachweis, dass DNA-Moleküle, welche die Nukleotide 3503-35953, (namentlich 9.7 bis 100 map units) des Adenovirus Typ 5 Genoms (dem folglich die E1-Protein kodierenden Regionen, das rechte ITR und die Verpackungssequenzen fehlen) und eine terminale DNA Sequenz enthalten, welche zu einem anderen Teil als der ITR des selben Stranges des DNA-Moleküls komplementär ist, und als Ergebnis zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur in der Lage ist, in 911 Zellen replizieren können und die Helferfunktionen bereitstellen können, welche zur Verpackung der von pICLI und pICLhac abgeleiteten DNA-Fragmente erforderlich sind
Der Zweck der folgenden Serie von Experimenten ist der Nachweis, dass das in Beispiel 5 beschriebene DNA-Molekül verwendet werden kann, um die minimalen Adenovektoren, die in den Beispielen 3 und 4 beschrieben sind, zu verpacken.
Das große Fragment, welches nach Verdau von Ad-CMV-hcTK DNA mit der Endonuklease ClaI isoliert wurde, wurde zusammen mit dem mit der Endonuklease SalI, der Nuklease aus Mungbohnen und der Endonuklease Asp718 behandelten Plasmid pICLhac oder als Kontrolle dem ähnlich behandelten Plasmid pICLhaw, in 911 Zellen eingebracht. Nach 48 Stunden wurde das Virus mit Hilfe des Frieren-Tauen-Aufbrechens aus der transfizierten Zellpopulation isoliert. Die Viruspräparation wurde mit DNAse I behandelt, um kontaminierende freie DNA zu entfernen. Das Virus wurde nachfolgend zur Infektion von Ratten 2-Fibroblasten verwendet. 48 Stunden nach Infektion wurden die Zellen auf Luciferase-Aktivität untersucht. Signifikante Luciferase-Aktivität wurde nur in den Zellen nachgewiesen, die mit dem Virus infiziert waren, welches aus Zellen isoliert wurde, die mit dem Plasmid pICLhac und nicht mit dem Plasmid pICLhaw transfiziert waren. Hitzeinaktivierung des Virus vor der Infektion hemmte die Luciferase-Aktivität vollständig, was den Transfer des Luciferasegens durch ein virales Partikel anzeigt. Die -Infektion von 911 Zellen mit dem Virusstock hatte keine cytopathologischen Effekte zur Folge, was nachweist, dass pICLhac ohne jedes infektiöse Helfervirus, das in 911 Zellen propagiert wird, hergestellt wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass das vorgeschlagene Verfahren verwendet werden kann, um Stocks von minimalen adenoviralen Vektoren herzustellen, die vollständig frei von infektiösen Helferviren sind, und die zur autonomen Replikation in Adenovirus-transformierten humanen Zellen oder nicht Adenovirus-transformierten humanen Zellen in der Lage sind.
Beispiel 7
Konstruktion von Plasmiden für die Generierung und Produktion minimaler adenoviraler Vektoren
Ein minimaler Adenovirusvektor enthält als operativ verknüpfte Komponenten die von einem Adenovirus abstammenden cis- Elemente, die für die Replikation und Verpackung erforderlich sind, mit oder ohne zu transferierende fremde Nukleinsäuremoleküle. Vor kurzem wurde das untere Limit für die effiziente Verpackung adenoviraler Vektoren mit 75% der Genomlänge bestimmt (Parks und Graham, 1997). Um die flexible Inkorporation verschiedener Längen von Füllfragmenten zu ermöglichen, wurde eine multiple Klonierungsstelle (MCS) in einen minimalen adenoviralen Vektor eingebracht. Um einen minimalen adenoviralen Vektor entsprechend der Erfindung zu erhalten, wurden die folgenden Konstrukte hergestellt: pAd/L420-HHSA (19) wurde mit BgIII und SalI verdaut, und das Vektor-enthaltende Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment enthält das linke ITR und das Verpackungssignal von Ad5 und das Maus-HSA-Gen unter Kontrolle eines modifizierten retroviralen LTR. Das rechte ITR des Adenovirus wurde aus pBr/Ad.BamHI-rITR Template-DNA unter Verwendung der folgenden Primer mittels PCR amplifiziert: PolyL-ITR: 5'-AAC TGC AGA TCT ATC GAT ACT AGT CAA TTG CTC GAG TCT AGA CTA CGT CAC CCG CCC CGT TCC-3' (SEQ ID NO: 14) und ITR-BSN: 5'-CGG GAT CCG TCG ACG CGG CCG CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3' (SEQ ID NO: 15). Das amplifizierte Fragment wurde mit PstI und BamHI verdaut und in das mit den selben Enzymen verdauten pUC119 kloniert. Nach Sequenzbestätigung der korrekten Amplifikation des ITR und der MCS wurde ein BgIII-SalI Fragment isoliert und in das oben beschriebene mit BgIII-SalI verdaute pAd/L420-HSA Fragment kloniert. Der resultierende Klon wurde als pAd/L420-HSA.ITR bezeichnet.
Um in der Lage zu sein, Konstrukte mit Längen größer als 10 kb zu manipulieren, wurde der minimale adenovirale Vektor pAd/L420-HSA.ITR in einen Cosmidvektor-Hintergrund subkloniert. Dazu wurde der Cosmidvektor pWE15 modifiziert, um Restriktionsschnittstellen im Grundgerüst zu entfernen. pWE15 wurde mit PstI verdaut, und Fragmente mit 4 kb und 2.36 kb wurden aus einem Agarosegel isoliert und ligiert. Der erhaltene Klon, aus dem der SV40 Ori/Early-Promoter und die Neomycinresistenz-kodierende Sequenz entfernt wurden, wurde als pWE20 bezeichnet. Anschließend wurde pWE20 mit ClaI und HindIII verdaut, und die überhängenden Enden wurden mit Klenow Enzym aufgefüllt. Das 6354 bp Fragment mit glatten Enden wurde an einen phosphorylierten NsiI-Linker mit der folgenden Sequenz ligiert: 5'-CGATGCATCG-3' (SEQ ID NO: 16). Die ligierte DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, um die Puffer zu wechseln, und mit einem Überschuss NsiI verdaut. Die verdaute DNA wurde mittels Elektrophorese von den Linkern getrennt, isoliert und religiert. Der erhaltene Klon wurde als pWE25 bezeichnet. Die korrekte Insertion des NsiI-Linkes wurde mittels-Restriktionsenzymverdau und Sequenzierung bestätigt. Um den minimalen afenoviralen Vektor zu konstruieren, wurde pAd/L420-HSA.ITR mit ScaI und NotI verdaut, und das 2 kb Fregment, das einen Teil des Ampicillingens und die Adeno ITRs enthält, wurde in das mit ScaI und NotI verdaute pWE25 kloniert. Der resultierende Klon wurde pMV/L420H (24) genannt. Dieser Klon erlaubt die einfach Manipulation, um den Promoter und/oder das Gen auszutauschen, und erlaubt ferner die Insertion von DNA-Fragmenten mit Längen, die in normale Plasmid-Grundgerüste nicht einfach zu klonieren sind.
Das Plasmid pMV/CMV-LacZ wurde hergestellt durch Austausch des L420-HSA Fragments (SnaBI-BamHI) gegen ein Fragment aus pcDNA3-nlsLacZ (NruI-BamHI), welches den CMV-Promotor und die LacZ kodierenden Sequenzen enthält. pcDNA3-nlsLacZ wurde durch Insertion eines KpnI-BamHI Fragments, das nach PCR Amplifikation der nlsLacZ kodierenden Sequenzen erhalten wurde, in pcDNA3 (Invitrogen) konstruiert, das mit KpnI und BamHI verdaut wurde. Die PCR-Reaktion wurde mit pMLP.nlsLacZ Template-DNA unter Verwendung der Primer 1: 5'-GGG GTG GCC AGG GTA CCT CTA GGC TTT TGC AA-3' (SEQ ID NO: 17) und 2: 5'-GGG GGG ATC CAT AAA CAA GTT CAG AAT CC-3' (SEQ ID NO: 18) durchgeführt. Die korrekte Amplifikation und Klonierung wurden durch Bestimmen der β-Galactosidase-Expession in einem transienten Transfektionsexperiment mit 911 Zellen bestätigt.
Der Vektor pAd/MLPnlsLacZ wurde wie folgt hergestellt: pMLP10 (Levrero et al. (1991) Gene 101: 195–202) wurde mit HindIII und BamHI verdaut und in einer Drei-Teile Ligation an ein 3.3 kb AvrII-BamHI Fragment aus L7RHbgal (Kalederon et al. (1984) Cell 499–509) und an einem synthetischen Linker mit HindIII und XbaI Überhang ligiert. Der Linker wurde hergestellt durch Hybridisieren von zwei Oligonukleotiden mit der Sequenz 5'-AGC TTG AAT TCC CGG GTA CCT-3' (SEQ ID NO: 19) and 5'-CTA GAG GTA CCC GGG AAT TCA-3' (SEQ ID NO: 20). Der erhaltene Klon wurde als pMLP.nlsLacZ/-Ad bezeichnet. Als nächstes wurde pMLP-nlaLacZ/-Ad mit BamHI und NruI verdaut, und das Vektor-enthaltende Fragment wurde an ein 2766 bp BgIII-ScaI Fragment aus pAd5SalB (Bernards et al. (1982) Virology 120: 422–432) ligiert. Dies ergab das Adapterplasmid pMLP.nlsLacZ (beschrieben in EP 0 707 071 ).
Die Propagation eines minimalen adenoviralen Vektors kann nur durch Expression der Adenovirus-Genprodukte erreicht werden. Die Expression der Adenovirus-Genprodukte auf Niveaus, die hoch genug sind, um die Herstellung großer Mengen an Virus sicherzustellen, erfordert die Replikation des kodierenden Nukleinsäuremoleküls. Üblicherweise werden dafür replizierende Helferviren verwendet, um die minimalen adenoviralen Vektoren zu komplementieren. Die Erfindung stellt jedoch Verpackungssysteme für minimale adenovirale Vektoren ohne die Verwendung von Helferviren bereit. Eines der Verfahren der Erfindung verwendet ein replizierendes DNA-Molekül, welches das 5'-ITR und alle adenoviralen Sequenzen zwischen bp 3510 und 35938 enthält, i. e. das komplette adenovirale Genom ausgenommen die E1-Region und das Verpackungssignal. Konstrukt pWE/Ad.Δ5' (23) ist ein Beispiel eines replizierenden Moleküls gemäß der Erfindung, welches zwei adenovirale ITRs enthält. pWE/Ad.Δ5' wurde in einem Cosmidvektor-Hintergund aus drei Fragmenten hergestellt. Zunächst wurde das 5'ITR von Ad5 unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: ITR-EPH: 5'-CGG AAT TCT TAA TTA AGT TAA CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3' (SEQ ID NO: 21) und ITR-pIX: 5'-ACG GCG CGC CTT AAG CCA CGC CCA CAC ATT TCA GTA CGT ACT AGT CTA CGT CAC CCG CCC CGT TCC-3' (SEQ ID NO: 22). Das erhaltene PCR Fragment wurde mit EcoRI und AscI verdaut und in den mit den gleichen Enzymen verdauten Vektor pNEB193 (New England Biolabs) kloniert. Das resultierende Konstrukt wurde als pNEB/ITB-pIX bezeichnet. Eine Sequenzierung bestätigte die korrekte Amplifikation der Ad5-Sequenzen im linken ITR (Ad5-Sequenzen 1 bis 103), verküpft mit dem pIX-Promoter (Ad5-Sequenzen 3511 bis 3538), mit Ausnahme einer einzelnen Fehlpaarung mit der erwarteten Sequenz gemäß GenBank (Hinterlegungsnummer: M73260/M29978), i. e. ein extra C-Rest wurde gerade oberhalb der AflII Schnittstelle gefunden. Dieses IPR-pIX Fragment wurde mit EcoRI und AflII isoliert und an ein EcoRI-AflII Vektorfragment ligiert, welches die Ad5-Sequenzen 3539-21567 enthält. Das letztere Fragment wurde durch Verdau von pBr/Ad.Cla-Bam (siehe oben) mit EcoRI und partiell mit AflII erhalten. Der resultierende Klon wurde als pAd/LITR(Δ5')-BamHI bezeichnet. Das endgültige Konstrukt pWE/Ad.Δ5' wurde durch Ligieren des Cosmidvektors pWE15.Pac (siehe oben), der mit PacI verdaut wurde, an pAd/LITR(Δ5')-BamHI, verdaut mit PacI/BamHI, und an pBr/Ad.Bam-rITR.pac#2 (siehe oben), verdaut mit PacI/BamHI, hergestellt (23).
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Verpackungssystemen für minimale adenovirale Vektoren ohne die Verwendung von Helferviren gemäß der Erfindung besteht darin, ein replizierendes DNA-Molekül zu verwenden, welches das vollständige adenovirale Genom mit Ausnahme der E1-Region und des Verpackungssignals enthält, und in dem eines der ITRs durch ein Fragment ersetzt ist, das eine DNA-Sequenz komplementär zu einem anderen Teil als dem ITR des gleichen Stranges enthält, und das daher zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur in der Lage ist (10). In einem nicht einschränkenden Beispiel ist die DNA Sequenz, die komplementär zu einem anderen Teil als dem ITR des gleichen Stranges ist, vom Adeno-assoziierten Virus (AAV) Terminal Repeat abgeleitet. Ein solches replizierendes DNA-Molekül wird nach der gleichen Klonierungsstrategie hergestellt wie für pWE/Ad.Δ5' beschrieben, aber nun ausgehend vom AAV Terminal Repeat, das mit einem Teil des adenoviralen pIX-Promoters verknüpft ist. Dazu wurden die adenoviralen ITR-Sequenzen zwischen den HpaI und SpeI Schnittstellen im Konstrukt pNEB/ITR-pIX gegen das AAV ITR ausgetauscht, und zwar durch Einbringen des PvuII/XbaI Fragments aus psub201(+), welches das AAV ITR (Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822–3828) enthält. Dies ergibt das Konstrukt pWE/AAV.Δ5', welches in einer E1-komplimentierenden Zelllinie repliziert.
Ein weiteres alternatives Verpackungssystem für minimale adinovirale Vektoren wird nachfolgend beschrieben und verwendet das Replikationssystem von SV40. Ein funktionelles Helfemolekül gemäß diesem Verfahren enthält zumindest die adenoviralen Sequenzen, die zur Aufrechterhaltung der Verpackung eines minimalen Konstrukts notwendig sind, nicht aber die E1-Sequenzen und das Verpackungssignal, und vorzugsweise fehlen ihm auch die ITRs. Dieses Adenovirusabgeleitete Gesamtkonstrukt muss auf einem Vektor vorhanden sein, welcher außer dem für die Propagation in Bakterien nötigen Sequenzen auch einen Origin of Replication aus dem SV40 Virus enthält. Die Transfektion eines derartigen Moleküls zusammen mit dem minimalen adenoviralen Vektor, wie oben beschrieben, in eine Verpackungszelllinie (zum Beispiel PER.C6), die außer den E1-Proteinen SV40-abgeleitete Large T-Antigen-Proteine exprimiert, hat eine Large T-aghängige Replikation des Adenovirus-abgeleiteten Helferkonstrukt zu Folge. Diese Replikation führt zu hohen Niveaus an adenoviralen Proteinen, die für die Replikation des minimalen adenoviralen Vektors und das Verpacken in Viruspartikel erforderlich sind. Auf diese Weise gibt es keinen Sequenzüberlapp, der zu homologer Rekombination zwischen den minimalen adenoviralen Vektorkonstrukt und dem Helfermolekül führt. Zusätzlich gibt es keinen Sequenzüberlapp, der zu homologer Rekombination zwischen dem Helfermolekül und dem minimalen adenoviralen Vektor auf der einen Seite und der E1-Sequenz in der Verpackungszelllinie auf der anderen Seite führt.
Die Replikation eines 40 kb adenoviralen Konstrukts wurde in Zellen untersucht, die SV40 Large T-Proteine expimieren. Dazu wurden 2 × 10⁶Cos-1 Zellen in T25 Flaschen mit den folgende Konstrukten, die mit Lipofectamin-Reagenz (Life Technologies) komplexiert waren, transfeziert: Der 8 kb Cosmidvektor pWE.pac, das 40.5 kb Konstrukt pWE/Ad.AflII-rITR und drei Klone (#1, #5 und #9) des 40.6 kb Konstrukts pWE/Ad.Δ5' (nachfolgend beschrieben). Kontrolltransfektionen wurden mit den Konstrukten pWE.pac und pWE/Ad.AflII-rITR, die mit dem Enzym PacI verdaut wurden, und einem CMV-LacZ Expressionsvektor ohne die SV40 Ori-Sequenz durchgeführt. Die Transfektionseffizienz lag bei 50%, wie durch eine separate Transfektion unter Verwendung des CMV-LacZ Vektors und X-Gal Färbung nach 48 Stunden bestimmt wurde. Alle Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion geerntet, und die DNA wurde gemäß der Hirt-Prozedur (beschrieben in Einerhand et al. (1995) Gene Therapy 2: 336–343) extrahiert. Die finalen Pellets wurden in 50 μl TE + RNase (20 μg/ml) resuspendiert, und 10 μl Proben wurden mit MboI (30 Units über Nacht bei 37°C) verdaut. Unverdaute Proben (5 μl) und mit MboI verdaute Proben wurden auf einen 0.8% Agarosegel aufgetrennt, auf einem Nylonfilter (Amersham) transferiert und entsprechend Standardverfahren mit radioaktiven Sonden hybridisiert. Eine Probe stammte von einem 887 bp DpnI-Fragment aus dem Cosmidvektor pWE.pac, und eine stammte von einem 1864 bp BsrGI-BamHI Fragment aus adenoviralen Sequenzen. Diese Proben hybridisieren mit einer 887 bp Bande bzw. einer 1416 bp Bande in mit MboI verdautem Materiel. Ausgangs-DNA aus bakteriellem Ursprung wird methyliert und daher mit MboI nicht verdaut. Auf diese Weise ist es möglich, spezifisch DNA zu detektieren, welche in eukaryontischen Zellen repliziert wird. 26A zeigt eine schematische Darstellung des Konstrukts pWE/Ad.Δ5' und die Positionen des SV40 Origin of Replication, der pWE-abgeleiteten Sonde und der Adenovirus-abgeleiteten Sonde. Der untere Teil stellt die Autoradiogramme der Southern Blots dar, die mit der Adenovirus-Sonde (B) und der pWE-Sonde (C) hybridisiert wurden. Siehe die Legende für die Erklärung des Probenauftrags. Diese Experimente zeigen, dass alle Spuren, die Material aus Cos-1 Zellen enthalten, welche mit Plasmiden mit einem Sv40 Ori transfiziert wurden, MboI-sensitive DNA enthalten und eine spezifische Bande der erwarteten Länge zeigen. Die für die Replikation spezifischen Banden in den Spuren mit Cos-1 Zellen, welche mit PacI verdautem Material (Spuren B17/18 und C15–18) transfiziert wurden, resultieren möglicherweise aus einem unvollständigen PacI Verdau. Aus diesen Experimenten kann geschlossen werden, dass es möglich ist, große DNA-Fragmente mit den SV40 Large T/Ori-System in eukaryontischen Zellen zu replizieren.
Beispiel 8
Ein funktionelles Adenovirus Helfermolekül ohne ITR-Sequenzen wurde ausgehend vom Klon pWE/Ad.Δ5', der oben beschrieben wurde, konstruiert. pWE/Ad.Δ5' wurde mit Bst1107I verdaut, und das 17.5 kb Vektor-enthaltende Fragment wurde religiert, was pWE/Ad.D5'-Bst1107I ergibt. Dieser Klon wurde im Anschluss verwendet, um den 3' Teil der Adenovirus Genomsequenzen ohne das rechte ITR zu amplifizieren. Ein 2645 bp PCR Fragment wurde generiert unter Verwendung der Primer Ad3'/Forw: 5'-CGG AAT TCA GGA TAG GGC GGT GG-3' (SEQ ID NO: 23) und Ad3'/Rev: 5'-CGG GAT CCT ATC GAT ATT TAA ATG TTT TAG GGC GGA GTA ACT TG-3' (SEQ ID NO: 24). Das amplifizierte Fragment wurde mit EcoRI und BamHI verdaut und in pBR322, das mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, subkloniert. Nach Bestätigung der korrekten Amplifikation durch Sequenzierung wurde das 2558 bp SbfI-ClaI Fragment dieses Klons in pWE/Ad.Δ5'-Bst1107I, das mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, kloniert. Dem resultierenden Kostrukt fehlt das rechte ITR, und es wird als pWE/ΔrI-Bst1104I bezeichnet. Anschließend wird in diesem Klon das linke ITR durch einen Linker mit einem Pac2 und AflII Übergang ersetzt, welcher durch Hybridisieren der folgenden Primer hergestellt wurde: PA-pIX1: 5'-TAA GCC ACT AGT ACG TAC TGA AAT GTG TGG GCG TGG C-3' (SEQ ID NO: 25) und PA-Pix2: 5'-TTA AGC CAC GCC CAC ACA TTT CAG TAC GTA CTA GTG GCT TAA T-3' (SEQ ID NO: 26). Dies entfernte das linke ITR und stellte die korrekte Sequenz des pIX-Promotors wieder her. Der Klon wird als pWE/ΔITR-Bst1107I bezeichnet. Die korrekte Insertion des doppelsträngigen Linkers wurde durch Sequenzierung bestätigt. Das deletierte Bst1107I-Fragment wurde im Anschluss zurück in pWE/ΔITR-Bst1107I kloniert, und die korrekte Orientierung wurde mittels Restriktionsverdau überprüft. Der resultierende Klon wird mit pWE/Ad-H bezeichnet. Nach Transfektion dieses DNA-Moleküls in Verpackungszellen, die adenovirale E1-Proteine und das SV40 Large T-Antigen exprimieren, erfolgte die Replikation dieses Moleküls, was hohe Konzentrationen an adenoviralen Proteinen zu Folge hat, welche von adenoviralen Gesamtkonstrukt in diesem Molekül kodiert werden.
Beispiel 9
Miniaturisierte multiwell-Produktion rekombinanter adenoviraler Vektoren
Eine 96-Well Mikrotiter Gewebekulturplatte (Platte 1) (Greiner, Niederlande, Katalog #6555180) wurde zunächst durch Inkubation eines jeden Wells für 20–120 Minuten bei Raumtemperatur mit Poly-L-Lysin (PLL, 0.1 mg/ml)(Sigma), gelöst in sterilem Wasser, beschichtet. Alternativ können vorbeschichtete 96-Wellplatten (Becton und Dickinson) verwendet werden. Nach der Inkubation mit PLL wurde jedes Well zweimal mit 100 μl sterilem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur für zumindest 2 Stunden getrocknet. Am Tag vor der Transfektion wurden PER.C6 Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA geerntet und gezählt. Anschließend wurde die Zellen zu einer Suspension von 45000 Zellen pro 100 μl verdünnt, gefolgt vom Aussäen von 100 μl/Well der mit PLL beschichteten 96-Wellplatten. An nächsten Tag wurden 2.6 μl der mit SalI linealisierten pAd/CMV-LacZ und 2.6 μl der mit PacI linearisierten pWE-Ad.AflII-rITR Plasmid-DNA (beide 1 μg/μl) und 95 μl serum-freies Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM) mit 25.6 μl Lipofectamin gemischt, welches in 74.4 μl serum-freiem DMEM durch Zugabe des Lipofectamins zum DNA-Gemisch verdünnt wurde. Die DNA/Lipofectamin-Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, und anschließend wurden 1.3 ml serum-freies Medium hinzugegeben. Das letztere Gemisch wurde im Anschluss (30 μl/Well) zu den mit PER.C6 ausgesäten Wells gegeben, welche vor der Transfektion mit 200 μl DMEM gewaschen wurden. Nach 3 Stunden in einem belüfteten CO₂ Inkubator (37°C, 10% CO₂) wurden 200 μl DMEM mit 10% fötalem Kälberserum und 10 mM MgCL₂ zu jedem Well gegeben, und die Platten wurden zurück in den belüfteten CO₂ Inkubator (37°C, 10% CO₂) gegeben. An nächsten Tag wurde das Medium eines jeden Wells mit 200 μl DMEM, 10% FCS, 10 mM MgCl₂ ersetzt. Die Platten wurden anschließend drei weitere Tage im belüfteten CO₂ Inkubator belassen, und anschließend wurden die Wells bei –20°C für zumindest eine Stunde eingefroren, gefolgt von Auftauen und Resuspendieren durch wiederholtes Pipettieren unterzogen. Die Transfektionseffizienz wurde mittels LacZ-Färbung in zusätzlichen Platten bestimmt, und es wurde gefunden, dass sie für jedes transfizierte Well von PER.C6 Zellen bei annähernd 40% lag. Ein 100 μl Aliquot der gefrorenen/aufgetauten transfizierten Zellen wurden in jedes Well einer Platte mit neuen PER.C6 Zellen, welche wie oben beschrieben ohne PLL-beschichtete Platten ausgesät wurden (Platte 2), transferiert. Die zweite 96-Wellplatte mit PER.C6 Zellen, die mit den gefrorenen/aufgetauten Zelllysat der ersten transfizierten Platte inkubiert wurde, wurde auf CPE untersucht. Zumindest 5% der Wells zeigten nach 2 Tagen klares CPE. Vier Tage nach Infektion mit dem Lysat der ersten Platte wurde die Platte einem Frieren/Tauen-Zyklus unterzogen, und 10 μl von jedem lysierten Well wurden zu Wells einer Platte gegeben, auf der A549 Zellen ausgesät waren (1 × 10⁴ Zellen pro Well, ausgesät in 100 μl DMEM, 10% FCS am Tag zuvor). Zwei Tage nach Infektion wurden die Wells zur Bestimmung der LacZ-Aktivität gefärbt. Von den infizierten Wells waren 96% tatsächlich infiziert und blau gefärbt. Alle gefärbten Wells und eine große Anzahl der Wells zeigten 100% Färbung und damit Transduktion aller Zellen mit dem adenoviralen Vektor, der LacZ trägt. Extrapoliert von MOI-Experimenten in Gewebekulturflaschen beträgt der adenovirale Titer des hergestellten Virus 10⁶ – 10⁷ infektiöse Einheiten pro ml.
Die Erfindung offenbart Verfahren und Zusammensetzungen zur Hochdurchsetzabgabe und -expression einer Nukleinsäureprobe(n), die ein Produkt (Produkte) unbekannter Funktion kodieren, in einem Wirt. Beschrieben sind Verfahren für die Konstruktion komplementierender Zelllinien, Bibliotheken von Adenovirus-abgeleiteten Plasmiden, welche Nukleinsäureproben enthalten, Verpacken der Adenovirus-abgeleiteten Plasmide in Adenovirusvektoren, Infizieren eines Wirts mit den Adenovirusvektoren, welche das Produkt (die Produkte) der Nukleinsäureprobe(n) im Wirt exprimieren, Identifizieren eines veränderten Phänotyps, der durch das Produkt (die Produkte) der Nukleinsäureproben im Wirt induziert wird, und dabei die Zuteilung einer Funktion zum Produkt (Produkten), das durch die Nukleinsäureproben kodiert wird. Die Nukleinsäureproben können beispielsweise synthetische Oligonukleotide, DNAs oder cDNAs sein und können zum Beispiel Polypeptide, antisense-Nukleinsäuren oder GSEs kodieren. Die Verfahren können vollständig automatisiert und in einem Multiwell-Format durchgeführt werden, um eine zweckmäßige Hochdurchsatzanalyse der Bibliotheken von Nukleinsäureproben zu ermöglichen.
Beispiel 10
Miniaturisierte Multiwell-Produktion von E1- und E2Adeletierten rekombinanten adenoviralen Vektoren, die therapeutische und Marker-Transgene tragen
Um die Konstruktion von cDNA-Bibliotheken mit einem repräsentativen Repertoire von cDNA-Sequenzen zu ermöglichen, wurde die Klonierungskapazität des miniaturisierten adenoviralen Produktionssystems, eines Derivats von PER.C6, nämlich PER.C6/E2A, verwendet. Diese Zelllinie ermöglicht die Herstellung eines Vektors mit drei Deletionen adenoviraler Expressionskassetten: E1, E2A und E3. Diese drei Deletionen ermöglichen das theoretische Klonieren von Vektoren mit Transgen-Größen von bis zu 10.5 kb. Hier zeigen wir die Produktion von E1- und E2A-deletierten Vektoren, die eine Vielzahl von humanen und Maus cDNAs sowie zusätzliche Markergene tragen.
Am Tag vor der Transfektion wurden die PER.C6/E2A Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA geerntet und gezählt. Die Zellen wurde anschließend mit Kulturmedium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum und 10 mM MaCl₂) zu einer Suspension von 22.500 Zellen pro 100 μl verdünnt, gefolgt vom Aussäen von 100 μl/Well Poly-L-Lysin (PLL)-beschichteter 96-Wellplatten (Becton und Dickinson). Am nächsten Tag wurden 2.6 μg der linearisierten Adaptermoleküle und 2.6 μg der mit PacI linearisierten pWE/Ad.AslII-rITR.deltaE2A Plasmid-DNA (siehe Beispiel 19) in einem Volumen von 100 μl serum-freiem Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) mit 25.6 μl Lipofectamin gemischt, welches in 74.4 μl serum-freiem DMEM durch Zugabe des Lipofectamin-Gemischs zum DNA-Gemisch verdünnt wurde. Das DNA/Lipofectamin-Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen gelassen, und anschließend wurden 1.3 ml serum-freies Medium hinzugegeben. Das letztere Gemisch wurde anschließend (30 μl/Well) zu mit PER.C6/E2A ausgesäten Wells gegeben, die vor der Transfektion mit 200 μl DMEM gewaschen wurden. Nach drei Stunden in einem belüfteten CO₂ Inkubator (39°C, 10% CO₂) wurden 200 μl DMEM mit 10% fötalem Kälberserum und 10 mM MgCl₂ zu jedem Well gegeben, und die Platten wurden zurück in den belüfteten CO₂ Inkubator (39°C, 10% CO₂) gegeben. Am nächsten Tag wurde das Medium jedes Wells mit 200 μl DMEM mit 10% fötalem Kälberserum und 10 mM MgCl₂ ersetzt. Die Platten wurden anschließend für weitere sieben Tage zurück in den belüfteten CO₂ Inkubator (32°C, 10% CO₂) gegeben, und anschließend wurden die Wells bei –20°C über Nacht eingefroren, gefolgt von Auftauen und Resuspension durch wiederholtes Pipettieren. Ein 100 μl Aliquot der gefrorenen/aufgetauten transfizierten Zellen wurde in jedes Well normaler 96-Well Gewebekulturplatten (Platte 2) mit frischen PER.C6/E2A Zellen gegeben, die wie oben beschrieben ausgesät wurden. Die zweite 96-Wellplatte mit PER.C6/E2A Zellen, welche inkubiert und somit mit gefrorenem/aufgetautem Zelllysat der ersten transfizierten Platte infiziert wurden, wurde auf CPE-Bildung (siehe 27) untersucht und bei –20°C gelagert. In 27 ist der Prozentanteil der virus-produzierenden Zellen (CPE positive Wells) gezählt nach Propagation der gefrorenen/aufgetauten transfizierten Zellen zu neuen PER.C6/E2A Zellen dargestellt. Das miniaturisierte System dieser Erfindung erlaubt eindeutig die effiziente Produktion von deltaE1/E2A doppelt deletierten Vektoren mit einer Vielzahl von Transgen-Inserts.
Beispiel 11
Quantifizierung adenoviraler Vektorpartikel, die im miniaturisierten Produktionssystem unter Verwendung von PER.C6/E2A hergestellt wurden
Adenovirale Plaqueassys wurden zur Bestimmung des Titers adenoviraler Vektoren, die in einem Well einer 96-Well Gewebekulturplatte hergestellt wurden, durchgeführt.
PER.C6/E2A Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin-EDTA geerntet und gezählt. Die Zellen wurden anschließend mit Kulturmedium (DMEM mit 10% fötalem Kälberserum und 10 mM MgCl₂) zu einer Suspension von 1.5 × 10⁶ Zellen pro 2 ml verdünnt, gefolgt vom Aussäen von 2 ml pro Well von PLL-beschichteten 6-Well Platten (Becton und Dickinson). Mikrotiterplatten, welche adenoverale Vektorlysate enthalten, wurden aufgetaut, und 50 μl eines zufällig ausgewählten Wells jedes Adenovirus wurden verwendet, um zehnfache serielle Verdünnungen des Adenovirus in Kulturmedium herzustellen. Das Medium der PER.C6/E2A Zellen, die am selben Tag ausgesät wurden, wurde mit 2 ml verdünntem Virus pro Well ersetzt, und der 50–60% Monolayer wurde für ungefähr 16 Stunden in einem belüfteten CO₂ Inkubator (32°C, 10% CO₂) infiziert. Nach Infektion wurden die Zellen mit 3 ml Agarosemix (2 × MEM, 2% fötales Kälberserum, 1 mM MgCl₂, PBS und 1% Agarose) pro Well überschichtet und zurück in den belüfteten CO₂ Inkubator (32°C, 10% CO₂) gegeben. Nach zwei Wochen wurde neun einzelne Plaques einschließlich einer Negativkontrolle in 200 μl Kulturmedium transferiert und bei –20°C gelagert. Ein 25 μl Aliquot dieses Materials wurde verwendet, um PER.C6/E2A Zellen (2.25 × 10⁴ Zellen pro Well in 100 μl) zu infizieren, ausgesät in 96-Well Gewebekulturschalen einen Tag vor den Infektionen. Diese wurden in einem belüfteten CO₂ Inkubator (32°C, 10% CO₂) inkubiert, bis eine vollständige CPE beobachtet wurde, und anschließend bei –20°C gelagert.
Der finale Titer der Adenoviren, welche in einem Well einer 96-Well Gewebekulturplatte hergestellt wurden, wurde eine Woche nach dem Picken einzelner Plaques bestimmt. In 28 ist der Titer von Adenoviren in pfu/ml, produziert in einem Well einer 96-Wellplatte, dargestellt. Durchschnittliche Titer von 0.8 ± 0.7 × 10⁹ pfu/ml implizieren, dass abhängig von der in einem speziellen zell-basierten Assay in einem funktionellen Genomanalyse-Screen unter Verwendung von 384-Wellplatten benötigten MOI ausreichend Virus für 400–4000 Assays (MOIs von 100-10) produziert wird. Dies ermöglicht mehrfache Screens bei Verwendung einer einzelnen Bibliothek.
Beispiel 12
Qualität eines adenoviralen Vektors, der in einer Mikrotiterplatte auf PER.C6/E2A Zellen produziert wurde
Um die Funktionalität des produzierten rekombinanten Adenovirus zu testen, wurden die folgenden funktionellen Essays in Zellen durchgeführt, welche mit den entsprechenden adenoviralen Vektoren infiziert wurden:

– β-Galactosidase-Assay
– hIL3-Essay
– Luciferase-Assay
– ceNOS-Assay
– GLVR2-Assay
– EGFP-Asaay

β-Galactosidase-Assay
A549 Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin-EDTA geerntet und gezählt. Die Zellen wurden anschließend mit Kulturmedium (DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem FBS) zu einer Suspension von 10.000 Zellen pro 100 μl verdünnt, gefolgt vom Aussäen von 100 μl pro Well von 96-Well Gewebekulturplatten. Am nächsten Tag wurden alle CPE-positiven PER.C6/E2A Wells, die LacZ-transduzierende Adenoviren enthielten, sowie Negativkontrollen (sowohl primäre Wells als auch Plaques, welche auf frischen PER.C6/E2A Zellen amplifiziert wurden) zur Infektion von A549 Zellen verwendet. Zu diesem Zweck wurden die gefrorenen Zellen aufgetaut, und 20 μl des gefrorenen/aufgetauten Zelllysats wurden verwendet, um ein Well der A549 Zellen zu infizieren. Zwei Tage nach Infektion wurde das Medium der infizierten A549 Zellen entfernt, und jedes Well wurde zweimal mit 100 μl PBS (Phosphat-gepufferte Saline) gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen für fünf Minuten bei Raumtemperatur durch Zugabe von 100 μl Fixierer (1% Formaldehyd, 0.2% Glutardialdehyd) pro Well fixiert. Nach zweimaligen Waschen der Zellen mit PBS wurden 100 μl X-Gal Färbelösung (0.2 M K₃Fe(CN)₆, 0.2 M K₄Fe(CN)₆, X-gal in DMSO und 0.1 M MgCl₂) zu jedem Well hinzugegeben.
Alle Wells, die mit CPE-positiven Wells infiziert waren, färbten sich blau. Eine große Zahl von Wells zeigte 100% Blaufärbung und somit Transduktion aller Zelle mit dem adenoviralen Vektor, welcher LacZ trägt (siehe 29).
hIL3-Essay
Am Tag vor der Infektion wurden die A549 Zellen wie oben beschrieben ausgesät. Am nächsten Tag wurden alle CPE-positiven PER.C6/E2A Wells, die humane Interleukin-3 (hIL-3) transduzierende Adenoviren (sowohl primäre Wells als auch Plaques, die auf frischen PER.C3/E2A Zellen amplifiziert wurden) enthielten, sowie Positiv- und Negativkontrollen zur Infektion von A549 Zellen verwendet. Zu diesem Zweck wurden die gefrorenen Zellen aufgetaut, und 20 μl des gefrorenen/aufgetauten Zelllysats wurde verwendet, um ein Well der A549 Zellen zu infizieren. Drei Tage nach Infektion wurde die Höhe der hIL-3 Konzentrationen in 100 μl der Überstände der infizierten A549 Zellen unter Verwendung des humanen IL-3 Immunoessays (Quantikine^TM) bestimmt.
Alle Wells, die mit CPE-positiven Wells infiziert waren, zeigten hohe hIL-3 Konzentrationen (siehe 29).
Luciferanse-Essay
Am Tag vor der Infektion wurden die A549 Zellen wie oben beschrieben ausgesät. An nächsten Tag wurden alle CPEpositiven PER.C6/E2A Wells, welche Luciferase-transduzierende Adenoviren (sowohl primäre Wells als auch Plaques, die auf frischen PER.C6/E2A Zellen amplifiziert wurden) enthalten, sowie Positiv- und Negativkontrollen zur Infektion der A549 Zellen verwendet. Zu diesem Zweck wurden die gefrorenen Zellen aufgetaut, und 20 μl jedes Wells des gefrorenen/aufgetauten Zelllysats wurden verwendet, um ein Well der A549 Zellen zu infizieren. Zwei Tage nach der Infektion wurde das Medium der infizierten A549 Zellen entfernt, und jedes Well wurde mit 100 μl PBS gewaschen. Nach Zugabe von 100 μl 1 × Reporter-Lysepuffer (Promega) wurden die Wells einer Frieren/Tauen-Prozedur unterzogen, gefolgt vom Messen der Luciferase-Aktivität in 20 μl der gefrorenen/aufgetauten Zelllysate.
Alle Wells, die mit CPE-positiven Wells infiziert waren, zeigten eine hohe Luziferase-Aktivität (siehe 29).
ceNOS-Essay
PER.C6/E2A Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin-EDTA geerntet und gezählt. Anschließend wurden die Zellen mit Kulturmedium (DMEM ohne Phenol-Rot mit 10% FBS und 10 mM MgCl₂) zu einer Suspension von 22.500 Zellen pro 100 μl verdünnt, gefolgt vom Aussäen von 100 μl pro Well von 96-Well Gewebekulturplatten. Am nächsten Tag wurden alle CPE-positiven PER.C6/E2A Wells, welche ceNOS-transduzierende Adenoviren (sowohl primäre Wells als auch Plaques, die auf frischen PER.C6/E2A Zellen amplifiziert wurden) enthalten, sowie Positiv- und Negativekontrollen zur Infektion von PER.C6/E2A Zellen verwendet. Zu diesem Zweck wurden die gefrorenen Wells aufgetaut, und 20 μl jedes Wells des gefrorenen/aufgetauten Zelllysats wurden zur Infektion eines Wells der PER.C6/E2A Zellen verwendet. Drei Tage nach Infektion wurden 50 μl Färbelösung [GreissA Reagenz (0.1% N-(1-Naphtyl)-Ethylenediamin) und GreissB-Reagenz (25% Sulfanylamid in 5% Phosphorsäure) in einem Verhältnis von 1 : 1] zu 50 μl der Überstände der infizierten PER.C6/E2A Zellen hinzugegeben. Nach Zugabe der Färbelösung wurden die Überstände mit einer positiven ceNOS-Aktivität direkt pinkfarben.
Alle Wells, die mit CPE-positiven Wells infiziert waren, zeigten eine positive ceNOS-Aktivität (siehe 29).
GLVR2 Amphotroperrezeptor Essay
Adenovirus-vermittelte Transduktion von GLVR2, dem Rezeptor für amphotrophe Retroviren, wurde im wesentlichen wie beschrieben gemessen (Lieber et al., 1995), mit Ausnahme der Verwendung eines amphotrophen retroviralen Überstands, der eine trunkierte Version des-humanen Nervenwachstumsrezeptors (nerve growth receptor, NGFR) tranferiert. Die retroverale Transduktion der CHO Zellen, die mit GLVR2 adenoveralem Überstand infiziert wurden, wurde unter Verwendung von anti-NGFR Antikörpern und einem Flusscytometer detektiert.
Alle Wells, die mit CPE-positiven PER.C6/E2A Wells infiziert waren, welche GLVR2-transduzierende Adenoviren (Plaques, die auf frischen PER.C6/E2A Zellen amplifiziert wurden) enthalten, zeigten eine positive GLVR2-Aktivität (siehe 29).
EGFP-Essay
EGPF-Expression wurde mit einem Mikrotiterplatten-Fluorimeter oder einem Flusscytometer gemessen.
Als Fazit zeigten sowohl der von den Wells produzierte Virus als auch der Virus, der von produzierenden Wells plaquegereinigt (i. e. kloniert) wurde, Transduktion ihrer entsprechenden Transgene. Das System zeigt daher in der Produktion funktionaler adenoviraler Vektoren eine hohe Genauigkeit und produziert keine aberranten Formen der getesteten Transgen-Inserts.
Beispiel 13
DNA-Isolationsverfahren zur Herstellung ausreichend gereinigter Plasmid-DNA für die Produktion adenoviraler Vektoren in PER.C6 und PER.C6-E2A Zellen
Es ist bekannt, dass Plasmid-DNA, die für Transfektionsuntersuchungen in eukaryontischen Zellen verwendet wird, von ausreichender Reinheit und frei von Endotoxinen sein muss, um hohe Transfektionseffizienzen zu erreichen. Herkömmliche Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA aus E. coli umfassen einalkalisches Lyse-Verfahren (Birnboim, H. C. and Doly, J. (1979) A rapid alkaline lysis procedure for screeing recombinant plasmid DNA. Nucleic Acid Res. 7: 1513–1522), entweder gefolgt vom Auftrennen (banding) der Plasmid-DNA auf Caesiumchlorid (CsCI)-Gradienten (siehe Sambrook, J. et al., Eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press) oder Binden an und Elution von einem Anionenaustauschharz (siehe z. B. Qiagen^TM Plasmidreinigungsverfahren von Qiagen Inc.; und Concert^TM Plasmidreinigungssysteme von Life Technologies). Alle diese Verfahren sind jedoch für Hochdurchsatz-DNA-Isolationen ungeeignet, da sie einen beträchtlichen Zeitaufwand pro Isolation erfordern. Daher und um die Kosten der Isolation zu reduzieren, wurden andere Verfahren untersucht.
Verfahren, die unter Verwendung des mit SalI linearisierten adenoviralen Adapterplasmids pCLIP-SalI-LacZ und des E2A-deletierten Helferfragments pWE/Ad.AflII-rITR.ΔE2A untersucht wurden: alkalische Lyse, gefolgt von säulenbasierter Plasmidreinigung (Qiagen)

1. Alkalische Lyse, gefolgt von Isopropanol-Präzipitation und Solubilisierung in TE-Puffer.
2. Alkalische Lyse, gefolgt von Isopropanol-Präzipitation und Solubilisierung in TE-Puffer, der 10 μg/ml RNAse enthält.
3. Alkalische Lyse, gefolgt von Isopropanol-Präzipitation und Solubilisierung in TE-Puffer, der 10 μg/ml RNAse enthält, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation.
4. Standard Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) Plasmidisolation (Nucleic Acids Res. 16²⁰: 1488).
5. Standard CTAB-Plasmidisolation, aber Solubilisierung in TE-Puffer, der 10 μg/ml RNAse enthält, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extration.

Gleiche Volumina der erhaltenen Plasmide wurden mit SalI linearisiert, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation. Nach Solubilisierung in TE-Puffer und Überprüfung auf einem Agarosegel wurden gleiche Mengen DNA (wie durch Ethidiumbromid-Färbung bestimmt) mit Lipofectamin, wie in den Beispielen 9 und 10 beschrieben, in PER.C6/E2A Zellen transfiziert. Nach Propagation wurden die Wells hinsichtlich CPE-Bildung als Maß für die Virusproduktion untersucht.
In 30 sind die relativen Anzahlen von Wells dargestellt, die nach Transfektion der PER-C6/E2A Zellen, die mit pCLIP-LacZ transfiziert wurden, den adenoviralen Vektor produzieren (CPE positiv), gereinigt nach 6 verschiedenen Protokollen. Qiagen: Standard alkalische Lyse, gefolgt von Qiagen Plasmidreinigung; AlkLys: alkalische Lyse, gefolgt von Isopropanol-Präzipitation und Solubilisierung in TE-Puffer; AL + RNAse: alkalische Lyse, gefolgt von Isopropanol-Präzipitation und Solubilisierung in TE-Puffer der 10 μg/ml RNAse enthält; AL + R + Phenol: alkalische Lyse, gefolgt von Isopropanol-Präzipitation und Solubilisierung in TE-Puffer, der 10 μg/ml RNAse enthält, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation; CTAB: Standard CTAB Plasmidisolierung; CTAB + Phenol: Standard CTAB Plasmidisolierung, aber Solubilisierung in TE-Puffer, der 10 μg/ml RNAse enthält, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion. Es ist offensichtlich, dass die Qualität der DNA keine primäre Determinante der Transfektion von und Virusproduktion in PER.C6/E2A Zellen ist, da alle sechs auf unterschiedliche Weise isolierten Plasmide ähnliche Zahlen an Wells mit CPE erzeugen.
Schlussfolgerung: Für Hochdurchsatztransfektionen von und Virusproduktion in PER.C6/E2A Zellen ist es ausreichend, Plasmid-DNA zu verwenden, die mit 0.6 Volumen Isopropanol nach Standard alkalischer Lyse, gefolgt von Solubilisierung in TE-Puffer gereinigt wurde.
Bespiel 14
Verwendung ungereinigter verdauter adenoviraler Adapter- und Helfer DNA-Moleküle für die Erzeugung adenoviraler Vektoren in einem miniaturisierten Format.
Um die Gesamtkosten und die Chancen für das Auftreten von Fehlern im Verfahren zu minimieren, und um den Durchsatz bei Herstellung rekombinanter Adenoviren in einem Hochdurchsatzaufbau zu maximieren, ist es wünschenswert, so viele Schritte wie möglich wegzulassen. Jede Verbesserung hier ist auch anwendbar, wenn adenovirale Vektoren in einem kleineren Maßstab mit geringem Durchsatz erzeugt werden. Der in der Produktion rekombinanter Adenoviren am schwierigsten zu automatisierende Schritt ist der DNA-Reinigungsschritt durch Phenol/Chloroform-Extraktion (P/C) vor der Transfektion der Zellen mit den DNAs. Die DNA wird nach der Linerarisierung gereinigt, um enzym-freie DNA zu erhalten. Man glaubt, dass dies wichtig ist, um hohe Prozentsätze an Virusgenerierung nach Transfektion mit dem Adapter- und Helfer- DNA-Molekülen zu erhalten. Eine zusätzliche Motivation zum Weglassen der P/C Reinigungsprozedur ist das Risiko von Spuren von Phenol und Chloroform in der für die Transfektion verwendeten DNA, die einen negativen Effekt aus die Generierung von Viren haben können. Daher wurde untersucht, ob der komplizierte Schritt der P/C Reinigung aus dem Protokoll für die miniaturisierte adenovirale Vektorgenerierung dieser Anmeldung weggelassen werden könnte. Dieses Verfahren bildet die Grundlage für die Hochdrucksatzkonstruktion von Bibliotheken, wie zum Beispiel sense oder antisense cDNA-Expressionsbibliotheken. Mehrere unabhängige Experimente wurden durchgeführt, um den Einfluss des Weglassens des P/C-Schritts auf die Effizienz der andenoviralen Vektorgenerierung zu untersuchen. Die P/C-Reinigung wurde wie folgt ausgeführt. Nach Verdauen der Adapter-DNA und der rITR-DNA mit den geeigneten Restrektionsenzymen wurde ein Volumen von Phenol und Chloroform (1 : 1) hinzugegeben, gründlich vermischt und zentrifugiert (5 min, 14000 rpm). Die wässrige Phase wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und ein Volumen Chloroform hinzugegeben. Dieses wurde wiederum gründlich gemischt und zentrifugiert (5 min, 14000 rpm). Die wässrige Phase wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen transferiert, und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5.2) und 2.5 Volumen absoluter Ethanol wurden hinzugegeben. Dieses wurde für mindestens 20 min bei –20°C gehalten, anschließend zentrifugiert (15 min, 14000 rpm), und das Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde luftgetrocknet, und ein geeignetes Volumen steriles Wasser wurde hinzugegeben (in einer Sterilbank). Die Transfektion wurde wie in den Beispielen 9 und folgende beschrieben unter Verwendung von PER.C6/E2A Zellen durchgeführt. Alle Viren sind E1- und E2A-deletiert und wurden in PER.C6/E2A produziert.
Im ersten Experiment wurde Adapter-DNA, die β-Galactosidase (pAd5.ClipSal,LacZ) enthält, aus 6 verschiedenen DNA-Isolationsprotokollen (wie im Beispiel 13 beschrieben) analysiert und hinsichtlich ihrer Effizienz in der Herstellung eines adenoviralen Vektors durch Überwachung der CPE-Bildung verglichen. Von allen DNA-Proben wurde die Hälfte nach Linearisierung mit einem geeigneten Restriktionsenzym (SalI) P/C-gereinigt, die andere Hälfte wurde nach der Linerarisierung nicht gereinigt. Das Restriktionsenzym wurde hitzeinaktiviert, da die SalI Schnittstelle im verwendeten rITRΔE2A-Helferfregment liegt, um einen versehentlichen Verdau der Helfer-DNA auszuschließen. In diesem Experiment wurde P/C-gereinigte rITRΔE2A Helfer-DNA verwendet. In allen der verwendeten DNA-Isolationsverfahren wurde effizient CPE ausgebildet (31A). In einigen Fällen ergab das Weglassen der Reinigung durch Phenol/Chloroform-Extraktion höhere CPE-Effizienzen. Schlussfolgerung: Adenovirale Adapter-DNA, die mit dem liniearisierenden Enzym verdaut wurde kann zur Transfektion ohne vorherige Reinigung verwendet werden.
Im zweiten Experiment wurden Reinigung und Nicht-Reinigung mit Hilfe von Adapter-DNAs, die das Enhanced Green Fluorescent Protein (EGEP) und das Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP)(pAd5.ClipPac.EGFP und pAd5.ClipPac.EYFP) enthalten, verglichen. Die Adapterplasmid DNA wurde mit Hilfe des Qiagen Isolationsverfahrens isoliert. Die rITR-ΔE2A-DNA wurde P/C-gereinigt. Die Adapter-DNR wurde mit Hilfe von PacI linearisiert, das vor der Transfektion nicht hitzeinaktiviert werden musste, da im rITR keine PacI-Schnittstelle vorhanden ist. In den Prozentanteilen des beobachteten CPE wurden keine konsistenten Unterschiede beobachtet, und die Produktion des adenoviralen Vektors war effizient (31B).
Das dritte Experiment enthielt eine zusätzliche Variable. Das Erfordernis, das rITR zu reinigen, wurde untersucht. Die verwendete Adapter-DNA enthielt EGFP (pAd5.ClipPac.EGFP) und wurde mit Hilfe des Qiagen Isolationsverfahrens isoliert (30C). Die Ergebnisse nach Transfektion und Propagation zeigen, dass die Reinigung sowohl der Adapter- als auch der rITR-DNA nach Restriktionsenzymverdau nicht notwendig ist.
Unter Berücksichtigen aller Ergebnisse wird klar, dass der Phenol/Chloroform-Reinigungsschritt der Adapter-DNA und des rITR nicht obligatorisch ist, um hohe Prozentanteile an CPE zu enthalten, und daher auch nicht für die Produktion des adenoviralen Vektors. Die oben beschriebenen Modifikation des Verfahrens wie zum Beispiel in den Beispielen 9 und 10 beschrieben, hat eine signifikante Erhöhung des Durchsatzes zur Folge, wenn adenovirale Vektorbibliotheken in einem automatisierten Aufbau erzeugt werden, und wenn Vektoren manuell in kleinerem Maßstab hergestellt werden.
Beispiel 15
Produktion adenoviraler Vektoren in Relation zur Stabilität des produzierten Vektors
Die Generierung rekombinanter Adenoviren, wie in den verschiedenen Beispielen hierin beschrieben, zeigt, dass ein funktionelles Adenovirus ungefähr 5 bis 11 Tage nach Amplifikation des Virus gebildet werden kann, das in den transfizierten, in Multiwell-Gewebekulturplatten angezogenen PER.C6 Zellen (und Derivaten) hergestellt wird. Die Beobachtung eines cytopathischen Effekts (CPE) zeigt, dass ein funktionelles Adenovirus gebildet wurde und repliziert. Die Natur der Transgen-Inserts und Variationen in den experimentellen Bedingungen verursachen variable Kinetiken der Virusgenerierung. In einem Hochdurchsatzaufbau, in dem große Anzahlen von Wells und somit auch Platten gehandhabt werden, die den adenoviralen Vektor enthalten, ist es wünschenswert, einen einzigen Zeitpunkt zum Ernten der Platten und Auswerten der adenoviralen Vektorproduktion zu haben. Die oben erwähnten Variationen in der Generierung eines adenoviralen Vektors können überwunden werden, indem die Ernte der Platte solange wie möglich nach hinten verschoben wird, i. e. bis die langsameren Wells ebenfalls einen adenoviralen Vektor produziert haben. Dazu wurde die Stabilität des rekombinanten LacZ Adenovirus (pCLIP-LacZ) untersucht, sobald dieser ausgehend von geringen Viruszahlen in hohen Viruszahlen hergestellt ist, und anschließend wurden die Titer sowie das LacZ Transduktionspotential des Virus nach bis zu drei Wochen bestimmt (siehe Beispiel 11).
PER.C6/E2A Zellen wurden in zwei Reihen von 96-Well Mikrotiter-Gewebekulturplatten unter Verwendung von 4 × 10⁴ Zellen/Well ausgesät. Die Platten wurden über Nacht bei 39°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die PER.C6/E2A Zellen mit gereinigtem LacZ-adenoviralen Vektor des Serotyps 5 infiziert. Die Infektionen wurden mit verschiedenen MOIs gemäß dem unten stehenden Schema durchgeführt (insgesamt 21 Platten).
Tabelle 1
Um den Einfluss der Temperatur auf die Stabilität der in den Wells produzierten Adenoviren zu bestimmen, wurden 7 Platten bei 32°C, 7 Platten bei 34°C und 7 Platten bei 39°C inkubiert. Am Tag 2, 3, 6, 9, 13, 16 und 21 nach Infektion wurde jeweils eine Platte entsprechend jeder Inkubationstemperatur eingefroren. Die Zelllysate wurden in den nachfolgenden Experimenten verwendet. Um das Transduktionspotential der produzierten Adenoviren zu bestimmen, wurden A549 Zellen in 96-Well Mikrotiter-Gewebekulturplatten mit 1 × 10⁴ Zellen/Well ausgesät und über Nacht bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen mit 50 μl Zelllysat infiziert und bei 37°C inkubiert Nach zwei Tagen wurden die Zellen auf Toxizität untersucht, gefolgt von LacZ-Färbung. Mit steigender MOI und steigender Infektionszeit wurde ein eindeutiger toxischer Effekt beobachtet. Die folgende Tabelle ist eine Zusammenfassung, wenn alle Zellen in allen Wells blau gefärbt sind.
Tabelle 2
Drei Wochen nach Infektion sind immer noch 100% blaue Zellen/Well zu beobachten, und folglich weisen alle Zellen den adenoviralen Vektor auf, der LacZ trägt. Folglich zeigt sich keine abfallende Infektivität nach Inkubation bis zu drei Wochen.
Um die Anzahl infektiöser Viruspartikel im Zelllysat zu bestimmen, wurde ein Titrationsassay mit den Proben, die 2, 6 und 21 Tage nach Infektion entsprechend der jeweiligen Inkubationstemperatur und MOI inkubiert wurden, durchgeführt. Drei Wochen nach Infektion wurde ein durchschnittlicher Titer von 2 × 10¹⁰ pfu pro ml beobachtet. Eine Übersicht der Titer ist in 32 dargestellt.
Die oben erwähnten Experimente zeigen, dass Variationen in der Generierung eines adenoviralen Vektors überwunden werden können, indem die Ernte der Platten solange als möglich nach hinten verschoben wird, i. e. bis die langsameren Wells ebenfalls einen adenoveralen Vektor erzeugt haben. Obwohl wir mit steigender MOI und steigender Infektionszeit einen eindeutigen toxischen Effekt sehen, gibt es keine verminderte Infektivität und keinen Abfall im Titer des produzierten adenoviralen Vektors.
Beispiel 16
Miniaturisierte Herstellung adenoviraler Vektoren, die antisense DNA-Sequenzen tragen und antisense mRNA-Sequenzen exprimieren
Eine verminderte endogene Genexpression in Sceens unter Verwendung von antisense cDNA-Expressionsbibliotheken ist in funktionellen Genomanalyseprogrammen sehr zweckmäßig. Einzelne antisense adenovirale Vektoren können ferner für die Genvalidierung und die Entwicklung eines antisense Gentherapeutikums verwendet werden. Ein Beispiel ist die Verwendung von antisense-Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). VEGF ist ein Schlüsselmolekül in der Tumorangiogenese, das endoteliales Zellwachstum fördert und eine wichtige Rolle in der Neovaskularisierung und dem Wachstum von Gliomas spielt. Das VEGF-antisense Molekül hemmt Tumorwachstum in vivo (Seock-Ah et al. (1999) Cancer Research 59: 895–900). Die Konstruktion großer und komplexer antisense-Bibliotheken in adenoviralen Vektoren ist nützlich und sehr hilfreich für Screeningprogramme in der funktionellen Genomanalyse.
PER.C6/E2A Zellen wurden mit linearsisierter Adapter-DNA, die eine definierte humane cDNA-Sequenz in antisense-Orientierung enthält, und mit linearisierter rITRΔE2A Helfer-DNA cotransfiziert, wie in Beispiel 10 beschrieben. Die in antisense-Orientierung in der Adapter-DNA klonierten Gene sind in der nachfolgenden Tabelle beschrieben. Für pCLIP wurden abhängig von den Transgen-Inserts zwei Varianten mit SalI oder PacI als Schnittstelle zur Linearisierung verwendet.
Tabelle 3
In 33 wird ein Beispiel einiger der oben erwähnten cDNAs zu Generierung von antisense adenoviraler cDNA-Vektoren unter Verwendung des miniaturisierten Produktionssystems dieser Erfindung gegeben. Diese Viren werden verwendet, um zu versuchen, die endogene Expression der getesteten Zellen zu vermindern.
Beispiel 17
Konstruktion von Adapterplasmiden für die Generierungung und Produktion rekombinanter Adenoviren, insbesondere für die Generierung und Produktion von adenoviralen Expressionsbibliotheken
Es wurden adenovirale Adapterplasmide (kurz: Adapter) konstruiert, die multiple Klonierungsstellen in multiplen Orientierungen enthalten, welche die effiziente Klonierung von sense oder antisense cDNA-Sequenzen und die Generierung von Bibliotheken aus Nukleinsäuren einschließlich cDNA-Bibliotheken in diesen Vektoren ermöglichen. Zusätzlich enthalten diese neuen Adapterplasmide neue Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen, welche das linke adenovirale ITR und die Sequenzen bis Nukleotid 6095 des Ad5-viralen Genoms begrenzen, welche mit dem Helferfragment überlappen. Diese Modifikationen der adenoviralen Adapterproteine erhöhen signifikant die Möglichkeit, die Adapterplasmide ohne Verdau der isolierten Transgene oder Transgen-Bibliotheken zu linearisieren. Nach Cotransfektion mit pWE/Ad.AflII-rITR.ΔE2A hat die homologe Rekombination zwischen den verbesserten Adapterplasmiden und dem adenoviralen Cosmid die Generierung funktioneller Adenoviren zu Folge.
Die ersten Adapterkonstrukte pCLIP-IppoI (34A) und pCLIP-IppoI-polynew (34B) stammen von pAd5/CLIP-Pac und enthalten an Position –11 bp vor dem linken ITR eine neue I-PpoI Liearisierungsschnittstelle. Zusätzliche enthält pCLIP-IppoI-polynew eine verbesserte Polylinker-Sequenz unterhalb des CMV-Promotors, die Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen für verschiedene selten schneidende Restriktionsendonukleasen und Intron-kodierte Endonukleasen umfasst. Die Erkennungssequenzen für Intron-kodierte Endonukleasen sind in Genomen einschließlich des humanen Genoms sehr selten und bestehen aus 11–23 bp. Da diese Intron-kodierten Endonuklease-Schnittstellen im adenoviralen Genom fehlen, können die Sequenzen direkt in ein vollständiges adenovirales Vektorgenom inseriert werden, welches von einem insertlosen pCLIP-IppoI erhalten wurde (siehe auch unten).
Um dieses Adapterplasmid zu konstruiren, wurde ein Teil des linke ITRs von Ad5 mittels PCR mit pCLIP-PacI Template Plasmid-DNA unter Verwendung von Elongase-Polymerase von Life Technologies (LTI; Breda, Niederlande) und der folgenden Primer amplifiziert: PCLIPPACIPPO: 5'-TTT TTA ATT AAT AAC TAT GAC TCT CTT AAG GTA GCC AAA TCA TCA TCA ATA ATA TAC CTT ATT TTG G-3' und PCLIPBSRGI: 5'-GCG AAA ATT GTC ACT TCC TGT G-3'. Der Primer pCLIP-PacI enthält eine PacI Schnittstelle 5' von einer I-PpoI Sequenz. Das amplifizierte Fragment wurde mit PacI und BsrGI und verdaut, und das erhaltene 255 bp Fragment wurde in ein Fragment mit 6471 bp kloniert, das von pAd5/CLIP-PacI, verdaut mit den gleichen Enzymen und isoliert aus einem 1% Agarosegel, erhalten wurde. Die Nukleotidsequenzen wurden durch Dideoxynukleotid-Sequenzanalyse bestätigt. Dieses Konstrukt, das PacI und I-PpoI Erkennunssequenzen 5' des linken ITRs in einem Abstand von 33 Nukleotiden bzw. 11 Nukleotiden enthält, wurde als pCLIP-I-PpoI bezeichnet (siehe
34A). Dieses Konstrukt wurde anschließend mit XbaI und HindIII verdaut, auf einem Gel aufgetrennt und verwendet, um eine neue synthetische Linker-Sequenz einzufügen. Diese Linker-Sequenz, die aus den zwei einzelsträngigen und hybridisierten Oligonukleotiden besteht: LINKERPOLYNEW-S: 5'-AGC TTT AAC TAT AAC GGT CCT AAG GTA GCG ATT AAT TAA CAG TTT AAT TAA TGG CAA ACA GCT ATT ATG GGT ATT ATG GGT T-3' und LINKERPOLYNEW-AS: 5'-CTA GAA CCC ATA ATA CCC ATA ATA GCT GTT TGC CAT TAA TTA AAC TGT TAA TTA ATC GCT ACC TTA GGA CCG TTA TAG TTA A-3', wurde direkt in das verdaute Konstrukt ligiert. Dieses Adapterkonstrukt, das als pCLIP-I-PpoI-polynew bezeichnte wurde, enthält nun Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme HindIII, I-CeuI, PacI, Pi-PspI und XbaI im Polylinker (siehe 34B). Die korrekte Insertion dieses Linkers wurde durch Verdau mit den entsprechenden Enzymen und Sequenzanalyse bestätigt.
Ein anderes Adapterkonstrukt, pADAPT, das einen stärkeren CMV-Promotor als pCLIP-basierte adenovirale Adaptoren sowie eine andere Poly(A)-Sequenz enthält, wurde als Grundgerüst zur Konstruktion eines weiteren Sets von Adapterplasmiden verwendet. Um die Linearisierungsmöglichkeiten zu erhöhen, wurde eine Reihe von pADAPT-Derivaten konzipiert und konstruiert. Zu diesem Zweck wurde die pADAPT Plasmid-DNA mit SalI verdaut und mit Shrimps Alkalischer-Phosphatase behandelt, um Religation zu reduzieren. Ein Linker, der aus den folgenden beiden phosphorylierten und hybridisierten Oligonukleotiden zusammengesetzt ist: ExSalPacF: 5'-TCG ATG GCA AAC AGC TAT TAT GGG TAT TAT GGG TTC GAA TTA ATT AA-3' und ExSalPacR: 5'-TCG ATT AAT TAA TTC GAA CCC ATA ATA CCC ATA ATA GCT GTT TGC CA-3', wurde direkt in das verdaute Konstrukt ligiert, wodurch die SalI-Restriktionsschnittstelle durch Pi-PspI, SwaI und PacI ersetzt wurde. Weiterhin wurde ein Teil des linken ITRs von pADAPT mittels PCR unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: PCLIPMSE: 5'-CCC CAA TTG GTC GAC CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT TGG-3'; und pCLIPBSRGI (siehe oben). Das amplifizierte Fragment wurde mit MunI und BsrGI verdaut und in pCLIP-EcoRI kloniert, das partiell mit EcoRI und nach Reinigung mit BsrGI verdaut wurde. Nach Restriktionsenzymanalyse wurde das Konstrukt mit ScaI und SgrAI verdaut, und ein 800 bp Fragment wurde aus dem Gel isoliert und in das mit ScaI-SgrAI verdaute pADAPT+ExSalPac-Linker ligiert. Das erhaltene Konstrukt, bezeichnet als pIPspSalAdapt (siehe 34C), wurde mit SalI verdaut, dephosphoryliert und mit dem zuvor erwähnten phosphorylierten doppelsträngigen ExSalPacF/ExSalPacR-Linker ligiert. Ein Klon, in dem die PacI Schnittstelle am nächsten zum ITR lag, wurde mittels Restriktionsanalyse identifiziert, und die Sequenzen wurden mit Hilfe einer Sequenzanalyse bestätigt. Dieses neue pADAPT-Konstrukt, bezeichnet als pIPspAdapt (siehe 34D) enthält folglich zwei ExSalPac-Linker, die Erkennungssequenzen für PacI, Pi-PspI und BstBI enthalten, welche den adenoviralen Anteil des adenoviralen Adapterkonstrukts umgeben; und die verwendet werden können, um die Plasmid-DNA vor der Cotransfektion mit dem adenoviralen Helferfragmenten zu linearisieren.
Um die Permutationen der Transgen-Klonierung weiter zu erhöhen, wurde basierend auf pIPspAdapt eine Reihe von Polylinker-Varianten konstruiert. Dazu wurde zunächst pIPspAdapt mit EcoRI verdaut und dephosphoryliert. Ein Linker, bestehend aus den folgenden beiden phosphorylierten und hybridisierten Oligonukleotiden: Ecolinker⁺: 5'-AAT TCG GCG CGC CGT CGA CGA TAT CGA TAG CGG CCG C-3' und Ecolinker^–: 5'-AAT TGC GGC CGC TAT CGA TAT CGT CGA CGG CGC GCC G-3', wurde in dieses Konstrukt ligiert, wodurch Restriktionsschnittstellen für AscI, SalI, EcoRV, ClaI und NotI erzeugt wurden. Beide Orientierungen dieses Linkers wurden erhalten, und die Sequenzen wurden durch Restriktionsanalyse und Sequenzanalyse bestätigt. Das Plasmid, das den Polylinker in der Orientierung 5' HindIII, KpnI, AgeI, EcoRI, AscI, SalI, EcoRV, ClaI, NotI, NheI, HpaI, BamHI und XbaI enthält, wurde als pIPspAdapt1 (siehe 34) bezeichnet, während das Plasmid, das den Polylinker in der Orientierung 5' HindIII, KpnI, AgeI, NotI, ClaI, EcoRV, SalI, AscI, EcoRI, NheI, HpaI, BamHI und XbaI enthält, als pIPspAdapt2 (siehe 34F) bezeichnet wurde.
Fachleute in der Herstellung von cDNA-Bibliotheken werden erkennen, dass ein zusätzlicher Polylinker, bestehend aus den Oligonukleotiden GalMlu-F: 5'-CGA TCG GAC CGA CGC GTT CGC GAG C-3' und GalMlu-R: 5'-GGC CGC TCG CGA ACG CGT CGG TCC GAT-3', zwischen die ClaI und NotI Schnittstellen von pIPspAdapt1 inseriert wurde, um pIPspAdapt6 (siehe 34G) zu erzeugen. pIPspAdapt6 enthält zusätzliche Restriktionsschnittstellen für RsrII, MluI und NruI, die eingeführt wurden, um den Abstand zwischen der SalI und der NotI Schnittstelle zu erhöhen, was den Verdau mit einer Kombination dieser Enyme verbessert. Weiterhin ermöglichen sie den Vorverdau und die Dephosphorylierung dieses Vektors vor der Restriktion mit SalI und NotI, was den Rekombinationshintergrund im Falle der Klonierung individueller Inserts oder Bibliotheken mit SalI- und NotI-kompatiblen Überhängen reduziert. Das GalMlu Oligo wurde ebenfalls in pIPspAdapt2 kloniert, was zu pIPspAdapt1 (siehe 34H) führt.
Um die Klonierung anderer sense oder antisense-Konstrukte zu erleichtern, wurde ein Linker bestehend aus den folgenden beiden Oligonukleotiden konzipiert, um den Polylinker von pIPspAdapt umzudrehen: HindXba⁺: 5'-AGC TCT AGA GGA TCC GTT AAC GCT AGC GAA TTC ACC GGT ACC AAG CTT A-3' und HindXba^–: 5'-CTA GTA AGC TTG GTA CCG GTG AAT TCG CTA GCG TTA ACG GAT CCT CTA G-3'. Dieser Linker wurde in das mit HindIII/XbaI verdaute pIPspAdapt ligiert, und das korrekte Konstrukt wurde isoliert. Die Bestätigung erfolgte durch Restriktionsenzymanalyse und Sequenzierung. Dieses neue Konstrukt pIPspAdaptA (siehe 34I) wurde mit EcoRI verdaut, und der oben erwähnte Eco-Linker wurde in dieses Konstrukt ligiert. Beide Orientierungen dieses Linkers wurden erhalten, was zu pIPspAdapt3 (siehe 34J) führt, das den Polylinker in der Reihenfolge XbaI, BamHI, HpaI, NheI, EcoRI, AscI, SalI, EcoRV, ClaI, NotI, AgeI, KpnI und HindIII enthält. pIPspAdapt4 enthält den Polylinker in der Reihenfolge XbaI, BamHI, HpaI, NheI, NotI, ClaI, EcoRV, SalI, AscI, EcoRI, AgeI, KpnI und HindIII (siehe 34K). Alle Sequenzen wurden durch Restriktionsenzymanalyse und Sequenzierung bestätigt.
Wie oben erwähnt, sind Intron-kodierte Endonukleasen selten schneidende Enzyme und verdauen das adenovirale Genom nicht. Fachleute werden erkennen, dass diese Enzyme die direkte Ligation von Sequenzen in das adenovirale Genom ermöglichen, da sie im adenoviralen Genom keine Erkennungssequenzen besitzen. Um eine pADAPT-Version zu erhalten, die Erkennungssequenzen für Intron-kodierte Endonukleasen im Polylinker enthält, wurde ein Linker in das mit HindIII/XbaI verdaute pIPspAdapt ligiert, welcher aus den einzelsträngigen Sequenzen besteht: 5'-AGC TTA ACT ATA ACG GTC CTA AGG TAG CGA TAG GGA TAA CAG GGT AAT TAA TTA ATT TAA ATT AAT TAA TCT ATG TCG GGT GCG GAG AAA GAG GTA ACT ATG ACT CTC TTA AGG TAG CCA AAT-3', und 5'-CTA GAT TTG GCT ACC TTA AGA GAG TCA TAG TTA CCT CTT TCT CCG CAC CCG ACA TAG ATT TAA TTT AAA TTA ATT ATT TAC CCT GTT ATC CCT ATC GCT ACC TTA GGA CCG TTA TAG TTA-3'. Dieser Linker bestand aus vier Oligonukleotiden: IntrolinkerF1, IntrolinkerF2, IntrolinkerR1 und IntrolinkerR2, und enthält Erkennungssequenzen für die Intron-kodierten Endonukleasen I-CeuI, I-SceI, PI-SceI und I-PpoI und die Endonucleasen PacI und SwaI. Die Korrektheit des Konstruktes wurde durch Sequenzanalyse bestätigt, und das Konstrukt wurde als pIPspAdapt5 bezeichnet (siehe 34L).
Adenovirale DNA aus Viren, die pIPspAdapt5 oder pCLIP-IppoI-polynew enthalten, wurde isoliert und in den Cosmidvektor pWE16/SnaBI kloniert. pWE15/5naBI wurde durch Autohybridisierung des phosphorylierten Oligonukleotids PacSna: 5'-TAA TAC GTA TTA AT-3' erzeugt, und die erhaltene doppelsträngige Sequenz wurde in mit PacI verdautes und dephosphoryliertes pWe15/Pac ligiert, ein Derivat von pWE15 (siehe Sambrook, J. et al., Eds. (1989) Molecuar Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Dies erzeugt eine Restrictionsschnittstelle für SnaBI, die von PacI Schnittstellen flankiert ist. Für die Generierung eines adenoviralen DNA-enthaltenden Cosmids wurde adenovirale DNA mit glatten Enden (bunt-ended) entsprechend Standard-Laborvorschriften unter Verwendung von DNAse und Proteinase K isoliert, gefolgt von der Elution von einer Anionenaustauscherharz-Zentrifugationssäule. Ein molarer Überschuss der erhaltenen gereinigten adenoviralen DNA wurde in mit SnaBI verdautes pWE15/SnaBI ligiert, und das resultierende Ligationsgemisch wurde in E. coli Stbl2 Zellen (LTI, Breda) transfiziert.
Die resultierende Plasmid-DNA wurde anschließend in in vitro Ligationen verwendet (siehe 34M). Die Verwendung von pIPspAdapt5 abgeleiteter Cosmid-DNA wird nachfolgend als Beispiel verwendet: Doppelsträngige Oligonukleotide, die kompatible Überhänge enthalten, wurden zwischen die I-CeuI und PI-SceI Schnittstellen, zwischen I-CeuI und I-PpoI, zwischen I-SceI und PI-SceI und zwischen I-SceI und I-PpoI ligiert. Die Restriktionsendonuklease PacI wurde anschließend nicht nur dazu verwendet, das Konstrukt nach Ligation zu linearisieren, und dabei das linke und rechte ITR freizusetzen, sondern auch zur Elimination Nicht-Rekombinanter. In diesem Fall können Ligationsgemische direkt für Transfektionen in PER.C6/PER.C6/E2A Verpackungszellen oder Varianten davon verwendet werden, wodurch das Erfordernis für ein Cross-over oder ein homologes Rekombinationsereignis in der Generierung funktioneller Adonoviren eliminiert wird.
Als Alternative wurden Adapterplasmide und Cosmide verwendet, die adenovirale DNA aus pIPspAdapt5 oder pCLIP-IppoI-polynew enthalten, um Fragmente zu erzeugen, die entweder die Region zwischen dem linken ITR und dem ersten Teil des Polylinkers umfassen oder den zweiten Teil des Polylinkers bis zum rechten ITR umfassen. Es wurde darauf geachtet, dass das linke und das rechte ITR mit verschiedenen und nicht kompatiblen Restriktionsenzymen linearisiert werden, da anderenfalls die Ligationseffizienzen drastisch vermindert werden. pIPspAdapt5 abgeleitete Cosmid-DNA wird als Beispiel verwendet: Das Plasmid pIPspAdapt5 wurde entweder mit BstBI und I-CeuI oder BstBI und I-SecI geschnitten, um ein adenovirales Fragment zu erzeugen, welches das linke ITR enthält. Das Cosmid, das die von pIPspAdapt5 abgeleitete adenovirale DNA enthält, wurde mit I-PpoI und PacI oder PI-SceI und PacI geschnitten, um das Fragment zu erzeugen, welches das recht ITR enthält. Die Fragmente, die das linke bzw. das rechte ITR enthalten, wurden aus einem 0.8%igen Agarosegel isoliert und mit Hilfe von Anionenaustauscher-Harzen gereinigt. Anschließend wurden doppelsträngige Oligonukleotide, die kompertible Überhänge für entweder I-CeuI oder I-SceI am 5' Ende und I-PpoI oder PI-SceI am 3' Ende enthalten, in equimolaren Mengen.. mit den Fragmenten ligiert, die das linke bzw. das rechte ITR enthalten. Das resultierende Ligationsgemisch wurde für eine Transfektion in PER.C6/PER.C6-E2A Verpackungszellen oder Varianten davon verwendet, wiederum um das Erfordernis für ein Cross-over oder ein homologes Rekombinationsereignis in der Generierung funktioneller Adenoviren zu eliminieren.
Die direkte Transfektion von in vitro ligierten Produkten profitiert von einem alternativen Weg, adenovirale Vektor-DNA zu isolieren. Um die Effizienz der Virusproduktion nach Transfektion von in vitro Ligationsreaktionen zu verbessern, kann adenovirale Vektor-DNA aus gereinigten adenoviralen Partikeln isoliert werden (siehe Pronk, R. et al. (1992) Chromosoma 102: S39–S45). Diese Virion-DNA enthält zwei Moleküle des Terminal-Proteins (TP), das kovalent an die ITR-Sequenzen gebunden ist. Es ist bekannt, dass TP-DNA die Adenovirus DNA-Replikation mehr als zwanzigfach verglichen mit Protein-freier DNA stimuliert. Daher können von pIPspAdapt5-oder pCLIP-IppoI-polynew abgeleitete adenovirale DNAs aus Virionen unter Verwendung von Guanidinium-Hydrochlorid wie beschrieben (Van Bergen, B. et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 1975–1989) isoliert werden. Diese DNA wurde mit einer geeigneten Kombination Intron-kodierter Restriktionsendonukleaen verdaut und für in vitro Ligationsreaktionen verwendet. Nach der Ligation wurden Nicht-Rekombinante durch Verdau mit PacI entfernt. Das weitere Verfahren erfolgte wie oben sowie in Beispiel 10 und folgenden beschrieben. pIPspAdapt Adapterplasmide wurden mit pWE/Ad.AflII-rITRΔE2A in die PER.C6/E2A Verpackungszellen cotranzfiziert, um rekombinante Adenoviren zu erzeugen, wie in 34N für pIPspAdapt2 als Beispiel dargestellt.
Beispiel 18
E1-deletierte oder E1 + E2A-deletierte rekombinante Adenoviren mit Deletionen in der E3-Region zur Klonierung großer DNA-Inserts im miniaturisierten adenoviralen Vektorproduktionssystem
Es ist bekannt, dass keines der E3-kodierten Proteine für die adenovirale Replikation, die Verpackung und die Infektion in kultivierten Zellen erforderlich ist. Dies ermöglicht ein Entfernen der E3-Region aus rekombinanten Adenoviren, was die Möglichkeit zur Insertion großer Gene oder komplexer regulatorischer Elemente ohne ein Überschreiten der maximalen Verpackungskapazität bietet. Zum Beispiel kann durch Deletion eines XbaI-XbaI Fragments (entsprechend der Ad5 Wildtypsequenz 28592-30470) ein Teil der E3-Region entfernt werden. Ein anderes Beispiel ist eine ausgedehnte Deletion der E3-Region, in der Sequenzen zwischen dem Stop-Codon von pVIII und dem Translationsinitiations-Codon des Fiber-Proteins (entsprechend der Ad5 Wildtypsequenz 27865-30995) entfernt wurden.
Generierung von pWE/Ad.AflII-rITRΔE2A
Die Deletion der E2A-kodierenden Sequenzen aus pWE/Ad.AflII-rITR (ECACC Hinterlegungsnummer P97082116) wurde wie folgt durchgeführt. Die adenoviralen Sequenzen, welche die E2A-kodierende Region an der linken und rechten Seite flankieren, wurden aus den Plasmid pBr/Ad.Sal.rITR (ECACC Hinterlegungsnummer P97082119) in einer PCR-Reaktion mit dem Expand PCR System (Boehringer) gemäß den Anweisungen des Herstellers amplifiziert. Die folgenden Primer wurden verwendet:
Rechte flankierende Sequenzen (entsprechend den Ad5 Nukleotiden 24033 bis 25180)
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit SnaBI und NsiI verdaut (die NsiI Schnittstelle wird im Primer ΔE2A.DBP-Start erzeugt, unterstrichen).
Linke flankierende Sequenzen (entsprechend den Ad5 Nukleotiden 21557 bis 22242)
Die amplifizierte DNA wurde mit BamHI und NsiI verdaut (die NsiI Schnittstelle wird im Primer ΔE2A.DBP-Stop erzeugt, unterstrichen).
Anschließend wurden die verdauten DNA-Fragmente in das mit SnaBI/BamHI verdaute pBr/Ad.Sal-rITR ligiert. Eine Sequenzierung bestätigte das genaue Ersetzen der DBPkodierenden Region mit einer singulären NsiI Schnittstelle im Plasmid pBr/Ad.Sal-rITRΔE2A. Die singuläre NsiI Schnittstelle kann zum Einführen einer Expressionskassette für ein Gen verwendet werden, das durch den rekombinanten Vektor zu transduzieren ist.
Die Deletion der E2A-kodierenden Sequenzen wurde derart durchgeführt, dass die Splice-Akzeptorstelle des 100 K kodierenden L4-Gens an Position 24048 im oberen Strang intakt gelassen wurde. Zusätzlich wurden die Polyadenylierungssignale der ursprünglichen E2A-RNA und der L3-RNA an der linken Seite der E2A-kodierenden Sequenzen intakt gelassen. Dies sichert die genaue Expression der L3-Gene und des Gens, welches das 100 K L4-Protein kodiert, während des Adenovirus Lebenszyklus.
Als nächstes wurde das Plasmid pWE/Ad.AflII-rITRΔE2A erzeugt. Das Plasmid pBr/Ad.Sal-rITRΔE2A wurde mit BamHI und SpeI verdaut. Das 3.9 kb Fragment, in dem die E2A-kodierende Region durch die singuläre NsiI-Schnittstelle ersetzt wurde, wurde isoliert. Das Plasmid pWE/Ad.AflII-rITR wurde mit BamHI und SpeI verdaut. Das 35 kb DNA-Fragment, aus dem das die E2A-kodierende Sequenz enthaltende BamHI/SpeI Fragment entfernt wurde, wurde isoliert. Die Fragmente wurden ligiert und unter Verwendung des λ Phagen-Verpackungsextrakts gemäß den Anweisungen des Herstellers (Strategene) verpackt, was zum Plasmid pWE/Ad.AflII-rITRΔE2R führt.
Dieser Cosmid-Klon kann verwendet werden, um durch Cotransfektion von mit PacI verdauter DNA zusammen mit verdauten Adapterplasmiden in Verpackungszellen, die ein funktionelles E2A-Genprodukt exprimieren, E2A-deletierte adenovirale Vektoren zu erzeugen. Beispiele E1-komplementierender Kennlinien sind nachfolgend beschrieben.
Generierung von pBr/Ad.Bam-rITRsp und pWE/Ad.AflII-rITRsp
Das 3'ITR im Vektor pWE/Ad.AflII-rITR umfasst kein terminales G-Nukleotid. Weiterhin liegt die PacI Schnittstelle beinahe 30 bp vom rechten ITR entfernt. Beide dieser Eigenschaften können aufgrund der ineffizienten Initiation der Replikation am 3' ITR die Effizienz der Virusgenerierung vermindern. Zu beachten ist, dass während der Virusgenerierung das linke ITR im Adapterplasmid intakt ist und die Replikation der Virus-DNA nach homologer Rekombination ermöglicht.
Um die Effizienz der Initiation der Replikation am 3'ITR zu verbessern, wurde pWE/Ad.AflII-rITR wie folgt modifiziert: Konstrukt pBr/Ad.Bam-rITRpac#2 wurde zunächst mit PacI und anschließend partiell mit AvrII verdaut, und das 17.8 kb Vektor-enthaltende Fragment wurde isoliert und unter Verwendung von SAP-Enzym (Boehringer Mannheim) dephosphoryliert. Diesem Fragment fehlen die adenoviralen Sequenzen von Nukleotid 35464 bis zum 3'ITR.
Ein 630 bp PCR-Fragment, das den 3' Ad5 Sequenzen entspricht, wurde unter Verwendung von DNA von pWE/Ad.AflII-rITR als Template und der folgenden Primer erzeugt: ITR-EPH: 5'-CGG AAT TCT TAA TTA AGT TAA CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3' und Ad101: 5'-TGA TTC ACA TCG GTC AGT GC-3'. Dieses PCR-Fragment wurde anschließend in den Vektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert, und Klone mit dem PCR-Fragment wurden isoliert und sequenziert, um die korrekte Amplifikation der DNA zu überprüfen. Der PCR-Klon wurde im Anschluss mit PacI und AvrII verdaut, und das 0.5 kb Adeno-Insert wurde in das mit PacI/partiell mit AvrII verdaute pBr/Ad.Bam-rITRpac#2-Fragment ligiert, um pBR/Ad.Bam-rITRsp zu erzeugen. Als nächstes wurde dieses Konstrukt verwendet, um einen Cosmid-Klon mit einem Insert entsprechend den Adenosequenzen 3534 bis 35938 zu erzeugen. Dieser K1on wurde als pWE/AflII-rITRsp bezeichnet.
Generierung von pBr/Ad.Bam-rITRspΔXba und pWE/Ad.AflII-rITRspΔXba
Das Plasmid pBr/Ad.Bam-rITRsp wurde im E. coli Stamm DM1 (dam, dcm) (Life Technologies) propagiert. Das Plasmid wurde mit XbaI verdaut, wodurch das 1.88 kb XbaI-XbaI Fragment entfernt wird, und religiert. Der erhaltene K1on pBr/Ad.Bam-rITRspΔXba wurde verwendet, um das Helfercosmid pWE/Ad.AflII- rITRspΔXba zu konstruieren, wie oben beschrieben. In Kürze, die folgenden Fragmente wurden mittels Extraktion aus einem Agarosegel (QIAGEN) isoliert: pWE.pac, verdaut mit PacI, pBr/AflII-Bam, verdaut mit PacI und BamHI, und pBr/Ad.Bam-rITRΔXba, verdaut mit BamHI und PacI. Diese Fragmente wurden ligiert und unter Verwendung des Lambda Phagen-Verpackungsextrakts gemäß den Anweisungen des Herstellers (Strategene) verpackt. Nach Infektion der Wirtsbakterien und Zusammenbau der Phagen wurden die erhaltenen Kolonien auf die Präsenz des intakten Inserts hin untersucht. pWE/Ad.AflII-rITRΔXba enthält Sequenzen, die identisch zu denen von pWE/Ad.AflII-rITRsp sind, aber mit Deletion des XbaI-XbaI Fragments.
Generierung von pBr/Ad.Bam-rITRspΔE2AΔXba und pWE/Ad.AflII-rITRspΔE2aΔXba
Das Plasmid pBr/Ad.Bam-rITRspΔE2AΔXba wurde für die Generierung von E1-deletierten rekombinanten Adenoviren mit einer dualen Deletion von E2A und E3 konstruiert. Ein SpeI-BamHI Fragment, das die E2A Deletion enthält, wurde aus dem Plasmid pBr/Ad.Sal-rITRΔE2A isoliert und in das mit SpeI-BamHI verdaute pBr/Ad.Bam-rITRspΔXba inseriert, was zum Plasmid pBr/Ad.Bam-rITRspΔE2AΔXba führt. Dieses Plasmid wurde verwendet, um mittels einer Drei-Fragment Ligation, wie oben beschrieben, das Helfercosmid pWE/Ad.AflII-rITRspΔE2AΔXba zu konstruieren. pWE/Ad.AflII-rITRspΔE2aΔXba enthält Sequenzen, die identisch zu pWE/Ad.AflII-rITRsp sind, aber mit einer dualen Deletion der E2A-Region und des XbaI-XbaI-Fragments.
Generierung von pBr/Ad.Bam-rITRspΔE3 und pWE/Ad.AflIIrITRspΔE3 und von pBr/Ad.Bam-rITRspΔE2AΔE3 und pWE/Ad.AflII-rITRspΔE2AΔE3
Um die Insertion selbst größerer DNA-Fragmente zu ermöglichen, wurde eine erweiterte Deletion der E3-Region konstruiert, in der die vollständige E3-kodierende Region entfernt wurde. Primer 1 (5'-AAA CCG AAT TCT CTT GGA ACA GGC GGC-3')(SEQ ID NO: 1) und Primer 2 (5'-GCT CTA GAC TTA ACT ATC AGT CGT AGC CGT CCG CCG-3')(SEQ ID NO: 2) wurden verwendet, um die Sequenz von pBr/Ad.Bam-rITRsp zu amplifizieren, welche den Sequenzen 27326 bis 27857 im Wildtyp Ad5-Genom entspricht. Primer 3 (5'-GCT CTA GAC CTC CTG TTC CTG TCC ATC CGC-3')(SEQ ID NO: 3) und Primer 4 (5'-GTA TGT TGT TCT GGA GCG GGA GGG TGC-3') (SEQ ID NO: 4) wurden verwendet, um die Sequenz von gleichen DNA-Template zu amplifizieren, die den Sequenzen 30994 bis 35502 im Wildtyp Ad5-Genom entspricht. Die Amplifikationsprodukte wurden mit EcoRI/XbaI bzw. XbaI/AvrII verdaut und ligiert. Das resultierende EcoRI-AvrII Fragment wurde in die Vektoren pBr/Ad.Bam-rITRsp und pBr/Ad.Bam-rITRspΔE2A kloniert, welche mit EcoRI und AvrII verdaut wurden, was zu pBr/Ad.Bam-rITRspΔE3 bzw. pBr/Ad.Bam-rITRspΔE2AΔE3 führt. Diese beiden Plasmide wurden verwendet, um die Cosmid-Helfermoleküle zu konstruieren wie oben beschrieben. pWE/Ad.AflII-rITRspΔE3 enthält Sequenzen, die identisch zu denen von pWE/Ad.AflII-rITRsp sind, aber mit einer Deletion der E3-Region, welche den Sequenzen 27857-30994 im Wildtyp Ad5-Genom entspricht, während pWE/Ad.AflII-rITRspΔE2AΔE3 identisch zu pWE/Ad.AflII-rITRspΔ3 ist, aber mit einer zusätzlichen Deletion der E2A-Region.
Die oben beschriebenen Cosmide sind vor allem zweckmäßig für die Produktion adenoviraler Expresssionsbibliotheken, insbesondere für Bibliotheken, die Kollektionen großer Inserts tragen. Siehe auch die Beispiele 19 und 20.
Beispiel 19
Miniaturisierte Multiwell-Produktion von E1-, E2A- und E3-deletierten rekombinanten adenviralen Vektoren, die therapeutische und Marker-Transgene tragen
Wie in Beispiel 10 erwähnt, ermöglicht eine kombinierte Deletion von E1, E2A und E3 die Klonierung fremder DNA-Sequenzen bis zu einer Größe von ungefähr 10.5 kb. Hier zeigen wir die Herstellung von E1-, E2A- und E3-deletierter Vektoren in PER.C6/E2A Zellen, welche humane cDNAs sowie Markergene tragen.
Die Zellkultur Bedingungen wurden im Beispiel 10 beschrieben. Für die DNA-Transfektion wurden die Adapter- und Helfermoleküle gemäß Beispiel 14 hergestellt. Die linearisierten Adapterplasmide pAD/CLIP-ceNOS und pAD/CLIP-lacZ wurden für die Transfektion in Kombination mit vier verschiedenen mit PacI linearisierten Helfercosmiden verwendet, nämlich wPE/Ad.AflII-rITRsp, pWE/Ad.AflII-rITRsp.ΔE2A, pWE/Ad.AflII-rITRsp.ΔXba und pWE/Ad.AflII-rITR. Das DNA-Transfektionsverfahren war identisch zu dem, das in Beispiel 10 beschrieben wurde. Ein 100 μl Aliquot der gefrorenen/aufgetauten Lysate wurde zur Infektion einer zweiten 96-Well Platte mit PER.C6/E2A Zellen verwendet, und die CPE-Bildung wurde kontrolliert. 35 zeigt den Prozentanteil virus-produzierender Wells (CPE positiv) in einer 96-Well Platte mit PER.C6/E2A Zellen nach Propagation der gefrorenen/aufgetauten transfizierten Zellen. Es ist eindeutig möglich, in PER.C6/E2A Zellen E1- und E3-deletierte rekombinante adenovirale Vektoren zu erzeugen, welche therapeutische und Marker-Transgene tragen.
Beispiel 20
Konstruktion einer sense oder antisense adenoviralen Expressionsbibliothek in Array-Anordnung zur Selektion von Phänotypen
Die Miniaturisierung der adenoviralen Vektorproduktion ermöglicht in großem Maßstab die Hochdurchsatz-Konstruktion und das Screening geklonter oder gepoolter Genexpressionsbibliotheken.
Um eine klonierte cDNA-Expressionsbibliothek in Array-Anordnung in einem adenoviralen Vektor-Format, basierend auf dem PER.C6 (und Derivaten) Produktionssystem, zu konstruieren, wurde mit Hilfe von Oligo(dT)-Celloluse Poly(A+)-mRNA aus humaner Plazenta isoliert und unter Verwendung von Materialien und Reagenzien von Herstellern wie zum Beispiel Life Technologies, Inc. (LTI; Breda, Niederlande) in cDNA umgewandelt. Die resultierenden doppelsträngigen cDNA-Moleküle enthalten einen SalI-kompatiblen Überhang am 5' Ende und einen NotI-kompatiblen Überhang am 3' Ende. Die gesamte-cDNA wurde in pIPspAdapt6 (für die sense-Orientierung der cDNA Inserts) oder in pIPspAdapt7 (für die antisense-Orientierung der cDNA Inserts) ligiert (siehe Beispiel 17 für die Adapter-Konfigurationen). Dazu wurden pIPspAdapt6 und pIPspAdapt7 mit der Restriktionsendonuklease MluI verdaut, gefolgt von der Dephosphorylierung der 5' Überhänge mit Hilfe einer thermosensitiven alkalischen Phosphatase (LTI). Nach Verdau mit SalI und NotI wurde das linearisierte Plasmid aus einem 0.8%igen Agarosegel isoliert und mittels Anionenaustauscher-Chromatographie gereinigt. Nach Ligation der cDNA-Moleküle in die Plasmide wurde die resultierende Bibliothek in E. coli DH5α elektrokompetente Bakterien mit Hilfe von Elektroporation mit einem BTX 600 Elektrozell-Manipulator oder einem Äquivalent davon eingebracht. Die nicht amplifizierte Bibliothek wurde aliquotiert und als Glyzerin-Stock eingefroren.
Am Tag des Plattierens wurden die Röhrchen aufgetaut und auf große Petrischalen mit LB Medium mit 1.5% Agar und 50 μg/ml Ampicillin ausplattiert. Um eine gleichmäßige Verteilung der plattierten Kolonien zu erhalten, wurden während des Plattierens Glasperlen verwendet. Nach Wachstum über Nacht bei 37°C wurden die Agarplatten zu einem automatisierten Kolonien-pickenden Roboter (Flexys; Genome Solutions) transferiert. Einzelne Kolonien wurden gepickt und mit Hilfe des Roboters zu Mikrotiterplatten mit 300 μl Terrific Broth-Medium mit 50 μg/ml Ampicillin transferiert. Auf diese Weise inokulierte Platten wurden in Anschluss in mit Sauerstoff belüftete HiGro-Inkubatoren (Genemachines) transferiert und gemäß den Anweisungen des Herstellers 12–16 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die einzelnen Plasmide mit Hilfe einer konventionellen alkalischen Lyse/Plasmid DNA-Isolationsmethode isoliert, wie in Sambrook et al. beschrieben (Sambrook, J. et al., Eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Dazu werden die Platten zunächst in Zentrifugen (zum Beispiel Eppendorf 5810R oder Heraeus Megafuge 2.0) transferiert und die Bakterien 20 Minuten bei 1500 × g pelletiert. Mit Hilfe eines Flüssigkeiten handhabenden Roboters wird der Überstand in den einzelnen Wells der einzelnen Platten entfernt und verworfen. Die Bakterienpellets werden in 100 μl 25 mM Tris, pH 8.0 mit 50 mM Glukose und 10 mM EDTA resuspendiert und die Bakterien durch Zugabe von 100 μl 0.2 N NaOH/1% SDS lysiert. Nach Zugabe von 100 μl 5M Kaliumacetat wird durch Filtration über eine Multiscreen-NA Lysat Filterplatte (Millipore B. V., Etten-Leur) oder ein Äquivalent davon unter Verwendung eines Vakuumblocks ein klares Lysat erhalten. Die Plasmid-DNA in dem geklärten Lysat wird anschließend durch Zugabe von 200 μl Isopropanol und Zentrifugation bei 4°C und 1500 × g für 30 Minuten präzipitiert. Das Präzipitat wird einmal mit 70%igem Ethanol gewaschen und nach Lufttrocknen in 20 μl TE aufgenommen.
Die isolierte Plasmid-DNA in jedem einzelnen Well wird mit Hilfe des Picogreen DNA Quantification Kits quantifziert, wie von Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA) beschrieben, indem ein Aliquot der Plasmid-DNA aus jedem Well in frische Platten mit der geeigneten Verdünnung übertragen wird. In der Zwischenzeit werden, wie in den anderen Beispielen für miniaturisierte Adenovirus-Generierung beschrieben, PER.C6 Zellen oder Derivate davon, wie zum Beispiel PER.C6/E2A, ausgesät. Für jedes Well werden 55 Nanogramm Plasmid-DNA in eine neue Platte überführt und mit PiPspI 60 Minuten bei 65°C linearisiert. Dieses Plasmid wird im Anschluss mit einem geeigneten Helfer DNA-Molekül (z. B. E2A-deletiert, wie zum Beispiel pWE/Ad.AflII-rITR.ΔE2A) oder E2A/E3-deletiert oder E2A/E3/E4-deletiert, siehe Beispiel 18) in PER.C6 oder PER.C6/E2A Verpackungszellen cotransfiziert. Die Transfektion erfolgt ähnlich den Experimenten und Verfahren, die in den Beispielen 9, 10 oder 25 für die Adenovirus-Generierung in Mikrotiterplatten beschrieben wurden.
Die Virusbildung in einzelnen Wells wird mit Hilfe der CPE-Bildung, blot-basierten Virusassays oder Reportersystemen quantifiziert. Die Adenovirus-Bibliothek in Array-Anordnung ist im Anschluss bereit, um im zell-basierten Screens verwendet zu werden, in denen nach einem bestimmten Phänotyp selektiert werden kann.
In 36 ist ein Überblick über ein Schema einer adenoviralen cDNA-Expressionsbibliothek dargestellt, die wie oben beschrieben konstruiert und angeordnet wurde. Dieses Schema beschreibt die Konstruktion von Bibliotheken einzeln klonierter adenoviraler Vektorbibliotheken in einem Hochdurchsatz-Modus. Die Verbesserung dieser Strategie gegenüber gepolten Bibliotheken liegt darin, dass keine Tendenz (bias) für Viren mit einem Wachstumsvorteil erfolgt. Dies liegt daran, dass die individuellen Mitglieder der Bibliothek unmittelbar nach dem Plattieren der Bibliothek in Form individueller Kolonien vorliegen und während aller weiterer Verfahren belassen werden.
Die adenovirale Expressionsbibliothek kann zur Infektion verschiedener Zellen verwendet werden, die für die Selektion eines bestimmten Phänotyps geeignet sind, wie zum Beispiel Kapillarbildung, Zellproliferation, Zellmigration oder Markergenexpression, entweder in einem geeigneten unmodifizierten Zelltyp oder einer Reporter-Zelllinie, die für diesen Zweck konzipiert wurde. Die Detektion dieser Phänotypen kann zum Beispiel mit Hilfe automatisierter Bildanalyse von Veränderungen in der Morphologie oder Veränderungen in der intrazellulären Lokalisation eines Reporterproteins erfolgen. Sobald Treffer selektiert wurden, ist die klonierte bakterielle DNA-Version unmittelbar in Form von pIPspAdapt6-oder pIPspAdapt7-Adapterplasmid, wie in E. coli produziert, für eine Sequenzanalyse verfügbar. Dies bedeutet, dass keine Isolation (rescue) notwendig ist, wie es im Falle von gepoolten retroviralen oder plasmid-basierten Expressionsbibliotheken der Fall ist.
Falls erwünscht (zum Beispiel bei Verwendung von Flüssigkeiten handhabenden Robotern oder manuell), können vor der Durchführung von Assays einzelne Wells, die individuelle adenovirale Vektoren enthalten, in einer Reihe oder einer Spalte oder einer Platte oder vielen Platten gepoolt werden. Dies ist der Fall, wenn ein gewünschter Assay nicht für Hochdurchsatzanalysen zugänglich ist, und die Gesamtzahl an Wells für einen primären Screen vermindert werden muss. Eine zusätzliche Verbesserung oder Vorteil gepoolter, aber ursprünglich klonierter adenoviraler Vektoren liegt darin, dass multigen-abhängige Phänotypen selektierbar sind.
Beispiel 21
Virusproduktion in Wells einer 384-Well Gewebekulturplatte
Im wesentlichen wurde dieses Experiment wie im Beispiel 10 beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme der folgenden kleinen Veränderungen. Am Tag vor der Transfektion wurden die PER.C6/E2A Zellen mit Kulturmedium (DMEM mit 10% fötalem Kälberserum und 10 mM Magnesiumchlorid) zu einer Suspension von 11250 Zellen pro 25 μl verdünnt, gefolgt vom Aussäen von 25 μl pro Well einer 384-Well Gewebekulturplatte unter Verwendung einer 16 Kanal-Multikanalpipette (Finn). Nach Zugabe von 1.3 ml serum-freiem DMEM zum DNA/Lipofektamin-Gemisch wurden 15 μl dieses Gemisches pro Well zu den mit PER.C6/E2A ausgesäten Wells gegeben, welche vor der Transfektion mit 25 μl DMEM gewaschen wurden. Nach 3 Stunden in einem belüfteten CO₂ Inkubator (39°C, 10% CO₂) wurden 50 μl Kulturmedium zu jedem Well gegeben, und die Platen wurden in den belüfteten CO₂ Inkubator (39°C, 10% CO₂) zurückgestellt. Am nächsten Tag wurde das Medium eines jedem Wells mit 50 μl Kulturmedium ersetzt. Die Platten wurden anschließend für weitere vier Tage in einem belüfteten CO₂ Inkubator (32°C, 10% CO₂) zurückgestellt, und anschließend wurden die Wells einer Gefrierprozedur bei –20°C über Nacht, gefolgt vom Auftauen und Resuspension durch wiederholtes Pipettieren unterzogen. Ein 25 μl Aliquot der gefrorenen/aufgetauten transfizierten Zellen wurde in jedes Well einer Platte mit frischen PER.C6/E2A Zellen überführt, welche wie oben beschrieben auf 384-Well Gewebekulturplatten (Platte 2) ausgesät wurden. Die zweite 384-Well Platte mit PER.C6/E2A Zellen, die mit gefrorenem/aufgetautem Zelllysat der ersten transfizierten Platte inkubiert und damit infiziert wurden, wurde auf CPE-Bildung hin untersucht und bei –20°C gelagert. Das oben erwähnte Experiment wurde zweimal durchgeführt. In 37 ist der Prozentanteil CPE-positiver Wells dargestellt, der nach Propagation der gefrorenen/aufgetauten transfizierten Zellen zu neuen PER.C6/E2A gezählt wurden.
Beispiel 22
Einfluss des Weglassens der Propagation oder Erneuerung des Kulturmediums anstelle der Propagation auf die Geschwindigkeit und Produktionseffizienz der Virusbildung
Ein Zugänglichmachen des Verfahrens der miniaturisierten adenoviralen Vektorproduktion für die Automatisierung erfordert eine Vereinfachung des gesamten Verfahrens. Ein aufwendiger und zeitraubender Schritt ist die Propagation der Zelllysate von den transfizierten PER.C6/E2A Zellen auf frische Zellen, und daher ist das Weglassen dieses Schrittes wünschenswert. Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um dieses Ziel zu erreichen. Um den Einfluss des Mediumwechsels transfizierter Zellen anstelle der Verwendung gefrorener/aufgetauter transfizierter PER.C6/E2A Zellen (siehe Beispiel 10 und andere) für die Infektion neuer PER.C6/E2A Zellen (Propagation) zu bestimmen oder die Propagation insgesamt wegzulassen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Am Tag vor der Transfektion wurden PER.C6/E2A Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA geerntet und gezählt. Anschließend wurden die Zellen mit Kulturmedien (DMEM mit 10% fötalem Kälberserum und 10 mM MgCl₂) zu einer Suspension von 22500 Zellen pro 100 μl verdünnt, gefolgt vom Aussäen von 100 μl pro Well der 96-Well Gewebekulturplatten. Am nächsten Tag wurden 2.6 μg der linearisierten Adaptermoleküle und 2.6 μg der mit PacI linearisierten pWE/Ad.AflII-rITRΔE2A Plasmid-DNA in einem Volumen von 100 μl serum-freiem Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) mit 26.5 μl Lipofektamin gemischt, welches in 74.4 μl serum-freiem DMEM durch Zugabe des Lipofektamin-Gemisches zum DNA-Gemisch verdünnt wurde. Das DNA/Lipofektamin-Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen, und anschließend wurden 1.3 ml serum-freies DMEM zugegeben. Das letztere Gemisch wurde im Anschluss (30 μl pro Well) zu mit PER.C6/E2A ausgesäten Wells gegeben, die vor der Transfektion mit 200 μl DMEM gewaschen wurden. Alle Transfektionen wurden zweimal durchgeführt. Nach drei Stunden in einem belüfteten CO₂ Inkubator (39°C, 10% CO₂) wurden zu jedem Well 200 μl Kulturmedium gegeben und die Platten wurden anschließend in den belüfteten CO₂ Inkubator (39°C, 10% CO₂, zurückgestellt. Am nächsten Tag wurde das Medium eines jeden Wells mit 200 μl Kulturmedium ersetzt. Im Anschluss wurden die Platten zurück in einen belüfteten CO₂ Inkubator (32°C, 10% CO₂) gestellt. Nach sieben Tagen wurde das Medium einer der beiden transfizierten Platten mit 200 μl Kulturmedium ersetzt, und die Platte zurück in einen belüfteten CO₂ Inkubator (32°C, 10% CO₂) zurückgestellt, und anschließend wurde die CPE-Bildung verfolgt. In 38A ist der Prozentanteil der virusproduzierenden Zellen (CPE positive Wells), gezählt nach Wechsel des Mediums der transfizierten Zellen anstelle der Propagation und Amplifikation frischer PER.C6/E2A Zellen, dargestellt.
Die Wells der zweiten Platte wurden einer Gefrierprozedur bei –20°C über Nacht, gefolgt vom Auftauen und Resuspension durch wiederholtes Pipettieren unterzogen. Ein 100 μl Aliquot der gefrorenen/aufgetauten transfizierten Zellen wurde in jedes Well einer Platte mit neuen PER.C6/E2A Zellen (2.25 × 10⁴ Zellen pro Well in 100 μl) überführt, die in 96-Well Gewebekulturplatten einen Tag vor den Infektionen ausgesät wurden. Diese wurden in einem belüfteten CO₂ Inkubator (32°C, 10% CO₂) inkubiert, bis das Vorhandensein einer vollständigen CPE beobachtet wurde. In 38B ist der Prozentanteil virus-produzierender Zellen (CPE positiver Wells) dargestellt, gezählt nach Propagation auf frischen PER.C6/E2A Zellen. In allen Experimenten wurden untransfizierte Wells zur Kontrolle von Kreuzkontaminationen eingeschlossen. Alle diese Wells blieben hinsichtlich CPE-Bildung negativ. In 38C sind die Ergebnisse eines parallelen normalen Verfahrens wie in Beispiel 10 beschrieben dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Ersetzen des Mediums oder komplettes Weglassen jedweder Handhabung nach der Transfektion die Reinfektion frischer PER.C6/E2A Zellen mit dem Lysat von den primär transfizierten Platten ersetzen kann.
Beispiel 23
Bestimmung des Einflusses des Zellwachstums von PER.C6/E2A Zellen auf die Geschwindigkeit und Produktionseffizienz der Virusbildung
Für die Konstruktion adenoviraler Genexpressionsbibliotheken müssen die Bedingungen für die miniaturisierte Produktion des adenoviralen Vektors optimal sein. Dazu wurde eine Reihe von Parametern, die Virusgenerierung beeinflussen können, variiert und ihr Effekt auf die Produktion adenoviraler Vektoren gemessen. Um zu bestimmen, wie die Zellkonfluenz der komplementierenden Zelllinie PER.C6/E2A vor dem Aussäen in Mikrotiterplatten die Geschwindigkeit der Effizienz der Virusproduktion beeinflusst, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Am Tag eins wurden die PER.C6/E2A Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA geerntet und gezählt, gefolgt vom Aussäen von 1/10, 1/5 und 1/2.5 der geernteten Zellen in drei verschiedenen 175 cm² Gewebekulturflaschen. In Tabelle 9 ist die Anzahl der Zellen dargestellt, die in jeder 175 cm² Gewebekulturflasche in drei verschiedenen Experimenten ausgesät wurden. Vier Tage später wurden die PER.C6/E2A Zellen von jeder Flasche geerntet, gezählt und anschließend mit Kulturmedium (DMEM mit 10% fötalem Kälberserum und 10 mM MgCl₂) zu einer Suspension von 22500 Zellen pro 100 μl verdünnt. Von jeder Zellsuspension wurden zwei 96-Well Gewebekulturplatten mit 100 μl Zellsuspension pro Well ausgesät. Am nächsten Tag wurden 10.6 μg von mit SalI linearisierter pAd/Clip-lacZ und 10.6 μg von mit PacI linearisierter pWE-Ad.AflII-rITRΔE2A Plasmid-DNA in einem Volumen von 600 μl serum-freiem Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) mit 153.6 μl Lipofectamin gemischt, welches in 446.4 μl Serum-freiem DMEM durch Zugabe des Lipofectamin-Gemischs zum DNA-Gemisch verdünnt wurde. Das DNA/Lipofectamin-Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, und anschließend wurden 7.8 ml serum-freies DMEM zugegeben. Das letztere Gemisch wurde im Anschluss (30 μl pro Well) in mit PER.C6/E2A ausgesäten Wells gegeben, welche vor der Transfektion mit 200 μl DMEM gewaschen wurden. Nach drei Stunden in einem belüfteten CO₂ Inkubator (39°C, 10% CO₂) wurden 200 μl mit 10% fötalem Kälberserum und 10 mM MgCl₂ zu jedem Well gegeben und die Platten wurden zurück in den belüfteten CO₂ Inkubator (39°C, 10% CO₂) gestellt. Am nächsten Tag wurde das Medium eines jeden Wells mit 200 μl DMEM mit 10% fötalem Kälberserum und 10 mM MgCl₂ ersetzt. Die Platten wurden anschließend zurück in den belüfteten CO₂ Inkubator (32°C, 10% CO₂) gestellt. Nach zwei Tagen wurde eine der beiden transfizierten Platten verwendet, um mit Hilfe von lacZ-Färbung die Transfektionseffizienz zu bestimmen. In Tabelle 9 ist die Transfektionseffizienz jeder 96-Well Gewebekulturplatte gezeigt, gezählt nach lacZ-Färbung in drei verschiedenen Experimenten. Die zweite Platte der beiden transfzierten Platten wurde zur Virusproduktion verwendet. Sieben Tage nach Transfektion wurden die Wells der zweiten Platte einer Gefrierprozedur bei –20°C über Nacht, gefolgt von Auftauen und Resuspension durch wiederholtes Pipettieren unterzogen. Ein 100 μl Aliquot der gefrorenen/aufgetauten transfizierten Zellen wurden in jedes Well einer Platte mit neuen PER.C6/E2A Zellen (2.25 × 10⁴ Zellen pro Well in 100 μl) überführt, ausgesät in 96-Well Gewebekulturplatten am Tag vor den Infektionen. Diese wurden in belüfteten CO₂ Inkubator (32°C, 10% CO₂) inkubiert, bis das Vorhandensein einer vollständigen CPE beobachtet wurde. In 39 ist der Prozentanteil virus-produzierender Zellen (CPE positiver Wells) dargestellt, gezählt nach Propagation der gefrorenen/aufgetauten transfizierten Zellen zu neuen PER.C6/E2A Zellen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Konfluenzgrad der PER.C6/E2A Zellen vor Transfektion mit den adenoviralen Adapter und Helfer DNA-Molekülen den letztendlichen Prozentanteil der virus-produzierenden Wells beeinflusst, wobei je höher die Konfluenz ist, desto besser ist dies für die absolute Endzahl an virus-produzierenden Wells und auch für die Geschwindigkeit, mit der die Virusgenerierung erfolgt.
Beispiel 24
Langzeitinkubation mit adenoviralem Überstand ermöglicht die Detektion langsamer Phänotypen
Die Verwendung adenoviraler Vektorbibliotheken in der funktionellen Genomanalyse erfordert die Verwendung geeigneter zell-basierter Assays, die für HTS und Miniaturisierung zugänglich sind, zusätzlich zu einem Phänotyp, der detektierbar und für die Gene, die man sucht, relevant ist, wie zum Beispiel die in Beispiel 12 verwendeten. Der Untersuchungszeitraum nach Infektion mit einer adenoviralen Expressionsbibliothek, zum Beispiel in einem Aufbau wie in Beispiel 20 beschrieben, ist variabel und hängt von den Parametern ab, die den zu untersuchenden Phänotyp determinieren. Zum Beispiel kann die Bildung von Blutkapillargefäßen bei Verwendung einer automatischen Windanalyse in jedem Well einfach durch Detektion der Bildung der Kapillargefäße untersucht werden. Die Ausbildung dieser Strukturen, die Indikativ für Angiogenese oder Blutgefäßbildung sind, kann durch Infektion der relevanten Vorläuferzellen reduziert werden. Solche Zellen können endotheliale Zellen aus dem Herzen oder aus Tumorgewebe sein, mit einem adenoviralen Vektor, der ein relevantes Transgen trägt, zum Beispiel einen vaskulären endothelial-ähnlichen Wachstumsfaktor (VEGF, vascular endothelial-like growth factor). Ein komplexer Phänotyp, wie zum Beispiel die Bildung von Kapillargefäßen, erscheint jedoch erst nach mehreren Tagen bis Wochen. Daher muss in einigen Fällen die Expression der Bibliothek von Genen, vermittelt durch die adenovirale Expressionskassette, ausreichend lang sein, damit sich der Phänotyp entwickeln kann. In 40 sind die Ergebnisse eines Experiments mit einem EGFP-adenoviralen Vektor gezeigt, der zur Infektion von A549 Zellen in 96-Zellplatten verwendet wurde. Basierend auf den in Beispiel 15 beschriebenen Stabilitätsmerkmalen wurde die adenovirale Verdünnung (in DMEM) nicht entfernt, sondern bis zu zwei Wochen belassen und die EGFP-Expression in regelmäßigen Abständen gemessen. Diese Experimente zeigen eindeutig, dass die adenovirale Transfektion als semistabil angesehen werden kann und sich über die Zeit sogar erhöht, was suggeriert, dass eine Reinfektion erfolgt und/oder die Infektion sich neu teilender Zellen. Dies impliziert, dass das transiente adenovirale Vektorsystem durch Belassen des adenoviralen Überstands auf den Zellen in den Multiwellplatten (96, 384-Well oder kleiner) zum Screening nach Phänotypen verwendet werden kann, deren Entwicklung zwei Wochen oder länger dauert.
Beispiel 25
Miniaturisierte Multiwell-Produktion rekombinanter adenoviraler Vektoren mit Hilfe kostengünstigen Polyethylenimins (PEI) als DNA-Transfektionsagens
Zum Zweck der Kostenreduktion und der Reduktion der variablen Toxizität ist es wünschenswert, das liposomale Transfektionsreagenz Lipofectamin zu ersetzen. Das kationische Polymer Polyethylenimin (PEI) wurde für diesen Zweck in dem miniaturisierten Multiwell (96-Well) adenoviralen Vektorproduktionssystem getestet. Siehe auch Beispiele 9 und 10. PEI wurde hinsichtlich der Transfektion der von PER.C6 sowie PER.C6/E2A Zellen mit verschiedenen Transgen-Inserts im adenoviralen Helferplasmid getestet: LacZ und EGFP. Verschiedene Parameter wurden untersucht: PEI/DNA-Verhältnisse, Inkubationszeiten, Mengen an MEI/DNA-Komplex pro einzelnem Well.
Untersuchung von PEI mit verschiedenen PEI/DNA-Verhältnissen
Die 96-Well Mikrotiterplatten wurden am Tag vor der Transfektion mit PER.C6 oder PER.C6/E2A Zellen ausgesät, wie in Beispiel 10 beschrieben. Am nächsten Tag wurden für 16 Wells (8 Wells zweifach auf verschiedenen Platten) 3 μg mit SalI linearisiertes pCLIP-LacZ und 3 μg mit PacI linearisiertes pWE/AflII-rITR für PER.C6 beziehungsweise pWE/AflII-rITRΔE2A für PER.C6/E2A in 150 μl 150 mM NaCl verdünnt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Eine 20 mM 25 kDA PEI-Lösung wurde in unterschiedlichen Mengen ebenfalls in 150 μl 150 mM NaCL verdünnt, um verschiedene PEI/DNA-Verhältnisse zu haben, und ebenfalls 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Siehe Tabelle 4.
Die DNA- und die PEI-Lösung wurden durch tropfenweises Zugeben von PEI zur DNA gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden mit 100 μl serum-freiem Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) pro Well gewaschen. Anschließend wurden 1.3 ml DMEM zu dem Gemisch gegeben, und 80 μl pro Well wurden in jedes Well zu den Zellen gegeben. Als Positivkontrolle wurden die DNA/Lipofectamin-Komplexe transfiziert (präpariert entsprechend Beispiel 9). Weitere Kontrollinkubationen umfassten nur DMEM, nur PEI ohne DNA (Verhältnis 13) und zweimal die Menge von PEI/DNA-Verhältnis 13. Nach vierstündiger Inkubation bei 37°C für PER.C6 Zellen und bei 39°C für PER.C6/E2A Zellen in einem belüfteten CO₂ Inkubator wurden für die PEI-Transfektionen 80 μl PEIPER.C6 Medium (DMEM mit 20% v/v fötalem Kälberserum (FCS), 10 mM MgCl₂) pro Well zu den Zellen gegeben. Für die Lipofectamin-Transfektionen wurden 180 μl DMEM, 10% v/v FCS, 10 mM MgCl₂ pro Well zu den Zellen gegeben, und die Platten wurden in den belüfteten CO₂ Inkubator zurückgestellt. Am nächsten Tag wurde das Medium jedes Wells mit 200 μl DMEM, 10% v/v FCS, 10 mM MgCl₂ ersetzt. Die Platten wurden anschließend bei 37°C PER.C6-Platten und 32°C für PER.C6/E2A-Platten in einem belüfteten CO₂ Inkubator belassen. Nach drei Tagen wurde eine der duplizierten Platten mit X-Gal gefärbt, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen. Die Transfektionseffizienz-Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Vier Tage nach der Transfektion wurden die Platten vier Stunden bei –20°C eingefroren, gefolgt von Auftauen und Resuspension durch wiederholtes Pipettieren. Ein 100 μl Aliquot wurde in eine neue Platte mit PER.C6/E2A Zellen transferiert, die einen Tag vor Transfektion wie oben beschrieben ausgesät wurden. Die Platten wurden anschließend zurück in die CO₂ Inkubatoren erstellt. Vierzehn Tage nach der Propagation wurde CPE als Indikator für die Virusbildung ausgezählt, und die Platten wurden vier Stunden bei –20°C eingefroren, gefolgt von Auftauen und Resuspension durch wiederholtes Pipettieren. Ein 20 μl Aliquot wurde in Wells von Platten überführt, die pro Well einer 96-Wellplatte mit 1 × 10⁴ A549 Zellen in einem Volumen von 100 μl ausgesät waren. Zwei Tage nach Infektion wurden die Wells mit X-Gal gefärbt und auf LacZ Aktivität untersucht, wie im Beispiel 9 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
Untersuchung von PEI mit verschiedenen PEI/DNA-Verhältnissen in Kombination mit verschiedenen Mengen des Komplexes pro Well
Um die optimale absolute Menge an PEI/DNA-Komplex in zwei Verhältnissen zu testen, die an Zellen appliziert werden können, ohne toxisch zu sein, wurden die PEI/DNA-Verhältnisse 5 und 11.7 getestet. Dies wurde an PER.C6/E2A Zellen untersucht. Die Standardkonzentration (1 X) ist die Konzentration, die in den vorangegangenen Transfektionsexperimenten beschrieben wurde (siehe Tabelle 4).
Um PEI-Lösungen mit PEI-Mengen zwischen 0.9 und 42 μl herzustellen, wurden in einem finalen Volumen von 300 μl verschiedene Mengen einer 150 mM NaCl Lösung zu einer 20 mM 25 kDa PEI-Lösung (Fluka Katalog Nr. 03880) gegeben. Von dieser Lösung wurden 150 Mikroliter zum DNA-Gemisch gegeben (siehe Tabelle 7). DNA (50% pCLIP-LacZ und 50% pWE/AflII-rITRdE2A) zu 150 Mikrolitern mit 150 mM NaCl. Die Transfektionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Lipofectamin wurde als Positivkontrolle verwendet ebenso wie DNA oder PEI oder DMEM ohne irgendwelche Zusätze. Nach drei Tagen wurde ein Plattenduplikat hinsichtlich LacZ Expression gefärbt, und die Resultate sind in Tabelle 8 dargestellt. Zunächst wurden die Zellen hinsichtlich Toxizität überprüft. Zwischen den beiden Verhältnissen konnte ein Unterschied gesehen werden.. Beim Verhältnis 11.7 ist die doppelte Konzentration (2 X) toxischer, aber die Transfektionseffizienz ist höher als bei X. Bei einer Konzentration 0.1 X waren nach Färbung für beide Verhältnisse keine blauen Quellen zu sehen, was anzeigt, dass die Zellen nicht transfiziert wurden.
Prozessierung, CPE Überwachung, A549-Transduktion und LacZ-Färbung wurden wie oben beschrieben ausgeführt.
Um die Toxizität quantitativ zu testen, wurden die letzteren Transfektionen wiederholt, und zwei Tage nach dem Mediumswechsel wurde ein Zellproliferationseffekt (Promega) durchgeführt, um die Anzahl der lebenden Zellen beziehungsweise die Toxizität der PEI/DNA-Komplexe zu bestimmen. Die Durchführung erfolgte gemäß dem Protokoll des Herstellers. Nach vier Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Platten mit Hilfe eines Mikroplatten-Managers (Bio-Rad) gelesen. Die Ergebnisse dieses Experiments mit den PEI-Verhältnissen 5 und 11.7 sind in 41 zusammengefasst. Die Toxizität ist eindeutig am niedrigsten und die Virusgenerierung optimal beim Verhältnis 5 (1.5 mal die Standardmenge des Komplexes) und beim Verhältnis 11.7 unter Standardbedingungen (zwischen 0.5 und 1.5 mal die Standardmenge).
Untersuchung von PEI als DNA-Träger mit verschiednen PEI/DNA-Verhältnissen, mit einem unterschiedlichen Gen und warmem vs. kaltem PEI
Um zu testen, ob die Temperatur von PEI die Komplexbildung beeinflusst, wurde das oben beschriebene Protokoll mit PEI bei 4°C und bei Raumtemperatur getestet. Zusätzlich wurde ein anderes Transgen-Insert, EGFP, untersucht. Weiterhin wurden in diesem Transfektionsexperiment die besten Konzentrationen der beiden Verhältnisse verwendet (450 ng DNA/Well, PEI/DNA-Verhältnis 5 und 300 ng DNR/Well, PEI/DNA-Verhältnis 11.7). Prozessierung, CPE Überwachung, A549-Transduktion und LacZ-Färbung wurden wie beschrieben durchgeführt, und wie aus 42 ersichtlich, gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen warmem und kaltem PEI. Die Virusbildung mit EGFP und PEI funktionierte sehr gut (PEI Verhältnis 5 warm und die Positivkontrolle Lipofectamin beide 100 CPE).
Untersuchung von PEI als DNA-Träger mit verschiedenen PEI/DNA-Komplexvolumina pro Well
Um zu testen, ob das Volumen des DNA/PEI-Komplexes die Effizienz der Virusgenerierung im oben beschriebenen Protokoll beeinflusst, wurden verschieden Volumina des PEI/DNA-Komplexes (Verhältnis 5, 450 ng DNA pro Well, PEI 20 mM 25 kDa Fluka) zu den Zellen hinzugefügt. In diesem Fall wurden 30, 80 und 120 Mikroliter pro Well hinzugegeben. Prozessierung, CPE Überwachung, A549-Transduktion und LacZ-Färbung wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Wie aus 43 ersichtlich, gibt es einen signifikanten Unterschied in der Transfektionseffienz zwischen der Applikation von 30 μl, 80 μl und 120 μl. Bei Verwendung von 30 μl waren nur 1% der Zellen innerhalb eines Wells blau gefärbt, während bei 80 μl 60% der Zellen blau gefärbt waren. Eine Erhöhung der Menge des Komplexes auf 120 μl hatte die gleichen Ergebnisse zur Folge wie die Applikation von 80 μl. Bezüglich der Virusbildung wurde der gleiche Trend beobachtet; kein CPE wurde bei 30 μl gefunden, während 80 μl und 120 μl ähnliche Prozentanteile ergaben (nicht gezeigt). Schlussfolgerung: PEI kann verwendet werden, um adenovirale Vektoren in einem miniaturisierten Aufbau zu produzieren.
Beispiel 26
Miniaturisierte Multiwell-Produktion rekombinanter adenoviraler Vektoren ohne einen Zell-Waschschritt vor der Transfektion
Zum Zweck der Reduktion von Schritten in der Automatisierung der miniaturisierten Multiwell-Produktion rekombinanter adenoviraler Vektoren und der Kostenreduktion wurde der Waschschritt der PER.C6 oder PER.C6/E2A Zellen oder Derivaten davon mit serum-freiem Medium (SFM) vor der Transfektion aus dem Standardprotokoll entfernt. Die Transfektionen wurden wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt. Die Transfektionen wurden mit Hilfe von humanem ceNOS als Transgen-Insert durchgeführt. Die Entfernung des Zell-Waschschritts wurde untersucht und mit der Standardprozedur einschließlich waschen verglichen. Prozessierung und CPE Überwachung wurden wie beschrieben durchgeführt, und wie aus 44 ersichtlich wurde keine signifikante Reduktion der Virusproduktion beobachtet, wenn die Zellen vor der Transfektion nicht gewaschen wurden.
Schlussfolgerung: Die Entfernung des Zell-Waschschritts zur Entfernung des Großteils der Serumproteine als Teil des Standard-Transfektionsprotokolls ist ohne Einfluss auf die CPE-Effizienz möglich. Letzteres ist sehr zweckmäßig, wenn die Komplexität des gesamten Prozesses reduziert werden soll, was zur Automatisierung der miniaturisierten Multiwell-Produktion rekombinanter adenoviraler Vektoren wünschenswert ist.
Beispiel 27
Verwendung adenoviraler Konstrukte zur Modulation der Genexpression in Zebrafisch
Die Modulation der Genexpression durch adenovirale Konstrukte in Tieren kann wichtige Informationen über die Funktion von Genen liefern. Adenovirale Konstrukte, die ein sense cDNA-Konstrukt exprimieren, welches ein vollständiges Protein kodiert, können zum Beispiel für die Überexpression dieses Proteins in Tiemodellsystemen verwendet werden, während adenovirale Konstrukte, welche die antisense cDNA exprimieren, verwendet werden können, um das Expressionsniveau des endogenen Proteins zu reduzieren. Zusätzlich kann die Überexpression eines adenoviral kodierten Proteins einen mutierten Phänotyp retten. Die adenoviral vermittelte Modulation der Genexpression in Tiermodellen kann wichtige Informationen über die Funktion eines Gens liefern.
In diesem Beispiel wird Zebrafisch, Danio rerio, als Tiermodellsystem diskutiert, um die Ausführbarkeit des Ansatzes zu zeigen. Dazu werden Zebrafisch cDNA-Bibliotheken mit cDNAs gescrennt, die mit Hilfe der in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren identifiziert und isoliert werden. Die so erhaltenen homologen Zebrafisch cDNAs, die vollständige Proteine kodieren, werden isoliert und in beiden Orientierungen, sense und antisense, in Adapterplasmide der pIPSPAdapt-Serie (siehe Beispiel 17) kloniert. Diese werden anschließend zur Generierung rekombinanter Adenoviren verwendet, welche zur Infektion von entweder Wildtyp- oder mutierter Zebrafischembryos (siehe zum Beispiel Development (1996) Band 123, Dezember) verwendet werden. Verfahren zur Züchtung von Zebrafischen sind Fachleuten gut bekannt.
Der Effekt der Modulation der Genexpression nach oben oder nach unten kann in Wildtyp- oder in mutierten Embryos oder in ausgewachsenen Fischen untersucht werden. Embryos werden wie folgt gesammelt: Zebrafische sind in ihrer Zucht photoperiodisch und produzieren Embryos jeden Morgen kurz nach Sonnenaufgang. Für die kontinuierliche Produktion einer relativ kleinen Anzahl von Embryos (30–50 pro Tank pro Tag) wird eine gleiche Anzahl von Männchen und Weibchen verwendet. Der Tag-Nacht-Zyklus wird mit Hilfe eines automatischen Timers (14 Stunden Licht/10 Stunden Dunkelheit) kontrolliert. Der Boden des Tanks ist mit einer einzelnen Schicht aus Murmeln (marbles) bedeckt, um die Fische vom Auffressen der frisch gelaichten Eier abzuhalten. Die neu erzeugten Embryos werden jeden Morgen durch Absaugen des Bodens des Tanks gesammelt und mit dem rekombinanten Adenovirus infiziert. Dies kann auf mehrere Arten erreicht werden, wie nachfolgend beschrieben. Die Methode der Wahl hängt vom Expressionsmuster des Gens ab.
Das rekombinante Adenovirus kann direkt in die Chorionflüssigkeit injiziert werden, und anschließend werden die Embryos gewaschen und weiter in einem Wassertank kultiviert.
In ähnlicher weise kann das rekombinante Adenovirus an spezifischen Stellen in Embryos und erwachsenen Fischen abgeschieden werden, zum Beispiel durch Injektion in den Blutstrom oder durch orale oder rektale Administration. Die Injektion kann durch Halten der Embryos in keilförmigen Mulden erfolgen, welche mit Kunststoff-Formen in 1.5% Agarose gemacht werden, wobei dann ihre Chorions nicht entfernt zu werden brauchen. Jede Mulde kann ungefähr 35 Embryos (mit Chorions) halten. Die Embryos können durch sanftes Nach-Unten-Klopfen mit einer Pinzette ausgerichtet werden. Die Agarose ist zweckmäßig, da Pipettenspitzen im allgemeinen nicht brechen, wenn sie unabsichtlich die Oberfläche berühren. Da die Pipette das Chorion durchdringt, wird das Embryo an die vertikale Rückwand der Mulde gedrückt. Die exakte Positionierung der Pipettenspitze innerhalb des Embryos wird durch geringfügige Bewegung der Pipette mit Hilfe eines Mikromanipulators oder durch Bewegung des Podiums erreicht. Alternativ kann das Chorion der Embryos entfernt werden (siehe untern), und die Embryos werden im Medium, welches das rekombinante Adenovirus enthält, inkubiert.
Nach der Injektion werden 25–30 Eier in 250 ml Bechern abgelagert. Nach dem Ausschlüpfen werden die Larven in einen neuen Becher transferiert und vollständig von ihren Chorions getrennt. Die Larven werden unter Standardbedingungen aufgezogen, die Fachleuten gut bekannt sind.
Die Überwachung der Veränderungen der Zebrafische nach adenoviraler Infektion kann bereits im embryonalen Stadium erfolgen. Einige Beobachtungen der Zebrafisch-Entwicklung können direkt durch das Chorion gemacht werden. Für die meisten Verfahren ist es jedoch besser, das Chorion zu entfernen. Chorions können einfach mit spitzen Pinzetten entfernt werden. Aufgezogen bei 28.5°C entwickeln sich Zebrafische außerhalb ihrer Chorions normal. Embryos, deren Chorions entfernt wurden, können durch sanftes Pipettieren mit einer abgeflammten Pasteur-Pipette oder durch sanftes Umgießen von einem Container in einen anderen überführt werden. Kleine Petri-Schalen (35 mm Durchmesser) sind geeignet, in den ersten paar Tagen der Entwicklung bis zu 25 Embryos aufzunehmen. Die Embryos können durch sanftes kreisförmiges Herumwirbeln des Mediums zur Betrachtung in die Mitte der Schale gebracht werden.
Larven und ausgewachsene Fische können ohne zusätzliche Behandlung überwacht werden.
Aufwendigere Analyseverfahren umfassen die Färbung von Sektionen mittels klassischer histologischer Verfahren oder durch die Verwendung spezifischer Methoden, wie zum Beispiel Antisense-Hybridisierung oder die Inkubation mit Antikörpern, um nach Unterschieden auf molekularer Ebene zu schauen.
Die phänotypischen Veränderungen, die nach Infektion von Zebrafisch mit einem rekombinanten Adenovirus beobachtet werden, können wichtige Informationen über die Funktion der kodierten Gene in vivo geben. Die oben beschriebenen Verfahren können auch auf andere Tiermodelle angewandt werden.
Tabelle 4
Tabelle 5 Kontrolle der Transfektionseffizienz. X-Gal Färbung
Tabelle 6
Tabelle 7
Tabelle 8
Tabelle 9 Konfluenz der für die Transfektion geernteten Zellen
Transformationseffizienzen
Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Patentschrift erwähnt sind, sind für Fachleute auf dem Gebiet diese Erfindung beispielhaft.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Bibliothek einer Vielzahl singulärer, zu exprimierender Nukleinsäuren, wobei die Bibliothek eine Vielzahl von Kompartimenten umfasst, wobei jedes Kompartiment einen oder mehr adenoviralen Vektor umfasst, der zumindest eine singuläre zu exprimierende Nukleinsäure der Bibliothek in einem wässrigem Medium umfasst, wobei der adenovirale Vektor: (i) in der Lage ist, die singuläre zu exprimierende Nukleinsäure in eine Wirtszelle einzubringen, (ii) in der Lage ist, das Produkt der singulären zu exprimierenden Nukleinsäure in der Wirtszelle zu exprimieren, und (iii) in einem Teil des adenoviralen Genoms deletiert ist, der für dessen Replikation in der Wirtszelle notwendig ist.
Bibliothek gemäß Anspruch 1, wobei die Funktion des Expressionsprodukts von allen singulären zu exprimierenden Nukleinsäuren zu der Zeit, zu der die Bibliothek erstmals hergestellt wird, unbekannt ist.
Bibliothek gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei keines der Kompartimente irgendeinen adenoviralen Vektor enthält, der ausgenommen in einer Verpackungszelle, die den deletierten Teil des adenoviralen Genoms enthält, zur Replikation in der Lage ist.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Wirtszelle eine eukaryontische Zelle ist, wie beispielsweise eine Pflanzenzelle, eine tierische Zelle, zum Beispiel eine Zebrafischzelle, oder eine humane Zelle.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Wirtszelle Teil eines Tieres ist, zum Beispiel eines Zebrafischembryos.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mindestens ein Kompartiment mindestens zwei adenovirale Vektoren umfasst.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mindestens ein Kompartiment einen der adenoviralen Vektoren umfasst.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der adenovirale Vektor in einem adenoviralen Capsid verpackt ist.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der adenovirale Vektor adenovirale Genomsequenzen umfasst, aus denen die Sequenz deletiert wurde, welche die E1-Region Proteine kodiert, und aus denen vorzugsweise ferner die Sequenzen deletiert wurden, welche die E2A-Region Proteine oder die E2B-Region Proteine, die vollständigen E2-Region Proteine und/oder die E3-region Proteine kodieren.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der adenovirale Vektor ferner adenovirale Genomsequenzen umfasst, die adenovirale Fiber-Proteine von mindestens zwei Adenovirus Serotypen kodieren.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der adenovirale Vektor ein Minimalvektor ist.
Bibliothek gemäß Anspruch 11, wobei der Minimalvektor ein Adenovirus Verpackungssignal und mindestens eine Kopie eines adenoviralen ITR umfasst.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei der Minimalvektor ferner ein Adeno-assoziiertes Virus Terminal Repeat umfasst.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der adenovirale Vektor einen induzierbaren Promotor umfasst, welcher operativ mit der singulären zu exprimierenden Nukleinsäure verknüpft ist, wobei der induzierbare Promotor vorzugsweise durch das adenovirale E1-Genprodukt reprimiert wird, und wobei der induzierbare Promotor vorzugsweise ein AP1-abhängiger Promotor ist.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Vielzahl von Kompartimenten ein Multiwell-Format mit mindestens 6 Wells, vorzugsweise mit mindestens 96 Wells umfasst.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei jede der singulären zu exprimierenden Nukleinsäuren von einem Mitglied einer Population von Nukleinsäuren abgeleitet ist, wobei die Population aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus natürlich vorkommenden Populationen von messenger-RNAs, DNAs, cDNAs, Genen, ESTs oder genetischen Suppressorelementen und synthetischen Oligonukleotiden und Antisense-Nukleinsäuren besteht.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Kompartimente das Rohlysat der Verpackungszellen umfassen.
Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek, die eine Vielzahl singulärer zu exprimierender Nukleinsäuren umfasst, welche in einer Vielzahl von Kompartimenten angeordnet sind, wobei jedes Kompartiment einen replikationsdefizienten adenoviralen Vektor umfasst, der zumindest eine der singulären zu exprimierende Nukleinsäuren umfasst, welches umfasst: (i) Transfizieren (a) einer Verpackungszelle, die einen ersten Teil des adenoviralen Genoms in ihr Genom integriert hat, mit einem Zusatz (b) eines Nukleinsäureabgabevehikels, das die singuläre zu exprimierende Nukleinsäure operativ verknüpft mit einem Promotor enthält, und das ferner einen zweiten Teil des adenoviralen Genoms enthält, wobei der zweite Teil mindestens ein adenovirales ITR umfasst, und (c) einer Helfer-Nukleinsäure, die einen dritten Teil des adenoviralen Genoms umfasst, (ii) wobei die Sequenz des ersten Teils des adenoviralen Genoms mit den Sequenzen weder des zweiten noch des dritten Teils des adenoviralen Genoms überlappt, und (iii) wobei der erste, zweite und dritte Teil des adenoviralen Genoms derart angeordnet sind, dass alle für die Replikation und Verpackung essentiellen adenoviralen Proteine zur Expression in den Verpackungszellen geeignet sind.
Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek gemäß Anspruch 18, wobei die Sequenzen des zweiten und des dritten Teils des adenoviralen Genoms zumindest teilweise zur homologen Rekombination zwischen der Abgabevehikel-Nukleinsäure und der Helfer-Nukleinsäure überlappen.
Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei die Sequenzen des adenoviralen Genoms, die in der Abgabevehikel-Nukleinsäure und der Helfer-Nukleinsäure enthalten sind, keinen Teil der E1-Region enthalten.
Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die Verpackungszelllinie eine eukaryontische Zelle umfasst, in deren Genom die E1-Region des adenoviralen Genoms integriert ist, vorzugsweise auch eine E2-Region des adenoviralen Genoms integriert ist, wobei vorzugsweise die E2-Region des adenoviralen Genoms eine E2A-Region des adenoviralen Genoms oder eine E2B-Region des adenoviralen Genoms ist, und vorzugsweise auch eine E4-Region des adenoviralen Genoms integriert ist.
Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei die Sequenzen des Abgabevehikels und der Helfer-Nukleinsäure derart ausgewählt sind, dass jede mittels Restriktionsenzymen, die mit zugesetzt werden können, bei Fehler weiterer enzymatischer Restriktion vor Transfektion in die Verpackungszellen linearisiert werden kann.
Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei das Abgabevehikel ein oder mehr Restriktionsschnittstellensequenzen umfasst, die zur Spaltung durch ein Enzym geeignet sind, das durch die singulären zu exprimierende Nukleinsäuren kodierte Sequenzen nicht verdaut, wobei die Restriktionsschnittstellensequenzen vorzugsweise eine Erkennungssequenz für eine selten schneidende Restriktionsendonuklease oder eine Intron-kodierte Endonuklease umfassen, wobei die Restriktionsschnittstellensequenz vorzugsweise aus den Restriktionsschnittstellensequenzen ausgewählt wird, die von PacI, BstBI oder PiPspI erkannt werden.
Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei die Verpackungszellen PER.C6 Zellen (ECACC Hinterlegungsnummer 96022940) sind oder von PER.C6 Zellen abstammen und vorzugsweise adenovirale Genomsequenzen der E2-Region umfassen.
Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei mindestens einer der durchgeführten Schritte automatisiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei in Schritt (i) PEI als Transfektionsagens verwendet wird.
Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 18 bis 26, wobei der adenovirale Vektor verwendet wird, um die Wirtszelle in der Gegenwart des Rohlysats der Verpackungszellen zu transfizieren.
Verfahren zur Messung der Funktion singulärer Nukleinsäure(n) unbekannter Funktion in einem Hochdurchsatzaufbau, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Bereitstellen einer Bibliothek rekombinanter adenoviraler Vektoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, (ii) Transduzieren einer Wirtszelle mit den rekombinanten adenoviralen Vektoren aus Schritt (i), (iii) Exprimieren des (der) Produkts(e) der singulären zu exprimierenden Nukleinsäure(n) in der Wirtszelle, wobei der Phänotyp des Wirts verändert wird, (iv) Identifizieren des veränderten Phänotyps, und (v) Zuordnen einer Funktion zu dem (den) Produkt(en), das (die) durch die singulären zu exprimierenden Nukleinsäure(n) kodiert ist (sind).
Verwendung einer Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Messung einer Funktion der in der Bibliothek vorhandenen singulären zu exprimierenden Nukleinsäure.