JP2010538244A - 骨及び関節の変性疾患の治療に有用な分子標的及び化合物並びにその同定方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本発明は、破骨細胞形成を調節する過程に関与するタンパク質の発現又は活性を阻害できる作用物質を同定する方法であって、該阻害が、骨及び関節の変性疾患、並びに破骨細胞の異常な活性が関与する疾患の予防及び/又は治療に有用である、前記方法に関する。特に、本発明は、関節リウマチの予防及び/又は治療に有用な作用物質を同定するための方法を提供する。
NSAIDS(非ステロイド性抗炎症剤)は、RAに伴う痛みを和らげ、患者の生活の質を改善するために使用する。しかしながら、これらの薬は、RA関連性の関節破壊を抑制しない。
本発明は、破骨細胞形成を阻害する化合物を同定する方法であって、化合物を、配列番号41〜69及び80からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(以下「TARGETS」)及びその断片と、前記ポリペプチドが前記化合物と結合し得る条件下で接触させること、並びに、破骨細胞形成に関連する化合物-ポリペプチド特性を測定することを含む、前記方法に関する。具体的実施態様において、測定された化合物-ポリペプチド特性は、OPG発現レベルである。
(1) アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む発現阻害剤であって、前記ポリヌクレオチドが、TARGETポリペプチドをコードする天然存在型ポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から人為操作された核酸配列を含み、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号1〜29及び40からなる群から選択される配列を含む、前記発現阻害剤、並びに、
(2) 関節リウマチなどの慢性的関節変性疾患の治療又は予防に有用な前記阻害剤を含む医薬組成物、
にも関する。
以下の用語は、下記においてそれとともに提示される意味を有することを意図し、かつ本発明の説明及び意図する範囲を理解することに有用である。
(a) 哺乳動物細胞の集団を、TARGETポリペプチド又はその断片に結合親和性を呈する1以上の化合物と接触させること、及び、
(b) 化合物-ポリペプチド特性を測定すること。
(a) 化合物を、配列番号41〜69及び80からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド及びその断片と接触させること;及び、
(b) 骨吸収に関連する化合物-ポリペプチド特性を測定すること;
を含む前記方法。
a) 化合物を、配列番号41〜69及び80からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること;
b) 該化合物の該ポリペプチドに対する結合親和性を測定すること;
c) 前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、少なくとも10マイクロモル濃度の結合親和性を呈する化合物と接触させること;及び、
d) 骨吸収を阻害する化合物を同定すること;
を含む、前記方法に関する。
a)化合物を、配列番号41〜69及び80からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること;
b) 該化合物の該ポリペプチドの発現又は活性を阻害する能力を測定すること;
c) 前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、該ポリペプチドの発現又は活性を著しく阻害する化合物と接触させること;及び、
d)骨吸収を阻害する化合物を同定すること;
を含む、前記方法に関する。
SilenceSelect(登録商標)コレクションのスクリーニングのために開発されたOPGアッセイは、以下の弁別的特徴を有する:
1)本アッセイは、初代ヒト滑膜線維芽細胞で実行されるが、最小限の適応化を伴って初代細胞の任意の他の供給源、又はOPG発現に感受性の細胞株にさえも使用できる。
2)本アッセイは、機能的な遺伝学的目的のために配列されたアデノウイルスコレクションを用いる利用のために最適化されている。
3)最小限の適応化を伴い、本アッセイを使用して、化合物又は合成コレクションを選別することも使用できる。
4)本アッセイは、ハイスループットモードで実行できる。
その開発が実施例1に記載されているOPGアッセイは、RA患者に由来する初代ヒト滑膜線維芽細胞(RASF)におけるshRNAの発現を媒介する11330の異なる組換えアデノウイルスのアレイコレクションに対してスクリーニングされた。これらのshRNAは、RNA干渉(RNAi)として公知の機構により、相同配列を含む遺伝子の発現レベルにおける減少を引き起こす。アレイコレクションに含まれる11330のAd-siRNAは、5046の異なる転写産物を標的とする。平均して、全ての転写産物は、2〜3の独立Ad-siRNAによって標的化される。スクリーニングの原理を図3に図示する。手短に言えば、滑膜線維芽細胞(SF)を384枚のウエルプレートにまき、まいた翌日にアレイshRNAライブラリで感染させ、これにより、各ウエルは、1つの個々のAd-siRNAに感染する。感染の5日後に、細胞上の培地を交換し、細胞をさらに2日培養に供する。2日後に、上清を回収し、OPG ELISAに供する。
OPG ELISAにおいて同定されたAd-siRNAの結果を確認するために、以下のアプローチを取り得る:Ad-siRNAヒットは96ウエルプレートレベルでPerC6細胞(Crucell, Leiden, The Netherlands)を使用して再増殖させ、その後3つのMOI(感染多重度)にてOPGアッセイにおける再試験をする。はじめに、同定されたヒットAd-siRNAサンプルの粗溶解物を含む管をSilenceSelect(登録商標)コレクションから回収し、ネガティブ/ポジティブコントロールと共に96ウエルプレートにおいて再配置する。選別A及び選別Bからの一次ヒットは、4つの96ウエルプレートに渡ってそれぞれ再配置する。管をバーコード(Screenmates(商標)、Matrix technologies)でラベルし、品質チェックを再編成されたプレートに実施する。再編成されたヒットウイルスを増殖させるために、40.000のPerC6.E2A細胞を、10%非熱不活性化FBSを含有する200μLのDMEM中96ウエルプレートの各ウエルにまき、10%CO2加湿インキュベータ中39℃で終夜インキュベートする。その後、上記のように96ウエルプレートにおいて再配置されるヒットAd-siRNAからの2μLの粗溶解物は、96ウエルディスペンサを使用してPerC6.E2A細胞に添加する。プレートはそれから、10%CO2の加湿インキュベータにおいて7〜10日間、34℃にてインキュベートできる。この期間の後、再増殖プレートを-20℃で凍らせるが、但し、完全CPEが見られ得ることを条件とする。増殖されたAd-siRNAは、3つのMOI(4μL、2μL及び1μL)でのOPGアッセイにおいて再選別する。3つのMOIでの感染は、以下の通りに実行される:96/384TeMoピペッタを使用して、1/2及び1/4希釈物は、再増殖されたヒットの粗溶解物を含む各96ウエルプレートからなる。その後、選別A又は選別Bの再増殖されたヒットの希釈していない粗溶解物を含んでいる4枚の96ウエルプレートの各々の一定分量を、1枚の384-ウエルプレートに移す。同様に、1/2又は1/4(それぞれ)希釈物の一定分量を1枚の384-ウエルプレートに混合し、選別Aの(又は選別Bの)再増殖されたヒットの非希釈、1/2又は1/4希釈した粗溶解物を含む3枚の384ウエルプレートを結果的に生じる。最後に、これらの3枚の384-ウエルプレートの各々の4μLをアッセイプレートに移し、4μL、2μL及び1μLの感染を生じる。1回の3つのMOIでの再選別内で、各MOIでの感染は反復実施し、各回数を異なるアッセイプレートで実施する。
(破骨細胞共培養アッセイの背景及び原理)
図6Aは、破骨細胞共培養アッセイの原理を表す。このアッセイにおいて、RASFは、マルチウエルプレートに播種する。これらの細胞は、負の方向(例えばOPG)又は正の方向(例えばTNF又はRANKL)のいずれかでの破骨細胞前駆細胞の分化を調節する因子を発現できる。破骨細胞前駆細胞をそれからRASFの上にまき、M-CSF並びにRANKLを共培養に添加する。この設定において、破骨細胞前駆細胞は、阻害因子が共培養されたRASFにより発現されない限り、分化する。このように、このアッセイは、RASFによる破骨細胞分化を調節している因子の発現を機能的にモニタすることを可能にする。共培養における破骨細胞の分化を定量化するために適用される読み取りは、分化した破骨細胞に特異的なマーカー(ビトロネクチン受容体、αv-β3インテグリンとも呼ばれる)の発現を測定する細胞に基づくELISAである。破骨細胞共培養アッセイにおいて配列されたアデノウイルスコレクションのスクリーニングの原理を図6Bに図示する。手短に言えば、RASFをマルチウエルプレートに播種し、1日目に配列されたフォーマットでAd-siRNAで感染させる。7日目に、破骨細胞前駆細胞及びM-CSFをRASF上に添加する。8日目にsRANKLを加え、19日目(10日の培養後)に、ビトロネクチンcELISAを実施する。
抗体に基づく検出方法は、HTS開発に従う。従って、発明者らは、αvβ3インテグリン(ビトロネクチン受容体)及びカルシトニン受容体のためのcELISA検出方法を評価することを目的とし、該2つのマーカーはOC分化をアッセイするのに多用され、そのための抗体は市販されている。
確認されたOPGヒットは、上で記載され(実施例4)、開発し、実施される破骨細胞RASF共培養アッセイで更にアッセイする。所望の効果は、以下である:RASF単層におけるAd-siRNA標的遺伝子発現のノックダウンは、RANKL及びMCSFにより駆動される破骨細胞分化を阻害すべきである。破骨細胞分化アッセイにおいて試験する確認されたOPGヒット(選別Bから生じるヒット)の大部分については、以下の通りである。Ad-siRNAは、各々が3つのMOIで実施される、2つの独立実験において試験する。Ad-siRNA及びポジティブコントロール及びネガティブコントロールのためのウイルス材料は、3つのMOI OPGにおける一次ヒットの再試験のために調製されたものと同じである。破骨細胞分化アッセイからの読み取り後に得られた結果は、3つのMOI OPG ELISAについて記載されている各プレート上のネガティブコントロールの平均及び標準偏差に基づく「カットオフ値」に変換されるが、偶数行及び奇数行についての結果は、偶数/奇数行上のコントロールのシグナル強度において観察された差を修正するために最初に分離する場合においてはこの限りではない。各MOIについて、ヒット判定するための閾値を設定する。閾値は、いずれの陰性も陽性を得点しない(すなわち、閾値より低いカットオフ値を有する)、最も低い「カットオフ」値である。2の独立した3 MOI OC試験の設定は、-1.8/-1.8/-1.8(それぞれ3 MOI 4μL/2μL/1μL)である。Ad-siRNAは、3つのMOI実験の範囲内で陽性のMOIのうちの少なくとも1つにおいて反復して得点化することを必要とする。159の確認されたOPGヒット(選別B)のうちの53は、両方の3つのMOI実験において陽性であり、この制御試験に合格する。他の33は、2つの3 MOI実験のうちの1のみにおいて陽性であった。これらの33のAd-siRNAは、コントロールと共にウイルスプレートから選別され、3つのMOIでのOCアッセイで3回試験する。33のうちの7がアッセイの後に陽性の得点を有することがわかり、OC分化制御試験に合格する。従って、選別Bから生じているヒットが確認される159のOPG中60(すなわち37.7%)は、このように、OCに共培養アッセイに合格することがわかる。
(*)=選別Aから同定されるヒットについてのOCのランBは、2つの独立実験の1つのMOIのみでなされた。このランにおいてヒットであるために、Ad-siRNAは、2つの実験のうちの1件において得点しなければならなかった。
特定の同定された標的の発現レベルは、以下の通りに初代ヒト滑膜線維芽細胞の異なる分離株において測定する。
ヒットの検証を強化するために、異なる配列を介して同じ標的遺伝子を標的としている完全に独立なsiRNAを使用してその効果を要約することは有用である。この解析は、「オンターゲット解析」とよばれる。実際には、これは、記載されている専門アルゴリズムを使用して標的に対して複数の新規なshRNAオリゴヌクレオチドを設計すること、及びこれらをWO 03/020931に従ってアデノウイルスに組み込むことによりなされる。ウイルス産生後、これらのウイルスを、ポジティブコントロールウイルス及びネガティブコントロールウイルスと共に、96ウエルプレートに配置する。平均して、6つの新規な独立Ad-siRNAが、一組の標的について産生される。これらのウイルスプレートの2つの独立した再複製物をそれから、上記の通りに3つのMOIでの再選別について実施する。これらの2つの独立する再増殖において産生されるプレートは、3つのMOIのOPGアッセイにおいて、及び3つのMOIでの再選別(実施例3)に記載されているプロトコルに従い反復で2つの独立実験において試験する。2つの独立実験のうち少なくとも1つのMOIにおいて設定カットオフ値より上のOPGレベルで増加を媒介するAd-siRNAは、「オンターゲット解析」で得点されるヒットとして推薦される。これらの実験のカットオフ値は、ネガティブコントロールを上回る平均、かつネガティブコントロールの標準偏差の2倍超として定義する。この行使を介し、以下の最も特定の標的が同定される:ENPP2、CXCR6、MAP3K3、PTK6、MRAS。「オンターゲット解析」試験の1つにおいてこれらの標的について得られるデータを図8に示す。この図において、OPGレベルの測定において得られた生データを示す。全ての標的について、同じプレートで試験されるネガティブコントロールについて得られた生のOPGデータの平均を示し、ヒットAd-siRNAについてOPG発現における増加を認めることができる。
上記の骨浸食態様に加え、関節リウマチは、TNFα遮断薬の効果により示されるような、強い炎症性の組成物要素も有する。OPGヒットの選択のプロファイルを更に強化するために、追加的な調査を実施できる。この行使の目的は、OPGを誘導すること、及びそれゆえの骨保護特性の他に、これらのOPGヒットの付加的な抗炎症性の特徴を実証することである。基本的に、実施される追加的な試験は、どのOPGヒットが、サイトカイン誘導マーカー(MMP1)の発現によりモニタされるようなRASFのサイトカイン活性化を減少させることが可能であることを実証することを目的とする。この追加的な試験は、より好適なヒットの同定を可能にする。この追加的な試験は、以下の通りに実施できる:
特定の遺伝子の発現を標的化するOPGヒットの選択のために、一組の独立KDウイルスを回収し、これは、標的mRNA上の異なる配列を介して同じ標的遺伝子の発現の減少を媒介する。これらのウイルスは、元のOPGヒットウイルスと共に、ポジティブコントロールウイルス及びネガティブコントロールウイルスと共に、96ウエルプレート(「ヒットプレート」)に配置する。プレートの一般的レイアウトを図10hに図示する。外側のウエルは周辺効果を回避するために空のままにされるので、全てのコントロールプレートは、合計60の試料(40のヒットウイルス及び20のコントロールウイルス)を収容できる。MMP 1を標的化するKDウイルスはポジティブコントロールとして選択されるが(プレートにつき4ウエル)、異なる3種類のネガティブコントロールが、ルシフェラーゼ遺伝子転写産物(プレートにつき8つのウエル)、M6PR遺伝子転写産物(プレートにつき4つのウエル)又はeGFP遺伝子転写産物(プレートにつき4つのウエル)のいずれかを標的化するのに使用された。再構成されたプレートは、試験されるウイルスの力価の均一性を保証するために再増殖される。
0日目に、RASF(継代数11未満)を、3000細胞/ウエルの密度で50μLの培地中、96ウエルプレートに播種する。翌日(1日目)、ウイルスプレートに含まれるウイルス粗溶解物のうちの8、16又は24μLを、細胞を含むプレートに移す。全てのウイルス充填物を反復して試験するにつれ、6×60のデータ点が全ての「ヒットプレート」について生じる。
細胞の形質導入の5日後に、KDウイルスにより媒介される標的遺伝子の発現の減少は、完全に効果的である。6日目に、培地を除去し、8倍の希釈の「TNFαに基づく誘発剤」を含むM 199培地+1%FBSで置き換える。この誘発剤は、以下の通りに調製する。「TNFαに基づく誘発剤」の生産は、THP-1単球細胞を、1%血清を補充したM199培地に1×10E6細胞/mLの密度で接種することにより開始する。播種の翌日、組換えヒトTNFα(Sigma)を、培養フラスコに25ng/mLの最終濃度に添加する。サイトカインの追加の48時間後に、上清を回収し、更なる使用まで一定分量で-80℃に保存する。「TNFαに基づく誘発剤」の全ての新規バッチを、RASFによるMMP1発現を誘導することにより、その有効性を特徴づける。この誘発剤は、RASFにおける多様なシグナル形質導入経路を活性化させる様々な炎症メディエータを含む。8日目に、誘発した細胞上の上清を回収し、MMP1 ELISAに供する。
MMP1 ELISAは、WO 2006/040357にて記載されるように384ウエルフォーマットで実施する。以下のプロトコルが適用される:白いLumitrac 600 384ウエルプレート(Greiner)を、2μg/mlの抗MMP1抗体MAB1346(Chemicon)で被覆する。該抗体は、緩衝液40(1.21gのトリス塩基(Sigma)、0.58gのNaCl(Calbiochem)及び5mLの10%NaN3(Sigma)の1LのmilliQ水溶液、pH 8.5に調整)で希釈する。4℃で一晩のインキュベーション後、プレートをPBS(80gのNaCl、2gのKCl(Sigma)、11.5gのNa2HPO4・7H2O及び2gのKH2PO4の10LのmilliQ溶液、pH 7.4)で洗浄し、100μL/ウエルのカゼイン緩衝液(2%カゼイン(VWR International)含有PBS)でブロッキングする。翌日、カゼイン緩衝液をELISAプレートから除去し、50μL/ウエルEC緩衝液(4gのカゼイン、2.13gのNa2HPO4(Sigma)、2gのウシアルブミン(Sigma)、0.69gのNaH2PO4・H2O(Sigma)で、0.5gのCHAPS(Roche)、23.3gのNaCl、4mlの0.5M EDTA pH 8(Invitrogen)、5mLの10%NaN3の1LのmilliQ溶液、pH 7.0に調整)で置き換える。0.25mM DTT(Sigma)を、解凍されたサンプルプレートに添加する。EC緩衝液の除去後、20μLのサンプルをELISAプレートに移す。4℃で一晩の培養後、プレートをPBSで2回、PBST(0.05% Tween-20(Sigma)含有PBS)で1回洗浄し、35μL/ウエルのビオチン化された抗MMP 1抗体溶液(R&D)をインキュベートする。この二次抗体を、5μg/mLの濃度で、緩衝液C(0.82g NaH2PO4・H2O、4.82 gのNa2HPO4、46.6gのNaCl、20gのウシアルブミン、及び4mLの0.5M EDTA pH 8の2LのmilliQ溶液、pH 7.0に調整)で希釈する。室温で2時間の培養後、プレートを先に記載したように洗浄し、50μL/ウエルのストレプトアビジン-HRP抱合体(Biosource)とインキュベートする。ストレプトアビジン-HRP抱合体は、0.25μg/mLの濃度で、緩衝液Cで希釈する。45分後に、プレートを先に記載したように洗浄し、50μL/ウエルのBM Chem ELISA基質(Roche)と5分間インキュベートする。読み取りは、200ミリ秒の集積時間を有する、又はEnvision reader(Perkin Elmer)を有するLuminoscan Ascent Luminometer(Labsystems)で実施する。
「TNFαに基づく誘発剤」により活性化するRASFによるMMP1の発現を減少させる回収されたウイルスの能力は、以下の通りに測定できる。全てのプレートについて、3つの対照ウエルを誘発しないままにしておき、MMP1発現が予想通りに誘導されるかどうかを測定することを可能にする。17の対照ウエル(13の負のネガティブコントロール及び4のポジティブコントロールを含む)を誘発する。平均及び標準偏差は、13の誘発したネガティブコントロールウエルの全体にわたり、MMP1シグナルについて算出する。全てのデータ点について、MMP1発現の標準化された減少は、以下の通りに算出される:
KDウイルスXについてのMMP1シグナルの標準化された減少=[(13のネガティブコントロールについての平均シグナル(KDウイルスXについてのシグナル))/(13のネガティブコントロールの全体にわたるMMP1シグナルの標準偏差)]。
実施例5において、Ad-siRNA OPGヒットは、形質導入されたRASFとの共培養においてRANKL誘導性破骨細胞分化を減少させるそれらの能力に基づいて選択される。この実施例に記載されるアッセイ(更に「OPG依存アッセイ」ともよばれる)の目的は、共培養アッセイにおいて観察された破骨細胞分化の阻害が、選択されたAd-siRNAで形質導入されたRASFによるOPG放出の増加に起因することを実証することである。このアッセイの原理を図6Aに図示する。手短にいうと、Ad-siRNAは、OPG生物活性を中和できる抗OPG抗体を含み又は含まずに、破骨細胞共培養アッセイで試験する。Ad-siRNAのための所望のプロファイルは、以下である:共培養アッセイが抗OPG抗体の不在下で実施される場合の阻害RANKL駆動破骨細胞分化、及びアッセイが抗OPG抗体の存在下で実施される場合の効果の欠如。実験のために選択される抗OPG抗体(カタログ番号AF805、R&D Systems)は、ヤギポリクローナルIgG抗体であって、図7Cに示してあり、これは、可溶OPGを中和でき、かつ共培養アッセイにおいてsRANKL駆動型破骨細胞形成のOPG媒介型阻害を予防できる。追加的な試験は、以下の通りに実施される:
共培養アッセイ(実施例5)においてOC分化を阻害することも見出された確認されたOPGヒットを、「OPG依存アッセイ」の試験のために選択できる。この実験のために使用されるウイルス材料は、3つのMOI OPG(実施例3)における一次ヒットの再試験のために調製したものと同じである。選択されたAd-siRNAを、これらのウイルスプレートから選別し、それぞれポジティブコントロールウイルス及びネガティブコントロールウイルス(すなわち、3つのMOIの再試験の材料を調製すると同時にAd-siRNAで再増殖させたコントロールウイルス)と共に、96ウエルプレート(「ヒットプレート」)に再配置する。プレートの一般的レイアウトを図4に図示する。全てのプレートは、3種類の異なるネガティブコントロールウイルス(N1=Ad5-eGFP_v1_KI、N2=Ad5-Luc_v13_KD)、N3=Ad5-eGFP_v5_KD)のための4つのウエル、及びポジティブコントロール(P=Ad5-OPG_v1_KI)を含む1つのウエルを含む。該アッセイにおいて、形質導入は、以下の通りに実施する:ウイルスヒットプレートからの3μLを、全ての4つの四半分(quadrant)が同じウイルスに感染しているように、4回、384-ウエルアッセイプレートに移す。
1日目に、RASF細胞(1000細胞/ウエル)を、0.1%ゼラチンで被覆した384ウエルプレート(Greiner、カタログ番号781080)上に50μLの培地中でまく。翌日(2日目)、細胞を3μLのAd-siRNA材料で感染させる。トランスフェクションは、4重に実施する(1つの96ウエルに関し、全ての4つの四半分を同じAd-siRNAで感染させる)。7日目に、培地を30μLの共培養培地で交換し、それから破骨細胞前駆体細胞(105ng/mlのrhMCSFを有する30μLの共培養培地に含まれる1600個の細胞)をRASFの上に加え、その後、24μg/mLの濃度で中和抗OPG抗体を含まない(奇数列のみ)又は含む(偶数列のみ)10μLの共培養培地の添加を行う。このようにして、4つのデータ点(抗OPG抗体の存在下で2つ及び不在下で2つ)が、全ての「ヒットプレート」について生成される。一晩のインキュベーションの後(8日目)、40ng/mLのrhMCSF及び120ng/mLのsRANKLを含む10μLの共培養培地を全てのウエルに添加し、破骨細胞分化を誘導する。この時点での試薬の最終濃度は、15ng/mLのsRANKL、40ng/mLのrhMCSF及び3μg/mLの抗OPG抗体(添加される場合)である。20日目(37℃、5%CO2でのインキュベーション11日後)に、破骨細胞分化を、cELISAによるビトロネクチン受容体発現を定量化することにより読み取る。
各ヒットウイルスについて、抗OPG抗体の存在下又は不在下における反復の値を平均し、閾値をセットした。閾値の下にある値を生じるヒットウイルスは、RANKLによる駆動される破骨細胞分化を阻害するものとみなす。ヒット判定のための閾値シグナルは、個々のネガティブコントロール(抗OPG Abの存在下又は不在下において)によって生じる値のいずれも陽性を得点しないように規定する。ヒットウイルスについての観察された破骨細胞阻害は、抗OPG Ab不在下での平均値が該閾値を下回り、かつ抗OPG Ab存在下での値が該閾値を上回る場合に、OPG依存的であるという。代表的な実験において得られたデータの例を図12に挙げる。
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Claims (37)
- 骨吸収を阻害する化合物を同定する方法であって、
(a) 化合物を、配列番号41〜69及び80からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド及びその断片と接触させること;及び、
(b) 骨吸収に関連する化合物-ポリペプチド特性を測定すること;
を含む、前記方法。 - 前記ポリペプチドが、インビトロ無細胞調製におけるものである、請求項1記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、哺乳動物細胞内に存在する、請求項1記載の方法。
- 前記特性が、前記化合物の前記ポリペプチドに対する結合親和性である、請求項2記載の方法。
- c) 前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、少なくとも10マイクロモル濃度の結合親和性を呈する化合物と接触させる工程;及び、
d) 骨吸収を阻害する化合物を同定する工程;
をさらに含む、請求項4記載の方法。 - 前記特性が、骨吸収の阻害の指標となる生化学的マーカーを産生する生物学的経路の上方制御である、請求項1又は3記載の方法。
- 前記指標がオステオプロテゲリンである、請求項6記載の方法。
- 前記特性が、前記ポリペプチドの活性である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 前記特性が、前記ポリペプチドの発現である、請求項1又は3に記載の方法。
- c) 前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、該ポリペプチドの発現又は活性を顕著に阻害する化合物と接触させる工程;及び、
d) 骨吸収を阻害する化合物を同定する工程;
をさらに含む、請求項8又は9記載の方法。 - 試験される化合物を、コントロールに対して比較する工程をさらに含む、請求項1〜10いずれか1項記載の方法。
- 前記コントロールが、前記ポリペプチドが前記化合物と接触されていない場合のものである、請求項11記載の方法。
- 前記化合物をコントロールと比較する工程をさらに含み、前記コントロールが、前記ポリペプチドを発現しない哺乳動物細胞集団である、請求項5又は10記載の方法。
- 前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリの化合物、並びに配列番号41〜69及び80からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性を有する化合物からなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
- 前記化合物が、ファージディスプレイライブラリ又は抗体断片ライブラリのペプチドである、請求項1記載の方法、
- 骨吸収を阻害することに効果のある作用物質であって、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択され、前記作用物質が、配列番号1〜29及び40からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の連続するヌクレオチドの天然存在型ポリヌクレオチド配列に相補的な核酸配列、又は該天然存在型ポリヌクレオチド配列から人為操作した核酸配列を含む、前記作用物質。
- 哺乳動物細胞内のベクターが前記作用物質を発現する、請求項16記載の作用物質。
- OPGアッセイにおいてオステオプロテゲリン(OPG)発現を誘導することに効果的である、請求項16記載の作用物質。
- 前記ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴性ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純疱疹ウイルスベクター、又はセンダイウイルスベクターである、請求項17記載の作用物質。
- 前記アンチセンスポリヌクレオチド及び前記siRNAが、センス鎖に相補的な17〜25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号1〜29及び40からなる群から選択される核酸配列の17〜25の連続ヌクレオチドから選択される、請求項16記載の作用物質。
- 前記siRNAが、前記センス鎖をさらに含む、請求項20記載の作用物質。
- 前記センス鎖が、配列番号81〜97及び107からなる群から選択される、請求項21記載の作用物質。
- 前記siRNAが、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖を連結しているループ領域を更に含む、請求項20記載の作用物質。
- 前記ループ領域が、UUGCUAUA又はGUUUGCUAUAAC(配列番号108)からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項23記載の作用物質。
- 前記作用物質が、配列番号81〜97及び107からなる群から選択される核酸配列に相補的な核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム又はsiRNAである、請求項16〜24のいずれか1項記載の作用物質。
- 治療上有効量の請求項16〜25のいずれか1項記載の作用物質を医薬として許容し得る担体との混合物において含む、骨吸収阻害医薬組成物。
- 骨代謝におけるアンバランスが関与する疾患に苦しむ対象又は該疾患に感受性である対象における該疾患の治療及び/又は予防における使用のための請求項26記載の医薬組成物。
- 前記疾患が関節変性疾患である、請求項27記載の医薬組成物。
- 前記疾患が関節リウマチである、請求項28記載の医薬組成物。
- 異常な骨吸収が関与する疾患の治療及び/又は予防における使用のための請求項16〜25のいずれか1項記載の作用物質。
- 前記疾患が、関節変性疾患及び炎症疾患からなる群から選択される、請求項30記載の作用物質。
- 前記疾患が関節リウマチである、請求項30又は31記載の作用物質。
- 異常なオステオプロテゲリン(OPG)発現及び/又は活性により特徴づけられる状態の治療又は予防における使用のための請求項16〜25のいずれか1項記載の作用物質。
- 前記治療及び/又は予防が、前記医薬組成物又は前記OPG誘導性作用物質を、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)又は抗炎症化合物と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項26〜33のいずれか1項記載の作用物質又は医薬組成物。
- 前記DMARDが、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、リツキシマブ、CTLA4-Ig メトトレキサート、レフルノミド及びスルファサラジンからなる群から選択される、請求項34記載の方法又は使用。
- 前記抗炎症剤が、副腎皮質ステロイド又は非ステロイド性抗炎症剤からなる群から選択される、請求項34記載の方法又は使用。
- 対象における異常な骨吸収が関与する病的状態又は該状態に対する感受性を診断する方法であって、前記対象から得られる生体サンプルに存在する配列番号41〜67及び80からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの第1の量を測定すること、並びに、前記第1の量を、健常対象集団で測定された該ポリペプチド量の範囲と比較することを含み、該健常対象について測定された量の範囲に対して比較される前記生体サンプル中のポリペプチド量の増加が該病的状態の存在の指標である、前記方法。
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