CN112584874A - 用于治疗莱伯氏遗传性视神经病变的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了重组核酸，其包含：线粒体靶向序列；线粒体蛋白编码序列，其中所述线粒体蛋白编码序列编码包含线粒体蛋白的多肽；和3’UTR核酸序列。还提供了包含所述重组核酸的药物组合物以及使用所述药物组合物治疗莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)的方法。

Description

用于治疗莱伯氏遗传性视神经病变的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月4日提交的PCT/CN2018/103937号PCT申请；2018年11月2日提交的PCT/CN2018/113799号PCT申请；2018年10月22日提交的CN201811230856.2号中国申请；2018年11月30日提交的PCT/CN2018/118662号PCT申请；2018年10月19日提交的CN201811221305.X号中国申请；2019年1月4日提交的PCT/CN2019/070461号PCT申请；2018年8月20日提交的CN201810948193.1号中国申请的权益；上述申请中的每一者以全文引用的方式并入本文。
序列表的引用
本申请含有已经由EFS-Web以ASCII格式提交且以引用的方式全文在此并入的序列表。创建于2019年8月16日的ASCII副本命名为WNBT-005_02WO_ST25.txt，并且大小为298kb。
背景技术
莱伯氏遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy,LHON)是一种线粒体遗传(由母亲传给后代)的视网膜神经节细胞(RGC)及其轴突变性，其导致急性或亚急性中心视力丧失；这主要影响年轻的成年男性。LHON仅通过母亲传播，因为其主要是由于线粒体(而不是细胞核)基因组中的突变所致，并且仅卵子将线粒体贡献给胚胎。LHON通常是由于三种致病性线粒体DNA(mtDNA)点突变之一所致。这些突变分别在线粒体中的氧化磷酸化链的复合体I的NADH脱氢酶亚基-4蛋白(ND4)、NADH脱氢酶亚基-1蛋白(ND1)和NADH脱氢酶亚基-6蛋白(ND6)亚基基因中的核苷酸位置11778G至A(G11778A)、3460G至A(G3460A)和14484T至C(T14484C)处。每种突变都被认为有永久性视力丧失的重大风险。其通常在数周至数月内进展而没有疼痛，直到双眼视力恶化至0.1以下，这严重影响到患者的生活质量。两种LHON突变体G3460A和T14484C导致患者血小板分离的线粒体NADH脱氢酶活性降低80％。百分之九十的中国LHON患者携带G11778A突变。G11778A突变将ND4蛋白中的精氨酸变成组氨酸，导致LHON患者的功能障碍和视神经损伤。有必要开发转染效率和治疗功效更高的治疗LHON的组合物和方法。
发明内容
本文公开了用于治疗LHON的重组核酸、药物组合物和方法。一方面，本文公开了一种重组核酸，其包含：线粒体靶向序列；线粒体蛋白编码序列，其包含与选自由SEQ ID NO:7、8、10和12组成的组的序列具有至少99％同一性的序列；和3’UTR核酸序列。
在一些情况下，所述线粒体靶向序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ IDNO:129-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的肽序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:2中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:3中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:5中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:7或8中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:10中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ IDNO:12中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:17-20、23-24、27-28、31-34、37-38、41-42、45-48、51-52、55-56、59-62、65-66、69-70、73-76、79-80和83-84组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
另一方面，本文公开了一种重组核酸，其包含：线粒体靶向序列，其包含与选自由SEQ ID NO:2、3、4和5组成的组的序列具有至少90％同一性的序列；线粒体蛋白编码序列，其中所述线粒体蛋白编码序列编码包含线粒体蛋白的多肽；和3’UTR核酸序列。
在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:2中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:3中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:5中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。在一些情况下，所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶4(ND4)或其变体。在一些情况下，所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:160中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的肽序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6、7或8中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶6(ND6)或其变体。在一些情况下，所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:161中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:9或10中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶1(ND1)或其变体。在一些情况下，所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:162中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:11或12中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。在一些情况下，所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
在一些情况下，所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:29-84组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
另一方面，本文公开了一种重组核酸，其包含：线粒体靶向序列；线粒体蛋白编码序列，其包含与选自由SEQ ID NO:7、8、10和12组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列；和3’UTR核酸序列。
在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含编码选自由以下组成的组的多肽的序列：hsCOX10、hsCOX8、scRPM2、lcSirt5、tbNDUS7、ncQCR2、hsATP5G2、hsLACTB、spilv1、gmCOX2、crATP6、hsOPA1、hsSDHD、hsADCK3、osP0644B06.24-2、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)ATP9(ncATP9)、hsGHITM、hsNDUFAB1、hsATP5G3、crATP6_hsADCK3、ncATP9_ncATP9、zmLOC100282174、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9、zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6_hsATP5G3、zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3、ncATP9_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6_hsATP5G3、crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3、hsADCK3_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9和ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9。在一些情况下，所述线粒体靶向序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:129-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的肽序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQID NO:2或3中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:5中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:7或8中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:10中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ IDNO:12中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。在一些情况下，所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
在一些情况下，所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:17-20、23-24、27-28、31-34、37-38、41-42、45-48、51-52、55-56、59-62、65-66、69-70、73-76、79-80和83-84组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
另一方面，本文公开了一种重组核酸，其包含与选自由SEQ ID NO:2、3和4组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的线粒体靶向序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:2中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:3中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述重组核酸进一步包含线粒体蛋白编码序列，其中所述线粒体蛋白编码序列编码包含线粒体蛋白的多肽。在一些情况下，所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。在一些情况下，所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶4(ND4)或其变体。在一些情况下，所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:160中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的肽序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6、7或8中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶6(ND6)或其变体。在一些情况下，所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:161中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:9或10中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白包括NADH脱氢酶1(ND1)或其变体。在一些情况下，所述线粒体蛋白包含与SEQ IDNO:162中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:11或12中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述重组核酸进一步包含3’UTR核酸序列。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。在一些情况下，所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
在一些情况下，所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:29-70组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
另一方面，本文公开了一种重组核酸，其包含线粒体蛋白编码序列，其中所述线粒体蛋白编码序列编码包含线粒体蛋白的多肽，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与选自由SEQ ID NO:7、8、10和12组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述重组核酸进一步包含线粒体靶向序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含编码选自由以下组成的组的多肽的序列：hsCOX10、hsCOX8、scRPM2、lcSirt5、tbNDUS7、ncQCR2、hsATP5G2、hsLACTB、spilv1、gmCOX2、crATP6、hsOPA1、hsSDHD、hsADCK3、osP0644B06.24-2、粗糙脉孢菌ATP9(ncATP9)、hsGHITM、hsNDUFAB1、hsATP5G3、crATP6_hsADCK3、ncATP9_ncATP9、zmLOC100282174、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9、zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6_hsATP5G3、zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3、ncATP9_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6_hsATP5G3、crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3、hsADCK3_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9和ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9。在一些情况下，所述线粒体靶向序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:129-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的肽序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:2中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:3中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列包含与SEQID NO:5中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:7或8中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:10中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ IDNO:12中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些情况下，所述重组核酸进一步包含3’UTR核酸序列。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些情况下，所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。在一些情况下，所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
在一些情况下，所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:17-20、23-24、27-28、31-34、37-38、41-42、45-48、51-52、55-56、59-62、65-66、69-70、73-76、79-80和83-84组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
另一方面，本文公开了包含本文公开的重组核酸的病毒载体。在一些情况下，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些情况下，所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV1载体、AAV2载体、AAV3载体、AAV4载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV7载体、AAV8载体、AAV9载体、AAV10载体、AAV11载体、AAV12载体、AAV13载体、AAV14载体、AAV15载体和AAV16载体。在一些情况下，所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体。在一些情况下，所述rAAV载体是rAAV2载体。
另一方面，本文公开了包含腺相关病毒(AAV)的药物组合物，所述腺相关病毒包含本文公开的任何重组核酸。在一些情况下，所述药物组合物进一步包含其药学上可接受的赋形剂。还公开了药物组合物，其包含本文公开的病毒载体及其药学上可接受的赋形剂，其中所述病毒载体包含本文公开的任何重组核酸。还公开了药物组合物，其包含：包含本文公开的任何重组核酸的腺相关病毒(AAV)，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:15中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列；和药学上可接受的赋形剂。
在一些情况下，所述药学上可接受的赋形剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-脱水海藻糖(trehalose dehydrate)、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、聚山梨醇酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188或其任意组合。在一些情况下，所述药学上可接受的赋形剂选自磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-脱水海藻糖、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、聚山梨醇酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188及其任意组合。在一些情况下，所述药学上可接受的赋形剂包括泊洛沙姆188。在一些情况下，所述药学上可接受的赋形剂包括0.0001％-0.01％泊洛沙姆188。在一些情况下，所述药学上可接受的赋形剂包括0.001％泊洛沙姆188。在一些情况下，所述药学上可接受的赋形剂进一步包括一种或多种盐。在一些情况下，所述一种或多种盐包括NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4和KH2PO4。在一些情况下，所述一种或多种盐包括80mM NaCl、5mM NaH2PO4、40mM Na2HPO4和5mM KH2PO4。在一些情况下，所述一种或多种盐包括NaCl、Na2HPO4和KH2PO4。在一些情况下，所述一种或多种盐包括154mM NaCl、5.6mM Na2HPO4和8.4mM KH2PO4。在一些情况下，所述药物组合物的pH为6-8。在一些情况下，所述药物组合物的pH为7.2-7.4。在一些情况下，所述药物组合物的pH为7.3。在一些情况下，所述药物组合物的病毒滴度为至少1.0×1010vg/mL。在一些情况下，所述药物组合物的病毒滴度为至少5.0×1010vg/mL。
在一些情况下，所述药物组合物经受五个冷冻/解冻循环，与所述五个冷冻/解冻循环之前的病毒滴度相比，所述药物组合物保持至少60％、70％、80％或90％的病毒滴度。在一些情况下，所述药物组合物在向患有莱伯氏遗传性视神经病变的患者施用时比没有所述重组核酸的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。在一些情况下，所述药物组合物在向患有莱伯氏遗传性视神经病变的患者施用时比包含SEQ ID NO:15中列出的重组核酸的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。
另一方面，本文公开了治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用本文公开的任何药物组合物。在一些情况下，所述眼部病症是莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)。在一些情况下，所述方法包括向所述患者的单眼或双眼施用所述药物组合物。在一些情况下，经由眼内注射或玻璃体内注射施用所述药物组合物。在一些情况下，经由玻璃体内注射施用所述药物组合物。在一些情况下，经由玻璃体内注射施用约0.01-0.1mL的所述药物组合物。在一些情况下，经由玻璃体内注射施用约0.05mL的所述药物组合物。
在一些情况下，所述方法进一步包括向所述患者施用甲泼尼龙。在一些情况下，在所述药物组合物的玻璃体内注射之前施用甲泼尼龙。在一些情况下，口服施用甲泼尼龙。在一些情况下，在所述药物组合物的玻璃体内注射之前每日施用甲泼尼龙持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一些情况下，每日施用甲泼尼龙。在一些情况下，施用约32mg/60kg的甲泼尼龙的日剂量。在一些情况下，在所述药物组合物的玻璃体内注射后施用甲泼尼龙。在一些情况下，所述方法进一步包括向所述患者施用磷酸肌酸钠。在一些情况下，静脉内施用磷酸肌酸钠。在一些情况下，静脉内或口服施用甲泼尼龙。在一些情况下，所述方法包括静脉内施用甲泼尼龙持续至少一天，接着口服施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些情况下，所述方法包括静脉内施用甲泼尼龙持续约3天，接着口服施用甲泼尼龙持续至少约6周。在一些情况下，以约80mg/60kg的日剂量静脉内施用甲泼尼龙。在一些情况下，施用所述药物组合物比没有所述重组核酸的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。在一些情况下，施用所述药物组合物比包含SEQ ID NO:15中列出的重组核酸的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列；(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列，所述核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列；和(iii)3’UTR核酸序列；以及(b)包含类固醇的第二药物组合物。
在一些实施方案中，编码所述线粒体蛋白的所述核酸序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:160-162组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码线粒体靶向肽的核酸序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:126-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码线粒体靶向肽的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列(nucleic sequence)。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列，所述线粒体靶向肽包含与选自由SEQ IDNO:126-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列(amino sequence)；(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列；和(iii)3’UTR核酸序列；以及(b)包含类固醇的第二药物组合物。
在一些实施方案中，所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。在一些实施方案中，编码线粒体蛋白的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码线粒体蛋白的核酸序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:160-162组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码线粒体靶向肽的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗眼部病症的方法，包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列，所述线粒体靶向肽包含与选自由SEQ ID NO:126-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列，所述核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列；和(iii)与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的3’UTR核酸序列；以及(b)包含类固醇的第二药物组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列；和(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列；以及(b)包含类固醇的第二药物组合物。在一些实施方案中，所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。在一些实施方案中，所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:15-84组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述重组核酸包含与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，经由眼内注射或玻璃体内注射施用所述第一药物组合物。在一些实施方案中，经由玻璃体内注射施用约0.01-0.1mL的所述第一药物组合物。在一些实施方案中，经由玻璃体内注射施用约0.05mL的所述第一药物组合物。在一些实施方案中，向所述患者的单眼或双眼施用所述第一药物组合物。
在一些实施方案中，所述类固醇选自由以下组成的组：二丙酸阿氯米松、安西奈德、二丙酸倍氯米松、倍他米松、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠和醋酸钠、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、新戊酸氯可托龙、皮质醇(氢化可的松)、醋酸皮质醇(氢化可的松)、丁酸皮质醇(氢化可的松)、环戊丙酸皮质醇(氢化可的松)、皮质醇(氢化可的松)磷酸钠、皮质醇(氢化可的松)琥珀酸钠、戊酸皮质醇(氢化可的松)、醋酸可的松、地奈德、去氧米松、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、二醋酸二氟拉松、醋酸氟氢可的松、氟尼缩松、醋酸肤轻松、氟轻松醋酸酯、氟米龙、氟氢缩松、哈西奈德、甲羟松、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠、糠酸莫米松、醋酸帕拉米松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、丁乙酸泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、曲安奈德、二醋酸曲安西龙和己曲安奈德或其合成类似物。
在一些实施方案中，所述类固醇是糖皮质激素。在一些实施方案中，所述糖皮质激素是甲泼尼龙或泼尼松。
在一些实施方案中，甲泼尼龙被配制为片剂或用于静脉内施用的液体。在一些实施方案中，口服或静脉内施用所述类固醇。
在一些实施方案中，在施用所述第一药物组合物之前施用所述类固醇。在一些实施方案中，在施用所述第一药物组合物之前每日施用所述类固醇持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙，并且以约30mg/60kg至约40mg/60kg或约30mg至约40mg的日剂量施用。在一些实施方案中，甲泼尼龙的日剂量为约32mg/60kg或32mg。在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松，并且以约50mg/60kg至约70mg/60kg的日剂量施用。在一些实施方案中，泼尼松的日剂量为约60mg/60kg。
在一些实施方案中，在施用所述第一药物组合物后施用所述类固醇。在一些实施方案中，在施用所述第一药物组合物后每日施用所述类固醇持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周或至少15周。
在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙，并且以介于约70mg/60kg与90mg/60kg之间或介于约70mg与90mg之间的日剂量施用。在一些实施方案中，甲泼尼龙的日剂量为约80mg/60kg或80mg。在一些实施方案中，在施用所述第一药物组合物后施用甲泼尼龙持续至少两天。在一些实施方案中，在施用所述第一药物组合物后每日施用甲泼尼龙的后续剂量持续至少7周，并且其中甲泼尼龙的剂量逐周减少。
在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松，并且以介于约50mg/60kg与70mg/60kg之间或介于约50mg与约70mg之间的日剂量施用。在一些实施方案中，泼尼松的日剂量为约60mg/60kg或约60mg。在一些实施方案中，在施用所述第一药物组合物后施用泼尼松持续至少七天。在一些实施方案中，其中七天后，以介于约30mg/60kg与约50mg/60kg之间或介于约30mg与50mg之间的日剂量施用泼尼松。在一些实施方案中，泼尼松的日剂量为约40mg/60kg或40mg。在一些实施方案中，每日施用泼尼松的后续剂量持续至少4天，并且其中泼尼松的剂量逐日减少。
在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物之前和之后施用所述类固醇。
在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙，并且在施用所述第一药物化合物之前每日施用持续至少七天，并且在施用所述第一药物化合物后每日施用持续至少7周。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物之前以约32mg/60kg或32mg的日剂量施用甲泼尼龙。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后以约80mg/60kg或80mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少2天。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后三天开始，以约40mg/60kg或40mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少4天。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后一周开始，以约32mg/60kg或32mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后两周开始，以约24mg/60kg或24mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后三周开始，以约16mg/60kg或16mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后四周开始，以约8mg/60kg或8mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后五周开始，以约6mg/60kg或6mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后六周开始，以约4mg/60kg或4mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松，并且在施用所述第一药物化合物之前每日施用持续至少两天，并且在施用所述第一药物化合物后每日施用持续至少十一天。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物之前以约60mg/60kg或60mg的日剂量施用泼尼松。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后以约60mg/60kg或60mg的日剂量施用泼尼松持续至少七天。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后八天，以约40mg/60kg或40mg的日剂量施用泼尼松持续至少一天。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后九天，以约20mg/60kg或20mg的日剂量施用泼尼松持续至少一天。在一些实施方案中，在施用所述第一药物化合物后十天，以约10mg/60kg或10mg的日剂量施用泼尼松持续至少一天。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述患者施用磷酸肌酸钠。在一些实施方案中，在施用所述第一药物组合物之前和/或之后静脉内施用磷酸肌酸钠。
在一些实施方案中，施用所述第一药物组合物和第二药物组合物比在没有所述第二药物组合物情况下施用的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。在一些实施方案中，施用所述第一药物组合物和第二药物组合物比在没有所述第二药物组合物情况下施用的相当的药物组合物产生更低的不良事件发生率。在一些实施方案中，所述不良事件选自前房炎症、玻璃体炎、高眼压、白内障摘除、角膜炎、玻璃体出血、过敏性结膜炎和眼痛。在一些实施方案中，在患有所述眼部病症的患者群体中确定所述更高的平均视力恢复和所述更低的不良事件发生率。在一些实施方案中，所述患者群体是种族匹配的。在一些实施方案中，所述患者群体是中国人或阿根廷人。
在一些实施方案中，所述眼部病症是莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)。在一些实施方案中，所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AA8、AAV9和AAV10。在一些实施方案中，所述AAV是AAV2。
在一些实施方案中，本公开提供了筛选治疗眼部病症的患者的方法，所述方法包括：(a)获得来自患者的血清样品；(b)在所述血清样品存在下将靶细胞群与包含腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养，所述腺相关病毒包含编码可检测标记的重组核酸；并且(c)在所述培养后检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平，其中如果所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值，则选择所述患者进行所述治疗。
在一些实施方案中，本公开提供了筛选治疗眼部病症的患者的方法，所述方法包括：(a)在来自患者的血清样品存在下将靶细胞群与包含腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养，所述腺相关病毒包含编码可检测标记的重组核酸；并且(b)在所述培养后检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平，其中如果所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值，则选择所述患者进行所述治疗。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗有需要的患者的眼部病症的方法，其包括：(a)获得来自患者的血清样品；(b)在所述血清样品存在下将靶细胞群与包含第一腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养，所述第一腺相关病毒包含编码可检测标记的第一重组核酸；(c)检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平；并且(d)向所述患者施用包含第二AAV的药物组合物，所述第二AAV包含第二重组核酸，其中所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗有需要的患者的眼部病症的方法，其包括：(a)在来自患者的血清样品存在下将靶细胞群与包含第一腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养，所述第一腺相关病毒包含编码可检测标记的第一重组核酸；(b)检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平；并且(c)向所述患者施用包含第二AAV的药物组合物，所述第二AAV包含第二重组核酸，其中所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值。
在一些实施方案中，所述可检测标记是荧光蛋白。在一些实施方案中，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方案中，通过流式细胞术或qPCR检测所述可检测标记。在一些实施方案中，所述培养步骤为至少12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长。
在一些实施方案中，当通过流式细胞术检测时，所述预定阈值是表达所述可检测标记的细胞的约40％。在一些实施方案中，当通过qPCR检测时，所述预定阈值是约0.6的所述可检测标记的相对表达水平。在一些实施方案中，所述靶细胞是HEK-293T细胞。
在一些实施方案中，所述治疗是包含编码线粒体蛋白的核酸序列的重组AAV。在一些实施方案中，所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。在一些实施方案中，所述患者包含选自以下的突变：ND4基因中的G11778A、ND1基因中的G3460A和ND6基因中的T14484C。
在一些实施方案中，本公开提供了一种试剂盒，其包含：包含编码可检测标记的重组核酸的腺相关病毒(AAV)、靶细胞群和一种或多种用于检测所述可检测标记的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于用所述AAV转染所述靶细胞群的转染试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含第二AAV，所述第二AAV包含编码线粒体蛋白的重组核酸。在一些实施方案中，用于检测可检测标记的一种或多种试剂选自与所述可检测标记结合的抗体和一种或多种对编码所述可检测标记的所述重组核酸具有特异性的引物寡核苷酸。
附图说明
在所附权利要求中特别列出了本发明的新颖特征。通过参考以下列举说明性实施方案(其中利用了本发明的原理)的详细描述及附图将会更好地理解本发明的特征和优点，其中：
图1显示ND4(泳道A)和优化的ND4(泳道B)基因克隆结果的PCR核酸电泳验证。
图2显示rAAV2-opt_ND4(左黑柱)与rAAV2-ND4(右黑柱)之间的使用qPCR得到的相对表达水平比较。β-肌动蛋白是内部参考基因(白柱)。
图3显示rAAV2-opt_ND4(左黑柱)与rAAV2-ND4(右黑柱)之间的使用免疫印迹得到的相对表达水平比较。β-肌动蛋白是内部参考基因(白柱)。
图4显示分别注射rAAV2-opt_ND4(右)和rAAV2-ND4(左)的兔的眼底照相结果。
图5显示患者在注射rAAV2优化的ND4之前(左)和之后(右)的眼底照相结果。
图6显示rAAV2-ND4(左)和rAAV2-opt_ND4*(右)的EGFP表达水平。
图7显示293T细胞中的ND4表达：rAAV2-ND4(左)和rAAV2-opt_ND4*(右)。
图8显示293T细胞中的相对ND4表达：rAAV2-ND4(左)和rAAV2-opt_ND4*(右)。
图9显示兔视神经细胞中的ND4表达：rAAV2-ND4(左)和rAAV2-opt_ND4*(右)。
图10显示兔视神经细胞中的相对ND4表达：rAAV2-ND4(左)和rAAV2-opt_ND4*(右)。
图11显示rAAV2-ND4(左)和rAAV2-opt_ND4*(右)的眼底照相结果。
图12显示rAAV2-ND4(左)和rAAV2-opt_ND4*(右)的显微镜检查(HE染色)结果。
图13显示分别注射rAAV2-ND6(A)、rAAV-GFP(B)和PBS的兔的眼底照相结果。
图14显示分别注射rAAV2-opt_ND6(A)、rAAV2-ND6(B)、rAAV-EGFP(C)的兔的眼底照相结果。
图15显示兔视神经细胞中的相对ND6表达：rAAV2-opt_ND6(A)、rAAV2-ND6(B)和rAAV-EGFP(C)。
图16显示通过western印迹得到的相对ND6表达：rAAV2-opt_ND6(A)、rAAV2-ND6(B)和rAAV-EGFP(C)。
图17显示兔视神经细胞中的相对ND1表达：rAAV2-opt_ND1(A)、rAAV2-ND1(B)和rAAV-EGFP(C)。
图18显示通过western印迹得到的相对ND1表达：rAAV2-opt_ND1(A)、rAAV2-ND1(B)和rAAV-EGFP(C)。
图19显示第一示例性类固醇给药方案。
图20显示第二示例性类固醇给药方案。
具体实施方式
定义
除另有定义外，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然在实施或测试本文的制剂或单位剂量时可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但现在要对一些方法和材料进行描述。除另有说明外，本文所采用或考虑的技术是标准方法。所述材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非上下文明确另有规定，否则在本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一个(种)”、“和”以及“该(所述)”包括复数个指代项。因此，例如提到“化合物”包括多种这类剂，并且提到“所述盐”包括提到一种或多种盐(或提到多种盐)及其本领域技术人员已知的等同物，等等。
如本文所用，除另指出外，术语“或”可以是连接词或反意连接词。如本文所用，除另指出外，任何实施方案可与任何其它实施方案组合。
如本文所用，除另指出外，本文的一些发明实施方案考虑了数值范围。当存在范围时，所述范围包括范围端点。另外，所述范围内的每个子范围和值如同明确写出一样存在。
术语“约”及其与参考数值相关的语法对等词以及其如本文所用的语法对等词可包括值的范围加上或减去该值的10％，如值的范围加上或减去该值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。例如，量“约10”包括9至11的量。
术语“包含”(及相关术语如“包含”或“具有”或“包括”)并不旨在排除在其它某些实施方案(例如本文所述的任何物质组成、组合物、方法或过程等的实施方案)中可“由所描述的特征组成”或“基本上由所描述的特征组成”。
术语“受试者”是指已经或将成为治疗、观察或实验的对象的哺乳动物。术语“哺乳动物”旨在具有其标准含义，并且涵盖例如人、狗、猫、绵羊和母牛。本文所述的方法可用于人的治疗和兽医应用。在一些实施方案中，受试者是人。
术语“治疗”涵盖将至少一种本文公开的化合物或其药学上可接受的盐施用给需要这种施用的哺乳动物受试者，特别是人受试者，并且包括(i)遏制疾病如癌症的临床症状的发展，(ii)使疾病如癌症的临床症状消退，和/或(iii)防止疾病如癌症发作的预防性治疗。
本文所述的化学实体的术语“治疗有效量”是指当向人或非人受试者施用时有效提供治疗益处的量，所述治疗益处如改善症状、减缓疾病进展或预防疾病。
如本文所用，除另指出外，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。
如本文所用，除另指出外，X mg/60kg的药物剂量是指每60kg患者体重使用X mg的药物。例如，100mg/60kg的药物剂量意指要求体重60kg的患者服用100mg药物，并且相应地，要求体重30kg的另一患者服用50mg药物。
核酸和多肽序列
表1公开了本文公开的所有核酸和多肽序列。第一列显示每个序列的SEQ ID NO。第二列描述核酸或多肽构建体。例如，构建体COX10-ND6-3’UTR是结合COX10(SEQ ID NO:1)、ND6(SEQ ID NO:9)和3’UTR(SEQ ID NO:13)的核酸序列的核酸(在核酸序列之间从5’至3’没有接头。
表1-核酸和多肽序列及SEQ ID NO
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腺相关病毒(AAV)
腺相关病毒(AAV)是感染人和一些其他灵长类物种的小型病毒。本文公开的组合物首先包含腺相关病毒(AAV)基因组或其衍生物。
AAV基因组是编码产生AAV病毒颗粒所需的功能的多核苷酸序列。这些功能包括AAV在宿主细胞中复制和包装循环中运行的功能，包括将AAV基因组衣壳化到AAV病毒颗粒中。天然存在的AAV病毒是复制缺陷型的，并且依靠反式提供辅助功能来完成复制和包装循环。因此，本发明的载体的AAV基因组通常是复制缺陷型的。
AAV基因组可以呈正义或负义的单链形式，或者呈双链形式。双链形式的使用允许绕过靶细胞中的DNA复制步骤，从而可加速转基因表达。
AAV基因组可来自AAV的任何天然来源的血清型或分离株或分化枝(Glade)。因此，AAV基因组可以是天然存在的AAV病毒的全基因组。如技术人员所知，自然界中存在的AAV病毒可根据各种生物学体系进行分类。
通常，提到AAV病毒是依照其血清型。血清型对应于AAV的变体亚种，这种变体亚种由于其衣壳表面抗原的表达谱原因而具有独特的反应性，这可用于将其与其它变体亚种区分开。通常，具有特定AAV血清型的病毒不与对任何其它AAV血清型具有特异性的中和抗体有效地发生交叉反应。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16，以及近来从灵长类动物脑中鉴定的重组血清型，如Rec2和Rec3。
用于本发明的优选AAV血清型是AAV2。用于本发明所特别关注的其它血清型包括AAV4、AAV5和AAV8，它们有效地转导眼睛中的组织，如视网膜色素上皮细胞。使用的AAV的血清型可以为不是AAV4的AAV血清型。关于AAV血清型的综述可见于Choi等人(Curr GeneTher.2005；5(3)；299-310)和Wu等人(Molecular Therapy.2006；14(3),316-327)。用于本发明的AAV基因组或AAV基因组的元件的序列(包括ITR序列、rep或cap基因)可来源于AAV整个基因组序列的以下登录号：腺相关病毒1NC_002077,AF063497；腺相关病毒2NC_001401；腺相关病毒3NC_001729；腺相关病毒3B NC_001863；腺相关病毒4NC_001829；腺相关病毒5Y18065、AF085716；腺相关病毒6NC_001862；鸟AAV ATCC VR-865 AY186198、AY629583、NC_004828；鸟AAV毒株DA-1 NC_006263、AY629583；牛AAV NC_005889、AY388617。
提到AAV病毒也可以是依照分化枝或克隆。这是指天然来源的AAV病毒的系统发生关系，并且通常是指AAV病毒的系统发生组，其可追溯至共同的祖先，并包括其所有的后代。另外，提到AAV病毒可以是依照特定的分离株，即自然界中所见的特定AAV病毒的遗传分离株。术语遗传分离株描述经历了与其它天然存在的AAV病毒的有限遗传混合的AAV病毒群，从而在遗传水平上定义了可识别的不同群体。
可用于本发明的AAV的分化枝和分离株的实例包括：分化枝A：AAV1 NC_002077、AF063497、AAV6 NC_001862、Hu.48AY530611、Hu 43AY530606、Hu 44AY530607、Hu46AY530609；分化枝B：Hu.19AY530584、Hu.20AY530586、Hu 23AY530589、Hu22 AY530588、Hu24 AY530590、Hu21 AY530587、Hu27 AY530592、Hu28 AY530593、Hu 29AY530594、Hu63AY530624、Hu64 AY530625、Hu13 AY530578、Hu56 AY530618、Hu57 AY530619、Hu49AY530612、Hu58 AY530620、Hu34 AY530598、Hu35 AY530599、AAV2 NC_001401、Hu45AY530608、Hu47 AY530610、Hu51 AY530613、Hu52 AY530614、Hu T41 AY695378、Hu S17AY695376、Hu T88 AY695375、Hu T71 AY695374、Hu T70 AY695373、Hu T40 AY695372、HuT32 AY695371、Hu T17 AY695370、Hu LG15 AY695377；分化枝C：Hu9 AY530629、Hu10AY530576、Hu11 AY530577、Hu53 AY530615、Hu55 AY530617、Hu54 AY530616、Hu7AY530628、Hu18 AY530583、Hu15 AY530580、Hu16 AY530581、Hu25 AY530591、Hu60AY530622、Ch5 AY243021、Hu3 AY530595、Hu1 AY530575、Hu4 AY530602Hu2、AY530585、Hu61AY530623；分化枝D：Rh62 AY530573、Rh48 AY530561、Rh54 AY530567、Rh55 AY530568、Cy2AY243020、AAV7 AF513851、Rh35 AY243000、Rh37 AY242998、Rh36 AY242999、Cy6AY243016、Cy4 AY243018、Cy3 AY243019、Cy5 AY243017、Rh13 AY243013；分化枝E：Rh38AY530558、Hu66 AY530626、Hu42 AY530605、Hu67 AY530627、Hu40 AY530603、Hu41AY530604、Hu37 AY530600、Rh40 AY530559、Rh2 AY243007、Bb1 AY243023、Bb2 AY243022、Rh10 AY243015、Hu17 AY530582、Hu6 AY530621、Rh25 AY530557、Pi2 AY530554、Pi1AY530553、Pi3 AY530555、Rh57 AY530569、Rh50 AY530563、Rh49 AY530562、Hu39AY530601、Rh58 AY530570、Rh61 AY530572、Rh52 AY530565、Rh53 AY530566、Rh51AY530564、Rh64 AY530574、Rh43 AY530560、AAV8 AF513852、Rh8 AY242997、Rh1 AY530556；分化枝F：Hu14(AAV9)AY530579、Hu31 AY530596、Hu32 AY530597、克隆分离株AAV5 Y18065、AF085716、AAV 3NC_001729、AAV 3B NC_001863、AAV4 NC_001829、Rh34 AY243001、Rh33AY243002、Rh32 AY243003。
技术人员可基于他们的公知常识选择用于本发明的AAV的适当的血清型、分化枝、克隆或分离株。例如，已显示AAV5衣壳有效地转导灵长类动物视锥光感受器，如通过成功纠正遗传的色觉缺陷所证实(Mancuso等人，Nature 2009,461:784-7)。
然而应当理解的是，本发明还涵盖使用可能尚未鉴定或表征的其它血清型的AAV基因组。AAV血清型决定AAV病毒感染的组织特异性(或向性)。因此，用于根据本发明向患者施用的AAV病毒的优选AAV血清型是在LHON中对眼睛内的靶细胞有天然向性或高感染效率的血清型。因此，用于向患者施用的AAV病毒的AAV血清型可以是感染神经感觉视网膜和视网膜色素上皮细胞的血清型。
通常，AAV的天然来源的血清型或分离株或分化枝的AAV基因组包含至少一个末端反向重复序列(ITR)。ITR序列顺式作用以提供复制的功能性起点，并允许从细胞的基因组中整合及切除载体。在优选的实施方案中，一个或多个ITR序列侧接编码ND4、ND6或ND1或其变体的多核苷酸序列。优选的ITR序列是AAV2及其变体的那些。AAV基因组通常还包含编码AAV病毒颗粒的包装功能的包装基因，如rep和/或cap基因。rep基因编码蛋白质Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其变体中的一者或多者。cap基因编码一种或多种衣壳蛋白，如VP1、VP2和VP3或其变体。这些蛋白质组成AAV病毒颗粒的衣壳。衣壳变体在下面讨论。
启动子将与包装基因中的每一者可操作地连接。这类启动子的具体实例包括p5、p19和p40启动子(Laughlin等人，1979,PNAS,76:5567-5571)。例如，p5和p19启动子通常用于表达rep基因，而p40启动子通常用于表达cap基因。
如上面所讨论，用于本发明的载体的AAV基因组因此可以是天然存在的AAV病毒的全基因组。例如，包含全AAV基因组的载体可用于在体外制备AAV病毒。然而，虽然原则上可以向患者施用这种载体，但在实践中将很少这样做。优选地，出于对患者施用的目的，AAV基因组将被衍生化。这种衍生化是本领域中的标准，并且本发明涵盖使用AAV基因组的任何已知衍生物以及可通过应用本领域中已知的技术产生的衍生物。Coura和Nardi(VirologyJournal,2007,4:99)以及Choi等人和Wu等人在上面引用的参考文献中对AAV基因组和AAV衣壳的衍生化进行了综述。
AAV基因组的衍生物包括AAV基因组的任何截短或修饰形式，其允许从本发明的载体在体内表达ND4、ND6或ND1转基因。通常，有可能将AAV基因组显著截短以使其包括最小病毒序列，但保留上述功能。出于安全原因，这是优选的，来降低载体与野生型病毒重组的风险，并且也避免由于靶细胞中存在病毒基因蛋白而引发细胞免疫反应。
通常，衍生物将包括至少一个末端反向重复序列(ITR)，优选多于一个ITR，如两个或更多个ITR。一个或多个ITR可来源于具有不同血清型的AAV基因组，或者可以是嵌合或突变ITR。优选的突变ITR是具有trs(末端解链位点(terminal resolution site))缺失的突变ITR。这种缺失允许持续复制基因组以产生含有编码序列和互补序列两者的单链基因组，即自互补AAV基因组。这允许在靶细胞中绕过DNA复制，从而能够加速转基因表达。
一个或多个ITR将优选在任一端侧接编码ND4、ND6、ND1或其变体的多核苷酸序列。优选包含一个或多个ITR以协助本发明的载体在宿主细胞的细胞核中形成多联体，例如在通过宿主细胞DNA聚合酶的作用将单链载体DNA转化成双链DNA之后。这类游离基因多联体的形成在宿主细胞的生命期间保护载体构建体，从而延长了转基因在体内的表达。
在优选的实施方案中，ITR元件将是原AAV基因组保留在衍生物中的仅有序列。因此，衍生物将优选不包括原基因组的rep和/或cap基因以及原基因组的任何其它序列。出于上述原因，也是为了降低载体整合到宿主细胞基因组中的可能性，这是优选的。另外，减小AAV基因组的大小允许增加除了转基因之外还在载体内掺入其它序列元件(如调控元件)的灵活性。
因此，关于AAV2基因组，可以在本发明的衍生物中去除以下部分：一个末端反向重复(ITR)序列、复制(rep)和衣壳(cap)基因(NB：不应将野生型AAV基因组中的rep基因与在LHON中受影响的人基因ND4、ND6或ND1相混淆)。然而，在包括体外实施方案在内的一些实施方案中，衍生物可另外包括一个或多个rep和/或cap基因或AAV基因组的其它病毒序列。天然存在的AAV病毒在人染色体19上的特异性位点以高频率整合，并显示出可忽略的随机整合频率，使得在治疗环境中可以容忍载体中的整合能力的保留。
在衍生基因组包含编码衣壳蛋白即VP1、VP2和/或VP3的基因的情况下，衍生物可以是一种或多种天然存在的AAV病毒的嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物。特别地，本发明涵盖在同一载体内提供来自AAV的不同血清型、分化枝、克隆或分离株的衣壳蛋白序列，即假型化。
通常将选择嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物，以为病毒载体提供一种或多种所需的功能。因此，与包含天然存在的AAV基因组如AAV2基因组的AAV病毒载体相比，这些衍生物可显示出基因递送效率提高、免疫原性(体液或细胞)降低、向性范围改变和/或特定细胞类型的靶向改善。基因递送效率的提高可通过以下方式来实现：改善在细胞表面的受体或共受体结合、改善内化、改善在细胞内和进入细胞核的转运、改善病毒颗粒的脱壳和提高单链基因组向双链形式的转化率。效率的提高也可能与向性范围改变或特定细胞群的靶向有关，使得载体剂量不会由施用给不需要其的组织而被稀释。
嵌合衣壳蛋白包括通过天然存在的AAV血清型的两个或更多个衣壳编码序列之间的重组产生的那些。这可例如通过标志补救方法来进行，其中一种血清型的非感染衣壳序列与不同血清型的衣壳序列共转染，并采用定向选择来选择具有所需特性的衣壳序列。可通过细胞内的同源重组来改变不同血清型的衣壳序列，以产生新型嵌合衣壳蛋白。
嵌合衣壳蛋白还包括通过对衣壳蛋白序列进行工程改造以在两种或更多种衣壳蛋白之间(例如在不同血清型的两种或更多种衣壳蛋白之间)转移特定的衣壳蛋白结构域、表面环或特定的氨基酸残基而产生的那些。
也可通过DNA改组或通过易错PCR产生改组或嵌合衣壳蛋白。可通过如下方式来产生杂合AAV衣壳基因，即随机片段化相关AAV基因的序列(例如编码多种不同血清型的衣壳蛋白的序列)，然后在自引发聚合酶反应中后续重新装配片段，这也可能在序列同源性的区域中导致交叉。可筛选以这种方式通过改组若干血清型的衣壳基因而产生的杂合AAV基因的文库，以鉴定具有所需功能的病毒克隆。类似地，易错PCR可用于使AAV衣壳基因随机突变，以产生变体的多样文库，然后可针对所需特性对其进行选择。
也可以对衣壳基因的序列进行遗传修饰，以相对于天然野生型序列引入特定的缺失、取代或插入。特别地，可通过在衣壳编码序列的开放阅读框内或者在衣壳编码序列的N和/或C末端插入无关蛋白或肽的序列来修饰衣壳基因。
无关蛋白或肽可有利地为充当特定细胞类型的配体的蛋白或肽，从而改善与靶细胞的结合，或提高载体靶向特定细胞群的特异性。一个实例可包括使用RGD肽来阻止视网膜色素上皮细胞中的摄取，从而增强周围视网膜组织的转导(Cronin等人，2008ARVO文摘：D1048)。无关蛋白也可以是有助于作为生产过程的一部分的病毒颗粒的纯化的蛋白质，即表位或亲和标签。通常选择插入的位点，以便不干扰病毒颗粒的其它功能，例如病毒颗粒的内化、转运。技术人员可基于他们的公知常识来鉴定合适的插入位点。Choi等人在上面引用的参考文献中公开了特定的位点。
本发明另外涵盖以与天然AAV基因组不同的顺序和构型提供AAV基因组的序列。本发明还涵盖用来自另一种病毒的序列或用由来自一种以上病毒的序列组成的嵌合基因来替换一个或多个AAV序列或基因。这类嵌合基因可由来自不同病毒种类的两种或更多种相关病毒蛋白的序列组成。
本发明的载体采取包含AAV基因组或其衍生物和编码ND4、ND6、ND1或其变体的序列的多核苷酸序列的形式。
为了避免疑义，本发明还提供包含本发明的载体的AAV病毒颗粒。本发明的AAV颗粒包括反式衣壳化形式，其中具有一种血清型的ITR的AAV基因组或衍生物被包装在不同血清型的衣壳中。本发明的AAV颗粒还包括镶嵌形式，其中来自两种或更多种不同血清型的未修饰衣壳蛋白的混合物构成病毒包膜。AAV颗粒还包括带有吸附至衣壳表面的配体的化学修饰形式。例如，这类配体可包括用于靶向特定细胞表面受体的抗体。
本发明另外提供包含本发明的载体或AAV病毒颗粒的宿主细胞。
重组核酸序列
本文还公开了包含编码NADH脱氢酶亚基-4(ND4)、NADH脱氢酶亚基-1(ND1)和NADH脱氢酶亚基-6(ND6)多肽或其变体的多核苷酸序列的重组核酸序列。
ND4的多核苷酸序列示于SEQ ID NO:6，并且编码SEQ ID NO:160所示的蛋白质。ND4进一步的核酸序列为SEQ ID NO:7和8。ND6的多核苷酸序列示于SEQ ID NO:9，并且编码SEQ ID NO:161所示的蛋白质。ND6进一步的核酸序列为SEQ ID NO:10。ND1的多核苷酸序列示于SEQ ID NO:11，并且编码SEQ ID NO:162所示的蛋白质。ND1进一步的核酸序列为SEQID NO:12。
SEQ ID NO:160、161或162中任一者的变体可包括其截短物、突变体或同源物及其编码功能性ND4、ND6或ND1多肽的任何转录变体。本文提到的任何同源物通常与ND4、ND6或ND1的相关区域至少70％同源，并且可以在功能上补偿多肽不足。
可采用已知的方法来测量同源性。例如UWGCG软件包提供了可用于计算同源性的BESTFIT程序(例如按其默认设置使用)(Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research12,387-395)。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或排列序列(通常按其默认设置)，例如如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S,F等人(1990)J Mol Biol215:403-10中所述。可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得用于进行BLAST分析的软件。
在优选的实施方案中，重组核酸序列可编码如下多肽，所述多肽在至少20个(优选至少30个，例如至少40个、60个、100个、200个、300个、400个或更多个连续氨基酸)上或者甚至在所述重组核酸的整个序列上与ND4、ND6或ND1的相关区域(SEQ ID NO:160、161或162)至少55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％且更优选至少95％、97％、99％、99.5％或100％同源。相关区域将是提供ND4、ND6或ND1的功能活性的区域。
或者，且优选地，重组核酸序列可编码如下多肽，所述多肽在其整个序列上与全长ND4、ND6或ND1(SEQ ID NO:160、161或162)至少70％、75％、80％、85％、90％并且更优选至少95％、97％、99％、99.5％或100％同源。通常重组核酸序列与ND4、ND6或ND1(SEQ ID NO:160、161或162)的相关区域相差至少或少于2个、5个、10个、20个、40个、50个或60个突变(其每个可以是取代、插入或缺失)。
重组核酸ND4、ND6或ND1多肽可与SEQ ID NO:160、161或162的特定区域具有一定的同一性百分比，其与跨越上述序列的任何长度的任何具体百分比同源性值相同(即其可具有至少70％、80％或90％且更优选至少95％、97％、99％同一性)。
ND4、ND6或ND1(SEQ ID NO:160、161或162)的变体还包括截短物。可以使用任何截短物，只要变体仍然是功能性的即可。通常将使截短物去除对于蛋白质活性是非必需的和/或不影响折叠蛋白质的构象(特别是活性位点的折叠)的序列。常规上可通过从N或C末端系统性截短不同长度的序列来鉴定适当的截短物。优选的截短物是N末端的，并且可去除除催化结构域以外的所有其它序列。
ND4、ND6或ND1(SEQ ID NO:160、161或162)的变体进一步包括相对于ND4、ND6或ND1(SEQ ID NO:160、161或162)的特定区域具有一个或多个(例如2个、3个、4个、5至10个、10至20个、20至40个或更多个氨基酸插入、取代或缺失)的突变体。如下所述优选在催化结构域以外进行缺失和插入。还通常在对于蛋白酶活性是非必需的和/或不影响折叠蛋白质的构象的区域中进行取代。
取代优选引入一个或多个将氨基酸用化学结构类似、化学性质类似或侧链体积类似的其它氨基酸替换的保守性改变。引入的氨基酸可具有与它们替换的氨基酸类似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。或者，保守性改变可引入另一种芳族或脂族的氨基酸代替预先存在的芳族或脂族氨基酸。保守性氨基酸改变是本领域中熟知的，并且可根据氨基酸的性质进行选择。
类似地，ND4、ND6或ND1(SEQ ID NO:6、9或11)的多核苷酸序列的优选变体包括与ND4、ND6或ND1(SEQ ID NO:6、9或11)的相关区域具有至少70％、75％、80％、85％、90％且更优选至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同源性的多核苷酸。优选该变体在其整个序列上显示出与全长ND4、ND6或ND1(SEQ ID NO:6、9或11)的这些水平的同源性。
线粒体靶向序列(MTS)和三个主要非翻译区(3'UTR)可用于将蛋白质或mRNA靶向至线粒体。MTS的电荷、长度和结构对于将蛋白质输入线粒体很重要。特定的3'UTR可能驱动mRNA定位到线粒体表面，从而促进共翻译蛋白进入线粒体。
线粒体靶向序列的多核苷酸序列可编码选自以下的多肽：hsCOX10、hsCOX8、scRPM2、lcSirt5、tbNDUS7、ncQCR2、hsATP5G2、hsLACTB、spilv1、gmCOX2、crATP6、hsOPA1、hsSDHD、hsADCK3、osP0644B06.24-2、粗糙脉孢菌ATP9(ncATP9)、hsGHITM、hsNDUFAB1、hsATP5G3、crATP6_hsADCK3、ncATP9_ncATP9、zmLOC100282174、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9、zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6_hsATP5G3、zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3、ncATP9_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6_hsATP5G3、crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3、hsADCK3_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9和ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9(关于SEQ ID NO，参见表1)。在一个实例中，多核苷酸序列COX10(SEQ ID NO:1、2或3)可编码线粒体靶向序列MTS-COX10(SEQ ID NO:126)。在另一实例中，多核苷酸序列COX8(SEQ ID NO:4)可编码线粒体靶向序列MTS-COX8(SEQ ID NO:127)。在另一实例中，多核苷酸序列OPA1(SEQ ID NO:5)可编码线粒体靶向序列MTS-OPA1(SEQ ID NO:128)。
3’UTR核酸序列可选自hsACO2(SEQ ID NO:111)、hsATP5B(SEQ ID NO:112)、hsAK2(SEQ ID NO:113)、hsALDH2(SEQ ID NO:114)、hsCOX10(SEQ ID NO:115)、hsUQCRFS1(SEQID NO:116)、hsNDUFV1(SEQ ID NO:117)、hsNDUFV2(SEQ ID NO:118)、hsSOD2(SEQ ID NO:119)、hsCOX6c(SEQ ID NO:120)、hsIRP1(SEQ ID NO:121)、hsMRPS12(SEQ ID NO:122)、hsATP5J2(SEQ ID NO:123)、rnSOD2(SEQ ID NO:124)和hsOXA1L(SEQ ID NO:125)。3’UTR核酸序列也可以是与这里列出的任何3’UTR核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％且更优选至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同源性的变体。例如，3’UTR核酸序列可以是SEQ ID NO:13或14。
本文还公开了包含线粒体靶向序列、线粒体蛋白编码序列和3’UTR核酸序列的重组核酸序列。例如，重组核酸序列可选自SEQ ID NO:15-84。重组核酸序列也可以是与这里列出的任何重组核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％且更优选至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同源性的变体。
启动子和调控序列
本发明的载体还包括允许在体外或体内表达所公开的转基因的元件。因此，载体通常包含与编码ND4、ND6或ND1转基因或其变体的多核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。
可以使用任何合适的启动子。启动子序列可以是组成型活性的，即可以在任何宿主细胞背景中操作，或者可仅在特定宿主细胞环境中具有活性，从而允许在特定细胞类型中靶向表达转基因。启动子可响应于另一种因子(例如宿主细胞中存在的因子)而显示诱导型表达。无论如何，在施用载体进行治疗的情况下，启动子必须在视网膜细胞背景中具有功能。
在一些实施方案中，为了允许转基因仅在视网膜细胞群中表达，优选启动子显示视网膜细胞特异性表达。因此，来自启动子的表达可以是视网膜细胞特异性的，例如仅局限于神经感觉视网膜和视网膜色素上皮的细胞。
ND4、ND6或ND1转基因的优选启动子包括任选与巨细胞病毒(CME)增强子元件组合的鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些情况下，ND4、ND6或ND1转基因的优选启动子包括CAG启动子。特别优选的启动子是杂合CBA/CAG启动子，例如用于rAVE表达盒的启动子。可诱导视网膜特异性基因表达的基于人序列的启动子的实例包括视杆细胞和视锥细胞的视紫红质激酶(Allocca等人，2007,J Viol 81:11372-80)、仅视锥细胞的PR2.1(Mancuso等人，2009,Nature)和/或视网膜色素上皮细胞的RPE65(Bainbridge等人，2008,N Eng J Med)。
本发明的载体还可以包含一个或多个可在转录前或转录后起作用的另外的调控序列。调控序列可以是天然ND4、ND6或ND1基因座的一部分，或者可以是异源调控序列。本发明的载体可包含来自天然ND4、ND6或ND1转录物的5′UTR或3′UTR的若干部分。
调控序列是促进转基因的表达的任何序列，即起到增加转录物的表达、改善mRNA的细胞核输出或增强其稳定性的作用。这类调控序列包括例如增强子元件、调控后元件和聚腺苷酸化位点。优选的聚腺苷酸化位点是牛生长激素poly-A信号。在本发明的载体背景下，这类调控序列将是顺式作用的。然而，本发明也涵盖使用位于另外的遗传构建体上的反式作用调控序列。
用于本发明的载体的优选调控后元件是土拨鼠肝炎调控后元件(WPRE)或其变体。可用于本发明的载体的另一调控序列是支架附着区(SAR)。本领域技术人员可以根据他们的公知常识来选择另外的调控序列。
载体的制备
可通过本领域中已知的用于提供基因治疗的载体的标准方法来制备本发明的载体。因此，成熟的公共结构域转染、包装和纯化方法可用于制备合适的载体制剂。
如上面所讨论，除了编码ND4、ND6或ND1或其变体的多核苷酸序列之外，本发明的载体还可以包含天然存在的AAV病毒的全基因组。然而，通常将使用衍生化基因组，例如具有至少一个末端反向重复序列(ITR)但可能缺少任何AAV基因如rep或cap的衍生物。
在这类实施方案中，为了将衍生化基因组装配到AAV病毒颗粒中，提供AAV和/或辅助病毒功能的另外的遗传构建体将在宿主细胞中与衍生化基因组组合来提供。这些另外的构建体通常将含有编码结构性AAV衣壳蛋白即cap、VP1、VP2、VP3的基因和编码AAV生命周期所需的其它功能如rep的基因。在另外的构建体上提供的结构性衣壳蛋白的选择将决定包装的病毒载体的血清型。
用于本发明的特别优选的包装病毒载体包含AAV2的衍生化基因组与AAV5或AAV8衣壳蛋白组合。此包装病毒载体通常包含一个或多个AAV2 ITR。
如上所述，AAV病毒不具备复制能力，因此通常也将在一个或多个另外的构建体上提供辅助病毒功能，优选腺病毒辅助功能，以允许AAV复制。
所有上述另外的构建体可作为宿主细胞中的质粒或其它游离基因元件提供，或者可将一个或多个构建体整合到宿主细胞的基因组中。
在这些方面，本发明提供了产生本发明的载体的方法。所述方法包括在宿主细胞中提供包含腺相关病毒(AAV)基因组或其衍生物和编码ND4、ND6或ND1或其变体的多核苷酸序列的载体，并提供将载体复制和装配到AAV病毒颗粒中的方式。优选地，所述方法包括提供载体，所述载体包含AAV基因组的衍生物和编码ND4、ND6或ND1或其变体的多核苷酸序列以及一种或多种编码AAV和/或辅助病毒功能的另外的遗传构建体。通常，AAV基因组的衍生物包含至少一个ITR。任选地，所述方法进一步包括纯化装配的病毒颗粒的步骤。另外，所述方法可包括配制用于治疗用途的病毒颗粒的步骤。
治疗方法和医学用途
如上面所讨论，本发明人已经意外地证明，本发明的载体可用于解决LHON潜在的细胞功能障碍问题。特别地，他们已经表明，使用所述载体可纠正与LHON相关的缺陷。这提供了可以藉以治疗、遏制、减轻或预防疾病的变性过程的方式。
因此本发明提供了治疗或预防有需要的患者的LHON的方法，其包括通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射向患者施用治疗有效量的编码本文所述的线粒体蛋白的载体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用编码线粒体蛋白的载体之前、期间和/或之后施用类固醇。因此，从而治疗或预防患者的LHON。
适用于本发明方法的载体包括本文所述的载体、编码线粒体蛋白的相当的载体及其生物类似物。适用于根据本发明方法的编码线粒体蛋白的相当的载体包括本领域中描述的那些，例如Guy等人在Ophthalmology 2017；124:1621-1634中和Vignal等人在Ophthalmology 2018；6:945-947中描述的那些，上述文献中的每一者以引用的方式全文并入。生物类似物是生物产品，其与现有的FDA批准的参考产品(“参考产品”)高度类似，并且没有临床上有意义的差别。“高度类似的”产品是具有与参考产品类似的纯度、化学特性和生物活性的产品。然而，参考产品与提出的生物类似物产品的临床非活性组分之间的微小差别是可以接受的。例如，这些可包括稳定剂或缓冲剂与参考产品中使用的稳定剂或缓冲剂相比的微小差别，并且在生产过程期间预期会略有差别(即，可接受的产品内变化)。FDA会仔细评估提出的生物类似物产品与参考产品之间的任何差别，以确保生物类似物满足FDA的高批准标准。“无临床上有意义的差别”意指生物类似物产品与参考产品在安全性、纯度和效力(安全性和有效性)方面没有临床上有意义的差别，这通常是通过人体药代动力学(暴露)和药效动力学(反应)研究、临床免疫原性评估以及必要时另外的临床研究证实的。
在一些实施方案中，需要根据本文提供的方法治疗的患者具有一种或多种线粒体DNA(mtDNA)点突变。在一些实施方案中，患者在编码线粒体的氧化磷酸化链中的复合物I的蛋白质的基因中具有点突变。例如，患者可在编码NADH脱氢酶亚基-4蛋白(ND4)的MT-ND4基因(也称为ND4，NCBI基因ID:4538)、编码NADH脱氢酶亚基-1蛋白(ND1)的MT-ND1基因(也称为ND1，NCBI基因ID:4535)或编码NADH脱氢酶亚基-6蛋白(ND6)的MT-ND6基因(也称为ND6，NCBI基因ID:4541)中有一种或多种点突变。在一些实施方案中，患者在ND4基因中的核苷酸位置11778具有点突变。在一些实施方案中，点突变是ND4基因中的G11778A。在一些实施方案中，患者在ND1基因中的核苷酸位置3460具有点突变。在一些实施方案中，点突变是ND1基因中的G3460A。在一些实施方案中，患者在ND6基因中的核苷酸位置14484具有点突变。在一些实施方案中，点突变是ND6基因中的T14484C。在一些实施方案中，需要根据本文提供的方法治疗的患者具有一种或多种选自以下的点突变：ND4基因中的G11778A、ND1基因中的G3460A和ND6基因中的T14484C，并且具有中国人和/或阿根廷人血统。
在一些实施方案中，需要根据本文提供的方法治疗的患者具有一种或多种选自以下的点突变：ND4基因中的G11778A、ND1基因中的G3460A和ND6基因中的T14484C，并且具有阿根廷人血统。在一些实施方案中，需要根据本文提供的方法治疗的患者具有一种或多种选自以下的点突变：ND4基因中的G11778A、ND1基因中的G3460A和ND6基因中的T14484C，并且具有中国人血统。在特定的实施方案中，需要根据本文提供的方法治疗的患者具有一种或多种选自ND4基因中的G11778A的点突变，并且具有中国人血统。
在相关方面，本发明提供了本发明的载体在通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射向患者施用所述载体来治疗或预防LHON的方法中的用途。另外，本发明提供了本发明的载体在制造用于通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射来治疗或预防LHON的药物中的用途。
在所有这些实施方案中，可以施用本发明的载体，以便预防LHON的一种或多种症状的发作。患者可以是无症状的。受试者可能易患所述疾病。所述方法或用途可包括鉴定受试者是否有发展LHON的风险或患有LHON的步骤。向这种受试者施用预防有效量的载体。预防有效量是防止疾病的一种或多种症状发作的量。
或者，一旦受试者已出现疾病的症状便可以施用载体，即以治愈现有的疾病症状。向这种受试者施用治疗有效量的拮抗剂。治疗有效量是有效改善疾病的一种或多种症状的量。这种量也可以遏制、减缓或逆转一些与LHON相关的周边视力丧失。这种量也可以遏制、减缓或逆转LHON的发作。
典型的单次剂量介于1010个基因组颗粒与1012个基因组颗粒之间，这取决于需要转导的剩余视网膜组织的量。基因组颗粒在本文中定义为含有可用序列特异性方法(如实时PCR)定量的单链DNA分子的AAV衣壳。该剂量可作为单次剂量提供，但对于对侧眼或者在载体由于无论何种原因(如手术并发症)而可能没有靶向正确的视网膜区域的情况下可重复。治疗优选为对每只眼睛的单次永久性治疗，但可以考虑重复注射，例如在未来的几年中和/或用不同的AAV血清型重复注射。
本发明还提供了监测患者的LHON的治疗或预防的方法，其包括在通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射施用本发明的AAV载体之后测量得自所述患者的视网膜细胞中的离体活性。这种方法可允许测定治疗的功效。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗眼部病症(例如，LHON)的方法，其包括施用治疗有效量的本文所述的载体和类固醇。示例性类固醇包括但不限于二丙酸阿氯米松、安西奈德、二丙酸倍氯米松、倍他米松、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠和醋酸钠、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、新戊酸氯可托龙、皮质醇(氢化可的松)、醋酸皮质醇(氢化可的松)、丁酸皮质醇(氢化可的松)、环戊丙酸皮质醇(氢化可的松)、皮质醇(氢化可的松)磷酸钠、皮质醇(氢化可的松)琥珀酸钠、戊酸皮质醇(氢化可的松)、醋酸可的松、地奈德、去氧米松、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、二醋酸二氟拉松、醋酸氟氢可的松、氟尼缩松、醋酸肤轻松、氟轻松醋酸酯、氟米龙、氟氢缩松、哈西奈德、甲羟松、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠、糠酸莫米松、醋酸帕拉米松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、丁乙酸泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、曲安奈德、二醋酸曲安西龙和己曲安奈德或其合成类似物或其组合。在一些实施方案中，所述类固醇是糖皮质激素。在一些实施方案中，所述类固醇选自泼尼松、甲泼尼龙和甲泼尼龙琥珀酸钠。
在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙。在一些实施方案中，甲泼尼龙被配制为用于口服施用的片剂，例如
Figure BDA0002946020820001001
片剂。例如，在一些实施方案中，甲泼尼龙与一种或多种非活性成分如硬脂酸钙、玉米淀粉、赤藓红钠、乳糖、矿物油、山梨酸、蔗糖或FD&C黄6号一起配制为片剂。在一些实施方案中，甲泼尼龙被配制为用于通过注射施用的液体，例如
Figure BDA0002946020820001002
例如，在一些实施方案中，甲泼尼龙琥珀酸钠与一种或多种非活性成分如无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠或水合乳糖一起配制为液体，任选地与防腐剂如苄醇一起配制。在一些实施方案中，所述类固醇是
Figure BDA0002946020820001003
或
Figure BDA0002946020820001004
包括其一般形式。
在一些实施方案中，患者接受约1mg/60kg至约100mg/60kg、约1mg/60kg至约80mg/60kg、约1mg/60kg至约60mg/60kg、约1mg/60kg至约40mg/60kg、约1mg/60kg至约20mg/60kg、约20mg/60kg至约100mg/60kg、约20mg/60kg至约80mg/60kg、约20mg/60kg至约60mg/60kg、约20mg/60kg至约40mg/60kg、约40mg/60kg至约100mg/60kg、约40mg/60kg至约80mg/60kg、约40mg/60kg至约60mg/60kg、约60mg/60kg至约100mg/60kg、约60mg/60kg至约80mg/60kg或约80mg/60kg至约100mg/60kg之间的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约4mg/60kg、6mg/60kg、8mg/60kg、10mg/60kg、16mg/60kg、20mg/60kg、24mg/60kg、32mg/60kg、40mg/60kg、48mg/60kg、60mg/60kg或80mg/60kg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1mg至约96mg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受至少约1mg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受至多约96mg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1mg至约2mg、约1mg至约4mg、约1mg至约8mg、约1mg至约16mg、约1mg至约32mg、约1mg至约64mg、约1mg至约96mg、约2mg至约4mg、约2mg至约8mg、约2mg至约16mg、约2mg至约32mg、约2mg至约64mg、约2mg至约96mg、约4mg至约8mg、约4mg至约16mg、约4mg至约32mg、约4mg至约64mg、约4mg至约96mg、约8mg至约16mg、约8mg至约32mg、约8mg至约64mg、约8mg至约96mg、约16mg至约32mg、约16mg至约64mg、约16mg至约96mg、约32mg至约64mg、约32mg至约96mg或约64mg至约96mg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1mg、约2mg、约4mg、约8mg、约16mg、约32mg、约64mg或约96mg的一种或多种类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001011
)。在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松。
在一些实施方案中，在施用治疗性载体之前施用一个或多个类固醇的剂量(即，一个或多个术前类固醇剂量)。在一些实施方案中，在施用治疗性载体前递送类固醇的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，患者接受约1mg/60kg至约100mg/60kg、约1mg/60kg至约80mg/60kg、约1mg/60kg至约60mg/60kg、约1mg/60kg至约40mg/60kg、约1mg/60kg至约20mg/60kg、约20mg/60kg至约100mg/60kg、约20mg/60kg至约80mg/60kg、约20mg/60kg至约60mg/60kg、约20mg/60kg至约40mg/60kg、约40mg/60kg至约100mg/60kg、约40mg/60kg至约80mg/60kg、约40mg/60kg至约60mg/60kg、约60mg/60kg至约100mg/60kg、约60mg/60kg至约80mg/60kg或约80mg/60kg至约100mg/60kg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约4mg/60kg、6mg/60kg、8mg/60kg、10mg/60kg、16mg/60kg、20mg/60kg、24mg/60kg、32mg/60kg、40mg/60kg、48mg/60kg、60mg/60kg或80mg/60kg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1mg至约96mg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受至少约1mg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受至多约96mg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1mg至约2mg、约1mg至约4mg、约1mg至约8mg、约1mg至约16mg、约1mg至约32mg、约1mg至约64mg、约1mg至约96mg、约2mg至约4mg、约2mg至约8mg、约2mg至约16mg、约2mg至约32mg、约2mg至约64mg、约2mg至约96mg、约4mg至约8mg、约4mg至约16mg、约4mg至约32mg、约4mg至约64mg、约4mg至约96mg、约8mg至约16mg、约8mg至约32mg、约8mg至约64mg、约8mg至约96mg、约16mg至约32mg、约16mg至约64mg、约16mg至约96mg、约32mg至约64mg、约32mg至约96mg或约64mg至约96mg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1mg、约2mg、约4mg、约8mg、约16mg、约32mg、约64mg或约96mg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001021
)。在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松。
在一些实施方案中，患者接受约20mg/60kg至约45mg/60kg、约25mg/60kg至约45mg/60kg、约30mg/60kg至约45mg/60kg、约35mg/60kg至约45mg/60kg、约40mg/60kg至约45mg/60kg、约20mg/60kg至约40mg/60kg、约25mg/60kg至约40mg/60kg、约30mg/60kg至约40mg/60kg、约35mg/60kg至约40mg/60kg、约20mg/60kg至约35mg/60kg、约25mg/60kg至约35mg/60kg、约30mg/60kg至约35mg/60kg、约20mg/60kg至约30mg/60kg、约25mg/60kg至约30mg/60kg或约20mg/60kg至约25mg/60kg之间的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约25mg/60kg、约26mg/60kg、约27mg/60kg、约28mg/60kg、约29mg/60kg、约30mg/60kg、约31mg/60kg、约32mg/60kg、约33mg/60kg、约34mg/60kg或约35mg/60kg的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001031
)。在一些实施方案中，在施用治疗性载体前递送约25mg/60kg与约45mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001032
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体前递送约32mg/60kg的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001033
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，患者接受约50mg/60kg至约70mg/60kg、约55mg/60kg至约70mg/60kg、约60mg/60kg至约70mg/60kg、约65mg/60kg至约70mg/60kg、约50mg/60kg至约65mg/60kg、约55mg/60kg至约65mg/60kg、约60mg/60kg至约65mg/60kg、约50mg/60kg至约60mg/60kg、约55mg/60kg至约60mg/60kg或约50mg/60kg至约55mg/60kg之间的一个或多个术前类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约55mg/60kg、约56mg/60kg、约57mg/60kg、约58mg/60kg、约59mg/60kg、约60mg/k、约61mg/60kg、约62mg/60kg、约63mg/60kg、约64mg/60kg或约65mg/60kg的一个或多个术前剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松。在一些实施方案中，在施用治疗性载体前递送约50mg/60kg与约70mg/60kg之间的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体前递送约60mg/60kg的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，在施用治疗性载体后施用一个或多个类固醇的剂量(即，一个或多个术后类固醇剂量)。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送类固醇的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送类固醇的日剂量持续至少1周、2周、3周、4周、5天、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或至少15周。在一些实施方案中，患者接受约1mg/60kg至约100mg/60kg、约1mg/60kg至约80mg/60kg、约1mg/60kg至约60mg/60kg、约1mg/60kg至约40mg/60kg、约1mg/60kg至约20mg/60kg、约20mg/60kg至约100mg/60kg、约20mg/60kg至约80mg/60kg、约20mg/60kg至约60mg/60kg、约20mg/60kg至约40mg/60kg、约40mg/60kg至约100mg/60kg、约40mg/60kg至约80mg/60kg、约40mg/60kg至约60mg/60kg、约60mg至约100mg/60kg、约60mg/60kg至约80mg/60kg and约80mg/60kg至约100mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1mg至约96mg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受至少约1mg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受至多约96mg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1mg至约2mg、约1mg至约4mg、约1mg至约8mg、约1mg至约16mg、约1mg至约32mg、约1mg至约64mg、约1mg至约96mg、约2mg至约4mg、约2mg至约8mg、约2mg至约16mg、约2mg至约32mg、约2mg至约64mg、约2mg至约96mg、约4mg至约8mg、约4mg至约16mg、约4mg至约32mg、约4mg至约64mg、约4mg至约96mg、约8mg至约16mg、约8mg至约32mg、约8mg至约64mg、约8mg至约96mg、约16mg至约32mg、约16mg至约64mg、约16mg至约96mg、约32mg至约64mg、约32mg至约96mg或约64mg至约96mg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1mg、约2mg、约4mg、约8mg、约16mg、约32mg、约64mg或约96mg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001051
)。在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松。
在一些实施方案中，患者接受约70mg/60kg至约90mg/60kg、75mg/60kg至约90mg/60kg、约80mg/60kg至约90mg/60kg、约85mg/60kg至约90mg/60kg、约70mg/60kg至约85mg/60kg、约75mg/60kg至约85mg/60kg、约80mg/60kg至约85mg/60kg、约70mg/60kg至约80mg/60kg、约75mg/60kg至约80mg/60kg或约70mg/60kg至约75mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约75mg/60kg、约76mg/60kg、约77mg/60kg、约78mg/60kg、约79mg/60kg、约80mg/60kg、约81mg/60kg、约82mg/60kg、约83mg/60kg、约84mg/60kg或约85mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙琥珀酸钠(例如，
Figure BDA0002946020820001052
)。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送介于约70mg与约90mg/60kg之间的甲泼尼龙琥珀酸钠(例如，
Figure BDA0002946020820001053
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约80mg/60kg的甲泼尼龙琥珀酸钠(例如，
Figure BDA0002946020820001061
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，患者接受约30mg/60kg至约50mg/60kg、35mg/60kg至约50mg/60kg、约40mg/60kg至约50mg/60kg、约45mg/60kg至约50mg/60kg、约30mg/60kg至约45mg/60kg、约35mg/60kg至约45mg/60kg、约40mg/60kg至约45mg/60kg、约30mg/60kg至约40mg/60kg、约35mg/60kg至约40mg/60kg或约30mg/60kg至约35mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约35mg/60kg、约36mg/60kg、约37mg/60kg、约38mg/60kg、约39mg/60kg、约40mg/60kg、约41mg/60kg、约42mg/60kg、约43mg/60kg、约44mg/60kg或约45mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001062
)。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送介于约30mg/60kg与约50mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001063
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约40mg/60kg的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001064
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，患者接受约20mg/60kg至约45mg/60kg、25mg/60kg至约45mg/60kg、约30mg/60kg至约45mg/60kg、约35mg/60kg至约45mg/60kg、约40mg/60kg至约45mg/60kg、约20mg/60kg至约40mg/60kg、约25mg/60kg至约40mg/60kg、约30mg/60kg至约40mg/60kg、约35mg/60kg至约40mg/60kg、约20mg/60kg至约35mg/60kg、约25mg/60kg至约35mg/60kg、约30mg/60kg至约35mg/60kg、约20mg/60kg至约30mg/60kg、约25mg/60kg至约30mg/60kg或约20mg/60kg至约25mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约25mg/60kg、约26mg/60kg、约27mg/60kg、约28mg/60kg、约29mg/60k、约30mg/60kg、约31mg/60kg、约32mg/60kg、约33mg/60kg、约34mg/60kg或约35mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001072
)。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送介于约20mg/60kg与约45mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001071
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约32mg/60kg的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001073
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，患者接受约15mg/60kg至约35mg/60kg、20mg/60kg至约35mg/60kg、约25mg/60kg至约35mg/60kg、约30mg/60kg至约35mg/60kg、约15mg/60kg至约30mg/60kg、约20mg/60kg至约30mg/60kg、约25mg/60kg至约30mg/60kg、约15mg/60kg至约25mg/60kg、约20mg/60kg至约25mg/60kg、约15mg/60kg至约20mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约20mg/60kg、约21mg/60kg、约22mg/60kg、约23mg/60kg、约24mg/60kg、约25mg/60kg、约26mg/60kg、约27mg/60kg、约28mg/60kg、约29mg/60kg或约30mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001074
)。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送介于约15mg/60kg与约35mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001081
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约24mg/60kg的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001082
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，患者接受约5mg/60kg至约25mg/60kg、10mg/60kg至约25mg/60kg、约15mg/60kg至约25mg/60kg、约20mg/60kg至约25mg/60kg、约5mg/60kg至约20mg/60kg、约10mg/60kg至约20mg/60kg、约15mg/60kg至约20mg/60kg、约5mg/60kg至约15mg/60kg、约10mg/60kg至约15mg/60kg或约5mg/60kg至约10mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约10mg/60kg、约11mg/60kg、约12mg/60kg、约13mg/60kg、约14mg/60kg、约15mg/60kg、约16mg/60kg、约17mg/60kg、约18mg/60kg、约19mg/60kg或约20mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001083
)。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送介于约5mg/60kg与约25mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001084
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约16mg/60kg的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001085
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，患者接受约1mg/60kg至约20mg/60kg、5mg/60kg至约20mg/60kg、约10mg/60kg至约20mg/60kg、约15mg/60kg至约20mg/60kg、约1mg/60kg至约15mg/60kg、约5mg/60kg至约15mg/60kg、约10mg/60kg至约15mg/60kg、约1mg/60kg至约10mg/60kg、约5mg/60kg至约10mg/60kg或约1mg/60kg至约5mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1mg/60kg、约2mg/60kg、约3mg/60kg、约4mg/60kg、约5mg/60kg、约6mg/60kg、约7mg/60kg、约8mg/60kg、约9mg/60kg、约10mg/60kg、约11mg/60kg、约12mg/60kg、约13mg/60kg、约14mg/60kg或约15mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001091
)。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送介于约1mg/60kg与约20mg/60kg之间的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001092
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约8mg/60kg的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001093
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约6mg/60kg的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001094
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约4mg/60kg的甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001095
)的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，患者接受约30mg/60kg至约50mg/60kg、35mg/60kg至约50mg/60kg、约40mg/60kg至约50mg/60kg、约45mg/60kg至约50mg/60kg、约30mg/60kg至约45mg/60kg、约35mg/60kg至约45mg/60kg、约40mg/60kg至约45mg/60kg、约30mg/60kg至约40mg/60kg、约35mg/60kg至约40mg/60kg或约30mg/60kg至约35mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约35mg/60kg、约36mg/60kg、约37mg/60kg、约38mg/60kg、约39mg/60kg、约40mg/60kg、约41mg/60kg、约42mg/60kg、约43mg/60kg、约44mg/60kg或约45mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送介于约30mg/60kg与约50mg/60之间的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约40mg/60kg的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，患者接受约10mg/60kg至约30mg/60kg、15mg/60kg至约30mg/60kg、约20mg/60kg至约30mg/60kg、约25mg/60kg至约30mg/60kg、约10mg/60kg至约25mg/60kg、约15mg/60kg至约25mg/60kg、约20mg/60kg至约25mg/60kg、约10mg/60kg至约20mg/60kg、约15mg/60kg至约20mg/60kg或约10mg/60kg至约15mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约15mg/60kg、约16mg/60kg、约17mg/60kg、约18mg/60kg、约19mg/60kg、约20mg/60kg、约21mg/60kg、约22mg/60kg、约23mg/60kg、约24mg/60kg或约25mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送介于约10mg/60kg与约30mg/60kg之间的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约20mg/60kg的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，患者接受约1mg/60kg至约20mg/60kg、5mg/60kg至约20mg/60kg、约10mg/60kg至约20mg/60kg、约15mg/60kg至约20mg/60kg、约1mg/60kg至约15mg/60kg、约5mg/60kg至约15mg/60kg、约10mg/60kg至约15mg/60kg、约1mg/60kg至约10mg/60kg、约5mg/60kg至约10mg/60kg或约1mg/60kg至约5mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1mg/60kg、约2mg/60kg、约3mg/60kg、约4mg/60kg、约5mg/60kg、约6mg/60kg、约7mg/60kg、约8mg/60kg、约9mg/60kg、约10mg/60kg、约11mg/60kg、约12mg/60kg、约13mg/60kg、约14mg/60kg或约15mg/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送介于约1mg/60kg与约20mg/60kg之间的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约10mg/60kg的泼尼松的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，患者接受约1g/60kg至约15g/60kg、约5g/60kg至约15g/60kg、约10g/60kg至约15g/60kg、约1g/60kg至约10g/60kg、约5g/60kg至约10g/60kg或约1g/60kg至约5g/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，患者接受约1g/60kg、约2g/60kg、约3g/60kg、约4g/60kg、约5g/60kg、约6g/60kg、约7g/60kg、约8g/60kg、约9g/60kg、约10g/60kg、约11g/60kg、约12g/60kg、约13g/60kg、约14g/60kg或约15g/60kg的一个或多个术后类固醇剂量。在一些实施方案中，所述类固醇是磷酸肌酸钠。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送介于约1g/60kg与约15g/60kg之间的磷酸肌酸钠的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。在一些实施方案中，在施用治疗性载体后递送约2g/60kg的磷酸肌酸钠的日剂量持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或至少10天。
在一些实施方案中，患者在施用治疗性AAV载体的同一天接受静脉内剂量的磷酸肌酸钠(2g/60kg)和静脉内剂量的甲泼尼龙琥珀酸钠(例如，
Figure BDA0002946020820001121
Figure BDA0002946020820001122
80mg/60kg)，并在施用治疗性AAV载体之后每日都接受上述药物持续3天。在施用治疗性AAV载体之后第3天，以40mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001123
)片剂持续4天。在施用治疗性AAV载体之后第7天，以32mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001124
)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第14天，以24mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001125
)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第21天，以16mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001126
)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第28天，以8mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001127
)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第35天，以6mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001128
)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第42天，以4mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001129
)片剂持续7天。关于LHON基因疗法的示例性治疗方案的示意图参见图19。
在一些实施方案中，患者在施用治疗性AAV载体之前7天以32mg/60kg的剂量接受甲泼尼龙(例如，
Figure BDA00029460208200011210
)片剂。在施用治疗性AAV载体当天，患者接受静脉内剂量的甲泼尼龙琥珀酸钠(例如，
Figure BDA00029460208200011211
(80mg/60kg)，其每日施用持续3天。在施用治疗性AAV载体之后第3天，以40mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001131
)片剂持续4天。在施用治疗性AAV载体之后第7天，以32mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001132
)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第14天，以24mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001133
)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第21天，以16mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001134
)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第28天，以8mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001135
)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第35天，以6mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001136
)片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第42天，以4mg/60kg的剂量向患者施用甲泼尼龙(例如，
Figure BDA0002946020820001137
)片剂持续7天。关于LHON基因疗法的治疗方案的示例性示意图参见图20。
在一些实施方案中，患者在施用治疗性AAV载体之前以60mg/60kg的剂量接受泼尼松片剂，并在施用治疗性AAV载体之后每日接受泼尼松片剂持续7天。在施用治疗性AAV载体之后第8天，以40mg/kg的剂量向患者施用泼尼松片剂持续一天。在施用治疗性AAV载体之后第9天，以20mg/kg的剂量向患者施用泼尼松片剂持续一天。在施用治疗性AAV载体之后第10天，以10mg/kg的剂量向患者施用泼尼松片剂持续一天。关于LHON基因疗法的治疗方案的示例性示意图参见图21。
剂量和间隔可单独调整成足以维持治疗效果。技术人员将能够在不进行过多实验的情况下优化有效的局部剂量。
在一些实施方案中，在例如至少10名患者的群体中，在施用本文所述的治疗性AAV载体之前、期间和/或之后施用类固醇导致比施用不含类固醇的相当的治疗性AAV载体实现更高的平均视力恢复。在一些实施方案中，在例如至少10名患者的群体中，在施用治疗性AAV载体之前、期间和/或之后施用类固醇导致比施用不含类固醇的相当的治疗性AAV载体实现更低的不良事件发生率。在一些实施方案中，所述不良事件选自前房炎症、玻璃体炎、高眼压、白内障摘除、角膜炎、玻璃体出血、过敏性结膜炎和眼痛(参见例如实施例15)。
在一些实施方案中，通过与在施用治疗性AAV载体之前、期间和/或之后不施用类固醇而用治疗性AAV载体治疗眼部病症的患者群体进行比较来确定根据本发明方法实现的更高的平均视力恢复和更低的不良事件发生率。在一些实施方案中，根据本公开的方法治疗的患者群体和用相当的治疗性AAV载体治疗的患者群体是种族匹配的。在一些实施方案中，患者群体是中国人或阿根廷人。
诊断方法和试剂盒
在一些实施方案中，本公开提供了筛选治疗眼部病症的患者的方法。在这类实施方案中，所述方法包括在得自患者的血清样品存在下将靶细胞群与包含AAV的组合物一起培养，所述AAV包含编码可检测标记的重组核酸序列；并在培养后检测靶细胞中可检测标记的表达水平，其中如果靶细胞中可检测标记的表达水平高于预定阈值，则选择所述患者进行所述治疗。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述患者施用包含AAV的药物组合物，所述AAV包含编码线粒体蛋白的重组核酸序列。
本文所述的筛选治疗眼部病症的患者的方法利用来自患者的血清样品来评估特定患者对用于递送治疗性蛋白质的重组病毒载体的免疫反应。患者血清中存在的可溶性因子(例如，抗体)可防止靶细胞的病毒感染，从而减少治疗性蛋白质的递送和/或降低药物组合物的功效。本公开的方法利用编码可检测标记的AAV，使得可通过检测标记来测量靶细胞的感染性水平。在一些实施方案中，本公开提供了用于鉴定对AAV组合物显示低免疫反应性的患者并选择这些患者用本文所述的治疗性AAV载体进行治疗的方法。在一些实施方案中，本公开提供了用于鉴定对AAV组合物显示高免疫反应性的患者并将这些患者排除在将来用本文所述的治疗性AAV载体进行治疗之外的方法。
在一些实施方案中，靶细胞中可检测标记的表达水平与患者针对AAV载体的免疫反应相关。例如，来自患者的对AAV显示高免疫反应性的血清含有可溶性因子，其防止编码可检测标记的AAV感染靶细胞，并防止可检测标记在靶细胞中表达。在这样的情况下，在患者血清存在下培养的靶细胞中可检测标记的表达水平相对于在不存在患者血清的情况下培养的靶细胞中可检测标记的表达水平降低。或者，来自患者的对AAV显示低免疫反应性的血清含有较少或不含防止编码可检测标记的AAV感染靶细胞的可溶性因子。在这样的情况下，在患者血清存在下培养的靶细胞中可检测标记的表达水平相对于在不存在患者血清的情况下培养的靶细胞中可检测标记的表达水平是相同的或没有显著降低。
可检测标记可以是不由靶细胞和/或AAV载体内源性表达的任何蛋白质或核酸分子。可检测标记的实例包括但不限于FLAG标签、多组氨酸标签(例如6xHis)、SNAP标签、Halo标签、cMyc标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、抗生物素蛋白、酶、荧光蛋白、发光蛋白、化学发光蛋白、生物发光蛋白和磷光蛋白。在一些实施方案中，荧光蛋白选自由以下组成的组：蓝色/UV蛋白(如BFP、TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire和T-Sapphire)；青色蛋白(如CFP、eCFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、单体Midoriishi-Cyan、TagCFP和mTFP1)；绿色蛋白(如：GFP、eGFP、meGFP(A208K突变)、Emerald、Superfolder GFP、单体Azami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover和mNeonGreen)；黄色蛋白(如YFP、eYFP、Citrine、Venus、SYFP2和TagYFP)；橙色蛋白(如单体Kusabira-Orange、mKOκ、mKO2、mOrange和mOrange2)；红色蛋白(如RFP、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby和mRuby2)；远红外蛋白(如mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune和NirFP)；近红外蛋白(如TagRFP657、IFP1.4和iRFP)；长斯托克斯位移蛋白(如mKeima Red、LSS-mKate1、LSS-mKate2和mBeRFP)；光激活型蛋白(如PA-GFP、PAmCherry1和PATagRFP)；光转换型蛋白(如Kaede(绿色)、Kaede(红色)、KikGR1(绿色)、KikGR1(红色)、PS-CFP2、PS-CFP2、mEos2(绿色)、mEos2(红色)、mEos3.2(绿色)、mEos3.2(红色)、PSmOrange和PSmOrange)；以及光开关型蛋白(如Dronpa)。在一些实施方案中，可检测标签可选自AmCyan、AsRed、DsRed2、DsRed Express、E2-Crimson、HcRed、ZsGreen、ZsYellow、mCherry、mStrawberry、mOrange、mBanana、mPlum、mRasberry、tdTomato、DsRed单体和/或AcGFP，所有这些均可得自Clontech。在特定的实施方案中，可检测标记是GFP。
可通过本领域中通常已知的方法检测可检测标记，包括但不限于流式细胞术、qPCR、Western印迹、ELISA和免疫组织化学法。在特定的实施方案中，检测方法是高通量检测方法，如流式细胞术或qPCR，使得可以同时分析多个患者样品。在一些实施方案中，检测方法是流式细胞术。在一些实施方案中，检测方法是qPCR。
在一些实施方案中，为筛选治疗眼部病症的患者设置预先确定的可检测标记的表达水平的阈值。在一些实施方案中，选择满足或超过此阈值的患者用本文所述的治疗性AAV载体进行治疗。在一些实施方案中，不满足此阈值的患者被排除在将来用本文所述的治疗性AAV载体进行治疗之外，或者必须在开始用本文所述的治疗性AAV载体进行治疗之前接受免疫抑制方案。
在一些实施方案中，预先确定的阈值可表示为测试样品中可检测标记的绝对表达水平，高于该水平则患者被表征为适合基因疗法，和/或低于该水平则患者被表征为不适合基因疗法。例如，在通过qPCR检测可检测标记的一些实施方案中，预先确定的阈值是大于或等于0.2的绝对表达水平。在这样的实施方案中，如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于0.2，则患者被表征为适合基因疗法，并且如果可检测标记的绝对表达水平小于0.2，则患者被表征为不适合基因疗法。在一些实施方案中，预先确定的阈值是大于或等于0.6的绝对表达水平。在这样的实施方案中，如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于0.6，则患者被表征为适合基因疗法，并且如果可检测标记的绝对表达水平小于0.6，则患者被表征为不适合基因疗法。
在通过流式细胞术检测可检测标记的一些实施方案中，预先确定的阈值是测试样品中大于或等于20％标记阳性靶细胞的绝对表达水平(例如，％GFP+细胞≥20％)。在这样的实施方案中，如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于20％标记阳性靶细胞，则患者被表征为适合基因疗法，并且如果可检测标记的绝对表达水平小于20％标记阳性靶细胞，则患者被表征为不适合基因疗法。在一些实施方案中，预先确定的阈值是测试样品中大于或等于40％标记阳性靶细胞的绝对表达水平(例如，％GFP+细胞≥40％)。在这样的实施方案中，如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于40％标记阳性靶细胞，则患者被表征为适合基因疗法，并且如果可检测标记的绝对表达水平小于40％标记阳性靶细胞，则患者被表征为不适合基因疗法。
在一些实施方案中，预先确定的阈值可表示为测试样品中可检测标记的相对表达水平(即，测试样品中可检测标记相对于对照样品的表达)，高于该水平则患者被表征为适合基因疗法，和/或低于该水平则患者被表征为不适合基因疗法。在通过流式细胞术检测可检测标记的一些实施方案中，预先确定的阈值是测试样品中大于或等于40％标记阳性靶细胞的相对表达水平(例如，％GFP+细胞≥40％)。在这样的实施方案中，如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于40％标记阳性靶细胞，则患者被表征为适合基因疗法，并且如果可检测标记的绝对表达水平小于40％标记阳性靶细胞，则患者被表征为不适合基因疗法。在通过流式细胞术检测可检测标记的一些实施方案中，预先确定的阈值是测试样品中大于或等于80％标记阳性靶细胞的相对表达水平(例如，％GFP+细胞≥80％)。在这样的实施方案中，如果可检测标记的绝对表达水平大于或等于80％标记阳性靶细胞，则患者被表征为适合基因疗法，并且如果可检测标记的绝对表达水平小于80％标记阳性靶细胞，则患者被表征为不适合基因疗法。
在一些实施方案中，根据本文所述的方法筛选和/或选择进行治疗的患者具有一种或多种mtDNA点突变。在一些实施方案中，患者在编码线粒体的氧化磷酸化链中的复合体I的蛋白质的基因中具有点突变。例如，患者可在ND4基因、ND1基因或ND6基因中具有一种或多种点突变。在一些实施方案中，患者在ND4基因中的核苷酸位置11778具有点突变。在一些实施方案中，点突变是ND4基因中的G11778A。在一些实施方案中，患者在ND1基因中的核苷酸位置3460具有点突变。在一些实施方案中，点突变是ND1基因中的G3460A。在一些实施方案中，患者在ND6基因中的核苷酸位置14484具有点突变。在一些实施方案中，点突变是ND6基因中的T14484C。在一些实施方案中，根据本文所述的方法筛选和/或选择进行治疗的患者具有一种或多种选自以下的点突变：ND4基因中的G11778A、ND1基因中的G3460A和ND6基因中的T14484C，并且具有中国人和/或阿根廷人血统。
在一些实施方案中，根据本文所述的方法筛选和/或选择进行治疗的患者具有一种或多种选自以下的点突变：ND4基因中的G11778A、ND1基因中的G3460A和ND6基因中的T14484C，并且具有阿根廷人血统。在一些实施方案中，根据本文所述的方法筛选和/或选择进行治疗的患者具有一种或多种选自以下的点突变：ND4基因中的G11778A、ND1基因中的G3460A和ND6基因中的T14484C，并且具有中国人血统。在特定的实施方案中，根据本文所述的方法筛选和/或选择进行治疗的患者具有一种或多种选自ND4基因中的G11778A的点突变，并且具有中国人血统。
在一些实施方案中，本公开提供了用于筛选治疗眼部病症的患者和/或用于选择治疗眼部病症的患者的试剂盒。在这样的实施方案中，所述试剂盒包含：包含编码可检测标记的重组核酸的AAV和一种或多种用于检测所述可检测标记的试剂。在一些实施方案中，用于检测所述可检测标记的一种或多种试剂选自与所述可检测标记结合的抗体和一种或多种对编码所述可检测标记的重组核酸具有特异性的引物寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种或多种用于复原和/或稀释AAV载体和/或检测试剂组分的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种或多种另外的试剂，如用于将AAV载体引入细胞的缓冲液、洗涤缓冲液和/或细胞培养基。试剂盒的组分可处于分开的容器中，或者可合并在单个容器中。
除了上面提到的组分之外，在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于使用试剂盒的组分来实施本公开的方法的说明书。用于实施所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可印刷在诸如纸或塑料等的基材上。如此，说明书可作为包装插页存在于试剂盒中，或者存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或子包装相关联)。在其它实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如CD-ROM、磁盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件存在。又在其它实施方案中，试剂盒中不存在实际的说明书，而是提供例如经由因特网从远程来源获得说明书的方式。此实施方案的实例为包括网址的试剂盒，可以在网址上查看说明书和/或可以从网址下载说明书。如同说明书一样，此获得说明书的方式记录在合适的基材上。
药物组合物
可将本发明的载体配制成药物组合物。除了载体之外，这些组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它物质。这类物质应该是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载剂或其他物质的确切性质可由技术人员根据施用途径(即这里为直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射)来确定。
药物组合物通常呈液体形式。液体药物组合物通常包括液体载剂，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、氯化镁、葡萄糖或其它糖溶液或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。在一些情况下，可以使用表面活性剂，如普朗尼克酸(PF68)0.001％。
对于在病痛部位注射，活性成分将呈无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性的水溶液形式。本领域相关技术人员完全能够使用例如等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来制备合适的溶液。根据需要可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。
对于延迟释放，载体可包括在配制成缓慢释放的药物组合物中，如根据本领域中已知的方法在由生物相容性聚合物形成的微胶囊中或在脂质体载剂系统中。
样品
适用于本文所述的方法的样品可以是来自受试者的核酸样品。如本文所用的“核酸样品”可包括RNA或DNA或其组合。在另一实施方案中，“多肽样品”(例如，肽或蛋白质或由其得到的片段)可用于确定由于遗传性变型，氨基酸已发生变化的信息。核酸和多肽可提取自一种或多种样品，包括但不限于血液、唾液、尿液、口腔内衬的粘膜刮屑、祛痰剂、血清、泪液、皮肤、组织或毛发。可对核酸样品进行核酸信息分析。如本文所用的“核酸信息”包括核酸序列本身、核酸序列中遗传变异的存在/不存在、根据核酸序列而变化的物理性质(例如，Tm)及核酸的量(例如，mRNA拷贝数)。“核酸”意指DNA、RNA、包括人工核苷酸的DNA或包括人工核苷酸的RNA中的任一者。如本文所用，“纯化的核酸”包括cDNA、基因组核酸的片段、采用聚合酶链式反应(PCR)产生的核酸、通过基因组核酸的限制性酶处理形成的核酸、重组核酸及化学合成的核酸分子。“重组”核酸分子包括通过两个以其它方式分开的序列片段的人工组合而成的核酸分子，例如通过化学合成或者通过遗传工程改造技术操纵分离的核酸片段。如本文所用，“多肽”包括蛋白质、蛋白质片段和肽，无论是分离自天然来源的、通过重组技术产生的还是化学合成的。多肽可具有一种或多种修饰，如翻译后修饰(例如，糖基化、磷酸化等)或任何其它修饰(例如，聚乙二醇化等)。多肽可含有一种或多种非天然存在的氨基酸(例如，如具有侧链修饰的氨基酸)。
在一些实施方案中，核酸样品可包括细胞或组织，例如细胞系。可采用本文所述的方法从其中获得核酸的示例性细胞类型包括但不限于以下：血细胞，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、白细胞、红细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞；肌肉细胞，如骨骼细胞、平滑肌细胞或心肌细胞；生殖细胞，如精子或卵子；上皮细胞；结缔组织细胞，如脂肪细胞、软骨细胞；成纤维细胞或成骨细胞；神经元；星形细胞；基质细胞；器官特异性细胞，如肾细胞、胰腺细胞、肝细胞或角质细胞；干细胞；或由其发育而来的任何细胞。可从其中获得核酸的细胞可以是血细胞或特定类型的血细胞，包括例如造血干细胞或由造血干细胞产生的细胞，如红细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或血小板。一般地，可以使用任何类型的干细胞，包括但不限于胚胎干细胞、成体干细胞或多能干细胞。
在一些实施方案中，可处理核酸样品以进行RNA或DNA分离，例如可以使细胞或组织样品中的RNA或DNA与核酸样品的其它组分分离。可以采用标准技术，例如通过离心细胞样品，并将沉淀的细胞重新悬浮在例如缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))中，由此从核酸样品中收获细胞。在一些实施方案中，在离心细胞悬浮液以获得细胞沉淀后，可将细胞裂解以提取DNA。在一些实施方案中，可将核酸样品浓缩和/或纯化以分离DNA。得自受试者的所有核酸样品，包括经受任何种类的进一步处理的核酸样品，都被认为是得自受试者。在一些实施方案中，本领域中已知的标准技术和试剂盒可用于从核酸样品中提取RNA或DNA，包括例如苯酚提取、
Figure BDA0002946020820001221
组织试剂盒(Qiagen,Chatsworth,Calif.)、
Figure BDA0002946020820001222
基因组DNA纯化试剂盒(Promega)或采用Puregene化学的Qiagen Autopure方法，它们能够纯化非常适于归档的高度稳定的DNA。
在一些实施方案中，确定等位基因的特性(identity)或确定拷贝数可以但不必包括自受试者获得包含RNA和/或DNA的核酸样品，和/或评估来源于核酸样品的基因组DNA(即受试者的基因组)内的一种或多种遗传变异的特性、拷贝数、存在与否及其染色体位置。
进行测定的个体或组织不需要实际上对来自受试者的核酸样品进行物理分析。在一些实施方案中，所述方法可以包括使用通过第三方分析核酸样品获得的信息。在一些实施方案中，所述方法可以包括在多于一个地点进行的步骤。例如，核酸样品可在第一地点得自受试者，如在医疗服务机构或者在自我检测试剂盒的情况下在受试者的家中。可以在同一地点或者在第二地点例如在实验室或其它测试场所分析核酸样品。
核酸
本文所述的核酸和多肽可用于本公开的方法和试剂盒。在一些实施方案中，特异性结合本文所述的核酸和多肽的适体可用于本公开的方法和试剂盒。如本文所用，核酸可包含脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)，无论是单一的还是在聚合物中、天然存在的还是非天然存在的、双链的还是单链的、编码的(例如翻译的基因)还是非编码的(例如调控区)或其任何片段、衍生物、模拟物或互补物。在一些实施方案中，核酸可包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸、核酸序列、基因组序列、互补DNA(cDNA)、反义核酸、DNA区域、探针、引物、基因、调控区域、内含子、外显子、开放阅读框、结合位点、靶核酸和等位基因特异性核酸。
如本文所用的“探针”包括用于采用基于核酸的互补性的杂交反应来检查样本中的核酸的核酸片段。
如本文所用的“杂交体”包括在上面提到的核酸的同一类型内或跨越不同类型的任一者之间形成的双链，包括DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等。
如本文所用的“分离的”核酸是与通常侧接基因或核苷酸序列(如在基因组序列中)和/或已从其它转录序列中(例如，如在RNA文库中)完全或部分纯化的核酸分离的。例如，本公开的分离的核酸相对于其天然存在的复杂细胞环境或当通过重组技术产生时的培养基或当化学合成时的化学前体或其它化学物质而言可以是基本上分离的。在一些情况下，分离的物质可形成组合物的一部分，例如含有其它物质的粗提取物、缓冲系统或试剂混合物。在一些实施方案中，可采用本领域中已知的方法将物质纯化至基本上均匀，例如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或柱色谱法(例如，HPLC)。关于基因组DNA(gDNA)，术语“分离的”也可指同与基因组DNA天然关联的染色体分离的核酸。例如，分离的核酸分子可含有小于约250kb、200kb、150kb、100kb、75kb、50kb、25kb、10kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸，所述核苷酸侧接核酸分子所来源的细胞的gDNA中的核酸分子。
核酸可与其它编码或调控序列融合，可以被认为是分离的。例如，载体中含有的重组DNA包括在如本文所用的“分离”的定义中。在一些实施方案中，分离的核酸可包括异源宿主细胞或异源生物体中的重组DNA分子以及溶液中部分或基本上纯化的DNA分子。分离的核酸还涵盖本公开的DNA分子的体内和体外RNA转录物。可以化学合成或通过重组方式合成分离的核酸分子或核苷酸序列。这类分离的核苷酸序列可用于例如制造编码的多肽，作为用于分离同源序列(例如，来自其它哺乳动物物种)、用于基因作图(例如，通过与染色体原位杂交)或用于如通过Northern印迹分析或本文公开的其它杂交技术检测组织(例如，人体组织)中的基因表达的探针。本公开还涉及在诸如用于选择性杂交的高度严格杂交条件下与本文所述的核苷酸序列杂交的核酸序列。可通过等位基因特异性或序列特异性杂交(例如，在高度严格条件下)检测和/或分离这类核酸序列。核酸杂交的严格条件和方法是技术人员熟知的(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel,F.等人，JohnWiley&Sons,(1998)以及Kraus,M.和Aaronson,S.，Methods Enzymol.,200:546-556(1991)，其全部教导内容以引用的方式并入本文。
可通过为了最佳比较的目的而比对序列来确定两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的“同一性”或“同一性百分比”计算(例如，可在第一序列的序列中引入缺口)。然后比较相应位置上的核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即％同一性＝相同位置的数目/位置的总数目×100)。例如，第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的位置的核苷酸占据，则在该位置上分子是相同的。考虑到为了两个序列的最佳比对而需要引入的缺口的数目和每个缺口的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数。
在一些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度为参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。可通过熟知的方法来完成两个序列的实际比较，例如采用数学算法。Karlin,S.和Altschul,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90-5873-5877(1993)中描述了这种数学算法的非限制性实例。如Altschul,S.等人，Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997)中所述，这种算法被结合到NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。当利用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，NBLAST)的任何相关参数。例如，用于序列比较的参数可以被设置为评分＝100，字长＝12，或者可以变化(例如，W＝5或W＝20)。其它实例包括Myers和Miller的算法、CABIOS(1989)、ADVANCE、ADAM、BLAT和FASTA。在一些实施方案中，可使用例如GCG软件包(Accelrys,Cambridge,UK)中的GAP程序来完成两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
“探针”或“引物”可以是以碱基特异性方式与核酸分子的互补链杂交的寡核苷酸。探针可包括引物，引物可以是单链寡核苷酸探针，其可作为采用包括但不限于扩增靶序列的聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)的方法进行模板导向DNA合成的起始点。如本文所述的寡核苷酸可包括核酸序列或其互补序列的片段(segment/fragment)。在一些实施方案中，DNA片段可以是介于5个与10,000个之间的连续碱基，并且可以在5、10、12、15、20或25个核苷酸至10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、1000或10,000个核苷酸范围内。如Nielsen,P.等人，Science 254:1497-1500(1991)中所述，除了DNA和RNA之外，探针和引物还可以包括多肽核酸(PNA)。探针或引物可包含与核酸分子的至少约15个、通常约20-25个且在某些实施方案中约40个、50个、60个或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列的区域。
本公开还提供了分离的核酸，例如探针或引物，其含有可选择性地与包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的核酸杂交的片段或部分，其中所述核苷酸序列可包含至少一个本文所述的遗传变异中所含有的多态性或多态性等位基因或位于相同位置的野生型核苷酸或其互补序列。在一些实施方案中，探针或引物可与连续核苷酸序列或与连续核苷酸序列的互补序列具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。
在一些实施方案中，核酸探针可以是能够与含有本文所述的遗传变异的与疾患(例如，LHON)相关的基因的互补区杂交的寡核苷酸。本公开的核酸片段可在诸如本文所述的测定中用作探针或引物。
可采用技术人员熟知的标准分子生物学技术来鉴定和分离本公开的核酸，如上述的核酸。在一些实施方案中，DNA可以被扩增和/或可以被标记(例如，放射性标记、荧光标记)，并用作筛选例如来源于生物体的cDNA文库的探针。cDNA可来源于mRNA，并且可以含在合适的载体中。例如，可以分离相应的克隆，体内切除之后获得DNA，并且可以通过技术领域公认的方法在任一或两个方向上对克隆的插入片段进行测序，以鉴定编码适当分子量的多肽的正确阅读框。采用这些或类似的方法，多肽和编码多肽的DNA可以被分离、测序并进一步表征。
在一些实施方案中，核酸可包含一种或多种多态性、变异或突变，例如单核苷酸多态性(SNP)、单核苷酸变异(SNV)、拷贝数变异(CNV)，例如插入、缺失、倒位和易位。在一些实施方案中，核酸可包含类似物，例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸或修饰的核酸，例如修饰的主链残基或键联，或与碳水化合物、脂质、多肽或其它物质结合的核酸，或肽核酸(PNA)，例如染色质、核糖体和转录体。在一些实施方案中，核酸可包括各种结构的核酸，例如ADNA、B DNA、Z型DNA、siRNA、tRNA及核酶。在一些实施方案中，核酸可以是天然或非天然多态性的，例如与参考序列相比具有一个或多个序列差异，例如添加、缺失和/或取代。在一些实施方案中，参考序列可基于可公开获得的信息，例如U.C.Santa Cruz人类基因组浏览器网关(genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)或NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。在一些实施方案中，可由本公开的从业者采用本领域中熟知的方法来确定参考序列，例如通过对参考核酸进行测序。
在一些实施方案中，如本文所述，探针可与等位基因、SNP、SNV或CNV杂交。在一些实施方案中，探针可与如本文所述与LHON相关的另一标记物序列结合。
本领域技术人员将知道如何设计探针，使得只有当来自测试核酸样品的基因组序列中存在特定的等位基因时才能发生序列特异性杂交。本公开也可被简化成采用任何方便的基因分型方法来实施，包括商业上可行的对特定遗传变异进行基因分型的技术和方法。
也可以使用对照探针，例如结合较少可变序列的探针，例如与染色体的着丝粒相关的重复DNA可用作对照。在一些实施方案中，探针可得自商业来源。在一些实施方案中，探针可以是例如化学合成或体外合成的，或者是通过标准技术由染色体或基因组DNA制成的。在一些实施方案中，可以使用的DNA的来源包括基因组DNA、克隆的DNA序列、含有一个人类染色体或一个人类染色体的一部分以及宿主的正常染色体互补体和通过流式细胞术或显微切割纯化的染色体的体细胞杂合体。可通过克隆或通过使用PCR的位点特异性扩增来分离所关注的区域。
一种或多种核酸例如探针或引物也可以被标记，例如通过直接标记，以包含可检测标记。可检测标记可包括能够通过物理、化学或生物方法检测的任何标记，例如放射性标记，如32P或3H；荧光标记，如FITC；发色团标记；亲和配体标记；酶标记，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或I2半乳糖苷酶；酶辅因子标记；半抗原缀合物标记，如地高辛或二硝基苯基；拉曼信号产生标记；磁性标记；自旋标记；表位标记，如FLAG或HA表位；发光标记；重原子标记；纳米颗粒标记；电化学标记；光散射标记；球壳标记；半导体纳米晶体标记，如量子点(描述于6,207,392号美国专利中)和用本领域技术人员已知的任何其它信号产生标记物标记的探针，其中标记物可使探针在有或没有次级检测分子的情况下可视化。可利用标准技术例如切口平移、随机引发和PCR标记将核苷酸直接结合到探针中。如本文所用的“信号”包括可合适地通过适当的方式检测和测量的信号，包括荧光、放射性、化学发光等。
可用于检测的标记部分的非限制性实例包括但不限于合适的酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；能够形成复合物的结合对的成员，如链霉亲和素/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体复合物，包括例如兔IgG和抗兔IgG；荧光团，如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、二苯乙烯、萤虫黄、孔雀蓝(Cascade Blue)、德克萨斯红、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、荧光镧系元素络合物如包括铕和铽的那些、花青染料家族成员如Cy3和Cy5、分子信标及其荧光衍生物，以及本领域中已知的其它物质，如在例如Principles of Fluorescence Spectroscopy,Joseph R.Lakowicz(编),Plenum Pub Corp，第2版(1999年7月)和Richard P.Hoagland的第6版Molecular ProbesHandbook中所述；发光物质，如鲁米诺；光散射或等离子体共振物质，如金或银颗粒或量子点；或者放射性物质包括14C、123I、124I、125I、Tc99m、32P、33P、35S或3H。
其它标记也可用于本公开的方法中，例如主链标记。主链标记包含以序列无关方式结合核酸的核酸染料。非限制性实例包括嵌入染料，如菲啶和吖啶(例如，溴化乙锭、碘化丙锭、碘化己锭、二氢乙锭、乙锭同二聚体-1和-2、乙锭一叠氮化物和ACMA)；一些小沟结合剂，如吲哚和咪唑(例如，Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580和DAPI)；以及杂类核酸染料，如吖啶橙(也能够嵌入)、7-AAD、放线菌素D、LDS751和羟芪巴脒。所有上面提到的核酸染料均可商购自诸如Molecular Probes,Inc的供应商。还有核酸染料的其它实例包括得自Molecular Probes的以下染料：花青染料，如SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR DX、SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝色)、SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿色)、SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙色)、SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红色)。
在一些实施方案中，可以选择不同颜色的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、5-(和-6)-羧基-X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、5-(和-6)-羧基荧光素、荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)、7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸、四甲基罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯、5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明、7-羟基香豆素-3-羧酸、6-[荧光素5-(和-6)-羧酰胺基]己酸、N-(4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼烷-3a,4a二氮杂-3-引达省丙酸、曙红-5-异硫氰酸酯、赤藓红-5-异硫氰酸酯、TRITC、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、德克萨斯红、Phar-红、别藻蓝蛋白(APC)和CASCADETM蓝乙酰基叠氮化物，使得在或不在一组中的每种探针可以被清楚地可视化。在一些实施方案中，可用荧光显微镜和用于每种荧光团的适当滤光片或者通过使用双或三带通滤光器组观察多个荧光团来观察荧光标记的探针。在一些实施方案中，诸如流式细胞术的技术可用于检查探针的杂交模式。
在其它实施方案中，探针可例如用生物素或地高辛间接标记，或者用放射性同位素如32P和/或3H标记。作为非限制性实例，可通过与可检测标记物缀合的抗生物素蛋白来检测用生物素间接标记的探针。例如，抗生物素蛋白可与酶标记物如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶缀合。在一些实施方案中，可以使用酶的底物和/或催化剂利用比色反应来检测酶标记物。在一些实施方案中，可以使用碱性磷酸酶的催化剂，例如5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐和硝基蓝四唑鎓。在一些实施方案中，催化剂可用于辣根过氧化物酶，例如二氨基苯甲酸盐。
制剂、施用途径和有效剂量
本公开的又一方面涉及包含本公开的药剂或药剂组合的药物组合物的制剂、施用途径和有效剂量。这类药物组合物可用于治疗如上所述的疾患(例如，LHON)。
本公开的化合物可作为药物制剂施用，包括适于口服(包括经颊和舌下)、经直肠、经鼻、局部、透皮贴剂、经肺、经阴道、栓剂或肠胃外(包括眼内、玻璃体内、肌内、动脉内、鞘内、皮内、腹膜内、皮下和静脉内)施用或呈适于通过雾化、吸入或吹入施用的形式的药物制剂。关于药物递送系统的一般信息可见于Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems(Lippencott Williams&Wilkins,Baltimore Md.(1999)。
在各种实施方案中，药物组合物包括载剂和赋形剂(包括但不限于缓冲剂、碳水化合物、甘露糖醇、多肽、氨基酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)、水、油(包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)、盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液、调味剂、着色剂、防粘剂及其它可接受的添加剂、佐剂或粘结剂、用以接近生理条件的其它药学上可接受的辅助物质如pH缓冲剂、张力调节剂、乳化剂、润湿剂等。赋形剂的实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。在一些实施方案中，药物制剂基本上不含防腐剂。在其它实施方案中，药物制剂可含有至少一种防腐剂。关于药物剂型的一般方法见于Ansel等人，Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems(Lippencott,Williams,&Wilkins,Baltimore Md.(1999))。可以认识到，虽然可以使用本领域普通技术人员已知的任意合适的载体来施用本公开的组合物，但载体的类型可根据施用方式而变化。
也可采用熟知的技术将化合物包封在脂质体内。也可以使用生物可降解的微球作为本公开的药物组合物的载剂。合适的生物可降解微球公开在例如美国专利第4,897,268、5,075,109、5,928,647、5,811,128、5,820,883、5,853,763、5,814,344和5,942,252号中。
可以脂质体或微球(或微颗粒)形式施用化合物。用于向受试者施用的脂质体和微球的制备方法是本领域技术人员熟知的。美国专利第4,789,734号(其内容特此以引用的方式并入)描述了将生物物质包封在脂质体中的方法。基本上，将物质溶解在水溶液中，添加适当的磷脂和脂质，如果需要的话连同表面活性剂一起添加，并且必要时对物质进行渗析或声处理。G.Gregoriadis，第14章，“Liposomes,”Drug Carriers in Biology andMedicine，第2页、增补87-341页(Academic Press,1979)提供了已知方法的综述。
由聚合物或多肽形成的微球是本领域技术人员熟知的，并且可以被设计成通过胃肠道直接进入血流。或者，可以掺入化合物，并植入微球或微球复合物，以在数天至数月的时间段内缓慢释放。参见例如美国专利第4,906,474、4,925,673和3,625,214号以及Jein,TIPS 19:155-157(1998)，上述内容特此以引用的方式并入。
可调节药物的浓度，缓冲溶液的pH，并调节等渗性以与眼内注射或玻璃体内注射相容。
可将本公开的化合物配制为在合适媒介物中的无菌溶液或悬浮液。药物组合物可通过常规的熟知灭菌技术进行灭菌，或者可进行无菌过滤。所得到的水溶液可原样包装使用或冻干，冻干制剂在施用之前与无菌溶液合并。Remington“The Science and Practiceof Pharmacy”(第20版，Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore MD)中描述了合适的制剂和另外的载剂。
剂或其药学上可接受的盐可单独或与一种或多种其它剂组合提供，或者以一种或多种其它形式提供。例如，制剂可包含特定比例的一种或多种剂，这取决于每种剂的相对效力和预期的适应症。例如，在用于靶向两种不同宿主靶标的组合物中，并且在效力相似的情况下，可以使用约1:1比率的剂。可将两种形式一起配制在同一剂量单位中，例如在一种霜剂、栓剂、片剂、胶囊、气溶胶喷雾剂或要在饮料中溶解的粉末包中；或者可将每种形式配制在单独的单位中，例如两种霜剂、两种栓剂、两种片剂、两种胶囊、片剂和用于溶解片剂的液体、两种气溶胶喷雾剂或粉末包和用于溶解粉末的液体等。
术语“药学上可接受的盐”意指那些保留了在本公开中使用的剂的生物有效性和特性并且不是生物学上或其它方面上不可取的盐。
典型的盐为无机离子比如钠、钾、钙、镁离子等的盐。这类盐包括与无机或有机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、扁桃酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或马来酸形成的盐。此外，如果剂含有羧基或其它酸性基团，则可以用无机或有机碱将其转化成药学上可接受的加成盐。合适的碱的实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨、环己胺、二环己胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等。
药学上可接受的酯或酰胺是指保留了在本公开中使用的剂的生物有效性和特性并且不是生物学上或其它方面上不可取的那些酯和酰胺。典型的酯包括乙酯、甲酯、异丁酯、乙二醇酯等。典型的酰胺包括未取代的酰胺、烷基酰胺、二烷基酰胺等。
在一些实施方案中，剂可以与一种或多种例如如上所述的其它化合物、形式和/或剂组合施用。可将含有一种或多种其它活性剂的药物组合物配制成包含一定的摩尔比。例如，第一活性剂与其它活性剂的摩尔比可以是约99:1至约1:99。在实施方案的一些子集中，第一活性剂:其它活性剂的摩尔比范围选自约80:20至约20:80；约75:25至约25:75、约70:30至约30:70、约66:33至约33:66、约60:40至约40:60；约50:50；和约90:10至约10:90。第一活性剂:其它活性剂的摩尔比可以为约1:9，并且在一些实施方案中可以为约1:1。可将两种剂、形式和/或化合物一起配制在同一剂量单位中，例如在一种霜剂、栓剂、片剂、胶囊或要在饮料中溶解的粉末包中；或者可将每种剂、形式和/或化合物配制在单独的单位中，例如两种霜剂、栓剂、片剂、两种胶囊、片剂和用于溶解片剂的液体、气溶胶喷雾剂、粉末包和用于溶解粉末的液体等。
如果必要或需要的话，剂和/或剂组合可再与其它剂一起施用。可与本公开的剂和/或剂组合共同施用的剂的选择可至少部分地取决于所治疗的疾患。
剂(或其药学上可接受的盐、酯或酰胺)可单独或以药物组合物的形式施用，其中活性剂与一种或多种药学上可接受的载剂相掺合或混合。如本文所用的药物组合物可以是制备用于向受试者施用的任何组合物。可以使用一种或多种生理学上可接受的载剂以常规方式配制根据本公开使用的药物组合物，所述载剂包括赋形剂、稀释剂和/或助剂，其例如有助于将活性剂加工成可施用的制剂。适当的制剂可至少部分地取决于所选择的施用途径。可采用多种施用途径或模式向受试者递送用于本公开的剂或其药学上可接受的盐、酯或酰胺，包括口服、经颊、局部、经直肠、经皮、经粘膜、皮下、静脉内、眼内、玻璃体内和肌内施加以及通过吸入。
在一些实施方案中，由于例如存在大的亲脂性部分，可使用油或非水溶剂将剂带入溶液中。或者，可以使用乳液、悬浮液或其它制剂，例如脂质体制剂。关于脂质体制剂，可以采用任何已知的方法制备用于治疗疾患的脂质体。参见例如以引用的方式并入本文的Bangham等人，J.Mol.Biol.23:238-252(1965)和Szoka等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA75:4194-4198(1978)。也可以使配体与脂质体附接，以将这些组合物导向特定的作用位点。也可将本公开的剂并入到食品例如奶油干酪、黄油、色拉酱或冰淇淋中，以在某些受试者群体中促进增溶、施用和/或顺应性。
本公开的化合物可以被配制成用于肠胃外施用(例如，通过注射，例如眼内注射或玻璃体内注射)，并且可以单位剂型存在于安瓿、预填充注射器、小体积输注液中，或者存在于添加有防腐剂的多剂量容器中。组合物可采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，例如在含水聚乙二醇中的溶液。
对于可注射制剂，媒介物可选自本领域中已知合适的那些，包括水溶液或油悬浮液或乳液，以及芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及酏剂、甘露糖醇、葡萄糖，或无菌水溶液及类似的药物媒介物。制剂还可以包含生物相容性可生物降解的聚合物组合物，如聚(乳酸-共-乙醇酸)。可将这些物质制成微球或纳米球，装载药物并进一步包衣或衍生化，以提供优异的持续释放性能。适用于眼周或眼内注射的媒介物包括例如治疗剂在注射级水、脂质体和适用于亲脂性物质的媒介物中的悬浮液。用于眼周或眼内注射的其它媒介物是本领域中熟知的。
在一些实施方案中，根据常规程序将组合物配制为适于向人静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲剂中的溶液。在必要的情况下，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，各成分以单位剂型单独或混合在一起提供，例如作为在密闭密封容器中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物，所述容器如指示活性剂的量的安瓿或小药囊。在组合物要通过输注施用的情况下，可将其用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶进行分配。在通过注射施用组合物的情况下，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿，以便可以在施用之前将各成分混合。
当通过注射施用时，可将活性化合物配制在水溶液中，特别是在生理相容的缓冲液中，如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。溶液可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性化合物可呈粉末形式，在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水进行复原。在一些实施方案中，药物组合物不包含添加以增强由肽刺激的免疫反应的佐剂或任何其它物质。在一些实施方案中，药物组合物包含抑制对肽的免疫反应的物质。配制方法是本领域中已知的，例如公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences，最新版，Mack Publishing Co.,Easton P中。
在一些实施方案中，可用包含本公开的剂或的剂组合的眼用溶液、悬浮液、油膏或插入物来有效地治疗眼部病症。可通过将活性成分溶解在无菌水溶液如生理盐水、缓冲溶液等中或者通过在使用前将要溶解的粉末组合物合并来制备眼药水。可选择本领域中已知的其它媒介物，包括但不限于：平衡盐溶液、盐水溶液、水溶性聚醚如聚乙二醇、聚乙烯类化合物如聚乙烯醇和聚维酮、纤维素衍生物如甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素、石油衍生物如矿物油和白凡士林、动物脂肪如羊毛脂、丙烯酸的聚合物如羧基聚亚甲基凝胶、植物脂肪如花生油和多糖如葡聚糖以及糖胺聚糖如透明质酸钠。如果需要的话，可以添加眼药水中常用的添加剂。这类添加剂包括等渗剂(例如，氯化钠等)、缓冲剂(例如，硼酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠等)、防腐剂(例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇等)、增稠剂(例如，糖类，如乳糖、甘露糖醇、麦芽糖等；例如，透明质酸或其盐，如透明质酸钠、透明质酸钾等；例如，粘多糖，如硫酸软骨素等；例如，聚丙烯酸钠、羧乙烯基聚合物、交联聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素或本领域技术人员已知的其它剂)。
可通过组合物中的表面活性剂或其它适当的共溶剂来提高本发明组合物的组分的溶解度。这类共溶剂包括聚山梨醇酯20、60和80；Pluronic F68、F-84和P-103；环糊精或本领域技术人员已知的其它试剂。这类共溶剂的使用水平可以是约0.01重量％至2重量％。
可按多剂量形式包装本公开的组合物。防腐剂可优选防止使用期间的微生物污染。合适的防腐剂包括：苯扎氯铵、硫柳汞、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸、Onamer M或本领域技术人员已知的其它剂。在现有技术的眼用产品中，这类防腐剂的使用水平可以是0.004％至0.02％。在本申请的组合物中，可以按0.001重量％至少于0.01重量％(例如0.001重量％至0.008重量％，优选约0.005重量％)的水平使用防腐剂，优选苯扎氯铵。已发现0.005％浓度的苯扎氯铵可足以保护本公开的组合物免受微生物攻击。
在一些实施方案中，以可溶性而不是悬浮液形式递送本公开的剂，这样允许更快速和定量地吸收至作用位点。一般来说，诸如凝胶剂、霜剂、洗剂、栓剂和油膏的制剂可提供更长时间暴露于本公开的剂的区域，而溶液形式的制剂例如喷雾剂则提供更直接的短期暴露。
另外可以预见，本公开的化合物可以可释放的方式附着于生物相容性聚合物上，用于在持续释放的制剂中使用，所述持续释放的制剂在用于局部、眼内、眼周或全身施用的插入物之上、之中或附着于其上。从生物相容性聚合物中的受控释放也可以水溶性聚合物利用以形成可滴注的制剂。从生物相容性聚合物比如PLGA微球或纳米球中的受控释放可用于适于眼内植入或注射以进行持续释放施用的制剂中，也可以使用任意合适的可生物降解且是生物相容性的聚合物。
实施例
由以下示例性实施方案进一步描述本发明。应当理解的是，这些实施例仅旨在说明本发明，而不是限制本发明的范围。除另指出外，下面的实施例中可采用例如sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual(New York:cold spring harborlaboratory press,1989)中公开的方法和条件或制造商推荐的条件。
实施例1–ND4质粒和病毒制备
1.1质粒制备
基于美国国家生物技术信息中心参考序列yp_003024035.1获得人ND4(SEQ IDNO:6)的核苷酸序列。非优化线粒体靶向序列COX10的序列为SEQ ID NO:1。设计线粒体靶向序列COX10的优化序列(opt_COX10,SEQ ID NO:2)和人ND4的编码序列(opt_ND4,SEQ IDNO:7)以提高转录效率和翻译效率。与非优化COX10-ND4具有约75.89％同源性的优化COX10-ND4序列之后是重组核酸opt_COX10-opt_ND4-3’UTR(如SEQ ID NO:31所示)的三个起始非翻译区(即，3’UTR,SEQ ID NO:13)。
通过PCR扩增将合成的重组核酸opt_COX10-opt_ND4-3’UTR掺入到腺相关病毒(AAV)载体中(图1)。由EcoRI/SalI限制酶切割opt_COX10-opt_ND4-3’UTR以形成粘性末端，然后嵌入到具有EcoRI/SalI限制位点的AAV载体如pSNaV载体中，以产生pSNaV/rAAV2/2-ND4质粒(即，pAAV2-优化的ND4质粒)。将pAAV2-opt_ND4质粒与非优化pAAV2-ND4质粒进行比较。
侦查筛选和鉴定步骤类似于CN102634527B：在LB板中在37℃下培养质粒。出现蓝色菌落和白色菌落，其中白色菌落是重组克隆。挑取白色菌落，添加到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、200rpm下培养8小时，然后基于Biomiga质粒提取方案从培养的细菌培养基中提取质粒。使用EcoRI/SalI限制酶确认质粒的鉴定。
1.2细胞转染
在转染前一天，将HEK293细胞接种到225cm2细胞培养瓶中：接种密度为3.0×107个细胞/ml，培养基为含10％牛血清的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)，在37℃下在5％CO2温育箱中过夜。在转染的当天用含10％牛血清的新鲜DMEM更换培养基。
细胞生长到80-90％后，弃去培养基，并使用PlasmidTrans(VGTC)转染试剂盒，用pAAV2-ND4和pAAV2-opt_ND4质粒转染细胞。CN102634527B实施例1中描述了详细的转染方案。转染后48h收集细胞。
1.3重组腺相关病毒的收集、浓缩和纯化
病毒收集：1)准备干冰乙醇浴(或液氮)和37℃水浴；2)将转染的细胞连同培养基一起收集在15ml离心管中；3)将细胞以1000rpm/min离心3分钟；将细胞和上清液分离；单独储存上清液；并将细胞重新悬浮在1ml的PBS中；4)将细胞悬浮液在干冰-乙醇浴与37℃水浴之间反复转移，冷冻解冻四次，每次10分钟，每次解冻后轻微摇动。
病毒浓缩：1)采用10,000g离心移除细胞碎片；将离心上清液转移到新的离心管中；2)通过用0.45μm过滤器进行过滤移除杂质；3)在样品中添加各1/2体积的1M NaCl和10％PEG 8000溶液，均匀混合，并在4℃下储存过夜；4)12,000rpm离心2h后弃去上清液；在病毒沉淀完全溶于适量的PBS溶液后，将样品用0.22μm过滤器灭菌；5)添加全能核酸酶(benzonase nuclease)以移除残留的质粒DNA(最终浓度50U/ml)。将管倒置数次以充分混合，然后在37℃下温育30分钟；6)将样品用0.45μm过滤头过滤；滤液为浓缩的rAAV2病毒。
病毒纯化：1)将CsCl添加到浓缩的病毒溶液中，直到密度为1.41g/ml(折射率为1.372)；2)将样品添加在超速离心管中，并用预先制备的1.41g/ml CsCl溶液填充管；3)以175,000g离心24小时以形成密度梯度。顺序收集不同密度的样品。收集富集的rAAV2颗粒；4)再一次重复该过程。将病毒装载到100kDa透析袋中，并在4℃下透析/脱盐过夜。浓缩和纯化的重组腺相关病毒为rAAV2-ND4和rAAV2-优化的ND4。
类似地，其它线粒体靶向序列(MTS)如OPA1(SEQ ID NO:5)可用于替换上述实施例中的COX10，并用重组质粒产生AAV。
实施例2–兔眼玻璃体内注射rAAV2
将十二只兔分成2组：rAAV2-ND4和rAAV2-优化的ND4。将病毒溶液(1×1010vg/0.05mL)从平坦部的角膜缘外3mm处刺入玻璃体腔。玻璃体内注射后，采用裂隙灯检查和眼底照相检查对眼睛进行检查。注射30天。分别在每组中进行RT-PCR检测和免疫印迹。
实施例3–ND4的表达的实时PCR
使用TRIZOL总RNA提取试剂盒从转染的rAAV2-ND4和rAAV2-优化的ND4兔视神经细胞中提取RNA。通过提取的RNA的逆转录合成cDNA模板。
使用NCBI保守结构域分析软件分析ND4的保守结构，确保设计的引物扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR引物设计原则设计引物：
(a)β-肌动蛋白-S：CGAGATCGTGCGGGACAT(SEQ ID NO:85)；
(b)β-肌动蛋白-A：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC(SEQ ID NO:86)；
(c)ND4-S：CTGCCTACGACAAACAGAC(SEQ ID NO:87)；
(d)ND4-A：AGTGCGTTCGTAGTTTGAG(SEQ ID NO:88)；
荧光定量PCR反应和方案：在实时PCR检测系统中测量荧光定量PCR。在0.2ml PCR反应管中添加12.5μl SYBR绿混合物、8μl ddH2O、1μl的每种引物和2.5μl cDNA样品至总体积为25μl。将每个样品用于靶基因的扩增和扩增参考基因β-肌动蛋白，并且每一扩增重复三次。将共同的试剂在一起添加，然后单独分开以使处理差异最小化。进行荧光定量PCR：在95℃下预变性1s，在94℃下变性15s，在55℃下退火15秒，在72℃下延伸45s。进行总共40个循环的扩增反应，并在每个循环的延伸阶段进行荧光信号采集。反应后，进行94℃至55℃熔融曲线分析。通过采用相对定量方法，将与β-肌动蛋白的基因表达水平差异的研究用作内部参考基因。
如图2中所示，rAAV2-ND4和rAAV2-优化的ND4的相对表达水平(mRNA水平)分别为0.42±0.23和0.57±0.62(p<0.05，图2)。结果出乎意料地显示，优化的ND4(opt_ND4，SEQID NO:7)编码核酸序列和相应的重组核酸(opt_COX10-opt_ND4-3’UTR，SEQ ID NO:31)意外地增加了转录效率，使rAAV2-优化的ND4的表达增加了约36％。结果显示，rAAV2-优化的ND4的转录效率显著较高。
实施例4-ND4表达的免疫印迹检测
分别从rAAV2-优化的ND4和rAAV2-ND4转染的兔神经细胞中纯化ND4蛋白。在10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad，HER-Hercules，CA，USA)进行免疫检测。β-肌动蛋白用作内部参考基因。采用积分归一化方法，利用蛋白质条带的积分光密度，在自动图像分析仪(Li-Cor；Lincoln，NE，USA)上观察胶片条，以便获得同一样品对应的光密度值。统计分析软件SPSS 19.0用于数据分析。
结果示于图3中。rAAV2-优化的ND4(左黑柱)和rAAV2-ND4的ND4的平均相对蛋白表达水平分别为0.32±0.11和0.68±0.20(p<0.01，图3)。结果出乎意料地显示，优化的ND4编码核酸序列(opt_ND4，SEQ ID NO:7)和相应的重组核酸(opt_COX10-opt_ND4-3’UTR，SEQID NO:31)意外地增加了翻译效率，使rAAV2-优化的ND4的表达增加了约112％。结果显示，rAAV2-优化的ND4的翻译效率也显著较高。
实施例5-兔眼内压和眼底照相
在手术后第1、3、7和30天对两组兔进行裂隙灯检查和眼内压测量。在所有兔中没有观察到明显的异常、结膜充血、分泌物或眼内炎，并且眼内压没有升高。
眼底照相结果示于图4中。兔的视神经和视网膜血管没有明显损伤或并发症，表明标准玻璃体内注射是安全的，没有明显的炎症反应或其它并发症。
实施例6–人体临床试验
测试了两组患者：1)在2011年与2012年之间，9名患者作为对照组接受了单眼玻璃体内注射1×1010vg/0.05mL rAAV2-ND4；且2)在2017年与2018年一月之间，20名患者作为实验组接受了单眼玻璃体内注射1×1010vg/0.05mL rAAV2-优化的ND4。使用统计分析SPSS19.0分析临床试验的结果。
两组的比较示于表2中。实验组中最快的视力改善时间为1个月，其显著快于对照组的3个月(p<0.01)；实验组的最佳视力恢复为1.0，其明显高于对照组的0.8(p<0.01)；实验组中的平均视力恢复为0.582±0.086，其明显高于对照组的0.344±0.062(p<0.01)。眼底照相结果示于图5中。实验组和对照组中患者的视神经和视网膜血管没有明显损伤或并发症，表明玻璃体内注射rAAV2-优化的ND4和rAAV2-ND4具有安全性。
表2：rAAV2-优化的ND4和rAAV2-ND4在LHON基因疗法中的比较
Figure BDA0002946020820001441
实施例7–作为线粒体靶向序列的OPA1
将实施例1-6中的重组核酸(opt_COX10-opt_ND4-3’UTR，SEQ ID NO:31)中的COX10和3’UTR序列分别用另一线粒体靶向序列OPA1(SEQ ID NO:5)和另一3’UTR序列3’UTR*(SEQ ID NO:14)替换，以产生新的重组核酸OPA1-opt_ND4-3’UTR*(SEQ ID NO:74)。
实验方法与实施例1-6相同，其中重组核酸opt_COX10-opt_ND4-3’UTR(SEQ IDNO:31)被OPA1-opt_ND4-3’UTR*(SEQ ID NO:74)替换。已发现当与非优化的ND4(COX10-ND4-3’UTR，SEQ ID NO:15)相比时，优化的ND4序列在治疗LHON方面具有显著提高的转录和翻译效率、表达水平以及更高的功效和安全性。
实施例8–优化的ND4序列opt_ND4*
使用核酸opt_COX10*-opt_ND4*-3’UTR(SEQ ID NO:47)，遵循实施例1-6中类似的实验方法。按照与实施例1中类似的程序，将用荧光蛋白EGFP标记的病毒制备为rAAV2-ND4-EGFP和rAAV2-opt_ND4*-EGFP。
将冷冻的293T细胞复苏，并允许在T75烧瓶中生长至约90％。将细胞沉淀，并重新悬浮在DMEM完全培养基中至细胞密度为5×104个细胞/mL。将细胞重新悬浮。在96孔板的每个孔中添加约100μl细胞悬浮液(约5000个细胞)。将细胞在37℃和5％CO2下培养并生长至50％。将约0.02μl PBS分别与2×1010vg/0.02μl病毒rAAV2-ND4-EGFP和rAAV2-opt_ND4*-EGFP混合。48小时后，进行荧光显微镜检查和RT-PCR检测以及免疫印迹实验。如图6中所示，EGFP被成功表达，表明携带EGFP基因的rAAV在293T细胞中被成功转染，并且rAAV2-ND4-EGFP和rAAV2-opt_ND4*-EGFP被成功表达。
使用以下引物进行与实施例3类似的实时PCR测试：
(a)β-肌动蛋白-S：CGAGATCGTGCGGGACAT(SEQ ID NO:85)；
(b)β-肌动蛋白-A：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC(SEQ ID NO:86)；
(c)ND4-S:GCCAACAGCAACTACGAGC(SEQ ID NO:107)；
(d)ND4-A:TGATGTTGCTCCAGCTGAAG(SEQ ID NO:108)；
结果出乎意料地显示，优化的ND4*(opt_ND4，SEQ ID NO:8)编码核酸序列和相应的重组核酸(opt_COX10*-opt_ND4*-3’UTR，SEQ ID NO:47)意外地增加了转录效率，使rAAV2-opt_ND4的表达增加了约20％。结果显示，rAAV2-opt_ND4的转录效率显著较高。
图7显示293T细胞中的ND4表达。rAAV2-ND4的ND4蛋白平均表达为0.36，而rAAV2-opt_ND4*的ND4蛋白平均表达为1.65，其是rAAV2-ND4组的约4.6倍(p<0.01)(参见图8)。
图9显示兔视神经细胞中的ND4表达。rAAV2-ND4的ND4蛋白平均表达为0.16，而rAAV2-opt_ND4*的ND4蛋白平均表达为0.48，其是rAAV2-ND4组的约3倍(p<0.01)(参见图10)。
类似于实施例5，在手术后第1、3、7和30天对两组兔进行裂隙灯检查和眼内压测量。在所有兔中没有观察到明显的异常、结膜充血、分泌物或眼内炎，并且眼内压没有升高。
rAAV2-ND4和rAAV2-opt_ND4*的眼底照相结果示于图11中。兔的视神经和视网膜血管没有明显损伤或并发症，表明标准玻璃体内注射是安全的，没有明显的炎症反应或其它并发症。
在裂隙灯检查和眼内压测量后，将两组兔的眼球摘除。将眼球固定，并使用石蜡脱水。沿视神经的方向对组织进行病理学切片。进一步脱水后，使用苏木精和曙红对组织样品进行染色。显微镜检查结果参见图12。如HE染色结果中所示，兔视网膜神经节纤维层没有受损，并且神经节细胞的数目没有减少，表明玻璃体内注射不产生视网膜毒性或神经损伤，可以安全使用。
实验方法与实施例8相同，其中重组核酸opt_COX10*-opt_ND4*-3’UTR(SEQ IDNO:47)被OPA1-opt_ND4*-3’UTR*(SEQ ID NO:76)替换。已发现当与非优化的ND4(COX10-ND4-3’UTR，SEQ ID NO:15)相比时，优化的ND4序列在治疗LHON方面具有显著提高的转录和翻译效率、表达水平以及更高的功效和安全性。
实施例9–ND6序列
使用核酸COX10-ND6-3’UTR(SEQ ID NO:21)，其是COX10(SEQ ID NO:1)、ND6(SEQID NO:9)和3’UTR(SEQ ID NO:13)的组合(5'至3')，遵循实施例1-6中类似的实验方法。
针对COX10-ND6-3’UTR(SEQ ID NO:21)的质粒筛选使用以下引物：
(a)ND6-F：ATGATGTATGCTTTGTTTCTG(SEQ ID NO:89)；
(b)ND6-R：CTAATTCCCCCGAGCAATCTC(SEQ ID NO:90)。
转染并筛选的病毒rAAV2-ND6的病毒滴度为2.0×1011vg/mL。类似于实施例5，在手术后第1、7和30天对三组兔(A：rAAV2-ND6；B：rAAV-GFP；C：PBS)进行裂隙灯检查和眼内压测量(图13)。在所有兔中没有观察到明显的异常、结膜充血、分泌物或眼内炎，并且眼内压没有升高。
使用以下引物进行与实施例3类似的实时PCR测试：
(a)β-肌动蛋白-S：CGAGATCGTGCGGGACAT(SEQ ID NO:85)；
(b)β-肌动蛋白-A：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC(SEQ ID NO:86)；
(c)ND6-S：AGTGTGGGTTTAGTAATG(SEQ ID NO:91)；
(d)ND4-A：TGCCTCAGGATACTCCTC(SEQ ID NO：92)。
结果显示，rAAV2-ND6和对照(PBS)的ND6表达分别为0.59±0.06和0.41±0.03。结果显示，rAAV2-ND6的转录效率高于对照组(p<0.01)。
实施例10–优化的opt_ND6序列
使用核酸opt_COX10*-opt_ND6-3’UTR(SEQ ID NO:51)，其是opt_COX10*(SEQ IDNO:3)、opt_ND6(SEQ ID NO:10)和3’UTR(SEQ ID NO:13)的组合(5'至3')，遵循实施例1-6中类似的实验方法。
给三组兔注射：A：1010vg/50μl的rAAV2-opt_ND6，B：1010vg/50μl的rAAV2-ND6(实施例9)，和C：1010vg/50μl的rAAV2-EGFP。图14显示分别注射rAAV2-opt_ND6(A)、rAAV2-ND6(B)、rAAV-EGFP(C)的兔的眼底照相结果。在所有兔中没有观察到明显的异常、结膜充血、分泌物或眼内炎，并且眼内压没有升高。
使用以下引物进行与实施例3类似的实时PCR测试：
(a)β-肌动蛋白-F：CTCCATCCTGGCCTCGCTGT(SEQ ID NO:93)；
(b)β-肌动蛋白-R：GCTGTCACCTTCACCGTTCC(SEQ ID NO:94)；
(c)ND6-F：GGGTTTTCTTCTAAGCCTTCTCC(SEQ ID NO:95)；
(d)ND6-R：CCATCATACTCTTTCACCCACAG(SEQ ID NO:96)；
(e)opt_ND6-F：CGCCTGCTGACCGGCTGCGT(SEQ ID NO:97)；
(f)opt_ND6-R：CCAGGCCTCGGGGTACTCCT(SEQ ID NO:98)。
如图15中所示，rAAV2-opt_ND6(A)和rAAV2-ND6(B)均具有比对照组(C)高(p<0.05)的相对ND6表达水平。rAAV2-opt_ND6(A)具有比rAAV2-ND6(B)略高的相对ND6表达水平。如图16中的western印迹所示，rAAV2-opt_ND6(A)具有为rAAV2-ND6(B)的3倍以上的相对ND6表达水平。
实验方法与实施例8相同，其中重组核酸COX10-ND6-3’UTR(SEQ ID NO:21)和opt_COX10*-opt_ND6-3’UTR(SEQ ID NO:51)被OPA1-ND6-3’UTR(SEQ ID NO:77)和OPA1-opt_ND6-3’UTR(SEQ ID NO:79)替换。已发现优化的ND6序列在治疗LHON方面具有显著提高的转录和翻译效率、表达水平以及更高的功效和安全性。
实施例11–ND1和opt_ND1序列
使用rAAV2-ND1、COX10-ND1-3’UTR(SEQ ID NO:25)，其是COX10(SEQ ID NO:1)、ND1(SEQ ID NO:11)和3’UTR(SEQ ID NO:13)的组合(5'至3')；以及rAAV2-opt_ND1、opt_COX10*-opt_ND1-3’UTR(SEQ ID NO:55)，其是opt_COX10*(SEQ ID NO:3)、opt_ND1(SEQ IDNO:12)和3’UTR(SEQ ID NO:13)的组合(5'至3')，遵循实施例1-6中类似的实验方法。
针对COX10-ND1-3’UTR(SEQ ID NO:25)的质粒筛选使用以下引物：
(a)ND1-F：ATGGCCGCATCTCCGCACACT(SEQ ID NO:99)，
(b)ND1-R：TTAGGTTTGAGGGGGAATGCT(SEQ ID NO:100)，
针对opt_COX10*-opt_ND1-3’UTR(SEQ ID NO:55)的质粒筛选使用以下引物：
(a)ND1-F：AACCTCAACCTAGGCCTCCTA(SEQ ID NO:101)，
(b)ND1-R：TGGCAGGAGTAACCAGAGGTG(SEQ ID NO:102)，
给三组兔注射：A：1010vg/50μl的rAAV2-opt_ND1，B：1010vg/50μl的rAAV2-ND1(实施例9)，和C：1010vg/50μl的rAAV2-EGFP。在所有兔中没有观察到明显的异常、结膜充血、分泌物或眼内炎，并且眼内压没有升高。
使用以下引物进行与实施例3类似的实时PCR测试：
(a)ND1-F：AGGAGGCTCTGTCTGGTATCTTG(SEQ ID NO:103)；
(b)ND1-R：TTTTAGGGGCTCTTTGGTGAA(SEQ ID NO:104)；
(c)opt_ND1-F：GCCGCCTGCTGACCGGCTGCGT(SEQ ID NO:105)；
(d)opt_ND1-R：TGATGTACAGGGTGATGGTGCTGG(SEQ ID NO:106)；
如图17中所示，rAAV2-opt_ND1(A)和rAAV2-ND1(B)均具有比对照组(C)高(p<0.05)的相对ND1表达水平。如图18中的western印迹所示，rAAV2-opt_ND1(A)具有为rAAV2-ND1(B)的2倍以上的相对ND6表达水平。
实验方法与实施例8相同，其中重组核酸COX10-ND1-3’UTR(SEQ ID NO:25)和opt_COX10*-opt_ND1-3’UTR(SEQ ID NO:55)被OPA1-ND1-3’UTR(SEQ ID NO:81)和OPA1-opt_ND1-3’UTR(SEQ ID NO:83)替换。已发现优化的ND1序列在治疗LHON方面具有显著提高的转录和翻译效率、表达水平以及更高的功效和安全性。
实施例12–其它融合蛋白
可以使用如SEQ ID NO:15-84中示出的其它融合蛋白，遵循实施例1-6中类似的实验方法。并且预期可获得类似的结果。
实施例13–制剂开发
AAV2病毒样品用于筛选不同的AAV制剂。使用StepOnePlus实时PCR系统评估不同AAV制剂的稳定性。测量每种制剂在冷冻/解冻循环条件下的病毒滴度。
首先，在1、2、3、4和5个冷冻/解冻循环下测试三种不同的制剂，测量病毒滴度并汇总于表3中。测试的三种制剂是：A：磷酸盐缓冲盐水(PBS)；B：1％α,α-脱水海藻糖、1％L-组氨酸单盐酸盐一水合物和1％聚山梨醇酯20；以及C：180mM NaCl、10mM NaH2PO4/Na2HPO4和0.001％泊洛沙姆188，pH 7.3。如表3中所示，制剂C在5个冷冻/解冻循环后具有最低的相对标准偏差(RSD)，表明作为AAV制剂具有优异的稳定性。
表3–制剂A、B和C的病毒滴度
0个循环 1个循环 2个循环 3个循环 4个循环 5个循环 RSD
制剂A 1.15E+11 9.48E+10 6.16E+10 2.90E+10 1.56E+10 5.26E+09 83.18
制剂B 4.25E+11 5.12E+11 6.66E+11 4.30E+11 4.77E+11 4.20E+11 19.30
制剂C 4.96E+11 6.91E+11 7.69E+11 6.82E+11 6.83E+11 7.27E+11 13.90
如表3中所示，制剂C在5个冷冻/解冻循环后具有最低的相对标准偏差(RSD)，表明作为AAV制剂具有优异的稳定性。
其次，在1、2、3、4和5个冷冻/解冻循环下测试另一组三种不同的制剂，测量病毒滴度并汇总于表4中。测试的三种制剂是：D：磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.2-7.4；E：PBS和0.001％泊洛沙姆188，pH 7.2-7.4；以及F：80mM NaCl、5mM NaH2PO4、40mM Na2HPO4、5mMKH2PO4和0.001％泊洛沙姆188，7.2-7.4。
表4–D、E和F制剂的病毒滴度
0个循环 1个循环 2个循环 3个循环 4个循环 5个循环 RSD
制剂D 1.13E+10 4.62E+09 2.25E+09 1.25E+09 1.01E+09 9.48E+08 113.25
制剂E 4.72E+10 5.48E+10 5.33E+10 5.33E+10 4.94E+10 4.08E+10 10.53
制剂F 6.61E+10 6.08E+10 6.47E+10 6.84E+10 6.52E+10 6.05E+10 4.81
如表4中所示，制剂F在5个冷冻/解冻循环后具有最低的相对标准偏差(RSD)，表明作为AAV制剂具有优异的稳定性。总之，制剂F在所有测试的制剂当中也具有最低的RSD，并且可用作将来待开发的AAV制剂。
在1、2、3和4个冷冻/解冻循环下测试第三组制剂，并利用qRT-PCR测定病毒滴度。除了制剂F之外，测试的另外两种制剂是：G：8.4mM KH2PO4、5.6mM Na2HPO4和154mM NaCl；H：8.4mM KH2PO4、5.6mM Na2HPO4、0.15M NaCl和0.001％泊洛沙姆188，pH 7.2-7.4。
HEK293细胞培养物和rAAV2转导：将含有HEK293细胞的冷冻管解冻，并分配到含有补充了10％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基的细胞培养瓶中。将HEK293细胞在5％CO2中在37℃下温育24小时。将HEK293细胞接种到24孔板中，并用AAV2制剂F、G或H以20000的MOI转导。对照组仅与PBS一起温育。
RNA提取：
使用TRIZOL从转导的HEK293细胞中分离总RNA，并通过逆转录合成cDNA。用于RT-PCR分析的引物如下：
(a)β-肌动蛋白-F：CTCCATCCTGGCCTCGCTGT(SEQ ID NO:93)
(b)β-肌动蛋白-R：GCTGTCACCTTCACCGTTCC(SEQ ID NO:94)
(c)ND4-F：atctccgcacactctctcctca(SEQ ID NO:165)
(d)ND4-R：taggttgttgttgatttggtt(SEQ ID NO:166)
qRT-PCR：制备含有10μL TB绿、0.3μL正向和反向引物、0.4μL ROX参考染料、4.3μLEASY稀释液和5μL cDNA的反应混合物。通过在95℃下预变性10分钟、接着是95℃持续15秒和60℃持续1分钟的40个循环来进行定量RT-PCR。在每个循环的延伸阶段期间收集荧光信号。ND4表达水平(相对定量)可计算为2-(Ct(ND4，样品)-Ct(β-肌动蛋白，样品)-Ct(ND4，对照)-Ct(β-肌动蛋白，对照))。
表17：以PBS对照作归一化的ND4表达
初始 1个循环 2个循环 3个循环 4个循环 平均值 RSD
制剂G 13.21 11.27 12.77 14.95 13.37 13.05 10.11％
制剂H 105.39 104.60 71.80 102.28 107.29 96.0175 15.53％
制剂F 122.45 35.19 89.60 78.85 30.93 81.5225 47.28％
如表17中所示，制剂F和H在4个冷冻/解冻循环后显示出较高的ND4相对表达，特别是制剂H，其表明作为AAV制剂具有优异的稳定性和转导效率。
实施例14-重组腺相关病毒的制备
根据实施例1中所述的方法制备重组腺相关病毒rAAV2/2-ND4。
质粒制备：根据SEQ ID NO:6的融合核酸由Chengdu Qingke Yuxi BiotechnologyCo.,Ltd合成。通过PCR扩增全长基因，并通过EcoRI/SalI消化在融合基因上形成粘性末端。将融合基因插入到具有EcoRI/SalI限制位点的腺相关病毒载体pSNaV中，即pSNaV/rAAV2/2-ND4(下文称为pAAV2-ND4)。简言之，在37℃下温育后，LB板显示出蓝色菌落和白色菌落，其中白色菌落是重组克隆。挑取白色菌落，并添加到含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中，并在37℃和200rpm下培养8小时。培养后，获得细菌溶液并提取质粒。在质粒提取步骤中，参考Biomega说明书采用EcoRI/SalI酶消化。
细胞转染：将HEK293细胞以3.0×107个细胞/mL的密度接种在225cm2细胞培养瓶中的含10％牛血清的DMEM中，并在37℃和5％CO2下温育过夜。当细胞达到80-90％汇合时，弃去培养基，并使用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒，用pAAV2-ND4转染细胞(关于具体的转染步骤，参见实施例1)。转染之后48小时收获细胞。
病毒的收集和浓缩：将转导的细胞与培养基一起收集到15mL离心管中，并以1000rpm离心3分钟。分离细胞和上清液，另外储存上清液，并将细胞重新悬浮在1mL PBS中。将细胞悬浮液反复在干冰乙醇浴或液氮浴中冷冻，并在37℃水浴中解冻四次，每次10分钟，并在每次熔解后轻微涡旋。将上清液以10,000×g离心以移除细胞碎片，转移到新的离心管中，并使用0.45μm过滤器进行过滤以移除杂质。将一半体积的1M NaCl 10％PEG8000溶液添加到上清液中，充分混合，并在4℃下保持过夜。第二天，将病毒以12,000rpm离心2h，弃去上清液，并将沉淀的病毒重新悬浮在适量的PBS溶液中，并使用0.22μm过滤器进行过滤以供灭菌。通过在37℃下用全能核酸酶(50U/mL)消化30分钟来移除剩余的质粒DNA，并用0.45μm过滤器头进行再过滤，获得浓缩的rAAV2病毒。
病毒的纯化：将固体CsCl添加到浓缩的病毒中至密度为1.41g/mL(折射率为1.372)。将样品放入超速离心管中，并将离心管的剩余空间用预先配制的1.41g/mL CsCl溶液填充。将样品以175,000×g离心24小时以形成密度梯度，从而收集不同密度的样品。测定样品的病毒滴度，并收集富含rAAV2颗粒的组分。重复此过程，将病毒装载到100kDa透析袋中，并在4℃下储存过夜以用于透析。
实施例15–治疗莱伯氏遗传性视神经病变的基因疗法
进行多中心前瞻性临床试验以评估rAAV-ND4在满足LHON诊断标准的患者中的功效。
研究设计
研究地点：本研究为临床试验，遗传诊断在同济医院的遗传诊断中心进行。眼科检查在同济医院的眼科检查室完成。全身检查(部分)由实验室中的指定人员和标准设备进行。
患者招募指南：患者需要通过11778位点突变的遗传检测被诊断为LHON。受试者年龄为10-65岁，男女不限。观察患者至少三个月的视力改善。如果患者有晚期疾病、既往眼病史、对治疗期间使用的基本药物过敏或者在AAV2体液反应测试中显示阳性结果，则将他们排除在研究之外。要求患者签署莱伯氏基因疗法的知情同意书和玻璃体注射的知情同意书。
术前指导：建议医务人员在手术前将手术室和医疗用品进行消毒，准备手术期间的消耗品，并严格遵守手术分级制度和无菌手术原则。
术前检查：患者在手术之前进行全身检查，包括血液分析、尿液分析、肝肾功能、凝血功能、传染病筛查、免疫分析(细胞免疫：CD3、CD4、CD8；体液免疫：IgA、IgM、IgG)；心电图和胸部透视。患者另外接受术前眼科检查，包括视敏度、眼内压、裂隙灯检查、眼底检查、眼底照相、前段照相、视神经OCT、视野检查和VEP。这些系列检查在6个月内进行不少于三次。筛查患者的莱伯氏病中的mtDNA碱基对突变G11778A。也就是说，NADH脱氢酶亚基4蛋白的精氨酸被转化成组氨酸，导致功能丧失病症、视神经损伤和莱伯遗传性视神经病变，其发病率高且预后不良(参见中国专利CN 102634527 B)。在治疗之前还进行AAV2体液免疫测定(下面在实施例16中描述)。
术前治疗：向接受LHON基因疗法的患者施用每日32mg/60kg剂量的口服类固醇
Figure BDA0002946020820001551
在手术前7天开始一天一次。使用患者血清进行AAV2体液免疫检查，以确定在开始rAAV2治疗之前患者的治疗前rAAV2免疫力是否低。在手术前一天施加抗生素眼药水和眼药膏以清洗泪结膜囊。
玻璃体内注射：
临床级rAAV2-ND4剂型(四川大学生物治疗国家重点实验室)用作注射剂。如实施例14中所述制备重组腺相关病毒rAAV2-ND4(SEQ ID NO:6)。剂量为1×1010vg/0.05mL。局部麻醉下玻璃体内注射的药物量为0.05mL。在局部麻醉下通过腔内注射施用单剂量的药物。在层流手术室中准备消毒措施和手术消耗品。在手术前对毛巾、脸部和眼睛进行常规消毒，并对眼睛进行注射标记。
基因药物由指定人员管理。在施用药物前，检查患者的信息以确保药物包装完整且无污染，并且药物包装经严格消毒。当从小瓶中取药时，操作要缓慢且平稳，并且药物被泵送一次，并且不反复抽吸和接触瓶壁以避免药物污染。从小瓶中取出药物后，在半小时内完成注射。注射完成后，保留药物包装和剩余药物，并在-20℃下储存以供参考。在取药过程期间要求绝对无菌操作。如果药物掉到地上，或者吸针接触到污染区域，则弃掉药物。不将任何有污染风险的药物注入患者的玻璃体腔。
玻璃体腔注射的具体操作指南：在注射前准备器械和药物，并有助手进行常规玻璃体腔注射操作，如消毒和盖布。将药物从干冰中取出，并用手紧握2-3分钟，直到药物融化成液体。用含碘伏的纱布擦拭瓶盖和瓶子两次进行消毒，然后用干纱布擦拭瓶子和瓶盖。应当注意的是，擦拭是顺时针方向，以防止瓶口开启和碘伏渗透。消毒完成后，打开瓶盖，操作者用胰岛素针取药，并将体积调节至0.05mL。同时，助手做好麻醉注射、消毒、回收等准备，用0.5％聚维酮碘清洗结膜囊3次，并根据玻璃体腔注射指南注射玻璃体腔。拔出针后立即用棉签按压注射部位并揉擦10秒钟，以防止药物泄漏。
注射药物后，将抗生素眼药膏涂到注射的眼睛上，并用棉签盖住眼睛。患者平躺20分钟，然后返回病房。告诉患者不要揉眼睛。完成注射后，关注基因疗法之后的患者恢复。
术后用药：
全身用药：
(a)在手术之前持续7天，
Figure BDA0002946020820001561
片剂，32mg/60kg；
(b)在手术后持续3天(包括手术当天)，磷酸肌酸钠iv滴注，2g/60kg；
(c)在手术后持续3天(包括手术当天)，
Figure BDA0002946020820001562
iv滴注，80mg/60kg；
(d)在手术后第三天，将
Figure BDA0002946020820001563
改为
Figure BDA0002946020820001564
po，40mg/60kg；一天一次，持续4天；
(e)在手术后第二周，将
Figure BDA0002946020820001565
减少，po，32mg/60kg；一天一次，持续7天；
(f)在手术后第三周，将
Figure BDA0002946020820001566
减少，po，24mg/60kg；一天一次，持续7天；
(g)在手术后第四周，将
Figure BDA0002946020820001571
减少，po，16mg/60kg；一天一次，持续7天；
(h)在手术后第五周，将
Figure BDA0002946020820001572
减少，po，8mg/60kg；一天一次，持续7天；
(i)在手术后第六周，将
Figure BDA0002946020820001573
减少，po，6mg/60kg；一天一次，持续7天；
(j)在手术后第七周，将
Figure BDA0002946020820001574
减少，po，4mg/60kg；一天一次，持续7天。
局部用药：
(a)妥布霉素地塞米松：眼药水，一天一次，持续7天；
(b)妥布霉素地塞米松眼药膏：眼药水，一天一次，持续7天。
图19中提供了显示用药给药方案的示意图。
术后检查和复查
手术后第一天，患者接受术后眼科检查，包括视敏度、眼内压、裂隙灯检查、眼底检查、前段照相和眼底照相。手术后第二天，患者接受视敏度、眼内压、裂隙灯和眼底检查测试。手术后第三天，患者接受视敏度、眼内压、裂隙灯和眼底检查测试。
接受LHON眼部基因疗法的患者被告知在与医生预约的时间或者如果他们感到任何不适时去医院会诊。术后检查由专业人员进行。所有检查报告均由医务人员审查并签字。禁止非专业人员或不熟悉该领域的医务人员擅自检查患者或回答患者病情。
在进行所有检查前，使用酒精擦拭器械与患者之间的接触区域。检查完成后，给予抗生素眼药水。禁止将受污染的眼药水和眼药水滴入结膜囊。
结果
功效评估：
改善视力国际标准指南规定，视敏度提高0.3logMAR(15个字母)被认为是显著的改善，并且0.2logMAR(10个字母)的提高被认为是改善。提高低于0.1logMAR(5个字母)表示没有改善。导致视力提高0.2logMAR的治疗被认为是有效的。
在研究的第一阶段，共治疗145名患者。在治疗的一天内，24例(16.55％)显示出0.3logMAR的显著提高，并且6例(4.14％)显示出0.2logMAR的提高。治疗后一天的总功效为20.69％，其中2例(1.38％)出现视力丧失。治疗的2天内，35例(24.14％)显示出0.3logMAR的显著提高，12例(8.22％)显示出0.2logMAR的提高，并且总功效为32.41％。治疗的3天内，42例(28.96％)显示出0.3logMAR的显著提高，11例(7.59％)显示出0.2logMAR的提高，并且总功效为36.55％。这些结果汇总于下表5中。
表5.手术后3天的治疗功效
Figure BDA0002946020820001581
Figure BDA0002946020820001591
129名患者在手术后一个月完成复查。这些患者中，55名患者(42.66％)视力显著提高0.3logMAR，并且16名(12.40％)视力提高0.2logMAR。一个月复查表明，视力提高总有效率为55.04％。9名患者(6.98％)视力下降。67名患者在手术后三个月后完成复查。这些患者中，37名患者(55.22％)视力显著提高0.3logMAR，并且8名患者(11.94％)视力提高0.2logMAR。三个月复查表明，视力提高总有效率为67.16％。4名患者(5.97％)视力下降。最近，总共治疗了159名：64.66％的患者视力显著提高0.3logMAR，并且6.89％的患者视力提高0.2logMAR。治疗功效示于下表6中。
表6.手术后1个月和3个月的治疗功效
Figure BDA0002946020820001592
安全性结果：在研究的早期阶段共治疗了143名患者，包括7名阿根廷国际患者。发病时间分为两年和两年以上，定期进行安全性测试。我们在手术后三天、一个月和三个月检查眼部不良反应。手术后三天有21名患者轻度高眼压，这是轻度并发症，并且自行恢复而没有其它严重的并发症。手术后一个月有17名患者高眼压，并且手术后三个月仅有5名患者高眼压。没有其它不良反应。不良反应汇总于表7中。
表7.LHON的基因疗法的并发症
Figure BDA0002946020820001601
总共治疗了10名阿根廷患者。在手术后第3天进行的安全性检查显示没有安全性问题。在第10天进行的另一项安全性检查显示，一名受试者有轻度高眼压，在一个月内药物治疗之后恢复正常。在手术后第3天也进行了功效检查。这些阿根廷患者当中分别有50％和10％视力提高0.3logMAR和0.2logMAR。在一个月、三个月和六个月时分别有60％、90％和100％视力提高0.3logMAR。
GenSight Biologics进行了类似的研究：15名具有ND4-G11778A突变的受试者接受在视力较差的眼睛中单次玻璃体内注射rAAV2/2-ND4。研究设计包括48周的最初随访期，接着是另外4年的长期随访期。将患者分成两组：发病时为6个月和6至12个月。一般来说，发病时间较短的患者视神经细胞损伤较少，并且基因疗法预后最好。随着发病时间增加，预后变差。在所治疗的15名患者中，有10例高眼压，2名患者选择性白内障摘除，2名患者有重度前房炎症和玻璃体炎事件，并且有许多其它不良反应，如角膜炎、玻璃体出血、过敏性结膜炎和眼痛(参见表7)。参见Vignal等人，Ophthalmology 2018；6:945-947。
在Guy等人的单独研究中，14名LHON患者接受了单次玻璃体内注射AAV2Y444、500、730F)-P1ND4v2，随访18个月。将患者分成两组，一组发病时间超过12个月，另一组发病时间不到12个月。类似于GenSight Biologics，发病不到12个月的患者对基因疗法预后较好。观察到两例葡萄膜炎、1例角膜炎、1例眼痛和1例高眼压。参见Guy等人，Ophthalmology 2017；124:1621-1634。如下表8中所示，本公开的方法比GenSight Biologics或Guy等人的方法导致更少的手术后并发症。
表8.莱伯氏病基因疗法的并发症的比较
Figure BDA0002946020820001611
Figure BDA0002946020820001621
*轻微并发症(可自我恢复)
值得注意的是，本公开的方法没有导致任何手术后葡萄膜炎病例。葡萄膜炎被认为是严重的并发症，并且许多类型的葡萄膜炎需要用激素和免疫抑制剂治疗。在西方，约四分之一的葡萄膜炎患者需要激素和免疫抑制剂治疗，并且即使如此，35％的患者也有视力障碍。高眼压被认为是轻微并发症，并且是眼科手术中最常见的并发症。在正常情况下，患者自我恢复，并且眼内压恢复到正常水平。
总之，本公开的方法提供了LHON的安全有效治疗，并且未观察到严重的并发症。
进行类似的实验以评估包含SEQ ID NO:7的核酸序列的rAAV2的功效。预期这些结果显示施用rAAV2-SEQ5可安全有效地治疗眼部疾病。
实施例16–LHON基因疗法的诊断测定
在本实施例中，绿色荧光蛋白被用作rAAV2载体中的报告基因(rAAV2-GFP)。用来自不同患者的血清培养HEK293T细胞，并用rAAV2-GFP转导。采用RT-PCR或流式细胞术测定rAAV2的转导效率，以便确定rAAV2载体在患者血清存在下感染细胞的能力。本公开的方法可用于在用rAAV2载体治疗之前筛选患者，以鉴定对rAAV2载体具有低免疫反应(即，高rAAV2载体转导)和对rAAV2载体具有高免疫反应(即，低rAAV2载体转导)的那些患者。在此实施例中，对rAAV2载体具有低免疫反应的患者被归类为适合用rAAV2载体治疗的患者。
rAAV2-GFP病毒的制备
将HEK293T细胞以3.0×107个细胞/mL的密度接种在225cm2细胞培养瓶中的含10％牛血清的DMEM中，并在含5％CO2的37℃温育箱中培养过夜。当HEK293T细胞达到80-90％汇合时，弃去培养基，并使用Plasmid Trans II(VGTC)转染试剂盒，用rAAV2-GFP转染细胞。转染之后两天，收获HEK293T细胞，并将收集的细胞重新悬浮在PBS中，冷冻并解冻3次，然后分离、浓缩并纯化，以获得重组腺相关病毒rAAV2-GFP。测量滴度，并由广州派真生物技术有限公司定制产品。
患者血清的分离
收集来自患者的2mL全血，并离心以分离血清。将血清分别添加到两个管中，并在-20℃或-80℃下储存以备后用。将剩余的全血置于试管中。记录患者信息。
HEK293T细胞培养
灭菌：在使用前对端头(1mL、5mL、0mL)和EP管进行最少30分钟的高温灭菌和UV消毒。灭菌后，将端头和EP管储存长达12小时，其不会导致细胞污染。
细胞培养基制剂：1:9培养基制剂或1:4培养基制剂，保持在4℃下，其中1:9培养基制剂：将5mL胎牛血清、45mL DMEM高葡萄糖细胞培养基以及0.5mL或1mL青霉素(10000U/mL)和链霉素(10000/mL)添加到50mL离心管中并混合；1:4给药：将10mL胎牛血清、40mL DMEM高葡萄糖细胞培养基以及0.5mL或1mL青霉素(10000U/mL)和链霉素(10000/mL)添加到50mL离心管中并混合。
HEK293T细胞的传代和接种
从液氮中取出含有HEK293T细胞的冷冻管，并快速转移到37℃水浴中持续1-2分钟。解冻后，将冷冻管的外部部分用酒精擦拭，并置于4℃下的冰浴中。时而在水浴中摇动冷冻管，以确保热分布均匀。
消毒后，将HEK293T细胞转移到离心管中，并将10倍体积的高葡萄糖DMEM添加到细胞中。然后将悬浮液以1000rpm离心5分钟，弃去上清液，并将HEK293T细胞重新悬浮在培养基中。然后将细胞悬浮液转移到4mL培养基小瓶中，并将小瓶转移到温育箱中，以使HEK293T细胞贴附到小瓶壁上。细胞贴附后，小心地移除培养基，并添加5mL新鲜的培养基继续培养。将HEK293T细胞温育24小时后，更换培养基并使细胞生长，直到形成单层，然后将其用于细胞传代。每2至3天通过如下方式更换组织培养基，移除旧的培养基，用PBS冲洗细胞3次，并向细胞中添加新制备的培养基。
烧瓶中的细胞传代：一旦细胞达到汇合并具有圆形形状，则使用10mL移液管从烧瓶中移除培养基，并用5mL PBS将HEK293T细胞洗涤三次。洗涤后，将5mL EDTA添加到细胞中，温育3分钟，然后快速向烧瓶中添加20mL培养基。使用10mL移液管反复向培养物中吹入空气，直到细胞均匀地重新悬浮。将一半细胞悬浮液转移到另一个烧瓶中，并向两个烧瓶中添加培养基至体积为20mL。
24孔板中的细胞传代：一旦细胞达到汇合并具有圆形形状，则使用10mL移液管从烧瓶中移除培养基，并用5mL PBS将HEK293T细胞洗涤三次。洗涤后，将5mL EDTA添加到细胞中，温育3分钟，然后快速向烧瓶中添加50mL培养基。使用10mL移液管反复向培养物中吹入空气，直到细胞均匀地重新悬浮。将两mL细胞悬浮液分配到24孔板的每个孔中，将烧瓶固定至总体积为20mL，并将烧瓶和24孔板都置于温育箱中继续培养。一旦24孔板中的HEK293T细胞达到汇合(2-3天后)，细胞接受1.7mL新鲜培养基，并如下所述用rAAV2-GFP病毒转导。
在患者血清存在下在HEK293T细胞中转导rAAV2-GFP
病毒稀释液：将1μL的rAAV2-GFP稀释到40μL PBS中，并添加到4mL EP管中的1960μL高葡萄糖DMEM中。制成rAAV2-GFP稀释液后，将EP管密封件保持在4℃下。
如下制备患者血清和稀释的rAAV2-GFP：
(e)1:20组:300μL患者血清+300μL培养基+300μL病毒稀释液(1:3工作稀释液)；
(f)1:60组:100μL患者血清+500μL培养基+300μL病毒稀释液(1:9工作稀释液)；
(g)对照组:600μL培养基(或300μL PBS+300μL培养基)+300μL病毒稀释液。
rAAV2-GFP转导：将300μL患者血清/来自1:20组、1:60组和对照组的rAAV2-GFP添加到HEK293T细胞的每个孔中，并在转导之后温育48小时。每组一式三份进行实验。
实施例17-rAAV2-GFP表达的RT-PCR分析
使用TRIZOL从转导的HEK293T细胞中分离总RNA，并通过逆转录合成cDNA。使用Primer Premier 5设计用于RT-PCR分析的引物并显示如下：
(a)β-肌动蛋白-F：cctagaagcatttgcggt(SEQ ID NO:167)
(b)β-肌动蛋白-R：gagctacgagctgcctga(SEQ ID NO:168)
(c)GFP-F：acaagttcagcgtgtccg(SEQ ID NO:163)
(d)GFP-R：ctcgttggggtctttgct(SEQ ID NO:164)
对于qRT-PCR分析，制备含有5μL SYBR绿、8μL ddH2O、正向和反向引物各1μL和2.5μL cDNA的反应混合物。将反应混合物以25μL的总体积添加到0.2mL PCR反应管中。将每个样品一式三份进行分析。为了减少误差，在每个PCR反应管中混合试剂，然后分配。添加样品后，通过如下方式在RT-PCR检测系统上进行定量RT-PCR：在95℃下预变性1s，在94℃下变性15s，在55℃下退火15s，并在72℃下延伸45s，总共40个循环。在每个循环的延伸阶段期间收集荧光信号。在每个循环后，进行94℃-55℃的熔解曲线分析。
相对表达值＝GFP表达水平/β-肌动蛋白，并且GFP的表达水平和内部参考基因的表达水平为1。GFP表达水平的筛选标准如下：
(a)低表达＝相对表达值<0.2
(b)中等表达＝0.2≤相对表达值<0.6
(c)高表达＝0.6≤相对表达值；
GFP的高表达和中等表达指示患者的血清不含防止HEK293T细胞感染的抗rAAV2抗体，并且针对病毒的免疫反应的可能性低。这些患者被鉴定为适合基因疗法的患者。低GFP表达指示患者的血清含有防止HEK293T细胞感染的抗rAAV2抗体，并且rAAV基因疗法可引起免疫反应，需要患者在基因疗法治疗之前接受免疫疗法。结果示于下表9中。
表9.在HEK293T细胞+患者血清中通过qPCR测定的GFP表达
Figure BDA0002946020820001671
实施例18–通过流式细胞术测定的HEK293T细胞中的GFP表达
将用rAAV2-GFP转导的HEK293T细胞重新悬浮在孔中，并转移到流式细胞仪管中。使用Beckman Coulter Cyto FLEX S测定HEK293T细胞中的GFP表达。
未转导的细胞(无药物)用作GFP表达的阴性对照(数据未显示)。在没有患者血清情况下用rAAV2-GFP载体转导的细胞用作GFP表达的阳性对照(实施例16中描述的对照组)。对照组的感染效率设定为50％。表10中示出与来自患者A的血清稀释液一起温育后的HEK293T细胞中的GFP表达，表11中示出与来自患者B的血清稀释液一起温育后的HEK293T细胞中的GFP表达，表12中示出与来自患者C的血清稀释液一起温育后的HEK293T细胞中的GFP表达，表13中示出与来自患者D的血清稀释液一起温育后的HEK293T细胞中的GFP表达，表14中示出与来自患者E的血清稀释液一起温育后的HEK293T细胞中的GFP表达。
表10.HEK293T细胞+患者A血清中的GFP表达％
重复实验 1:20 1:60 对照组
1 25.80 37.63 48.56
2 25.03 36.21 52.09
3 25.51 40.32 50.07
平均GFP+细胞％ 25.45 38.05 50.24
表11.HEK293T细胞+患者B血清中的GFP表达％
重复实验 1:20 1:60 对照组
1 33.90 36.59 48.26
2 29.05 33.84 53.88
3 31.35 33.86 51.37
平均GFP+细胞％ 31.43 34.76 51.17
表12.HEK293T细胞+患者C血清中的GFP表达％
重复实验 1:20 1:60 对照组
1 31.45 38.16 51.56
2 28.92 33.60 50.09
3 30.41 36.58 50.33
平均GFP+细胞％ 30.26 36.11 50.66
表13.HEK293T细胞+患者D血清中的GFP表达％
Figure BDA0002946020820001681
Figure BDA0002946020820001691
表14.HEK293T细胞+患者E血清中的GFP表达％
重复实验 1:20 1:60 对照组
1 12.07 15.85 49.00
2 16.27 16.94 53.88
3 13.70 14.07 50.37
平均GFP+细胞％ 14.01 15.62 51.08
GFP表达(即，通过流式细胞术测定为GFP+的细胞的百分比)可表示为绝对荧光(测试样品中GFP+细胞的百分比；如表10-14中所示)或相对荧光([测试样品中GFP+细胞的百分比/对照样品中GFP+细胞的百分比]*100；如表15中的“相对GFP荧光”列中所示)。通过相对GFP表达筛选患者的标准如下：
(a)低表达＝％GFP+细胞<20％
(b)中等表达＝20％≤％GFP+细胞<40％
(c)高表达＝40％≤％GFP+细胞
高GFP表达和中等GFP表达指示患者的血清不含防止靶细胞感染的抗rAAV2抗体，并且可以进行基因疗法。低GFP表达指示患者的血清含有防止靶细胞感染的抗rAAV2抗体，并且用rAAV进行的基因疗法可引起免疫反应，并且免疫疗法应在进行基因疗法之前进行。
患者A、B、C和D的GFP表达均高于20％(如表10-14中所示，表明患者血清不含防止靶细胞感染的抗rAAV2抗体，并且可直接进行基因疗法。特别地，患者D的GFP表达水平高于40％，表明该患者处于进行基因疗法的理想条件(表13)。患者E测试的GFP表达水平低于20％(表14)，表明用rAAV2进行的基因疗法可引起免疫反应，并且在开始治疗之前需要进行免疫疗法。
实施例19–基因疗法在对rAAV2免疫力低的患者中的功效
本发明人首先发现了GFP表达与基因疗法之间的关系。在现有技术中没有相关报道，并且在本领域中还没有建立起特异性表达水平与基因疗法效果之间关系的标准。
在临床中，本发明人意外地发现，GFP表达水平低于20％的受试者经历对rAAV2基因疗法的免疫反应，并且出于安全性原因，没有被进一步包括在研究中。表达水平高于50％的受试者少见，因此本实施例的目的是验证表达水平介于20％与50％之间的受试者。
如上所述(实施例16-18)，针对对重组腺相关病毒的免疫反应筛选基因疗法的候选者。实施例15中描述了患者招募指南以及术前和术后检查程序。局部麻醉下的玻璃体内注射剂量为1×1010vg/0.05mL。进行单次施用。临床观察持续3个月，并且随着时间的推移观察视敏度。
根据GFP+细胞％将受试者分组：A组＝高GFP表达(40％≤GFP+细胞％≤50％)和B组＝中等GFP表达(20％≤GFP+细胞％<40％)。用rAAV2-GFP转导靶细胞，使得对照组中大约50％的细胞被载体转导。在20-50％GFP+范围内，本发明人发现了表达水平与基因疗法效果之间的关系。在GFP+细胞％低于40％的受试者中，基因疗法比GFP+细胞％大于或等于40％的受试者效果稍差。因此，建立了低表达、中等表达和高表达的上述标准。
结果示于表15中。A组(高表达)的基因疗法的疗效显著高于B组(中等表达)(P<0.05)。实施例15中描述了评估效率和视敏度的指导原则。
表15.A组与B组之间的功效比较
Figure BDA0002946020820001711
实施例20–筛选LHON基因疗法的患者
上述诊断测定的有效性在另外的患者中得到了进一步验证。将来自37名患者的血清如上面在实施例16中所述进行稀释，并在上面实施例17和18中描述的qPCR和流式细胞术测定中进行评价。每个样品的测试重复3次(n＝3)，并获得平均值(即，平均GFP+细胞％)。相对于对照样品的平均GFP+细胞％计算1:20和1:60稀释液的相对GFP+细胞％，并基于相对GFP+细胞％将受试者分类为适合或不适合用rAAV2载体治疗(适合治疗＝相对GFP+细胞％≥40％；不适合治疗＝相对GFP+细胞％<40％)。采用本文所述的方法，28名患者被归类为适合治疗，9名患者被归类为不适合治疗。37名受试者的结果示于表16中。
表16.GFP+HEK293T细胞％+患者血清
Figure BDA0002946020820001712
Figure BDA0002946020820001721
Figure BDA0002946020820001731
分类为适合治疗的28名患者接受了rAAV2基因疗法载体。在接受治疗的28名患者中，治疗对20名患者有效(有效率71.43％(20/28))。在分类为不适合治疗的9名患者中，6名患者仍然想要接受基因疗法。然而，该治疗仅对一名分类为不适合治疗的患者有效(有效率16.67％(1/6))。
实施例21–LHON基因疗法的泼尼松治疗方案
本研究将按照如实施例15中所述的患者招募指南、手术和检查程序进行。
接受LHON基因疗法的患者将接受以下治疗方案：
(a)手术前2天：泼尼松片剂，60mg/60kg，每天一次，持续10天；
(b)手术后8天：泼尼松片剂，40mg/60kg，每天一次，持续1天；
(c)手术后9天：泼尼松片剂，20mg/60kg，每天一次，持续1天；
(d)手术后10天：泼尼松片剂，10mg/60kg，每天一次，持续1天；
(e)手术后11天：停止类固醇治疗。
图20中提供了显示用药给药方案的示意图。手术之后将对患者进行3个月的监测，并且如果他们在整个研究过程中感觉到任何不适或疼痛，则建议咨询医生。
在AAV2-ND4的玻璃体内施用和上述治疗方案之后，预期结果将显示LHON患者视敏度提高且副作用最小。
虽然本文示出并描述了本发明优选的实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，这类实施方案仅是作为示例提供的。本领域技术人员在不偏离本发明的情况下将会设想许多变动、更改和替换。应当理解的是，在实施本发明时可采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等同表述的范围内的方法和结构。
进一步编号的实施方案
在下面编号的实施方案中提供本发明进一步的实施方案：
实施方案1.一种重组核酸，其包含：线粒体靶向序列；线粒体蛋白编码序列，其包含与选自由SEQ ID NO:7、8、10和12组成的组的序列具有至少99％同一性的序列；和3’UTR核酸序列。
实施方案2.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列编码如下多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:129-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的肽序列。
实施方案3.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQID NO:2中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案4.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQID NO:3中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案5.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQID NO:4中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案6.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQID NO:5中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案7.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:7或8中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案8.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:10中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案9.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:12中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案10.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案11.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含与SEQID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案12.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与选自由SEQID NO:17-20、23-24、27-28、31-34、37-38、41-42、45-48、51-52、55-56、59-62、65-66、69-70、73-76、79-80和83-84组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案13.一种重组核酸，其包含：线粒体靶向序列，其包含与选自由SEQ IDNO:2、3、4和5组成的组的序列具有至少90％同一性的序列；线粒体蛋白编码序列，其中所述线粒体蛋白编码序列编码包含线粒体蛋白的多肽；和3’UTR核酸序列。
实施方案14.如实施方案13所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQID NO:2中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案15.如实施方案13-14中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:3中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案16.如实施方案13-15中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案17.如实施方案13-16中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:5中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案18.如实施方案13-17中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。
实施方案19.如实施方案18所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含NADH脱氢酶4(ND4)或其变体。
实施方案20.如实施方案13-19中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:160中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的肽序列。
实施方案21.如实施方案13-20中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6、7或8中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案22.如实施方案18所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含NADH脱氢酶6(ND6)或其变体。
实施方案23.如实施方案13-22中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:161中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案24.如实施方案13-23中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:9或10中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案25.如实施方案13-24中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含NADH脱氢酶1(ND1)或其变体。
实施方案26.如实施方案13-25中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:162中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案27.如实施方案13-26中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:11或12中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案28.如实施方案13-27中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
实施方案29.如实施方案13-28中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。
实施方案30.如实施方案13-29中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案31.如实施方案13-29中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案32.如实施方案13-31中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。
实施方案33.如实施方案13-32中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
实施方案34.如实施方案13-33中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:29-84组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案35.一种重组核酸，其包含：线粒体靶向序列；线粒体蛋白编码序列，其包含与选自由SEQ ID NO:7、8、10和12组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列；和3’UTR核酸序列。
实施方案36.如实施方案35所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含编码选自由以下组成的组的多肽的序列：hsCOX10、hsCOX8、scRPM2、lcSirt5、tbNDUS7、ncQCR2、hsATP5G2、hsLACTB、spilv1、gmCOX2、crATP6、hsOPA1、hsSDHD、hsADCK3、osP0644B06.24-2、粗糙脉孢菌ATP9(ncATP9)、hsGHITM、hsNDUFAB1、hsATP5G3、crATP6_hsADCK3、ncATP9_ncATP9、zmLOC100282174、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9、zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6_hsATP5G3、zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3、ncATP9_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6_hsATP5G3、crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3、hsADCK3_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9和ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9。
实施方案37.如实施方案35-36中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:129-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的肽序列。
实施方案38.如实施方案35-37中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:2或3中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案39.如实施方案35-38中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案40.如实施方案35-39中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:5中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案41.如实施方案35-40中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:7或8中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案42.如实施方案35-41中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:10中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案43.如实施方案35-42中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:12中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案44.如实施方案35-43中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
实施方案45.如实施方案35-44中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。
实施方案46.如实施方案35-45中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案47.如实施方案35-46中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案48.如实施方案35-47中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。
实施方案49.如实施方案35-48中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
实施方案50.如实施方案35-49中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:17-20、23-24、27-28、31-34、37-38、41-42、45-48、51-52、55-56、59-62、65-66、69-70、73-76、79-80和83-84组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案51.一种重组核酸，其包含与选自由SEQ ID NO:2、3和4组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的线粒体靶向序列。
实施方案52.如实施方案51所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQID NO:2中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案53.如实施方案51-52中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:3中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案54.如实施方案51-53中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案55.如实施方案51-54中任一项所述的重组核酸，其进一步包含线粒体蛋白编码序列，其中所述线粒体蛋白编码序列编码包含线粒体蛋白的多肽。
实施方案56.如实施方案51-55中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。
实施方案57.如实施方案51-56中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含NADH脱氢酶4(ND4)或其变体。
实施方案58.如实施方案51-57中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:160中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的肽序列。
实施方案59.如实施方案51-58中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:6、7或8中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案60.如实施方案51-59中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含NADH脱氢酶6(ND6)或其变体。
实施方案61.如实施方案51-60中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:161中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案62.如实施方案51-61中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:9或10中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案63.如实施方案51-62中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含NADH脱氢酶1(ND1)或其变体。
实施方案64.如实施方案51-63中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白包含与SEQ ID NO:162中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案65.如实施方案51-64中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:11或12中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案66.如实施方案51-65中任一项所述的重组核酸，其进一步包含3’UTR核酸序列。
实施方案67.如实施方案51-66中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
实施方案68.如实施方案51-67中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。
实施方案69.如实施方案51-68中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案70.如实施方案51-69中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案71.如实施方案51-70中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。
实施方案72.如实施方案51-71中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
实施方案73.如实施方案51-72中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:29-70组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案74.一种重组核酸，其包含线粒体蛋白编码序列，其中所述线粒体蛋白编码序列编码包含线粒体蛋白的多肽，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与选自由SEQ IDNO:7、8、10和12组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案75.如实施方案74所述的重组核酸，其进一步包含线粒体靶向序列。
实施方案76.如实施方案74-75中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含编码选自由以下组成的组的多肽的序列：hsCOX10、hsCOX8、scRPM2、lcSirt5、tbNDUS7、ncQCR2、hsATP5G2、hsLACTB、spilv1、gmCOX2、crATP6、hsOPA1、hsSDHD、hsADCK3、osP0644B06.24-2、粗糙脉孢菌ATP9(ncATP9)、hsGHITM、hsNDUFAB1、hsATP5G3、crATP6_hsADCK3、ncATP9_ncATP9、zmLOC100282174、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_ncATP9、zmLOC100282174_hsADCK3_crATP6_hsATP5G3、zmLOC100282174_hsADCK3_hsATP5G3、ncATP9_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6_hsATP5G3、crATP6_hsADCK3_zmLOC100282174_hsATP5G3、hsADCK3_zmLOC100282174、hsADCK3_zmLOC100282174_crATP6、ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_GNFP_ncATP9和ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncATP9。
实施方案77.如实施方案74-76中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:129-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的肽序列。
实施方案78.如实施方案74-77中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:2中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案79.如实施方案74-78中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:3中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案80.如实施方案74-79中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:4中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案81.如实施方案74-80中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列包含与SEQ ID NO:5中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案82.如实施方案74-81中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:7或8中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案83.如实施方案74-80中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:10中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案84.如实施方案74-83中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体蛋白编码序列包含与SEQ ID NO:12中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案85.如实施方案74-84中任一项所述的重组核酸，其进一步包含3’UTR核酸序列。
实施方案86.如实施方案74-85中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
实施方案87.如实施方案74-86中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：hsACO2、hsATP5B、hsAK2、hsALDH2、hsCOX10、hsUQCRFS1、hsNDUFV1、hsNDUFV2、hsSOD2、hsCOX6c、hsIRP1、hsMRPS12、hsATP5J2、rnSOD2和hsOXA1L。
实施方案88.如实施方案74-87中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案89.如实施方案74-88中任一项所述的重组核酸，其中所述3’UTR核酸序列包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案90.如实施方案74-89中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列位于所述3’UTR核酸序列的5’。
实施方案91.如实施方案74-90中任一项所述的重组核酸，其中所述线粒体靶向序列位于所述线粒体靶向序列的3’。
实施方案92.如实施方案74-91中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:17-20、23-24、27-28、31-34、37-38、41-42、45-48、51-52、55-56、59-62、65-66、69-70、73-76、79-80和83-84组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案93.一种病毒载体，其包含实施方案1-92中任一项的所述重组核酸。
实施方案94.如实施方案93所述的病毒载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
实施方案95.如实施方案94所述的病毒载体，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV1载体、AAV2载体、AAV3载体、AAV4载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV7载体、AAV8载体、AAV9载体、AAV10载体、AAV11载体、AAV12载体、AAV13载体、AAV14载体、AAV15载体和AAV16载体。
实施方案96.如实施方案93-95中任一项所述的病毒载体，其中所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体。
实施方案97.如实施方案96所述的病毒载体，其中所述rAAV载体是rAAV2载体。
实施方案98.一种包含腺相关病毒(AAV)的药物组合物，所述腺相关病毒包含实施方案1-92中任一项的所述重组核酸。
实施方案99.如实施方案98所述的药物组合物，其进一步包含其药学上可接受的赋形剂。
实施方案100.一种药物组合物，其包含实施方案93-97中任一项的所述病毒载体及其药学上可接受的赋形剂，其中所述病毒载体包含实施方案1-92中任一项的所述重组核酸。
实施方案101.一种药物组合物，其包含：包含实施方案1-92中任一项所述的重组核酸的腺相关病毒(AAV)，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:15中列出的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列；和药学上可接受的赋形剂。
实施方案102.如实施方案98-101中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-脱水海藻糖、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、聚山梨醇酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188或其任意组合。
实施方案103.如实施方案98-102中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂选自磷酸盐缓冲盐水(PBS)、α,α-脱水海藻糖、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、聚山梨醇酯20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、泊洛沙姆188及其任意组合。
实施方案104.如实施方案102所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包括泊洛沙姆188。
实施方案105.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包括0.0001％-0.01％泊洛沙姆188。
实施方案106.如实施方案105所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包括0.001％泊洛沙姆188。
实施方案107.如实施方案98-106中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂进一步包括一种或多种盐。
实施方案108.如实施方案107所述的药物组合物，其中所述一种或多种盐包括NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4和KH2PO4。
实施方案109.如实施方案107所述的药物组合物，其中所述一种或多种盐包括80mM NaCl、5mM NaH2PO4、40mM Na2HPO4和5mM KH2PO4。
实施方案109.1.如实施方案107所述的药物组合物，其中所述一种或多种盐包括NaCl、Na2HPO4和KH2PO4。
实施方案109.2.如实施方案107所述的药物组合物，其中所述一种或多种盐包括154mM NaCl、5.6mM Na2HPO4和8.4mM KH2PO4。
实施方案110.如实施方案98-109中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为6-8。
实施方案111.如实施方案110所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为7.2-7.4。
实施方案112.如实施方案111所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为7.3。
实施方案113.如实施方案98-112中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的病毒滴度为至少1.0×1010vg/mL。
实施方案114.如实施方案113所述的药物组合物，其中所述药物组合物的病毒滴度为至少5.0×1010vg/mL。
实施方案115.如实施方案98-114中任一项所述的药物组合物，当所述药物组合物经受五个冷冻/解冻循环时，与所述五个冷冻/解冻循环之前的病毒滴度相比，所述药物组合物保持至少60％、70％、80％或90％的病毒滴度。
实施方案116.如实施方案98-115中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物在向患有莱伯氏遗传性视神经病变的患者施用时比没有所述重组核酸的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。
实施方案117.如实施方案98-116中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物在向患有莱伯氏遗传性视神经病变的患者施用时比包含SEQ ID NO:15中列出的重组核酸的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。
实施方案118.一种治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用实施方案98-117中任一项的所述药物组合物。
实施方案119.如实施方案118所述的方法，其中所述眼部病症是莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)。
实施方案120.如实施方案118或119所述的方法，其包括向所述患者的单眼或双眼施用所述药物组合物。
实施方案121.如实施方案118-120中任一项所述的方法，其中经由眼内注射或玻璃体内注射施用所述药物组合物。
实施方案122.如实施方案121所述的方法，其中经由玻璃体内注射施用所述药物组合物。
实施方案123.如实施方案122所述的方法，其中经由玻璃体内注射施用约0.01-0.1mL的所述药物组合物。
实施方案124.如实施方案123所述的方法，其中经由玻璃体内注射施用约0.05mL的所述药物组合物。
实施方案125.如实施方案118-124中任一项所述的方法，其进一步包括向所述患者施用甲泼尼龙。
实施方案126.如实施方案125所述的方法，其中在所述药物组合物的所述玻璃体内注射之前施用所述甲泼尼龙。
实施方案127.如实施方案125-126中任一项所述的方法，其中口服施用所述甲泼尼龙。
实施方案128.如实施方案125-127中任一项所述的方法，其中在所述药物组合物的所述玻璃体内注射之前每日施用所述甲泼尼龙持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。
实施方案129.如实施方案125-128中任一项所述的方法，其中每日施用所述甲泼尼龙。
实施方案130.如实施方案125-129中任一项所述的方法，其中施用约32mg/60kg甲泼尼龙的日剂量。
实施方案131.如实施方案125-130中任一项所述的方法，其中在所述药物组合物的所述玻璃体内注射后施用所述甲泼尼龙。
实施方案132.如实施方案125-131中任一项所述的方法，其进一步包括向所述患者施用磷酸肌酸钠。
实施方案133.如实施方案132所述的方法，其中静脉内施用所述磷酸肌酸钠。
实施方案134.如实施方案125-133中任一项所述的方法，其中静脉内或口服施用所述甲泼尼龙。
实施方案135.如实施方案125-134中任一项所述的方法，其包括静脉内施用甲泼尼龙持续至少一天，接着口服施用甲泼尼龙持续至少一周。
实施方案136.如实施方案135所述的方法，其包括静脉内施用甲泼尼龙持续约3天，接着口服施用甲泼尼龙持续约6周。
实施方案137.如实施方案125-136中任一项所述的方法，其中以约80mg/60kg的日剂量静脉内施用所述甲泼尼龙。
实施方案138.如实施方案125-137中任一项所述的方法，其中所述施用所述药物组合物比没有所述重组核酸的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。
实施方案139.如实施方案125-138中任一项所述的方法，其中所述施用所述药物组合物比包含SEQ ID NO:15中列出的重组核酸的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。
实施方案140.一种治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列；(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列，所述核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列；和(iii)3’UTR核酸序列；以及(b)包含类固醇的第二药物组合物。
实施方案141.如实施方案140所述的方法，其中编码所述线粒体蛋白的所述核酸序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:160-162组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
实施方案142.如实施方案140或实施方案141所述的方法，其中所述编码线粒体靶向肽的核酸序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:126-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
实施方案143.如实施方案140-142中任一项所述的方法，其中所述编码线粒体靶向肽的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
实施方案144.如实施方案140-143中任一项所述的方法，其中所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
实施方案145.一种治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列，所述线粒体靶向肽包含与选自由SEQ ID NO:126-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列；和(iii)3’UTR核酸序列；以及(b)包含类固醇的第二药物组合物。
实施方案146.如实施方案145所述的方法，其中所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。
实施方案147.如实施方案146所述的方法，其中所述编码线粒体蛋白的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
实施方案148.如实施方案146或147所述的方法，其中编码线粒体蛋白的核酸序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:160-162组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
实施方案149.如实施方案146-148中任一项所述的方法，其中所述编码线粒体靶向肽的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
实施方案150.如实施方案146-149中任一项所述的方法，其中所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案151.一种治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列，所述线粒体靶向肽包含与选自由SEQ ID NO:126-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列，所述核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列；和(iii)与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的3’UTR核酸序列；以及(b)包含类固醇的第二药物组合物。
实施方案152.一种治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列；和(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列；以及(iii)包含类固醇的第二药物组合物。
实施方案153.如实施方案152所述的方法，其中所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。
实施方案154.如实施方案152或153所述的方法，其中所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
实施方案155.如实施方案140-154中任一项所述的方法，其中所述重组核酸包含与选自由SEQ ID NO:15-84组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案156.如实施方案140-155中任一项所述的方法，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
实施方案157.如实施方案140-156中任一项所述的方法，其中经由眼内注射或玻璃体内注射施用所述第一药物组合物。
实施方案158.如实施方案140-157中任一项所述的方法，其中经由玻璃体内注射施用约0.01-0.1mL的所述第一药物组合物。
实施方案159.如实施方案140-158中任一项所述的方法，其中经由玻璃体内注射施用约0.05mL的所述第一药物组合物。
实施方案160.如实施方案140-159中任一项所述的方法，其中向所述患者的单眼或双眼施用所述第一药物组合物。
实施方案161.如实施方案140-160中任一项所述的方法，其中所述类固醇选自由以下组成的组：二丙酸阿氯米松、安西奈德、二丙酸倍氯米松、倍他米松、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠和醋酸钠、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、新戊酸氯可托龙、皮质醇(氢化可的松)、醋酸皮质醇(氢化可的松)、丁酸皮质醇(氢化可的松)、环戊丙酸皮质醇(氢化可的松)、皮质醇(氢化可的松)磷酸钠、皮质醇(氢化可的松)琥珀酸钠、戊酸皮质醇(氢化可的松)、醋酸可的松、地奈德、去氧米松、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、二醋酸二氟拉松、醋酸氟氢可的松、氟尼缩松、醋酸肤轻松、氟轻松醋酸酯、氟米龙、氟氢缩松、哈西奈德、甲羟松、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠、糠酸莫米松、醋酸帕拉米松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、丁乙酸泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、曲安奈德、二醋酸曲安西龙和己曲安奈德或其合成类似物。
实施方案162.如实施方案140-161所述的方法，其中所述类固醇是糖皮质激素。
实施方案163.如实施方案162所述的方法，其中所述糖皮质激素是甲泼尼龙或泼尼松。
实施方案164.如实施方案163所述的方法，其中所述甲泼尼龙被配制为片剂或用于静脉内施用的液体。
实施方案165.如实施方案140-164中任一项所述的方法，其中口服或静脉内施用所述类固醇。
实施方案166.如实施方案140-165中任一项所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物之前施用所述类固醇。
实施方案167.如实施方案166所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物之前每日施用所述类固醇持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。
实施方案168.如实施方案167所述的方法，其中所述类固醇是甲泼尼龙，并且以约30mg/60kg至约40mg/60kg或约30mg至约40mg的日剂量施用。
实施方案169.如实施方案168所述的方法，其中甲泼尼龙的日剂量为约32mg/60kg或32mg。
实施方案170.如实施方案168所述的方法，其中所述类固醇是泼尼松，并且以约50mg/60kg至约70mg/60kg的日剂量施用。
实施方案171.如实施方案170所述的方法，其中泼尼松的日剂量为约60mg/60kg。
实施方案172.如实施方案140-171中任一项所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物后施用所述类固醇。
实施方案173.如实施方案172所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物后每日施用所述类固醇持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周或至少15周。
实施方案174.如实施方案173所述的方法，其中所述类固醇是甲泼尼龙，并且以介于约70mg/60kg与90mg/60kg之间或介于约70mg与90mg之间的日剂量施用。
实施方案175.如实施方案174所述的方法，其中甲泼尼龙的日剂量为约80mg/60kg或80mg。
实施方案176.如实施方案174或175所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物后施用甲泼尼龙持续至少两天。
实施方案177.如实施方案176所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物后每日施用甲泼尼龙的后续剂量持续至少7周，并且其中甲泼尼龙的剂量逐周减少。
实施方案178.如实施方案173所述的方法，所述类固醇是泼尼松，并且以介于约50mg/60kg与70mg/60kg之间或介于约50mg与约70mg之间的日剂量施用。
实施方案179.如实施方案178所述的方法，其中泼尼松的日剂量为约60mg/60kg或约60mg。
实施方案180.如实施方案178或179所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物后施用泼尼松持续至少七天。
实施方案181.如实施方案180所述的方法，其中七天后，以介于约30mg/60kg与约50mg/60kg之间或介于约30mg与50mg之间的日剂量施用泼尼松。
实施方案182.如实施方案181所述的方法，其中泼尼松的日剂量为约40mg/60kg或40mg。
实施方案183.如实施方案182所述的方法，其中每日施用泼尼松的后续剂量持续至少4天，并且其中泼尼松的剂量逐日减少。
实施方案184.如实施方案140-183中任一项所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物之前和之后施用所述类固醇。
实施方案185.如实施方案184所述的方法，其中所述类固醇是甲泼尼龙，并且在施用所述第一药物化合物之前每日施用持续至少七天，并且在施用所述第一药物化合物后每日施用持续至少7周。
实施方案186.如实施方案185所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物之前以约32mg/60kg或32mg的日剂量施用甲泼尼龙。
实施方案187.如实施方案185或186所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后以约80mg/60kg或80mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少2天。
实施方案188.如实施方案187所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后三天开始，以约40mg/60kg或40mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少4天。
实施方案189.如实施方案188所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后一周开始，以约32mg/60kg或32mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
实施方案190.如实施方案189所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后两周开始，以约24mg/60kg或24mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
实施方案191.如实施方案190所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后三周开始，以约16mg/60kg或16mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
实施方案192.如实施方案191所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后四周开始，以约8mg/60kg或8mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
实施方案193.如实施方案192所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后五周开始，以约6mg/60kg或6mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
实施方案194.如实施方案193所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后六周开始，以约4mg/60kg或4mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
实施方案195.如实施方案194所述的方法，其中所述类固醇是泼尼松，并且在施用所述第一药物化合物之前每日施用持续至少两天，并且在施用所述第一药物化合物后每日施用持续至少十一天。
实施方案196.如实施方案195所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物之前以约60mg/60kg或60mg的日剂量施用泼尼松。
实施方案197.如实施方案195或196所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后以约60mg/60kg或60mg的日剂量施用泼尼松持续至少七天。
实施方案198.如实施方案197所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后八天，以约40mg/60kg或40mg的日剂量施用泼尼松持续至少一天。
实施方案199.如实施方案198所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后九天，以约20mg/60kg或20mg的日剂量施用泼尼松持续至少一天。
实施方案200.如实施方案199所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后十天，以约10mg/60kg或10mg的日剂量施用泼尼松持续至少一天。
实施方案201.如权利要求140-200中任一项所述的方法，其进一步包括向所述患者施用磷酸肌酸钠。
实施方案202.如实施方案201所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物之前和/或之后静脉内施用所述磷酸肌酸钠。
实施方案203.如实施方案140-202中任一项所述的方法，其中施用所述第一药物组合物比和第二药物组合物比在没有所述第二药物组合物情况下施用的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。
实施方案204.如实施方案140-203中任一项所述的方法，其中施用所述第一药物组合物比和第二药物组合物比在没有所述第二药物组合物情况下施用的相当的药物组合物产生更低的不良事件发生率。
实施方案205.如实施方案204所述的方法，其中所述不良事件选自前房炎症、玻璃体炎、高眼压、白内障摘除、角膜炎、玻璃体出血、过敏性结膜炎和眼痛。
实施方案206.如实施方案203-205中任一项所述的方法，其中在患有所述眼部病症的患者群体中确定所述更高的平均视力恢复和所述更低的不良事件发生率。
实施方案207.如实施方案206所述的方法，其中所述患者群体是种族匹配的。
实施方案208.如实施方案207所述的方法，其中所述患者群体是中国人或阿根廷人。
实施方案209.如实施方案140-208中任一项所述的方法，其中所述眼部病症是莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)。
实施方案210.如实施方案140-209中任一项所述的方法，其中所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AA8、AAV9和AAV10。
实施方案211.如实施方案140-210中任一项所述的方法，其中所述AAV是AAV2。
实施方案212.一种筛选治疗眼部病症的患者的方法，所述方法包括：(a)获得来自患者的血清样品；(b)在所述血清样品存在下将靶细胞群与包含腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养，所述腺相关病毒包含编码可检测标记的重组核酸；并且(c)在所述培养后检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平，其中如果所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值，则选择所述患者进行所述治疗。
实施方案213.一种治疗有需要的患者的眼部病症的方法，其包括：(a)获得来自患者的血清样品；(b)在所述血清样品存在下将靶细胞群与包含第一腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养，所述第一腺相关病毒包含编码可检测标记的第一重组核酸；(c)检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平；并且(d)向所述患者施用包含第二AAV的药物组合物，所述第二AAV包含第二重组核酸，其中所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值。
实施方案214.如实施方案212或213所述的方法，其中所述可检测标记是荧光蛋白。
实施方案215.如实施方案214所述的方法，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。
实施方案216.如实施方案212-215中任一项所述的方法，其中通过流式细胞术或qPCR检测所述可检测标记。
实施方案217.如实施方案212-216中任一项所述的方法，其中当通过流式细胞术检测时，所述预定阈值是表达所述可检测标记的细胞的约40％。
实施方案218.如实施方案212-216中任一项所述的方法，其中当通过qPCR检测时，所述预定阈值是约0.6的所述可检测标记的相对表达水平。
实施方案219.如实施方案212-218中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是HEK-293T细胞。
实施方案220.如实施方案212-219中任一项所述的方法，其中所述治疗是包含编码线粒体蛋白的核酸序列的重组AAV。
实施方案221.如实施方案220所述的方法，其中所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。
实施方案222.如实施方案212-221中任一项所述的方法，其中所述患者包含选自以下的突变：ND4基因中的G11778A、ND1基因中的G3460A和ND6基因中的T14484C。
实施方案223.如实施方案212-222中任一项所述的方法，其中所述培养步骤为至少12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长。
实施方案224.一种试剂盒，其包含：包含编码可检测标记的重组核酸的腺相关病毒(AAV)、靶细胞群和一种或多种用于检测所述可检测标记的试剂。
实施方案225.如实施方案224所述的试剂盒，其进一步包含用于用所述AAV转染所述靶细胞群的转染试剂。
实施方案225.如实施方案224或225所述的试剂盒，其进一步包含第二AAV，所述第二AAV包含编码线粒体蛋白的重组核酸。
实施方案225.如实施方案224所述的试剂盒，其中用于检测所述可检测标记的所述一种或多种试剂选自与所述可检测标记结合的抗体和一种或多种对编码所述可检测标记的所述重组核酸具有特异性的引物寡核苷酸。
以引用的方式并入
本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请出于所有目的以全文引用的方式并入。然而，提及本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请并不被且不应被视为承认或以任何形式暗示它们在世界上任何国家构成有效的现有技术或构成公知常识的一部分。
序列表
<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司
<120> 用于治疗莱伯氏遗传性视神经病变的组合物和方法
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<223> opt_ND4
<400> 7
atgctgaagc tgatcgtgcc caccatcatg ctgctgcctc tgacctggct gagcaagaaa 60
cacatgatct ggatcaacac caccacgcac agcctgatca tcagcatcat ccctctgctg 120
ttcttcaacc agatcaacaa caacctgttc agctgcagcc ccaccttcag cagcgaccct 180
ctgacaacac ctctgctgat gctgaccacc tggctgctgc ccctcacaat catggcctct 240
cagagacacc tgagcagcga gcccctgagc cggaagaaac tgtacctgag catgctgatc 300
tccctgcaga tctctctgat catgaccttc accgccaccg agctgatcat gttctacatc 360
tttttcgaga caacgctgat ccccacactg gccatcatca ccagatgggg caaccagcct 420
gagagactga acgccggcac ctactttctg ttctacaccc tcgtgggcag cctgccactg 480
ctgattgccc tgatctacac ccacaacacc ctgggctccc tgaacatcct gctgctgaca 540
ctgacagccc aagagctgag caacagctgg gccaacaatc tgatgtggct ggcctacaca 600
atggccttca tggtcaagat gcccctgtac ggcctgcacc tgtggctgcc taaagctcat 660
gtggaagccc ctatcgccgg ctctatggtg ctggctgcag tgctgctgaa actcggcggc 720
tacggcatga tgcggctgac cctgattctg aatcccctga ccaagcacat ggcctatcca 780
tttctggtgc tgagcctgtg gggcatgatt atgaccagca gcatctgcct gcggcagacc 840
gatctgaagt ccctgatcgc ctacagctcc atcagccaca tggccctggt ggtcaccgcc 900
atcctgattc agaccccttg gagctttaca ggcgccgtga tcctgatgat tgcccacggc 960
ctgacaagca gcctgctgtt ttgtctggcc aacagcaact acgagcggac ccacagcaga 1020
atcatgatcc tgtctcaggg cctgcagacc ctcctgcctc ttatggcttt ttggtggctg 1080
ctggcctctc tggccaatct ggcactgcct cctaccatca atctgctggg cgagctgagc 1140
gtgctggtca ccacattcag ctggtccaat atcaccctgc tgctcaccgg cctgaacatg 1200
ctggttacag ccctgtactc cctgtacatg ttcaccacca cacagtgggg aagcctgaca 1260
caccacatca acaatatgaa gcccagcttc acccgcgaga acaccctgat gttcatgcat 1320
ctgagcccca ttctgctgct gtccctgaat cctgatatca tcaccggctt ctccagctga 1380
<210> 8
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt_ND4*
<400> 8
atgctgaagc tgatcgtgcc caccatcatg ctgctgcccc tgacctggct gagcaagaag 60
cacatgatct ggatcaacac caccacccac agcctgatca tcagcatcat ccccctgctg 120
ttcttcaacc agatcaacaa caacctgttc agctgcagcc ccaccttcag cagcgacccc 180
ctgaccaccc ccctgctgat gctgaccacc tggctgctgc ccctgaccat catggccagc 240
cagcgccacc tgagcagcga gcccctgagc cgcaagaagc tgtacctgag catgctgatc 300
agcctgcaga tcagcctgat catgaccttc accgccaccg agctgatcat gttctacatc 360
ttcttcgaga ccaccctgat ccccaccctg gccatcatca cccgctgggg caaccagccc 420
gagcgcctga acgccggcac ctacttcctg ttctacaccc tggtgggcag cctgcccctg 480
ctgatcgccc tgatctacac ccacaacacc ctgggcagcc tgaacatcct gctgctgacc 540
ctgaccgccc aggagctgag caacagctgg gccaacaacc tgatgtggct ggcctacacc 600
atggccttca tggtgaagat gcccctgtac ggcctgcacc tgtggctgcc caaggcccac 660
gtggaggccc ccatcgccgg cagcatggtg ctggccgccg tgctgctgaa gctgggcggc 720
tacggcatga tgcgcctgac cctgatcctg aaccccctga ccaagcacat ggcctacccc 780
ttcctggtgc tgagcctgtg gggcatgatc atgaccagca gcatctgcct gcgccagacc 840
gacctgaaga gcctgatcgc ctacagcagc atcagccaca tggccctggt ggtgaccgcc 900
atcctgatcc agaccccctg gagcttcacc ggcgccgtga tcctgatgat cgcccacggc 960
ctgaccagca gcctgctgtt ctgcctggcc aacagcaact acgagcgcac ccacagccgc 1020
atcatgatcc tgagccaggg cctgcagacc ctgctgcccc tgatggcctt ctggtggctg 1080
ctggccagcc tggccaacct ggccctgccc cccaccatca acctgctggg cgagctgagc 1140
gtgctggtga ccaccttcag ctggagcaac atcaccctgc tgctgaccgg cctgaacatg 1200
ctggtgaccg ccctgtacag cctgtacatg ttcaccacca cccagtgggg cagcctgacc 1260
caccacatca acaacatgaa gcccagcttc acccgcgaga acaccctgat gttcatgcac 1320
ctgagcccca tcctgctgct gagcctgaac cccgacatca tcaccggctt cagcagctaa 1380
<210> 9
<211> 525
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
atgatgtatg ctttgtttct gttgagtgtg ggtttagtaa tggggtttgt ggggttttct 60
tctaagcctt ctcctattta tgggggttta gtattgattg ttagcggtgt ggtcgggtgt 120
gttattattc tgaattttgg gggaggttat atgggtttaa tggttttttt aatttattta 180
gggggaatga tggttgtctt tggatatact acagcgatgg ctattgagga gtatcctgag 240
gcatgggggt caggggttga ggtcttggtg agtgttttag tggggttagc gatggaggta 300
ggattggtgc tgtgggtgaa agagtatgat ggggtggtgg ttgtggtaaa ctttaatagt 360
gtaggaagct ggatgattta tgaaggagag gggtcagggt tgattcggga ggatcctatt 420
ggtgcggggg ctttgtatga ttatgggcgt tggttagtag tagttactgg ttggacattg 480
tttgttggtg tatatattgt aattgagatt gctcggggga attag 525
<210> 10
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt_ND6
<400> 10
atgatgtacg ccctgttcct gctgagcgtg ggcctggtga tgggcttcgt gggcttcagc 60
agcaagccca gccccatcta cggcggcctg gtgctgatcg tgagcggcgt ggtgggctgc 120
gtgatcatcc tgaacttcgg cggcggctac atgggcctga tggtgttcct gatctacctg 180
ggcggcatga tggtggtgtt cggctacacc accgccatgg ccatcgagga gtaccccgag 240
gcctggggca gcggcgtgga ggtgctggtg agcgtgctgg tgggcctggc catggaggtg 300
ggcctggtgc tgtgggtgaa ggagtacgac ggcgtggtgg tggtggtgaa cttcaacagc 360
gtgggcagct ggatgatcta cgagggcgag ggcagcggcc tgatccgcga ggaccccatc 420
ggcgccggcg ccctgtacga ctacggccgc tggctggtgg tggtgaccgg ctggaccctg 480
ttcgtgggcg tgtacatcgt gatcgagatc gcccgcggca actaa 525
<210> 11
<211> 951
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
atggccaacc tcctactcct cattgtaccc attctaatcg caatggcatt cctaatgctt 60
accgaacgaa aaattctagg ctatatgcaa ctacgcaaag gccccaacgt tgtaggcccc 120
tacgggctac tacaaccctt cgctgacgcc ataaaactct tcaccaaaga gcccctaaaa 180
cccgccacat ctaccatcac cctctacatc accgccccga ccttagctct caccatcgct 240
cttctactat ggacccccct ccccatgccc aaccccctgg tcaacctcaa cctaggcctc 300
ctatttattc tagccacctc tagcctagcc gtttactcaa tcctctggtc agggtgggca 360
tcaaactcaa actacgccct gatcggcgca ctgcgagcag tagcccaaac aatctcatat 420
gaagtcaccc tagccatcat tctactatca acattactaa tgagtggctc ctttaacctc 480
tccaccctta tcacaacaca agaacacctc tggttactcc tgccatcatg gcccttggcc 540
atgatgtggt ttatctccac actagcagag accaaccgaa cccccttcga ccttgccgaa 600
ggggagtccg aactagtctc aggcttcaac atcgaatacg ccgcaggccc cttcgcccta 660
ttcttcatgg ccgaatacac aaacattatt atgatgaaca ccctcaccac tacaatcttc 720
ctaggaacaa catatgacgc actctcccct gaactctaca caacatattt tgtcaccaag 780
accctacttc taacctccct gttcttatgg attcgaacag catacccccg attccgctac 840
gaccaactca tgcacctcct atggaaaaac ttcctaccac tcaccctagc attacttatg 900
tggtatgtct ccatgcccat tacaatctcc agcattcccc ctcaaaccta a 951
<210> 12
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt_ND1
<400> 12
atggccaacc tgctgctgct gatcgtgccc atcctgatcg ccatggcctt cctgatgctg 60
accgagcgca agatcctggg ctacatgcag ctgcgcaagg gccccaacgt ggtgggcccc 120
tacggcctgc tgcagccctt cgccgacgcc atcaagctgt tcaccaagga gcccctgaag 180
cccgccacca gcaccatcac cctgtacatc accgccccca ccctggccct gaccatcgcc 240
ctgctgctgt ggacccccct gcccatgccc aaccccctgg tgaacctgaa cctgggcctg 300
ctgttcatcc tggccaccag cagcctggcc gtgtacagca tcctgtggag cggctgggcc 360
agcaacagca actacgccct gatcggcgcc ctgcgcgccg tggcccagac catcagctac 420
gaggtgaccc tggccatcat cctgctgagc accctgctga tgagcggcag cttcaacctg 480
agcaccctga tcaccaccca ggagcacctg tggctgctgc tgcccagctg gcccctggcc 540
atgatgtggt tcatcagcac cctggccgag accaaccgca cccccttcga cctggccgag 600
ggcgagagcg agctggtgag cggcttcaac atcgagtacg ccgccggccc cttcgccctg 660
ttcttcatgg ccgagtacac caacatcatc atgatgaaca ccctgaccac caccatcttc 720
ctgggcacca cctacgacgc cctgagcccc gagctgtaca ccacctactt cgtgaccaag 780
accctgctgc tgaccagcct gttcctgtgg atccgcaccg cctacccccg cttccgctac 840
gaccagctga tgcacctgct gtggaagaac ttcctgcccc tgaccctggc cctgctgatg 900
tggtacgtga gcatgcccat caccatcagc agcatccccc cccagaccta a 951
<210> 13
<211> 1425
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
gagcactggg acgcccaccg cccctttccc tccgctgcca ggcgagcatg ttgtggtaat 60
tctggaacac aagaagagaa attgctgggt ttagaacaag attataaacg aattcggtgc 120
tcagtgatca cttgacagtt tttttttttt ttaaatatta cccaaaatgc tccccaaata 180
agaaatgcat cagctcagtc agtgaataca aaaaaggaat tatttttccc tttgagggtc 240
ttttatacat ctctcctcca accccaccct ctattctgtt tcttcctcct cacatggggg 300
tacacataca cagcttcctc ttttggttcc atccttacca ccacaccaca cgcacactcc 360
acatgcccag cagagtggca cttggtggcc agaaagtgtg agcctcatga tctgctgtct 420
gtagttctgt gagctcaggt ccctcaaagg cctcggagca cccccttcct tgtgactgag 480
ccagggcctg catttttggt tttccccacc ccacacattc tcaaccatag tccttctaac 540
aataccaata gctaggaccc ggctgctgtg cactgggact ggggattcca catgtttgcc 600
ttgggagtct caagctggac tgccagcccc tgtcctccct tcacccccat tgcgtatgag 660
catttcagaa ctccaaggag tcacaggcat ctttatagtt cacgttaaca tatagacact 720
gttggaagca gttccttcta aaagggtagc cctggactta ataccagccg gatacctctg 780
gcccccaccc cattactgta cctctggagt cactactgtg ggtcgccact cctctgctac 840
acagcacggc tttttcaagg ctgtattgag aagggaagtt aggaagaagg gtgtgctggg 900
ctaaccagcc cacagagctc acattcctgt cccttgggtg aaaaatacat gtccatcctg 960
atatctcctg aattcagaaa ttagcctcca catgtgcaat ggctttaaga gccagaagca 1020
gggttctggg aattttgcaa gttacctgtg gccaggtgtg gtctcggtta ccaaatacgg 1080
ttacctgcag ctttttagtc ctttgtgctc ccacgggtct acagagtccc atctgcccaa 1140
aggtcttgaa gcttgacagg atgttttcga ttactcagtc tcccagggca ctactggtcc 1200
gtaggattcg attggtcggg gtaggagagt taaacaacat ttaaacagag ttctctcaaa 1260
aatgtctaaa gggattgtag gtagataaca tccaatcact gtttgcactt atctgaaatc 1320
ttccctcttg gctgccccca ggtatttact gtggagaaca ttgcatagga atgtctggaa 1380
aaagcttcta caacttgtta cagccttcac atttgtagaa gcttt 1425
<210> 14
<211> 625
<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
gagcactggg acgcccaccg cccctttccc tccgctgcca ggcgagcatg ttgtggtaat 60
tctggaacac aagaagagaa attgctgggt ttagaacaag attataaacg aattcggtgc 120
tcagtgatca cttgacagtt tttttttttt ttaaatatta cccaaaatgc tccccaaata 180
agaaatgcat cagctcagtc agtgaataca aaaaaggaat tatttttccc tttgagggtc 240
ttttatacat ctctcctcca accccaccct ctattctgtt tcttcctcct cacatggggg 300
tacacataca cagcttcctc ttttggttcc atccttacca ccacaccaca cgcacactcc 360
acatgcccag cagagtggca cttggtggcc agaaagtgtg agcctcatga tctgctgtct 420
gtagttctgt gagctcaggt ccctcaaagg cctcggagca cccccttcct tgtgactgag 480
ccagggcctg catttttggt tttccccacc ccacacattc tcaaccatag tccttctaac 540
aataccaata gctaggaccc ggctgctgtg cactgggact ggggattcca catgtttgcc 600
ttgggagtct caagctggac tgcca 625
<210> 15
<211> 2889
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COX10-ND4-3'UTR
<400> 15
atggccgcat ctccgcacac tctctcctca cgcctcctga caggttgcgt aggaggctct 60
gtctggtatc ttgaaagaag aactatgcta aaactaatcg tcccaacaat tatgttacta 120
ccactgacat ggctttccaa aaaacacatg atttggatca acacaaccac ccacagccta 180
attattagca tcatccctct actatttttt aaccaaatca acaacaacct atttagctgt 240
tccccaacct tttcctccga ccccctaaca acccccctcc taatgctaac tacctggctc 300
ctacccctca caatcatggc aagccaacgc cacttatcca gtgaaccact atcacgaaaa 360
aaactctacc tctctatgct aatctcccta caaatctcct taattatgac attcacagcc 420
acagaactaa tcatgtttta tatcttcttc gaaaccacac ttatccccac cttggctatc 480
atcacccgat ggggcaacca gccagaacgc ctgaacgcag gcacatactt cctattctac 540
accctagtag gctcccttcc cctactcatc gcactaattt acactcacaa caccctaggc 600
tcactaaaca ttctactact cactctcact gcccaagaac tatcaaactc ctgggccaac 660
aacttaatgt ggctagctta cacaatggct tttatggtaa agatgcctct ttacggactc 720
cacttatggc tccctaaagc ccatgtcgaa gcccccatcg ctgggtcaat ggtacttgcc 780
gcagtactct taaaactagg cggctatggt atgatgcgcc tcacactcat tctcaacccc 840
ctgacaaaac acatggccta ccccttcctt gtactatccc tatggggcat gattatgaca 900
agctccatct gcctacgaca aacagaccta aaatcgctca ttgcatactc ttcaatcagc 960
cacatggccc tcgtagtaac agccattctc atccaaaccc cctggagctt caccggcgca 1020
gtcattctca tgatcgccca cgggcttaca tcctcattac tattctgcct agcaaactca 1080
aactacgaac gcactcacag tcgcatcatg atcctctctc aaggacttca aactctactc 1140
ccactaatgg ctttttggtg gcttctagca agcctcgcta acctcgcctt accccccact 1200
attaacctac tgggagaact ctctgtgcta gtaaccacgt tctcctggtc aaatatcact 1260
ctcctactta caggactcaa catgctagtc acagccctat actccctcta catgtttacc 1320
acaacacaat ggggctcact cacccaccac attaacaaca tgaaaccctc attcacacga 1380
gaaaacaccc tcatgttcat gcacctatcc cccattctcc tcctatccct caaccccgac 1440
atcattaccg ggttttcctc ttaagagcac tgggacgccc accgcccctt tccctccgct 1500
gccaggcgag catgttgtgg taattctgga acacaagaag agaaattgct gggtttagaa 1560
caagattata aacgaattcg gtgctcagtg atcacttgac agtttttttt ttttttaaat 1620
attacccaaa atgctcccca aataagaaat gcatcagctc agtcagtgaa tacaaaaaag 1680
gaattatttt tccctttgag ggtcttttat acatctctcc tccaacccca ccctctattc 1740
tgtttcttcc tcctcacatg ggggtacaca tacacagctt cctcttttgg ttccatcctt 1800
accaccacac cacacgcaca ctccacatgc ccagcagagt ggcacttggt ggccagaaag 1860
tgtgagcctc atgatctgct gtctgtagtt ctgtgagctc aggtccctca aaggcctcgg 1920
agcaccccct tccttgtgac tgagccaggg cctgcatttt tggttttccc caccccacac 1980
attctcaacc atagtccttc taacaatacc aatagctagg acccggctgc tgtgcactgg 2040
gactggggat tccacatgtt tgccttggga gtctcaagct ggactgccag cccctgtcct 2100
cccttcaccc ccattgcgta tgagcatttc agaactccaa ggagtcacag gcatctttat 2160
agttcacgtt aacatataga cactgttgga agcagttcct tctaaaaggg tagccctgga 2220
cttaatacca gccggatacc tctggccccc accccattac tgtacctctg gagtcactac 2280
tgtgggtcgc cactcctctg ctacacagca cggctttttc aaggctgtat tgagaaggga 2340
agttaggaag aagggtgtgc tgggctaacc agcccacaga gctcacattc ctgtcccttg 2400
ggtgaaaaat acatgtccat cctgatatct cctgaattca gaaattagcc tccacatgtg 2460
caatggcttt aagagccaga agcagggttc tgggaatttt gcaagttacc tgtggccagg 2520
tgtggtctcg gttaccaaat acggttacct gcagcttttt agtcctttgt gctcccacgg 2580
gtctacagag tcccatctgc ccaaaggtct tgaagcttga caggatgttt tcgattactc 2640
agtctcccag ggcactactg gtccgtagga ttcgattggt cggggtagga gagttaaaca 2700
acatttaaac agagttctct caaaaatgtc taaagggatt gtaggtagat aacatccaat 2760
cactgtttgc acttatctga aatcttccct cttggctgcc cccaggtatt tactgtggag 2820
aacattgcat aggaatgtct ggaaaaagct tctacaactt gttacagcct tcacatttgt 2880
agaagcttt 2889
<210> 16
<211> 2089
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COX10-ND4-3'UTR*
<400> 16
atggccgcat ctccgcacac tctctcctca cgcctcctga caggttgcgt aggaggctct 60
gtctggtatc ttgaaagaag aactatgcta aaactaatcg tcccaacaat tatgttacta 120
ccactgacat ggctttccaa aaaacacatg atttggatca acacaaccac ccacagccta 180
attattagca tcatccctct actatttttt aaccaaatca acaacaacct atttagctgt 240
tccccaacct tttcctccga ccccctaaca acccccctcc taatgctaac tacctggctc 300
ctacccctca caatcatggc aagccaacgc cacttatcca gtgaaccact atcacgaaaa 360
aaactctacc tctctatgct aatctcccta caaatctcct taattatgac attcacagcc 420
acagaactaa tcatgtttta tatcttcttc gaaaccacac ttatccccac cttggctatc 480
atcacccgat ggggcaacca gccagaacgc ctgaacgcag gcacatactt cctattctac 540
accctagtag gctcccttcc cctactcatc gcactaattt acactcacaa caccctaggc 600
tcactaaaca ttctactact cactctcact gcccaagaac tatcaaactc ctgggccaac 660
aacttaatgt ggctagctta cacaatggct tttatggtaa agatgcctct ttacggactc 720
cacttatggc tccctaaagc ccatgtcgaa gcccccatcg ctgggtcaat ggtacttgcc 780
gcagtactct taaaactagg cggctatggt atgatgcgcc tcacactcat tctcaacccc 840
ctgacaaaac acatggccta ccccttcctt gtactatccc tatggggcat gattatgaca 900
agctccatct gcctacgaca aacagaccta aaatcgctca ttgcatactc ttcaatcagc 960
cacatggccc tcgtagtaac agccattctc atccaaaccc cctggagctt caccggcgca 1020
gtcattctca tgatcgccca cgggcttaca tcctcattac tattctgcct agcaaactca 1080
aactacgaac gcactcacag tcgcatcatg atcctctctc aaggacttca aactctactc 1140
ccactaatgg ctttttggtg gcttctagca agcctcgcta acctcgcctt accccccact 1200
attaacctac tgggagaact ctctgtgcta gtaaccacgt tctcctggtc aaatatcact 1260
ctcctactta caggactcaa catgctagtc acagccctat actccctcta catgtttacc 1320
acaacacaat ggggctcact cacccaccac attaacaaca tgaaaccctc attcacacga 1380
gaaaacaccc tcatgttcat gcacctatcc cccattctcc tcctatccct caaccccgac 1440
atcattaccg ggttttcctc ttaagagcac tgggacgccc accgcccctt tccctccgct 1500
gccaggcgag catgttgtgg taattctgga acacaagaag agaaattgct gggtttagaa 1560
caagattata aacgaattcg gtgctcagtg atcacttgac agtttttttt ttttttaaat 1620
attacccaaa atgctcccca aataagaaat gcatcagctc agtcagtgaa tacaaaaaag 1680
gaattatttt tccctttgag ggtcttttat acatctctcc tccaacccca ccctctattc 1740
tgtttcttcc tcctcacatg ggggtacaca tacacagctt cctcttttgg ttccatcctt 1800
accaccacac cacacgcaca ctccacatgc ccagcagagt ggcacttggt ggccagaaag 1860
tgtgagcctc atgatctgct gtctgtagtt ctgtgagctc aggtccctca aaggcctcgg 1920
agcaccccct tccttgtgac tgagccaggg cctgcatttt tggttttccc caccccacac 1980
attctcaacc atagtccttc taacaatacc aatagctagg acccggctgc tgtgcactgg 2040
gactggggat tccacatgtt tgccttggga gtctcaagct ggactgcca 2089
<210> 17
<211> 2889
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COX10-opt_ND4-3'UTR
<400> 17
atggccgcat ctccgcacac tctctcctca cgcctcctga caggttgcgt aggaggctct 60
gtctggtatc ttgaaagaag aactatgctg aagctgatcg tgcccaccat catgctgctg 120
cctctgacct ggctgagcaa gaaacacatg atctggatca acaccaccac gcacagcctg 180
atcatcagca tcatccctct gctgttcttc aaccagatca acaacaacct gttcagctgc 240
agccccacct tcagcagcga ccctctgaca acacctctgc tgatgctgac cacctggctg 300
ctgcccctca caatcatggc ctctcagaga cacctgagca gcgagcccct gagccggaag 360
aaactgtacc tgagcatgct gatctccctg cagatctctc tgatcatgac cttcaccgcc 420
accgagctga tcatgttcta catctttttc gagacaacgc tgatccccac actggccatc 480
atcaccagat ggggcaacca gcctgagaga ctgaacgccg gcacctactt tctgttctac 540
accctcgtgg gcagcctgcc actgctgatt gccctgatct acacccacaa caccctgggc 600
tccctgaaca tcctgctgct gacactgaca gcccaagagc tgagcaacag ctgggccaac 660
aatctgatgt ggctggccta cacaatggcc ttcatggtca agatgcccct gtacggcctg 720
cacctgtggc tgcctaaagc tcatgtggaa gcccctatcg ccggctctat ggtgctggct 780
gcagtgctgc tgaaactcgg cggctacggc atgatgcggc tgaccctgat tctgaatccc 840
ctgaccaagc acatggccta tccatttctg gtgctgagcc tgtggggcat gattatgacc 900
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gcgtatgagc atttcagaac tccaaggagt cacaggcatc tttatagttc acgttaacat 1320
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<211> 1234
<212> DNA
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<220>
<223> COX10-opt_ND6-3'UTR*
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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ggtgaaaaat acatgtccat cctgatatct cctgaattca gaaattagcc tccacatgtg 2460
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tgtggtctcg gttaccaaat acggttacct gcagcttttt agtcctttgt gctcccacgg 2580
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt_COX10-ND4-3'UTR*
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atggccgcct ctccacacac actgagtagc agactgctga ccggctgtgt tggcggctct 60
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ccactgacat ggctttccaa aaaacacatg atttggatca acacaaccac ccacagccta 180
attattagca tcatccctct actatttttt aaccaaatca acaacaacct atttagctgt 240
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<223> opt_COX10-ND6-3'UTR*
<400> 36
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ttaatggttt ttttaattta tttaggggga atgatggttg tctttggata tactacagcg 300
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<211> 2034
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 37
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<223> opt_COX10-ND1-3'UTR
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<212> DNA
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<223> opt_COX10-ND1-3'UTR*
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<210> 42
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<212> DNA
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<220>
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aatgctcccc aaataagaaa tgcatcagct cagtcagtga atacaaaaaa ggaattattt 1260
ttccctttga gggtctttta tacatctctc ctccaacccc accctctatt ctgtttcttc 1320
ctcctcacat gggggtacac atacacagct tcctcttttg gttccatcct taccaccaca 1380
ccacacgcac actccacatg cccagcagag tggcacttgg tggccagaaa gtgtgagcct 1440
catgatctgc tgtctgtagt tctgtgagct caggtccctc aaaggcctcg gagcaccccc 1500
ttccttgtga ctgagccagg gcctgcattt ttggttttcc ccaccccaca cattctcaac 1560
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<210> 43
<211> 2889
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt_COX10*-ND4-3'UTR
<400> 43
atggccgcca gcccccacac cctgagcagc cgcctgctga ccggctgcgt gggcggcagc 60
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ccactgacat ggctttccaa aaaacacatg atttggatca acacaaccac ccacagccta 180
attattagca tcatccctct actatttttt aaccaaatca acaacaacct atttagctgt 240
tccccaacct tttcctccga ccccctaaca acccccctcc taatgctaac tacctggctc 300
ctacccctca caatcatggc aagccaacgc cacttatcca gtgaaccact atcacgaaaa 360
aaactctacc tctctatgct aatctcccta caaatctcct taattatgac attcacagcc 420
acagaactaa tcatgtttta tatcttcttc gaaaccacac ttatccccac cttggctatc 480
atcacccgat ggggcaacca gccagaacgc ctgaacgcag gcacatactt cctattctac 540
accctagtag gctcccttcc cctactcatc gcactaattt acactcacaa caccctaggc 600
tcactaaaca ttctactact cactctcact gcccaagaac tatcaaactc ctgggccaac 660
aacttaatgt ggctagctta cacaatggct tttatggtaa agatgcctct ttacggactc 720
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<220>
<223> opt_COX10*-opt_ND1-3'UTR
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tacaccacct acttcgtgac caagaccctg ctgctgacca gcctgttcct gtggatccgc 900
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ctcctcacat gggggtacac atacacagct tcctcttttg gttccatcct taccaccaca 1380
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<210> 56
<211> 1660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt_COX10*-opt_ND1-3'UTR*
<400> 56
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COX8-ND4-3'UTR
<400> 57
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<212> DNA
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<400> 59
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> COX8-ND6-3'UTR
<400> 63
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 73
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> OPA1-ND6-3'UTR
<400> 77
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<223> OPA1-opt_ND6-3'UTR
<400> 79
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<220>
<223> OPA1-ND1-3'UTR
<400> 81
gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60
tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120
cttgctgctg agggccactt cctgggtcat tcctggaccg ggagccgggc tggggctcac 180
acgggggctc ccgcgtggcc gtctcggcgc ctgcgtgacc tccccgccgg cgggatgtgg 240
cgactacgtc gggccgctgt ggcctgatgg ccaacctcct actcctcatt gtacccattc 300
taatcgcaat ggcattccta atgcttaccg aacgaaaaat tctaggctat atgcaactac 360
gcaaaggccc caacgttgta ggcccctacg ggctactaca acccttcgct gacgccataa 420
aactcttcac caaagagccc ctaaaacccg ccacatctac catcaccctc tacatcaccg 480
ccccgacctt agctctcacc atcgctcttc tactatggac ccccctcccc atgcccaacc 540
ccctggtcaa cctcaaccta ggcctcctat ttattctagc cacctctagc ctagccgttt 600
actcaatcct ctggtcaggg tgggcatcaa actcaaacta cgccctgatc ggcgcactgc 660
gagcagtagc ccaaacaatc tcatatgaag tcaccctagc catcattcta ctatcaacat 720
tactaatgag tggctccttt aacctctcca cccttatcac aacacaagaa cacctctggt 780
tactcctgcc atcatggccc ttggccatga tgtggtttat ctccacacta gcagagacca 840
accgaacccc cttcgacctt gccgaagggg agtccgaact agtctcaggc ttcaacatcg 900
aatacgccgc aggccccttc gccctattct tcatggccga atacacaaac attattatga 960
tgaacaccct caccactaca atcttcctag gaacaacata tgacgcactc tcccctgaac 1020
tctacacaac atattttgtc accaagaccc tacttctaac ctccctgttc ttatggattc 1080
gaacagcata cccccgattc cgctacgacc aactcatgca cctcctatgg aaaaacttcc 1140
taccactcac cctagcatta cttatgtggt atgtctccat gcccattaca atctccagca 1200
ttccccctca aacctaagag cactgggacg cccaccgccc ctttccctcc gctgccaggc 1260
gagcatgttg tggtaattct ggaacacaag aagagaaatt gctgggttta gaacaagatt 1320
ataaacgaat tcggtgctca gtgatcactt gacagttttt ttttttttta aatattaccc 1380
aaaatgctcc ccaaataaga aatgcatcag ctcagtcagt gaatacaaaa aaggaattat 1440
ttttcccttt gagggtcttt tatacatctc tcctccaacc ccaccctcta ttctgtttct 1500
tcctcctcac atgggggtac acatacacag cttcctcttt tggttccatc cttaccacca 1560
caccacacgc acactccaca tgcccagcag agtggcactt ggtggccaga aagtgtgagc 1620
ctcatgatct gctgtctgta gttctgtgag ctcaggtccc tcaaaggcct cggagcaccc 1680
ccttccttgt gactgagcca gggcctgcat ttttggtttt ccccacccca cacattctca 1740
accatagtcc ttctaacaat accaatagct aggacccggc tgctgtgcac tgggactggg 1800
gattccacat gtttgccttg ggagtctcaa gctggactgc cagcccctgt cctcccttca 1860
cccccattgc gtatgagcat ttcagaactc caaggagtca caggcatctt tatagttcac 1920
gttaacatat agacactgtt ggaagcagtt ccttctaaaa gggtagccct ggacttaata 1980
ccagccggat acctctggcc cccaccccat tactgtacct ctggagtcac tactgtgggt 2040
cgccactcct ctgctacaca gcacggcttt ttcaaggctg tattgagaag ggaagttagg 2100
aagaagggtg tgctgggcta accagcccac agagctcaca ttcctgtccc ttgggtgaaa 2160
aatacatgtc catcctgata tctcctgaat tcagaaatta gcctccacat gtgcaatggc 2220
tttaagagcc agaagcaggg ttctgggaat tttgcaagtt acctgtggcc aggtgtggtc 2280
tcggttacca aatacggtta cctgcagctt tttagtcctt tgtgctccca cgggtctaca 2340
gagtcccatc tgcccaaagg tcttgaagct tgacaggatg ttttcgatta ctcagtctcc 2400
cagggcacta ctggtccgta ggattcgatt ggtcggggta ggagagttaa acaacattta 2460
aacagagttc tctcaaaaat gtctaaaggg attgtaggta gataacatcc aatcactgtt 2520
tgcacttatc tgaaatcttc cctcttggct gcccccaggt atttactgtg gagaacattg 2580
cataggaatg tctggaaaaa gcttctacaa cttgttacag ccttcacatt tgtagaagct 2640
tt 2642
<210> 82
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OPA1-ND1-3'UTR*
<400> 82
gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60
tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120
cttgctgctg agggccactt cctgggtcat tcctggaccg ggagccgggc tggggctcac 180
acgggggctc ccgcgtggcc gtctcggcgc ctgcgtgacc tccccgccgg cgggatgtgg 240
cgactacgtc gggccgctgt ggcctgatgg ccaacctcct actcctcatt gtacccattc 300
taatcgcaat ggcattccta atgcttaccg aacgaaaaat tctaggctat atgcaactac 360
gcaaaggccc caacgttgta ggcccctacg ggctactaca acccttcgct gacgccataa 420
aactcttcac caaagagccc ctaaaacccg ccacatctac catcaccctc tacatcaccg 480
ccccgacctt agctctcacc atcgctcttc tactatggac ccccctcccc atgcccaacc 540
ccctggtcaa cctcaaccta ggcctcctat ttattctagc cacctctagc ctagccgttt 600
actcaatcct ctggtcaggg tgggcatcaa actcaaacta cgccctgatc ggcgcactgc 660
gagcagtagc ccaaacaatc tcatatgaag tcaccctagc catcattcta ctatcaacat 720
tactaatgag tggctccttt aacctctcca cccttatcac aacacaagaa cacctctggt 780
tactcctgcc atcatggccc ttggccatga tgtggtttat ctccacacta gcagagacca 840
accgaacccc cttcgacctt gccgaagggg agtccgaact agtctcaggc ttcaacatcg 900
aatacgccgc aggccccttc gccctattct tcatggccga atacacaaac attattatga 960
tgaacaccct caccactaca atcttcctag gaacaacata tgacgcactc tcccctgaac 1020
tctacacaac atattttgtc accaagaccc tacttctaac ctccctgttc ttatggattc 1080
gaacagcata cccccgattc cgctacgacc aactcatgca cctcctatgg aaaaacttcc 1140
taccactcac cctagcatta cttatgtggt atgtctccat gcccattaca atctccagca 1200
ttccccctca aacctaagag cactgggacg cccaccgccc ctttccctcc gctgccaggc 1260
gagcatgttg tggtaattct ggaacacaag aagagaaatt gctgggttta gaacaagatt 1320
ataaacgaat tcggtgctca gtgatcactt gacagttttt ttttttttta aatattaccc 1380
aaaatgctcc ccaaataaga aatgcatcag ctcagtcagt gaatacaaaa aaggaattat 1440
ttttcccttt gagggtcttt tatacatctc tcctccaacc ccaccctcta ttctgtttct 1500
tcctcctcac atgggggtac acatacacag cttcctcttt tggttccatc cttaccacca 1560
caccacacgc acactccaca tgcccagcag agtggcactt ggtggccaga aagtgtgagc 1620
ctcatgatct gctgtctgta gttctgtgag ctcaggtccc tcaaaggcct cggagcaccc 1680
ccttccttgt gactgagcca gggcctgcat ttttggtttt ccccacccca cacattctca 1740
accatagtcc ttctaacaat accaatagct aggacccggc tgctgtgcac tgggactggg 1800
gattccacat gtttgccttg ggagtctcaa gctggactgc ca 1842
<210> 83
<211> 2642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OPA1-opt_ND1-3'UTR
<400> 83
gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60
tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120
cttgctgctg agggccactt cctgggtcat tcctggaccg ggagccgggc tggggctcac 180
acgggggctc ccgcgtggcc gtctcggcgc ctgcgtgacc tccccgccgg cgggatgtgg 240
cgactacgtc gggccgctgt ggcctgatgg ccaacctgct gctgctgatc gtgcccatcc 300
tgatcgccat ggccttcctg atgctgaccg agcgcaagat cctgggctac atgcagctgc 360
gcaagggccc caacgtggtg ggcccctacg gcctgctgca gcccttcgcc gacgccatca 420
agctgttcac caaggagccc ctgaagcccg ccaccagcac catcaccctg tacatcaccg 480
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tgctgatgag cggcagcttc aacctgagca ccctgatcac cacccaggag cacctgtggc 780
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ataaacgaat tcggtgctca gtgatcactt gacagttttt ttttttttta aatattaccc 1380
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accatagtcc ttctaacaat accaatagct aggacccggc tgctgtgcac tgggactggg 1800
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ccagccggat acctctggcc cccaccccat tactgtacct ctggagtcac tactgtgggt 2040
cgccactcct ctgctacaca gcacggcttt ttcaaggctg tattgagaag ggaagttagg 2100
aagaagggtg tgctgggcta accagcccac agagctcaca ttcctgtccc ttgggtgaaa 2160
aatacatgtc catcctgata tctcctgaat tcagaaatta gcctccacat gtgcaatggc 2220
tttaagagcc agaagcaggg ttctgggaat tttgcaagtt acctgtggcc aggtgtggtc 2280
tcggttacca aatacggtta cctgcagctt tttagtcctt tgtgctccca cgggtctaca 2340
gagtcccatc tgcccaaagg tcttgaagct tgacaggatg ttttcgatta ctcagtctcc 2400
cagggcacta ctggtccgta ggattcgatt ggtcggggta ggagagttaa acaacattta 2460
aacagagttc tctcaaaaat gtctaaaggg attgtaggta gataacatcc aatcactgtt 2520
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cataggaatg tctggaaaaa gcttctacaa cttgttacag ccttcacatt tgtagaagct 2640
tt 2642
<210> 84
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OPA1-opt_ND1-3'UTR*
<400> 84
gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60
tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120
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cgactacgtc gggccgctgt ggcctgatgg ccaacctgct gctgctgatc gtgcccatcc 300
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aaaatgctcc ccaaataaga aatgcatcag ctcagtcagt gaatacaaaa aaggaattat 1440
ttttcccttt gagggtcttt tatacatctc tcctccaacc ccaccctcta ttctgtttct 1500
tcctcctcac atgggggtac acatacacag cttcctcttt tggttccatc cttaccacca 1560
caccacacgc acactccaca tgcccagcag agtggcactt ggtggccaga aagtgtgagc 1620
ctcatgatct gctgtctgta gttctgtgag ctcaggtccc tcaaaggcct cggagcaccc 1680
ccttccttgt gactgagcca gggcctgcat ttttggtttt ccccacccca cacattctca 1740
accatagtcc ttctaacaat accaatagct aggacccggc tgctgtgcac tgggactggg 1800
gattccacat gtttgccttg ggagtctcaa gctggactgc ca 1842
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> beta-actin-S primer
<400> 85
cgagatcgtg cgggacat 18
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> beta-actin-A primer
<400> 86
caggaaggag ggctggaac 19
<210> 87
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND4-S primer
<400> 87
ctgcctacga caaacagac 19
<210> 88
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND4-A primer
<400> 88
agtgcgttcg tagtttgag 19
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND6-F primer
<400> 89
atgatgtatg ctttgtttct g 21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND6-R primer
<400> 90
ctaattcccc cgagcaatct c 21
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND6-S primer
<400> 91
agtgtgggtt tagtaatg 18
<210> 92
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND6-A primer
<400> 92
tgcctcagga tactcctc 18
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> beta-actin-F primer
<400> 93
ctccatcctg gcctcgctgt 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> beta-actin-R primer
<400> 94
gctgtcacct tcaccgttcc 20
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND6-F primer
<400> 95
gggttttctt ctaagccttc tcc 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND6-R primer
<400> 96
ccatcatact ctttcaccca cag 23
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt_ND6-F primer
<400> 97
cgcctgctga ccggctgcgt 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt_ND6-R
<400> 98
ccaggcctcg gggtactcct 20
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND1-F primer
<400> 99
atggccgcat ctccgcacac t 21
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND1-R primer
<400> 100
ttaggtttga gggggaatgc t 21
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND1-F primer
<400> 101
aacctcaacc taggcctcct a 21
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND1-R primer
<400> 102
tggcaggagt aaccagaggt g 21
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND1-F primer
<400> 103
aggaggctct gtctggtatc ttg 23
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND1-R primer
<400> 104
ttttaggggc tctttggtga a 21
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt-ND1-F primer
<400> 105
gccgcctgct gaccggctgc gt 22
<210> 106
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt-ND1-R primer
<400> 106
tgatgtacag ggtgatggtg ctgg 24
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND4-S primer
<400> 107
gccaacagca actacgagc 19
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND4-A primer
<400> 108
tgatgttgct ccagctgaag 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt-ND4-S primer
<400> 109
gcctgaccct gatcctgaac 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> opt-ND4-A primer
<400> 110
gtgcgctcgt agttgctgtt 20
<210> 111
<211> 376
<212> DNA
<213> 智人
<400> 111
gggcagtgcc tccccgcccc gccgctggcg tcaagttcag ctccacgtgt gccatcagtg 60
gatccgatcc gtccagccat ggcttcctat tccaagatgg tgtgaccaga catgcttcct 120
gctccccgct tagcccacgg agtgactgtg gttgtggtgg gggggttctt aaaataactt 180
tttagccccc gtcttcctat tttgagtttg gttcagatct taagcagctc catgcaactg 240
tatttatttt tgatgacaag actcccatct aaagtttttc tcctgcctga tcatttcatt 300
ggtggctgaa ggattctaga gaaccttttg ttcttgcaag gaaaacaaga atccaaaacc 360
agtgactgtt ctgtga 376
<210> 112
<211> 146
<212> DNA
<213> 智人
<400> 112
ggggtctttg tcctctgtac tgtctctctc cttgccccta acccaaaaag cttcattttt 60
ctgtgtaggc tgcacaagag ccttgattga agatatattc tttctgaaca gtatttaagg 120
tttccaataa aatgtacacc cctcag 146
<210> 113
<211> 1956
<212> DNA
<213> 智人
<400> 113
tgttgggtcc aagaaggaat ttctttccat ccctgtgagg caatgggtgg gaatgatagg 60
acaggcaaag agaagcttcc tcaggctagc aaaaatatca tttgatgtat tgattaaaaa 120
agcacttgct tgatgtatct ttggcgtgtg tgctactctc atctgtgtgt atgtgtgttg 180
tgtgtgtgtg tgtgtgcatg cacatatgtg ttcactctgc tactttgtaa gttttaggct 240
aggttgcttt accagctgtt tacttctttt ttgttgttgt tttgagacaa ggtttcgctc 300
tgccaccctg gctggagtgc agtggcgtga tcttggctca cggcaacctc tgcctcctgg 360
ggctcaagca attatcccac ctcagcctcc tgagcagctg ggactacagg tgcatgccac 420
aacacctggc tgatatttgt attttttgta gagacaggat tttgccaagt tgcccaggct 480
ggtcttgaac tcctaggctt aagcaatcca cccaccttgg cctcctgaag tgccaggatc 540
acagacgtga gccactacac ccagcccagc tgtttacttc tttaaccata cttttgattt 600
tattttttga ccaaaatgaa ctaacccagg taatcttcca gggaccgcaa ttccagaacc 660
tcatagtatt tcttccattt ccagcagctg attagaagtc caggatcatg tgaagtcagg 720
cagggtcaca gttcctgatg gcacattatg gacagagaat tccattttgt tttctaaccc 780
atgatgaaaa cccacgtgag tcagtgtgtg aacagggatc attaattttt tccccctagg 840
tggaaggaaa aaggcactta ctttgcaggt tacagaaatt actgggagag gatatcgtca 900
taaaaagagc caggccaaat tggaatattt ttgtgatctg catcatgatg ctgaaaatag 960
caattatttg ggaattgggt ttgaaaactg aattgttgcc agagaattaa accaggtgaa 1020
aggtcctttt gaattcagat tgtcttctga acatccaggc tgatcatctg agagcagtca 1080
aatctacttc cccaaaaaga gaccagggta ggtttatttg cttttatttt taatgtttgc 1140
ctgtgtttcc aagtgtgaac aaaacagtgt gtgatctatt cttggattca ttttgatcag 1200
tatttattca aacccagtct ctctccagga cataaaactg aaatcagata tgttcttttt 1260
aagcccaaac cctctccttt ctagatccaa cccttcaccc ctaattttat gatggctata 1320
gccatggact tccccaagaa aagatcaccc agaaataaga ccacctgtga cagttaccag 1380
cttttattca taaccttagc ttcccaacta ttgagcattt tctaaggtcc ctgctgtctt 1440
ttggtctctg gtttgatttg tggcaaacag atgaagtaac agactgctat gaaggaccac 1500
aaaaacggca gcctctggaa aaaccattag aaagtcagtg gcagatccag taaataatat 1560
cgccagcctc agcataatct gctgctgact cgattcagtg gactctaaag tgcccagcct 1620
cctgacctga gctctcctgc catctgtgag actaccagag gtcttatctg ctgtccacat 1680
ggcaactggg catgagtacc tggccacctt gcttccctct ttgcctggtc caagtgagtg 1740
tctgctgcct ctgtcctgcc ttgttttcct ggctctaaac caactccacc cactcttaat 1800
ggaaactcag tctggctttg tgtgtttctg ggaagcacat gacttctggg aatgggcaag 1860
gaagaggagt gaaacaaaaa ctgtcagcta tgtgtgcctg gtctgggatc cttctctggg 1920
tgacagtggc atcatgaatc ttagaatcag ctcccc 1956
<210> 114
<211> 411
<212> DNA
<213> 智人
<400> 114
gaatcatgca agcttcctcc ctcagccatt gatggaaagt tcagcaagat cagcaacaaa 60
accaagaaaa atgatccttg cgtgctgaat atctgaaaag agaaattttt cctacaaaat 120
ctcttgggtc aagaaagttc tagaatttga attgataaac atggtgggtt ggctgagggt 180
aagagtatat gaggaacctt ttaaacgaca acaatactgc tagctttcag gatgattttt 240
aaaaaataga ttcaaatgtg ttatcctctc tctgaaacgc ttcctataac tcgagtttat 300
aggggaagaa aaagctattg tttacaatta tatcaccatt aaggcaactg ctacaccctg 360
ctttgtattc tgggctaaga ttcattaaaa actagctgct cttaacttac a 411
<210> 115
<211> 1465
<212> DNA
<213> 智人
<400> 115
gagcactggg acgcccaccg cccctttccc tccgctgcca ggcgagcatg ttgtggtaat 60
tctggaacac aagaagagaa attgctgggt ttagaacaag attataaacg aattcggtgc 120
tcagtgatca cttgacagtt tttttttttt ttaaatatta cccaaaatgc tccccaaata 180
agaaatgcat cagctcagtc agtgaataca aaaaaggaat tatttttccc tttgagggtc 240
tttatacatc tctcctccaa ccccaccctc tattctgttt cttcctcctc acatgggggt 300
acacatacac agcttcctct tttggttcca tccttaccac cacaccacac gcacactcca 360
catgcccagc agagtggcac ttggtggcca gaaagtgtga gcctcatgat ctgctgtctg 420
tagttctgtg agctcaggtc cctcaaaggc ctcggagcac ccccttcctg gtgactgagc 480
cagggcctgc atttttggtt ttccccaccc cacacattct caaccatagt ccttctaaca 540
ataccaatag ctaggacccg gctgctgtgc actgggactg gggattccac atgtttgcct 600
tgggagtctc aagctggact gccagcccct gtcctccctt cacccccatt gcgtatgagc 660
atttcagaac tccaaggagt cacaggcatc tttatagttc acgttaacat atagacactg 720
ttggaagcag ttccttctaa aagggtagcc ctggacttaa taccagccgg atacctctgg 780
cccccacccc attactgtac ctctggagtc actactgtgg gtcgccactc ctctgctaca 840
cagcacggct ttttcaaggc tgtattgaga agggaagtta ggaagaaggg tgtgctgggc 900
taaccagccc acagagctca cattcctgtc ccttgggtga aaaatacatg tccatcctga 960
tatctcctga attcagaaat tagcctccac atgtgcaatg gctttaagag ccagaagcag 1020
ggttctggga attttgcaag ttatcctgtg gccaggtgtg gtctcggtta ccaaatacgg 1080
ttacctgcag ctttttagtc ctttgtgctc ccacgggtct gcagagtccc atctgcccaa 1140
aggtcttgaa gcttgacagg atgttttcat tactcagtct cccagggcac tgctggtccg 1200
tagggattca ttggtcgggg tgggagagtt aaacaacatt taaacagagt tctctcaaaa 1260
atgtctaaag ggattgtagg tagataacat ccaatcactg tttgcactta tctgaaatct 1320
tccctcttgg ctgcccccag gtatttactg tggagaacat tgcataggaa tgtctggaaa 1380
aagcctctac aacttgttac agccttcaca tttgtacaat tcattgattc tcttttcctt 1440
ccacaataaa atggtataca agaac 1465
<210> 116
<211> 288
<212> DNA
<213> 智人
<400> 116
gagacttgga ctcaagtcat aggcttcttt cagtctttat gtcacctcag gagacttatt 60
tgagaggaag ccttctgtac ttgaagttga tttgaaatat gtaagaattg atgatgtatt 120
tgcaaacatt aatgtgaaat aaattgaatt taatgttgaa tactttcagg cattcactta 180
ataaagacac tgttaagcac tgttatgctc agtcatacac gcgaaaggta caatgtcttt 240
tagctaattc taattaaaaa ttacagactg gtgtacaaga tacttgtg 288
<210> 117
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 117
cccaccaccc tggcctgctg tcctgcgtct atccatgtgg aatgctggac aataaagcga 60
gtgctgccca ccctccagct gcc 83
<210> 118
<211> 66
<212> DNA
<213> 智人
<400> 118
tttatattga actgtaaata tgtcactaga gaaataaaat atggacttcc aatctacgta 60
aactta 66
<210> 119
<211> 214
<212> DNA
<213> 智人
<400> 119
accacgatcg ttatgctgag tatgttaagc tctttatgac tgtttttgta gtggtataga 60
gtactgcaga atacagtaag ctgctctatt gtagcatttc ttgatgttgc ttagtcactt 120
atttcataaa caacttaatg ttctgaataa tttcttacta aacattttgt tattgggcaa 180
gtgattgaaa atagtaaatg ctttgtgtga ttga 214
<210> 120
<211> 286
<212> DNA
<213> 智人
<400> 120
tcttggaata taaagaattt cttcaggttg aattacctag aagtttgtca ctgacttgtg 60
ttcctgaact atgacacatg aatatgtggg ctaagaaata gttcctcttg ataaataaac 120
aattaacaaa tactttggac agtaagtctt tctcagttct taatgataat gcagggcact 180
tactagcata agaattggtt tgggatttaa ctgtttatga agctaacttg atttccgtgt 240
tttgttaaaa tttcattgtt ctagcacatc tttaactgtg atagtt 286
<210> 121
<211> 721
<212> DNA
<213> 智人
<400> 121
gagacgtgca cttggtcgtg cgcccaggga ggaagccgca ccaccagcca gcgcaggccc 60
tggtggagag gcctccctgg ctgcctctgg gaggggtgct gccttgtaga tggagcaagt 120
gagcactgag ggtctggtgc caatcctgta ggcacaaaac cagaagtttc tacattctct 180
atttttgtta atcatcttct ctttttccag aatttggaag ctagaatggt gggaatgtca 240
gtagtgccag aaagagagaa ccaagcttgt ctttaaagtt actgatcaca ggacgttgct 300
ttttcactgt ttcctattaa tcttcagctg aacacaagca aaccttctca ggaggtgtct 360
cctaccctct tattgttcct cttacgctct gctcaatgaa accttcctct tgagggtcat 420
tttcctttct gtattaatta taccagtgtt aagtgacata gataagaact ttgcacactt 480
caaatcagag cagtgattct ctcttctctc cccttttcct tcagagtgaa tcatccagac 540
tcctcatgga taggtcgggt gttaaagttg ttttgattat gtaccttttg atagatccac 600
ataaaaagaa atgtgaagtt ttcttttact atcttttcat ttatcaagca gagacctttg 660
ttgggaggcg gtttgggaga acacatttct aatttgaatg aaatgaaatc tattttcagt 720
g 721
<210> 122
<211> 163
<212> DNA
<213> 智人
<400> 122
cagaagaagt gacggctggg ggcacagtgg gctgggcgcc cctgcagaac atgaaccttc 60
cgctcctggc tgccacaggg tcctccgatg ctggcctttg cgcctctaga ggcagccact 120
catggattca agtcctggct ccgcctcttc catcaggacc act 163
<210> 123
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人
<400> 123
agaggacaca ctctgcaccc ccccacccca cgaccttggc ccgagcccct ccgtgaggaa 60
<210> 124
<211> 65
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 124
agcccttccg ccaggctgtg tgtcaggccc gtggtgggtg ttttgtagta gtgtagagca 60
ttgca 65
<210> 125
<211> 231
<212> DNA
<213> 智人
<400> 125
cttatgttct gtgcgcattc tggcaggaat tctgtctctt cagagactca tcctcaaaac 60
aagacttgac actgtgtcct tgccccagtc ctaggaactg tggcacacag agatgttcat 120
tttaaaaacg gatttcatga aacactcttg tacttatgtt tataagagag cactgggtag 180
ccaagtgatc ttcccattca cagagttagt aaacctctgt actacatgct g 231
<210> 126
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
Met Ala Ala Ser Pro His Thr Leu Ser Ser Arg Leu Leu Thr Gly Cys
1 5 10 15
Val Gly Gly Ser Val Trp Tyr Leu Glu Arg Arg Thr
20 25
<210> 127
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
Met Ser Val Leu Thr Arg Leu Leu Leu Arg Gly Leu Thr Arg Leu Gly
1 5 10 15
Ser Ala Ala Pro Val Arg Arg Ala Arg Ile His Ser Leu
20 25
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
Met Trp Arg Leu Arg Arg Ala Ala Val Ala
1 5 10
<210> 129
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<400> 129
Met Ala Ala Ser Pro His Thr Leu Ser Ser Arg Leu Leu Thr Gly Cys
1 5 10 15
Val Gly Gly Ser Val Trp Tyr Leu Glu Arg Arg Thr
20 25
<210> 130
<211> 122
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 130
Met Ala Phe Lys Ser Phe Ile Tyr Ser Lys Gly Tyr His Arg Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Lys Lys Thr Ala Thr Ser Phe Phe Asp Ser Ser Tyr Gln Tyr
20 25 30
Leu Arg Gln Asn Gln Gly Leu Val Asn Ser Asp Pro Val Leu His Ala
35 40 45
Ser His Leu His Pro His Pro Val Val Val Ala Asn Val Asn Tyr Asn
50 55 60
Asn Val Asp Asp Ile Leu His Pro His Asp Leu Asp Ser Ser Ile Asn
65 70 75 80
Asn Thr Asn Asn Pro Leu Thr His Glu Glu Leu Leu Tyr Asn Gln Asn
85 90 95
Val Ser Leu Arg Ser Leu Lys Gln Gln Gln Ser Thr Asn Tyr Val Asn
100 105 110
Asn Asn Asn Asn Asn Gln His Arg Tyr Tyr
115 120
<210> 131
<211> 174
<212> PRT
<213> 大黄鱼
<400> 131
Met Arg Lys Arg Ser Leu Arg Cys His Leu Trp Ser Ala Asn Ala Ser
1 5 10 15
Leu Ser Pro Arg Lys Asp Glu Val Thr Ser Arg Lys Glu Ser Glu Asn
20 25 30
Leu Val Lys Gly Lys Lys Asn Lys Lys Ser His Leu His Leu Leu Leu
35 40 45
Phe Thr Ala Ser Lys Ile Gly Thr Asp Ser Val Phe Asp Val Gln Lys
50 55 60
Ser Lys Glu Cys Cys Lys Glu Leu Gly Leu Leu Phe Thr Ser Leu Ile
65 70 75 80
His Ser Ile Gly Ser Phe Pro Phe Asp Glu Glu Pro Lys Ala Ala Ala
85 90 95
Val Phe Leu Pro Gly Ser Leu Pro Gln Leu Thr Val Leu Val Leu Ala
100 105 110
Pro Gly Ser Gly Ser Cys Pro Thr Gly Lys Ser Thr Pro His Leu Ala
115 120 125
Ala Ser Gly Arg Asn Ala Glu Leu Leu Arg Pro Gln Asn Ser Met Ile
130 135 140
Val Arg Gln Phe Thr Cys Arg Gly Thr Ile Ser Ser His Leu Cys Ala
145 150 155 160
His Leu Arg Lys Pro His Asp Ser Arg Asn Met Ala Arg Pro
165 170
<210> 132
<211> 56
<212> PRT
<213> 布氏锥虫
<400> 132
Met Leu Arg Arg Thr Ser Phe Asn Phe Thr Gly Arg Ala Met Ile Ser
1 5 10 15
Arg Gly Ser Pro Glu Trp Ser His Arg Leu Asp Leu Lys Lys Gly Lys
20 25 30
Lys Thr Thr Met Met His Lys Leu Gly Thr Ser Lys Pro Asn Asn Ala
35 40 45
Leu Gln Tyr Ala Gln Met Thr Leu
50 55
<210> 133
<211> 46
<212> PRT
<213> 粗糙脉孢菌
<400> 133
Met Ile Ser Arg Ser Ala Leu Ser Arg Gly Ser Gln Leu Ala Leu Arg
1 5 10 15
Arg Pro Ala Ala Ala Lys Thr Ala Gln Arg Gly Phe Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Glu Pro Thr Thr Ile Ala Gly
35 40 45
<210> 134
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人
<400> 134
Met Pro Glu Leu Ile Leu Tyr Val Ala Ile Thr Leu Ser Val Ala Glu
1 5 10 15
Arg Leu Val Gly Pro Gly His Ala Cys Ala Glu Pro Ser Phe Arg Ser
20 25 30
Ser Arg Cys Ser Ala Pro Leu Cys Leu Leu Cys Ser Gly Ser Ser Ser
35 40 45
Pro Ala Thr Ala Pro His Pro Leu Lys Met Phe Ala Cys Ser Lys Phe
50 55 60
Val Ser Thr Pro Ser Leu Val Lys Ser Thr Ser Gln Leu Leu Ser Arg
65 70 75 80
Pro Leu Ser Ala Val Val Leu Lys Arg Pro Glu Ile Leu Thr Asp Glu
85 90 95
Ser Leu Ser Ser Leu Ala Val Ser Cys Pro Leu Thr Ser Leu Val Ser
100 105 110
Ser Arg Ser Phe Gln Thr Ser Ala Ile Ser Arg Asp Ile Asp Thr Ala
115 120 125
<210> 135
<211> 115
<212> PRT
<213> 智人
<400> 135
Met Tyr Arg Leu Met Ser Ala Val Thr Ala Arg Ala Ala Ala Pro Gly
1 5 10 15
Gly Leu Ala Ser Ser Cys Gly Arg Arg Gly Val His Gln Arg Ala Gly
20 25 30
Leu Pro Pro Leu Gly His Gly Trp Val Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu
35 40 45
Gly Leu Ala Leu Gly Val Lys Leu Ala Gly Gly Leu Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Gln Ser Pro Ala Ala Pro Asp Pro Glu Ala Ser Pro Leu Ala
65 70 75 80
Glu Pro Pro Gln Glu Gln Ser Leu Ala Pro Trp Ser Pro Gln Thr Pro
85 90 95
Ala Pro Pro Cys Ser Arg Cys Phe Ala Arg Ala Ile Glu Ser Ser Arg
100 105 110
Asp Leu Leu
115
<210> 136
<211> 140
<212> PRT
<213> 粟酒裂殖酵母
<400> 136
Met Thr Val Leu Ala Pro Leu Arg Arg Leu His Thr Arg Ala Ala Phe
1 5 10 15
Ser Ser Tyr Gly Arg Glu Ile Ala Leu Gln Lys Arg Phe Leu Asn Leu
20 25 30
Asn Ser Cys Ser Ala Val Arg Arg Tyr Gly Thr Gly Phe Ser Asn Asn
35 40 45
Leu Arg Ile Lys Lys Leu Lys Asn Ala Phe Gly Val Val Arg Ala Asn
50 55 60
Ser Thr Lys Ser Thr Ser Thr Val Thr Thr Ala Ser Pro Ile Lys Tyr
65 70 75 80
Asp Ser Ser Phe Val Gly Lys Thr Gly Gly Glu Ile Phe His Asp Met
85 90 95
Met Leu Lys His Asn Val Lys His Val Phe Gly Tyr Pro Gly Gly Ala
100 105 110
Ile Leu Pro Val Phe Asp Ala Ile Tyr Arg Ser Pro His Phe Glu Phe
115 120 125
Ile Leu Pro Arg His Glu Gln Ala Ala Gly His Ala
130 135 140
<210> 137
<211> 125
<212> PRT
<213> 橹豆
<400> 137
Met Ile Leu Cys Pro Leu Glu Ala Phe Ile Val Gln His Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ile Ser Val Met Gly Leu Leu Ser Cys Phe Arg Ser Thr Val Leu Arg
20 25 30
Lys Cys Ser Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Arg Phe Leu Tyr Thr Asn
35 40 45
Asn Phe Gln Arg Asn Leu Ile Ser Ser Gly Gly Asn Glu Ser Tyr Tyr
50 55 60
Gly Tyr Phe Asn Arg Arg Ser Tyr Thr Ser Leu Tyr Met Gly Thr Gly
65 70 75 80
Thr Val Gly Gly Ile Thr Ser Ala Arg Ile Arg Val Pro Asn Val Gly
85 90 95
Cys Glu Gly Phe Met Cys Ser Ser His Leu Ser Ile Thr Gln Arg Asn
100 105 110
Ser Arg Leu Ile His Ser Thr Ser Lys Ile Val Pro Asn
115 120 125
<210> 138
<211> 107
<212> PRT
<213> 莱茵衣藻
<400> 138
Met Ala Leu Gln Gln Ala Ala Pro Arg Val Phe Gly Leu Leu Gly Arg
1 5 10 15
Ala Pro Val Ala Leu Gly Gln Ser Gly Ile Leu Thr Gly Ser Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Asn Gln Gly Phe Asn Gly Ser Leu Gln Ser Val Glu Asn His
35 40 45
Val Tyr Ala Gln Ala Phe Ser Thr Ser Ser Gln Glu Glu Gln Ala Ala
50 55 60
Pro Ser Ile Gln Gly Ala Ser Gly Met Lys Leu Pro Gly Met Ala Gly
65 70 75 80
Ser Met Leu Leu Gly Lys Ser Arg Ser Gly Leu Arg Thr Gly Ser Met
85 90 95
Val Pro Phe Ala Ala Gln Gln Ala Met Asn Met
100 105
<210> 139
<211> 87
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
Met Trp Arg Leu Arg Arg Ala Ala Val Ala Cys Glu Val Cys Gln Ser
1 5 10 15
Leu Val Lys His Ser Ser Gly Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Gln Lys
20 25 30
Leu His Leu Val Ser Arg Ser Ile Tyr His Ser His His Pro Thr Leu
35 40 45
Lys Leu Gln Arg Pro Gln Leu Arg Thr Ser Phe Gln Gln Phe Ser Ser
50 55 60
Leu Thr Asn Leu Pro Leu Arg Lys Leu Lys Phe Ser Pro Ile Lys Tyr
65 70 75 80
Gly Tyr Gln Pro Arg Arg Asn
85
<210> 140
<211> 56
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
Met Ala Val Leu Trp Arg Leu Ser Ala Val Cys Gly Ala Leu Gly Gly
1 5 10 15
Arg Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Val Val Arg Pro Ala His Ile Ser
20 25 30
Ala Phe Leu Gln Asp Arg Pro Ile Pro Glu Trp Cys Gly Val Gln His
35 40 45
Ile His Leu Ser Pro Ser His His
50 55
<210> 141
<211> 162
<212> PRT
<213> 智人
<400> 141
Met Ala Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ile Met Val Ala Lys Gly Leu Val
1 5 10 15
Lys Leu Thr Gln Ala Ala Val Glu Thr His Leu Gln His Leu Gly Ile
20 25 30
Gly Gly Glu Leu Ile Met Ala Ala Arg Ala Leu Gln Ser Thr Ala Val
35 40 45
Glu Gln Ile Gly Met Phe Leu Gly Lys Val Gln Gly Gln Asp Lys His
50 55 60
Glu Glu Tyr Phe Ala Glu Asn Phe Gly Gly Pro Glu Gly Glu Phe His
65 70 75 80
Phe Ser Val Pro His Ala Ala Gly Ala Ser Thr Asp Phe Ser Ser Ala
85 90 95
Ser Ala Pro Asp Gln Ser Ala Pro Pro Ser Leu Gly His Ala His Ser
100 105 110
Glu Gly Pro Ala Pro Ala Tyr Val Ala Ser Gly Pro Phe Arg Glu Ala
115 120 125
Gly Phe Pro Gly Gln Ala Ser Ser Pro Leu Gly Arg Ala Asn Gly Arg
130 135 140
Leu Phe Ala Asn Pro Arg Asp Ser Phe Ser Ala Met Gly Phe Gln Arg
145 150 155 160
Arg Phe
<210> 142
<211> 117
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 142
Met Ala Leu Leu Leu Arg His Ser Pro Lys Leu Arg Arg Ala His Ala
1 5 10 15
Ile Leu Gly Cys Glu Arg Gly Thr Val Val Arg His Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Thr Cys Ser Ser Leu Val Lys Glu Asp Thr Val Ser Ser Ser Asn Leu
35 40 45
His Pro Glu Tyr Ala Lys Lys Ile Gly Gly Ser Asp Phe Ser His Asp
50 55 60
Arg Gln Ser Gly Lys Glu Leu Gln Asn Phe Lys Val Ser Pro Gln Glu
65 70 75 80
Ala Ser Arg Ala Ser Asn Phe Met Arg Ala Ser Lys Tyr Gly Met Pro
85 90 95
Ile Thr Ala Asn Gly Val His Ser Leu Phe Ser Cys Gly Gln Val Val
100 105 110
Pro Ser Arg Cys Phe
115
<210> 143
<211> 66
<212> PRT
<213> 粗糙脉孢菌
<400> 143
Met Ala Ser Thr Arg Val Leu Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gln Met Ala
1 5 10 15
Ala Ser Ala Lys Val Ala Arg Pro Ala Val Arg Val Ala Gln Val Ser
20 25 30
Lys Arg Thr Ile Gln Thr Gly Ser Pro Leu Gln Thr Leu Lys Arg Thr
35 40 45
Gln Met Thr Ser Ile Val Asn Ala Thr Thr Arg Gln Ala Phe Gln Lys
50 55 60
Arg Ala
65
<210> 144
<211> 44
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
Met Leu Ala Ala Arg Leu Val Cys Leu Arg Thr Leu Pro Ser Arg Val
1 5 10 15
Phe His Pro Ala Phe Thr Lys Ala Ser Pro Val Val Lys Asn Ser Ile
20 25 30
Thr Lys Asn Gln Trp Leu Leu Thr Pro Ser Arg Glu
35 40
<210> 145
<211> 68
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
Met Ala Ser Arg Val Leu Ser Ala Tyr Val Ser Arg Leu Pro Ala Ala
1 5 10 15
Phe Ala Pro Leu Pro Arg Val Arg Met Leu Ala Val Ala Arg Pro Leu
20 25 30
Ser Thr Ala Leu Cys Ser Ala Gly Thr Gln Thr Arg Leu Gly Thr Leu
35 40 45
Gln Pro Ala Leu Val Leu Ala Gln Val Pro Gly Arg Val Thr Gln Leu
50 55 60
Cys Arg Gln Tyr
65
<210> 146
<211> 67
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Met Phe Ala Cys Ala Lys Leu Ala Cys Thr Pro Ser Leu Ile Arg Ala
1 5 10 15
Gly Ser Arg Val Ala Tyr Arg Pro Ile Ser Ala Ser Val Leu Ser Arg
20 25 30
Pro Glu Ala Ser Arg Thr Gly Glu Gly Ser Thr Val Phe Asn Gly Ala
35 40 45
Gln Asn Gly Val Ser Gln Leu Ile Gln Arg Glu Phe Gln Thr Ser Ala
50 55 60
Ile Ser Arg
65
<210> 147
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Pro Ser Ile Gln Gly Ala Ser Gly Met Lys Leu Pro Gly Met Ala Gly
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Gly Gln Ala Ser Ser Pro Leu Gly Arg Ala Asn Gly Arg Leu Phe Ala
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260 265 270
Gly
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<213> 玉蜀黍
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275 280 285
Gln Gln Ala Ala Pro Arg Val Phe Gly Leu Leu Gly Arg Ala Pro Val
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Gln Gly Phe Asn Gly Ser Leu Gln Ser Val Glu Asn His Val Tyr Ala
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100 105 110
Pro His Ala Asp Arg Arg His Val Ile Ala Leu Arg Arg Cys Pro Pro
115 120 125
Leu Pro Ala Ser Ala Val Leu Ala Pro Glu Leu Leu His Ala Arg Gly
130 135 140
Leu Leu Pro Arg His Trp Ser His Ala Ser Pro Leu Ser Thr Ser Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Arg Pro Ala Asp Lys Ala Gln Leu Thr Trp Val Asp Lys
165 170 175
Trp Ile Pro Glu Ala Ala Arg Pro Tyr Met Thr Val Leu Ala Pro Leu
180 185 190
Arg Arg Leu His Thr Arg Ala Ala Phe Ser Ser Tyr Gly Arg Glu Ile
195 200 205
Ala Leu Gln Lys Arg Phe Leu Asn Leu Asn Ser Cys Ser Ala Val Arg
210 215 220
Arg Tyr Gly Thr Gly Phe Ser Asn Asn Leu Arg Ile Lys Lys Leu Lys
225 230 235 240
Asn Ala Phe Gly Val Val Arg Ala Asn Ser Thr Lys Ser Thr Ser Thr
245 250 255
Val Thr Thr Ala Ser Pro Ile Lys Tyr Asp Ser Ser Phe Val Gly Lys
260 265 270
Thr Gly Gly Glu Ile Phe His Asp Met Met Leu Lys His Asn Val Lys
275 280 285
His Val Phe Gly Tyr Pro Gly Gly Ala Ile Leu Pro Val Phe Asp Ala
290 295 300
Ile Tyr Arg Ser Pro His Phe Glu Phe Ile Leu Pro Arg His Glu Gln
305 310 315 320
Ala Ala Gly His Ala Val Ser Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys
325 330 335
Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp
340 345 350
Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg
355 360 365
Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro
370 375 380
Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn
405 410 415
Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu
420 425 430
Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met
435 440 445
Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His
450 455 460
Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn
465 470 475 480
Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu
485 490 495
Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Met Ala Ser Thr
500 505 510
Arg Val Leu Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gln Met Ala Ala Ser Ala Lys
515 520 525
Val Ala Arg Pro Ala Val Arg Val Ala Gln Val Ser Lys Arg Thr Ile
530 535 540
Gln Thr Gly Ser Pro Leu Gln Thr Leu Lys Arg Thr Gln Met Thr Ser
545 550 555 560
Ile Val Asn Ala Thr Thr Arg Gln Ala Phe Gln Lys Arg Ala
565 570
<210> 159
<211> 810
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ncATP9_zmLOC100282174_spilv1_lcSirt5_osP0644B06.24-2_hsATP5G2_ncA
TP9
<400> 159
Met Ala Ser Thr Arg Val Leu Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gln Met Ala
1 5 10 15
Ala Ser Ala Lys Val Ala Arg Pro Ala Val Arg Val Ala Gln Val Ser
20 25 30
Lys Arg Thr Ile Gln Thr Gly Ser Pro Leu Gln Thr Leu Lys Arg Thr
35 40 45
Gln Met Thr Ser Ile Val Asn Ala Thr Thr Arg Gln Ala Phe Gln Lys
50 55 60
Arg Ala Met Ala Leu Leu Arg Ala Ala Val Ser Glu Leu Arg Arg Arg
65 70 75 80
Gly Arg Gly Ala Leu Thr Pro Leu Pro Ala Leu Ser Ser Leu Leu Ser
85 90 95
Ser Leu Ser Pro Arg Ser Pro Ala Ser Thr Arg Pro Glu Pro Asn Asn
100 105 110
Pro His Ala Asp Arg Arg His Val Ile Ala Leu Arg Arg Cys Pro Pro
115 120 125
Leu Pro Ala Ser Ala Val Leu Ala Pro Glu Leu Leu His Ala Arg Gly
130 135 140
Leu Leu Pro Arg His Trp Ser His Ala Ser Pro Leu Ser Thr Ser Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Arg Pro Ala Asp Lys Ala Gln Leu Thr Trp Val Asp Lys
165 170 175
Trp Ile Pro Glu Ala Ala Arg Pro Tyr Met Thr Val Leu Ala Pro Leu
180 185 190
Arg Arg Leu His Thr Arg Ala Ala Phe Ser Ser Tyr Gly Arg Glu Ile
195 200 205
Ala Leu Gln Lys Arg Phe Leu Asn Leu Asn Ser Cys Ser Ala Val Arg
210 215 220
Arg Tyr Gly Thr Gly Phe Ser Asn Asn Leu Arg Ile Lys Lys Leu Lys
225 230 235 240
Asn Ala Phe Gly Val Val Arg Ala Asn Ser Thr Lys Ser Thr Ser Thr
245 250 255
Val Thr Thr Ala Ser Pro Ile Lys Tyr Asp Ser Ser Phe Val Gly Lys
260 265 270
Thr Gly Gly Glu Ile Phe His Asp Met Met Leu Lys His Asn Val Lys
275 280 285
His Val Phe Gly Tyr Pro Gly Gly Ala Ile Leu Pro Val Phe Asp Ala
290 295 300
Ile Tyr Arg Ser Pro His Phe Glu Phe Ile Leu Pro Arg His Glu Gln
305 310 315 320
Ala Ala Gly His Ala Met Arg Lys Arg Ser Leu Arg Cys His Leu Trp
325 330 335
Ser Ala Asn Ala Ser Leu Ser Pro Arg Lys Asp Glu Val Thr Ser Arg
340 345 350
Lys Glu Ser Glu Asn Leu Val Lys Gly Lys Lys Asn Lys Lys Ser His
355 360 365
Leu His Leu Leu Leu Phe Thr Ala Ser Lys Ile Gly Thr Asp Ser Val
370 375 380
Phe Asp Val Gln Lys Ser Lys Glu Cys Cys Lys Glu Leu Gly Leu Leu
385 390 395 400
Phe Thr Ser Leu Ile His Ser Ile Gly Ser Phe Pro Phe Asp Glu Glu
405 410 415
Pro Lys Ala Ala Ala Val Phe Leu Pro Gly Ser Leu Pro Gln Leu Thr
420 425 430
Val Leu Val Leu Ala Pro Gly Ser Gly Ser Cys Pro Thr Gly Lys Ser
435 440 445
Thr Pro His Leu Ala Ala Ser Gly Arg Asn Ala Glu Leu Leu Arg Pro
450 455 460
Gln Asn Ser Met Ile Val Arg Gln Phe Thr Cys Arg Gly Thr Ile Ser
465 470 475 480
Ser His Leu Cys Ala His Leu Arg Lys Pro His Asp Ser Arg Asn Met
485 490 495
Ala Arg Pro Met Ala Leu Leu Leu Arg His Ser Pro Lys Leu Arg Arg
500 505 510
Ala His Ala Ile Leu Gly Cys Glu Arg Gly Thr Val Val Arg His Phe
515 520 525
Ser Ser Ser Thr Cys Ser Ser Leu Val Lys Glu Asp Thr Val Ser Ser
530 535 540
Ser Asn Leu His Pro Glu Tyr Ala Lys Lys Ile Gly Gly Ser Asp Phe
545 550 555 560
Ser His Asp Arg Gln Ser Gly Lys Glu Leu Gln Asn Phe Lys Val Ser
565 570 575
Pro Gln Glu Ala Ser Arg Ala Ser Asn Phe Met Arg Ala Ser Lys Tyr
580 585 590
Gly Met Pro Ile Thr Ala Asn Gly Val His Ser Leu Phe Ser Cys Gly
595 600 605
Gln Val Val Pro Ser Arg Cys Phe Met Pro Glu Leu Ile Leu Tyr Val
610 615 620
Ala Ile Thr Leu Ser Val Ala Glu Arg Leu Val Gly Pro Gly His Ala
625 630 635 640
Cys Ala Glu Pro Ser Phe Arg Ser Ser Arg Cys Ser Ala Pro Leu Cys
645 650 655
Leu Leu Cys Ser Gly Ser Ser Ser Pro Ala Thr Ala Pro His Pro Leu
660 665 670
Lys Met Phe Ala Cys Ser Lys Phe Val Ser Thr Pro Ser Leu Val Lys
675 680 685
Ser Thr Ser Gln Leu Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ala Val Val Leu Lys
690 695 700
Arg Pro Glu Ile Leu Thr Asp Glu Ser Leu Ser Ser Leu Ala Val Ser
705 710 715 720
Cys Pro Leu Thr Ser Leu Val Ser Ser Arg Ser Phe Gln Thr Ser Ala
725 730 735
Ile Ser Arg Asp Ile Asp Thr Ala Met Ala Ser Thr Arg Val Leu Ala
740 745 750
Ser Arg Leu Ala Ser Gln Met Ala Ala Ser Ala Lys Val Ala Arg Pro
755 760 765
Ala Val Arg Val Ala Gln Val Ser Lys Arg Thr Ile Gln Thr Gly Ser
770 775 780
Pro Leu Gln Thr Leu Lys Arg Thr Gln Met Thr Ser Ile Val Asn Ala
785 790 795 800
Thr Thr Arg Gln Ala Phe Gln Lys Arg Ala
805 810
<210> 160
<211> 459
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
Met Leu Lys Leu Ile Val Pro Thr Ile Met Leu Leu Pro Leu Thr Trp
1 5 10 15
Leu Ser Lys Lys His Met Ile Trp Ile Asn Thr Thr Thr His Ser Leu
20 25 30
Ile Ile Ser Ile Ile Pro Leu Leu Phe Phe Asn Gln Ile Asn Asn Asn
35 40 45
Leu Phe Ser Cys Ser Pro Thr Phe Ser Ser Asp Pro Leu Thr Thr Pro
50 55 60
Leu Leu Met Leu Thr Thr Trp Leu Leu Pro Leu Thr Ile Met Ala Ser
65 70 75 80
Gln Arg His Leu Ser Ser Glu Pro Leu Ser Arg Lys Lys Leu Tyr Leu
85 90 95
Ser Met Leu Ile Ser Leu Gln Ile Ser Leu Ile Met Thr Phe Thr Ala
100 105 110
Thr Glu Leu Ile Met Phe Tyr Ile Phe Phe Glu Thr Thr Leu Ile Pro
115 120 125
Thr Leu Ala Ile Ile Thr Arg Trp Gly Asn Gln Pro Glu Arg Leu Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Tyr Phe Leu Phe Tyr Thr Leu Val Gly Ser Leu Pro Leu
145 150 155 160
Leu Ile Ala Leu Ile Tyr Thr His Asn Thr Leu Gly Ser Leu Asn Ile
165 170 175
Leu Leu Leu Thr Leu Thr Ala Gln Glu Leu Ser Asn Ser Trp Ala Asn
180 185 190
Asn Leu Met Trp Leu Ala Tyr Thr Met Ala Phe Met Val Lys Met Pro
195 200 205
Leu Tyr Gly Leu His Leu Trp Leu Pro Lys Ala His Val Glu Ala Pro
210 215 220
Ile Ala Gly Ser Met Val Leu Ala Ala Val Leu Leu Lys Leu Gly Gly
225 230 235 240
Tyr Gly Met Met Arg Leu Thr Leu Ile Leu Asn Pro Leu Thr Lys His
245 250 255
Met Ala Tyr Pro Phe Leu Val Leu Ser Leu Trp Gly Met Ile Met Thr
260 265 270
Ser Ser Ile Cys Leu Arg Gln Thr Asp Leu Lys Ser Leu Ile Ala Tyr
275 280 285
Ser Ser Ile Ser His Met Ala Leu Val Val Thr Ala Ile Leu Ile Gln
290 295 300
Thr Pro Trp Ser Phe Thr Gly Ala Val Ile Leu Met Ile Ala His Gly
305 310 315 320
Leu Thr Ser Ser Leu Leu Phe Cys Leu Ala Asn Ser Asn Tyr Glu Arg
325 330 335
Thr His Ser Arg Ile Met Ile Leu Ser Gln Gly Leu Gln Thr Leu Leu
340 345 350
Pro Leu Met Ala Phe Trp Trp Leu Leu Ala Ser Leu Ala Asn Leu Ala
355 360 365
Leu Pro Pro Thr Ile Asn Leu Leu Gly Glu Leu Ser Val Leu Val Thr
370 375 380
Thr Phe Ser Trp Ser Asn Ile Thr Leu Leu Leu Thr Gly Leu Asn Met
385 390 395 400
Leu Val Thr Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Met Phe Thr Thr Thr Gln Trp
405 410 415
Gly Ser Leu Thr His His Ile Asn Asn Met Lys Pro Ser Phe Thr Arg
420 425 430
Glu Asn Thr Leu Met Phe Met His Leu Ser Pro Ile Leu Leu Leu Ser
435 440 445
Leu Asn Pro Asp Ile Ile Thr Gly Phe Ser Ser
450 455
<210> 161
<211> 174
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
Met Met Tyr Ala Leu Phe Leu Leu Ser Val Gly Leu Val Met Gly Phe
1 5 10 15
Val Gly Phe Ser Ser Lys Pro Ser Pro Ile Tyr Gly Gly Leu Val Leu
20 25 30
Ile Val Ser Gly Val Val Gly Cys Val Ile Ile Leu Asn Phe Gly Gly
35 40 45
Gly Tyr Met Gly Leu Met Val Phe Leu Ile Tyr Leu Gly Gly Met Met
50 55 60
Val Val Phe Gly Tyr Thr Thr Ala Met Ala Ile Glu Glu Tyr Pro Glu
65 70 75 80
Ala Trp Gly Ser Gly Val Glu Val Leu Val Ser Val Leu Val Gly Leu
85 90 95
Ala Met Glu Val Gly Leu Val Leu Trp Val Lys Glu Tyr Asp Gly Val
100 105 110
Val Val Val Val Asn Phe Asn Ser Val Gly Ser Trp Met Ile Tyr Glu
115 120 125
Gly Glu Gly Ser Gly Leu Ile Arg Glu Asp Pro Ile Gly Ala Gly Ala
130 135 140
Leu Tyr Asp Tyr Gly Arg Trp Leu Val Val Val Thr Gly Trp Thr Leu
145 150 155 160
Phe Val Gly Val Tyr Ile Val Ile Glu Ile Ala Arg Gly Asn
165 170
<210> 162
<211> 316
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
Met Ala Asn Leu Leu Leu Leu Ile Val Pro Ile Leu Ile Ala Met Ala
1 5 10 15
Phe Leu Met Leu Thr Glu Arg Lys Ile Leu Gly Tyr Met Gln Leu Arg
20 25 30
Lys Gly Pro Asn Val Val Gly Pro Tyr Gly Leu Leu Gln Pro Phe Ala
35 40 45
Asp Ala Ile Lys Leu Phe Thr Lys Glu Pro Leu Lys Pro Ala Thr Ser
50 55 60
Thr Ile Thr Leu Tyr Ile Thr Ala Pro Thr Leu Ala Leu Thr Ile Ala
65 70 75 80
Leu Leu Leu Trp Thr Pro Leu Pro Met Pro Asn Pro Leu Val Asn Leu
85 90 95
Asn Leu Gly Leu Leu Phe Ile Leu Ala Thr Ser Ser Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Ser Ile Leu Trp Ser Gly Trp Ala Ser Asn Ser Asn Tyr Ala Leu Ile
115 120 125
Gly Ala Leu Arg Ala Val Ala Gln Thr Ile Ser Tyr Glu Val Thr Leu
130 135 140
Ala Ile Ile Leu Leu Ser Thr Leu Leu Met Ser Gly Ser Phe Asn Leu
145 150 155 160
Ser Thr Leu Ile Thr Thr Gln Glu His Leu Trp Leu Leu Leu Pro Ser
165 170 175
Trp Pro Leu Ala Met Met Trp Phe Ile Ser Thr Leu Ala Glu Thr Asn
180 185 190
Arg Thr Pro Phe Asp Leu Ala Glu Gly Glu Ser Glu Leu Val Ser Gly
195 200 205
Phe Asn Ile Glu Tyr Ala Ala Gly Pro Phe Ala Leu Phe Phe Met Ala
210 215 220
Glu Tyr Thr Asn Ile Ile Met Met Asn Thr Leu Thr Thr Thr Ile Phe
225 230 235 240
Leu Gly Thr Thr Tyr Asp Ala Leu Ser Pro Glu Leu Tyr Thr Thr Tyr
245 250 255
Phe Val Thr Lys Thr Leu Leu Leu Thr Ser Leu Phe Leu Trp Ile Arg
260 265 270
Thr Ala Tyr Pro Arg Phe Arg Tyr Asp Gln Leu Met His Leu Leu Trp
275 280 285
Lys Asn Phe Leu Pro Leu Thr Leu Ala Leu Leu Met Trp Tyr Val Ser
290 295 300
Met Pro Ile Thr Ile Ser Ser Ile Pro Pro Gln Thr
305 310 315
<210> 163
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP forward primer
<400> 163
acaagttcag cgtgtccg 18
<210> 164
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP reverse primer
<400> 164
ctcgttgggg tctttgct 18
<210> 165
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND4-F primer
<400> 165
atctccgcac actctctcct ca 22
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ND4-R primer
<400> 166
taggttgttg ttgatttggt t 21
<210> 167
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B-actin F2 primer
<400> 167
cctagaagca tttgcggt 18
<210> 168
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B-actin R2 primer
<400> 168
gagctacgag ctgcctga 18

Claims (88)

1.一种治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用
a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：
i)编码线粒体靶向肽的核酸序列；
ii)编码线粒体蛋白的核酸序列，所述核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列；和
iii)3’UTR核酸序列；和
b)包含类固醇的第二药物组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中编码所述线粒体蛋白的所述核酸序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:160-162组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述编码线粒体靶向肽的核酸序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:126-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述编码线粒体靶向肽的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ IDNO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
6.一种治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用
a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：
i)编码线粒体靶向肽的核酸序列，所述线粒体靶向肽包含与选自由SEQ ID NO:126-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；
ii)编码线粒体蛋白的核酸序列；和
iii)3’UTR核酸序列；和
b)包含类固醇的第二药物组合物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述编码线粒体蛋白的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中编码线粒体蛋白的核酸序列编码多肽，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:160-162组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述编码线粒体靶向肽的核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
12.一种治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用
a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：
i)编码线粒体靶向肽的核酸序列，所述线粒体靶向肽包含与选自由SEQ ID NO:126-159组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；
ii)编码线粒体蛋白的核酸序列，所述核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:6-12组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列；和
iii)与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的3’UTR核酸序列；和
(b)包含类固醇的第二药物组合物。
13.一种治疗眼部病症的方法，其包括向有需要的患者施用
(a)包含腺相关病毒(AAV)的第一药物组合物，所述腺相关病毒包含重组核酸，所述重组核酸包含：
(i)编码线粒体靶向肽的核酸序列；和
(ii)编码线粒体蛋白的核酸序列；和
(b)包含类固醇的第二药物组合物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述3’UTR核酸序列包含与选自由SEQ ID NO:13、14和111-125组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述重组核酸包含与选自由SEQ IDNO:15-84组成的组的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中经由眼内注射或玻璃体内注射施用所述第一药物组合物。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中经由玻璃体内注射施用约0.01-0.1mL的所述第一药物组合物。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中经由玻璃体内注射施用约0.05mL的所述第一药物组合物。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中向所述患者的单眼或双眼施用所述第一药物组合物。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述类固醇选自由以下组成的组：二丙酸阿氯米松、安西奈德、二丙酸倍氯米松、倍他米松、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠和醋酸钠、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、新戊酸氯可托龙、皮质醇(氢化可的松)、醋酸皮质醇(氢化可的松)、丁酸皮质醇(氢化可的松)、环戊丙酸皮质醇(氢化可的松)、皮质醇(氢化可的松)磷酸钠、皮质醇(氢化可的松)琥珀酸钠、戊酸皮质醇(氢化可的松)、醋酸可的松、地奈德、去氧米松、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、二醋酸二氟拉松、醋酸氟氢可的松、氟尼缩松、醋酸肤轻松、氟轻松醋酸酯、氟米龙、氟氢缩松、哈西奈德、甲羟松、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠、糠酸莫米松、醋酸帕拉米松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、丁乙酸泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、曲安奈德、二醋酸曲安西龙和己曲安奈德或其合成类似物。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中类固醇是糖皮质激素。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述糖皮质激素是甲泼尼龙或泼尼松。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述甲泼尼龙被配制为片剂或用于静脉内施用的液体。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中口服或静脉内施用所述类固醇。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物之前施用所述类固醇。
28.如权利要求27所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物之前每日施用所述类固醇持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述类固醇是甲泼尼龙，并且以约30mg/60kg至约40mg/60kg或约30mg至约40mg的日剂量施用。
30.如权利要求29所述的方法，其中甲泼尼龙的日剂量为约32mg/60kg或32mg。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述类固醇是泼尼松，并且以约50mg/60kg至约70mg/60kg的日剂量施用。
32.如权利要求31所述的方法，其中泼尼松的日剂量为约60mg/60kg。
33.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物后施用所述类固醇。
34.如权利要求33所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物后每日施用所述类固醇持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周或至少15周。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述类固醇是甲泼尼龙，并且以介于约70mg/60kg与90mg/60kg之间或介于约70mg与90mg之间的日剂量施用。
36.如权利要求35所述的方法，其中甲泼尼龙的日剂量为约80mg/60kg或80mg。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物后施用所述甲泼尼龙持续至少两天。
38.如权利要求37所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物后每日施用甲泼尼龙的后续剂量持续至少7周，并且其中甲泼尼龙的剂量逐周减少。
39.如权利要求34所述的方法，所述类固醇是泼尼松，并且以介于约50mg/60kg与70mg/60kg之间或介于约50mg与约70mg之间的日剂量施用。
40.如权利要求39所述的方法，其中泼尼松的日剂量为约60mg/60kg或约60mg。
41.如权利要求39或40所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物后施用所述泼尼松持续至少七天。
42.如权利要求41所述的方法，其中七天后，以介于约30mg/60kg与约50mg/60kg之间或介于约30mg与50mg之间的日剂量施用泼尼松。
43.如权利要求42所述的方法，其中泼尼松的日剂量为约40mg/60kg或40mg。
44.如权利要求43所述的方法，其中每日施用泼尼松的后续剂量持续至少4天，并且其中泼尼松的剂量逐日减少。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物之前和之后施用所述类固醇。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述类固醇是甲泼尼龙，并且在施用所述第一药物化合物之前每日施用持续至少七天，并且在施用所述第一药物化合物后每日施用持续至少7周。
47.如权利要求46所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物之前以约32mg/60kg或32mg的日剂量施用所述甲泼尼龙。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后以约80mg/60kg或80mg的日剂量施用所述甲泼尼龙持续至少2天。
49.如权利要求48所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后三天开始，以约40mg/60kg或40mg的日剂量施用所述甲泼尼龙持续至少4天。
50.如权利要求49所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后一周开始，以约32mg/60kg或32mg的日剂量施用所述甲泼尼龙持续至少一周。
51.如权利要求50所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后两周开始以约24mg/60kg或24mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
52.如权利要求51所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后三周开始以约16mg/60kg或16mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
53.如权利要求52所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后四周开始以约8mg/60kg或8mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
54.如权利要求53所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后五周开始以约6mg/60kg或6mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
55.如权利要求54所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后六周开始以约4mg/60kg或4mg的日剂量施用甲泼尼龙持续至少一周。
56.如权利要求45所述的方法，其中所述类固醇是泼尼松，并且在施用所述第一药物化合物之前每日施用持续至少两天，并且在施用所述第一药物化合物后每日施用持续至少十一天。
57.如权利要求56所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物之前以约60mg/60kg或60mg的日剂量施用所述泼尼松。
58.如权利要求56或57所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后以约60mg/60kg或60mg的日剂量施用所述泼尼松持续至少七天。
59.如权利要求58所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后八天，以约40mg/60kg或40mg的日剂量施用所述泼尼松持续至少一天。
60.如权利要求59所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后九天，以约20mg/60kg或20mg的日剂量施用所述泼尼松持续至少一天。
61.如权利要求60所述的方法，其中在施用所述第一药物化合物后十天，以约10mg/60kg或10mg的日剂量施用所述泼尼松持续至少一天。
62.如权利要求1-61中任一项所述的方法，其进一步包括向所述患者施用磷酸肌酸钠。
63.如权利要求62所述的方法，其中在施用所述第一药物组合物之前或之后静脉内施用所述磷酸肌酸钠。
64.如权利要求1-63中任一项所述的方法，其中施用所述第一药物组合物和第二药物组合物比在没有所述第二药物组合物情况下施用的相当的药物组合物产生更高的平均视力恢复。
65.如权利要求1-64中任一项所述的方法，其中施用所述第一药物组合物和第二药物组合物比在没有所述第二药物组合物情况下施用的相当的药物组合物产生更低的不良事件发生率。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述不良事件选自前房炎症、玻璃体炎、高眼压、白内障摘除、角膜炎、玻璃体出血、过敏性结膜炎和眼痛。
67.如权利要求64-66中任一项所述的方法，其中在患有所述眼部病症的患者群体中确定所述更高的平均视力恢复和所述更低的不良事件发生率。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述患者群体是种族匹配的。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述患者群体是中国人或阿根廷人。
70.如权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述眼部病症是莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)。
71.如权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AA8、AAV9和AAV10。
72.如权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述AAV是AAV2。
73.一种筛选治疗眼部病症的患者的方法，所述方法包括：
(a)获得来自患者的血清样品；
(b)在所述血清样品存在下将靶细胞群与包含腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养，所述腺相关病毒包含编码可检测标记的重组核酸；并且
(c)在所述培养后检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平，其中如果所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值，则选择所述患者进行所述治疗。
74.一种治疗有需要的患者的眼部病症的方法，其包括：
(a)获得来自患者的血清样品；
(b)在所述血清样品存在下将靶细胞群与包含第一腺相关病毒(AAV)的组合物一起培养，所述第一腺相关病毒包含编码可检测标记的第一重组核酸；
(c)检测所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平；并且
(d)向所述患者施用包含第二AAV的药物组合物，所述第二AAV包含第二重组核酸，其中所述靶细胞群中所述可检测标记的表达水平高于预定阈值。
75.如权利要求73或74所述的方法，其中所述可检测标记是荧光蛋白。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。
77.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中通过流式细胞术或qPCR检测所述可检测标记。
78.如权利要求73-77中任一项所述的方法，其中当通过流式细胞术检测时，所述预定阈值是表达所述可检测标记的细胞的约40％。
79.如权利要求73-77中任一项所述的方法，其中当通过qPCR检测时，所述预定阈值是约0.6的所述可检测标记的相对表达水平。
80.如权利要求73-79中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是HEK-293T细胞。
81.如权利要求73-80中任一项所述的方法，其中所述治疗是包含编码线粒体蛋白的核酸序列的重组AAV。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述线粒体蛋白选自由以下组成的组：NADH脱氢酶4(ND4)、NADH脱氢酶6(ND6)、NADH脱氢酶1(ND1)及其变体。
83.如权利要求73-82中任一项所述的方法，其中所述患者包含选自以下的突变：ND4基因中的G11778A、ND1基因中的G3460A和ND6基因中的T14484C。
84.如权利要求73-83中任一项所述的方法，其中所述培养步骤为至少12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长。
85.一种试剂盒，其包含：包含编码可检测标记的重组核酸的腺相关病毒(AAV)、靶细胞群和一种或多种用于检测所述可检测标记的试剂。
86.如权利要求85所述的试剂盒，其进一步包含用于用所述AAV转染所述靶细胞群的转染试剂。
87.如权利要求85或86所述的试剂盒，其进一步包含第二AAV，所述第二AAV包含编码线粒体蛋白的重组核酸。
88.如权利要求85-87中任一项所述的试剂盒，其中用于检测所述可检测标记的所述一种或多种试剂选自与所述可检测标记结合的抗体和一种或多种对编码所述可检测标记的所述重组核酸具有特异性的引物寡核苷酸。
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