JP2010271181A - Ccr5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】血液・尿生化学検査法によりCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、尿中のデオキシピリノジリン、I型コラーゲン架橋N−テロペプチド若しくはI型コラーゲン架橋C−テロペプチド、又は、血清中の酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ、骨型アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、I型コラーゲン架橋N−テロペプチド、MIP−1α若しくはMIP−1β、又は、血漿中のRANTESを測定するCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
【選択図】 図1
Description
このようなCCR5を標的とする阻害剤からなる新薬の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法が求められていた。
本発明は、また、細胞生物学検査法によりCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、骨髄細胞又は単球を、CCR5を標的とする阻害剤を添加した培養液を用いて培養することにより誘導した破骨細胞を象牙板上で培養し、培養後の前記象牙板を顕微鏡観察することを特徴とするCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法である。
以下に本発明を詳述する。
本発明者は、CCR5が骨の代謝に重要な働きをしている事実を世界で初めて確認した。本発明者は、更に鋭意検討の結果、骨の代謝に関連する血液・尿生化学検査法、細胞生物学検査法、骨軟骨形態学検査法により、CCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価することができることを見出し、本発明を完成した。
本発明者は、通常のマウス(以下、「野生型」ともいう)、ケモカインレセプター1(CCR1)が欠損したノックアウトマウス(以下、「CCR1抑制型」ともいう)、ケモカインの一種であるフラクタルカイン(CX3CR1)が欠損したノックアウトマウス(以下、「CX3CR1抑制型」ともいう)、及び、ケモカインレセプター5(CCR5)が欠損したノックアウトマウス(以下、「CCR5抑制型」ともいう)を用いて種々の実験を行い、CCR5が骨の代謝に重要な働きをしている事実を世界で初めて確認した。
破骨細胞は、酸性フォスファターゼとペプチターゼとを分泌する。酸性ホスファターゼは、骨表面のリン酸カルシウムを融解する役割を有する。ぺプチターゼは、骨表面下に存在するコラーゲン繊維を分解する役割を有する。例えば、近年、患者が増加している骨粗しょう症は、老化によって破骨細胞が制御できなくなり、骨の破壊が一方的に進むことが原因の一つであると考えられている。
骨形成マーカーである骨型アルカリフォスファターゼ(BAP)については、野生型、CCR1抑制型、CX3CR1抑制型、及び、CCR5抑制型の間で有意な差異は認められない。これに対して、骨吸収のマーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ(TRACP)については、CCR1抑制型、CX3CR1抑制型、及び、CCR5抑制型ともに、有意に野生型よりも低値であることが判った。
Fアクチン(フィラメント)染色された破骨細胞について、野生型では、Fアクチン(フィラメント)がリング状に細胞の周囲に存在する。一方、CCR1抑制型では、前骨細胞の融合は見られない(正常であれば、前骨細胞が融合し、多核の正常な破骨細胞が観察される。CCR5抑制型では、Fアクチン(フィラメント)の異常凝集が認められた。
酸性フォスファターゼ染色された破骨細胞について、野生型では、濃く染色されている。一方、CCR5抑制型では、酸性フォスファターゼの発現量が少なく、染色が薄い。また、CCR1抑制型では、正常な破骨細胞が認められず、染色もごく薄いものであった。
野生型の破骨細胞を培養した象牙板は、セメント質も、その下のコラーゲン繊維も溶解していた。一方、CCR1抑制型の破骨細胞を培養した象牙板は、セメント質も、その下のコラーゲン繊維も溶解しておらず、CCR5抑制型の破骨細胞を培養した象牙板は、セメント質は溶解していたが、その下のコラーゲン繊維は溶解していなかったことが判った。
本発明のCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法について詳しく説明する。本発明のCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法は、血液・尿生化学検査法、細胞生物学検査法、骨軟骨形態学検査法の3つに大別される。
血液・尿生化学検査法においては、尿中のデオキシピリノジリン(DPD)、I型コラーゲン架橋N−テロペプチド(NTX)、I型コラーゲン架橋C−テロペプチド(CTX)を測定する。また、血清中の酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ(TRACP)、骨型アルカリフォスファターゼ(BAP)、オステオカルシン、I型コラーゲン架橋N−テロペプチド(NTX)、MIP(macrophage inflammatory protein)−1α、MIP−1βや、血漿中のRANTES(regulated upon activation、 normal T−cell expressed and secreted)を測定する。
上記骨型アルカリフォスファターゼ(BAP)、オステオカルシンは、骨形成マーカーとして知られるものである。
上記MIP(macrophage inflammatory protein)−1α、MIP−1β、RANTES(regulated upon activation、 normal T−cell expressed and secreted)は、ケモカインレセプターCCR1、CCR5に結合するケモカインである。
細胞生物学検査法においては、骨髄細胞又は単球をin vitroで培養して誘導した、破骨細胞を用いる。
マウスやヒトの骨髄から採取した骨髄細胞を、10ng/mlのマクロファージコロニー刺激因子(Macrophage−Colony Stimulating Factor:M−CSF)を含むMEM培地にて24時間培養した後、破骨細胞に分化させる骨髄マクロファージとして浮遊細胞を分離する。更に10日間、10ng/mlのM−CSFを含むMEM培地にて培養した後、セファデックスカラム(Sephadex G−10 microspheres、Amersham biosciences社製)を通過させることにより、破骨細胞に分化させる骨髄マクロファージとして浮遊細胞を分離する。得られた浮遊細胞を、10ng/mlのM−CSFと20ng/mlのReceptor activator of NF−κB ligand(RANKL)を含むMEM培地で4日間培養することにより、前破骨細胞が得られる。その後、細胞数を5×104cells/mlに整えた条件下で、10ng/mlのM−CSFと20ng/mlのRANKLを含むMEM培地中で14〜21日程度培養することにより、破骨細胞が得られる。なお、培養液の交換は、4日に1回程度行う。
マウスやヒトの抹消血から分離した単球を、10ng/mlのM−CSFを含むMEM培地にて、10日間程度培養する。培養液を10ng/mlのM−CSFと20ng/mlのRANKLを含むMEM培地に変え、更に4日間程度培養することにより前破骨細胞が得られる。その後、細胞数を5×104cells/mlに整えた条件下で、10ng/mlのM−CSFと20ng/mlのRANKLを含むMEM培地中で14日程度培養することにより、破骨細胞が得られる。なお、培養液の交換は、4日に1回程度行う。
骨軟骨形態学検査法においては、マウス等の実験動物に対象となるCCR5を標的とする阻害剤を投与した群と、投与しない群とを設定し、投与後の骨又は軟骨を採取して比較を行う。対象となるCCR5を標的とする阻害剤が高い疾病治療効果、予防効果を有したり、又は、強い副作用を有する場合には、骨の骨厚が大きくなったり、海綿骨が少なく疎になったり、また、軟骨中の軟骨細胞の並びが崩れたりする。
Claims (4)
- 血液・尿生化学検査法によりCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
尿中のデオキシピリノジリン(DPD)、I型コラーゲン架橋N−テロペプチド(NTX)若しくはI型コラーゲン架橋C−テロペプチド(CTX)、又は、血清中の酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ(TRACP)、骨型アルカリフォスファターゼ(BAP)、オステオカルシン、I型コラーゲン架橋N−テロペプチド(NTX)、MIP(macrophage inflammatory protein)−1α若しくはMIP−1β、又は、血漿中のRANTES(regulated upon activation、 normal T−cell expressed and secreted)を測定する
ことを特徴とするCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。 - 細胞生物学検査法によりCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
骨髄細胞又は単球を、CCR5を標的とする阻害剤を添加した培養液を用いて培養することにより誘導した破骨細胞を、Fアクチン(フィラメント)染色又は酸性フォスファターゼ染色により染色して顕微鏡観察する
ことを特徴とするCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。 - 細胞生物学検査法によりCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
骨髄細胞又は単球を、CCR5を標的とする阻害剤を添加した培養液を用いて培養することにより誘導した破骨細胞を象牙板上で培養し、培養後の前記象牙板を顕微鏡観察する
ことを特徴とするCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。 - 細胞生物学検査法によりCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
実験動物に対象となるCCR5を標的とする阻害剤を投与した後に骨又は軟骨を採取して観察を行う
ことを特徴とするCCR5を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
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