WO2000044894A1 - Verfahren zur isolation von apoptose-induzierenden dna-sequenzen und detektionssystem - Google Patents

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WO2000044894A1
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apoptosis
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Stefan Grimm
Alexis Schubert
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries

Definitions

  • the invention relates to a method for identifying nucleic acid sequences which have non-selectable activity in a target cell, the use of the identified genes to provide diagnostic and therapeutic agents and the use of secreted enzymes as a reporter system for apoptosis processes.
  • Apoptosis is the genetically encoded suicide program that is induced in eukaryotic lines under certain physiological or pathological conditions.
  • the induction of apoptosis must be regulated extremely precisely because hyperactivity can lead to degenerative diseases.
  • reduced apoptosis induction can contribute to tumor progression.
  • This method is complex and, due to the need to determine the apoptosis-inducing activity by microscopic inspection of morphological characteristics, can be automated only with difficulty and is therefore unsuitable for screening examinations. Furthermore, the method is limited to cell lines which can be transfected particularly efficiently.
  • DE-OS 43 42 769 describes a method for isolating and cloning cDNA coding for an RNA-binding protein by producing a cDNA library from a cell line which is likely to contain the RNA-binding protein, ligating the library into expression vectors and expressing them in Cells which already contain a further expression vector which has a marker gene and in the 5'-untranslated region of this gene has the binding site of the RNA-binding protein in question, and detecting the presence of the cDNA by reducing expression of the marker gene.
  • this method cannot identify dominant genes with a non-selectable activity whose stable recombinant expression in a cell is not possible.
  • DE-OS 38 06 61 7 describes a method for the expression of non-selectable genes in eukaryotic cells, wherein two or more selection marker genes are transfected with the non-selectable genes, the selection marker genes and the non-selectable genes on one or more vectors or DNA structures are located and then selected for all transfected selection markers. With this method too, no dominant genes with a non-selectable activity can be identified whose stable recominant expression is not possible in a cell.
  • WO 91/199796 relates to a method for obtaining an animal or plant cell which contains a non-selectable gene sequence inserted within a predetermined gene sequence of the cell genome by means of homologous recombination. This method is also unsuitable for the identification of dominant non-selectable genes by means of serial examinations.
  • WO 91/00361 relates to a method for the identifiable expression of a non-selectable gene using a dominant-selectable multidrug resistance gene MDRI, the non-selectable gene being amplified and overexpressed by selection for the MDR 1 gene.
  • This method is also fundamentally unsuitable for the identification of dominant non-selectable genes.
  • the object on which the invention is based was therefore to provide a new method for identifying dominant nucleic acid sequences with a non-selectable activity and suitable reporter or detection systems with which the disadvantages of the prior art described above are at least partially eliminated.
  • the invention relates to a method for identifying dominant activities of nucleic acid sequences, which is simple and can be carried out in intact cells and can be automated.
  • a library of nucleic acid sequences is cloned into preferably eukaryotic expression vectors and from this library individual clones or small pools of clones in bacteria are propagated.
  • the plasmid DNA is preferably isolated using an automated protocol which can be carried out in 96-hole format.
  • the isolated plasmid DNAs can be introduced into eukaryotic cells together with a reporter vector by means of individual transfection approaches. As a result, the procedure described here is a series examination, a so-called "screen”.
  • the activity of the reporter vector is then determined in the transfected eurkaryotic cells and correlated with the activity of the nucleic acid sequence. Since plasmid DNA is still retained from the respective batches in a preferred version of the screen after transfection of the target cells, it does not have to be isolated from the target cells. This is an advantage in the case of apoptosis induction, since this process breaks down the DNA in the cells.
  • the steps of DNA isolation, transfection and activity detection can be easily automated using robots.
  • Enzymes in particular secreted alkaline phosphatase (SEAP), which is preferably introduced into the cell to be examined as a reporter vector and whose secretion can serve as a measure of the non-selectable activity to be examined.
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • An advantage of using secreted enzymes is that the cell does not have to be destroyed to determine activity. The activity can therefore be measured several times in the supernatant: shortly after the transfection, if the effect of the nucleic acid sequence to be examined and introduced into the cell, for example apoptosis induction, has not yet started to determine a base value, and at a later point in time, to measure the change in enzymatic activity due to the nucleic acid sequence expressed in the cell. For example, the secretion of proteins is reduced in apoptotic cells, so that, in contrast to control cells, the activity of the reporter enzyme does not increase.
  • a first aspect of the invention thus relates to a method for identifying nucleic acid sequences which have a non-selectable activity in a target cell, comprising the steps:
  • step (c) obtaining the expression vector from the cultivated host cells, (d 1) cotransfecting target cells with (i) the expression vector obtained in step (c) and
  • the nucleic acid sequences to be examined can in principle originate from any sources, for example from eukaryotes such as plants, vertebrates, for example mammals, fungi, parasites etc., but also from bacteria, archeae or viruses or from synthetic or semisynthetic sources. They are selected, for example, from genomic sequences of any origin, cDNA sequences, cDNA fragments or partial sequences, or also from synthetically generated sequences such as antisense molecules or combinatorially modified nucleic acid sequences.
  • the aim of the method according to the invention is to identify nucleic acid sequences which have a non-selectable activity in a target cell, i.e. which cannot be stably expressed recombinantly (over) in a target cell, e.g. because they inhibit cell growth or cell death, e.g. through apoptosis.
  • non-selectable activities include apoptosis induction, cell cycle arrest, cell differentiation, inhibition of cell metabolism and inhibition or activation of the expression of genes, e.g. through transcription factors.
  • the method according to the invention is particularly preferably used to identify dominant apoptosis induction genes.
  • Step (a) of the method consists in providing a DNA library comprising a multiplicity of host cells, each of which contains a nucleic acid sequence to be examined.
  • This DNA library is preferably - especially if it is a cDNA library - a normalized library, i.e. a library depleted in abundant species.
  • the production of such normalized libraries was carried out by Sasaki et al. (Nucleic Acids Res. 22 (1 994), 9987-9992). The depletion of abundant species in a population of mRNA molecules is achieved by adding cDNA molecules immobilized, for example, on latex beads, optionally in several rounds of hybridization.
  • the nucleic acid library is set up in an expression vector which is active in the desired target cell, preferably a eukaryotic cell and in particular a mammalian cell, ie the nucleic acid to be examined is operatively linked to an expression control sequence which is constitutively or regulatably active in the target cell.
  • the expression vector furthermore contains elements which enable replication and selection in the host cell, ie a corresponding origin of replication and a selection marker gene, for example an antibiotic resistance gene. Since selection of the expression vector cannot be carried out in the target cell, the presence of elements which allow replication and selection in the target cell is not necessary. Since bacterial cells, in particular gram-negative bacteria and particularly preferably E. coli cells, are preferably used as host cells, the expression vector can be a shuttle vector which contains both prokaryotic and eukaryotic sequence elements.
  • the expression vector is expediently an extrachromosomal vector and in particular a transiently transfectable plasmid. Alternatively, however, a stable episomal expression vector can also be used.
  • Such expression vectors are known to the person skilled in the field of molecular biology and are described, for example, by Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1 989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, or other standard textbooks.
  • Step (b) of the method according to the invention comprises culturing host cells.
  • Individual host cells are preferably used as the starting material for cultivation.
  • Such individual host cells can be obtained, for example, by plating clones of the nucleic acid library onto solid culture plates or by diluting liquid culture media accordingly.
  • several host cells for example small pools of up to 20 different clones, in particular of up to 10 different clones per Transfection approach are cultivated together, although in most cases this is less preferred.
  • Step (c) of the method according to the invention involves obtaining the expression vector from the cultivated cells.
  • Methods known from the prior art for isolating extrachromosomal DNA see, for example, Sambrook et al., Supra) can be used for this purpose. It should be noted, however, that the DNA isolated from the host cell should be of sufficient purity to enable subsequent cotransfection of the target cell with high efficiency.
  • alkaline lysis is preferably carried out.
  • the quality of the plasmid DNA obtained can be improved by adsorption on a solid matrix, in particular a silica adsorption matrix, washing with organic solvents and subsequent elution.
  • adsorption matrix in particular a silica adsorption matrix
  • washing with organic solvents and subsequent elution Surprisingly, it was found that the DNA can be bound to the adsorption matrix with high efficiency after alkaline lysis without the addition of chaotropic substances, as described in the prior art.
  • the absence of added chaotropic substances leads to considerable improvements and simplifications in the subsequent purification procedure and therefore represents a further aspect of the present invention, regardless of the preceding and subsequent steps of the claimed method.
  • Step (d) involves transfection or cotransfection of target cells, in particular eukaryotic cells such as mammalian cells, with the previously isolated expression vector and optionally a reporter vector.
  • target cells in particular eukaryotic cells such as mammalian cells
  • the transfection or cotransfection is preferably carried out by calcium phosphate coprecipitation, lipofection, electroporation, particle bombardment or viral infection (retroviruses, adenoviruses, etc.).
  • Target cells can be expressed transiently, the reporter vector transiently or stably. Transient expression is preferred.
  • the expression vector is advantageously used in a molar excess with respect to the reporter vector.
  • the molar ratio between reporter vector and expression vector is particularly preferably 1: 2 to 1:20. If the expression vector is used in a molar excess, the presence of the reporter vector in the target cell can serve as a marker for the simultaneous presence of the expression vector in the target cell, since cells cotransfect the plasmids used according to their molar ratio in the cotransfection batch.
  • the method according to the invention also allows the use of several reporter vectors, one of which is already present (chromosomal or extrachromosomal) in the target cell and another is introduced into the cell together with the expression vector by means of cotransfection.
  • the reporter vector is preferably selected so that there is no direct functional connection between the reporter and expression vector, i.e. that a gene product encoded by the expression vector does not act directly on the activity of the reporter vector, but that a gene product encoded by the expression vector only indirectly, i.e. affects the activity of the reporter vector by influencing the metabolism of the target cell.
  • embodiments of the screen are also possible which allow detection of direct interactions between reporter vector and expression vector.
  • the reporter vector co-transfected with the expression vector or already present in the target cell generally contains a nucleic acid sequence coding for a detectable gene product in a in the Target cell expressible form.
  • the reporter vector is preferably an extrachromosomal vector, particularly preferably a transiently transfectable plasmid.
  • a stable episomal or chromosomal reporter vector can also be used.
  • the reporter vector contains elements that enable selection and, if necessary, replication in the target cells.
  • the detectable gene product can be expressed via a constitutive or regulatable expression control sequence, preferably via a constitutive expression control sequence.
  • the gene product encoded by the reporter vector is a secreted enzyme, i.e. an enzyme that is secreted by the target cell.
  • a secreted enzyme i.e. an enzyme that is secreted by the target cell.
  • examples of such enzymes are the secreted alkaline phosphatase (SEAP) (Berger et al., Gene 66 (1 988), 1 -1 0)) and the luciferase (Lui et al., Gene 202 (1 977), 1 41 - 1 48).
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • the SEAP is particularly preferably used as a secreted enzyme. If secreted gene products are used as a reporter system, the activity in the culture supernatant of the target cells is determined.
  • the detectable gene product encoded by the reporter vector can also be a non-secreted polypeptide which can be detected intracellularly in an intact cell, for example a fluorescent protein such as GFP.
  • the detectable gene product expressed by the reporter vector can also be a membrane-bound, e.g. be a polypeptide detectable by incubation with antibodies or affinity ligands.
  • Step (e) of the method according to the invention includes determining the activity of the reporter vector in the target cells or in their culture supernatant as a measure of the non-selectable activity of the nucleic acid sequence under investigation. This determination method is based on the fact that the nucleic acid sequence to be examined on the expression vector in the target cell after expression has an influence on the cell metabolism, for example by induction of apoptosis, which in turn affects the activity of the reporter vector or the detectable gene product encoded by it in a measurable manner.
  • the activity of the reporter vector is preferably determined at at least two points after the transfection or cotransfection, the first point in time being chosen such that expression of the nucleic acid sequence contained on the expression vector has no influence on the activity of the reporter vector and can thus serve determine a basic activity for the target cell being examined.
  • the second point in time is chosen such that expression of the nucleic acid sequence contained on the expression vector already has a measurable influence on the activity of the reporter vector - provided the nucleic acid sequence present in the respective cell has the non-selectable activity investigated. In this way, regardless of the basic activity of the reporter vector, which depends on the transfection efficiency in transfection or cotransfection, the activity of a nucleic acid sequence introduced into a specific cell can be determined.
  • the implementation of the method according to the invention is preferably at least partially automated, steps (b) to (e) being able to be carried out in parallel on at least 50 samples.
  • the method according to the invention is used to identify nucleic acid sequences which have an influence on secretory properties of the target cell, such as apoptosis induction, the measurement of the activity of the reporter vector in the cell supernatant is sufficient to identify the desired nucleic acid sequences.
  • the detectable gene product encoded by the reporter vector for example a fluorescent protein such as GFP
  • GFP fluorescent protein
  • This label can optionally be combined with the detection of additional cellular parameters, for example detection of surface markers with antibodies or receptor ligands. To detect this fluorescent reagents can be used for additional parameters.
  • the presence or / and the intensity of the label (s) on the cells can then be determined by fluorescence cytometry, e.g. B. can be determined by means of FACS (fluorescence activated cell sorting).
  • the genes identified by the method according to the invention can be used to provide diagnostic and therapeutic agents.
  • Different target cells normal cells, tumor cells
  • Cells with defined genetic changes such as e.g. Cells with activated oncogenes or inactivated tumor suppressor genes, as well as virus-infected cells can be used for the scan.
  • This allows nucleic acid sequences to be identified or isolated which have their activity selectively in certain cell types, e.g. Genes that induce selective apoptosis induction in tumor cells or virus-infected cells.
  • These genes could then be expressed in the body of patients, for example for gene therapy to combat tumor diseases or viral infections. Since only a transient activity is necessary for the induction of apoptosis, the currently still difficult permanent expression in gene therapy is avoided.
  • Another aspect of the invention is the use of secreted enzymes as a reporter system for apoptosis processes, for example for the identification of apoptosis-associated genes or for the identification of drugs influencing apoptosis.
  • Use as a reporter system for identifying apoptosis induction or apoptosis inhibition genes is particularly preferred.
  • the secreted alkaline phosphatase (SEAP) is particularly preferably used as a reporter system.
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • the enzyme activity is advantageously detected using chromogenic or fluorescent substrates for the enzyme in question. Such enzyme substrates are known. Use as a reporter system in a previously described method is particularly preferred.
  • Yet another aspect of the invention is a device for the automated implementation of the method described above.
  • This device preferably contains two robots: one for the isolation of the plasmid DNA from the host cells and one for the transfection of target cells (FIGS. 4 and 5).
  • the DNA isolation robot comprises means for culturing a large number of host cells, for example a block or a microtiter plate.
  • the culture volumes for the host cells are preferably in the range from 0.5 to 2.5 ml, particularly preferably in the range from 0.5 to 1 ml.
  • the device comprises means for obtaining plasmid DNA from a large number of host cells, which are, for example, microtiter plates or blocks, which can optionally contain mini-columns for purifying the plasmid DNA.
  • the transfection robot contains means for transfection and cultivation of a large number of target cells, which can also be blocks or microtiter plates.
  • the device contains means for determining the activity of a reporter vector in target cells, preferably a spectrophotometric measuring device or a fluorescence measuring device. Both robots work with multi-channel pipettes, whereby the respective liquids can be pipetted at the same time in order to achieve a corresponding sample throughput.
  • FIGS. 4 and 5 are two preferred embodiments in which the treated plates with the DNA samples and the host cells or the DNA samples and the target cells are laid out on one surface and by a pipetting head which is arranged in x, y, z. Direction is movable, are interconnected.
  • the invention is further illustrated by the figures and examples described below. Show it:
  • Figure 1 is a schematic representation of a screening process for dominant non-selectable nucleic acid activities in one
  • Figure 2 shows the binding capacity of DNA after alkaline lysis of
  • Figure 3 shows the measurement of SEAP activities for the detection of dominant
  • Expression vector and a control vector (circle), an expression vector coding for the cell cycle locking gene p21 (square) and an apoptosis-inducing gene (rhombus). Data are normalized for activity at 1 6 h after transfection
  • FIG. 4 is a schematic representation of the DNA isolation robot.
  • Storage locations for blocks for example 96-well blocks with host cells or the DNA isolated therefrom and their intermediate stages are designated as A, B, C, d.
  • the one for DNA extraction necessary reagents are arranged on both sides.
  • P1, P2, P4, SiOx (silicon oxide solution) Acet. (Acetate solution), and H 2 O denote reservoirs with corresponding solutions which are required for DNA extraction.
  • a washing station (“washing") is used to clean the syringes of the
  • Pipetting head needed. Means for centrifuging (“centrifuge”), for applying a vacuum (“vacuum”), for shaking (shaking) and incubation stations (ine.) are used to process the plates for the purification of the DNA.
  • a pipetting head with a gripper arm that can move over the entire surface and can be moved in different directions by drives (X, Y, Z) connects the plates and the processing stations to one another.
  • the robot is shown in a side view in the upper half of the picture.
  • Figure 5 is a schematic representation of the transfection robot.
  • Target cells for transfection are drawn in four superimposed areas in multiwell plates.
  • the DNA samples to be transfected are arranged in the top row in 96-well plates.
  • the transfection reactions are set up in the row below.
  • the reagents required for this in addition to the DNA are designated as L1 and L2.
  • a washing station and a waste station serve to clean the syringes of the pipetting head ("Z"), which can be moved in the X, Y, Z direction and is driven by corresponding stepper motors (X, Y, Z).
  • a side view of the robot or the movable pipetting head is shown at the top and right edge of the picture.
  • Figure 6 shows the phenotypic change in the
  • Apoptosis induction with ANT-1 using cotransfection of GFP 3 ⁇ g expression plasmid for ANT-1 or an empty one Expression vectors were transfected into HeLa cells. For this purpose, 1 ⁇ g of an expression vector for GFP ("Green fluorescent protein") was cotransfected in order to label the transfected cells. The fluorescence was recorded with a 200-fold magnification 24 hours after the transfection.
  • Baby hamster kidney cells (BHK) were supplemented in DMEM with 5% fetal calf serum (Sigma, Deisenhofen, Germany) in a humidified 5% CO 2 atmosphere.
  • the cells were placed in 24-well plates and treated with 2 ⁇ g plasmid DNA according to the calcium phosphate creprecipitation method as described by Roussel et al. (Mol. Cell. Biol. 4 (1 984), 1 999-2009).
  • kidney cDNA library The normalization and construction of a kidney cDNA library was carried out as described by Grimm and Leder (J. Exp. Meth. 1 85 (1 997), 1 1 37-1 1 42) and s Sasaki et al. (Nucleic Acids Res. 22 (1 994), 987-992).
  • Kidney mRNA from 4 to 6 week old FVB mice was normalized by association of abundant mRNA species with antisense cDNA molecules covalently coupled to latex beads 0 and subsequent separation by centrifugation. After two rounds of hybridization, 200 ng (from originally 2 ⁇ g) of mRNA were obtained and used to prepare a cDNA library using a cDNA synthesis kit (Gibco BRL, Gaithersburg, MD).
  • the cDNA molecules were inserted into a modified pcDNA3 vector (Invitrogen) under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter in which the neomycin resistance gene had been deleted.
  • CMV cytomegalovirus
  • the DNA was introduced by electroporation into E. coli SURE cells (Stratagene, Corp. La Jolla, CA) 0, which were then immediately frozen.
  • SEAP activity was as described by Berger et al. (Gene 66 (1 988), 1-10). For this, the culture supernatant was centrifuged at 4000 rpm. After heat treatment at 65 ° C for 30 min, the activity was tested in a SEAP buffer as described.
  • 96-hole blocks with bacteria were centrifuged for 5 min at 3000 g (Sigma centrifuges, Osterode am Harz, Germany). The supernatant was decanted and the blocks were inverted for 2-3 minutes. Then 1 70 ⁇ ⁇ buffer P1 (50 mM Tris-HCl / 1 OmM EDTA pH 8.0) was added and the bacterial pellets were resuspended by complete vortex treatment for 10 to 20 minutes. After adding 1 70 ⁇ l of buffer P2 (200 mM NaOH, 1% SDS), the block was sealed with film, mixed by inverting and incubated for 5 min at room temperature. The lysis was terminated by adding 1 70 ⁇ l of 4 ° C.
  • the blocks were centrifuged at 6000 rpm for 10 min and the supernatant was transferred to an array of 96 columns made by inserting commercially available columns (Qiagen) into 96-well plates cut to size. These plates were placed in vacuum chambers (Qiagen). Then 150 ⁇ l of silicon oxide suspension were added and incubated for 20 min at room temperature (the silicon oxide suspension was prepared by adding 150 ⁇ l of HCl (37%) to 250 ml of a suspension of 50 mg / ml SiO 2 (Sigma) and subsequent autoclaving).
  • the 96-well column plate was placed on a 96-well microtiter plate and centrifuged for 4 min at 6000 rpm.
  • the column plate was first dried in a vacuum chamber for 5 min at 37 ° C and then for 5 min. Then it was placed on another microtiter plate. 70 ul H 2 O (60 ° C) were added and then centrifuged for 3 min at 6000 rpm.
  • the microtiter plate was stored at -20 ° C.
  • the pellets were resuspended in 75 ul water (60 ° C) and centrifuged at 6000 rpm and 4 ° C for 10 minutes. The supernatant was stored in a 96-well microtiter plate at -20 ° C.
  • FIG. 1 The schematic implementation of the screening process for non-selectable genes in a 96-hole format is shown in FIG. 1 shown.
  • there medium-containing 96-well blocks were inoculated with aliquots of a normalized, non-amplified cDNA expression library which statistically contain individual bacterial clones. Plasmid DNA was isolated from these bacterial cultures using mini-columns (see item 1.4). A corresponding protocol without columns is described under point 1.5. Screening in this format allows four workers to screen a complete normalized cDNA library, typically containing about 250,000 clones, in about 1 to 4 weeks.
  • plasmid DNA After subsequent washing in acetone, optionally with the addition of SDS, plasmid DNA of excellent quality could be obtained - corresponding to a purification using a cesium chloride gradient. About 10 ⁇ g of plasmid DNA were usually obtained from 900 ⁇ l LB medium with an OD260 / 280 of more than 1.8, of which 90% were in the supereoiled form.
  • the apoptosis-inducing genes were screened by determining the activity of the secreted alkaline phosphatase (SEAP) in the cell supernatant.
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • a DNA sequence coding for SEAP was inserted into the BHK cells together with the cDNA expression vector on a reporter plasmid (Flanagan and Leder, Cell 63 (1 990), 1 85-1 95) under the control of the constitutive Moloney Virus LTR promoter ( or other cells such as HeLa cells) by cotransfection.
  • a first measurement of SEAP activity was carried out 16 hours after transfection. This initial activity was used to normalize the subsequent activity determinations and set as the zero point (Fig. 3A). This normalization was done to compensate for different transfection efficiencies.
  • FIG. 3B shows that the SEAP activity is reduced by a factor of 10 when a apoptosis-inducing gene is cotransfected compared to a control.
  • the screen for apoptosis-inducing genes was also carried out by cotransfecting a GFP gene to mark the transfected cells and then determining the apoptosis by detecting phenotypic changes characteristic of apoptosis. For example, apoptopic cells have a contracted cytoplasm and therefore a reduced cell volume.
  • an expression vector from the gene library were cotransfected with 1 ⁇ g each of the GFP vector (pLantern, Gibco BRL).
  • the Transfected (and therefore fluorescent, since GFP positive) cells were examined at different times (1- 2-48 hours after transfection) under the fluorescence microscope (Axiovert 25 CFL, Zeiss) for phenotypic changes caused by apoptosis.
  • the search was for cells with a reduction in cell volume. Since the GFP protein is distributed all over the cell, it was easy to identify such cells. The detection can be easily automated using suitable computer programs and fluorescence cameras.
  • FIG. 6 shows the morphological changes which are caused by the transfection of ANT-1 in cells.
  • This gene also induces other biochemical processes that are specific for apoptosis, e.g. the breakdown of DNA, the release of cytochrome c from mitochondria and the activation of the cysteine proteases of the caspase family.
  • ANT-1 is a component of the "Permeability Transition" complex in mitochondria, which is known to play a role in apoptosis induction. Isolation of this gene is therefore confirmation that the screen allows the isolation of genes that play a role in apoptosis induction.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die in einer Zielzelle eine nicht-selektionierbare Aktivität aufweisen, die Verwendung der identifizierten Gene zur Bereitstellung diagnostischer und therapeutischer Mittel sowie die Verwendung von sezernierten Enzymen als Reportersystem für Apoptose-Prozesse.

Description

Verfahren zur Isolation von Apoptose-induzierenden DNA-Sequenzen und Detektionssystem
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die in einer Zielzelle eine nicht-selektionierbare Aktivität aufweisen, die Verwendung der identifizierten Gene zur Bereitstellung diagnostischer und therapeutischer Mittel sowie die Verwendung von sezernierten Enzymen als Reportersystem für Apoptose- Prozesse.
Apoptose ist das genetisch kodierte Selbstmordprogramm, welches in eukaryontischen Zeilen unter bestimmten physiologischen oder pathologischen Bedingungen induziert wird. Die Induktion der Apoptose muß außerordentlich präzise reguliert sein, denn eine Hyperaktivität kann zu degenerativen Erkrankungen führen. Auf der anderen Seite kann eine verringerte Apoptose-Induktion zur Tumorprogression beitragen.
Verschiedene niedermolekulare Induktoren der Apoptose wurden bereits beschrieben. Eine wichtige Klasse sind Tumorcytostatika. Auf welche Weise diese Cytostatika oder andere Substanzen Apoptose induzieren können, ist in den meisten Fällen jedoch unbekannt.
Die Identifizierung von Apoptose-induzierenden Genen oder anderen dominanten Genen mit einer nicht-selektionierbaren Aktivität ist problematisch, da eine stabile rekombinante Expression solcher Gene in einer Zielzelle entweder gar nicht oder nur sehr schwer möglich ist. Daher ist es erforderlich, spezielle Screening-Verfahren zur Identifizierung solcher Gene zu verwenden. Hierzu wurden bereits verschiedene in vitro Verfahren entwickelt (King et al. , Science 277 ( 1 997), 973-974 und Lustig et al., Meth. Enzymol. 283 ( 1 997) , 83-99) . Von anderen Arbeitsgruppen wurden transgene Mäuse erzeugt, die multiple Transgene enthalten, deren Funktionen durch Untersuchung des Phänotyps bestimmt wird (Simonet et al . , Cell 89 ( 1 997) , 309-31 9 und Smith et al . , Nat. Genet. 1 6 ( 1 997), 28- 36) . Ein Nachteil bei den in vitro Verfahren besteht darin, daß die erhaltenen Ergebnisse nicht ohne weiteres mit komplex regulierten zellbiologischen Effekten korrelieren. Untersuchungen an transgenen Tiere wiederum sind sehr aufwendig und mühsam.
Grimm und Leder (J . Exp. Med . 1 85 ( 1 997) , 1 1 37- 1 1 42) beschreiben ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung dominanter Apoptose- induzierender Nukleinsäuresequenzen. Hierbei werden kleine Plasmidpools entsprechend 20 Klonen aus normalisierten cDNA-Expressionsbibliotheken in die humane Nierenzellinie 293 transient eingeführt. Die Apoptose- induzierende Aktivität einer Nukleinsäuresequenz wird manuell durch mikroskopische Inspektion auf für Apoptose charakteristische morphologische Merkmale bestimmt. Ein Reporterplasmid wird zur Identifizierung von Apoptose-induzierenden Nukleinsäuresequenzen nicht verwendet. Dieses Verfahren ist aufwendig, kann aufgrund der Notwendigkeit, die Apoptose-induzierende Aktivität durch mikroskopische Inspektion morphologischer Charakteristika zu bestimmen, nur schwer automatisiert werden und ist daher für Reihenuntersuchungen ungeeignet. Weiterhin ist das Verfahren auf besonders effizient transfizierbare Zellinien beschränkt.
DE-OS 43 42 769 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung und Klonierung von für ein RNA-bindendes Protein kodierender cDNA durch Herstellung einer cDNA-Genbank von einer Zellinie, welche das RNA-bindende Protein voraussichtlich enthält, Einligieren der Genbank in Expressionsvektoren und deren Expression in Zellen, die bereits einen weiteren Expressionsvektor enthalten, der ein Markergen und in der 5'-nichttranslatierten Region dieses Gens die Bindungsstelle des betreffenden RNA-bindenden Proteins aufweist, und Nachweisen der Anwesenheit der cDNA über eine Verminderung der Expression des Markergens. Mit diesem Verfahren können jedoch keine dominanten Gene mit einer nicht-selektionierbaren Aktivität, deren stabile rekombinante Expression in einer Zelle nicht möglich ist, identifiziert werden.
DE-OS 38 06 61 7 beschreibt ein Verfahren zur Expression von nicht- selektionierbaren Genen in eukaryontischen Zellen, wobei zwei oder mehr Selektionsmarkergene mit den nicht-selektionierbaren Genen transfiziert werden, wobei sich die Selektionsmarkergene und die nicht- selektionierbaren Gene auf einem oder mehreren Vektoren oder DNA- Strukturen befinden und anschließend auf alle transfizierten Selektionsmarker selektioniert wird . Auch mit diesem Verfahren können keine dominanten Gene mit einer nicht-selektionierbaren Aktivität identifiziert werden, deren stabile rekominante Expression in einer Zelle nicht möglich ist.
WO 91 /1 9796 betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer tierischen oder pflanzlichen Zelle, die eine nicht-selektionierbare Gensequenz inseriert innerhalb einer vorbestimmten Gensequenz des Zellgenoms enthält, mittels homologer Rekombination. Auch dieses Verfahren ist nicht zur Identifizierung von dominanten nicht-selektionierbaren Genen mittels Reihenuntersuchungen geeignet.
WO 91 /00361 betrifft ein Verfahren zur identifizierbaren Expression eines nicht-selektionierbaren Gens unter Verwendung eines dominant- selektionierbaren Multidrug-Resistenzgens MDRI , wobei durch Selektion auf das MDR 1 Gen eine Amplifikation und Überexpression des nicht- selektionierbaren Gens erfolgt. Auch dieses Verfahren ist zur Identifizierung von dominant nicht selektionierbaren Genen grundsätzlich ungeeignet. Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein neues Verfahren zur Identifizierung von dominanten Nukleinsäuresequenzen mit einer nicht-selektionierbaren Aktivität und dafür geeignete Reporter- bzw. Detektionssysteme bereitzustellen, mit denen die oben geschilderten Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise beseitigt werden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von dominanten Aktivitäten von Nukleinsäuresequenzen, das einfach und in intakten Zellen durchführbar ist und automatisiert werden kann. Dabei wird eine Bibliothek von Nukleinsäuresequenzen in vorzugsweise eukaryontische Expressionsvektoren kloniert und von dieser Bibliothek werden einzelne Klone oder kleine Pools von Klonen in Bakterien vermehrt. Die Isolierung der Plasmid- DNA erfolgt vorzugsweise über ein automatisiertes Protokoll, das im 96- Loch-Format durchgeführt werden kann . Die isolierten Plasmid-DNAs können hierzu jeweils zusammen mit einem Reportervektor durch einzelne Transfektionsansätze in eukaryontische Zellen eingebracht werden. Dadurch handelt es sich bei dem hier beschriebenen Vorgehen um eine Reihenuntersuchung, einen sogenannten "Screen" . Anschließend wird in den transfizierten eurkaryontischen Zellen die Aktivität des Reportervektors bestimmt und mit der Aktivität der Nukleinsäuresequenz korreliert. Da in einer bevorzugten Version des Screens nach Transfektion der Zielzellen immer noch Plasmid-DNA aus den jeweiligen Ansätzen zurückbehalten wird, muß diese nicht aus den Zielzellen isoliert werden. Dies ist bei der Apoptose-Induktion von Vorteil, da bei diesem Vorgang die DNA in den Zellen abgebaut wird. Die Schritte der DNA-Isolierung, Transfektion und Aktivitätsdetektion lassen sich auf einfache Weise durch Verwendung von Robotern automatisieren .
Weiterhin werden neue Detektionssysteme bereitgestellt, welche die Identifizierung von Genen mit nicht-selektionierbarer Aktivität erleichtern.
Diese Detektionssysteme umfassen die Verwendung von sezernierten
Enzymen, insbesondere der Sezernierten Alkalischen Phosphatase (SEAP) , die vorzugsweise als Reportervektor in die zu untersuchende Zelle eingeführt und deren Sekretion als Maß der zu untersuchenden nicht- selektionierbaren Aktivität dienen kann . Ein Vorteil der Verwendung sezernierter Enzyme besteht darin, daß die Zelle nicht zerstört werden muß, um die Aktivität zu bestimmen. Die Aktivität kann daher im Überstand mehrmals gemessen werden: kurz nach der Transfektion, wenn die Wirkung der zu untersuchenden, in die Zelle eingeführten Nukleinsäuresequenz, beispielsweise die Apoptose-Induktion noch nicht eingesetzt hat, um einen Basiswert zu bestimmen, und zu einem späteren Zeitpunkt, um die Veränderung der enzymatischen Aktivität aufgrund der in der Zelle exprimierten Nukleinsäuresequenz zu messen. Beispielsweise wird in apoptotischen Zellen die Sekretion von Proteinen vermindert, so daß im Gegensatz zu Kontrollzellen die Aktivität des Reporterenzyms nicht ansteigt.
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die in einer Zielzelle eine nicht selektionierbare Aktivität aufweisen, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer DNA-Bibliothek umfassend eine Vielzahl von Wirtszellen, die jeweils eine zu untersuchende Nukleinsäuresequenz auf einem Expressionsvektor in operativer Verknüpfung mit einer in der Zielzelle aktiven Expressionskontrollsequenz enthalten,
(b) Kultivieren von Wirtszellen,
(c) Gewinnen des Expressionsvektors aus den kultivierten Wirtszellen, (d 1 ) Cotransfizieren von Zielzellen mit (i) dem in Schritt (c) gewonnen Expressionsvektor und
(ii) einem Reportervektor, oder (d2) Transfizieren von bereits einen Reportervektor enthaltenden Zielzellen mit dem in Schritt (c) gewonnenen Expressionsvektor und (e) Bestimmen der Aktivität des Reportervektors in den Zielzellen oder in deren Kulturüberbestand als qualitatives oder quantitatives Maß für die zu nicht-selektionierbare Aktivität der untersuchten Nukleinsäuresequenz. Die zu untersuchenden Nukleinsäuresequenzen können grundsätzlich aus beliebigen Quellen stammen, z.B. aus Eukaryonten wie Pflanzen, Wirbeltieren z.B. Säugern, Pilzen, Parasiten etc. , aber auch aus Bakterien, Archeae oder Viren oder aus synthetischen oder semisynthetischen Quellen . Sie werden beispielsweise aus genomischen Sequenzen beliebiger Herkunft, cDNA-Sequenzen, cDNA-Fragmenten oder Teilsequenzen oder auch aus synthetisch erzeugten Sequenzen wie etwa Antisense-Molekülen oder kombinatorisch modifizierten Nukleinsäuresequenzen ausgewählt.
Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, Nukleinsäuresequenzen zu identifizieren, die in einer Zielzelle eine nicht-selektionierbare Aktivität aufweisen, d .h. die nicht stabil in einer Zielzelle rekombinant (über)ex- primiert werden können, beispielsweise weil sie das Wachstum der Zelle hemmen oder den Zelltod, z.B. durch Apoptose, herbeiführen. Beispiele solcher nicht-selektionierber Aktivitäten sind etwa die Apoptose-Induktion, die Zellzyklus-Arretierung, die Zelldifferenzierung, die Inhibition des Zellstoffwechsels und die Inhibition oder Aktivierung der Expression von Genen, z.B. durch Transkriptionsfaktoren . Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von dominanten Apoptose- Induktionsgenen verwendet.
Schritt (a) des Verfahrens besteht darin, eine DNA-Bibliothek bereitzustellen, umfassend eine Vielzahl von Wirtszellen, die jeweils eine zu untersuchende Nukleinsäuresequenz enthalten . Diese DNA-Bibliothek ist vorzugsweise - insbesondere wenn es sich um eine cDNA-Bibliothek handelt - eine normalisierte Bibliothek, d .h . eine Bibliothek, die an abundanten Spezies abge- reichert ist. Die Herstellung solcher normalisierten Bibliotheken wurde von Sasaki et al. (Nucleic Acids Res. 22 ( 1 994), 9987-9992) beschrieben. Die Abreicherung abundanter Spezies in einer Population von mRNA-Molekülen wird durch Zugabe von beispielsweise auf Latexbeads immobilisierten cDNA Molekülen, gegebenenfalls in mehreren Hybridisierungsrunden erreicht. Die Nukleinsäurebibliothek wird in einem Expressionsvektor angelegt, der in derjeweils gewünschten Zielzelle, vorzugsweise einer eukaryontischen Zelle und insbesondere einer Säugerzelle aktiv ist, d.h. die zu untersuchende Nu kleinsäure steht auf dem Expressionsvektor in operativer Verknüpfung mit einer in der Zielzelle konstitutiv oder regulierbar aktiven Expressionskontrollsequenz. Weiterhin enthält der Expressionsvektor Elemente, welche eine Replikation und Selektion in der Wirtszelle ermöglichen, d.h. einen entsprechenden Replikationsursprung und ein Selektionsmarkergen, z.B. ein Antibiotikaresistenzgen . Da eine Selektion des Expressionsvektors in der Zielzelle nicht durchgeführt werden kann, ist das Vorhandensein von Elementen, die eine Replikation und Selektion in der Zielzelle erlauben, nicht notwendig . Da als Wirtszellen vorzugsweise Bakterienzellen, insbesondere gramnegative Bakterien und besonders bevorzugt E.coli Zellen verwendet werden, kann der Expressionsvektor ein Shuttle-Vektor sein, der sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Sequenzelemente enthält.
Der Expressionsvektor ist zweckmäßigerweise ein extrachromosomaler Vektor und insbesondere ein transient transfizierbares Plasmid. Alternativ kann jedoch auch ein stabiler episomaler Expressionsvektor eingesetzt werden . Derartige Expressionsvektoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt und beispielsweise bei Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual ( 1 989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder in anderen Standardlehrbüchern beschrieben.
Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt eine Kultivierung von Wirtszellen. Vorzugsweise werden einzelne Wirtszellen als Ausgangsmaterial zur Kultivierung verwendet. Solche einzelnen Wirtszellen können beispielsweise durch Ausplattieren von Klonen der Nukleinsäurebibliothek auf festen Kulturplatten oder entsprechende Verdünnung flüssiger Kulturmedien erhalten werden. Gegebenenfalls können auch mehrere Wirtszellen, z.B. kleine Pools von maximal bis zu 20 verschiedenen Klonen, insbesondere von maximal bis zu 10 verschiedenen Klonen pro Transfektionsansatz gemeinsam kultiviert werden, obwohl dies in den meisten Fällen weniger bevorzugt ist.
Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahren beinhaltet das Gewinnen des Expressionsvektors aus den kultivierten Zellen. Hierzu können aus dem Stand der Technik bekannte Methoden zur Isolierung extrachromosomaler DNA (siehe z. B. Sambrook et al., supra) eingesetzt werden. Dabei ist jedoch zu beachten, daß die aus der Wirtszelle isolierte DNA eine ausreichende Reinheit aufweisen sollte, um die spätere Cotransfektion der Zielzelle mit hoher Effizienz zu ermöglichen.
Bei bakteriellen Wirtszellen wird vorzugsweise eine alkalische Lyse durchgeführt. Die Qualität der erhaltenen Plasmid-DNA kann durch Adsorption an eine feste Matrix, insbesondere eine Silika-Adsorptionsmatrix, Waschen mit organischen Lösungsmitteln und anschließende Elution verbessert werden. Überraschenderweise wurde dabei gefunden, daß die DNA nach der alkalischen Lyse ohne daß - wie im Stand der Technik beschrieben - die Zugabe chaotroper Substanzen erforderlich ist, mit hoher Effizienz an die Adsorptionsmatrix gebunden werden kann . Die Abwesenheit zugesetzter chaotroper Substanzen führt zur erheblichen Verbesserungen und Vereinfachungen bei der anschließenden Aufreinigungsprozedur und stellt daher - unabhängig von den vorhergehenden und nachfolgenden Schritten des beanspruchten Verfahrens - einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar.
Schritt (d) beinhaltet eine Transfektion oder Cotransfektion von Zielzellen, insbesondere eukaryontische Zellen wie etwa Säugerzellen, mit dem zuvor isolierten Expressionsvektor und gegebenenfalls einem Reportervektor. Bei eukaryontischen Zielzellen erfolgt die Transfektion bzw. Cotransfektion vorzugsweise durch Calciumphosphat-Copräzipitation, Lipofektion, Elektroporation, Partikelbeschuß oder virale Infektion (Retroviren, Adenoviren etc.) . In den durch Transfektion oder Cotransfektion erzeugten Zielzellen kann der Expressionsvektortransient, der Reportervektor transient oder stabil exprimiert werden . Eine transiente Expression ist bevorzugt.
Bei der bevorzugten Cotransfektion wird der Expressionsvektor günstigerweise in einem molaren Überschuß bezüglich des Reportervektors eingesetzt. Besonders bevorzugt beträgt das Molverhältnis zwischen Reportervektor und Expressionsvektor 1 :2 bis 1 :20. Bei Verwendung des Expressionsvektors im molaren Überschuß kann die Anwesenheit des Reportervektors in der Zielzelle als Marker für das gleichzeitige Vorhandensein des Expressionsvektors in der Zielzelle dienen, da Zellen bei einer Cotransfektion die eingesetzten Plasmide entsprechend ihrem Molverhältnis im Cotransfektionsansatz aufnehmen.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt im übrigen auch die Verwendung mehrerer Reportervektoren, von denen einer bereits (chromosomal oder extrachromosomal) in der Zielzelle vorliegt und ein anderer mittels Cotransfektion zusammen mit dem Expressionsvektor in die Zelle eingeführt wird .
Der Reportervektor wird vorzugsweise so gewählt, daß kein unmittelbarer funktioneller Zusammenhang zwischen Reporter- und Expressionsvektor besteht, d .h. daß ein von dem Expressionsvektor kodiertes Genprodukt nicht direkt auf die Aktivität des Reportervektors wirkt, sondern daß ein vom Expressionsvektor kodiertes Genprodukt nur mittelbar, d.h. über eine Beeinflußung des Metabolismus der Zielzelle auf die Aktivität des Reprotervektors wirkt. Es sind jedoch auch Ausführungsformen des Screens möglich, welche eine Detektion von direkten Interaktionen zwischen Reportervektor und Expressionsvektor erlauben.
Der zusammen mit dem Expressionsvektor cotransfizierte oder bereits in der Zielzelle vorhandene Reportervektor enthält im allgemeinen eine für ein nachweisbares Genprodukt kodierende Nukleinsäuresequenz in einer in der Zielzelle exprimierbaren Form. Der Reportervektor ist vorzugsweise ein extrachromosomaler Vektor, besonders bevorzugt ein transient transfizier- bares Plasmid . Andererseits kann auch ein stabiler episomaler oder chromo- somaler Reportervektor eingesetzt werden. In diesem Fall enthält der Reportervektor Elemente, die eine Selektion und gegebenenfalls eine Replikation in den Zielzellen ermöglichen . Die Expression des nachweisbaren Genprodukts kann über eine konstitutive oder regulierbare Expressionskontrollsequenz, vorzugsweise über eine konstitutive Expressionskontrollsequenz erfolgen.
Das vom Reportervektor kodierte Genprodukt ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein sezerniertes Enzym, d .h . ein Enzym, welches von der Zielzelle sekretiert wird. Beispiele für solche Enzyme sind die Sezernierte Alkalische Phosphatase (SEAP) (Berger et al., Gene 66 ( 1 988), 1 -1 0)) sowie die Luziferase (Lui et al., Gene 202 ( 1 977) , 1 41 -1 48) . Besonders bevorzugt wird die SEAP als sezerniertes Enzym verwendet. Bei Verwendung sezernierter Genprodukte als Reportersystem erfolgt die Bestimmung der Aktivität im Kulturüberstand der Zielzellen. Andererseits kann das vom Reportervektor kodierte nachweisbare Genprodukt auch ein nicht sekretiertes Polypeptid sein, welches intrazellulär in einer intakten Zelle nachweisbar ist, beispielsweise ein Fluoreszenzprotein wie GFP. Ebenso kann das vom Reportervektor exprimierte nachweisbare Genprodukt auch ein membranständiges, z.B. durch Inkubation mit Antikörpern oder Affinitätsliganden nachweisbares Polypeptid sein.
Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet die Bestimmung der Aktivität des Reportervektors in den Zielzellen oder in deren Kulturüberstand als Maß für die nicht-selektionierbare Aktivtät der untersuchten Nukleinsäuresequenz. Diese Bestimmungsmethode beruht darauf, daß die auf dem Expressionsvektor befindliche zu untersuchende Nukleinsäuresequenz in der Zielzelle nach Expression einen Einfluß auf den Zellmetabolismus, z.B. durch Apoptose-Induktion, aufweist, der wiederum die Aktivität des Reportervektors bzw. des von ihm kodierten nachweisbaren Genprodukts auf meßbare Weise beeinflußt. Vorzugsweise wird die Aktivität des Reportervektors an mindestens zwei Punkten nach der Transfektion oder Cotransfektion bestimmt, wobei der erste Zeitpunkt so gewählt wird, daß eine Expression der auf dem Expressionsvektor enthaltenen Nukleinsäuresequenz noch keinen Einfluß auf die Aktivität des Reportervektors hat, und somit dazu dienen kann, eine Basisaktivität für die jeweils untersuchte Zielzelle festzulegen. Der zweite Zeitpunkt wird so gewählt, daß eine Expression der auf dem Expressionsvektor enthaltenen Nukleinsäuresequenz bereits einen meßbaren Einfluß auf die Aktivität des Reportervektors hat - sofern die in der jeweiligen Zelle vorhandene Nukleinsäuresequenz die untersuchte nicht-selektionierbare Aktivtät aufweist. Auf diese Weise kann unabhängig von der Basisaktivtät des Reportervektors, die von der Transfektionseffizienz bei der Transfektion oder Cotransfektion abhängt, die Aktivität einer in eine bestimmte Zelle eingeführten Nukleinsäuresequenz bestimmt werden. Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren wird bevorzugt zumindest teilweise automatisiert, wobei die Schritte (b) bis (e) an mindestens 50 Proben jeweils parallel durchgeführt werden können.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen eingesetzt wird, die einen Einfluß auf sekretorische Eigenschaften der Zielzelle haben wie etwa die Apoptose-Induktion, ist die Messung der Aktivität des Reportervektors im Zeilüberstand zur Identifizierung der gewünschten Nukleinsäuresequenzen ausreichend . In anderen Ausführungsformen des Verfahrens, z.B. bei der Identifizierung von die Zelldifferenzierung beeinflussenden Substanzen, kann das vom Reportervektor kodierte nachweisbare Genprodukt, z.B. ein Fluoreszenzprotein wie GFP, intrazellulär zur Markierung der transfizierten Zellen exprimiert werden. Diese Markierung kann gegebenenfalls mit der Detektion zusätzlicher zellulärer Parameter, z.B. Detektion von Oberflächenmarkern mit Antikörpern oder Rezeptorliganden, kombiniert werden. Zur Detektion dieser zusätzlichen Parameter können fluoreszierende Reagenzien eingesetzt werden . Das Vorhandensein oder/und die Intensität der Markierung(en) auf den Zellen können dann durch Fluoreszenzcytometrie, z. B. mittels FACS (Fluorescence activated cell sorting) bestimmt werden.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren identifizierten Gene können zur Bereitstellung diagnostischer und therapeutischer Mittel eingesetzt werden . So können bei Durchführung des Verfahrens unterschiedliche Zielzellen (normale Zellen, Tumorzellen) verwendet werden . Es können auch Zellen mit definierten genetischen Veränderungen wie z.B. Zellen mit aktivierten Onkogenen oder inaktivierten Tumorsuppressorgenen, sowie Virus-infizierte Zellen für den Sceen benutzt werden . Dadurch können Nukleinsäuresequenzen identifiziert bzw. isoliert werden, welche ihre Aktivität selektiv in bestimmten Zelltypen aufweisen, z.B. Gene die eine selektive Apoptose- Induktion in Tumorzellen oder virusinfizierten Zellen herbeiführen. Diese Gene könnten dann beispielsweise zur gentherapeutischen Bekämpfung von Tumorerkrankungen oder Virusinfektionen im Körper von Patienten exprimiert werden. Da für die Apoptose-Induktion nur eine transiente Aktivtät notwendig ist, wird die derzeit noch schwierige permanente Expression bei der Gentherapie umgangen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von sezernierten Enzymen als Reportersystem für Apoptose-Prozesse, beispielsweise zur Identifizierung von Apoptose-assoziierten Genen oder zur Identifizierung von die Apoptose beeinflussenden Arzneimitteln. Besonders bevorzugt ist die Verwendung als Reportersystem zur Identifizierung von Apoptose- Induktions- oder Apoptose-Inhibitionsgenen.
Besonders bevorzugt wird die Sezernierte Alkalische Phosphatase (SEAP) als Reportersystem eingesetzt. Der Nachweis der Enzymaktivität erfolgt günstigerweise unter Verwendung von chromogenen oder auch fluoreszierenden Subtraten für das jeweilige Enzym. Derartige Enzymsubstrate sind bekannt. Besonders bevorzugt ist die Verwendung als Reportersystem in einem zuvor beschriebenen Verfahren.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Vorrichtung zur automatisierten Durchführung des zuvor beschriebenen Verfahrens. Diese Vorrichtung enthält bevorzugt zwei Roboter: einen für die Isolation der Plasmid DNA aus den Wirtszellen und einen für die Transfektion von Zielzellen (Figuren 4 und 5) . Der DNA Isolationsroboter umfaßt Mittel zur Kultivierung einer Vielzahl von Wirtszellen, beispielsweise einen Block oder eine Mikrotiterplatte. Die Kulturvolumina für die Wirtszellen liegen vorzugsweise im Bereich von 0, 5-2,5 ml, besonders bevorzugt im Bereich von 0, 5 bis 1 ml . Weiterhin umfaßt die Vorrichtung Mittel zur Gewinnung von Plasmid-DNA aus einer Vielzahl von Wirtszellen, bei denen es sich beispielsweise um Mikrotiterplatten oder Blöcke handelt, die gegebenenfalls Minisäulen zur Aufreinigung der Plasmid-DNA enthalten können. Der Transfektionsroboter enthält Mittel zur Transfektion und Kultivierung einer Vielzahl von Zielzellen, bei denen es sich ebenfalls um Blöcke oder Mikrotiterplatten handeln kann. Schließlich enthält die Vorrichtung Mittel zur Bestimmung der Aktivität eines Reportervektors in Zielzellen, vorzugsweise ein spektrophotometrisches Meßgerät oder ein Fluoreszenzmeßgerät. Beide Roboter arbeiten mit Mehrkanalpipetten, wobei die jeweiligen Flüssigkeiten gleichzeitig pipettiert werden können, um einen entsprechenden Probendurchsatz zu erreichen.
Eine Vielzahl von möglichen Roboterausführungen ist möglich, um den Screen durchzuführen. Gezeigt sind in Figur 4 und 5 zwei bevorzugte Ausführungsformen, bei denen die behandelten Platten mit den DNA Proben und den Wirtszellen bzw. die DNA-Proben und die Zielzellen auf einer Fläche ausgelegt werden und durch einen Pipettierkopf, der in x,y,z-Richtung beweglich ist, miteinander verbunden sind . Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgend beschriebenen Figuren und Beispiele näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1 die schematische Darstellung eines Screening-Verfahrens auf dominante nicht-selektierbare Nukleinsäureaktivitäten in einem
96-Loch-Format,
Figur 2 die Bindekapapzität von DNA nach alkalischer Lyse von
Bakterienzellen an Siliciumoxid abhängig von der Konzentration an Guanidiniumhydrochlorid,
Figur 3 die Messung von SEAP-Aktivitäten zum Nachweis dominanter
Apoptose-induzierender Gene:
A: Zeitverlauf der SEAP-Aktivität in Cotransfektions- experimenten unter Verwendung eines SEAP-
Expressionsvektors und eines Kontrollvektors (Kreis), eines für das Zellzyklus-Arretierungsgen p21 kodierenden Expressionsvektors (Quadrat) und eines Apoptose-induzierenden Gens (Raute) . Die Daten sind bezüglich der Aktivität bei 1 6 h nach Transfektion normalisiert
B: Verringerung der SEAP Aktivität (Δ A405 nm) durch
Apoptoseinduktion. Die SEAP-Aktivität 1 6 h nach
Transfektion wurde zur Normalisierung der Aktivität nach 36 h verwendet, deren Mittelwerte und
Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten angezeigt sind.
Figur 4 eine schematische Darstellung des DNA Isolationsroboters. Lagerungsplätze für Blöcke z.B. 96-well Blöcke mit Wirtszellen oder der daraus isolierten DNA und deren Zwischenstufen sind als A, B, C, d bezeichnet. Die für die DNA Gewinnung notwendigen Reagenzien sind zu beiden Seiten angeordnet. P1 , P2, P4, SiOx (Siliciumoxid-Lösung) Acet. (Acetat-Lösung) , und H2O bezeichnen Reservoire mit entsprechenden Lösungen, die für die DNA-Gewinnung benötigt werden. Eine Waschstation ( "washing") wird zum Reinigen der Spritzen des
Pipettierkopfes benötigt. Mittel zum Zentrifugieren, ("centrifuge") , zum Anlegen eines Vakuums ("vacuum") , zum Schütteln (shaking) und Inkubationsstationen (ine.) dienen zur Bearbeitung der Platten für die Aufreinigung der DNA. Ein über die gesamte Fläche beweglicher Pipettierkopf mit Greifarm, der durch Antriebe (X,Y,Z) in verschiedene Richtungen bewegt werden kann, verbindet die Platten und die Bearbeitungsstationen untereinander. In der oberen Bildhälfte ist der Roboter in einer Seitenansicht gezeigt.
Figur 5 eine schematische Darstellung des Transfektionsroboters. Die
Zielzellen für die Transfektion sind in vier übereinander angeordneten Reichen in Multiwell-Platten eingezeichnet. Die zu transfizierenden DNA-Proben sind in der obersten Reihe in 96-well Platten angeordnet. In der darunterliegenden Reihe werden die Transfektionsreaktionen angesetzt. Die dazu zusätzlich zur DNA benötigten Reagenzien sind als L1 und L2 bezeichnet. Eine Waschstation, ebenso wie eine Abfalistation (waste) dient der Säuberung der Spritzen des Pipettierkopfes ("Z"), der in X,Y,Z Richtung beweglich ist und durch entsprechende Schrittmotoren (X,Y,Z) angetrieben wird . Am oberen und rechten Bildrand ist eine seitliche Ansicht des Roboters bzw. des beweglichen Pipettierkopfes eingezeichnet.
Figur 6 eine Darstellung der phänotypischen Veränderung bei der
Apoptose-Induktion mit ANT-1 mittels Cotransfektion von GFP. 3 μg Expressionplasmid für ANT-1 oder ein leerer Expressionsvektor wurden in HeLa Zellen transfiziert. Dazu wurde jeweils 1 μg eines Expressionsvektors für GFP ("Green fluorescent protein") cotransfiziert, um die transfizierten Zellen zu markieren . Die Fluoreszenz wurde mit einer 200-fachen Vergrößerung 24 Stunden nach der Transfektion aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1
Isolation von Apoptose-induzierenden Genen durch Cotransfektion eines SEAP-Gens auf einem Markerplasmid
1 . Experimentelle Protokolle
1 . 1 Zellkultur und Transfektionen
Babyhamster Nierenzellen (BHK) wurden in DMEM ergänzt mit 5 % fötalem Kälberserum (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in einer befeuchteten 5% CO2-Atmosphäre kultiviert. Für Transfektionen wurden die Zellen in 24- Loch-Platten gegeben und mit 2 μg Plasmid DNA nach der Calciumphos- phat-Cropräzipitationsmethode wie von Roussel et al. (Mol. Cell. Biol. 4 ( 1 984), 1 999-2009) beschrieben transfiziert. Hierfür wurden 25 μ\ DNA Lösung mit 25 μ\ 2 x HBS-Puffer pH 6,9 (274 mM NaCI, 1 0 mM KCI, 40 mM Hepes, 1 ,4 mM Na2HPO4) bei 4°C in einer 96-Loch-Platte mit einem 1 2- Kanal-Pipettierautomaten (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) vermischt. Nach Zugabe von 20 μ\ einer 0,25 M CaCI2 Lösung (4°C) und Mischen wurden 38 μ\ nach Inkubation für 25 min bei Raumtemperatur auf die Zellen gegeben. 1 .2 Erzeugung einer normalisierten Bibliothek und cDNA Screeninq
Die Normalisierung und Konstruktion einer Nieren cDNA Bibliothek wurde wie von Grimm und Leder (J . Exp. Meth. 1 85 ( 1 997) , 1 1 37- 1 1 42) und s Sasaki et al. (Nucleic Acids Res. 22 ( 1 994) , 987-992) beschrieben durchgeführt.
mRNA aus der Niere von 4 bis 6 Wochen alten FVB Mäusen wurde durch Assoziation abundanter mRNA Spezies mit kovalent an Latexbeads 0 gekoppelten Antisense-cDNA-Molekülen und anschließende Abtrennung durch Zentrifugation normalisiert. Nach zwei Hybridisierungsrunden wurden 200 ng (von ursprünglich 2 μg) mRNA erhalten und zur Herstellung einer cDNA Bibliothek unter Verwendung eines cDNA Synthesekits (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) verwendet. Nach Ligation eines BstXI Adaptors 5 (Invitrogen, San Diego, CA) und einer Spaltung mit Notl wurden die cDNA Moleküle in einen modifizierten pcDNA3-Vektor (Invitrogen) unter Kontrolle des Cytomegalovirus (CMV) Promotors inseriert, in dem das Neomycinresistenzgen deletiert worden war. Die DNA wurde durch Elektroporation in E.coli SURE-Zellen (Stratagene, Corp. La Jolla, CA) 0 eingeführt, die anschließend sofort eingefroren wurden.
Durch Ausplattieren von Aliquots des Transformationsansatzes auf Agar wurde gefunden, daß die Bibliothek etwa 2,5x1 05 Klone enthielt. Aliquots, die statistisch Einzelklone enthielten, wurden in Löchern von 96-Loch- 5 Blöcken (Qiagen, Hilden, Deutschland) in 900 μl LB-Medium inokuliert und für 30 h unter Schütteln bei 300 Upm kultiviert. Nach Identifizierung eines positiven Pools wurde die DNA zur Bestätigung des Ergebnisses erneut transfiziert. Die verbleibende DNA wurde zur Transformation von Bakterien für eine Plasmidisolierung im großen Maßstab verwendet. 0 1 .3 Bestimmung der Aktivität von Sezernierter Alkalischer Phosphatase (SEAP)
Die SEAP-Aktivität wurde wie von Berger et al. (Gene 66 ( 1 988), 1 - 1 0) beschrieben bestimmt. Hierzu wurde der Kulturüberstand bei 4000 Upm zentrifugiert. Nach Hitzebehandlung bei 65 °C für 30 min wurde die Aktivität in einem SEAP-Puffer wie beschrieben getestet.
1 .4 Plasmidisolierung mit Säulen
96-Loch-Blöcke mit Bakterien wurden für 5 min bei 3000 g (Sigma Zentrifugen, Osterode am Harz, Deutschland) zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Blöcke wurden für 2 bis 3 min umgedreht. Dann wurden 1 70 μ\ Puffer P1 (50 mM Tris-HCI/1 OmM EDTA pH 8,0) zugegeben und die Bakterienpellets wurden durch vollständige Vortexbehandlung für 1 0 bis 20 min resuspendiert. Nach Zugabe von 1 70 μl Puffer P2 (200 mM NaOH, 1 % SDS) wurde der Block mit Folie abgedichtet, durch Invertieren gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lyse wurde durch Zugabe von 1 70 μl von 4° C kaltem Puffer P3 (3 M Kaliumacetat pH 5, 5) beendet. Dann wurden 10 μl RNaseA Lösung (1 ,7 mg/ml) zugegeben, für 5 min bei Raumtemperatur und dann bei -20°C inkubiert und erneut für 1 0 min bei 6000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Blöcke dekantiert und 100 μl Puffer P4 (2,5% SDS in Isopropanol) wurden zugegeben. Der Block wurde einer Vortexbehandlung für 5 min unterzogen und zuerst für 1 5 min bei 4°C und dann für 1 5 min bei -20° C inkubiert. Die Blöcke wurden für 10 min bei 6000 Upm zentrifugiert und der Überstand wurde in eine Anordnung von 96 Säulen überführt, die durch Einsetzen von kommerziell erhältlichen Säulen (Qiagen) in entsprechend zugeschnittene 96-Loch-Platten hergestellt worden war. Diese Platten wurden in Vakuumkammern (Qiagen) gestellt. Dann wurden 1 50 μl Siliciumoxid- suspension zugegeben und für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert (die Siliciumoxidsuspension wurde hergestellt durch Zugabe von 1 50 μl HCI (37%) zu 250 ml einer Suspension von 50 mg/ml SiO2 (Sigma) und anschließendes Autoklavieren) .
Nach Anlegen von Vakuum wurden die Säulen zweimal mit 600 μl Aceton (-20 ° C) gewaschen . Die 96-Loch-Säulenplatte wurde auf eine 96-Loch- Mikrotiterplatte gegeben und für 4 min bei 6000 Upm zentrifugiert. Die Säulenplatte wurde zuerst für 5 min bei 37 °C und dann für 5 min in einer Vakuumkammer getrocknet. Dann wurde sie auf eine weitere Mikrotiterplatte gestellt. 70 μl H2O (60°C) wurden zugegeben und dann erfolgte eine Zentrifugation für 3 min bei 6000 Upm. Die Mikrotiterplatte wurde bei - 20 °C aufbewahrt.
1 .5 Plasmidisolierung ohne Säulen
Das Verfahren erfolgte bis zur Zugabe des Puffers P4 wie unter Punkt 1 .4 beschrieben . Dann wurde der Überstand nach Zentrifugation für 1 0 min bei 6000 Upm in 96-Loch-Polyoxymethylen-Mikrotiterblöcke gegeben. 1 50 μl Siliciumoxidsuspension wurden zugegeben und für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden für 5 min bei 6000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig dekantiert und 400 μl Aceton (-20°C) wurden zugegeben. Die Platten wurden erneut einer Vortexbehandlung (30 sec) unterzogen und für 3 min bei 6000 Upm zentrifugiert. Dieser Acetonwaschvorgang wurde einmal wiederholt. Die Platten wurden zuerst bei Raumtemperatur für 5 min und dann für 5 min in einer Vakuumkammer getrocknet. Die Pellets wurden in 75 μl Wasser (60°C) resuspendiert und bei 6000 Upm und 4°C 1 0 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte bei -20°C aufbewahrt.
2. Ergebnisse
Die schematische Durchführung des Screeningsverfahrens auf nicht seiektierbare Gene in einem 96-Loch-Format ist in Fig . 1 gezeigt. Dabei wurden Medium enthaltende 96-Loch-Blöcke mit Aliquots einer normalisierten, nicht amplifizierten cDNA-Expressions-Bibliothek inokuliert, die statistisch einzelne Bakterienklone enthalten . Aus diesen Bakterienkulturen wurde Plasmid-DNA unter Verwendung von Minisäulen (siehe Punkt 1 .4) isoliert. Ein entsprechendes Protokoll ohne Säulen ist unter Punkt 1 .5 beschrieben. Ein Screening in diesem Format ermöglicht es, daß vier Arbeitskräfte eine vollständige normalisierte cDNA Bibliothek, die üblicherweise etwa 250 000 Klone enthält, in etwa 1 4 Wochen durchmustern.
Für den Transfektionsschritt bei diesem Screeningprozeß ist es wichtig, Plasmid-DNA sehr hoher Reinheit zu erhalten. Hierzu wurde Siliciumdioxid als Bindematrix für Plasmid-DNA verwendet. Die Bindung von DNA an Siliciumdioxid in Anwesenheit chaotroper Substanzen ist bekannt (Vogelstein und Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 ( 1 979), 61 5-61 9) . Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, daß selbst in Abwesenheit einer zugefügten chaotropen Substanz wie etwa Guaidinhydrochlorid die Plasmid-DNA mit ausreichender Kapazität an Siliciumdioxid bindet (Fig . 2) . Nach anschließendem Waschen in Aceton gegebenenfalls unter Zusatz von SDS, konnte Plasmid DNA in hervorragender Qualität - entsprechend einer Reinigung über eine Cäsiumchloridgradienten - erhalten werden. Üblicherweise wurden etwa 1 0 μg Plasmid-DNA aus 900 μl LB-Medium mit einer OD260/280 von mehr als 1 ,8 erhalten, wovon 90% in der supereoiled Form vorlagen.
Das Screening auf Apoptose-induzierende Gene erfolgte durch Bestimmung der Aktivität von der Sezernierten Alkalischen Phosphatase (SEAP) im Zeilüberstand . Eine für SEAP kodierende DNA-Sequenz wurde auf einem Reporterplasmid (Flanagan und Leder, Cell 63 ( 1 990) , 1 85-1 95) unter Kontrolle des konstitutiven Moloney Virus LTR-Promotors zusammen mit dem cDNA-Expressionsvektor in die BHK-Zellen (oder auch andere Zellen wie etwa HeLa-Zellen) durch Cotransfektion eingeführt. 1 6 h nach Transfektion erfolgte eine erste Messung der SEAP Aktivität. Diese anfängliche Aktivität wurde zur Normalisierung der nachfolgenden Aktivitätsbestimmungen verwendet und als Nullpunkt gesetzt (Fig. 3A) . Diese Normalisierung erfolgte zum Ausgleich unterschiedlicher Transfektionseffizienzen .
Bei Cotransfektion mit einem Kontrollvektor konnte eine starke Zunahme der SEAP-Aktivität gefunden werden. Bei Cotransfektion mit einem Vektor, der ein Aptoptose-induzierendes Gen enthält, wurde jedoch nur ein sehr geringer Anstieg in der SEAP Aktivität festgestellt (Fig . 3A) .
Der Rückgang der SEAP-Aktivität durch Apoptose-Induktion ließ sich durch zweimalige Messung des Kulturüberstands - 1 6 und 36 h nach Transfektion - reproduzierbar bestimmen. Figur 3B zeigt, daß die SEAP Aktivität um den Faktor 1 0 bei Cotransfektion eines Apoptose-induzierenden Gens im Vergleich zu einer Kontrolle verringert wird . Unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens konnten bereits mehrere Apoptose-induzierende Gene identifiziert werden.
Beispiel 2
Isolation von Apoptose-induzierenden Genen durch Cotransfektion eines GFP-Gens auf einem Markerplasmid
Der Screen nach Apoptose-induzierenden Genen wurde auch mittels Cotransfektion eines GFP-Gens zur Markierung der transfizierten Zellen und anschließender Bestimmung der Apoptose durch die Detektion von für Apoptose charakteristischen phänotypischen Veränderungen durchgeführt. So weisen apoptopische Zellen ein kontrahiertes Cytoplasma und daher ein verringertes Zellvolumen auf.
Hierzu wurden 3 μg eines Expressionsvektors aus der Genbibliothek mit jeweils 1 μg des GFP Vektors (pLantern, Gibco BRL) cotransfiziert. Die transfizierten (und damit fluoreszierenden, da GFP positiven) Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten ( 1 2-48 Stunden nach der Transfektion) unter dem Fluoreszenzmikroskop (Axiovert 25 CFL, Zeiss) nach phänotypischen Veränderungen, die durch die Apoptose verursacht werden, untersucht. Dabei wurde nach Zellen gesucht, die eine Reduktion im Zellvolumen aufweisen . Da das GFP-Protein über die ganze Zelle verteilt ist, konnten solche Zellen leicht identifiziert werden. Unter Verwendung geeigneter Computerprogramme und Fluoreszenzkameras läßt sich die Detektion ohne weiteres automatisieren.
Mit dieser Version des Screens wurde das Gen für die Adenosin-Nukleotid- translokase- 1 (ANT- 1 ) isoliert. Figur 6 zeigt die morphologischen Veränderungen, die durch die Transfektion von ANT-1 in Zellen hervorgerufen werden. Dieses Gen induziert auch andere biochemische Vorgänge, die spezifisch für Apoptose sind, so z.B. den Abbau der DNA, die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien und die Aktivierung der Cysteinproteasen der Caspasenfamilie. ANT-1 ist eine Komponente des " Permeability Transition" Komplexes in Mitochondrien, der bekanntermaßen bei der Apoptose-Induktion eine Rolle spielt. Die Isolation dieses Gens ist daher eine Bestätigung, daß der Screen die Isolierung von Genen erlaubt, die bei der Apoptose-Induktion eine Rolle spielen.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die in einer Zielzelle eine nicht-selektionierbare Aktivität aufweisen, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer DNA-Bibliothek umfassend eine Vielzahl von Wirtszellen, die jeweils eine zu untersuchende Nukleinsäuresequenz auf einem Expressionsvektor in operativer Verknüpfung mit einer in der Zielzelle aktiven
Expressionskontrollsequenz enthalten,
(b) Kultivieren von Wirtszellen,
(c) Gewinnen des Expressionsvektors aus den kultivierten Wirtszellen, (d 1 ) Cotransfizieren von Zielzellen mit
(i) dem in Schritt (c) gewonnenen Expressionsvektor und
(ii) einem Reportervektor, oder (d2) Transfizieren von bereits einen Reportervektor enthaltenden
Zielzellen mit dem in Schritt (c) gewonnenen Expressionsvektor und
(e) Bestimmen der Aktivität des Reportervektors in den Zielzellen oder in deren Kulturüberstand als qualitatives oder quantitatives Maß für die nicht-selektionierbare Aktivität der untersuchten Nukleinsäuresequenz.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenzen aus genomischen Sequenzen beliebiger Herkunft, cDNA-Sequenzen, cDNA-Fragmenten und Antisense-Molekülen ausgewählt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-selektionierbare Aktivität aus Apoptose-Induktion, Zellzyklus-Arretierung , Zelldifferenzierung, Inhibition des Zellstoffwechsels und Inhibition oder Aktivierung der Expression von
Genen ausgewählt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als nicht-selektionierbare Aktivität die Apoptose-Induktion ausgewählt wird .
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine normalisierte DNA-Bibliothek bereitstellt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bakterielle Wirtszellen, insbesondere E.coli-Wirtszellen verwendet.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Expressionsvektor ein Plasmid verwendet.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (b) eine Kultivierung von einzelnen Wirtszellen umfaßt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (c) eine alkalische Lyse der Wirtszellen umfaßt.
0. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA nach der alkalischen Lyse ohne Zugabe chaotroper Substanzen an eine Adsorptionsmatrix, insbesondere eine Silika- Adsorptionsmatrix, gebunden wird.
1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zielzellen gegebenenfalls genetisch manipulierte eukaryontische Zellen, insbesondere Säugerzellen, verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion oder Cotransfektion in Schritt (d) durch Calciumphosphat-Copräzipitation, Lipofektion, Elektroporation,
Partikelbeschuß oder virale Infektion erfolgt.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (d) eine transiente Cotransfektion des Expressionsvektors und des Reportervektors umfaßt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Reportervektor eine für ein nachweisbares Genprodukt kodierende Nukleinsäuresequenz in exprimierbarer Form enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 1 4, dadurch gekennzeichnet, daß das nachweisbare Genprodukt aus sezernierten Enzymen ausgewählt wird.
1 6. Verfahren nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sezernierte Alkalische Phosphatase (SEAP) verwendet.
1 7. Verfahren nach Anspruch 1 5 oder 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung der Aktivität des Reportervektors eine Aktivitätsbestimmung des sezernierten Enzyms im Kulturüberstand umfaßt.
1 8. Verfahren nach Anspruch 1 7, dadurch gekennzeichnet, daß man chromogene oder fluoreszierende Enzymsubstrate verwendet.
1 9. Verfahren nach Anspruch 1 4, dadurch gekennzeichnet, daß das nachweisbare Genprodukt aus intrazellulär nachweisbaren Polypeptiden ausgewählt wird .
20. Verfahren nach Anspruch 14 oder 1 9, dadurch gekennzeichnet, daß das nachweisbare Genprodukt aus Fiuoreszenzproteinen ausgewählt wird.
21 . Verfahren nach Anspruch 1 4, dadurch gekennzeichnet, daß das nachweisbare Genprodukt aus membranständigen nachweisbaren Polypeptiden ausgewählt wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß zusätzliche Parameter der Zieizellen analysiert werden.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß Bestimmung der Aktivität des Reportervektors und gegebenenfalls zusätzlicher Parameter durch Fluoreszenzcytometrie erfolgt.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aktivität des Reportervektors an mindestens zwei Zeitpunkten nach der Transfektion oder Cotransfektion bestimmt, wobei der erste Zeitpunkt so gewählt wird, daß eine Expression der auf dem Expressionsvektor enthaltenen Nukleinsäuresequenz keinen Einfluß auf die Aktivität des Reportervektors hat und wobei der zweite Zeitpunkt so gewählt wird, daß eine Expression der auf dem Expressionsvektor enthaltenen Nukleinsäuresequenz bereits einen meßbaren Einfluß auf die Aktivität des Reportervektors haben kann.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchführung zumindest teilweise automatisiert wird.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte (b) bis (e) an mindestens 50 Proben jeweils parallel durchgeführt werden.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend die Verwendung der identifizierten Gene zur Bereitstellung diagnostischer und therapeutischer Mittel.
28. Verwendung von sezernierten Enzymen als Reportersystem für Apoptose-Prozesse.
29. Verwendung nach Anspruch 28 als Reportersystem zur Identifizierung von Apoptose-assoziierten Genen.
30. Verwendung nach Anspruch 29 als Reportersystem zur Identifizierung von Apoptose-Induktions- oder Apoptose- Inhibitionsgenen.
31 . Verwendung nach Anspruch 28 als Reportersystem zur Identifizierung von die Apoptose beeinflussenden Arzneimitteln.
32. Verwendung nach einem der Ansprüche 28 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, daß die Sezernierte Alkalische Phosphatase (SEAP) als
Reportersystem eingesetzt wird.
33. Verwendung von sezernierten Enzymen als Reportersystem in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27.
34. Vorrichtung zur automatisierten Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 27 umfassend
(a) Mittel zur Kultivierung einer Vielzahl von Wirtszellen,
(b) Mittel zur Gewinnung von Plasmid-DNA aus einer Vielzahl von Wirtszellen,
(c) Mittel zur Transfektion und Kultivierung einer Vielzahl von Zielzellen und (d) Mittel zur Bestimmung der Aktivität eines Reportervektors in den Zielzellen.
35. Vorrichtung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Roboter für die Gewinnung von Plasmid-DNA aus den Wirtszellen und einen Roboter für die Transfektion von Zielzellen enthält.
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