DE10126344A1

DE10126344A1 - Apoptose-induzierende DNA-Sequenzen

Info

Publication number: DE10126344A1
Application number: DE10126344A
Authority: DE
Inventors: Stefan Grimm; Nicole Schoenfeld; Erik Braziulis; Ursula Cramer; Andreas Gewies; Frank Vos; Thomas Mund; Timur Albayrak; Hendrik Gille; Matthias Klein
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2000-07-14
Filing date: 2001-05-30
Publication date: 2002-01-24
Also published as: US20040088746A1

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Apoptose-assoziierte und insbesondere Apoptose-induzierende Nukleinsäuresequenzen, davon codierte Polypeptide und deren Verwendung zur Bereitstellung diagnostischer und therapeutischer Mittel. Zusätzlich betrifft die Erfindung Zellsysteme sowie transgene Tiere und deren Verwendung zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von Apoptose-assoziierten Krankheiten.

Description

Die Erfindung betrifft neue Apoptose-assoziierte und insbesondere Apoptose-induzierende Nukleinsäuresequenzen, davon kodierte Polypeptide und deren Verwendung zur Bereitstellung diagnostischer und therapeutischer Mittel. Zusätzlich betrifft die Erfindung transgene Zellsysteme sowie Tiere und deren Verwendung zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von Apoptose-assoziierten Krankheiten.

Apoptose ist das genetisch kodierte Selbstmordprogramm, welches in eukaryontischen Zellen unter bestimmten physiologischen oder pathologischen Bedingungen induziert wird. Die Induktion der Apoptose muss außerordentlich präzise reguliert sein, denn eine Hyperaktivität kann zu degenerativen Erkrankungen führen. Auf der anderen Seite kann eine verringerte Apoptose-Induktion zur Tumorprogression beitragen.

Verschiedene niedermolekulare Induktoren der Apoptose wurden bereits beschrieben. Eine wichtige Klasse sind Tumorcytostatika. Auf welche Weise diese Cytostatika oder andere Substanzen Apoptose induzieren können, ist in den meisten Fällen jedoch unbekannt.

Die Identifizierung von Apoptose-induzierenden Genen oder anderen dominanten Genen mit einer nicht-selektionierbaren Aktivität ist problematisch, da eine stabile rekombinante Expression solcher Gene in einer Zielzelle entweder gar nicht oder nur sehr schwer möglich ist. Daher ist es erforderlich, spezielle Screening-Verfahren zur Identifizierung solcher Gene zu verwenden. Hierzu wurden bereits verschiedene in vitro Verfahren entwickelt (King et al., Science 277 (1997), 973-974 und Lustig et al., Meth. Enzymol. 283 (1997), 83-99). Von anderen Arbeitsgruppen wurden transgene Mäuse erzeugt, die multiple Transgene enthalten, deren Funktionen durch Untersuchung des Phänotyps bestimmt wird (Simonet et al., Cell 89 (1997), 309-319 und Smith et al., Nat. Genet. 16 (1997), 28-36). Ein Nachteil bei den in vitro Verfahren besteht darin, dass die erhaltenen Ergebnisse nicht ohne weiteres mit komplex regulierten zellbiologischen Effekten korrelieren. Untersuchungen an transgenen Tiere wiederum sind sehr aufwendig und mühsam.

Grimm und Leder (J. Exp. Med. 185 (1997), 1137-1142) beschreiben ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung dominanter Apoptose- induzierender Nukleinsäuresequenzen. Hierbei werden kleine Plasmidpools entsprechend 20 Klonen aus normalisierten cDNA-Expressionsbibliotheken in die humane Nierenzellinie 293 transient eingeführt. Die Apoptose induzierende Aktivität einer Nukleinsäuresequenz wird manuell durch mikroskopische Inspektion auf für Apoptose charakteristische morphologische Merkmale bestimmt. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnte das Apoptose-induzierende Adenin-nukelotid-Translokase-1-(ANT-1) Gen identifiziert werden. Das ANT-1-Gen gilt als ursächlich für die degenerative Herzkrankheit dilatorische Kardiomyopathie (DCM) (PCT/EP00/08812).

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue Apoptose-assoziierte und insbesondere Apoptose-induzierende Nukleinsäuren umfassend:

a) die in Tabelle 1 gezeigten Nukleinsäuren der Klone 1-124, dazu komplementäre Nukleinsäuren oder Fragmente davon,
b) den Sequenzen gemäß (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleinsäuren und
c) mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleinsäuren.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind Apoptose-assoziierte Nukleinsäuren, d. h. Nukleinsäuren, die mit dem Auftreten apoptotischer Prozesse in einer Zelle, insbesondere in einer Säugerzelle, assoziiert sind. Vorzugsweise sind die Nukleinsäuren Apoptose-induzierende Nukleinsäuren, d. h. Nukleinsäuren, die apoptotische Prozesse hervorrufen oder/und fördern können. Besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren dominant Apoptose-induzierende Nukleinsäuren, die in der Lage sind, bei Expression in einer Zelle Apoptose zu induzieren und die für Apoptose charakteristischen Merkmale, wie etwa DNA-Fragmentierung, morphologische Besonderheiten etc., hervorzurufen. Die Nukleinsäuren können in doppelsträngiger oder einzelsträngiger Form, z. B. als DNA oder RNA, vorliegen. Die isolierten Nukleinsäuren können ihren zellulären Effekt durch Expression, insbesondere durch Überexpression in Zellen entfalten. Damit sind sie induzierbar und ihre Verwendung als therapeutisches Agens definiert.

Neben den in Tabelle 1 bzw. den entsprechenden Sequenzprotokollen gezeigten Nukleinsäuren oder Teilfragmenten davon mit einer Länge von vorzugsweise mindestens 15, besonders bevorzugt mindestens 20 und am meisten bevorzugt mindestens 25 Nukleotiden, werden auch Varianten dieser Sequenzen von der vorliegenden Erfindung erfaßt. Neben den Nukleinsäuren, die den Sequenzen gemäß (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechen und für ein Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz codieren, werden auch Nukleinsäuren erfasst, die mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Hybridisierung unter stringenten Bedingungen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Anmeldung, dass nach Vorhybridisierung und Hybridisierung bei geeigneten Bedingungen und Waschen in 1 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C und insbesondere in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C noch ein Hybridisierungssignal gefunden wird (siehe auch Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.101-1.104).

Die erfindungsgemäßen Apoptose-assoziierten Nukleinsäuren codieren vorzugsweise für ein Apoptose-assoziiertes Polypeptid oder ein funktionelles Fragment davon. Die Nukleinsäuren können von einem beliebigen Organismus stammen, wobei eukaryontische Organismen wie Nematoden, z. B. C. elegans, Arthropoden wie Drosophila, Cordata und Wirbeltiere, z. B. Säuger, bevorzugt sind. Besonders bevorzugt handelt es sich um Sequenzen von Säugern, z. B. von der Maus oder vom Menschen, wobei diese Sequenzen gegebenenfalls noch durch bekannte molekularbiologische Techniken, wie etwa ortsspezifische Mutagenese, PCR, Restriktionsspaltung und Ligation, verändert werden können.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren liegen vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz vor, so dass sie in einer geeigneten Wirtszelle transkribiert und gegebenenfalls translatiert werden können. Expressionskontrollsequenzen umfassen üblicherweise einen Promotor und gegebenenfalls regulatorische Sequenzen wie Operatoren oder Enhancer. Weiterhin können auch Translations-Initiationssequenzen vorhanden sein. Geeignete Expressionskontrollsequenzen für prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., supra).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz enthält. Der rekombinante Vektor kann weiterhin noch übliche Elemente wie einen Replikationsursprung und ein Selektionsmarkergen enthalten. Beispiele für geeignete rekombinante Vektoren, z. B. Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren etc., sind dem Fachmann bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., supra).

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind rekombinante Zellen, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert oder transfiziert sein können. Die Transformation bzw. Transfektion kann nach bekannten Methoden erfolgen, z. B. durch Calciumphosphat-Copräzipitation, Lipofektion, Elektroporation, Partikelbeschuß oder virale Infektion. Die erfindungsgemäße Zelle kann die rekombinante Nukleinsäure in extrachromosomaler oder chromosomal integrierter Form enthalten.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Apoptose-assoziierte Polypeptide, die von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure codiert sind. Apoptose-assoziierte Polypeptide können durch Expression der erfindungsgemäßen Apoptose-assoziierten Nukleinsäuren, durch chemische Synthese oder durch Kombinationen beider Methoden erhalten werden.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, einen erfindungsgemäßen Vektor oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger- und Hilfsstoffen enthält. Die zuvor beschriebenen Nukleinsäuren, Vektoren, Zellen und Polypeptide können zur Herstellung eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels eingesetzt werden, insbesondere eines Mittels zur Diagnose, Therapie oder Prävention von Apoptose-assoziierten Erkrankungen. Apoptose-assoziierte Erkrankungen können sich einerseits durch eine abnorm verringerte Apoptose und somit durch eine Hyperproliferation auszeichnen, beispielsweise Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen und virale Infektionen (Thompson, Science 267 (1995), 1456-1462). Andererseits können Apoptose-assoziierte Erkrankungen sich auch durch eine abnorm erhöhte Apoptose und somit durch degenerative Erscheinungen auszeichnen, wie etwa die Alzheimer Krankheit, Huntington's Disease, Parkinsons Krankheit, Reperfusions- Schäden, Schlaganfall und Alkohol-Schädigungen der Leber (Thompson (1995), supra).

Die diagnostische Anwendung umfasst einen qualitativen oder/und quantitativen Nachweis der Apoptose-assoziierten Nukleinsäure, z. B. in Form eines Transkripts, oder des davon codierten Polypeptids in einer Probe, insbesondere einer Probe, die einem erkrankten Organismus, beispielsweise einem Patienten, entnommen wurde. Der Nachweis kann auf übliche Art und Weise, z. B. durch Nukleinsäure-Hybridisierung oder -Amplifikationsreaktionen wie etwa PCR oder durch Proteinnachweis über Antikörper, erfolgen. Dem Fachmann sind hierzu zahlreiche Techniken bekannt. Der Nachweis kann auch durch die Verwendung der isolierten Gene auf einem DNA-Chip erfolgen. Dadurch können mehrere, z. B. alle Gene gleichzeitig in einem Experiment untersucht werden.

Die therapeutische oder präventive Anwendung umfasst die Verabreichung eines Wirkstoffs an einen erkrankten Organismus in einer ausreichenden Dosierung, um die Apoptose-assoziierte Erkrankung zu lindern oder zu heilen bzw. um den Ausbruch einer Apoptose-assoziierten Krankheit zu verhindern. In einer Ausführungsform der Erfindung wird dabei eine Apoptose-assoziierte Nukleinsäure auf einem gentherapeutischen Vektor, z. B. einem Adenovirus, einem Retrovirus, einem Adeno-assoziierten Virus etc., verabreicht, um in einer erkrankten Zielzelle eine erhöhte Expression der Apoptose-assoziierten Nukleinsäure zu bewirken. Alternativ kann auch eine Antisense-Nukleinsäure, z. B. auf einem gentherapeutischen Vektor oder auch direkt, verabreicht werden, sofern eine Verringerung der Expression der Apoptose-assoziierten Nukleinsäure angestrebt wird. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können Apoptose-assoziierte Polypeptide oder Modulatoren der Aktivität solcher Apoptose-assoziierter Polypeptide, z. B. Aktivatoren oder Inhibitoren, verabreicht werden. Die Verabreichung der Wirkstoffe erfolgt nach bekannten Methoden wie beispielsweise in der Gentherapie (Anderson, Nature 392 (1998), 25-30) oder der Proteintherapie (Schwarze et al., Science 285 (1999), 1569-1572) beschrieben.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Vektoren, Zellen und Polypeptide können schließlich auch zur Identifizierung von neuen Wirksubstanzen für die Therapie oder Prävention von Apoptose-assoziierten Erkrankungen eingesetzt werden. Denkbar ist hier der Einsatz in bekannten zellulären oder molekularen Screeningassays gegebenenfalls in einem Hochdurchsatzformat. Die Erfindung betrifft auch selbstverständlich die durch Anwendung solcher Screeningverfahren identifizierten Wirkstoffe bzw. davon abgeleitete Substanzen. Die durch den Screen identifizierten Wirksubstanzen sind in der Lage, Signalwege zu aktivieren oder zu inhibieren, die durch die Expression der Nukleinsäuren induziert werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind transgene nicht- humane Tiere, die (i) das Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder das ANT-1-Gen konstitutiv oder induzierbar überexprimieren, (ii) das endogene Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder das ANT-1-Gen in inaktivierter Form enthalten, (iii) das endogene Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder das ANT-1-Gen vollständig oder teilweise durch ein mutiertes Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder ein mutiertes ANT-1-Gen ersetzt enthalten, (iv) eine konditionale und gewebsspezifische Überexpression oder Unterexpression des Gens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder des ANT-1-Gens aufweisen oder (v) einen konditionalen und gewebsspezifischen Knock-out des Gens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder des ANT-1-Gens aufweisen.

Vorzugsweise kann das transgene Tier zusätzlich ein exogenes Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder ein exogenes ANT-1-Gen unter Kontrolle eines die Überexpression erlaubenden Promotors enthalten. Alternativ kann das endogene Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder das endogene ANT-1-Gen durch Aktivierung oder/und Austausch des eigenen Promotors überexprimiert werden. Vorzugsweise weist der endogene Promotor des Gens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder des ANT-1-Gens eine genetische Veränderung auf, die zu einer veränderten Expression des Gens führt. Die genetische Veränderung des endogenen Promotors umfasst dabei sowohl eine Mutation einzelner Basen als auch Deletions- und Insertionsmutationen.

Eine erste Ausführungsform betrifft ein transgenes Tier, das das Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder das ANT-1-Gen konstitutiv oder induzierbar überexprimiert. Gegebenenfalls kann das eingeführte Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder das eingeführte ANT-1-Gen zusätzliche Mutationen aufweisen.

Eine zweite Ausführungsform betrifft ein transgenes Tier, welches das endogene Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder das endogene ANT-1-Gen in inaktivierter Form enthält. Die Inaktivierung des Gens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder des ANT-1-Gens erfolgt dabei vorzugsweise durch Einführung einer Knock-out-Mutation mittels homologer Rekombination oder durch Einführung eines Antisense- Konstrukts oder eines RNAi-Konstrukts.

Eine dritte Ausführungsform betrifft ein transgenes Tier, bei dem das endogene Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder das endogene ANT-1-Gen vollständig oder teilweise durch ein mutiertes Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder ein mutiertes ANT-1-Gen ersetzt ist.

Eine vierte Ausführungsform betrifft ein transgenes Tier, welches eine konditionale und gewebsspezifische Überexpression oder Unterexpression des Gens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder des ANT-1-Gens aufweist.

In einer fünften Ausführungsform weist das transgene Tier einen konditionalen und gewebsspezifischen Knock-out des Gens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder des ANT-1-Gens auf.

Vorzugsweise ist das transgene Tier ein Säugetier, wie etwa ein Nager, z. B. eine Maus. Mäuse haben gegenüber anderen Tieren zahlreiche Vorteile. Sie sind leicht zu halten und ihre Physiologie gilt als Modellsystem für die des Menschen. Die Herstellung solch Gen-manipulierter Tiere ist dem Fachmann hinreichend bekannt und wird nach üblichen Verfahren durchgeführt (Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F. und Lacy, E. (1994), Manipulating the Mouse-Embryo; A Laboratory Manual, 2. Aufl., Could Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines solchen transgenen Tiers zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von Krankheiten, die mit übermäßiger oder verminderter bzw. fehlender Expression eines Gens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines ANT-1-Gens verbunden sind.

Die erfindungsgemäßen transgenen Tiere können als Modell für die mit dem Gen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder ANT-1-Gen verbundenen Krankheiten bei Menschen oder auch bei Nutztieren dienen. So kann beispielsweise die Auswirkung von Wirkstoffen oder Gentherapien auf den Krankheitsverlauf bestimmt werden. Ebenfalls können die Tiere zur Diagnose bzw. dem frühzeitigen Erkennen einer Krankheit von Nutzen sein.

So kann beispielsweise ein erfindungsgemäßes transgenes Tier, welches das ANT-1-Gen enthält als Modell für die degenerative Herzkrankheit dilatorische Kardiomyopathie (DCM) dienen. Diese degenerative Herzkrankheit ist mit übermäßiger Apoptose in den Herz-Zellen eines Patienten verbunden. Ein erstes Anzeichen, dass der Apoptose-Inducer ANT-1 eine wichtige Rolle bei der Induktion der Apoptose bei der DCM spielt, war die Beobachtung, dass sich bei einem Patienten im Verlauf der DCM bereits sehr früh das Expressionsmuster der ANT-1-Isoformen im Herzen verschiebt. Es kommt zu einer verstärkten Expression von ANT-1- mRNA und ANT-1-Protein (PCT/EP00/08812). Zu diesem Zweck kann das ANT-1-Gen unter Kontrolle des herzspezifischen α-Myosin Heavy Chain Promoters (Subramaniam, A. (1991), J. Biol. Chem. 266 (36), Seite 24613-24620) in transgenen Mäusen exprimiert werden. Dieser Promoter ist gut charakterisiert und wird erst zum Zeitpunkt der Geburt eingeschaltet. Das Expressionskonstrukt kann beispielsweise hergestellt werden, in dem das ANT-1-Gen in die Sall-Restriktionsschnittstelle des dritten nicht-kodierenden Exons des 5,5 kB umfassenden Promotors eingefügt wird. Die Herzen der so hergestellten erfindungsgemäßen transgenen Tiere sollten einige der hinsichtlich DCM-spezifischen zellulären Veränderungen, wie Fibrinisierung, Apoptose und Hypertrophie, oder Funktionsstörungen, wie linksventrikulärer Druck, enddiastolischer Druck, Kontraktilität, linksventrikuläre Ausstoßfraktion und linksventrikufärer Fülldruck aufweisen.

Alternativ oder zusätzlich können auch Zellkultursysteme, insbesondere humane Zellkultursysteme, für die Anwendungen eingesetzt werden, die für das transgene Tier beschrieben sind.

Weiterhin soll die Erfindung durch das nachfolgende Beispiel näher erläutert werden.

Das Sequenzprotokoll enthält die Sequenzen SEQ ID No. 1-225, welche die in Tabelle 1 aufgelisteten T7-Sequenzen, BGH-Sequenzen und internen Primer-Sequenzen der identifizierten Apoptose-induzierenden Gene der Klone 1-124 umfassen.

Beispiel Isolation von Apoptose-induzierenden Genen 1. Allgemeines

Apoptose-induzierende Gene wurden durch einen genetischen Screen in der humanen Zellinie HEK 293T gefunden (Grimm und Leder (1997), supra), der auf der iterativen Transfektion kleiner Expressionsplasmid-Pools aus einer normalisierten Genbibliothek beruht und der anschließenden mikroskopischen Bestimmung des programmierten Zelltodes durch den Phänotyp der apoptotischen Zellen. Die Transfektion von einzelnen Klonen aus einem positiven Plasmid-Pool erlaubt dann, das Apoptose-induzierende Gen zu bestimmen.

Dieser Screen wurde in einem 96-Well Format durchgeführt. Desweiteren wurde eine besonders effektive Art, die Plasmid-DNA zu reinigen, verwendet (Neudecker und Grimm, Biotechniques 28 (2000), 107-109).

2. Experimentelle Protokolle 2.1 Zellkultur und Transfektionen

Humane HEK 293T-Zellen wurden in DMEM ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in einer befeuchteten 5% CO₂-Atmosphäre kultiviert. Für Transfektionen wurden die Zellen in 24- Loch-Platten gegeben und mit 2 µg Plasmid DNA nach der Calciumphos phat-Copräzipitationsmethode wie von Roussel et al. (Mol. Cell. Biol. 4 (1984), 1999-2009) beschrieben transfiziert. Hierfür wurden 25 µl DNA Lösung mit 25 µl 2 × HBS-Puffer pH 6,9 (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 40 mM Hepes, 1,4 mM Na₂HPO₄) bei 4°C in einer 96-Loch-Platte mit einem 12-Kanal-Pipettierautomaten (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) vermischt. Nach Zugabe von 20 µl einer 0,25 M CaCl₂ Lösung (4°C) und Mischen wurden 38 µl nach Inkubation für 25 min bei Raumtemperatur auf die Zellen gegeben.

2.2 Erzeugung einer normalisierten Bibliothek und cDNA Screening

Die Normalisierung und Konstruktion einer Nieren cDNA Bibliothek wurde wie von Grimm und Leder (J. Exp. Meth. 185 (1997), 1137-1142) und Sasaki et al. (Nucleic Acids Res. 22 (1994), 987-992) beschrieben durchgeführt.

mRNA aus der Niere von 10 Wochen alten CD1 Mäusen wurde durch Assoziation abundanter mRNA Spezies mit kovalent an Latexbeads gekoppelten Antisense-cDNA-Molekülen und anschließende Abtrennung durch Zentrifugation normalisiert. Nach zwei Hybridisierungsrunden wurden 200 ng (von ursprünglich 2 µg) mRNA erhalten und zur Herstellung einer cDNA Bibliothek unter Verwendung eines cDNA Synthesekits (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) verwendet. Nach Ligation eines BstXI Adaptors (Invitrogen, San Diego, CA) und einer Spaltung mit NotI wurden die cDNA Moleküle in einen modifizierten pcDNA3-Vektor (Invitrogen) unter Kontrolle des Cytomegalovirus (CMV) Promotors inseriert, in dem das Neomycinresistenzgen deletiert worden war. Die DNA wurde durch Elektroporation in E. coli SURE-Zellen (Stratagene, Corp. La Jolla, CA) eingeführt, die anschließend sofort eingefroren wurden.

Durch Ausplattieren von Aliquots des Transiormationsansatzes auf Agar wurde gefunden, dass die Bibliothek etwa 2,5 × 10⁵ Klone enthielt. Aliquots, die statistisch Einzelklone enthielten, wurden in Löchern von 96-Loch- Blöcken (Qiagen, Hilden, Deutschland) in 900 µl LB-Medium inokuliert und für 30 h unter Schütteln bei 300 Upm kultiviert. Nach Identifizierung eines positiven Pools wurde die DNA zur Bestätigung des Ergebnisses erneut transfiziert. Die verbleibende DNA wurde zur Transformation von Bakterien für eine Plasmidisolierung im großen Maßstab und zur Sequenzierung der insertierten DNA verwendet. Anhand der DNA-Sequenz wurde mit Hilfe des Computerprogramms "Blast" ein Sequenzvergleich mit kommerziellen Sequenzdatenbanken durchgeführt.

2.3 Bestimmung der Apontose-induzierenden Nukleinsäuren

Die Apoptose-induzierende Aktivität der transfizierten Nukleinsäuren erfolgte durch mikroskopische Bestimmung des Zellphänotyps. Bei apoptotischen Zellen nimmt die optische Dichte der Zellen zu, da sich das Cytoplasma-Kernvolumen-Verhältnis verringert und durch den Abbau des Cytoskeletts bilden sich Blasen in der Cytoplasmamembran.

2.4 Plasmidisolierung

96-Loch-Blöcke mit Bakterien wurden für 5 min bei 3000 g (Sigma Zentrifugen, Osterode am Harz, Deutschland) zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Blöcke wurden für 2 bis 3 min umgedreht. Dann wurden 170 µl Puffer P1 (50 mM Tris-HCl/10 mM EDTA pH 8,0) zugegeben und die Bakterienpellets wurden durch vollständige Vortexbehandlung für 10 bis 20 min resuspendiert. Nach Zugabe von 170 µl Puffer P2 (200 mM NaOH, 1% SDS) wurde der Block mit Folie abgedichtet, durch Invertieren gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lyse wurde durch Zugabe von 170 µl von 4°C kaltem Puffer P3 (3 M Kaliumacetat pH 5,5) beendet. Dann wurden 10 µl RNaseA Lösung (1,7 mg/ml) zugegeben, für 5 min bei Raumtemperatur und dann bei -20°C inkubiert und erneut für 10 min bei 6000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Blöcke dekantiert und 100 µl Puffer P4 (2,5% SDS in Isopropanol) wurden zugegeben. Der Block wurde einer Vortexbehandlung für 5 min unterzogen und zuerst für 15 min bei 4°C und dann für 15 min bei -20°C inkubiert.

Der Überstand nach Zentrifugation für 10 min bei 6000 Upm wurde in 96- Loch-Polyoxymethylen-Mikrotiterblöcke gegeben. 150 µl Siliciumoxidsuspension wurden zugegeben und für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden für 5 min bei 6000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig dekantiert und 400 µl Aceton (-20°C) wurden zugegeben. Die Platten wurden erneut einer Vortexbehandlung (30 sec) unterzogen und für 3 min bei 6000 Upm zentrifugiert. Dieser Acetonwaschvorgang wurde einmal wiederholt. Die Platten wurden zuerst bei Raumtemperatur für 5 min und dann für 5 min in einer Vakuumkammer getrocknet. Die Pellets wurden in 75 µl Wasser (60°C) resuspendiert und bei 6000 Upm und 4°C 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte bei -20°C aufbewahrt.

3. Ergebnisse

Die durch den genetischen Screen identifizierten Apoptose-induzierenden Gene (Klone 1-124) sind in der als Abbildung beigefügten Tabelle 1 (Seiten 1-125) aufgelistet:
Die Angaben in Tabelle 1 sind wie folgt definiert:
"T7-Sequenz": 5'-seitige Sequenz des Klons
"BGH-Sequenz": 3'-seitige Sequenz des Klons
"interner Primer": interne Sequenzen des Klons identifiziert unter Verwendung von Primern erhalten aus der T7- Sequenz (links) bzw. der BGH-Sequenz (rechts)
"Identität": Vergleich mit Sequenzen aus dem Computerprogramm "BLAST". Neben völlig identischen Sequenzen (Identität 100%) sind auch teilidentische Sequenzen (Identität von vorzugsweise ≧ 85%) angegeben, die allelische Varianten der konkret gezeigten Sequenz bzw. homologe Sequenzen aus anderen Spezies, insbesondere aus dem Menschen, zeigen.

Derartige Varianten bzw. homologe Sequenzen werden selbstverständlich ebenfalls von der vorliegenden Erfindung erfaßt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Apoptose-assoziierte Nukleinsäuren umfassend:

2. Nukleinsäuren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach Expression in einer Zelle Apoptose induzieren.

3. Nukleinsäuren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie für ein Apoptose-assoziiertes Polypeptid codieren.

4. Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem eukaryontischen Organismus stammen.

5. Nukleinsäuren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem Säuger stammen.

6. Nukleinsäuren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie von humanem Ursprung sind.

7. Nukleinsäuren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilfragmente eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden aufweisen.

8. Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie in operativer Verknüpfung mit einer Expressionkontrollsequenz sind.

9. Nukleinsäuren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionkontrollsequenz eine heterologe Expressionkontrollsequenz ist.

10. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 enthält.

11. Rekombinante Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einem Vektor nach Anspruch 8 transformiert oder transfiziert ist.

12. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es von einer Nukleinsäure nach Anspruch 1 codiert ist.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, einen Vektor nach Anspruch 10 oder ein Polypeptid nach Anspruch 12, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger- und Hilfsstoffen.

14. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Vektors nach Anspruch 10, einer Zelle nach Anspruch 11 oder eines Polypeptids nach Anspruch 12 zur Herstellung eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels.

15. Verwendung nach Anspruch 14 zur Diagnose, Therapie oder Prävention von Apoptose-assoziierten Erkrankungen.

16. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Vektors nach Anspruch 10, einer Zelle nach Anspruch 11 oder eines Polypeptids nach Anspruch 12 zur Identifizierung von Wirksubstanzen für die Therapie oder Prävention von Apoptose- assoziierten Erkrankungen.

17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung in einem Hochdurchsatz-Verfahren erfolgt.

18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksubstanzen Signalwege aktivieren oder inhibieren, die durch die Expression der Nukleinsäure induziert werden.

19. Transgenes nicht-humanes Tier,

a) welches das Gen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder das ANT-1-Gen konstitutiv oder induzierbar überexprimiert,
b) welches das endogene Gen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder das ANT-1-Gen in inaktivierter Form enthält,
c) bei dem das endogene Gen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder das ANT-1-Gen vollständig oder teilweise duch ein mutiertes Gen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder ein mutiertes ANT-1-Gen ersetzt ist,
d) welches eine konditionale und gewebsspezifische Über- oder Unterexpression des Gens einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder des ANT-1-Gens aufweist oder
e) welches einen konditionalen und gewebsspezifischen Knock- out des Gens einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder des ANT-1-Gens aufweist.

20. Transgenes Tier nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der endogene Promotor des Gens einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder des ANT-1-Gens eine genetische Veränderung aufweist, die zu einer veränderten Expression des Gens führt.

21. Transgenes Tier nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nager, insbesondere eine Maus ist.

22. Verwendung eines transgenen Tiers nach einem der Ansprüche 19 bis 21 zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von apoptotischen Prozessen, insbesondere von Krankheiten, die mit erhöhter oder verminderter Apoptose assoziiert sind.

23. Zellkultur

a) welche das Gen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder das ANT-1-Gen konstitutiv oder induzierbar überexprimiert,
b) welche das endogene Gen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder das ANT-1-Gen in inaktivierter Form enthält,
c) bei der das endogene Gen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder das ANT-1-Gen vollständig oder teilweise duch ein mutiertes Gen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder ein mutiertes ANT-1-Gen ersetzt ist,
d) welche eine konditionale und gewebsspezifische Über- oder Unterexpression des Gens einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder des ANT-1-Gens aufweist oder
e) welche einen konditionalen und gewebsspezifischen Knock- out des Gens einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder des ANT-1-Gens aufweist.

24. Zellkultur nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus humanen Zellen besteht.

25. Verwendung einer Zellkultur nach Anspruch 23 oder 24 zur genetischen und/oder pharmakologischen Untersuchung von apoptotischen Prozessen, insbesondere von Krankheiten, die mit erhöhter oder verminderter Apoptose assoziiert sind.