DE60133366T2

DE60133366T2 - Irak-4 zusammensetzungen und deren verwendungen

Info

Publication number: DE60133366T2
Application number: DE60133366T
Authority: DE
Inventors: Holger San Francisco WESCHE; Shyun Fremont LI
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-01-13
Filing date: 2001-01-12
Publication date: 2008-10-02
Anticipated expiration: 2021-01-13
Also published as: AU3092601A; US20030059916A1; AU783742B2; WO2001051641A9; DE60133366D1; US7235635B2; US6818419B2; EP1248847B1; WO2001051641A1; EP1248847A1; US20050255549A1; ATE390485T1; CA2397481A1; EP1248847B8; JP2004500074A

Description

Verweis auf eine verwandte Anmeldung
Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der vorläufigen U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 60/176,395, eingereicht am 13. Januar 2000, welche hierin durch die Bezugnahme für alle Zwecke vollständig enthalten ist.
Hintergrund der Erfindung
Das proinflammatorische Zytokin Interleukin-1 (IL-1) wirkt bei der Erzeugung von systemischen und lokalen Reaktionen auf eine Infektion, Verletzung und immunologische Herausforderungen. Die Bedeutung von IL-1 bei einer Entzündung wurde durch die Fähigkeit des hochspezifischen IL-2-Rezeptorantagonistenproteins (IL-1Ra oder IRAP) gezeigt, entzündliche Krankheiten bzw. Störungen zu lindern (für einen Überblick siehe beispielsweise Dinarello, Cytokine Growth Factor Rev. 8: 253–265 (1997)). IL-1 wird primär durch aktivierte Makrophagen und Monocyten erzeugt, und es ist an Lymphozytenaktivierung, Fieber, Verteilung bzw. Transport von Leukozyten, der Akut-Phase-Reaktion, Knorpelumbau und anderen Prozessen beteiligt. IL-1 übt seine Effekte durch Bindung an einen Rezeptor IL-1RI aus, der auf der Plasmamembran von empfänglichen Zellen lokalisiert ist. Unter den Ergebnissen der Bindung von IL-1 an den IL-1RI-Rezeptor ist die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, was schließlich zur Expression von zahlreichen Genen führt, die an einer Entzündung beteiligt sind, wie etwa Zytokine, Wachstumsfaktoren, Immunrezeptoren und Zelladhäsionsmoleküle (für eine Übersicht siehe z. B. Lee et al., J. Clin. Pharmacol. 38 (11): 981–93 (1998)).
Es wurde herausgefunden, dass mehrere Proteine die Signaltransduktion nach einer IL-1RI-Aktivierung vermitteln, was schließlich zur Aktivierung von NF-κB führt. Beispielsweise ist gezeigt worden, dass das akzessorische IL-1R-Protein IL-1RAcP nach der Bindung mit IL-1 mit dem IL-1RI-Rezeptor assoziiert, wobei die Signaltransduktionskaskade initiiert wird (Greenfeder et al., J. Biol. Chem. 270 (23): 13757–65 (1995)). Außerdem sind drei IL-1-Rezeptor-assoziierte Kinasen (IRAKs) identifiziert worden, IRAK ("IRAK-1"; Cao et al., Science 271: 1128–1131 (1996)), IRAK-2 (Muzio et al., Science 278: 1612–1615 (1997)), und die für monomyeloische Zellen spezifische IRAK-M (Wesche et al., J. Biol. Chem. 274: 19403–10 (1999)). Es ist gezeigt worden, dass IRAK phosphoryliert wird und mit IL-1RI auf eine IL-1-abhängige Art und Weise assoziiert. Außerdem ist gezeigt worden, dass das MyD88-Protein die Assoziation von IRAK-Proteinen mit dem aktivierten IL-1-Rezeptor vermittelt (Wesche et al., 7: 837–47 (1997)). Darüber hinaus transduziert TRAF6 das IRAK-Signal an Effektormoleküle stromabwärts (Cao et al., Nature 383: 443–6 (1996)). Es ist gezeigt worden, dass die IRAK-Proteine ebenso wie MyD88 bei der Transduktion von anderen Signalen als den Signalen, die von IL-1R-Rezeptoren stammen, eine Rolle spielen, einschließlich Signale, die durch Aktivierung von IL-18-Rezeptoren (Kanakaraj et al., J. Exp. Med. 189 (7): 1129–38 (1999)) und LPS-Rezeptoren (Yang et al., J. Immunol. 163: 639–643 (1999), Wesche et al., J. Biol. Chem. 274: 19403–10 (1999)) ausgelöst werden. Es ist gezeigt worden, dass eine Überexpression von IRAK-2 und IRAK-M die Reaktion auf IL-1 und LPS in einer IRAK-defizienten Zelllinie wieder herstellen kann.
Die IL-1-Signaltransduktionskaskade entspricht einer Signalkaskade bei Drosophila melanogaster, die während der frühen Entwicklung von Drosophila-Embryonen bei der Anlage der dorsalen-ventralen Polarität beteiligt ist. Bei Drosophila bindet insbesondere der extrazelluläre Ligand Spaetzle an einen Rezeptor, der Toll genannt wird, der eine Homologie mit IL-1R teilt. Außerdem ist eine Serin/Threonin-Kinase, die stromabwärts der Toll-Aktivierung wirkt, Pelle, zu den IRAK-Kinasen homolog (Cao et al., Science 271: 1128–1131 (1996), Muzio et al., Science 278: 1612–1615 (1997), Wesche et al., J. Biol. Chem. 274: 403–410 (1999)). Schließlich führt die Aktivierung des Toll-Rezeptors zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors Dorsal, der zu NF-κB homolog ist. Dorsal wird in Drosophila-Zellen von Cactus inhibiert, der selbst zum NF-κB-Inhibitor IκB homolog ist.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung eines neuen Mitglieds der IRAK-Familie, IRAK-4. Es werden Nukleinsäure- und Protein-Sequenzen von IRAK-4 bereitgestellt, ebenso wie Verfahren zur Herstellung von IRAK-4-Nukleinsäuren und -Proteinen. Ebenso werden Verfahren zur Verwendung von IRAK-4-Polynukleotiden und Polypeptiden bereitgestellt, einschließlich Verfahren zur Verwendung der hierin offenbarten Sequenzen zur Isolierung von Verbindungen, die bei der Behandlung oder Prophylaxe einer beliebigen entzündlichen Krankheit und Störung aus einer Vielzahl von entzündlichen Krankheiten und Störungen verwendbar sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue Nukleinsäuren und Polypeptide für Säuger-IRAK-4, einem neuen Mitglied der IRAK-Genfamilie bereit. IRAK-Kinasen assoziieren mit aktiviertem IL-1, IL-18 und anderen Rezeptoren und wirken bei der Transduktion von Signalen, die von den aktivierten Rezeptoren stammen, was schließlich zu einer Vielzahl von Effekten stromabwärts führt, wie beispielsweise der Aktivierung von NF-κB.
In einem Aspekt wird eine isolierte Nukleinsäure bereitgestellt, die ein IRAK-4-Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid IL-1R/Toll-Familienmitglieds-Signaltransduktionsaktivität aufweist, das Polypeptid mindestens etwa 98% Aminosäure-Sequenzidentität zu SEQ ID NO:1 oder zu einer Subsequenz davon umfasst, wobei die Aminosäure-Sequenz des Polypeptids einen Alanin-Rest an der Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 81 von SEQ ID NO:1 umfasst, und worin die Nukleinsäure mindestens etwa 400 Nukleotide umfasst.
In einer Ausführungsform umfasst das Polypeptid weiter eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Valin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 432 von SEQ ID NO:1, (ii) einem Leucin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 437 von SEQ ID NO:1, (iii) einem Arginin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 444 von SEQ ID NO:1 und (iv) einem Glutamin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 451 von SEQ ID NO:1. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polypeptid jede der in (i) bis (iv) aufgelisteten Aminosäuren. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:1. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polypeptid mindestens etwa 100 Aminosäuren. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polypeptid mindestens etwa 450 Aminosäuren.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure ein Cytosin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 242 von SEQ ID NO:2. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure ein Nukleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Thymin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1295 von SEQ DI NO:2, (ii) einem Thymin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1302 von SEQ ID NO:2, (iii) einem Thymin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1310 von SEQ ID NO:2, (iv) einem Adenin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1332 von SEQ ID NO:2 und (v) einem Adenin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1353 von SEQ ID NO:2. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure jedes der als (i) bis (v) aufgelisteten Nukleotide. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure eine Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO:2. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure mindestens etwa 350 Nukleotide. In einer anderen Ausführungsform bindet das Polypeptid spezifisch an Antikörper, erzeugt gegen ein Polypeptid umfassend eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:1.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes IRAK-4-Polypeptid bereit, worin das Polypeptid IL-1R/Toll-Familienmitglieds-Signaltransduktionsaktivität aufweist, das Polypeptid mindestens etwa 98% Aminosäure-Sequenzidentität mit SEQ ID NO:1 oder einer Subsequenz davon aufweist, worin die Aminosäure-Sequenz des Polypeptids einen Alanin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 81 von SEQ ID NO:1 aufweist, und worin das Polypeptid mindestens etwa 100 Aminosäuren umfasst.
In einer Ausführungsform umfasst das Polypeptid weiter eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Valin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 432 von SEQ ID NO:1, (ii) einem Leucin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 437 von SEQ ID NO:1, (iii) einem Arginin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 444 von SEQ ID NO:1 und (iv) einem Glutamin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 451 von SEQ ID NO:1. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polypeptid alle die als (i) bis (iv) aufgelisteten Polypeptide. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:1. In einer anderen Ausführungsform ist das Polypeptid durch eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO:2 kodiert. In einer anderen Ausführungsform bindet das Polypeptid spezifisch an Antikörper, erzeugt gegen ein Polypeptid umfassend eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:1. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polypeptid mindestens etwa 450 Aminosäuren.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, die ein IRAK-4-Polypeptid kodiert, worin das Polypeptid IL-1R/Toll-Familienmitglieds-Signaltransduktionsaktivität aufweist, das Polypeptid mindestens etwa 70% Aminosäure-Sequenzidentität zu SEQ ID NO:3 oder zu einer Subsequenz davon umfasst.
In einer Ausführungsform umfasst das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:3. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure mindestens etwa 70% Nukleotid-Sequenzidentität zu SEQ ID NO:4 oder zu einer Subsequenz davon. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure eine Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO:4. In einer anderen Ausführungsform hybridisiert die Nukleinsäure unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO:4 umfasst.
In bestimmten Ausführungsformen sind die obigen Nukleinsäuren wirksam mit einem Promotor verbunden. In anderen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung Expressionskassetten bereit, welche die Nukleinsäuren umfassen, worin die Nukleinsäuren wirksam mit einem Promotor verbunden sind. In anderen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung isolierte Zellen bereit, die eine Expressionskassette umfassen.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines IRAK-4-Polypeptids bereit, wobei das Verfahren umfasst: (i) Einbringen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in eine Wirtszelle oder einen zellulären Extrakt, worin die Nukleinsäure ein Polypeptid kodiert entweder mit: (a) mindestens etwa 98% Aminosäure-Sequenzidentität zu SEQ ID NO:1 oder zu einer Subsequenz davon, worin das Polypeptid einen Alanin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 81 von SEQ ID NO:1 umfasst und worin die Nukleinsäure mindestens etwa 400 Nukleotide umfasst, oder (b) mindestens etwa 70% Aminosäure-Sequenzidentität mit SEQ ID NO:3 oder mit einer Subsequenz davon, (ii) Inkubieren der Wirtszelle oder des zellulären Extrakts unter derartigen Bedingungen, dass das IRAK-4-Polypeptid in der Wirtszelle oder in dem zellulären Extrakt exprimiert wird, und (ii) Gewinnen des IRAK-4-Polypeptids aus der Wirtszelle oder aus dem zellulären Extrakt.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereit, die bei der Behandlung von Entzündungskrankheiten verwendbar ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Kontaktieren eines IRAK-4-Polypeptids mit der Verbindung, worin das IRAK-4-Polypeptid mindestens etwa 70% Aminosäure-Sequenzidentität zu SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 umfasst, und (ii) Bestimmen des funktionellen Effekts der Verbindung auf das IRAK-4-Polypeptid.
In einer Ausführungsform umfasst das IRAK-4-Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz, die als SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 gezeigt ist. In einer anderen Ausführungsform inhibiert die Verbindung die Aktivität der IRAK-4-Kinase. In einer anderen Ausführungsform liegt die IRAK-4 im Innern einer eukaryotischen Zelle vor.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung bereit, die IRAK-4 moduliert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Entzündungskrankheit bei einem Patienten, wobei der Inhibitor eine dominant negative Form einer IRAK-4 umfasst, wobei bevorzugt (a) die dominant negative Form von IRAK-4 eine Mutation in einem Lysin-Rest in der ATP-Bindungstasche umfasst, wobei bevorzugt die Mutation eine Substitution von Alanin-Resten für Lysin-Reste in der IRAK-4 an den Aminosäure-Positionen 213 und 214 von SEQ ID NO:1 umfasst, oder (b) die dominant negative Form von IRAK-4 eine trunktierte Form von IRAK-4 ist, wobei bevorzugt die trunkierte Form von IRAK-4 im Wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 191 von SEQ ID NO:1 besteht.
In einer Ausführungsform ist die Entzündungskrankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lungenkrankheiten und Krankheiten der Atemwege, Transplantatabstoßung, Autoimmunkrankheiten, Krebs, kardio-vaskulären Krankheiten, Krankheiten des zentralen Nervensystems, CD14 vermittelter Sepsis, nicht-CD14 vermittelter Sepsis, Osteoarthritis, Osteoporosis, Psoriasis, Krankheiten der Haut, entzündlicher Darmkrankheit, Behcet-Syndrom, Spondylitis ankylosans, Sarcoidosis, Gicht und ophthalmischen Krankheiten und Störungen.
In einer Ausführungsform ist die Lungenkrankheit und Krankheit der Atemwege ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adult Respiratory Disease Syndrome (ARDS), chronisch obstruktiver Lungenkrankheit (COPD), Lungenfibrose, interstitialer Lungenkrankheit, Asthma, chronischem Husten und allergischer Rhinitis. In einer anderen Ausführungsform ist die Autoimmunkrankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematodes, multipler Sklerose und Diabetes (z. B. Typ-1-Diabetes mellitus). In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus soliden Tumoren, Hautkrebs und Lymphom. In einer anderen Ausführungsform ist die kardiovaskuläre Krankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Schlaganfall und Arteriosklerose. In einer anderen Ausführungsform ist die Krankheit des zentralen Nervensystems eine neurodegenerative Krankheit. In einer anderen Ausführungsform ist die Krankheit der Haut ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ausschlag, Kontaktdermatitis und atopischer Dermatitis. In einer anderen Ausführungsform ist die entzündliche Darmkrankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Crohn'scher Krankheit und Colitis ulcerosa.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Inhibieren der Signaltransduktion bereit, hervorgerufen durch die Aktivierung eines IL-1R/Toll-Rezeptors in einer Zelle, worin das Verfahren Einführen eines Inhibitors der Aktivität oder Expression von IRAK-4 in die Zelle umfasst, wobei der Inhibitor eine dominant negative Form von IRAK-4 umfasst, wobei bevorzugt (a) die dominant negative Form von IRAK-4 eine Mutation in einem Lysin-Rest in der ATP-Bindungstasche umfasst, wobei bevorzugt die Mutation eine Substitution von Alanin-Resten für Lysin-Reste in der IRAK-4 an den Aminosäure-Positionen 213 und 214 von SEQ ID NO:1 umfasst, oder (b) die dominant negative Form von IRAK-4 eine trunkierte Form von IRAK-4 ist, wobei bevorzugt die trunkierte Form von IRAK-4 im Wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 191 von SEQ ID NO:1 besteht.
In einer Ausführungsform wird der IL-1R/Toll-Rezeptor durch IL-1 aktiviert. In einer Ausführungsform inhibiert der Inhibitor die Aktivierung von mindestens einem Transkriptionsfaktor. In einer anderen Ausführungsform aktiviert der Transkriptionsfaktor NF-κB in der Zelle.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein transgenes nicht-humanes Tier bereit, das eine Mutation in einem endogenen IRAK-4-Gen umfasst, kodierend ein IRAK-4-Polypeptid gemäß der Erfindung. In einer Ausführungsform inaktiviert die Mutation das endogene IRAK-4-Gen. In einer anderen Ausführungsform deletiert die Mutation das gesamte oder Teile des IRAK-4-Gens. In einer anderen Ausführungsform ist das Tier eine Maus.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Säugerzelle bereit, umfassend eine Mutation in einem endogenen IRAK-4-Gen kodierend ein IRAK-4-Polypeptid gemäß der Erfindung. In einer Ausführungsform inaktiviert die Mutation das IRAK-4-Gen. In einer anderen Ausführungsform deletiert die Mutation das gesamte oder Teile des IRAK-4-Gens.
Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt eine Aminosäure-Sequenz der humanen IRAK-4 bereit.
2 stellt eine Nukleotid-Sequenz der humanen IRAK-4-cDNA bereit.
3 stellt eine Aminosäure-Sequenz der murinen IRAK-4 bereit.
4 stellt eine Nukleotid-Sequenz der murinen IRAK-4-cDNA bereit.
5 stellt Daten bereit, die zeigen, dass endogene IRAK-4 physisch sowohl TRAF-6 als auch IRAK-4 auf IL-1-abhängige Art und Weise beeinflusst.
Beschreibung der speziellen Ausführungsformen
1. Einleitung
Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuren und Polypeptide für IRAK-4 bereit, einem neuen Mitglied der IRAK-Familie der Proteinkinasen. Die IRAK-Familienmitglieder sind unentbehrliche Signaltransduktoren für Mitglieder der IL-1R/Toll-Familie der Transmembranrezeptoren, einschließlich IL-1-Rezeptoren, IL-18-Rezeptoren und LPS-Rezeptoren. Wie die anderen IRAK-Familienmitglieder kann IRAK-4 die Adapterproteine MyD88, welches die Kinasen mit dem Rezeptorkomplex verbindet (Wesche et al., Immunity 7: 837–47 (1997)) und TRAF6, welches das Signal stromabwärts der Effektormoleküle transduziert (Cao et al., Nature 383: 443–6 (1996)), beeinflussen. Es werden IRAK-4-Sequenzen vom Mensch (siehe z. B. SEQ ID NO:1 und 2) und der Maus (siehe z. B. SEQ ID NO:3 und 4) bereitgestellt.
Modulatoren, rekombinante Formen oder Fragmente von IRAK-4 können verwendet werden, um die proinflammatorische Signalkaskade der IL-1/Toll-Rezeptorfamilie zu stören, und können deshalb bei der Behandlung einer großen Zahl von Entzündungskrankheiten nützlich sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf a) Lungenkrankheiten und Krankheiten der Atemwege wie etwa das Adult Respiratory Disease Syndrom (ARDS), chronisch obstruktive Lungenkrankheit (COPD), Lungenfibrose, interstitiale Lungenkrankheit, Asthma, chronischer Husten und allergische Rhinitis, b) Transplantation, c) die Autoimmunkrankheiten wie etwa rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, multiple Sklerose und Diabetes (z. B. Typ-1-Diabetes mellitus), d) Krebs einschließlich fester Tumoren, Hautkrebs und Lymphom, e) kardio-vaskulärer Krankheiten einschließlich Schlaganfall und Arteriosklerose, f) Krankheiten des zentralen Nervensystems einschließlich neurodegenerativer Krankheiten, g) nicht-CD14 vermittelte Sepsis, h) Osteoarthritis, i) Osteoporose, j) Psoriasis und Krankheiten der Haut wie etwa Ausschlag und Kontakt- und atopische Dermatitis, k) entzündliche Darmkrankheit wie etwa Crohn'sche Krankheit und Colitis ulcerosa, l) Behcet-Syndrom, m) Spondylitis ankylosans, n) Sarcoidosis, o) Gicht, p) ophthalmische Krankheiten und Störungen und h) CD14 vermittelte Sepsis.
In zahlreichen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screening von Modulatoren, z. B. Aktivatoren, Inhbitoren, Stimulatoren, Enhancern usw. von IRAK-4-Nukleinsäuren und Proteinen bereit. Solche Modulatoren können die IRAK-4-Aktivität auf zahlreichen Wegen beeinflussen, z. B. durch Modulieren der IRAK-4-Transkription, Translation, Phosphorylierung, mRNA- oder Proteinstabilität, durch Veränderung der Bindung von IRAK-4 mit heterologen Proteinen oder anderen Molekülen, oder durch Beeinflussen der IRAK-4-Proteinaktivität. In bevorzugten Ausführungsformen werden Modulatoren verwendet, welche die IRAK-4-Aktivität oder -Mengen inhibieren, um eine beliebige der oben aufgezählten Entzündungskrankheiten zu behandeln.
In einer Ausführungsform werden die Verbindungen einem Screening unterzogen, beispielsweise unter Verwendung eines Screenings mit einem hohem Durchsatz (HTS, „High Throughput Screening"), um diejenigen Verbindungen zu identifizieren, welche an ein isoliertes IRAK-4-Polypeptid oder ein Fragment davon binden können und/oder die Aktivität eines isolierten IRAK-4-Polypeptids oder eines Fragmentes davon modulieren können. In einer anderen Ausführungsform werden IRAK-4-Proteine in Zellen rekombinant exprimiert, und mögliche Modulatoren von IRAK-4 werden durch Messen eines Indikators der IRAK-4-Aktivität, wie etwa der Aktivität von NF-κB untersucht.
In zahlreichen Ausführungsformen wird ein IRAK-4-Polynukleotid oder -Polypeptid in vivo oder ex vivo in eine Zelle eingeführt, und dabei wird die IRAK-4-Aktivität in der Zelle moduliert. Beispielsweise wird ein Polynukleotid, das ein Volllängen-IRAK-4-Polypeptid kodiert, in eine Population von Zellen eingebracht, wobei die Menge oder die Aktivität von IRAK-4 in den Zellen erhöht wird. Alternativ kann ein Antisense-, ein Ribozyme oder ein dominant negativ kodierendes Poly nukleotid in eine Population von Zellen eingeführt werden, wobei IRAK-4 und die verbundene Transduktion von inflammatorischen Signalen in den Zellen inhibiert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Nachweisen einer IRAK-4-Nukleinsäure und der Proteinexpression bereit, was eine Untersuchung von IL-1, IL-18, LPS und anderen Arten der Signaltransduktion ermöglicht, und die spezifische Identifizierung von IL-1-, IL-18- oder LPS-empfänglichen Zellen ermöglicht. IRAK-4 stellt auch nützliche Nukleinsäuresonden für Vaterschaftsuntersuchungen und für forensische Untersuchungen bereit. IRAK-4-Polypeptide können auch verwendet werden, um monoklonale und polyklonale Antikörper zu erzeugen, die bei der Identifizierung von IL-1-, IL-18- oder LPS-empfänglichen Zellen verwendbar sind. Die IRAK-4-Expression kann unter Verwendung von Techniken identifiziert werden wie beispielsweise der reversen Transkription und Amplifikation von mRNA, Isolierung von Gesamt-RNA oder Poly-A⁺-RNA, Northern Blotting, Dot Blotting, in situ-Hybridisierung, RNase Protection, S1-Verdau, Untersuchung von DNA-Mikrochip-Arrays, Western Blotting und dergleichen.
Funktional kodieren IRAK-4-Nukleinsäuren Proteinkinasen, die bei der Transduktion von Signalen von Transmembranrezeptoren der IL-1R/Toll-Familie wirken, einschließlich IL-1-Rezeptoren, IL-18-Rezeptoren und LPS-Rezeptoren. Strukturell kodiert die Nukleotid-Sequenz von IRAK-4 (siehe z. B. SEQ ID NO:2 oder 4, isoliert aus Menschen bzw. Mäusen) Polypeptide umfassend eine aminoterminale (N-terminale) "Todes"-Domäne (DD, "Death Domain") und eine zentrale Kinase-Domäne. Verwandte IRAK-4-Gene von anderen Spezies teilen eine mindestens 60%ige Nukleotid-Sequenzidentität über eine Region von mindestens etwa 50 Nukleotiden Länge, optional 100, 200, 500 oder mehr Nukleotide Länge mit SEQ ID NO:2 oder 4, oder kodieren Polypeptide, die mindestens eine etwa 60%ige Aminosäure-Sequenzidentität über eine Aminosäureregion von mindestens etwa 25 Aminosäuren Länge, optional 50 bis 100 Aminosäuren Länge mit SEQ ID NO:1 oder 3 teilen. Bevorzugt umfasst das IRAK-4-Polypeptid etwa 459 oder 460 Aminosäuren und besitzt eine berechnete Molekularmasse von etwa 51 oder 52 kDa.
Die vorliegende Erfindung stellt auch polymorphe Varianten des IRAK-4-Proteins bereit, dargestellt in SEQ ID NO:1: Variante #1, worin an Aminosäure-Position 53 ein Leucin-Rest mit einem Isoleucin-Rest ausgetauscht ist, und Variante #2, worin an Aminosäure-Position 17 ein Alanin-Rest mit einem Glycin-Rest ausgetauscht ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch polymorphe Varianten des IRAK-4-Proteins bereit, dargestellt in SEQ ID NO:3: Variante #1, worin an Aminosäure-Position 12 ein Lysin-Rest mit einem Arginin-Rest ausgetauscht ist, und Variante #2, worin an Aminosäure-Position 59 ein Valin-Rest mit einem Leucin-Rest ausgetauscht ist.
Spezifische Regionen des IRAK-4-Nukleotids und der Aminosäure-Sequenzen können verwendet werden, um polymorphe Varianten, Interspezieshomologe und Allele von IRAK-4-Genen zu identifizieren. Diese Identifizierung kann in vitro durchgeführt werden, beispielsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen oder durch PCR und Sequenzierung, oder durch Verwendung der Sequenzinformation in einem Computersystem für einen Vergleich mit anderen Nukleotid-Sequenzen. Normalerweise wird die Identifizierung von polymorphen Varianten und Allelen von IRAK-4 durch den Vergleich einer Aminosäure-Sequenz von etwa 25 Aminosäuren oder mehr, z. B. 50–100 Aminosäuren durchgeführt. Eine Aminosäure-Identität von mindestens etwa 60% oder mehr, optional 65%, 70%, 75%, 80%, 85% oder 90–95% oder mehr zeigt normalerweise, dass ein Protein eine polymorphe Variante, ein Interspezieshomologes oder Allel von IRAK-4 ist. Der Sequenzvergleich kann unter Verwendung eines beliebigen der unten beschriebenen Algorithmen zum Sequenzvergleich durchgeführt werden. Auch Antikörper, die spezifisch an IRAK-4-Polypeptide oder konservierte Regionen davon binden, können zur Identifizierung von Allelen, Interspezieshomologen und polymorphen Varianten verwendet werden.
Polymorphe Varianten, Interspezieshomologe und Allele von IRAK-4 werden durch eine Untersuchung bestätigt, beispielsweise der Assoziierung mit dem IL-1/Toll-Rezeptor, die Fähigkeit zur Aktivierung von NF-κB oder der Aktivität der MyD88-Assoziierung des mutmaßlichen IRAK-4-Polypeptids. Normalerweise wird ein IRAK-4-Polypeptid mit einer Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 als positive Kontrolle zum Vergleich mit dem mutmaßlichen IRAK-4-Protein verwendet, um die Identifizierung einer polymorphen Variante oder eines Allels des IRAK-4-Gens oder Proteins zu zeigen.
Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzinformationen für IRAK-4 können auch verwendet werden, um in einem Computersystem Modelle von IRAK-4-Polypeptiden zu konstruieren. Diese Modelle werden anschließend verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die IRAK-4-Proteine aktivieren oder inhibieren können. Solche Verbindungen, welche die Aktivität von IRAK-4-Genen oder -Proteinen modulieren, können verwendet werden, um die Rolle der IRAK-4-Gene bei der IL-1/Toll-Signaltransduktion zu untersuchen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Assays bereit, bevorzugt Assays mit einem hohen Duchsatz, um Verbindungen oder andere Moleküle zu identifizieren, die mit IRAK-4 Wechselwirken und/oder IRAK-4 modulieren. In bestimmten Assays wird eine bestimmte Domäne von IRAK-4 verwendet, z. B. eine N-terminale oder eine zentrale Kinase-Domäne.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Behandlung von Krankheiten oder Störungen bereit, die mit der IL-1/Toll-Rezeptoraktivität assoziiert sind, wie etwa Entzündungskrankheiten. Beispielsweise kann die IRAK-4-Aktivität und/oder Expression in den Zellen eines Patienten mit einer Entzündungskrankheit verändert sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die folgenden: (a) Lungenkrankheiten und Krankheiten der Atemwege wie etwa das Adult Respiratory Disease Syndrom (ARDS), chronisch obstruktive Lungenkrankheit (COPD), Lungenfibrose, interstitiale Lungenkrankheit, Asthma, chronischer Husten und allergische Rhinitis, (b) Transplantation, c) die Autoimmunkrankheiten einschließlich, aber nicht beschränkt auf rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematodes, Multiple Sklerose und Diabetes (z. B. Typ-1-Diabetes mellitus), d) Krebs einschließlich, aber nicht beschränkt auf feste Tumoren, Hautkrebs und Lymphom, e) kardio-vaskuläre Krankheiten einschließlich, aber nicht beschränkt auf Schlaganfall und Arteriosklerose, f) Krankheiten des zentralen Nervensystems einschließlich, aber nicht beschränkt auf neurodegenerative Krankheiten, g) nicht-CD14 vermittelte Sepsis, h) Osteoarthritis, i) Osteoporose, j) Psoriasis und Krankheiten der Haut einschließlich, aber nicht beschränkt auf Ausschlag und Kontakt- und atopische Dermatitis, k) entzündliche Darmkrankheit wie etwa Crohn'sche Krankheit und Colitis ulcerosa, l) Behcet-Syndrom, m) Spondylitis ankylosans, n) Sarcoidosis, o) Gicht, p) ophthalmische Krankheiten und Störungen und h) CD14 vermittelte Sepsis. Bei solchen Patienten blockiert beispielsweise die Inhibierung von IRAK-4 in IL1-empfänglichen Zellen die Transduktion des durch IL-1 initiierten Signals, wobei die NF-κB-Aktivierung verhindert wird und somit eine Behandlung für die Krankheit bereitgestellt wird.
Es werden auch transgene Tiere und Zellen bereitgestellt, denen ein oder mehrere IRAK-4-Allele fehlen, oder die veränderte Formen von IRAK-4 enthalten, ebenso werden auch Kits zur Verwendung der hierin offenbarten Polynukleotide und Polypeptide und für die Anwendung der hierin offenbarten Verfahren bereitgestellt.
II. Definitionen
Solange nichts anderes angegeben ist, haben die folgenden Begriffe, wie hierin verwendet, die ihnen unten zugeordnete Bedeutung.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "IRAK-4" auf eine Proteinkinase, wie in SEQ ID NO:1 oder 3 gezeigt, oder ein beliebiges Derivat, Homologes oder Fragment davon, oder auf eine beliebige Nukleinsäure, die ein solches Protein, Derivat, Homologes oder Fragment davon kodiert. IRAK-4-Proteine oder -Derivate können in einem beliebigen Zelltyp exprimiert werden, einschließlich einer beliebigen eukaryotischen oder prokaryotischen Zelle, oder sie können in vitro synthetisiert werden. Normalerweise kodieren IRAK-4-Nukleinsäuren aktive Serin/Threoninkinasen, die auf eine Liganden-(z. B. IL-1)abhängige Art und Weise an TRAF6 und IRAK-1 binden. Es wird ersichtlich sein, dass Derivate, Homologe und Fragmente von IRAK-4 ohne Weiteres bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Solche IRAK-4-Varianten können eine beliebige oder mehrere Domänen des in SEQ ID NO:1 oder 3 gezeigten Polypeptids, oder mehrfache Kopien einer beliebigen oder mehrerer der Domänen, oder eine beliebige Anzahl von Domänen in neuen Kombinationen miteinander oder mit anderen Proteinen oder Protein-Domänen umfassen.
In bestimmten Ausführungsformen ist ein IRAK-4-Polypeptid mindestens etwa 98% identisch mit SEQ ID NO:1 und besitzt bevorzugt einen Alanin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Position 81 von SEQ ID NO:1. Bevorzugt weist das IRAK-4-Polypeptid auch mindestens eine der folgenden Aminosäuren auf: (i) ein Valin an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Position 432 von SEQ ID NO:1, (ii) ein Leucin an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Position 437 von SEQ ID NO:1, (iii) ein Arginin an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Position 444 von SEQ ID NO:1 oder (iv) ein Glutamin an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 451 von SEQ ID NO:1. Solche Polypeptide werden bevorzugt durch ein Polynukleotid kodiert, das mindestens eines der folgenden Nukleotide aufweist: (i) ein Cytosin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 242 von SEQ ID NO:2, (ii) ein Thymin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1302 von SEQ ID NO:2, (iii) ein Thymin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1310 von SEQ ID NO:2, (iv) ein Adenin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1332 von SEQ ID NO:2 oder (v) ein Adenin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1353 von SEQ ID NO:2.
Die Bezeichnung "IRAK-4" bezieht sich auch auf polymorphe Varianten, Allele, Mutanten und Interspezieshomologe, welche: (1) etwa 60% Aminosäure-Sequenzidentität aufweisen, optional etwa 75, 80, 85, 90 oder 95% Aminosäure-Sequenzidentität mit SEQ ID NO:1 oder 3, über ein Fenster von etwa 25 Aminosäuren, optional 50–100 Aminosäuren, (2) spezifisch an Antikörper binden, die gegen ein Immunogen gerichtet sind, das eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:1 oder 3 umfasst und konservativ modifizierte Varianten davon oder (3) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch mit einer Sequenz von SEQ ID NO:2 oder 4 oder konservativ modifizierten Varianten davon hybridisieren (bei einer Länge von mindestens etwa 100, optional mindestens etwa 500 bis 1000 Nukleotiden).
Topologisch enthalten Volllängen-IRAK-4-Polypeptide eine "N-terminale Domäne" oder "Todes-Domäne" und eine "zentrale Kinase-Domäne". Diese Domänen können strukturell unter Verwendung von Verfahren identifiziert werden, die Fachleuten bekannt sind, wie beispielsweise Standard-Sequenzanalyseprogramme und durch Vergleichen mit verwandten Proteinen. Außerdem enthält IRAK-4 wie andere IRAK-Proteine jede der 12 Standard-Subdomänen der Proteinkinasen (siehe z. B. Cao et al., Science 271: 1128–1131 (1996)). Die "ATP-Bindungstasche" bezieht sich auf eine konservierte Kinase-Domäne, die beispielsweise der Subdomäne II der IRAK-1-Sequenz entspricht (siehe Cao et al. (1996)), und die den Lysin-Rest an Position 213 von SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:3 umfasst.
Die "N-terminale Domäne" oder "Todes-Domäne" bezieht sich auf eine im N-Terminus zu findende Region, die zu einer Region des Pelle-Proteins von Drosophila melanogaster homolog ist. In IRAK-4 erstreckt sich die "Todes-Domäne" ungefähr von Aminosäure 5 bis Aminosäure 147, wie beispielsweise in SEQ ID NO:1 oder 3 gezeigt wird (siehe z. B. Feinstein et al., Trends Biochem. Sci. 20: 342–4 (1995)).
Die "zentrale Kinase-Domäne" bezieht sich auf eine konservierte Region des IRAK-4-Proteins, die zu anderen Serin/Threoninkinasen homolog ist. Bei IRAK-4 erstreckt sich die "zentrale Kinase-Domäne" ungefähr von Aminosäure 192 bis Aminosäure 460 von SEQ ID NO:1 und 3 (siehe z. B. Wesche et al., J. Biol. Chem. 274: 19403–10 (1999)).
"Biologische Probe" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Probe eines biologischen Gewebes oder Fluids, das eine oder mehrere IRAK-4-Nukleinsäuren enthält, die ein oder mehrere IRAK-4-Proteine kodieren. Solche Proben umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Gewebe, das von Menschen und Mäusen isoliert wird insbesondere Thymus, Milz, Niere, Plazenta, Lunge, Leber, Niere, Pankreas, Prostata, Hoden, Ovar, Dünndarm, Colon, Lymphknoten und Tonsillen. Biologische Proben können auch Schnitte von Geweben umfassen, wie etwa gefrorene Schnitte, die für histologische Zwecke entnommen wurden. Eine biologische Probe wird normalerweise von einem eukaryotischen Organismus erhalten, wie etwa Insekten, Protozoen, Vögeln, Fischen, Reptilien und bevorzugt einem Säuger, wie etwa einer Ratte, Maus, Kuh, einem Hund, Meerschweinchen oder Kaninchen, und am meisten bevorzugt einem Primaten, wie etwa einem Schimpansen oder einem Menschen.
"Bestimmen des funktionellen Effekts" soll eine Untersuchung hinsichtlich einer Verbindung bedeuten, die einen Parameter moduliert, beispielsweise erhöht oder verringert, der indirekt oder direkt unter dem Einfluss eines IRAK-4-Polypeptids steht, beispielsweise funktionelle, physikalische und chemische Effekte. Solche funktionellen Effekte können durch ein beliebiges Mittel gemessen werden, das Fachleuten bekannt ist, z. B. durch Veränderungen der spektroskopischen Eigenschaften (beispielsweise Fluoreszenz, Extinktion, Brechungsindex), der hydrodynamischen (z. B. Form), chromatographischen oder Löslichkeits-Eigenschaften, durch Veränderungen der Genexpression von IRAK-4 oder von beliebigen Markergenen, die eine IRAK-4-Aktivität anzeigen, und dergleichen.
"Inhibitoren", "Aktivatoren" und "Modulatoren" von IRAK-4-Genen oder -Proteinen werden austauschbar verwendet, um auf inhibitorische, aktivierende oder modulierende Moleküle für IRAK-4 Bezug zu nehmen, die unter Verwendung von in vitro- und in vivo-Assays identifiziert werden. Inhibitoren sind Verbindungen, die beispielsweise an IRAK-4-Proteine binden, die IRAK-4-Aktivität teilweise oder vollständig blockieren, die IRAK-4-Expression oder -Stabilität herunterregulieren oder die IRAK-4-Bindung an heterologe Moleküle, z. B. MyD88, IL-1R1 oder TRAF6 verhindern. Aktivatoren sind Verbindungen, die z. B. an IRAK-4 binden, die IRAK-4-Aktivität stimulieren, die IRAK-4-Expression oder -Stabilität erhöhen oder die IRAK-4-Bindung an Membranen oder an ein beliebiges anderes Protein oder einen beliebigen anderen Faktor erleichtern. Modulatoren können genetisch modifizierte Versionen von IRAK-4-Proteinen umfassen, z. B. dominant negative oder aktivierte Formen von IRAK-4. Solche Assays für Inhibitoren und Aktivatoren werden unten beschrieben und umfassen beispielsweise die Expression von IRAK-4-Proteinen in Zellen, Anwenden von mutmaßlichen Modulatorverbindungen und dann Bestimmen der funktionellen Effekte auf die IRAK-4-Aktivität. Proben oder Assays umfassend IRAK-4-Polypeptide, die mit einem möglichen Aktivator, Inhibitor oder Modulator behandelt werden, werden mit Kontrollproben ohne den Inhibitor, Aktivator oder Modulator verglichen, um den Effekt auf die Kandidatenverbindung zu untersuchen. Den Kontrollproben (nicht mit der Verbindung behandelt) wird ein relativer IRAK-4-Aktivitätswert von 100% zugeordnet. Die Inhibierung eines IRAK-4-Polypeptids wird erreicht, wenn der Aktivitätswert relativ zur Kontrolle etwa 80%, optional 50% oder 25-0% beträgt. Die Aktivierung eines IRAK-4-Polypeptids wird erreicht, wenn der Aktivitätswert relativ zu der Kontrolle 110%, optional 150%, optional 200 bis 500% oder 1000–3000% mehr beträgt.
Die Begriffe" isoliert", "gereinigt" oder "biologisch rein" beziehen sich auf ein Material, das im Wesentlichen oder essentiell frei von Bestandteilen ist, die es normalerweise begleiten, wenn es in seinem natürlichen Zustand gefunden wird. Reinheit und Homogenität werden normalerweise unter Verwendung von analytischen chemischen Verfahren bestimmt, wie etwa einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder einer Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie. Ein Protein, das in einer Präparation die vorherrschende Spezies darstellt, ist im Wesentlichen gereinigt. Eine isolierte IRAK-4-Nukleinsäure wird insbesondere von anderen offenen Leserahmen getrennt, die das IRAK-4-Gen flankieren und andere Proteine als IRAK-4 kodieren. Der Begriff "gereinigt" bedeutet, dass eine Nukleinsäure oder ein Protein in einem Elektrophoresegel im Wesentlichen eine Bande erzeugt. Insbesondere bedeutet es, dass die Nukleinsäure oder das Protein mindestens 85% rein ist, optional mindestens 95% rein und optional mindestens 99% rein.
"Nukleinsäure" bezieht sich auf Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon, entweder in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form. Der Begriff umfasst Nukleinsäuren mit bekannten Nukleotidanaloga oder modifizierten Resten oder Bindungen des Grundgerüsts, die synthetisch sind, natürlich auftreten und nicht natürlich auftreten, die ähnliche Bindungseigenschaften wie die Referenznukleinsäure aufweisen und die auf eine ähnliche Art und Weise metabolisiert werden wie die Referenznukleotide. Beispiele solcher Analoga umfassen ohne Beschränkung Phosphorthioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, chirale Methylphosphonate, 2-O-Methylribonukleotide, Peptid-Nukleinsäuren (PNA).
Solange nichts anderes angegeben wird, umfasst eine bestimmte Nukleinsäure-Sequenz ebenso wie explizit angegebene Sequenz implizit auch konservativ modifizierte Varianten davon (z. B. degenerierte Kodon-Substitutionen) und komplementäre Sequenzen. Degenerierte Kodon-Substitutionen können insbesondere durch Erzeugen von Sequenzen erreicht werden, bei denen die dritte Position von einem oder mehreren ausgewählten (oder allen) Kodons durch gemischte Basen und/oder Desoxyinosin-Reste ausgetauscht wird (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991), Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605–2608 (1985), Rossolini et al., Mol. Coll. Probes 8: 91–98 (1994)). Der Begriff "Nukleinsäure" wird austauschbar mit Gen, cDNA, mRNA, Oligonukleotid und Polynukleotid verwendet.
Die Begriffe "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet, um ein Polymer von Aminosäure-Resten zu bezeichnen. Der Begriff betrifft Aminosäurepolymere, worin ein oder mehrere Aminosäure-Reste eine artifizielle chemische Nachahmung einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure darstellt bzw. darstellen, ebenso wie natürlich vorkommende Aminosäurepolymere und ein nicht natürlich vorkommendes Aminosäurepolymer.
Der Begriff "Aminosäure" bezieht sich ebenso auf natürlich vorkommende und synthetische Aminosäuren wie auf Aminosäureanaloga und Aminosäuremimetika, die auf eine ähnliche Art und Weise wie die natürlich vorkommenden Aminosäuren funktionieren. Natürlich vorkommende Aminosäuren sind diejenigen, die durch den genetischen Code kodiert werden, ebenso wie diejenigen Amino säuren, welche später modifiziert werden, z. B. Hydroxyprolin, γ-Carboxyglutamat und O-Phosphoserin. Aminosäureanaloga beziehen sich auf Verbindungen, welche die gleiche chemische Grundstruktur wie eine natürlich vorkommende Aminosäure aufweisen, d. h. einen α-Kohlenstoff, der mit einem Wasserstoff, einer Carboxylgruppe, einer Aminogruppe und einer Gruppe R verbunden ist, z. B. Homoserin, Norleucin, Methioninsulfoxid, Methioninmethylsulfonium. Solche Analoga besitzen modifizierte R-Gruppen (z. B. Norleucin) oder modifizierte Peptidgrundgerüste, behalten jedoch gleiche chemische Grundstruktur wie eine natürlich vorkommende Aminosäure bei. Aminosäuremimetika beziehen sich auf chemische Verbindungen, die eine Struktur besitzen, die sich von der allgemeinen chemischen Struktur einer Aminosäure unterscheidet, die jedoch auf eine ähnliche Art und Weise wie eine natürlich vorkommende Aminosäure wirken.
Auf Aminosäuren kann hierin entweder durch ihre allgemein bekannten Drei-Buchstaben-Symbole oder durch die von der IUPAC-IUB „Biochemical Nomenclature Commission" empfohlenen Ein-Buchstaben-Symbole hingewiesen werden. Entsprechend kann auf Nukleotide durch ihren allgemein akzeptierten Ein-Buchstaben-Code hingewiesen werden.
Der Begriff "konservativ modifizierte Varianten" trifft sowohl auf Aminosäure- als auch Nukleinsäure-Sequenzen zu. Bei bezugnahme auf auf ihre bestimmten Aminosäure-Sequenzen beziehen sich konservativ modifizierte Varianten auf diejenigen Nukleinsäuren, die identische oder im Wesentlichen identische Aminosäure-Sequenzen kodieren, oder wenn die Nukleinsäure keine Aminosäure-Sequenz kodiert, auf im Wesentlichen identische Sequenzen. Wegen der Degeneration des genetischen Codes kodiert eine große Zahl von funktionell identischen Nukleinsäuren ein beliebiges bestimmtes Protein. Beispielsweise kodieren die Kodons GCA, GCC, GCG und GCU alle die Aminosäure Alanin. Somit kann an jeder Position, an der ein Alanin durch ein Kodon spezifiziert wird, das Kodon zu jedem der entsprechend beschriebenen Kodons verändert werden, ohne das kodierte Polypeptid zu verändern. Solche Nukleinsäurevariationen sind "stumme Variationen", die eine Art von konservativ modifizierten Variationen darstellen. Jede Nukleinsäure-Sequenz hierin, die ein Polypeptid kodiert, beschreibt auch jede mögliche stumme Variation der Nukleinsäure. Ein Fachmann erkennt, dass jedes Kodon in einer Nukleinsäure (außer AUG, das normalerweise das einzige Kodon für Methionin ist, und TGG, das normalerweise das einzige Kodon für Tryptophan ist) so modifiziert werden kann, dass sich ein funktionell identisches Molekül ergibt. Entsprechend ist jede stumme Variation einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, implizit in jeder beschriebenen Sequenz enthalten.
Im Hinblick auf Aminosäure-Sequenzen erkennt ein Fachmann, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen an einer Nukleinsäure-, Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsequenz, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentanteil von Aminosäuren in der kodierten Sequenz verändern, hinzufügen oder deletieren, eine "konservativ modifizierte Variante" ist, wobei die Veränderung die Substitution einer Aminosäure mit einer chemisch ähnlichen Aminosäure ergibt. Tabellen mit konservativen Substitutionen, die funktional ähnliche Aminosäuren ergeben, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Solche konservativ modifizierten Varianten stehen neben den polymorphen Varianten, Interspezieshomologen und Allelen der Erfindung und schließen diese nicht aus.
Die folgenden acht Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die für einander konservative Substitutionen darstellen:

1) Alanin (A), Glycin (G);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (T), Lysin (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V);
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W);
7) Serin (S), Threonin (T); und
8) Cystein (C), Methionin (M)

Makromolekulare Strukturen, wie etwa Polypeptid-Strukturen, können als verschiedene Organisationsebenen beschrieben werden. Für eine allgemeine Diskussion dieser Organisation siehe z. B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3. Ed., 1994) und Cantor und Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980). "Primärstruktur" bezieht sich auf die Aminosäure-Sequenz eines bestimmten Peptids. "Sekundärstruktur" bezieht sich auf räumlich geordnete dreidimensionale Strukturen innerhalb eines Polypeptids. Diese Strukturen sind allgemein als Domänen bekannt. Domänen sind Teile eines Polypeptids, die eine kompakte Einheit des Polypeptids bilden und sind normalerweise 50 bis 350 Aminosäuren lang. Typische Domänen bestehen aus Bereichen mit einer geringeren Organisation, wie etwa Bereichen von β-Faltblatt und α-Helices. "Tertiärstruktur" bezieht sich auf die vollständige dreidimensionale Struktur eines Polypeptidmonomers. "Quartärstruktur" bezieht sich auf die dreidimensionale Struktur, die durch eine nicht kovalente Assoziation von unabhängigen tertiären Einheiten gebildet wird. Anisotropische Begriffe sind auch als Energiebegriffe bekannt.
Eine "Markierung" oder ein "nachweisbarer Anteil" ist eine Struktur, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische oder chemische Mittel nachweisbar ist. Beispielsweise umfassen nützliche Markierungen ³²P, Fluoreszenzfarbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Enzyme (wie beispielsweise gemeinhin in einem ELISA verwendet), Biotin, Digoxigenin oder Haptene und Proteine, welche nachweisbar gemacht werden können, z. B. durch Einbringen einer Radiomarkierung in das Peptid oder zum Nachweis von Antikörpern verwendet werden, die spezifisch mit dem Peptid reagieren.
Eine "markierte Nukleinsäuresonde oder Oligonukleotid" ist eine Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid, die bzw. das entweder kovalent, durch einen Linker oder eine chemische Bindung oder nicht kovalent durch ionische, van der Waals-, elektrostatische oder Wasserstoffbindungen mit einer Markierung verbunden ist, sodass das Vorliegen der Sonde durch das Vorliegen der mit der Sonde verbundenen Markierung nachgewiesen werden kann.
Wie hierin verwendet, ist eine "Nukleinsäuresonde oder Oligonukleotid" als eine Nukleinsäure definiert, die an eine Zielnukleinsäure mit komplementärer Sequenz durch eine oder mehrere Arten von chemischen Bindungen binden kann, normalerweise durch eine komplementäre Basenpaarung, normalerweise durch die Bildung von Wasserstoffbrücken. Wie hierin verwendet, kann eine Sonde natürliche (d. h. A, G, C oder T) oder modifizierte Basen (7-Deazaguanosin, Inosin usw.) enthalten. Außerdem können die Basen in einer Sonde durch eine andere Verbindung als eine Phosphodiesterbindung verbunden sein, solange diese die Hybridisierung nicht stört. So können Sonden beispielsweise Peptidnukleinsäuren sein, worin die einzelnen Basen eher durch Peptidbindungen als durch Phosphodiesterverbindungen verbunden sind. Es ist für einen Fachmann verständlich, dass Sonden an Zielsequenzen ohne vollständige Komplementarität binden können, wobei die Sondensequenz von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen abhängt. Die Sonden werden optional direkt markiert, etwa mit Isotopen, Chromophoren, Lumiphoren, Chromogenen, oder indirekt markiert, wie etwa mit Biotin, an das später ein Streptavidin-Komplex binden kann. Durch Untersuchung hinsichtlich der Anwesenheit oder Abwesenheit der Sonde kann man die Anwesenheit oder Abwesenheit der ausgewählten Sequenz oder Subsequenz nachweisen.
Der Begriff "rekombinant", wenn er unter Bezugnahme beispielsweise auf eine Zelle oder Nukleinsäure, ein Protein oder Vektor verwendet wird, zeigt an, dass die Zelle, Nukleinsäure, das Protein oder der Vektor durch das Einbringen einer heterologen Nukleinsäure oder eines Proteins oder der Veränderung einer nativen Nukleinsäure oder eines Proteins modifiziert worden ist, oder das die Zelle von einer so modifizierten Zelle abstammt. Somit exprimieren beispielsweise rekombinante Zellen Gene, die in der nativen (nicht rekombinanten) Form der Zelle nicht zu finden sind, oder sie exprimieren native Gene, die anderenfalls anormal exprimiert werden, unterexprimiert werden oder gar nicht exprimiert werden.
Der Begriff "heterolog", wenn er unter Bezugnahme auf Teile einer Nukleinsäure verwendet wird, zeigt an, dass die Nukleinsäure zwei oder mehrere Subsequenzen umfasst, die in der Natur nicht in der gleichen Beziehung zueinander zu finden sind. Beispielsweise wird eine Nukleinsäure normalerweise rekombinant produziert, wobei sie eine Anordnung von zwei oder mehreren Sequenzen von nicht verwandten Genen unter Bildung einer neuen funktionellen Nukleinsäure aufweist, z. B. einem Promotor aus einer Quelle und eine kodierende Region aus einer anderen Quelle. Entsprechend bedeutet ein heterologes Protein, dass das Protein zwei oder mehrere Subsequenzen umfasst, die in der Natur nicht in der gleichen Beziehung zueinander zu finden sind (z. B. ein Fusionsprotein).
Ein "Promotor" wird als eine Anordnung von Nukleinsäure-Kontrollsequenzen definiert, welche die Transkription einer Nukleinsäure steuern bzw. regeln. Wie hierin verwendet, umfasst ein Promotor notwendige Nukleinsäure-Sequenzen nahe der Startstelle der Transkription, wie etwa im Fall eines Promotors des Typs Polymerase II ein TATA-Element. Ein Promotor enthält optional auch distale Enhancer- oder Repressorelemente, die bis zu mehreren Tausend Basenpaaren von der Startstelle der Transkription entfernt lokalisiert sein können. Ein "konstitutiver" Promotor ist ein Promotor, der unter den meisten Umwelt- und Entwicklungsbedingungen aktiv ist. Ein "induzierbarer" Promotor ist ein Promotor, der unter Umwelt- oder Entwicklungsregulation aktiv ist. Der Begriff "wirksam verbunden" bezieht sich auf eine funktionelle Verbindung zwischen einer Nukleinsäure-Expressionskontrollsequenz (wie etwa einem Promotor oder einer Anordnung von Transkriptionsfaktorbindungsstellen) und einer zweiten Nukleinsäuresequenz, worin die Expressionskontrollsequenz die Transkription der Nukleinsäure, die der zweiten Sequenz entspricht, steuert bzw. kontrolliert.
Ein "Expressionsvektor" ist ein Nukleinsäurekonstrukt, das rekombinant oder synthetisch erzeugt wird, mit einer Reihe von spezifizierten Nukleinsäureelementen, welche die Transkription einer bestimmten Nukleinsäure in einer Wirtszelle ermöglichen. Der Expressionsvektor kann Teil eines Plasmids, eines Virus oder eines Nukleinsäurefragments sein. Normalerweise enthält der Expressionsvektor eine zu transkribierende Nukleinsäure, die wirksam mit einem Promotor verbunden ist.
Die Begriffe "identisch" oder prozentuale "Identität" im Zusammenhang mit zwei oder mehreren Nukleinsäuren oder Polypeptid-Sequenzen beziehen sich auf zwei oder mehrere Sequenzen oder Subsequenzen, die gleich sind oder einen bestimmten Prozentanteil von Aminosäure-Resten oder Nukleotiden aufweisen, die gleich sind (d. h. 60% Identität, optional 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% Identität über eine bestimmte Region), wenn sie verglichen und über ein Vergleichsfenster oder eine bestimmte Region hinsichtlich der maximalen Übereinstimmung ausgerichtet werden, wie etwa unter Verwendung eines der folgenden Algorithmen zum Sequenzvergleich oder durch manuelles Ausrichten und visuelle Überprüfung gemessen. Solche Sequenzen werden dann als "im Wesentlichen identisch" bezeichnet. Diese Definition bezieht sich auch auf das Komplement einer Testsequenz. Optional existiert die Identität über eine Region, die mindestens etwa 50 Aminosäuren oder Nukleotide lang ist, oder mehr bevorzugt über eine Region, die 75 bis 100 Aminosäuren oder Nukleotide lang ist.
Für einen Sequenzvergleich dient normalerweise eine Sequenz als eine Referenzsequenz, mit der die Testsequenzen verglichen werden. Bei Verwendung eines Algorithmus zum Sequenzvergleich werden Test- und Referenz-Sequenzen in einen Computer eingegeben, falls nötig, werden die Koordinaten Subsequenz bestimmt, und es werden die Programmparameter des Sequenzalgorithmus bestimmt. Es können standardmäßige Programmparameter verwendet werden oder es können alternative Parameter bestimmt werden. Dann berechnet der Algorithmus zum Sequenzvergleich basierend auf den Programmparametern die prozentualen Sequenzidentitäten der Testsequenzen bezogen auf die Referenzsequenz.
Ein "Vergleichsfenster", wie hierin verwendet, enthält die Bezugnahme auf ein Segment mit einer beliebigen der Anzahl der aufeinanderfolgenden Positionen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus von 20 bis 600, normalerweise etwa 50 bis etwa 200, normalerweise etwa 100 bis etwa 150, worin eine Sequenz mit einer Referenzsequenz mit der gleichen Anzahl an aufeinanderfolgenden Positionen verglichen werden kann, nachdem die zwei Sequenzen optimal ausgerichtet sind. Verfahren zur Ausrichtung von Sequenzen für einen Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Eine optimale Ausrichtung von Sequenzen für einen Vergleich kann beispielsweise durchgeführt werden durch den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und waterman, Adv. Appi. Math. 2: 482 (1981), durch den Algorithmus der Homologieausrichtung von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch das Ähnlichkeitssuche-Verfahren von Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), durch Computerimplementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASIA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch manuelles Ausrichten und visuelle Überprüfung (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. 1995 Supplement)).
Ein Beispiel für einen nützlichen Algorithmus ist PILEUP. PILEUP erzeugt eine multiple Sequenzausrichtung aus einer Gruppe von verwandten Sequenzen unter Verwendung von progressiven, paarweisen Ausrichtungen, um die Beziehung und die prozentuale Sequenzidentität zu zeigen. Es berechnet auch einen Baum oder ein Dendogramm, das die Cluster der Beziehungen zeigt, die zur Erzeugung der Ausrichtung verwendet werden. PILEUP verwendet eine Vereinfachung des progressiven Ausrichtungsverfahrens von Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351–360 (1987). Das verwendete Verfahren ist ähnlich wie das von Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151–153 (1989) beschriebene Verfahren. Das Programm kann bis zu 300 Sequenzen ausrichten, jede mit einer maximalen Länge von 5.000 Nukleotiden oder Aminosäuren. Das multiple Ausrichtungsverfahren beginnt mit der paarweisen Ausrichtung der zwei ähnlichsten Sequenzen, wobei ein Cluster von zwei ausgerichteten Sequenzen produziert wird. Dieser Cluster wird dann mit der nächsten am meisten verwandten Sequenz oder einem Cluster von ausgerichteten Sequenzen ausgerichtet. Zwei Cluster von Sequenzen werden durch eine einfache Extension der paarweisen Ausrichtung von zwei einzelnen Sequenzen ausgerichtet. Die finale Ausrichtung wird durch eine Reihe von progressiven, paarweisen Ausrichtungen erreicht. Das Programm wird durch die Bestimmung von speziellen Sequenzen und ihren Aminosäure- oder Nukleotidkoordinaten für die Regionen des Sequenzvergleichs und durch Bestimmen der Programmparameter durchgeführt. Unter Verwendung von PILEUP wird eine Referenzsequenz mit anderen Testsequenzen verglichen, um die Beziehung der prozentualen Sequenzidentität unter Verwendung der folgenden Parameter zu bestimmen: Default Gap Weight (3,00), Default Gap Lenghth Weight (0,10) und Weighted End Gaps. PILEUP kann vom GCG Sequenz Analysis Softwarepaket, beispielsweise Version 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387–395 (1984)) erhalten werden.
Ein anderes Beispiel eines Algorithmus, der für die Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit geeignet ist, sind die BLAST und BLAST 2.0 Algorithmen, welche von Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389–3402 (1977) bzw. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990) beschrieben werden. Software zum Durchführen von BLAST-Analysen ist öffentlich über das „National Center for Biotechnology Information" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) verfügbar. Dieser Algorithmus betrifft zuerst die Identifizierung von Sequenzpaaren mit hoher Trefferquote (HSP, „High Scoring Sequence Pairs") durch Identifizierung von kurzen Worten der Länge W in der Suchsequenz, die bei der Ausrichtung mit einem Wort der gleichen Länge in einer Datenbanksequenz entweder zusammenpassen oder einen positiven Schwellenwert T erfüllen. T wird als Schwellenwert des Nachbarwortes ("Neighborhood Word Score Threshold") (Altschul et al, supra) bezeichnet. Diese ersten Treffer bei Nachbarworten fungieren als Ausgangspunkte für die Initiierung von Suchen, um längere HSPs zu finden, welche diese enthalten. Die Worttreffer werden in beide Richtungen entlang jeder Sequenz ausgedehnt, solange das Ergebnis der kumulativen Ausrichtung erhöht werden kann. Kumulative Ergebnisse werden bei Nukleotid-Sequenzen unter Verwendung der Parameter M (Wert der Belohnung für ein Paar übereinstimmende Reste, immer > 0) und N (Wert der Strafe für nicht übereinstimmende Reste, immer < 0) berechnet. Bei Aminosäure-Sequenzen wird eine Ergebnismatrix verwendet, um das kumulative Ergebnis zu berechnen. Eine Ausdehnung der Worttreffer in jeder Richtung wird angehalten, wenn: das kumulative Ergebnis der Ausrichtung um die Größe X von dem maximal erreichten Wert abfällt, das kumulative Ergebnis aufgrund der Akkumulierung von einer oder mehreren negativ-wertigen Ausrichtungen der Reste Richtung Null oder darunter geht, oder wenn das Ende jeder Sequenz erreicht ist. Die Parameter W, T und X des BLAST-Algorithmus bestimmen die Sensitivität und die Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLASTN-Programm (für Nukleotid-Sequenzen) verwendet als Standard eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäure-Sequenzen verwendet das BLASTP-Programm als Standard eine Wortlänge von 3 und eine Erwartung (E) von 10, und die BLOSUM62-Ergebnismatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10815 (1989)) Ausrichtungen (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4 und einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST-Algorithmus führt auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z. B. Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787 (1993)). Ein Maß der durch BLAST-Algorithmus bereitgestellten Ähnlichkeit ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit bereitstellt, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenzen per Zufall auftreten wird. Beispielsweise wird eine Nukleinsäure als ähnlich mit einer Referenzsequenz betrachtet, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Testnukleinsäure mit der Referenznukleinsäure weniger als etwa 0,2, mehr bevorzugt weniger als etwa 0,01 und am meisten bevorzugt weniger als etwa 0,001 beträgt.
Ein Hinweis darauf, dass zwei Nukleinsäure-Sequenzen oder Polypeptide im Wesentlichen identisch sind, ist der, dass das durch die erste Nukleinsäure kodierte Polypeptid immunologisch mit den Antikörpern kreuzreagiert, die gegen das durch die zweite Nukleinsäure kodierte Polypeptid gerichtet sind, wie unten beschrieben wird. Somit ist normalerweise ein Polypeptid im Wesentlichen identisch mit einem zweiten Polypeptid, wenn sich beispielsweise die zwei Peptide nur durch konservative Substitutionen unterscheiden. Ein anderer Hinweis darauf, dass zwei Nukleinsäure-Sequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist der, dass die zwei Moleküle oder ihre Komplemente miteinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren, wie unten beschrieben wird. Noch ein anderer Hinweis darauf, dass zwei Nukleinsäure-Sequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist der, dass für die Amplifizierung der Sequenz die gleichen Primer verwendet werden können.
Der Begriff "hybridisiert selektiv (oder spezifisch) mit" bezieht sich auf die Bindung, das Ausbilden eines Duplex oder die Hybridisierung eines Moleküls nur mit einer bestimmten Nukleotid-Sequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, wenn die Sequenz in einem komplexen Gemisch (z. B. zelluläre Gesamt-DNA- oder RNA oder DNA- oder RNA-Bibliothek) vorliegt.
Der Begriff "stringente Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter denen eine Sonde mit ihrer Zielsubsequenz hybridisiert, normalerweise in einem komplexen Gemisch der Nukleinsäure, jedoch mit keinen anderen Sequenzen. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter unterschiedlichen Umständen unterschiedlich. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Ein ausführlicher Leitfaden für die Hybridisierung von Nukleinsäuren findet sich in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie etwa 5 bis 10°C geringer als der thermische Schmelzpunkt (T_m) der spezifischen Sequenz bei einem pH mit definierter Ionenstärke sind. Der T_m ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der Sonden, die komplementär mit dem Ziel sind, mit der Zielsequenz im Gleichgewicht hybridisieren (wenn die Zielsequenzen im Überschuss vorliegen, sind beim bei T_m, 50% der Sonden sind im Gleichgewicht besetzt). Stringente Bedingungen sind diejenigen, bei denen die Salzkonzentration weniger als etwa 1,0 M Natriumion beträgt, normalerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3, und die Temperatur bei kurzen Sonden (z. B. 10 bis 50 Nukleotide) mindestens etwa 30°C beträgt und bei langen Sonden (z. B. mehr als 50 Nukleotide) mindestens etwa 60°C beträgt. Stringente Bedingungen können auch durch Zugabe von destabilisierenden Agenzien, wie etwa Formamid erreicht werden. Bei einer selektiven oder spezifischen Hybridisierung zeigt ein positives Signal mindestens zweifmal den Hintergrund, optional die 10-fache Hintergrundhybridisierung. Exemplarische stringente Hybridisierungsbedingungen können wie folgt sein: 50% Formamid, 5 × SSC und 1% SDS, Inkubation bei 42°C, oder 5 × SSC, 1% SDS, Inkubation bei 65°C mit Waschungen in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C. Solche Waschungen können über 5, 15, 30, 60, 120 oder mehr Minuten durchgeführt werden.
Nukleinsäuren, welche unter stringenten Bedingungen nicht miteinander hybridisieren, sind doch im Wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, welche sie kodieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies tritt beispielsweise auf, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der maximalen durch den genetischen Code erlaubten Degeneration der Kodons erzeugt wird. In solchen Fällen hybridisieren die Nukleinsäuren normalerweise unter moderaten stringenten Hybridisierungsbedingungen. Exemplarische "moderate stringente Hybridisierungsbedingungen" umfassen eine Hybridisierung in einem Puffer mit 40% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und eine Wäsche in 1 × SSC bei 45°C. Solche Wäschen können über 5, 15, 30, 60, 120 oder mehr Minuten durchgeführt werden. Eine positive Hybridisierung zeigt zumindest den zweifachen Hintergrund. Durchschnittsfachleute werden schnell erkennen, dass alternative Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden können, um Bedingungen ähnlicher Stringenz bereitzustellen.
"Antikörper" bezieht sich auf ein Polypeptid, das ein gerüst aus einem Immunglobulingen oder von Fragmenten davon umfasst, das spezifisch an ein Antigen bindet und ein Antigen erkennt. Die anerkannten Immunglobulingene umfassen die Kappa-, Lambda-, Alpha-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und Mu-Gene der konstanten Region, ebenso wie die unzähligen Immunglobulingene der variablen Region. Leichte Ketten werden entweder als Kappa oder Lambda klassifiziert. Schwere Ketten werden als Gamma, Mu, Alpha, Delta oder Epsilon klassifiziert, die wiederum die Immunglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE definieren.
Eine beispielhafte strukturelle Immunglobulin(Antikörper)-einheit umfasst ein Tetramer. Jedes Tetramer setzt sich aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten zusammen, wobei jedes Paar eine "leichte" (etwa 25 kDa) und eine "schwere" Kette (etwa 50–70 kDa) aufweist. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die hauptsächlich für die Antigenerkennung verantwortlich sind. Die Bezeichnungen variable leichte Kette (V_L) und variable schwere Kette (V_H) beziehen sich auf diese leichten bzw. schweren Ketten.
Es gibt Antikörper z. B. als intakte Immunglobuline oder als eine Anzahl von gut charakterisierten Fragmenten, die durch den Verdau mit verschiedenen Peptidasen erzeugt werden. So verdaut beispielsweise Pepsin einen Antikörper unterhalb der Disulfidverbindungen in der Gelenkregion unter Erzeugung von F(ab)'₂, einem Dimer von Fab, das selbst eine über eine Disulfidbindung mit V_H-C_HI verbundene leichte Kette ist. Das F(ab)'₂ kann unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disulfidverbindung in der Gelenkregion aufzubrechen, wobei das F(ab)'₂-Dimer in ein Fab'-Monomer umgewandelt wird. Das Fab'-Monomer ist im Wesentlichen Fab mit einem Teil der Scharnierregion (siehe Fundamental Immunology (Paul Editor, 3. Auflage, 1993). Während verschiedene Antikörperfragmente bezüglich des Verdaus eines intakten Antikörpers definiert werden, wird ein Fachmann verstehen, dass solche Fragmente de novo entweder chemisch oder durch Verwendung einer rekombinanten DNA-Methodik synthetisiert werden können. So umfasst der Begriff Antikörper, wie hierin verwendet, auch Antikörperfragmente, die entweder durch die Modifikation ganzer Antikörper erzeugt werden, oder diejenigen, die de novo unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken (z. B. Einzelketten-Fv) synthetisiert werden oder diejenigen, die unter Verwendung von Phagendisplay-Bibliotheken identifiziert werden (siehe z. B. McCafferty et al., Nature 348: 552–554 (1990)).
Für die Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern kann jedes im Fachgebiet bekannte Verfahren angewandt werden (siehe z. B. Kohler & Milstein, Nature 256: 495–497 (1975), Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983), Cole et al., S. 77–96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Verfahren für die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern ( U. S. Patent 4,946,778 ) können adaptiert werden, um Antikörper gegen erfindungsgemäße Polypeptide herzustellen. Es können auch transgene Mäuse oder andere Organismen, wie etwa andere Säuger verwendet werden, um humanisierte Antikörper zu exprimieren. Alternativ kann eine Phagendisplay-Technologie angewandt werden, um Antikörper und heteromere Fab-Fragmente zu identifizieren, die spezifisch an ausgewählte Antigene binden (siehe z. B. McCafferty et al., Nature 348: 552–554 (1990), Marks et al., Biotechnology 10: 779–783 (1992)).
Ein "chimärer Antikörper" ist ein Antikörpermolekül, worin (a) die konstante Region oder ein Teil davon verändert, ersetzt oder ausgetauscht ist, sodass die Antigenbindungsstelle (variable Region) mit einer konstanten Region einer anderen oder veränderten Klasse, Effektorfunktion und/oder Spezies, oder mit einem vollkommen verschiedenen Molekül verbunden ist, das dem chimären Antikörper neue Eigenschaften verleiht, beispielsweise einem Enzym, Toxin, Hormon, Wachstumsfaktor, Wirkstoff usw., oder (b) die variable Region oder ein Teil davon verändert, ersetzt oder durch eine variable Region ausgetauscht ist, die eine andere oder veränderte Antigenspezifität aufweist.
Ein "Anti-IRAK-4"-Antikörper ist ein Antikörper oder Antikörperfragment, welcher bzw. welches spezifisch an ein durch das IRAK-4-Gen, cDNA oder eine Subsequenz davon kodiertes Polypeptid bindet.
Der Begriff "Immunoassay" ist ein Assay, bei welchem ein Antikörper für die spezifische Bindung eines Antigens verwendet wird. Der Immunoassay ist durch die Verwendung von spezifischen Bindungseigenschaften eines bestimmten Antikörpers charakterisiert, um das Antigen zu isolieren, anzusteuern und/oder zu quantifizieren.
Der Begriff "bindet spezifisch (oder selektiv)" an einen Antikörper oder „zeigt eine spezifische (oder selektive) Immunreaktion mit" bezieht sich bei einem Verweis auf ein Protein oder Peptid auf eine Bindungsreaktion, die für die Anwesenheit des Proteins in einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Substanzen maßgeblich ist. So binden unter bestimmten Immunoassay-Bedingungen die spezifischen Antikörper an ein bestimmtes Protein mit mindestens dem zweifachen Hintergrund, und binden nicht wesentlich in einer signifikanten Menge an andere Proteine, die in der Probe vorliegen. Eine spezifische Bindung an einen Antikörper unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der hinsichtlich der Spezifität für ein bestimmtes Protein ausgewählt wird. Beispielsweise können polyklonale Antikörper gegen ein IRAK-4-Polypeptid von spezifischen Spezies, wie etwa Ratte, Maus oder Mensch ausgewählt werden, um nur diejenigen polyklonalen Antikörper auszuwählen, die spezifisch mit dem IRAK-4-Protein immunreaktiv sind und nicht mit anderen Proteinen, mit Ausnahme von polymorphen Varianten oder Allelen des IRAK-4-Proteins. Diese Selektion kann durch Abziehen der Antikörper, die mit IRAK-4-Molekülen von anderen Spezies kreuzreagieren, erreicht werden. Für die Selektion von Antikörpern, die spezifisch mit einem bestimmten Protein immunreagieren, kann eine Vielzahl von Immunoassay-Formaten verwendet werden. Beispielsweise werden Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig verwendet, um Antikörper auszuwählen, die spezifisch mit einem Protein immunreagieren (siehe z. B. Harlow & Lane, Antibodies, A Laborstory Manual (1988) für eine Beschreibung von Immunoassay-Formaten und Bedingungen, die zur Bestimmung einer spezifischen Immunreaktivität verwendet werden können). Normalerweise stellt eine spezifische oder selektive Reaktion mindestens das zweifache Hintergrundsignal oder Rauschen dar, und normalerweise mehr als 10- bis 100-mal den Hintergrund.
Der Begriff "assoziiert selektiv mit" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Nukleinsäure, mit einer anderen, wie oben definiert wurde, "selektiv zu hybridisieren", oder auf die Fähigkeit eines Antikörpers, an ein Protein "selektiv (oder spezifisch) zu binden", wie oben definiert wurde.
Mit "Wirtszelle" ist eine Zelle gemeint, die einen Expressionsvektor enthält und die Replikation oder Expression des Expressionsvektors unterstützt. Wirtszellen können prokaryotische Zellen, wie etwa E. coli, oder eukaryotische Zellen sein, wie etwa Hefe-, Insekten-, Amphibien- oder Säugerzellen, wie etwa CHO, HeLa und ähnliche, beispielsweise kultivierte Zellen, Explantate und Zellen in vivo.
III. Manipulation und Nachweis von IRAK-4-Nukleinsäuren
In zahlreichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Nukleinsäuren verwendet, die ein IRAK-4-Polypeptid kodieren, einschließlich ein Volllängen-IRAK-4-Protein oder ein beliebiges Derivat, eine Variante, ein Homologes oder Fragment davon. Solche Nukleinsäuren sind für eine beliebige aus einer Anzahl von Anwendungen verwendbar, einschließlich der Herstellung eines IRAK-4-Proteins, für diagnostische Assays, für therapeutische Applikationen, für IRAK-4-spezifische Sonden, für Assays für IRAK-4-bindende und/oder modulierende Verbindungen, für die Identifizierung und/oder Isolierung von IRAK-4-Homologen von anderen Spezies und für andere Anwendungen.
A. Allgemeine rekombinante DNA-Methoden
Zahlreiche Anwendungen der vorliegenden Erfindung betreffen die Klonierung, Synthese, Erhaltung, Mutagenese und andere Manipulationen von Nukleinsäure-Sequenzen, die unter Verwendung von Routineverfahren auf dem Gebiet der rekombinanten Genetik durchgeführt werden können. Grundlagentexte für die Offenbarung der allgemeinen Verfahren für die Verwendung in dieser Erfindung umfassen Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laborstory Manual (2. Ed. 1989), Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laborstory Manual (1990) und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Ed., 1994)).
Bei Nukleinsäuren sind die Größen entweder in Kilobasen (kb) oder Basenpaaren (bp) angegeben. Dies sind Schätzungen, die von einer Agarose- oder Acrylamid-Gelelektrophorese stammen, von sequenzierten Nukleinsäuren oder von publizierten DNA-Sequenzen. Bei Proteinen sind die Größen in Kilodalton (kDa) oder als Anzahl der Aminosäurereste angegeben. Proteingrößen werden von einer Gelelektrophorese, von sequenzierten Proteinen, von abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen oder von publizierten Protein-Sequenzen abgeschätzt.
Oligonukleotide, die nicht kommerziell erhältlich sind, können nach dem Festphasen-Phosphoramididtriester-Verfahren chemisch synthetisiert werden, das zuerst von Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859–1862 (1981) beschrieben wurde, unter Verwendung eines automatisierten Syntheseapparats, wie von Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159–6168 (1984) beschrieben wird. Die Reinigung von Oligonukleotiden erfolgt entweder durch eine native Acrylamid-Gelelektrophorese oder durch Anionenaustausch-HPLC, wie von Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137–149 (1983) beschrieben wird.
Die Sequenz der klonierten Gene und synthetischen Oligonukleotide kann nach der Klonierung beispielsweise unter Verwendung des Kettenterminationsverfahrens für die Sequenzierung von doppelsträngigen Templates von Wallace et al., Gene 16: 21–26 (1981) verifiziert werden.
B. Isolierung und Nachweis von IRAK-4-Nukleotid-Sequenzen
In zahlreichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden IRAK-4-Nukleinsäuren unter Verwendung rekombinanter Verfahren isoliert und kloniert. Solche Ausführungsformen werden beispielsweise verwendet, um IRAK-4-Polynukleotide für die Proteinexpression zu isolieren oder während der Erzeugung von Varianten, Derivaten, Expressionskassetten oder anderen Sequenzen, die von IRAK-4 stammen, um die IRAK-4-Genexpression zu überwachen, für die Isolierung oder den Nachweis von IRAK-4-Sequenzen in unterschiedlichen Spezies, für diagnostische Zwecke bei einem Patienten, d. h. zum Nachweis von Mutationen in IRAK-4 oder zum Genotypisieren und/oder für forensische Anwendungen.
Oft werden die Nukleinsäure-Sequenzen, die IRAK-4-Proteine kodieren und verwandte Nukleinsäure-Sequenzhomologe aus cDNA und genomischen DNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit Sonden kloniert, oder unter Verwendung von Amplikationsverfahren mit Oligonukleotidprimern isoliert. Beispielsweise werden IRAK-4-Sequenzen normalerweise aus Bibliotheken von Säugernukleinsäure (genomisch oder cDNA) durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde isoliert, deren Sequenz kann aus SEQ ID NO:2 oder 4 entnommen werden, oder unter Verwendung von Primern amplifiziert, die SEQ ID NO:5 und 6 umfassen. Ein geeignetes biologisches Material, aus dem RNA und cDNA für IRAK-4 isoliert werden kann, ist beispielsweise Thymus, Milz, Niere, Plazenta, Lunge, Leber, Niere, Pankreas, Prostata, Hoden, Ovar, Dünndarm, Colon, Lymphknoten und Tonsillen.
Amplifikationsverfahren unter Verwendung von Primern können auch angewandt werden, um IRAK-4-Sequenzen aus DNA oder RNA zu amplifizieren und zu isolieren (siehe z. B. Dieffenbach & Dveksler, PCR Primer: A Laborstory Manual (1995)). Beispielsweise können Primer verwendet werden, um entweder die Volllängensequenz oder eine Sonde oder von ein bis mehrere Hundert Nukleotide zu amplifizieren (beispielsweise unter Verwendung der als SEQ ID NO:5 und 6 gezeigten Primer), die dann zum Screening einer Säugerbibliothek für Volllängen-IRAK-4-Klone verwendet wird.
Nukleinsäuren, die IRAK-4-Polypeptide kodieren, können auch aus Expressionsbibliotheken unter Verwendung von Antikörpern als Sonden isoliert werden. Solche polyklonalen oder monoklonalen Antikörper können unter Verwendung der Sequenz von SEQ ID NO:1 oder 3 oder Derivaten oder Fragmenten davon hergestellt bzw. erhalten werden.
Polymorphe Varianten, Allele und Interspezieshomologe, die im Wesentlichen mit einem IRAK-4-Gen identisch sind, können unter Verwendung von IRAK-4-Nukleinsäuresonden und Oligonukleotiden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durch Screening von Bibliotheken isoliert werden. Alternativ können Expressionsbibliotheken verwendet werden, um polymorphe Varianten, Allele und Interspezieshomologe von IRAK-4 zu klonieren, durch den immunologischen Nachweis exprimierter Homologe mit einem Antiserum oder mit gereinigten Antikörpern, die gegen ein IRAK-4-Polypeptid hergestellt werden, das auch das IRAK-4-Homologe erkennt und selektiv daran bindet.
Entfernter verwandte IRAK-4-Homologe können unter Verwendung eines beliebigen aus einer Vielzahl von allgemein bekannten Verfahren identifiziert werden, einschließlich Hybridisieren einer IRAK-4-Sonde mit einer genomischen oder cDNA-Bibliothek unter Verwendung von moderat stringenten Bedingungen oder unter niedrig stringenten Bedingungen. Ein entferntes Homologes kann auch aus einer Nukleinsäurenbibliothek unter Verwendung eines Sets degenerierter Primer amplifiziert werden, d. h. Primer, die alle möglichen Kodons enthalten, die eine bestimmte Aminosäure-Sequenz kodieren, insbesondere auf Basis eines hoch konservierten Aminosäureabschnitts. Solche Primer sind Fachleuten allgemein bekannt und es sind zahlreiche Programme für das Design degenerierter Primer erhältlich, beispielsweise im Internet.
Um eine cDNA-Bibliothek herzustellen, sollte man eine Quelle auswählen, die reich ist an IRAK-4-mRNA, z. B. Zellen, die aus Thymus, Milz, Niere, Plazenta, Lunge, Leber, Niere, Pankreas, Prostata, Hoden, Ovar, Dünndarm, Colon, Lymphknoten oder Transillen isoliert werden. Die mRNA wird dann unter Verwendung reverser Transkriptase zu cDNA, in einen rekombinanten Vektor ligiert und für die Vermehrung, das Screening und die Klonierung in einen rekombinanten Wirt transfiziert. Verfahren zum Herstellen und Screening von cDNA-Bibliotheken sind allgemein bekannt (siehe z. B. Gubler & Hoffman, Gene 25: 263–269 (1983), Sambrook et al., oben, Ausubel et al., oben).
Für eine genomische Bibliothek wird die DNA aus dem Gewebe oder den Zellen extrahiert und entweder mechanisch durch Scherung zerkleinert oder enzymatisch verdaut, um Fragmente von etwa 12–20 kb zu erhalten. Die Fragmente werden dann durch eine Gradienten-Zentrifugation von unerwünschten Größen getrennt und werden in Bakteriophagen Lambda-Vektoren konstruiert. Diese Vektoren und Phagen werden in vitro verpackt. Rekombinante Phagen werden durch Plaquehybridisierung analysiert, wie von Genton & Davis, Science 196: 108–182 (1977) beschrieben wird. Eine Koloniehybridisierung wird durchgeführt, wie allgemein in Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961–3965 (1975) beschrieben.
Ein alternatives Verfahren zur Isolierung einer IRAK-4-Nukleinsäure und Homologen davon kombiniert die Verwendung von synthetischen Oligonukleotidprimern und die Amplifikation eines RNA- oder DNA-Templates (siehe z. B. U. S. Patent Nr. 4,683,195 und 4,683,202 ; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Eds. 1990)). Es können Verfahren wie etwa eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und eine Ligase-Kettenreaktion (LCR) angewandt werden, um Nukleinsäure-Sequenzen von IRAK-4-Genen direkt aus mRNA, aus cDNA, aus genomischen Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken zu amplifizieren. Degenerierte Oligonukleotide können unter Verwendung der hierin bereitgestellten Sequenzen so gestaltet werden, dass sie IRAK-4-Homologe amplifizieren. In die Primer können Restriktionsendonuklease-Stellen eingefügt werden. Die Polymerase-Kettenreaktion oder andere in vitro-Amplifikationsverfahren können auch nützlich sein, beispielsweise für die Klonierung von Nukleinsäure-Sequenzen, welche die zu exprimierenden Proteine kodieren, zur Herstellung von Nukleinsäuren zur Verwendung als Sonden zum Nachweis der Vorliegens von IRAK-4-kodierender mRNA in physiologischen Proben, für die Nukleinsäure-Sequenzierung oder für andere Zwecke. Durch die PCR-Reaktion amplifizierte Gene können aus Agarosegelen gereingt und in einen geeigneten Vektor kloniert werden.
Synthetische Oligonukleotide können verwendet werden, um rekombinante IRAK-4-Gene für die Verwendung als Sonden oder für die Proteinexpression zu konstruieren. Dieses Verfahren wird durchgeführt unter Verwendung einer Reihe von überlappenden Oligonukleotiden, normalerweise 40–120 bp lang, die sowohl den Sense-Strang als auch den Antisense-Strang des Gens repräsentieren. Diese DNA-Fragmente werden dann einem Annealing unterzogen, ligiert und kloniert. Alternativ können Amplifikationsverfahren mit genauen Primern angewandt werden, um eine spezifische Subsequenz der IRAK-4-Nukleinsäure zu amplifizieren. Die spezifische Subsequenz wird dann in einen Expressionsvektor ligiert.
Die Nukleinsäure, die ein IRAK-4-Polypeptid kodiert, wird normalerweise vor der Transformation in prokaryotische oder eukaryotische Zellen für eine Replikation und/oder Expression in Zwischenvektoren kloniert. Diese Zwischenvektoren sind normalerweise prokaryotische Vektoren, z. B. Plasmide, oder Shuttlevektoren. Vektoren, Zellen und Transfektionsverfahren sind Fachleuten allgemein bekannt und werden z. B. in Ausubel oder in Sambrook beschrieben, beide oben.
Optional werden Nukleinsäuren verwendet, die chimäre Proteine kodieren, umfassend ein IRAK-4-Polypeptid oder Domänen davon, in Kombination mit einem heterologen Polypeptid oder Polypeptiden. Beispielsweise kann eine Domäne, wie etwa eine N-terminale "Todes"-Domäne, eine zentrale Kinase-Domäne oder eine beliebige der 12 konservierten Kinase-Domänen kovalent mit einem heterologen Protein verbunden werden, wie etwa einer heterologen Transmembran-Domäne oder einer heterologen extrazellulären Domäne. Andere heterologe Proteine der Wahl umfassen z. B. Luciferase, GFP ("Green Fluorescent Protein") und β-gal, wobei jedes davon im Fachgebiet allgemein bekannt ist.
In bestimmten Ausführungsformen werden IRAK-4-Polynukleotide unter Verwendung von Hybridisierungs-basierten Verfahren nachgewiesen, um beispielsweise IRAK-4-RNA-Mengen zu bestimmen oder um bestimmte DNA-Sequenzen nachzuweisen, beispielsweise für eine Genotypisierung oder für forensische Anwendungen. Die Genexpression von IRAK-4 kann beispielsweise durch Verfahren analysiert werden, die im Stand der Technik bekannt sind, beispielsweise durch Northern Blotting, reverse Transkription und Amplifikation von mRNA, Dot Blotting, in situ-Hybridisierung, RNase Protection, Sondierung von DNA-Mikrochip-Arrays und dergleichen. In einer anderen Ausführungsform wird eine Analysetechnologie mit hochdichten Oligonukleotiden (z. B. GeneChip^TM) verwendet, um homologe und polymorphe Varianten von IRAK-4 zu identifizieren, oder um die Mengen an IRAK-4-mRNA zu beobachten. Für den Fall, dass ein Homologes mit einer bekannten Krankheit verbunden ist, können diese mit einem GeneChip^TM als diagnostisches Werkzeug beim Nachweis der Krankheit in einer biologischen Probe verwendet werden, siehe z. B. Gunthand et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 869–876 (1998); Kozal et al., Nat. Med. 2: 753–759 (1996), Matson et al., Anal. Biochem. 224: 110–106 (1995), Lockhart et al., Nat. Biotechnol. 14: 1675–1680 (1996), Gingeras et al., Genome Res. 8: 435–448 (1998), Hacia et al., Nucleic Acids Res. 26: 3865–2755 (1998).
Bei bestimmten Anwendungen wird eine IRAK-4-Nukleinsäure-Sequenz (beispielsweise DNA) nachgewiesen, beispielsweise für diagnostische und forensische Anwendungen. Ein IRAK-4-Allel kann bei einem Säuger beispielsweise unter Verwendung der Southern Blot-Hybridisierung nachgewiesen werden, d. h. durch Isolieren genomischer DNA, Durchführen eines Restriktionsverdaus mit der isolierten DNA, elektrophoretische Trennung der Restriktionsfragmente, z. B. in einem Agarosegel, und Übertragen der aufgetrennten DNA auf eine Membran und Sondieren mit einer spezifischen, markierten Sequenz. Southern Blotting ist Fachleuten allgemein bekannt und wird in zahlreichen Quellen gelehrt, einschließlich Ausubel et al. und Sambrook et al.
In anderen Ausführungsformen, z. B. für den Nachweis von gewebespezifischen oder zeitlichen Mustern der Genexpression, wird ein IRAK-4-Polynukleotid unter Verwendung einer in situ-Hybridisierung nachgewiesen. Bei einer in situ-Hybridisierung wird die Zielnukleinsäure von ihrer zellulären Umgebung befreit, sodass sie für eine Hybridisierung innerhalb der Zelle verfügbar ist, während die zelluläre Morphologie für eine nachfolgende Interpretation und Analyse erhalten wird. Die folgenden Artikel stellen einen Überblick des Fachgebiets der in situ-Hybridisierung bereit: Singer et al., Biotechniques 4: 230–250 (1986); Haase et al., Methods in Virology, Vol. VII, S. 189–226 (1984), und Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (Hames et al., Eds. 1987).
C. Expression in Prokaryoten und Eukaroyten
Oft wird eine klonierte IRAK-4-Sequenz in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle exprimiert, um eine Expression zu erhalten, d. h. eine Produktion der kodierten mRNA oder des Proteins. In zahlreichen Ausführungsformen wird beispielsweise ein IRAK-4-Polynukleotid in eine Zelle eingebracht, um das Ausmaß der IRAK-4-Aktivität in der Zelle zu modulieren, und dabei das Ausmaß der IL-1-, IL-18- oder LPS-Signaltransduktion in den Zellen eines Patienten zu modulieren. Um die Expression eines klonierten Gens oder einer Nukleinsäure, wie etwa einer cDNA, die ein IRAK-4-Polypeptid kodiert, auf hohem Niveau zu erhalten, wird normalerweise eine IRAK-4-Sequenz in einen Expressionsvektor subkloniert, der einen starken Promotor zur Regelung bzw. Steuerung der Transkription, einen Transkriptions/Translations-Terminator und, falls die Nukleinsäure ein Protein kodiert, eine Ribosomenbindungsstelle für den Beginn der Translation enthält. Geeignete bakterielle Promotoren sind im Fachgebiet allgemein bekannt und werden z. B. in Sambrook et al. und Ausubel et al. beschrieben. Bakterielle Expressionssysteme für die Expression des IRAK-4-Proteins sind beispielsweise erhältlich in E. coli, Bacillus sp. und Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229–235 (1983), Mosbach et al., Nature 302: 543–545 (1983). Kits für solche Expressionssysteme sind kommerziell erhältlich. Eukaryotische Expressionssysteme für Säugerzellen, Hefe- und Insektenzellen sind im Fachgebiet allgemein bekannt und sind ebenso kommerziell erhältlich. In einer Ausführungsform ist der eukaryotische Expressionsvektor ein adenoviraler Vektor, ein adenoassoziierter Vektor oder ein retroviraler Vektor.
Bei therapeutischen Anwendungen werden IRAK-4-Nukleinsäuren in vitro, in vivo oder ex vivo unter Verwendung eines beliebigen aus einer großen Anzahl von Verfahren in eine Zelle eingebracht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine Infektion mit viralen Vektoren, Verfahren auf Basis von Liposomen, einer biolistischen Partikelbeschleunigung (der Gene Gun) und der Injektion nackter DNA. Solche therapeutisch verwendbaren Nukleinsäuren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf kodierende Sequenzen für Volllängen-IRAK-4, kodierende Sequenzen für ein IRAK-4-Fragment, eine Domäne, ein Derivat oder eine Variante, IRAK-4-Antisense-Sequenzen und IRAK-4-Ribozyme. Normalerweise werden solche Sequenzen wirksam mit einem Promotor verbunden, aber in zahlreichen Anwendungen wird eine Nukleinsäure einer Zelle zugeführt, die selbst direkt therapeutisch wirksam ist, z. B. bestimmte Antisense- oder Ribozym-Moleküle.
Der für die Steuerung der Expression einer heterologen Nukleinsäure verwendete Promotor hängt von der bestimmten Anwendung ab. Der Promotor wird optional in der gleichen Distanz von der heterologen Transkriptionsstartstelle positioniert wie die Distanz zur Transkriptionsstartstelle in seiner natürlichen Umgebung. Wie im Fachgebiet bekannt ist, kann jedoch ohne Verlust der Promotorfunktion in dieser Distanz eine erhebliche Variation eingestellt werden.
Neben dem Promotor enthält der Expressionsvektor normalerweise eine Transkriptionseinheit oder Expressionskassette, die alle zusätzlichen Elemente enthält, die für die Expression der IRAK-4 kodierenden Nukleinsäure in den Wirtszellen erforderlich sind. Eine typische Expressionskassette enthält somit einen wirksam mit der Nukleinsäuresequenz, die ein IRAK-4-Polypeptid kodiert, verbundenen Promotor, und Signale, die für eine effiziente Polyadenylierung des Transkripts erforderlich sind, Ribosomenbindungsstellen und eine Translationstermination. Die Nukleinsäuresequenz, die ein IRAK-4-Polypeptid kodiert, kann mit einer abspaltbaren Signalpeptidsequenz verbunden sein, um die Sekretion des kodierten Proteins durch die transfiizierte Zelle zu fördern. Solche Signalpeptide umfassen unter anderem die Signalpeptide des Gewebsplasminogenaktivators, Insulin und des Nervenwachstumsfaktors, und die juvenile Hormonesterase von Heliothis virescens. Weitere Elemente der Kassette können Enhancer enthalten und, falls genomische DNA als das Strukturgen verwendet wird, Introns mit funktionalen Splice-Donor- und Akzeptorstellen.
Neben einer Promotorsequenz sollte die Expressionskassette auch eine Transkriptionsterminations-Region stromabwärts des Strukturgens enthalten, um eine effiziente Termination zu ermöglichen. Die Terminationsregion kann aus dem gleichen Gen wie die Promotorsequenz erhalten werden, oder kann aus unterschiedlichen Genen erhalten werden.
Der für den Transport der genetischen Information in die Zelle verwendete Expressionsvektor ist nicht besonders entscheidend. Es kann ein beliebiger der konventionellen Vektoren verwendet werden, die für die Expression in eukaryotischen und prokaryotischen Zellen verwendet werden. Standardvektoren für eine bakterielle Expression umfassen Plasmide wie etwa Plasmide auf Basis von pBR322, pSKF, pET23D und Fusionsexpressionssysteme, wie etwa GST und LacZ. Es können auch Epitop-Tags an rekombinante Proteine angefügt werden, um zweckmäßige Isolierungsverfahren zu ermöglichen, z. B. c-myc, HA-Tag, 6-His-Tag, Maltosebindungsprotein, VSV-G-Tag, Anti-DYKDDDDK-Tag oder eine beliebiges derartiges Tag, wobei Fachleuten eine große Anzahl davon gut bekannt sind.
Expressionsvektoren mit regulatorischen Elementen von eukaryotischen Viren werden normalerweise in eukaryotischen Expressionsvektoren verwendet, z. B. SV40-Vektoren, Papilloma-Virus-Vektoren und vom Epstein-Barr-Virus stammende Vektoren. Andere beispielhafte eukaryotische Vektoren umfassen pMSG, pAV009/A⁺, pMTO10/A⁺, pMAMneo-5, Baculovirus pDSVE und jeden anderen Vektor, der eine Expression von Proteinen unter der Steuerung des CMV-Promotors, SV40-Early-Promotors, SV40-Late-Promotors, Metallothionein-Promotors, des Maus-Mammatumorvirus-Promotors, Rous-Sarkom-Virus-Promotors, Polyhedrin-Promotors oder anderen Promotoren ermöglicht, die sich für eine Expression in eukaryotischen Zellen als wirksam erwiesen haben.
Einige Expressionssysteme weisen Marker auf, die eine Genamplifikation ermöglichen, wie etwa Neomycin, Thymidinkinase, Hygromycin B Phosphotransferase und Dihydrofolatreduktase. Alternativ sind auch Expressionssysteme mit hoher Ausbeute geeignet, die keine Genamplifikation einbeziehen, wie etwa die Verwendung eines Baculovirus-Vektors in Insektenzellen, mit einer Sequenz, die ein IRAK-4-Polypeptid kodiert, unter der Steuerung des Polyhedrin-Promotors oder anderen starken Baculovirus-Promotoren.
Die Elemente, die normalerweise in Expressionsvektoren enthalten sind, umfassen auch ein Replikon, das in E. coli funktioniert, ein Gen, das eine Antibiotikaresistenz kodiert, um die Selektion von Bakterien zu ermöglichen, die rekombinante Plasmide in sich tragen, und einmalige Restriktionsstellen in unwesentlichen Regionen des Plasmids, um die Insertion von eukaryotischen Sequenzen zu ermöglichen. Das spezielle ausgewählte Antibiotika-Resistenzgen ist nicht entscheidend, jedes der zahlreichen, im Fachgebiet bekannten Resistenzgene ist geeignet. Die prokaryotischen Sequenzen werden optional so ausgewählt, dass sie die Replikation der DNA in eukaryotischen Zellen nicht stören, falls dies erforderlich ist.
Es werden Standard-Transfektionsverfahren verwendet, um bakterielle, Säuger-, Hefe- oder Insektenzelllinien zu erzeugen, die große Mengen eines IRAK-4-Proteins exprimieren, das dann unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt wird (siehe z. B. Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619–17622 (1989), Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, Vol. 182 (Deutscher, Ed. 1990)). Die Transformation von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen wird unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt (siehe z. B. Morrison, J. Bact. 132: 349–351 (1977), Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347–362 (Wu et al., Ed. 1983).
Für das Einbringen des Expressionsvektors kann ein beliebiges der allgemein bekannten Verfahren zum Einbringen von fremden Nukleotid-Sequenzen in Wirtszellen verwendet werden. Diese umfassen die Verwendung von Reagenzien, wie etwa Superfect (Qiagen), Liposomen, Calciumphosphat-Transfektion, Polybren, Protoplastenfusion, Elektroporation, Mikroinjektion, Plasmidvektoren, virale Vektoren, biolistische Partikelbeschleunigung (die Gene Gun) oder ein beliebiges der anderen allgemein bekannten Verfahren zum Einbringen klonierter genomischer DNA, cDNA, synthetischer DNA oder von anderem fremden genetischen Material in eine Wirtszelle (siehe z. B. Sambrook et al., oben). Es ist nur notwendig, dass das bestimmte verwendete Verfahren zur Genmanipulation mindestens ein Gen in die Wirtszelle, die ein IRAK-4-Gen exprimieren kann, erfolgreich einbringen kann.
Nachdem der Expressionsvektor in die Zellen eingebracht wurde, werden die transfizierten Zellen unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression des IRAK-4-Polypeptids begünstigen, das unter Verwendung der unten beschriebenen Standardverfahren aus der Kultur gewonnen wird. Verfahren zur Kultivierung von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen sind allgemein bekannt und werden z. B. in Ausubel et al., Sambrook et al. und Freshney, Culture of Animal Cells, 3. Ed., (1993), Eine Wiley-Liss Publikation, gelehrt.
IV. Reinigung von IRAK-4-Polypeptiden
Entweder natürlich vorkommende oder rekombinante IRAK-4-Polypeptide können für eine Verwendung in funktionellen Assays, Bindungsassays, diagnostischen Assays und anderen Anwendungen gereinigt werden. Optional werden rekombinante IRAK-4-Polypeptide gereinigt. Natürlich vorkommende IRAK-4-Polypeptide werden beispielsweise aus Säugergewebe, wie etwa Thymus, Milz, Niere, Plazenta, Lunge, Leber, Niere, Pankreas, Prostata, Hoden, Ovar, Dünndarm, Colon, Lymphknoten und Tonsillen gereinigt, oder aus einer beliebigen anderen Quelle eines IRAK-4-Homologen. Rekombinante IRAK-4-Polypeptide werden aus einem beliebigen geeigneten bakteriellen oder eukaryotischen Expressionssystem gereinigt, z. B. aus CHO-Zellen oder Insektenzellen.
IRAK-4-Proteine können durch Standardverfahren bis zu einer wesentlichen Reinheit gereinigt werden, einschließlich einer selektiven Präzipitation mit solchen Substanzen wie Ammoniumsulfat, einer Säulenchromatographie, Immunreinigungsverfahren und anderen Verfahren (siehe z. B. Scopes, Protein, Purification: Principles and Practice (1982), U.S. Patent Nr. 4,673,641 , Ausubel et al., oben, und Sambrook et al., oben).
Wenn ein rekombinantes IRAK-4-Polypeptid gereinigt wird, kann eine Vielzahl von Verfahren angewandt werden. Beispielsweise können Proteine mit etablierten molekularen Adhäsionseigenschaften reversibel mit dem IRAK-4-Polypeptid fusioniert werden. Mit dem geeigneten Liganden kann ein IRAK-4-Polypeptid selektiv an eine Reinigungssäule adsorbiert werden und dann von der Säule in einer relativ reinen Form abgelöst werden. Das fusionierte Protein wird dann durch enzymatische Aktivität entfernt. IRAK-4-Proteine können auch unter Verwendung von Immunaffinitätssäulen gereinigt werden.
A. Reinigung von IRAK-4-Protein aus rekombinanten Zellen
Rekombinante Proteine werden durch transformierte Bakterien oder eukaryotische Zellen, wie etwa CHO-Zellen oder Insektenzellen, in großen Mengen exprimiert, normalerweise nach der Induktion eines Promotors, jedoch kann die Expression konstitutiv sein. Die Promotorinduktion mit IPTG ist ein Beispiel eines induzierbaren Promotorsystems. Zellen werden nach Standardverfahren des Fachgebiets angezogen. Für die Isolierung von Protein werden frische oder gefrorene Zellen verwendet.
In Bakterien exprimierte Proteine können unlösliche Aggregate ("Einschlusskörper") bilden. Für die Reinigung von IRAK-4-Einschlusskörpern sind mehrere Protokolle geeignet. Beispielsweise beeinhaltet die Reinigung von Einschlusskörpern normalerweise die Extraktion, Trennung und/oder Reinigung von Einschlusskörpern durch Aufbrechen der Bakterienzellen, z. B. durch Inkubation in einem Puffer mit 50 mM TRIS/HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP und 1 mM PMSF. Die Zellsuspension kann unter Verwendung von 2–3 Passagen durch eine French Press lysiert werden, unter Verwendung eines Polytrons (Brinkman Instruments) homogenisiert werden oder auf Eis beschallt werden. Alternative Verfahren zur Lyse von Bakterien sind Fachleuten bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., oben, Ausubel et al., oben).
Falls erforderlich, werden die Einschlusskörper solubilisiert und die lysierte Zellsuspension wird normalerweise zentrifugiert, um unerwünschte unlösliche Substanzen zu entfernen. Die Proteine, welche die Einschlusskörper gebildet haben, können durch Verdünnung oder Dialyse mit einem geeigneten Puffer renaturiert werden. Geeignete Lösungsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Harnstoff (von etwa 4 M bis etwa 8 M), Formamid (mindestens etwa 80% bezogen auf Volumen/Volumen) und Guanidinhydrochlorid (von etwa 4 M bis etwa 8 M). Einige Lösungsmittel, die aggregatbildende Proteine solubilisieren können, beispielsweise SDS (Natriumdodecylsulfat) und 70%ige Ameisensäure, sind für eine Verwendung in diesem Verfahren aufgrund der Möglichkeit einer irreversiblen Denaturierung der Proteine, begleitet von einem Verlust der Immunogenität und/oder Aktivität nicht geeignet. Obwohl Guanidinhydrochlorid und ähnliche Agenzien Denaturierungsmittel sind, ist diese Denaturierung nicht irreversibel und bei der Entfernung (beispielsweise durch Dialyse) oder Verdünnung des Denaturierungsmittels kann eine Renaturierung erfolgen, was die Rückbildung des immunologisch und/oder biologisch aktiven Proteins ermöglicht. Fachleuten sind andere geeignete Puffer bekannt. IRAK-4-Polypeptide werden von anderen bakteriellen Proteinen durch standardmäßige Trennungsverfahren getrennt, z. B. mit einem Ni-NTA-Agaroseharz.
Alternativ ist es möglich, IRAK-4-Polypeptide aus Bakterienperiplasma aufzureinigen. Wenn ein IRAK-4-Protein in das Periplasma der Bakterien exportiert wird, kann die Periplasmafraktion der Bakterien nach der Lyse der Bakterien durch einen kalten osmotischen Schock in Verbindung mit anderen Verfahren isoliert werden, die Fachleuten bekannt sind. Um rekombinante Proteine aus dem Periplasma zu isolieren, werden die Bakterien unter Bildung eines Pellets zentrifugiert. Das Pellet wird in einem Puffer mit 20% Saccharose resuspendiert. Um die Zellen zu lysieren, werden die Bakterien zentrifugiert und das Pellet wird in eiskaltem 5 mM MgSO₄ resuspendiert und für ungefähr 10 Minuten in einem Eisbad gehalten. Die Zellsuspension wird zentrifugiert, und der Überstand wird abgegossen und aufbewahrt. Die im Überstand vorhandenen rekombinanten Proteine können von den Wirtsproteinen durch Standard-Trennungsverfahren, die Fachleuten allgemein bekannt sind, getrennt werden.
B. Standard-Protein-Trennungsverfahren zur Reinigung von IRAK-4-Polypeptiden
1. Löslichkeitsfraktionierung
Oft kann als ein erster Schritt, insbesondere wenn das Proteingemisch komplex ist, eine erste Salzfraktionierung viele der unerwünschten Wirtszellproteine (oder der aus dem Zellkulturmedium stammenden Proteine) von dem rekombinanten Protein von Interesse abtrennen. Das bevorzugte Salz ist Ammoniumsulfat. Ammoniumsulfat präzipitiert Proteine durch effektive Verringerung der Wassermenge in dem Proteingemisch. Proteine präzipitieren dann auf Basis ihrer Löslichkeit. Je hydrophober ein Protein ist, umso wahrscheinlicher präzipitiert es bei niedrigeren Ammoniumsulfatkonzentrationen. Ein typisches Protokoll umfasst Zugeben von gesättigtem Ammoniumsulfat zu einer Proteinlösung, sodass die resultierende Ammoniumsulfatkonzentration zwischen 20–30% beträgt. Bei dieser Konzentration werden die am meisten hydrophoben der Proteine präzipitiert. Das Präzipitat wird dann verworfen (ausser, wenn das Protein von Interesse hydrophob ist) und Ammoniumsulfat wird bis zu einer Konzentration zu dem Überstand zugegeben, für den bekannt ist, dass das Protein von Interesse präzipitiert. Das Präzipitat wird dann in Puffer solubilisiert und das überschüssige Salz, falls erforderlich, entweder durch Dialyse oder Diafiltration entfernt. Andere Verfahren, die auf der Löslichkeit von Proteinen beruhen, wie etwa eine kalte Ethanolpräzipitation, sind Fachleuten allgemein bekannt und können zur Fraktionierung von komplexen Proteingemischen verwendet werden.
2. Größenausschlussfiltration
Das Molekulargewicht eines IRAK-4-Proteins kann verwendet werden, um es von Proteinen mit einer größeren und geringeren Größe unter Verwendung von Ultrafiltration durch Membranen von unterschiedlicher Porengröße (beispielsweise Amicon- oder Millipore-Membranen) abzutrennen. Als erster Schritt wird das Proteingemisch durch eine Membran mit einer Porengröße ultrafiltriert, die einen geringeren Molekulargewichts-Cut-Off aufweist als das Molekulargewicht des Proteins von Interesse. Das Retentat der Ultrafiltration wird dann gegen eine Membran mit einem Molekulargewichts-Cut-Off ultrafiltriert, der größer ist als das Molekulargewicht des Proteins von Interesse. Das rekombinante Protein wird durch die Membran in das Filtrat gelangen. Das Filtrat kann dann, wie unten beschrieben, einer Chromatographie unterzogen werden.
3. Säulenchromatographie
IRAK-4-Proteine können auch auf Basis ihrer Größe, ihrer Nettooberflächenladung, ihrer Hydrophobizität und ihrer Affinität für heterologe Moleküle von anderen Proteinen abgetrennt werden. Außerdem können Antikörper gegen Proteine mit Säulenmatrices konjugiert werden und die Proteine können immungereinigt werden. Alle diese Verfahren sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Es ist für einen Fachmann offensichtlich, dass chromatographische Verfahren in einem beliebigen Maßstab und unter Verwendung eine Apparatur von vielen unterschiedlichen Herstellern (z. B. Pharmacia Biotech) durchgeführt werden können.
V. Antikörper gegen IRAK-4-Familienmitglieder
In zahlreichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Antikörper verwendet, die spezifisch an IRAK-4-Polypeptide binden. Solche Antikörper haben zahlreiche Anwendungen einschließlich der Modulation der IRAK-4-Aktivität und für Immunoassays zum Nachweis von IRAK-4 und Varianten, Derivaten, Fragmenten usw. von IRAK-4. Immunoassays können verwendet werden, um IRAK-4-Polypeptide qualitativ oder quantitativ zu analysieren. Eine allgemeine Übersicht der anwendbaren Technologie ist in Harlow & Lane, Antibodies: A Laborstory Manual (1988) zu finden.
Verfahren zur Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper, die spezifisch mit IRAK-4-Polypeptiden reagieren, sind Fachleuten bekannt (siehe z. B. Coligan, Current Protocols in Immunology (1991), Harlow & Lane, oben, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Ed. 1986), und Kohler & Milstein, Nature 256: 495–497 (1975)). Solche Verfahren umfassen die Herstellung von Antikörpern durch Selektion von Antikörpern aus Bibliotheken von rekombinanten Anti körpern in Phagen oder ähnlichen Vektoren ebenso wie die Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper durch Immunisierung von Kaninchen oder Mäusen (siehe z. B. Huse et al., Science 246: 1275–1281 (1989), Ward et al., Nature 341: 544–546 (1989)).
Für die Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch mit einem IRAK-4-Polypeptid reagieren, kann eine Vielzahl von IRAK-4 umfassenden Immunogenen verwendet werden. Beispielsweise wird ein rekombinantes IRAK-4-Protein oder ein antigenes Fragment davon, wie hierin beschrieben, isoliert. Ein rekombinantes Protein kann in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen, wie oben beschrieben, exprimiert werden und, wie oben allgemein beschrieben, gereinigt werden. Ein rekombinantes Protein ist das bevorzugte Immunogen für die Herstellung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. Alternativ kann ein synthetisches Peptid, das von den hierin offenbarten Sequenzen stammt und mit einem Carrierprotein konjugiert ist, als Immunogen verwendet werden. Ein natürlich vorkommendes Protein kann auch entweder in reiner oder unreiner Form verwendet werden. Das Produkt wird dann in ein Tier injiziert, das Antikörper erzeugen kann. Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper erzeugt werden, für die anschließende Verwendung in Immunoassays zur Messung des Proteins.
Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind Fachleuten bekannt. Ein Inzucht-Mäusestamm (z. B. BALB/C-Mäuse) oder Kaninchen wird mit dem Protein unter Verwendung eines Standard-Adjuvanz, wie etwa Freund-Adjuvanz, und eines Standard-Immunisierungsprotokolls immunisiert. Die Immunreaktion des Tieres auf die Immunogen-Präparation wird durch Entnehmen von Testblut und Bestimmen des Titers der Reaktivität auf das IRAK-4-Polypeptid überwacht. Wenn angemessen hohe Titer eines Antikörpers gegen das Immunogen erhalten werden, wird das Blut aus dem Tier gesammelt und es werden Antiseren. Falls erforderlich, kann zur Anreicherung von Antikörpern, die mit dem Protein reagieren, eine weitere Fraktionierung der Antiseren durchgeführt werden (siehe Harlow & Lande, oben).
Monoklonale Antikörper können durch verschiedene Techniken erhalten werden, die Fachleuten vertraut sind. Kurz gesagt werden Milzzellen aus einem mit einem gewünschten Antigen immunisierten Tier immortalisiert, normalerweise durch Fusion mit einer Myelomzelle (siehe Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511–519 (1976)). Alternative Verfahren der Immortalisierung umfassen die Transformation mit Epstein Barr-Virus, Onkogenen oder Retroviren oder andere im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren. Kolonien, die aus einzelnen immortalisierten Zellen entstehen, werden hinsichtlich der Produktion von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität und Affinität für das Antigen durchsucht und die Ausbeute der monoklonalen Antikörper, die durch solche Zellen produziert werden, kann durch verschiedene Techniken erhöht werden, einschließlich der Injektion in die Peritonealhöhe eines vertebraten Wirts. Alternativ kann man durch Screening einer DNA-Bibliothek von humanen B-Zellen nach dem von Huse et al., Science 246: 1275–1281 (1989) skizzierten allgemeinen Protokoll DNA-Sequenzen isolieren, die einen monoklonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon kodieren.
Monoklonale Antikörper und polyklonale Seren werden gesammelt und in einem Immunoassay titriert, beispielsweise einem Festphasen-Immunoassay, wobei das Immunogen an einem festen Träger immobilisiert ist. Normalerweise werden polyklonale Antiseren mit einem Titer von 10⁴ oder mehr ausgewählt und im Hinblick auf ihre Kreuzreaktivität gegen Nicht-IRAK-4-Proteine oder sogar verwandte Proteine von anderen Organismen untersucht, unter Verwendung eines kompetitiven Bindungs-Immunoassays. Spezifische polyklonale Antiseren und monoklonale Antikörper binden normalerweise mit einem K_d von mindestens etwa 0,1 mM, normalerweise mindestens etwa 1 μM, optional mindestens etwa 0,1 μM oder besser und optional 0,01 μM oder besser.
Unter Verwendung von IRAK-4-spezifischen Antikörpern können einzelne IRAK-4-Proteine durch eine Vielzahl von Immunoassay-Verfahren nachgewiesen werden. Für einen Überblick über immunologische und Immunoassay-Verfahren siehe Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr Editoren, 7. Auflage 1991). Außerdem können die erfindungsgemäßen Immunoassays in einer beliebigen von mehreren Konfigurationen durchgeführt werden, die ausführlich in Enzyme Immunoassay (Maggio, Ed., 1980) und Harlow & Lane, oben, rezensiert werden.
A. Immunologische Bindungsassays
IRAK-4-Proteine können unter Verwendung einer Vielzahl von allgemein bekannten immunologischen Bindungsassays (siehe z. B. U. S. Patent Nr. 4,366,241 , 4,376,110 , 4,517,288 und 4,837,168 ) nachgewiesen und/oder quantifiziert werden. Für einen Überblick über allgemeine Immunoassays siehe auch Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, Vol. 37 (Asai, Ed. 1993), Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, Eds., 7. Auflage, 1991). Bei immunologischen Bindungsassays (oder Immunoassays) wird normalerweise ein Antikörper verwendet, der spezifisch an ein Protein oder Antigen der Wahl (in diesem Fall ein IRAK-4-Protein oder eine antigene Subsequenz davon) bindet. Der Antikörper (z. B. Anti-IRAK-4) kann durch ein beliebiges einer Vielzahl von Mitteln, die Fachleuten allgemein bekannt sind und hierin oben beschrieben werden, hergestellt werden.
Bei Immunoassays wird oft auch ein Markierungsmittel verwendet, um spezifisch an den durch Antikörper und Antigen gebildeten Komplex zu binden und diesen zu markieren. Das Markierungsmittel kann selbst eine der Einheiten des Antikörper/Antigen-Komplexes darstellen. Somit kann das Markierungsmittel ein markiertes IRAK-4-Polypeptid oder ein markierter Anti-IRAK-4-Antikörper sein. Alternativ kann das Markierungsmittel ein dritter Anteil sein, wie etwa ein sekundärer Antikörper, der spezifisch an den Antikörper/IRAK-4-Komplex bindet (ein sekundärer Antikörper ist normalerweise spezifisch für Antikörper der Spezies, von der der erste Antikörper stammt). Als Markierungsmittel können auch andere Proteine verwendet werden, die spezifisch an konstante Immunglobulinregionen binden, wie etwa Protein A oder Protein G. Diese Proteine zeigen eine starke, nicht immunogene Reaktivität mit konstanten Immunglobulinregionen einer Vielzahl von Spezies (siehe z. B. Kronval et al., J. Immunol. 111: 1401–1406 (1973), Akerstrom et al., J. Immunol. 135: 2589–2542 (1985)). Das Markierungsmittel kann mit einem nachweisbaren Anteil, wie etwa Biotin, modifiziert werden, an den ein anderes Molekül spezifisch binden kann, wie etwa Streptavidin. Eine Vielzahl von nachweisbaren Anteilen sind Fachleuten allgemein bekannt.
Während der Assays können nach jeder Kombination von Reagenzien Inkubations- und/oder Waschschritte erforderlich sein. Inkubationsschritte können von etwa 5 Sekunden bis zu mehreren Stunden variieren, optional von etwa 5 Minuten bis etwa 24 Stunden. Jedoch hängt die Inkubationszeit vom Format des Assays, vom Antigen, vom Volumen der Lösung, von den Konzentrationen und dergleichen ab. Normalerweise werden die Assays bei Umgebungstemperatur durchgeführt, obwohl sie über einen Temperaturbereich, wie etwa 10°C bis 40°C durchgeführt werden können.
1. Nicht-kompetitive Assayformate
Immunoassays zum Nachweis eines IRAK-4-Proteins in einer Probe können entweder kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein. Nicht-kompetitive Immunoassays sind Assays, worin die Menge des Antigens direkt gemessen wird. In einem bevorzugten "Sandwich"-Assay können beispielsweise die Anti-IRAK-4-Antikörper direkt an ein festes Substrat gebunden werden, auf dem sie immobilisiert werden. Diese immobilisierten Antikörper fangen dann die in der Testprobe vorliegenden IRAK-4-Proteine ein. Das IRAK-4-Protein wird somit immobilisiert, wird dann durch ein Markierungsmittel gebunden, wie etwa einen zweiten IRAK-4-Antikörper mit einer Markierung. Alternativ kann dem zweiten Antikörper eine Markierung fehlen, aber er kann wiederum durch einen markierten dritten Antikörper gebunden sein, der für Antikörper der Spezies spezifisch ist, aus welcher der zweite Antikörper stammt. Der zweite oder dritte Antikörper wird normalerweise mit einem nachweisbaren Anteil, wie etwa Biotin, modifiziert, an den ein anderes Molekül spezifisch bindet, z. B. Streptavidin, um einen nachweisbaren Anteil bereitzustellen.
2. Kompetitive Assayformate
Bei kompetitiven Assays wird die in der Probe vorliegende Menge des IRAK-4-Proteins indirekt gemessen, durch Messung der Menge eines bekannten, zugegebenen (exogenen) IRAK-4-Proteins, das von einem Anti-IRAK-4-Antikörper durch das unbekannte IRAK-4-Protein, das in der Probe vorliegt, ersetzt (verdrängt) wird. In einem kompetitiven Assay wird eine bekannte Menge IRAK-4-Protein zu einer Probe zugegeben und die Probe wird dann mit einem Antikörper kontaktiert, der spezifisch an das IRAK-4-Protein bindet. Die Menge an exogenem, an den Antikörper gebundenem IRAK-4-Protein ist umgekehrt proportional zur Konzentration des in der Probe vorliegenden IRAK-4-Proteins. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper an ein festes Substrat immobilisiert. Die Menge des an den Antikörper gebundenen IRAK-4-Proteins kann entweder durch Messung der Menge des IRAK-4-Proteins bestimmt werden, die in einem IRAK-4/Antikörper-Komplex vorliegt, oder alternativ durch Messung der Menge des restlichen, nicht-komplexierten Proteins. Die Menge an IRAK-4-Protein kann durch Bereitstellen eines markierten IRAK-4-Moleküls nachgewiesen werden.
Ein anderer bevorzugter kompetitiver Assay ist ein Hapten-Inhibierungsassay. In diesem Assay ist das bekannte IRAK-4-Protein an ein festes Substrat immobilisiert. Eine bekannte Menge eines Anti-IRAK-4-Antikörpers wird zu der Probe zugegeben und die Probe wird dann mit dem immobilisierten IRAK-4 kontaktiert. Die Menge an Anti-IRAK-4-Antikörper, die an das bekannte immobilisierte IRAK-4-Protein gebunden ist, ist umgekehrt proportional zur Menge an IRAK-4-Protein, das in der Probe vorliegt. Wiederum kann die Menge an immobilisiertem Antikörper durch Nachweis entweder des immobilisierten Anteils des Antikörpers oder des Anteils an Antikörper nachgewiesen werden, der in Lösung verbleibt. Der Nachweis kann direkt erfolgen, wenn der Antikörper markiert ist, oder indirekt durch die nachfolgende Zugabe eines markierten Anteils, der spezifisch, wie oben beschrieben, an den Antikörper bindet.
3. Bestimmungen der Kreuzreaktivität
Immunoassays im kompetitiven Bindungsformat können auch für Bestimmungen der Kreuzreaktivität verwendet werden. Beispielsweise kann ein Protein, das zumindest teilweise durch SEQ ID NO:2 oder 4 kodiert wird, an einen festen Träger immobilisiert werden. Es werden Proteine (z. B. IRAK-4-Proteine und Homologe) zu dem Assay zugegeben, die hinsichtlich der Bindung der Antiseren an das immobilisierte Antigen konkurrieren. Die Fähigkeit der zugegebenen Proteine, hinsichtlich der Bindung der Antiseren an das immobilisierte Protein zu konkurrieren, wird mit der Fähigkeit des IRAK-4-Polypeptids verglichen, das durch SEQ ID NO:2 oder 4 kodiert wird, mit sich selbst zu konkurrieren. Die prozentuale Kreuzreaktivität der obigen Proteine wird unter Verwendung von Standardberechnungen ermittelt. Diejenigen Antiseren mit weniger als 10% Kreuzreaktivität mit jedem der oben aufgelisteten zugegebenen Proteine werden ausgewählt und vereinigt. Die kreuzreagierenden Antikörper werden optional aus den vereinigten Antiseren entfernt, durch Immunabsorption mit den zugegebenen in Betracht gezogenen Proteinen, z. B. entfernt verwandte Homologe.
Die immunabsorbierten und vereinigten Antiseren werden dann in einem kompetitiven Bindungs-Immunoassay, wie oben beschrieben, verwendet, um ein zweites Protein, von dem angenommen wird, dass es möglicherweise ein Allel oder eine polymorphe Variante eines IRAK-4-Proteins ist, mit dem immunogenen Protein (d. h. IRAK-Protein kodiert durch SEQ ID NO:2 oder 4) zu vergleichen. Um diesen Vergleich durchzuführen, werden die zwei Proteine jeweils in einem weiten Konzentrationsbereich untersucht, und es wird die Menge jedes Proteins bestimmt, die für eine 50%ige Inhibierung der Bindung der Antiseren an das immobilisierte Protein erforderlich ist. Wenn die Menge des zweiten Proteins, die erforderlich ist, um 50% der Bindung zu inhibieren, weniger als das 10-fache der Menge des durch SEQ ID NO:2 oder 4 kodierten Proteins beträgt, die erforderlich ist, um 50% der Bindung zu inhibieren, dann wird gesagt, dass das zweite Protein spezifisch an die gegen ein IRAK-4-Immunogen erzeugten polyklonalen Antikörper bindet.
Polyklonale Antikörper aus einer bestimmten Spezies, die spezifisch an ein IRAK-4-Protein binden, können durch Entfernen kreuzreaktiver Antikörper hergestellt werden, unter Verwendung von IRAK-4-Homologen. Beispielsweise können spezifische Antikörper für humanes IRAK-4 (SEQ ID NO:1) durch Abziehen von Antikörpern hergestellt werden, die mit Maus-IRAK-4 (SEQ ID NO:3) kreuzreagieren. Auf analoge Art und Weise können Antikörper in einem Organismus mit mehreren IRAK-4-Genen erhalten werden, die für ein bestimmtes IRAK-4-Protein spezifisch sind.
4. Andere Assayformate
Eine Western Blot(Immunoblot)-Analyse wird verwendet, um die Gegenwart eines IRAK-4-Proteins in einer Probe nachzuweisen und zu quantifizieren. Das Verfahren umfasst im Allgemeinen das Auftrennen von Probenproteinen durch Gelelektrophorese auf Basis des Molekulargewichts, Übertragen der aufgetrennten Proteine auf einen geeigneten festen Träger (wie etwa einen Nitrocellulosefilter, einen Nylonfilter oder einen derivatisierten Nylonfilter) und Inkubieren der Probe mit den Antikörpern, die spezifisch an das IRAK-4-Protein binden. Die Anti-IRAK-4-Polypeptid-Antikörper binden spezifisch an das IRAK-4-Polypeptid auf dem festen Träger. Diese Antikörper können direkt markiert sein oder alternativ durch die Verwendung von markierten Antikörpern (z. B. markierte Schaf-Anti-Maus-Antikörper), die spezifisch an die Anti-IRAK-4-Antikörper binden, anschließend nachgewiesen werden.
Andere Assayformate umfassen Liposomen-Immunoassays (LIA), bei denen Liposomen verwendet werden, die so gestaltet sind, dass sie spezifische Moleküle (z. B. Antikörper) binden und verkapselte Reagenzien oder Marker freisetzen. Die freigesetzten Chemikalien werden dann nach Standardverfahren nachgewiesen (siehe Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34–41 (1986)).
5. Verringerung der unspezifischen Bindung
Ein Fachmann erkennt, dass es oft erwünscht ist, die nicht-spezifische Bindung in Immunoassays zu minimieren. Insbesondere, wenn der Assay ein an ein festes Substrat immobilisiertes Antigen oder einen Antikörper einbezieht, ist es wünschenswert, das Ausmaß der unspezifischen Bindung an das Substrat zu minimieren. Mittel zur Verringerung einer solchen unspezifischen Bindung sind Fachleuten allgemein bekannt. Normalerweise beeinhaltet dieses Verfahren die Beschichtung des Substrats mit einer proteinartigen Zusammensetzung. Insbesondere sind Proteinzusammensetzungen, wie etwa Rinderserumalbumin (BSA), fettfreie Pulvermilch und Gelatine weit verbreitet, wobei Milchpulver am meisten bevorzugt ist.
6. Markierungen
Die bestimmte Markierung oder nachweisbare Gruppe, die in dem Assay verwendet wird, ist kein entscheidender Aspekt der Erfindung, solange die spezifische Bindung des in dem Assay verwendeten Antikörpers nicht signifikant gestört wird. Die nachweisbare Gruppe kann ein beliebiges Material mit einer nachweisbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft sein. Solche nachweisbaren Markierungen sind auf dem Gebiet von Immunoassays gut entwickelt und im Allgemeinen kann nahezu jede Markierung, die bei solchen Verfahren verwendbar ist, bei der vorliegenden Erfindung angewandt werden. So ist eine Markierung eine beliebige Zusammensetzung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Möglichkeiten nachweisbar ist. Bei der vorliegenden Erfindung verwendbare Markierungen umfassen magnetische Beads (z. B. DYNABEADS^TM), Fluoreszenzfarbstoffe (z. B. Fluoresceinisothiocyanat, Texas Rot, Rhodamin und dergleichen), Radiomarkierungen (z. B. ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³²P), Enzyme (z. B. Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und andere, die gewöhnlich in einem ELISA verwendet werden) und colorimetrische Markierungen, wie etwa kolloidales Gold oder gefärbtes Glas oder Plastikbeads (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Latex usw.).
Die Markierung kann gemäß den im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren direkt oder indirekt mit dem gewünschten Bestandteil des Assays gekoppelt werden. Wie oben angegeben, kann eine breite Vielzahl von Markierungen angewandt werden, wobei die Wahl der Markierung von der erforderlichen Sensitivität, der Leichtigkeit der Konjugation mit der Verbindung, den Anforderungen an die Stabilität, den verfügbaren Instrumenten und den Auflagen für die Entsorgung abhängig ist.
Nicht-radioaktive Markierungen werden oft durch indirekte Mittel angeheftet. Im Allgemeinen wird ein Ligandenmolekül (z. B. Biotin) kovalent mit dem Molekül verbunden. Der Ligand bindet dann an ein anderes Molekül (z. B. Streptavidin), das entweder inhärent nachweisbar oder kovalent mit einem Signalsystem verbunden ist, wie etwa einem nachweisbaren Enzym, einer fluoreszenten Verbindung oder einer chemilumineszenten Verbindung. Die Liganden und ihre Ziele können in einer beliebigen geeigneten Kombination mit Antikörpern verwendet werden, die ein IRAK-4-Protein erkennen, oder mit sekundären Antikörpern, die Anti-IRAK-4 erkennen.
Die Moleküle können auch direkt mit signalerzeugenden Verbindungen konjugiert werden, z. B. durch Konjugation mit einem Enzym oder Fluorophor. Enzyme, die als Markierungen von Interesse sind, sind in erster Linie Hydrolasen, insbesondere Phosphatasen, Esterasen und Glycosidasen oder Oxidasen, insbesondere Peroxidasen. Fluoreszente Verbindungen umfassen Fluorescein und Derivate davon, Rhodamin und Derivate davon, Dansyl, Umbelliferon usw. Chemilumineszente Verbindungen umfassen Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazindione, z. B. Luminol. Für einen Überblick über verschiedene Markierungs- oder signalerzeugende Systeme, die verwendet werden können, siehe z. B. U. S. Patent Nr. 4,391,904 .
Möglichkeiten zum Nachweis von Markierungen sind Fachleuten allgemein bekannt. Wenn somit beispielsweise die Markierung eine radioaktive Markierung ist, umfassen Mittel zum Nachweis einen Szintillationszähler oder einen photographischen Film wie bei einer Autoradiographie. Wenn die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist, kann sie durch Anregung des Fluorochroms mit der geeigneten Wellenlänge an Licht und Nachweis der sich ergebenden Fluoreszenz nachgewiesen werden. Die Fluoreszenz kann visuell nachgewiesen werden, mittels eines photographischen Films oder durch die Verwendung eines elektronischen Detektors, wie etwa ladungsgekoppelten Speichern (CCD) oder Photovervielfacher und dergleichen. Entsprechend können enzymatische Markierungen durch Bereitstellen der geeigneten Substrate für das Enzym und Nachweisen des resultierenden Reaktionsprodukts nachgewiesen werden. Schließlich können einfache kolorimetrische Markierungen einfach durch Beobachten der mit der Markierung verbundenem Farbe nachgewiesen werden. So erscheint in verschiedenen Dipstick-Assays konjugiertes Gold oft pink, während verschiedene konjugierte Beads als Farbe des Beads erscheinen.
Einige Assayformate erfordern keine Verwendung von markierten Bestandteilen. Beispielsweise können Agglutinierungs-Assays verwendet werden, um das Vorliegen der Zielantikörper nachzuweisen. In diesem Fall werden mit Antigen beschichtete Partikel durch Proben mit dem Zielantikörpern agglutiniert. In diesem Format benötigt keiner der Bestandteile eine Markierung und das Vorliegen des Zielantikörpers wird durch einfache visuelle Überprüfung nachgewiesen.
VI. Modulation der IRAK-4-Aktivität in Zellen.
A. Assays für Modulatoren von IRAK-4-Proteinen
In zahlreichen Ausführungsformen dieser Erfindung wird das Niveau der IRAK-4-Aktivität in einer Zelle moduliert durch Verabreichung eines beliebigen aus einer großen Anzahl von IRAK-4-modulierenden Molekülen, z. B. Polypeptiden, Antikörpern, Aminosäuren, Nukleotiden, Lipiden, Kohlehydraten oder beliebigen organischen oder anorganischen Molekülen an die Zelle in vivo oder in vitro. Solche IRAK-4-Modulatoren sind bei der Behandlung einer beliebigen aus einer großen Anzahl von Entzündungskrankheiten verwendbar.
Um Moleküle zu identifizieren, die IRAK-4 modulieren können, werden Assays durchgeführt, um den Effekt von verschiedenen Verbindungen auf die IRAK-4-Aktivität in einer Zelle nachzuweisen. Solche Assays können die Identifizierung von Verbindungen einbeziehen, die mit IRAK-4-Proteinen Wechselwirken, entweder physikalisch oder genetisch, und können so auf ein beliebiges aus einer Anzahl von Standardverfahren zurückgreifen, um physikalische oder genetische Wechselwirkungen zwischen Verbindungen nachzuweisen. Solche Assays können auch die Identifizierung von Verbindungen einbeziehen, welche die IRAK-4-Expression, Aktivität oder andere Eigenschaften beeinflussen, wie etwa die Phosphorylierung oder die Fähigkeit, an andere Proteine zu binden. Solche Assays können auch den Nachweis der IRAK-4-Aktivität in einer Zelle einbeziehen, entweder in vitro oder in vivo, und können so den Nachweis beispielsweise der NF-κB-Aktivierung unter Verwendung eines beliebigen Standardassays einbeziehen, z. B. durch Messen von IκB-Niveaus, der NF-κB-Kernlokalisation oder der Expression von natürlichen oder rekombinanten NF-κB-Zielgenen. Solche Assays auf Zellbasis können in einem beliebigen Zelltyp durchgeführt werden, z. B. in einer Zelle, die von Natur aus IRAK-4 exprimiert, oder in einer kultivierten Zelle, die aufgrund einer rekombinanten Expression IRAK-4 erzeugt.
B. Assays für Verbindungen, die mit IRAK-4 Wechselwirken In bestimmten Ausführungsformen werden Assays durchgeführt, um Moleküle zu identifizieren, die physikalisch oder genetisch mit IRAK-4-Proteinen Wechselwirken. Solche Moleküle können eine beliebige Molekülart darstellen, einschließlich Polypeptiden, Polynukleotiden, Aminosäuren, Nukleotiden, Kohlehydraten, Lipiden, und beliebigen anderen organischen oder anorganischen Molekülen. Solche Moleküle können Moleküle darstellen, die normalerweise mit IRAK-4 unter Beeinflussung der IL-1/Toill-Rezeptorsignaltransduktion Wechselwirken, oder sie können synthetisch sein oder andere Moleküle sein, die mit IRAK-4 Wechselwirken können und die potenziell zur Modulation der IRAK-4-Aktivität in Zellen verwendet werden können, oder als Leitverbindungen zur Identifizierung von Molekülklassen verwendet werden können, die mit IRAK-4 Wechselwirken können und/oder IRAK-4 modulieren können. Solche Assays können physikalische Bindungsassays darstellen, wie etwa Affinitätschromatographie, Immunpräzipitation, Two-Hybrid-Screens oder andere Bindungsassays, oder sie können genetische Assasys wie unten beschrieben darstellen.
Bei jedem der hierin beschriebenen Bindungsassays oder funktionellen Assays kann ein beliebiges IRAK-4-Protein oder ein beliebiges Derivat, eine Variation, ein Homologes oder ein Fragment eines IRAK-4-Proteins in vivo oder in vitro verwendet werden. Bevorzugt ist das IRAK-4-Protein mindestens etwa zu 70% identisch mit SEQ ID NO:1 oder 3. In zahlreichen Ausführungsformen wird ein Fragment eines IRAK-4-Proteins verwendet. Beispielsweise kann ein Fragment verwendet werden, das nur eine N-terminale Todes-Domäne oder eine zentrale Kinase-Domäne enthält. Solche Fragmente können alleine, in Kombination mit anderen IRAK-4-Fragmenten oder in Kombination mit Sequenzen von heterologen Proteinen verwendet werden, z. B. können die Fragmente mit einem heterologen Polypeptid unter Bildung eines chimären Polypeptids fusioniert werden.
1. Assays für physikalische Wechselwirkungen
Verbindungen, die mit IRAK-4-Proteinen Wechselwirken, können auf Basis der Fähigkeit isoliert werden, spezifisch an ein IRAK-4-Protein oder Fragment davon zu binden. In zahlreichen Ausführungsformen wird das IRAK-4-Protein oder Proteinfragment mit einem festen Träger verbunden. In einer Ausführungsform werden unter Verwendung des IRAK-4-Polypeptids Affinitätssäulen hergestellt, und es werden physikalisch wechselwirkende Moleküle identifiziert. Es ist für einen Fachmann ersichtlich, dass chromatographische Verfahren in jedem beliebigen Maßstab und unter Verwendung einer Apparatur von vielen unterschiedlichen Herstellern (z. B. Pharmacia Biotech) durchgeführt werden können. Außerdem können Moleküle, die mit IRAK-4-Proteinen in vivo Wechselwirken, durch Co-Immunpräzipitation oder andere Verfahren identifiziert werden, z. B. durch Immunpräzipitation von IRAK-4-Proteinen unter Verwendung von Anti-IRAK-4-Antikörpern aus einer Zelle oder einem Zellextrakt und Identifizieren von Verbindungen, z. B. Proteinen, die zusammen mit dem IRAK-4-Protein präzipitiert werden. Solche Verfahren sind Fachleuten allgemein bekannt und werden z. B. in Ausubel et al., Sambrook et al., Harlow & Lane, oben, gelehrt.
Es können auch Two-Hybrid-Screens verwendet werden, um Polypeptide zu identifizieren, die in vivo mit einem IRAK-4-Polypeptid oder einem Fragment davon Wechselwirken (Fields et al., Nature 340: 245–246 (1989)). Solche Screens umfassen zwei getrennte molekulare Domänen eines Transkriptionsfaktorproteins, z. B. eine DNA-Bindungs-Domäne und eine Transkriptions-Aktivierungs-Domäne, die in einer Zelle als zwei separate Polypeptide produziert werden, wobei jedes davon auch eines von zwei möglichen Bindungspolypeptiden umfasst. Wenn die zwei möglichen Bindungspolypeptide tatsächlich in vivo Wechselwirken, dann sind die DNA-Bindungs-Domäne und die Transkriptions-Aktivierungs-Domäne des Transkriptionsfaktors vereinigt, wobei die Expression eines Zielgens in der Zelle erreicht wird. Das Zielgen kodiert normalerweise ein leicht nachweisbares Genprodukt, z. B. β-Galactosidase, GFP oder Luciferase, das unter Verwendung von Standardverfahren nachgewiesen werden kann. Bei der vorliegenden Erfindung wird ein IRAK-4-Polypeptid mit einer der zwei Domänen des Transkriptionsfaktors fusioniert und die möglichen IRAK-4-bindenden Polypeptide (z. B. durch eine cDNA-Bibliothek kodiert) werden mit der anderen Domäne fusioniert. Solche Verfahren sind Fachleuten allgemein bekannt und werden beispielsweise in Ausubel et al, oben, gelehrt.
C. Assays für die IRAK-4-Proteinaktivität
IRAK-4-Gene und ihre Allele und polymorphen Varianten kodieren Proteinkinasen, welche die IL-1/Toll-Rezeptorsignaltransduktion begünstigen. Entsprechend kann die Aktivität von IRAK-4-Polypeptiden unter Verwendung einer Vielzahl von in vitro- und in vivo-Assays beurteilt werden, um die funktionellen, chemischen und physikalischen Effekte zu beurteilen, z. B. direktes Messen der Kinasesaktivität von IRAK-4 unter Verwendung von in vitro-Kinaseassays, z. B. unter Verwendung von IRAK-1 als ein Substrat, Messen der Expression oder Aktivität von Effektoren stromabwärts, wie etwa NF-κB oder TRAF-6, Messen der Bindung von IRAK-4 an heterologe Proteine, z. B. TRAF-6 oder IRAK-1, oder an andere Moleküle (z. B. radioaktive Bindung), Messen der Menge des IRAK-4-Proteins und/oder der RNA, oder Messen von anderen Aspekten der IRAK-4-Polypeptide, z. B. Phosphorylierungsniveaus, Transkriptionsniveaus und dergleichen. Solche Assays können verwendet werden, um sowohl Aktivatoren als auch Inhibitoren von IRAK-4-Proteinen zu untersuchen. Modulatoren können auch genetisch veränderte Versionen von IRAK-4-Proteinen sein, z. B. dominant negative Formen von IRAK-4 oder von Proteinen, die mit IRAK-4 Wechselwirken, z. B. IL-1R1, MyD88 und TRAF-6. Solche Modulatoren der Aktivität sind beispielsweise bei vielen diagnostischen und therapeutischen Applikationen verwendbar.
Das IRAK-4-Protein des Assays ist normalerweise ein rekombinantes oder natürlich vorkommendes Polypeptid mit einer Sequenz von SEQ ID NO:1 oder 3, oder konservativ modifizierte Varianten davon. Alternativ stammt das IRAK-4-Protein des Assays von einem Eukaryonten und umfasst eine Aminosäure-Sequenz mit einer Aminosäure-Sequenzidentität mit SEQ ID NO:1 oder 3. Im Allgemeinen beträgt die Aminosäure-Sequenzidentität mindestens 60%, optional mindestens 70% bis 85%, optional mindestens 90–95%. Optional umfassen die Polypeptide der Assays eine Domäne eines IRAK-4-Proteins, wie etwa eine N-terminale Todes-Domäne oder eine zentrale Kinase-Domäne. In bestimmten Ausführungsformen ist eine Domäne eines IRAK-4-Proteins, z. B. eine N-terminale Todes-Domäne oder eine zentrale Kinase-Domäne, an ein festes Substrat gebunden und wird beispielsweise verwendet, um beliebige Moleküle zu isolieren, die daran binden können und/oder deren Aktivität modulieren können. In bestimmten Ausführungsformen wird eine Domäne eines IRAK-4-Polypeptids, z. B. eine N-terminale Domäne, eine C-terminale Domäne, eine extrazelluläre Schleife oder eine oder mehrere Transmembran-Domänen mit einem heterologen Polypeptid unter Bildung eines chimären Polypeptids fusioniert. Solche chimären Polypeptide sind beispielsweise auch in Assays zur Identifizierung von Modulatoren von IRAK-4 verwendbar.
Proben oder Assays, die mit einem möglichen IRAK-4-Proteininhibitor oder -aktivator behandelt werden, werden mit Kontrollproben ohne Testverbindung verglichen, um das Ausmaß der Modulation zu untersuchen. Den Kontrollproben (nicht mit Aktivatoren oder Inhibitoren behandelt) wird ein relativer IRAK-4-Aktivitätswert von 100 zugeordnet. Die Inhibierung eines IRAK-4-Proteins wird erreicht, wenn der Aktivitätswert von IRAK-4 relativ zur Kontrolle etwa 90%, optional 50%, optional 25-0% beträgt. Die Aktivierung eines IRAK-4-Proteins wird erreicht, wenn der IRAK-4-Aktivitätswert relativ zur Kontrolle 110% beträgt, optional 150%, 200–500% oder 1000–2000%.
Die Effekte der Testverbindungen auf die Funktion der Polypeptide kann durch Untersuchen eines beliebigen der oben beschriebenen Parameter gemessen werden. Jede geeignete physiologische Veränderung, welche die IRAK-4-Aktivität beeinflusst, kann verwendet werden, um den Einfluss einer Testverbindung auf die erfindungsgemäßen Polypeptide zu beurteilen. Wenn die funktionellen Folgen unter Verwendung von intakten Zellen oder Tieren bestimmt werden, kann man auch eine Vielzahl von Effekten messen, wie etwa Veränderungen bei der Entzündung von Geweben, wie beispielsweise angezeigt wird durch Schmerzen, Wärme, Rötung, Schwellung, Funktionsverlust, Dilatation von Arteriolen, Kapillaren und Venen, durch erhöhte Permeabilität und Blutfluss, Exsudation von Fluiden einschließlich Plasmaproteinen und Leukozytenmigration in die Stelle der Entzündung.
In einer anderen Ausführungsform können Transkriptionsniveaus gemessen werden, um die Effekte einer Testverbindung auf die IRAK-4-Signaltransduktion zu messen. Eine Wirtszelle mit einem IRAK-4-Protein von Interesse wird mit einer Testverbindung für eine Zeit kontaktiert, die ausreichend ist, um beliebige Interaktionen zu bewirken, und dann wird das Ausmaß der Genexpression gemessen. Die Zeitdauer, um solche Interaktionen zu bewirken, kann empirisch bestimmt werden, wie etwa mittels Durchlaufen eines zeitlichen Ablaufs und Messen des Niveaus der Transkription als eine Funktion der Zeit. Das Ausmaß der Transkription kann unter Verwendung jedes Verfahrens gemessen werden, das Fachleuten als geeignet bekannt ist. Beispielsweise kann die mRNA-Expression des Proteins von Interesse unter Verwendung von Northern Blots nachgewiesen werden, oder durch den Nachweis der Polypeptidprodukte unter Verwendung von Immunoassays. Es kann jedes Polynukleotid verwendet werden, das normalerweise nach einer IRAK-4-Aktivierung exprimiert wird, d. h. jedes Gen mit einer NF-κB-verwandten DNA-Bindungsstelle (siehe z. B. Lenardo et al., Cee 58: 227 (1989), Grilli et al., Int. Rev. Cytol. 143: 1 (1993), Baeuerle et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 141 (1994)). Solche Assays können natürliche Ziele von NF-κB ausnutzen, oder sie können Reportergene verwenden, z. B. Chloramphenicol-Acetyltransferase, Luciferase, β-Galactosidase, GFP und alkalische Phosphatase, wirksam mit einem Promotor mit einer NF-κB-Bindungsstelle verbunden. Weiter kann das Protein von Interesse als ein indirekter Reporter verwendet werden, durch Anheftung an einen zweiten Reporter, wie etwa GFP ("Green Fluorescent Protein") (siehe z. B. Mistili & Spector, Nature Biotechnology 15: 961–964 (1997)).
Das Ausmaß der Transkription wird dann mit dem Ausmaß der Transkription entweder in der gleichen Zelle ohne die Testverbindung verglichen, oder es kann mit dem Ausmaß der Transkription in einer im Wesentlichen identischen Zelle verglichen werden, der das Protein von Interesse fehlt. Eine im Wesentlichen identische Zelle kann von den gleichen Zellen stammen, aus denen die rekombinante Zelle hergestellt wurde, die aber nicht durch das Einbringen von heterologer DNA modifiziert worden sind. Jeder Unterschied im Ausmaß der Transkription zeigt an, dass die Testverbindung auf irgendeine Art und Weise die Aktivität des Proteins von Interesse verändert hat.
D. Modulatoren und Bindungsverbindungen
Die als Modulatoren eines IRAK-4-Proteins untersuchten Verbindungen können beliebige kleine chemische Verbindungen oder eine biologische Einheit sein, wie etwa ein Protein, Zucker, eine Nukleinsäure oder ein Lipid. Alternativ können Modulatoren genetisch veränderte Versionen eines IRAK-4-Gens sein. Normalerweise sind die Testverbindungen kleine chemische Moleküle und Peptide. Es kann im Wesentlichen jede chemische Verbindung als möglicher Modulator oder mögliche Bindungsverbindung in den erfindungsgemäßen Assays verwendet werden, obwohl meistens Verbindungen verwendet werden, die in wässrigen oder organischen (insbesondere auf DMSO basierenden) Lösungen gelöst werden können. Die Assays sind so gestaltet, dass große chemische Bibliotheken durchsucht werden können, durch Automatisieren der Assayschritte und Bereitstellen von Verbindungen von jeder zweckmäßigen Quelle für Assays, die normalerweise parallel durchgeführt werden (z. B. in Mikrotiterformaten auf Mikrotiterplatten in Roboterassays). Es ist selbstverständlich, dass es viele Lieferanten von chemischen Verbindungen gibt, einschließlich Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Schweiz) und dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform beeinhalten die Screeningverfahren mit hohem Durchsatz die Bereitstellung einer kombinatorischen chemischen oder Peptidbibliothek mit einer großen Anzahl von möglichen therapeutischen Verbindungen (mögliche Modulatoren oder Bindungsverbindungen). Solche "kombinatorischen chemischen Bibliotheken" werden dann in einem oder mehreren Assays einem Screening unterzogen, wie hierin beschrieben, um diejenigen Mitglieder der Bibliothek zu identifizieren (insbesondere chemische Spezies oder Subklassen), welche die gewünschte charakteristische Aktivität zeigen. Die so identifizierten Verbindungen können als konventionelle "Leitverbindungen" dienen, oder sie können selbst als mögliche oder tatsächliche Therapeutika verwendet werden.
Eine kombinatorische chemische Bibliothek ist eine Sammlung von unterschiedlichen chemischen Verbindungen, die entweder durch eine chemische Synthese oder eine biologische Synthese erzeugt wurden, durch Kombination einer Anzahl von chemischen "Bildungsblöcken", wie etwa Reagenzien. Beispielsweise wird eine lineare kombinatorische Bibliothek, wie etwa eine Polypeptidbibliothek, durch Kombination einer Gruppe von chemischen Bildungsblöcken (Aminosäuren) mit einer bestimmten Verbindungslänge (d. h. die Anzahl der Aminosäuren in einer Polypeptidverbindung) auf jede mögliche Art und Weise gebildet. Durch eine solche kombinatorische Mischung von chemischen Bildungsblöcken können Millionen von chemischen Verbindungen synthetisiert werden.
Die Herstellung und das Screening von kombinatorischen chemischen Bibliotheken ist Fachleuten allgemein bekannt. Solche kombinatorischen chemischen Bibliotheken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Peptid-Bibliotheken (siehe z. B. U. S. Patent Nr. 5,010,175 , Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487–493 (1991) und Houghton et al., Nature 354: 84–88 (1991)). Es können auch andere Chemien zum Erzeugen von Bibliotheken mit chemischer Vielfalt verwendet werden. Solche Chemien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Peptoide (z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/19735 ), kodierte Peptide (z. B. PCT-Publikation Nr. WO 93/20242 ), zufällige Biooligomere (z. B. PCT-Publikation Nr. WO 92/00091 ), Benzodiazepine (z. B. U. S.-Patent Nr. 5,288,514 ), Diversomere, wie etwa Hydantoine, Benzodiazepine und Dipeptide (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 90: 6909–6913 (1993)), vinyloge Polypeptide (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)), nicht-peptidale Peptidomimetika mit Glucosegerüst (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217–9218 (1992)), analoge organische Synthesen von Bibliotheken von kleinen Verbindungen (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)), Oligocarbamate (Cho et al., Science 261: 1303 (1993)) und/oder Peptidylphosphonate (Campbell et al., J. Org. Chem. 59: 658 (1994)), Nukleinsäure-Bibliotheken (siehe Ausubel, Berger und Sambrook, alle oben), Peptidnukleinsäure-Bibliotheken (siehe z. B. U. S.-Patent Nr. 5,539,083 ), Antikörper-Bibliotheken (siehe z. B. Vaughn et al., Nature Biotechnology 14(3): 309–314 (1996) und PCT/US96/10287 ), Kohlehydratbibliotheken (siehe beispielsweise Lang et al., Science, 274: 1520–1522 (1996) und U. S.-Patent Nr. 5,593,853 ), Bibliotheken von kleinen organischen Molekülen (siehe z. B. Benzodiazepine, Baum C & EN, 18. Jan., Seite 33 (1993), Isoprenoide, U. S.-Patent 5,569,588 , Thiazolidinone und Metathiazanone, U.S.-Patent Nr. 5,549,974 , Pyrrolidine, U. S.-Patent Nr. 5,525,735 und 5,519,134 , Morpholinoverbindungen, U. S.-Patent Nr. 5,506,337 , Benzodiazepine, U. S.-Patent Nr. 5,288,514 und dergleichen).
Vorrichtungen für die Herstellung von kombinatorischen Bibliotheken sind kommerziell erhältlich (siehe z. B. 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Redford, MA). Außerdem sind zahlreiche kombinatorische Bibliotheken selbst kommerziell erhältlich (siehe z. B. ComGenex, Princeton, N. J., Tripos, Inc.; St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).
1. Festphasen- und lösliche Hochdurchsatzassays
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung lösliche Assays bereit, unter Verwendung von Molekülen, wie etwa einer N-terminalen oder C-terminalen Domäne, entweder alleine oder kovalent mit einem heterologen Protein verbunden, unter Bildung eines chimären Moleküls. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Festphase, auf Basis von in vitro-Assays in einem Hochdurchsatzformat bereit, wobei eine Domäne, ein chimäres Molekül, ein IRAK-4-Protein oder eine Zelle oder ein Gewebe, die ein IRAK-4-Protein exprimieren, mit einem Festphasensubstrat verbunden ist.
In den erfindungsgemäßen Hochdurchsatzassays ist es möglich, bis zu mehrere Tausend unterschiedliche Moleküle an einem einzelnen Tag zu durchsuchen. Insbesondere kann jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte verwendet werden, um einen separaten Assay gegen einen ausgewählten möglichen Modulator durchzuführen, oder wenn Effekte der Konzentration oder der Inkubationszeit beobachtet werden sollen, kann jeweils in 5–10 Vertiefungen ein einziger Modulator untersucht werden. So können in einer einzigen Standard-Mikrotiterplatte etwa 100 (z. B. 96) Modulatoren untersucht werden. Wenn Platten mit 1536 Vertiefungen verwendet werden, dann kann man in einer einzigen Platte leicht von etwa 100 bis etwa 1500 unterschiedliche Verbindungen untersuchen. Es ist möglich, mehrere unterschiedliche Platten am Tag zu untersuchen, unter Verwendung der integrierten Systeme der Erfindung sind Assayscreenings für bis zu etwa 6000–20000 unterschiedliche Verbindungen möglich. Kürzlich sind mikrofluide Ansätze zur Manipulation von Reagenzien entwickelt worden.
Das Molekül von Interesse kann direkt oder indirekt über eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung mit dem Festphasenbestandteil verbunden sein, z. B. über ein Tag. Das Tag kann ein beliebiges einer Vielzahl von Bestandteilen darstellen. Im Allgemeinen wird ein Molekül, das mit dem Tag verbunden ist (ein Tag-Bindungsmittel) an einen festen Träger fixiert und das mit einem Tag versehene Molekül von Interesse ist durch Wechselwirkung des Tags und des Tag-Bindungsmittels mit dem festen Träger verbunden.
Es kann eine Vielzahl von Tags und Tag-Bindungsmitteln verwendet werden, auf Basis von bekannten molekularen Wechselwirkungen, die in der Literatur gut beschrieben sind. Wenn ein Tag beispielsweise ein natürliches Bindungsmittel aufweist, beispielsweise Biotin, Protein A oder Protein G, kann es in Konjugation mit geeigneten Tag-Bindungsmitteln (Avidin, Streptavidin, Neutravidin, der Fc-Region eines Immunglobulins usw.) verwendet werden. Antikörper für Moleküle mit natürlichen Bindungsmitteln, wie etwa Biotin, sind genauso allgemein erhältlich wie geeignete Tag-Bindungsmittel, siehe Katalog SIGMA Immunochemicals 1998, SIGMA, St. Louis MO).
Entsprechend kann jede haptenische oder antigene Verbindung in Kombination mit einem geeigneten Antikörper verwendet werden, unter Bildung eines Paares aus Tag/Tag-Bindungsmittel. Tausende spezifischer Antikörper sind kommerziell erhältlich und viele weitere Antikörper werden in der Literatur beschrieben. In einer allgemeinen Konfiguration ist der Tag ein erster Antikörper und das Tag-Bindungsmittel ist ein zweiter Antikörper, der den ersten Antikörper erkennt.
Auch synthetische Polymere, wie etwa Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethylenimine, Polyarylensulfide, Polysiloxane, Polyimidine und Polyacetate, können geeignete Tags oder Tag-Bindungsmittel bilden. Viele andere Paare aus Tag/Tag-Bindungsmittel sind ebenso bei den hierin beschriebenen Assaysystemen verwendbar, wie ein Fachmann bei Durchsicht dieser Offenbarung erkennen wird.
Allgemeine Linker, wie etwa Peptide, Polyether und dergleichen können auch als Tags dienen, und können Polypeptid-Sequenzen, wie etwa Poly-Gly-Sequenzen von zwischen etwa 5 und 200 Aminosäuren enthalten. Solche flexiblen Linker sind Fachleuten bekannt. Beispielsweise sind Poly(ethylenglykol)-Linker von Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama erhältlich. Diese Linker weisen optional Amidbindungen, Sulfhydrylbindungen und heterofunktionelle Bindungen auf.
Tag-Bindungsmittel werden unter Verwendung einer beliebigen aus einer Vielzahl von momentan verfügbaren Verfahren an feste Substrate fixiert. Feste Substrate sind im Allgemeinen derivatisiert oder funktionalisiert durch Exposition des gesamten oder eines Teils des Substrats gegenüber einem chemischen Reagenz, das eine chemische Gruppe an die Oberfläche fixiert, die mit einem Teil des Tag-Bindungsmittels reaktiv ist. Gruppen, die für eine Anheftung eines Teils einer längeren Kette geeignet sind, umfassen beispielsweise Amine, Hydroxyl, Thiol und Carboxylgruppen. Aminoalkylsilane und Hydroxyalkylsilane können verwendet werden, um eine Vielzahl von Oberflächen, wie etwa Glasoberflächen, zu funktionalisieren. Die Konstruktion von solchen Festphasen-Biopolymerarrays ist in der Literatur ausführlich beschrieben (siehe z. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2154 (1963) (worin die Festphasensynthese, beispielsweise von Peiltiden beschrieben wird), Geysen et al., J. Immun. Meth. 102: 259–274 (1987) (worin die Synthese von Festphasenbestandteilen auf Pins beschrieben wird), Frank & Doring, Tetrahedron 44: 60316040 (1988) (worin die Synthese von verschiedenen Peptid-Sequenzen auf Cellulosescheiben beschrieben wird), Fodor et al., Science, 251: 767–777 (1991), Sheldon et al., Clinical Chemistry 39(4): 718–719 (1993), und Kozal et al., Nature Medicine 2 (7): 753759 (1996) (worin jeweils Arrays von Biopolymeren beschrieben werden, die an feste Substrate fixiert sind). Nicht-chemische Ansätze zum Fixieren von Tag-Bindungsmitteln an Substrate umfassen andere bekannte Verfahren, wie etwa Wärme, Vernetzung durch UV-Strahlung und dergleichen.
2. Assays auf Computerbasis
Noch ein anderer Assay für Verbindungen, welche die IRAK-4-Proteinaktivität modulieren, bezieht eine computergestützte Wirkstoffgestaltung ein, worin ein Computersystem verwendet wird, um eine dreidimensionale Struktur eines IRAK-4-Proteins zu erzeugen, basierend auf der Strukturinformation, die durch dessen Aminosäure-Sequenz kodiert wird. Die eingegebene Aminosäure-Sequenz interagiert direkt und aktiv mit einem zuvor etablierten Algorithmus in einem Computerprogramm und ergibt Proteinmodelle mit Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur. Die Modelle der Proteinstruktur werden dann untersucht, um die Regionen der Struktur zu identifizieren, welche die Möglichkeit zur Bindung aufweisen. Diese Regionen werden dann verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die an das Protein binden.
Das dreidimensionale Strukturmodell des Proteins wird durch Eingeben von Proteinaminosäure-Sequenzen von mindestens 10 Aminosäure-Resten oder entsprechenden Nukleinsäure-Sequenzen, die ein IRAK-4-Polypeptid kodieren, in das Computersystem erzeugt. Die Nukleotid-Sequenz, die das Polypeptid kodiert, umfasst bevorzugt SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:4 und konservativ modifizierte Versionen davon. Die Aminosäure-Sequenz, bevorzugt umfassend SEQ ID NO:1 oder 3 oder konservativ modifizierte Versionen davon, stellt die Primärsequenz oder Subsequenz des Proteins dar, das die strukturelle Information des Proteins kodiert. Mindestens 10 Reste der Aminosäure-Sequenz (oder eine Nukleotid-Sequenz, die 10 Aminosäuren kodiert) werden in das Computersystem eingegeben, über Computertastaturen, computerlesbare Substrate, die elektronische Speichermedien (z. B. Magnetdisketten, Bänder, Kassetten und Chips), optische Medien (z. B. CD-ROM), durch Internet-Seiten verbreitete Information umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, und durch RAM. Das dreidimensionale Strukturmodell des Proteins wird dann durch die Wechselwirkung der Aminosäure-Sequenz und des Computersystems unter Verwendung von Software erzeugt, die Fachleuten bekannt ist.
Die Aminosäure-Sequenz stellt eine Primärstruktur dar, welche die für die Bildung der sekundären, tertiären und quartären Struktur des Proteins von Interesse notwendige Information kodiert. Die Software prüft bestimmte Parameter, die durch die Primärsequenz kodiert werden, um das Strukturmodell zu erzeugen. Diese Parameter werden als "Energiezustände" bezeichnet und umfassen in erster Linie elektrostatische Potenziale, hydrophobe Potenziale, für Lösungsmittel zugängliche Oberflächen und Wasserstoffbindung. Sekundäre Energiezustände umfassen van der Waals-Potenziale. Biologische Moleküle bilden die Strukturen, welche die Energiezustände auf kumulative Art und Weise minimieren. Das Computerprogramm verwendet deshalb diese Zustände, die durch die Primärstruktur oder Aminosäure-Sequenz kodiert werden, um das Sekundärstrukturmodell zu erzeugen.
Die Tertiärstruktur des Proteins, kodiert durch die Sekundärstruktur, wird dann auf Basis der Energiezustände der Sekundärstruktur gebildet. An diesem Punkt kann der Anwender weitere Variablen eingeben, etwa, ob das Protein membrangebunden oder löslich ist, die Lokalisierung im Körper und die zelluläre Lokalisierung, z. B. Zytoplasma, Oberfläche oder Nucleus. Diese Variablen werden zusammen mit den Energiezuständen der Sekundärstruktur verwendet, um das Modell der Tertiärstruktur zu bilden. Zum Modellieren der Tertiärstruktur stimmt das Computerprogramm hydrophobe Flächen der Sekundärstruktur mit gleichen und hydrophile Flächen der Sekundärstruktur mit gleichen ab.
Wenn diese Struktur erzeugt worden ist, werden mögliche Regionen der Modulatorbindung durch das Computersystem identifiziert. Dreidimensionale Strukturen für mögliche Modulatoren werden durch Eingeben von Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenzen oder chemischen Formeln von Verbindungen erzeugt, wie oben beschrieben wird. Die dreidimensionale Struktur des möglichen Modulators wird dann mit der des IRAK-4-Proteins verglichen, um Verbindungen zu identifizieren, die an das Protein binden. Die Bindungsaffinität zwischen dem Protein und der Verbindung wird unter Verwendung von Energiezuständen bestimmt, um zu bestimmen, welche Verbindungen eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für eine Bindung mit dem Protein aufweisen.
Computersysteme werden auch verwendet, um ein Screening bezüglich Mutationen, polymorphen Varianten, Allelen und Interspezieshomologen von IRAK-4-Genen durchzuführen. Solche Mutationen können mit Krankheitszuständen oder genetischen Merkmalen assoziiert sein. Wie oben beschrieben, kann auch ein GeneChip^TM und verwandte Technologie verwendet werden, um ein Screening bezüglich Mutationen, polymorphen Varianten, Allelen und Interspezieshomologen durchzuführen. Wenn die Varianten einmal identifiziert sind, können diagnostische Assays verwendet werden, um Patienten mit solchen mutierten Genen zu identifizieren. Die Identifizierung der mutierten IRAK-4-Gene beinhaltet das Eingeben einer ersten Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO:2 oder 4 oder einer ersten Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:1 oder 3, und konservativ modifizierten Versionen davon. Die Sequenz wird, wie oben beschrieben, in das Computersystem eingegeben. Die erste Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenz wird dann mit einer zweiten Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenz verglichen, die im Wesentlichen mit der ersten Sequenz identisch ist. Die zweite Sequenz wird auf die oben beschriebene Art und Weise in das Computersystem eingegeben. Wenn die erste und zweite Sequenz einmal verglichen sind, werden Nukleotid- oder Aminosäure-Unterschiede zwischen den Sequenzen identifiziert. Solche Sequenzen können Allelen-Unterschiede in verschiedenen IRAK-4-Genen und Mutationen darstellen, die mit Krankheitszuständen und genetischen Merkmalen assoziiert sind.
VII. Modulation der IRAK-4-Aktivität/Expression zur Behandlung von Krankheiten oder Störungen
In zahlreichen Ausführungsformen dieser Erfindung wird eine Verbindung, z. B. eine Nukleinsäure, ein Polypeptid oder ein anderes Molekül, einem Patienten in vivo oder ex vivo verabreicht, um eine Veränderung der IRAK-4-Aktivität oder Expression bei dem Patienten zu bewirken. Solche Verbindungen können Nukleinsäuren sein, die IRAK-4-Polypeptide mit voller Länge, beispielsweise wie in SEQ ID NO:1 oder 3 gezeigt, ein beliebiges Derivat, Fragment oder eine Variante davon kodieren, wirksam mit einem Promotor verbunden. Geeignete Nukleinsäuren umfassen auch inhibitorische Sequenzen, wie etwa Antisense- oder Ribozym-Sequenzen, welche beispielsweise in einem Expressionsvektor zugeführt werden können, der wirksam mit einem Promotor verbunden ist, oder welche direkt zugeführt werden können. Es kann auch eine beliebige Nukleinsäure verwendet werden, die ein Polypeptid kodiert, das die Expression von IRAK-4 moduliert. Im Allgemeinen können Nukleinsäuren Zellen unter Verwendung jedes beliebigen aus einer großen Anzahl von Vektoren oder Verfahren zugeführt werden, z. B. durch retrovirale, adenovirale oder adenoassoziierte Virusvektoren, liposomale Formulierungen, Injektion nackter DNA und anderen. Alle diese Verfahren sind Fachleuten allgemein bekannt.
Um die IRAK-4-Aktivität zu modulieren, können einem Patienten auch Proteine verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper verabreicht, der spezifisch an IRAK-4 bindet, insbesondere an eine N-terminale Todes-Domäne oder eine zentrale Kinase-Domäne eines IRAK-4-Polypeptids. Außerdem kann jedes Polypeptid, das mit der IRAK-4-Aktivität wechselwirkt und/oder die IRAK-4-Aktivität moduliert, verwendet werden, z. B. ein Polypepitd, das unter Verwendung der derzeit beschriebenen Assays identifiziert wird, oder eine beliebige dominant negative Form von IRAK-4 oder eines mit IRAK-4 wechselwirkenden Proteins, z. B. IL-1RI, MyD88, TRAF6 usw. Zusätzlich können Polypeptide verwendet werden, welche die IRAK-4-Expression beeinflussen.
Weiter kann eine beliebige Verbindung verwendet werden, von welcher herausgefunden wird oder welche so gestaltet ist, dass sie mit der Aktivität von IRAK-4 wechselwirkt und/oder die Aktivität von IRAK-4 moduliert. Beispielsweise kann jede Verbindung, von welcher unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren herausgefunden wird, dass sie an IRAK-4 bindet oder die Aktivität von IRAK-4 moduliert, verwendet werden.
Jedes der oben beschriebenen Moleküle kann verwendet werden, um die Expression oder Aktivität von IRAK-4 zu erhöhen oder zu verringern, oder um die Eigenschaften und/oder das Verhalten von IRAK-4-Polypeptiden oder Polynukleotiden zu beeinflussen, beispielsweise die Stabilität, Phosphorylierung, Kinase-Aktivität, Wechselwirkungen mit anderen Proteinen usw. Die vorliegenden Verbindungen können somit verwendet werden, um jede beliebige aus einer Vielzahl von Krankheiten zu behandeln, einschließlich, aber nicht beschränkt auf (a) Lungenkrankheiten und Krankheiten der Atemwege einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Adult Respiratory Disease Syndrom (ARDS), chronisch obstruktive Lungenkrankheit (COPD), Lungenfibrose, interstitiale Lungenkrankheit, Asthma, chronischen Husten und allergische Rhinitis, b) Transplantation, c) die Autoimmunkrankheiten einschließlich, aber nicht beschränkt auf rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematodes, multipler Sklerose und Diabetes (z. B. Typ-1-Diabetes mellitus), d) Krebs einschließlich, aber nicht beschränkt auf feste Tumoren, Hautkrebs und Lymphom, e) kardio-vaskulärer Krankheiten einschließlich, aber nicht beschränkt auf Schlaganfall und Arteriosklerose, f) Krankheiten des zentralen Nervensystems einschließlich, aber nicht beschränkt auf neurodegenerative Krankheiten, g) nicht-CD14 vermittelte Sepsis, h) Osteoarthritis, i) Osteoporose, j) Psoriasis und Krankheiten der Haut einschließlich, aber nicht beschränkt auf Ausschlag und Kontakt- und atopische Dermatitis, k) entzündliche Darmkrankheit (einschließlich, aber nicht beschränkt auf Crohn'sche Krankheit und Colitis ulcerosa), l) Behcet-Syndrom, m) Spondylitis ankylosans, n) Sarcoidosis, o) Gicht, p) ophthalmische Krankheiten und Störungen und h) CD14 vermittelte Sepsis.
A. Verabreichung und pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Verabreichung jedes der vorliegenden Moleküle kann durch jeden Weg erreicht werden, der normalerweise für das Einbringen einer Modulatorverbindung in den optimalen Kontakt mit dem zu behandelnden Gewebe verwendet wird. Die Modulatoren werden auf jede geeignete Art und Weise verabreicht, optional mit pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanzen. Es sind geeignete Verfahren zur Verabreichung solcher Modulatoren verfügbar und Fachleuten allgemein bekannt, und obwohl mehr als ein Weg verwendet werden kann, um eine bestimmte Zusammensetzung zu verabreichen, kann ein bestimmter Weg oft eine direktere und effektivere Reaktion bewirken als ein anderer Weg.
Pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe werden teilweise durch die bestimmte, zu verabreichende Zusammensetzung ermittelt, ebenso wie durch das bestimmte Verfahren, das zum Verabreichen der Zusammensetzung verwendet wird. Entsprechend gibt es eine breite Vielzahl von geeigneten Formulierungen von erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen (siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage (1985)).
Die IRAK-4-Modulatoren können alleine oder in Kombination mit anderen geeigneten Bestandteilen in Aerosolformulierungen gebracht werden (d. h. sie können "vernebelt" werden), um über eine Inhalation verabreicht zu werden. Aerosolformulierungen können in unter Druck stehende akzeptable Treibmittel, wie etwa Dichlorfluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen eingebracht werden.
Für eine Verabreichung geeignete Formulierungen umfassen wässrige und nicht-wässrige Lösungen, isotone sterile Lösungen, die Antioxidationsmittel, Puffer, bakteriostatische Mittel und gelöste Stoffe enthalten können, welche die Formulierung isotonisch machen, und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel, Solubilisierungsmittel, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel enthalten können. In der Praxis dieser Erfindung können Zusammensetzungen beispielsweise oral, nasal, topisch, intravenös, intraperitoneal, intravesikal oder intrathekal verabreicht werden. Die Formulierungen der Verbindungen können in verschlossenen Behältern als Einheitsdosis oder Mehrfachdosis bereitgestellt werden, wie etwa in Ampullen und Phiolen. Lösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden. Die Modulatoren können auch als ein Teil einer vorbereiteten Nahrung oder eines Arzneimittels verabreicht werden.
Die einem Patienten zu verabreichende Dosis sollte im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ausreichend sein, um bei dem Patienten mit der Zeit eine nützliche Reaktion zu bewirken. Die Dosis wird durch die Wirksamkeit der bestimmten verwendeten Modulatoren und der Krankheit bzw. Störung des Patienten bestimmt, ebenso wie durch das Körpergewicht oder die Oberfläche der zu behandelnden Region. Die Höhe der Dosis wird auch durch das Vorliegen, die Art und das Ausmaß aller Nebenwirkungen bestimmt, welche die Verabreichung einer bestimmten Verbindung oder eines Vektors in einem bestimmten Patienten begleiten.
Bei der Bestimmung der wirksamen Menge des zu verabreichenden Modulators kann ein Arzt zirkulierende Plasmaspiegel des Modulators, die Toxizität des Modulators und die Bildung von Antikörpern gegen den Modulator bewerten. Im Allgemeinen beträgt das Dosisäquivalent eines Modulators von etwa 1 ng/kg bis zu 10 mg/kg für einen typischen Patienten.
Für eine Verabreichung können die Modulatoren der vorliegenden Erfindung mit einer Rate verabreicht werden, die durch den LD-50-Wert des Modulators und den Nebenwirkungen der Verbindung bei verschiedenen Konzentrationen bestimmt wird, bezüglich der Masse und der allgemeinen Gesundheit des Patienten angewandt. Die Verabreichung kann durch eine einzelne oder geteilte Dosierungen durchgeführt werden.
VIII. Transgene Tiere
Transgene und chimäre nicht-humane Säuger und Verfahren zu deren Erzeugung werden unten beschrieben. Die Säuger sind u. a. für die Untersuchung der Funktion von IRAK-4 in vivo, zur Erzeugung von Modellen für die Untersuchung von Entzündungskrankheiten und Störungen und für die Entwicklung von möglichen Behandlungen für mit IRAK-4 verbundenen Entzündungskrankheiten und Störungen verwendbar.
Es werden transgene und chimäre nicht-humane Säuger erzeugt, die Zellen enthalten, denen mindestens ein funktionales endogenes Allel für IRAK-4 fehlt. Ein "chimäres Tier" enthält einige Zellen, denen das funktionale IRAK-4-Gen von Interesse fehlt, und andere Zellen, die das inaktivierte Gen nicht besitzen. Ein "transgenes Tier" besteht im Gegensatz dazu aus Zellen, die alle die spezifische Modifikation enthalten, die das IRAK-4-Gen inaktiv macht oder auf andere Art verändert. Während ein transgenes Tier normalerweise immer das mutante IRAK-4-Gen an seine Nachkommen übertragen kann, hängt die Fähigkeit eines chimären Tiers zur Übertragung der Mutation davon ab, ob das inaktivierte Gen in den Keimzellen des Tieres vorhanden ist. Die Modifikationen, die das IRAK-4-Gen inaktivieren oder auf andere Art verändern, können beispielsweise Insertionen, Deletionen oder Substitutionen eines oder mehrerer Nukleotide umfassen. Die Modifikationen können die Transkription des Gens selbst, die Translation und/oder Stabilität der resultierenden mRNA beeinträchtigen, oder sie können bewirken, dass das Gen ein inaktives oder auf andere Art verändertes IRAK-4-Polypeptid kodiert, z. B. ein IRAK-4-Polypeptid mit modifizierten Bindungseigenschaften oder modifizierter Kinase-Aktivität.
Die beanspruchten Verfahren sind beim Erzeugen transgener und chimärer Tiere der meisten Wirbeltierspezies verwendbar. Solche Spezies umfassen, sind aber nicht beschränkt auf nicht-humane Säuger, einschließlich Nagetiere wie etwa Mäuse und Ratten, Kaninchen, Schafartige, wie etwa Schafe und Ziegen, Schweineartige wie etwa Schweine, und Rinderartige wie etwa Rinder und Büffel. Verfahren zum Erhalten von transgenen Tieren werden beispielsweise in Puhler, A. et al., Ed., Genetic Engineering of Animals, VCH Publ., 1993, Murphy und Carter, Editoren, Trasngenesis Techniques: Principles and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 18), 1993; und Pinkert, CA, Ed., Transgenic Aminal Technolgy: A Laborstory Handbook, Academic Press, 1994 beschrieben.
In bevorzugten Ausführungsformen werden transgene Mäuse produziert, wie in Thomas et al., (1999) Immunol. 163: 978–84, Kanakaraj et al., (1998) J. Exp. Med. 187: 2073–9, oder Yeh et al., (1997) Immunity 7: 715–725 beschrieben wird.
Normalerweise wird ein modifiziertes IRAK-4-Gen beispielsweise durch homologe Rekombination in embryonale Stammzellen (ES) eingefügt, die von Präimplantationsembryonen erhalten und in vitro kultiviert werden. Siehe z. B. Hooper, ML, Embryonal Stem Cells: Introducing Planned Changes into the Animal Germline (Modern Genetics, v. l.), Int'I. Pub. Distrib., Inc., 1993, Bradley et al. (1984) Nature 309, 255–258). Anschließend wird die transformierte ES-Zelle mit einer Blastozyste aus einem nicht-humanen Tier, beispielsweise einer Maus, kombiniert. Die ES-Zellen kolonisieren den Embryo und bei einigen Embryos bildet sich die Keimbahn des resultierenden chimären Tiers. Siehe Jaenisch, Science 240: 1468–1474 (1988). Alternativ können ES-Zellen oder somatische Zellen, die einen Organismus neu bilden können ("somatische repopulierende Zellen") als eine Quelle von Nuklei für die Transplantation in einen entkernten befruchteten Oozyten verwendet werden, was einen transgenen Säuger ergibt. Siehe z. B. Wilmut et al., Nature 385: 810–813 (1997).
Andere Verfahren zum Erhalten eines transgenen oder chimären Tiers mit einem mutanten IRAK-4-Gen in seinem Genom beinhalten den Kontakt von befruchteten Oozyten mit einem Vektor, der ein Polynukleotid enthält, das ein modifiziertes, beispielsweise ein inaktives IRAK-4-Polypeptid kodiert. Bei solchen Tieren, wie etwa Mäusen, wird die Befruchtung normalerweise in vivo durchgeführt und befruchtete Eizellen werden chirurgisch entfernt. Bei anderen Tieren, insbesondere Rinderartigen, ist es bevorzugt, Eizellen aus lebenden Tieren oder Schlachthaustieren zu entfernen und die Eizellen in vitro zu befruchten. Siehe DeBoer et al., WO 91/08216 . Eine in vitro-Befruchtung ermöglicht, dass die Modikationen in im Wesentlichen synchrone Zellen eingefügt werden.
Befruchtete Oozyten werden normalerweise in vitro kultiviert, bis ein Präimplantationsembryo mit etwa 16–150 Zellen erhalten wird. Das 16-32-Zellstadium eines Embryos wird als Morula beschrieben, wohingegen Präimplantationsembryonen mit mehr als 32 Zellen als Blastozysten bezeichnet werden. Diese Embryonen zeigen normalerweise im 64-Zellstadium die Entwicklung einer Keimhöhle. Das Vorliegen einer gewünschten IRAK-4-Mutation in den Zellen des Embryos kann durch Verfahren nachgewiesen werden, die Fachleuten bekannt sind, z. B. Southern Blotting, PCR, DNA-Sequenzierung und anderen Standardverfahren. Verfahren zum Kultivieren von befruchteten Oozyten bis zum Präimplantationsstadium werden beispielsweise von Gordon et al. (1983) Methods Enzymol. 101: 41, Hogan et al., Manipulation of the Mouse Embryo: A Laborstory Manual, C. S. H. L. N. Y. (1986) (Mausembryo), Hammer aet al., Nature 315: 680 (1985) (Kaninchen- und Schweineembryonen), Gandolfi et al., J. Reprod. Fert. 81: 23–28 (1987), Rexroad et al., J. Amin. Sci. 66: 947–953 (1988) (Schafembryonen) und Eyestone et al., J. Reprod. Fert. 85: 715–720 (1989), Camous et al., J. Reprod. Fert. 72: 779–785 (1984), und Heyman et al., Theriogenology 27: 5968 (1987) (Rinderembryonen) beschrieben. Präimplantationsembryonen können auch für eine Zeit bis zur Implantation eingefroren gelagert werden.
Die Präimplantationsembryonen werden in ein geeignetes weibliches Tier übertragen, was die Geburt eines transgenen oder chimären Tieres ergibt, abhängig vom Entwicklungsstadium, in dem das Transgen integriert wird. Chimäre Säuger können unter Bildung von transgenen Tieren mit echter Keimbahn („true germline") gezüchtet werden. Chimäre Mäuse und transgene Keimbahnmäuse können auch von kommerziellen Quellen bestellt werden (z. B. Deltagen, San Carlos, CA).
Andere Verfahren zum Einbringen von Mutationen in Säugerzellen oder Tieren umfassen Rekombinase-Systeme, die verwendet werden können, um den gesamten oder einen Teil eines Genortes von Interesse zu deletieren. Beispiele für Rekombinase-Systeme umfassen das cre/lox-System des Bakteriophagen P1 (siehe z. B. Gu et al., Science 265: 103–106 (1994), Terry et al., Transgenic Res. 6: 349–356 (1997)) und das ortsspezifische FLP/FRT-Integrationssystem (siehe z. B. Dymecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6191–6196 (1996)). In diesen Systemen werden normalerweise Stellen, die von der bestimmten Rekombinase erkannt werden, in das Genom an einer Position, die den Teil des Gens, der deletiert werden soll, flankiert, eingebracht. Das Einbringen der Rekombinase in die Zellen katalysiert dann eine Rekombination, welche die Polynukleotidsequenz, die von den Rekombinationsstellen flankiert wird, aus dem Genom deletiert. Falls erwünscht, kann man Tiere erhalten, in denen nur bestimmten Zellen das IRAK-4-Gen von Interesse fehlt, z. B. durch Verwendung eines gewebespezifischen Promotors, der die Expression der Rekombinase antreibt. Siehe z. B. Tsien et al., Cell 87: 1317–26 (1996), Brocard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10887–10890 (1996), Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3932–6 (1996), Meyers et al., Nat. Genet. 18: 136–41 (1998)).
Das Vorliegen einer beliebigen Mutation in einem IRAK-4-Gen in einer Zelle oder in einem Tier kann unter Verwendung eines beliebigen, hierin beschriebenen Verfahrens nachgewiesen werden, z. B. Southern Blotting, PCR oder DNA-Sequenzierung. Siehe z. B. Ausubel et al., oben.
IX. Kits
IRAK-4-Gene und deren Homologe sind nützliche Werkzeuge für eine Anzahl von Anwendungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Identifizierung von IL-1-, IL-18- oder LPS-responsiven Zellen, für forensische und Vaterschaftsbestimmungen und für die Behandlung einer beliebigen aus einer großen Anzahl von mit IL-1, IL-18 oder LPS assoziierten Krankheiten, wie etwa Entzündungskrankheiten. IRAK-4-spezifische Reagenzien, die spezifisch mit IRAK-4-Nukleinsäuren hybridisieren, wie etwa IRAK-4-Sonden und Primer, und IRAK-4-spezifische Reagenzien, die spezifisch an ein IRAK-4-Protein binden oder die Aktivität eines IRAK-4-Proteins modulieren, z. B. IRAK-4-Antikörper oder andere Verbindungen, können somit für die Praxis aller hierin beschriebenen Anwendungen in einem Kit bereitgestellt werden.
Nukleinsäureassays für das Vorliegen von DNA und RNA für ein IRAK-4-Polynukleotid in einer Probe umfassen zahlreiche Techniken, die Fachleuten bekannt sind, wie etwa Southern-Analyse, Northern-Analyse, Dot Blots, RNase Protection, S1-Analyse, Amplifikationstechniken wie etwa PCR und LCR, und in situ-Hybridisierung. Bei einer in situ-Hybridisierung wird beispielsweise eine Zielnukleinsäure von ihren zellulären Umgebungen freigesetzt, sodass sie für eine Hybridisierung innerhalb der Zelle verfügbar ist, während die zelluläre Morphologie für eine anschließende Interpretation und Analyse erhalten wird. Die folgenden Artikel stellen einen Überblick des Fachgebiets der in situ-Hybridisierung bereit: Singer et al., Biotechniques 4: 230–250 (1986), Haase et al., Methods in Virology, Vol. VII, S. 189–226 (1984) und Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (Hames et al., Eds. 1987). Außerdem kann ein IRAK-4-Protein mit den verschiedenen oben beschriebenen Immunoassay-Techniken nachgewiesen werden. Die Testprobe wird normalerweise sowohl mit einer positiven Kontrolle (z. B. einer Probe, worin ein rekombinantes IRAK-4-Protein exprimiert wird) als auch einer Negativkontrolle verglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits zum Screening von Modulatoren von IRAK-4-Proteinen oder -Nukleinsäuren bereit. Solche Kits können aus leicht erhältlichen Materialien oder Reagenzien hergestellt werden. Beispielsweise können solche Kits ein beliebiges oder mehrere der folgenden Materialien umfassen: IRAK-4-Nukleinsäuren oder -Proteine, Reaktionsröhrchen und Anleitungen zum Testen der IRAK-4-Aktivität. Optional enthält das Kit ein biologisch aktives IRAK-4-Protein. Erfindungsgemäß kann eine breite Vielzahl von Kits und Bestandteilen hergestellt werden, abhängig von dem beabsichtigten Benutzer des Kits und den bestimmten Bedürfnissen des Benutzers.
X. Beispiele
A. Identifizierung von humaner IRAK-4
Sequenzen, die mit humaner IRAK verwandt sind (Cao et al., Science 271: 1128–31 (1996)) wurden in der Sequenzdatenbank (Genebank) am „National Center for Biotechnology Information" unter Verwendung des TFASTX-Programms des Wisconsin Package Version 9.1 (Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.) identifiziert. Es wurde eine humane cDNA-Sequenz (Signatur AF155118) gefunden, die ein Polypeptid kodiert, das eine signifikante Homologie mit IRAK teilt. Ein Volllängen-cDNA-Klon wurde aus einer cDNA-Bibliothek (Clontech Universal Quick Clone cDNA) mit einer PCR-Reaktion unter Verwendung eines Sense-Primers mit der Sequenz ATGAACAAACCCATAACACCATCAACATATGTGC (SEQ ID NO:5) und eines Antisense-Primers mit der Sequenz TTAAGAAGCTGTCATCTCTTGCAGC (SEQ ID NO:6) amplifiziert. Die Nukleotid-Sequenz dieser cDNA wurde mit dem Sanger-Verfahren der Didesoxy-vermittelten Kettentermination bestimmt. Die humane IRAK-4-cDNA (siehe z. B. SEQ ID NO:2) kodiert ein Protein (siehe z. B. SEQ ID NO:1) mit 460 Aminosäuren und einer berechneten Molekularmasse von 52 kDa. Die Analyse der abgeleiteten Protein-Sequenz ergab eine N-terminale Todes-Domäne (Feinstein et al., Trends Biochem. Sci. 20: 342–4 (1995)) und eine zentrale Kinase-Domäne, die den Domäne-Strukturen von IRAK, IRAK-2 und IRAK-M (Wesche et al., J. Biol. Chem. 274: 19403–10 (1999)) ähnlich war. Die allgemeine Sequenzidentität, die das neu identifizierte Protein mit den existierenden IRAK-ähnlichen Molekülen teilt, beträgt zwischen 30 bis 40% (Tabelle 1).

Sequenzidentität Sequenzähnlichkeit

IRAK 36% 48%

IRAK-2 28% 39%

IRAK-M 31% 41%

Pelle 30% 40%

Tabelle 1: Sequenzählichkeiten von humaner IRAK-4 mit Mitgliedern der IRAK/Pelle-Familie. Sequenzvergleiche wurden unter Verwendung des GAP-Programms des Wisconsin GCG-Pakets durchgeführt.
B. Expressionsmuster von humaner IRAK-4
Das Expressionsmuster von humaner IRAK-4 wurde durch Northern Blot-Analyse bestimmt, unter Verwendung von Proben, die eine Vielzahl von humanen Geweben darstellten. Es wurden zwei mRNA-Spezies mit Größen von ungefähr 4,4 kb und 3 kb nachgewiesen. Die IRAK-4-Expression wurde in Thymus, Milz, Niere und Leber nachgewiesen.
Unter Verwendung einer RT-PCR zur Amplifikation von humaner IRAK-4-RNA aus verschiedenen Geweben war ein Amplifikationsprodukt ohne Weiteres in Plazenta, Lunge, Leber, Niere, Pankreas, Prostata, Hoden, Ovar, Dünndarm, Colon, Lymphknoten und Tonsille nachweisbar.
C. IRAK-4 aktiviert NF-κB
In der humanen embryonalen Nierenzelllinie 293 wurde eine transiente Überexpression von humaner IRAK-4 induziert. Durch Nachweis von Reporterassays wurde herausgefunden, dass diese Überexpression zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB in den Zellen führt. Das in diesen Assays verwendete Reporterkonstrukt war das NF-κB-abhängige E-Selectin-Luciferase-Reportergenplasmid pELAM-luc (Schindler und Baichwa (1994) Mol. Cell Biol., 14: 5820–31). Die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung des Luciferaseassay-Systems (Promega) bestimmt, wie von Wesche et al., Immunity 7: 837–47 (1997) beschrieben.
Es wurde herausgefunden, dass die Überexpression einer IRAK-4-Mutante, der Kinaseaktivität fehlt (IRAK-4 KK213AA, eine Mutation, die einen kritischen Lysin-Rest in der ATP-Bindungstasche entfernt) oder einer trunkierten Form von IRAK-4 (aa 1...191, bestehend nur aus den ersten 191 Aminosäuren), auf dominant negative Art und Weise funktioniert, unter Blockierung der durch Interleukin-1 induzierten NF-κB-Aktivierung. Diese veränderten Formen von IRAK-4 besaßen jedoch keinen Effekt auf die durch TNF induzierte NF-κB-Aktivierung (untersucht in HEK 293-Zellen unter Verwendung von Reporterassays).
D. Identifizierung von Maus-IRAK-4
Um murine IRAK-4-Homologe zu identifizieren, wurde eine murine Nieren-cDNA-Phagenbibliothek (Clontech) bei niedrig stringenten Bedingungen nach Standardverfahren mit einer Sonde durchsucht, die von einer trunkierten humanen IRAK-4 stammt (umfassend die Nukleotide 1–992). Es wurde ein cDNA-Klon identifiziert, der ein ORF mit etwa 80% Homologie (auf Proteinebene) mit dem humanen IRAK-4 kodiert. Um Volllängen-mIRAK-4 zu erhalten, wurde dieser Klon verwendet, um die gleiche Bibliothek unter hoch stringenten Bedingungen zu durchsuchen. Es wurden mehrere positive Klone identifiziert, die überlappende Fragmente von mIRAK-4 kodierten.
Die murine IRAK-4-cDNA (siehe z. B. SEQ ID NO:4) kodiert ein Protein mit 459 Aminosäuren (siehe z. B. SEQ ID NO:3) mit einer berechneten molekularen Masse von 51 kDa, das eine 87%ige Ähnlichkeit und eine 84%ige Identität mit dem humanen IRAK-4-Protein teilt (analysiert mit der GAP-Funktion des GCG-Pakets).
E. IL-1-induzierte Assoziation von IRAK-4 mit TRAF6 und IRAK-1
Verfahren:
HEK 293-Zellen, die IL-1RI stabil exprimierten (293RI, 1,5 × 10⁸ Zellen pro Probe, (Cao et al., Science 271: 1128–31 (1996), Cao et al., Nature 383: 443–6 (1996)) wurden für 0, 2, 10 und 30 Mintuten mit 100 ng/ml Interleukin-1 stimuliert. Die Zellen wurden gesammelt, für 20 Minuten auf Eis in Lysepuffer lysiert und zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, wie anderweitig beschrieben (Wesche et al., Immunity 7: 837–47 (1997)). Die klaren Lysate wurden mit Protein-G-Beads (Pharmacia) inkubiert und entweder mit einem Präimmunserum oder einem Kaninchen-Antiserum gegen E. coli-exprimierter Volllängen-IRAK-4 für 24 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Immunpräzipitate wurden sorgfältig gewaschen, durch SDS-PAGE fraktioniert, auf PVDF-Membranen übertragen und mit Antiserum gegen TRAF6 (Cao et al., Nature 383: 443–6 (1996)), IRAK-1 (Cao et al., Science 271: 1128–31 (1996)) oder IRAK-4 geblottet.
Ergebnis:
Um die Beteiligung von IRAK-4 beim IL-1-Signalweg zu adressieren, wurde die Fähigkeit von endogener IRAK-4 analysiert, auf IL-1-abhängige Art und Weise mit bekannten Transduktoren des IL-1-Signals zusammenzuwirken. Lysate von 293RI-Zellen, die für verschiedene Zeiten mit Interleukin-1 stimuliert wurden, wurden mit einem Antiserum gegen IRAK-4 immunpräzipitiert und mit Antiseren gegen IRAK-1 und TRAF6 immungeblottet. Es wurde bei den frühesten untersuchten Zeitpunkten (zwei Minuten) eine IL-1-induzierte Assoziation von IRAK-4 mit IRAK-1 und TRAF6 beobachtet, die nach 10 Minuten Inkubation erhöht und nach 30 Minuten verringert war, was eine IL-1-induzierte, schnelle und transiente Wechselwirkung von IRAK-4 mit IRAK-1 und TRAF6 zeigt, übereinstimmend mit einer Rolle als ein wichtiges Molekül bei der Transduktion des IL-1-Signals. (Siehe z. B. 5.)
Das Fehlen aller IRAK-1- oder TRAF6-Signale in den Proben, die mit Präimmunserum präzipitiert wurden, zeigt die Spezifität der Wechselwirkung, und der Kontrollblot mit einem IRAK-4-Antiserum zeigt, dass gleiche Mengen präzipitiert wurden.
Sequenzprotokoll SEQ ID NO:1 Humane IRAK-4-Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO:2 Humane IRAK-4-cDNA-Sequenz
SEQ ID NO:3 Murine IRAK-4-Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NO:4 Maus-IRAK-4-cDNA-Sequenz
SEQ ID NO:5 Sense-Primer für eine Amplifikation von humaner IRAK-4
SEQ ID NO:6 Antisense-Primer für eine Amplifikation von humaner IRAK-4
Sequenzprotokoll

Claims

Isolierte Nukleinsäure kodierend ein IRAK-4-Polypeptid, wobei das Polypeptid IL-1R/Toll-Familienmitglieds-Signaltransduktionsaktivität hat, das Polypeptid mindestens etwa 98% Aminosäure-Sequenzidentität zu SEQ ID NO:1 oder zu einer Subsequenz davon hat, wobei die Aminosäure-Sequenz des Polypeptids einen Alanin-Rest an der Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 81 von SEQ ID NO:1 umfasst, und wobei die Nukleinsäure mindestens etwa 400 Nukleotide umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid mindestens eine Aminosäure umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Valin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 432 von SEQ ID NO:1; (ii) einem Leucin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 437 von SEQ ID NO:1; (iii) einem Arginin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 444 von SEQ ID NO:1; und (iv) einem Glutamin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 451 von SEQ ID NO:1.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:1 umfasst.
Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid mindestens etwa 100 Aminosäuren, bevorzugt mindestens etwa 450 Aminosäuren umfasst.
Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure ein Cytosin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 242 von SEQ ID NO:2 umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 5, wobei die Nukleinsäure weiterhin mindestens ein Nukleotid umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Thymin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1295 von SEQ ID NO:2; (ii) einem Thymin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1302 von SEQ ID NO:2; (iii) einem Thymin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1310 von SEQ ID NO:2; (iv) einem Adenin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1332 von SEQ ID NO:2; und (v) einem Adenin an einer Nukleotid-Position korrespondierend zu Nukleotid-Position 1353 von SEQ ID NO:2.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure eine Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO:2 umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure mindestens etwa 1350 Nukleotide umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid spezifisch an Antikörper bindet, erzeugt gegen ein Polypeptid umfassend eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:1.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure wirksam mit einem Promotor verbunden ist.
Expressionskassette, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 10.
Isolierte Zelle, umfassend die Expressionskassette nach Anspruch 11.
Isoliertes IRAK-4-Polypeptid, wobei das Polypeptid IL-1R/Toll-Familienmitglieds-Signaltransduktionsaktivität hat, das Polypeptid mindestens etwa 98% Aminosäure-Sequenzidentität zu SEQ ID NO:1 oder zu einer Subsequenz davon hat, wobei die Aminosäure-Sequenz des Polypeptids einen Alanin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 81 von SEQ ID NO:1 umfasst, und wobei das Polypeptid mindestens etwa 100 Aminosäuren umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid weiterhin mindestens eine Aminosäure umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Valin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 432 von SEQ ID NO:1; (ii) einem Leucin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 437 von SEQ ID NO:1; (iii) einem Arginin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 444 von SEQ ID NO:1; und (iv) einem Glutamin-Rest an einer Aminosäure-Position korrespondierend zu Aminosäure-Position 451 von SEQ ID NO:1.
Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:1 umfasst, oder wobei das Polypeptid durch eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleinsäure-Sequenz von SEQ ID NO:2, kodiert ist.
Polypeptid nach Anspruch 13, 14 oder 15, wobei das Polypeptid spezifisch an Antikörper bindet, erzeugt gegen ein Polypeptid umfassend eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:1, und/oder wobei das Polypeptid mindestens etwa 450 Aminosäuren umfasst.
Isolierte Nukleinsäure kodierend ein IRAK-4-Polypeptid, wobei das Polypeptid IL-1R/Toll-Familienmitglieds-Signaltransduktionsaktivität hat, das Polypeptid mindestens etwa 70% Aminosäure-Sequenzidentität zu SEQ ID NO:3 oder zu einer Subsequenz davon umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 16, wobei das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:3 umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Nukleinsäure wirksam mit einem Promotor verbunden ist.
Expressionskassette, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 19.
Isolierte Zelle, umfassend die Expressionskassette nach Anspruch 20.
Verfahren zur Herstellung eines IRAK-4-Polypeptids, das Verfahren umfassend: (i) Einführen einer Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder Anspruch 19 in eine Wirtszelle oder einen zellulären Extrakt; (ii) Inkubieren der Wirtszelle oder des zellulären Extrakts unter derartigen Bedingungen, dass das IRAK-4-Polypeptid in der Wirtszelle oder dem zellulären Extrakt exprimiert ist; und (iii) Gewinnen des IRAK-4-Polypeptids aus der Wirtszelle oder dem zellulären Extrakt.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, verwendbar in der Behandlung von Entzündungskrankheiten, umfassend die Schritte: (i) Kontaktieren eines IRAK-4-Polypeptids mit der Verbindung, wobei das IRAK-4-Polypeptid mindestens etwa 70% Aminosäure-Sequenzidentität zu SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 umfasst; und (ii) Bestimmen des funktionellen Effekts der Verbindung auf das IRAK-4-Polypeptid.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das IRAK-4 eine Aminosäure-Sequenz dargestellt als SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 umfasst, wobei die Verbindung IRAK-4-Kinase-Aktivität inhibiert, und/oder wobei das IRAK-4 innerhalb einer eukaryotischen Zelle vorhanden ist.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge von einer Verbindung, welche IRAK-4 moduliert, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Entzündungskrankheit in einem Patienten, wobei die Verbindung eine dominant negative Form von IRAK-4 umfasst, wobei bevorzugt (a) die dominant negative Form von IRAK-4 eine Mutation in einem Lysin-Rest in der ATP-Bindungstasche umfasst, wobei bevorzugt die Mutation eine Substitution von Alanin-Resten für Lysin-Reste in dem IRAK-4 an Aminosäure-Positionen 213 und 214 von SEQ ID NO:1 umfasst, oder (b) die dominant negative Form von IRAK-4 eine trunkierte Form von IRAK-4 ist, wobei bevorzugt die trunkierte Form von IRAK-4 hauptsächlich aus Aminosäure 1 bis 191 von SEQ ID NO:1 besteht.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Verbindung IRAK-4-Kinase-Aktivität inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Verbindung durch Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 23 oder 24 identifiziert wird.
Verwendung nach Anspruch 25, 26 oder 27, wobei die Entzündungskrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lungenkrankheiten und Krankheiten der Atemwege, Transplantatabstoßung, Autoimmunkrankheiten, Krebs, kardiovaskulären Krankheiten, Krankheiten des zentralen Nervensystems, CD14 vermittelter Sepsis, nicht-CD14 vermittelter Sepsis, Osteoarthritis, Osteoporosis, Psoriasis, Krankheiten der Haut, entzündlicher Darmkrankheit, Behcet's Syndrom, Spondylitis ankylosans, Sarkoidosis, Gicht und ophthalmischen Krankheiten und Zuständen.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Lungenkrankheit und Krankheit der Atemwege ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adult Respiratory Disease Syndrome (ARDS), chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), Lungenfibrose, interstitialer Lungenkrankheit, Asthma, chronischem Husten und allergischer Rhinitis, wobei die Autoimmunkrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematodes, multipler Sklerose und Diabetes, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus soliden Tumoren, Hautkrebs und Lymphom, wobei die kardio-vaskuläre Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Schlaganfall und Arteriosklerose, wobei die Krankheit des zentralen Nervensystems eine neurodegenerative Krankheit ist, wobei die Krankheit der Haut ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ausschlag, Kontaktdermatitis und atopischer Dermatitis und wobei die entzündliche Darmkrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Crohn'scher Krankheit und Colitis ulcerosa.
Verfahren zum Inhibieren der Signaltransduktion hervorgerufen von der Aktivierung eines IL-1R/Toll-Rezeptors in einer Zelle, wobei das Verfahren Einführen eines Inhibitors der Aktivität oder Expression von IRAK-4 in die Zelle umfasst, wobei der Inhibitor eine dominant negative Form von IRAK-4 umfasst, wobei bevorzugt (a) die dominant negative Form von IRAK-4 eine Mutation in einem Lysine-Rest in der ATP-Bindungstasche umfasst, wobei bevorzugt die Mutation eine Substitution von Alanin-Resten für Lysin-Reste in dem IRAK-4 an Aminosäure-Positionen 213 und 214 von SEQ ID NO:1 umfasst, oder (b) die dominant negative Form von IRAK-4 eine trunkierte Form von IRAK-4 ist, wobei bevorzugt die trunkierte Form von IRAK-4 hauptsächlich aus Aminosäuren 1 bis 191 von SEQ ID NO:1 besteht.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Inhibitor die Aktivierung von mindestens einem Transkriptionsfaktor inhibiert, wobei bevorzugt der Transkriptionsfaktor NFkB in der Zelle aktiviert.
Nicht-humanes transgenes Tier, umfassend eine Mutation in einem endogenen IRAK-4-Gen kodierend ein IRAK-4-Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 16.
Transgenes Tier nach Anspruch 32, wobei die Mutation das endogene IRAK-4-Gen inaktiviert, wobei bevorzugt die Mutation eine Deletion des ganzen oder von Teilen des endogenen IRAK-4-Gens umfasst.
Transgenes Tier nach Anspruch 33, wobei das Tier eine Maus ist.
Isolierte mutierte Säugerzelle, umfassend eine Mutation in einem endogenen IRAK-4-Gen kodierend ein IRAK-4-Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei bevorzugt die Mutation das endogene IRAK-4-Gen inaktiviert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung, welche IRAK-4 moduliert, zur Behandlung einer Entzündungskrankheit in einem Patienten, wobei die Verbindung eine dominant negative Form von IRAK-4 umfasst, wobei bevorzugt (a) die dominant negative Form von IRAK-4 eine Mutation in einem Lysin-Rest in der ATP-Bindungstasche umfasst, wobei bevorzugt die Mutation eine Substitution von Alanin-Resten für Lysin-Reste in dem IRAK-4 an Aminosäure-Positionen 213 und 214 von SEQ ID NO:1 umfasst oder (b) die dominant negative Form von IRAK-4 eine trunkierte Form von IRAK-4 ist, wobei bevorzugt die trunkierte Form von IRAK-4 hauptsächlich aus Aminosäuren 1 bis 191 von SEQ ID NO:1 besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 36, wobei die Verbindung IRAK-4-Kinase-Aktivität inhibiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 36 oder 37, wobei die Verbindung durch Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 23 oder 24 identifiziert wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 36, 37 oder 37, wobei die Entzündungskrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lungenkrankheiten und Krankheiten der Atemwege, Transplantatabstoßung, Autoimmunkrankheiten, Krebs, kardiovaskulären Krankheiten, Krankheiten des zentralen Nervensystems, CD14 vermittelter Sepsis, nicht-CD14 vermittelter Sepsis, Osteoarthritis, Osteoporosis, Psoriasis, Krankheiten der Haut, entzündlicher Darmkrankheit, Behcet's Syndrom, Spondylitis ankylosans, Sarkoidosis, Gicht und ophthalmischen Krankheiten und Zuständen.
Zusammensetzung nach Anspruch 39, wobei die Lungenkrankheit und Krankheit der Atemwege ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adult Respiratory Disease Syndrome (ARDS), chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), Lungenfibrose, interstitialer Lungenkrankheit, Asthma, chronischem Husten und allergischer Rhinitis, wobei die Autoimmunkrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematodes, multipler Sklerose und Diabetes, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus soliden Tumoren, Hautkrebs und Lymphom, wobei die kardio-vaskuläre Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Schlaganfall und Arteriosklerose, wobei die Krankheit des zentralen Nervensystems eine neurodegenerative Krankheit ist, wobei die Krankheit der Haut ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ausschlag, Kontaktdermatitis und atopischer Dermatitis und wobei die entzündliche Darmkrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Crohn'scher Krankheit und Colitis ulcerosa.