JP2004500074A - Ｉｒａｋ−４：組成物および使用方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＩＲＡＫ−４（タンパク質キナーゼのＩＲＡＫファミリーの新規メンバー）の核酸およびポリペプチドを提供する。ＩＲＡＫファミリーのメンバーは、膜貫通レセプターのＩＬ−ｌＲ／Ｔｏｌｌファミリーのメンバー（ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−１８レセプターおよびＬＰＳレセプターを含む）のための、不可欠なシグナル伝達因子である。ヒトおよびマウス由来のＩＲＡＫ−４配列が提供され、炎症疾患の処置または予防において有用な化合物を同定するための方法もまた提供される。

Description

【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０００年１月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６０／１７６，３９５号の利益を主張する。同出願は、本明細書中ですべての目的のために、その全体を参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
炎症誘発性サイトカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、感染、損傷、および免疫学的チャレンジに対する全身性および局所性の応答の発生において機能する。炎症におけるＩＬ−１の重要性は、高い特異性のＩＬ−１レセプターアンタゴニストタンパク質（ＩＬ−１Ｒａ、またはＩＲＡＰ）の炎症状態を和らげる能力により実証された（総説に関しては、例えば、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｖ．８：２５３−２６５（１９９７）を参照のこと）。ＩＬ−１は、主に活性化したマクロファージおよび単球により産生され、そしてリンパ球活性化、発熱、白血球輸送、急性期応答、軟骨組織再構築、および他のプロセスに関与する。ＩＬ−１は、応答細胞の細胞膜に存在するレセプターＩＬ−１ＲＩに結合することによりその効果を発揮する。
ＩＬ−１ＲＩレセプターへのＩＬ−１の結合の結果は、ＮＦ−κＢ転写因子の活性化であるが、最終的には炎症に関与する多数の遺伝子（例えば、サイトカイン、増殖因子、免疫レセプター、および細胞接着分子）の発現を誘導する（総説に関しては、例えば、Ｌｅｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８（１１）：９８１−９３（１９９８）を参照のこと）。
【０００３】
種々のタンパク質が、ＩＬ−１ＲＩの活性化に続くシグナル伝達を媒介し、最終的にＮＦ−κＢの活性化を誘導することが発見された。例えば、ＩＬ−１Ｒアクセサリータンパク質、ＩＬ−１ＲＡｃＰは、ＩＬ−１との結合に続き、ＩＬ−１ＲＩレセプターと結合し、それによって、シグナル伝達カスケードが開始することが示された（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２３）：１３７５７−６５（１９９５））。さらに、３つのＩＬ−１レセプター結合キナーゼ（ＩＲＡＫ）である、ＩＲＡＫ（「ＩＲＡＫ−１」，Ｃａｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７１：１１２８−１１３１（１９９６））、ＩＲＡＫ−２（Ｍｕｚｉｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７８：１６１２−１６１５（１９９７））、および単骨髄球性細胞（ｍｏｎｏｍｙｅｌｏｉｃ　ｃｅｌｌ）特異的ＩＲＡＫ−Ｍ（Ｗｅｓｃｈｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９４０３−１０（１９９９））が同定された。ＩＲＡＫは、ＩＬ−１依存性の様式でリン酸化され、そしてＩＬ−１ＲＩと結合することが示された。さらに、ＭＹＤ８８タンパク質は、活性化ＩＬ−１レセプターへのＩＲＡＫタンパク質の結合を媒介することが示された（Ｗｅｓｃｈｅら，７：８３７−４７（１９９７））。また、ＴＲＡＦ６は、ＩＲＡＫシグナルを下流のエフェクター分子へ伝達する（Ｃａｏら，Ｎａｔｕｒｅ　３８３：４４３−６（１９９６））。ＩＲＡＫタンパク質、ならびにＭｙＤ８８は、ＩＬ−１Ｒレセプターから発生するシグナル以外のシグナル（ＩＬ−１８レセプター（Ｋａｎａｋａｒａｊら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（７）：１１２９−３８（１９９９））およびＬＰＳレセプター（Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：６３９−６４３（１９９９）；Ｗｅｓｃｈｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９４０３−１０（１９９９））の活性化によって引き金を引かれるシグナルを含む）を伝達する役割を果たすことが示された。ＩＲＡＫ−２およびＩＲＡＫ−Ｍの過剰発現は、ＩＲＡＫ欠損細胞株におけるＩＬ−１およびＬＰＳに対する応答を復帰させ得ることが示された。
【０００４】
ＩＬ−１シグナル伝達カスケードは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける、ショウジョウバエ幼虫の初期発育段階の背面腹部の有極性の構築に関与するシグナル伝達カスケードと類似する。詳細には、ショウジョウバエにおいて、細胞外リガンドＳｐａｅｔｚｌｅは、ＩＬ−１Ｒと相同性を共有するＴｏｌｌと呼ばれるレセプターに結合する。さらに、Ｔｏｌｌ活性化の下流で作用するセリン／スレオニンキナーゼ、Ｐｅｌｌｅは、ＩＲＡＫキナーゼに相同である（Ｃａｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７１：１１２８−１１３１（１９９６）；Ｍｕｚｉｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７８：１６１２−１６１５（１９９７）；Ｗｅｓｃｈｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：４０３−４１０（１９９９））。最終的に、Ｔｏｌｌレセプターの活性化は、ＮＦ−κＢに相同である転写因子Ｄｏｒｓａｌの活性化を引き起こす。ショウジョウバエ細胞においてＤｏｒｓａｌは、それ自身がＮＦ−κＢインヒビターＩκＢに相同であるＣａｃｔｕｓにより阻害される。
【０００５】
本発明は、ＩＲＡＫファミリーの新規のメンバー、ＩＲＡＫ−４の同定に基く。ＩＲＡＫ−４の核酸およびタンパク質配列が提供され、ＩＲＡＫ−４核酸およびタンパク質を作製する方法も同様に提供される。本明細書で開示される配列を使用して、任意の多くの炎症疾患および状態の処置および予防において有用な化合物を単離する方法を含む、ＩＲＡＫ−４ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用する方法もまた提供される。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、ＩＲＡＫ遺伝子ファミリーの新規メンバーである、哺乳動物ＩＲＡＫ−４の新規の核酸およびポリペプチドを提供する。ＩＲＡＫキナーゼは、活性化したＩＬ−１、ＩＬ−８および他のレセプターに結合し、そしてこれらの活性化したレセプターから生じるシグナルを伝達し、最終的にＮＦ−κＢ活性化のような種々の下流での効果を誘導する作用を有する。
【０００７】
１つの局面において、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。このポリペプチドは、配列番号１またはその部分配列に対する少なくとも約９８％のアミノ酸配列の同一性を有し、ここでこのポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸第８１位に対応するアミノ酸位置にアラニン残基を有し、そしてここで、上記核酸は、少なくとも約４００ヌクレオチドを含む。
【０００８】
１つの実施形態において、このポリペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸をさらに含む：（ｉ）配列番号１のアミノ酸第４３２位に対応するアミノ酸位置のバリン残基；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸第４３７位に対応するアミノ酸位置のロイシン残基；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸第４４４位に対応するアミノ酸位置のアルギニン残基；および（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸第４５１位に対応するアミノ酸位置のグルタミン残基。別の実施形態において、このポリペプチドは、（ｉ）〜（ｉｖ）に列挙された各アミノ酸を含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、少なくとも約１００アミノ酸を含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、少なくとも約４５０アミノ酸を含む。
【０００９】
別の実施形態において、この核酸は、配列番号２のヌクレオチド第２４２位に対応するヌクレオチド位置にシトシンを含む。別の実施形態において、この核酸は、以下からなる群より選択されるヌクレオチドをさらに含む：（ｉ）配列番号２のヌクレオチド第１２９５位に対応するヌクレオチド位置のチミン；（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド第１３０２位に対応するヌクレオチド位置のチミン；（ｉｉｉ）配列番号２のヌクレオチド第１３１０位に対応するヌクレオチド位置のチミン；（ｉｖ）配列番号２のヌクレオチド第１３３２位に対応するヌクレオチド位置のアデニン；および（ｖ）配列番号２のヌクレオチド第１３５３位に対応するヌクレオチド位置のアデニン。別の実施形態において、この核酸は、（ｉ）〜（ｖ）に列挙された各ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、この核酸は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、この核酸は、少なくとも約３５０ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して作製された抗体に特異的に結合する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、単離されたＩＲＡＫ−４ポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号１またはその部分配列に対する少なくとも約９８％のアミノ酸配列の同一性を有し、ここで、このポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸第８１位に対応するアミノ酸位置にアラニン残基を含み、ここで、このポリペプチドは、少なくとも約１００アミノ酸を含む。
【００１１】
１つの実施形態において、このポリペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸をさらに含む：（ｉ）配列番号１のアミノ酸第４３２位に対応するアミノ酸位置のバリン残基；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸第４３７位に対応するアミノ酸位置のロイシン残基；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸第４４４位に対応するアミノ酸位置のアルギニン残基；および（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸第４５１位に対応するアミノ酸位置のグルタミン残基。別の実施形態において、このポリペプチドは、（ｉ）〜（ｉｖ）に列挙された各アミノ酸を含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。別の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して作製された抗体に特異的に結合する。別の実施形態において、このポリペプチドは、少なくとも約４５０アミノ酸を含む。
【００１２】
別の局面において、本発明は、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。このポリペプチドは、配列番号３またはその部分配列に対する少なくとも約７０％のアミノ酸配列の同一性を有する。
【００１３】
１つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、この核酸は、配列番号４またはその部分配列に対する少なくとも約７０％のヌクレオチド配列の同一性を有する。別の実施形態において、この核酸は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、この核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号４のヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする。
【００１４】
特定の実施形態において、上記核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。他の局面において、本発明は、プロモーターに作動可能に連結されている核酸を含む発現カセットを提供する。他の局面において、本発明は、発現カセットを含む、単離された細胞を提供する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドを作製する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）核酸を宿主細胞または細胞抽出物に導入する工程であって、この核酸が、（ａ）配列番号１またはその部分配列に対する少なくとも約９８％のアミノ酸配列の同一性（ここで、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸第８１位に対応するアミノ酸位置にアラニン残基を含み、そしてこの核酸は、少なくとも約４００ヌクレオチドを含む）；または（ｂ）配列番号３またはその部分配列に対する少なくとも約７０％のアミノ酸配列の同一性、のいずれかを有するポリペプチドをコードする工程；（ｉｉ）このＩＲＡＫ−４ポリペプチドが、宿主細胞または細胞抽出物中で発現されるような条件下で、この宿主細胞または細胞抽出物をインキュベートする工程；および（ｉｉｉ）この宿主細胞または細胞抽出物からＩＲＡＫ−４ポリペプチドを回収する工程。
【００１６】
別の局面において、本発明は、炎症疾患の処置に有用な化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）ＩＲＡＫ−４ポリペプチドとこの化合物を接触させる工程であって、ここで、このＩＲＡＫ−４ポリペプチドが、配列番号１または配列番号３に対する少なくとも約７０％のアミノ酸配列の同一性を有する工程；および（ｉｉ）このＩＲＡＫ−４ポリペプチドに対するこの化合物の機能的な効果を決定する工程。
【００１７】
１つの実施形態において、このＩＲＡＫ−４ポリペプチドは、配列番号１または配列番号３として示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、この化合物は、ＩＲＡＫ−４キナーゼ活性を阻害する。別の実施形態において、このＩＲＡＫ−４ポリペプチドは、真核生物細胞内に存在する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、患者における炎症疾患を処置する方法を提供する。この方法は、治療有効量の化合物を患者に投与する工程を包含し、この化合物は、以下の工程を包含する方法を用いて同定される：（ｉ）ＩＲＡＫ−４ポリペプチドとこの化合物を接触させる工程であって、ここで、このＩＲＡＫ−４ポリペプチドが、配列番号１または配列番号３に対する少なくとも約７０％のアミノ酸配列の同一性を有する工程；および（ｉｉ）このＩＲＡＫ−４ポリペプチドに対するこの化合物の機能的な効果を決定する工程。
【００１９】
１つの実施形態において、上記炎症疾患は、肺疾患および気道の疾患、移殖片拒絶、自己免疫疾患、癌、心臓血管疾患、中枢神経系の疾患、ＣＤ１４媒介性敗血症、非ＣＤ１４媒介性敗血症、変形性関節症、骨粗鬆症、乾癬、皮膚の疾患、炎症性腸疾患、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、類肉腫症、痛風、ならびに眼の疾患および状態からなる群より選択される。
【００２０】
１つの実施形態において、上記肺疾患および気道の疾患は、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＯＰＤ）、肺線維症、間質性肺疾患、ぜん息、慢性咳、およびアレルギー性鼻炎からなる群より選択される。別の実施形態において、上記自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、および糖尿病（例えば、１型糖尿病）からなる群より選択される。別の実施形態において、上記癌は、固形腫瘍、皮膚癌、およびリンパ腫からなる群より選択される。別の実施形態において、上記心臓血管疾患は、発作およびアテローム硬化症からなる群より選択される。別の実施形態において、上記中枢神経系の疾患は、神経変性疾患である。別の実施形態において、上記皮膚の疾患は、発疹、接触皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎からなる群より選択される。別の実施形態において、上記炎症性腸疾患は、クローン病および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される。
【００２１】
別の局面において、本発明は、細胞においてＩＬ−１Ｒ／Ｔｏｌｌレセプターの活性化により生じるシグナルの伝達を阻害する方法を提供する。この方法は、ＩＲＡＫ−４の活性または発現のインヒビターを細胞に導入する工程を包含する。
【００２２】
１つの実施形態において、ＩＬ−１Ｒ／Ｔｏｌｌレセプターは、ＩＬ−１によって活性化される。別の実施形態において、このインヒビターは、ＩＲＡＫ−４のドミナントネガティブ形態を含む。別の実施形態において、このＩＲＡＫ−４のドミナントネガティブ形態は、ＡＴＰ結合ポケットのリジン残基における変異を含む。別の実施形態において、この変異は、上記ＩＲＡＫ−４内にある、配列番号１の第２１３位および第２１４位に対応するアミノ酸位置のリジン残基に代わるアラニン残基の置換を含む。別の実施形態において、このＩＲＡＫ−４のドミナントネガティブ形態は、ＩＲＡＫ−４の切断型形態である。別の実施形態において、このＩＲＡＫ−４の切断型形態は、本質的に配列番号１のアミノ酸１〜１９１からなる。別の実施形態において、このインヒビターは、以下の工程を含む方法を用いて同定される化合物を含む：（ｉ）ＩＲＡＫ−４ポリペプチドとこの化合物を接触させる工程であって、ここで、このＩＲＡＫ−４ポリペプチドが、配列番号１または配列番号３に対する少なくとも約７０％のアミノ酸配列の同一性を有する工程；および（ｉｉ）このＩＲＡＫ−４ポリペプチドに対するこの化合物の機能的な効果を決定する工程。１つの実施形態において、このインヒビターは、少なくとも１つの転写因子の活性化を阻害する。別の実施形態において、この転写因子は、その細胞においてＮＦκＢを活性化する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、内因性ＩＲＡＫ−４遺伝子における変異を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、この変異は、内因性ＩＲＡＫ−４遺伝子を不活性化する。別の実施形態において、この変異は、ＩＲＡＫ−４遺伝子の全てかまたは一部を欠失している。別の実施形態において、この動物は、マウスである。
【００２４】
別の局面において、本発明は、内因性ＩＲＡＫ−４遺伝子における変異を含む単離された哺乳動物細胞を提供する。１つの実施形態において、この変異は、ＩＲＡＫ−４遺伝子を不活性化する。別の実施形態において、この変異は、ＩＲＡＫ−４遺伝子の全てかまたは一部を欠失している。
【００２５】
（特定の実施形態の説明）
（Ｉ．導入部）
本発明は、ＩＲＡＫ−４（タンパク質キナーゼのＩＲＡＫファミリーの新規メンバー）の核酸およびポリペプチドを提供する。ＩＲＡＫファミリーのメンバーは、膜貫通レセプターのＩＬ−ｌＲ／Ｔｏｌｌファミリーのメンバー（ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−１８レセプターおよびＬＰＳレセプターを含む）のための、不可欠なシグナル伝達因子である。他のＩＲＡＫファミリーのメンバーと同様に、ＩＲＡＫ−４はまた、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８と相互作用し、これは、このキナーゼをレセプター複合体（Ｗｅｓｃｈｅら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　７：８３７−４７（１９９７））、およびＴＲＡＦ６に連結し、これは、下流のエフェクター分子にシグナルを伝達する（Ｃａｏら，Ｎａｔｕｒｅ　３８３：４４３−６（１９９６））。ヒト由来のＩＲＡＫ−４配列（例えば、配列番号１および２を参照のこと）およびマウス由来のＩＲＡＫ−４配列（例えば、配列番号３および４を参照のこと）が、提供される。
【００２６】
ＩＲＡＫ−４の調節因子、組換え形態、またはフラグメントが、使用されて、ＩＬ−１／Ｔｏｌｌレセプターファミリーの前炎症性シグナル伝達カスケードを妨害し得、故に、これらは、多数の炎症性疾患の処置に有用であり得、この疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）肺疾患および気道の疾患、例えば、成体呼吸性疾患症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＯＰＤ）、肺性線維症、間質性肺疾患、喘息、慢性の咳、およびアレルギー性鼻炎；ｂ）移植；ｃ）自己免疫疾患、例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、および糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病）；ｄ）固形腫瘍、皮膚癌、およびリンパ腫を含む、癌；ｅ）発作およびアテローム性動脈硬化症を含む、心血管疾患；ｆ）神経変性疾患を含む中枢神経系の疾患；ｇ）非ＣＤ１４媒介の敗血症；ｈ）変形性関節症；ｉ）骨粗しょう症；ｊ）乾癬ならびに発疹および接触皮膚炎およびアトピー性皮膚炎のような皮膚の疾患；ｋ）炎症性腸疾患、例えば、クローン病および潰瘍性結腸炎；ｌ）ベーチェット病；ｍ）強直性脊椎炎；ｎ）類肉腫症；ｏ）痛風；ｐ）眼の疾患および状態；ならびにｈ）ＣＤ１４媒介の敗血症。
【００２７】
多数の実施形態において、本発明は、ＩＲＡＫ−４核酸およびＩＲＡＫ−４タンパク質の調節因子（例えば、アクチベーター、インヒビター、刺激因子、エンハンサーなど）をスクリーニングする方法を提供する。このような調節因子は、多数の様式のうちのいずれかにおいてＩＲＡＫ−４活性に影響をおよぼし得、これは、例えば、ＩＲＡＫ−４の転写、翻訳、リン酸化、ｍＲＮＡ安定性もしくはタンパク質安定性を調節することによってか、またはＩＲＡＫ−４の異種タンパク質もしくは他の分子への結合を変更することによってか；またはＩＲＡＫ−４タンパク質活性に影響を及ぼすことによる。好ましい実施形態において、ＩＲＡＫ−４活性またはＩＲＡＫ−４レベルを阻害する調節因子は、上記に引用される炎症性疾患のうちの何れかを処置するために使用される。
【００２８】
１つの実施形態において、化合物が、例えば、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を用いてスクリーニングされ、単離されたＩＲＡＫ−４ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合および／または単離されたＩＲＡＫ−４ポリペプチドまたはそのフラグメントの活性を調節し得る化合物を同定する。別の実施形態において、ＩＲＡＫ−４タンパク質は、細胞中で組換え発現され、そしてＩＲＡＫ−４の潜在的な調節因子は、ＩＲＡＫ−４活性の指示因子（例えば、ＮＦ−κＢ活性）を測定することによってアッセイされる。
【００２９】
多数の実施形態において、ＩＲＡＫ−４ポリヌクレオチドまたはＩＲＡＫ−４ポリペプチドは、インビボまたはエキソビボで細胞に導入され、これによって、この細胞内のＩＲＡＫ−４活性が、調節される。例えば、全長ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、細胞集団に導入され、これによって、この細胞中のＩＲＡＫ−４のレベルまたは活性を増加する。あるいは、アンチセンス、リボザイム、またはドミナントネガティブにコードしているポリヌクレオチドが、細胞集団に導入され得、それによって、この細胞中でＩＲＡＫ−４および関連する炎症性シグナルのシグナル伝達を阻害する。
【００３０】
本発明はまた、ＩＲＡＫ−４核酸およびＩＲＡＫ−４タンパク質の発現を検出するための方法を提供し、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＬＰＳ、および他の型のシグナル伝達の調査を可能にし、そして、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、またはＬＰＳ応答細胞の特異的な同定を可能にする。ＩＲＡＫ−４はまた、実父確定検査および法医学的検査のための有用な核酸プローブを提供する。ＩＲＡＫ−４ポリペプチドはまた、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、またはＬＰＳ応答細胞を同定するのに有用なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製するために使用され得る。ＩＲＡＫ−４発現は、ｍＲＮＡの逆転写および増幅、総ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡの単離、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護法、Ｓ１消化、プローブ化ＤＮＡマイクロチップアレイ、ウエスタンブロットなどのような技術を用いて同定され得る。
【００３１】
機能的には、ＩＲＡＫ−４核酸は、膜貫通レセプターのＩＬ−ｌＲ／Ｔｏｌｌファミリー（ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−１８レセプター、およびＬＰＳレセプターを含む）からのシグナル伝達において作用するタンパク質キナーゼをコードする。構造的には、ＩＲＡＫ−４のヌクレオチド配列（例えば、それぞれヒトおよびマウスから単離された、配列番号２または４を参照のこと）は、アミノ末端（Ｎ末端）「死の（ｄｅａｔｈ）」ドメイン（ＤＤ）および中心キナーゼドメインを含むポリペプチドをコードする。他の種由来の関連するＩＲＡＫ−４遺伝子は、配列番号２または４に対して、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域（必要に応じて１００、２００、５００、またはより長い長さのヌクレオチド）にわたって少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を共有するか、または配列番号１または３に対して、少なくとも約２５アミノ酸長（必要に応じて５０〜１００アミノ酸長）のアミノ酸領域にわたって少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を共有するポリペプチドをコードする。好ましくは、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドは、約４５９または４６０アミノ酸を含み、そして約５１または５２ｋＤａの計算分子量を有する。
【００３２】
本発明はまた、配列番号１に示されるＩＲＡＫ−４タンパク質の多型改変体を提供する：改変体番号１、これは、ロイシン残基が、アミノ酸５３位においてイソロイシン残基に置換される；および改変体番号２、これは、アラニン残基が、アミノ酸１７位においてグリシン残基に置換される。
【００３３】
本発明はまた、配列番号３に示されるＩＲＡＫ−４タンパク質の多型改変体を提供する：改変体番号１、これは、リジン残基が、アミノ酸１２位においてアルギニン残基に置換される；および改変体番号２、これは、バリン残基が、アミノ酸５９位においてロイシン残基に置換される。
【００３４】
ＩＲＡＫ−４ヌクレオチド配列およびＩＲＡＫ−４アミノ酸配列の特定の領域は、ＩＲＡＫ−４遺伝子の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子を同定するために使用され得る。この同定は、インビトロで、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でなされるか、またはＰＣＲおよび配列決定でなされるか、または他のヌクレオチド配列との比較のためのコンピューターシステムにおける配列情報を用いすることによってなされ得る。代表的には、ＩＲＡＫ−４の多型改変体および対立遺伝子の同定は、約２５アミノ酸以上（例えば、５０〜１００アミノ酸）のアミノ酸配列を比較することによってなされる。少なくとも約６０％以上（必要に応じて、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０〜９５％またはより上）のアミノ酸同一性は、代表的に、タンパク質がＩＲＡＫ−４の多型改変体、種間ホモログ、または対立遺伝子であることを示す。配列比較は、以下に議論される配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて実行され得る。ＩＲＡＫ−４ポリペプチドまたはその保存領域に特異的に結合する抗体がまた、対立遺伝子、種間改変体、および多型改変体を同定するために使用され得る。
【００３５】
ＩＲＡＫ−４の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子は、例えば、推定ＩＲＡＫ−４ポリペプチドのＩＬ−１／Ｔｏｌｌレセプター結合、ＮＦ−ｋＢ活性化能力、またはＭｙＤ８８結合活性を試験することによって確認される。代表的に、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を有するＩＲＡＫ−４ポリペプチドは、推定ＩＲＡＫ−４タンパク質に対する比較の際にポジティブコントロールとして使用されて、ＩＲＡＫ−４遺伝子またはＩＲＡＫ−４タンパク質の多型改変体または対立遺伝子の同定を実証する。
【００３６】
ＩＲＡＫ−４に関するヌクレオチド配列情報およびアミノ酸配列情報はまた、コンピューターシステムにおいてＩＲＡＫ−４ポリペプチドのモデルを構築するために使用され得る。これらのモデルは、引続き使用されて、ＩＲＡＫ−４タンパク質を活性化または阻害し得る化合物を同定する。ＩＲＡＫ−４遺伝子またはＩＲＡＫ−４タンパク質の活性を調節するこのような化合物は、ＩＬ−１／Ｔｏｌｌシグナル伝達におけるＩＲＡＫ−４遺伝子の役割を調査するために使用され得る。
【００３７】
本発明はまた、ＩＲＡＫ−４と相互作用および／またはＩＲＡＫ−４を調節する化合物または他の分子を同定するのアッセイ、好ましくは高スループットアッセイを提供する。特定のアッセイにおいて、ＩＲＡＫ−４の特定のドメイン（例えば、Ｎ末端ドメインまたは中心キナーゼドメイン）が使用される。
【００３８】
本発明はまた、ＩＬ−１／Ｔｏｌｌレセプター活性と関連する疾患または状態（例えば、炎症性疾患）を処置するための方法を提供する。例えば、ＩＲＡＫ−４活性および／またはＩＲＡＫ−４発現は、炎症性疾患を有する患者の細胞において変更され得、この疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）肺疾患および気道の疾患（成体呼吸性疾患症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＯＰＤ）、肺性線維症、間質性肺疾患、喘息、慢性の咳、およびアレルギー性鼻炎を含むが、これらに限定されない）；ｂ）移植；ｃ）自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、および糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病）を含むが、これらに限定されない）；ｄ）固形腫瘍、皮膚癌、およびリンパ腫を含むが、これらに限定されない、癌；ｅ）発作およびアテローム性動脈硬化症を含むが、これらに限定されない、心血管疾患；ｆ）神経変性疾患を含むが、これらに限定されない、中枢神経系の疾患；ｇ）非ＣＤ１４媒介の敗血症；ｈ）変形性関節症；ｉ）骨粗しょう症；ｊ）乾癬ならびに発疹および接触皮膚炎およびアトピー性皮膚炎を含むが、これらに限定されない皮膚の疾患；ｋ）炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性結腸炎を含むが、これらに限定されない）；ｌ）ベーチェット病；ｍ）強直性脊椎炎；ｎ）類肉腫症；ｏ）痛風；ｐ）眼の疾患および状態；ならびにｑ）ＣＤ１４媒介の敗血症。このような患者において、例えば、ＩＬ−１応答細胞におけるＩＲＡＫ−４の阻害は、ＩＬ−１によって開始されたシグナルの伝達をブロックし、それによって、ＮＦ−κＢ活性化を妨げ、従って、この障害のための処置を提供する。
【００３９】
１つ以上のＩＲＡＫ−４対立遺伝子を欠くか、または変更された形態のＩＲＡＫ−４を含むトランスジェニック動物およびトランスジェニック細胞がまた、提供され、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用するためならびに本明細書中に開示される方法を実行するためのキットがまた、提供される。
【００４０】
（ＩＩ．定義）
本明細書中に使用される場合、以下の用語は、他に特に示されない限り、それらに関して以下に割当てられる意味を有する。
【００４１】
本明細書中に使用される場合、「ＩＲＡＫ−４」は、配列番号１もしくは３に示されるタンパク質キナーゼ、またはその任意の誘導体、ホモログ、またはフラグメントをいうか、あるいは、このようなタンパク質、その誘導体、ホモログ、もしくはフラグメントをコードする任意の核酸をいう。ＩＲＡＫ−４タンパク質または誘導体は、任意の細胞型（任意の真核生物細胞または原核生物細胞を含む）で発現され得るか、またはインビトロで合成され得る。代表的に、ＩＲＡＫ−４核酸は、リガンド（例えば、ＩＬ−１）依存様式で、ＴＲＡＦ６およびＩＲＡＫ−１に結合する、活性なせリン／チロシンキナーゼをコードする。ＩＲＡＫ−４の誘導体、ホモログ、およびフラグメントが本発明に容易に使用され得ることが認識される。このようなＩＲＡＫ−４改変体は、配列番号１もしくは３に示されるようなポリペプチドのうちの任意の１つ以上のドメイン、または任意の１つ以上のドメインの複数コピー、または任意の数のドメインを、互いに新規な組み合わせか、または他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインとの新規組合わせで、含み得る。
【００４２】
特定の実施形態において、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドは、配列番号１に少なくとも約９８％同一であり、好ましくは、配列番号１の第８１位に対応するアミノ酸位置にアラニン残基を有する。好ましくは、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドはまた、以下のアミノ酸のうちの少なくとも１つを有する：（ｉ）配列番号１の第４３２位に対応するアミノ酸位置にバリン；（ｉｉ）配列番号１の第４３７位に対応するアミノ酸位置にロイシン；（ｉｉｉ）配列番号１の第４４４位に対応するアミノ酸位置にアルギニン；または（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸第４５１位に対応するアミノ酸位置にグルタミン。このようなポリペプチドは、好ましくは、以下のヌクレオチドのうちの少なくとも１つを有するポリヌクレオチドによってコードされる：（ｉ）配列番号２の２４２位に対応するヌクレオチド位置にチロシン；（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド第１３０２位に対応するヌクレオチド位置にチミン；（ｉｉｉ）配列番号２のヌクレオチド第１３１０位に対応するヌクレオチド位置にチミン；（ｉｖ）配列番号２のヌクレオチド第１３３２位に対応するヌクレオチド位置にアデニン；または（ｖ）配列番号２のヌクレオチド第１３５３位に対応するヌクレオチド位置にアデニン。
【００４３】
用語「ＩＲＡＫ−４」はまた、多型改変体、対立遺伝子、変異体および種間ホモログをいい、これらは、：（１）約２５アミノ酸、必要に応じて５０〜１００アミノ酸のウィンドウ上で、配列番号１または３に対して、約６０％のアミノ酸配列同一性、必要に応じて約７５、８０、８５、９０、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するか；（２）配列番号１または３のアミノ酸配列およびその保存的に改変された改変体を含む免疫原に対して惹起された抗体に特異的に結合するか；または（３）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２もしくは４またはこれらの保存的に改変された改変体の配列に、（少なくとも約１００ヌクレオチド、必要に応じて少なくとも約５００〜１０００ヌクレオチドのサイズで）特異的にハイブリダイズする。
【００４４】
位相的には、全長ＩＲＡＫ−４ポリペプチドは、「Ｎ末端ドメイン」または「死のドメイン（ｄｅａｔｈ　ｄｏｍａｉｎ）」および「中心キナーゼドメイン」を含む。これらのドメインは、当業者に公知の方法、例えば、標準的な配列分析プログラムを用いて、および関連するタンパク質との比較によって、構造的に同定され得る。さらに、他のＩＲＡＫタンパク質のように、ＩＲＡＫ−４は、タンパク質キナーゼの１２の標準的なサブドメインの各々を含む（例えば、Ｃａｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７１：１１２８−１１３１（１９９６）を参照のこと）。「ＡＴＰ結合ポケット」は、例えば、ＩＲＡＫ−１配列のサブドメインＩＩに対応する保存されたキナーゼドメインをいい（例えば、Ｃａｏら（１９９６））、これは、配列番号１および配列番号３の２１３位にリジン残基を含む。
【００４５】
「Ｎ末端ドメイン」または「死のドメイン」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＰｅｌｌｅタンパク質の領域に相同性であるＮ末端において見いだされる領域をいう。ＩＲＡＫ−４において、「死のドメイン」は、例えば、配列番号１または３に示されるように、おおよそアミノ酸５〜アミノ酸１４７に広がる（例えば、Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎら，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：３４２−４（１９９５）を参照のこと）。
【００４６】
「中心キナーゼドメイン」は、他のセリン／トレオニンキナーゼに相同性であるＩＲＡＫ−４タンパク質の保存領域をいう。ＩＲＡＫ−４において、「中心キナーゼドメイン」は、配列番号１および３のおおよそアミノ酸１９２〜アミノ酸４６０に広がる（例えば、Ｗｅｓｃｈｅら，Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９４０３−１０（１９９９）を参照のこと）。
【００４７】
「生物学的サンプル」は、本明細書中に使用される場合、１つ以上のＩＲＡＫ−４タンパク質をコードする１つ以上のＩＲＡＫ−４核酸を含む、生物学的組織または流体のサンプルをいう。このようなサンプルは、ヒトおよびマウスから単離された組織、特に、胸腺、脾臓、腎臓、胎盤、肺、肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、リンパ節および扁桃から単離された組織を含むが、これらに限定されない。生物学的サンプルはまた、組織学的目的のために採取された凍結切片のような組織切片を含み得る。生物学的サンプルは、代表的に、真核生物、例えば、昆虫、原生動物、鳥類、魚類、爬虫類、および好ましくは、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、またはウサギのような哺乳動物、そして最も好ましくは、チンパンジーまたはヒトのような霊長類から得られる。
【００４８】
「機能的効果を決定すること」は、間接的かまたは直接的にＩＲＡＫ−４ポリペプチドの影響下であるパラメーターを調節（例えば、増加または減少）する化合物に関してアッセイこと（例えば、機能的効果、物理的効果および化学的効果）を意味する。このような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段によって測定され得る（例えば、分光特徴（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学特性（例えば、形状）、色層分析特性、または可溶性特性における変化、ＩＲＡＫ−４またはＩＲＡＫ−４活性を示す任意のマーカー遺伝子の遺伝子発現における変化など）。
【００４９】
ＩＲＡＫ−４遺伝子またはＩＲＡＫ−４タンパク質の「インヒビター」「アクチベーター」および「調節因子」は、ＩＲＡＫ−４についてのインビトロアッセイおよびインビボアッセイを用いて同定される分子の阻害、活性化または調節をいうために、交換可能に使用される。インヒビターは、例えば、ＩＲＡＫ−４タンパク質に結合するか、ＩＲＡＫ−４活性を部分的または完全にブロックするか、ＩＲＡＫ−４発現もしくはＩＲＡＫ−４安定性をダウンレギュレートするか、または異種分子（例えば、ＭｙＤ８８、ＩＬ−１ＲＩ、またはＴＲＡＦ６）へのＩＲＡＫ−４結合を妨害する化合物である。アクチベーターは、例えば、ＩＲＡＫ−４に結合するか、ＩＲＡＫ−４活性を刺激するか、ＩＲＡＫ−４発現もしくはＩＲＡＫ−４安定性を増加するか、または膜もしくは任意の他のタンパク質もしくは任意の他の因子へのＩＲＡＫ−４結合を促進する化合物である。調節因子は、ＩＲＡＫ−４タンパク質の遺伝子的に改変されたバージョン（ＩＲＡＫ−４のドミナントネガティブまたは活性化形態）を含み得る。インヒビターおよびアクチベーターについてのこのようなアッセイは、以下に記載され、そして例えば、細胞中でＩＲＡＫ−４タンパク質を発現させること、推定の調節因子化合物を適用すること、そしてＩＲＡＫ−４活性に対する機構的効果を決定することを含む。潜在的なアクチベーター、インヒビターまたは調節因子で処理されるＩＲＡＫ−４ポリペプチドを含むサンプルまたはアッセイは、候補化合物の効果を調べるために、インヒビター、アクチベーター、または調節因子無しのコントロールサンプルに対して比較される。コントロールサンプル（化合物で処理されていない）は、１００％の相対的ＩＲＡＫ−４活性値を割当てられる。ＩＲＡＫ−４ポリペプチドの阻害は、コントロールに対するこの活性値が約８０％、必要に応じて５０％または２５〜０％である場合に、達成される。ＩＲＡＫ−４ポリペプチドの活性化は、コントロールに対するこの活性値が、１１０％、必要に応じて１５０％、必要に応じて２００〜５００％、または１０００〜３０００％高い場合に、達成される。
【００５０】
用語「単離された」「精製された」または「生物学的に純粋な」は、その天然の状態で見出されるように通常伴う化合物を実質的に含まないか、または本質的に含まない物質をいう。純度および均一性は、代表的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を用いて決定される。調節物中に存在する優性種であるタンパク質が、引続き精製される。特に、単離されたＩＲＡＫ−４核酸は、ＩＲＡＫ−４遺伝子に隣接するオープンリーディングフレームと分離され、ＩＲＡＫ−４以外のタンパク質をコードする。用語「精製された」は、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じさせる核酸またはタンパク質を示す。詳細には、これは、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％純粋、必要に応じて少なくとも９５％純粋、および必要に応じて少なくとも９９％純粋であることを意味する。
【００５１】
「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびこれらの重合体をいう。この用語は、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾されたバックボーン残基または連鎖を含む核酸を含み、これは、合成され、天然に存在し、そして天然には存在せず、これは、参照核酸に類似した結合特性を有し、そしてこれは、参照ヌクレオチドと類似した様式で代謝される。このようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、暗黙の内に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列を含み、そしてその配列が、暗黙の内に示される。詳細には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンのうちの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ　８：９１−９８（１９９４））。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。
【００５３】
用語「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体をいうために、本明細書中において交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸重合体、ならびに天然に存在するアミノ酸重合体および天然に存在しないアミノ酸重合体に対して適用される。
【００５４】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾される（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）アミノ酸である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素に結合するα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をいう。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチドバックボーンを有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する化学化合物をいう。
【００５５】
アミノ酸は、本明細書中において、一般に公知の３文字記号によってかまたはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号のいずれかによって参照され得る。同様に、ヌクレオチドは、その一般に受容された１文字コードによって参照され得る。
【００５６】
用語「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体は、本質的に同一な配列に対して、同一なアミノ酸配列または本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸（またはここで核酸は、アミノ酸配列をコードしない）をいう。遺伝暗号の縮重に起因して、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵの全ては、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定される全ての位置において、このコドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく記載される対応のコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸バリエーションは、「サイレントなバリエーション（ｓｉｌｅｎｔ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」であり、これは、保存的に改変されたバリエーションの１つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能性のあるサイレントなバリエーションを記載する。当業者は、核酸中の各コドン（ＡＵＧ（これは、通常メチオニンのための唯一のコドンである）およびＴＧＧ（これは、通常トリプトファンのための唯一のコドンである）以外）は、機能的に同一な分子を生じるために改変され得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントなバリエーションは、各記載された配列を暗黙のうちに意味する。
【００５７】
アミノ酸配列の場合、当業者は、コードされる配列中の単一アミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変更、付加または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、「保存的に改変された改変体」であることを認識し、ここでこの変更は、化学的に類似するアミノ酸とのアミノ酸の置換を生じる。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の量は、当該分野で周知である。このような保存的に改変された改変体が加えられ、そして本発明の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子を除外しない。
【００５８】
以下の８つの群の各々は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００５９】
ポリペプチド構造のような高分子構造が、種々のレベルの組成に関して記載され得る。この組成の一般的な議論に関しては、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ（第３版，１９９４）ならびにＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｔｈｅ　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照のこと。「１次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「２次構造」は、局所的に順序付けられたポリペプチド内の３次元構造をいう。これらの構造は、一般的にドメインとして公知である。ドメインは、ポリペプチドの小型単位を形成するポリペプチドの一部であり、そして代表的に５０〜３５０アミノ酸長である。代表的なドメインは、βシートおよびαヘリックスのストレッチのようなより小さな組成の区分から構成される。「３次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な３次元構造をいう。「４次構造」は、独立した３次単位の非共有結合によって形成された３次元構造をいう。異方性ターム（ｔｅｒｍ）はまた、エネルギータームとして公知である。
【００６０】
「標識」または「検出可能な部分」とは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段によって検出可能な、組成物である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、電子集合（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ）試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるような酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および検出可能にされ得る（例えば、そのペプチド中に放射性標識を組み込むことによる）かそのペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用され得る、タンパク質が挙げられる。
【００６１】
「標識核酸プローブまたは標識オリゴヌクレオチド」とは、共有結合（リンカーもしくは化学結合を介して）または非共有結合（イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、もしくは水素結合を介して）のいずれかによって、そのプローブに結合した標識の存在を検出することによってそのプローブの存在が検出され得るように標識に結合した、核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドである。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、１つ以上の型の化学結合を介して、通常は相補的塩基対合を介して、通常は水素結合形成を介して、相補的配列の標的核酸に結合し得る核酸として、規定される。本明細書中で使用される場合、プローブは、天然の塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、もしくはＴ）を含んでもよいし、または改変型塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含んでもよい。さらに、プローブ中の塩基は、それがハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって結合され得る。従って、例えば、プローブは、その構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により結合された、ペプチド核酸であり得る。プローブが、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、そのプローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列に結合し得ることが、当業者により理解される。そのプローブは、必要に応じて、例えば同位体、発色団、発光体、クロモゲンを用いて直接標識されるか、あるいは、例えば、後にストレプトアビジン複合体が結合し得るビオチンを用いて間接的に標識される。そのプローブの存在もしくは不在についてアッセイすることによって、選択配列もしくは選択部分配列の存在もしくは不在を検出し得る。
【００６３】
用語「組換え」は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質もしくはベクターが、異種核酸もしくは異種タンパク質の導入によってか、またはネイティブの核酸もしくはタンパク質の変化によって改変されていること、あるいはその細胞が、そのように改変された細胞に由来することを、示す。従って、例えば、組換え細胞は、その細胞のネイティブ（非組換え）形態中では見出されない遺伝子を発現するか、または他の方法では異常発現されるか、過小発現されるか、または全く発現されない、ネイティブの遺伝子を発現する。
【００６４】
用語「異種」とは、核酸の一部に関して使用される場合、その核酸が、天然では互いに対して同じ関係では見出されない、２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、その核酸は、代表的には、組換え産生され、新規な機能性核酸を作製するように配置された関連しない遺伝子由来の２つ以上の配列（例えば、１つの供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域）を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然では互いに対して同じ関係では見出されない、２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００６５】
「プロモーター」は、核酸の転写を指令する一群の核酸制御配列として規定される。本明細書中で使用される場合、プロモーターは、転写の開始部位付近の必要な核酸配列（例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合は、ＴＡＴＡエレメント）を含む。プロモーターはまた、必要に応じて、転写の開始部位から数千塩基対程にも位置し得る、遠位のエンハンサーエレメントもしくはリプレッサーエレメントも含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件および発達条件下で活性である、プロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境調節もしくは発達調節下で活性である、プロモーターである。用語「作動可能に連結された」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、または一群の転写因子結合部位）と第２の核酸配列との間の機能的連結をいい、ここでその発現制御配列は、その第２の配列に対応する核酸の転写を指令する。
【００６６】
「発現ベクター」は、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にする、一連の特定の核酸エレメントを用いて組換え生成もしくは合成された、核酸構築物である。この発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部であり得る。代表的には、この発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された、転写されるべき核酸を含む。
【００６７】
用語「同一」または「同一性」パーセントは、２つ以上の核酸もしくはポリペプチド配列の文脈において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してかまたは手動のアライメントおよび視察により測定される場合に、比較範囲または指定領域にわたって最大一致について比較および整列された場合に、同じであるか、または特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する（すなわち、特定の領域にわたって６０％同一性、必要に応じて６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％同一性）、２つ以上の配列もしくは部分配列をいう。次いで、このような配列は、「実質的に同一」であるといわれる。この定義はまた、試験配列の相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）もいう。必要に応じて、この同一性は、少なくとも約５０アミノ酸長もしくは少なくとも約５０ヌクレオチド長である領域にわたってか、またはより好ましくは７５〜１００アミノ酸長もしくは７５〜１００ヌクレオチド長である領域にわたって、存在する。
【００６８】
配列比較について、代表的には、１つの配列が参照配列として作用し、この配列に対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され、必要な場合は部分配列座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが使用され得るし、または代替的パラメーターが指定され得る。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対するその試験配列についての配列同一性パーセントを算出する。
【００６９】
「比較範囲」は、本明細書中で使用される場合、配列が同じ数の連続位置の参照配列と、その２つの配列が最適に整列された後に比較され得る、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群より選択される連続位置数のいずれか１つのセグメントに対する言及を包含する。比較のための配列の整列方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適整列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによってか、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによってか、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によってか、これらのアルゴリズムのコンピューター化実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によってか、または手動整列および視察（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５補遺）を参照のこと）によって、実行され得る。
【００７０】
有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進行性対合整列を使用して、一群の関連配列からの多重配列整列を作製して、関係性および配列同一性パーセントを示す。これはまた、その整列を作製するために使用されるクラスター形成関係を示す、ツリーもしくは樹形図をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０（１９８７）の進行性整列方法の単純形を使用する。使用される方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ　５：１５１〜１５３（１９８９）により記載された方法と類似する。このプログラムは、３００個の配列まで整列し得、各配列は、最大長５，０００ヌクレオチドもしくは５，０００アミノ酸である。この多重整列手順は、最も類似する２つの配列の対合整列で始まり、整列された２つの配列のクラスターを生じる。次いで、このクラスターが、その次に最も関連する配列にか、または整列された配列クラスターに、整列される。２つの配列クラスターが、２つの個々の配列の対合整列の単純な拡張によって整列される。最終整列は、一連の進行性対合整列により達成される。このプログラムは、特定の配列と配列比較の領域についてのそのアミノ酸座標もしくはヌクレオチド座標とを指定すること、そしてそのプログラムのパラメーターを指定することによって、実行される。ＰＩＬＥＵＰを使用して、参照配列は、他の試験配列と比較され、以下のパラメーターを使用して、配列同一性関係パーセントが決定される：ｄｅｆａｕｌｔ　ｇａｐ　ｗｅｉｇｈｔ（３．００）、ｄｅｆａｕｌｔ　ｇａｐ　ｌｅｎｇｔｈ　ｗｅｉｇｈｔ（０．１０）、およびｗｅｉｇｈｔｅｄ　ｅｎｄ　ｇａｐ。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ（例えば、バージョン７．０（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５（１９８４））から得られ得る。
【００７１】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＳＡＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列中の短いワード長Ｗ（データベース配列中の同じ長さのワードと整列した場合に、いくらかの正の値の閾値スコア（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｓｃｏｒｅ）Ｔと一致するかもしくはそれを満たすかのいずれかである）を同定することにより、高スコア配列対（ｈｉｇｈ　ｓｃｏｒｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）を同定することを包含する。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ　ｗｏｒｄ　ｓｃｏｒｅ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｈｕｌら、前出）。これらの開始近傍ワードヒット（ｉｎｉｔｉａｌ　ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ　ｗｏｒｄ　ｈｉｔ）は、種を含むもっと長いＨＳＰを見出すための検索を開始するために種として作用する。このワードヒットは、累積整列スコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方の方向で伸長される。累積スコアが、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一対の一致する残基についての報酬スコア；通常＞０）およびＮ（ミスマッチする残基についてのペナルティスコア；通常＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために使用される。各方向でのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大達成値から量Ｘの分下がる場合；１つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積に起因して累積スコアが０以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、その整列の感度および速度を決定する。このＢＬＡＳＴＮプログラムは（ヌクレオチド配列について）、デフォルトとして、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）＝１１、ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＰプログラムは、デフォルトとして、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３、ならびにｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）＝１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２　ｓｃｏｒｉｎｇ　ｍａｔｒｉｘ（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（Ｂ）＝５０、ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００７２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照のこと）。このＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満であり、より好ましくは約０．０１未満であり、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合に、その参照配列に類似するとみなされる。
【００７３】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、下記のように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して惹起される抗体と免疫学的に交差反応性であることである。従って、ポリペプチドは、第２のポリペプチドに対して、例えば、その２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、代表的には実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、その２つの分子またはその成分が、下記のようなストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというなお別の指標は、同じプライマーが、その配列を増幅するために使用され得ることである。
【００７４】
句「選択的（または特異的）にハイブリダイズする」とは、特定のヌクレオチド配列に対してのみ、その配列が複合混合物（例えば、全細胞ＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡあるいはライブラリーＤＮＡまたはライブラリーＲＮＡ）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で分子が結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズすることをいう。
【００７５】
句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プロープが、代表的には核酸の複合混合物中のその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境では異なる。より長い配列ほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ｐｒｏｂｅｓ「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ａｓｓａｙｓ」（１９９３）に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度、ｐＨで、特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択される。このＴｍは、標的に相補的なプローブのうちの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下での）温度である（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍにて、プローブのうちの５０％が平衡状態にある）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３にて、塩濃度が、約１．０Ｍナトリウムイオン未満、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションについて、ポジティブなシグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、必要に応じてバックグラウンドのハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のようであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％　ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート、または５×ＳＳＣ、１％　ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、そして６５℃の０．２×ＳＳＣおよび０．１％　ＳＤＳ中での洗浄である。このような洗浄は、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分以上実施され得る。
【００７６】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらの核酸がコードするポリペプチドが実質的に同一である場合は、依然として実質的に同一である。このようなことは、例えば、１コピーの核酸が、遺伝コードにより許容される最大のコドンの縮重を使用して作製される場合に生じる。このような場合、それらの核酸は、代表的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、３７℃の４０％ホルムアミド、１Ｍ　ＮａＣｌ、１％　ＳＤＳという緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および４５℃の１×ＳＳＣ中での洗浄を包含する。このような洗浄は、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分以上実施され得る。ポジティブなハイブリダイゼーションは、少なくともバックグラウンドの２倍である。当業者は、別のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が、同様のストリンジェンシー条件を提供するために利用され得ることを容易に認識する。
【００７７】
「抗体」とは、抗原に特異的に結合しそしてそれを認識する、免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域を含むポリペプチド、もしくはそのフラグメントをいう。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、および種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、もしくはεとして分類され、これは、それぞれ、イムノグロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。
【００７８】
例示的免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含む。各テトラマーは、２つの同一なポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域を規定する。用語、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００７９】
抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとしてか、または種々のペプチダーゼによる消化によって生じる、多数の十分に特徴付けられたフラグメントとして、存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下で抗体を消化し、Ｆ（ａｂ）’２（Ｆａｂ（それ自体は、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合される軽鎖である）のダイマー）を産生する。Ｆ（ａｂ）’２は、温和な条件下で還元されてヒンジ領域におけるジスルフィド結合を壊し得、それによってＦ（ａｂ）’２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換する。Ｆａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年）を参照のこと）。種々の抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化に関して規定されるが、当業者は、このようなフラグメントは、化学的にかまたは組み換えＤＮＡ方法論を用いることによってのいずれかで新規に合成され得ることを理解する。従って、用語、抗体はまた、本明細書中で使用される場合、完全な抗体の改変によって産生される抗体フラグメント、組み換えＤＮＡ方法論を用いて新規に合成される抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ）か、またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定される抗体フラグメント（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照のこと）のいずれかを含む。
【００８０】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製のために、当該分野で公知の任意の技術が使用され得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、７７−９６頁、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）を参照のこと）。単鎖抗体の産生のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生するために適応され得る。また、トランスジェニックマウス、または他の生物（例えば、他の哺乳動物）が、ヒト化抗体を発現するために使用され得る。あるいは、ファージディスプレイ技術は、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびへテロマーＦａｂフラグメントを同定するために使用され得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２）を参照のこと）。
【００８１】
「キメラ抗体」は、抗体分子であり、ここで、（ａ）定常領域またはその部分は、変更、置換または交換され、その結果、抗原体結合部位（可変領域）は、異なるクラスまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、あるいは新規の特性をキメラ抗体に与える完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物など）に結合されるか；あるいは（ｂ）可変領域またはその部分は、異なる抗原特異性または変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換または交換される。
【００８２】
「抗ＩＲＡＫ−４」抗体は、ＩＲＡＫ−４の遺伝子、ｃＤＮＡまたはその部分配列によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントである。
【００８３】
用語「イムノアッセイ」は、抗原に特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、抗原を単離、標的化、および／または定量するための、特定の抗体の特異的結合特性の使用によって特徴付けられる。
【００８４】
抗体に「特異的（または選択的）に結合する」または「特異的に（または選択的に）免疫反応性の」という句は、タンパク質またはペプチドに言及する場合、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中のタンパク質の存在を決定する結合反応をいう。従って、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍にて特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質に有意な量で実質的には結合しない。このような条件下での抗体への特定の結合は、特定のタンパク質についてのその特異性について選択された抗体を必要とし得る。例えば、特定の種（例えば、ラット、マウスもしくはヒト）由来のＩＲＡＫ−４ポリペプチドに対して惹起されるポリクローナル抗体が、ＩＲＡＫ−４タンパク質と特異的に免疫反応性であるが他のタンパク質（ＩＲＡＫ−４タンパク質の多型改変体および対立遺伝子を除く）と免疫反応性でないポリクローナル抗体のみを得るように選択され得る。この選択は、他の種湯ラオのＩＲＡＫ−４分子と交差反応する抗体を差引くことによって達成され得る。種々の免疫アッセイ形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る（例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイの形式および条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ　＆　Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照のこと）。代表的に、特異的反応または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズのの少なくとも２倍であり、そしてより代表的には、バックグラウンドの１０〜１００倍より高い。
【００８５】
用語「選択的に会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ｗｉｔｈ）する」とは、上記で規定されるような、別の核酸と「選択的にハイブリダイズする」核酸の能力、または上記で規定されるような、タンパク質に「選択的（または特異的に）結合する」抗体の能力をいう。
【００８６】
「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、そして発現ベクターの複製または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物（例えば、酵母、昆虫、両生類または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａなど）、例えば、培養された細胞、外植片およびインビボの細胞）であり得る。
【００８７】
（ＩＩＩ．ＩＲＡＫ−４核酸の操作および検出）
本発明の多数の実施形態において、ＩＲＡＫ−４ポリペプチド（全長ＩＲＡＫ−４タンパク質、またはその任意の誘導体、改変体、ホモログもしくはフラグメントを含む）をコードする核酸が使用される。このような核酸は、多数の適用のため（ＩＲＡＫ−４タンパク質の生成のため、診断アッセイのため、治療適用のため、ＩＲＡＫ−４特異的プローブのため、ＩＲＡＫ−４結合化合物およびＩＲＡＫ−４調節化合物についてのアッセイのため、他の種からＩＲＡＫ−４ホモログを同定および／または単離するため、ならびに他の適用を含む）に有用である。
【００８８】
（Ａ．一般的組換えＤＮＡ方法）
本発明の多数の適用は、組換え遺伝学の分野における慣用技術を使用して実施され得る、核酸配列のクローニング、合成、維持、変異誘発、および他の操作を包含する。本発明における使用の一般的な方法を開示する基本書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。
【００８９】
核酸については、サイズが、キロベース（Ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで与えられる。これらは、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルの電気泳動由来、配列決定された核酸由来または公表されたＤＮＡ配列由来の見積もりである。タンパク質については、サイズはキロダルトン（ｋＤ）またはアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、誘導されたアミノ酸配列から、または公表されたタンパク質配列から見積もられる。
【００９０】
市販されていないオリゴヌクレオチドを、Ｖａｎ　Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載されるような自動化された合成機を使用して、Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２（１９８１）に最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成し得る。オリゴヌクレオチドの精製は、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動かまたはＰｅａｒｓｏｎ＆Ｒｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９（１９８３）に記載されるようなアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによる。
【００９１】
クローニングされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、Ｇｅｎｅ　１６：２１−２６（１９８１）の二本鎖テンプレートの配列決定についてのチェーンターミネーション法を使用してクローニング後に確認され得る。
【００９２】
（Ｂ．ＩＲＡＫ−４ヌクレオチド配列の単離および検出）
本発明の多数の実施形態において、ＩＲＡＫ−４核酸が、組換え方法を使用して単離およびクローニングされる。このような実施形態が、例えば、タンパク質発現のためにＩＲＡＫ−４ポリヌクレオチドを単離するため、またはＩＲＡＫ−４由来の改変体、誘導体、発現カセットもしくは他の配列の生成の間に、ＩＲＡＫ−４遺伝子発現をモニターするため、異なる種におけるＩＲＡＫ−４配列の単離もしくは検出のため、患者における診断目的のため、すなわち、ＩＲＡＫ−４における変異を検出するため、あるいは遺伝子型決定適用および／もしくは法医学的適用のために、使用される。
【００９３】
しばしば、ＩＲＡＫ−４タンパク質をコードする核酸配列および関連核酸配列ホモログは、プローブを用いるハイブリダイゼーションによってｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングされるか、あるいはオリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅技術を使用して単離される。例えば、ＩＲＡＫ−４配列は、代表的には、核酸プローブを用いてハイブリダイズすることによって哺乳動物核酸（ゲノムもしくはｃＤＮＡ）ライブラリーから単離され、その核酸プローブの配列は、配列番号２もしくは４に由来し得るか、または配列番号５および６を含むプライマーを使用して増幅され得る。ＩＲＡＫ−４のＲＮＡおよびｃＤＮＡが単離され得る適切な生物学的材料は、例えば、胸腺、脾臓、腎臓、胎盤、肺、肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、リンパ節、および扁桃である。
【００９４】
プライマーを使用する増幅技術もまた、ＤＮＡもしくはＲＮＡからＩＲＡＫ−４配列を増幅および単離するために使用され得る（例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｆａｃｈおよびＤｖｅｓｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ　Ｐｒｉｍａｅｒ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９９５）を参照のこと）。プライマーは、例えば、全長配列または１〜数百ヌクレオチドのプローブのいずれかを（例えば、配列番号５および６のように示されるプライマーを使用して）増幅するために、使用され得、それは次いで、全長ＩＲＡＫ−４クローンについて哺乳動物ライブラリーをスクリーニングするために使用される。
【００９５】
ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードする核酸はまた、プローブとして抗体を使用して、発現ライブラリーから単離され得る。このようなポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体は、配列番号１もしくは３の配列、またはその誘導体もしくはフラグメントを使用して惹起され得る。
【００９６】
ＩＲＡＫ−４遺伝子と実質的に同一である多型改変体、対立遺伝子および種間ホモログが、ＩＲＡＫ−４核酸プローブおよびオリゴヌクレオチドを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で使用して、ライブラリーをスクリーニングすることによって、単離され得る。あるいは、発現ライブラリーが、発現されたホモログをＩＲＡＫ−４ポリペプチドに対して生じた抗血清もしくは精製抗体（これはまた、ＩＲＡＫ−４ホモログを認識しそしてこれに特異的に結合する）を用いて免疫学的に検出することによって、ＩＲＡＫ−４多型改変体、対立遺伝子および種間ホモログをクローニングするために使用され得る。
【００９７】
より遠縁で関連したＩＲＡＫ−４ホモログは、多くの任意の周知技術を使用して同定され得る。この周知技術には、中程度にストリンジェントな条件を使用してかまたは低いストリンジェンシーの条件の下で、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーとＩＲＡＫ−４プローブをハイブリダイズさせることによるものを含む。また、遠縁のホモログは、特に、高度に保存されたアミノ酸ストレッチに基づいた縮重プライマーセット（すなわち、所定のアミノ酸配列をコードするすべての可能なコドンを組み込んだプライマー）を使用して、核酸ライブラリーから増幅され得る。このようなプライマーは、当業者に周知であり、そして縮重プライマー設計については多くのプログラムが利用可能である（例えば、インターネット上において）。
【００９８】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、ＩＲＡＫ−４　ｍＲＮＡの豊富な供給源（例えば、胸腺、脾臓、腎臓、胎盤、肺、肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、リンパ節または扁桃から単離された細胞）が選択されるべきである。次いで、ｍＲＮＡを、逆トランスクリプターゼを使用してｃＤＮＡにし、組換えベクターに連結し、そして増殖、スクリーニング、およびクローニングのために組換え宿主中にトランスフェクトする。ｃＤＮＡライブラリーを作製する方法およびスクリーニングする方法は周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ　２５：２６３−２６９（１９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら，前出；Ａｕｓｕｂｅｌら，前出を参照のこと）。
【００９９】
ゲノムライブラリーについては、ＤＮＡを組織または細胞から抽出し、そして機械的に剪断するかまたは酵素学的に消化するかのいずれかにより約１２〜２０ｋｂのフラグメントを産生する。次いで、このフラグメントを、勾配遠心によって所望されないサイズから分離し、そしてバクテリオファージλベクター中に構築する。これらのベクターおよびファージを、インビトロでパッケージングする。組換えファージを、Ｂｅｎｔｏｎ＆Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８０−１８２（１９７７）に記載されるようなプラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロニーハイブリダイゼーションを、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７２：３９６１−３９６５（１９７５）に一般的に記載されたように実施する。
【０１００】
ＩＲＡＫ−４核酸およびそのホモログを単離する代替的方法は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用と、ＲＮＡまたはＤＮＡテンプレートの増幅とを組み合わせる（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編，１９９０）を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような方法を使用して、ｍＲＮＡからか、ｃＤＮＡからか、ゲノムライブラリーからか、またはｃＤＮＡライブラリーから直接的に、ＩＲＡＫ−４遺伝子の核酸配列を増幅し得る。縮重オリゴヌクレオチドは、本明細書中に提供される配列を使用して、ＩＲＡＫ−４ホモログを増幅するように設計され得る。制限エンドヌクレアーゼ部位が、このプライマーに組み込まれ得る。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅方法もまた、例えば、発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローン化するために、生理学的サンプル中においてＩＲＡＫ−４をコードするｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用される核酸を作製するために、核酸配列決定のために、または他の目的のために有用であり得る。ＰＣＲ反応によって増幅された遺伝子は、アガロースゲルから精製され得、そして適切なベクター中にクローン化され得る。
【０１０１】
合成オリゴヌクレオチドを使用して、プローブとして使用するためかまたはタンパク質発現のための組換えＩＲＡＫ−４遺伝子を構築し得る。この方法は、この遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の両方を表す、通常４０〜１２０ｂｐ長の一連の重複オリゴヌクレオチドを使用して実施される。次いで、これらのＤＮＡフラグメントをアニールし、連結し、そしてクローン化する。あるいは、正確なプライマーを用いて増幅技術を使用し、ＩＲＡＫ−４核酸の特定の部分配列を増幅し得る。次いで、この特定の部分配列を発現ベクター中に連結する。
【０１０２】
ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードする核酸は代表的に、複製および／または発現のために原核生物細胞または真核生物細胞中に形質転換される前に、中間体ベクター中にクローン化される。これらの中間体ベクターは、代表的に、原核生物ベクター（例えば、プラスミドまたはシャトルベクター）である。ベクター、細胞、およびトランスフェクション方法は、当業者に周知であり、そして例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＳａｍｂｒｏｏｋ（共に前出）に記載される。
【０１０３】
必要に応じて、異種ポリペプチド（１つまたは複数）との組み合わせにおいてＩＲＡＫ−４ポリペプチドまたはそのドメインを含むキメラタンパク質をコードする核酸を使用する。例えば、Ｎ末端「死の」ドメイン、中心キナーゼドメイン、または１２個の保存されたキナーゼドメインのいずれかのようなドメインが、異種膜貫通ドメインまたは異種細胞外ドメインのような異種タンパク質に共有結合的に連結され得る。選り抜きの他の異種タンパク質としては、例えば、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびβ−ｇａｌ（これらの各々は、当該分野において周知である）が挙げられる。
【０１０４】
特定の実施形態では、ＩＲＡＫ−４ポリヌクレオチドは、例えば、ＩＲＡＫ−４　ＲＮＡレベルを決定するためか、または例えば、遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）または法医学的適用のために特定のＤＮＡ配列を検出するために、ハイブリダイゼーションに基づく方法を使用して検出される。例えば、ＩＲＡＫ−４の遺伝子発現を、当該分野において公知の技術（例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロッティング、逆転写および増幅、ドットブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、ＤＮＡマイクロチップアレイのプロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ　ＤＮＡ　ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ　ａｒｒａｙ）など）によって分析し得る。１つの実施形態では、高密度オリゴヌクレオチド分析技術（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ）を使用して、ＩＲＡＫ−４のホモログおよび多型性改変体を同定するか、またはＩＲＡＫ−４　ｍＲＮＡのレベルをモニターする。ホモログが既知の疾患と関連付けられる場合、これらを、生物学的サンプル中においてこの疾患を検出する際の診断用ツールとして、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭと共に使用し得る。例えば、Ｇｕｎｔｈａｎｄら，ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１４：８６９−８７６（１９９８）；Ｋｏｚａｌら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９（１９９６）；Ｍａｔｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：１１０−１０６（１９９５）；Ｌｏｃｋｈａｒｔら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１６７５−１６８０（１９９６）；Ｇｉｎｇｅｒａｓら，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．８：４３５−４４８（１９９８）；Ｈａｃｉａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２６：３８６５−３８６６（１９９８）を参照のこと。
【０１０５】
特定の適用では、ＩＲＡＫ−４核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を、診断的適用または法医学的適用のために検出する。例えば、ＩＲＡＫ−４対立遺伝子は、サザンブロットハイブリダイゼーションを使用して（すなわち、ゲノムＤＮＡを単離し、単離されたＤＮＡに対して制限消化を実施し、電気泳動的に（例えば、アガロースゲルにおいて）制限フラグメントを分離し、そして分離されたＤＮＡをメンブレンに転写し、そして標識された特定の配列を用いて探索することによって）、哺乳動物において検出され得る。サザンブロッティングは、当業者に周知であり、そして多数の情報源（Ａｕｓｕｂｅｌら、およびＳａｍｂｒｏｏｋらを含む）において教示される。
【０１０６】
他の実施形態では、例えば、遺伝子発現の組織特異的パターンまたは時間的パターンを検出するために、インサイチュハイブリダイゼーションを使用して、ＩＲＡＫ−４ポリヌクレオチドを検出する。インサイチュハイブリダイゼーションでは、以後の解釈および分析のために細胞の形態を保持しつつ、細胞内でのハイブリダイゼーションに利用可能なように、標的核酸をその細胞の周辺物から遊離させる。以下の文献は、インサイチュハイブリダイゼーションの分野の概説を提供する：Ｓｉｎｇｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２３０−２５０（１９８６）；Ｈａａｓｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第ＶＩＩ巻，第１８９−２２６頁（１９８４）；およびＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｈａｍｅｓら編、１９８７）。
【０１０７】
（Ｃ．原核生物および真核生物における発現）
しばしば、クローン化されたＩＲＡＫ−４配列は、発現（すなわち、コードされたｍＲＮＡまたはタンパク質の産生）を得るために、原核生物細胞または真核生物細胞中において発現される。例えば、多数の実施形態において、ＩＲＡＫ−４ポリヌクレオチドは、細胞中に導入されて、その細胞のＩＲＡＫ−４活性レベルを調節し、そしてそれによって、患者の細胞内におけるＩＬ−１、ＩＬ−１８、またはＬＰＳシグナル伝達のレベルを調節する。クローン化された遺伝子または核酸（例えば、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ）の高レベル発現を得るために、ＩＲＡＫ−４配列は代表的に、転写を指示するための強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、そしてタンパク質をコードする核酸の場合には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクター中にサブクローン化される。適切な細菌性プロモーターは、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌらに記載される。ＩＲＡＫ−４タンパク質を発現する細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａら，Ｇｅｎｅ　２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ　３０２：５４３−５４５（１９８３）。このような発現系についてのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞についての真核生物発現系は、当該分野において周知であり、そしてまた市販されている。１つの実施形態では、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
【０１０８】
治療的適用のために、ＩＲＡＫ−４核酸は、ウイルスベクターによる感染、リポソームに基づく方法、微粒子加速（遺伝子銃）、および裸のＤＮＡの注入を含むがこれらに限定されない多数の方法のいずれかを使用して、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで細胞中に導入される。このような治療的に有用な核酸としては、全長ＩＲＡＫ−４についてのコード配列、ＩＲＡＫ−４のフラグメント、ドメイン、誘導体、または改変体についてのコード配列、ＩＲＡＫ−４アンチセンス配列、およびＩＲＡＫ−４リボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。代表的に、このような配列は、プロモーターに作動可能に連結されるが、多数の適用では、それ自体が直接的に治療的に有効な核酸（例えば、特定のアンチセンスまたはリボザイム分子）が細胞に投与される。
【０１０９】
異種核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。プロモーターは、必要に応じて、それが、その天然の設置条件において転写開始部位からあるのとほぼ同じ距離で、異種転写開始部位から位置付けられる。しかし、当該分野において公知なように、この距離におけるいくつかのバリエーションが、プロモーターの機能を損失させることなく適合され得る。
【０１１０】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的に、転写単位、または宿主細胞中におけるＩＲＡＫ−４コード核酸の発現のために必要とされるすべてのさらなるエレメントを含む発現カセットを含む。従って、代表的な発現カセットは、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに転写、リボソーム結合部位および翻訳終結の効率的なポリアデニル化のために必要とされるシグナルに作動可能に連結されたプロモーターを含む。ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードする核酸配列は、切断可能なシグナルペプチド配列に連結されて、トランスフェクトされた細胞によるコードタンパク質の分泌を促進し得る。このようなシグナルペプチドとしては、とりわけ、組織プラスミノゲンアクチベーター、インスリン、およびニューロン増殖因子、ならびにＨｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの若年性ホルモンエステラーゼ由来のシグナルペプチドが挙げられる。カセットのさらなるエレメントとしては、エンハンサー、およびゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合には、機能的なスプライスドナーおよびアクセプター部位を有するイントロンが挙げられ得る。
【０１１１】
プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含むべきである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られても、異なる遺伝子から得られてもよい。
【０１１２】
細胞中に遺伝情報を運ぶために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核生物細胞または原核生物細胞における発現のために使用される、任意の従来のベクターが使用され得る。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミド，ｐＳＫＦ，ｐＥＴ２３Ｄのようなプラスミド、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺのような融合発現系が挙げられる。エピトープタグもまた組換えタンパク質に付加されて、簡便な単離方法を提供し得る（例えば、ｃ−ｍｙｃ，ＨＡ−タグ，６−Ｈｉｓタグ，マルトース結合タンパク質，ＶＳＶ−Ｇタグ，抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ、または任意のこのようなタグ；これらの多くが、当業者に周知である）。
【０１１３】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターが、代表的に、真核生物発現ベクターにおいて使用される（例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ，ｐＡＶ００９／Ａ＋，ｐＭＴＯ１０／Ａ＋，ｐＭＡＭｎｅｏ−５，バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現のために有効であることが示されている他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【０１１４】
いくつかの発現系は、遺伝子増幅を提供するマーカー（例えば、ネオマイシン、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびデヒドロフォレートレダクターゼ）を有する。あるいは、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下でＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードする配列を有する、遺伝子増幅には関与しない高収率発現系（例えば、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用する）もまた適切である。
【０１１５】
発現ベクター中に典型的に含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物配列の挿入を可能にするための、プラスミドの非必須領域における固有の制限部位が挙げられる。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当該分野において公知の多くの任意の耐性遺伝子が適切である。原核生物配列が、必要に応じて選択され、その結果、それらは、必要な場合に真核生物細胞中におけるＤＮＡの複製を妨げない。
【０１１６】
標準的なトランスフェクション方法を使用して、多量のＩＲＡＫ−４タンパク質を発現する細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株、または昆虫細胞株を産生し、次いで、ＩＲＡＫ−４タンパク質を標準的な技術を使用して精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）；Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，１９９０）を参照のこと）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１：３４７−３６２（Ｗｕら編、１９８３を参照のこと）。
【０１１７】
外来のヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するための任意の周知手順を使用して、発現ベクターを導入し得る。これらの手順としては、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）のような試薬の使用、リポソーム、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微量注入、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子加速（遺伝子銃）、またはクローン化されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡもしくは他の外来の遺伝物質を宿主細胞中に導入するための任意の他の周知の方法が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出、を参照のこと）。使用される特定の遺伝子操作手順は、ＩＲＡＫ−４遺伝子を発現し得る宿主細胞中に少なくとも１つの遺伝子を首尾よく導入し得ることのみが必要とされる。
【０１１８】
発現ベクターが細胞中に導入された後に、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドの発現に有利な条件下でトランスフェクトされた細胞を培養し、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドを、以下に同定される標準的な技術を使用して、培養物から回収する。原核生物細胞または真核生物細胞を培養する方法は周知であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，およびＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ，第３版，（１９９３），Ａ　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎに教示される。
【０１１９】
（ＩＶ．ＩＲＡＫ−４ポリペプチドの精製）
天然に存在するＩＲＡＫ−４ポリペプチドまたは組換えＩＲＡＫ−４ポリペプチドのいずれかが、機能的アッセイ、結合アッセイ、診断的アッセイ、および他の適用において使用するために精製され得る。必要に応じて、組換えＩＲＡＫ−４ポリペプチドが精製される。天然に存在するＩＲＡＫ−４ポリペプチドは、例えば、哺乳動物組織（例えば、胸腺、脾臓、腎臓、胎盤、肺、肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、リンパ節および扁桃）またはＩＲＡＫ−４ホモログの任意の他の供給源から精製される。組換えＩＲＡＫ−４ポリペプチドは、任意の適切な細菌発現系または真核生物発現系（例えば、ＣＨＯ細胞または昆虫細胞）から精製される。
【０１２０】
ＩＲＡＫ−４タンパク質は、標準的な技術（硫安のような物質を用いる選択的沈殿；カラムクロマトグラフィー、免疫沈降法など（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら，前出；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，前出、を参照のこと）を含む）によって、実質的に純粋なまでに精製され得る。
【０１２１】
多くの手順が、組換えＩＲＡＫ−４ポリペプチドを精製する場合に使用され得る。例えば、確証された分子接着特性を有するタンパク質が、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドに対して可逆的に融合され得る。適切なリガンドを用いて、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドが、精製カラムに選択的に吸着され得、次いで、比較的純粋な形態でこのカラムから遊離され得る。次いで、融合タンパク質は、酵素学的活性によって回収される。ＩＲＡＫ−４タンパク質はまた、免疫親和性カラムを使用して精製され得る。
【０１２２】
（Ａ．組換え細胞からのＩＲＡＫ−４タンパク質の精製）
組換えタンパク質を、代表的にプロモーター誘導後（しかし、発現は構成的であり得る）に、形質転換された細菌または真核生物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞または昆虫細胞）によって多量に発現させる。ＩＰＴＧを用いるプロモーター誘導は、誘導性プロモーター系の一例である。細胞を、当該分野で標準的な手順に従って増殖する。新鮮な細胞または凍結された細胞を、タンパク質の単離のために使用する。
【０１２３】
細菌において発現されたタンパク質は、不溶性凝集体（「封入体」）を形成し得る。いくつかのプロトコールが、ＩＲＡＫ−４封入体の精製のために適切である。例えば、封入体の精製は、代表的に、例えば、５０ｍＭ　ＴＲＩＳ／ＨＣＬ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＤＴＴ，０．１ｍＭ　ＡＴＰ，および１ｍＭ　ＰＭＳＦの緩衝液中でのインキュベーションによって細菌細胞を破壊することによる、封入体の抽出、分離、および／または精製を包含する。細胞懸濁物を、フレンチプレスに２〜３回通過させることにより溶解し得、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してホモジネートし得、そして氷上で音波破砕し得る。細菌を溶解する代替方法は、当業者に明らかである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；Ａｕｓｕｂｅｌら，前出、を参照のこと）。
【０１２４】
必要に応じて、封入体を可溶化し、そして溶解された細胞懸濁物を、代表的に遠心分離して、望ましくない不溶性物質を取り除く。封入体を形成したタンパク質を、適合性の緩衝液を用いる希釈または透析によって再生し得る。適切な溶媒としては、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、容量／容量基準）および塩酸グアニジン（約４Ｍ〜約８Ｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。凝集体形成タンパク質を可溶化し得るいくつかの溶媒（例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および７０％ギ酸）は、免疫原性および／または活性の損失を伴うタンパク質の不可逆的変性の可能性が理由で、この手順において使用するには不適切である。塩酸グアニジンおよび類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、そして変性剤の除去（例えば、透析による）または希釈に際して再生が生じ得、免疫学的および／または生物学的に活性なタンパク質の再形成を可能にする。他の適切な緩衝液は、当業者に公知である。ＩＲＡＫ−４ポリペプチドは、標準的な分離技術（例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を用いる）によって、他の細菌性タンパク質から分離される。
【０１２５】
あるいは、細菌のペリプラズムからＩＲＡＫ−４ポリペプチドを精製することが可能である。ＩＲＡＫ−４タンパク質が細菌のペリプラズム中に運ばれる場合、細菌の溶解後に細菌のペリプラズム画分を、当業者に公知の他の方法に加えて冷浸透圧ショックによって単離し得る。ペリプラズムから組換えタンパク質を単離するために、細菌細胞を遠心分離してペレットを形成する。このペレットを、２０％スクロースを含有する緩衝液中に再懸濁する。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、そしてこのペレットを氷冷５ｍＭ　ＭｇＳＯ４中に再懸濁し、そして約１０分間、氷浴中に維持する。この細胞懸濁物を遠心分離し、そしてこの上清をデカントし、そして保存する。この上清中に存在する組換えタンパク質を、当業者に周知の標準的な分離技術によって、宿主タンパク質から分離し得る。
【０１２６】
（Ｂ．ＩＲＡＫ−４ポリペプチドを精製するための標準的なタンパク質分離技術）
（１．溶解度分画）
しばしば最初の工程として、特にタンパク質混合物が複合体である場合に、最初の塩類画分は、多くの望ましくない宿主細胞タンパク質（または、細胞培養培地由来のタンパク質）を目的の組換えタンパク質から分離し得る。好ましい塩類は、硫安である。硫安は、タンパク質混合物中の水分量を効率的に減少させることによって、タンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質を、その溶解度に基づいて沈殿させる。タンパク質が疎水性になるにつれて、より低い硫安濃度で沈殿する可能性が高まる。代表的なプロトコールは、結果として生じる硫安濃度が２０〜３０％の間であるように、飽和硫安をタンパク質溶液に添加することを包含する。この濃度は、大半の疎水性タンパク質を沈殿させる。次いで、沈殿物を捨て（目的のタンパク質が疎水性でない限り）、そして目的のタンパク質を沈殿させることが既知の濃度まで、硫安を上清に添加する。次いで、沈殿物を緩衝液中に溶解し、そして必要に応じて、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかを通して、過剰な塩類を取り除く。タンパク質の溶解度に依存する他の方法（例えば、冷エタノール沈殿）は、当業者に周知であり、そして複合体タンパク質混合物を分画するために使用され得る。
【０１２７】
（２．サイズ識別濾過）
ＩＲＡＫ−４タンパク質の分子量を使用して、異なる孔サイズのメンブレン（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅメンブレン）を通した限外濾過を用いて、ＩＲＡＫ−４タンパク質を、より大きなサイズおよびより小さなサイズのタンパク質から単離し得る。最初の工程として、タンパク質混合物を、目的のタンパク質の分子量よりも低い分子量カットオフを有する孔サイズを有するメンブレンを通して限外濾過する。次いで、この限外濾過の滞留物を、目的のタンパク質の分子量よりも高い分子カットオフを有するメンブレンに対して限外濾過する。組換えタンパク質を、メンブレンを通して濾液中に通過させる。次いで、濾液を以下に記載のようにクロマトグラフし得る。
【０１２８】
（３．カラムクロマトグラフィー）
ＩＲＡＫ−４タンパク質をまた、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、および異種分子に対する親和性に基づいて、他のタンパク質から分離し得る。さらに、タンパク質に対して惹起された抗体を、カラムマトリクスに対して結合体化し得、そしてタンパク質を免疫精製し得る。これらのすべての方法が当該分野において周知である。クロマトグラフィー技術が、任意の規模で、そして多くの異なる製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）からの機器を使用して実施され得ることが、当業者に明らかである。
【０１２９】
（Ｖ．ＩＲＡＫ−４ファミリーメンバーに対する抗体）
本発明の多数の実施形態において、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドに特異的に結合する抗体が使用される。このような抗体は、多数の適用（ＩＲＡＫ−４活性の調節のため、ならびに、ＩＲＡＫ−４、およびＩＲＡＫ−４の改変体、誘導体、フラグメントなどを検出するためのイムノアッセイのための適用を含む）を有する。イムノアッセイを使用して、定性的または定量的にＩＲＡＫ−４ポリペプチドを分析し得る。適用可能な技術の一般的な概説は、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８８）において見出され得る。
【０１３０】
ＩＲＡＫ−４ポリペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，前出；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）；およびＫｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５）を参照のこと）。このような技術としては、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体調製、ならびにウサギまたはマウスを免疫することによるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製が挙げられる（例えば、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ　３４１：５４４−５４６（１９８９）を参照のこと）。
【０１３１】
多くのＩＲＡＫ−４を含む免疫原を使用して、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドと特異的に反応する抗体を産生し得る。例えば、組換えＩＲＡＫ−４タンパク質またはその抗原性フラグメントが、本明細書に記載のように単離される。組換えタンパク質は、上記のように真核生物細胞または原核生物細胞において発現され得、そして一般的に上記のように精製され得る。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生のために好ましい免疫原である。あるいは、本明細書中に開示された配列由来の合成ペプチドおよびキャリアタンパク質に結合体化された合成ペプチドが、免疫原として使用され得る。天然に存在するタンパク質もまた、純粋形態または不純形態のいずれかで使用され得る。次いで、産物が、抗体を産生し得る動物に注射される。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかが、タンパク質を測定するためのイムノアッセイにおいて引き続き使用するために、生成され得る。
【０１３２】
ポリクローナル抗体の産生方法は、当業者に公知である。マウス（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはウサギの近交系に、標準的なアジュバント（例えば、フロイントアジュバント）および標準的な免疫プロトコールを使用して、タンパク質で免疫する。免疫原調製物に対するこの動物の免疫応答を、試験採血し、そしてＩＲＡＫ−４ポリペプチドに対する反応性力価を決定することによってモニターする。免疫原に対して適切に高力価の抗体が得られた場合、この動物から血液を収集し、そして抗血清を調製する。タンパク質に対して反応性の抗体を富化するための抗血清のさらなる分画を、所望される場合に実施し得る（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，前出、を参照のこと）。
【０１３３】
モノクローナル抗体が、当業者が精通している種々の技術によって得られ得る。要するに、所望の抗原で免疫された動物由来の脾臓細胞を、通常、ミエローマ細胞との融合によって、不死化する（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１〜５１９（１９７６）を参照のこと）。不死化の別の方法としては、エプスタイン−バーウイルス、癌遺伝子、もしくはレトロウイルスでの形質転換、または当該分野で周知の他の方法が挙げられる。単一の不死化細胞から得られたコロニーは、この抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングされ、そしてこのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収率は、種々の技術（脊椎動物宿主の腹膜腔への注射を含む）によって増強され得る。あるいは、当業者は、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）によって概説される一般的プロトコールに従って、ヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離し得る。
【０１３４】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を、収集し、そしてイムノアッセイ（免疫アッセイ）（例えば、固体支持体上に固定された免疫原を用いた固相イムノアッセイ）において、免疫原タンパク質に対して力価測定する。代表的には、１０４以上の力価を有するポリクローナル抗血清を、非−ＩＲＡＫ−４タンパク質に対して、または他の生物体由来の関連タンパク質に対しても、その交差反応性について、競合結合イムノアッセイを用いて、選択および試験する。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約０．１ｍＭ、より通常には少なくとも約１μＭ、必要に応じて、少なくとも約０．１μＭ以上、そして必要に応じて０．０１μＭ以上のＫｄで結合する。
【０１３５】
ＩＲＡＫ−４−特異的抗体を用いて、個々のＩＲＡＫ−４タンパク質が、種々のイムノアッセイ法で検出され得る。免疫学的およびイムノアッセイ手順の概説については、Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照のこと。さらに、本発明のイムノアッセイは、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ、編、１９８０）；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前出）において広範に概説されている、いくつかの任意の構成で実施され得る。
【０１３６】
（Ａ．免疫学的結合アッセイ）
ＩＲＡＫ−４タンパク質は、任意の多数の、十分に認識されている免疫学的結合アッセイを用いて検出、および／または定量され得る（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；および同第４，８３７，１６８号を参照のこと）。一般的イムノアッセイの概説については、以下も参照のこと：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３７巻（Ａｓａｉ編、１９９３）；Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＳｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ，編、第７版、１９９１）。免疫学的結合アッセイ（すなわちイムノアッセイ）は、代表的に、選り抜きのタンパク質または抗原に特異的に結合する抗体を使用する（ＩＲＡＫ−４タンパク質またはその抗原性小配列の場合）。抗体（例えば、抗ＩＲＡＫ−４）は、当業者に周知のそして上記の任意の多くの手段によって産生され得る。
【０１３７】
イムノアッセイはまた、抗体および抗原によって形成された複合体に特異的に結合し、そして標識するための標識剤をしばしば使用する。この標識剤は、それ自体が、抗体／抗原複合体を含む部分の１つであり得る。従って、標識剤は、標識されたＩＲＡＫ−４ポリペプチドまたは標識された抗ＩＲＡＫ−４抗体であり得る。あるいは、この標識剤は、二次抗体のような第３部分であり得、これは、抗体／ＩＲＡＫ−４複合体に特異的に結合する（二次抗体は代表的に、一次抗体が由来する標品の抗体に特異的である）。免疫グロブリン定常領域に特異的に結合し得る他のタンパク質（例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ）はまた、標識剤として用いられ得る。これらのタンパク質は、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域と強力な非免疫原性反応性を示す（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１〜１４０６（１９７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９〜２５４２（１９８５））。この標識剤は、検出可能部分（例えば、ビオチン）で改変され得る。この検出可能部分に対して、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）が特異的に結合し得る。種々の検出可能部分が、当業者に周知である。
【０１３８】
アッセイを通じて、インキュベーション工程および／または洗浄工程が、試薬の各組み合わせ後に必要とされ得る。インキュベーション工程は、約５秒〜数時間、必要に応じて、約５分〜約２４時間にわたって変化し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ様式、抗原、溶液の用量、濃度などに依存する。通常、このアッセイは、環境温度で実行されるが、それらは、１０〜４０℃のような温度の範囲を超えて実施され得る。
【０１３９】
（１．非競合的アッセイ様式）
サンプル中のＩＲＡＫ−４タンパク質を検出するためのイムノアッセイは、競合的または非競合的のいずれかであり得る。非競合的イムノアッセイは、抗原の量が直接測定されるアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、例えば、抗ＩＲＡＫ−４抗体が、固体基板に直接結合され得、ここでこの抗体は固定される。次いでこれらの固定された抗体は、試験サンプル中に存在するＩＲＡＫ−４タンパク質を捕獲する。従って、ＩＲＡＫ−４タンパク質は、固定され、次いで標識剤（例えば、標識を保有する二次ＩＲＡＫ−４抗体）によって結合される。あるいは、二次抗体は、標識を欠失し得るが、しかし、次に、それは標品の抗体に特異的な標識された三次抗体（二次抗体が由来する）に結合され得る。二次抗体および三次抗体は代表的に、検出可能部分（例えば、ビオチン）で改変され得る。この検出可能部分に対して別の分子（例えば、ストレプトアビジン）が特異的に結合し、検出可能部分を提供する。
【０１４０】
（２．競合アッセイ様式）
競合アッセイにおいて、サンプル中に存在するＩＲＡＫ−４タンパク質の量は、サンプル中に存在する未知のＩＲＡＫ−４タンパク質によって、抗ＩＲＡＫ−４抗体から（競合的様式で）置換された、既知の、添加された（外因性）ＩＲＡＫ−４タンパク質の量を測定することによって間接的に測定される。競合的アッセイの１つにおいて、既知の量のＩＲＡＫ−４タンパク質がサンプルに加えられ、次いでこのサンプルが、ＩＲＡＫ−４タンパク質の特異的に結合する抗体に接触される。この抗体に結合した外因性ＩＲＡＫ−４タンパク質の量は、このサンプル中に存在するＩＲＡＫ−４タンパク質の濃度に反比例する。特に好ましい実施形態において、この抗体は、固体基板に結合される。この抗体に結合したＩＲＡＫ−４タンパク質の量は、ＩＲＡＫ−４／抗体複合体中に存在するＩＲＡＫ−４タンパク質の量を測定するか、または残りの非複合体化タンパク質の量を測定するかのいずれかによって、決定され得る。ＩＲＡＫ−４タンパク質の量は、標識されたＩＲＡＫ−４分子を提供することによって検出され得る。
【０１４１】
ハプテン阻害アッセイは、別の好ましい競合アッセイである。このアッセイにおいて、既知のＩＲＡＫ−４タンパク質は、固体基板上に固定される。既知の量の抗ＩＲＡＫ−４抗体が、このサンプルに添加され、次いで、このサンプルは、固定されたＩＲＡＫ−４と接触される。既知の固定されたＩＲＡＫ−４タンパク質に結合した抗−ＩＲＡＫ−４抗体の量は、このサンプル中に存在するＩＲＡＫ−４タンパク質の量と反比例する。再度、固定された抗体の量は、抗体の固定された画分、または溶液中に残っている抗体の画分のいずれかを検出することによって検出され得る。検出は、抗体が標識される場合、直接的であり得るか、または標識部分（上記のように抗体に特異的に結合する）のさらなる付加によって間接的であり得る。
【０１４２】
（３．交差反応性決定）
競合結合様式におけるイムノアッセイがまた、交差反応性決定のために用いられ得る。例えば、配列番号２または４によって少なくとも部分的にコードされるタンパク質は、固体支持体に固定され得る。タンパク質（例えば、ＩＲＡＫ−４タンパク質およびホモログ）がこのアッセイに添加され、これは、固定された抗原に対するこの抗血清の結合について競合する。この添加されたタンパク質が、固定されたタンパク質に対する抗血清の結合について競合する能力を、配列番号２または４にコードされるＩＲＡＫ−４ポリペプチドがそれ自体と競合する能力と比較する。上記のタンパク質についての交差反応性パーセントを、標準的な計算を用いて計算する。上記列挙される各々の添加されたタンパク質との交差反応性が１０％未満である抗血清を選択してプールする。この交差反応する抗体は、添加された考慮されたタンパク質（例えば、縁の遠いホモログ（相同体））との免疫吸着によって、プールされた抗血清から必要に応じて取り出される。
【０１４３】
次いで、免疫吸着されそしてプールされた抗血清を、上記の競合結合イムノアッセイにおいて用いて、二次タンパク質（ＩＲＡＫ−４タンパク質の対立遺伝子改変体または多形性改変体であるとおそらく考えられる）と免疫原タンパク質（すなわち、配列番号２または４によってコードされるＩＲＡＫ−４タンパク質）を比較する。この比較をなすため、２つのタンパク質を広範な濃度で各々アッセイし、そして固定されたタンパク質に対する抗血清の結合を５０％阻害するのに必要な各タンパク質の量を決定する。結合の５０％阻害に必要な二次タンパク質の量は、結合の５０％を阻害するのに必要な、配列番号２または４によってコードされるタンパク質の１０分の１未満の量であり、次いで、二次タンパク質は、ＩＲＡＫ−４免疫原に対して生成されたポリクローナル抗体に特異的に結合すると言われる。
【０１４４】
特定の種由来のＩＲＡＫ−４タンパク質に特異的に結合するポリクローナル抗体は、ＩＲＡＫ−４ホモログ（相同体）を用いて交差反応性抗体を取り去る（サブトラクトする）ことによってなされ得る。例えば、ヒトＩＲＡＫ−４（配列番号１）に特異的な抗体は、マウスＩＲＡＫ−４（配列番号３）と交差反応性である抗体を差し引き（サブトラクト）することによってなされ得る。類似の様式で、特定のＩＲＡＫ−４タンパク質に特異的な抗体は、複数のＩＲＡＫ−４遺伝子を有する生物体において得られ得る。
【０１４５】
（４．他のアッセイ様式）
ウエスタンブロット（イムノブロット）分析を用いて、サンプル中のＩＲＡＫ−４タンパク質の存在を検出および定量する。この技術は、一般に、分子量に基づくゲル電気泳動によってサンプルタンパク質を分離する工程、分離されたタンパク質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルター）に転写する工程、およびＩＲＡＫ−４タンパク質に特異的に結合する抗体とともにこのサンプルをインキュベートする工程、を包含する。抗ＩＲＡＫ−４ポリペプチド抗体は、この固体支持体上のＩＲＡＫ−４ポリペプチドに特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識され得るか、または抗ＩＲＡＫ−４抗体に特異的に結合する標識抗体（例えば、標識化ヒツジ抗マウス抗体）を用いて引き続き検出され得る。
【０１４６】
他のアッセイ様式は、リポソーム免疫アッセイ（ＬＩＡ）を含む。このアッセイは、特定の分子（例えば、抗体）に結合し、カプセル化された試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを用いる。次いで、この放出された化学物質は、標準的方法に従って検出される（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４〜４１（１９８６）を参照のこと）。
【０１４７】
（５．非特異的結合の減少）
当業者は、イムノアッセイにおいて非特異的結合を最小化することがしばしば所望されることを理解する。詳細には、アッセイが固体基板上に固定された抗原または抗体を含む場合、この基板に対する非特異的結合の量を最小化することが所望され得る。このような非特異的結合を減少する手段は、当業者に周知である。代表的には、この技術は、タンパク質性組成物を用いた基板のコーティングを包含する。詳細には、タンパク質組成物（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、脱脂粉乳、およびゼラチン）が、広範に用いられるが、粉乳が最も好ましい。
【０１４８】
（６．標識）
このアッセイにおいて用いられる特定の標識または検出可能基は、それが、このアッセイにおいて用いられる抗体の特異的結合を有意に妨害しない限り、本発明の重大な局面ではない。検出可能基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質であり得る。このような検出可能標識は、イムノアッセイの分野で十分開発されており、そして一般にこのような方法において有用な任意の標識のほとんどが、本発明に適用され得る。従って、標識は、分光光学的手段、光化学物質手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識としては、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで共通して用いられる他のもの）、ならびに比色標識（例えば、コロイド金、または色ガラス）、またはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ラテックスなど）が挙げられる。
【０１４９】
標識は、当該分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の成分に対して直接または間接的に結合され得る。上記のように、広範な種々の標識が、用いられ得る。これは、必要な感度、化合物との結合体化の容易さ、安定性要件、利用可能な装置、および廃棄可能な設備に依存した標識の選択をともなう。
【０１５０】
非放射活性標識は、しばしば間接的な手段によって結合される。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、この分子に共有結合される。このリガンドは、次いで、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合し、これは、固有に検出可能であるかまたはシグナル系（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物）に共有結合されるかのいずれかである。このリガンドおよびこれらの標的は、ＩＲＡＫ−４タンパク質を認識する抗体、または抗ＩＲＡＫ−４を認識する第二の抗体との任意の適切な組合せで使用され得る。
【０１５１】
この分子はまた、シグナル発生化合物（例えば、酵素または発蛍光団との結合により）に直接結合され得る。標識として目的の酵素は、主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシダーゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物として、フルオレセインおよびその誘導体、ロドサミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）などが挙げられる。化学発光化合物として、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタルアジンジオン（例えば、ルミノール）が挙げられる。使用され得る種々の標識化またはシグナル生成系のレビューについては、例えば、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
【０１５２】
標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射活性標識である場合、検出手段として、シンチレーションカウンターまたはオートラジオフラフィーにおける写真用フィルムが挙げられる。標識が、蛍光標識である場合、適切な光波長を用いて蛍光色素を励起すること、および生じる蛍光を検出することによって検出され得る。この蛍光は、写真用フィルムの手段によって、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子倍増などのような電気的検出器の使用によって、可視的に検出され得る。同様に、酵素標識は、この酵素の適切な基質を提供すること、そして生じる反応産物を検出することによって検出され得る。最後に、単純な比色標識は、標識に結合した色素を観察することにより単純に検出され得る。従って、種々のディップスティックアッセイ（ｄｉｐｓｔｉｃｋ　ａｓｓａｙ）において、結合された金は、しばしばピンク色を示し、一方、種々の結合されたビーズは、このビーズの色を示す。
【０１５３】
いくつかのアッセイ型式は、標識された成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイを使用して、標的抗体の存在を検出し得る。この場合において、抗原でコーティングされた粒子は、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この型式において、いずれの成分も標識化される必要がなく、そして標的抗体の存在が、単純な可視的検査によって検出される。
【０１５４】
（ＶＩ．細胞中のＩＲＡＫ−４活性を調節する）
（Ａ．ＩＲＡＫ−４タンパク質の調節因子についてのアッセイ）
本発明の多数の実施形態において、ＩＲＡＫ−４活性のレベルは、多数のＩＲＡＫ−４調節分子（例えば、ポリペプチド、抗体、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、または任意の有機分子もしくは無機分子）のいずれかをインビボまたはインビトロで細胞に投与することによって細胞中で調節される。このようなＩＲＡＫ−４調節因子は、多数の炎症性疾患の処置のいずれかにおいて特に有用である。
【０１５５】
ＩＲＡＫ−４を調節し得る分子を同定するために、細胞中のＩＲＡＫ−４活性に影響する種々の化合物を検出するためのアッセイが行われる。このようなアッセイは、物理的または遺伝的のいずれかによってＩＲＡＫ−４タンパク質と相互作用する化合物の同定に関連し得、従って、化合物間の物理的または遺伝的相互作用を検出する多数の標準的な方法のいずれかに依存し得る。このようなアッセイはまた、ＩＲＡＫ−４発現、活性または他の特性（例えば、そのリン酸化または他のタンパク質に結合する能力）に影響する化合物の同定に関連し得る。このようなアッセイはまた、インビトロまたはインビボのいずれかにおける細胞中のＩＲＡＫ−４活性の検出に関連し得、従って、任意の標準的なアッセイ（例えば、ＩκＢレベル、ＮＫ−κＢの核の局在化、または天然のまたは組換えのＮＫ−κＢ標的遺伝子の発現を測定することによる）を使用する、例えば、ＮＫ−κＢ活性の検出に関連し得る。このような細胞に基くアッセイは、任意の細胞型（例えば、ＩＲＡＫ−４を天然に発現する細胞、または組換え発現に起因してＩＲＡＫ−４を産生する培養細胞）において実施され得る。
【０１５６】
（Ｂ．ＩＲＡＫ−４相互作用化合物についてのアッセイ）
特定の実施形態において、アッセイを実施し、ＩＲＡＫ−４タンパク質と物理的または遺伝的に相互作用する分子を同定する。このような分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ヌクレオチド、炭水化物、脂質、もしくは任意の他の有機または無機分子を含む任意の分子型であり得る。このような分子は、ＩＬ−１／Ｔｏｌｌレセプターシグナル伝達をもたらすＩＲＡＫ−４と正常に相互作用する分子を表し得るか、またはＩＲＡＫ−４と相互作用し得、そして細胞中のＩＲＡＫ−４活性を調節するために潜在的に使用され得るか、もしくはＩＲＡＫ−４と相互作用し、そして／またはＩＲＡＫ−４を調節し得る分子のクラスを同定する化合物をもたらすように使用される合成分子または他の分子であり得る。このようなアッセイは、物理的な結合アッセイ（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降法、ツーハイブリッドスクリーニング、もしくは他の結合アッセイ）を表すか、または後に記載されるような遺伝的アッセイを表し得る。
【０１５７】
本明細書中で記載されたインビボもしくはインビトロでの任意の結合または機能アッセイにおいて、任意のＩＲＡＫ−４タンパク質、もしくは任意の誘導体、改変体、ホモログ、またはＩＲＡＫ−４タンパク質のフラグメントが使用され得る。好ましくは、ＩＲＡＫ−４タンパク質は、配列番号１または３と少なくとも約７０％同一である。多数の実施形態において、ＩＲＡＫ−４タンパク質のフラグメントが使用される。例えば、Ｎ末端の死のドメインのみ、または中心キナーゼドメインを含むフラグメントが使用され得る。このようなフラグメントは、単独で、他のＩＲＡＫ−４フラグメントとの組み合わせで、または異種タンパク質（例えば、フラグメントは、異種ポリペプチドに融合され得る）由来の配列との組み合わせで使用され得、これによって、キメラポリペプチドを形成する。
【０１５８】
（１．物理的相互作用についてのアッセイ）
ＩＲＡＫ−４タンパク質と相互作用する化合物は、ＩＲＡＫ−４タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する能力に基いて単離され得る。多数の実施形態において、ＩＲＡＫ−４タンパク質またはタンパク質フラグメントは、固体支持体に結合され得る。１つの実施形態において、アフィニティーカラムをＩＲＡＫ−４ポリペプチドを使用して作製し、そして物理的に相互作用する分子が同定される。クロマトグラフィー技術が、任意のスケールで、異なる多くの製造者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）由来の機器を使用して行われ得ることが当業者には明らかである。さらに、ＩＲＡＫ−４タンパク質とインビボで相互作用する分子は、共免疫沈降法または他の方法（すなわち、細胞または細胞抽出物由来の抗ＩＲＡＫ−４抗体を使用してＩＲＡＫ−４タンパク質を免疫沈降すること、およびＩＲＡＫ−４タンパク質と共に沈殿する化合物（例えば、タンパク質）を同定すること）によって同定され得る。このような方法は、当業者に周知であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（全て前出）に教示される。
【０１５９】
またツーハイブリッドスクリーニングを使用して、インビボでＩＲＡＫ−４ポリペプチドまたはそれらのフラグメントと相互作用するポリペプチドを同定し得る（Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３４０：２４５−２４６（１９８９））。このようなスクリーニングは、２つの別の転写因子タンパク質のモジュラードメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメイン）を含み、これらは２つの別のポリペプチドとして細胞中で産生され、その各々はまた、２つの潜在的に結合するポリペプチドのうちの１つを含む。この２つの潜在的に結合するポリペプチドが実際にインビボで相互作用し、次いで転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが結合する場合、これによって細胞中の標的遺伝子の発現を産生する。代表的には標的遺伝子は、容易に検出可能な遺伝子産物（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ、またはルシフェラーゼ（これらは、標準的な方法を使用して検出され得る））をコードする。本発明において、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドは、転写因子の２つのドメインのうちの１つに融合し、そして潜在的なＩＲＡＫ−４結合ポリペプチド（例えば、ＤＮＡライブラリーによってコードされる）は、他のドメインに融合する。このような方法は、当業者に周知であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）に教示される。
【０１６０】
（Ｃ．ＩＲＡＫ−４タンパク質活性についてのアッセイ）
ＩＲＡＫ−４遺伝子およびそれらの対立遺伝子ならびに多型性改変体は、ＩＬ−１／Ｔｏｌｌレセプターシグナル伝達を促進するタンパク質キナーゼをコードする。従って、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドの活性は、機能的、化学的、および物理的効果を決定する（例えば、キナーゼアッセイをインビトロで使用してＩＲＡＫ−４のキナーゼ活性を、例えば、ＩＲＡＫ−１を基質として使用して直接測定する、ＮＦ−κＢまたはＴＲＡＦ−６のようなダウンストリームのエフェクターの発現または活性を測定する、異種タンパク質（例えば、ＴＲＡＦ−６もしくはＩＲＡＫ−１）もしくは他の分子（例えば、放射活性結合）へのＩＲＡＫ−４の結合を測定する、ＩＲＡＫ−４タンパク質および／もしくはＲＮＡレベルを測定する、またはＩＲＡＫ−４ポリペプチドの他の局面（例えば、リン酸化レベル、転写レベル）を測定するなど）ための種々のインビトロまたはインビボでのアッセイを使用して評価され得る。このようなアッセイは、ＩＲＡＫ−４タンパク質のアクチベーターおよびインヒビターの両方を試験するために使用され得る。調節因子はまた、一般的にＩＲＡＫ−４タンパク質のバージョン（例えば、ＩＲＡＫ−４と相互作用するＩＲＡＫ−４のドミナントネガティブな形態またはタンパク質のドミナントネガティブな形態（例えば、ＩＬ−１ＲＩ、ＭｙＤ８８、およびＴＲＡＦ−６））を変更する。このような調節因子の活性は、例えば、多くの診断的および治療的適用に有用である。
【０１６１】
このアッセイのＩＲＡＫ−４タンパク質は、代表的には、配列番号１または３の配列を有する組換えもしくは天然に存在するポリペプチドまたは保存的に改変されたそれらの改変体である。あるいは、このアッセイのＩＲＡＫ−４タンパク質は、真核細胞由来であり、そして配列番号１または３と同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸部分配列を含む。一般的に、アミノ酸配列の同一性は、少なくとも６０％、必要に応じて少なくとも７０％〜８５％、必要に応じて少なくとも９０〜９５％である。必要に応じて、このアッセイのポリペプチドは、ＩＲＡＫ−４タンパク質のドメイン（例えば、Ｎ−末端の死のドメインまたは中心キナーゼドメイン）を含む。特定の実施形態において、ＩＲＡＫ−４タンパク質のドメイン（例えば、Ｎ−末端の死のドメインまたは中心キナーゼドメイン）は、固体基質に結合し、そして例えば、結合および／またはそれらの活性を調節し得る任意の分子を単離するために使用される。特定の実施形態において、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドのドメイン（例えば、Ｎ−末端ドメイン、Ｃ−末端ドメイン、細胞外ループ、または１以上の膜内外ドメイン）は、異種ポリペプチドに融合され、これによって、キメラポリペプチドを形成する。このようなキメラポリペプチドはまた、例えば、ＩＲＡＫ−４の調節因子を同定するためのアッセイにおいて有用である。
【０１６２】
潜在的なＩＲＡＫ−４タンパク質インヒビターまたはアクチベーターで処理されたサンプルまたはアッセイは、試験化合物なしのコントロールサンプルと比較され、調節の程度を検査される。コントロールサンプル（アクチベーターまたはインヒビターで処理されていない）は、１００の相対的なＩＲＡＫ−４活性値を設定される。ＩＲＡＫ−４タンパク質の阻害は、コントロールに対するＩＲＡＫ−４活性値が、約９０％、必要に応じて５０％、必要に応じて２５〜０％である場合に達成される。ＩＲＡＫ−４タンパク質の活性化は、コントロールに対するＩＲＡＫ−４活性値が、１１０％、必要に応じて１５０％、２００〜５００％、または１０００〜２０００％である場合に達成される。
【０１６３】
試験化合物のポリペプチドの機能に対する効果は、上記任意のパラメーターを調査することによって測定され得る。ＩＲＡＫ−４活性に影響する任意の適切な生理学的変化を使用して、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の影響を評価し得る。機能的な結果が、インタクトな細胞または動物を使用して決定される場合、透過性および血流、血漿タンパク質および白血球の炎症部位への遊走を含む体液の浸出の増加に伴う組織の炎症の変化（例えば、痛み、熱、赤み、膨潤、機能の損失、小動脈毛細管、および小静脈の拡張）のような種々の影響をもまた測定し得る。
【０１６４】
別の実施形態では、転写レベルを測定して、ＩＲＡＫ−４シグナル伝達に対する試験化合物の影響を評価し得る。目的のＩＲＡＫ−４タンパク質を含む宿主細胞を、何らかの相互作用をもたらすに十分な時間にわたって試験化合物と接触させ、次いで、遺伝子発現のレベルを測定する。このような相互作用をもたらす時間量は、例えば、時間経過を行い、そして転写レベルを時間の関数として測定することによって、経験的に決定され得る。転写量は、適切であることが当業者に公知の任意の方法を用いて測定され得る。例えば、目的のタンパク質のｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロットを用いて、または免疫アッセイを用いてそれらのポリペプチド産物を検出することによって、検出され得る。ＩＲＡＫ−４活性化後に代表的に発現される任意のポリヌクレオチド（すなわち、ＮＦ−κＢ同族ＤＮＡ結合部位（例えば、Ｌｅｎａｒｄｏら，Ｃｅｌｌ　５８：２２７（１９８９）；Ｇｒｉｌｌｉら，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１４３：１（１９９３）；Ｂａｅｕｅｒｌｅら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１４１（１９９４）を参照のこと）を有する任意の遺伝子）が用いられ得る。このようなアッセイは、ＮＦ−κＢの天然の標的を用い得るか、またはＮＦ−κＢ結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰおよびアルカリホスファターゼ）を用い得る。さらに、目的のタンパク質は、第２のレポーター（例えば、グリーン蛍光タンパク質（例えば、ＭｉｓｔｉｌｉおよびＳｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１５：９６１−９６４（１９９７）を参照のこと））への結合を介して間接的レポーターとして用いられ得る。
【０１６５】
次いで、転写量は、この試験化合物の非存在下での同じ細胞における転写量に対して比較されるか、または目的のタンパク質を欠く実質的に同一の細胞における転写量と比較され得る。実質的に同一の細胞は、その細胞から組換え細胞を調製したが異種ＤＮＡの導入によって改変されていない、同じ細胞から誘導され得る。転写量における何らかの差は、この試験化合物が、目的のタンパク質の活性を何らかの様式で改変したことを示す。
【０１６６】
（Ｄ．調節因子および結合化合物）
ＩＲＡＫ−４タンパク質の調節因子として試験された化合物は、任意の低分子化学化合物または生物学的実体（例えば、タンパク質、糖、核酸または脂質）であり得る。あるいは、調節因子は、遺伝的に改変されたバージョンのＩＲＡＫ−４遺伝子であり得る。代表的に、試験化合物は、低分子化学分子およびペプチドである。本質的に任意の化学化合物は、本発明のアッセイにおいて潜在的調節因子または結合化合物として用いられ得るが、水性または有機性（特にＤＭＳＯベースの）溶液中に溶解され得るたいていの化合物が用いられる。アッセイは、アッセイ工程を自動化し、そして任意の便利な供給源から化合物をアッセイ（これは代表的には（例えば、自動アッセイにおけるマイクロタイタープレートでのマイクロタイター形式において）並行して行われる）に提供することによって、大きな化学的ライブラリーをスクリーニングするように設計される。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などを含めた、化学化合物の多くの供給業者が存在することが認識される。
【０１６７】
１つの好ましい実施形態では、高処理能力スクリーニング方法は、非常に多数の潜在的治療化合物（潜在的調節因子または結合化合物）を含む、コンビナトリアル化学ライブラリーまたはペプチドライブラリーを提供する工程を含む。次いで、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」は、本明細書中に記載されるように、１以上のアッセイにおいてスクリーニングされて、所望の特徴的活性を提示するライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）が同定される。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」として役立ち得るか、またはこれら自体が潜在的治療物質または実際の治療物質として用いられ得る。
【０１６８】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、化学合成または生物学的合成のいずれかによって、多数の化学的「構築ブロック」（例えば、試薬）をあわせることによって、生成された多様な化学化合物の収集物である。例えば、直鎖状コンビナトリアル化学ライブラリー（例えば、ポリペプチドライブラリー）は、化学的構築ブロック（アミノ酸）のセットを、所定の化合物長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）について可能なあらゆる方法で合わせることによって形成される。数百万の化学化合物が、このような化学的構築ブロックのこのようなコンビナトリアル混合を通して合成され得る。
【０１６９】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号，Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）およびＨｏｕｇｈｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８４−８８（１９９１）を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。化学的多様性ライブラリーを作製するための他の化学もまた用いられ得る。このような化学としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ペプトイド（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ　９１／１９７３５）、コードされるペプチド（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ　９３／２０２４２）、ランダム生体オリゴマー（ｒａｎｄｏｍ　ｂｉｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒ）（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ　９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ダイバースマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド）（Ｈｏｂｂｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニローグ性（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、低分子化合物ライブラリーの同様の有機合成（Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１３０３（１９９３））、および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ，ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（全て前出）を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）、糖質ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号を参照のこと）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ　ＣおよびＥＮ，１月１８日，３３頁（１９９３）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）およびメタチアザノン（ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅ）、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号などを参照のこと）。
【０１７０】
コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは、市販されている（例えば、３５７　ＭＰＳ，３９０　ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ　ＫＹ，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，４３３Ａ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，９０５０　Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡを参照のこと）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，３Ｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，Ｍａｒｔｅｋ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤなどを参照のこと）。
【０１７１】
（１．固体状態および可溶性高処理能力アッセイ）
１つの実施形態では、本発明は、分子（例えば、Ｎ末端またはＣ末端のドメイン）を単独でまたは異種タンパク質に共有結合してキメラ分子を作製してのいずれかで用いる、可溶性アッセイを提供する。別の実施形態では、本発明は、固相ベースのインビトロアッセイを高処理能力形式で提供し、ここで、ドメイン、キメラ分子、ＩＲＡＫ−４タンパク質、またはＩＲＡＫ−４タンパク質を発現する細胞もしくは組織が固相基材に結合される。
【０１７２】
本発明の高処理能力アッセイでは、数千までの異なる調節因子を１日にスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選択された潜在的調節因子に対して別々のアッセイを行い得るか、または濃度もしくはインキュベーション時間の影響が観察される場合、５〜１０個のウェル毎に単一の調節因子を試験し得る。従って、１枚の標準的マイクロタイタープレートは、約１００（例えば、９６）の調節因子をアッセイし得る。１５３６ウェルプレートを用いる場合、１枚のプレートは、約１００〜約１５００の異なる化合物を容易にアッセイし得る。１日あたり数枚の異なるプレートをアッセイすることが可能である；約６，０００〜２０，０００までの異なる化合物についてのアッセイスクリーニングが、本発明の一体化システムを用いて可能である。より最近では、試薬操作に対するミクロ流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）アプローチが開発されている。
【０１７３】
目的の分子は、固相状態の成分に、共有結合または非共有結合を介して（例えば、タグを介して）直接的または間接的に結合され得る。タグは、種々の成分のいずれかであり得る。一般に、タグを結合する分子（タグバインダー）は固体支持体に固定され、そしてタグ化された目的の分子は、タグとタグバインダーとの相互作用によって固体支持体に結合する。
【０１７４】
多数のタグおよびタグバインダーが、文献に十分に記載される公知の分子相互作用に基づいて用いられ得る。例えば、タグが天然のバインダー（例えば、ビオチン、プロテインＡまたはプロテインＧ）を有する場合、このタグは、適切なタグバインダー（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、免疫グロブリンのＦｃ領域など）とともに用いられ得る。天然のバインダー（例えば、ビオチン）を有する分子に対する抗体もまた、広範に利用可能であり、そして適切なタグバインダーである；ＳＩＧＭＡ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　１９９８カタログ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ　ＭＯを参照のこと）。
【０１７５】
同様に、任意のハプテン性または抗原性の化合物は、適切な抗体と組み合わせて用いられてタグ／タグバインダー対を形成し得る。数千の特異抗体が市販されており、そして多くのさらなる抗体は文献に記載される。例えば、１つの共通の構造では、タグは第１抗体であり、そしてタグバインダーは第１抗体を認識する第２抗体である。
【０１７６】
合成ポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミドおよびポリアセテート）もまた、適切なタグまたはタグバインダーを形成し得る。多くの他のタグ／タグバインダー対もまた、本開示を顧みれば当業者に明らかであるように、本明細書中に記載されるアッセイシステムにおいて有用である。
【０１７７】
通常のリンカー（例えば、ペプチド、ポリエーテルなど）もまた、タグとして役立ち得、そしてポリペプチド配列（例えば、約５アミノ酸と２００アミノ酸との間のポリ−ｇｌｙ配列）を含み得る。このような可撓性リンカーは、当業者に公知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーが、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手可能である。これらのリンカーは必要に応じて、アミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ官能性結合を有する。
【０１７８】
タグバインダーは、現在利用可能な種々の方法のうちのいずれかを用いて固体基材に固定される。固体基材は通常、基材の全てまたは一部を、タグバインダーの一部と反応性である化学基を表面に固定する化学試薬に対して暴露することによって、誘導体化または官能化される。例えば、より長い鎖の部分に対する結合のために適切である基としては、アミン、ヒドロキシル基、チオール基およびカルボキシル基が挙げられる。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを用いて、種々の表面（例えば、ガラス表面）を官能化し得る。このような固相生体高分子アレイの構築は、文献に十分に記載されている。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ　Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）（例えば、ペプチドの固相合成を記載する）；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．１０２：２５９−２７４（１９８７）（ピン上での固相成分の合成を記載する）；ＦｒａｎｋおよびＤｏｒｉｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４４：６０３１−６０４０（１９８８）（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載する）；Ｆｏｄｏｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）；Ｓｈｅｌｄｏｎら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３９（４）：７１８−７１９（１９９３）；ならびにＫｏｚａｌら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２（７）：７５３−７５９（１９９６）（全て、固体基材に固定した生体高分子のアレイを記載する）を参照のこと。タグバインダーを基材に固定する非化学的アプローチとしては、他の通常の方法（例えば、加熱、ＵＶ照射による架橋など）が挙げられる。
【０１７９】
（２．コンピュータベースのアッセイ）
ＩＲＡＫ−４タンパク質活性を調節する化合物についてのなお別のアッセイは、コンピュータ支援薬物設計を含み、ここでは、コンピュータシステムを用い、そのアミノ酸配列によってコードされる構造情報に基づいてＩＲＡＫ−４タンパク質の三次元構造を作製する。入力アミノ酸配列は、コンピュータプログラム中の予め確立されたアルゴリズムと直接および活発に相互作用して、そのタンパク質の二次構造モデル、三次構造モデルおよび四次構造モデルが得られる。次いで、そのタンパク質構造のモデルを調べて、結合能力を有する構造領域を同定する。次いで、これらの領域を用いて、このタンパク質に結合する化合物を同定する。
【０１８０】
このタンパク質の三次元構造モデルは、少なくとも１０アミノ酸残基のタンパク質アミノ酸配列またはＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードする対応する核酸配列をこのコンピュータシステムに入力することによって作製される。このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は好ましくは、配列番号２または配列番号４、およびこれらの保存的に改変されたバージョンを含む。好ましくは配列番号１もしくは３またはそれらの保存的に改変されたバージョンを含むアミノ酸配列は、このタンパク質の主な配列または部分配列を表し、これは、このタンパク質の構造情報をコードする。少なくとも１０残基のアミノ酸配列（または１０アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）は、コンピュータキーボード、コンピュータ読み取り可能な基板（これは、電子格納媒体（例えば、磁気ディスケット、テープ、カートリッジおよびチップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ　ＲＯＭ）、インターネットサイトおよびＲＡＭによって配布される情報を包含するがこれらに限定されない）からコンピュータシステムに入力される。次いで、このタンパク質の三次元構造モデルは、アミノ酸配列とこのコンピュータシステムとの相互作用によって、当業者に公知のソフトウェアを用いて作製される。
【０１８１】
アミノ酸配列は、目的のタンパク質の二次構造、三次構造および四次構造を形成するために必要な情報をコードする一次構造を表す。ソフトウェアは、一次配列によってコードされる特定のパラメータを探して、構造モデルを作製する。これらのパラメータは、「エネルギー条件（ｅｎｅｒｇｙ　ｔｅｒｍ）」と呼ばれ、そして主に、電位、疎水性ポテンシャル（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、溶媒が接近可能な表面および水素結合を含む。二次エネルギー条件は、ファンデルワールスポテンシャルを含む。生物学的分子は、累積様式でエネルギー条件を最小にする構造を形成する。それゆえ、このコンピュータプログラムは、一次構造、すなわちアミノ酸配列によってコードされるこれらの条件を用いて、二次構造モデルを作製する。
【０１８２】
次いで、二次構造によってコードされるタンパク質の三次構造は、二次構造のエネルギー条件に基づいて形成される。この時点で、使用者は、さらなる変動要因（例えば、このタンパク質が膜結合性であるかまたは可溶性であるか、身体におけるその位置、およびその細胞内位置（例えば、細胞質性、表面または核））を入力し得る。二次構造のエネルギー条件とともにこれらの変動要因を用いて、三次構造のモデルを形成する。三次構造のモデル形成において、このコンピュータプログラムは、二次構造の疎水性面と同様の疎水性面とを一致させ、そして二次構造の親水性面を同様の親水性面と一致させる。
【０１８３】
一旦、構造が作製されたら、潜在的な調節因子結合領域が、このコンピュータシステムによって同定される。潜在的調節因子についての三次元構造は、上記のように、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列または化合物の化学式を入力することによって作製される。次いで、潜在的調節因子の三次元構造は、ＩＲＡＫ−４タンパク質の三次元構造と比較されて、このタンパク質と結合する化合物が同定される。このタンパク質と化合物との間の結合親和性は、エネルギー条件を用いて決定されて、どの化合物が、このタンパク質に対する増強された結合確率を有するかが決定される。
【０１８４】
コンピュータシステムをまた用いて、ＩＲＡＫ−４遺伝子の変異、多型改変体、対立遺伝子および種間ホモログについてスクリーニングする。このような変異は、疾患状態または遺伝形質と関連し得る。上記のように、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭおよび関連技術をまた用いて、変異、多型改変体、対立遺伝子および種間ホモログについてスクリーニングし得る。一旦改変体が同定されたら、診断アッセイを用いて、このような変異した遺伝子を有する患者を同定し得る。変異したＩＲＡＫ−４遺伝子の同定は、配列番号２もしくは４の第１の核酸配列、または配列番号１もしくは３の第１のアミノ酸配列、およびこれらの保存的に改変されたバージョンの入力を受け取る工程を含む。この配列は、上記のとおりにこのコンピュータシステムに入力される。次いで、第１の核酸またはアミノ酸の配列は、第１の配列に対して実質的同一性を有する、第２の核酸またはアミノ酸の配列に対して比較される。第２の配列は、このコンピュータシステムに上記の様式で入力される。一旦、第１および第２の配列が比較されたら、これらの配列の間のヌクレオチドまたはアミノ酸の差が同定される。このような配列は、種々のＩＲＡＫ−４遺伝子における対立遺伝子の差、ならびに疾患状態および遺伝形質と関連した変異を表し得る。
【０１８５】
（ＶＩＩ．疾患または状態を処置するためのＩＲＡＫ−４活性／発現の調節）　本発明の多数の実施形態では、化合物（例えば、核酸、ポリペプチドまたは他の分子）は、患者にインビボまたはエキソビボで投与されて、ＩＲＡＫ−４の活性または発現における変化をこの患者においてもたらす。このような化合物は、プロモーターに作動可能に連結された、全長ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号１もしくは３として示すような）またはその任意の誘導体、フラグメントもしくは改変体であり得る。適切な核酸としてはまた、例えば、プロモーターに作動可能に連結された発現ベクター中で送達され得るか、または直接送達され得る、阻害配列（例えば、アンチセンス配列またはリボザイム配列）が挙げられる。また、ＩＲＡＫ−４の発現を調節するポリペプチドをコードする任意の核酸が用いられ得る。一般に、核酸は、多数のベクターまたは方法（例えば、レトロウイルス性、アデノウイルス性またはアデノ随伴ウイルス性のベクター、リポソーム処方物、裸のＤＮＡ注射など）のいずれかを用いて細胞に送達され得る。これらの方法は全て、当業者に周知である。
【０１８６】
タンパク質をまた患者に送達して、ＩＲＡＫ−４活性を調節し得る。好ましい実施形態では、ＩＲＡＫ−４に、特に、ＩＲＡＫ−４ポリペプチドのＮ末端死のドメインまたは中心キナーゼドメインに特異的に結合する、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が送達される。さらに、ＩＲＡＫ−４と相互作用するおよび／またはＩＲＡＫ−４の活性を調節する任意のポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるアッセイを用いて同定されるポリペプチド、または任意のドミナントネガティブ形態のＩＲＡＫ−４もしくＩＲＡＫ−４相互作用タンパク質（例えば、ＩＬ−１ＲＩ、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６など））が用いられ得る。さらに、ＩＲＡＫ−４発現に影響を与えるポリペプチドが用いられ得る。
【０１８７】
さらに、ＩＲＡＫ−４と相互作用するおよび／またはＩＲＡＫ−４の活性を調節することが見出されるかまたはそのように設計された任意の化合物が用いられ得る。例えば、本明細書中に記載される方法を用いて、ＩＲＡＫ−４に結合するまたはＩＲＡＫ−４の活性を調節することが見出された任意の化合物が用いられ得る。
【０１８８】
上記の分子のいずれかを用いて、ＩＲＡＫ−４の発現もしくは活性を上昇もしくは下降させ得るか、またはＩＲＡＫ−４ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの特性および／もしくは挙動（例えば、安定性、リン酸化、キナーゼ活性、他のタンパク質との相互作用など）に他の点で影響を与え得る。従って、本発明の化合物を用いて、以下を含むがこれらに限定されない多数の疾患のうちのいずれかを処置し得る：（ａ）肺の疾患および気道の疾患（成人呼吸疾患症候群（Ａｄｕｌｔ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＯＰＤ）、肺線維症、間質肺疾患、喘息、慢性の咳およびアレルギー性鼻炎を含むがこれらに限定されない）；（ｂ）移植；（ｃ）自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症および糖尿病（例えば、１型糖尿病）を含むがこれらに限定されない）；（ｄ）癌（固形癌、皮膚癌、およびリンパ腫を含むがこれらに限定されない）；（ｅ）心血管疾患（発作およびアテローム性動脈硬化症を含むがこれらに限定されない）；（ｆ）中枢神経系の疾患（神経変性疾患を含むがこれらに限定されない）；（ｇ）非ＣＤ１４媒介性敗血症；（ｈ）変形性関節症；（ｉ）骨粗鬆症；（ｊ）乾癬および皮膚の疾患（発疹および接触皮膚炎およびアトピー性皮膚炎を含むがこれらに限定されない）；（ｋ）炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含むがこれらに限定されない）；（ｌ）ベーチェット症候群；（ｍ）強直性脊椎炎；（ｎ）サルコイドーシス；（ｏ）通風；（ｐ）眼の疾患および状態；ならびに（ｑ）ＣＤ１４媒介性敗血症。
【０１８９】
（Ａ．投与および薬学的組成物）
本発明の分子のいずれかの投与は、調節因子化合物を導入して、処置される組織と最終的に接触させるために通常用いられる経路のいずれかによって達成され得る。調節因子は、任意の適切な様式で、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアとともに投与される。このような調節因子を投与する適切な方法は、当業者に利用可能であり、そして周知であり、そして１より多くの経路が特定の組成物を投与するために用いられ得るが、特定の経路によって通常、別の経路よりも直接的でかつより効果的な反応が提供され得る。
【０１９０】
薬学的に受容可能なキャリアは、投与される特定の組成物によって部分的に、ならびにその組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決定される。従って、本発明の薬学的組成物の広範な種々の適切な処方物が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版（１９８５）を参照のこと）。
【０１９１】
ＩＲＡＫ−４調節因子は、単独で、または他の適切な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるように、エアゾール処方物にされ得る（すなわち、これらは、「噴霧」され得る）。エアゾール処方物は、加圧した受容可能なプロペラント（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に入れられ得る。
【０１９２】
投与のために適切な処方物としては、水性および非水性の溶液、等張な滅菌溶液（これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および処方物を等張にする溶質を含み得る）、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁物（これらは、懸濁剤、可溶化剤、濃化剤（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）、安定剤および保存剤を含み得る）が挙げられる。本発明の実施では、組成物は、例えば、経口的に、鼻腔的に、局所的に、静脈内に、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内に投与され得る。化合物の処方物は、単回用量または多回用量のシールされた容器（例えば、アンプルおよびバイアル）内に存在し得る。溶液および懸濁物は、以前に記載された類の無菌の散剤、顆粒剤および錠剤から調製され得る。調節因子はまた、調製された食品または薬物の一部として投与され得る。
【０１９３】
本発明の状況で患者に投与される用量は、経時的に被験体において有益な応答をもたらすに十分であるべきである。用量は、用いられる特定の調節因子の効力および被験体の状態、ならびに体重または処置される領域の表面積によって決定される。用量の大きさはまた、特定の被験体における特定の化合物またはベクターの投与に付随する、任意の有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。
【０１９４】
投与される調節因子の有効量を決定する際に、医師は、調節因子の循環血漿レベル、調節因子の毒性および抗調節因子抗体の産生を評価し得る。一般に、調節因子の用量等量は、典型的な被験体について約１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１９５】
投与については、本発明の調節因子は、被験体の質量および全般的健康に当てはめた場合の、調節因子のＬＤ−５０および種々の濃度でのこの化合物の副作用によって決定される速度で投与され得る。投与は、単回用量または分割用量によって達成され得る。
【０１９６】
（ＶＩＩＩ．トランスジェニック動物）
トランスジェニックおよびキメラ非ヒト哺乳動物ならびにそれらを作製するための方法を、以下に記載する。これらの哺乳動物は、とりわけ、ＩＲＡＫ−４の機能をインビボで試験するため、炎症性の疾患および状態の研究のためのモデルを作製するため、ならびにＩＲＡＫ−４関連性の炎症性の疾患および状態の強力な処置の開発のために有用である。
【０１９７】
ＩＲＡＫ−４の少なくとも１つの機能的な内因性対立遺伝子を欠く細胞を含む、トランスジェニックおよびキメラ非ヒト哺乳動物を作製する。「キメラ動物」は、目的の機能的ＩＲＡＫ−４遺伝子を欠くいくらかの細胞およびその不活化された細胞を有さないいくらかの細胞を含む。対照的に、「トランスジェニック動物」は、全てが、ＩＲＡＫ−４遺伝子を不活化するかまたは変更する特異的改変を組み込まれた細胞から構成される。トランスジェニック動物は、代表的には、通常、変異体ＩＲＡＫ−４遺伝子をその子孫に伝達し得、一方、キメラ動物が変異を伝達する能力は、その不活化された遺伝子が、その動物の生殖細胞に存在するか否かに依存する。ＩＲＡＫ−４遺伝子を不活化または変更する改変としては、例えば、１以上のヌクレオチドの、挿入、欠失または置換が挙げられ得る。これらの改変は、その遺伝子自体の転写、生じるｍＲＮＡの翻訳および／または安定性を干渉し得るか、あるいはその遺伝子に不活化または変更されたＩＲＡＫ−４ポリペプチド（例えば、改変された結合特性またはキナーゼ活性を有するＩＲＡＫ−４ポリペプチド）をコードさせ得る。
【０１９８】
本発明の方法は、ほとんどの脊椎動物種のトランスジェニック動物およびキメラ動物の産生に有用である。このような種としては、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ウサギ、ヒツジ類（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）およびヤギ）、ブタ類（ｐｏｒｃｉｎｅ）（例えば、ブタ（ｐｉｇ））、ならびにウシ類（ｂｏｖｉｎｅ）（例えば、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）およびバッファロー）を含む、非ヒト哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。トランスジェニック動物を得る方法は、例えば、Ｐｕｈｌｅｒ，Ａ．編、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌｓ，ＶＣＨ　Ｐｕｂｌ．，１９９３；ＭｕｒｐｈｙおよびＣａｒｔｅｒ編、Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８）、１９９３；およびＰｉｎｋｅｒｔ，ＣＡ編、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｎｉｍａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９９４に記載される。
【０１９９】
好ましい実施形態において、トランスジェニックマウスは、Ｔｈｏｍａｓら、（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：９７８−８４；Ｋａｎａｋａｒａｊら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０７３−９；またはＹｅｈら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　７：７１５−７２５に記載されるように、産生される。
【０２００】
代表的には、改変ＩＲＡＫ−４遺伝子を、胚性幹細胞（ＥＳ）に、例えば、相同組換えによって導入する。胚性幹細胞は、着床前の胚から得られそしてインビトロで培養される。例えば、Ｈｏｏｐｅｒ，ＭＬ，Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｐｌａｎｎｅｄ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　Ａｎｉｍａｌ　Ｇｅｒｍｌｉｎｅ（Ｍｏｄｅｒｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖ．１），Ｉｎｔ’ｌ．Ｐｕｂ．Ｄｉｓｔｒｉｂ．，Ｉｎｃ．，１９９３；Ｂｒａｄｌｅｙら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３０９，２５５−２５８を参照のこと。その後、この形質転換したＥＳ細胞を、非ヒト動物（例えば、マウス）由来の胚盤胞と合わせる。このＥＳ細胞は、胚を形成し、いくつかの胚において、その得られたキメラ動物の生殖系列を形成する。Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１４６８−１４７４（１９８８）を参照のこと。あるいは、ＥＳ細胞または生物を再構成し得る体細胞（「体性再増殖細胞（ｓｏｍａｔｉｃ　ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ）」）を、トランスジェニック動物を生じる除核した受精卵母細胞への移植のための、核の供給源として使用し得る。例えば、Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３８５：８１０−８１３（１９９７）を参照のこと。
【０２０１】
そのゲノム中に変異体ＩＲＡＫ−４遺伝子を有するトランスジェニック動物またはキメラ動物を得るための他の方法は、受精卵母細胞に、改変（例えば、不活性な）ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを接触させることである。いくつかの動物（例えば、マウス）において、受精は、代表的に、インビボで行われ、そして受精卵を、外科的に取り出す。他の動物（特に、ウシ）において、生存動物または屠殺した動物から卵子を取り出しそしてインビトロで卵子に受精させることが好ましい。ＤｅＢｏｅｒら、ＷＯ９１／０８２１６を参照のこと。インビトロ受精は、これらの改変物を、実質的に同調の細胞内に導入するのを可能にする。
【０２０２】
受精卵母細胞を、代表的には、約１６〜１５０細胞を含む着床前の胚が得られるまで、インビトロで培養する。胚の１６〜３２個の細胞の段階は、桑実胚と呼ばれ、３２個より多い細胞を含む着床前の胚を、胚盤胞と呼ぶ。これらの胚は、代表的には、６４個の細胞の段階で、胞胚腔の発生を示す。この胚の細胞における所望のＩＲＡＫ−４変異の存在は、当業者に公知の方法（例えば、サザンブロッティング、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定または他の標準的方法）によって検出され得る。着床前段階に受精卵母細胞を培養するための方法は、例えば、Ｇｏｒｄｏｎら、（１９８４）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：４１４；Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｎ．Ｙ．（１９８６）（マウス胚）；Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３１５：６８０（１９８５）（ウサギおよびブタ胚）；Ｇａｎｄｏｌｆｉら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８１：２３−２８（１９８７）；Ｒｅｘｒｏａｄら、Ｊ　Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６６：９４７−９５３（１９８８）（ヒツジ胚）ならびにＥｙｅｓｔｏｎｅら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８５：７１５−７２０（１９８９）；Ｃａｍｏｕｓら、Ｊ　Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．７２：７７９−７８５（１９８４）；およびＨｅｙｍａｎら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ　２７：５９６８（１９８７）（ウシ胚）によって記載される。着床前の胚はまた、着床までの期間に凍結保存され得る。
【０２０３】
着床前の胚を、適切な雌に移入し、これは、導入遺伝子が組み込まれる発生段階に依存して、トランスジェニック動物またはキメラ動物の誕生を生じる。キメラ動物を交配させて、真性の生殖系列トランスジェニック動物を形成し得る。キメラマウスおよび生殖系列トランスジェニックマウスはまた、市販の供給源（例えば、Ｄｅｌｔａｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）から入手し得る。
【０２０４】
哺乳動物細胞または動物に変異を導入するための他の方法としては、リコンビナーゼ系が挙げられ、これは、目的の遺伝子座の全てまたは一部を欠失させるために使用され得る。リコンビナーゼ系の例としては、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘ系（例えば、Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６５：１０３−１０６（１９９４）；Ｔｅｒｒｙら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ．６：３４９−３５６（１９９７）を参照のこと）およびＦＬＰ／ＦＲＴ部位特異的組み込み系（例えば、Ｄｙｍｅｃｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：６１９１−６１９６（１９９６）を参照のこと）が挙げられる。これらの系において、その特定のリコンビナーゼによって認識される部位は、代表的に、欠失されるべき遺伝子の部分に隣接する位置で、そのゲノムに導入される。次いで、細胞内へのリコンビナーゼの導入が、組換えを触媒し、これが、その組換え部位によって隣接されるポリヌクレオチド配列をゲノムから欠失する。所望の場合には、例えば、リコンビナーゼの発現を駆動する組織特異的プロモーターを使用することによって、特定の細胞型のみが目的のＩＲＡＫ−４遺伝子を欠く動物を獲得し得る。例えば、Ｔｓｉｅｎら、Ｃｅｌｌ　８７：１３１７−２６（１９９６）；Ｂｒｏｃａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１０８８７−１０８９０（１９９６）；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：３９３２−６（１９９６）；Ｍｅｙｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１３６−４１（１９９８）を参照のこと。
【０２０５】
細胞または動物中のＩＲＡＫ−４遺伝子における任意の変異の存在は、本明細書中に記載の任意の方法（例えば、サザンブロット、ＰＣＲまたはＤＮＡ配列決定）を使用して検出され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと。
【０２０６】
（ＩＸ．キット）
ＩＲＡＫ−４遺伝子およびそれらのホモログは、ＩＬ−１、ＩＬ−１８またはＬＰＳ応答性の細胞の同定を含むがこれに限定されない多くの適用のため、法医学および父子鑑定のため、および任意の多くのＩＬ−１、ＩＬ−１８またはＬＰＳ関連疾患（例えば、炎症性疾患）の処置のための、有用なツールである。従って、ＩＲＡＫ−４核酸に特異的にハイブリダイズするＩＲＡＫ−４特異的試薬（例えば、ＩＲＡＫ−４プローブおよびプライマー）、ならびにＩＲＡＫ−４タンパク質に特異的に結合するかまたはＩＲＡＫ−４タンパク質の活性を特異的に調節するＩＲＡＫ−４特異的試薬（例えば、ＩＲＡＫ−４抗体または他の化合物）が、本明細書中に記載の任意の適用の実施のためのキットにおいて提供され得る。
【０２０７】
サンプル中のＩＲＡＫ−４ポリヌクレオチドのＤＮＡおよびＲＮＡの存在についての核酸アッセイとしては、以下のような、当業者に公知の多くの技術が挙げられる：サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット、ＲＮａｓｅ保護、Ｓ１分析、増幅技術（例えば、ＰＣＲおよびＬＣＲ）、およびインサイチュハイブリダイゼーション。例えば、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、標的核酸は、その後の処理および分析のために細胞形態を維持しながら、細胞内でのハイブリダイゼーションに利用可能なように、その細胞周辺物から遊離される。以下の文献は、インサイチュハイブリダイゼーションの技術の概要を提供する：Ｓｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２３０−２５０（１９８６）；Ｈａａｓｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ。ＶＩＩ、１８９−２２６頁（１９８４）；およびＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｈａｍｅｓら編、１９８７）。さらに、ＩＲＡＫ−４タンパク質は、上記の種々の免疫アッセイ技術を用いて検出され得る。試験サンプルは、代表的には、ポジティブコントロール（例えば、組換えＩＲＡＫ−４タンパク質を発現するサンプル）およびネガティブコントロールの両方と比較される。
【０２０８】
本発明はまた、ＩＲＡＫ−４タンパク質または核酸の調節因子についてスクリーニングするためのキットを提供する。このようなキットは、容易に利用可能な材料および試薬から調製され得る。例えば、このようなキットは、以下の材料の任意の１以上を含み得る：ＩＲＡＫ−４核酸またはタンパク質、反応チューブ、およびＩＲＡＫ−４活性を試験するための指示書。必要に応じて、このキットは、生物学的に活性なＩＲＡＫ−４タンパク質を含む。広範に種々のキットおよび成分が、そのキットの意図される使用者およびその使用者の特定の必要性に依存して、本発明に従って調製され得る。
【０２０９】
（Ｘ．実施例）
（Ａ．ヒトＩＲＡＫ−４の同定）
ヒトＩＲＡＫに関連する配列（Ｃａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７１：１１２８−３１（１９９６））を、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　９．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）のＴＦＡＳＴＸプログラムを使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎの配列データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）において同定した。ＩＲＡＫと有意な相同性を共有するポリペプチドをコードするヒトｃＤＮＡ配列（登録番号ＡＦ１５５１１８）を見出した。全長ｃＤＮＡクローンを、配列ＡＴＧＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＴＡＴＧＴＧＣ（配列番号５）を有するセンスプライマーおよび配列ＴＴＡＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣ（配列番号６）を有するアンチセンスプライマーを使用するＰＣＲ反応により、ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｑｕｉｃｋ　Ｃｌｏｎｅ　ｃＤＮＡ）から増幅した。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、ジデオキシ媒介鎖終結のサンガー法を用いて決定した。ヒトＩＲＡＫ−４　ｃＤＮＡ（例えば、配列番号２を参照のこと）は、４６０アミノ酸の算定分子量５２ｋＤａのタンパク質（例えば、配列番号１を参照のこと）をコードする。推定タンパク質配列の分析は、ＩＲＡＫ、ＩＲＡＫ−２およびＩＲＡＫ−Ｍのドメイン構造（Ｗｅｓｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９４０３−１０（１９９９））に類似の、Ｎ末端死のドメイン（Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：３４２−４（１９９５））および中心キナーゼドメインを明らかにした。この新しく同定されたタンパク質とこれらの既存のＩＲＡＫ様分子との間で共有される全体の配列同一性は、３０〜４０％の間である（表１）。
【０２１０】
【表１】
Figure 2004500074
表１：ＩＲＡＫ／Ｐｅｌｌｅファミリーのメンバーに対するヒトＩＲＡＫ−４の配列類似性。配列比較は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　ＧＣＧパッケージのＧＡＰプログラムを使用して行った。
【０２１１】
（Ｂ．ヒトＩＲＡＫ−４の発現パターン）
ヒトＩＲＡＫ−４の発現パターンを、種々のヒト組織を表すサンプルを使用する、ノーザンブロット分析によって決定した。約４．４ｋｂおよび３ｋｂのサイズを有する、２つのｍＲＮＡ種を検出した。ＩＲＡＫ−４発現を、胸腺、脾臓、腎臓および肝臓において検出した。
【０２１２】
ＲＴ−ＰＣＲを使用して種々の組織からヒトＩＲＡＫ−４　ＲＮＡを増幅し、増幅産物が、胎盤、肺、肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、リンパ節および扁桃において容易に検出可能であった。
【０２１３】
（Ｃ．ＩＲＡＫ−４はＮＦ−κＢを活性化する）
ヒトＩＲＡＫ−４の一過性の発現を、ヒト胚性腎臓細胞株２９３において誘導した。レポーターアッセイによって検出されるように、この過剰発現は、細胞中の転写因子ＮＦ−κＢの活性化を導くことが見出された。これらのアッセイにおいて使用したレポーター構築物は、ＮＦ−κＢ依存性Ｅ選択ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドｐＥＬＡＭ−ｌｕｃ（ＳｃｈｉｎｄｌｅｒおよびＢａｉｃｈｗａｌ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：５８２０−３１）であった。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、Ｗｅｓｃｈｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　７：８３７−４７（１９９７）に記載のように測定した。
【０２１４】
キナーゼ活性を欠くＩＲＡＫ−４変異体（ＩＲＡＫ−４　ＫＫ２１３ＡＡ、ＡＴＰ結合ポケットにおける重要なリジン残基を除去する変異）またはＩＲＡＫ−４の短縮型形態（アミノ酸１．．１９１、最初の１９１アミノ酸のみからなる）の過剰発現は、ドミナントネガティブな様式で作用し、インターロイキン−１によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化をブロックすることが見出された。しかし、ＩＲＡＫ−４のこれらの改変形態は、ＴＮＦによって誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対して効果を有さなかった（レポーターアッセイを使用して、ＨＥＫ２９３細胞においてアッセイされたように）。
【０２１５】
（Ｄ．マウスＩＲＡＫ−４の同定）
マウスＩＲＡＫ−４ホモログを同定するために、マウス腎臓ｃＤＮＡファージライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、標準的な手順に従って、短縮型ヒトＩＲＡＫ−４（ヌクレオチド１〜９９２からなる）由来のプローブを用いて低いストリンジェンシー条件下でスクリーニングした。ヒトＩＲＡＫ−４に対して約８０％の相同性（タンパク質レベルで）を有するＯＲＦをコードする１つのｃＤＮＡクローンが、同定された。全長ｍＩＲＡＫ−４を得るために、このクローンを使用して、高いストリンジェンシー条件下で同じライブラリーをスクリーニングした。ｍＩＲＡＫ−４の重複するフラグメントをコードする、いくつかのポジティブクローンを同定した。
【０２１６】
このマウスＩＲＡＫ−４　ｃＤＮＡ（例えば、配列番号４を参照のこと）は、算定分子量５１ｋＤａを有する４５９アミノ酸のタンパク質（例えば、配列番号３を参照のこと）をコードし、これは、ヒトＩＲＡＫ−４タンパク質と８７％の類似性および８４％の同一性を共有する（ＧＣＧパッケージのＧＡＰユーティリティーを用いて分析した）。
【０２１７】
（Ｅ．ＴＲＡＦ６およびＩＲＡＫ−１とのＩＲＡＫ−４のＩＬ−１誘導性会合）
（方法）
ＩＬ−１ＲＩを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（２９３ＲＩ、１．５×１０８細胞／サンプル（Ｃａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７１：１１２８−３１（１９９６）；Ｃａｏら、Ｎａｔｕｒｅ　３８３：４４３−６（１９９６））を、１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１で０、２、１０および３０分間刺激した。他に記載されるように（Ｗｅｓｃｈｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　７：８３７−４７（１９９７））、これらの細胞を収集し、溶解緩衝液中で氷上で２０分間溶解し、そして遠心分離して細胞細片を除去した。この清澄化した溶解物を、プロテイン−Ｇビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、および免疫前血清またはＥ．ｃｏｌｉ発現全長ＩＲＡＫ−４に対して２４時間４℃で惹起したウサギ抗血清のいずれかと共に、インキュベートした。免疫沈降物を、徹底的に洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＴＲＡＦ６（Ｃａｏら、Ｎａｔｕｒｅ　３８３：４４３−６（１９９６））、ＩＲＡＫ−１（Ｃａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７１：１１２８−３１（１９９６））またはＩＲＡＫ−４に対して惹起した抗血清でブロットした。
【０２１８】
（結果）
ＩＬ−１シグナル伝達におけるＩＲＡＫ−４の関与を調べるために、内因性ＩＲＡＫ−４がＩＬ−１シグナルの公知のトランスデューサーとＩＬ−１依存性様式で相互作用する能力を、分析した。種々の長さの時間でインターロイキン−１で刺激した２９３ＲＩ細胞の溶解物を、ＩＲＡＫ−４に対する抗血清で免疫沈降し、そしてＩＲＡＫ−１およびＴＲＡＦ６に対する抗血清で免疫ブロットした。ＩＲＡＫ−１およびＴＲＡＦ６とのＩＲＡＫ−４のＩＬ−１誘導性の会合は、試験した最も早い時点（２分）で観察され、そして１０分のインキュベーション後に増加し、そして３０分後に減少した。これは、ＩＬ−１シグナルを伝達する重要な分子としての役割と一貫する、ＩＲＡＫ−１およびＴＲＡＦ６とのＩＲＡＫ−４のＩＬ−１誘導性の迅速かつ一過性の相互作用を示す（例えば、図５を参照のこと）。
【０２１９】
免疫前血清で沈降したサンプルにおけるＩＲＡＫ−１またはＴＲＡＦ６シグナルの非存在は、この相互作用の特異性を実証し、そしてＩＲＡＫ−４抗血清でのコントロールブロットは、等量が沈殿されたことを示す。
【０２２０】
本明細書中に記載の実施形態が例示目的のみであること、およびそれを考慮した種々の改変または変化が、当業者に示唆されそして本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが、理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のためのそれらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【０２２１】
（配列表）
（配列番号１）
（ヒトＩＲＡＫ−４アミノ酸配列）
【０２２２】
【化１】
Figure 2004500074
。
【０２２３】
（配列番号２）
（ヒトＩＲＡＫ−４　ｃＤＮＡ配列）
【０２２４】
【化２】
Figure 2004500074
。
【０２２５】
（配列番号３）
（マウスＩＲＡＫ−４アミノ酸配列）
【０２２６】
【化３】
Figure 2004500074
。
【０２２７】
（配列番号４）
（マウスＩＲＡＫ−４　ｃＤＮＡ配列）
【０２２８】
【化４】
Figure 2004500074
。
【０２２９】
（配列番号５）
（ヒトＩＲＡＫ−４の増幅のためのセンスプライマー）
【０２３０】
【化５】
Figure 2004500074
。
【０２３１】
（配列番号６）
（ヒトＩＲＡＫ−４増幅のためのアンチセンスプライマー）
【０２３２】
【化６】
Figure 2004500074
。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒトＩＲＡＫ−４のアミノ酸配列を提供する。
【図２】
図２は、ヒトＩＲＡＫ−４　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を提供する。
【図３】
図３は、マウスＩＲＡＫ−４のアミノ酸配列を提供する。
【図４】
図４は、マウスＩＲＡＫ−４　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を提供する。
【図５】
図５は、内因性ＩＲＡＫ−４が、ＩＬ−１依存性の様式で、ＴＲＡＦ−６およびＩＲＡＫ−１の両方と生理的に相互作用することを示すデータを提供する。

Claims (62)

  1. ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該ポリペプチドが、配列番号１またはその部分配列に対する少なくとも約９８％のアミノ酸配列の同一性を有し、ここで、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸第８１位に対応するアミノ酸位置にアラニン残基を含み、そしてここで、該核酸が、少なくとも約４００ヌクレオチドを含む、核酸。
  2. 請求項１に記載の核酸であって、前記ポリペプチドが、以下：
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸第４３２位に対応するアミノ酸位置のバリン残基；
    （ｉｉ）配列番号１のアミノ酸第４３７位に対応するアミノ酸位置のロイシン残基；
    （ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸第４４４位に対応するアミノ酸位置のアルギニン残基；および
    （ｉｖ）配列番号１のアミノ酸第４５１位に対応するアミノ酸位置のグルタミン残基
    からなる群より選択されるアミノ酸をさらに含む、核酸。
  3. 請求項２に記載の核酸であって、前記ポリペプチドが、（ｉ）〜（ｉｖ）に列挙された各前記アミノ酸を含む、核酸。
  4. 請求項１に記載の核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、核酸。
  5. 請求項１に記載の核酸であって、前記ポリペプチドが、少なくとも約１００アミノ酸を含む、核酸。
  6. 請求項１に記載の核酸であって、前記ポリペプチドが、少なくとも約４５０アミノ酸を含む、核酸。
  7. 請求項１に記載の核酸であって、該核酸が、配列番号２のヌクレオチド第２４２位に対応するヌクレオチド位置にシトシンを含む、核酸。
  8. 請求項７に記載の核酸であって、該核酸が、以下：
    （ｉ）配列番号２のヌクレオチド第１２９５位に対応するヌクレオチド位置のチミン；
    （ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド第１３０２位に対応するヌクレオチド位置のチミン；
    （ｉｉｉ）配列番号２のヌクレオチド第１３１０位に対応するヌクレオチド位置のチミン；
    （ｉｖ）配列番号２のヌクレオチド第１３３２位に対応するヌクレオチド位置のアデニン；および
    （ｖ）配列番号２のヌクレオチド第１３５３位に対応するヌクレオチド位置のアデニン
    からなる群より選択されるヌクレオチドをさらに含む、核酸。
  9. 請求項８に記載の核酸であって、該核酸が、（ｉ）〜（ｖ）に列挙された各前記ヌクレオチドを含む、核酸。
  10. 請求項１に記載の核酸であって、該核酸が、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、核酸。
  11. 請求項１に記載の核酸であって、該核酸が、少なくとも約１３５０ヌクレオチドを含む、核酸。
  12. 請求項１に記載の核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して作製された抗体に特異的に結合する、核酸。
  13. 請求項１に記載の核酸であって、該核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、核酸。
  14. 請求項１３に記載の核酸を含む、発現カセット。
  15. 請求項１４に記載の発現カセットを含む、単離された細胞。
  16. 単離されたＩＲＡＫ−４ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号１またはその部分配列に対する少なくとも約９８％のアミノ酸配列の同一性を有し、ここで、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸第８１位に対応するアミノ酸位置にアラニン残基を含み、そしてここで、該ポリペプチドが、少なくとも約１００アミノ酸を含む、ポリペプチド。
  17. 請求項１６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、以下：
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸第４３２位に対応するアミノ酸位置のバリン残基；
    （ｉｉ）配列番号１のアミノ酸第４３７位に対応するアミノ酸位置のロイシン残基；
    （ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸第４４４位に対応するアミノ酸位置のアルギニン残基；および
    （ｉｖ）配列番号１のアミノ酸第４５１位に対応するアミノ酸位置のグルタミン残基
    からなる群より選択されるアミノ酸をさらに含む、ポリペプチド。
  18. 請求項１７に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、（ｉ）〜（ｉｖ）に列挙された全ての前記アミノ酸を含む、ポリペプチド。
  19. 請求項１６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  20. 請求項１６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、ポリペプチド。
  21. 請求項１６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して作製された抗体に特異的に結合する、ポリペプチド。
  22. 請求項１６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも約４５０アミノ酸を含む、ポリペプチド。
  23. ＩＲＡＫ−４ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該ポリペプチドが、配列番号３またはその部分配列に対する少なくとも約７０％のアミノ酸配列の同一性を有する、核酸。
  24. 請求項２３に記載の核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、核酸。
  25. 請求項２３に記載の核酸であって、該核酸が、配列番号４またはその部分配列に対する少なくとも約７０％のヌクレオチド配列の同一性を有する、核酸。
  26. 請求項２３に記載の核酸であって、該核酸が、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、核酸。
  27. 請求項２３に記載の核酸であって、該核酸が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号４のヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする、核酸。
  28. 請求項２３に記載の核酸であって、該核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、核酸。
  29. 請求項２８に記載の核酸を含む、発現カセット。
  30. 請求項２９に記載の発現カセットを含む、単離された細胞。
  31. ＩＲＡＫ−４ポリペプチドを作製する方法であって、該方法は、以下：
    （ｉ）請求項１または請求項１９に記載の核酸を、宿主細胞または細胞抽出物に導入する工程；
    （ｉｉ）該ＩＲＡＫ−４ポリペプチドが、該宿主細胞または細胞抽出物中で発現されるような条件下で、該宿主細胞または細胞抽出物をインキュベートする工程；および
    （ｉｉｉ）該宿主細胞または細胞抽出物から該ＩＲＡＫ−４ポリペプチドを回収する工程
    を包含する、方法。
  32. 炎症疾患を処置する際に有用な化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
    （ｉ）ＩＲＡＫ−４ポリペプチドと該化合物を接触させる工程であって、ここで、該ＩＲＡＫ−４ポリペプチドが、配列番号１または配列番号３に対する少なくとも約７０％のアミノ酸配列の同一性を有する、工程；および
    （ｉｉ）該ＩＲＡＫ−４ポリペプチドに対する該化合物の機能的な効果を決定する工程
    を包含する、方法。
  33. 請求項３２に記載の方法であって、前記ＩＲＡＫ−４が、配列番号１または配列番号３として示されるアミノ酸配列を含む、方法。
  34. 請求項３２に記載の方法であって、前記化合物が、ＩＲＡＫ−４キナーゼ活性を阻害する、方法。
  35. 請求項３２に記載の方法であって、前記ＩＲＡＫ−４が、真核生物細胞内に存在する、方法。
  36. 患者における炎症疾患を処置する方法であって、該方法が、ＩＲＡＫ−４を調節する治療有効量の化合物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
  37. 請求項３６に記載の方法であって、前記化合物が、ＩＲＡＫ−４キナーゼ活性を阻害する、方法。
  38. 請求項３６に記載の方法であって、前記化合物が、請求項３２に記載の方法を用いて同定される、方法。
  39. 請求項３６に記載の方法であって、前記炎症疾患が、肺疾患および気道の疾患、移殖片拒絶、自己免疫疾患、癌、心臓血管疾患、中枢神経系の疾患、ＣＤ１４媒介性敗血症、非ＣＤ１４媒介性敗血症、変形性関節症、骨粗鬆症、乾癬、皮膚の疾患、炎症性腸疾患、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、類肉腫症、痛風、ならびに眼の疾患および状態からなる群より選択される、方法。
  40. 請求項３９に記載の方法であって、前記肺疾患および気道の疾患が、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＯＰＤ）、肺線維症、間質性肺疾患、ぜん息、慢性咳、およびアレルギー性鼻炎からなる群より選択される、方法。
  41. 請求項３９に記載の方法であって、前記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、および糖尿病からなる群より選択される、方法。
  42. 請求項３９に記載の方法であって、前記癌が、固形腫瘍、皮膚癌、およびリンパ腫からなる群より選択される、方法。
  43. 請求項３９に記載の方法であって、前記心臓血管疾患が、発作およびアテローム硬化症からなる群より選択される、方法。
  44. 請求項３９に記載の方法であって、前記中枢神経系の疾患が、神経変性疾患である、方法。
  45. 請求項３９に記載の方法であって、前記皮膚の疾患が、発疹、接触皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎からなる群より選択される、方法
  46. 請求項３９に記載の方法であって、前記炎症性腸疾患が、クローン病および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、方法。
  47. 細胞においてＩＬ−１Ｒ／Ｔｏｌｌレセプターの活性化により生じるシグナルの伝達を阻害する方法であって、該方法が、ＩＲＡＫ−４の活性または発現のインヒビターを該細胞に導入する工程を包含する、方法。
  48. 請求項４７に記載の方法であって、前記ＩＬ−１Ｒ／Ｔｏｌｌレセプターが、ＩＬ−１によって活性化される、方法。
  49. 請求項４７に記載の方法であって、前記インヒビターが、ＩＲＡＫ−４のドミナントネガティブ形態を含む、方法。
  50. 請求項４９に記載の方法であって、前記ＩＲＡＫ−４のドミナントネガティブ形態が、ＡＴＰ結合ポケットのリジン残基における変異を含む、方法。
  51. 請求項５０に記載の方法であって、前記変異が、前記ＩＲＡＫ−４内にある、配列番号１の第２１３位および第２１４位に対応するアミノ酸位置のリジン残基に代わるアラニン残基の置換を含む、方法。
  52. 請求項４９に記載の方法であって、前記ＩＲＡＫ−４のドミナントネガティブ形態が、ＩＲＡＫ−４の切断型形態である、方法。
  53. 請求項５２に記載の方法であって、前記ＩＲＡＫ−４の切断型形態が、本質的に配列番号１のアミノ酸１〜１９１からなる、方法。
  54. 請求項４７に記載の方法であって、前記インヒビターが、請求項３２に記載の方法を用いて同定される化合物を含む、方法。
  55. 請求項４５に記載の方法であって、前記インヒビターが、少なくとも１つの転写因子の活性化を阻害する、方法。
  56. 請求項５３に記載の方法であって、前記転写因子が、前記細胞においてＮＦκＢを活性化する、方法。
  57. 内因性ＩＲＡＫ−４遺伝子における変異を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
  58. 請求項５７に記載のトランスジェニック動物であって、前記変異が、前記内因性ＩＲＡＫ−４遺伝子を不活性化する、トランスジェニック動物。
  59. 請求項５８の変異であって、前記変異が、前記内因性ＩＲＡＫ−４遺伝子の全てかまたは一部の欠失を含む、変異。
  60. 請求項５７に記載のトランスジェニック動物であって、該動物がマウスである、トランスジェニック動物。
  61. 内因性ＩＲＡＫ−４遺伝子における変異を含む、単離された変異体哺乳動物細胞。
  62. 請求項６１に記載の単離された変異体哺乳動物細胞であって、前記変異が、前記内因性ＩＲＡＫ−４遺伝子を不活性化する、単離された変異体哺乳動物細胞。
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