DE4342769A1 - Isolierung und Klonierung von für ein RNA-bindendes Protein kodierender cDNA sowie Untersuchung RNA-bindender Proteine - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Klonie­ rung von für ein RNA-bindendes Protein kodierender cDNA sowie weitere Verfahren unter Anwendung einer derartigen cDNA oder einer DNA, welche für ein RNA-bindendes Protein kodiert.

Spezifische Wechselwirkungen zwischen definierten Nukleotidbe­ reichen von RNA-Molekülen, wie mRNA, tRNA, rRNA und anderen RNAs, mit Proteinen spielen eine wichtige Rolle für biologische und pathologische Prozesse. Beispiele hierfür sind unter anderem RNA-Prozessierung, Kern-Cytoplasma-Transport, mRNA-Translation, RNA-Stabilität, RNA-Lokalisierung, Protein-Sekretion und viraler RNA-Metabolismus. In vielen Fällen sind die Bindungsregionen für Proteine auf RNA-Molekülen bekannt, teilweise durch Rückschlüsse über Sequenzanalogien, jedoch ist die Identität des Bindungs­ proteins unklar, eine cDNA dafür nicht vorhanden und kloniert, oder es ist überhaupt unklar, ob ein solches Protein für die gegebene RNA existiert.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher ein Verfahren bereitzustellen, welches es erlaubt zu untersuchen, ob für eine gegebene RNA ein daran bindendes Protein existiert, eine cDNA des Proteins zu klonieren oder mit Hilfe einer DNA oder cDNA für ein RNA-bindendes Protein Untersuchungen durchzuführen.

Gelöst wird diese Aufgabe u. a. durch ein Verfahren zur Isolie­ rung und Klonierung von für ein RNA-bindendes Protein kodieren­ der cDNA durch Herstellung einer cDNA-Genbank von einer Zell­ linie, welche das RNA-bindende Protein voraussichtlich enthält, wobei die Genbank in Expressionsvektoren einligiert wird, mit Hilfe derer in geeigneten Wirtszellen nach Transformation eine Expression des Proteins bewirkt werden kann, und die Expression in Wirtszellen durchgeführt wird, welche bereits einen weiteren Expressionsvektor enthalten, der ein Markergen und in der 5′- nicht-translatierten Region dieses Gens die Bindungsstelle des RNA-bindenden Proteins aufweist, und die Anwesenheit der cDNA über eine Verminderung der Expression des Markergens nachgewie­ sen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Feststellung, daß spezifische RNA/Protein-Komplexe die mRNA-Translation inhibie­ ren, wenn das Protein an eine RNA-Stelle in einer nahe an der cap-site liegenden Position bindet, welche in der nicht-trans­ latierten Region auf der 5′-Seite des Strukturgens liegt.

Dieser Effekt hängt vermutlich ab von der speziellen Position der Bindungsstelle und der Affinität der Wechselwirkung, ist jedoch anscheinend unabhängig von der physiologischen Rolle, die diese Wechselwirkung spielt, und der Sequenz der Bindungsstelle, wobei lediglich das Triplett "AUG" nicht enthalten sein sollte.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sollte die Bindungsstelle für das RNA-bindende Protein nicht allzu weit vom Transkrip­ tionsstartpunkt ("cap") entfernt liegen und vorzugsweise sollten sich nicht mehr als 40 Nukleotide zwischen cap und der Bindungs­ stelle befinden.

Wenn die Bindungsstelle in 5′-Position vor dem Beginn eines offenen Leserahmens für ein Protein kloniert wird, das aufgrund seiner Funktion nachgewiesen werden kann (Indikatoren, wie z. B. lacZ, Luziferase etc., oder selektierbare Marker, wie z. B. ura), dann kann die Bindung des RNA-bindenden Proteins nachgewiesen werden (Farbtest, Wachsen auf geeigneten Selektionsmedien). Die Klonierung ist schematisch in Fig. 1 dargestellt, der Nachweis über das Selektionsschema in Fig. 2.

Als selektierbare Marker, die im Rahmen der vorliegenden Erfin­ dung eingesetzt werden können und welche durch das Markergen exprimiert werden, können alle dem Fachmann hierfür bekannten und geeignet erscheinenden Marker oder andere über ihre Funktion nachweisbare Gene verwendet werden. Es sind dies beispielsweise Marker, welche mit einem geeigneten Substrat eine Farbbildung ergeben. Im vorliegenden Fall würde dies also dazu führen, daß die Background-Zellen aufgrund der ungehinderten Expression des Markergens bei fehlendem RNA-bindenden Protein farbig sind, wogegen in Zellen, in welchen das RNA-bindende Protein expri­ miert wird, die Translation der RNA zu Markerprotein unterbleibt und damit keine oder deutlich reduzierte Farbbildung stattfin­ det.

Antibiotikum-Resistenz verleihende Gene als Marker funktionieren ähnlich. Gegenüber Vergleichsplatten ohne Antibiotikum im Medium zeigen solche Platten mit Antibiotikum kein Wachstum an der Stelle, auf die ein für RNA-bindendes Protein positiver Klon ausplattiert wurde.

Schließlich kann auch vorteilhaft die Verwendung von Markern in defizienten Wirtszellstämmen und insbesondere auf "gegenselek­ tiven" Medien erfolgen. Hierbei werden Wirtszellstämme, insbe­ sondere Hefestämme sowie ein Markergen mit der beschriebenen RNA-Bindungsstelle verwendet. Die Ausnützung dieses Gens als Markergen in Zellen, welche kein RNA-bindendes Protein erzeugen, kann dann in positiver oder negativer Weise erfolgen. Positive Weise würde bedeuten, daß die Wirtszellen für das Markergen defizient sind und die Zellen, die den Marker exprimieren, also kein RNA-bindendes Protein exprimieren, einen Wachstumsvorteil haben gegenüber Zellen, bei denen die Markerexpression inhibiert ist durch das RNA-bindende Protein.

Negative Weise bedeutet, daß die Zellen, welche den Marker ex­ primieren, nicht auf dem verwendeten Medium wachsen können. Hierzu wird ein sogenanntes "gegenselektives Medium" verwendet. Ein Beispiel hierfür ist die Verwendung des ura-Markers und Kulturplatten mit Medium, enthaltend 5′-fluoro-orotic acid (5′- FOA) (Bolke et al., Mol. Gen. Genet. (1984), 197 : 345-346). Wird der ura-Marker exprimiert, weil kein RNA-bindendes Protein vorhanden ist, so wird auf diesen Platten aus 5′-FOA eine to­ xische Substanz gebildet (5′-Fluorouracil), weshalb die Zellen in ihrem Wachstum gehemmt bzw. getötet werden. Dagegen können Zellen, bei denen die ura-Marker-Produktion inhibiert ist auf­ grund der Anwesenheit von RNA-bindendem Protein wachsen.

Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte Klonie­ rungsstrategie beinhaltet die Herstellung einer cDNA-Bibiliothek aus einem Gewebe (einer Zellinie) in der ein vermutetes Binde­ protein exprimiert wird. Diese Bibliothek wird dann in einen Expressionsvektor kloniert, der eine regulierbare Expression des davon kodierten Proteins (die Regulierung erfolgt bespielsweise über einen durch Galaktose induzierbaren Promotor) nach Trans­ formation in Hefezellen erlaubt, die bereits das Konstrukt mit der gewünschten Bindungsstelle vor einem Markergen enthält. Der Klon, der die gesuchte cDNA, welche für das Bindeprotein ko­ diert, enthält, wird erkennbar sein durch eine reduzierte Ex­ pression des Markers (z. B. nach Galaktose-Induktion) vor einem Background von Zellen, in denen das Markerprotein stark expri­ miert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man Expressionsvektoren, in welche die cDNA einligiert wird, die einen regulierbaren Promotor enthalten, unter dessen Kontrolle die cDNA für das RNA-bindende Protein exprimiert wird. Es ist auch möglich, die Expression des Markerproteins (unabhängig von der Wirkung des RNA-bindenden Proteins) regulierbar zu gestalten durch Verwendung bespielsweise eines ebenfalls regulierbaren Promotors in diesem Vektorkonstrukt. Besonders bevorzugt ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, einen induzierbaren Promo­ tor für die Expression der cDNA des RNA-bindenden Proteins zu verwenden, und insbesondere einen durch Galaktose induzierbaren Promotor. Derartige Promotoren sind gut erforscht und der Zu­ satz des Induktors beeinträchtigt das Zellwachstum nicht.

Als Markergen wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt ein solches verwendet, welches nach Expres­ sion ein sichtbares Signal erzeugt, insbesondere das lacZ-Gen, welches zusammen mit einem Substrat eine Blaufärbung bei Expres­ sion ergibt, ein Antibiotikum-Resistenz vermittelndes Gen oder ein eine Defizienz im Wirtsstamm ausgleichendes Gen, wie oben beschrieben. Als Markergen können auch für DNA-bindende oder andere Regulatorproteine kodierende DNA-Sequenzen verwendet werden, deren Expression sich indirekt, d. h. durch den Effekt der Proteine nachweisen läßt.

Als Wirtszellen verwendet man bevorzugt Hefezellen, Bakterien oder Säugerzellen. Als Hefezellen verwendet man besonders bevor­ zugt Saccharomyces cerevisiae und als Bakterien E. coli Zellen. Bei Verwendung von E. coli Zellen erscheint es sinnvoll, die Bindungsstelle für das RNA-bindende Protein möglichst nahe an der Shine-Dalgarno Sequenz des Markergens zu positionieren. Auch hier kann der optimale Abstand leicht durch einfache Vorversuche festgestellt werden.

Die Verwendung von Säugerzellen als Wirtszellen bietet den zu­ sätzlichen Vorteil, daß für manche Anwendungen des erfindungs­ gemäßen Verfahrens posttranslationale Modifikationen des RNA- bindenden Proteins bzw. assoziierte Faktoren erforderlich sein könnten, wie sie in Säugerzellen, aber nicht in Hefen oder E. coli stattfinden können bzw. vorhanden sind.

Wenn eine (c)DNA für ein RNA-bindendes Protein bereits vorhanden ist, kann die (c)DNA und der Marker wie im obengenannten Ver­ fahren koexprimiert werden. Dabei können verschiedene Untersu­ chungen durchgeführt werden. Natürlich können derartige Unter­ suchungen auch mit einer wie oben beschrieben erfindungsgemäß isolierten cDNA durchgeführt werden.

Derartige Verfahren sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Eine bevorzugte Anwendungsmöglichkeit ist ein Ver­ fahren zur Untersuchung und Auffindung von Varianten von RNA- bindenden Proteinen mit neuen Eigenschaften, bei dem eine oder eine Bank entsprechend abgeänderter, für Varianten kodierender DNA-Sequenzen koexprimiert werden mit einer DNA-Sequenz, welche für die Bindungsstelle des Proteins auf der RNA und ein Marker­ gen kodiert, und die Bindeeigenschaften der Varianten anhand der Erzeugung des Markergenprodukts bestimmt werden. Hierbei ist beispielsweise die Herstellung von Varianten von RNA-bindenden Proteinen denkbar, die unterschiedliche Affinitäten zu Bindungs­ stellen aufweisen bzw. neue Bindungsstellen erkennen.

Wiederum ein weiteres Anwendungsgebiet liegt in einem Verfahren zur Untersuchung und Auffindung von Varianten von Bindungsstel­ len von RNA-bindenden Proteinen, bei dem eine für ein RNA-bin­ dendes Protein kodierende DNA-Sequenz koexprimiert wird mit einer DNA-Sequenz oder einer Bank von DNA-Sequenzen, welche für die mutierte Bindungsstelle des Proteins auf der RNA und ein Markergen kodieren, und die Bindefähigkeit des Proteins an die Bindungsstellenvariante über das Markergenprodukt bestimmt wird. Bei diesen beiden letztgenannten erfindungsgemäßen Verfahren liegt der Sinn in der Erkennung von Bindesequenzvarianten, die neue Eigenschaften aufweisen (z. B. höhere Affinität zum Binde- Protein).

Schließlich ist noch eine Verwendung Gegenstand der Erfindung als Verfahren zur Untersuchung von Pharmazeutika auf die Fähig­ keit, die Wechselwirkung von RNA und RNA-bindendem Protein zu beeinflussen, bei dem eine für das RNA-bindende Protein und eine für die Bindungsstelle des Proteins auf der RNA kodierende DNA- Sequenz und damit verbunden ein Markergen in Gegenwart eines oder mehrerer Pharmazeutika koexprimiert werden, und deren Ein­ fluß auf die Bindung zwischen Protein und RNA über die Menge des gebildeten Markergenprodukts bestimmt wird.

Ein wiederum weiterer Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren zur Regulierung der Expression eines Proteins A durch Koexpression einer entsprechenden DNA mit einer DNA-Se­ quenz, welche für ein Protein B kodiert, welches an die mRNA für Protein A bindet und welche unter Kontrolle eines regulierbaren Promotors steht.

Dieses erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Kontrolle der Synthese des Proteins A als Reaktion auf die Induktion bzw. Repression des Promotors, der die Expression des RNA-bindenden Proteins B steuert. Bevorzugt ist es hierbei, auch die Expres­ sion des Proteins A unter Verwendung transkriptionaler Kontroll­ mechanismen, z. B. regulierbarer Promotoren zu steuern. Schließ­ lich ist es auch denkbar, an das RNA-bindende Protein eine Do­ mäne anzuhängen, die es wiederum einer anderen Regulation, z. B. durch exogene Regulatoren zugänglich macht (Picard et al., Cell (1988) 54 : 1073-1080).

Die folgenden Beispiele erläutern in Verbindung mit den Abbil­ dungen die Erfindung weiter.

Fig. 1 zeigt schematisch den Aufbau eines im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Expressionskonstrukts, enthaltend einen konstitutiven Promotor, eine Protein-Bindungsstelle sowie ein Markergen, und dessen Transkription in die m-RNA, welche von dem RNA-bindenden Protein erkannt wird.

Fig. 2 zeigt ein Selektionsschema, welches den Nachweis des Vorhandenseins des RNA-bindenden Proteins erlaubt.

BEISPIELE I. Methoden 1) Konstruktion von rekombinanten Plasmiden

Die rekombinanten Plasmide, die verwendet wurden, um RNA-bin­ dende Proteine in der Hefe Saccharomyces cerevisiae unter Kon­ trolle des GAL::PGK-Fusionspromotors zu überexprimieren, wurden abgeleitet vom Plasmid YCpCATex (Oliveira et al., Molecular Microbiol 9 (1993), 521-532), welches das Ura3-Gen als Selek­ tionsmarker enthält (Fig. 3A). Zur Herstellung von YCp-U1A wurde das Plasmid pGEM-A verwendet, das die humane U1A cDNA- Sequenz, subkloniert in die EcoRI-Site von pGEM-3Zf(-) (Boelens et al., Nucl. Acids Res. 19 (1991), 4611-4618) enthält. Das Plasmid pGEM-A wurde mit StyI verdaut, die Enden aufgefüllt und das 900 bp Fragment in die Xho- und XbaI-Sites von YCpCATex eingebracht, welche ebenfalls aufgefüllte Enden aufwiesen. Für die Konstruktion des Plasmids pCT1-5′, enthaltend das MS2-Coat­ proteingen mit einer Säugerkonsensussequenz für effiziente Translationsinitiation (Kozak, J. Mol. Bio. 196 (1987b), 947- 950) wurde das Plasmid pCT1 (Peabody, J. Biol. Chem. 265 (1990), 5684-5689) mit PstI und SalI verdaut und mit basengepaarten und phosphorylierten komplementären Oligonukleotiden ligiert, welche die Sequenz 5′ GGATCCTCGA GCCACCAUGG CTTCTAACTT TACTCAGTTC GTTCTCG 3′ enthielten. Das Plasmid pCT1-5′ wurde mit KpnI ver­ daut, die überhängenden Enden aufgefüllt, mit XhoI verdaut und das 400 bp große Fragment in das Plasmid YCpCATex eingebracht unter Verwendung von XhoI/XbaI-Sites unter Bildung des Plasmids YCP-CP (enthalten in der Zellinie RS 453a/YCP-CP, FL-MSC, hin­ terlegt bei der DSM unter Nr. 8811 am 14. Dezember 1993).

Das Hefeindikatorplasmid YCpFL1 wurde hergestellt, wie bei Oli­ veira et al. (supra) beschrieben, und enthält den TEF1 (Trans­ lations-Elogations-Faktor) -Promotor, kloniert in YCplac22 (Gietz & Sugino, Gene 74 (1988), 527-534) und die Leadersequenz, das Luciferasegen und die PGK-Terminatorsequenz aus dem Plasmid YCpLUC/SUPex1 (Oliveira et al., supra). Das YCpFL1 enthält den Trp1-Selektionsmarker. Oligonukleotide entsprechend der RNA- Bindungssequenz für U1A und CP wurden wie bei Oliveira (supra) beschrieben in die AflII-Site auf der Luciferase-Leadersequenz kloniert (siehe Oliveira et al., und Fig. 3B und C). Das Indi­ katorplasmid FL-MSC ist enthalten in der Zellinie RS 453a/YCP- CP, FL-MSC, welche am 14. Dezember 1993 bei DSM unter der Nummer 8811 hinterlegt wurde.

Die für die Überexpression von RNA-bindenden Proteinen in Säu­ gerzellen verwendeten Plasmide sind abgeleitet von den Plasmiden pSG5 (Green et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988), 369). Dieses Plasmid enthält den frühen SV40 Promotor, die Intron II-Sequenz aus dem Ratten-β-Globingen, eine multiple cloning site und das SV40-Polyadenylierungssignal. EcoRI-Fragmente, enthaltend die U1A_wt (Sillekens et al., EMBO J. 6 (1987), 3841-3848), U1A_52-53 (Boelens et al., Nucl. Acids Res. 19 (1991), 4611-4618) und U1A_94-119 (Kambach & Mattaj, J. Cell Biol. 118 (1992), 11-21) kodierenden Sequenzen wurden subkloniert in die EcoRI-Site von pSG5, unter Erhalt der Plasmide pSG5-U1A_wt, pSG5-U1A_52-53 und pSG5- U1A_94-119. Das MS2-Coatproteingen, enthaltend eine eukaryontische Translationsinitionskonsensussequenz wurde erhalten durch Ver­ dauung des Plasmids pCT15′ mit KpnI, Auffüllen der überhängenden Enden und dann Verdauung mit BamHI. Das 400 bp Fragment wurde in die BamHI-Stelle und die aufgefüllte BglII-Stelle von pSG5 ein­ gebracht unter Erhalt des Plasmids pSG5-CP.

Alle Indikatorkonstrukte, welche in Säugerzellen verwendet wur­ den, wurden abgeleitet von dem Plasmid D4-GH (auch L5-GH ge­ nannt; Casey et al., Science 240 (1988), 924-928), welches be­ nachbarte 5′ BamHI und XbaI 3′-Sites eingeschlossen zwischen der gut charakterisierten Transkriptionsstartstelle des Ferritin­ promotors (Hentze et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 7226-7230) und der proteinkodierenden Region des humanen Wachs­ tumshormongens. Paare von komplementären Oligonukleotiden ent­ sprechend den Proteinbindungssequenzen (Fig. 4) wurden hybri­ disiert, phosphoryliert und zwischen die BamHI- und XbaI-Sites von D4-GH kloniert unter Bildung der folgenden Konstrukte: U1A- GH, U1Amut-GH, MSCU-GH, MSC-GH, MSU-GH und MSA-GH. Die für die Konstruktion dieser Plasmide verwendeten Verfahren entsprechen den im Stand der Technik bekannten und beispielsweise von Sam­ brook, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) beschriebenen.

Das Plasmid GH-short enthält eine Deletion des dritten Exon von hGH (Fig. 4) und wurde als interne Kontrolle für Transfektion und Wachstumshormonsimmunopräzipitationsassays verwendet. GH- short wurde wie folgt hergestellt. 100 ng eines Primers mit der Sequenz von 5′ CCTGTAGACA GAGCCCCCGG 3′, 100 ng eines M13 Uni­ versalprimers und 40 ng des Plasmids D4-GH wurden in einem End­ volumen von 30 µl einer Lösung, enthaltend 16,7 mM HCl/6,6 mM Tris-HCl pH 8,3/0,5 mM MgCl₂/0,66 mM jedes der dNTPs/33,33% DMSO/2,5 U Taq-Polymerase inkubiert und eine PCR (Polymerase- Kettenreaktion) wurde mit 30 Zyklen durchgeführt (30 Sekunden Denaturierung bei 93°C/30 Sekunden Annealing bei 40°C/150 Sekun­ den Extension bei 70°C) unter Bildung eines DNA-Produkts, ent­ haltend ungefähr 800 bp. Plasmid D4-GH wurde mit AccI und Hin­ dIII verdaut, das 4 kb Fragment isoliert und an das mit AccI/- HindIII verdaute PCR-Produkt ligiert.

2) Hefekulturbedingungen

Der Hefestamm RS453 (MATa, ade 2-1, trp 1-1, leu2-3, his 3-11, ura 3-52, lys⁺, can 1-100) wurde für mittlere Zeiträume (weniger als 2 Monate) bei 4°C auf YPD-Agarplatten gehalten (1% Pepton/1% Hefeextrakt/2% Glucose/2% Agar). Für längere Aufbewahrung galt folgendes: Einzelkolonien wurden in 5 ml YPD-Medium ange­ impft und über Nacht bei 30°C und ungefähr 150 rpm inkubiert; 500 µl der Kultur wurden mit 500 µl von 30% sterilen Glycerolen gemischt und nach 10 Minuten bei -80°C eingefroren.

Das selektive definierte Hefemedium (SD) enthält 0,67% (w/v) Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren (Difco)/2,0% Glucose/Ami­ nosäuren und Nukleotide in den folgenden Endkonzentrationen: Adenin 20 mg/l; Arginin 20 mg/l; Histidin 20 mg/l; Leucin 60 mg/l; Tryptophan 20 mg/l und Uracil 20 mg/l. Festes definiertes Medium wurde genau nach demselben Protokoll hergestellt unter Zugabe von 2% Agar.

Das Verfahren zur Indukation des Gal-Promotors wurde wie bei Guthrie und Fink, Guide to yeast genetics and molecular biology. Methods Enz. 194 (1991), 384 beschrieben, durchgeführt. Das Übernachtinokulum wurde bei 30°C in Lactatmedium pH 4,5, ent­ haltend 0,84% (v/v) Natriumlactat (60% w/v - Sigma)/1,13% (v/v) Milchsäure/0,67% (w/v) Hefestickstoffbasis ohne Aminosäu­ ren/0,05% Glucose/0,05% Hefeextrakt und den entsprechenden Aminosäuren oder Nukleotiden gezüchtet. Die Induktion wurde durchgeführt durch Verdünnung der Kultur auf OD₆₀₀ = 0,1, unter Zugabe von 1/10 Volumen 20% Galactose und weitere Inkubation bei 30°C.

3) Hefetransformation durch LiAc-Prozedur

Einzelkolonien wurden in YPD-Medium geimpft und über Nacht bei 30°C und 150 rpm inkubiert. Das Inokulum wurde auf OD₆₀₀ = 0,1 verdünnt und das Wachstum wird fortgesetzt unter denselben Be­ dingungen in der frühen log-Phase (OD₆₀₀ = 0,4 bis 0,5). Die Zellen wurden gewaschen in sterilem destilliertem Wasser und wiederaufgenommen in ein 1/200 Volumen einer Lösung, enthaltend 100 mM Lithiumacetat/10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA und inku­ biert für 1 Stunde bei 30°C unter leichtem Schütteln. 100 µl Zellen und 5 bis 10 µg der transformierten DNA wurden in einem Mikrofugenröhrchen gemischt und 30 Minuten bei 30°C inkubiert. 700 µl einer Lösung, enthaltend 40% PEG 4000/100 mM Lithium­ acetat/10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA wurden zugegeben und die Mischung weiter inkubiert für 30 Minuten bei 30°C. Nach Erhitzen auf 42°C über 5 Minuten wurden die Zellen durch 10 sekündige Zentrifugation bei 13000 g in einer Microfuge geerntet. Die Pellets wurden zweimal mit 0,7 ml TE gewaschen, resuspendiert in 100 µl TE und auf selektives Medium ausplattiert. Die Platten wurden 3 bis 4 Tage bei 30°C gehalten. Vier Klone jedes Kon­ strukts wurden zweimal hintereinander selektiert in dem entspre­ chenden festen Selektionsmedium. Einer dieser Klone RS 453a/YCP- CP, FL-MSC, transformiert mit dem Expressionsplasmid YCP-CP und dem Indikatorplasmid FL-MSC, wurde am 14. Dezember 1993 bei DSM hinterlegt unter Nr. 8811.

4) Herstellung von Hefeproteinextrakt

Die Proteinextraktherstellung wurde durchgeführt nach dem Ver­ fahren, wie es von Kingsman et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 329-341 beschrieben ist, mit geringen Abwandlungen. 5,0 bis 15,0 ml der Hefekultur wurden mit einer ungefähren Dichte von OD₆₀₀ = 0,8 geerntet durch Zentrifugation über 5 Minuten mit 3000 rpm bei Raumtemperatur in einer Laborzentrifuge (bench-top centrifuge). Das Pellet wurde einmal mit 10 ml sterilem destil­ liertem Wasser gewaschen, wiederum zentrifugiert und in 1,0 ml Hefelysispuffer resuspendiert (100 mM NaCl/50 mM Tris-HCl pH 7,4). Die Zellensuspension wurde in ein Eppendorf-Röhrchen über­ führt und 20 Sekunden bei Raumtemperatur mit maximaler Geschwin­ digkeit in einer Mikrofuge zentrifugiert. Das Pellet wurde in 200 ml Lysispuffer, enthalten 1 mM PMSF/10 µg/ml Leupeptin/1 mM DTT (nur für Extrakte enthaltend U1A oder Coatprotein) resuspen­ diert. Dann wurden Glaskügelchen (0,45 bis 0,50 mm, Braun Mel­ sungen AG, Deutschland) zugegeben bis zum Miniskus und die Zel­ len wurden zerstört bei 4°C durch drei Zyklen mit Vortexing 1 Minute und Inkubation auf Eis 1 Minute. Nach Zentrifugation über 2 Minuten bei 6000 g in einer Mikrofuge wurde der überstand in ein frisches Röhrchen überführt, das 5 Minuten bei 15000 g zen­ trifugiert wurde. Der überstand, enthaltend den löslichen Ex­ trakt der Zellen, wurde auf Eis oder bei -80°C gefroren aufgeho­ ben.

5) Luciferasetest

Der Luciferasetest wurde durchgeführt gemäß Brasier et al., Biotechniques 7 (1989), 116-121 mit geringen Abwandlungen. Eine Reaktionsmischung wurde hergestellt, welche 25 mM Glycil-Glycin pH 7,8/25 mM MgSO₄/4 mM EGTA/15 mM Kaliumphosphat ph 7,8/ 1 mM DTT/2 mM ATP enthielt. Eine Injektionsmischung wurde herge­ stellt, enthaltend 4 ml 25 mM Glycil-Glycin pH 7,8/25 mM MgSO₄/4 mM EGTA/2 mM DTT/0,2 mM D-Luciferin (Sigma, gelöst in destil­ liertem Wasser). 10 µl des Zellextraktes mit einer geeigneten Proteinkonzentration wurde zu 360 µl der Reaktionsmischung in einem Teströhrchen zugegeben, und dieses sofort in ein Luminome­ ter (Berthold, Biolumat LB9500C) eingeführt, das dann automa­ tisch 100 µl Puffer, enthaltend die Substrate, injizierte. Das von Umsetzung von Luciferin und ATP durch das Luciferaseenzym, welches in den Extrakten vorhanden ist, emittierte Lichte wurde in einem Luminometer 30 Sekunden bei 25°C gemessen

6) Säugerzellkulturbedingungen

Die Säugerzellen, welche im Rahmen der vorliegenden Arbeit ver­ wendet wurden, waren menschliche HeLa-Zellen (ATCC CCL2) und die Mausfibroblastenzellinie B6 (auch L-M(TK⁻) genannt, ATCC CCL1.3). Die Zellen wurden in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), enthaltend 10% fötales Kälberserum/1 U/ml Penicillin/- Streptomycin (Gibco)/2 mM Glutamin, bei 37°C, 5% CO₂ gehalten und wurden routinemäßig umgesetzt mit niedrigerer Dichte alle 3 Tage.

7) Transfektion

Die Plasmide wurde in B6- und HeLa-Zellen transfiziert unter Verwendung der Calciumphosphatpräzipitationsmethode, die von Graham und van der Eb, Virol. 52 (1973), 456-464 beschrieben wurde. Die Zellen wurden 24 Stunden vor Transfektion passagiert auf 0,5 bis 0,8 × 10⁶ pro 10 cm Platte. Das Medium wurde 3 Stun­ den vor der Transfektion erneuert. Für jede Transfektionsprobe wurden geeignete DNA-Mischungen gemischt mit 68,2 µl 2M CaCl₂·2H₂O in einem Endvolumen von 550 µl. Zu dieser Mischung wurden dann tropfenweise 550 µl 2x HBS (50 mM Hepes/280 mM NaCl/1,5 mM Na₂HPO₄/pH 7,08) zugegeben, während kontinuierlicher Bewegung der Probe durch Vortexen. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde 1,0 ml Präzipitat zu jeder Platte zu­ gegeben. Nach 16 bis 18 Stunden, in denen die Zellen dem Präzi­ pitat ausgesetzt waren, wurden die Zellen zweimal mit serum­ freiem DMEM-Medium gewaschen und in 10 ml frischem Medium inku­ biert. 50 µl 1M Natriumbutyrat pH 7,3 wurde pro Platte 24 Stun­ den nach Transfektion zugegeben und über Nacht inkubiert.

8) Metabolische Markierung der Zellen mit ³⁵S-Methionin und Immunpräzipitation

40 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen zweimal mit met­ hioninfreiem RPMI-Medium (Gibco) gewaschen und biosynthetisch 2 Stunden lang mit 100 µCi L-[³⁵S] Methionin (spezifische Aktivität 1300 Ci/mM) markiert in 2,5 ml methioninfreiem RPMI-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, 1 U/ml Penicillin/Strepto­ mycin (Gibco) und 2 mM Glutamin.

Nachfolgend wurden die Zellen zweimal mit eiskalter phosphatge­ pufferten Saline gewaschen und mit einer Zellkratzer geerntet. Die Zellen wurden 5 Minuten bei 1500 rpm und 4°C in einer Bench- Top-Zentrifuge zentrifugiert und 1 ml Lysispuffer (300 mM NaCl/50 mM Tris-HCl pH 7,4/1% Triton X-100/0,1% Phenylmethyl­ sulfonylfluorid/10 µg/ml Leupeptin) durch Vortexen und Inkuba­ tion auf Eis für 30 Minuten lysiert. Gleiche Volumen von Tri­ chloressigsäure-präzipitierbarem markierten Protein (1 bis 5 × 10⁷ cpm) wurden immunopräzipitiert mit einem Überschuß polyklo­ naler Anti-hGH-Antikörper, Anti-Luciferase-Antikörper oder Anti- U1A-Antikörper nach Einstellung des Volumens auf 1 ml mit Lysi­ spuffer. Nach leichtem Schaukeln der Proben bei 4°C über Nacht wurden 50 µl einer 50%igen (vol/vol) Suspension von Protein-A- Sepharose in phosphatgepufferten Kochsalzlösung zu jeder Probe zugegeben, die dann weiter unter Schütteln 1 Stunde bei 4°C inkubiert wurde. Die Sepharose wurde dann zweimal mit Waschpuf­ fer (50 mM Tris-HCl pH 7,5/100 mM NaCl/0,1% Triton X-100) gewa­ schen und in Elektrophorese-Probenpuffer (2X = 0,25 M Tris-HCl pH 6,8/4% SDS/20% Glycerol/10% 2-Mercaptoethanol/1‰ Bromp­ henolblau) 15 Minuten lang gekocht. 20 µl der Proben wurden auf 15 bis 17,5% SDS-Polyacrylamidgele geladen. Die Gele wurden mit Entensify (NEN, Boston, USA) behandelt, getrocknet und für die Autoradiographie belichtet.

II. Das MS2 Coatprotein und U1A reprimieren die Translation von Luciferase mRNAs, enthaltend die entsprechenden Bindungs­ stellen in 5′ UTR in Saccharomyces cerevisiae

Drei MS2 Coatprotein-Bindungssitemotive wurden entworfen und in die 5′ UTR von Luciferase-Reporterkonstrukten eingeführt: MSC (Motiv enthalten in FL-MSC, hinterlegt mit DSM 8811), MSA und MSA/del (Fig. 3). Die MSC-stem-loop ist eine Bindungsstelle mit hoher Affinität, während die Interaction von MS2 Coatprotein mit der MSA-stem-loop eine geringe Affinität aufweist (Romaniuk et al. (1987); Lowary & Uhlenbeck, Nucl. Acids Res. 15 (1987), 10483-10493). Die MSA/del Mutante enthält eine zusätzliche Muta­ tion in dem stem, das eine Herabsetzung der Stabilität der vor­ hergesagten RNA-stem-loop-Struktur bewirkt. Drei Klone, die jeweils eines FL-abgeleiteten Plasmide und YCP-CP-Plasmide auf­ weisen, wurden in Galactose- und Lactatmedium herangezogen und das gal/lac-Verhältnis der Luciferase-Expression berechnet. Die Klone, welche das Plasmid FL-MSC (hinterlegt mit DSM 8811) ent­ halten und auf Galactose herangezogen wurden, zeigten eine dra­ stische Reduktion der Luciferaseaktivität (gal/lac - ungefähr 15 bis 25%), wogegen die Klone, enthaltend die FL-MSA/del-Kon­ struktion enthielten eine Erhöhung der Luciferaseexpression in Galactosemedium zeigten (gal/lac - ungefähr 125%) (Fig. 5). Die Reduktion der Luciferaseexpression von dem FL-MSC-Konstrukt war gleichlaufend mit der Anwesenheit von Coatprotein, welches durch Galactose induziert war und läßt darauf schließen, daß Coatprotein die Repression in trans durch Bindung an das MSC- mRNA Target bewirkt. Interessanterweise zeigten die Klone, wel­ che die Bindungsstelle MSA mit niedriger Affinität enthielten, auch Inhibition der Luciferaseexpression in Galactosemedium (gal/lac = ungefähr 60%) (Fig. 5). Dies läßt darauf schließen, daß die Konzentration von Repressorprotein in den Zellen unter diesen Bedingungen ausreichend war, um sogar bei einer niedrigen Bindungsstellenaffinität zu sättigen.

Drei verschiedene U1A-Erkennungsregionen wurden in die 5′UTR von einem Luciferasekontrukt eingebracht, um zu untersuchen, ob die Translation ebenfalls in trans durch humanes U1A-Protein bloc­ kiert wird. Die Konstrukte, genannt Fl-U1Awt, FL-U1Awt/del und FL-U1Amut, sind in Fig. 3 gezeigt. Das U1Awt-Target erlaubt hochaffine Bindung von humanem U1A-Protein, wogegen die U1Amut- Bindungsstelle spezifische Bindung von U1A nicht erlaubt (Scherly et al., EMBO J. 8 (1989), 4163-4170). Das zusätzliche U1Awt/del-Target hat eine einzige Nukleotiddeletion in dem vor­ hergesagten stem, wobei sich die Stabilität des RNA-stem-loop RNA-Motivs reduziert.

Die Wirkung des humanen U1A-Proteins auf Luciferaseaktivität exprimiert aus den FL-U1A-Konstrukten ist in Fig. 6 gezeigt (die experimentelle Untersuchung war identisch zu der vorher für das Coatprotein beschriebenen). Die Luciferaseproduktion durch FL-U1Amut war höher in Galactose- als in Lactatmedium (gal/lac- Verhältnis = ungefähr 150%).

Die Effektivitäten der translationalen Repression, die mit dem MS2-Coatproteinsystem beobachtet wurden, waren vergleichsweise hoch, wogegen das U1A-System nicht so wirksam war wie das vor­ genannte. Diese Feststellung kann in Verbindung stehen mit einer möglichen Interaktion des exprimierten humanen U1A mit Targetsi­ tes des Hefe U1A-Gegenstücks.

III) Das MS2-Coatprotein reprimiert in trans die Expression von hGH mRNAs, enthaltend spezifische Bindungsstellen für das Coatprotein in der 5′UTR in transient transfizierten HeLa-Zel­ len

Reporterkonstruktionen, enthaltend Targetsites mit verschiedenen Affinitäten für das Coatprotein, wurden in HeLa-Transfektions­ assays verwendet und abgeleitet von dem Elternplasmid D4-GH. Die stem-loop-Targets MSA, MSU, MSC und MSCU besitzen in dieser Reihenfolge steigende Bindungsaffinitäten für das Coatprotein (Witherell et al., Biochem. 29 (1990), 11051-11057 und Fig. 4) und entsprechen denselben Strukturen, die in die Reportersysteme bei den in vitro Untersuchungen verwendet wurden, eingeführt wurden. Das Plasmid pMSCU-GH, welches die Bindungsstelle mit der höchsten vorhergesagten Affinität für das Coatprotein aufweist, wurde mit der internen Kontrolle D4-GHshort und mit dem Plasmid pSG5-CP in HeLa-Zellen cotransfiziert. Die ³⁵S-markierten Ext­ rakte wurden einer hGH-Immunpräzipitation unterworfen und eine intensive Bande entsprechend der internen Kontrolle des 17 kDa GHshort-Produkts wurde beobachtet, wogegen nur eine sehr schwa­ che Bande entsprechend dem 22 kDa hGH-Protein entdeckt werden konnte (Fig. 7B, Spuren 5 bis 6). Jedoch war, wenn das nicht­ spezifische Kontrollplasmid pSG5-U1A_52-53 verwendet wurde, bei der Cotransfektion anstelle von pSG5-CP, die Expression des 22 kDa hGH-Proteins genauso stark wie die Expression des GHshort-Prot­ eins. Daher korreliert die Produktion des Coatproteins mit der Abnahme der Expression des MSCU-GH-Konstrukts, was auf eine spezifische Repression von dem MSCU-GH-Konstrukt durch das Coat­ protein hinweist. Die Quantifizierung der hGH-Expression von MSCU-GH (unter Verwendung der Expression der internen Kontrolle D4-GHshort als Referenz) zeigt eine 10fache Reduktion unter reprimierbaren Bedingungen.

IV) Translationale Repression als eine Funktion von Re­ pressorproteinkonzentration und Bindungsstellenaffinität

Die Titration des pSG5-CP-Plasmids in einem HeLa-Cotransfek­ tionsexperiment ist gezeigt in Fig. 8A. Das Signal entsprechend dem ³⁵S-markierten Coatprotein, analysiert durch SDS-PAGE-Analy­ se, war erstmals sichtbar, wenn 0,4 µg des pSG5-Plasmids für die Transfektion verwendet wurden (vgl. Spuren 5 bis 8 mit Spur 9), nachher erhöhte sich die Coatproteinsynthese proportional zu der verwendeten Menge von pSG5-CP (Spuren 10 bis 12) bis zu 6 µg von pSG5-CP, wenn die Expression beginnt, gesättigt zu sein (nicht gezeigte Resultate).

Der Einfluß der Coatproteinkonzentration auf die Repression des MSC-GH-Konstrukts ist in Fig. 8B gezeigt und demonstriert, daß die GH-Expression umgekehrt proportional zur exprimierten Menge von Coatprotein war (Spuren 5 bis 12). Sogar 0,1 µg pSG5-CP war genug, um eine klare Repression des hochaffinen Targets MSC-GH zu übertragen (vgl. Spuren 5 bis 5 mit 7). Wenn 0,4 µg pSG5-CP für die Transfektion verwendet wurden, wurde die MSC-GH-Expres­ sion drastisch reduziert (Spur 9), im Gegensatz zur scheinbaren Unempfindlichkeit des MSA-GH-Konstrukts (Spur 3). Jedoch war, wenn 3,2 µg pSG5-CP verwendet wurden für die Transfektion, zu­ sätzlich zum praktischen Verschwinden des hGH-Signals vom MSC- GH-Konstrukt (Spur 11), die hGH-Expression von dem niedrigaffi­ nen Target MSA-GH ebenfalls betroffen (Spur 4). Dieses Resultat wurde nicht bewirkt durch eine nicht-spezifische Senstivität des GH-Konstrukts für hohe Dosen eines RNA-bindenden Proteins in der Zelle, da die Cotransfektion unter Verwendung von 3,2 µg pSG5- U1A-Plasmid nicht die MSC-GH-Expression inhibierte (Spur 13) und weil die Expression von MSA-GH signifikant mehr betroffen war, als die interne Kontrollen D4-GH.

V) Repression, bewirkt durch das Coatprotein korreliert mit den Bindungsaffinitäten zwischen den Proteinen der Target-mRNA

Die späteren Ergebnisse, die die Repression der niedrigaffinen Bindungsstelle MSA durch das Coatprotein zeigen, deuteten darauf hin, daß in einer weiteren Untersuchung der Einfluß der Affini­ tät zwischen dem Coatprotein und seinem mRNA-Target auf die Repression der mRNA untersucht werden sollte. Zu diesem Zweck wurden die Reporterkonstrukte MSA, MSU, MSC, MSCU-GH, welche die Bindungsstellen mit verschiedenen Affinitäten für das Coatpro­ tein enthalten (Fig. 4), in HeLa-Transfektionsassays verwendet. Für jeden Punkt der Transfektion wurde eines der Reporterplasmi­ de, die interne Kontrolle D4-GHshort und verschiedene Mengen von pSG5-CP cotransfiziert. Die hGH-Immunpräzipitation, welche mit diesem Experiment erhalten wurde, ist in Fig. 9 dargestellt. Wenn kein pSG5-CP zugegeben wurde zu dem Transfektionsassay, war die Expression von GH- und GHshort-Proteinen äquivalent (Spuren 2 bis 3, 6 bis 7, 11 bis 12, 14 bis 15, 18 bis 19). Das Bild veränderte sich nach Zugabe von 0,2 µg pSG5-CP in den Transfek­ tionsassay: Die Expression des MSC- und MSCU-GH-Konstrukts fiel drastisch ab (Spuren 12 und 16), es gab einen kleinen Rückgang in MSU-GH-Expression (Spur 8), während die Expression des MSA-GH und D4-GH unbetroffen blieben (Spuren 4 und 20). Mit Zugabe von 1,0 µg pSG5-CP-Plasmid in die Cotransfektion veränderte sich die Situation weiter: Die Wachstumshormonproduktion durch MSC und MSCU-GH verschwand praktisch (Spuren 13 und 17), wogegen die Expression der MSU- und MSA-GH-Reporter stark inhibiert war (Spuren 5 und 9). Eine nicht spezifische Inhibition des GHshort- Polypeptids trat in diesem Beispiel auf, aber der spezifische inhibitorische Effekt auf die MSA-GH-Expression ist klar von größerer Ordnung als der nicht-spezifische Effekt, der für die D4-GH-Expression beobachtet wurde (vgl. Spuren 5 und 21), was darauf hinweist, daß unter diesen Umständen das MSA-Target auf die Repression, welche durch das Coatprotein bewirkt wurde, ansprach. Die Quantifikation dieser Resultate ist in Tabelle 1 gezeigt. Die Quantifizierung zeigt die Werte, erhalten mit Indi­ kator-GH-Expression im Vergleich zu GHshort. Die Werte, welche für die Transfektionspunkte erhalten wurden, bei denen kein Coatprotein vorhanden war, wurden als 100% angenommen. Diese Zahlen zeigen eine direkte Korrelation zwischen den vorhergesag­ ten Bindungsaffinitäten und den verschiedenen Targets für das Coatprotein und den beobachteten inhibitorischen Effekt auf die GH-Expression.

Tatsächlich zeigen sowohl Hefe- und Säugerzellresulate, daß das niedrigaffine MSA-Target ausreicht, um die mRNA-Repression zu übertragen, wenn das Coatprotein in großen Mengen vorhanden war.

VI) Translationale Repression durch MS2 Coatprotein in stabil transfizierten Maus-B6-Zellen

Ein System, bestehend aus B6-Mausfibroblasten (auch L-M(TK⁻) genannt), welche stabil transfiziert sind mit pSG5-CP-Plasmid, von dem das Repressorprotein gleichmäßig produziert wird, wurde hergestellt. 20 individuelle Klone wurden von der stabilen Transfektionsmethode zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Eine Immunoblotanalyse, welche mit Proteinextrakten von einigen der erhaltenen Zellinien durchgeführt wurde, ist in Fig. 10 dargestellt. Unter den Proteinextrakten zeigten einige die Ex­ pression des Coatproteins als eine klare Bande, die an derselben Position wanderte wie das gereinigte Coatprotein (14 kDa), wäh­ rend kein Signal entdeckt werden konnte in Extrakten, welche mit nicht-transfizierten B6-Zellen hergestellt wurden. Die am besten Coatprotein exprimierenden Zellinien, abgeleitet von den Klonen Nr. 15 und Nr. 18 wurden für die weiteren Transfektionsexperi­ mente ausgewählt.

Die Analyse von Coatproteinproduktion in diesen Zellinien durch pulse labeling ist in Fig. 11 gezeigt. Die Zellen wurden 2 Stunden mit ³⁵S-Methionin markiert und Proteinextrakte durch SDS- PAGE analysiert. Die Spuren 6 bis 9 zeigen die B6-CP Nr. 15 markierten Proteine, und weisen auf die Anwesenheit einer Haupt­ bande eines 15 kDa Proteins hin, welches ebenfalls in geringeren Mengen in Extrakten aus B6-CP Nr. 18-Zellen (Spuren 10 bis 13), jedoch nicht in B6wt-Extrakten (Spuren 2 bis 5) erkennbar waren. Diese Resultate sind in Übereinstimmung mit den beim Immunblot erhaltenen Resultaten, zeigend, daß die B6-CP Nr. 15-Zellinie mehr Coatprotein als die B6-CP Nr. 18-Linie synthetisierte.

Die Expression einer niedrigaffinen (MSA) und einer hochaffinen (MSCU) Targetkonstruktion in B6-, in B6-CP Nr. 15- und in B6-CP Nr. 18-Zellen wurde verglichen durch cotransfizieren der MSA- oder der MSCU-GH-Konstrukte mit der internen Kontrolle D4- GHshort in verschiedene Zellinien. Die Wachstumshormon-Immun­ präzipitation, die aus dem Transfektionsexperiment durchgeführt wurde, ist in Fig. 11B dargestellt. Unter Verwendung des GHshort-Produkts als standardisierendem Parameter, um die MSA- und MSCU-GH-Expression in verschiedenen Zellinien zu verglei­ chen, wurde eine höhere Expression von MSCU-GH als MSA-GH fest­ gestellt in den Kontroll-B6wt-Zellen (vgl. Spuren 4 bis 5 mit 2 bis 3). Die hGH- und GHshort-Bandsignale wurden quantifiziert und als GH/GHshort-Verhältnisse ausgedrückt (gezeigt in Fig. 11C). Die MSCU/GH-Konstrukte exprimierten fast zweimal die Menge von hGH im Vergleich zum MSA-GH-Konstrukt. Diese Situation stellte sich umgekehrt dar bei den Coatprotein produzierenden Zellen. Die Expression des Wachstumshormons durch das MSCU-GH- Plasmid war immer geringer als die Expression, die für das MSA- GH-Plasmid beobachtet wurde (Fig. 11B, vgl. Spuren 8 bis 9 und 12 bis 13 mit 6 bis 7 und 10 bis 11, siehe auch quantifizierte Werte in Fig. 11C). Darüber hinaus war bei einem Vergleich der Werte, welche erhalten wurden für die MSCU-GH-Expression in verschiedenen Zellinien, das GH/GHshort-Verhältnis in den Coat­ protein-exprimierenden Zellen auf ungefähr 12% des Verhältnis­ ses reduziert, welches für die B6-Wildtypzellen erhalten wurden. Das ähnliche MSCU-GH/GHshort-Verhältnis, welches für die Zel­ linien B6-CP Nr. 15 und B6-CP Nr. 18 erhalten wurde, korreliert nicht mit der höheren Produktion des Repressorproteins durch die Linie Nr. 15, was darauf hinweist, daß die Menge von Coatpro­ tein, die durch Stamm Nr. 18 hergestellt wurde, bereits sätti­ gend für die Repression war. Dies könnte auch verantwortlich sein für die Verringerung der GH-Expression, die beobachtet wurde für das niedrigaffine MSA-GH-Konstrukt in den Coatprotein produzierenden Zellen (Fig. 11C). Wie bereits in früheren Expe­ rimenten war das niedrigaffine MSA-Target sensitiv für die Re­ pression durch Coatprotein, wenn die Konzentration des Repres­ sorproteins in den Zellen ausreichend hoch war.

Tabelle

Claims (14)

1. Verfahren zur Isolierung und Klonierung von für ein RNA- bindendes Protein kodierender cDNA durch Herstellung einer cDNA-Genbank von einer Zellinie, welche das RNA-bindende Protein voraussichtlich enthält, wobei die Genbank in Ex­ pressionsvektoren einligiert wird, mit Hilfe derer in ge­ eigneten Wirtszellen nach Transformation eine Expression des Proteins bewirkt werden kann, und die Expression in Wirtszellen durchgeführt wird, welche bereits einen weite­ ren Expressionsvektor enthalten, der ein Markergen und in der 5′-nicht-translatierten Region dieses Gens die Bin­ dungsstelle des betreffenden RNA-bindenden Proteins auf­ weist, und die Anwesenheit der cDNA über eine Verminderung der Expression des Markergens nachgewiesen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest die Expressionsvektoren, in welche die cDNA einligiert wird, einen regulierbaren Promotor enthalten, unter dessen Kontrolle die cDNA exprimiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen induzierbaren Promotor und insbesondere einen durch Galaktose induzierbaren Promotor verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß man als Markergen ein ein sichtbares Signal erzeugendes Gen, insbesondere das lacZ-Gen, ein Antibiotikumresistenz vermittelndes Gen oder ein eine Defizienz des Wirtsstammes ausgleichendes Gen verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markergen ein für ein Enzym kodierendes Gen verwendet, welches die Umwandlung einer nicht-toxischen Substanz in ein toxisches Produkt katalysiert und damit Selektion gegen die Expression dieses Markergens erlaubt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markergen ura und als Substanz 5-fluoroorotic acid (5-FOA) verwendet.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtszellen Hefezellen, Bakterien oder Säuger­ zellen verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen des Typs Saccharomyces cerevisiae oder E. coli verwendet.

9. Verfahren zur Untersuchung und Auffindung von Varianten von RNA-bindenden Proteinen mit neuen Eigenschaften, bei dem eine entsprechend abgeänderte, für die Variante kodierende DNA-Sequenz koexprimiert wird mit einer DNA-Sequenz, welche für die Bindungsstelle des Proteins auf der RNA und ein Markergen kodiert, und die Bindeeigenschaften anhand der Erzeugung des Markergenprodukts bestimmt.

10. Verfahren zur Untersuchung und Auffindung von Varianten von Bindungsstellen von RNA-bindenden Proteinen, bei dem eine für ein RNA-bindendes Protein kodierende DNA-Sequenz koex­ primiert wird mit einer DNA-Sequenz, welche für die mu­ tierte Bindungsstelle des Proteins auf der RNA und ein Markergen kodiert, und die Bindefähigkeit des Proteins an die Bindungsstellen-Mutante über das Markergenprodukt be­ stimmt.

11. Verfahren zur Untersuchung von Pharmazeutika auf ihre Fähigkeit, die Wechselwirkung von RNA und RNA-bindendem Protein zu beeinflussen, bei dem man eine für das RNA-bin­ dende Protein und eine für die Bindungsstelle des Proteins auf der RNA kodierende DNA-Sequenz und damit verbunden ein Markergen in Gegenwart eines oder mehrerer Pharmazeutika koexprimiert und deren Einfluß auf die Bindung zwischen Protein und RNA über die Menge des gebildeten Markergen­ produkts bestimmt.

12. Verfahren zur Regulierung der Expression eines Proteins A durch Koexpression einer entsprechenden DNA-Sequenz mit einer DNA-Sequenz, welche für ein Protein B kodiert, wel­ ches an die mRNA für Protein A bindet, und welche unter Kontrolle eines regulierbaren Promotors steht.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß auch die Expression des Proteins A unter Verwendung transkriptionaler Kontrollmechanismen erfolgt.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die für Protein B kodierende DNA-Sequenz mit einer zusätzlichen Sequenz versieht, welche für eine zusätzliche Proteindomäne kodiert, deren Anwesenheit bewirkt, daß die Bindeeigenschaften des RNA-bindenden Proteins durch exogene Regulatoren beeinflußt werden können.