DE60028554T2

DE60028554T2 - Verfahren zum screenen nach gegen krebs gerichteten medikamenten

Info

Publication number: DE60028554T2
Application number: DE60028554T
Authority: DE
Inventors: Yanagimachi Yoshihiro 201 Yanagikoji 335-3 SOWA; Inc. Tetsuro Chugai Res. Inst. Molec. Med ORITA
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-03-23
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2020-03-24
Also published as: AU3326300A; EP1164198A4; DE60028554D1; ATE329058T1; EP1164198A1; JP4394840B2; EP1164198B1; WO2000056917A1; US7407745B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen nach gegen Krebs gerichteten Medikamenten. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zum Screenen nach gegen Krebs gerichteten Medikamenten, die auf das Sp3-Protein abzielen, das an dem tumorsupprimierenden Mechanismus beteiligt ist.
Hintergrund des Fachgebiets
Krebs wird von einer Reihe genetischer Veränderungen verursacht, die die normalen Mechanismen zerstören, die den Zellzyklus, die Zelldifferenzierung und Zellmorphologie kontrollieren. Zahlreiche natürliche Verbindungen wurden isoliert, basierend auf ihrer Fähigkeit, Zellen mit abnormer Morphologie wiederherzustellen, um die Zelldifferenzierung zu induzieren und unkontrollierte Zellzyklen in verschiedenen Krebszellen und transformierten Zellen zu stoppen. Trichostatin A (TSA) (Sugita K et al., 1992, Cancer Res., 52, 168–172) und Trapoxin (Itazaki H et al., 1990, J. Antibiot., 43, 1524–1532) wurden als Substanzen isoliert, die die Transformation unterdrücken können. Diese Substanzen induzieren auch die Zelldifferenzierung und den Abbruch des Zellzyklus. Es war jedoch nicht klar, wie diese Substanzen derartige tumorsupprimierende Aktivität zeigten.
Man glaubt derzeit, dass Histondeacetylasen (HDAC) das Ziel dieser Medikamente sind. Tatsächlich hemmen TSA und Trapoxin die HDAC-Aktivität bei derselben Konzentration, bei der sie Antitumor-Aktivität zeigen (Yoshida et al. (1990), J. Biol. Chem., 265: 17174–17179; Kijima M et al. (1993), J. Biol. Chem., 268, 22429–22435). Rasch sich anhäufende Befunde legen nahe, dass die Acetylierung und Deacetylierung von Histon- und Nicht-Histonproteinen eine wichtige Rolle bei der Transkriptionskontrolle von eukaryontischen Zellen spielen (Wolffe AP und Pruss D. (1996), Cell, 84, 817–819; Wade PA et al. (1997), TIBS, 22, 128–132; Pazin MJ und Kadonaga JT (1997), Cell, 89, 325–328; Struhl K. (1998), Genes Dev., 12, 599–606; Kuo MH und Allis CD (1998), Bioessays, 20, 615–626). Da viele Transkriptionsfaktoren, Transkriptionscoaktivatoren und basische Transkriptionsinitiationskomplexproteine Histon-Acetyltransferase-Aktivität besitzen, wurde klar, dass die Acetylierung der Histone eine wichtige Rolle bei der Initiation und Förderung der Transkription spielen. Ferner zeigten die kürzliche Clonierung einiger der HDACs und die Tatsache, dass Transkriptionsrepressoren und Transkriptionscorepressoren Komplexe mit HDAC bilden, nach und nach, dass HDAC eine wichtige Rolle bei der Transkriptionsrepression spielt (Wolffe AP (1997), Nature, 387, 16–17). Da HDAC-Inhibitoren Antitumor-Aktivität zeigen, kann HDAC die Transkription einer Gruppe von Antitumorgenen unterdrücken, deren Produkte den Abbruch der Zellproliferation oder die Zelldifferenzierung induzieren (DePinho RA (1998), Nature, 391, 533–536).
Die hier genannten Erfinder bewiesen früher, dass Natriumbutyrat, das als Induktor für die Differenzierung gut bekannt ist und als HDAC-Inhibitor bei mikromolaren Konzentrationen wirkt, die Expression von p21/WAF1/Cip1 induzierte, das ein Cyclin-CDK-Inhibitor (ein negativer Regulator des Zellzyklus) ist, der unabhängig von p53 wirkt (Nakano K. et al. (1997), J. Biol. Chem., 272, 22199–22206). Sie berichteten auch, dass sowohl Natriumbutyrat als auch TSA den p21/WAF1/Cip1-Genpromotor durch die Sp1-Bindungssequenz aktivierten (Sowa Y et al. (1997), Biochem. Biophys. Res. Comm., 241, 142–150). Interessanterweise wurde kürzlich berichtet, dass die Sp1-Bindestelle im p21/WAF1/Cip1-Promotor ebenfalls an der Induktion von p21/WAF1/Cip1 durch TGF-β, Phorbolester, Okadainsäure, Progesteron oder durch den Geranylgeranyl-Transferase I-Inhibitor GGTI-298 beteiligt war (Datto MB et al. (1995), J. Biol. Chem., 270, 28623–28628; Biggs JR et al. (1996), J. Biol. Chem., 271, 901–906; Adnane J et al. (1998), Mol. Cell. Biol., 18, 6962–6970; Owen GI et al. (1998), J. Biol. Chem., 273, 10696–10701). Über diese wurde berichtet, dass TGF-β und GGTI-298 die Transkription von p21/WAF1/Cip1 induzierten, indem sie die Transkriptionsaktivität von Sp1 verstärkten, während Progesteron dasselbe durch Sp1 und CBP/p300 bewerkstelligt (Li JM et al. (1998), Nucleic Acids Res., 26, 2449–2456; Owen GI et al. (1998), J. Biol. Chem., 273, 10696–10701).
Man glaubt, dass diese Berichte die Transkriptionsinduktion durch SP1-vermittelte Aktivierung der Histon-Acetytransferase nahe legt. Man glaubt, dass die Histonacetylierung an der Aktivierung der Transkription vieler Gene beteiligt ist. Dagegen ist man der Ansicht, dass die Histondeacetylierung an der Repression der Transkription beteiligt ist, obwohl der detaillierte Mechanismus nicht klar ist. Kürzlich wurde berichtet, dass die Transkriptionsrepressoren N-CoR und SMRT die Transkription reprimierten, die für eine DNA-Sequenz spezifisch ist, indem sie intranukleare Transkriptionsfaktoren binden (Horlein AJ et al. (1995), Nature, 377, 397–404; Kurokawa R et al. (1995), Nature, 377, 451–454; Chen JD und Evans RM (1995), Nature, 377, 454–457). Da diese Faktoren an HDAC gleichzeitig binden und einen Komplex höherer Ordnung bilden, wird nahe gelegt, dass die rigide Organisation von Chromatin, die durch Histondeacetylierung vermittelt wird, die Transkription reprimiert (Pazin MJ und Kadonaga JT (1997), Cell, 89, 325–328; Heinzel T et al. (1997), Nature, 387, 43–48; Alland L et al. (1997), Nature, 387, 49–55). Tatsächlich zeigten Studien, bei denen ein Fusionsprotein der promyelocytischen Leukämie oder das promyelocytische Leukämie-Zinkfingerprotein und der Retinsäure-Rezeptor verwendet wurden, dass die Bindung von HDAC für die Repression der Transkription notwendig war (Lin RJ et al. (1998), Nature, 391, 811–814; Grignani F et al. (1998), Nature, 391, 815–818; He LZ et al. (1998), Nature Genet., 18, 126–135). Ein ähnlicher HDAC-vermittelter Mechanismus der Repression der Transkription, der für eine DNA-Sequenz spezifisch ist, wurde auch im Falle von Myc/Mad/Max (Hassig C et al. (1997), Cell, 89, 341–347; Laherty CD et al. (1997), Cell, 89, 349–356), E2F/Rb (Brehm A et al. (1998), Nature, 391, 597–601; Magnaghi-Jaulin L et al. (1998), Nature, 391, 601–605; Luo RX et al. (1998), Cell, 92, 463–473) und im Falle der DNA-Methylierung (Nan X et al. (1998), Nature, 393, 386–389; Jones PL et al. (1998). Nature Genet., 19, 187–191) gezeigt. Jedoch war nicht klar, ob ein spezifischer Transkriptionsfaktor, der an die SP1-Bindungssequenz binden kann, das Transkriptionsaktivierungssignal durch einen HDAC-Inhibitor vermittelt oder nicht.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel dieser Erfindung besteht darin, ein wirksames Verfahren zum Screenen nach einem gegen Krebs gerichteten Medikament bereitzustellen.
Die hier genannten Erfinder berichteten, dass TSA, von dem bekannt ist, dass es ein HDAC-Inhibitor mit einer tumorsupprimierenden Wirkung ist, den p21/WAF1/Cip1-Promotor durch die Sp1-Bindungssequenz aktivierte (Nakano K. et al. (1997), J. Biol. Chem., 272, 22199–22206; Sowa et al. (1997), Biochem. Biophys. Res. Comm., 241, 142–150). Die Erfinder glaubten, dass es möglich sein könnte, nach einem gegen Krebs gerichteten Medikament zu screenen, wobei man auf ein neuartiges Molekül abzielt, indem ein neues Molekül identifiziert wird, das an der Signalübertragung beteiligt ist, die zur Aktivierung des p21/WAF1/Cip1-Promotors als Reaktion auf einen TSA-Stimulus führt.
Deshalb suchten die Erfinder unter Verwendung von Gel-Mobilitätsshift-Tests des MG63-Zellkernextrakts zuerst nach Faktoren, die an die Sp1-Bindungssequenz im p21/WAF1/Cip1-Promotor während der Aktivierung des Promotors durch TSA banden. Dabei zeigten sie, dass Sp1 und Sp3 die Hauptmoleküle waren, die an die Sp1-Bindungssequenz im p21/WAF1/Cip1-Promotor banden (Lania L et al., 1997, Int. J. Biochem. Cell Biol., 29, 1313–1323).
Zusätzlich zum p21/WAF1/Cip1-Promotor untersuchten die Erfinder auch die Funktion von Sp1 und Sp3 mit einem Testsystem unter Verwendung des Luciferasegens als Reportergen, das abhängig von der GAL4-Bindungssequenz aktiviert wird. Sie zeigten, dass die Transkriptionsinduktion des Reportergens durch TSA in Gegenwart von GAL4-Sp3 auftrat, das ein Fusionsprotein von GAL4 und Sp3 ist, aber sie trat nicht in Gegenwart von GAL4-Sp1 auf, das ein Fusionsprotein von GAL4 und Sp1 ist. Ferner zeigten sie durch die Konstruktion verschiedener Sp3-Deletionsmutanten, dass die Aktivierung der Transkription als Reaktion auf einen TSA-Stimulus auftreten könnte, falls mindestens eine der beiden glutaminreichen Domänen vorhanden war, die in der Transkriptionsaktivierungsdomäne enthalten sind. Sie zeigten auch, dass die erzwungene Expression von dominantem negativen Sp3, dem eine Transkriptionsaktivierungsdomäne fehlt, die TSA-vermittelte Aktivierung des p21/WAF1/Cip1-Promotors und diejenige des Promotors, der durch die Sp1-Bindungssequenz aktiviert wird, reprimiert.
Diese Ergebnisse beweisen, dass Sp3 an der Aktivierung der Transkription von p21/WAF1/Cip1 durch TSA beteiligt ist. Diese Ergebnisse legen auch nahe, dass das Screenen nach gegen Krebs gerichteten Medikamenten, die auf Sp3 abzielen, möglich sein könnte. Das von den Erfindern unter Verwendung des Luciferasegens entwickelte Testsystem, das abhängig von der GAL4-Sequenz als Reportergen aktiviert wird, ist zum effizienten Screenen nach gegen Krebs gerichteten Medikamenten besonders geeignet.
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen nach einem gegen Krebs gerichteten Medikament, das auf das Sp3-Protein abzielt, das an der Tumorsuppression beteiligt ist. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zum effizienten Screenen nach einem gegen Krebs gerichteten Medikament unter Verwendung des Luciferasegens, das abhängig von der GAL4-Bindungssequenz als Reportergen aktiviert wird. Diese Erfindung betrifft insbesondere:

1) ein Verfahren zum Screenen nach einem gegen Krebs gerichteten Medikament, umfassend die Schritte:
(a) Herstellen einer Zelle, die (i) einen ersten Vektor enthält, der in exprimierbarer Weise DNA umfasst, die ein Fusionsprotein codiert, das eine Region des Sp3-Proteins mit transkriptioneller Aktivierungskapazität des Sp3-Proteins umfasst, wobei die Region mindestens eine der beiden glutaminreichen Regionen des Sp3-Proteins umfasst und ihr mindestens ein Teil der DNA-Bindungsdomäne fehlt, und eine Region umfasst, die die DNA-Bindungskapazität des GAL4-Proteins aufweist, und (ii) einen zweiten Vektor enthält, der eine Bindungssequenz des GAL4-Proteins, eine die Expression regulierende Sequenz, die durch die Bindung des Fusionsproteins aktiviert wird, und stromabwärts ein Reportergen umfasst, das funktional an die regulatorische Sequenz gebunden ist,
b) Inkontaktbringen einer Testprobe mit der Zelle und Messen der Reporteraktivität, und
(c) Auswählen einer Verbindung, die die Reporteraktivität im Vergleich mit einem Kontrolltest, bei dem die Testprobe nicht mit der Zelle in Kontakt gebracht wird, erhöht.

Hier offenbart wird ferner ein Verfahren nach (1), wobei das GAL4-Protein durch ein LexA-Protein oder Tetracyclin-Repressorprotein ersetzt wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren nach (1), wobei das Reportergen Luciferase, Chloramphenicol-Acetyltransferase, beta-Galaktosidase, menschliches Wachstumshormon (hGH) oder sezernierte alkalische Phosphatase codiert.
Ferner wird hier ein gegen Krebs gerichtetes Medikament offenbart, umfassend eine Verbindung, die die Sp3-vermittelte Transkriptionsaktivität als aktiven Bestandteil verstärkt, und das gegen Krebs gerichtete Medikament, wobei das Medikament durch ein Verfahren nach (1) oder (2) isoliert werden kann.
Wie in den Beispielen gezeigt, kann die Transkriptionsaktivierungsdomäne von Sp3 die Transkription vom p21/WAF1/Cip1-Promotor erhöhen. Das p21/WAF1/Cip1-Gen besitzt eine supprimierende Wirkung auf die Zellproliferation, und seine Expression wird durch TSA erhöht, von dem bekannt ist, dass es eine tumorsupprimierende Wirkung hat. Es ist auch bekannt, dass die Expression von p21/WAF1/Cip1 durch die Sp1-Bindungssequenz durch mehrere HDAC-Inhibitoren induziert wird, die mit Antitumor-Effekten eng in Beziehung stehen. Da diese Offenbarung zeigte, dass Sp3 an der Transkriptionsinduktion durch die Sp1-Bindungssequenz beteiligt war, glaubt man, dass die Behandlung und Vermeidung von Krebs durch die Aktivität von Sp3, das die Zellneoplasie supprimiert, ebenfalls möglich ist.
Das Verfahren dieser Erfindung zum Screenen nach einem gegen Krebs gerichteten Medikament basiert auf dem Befund durch die Erfinder, dass Sp3 an der Signalübertragung beteiligt ist, die zur Expression von Antitumoreffekten als Reaktion auf einen TSA-Stimulus führt. Dieses Verfahren basiert auch auf dem Befund, dass das von den Erfindern entwickelte System zum Nachweis der Transkriptionsaktivität von Sp3 unter Verwendung eines Reportergens auch zum Screenen nach einer Verbindung verwendet werden kann, die einen Antitumoreffekt besitzt, der TSA ähnelt.
Das Prinzip hinter dem Screening-Verfahren dieser Erfindung beinhaltet folgendes: Zuerst werden die Vektoren konstruiert. Der erste Vektor umfasst in exprimierbarer Weise DNA, die ein Fusionsprotein codiert, das eine Region des Sp3-Proteins mit transkriptioneller Aktivierungskapazität des Sp3-Proteins und eine Region mit der DNA-Bindungskapazität eines Heteroproteins umfasst. Der zweite Vektor umfasst die Bindungssequenz des Heteroproteins, eine die Expression regulierende Sequenz, die durch die Bindung des Fusionsproteins aktiviert wird, und stromabwärts ein Reportergen, das funktional an die regulatorische Sequenz gebunden ist. Diese Vektoren werden dann in eine Zelle eingeführt. In dieser Zelle wird das Fusionsprotein, das die Region mit der transkriptionellen Aktivierungskapazität des Sp3-Proteins und die Region mit der DNA-Bindungskapazität eines Heteroproteins umfasst, durch den ersten Vektor exprimiert. Das Fusionsprotein bindet an die Expression regulierende Sequenz im zweiten Vektor durch die DNA bindende Region, die vom Heteroprotein stammt. Wenn eine Verbindung, die positiv auf ein Antitumorsignal wie TSA wirkt, mit der Zelle in Kontakt kommt, wird die Expression eines Reportergens, das sich stromabwärts von der die Expression regulierenden Region befindet, im zweiten Vektor durch die Aktivierung der Transkription und der Aufhebung der Repression der Transkription des Reportergens durch die Transkriptionsaktivierungsregion induziert, die vom Sp3-Protein im Fusionsprotein stammt. Deshalb ist, falls dieses Testsystem unter Verwendung des Reportergens verwendet wird, ein effizientes Sp3-vermitteltes Screenen nach einem gegen Krebs gerichteten Medikament durch den Nachweis der Reporteraktivität in der Zelle nach Inkontaktbringen der Testprobe mit der Zelle möglich.
Und zwar umfasst das Screening-Verfahren dieser Erfindung die Schritte (a) Herstellen einer Zelle, enthaltend (i) den ersten Vektor, der in exprimierbarer Weise DNA umfasst, die ein Fusionsprotein codiert, das eine Region des Sp3-Proteins mit transkriptioneller Aktivierungskapazität des Sp3-Proteins und eine Region mit der DNA-Bindungskapazität eines Heteroproteins umfasst, und (ii) den zweiten Vektor, der eine Bindungssequenz des Heteroproteins, eine die Expression regulierende Sequenz, die durch die Bindung des Fusionsproteins aktiviert wird, und ein stromabwärtsliegendes Reportergen umfasst, das funktional an die regulatorische Sequenz gebunden ist, (b) Inkontaktbringen einer Testprobe mit der Zelle und Messen der Reporteraktivität, und (c) Auswählen einer Verbindung, die die Reporteraktivität im Vergleich mit einem Kontrolltest, bei dem die Testprobe nicht mit der Zelle in Kontakt gebracht wird, erhöht.
Der erste Vektor, der beim erfindungsgemäßen Screenen verwendet wird, umfasst in exprimierbarer Weise DNA, die ein Fusionsprotein codiert, das eine Region des Sp3-Proteins mit transkriptioneller Aktivierungskapazität des Sp3-Proteins und eine Region mit der DNA-Bindungskapazität eines Heteroproteins umfasst. DNA in exprimierbarer Weise umfassen, bedeutet, dass die DNA, die das Fusionsprotein codiert, mit der die Expression regulierenden Region (beispielsweise Promotor oder Enhancer) verbunden ist, die die Expression im Vektor sicherstellt. Beispielsweise wird die DNA, die das Fusionsprotein codiert, stromabwärts eines geeigneten Promotors innerhalb des Vektors, wie dem CMV-Promotor, eingebaut, so dass der Vektor das Fusionsprotein in einer geeigneten Wirtszelle, wie einer tierischen Zelle oder einer Hefezelle, exprimieren kann.
Die Region mit transkriptioneller Aktivierungskapazität des Sp3-Proteins, die in dem Fusionsprotein umfasst ist, das vom ersten Vektor exprimiert wird, ist nicht besonders begrenzt, solange es eine Region enthält, die zur Aktivierung der Transkription als Reaktion auf einen TSA-Stimulus fähig ist. Wünschenswerterweise umfasst eine derartige Region mindestens einen Teil der Transkriptionsaktivierungsdomäne, und ihr fehlt mindestens ein Teil der DNA-Bindungsdomäne. Obwohl das erfindungsgemäße Screenen sogar in Gegenwart der von Sp3 stammenden DNA-Bindungsregion möglich ist, ist das Vorhandensein dieser Region nicht wünschenswert, da ein Fusionsprotein, das diese Region umfasst, an verschiedene endogene Sp1-Bindungssequenzen binden kann. Im Falle des menschlichen Sp3-Proteins umfasst eine wünschenswerte Region mindestens eine der beiden glutaminreichen Regionen (Aminosäuren 10–123 und 223–358) und ihr fehlt mindestens ein Teil der Zinkfinger-Region (Aminosäuren 495–517, 525–547 und 555–575) (Chris, K. et al., 1992, J. Biol. Chem., 12: 4251–4261). Die Spezies, von der das Sp3-Protein stammt ist nicht begrenzt. Beispielsweise kann das Sp3-Protein aus Menschen, Säugern oder anderen Spezies verwendet werden.
Die Region, genauer gesagt, die Aminosäuren 1–398, 81–398, 161–398, 1–320, 1–240, oder 1–160 des menschlichen Sp3-Proteins, wie in 3 gezeigt, können entsprechend für diese Erfindung verwendet werden, aber sie sollten nicht dahingehend ausgelegt werden, dass sie darauf begrenzt ist.
Das in dem Fusionsprotein enthaltene Heteroprotein, das vom ersten Vektor exprimiert wird, ist nicht besonders begrenzt, solange es spezifisch an eine spezifizierte DNA-Sequenz binden kann. Beispielsweise können als Heteroprotein das GAL4-Protein, LexA-Protein (Gyuris, J. et al., 1993, Cell, 75: 791–803), Tetracyclin-Repressorprotein (Tet R) (Manfred, G. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547–5551) verwendet werden, aber das Heteroprotein sollte nicht dahingehend ausgelegt werden, dass es darauf begrenzt ist. Teilpeptide dieser Proteine können ebenfalls verwendet werden, solange sie spezifisch an eine spezifizierte DNA-Sequenz binden. Die Region mit der DNA-Bindungskapazität des Heteroproteins kann beispielsweise Peptide beinhalten, die die DNA-Bindungsdomäne des GAL4-Proteins (beispielsweise Aminosäuren 1–94 oder 1–147), die DNA-Bindungsdomäne des LexA- Proteins (beispielsweise Aminosäuren 1–202) (Erica, A. et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12: 3006–3014) und die DNA-Bindungsdomäne des Tetracyclin-Repressorproteins (Tet R) (Manfred, G. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547–5551) umfassen, aber die Peptide sollten nicht dahingehend ausgelegt werden, dass sie darauf begrenzt sind.
Der zweite Vektor dieser Erfindung umfasst eine Bindungssequenz des Heteroproteins, eine die Expression regulierende Sequenz, die durch die Bindung des Fusionsproteins aktiviert wird, und ein stromabwärtsliegendes Reportergen, das funktional an die regulatorische Sequenz gebunden ist.
Die für die Konstruktion des zweiten Vektors dieser Erfindung verwendete Bindungssequenz des Heteroproteins ist nicht besonders begrenzt, solange das vom ersten Vektor exprimierte Fusionsprotein spezifisch an die Bindungssequenz binden kann. Falls das Fusionsprotein beispielsweise die GAL4-DNA-Bindungsregion umfasst, kann die Bindungssequenz beispielsweise „5'-cggasgacwgtcstccg-3'; s = c oder g, w = a oder t" sein (Marmorstein, R. et al., 1992, Nature 356: 408–414). Falls das Fusionsprotein die LexA-Protein-DNA-Bindungsregion umfasst, kann die Bindungssequenz beispielsweise „5'-ctgtnnnnnnnnacag-3'; n = a, t, g oder c" sein (Erica, A. et al. (1992), Mol. Cell. Biol., 12: 3006–3014). Falls das Fusionsprotein die Bindungsdomäne des Tetracyclin-Repressorproteins (Tet R) umfasst, kann die Bindungssequenz beispielsweise „5'-tccctatcagtgatagaga-3'" sein (Manfred, G. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547–5551).
Es ist wünschenswert, eine Bindungssequenz zu verwenden, die von endogenen Proteinen innerhalb der vom Vektor transfizierten Zelle nicht erkannt wird. Es ist nicht wünschenswert, eine Sequenz zu verwenden, die von endogenen Proteinen erkannt wird, da die Reporteraktivitäten, die als Reaktion auf die Wirkungen der endogenen Proteine erzeugt werden, nachgewiesen werden können.
Um sicherzustellen, dass das stromabwärtsgelegene Reportergen exprimiert wird, wenn das Fusionsprotein, das vom ersten Vektor stammt, an die Bindungssequenz bindet, kann zusätzlich zur Bindungssequenz auch eine Promotorsequenz (wie die TATA-Sequenz und Kozak-Sequenz) in den zweiten Vektor als eine die Expression regulierende Sequenz eingeschlossen werden.
Wenn die DNA-Bindungsdomäne des GAL4-Proteins als die Region mit der DNA-Bindungskapazität des Fusionsproteins, das vom ersten Vektor stammt, verwendet wird, kann die im zweiten Vektor verwendete, die Expression regulierende Sequenz beispielsweise die 5x-GAL4-Bindungssequenz, der E1B-Minimalpromotor und die DNA-Sequenz sein, die die TATA-Sequenz enthält.
In dem zweiten Vektor der vorliegenden Erfindung ist das Reportergen funktional an die stromabwärtsliegende, die Expression regulierende Sequenz gebunden. Der Ausdruck „funktional gebunden" gibt an, dass das Reportergen an die Expression regulierende Sequenz gebunden ist, so dass es als Reaktion auf die Bindung des vom ersten Vektor stammenden Fusionsproteins an die Expression regulierende Sequenz exprimiert wird.
Obwohl das für diese Erfindung verwendete Reportergen nicht speziell begrenzt ist, solange sein Produkt nachweisbar ist, ist es wünschenswert, ein Gen zu verwenden, dessen Produkt ohne komplizierte Bearbeitung wie Northern-Blot-Analyse oder Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden kann. Geeignete Reportergene sind beispielsweise das Luciferasegen, Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gen, beta-Galaktosidase (β-Gal)-Gen, menschliches Wachstumshormon (hGH)-Gen und das sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP)-Gen.
Die Zelle, die für das erfindungsgemäße Screenen verwendet wird, ist nicht spezifisch begrenzt. Beispielsweise kann eine menschliche Zelle oder eine Säugerzelle, wie die MG63-Zelle (eine Zelllinie, die vom menschlichen Osteosarkom stammt), der genetisch p53 fehlt, verwendet werden. Eine Hefezelle oder eine Zelle von einem Mikroorganismus wie Escherichia coli kann ebenfalls verwendet werden. Ein dem Fachmann bekanntes Verfahren kann für Genmanipulationen zur Konstruktion von Vektoren, zur Einführung des Vektors in die Zelle etc. verwendet werden.
Beim erfindungsgemäßen Screenen wird eine Testprobe mit der Zelle in Kontakt gebracht, in die die vorstehend beschriebenen beiden Vektoren eingeführt wurden, und die Reporteraktivität wird gemessen.
Die für das Screenen verwendete Testprobe kann beispielsweise ein gereinigtes Protein (einschließlich Antikörpern), eine Genbank, Produkte einer Genbank, eine Bank für synthetische Peptide, Zellextrakt, Zellkulturüberstand, eine Bank für synthetische niedermolekolare Verbindungen, natürlicher Extrakt sein, aber sie sollte nicht dahingehend ausgelegt werden, dass sie darauf begrenzt ist. Die Testprobe kann durch ein Verfahren wie Zugabe der Testprobe zu einem Zellkulturmedium oder Einführen der Testprobe in die Zelle (einschließlich der Einführung des Gens) nach Art der verwendeten Testprobe mit der Zelle in Kontakt gebracht werden.
Die Reporteraktivität kann durch ein dem Fachmann bekanntes Verfahren je nach der Art des verwendeten Reportergens nachgewiesen werden. Beispielsweise wird bei Verwendung des Luciferasegens als Reportergen das Substrat für die Luciferase dem Zellextrakt zugegeben, und die Menge des emittierten Lichts durch die enzymatische Reaktion wird durch ein Luminometer nachgewiesen. Bei Verwendung des CAT-Gens als Reportergen kann die CAT-Menge im Zellextrakt durch das ELISA-Verfahren unter Verwendung von anti-CAT-Antikörpern nachgewiesen werden. Bei Verwendung des beta-Galaktosidase-Gens wird das Substrat für beta-Galaktosidase dem Zellextrakt zugegeben, und die durch die enzymatische Reaktion emittierte Lichtmenge wird durch ein Luminometer bestimmt. Bei Verwendung des menschlichen Wachstumshormon (hGH)-Gens wird die hGH-Menge in der Zellkultur durch das ELISA-Verfahren unter Verwendung von anti-hGH-Antikörpern nachgewiesen. Bei Verwendung des sezernierten alkalische Phosphatase (SEAP)-Gens als Reportergen wird das Substrat für die alkalische Phosphatase der Zellkultur zugegeben, und die durch die enzymatische Reaktion emittierte Lichtmenge kann durch ein Luminometer nachgewiesen werden.
Falls ein signifikanter Anstieg der Reporteraktivität als Folge der Messung der Reporteraktivität im Vergleich zu einem Kontrolltest beobachtet wird, bei dem die Testprobe nicht mit der Zelle in Kontakt gebracht wird, wird die verwendete Testprobe zu einem Kandidaten für eine Verbindung, die die Proliferation eines Tumors hemmt.
In dieser Erfindung wurde gezeigt, dass die durch Sp3 vermittelte Transkriptionsaktivität bei der Signalübertragung von TSA gefördert wird, das an der tumorsupprimierenden Wirkung beteiligt ist. Diese Tatsache zeigt, dass eine Verbindung, die die durch Sp3 vermittelte Transkriptionsaktivität verstärken kann, eine tumorsupprimierende Wirkung besitzen könnte. Daher betrifft die vorliegende Offenbarung auch ein gegen Krebs gerichtetes Medikament, das als aktiven Bestandteil eine Verbindung umfasst, die die durch Sp3 vermittelte Transkriptionsaktivität verstärkt.
Derartige Verbindungen, die die Sp3-Aktivität erhöhen, schließen verschiedene Verbindungen mit verschiedenen Wirkorten ein. Diese Verbindungen schließen beispielsweise diejenigen ein, die direkt auf Sp3 wirken und deren Funktion fördern, diejenigen, die auf Moleküle wirken, die an Sp3 binden und die Funktion von Sp3 indirekt fördern, diejenigen, die auf eine Gruppe von Proteinen wirken, die an der Reaktion von der Bindung von Sp3 an DNA bis zur Transkription beteiligt sind, diejenigen, die die Interaktion zwischen Sp3 und HDAC hemmen, diejenigen, die die Aktivität von HDAC hemmen und diejenigen, die die Funktion von Sp1 hemmen. Diese Verbindungen können durch das vorstehend erwähnte erfindungsgemäße Verfahren isoliert werden.
Man glaubt, dass eine Verbindung, die die durch Sp3 vermittelte Transkriptionsaktivität verstärkt, für viele Tumorarten anwendbar ist. Da die Induktion der durch Sp3 vermittelten p21/WAF1/Cip1-Expression nicht von p53 abhängt, erwartet man, dass die Verbindung besonders für Tumoren anwendbar ist, die ein mutiertes oder deletiertes p53 besitzen.
Wenn eine Verbindung, die die durch Sp3 vermittelte Transkriptionsaktivität verstärkt, als Arzneimittel verwendet wird, kann sie durch gut bekannte pharmazeutische Herstellungsverfahren formuliert werden. Beispielsweise kann die Verbindung als Formulierung verabreicht werden, die passend mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikel, genauer gesagt mit sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Pflanzenöl, Emulgator, Suspensionsmittel, Detergenz, Stabilisator etc. gemischt wird.
Die Verbindung kann Patienten beispielsweise durch transdermale, intranasale, transbronchiale, intramuskuläre, intravenöse oder orale Gabe verabreicht werden, abhängig von den Eigenschaften der Verbindung.
Obwohl die Dosierung abhängig vom Alter, Gewicht und den Symptomen des Patienten, dem Verabreichungsverfahren usw. variieren kann, kann der Fachmann eine geeignete Dosierung passend auswählen. Falls die Verbindung durch DNA codiert werden kann, ist eine Gentherapie ebenfalls durch Integrieren der DNA in einen Vektor für die Gentherapie möglich. Obwohl die Dosierung und das Verabreichungsverfahren abhängig vom Gewicht, Alter, Symptomen und dem Patienten variieren können, kann der Fachmann eine geeignete Dosierung und ein geeignetes Verabreichungsverfahren passend auswählen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist ein Foto eines Gel-Shift-Tests (EMSA), der die Bindung von Sp1 und Sp3 an die Sp1-Bindungssequenz zeigt, die für die TSA-abhängige p21/WAF1/Cip1-Promotoraktivierung notwendig ist. EMSA wurde sowohl mit Kernextrakten aus TSA-behandelten (Spuren 5–9) als auch mit nicht TSA-behandelten (Spuren 1–4) MG63-Zellen durchgeführt. Die Sp1-Bindungssequenz (Positionen –87 bis –72 von der Transkriptionsstartstelle), die für die TSA-abhängige Promotoraktivierung notwendig ist, wurde als DNA-Sonde verwendet. Es erfolgte ein Supershift-Test für jede der Banden unter Verwendung von Anti-Sp1-Antikörpern (Spuren 2, 4, 6 oder 8) oder Anti-Sp3-Antikörpern (Spuren 3, 4, 7 oder 8). Die Positionen der Sp1- und Sp3-Banden sind links angegeben.
2 zeigt die TSA-abhängige Transkriptionsinduktion durch Sp3. MG63-Zellen wurden gemeinsam mit 2,5 μg von entweder GAL-4-Sp1- oder GAL4-Sp3-Plasmid und mit 0,5 μg pG5-luc Reporterplasmid transfiziert. An Stunde 24 der Posttransfektion wurde TSA (500 ng/ml) zugegeben, 24 Stunden später wurden die Zellen lysiert, und die Luciferaseaktivität wurde gemessen. Die Transkriptionsinduktion durch TSA wird als Verhältnis zum nicht mit TSA behandelten Kontrollwert ausgedrückt. Jedes Experiment erfolgte in dreifacher Ausführung und die gezeigten Daten sind für fünf unabhängige Experimente repräsentativ.
3 zeigt die TSA-abhängige, durch die glutaminreiche Sp3-Domäne vermittelte Transkriptionsinduktion. Die Sequenzen der verschiedenen GAL4-Sp3-Deletionsmutantenproteine sind in 3 angegeben. Die Stärken der Transkriptionsinduktion durch TSA bei der Expression jedes dieser Proteine in den MG63-Zellen sind rechts angegeben. Die Transfektion und TSA-Behandlung erfolgten ähnlich wie bei 2. Jedes Experiment erfolgte in dreifacher Ausführung und die gezeigten Daten sind für drei unabhängige Experimente repräsentativ.
4 zeigt die Repression der TSA-abhängigen Transkriptionsinduktion von entweder dem p21/WAF1/Cip1-Promotor oder dem Sp1-Promotor durch dominantes negatives Sp3. MG63-Zellen wurden gleichzeitig mit 0, 1,25, 2,5 oder 5,0 μg pCMV-DNSp3 transfiziert, während die Gesamtmenge der Plasmide auf 5,0 μg durch Zugabe des pCMV3.1-Kontrollplasmids und mit 0,5 μg Reporterplasmid, pWWP (a), pWPdel-BstXI (b), Sp1-luc (c) oder mtSp1-luc (d) eingestellt wurde. Die Transfektion und TSA-Behandlung erfolgte ähnlich wie bei 2. Jedes Experiment erfolgte in dreifacher Ausführung und die gezeigten Daten sind für drei unabhängige Experimente repräsentativ.
Das beste Verfahren zur Durchführung der Erfindung
Diese Erfindung wird nachstehend unter Verwendung spezifischer Beispiele detailliert beschrieben, aber sie sollte nicht dahingehend ausgelegt werden, dass sie darauf begrenzt ist.
[Beispiel 1] Gel-Shift-Test der Sp1-Bindungssequenz im p21/WAF1/Cip1-Promotor
TSA induziert die Transkription des p21/WAF1/Cip1-Gens auf eine p53-unabhängige Weise durch die Sp1-Bindungssequenz, die im Promotorbereich des p21/WAF1/Cip1-Gens vorliegt. Deshalb wurde, um den Induktionsmechanismus zu erklären, die –87- bis –72 bp-Region von der Transkriptionsstartstelle, die für die Transkriptionsinduktion durch TSA wesentlich ist, als p21/WAF1/Cip1-Sonde verwendet, und das Bindeprotein wurde durch einen Gel-Shift-Test (elektrophoretischer Mobilitätsshift-Test; EMSA) analysiert, wie nachstehend beschrieben.
(1-1) Zellkultur und Herstellung von Kernextrakten
Zuerst wurden die MG63-Zellen bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ unter Verwendung von DMEM-Medium (GIBCO BRL), enthaltend 10% fötales Kälberserum (GIBCO BRL), inkubiert. Die Kernextrakte dieser Zellen wurden sowohl aus mit TSA behandelten als auch aus unbehandelten Zellen nach dem Verfahren von Dignam et al. (Dignam, J. D. et al. (1983), Nucleic Acids Res. 11: 1475–1489) hergestellt. Zuerst wurden die in einer Schale (100 mm) gezüchteten Zellen 24 Stunden mit 500 ng/ml TSA (Wako) inkubiert. Dies wurde dann zweimal mit kaltem PBS, enthaltend 0,5 mM 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid × HCl (p-ABSF) (Wako), gewaschen, die Zellen wurden von der Platte abgekratzt und in 10 mM Hepes/KOH-Puffer (pH 7,9), enthaltend 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,5 mM DTT, 5 mM NaF, 5 mM NaVO₄ und 0,5 mM p-ABSF, suspendiert. Nachdem sie 10 Minuten auf Eis gesetzt wurden, wurden die Zellen unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators aufgebrochen. Bei einer 10-minütigen Zentrifugation bei 3.000 Upm bei 4°C wurden die Kerne in 20 mM Hepes/KOH-Puffer (pH 7,9), enthaltend 400 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 25% Glycerin, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 mM NaF, 5 mM NaVO₄ und 0,5 mM p-ABSF, resuspendiert und 60 Minuten bei 4°C gemischt, um die Kernbestandteile zu extrahieren. Dieser Extrakt wurde 30 Minuten bei 35.000 Upm bei 4°C zentrifugiert, und der Überstand wurde als Kernextrakt gewonnen. Die erhaltenen Kernextrakte wurden gegen 20 mM Hepes/KOH-Puffer (pH 7,9), enthaltend 400 mM KCl, 20% Glycerin, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 mM NaF, 5 mM NaVO₄ und 0,5 mM p-ABSF, dialysiert und bei –80°C aufbewahrt.
(1-2) Gel-Shift-Test (EMSA)
Anschließend wurden, basierend auf der TSA-abhängigen Promotorsequenz (5'-CGGGTCCCGCCTCCTT-3'/SEQ ID NO: 1), die –87 bis –72 bp von der Transkriptionsstartstelle des p21/WAF1/Cip1-Gens lokalisiert ist, die Oligonucleotide (5'-AGCTCGGGTCCCGCCTCCTT-3'/SEQ ID NO: 2 und 5'-TCGAAAGGAGGCGGGACCCG-3'/SEQ ID NO: 3) synthetisiert. Bei der Anlagerung wurden die DNAs unter Verwendung von [α-³³P] dCTP und Klenow-Fragment (TAKARA) markiert, und diese wurden als DNA-Sonden verwendet. Nach 5-minütiger Inkubation des vorstehend erwähnten Kernextrakts (8 μg) in 20 μl Reaktionslösung (8 mM Tris/HCl (pH 7,9), 24 mM Hepes/KCl (pH 7,9), 120 mM KCl, 24% Glycerin, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mg Poly (dI-dC) (Pharmacia)) wurde die ³³P-markierte DNA-Sonde (spezifische Aktivität 50.000 cpm/μl) zugegeben und man ließ die Bindungsreaktion 20 Minuten ablaufen. Beim Antikörper-Supershift-Test-Experiment, das später beschrieben wird, wurden ferner 2 μg Anti-Sp1-Antikörper oder 1 μg Anti-Sp3-Antikörper (Santa Cruz, sc-59X und sc-644X) zugegeben, und 20 Minuten inkubiert. Die Reaktionslösung wurde über eine Elektrophorese auf einem 6%-igen Acrylamidgel aufgetrennt und die Proteine, die an die p21/WAF1/Cip1-Sonde binden, wurden unter Verwendung von BAS 2000 (Fujix) nachgewiesen.
(1-3) Ergebnis
Wenn man den aus den mit TSA-behandelten und unbehandelten MG63-Zellen hergestellten Kernextrakt mit der p21/WAF1/Cip1-Sonde reagieren ließ und der vorstehend beschriebene Gel-Shift-Test durchgeführt wurde, wurden zwei spezifische Banden nachgewiesen (1, 1 und 5). Anschließend, als die Reaktivität von jeder der „supershifted" Banden durch das vorstehend erwähnte Verfahren unter Verwendung des Anti-Sp1- oder Anti-Sp3-Antikörpers beobachtet wurde, wurde ein Teil der oberen Bande in Gegenwart des Anti-Sp1-Antikörpers verlagert, zwei Banden einschließlich eines Teils der oberen Bande und der unteren Bande wurden in Gegenwart des Anti-Sp3-Antikörpers verlagert und alle Banden wurden verlagert, wenn sowohl der Anti-Sp1-Antikörper als auch der anti-Sp3-Antikörper zugegeben wurde (1). Man glaubt, dass die beiden Sp3-Banden von großen (97 kDa) bzw. kleinen (60 kDa und 65 kDa) Sp3-Proteinen stammen (Gustav, H. et al. (1994), EMBO J. 13: 3843–3851; Addanki, P. B. et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25: 2012–2019). Deshalb wurde gezeigt, dass Sp1 und Sp3, die im Kernextrakt von MG63-Zellen vorliegen, tatsächlich an die Sp1-Bindungsregion von p21/WAF1/Cip1 binden, und dies legte nahe, dass Sp1 und Sp3 an der TSA-abhängigen Transkriptionsinduktion beteiligt waren. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, die von den Erfindern (Nakano, K. et al. (1997), J. Biol. Chem. 272: 22199–22206) und von anderen Arbeitsgruppen (Datto, M. B. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270: 28623–28628; Adnane, J. et al. (1998), Mol. Cell. Biol. 18: 6962–6970) gemacht wurden. Es konnte jedoch aufgrund des Vorliegens oder Fehlens der TSA-Behandlung kein Unterschied bei der DNA-Menge beobachtet werden, die von Sp1 und Sp3 gebunden wurde (1). Deshalb schien die TSA-abhängige Transkriptionsinduktion durch Mechanismen stattzufinden, die andere sind als die Unterschiede bei der exprimierten Sp1- oder Sp3-Menge oder Unterschiede bei deren Fähigkeit, an DNA zu binden. Dies stimmt auch mit den Berichten der Erfinder überein, bei denen Natriumbutyrat, ein HDAC-Inhibitor (Nakano, K. et al. (1997), J. Biol. Chem. 272: 22199–22206) verwendet wurde, und mit dem Bericht von Datto et al., bei dem die TGF-β-abhängige Transkriptionsinduktion (Datto, M. B. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270: 28623–28628) beobachtet wurde, stimmt jedoch nicht mit dem Bericht von Adnane et al. überein, bei dem Geranylgeranyl-Transferase I-Inhibitor verwendet wurde (Adnane, J. et al. (1998), Mol. Cell. Biol. 18: 6962–6970).
[Beispiel 2] Reporter-Test unter Verwendung der GAL4-Bindungssequenz
TSA verursacht die Transkriptionsinduktion durch die Sp1-Bindungssequenz des p21/WAF1/Cip1-Promotors und auf ähnliche Weise kann es die Transkriptionsinduktion durch die 3x-Sp1-Konsensusbindungssequenz verursachen, die in den SV40-Promotor eingebaut ist (Sowa, Y. et al. (1997), Biochem. Biophys. Res. Comm. 241: 142–150). Folglich wurde, um zu bestimmen, ob Sp1 oder Sp3, die an diese Sp1-Bindungssequenz binden, tatsächlich an der durch TSA-Behandlung verursachten Transkriptionsinduktion beteiligt sind, ein Reporter-Testsystem unter Verwendung der GAL4-Bindungssequenz untersucht. Und zwar werden beim Versuch, Effekte von Sp1 oder Sp3 durch erzwungene Expression zu beobachten, endogene Effekte für Sp1 oder Sp3 nachgewiesen, falls die Sp1-Bindungssequenz als Promotor für das Reportergen verwendet wird. Deshalb ließ die erzwungene Expression eines Fusionsproteins, das zwischen der DNA-Bindungsdomäne und dem bakteriellen GAL4-Protein und Sp1 oder Sp3 gebildet wurde, die Analyse zu, ob eine GAL4-Protein-Bindungssequenz abhängige Transkriptionsaktivität durch TSA induziert wird, oder ob Sp1 oder Sp3 diese Induktion reguliert.
(2-1) Expressionsplasmid und Reporterplasmid
Um GAL4-Proteine zu exprimieren, die Sp1 (Aminosäuren 83–778), Sp3 mit der gesamten Länge (Aminosäuren 1–653), ein Transkriptionsaktivierungsdomänen-deletiertes Sp1 (Aminosäuren 592–778) (DNSp1) oder ein Transkriptionsaktivierungsdomänen-deletiertes Sp3 (Aminosäuren 399–653) (DNSp3) besitzen, die an das C-terminale Ende ihrer DNA-Bindungsdomäne gebunden sind, wurde jedes dieser Gene in einen pM-Vektor (Clontech) eingebaut, der eine GAL4-Bindungsdomäne besitzt. Dies ergab pM-Sp1, pM-Sp3, pM-DNSp1 bzw. pM-DNSp3. Jedes dieser Sp1- und Sp3-Gene wurde durch PCR amplifiziert. Genauer gesagt, wurden bei der Herstellung von pM-Sp1 Sp1-S (5'-acaggtgagcttga-3'/SEQ. ID NO: 4) und Sp1-AS (5'-tcagaagccattgcc-3'/SEQ ID NO: 5) als Primer und pPacSp1 als Matrize zur Amplifikation verwendet (Kadonaga, J. T. et al. (1987), Cell 51: 1079–1090). Bei der Herstellung von pM-DNSp1 wurden DNSp1-S (5'-ccaaaaaagaagagaaaggtaacccggcgg-3'/SEQ ID NO: 6) und DNSp1-AS (5'-gaagcatgcacctgc-3'/SEQ ID NO: 7) als Primer und pM-Sp1 als Matrize zur Amplifikation verwendet (Kadonaga, J. T. et al. (1987), Cell 51: 1079–1090). Bei der Herstellung von pM-Sp3 wurden Sp3-18F (5'-cgggatccattccaagtgctgct- 3'/SEQ ID NO: 8) und Sp3-2R (5'-ataggatccttactccattgtctcatttcc-3'/SEQ ID NO: 9) als Primer und Marathon-Ready cDNA (menschliche fötale Leber) (Clontech, Cat. #7403-1) als Matrize zur Amplifikation verwendet (Chris, K. et al. (1992), J. Biol. Chem. 12: 4251–4261). Bei der Herstellung von pM-DNSp3 wurden Sp3-11F (5'-cgggatccaactctatagattctgct-3'/SEQ ID NO: 10) und Sp3-2R (SEQ ID NO: 9) als Primer und pM-Sp3 als Matrize zur Amplifikation verwendet (Chris, K. et al. (1992), J. Biol. Chem. 12: 4251–4261). Alle PCRs erfolgten, indem 30 Zyklen 1 Minute bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 30 Sekunden bei 72°C durchgeführt wurden. Das sich ergebende amplifizierte Produkt wurde in einen pM-Vektor eingebaut und die Nucleotidsequenz wurde unter Verwendung eines DNA-Sequenziergeräts ABI PRISM 355 (Applied Bio System) bestätigt. Als Kontrolle für den Transfektionstest wurde der pM-Vektor verwendet, der nur die GAL4-DNA-Bindungsdomäne exprimiert. Das Reporterplasmid (pG5-luc) auf GAL4, das verwendet wurde, um die Abhängigkeit der Transkriptionsaktivierung zu zeigen, war der pGL3-Basic Vektor (Promega), der die 5x-GAL4-Bindungssequenz, den minimalen E1B-Promotor und die TATA-Sequenz stromaufwärts des Luciferasegens trägt.
(2-2) Transfektionstest
Der vorstehend beschriebene Expressionsvektor, der verschiedene Sp1- oder Sp3-GAL4-Fusionsproteine codiert, und der vorstehend erwähnte Vektor, der ein Luciferasereportergen stromabwärts der Konsensus-5x-GAL4-Bindungssequenz trägt, wurden gemeinsam in MG63-Zellen unter Verwendung von SuperFect transfiziert, gemäß dem QIAGEN-Verfahren. Und zwar wurden die Zellen bei einer Dichte von 0,8 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 12 Vertiefungen angesetzt. Nach 24 Stunden wurden eine vorgemischte Reaktionslösung, enthaltend 0,5 μg Reporterplasmid, 2,5 μg Expressionsvektor, und SuperFect den MG63-Zellen zugegeben und man ließ das Gemisch 2 Stunden reagieren. Anschließend wurden die Zellen 24 Stunden unter normalen Züchtungsbedingungen gezüchtet, weitere 24 Stunden mit oder ohne (Kontrolle) 500 ng/ml TSA gezüchtet, und dann wurden die Zellen lysiert. Unter Verwendung von Luciferasesubstrat (Promega) wurde die Luciferaseaktivität der Zelllysate unter Verwendung von LB-96P (Berthold) gemessen. Die gemessenen Werte wurden normalisiert und als Aktivität pro Proteinmenge ausgedrückt. Die Transkriptionsinduktion aufgrund der TSA- Behandlung wurde als Verhältnis zum Kontrollwert ohne TSA-Behandlung (Aktivierungsamplifikation durch TSA) berechnet.
(2-3) Ergebnis
Obwohl GAL4-Sp1 und GAL4-Sp3 beide Transkriptionsaktivität sogar ohne TSA-Behandlung zeigten, schien dies durch die Transkriptionsaktivierungsdomäne vermittelt zu werden, die in Sp1 und Sp3 selbst vorhanden ist. Bei Behandlung mit TSA zeigten GAL4-Sp3 exprimierende Zellen eine starke Transkriptionsinduktion des Luciferasegens, während die Aktivität in den GAL4-Sp1 exprimierenden Zellen in der Stärke derjenigen ähnelte, die bei der Kontrolle unter Verwendung von GAL4 beobachtet wurde (2). Bei der Durchführung einer ähnlichen Studie mit dem Fusionsprotein, das aus N-terminalem und Transkriptionsaktivierungsdomäne-deletiertem Sp1 oder Sp3 und der vorstehend beschriebenen GAL4-DNA-Bindungsdomäne hergestellt wurde, zeigte GAL4-DNSp3 keine TSA-abhängige Transkriptionsinduktion mehr (2). Diese Ergebnisse legten nahe, dass die Transkriptionsinduktion des p21/WAF1/Cip1-Gens durch TSA-Behandlung durch die Transkriptionsaktivierungsdomäne von Sp3 auftritt, die an die Sp1-Bindungssequenz des Promotors gebunden ist.
[Beispiel 3] Identifizierung der TSA-reaktiven Domäne von Sp3
Anschließend wurde ein Reporter-Test unter Verwendung verschiedener, an die GAL4-DNA-Bindungsdomäne fusionierter Sp3-Deletionsmutanten durchgeführt, um die TSA-reaktive Region von Sp3 zu identifizieren. Zuerst wurden pM-Sp3 (1–398), pM-Sp3 (81–398), pM-Sp3 (161–398), pM-Sp3 (241–398), pM-Sp3 (1–80), pM-Sp3 (1–160), pM-Sp3 (1–240) und pM-Sp3 (1–320) hergestellt. Sie tragen jeweils Regionen, die den angegebenen Aminosäurenummern entsprechen. Jedes der Sp1- und Sp3-Gene wurde durch PCR amplifiziert, in einen pM-Vektor eingebaut, und die Nucleotidsequenzen wurden unter Verwendung eines DNA-Sequenziergerätes, ABI PRISM 355 (Applied Bio System), bestätigt. Die für die PCR-Amplifikation verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt. Die PCR erfolgte unter Verwendung von pM-Sp3 als Matrize, wobei 25 Zyklen 15 Sekunden bei 98°C, 2 Sekunden bei 65°C und 30 Sekunden bei 74°C durchgeführt wurden.
Tabelle 1
Als Kontrolle für den Transfektionstest wurde pM verwendet, der nur die GAL4-DNA-Bindungsdomäne exprimiert. Das Reporterplasmid (pG5-luc), das als Index für die GAL4-abhängige Transkriptionsaktivierung verwendet wurde, war der vorstehend erwähnte pGL3-Basic Vektor (Promega).
Die Transfektion unter Verwendung dieser Gene folgte demselben Verfahren, wie vorstehend beschrieben, und das Auftreten der Transkriptionsinduktion aufgrund der TSA-Behandlung in diesen Mutanten wurde überwacht. Infolgedessen trat die TSA-abhängige Transkriptionsinduktion mit GAL4-Sp3 (1–398) auf, dem die Sp3-DNA-Bindungsdomäne fehlt (3), und diese Induktion war tatsächlich stärker als mit GAL4-Sp3 (3). Dieses Ergebnis korrelierte mit dem vorstehend erwähnten Ergebnis (Beispiel 2), bei dem die Deletion der N-terminalen und Transkriptionsaktivierungsdomäne die Aufhebung der Transkriptionsinduktion aufgrund der TSA-Behandlung verursachte. Dies legte auch eine Korrelation mit dem Bericht nahe, der beschrieb, dass von den beiden glutaminreichen Domänen in Sp3, die repressive Domäne, die zwischen der C-terminalen Domäne und der DNA-bindenden Domäne vorliegt, die Transkriptionsaktivierung von Sp3 reprimiert (Dennig, J. et al. (1996), EMBO J. 15: 5659–5667; Majello B et al. (1997), J. Biol. Chem. 272: 4021–4026).
Wie 3 zeigt, verschwand die Induktion aufgrund der TSA-Behandlung mit GAL4-Sp3 (241–398) und mit GAL4-Sp3 (1–80), wenn Deletionen vom N-terminalen Ende oder vom C-terminalen Ende von Sp3 (1–398) erfolgten. Anhand dieser Ergebnisse schien Sp3 (81–160) für die Transkriptionsinduktion aufgrund der TSA-Behandlung wichtig. Jedoch zeigte GAL4-Sp3 (81–160) alleine fast keine Aktivität. Da sowohl GAL4-Sp3 (241–398) als auch GAL4-Sp3 (1–80) eine vollständige glutaminreiche Domäne fehlt, scheint die Transkriptionsinduktion durch TSA das Vorliegen von mindestens einer der glutaminreichen Domänen in der Sp3-Transkriptionsaktivierungsdomäne zu benötigen. Die 80–160-Region von Sp3 kann einen Teil einer wichtigen Region für die TSA-vermittelte Transkriptionsinduktion enthalten.
[Beispiel 4] Dominant negatives Sp3
Um zudem zu bestimmen, ob Sp3 tatsächlich die Transkriptionsinduktion durch TSA durch die Sp1-Bindungssequenz von p21/WAF1/Cip1 vermittelt, wurde die Transkriptionsaktivierungsdomäne deletiert, und eine Sp3-Mutante (DNSp3) (Aminosäure 399–653), die nur die DNA-Bindungsdomäne besitzt, wurde in pCMV3.1-His-C (Invitrogen) integriert, um pCMV-DNSp3 herzustellen. pCMV3.1 wurde als Kontrolle verwendet. Die verwendeten Reporterplasmide waren pWWP und pWPdel-BstXI, die den p21/WAF1/Cip1-Promotor bzw. den TSA-abhängigen minimalen, stromaufwärts des Luciferasegens eingebauten p21/WAF1/Cip1-Promotor besitzen, über die zuvor berichtete wurde, und Sp1-luc und mtSp1-luc, die die stromaufwärts des Luciferasegens eingebaute 3x-Sp1-Bindungssequenz bzw. die mutierte 3x-Sp1-Bindungssequenz besitzen (Nakano, K. et al. (1997), J. Biol. Chem. 272: 22199–22206; Sowa, Y. et al. (1997), Biochem. Biophys. Res. Comm. 241: 142–150).
Durch die erzwungene Expression dieser Gene durch Transfektion unter Verwendung desselben Verfahrens, wie vorstehend beschrieben, untersuchten die Erfinder, ob diese Gene auf eine dominant negative Weise hinsichtlich der Transkriptionsinduktion durch TSA funktionieren. Infolgedessen wurde die Transkriptionsinduktion von p21/WAF1/Cip1 durch TSA durch DNSp3 beträchtlich reprimiert, und dies wurde auch durch pWPdel-BstXI bestätigt, das die kleinste Einheit des TSA-abhängigen p21/WAF1/Cip1-Promotors besitzt, der die Sp1-Bindungssequenz (+16 bis –101 von der Transkriptionsstartstelle) trägt (4a, b). Auf ähnliche Weise zeigte die von der Konsensus-Sp1-Bindungssequenz TSA-abhängige Transkriptionsinduktion eine merkliche Repression (4c). Bei Verwendung der mutierten Sp1-Bindungssequenz fand die Transkriptionsinduktion durch TSA nicht statt, und der Effekt von DNSp3 fehlte ebenfalls (4d). Bei beiden Promotoren zeigte DNSp3 keine Repression hinsichtlich der TSA-unbehandelten Grundtranskriptionsaktivität. Diese Ergebnisse zeigten die Bedeutung der Sp3-Transkriptionsaktivierungsdomäne bei der TSA-abhängigen p21/WAF1/Cip1-Transkriptionsinduktion. Man nimmt an, dass beim Fehlen der TSA-Behandlung Sp3 nur eine extrem schwache Transkriptionsfaktoraktivität aufweist, jedoch in Gegenwart der TSA-Behandlung ein durch Repression von HDAC acetyliertes Molekül erkannt wird und anschließend die starke Transkriptionsaktivität exprimiert wird.
Kürzlich wurde als neuer Ansatz gegen Krebs eine transkriptionsregulierende Chemotherapie und transkriptionsregulierende Chemoprävention vorgeschlagen (Sakai, T. (1996), Jpn. J. Hyg. 50: 1036–1046). Die Strategie besteht darin, die Transkription der Zellproliferation-supprimierenden p53-Zielgene zu induzieren, so dass Antikrebsaktivität gezeigt wird. Als Ziel für die Transkriptionsinduktion ist jedoch der Befund, dass p53 in vielen menschlichen Tumorzellen mutiert ist, ein Nachteil (Sakai, T. (1996), Jpn. J. Hyg. 50: 1036–1046; Vogelstein, B. und Kinzler, K. W. (1992), Cell 70: 523–526). Dagegen wurde über fast keine Mutation in menschlichen Tumorzellen bei p21/WAF1/Cip1 berichtet, das eines der Zielgene von p53 ist und eine Zellzyklus-supprimierende Aktivität besitzt (Chedid, M et al. (1994), Oncogene 9: 3021–3024; Li, Y. J. et al. (1995), Oncogene 10: 599–601). Deshalb kann man eine Antikrebsaktivität durch die Transkriptionsinduktion von p21/WAF1/Cip1 erwarten. Diese Erfindung zeigte, dass ein Weg für eine p53-unabhängige p21/WAF1/Cip1 Transkriptionsinduktion existiert, die durch Histonacetylierung vermittelt wird, und legt nahe, dass die transkriptionsregulierende Chemoprävention von Krebs sogar, wenn p53 mutiert ist, möglich ist. HDAC-Inhibitoren werden als mögliche Medikamente betrachtet, und in der Realität wurde gezeigt, dass Natriumphenylbutyrat, ein HDAC-Inhibitor, der kürzlich für die Behandlung von Thalassämie und Hyperammonämie in Kombination mit all-trans Retinsäure verwendet wurde, die vollständige Remission von all-trans Retinsäure induzierte, die resistent gegenüber akuter promyelotischer Leukämie ist (Warrel, R. P., Jr. et al. (1998), J. Natl. Cancer Inst. 90: 1621–1625). Diese Ergebnisse legen HDAC als eines der möglichen Zielmoleküle für die Krebstherapie nahe.
Industrielle Anwendbarkeit
Diese Erfindung zeigte, dass Sp3, das HDAC reguliert, ein neues Zielmolekül für die Krebstherapie sein könnte. Diese Erfindung stellte auch ein wirksames auf Sp3 abzielendes Verfahren zum Screenen nach gegen Krebs gerichteten Medikamenten bereit. Man erwartet, dass Verbindungen, die durch das Screening-Verfahren dieser Erfindung isoliert werden, in neuartigen transkriptionsregulierenden Chemotherapien und der Chemoprävention gegen Krebs angewandt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Screenen eines Antikrebsmittels, das auf das Sp3-Protein abzielt, welches die Schritte umfasst: (a) Herstellen einer Zelle, die (i) einen ersten Vektor enthält, der in exprimierbarer Weise DNA umfasst, die ein Fusionsprotein codiert, das eine Region des Sp3-Proteins mit transkriptioneller Aktivierungskapazität umfasst, wobei die Region mindestens eine der beiden glutaminreichen Regionen des Sp3-Proteins umfasst und ihr mindestens ein Teil der DNA-Bindungsdomäne fehlt, und eine Region umfasst, die die DNA-Bindungskapazität des GAL4-Proteins aufweist; und (ii) einen zweiten Vektor enthält, der eine Bindungssequenz des GAL4-Proteins, eine die Expression regulierende Sequenz, die aktiviert wird durch die Bindung des Fusionsproteins, und stromabwärts ein Reportergen umfasst, das funktionell an die regulatorische Sequenz gebunden ist; (b) Inkontaktbringen einer Testprobe mit der Zelle und Messen der Reporteraktivität; und (c) Auswählen einer Verbindung, die die Reporteraktivität im Vergleich mit der Kontrolle, bei der die Testprobe nicht mit der Zelle in Kontakt gebracht wurde, erhöht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reportergen Luciferase, Chloramphenicol-Acetyltransferase, beta-Galactosidase, menschliches Wachstumshormon (HGH) oder sezernierte alkalische Phosphatase codiert.