JP6723011B2 - 被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクター、アッセイキット、方法および装置 - Google Patents
被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクター、アッセイキット、方法および装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6723011B2 JP6723011B2 JP2016008125A JP2016008125A JP6723011B2 JP 6723011 B2 JP6723011 B2 JP 6723011B2 JP 2016008125 A JP2016008125 A JP 2016008125A JP 2016008125 A JP2016008125 A JP 2016008125A JP 6723011 B2 JP6723011 B2 JP 6723011B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- sequence
- reporter
- reporter gene
- replication initiation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
- B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/18—Means for temperature control
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
- C12N2710/22041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/22043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32211—Cardiovirus, e.g. encephalomyocarditis virus
- C12N2770/32241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/32243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
実施形態に従うレポーターベクターは、例えば、被検細胞の細胞特性を評価するための自己複製型マルチレポーターベクターであり得る。
細胞特性マーカーのプロモーター配列11は、細胞特性マーカーのプロモーターを含む。細胞特性マーカーのプロモーターは、被検細胞に由来する細胞特性マーカーのプロモーターであり得る。細胞特性マーカーは、特定の疾患に罹患した細胞において発現する、または特定の疾患に罹患した細胞において正常な細胞に比べて多く若しくは少なく発現する遺伝子である。特定の疾患に罹患した細胞において発現する細胞特性マーカーは、例えば、特定の疾患に罹患した細胞のみにおいて発現する遺伝子であってもよい。これらの遺伝子の発現は、そこに含まれるプロモーターの活性化により発現される。したがって、細胞特性マーカーのプロモーターの活性化は、被検細胞の細胞特性、例えば、細胞自体の状態または細胞を取り囲む環境に従った細胞特性マーカーの発現量に対応している。
構成的な活性を示すプロモーター配列21は、被検細胞内で構成的な活性を示すプロモーターを含む。このようなプロモーターは、被検細胞内で構成的に発現されている遺伝子の転写が開始される際に活性化され得る。
複製開始配列30は、複製開始蛋白質が結合することにより、レポーターベクター1の複製が開始されるような配列を含む塩基配列であり得る。複製開始蛋白質は、複製開始蛋白質遺伝子23から発現される複製開始蛋白質であってもよいし、被検細胞内に存在する複製開始蛋白質であってもよい。
更なる実施の形態として、本実施形態にかかるレポーターベクターを含む被検細胞の細胞特性を評価するためのアッセイキットが提供され得る。
上述のようなレポーターベクターを用いて、被検細胞の細胞特性を評価する方法は、図4に示される以下の工程を含み得る。
(B)被検細胞に、レポーターベクターを導入することと、
(C)レポーターベクターを複製ならびに第1のレポーター遺伝子および第2のレポーター遺伝子を発現させることと、
(D)第1のレポーター遺伝子からの第1の信号および第2のレポーター遺伝子からの第2の信号を検出することと、
(E)第1の信号および第2信号に基づいて前記被検細胞の細胞特性を評価することと。
レポーターベクターは、上述のような第1のレポーター遺伝子発現ユニットと、第2のレポーター遺伝子発現ユニットと、複製開始配列を同一のベクター上に組み込むことにより作製され用意され得る。
上記(A)で得られたレポーターベクターは、被検細胞および/または前記基準となる細胞に導入され得る。
レポーターベクターを被検細胞に導入した後、被検細胞を当該ベクターの自己複製と第1および第2のレポーター遺伝子の発現が可能な条件で維持され得る。当該条件は、被検細胞が分裂して増殖し得るような、当業者に公知の培養条件であり得る。
第1および第2の信号の検出は、第1および第2のレポーター遺伝子から合成されたレポーター蛋白質から得られる、例えば、光学的信号を検出または定量することにより行われ得る。検出の方法は、レポーター遺伝子がコードするレポーター蛋白質の種類に応じて、適切な方法が選択され得る。以下にその方法について説明する。
上記(D)で得られた第1の信号の値を第2の信号で除算することにより相対値が算出され得る。前記相対値は、被検細胞と基準となる細胞とで比較され得る。
上述のような被検細胞の細胞特性を評価する方法は、細胞特性評価装置によって行われ得る。細胞特性評価装置について、以下に図5を用いて説明する。図5は、細胞特性評価装置の概略を示すブロック図である。細胞特性評価装置は、被検細胞の細胞特性を検出し、それに基づいて被検細胞の細胞特性を評価する装置の1例である。
(i)レポーターベクターを被検細胞に導入するための遺伝子導入部、
(ii)前記ベクター導入部で得られた前記被検細胞を含む試料を受け取り、所望の時間に亘り前記被検細胞を培養するための恒温部、
(iii)前記恒温部から前記試料を受け取り、前記試料に含まれる前記被検細胞の前記第1のレポーター遺伝子および前記第2のレポーター遺伝子から生ずる信号を検出する検出部、および
(iv)前記検出の結果に基づいて前記被検細胞の細胞特性を評価する評価部。
例1.乳癌細胞株を用いたデュアルレポーターベクターの構造評価
(a)デュアルレポーターベクターの作製
ニコチンアミドホスホリボシル転移酵素(NAMPT)遺伝子のプロモーター領域(−2426〜+276bp、配列番号1)を組込んだレポーターベクターを作製した。Nampt遺伝子のプロモーター領域は、ヒトのゲノムを鋳型としたPCRで増幅して調整した。PCRは、PrimeStar GXLDNA polymerase(TaKaRa BIO)を用いて行った。PCRに用いたプライマー配列を以下に示す。
Reverse primer;5’−CGGCTCGAGAGCTCCCTGGCGCGGCTGCGAGGAA−3’
このように調整したNampt遺伝子のプロモーター配列(Namptプロモーター)を、トゲオキヒオドシエビ由来NanoLuc(登録商標)遺伝子の上流に組み込んで、Namptプロモーター配列とNanoLuc(Nluc)(登録商標)遺伝子とSV40転写終結配列とからなるレポーター遺伝子発現ユニット、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターとホタル由来ルシフェラーゼ(Fluc, Firefly Luciferase)遺伝子とウシ成長モル本遺伝子の転写終結配列とからなるレポーター遺伝子発現ユニット、およびSV40複製開始配列を同一核酸上に含む自己複製型デュアルレポーターベクターを作製した。自己複製型デュアルレポーターベクターは、2つのレポーター遺伝子発現ユニットの向きが異なる2種類を作製した(pS−Nampt−D(図8(A))とpA−NampD(図8(B)))。当該自己複製型デュアルレポーターベクターは、上述のように乳癌細胞株のマーカー遺伝子のプロモーターを含む第1のレポーター遺伝子発現ユニット(Namptプロモーター配列を含むユニット)と、構成的な活性を示すプロモーターを含む第2のレポーター遺伝子発現ユニット(CMVプロモーターを含むユニット)からなる設計とした。
100μlのOpti−MEM(Life Technologies)に、0.5μgのデュアルレポーターベクターを加えた。その後、0.5μgのエンハンサー試薬(Plus reagent、Life Technologies)を加えて室温で5分間インキュベートした。この溶液に、1.5μlのLipofectamine LTX(Life Technologies)を加えてよく縣濁し、室温に25分間インキュベートした。溶液40μlを48ウェルプレートに移した後、200μlのヒト乳がん細胞株の縣濁液(高転移性悪性腫瘍細胞株:MDA−MB−231)を加えて穏やかに混合した。その後、37℃、5%CO2雰囲気のインキュベータ内で細胞を培養した。
リポフェクションから96時間後、48ウェルプレートから培養液を取り除き、細胞をPBSで洗浄した。その後、150μlの細胞溶解液(Glo−Lysis Buffer、Promega)を加えて−80℃に30分以上静置して凍結した。使用時には、細胞溶解液を室温で解凍した後、溶解液を遠心チューブに回収し、遠心により細胞残渣を沈殿させた。上清を新しいサンプルチューブに回収し、上清25μlを96ウェル・プレート(Nunc)に分注した。ウェルに等量のLuciferase基質溶液(One−Glo Luciferase Assay System、Promega)、またはNanoLuc(登録商標)基質溶液(Nano−Glo Luciferase Assay System、Promega)を加えた後、ルミノメーター(Mithras LB940、Berthold)で発光強度を測定した。それにより、腫瘍細胞の悪性度評価用のNlucのレポーター活性(Namptプロモーターの活性)、および細胞ごとの導入レポーターDNA量補正用のFlucのレポーター活性(CMVプロモーターの活性)を測定した。腫瘍細胞の悪性度評価に用いる相対レポーター活性(RLU)は、Nlucの活性値(発光強度)をFlucの活性値(発光強度)で除算した値とした。
pS−Nampt−Dを[例1](2)の方法で、正常乳腺上皮細胞(HMEC)と、3種類の乳癌細胞株(高転移性悪性腫瘍細胞株:MDA−MB−231、低転移性悪性腫瘍細胞株:T−47D, BT−474)に導入して培養した。72時間後、[例1](3)の方法でレポータージーンアッセイをおこない、相対レポーター活性(RLU)を算出した。相対レポーター活性(RLU)を算出した。
(a)レポーターベクターの構築
pS−Nampt−Dにおいて、CMVプロモーター::ルシフェラーゼ遺伝子とウシ成長ホルモン遺伝子ポリ(A)付加シグナルの間に、シミアン・ウイルス40(SV40)の複製開始蛋白質(LT)遺伝子を挿入した、自己複製型デュアルレポーターベクター(pAmp−NamNL−CMVLLT)を作製した(図11(A))。また、pS−Nampt−Dにおいて、Namptプロモーター::NanoLuc(登録商標)遺伝子とSV40ポリ(A)付加シグナルの間に、SV40の複製開始蛋白質(LT)遺伝子を挿入した、自己複製型デュアルレポーターベクター(pAmp−NamNLLT−CMVL)を作製した(図11(B))。
乳腺由来の悪性腫瘍細胞株10種類(T−47D,MCF7,BT−474,UACC−812,SK−BR−3,HCC70,MDA−MB−468,BT−549,MDA−MB−231,BT−20)、乳腺由来の良性腫瘍細胞株1種類(MCF10A)、および正常乳腺上皮細胞(HMEC)に対して、エレクトロポレーションで(a)に記載した2種類の自己複製型デュアルレポーターベクターを導入した。予め培養しておいた細胞をPBSで1回洗浄した後、トリプシン−EDTAを用いて培養容器から剥がし、血清入りの培地を加えて細胞を懸濁した。細胞懸濁液を50mLプラスチック遠心管に回収し、遠心により細胞を沈殿させた後、上清を取り除き、Opti−MEM(Life Technologies)を加えて細胞を懸濁した。細胞を遠心により沈殿させ上清を取り除いた後、1x107 細胞/mLの密度になるようにOpti−MEMを加えて細胞懸濁液を調整した。この細胞懸濁液100 μLを1.5mLチューブに分注し、レポーターベクター(pAmp−NamNL−CMVLLT、またはpAmp−NamNLLT−CMVL)を5.0μg加えた後、エレクトロポレーター(CUY EDIT II、Bex)とキュベット電極(2 mm幅、Bex)を用いてエレクトロポレーションを行った。培地1mLを加えて穏やかに混合した後、キュベット電極を5%CO2インキュベータ内に静置した。5分後、インキュベータからキュベット電極を取り出し、あらかじめ培地を加えた24ウェルプレートに細胞懸濁液を移して、37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。
エレクトロポレーションから72時間後に、[例1](3)の方法でレポータージーンアッセイをおこない、相対レポーター活性(RLU)を算出した。結果を、図12に示した。
T−47DとHMECを1:1、或いは1:3で混合した。このような混合細胞に対して、エレクトロポレーションにより、pAmp−NamNL−CMVLLTを導入した後、37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。72時間後、発光イメージングシステムは、LuminoView(LV200、オリンパス)を使用して、発光細胞の写真を撮影した。結果を、図13に示した。この結果、pAmp−NamNL−CMVLLTが導入されたT−47Dの97%で細胞発光が観察された。この結果から、pAmp−NamNL−CMVLLTで悪性乳腺腫瘍細胞株の評価が可能であることが示された。
以下に、本願出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1]
被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクターであって、
(1)細胞特性マーカーのプロモーター配列と、その下流に存在する第1のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第1の転写終結配列とを含む第1のレポーター遺伝子発現ユニット、
(2)構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第2のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第2の転写終結配列とを含む第2のレポーター遺伝子発現ユニット、および
(3)前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含むレポーターベクター。
[2]
前記第1のレポーター遺伝子は、前記細胞特性マーカーのプロモーター配列の活性化によって発現し、前記第2のレポーター遺伝子および前記複製開始蛋白質遺伝子は、前記構成的な活性を示すプロモーター配列の活性化によって発現する[1]に記載のレポーターベクター。
[3]
前記細胞特性マーカーのプロモーター配列が、NAMPT遺伝子のプロモーターである[1]または[2]に記載のレポーターベクター。
[4]
前記第1のレポーター遺伝子から生ずる信号と、前記第2のレポーター遺伝子から生ずる信号とが、互いに識別可能に異なる[1]〜[3]の何れか1つに記載のレポーターベクター。
[5]
前記第1のレポーター遺伝子および前記第2のレポーター遺伝子が、それぞれ青色蛍光蛋白質遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子、赤色蛍光蛋白質遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、NanoLuc(登録商標)ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、一酸化窒素合成酵素遺伝子、キサンチンオキシダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、または重金属結合蛋白質遺伝子の少なくとも一種である[4]に記載のレポーターベクター。
[6]
前記第1の転写終結配列および前記第2の転写終結配列が、ポリ(A)配列を含む配列である[1]〜[5]の何れか1つに記載のレポーターベクター。
[7]
前記第1の転写終結配列および前記第2の転写終結配列が、ポリ(A)付加シグナル配列である[6]に記載のレポーターベクター。
[8]
前記第1の転写終結配列および前記第2の転写終結配列が、シミアン・ウイルス40のポリ(A)付加シグナル配列、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ(A)付加シグナル配列、および人工合成されたポリ(A)付加シグナル配列の少なくとも一種である[7]に記載のレポーターベクター。
[9]
前記構成的な活性を示すプロモーター配列が、サイトメガロウイルスプロモーター、またはヒト・ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼプロモーターの少なくとも一種である[1〜8]の何れか1つに記載のレポーターベクター。
[10]
前記バイシストロニック発現用配列が、IRES配列である[1]〜[9]の何れか1つに記載のレポーターベクター。
[11]
前記IRES配列が、脳心筋炎ウイルスのIRES配列である[10]に記載のレポーターベクター。
[12]
前記複製開始蛋白質遺伝子が、シミアン・ウイルス40の野性型ラージT抗原遺伝子、エプスタイン・バー・ウイルスのEBNA−1遺伝子、またはマウス・ポリオーマ・ウイルスのラージT抗原遺伝子の少なくとも一種である[1]〜[11]の何れか1つに記載のレポーターベクター。
[13]
前記複製開始配列が、シミアン・ウイルス40、エプスタイン・バー・ウイルス、またはマウス・ポリオーマ・ウイルスの複製開始配列の少なくとも一種である[1]〜[12]の何れか1つに記載のレポーターベクター。
[14]
前記細胞特性マーカーのプロモーター配列が配列番号1に記載の塩基配列を含む塩基配列であり、前記第1および第2の転写終結配列が、それぞれポリ(A)付加シグナル配列を含む塩基配列であり、前記バイシストロニック発現用配列が、配列番号7に記載の配列を含む塩基配列であり、前記複製開始蛋白質遺伝子が、配列番号8、9または10に記載の配列を含む塩基配列であり、前記複製開始配列が、配列番号11に記載の配列を含む塩基配列である[1]に記載のレポーターベクター。
[15]
レポーターベクターおよび前記レポーターベクターを担持するキャリアを含む被検細胞の細胞特性を評価するためのアッセイキットであって、
前記レポーターベクターが、
(1)細胞特性マーカーのプロモーター配列と、その下流に存在する第1のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第1の転写終結配列とを含む第1のレポーター遺伝子発現ユニット、
(2)構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第2のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第2の転写終結配列とを含む第2のレポーター遺伝子発現ユニット、および
(3)前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含むアッセイキット。
[16]
被検細胞の細胞特性を評価する方法であって、
(a)被検細胞に、レポーターベクターを導入すること、
(b)レポーターベクターを複製ならびに第1のレポーター遺伝子および第2のレポーター遺伝子を発現させること、
(c)第1のレポーター遺伝子からの第1の信号および第2のレポーター遺伝子からの第2の信号を検出すること、および
(d)第1の信号および第2信号に基づいて前記被検細胞の細胞特性を評価することを含み、
前記レポーターベクターが、
(1)細胞特性マーカーのプロモーター配列と、その下流に存在する第1のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第1の転写終結配列とを含む第1のレポーター遺伝子発現ユニット、
(2)構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第2のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第2の転写終結配列とを含む第2のレポーター遺伝子発現ユニット、および
(3)前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含む方法。
[17]
前記被検細胞が、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、造血組織性腫瘍、胎児性腫瘍またはこれらの何れかの組み合わせである[16]に記載の方法。
[18]
被検細胞の細胞特性を評価するための装置であって、
レポーターベクターを被検細胞に導入するための遺伝子導入部、
前記ベクター導入部で得られた前記被検細胞を含む試料を受け取り、所望の時間に亘り前記被検細胞を培養するための恒温部、
前記恒温部から前記試料を受け取り、前記試料に含まれる前記被検細胞の第1のレポーター遺伝子および第2のレポーター遺伝子から生ずる信号を検出する検出部、および
前記検出の結果に基づいて前記被検細胞の細胞特性を評価する評価部
を具備し、
前記レポーターベクターが、
(1)細胞特性マーカーのプロモーター配列と、その下流に存在する前記第1のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第1の転写終結配列とを含む第1のレポーター遺伝子発現ユニット、
(2)構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する前記第2のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第2の転写終結配列とを含む第2のレポーター遺伝子発現ユニット、および
(3)前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含む装置。
10…細胞特性マーカーのプロモーター配列 11…第1のレポーター遺伝子
12…第1の転写終結配列 13…第1のレポーター遺伝子発現ユニット
20…構成的な活性を示すプロモーター配列 21…第2のレポーター遺伝子
22…バイシストロニック発現用配列 23…複製開始蛋白質遺伝子
24…第2の転写終結配列 30…複製開始配列
50…細胞特性評価装置 51…細胞分離ユニット 52…DNA導入ユニット
53…測定ユニット 54…ステージ 55…分離器 56…受容器
57…分離部 58…容器 59…被検細胞 60…制御部
61…導入プローブ 62…暗箱 63…光源 64…表示部 65…制御部
66…記憶部 67…対物レンズ 68…撮像部。
Claims (19)
- 被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクターであって、
(1)NAMPT遺伝子のプロモーター配列と、その下流に存在する第1のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第1の転写終結配列とを含む第1のレポーター遺伝子発現ユニット、
(2)構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第2のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第2の転写終結配列とを含む第2のレポーター遺伝子発現ユニット、および
(3)前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含むレポーターベクター。 - 前記第1のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記NAMPT遺伝子のプロモーター配列と、前記第1のレポーター遺伝子と、前記第1の転写終結配列と、前記第2のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記第2のレポーター遺伝子と、前記バイシストロニック発現用配列と、前記複製開始蛋白質遺伝子と、前記第2の転写終結配列とは、この順番で5’から3’に向う方向で配置される、請求項1に記載のレポーターベクター。
- 前記第1のレポーター遺伝子は、前記NAMPT遺伝子のプロモーター配列の活性化によって発現し、前記第2のレポーター遺伝子および前記複製開始蛋白質遺伝子は、前記構成的な活性を示すプロモーター配列の活性化によって発現する請求項1又は2に記載のレポーターベクター。
- 前記第1のレポーター遺伝子から生ずる信号と、前記第2のレポーター遺伝子から生ずる信号とが、互いに識別可能に異なる請求項1〜3の何れか1項に記載のレポーターベクター。
- 前記第1のレポーター遺伝子および前記第2のレポーター遺伝子が、それぞれ青色蛍光蛋白質遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子、赤色蛍光蛋白質遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、NanoLuc(登録商標)ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、一酸化窒素合成酵素遺伝子、キサンチンオキシダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、または重金属結合蛋白質遺伝子の少なくとも一種である請求項4に記載のレポーターベクター。
- 前記第1の転写終結配列および前記第2の転写終結配列が、ポリ(A)配列を含む配列である請求項1〜5の何れか1項に記載のレポーターベクター。
- 前記第1の転写終結配列および前記第2の転写終結配列が、ポリ(A)付加シグナル配列である請求項6に記載のレポーターベクター。
- 前記第1の転写終結配列および前記第2の転写終結配列が、シミアン・ウイルス40のポリ(A)付加シグナル配列、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ(A)付加シグナル配列、および人工合成されたポリ(A)付加シグナル配列の少なくとも一種である請求項7に記載のレポーターベクター。
- 前記構成的な活性を示すプロモーター配列が、サイトメガロウイルスプロモーター、またはヒト・ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼプロモーターの少なくとも一種である請求項1〜8の何れか1項に記載のレポーターベクター。
- 前記バイシストロニック発現用配列が、IRES配列である請求項1〜9の何れか1項に記載のレポーターベクター。
- 前記IRES配列が、脳心筋炎ウイルスのIRES配列である請求項10に記載のレポーターベクター。
- 前記複製開始蛋白質遺伝子が、シミアン・ウイルス40の野性型ラージT抗原遺伝子、エプスタイン・バー・ウイルスのEBNA−1遺伝子、またはマウス・ポリオーマ・ウイルスのラージT抗原遺伝子の少なくとも一種である請求項1〜11の何れか1項に記載のレポーターベクター。
- 前記複製開始配列が、シミアン・ウイルス40、エプスタイン・バー・ウイルス、またはマウス・ポリオーマ・ウイルスの複製開始配列の少なくとも一種である請求項1〜12の何れか1項に記載のレポーターベクター。
- 前記NAMPT遺伝子のプロモーター配列が配列番号1に記載の塩基配列を含む塩基配列であり、前記第1および第2の転写終結配列が、それぞれポリ(A)付加シグナル配列を含む塩基配列であり、前記バイシストロニック発現用配列が、配列番号7に記載の配列を含む塩基配列であり、前記複製開始蛋白質遺伝子が、配列番号8、9または10に記載の配列を含む塩基配列であり、前記複製開始配列が、配列番号11に記載の配列を含む塩基配列である請求項1又は2に記載のレポーターベクター。
- レポーターベクターおよび前記レポーターベクターを担持するキャリアを含む被検細胞の細胞特性を評価するためのアッセイキットであって、
前記レポーターベクターが、
(1)NAMPT遺伝子のプロモーター配列と、その下流に存在する第1のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第1の転写終結配列とを含む第1のレポーター遺伝子発現ユニット、
(2)構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第2のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第2の転写終結配列とを含む第2のレポーター遺伝子発現ユニット、および
(3)前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含むアッセイキット。 - 前記レポーターベクターの前記第1のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記NAMPT遺伝子のプロモーター配列と、前記第1のレポーター遺伝子と、前記第1の転写終結配列と、前記第2のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記第2のレポーター遺伝子と、前記バイシストロニック発現用配列と、前記複製開始蛋白質遺伝子と、前記第2の転写終結配列とは、この順番で5’から3’に向う方向で配置される、請求項15に記載
のアッセイキット。 - 被検細胞の細胞特性を評価する方法であって、
(a)被検細胞に、レポーターベクターを導入すること、
(b)レポーターベクターを複製ならびに第1のレポーター遺伝子および第2のレポーター遺伝子を発現させること、
(c)第1のレポーター遺伝子からの第1の信号および第2のレポーター遺伝子からの第2の信号を検出すること、および
(d)第1の信号および第2信号に基づいて前記被検細胞の細胞特性を評価することを含み、
前記レポーターベクターが、
(1)NAMPT遺伝子のプロモーター配列と、その下流に存在する第1のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第1の転写終結配列とを含む第1のレポーター遺伝子発現ユニット、
(2)構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第2のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第2の転写終結配列とを含む第2のレポーター遺伝子発現ユニット、および
(3)前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含む方法。 - 前記レポーターベクターの前記第1のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記NAMPT遺伝子のプロモーター配列と、前記第1のレポーター遺伝子と、前記第1の転写終結配列と、前記第2のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記第2のレポーター遺伝子と、前記バイシストロニック発現用配列と、前記複製開始蛋白質遺伝子と、前記第2の転写終結配列とは、この順番で5’から3’に向う方向で配置される、請求項17に記載の方法。
- 前記被検細胞が、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、造血組織性腫瘍、胎児性腫瘍またはこれらの何れかの組み合わせである請求項17又は18に記載の方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016008125A JP6723011B2 (ja) | 2016-01-19 | 2016-01-19 | 被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクター、アッセイキット、方法および装置 |
EP17152059.6A EP3196308B1 (en) | 2016-01-19 | 2017-01-18 | Reporter vector for evaluating characteristics of subject cell, assay kit, procedure and device |
US15/410,401 US20170204469A1 (en) | 2016-01-19 | 2017-01-19 | Reporter vector for evaluating characteristics of subject cell, assay kit, procedure and device |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016008125A JP6723011B2 (ja) | 2016-01-19 | 2016-01-19 | 被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクター、アッセイキット、方法および装置 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017127227A JP2017127227A (ja) | 2017-07-27 |
JP6723011B2 true JP6723011B2 (ja) | 2020-07-15 |
Family
ID=57860707
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016008125A Active JP6723011B2 (ja) | 2016-01-19 | 2016-01-19 | 被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクター、アッセイキット、方法および装置 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20170204469A1 (ja) |
EP (1) | EP3196308B1 (ja) |
JP (1) | JP6723011B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109402172B (zh) * | 2018-11-23 | 2021-11-26 | 四川农业大学 | 一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用 |
WO2021079522A1 (ja) * | 2019-10-25 | 2021-04-29 | 株式会社 東芝 | 腫瘍細胞群の特性を決定する方法、キット及びプログラム |
KR102405727B1 (ko) * | 2020-01-22 | 2022-06-07 | 한국한의학연구원 | 코로나바이러스 감염증 치료제 스크리닝 시스템 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002535003A (ja) * | 1999-01-29 | 2002-10-22 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ | アポトーシスを誘導するdna配列の単離方法及び検出システム |
JP2006158292A (ja) * | 2004-12-07 | 2006-06-22 | Toyobo Co Ltd | プロモーターの解析方法 |
JP5703086B2 (ja) | 2011-03-28 | 2015-04-15 | 株式会社東芝 | 細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクター |
JP5863338B2 (ja) * | 2011-08-25 | 2016-02-16 | 株式会社東芝 | プラスミド型ベクター、遺伝子プロモーター活性の検出方法、及びアッセイキット |
WO2013157020A1 (en) * | 2012-04-17 | 2013-10-24 | Indian Institute Of Technology, Kanpur | A method of measuring bmp signalling using bmp responsive reporter cell line |
JP2014006195A (ja) * | 2012-06-26 | 2014-01-16 | Univ Of Tsukuba | Chipの発現量を上昇させる化合物のスクリーニング方法 |
EP2998408B1 (en) * | 2013-05-17 | 2020-01-08 | Toshiba Medical Systems Corporation | Method for obtaining epigenetic cell information, method for determining cell characteristics, method for assessing drug sensitivity or selecting drug or immunotherapeutic agent variety, disease diagnosis method, self-replicating vector, assay kit, and analysis device |
JP6793451B2 (ja) * | 2014-11-14 | 2020-12-02 | キヤノンメディカルシステムズ株式会社 | 被検細胞の細胞特性を評価するための遺伝子マーカー、方法、レポーターベクター、プライマーセットおよびアッセイキット、並びに細胞特性評価装置 |
-
2016
- 2016-01-19 JP JP2016008125A patent/JP6723011B2/ja active Active
-
2017
- 2017-01-18 EP EP17152059.6A patent/EP3196308B1/en active Active
- 2017-01-19 US US15/410,401 patent/US20170204469A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170204469A1 (en) | 2017-07-20 |
EP3196308B1 (en) | 2019-08-14 |
JP2017127227A (ja) | 2017-07-27 |
EP3196308A1 (en) | 2017-07-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2021036915A (ja) | ダイナミックbh3プロファイリングを使用する毒性を評価するための組成物および方法 | |
Kim et al. | Acquired resistance to LY2874455 in FGFR2-amplified gastric cancer through an emergence of novel FGFR2-ACSL5 fusion | |
JP5764144B2 (ja) | 治療法に対するトリプルネガティブ乳癌の反応を予測するための方法 | |
JP6723011B2 (ja) | 被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクター、アッセイキット、方法および装置 | |
Zámbó et al. | Cellular expression and function of naturally occurring variants of the human ABCG2 multidrug transporter | |
Gaikwad et al. | Non-invasive imaging of PI3K/Akt/mTOR signalling in cancer | |
Wang et al. | Establishment of a bioluminescent MDA-MB-231 cell line for human triple-negative breast cancer research | |
JP2009506303A (ja) | 癌の化学療法のための予測方法 | |
Lee et al. | A novel 3D pillar/well array platform using patient-derived head and neck tumor to predict the individual radioresponse | |
JP6793451B2 (ja) | 被検細胞の細胞特性を評価するための遺伝子マーカー、方法、レポーターベクター、プライマーセットおよびアッセイキット、並びに細胞特性評価装置 | |
US20160153057A1 (en) | Method of obtaining epigenetic information of cell, method of determining characteristics of cell, method of determining drug sensitivity or selecting type of drug or immunotherapeutic agent, method of diagnosing disease, self-replicating vector, assay kit and analytic device | |
CN104450713A (zh) | 一种特异识别异质性核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)的寡核苷酸适配体C6-8的序列和应用 | |
Momota et al. | Bioluminescence technology for imaging cell proliferation | |
WO2012002472A1 (ja) | Acf検出方法 | |
JP6922444B2 (ja) | 蛍光ナノ粒子を用いた、病理学的完全奏効(pCR)の予測を支援するための検査支援方法 | |
Ratnayake et al. | Measurement of GPCR-G protein activity in living cells | |
JP5307426B2 (ja) | 補体活性検査方法 | |
JP6775911B2 (ja) | 細胞特性を判定する方法および装置、並びに疾患の検査方法 | |
JP6700249B2 (ja) | 患者特有の変異の薬物応答を測定する方法 | |
Ansari et al. | A method of targeted cell isolation via glass surface functionalization | |
WO2017213117A1 (ja) | 多重染色法、及び染色キット | |
EP3321682B1 (en) | Test support method for supporting prediction of pathological complete response (pcr) using fluorescent nanoparticles | |
Kwon et al. | Discovery of Live Cell Selective Fluorescent Probes and Elucidation of Their Mechanisms: Case Study of B Cell Selective Probe CDgB | |
Gant | Understanding Extracellular Matrix Alterations in High Grade Serous Ovarian Cancer | |
CN107236749A (zh) | 一种光学分子成像报告基因及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20160317 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181119 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190909 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190924 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191125 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200128 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200330 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200526 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200623 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6723011 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |