JP2002535003A - アポトーシスを誘導するｄｎａ配列の単離方法及び検出システム - Google Patents
アポトーシスを誘導するｄｎａ配列の単離方法及び検出システムInfo
- Publication number
- JP2002535003A JP2002535003A JP2000596136A JP2000596136A JP2002535003A JP 2002535003 A JP2002535003 A JP 2002535003A JP 2000596136 A JP2000596136 A JP 2000596136A JP 2000596136 A JP2000596136 A JP 2000596136A JP 2002535003 A JP2002535003 A JP 2002535003A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- activity
- cells
- cell
- reporter
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明はターゲット細胞中で選択不可能な活性を示す核酸配列を同定するための方法、診断薬及び治療薬の調製のための同定された遺伝子の使用並びにアポトーシスプロセスのためのレポーターシステムとしての分泌される酵素の使用に関する。
Description
【０００１】 本発明はターゲット細胞において選択不可能な活性を有する核酸配列の同定方
法、同定された遺伝子の診断薬及び治療薬の調製のための使用並びにアポトーシ
スプロセスのためのレポーターシステムとしての分泌される酵素の使用に関する
。
法、同定された遺伝子の診断薬及び治療薬の調製のための使用並びにアポトーシ
スプロセスのためのレポーターシステムとしての分泌される酵素の使用に関する
。
【０００２】 アポトーシスは真核細胞において規定の生理学的または病理学的な条件下に誘
導される遺伝子にコードされる自殺プログラムである。アポトーシスの誘導は非
常に厳密に制御されていなければならない。それというのも過剰活性は変性疾患
をもたらすからである。他方、アポトーシス誘導の低下は腫瘍進行に寄与するこ
とがある。
導される遺伝子にコードされる自殺プログラムである。アポトーシスの誘導は非
常に厳密に制御されていなければならない。それというのも過剰活性は変性疾患
をもたらすからである。他方、アポトーシス誘導の低下は腫瘍進行に寄与するこ
とがある。
【０００３】 種々の低分子量のアポトーシス誘導物が既に記載されている。１つの重要なク
ラスは細胞増殖抑止剤である。しかしながら、これらの細胞増殖抑止剤または別
の物質がどのようにアポトーシスを誘導しうるかは殆どの場合において未知であ
る。
ラスは細胞増殖抑止剤である。しかしながら、これらの細胞増殖抑止剤または別
の物質がどのようにアポトーシスを誘導しうるかは殆どの場合において未知であ
る。
【０００４】 アポトーシスを誘導する遺伝子または選択不可能な活性を有する別のドミナン
トな（dominant）遺伝子は問題がある。それというのも、かかる遺伝子をターゲ
ット細胞中で安定に組み換え発現させるのが全く不可能であるか、又は非常に困
難だからである。従って係る遺伝子の同定のための特別なスクリーニング法を使
用する必要がある。このために既に種々のインビトロ法が開発された（King et
al., Science 277 (1997), 973-974及びLustig et al., Meth. Enzymol. 283 (1
997), 83-99）。別の研究グループによって、複数のトランスジーンを有するト
ランスジェニックマウスが作成され、その機能は表現型の差異によって規定され
る（Simonet et al., Cell 89 (1997), 309-319及びSmith et al., Nat. Genet.
16 (1997), 28-36）。インビトロ法における欠点は、得られる結果が複雑に制
御された細胞生物学的効果と簡単に関連しないことにある。またトランスジェニ
ック動物の検査は非常に高価であり、かつ困難である。
トな（dominant）遺伝子は問題がある。それというのも、かかる遺伝子をターゲ
ット細胞中で安定に組み換え発現させるのが全く不可能であるか、又は非常に困
難だからである。従って係る遺伝子の同定のための特別なスクリーニング法を使
用する必要がある。このために既に種々のインビトロ法が開発された（King et
al., Science 277 (1997), 973-974及びLustig et al., Meth. Enzymol. 283 (1
997), 83-99）。別の研究グループによって、複数のトランスジーンを有するト
ランスジェニックマウスが作成され、その機能は表現型の差異によって規定され
る（Simonet et al., Cell 89 (1997), 309-319及びSmith et al., Nat. Genet.
16 (1997), 28-36）。インビトロ法における欠点は、得られる結果が複雑に制
御された細胞生物学的効果と簡単に関連しないことにある。またトランスジェニ
ック動物の検査は非常に高価であり、かつ困難である。
【０００５】 グリム及びレダー（Grimm und Leder）（J. Exp. Med. 185 (1997), 1137-114
2）はドミナントなアポトーシスを誘導する核酸配列の同定及び単離のための方
法を記載している。ここでは、ヒトの腎臓細胞系統２９３におけるノーマリゼー
ションされた（normalisierten）ｃＤＮＡ−発現ライブラリーからの２０個のク
ローンに相当する小規模のプラスミドプールを導入している。核酸配列のアポト
ーシス誘導活性は顕微鏡による観察によって手動で、アポトーシスに特徴的な形
態学的特徴に関して測定される。レポータープラスミドはアポトーシスを誘導す
る核酸配列の同定のためには使用されない。該方法は高価であり、アポトーシス
誘導活性を形態学的特徴の顕微鏡による観察によって規定する必要性に基づいて
自動化が困難であり、従ってマススクリーニングのためには不適である。更に該
方法は特に効率的にトランスフェクション可能な細胞系統に制限される。
2）はドミナントなアポトーシスを誘導する核酸配列の同定及び単離のための方
法を記載している。ここでは、ヒトの腎臓細胞系統２９３におけるノーマリゼー
ションされた（normalisierten）ｃＤＮＡ−発現ライブラリーからの２０個のク
ローンに相当する小規模のプラスミドプールを導入している。核酸配列のアポト
ーシス誘導活性は顕微鏡による観察によって手動で、アポトーシスに特徴的な形
態学的特徴に関して測定される。レポータープラスミドはアポトーシスを誘導す
る核酸配列の同定のためには使用されない。該方法は高価であり、アポトーシス
誘導活性を形態学的特徴の顕微鏡による観察によって規定する必要性に基づいて
自動化が困難であり、従ってマススクリーニングのためには不適である。更に該
方法は特に効率的にトランスフェクション可能な細胞系統に制限される。
【０００６】 ＤＥ−ＯＳ４３４２７６９号はＲＮＡに結合するタンパク質をコードするｃＤ
ＮＡを、ＲＮＡに結合するタンパク質を有すると見込まれる細胞系統からｃＤＮ
Ａ−遺伝子バンクを作成し、該遺伝子バンクを発現ベクターにライゲーション導
入し、かつこれらを１つのマーカー遺伝子及び遺伝子の５′−非翻訳領域におい
て当該ＲＮＡ結合性タンパク質の結合部位を有するもう一つの発現ベクターを既
に有する細胞中で発現させ、かつｃＤＮＡの存在をマーカー遺伝子の発現の低下
を介して検出することによって単離及びクローニングするための方法を記載して
いる。しかしながら、これらの方法では、細胞中で安定に組み換え発現できない
選択不可能な活性を有するドミナントな遺伝子を同定できない。
ＮＡを、ＲＮＡに結合するタンパク質を有すると見込まれる細胞系統からｃＤＮ
Ａ−遺伝子バンクを作成し、該遺伝子バンクを発現ベクターにライゲーション導
入し、かつこれらを１つのマーカー遺伝子及び遺伝子の５′−非翻訳領域におい
て当該ＲＮＡ結合性タンパク質の結合部位を有するもう一つの発現ベクターを既
に有する細胞中で発現させ、かつｃＤＮＡの存在をマーカー遺伝子の発現の低下
を介して検出することによって単離及びクローニングするための方法を記載して
いる。しかしながら、これらの方法では、細胞中で安定に組み換え発現できない
選択不可能な活性を有するドミナントな遺伝子を同定できない。
【０００７】 ＤＥ−ＯＳ３８０６６１７号は真核細胞中における選択不可能な遺伝子の発現
方法を記載しており、その際、選択不可能な遺伝子を有する２つ以上の選択マー
カー遺伝子がトランスフェクションされ、かつ選択マーカー遺伝子及び選択不可
能な遺伝子は１つ以上のベクターまたはＤＮＡ構造上に存在し、引き続きトラン
スフェクションされた全ての選択マーカーで選択される。また該方法で選択不可
能な活性を有するドミナントな遺伝子を同定できず、その安定な組み換え発現は
細胞中では不可能である。
方法を記載しており、その際、選択不可能な遺伝子を有する２つ以上の選択マー
カー遺伝子がトランスフェクションされ、かつ選択マーカー遺伝子及び選択不可
能な遺伝子は１つ以上のベクターまたはＤＮＡ構造上に存在し、引き続きトラン
スフェクションされた全ての選択マーカーで選択される。また該方法で選択不可
能な活性を有するドミナントな遺伝子を同定できず、その安定な組み換え発現は
細胞中では不可能である。
【０００８】 ＷＯ９１／１９７９６号は、細胞ゲノムの所定の遺伝子配列の内部に挿入され
た選択不可能な遺伝子配列を有する動物または植物の細胞を相同組み換えによっ
て得るための方法を記載している。また該方法はマススクリーニングによるドミ
ナントな選択不可能な遺伝子の同定のためには適当でない。
た選択不可能な遺伝子配列を有する動物または植物の細胞を相同組み換えによっ
て得るための方法を記載している。また該方法はマススクリーニングによるドミ
ナントな選択不可能な遺伝子の同定のためには適当でない。
【０００９】 ＷＯ９１／００３６１号は選択不可能な遺伝子をドミナントな選択可能な多剤
耐性遺伝子ＭＤＲ１の使用下に同定可能な発現をさせるための方法を記載してお
り、その際、ＭＤＲ１遺伝子での選択によって選択不可能な遺伝子の増幅及び過
剰発現を実施する。また該方法はドミナントな選択不可能な遺伝子を同定するた
めに原則的に不適である。
耐性遺伝子ＭＤＲ１の使用下に同定可能な発現をさせるための方法を記載してお
り、その際、ＭＤＲ１遺伝子での選択によって選択不可能な遺伝子の増幅及び過
剰発現を実施する。また該方法はドミナントな選択不可能な遺伝子を同定するた
めに原則的に不適である。
【００１０】 従って本発明の根底を成す課題は、選択不可能な活性を有するドミナントな核
酸配列の新規の同定方法及びそのために適当なレポーターシステムもしくは検出
システムを準備することにあり、これらによって前記の従来の技術の欠点を少な
くとも部分的に排除できる。
酸配列の新規の同定方法及びそのために適当なレポーターシステムもしくは検出
システムを準備することにあり、これらによって前記の従来の技術の欠点を少な
くとも部分的に排除できる。
【００１１】 本発明は核酸配列のドミナントな活性を同定するための容易であり、かつイン
タクトな細胞において実施でき、かつ自動化できる方法に関する。この場合、核
酸配列を有利な真核性発現ベクターにクローニングし、かつこれらのライブラリ
ーから単一のクローンまたはクローンの小規模なプールを細菌中で増大させる。
プラスミドＤＮＡの単離は、有利には自動化されたプロトコールによって実施し
、これは９６ウェルのフォーマット中で実施できる。このために単離されたプラ
スミドＤＮＡを、それぞれレポーターベクターと一緒にトランスフェクションバ
ッチによって真核細胞に導入してよい。それによって本願に記載のやり方はマス
スクリーニング、所謂“スクリーニング”である。引き続きトランスフェクショ
ンされた真核細胞中でレポーターベクターの活性を測定し、核酸配列の活性と相
関させる。ターゲット細胞のトランスフェクション後の有利な形式のスクリーニ
ングにおいて依然としてそれぞれのバッチからのプラスミドＤＮＡが留置される
ので、プラスミドはターゲット細胞から単離する必要がない。これはアポトーシ
ス誘導において有利である。それというのもこのやり方においてＤＮＡは細胞内
で分解するからである。ＤＮＡ単離、トランスフェクション及び活性検出の工程
は簡単な方法でロボットの使用によって自動化できる。
タクトな細胞において実施でき、かつ自動化できる方法に関する。この場合、核
酸配列を有利な真核性発現ベクターにクローニングし、かつこれらのライブラリ
ーから単一のクローンまたはクローンの小規模なプールを細菌中で増大させる。
プラスミドＤＮＡの単離は、有利には自動化されたプロトコールによって実施し
、これは９６ウェルのフォーマット中で実施できる。このために単離されたプラ
スミドＤＮＡを、それぞれレポーターベクターと一緒にトランスフェクションバ
ッチによって真核細胞に導入してよい。それによって本願に記載のやり方はマス
スクリーニング、所謂“スクリーニング”である。引き続きトランスフェクショ
ンされた真核細胞中でレポーターベクターの活性を測定し、核酸配列の活性と相
関させる。ターゲット細胞のトランスフェクション後の有利な形式のスクリーニ
ングにおいて依然としてそれぞれのバッチからのプラスミドＤＮＡが留置される
ので、プラスミドはターゲット細胞から単離する必要がない。これはアポトーシ
ス誘導において有利である。それというのもこのやり方においてＤＮＡは細胞内
で分解するからである。ＤＮＡ単離、トランスフェクション及び活性検出の工程
は簡単な方法でロボットの使用によって自動化できる。
【００１２】 更に、選択不可能な活性を有する遺伝子の同定を容易にする新規の検出システ
ムを準備する。これらの検出システムは分泌される酵素、特に分泌されるアルカ
リ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の使用を包含し、該酵素は、有利には調査され
る細胞中にレポーターベクターとして導入でき、その分泌を調査されるべき選択
不可能な活性の量として役立つ。分泌される酵素の使用の利点は、活性の測定の
ために細胞を分解させる必要がないことにある。従って活性は上清中で複数回測
定でき：トランスフェクションの直後に、細胞に導入された調査されるべき核酸
配列の作用、例えばアポトーシス誘導をまだ使用しないときに細胞内で発現され
る核酸配列に基づく酵素活性の変更が測定される。例えばアポトーシス細胞にお
いてタンパク質の分泌は減少するので、コントロール細胞に対してレポーター酵
素の活性は増大しない。
ムを準備する。これらの検出システムは分泌される酵素、特に分泌されるアルカ
リ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の使用を包含し、該酵素は、有利には調査され
る細胞中にレポーターベクターとして導入でき、その分泌を調査されるべき選択
不可能な活性の量として役立つ。分泌される酵素の使用の利点は、活性の測定の
ために細胞を分解させる必要がないことにある。従って活性は上清中で複数回測
定でき：トランスフェクションの直後に、細胞に導入された調査されるべき核酸
配列の作用、例えばアポトーシス誘導をまだ使用しないときに細胞内で発現され
る核酸配列に基づく酵素活性の変更が測定される。例えばアポトーシス細胞にお
いてタンパク質の分泌は減少するので、コントロール細胞に対してレポーター酵
素の活性は増大しない。
【００１３】 従って本発明の第一の態様は、ターゲット細胞中で選択不可能な活性を有する
核酸配列の同定するにあたり、以下の工程： （ａ）調査されるべき核酸配列をそれぞれ発現ベクター上に機能的な結合で、タ
ーゲット細胞中で活性の発現制御配列と一緒に有する多数の宿主細胞を有するＤ
ＮＡライブラリーを準備する工程、 （ｂ）宿主細胞を培養する工程、 （ｃ）培養された宿主細胞から発現ベクターを得る工程、 （ｄ１）ターゲット細胞に （ｉ）工程（ｃ）で得られた発現ベクター及び （ｉｉ）レポーターベクター をコトランスフェクションさせる工程、または （ｄ２）既にレポーターベクターを有するターゲット細胞に工程（ｃ）で得られ
た発現ベクターをトランスフェクションさせる工程、及び （ｅ）ターゲット細胞または培養上清中でのレポーターベクターの活性を、調査
されるべき核酸配列の選択不可能な活性に関して定性的または定量的な量として
測定する工程 を含む方法に関する。
核酸配列の同定するにあたり、以下の工程： （ａ）調査されるべき核酸配列をそれぞれ発現ベクター上に機能的な結合で、タ
ーゲット細胞中で活性の発現制御配列と一緒に有する多数の宿主細胞を有するＤ
ＮＡライブラリーを準備する工程、 （ｂ）宿主細胞を培養する工程、 （ｃ）培養された宿主細胞から発現ベクターを得る工程、 （ｄ１）ターゲット細胞に （ｉ）工程（ｃ）で得られた発現ベクター及び （ｉｉ）レポーターベクター をコトランスフェクションさせる工程、または （ｄ２）既にレポーターベクターを有するターゲット細胞に工程（ｃ）で得られ
た発現ベクターをトランスフェクションさせる工程、及び （ｅ）ターゲット細胞または培養上清中でのレポーターベクターの活性を、調査
されるべき核酸配列の選択不可能な活性に関して定性的または定量的な量として
測定する工程 を含む方法に関する。
【００１４】 調査されるべき核酸配列は原則的に任意の起源、例えば真核性物、例えば植物
、脊椎動物、例えばホニュウ類、菌類、寄生生物などに由来してよいが、細菌、
古細菌又はウイルスまたは合成起源もしくは半合成起源に由来してもよい。これ
らは、例えば任意の起源のゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ断片もしくは部
分配列または合成的に作成される配列、例えばアンチセンス分子または組み合わ
せて改変された核酸配列から選択される。
、脊椎動物、例えばホニュウ類、菌類、寄生生物などに由来してよいが、細菌、
古細菌又はウイルスまたは合成起源もしくは半合成起源に由来してもよい。これ
らは、例えば任意の起源のゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ断片もしくは部
分配列または合成的に作成される配列、例えばアンチセンス分子または組み合わ
せて改変された核酸配列から選択される。
【００１５】 本発明による方法の目的は、ターゲット細胞において選択不可能な活性を示す
、すなわち例えば細胞の増殖を阻害するか、または細胞死を、例えばアポトーシ
スによって引き起こすので不安定にターゲット細胞中で組み換え的に（過剰）発
現されうる核酸配列を同定することである。かかる選択不可能な活性の例は、例
えばアポトーシス誘導、細胞周期停止、細胞分化、細胞代謝の阻害及び、例えば
転写因子による遺伝子発現の阻害または活性化である。特に有利には本発明によ
る方法はドミナントなアポトーシス誘導遺伝子の同定のために使用される。
、すなわち例えば細胞の増殖を阻害するか、または細胞死を、例えばアポトーシ
スによって引き起こすので不安定にターゲット細胞中で組み換え的に（過剰）発
現されうる核酸配列を同定することである。かかる選択不可能な活性の例は、例
えばアポトーシス誘導、細胞周期停止、細胞分化、細胞代謝の阻害及び、例えば
転写因子による遺伝子発現の阻害または活性化である。特に有利には本発明によ
る方法はドミナントなアポトーシス誘導遺伝子の同定のために使用される。
【００１６】 方法の工程（ａ）は、それぞれ調査されるべき核酸配列を有する多数の宿主細
胞を有するＤＮＡライブラリーを準備することにある。このＤＮＡライブラリー
は、特に有利にはｃＤＮＡライブラリーであるときにノーマリゼーションされた
ライブラリー、すなわち多数の種類に対して減らされているライブラリーである
。かかるノーマリゼーションされたライブラリーの作成は、ササキ他（Sasaki e
t al）によって記載されている（Nucleic Acid Res. 22 (1994), 9987-9992）。
ｍＲＮＡ分子のポピュレーションにおいて多数の種類を減らすのは、例えばラテ
ックスビーズ上に固定されたｃＤＮＡ分子の添加によって、場合により複数回の
ハイブリダイゼーションサイクルにおいて達成される。
胞を有するＤＮＡライブラリーを準備することにある。このＤＮＡライブラリー
は、特に有利にはｃＤＮＡライブラリーであるときにノーマリゼーションされた
ライブラリー、すなわち多数の種類に対して減らされているライブラリーである
。かかるノーマリゼーションされたライブラリーの作成は、ササキ他（Sasaki e
t al）によって記載されている（Nucleic Acid Res. 22 (1994), 9987-9992）。
ｍＲＮＡ分子のポピュレーションにおいて多数の種類を減らすのは、例えばラテ
ックスビーズ上に固定されたｃＤＮＡ分子の添加によって、場合により複数回の
ハイブリダイゼーションサイクルにおいて達成される。
【００１７】 核酸ライブラリーは発現ベクター中に設けられており、該ベクターはそれぞれ
所望のターゲット細胞、有利には真核細胞及び、特にホニュウ類細胞において活
性である、すなわち調査されるべき核酸は発現ベクター上に機能的な結合でター
ゲット細胞中に構成的または調節可能に活性な発現制御配列と一緒に存在する。
更に発現ベクターは宿主細胞中で複製および選択を可能にするエレメント、すな
わち相応の複製開始点及び選択マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子を有
する。発現ベクターの選択をターゲット細胞中で実施しないので、複製及び選択
をターゲット細胞中で可能にするエレメントの存在は不必要である。宿主細胞と
して、有利には細菌細胞、特にグラム陰性細菌及び、特に有利にはＥ．ｃｏｌｉ
細胞を使用するので、発現ベクターは原核性配列エレメントも真核性配列エレメ
ントも有しているシャトルベクターであってよい。
所望のターゲット細胞、有利には真核細胞及び、特にホニュウ類細胞において活
性である、すなわち調査されるべき核酸は発現ベクター上に機能的な結合でター
ゲット細胞中に構成的または調節可能に活性な発現制御配列と一緒に存在する。
更に発現ベクターは宿主細胞中で複製および選択を可能にするエレメント、すな
わち相応の複製開始点及び選択マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子を有
する。発現ベクターの選択をターゲット細胞中で実施しないので、複製及び選択
をターゲット細胞中で可能にするエレメントの存在は不必要である。宿主細胞と
して、有利には細菌細胞、特にグラム陰性細菌及び、特に有利にはＥ．ｃｏｌｉ
細胞を使用するので、発現ベクターは原核性配列エレメントも真核性配列エレメ
ントも有しているシャトルベクターであってよい。
【００１８】 発現ベクターは、目的に応じて染色体外ベクター及び一過性にトランスフェク
ション可能なプラスミドである。しかしながら、選択的に安定なエピソームの発
現ベクターを使用してもよい。そのような発現ベクターは分子生物学の分野の当
業者に公知であり、例えばサンブローク他（Sambrook et al）のモレキュラーク
ローニング．研究室マニュアル（Molecular Cloning. A Laboratory Manual (19
89), Cold Spring Harbor Laboratory Press）または標準的な教科書に記載され
ている。
ション可能なプラスミドである。しかしながら、選択的に安定なエピソームの発
現ベクターを使用してもよい。そのような発現ベクターは分子生物学の分野の当
業者に公知であり、例えばサンブローク他（Sambrook et al）のモレキュラーク
ローニング．研究室マニュアル（Molecular Cloning. A Laboratory Manual (19
89), Cold Spring Harbor Laboratory Press）または標準的な教科書に記載され
ている。
【００１９】 本発明による方法の工程（ｂ）は宿主細胞の培養を含む。有利には少数の宿主
細胞を培養のための出発材料として使用する。かかる少数の宿主細胞は、例えば
固形培養プレートまたは相応の希釈の液体培養培地に核酸ライブラリーのクロー
ンから取り出してプレーティング（ausplattieren）することによって得ること
ができる。場合により、種々の宿主細胞、例えばトランスフェクションバッチあ
たり最大２０種の異なるクローン、特に最大１０種の異なるクローンの小規模の
プールを一緒に培養してもよいが、殆どの場合においてあまり有利でない。
細胞を培養のための出発材料として使用する。かかる少数の宿主細胞は、例えば
固形培養プレートまたは相応の希釈の液体培養培地に核酸ライブラリーのクロー
ンから取り出してプレーティング（ausplattieren）することによって得ること
ができる。場合により、種々の宿主細胞、例えばトランスフェクションバッチあ
たり最大２０種の異なるクローン、特に最大１０種の異なるクローンの小規模の
プールを一緒に培養してもよいが、殆どの場合においてあまり有利でない。
【００２０】 本発明による方法の工程（ｃ）は培養された細胞からの発現ベクターの回収を
含む。このために、先行技術から公知の方法を染色体外ＤＮＡ（例えば前記のSa
mbrook et al参照）の単離のために使用してよい。しかしながら、この場合に宿
主細胞から単離されるＤＮＡが十分な純度を示すべきことを顧慮すると、高い効
率で後のターゲット細胞のコトランスフェクションを可能にすることができる。
含む。このために、先行技術から公知の方法を染色体外ＤＮＡ（例えば前記のSa
mbrook et al参照）の単離のために使用してよい。しかしながら、この場合に宿
主細胞から単離されるＤＮＡが十分な純度を示すべきことを顧慮すると、高い効
率で後のターゲット細胞のコトランスフェクションを可能にすることができる。
【００２１】 細菌宿主細胞では、有利にはアルカリリシスが実施される。得られるプラスミ
ドＤＮＡの質は固相（feste Matrix）、特にシリカ吸着相上での吸着、有機溶剤
での洗浄及び引き続いての溶離によって改善することができる。意想外にも、こ
の場合にはＤＮＡをアルカリリシス後に、先行技術に記載のようにカオトロピッ
ク物質を必要とせずに高い効率で吸着相上に結合させることができると判明した
。添加されるカオトロピック物質の不在は引き続いての精製手順において著しい
改善及び簡素化をもたらし、従って要求される方法の前後の工程とは無関係に本
願発明の他の態様を意味する。
ドＤＮＡの質は固相（feste Matrix）、特にシリカ吸着相上での吸着、有機溶剤
での洗浄及び引き続いての溶離によって改善することができる。意想外にも、こ
の場合にはＤＮＡをアルカリリシス後に、先行技術に記載のようにカオトロピッ
ク物質を必要とせずに高い効率で吸着相上に結合させることができると判明した
。添加されるカオトロピック物質の不在は引き続いての精製手順において著しい
改善及び簡素化をもたらし、従って要求される方法の前後の工程とは無関係に本
願発明の他の態様を意味する。
【００２２】 工程（ｄ）は宿主細胞、特に真核細胞、例えばホニュウ類細胞を事前に単離さ
れた発現ベクター及び、場合によりレポーターベクターでトランスフェクション
またはコトランスフェクションさせることを含む。真核性のターゲット細胞では
、有利にはリン酸カルシウム−共沈殿、リポフェクション、エレクトロポレーシ
ョン、粒子打ち込み（Partikelbeschuss）またはウイルス感染（レトロウイルス
、アデノウイルスなど）によってトランスフェクションもしくはコトランスフェ
クションを実施する。トランスフェクションまたはコトランスフェクションによ
って生成したターゲット細胞においては、発現ベクターは一過性に発現し、レポ
ーターベクターは一過性または安定に発現することができる。
れた発現ベクター及び、場合によりレポーターベクターでトランスフェクション
またはコトランスフェクションさせることを含む。真核性のターゲット細胞では
、有利にはリン酸カルシウム−共沈殿、リポフェクション、エレクトロポレーシ
ョン、粒子打ち込み（Partikelbeschuss）またはウイルス感染（レトロウイルス
、アデノウイルスなど）によってトランスフェクションもしくはコトランスフェ
クションを実施する。トランスフェクションまたはコトランスフェクションによ
って生成したターゲット細胞においては、発現ベクターは一過性に発現し、レポ
ーターベクターは一過性または安定に発現することができる。
【００２３】 有利なコトランスフェクションにおいて発現ベクターは、有利にはレポーター
ベクターに対してモル過剰で使用される。特に有利にはレポーターベクターと発
現ベクターとのモル比は１：２〜１：２０である。発現ベクターをモル過剰で使
用するとき、ターゲット細胞中のレポーターベクターの存在はターゲット細胞中
に同時に存在する発現ベクターのためのマーカーとして役立つ。それというのも
細胞はコトランスフェクションにおいて使用されるベクターをコトランスフェク
ションバッチ中のそのモル比に応じて収容するからである。
ベクターに対してモル過剰で使用される。特に有利にはレポーターベクターと発
現ベクターとのモル比は１：２〜１：２０である。発現ベクターをモル過剰で使
用するとき、ターゲット細胞中のレポーターベクターの存在はターゲット細胞中
に同時に存在する発現ベクターのためのマーカーとして役立つ。それというのも
細胞はコトランスフェクションにおいて使用されるベクターをコトランスフェク
ションバッチ中のそのモル比に応じて収容するからである。
【００２４】 本発明による方法は、その他の点では種々のレポーターベクターの使用を可能
にし、これらに関して一方では既に（染色体内または染色体外で）ターゲット細
胞中に存在し、かつ他方では発現ベクターと一緒にコトランスフェクションする
ことによって細胞中に導入される。
にし、これらに関して一方では既に（染色体内または染色体外で）ターゲット細
胞中に存在し、かつ他方では発現ベクターと一緒にコトランスフェクションする
ことによって細胞中に導入される。
【００２５】 レポーターベクターは、有利にはレポーターベクター及び発現ベクターの間に
直接的な機能的関連が存在しない、すなわち発現ベクターによってコードされる
遺伝子産物はレポーターベクターの活性に直接作用しないが、発現ベクターによ
ってコードされる遺伝子産物は間接的にのみ、すなわちターゲット細胞の代謝の
影響を介してレポーターベクターの活性に作用するように選択される。しかしな
がらレポーターベクター及び発現ベクターの間の直接的な相互作用の検出を可能
にするスクリーニングの実施形も可能である。
直接的な機能的関連が存在しない、すなわち発現ベクターによってコードされる
遺伝子産物はレポーターベクターの活性に直接作用しないが、発現ベクターによ
ってコードされる遺伝子産物は間接的にのみ、すなわちターゲット細胞の代謝の
影響を介してレポーターベクターの活性に作用するように選択される。しかしな
がらレポーターベクター及び発現ベクターの間の直接的な相互作用の検出を可能
にするスクリーニングの実施形も可能である。
【００２６】 発現ベクターと一緒にコトランスフェクションされるか、または既にターゲッ
ト細胞中に存在するレポーターベクターは一般に検出可能な遺伝子産物をコード
する核酸配列をターゲット細胞中に発現可能な形で有する。レポーターベクター
は、有利には染色体外ベクター、特に有利には一過性トランスフェクション可能
なプラスミドである。他方では、安定なエピソームまたはクロモソームのレポー
ターベクターを使用してもよい。この場合にレポーターベクターはターゲット細
胞中で選択及び、場合により複製が可能なエレメントを有する。検出可能な遺伝
子産物の発現は、構成的または調節可能な制御配列、有利には構成的な発現制御
配列を介して実施できる。
ト細胞中に存在するレポーターベクターは一般に検出可能な遺伝子産物をコード
する核酸配列をターゲット細胞中に発現可能な形で有する。レポーターベクター
は、有利には染色体外ベクター、特に有利には一過性トランスフェクション可能
なプラスミドである。他方では、安定なエピソームまたはクロモソームのレポー
ターベクターを使用してもよい。この場合にレポーターベクターはターゲット細
胞中で選択及び、場合により複製が可能なエレメントを有する。検出可能な遺伝
子産物の発現は、構成的または調節可能な制御配列、有利には構成的な発現制御
配列を介して実施できる。
【００２７】 レポーターベクターによってコードされる遺伝子産物は特に有利な実施形にお
いては、分泌される酵素、すなわちターゲット細胞から分泌される酵素である。
かかる酵素の例は、分泌されるアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）（Berger
et al., Gene 66 (1988), 1-10）並びにルシフェラーゼ（Lui et al., Gene 20
2(1977), 141-148）である。特に有利にはＳＥＡＰが分泌される酵素として使用
される。レポーターシステムとしての分泌される遺伝子産物の使用において、活
性測定はターゲット細胞の培養上清中で実施する。他方では、レポーターベクタ
ーによってコードされる検出可能な遺伝子産物は、インタクトな細胞において細
胞内で検出される分泌されないポリペプチド、例えば蛍光タンパク質、例えばＧ
ＦＰであってよい。同様に、レポーターベクターによって発現される検出可能な
遺伝子産物は、例えば抗体またはアフィニティーリガンドとのインキュベートに
よって検出可能な膜常設のポリペプチドであってよい。
いては、分泌される酵素、すなわちターゲット細胞から分泌される酵素である。
かかる酵素の例は、分泌されるアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）（Berger
et al., Gene 66 (1988), 1-10）並びにルシフェラーゼ（Lui et al., Gene 20
2(1977), 141-148）である。特に有利にはＳＥＡＰが分泌される酵素として使用
される。レポーターシステムとしての分泌される遺伝子産物の使用において、活
性測定はターゲット細胞の培養上清中で実施する。他方では、レポーターベクタ
ーによってコードされる検出可能な遺伝子産物は、インタクトな細胞において細
胞内で検出される分泌されないポリペプチド、例えば蛍光タンパク質、例えばＧ
ＦＰであってよい。同様に、レポーターベクターによって発現される検出可能な
遺伝子産物は、例えば抗体またはアフィニティーリガンドとのインキュベートに
よって検出可能な膜常設のポリペプチドであってよい。
【００２８】 本発明による方法の工程（ｅ）はターゲット細胞またはその培養上清における
レポーターベクターの活性を、調査される核酸配列の選択不可能な活性に関する
量として測定することを含む。この測定法は、発現ベクターに存在する調査され
るべき核酸配列がターゲット細胞において発現後に細胞代謝への、例えばアポト
ーシス誘導による影響を有し、これは他方ではレポーターベクターの活性もしく
は該ベクターによってコードされる検出可能な遺伝子産物の活性に測定可能な形
で影響することに基づく。有利にはレポーターベクターの活性はトランスフェク
ションまたはコトランスフェクション後の少なくとも２つの時点で測定され、そ
の際、第１の時点は発現ベクター上にある核酸配列の発現がレポーターベクター
の活性にまだ影響を及ぼさず、従ってそれぞれの調査されるターゲット細胞に関
するベース活性を規定するために使用できるように選択する。第２の時点は、そ
れぞれの細胞中に存在する核酸配列が調査される選択不可能な活性を有する場合
は、発現ベクター上にある核酸配列の発現が既にレポーターベクターの活性に測
定可能な影響を及ぼすように選択される。こうして、トランスフェクションまた
はコトランスフェクションの際のトランスフェクション効率に依存するレポータ
ーベクターのベース活性とは無関係に、規定の細胞中に導入された核酸配列の活
性を測定できる。本発明による方法の実施は、有利には少なくとも部分的に自動
化され、その際、工程（ｂ）〜（ｅ）は少なくとも５０種の試料に対してそれぞ
れ並行に実施できる。
レポーターベクターの活性を、調査される核酸配列の選択不可能な活性に関する
量として測定することを含む。この測定法は、発現ベクターに存在する調査され
るべき核酸配列がターゲット細胞において発現後に細胞代謝への、例えばアポト
ーシス誘導による影響を有し、これは他方ではレポーターベクターの活性もしく
は該ベクターによってコードされる検出可能な遺伝子産物の活性に測定可能な形
で影響することに基づく。有利にはレポーターベクターの活性はトランスフェク
ションまたはコトランスフェクション後の少なくとも２つの時点で測定され、そ
の際、第１の時点は発現ベクター上にある核酸配列の発現がレポーターベクター
の活性にまだ影響を及ぼさず、従ってそれぞれの調査されるターゲット細胞に関
するベース活性を規定するために使用できるように選択する。第２の時点は、そ
れぞれの細胞中に存在する核酸配列が調査される選択不可能な活性を有する場合
は、発現ベクター上にある核酸配列の発現が既にレポーターベクターの活性に測
定可能な影響を及ぼすように選択される。こうして、トランスフェクションまた
はコトランスフェクションの際のトランスフェクション効率に依存するレポータ
ーベクターのベース活性とは無関係に、規定の細胞中に導入された核酸配列の活
性を測定できる。本発明による方法の実施は、有利には少なくとも部分的に自動
化され、その際、工程（ｂ）〜（ｅ）は少なくとも５０種の試料に対してそれぞ
れ並行に実施できる。
【００２９】 本発明による方法を、ターゲット細胞の分泌特性に、例えばアポトーシス誘導
のように影響を及ぼす核酸配列の同定のために使用する場合、細胞上清における
レポーターベクターの活性の測定は所望の核酸配列の同定のために十分である。
方法のもう一つの実施形、例えば細胞分化に影響を及ぼす物質の同定においては
、レポーターベクターによってコードされる検出可能な遺伝子産物、例えば蛍光
タンパク質、例えばＧＦＰを細胞内で、トランスフェクションされた細胞の標識
のために発現させてよい。この標識は、場合により付加的な細胞パラメータの検
出、例えば抗体または受容体リガンドによる表面マーカーの検出と組み合わせて
よい。この付加的なパラメータの検出のために、蛍光性試薬を使用してよい。次
いで細胞への標識の存在および／またはその強度を、蛍光サイトメトリー、例え
ばＦＡＣＳ（Fluorscence activated cell sorting）によって測定できる。
のように影響を及ぼす核酸配列の同定のために使用する場合、細胞上清における
レポーターベクターの活性の測定は所望の核酸配列の同定のために十分である。
方法のもう一つの実施形、例えば細胞分化に影響を及ぼす物質の同定においては
、レポーターベクターによってコードされる検出可能な遺伝子産物、例えば蛍光
タンパク質、例えばＧＦＰを細胞内で、トランスフェクションされた細胞の標識
のために発現させてよい。この標識は、場合により付加的な細胞パラメータの検
出、例えば抗体または受容体リガンドによる表面マーカーの検出と組み合わせて
よい。この付加的なパラメータの検出のために、蛍光性試薬を使用してよい。次
いで細胞への標識の存在および／またはその強度を、蛍光サイトメトリー、例え
ばＦＡＣＳ（Fluorscence activated cell sorting）によって測定できる。
【００３０】 本発明による方法によって同定された遺伝子は診断薬及び治療薬の調製のため
に使用できる。そのため、該方法の実施において種々のターゲット細胞（正常細
胞、腫瘍細胞）を使用することができる。また規定の遺伝的変異を有する細胞、
例えば活性化された腫瘍遺伝子または不活性化された癌抑制遺伝子並びにウイル
ス感染した細胞をスクリーニングのために使用してもよい。それによって、一定
の細胞型において選択的に活性を示す核酸配列、例えば腫瘍細胞またはウイルス
感染した細胞において選択的なアポトーシス誘導をもたらす遺伝子を同定もしく
は単離することができる。これらの遺伝子を次いで、例えば腫瘍疾患またはウイ
ルス感染の遺伝子治療的な撲滅のために患者の体内で発現させることもできる。
アポトーシス誘導のためには一過性の活性が必要とされるに過ぎないが、目下の
ところ依然困難な永続的な発現が遺伝子治療において普及している。
に使用できる。そのため、該方法の実施において種々のターゲット細胞（正常細
胞、腫瘍細胞）を使用することができる。また規定の遺伝的変異を有する細胞、
例えば活性化された腫瘍遺伝子または不活性化された癌抑制遺伝子並びにウイル
ス感染した細胞をスクリーニングのために使用してもよい。それによって、一定
の細胞型において選択的に活性を示す核酸配列、例えば腫瘍細胞またはウイルス
感染した細胞において選択的なアポトーシス誘導をもたらす遺伝子を同定もしく
は単離することができる。これらの遺伝子を次いで、例えば腫瘍疾患またはウイ
ルス感染の遺伝子治療的な撲滅のために患者の体内で発現させることもできる。
アポトーシス誘導のためには一過性の活性が必要とされるに過ぎないが、目下の
ところ依然困難な永続的な発現が遺伝子治療において普及している。
【００３１】 本発明の他の態様は分泌される酵素をアポトーシスプロセスのためのレポータ
ーシステムとして、例えばアポトーシス関連の遺伝子の同定のためか、またはア
ポトーシスに作用する薬剤の同定のために使用することである。特に有利にはア
ポトーシス誘導遺伝子またはアポトーシス抑制遺伝子の同定のためのレポーター
システムとして使用される。
ーシステムとして、例えばアポトーシス関連の遺伝子の同定のためか、またはア
ポトーシスに作用する薬剤の同定のために使用することである。特に有利にはア
ポトーシス誘導遺伝子またはアポトーシス抑制遺伝子の同定のためのレポーター
システムとして使用される。
【００３２】 特に有利には分泌されるアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をレポーター
システムとして使用する。酵素活性の検出は、有利にはそれぞれの酵素に対する
クロモゲンまたは蛍光性物質の使用下に実施する。そのような酵素基質は公知で
ある。前記の方法におけるレポーターシステムとしての使用が特に有利である。
システムとして使用する。酵素活性の検出は、有利にはそれぞれの酵素に対する
クロモゲンまたは蛍光性物質の使用下に実施する。そのような酵素基質は公知で
ある。前記の方法におけるレポーターシステムとしての使用が特に有利である。
【００３３】 なお本発明の他の態様は、前記の方法の自動化された実施のための装置である
。該装置は、有利には２つのロボット（宿主細胞からのプラスミドＤＮＡの単離
及びターゲット細胞の感染のため）を有する（図４及び図５）。ＤＮＡ単離ロボ
ットは多数の宿主細胞の培養のための手段、例えばブロックまたはマイクロタイ
タープレートを有する。宿主細胞のための培養容量は、有利には０．５〜２．５
ｍｌ、特に有利には０．５〜１ｍｌの範囲である。更に該装置はプラスミドＤＮ
Ａを多数の宿主細胞から得る手段を有し、該手段は、例えばマイクロタイタープ
レートまたはブロックであり、これらは場合によりプラスミドＤＮＡの精製のた
めのミニカラムを有していてよい。トランスフェクションロボットは多数の宿主
細胞のトランスフェクション及び培養のための手段を有し、該手段は同様にブロ
ックまたはマイクロタイタープレートであってよい。最後に該装置はターゲット
細胞中のレポーターベクターの活性測定のための手段、有利には分光測定装置ま
たは蛍光測定装置を有する。両者のロボットはマルチチャンネルピペットを使用
して作業し、その際、それぞれの液体を同時にピペット操作して、適切な試料ス
ループットを達成することができる。
。該装置は、有利には２つのロボット（宿主細胞からのプラスミドＤＮＡの単離
及びターゲット細胞の感染のため）を有する（図４及び図５）。ＤＮＡ単離ロボ
ットは多数の宿主細胞の培養のための手段、例えばブロックまたはマイクロタイ
タープレートを有する。宿主細胞のための培養容量は、有利には０．５〜２．５
ｍｌ、特に有利には０．５〜１ｍｌの範囲である。更に該装置はプラスミドＤＮ
Ａを多数の宿主細胞から得る手段を有し、該手段は、例えばマイクロタイタープ
レートまたはブロックであり、これらは場合によりプラスミドＤＮＡの精製のた
めのミニカラムを有していてよい。トランスフェクションロボットは多数の宿主
細胞のトランスフェクション及び培養のための手段を有し、該手段は同様にブロ
ックまたはマイクロタイタープレートであってよい。最後に該装置はターゲット
細胞中のレポーターベクターの活性測定のための手段、有利には分光測定装置ま
たは蛍光測定装置を有する。両者のロボットはマルチチャンネルピペットを使用
して作業し、その際、それぞれの液体を同時にピペット操作して、適切な試料ス
ループットを達成することができる。
【００３４】 考えられる多数のロボットの構成はスクリーニングの実施を可能にする。図４
及び図５に２つの有利な態様が示されており、そこにはＤＮＡ試料及び宿主細胞
もしくはＤＮＡ試料及びターゲット細胞で処理されたプレートが表面上に配置さ
れており、かつｘ、ｙ、ｚ−方向に可動なピペットヘッドによって互いに接続さ
れている。
及び図５に２つの有利な態様が示されており、そこにはＤＮＡ試料及び宿主細胞
もしくはＤＮＡ試料及びターゲット細胞で処理されたプレートが表面上に配置さ
れており、かつｘ、ｙ、ｚ−方向に可動なピペットヘッドによって互いに接続さ
れている。
【００３５】 更に本発明を以下に記載の図面及び実施例によって詳細に説明する。
【００３６】 図１はドミナントな選択不可能な核酸活性に関する９６ウェル−フォーマット
中でのスクリーニング法を図示している図を示す。
中でのスクリーニング法を図示している図を示す。
【００３７】 図２は細菌細胞のアルカリリシス後のＤＮＡが塩酸グアニジニウムの濃度に依
存して酸化ケイ素上に結合する能力を示している。
存して酸化ケイ素上に結合する能力を示している。
【００３８】 図３はドミナントなアポトーシス誘導遺伝子の検出のためのＳＥＡＰ活性の測
定を示している： Ａ：ＳＥＡＰ発現ベクター及びコントロールベクター（○）、細胞周期停止遺伝
子ｐ２１をコードする発現ベクター（□）及びアポトーシス誘導遺伝子（◇）を
使用するコトランスフェクション試験におけるＳＥＡＰ活性の時間経過。該デー
タは活性に関してはトランスフェクションの１６時間後に正規化されている。
定を示している： Ａ：ＳＥＡＰ発現ベクター及びコントロールベクター（○）、細胞周期停止遺伝
子ｐ２１をコードする発現ベクター（□）及びアポトーシス誘導遺伝子（◇）を
使用するコトランスフェクション試験におけるＳＥＡＰ活性の時間経過。該デー
タは活性に関してはトランスフェクションの１６時間後に正規化されている。
【００３９】 Ｂ：アポトーシス誘導によるＳＥＡＰ活性（ΔＡ４０５ｎｍ）の低下。トランス
フェクションの１６時間後のＳＥＡＰ活性は３６時間後の活性の正規化のために
使用し、その平均値及び標準偏差は３つの独立の試験から示される。
フェクションの１６時間後のＳＥＡＰ活性は３６時間後の活性の正規化のために
使用し、その平均値及び標準偏差は３つの独立の試験から示される。
【００４０】 図４はＤＮＡ単離ロボットを図示している図を示している。宿主細胞またはそ
こから単離されるＤＮＡ並びにその中間段階を有するブロック、例えば９６ウェ
ル−ブロックのための置き場をＡ、Ｂ、Ｃ、ｄと呼ぶ。ＤＮＡを得るために必要
な試薬は両側に配置されている。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、ＳｉＯｘ（酸化ケイ素溶液
）、Ａｃｅｔ（アセテート溶液）及びＨ２Ｏは、ＤＮＡを得るために必要な相応
の溶液を有するレザバーを示す。洗浄所（“washing”）はピペットヘッドの先
の洗浄のために必要である。遠心分離のための手段（“centrifuge”）、真空を
施すための手段（“vacuum”）、振盪のための手段（shaking）及びインキュベ
ーションステーション（inc）はＤＮＡの精製のためのプレートの処理に使用さ
れる。駆動装置（Ｘ，Ｙ，Ｚ）によって種々の方向に動くことができるグリップ
アームを有する全表面にわたり可動のピペットヘッドはプレート及び処理ステー
ションを互いに結ぶ。上半分においてロボットを側面図で示している。
こから単離されるＤＮＡ並びにその中間段階を有するブロック、例えば９６ウェ
ル−ブロックのための置き場をＡ、Ｂ、Ｃ、ｄと呼ぶ。ＤＮＡを得るために必要
な試薬は両側に配置されている。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、ＳｉＯｘ（酸化ケイ素溶液
）、Ａｃｅｔ（アセテート溶液）及びＨ２Ｏは、ＤＮＡを得るために必要な相応
の溶液を有するレザバーを示す。洗浄所（“washing”）はピペットヘッドの先
の洗浄のために必要である。遠心分離のための手段（“centrifuge”）、真空を
施すための手段（“vacuum”）、振盪のための手段（shaking）及びインキュベ
ーションステーション（inc）はＤＮＡの精製のためのプレートの処理に使用さ
れる。駆動装置（Ｘ，Ｙ，Ｚ）によって種々の方向に動くことができるグリップ
アームを有する全表面にわたり可動のピペットヘッドはプレート及び処理ステー
ションを互いに結ぶ。上半分においてロボットを側面図で示している。
【００４１】 図５はトランスフェクションロボットを図示している図を示している。トラン
スフェクションのためのターゲット細胞はマルチウェル−プレートにおいて上下
に配置された４つの領域につけられている。トランスフェクションされるべきＤ
ＮＡ試料は９６ウェル−プレート中の上方領域に配置されている。その下方の領
域でトランスフェクション反応が生ずる。その他のＤＮＡのために必要とされる
試薬はＬ１及びＬ２として表す。洗浄ステーション、同様に廃棄ステーション（
waste）は、Ｘ，Ｙ，Ｚの方向に可動でありかつステップモータ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）
によって動くピペットヘッド（“Ｚ”）の先の浄化に使用される。右上隅にはロ
ボットもしくは可動のピペットヘッドの側面図が描写されている。
スフェクションのためのターゲット細胞はマルチウェル−プレートにおいて上下
に配置された４つの領域につけられている。トランスフェクションされるべきＤ
ＮＡ試料は９６ウェル−プレート中の上方領域に配置されている。その下方の領
域でトランスフェクション反応が生ずる。その他のＤＮＡのために必要とされる
試薬はＬ１及びＬ２として表す。洗浄ステーション、同様に廃棄ステーション（
waste）は、Ｘ，Ｙ，Ｚの方向に可動でありかつステップモータ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）
によって動くピペットヘッド（“Ｚ”）の先の浄化に使用される。右上隅にはロ
ボットもしくは可動のピペットヘッドの側面図が描写されている。
【００４２】 図６はＧＦＰのコトランスフェクションによるＡＮＴ−１でのアポトーシス誘
導における表現型の変化の図を示している。ＡＮＴ−１のための３μｇの発現ベ
クターまたは空の発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションさせた。
そのために、ＧＦＰ（“緑色蛍光タンパク質”）のための発現ベクターをそれぞ
れ１μｇコトランスフェクションさせて、トランスフェクションされた細胞を標
識した。蛍光をトランスフェクションの２４時間後に２００倍の拡大で撮影した
。
導における表現型の変化の図を示している。ＡＮＴ−１のための３μｇの発現ベ
クターまたは空の発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションさせた。
そのために、ＧＦＰ（“緑色蛍光タンパク質”）のための発現ベクターをそれぞ
れ１μｇコトランスフェクションさせて、トランスフェクションされた細胞を標
識した。蛍光をトランスフェクションの２４時間後に２００倍の拡大で撮影した
。
【００４３】 実施例 例１ マーカープラスミド上のＳＥＡＰ遺伝子をコトランスフェクションさせること
によるアポトーシスを誘導する遺伝子の単離 １． 実験プロトコール １．１ 細胞培養及びトランスフェクション ベビーハムスターの腎臓細胞（BHK）を、５％のウシ胎仔血清（Sigma, Deisen
hofen, Deutschland）を補ったＤＭＥＭ中で給湿された５％のＣＯ２雰囲気下で
培養した。トランスフェクションのために細胞を２４ウェル−プレート中に添加
し、２μｇのプラスミドＤＮＡでリン酸カルシウム共沈殿法によってロウッセル
他（Roussel et al）（Mol. Cell. Biol. 4 (1984), 1999-2009）に記載のよう
にトランスフェクションさせた。このために有する２５μｌのＤＮＡ溶液を２５
μｌの２×ＨＢＳバッファー（ｐＨ６．９）（２７４ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭ
のＫＣｌ、４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４）と４℃で９６
ウェル−プレートにおいて１２チャンネルのピペット操作自動装置（Eppendorf,
Hamburg, Deutschland）で混合した。２０μｌの０．２５ＭのＣａＣｌ２溶液
（４℃）の添加及び混合の後に３８μｌを２５分のインキュベート後に室温で細
胞上に添加した。
によるアポトーシスを誘導する遺伝子の単離 １． 実験プロトコール １．１ 細胞培養及びトランスフェクション ベビーハムスターの腎臓細胞（BHK）を、５％のウシ胎仔血清（Sigma, Deisen
hofen, Deutschland）を補ったＤＭＥＭ中で給湿された５％のＣＯ２雰囲気下で
培養した。トランスフェクションのために細胞を２４ウェル−プレート中に添加
し、２μｇのプラスミドＤＮＡでリン酸カルシウム共沈殿法によってロウッセル
他（Roussel et al）（Mol. Cell. Biol. 4 (1984), 1999-2009）に記載のよう
にトランスフェクションさせた。このために有する２５μｌのＤＮＡ溶液を２５
μｌの２×ＨＢＳバッファー（ｐＨ６．９）（２７４ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭ
のＫＣｌ、４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４）と４℃で９６
ウェル−プレートにおいて１２チャンネルのピペット操作自動装置（Eppendorf,
Hamburg, Deutschland）で混合した。２０μｌの０．２５ＭのＣａＣｌ２溶液
（４℃）の添加及び混合の後に３８μｌを２５分のインキュベート後に室温で細
胞上に添加した。
【００４４】 １．２ ノーマリゼーションされたライブラリーの作成及びｃＤＮＡスクリー ニング 腎臓のｃＤＮＡライブラリーのノーマリゼーション及び構築をグリム及びレダ
ー（J.Ecp.Meth.185(1997),1137-1142）及びササキ他（Nucleic Acids Res. 22
(1994), 987-992）に記載されているように実施した。
ー（J.Ecp.Meth.185(1997),1137-1142）及びササキ他（Nucleic Acids Res. 22
(1994), 987-992）に記載されているように実施した。
【００４５】 ４〜６週齢のＦＶＢマウスの腎臓からのｍＲＮＡを多数の種のｍＲＮＡとラテ
ックスビーズに共有結合されたアンチセンスｃＤＮＡ分子とを会合させ、引き続
き遠心分離によって分離することによってノーマリゼーションした。２回のハイ
ブリダイゼーションサイクルの後に、２００ｎｇ（当初の２μｇのうち）のｍＲ
ＮＡが得られ、これをｃＤＮＡライブラリーの作成のためにｃＤＮＡ合成キット
（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）の使用下に使用した。ＢｓｔＸＩアダプター
（Invitrogen, San Diego, CA）のライゲーション及びＮｏｔＩでの分解の後に
、ｃＤＮＡ分子を、ネオマイシン耐性遺伝子を欠失している改変されたｐｃＤＮ
Ａ３−ベクター（Invitrogen）中にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーのコントロール下に挿入した。このＤＮＡをエレクトロポレーションによって
Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ細胞（Stratagene, Corp. La Jolla, CA）中に導入し、
引き続きこれらを直ちに凍結させた。
ックスビーズに共有結合されたアンチセンスｃＤＮＡ分子とを会合させ、引き続
き遠心分離によって分離することによってノーマリゼーションした。２回のハイ
ブリダイゼーションサイクルの後に、２００ｎｇ（当初の２μｇのうち）のｍＲ
ＮＡが得られ、これをｃＤＮＡライブラリーの作成のためにｃＤＮＡ合成キット
（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）の使用下に使用した。ＢｓｔＸＩアダプター
（Invitrogen, San Diego, CA）のライゲーション及びＮｏｔＩでの分解の後に
、ｃＤＮＡ分子を、ネオマイシン耐性遺伝子を欠失している改変されたｐｃＤＮ
Ａ３−ベクター（Invitrogen）中にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーのコントロール下に挿入した。このＤＮＡをエレクトロポレーションによって
Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ細胞（Stratagene, Corp. La Jolla, CA）中に導入し、
引き続きこれらを直ちに凍結させた。
【００４６】 形質転換バッチのアリコートをアガー上にプレーティングすることによって、
ライブラリーは約２．５×１０５個のクローンを含んでいることが判明した。統
計的に単一のクローンを有するアリコートを９６ウェル−ブロック（Qiagen, Hi
lden, Deutschland）のウェルにおいて９００μｌのＬＢ培地中に接種し、かつ
３００ｒｐｍの撹拌下に３０時間培養した。陽性プールの同定後に、ＤＮＡを効
果の証明のために再びトランスフェクションさせた。残留しているＤＮＡを細菌
の形質転換のために大規模にプラスミドを単離するために使用した。
ライブラリーは約２．５×１０５個のクローンを含んでいることが判明した。統
計的に単一のクローンを有するアリコートを９６ウェル−ブロック（Qiagen, Hi
lden, Deutschland）のウェルにおいて９００μｌのＬＢ培地中に接種し、かつ
３００ｒｐｍの撹拌下に３０時間培養した。陽性プールの同定後に、ＤＮＡを効
果の証明のために再びトランスフェクションさせた。残留しているＤＮＡを細菌
の形質転換のために大規模にプラスミドを単離するために使用した。
【００４７】 １．３ 分泌されるアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の活性測定 ＳＥＡＰ活性をベルガー他（berger et al）（Gene 66 81988), 1-10）によっ
て記載されるように測定した。このために培養上清を４０００ｒｐｍで遠心分離
した。６５℃で３０分間熱処理した後に、活性をＳＥＡＰバッファー中で記載の
ように試験した。
て記載されるように測定した。このために培養上清を４０００ｒｐｍで遠心分離
した。６５℃で３０分間熱処理した後に、活性をＳＥＡＰバッファー中で記載の
ように試験した。
【００４８】 １．４ カラムによるプラスミド単離 細菌を含有する９６ウェル−ブロックを３０００ｇで５分間遠心分離した（Si
gma Zentrifugen Osterode am Harz, Deutschland）。上清をデカンテーション
し、かつブロックを２〜３分間転回させた。次いで１７０μｌのバッファーＰ１
（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ／１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を添加し、
細菌ペレットを完全なボルテックス処理によって１０〜２０分間再懸濁した。１
７０μｌのバッファーＰ２（２００ｍＭのＮａＯＨ、１％のＳＤＳ）の添加後に
、ブロックをフィルムで密封し、転回によって混合し、かつ室温で５分間インキ
ュベートした。リシスを、４℃に冷却したバッファーＰ３（３Ｍの酢酸カリウム
ｐＨ５．５）１７０μｌを添加することによって完了させた。次いで１０μｌの
ＲＮａｓｅＡ溶液（１．７ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で５分間、次いで−２０
℃でインキュベートし、再び６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を新
たなブロック中にデカンテーションし、かつ１００μｌのバッファーＰ４（イソ
プロパノール中の２．５％のＳＤＳ）を添加した。ブロックを５分間ボルテック
ス処理し、次いで４℃で１５分間、次いで−２０℃で１５分間インキュベートし
た。これらのブロックを６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、かつ上清を、市
販のカラム（Qiagen）の使用によって相応に切断された９６ウェル−プレート中
で作成されている９６個のカラムの配列中に移送した。これらのプレートを真空
チャンバ（Qiagen）中に置いた。次いで１５０μｌの酸化ケイ素懸濁液を添加し
、室温で２０分間インキュベートした（前記の酸化ケイ素懸濁液は５０ｍｇ／ｍ
ｌのＳｉＯ２（Sigma）の２５０ｍｌの懸濁液に１５０μｌのＨＣｌ（３７％）
を添加することによって製造し、引き続きオートクレーブにかけた）。
gma Zentrifugen Osterode am Harz, Deutschland）。上清をデカンテーション
し、かつブロックを２〜３分間転回させた。次いで１７０μｌのバッファーＰ１
（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ／１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を添加し、
細菌ペレットを完全なボルテックス処理によって１０〜２０分間再懸濁した。１
７０μｌのバッファーＰ２（２００ｍＭのＮａＯＨ、１％のＳＤＳ）の添加後に
、ブロックをフィルムで密封し、転回によって混合し、かつ室温で５分間インキ
ュベートした。リシスを、４℃に冷却したバッファーＰ３（３Ｍの酢酸カリウム
ｐＨ５．５）１７０μｌを添加することによって完了させた。次いで１０μｌの
ＲＮａｓｅＡ溶液（１．７ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で５分間、次いで−２０
℃でインキュベートし、再び６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を新
たなブロック中にデカンテーションし、かつ１００μｌのバッファーＰ４（イソ
プロパノール中の２．５％のＳＤＳ）を添加した。ブロックを５分間ボルテック
ス処理し、次いで４℃で１５分間、次いで−２０℃で１５分間インキュベートし
た。これらのブロックを６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、かつ上清を、市
販のカラム（Qiagen）の使用によって相応に切断された９６ウェル−プレート中
で作成されている９６個のカラムの配列中に移送した。これらのプレートを真空
チャンバ（Qiagen）中に置いた。次いで１５０μｌの酸化ケイ素懸濁液を添加し
、室温で２０分間インキュベートした（前記の酸化ケイ素懸濁液は５０ｍｇ／ｍ
ｌのＳｉＯ２（Sigma）の２５０ｍｌの懸濁液に１５０μｌのＨＣｌ（３７％）
を添加することによって製造し、引き続きオートクレーブにかけた）。
【００４９】 真空を施した後に、カラムを６００μｌのアセトン（−２０℃）で２回洗浄し
た。９６ウェル−カラムプレートを９６ウェル−マイクロタイタープレートの上
にゆだね、かつ６０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。カラムプレートをまず３
７℃で５分間、次いで真空チャンバ中で５分間乾燥させた。次いでこれらを他の
マイクロタイタープレート上に配置した。７０μｌのＨ２Ｏ（６０℃）を添加し
、次いで６０００ｒｐｍでの３分間の遠心分離を実施した。マイクロタイタープ
レートを−２０℃で貯蔵した。
た。９６ウェル−カラムプレートを９６ウェル−マイクロタイタープレートの上
にゆだね、かつ６０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。カラムプレートをまず３
７℃で５分間、次いで真空チャンバ中で５分間乾燥させた。次いでこれらを他の
マイクロタイタープレート上に配置した。７０μｌのＨ２Ｏ（６０℃）を添加し
、次いで６０００ｒｐｍでの３分間の遠心分離を実施した。マイクロタイタープ
レートを−２０℃で貯蔵した。
【００５０】 １．５ カラムを使用しないプラスミドの単離 この方法はバッファーＰ４を添加するところまでは項目１．４に記載のように
実施した。次いで上清を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後に９６ウェル
−ポリオキシメチレン−マイクロタイターブロック中に添加した。１５０μｌの
酸化ケイ素懸濁液を添加し、室温で２０分間インキュベートした。これらのプレ
ートを６０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を慎重にデカンテーションし
、４００μｌのアセトン（−２０℃）を添加した。これらのプレートを再びボル
テックス処理（３０秒）し、６０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。このアセト
ン洗浄プロセスを一回繰り返した。これらのプレートをまず室温で５分間、次い
で真空チャンバ中で５分間乾燥させた。ペレットを７５μｌの水（６０℃）中で
再懸濁し、かつ６０００ｒｐｍ及び４℃で１０分間遠心分離した。上清を９６ウ
ェル−マイクロタイタープレート中で−２０℃において貯蔵した。
実施した。次いで上清を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後に９６ウェル
−ポリオキシメチレン−マイクロタイターブロック中に添加した。１５０μｌの
酸化ケイ素懸濁液を添加し、室温で２０分間インキュベートした。これらのプレ
ートを６０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を慎重にデカンテーションし
、４００μｌのアセトン（−２０℃）を添加した。これらのプレートを再びボル
テックス処理（３０秒）し、６０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。このアセト
ン洗浄プロセスを一回繰り返した。これらのプレートをまず室温で５分間、次い
で真空チャンバ中で５分間乾燥させた。ペレットを７５μｌの水（６０℃）中で
再懸濁し、かつ６０００ｒｐｍ及び４℃で１０分間遠心分離した。上清を９６ウ
ェル−マイクロタイタープレート中で−２０℃において貯蔵した。
【００５１】 ２．結果 ９６ウェル−フォーマットにおける選択不可能な遺伝子に関するスクリーニン
グ法の図解による実施は図１に示されている。この場合、培地を含有する９６ウ
ェル−ブロックにノーマリゼーションされた増幅されない、統計的に単一の細菌
クローンを有するｃＤＮＡ発現ライブラリーのアリコートを接種した。この細菌
培養からプラスミドＤＮＡをミニカラム（項目１．４を参照のこと）の使用下に
単離した。カラムを使用しない相応のプロトコールは項目１．５に記載している
。前記のフォーマット中でのスクリーニングは、４人の作業員が通常約２５００
００個のクローンを有する完全にノーマリゼーションされたｃＤＮＡライブラリ
ーを約１４週間でサンプリングすることを可能にする。
グ法の図解による実施は図１に示されている。この場合、培地を含有する９６ウ
ェル−ブロックにノーマリゼーションされた増幅されない、統計的に単一の細菌
クローンを有するｃＤＮＡ発現ライブラリーのアリコートを接種した。この細菌
培養からプラスミドＤＮＡをミニカラム（項目１．４を参照のこと）の使用下に
単離した。カラムを使用しない相応のプロトコールは項目１．５に記載している
。前記のフォーマット中でのスクリーニングは、４人の作業員が通常約２５００
００個のクローンを有する完全にノーマリゼーションされたｃＤＮＡライブラリ
ーを約１４週間でサンプリングすることを可能にする。
【００５２】 このスクリーニング法のためには、非常に高純度のプラスミド−ＤＮＡを得る
ことが重要である。このために酸化ケイ素をプラスミド−ＤＮＡの結合相として
使用した。カオトロピック物質の存在下でのＤＮＡの酸化ケイ素への結合は知ら
れている（Vogelstein und Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(1979),
615-619）。しかしながら、意想外にも供給されるカオトロピック物質、例えば
塩酸グアニジンの不在下でさえ、プラスミド−ＤＮＡは十分な能力で酸化ケイ素
に結合することが確認された（図２）。アセトン中での、場合によりＳＤＳを添
加する引き続きの洗浄の後に、プラスミドＤＮＡは（塩化セシウムグラジエント
による精製に相応して）卓越した品質で得られる。通常は、約１０μｇのプラス
ミドＤＮＡは１．８より大きいＯＤ２６０／２８０を有する９００μｌのＬＢ−
培地から得られ、その内、９０％がスーパーコイル形で存在していた。
ことが重要である。このために酸化ケイ素をプラスミド−ＤＮＡの結合相として
使用した。カオトロピック物質の存在下でのＤＮＡの酸化ケイ素への結合は知ら
れている（Vogelstein und Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(1979),
615-619）。しかしながら、意想外にも供給されるカオトロピック物質、例えば
塩酸グアニジンの不在下でさえ、プラスミド−ＤＮＡは十分な能力で酸化ケイ素
に結合することが確認された（図２）。アセトン中での、場合によりＳＤＳを添
加する引き続きの洗浄の後に、プラスミドＤＮＡは（塩化セシウムグラジエント
による精製に相応して）卓越した品質で得られる。通常は、約１０μｇのプラス
ミドＤＮＡは１．８より大きいＯＤ２６０／２８０を有する９００μｌのＬＢ−
培地から得られ、その内、９０％がスーパーコイル形で存在していた。
【００５３】 アポトーシスを誘導する遺伝子に関するスクリーニングは上清中の分泌される
アルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の活性を測定することによって実施した
。ＳＥＡＰをコードするＤＮＡ配列をレポータープラスミド（Flanagan und Led
er, Cell 63 (1990), 185-195）に構成的なモロニーウイルスＬＴＲ−プロモー
ターのコントロール下にｃＤＮＡ発現ベクターと一緒にＢＨＫ細胞（又はＨｅＬ
ａ細胞のような他の細胞）にコトランスフェクションさせることによって導入し
た。
アルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の活性を測定することによって実施した
。ＳＥＡＰをコードするＤＮＡ配列をレポータープラスミド（Flanagan und Led
er, Cell 63 (1990), 185-195）に構成的なモロニーウイルスＬＴＲ−プロモー
ターのコントロール下にｃＤＮＡ発現ベクターと一緒にＢＨＫ細胞（又はＨｅＬ
ａ細胞のような他の細胞）にコトランスフェクションさせることによって導入し
た。
【００５４】 トランスフェクションの１６時間後に、まずＳＥＡＰ活性の測定を実施した。
最初の活性を後続の活性測定の正規化のために使用し、ゼロ点として設定した（
図３Ａ）。この正規化は種々のトランスフェクション効率の補正のために実施し
た。
最初の活性を後続の活性測定の正規化のために使用し、ゼロ点として設定した（
図３Ａ）。この正規化は種々のトランスフェクション効率の補正のために実施し
た。
【００５５】 コントロールベクターでのコトランスフェクションにおいて、ＳＥＡＰ活性の
激しい増大を見ることができる。しかしながらアポトーシス誘導遺伝子を有する
ベクターでのコトランスフェクションにおいては、ＳＥＡＰ活性の非常に僅かな
増大のみが認められた（図３Ａ）。
激しい増大を見ることができる。しかしながらアポトーシス誘導遺伝子を有する
ベクターでのコトランスフェクションにおいては、ＳＥＡＰ活性の非常に僅かな
増大のみが認められた（図３Ａ）。
【００５６】 アポトーシス誘導によるＳＥＡＰ活性の低下は培養上清（トランスフェクショ
ンの１６時間及び３６時間後）の２度の測定によって再現的に測定できた。図３
Ｂは、ＳＥＡＰ活性がアポトーシス誘導遺伝子のコトランスフェクションの場合
にコントロールと比較して１０分の１に減少することを示している。記載の方法
を使用して、既に種々のアポトーシス誘導遺伝子を同定できた。
ンの１６時間及び３６時間後）の２度の測定によって再現的に測定できた。図３
Ｂは、ＳＥＡＰ活性がアポトーシス誘導遺伝子のコトランスフェクションの場合
にコントロールと比較して１０分の１に減少することを示している。記載の方法
を使用して、既に種々のアポトーシス誘導遺伝子を同定できた。
【００５７】 例２ マーカープラスミド上のＧＦＰ遺伝子のコトランスフェクションによるアポト
ーシス誘導遺伝子の単離 アポトーシス誘導遺伝子によるスクリーニングは、トランスフェクションされ
た細胞の標識のためのＧＦＰ遺伝子のコトランスフェクションならびに引き続い
てのアポトーシスを特徴付ける表現型の変化の検出によるアポトーシスの測定に
よって実施した。このように、アポトーシス細胞は細胞質の退縮ひいては細胞容
量の低下を示す。
ーシス誘導遺伝子の単離 アポトーシス誘導遺伝子によるスクリーニングは、トランスフェクションされ
た細胞の標識のためのＧＦＰ遺伝子のコトランスフェクションならびに引き続い
てのアポトーシスを特徴付ける表現型の変化の検出によるアポトーシスの測定に
よって実施した。このように、アポトーシス細胞は細胞質の退縮ひいては細胞容
量の低下を示す。
【００５８】 このために遺伝子ライブラリーからの３μｇの発現ベクターをそれぞれ１μｇ
のＧＦＰベクター（pLantern, Gibco BRL）とコトランスフェクションした。ト
ランスフェクションされた細胞（および従ってＧＦＰ陽性なので蛍光を発する細
胞）を種々の時点（トランスフェクションの１２〜４８時間後）に対して蛍光顕
微鏡（Axiovert 25 CFL, Zeiss）中でアポトーシスによって引き起こされる表現
型の変化に応じて調査した。この場合、細胞容量の減少を示す細胞を調査した。
ＧＦＰタンパク質が細胞全体に分配されているので、かかる細胞は容易に同定で
きた。適当なコンピュータプログラム及び蛍光カメラの使用下に、該検出を容易
に自動化できた。
のＧＦＰベクター（pLantern, Gibco BRL）とコトランスフェクションした。ト
ランスフェクションされた細胞（および従ってＧＦＰ陽性なので蛍光を発する細
胞）を種々の時点（トランスフェクションの１２〜４８時間後）に対して蛍光顕
微鏡（Axiovert 25 CFL, Zeiss）中でアポトーシスによって引き起こされる表現
型の変化に応じて調査した。この場合、細胞容量の減少を示す細胞を調査した。
ＧＦＰタンパク質が細胞全体に分配されているので、かかる細胞は容易に同定で
きた。適当なコンピュータプログラム及び蛍光カメラの使用下に、該検出を容易
に自動化できた。
【００５９】 この形式のスクリーニングによって、アデノシン−ヌクレオチド−トランスロ
カーゼ−１（ＡＮＴ−１）のための遺伝子が単離された。図６は、細胞中にＡＮ
Ｔ−１をトランスフェクションさせることによって引き起こされる形態学的変化
を示している。該遺伝子は、アポトーシスに特異的な別の生物化学的なプロセス
、例えばＤＮＡの分解、ミトコンドリアからのシトクロムｃの遊離及びカスパー
ゼファミリーのシステインプロテアーゼの活性化をも誘導する。ＡＮＴ−１は、
公知のようにアポトーシス誘導に関与するミトコンドリア中の“透過性亢進”複
合体の成分である。該遺伝子の単離は従って、該スクリーニングがアポトーシス
誘導に関与する遺伝子の単離を可能にすることの証明である。
カーゼ−１（ＡＮＴ−１）のための遺伝子が単離された。図６は、細胞中にＡＮ
Ｔ−１をトランスフェクションさせることによって引き起こされる形態学的変化
を示している。該遺伝子は、アポトーシスに特異的な別の生物化学的なプロセス
、例えばＤＮＡの分解、ミトコンドリアからのシトクロムｃの遊離及びカスパー
ゼファミリーのシステインプロテアーゼの活性化をも誘導する。ＡＮＴ−１は、
公知のようにアポトーシス誘導に関与するミトコンドリア中の“透過性亢進”複
合体の成分である。該遺伝子の単離は従って、該スクリーニングがアポトーシス
誘導に関与する遺伝子の単離を可能にすることの証明である。
【図１】 図１はドミナントな選択不可能な核酸活性に関する９６ウェル−フォーマット
中でのスクリーニング法を図示している図を示す。
中でのスクリーニング法を図示している図を示す。
【図２】 図２は細菌細胞のアルカリリシス後のＤＮＡが塩酸グアニジニウムの濃度に依
存して酸化ケイ素上に結合する能力を示している。
存して酸化ケイ素上に結合する能力を示している。
【図３Ａ】 図３ＡはＳＥＡＰ発現ベクター及びコントロールベクター（○）、細胞周期停
止遺伝子ｐ２１をコードする発現ベクター（□）及びアポトーシス誘導遺伝子（
◇）を使用するコトランスフェクション試験におけるＳＥＡＰ活性の時間経過を
示している。
止遺伝子ｐ２１をコードする発現ベクター（□）及びアポトーシス誘導遺伝子（
◇）を使用するコトランスフェクション試験におけるＳＥＡＰ活性の時間経過を
示している。
【図３Ｂ】 図３Ｂはアポトーシス誘導によるＳＥＡＰ活性（ΔＡ４０５ｎｍ）の低下を示
している。
している。
【図４】 図４はＤＮＡ単離ロボットを図示している図を示している。
【図４／Ｉ】 図４／ＩはＤＮＡ単離ロボットを図示している図を示している。
【図５】 図５はトランスフェクションロボットを図示している図を示している。
【図５／ＩＩ】 図５／ＩＩはトランスフェクションロボットを図示している図を示している。
【図６】 図６はＧＦＰのコトランスフェクションによるＡＮＴ−１でのアポトーシス誘
導における表現型の変化の図を示している。
導における表現型の変化の図を示している。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月１２日（２００１．１．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｂ 1/34 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/42 1/42 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｋ Ｇ０１Ｎ 30/48 30/88 Ｅ 30/88 33/483 Ｃ 33/483 33/68 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA35 BB20 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 FA11 FA19 FA37 FB01 FB06 4B024 AA11 BA80 CA04 CA11 DA02 EA04 FA02 GA11 HA11 4B029 AA01 AA07 BB11 CC02 DG10 FA10 FA12 4B063 QQ01 QQ33 QR33 QR58 QR77 QR80 QS05 QS36 QX02 4C084 AA13 ZB21 ZB26 ZB33
Claims (35)
- 【請求項１】 ターゲット細胞中で選択不可能な活性を示す核酸配列を同定
するために、 （ａ）それぞれ１つの調査されるべき核酸配列を発現ベクター上にターゲット細
胞において活性の発現制御配列と機能的に結合して有する多数の宿主細胞を含む
ＤＮＡライブラリーを作成する工程、 （ｂ）宿主細胞を培養する工程、 （ｃ）培養された宿主細胞から発現ベクターを得る工程、 （ｄ１）ターゲット細胞を （ｉ）工程（ｃ）において得られた発現ベクター及び （ｉｉ）レポーターベクター でコトランスフェクションさせる工程または （ｄ２）既にレポーターベクターを有するターゲット細胞を工程（ｃ）で得られ
た発現ベクターでトランスフェクションさせる工程並びに （ｅ）レポーターベクターの活性をターゲット細胞またはその培養上清において
、調査される核酸配列の選択不可能な活性に関する定量的量または定性的量とし
て測定する工程 を含む方法。 - 【請求項２】 核酸配列を、任意の由来のゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ｃＤ
ＮＡ断片及びアンチセンス分子から選択する、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 選択不可能な活性を、アポトーシス誘導、細胞周期停止、細
胞分化、細胞代謝の阻害及び遺伝子発現の阻害もしくは活性化から選択する、請
求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 選択不可能な活性としてアポトーシス誘導を選択する、請求
項３記載の方法。 - 【請求項５】 ノーマリゼーションされたＤＮＡライブラリーを作成する、
請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】 細菌宿主細胞、特にＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を使用する、請求
項１から５までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 発現ベクターとしてプラスミドを使用する、請求項１から６
までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 工程（ｂ）が少数の宿主細胞の培養を含む、請求項１から７
までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】 工程（ｃ）が宿主細胞のアルカリリシスを含む、請求項６か
ら８までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】 アルカリリシス後のＤＮＡをカオトロピック物質を添加せ
ずに吸着相、特にシリカ吸着相上に結合させる、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 ターゲット細胞として、遺伝子操作されていてよい真核細
胞、特にホニュウ類細胞を使用する、請求項１から１０までのいずれか１項記載
の方法。 - 【請求項１２】 工程（ｄ）におけるトランスフェクションまたはコトラン
スフェクションをリン酸カルシウム共沈殿、リポフェクション、エレクトロポレ
ーション、粒子打ち込みまたはウイルス感染によって実施する、請求項１１記載
の方法。 - 【請求項１３】 工程（ｄ）が発現ベクター及びレポーターベクターの一過
性トランスフェクションを含む、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項１４】 レポーターベクターが検出可能な遺伝子産物をコードする
核酸配列を発現可能な形で有する、請求項１から１３までのいずれか１項記載の
方法。 - 【請求項１５】 検出可能な遺伝子産物を分泌される酵素から選択する、請
求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 分泌されるアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を使用
する、請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 レポーターベクターの活性測定が培養上清において分泌さ
れる酵素の活性測定を含む、請求項１５または１６記載の方法。 - 【請求項１８】 クロモゲンまたは蛍光を発する酵素基質を使用する、請求
項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 検出可能な遺伝子産物を細胞内で検出可能なポリペプチド
から選択する、請求項１４記載の方法。 - 【請求項２０】 検出可能な遺伝子産物を蛍光タンパク質から選択する、請
求項１４または１９記載の方法。 - 【請求項２１】 検出可能な遺伝子産物を膜常設の検出可能なポリペプチド
から選択する、請求項１４記載の方法。 - 【請求項２２】 ターゲット細胞の付加的なパラメータを分析する、請求項
１から２１までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２３】 レポーターベクターの活性測定及び、場合により付加的な
パラメータの測定を蛍光サイトメトリーによって実施する、請求項１から２８ま
でのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２４】 レポーターベクターの活性をトランスフェクションまたは
コトランスフェクションの後の少なくとも２つの時点で測定し、その際、第１の
時点を、発現ベクター上に含む核酸配列の発現がレポーターベクターの活性に影
響を及ぼさないように選択し、かつ第２の時点を、発現ベクター上に含む核酸配
列の発現が既にレポーターベクターの活性に測定可能な影響を及ぼしうるように
選択する、請求項１から２３までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２５】 実施を少なくとも部分的に自動化する、請求項１から２４
までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２６】 工程（ｂ）〜（ｅ）を少なくとも５０種の試料に関してそ
れぞれ並行に実施する、請求項１から２５までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２７】 更に、同定された遺伝子を診断薬及び治療薬の調製のため
に使用することを含む、請求項１から２６までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２８】 アポトーシスプロセスのためのレポーターシステムとして
の、分泌される酵素の使用。 - 【請求項２９】 アポトーシスに関連する遺伝子を同定するためのレポータ
ーシステムとしての、請求項２８記載の使用。 - 【請求項３０】 アポトーシス誘導遺伝子またはアポトーシス抑制遺伝子の
同定のためのレポーターシステムとしての、請求項２９記載の使用。 - 【請求項３１】 アポトーシスに作用する薬剤を同定するためのレポーター
システムとしての、請求項２８記載の使用。 - 【請求項３２】 分泌されるアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をレポ
ーターシステムとして使用する、請求項２８から３１までのいずれか１項記載の
使用。 - 【請求項３３】 請求項１から２７までのいずれか１項記載の方法における
、レポーターシステムとしての分泌される酵素の使用。 - 【請求項３４】 請求項１から２７までのいずれか１項記載の方法を自動的
に実施するための、 （ａ）多数の宿主細胞の培養のための手段、 （ｂ）多数の宿主細胞からプラスミドＤＮＡを得る手段、 （ｃ）多数のターゲット細胞のトランスフェクション及び培養のための手段及び
（ｄ）ターゲット細胞におけるレポーターベクターの活性を測定するための手段
を有する装置。 - 【請求項３５】 宿主細胞からプラスミドＤＮＡを得るためのロボット及び
ターゲット細胞のトランスフェクションのためのロボットを有する、請求項３４
記載の装置。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19903541 | 1999-01-29 | ||
| DE19903541.5 | 1999-10-19 | ||
| DE19950385.0 | 1999-10-19 | ||
| DE19950385A DE19950385A1 (de) | 1999-01-29 | 1999-10-19 | Verfahren zur Isolation von Apoptose-induzierenden DNA-Sequenzen und Detektionssystem |
| PCT/EP2000/000683 WO2000044894A1 (de) | 1999-01-29 | 2000-01-28 | Verfahren zur isolation von apoptose-induzierenden dna-sequenzen und detektionssystem |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002535003A true JP2002535003A (ja) | 2002-10-22 |
Family
ID=26051562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000596136A Pending JP2002535003A (ja) | 1999-01-29 | 2000-01-28 | アポトーシスを誘導するｄｎａ配列の単離方法及び検出システム |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1144618A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002535003A (ja) |
| AU (1) | AU2799500A (ja) |
| WO (1) | WO2000044894A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017127227A (ja) * | 2016-01-19 | 2017-07-27 | 東芝メディカルシステムズ株式会社 | 被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクター、アッセイキット、方法および装置 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2067711C (en) * | 1991-05-03 | 2000-08-08 | Daniel Lee Woodard | Solid phase extraction purification of dna |
| DE69324716T2 (de) * | 1992-02-13 | 1999-09-09 | Becton Dickinson Co | Celithydrat und Reinigung von DNS |
| US5503816A (en) * | 1993-09-27 | 1996-04-02 | Becton Dickinson And Company | Silicate compounds for DNA purification |
| DE4342769A1 (de) * | 1993-12-15 | 1995-06-22 | Europ Lab Molekularbiolog | Isolierung und Klonierung von für ein RNA-bindendes Protein kodierender cDNA sowie Untersuchung RNA-bindender Proteine |
| WO1997010349A1 (en) * | 1995-09-11 | 1997-03-20 | Arch Development Corporation | Materials and methods for treating neurodegenerative diseases and for screening for candidate apoptosis inhibitors and inducers |
| AU5927598A (en) * | 1997-01-23 | 1998-08-18 | Immusol Incorporated | Gene functional analysis and discovery using randomized or target-specific ribozyme gene vector libraries |
| US6413776B1 (en) * | 1998-06-12 | 2002-07-02 | Galapagos Geonomics N.V. | High throughput screening of gene function using adenoviral libraries for functional genomics applications |
-
2000
- 2000-01-28 AU AU27995/00A patent/AU2799500A/en not_active Abandoned
- 2000-01-28 EP EP00906243A patent/EP1144618A1/de not_active Withdrawn
- 2000-01-28 WO PCT/EP2000/000683 patent/WO2000044894A1/de not_active Application Discontinuation
- 2000-01-28 JP JP2000596136A patent/JP2002535003A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017127227A (ja) * | 2016-01-19 | 2017-07-27 | 東芝メディカルシステムズ株式会社 | 被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクター、アッセイキット、方法および装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2799500A (en) | 2000-08-18 |
| WO2000044894A1 (de) | 2000-08-03 |
| EP1144618A1 (de) | 2001-10-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7736870B2 (en) | Nucleic acid sequences having gene transcription regulatory qualities | |
| US20030068649A1 (en) | Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries | |
| AU2002314629A1 (en) | Method of selecting DNA sequence with transcription modulating activity using a vector comprising an element with a gene transcription repressing activity | |
| WO2002097090A1 (en) | Genes with es cell-specific expression | |
| JP2003507063A (ja) | 融合ライブラリを構築及び使用するための方法及び組成物 | |
| JP2003505041A (ja) | 固体支持体担体を用いる試験管内選択及びポリペプチドの任意の同定 | |
| US20030049647A1 (en) | Use of nucleic acid libraries to create toxicological profiles | |
| WO1999055886A1 (en) | Function-based gene discovery | |
| CA2272823A1 (en) | Method for identifying genes encoding novel secreted or membrane-associated proteins | |
| US6274321B1 (en) | High throughput functional screening of cDNAs | |
| Zhang et al. | [5] Yeast three-hybrid system to detect and analyze interactions between RNA and protein | |
| Tiwari et al. | Transfection assays with protoplasts containing integrated reporter genes | |
| JP7233545B2 (ja) | 標的タンパク質への検出可能なタグのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ制御組み込みに基づく細胞の選択方法 | |
| JP2002535003A (ja) | アポトーシスを誘導するｄｎａ配列の単離方法及び検出システム | |
| KR100648842B1 (ko) | 약리학적 활성 물질을 동정하는 방법 및 이러한 방법에서 사용하기 위한 dna 주형 | |
| Novy et al. | Coexpression of multiple target proteins in E. coli | |
| Ganesan et al. | Selective profiling of ribosomes associated with yeast Upf proteins | |
| DE19950385A1 (de) | Verfahren zur Isolation von Apoptose-induzierenden DNA-Sequenzen und Detektionssystem | |
| US20080248958A1 (en) | System for pulling out regulatory elements in vitro | |
| McDonald et al. | Generation of Protein Inhibitors for Validation of Cancer Drug Targets Identified in Functional Genomic Screens | |
| Horswill et al. | Identifying small‐molecule modulators of protein‐protein interactions | |
| 森脇宏介 | Two independent cis-acting elements are required for the guard cell-specific expression of SCAP1, which is essential for functionalization of stomata | |
| EP1070145A1 (en) | Methods for identifying genetic determinants associated with modulation of test compound activity | |
| CN114606208A (zh) | 一种具有高可信度快速的临近蛋白标记系统ScPhastID及标记方法 | |
| Biffo et al. | The identification of signaling molecules by the yeast two-hybrid system |