KR100648842B1 - 약리학적 활성 물질을 동정하는 방법 및 이러한 방법에서 사용하기 위한 dna 주형 - Google Patents

약리학적 활성 물질을 동정하는 방법 및 이러한 방법에서 사용하기 위한 dna 주형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자동화시킬 수 있으며 유전자 활성에 대한 선택적인 효과를 갖는 특이적인 화학 선도 구조물을 찾기 위한 목적의 효율적이고 경제적인 벌크 선별법에 적합한, 바이러스 및 세포 유전자의 전사를 분석하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
1개 이상의 유전자-조절 성분의 조절하에서 전사시킬 DNA 서열을 포함하는 DNA 주형의 세포 비함유 시험관내 전사 방법은
a) 전사용으로, 농축되고, 경우에 따라, 정제되었으며, 경우에 따라, 전사 인자 및/또는 보조인자로 보충되거나, 부분적으로 또는 완전히 대체될 수 있는, 세포핵으로부터의 추출물, 및 1개 이상의 표지된 뉴클레오티드를 사용하고,
b) 경우에 따라, 전사 반응후, 반응 혼합물중의 단백질을 단리시키고/시키거나 분해시키고,
c) 표지된 전사물을 고체 매트릭스에 결합시키고,
d) 과량의 표지된 뉴클레오티드를 제거하고,
e) 표지된 전사물의 양을 측정하는 단계를 포함한다.

Description

약리학적 활성 물질을 동정하는 방법 및 이러한 방법에서 사용하기 위한 DNA 주형
본 발명은 자동화할 수 있으며 유전자 활성에 대해 선택적인 효과를 갖는 특이적인 화학 선도 구조물을 발견하기 위한 효율적이고 경제적인 벌크 선별에 적합한 바이러스 및 세포 유전자의 전사에 대한 시험관내 분석 방법에 관한 것이다.
활성 물질의 이론적인 디자인만으로는 활성 물질을 성공적으로 발견할 수 없는 것으로 밝혀진 이후 생활성 구성성분에 대한 천연 산물을 선별하는 것이 추구되었다. 따라서, 화학 물질의 라이브러리와 조합 라이브러리 뿐만 아니라, 활성 물질에 대한 공급원으로서 천연 산물의 전통적인 추출물에 대한 연구가 활발히 진행되었다. 이는 주로 이들 추출물이 함유하는 물질의 다양성에 기인한다. 모델 분석 방법으로 미생물 발효의 추출물이 대략 500종의 화합물을 함유하는 것으로 밝혀졌는데, 이들은 구조에 있어서 크게 상이하다. 따라서, 다양성에 있어서, 이들은 화학 물질 및 조합 물질 라이브러리 보다 훨씬 월등하다.
다양하고, 아직까지 충분히 연구되지 않은 천연 산물의 잠능에 대한 약리학적 개발을 제한하는 인자는 후보 활성 물질을 시험할 수 있는 수많은 상용가능한, 의미있는 방법의 수이다. 특히, 사용시 부작용이 최소인, 고도로 특이적인 약리학적 활성 물질을 확인하는데 이용할 수 있는 방법이 요구된다.
이후 기술되는 방법은 유전 정보를 전환시키는 매우 초기 단계에 관계하는 이들의 잠능, 즉 유전자 전사 조절 능력에 대해 물질을 시험하는 방법을 기본으로 한다. 상기와 같은 방법은 전사에 직접 또는 간접적인, 포지티브 또는 네가티브 영향을 주는 물질을 확인하기 위함이다.
유전자의 전사 강도는 유전자의 유전자-조절 성분, 특히 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer) 또는 사일렌서(silencer)에 의해 결정된다. 유전자-조절 성분의 작용은 전사 인자 및 보조인자에 의해 매개되고 전환된다. 이들 전사 인자는 유전자의 전사 비율에 네가티브 또는 포지티브 영향을 줄 수 있으며 따라서 전사 강도와 관련이 있다. 한편, 수많은 전사 인자가 시그날 변환, 세포-주기 조절, 분화 및 조절된 세포 사멸(아포프토시스: apoptosis)을 포함한 다양한 세포 프로세싱 동안에 중요한 "분자 스위치"인 것으로 확인되었다.
유전자의 전사 강도에 영향을 주는, 세포에 의해 수용되는 대부분의 시그날은 횡단막 단백질에 의해 "등록"되어, 시그날 변환 쇄에 의해 세포내로 전달된 다음 전사 인자에 의해 전환된다. 외부 시그날을 수용하는 단백질의 예로는 cAMP-결합 단백질, 성장 시그날(예, 혈청 반응 인자, SRF)에 대한 센서, 호르몬 수용체 또는 사이토킨 발현에 역할을 하는 전사 인자인, 소위 STAT 단백질(시그날 변환 및 전사 활성화제)이 있다.
한편, 유전자의 전사 강도에 직접 또는 간접적인 영향을 주는 다수의 물질이 공지되어 있다. 상기와 같은 물질은 특히, 이들 물질의 작용이 종종 특이적이지 못함에도 불구하고 약제에 있어서 약리학적 활성 물질로 이용되고 있다. 따라서 상기와 같은 약제를 취할 경우 종종 바람직하지 못한 부작용이 수반된다.
예를 들면, 면역학적 질환은 활성 물질로서 사이클로스포린과 스테로이드 유도체를 포함하는 약제로 치료한다. 사이클로스포린 A는 사이클로필린과 복합체를 형성한다. 사이클로필린은 여러가지 대사 경로를 통하여 단백질을 탈포스포릴화하는, 어디에나 편재하는 포스파타제인 칼시네우린을 억제한다. 칼시네우린은 예를 들어, 전사 인자 NFAT의 서브유니트가 세포질로부터 핵내로 운반되는 것을 조절한다(Liu, J.(1993); Immunology Today 14, 290-295). NFAT(활성화된 T-세포의 핵 인자)는 일부 면역학적 관련 유전자의 활성화에 관여한다. 사이클로스포린 A(CsA)는 NFAT(활성화된 T-세포의 핵 인자)에 영향을 줌으로써 이들 유전자의 발현을 간접적으로 조절한다. 그러나, 사이클로스포린 A는 NFAT 활성을 간접적으로만 조절하기 때문에, 즉, 어디에나 편재하는 칼시네우린을 통하여 간접적으로 조절하기 때문에, 사이클로스포린 A는 또한 다른 대사 경로를 통하여, 혈관수축제 및 신장- 및 신경독으로 작용한다. 약리학적 활성 물질이 NFAT를 특이적으로, 가능하게는 직접적으로 억제할 수 있는 것으로 공지된 경우, 이런 활성 물질을 함유하는 약제는 아마도 보다 소수의 부작용을 일으킬 것이다.
목적하는 효과외에, 또한 강력한 부작용을 수반하는 약리학적 활성 물질로는 글루코코르티코이드가 있다. 글루코코르티코이드는 수년동안 알레르기, 류마티즘, 염증 및 과반응성 면역계에 의해 유발되는 기타 질환의 표준 치료에 사용되고 있다. 이들은 특히 세포의 NFKB 억제제, 즉 IKB 단백질의 형성을 자극함으로써 세포-타입-특이적 전사 인자 NfkB(Scheinmann, R.I., Cogswell, P.C., Lofquist, A.K. & Baldwin Jr., A.S.(1995) Science 270, 283-286; Auphan, N., DiDonato, J.A., Rosette, C., Helmberg, A & Karin M.(1995) Science 270, 286-290)의 활성화의 억제를 유발한다. IKB는 다시 활성 NFKB 이합체가 핵내로 운반되는 것을 방지하여 중요한 면역학적 표적 유전자의 활성화를 방지한다. CSA에 대해 언급한 바와 유사하게, 유전자 발현에 대한 글루코코르티코이드의 효과는 글루코코르티코이드가 NFKB 뿐만 아니라 다른 단백질에 대해서도 작용하기 때문에 비교적 비특이적이다.
이들 예는 작용 프로필이 가능한한 특이적인 약리학적 활성 물질이 강력하게 요구되고 있음을 명확하게 한다. 상기와 같은 특성을 갖는 신규한 화학 선도 물질을 찾기 위해서는 특이적 활성에 대해 수많은 물질을 시험해야 한다.
동일한 유전자 구성에도 불구하고, 각각의 세포는 항상 세포 타입 및/또는 특정 질환 또는 결함 및 이들 세포가 발달하여 분화되는 각각의 정도에 따라서, 특정 단백질만을 발현시킨다. 세포의 이런 개별성의 기준은 유전자-조절 단백질의 특이적인 레퍼토리, 예를 들어 명확한 유전자의 조화롭고 조절된 전사를 조절하는 특정 전사 인자 및 보조인자(액세서리 단백질)를 제공하는 세포-타입-특이적 및 발달-특이적 구성인 것으로 인식되어 있다.
따라서, 특이적인 약리학적 활성 물질은 정의된 타입의 세포중에서 병리학적 관련 유전자의 전사의 선택적인 활성화 또는 억제를 제공하여야 한다. 그러한 활성 물질을 확인하기 위하여, 각각의 유전자의 전사에 대한 후보 활성 물질의 영향, 즉, 전사 조절에 관여하는 단백질 및 유전자-조절 성분에 대한 영향을 정의된 조건하에서 직접 측정할 수 있는 전사 방법이 요구된다. 다수의 후보 활성 물질을 시험해야 하기 때문에, 다른 전제조건은 수행이 간단하고 자동화할 수 있는 방법이어야 한다.
첫번째 세포 비함유 전사 방법이 웨일 등에 의해 기술되었다(Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J., Roeder, R.G.(1979) Cell 18, 469-484). 이 방법에서는, 세포 핵으로부터의 농축된 추출물(소위 S100 추출물)(Weil, P.A., Segall, J., Harris, B. Ng, S.Y., Roeder, R.G.(1979) J. Biol, Chem. 254, 6163-6173), 및 정제된 RNA 폴리머라제 II를 시험관내 전사용으로 사용하였다. 외인성 RNA 폴리머라제 II를 사용하지 않고는, 농축되었지만, 추가로 정제되지 않은 이들 핵 추출물을 전사시킬 수 없었다(Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J., Roeder, R.G.(1979) Cell 18, 469-484; Dignam, J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G.(1983) Methods in Enzymology 101, 582-598).
상기와 같은 핵 추출물로부터 출발하여, 수개의 정제 단계를 이용하여 전사 인자를 단리시키는 방법들이 연속적으로 개발되었다. 그중에서도 이들 방법은 예를 들어, 포스포셀룰로즈 칼럼과 같이, 핵 단백질을 결합시키는 물질상에서의 크로마토그래피에 의해 핵 추출물을 정제하는 정제 단계를 포함한다. 이들 수개의 단계를 포함하는 복잡한 방법의 범주내에서, 디그남 등이 먼저 상업적으로 입수가능한 P11R 시스템(Whatman, Maidstone, England)을 정제 단계중 하나에 사용하는 것을 기술하였다(Dignam. J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G.(1983) Methods in Enzymology 101, 582-598).
수개의 단계를 포함하는 이들 정제 공정을 보다 우수하게 적응시켜 복잡한 방법을 통하여, 현재 세포핵의 추출물로부터 각각의 전사 인자를 단리할 수 있다. 또한, 각각의 인자, 또는 이들의 서브유니트가 또한 예를 들어, TFIIA, TFIIB, TFIIEα, TFIIEβ 및 TFIIF와 같은 재조합 형태로 현재 입수가능하다(Zawel, L. 및 Reinberg, D.(1995) Annu. Rev. Biochem. 64, 533-561).
따라서, 현재 재조합 및 천연 정제된 인자의 혼합물로 구성된 전사 시스템이 이미 존재하고 있다. 그러나, 상기와 같은 전사 시스템은 기술적 관점에서 너무 복잡하고 샘플 처리량이 높은 선별 방법에 있어 너무 비싸다. 대조적으로, 다른 전사 시스템, 예를 들어 재조합 또는 정제된 인자 대신 세포핵으로부터의 추출물을 사용하는 시스템에서는, 수많은 2차 반응이 발견될 수 있다. 불충분하게 정제되거나 정제되지 않은 핵 추출물(조 추출물)에 있어서 시험관내 전사에 나쁜 영향을 주는 것은 주로 핵산 및 DNA-결합 단백질, 예를 들면 히스톤과 같은 리프레서이다. 조 추출물중에서 발견되는 핵산중에서는, 특히 나쁜 영향을 주는 t-RNA를 암호화하는 DNA 서열이다. t-RNA에 대한 유전자가 mRNA보다 대략 100배 정도 더 강하게 전사되기 때문에, 이들 t-RNA-암호화 서열은 비특이적인 전사물이 과도해지게 한다. 이후 비특이적 전사물은 특이적 전사물이 검출되기 전에 복잡한 정제 단계에 의해 제거해야만 한다.
시험관내 전사의 결과를 정량적으로 분석하도록 하기 위하여, 전사시킬 DNA 서열에서 구아닌 염기가 결핍되어 있는 벡터(소위 G-유리 서열 또는 G-유리 카세트)가 개발되었으며, 경우에 따라, G-유리 서열 다음에 수많은 구아닌을 함유하는 서열의 절편이 배열되도록 할 수 있다. 이들 벡터를 사용하여 GTP 부재시 전사가 수행되도록 할 수 있다. 따라서, G를 함유하는 다른 서열이 아닌, G-유리 서열만이 전사된다. 이는 또한 길이가 (실제적으로) 균일한 특이적 전사물을 제공한다. 사바도고(Sawadogo)와 뢰더(Roeder)가 최초로 400개-뉴클레오티드-길이 서열을 ML(아데노바이러스 주요 후기) 프로모터의 조절하에 있는 전사용 벡터의 사용을 기술하였다. 상기 벡터는 길이가 대략 400개 뉴클레오티드인 전사물을 제공한다(Sawadogo, M. 및 Roeder, R.G.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4394-4398).
이들 벡터를 사용함으로써 현저하게 더 적은 수의 비특이적 전사물이 수득되는데, 전사 반응에 있어서 이들 벡터를 사용하는 이유는 여러번 기술된 바 있다(Goppelt, A., Stelzer, G., Lottspeich, F., Meisterernst, M.(1996) EMBO J. 15, 3105-3115; Kretzschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meisterernst, M.(1994) Cell 78, 525-534; Meisterernst, M. Roy, A.L., Lieu, H.M. 및 Roeder, R.G.(1991) Cell 66, 981-993). 그러나, 지금까지, 사용된 벡터는 오로지 G-유리 서열의 길이가 400개의 뉴클레오티드를 초과하지 않는 것이다.
이미 기술된 전사 방법의 결과를 정량 및 정성적인 분석을 수행하기 위하여, 방사선표지된 뉴클레오티드의 존재하에서 전사를 수행하고 방사선표지된 전사물을 먼저 페놀화시켜 침전시킨 다음, 겔상에서 분리한다. 이는 잘못 개시되거나 잘못 종결된 전사물과 비특이적으로 표지된 핵산(예를 들면 플라스미드에 의해 유발된 전사물 또는 tRNA) 뿐만 아니라, 특이적 전사물로부터 제거해야할 과량의 뉴클레오티드를 발생시킨다. 과량의 방사선표지된 뉴클레오티드 대 방사선표지된 전사물의 활성비는 바람직하지 못한 조건하에서 대략 10,000:1이므로, 표지된 전사물을 대략 10,000배 농축시켜야 한다. 특이적 전사물의 이와 같은 농축은 침전 단계 및 전기영동에 의한 분리에 의해 수행한다. 그러나, 이들 농축 단계는 자동화된 벌크 선별에 있어 적합하지 않은데, 이는 전사 결과의 정량적 분석이 가능할 정도로 표지된 뉴클레오티드를 제거하기 위한 별개의 방법을 개발해야 하기 때문이다.
전사는 또한 반응 용액을 막, 예를 들면 DEAE-셀룰로즈 막에 적용시킴으로써 모니터할 수 있다. 방사선표지된 전사물을 직접 막상에서 검출할 수 있다. 그러나, 지금까지 막을 사용하는 것은 정제된 RNA 폴리머라제 II의 존재하에서(Roeder, R.G.(1974) J. Biol. Chem. 249, 241-248) 또는 정제된 기본 전사 인자(Ohkuma, Y., Sumimoto, H., Horikoshi, M., Roeder, R.G.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9163-9167)의 존재하에서 수행된 시험관내 전사로부터 전사물을 검출하기 위해서만 성공적으로 이용되었다. 농축되고, 경우에 따라 미리 정제한 세포핵으로부터의 추출물을 사용하여 수득한 전사물을 이런 방법으로 검출할 수 있다는 교시는 어떠한 것도 없었다.
활성 물질을 선별하기 위한 유전자 전사법의 개발은 이미 WO 96/26959에 기술되어 있다. 상기 공보에는 사람의 NFAT(hNFAT)의 서열 및 전사 검정에 있어서 이들의 잠재적 용도가 기술되어 있는데, 이는 또한 천연 산물의 벌크 선별, 가능하게는 자동화된 벌크 선별에 이용된다. 이후 기술되는 전사 방법과는 대조적으로, 상기 전사 검정법은 순수한 결합 검정법으로, 여기에서는 전사 반응이 수행되지 않는다.
US 5,563,036에는 다른 결합 검정법이 기술되어 있는데, 이 방법은 전사 인자가 핵산에 결합하는 것을 억제할 수 있는 물질을 선별하기 위해 사용할 수 있다. 이 방법 또한, 검정에서 전사를 수행하지 않는다.
US 5,563,039에는 다른 결합 검정법의 예가 기술되어 있는데, 이 또한 종양 괴사 인자 수용체(TRADD)와 결합된 단백질이 특정 DNA 서열에 결합하는 것을 억제할 수 있는 물질을 찾기 위하여 사용하기 위함이다.
본 발명의 목적은 수행이 간단하고, 재현가능하며 특히 벌크 선별에 범용될 수 있는, 정의된 반응 조건하에서, 유전자, 예를 들면 세포 및 바이러스 유전자의 전사를 분석하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은
a) 경우에 따라, 보충될 수 있거나, 전사 인자 및/또는 보조인자에 의해 부분적으로 또는 완전히 대체될 수 있는, 농축되고, 경우에 따라, 정제된 세포핵의 추출물과 1개 이상의 표지된 뉴클레오티드를 전사용으로 사용하고,
b) 전사후, 반응 혼합물이 함유하는 단백질을 경우에 따라, 단리시키고/시키거나 분해시키고,
c) 표지된 전사물을 고체 매트릭스상에 결합시키고,
d) 과량의 표지된 뉴클레오티드를 제거하고,
e) 표지된 전사물의 양을 측정하는, 1개 이상의 유전자-조절 성분의 조절하에 있는, 전사시킬 DNA 서열을 함유하는 DNA 주형의 세포-비함유 시험관내 전사 방법에 관한 것이다.
본 방법은 실제적인 전사 반응 (a), 특이적 전사물의 단리 (b, c, d) 및 특이적 전사물의 검출 (e)를 포함한다. 본 방법은 특이적 전사물의 단리를 위한 특별 양태를 포함하며, 상기 언급한 b, c 및 d의 순서는 단지 가능한 것 중 하나이다. 특이적인 전사물의 단리 순서는 또한 경우에 따라, c, d, b 또는 d, b, c일 수도 있다. 또한, 본 발명의 특정 양태는 별개의 단리 단계를 면제시킬 수 있다. 예를 들면, 본 전사 방법은 단지 단계 a, c, d 및 e 또는 단지 단계 a, c 및 e 또는 단지 a, b, c 및 e 또는 단지 a, b, d 및 e 또는 단지 a, b 및 e 또는 단지 a, d 및 e를 포함할 수 있다.
본 방법의 특징은 모든 공정 단계로, 실제적인 전사 반응(전사) 및 특이적 전사물의 단리 및 검출이 자동화되어 특정한 반응 조건하에서 수득한 특이적인 전사물의 양, 및 이로써 전사 속도가 간단하고 신뢰성있게 측정 가능하게 된다는 점이다.
전사 속도는 특정 유전자가 단위 시간당 어떤 빈도로 전사되는가, 또는 기술된 전사 공정에서, 전사될 DNA 서열이 단위 시간당 어떤 빈도로 전사되는가를 나타낸다. 전사 속도를 측정하기 위하여, 정의된 단위 시간후 수득한 방사선표지된 전사물의 양을 측정한다.
상기 공정의 양태는 활성화제 및/또는 억제제의 존재하에서, 즉 전사에 포지티브 또는 네가티브 영향을 갖는 화합물의 존재하에서 전사를 수행하는 것이다. 예를 들면, 전사될 수 있는 세포핵으로부터의 추출물을 기본적인 전사용으로 사용할 수 있다. 이런 기본적인 전사 시스템에 활성화제 및/또는 억제제를 보충할 수 있다. 기본적인 전사와 비교하여, 전사 억제는 전사 속도를 감소시켜 단위 시간당 특이적 전사물의 양을 저하시키는 한편 전사 활성화는 전사 속도를 증가시켜 단위 시간당 특이적 전사물의 양을 더 크게 한다.
유전자의 전사는 여러개의 단계, 즉 예비-개시 복합체(PIC)의 형성, PIC 활성화, 개시, 프로모터 제거, 신장 및 종결로 나눌 수 있다. 진핵세포의 경우, 전사 개시를 위해서 RNA 폴리머라제(단백질-암호화 유전자의 전사인 경우, RNA 폴리머라제 II)와 RNA 폴리머라제 II와 DNA가 특이적으로 상호반응할 수 있도록 하는 DNA-결합 단백질을 필요로 한다. 이들 DNA-결합 단백질을 전사 인자라 칭하며, 일반적인 전사 인자는 필수적으로 프로모터와의 상호반응에 관여하는 반면, 특이적인 전사 인자는 프로모터의 하류 또는 상류에 위치하는 유전자-조절 성분의 활성을 매개한다.
일반적인 전사 인자인 TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF 및 TFIIH는 진핵세포 유전자의 전사에 작용한다. 유전자의 낮은 기본적인 활동에 관련된, 전사될 수 있는 단백질 분획은 프로모터에 따라서 모든 또는 대부분의 이들 일반적인 전사 인자와 RNA 폴리머라제 II(RNA Pol II)를 함유한다. ML 프로모터의 기본적인 활성은 예를 들면, TBP(TFIID의 TATA-결합 서브유니트), TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH 및 RNA Pol II에 의해 성취된다. 상기와 같은 기본적인 활성을 유발하는 단백질 분획을 기본 전사 시스템으로 칭한다. 본 발명의 목적에 있어서, 이들 용어는 또한 농축되고, 경우에 따라, 정제된 세포핵으로부터의 추출물에 대해서도 사용된다. 기본 전사 시스템을 사용하여 수행되는 전사를 기본 전사라 한다. 시험관내에서 세포 비함유 전사를 수행하기 위해서는 적어도 1개의 기본 전사 시스템, 뉴클레오티드 및 전사시킬 DNA 주형을 필요로 한다.
활성화된 전사의 경우, 일반적인 전사 인자와 기본 전사 시스템이외에, 특이적인 전사 인자와 보조인자(액세서리 단백질)를 필요로 한다(Kaiser, K., Stelzer, G. 및 Meisterernst, M.(1995) EMBO J. 14, 3520-3527). 특이적인 전사 인자는, 단지 낮으며, 전사 개시 빈도를 조절하는 특이적인 유전자의 기본 전사의 강도를 배가시킬 수 있다. 따라서, DNA-결합 단백질은 유전자가 얼마나 자주 전사되는가(전사 속도)에 크게 관여한다. DNA에 직접 결합하지 않지만, 예를 들어, 보조인자와 같은 단백질-단백질 상호반응을 통하여 전사 인자 또는 RNA 폴리머라제 II의 활성에 영향을 주는 다른 단백질도 또한 상기 조절 공정에 작용한다.
본 방법의 양태는 세포핵으로부터의 농축 추출물(세포로부터의 핵 추출물, 핵내 추출물)을 기본적인 전사에 사용한다. 상기 파라미터와 관련하여, 본 공정은 다양하게 이용할 수 있으며; 이는 사용되는 세포와 또한 사용되는 진핵세포종에 적용된다.
예를 들면, 사람 또는 동물 세포로부터 유래된 세포주로부터의 농축된 핵 추출물을 수득할 수 있다. 예를 들어, 헬라 세포와 같이 대규모의 발효기에서 성장시켜 증식시킬 수 있는 것들이 특히 적합한 것이다. 또한, 선택된 세포 타입의 세포핵으로부터의 추출물, 특히 예를 들어, 전사 인자 및/또는 보조인자를 갖는 세포-타입-특이적, 세포-주기-특이적, 발달-특이적, 분화-특이적 또는 질병-특이적 구성에 의해 구별되는 것을 사용할 수 있다. 특히, 예를 들면, 면역 시스템의 세포(예를 들면 B 및 T 세포)와 같은, 질병의 기원에 핵심 역할을 하는 세포 타입을 사용할 수 있다.
본 방법의 특별한 잇점은 조직 또는 종양 세포로부터의 핵 추출물을 단리하여 사용할 수 있다는 것이다. 이는 적합한 세포주를 입수할 수 없는 경우에 특히 유리하다. 특히, 핵 추출물은 동물 또는 사람의 탯줄 도관, 동물 또는 사람의 이식 폐기 생성물, 동물 또는 사람의 생검 물질 또는 동물 또는 사람의 종양 조직(예를 들면 외과 수술중에 제거되는 조직) 또는 동물 또는 사람의 태반과 같이, 접근이 용이한 조직으로부터 단리시킬 수 있으며, 본 방법에 사용할 수 있다.
본 방법의 양태는 농축된 핵 추출물을 신선하거나 냉동된 세포의 세포핵으로부터 또는 신선하거나 냉동된 세포핵으로부터의 단백질을 농축시키기 위한 공지된 방법으로, 예를 들면 문헌에 기술된 방법으로 제조한다는 것이다(Dignam, J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G.(1983) Methods in Enzymology 101, 582-598; Dignam, J.D., Lebovitz, R.M., Roeder, R.G.(1983) Nuclei Acid Res. 11, 1475-1489). 본 방법의 특별한 양태는 농축된 핵 추출물을 제조하기 위해서, 세포핵을 균질화한 다음, 균질물을 투석시키는 방법을 사용하는 것이다.
본 방법의 중요 양태의 양상은 세포핵으로부터의 농축된 추출물을 1개 이상의 정제 단계, 특히 단순한 정제 단계로, 전사될 수 있을 정도로, 즉, 공정 수행시 특이적인 전사물이 수득될 수 있을 정도로 정제하는 것이다. 예를 들면, 추출물을 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 정제는 예를 들면, 포스포셀룰로즈, DEAE-셀룰로즈 또는 헤파린-세파로즈와 같은 핵-단백질-결합 물질상에서 수행할 수 있다. 별법으로, 양이온- 및/또는 음이온-교환기 칼럼 또는 특이적 친화성 칼럼, 예를 들면, 항체 또는 올리고뉴클레오티드가 칼럼 재질에 결합하는 것들을 정제에 사용할 수 있다.
본 방법의 특별한 양태의 양상은 농축된 핵 추출물을 포스포셀룰로즈 칼럼, 특히 P11R 칼럼(P11R 시스템, Whatman, Maidstone, England)상에서 정제하는 것이다. 본 방법의 다른 특별한 양태의 양상은 농축된 핵 추출물을 단일 단계만으로, 예를 들면, 단일 P11R 칼럼상에서, 또는 DEAE-셀룰로즈 또는 헤파린-세파로즈를 함유하는 칼럼 재질을 갖는 단일 칼럼상에서 정제하는 것이다.
P11R 정제의 특정 양태로, 핵 추출물을 먼저, 다른 구성성분외에, 0.05 내지 0.15M, 바람직하게는 0.1M KCl을 포함하는 완충액의 존재하에서 포스포셀룰로즈에 결합시킨다. 부하된 칼럼을 적합한 완충액, 바람직하게는 0.05 내지 0.15M, 바람직하게는 0.1M KCl을 포함하는 완충액으로 세척하여 비특이적이고 방해가 되는 성분이 칼럼으로부터 세척되도록 한다. 전사될 수 있는 성분을 2개의 분획으로 칼럼으로부터 용출시키는 것이 바람직한데, 첫번째것은 예를 들어, 0.4 내지 0.6M KCl, 바람직하게는 0.5M KCl을 사용하고, 두번째것은 예를 들어, 0.7 내지 1M KCl, 바람직하게는 0.85M KCl을 사용한다.
본 방법의 특정 양태는 농축되고, 경우에 따라 정제된 핵 추출물을 사용하여 외인성 RNA 폴리머라제 II의 존재하에서 전사를 수행하는 것이다. 사용되는 RNA 폴리머라제는 바람직하게는 진핵세포 타입 II RNA 폴리머라제(RNA 폴리머라제 II), 특히 동물 또는 사람의 RNA 폴리머라제 II일 수 있다.
본 방법의 다른 양태의 양상은 농축되고, 경우에 따라 정제된 핵 추출물을 단백질, 예를 들면 전사 인자 및/또는 보조인자(액세서리 단백질)로 보충하거나 완전히 또는 부분적으로 대체하는 것이다. 예를 들면, 이들 단백질은 세포핵으로부터 단리할 수 있거나, 재조합 방법으로 제조할 수 있다.
본 방법의 특정 양태는 핵 추출물을 전사 인자 및/또는 보조인자만으로 보충하는 것이다. 다른 한편으로, 본 방법의 양상은 전사될 수 있는 단백질 분획(기본적인 전사 시스템)이 단리되거나 재조합 방법에 의해 제조된 전사 인자 및/또는 보조인자, 및 RNA 폴리머라제만으로 구성되어 있는 것이다.
사용될 수 있는 전사 인자는 예를 들면, 경우에 따라 융합 단백질 형태인, 이들중 일부의 통상적이고/이거나 특이적인 전사 인자이다.
사용될 수 있는 일반적인 전사 인자는 예를 들어, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH, TFIIJ 및 TBP(TATA-결합 단백질)이다.
사용될 수 있는 특이적인 전사 인자는 예를 들어, NFKB, AP1, NFAT, GATA3, TCF/Lef, CBF, Tat, fos/jun 계열의 구성원, Oct 계열의 구성원(Oct-1, Oct-2) 및 이들과 상호반응하는 인자, 예를 들어, BobI, OCA-B 또는 OBF, Ets 계열의 구성원, ATF/CREB 단백질계열의 활성화제, 핵 수용체, 예를 들어 PPARα 또는 전사 인자의 상응하는 세포-타입-특이적인 이소 형태이다(Kel, O.V., Romaschenko, A.G., Kel, A.E., Wingender, E., Kolachenov, N.A.,(1995) Nucl. Acids, Res. 20, 3-16).
특이적인 전사 인자의 다른 예로는 하기와 같은 것이 있다:
1. 전발암유전자(proto-oncogene), 예를 들어 jun, fos, ets, myc, bcl-이소 형태 및 erb
2. 호르몬 수용체, 예를 들어(erb), 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체, 레티노산 수용체, 비타민 D 수용체
3. 종양 억제인자, 예를 들어 p53, NF1, WT1, RB
4. 바이러스성 병원체, 예를 들어 VP16 또는 ICP4와 같은 단순포진 바이러스의 단백질, 예를 들어 E1, E2, E6 또는 E7과 같은 유두종 바이러스의 단백질, 예를 들어 E1A 또는 E2A와 같은 아데노바이러스의 단백질, 예를 들어 IE86과 같은 사이토메갈로바이러스의 단백질, 예를 들어 pX와 같은 B형 간염 바이러스의 단백질, 예를 들어 Tat 또는 Rev와 같은 HIV 바이러스의 단백질
5. 예를 들어 미오겐성 인자, Pit-1, Oct-2, Pu-1, OCA-B 또는 HNFs와 같은 세포-타입-특이적 및/또는 조직-특이적 인자 또는 Ets-1, GATA3, TCF/Lef, CBF와 같은 T-세포 특이적 인자
6. STAT 단백질(시그날 변환자 및 전사 활성화제), 예를 들면, IL-1, Stat, IL-2 Stat, IL-3 Stat, IL-4, IL-5 Stat, IL-6 Stat, IL-7 Stat, IL-8 Stat, IL-9 Stat, IL-10 Stat, IL-11 Stat, IL-12 Stat("Stat"는 작용을 매개하는 단백질을 의미함)와 같은 사이토킨-활성화된 전사 인자 또는
7. 제2-메신저 변환 캐스케이드에 관여하는 단백질, 예를 들면 CREB 또는 abl
8. 핵 수용체, 예를 들면 제2-메신저 수용체(예, cAMP 또는 IP3 수용체, Ca2+-의존성 수용체), 레티노산 수용체, 글루코코르티코이드 수용체 또는 스테로이드 수용체
9. 유전자-특이적 활성화제 또는 억제제, 예를 들면 NFKB, AP1 또는 NFAT와 같은, IL-2 유전자의 특이적 활성화제
10. 발달-특이적, 세포-주기-특이적 및 분화-의존적으로 발현된 전사 인자.
보조인자는 예를 들어 단백질-단백질 상호반응 및/또는 단백질-DNA 상호반응을 통하여 전사에 직접 또는 간접적인 역할을 한다. 일부 보조인자는 이미 기본적인 전사 시스템에 존재하며, 다른 것들은 활성화된 전사 시스템에만 존재한다. 보조인자는 전사 속도에 포지티브 또는 네가티브 영향을 가질 수 있다. 사용할 수 있는 보조인자의 예를 들면 하기와 같은 것들이 있다:
- TBP-관련 인자(TAF), 예를 들면, TAFII30, TAFII40, TAFII55, TAFII60, TAFII110, TAFII150, TAFII250(Verrijzer, C.P. 및 Tjian, R.(1996) Trends Biochem. Sci. 21, 338-342; TAF는 TBP와 함께 TFIID 복합체를 형성하며, TFIID중의 TAF 조성은 상당히 변화시킬 수 있음);
- 매개 인자, 즉 RNA 폴리머라제 II와 관련된 보조인자, 예를 들면, CTD(카복시-말단-도메인)-상호반응성 단백질 및/또는 RNA 폴리머라제 II의 억제제 및/또는 활성화제, 특히 RAP 30, RAP 74, RAP 38, SR7(RNA 폴리머라제 B의 억제제, SRB), 사이클린 또는 키나제(예를 들면 CKII);
- 일반적인 보조인자;
- USA(상류 자극성 활성; upstream stimulatory activity) 분획중에 함유된 보조인자(Kaiser, K. 및 Meisterernst, M.(1996) Trends Biochem, Sci, 342-345);
- 포지티브 보조인자, 예를 들면 PC1, PC2, PC4(p15), PC5, PC6, Dr2(D 억제제 2)/PC3, ACF(활성화 보조인자), CofA(보조인자 A), HMG-단백질(크로마틴-관련 고-이동성 그룹 단백질);
- 네가티브 보조인자, 예를 들면 NC1, NC2 및/또는
- 특이적 보조인자.
본 방법의 특징은 1개 이상의 유전자-조절 성분과 전사시킬 DNA 서열을 포함하는 DNA 주형을 전사용으로 사용하는 것이다.
본 발명의 주제는 세포 비함유 시험관내 전사를 위한 상기 방법에 사용될 수 있는 DNA 주형이다. 상기 DNA 주형은 1개 이상의 유전자-조절 성분과 전사시킬 DNA 서열을 포함한다. 상기 DNA 주형은 추가의 서열 단편을 포함할 수 있다.
유전자-조절 성분은 공지된 유전자-조절 성분 또는 조사할 유전자-조절 성분, 또는 1개 이상의 공지된 유전자-조절 성분과 조사할 1개 이상의 유전자-조절 성분의 작제물일 수 있다. 유전자-조절 성분은 유전자 조절에 관여하는 DNA 서열, 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 유전자-조절 성분, DNA 주형, 또는 방법이 통상적인 경우, 유전자-조절 성분은 진핵세포의 유전자로부터 유래되는 것이거나, 이에 상응하는 것이 바람직하다. 유전자-조절 성분은 세포 또는 바이러스 유전자-조절 성분 또는 합성 유전자-조절 성분일 수 있다. 유전자-조절 성분이 특히 DNA-결합 단백질에 대한 결합 부위를 나타내는 DNA 서열(단백질-결합 DNA 서열, 예를 들면 전사 인자 또는 융합 단백질에 대한 결합 부위)을 포함하는 것이 바람직하다. 유전자-조절 성분은 프로모터(프로모터 서열) 및/또는 1개 이상의 인핸서(인핸서 서열) 및/또는 1개 이상의 사일렌서(사일렌서 서열)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 유전자-조절 성분이 천연적으로 및/또는 인위적으로 배열된 프로모터, 인핸서 및/또는 사일렌서 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
프로모터는 "TATA" 박스 및/또는 개시제 영역(INR)(전사 개시)을 포함할 수 있다. 프로모터는 "GC" 박스 및/또는 "GATA" 박스를 포함할 수 있다.
DNA 주형의 특이적 양태는, 유전자-조절 성분이 모델 프로모터인 것이다.
모델 프로모터는 프로모터와 추가의 단백질-결합 DNA 서열 및, 경우에 따라, 다른 유전자-조절 성분을 포함한다. 모델 프로모터가 "TATA" 박스와 개시제 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 특이적인 양태로, 모델 프로모터는 사람의 T-세포 수용체 Vβ8.1의 "TATA" 박스와 ML 프로모터의 개시제 영역을 포함한다. 이들 2개의 기본적인 프로모터 성분은 기본적인 시험관내 전사가 가능토록 한다. 또한, 상기 특이적인 모델 프로모터는 효모의 Gal4 단백질에 대한 결합 부위를 5개 갖는다. 상기 모델 프로모터는 경우에 따라, 예를 들어 분자생물학적 방법을 사용하여, 예로서, 모델 프로모터를 예를 들면 조사할 유전자-조절 성분으로 보충시키고/시키거나 모델 프로모터의 각각의 부분을 다른 유전자-조절 성분, 예를 들면 조사할 유전자-조절 성분으로 대체시켜 변형시킬 수 있다.
모델 프로모터를 제작하기 위해서는, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 절단 부위를 1개 이상 함유하는 것이 바람직하다. 모델 프로모터의 특이적인 양태로, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 1개 이상의 단일 절단 부위가 "TATA" 박스와 Gal4 결합 부위 사이에 위치하는 것이다.
이미 존재하는 단백질-결합 서열 이외에(예를 들면 Gal4 서열 이외에), 다른 단백질-결합 서열이 모델 프로모터내로 통합될 수 있다. 이는 예를 들어, 조사할 다른 전사 인자, 예를 들면, 특이적 전사 인자가 이미 조사된 전사 시스템 이외에 추가로 첨가되는 경우 특히 유리하다.
본 방법의 특징은 융합 단백질이 전사 활성화제 및/또는 억제제로서, 모델 프로모터와 함께 사용될 수 있다는 것이다. 상기와 같은 융합 단백질은 예를 들어, 효모 Gal4 단백질의 DNA-결합 도메인과 같은 DNA-결합 도메인, 및 예를 들어, HSV 활성화제 VP16의 활성화 도메인과 같은 특이적 활성화 도메인으로 이루어질 수 있다. 융합 단백질은 규정된 활성화제 및/또는 억제제, 또는 이들의 일부, 예를 들어 이의 활성화- 또는 억제 도메인을 각각 분석할 수 있도록 하며, 유전자-조절 성분의 경우, 배경이 없이도 조사할 수 있도록 한다. 예를 들면, 이는 DNA-결합 도메인이 사용되는 전사 시스템(예를 들어 농축된 핵 추출물)에는 결핍되어 있는 DNA-결합 단백질로부터 유래되는 경우 가능하다. 예를 들어, 효모 Gal4 결합 도메인을 갖는 융합 단백질로서 존재하는, 전사 인자의 활성화제(도메인)는 포유동물 세포로부터의 농축된 핵 추출물이 당해 방법에 사용되는 경우, 포유동물 세포로부터의 핵 추출물이 Gal4를 함유하지 않기 때문에, 배경이 없어도 분석할 수 있다.
사용할 수 있는 유전자-조절 성분과 조사할 유전자-조절 성분은 사람 및/또는 동물 및/또는 바이러스의 정의된 유전자-조절 성분이며, 특히 병원학적으로 관심의 대상이 되는 유전자의 유전자-조절 성분이다. 예로는 접착 분자, 성장 인자, 포스포디에스테라제, 포스파타제, 키나제, ATP아제, 막 수용체, 제2 메신저 수용체, 호르몬 수용체, 예를 들면 스테로이드 수용체, 메탈로프로테아제, 이뮤노필린, NO-합성효소, 5-리폭시게나제 유전자의 유전자-조절 성분, 또는 사이토킨, 예를 들면 인터류킨의 유전자-조절 성분, 예를 들면, T- 또는 B-세포 특이적으로 발현된 유전자 즉, CD4 수용체의 프로모터, TCR 또는 BCR(T- 또는 B-세포 수용체), 예를 들면 림포이드-특이적 유전자, 즉 TNF(종양 괴사 인자)의 프로모터와 같은 면역학적 표적, 또는 T-세포-특이적 레트로바이러스, 예를 들어 HTLV-1 또는 HIV-1의 유전자-조절 성분과 같은 유전자-조절 성분이 있다.
모델 프로모터의, 본 방법의 특별한 잇점은 사용할 수 있는 유전자-조절 성분이 예를 들어, 인터류킨-2(IL-2)를 암호화하는 유전자의 프로모터와 같은 "TATA" 박스를 함유하는 프로모터 뿐만 아니라, 예를 들어, T-세포 수용체의 β-쇄를 암호화하는 유전자의 프로모터와 같이, "TATA" 박스가 결핍되어 있는 프로모터가 될 수 있는 점이다. 예를 들어, "TATA" 박스가 결핍되어 있는 프로모터는 모델 프로모터내로, 또는 일반적으로 사용되는 리포터 플라스미드 pGS100내로 통합시켜, 전사용으로 사용할 수 있다.
전사시킬 DNA 서열의 특징은 서열중에 핵 염기가 1개 이상 결핍되어 있다는 것이다. 전사시킬 DNA 서열은 선택적으로 구아닌 또는 시토신 또는 티민 중 어느 하나를 포함하지 않는 것, 즉 서열이 G-유리, C-유리 또는 T-유리 서열인 것이 바람직하다. 또한, 상기 서열은 구아닌과 티민 또는 구아닌과 시토신 또는 시토신과 티민과 같은 핵 염기가 1개 이상 결핍되어 있을 수 있다.
사용되는 G-유리, T-유리 또는 C-유리 서열은, 특히, 길이가 400개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 400 내지 2000개인 뉴클레오티드 또는 더 긴 뉴클레오티드인 G-유리, T-유리 또는 C-유리 서열이 사용된다. 특히, 길이가 대략 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 5000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드인 서열을 사용한다. 특정 핵 염기가 결핍되어 있는 서열의 길이는 대략 800, 1200, 1600 또는 2000개 뉴클레오티드인 것이 특히 바람직하다.
DNA 주형은 선형 또는 원형 DNA 서열일 수 있으며, 예를 들어 DNA 주형은 폴리머라제 연쇄 반응 또는 플라스미드에 의해 발생된 선형 서열일 수 있다.
하나의 양태로, DNA 주형은 플라스미드이며 벡터 모두 또는 일부, 모델 프로모터 및 전사시킬 DNA 서열, 예를 들어, G-유리, T-유리 또는 C-유리 서열로 작제된다.
본 발명의 대상은 널리 이용가능한 리포터 플라스미드(보편적인 리포터 플라스미드)이다. 보편적인 리포터 플라스미드는 제한 엔도뉴클레아제 PstI, EcoRI, SacI, KpnI, SacII, BamHI, SwaI에 대한 단일 절단 부위, 플라스미드 pUC19의 일부, 효모 Gal4 단백질에 대한 5개의 결합 부위, SacII와 BamHI 제한 부위 사이에 사람의 T-세포 수용체 Vβ 8.1의 "TATA" 박스, BAMHI와 SwaI 제한 부위 사이에 ML 프로모터(아데노바이러스 주요 후기 프로모터)의 INR(개시제) 영역, 및 길이가 대략 800 뉴클레오티드(염기쌍)인 G-유리 서열을 함유한다. 보편적인 리포터 플라스미드중 모델 프로모터는 5개의 효모 GaI4 결합 부위, PstI, EcoRI, SacI, KpnI, SacII, BamHI 및 SwaI에 대한 단일 절단 부위, 사람의 T-세포 수용체 Vβ 8.1의 TATA 박스 및 ML 프로모터의 INR을 함유하는 합성 프로모터이다. 조사할 유전자-조절 성분은 상기 프로모터 영역중으로 통합시킬 수 있다. 모델 프로모터 또는 완전한 모델 프로모터의 일부를 제거하여 조사할 유전자-조절 성분으로 대체시킬 수 있다.
보편적인 리포터 플라스미드의 양태를 pGS100으로 칭한다(도 2).
보편적인 리포터 플라스미드 pGS100의 양태중 하나로, 합성 프로모터가 뉴클레오티드 위치 2168과 2337 사이의 서열 영역에 위치한다. 아데노바이러스 주요 후기(ML) 프로모터의 개시제 영역은 뉴클레오티드 위치 2322 내지 2337상에 위치하며, 사람의 T-세포 수용체 Vβ 8.1 프로모터의 TATA 박스를 갖는 영역은 뉴클레오티드 위치 2289 내지 2316상에 위치한다. 효모 Gal4 단백질에 대한 5개의 결합 부위는 뉴클레오티드 위치 2168 내지 2260상에 위치한다.
보편적인 리포터 플라스미드 pGS100의 다른 양태를 표 1의 뉴클레오티드 서열(서열 1)로 나타낸다.
보편적인 리포터 플라스미드 pGS100의 다른 양태는 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 조항에 따라, DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH: 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐로더 베크 1베 소재)에 DSM 기탁 번호 11450으로 기탁되어 있다.
본 방법의 한 국면은 특이적 전사물의 명확한 검출이 더 이상 불가능한 방식으로 특이적 전사물의 검출을 직접적으로 또는 간접적으로 방해하는 단백질을 전사후 제거하고/하거나 분해시키는 것이다. 제거 또는 분해는 특히 예를 들어, 반응을 화학적 및/또는 기계적 및/또는 효소적 공정 단계로 중단시키고, 경우에 따라, 전사물을 과량의 표지된 뉴클레오티드가 상기 공정 단계후 특이적 전사물로부터, 예를 들면 세척 단계에 의해 제거될 수 있는 방식으로 전사물로부터 방해가 되는 단백질을 동시에 제거하는 것과 같이 수행이 간단한 공정 단계를 포함한다.
본 방법의 상기 국면은 예를 들면, 단백질을 전사 반응후 프로테아제를 사용하여 분해시킬 수 있다는 것이다. 사용될 수 있는 프로테아제의 예로는 아연 프로테아제, 세린 프로테아제, 티올 프로테아제 및 카복시프로테아제가 있다. 특히, 프로테이나제 K, 트립신, 키모트립신, 카복시펩티다제 A, 파파인 및 펩신을 사용할 수 있다. 본 방법의 특별한 양태는 프로테이나제 K를 사용하여 전사후에 분해시키는 것이다.
전사 정도, 즉 전사 속도를 측정할 수 있으려면, 특이적 전사물의 양을 측정하여야 한다.
본 방법의 한 국면은 표지된 뉴클레오티드의 존재하에서 전사를 수행하거나 특이적 전사물을 표지시키는 것이다. 예를 들면, 전사용으로 적절한 비-방사선표지된 뉴클레오티드를 사용할 경우 전사물을 비-방사선표지시킬 수 있다. 사용할 수 있는 뉴클레오티드용 표지화 그룹의 예로는 단실(=N-디메틸-1-아미노나프틸-5-술포닐) 유도체, 플루오레세인 유도체 또는 쿠마린 유도체와 같은 형광성 그룹, 또는 아크리딘 유도체와 같은 화학발광성 그룹이 있다. 상기 언급한 표지화 그룹은 특이적인 전사물을 직접 검출할 수 있도록 한다. 또한, 전사물의 간접적인 검출에 적합한 표지화 그룹을 사용할 수도 있다. 예를 들면, ELISA에서 특이적인 항-디곡시게닌-항체로 검출할 수 있는 디곡시게닌, 비오틴/아비딘 시스템을 통하여 검출할 수 있는 비오틴, 및 검출가능한 수용체 그룹으로 후속해서 유도시키는 기능성 그룹을 함유하는 링커 암(arm)이 있다. 가능한 링커 암의 예로는 전사후, 화학발광 시험에서 아크리디늄 활성화된-에스테르와 반응하여 검출할 수 있는 아미노알킬 링커가 있다.
본 방법의 특별한 양태는 방사선표지된 뉴클레오티드의 존재하에서 전사를 수행하는 것이다. 뉴클레오티드는 예를 들면, 인(32P 또는 33P), 황(35S) 또는 트리튬(3H)으로 방사선표지시킬 수 있다.
본 방법의 특별한 양태는 특이적인 전사물을 고체상(고체 매트릭스)에 결합시켜, 예를 들면 미세역가판에 결합시키거나 특이적인 전사물을 특수 필터, 막 또는 기타 고체상에 결합시킴으로써, 특히 하전된 막 또는 하전된 필터, 바람직하게는 나일론 또는 니트로셀룰로즈로 제조된 것에 결합시킴으로써, 특히 바람직하게는 예를 들어 디에틸아미노에틸 그룹과 같은 하전 그룹을 함유하는 막, 예를 들면, DEAE-셀룰로즈 막에 결합시킴으로써 반응 혼합물로부터 단리시키는 것이다. 본 양태의 국면은 고체 매트릭스에 결합하는 특이적인 전사물로부터 과량의 표지된 뉴클레오티드를 특이적인 전사물을 명백하게 검출할 수 있을 정도로 세척 단계에 의해 제거할 수 있다는 것이다.
페놀화, 침전 및 후속되는 변성 겔상에서의 전사물의 분리 단계로 이루어진, 통상적인 단리 및 검출 방법과 비교하여, 본 방법은 놀랍게도, 동등하게 명백하게 검출할 수 있는 특이적인 시그날을 생산한다(예, 실시예 7 및 도 4).
본 방법은 예를 들어, 활성화제의 존재(활성화제 전사) 또는 억제제의 존재(억제제 전사)하에서의 특이적 전사에 의해 촉발되는 특이적인 시그날을 발생시키는데 적합하며, 시그날은 예를 들어, 활성화제 또는 억제제의 부재하에서의 기본적인 전사에 의해 촉발되는 기본적인 시그날 강도와 적어도 7, 바람직하게는 8, 특정한 경우에는 9 또는 10의 인자로 구별된다(예, 실시예 7 및 도 4).
본 방법의 중요한 양태는 약리학적 활성 물질의 선별용으로 사용할 수 있다는 것이다. 후보 약리학적 활성 물질을 이들의 활성(예, 활성화 또는 억제능)에 대해 시험하기 위하여, 시험할 활성 물질의 존재하에서 전사를 수행한다. 경우에 따라, 각각의 성분, 예를 들면, 농축된 핵 추출물을 시험할 활성 물질과 함께 예비 배양시킬 수 있다. 또한, 시험할 활성 물질의 특이성은 각각의 반응 혼합물이 상이한 성분을 포함하는 다수의 전사 반응 혼합물을 나란히 시험할 활성 물질의 존재하에서 전사를 수행한 다음, 전사 속도를 측정하여 비교함으로써 특성화할 수 있다.
시험할 활성 물질의 예는 천연 산물 및/또는 화학 및 조합 물질 라이브러리로부터의 물질일 수 있다. 천연 산물은 예를 들면, 식물, 동물, 식물 분비물, 동물 분비물, 및 특히, 예를 들어, 진균류, 효모, 세균 또는 조류와 같은 미생물로부터 단리할 수 있다.
본 방법의 다른 특별한 양태는 전사를 시험할 활성 물질, 전사 인자, 보조인자 또는 세포-타입-특이적 핵 추출물의 존재하에서 수행하고 대등한 반응 혼합물을 시험할 활성 물질, 전사 인자, 보조인자 또는 세포-타입-특이적 핵 추출물의 부재하에서 수행하지만, 다른 것은 동등한 조건하에서 수행하며, 유전자-조절 성분(또는 유전자) 및/또는 전사 인자 및/또는 보조인자와 관련하여 시험된 활성 물질, 전사 인자, 보조인자 또는 세포-타입-특이적 핵 추출물의 활성(예, 억제, 활성화) 또는 효과를 표지된 전사물의 양에 있어서의 차이로부터 측정할 수 있는 것이다.
본 방법의 국면은 시험할, 유전자 조절에 관여하는 단백질의 효과를 동등한 조건하에서 대등하게 수행된 전사를 사용하여 측정하는 것으로, 조사할 단백질은 2개의 반응 혼합물중 하나에만 존재한다.
본 방법의 양태중 하나의 특징은
a) 2개 이상의 전사를 대등하게 동등한 조건하에서 수행하며, 여기서
b) 전사 반응 혼합물은 이들이 상이한 양의 시험할 활성 물질 및/또는 1개 이상의 전사 인자 및/또는 1개 이상의 보조인자 및/또는 농축된 핵 추출물을 포함한다는 사실만으로 구별되고,
c) 표지된 전사물의 생성량을 전사후 각각의 반응 혼합물에 대해 측정하며,
d) 유전자-조절 성분과 관련하여 시험된 활성 물질, 전사 인자, 보조인자 및/또는 농축된 핵 추출물의 활성 및/또는 특이성을 표지된 전사물의 생성량에 있어서의 차이로부터 측정한다.
본 방법은 전사 반응 혼합물에 함유되어 있는 각각의 개별 성분의 효과(예를 들면 핵 추출물에 대한 효과(즉, 특이적 세포 타입에 대한 효과) 또는 특이적 전사 인자에 대한 효과)를 표적-특이적으로 시험할 수 있도록 한다. 예를 들어, 규정된 유전자-조절 성분에 대한 조사할 활성 물질의 효과를 분석할 수 있다. 여기서 결정적인 것은 전사 반응 조건을 정확하게 규정할 수 있다는 것이다.
본 방법은 유전자-조절 성분 및 전사 인자 및/또는 보조인자 및/또는 세포-타입-특이적 핵 추출물을 선택함으로써 적합한 반응 조건을 조정하거나 정확하게 맞출 수 있으므로 병원성 유전자 발현에 대한 각각의 인자의 작용을 표적-특이적 방식으로 영향을 주는 방법을 제공한다.
본 방법의 특별한 잇점은 규정된 조건하에서 전사에 포지티브 또는 네가티브 영향을 발휘할 수 있는 약리학적 활성 물질, 특히 규정된 (표적) 유전자의 전사를 활성화하거나 억제하는 활성 물질을 확인할 수 있도록 하며, 이들 활성 물질은 규정된 유전자-조절 성분 및/또는 규정된 전사 인자, 보조인자 및/또는 세포-타입-특이적 핵 추출물(또는 세포)에 대해 특이적인 효과를 갖는다.
본 발명은 특이적인 활성 물질의 확인 방법의 사용에 관한 것이다. 본 방법은 예를 들면 시험할 물질을 특성화하기 위하여 사용할 수 있다. 본 방법은 예를 들면 규정된 조건하에서 이의 특이성에 대해 시험할 물질을 특성화하기 위하여 사용할 수 있다. 본 방법에 의해 확인된 약제학적 활성 물질은 예를 들면 유전자-조절 성분의 조절하에서 DNA-서열의 전사를 억제하거나 활성화시켜야 한다.
본 방법의 보다 특별하게 유익한 특성은 모든 단계를 단순한 방식으로 자동화할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 공급 로보트 모듈에 연결된, 피펫팅 로보트 Biomek 2000R(Beckman, Munich)을 사용할 수 있다. 이어서 고체상에 결합된 전사물은 수동식으로 또는 자동적으로, 예를 들면 콘베이어 벨트를 사용하여 세척할 수 있다.
본 발명의 국면은 피펫팅 로보트, 예를 들면, Biomek 2000R에 단백질 분획(예, 핵 추출물 및 기타 단백질), DNA 주형, 전사 완충액, 전사에서 조사할 물질, 피펫 팁, 미세역가판 및 막과 같은 각각의 반응 성분이 장착되어 있다. 각각의 반응은 예를 들면, 미세역가판의 웰 내부의 이들 성분으로 이루어져 있으며, 피펫팅 단계가 모두 자동적으로 수행된다. 이 방법으로, 평판 당 96개 이상의 상이한 전사 반응 혼합물이 작은 용량의 샘플, 특히 100㎕ 미만, 바람직하게는 10 내지 50㎕, 특히 20㎕와 함께 동시에 처리될 수 있다. 각각의 전사 시간은 대략 1 내지 1.5시간 정도 소요되어, 배양 시간을 최상의 가능한 방식으로 이용할 경우 이 방식으로 일일 1000회 이상까지 전사를 수행할 수 있다.
전사는 예를 들면 20 내지 50℃에서 수행할 수 있다. 대략 30℃에서 전사를 수행하는 것이 특히 바람직하다.
특히 시험할 활성 물질, 전사 인자, 보조인자, 및 경우에 따라, 또한 농축된 핵 추출물은 소량으로만 입수할 수 있지만, 이들 물질은 다수의 전사에 있어서 다양한 반응 조건하에서 시험하여야 하기 때문에, 본 방법은 전사 반응에서 요구되는 샘플의 용적이 가능한한 적어야 하는 요구조건을 만족시켜야 한다. 따라서, 본 방법이 또한 나노리터 규모로, 즉 대략 50 내지 500nℓ의 반응 규모로 수행하기에 적합하다는 것이 특이 중요하다.
본 발명의 전사 방법은 널리 사용할 수 있다. 전사 및/또는 보조인자 및/또는 유전자 전사의 조절에 직접 또는 간접적인 역할을 하는 기타 단백질(즉, 표적으로서 특이적인 단백질) 및/또는 농축된 핵 추출물(즉, 표적으로서 특이적인 핵 추출물 또는 특이적인 세포 타입)의 유전자-조절 성분(즉, 표적으로서 특이적인 유전자)을 확인하고 특성화하는데 사용할 수 있다. 특히, 본 전사 방법은 병원학에서 관심의 대상이 되는 신규한 유전자-조절 성분을 확인하고 이들 성분의 효과를 매개하는 유전자-조절 단백질을 상응하는 유전자-조절 성분에 부여하는데 이용할 수 있다.
세포 검정법과 비교하여, 상기한 전사 방법은 표적 특이성이 더 높다. 세포 검정법과는 대조적으로, 각 성분의 세포 흡수는 전사 효과에 대해 어떤 영향도 끼치지 않는다. 또한, 상기한 방법은 간단하고 신속하게 수행할 수 있다(예를 들면, 각각의 성분을 제조하여 냉동 상태로 보관할 수 있다). 본 방법은 표준화시키기에 간단하고 어떤 세포 타입 및 어떤 유전자이든지 간에 실제적으로 적용시킬 수 있기 때문에, 널리 이용할 수 있다.
본 방법은 약제의 제조를 위하여 사용할 수 있는 약리학적 활성 물질을 확인할 수 있도록 한다. 이들 전사 방법에 의해 확인된 활성 물질은 공지된 활성 물질과 비교하여 부작용을 거의 일으키지 않아야 한다. 예를 들면, (자가)면역 질환, 대사 질환, 암, 심장혈관계 질환, 전염성 질환, 류마티즘, 당뇨병, 퇴행성 및 정신 질환 치료용 약제의 제조, 특히 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 진성 당뇨병, 알레르기, 천식, 과민증, 아토피성 피부염, 알쯔하이머병, 파킨슨씨병, AIDS, 크로이츠펠트-야콥병, 간질, 정신분열증, 동맥경화증 및 결핵 치료용 약제의 제조용으로 사용될 수 있는 활성 물질을 시험하거나 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 통용되는 방법은 다수의 기타 가능한 용도를 제공한다. 예를 들면, 본 방법은 미지의 유기체로부터 관련된 기본적인 전사 시스템 및 특이적인 유전자-조절 성분, 전사 인자 및/또는 보조인자 및/또는 전사 반응에 직접 또는 간접적으로 관여하는 기타 단백질의 경우 특이적인 약리학적 활성 물질을 찾기 위해 동물 병원학 및 동물 번식, 작물 보호 또는 식물 육종에 유사하게 이용할 수 있다.
원칙적으로, 본 시험관내 전사 방법은 또한, 상응하게는, 미생물, 예를 들면, 효모, 진균, 세균 또는 곤충의 유전자-조절 성분, 전사시킬 수 있는 시스템, 전사 인자 및/또는 보조인자가 사용되는 경우, 물질과 식품의 보존에 사용될 수 있는 물질을 확인하는데 유사하게 이용할 수 있다.
도 1에서 나타내는 것은 보편적인 리포터 플라스미드 pGS100(도 2)과 2개의 표준 프로모터의 비교이다. 전사 반응은 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행한다.
A) 기본적인 전사: 프로모터를 활성화시키지 않고 수득한 방사성 전사물의 양[상대적 단위로](기본적인 시그날 강도);
B) Gal4-폴리글루타민으로 프로모터를 활성화시켜 수득한 방사성 전사물의 양[상대적 단위로].
I) 사용되는 리포터 플라스미드는 pMRG5(Kretschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meisterernst, M.(1984) Cell 78, 525-534)이다. pMRG5중의 합성 프로모터는 HIV 프로모터의 TATA 박스, ML 프로모터의 개시제 및 pUC19중 길이가 대략 400개 뉴클레오티드인 G-유리 서열을 함유한다.
II) 사용되는 리포터 플라스미드는 pVβML이다. 리포터 플라스미드 pVβML의 작제는 리포터 플라스미드 pGS100에 대해서와 같지만, 800개 뉴클레오티드 대신 길이가 단지 400개 뉴클레오티드인 G-유리 서열을 함유한다.
III) 사용되는 리포터 플라스미드는 pGS100으로, 이는 대략 800개 뉴클레오티드의 G-유리 서열을 함유한다.
각 경우 비교되는 것은 기본적인 전사(A)와 활성화된 전사(B)이다. 사용되는 활성화제는 Gal4 결합 도메인(94개 아미노-말단 아미노산)과 폴리글루타민 활성화 도메인(11개의 글루탐산 단위의 합성 펩타이드)으로 이루어진 융합 단백질이다. 도식화된 데이타는 배경을 공제한 후의 절대값(이들을 포스포이미저(Phosphoimager)를 사용하여 수득함에 따른 상대적인 단위)이다. 리포터 플라스미드로서 pGS100을 사용하는 전사 반응에 있어서, 더 높은 절대값과, 합성 프로모터의 작제가 상이함으로 인하여, mRG5 보다 더 우수한 활성이 측정된다. 또한, 길이가 400개 이상의 뉴클레오티드인 G-유리 서열의 포지티브 효과가 명백하다.
도 2: 보편적인 리포터 플라스미드 pSG100.
보편적인 리포터 플라스미드 pGS100은 pUC19중에 길이가 대략 800개 염기쌍인 G-유리 영역의 상류에 모델 프로모터로서 합성 프로모터 영역을 함유한다. BamHI와 SwaI 제한 부위내에 아데노바이러스 주요 후기(ML) 프로모터의 개시제 영역이 위치한다. SacII와 BamHI 제한 부위 사이에, 사람의 T-세포 수용체 Vβ 8.1 프로모터의 TATA 박스를 갖는 영역이 위치한다. 이들 2개의 기본적인 프로모터 성분(개시제 및 TATA 박스)은 기본적인 전사가 시험관내에서 이루어지도록 한다. 이들 후보 표적 유전자가 선별에 있어서 특이적으로 중요할 수 있기 때문에, 조사할 유전자의 상응하는 영역(상응하는 유전자-조절 성분)에 대해 이들을 개별적으로 교체할 수 있다. 표적 유전자의 어떠한 조절 영역도 기본적인 프로모터 하류의 폴리링커로 도입시킬 수 있다(특이적 활성화). 별법으로, 전체 프로모터 영역을 교체시킬 수 있다. 폴리링커(SacII 내지 PstI)의 상류에, pGS100은 효모 Gal4 단백질에 대한 결합 부위를 5개 함유한다. 이는 또한 합성 전사 활성화제, 예를 들어, 목적하는 활성화 도메인(예, 단순포진 트랜스활성화제 VP16)과 Gal4 DNA 결합 도메인으로 이루어진 융합 단백질의 분석을 가능토록 한다. G-유리 서열은 pGS100의 필수적인 단위이다.
도 3은 상이한 반응 조건하에서 수득한 시그날 강도(전사물의 양과 이에 따른 전사 강도를 척도로 함)의 비교를 나타낸다. 전사 반응은 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행한다.
A) 특이적인 전사물을 단백질과 과량의 뉴클레오티드로부터 페놀 처리, 에탄올로의 침전 그리고 이후 변성 겔 전기영동에 의해 제거하는, 통상의 표준 전사 방법;
B) 단백질을 프로테이나제 K로 분해하고 과량의 뉴클레오티드를 DEAE 필터에 결합된 특이적인 전사물을 세척함으로써 제거하는, 상기한 시험관내 전사 방법;
I) 전사에 사용되는 물질은 헬라 세포핵으로부터의 추출물로, 이는 전사될 수 있으며 상응하는 DNA 주형을 사용하지 않고 P11R 칼럼상에서 정제한다(대조 실험);
II) 기본적인 전사: I의 반응 혼합물에 상응하는 반응 혼합물을 DNA 주형으로서 리포터 플라스미드 pMRG5로 처리하고 전사 반응을 수행한다; 기본적인 시그날 강도는 상기 방법으로 측정한다;
III) 활성화된 전사: 반응 혼합물 II에 상응하는 반응 혼합물을 전사 활성화제, Gal4의 DNA 결합 도메인과 VP16의 활성화 도메인으로 이루어진 융합 단백질(Gal4-VP16)로 처리하고, 전사를 수행한다; 이 방법으로, 활성화된 시그날 강도가 수득된다;
IV) III의 전사 반응 혼합물에 상응하는 반응 혼합물을 RNA-폴리머라제 II 억제제로서 α-아마니틴으로 처리한다(대조 실험).
상이한 반응 조건하에서의 2개의 상이한 방법으로 수득한 시그날 강도의 비교는 기본적인 전사(II) 뿐만 아니라, 본 명세서에 기술된 시험관내 전사 방법을 사용하는 활성화된 전사(III)를 측정할 수 있음을 나타내며, 시그날 강도는 통상의 전사 방법을 사용하는 경우에 수득한 것과 유사하다. 기본적인 시그날 강도를 측정할 수 있다는 사실이 중요하므로, 상기한 전사 방법을 또한 전사 억제제 선별용으로 사용할 수 있다. 특이적인 RNA 폴리머라제 II 억제제 α-아마니틴을 사용함으로써 시그날이 대략 8배 감소된다(비교 III과 IV).
실시예:
실시예 1: 헬라 핵 추출물의 제조
헬라 세포핵으로부터 출발하여 핵 추출물을 제조한다. 헬라 세포핵은 여러 회사로부터 상업적으로 입수가능하다(예로서, "4℃", Mons; Sigma, Munich, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg). 이후 기술되는 세포핵의 프로세싱을 4℃(냉실)에서 수행한다. 완충액을 Tris pH 6.8로 실온(RT)에서 조정하는데, 이는 4℃에서의 pH 7.3에 상응한다. 사용전에, 완충액을 최종 농도 5mM가 되도록 DTT(수중의 1M 스톡 용액)로 처리하고 PMSF(DMSO중 200mM 스톡 용액)로 최종 농도 1mM로 처리한다.
세포핵의 프로세싱은 다음 단계를 포함한다:
1. 세포핵을 빙상에서 해동시켜 NPV 용적(핵 펠릿 용적)을 측정한다.
2. 2개의 별개의 유리 비이커에, 각 경우 ½ NPV 용적으로, 각각 0.02M KCl 완충액(염 함량이 낮은 완충액: 20㎖ 1M Tris pH 6.8 RT, 250㎖ 100% 글리세롤, 6.67㎖ 3M KCl, 1.5㎖ 1M MgCl2, 0.4㎖ 0.5M EDTA, H2O를 가하여 1000㎖) 및 1.2M KCl 완충액(염 함량이 높은 완충액: 20㎖ 1M Tris pH 6.8 RT, 250㎖ 100% 글리세롤, 400㎖ 3M KCl, 1.5㎖ 1M MgCl2, 0.4㎖ 0.5M EDTA, H2O를 가하여 1000㎖)을 도입시킨다. 각각의 완충액을 0.0007 x NPV/2 β-머캅토에탄올과 0.001 x NPV/2 0.2M PMSF로 처리한다.
펠릿을 ½ 용적의 0.02M KCl 완충액에 재현탁시키고 막자를 사용하여 부드럽게 균질화시킨다(6회).
3. 균질물을 유리 비이커에 도입시키고 30분에 걸쳐 연속적으로 교반시키면서 1.2M KCl 완충액으로 적가 처리한다. 추가로 30분간 교반시킨 후, 추출을 완료한다. 원심분리(Beckman 원심분리기, SS34 로터, 14,000rpm, 30분, 4℃)시킨 다음, 펠릿과 상등액을 각각 추가로 처리한다.
4. 상등액을 완충액 1(40㎖ 1M Tris pH 6.8 RT, 400㎖ 글리세롤, 0.8㎖ 0.5M EDTA, H2O를 가하여 2000㎖)중에서 완충액 2(40㎖ 1M Tris pH 6.8 RT, 400㎖ 글리세롤, 0.8㎖ 0.5M EDTA, 66.7㎖ 3M KCl, H2O를 가하여 2000㎖)의 전도율에 도달될 때까지 투석시킨다(45 내지 55분).
5. 투석시킨 상등액을 원심분리시킨다(Beckman, SS34 로터, 18,000rpm, 20분, 4℃). 헬라 핵 추출물이 상기 상등액에 존재한다(헬라 핵 추출물 = 헬라 NE). 추출물의 분취량을 액체 N2중에서 동결시킨다. 핵 추출로부터의 펠릿을 균질기로 옮기고, TGME 10㎖/5mM DTT(1ℓ에 대한 TGME: 250㎖ 100% 글리세롤, 50㎖ Tris pH 7.3 RT, 5㎖ 1M MgCl2, 0.2㎖ 500mM EDTA pH 8.0)로 처리하고, 막자로 20회 균질화시키고(강력하게) 액체 N2중에서 동결시킨다(헬라 핵 펠릿).
실시예 2: 핵 추출물을 단리시키기 위한 포스포셀룰로즈 칼럼의 제조
1. P11R 칼럼 재질을 수중에서 반복하여 세척한다. 팽윤된 물질의 용적을 측정한다.
2. 0.5N NaOH 5용적을 가하고, 5분간 방치시킨 다음, 중첩 필터를 통하여 즉시 흡인 여과시킨다.
3. 물로 pH 11이 되도록 세척한다.
4. 0.5N HCl 25용적을 가한다. 5분간 방치시킨 다음 즉시 흡인 여과한다.
5. 물로 pH 3이 되도록 세척한다.
6. 1M Tris pH 7로 pH가 7에서 일정해질 때까지 세척한다. 칼럼 재질을 4℃에서 저장한다. 밤새 평형화시킨다.
실시예 3: 포스포셀룰로즈 크로마토그래피에 의한 핵 추출물의 크로마토그래피 정제
P11R 물질의 용량은 10㎎ 단백질/1㎖ 물질이다. 크로마토그래피는 다음과 같이 수행한다:
1. 칼럼을 P11R 물질로 채우고 완충액 2(DTT와 PMSF를 새로이 가한 것, 실시예 1 참조)중에서 평형화시킨다. 칼럼을 펌프에 부착시킨다.
2. (완충액 2중의) 핵 추출물을 부하한다(1 칼럼 용적(CV)/시간).
3. 칼럼을 5 CV 완충액 2(5 내지 10 CV/시간)로 세척한다.
4. 완충액 3(40㎖ 1M Tris pH 6.8 RT, 400㎖ 글리세롤, 0.8㎖ 0.5M EDTA, 200㎖ 3M KCl, H2O를 가하여 2000㎖; 2 CV/시간)으로 용출시킨다. 단백질이 더 이상 용출되지 않을 때까지, 추가의 2 CV 완충액 3을 통해 전개시킨다.
5. 완충액 4(40㎖ 1M Tris pH 6.8 RT, 400㎖ 글리세롤, 0.8㎖ 0.5M EDTA, 333㎖ 3M KCl, H2O를 가하여 2000㎖; 2 CV/시간)로 용출시키고 피크 분획물을 수집한다.
6. 완충액 5(40㎖ 1M Tris pH 6.8 RT, 400㎖ 글리세롤, 0.8㎖ 0.5M EDTA, 567㎖ 3M KCl, H2O를 가하여 2000㎖; 2 CV/시간)로 용출시키고 피크 분획물을 수집한다.
7. 2개의 용출액을 각각 완충액 2에 대해 전도율이 일정해질 때까지 투석시킨 다음 분취량을 액체 N2중에서 동결시킨다.
실시예 4: 전사물의 분리를 위해 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 표준 전사 방법
전사 반응 혼합물(최종 용적 20㎕)은 다음과 같은 성분으로 이루어질 수 있다:
a) 미리-정제된 핵 추출물 또는 재조합 기술에 의해 생산되고, 경우에 따라 추가의 특이적인 전사 인자, 활성화제, 억제제 또는 융합 단백질이 보충된 형태의 일반적인 전사 인자;
b) DNA 주형(예를 들면 조사할 유전자-조절 성분을 갖는 벡터 pGS100);
c) 예를 들어, 조사할 활성 물질을 포함하는 전사 완충액;
d) 표지된 뉴클레오티드 및 비표지된 뉴클레오티드;
참고 a) 완충액 4 용출액과 완충액 5 용출액(실시예 3)을 전사될 수 있는 핵 추출물중에 포함시킨다(모든 일반적인 전사 인자). 각각의 제조에 최적량의 완충액 4 용출액 및 완충액 5 용출액을 측정하여야 한다(반응 혼합물 당 대략 완충액 4 용출액 3㎕ 및 완충액 5 용출액 2㎕);
참고 b) 반응 혼합물 당 통상적으로 DNA 주형(리포터 플라스미드, 예를 들어 pGS100중 유전자-조절 성분) 100ng을 사용한다;
참고 c) 전사 완충액(5mM MgCl2, 25mM HEPES KOH pH8.2, 0.5㎕ 아세틸화 BSA(스톡 20㎎/㎖), 대략 10% 글리세롤, 대략 70mM KCl, 0.2mM PMSF, 10mM DTT) + 각각의 경우 반응 혼합물 당 20U RNA아제 억제제;
참고 d) NPT(ATP, UTP 각 경우 100μ M 최종 농도, CTP 5μ M 최종 농도, o-m-GTP 20μ M 최종 농도, α-32P-CTP 대략 0.12μ M 최종 농도 3000 Ci/mmol, 10mCi/㎖).
1. 전사 완충액과 dNTP를 도입시키고 DNA 주형을 가한다.
2. 전사 활성화제 및 완충액 4 용출액 및 완충액 5 용출액을 가한다.
3. 전사 반응을 수행하기 위하여, 1시간 동안 30℃에서 배양시킨다.
4. 종결혼합물(7M 우레아, 10mM Tris HCl pH 7.8, 10mM EDTA/NaOH pH 8, 0.5% SDS, 100mM LiCl, 100㎍/㎖ tRNA, 300mM Na 아세테이트) 및 400㎕의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25/24/1)을 가한다. 혼합하여 원심분리시킨다(SS34 로터, Beckman 원심분리기, 5분, 14,000rpm, RT). 상등액을 배수시키고, 이소프로판올 400㎕를 가하여 혼합한 다음, 1시간 동안 -20℃에서 배양시킨다.
5. 원심분리시키고(SS34 로터, Beckman 원심분리기, 14,000rpm, 30분, 4℃). 펠릿을 70% 에탄올중에서 세척한 다음 Speedvac중에서 건조시킨다.
6. 펠릿을 10㎕의 부하 완충액(955㎕ 100% 포름아미드(탈이온화), 10㎕ 0.5M EDTA, 20㎕ 1M Tris pH 7, 각 경우 0.003% 브로모페놀 블루/크실렌 시아놀, H2O를 가하여 1㎖)에 용해시키고 15분간 50℃에서 배양시킨다.
7. 전개용 완충액으로서 1 x TBE를 사용하여 5% 변성 폴리아크릴아미드 겔중에서 전사물을 분리시킨다. 60 mA에서 20분간 예비 전개한다. 대략 1시간 동안 60 mA에서 겔을 전개시킨다.
8. 겔을 10% 아세트산중에 고정시키고, 건조시켜, PhosphoimagerR중에서 X-선 필름에 노출시킨다.
실시예 5: 전사물의 결합용 필터를 사용하여 자동화시킬 수 있는 전술한 시험관내 전사 방법의 프로토콜
1. 전사 완충액과 dNTP를 도입시키고 DNA 주형을 가한다.
2. 완충액 4 용출액과 완충액 5 용출액 및, 경우에 따라, 전사 활성화제 또는 전사 억제제를 가한다.
3. 상기 혼합물을 1시간 동안 30℃에서 배양시켜 전사 반응을 수행한다.
4. 프로테이나제 K 혼합물(1㎕ 프로테이나제 K 용액 [20㎎/㎖], 1㎕ 10% SDS, 0.5㎕ 0.5M EDTA pH 8, 1㎕ 50mM Tris pH 7.8, H2O를 가하여 5㎕)을 가한다.
5. 15분간 30℃에서 배양시킨다.
6. 막 세척 완충액(100mM 인산나트륨 완충액 pH 7.5, 250mM NaCl, 2% 피로인산나트륨)중에서 DEAE 막 NA 45R(Schleicher und Schuell)를 간단하게 세척한다.
7. 상기 반응 혼합물로부터, 막상에 5㎕를 피펫팅하여 5분간 건조시킨다.
8. 막 세척 완충액(+ 1% Triton) 대략 100㎖중에서 4 x 15분간 막을 부드럽게 진탕시킨다.
9. 와트만 3 MMR 페이퍼(Whatman, Maidstone, England)상으로 막을 옮기고, 공기중에서 건조시켜, 필름으로 덮고 PhosphoimagerR를 사용하여 필터를 X-선 필름에 노출시킨다.
실시예 6: 필터를 사용하는 상기 기술한 시험관내 전사 방법에 따라, 3개의 상이한 리포터 플라스미드를 사용하여 대등하게 전사 반응 수행함
과정은 실시예 1 내지 3 및 5에 기술된 바와 같다. 사용되는 리포터 플라스미드는 pMRG5(HIV 프로모터의 TATA 박스, ML 프로모터의 개시제 영역 및 pUC 19중 길이가 대략 400개 뉴클레오티드인 G-유리 카세트(Kretschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meisterernst, M.(1994) Cell. 78, 525-534), pGS100(도 2) 및 pVβML(pGS100과 같이 작제되지만, 800bp G-유리 카세트 대신 400bp G-유리 카세트만을 함유함)이다. 각 경우, 전사 반응을 위하여 DNA 주형 100ng과 P11R 분획물(완충액 4 용출액 및 완충액 5 용출액) 3㎕를 사용한다. 각 경우 활성화제(Gal4 결합 도메인과 폴리글루타민 활성화 도메인으로 이루어진 융합 단백질)를 사용하지 않는 경우와 사용한 경우를 병행하여 반응을 수행한다. 결과를 도 1에 제시하고 설명한다.
실시예 7: 표준 전사 방법으로 수득한 방사선표지된 전사물의 시그날 강도(전사물의 양에 따른 전사 강도의 척도로서)와 상기한 시험관내 전사 방법으로 수득한 시그날 강도와의 비교
전사 반응을 실시예 1 내지 5에 기술한 바와 같이 수행하고 대등한 반응 혼합물을 필터 검정법(실시예 5) 또는 겔 검정법(실시예 4)으로 분석한다. 각 경우 반응용 DNA 주형으로서 200ng의 pMRG5를 사용한다. 일부 전사 반응은 활성화제로서 사용되는 Gal4-VP16 30ng의 존재하에서 수행한다. 결과를 도 3에 제시하고 설명한다.
[표 1]
서열 1a
서열 1b
서열 1c
본 발명은 자동화시킬 수 있으며 유전자 활성에 대한 선택적인 효과를 갖는 특이적인 화학 선도 구조물을 찾기 위한 목적의 효율적이고 경제적인 벌크 선별법에 적합한, 바이러스 및 세포 유전자의 전사를 분석하기 위한 시험관내 방법을 제공한다.
서열 목록
(1) 일반적 정보:
(i) 출원인:
(A) 성명: 훽스트 아크티엔게젤샤프트
(B) 거리: -
(C) 시: 독일
(D) 주: -
(E) 국가: 독일 연방 공화국
(F) 우편번호(ZIP): 65926
(G) 전화: 069-305-7072
(H) 팩스: 069-35-7175
(I) 텔렉스: -
(ii) 발명의 명칭: 천연 산물 및 기타 화학 물질을 선별하기 위한 시험관내 전사 방법
(iii) 서열수: 1
(iv) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.25(EPO)
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 3130개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 원형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키(key): 엑손
(B) 존재 위치: 1..3130
(xi) 서열 기술:
[서열 1a]
[서열 1b]
[서열 1c]
도 1은 여러가지 유전자-조절 성분과 길이가 상이한 G-유리 서열을 갖는 리포터 플라스미드를 사용하는 전사 반응의 방사성 판독 결과를 나타낸다.
도 2는 보편적인 리포터 플라스미드 pGS100을 나타낸다.
도 3은 통상적인 표준 전사 방법과 상기 기술된 세포 비함유 시험관내 전사 방법의 효과를 비교한 것이다.

Claims (7)

  1. a) 하나 이상의 유전자-조절 성분의 조절하에서 표적 DNA 서열을 함유하는 DNA 주형(여기서, DNA 주형은 제한 엔도뉴클레아제 PstI, EcoRI, SacI, KpnI, SacII, BamHI, SwaI에 대한 특이적 절단 부위, 플라스미드 pUC19의 일부, 효모 Ga14 단백질에 대한 5개의 결합 부위, SacII와 BamHI 제한 부위 사이의 사람 T-세포 수용체 Vβ 8.1의 "TATA" 박스, BamHI과 Swal 제한 부위 사이의 아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 개시 영역 및 길이가 대략 800 염기쌍인 G-유리 서열을 함유하며, 도 2에 기재된 개열지도를 갖는 pGS100이다)을 제공하는 단계,
    b) 상기 주형을 핵 추출물 및 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드와 혼합하는 단계,
    c) 상기 주형을 후보 약리학적 활성 물질과 혼합하는 단계,
    d) 표지된 전사물을 고체 매트릭스에 결합시키는 단계,
    e) 과량의 표지된 뉴클레오티드를 제거하는 단계, 및
    f) 표지된 전사물의 양을 대조군 샘플과 비교하여 측정하는 단계를 포함하여, 약리학적 활성 물질을 동정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 c)와 d)의 사이에 DNA 주형을 시험관내 전사시킨 후 반응 혼합물로부터 단백질을 제거하는 단계 c')를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, DNA 주형이 서열 1의 서열을 갖는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, DNA 주형이 DSM 기탁 번호 11450으로 기탁되어 있는 방법.
  5. 제한 엔도뉴클레아제 PstI, EcoRI, SacI, KpnI, SacII, BamHI, SwaI에 대한 특이적 절단 부위, 플라스미드 pUC19의 일부, 효모 Ga14 단백질에 대한 5개의 결합 부위, SacII와 BamHI 제한 부위 사이의 사람 T-세포 수용체 Vβ 8.1의 "TATA" 박스, BamHI과 SwaI 제한 부위 사이의 아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 개시 영역 및 길이가 대략 800 염기쌍인 G-유리 서열을 함유하고, 도 2에 기재된 개열지도를 갖는 pGS100인 DNA 주형.
  6. 제38항에 있어서, 서열 1의 서열을 갖는 DNA 주형.
  7. 제38항에 있어서, DSM 기탁번호 11450으로 기탁되어 있는 DNA 주형.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2786788B1 (fr) * 1998-12-08 2002-04-19 Proteus Procede de criblage de substances capables de modifier l'activite d'une ou plusieurs proteines cibles ou d'un ensemble cible de proteines exprimees in vitro
AU2001292311A1 (en) * 2000-10-02 2002-04-15 Helix Research Institute Method of identifying target gene of transcription factor and method of isolation
US6818396B1 (en) 2000-11-28 2004-11-16 Proteus S.A. Process for determination of the activity of a substance using an in vitro functional test
WO2004007677A2 (en) * 2002-07-11 2004-01-22 The Ohio State University Research Foundation In vitro transcription assay for t box antitermination system
KR101866152B1 (ko) 2008-12-04 2018-06-08 큐알엔에이, 인크. 종양 억제 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 종양 억제 유전자 관련된 질환의 치료
RU2555553C1 (ru) * 2014-05-30 2015-07-10 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Применение гистонного белка в качестве ингибитора аденовирусной трансдукции
JP7279914B2 (ja) * 2017-04-18 2023-05-23 株式会社Ｔｊｍデザイン 携帯工具用ホルダ
EP3953485A4 (en) 2019-04-10 2023-05-17 University of Utah Research Foundation MODULATION OF HTRA1 FOR THE TREATMENT OF ARMD

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996026959A1 (en) * 1995-03-02 1996-09-06 Tularik, Inc. Human transcription factors and binding assays

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5563036A (en) 1994-04-29 1996-10-08 Tularik, Inc. Transcription factor-DNA binding assay

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996026959A1 (en) * 1995-03-02 1996-09-06 Tularik, Inc. Human transcription factors and binding assays

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Biol Chem. 1993 Feb 5;268(4):2525-34 *
J Biol Chem. 1996 Apr 12;271(15):8667-74 *
Proc Natl Acad Sci U S A. 1985 Jul;82(13):4394-8 *
Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Nov;87(21):8545-9 *
The Journal of Biological Chemistry, 268(4), pp. 2525-2534(1993. 2. 5) *

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