CZ72598A3 - Způsob transkripce in vitro vhodný ke screeningu přírodních látek a jiných chemických substancí - Google Patents

Description

Způsob transkripce in vitro vhodný ke screeningu přírodních látek a jiných chemických substancí

Oblast techniky

Vynález popisuje automatizovatelný způsob transkripce in vitro určený k analýze virových a buněčných genů, vhodný k ekonomickému, racionálnímu a hromadnému vyhledání specifických klíčových chemických struktur, které selektivně ovlivňuji genovou aktivitu.

Dosavadní stav techniky

Screening přírodních materiálů na obsah biologicky aktivních látek zaznamenal nový rozmach poté, co se ukázalo, že samotné racionální projektování účinných látek nevede k úspěchu. Proto se vedle knihoven chemických struktur a kombinatorických knihoven znovu dostaly do středu pozornosti klasické extrakty přírodních materiálů jako zdroj substancí. Je to především kvůli rozmanitosti látek obsažených v těchto extraktech. Moderními analytickými metodami se dá dokázat, že extrakty mikrobiální fermentace obsahují asi 500 strukturně výrazně odlišných tříd sloučenin. Svou diverzitou tím zřetelně překonávají chemické a kombinatorické knihovny sloučenin.

Limitujícím faktorem pro farmakologické využití bohatého a dosud málo prozkoumaného potenciálu přírodních látek je množství kompatibilních, dostatečně vypovídajících způsobů, kterými by mohly být potenciálně účinné látky testovány.

Obzvlášť potřebné jsou způsoby, které by mohly být použity k identifikaci vysoce specifických farmakologicky účinných látek, jejichž aplikace je spojena s co možno nejmenšími vedlejšími účinky.

-2Použiti níže popsaného způsobu spočívá v testování schopností látek zasahovat již do prvního kroku přenosu genetické informace - do regulace transkripce genů. Tímto způsobem se mají identifikovat látky, které mohou přímo či nepřímo, pozitivně nebo negativně ovlivnit transkripci.

Síla transkripce elementy tohoto genu, (enhancerem) anebo regulačních elementů transkripčními faktory mohou ovlivňovat míru genu je určena genovými obzvlášť promotorem, silencerem. Působení regulačními zesilovačem genových přenášeno Transkripční faktory i je zprostředkováno a kofaktory.

transkripce genu negativně k síle transkripce. Doposud bylo důležitých mnohých buněčných pochodů, kontroly buněčného cyklu, smrti (apoptóza).

pozitivně a tak přispívat identifikováno množství transkripčních faktorů, molekulárních řadičů průběhu včetně signální transdukce, diferenciace a kontroly buněčné

Většina buňkou přijatých signálů, které ovlivňují sílu transkripce, jsou registrované transmembránovými proteiny, vnitrobuněčně dále přenášené signálním transdukčním systémem a zpracované transkripčními faktory. Mezi proteiny, které přijímají extracelulární signály patří například AMP-vazebné proteiny, senzory pro růstové signály (například sérum response faktor, SRF), receptory pro hormony nebo transkripční faktory, které se podílí na expresy cytokinů; tzv. STÁT proteiny (signál transducers and activators of transcription).

V současnosti je známa celá řada látek, které přímo nebo nepřímo ovlivňují sílu transkripce genů. Takové látky se používají mezi jiným jako farmakologicky účinné látky v lécích, ačkoli jejich účinek není často specifický. Proto je příjem takových léků často spojen s nežádoucími vedlejšími účinky.

• · · · • · · · · · · · ♦ · • · ·· · · · · · • · · · · · · ··· · · • A ♦··· ··· ···· C ·· »· 99 ··

K léčení imunologických onemocnění se například používá lék, který obsahuje jako účinnou látku deriváty cyklosporinu a steroidů. Cyklosporin A tvoři komplex s cyklofilínem. Ten inhibuje kalcineurin, ubikvitní fosfatázu, která defosforyluje proteiny různých metabolických drah. Kalcineurin reguluje například přenos jedné podjednotky transkripčního faktoru NFAT z cytosolu do buněčného jádra (Liu, J. (1993) Immunology Today 14, 290295). NFAT (nuclear factor of activated T-cells) se účastní aktivace několika imunologicky důležitých genů. Cyklosporin A (CsA) reguluje nepřímo ovlivněním NFAT (nuclear factor of activated T-cells) expresi těchto genů. Protože ale Cyklosporin A reguluje aktivitu NFAT nepřímo, totiž prostředníctvým ubikvitního kalcineurinu, působí také skrze jiné metabolické dráhy nefro- a neurotoxicky a zužuje cévy. Kdyby byla známa farmakologicky účinná látka, kterou by byl NFAT specificky a pokud možno přímo bržděn, tak by lék obsahující tuto látku vyvolával zřetelně méně vedlejších účinků.

Také glukokortikoidy se řadí k farmakologicky účinným látkám jejichž použití vede vedle žádaných účinků i k silným vedlejším účinků. Již léta jsou používané ke standardní terapii alergií, revmatická onemocnění, zánětů a jiných onemocněni, kde inhibuji hyperaktivni imunitní systém. Způsobují mezi jiným zbrzdění aktivace buněčně specifického transkripčního faktoru NFkB tím, že stimulují tvorbu IkB proteinu, buněčného inhibitoru NFkB (Scheinmann, R.I., Cogswell, P. C., Lofquist, A.K. a Baldwin Jr., A.S. (1995) Science 270, strana 283 až 286; Auphan, N., DiDonato, J.A., Rosette, C., Helmberg, A. a Karin M. (1995) Science 270, strana 286 až 290) . IkB zabraňuje transferu aktivního NFKB-dimeru do buněčného jádra a tím aktivaci imunologicky důležitého cílového genu, vliv glukokortikoidů na genovou expresi je podobně jako v případě CsA relativně • I · · ·· • · · · · · nespecifický, protože působí nejen NFkB, ale také jiné proteiny.

Tyto příklady ozřejmují skutečnost, že existuje veliká potřeba na farmakologicky účinné látky, které by vykazovaly co možno nejspecifičtější účinky. Aby byly objevený nové chemické klíčové struktury s odpovídajícími vlastnostmi, musi být otestováno množství látek na jejich specifické účinky.

Navzdory identické genové výbavě jsou vždy určité proteiny exprimované v závislosti na buněčném typu a/anebo na určitém onemocněni nebo defektech, jako i na daném vývojovém a diferenciačním stupni jednotlivých buněk. Za základ individuality každé buňky může být pokládán specifický repertoár genových regulačních proteinů, například její vývojově- a buněčně specifické vybavení určitými transkripčními faktory a kofaktory (přídavné proteiny), které regulují koordinovanou a kontrolovanou transkripci odlišných genů.

Specifické farmakologicky účinné látky by měly proto selektivně aktivovat nebo inhibovat transkripci patologicky důležitých genů v buňkách definovaného typu. Pro identifikaci takových látek je zapotřebí způsob transkripce, kterým by byl za definovaných podmínek přímo měřitelný účinek testované látky na transkripci jednotlivých genů, to znamená efekt na regulaci transkripce zúčastněných proteinů a genových regulačních elementů. Protože musí být otestováno množství potenciálně účinných látek, měl by být současně takový způsob jednoduše proveditelný a automatizovatelný.

První bezbuněčný transkripčni systém byl popsán Weilem a dalšími (Weil, P.A., Lůse, D.S., Segall, J., Roeder, R.G. (1979) Cell 18, strana 469 až 484). v případě • · ···· ·· · · • · tohoto in vitro transkripčního systému byly použity zakoncetrované extrakty buněčných jader, tzv. SlOO-extrakty a vyčištěná RNA-polymeráza II (Weil, P.A., Segall, J., Harris, B., Ng, S.Y., Roeder, R.G. (1979) J. Biol. Chem. 254, strana 6163 až 6173) . Bez exogenni RNA polymerázy II však nebyly zakoncentrované, dále nepřečištěné jaderné extrakty schopné transkripce (Weil, P.A., Lůse, D.S., Segall, J., Roeder, R.G. (1979) Cell 18, strana 469 až 484; Dignam J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods in Enzymology 101, strana 582 až 598).

Vycházejíc z takokovýchto jaderných extraktů byly následně vyvinuty postupy, kterými je možno vyizolovat transkripčni faktory prostřednictvím vícestupňových purifikačních kroků. Tyto postupy obsahují mezi jiným také purifikační kroky, při kterých jsou jaderné extrakty chromatograficky čištěné na materiálech vázajících jaderné proteiny, například přes sloupce fosfocelulózy. Dignam a ostatní v rámci svého pokročilého, vícestupňového postupu popsali poprvé použití komerčního Systému P-ll® (Whatman, Maidstone, England) jako jednoho z purifikačních kroků (Dignam J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods in Enzymology 101, strana 582 až 598).

Vícestupňové purifikační procedury byly stále více používány, takže je v současnosti možné z extraktů jader buněk náročnými postupy vyizolovat jednotlivé transkripčni faktory. Mimoto jsou jednotlivé transkripčni faktory po případě jejich podjednotky dostupné i v rekombinantní formě tak, jako například TFIIA, TFIIB, TFIIEa a TFIIF (Zawel, L. a Reinberg, D. (1995) Annu Rev. Biochem. 64, strana 533 až 561) .

V současnosti již proto existují transkripčni systémy, které se skládají ze směsi rekombinantních a přirozeně purifikovaných faktorů. Takové transkripčni • · • · · · • · · · • · · φ φ φ φ φφ • · Φ -φ Φ ΦΦΦΦ Φ • · ΦΦΦΦ ♦ · ·

ΦΦΦΦ φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ «Φ

- 6— systémy jsou však pro sreening s vysokým počtem pokusů technicky náročné a příliš drahé, v jiných transkripčních systémech, například při použití extraktů z buněčných jader místo rekombinantních nebo vyčištěných faktorů, se vyskytuje naproti tomu mnoho vedlejších reakcí. v nedostatečně nebo ve vůbec nepřečištěných jaderných extraktech (hrubé extrakty) se projevují nukleové kyseliny a DNA-vazebné proteiny, například represory jako například histony, které mají rušivý vliv na in vitro transkripci. Nukleové kyseliny vyskytující se v hrubých extraktech ruší především DNA sekvence kódující t-RNA. Protože jsou geny pro t-RNA transkribovány asi 100 krát silněji než geny pro mRNA, vedou tyto t-RNA kódující sekvence ke zvýšení množství nespecifických transkriptů. Nespecifické transkripty musí být pak před prokázáním specifických transkriptů odstraněny prostřednictvím náročných čistících kroků.

Na kvantitativní měření in vitro transkripce byly vyvinuty vektory, ve kterých transkribované DNA sekvence neobsahují žádné guaninové báze (tzv. G-neobsahující sekvence popřípadě G-neobsahující kazety), přičemž se případně na G-neobsahující sekvence připojí sekvenční úsek, který obsahuje mnoho guaninu. Použitím těchto vektorů je možné provést trankripci v nepřítomnosti GTP. Tím jsou transkribovány jenom G-neobsahující sekvence, ale ne Gobsahující sekvence. Tímto způsobem kromě toho obdržíme transkripty, které mají téměř stejnou délku. Sawadogo a Roeder popsali poprvé použití vektoru, ve kterém byla 400 nukleotidová sekvence pod kontrolou ML-(adenovirus major latě) promotoru. Tímto vektorem byly získány transkripty jedné délky o asi 400 nukleotidech (Sawadogo, M. a Roeder, R.G. (1985) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, strana 4394 až 4398).

·· · · • · · « ·· ·· • · · • · · · ·

• · w ·

S pomocí těchto vektorů bylo obdrženo zřetelně méně nespecifických transkriptů, jak bylo mnohokrát popsáno při použití těchto vektorů (viz Goppelt, A., Stelzer, G., Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1996) EMBO J. 15, strana 3105 až 3115; Kretzschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1994) Cell 78, strana 525 až 534; Meisterernst, M., Roy, A.L., Lieu, H.M. a Roeder, R.G. (1991) Cell 66, strana 981 až 993).

Doposud byly ovšem výlučně používány vektory, u kterých G-neobsahující sekvence nepřekročila délku 400 nukleotidů.

Ke kvantitativnímu a kvalitativnímu zhodnocení popsaných transkripčních postupů je transkripce provázena v přítomnosti radioaktivně značených nukleotidů a radioaktivně značené transkripty jsou po přidání fenolu a precipitaci rozděleny na gelu. Tímto způsobem jsou odseparovány nejenom špatně iniciované nebo špatně terminované transkripty, ale také nespecificky značené nukleové kyseliny (například transkripty vzniklé z plazmidu nebo tRNA) a přebytečné nukleotidy od specifických transkriptů. Poměr aktivity přebytečných radioaktivně značených nukleotidů ku radioaktivně značeným transkriptům činí v nepříznivých případech asi 10.000:1, takže značené transkripty musí být asi 10.000 krát zakoncentrovány. To je dosaženo srážením a elektroforetickým dělením. Tyto kroky zakoncentrováni však nejsou vhodné pro hromadné testování, proto musí být vyvinuty alternativní způsoby hromadného odstranění nukleotidů, které však dovolí kvantitativní zhodnocení výsledků transkripce.

Transkripce může být také sledována nanesením reakčního roztoku na membránu, například DEAE-celulózovou membránu. Radioaktivně značené transkripty tak mohou být přímo detegovány na membráně. Doposud však bylo úspěšné « · « «

-8použiti membrán omezeno jenom na důkaz transkriptů z in vitro transkripce, které byly vytvořeny v přítomnosti vyčištěné RNA polymerázy II (Roeder, R. G. (1974) J. Biol. Chem. 249, strana 241 až 248) nebo vyčištěných bazálnich transkripčních faktorů (Ohkuma, Y., Sumimoto, H., Horikoshi, M., Roeder, R.G. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, strana 9163 až 9167). Neexistují žádné důkazy, že by tímto způsobem byly detegovány transkripty, získané pomocí zakoncentrovaných popřípadě přečištěných jaderných extraktů buněk.

Transkripce genů pro screening účinných látek byla již popsána ve WO 96/26959. Byla v něm uveřejněna sekvence pro lidský NFAT (hNFAT) a její možné použití v transkripčním testu, vhodném pro automatizovaný hromadný screening přírodních látek. Oproti způsobu transkripce podle vynálezu se jedná v tomto transkripčním testu o čistě vazební test, při kterém neprobíhá žádná transkripční reakce.

Jiný vazebný test použitelný ke screeningu látek, které mohou inhibovat vazbu transkripčních faktorů na nukleové kyseliny byl popsán v americkém patentu US 5,563,036. Také u tohoto testu nedochází k žádné transkripci.

Další příklad vazebného testu, které jsou rovněž použitelné k vyhledání látek, které potenciálně mohou inhibovat vazbu tumornekrózafaktor-receptor asociovaného proteinu (TRADD) na určité DNA sekvence je popsána v americkém patentu US 5,563,039.

Vynálezu popisuje jednoduchý a reprodukovatelně proveditelný, univerzálně použitelný a především pro hromadný screening vhodný způsob analýzy transkripce genů,

-9·· například buněčných a virových a to za definovaných reakčnich podmínek.

Vynález popisuje způsob bezbuněčné in vitro transkripce DNA templátu, který obsahuje transkribovatelnou DNA-sekvenci ležící pod kontrolou jednoho nebo několika genových regulačních elementů a přičemž

a) k transkripci využívá minimálně jeden značený nukleotid a zakoncentrovaný a eventuálně přečištěný extrakt z buněčných jader. Extrakt může být eventuálně doplněn transkripčními faktory a/nebo kofaktory popřípadě částečně nebo úplně nahrazen.

b) po transkripci jsou proteiny použité v pokusu odseparované a/nebo popřípadě degradované

c) transkript je navázán na pevný nosič

d) přebytečné značené nukleotidy jsou odstraněny

e) stanoví se množství značeného transkriptu

Způsob podle vynálezu zahrnuje vlastní transkripční reakci (a), oddělení specifického transkriptu (b, c, d) a jeho detekci (e) .

Způsob transkripce in vitro podle vynálezu zahrnuje zvláštní způsob oddělení specifického transkriptu, přičemž jmenované pořadí kroků b, c, d je jenom jedna z možností. Oddělení specifického transkriptu ve způsobu podle vynálezu může eventuálně být též realizováno v pořadí kroků c, d, b nebo d, b, c. v určitých formách provedení vynálezu mohou být jednotlivé kroky oddělení transkriptu vynechány. Například může způsob transkripce podle vynálezu zahrnovat jenom kroky a, c, d, e nebo jenom kroky a, c, e nebo jenom a, b, c, e nebo jenom a, b, d, e nebo jenom a, b, e nebo jenom a, d, e.

99

9 9 9

Zvlášním znakem způsobu podle vynálezu je, že vlastni transkripčni reakce (transkripce) jakož i odděleni a detekce specifického transkriptu jsou automatizovatelné. Přitom je možné jednoduché a spolehlivé určeni množství specifického transkriptu získaného za každých podmínek a tím také určení míry transkripce.

Míra transkripce udává, jak často je určitý gen transkribován za jednotku času, eventuálně v popsané transkripčni metodě, jak často je transkribovaná DNAsekvence za časovou jednotku transkribována. Míra transkripce se stanoví množstvím radioaktivně značeného transkriptu obdrženého za definovanou jednotku času.

Způsob podle vynálezu zahrnuje transkripci realizovanou v přítomnosti aktivátorů a/nebo inhibitorů, to znamená v přítomnosti komponent ovlivňujících transkripci pozitivně nebo negativně. Například může být použit transkripce schopný extrakt z jader buněk pro bazální transkripci. Tento systém bazální transkripce může být doplněn aktivátory a/nebo inhibitory, v porovnání s bazální transkripcí vede inhibice transkripce ke snížení míry transkripce a tím ke snížení množství specifického transkriptu za jednotku času, zatímco aktivace transkripce vede ke zvýšení míry transkripce a tím k vyššímu množství specifického transkriptu za jednotku času.

Transkripce genů se dá rozdělit na více kroků - vazba pre-iniciačního-komplexu (PIC), aktivace PIC, iniciace, promotor clearance”, elongace a terminace. Pro iniciaci transkripce jsou potřebné eukaryotní RNA-polymerázy (pro transkripci protein kódujících genů RNA polymeráza II) a DNA vazebné proteiny, které umožňují specifickou interakci RNA polymerázy II s DNA. Tyto DNA-vazebné proteiny se označují jako transkripčni faktory, přičemž obecné transkripčni faktory se v podstatě účastní na interakci s

·· ··· · • · « · · ·

-11promotorem, zatímco specifické zprostředkují interakci genového transkripční faktory regulačního elementu, který je lokalizován ve směru nebo v protisměru promotoru.

Na transkripci eukaryotnich genů participují obecné transkripční faktory TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF a TFIIH. Proteinová frakce zodpovědná za nepatrnou, bazální aktivitu genů, zahrnuje vždy vedle promotoru všechny eventuálně většinu obecných transkripčních faktorů a RNA polymerázu II (RNA pol II) . Bazální aktivity ML-promotoru je možno dosáhnout dík TBP (TATA - vazební podjednotka TFIID), TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH a RNA pol II. Proteinové frakce, která vyvolávají takovou bazální aktivitu jsou označovány jako bazální transkripční systémy. Tento pojem bude dále používán také pro zakoncentrovaný eventuálně přečištěný extrakt z buněčných jader. Transkripce provedená s pomocí bazálního transkripčního systému je označovaná jako bazální transkripci. K provedení bezbuněčné in vitro transkripce je potřebný minimálně bazální transkripční systém, nukleotidy a transkribovatelný DNA-templát.

Pro aktivovanou faktorům transkripčním transkripčnímu transkripční (Kaiser, K., systému faktory a Stelzer, G., transkripci jsou eventuálně k ke obecným bazálnímu specifické proteiny) navíc potřebné kofaktory (přídavné a Meisterernst, M. (1995) EMBO J.

14, strana 3520 až 3527). Specifické transkripční faktory jsou schopné mnohonásobně zesílit malou bazální transkripci určitého genu a řídit frekvenci iniciace transkripce. DNAvazebné proteiny jsou určujícím způsobem zodpovědné za to, jak často je gen transkribovaný (míra transkripce). Na tomto regulačním procesu participují také jiné proteiny, které se nevážou přímo na DNA, ale které prostřednictvím protein-proteinové interakce ovlivňují aktivitu

9999 • 4 ·· • 9

transkripčních faktorů nebo RNA-polymerázy II, jako například kofaktory.

Způsob podle vynálezu zahrnuje pro bazální transkripci použiti zakoncentrovaného extraktu z buněčných jader (jaderný extrakt eventuálně buněčný jaderný extrakt). S ohledem na tento parametr je postup univerzálně aplikovatelný, to platí jak pro použité buňky tak pro použitý eukaryotní druh. Zakoncentrované jaderné extrakty mohou být například získány z lidských nebo zvířecích buněk odvozených z buněčných linií. Obzvlášť jsou vhodné buňky, které mohou být kultivovány a množeny ve velikém měřítku jako například HeLa buňky. Dále mohou být použity extrakty z buněčných jader vybraných buněčných typů, obzvlášť z takových, které se vyznačují svými specifickými transkripčními faktory a/nebo kofaktory exprimovanými v závislosti na buněčném cyklu, na diferenciačním a vývojovém stupni a na zdravotním stavu buňky. Mohou být také použity buněčné typy, kterým náleží centrální role při vzniku onemocnění, jako například buňky imunitního systému (B- a T-buňky).

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu mohou také být jaderné extrakty izolovány ze tkání nebo nádorových buněk. To je obzvlášť výhodné v případech, ve kterých není k dispozici žádná vhodná buněčná linie. Také mohou být použity jaderné extrakty z lehce dostupných tkání, jako ze zvířecích nebo lidských pupečních šňůr, zvířecích nebo lidských transplantačních odpadů, ze zvířecího nebo lidského materiálu z biopsii, ze zvířecích nebo lidských nádorových tkání (například operativně odstraněné tkáně) a ze zvířecí nebo lidské placenty.

Způsob podle vynálezu zabezpečuje, že zakoncentrování jaderných proteinů z buněčných jader čerstvých nebo hluboce zmražených buněk může být uskutečněno podle známých •9 9999

-13postupů, jako je například způsob popsaný Dignamem a dalšími ( viz Dignam, J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods in Enzymology 101, strana 582 až 598; Dignam, J.D., Lebovitz, R.M., Roeder, R.G. (1983) Nucleic Acid Res. 11, strana 1475 až 1489). ve zvláštním provedení způsobu je k přípravě zakoncentrovaných jaderných extraktů použit postup, zahrnující homogenizaci buněčných jader a následnou dialýzu homogenátu.

Důležitá modifikace způsobu podle vynálezu zahrnuje přečištění zakoncentrovaných jaderných extraktů jedním nebo několika, především jednoduchými, purifikačními kroky tak, že extrakty jsou schopné transkripce, to znamená po provedení způsobu podle vynálezu jsou získány specifické transkripty. Extrakt může být například přečištěn chromatograficky. Jeho čištění může být provedeno například na materiálech, které váží jaderné proteiny jako fosfocelulosa, DEAE-celulosa nebo také Heparin-Sepharosa. Alternativně může být použito k čištění sloupců katexů a/nebo anexů nebo specifické afinitní nosiče, například také, na kterých je navázána protilátka nebo oligonukleotidy.

Zvláštní provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje přečištění zakoncentrovaných jaderných extraktů na sloupci fosfocelulosy, především na sloupci Pil® (Pil® Systém, Whatman, Maidstone, England). Další zvláštní provedení způsobu transkripce podle vynálezu zahrnuje přečištění zakoncentrovaných jaderných extraktů jenom jediným krokem, například přes jediný sloupec Pil®, nebo jediný krok s chomatografickým nosičem DEAE-celulosou nebo HeparinSepharosou.

Ve speciálním provedení je jaderný extrakt čištěn na Pil®. Extrakt je nejdřív navázán v přítomnosti pufru, ve kterém je kromě ostatních komponent 0,05 až 0,15 M, nejlépe • ·

		• · · 9 · 9 · «9· ·	9 9 9 · • 9 9 9 · «
		• 999 * 9 9 ♦ · -14-	·♦ ··
0, 1 M	KC1. Během	promytí sloupce nosiče vhodným	pufrem,
který	obsahuje 0.	05 až 0.15 M, nejlépe 0.1 M KC1	j sou z

nosiče vymyty nespecifické a rušící komponenty. Transkripčni komponenty se eluuji z chromatografického nosiče přednostně ve dvou frakcích, přičemž je nejdřív použit pufr například s 0,4 až 0,6 M KC1, přednostně s 0,5 M KC1 a následně pufr s 0,7 až 1 M KC1, přednostně s 0,85 M KC1.

Ve specielním provedení způsobu podle vynálezu je transkripce realizovaná s pomoci zakoncentrovaného, eventuálně přečištěného jaderného extraktu a v přítomnosti exogenní RNA-polymerázy II. Jako RNA-polymeráza může být použita eukaryotní RNA-polymeráza typu II (RNA-polymeráza II), především zvířecí nebo lidská RNA-polymeráza II.

Další forma provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje zakoncentrovaný a eventuálně přečištěný jaderný extrakt, který může být doplněn popřípadě úplně nebo částečně nahrazen přidáním proteinů, například transkripčních faktorů a/nebo s kofaktory (přídavné proteiny). Tyto proteiny mohou být například vyčištěny z jader buněk nebo vyrobeny rekombinantně.

Ve speciální formě provedení způsobu podle vynálezu je jaderný extrakt doplněn transkripčními faktory a/nebo kofaktory. v jiném extrému zahrnuje způsob podle vynálezu transkripce schopnou proteinovou frakci (bazální transkripčni systém) z úplně vyčištěných nebo rekombinantně připravených transkripčních faktorů a/nebo kofaktorů jako i RNA-polymeráz.

Jako transkripčni faktory mohou být použity obecné a/nebo specifické transkripčni faktory eventuálně jejich časti popřípadě jako fúzní proteiny.

·· · · • ·

-15Jako obecné transkripční faktory mohou být použity například TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH, TFIIJ a TBP (TATA-vazebný protein).

Jako specifické transkripční faktory mohou být použity například NFkB, API, NFAT, GATA3, TCF/Lef, CBF, Tat, členové fos/jun rodiny, Oct rodina (Oct-1, Oct-2) a s nimi interagující faktory jako například Bobi, OCA-B nebo OBF, Ets rodina, aktivátory rodiny ATF/CREB proteinů, jaderné receptory jako například PPARcc a odpovídající buněčný typ- specifické izoformy transkripčních faktorů (Kel, O.V., Romaschenko, A.G., Kel, A. E., Wingender, E., Kolachenov, N.A. (1995) Nucl. Acids. Res. 20, 3-16).

Dalšími příklady pro specifické faktory jsou:

1. Protoonkogeny, například jun, fos, ets, mys, bcizoformy a erb

2. Hormonální receptory, například (erb), glukokortikoidní, estrogenové receptory a receptory pro kyselinu retinovou a vitamín D nebo

3. Tumorsupresory, například p53, NF1, WT1, RB

4. Virové patogeny, například proteiny herpes simplex viru jako například vP16 nebo ICP4, papilomaviru, jako například El, E2, E6 nebo E7, adenoviru jako například E1A nebo E2A, cytomegaloviru jako například IE86, viru hepatitidy B jako například pX, HIV viru jako Tat nebo Rev

5. Faktory specifické pro buněčný typ nebo tkáň, jako například myogenní faktory, Pit-1, Oct-2, Pu-1, OCA-B nebo HNF nebo faktory specifické pro T-buňky jako Ets-1, GATA3, TCF/Lef, CBF,

6. STAT-proteiny (signál transducers and activators of transcripption) například cytokinem aktivované • · transkripční faktory jako IL-1 Stát, IL-2 Stát, IL-3 Stát, IL-4 Stát, IL-5Stat, IL-6 Stát, IL-7 Stát, IL-8 Stát, IL-9 Stát, IL-10 Stát, IL-11 Stát, IL-12 Stát (Stát znamená protein sprostředkující interakci) nebo

Proteiny second například.CREB nebo messenger abl transdukční kaskády,

Jaderné receptory, (například závislé na receptory receptory retinové, receptory například cAMPCa²⁺) , nebo IP₃ receptory glukokortikoidní receptory nebo second messenger”receptory, kyseliny steroidní

9.

Genově specifické aktivátory a inhibitory, specifické aktivátory IL-2-genu jako NFkB, NFAT například

API nebo

10. Transkripční faktory exprimované vývojově specificky, v závislosti na diferenciaci a buněčném cyklu.

Kofaktory se účastní přímo nebo nepřímo transkripce prostřednictvím protein-proteinových interakcí a/nebo protein-DNA interakci. Některé kofaktory jsou již v bazálním transkripčním systému, jiné až v aktivovaném transkripčním systému. Kofaktory můžou ovlivnit míru transkripce pozitivně nebo negativně. Jako kofaktory mohou být použity například:

- TBP-asociované faktory (TAFs) , například TAFII₃₀, TAFII₄₀/ TAFII55/ TAFII₆o, AFII110, TAFII₁₅o, TAFII₂₅o (Verrijzer, C.P. a Tjian, R. (1996) Trends Biochem. Sci. 21, strana 338 až 342; TAFs tvoří s TBP TFIID-komplex, přičemž se skládání TAFs v TFIID může značně měnit);

- Mediátory, to znamená kofaktory, které jsou asociované s RNA polymerázou II, jako například CTD (carboxyterminal domain)-interagující proteiny a/nebo represory a/nebo

-17• •00 • 000 • 0 ··

00 0 ·00· • 0 0 0 0 0 00 • 00 · ·· 0000 · • 0000 000 9 ·· ·· 0· ·· aktivátory RNA polymerázy II, obzvlášť RAP 30, RAP 74, RAP 38, SR7 (supresor RNA polymerázy B, SRB), cyklíny nebo kinázy (například CKII);

- obecné kofaktory

- kofaktory obsažené v USA (upstream stimulatory activity)frakci (Kaiser, K. a Meisterernst, M. (1996) Trends Biochem. Sci., 342-345);

- pozitivní kofaktory , například PCI, PC2, PC4 (pl5), PC5, PC6, Dr2 (D represor 2)/PC3, ACF (aktivující kofaktor) , CofA (kofaktor A) , HMG-proteiny (chromatin-associated high mobility group proteins);

- negativní kofaktory, například NC1, NC2 a/nebo

- specifické kofaktory

Způsob transkripce in vitro podle vynálezu dále zahrnuje DNA-templát určený pro transkripci s jedním nebo několika genovými regulačními elementy a transkribovanou DNA-sekvencí.

Předmětem vynálezu je DNA templát, který může být použit v popsaném způsobu k bezbuněčné in vitro transkripci. DNA templát obsahuje jednu nebo několik genových regulačních elementů a jednu transkribovanou DNAsekvenci. DNA templát může ještě navíc obsahovat jiné sekvenční úseky.

Genový regulační element může být známým nebo objeveným genovým regulačním elementem nebo konstrukt z jednoho nebo několika známých a jednoho nebo několika objevených genových regulačních elementů.

Genový regulační element může obsahovat libovolné DNA sekvence podílející se na genové regulaci nebo jejich ·» ·♦·· • · · · * ·

-18fragmenty. vzhledem k genově regulačnímu elementu je DNAtemplát respektive způsob transkripce univerzální, přičemž takový genově regulační element ve výhodném provedení pochází z eukaryotického genu nebo mu odpovídá. Genově regulační element může být rovněž buněčný nebo virový popřípadě syntetický regulační element. ve výhodném provedení vynálezu obsahuje genově regulační element kromě jiných také sekvence DNA, které jsou schopny vázat proteiny, jako jsou například vazebná místa pro transkripční faktory nebo fúzní proteiny. Genově regulační element může rovněž obsahovat sekvenci některého promotoru a/nebo jednu nebo více sekvencí enhancerů a/nebo jednu nebo více sekvencí silencerů. ve výhodném provedení vynálezu může genově regulační element obsahovat přirozené a/nebo umělé promotorové, enhancerové a/nebo silancerové sekvence nebo jejich díly.

Promotor může obsahovat TATA-box a/nebo iniciační oblast (počátek transkripce). Promotor může rovněž obsahovat GC-box a/nebo GAAT-box.

V jednom z provedení DNA-templátu podle vynálezu je jako genově regulační element použit modelový promotor.

Modelový promotor podle vynálezu sestává z promotoru a příslušných vazebných DNA-sekvencí pro proteiny a popřípadě dalších genově regulačních elementů, ve výhodném provedení vynálezu obsahuje modelový promotor jeden TATAbox a jednu oblast pro iniciaci transkripce, v jednom z provedení vynálezu obsahuje modelový promotor TATA-box pocházející z lidského receptoru T-buněk νβθ.Ι a iniciační oblast z promotoru ML. Oba tyto bazální elementy umožňují bazální transkripci in vitro. Mimo tyto elementy obsahuje tento modelový promotor 5 vazebných míst pro kvasinkový protein Gal4. Modelový promotor může být změněn libovolným způsobem, například pomocí metod molekulární biologie.

·· ··«· * ·

Takovou změnou je například vloženi zkoumaného genově regulačního elementu, nebo záměna některé stávající oblasti modelového promotoru za zkoumaný genově regulační element.

Modelový promotor podle vynálezu obsahuje ve výhodném provedení jedno nebo více jedinečných cílových míst pro restikční enzymy, čímž je umožněna další manipulace s tímto promotorem, v jednom z provedení vynálezu se mezi TATAboxem a vazebným místem Gal4 nachází alespoň jedno jedinečné cílové místo pro restrikční enzym.

Do modelového promotoru je možno kromě stávajících protein-vazebných sekvencí (například kromě sekvence Gal4) vložit i další dodatečné sekvence vázající proteiny. To je zvláště zajímavé v případech, kdy se kromě již zkoumaného transkripčního systému předpokládá prozkoumání dalších specifických transkripčních faktorů.

Vynález dále popisuje způsob, ve kterém mohou být spolu s modelovým promotorem použity fúzní proteiny ve funkci aktivtorů a/nebo inhibitorů transkripce. Tyto fúzní proteiny mohou sestávat z nějaké DNA-vazebné domény, jako je například DNA vazebná doména kvasničného proteinu Gal4 a nějaké specifické aktivační domény, jako je například aktivační doména aktivátoru vP16 viru HSV.

Pomocí takovýchto fúzních proteinů mohou být pečlivě analyzovány aktivační a/nebo bez vlivu pozadí inhibiční domény respetkive jejich určité části a jejich vliv na zkoumaný genově regulační element. Je například možné, použít DNA vazebno doménu pocházející z DNA-vázajícího proteinu, který není v použitém transkripčním systému (například zakoncentrovaný jaderný extrakt) vůbec obsažen. Tak může být například bez vlivu pozadí zkoumána aktivační doména transkripčního faktoru ve spojení s kvasničnou doménou Gal4, přičemž se použije zakoncentrovaný extrakt ze savčích buněk protože savčí buňky neobsahují protein Gal4.

·· ··»· ·· ····

-20• 4 ·· • · · ·« · ··«« • · ··<· · · · · • · ·· · * · ··· · * • · ···· · · · ···· · ·· ·· «· ·♦

Jako genově regulační elementy a rovněž jako zkoumané genově regulační elementy mohou být použity definované lidské a/nebo zvířecí a/nebo virové regulační elementy, zvláštěpak regulační elementy patologicky zajímavých genů. Příklady takových genově regulačních elementů jsou například regulační sekvence adhezivních molekul, růstových faktorů, fosfodiesteráz, fosfatáz, kináz, ATP-áz, membránových receptorů, receptorů aktivovaných sekundárními posly, receptorů hormonů jako jsou například receptory pro steroidní hormony, metaloproteáz, imunofilinů, NO-syntázy,

5-lipoxygenáz nebo cílových elementů pro imunitní systém, jako jsou například regulační elementy cytokinů, například interleukinů, promotorů genů specificky exprimovaných v Tnebo B-lymfocytech, například receptor CD4, TCR nebo BCR, dále pak promotory genů specificky exprimovaných v lymfoidních buňkách tedy například promotory genu pro TNF (faktor nekrotizující tumory) nebo regulační elementy retrovirů specificky napadajících T-lymfocyty jako je například virus HTLV-1 nebo HIV-1.

Výhodným rysem způsobu podle vynálezu respektive modelového promotoru podle vynálezu je, že jako genově regulační elementy mohou být použity jak promotory obsahující TAT-box, jako je například promotor genu pro interleukin-2 (IL-2), tak i promotory, které TATA-box neobsahují, jako je například promotor genu β-řetězec receptorů T-buněk. Tak mohou být například promotory, které neobsahují TATA-box, integrovány do modelového promotoru nebo do univerzálního reportérového plazmidu pGSlOO a mohou být použity pro transkripci.

DNA sekvence podle vynálezu neobsahuje alespoň jednu nukleotidovou bázi. ve výhodném provedení neobsahuje transkribovaná sekvence žádný guanin nebo žádný cytosin nebo žádný thymin. v dalším výhodném provedení neobsahuje

-21···· ·· ·· ♦ · ·· • · * · · · ···· ·· · · · · ♦ ·· • 4 « · · ··»♦··· • · · · · · · · · ···« · ·· ·· ·· ·· transkribovaná sekvence více nukleotidových baží, neobsahuje tedy například guanin a thymin nebo guanin a cytosin nebo cytosin a thymin.

Používají se zejména sekvence bez guaninu, thyminu nebo cytosinu o délce více než 400 nukleotidů, ve výhodném provedeni vynálezu o délce mezi 400 a 2000 nukleotidy nebo delší. Zvláště výhodné jsou sekvence o délce přibližně 500,600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 5000 nebo více nukleotidů. Zejménapak jsou výhodné sekvence bez výskytu jednoho z uvedených nukleotidů o délce přibližně 800, 1200, 1600 a 2200 nukleotidů.

DNA te^mlátem může být lineární nebo cirkulární DNA sekvence, vhodným templátem může být například lineární DNA sekvence připravená pomocí PCR nebo plazmid.

Jedno z provedení DNA tepmlátu podle vynálezu představuje plazmid, který sestává z vektoru nebo jeho části, modelového promotoru a jedné DNA sekvence vhodné pro transkripci, která nepřiklad neobsahuje guanidové, thyminové nebo cytosinové nukleotidy.

Vynález popisuje univerzálně použitelný reportérový plazmid. Tento univerzální reportérový plazmid obsahuje unikátní cílová místa pro restrikční enzymy Pstl, EcoRI, Sací, KpnI, SacII, BamHI, Swal, část plazmidu pUC19, pět vazebných míst pro kvasinkový protein Gal4, TATA-box z genu pro lidský T-buněčný receptor νβ 8.1, který je umístěn mezi restrikční místa pro enzymy SacII a BamHI, iniciační oblast (INR) ML-promotoru (hlavní pozdní promotor adenoviru), která je umístěna mezi restrikční místa pro enzymy BamHI a Swal a jednu sekvenci bez guanidinů o délce přibližně 800 nukleotidových párů. Modelovým promotorem v tomto univerzálním reportérovém plazmidu je syntetický promotor, ·· φφφ» • Φ ····

ΦΦ φφ • φ φ * · φ · · • · · · · φ φφ • φ · · φ φ Φ·Φ · φ φ φφφφ φφφ φ φφ φφ φφ φφ který obsahuje pět vazebných míst pro kvasinkový protein Gal4, unikátní cílová místa pro restrikční enzymy Pstl, EcoRI, Sací, Kpnl, SacII, BamHI a Swal, TATA-box z genu pro lidský T-buněčný receptor νβ 8.1 a INR z promotoru ML. Do tohoto promotoru lze integrovat libovolné zkoumané genově regulační elementy. Rovněž lze jednotlivé součásti nebo celý tento modelový promotor odstranit a nahradit zkoumanými regulačními sekvencemi.

Jedno z provedení univerzálního reportérového plazmidu podle vynálezu bylo označeno jako pGSlOO a je znázorněnéo na obrázku 2.

Reportérový plazmid pGSlOO obsahuje syntetický promotor na nukleotidových pozicích 2168 až 2337. Úsek pro iniciaci transkripce z hlavního pozdního adenovirového (MLmajor latě) promotoru se nachází na pozicích 2322 až 2337 a oblast obsahující TATA-box z promotoru genu pro lidský Tbuněčný receptor νβ 8.1 se nachází na pozicích 2289 až 2316. Pět vazebných míst pro protein Gal4 z kvasinek se nachází v pozicích 2168 až 2260.

Jiné provedení univerzálního reportérového plazmidu pGSlOO je popsáno nukleotidovou Sekvencí id.č. 1 v tabulce 1.

Další provedení univerzálního reportérového plazmidu pGSlOO bylo uloženo u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur s.r.o. (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig pod přístupovým číslem DSM- 11450 podle ustanoveni Budapešťské smlouvy. Doklad o uložení mikroorganismů je přiložen.

Vynález dále popisuje způsob, kterým jsou proteiny, které by svoji přítomností přímo nebo nepřímo znemožňovaly jednoznačnou detekci specifického transkriptu, bezprostředně po transkripci odděleny a/nebo degradovány.

• · · · vhodnými způsoby pro takovéto odděleni a/nebo degradaci jsou zvláště jednoduché kroky, jak například takové, kdy se průběh reakce chemickým a/nebo mechanickým a/nebo enzymatickým způsobem zastaví a zároveň se odpovídajícím způsobem transkript zbaví rušivých proteinů tak, aby mohly být v následujícím kroku odděleny přebytečné značené nukleotidy od specifického transkriptu například promýváním.

V jednom z provedení způsobu podle vynálezu mohou být například bezprostředně po transkripci rušivé proteiny degradovány pomocí proteáz. Jako vhodné proteázy k tomu mohou být použity například zinkové proteázy, serinové proteázy, thiolové proteázy a karboxy proteázy. ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu mohou být použity například proteináza K, trypsin, chymotrypsin, karboxypeptidáza A, papain a pepsin. ve zvláště výhodném provedení způsobu podle vynálezu může být po transkripci provedeno štěpeni proteinázou K.

Pro stanovení rozsahu transkripce to jest transkripční rychlosti je nutno určit množství specifického transkriptu.

Vynález dále popisuje způsob transkripce v přítomnosti značených nukleotidů, nebo značení specifického transkriptu po ukončení transkripce. Transkript může být například značen bez použití radioizotopů pomocí odpovídajících neradioaktivnich značených nukleotidů. Jako vhodné značky pro toto značení nukleotidů lze použít například fluorescenční skupiny jako je dansyl (N-dimethyllaminonaftyl- 5- sulfonyl), fluoresceinové nebo kumarinové deriváty nebo chemiluminescenční skupiny jako jsou deriváty akridinu. Uvedené skupiny umožňují přímý důkaz specifického transkriptu. Kromě toho mohou být použity značící skupiny které umožňují nepřímý důkaz specifického transkriptu.

• · ·· · · · · · · ·· • · ·· · ···· • · ·· · · · · · · ·· • · · · · · · 9· ~ _t 9999 9 99 99 9999

-24Takovými skupinami jsou například dlgoxigenin, který je možno dokázat pomocí specifických protilátek například v ELISA testu, biotin který lze prokázat pomocí interakce s avidinem, linkery s kovalentně vázanými skupinami, které umožňují dodatečnou derivatizaci nějakou detekovatelnou skupinou. Příkladem posledně uvedených značek jsou například aminoalkylové linkery, které se po transkripci substituují aktivním akridiniovým esterem s chemiluminescenční sondou a lze je pak snadno detekovat.

Vynález dále popisuje transkripci v přítomnosti radioaktivně značených nukleotidů. Tyto nukleotidy mohou být značeny například fosforem (³^p nebo ^3pj sírou (³^S) nebo tritiem (¾)

Vynález dále popisuje způsob, při kterém jsou specifické transkripty odděleny od reakční směsi vazbou na pevnou fázi (pevný nosič). Příkladem takové vazby může být vazba na povrch mikrotitrační destičky, nebo vazba specifického transkriptu na speciální filtr, membránu nebo jiný pevný nosič, zvláště pak na nabitou membránu nebo nabitý filtr výhodně nylonový nebo nitrocelulózový a zvláště výhodně vazba na membránu, která obsahuje nabité skupiny jako jsou například diethylaminoethylové skupiny. Takovou posledně jmenovanou membránou je například DEAEcelulózová membrána. v tomto provedení způsobu podle vynálezu se specifické transkripty navázané na pevném nosiči promývají a zbavují tak přebytečných značených nukleotidů tak, aby byla zajištěna jednoznačná detekce specifického transkriptu.

Je zajímavé, že tímto způsobem lze získat stejně jednoznačné specifické signály jako při tradičním dělení a detekci, které sestává z fenolizace, precipitace a dělení transkriptu na denaturujícím gelu, viz příklad 7 a obrázek 4.

φ · · · · · • · · ·

-25podle vynálezu je signálů vyvolaných přítomnosti například nebo

Způsob specifických transkripcí v transkripce) které jsou sedminásobkem, výhodně pak osminásobkem, výhodně devíti- až kterou udává bazální nebo inhibitoru (viz vhodný pro odlišení například specifickou aktivátoru (aktivovaná inhibitoru (inhibovaná transkripce) , zvláště desítinásobkem signálu bazální linie, transkripce bez přítomnosti aktivátoru příklad 7 a obrázek

4) .

Jednu vyhledávání Je-li třeba je možno použít k aktivních látek.

účinek) provede látek, v z důležitých forem vynálezu (screeningu) farmakologicky otestovat aktivitu (aktivační nebo inhibiční potenciálních farmakologicky aktivních látek, se transkripce v přítomnosti těchto testovaných takovém případě mohou být jednotlivé komponenty, například zakoncentrovaný jaderný extrakt, předem inkubovány s testovanou účinnou látkou.

Kromě toho lze specifitu testované účinné látky ještě blíže charakterizovat tak, že se transkripce provede vícekrát paralelně v přítomnosti testované účinné látky, transkripčních reakcí obsahuje rozdílné lze srovnat dosažené transkripční přičemž každá z komponenty. Pak rychlosti.

účinnými a/nebo knihoven.

látkami látky

Přírodní živočichů, mohou být například z chemických nebo látky mohou například nebo j sou z rostlinných

Testovanými přírodní látky kombinatorických pocházet z rostlin, živočišných sekretů, zvláště pak z mikroorganismů jako například houby, kvasinky, bakterie nebo řasy.

lze

Podle dalšího provedení způsobu podle vynálezu transkripcí v přítomnosti testované účinné látky, transkripčního faktoru, kofaktoru nebo buněčně specifického jaderného extraktu a paralelní transkripcí v nepřítomnosti

-26testované účinné látky, transkripčního faktoru, kofaktoru nebo buněčně specifického jaderného extraktu za jinak stejných podmínek stanovit z rozdílných množství značeného transkriptů aktivační respektive inhibiční účinek testované účinné látky, transkripčního faktoru, kofaktoru nebo buněčně specifického jaderného extraktu na studovaný genově regulační element, respektive gen.

Vynález dále popisuje způsob, jímž lze stanovit účinek studovaného, na genové regulaci se podílejícího proteinu pomocí paralelně provedených transkripcí s a bez tohoto proteinu a za jinak stejných podmínek.

Vynález dále popisuje

a) alespoň dvě za stejných podmínek paralelně provedené transkripce při kterých

b) se jednotlivé reakční směsi pro transkripci liší jenom v tom, že obsahují rozdílná množství testované látky a/nebo alespoň jednoho z transkripčních faktorů a/nebo alespoň jednoho kofaktoru a/nebo zakoncentrovaného jaderného extraktu

c) bezprostředně po skončení transkripce se stanoví množství značeného transkriptů

d) z rozdílů množství získaného transkriptů se stanoví účinnost a/nebo specifita testované účinné látky, transkripčního faktoru, kofaktoru a/nebo zakoncentrovaneného jaderného extraktu vzhledem ke genově regulačnímu elementu.

Způsob podle vynálezu umožňuje cíleně otestovat účinek každé jednotlivé komponenty, která je obsažena v reakční směsi pro transkripci například na jaderný extrakt (to jest na určitý typ buňky) nebo na určitý transkripční faktor. Například je možné stanovit vliv určité studované

9

9 99

9

9 99

účinné látky na definovaný genově regulační element. Rozhodující je přitom to, že reakční podmínky pro transkripci mohou být předem exaktně definovány.

Způsob podle vynálezu tak umožňuje cíleně ovlivnit patologickou genovou expresi pomocí jednotlivých faktorů. Lze přitom stanovit odpovídající vhodné reakčni podmínky výběrem genově regulačních elementů jakož i transkripčních faktorů a/nebo kofaktorů a/nebo buněčně specifických jaderných extraktů, které lze všechny velmi přesně nastavit na požadovanou úroveň.

Ozvláštni výhodou způsobu podle vynálezu je, že s jeho pomocí lze identifikovat farmakologicky účinné látky, které mohou za definovaných podmínek ovlivňovat pozitivně nebo negativně transkripci, zvláště pak takové, které mohou aktivovat nebo inhibovat definovaného cílového genu, přičemž takové účinné látky mají specifický účinek na genově regulační elementy a/nebo definované transkripčni faktory, kofaktory, a/nebo buněčně specifické jaderné extrakty (respektive buňky).

Vynález dále popisuje použití způsobu podle vynálezu k identifikaci specifických farmakologicky účinných látek. Způsob podle vynálezu může být například použit pro charakterizaci testované účinné látky za definovaných podmínek. Způsob podle vynálezu může být dále například použit při dalším testování specifity takto identifikované účinné látky za definovaných podmínek. Například by měla takováto účinná látka identifikovaná způsobem transkripce podle vynálezu inhibovat nebo aktivovat transkripci DNAsekvence pod kontrolou přilehlých genově regulačních elementů.

Další zvláště výhodnou vlastností způsobu podle vynálezu je, že všechny reakční kroky lze jednoduchým • · • · • · · ·

-28způsobem automatizovat. Lze přitom například použít pipetovacího robota Biomek 2000® (Beckman, Mnichov) napojeného na modul pro práci se zásobními roztoky. Na pevnou fázi navázané transkripty lze poté manuálně nebo automaticky promýt.

Vynález popisuje provedení, ve kterém je pipetovací robot, například Biomek 2000® dostatečně vybaven jednotlivými komponentami reakce, jako jsou proteinová frakce (jaderný extrakt a další proteiny), DNA templát, transkripční pufry, testované účinné látky, pipetovací špičky, mikrotitrační destičky a membrány. Z těchto komponent jsou poté například v jamkách mikrotitrační destičky sestaveny jednotlivé reakční směsi, přičemž se všechny pipetovací kroky provádějí automaticky. Tímto způsobem lze při nepatrných reakčních objemech, zvláště při objemech menších než 10 μΐ, výhodně při objemech mezi 10 až 50 μΐ a zvláště výhodně při objemech 20 μΐ sestavit najednou 96 nebo více různých reakčních směsí na jedné mikrotitrační desce. Při délce transkripčních reakcí mezi 1 až 1,5 hodiny lze při optimálním využití inkubačnbích časů tímto způsobem provést za jeden den až 1000 a více transkripčních reakcí.

Transkripce může být prováděna například při teplotách mezi 20 až 50°C. Zvláště výhodné je provedení transkripce podle vynálezu při teplotě přibližně 30°C.

Protože testované účinné látky, transkripční faktory, kofaktory a popřípadě i zakoncentrované jaderné extrakty jsou k dispozici pouze v malých množstvích a musejí být otestovány za velkého počtu podmínek, je nutné, aby ve využít co možná nejmenšího výsledků reakce). Proto je kombinací různých reakčních způsobu podle vynálezu šlo množství sondy (k detekci důležité, že způsob podle

9 • 9 vynálezu je možné provádět i nanolitrových měřítcích, to jest při reakčních objemech 50 až 500 nl.

Způsob transkripce podle vynálezu je všeobecně použitelný. Může být použit například k identifikaci a charakterizaci genově regulačních elementů (t.j předmětem zkoumání je specifický gen), transkripčních faktorů a/nebo kofaktorů a/nebo dalších proteinů, které se nějakým způsobem přímo nebo nepřímo podílejí na regulaci genové transkripce (t.j předmětem zkoumání je specifický protein) a/nebo zakoncentrovaných jaderných extraktů (t.j předmětem zkoumání je specifický jaderný extrakt respektive buněčný typ). Způsob transkripce podle vynálezu může být také použit k identifikaci nových patologicky zajímavých genově regulačních elementů a pro správné přiřazení těchto elementů ke genově regulačním proteinům, které jejich účinek zprostředkovávají.

Ve srovnání se standardními buněčnými testy má způsob transkripce in vitro podle vynálezu vyšší cílovou specifitu. Na rozdíl od buněčných testů nemá na účinnost transkripce vliv přijeti jednotlivých komponent buňkou. Kromě toho lze způsob transkripce podle vynálezu provést snadno a rychle (například jednotlivé komponenty mohou být připraveny dopředu a zamraženy) . Způsob podle vynálezu lze rovněž snadno standardizovat a univerzálně nastavit tak, aby byl aplikovatelný v podstatě na všechny buněčné typy a všechny geny.

Pomocí způsobu podle vynálezu mohou být identifikovány farmakologické účinné látky vhodné pro přípravu léčiv. Účinné látky identifikované pomocí způsobu transkripce podle vynálezu by měly vyvolávat podstatně méně vedlejších účinků než známé účinné látky. Tak mohou být například připraveny, otestovány respektive identifikovány účinné látky vhodné pro výrobu léčiv použitelných pro léčbu

-30« · • · · · • · · ·

(auto-) imunitních onemocnění, metabolických poruch, onemocnění srdce a oběhové soustavy, infekční nemoci, revmatismus, diabetes, degenerativní a psychická onemocnění. Zvláště pak mohou být takové účinné látky požity pro výrobu léčiv pro léčbu revmatické artritidy, roztroušené sklerózy, str 27, diabetes mellitus, alergií, astmatu, anafylaxe, atopické dermatitidy, Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci, AIDS, CreutzfeldJacobsovy nemoci, epilepsie, schizofrenie, arteriosklerozy a tuberkulózy.

Kromě toho umožňuje způsob transkripce in vitro podle vynálezu mnoho dalších použití. Způsob podle vynálezu může být použit například ve zvířecí patologii a živočišné výrobě, v ochraně rostlin , a rostlinné výrobě k vyhledání specifických farmakologicky účinných látek. Odpovídající systém pro bazální trenskripci je přitom odvozen od příslušného organismu a jsou přitom použity příslušné specifické genově regulační elementy, transkripční faktory a/nebo kofaktory a/nebo další proteiny, které se přímo nebo nepřímo podílejí na transkripčních reakcích.

V principu lze použít způsobu transkripce podle vynálezu i k identifikaci látek použitelných pro konzervaci materiálů a potravin, přičemž se analogicky použijí příslušné genově regulační elementy, transkripční faktory a/nebo kofaktory mikroorganismů, například kvasinek, hub, bakterií nebo hmyzu.

Stručný popis obrázků:

Obrázek 1: Množství výsledných radioaktivně značených transkriptů z reakcí, při nichž byly použity rozdílné genově regulační elementy a reportérové plazmidy , které se lišily délkou sekvence bez G-nukleotidů.

• · · ·

-31• ♦ 4 44 4 4 · 44 • · 44 ·····

4 44 4 ·· 4444· • 4 444«·«· ····· ·· · · ·« ·«

Jde o srovnání dvou standardních promotorů s univerzálním reportérovým plazmidem pGSlOO ( viz obrázek 2) . Transkripčni reakce byly provedeny tak, jak je popsáno v příkladu 6. významy jednotlivých symbolů jsou následující:

A) Bazální transkripce. Množství radioaktivního transkriptu (v relativních jednotkách) získané bez aktivace promotoru (bazální úroveň signálu).

B) Aktivovaná transkripce. Množství radioaktivního transkriptu (v relativních jednotkách) získané po aktivaci promotoru proteinem Gal4-polyglutamin.

I) Jako reportérový plazmid byl použit pMRGS (viz

Kretschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meisterernst, M., (1994), Cell 78, strana 525 až 534.

Syntetický promotor v tomto plazmidu obsahuje TATAbox z promotoru HIV, iniciátor ML promotoru a přibližně 400 nukleotidů dlouhou sekvenci bez Gnukleotidů ve vektoru pUC19.

II) Jako reportérový plazmid byl použit pVpML. Tento reportérový plazmid je zkonstruován stejně jako plazmid pGSlOO, pouze místo 800 baží dlouhé sekvence bez G-nukleotidů obsahuje pouze 400 baží dlouhou sekvenci.

III) Jako reportérový plazmid byl použit plazmid pGSlOO, který obsahuje přibližně 800 baží dlouhou sekvenci bez G-nukleotidů.

Srovnávány byly vždy hodnoty bazální (A) a aktivované (B) transkripce. Jako aktivátor byl použit fúzní protein obsahující vazebnou doménu proteinu Gal4 (94 N-koncových aminokyselin) a polyglutamovou aktivační

-32doménu (syntetický peptid sestávající z 11 glutamových kyselin). Jde o absolutní hodnoty v relativních jednotkách tak, jak byly získány z fosfoimageru po odečtení pozadí. Při transkripcích, ve kterých byl použit plazmid pGSlOO bylo dosaženo rovněž vyšších absolutních hodnot díky tomu, že vložený syntetický promotor je ve srovnání s promotorem z plazmid pMRG5 silnější. Mimo to je patrný pozitivní vliv sekvence bez G-nukleotidů, která je delší než 400 baží.

Obrázek 2: Univerzální reportérový plazmid pGSlOO.

Univerzální reportérový plazmid pGSlOO obsahuje jako modelový promotor syntetickou promotorovou oblast přibližně 800 párů baží bez G nukleotidů v plazmidu pUC19. Mezi restrikčními místy pro enzymy BamHI a Swal se nachází iniciační oblast adenovirového ML promotoru. Mezi restrikčními místy pro enzymy SacII a BamHI se nachází úsek s TATA-boxem z genu pro lidský

T-buněčný receptor νβ8.1.

Oba tyto základní promotorové elementy bazální transkripci hledáni specifického (iniciátor a TATA-box) umožňují v podmínkách in vitro. Při okolí pro určitý cílový gen je možné tyto jednotlivé úseky zaměnit za odpovídající úseky studovaného genu (odpovídající genově regulační elementy). Do polylinkeru proti směru transkripce od bazálního promotoru je možno vložit libovolný regulační element cílového genu (specifická aktivace). Popřípadě lze vyměnit celou promotorovou oblast. Po směru transkripce od polylinkeru (SacII až Pstl) se v plazmidu pGSlOO nachází pět vazebných míst pro kvasinkový protein Gal4. To umožňuje analýzu syntetických transkripčních aktivátorů například jako • · • · · · · ·

-33fúznich proteinů, které obsahují libovolnou aktivační doménu (například transaktivátor vP16 viru herpes simplex) a DNA-vazebnou doménu proteinu Gal4. Nezbytným stavebním prvkem plazmidu pGS je sekvence bez G-nukleotidů.

Obrázek 3: Srovnání účinnosti standardního způsobu transkripce a způsobu transkripce in vitro podle vynálezu.

Na obrázku je znázorněno srovnání síly signálu (jakožto měřítka pro množství transkriptu a tím i síly transkripce), který byl získán za různých reakčních podmínek. Transkripční reakce byly provedeny tak, jak je popsáno v příkladu 7. významy jednotlivých symbolů jsou následující:

A) Standardní způsob transkripce, při kterém je transkript fenolizován, srážen ethanolem a poté zbaven proteinů a přebytečných nukleotidů pomocí denaturující gelové elektroforézy.

B) Způsob transkripce in vitro podle vynálezu, při kterém je transkript zbaven proteinů pomocí proteinázy-K a přebytečných nukleotidů jejich vypláchnutím z DEAE-filtru s navázaným transkriptem

I) pro transkripci byl použit transkripce schopný extrakt z jader HeLa buněk přečištěný na koloně Pil® bez odpovídajícího

DNA-templátu (kontrolní experiment)

II)

Bazální transkripce:

k reakční směsi jinak odpovídající bodu I byl přidán

DNA-templát z reportérového plazmidu pMRG5 a byla provedena transkripce. Tímto způsobem byla získána bazální úroveň signálu.

• · · · · · • ·

-34III)

Aktivovaná odpovídaj ici transkripce, DNA-vazebné transkripce:

bodu II reakční směsi jinak byl přidán aktivátor fúzní protein sestávající kterým byl domény proteinu Gal4 a aktivační doménu vP16 (Gal4-VP16).

Tímto způsobem signálu.

Poté byla byla provedena transkripce, získána aktivovaná úroveň

IV) k reakční směsi j inak j akožto přidán a-amanitin (kontrolní experiment).

odpovídající bodu III byl inhibitor RNA-polymerázy

Ze srovnání síly signálu, který byl získán za různých reakčnich podmínek dvěma různými způsoby vyplývá, že jak bazální (II) tak i aktivovaná (III) transkripce způsobem in vitro podle vynálezu je měřitelná, přičemž je síla signálu srovnatelná se standardním způsobem transkripce.

Rozhodujícím faktorem je to, že je měřitelná i úroveň bazálního signálu, což umožňuje použití způsobu podle vynálezu i ke screeningu inhibitorů transkripce. Pomocí specifického inhibitoru RNA-polymerázy II α-amanitinu bylo dosaženo zhruba 8-násobné zeslabení signálu (srovnej III a

IV)

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava jaderných extraktů HeLa-buněk

Jaderné extrakty se připravují z izolovaných jader buněk HeLa. Jádra HeLa buněk jsou komerčně dostupná a dodávají je • · ♦ ·

-35například firmy 4°C, Mons; Sigma, Mnichov; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg.

Dále popisované zpracování buněčných jader se provádí při teplotě 4°C, tzn. ve chladové místnosti. Popisované pufry se nastaví na hodnotu pH 6,8 pomocí Tris-báze za pokojové teploty, což odpovídá pH 7,3 při teplotě 4°C. K pufrům se přidá DTT (dithiotreitol) z 1M vodného zásobního roztoku do konečné koncentrace 5 mM a PMSF (fenylmethylsulfonyl fluorid) z 200mM zásobního roztoku v DMSO (dimethylsulfoxid) tak, aby jeho výsledná koncentrace činila 1 mmol/1.

Zpracování buněčných jader zahrnuje následující kroky:

1. Buněčná jádra se nechají roztát na ledu a stanoví se objem NPV (nuclear pellet volume- objem jaderné pelety)

2. NPV se rozdělí na dvě stejné části a vždy jedna polovina se přidá do jedné ze dvou kyvet. První kyveta obsahuje pufr 0,02 M KC1 (pufr s nízkým obsahem solí: 20 ml 1M Tris pH 6,8 za pokojové teploty, 250 ml 100% glycerinu, 6,67 ml 3M KC1, 1,5 ml 1M MgC12z 0/4 ml 0,5M EDTA, destilovaná voda do 1000 ml, zatímco druhá obsahuje 1,2M KC1 pufr s vysokým obsahem solí: 20 ml 1M Tris pH 6,8 za pokojové teploty, 250 ml 100% glycerinu, 400 ml 3M KC1, 1,5 ml 1M MgC12/ 0,4 ml 0,5M EDTA, destilovaná voda do 1000 ml.

Ke každému z pufrů se přidá 0,0007-násobek NPV/2 βmerkaptoethanolu a 0,001-naásobek NPV/2 0,2M PMSF.

Peleta se resuspenduje v 1/2 objemu 0,02M KC1 pufru a opatrně se homogenizuje (6x).

000 ·· «000 • ·

3. K homogenátu v kádince se v průběhu 30 minut po kapkách přidává za stálého míchání 1,2M KC1 pufr. Extrakce se ukončí po dalších 30 minutách. Poté se homogenát 30 minut centrifuguje při teplotě 4°C na centrifuze Beckman v rotoru SS-34 při 14.000 ot.min“ !. Peleta se oddělí od supernatantu, který je dále zpracováván.

4. Supernatant se nechá dialyzovat proti pufru 1 (40 ml

M Tris pH 6,8 za pkojové teploty, 400 ml glycerinu, 0,8 ml 0,5M EDTA, destilovaná voda do 2000 ml) tak dlouho, dokud se nadosáhne vodivosti supernatantu srovantelné s pufrem 2 (40 ml 1 M Tris pH 6,8 za pkojové teploty, 400 ml glycerinu, 0,8 ml 0,5M EDTA,

66,7 ml 3M KC1, destilovaná voda do 2000 ml), tzn. asi 45 až 55 minut.

5. Dialyzovaný suernatant se při teplotě 4°C zcentrifuguje na centrifuze Beckman v rotoru SS-34 při 18.000 ot.min^-l. jederný extrakt buněk HeLa se nachází v supernatantu a bude dále označován jako HeLa NE - HeLa Nuclear Extrakt. Alikvoty tohoto extraktu se zamrazí v kapalném dusíku. Peleta po extrakci jader se převede do homogenizátoru, kde se k ní přidá 10 ml TGME/5mM DTT (TGME na 11: 250 ml 100% glycerinu, 50 ml Tris pH 7,3 za pokojové teploty, 5 ml 1M MgC12z 0,2 ml 500mM EDTA pH 8,0). v homogenizátoru se 20-krát silně protře pístem a zamrazí v kapalném dusíku (HeLa jaderná peleta).

• · ···· «· ·««·

-37Příklad 2: Příprava fosfocelulózové kolony pro purifikaci jaderného extraktu

1. Médium Pil® pro chromatografické kolony se několikanásobně promyje vodou. Stanoví se objem materiálu po nabobtnáni.

2. Přidá se pětinásobek objemu 0,5N NaOH a pět minut se nechá působit. Poté se hned odsahe přes skládaný filtr.

3. Kolona se promývá vodou, až pH dosáhne hodnoty 11.

4. Přidá se 25-násobek objemu 0,5 N HC1, která se opět nechá působit pět minut a poté se hned odsaje přes skládaný filtr.

5. Kolona se promývá vodou, až pH dosáhne hodnoty 3

6. Kolona se promývá pufrem s 1M Tris o pH 7 až se pH ustálí na hodnotě 7. Připravené médium se skladuje při teplotě 4°C. Nejlépe je nechat ekvilibrovat přes noc.

Příklad 3: Chromatografická purifikace jaderného extraktu na fosfocelulóze

Kapacita média Pil® činí přibližně 10 mg proteinu na 1 ml média. Chromatografie byla provedena následujícím způsobem:

1. Kolona se naplní médiem Pil® a pak se ekvilibruje pufrem 2 s čerstvě přidaným DTT a PMSF, viz příklad

1. Kolona se připojí k tlakové pumpě.

2. Na kolonu se nanese jeden objem jaderného extraktu v pufru 2 (CV)/h.

3. Kolona se promyje 5 objemy pufru 2 (5 až 10 CV/h).

• 0 0000		····		00
• · 0	• 0	0	0 0 0	0
0 ·	• ·	0	• ·	00
• «	• · ·	•	• 00* ·	•
• ·	• 0	• ·	• 0	0
• 000 0	··	··	• 0	··

4. Kolona se eluuje pufrem 3 (40 ml 1 M Tris pH 6,8 za pokojové teploty, 400 ml glycerinu, 0,8 ml 0,5M EDTA, 200 ml 3M KC1, destilovaná voda do 2000 ml; 2 CV/h) . Poté co se z kolony přestanou uvolňovat proteiny, nechají se kolonou ještě projit další 2 objemy pufru

3.

5. Kolona se eluuje pufrem 4 (40 ml 1M Tris pH 6,8 za pokojové teploty, 400 ml glycerinu, 0,8 ml 0,5M EDTA, 333 ml 3M KC1, destilovaná voda do 2000 ml; 2 CV/h) a sbírají se frakce s píky.

6. Kolona se eluuje pufrem 5 (40 ml 1 M Tris pH 6,8 za pokojové teploty , 400 ml glycerinu, 0,8 ml 0,5M

EDTA, 567 ml 3M KC1, destilovaná voda do 2000 ml; 2 CV/h) a opět se sbírají frakce s píky.

7. Oba eluáty se dialyzují proti pufru 2, dokud není dosaženo konstantní vodivosti a poté se alikvoty zamrazí v kapalném dusíku.

Příklad 4: Standardní způsob transkripce a dělení transkriptů pomocí polyakrylamidového gelu

Reakční směs pro transkripci (celkový objem 20 μΐ) může sestávat z následujících komponent:

a) obecné transkripční faktory ve formě přečištěného jaderného extraktu nebo připravené rekombinantně, popřípadě zakoncentrované o některé specifické transkripční faktory, aktivátory, inhibitory, fúzní proteiny;

b) DNA-templát, například vektor pGSlOO se studovanými genově regulačními elementy;

• · · · · ·

-39c) transkripční pufr, ·· 9999

který například obsahuje studovanou účinnou látku;

d) značené a neznačené nukleotidy;

ad a) Eluát získaný pomocí pufru 4 a pufru 5 (viz příklad

3) obsahuje jaderný extrakt vhodný pro transkripční reakci (všechny obecné transkripční faktory).

Optimální množství použitého eluátu pufrů 4 a 5 je nutno stanovit přesně pro každou jednotlivou preparaci.

Použijí se přibližně 3 μΐ eluátu pufru 4 a 2 μΐ eluátu pufru 5 na jednu reakční směs.

ad b) Obyčejně se použije 100 ng DNA templátu (genově regulační elementy v reportérovém plazmidu například v pGSlOO) na jednu reakční směs;

ad c) Transkripční pufr (5mM MgC12z 25mM HEPES KOH pH 8,2, 0,5 μΐ acetylovaného BSA (ze zásobního roztoku 20 mg/ml), přibližně 10% glycerin, přibližně 70mM KC1, 0,2,M PMSF, 5mM DTT) s přídavkem 20 U inhibitoru RNáz na jednu reakční směs;

ad d) NTPs (ATP, UTP každý v koncentraci 100 μΜ, CTP při konečné koncentraci 5 μΜ,, o-m-GTP při konečné koncentraci 20 μΜ a a-³²p-CTP při konečné koncentraci přibližně 0,12 μΜ a aktivitě 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml).

1. Nukleotidy se smíchají s transkripčním pufrem a ke směsi se přidá DNA templát.

2. Přidají se aktivátory transkripce a eluát pufru 4 a 5.

3. Transkripce se inkubuje 1 hodiny při teplotě 30°C.

4. Reakce se zastaví přídavkem 400 μΐ zastavovacího roztoku (7M močovina, 10 mM Tris-HCl pH 7,8, lOmM • · • · · ·

EDTA/NaOH pH 8, 0,5% SDS, lOOmM LÍCI, 100 pg/ml tRNA, 300mM Na-acetát) a 400 μΐ směsi fenol/chloroform/isoamylalkohol (25/24/1) . Po důkladném zamícháni se směs 5 minut centrifuguje v rotoru SS34 na centrifuze Beckman při 14000 ot.min“ 1 za pokojové teploty. Supernatant se odebere a přidá se k němu 400 μΐ isopropanolu a zamíchá se. Poté se směs inkubuje 1 hodinu při - 20°C.

5. Směs se 30 minut centrifuguje v rotoru SS34 na centrifuze Beckman při 14000 ot.min^-^- při teplotě 4°C. Peleta se promyje v 70% ethanolu a poté se nechá vysušit ve vakuu (Speedvac).

6. Peleta se 15 minut inkubuje při teplotě 50°C v 10 μΐ vzorkového pufru (955 μΐ 100% deionizovaného formamidu, 10 μΐ 0,5M EDTA, 20 μΐ 1M Tris pH 7, 0,003% bromfenolové modři/xylenkyanolu, destilovaná voda do 10 ml).

7. Transkript se elektroforeticky rozdělí na 5% denaturujícím močovino/polyakrylamidovém gelu. Elektroforéza se provádí v pufru 1 x TBE, nechá se ještě před nanesením běžet 20 minut při 60 mA. Rozdělení trvá přibližně hodinu při 60 mA.

8. Gel se fixuje v 10% kyselině octové, vysuší a exponuje se s rentgenovým filmem ve Phosphoimageru®.

Příklad 5: Postup při popisované automatické transkripci in vitro s použitím vazby transkriptu na filtr

1. Nukleotidy se smíchají s transkripčním pufrem a ke směsi se přidá DNA-templát.

• ·

2. Přidá se eluát pufru 4 a 5 popřípadě aktivátor nebo inhibitor transkripce.

3. Transkripce se inkubuje 1 hodiny při teplotě 30°C.

4. K reakční směsi se přidá směs proteinázy K (1 μΐ roztoku obsahujícího 20 mg/ml proteinázy K, 1 μΐ 10% SDS, 0,5 μΐ 0,5M EDTA pH 8, 1 μΐ 50mM Tris pH 7,8, destilovaná voda do 5 μΐ).

5. Reakční směs se 15 minut inkubuje při teplotě 30°C.

6. DEAE membrána NA 45® (Schleicher und Schuell) se krátce namočí do promývacího pufru obsahujícího lOOmM fosforečnan sodný pH 7,5, 250mM NaCl, 2% pyrofosforečnan sodný).

7. 5 μΐ reakční směsi se napipetuje na membránu a nechá se 5 minut oschnout

8. Membrána se čtyřikrát po patnácti minutách promyje v přibližně 100 ml promývacího pufru s přídavkem 1 % Tritonu. Při promývání se s membránou v pufru zvolna pohybuj e.

9. Membrána se přiloží na papír Whatmann 3 MM® (Whatman, Maidstone, England) a nechá se na vzduchu uschnout. Poté se přikryje fólií a exponuje se s rentgenovým filmem.

Příklad 6: Transkripční reakce provedená způsobem podle vynálezu paralelně s třemi různými reportérovými plazmidy

Transkripční reakce byly provedeny tak, jak bylo popsáno v příkladech 1 až 3 a 5. Jako reportérové plazmidy byly

použity pMRG5 (obsahuje TATA box z HIV promotoru, iniciační oblast promotoru ML a zhruba 400 nukleotidů dlouhou kazetu bez G-bazí ve vektoru pUC19, viz (Kretschmar, M., Kaiser,

K., Lottspeich, F., Meisterernst, M.(1994) Cell. 78, strana 525 až 534), dále plazmid pGSlOO (viz obrázek 2) a plazmid pV$ML, který je zkonstruován podobně jako plazmid pGSlOO, ale místo 800 bp dlouhé kazety bez G-bazí obsahuje pouze 400 bp dlouhou kazetu. Pro každou reakci bylo použito 100 ng DNA-templátu a 3 μΐ frakcí jaderných extraktů Pil® (eluáty pufru 4 a 5). všechny reakce byly prováděny paralelně s a bez aktivátoru, kterým byl fúzní protein sestávající z vazebné domény proteinu Gal4 a aktivační domény polyglutaminu. výsledky jsou znázorněny na obrázku 1.

Příklad 7: Srovnání síly signálu (jakožto měřítka množství transkriptu a tudíž i síly transkripce) radioaktivně značených transkriptů získaných transkripcí standardním způsobem a získaných způsobem transkripce podle vynálezu

Transkripčni reakce byly provedeny tak, jak bylo popsáno v příkladech 1 až 5. Paralelně byly provedeny reakce s přenosem na filtr (víz příklad 5) a s dělením na gelu (viz příklad 4). Při všech reakcích bylo použito stejné množství templátu (200 ng pMRG5). Jednotlivé reakce probíhaly v přítomnosti 30ng Gal4-VP4, který byl použit jako aktivátor, výsledky jsou znázorněny a popsány na obrázku 3.

Tabulka 1: SEQ ID NO.l

ITTCCTGTGT GAřAITGITA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC CGGASGCATA 60

AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA 120

CTWZCGCIT TCTAGTCGGG AAACCTGTCG TUXAGGTGC ATIAATGAAT CGGCCAACGC 180

GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TAITGGGCGC TCITCCGCTT CXTIOXTCAC TGACTCGCTG 240

CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TGAGCTCACT CAAA3GCGGT AMACGGTTA 300

TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AA2ATGTGA3 OAAA3GCCA GCAAřAGGCC 360

AGSAACCGTA AÍAAGGCCGC GITGCTCGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCIGACGAG 420

CATCACAřAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC GGACAGGACT ATAAA3ATAC 480

CAGGCGITTC CCCCTGGAAG CTCXXTCCTG CX3CTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCITACC 540

GGATACCTGT CTGCCTITCT CCCITCGGGA A2CGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT 600

AGGTATCTCA GITCGGTGTA GCTCX3TTCGC TOTAGCTGG GCTGTGTGCA CX^ACCCCCC 660

GITCAGCCCG ACCX3CTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTCAGTCCAA CXXGGTAÍGA 720

CACGACITAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA 1TAGCAGA2C GAGGTATGTA 780

GGCGCTGCTA CAGAGTTCIT GAA3TGGTGG CCTAňCTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA 840

TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGIT ACCITCGGAA AAA1AGITGG TAGCTCITGA 900

TCCGGCAAAC APACCACCGC TGGTAGCGGT GGÍTÍTITTG TTTGCAAGCA GCAGKTTACG 960

CGCA3AAAAA APGSATCTCA AGAAGATCCT TTGKrCTTTT CTS0GGGGTC KKECTOC 1020

TG^RňCGRRA ACTCACGTIA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC 1080

TAGATCCnT TAAAITAAAA AIGAAGTTTT AAATCAATCT ΑΑΑ3ΓΑΓΑΤΑ TGAGTAAAUT 1140

TGGTCTGňCA GITACCAATG ClTAATCAGr GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CIGTCTATTT 1200

CGITCATCCA TAGITGCGTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGZOACG GGAGGGCTTA 1260

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob pro bezbuněčnou in vitro transkripci DNAtemplátu, který obsahuje transkribovatelnou DNAsekvenci pod kontrolou alespoň jednoho genově regulačního elementu vyznačuj ícísetím, že

   a) pro transkripci používá zakoncentrovaný a eventuálně přečištěný extrakt z buněčných jader, který může být eventuálně doplněn transkripčními faktory a/nebo kofaktory popřípadě jimy částečně nebo úplně nahrazen a alespoň jeden značený nukleotid

   b) po transkripci jsou proteiny použité v reakční směsi popřípadě odděleny a/nebo degradovány

   c) transkript je navázán na pevný nosič

   d) přebytečné značené nukleotidy jsou odstraněny

   e) je stanoveno značeného transkriptu.
2. 2.

   Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že transkribovaná DNA-sekvence neobsahuje jednu z nukleotidových baží vybranou ze skupiny tvořené guaninem, cytosinem a thyminem (tzv. Gneobsahující, C-neobsahující a T-neobsahující sekvence).

   Způsob podle vyznačuj C-neobsahuj ící libovolného z ící se tím f

   nebo T-neobsahující nároků 1 a 2 že G-neobsahující, sekvence je delší než 400 nukleotidů.

   • · · · · · • ·

   -454.

   Způsob podle jednoho nebo více vyznačující se tím,

   C-neobsahující nebo T-neobsahující z nároků 1 až 3 že G-neobsahující, sekvence je dlouhá přibližně 800 nukleotidů.
3. 5. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 4 vyznačuj ící se tím, že genově regulační element obsahuje promotor.
4. 6. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 5 vyznačuj ícísetím, že promotor obsahuje TATA-box a/nebo oblast iniciace transkripce.

   7. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 6 v y z n ačuj ící se t i m , že genově regulační element obsahuje enhancer. 8. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 7 v y z n ačujícíset i m , že genově regulační element obsahuje silencer. 9. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 8 v y z n ačuj ícíset i m , že genově regulačním

   elementem je modelový promotor.

   10. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 9 v y z n ačující se tím, že modelový

   promotor obsahuje TATA-box, oblast pro iniciaci transkripce a případné DNA-sekvence pro vazbu proteinů.

   11. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 10 vyznačující se tím, že modelový • · · 9 · · · · · · ··

   9 9 9 9 9 9 9 99

   999 9 9 9 9 9 9 9 9· · promotor obsahuje TATA-box z pocházející receptoru T-buněk νβ8.1, oblast pro z lidského iniciaci transkripce z ML-promotoru (hlavní pozdní promotor adenoviru) a 5 vazebných míst pro kvasinkový protein

   Gal4, jakož i alespoň jedno unikátní cílové místo pro restrikčni enzym umístěné mezi TATA-box a vazebná místa pro protein Gal-4.

   12. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 11 vyznačující se tím, že modelový promotor je zčásti nebo zcela nahrazen studovaným genově regulační elementem a/nebo je modelový promotor studovaným regulačním elementem doplněn.

   13. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že genově regulační element a/nebo studovaný genově regulační element je vybrán ze skupiny tvořené regulačními elementy genů adhezivních molekul, růstových faktorů, fosfodiesteráz, fosfatáz, kináz, ATP-áz, membránových receptorů, receptorů aktivovaných sekundárními posly, receptorů hormonů, receptorů pro steroidy, metaloproteáz, NO-syntáz, 5-lipoxygenáz, cytokinů, interleukinů, T- nebo B-buněčných receptorů, jaderných receptorů, virů a retrovirů a nebo díly regulačních elementů uvedených genů.

   14. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 13 vyznačující se tím, že DNA-templátem je univerzální reportérový plazmid.

   • ·

   15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že univerzálním reportérovým plazmidem je plazmid pGSlOO podle obrázku 2.

   16. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 14 a 15 vyznačující se tím, že univerzální reportérovy plazmid má sekvenci podle tabulky 1 (Sekvence id.č.:l).

   17. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 14 a 15 vyznačující setím, že univerzální plazmid byl uložen u DSM pod číslem 11450.

   18. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 17 vyznačující se tím, že zakoncentrovaný extrakt buněčných jader je přečištěn alespoň jedním chromatografickým krokem.

   19. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 18 vyznačující se tím, že zakoncentrovaný extrakt buněčných jader přečištěn na materiálu vázajícím jaderné proteiny vybraném ze skupiny tvořené fosfolelulózou, DEAE-celulózou a Heparin-Sepharózou.

   20. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 19 vyznačující se tím, že zakoncentrovaný extrakt buněčných jader je přečištěn na koloně s Pil®.

   21. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 20 vyznačující se tím, že zakoncentrovaný jaderný extrakt je doplněn alespoň jedním všeobecným a/nebo specifickým transkripčním faktorem.

   • · ·· «· ·♦ • · · · · · · · · · • · ·· · ···· • · · · · · · · * · · · • · · · · · · · · ···· · ·· ·· ·· ··

   22. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 21 vyznačující se tím, že zakoncentrovaný jaderný extrakt je doplněn alespoň jedním všeobecným transkripčním faktorem vybraným ze skupiny tvořené TFIIA, TFIIB, TFIID nebo TPB, TFIIE, TFIIF, TFIIH a

   TFII.

   23. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 22 vyznačující se tím, že zakoncentrovaný jaderný extrakt je doplněn alespoň jedním specifickým transkripčním faktorem vybraným ze skupiny tvořené receptory hormonů, supresory pathogeny, STAT-proteiny, proteiny na transdukční kaskádě tumorů, které se messenger), jadernými transkripčními poslem buněčně protoonkogeny, virovými podílejí (second specifickými specifickými transkripčními faktory, faktory exprimovanými v závislosti na s druhým receptory, faktory, transkripčními i diferenciaci tkáňově buňky, transkripčními faktory exprimovanými v závislosti vývojovém stádiu a v závislosti na buněčném cyklu a ze skupiny tvořené částmi nebo celými uvedenými proteiny, které mohou být v daném případě použity ve formě fúzních proteinů.

   24. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 23 vyznačující se tím, že zakoncentrovaný jaderný extrakt je doplněn alespoň jedním kofaktorem k* vy/raným ze skupiny tvořené obecnými kofaktory, specifickými kofaktory, pozitivními kofaktory, negativními kofaktory, TAF a mediátory.

   25. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 24 vyznačující se tím, že po transkripci jsou proteiny použité v reakční směsi popřípadě ···· ·· ···· ·· · · · · · · · · • · ··· ···· • · · · · ······· • · · · · · · · · ···· · « · ·· ·· ·· odděleny a/nebo degradovány chemicky a/nebo mechanicky a/nebo enzymatickým působením.

   26.

   Způsob podle jednoho nebo více vyznačující se tím, degradovány působením proteáz.

   z nároků že jsou

   27.

   Způsob podle jednoho nebo více vyznačující se tím proteáza je použita proteináza K.

   nároků

   28.

   Způsob podle v y z n a č u transkript se jednoho nebo více jící naváže na se ti

   29.

   Způsob tím,

   1 až 25 proteiny že jsou nároků že

   Z nabitý pevný nosič.

   až 26 jako až 27 značený podle že pevným osičem je DEAE-celulózová membrána.

   nároku

   28 vyznačují c i se

   30. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 29 v y z n a č u jící se tím, že alespoň jeden z nukleotidů ja značen radioaktivně. 31. Způsob podle j ednoho nebo více z nároků 1 až 30 v y z n a č u jící se tím z že kroky způsobu a) až e) jsou buď všechny nebo alespoň zčásti

   provedeny pomocí automatického systému.

   32.Způsob podle nároku 31 vyznačující tím, že automatickým systémem je Biomek 2000®.

   -50·· · ··· • · ·· • · · · · · ···· • · ··· «··· • · · · · · · ··· · · • · ···· · · · ···· · «· ·· ·· ··

   33. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 32 vyznačující se tím, že transkripce je provedena v přítomnosti studované účinné látky.

   34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že účinná látka inhibuje transkripci.

   35. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že účinná látka aktivuje transkripci.

   36. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 35 vyznačující se tím, že jsou

   a) alespoň dvě transkripční reakce provedeny současně za stejných podmínek přičemž

   b) jednotlivé reakční směsi se navzájem liší jen množstvím studované účinné látky a/nebo množstvím alespoň jednoho transkripčního faktoru a/nebo množstvím alespoň jednoho kofaktoru a/nebo množstvím zakoncentrovaného jaderného extraktu

   c) po skončení transkripce se v jednotlivých reakčních směsích stanoví množství značeného transkriptu a

   d) z rozdílu množství získaného transkriptu se stanoví účinnost a/nebo specifita studované účinné látky, transkripčního faktoru, kofaktoru a/nebo zakoncentrovaného jaderného extraktu na genově regulační element.

   37. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 1 až 36 vyznačujícíse tím, že jaderný extrakt je zakoncentrován, ale není dále purifikován.

   ♦· «···

   4 4 4 4 4 4

   38. DNA-templát podle nároku 1 obsahující transkribovatelnou DNA-sekvenci pod kontrolou alespoň jednoho genově regulačního elementu vyznačující se tím, že neobsahuje jednu z nukleotidových baží vybranou ze skupiny tvořené guaninem, cytosinem a thyminem, přičemž je tato sekvence delší než 400 nukleotidů.

   39. DNA-templát podle nároku 38 vyznačující se tím, že transkribovaná sekvence bez G, T nebo C nukleotidů je dlouhá přibližně 800 nukleotidů.

   40. DNA-templát podle jednoho nebo více z nároků 38 a 39 vyznačující se tím, že genově regulační element obsahuje promotor a popřípadě enhancer a/nebo silencer.

   41. DNA-templát podle jednoho nebo více z nároků 38 až 40 vyznačuj ícíse tím, že DNA-templátem je univerzální reportérový plazmid pGSlOO podle obrázku 1.

   42. DNA-templát podle jednoho nebo více z nároků 38 až 41 vyznačující .se tím, že univerzální reportérový plazmid má sekvenci podle tabulky 1 (Sekvence id.č.íl).

   43. DNA-templát podle jednoho nebo více z nároků 38 až 41 vyznačující se tím, že univerzální plazmid byl uložen u DSM pod číslem 11450.

   44. Použití DNA-templátu podle jednoho nebo více z nároků 38 až 43 ve způsobu transkripce.

   ·· ···· ··
5. 8« · · · · »··· • · · · · · · · · • · ♦ · · · * ··· · · • · · · · · ··· ···«· · · · · · · ··

   45. Použití

   DNA-templátu nároku vyznačující se tím, že způsob transkripce odpovídá způsobu podle jednoho nebo více z nároků 1 až 37.

   46. Použití způsobu podle jednoho nebo více z nároků 1 až

   37 k identifikaci specifické farmakologicky aktivní účinné látky.

   47 .

   Použití způsobu podle nároku farmakologicky ící charakterizaci vyznačuj farmakologicky podmínek inhibuje kontrolované přítomnými aktivní

   48.

   účinná

   46 k identifikaci a aktivní tím látka transkripci genově nároku

   Použití způsobu podle farmakologicky ící charakterizaci vyznačuj farmakologicky podmínek aktivuje kontrolované přítomnými aktivní za účinná účinné látky že tato definovaných

   DNA-sekvence regulačními elementy.

   46 k identifikaci a aktivní tím látka za účinné látky že tato transkripci DNA-sekver genově regulačními elementy.

   ?V VW-5Í