CN114606208A

CN114606208A - 一种具有高可信度快速的临近蛋白标记系统ScPhastID及标记方法

Info

Publication number: CN114606208A
Application number: CN202210334082.8A
Authority: CN
Inventors: 刘峰; 松阳洲; 李克成; 吴苏
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-03-31
Also published as: CN114606208B

Abstract

本发明公开了一种具有高可信度快速的临近蛋白标记系统ScPhastID及标记方法。本发明利用蛋白拆分技术将具有高催化活性的生物素标记酶PhBPL*拆分成不具活性的两部分：PhN32蛋白和PhC33蛋白，PhN32蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，PhC33蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。其中较小的片段PhN32作为蛋白标签与研究的目的蛋白融合，而PhC33可以与PhN32自组装恢复标记活性，两者组成临近蛋白标记系统ScPhastID。在ScPhastID中利用PhN32的小体积减少对于目的蛋白的定位影响，提高标记的准确度，同时通过控制PhC33的表达来控制标记效果。

Description

一种具有高可信度快速的临近蛋白标记系统ScPhastID及标记方法

技术领域

本发明涉及蛋白互作研究技术领域，更具体涉地，涉及一种具有高可信度快速的临近蛋白标记系统ScPhastID及标记方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的最终体现者，而生命活动本身则绝大部分体现在蛋白质与蛋白质之间的互作上。为了保证生命活动的正常进行，蛋白互作不仅数量庞大，并且往往具有高度的空间和时间特异性。这要求我们的研究不仅具有广泛性全面性还要求有一定的时空特异性，无疑增加了研究蛋白互作的难度。因此开发一种可靠灵敏并具有一定时空分辨率的研究蛋白互作工具是生物技术发展的一个核心课题。

BioID技术是一种新兴的互作蛋白体内筛选技术，它依赖于突变的Biotin标记酶，能够给靶蛋白的临近蛋白标记生物素酰标记。Streptavidin能与生物素酰特异性的结合，因此利用带有Streptavidin的beads能够特异性的富集被标记的蛋白。然后，通过偶联MS技术，来筛选互作的蛋白和构建互作网络。BioID的临近标记特性让它不仅够筛选互作蛋白，还能研究蛋白的细胞亚定位。利用BioID研究蛋白的细胞亚定位，依赖于融合到参考蛋白生物素标记酶上的对于细胞器特征蛋白的标记。这要求生物素标记酶不影响参考蛋白的正常细胞定位。另外，许多蛋白需要定位到特定的细胞器才能发挥生物学功能，与特定的蛋白互作，例如mTORC1只有在招募到溶酶体上时才发挥其蛋白激酶的功能。经典的BioID技术基于一种来源于E.coli.的突变BirA蛋白(BirA*)，大小是35.5kDa，例如中国专利公开了一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法和其应用，通过BioID富集来源于目的蛋白表达体系的蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，进而对富集的生物素化蛋白进行鉴定和定量。由于BirA*本身有35.5kDa，远远大于正常的蛋白标签，如Flag、HA、GST、His等。对于本身较小的蛋白，BirA*很可能会因为空间位阻等原因影响其正常的细胞定位。并且BirA*催化活性较低需要16h以上才能实现比较充分的标记，不适合检测瞬时的蛋白互作。

专利CN114149980A公开了一种蛋白质生物素连接酶BPL*的标记系统，其中，生物素标记酶PhBPL*作为生物素标记供体，相比与传统的BioID邻近标记系统，虽然其标记强度更高，所需标记时间更短，然而其蛋白分子量较大，会影响目的蛋白地细胞定位，且表达量无法调控，难以控制标记效果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种具有高可信度快速的临近蛋白标记系统ScPhastID及标记方法。

本发明的第一个目的在于提供一种用于临近蛋白标记的蛋白组合物。

本发明的第二个目的在于提供一种核酸分子组合物。

本发明的第三个目的在于提供一种重组表达质粒。

本发明的第四个目的在于提供一种细胞系。

本发明的第五个目的在于提供一种具有高可信度的临近蛋白标记方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种用于临近蛋白标记的蛋白组合物，包括PhN32蛋白和PhC33蛋白；所述PhN32蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述PhC33蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明利用蛋白拆分技术将具有高催化活性的生物素标记酶PhBPL*拆分成不具活性的两部分：PhN32蛋白和PhC33蛋白，PhN32蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，PhC33蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。其中较小片段的PhN32可作为蛋白标签与研究的目的蛋白融合，而另外一部分PhC33可以与PhN32自组装恢复标记活性。在临近蛋白标记时，利用PhN32的小体积减少对于目的蛋白的定位影响，提高标记的准确度，同时还通过控制PhC33的表达来控制标记效果。

在使用上述蛋白组合物进行临近蛋白标记研究时，具体是利用编码上述PhN32蛋白和PhC33蛋白的核苷酸序列来分别构建重组质粒或包含重组质粒的细胞系来进行临近蛋白标记研究。

因此，本发明还提供一种核酸分子组合物，包括编码SEQ ID No.2所示PhN32蛋白和SEQ ID No.3所示PhC33蛋白的核苷酸序列。

优选地，编码PhN32蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，编码PhC33蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明还提供分别含有上述核酸分子的重组表达质粒。

优选地，含有编码PhN32蛋白的核苷酸序列的重组表达质粒中还含有待研究的目的蛋白的核苷酸序列和/或蛋白纯化标签序列，例如Flag标签序列，方便后续蛋白纯化；含有编码PhC33蛋白的核苷酸序列的重组表达质粒中含有HA标签序列和/或核信号定位组件NLS。

进一步优选地，所述含有编码PhN32蛋白的核苷酸序列的重组表达质粒为pENTR-FL-PhN32-目的蛋白或pLenti-FL-PhN32-目的蛋白，其中“FL”即为Flag标签序列。

所述pENTR-FL-PhN32-目的蛋白的构建方法为将目的蛋白与PhN32融合蛋白的核酸序列与Flag标签序列连接，将得到的序列插入到pENTR/D-TOPO载体的多克隆酶切位点处，即得到重组质粒pENTR-FL-PhN32-目的蛋白。

所述pLenti-FL-PhN32-目的蛋白的构建方法为将重组质粒pENTR-FL-PhN32-目的蛋白通过LR反应使pENTR-FL-PhN32-目的蛋白与慢病毒表达载体pLenti-EF1A-CSFB-Puro重组构建质粒pLenti-FL-PhN32-目的蛋白。

进一步优选地，含有编码PhC33蛋白的核苷酸序列的重组表达质粒为pENTR-PhC33-NLS-HA或pLenti-tet-PhC33-NLS-HA。

所述pENTR-PhC33-NLS-HA的构建方法为将PhC33核酸序列与NLS、HA标签序列连接，再将得到的序列插入到pENTR/D-TOPO载体的多克隆酶切位点处，即得到重组质粒pENTR-PhC33-NLS-HA。

所述pLenti-tet-PhC33-NLS-HA的构建方法为利用LR反应将重组质粒pENTR-PhC33-NLS-HA中PhC33-NLS-HA的序列重组到pLenti-tet-CSFB-neo中，即得到真核表达重组质粒pLenti-tet-PhC33-NLS-HA。

本发明还提供含有上述重组表达质粒的重组细胞系。

本发明还提供上述任一所述蛋白组合物、所述核酸分子组合物、所述重组表达质粒或所述重组细胞系在临近蛋白标记中或在制备临近蛋白标记系统ScPhastID的应用。

一种具有高可信度快速的临近蛋白标记系统ScPhastID，包括含有编码目的蛋白-PhN32融合蛋白的核苷酸序列的重组质粒及含有编码PhC33蛋白核苷酸序列的重组质粒，或包括含有编码目的蛋白-PhN32融合蛋白的核苷酸序列的重组质粒及诱导表达PhC33蛋白的细胞系。例如：包含重组质粒pENTR-FL-PhN32-目的蛋白或pLenti-FL-PhN32-目的蛋白及重组质粒pENTR-PhC33-NLS-HA或pLenti-tet-PhC33-NLS-HA；或包含重组质粒pENTR-FL-PhN32-目的蛋白或pLenti-FL-PhN32-目的蛋白及含有pLenti-tet-PhC33-NLS-HA的诱导表达PhC33蛋白的细胞系。

本发明还提供所述临近蛋白标记系统ScPhastID在临近蛋白标记中的应用。

本发明还提供一种具有高可信度的临近蛋白标记方法，包括如下步骤：

S1.构建或直接提供诱导表达PhC33蛋白的细胞系，同时构建含有待研究的目的蛋白与PhN32融合蛋白编码核苷酸序列的重组质粒；

S2.将S1的重组质粒在诱导表达PhC33蛋白细胞系中构建稳定表达待研究的目的蛋白与PhN32融合蛋白、且能诱导表达PhC33蛋白的稳定细胞系；

S3.将诱导物和生物素加入步骤S2的稳定细胞系，培养，完成目的蛋白的临近蛋白生物素标记。

优选地，所述重组质粒为pENTR-PhC33-NLS-HA或pLenti-tet-PhC33-NLS-HA。

优选地，所述诱导表达PhC33蛋白的细胞系为多西环素诱导表达的细胞系，所述诱导物为多西环素。

进一优选地，所述诱导表达PhC33蛋白的细胞系为将重组质粒pLenti-tet-PhC33-NLS-HA通过慢病毒包装的方法在合适的细胞系中建立多西环素诱导表达PhC33蛋白细胞系。

优选地，所述细胞系为HeLa细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用蛋白拆分技术，将具有高催化活性的生物素标记酶PhBPL*拆分成不具活性的两部分，包括PhN32蛋白和PhC33蛋白。其中较小的片段PhN32作为蛋白标签与研究的目的蛋白融合，而另外一部分PhC33可以与PhN32自组装恢复标记活性，两者组成临近蛋白标记系统ScPhastID；利用PhN32的小体积减少对于目的蛋白的定位影响，提高标记的准确度，同时还可通过控制PhC33的表达来控制标记效果。

附图说明

图1为诱导表达HeLa-iC33-NLS-HA细胞裂解液中PhC33-NLS-HA蛋白Western blot检测结果。

图2为HeLa-iC33-PhN32-ZKSCAN1细胞系裂解液中PhC33-NLS-HA和FL-PhN32-ZKSCAN1蛋白以及生物素标记的Western blot检测结果。

图3为FL-N32-ZKSCAN1在细胞内的定位和标记情况。

图4为Flag-ZKSCAN1和Ph-ZKSCAN1在细胞内的定位和标记情况。

图5为ZKSCAN1临近互作蛋白进行GO分析结果。生物学通路(A)、细胞组分(B)和分子功能(C)。

图6为ZKSCAN1临近互作蛋白的火山图。

图7为GST下拉实验验证ZKSCAN1临近互作蛋白结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

PhBPL为发明人前期发现的来源于古细菌Pyrococcus horikoshii的蛋白质生物素连接酶(Biotin Protein Ligase，BPL)，通过将PhBPL R48氨基酸残基，PkBPL R48氨基酸残基及MfBPL R40氨基酸残基进行了突变，从而获得了较传统的BioID标记强度更高，所需标记时间更短的蛋白质生物素连接酶PhBPL*，其优化后的PhBPL*的开放阅读框序列(SEQID No.1)；本发明将具有高催化活性的生物素标记酶PhBPL*拆分成不具活性的两部分；其中较小的片段PhN32作为蛋白标签与研究的目的蛋白融合，而另外一部分PhC33可以与PhN32自组装恢复标记活性。将PhN32蛋白PhC33蛋白组合作为临近蛋白标记工具(ScPhastID)，可利用PhN32的小体积较少对于目的蛋白的定位影响，提高标记的准确度，同时通过控制PhC33的表达来控制标记效果。

实施例1诱导表达PhC33细胞系的构建与检测

将生物素标记酶PhBPL*拆分成不具活性的两部分PhN32(SEQ ID No.2)和PhC33(SEQ ID No.3)，其中PhC33用于构建诱导表达细胞系，具体包括如下步骤：

1、编码PhC33蛋白的基因序列设计及制备

(1)PhC33蛋白的基因序列设计

以人工优化后PhBPL*开放阅读框序列(SEQ ID No.1)为模板，设计用于扩增重组PhC33蛋白编码核酸片段(SEQ ID No.5)的特异性引物FP-PhC33-NotI和RP-PhC33-NLS-AscI；

FP-PhC33-NotI：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGGAGGGAACCGTGATCGTG-3’；

RP-PhC33-NLS-AscI：

5’-GGCGCGCCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACACCTTTCTCTTCTTCTTGGGCAGGAATCTCAGGGACACG-3’；

FP-PhC33-Not1在PhC33起始密码子前面加入NotI酶切位点和保护性碱基。RP-PhC33-NLS-Asc1在PhC33编码末端加有NLS、HA和AscI酶切位点与保护性碱基。

(2)编码PhC33蛋白的核酸片段制备

以PhBPL*质粒为模板，加入引物FP-PhC33-NotI和RP-PhC33-NLS-AscI进行基因扩增。扩增体系见：

表1

2×KOD Buffer	25μL
		dNTP	10μL
Primer Pairs(均5μM)	3μL
		cDNA	0.4μL
KOD Enzyme	1μL
		H<sub>2</sub>O	10.6μL

扩增条件：为94℃预变性2min，再进行32个循环，循环条件为98℃变性10s，65℃退火10s，68℃延伸40s；最后68℃延伸10min。

2、重组质粒的构建

将克隆载体pENTR/D-TOPO以NotI和AscI酶切后回收，然后与经NotI和AscI酶切后回收的PhC33-NLS-HA基因扩增产物在T4连接酶作用下连接，转化DH5α感受态细胞后涂布在含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，用送至测序公司测序鉴定，鉴定的阳性质粒即为本实施例所需重组质粒，提质粒保存，并保存菌种，经测序验证后将其命名为pENTR-PhC33-NLS-HA。通过LR反应使pENTR-PhC33-NLS-HA与慢病毒表达载体pLenti-tet-CSFB-neo重组构建质粒pLenti-tet-PhC33-NLS-HA。所述慢病毒表达载体pLenti-tet-CSFB-neo构建自商业化质粒pLenti-CMV-Neo-DEST(addgene，17392)，加入了SFB蛋白标签和tet响应元件(TRE)。

3、构建诱导表达PhC33细胞系的构建

(1)重组pLenti-tet-PhC33-NLS-HA质粒转染细胞

为构建稳定诱导表达PhC33-NLS-HA的真核细胞系，利用PEI转染法将pLenti-tet-PhC33-NLS-HA重组质粒与病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G和按(1.2μg：0.9μg：0.3μg)比例混合转染入CHO细胞，具体步骤如下所示：

转染前一天，在六孔板中接种293T细胞，37℃，5％CO₂培养，至转染时细胞密度为60％～80％。在50μL无血清Opti-MEM I低血清培养基中稀释2.4μg混合质粒(pLenti-tet-PhC33-NLS-HA：psPAX2：pMD2.G＝4：3：1)，并轻轻混匀。另取7.2μL 1×PEI试剂，稀释在50μLOpti-MEM培养基中。室温下静置5分钟。混合质粒稀释液和PEI的稀释液。轻轻混匀并在室温下静置20分钟。细胞板上接种293T细胞的孔中加混合液100μL，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀，转入CO₂培养箱中培养。8小时候换新鲜培养基。

在六孔板中接种野生型HeLa细胞，37℃，5％CO₂培养，至侵染时细胞密度为30％-40％。

(2)侵染HeLa细胞

取转染24小时后的239T细胞培养基上清液过0.22μm滤膜，将上清液和新鲜培养基以2：1的比例混合，加入polybrene(终浓度为8mg/mL)混匀后加入到HeLa细胞的6孔板中培养24h。重新为293T细胞加入新鲜培养基。培养24h后重复上述步骤，对HeLa进行二次侵染。

(3)阳性克隆的筛选

侵染HeLa细胞培养约48h后，换新鲜培养基在细胞培养基中加入G418(Geneticin，遗传霉素)使其终浓度为100μg/mL，48h后换入新的、G418终浓度为100μg/mL的新鲜培养基培养细胞。每隔2天换含100μg/mL的G418的新鲜培养基培养2天，重复6次。消化、收集细胞，用有限稀释法将细胞分在96孔板中，加入含100μg/mL的G418培养基培养，培养、等待10天左右。挑取96孔板中由单个细胞增殖来的一团细胞到1个24孔板中，待其长到合适的数量后，消化、收集细胞，传代到12孔板中。重复此过程，将细胞依次培养在6孔板、60mm培养皿、100mm培养皿，并保种。

(4)阳性克隆的鉴定

将克隆细胞在培养皿中培养1天，加多西环素培养16h收集细胞并裂解，用Westernblot进行鉴定，以获得克隆细胞中PhC33-NLS-HA的表达情况。利用HA特异性抗体，我们发现挑选的5、6号克隆中有PhC33-NLS-HA的表达，且表达量有差异，我们选择PhC33-NLS-HA表达量较高的6号细胞克隆继续扩大培养后保存，将该细胞系命名为HeLa-iC33-NLS-HA，进行后续实验(显影结果如图1所示)。

实施例2构建表达目的融合蛋白FL-N32-ZKSCAN1的细胞系

以ZKSCAN1蛋白为例，将生物素标记酶PhBPL*拆分成的两部分中的较小的片段PhN32(SEQ ID No.2)作为蛋白标签与研究的目的蛋白(ZKSCAN1)融合。具体包括如下步骤：

1、编码FL-N32-ZKSCAN1蛋白的基因序列设计及制备

(1)FL-PhN32氨基酸序列设计与制备

委托商业公司合成人工设计好的FL-PhN32核酸序列，包括两条单链DNA Ol1(SEQID No.6)和Ol2(SEQ ID No.7)。将Ol1和Ol2加去离子水稀释到100pM，按表2配置退火体系。将配好的混合液加热到95℃，保持2min，然后缓慢退火到25℃，于4℃保存。

表2

10×T4 ligase Buffer	1μL
		Ol1稀释液	1μL
Ol2稀释液	1μL
		H<sub>2</sub>O	7μL

(2)ZKSCAN1蛋白的基因序列设计

以ZKSCAN1开放阅读框序列(SEQ ID No.8)为模板，设计特异性引物FP-ZKSCAN1-Kp和RP-ZKSCAN1t-As用于扩增编码表达ZKSCAN1蛋白(SEQ ID No.9)的核酸片段。

FP-ZKSCAN1-Kp：5’-GGGGTACCATGATGACTGCTGAATCACG-3’；

RP-ZKSCAN1t-As：5’-AGGCGCGCCTTACACACAACTTTTCAGGA-3’；

FP-ZKSCAN1-Kp在起始密码子前面加入KpnI酶切位点和保护性碱基，RP-ZKSCAN1t-As在ZKSCAN1编码末端加有AscI酶切位点与保护性碱基。

(3)编码ZKSCAN1蛋白的核酸片段制备

以ZKSCAN1的CDS为模板，加入引物FP-ZKSCAN1-Kp和RP-ZKSCAN1t-As进行基因扩增。扩增体系见表1。

扩增条件：为94℃预变性2min，再进行32个循环，循环条件为98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸90s；最后68℃延伸10min。

2、重组质粒的构建

将克隆载体pENTR/D-TOPO以NotI和AscI酶切后回收，然后与FL-PhN32退火产物在T4连接酶作用下连接，转化DH5α感受态细胞后涂布在含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，用送至测序公司测序鉴定，鉴定的阳性质粒将其命名为pENTR-FL-PhN32。随后以KpnI和AscI酶切后回收，以前述的连接步骤将ZKSCAN1核酸片段插入回收的片段，即为本实施例所需重组质粒，提质粒保存，并保存菌种，经测序验证后将其命名为pENTR-FL-PhN32-ZKSCAN1。通过LR反应使pENTR-FL-PhN32-ZKSCAN1与慢病毒表达载体pLenti-EF1A-CSFB-Puro重组构建质粒pLenti-FL-PhN32-ZKSCAN1。所述慢病毒表达载体pLenti-EF1A-CSFB-Puro构建自商业化质粒pLenti-CMV-Puro-DEST(addgene，17452)，将CMV启动子置换为EF1a启动子，并加入了SFB蛋白标签。

3、在HeLa-iC33-NLS-HA细胞系的基础上构建稳定表达FL-PhN32-ZKSCAN1细胞系的构建

以质粒pLenti-FL-PhN32-ZKSCAN1为基础包装慢病毒，用慢病毒侵染HeLa-iC33-NLS-HA细胞系(实施例1中构建诱导表达PhC33细胞系)，用Puromycin筛选获得能够稳定表达FL-PhN32-ZKSCAN1且能诱导表达PhC33-NLS-HA的稳定细胞系，命名为HeLa-iC33-PhN32-ZKSCAN1。

4、HeLa-iC33-PhN32-ZKSCAN1细胞系的鉴定

将HeLa-iC33-PhN32-ZKSCAN1细胞在培养皿中培养1天，加多西环素和生物素(50μM)培养16h收集细胞并裂解，用Western blot进行鉴定，以获得细胞中FL-PhN32-ZKSCAN1的表达和生物素标记情况。利用HA和Flag特异性抗体，我们发现细胞系中有FL-PhN32-ZKSCAN1的表达，且在多西环素诱导下表达PhC33-NLS-HA实现生物素标记(显影结果如图2所示)。

实施例3利用HeLa-iC33-PhN32-ZKSCAN1细胞系研究ZKSCAN1临近互作蛋白

1、验证融合蛋白PhN32-ZKSCAN1在细胞内的定位以及生物素标记效果

(1)铺板：在6孔板内放置两块15mm规格的玻片，将HeLa-iC33-PhN32-ZKSCAN1按1:7铺到玻片上用于免疫荧光实验，每个样铺两个孔。

(2)加药：24小时后将一组细胞换加多西环素(终浓度1μg/mL)及生物素(终浓度50μM)的培养基。

(3)免疫荧光实验制样：将孔内培养基吸出，加入1mL PBS，在另一块12孔板每孔加入500μL PBS，将玻片转移到12孔板中，全部进行预透化。吸出PBS后加入透化液盖过玻片，冰上预透化1min，用PBS洗一遍。之后每孔加入500μL 4％甲醛(PBS稀释)，室温固定15min，PBS洗2遍，每次2min(水平摇床上)，备用玻片保存于4度。随后加入透化液盖过玻片室温透化20min，使用封闭液(5％山羊血清)洗2遍，每次2min(水平摇床上)，再使用封闭液封闭1h。每块玻片上加38μL m HA一抗(1:200)孵育1h，使用PBS洗3遍，每次5min(水平摇床上)。随后每块玻片上加38μL 555nm抗鼠HA二抗(1:1000)和strepavidin-FITC二抗(1:1000)孵育1h，使用PBS洗3遍，每次5min(水平摇床上)。在载玻片上滴加2.5μL封片液(内含染核试剂DAPI)，将玻片的细胞面朝下斜盖到载玻片的封片液上，晾一段时间后使用指甲油封片，再晾一段时间后使用荧光显微镜观察。

荧光显微镜成像结果如图3所示，可以看到和图4中使用完整PhBPL*的标记方法相比，ScPhastID(PhN32+PhC33)能显著改善ZKSCAN1的细胞核内定位，使其形成与野生型ZKSCAN1类似的点状分布形态。

2、通过LC-MS质谱研究ZKSCAN1临近互作蛋白

(1)制备质谱样品

将HeLa-iC33-PhN32-ZKSCAN1细胞传代到三个150mm培养皿中，同时对表达稳定表达Ph-NLS的HeLa细胞的对照组做同样的操作，正常培养到90％汇合度时，加入含加多西环素(终浓度1μg/mL)及生物素(终浓度50μM)的培养基培养16h。胰酶消化收集细胞，用PBS洗一次，10000g室温离心10秒。弃去上清用Buffer A(表3)于冰上裂解细胞15min，4℃15000g离心10min。弃去上清用，PBS轻柔洗涤沉淀团，4℃15000g离心5min。弃去上清用600μL RIPA裂解液冰上裂解沉淀团15min。用超声破碎仪充分打断样品中的DNA，15000g离心5min。取上清按一般质谱制样步骤制备质谱样品并委托测试中心进行样品分析，得到质谱数据。

(2)分析质谱数据

得到的质谱数据通过MAXQUANT软件进行搜库得到检出蛋白原始表单。对原始表单数据进行剔除、筛选、整理，然后计算iBAQ和FOT值。设定实验组和对照组FOT值的比值大于等于3为置信互作蛋白(包括实验组独有的蛋白)，得到总数88个可信度较高的ZKSCAN1临近互作蛋白。由此我们做出了ZKSCAN1临近蛋白的TOP40列表，如表3。

表3ZKSCAN1高置信度临近互作蛋白前40名

*左列为N32-ZKSCAN1组独有的检出蛋白TOP20，以FOT高低排序；右列为N32-ZKSCAN1组相对与N32-NLS对照组富集蛋白，以富集倍数高低排列。

对可信度较高的ZKSCAN1临近互作蛋白进行GO分析，结果显示这些富集到的ZKSCAN1临近互作蛋白主要集中在细胞核(图5-B)。这与Human Protein Atlas数据库中ZKSCAN1的定位是一致。另外我们也富集了大量的核仁蛋白可能是因为ZKSCAN1作为转录因子执行生理功能导致的(图5-A)。图5-C分子功能GO分析显示ZKSCAN1主要参与转录调节和DNA结合，这一结果也与前人的研究相符。这些分析结果表明通过ScPhastID得到的ZKSCAN1临近互作蛋白数据是真实可靠的。

3、ZKSCAN1临近/互作蛋白筛选及验证

(1)ZKSCAN1临近互作蛋白筛选

根据88个可信度较高的ZKSCAN1临近互作蛋白的p值和富集倍数，做出ZKSCAN1临近互作蛋白的火山图，从富集程度较高的蛋白中我们选取了5个候选蛋白验证是否有与ZKSCAN1存在互作的蛋白，如图6。5个候选蛋白分别为TRIM24、ADNP、ZNF592、ZNF8以及TRIM28。构建带有GST标签的候选蛋白表达质粒用于进行下拉实验。

(2)GST下拉实验验证ZKSCAN1临近互作蛋白

1.将HEK-293T细胞接种于6孔板，培养16小时至细胞汇和度为60％～70％。

2.将1.5μg候选蛋白表达质粒(一个孔)转染到6孔板中的293T细胞，并培养24小时。

3.用剪过的移液器吸头取40μL GST融合蛋白琼脂糖珠于200μL含1％BSA的1×PBS中封闭半小时。封闭完成后弃去封闭液用NETN裂解液洗一次琼脂糖珠。

4.将6孔板中的细胞消化脱壁，并用1×PBS洗一次去除培养基。

5.将一个孔中的所有细胞分散于含有1％cocktail蛋白酶抑制剂NETN裂解液在4℃冷库的3D旋转仪上进行裂解。

6.裂解半小时后，在4℃预冷的离心机中15,000g离心10分钟。回收上清，并取一定量上清制备上样样品(Input)。

7.将离心后的上清加入封闭完成的琼脂糖珠中，在4℃冷库的3D旋转仪上孵育一到两小时。

8.孵育完成后离心取一部分上清做样(Supernatant)，其余弃去。

9.用冰上预冷的NETN裂解液快速洗六次琼脂糖珠。加一定量NETN重悬琼脂糖珠并加入5×蛋白上样缓冲液制备下拉样品(Pulldown)。

10.用免疫印迹实验检测蛋白表达和下拉情况。

结果如图7所示，TRIM24、ZNF592和ZNF8能与ZKSCAN1共沉淀，说明这三个蛋白与ZKSCAN1可能存在蛋白互作。综合上述结果Sc-PhastID可以利用PhN32的小体积减少对于目的蛋白的定位影响，提高标记的准确度，从而用于研究目的蛋白的临近互作蛋白。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种具有高可信度快速的临近蛋白标记系统ScPhastID及标记方法

<141> 2022-03-31

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 708

<212> DNA

<213> 古细菌(Pyrococcus horikoshii)

<400> 1

atgctgggcc tgaagacaag catcatcggc cggcgggtca tctacttcgg ggagatcacc 60

agcaccaacg agttcgccaa gaccagctac ctggaggagg gaaccgtgat cgtggccgat 120

aagcagacca tgggccacgg aggcctgaac agaaagtggg agtccccaga aggaggcctg 180

tggctgtcta tcgtgctcag ccctaaagtg ccccagaagg acctgcctaa gatcgtgttc 240

ctgggagcag tgggcgtggt ggaaaccctg aaggagttca gcatcgacgg cagaatcaag 300

tggcccaacg acgtgctcgt gaactacaag aagatcgccg gcgtgctggt cgagggcaaa 360

ggcgacaaga tcgtgctggg catcggcctg aacgtgaaca acaaggtgcc caacggcgcc 420

acaagcatga aactggagct gggatcagaa gtgcctctgc tgagcgtgtt caggagcctg 480

atcaccaacc tggaccggct gtacctgaac ttcctgaaga accccatgga catcctgaac 540

ctcgtgcggg acaacatgat cctgggcgtg agagtgaaga tcctgggcga cggcagcttc 600

gagggcatcg ccgaggatat cgacgacttc gggcggctga tcatcaggct ggacagcggc 660

gaggtcaaga aggtcatcta cggcgacgtg tccctgagat tcctgtag 708

<210> 2

<211> 32

<212> PRT

<213> 古细菌(Pyrococcus horikoshii)

<400> 2

Met Leu Gly Leu Lys Thr Ser Ile Ile Gly Arg Arg Val Ile Tyr Phe

1 5 10 15

Gly Glu Ile Thr Ser Thr Asn Glu Phe Ala Lys Thr Ser Tyr Leu Glu

20 25 30

<210> 3

<211> 204

<212> PRT

<213> 古细菌(Pyrococcus horikoshii)

<400> 3

Met Glu Gly Thr Val Ile Val Ala Asp Lys Gln Thr Met Gly His Gly

1 5 10 15

Gly Leu Asn Arg Lys Trp Glu Ser Pro Glu Gly Gly Leu Trp Leu Ser

20 25 30

Ile Val Leu Ser Pro Lys Val Pro Gln Lys Asp Leu Pro Lys Ile Val

35 40 45

Phe Leu Gly Ala Val Gly Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Phe Ser Ile

50 55 60

Asp Gly Arg Ile Lys Trp Pro Asn Asp Val Leu Val Asn Tyr Lys Lys

65 70 75 80

Ile Ala Gly Val Leu Val Glu Gly Lys Gly Asp Lys Ile Val Leu Gly

85 90 95

Ile Gly Leu Asn Val Asn Asn Lys Val Pro Asn Gly Ala Thr Ser Met

100 105 110

Lys Leu Glu Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Phe Arg Ser

115 120 125

Leu Ile Thr Asn Leu Asp Arg Leu Tyr Leu Asn Phe Leu Lys Asn Pro

130 135 140

Met Asp Ile Leu Asn Leu Val Arg Asp Asn Met Ile Leu Gly Val Arg

145 150 155 160

Val Lys Ile Leu Gly Asp Gly Ser Phe Glu Gly Ile Ala Glu Asp Ile

165 170 175

Asp Asp Phe Gly Arg Leu Ile Ile Arg Leu Asp Ser Gly Glu Val Lys

180 185 190

Lys Val Ile Tyr Gly Asp Val Ser Leu Arg Phe Leu

195 200

<210> 4

<211> 96

<212> DNA

<213> 古细菌(Pyrococcus horikoshii)

<400> 4

atgctgggcc tgaagacaag catcatcggc cggcgggtca tctacttcgg ggagatcacc 60

agcaccaacg agttcgccaa gaccagctac ctggag 96

<210> 5

<211> 612

<212> DNA

<213> 古细菌(Pyrococcus horikoshii)

<400> 5

atggagggaa ccgtgatcgt ggccgataag cagaccatgg gccacggagg cctgaacaga 60

aagtgggagt ccccagaagg aggcctgtgg ctgtctatcg tgctcagccc taaagtgccc 120

cagaaggacc tgcctaagat cgtgttcctg ggagcagtgg gcgtggtgga aaccctgaag 180

gagttcagca tcgacggcag aatcaagtgg cccaacgacg tgctcgtgaa ctacaagaag 240

atcgccggcg tgctggtcga gggcaaaggc gacaagatcg tgctgggcat cggcctgaac 300

gtgaacaaca aggtgcccaa cggcgccaca agcatgaaac tggagctggg atcagaagtg 360

cctctgctga gcgtgttcag gagcctgatc accaacctgg accggctgta cctgaacttc 420

ctgaagaacc ccatggacat cctgaacctc gtgcgggaca acatgatcct gggcgtgaga 480

gtgaagatcc tgggcgacgg cagcttcgag ggcatcgccg aggatatcga cgacttcggg 540

cggctgatca tcaggctgga cagcggcgag gtcaagaagg tcatctacgg cgacgtgtcc 600

ctgagattcc tg 612

<210> 6

<211> 178

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcggccgcat ggattacaag gatgacgacg ataagggatc cctgggcctg aagacaagca 60

tcatcggccg gcgggtcatc tacttcgggg agatcaccag caccaacgag ttcgccaaga 120

ccagctacct ggaggaattc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggtaccgg 178

<210> 7

<211> 176

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtacctaat gttcctactg ctgctattcc ctagggaccc ggacttctgt tcgtagtagc 60

cggccgccca gtagatgaag cccctctagt ggtcgtggtt gctcaagcgg ttctggtcga 120

tggacctcct taagccgccg ccgccgtcgc cgccgccgcc gtcgccatgg ccgcgc 176

<210> 8

<211> 1692

<212> DNA

<213> ZKSCAN1蛋白(ZKSCAN1)

<400> 8

atgatgactg ctgaatcacg ggaagccacg ggtctgtccc cacaggctgc acaggagaag 60

gatggtatcg taatagtgaa ggtggaagag gaagatgagg aagaccacat gtgggggcag 120

gattccaccc tacaggacac gcctcctcca gacccagaga tattccgcca acgcttcagg 180

cgcttctgtt accagaacac ttttgggccc cgagaggctc tcagtcggct gaaggaactt 240

tgtcatcagt ggctgcggcc agaaataaac accaaggaac agatcctgga gcttctggtg 300

ctagagcagt ttctttccat cctgcccaag gagctccagg tctggctgca ggaataccgc 360

cccgatagtg gagaggaggc cgtgaccctt ctagaagact tggagcttga tttatcagga 420

caacaggtcc caggtcaagt tcatggacct gagatgctcg caagggggat ggtgcctctg 480

gatccagttc aggagtcctc gagctttgac cttcatcacg aggccaccca gtcccacttc 540

aaacattcgt ctcggaaacc ccgcctctta cagtcacgag ctcttcctgc tgcccacatt 600

cctgcacccc ctcatgaggg tagtcccaga gaccaggcga tggcatctgc actattcaca 660

gcggattccc aggcaatggt gaagatcgag gacatggctg tgtccctcat tctggaggaa 720

tggggatgtc agaatctggc tcggaggaat ctcagtaggg acaacaggca ggagaattat 780

gggagcgcat ttccccaggg tggtgaaaac aggaatgaga acgaggagtc aacctcaaag 840

gctgaaacct cggaagattc agcatcacgc ggggagacaa caggaagatc ccagaaagag 900

tttggagaga aacgtgacca ggagggcaaa acaggagaaa gacagcagaa aaaccctgag 960

gagaaaacca ggaaagagaa aagagattca gggccagcta taggaaagga caaaaaaacc 1020

atcacaggag agagaggtcc aagggagaag gggaaaggat tgggaagaag cttcagtctg 1080

agctccaact tcaccacccc tgaagaagtt cccacgggaa caaagtctca cagatgtgat 1140

gaatgtggta aatgcttcac gagaagttca agccttatcc gccataaaat aatccacact 1200

ggagaaaagc cctatgaatg tagtgagtgt gggaaagcct tcagtcttaa ctccaacctt 1260

gtcctgcatc agaggatcca cacaggagag aaacctcatg aatgtaacga gtgtggcaag 1320

gccttcagcc acagttccaa tctcatcctc catcagcgca tccactctgg agagaaacct 1380

tatgaatgta atgagtgcgg gaaggccttc agccagagct cggacctcac caagcatcag 1440

agaattcaca cgggggagaa accctatgaa tgtagtgaat gtggaaaagc tttcaaccga 1500

aactcatacc tgattttgca tcggagaatt cacactcgag aaaagcccta caagtgcact 1560

aagtgtggca aggccttcac ccgcagctcc accctcactc tgcatcacag aatccatgcc 1620

agagagagag cctctgagta cagcccagcc tcccttgatg catttggcgc gttcctgaaa 1680

agttgtgtgt aa 1692

<210> 9

<211> 563

<212> PRT

<213> ZKSCAN1蛋白(ZKSCAN1)

<400> 9

Met Met Thr Ala Glu Ser Arg Glu Ala Thr Gly Leu Ser Pro Gln Ala

1 5 10 15

Ala Gln Glu Lys Asp Gly Ile Val Ile Val Lys Val Glu Glu Glu Asp

20 25 30

Glu Glu Asp His Met Trp Gly Gln Asp Ser Thr Leu Gln Asp Thr Pro

35 40 45

Pro Pro Asp Pro Glu Ile Phe Arg Gln Arg Phe Arg Arg Phe Cys Tyr

50 55 60

Gln Asn Thr Phe Gly Pro Arg Glu Ala Leu Ser Arg Leu Lys Glu Leu

65 70 75 80

Cys His Gln Trp Leu Arg Pro Glu Ile Asn Thr Lys Glu Gln Ile Leu

85 90 95

Glu Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Leu Ser Ile Leu Pro Lys Glu Leu

100 105 110

Gln Val Trp Leu Gln Glu Tyr Arg Pro Asp Ser Gly Glu Glu Ala Val

115 120 125

Thr Leu Leu Glu Asp Leu Glu Leu Asp Leu Ser Gly Gln Gln Val Pro

130 135 140

Gly Gln Val His Gly Pro Glu Met Leu Ala Arg Gly Met Val Pro Leu

145 150 155 160

Asp Pro Val Gln Glu Ser Ser Ser Phe Asp Leu His His Glu Ala Thr

165 170 175

Gln Ser His Phe Lys His Ser Ser Arg Lys Pro Arg Leu Leu Gln Ser

180 185 190

Arg Ala Leu Pro Ala Ala His Ile Pro Ala Pro Pro His Glu Gly Ser

195 200 205

Pro Arg Asp Gln Ala Met Ala Ser Ala Leu Phe Thr Ala Asp Ser Gln

210 215 220

Ala Met Val Lys Ile Glu Asp Met Ala Val Ser Leu Ile Leu Glu Glu

225 230 235 240

Trp Gly Cys Gln Asn Leu Ala Arg Arg Asn Leu Ser Arg Asp Asn Arg

245 250 255

Gln Glu Asn Tyr Gly Ser Ala Phe Pro Gln Gly Gly Glu Asn Arg Asn

260 265 270

Glu Asn Glu Glu Ser Thr Ser Lys Ala Glu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

275 280 285

Ser Arg Gly Glu Thr Thr Gly Arg Ser Gln Lys Glu Phe Gly Glu Lys

290 295 300

Arg Asp Gln Glu Gly Lys Thr Gly Glu Arg Gln Gln Lys Asn Pro Glu

305 310 315 320

Glu Lys Thr Arg Lys Glu Lys Arg Asp Ser Gly Pro Ala Ile Gly Lys

325 330 335

Asp Lys Lys Thr Ile Thr Gly Glu Arg Gly Pro Arg Glu Lys Gly Lys

340 345 350

Gly Leu Gly Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ser Asn Phe Thr Thr Pro Glu

355 360 365

Glu Val Pro Thr Gly Thr Lys Ser His Arg Cys Asp Glu Cys Gly Lys

370 375 380

Cys Phe Thr Arg Ser Ser Ser Leu Ile Arg His Lys Ile Ile His Thr

385 390 395 400

Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser Leu

405 410 415

Asn Ser Asn Leu Val Leu His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro

420 425 430

His Glu Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser His Ser Ser Asn Leu

435 440 445

Ile Leu His Gln Arg Ile His Ser Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Asn

450 455 460

Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser Gln Ser Ser Asp Leu Thr Lys His Gln

465 470 475 480

Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Ser Glu Cys Gly Lys

485 490 495

Ala Phe Asn Arg Asn Ser Tyr Leu Ile Leu His Arg Arg Ile His Thr

500 505 510

Arg Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Thr Lys Cys Gly Lys Ala Phe Thr Arg

515 520 525

Ser Ser Thr Leu Thr Leu His His Arg Ile His Ala Arg Glu Arg Ala

530 535 540

Ser Glu Tyr Ser Pro Ala Ser Leu Asp Ala Phe Gly Ala Phe Leu Lys

545 550 555 560

Ser Cys Val

Claims

1.一种用于临近蛋白标记的蛋白组合物，其特征在于，包括PhN32蛋白和PhC33蛋白；所述PhN32蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述PhC33蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。

2.一种核酸分子组合物，其特征在于，包括编码权利要求1所述PhN32蛋白和PhC33蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述核酸分子组合物，其特征在于，编码PhN32蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，编码PhC33蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子组合物的重组表达质粒。

5.含有权利要求4所述重组表达质粒的重组细胞系。

6.权利要求1所述蛋白组合物、权利要求2或3所述核酸分子组合物、权利要求4所述重组表达质粒或权利要求5所述重组细胞系在临近蛋白标记中或在制备临近蛋白标记系统ScPhastID的应用。

7.一种具有高可信度快速的临近蛋白标记系统ScPhastID，其特征在于，包括含有编码目的蛋白-PhN32融合蛋白的核苷酸序列的重组质粒及含有编码PhC33蛋白核苷酸序列的重组质粒，或包括含有编码目的蛋白-PhN32融合蛋白的核苷酸序列的重组质粒及诱导表达PhC33蛋白的细胞系。

8.权利要求7所述临近蛋白标记系统ScPhastID在临近蛋白标记中的应用。

9.一种具有高可信度的临近蛋白标记方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.构建或提供诱导表达PhC33蛋白的细胞系，同时构建含有待研究的目的蛋白与PhN32融合蛋白编码核苷酸序列的重组质粒；

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述诱导表达PhC33蛋白的细胞系为多西环素诱导表达的细胞系，所述诱导物为多西环素。