ES2343518T3

ES2343518T3 - Polipeptidos interferon alfa modificados resistentes a proteasas.

Info

Publication number: ES2343518T3
Application number: ES03794017T
Authority: ES
Inventors: Rene Gantier; Thierry Guyon; Manuel Vega; Lila Drittanti
Original assignee: Hanall Biopharma Co Ltd
Current assignee: Hanall Biopharma Co Ltd
Priority date: 2002-09-09
Filing date: 2003-09-08
Publication date: 2010-08-03
Anticipated expiration: 2023-09-08
Also published as: US20090123974A1; US8114839B2; WO2004022593A3; US7611700B2; EP1539960A2; US20090053147A1; US8057787B2; US8105573B2; US20090131318A1; US20110142801A1; AU2003263552A1; US20080274081A9; CA2498319A1; US20080159977A1; ATE466085T1; US20080075672A1; US7998469B2; US20070254838A1; US20070224665A1; US7650243B2

Abstract

Una citocina interferón alfa modificada que presenta una resistencia aumentada a la proteolisis en comparación con la citocina no modificada, en la que: la citocina interferón alfa modificada es una IFNα-2b o una IFNα-2a que comprende una sustitución de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 ó 182, correspondiente a la sustitución de E por Q en la posición 41, en la que el resto 1 se corresponde con el resto 1 de la citocina IFNα-2b o IFNα-2a madura expuesta en las SEC ID Nº: 1 ó 182; o la citocina interferón alfa modificada es un homólogo estructural de IFNα-2b que comprende una sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente a la sustitución de E por Q en la posición 41 en IFNα2b.

Description

Polipéptidos interferón \alpha modificados resistentes a proteasas.

Campo de la invención

Se proponen proteínas citocinas modificadas que tienen propiedades modificadas seleccionadas en comparación con las proteínas no modificadas o naturales, así como moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas. Así mismo, se ofrecen usos de estas proteínas para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades.

Antecedentes

El suministro de proteínas terapéuticas para uso clínico es un desafío de primera magnitud para la ciencia farmacéutica. Una vez que acceden al torrente circulatorio, estas proteínas son constantemente eliminadas de la circulación en un breve periodo de tiempo a través de diferentes procesos fisiológicos que implican tanto el metabolismo como el aclaramiento, empleando vías normales para la eliminación de proteínas tales como filtración (glomerular) en los riñones o la proteolisis en la sangre. Esta última es con frecuencia el proceso limitante que afecta a la semivida de proteínas usadas como agentes terapéuticos en la administración por vía oral y por inyección intravenosa o intramuscular. Los problemas asociados con estas vías de administración de proteínas son bien conocidos y se han usado diversas estrategias en un intento de resolverlos.

La familia de las citocinas, incluida la del interferón, es una familia de proteínas sobre la que se ha centrado una gran parte del trabajo clínico y de los esfuerzos para mejorar su administración y bio-asimilación. Las moléculas de interferón se agrupan en la familia heterogénea de las citocinas, identificadas originalmente sobre la base de su capacidad para inducir resistencia celular a las infecciones víricas (Díaz et al., J Interferon Cytokine Res, 16:179-180,1996). Los interferones de tipo I, denominados interferones \alpha/\beta, incluyen muchos miembros de la familia del interferón \alpha (interferón \alpha1, \alpha2, \omega y \tau), así como el interferón \beta. El interferón \gamma de tipo II es diferente del tipo I en los mecanismos particulares que regulan su producción. Mientras que la producción de interferones \alpha/\beta se induce de manera muy eficaz en muchos tipos de células ante una infección vírica, el interferón \gamma se produce principalmente en células del sistema hematopoyético tales como células T o células asesinas naturales, tras la estimulación de antígenos o citocinas, respectivamente. Estos dos sistemas de interferón son funcionalmente no redundantes en la defensa antiviral del hospedador.

El interferón \alpha, al que se designará en lo sucesivo "interferón alfa-2b" o "interferón \alpha-2b" o "IFN \alpha-2b", usados de forma intercambiable, posee un amplio espectro de efectos biológicos, incluidos los efectos antivirales. Los efectos antivirales incluyen acciones antiproliferativas e inmunomoduladoras (Stark et al., Annu. Rev. Biochem., 67: 227-264, 1998). Además de desencadenar potentes actividades antivirales en células diana, los interferones \alpha/\beta activan también células efectoras del sistema inmune innato tales como células asesinas naturales y macrófagos (Pestka et al., Annu. Rev. Biochem., 56:727-777, 1987; Biron et al., Annu. Rev. Immunol., 17: 189-220, 1999). Como parte de su acción inmunomoduladora, el interferón de tipo I protege los linfocitos T de la apoptosis (Scheel-Toller et al., Eur. J. Immunol., 29: 2603-2612, 1999; Marrack et al., J. Exp. Med., 189: 521-530, 1999) y de los factores promotores del crecimiento (Robert et al., Hematol. Oncol. 4: 113-120, 1986; Morikawa et al., J. Immunol., 139: 761-766, 1987). Los efectos biológicos de los interferones \alpha/\beta se inician tras la unión al receptor de IFN tipo I, lo que da como resultado la activación de diversas moléculas efectoras corriente abajo (Hibbert y Foster, J. Interferon Cytokine Res., 19: 309-318, 1999). Análisis mutacionales han conducido a la identificación de restos específicos tanto en los interferones \alpha/\beta como en sus receptores, que interaccionan tras la unión de ligando-receptor (Piehler et al., J. Mol. Biol., 294: 223-237, 1999).

Los interferones, así como muchas citocinas, son agentes terapéuticos importantes. Dado que las variantes de origen natural no se han desarrollado como agentes terapéuticos, a menudo tienen efectos secundarios indeseables, así como los problemas de breve semivida, de administración y biodisponibilidad mencionados anteriormente. Por lo tanto, existe la necesidad de mejorar las propiedades de las citocinas, incluidos los interferones, para su uso como agentes terapéuticos. Por consiguiente, entre los objetos de este documento, uno es proporcionar citocinas con propiedades terapéuticas mejoradas.

Sumario

Este documento proporciona métodos para el desarrollo dirigido de familias de proteínas y familias resultantes de proteínas modificadas. Inicialmente, se identifica una familia, como la familia de proteínas citocinas. Se selecciona para su modificación una propiedad o fenotipo tal como la resistencia a la proteolisis para una mayor estabilidad en sangre. Se seleccionan uno o más miembros representativos de la familia tales como miembros de la familia del interferón \alpha como IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a, o de la familia del interferón \beta. Se les modifica usando cualquier método de desarrollo dirigido y se analizan e identifican proteínas con un fenotipo deseado. Además, es posible mapear la estructura tridimensional de la proteína para identificar topológica y espacialmente los loci que se modifican para lograr el cambio fenotípico. Se generan u obtienen estructuras tridimensionales de otros miembros de la familia, y se comparan con el miembro modificado de la familia. Se identifican y modifican los loci en los otros miembros de la familia que se corresponden con las proteínas de los modificados en la proteína original. Se pueden ensayar las proteínas resultantes para confirmar que exhiben el fenotipo modificado.

En este documento se ofrecen métodos para generar citocinas modificadas basadas en la homología estructural (exploración 3D). Estos métodos se basan en la estructura espacial y topológica; no lo hacen sobre sus secuencias subyacentes de restos aminoacídicos. Los métodos se usan para la identificación de sitios diana para mutagénesis, especialmente en familias de proteínas diana. Las dianas se identifican por la comparación de los patrones del plegamiento del esqueleto proteico entre proteínas relacionadas estructuralmente. En este documento, los métodos se ejemplifican para citocinas. Igualmente, se proporcionan en este documento familias de citocinas modifi-
cadas.

Para la optimización usando los métodos de desarrollo dirigido que se proporcionan en este documento resulta apropiada cualquier proteína conocida o disponible de alguna otra forma para el experto en la técnica, incluidas las citocinas (por ejemplo, IFN\alpha, incluidos IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a, e IFN\beta), o cualquier otra proteína que haya sufrido ya una mutación u optimización.

En este documento se ofrecen citocinas modificadas que muestran resistencia incrementada a la proteolisis, evaluada tanto in vivo como in vitro. Típicamente, el aumento de la resistencia es de al menos 5%, generalmente de 8%, 10% o mayor. Las citocinas modificadas que se proporcionan en este documento incluyen las diseñadas por exploración 3D empleado los interferones \alpha que se han modificado en base a los métodos de exploración 2D de este
documento.

También se ofrecen en este documento proteínas citocinas modificadas (mutantes) tales como variantes de IFN\alpha e IFN\beta, incluidas las proteínas IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a y proteínas IFN\beta, que poseen propiedades terapéuticas alteradas, en especial mejoradas, incluida una mayor estabilidad en comparación con las formas no modificadas. En particular, los ejemplos de citocinas modificadas que se ofrecen en este documento tienen una estabilidad incrementada que, por ejemplo, mejora su utilización como agentes terapéuticos. Entre las proteínas modificadas que se ofrecen en este documento se cuentan aquellas que muestran una mayor resistencia a la proteolisis comparadas con la citocina no modificada. En especial, dicha resistencia está incrementada en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 100% o más frente a la proteolisis en comparación con la citocina no modificada. También se ofrecen citocinas que poseen una mayor actividad antiproliferativa y/o antiviral y/o resistencia a la proteolisis con respecto a la citocina no
modificada.

Ejemplos de citocinas modificadas que se ofrecen en este documento son interferones modificados que muestran una mayor estabilidad comparados con las formas no modificadas. Estos interferones modificados se pueden usar para tratar enfermedades en el ser humano que responden a tratamientos con interferones tales como, sin limitaciones, infecciones víricas, cáncer o tumores, proliferación celular no deseada, y para la inmunomodulación.

De acuerdo con la invención, se ofrece en este documento una citocina interferón alfa que exhibe una resistencia aumentada a la proteolisis, en comparación con la citocina no modificada, en donde: la citocina interferón alfa modificada es un IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a que comprende una sustitución de aminoácido en SEC ID Nº: 1 ó 182, correspondiente a la sustitución de E por Q en la posición 41, en donde el resto 1 corresponde al resto 1 de la citocina IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a madura expuesta en las SEC ID Nos. 1 ó 182; o la citocina interferón alfa modificada es un homólogo estructural de IFN\alpha-2b, que comprende una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a la sustitución de E por Q en la posición 41 en IFN\alpha-2b.

Ejemplos de proteínas que pueden ser modificadas por los métodos de exploración 2D y 3D que se ofrecen en este documento son citocinas de la familia de interferones/interleucinas-10. Esta familia incluye, por ejemplo, interleucina-10 (IL-10; SEC ID Nº: 200, interferón beta (IFN\beta; SEC ID Nº: 196), interferón alfa-2a (IFN\alpha-2a; SEC ID Nº: 182), interferón alfa-2b (IFN\alpha-2b; SEC ID Nº: 1), e interferón gamma (IFN-\gamma; SEC ID Nº: 199). La familia de citocinas de cadena larga incluye, entre otros, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF; SEC ID Nº: 210), el factor inhibidor de leucemia (LIF; SEC ID Nº: 213), la hormona del crecimiento (hGH; SEC ID Nº: 216), el factor neurotrófico ciliar (CNTF; SEC ID Nº: 212), la leptina (SEC ID Nº: 211), la oncostatina M (SEC ID Nº: 214), la interleucina-6 (IL-6; SEC ID Nº: 217), y la interleucina-12 (IL-12; SEC ID Nº: 215). La familia de citocinas de cadena corta incluye, entre otras, la eritropoyetina (EPO; SEC ID Nº: 201), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-SCF; SEC ID Nº: 202), la interleucina-2 (IL-2; SEC ID Nº: 204), la interleucina-3 (IL-3; SEC ID Nº: 205), la interleucina-4 (IL-4; SEC ID Nº: 207), la interleucina-5 (IL-5; SEC ID Nº: 208), la interleucina-13 (IL-13; SEC ID Nº: 209), el ligando Flt3 (SEC ID Nº: 203), y el factor de células madre (SCF; SEC ID Nº: 206). Se ofrecen formas modificadas de cada uno de ellos que presentan una resistencia aumentada a la proteolisis. Fueron generadas por comparación entre las estructuras 3D para identificar los restos que mejoran la resistencia a la
proteolisis.

Se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen cada citocina modificada y métodos de tratamiento.

Las citocinas modificadas encuentran aplicación como agentes terapéuticos. Cada citocina tiene una actividad biológica y/o terapéutica optimizada en comparación con la actividad conocida de la citocina no modificada. En consecuencia, se ofrecen usos de las citocinas para el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas y de enfermedades en las que se utiliza inmunoterapia. Así mismo, se ofrecen métodos de tratamiento de enfermedades, usando las citocinas modificadas. Cada citocina tiene un uso terapéutico conocido, y dicho uso se contempla en este documento. Las citocinas que se proporcionan en este documento tienen propiedades mejoradas tales como biodisponibilidad mejorada, estabilidad optimizada, en especial in vivo, y/o mayor eficacia.

Descripción de las figuras

Figura 1(A) muestra la secuencia del IFN\alpha-2b maduro. Se subrayan y se marcan en negrita los restos que sirven de diana para una mezcla de proteasas, incluida \alpha-quimotripsina (F, L, M, W, e Y), endoproteinasa Arg-C ®, endoproteinasa Asp-N (D), endoproteinasa Glu-C (E), endoproteinasa Lys-C (K), y tripsina (K y R).

Figura 1(B) muestra la estructura de IFN\alpha-2b obtenida de la estructura de RMN de IFN\alpha-2a (código de PDB 1ITF) en representación de cinta. Los restos de superficie que están expuestos a la acción de las proteasas consideradas en Fig 1A se muestran en representación de llenado de espacio.

Figura 2 muestra la matriz de "Porcentaje de mutación aceptado" (PAM250). Los valores asignados a restos idénticos se muestran en cuadrados de color gris. Los valores máximos en la matriz se muestran en cuadrados de color negro y corresponden a la máxima incidencia de sustitución entre dos restos.

Figura 3 muestra las puntuaciones obtenidas en el análisis PAM250 para las sustituciones de aminoácidos (sustitución de aminoácidos en el eje vertical; posición de aminoácidos en el eje horizontal) dirigido a la introducción de resistencia a la proteolisis en el IFN\alpha-2b en las secuencias diana de las proteasas. Los dos mejores restos de sustitución para cada aminoácido diana,

\hbox{según las
puntuaciones máximas de sustitución, se muestran  en rectángulos de
color negro.}

Figuras 4(A)-4(C) ofrecen gráficos de experimentos que indican los niveles de protección contra la proteolisis in vitro para variantes de IFN\alpha-2b producidas en células de mamífero. En las Figuras 4(B) y 4/C), el eje vertical indica el nivel relativo de proteína no proteolizada y el eje horizontal indica el tiempo en horas.

Figura 5 muestra la caracterización de distintas variantes de IFN\alpha-2b producidas en células de mamífero, tratadas con \alpha-quimotripsina.

Figura 6(A) muestra la caracterización de la variante E113H de IFN\alpha-2b cuando se trata con \alpha-quimotripsina. El porcentaje de actividad (antiviral) residual para la variante (línea negra y círculos blancos) después del tratamiento con \alpha-quimotripsina se comparó con el IFN\alpha-2b natural tratado (línea punteada y cuadrados negros). Para este experimento, la variante E113H de IFN\alpha-2b se produjo en células de mamífero.

Figura 6(B) muestra la caracterización de la variante E113H de IFN\alpha-2b tratada con una mezcla de proteasas. El porcentaje de actividad (antiviral) residual para la variante (línea negra y círculos blancos) después del tratamiento con la mezcla de proteasas se comparó con el IFN\alpha-2b natural tratado (línea punteada y cuadrados negros). Para este experimento, la variante E113H de IFN\alpha-2b se produjo en células de mamífero.

Figura 6(C) muestra la caracterización de la variante E113H de IFN\alpha-2b tratada con lisado de sangre. El porcentaje de actividad (antiviral) residual para la variante (línea negra y círculos blancos) después del tratamiento con el lisado de sangre se comparó con el IFN\alpha-2b natural tratado (línea punteada y cuadrados negros). Para este experimento, la variante E113H de IFN\alpha-2b se produjo en células de mamífero.

Figura 6(D) muestra la caracterización de la variante E113H de IFN\alpha-2b tratada con suero. El porcentaje de actividad (antiviral) residual para la variante (línea negra y círculos blancos) después del tratamiento con suero se comparó con el IFN\alpha-2b natural tratado (línea punteada y cuadrados negros). Para este experimento, la variante E113H de IFN\alpha-2b se produjo en células de mamífero.

Figura 6(E) y (F) ofrecen gráficos que indican los niveles de protección contra la proteolisis in vitro para variantes de IFN\alpha-2b producidas en bacterias- En las Figuras 6(E) y 6(F), el eje vertical indica el nivel relativo de proteína no proteolizada y el eje horizontal muestra el tiempo en horas. El porcentaje de actividad (antiviral) residual para las variantes (círculos grises con línea continua) después del tratamiento se comparó con el IFN\alpha-2b natural tratado (círculos macizos con líneas punteadas).

Figura 6(G) ofrece gráficos que indican la potencia in vitro para actividad antiviral para variantes de IFN\alpha-2b producidas en bacterias. El eje vertical señala el nivel de actividad antiviral y el eje horizontal indica la concentración de las variantes con la que se alcanza cada nivel de actividad. Se comparó la actividad para las variantes (línea continua con círculos grises) con la de IFN\alpha-2b natural (triángulos negros con líneas punteadas). La potencia para cada variante se calculó a partir de los gráficos como la concentración en el punto de inflexión de las curvas respectivas. La Figura 6(T) muestra el valor de potencia obtenido para cada variante ensayada, en comparación con el IFN\alpha natural.

Figura 6(H) ofrece la potencia in vitro para la actividad antiproliferativa para variantes de IFN\alpha-2b producidas en bacterias. Se comparó la actividad de las variantes con la del IFN\alpha-2b natural en experimentos de dilución seriada, en los que la actividad antiproliferativa se midió para una serie de diluciones de cada variante. La potencia se calculó a partir de los gráficos como la concentración en el punto de inflexión de las curvas respectivas. La figura muestra el valor de potencia obtenido para cada variante ensayada y en comparación con el IFN\alpha natural.

Figuras 6(I) a 6(N) proporcionan gráficos que indican la farmacocinética en ratones tras la inyección subcutánea de variantes de IFN\alpha-2b producidas en bacterias. El eje vertical indica el nivel de actividad antiviral en sangre y el eje horizontal muestra el tiempo después de la inyección en el que se determina el nivel de actividad antiviral. La farmacocinética de las variantes (en círculos grises macizos con líneas continuas) se comparó con la del IFN\alpha-2b natural (en negro, con líneas punteadas) y de un derivado tratado con PEG [polietilenglicol] (Pegasys, Roche) 36 \mug/ml, triángulos abiertos con líneas negras continuas; y 18 \mug/ml, círculos abiertos con líneas negras continuas); y vehículo (triángulos grises macizos con líneas grises continuas). El Área Bajo la Curva (AUC) para cada variante se calculó a partir de los gráficos y se muestra en 6(U).

Figura 6(O) ofrece gráficos que indican los niveles de protección contra la proteolisis in vitro para variantes de IFN\beta producidas en células de mamífero.

Figura 6(N), el eje vertical indica el nivel relativo de proteína no proteolizada y el eje horizontal indica el tiempo en horas. El porcentaje de actividad (antiviral) residual para las variantes después del tratamiento se comparó con el de IFN\beta natural.

Figuras 6(P) a 6(S) proporcionan gráficos que indican la potencia in vitro de la actividad antiviral (6(P) y 6(Q)) o antiproliferativa (6(R) y 6(S)) para una serie de variantes de IFN\beta producidas en células de mamífero.

El eje vertical indica el nivel de actividad (antiviral o antiproliferativa) y el eje horizontal indica la concentración de las variantes a la que se alcanza cada nivel de actividad. Se comparó la actividad de las variantes (6(Q) y 6(S)) con la del IFN\beta natural (6(P) y 6(R)). Se muestra la actividad obtenida sin tratamiento previo o con el tratamiento de las variantes con proteasas antes de los ensayos de actividad.

Figura 6(T) ofrece una comparación de actividad antiviral (potencia), actividad antiproliferativa (potencia), número de mutaciones presentes y AUC (de PK) para una serie de IFN\alpha-2b y en comparación con el IFN\alpha-2b natural.

Figura 6(U) proporciona las unidades de IFN inyectadas y de proteína inyectada (\mug/ml) para los datos de la Figura 6(T).

Figura 7(A) muestra una vista superior de la representación en cinta de la estructura de IFN\alpha-2b obtenida de la estructura de RMN de IFN\alpha-2b (código de PDB 1ITF). Los restos representados en "llenado de espacio" definen (1) la "región de unión al receptor" basada en el análisis de "barrido con alanina" de los autores, o en estudios de Piehler et al., J. Biol. Chem., 275:40425-40433, 2000, y Roisman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:13231-13236, 2001 (en gris claro y gris oscuro, respectivamente), y (2) restos de sustitución (LEAD) para resistencia a la proteolisis (en negro).

Figura 7(B) muestra una visión lateral de la representación en cinta de la estructura de IFN\alpha-2b (código de PDB 1ITF). Representación de restos como en Fig 7(A).

Figura 8(A) esquematiza la identificación de posiciones homólogas de aminoácidos entre una serie de citocinas y los mutantes LEAD de IFN\alpha-2b usando la exploración tridimensional (también designado en este documento como basado en métodos de "homología basada en la estructura" o métodos de "homología estructural").

Figura 8(B) ilustra un solapamiento estructural entre un interferón \alpha-2b humano, obtenido de la estructura de RMN de IFN\alpha-2b (código de PDB 1ITF) y un interferón \beta humano (código de PDB 1AU1) usando el dispositivo Swiss PDB Viewer.

Figura 8(C) ilustra un solapamiento estructural entre un interferón \alpha-2b humano, obtenido de la estructura de RMN de IFN\alpha-2b (código de PDB 1ITF) y eritropoyetina (código de PDB 1BUY), usando el dispositivo Swiss PDB Viewer.

Figura 8(D) ilustra un solapamiento estructural entre un interferón \alpha-2b humano, obtenido de la estructura de RMN de IFN\alpha-2b (código de PDB 1ITF) y el factor estimulante de colonia de granulocitos (código de PDB 1CD9), usando el dispositivo Swiss PDB Viewer.

Figura 9 ilustra el alineamiento estructural de una serie de citocinas y secuencias de IFN\alpha-2b. Los restos en negrita y subrayados definen la región en cada secuencia de citocina que, sobre la base de la comparación de homología estructural, corresponde a las mutaciones estructuralmente relacionadas halladas en los LEAD para resistencia a proteasas en IFN\alpha-2b.

Figura 10(A) muestra la actividad antiviral de mutantes de IFN\alpha-2b generados por análisis de barrido con alanina usado para el rediseño de proteínas. Los símbolos trazados para el interferón \alpha-2b natural y sus variantes se indican en el recuadro.

Figura 10(B) muestra la proliferación celular después del tratamiento con mutantes de interferón \alpha-2b obtenidos por análisis de barrido con alanina. En el recuadro de indican los símbolos trazados para el interferón \alpha-2b natural y sus variantes.

Figura 10(C) muestra la correlación entre la actividad antiviral y la actividad sobre la proliferación celular de mutantes de interferón \alpha-2b obtenidos por análisis de barrido con alanina.

Figura 11 Sitios candidatos para glicosilación para la estabilización del interferón \alpha-2b y rediseño de los
mismos.

Figura 12(A) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de interferón \beta (correspondientes a SEC ID Nos. 233-289), basado en la exploración tridimensional (método de homología estructural), incluido el análisis PAM250.

Figura 12(B) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de interferón gamma (correspondientes a SEC ID Nos. 290-311), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(C) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de interleucina-10 (correspondientes a SEC ID Nos. 312-361), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(D) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas del factor neurotrófico ciliar (correspondientes a SEC ID Nos. 684-728), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(E) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas del factor estimulante de colonias de granulocitos (correspondientes a SEC ID Nos. 631-662), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(F) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de hormona humana del crecimiento (correspondientes a SEC ID Nos. 850-895), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(G) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de interleucina-12 (correspondientes a SEC ID Nos. 794-849), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(H) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de interleucina-6 (correspondientes a SEC ID Nos. 896-939), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(I) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de leptina (correspondientes a SEC ID Nos. 663-683), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(J) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas del factor inhibidor de leucemia (correspondientes a SEC ID Nos. 729-760), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(K) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de oncostatina M (correspondientes a SEC ID Nos. 761-793), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(L) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de eritropoyetina (correspondientes a SEC ID Nos. 940-977), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(M) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de ligando Flt3 (correspondientes a SEC ID Nos. 401-428), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(N) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (correspondientes a SEC ID Nos. 362-400), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(O) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de interleucina-13 (correspondientes a SEC ID Nos. 603-630), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(P) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de interleucina-2 (correspondientes a SEC ID Nos. 429-476), basado en homología estructural y análisis PAM250.

\newpage

Figura 12(Q) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de interleucina-3 (correspondientes a SEC ID Nos. 477-498), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(R) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de interleucina-4 (correspondientes a SEC ID Nos. 543-567), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(S) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de interleucina-5 (correspondientes a SEC ID Nos. 568-602), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Figura 12(T) muestra las posiciones del resto is-HIT y los tipos de aminoácidos de sustitución seleccionados para generar secuencias de proteínas modificadas de factor de células madre (correspondientes a SEC ID Nos. 499-542), basado en homología estructural y análisis PAM250.

Descripción detallada

ESQUEMA

A.: Definiciones.

B.: Desarrollo Dirigido

1): Mutagénesis Aleatoria Pura

2): Mutagénesis Aleatoria Restringida

3): Mutagénesis Racional no Restringida

C.: Exploración Racional Bidimensional (exploración 2D)

1): Identificación de HIT mediante simulación por ordenador

2): Identificación de Aminoácidos de Sustitución

(a): Porcentaje de mutación aceptado (PAM)

(i): Análisis PAM

(ii): PAM250

(b): Jones y Gonnet

(c): Fitch y Feng

(d): McLachlan, Grantham y Miyata

(e): Rao

(f): Risler

(g): Johnson

(h): Matriz de Sustitución en Bloque (BLOSUM)

3): Construcción Física de Proteínas Mutantes y Ensayos Biológicos

D.: Exploración Bidimensional de Proteínas para Resistencia Aumentada a la Proteolisis

E.: Desarrollo Racional de IFN\alpha-2b para Resistencia Aumentada a la Proteolisis.

1): Proteínas Modificadas de IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a con Sustituciones de un solo aminoácido (is-HIT)

2): Identificación de LEAD

3): Adición de Sitios de N-glicosilación

F.: Rediseño de Proteínas

G.: Exploración Tridimensional y su Uso para Modificar Citocinas

1): Homología

2): Exploración Tridimensional (Homología Estructural)

3): Aplicación del Método de Exploración Tridimensional a Citocinas

(a): Mutantes de Interferón Estructuralmente Homólogos

(b): Mutantes de Citocinas Estructuralmente Homólogos

H.: Desarrollo Racional de IFN\beta para Resistencia Aumentada a la Proteolisis. Proteínas Modificadas de IFN\beta con Sustituciones de un solo aminoácido

I.: Súper-LEAD y Mutagénesis Direccional Aditiva (ADM)

1): Mutagénesis Direccional Aditiva

2): Extensiones de Cebadores Multi-Solapados

J.: Usos del Mutante IFN\alpha, Genes de IFN/\beta-2b y Citocinas en Métodos Terapéuticos

1): Proteínas de Fusión

2): Moléculas de Ácido Nucleico para Expresión

3): Formulación de Citocinas Optimizadas.

K.: Ejemplos.

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A. Definiciones

Salvo que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que los entendidos habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. En caso de existir una pluralidad de definiciones para términos en este documento, prevalecerán las de esta sección. Cuando se haga referencia a una URL u otro identificador o dirección similar, se entenderá que estos identificadores pueden variar y que la información particular disponible en Internet puede ir y venir, si bien se puede encontrar información equivalente buscando en Internet.

La referencia a ella pone de manifiesto la disponibilidad y la difusión pública de esta información.

Como se usa en este documento, la actividad biológica de una proteína se refiere a cualquier actividad manifestada por la proteína in vivo.

Como se usa en este documento, un "método de desarrollo dirigido" hace referencia a métodos que "adaptan" proteínas naturales, proteínas sintéticas o dominios de proteínas para trabajar en entornos químicos o biológicos naturales o artificiales, nuevos o existentes, y/o a desarrollar nuevas funciones, y/o a aumentar o reducir una actividad determinada, y7o a modular una característica determinada. Ejemplos de métodos de desarrollo dirigido incluyen métodos de mutagénesis aleatoria pura; métodos de mutagénesis aleatoria restringida; y métodos de mutagénesis racional no restringida, tales como el método de desarrollo dirigido racional descrito en la solicitud de Estados Unidos en trámite junto con la presente Nº Serie 10/022.249; y el método de exploración racional bidimensional que se ofrece en este documento.

Como se usa en este documento, la exploración de mutagénesis bidimensional (exploración 2D) hace referencia a los procesos ofrecidos en este documento en los que se rastrean dos dimensiones de una secuencia particular de proteína: (1) una dimensión es para identificar restos aminoacídicos específicos a lo largo de la secuencia de proteína para sustituir con diferentes aminoácidos, designado como posiciones diana is-HIT, y (2) la segunda dimensión es el tipo de aminoácido seleccionado para sustituir la diana is-HIT particular, designado como aminoácido de sustitución.

Como se usa en este documento, la expresión "mediante simulación por ordenador" se refiere a investigaciones y experimentos llevados a cabo usando un ordenador. Los métodos de simulación por ordenador incluyen, sin limitaciones, estudios de modelado molecular y experimentos de acoplamiento biomolecular.

Como se usa en este documento, "is-HIT" se refiere a una posición aminoacídica identificada mediante simulación por ordenador a lo largo de una secuencia de proteína diana que se ha identificado en base a i) las propiedades de la proteína particular que se deben desarrollar, ii) la secuencia de aminoácidos de la proteína, y/o iii) las propiedades conocidas de los aminoácidos individuales. Estos loci is-HIT en la secuencia de proteína se identifican sin emplear métodos biológicos experimentales. Por ejemplo, una vez seleccionadas la o las características de la proteína que se deben optimizar, se utilizan diversas fuentes de información o conocimientos anteriores (es decir, estructuras primaria, secundaria o terciaria de proteína, bibliografía, patentes) para determinar aquellas posiciones aminoacídicas que pueden ser susceptibles para un mejor ajuste de las proteínas por sustitución con un aminoácido diferente. Esta etapa utiliza el análisis de proteína "mediante simulación por ordenador". Todas las posibles posiciones aminoacídicas candidatas a lo lago de la secuencia primaria de la proteína diana que pueden intervenir en la característica que se desarrolla se designan en este documento como "HIT obtenidos mediante simulación por ordenador" ("is-HIT"). La colección (biblioteca) de todos los is-HIT identificados durante esta etapa representa la primera dimensión (posición del resto diana) de los métodos de exploración bidimensional que se proporcionan en este documento.

Como se usa en este documento, la expresión "susceptible de ofrecer la propiedad o actividad predeterminada desarrollada", en el contexto de la identificación de is-HIT, se refiere a una posición aminoacídica en una proteína que, en base al análisis mediante simulación por ordenador, se considera que posee propiedades o características que, una vez sustituidas, darían como resultado el desarrollo de la actividad deseada. La expresión "susceptible de ofrecer la propiedad o actividad predeterminada desarrollada", en el contexto de la identificación de aminoácidos de sustitución, se refiere a un tipo particular de aminoácido que, sobre la base de un análisis mediante simulación por ordenador, se considera que posee propiedades o características que, cuando se usan para sustituir el aminoácido original en la proteína no modificada de partida, daría como resultado el desarrollo de la actividad deseada.

Como se usa en este documento, exploración de alto rendimiento (HTS) se refiere a procesos que analizan un gran número de muestras tales como muestras de proteínas o células de ensayo que contienen ácidos nucleicos que codifican las proteínas de interés, para identificar estructuras de interés, o para identificar compuestos de ensayo que interaccionan con las variantes de proteínas o células que los contienen. Las operaciones de HTS son susceptibles de automatización y están generalmente computarizadas para gestionar la preparación de muestras, los procedimientos de ensayo y el posterior procesamiento de grandes volúmenes de datos.

Como se usa en este documento, el término "restringido", cuando se utiliza en el contexto de la identificación de posiciones aminoacídicas is-HIT a lo largo de la secuencia de proteína seleccionada para la sustitución de aminoácidos y/o la identificación de aminoácidos de sustitución, significa que se seleccionan menos que todos los aminoácidos en el esqueleto proteico para la sustitución de aminoácidos; y/o que se seleccionan para la sustitución menos que los 19 aminoácidos remanentes disponibles para sustituir el aminoácido original en la proteína no modificada de partida. En formas de realización particulares de los métodos ofrecidos en este documento, las posiciones aminoacídicas is-HIT están restringidas, de forma que se seleccionan menos que todos los aminoácidos del esqueleto proteico para la sustitución de aminoácidos. En otras formas de realización, los aminoácidos de sustitución están restringidos, de manera que como aminoácidos de sustitución se seleccionan menos que los 19 aminoácidos remanentes disponibles para sustituir el aminoácido nativo presente en la proteína no modificada de partida. En una forma de realización particular, tanto las exploraciones para identificar posiciones aminoacídicas is-HIT como los aminoácidos de sustitución están restringidos, de modo que para la sustitución de aminoácidos se seleccionan menos que todos los aminoácidos del esqueleto proteico y para la sustitución de aminoácidos se seleccionan menos que los 19 aminoácidos remanentes disponibles para sustituir el aminoácido nativo.

Como se usa en este documento, "LEAD candidatos" son proteínas mutantes que se considera que poseen potencialmente una alteración en cualquier atributo, propiedad química, física o biológica en la que se busca dicha alteración. En los métodos de este documento, los LEAD candidatos se generan, por lo general, sustituyendo de forma sistemática los loci is-HIT en una proteína o dominio de la misma con un conjunto típicamente restringido, o con todos los 19 aminoácidos remanentes tal como se obtienen usando el análisis PAM. Los LEAD candidatos se pueden generar por otros métodos conocidos por el experto en la técnica, ensayados en los métodos de alto rendimiento de este documento.

Como se usa en este documento, "LEAD" son "LEAD candidatos" en los que se ha demostrado que su actividad se optimiza o mejora para el atributo particular, o propiedad química, física o biológica. A los efectos de este documento, un "LEAD" tiene actividad con respecto a la función de interés que difiere en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% o más en relación con la proteína no modificada y/o natural (nativa). En ciertas formas de realización, la variación de actividad es de al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% de la actividad de la proteína diana no modificada. En otras formas de realización, la variación de actividad no es mayor que aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% de la actividad de la proteína diana no modificada. En todavía otras formas de realización, la variación de actividad es de al menos aproximadamente 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces o más veces mayor que la actividad de la proteína diana no modificada. La alteración deseada, que puede ser un incremento o una reducción de la actividad, dependerá de la función o propiedad de interés (por ejemplo, \pm 10%, \pm 20%, etc.). Los LEAD pueden ser optimizados adicionalmente mediante la sustitución de una pluralidad (2 o más) de posiciones diana "is-HIT" en la misma molécula de proteína para generar "súper-LEAD".

Como se usa en este documento, la expresión "súper-LEAD" se refiere a mutantes de proteína (variantes) obtenidos por la combinación de las mutaciones aisladas presentes en dos o más de las moléculas LEAD en una única molécula de proteína. En consecuencia, en el contexto de las proteínas modificadas que se ofrecen en este documento, la expresión "proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido" incluye cualquier combinación de dos o más de las mutaciones descritas en este documento para una proteína correspondiente. Por ejemplo, las proteínas modificadas que se proporcionan en este documento, que tienen una o más sustituciones de un solo aminoácido, pueden tener cualquier combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de las sustituciones de aminoácidos en las posiciones de sustitución descritas. La colección de moléculas mutantes súper-LEAD se genera, se analiza y se caracteriza fenotípicamente una a una en matrices direccionables. Las moléculas mutantes súper-LEAD son tales que cada molécula contiene un número y tipo variables de mutaciones LEAD. Estas moléculas que muestran un ajuste adicional mejorado para la característica que se desea desarrollar, se designan súper-LEAD. Se pueden generar súper-LEAD por otros métodos conocidos por los expertos en la técnica, analizándolos en los métodos de alto rendimiento descritos en este documento. A los efectos de esta memoria, un súper-LEAD tiene típicamente una actividad con respecto a la función de interés que difiere de la actividad mejorada de un LEAD en una cantidad deseada, tal como al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% o más en relación con al menos uno de los mutantes de LEAD de los que deriva. Al igual que en el caso del LEAD, la variación de la actividad para los súper-LEAD depende de la actividad que esté "desarrollándose". La alteración deseada, que puede ser un incremento o una reducción de la actividad, dependerá de la función o propiedad de interés.

Como se usa en este documento, la aseveración de que la proteína modificada tiene más actividad antiviral (u otra actividad) que actividad antiproliferativa (u otra actividad) comparada con la citocina no modificada, consiste en la comparación del valor absoluto de la variación de cada actividad con respecto al tipo natural.

Como se usa en este documento, la expresión "loci alterados" se refiere a las posiciones aminoacídicas is-HIT en los LEAD o súper-LEAD que se sustituyen con diferentes aminoácidos de sustitución, dando como resultado el fenotipo o actividad alterada deseada.

Como se usa en este documento, un resto expuesto presenta más de 15% de su superficie expuesta al disolvente.

Como se usa en este documento, la expresión "homología estructural" se refiere al grado de coincidencia en el espacio entre dos o más esqueletos proteicos. Los esqueletos de proteínas que adoptan la misma estructura de proteína, el pliegue y que muestra similitudes en la superposición tridimensional estructural en el espacio se pueden considerar estructuralmente homólogos. La homología estructural no se basa en la homología de secuencias, sino más bien en la homología tridimensional. Dos aminoácidos de dos proteínas diferentes, considerados homólogos en base a la homología estructural entre dichas proteínas, no necesariamente tienen que encontrarse en regiones homólogas en base a las secuencias. Por ejemplo, los esqueletos proteicos que tienen una desviación media cuadrática (RMS) menor que 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,7 ó 1,5 angström a una determinada posición espacial o en una región definida entre ellas se puede considerar estructuralmente homóloga en esa región y se afirma en este documento que tienen una "elevada coincidencia" entre sus esqueletos. En este documento está previsto que posiciones aminoacídicas sustancialmente equivalentes (por ejemplo, "relacionadas estructuralmente") que están localizadas en dos o más secuencias diferentes de proteínas que comparten un cierto grado de homología estructural tendrán tareas funcionales comparables: se les designa también en este documento como "loci estructuralmente homólogos". Se puede afirmar entonces que estos dos aminoácidos son "estructuralmente similares" o "estructuralmente relacionados" entre sí, aun cuando sus posiciones lineales primarias exactas en las secuencias de aminoácidos, cuando estas secuencias están alineadas, no coincidan entre sí. Los aminoácidos que están "relacionados estructuralmente" pueden estar alejados unos de los otros en las secuencias primarias de proteínas, cuando se alinean estas secuencias siguiendo las normas convencionales de homología de secuencias.

Como se usa en este documento, una homología estructural es una proteína generada por homología estructural.

Como se usa en este documento, la expresión "proteína diana no modificada", "proteína no modificada", o "citocina no modificada", o las variaciones gramaticales similares, hace referencia a una proteína de partida que se selecciona para su optimización, usando los métodos descritos en este documento. La proteína diana no modificada de partida puede ser la forma natural de presentación de una proteína. Además, la proteína diana no modificada de partida puede haber sido sometida previamente a una alteración o mutación, de manera que difiere de la isoforma natural nativa, pero que, sin embargo, se designa en este documento como proteína diana no modificada de partida en relación con las proteínas subsiguientemente modificadas, producidas según esta memoria. De este modo, se pueden seleccionar proteínas existentes en la técnica, que hayan sido anteriormente modificadas para experimentar un incremento o decremento de una actividad biológica particular en comparación con una proteína de referencia no modificada, usándolas como "proteínas diana no modificadas" de partida. Por ejemplo, una proteína que haya sido modificada de su forma nativa por uno o más cambios de un solo aminoácido y que presenta un incremento o una reducción de una actividad deseada, tal como resistencia a la proteolisis, se puede utilizar con los métodos descritos en este documento como proteína diana no modificada de partida para una optimización adicional de la misma o de otra actividad biológica.

De la misma forma, se pueden utilizar proteínas existentes y conocidas en la técnica, que hayan sido previamente modificadas para experimentar un incremento o decremento deseado de una actividad biológica determinada, en comparación con una proteína no modificada de referencia, usándolas en este documento para la identificación de loci estructuralmente homólogos en otras proteínas diana estructuralmente homólogas. Por ejemplo, se puede usar una proteína que haya sido modificada por una o más sustituciones de un solo aminoácido y que posee un aumento o una reducción de una actividad deseada, tal como resistencia a la proteolisis, con los métodos que se proporcionan en este documento para identificar en proteínas diana estructuralmente homólogas los correspondientes loci estructuralmente homólogos que pueden ser sustituidos con aminoácidos de sustitución adecuados, analizando el incremento o la reducción de la actividad biológica deseada.

Como se usa en este documento, la expresión "sólo se produce una sustitución de aminoácido en cada proteína diana" se refiere a la modificación de una proteína diana, de manera que difiera de la forma no modificada de la proteína diana por un único cambio de aminoácido. Por ejemplo, en una forma de realización, se lleva a cabo una mutagénesis por la sustitución de un único resto aminoacídico en una sola posición diana de is-HIT en el esqueleto de la proteína (por ejemplo, "uno a uno" en matrices direccionables), de modo que cada mutante individual generado es producto único de cada reacción única de mutagénesis. Las reacciones de mutagénesis por sustitución única de aminoácidos se repiten para cada uno de los aminoácidos seleccionados en cada una de las posiciones diana is-HIT. De esta forma, se produce una pluralidad de moléculas de proteínas mutantes, en donde cada proteína mutante contiene una única sustitución de aminoácido en solamente una de las posiciones diana is-HIT.

Como se usa en este documento, la expresión "tipo pseudo-natural", en el contexto de sustituciones de un solo o de múltiples aminoácidos, se refiere a los aminoácidos que, aunque son diferentes de los originales, tales como aminoácidos nativos en una posición determinada de aminoácido, pueden sustituir el aminoácido nativo en una posición, sin introducir ningún cambio mensurable en la actividad de la proteína particular. Se genera una población de conjuntos de moléculas de ácidos nucleicos que codifican una serie de moléculas mutantes, a las que se caracteriza fenotípicamente de manera que se seleccionan proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes del aminoácido original, pero que continúan induciendo el mismo nivel (es decir, al menos 10%, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%, dependiendo de la proteína) y tipo de actividad deseada que la proteína original.

Como se usa en este documento, actividad biológica y farmacológica incluye cualquier actividad de un agente farmacéutico biológico e incluye, pero sin limitarse a ellas, la resistencia a la proteolisis, eficiencia biológica, eficiencia transduccional, expresión de genes/transgenes, expresión diferencial de genes y actividad de inducción, título, productividad de progenie, toxicidad, citotoxicidad, inmunogenicidad, actividad de proliferación y/o diferenciación celular, actividad antiviral, actividad morfogénica, actividad teratogénica, actividad patogénica, actividad terapéutica, actividad supresora de tumores, actividad ontogénica, actividad oncogénica, actividad enzimática, actividad farmacológica, tropismo celular/tisular y suministro.

Como se usa en este documento, "señal de salida" se refiere a parámetros a los que se puede realizar un seguimiento en el tiempo y, si se desea, que se pueden cuantificar. Por ejemplo, cuando se introduce una proteína recombinante en una célula, la célula que contiene la proteína recombinante experimenta una serie de cambios. Cualquiera de esos cambios que pueda ser monitorizado y usado para evaluar la transformación o transfección es una señal de salida, y la célula se designa como célula indicadora; el ácido nucleico codificador se designa gen indicador, y la construcción que incluye el ácido nucleico codificador es una construcción indicadora. Las señales de salida incluyen, sin limitaciones, actividad enzimática, fluorescencia, luminiscencia, cantidad de producto generado y otras señales semejantes. Las señales de salida incluyen expresión de un gen o producto génico, incluidos genes heterólogos (transgenes) insertados en el virus plasmídico. Las señales de salida son una función del tiempo ("t") y están relacionadas con la cantidad de proteína usada en la composición. Para cantidades superiores de proteína, la señal de salida puede ser mayor o menor. Para cualquier concentración particular, la señal de salida aumenta en función del tiempo hasta alcanzar una meseta. Las señales de salida pueden medir también la interacción entre células, genes heterólogos de expresión y agentes biológicos.

Como se usa en este documento, la actividad de una proteína IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a se refiere a cualquier actividad biológica susceptible de ser evaluada. En particular en este documento, la actividad evaluada para las proteínas IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a es resistencia a la proteolisis, actividad antiviral y actividad sobre la proliferación celular.

Como se usa en este documento, la ecuación de Hill es un modelo matemático que relaciona la concentración de un medicamento (es decir, un compuesto o sustancia de ensayo) con la respuesta medida

1

en donde y es la variable medida, tal como una respuesta, señal, y_{max} es la máxima respuesta alcanzable, [D] es la concentración molar de un medicamento, [D_{50}] es la concentración que produce 50% de respuesta máxima al medicamento, n es el parámetro de pendiente, que es 1 si el medicamento se une a un único sitio y sin cooperatividad entre sitios. Un trazado de Hill es el log_{10} de la relación de ligando-receptor ocupado al receptor libre frente a log [D] (M). La pendiente es n, en donde una pendiente mayor que 1 indica cooperatividad entre sitios de unión, y una pendiente menor que 1 puede indicar heterogeneidad de la unión. Esta ecuación general se ha utilizado para evaluar interacciones en sistemas biológicos complejos (véase Solicitud PCT internacional publicada Nº WO 01/44809, basada en la PCT Nº PCT/FR00/03503; véanse también los Ejemplos).

Como se usa en este documento, en el análisis basado en Hill (Solicitud PCT Internacional publicada Nº WO 01/44809, basada en la PCT Nº PCT/FR00/03503), los parámetros, \pi, \kappa, T, \varepsilon, \eta, \theta son como se indica a continuación:

: \pi es la potencia del agente biológico que actúa sobre el sistema de ensayo (basado en células);

: \kappa es la constante de resistencia del sistema de ensayo para inducir una respuesta a un agente biológico;

: \varepsilon es la eficiencia global del proceso o reacción desencadenada por el agente biológico en el sistema de ensayo;

: T es el título aparente del agente biológico;

: \theta es el título absoluto del agente biológico; y

: \eta es la heterogeneidad del proceso o reacción biológica.

De manera particular, como se usan en este documento, los parámetros \pi (potencia) o \kappa (constante de resistencia) se utilizan para evaluar, respectivamente, la potencia de un agente de ensayo para producir una respuesta en un sistema de ensayo, y la resistencia del sistema de ensayo para responder al agente.

Como se usa en este documento, \varepsilon (eficiencia) es la pendiente en el punto de inflexión de la curva de Hill (o, en general, de cualquier otra aproximación sigmoidal o lineal), para evaluar la eficiencia de la reacción global (el agente biológico y el sistema de ensayo tomados conjuntamente) para producir la respuesta biológica o farmacológica.

Como se usa en este documento, T (título aparente) se utiliza para medir la dilución limitante o el título aparente del agente biológico.

Como se usa en este documento, \theta (título absoluto) se utiliza para medir la dilución o título limitante absoluto del agente biológico.

Como se usa en este documento, \eta (heterogeneidad) mide la existencia de fases discontinuas a lo largo de la reacción global, que se refleja por un cambio abrupto del valor del coeficiente de Hill o de la constante de resistencia.

Como se usa en este documento, una población de conjuntos de moléculas de ácido nucleico que codifican una colección (biblioteca) de mutantes se refiere a una colección de plásmidos u otros vehículos que portan (codifican) las variantes génicas, de modo que plásmidos individuales u otros vehículos individuales portan variantes génicas individuales. Cada elemento (miembro) de la colección está separado físicamente de los demás, por ejemplo, de forma individual en una matriz direccionable, y ha sido generado como el producto aislado de una reacción de mutagénesis independiente. Cuando se contempla una colección (biblioteca) de tales proteínas, ésta se declarará de este modo.

Como se usa en este documento, una "célula indicadora" es la célula que "indica", es decir, experimenta el cambio en respuesta a una condición tal como, por ejemplo, la exposición a una proteína o a un virus, o a un cambio en su entorno externo o interno.

Como se usa en este documento, "indicador" o "resto indicador" se refiere a cualquier resto que permite la detección de una molécula de interés, tal como una proteína expresada por una célula. Los restos indicadores incluyen, sin limitaciones, por ejemplo proteínas fluorescentes tales como proteínas fluorescentes rojas, azules y verdes; LacZ y otras proteínas y productos génicos detectables. Para la expresión en células, los ácidos nucleicos que codifican el resto indicador se pueden expresar como una proteína de fusión con una proteína de interés o bajo el control de un promotor de interés.

Como se usa en este documento, fenotipo se refiere a la manifestación física, fisiológica o de otro tipo de un genotipo (una secuencia de un gen). En los métodos de esta memoria, se evalúan los fenotipos resultantes de la alteración de un genotipo.

Como se usa en este documento, "actividad" significa, en el sentido más amplio del término, cualquier cambio en un sistema (ya sea sistema biológico, químico o físico) de cualquier naturaleza (cambios en la cantidad de producto en una reacción enzimática, cambios de proliferación celular, de inmunogenicidad, de toxicidad), causado por una proteína o mutante de proteína cuando interaccionan con ese sistema. Adicionalmente, las expresiones "actividad", "mayor actividad" o "menor actividad", como se usan en este documento en referencia a la resistencia a proteasas, proteolisis, incubación con suero o con sangre, significan la relación o actividad biológica (antiviral) residual entre "después" del tratamiento con proteasa/sangre o suero y "antes" del tratamiento con proteasa/sangre o suero.

Como se usa en este documento, actividad se refiere a la función o propiedad que debe desarrollarse. Un sitio activo hace referencia a uno o múltiples sitios responsables o que intervienen en conferir la actividad o función. La actividad o sitio activo desarrollado (la función o propiedad y el sitio que confiere o interviene en conferir la actividad) puede no guardar relación alguna con las actividades naturales de una proteína. Por ejemplo, puede tratarse de un "sitio activo" para conferir inmunogenicidad (sitios inmunogénicos o epítopes) en una proteína.

Como se usa en este documento, los aminoácidos que se presentan en las distintas secuencias de aminoácidos que aparecen en este documento, se identifican de acuerdo con sus abreviaturas conocidas de tres o de una letra (véase la Tabla 1). Los nucleótidos que se presentan en los diversos fragmentos de ácido nucleico se denominan con las designaciones convencionales de una letra que se aplican en la técnica.

Como se usa en este documento, resto aminoacídico se refiere a un aminoácido formado tras la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido de sus enlaces peptídicos. Se presupone que los restos aminoacídicos descritos en este documento se encuentran en su forma isómera "L". Los restos en forma isómera "D", que se designan de ese modo, pueden sustituir cualquier resto aminoacídico L, con la condición de que el polipéptido conserve la propiedad funcional deseada. NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino terminal de un polipéptido. COOH hace referencia al grupo carboxi libre presente en el extremo carboxi terminal de un polipéptido. De acuerdo con la nomenclatura convencional de polipéptidos descrita en J. Bio/.Chem., 243:3552-3559, 1969, y adoptada en la 37 C.F.R. \NAK\NAK 1.821-1.822, se muestran en la Tabla 1 las abreviaturas de los restos aminoacídicos:

TABLA 1

2

Es necesario señalar que todas las secuencias de restos aminoacídicos representadas en este documento tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de extremo amino terminal a extremo carboxi terminal. Además, la expresión "resto aminoacídico" se define en su sentido más amplio para incluir los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y aminoácidos modificados e inusuales, tales como los citados en la 37 C.F.R. \NAK\NAK 1.821-1.822. Adicionalmente, se debe destacar que un guión al comienzo o al final de una secuencia de un resto aminoacídico indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o múltiples restos aminoacídicos o a un grupo amino terminal tal como NH_{2} o a un grupo carboxi terminal tal como COOH.

Como se usa en este documento, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y sus análogos, incluidos ácidos peptidonucleicos (PNA) y sus mezclas. Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena única o doble. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, opcionalmente marcados con una etiqueta detectable tal como una etiqueta fluorescente o radiactiva, se considera el uso de moléculas de una sola cadena. Estas moléculas tienen típicamente una longitud tal que son estadísticamente únicos con un bajo número de copias (típicamente, menos que 5, generalmente menos que 3) para usar como sonda o cebador en una biblioteca. Por lo general, una sonda o cebador contiene al menos 14, 16 ó 30 secuencias contiguas complementarias o idénticas a un gen de interés. Las sondas y cebadores pueden tener una longitud de 10, 14, 16, 20, 30, 50, 100 o más bases de ácido nucleico.

Por lo tanto, tal como se usa en este documento, el término "identidad" representa una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de ensayo y uno de referencia. Por ejemplo, un polipéptido de ensayo se puede definir como cualquier polipéptido que es idéntico en 90% o más a un polipéptido de referencia.

Como se usa en este documento, posiciones "correspondientes, estructuralmente relacionadas" en dos o más proteínas, tales como la proteína IFN\alpha-2b y otras citocinas se refiere a aquellas posiciones aminoacídicas determinadas en base a la homología estructural para maximizar el solapamiento tridimensional entre proteínas.

Como se usa en este documento, la expresión al menos "idéntico en 90% a" se refiere a identidades porcentuales desde 90 a 100% en relación con los polipéptidos de referencia. La identidad a un nivel de 90% o más es indicativa del hecho de que, comparando longitudes de polipéptidos de ensayo y de referencia de 100 aminoácidos, a efectos de ejemplificación, no más de 10% (es decir, 10 de 100) aminoácidos en el polipéptido de ensayo difiere de los del polipéptido de referencia. Se pueden realizar comparaciones similares entre polinucleótidos de ensayo y de referencia. Estas diferencias se pueden representar como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente en toda la longitud de una secuencia de aminoácidos, o pueden estar agrupadas en una o más localizaciones de longitud variable hasta el máximo permisible, por ejemplo, una diferencia de 10/100 aminoácidos (identidad de aproximadamente 90%). Las diferencias se definen como sustituciones o deleciones de ácidos nucleicos o aminoácidos.

Como se usa en este documento, la expresión "proteínas relacionadas con secuencias" se refiere a proteínas que tienen una identidad u homología de al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% aminoácidos entre sí.

Como se usa en este documento, familias de proteínas no relacionadas o "proteínas no relacionadas con secuencias" hacen referencia a proteínas que tienen una identidad u homología menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20% entre sí.

Como se usa en este documento, se entiende también que las expresiones "sustancialmente idéntico" o "similar" varía con el contexto, tal como lo comprenderán los expertos en la técnica pertinente.

Como se usa en este documento, las expresiones ácidos nucleicos heterólogos o extraños, tales como ADN y ARN, se utilizan de forma intercambiable y se refieren a un ADN o ARN que no se produce naturalmente como parte del genoma en el que se encuentra presente, o que se halla en una o más localizaciones del genoma que difieren de lo que sucede en la naturaleza. El ácido nucleico heterólogo por lo general no es endógeno para la célula en la que se introduce, sino que ha sido obtenido de otra célula o se ha preparado de manera sintética. Generalmente, aunque no necesariamente, este ácido nucleico codifica ARN y proteínas que no se producen normalmente en la célula en la que se expresan. ADN heterólogo comprende, en este documento, cualquier ADN o ARN que un experto en la técnica podría reconocer o considerar como heterólogo o extraño para la célula en la que se expresa. El ADN y ARN heterólogos pueden codificar también ARN o proteínas que median o alteran la expresión de ADN endógeno al afectar a la transcripción, traducción o cualquier otro proceso bioquímico regulable. Ejemplos de ácidos nucleicos heterólogos incluyen, sin limitaciones, ácidos nucleicos que codifican proteínas marcadoras trazables, tales como una proteína que confiere resistencia a un medicamento, ácidos nucleicos que codifican sustancias terapéuticamente eficaces tales como agentes anticancerosos, enzimas y hormonas, y ADN que codifica otros tipos de proteínas tales como anticuerpos.

Por lo tanto, en este documento ADN heterólogo o ADN extraño incluyen una molécula de ADN que no está presente en la orientación y posición exactas de la molécula de ADN equivalente hallada en el genoma. También puede referirse a una molécula de ADN de otro organismo o especie (es decir, exógeno).

Como se usa en este documento, una dosis terapéuticamente efectiva hace referencia a la cantidad de compuesto suficiente para dar como resultado la mejoría de los síntomas de una enfermedad.

Como se usa en este documento, aislado con referencia a una molécula de ácido nucleico o polipéptido u otra biomolécula significa que el ácido nucleico o el polipéptido se ha separado del entorno genético del cual se ha obtenido el polipéptido o el ácido nucleico. También puede significar alterado de su estado natural. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de manera natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", tal como se emplea el término en este documento. De esta forma, un polipéptido o polinucleótido producido y/o contenido dentro de una célula hospedadora recombinante se considera aislado. También se designan como "polipéptido aislado" o "polinucleótido aislado" los polipéptidos o polinucleótidos que han sido purificados, parcial o sustancialmente de una célula hospedadora recombinante o de una fuente nativa. Por ejemplo, la versión de un compuesto producido de manera recombinante puede ser purificada sustancialmente por el método de una etapa descrito en Smith et al., Gene, 67:31-40, 1988. Los términos aislado y purificado se utilizan, en ocasiones, de forma intercambiable.

Así, pues, por "aislado" se entiende que el ácido nucleico está exento de las secuencias codificadoras de aquellos genes que, en el genoma de origen natural del organismo (si lo hay) flanquean el gen que codifica el ácido nucleico de interés. El ADN aislado puede ser de una cadena o de doble cadena, y puede ser ADN genómico, ADNc, ADN híbrido recombinante, o ADN sintético. Puede ser idéntico a una secuencia inicial de ADN, o puede diferir de dicha secuencia por la deleción, adición o sustitución de uno o más nucleótidos.

Aislado o purificado, en relación con preparaciones hechas a partir de células o hospedadores biológicos, significa cualquier extracto celular que contiene el ADN o proteína indicada, incluido un extracto bruto del ADN o proteína de interés. Por ejemplo, en el caso de una proteína, se puede obtener una preparación purificada siguiendo una técnica individual o una serie de técnicas preparativas o bioquímicas, y el ADN o la proteína de interés puede estar presente en diversos grados de pureza en estas preparaciones. El procedimiento puede incluir, por ejemplo, pero sin limitaciones, fraccionamiento con sulfato de amonio, filtración sobre gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, centrifugación en gradiente de densidad y electroforesis.

Una preparación de ADN o proteína que es "sustancialmente pura" o "aislada" se debe entender que significa una preparación exenta de los materiales presentes de manera natural con los que el ADN o la proteína se asocian normalmente en la naturaleza. Como "esencialmente puro" se debe entender que significa una preparación "altamente" purificada, que contiene al menos 95% del ADN o proteína de interés.

Se debe entender que un extracto celular que contiene el ADN o la proteína de interés significa una preparación de homogeneizado o una preparación libre de células que expresa la proteína o contiene el ADN de interés. La expresión "extracto celular" pretende incluir medios de cultivo, especialmente medios de cultivo agotados de los que se han retirado las células.

Como se usa en este documento, un "agente de dirección" se refiere a cualquier molécula capaz de unirse a otra molécula diana tal como un anticuerpo, receptor o ligando.

Como se usa en este documento, receptor hace referencia a una molécula biológicamente activa que se une específicamente a (o con) otras moléculas. La expresión "proteína receptora" se puede usar para indicar de forma más específica la naturaleza proteica de un receptor específico.

Como se usa en este documento, recombinante se refiere a cualquier progenie formada como resultado de ingeniería genética.

Como se usa en este documento, una región promotora se refiere a una porción de ADN de un gen que controla la transcripción del ADN al que se encuentra unida operativamente. La región promotora incluye secuencias específicas de ADN que son suficientes para el reconocimiento, unión e inicio de transcripción de la ARN polimerasa. Esta porción de la región promotora se designa como promotor. Además, la región promotora incluye secuencias que modulan este reconocimiento, unión y actividad de inicio de la transcripción de la ARN polimerasa. Estas secuencias pueden actuar de forma cis o pueden responder a factores de actuación trans. Los promotores, dependiendo de la naturaleza de la regulación, pueden ser constitutivos o regulados.

Como se usa en este documento, la expresión "unido operativamente" significa por lo general las secuencias o segmentos que han sido unidas de forma covalente en una estructura de ADN, ya sea en su forma de cadena única o doble, a través de lo cual las secuencias de control o reguladoras de un segmento controlan o permiten la expresión o replicación u otro control semejante de otros segmentos. Los dos segmentos no son necesariamente contiguos. Para la expresión génica, se conectan una secuencia de ADN y una o varias secuencias reguladoras de manera tal que controlan o permiten la expresión génica cuando las proteínas moleculares apropiadas, por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción, se unen a la o las secuencias reguladoras.

Como se usa en este documento, producción por medios recombinantes, mediante el uso de métodos de ADN recombinante, significa el uso de los métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado, incluida la expresión por clonación de genes, y métodos tales como transposiciones genéticas y expresión en fagos, con exploración de especificidades deseadas.

Como se usa en este documento, una variante alternativa de corte y empalme se refiere a una variante producida por el procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da como resultado más de un tipo de ARNm.

Como se usa en este documento, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos o compuestos. Puede ser una solución, una suspensión, líquida, en polvo, una pasta, acuosa, no acuosa o cualquier combinación de las anteriores.

Como se usa en este documento, una combinación hace referencia a cualquier asociación entre dos o más artículos.

Como se usa en este documento, sustancialmente idéntico a un producto significa suficientemente similar de manera que la propiedad de interés permanece suficientemente inalterada, de modo que el producto sustancialmente idéntico se puede usar en lugar del producto.

Como se usa en este documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que ha sido enlazada. Un ejemplo de vector es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extra-cromosómica. Ejemplos de vectores son aquellos capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los que se hallan enlazadas. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que se encuentran enlazados de forma operativa se designan en este documento como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante se encuentran a menudo en forma de "plásmidos" que se refieren generalmente a lazos circulares de ADN de cadena doble que, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma. "Plásmido" y "vector" se usan de manera intercambiable, puesto que el plásmido es la forma más frecuentemente utilizada de vector. Otras formas de vectores de expresión que cumplen funciones equivalentes se darán a conocer más adelante.

Como se usa en este documento, el término vector se utiliza también de manera intercambiable con "vector de virus" o "vector viral". En este caso, que se explicará con el contexto, el "vector" no es auto-replicante. Los vectores virales son virus tratados por técnicas de ingeniería que se unen operativamente a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos hacia el interior de las células.

Como se usa en este documento, transducción hace referencia al proceso de transferencia de genes y su expresión en células de mamífero y otras células, mediada por virus. La transfección se refiere al proceso mediado por plásmidos.

Como se usa en este documento, "alelo" que se utiliza de manera intercambiable en este documento con la expresión "variante alélica", se refiere a formas alternativas de un gen o porciones del mismo. Los alelos ocupan el mismo locus o posición en cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, se dice que el sujeto es homocigótico para el gen o el alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterocigótico para el gen. Los alelos de un gen específico pueden diferir entre sí en un único nucleótido, o varios nucleótidos, y pueden incluir sustituciones, deleciones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen puede ser también una forma de un gen que contiene una mutación.

Como se usa en este documento, el término "gen" o "gen recombinante" se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto e incluye al menos un exón y (opcionalmente) una secuencia de intrón. Un gen puede ser ARN o ADN. Los genes pueden incluir regiones que preceden y siguen a la región codificadora (secuencia líder y secuencia remolque).

Como se usa en este documento, "intrón" se refiere a una secuencia de ADN presente en un gen determinado, que experimenta un desempalme durante la maduración del ARNm.

Como se usa en este documento, la expresión "secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº:" se refiere a la secuencia de nucleótidos de la cadena complementaria de una cadena de ácido nucleico que posee la SEC ID Nº: particular. La expresión "cadena complementaria" se usa en este documento de manera intercambiable con el término "complemento". El complemento de una cadena de ácido nucleico puede ser el complemento de una cadena codificadora o el complemento de una cadena no codificadora. Cuando se habla de ácidos nucleicos de cadena doble, el complemento de un ácido nucleico que tiene una SEC ID Nº: particular hace referencia a la cadena complementaria de la cadena expuesta en la SEC ID Nº: particular, o a cualquier ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la cadena complementaria de la SEC ID Nº: particular. Cuando se hace referencia a un ácido nucleico de cadena sencilla que tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a una SEC ID Nº: particular, el complemento de este ácido nucleico es un ácido nucleico que una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la de la SEC ID Nº: particular.

Como se usa en este documento, la expresión "secuencia codificadora" se refiere a esa porción de un gen que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína.

Como se usa en este documento, la expresión "cadena sentido" se refiere a la cadena de una molécula de ácido nucleico de doble cadena que tiene la secuencia del ARNm que codifica la secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de cadena doble.

Como se usa en este documento, la expresión "cadena antisentido" se refiere a esa cadena de una molécula de ácido nucleico de cadena doble que es el complemento de la secuencia del ARNm que codifica la secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de cadena doble.

Como se usa en este documento, una matriz se refiere a una colección de elementos tales como moléculas de ácido nucleico, que contienen tres o más miembros. Una matriz direccionable es aquella en la que los miembros de la matriz son identificables, típicamente, por la posición en un soporte de fase sólida o en virtud de una etiqueta identificable o detectable tal como por color, fluorescencia, señal electrónica (es decir, radiofrecuencia, microonda u otra frecuencia que no altera de forma sustancial la interacción de la molécula de interés), código de barras o cualquier otra simbología, química u otra etiqueta semejante. En ciertas formas de realización, los miembros de la matriz se inmovilizan sobre loci discretos identificables en la superficie de una fase sólida, o están directa o indirectamente enlazados o asociados de otra forma con la etiqueta identificable como, por ejemplo, fijados a una microesfera u otro soporte particulado (designado en este documento perlas) y suspendido en solución, o diseminado sobre una superficie.

Como se usa en este documento, un soporte (también llamado soporte de matriz, una matriz, soporte insoluble o soporte sólido) es cualquier soporte sólido o semisólido o insoluble sobre el que se enlaza o se hace contactar una molécula de interés, típicamente una molécula biológica, una molécula orgánica o un ligando bioespecífico. Estos materiales incluyen cualquier material que se use como matrices o soporte de afinidad para la síntesis y análisis de moléculas químicas y biológicas tales como, sin limitaciones: poliestireno, policarbonato, polipropileno, nailon, vidrio, dextrano, quitina, arena, piedra pómez, agarosa, polisacáridos, dendrímeros, fulerenos (buckyballs), poliacrilamida, silicio, caucho, y otros materiales usados como soportes para síntesis de fase sólida, separaciones de afinidad y purificaciones, reacciones de hibridación, inmunoensayos y otras aplicaciones semejantes. La matriz en este documento puede ser particulada o puede estar en forma de una superficie continua tal como una placa o pocillo de microtitulación, un portaobjetos de vidrio, un chip de silicio, una lámina de nitrocelulosa, una malla de nailon, u otros materiales semejantes. Cuando es particulada, las partículas tienen típicamente al menos una dimensión dentro del intervalo de 5-10 mm o menor. Estas partículas, denominadas colectivamente "perlas" en este documento, son a menudo, pero no necesariamente esféricas. Esta referencia no limita, sin embargo, la geometría de la matriz que puede tener cualquier forma, incluidas formas aleatorias, agujas, fibras y alargadas. También se contemplan "perlas" aproximadamente esféricas, especialmente microesferas que se pueden utilizar en la fase líquida. Las "perlas" pueden incluir componentes adicionales tales como partículas magnéticas o paramagnéticas (véase, por ejemplo, Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega)) para la separación usando imanes, siempre que los componentes adicionales no interfieran con los métodos y análisis de esta memoria.

Como se usa en este documento, una partícula de matriz o soporte son materiales de matriz que tienen forma de partículas discretas. Las partículas tienen cualquier forma y dimensión, pero típicamente tienen al menos una dimensión que es de 100 mm o menor, 50 mm o menor, 10 mm o menor, 1 mm o menor, 100 \mum o menor, 50 \mum o menor, y típicamente tienen un tamaño que es de 100 mm^{3} o menor, 50 mm^{3} o menor, 10 mm^{3} o menor, 1 mm^{3} o menor, 100 \mum^{3} o menor, y puede ser del orden de micrómetros cúbicos. Estas partículas se denominan colectivamente "perlas".

Como se usa en este documento, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácidos y otros compuestos son, a menos que se indique lo contrario, conformes con su uso habitual, abreviaturas reconocidas por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB (véase Biochem., 11:942-944, 1972).

B. Desarrollo dirigido

Hasta la fecha, se han descrito tres abordajes generales para el desarrollo dirigido de proteínas basado en la mutagénesis.

1) Mutagénesis Aleatoria Pura

La metodología de la mutagénesis aleatoria requiere que los aminoácidos en la secuencia de la proteína de partida estén sustituidos por todos (o un grupo) de los 20 aminoácidos. Se generan sustituciones aisladas o múltiples en diferentes posiciones aminoacídicas en la misma molécula, al mismo tiempo. El método de mutagénesis aleatoria se basa en una búsqueda directa de mejoría del ajuste basada en sustituciones aleatorias de aminoácidos y cambios de secuencias en múltiples posiciones aminoacídicas. En este método de abordaje, no existen restricciones ni para la posición de los aminoácidos (primera dimensión) ni para el tipo de aminoácidos (segunda dimensión); se generan y se analizan todas las posibilidades. Se pueden producir sustituciones múltiples de manera aleatoria al mismo tiempo en la misma molécula. Por ejemplo, los métodos de mutagénesis aleatoria se utilizan ampliamente para desarrollar anticuerpos con una mayor afinidad por su ligando, por la generación de bibliotecas de secuencias aleatorias de moléculas de anticuerpo, seguida de la expresión y exploración mediante el uso de fagos filamentosos.

2) Mutagénesis Aleatoria Restringida

Los métodos de mutagénesis aleatoria restringida introducen los 20 aminoácidos o restos desviados de ADN, en donde la desviación se basa en la secuencia del ADN y no en la de la proteína, de forma estocástica o semi-estocástica, respectivamente, dentro de regiones restringidas o predefinidas de la proteína que, de antemano, se sabe que intervienen en la actividad biológica que se desea "desarrollar". Este método se basa en una búsqueda directa de la mejoría del ajuste, basada en la sustitución aleatoria de aminoácidos y cambios de secuencia en posiciones aminoacídicas restringidos o múltiples. En esta forma de abordaje, la exploración puede estar limitada a posiciones seleccionadas de aminoácidos y/o tipos de aminoácidos, en tanto que los cambios materiales continúan siendo aleatorios en cuanto a posición y tipo. Por ejemplo, la posición aminoacídica puede estar restringida por una selección previa de la región diana que se debe someter a mutación (la selección de la región diana se basa en el conocimiento previo de la estructura/función de la proteína); en tanto que el tipo de aminoácido no está restringido, puesto que los aminoácidos de sustitución se seleccionan de forma estocástica o, como mucho, "semi-estocástica". A modo de ejemplo, este método se utiliza para optimizar sitios de unión en proteínas, incluidos los sistemas de hormona-receptor y sistemas de anticuerpo-epítopo.

3) Mutagénesis Racional No Restringida

La mutagénesis racional es un proceso de dos etapas y se describe en la solicitud de Estados Unidos en trámite junto con la presente de Nº Serie 10/022.249. Brevemente, la primera etapa requiere una exploración de aminoácidos, en el que todos y cada uno de los aminoácidos presentes en la secuencia de la proteína inicial se sustituyen por un tercer aminoácido de referencia (por ejemplo, alanina). Se sustituye solamente un único aminoácido en la molécula de proteína en cada momento. Se genera de este modo una colección de moléculas de proteína que tienen una sola sustitución de aminoácido, de manera que las moléculas difieren entre sí por la posición aminoacídica en la que ha tenido lugar la sustitución. Se diseñan moléculas de ADN mutante, generadas por mutagénesis, y se clonan individualmente, por ejemplo en matrices direccionables, de manera que están físicamente separadas entre sí y de forma que cada una de ellas es el producto único de una reacción de mutagénesis independiente. Las moléculas de proteína mutante derivadas de la colección de moléculas de ácido nucleico mutado también están físicamente separadas entre sí, por ejemplo por formateado en matrices direccionables. La evaluación de actividad en cada molécula de proteína permite identificar las posiciones aminoacídicas que dan como resultado un descenso de actividad cuando se sustituyen, indicando de esta forma la implicación de esa posición particular de aminoácido en la actividad biológica y/o conformación de la proteína que lleva al ajuste de la característica particular que se desarrolla. Estas posiciones aminoacídicas se denominan HIT. En la segunda etapa, se genera una nueva colección de moléculas, de modo que cada molécula difiere de las otras por el aminoácido presente en las posiciones HIT individuales identificadas en la etapa 1. Los 20 aminoácidos (19 remanentes) se introducen en cada una de las posiciones HIT identificadas en la etapa 1; así, cada molécula individual contiene, en principio, una y solamente una sustitución de aminoácido. Se diseñan moléculas de ADN mutante, generadas por mutagénesis, y se clonan individualmente, por ejemplo en matrices direccionables, de manera que están físicamente separadas entre sí y de forma que cada una de ellas es el producto único de una reacción de mutagénesis independiente. Las moléculas de proteínas mutantes derivadas de la colección de moléculas de ADN mutante, también están separadas físicamente entre sí, por formateado en matrices direccionables. A continuación, se lleva a cabo una evaluación individual de actividad en cada molécula mutante individual. Los mutantes generados que dan lugar a una alteración deseada (tal como una mejoría de una actividad de proteína) se designan como LEAD. Este método permite una búsqueda indirecta de alteración de la actividad, por ejemplo, una mejoría, basada en una sustitución racional de aminoácidos y un cambio de secuencia en cada posición aislada de aminoácido en cada momento, para la búsqueda de una nueva secuencia - inesperada - de aminoácidos en algunas regiones imprevistas a lo largo de la proteína, para producir una proteína que exhibe la actividad deseada o alterada, tal como un mejor rendimiento que la proteína de partida.

En este método de abordaje, ni la posición aminoacídica ni el tipo de aminoácido de sustitución están restringidos. Se efectúa una exploración de la proteína de longitud total durante la primera etapa, para identificar las posiciones HIT y, seguidamente, se ensayan los 20 aminoácidos en cada una de las posiciones HIT, para identificar las secuencias LEAD; así, en un punto de partida, sólo se sustituye un aminoácido en cada molécula en cada momento. La selección de la región diana (HIT y aminoácidos que la rodean) para la segunda etapa se basa en datos experimentales obtenidos en la primera etapa. De este modo, no es necesario un conocimiento previo de la estructura y/o función de la proteína. Usando este enfoque, se han encontrado secuencias LEAD en proteínas que están localizadas en regiones de la proteína que, con anterioridad, no se sabía que estaban implicadas en la actividad biológica particular que se desea optimizar; lo cual refuerza la fuerza de este método de abordaje para descubrir regiones impredecibles (HIT) como dianas para la mejoría del ajuste.

C. Exploración Racional Bidimensional

Los métodos de exploración racional bidimensional (o "exploración bidimensional") para el desarrollo racional de proteínas que se describen en este documento (véase también la solicitud de Estados Unidos en trámite junto con la presente de Nº Serie de expediente Nº 923, presentada el mismo día que este documento, en base a la solicitud provisional de Estados Unidos de las Series Nos. 60/457.063 y 60/410.258), se basan en la exploración en dos dimensiones. La primera dimensión rastreada es la posición aminoacídica a lo largo de la secuencia de la proteína para identificar las posiciones diana is-HIT, y la segunda dimensión es el tipo de aminoácido seleccionado para la sustitución de una posición aminoacídica is-HIT particular. Una ventaja de los métodos de exploración bidimensional que se describen en este documento es que al menos una y, típicamente, las dos exploraciones de posición aminoacídica y/o exploraciones de aminoácidos de sustitución se pueden limitar de manera que se seleccionan menos que todos los aminoácidos del esqueleto proteico para la sustitución de aminoácido; y/o se seleccionan para sustitución menos que todos los 19 aminoácidos remanentes disponibles para sustituir un aminoácido original, por ejemplo nativo.

En formas de realización particulares, basadas en i) las propiedades particulares de proteína que se desean desarrollar, ii) la secuencia de aminoácidos de la proteína, y iii) las propiedades conocidas de los aminoácidos individuales, se selecciona una serie de posiciones diana a lo largo de la secuencia de proteína, mediante simulación por ordenador, como "posiciones diana is-HIT". Este número de posiciones diana is-HIT es tan grande como sea posible, de modo que se incluyen todas las posiciones diana razonablemente posibles para la característica particular que se desea desarrollar. Especialmente en formas de realización en las que se selecciona para sustitución un número restringido de posiciones diana is-HIT, los aminoácidos seleccionados para sustituir las posiciones diana is-HIT en la proteína particular que está siendo optimizada pueden ser los 19 aminoácidos o, más a menudo, un grupo más restringido que comprende aminoácidos seleccionados que se considera que poseen el efecto deseado sobre la actividad de la proteína. En otra forma de realización, con la condición de que se utilice el número restringido de aminoácidos de sustitución, se pueden seleccionar todas las posiciones aminoacídicas a lo largo del esqueleto proteico como posiciones diana is-HIT para la sustitución de aminoácidos. A continuación, se practica una mutagénesis por medio de la sustitución de restos aminoacídicos aislados en posiciones diana is-HIT específicas en el esqueleto proteico (por ejemplo, una a una, como en matrices direccionables), de manera que cada mutante individual generado sea el producto único de cada reacción aislada de mutagénesis. Se diseñan moléculas de ADN mutante, generadas por mutagénesis, y se clonan individualmente, por ejemplo, en matrices direccionables, de forma que estén físicamente separadas entre sí y que cada una sea el producto único de una reacción independiente de mutagénesis. Las moléculas de proteína mutante derivadas de la colección de moléculas de ADN mutante también están separadas físicamente entre sí, por formateado en matrices direccionables. De este modo, se produce una pluralidad de moléculas de proteínas mutantes. Cada proteína mutante contiene una única sustitución de aminoácido en solamente una de las posiciones diana is-HIT. Se lleva a cabo entonces una evaluación de actividad de cada molécula de proteína mutante tras la expresión de la proteína y la medición de la actividad apropiada. Un ejemplo de la práctica de este método se muestra en los Ejemplos, en donde se producen moléculas de IFN\alpha y de IFN\beta mutantes.

Las proteínas de nueva generación que dan lugar a una alteración, típicamente, una mejoría de la actividad de la proteína diana se designan LEAD. Este método se basa en una búsqueda indirecta de mejoría de las proteínas para una actividad particular, tal como una mayor resistencia a la proteolisis, basada en una sustitución racional de aminoácidos y cambio de secuencia de una única o, en otra forma de realización, de un número limitado de posiciones aminoacídicas en cada momento. En consecuencia, se identifican y aíslan proteínas optimizadas que poseen nuevas secuencias de aminoácidos en algunas regiones a lo largo de la proteína que tiene un mejor rendimiento (de una actividad diana particular u otra propiedad) que la proteína de partida.

1) Identificación de HIT mediante simulación por ordenador

En este documento, se ofrece un método para el desarrollo dirigido que incluye identificar y seleccionar (usando análisis mediante simulación por ordenador) aminoácidos específicos y posiciones aminoacídicas (designadas en este documento como is-HIT) a lo largo de la secuencia de una proteína, y que se consideran directa o indirectamente implicados en la característica sometida a desarrollo. Como se ha señalado, los métodos de exploración bidimensional proporcionados incluyen las dos etapas siguientes. La primera es una búsqueda mediante simulación por ordenador de una secuencia de aminoácidos de una proteína diana para identificar las posibles posiciones aminoacídicas que pueden ser dianas potenciales para la actividad sometida a desarrollo. Esta fase se lleva a cabo, por ejemplo, evaluando el efecto de restos aminoacídicos sobre la o las propiedades que se desea alterar en la proteína, utilizando cualquier software convencional conocido. Los aspectos particulares del análisis mediante simulación por ordenador son una función de la propiedad que se pretende modificar. Por ejemplo, en el ejemplo en este documento, una propiedad consistente en una resistencia alterada de la proteína a la proteolisis. Para determinar los restos aminoacídicos que son dianas potenciales como is-HIT, en este ejemplo, se identificaron en primer lugar todos los restos diana posibles para las proteasas. Seguidamente, se consideró la estructura tridimensional de la proteína para identificar los restos de superficie. La comparación de los restos expuestos con restos escindibles por proteolisis ofrece restos que son dianas para el cambio.

Una vez identificadas, estas posiciones aminoacídicas o secuencias diana se designan como is-HIT (HIT obtenidos mediante simulación por ordenador). Los HIT obtenidos mediante simulación por ordenador se definen como aquellas posiciones aminoacídicas (o posiciones diana) que intervienen potencialmente en la característica "en desarrollo", tal como una mayor resistencia a la proteolisis. En una forma de realización, la discriminación de los is-HIT entre todas las posiciones aminoacídicas en una secuencia de proteína se efectúa en base a i) el tipo de aminoácido en cada posición, además de, siempre que esté disponible, pero no necesariamente, ii) la información en la estructura secundaria o terciaria de la proteína. Los HIT obtenidos mediante simulación por ordenador constituyen una colección de moléculas mutantes, de forma que están representados todos los aminoácidos posibles, las posiciones aminoacídicas o secuencias diana que intervienen potencialmente en la característica en desarrollo. En esta fase no se lleva a cabo una discriminación teórica importante entre aminoácidos o posiciones aminoacídicas.

Las posiciones HIT obtenidas mediante simulación por ordenador están diseminadas sobre toda la longitud de la secuencia de proteína. En una forma de realización, se sustituye solamente un aminoácido is-HIT en cada momento en la proteína diana. En otra forma de realización, se sustituye un número limitado de aminoácidos is-HIT simultáneamente en la misma molécula de la proteína diana. La selección de regiones diana (is-HIT y aminoácidos que los rodean) para la segunda etapa se basa en suposiciones y predicciones racionales. No se requiere un conocimiento previo de la estructura/función de la proteína. Por lo tanto, la metodología de exploración bidimensional que se ofrece en este documento no requiere ningún conocimiento previo de la estructura conformacional tridimensional de la proteína.

Para la optimización resulta apropiada cualquier proteína conocida o disponible para el experto en la técnica, usando los métodos de desarrollo dirigido que se proporcionan en este documento, incluidas citocinas (por ejemplo, IFN\alpha-2b) o cualquier otra proteína que haya sufrido una mutación u optimización anterior.

Para determinar si un aminoácido particular en una proteína puede intervenir o no en la característica en desarrollo se puede analizar una variedad de parámetros. Por ejemplo, se puede utilizar racionalmente la información que ofrecen las estructuras cristalinas de proteínas con el fin de llevar a cabo un análisis computarizado (mediante simulación por ordenador) dirigido a la predicción de variantes con las características deseadas. En una forma de realización particular, se usa un número limitado de premisas iniciales (típicamente, no más de 2) para determinar los HIT obtenidos mediante simulación por ordenador. En otras formas de realización, el número de premisas usado para determinar los HIT obtenidos mediante simulación por ordenador puede estar comprendido en el intervalo de 1 a 10 premisas, incluyendo no más de 9, no más de 8, no más de 7, no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, pero son características no más de 2 premisas. Para los métodos ofrecidos en este documento es importante que el número de premisas iniciales se mantenga en un mínimo, al objeto de mantener el número de is-HIT en un máximo (en este caso, los métodos ofrecidos no están limitados por un exceso de predicciones basado en suposiciones teóricas). Cuando se usan dos premisas, la primera condición es, típicamente, el tipo de aminoácido propiamente dicho, que está directamente relacionado con la naturaleza de la característica en desarrollo. Por ejemplo, si el objetivo fuera cambiar el pH óptimo para una enzima, entonces los aminoácidos seleccionados en esta etapa para sustituir la secuencia original incluirían solamente los que poseen un valor pKa determinado. La segunda premisa está relacionada típicamente con la posición específica de aquellos aminoácidos a lo largo de la estructura proteica. Por ejemplo, se podrían descartar algunos aminoácidos si se esperase que su exposición al disolvente no es suficiente, aun cuando pudieran tener valores pKa apropiados.

Durante la primera etapa de identificación de is-HIT según los métodos presentes, se considera de manera individual para aminoácido aislado a lo largo de la secuencia proteica, con el fin de evaluar si es candidato para is-HIT. Esta búsqueda se realiza una a una y la decisión de si un aminoácido se considera o no candidato para un is-HIT se basa en (1) el tipo del propio aminoácido; (2) la posición en la secuencia de aminoácidos y la estructura de la proteína, si es conocida; y (3) la interacción predicha entre ese aminoácido y sus vecinos en la secuencia y en el espacio.

Con el uso de los métodos de exploración tridimensional que se ofrecen en este documento, cuando se optimiza una proteína dentro de una familia de proteínas (por ejemplo, IFN\alpha-2b dentro de la familia de citocinas) usando los métodos presentes para generar mutantes LEAD, se pueden identificar los is-HIT en otras o en todas las proteínas dentro de una familia en particular identificando las correspondientes posiciones aminoacídicas en la misma, empleando análisis de homología estructural (basados en comparaciones de las estructuras 3D de los miembros de la familia con la proteína original para identificar los correspondientes restos para sustituir), tal como se describe más adelante. Los is-HIT de familias identificados de este modo se pueden someter, entonces, a la etapa siguiente de identificar aminoácidos de sustitución, sometiéndolos a ensayos posteriores para la obtención de LEAD o súper-LEAD tal como se describe en este documento.

2) Identificación de Aminoácidos de Sustitución

Una vez seleccionadas las posiciones diana is-HIT, la etapa siguiente consiste en identificar los aminoácidos que sustituirán a los aminoácidos originales, tales como nativos en cada posición is-HIT para alterar el nivel de actividad de la característica particular en desarrollo. El conjunto de aminoácidos de sustitución que se usarán para sustituir los aminoácidos originales, o nativos, en cada posición is-HIT puede ser diferente y específico para la posición is-HIT particular. La elección de los aminoácidos de sustitución tiene en consideración la necesidad de conservar las propiedades físico-químicas tales como hidrofobicidad, carga y polaridad de restos esenciales (por ejemplo, catalíticos, de unión, etc.). El número de aminoácidos de sustitución, de los 19 aminoácidos no nativos (o no originales), que se puede utilizar para sustituir una posición diana is-HIT determinada se halla en el intervalo de 1 hasta aproximadamente 19, desde 1 hasta aproximadamente 15, desde 1 hasta aproximadamente 10, desde 1 hasta aproximadamente 9, desde 1 hasta aproximadamente 8, desde 1 hasta aproximadamente 7, desde 1 hasta aproximadamente 6, desde 1 hasta aproximadamente 5, desde 1 hasta aproximadamente 4, desde 1 hasta aproximadamente 3 o de 1 a 2 sustituciones de aminoácidos.

En la técnica se conocen numerosos métodos para seleccionar aminoácidos de sustitución (también denominados en este documento como "aminoácidos sustituyentes"). Los químicos proteicos determinaron que determinadas sustituciones de aminoácidos se producen habitualmente en proteínas relacionadas de especies diferentes. Dado que la proteína sigue funcionando con estas sustituciones, los aminoácidos sustituyentes son compatibles con la estructura y función de la proteína. Con frecuencia, estas sustituciones se efectúan hacia un aminoácido químicamente similar, pero también pueden producirse otros tipos de cambios, si bien son relativamente raros.

El conocimiento de los tipos de cambios que son más y menos frecuentes en un número elevado de proteínas puede contribuir a predecir las alineaciones y las sustituciones de aminoácidos para cualquier conjunto de secuencias proteicas. A tal efecto se utilizan matrices de sustitución de aminoácidos.

En las matrices de sustitución de aminoácidos, los aminoácidos aparecen enumerados en la parte superior de la matriz y a lo largo del lado, y cada posición de matriz se rellena con una puntuación que refleja la frecuencia con la que un aminoácido se habría apareado con el otro en una alineación de secuencias de proteínas relacionadas. La probabilidad de cambiar el aminoácido A por el aminoácido B se considera idéntica a la probabilidad de cambiar B por A. Esta suposición se efectúa porque, para dos secuencias cualesquiera, el aminoácido ancestro en el árbol filogenético habitualmente es desconocido. Adicionalmente, la probabilidad de sustitución debería depender del producto de la frecuencia de aparición de los dos aminoácidos y de sus similitudes químicas y físicas. Una predicción de este modelo es que las frecuencias de aminoácidos no se modificarán durante el periodo de desarrollo (Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3):345-352, 1978). A continuación, se presenta una serie de ejemplos de matrices de sustitución de aminoácidos que incluyen, sin limitaciones, la matriz de sustitución de bloques (BLOSUM), Jones, Gonnet, Fitch, Feng, McLachlan, Grantham, Miyata, Rao, Risler, Johnson, y el porcentaje de mutación aceptado (PAM). Se puede emplear cualquiera de estos métodos conocido por el experto en la técnica.

(a) Porcentaje de mutación aceptado (PAM)

Dayhoff y col. desarrollaron un modelo de desarrollo de proteína que dio como resultado el desarrollo de un conjunto de matrices de sustitución ampliamente aceptado (Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3):345-352, 1978), denominado matrices de porcentaje de mutación aceptado (PAM). Al derivar estas matrices, cada cambio del aminoácido actual en un sitio particular se supone que es independiente de eventos mutacionales anteriores en ese sitio. Así, la probabilidad de cambio de cualquier aminoácido A a aminoácido B es la misma, independientemente de los cambios previos en ese sitio e independientemente también de la posición del aminoácido A en la secuencia de proteína.

En el método de Dayhoff, los índices de sustitución se derivan de alineaciones de secuencias proteicas que son idénticas en al menos 85%; esta limitación garantiza que la probabilidad de que una mutación particular sea consecuencia de un conjunto de mutaciones sucesivas sea baja. Dado que estos cambios se observan en proteínas estrechamente relacionadas, representan sustituciones de aminoácidos que no modifican significativamente la función de la proteína. Por lo tanto, se denominan "mutaciones aceptadas", según se definen los cambios de aminoácidos que son aceptados por la selección natural.

(i) Análisis de PAM

En formas de realización particulares de los métodos indicados en este documento, se utilizan los valores PAM ("Porcentaje de mutación aceptado" (PAM; Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3):345-352, 197 Fig. 2) para seleccionar un grupo apropiado de aminoácidos de sustitución. Las matrices PAM se desarrollaron originalmente para producir alineaciones entre secuencias proteicas basadas en distancias evolutivas. Debido a que en una familia de proteínas o secuencias homólogas (relacionadas) se comparten aminoácidos idénticos o similares (similitud de 85%), se pueden determinar sustituciones conservadoras o mutaciones puntuales permitidas de los correspondientes restos aminoacídicos a lo largo de toda la secuencia alineada de referencia. En este sentido, las "sustituciones conservadoras" de un resto en una secuencia de referencia son aquellas sustituciones que son física y funcionalmente similares a los correspondientes restos de referencia, por ejemplo, que poseen un tamaño, forma, carga eléctrica y propiedades químicas similares, incluida la capacidad para formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Sustituciones de aminoácidos conservadoras particularmente apropiadas son aquellas que muestran las puntuaciones más altas y cumplimentan los criterios de la matriz PAM en forma de "mutaciones puntuales aceptadas". Por ejemplo, en la comparación de una familia de matrices de puntuación, Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3):345-352, 1978encontraron una significación de puntuación consistentemente mayor con el uso de la matriz PAM250 para analizar una variedad de proteínas relacionadas de manera distante.

(ii) PAM250

En una forma de realización particular, la matriz PAM250 que se representa en la Fig. 2 se usa para determinar los aminoácidos de sustitución en base a criterios de similitud. La matriz PAM250 utiliza datos obtenidos directamente del desarrollo natural para facilitar la selección de aminoácidos de sustitución para los is-HIT para generar mutaciones conservadoras sin afectar en exceso a la función global de la proteína. Mediante el uso de la matriz PAM250, se identifican los aminoácidos de sustitución candidatos a partir de proteínas relacionadas de diferentes organismos.

(b) Jones y Gonnet

Este método (véanse, por ejemplo, Jones et al., Comput. Appl. Biosci., 8:275-282, 1992, y Gonnet et al., Science, 256:1433-1445, 1992) usan una metodología muy similar a la de Dayhoff (véase más adelante), pero con bases de datos modernas. La matriz de Jones et al. se extrae de Release 15.0 de la base de datos de la secuencia proteica de SWISS-PROT. Se emplearon mutaciones puntuales que alcanzaron un total de 59.160 a partir de 16.130 secuencias proteicas para calcular la matriz PAM250 (véase más adelante).

La matriz publicada por Gonnet et al., Science, 256:1433-1445, 1992 se construyó a partir de una base de datos de secuencias de 8.344.353 restos aminoacídicos. Se comparó cada secuencia frente a la base de datos completa, de modo que se obtuvieron 1,7 x 10^{6} equivalencias subsiguientes para las alineaciones significativas. Estas equivalencias se usaron entonces para generar una matriz con una distancia PAM de 250.

(c) Fitch y Feng

Fitch, J. Mol. Evol., 16(1):9-16, 1966, usó una matriz de intercambio que contuvo para cada par (A, B) de tipos de aminoácidos el número mínimo de nucleótidos que se debe cambiar para codificar el aminoácido A en lugar del aminoácido B.

Feng et al., J. Mol. Evol. 21:112-125, 1985, usaron una versión reforzada de Fitch, J. Mol. Evol., 16(1):9-16, 1966 para construir una matriz de Estructura Genética. Además de considerar el número mínimo de cambios de base necesarios para codificar el aminoácido B en lugar del aminoácido A, este método toma también en consideración la similitud estructural de los aminoácidos.

(d) McLachlan, Grantham y Miyata

McLachlan, J. Mol. Biol. 61:409-424, 1971, utilizó 16 familias de proteínas, cada una con 2 a 14 miembros. Las 89 secuencias se alinearon y se usó la frecuencia de intercambio por pares, observada en 9820 sustituciones, para generar una matriz de intercambio con valores que variaron de 0 a 9.

Grantham, Science, 185:862-864, 1974, considera la composición, polaridad y volumen molecular de las cadenas laterales de los aminoácidos, propiedades que estuvieron altamente correlacionadas con las frecuencias relativas de sustitución tabuladas por McLachlan, J. Mol. Biol. 61:409-424, 1971, para construir la matriz.

Miyata, J. Mol. Evol., 12:2319-236, 1979, usa los valores de volumen y polaridad de los aminoácidos publicados por Grantham, Science, 185:862-864, 1974. Para cada par de tipos de aminoácidos, se calculó la diferencia para las dos propiedades y se dividió por la desviación estándar de todas las diferencias. La raíz cuadrada de la suma de ambos valores se usó entonces en la matriz.

(e) Rao

Rao, J. Pept. Protein Res., 29:276-281, 1987, emplea cinco propiedades de los aminoácidos para crear una matriz, a saber: propensión a formar hélices alfa, cadenas beta y a la inversión, además de polaridad e hidrofobicidad. Se sumaron las propiedades estandarizadas y la matriz se rediseñó hasta el mismo valor medio que el de PAM (Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3):345-352, 1978).

(f) Risler

Risler et al., J. Mol. Biol. 204:1019-1029, 1988, alinearon 32 estructuras tridimensionales de 11 familias proteicas por la superposición de cuerpos rígidos de la topología del esqueleto. Se consideraron solamente sustituciones cuando al menos tres pares de átomos C^{\alpha} adyacentes y equivalentes de la cadena principal en las estructuras comparadas no estuvieron separados entre sí por más de 1,2 \ring{A}. Se consideró un total de 2860 sustituciones que se utilizaron para construir una matriz basada en cálculos de distancia \chi^{2}.

(g) Johnson

Johnson et al., J. Mol. Biol. 233:716-738, 1993, derivaron su matriz del alineamiento estructural terciario de 85 familias en una base de datos de 235 estructuras creada con el método de Sali et al., J. Mol. Biol. 212:403-428, 1990. Su examen de sustituciones se basó en las relaciones esperadas y observadas de aparición, y los valores de la matriz final se tomaron como log_{10} de las relaciones.

(h) Matriz de Sustitución de Bloques (BLOSUM)

Un abordaje empírico (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919,1992) utiliza alineamientos locales, sin separaciones, de secuencias relacionadas a distancia para derivar la serie de matrices de la matriz de sustitución de aminoácidos de bloque (BLOSUM). Los valores de la matriz están basados en las sustituciones de aminoácidos observadas en un grupo mayor de aproximadamente 2000 patrones conservados de aminoácidos, denominados bloques. Estos bloques actúan como firmas de familias de proteínas relacionadas. Las matrices de esta serie se identifican por una cifra después de la matriz (por ejemplo, BLOSUM50), que hace referencia al porcentaje de identidad mínimo de los bloques de aminoácidos múltiples alineados que se usan para construir la matriz. Es necesario destacar que estas matrices están calculadas directamente, sin extrapolaciones, y son análogas s las matrices de probabilidad de transición P(T) para diferentes valores de T, estimadas sin referencia a cualquier índice Q de matriz.

El resultado de estas dos etapas expuestas anteriormente, que se llevan a cabo mediante simulación por ordenador es que: (1) se identifican las posiciones aminoacídicas que serán la diana para la mutagénesis; estas posiciones se designan is-HIT; (2) se identifican los aminoácidos de sustitución para los aminoácidos originales, o nativos, en los is-HIT; para ofrecer una colección de moléculas mutantes LEAD candidatas que se prevé que tengan un rendimiento diferente del de las nativas. En éstas se analiza la existencia de una actividad biológica optimizada (o mejorada o alterada).

3) Construcción Física de Proteínas Mutantes y Ensayos Biológicos

Una vez seleccionados los is-HIT como se ha indicado más arriba, se introducen los aminoácidos de sustitución. Las proteínas mutantes se preparan típicamente usando métodos de ADN recombinante y se evalúan en ensayos biológicos apropiados para la actividad (característica) biológica particular (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1). Un ejemplo de un método para preparar las proteínas mutantes es por mutagénesis del gen original, o nativo, aplicando métodos bien conocidos en la técnica. Las moléculas mutantes se generan una a una, por ejemplo en matrices direccionables, de modo que cada mutante individual generado sea el producto único de cada reacción de mutagénesis aislada e independiente. Las reacciones individuales de mutagénesis se llevan a cabo por separado, por ejemplo en matrices direccionables, en donde están separadas físicamente entre sí. Cuando se ha preparado una población de conjuntos de moléculas de ácido nucleico que codifican las correspondientes proteínas mutantes, cada una de ellas se introduce por separado, una a una, en células adecuadas para la producción de las correspondientes proteínas mutantes. Esto se puede efectuar también, por ejemplo, en matrices direccionables en las que cada conjunto de moléculas de ácido nucleico que codifica una respectiva proteína mutante se introduce en células confinadas a una localización discreta, tal como un pocillo o una placa de microtitulación con múltiples pocillos. Cada proteína mutante individual se caracteriza fenotípicamente de forma individual y se evalúa cuantitativamente su rendimiento usando ensayos apropiados para la característica que se desea optimizar (es decir, la característica en desarrollo). Una vez más, esta etapa se puede realizar en matrices direccionables. Se identifican los mutantes que muestran el rendimiento incrementado o disminuido deseado con respecto a los originales, por ejemplo, moléculas nativas, y se designan LEAD. Desde el comienzo del proceso de generar las moléculas mutantes de ADN hasta la lectura y el análisis de los resultados de rendimiento, cada mutante candidato a LEAD se genera, produce y analiza de forma individual, por ejemplo desde su propia dirección en una matriz direccionable. El proceso es susceptible de automatización.

D. Exploración Bidimensional de Proteínas en Busca de una Resistencia Aumentada a la Proteolisis

Los métodos de exploración bidimensional permiten la preparación de proteínas modificadas para un rasgo, actividad u otro fenotipo seleccionado. Entre las modificaciones de interés para las proteínas terapéuticas se cuentan las que incrementan la protección contra la digestión de proteasas, manteniendo al mismo tiempo la actividad biológica requerida. Estos cambios son útiles para producir proteínas terapéuticas de mayor duración.

El aporte de medicamentos peptídicos y proteicos estables a pacientes constituye un desafío importante para la industria farmacéutica. Estos tipos de medicamentos en el organismo humano son constantemente eliminados o retirados de la circulación por medio de diferentes procesos fisiológicos que incluyen internalización, filtración glomerular y proteolisis. Esta última es, a menudo, el proceso limitante que afecta a la semivida de proteínas usadas como agentes terapéuticos en la administración por vía oral y las inyecciones intravenosas o intramusculares.

El proceso de exploración bidimensional para el desarrollo de proteínas se usa para mejorar efectivamente la resistencia de las proteínas a las proteasas y, de esta forma, incrementar la semivida de las proteínas in vitro y, en último término, in vivo. Como se ha indicado, los métodos ofrecidos en este documento para diseñar y generar proteínas altamente estables y de mayor duración, o proteínas como una semivida más larga, incluyen: i) identificar algunos o todos los sitios diana posibles en la secuencia de proteína que son susceptibles de digestión por una o múltiples proteasas específicas (estos sitios se designan en este documento como is-HIT); ii) identificar los aminoácidos de sustitución apropiados, específicos para cada is-HIT, de modo que tras la sustitución de uno o más de los aminoácidos originales, o nativos, en ese is-HIT específico, cabe esperar que aumenten la resistencia del is-HIT a la digestión por proteasa, al mismo tiempo conservando o mejorando la actividad biológica requerida de la proteína (estas proteínas con aminoácidos de sustitución son los "LEAD candidatos"); iii) introducir de manera sistemática los aminoácidos de sustitución específicos (LEAD candidatos) en cada posición diana is-HIT específica para generar una colección que contiene las correspondientes moléculas LEAD candidatas mutantes. Los mutantes se generan, producen y caracterizan fenotípicamente uno a uno, por ejemplo en matrices direccionables, de manera que cada molécula mutante contiene inicialmente una sustitución de aminoácido en solamente un sitio is-HIT.

En formas de realización particulares, como en ciclos subsiguientes, también es posible generar moléculas mutantes que contienen uno o más aminoácidos en uno o más sitios is-HIT que hayan sido sustituidos por aminoácidos LEAD candidatos. Esas proteínas mutantes portadoras de una o más mutaciones en uno o múltiples is-HIT, y que exhiben una resistencia mejorada a las proteasas se denominan LEAD (una mutación en un is-HIT) y súper-LEAD (mutaciones en más de un is-HIT).

La primera etapa del proceso toma en consideración los conocimientos disponibles sobre diferentes dominios:

(1): Acerca del entorno galénico y de suministro (tejido, órgano o fluido corporal) de la proteína terapéutica particular, con el fin de establecer una lista de proteasas con más probabilidades de estar presentes en ese entorno. Por ejemplo, una proteína terapéutica en una aplicación por vía oral tiene la probabilidad de encontrar las proteasas típicas de la luz del tracto gastrointestinal. Por el contrario, si esta proteína se inyectara en la circulación sanguínea, en la proteolisis intervendrían las proteasas del suero. En base a la lista específica de proteasas implicadas, se determina la lista completa de yodas las secuencias de aminoácidos que podrían actuar como dianas potenciales de las proteasas de la citada relación.

(2): Dado que la composición de las mezclas de proteasas en el organismo es bastante compleja, prácticamente todos los restos de cualquier proteína diana representa potencialmente una diana para la proteolisis (Fig. 6A). Sin embargo, las proteínas forman estructuras tridimensionales en las que los restos están más o menos expuestos al entorno y a la acción de las proteasas. Se puede suponer que los restos que forman el núcleo central de una proteína son inaccesibles para las proteasas, en tanto que los más "expuestos" al entorno son dianas mejores para las proteasas. Se puede tomar en consideración la probabilidad de todos los aminoácidos específicos de estar expuestos y, luego, ser accesibles a las proteasas, para reducir el número de is-HIT. En consecuencia, los métodos descritos en este documento consideran el análisis con respecto a la "exposición" o "accesibilidad" de los disolventes para cada aminoácido individual en la secuencia de proteína. Alternativamente, se puede determinar la accesibilidad del disolvente a los restos, independientemente de cualquier conocimiento previo sobre los datos estructurales específicos de la proteína, utilizando un algoritmo derivado de las probabilidades empíricas de accesibilidad a los aminoácidos, que se expresa en la ecuación siguiente (Boger et al., Reports of the Sixth International Congress in Immunology, pág. 250, 1986):

4

Brevemente, se trata de probabilidades fraccionales (\delta_{-(i)}) determinadas para un aminoácido (i) presente en la superficie de una proteína, que se basan sobre datos estructurales de un conjunto de varias proteínas. Así, es posible calcular la accesibilidad al disolvente (A) de un aminoácido (A(i)) en la posición de secuencia (i-2 a i+3, sobre una ventana deslizante de una longitud igual a 6), que se encuentra dentro de una superficie media accesible al disolvente de > 20 angström cuadrados (\ring{A}^{2}).

De esta forma, se identifican los aminoácidos diana accesibles a la proteasa a lo largo de la secuencia de proteína, es decir, los aminoácidos que se deben sustituir, y se les designa en este documento como HIT obtenidos mediante simulación por ordenador (is-HIT).

Entonces, los aminoácidos en los is-HIT se sustituyen por restos que hacen la secuencia menos vulnerable (en un factor de, por ejemplo, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,... 100%, dependiendo de la proteína) o invulnerable (ausencia sustancial de digestión en un periodo de tiempo establecido) a la digestión de proteasas, conservando al mismo tiempo una actividad o actividades biológicas de interés de la proteína. La elección de los a as de sustitución se ve complicada por (1) la extensa especificidad diana de ciertas proteasas, y (2) la necesidad de conservar propiedades físico-químicas tales como hidrofobicidad, carga y polaridad de restos esenciales (por ejemplo, actividades catalítica, de unión y/u otras actividades, dependiendo de la proteína). Para la aplicación en los métodos descritos en este documento se pueden utilizar los valores de "Porcentaje de mutación aceptado" (valores PAM; véase Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3):345-352, 1978, (Fig. 2)) tal como se describe en este documento. Los valores PAM, desarrollados originalmente para producir alineamientos entre secuencias de proteínas, están disponibles en forma de matrices de probabilidad, que reflejan una distancia evolutiva. Puesto que en una familia de proteínas o secuencias homólogas (relacionadas) se comparten aminoácidos idénticos o similares (similitud de 85%), se pueden determinar sustituciones conservadoras para, o "mutaciones puntuales permitidas" de los correspondientes restos aminoacídicos a lo largo de toda una secuencia alineada de referencia. En este sentido, "sustituciones conservadoras" de un resto en una secuencia de referencia son aquellas sustituciones que son física y funcionalmente similares a los correspondientes restos de referencia, por ejemplo, que tienen un tamaño, forma, carga eléctrica y propiedades químicas similares, incluida la capacidad para formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Por ejemplo, sustituciones conservadoras pueden ser las que exhiben la máxima puntuación y cumplimentan los criterios de la matriz PAM en forma de "mutaciones puntuales aceptadas".

Mediante la comparación de una familia de matrices de puntuación, Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3):345-352, 1978, hallaron una significación de puntuación consistentemente mayor con el uso de la matriz PAM250 en el análisis de una variedad de proteínas de las que se sabe que están relacionadas de manera distante. La matriz PAM250 ha sido seleccionada para los métodos de esta memoria. La matriz PAM250 se utiliza mediante el aprendizaje directo de la evolución natural para encontrar aminoácidos de sustitución para los is-HIT, con el fin de generar mutaciones conservadoras que no afectan a la función de la proteína. Mediante el uso de PAM250, se identifican los aminoácidos sustituyentes candidatos a partir de proteínas relacionadas de diferentes organismos.

Ejemplo de una clase de proteínas que pueden ser optimizadas según los métodos ofrecidos en este documento son las citocinas. Por ejemplo, se pueden usar los métodos de exploración bidimensional proporcionados en este documento para modificar las siguientes citocinas con el fin de incrementar su estabilidad, evaluada por una mayor resistencia a la proteolisis, que tiene como consecuencia una semivida prolongada de la proteína en el torrente circulatorio, o cualquier otra actividad biológica deseada de la proteína seleccionada. Ejemplos de citocinas incluyen, sin limitaciones: interleucina-10 (IL-10; SEC ID Nº: 200), interferón beta (IFN\beta; SEC ID Nº: 196), interferón alfa-2a (IFN\alpha-2a; SEC ID Nº: 182), interferón alfa-2b (IFN\alpha-2b; SEC ID Nº: 1), e interferón gamma (IFN\gamma, SEC ID Nº: 199), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-SCF; SEC ID Nº: 210), factor inhibidor de leucemia (LIF; SEC ID Nº: 213), hormona del crecimiento (hGH; SEC ID Nº: 214), factor neurotrófico ciliar (CNTF; SEC ID Nº: 212), leptina (SEC ID Nº: 211), oncostatina M (SEC ID Nº: 214), interleucina-6 (IL-6; SEC ID Nº: 217), interleucina-12 (IL-12; SEC ID Nº: 215), eritropoyetina (EPO; SEC ID Nº: 201), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF; SEC ID Nº: 202), interleucina-2 (IL-2; SEC ID Nº: 204), interleucina-3 (IL-3; SEC ID Nº: 205), interleucina-4 (IL-4; SEC ID Nº: 207), interleucina-5 (IL-5; SEC ID Nº: 208), interleucina-13 (IL-13; SEC ID Nº: 209), ligando Flt3 (SEC ID Nº: 203) y el factor de células madre (SCF; SEC ID Nº: 206).

Por lo tanto, en este documento se ofrecen citocinas modificadas que muestran una resistencia mayor a la proteolisis comparada con la citocina no modificada. Las citocinas modificadas se pueden seleccionar del grupo consistente en un miembro de la familia de proteínas interferones/interleucina-10, un miembro de la familia de citocinas de cadena larga; y un miembro de la familia de citocinas de cadena corta. En formas de realización particulares, las citocinas ofrecías en este documento se seleccionan del grupo consistente en: interleucina-10 (IL-10), interferón beta (IFN\beta), interferón alfa-2a (IFN\alpha-2a), interferón alfa-2b (IFN\alpha-2b) e interferón gamma (IFN-\gamma), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-SCF), factor inhibidor de leucemia (LIF), hormona del crecimiento humana (hGH), factor neurotrófico ciliar (CNTF), leptina, oncostatina M, interleucina-6 (IL-6) y interleucina-12 (IL-12), eritropoyetina (EPO), factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-SCF), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-13 (IL-13), ligando Flt3 y factor de células madre (SCF). En una forma de realización, la citocina modificada es un interferón, incluido el interferón \alpha-2b (IFN\alpha-2b)
modificado.

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E. Desarrollo Racional de IFN\alpha-2b para una Mayor Resistencia a la Proteolisis

IFN\alpha-2b se utiliza en una variedad de aplicaciones. Típicamente, se le usa para el tratamiento de las hepatitis B y C crónicas. Indicaciones adicionales incluyen, sin limitaciones, melanomas, infecciones de herpes, sarcomas de Kaposi y algunos casos de leucemia y linfoma. Los pacientes que reciben interferón se someten a frecuentes aplicaciones repetidas del medicamento. Puesto que estas inyecciones frecuentes provocan reacciones fisiológicas molestas, así como psicológicas indeseables en los pacientes, el incremento de la semivida de los interferones y la disminución de la frecuencia necesaria de inyecciones de interferón resultaría extremadamente útil para la comunidad médica. Por ejemplo, después de la administración de una inyección de IFN\alpha-2b humano nativo a ratones, como sistema modelo, su presencia se puede detectar en suero entre 3 y 10 horas, con una semivida de sólo aproximadamente 4 horas. El IFN\alpha-2b desaparece por completo hasta niveles indetectables en 18-24 horas después de la inyección. En este documento se ofrecen variantes mutantes de la proteína IFN\alpha-2b que exhiben propiedades alteradas que incluyen: (a) una estabilidad altamente mejorada, evaluada por la resistencia a las proteasas in vitro y por estudios farmacocinéticos en el ratón; y (b) una actividad biológica al menos comparable, según se evalúa por su acción antiviral y antiproliferativa comparada con la proteína IFN\alpha-2b tanto no modificada como natural y con, al menos, un derivado tratado con PEG del IFN\alpha-2b nativo natural. Como consecuencia, las proteínas mutantes de IFN\alpha-2b obtenidas en este documento proporcionan una elevada semivida y una actividad antiviral y antiproliferativa (suficientes para desarrollar un efecto terapéutico) al menos comparable con la secuencia nativa y con las moléculas derivadas, tratadas con PEG, que se usan actualmente en el tratamiento clínico de la infección de hepatitis C. Véanse las Figuras 6(A)-6(N), 6(T) y 6(U). De esta forma, los mutantes de la proteína IFN\alpha-2b optimizados, que poseen una resistencia incrementada a la proteolisis y/o la filtración glomerular, que se ofrecen en este documento dan como resultado un descenso de la frecuencia de inyecciones necesaria para mantener un nivel suficiente de medicamento en suero, lo que conduce a i) una mayor comodidad y aceptación por parte de los pacientes, ii) dosis menores necesarias para alcanzar efectos biológicos comparables, y iii) como consecuencia de ii), una atenuación de los efectos secundarios (dependientes de la dosis) observados en el ser humano.

En formas de realización particulares, la semivida de los mutantes de IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a obtenidos en este documento aumenta en una cantidad seleccionada desde al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150%, al menos 200%, al menos 250%, al menos 300%, al menos 350%, al menos 400%, al menos 450%, al menos 500% o más en comparación con la semivida de los IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a humanos nativos en sangre humana, suero humano o en una mezcla in vitro que contiene una o más proteasas. En otras formas de realización, la semivida de los mutantes de IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a obtenidos en este documento aumentó en una cantidad seleccionada desde al menos 6b veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces o más en comparación con la semivida de los IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a humanos nativos en sangre humana, suero humano o en una mezcla in vitro que contiene una o más proteasas.

En este documento se utilizaron dos metodologías para aumentar la estabilidad de IFN\alpha-2b por sustitución de aminoácidos: i) sustitución de aminoácidos que conduce a una mayor resistencia a las proteasas, por destrucción directa del resto o secuencia diana de la proteasa, manteniendo o mejorando simultáneamente la actividad biológica requerida (por ejemplo, actividad antiviral, actividad antiproliferativa), y/o ii) sustitución de aminoácidos que da lugar a un patrón diferente de N-glicosilación, reduciendo así tanto la filtración glomerular como la sensibilidad a las proteasas, a la vez que mejora o conserva la actividad biológica necesaria (por ejemplo, actividad antiviral, actividad antiproliferativa).

Los métodos de exploración bidimensional que se ofrecen en este documento se usaron para identificar los cambios de aminoácidos en IFN\alpha-2b que conducen a un aumento de estabilidad cuando se enfrenta al desafío de proteasas, lisado de sangre humana o suero humano. En este documento se considera que el incremento de la estabilidad de la proteína a las proteasas, lisado de sangre humana o suero humano, y/o el aumento del tamaño molecular proporciona una semivida in vivo más prolongada para las moléculas de la proteína particular y, por lo tanto, a una reducción de la frecuencia de las inyecciones necesarias en el paciente. Las actividades biológicas que se midieron para las moléculas de IFN\alpha-2b son i) su capacidad para inhibir la replicación vírica cuando se agregan a células permisivas infectadas previamente con el virus apropiado, y ii) su capacidad para estimular la proliferación celular cuando se agregan a células adecuadas. Antes de la medición de la actividad biológica, las moléculas de IFN\alpha-2b fueron estimuladas con proteasas, lisado de sangre humana o suero humano durante diferentes periodos de incubación. La actividad biológica medida corresponde entonces a la actividad biológica residual tras la exposición a las mezclas que contienen proteasa.

Tal como se ha señalado anteriormente, en este documento se ofrecen métodos para el desarrollo de moléculas de IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a que, al mismo tiempo que conservan intacta la actividad biológica necesaria, se han hecho menos susceptibles a la digestión por parte de las proteasas de la sangre y exhiben, por tanto, una semivida más prolongada en la circulación sanguínea. En este ejemplo particular, el método utilizado incluyó las siguientes etapas específicas, según se describe en el Ejemplo 2:

1): identificar algunos o todos los sitios diana posibles en la secuencia de proteína que son susceptibles a la digestión por una o múltiples proteasas específicas (estos sitios son los is-HIT), e

2): identificar aminoácidos de sustitución adecuados, específicos para cada is-HIT, de modo que si se utilizan para sustituir uno o más de los aminoácidos originales en su is-HIT específico, cabe esperar que aumenten la resistencia del is-HIT a la digestión por proteasas, manteniendo inalterada, al mismo tiempo, la actividad biológica de la proteína (estos aminoácidos de sustitución con los "LEAD candidatos").

Como se indica en el Ejemplo 2, se usó la estructura tridimensional del IFN\alpha-2b obtenida de la estructura de RMN de IFN\alpha-2a (código PDB 1ITF) para seleccionar solamente los restos expuestos al disolvente a partir de una lista de restos a lo largo de la secuencia de IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a que pueden ser considerados como un sustrato para diferentes enzimas presentes en el suero. El resto 1 corresponde al primer resto del péptido maduro IFN\alpha-2b codificado por los nucleótidos 580-1074 del Nº de acceso de secuencia J00207, SEC ID Nº: 1. Usando esta forma de abordaje, se identificaron las 42 posiciones diana de aminoácidos siguientes como is-HIT en IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a, cuya numeración es la de la proteína madura (SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 182, respectivamente): L3, P4, R12, R13, M16, R22, K23 o R23, F27, L30, K31, R33, E41, K49, E58, K70, E78, K83, Y89, E96, E107, P109, L110, M111, E113, L117, R120, K121, R125, L128, K131, E132, K133, K134, Y135, P137, M148, R149, E159, L161, R162, K164 y E165. Cada una de estas posiciones se sustituyó con restos definidos como compatibles por la matriz de sustitución PAM250, mientras que, al mismo tiempo, no generaron nuevos sustratos para las proteasas. Para estos 42 is-HIT, las sustituciones de resto determinadas por el análisis PAM250 fueron las siguientes:

: R a H, Q

: E a H, Q

: K a Q, T

: L a V. I

: M a I, V

: P a A, S

: Y a I, H.

1) Proteínas IFN\alpha-2b Modificadas con Sustituciones de un solo aminoácido

Entre las proteínas mutantes que se proporcionan en este documento, se encuentran las proteínas IFN\alpha-2b que muestran una resistencia aumentada a la proteolisis en comparación con la proteína natural típica, no modificada. Las proteínas IFN\alpha-2b mutantes incluyen las seleccionadas entre las proteínas que contienen más sustituciones de un solo aminoácido en SEC ID Nº: 1, correspondientes a: L por V en la posición 3; L por I en la posición 3; P por S en la posición 4; R por H en la posición 12; R por Q en la posición 12; R por H en la posición 13; R por Q en la posición 13; M por V en la posición 16; M por I en la posición 16; R por H en la posición 22; R por Q en la posición 22; R por H en la posición 23; R por Q en la posición 23; F por I en la posición 27; F por V en la posición 27; L por V en la posición 30; L por I en la posición 30; K por Q en la posición 31; K por T en la posición 31; R por H en la posición 33; R por Q en la posición 33; E por Q en la posición 41; E por H en la posición 41; K por Q en la posición 49; K por T en la posición 49; E por Q en la posición 58; E por H en la posición 58; K por Q en la posición 70; K por T en la posición 70; E por Q en la posición 78; E por H en la posición 78; K por Q en la posición 83; K por T en la posición 83; Y por H en la posición 89; Y por I en la posición 89; E por Q en la posición 96; E por H en la posición 96; E por Q en la posición 107; E por H en la posición 107; P por S en la posición 109; P por A en la posición 109; L por V en la posición 110; L por I en la posición 110; M por V en la posición 111; M por I en la posición 111; E por Q en la posición 113; E por H en la posición 113; L por V en la posición 117; L por I en la posición 17; R por H en la posición 120; R por Q en la posición 120; K por Q en la posición 121; K por T en la posición 121; R por H en la posición 125; R por Q en la posición 125; L por V en la posición 128; L por I en la posición 128; K por Q en la posición 131; K por T en la posición 131; E por Q en la posición 132; E por H en la posición 132; K por Q en la posición 133; K por T en la posición 133; K por Q en la posición 134; K por T en la posición 134; Y por H en la posición 135; Y por I en la posición 135; P por S en la posición 137; P por A en la posición 137; M por V en la posición 148; M por I en la posición 148; R por H en la posición 149; R por Q en la posición 149; E por Q en la posición 159; E por H en la posición 159; L por V en la posición 161; L por I en la posición 161; R por H en la posición 162; R por Q en la posición 162; K por Q en la posición 164; K por T en la posición 164; E por Q en la posición 165; y E por H en la posición 165.

2) Identificación de LEAD

A continuación, los aminoácidos de sustitución específicos (LEAD candidatos) se introducen de forma sistemática en cada posición is-HIT para generar una colección que contiene las correspondientes moléculas mutantes de ADN de IFN\alpha-2b, tal como se señala en el Ejemplo 2. Se utilizaron las moléculas mutantes de ADN para producir las correspondientes moléculas mutantes de proteína IFN\alpha-2b por transformación o transfección en las células apropiadas. En estos mutantes de proteína se analizaron (i) la protección contra la proteolisis, (ii) la actividad antiviral y antiproliferativa in vitro, (iii) la farmacocinética en ratón. Resultan particularmente interesantes las mutaciones que aumentan estas actividades de las proteínas mutantes de IFN\alpha-2b en comparación con la proteína IFN\alpha-2b natural y no modificada, y con los derivados tratados con PEG de la proteína natural. En base a los resultados obtenidos de estos ensayos, se asignó a cada variante individual de IFN\alpha-2b una actividad específica. Las proteínas variantes que mostraron la máxima estabilidad y/o resistencia a la proteolisis se seleccionaron como LEAD. Los LEAD candidatos que exhibieron al menos tanta actividad antiviral residual después del tratamiento con proteasa como el control, IFN\alpha-2b nativo, antes del tratamiento con proteasa se seleccionaron como LEAD. Los resultados se presentan en la Tabla 2 del Ejemplo 2.

Mediante el uso de este método, se ofrecen en este documento los siguientes mutantes seleccionados como LEAD y que corresponden al grupo de proteínas que contienen una o múltiples sustituciones de un solo aminoácido en SEC ID Nº: 1 correspondientes a: F por V en la posición 27; R por H en la posición 33; E por Q en la posición 41; E por H en la posición 41; E por Q en la posición 58; E por H en, a posición 58; E por Q en la posición 78; E por H en la posición 78; Y por H en la posición 89; E por Q en la posición 107; E por H en la posición 107; P por A en la posición 109; L por V en la posición 110; M por V en la posición 111; E por Q en la posición 113; E por H en la posición 113; L por V en la posición 117; L por I en la posición 117; K por Q en la posición 121; K por T en la posición 121; R por H en la posición 125; R por Q en la posición 125; K por Q en la posición 133; K por T en la posición 133; E por Q en la posición 159; y E por H en la posición 159. Entre éstas, puede haber mutaciones que pueden tener efectos múltiples. Por ejemplo, entre las mutaciones descritas existen mutaciones que dan como resultado un aumento de la actividad de IFN\alpha-2b evaluado por la detección de la actividad biológica requerida.

También se proporcionan proteínas IFN\alpha-2b que contienen una pluralidad de mutaciones basadas en los LEAD (véanse, por ejemplo, las Tablas 6 y 7, Ejemplo 5, en las que se enumeran los LEAD candidatos y los sitios LEAD). Estas proteínas IFN\alpha-2b poseen una actividad que está optimizada adicionalmente. Ejemplos de tales proteínas se describen en los Ejemplos. Se pueden preparar y ensayar otras combinaciones de mutaciones de la forma descrita en este documento para identificar otros LEAD de interés, en particular los que poseen una actividad antiviral IFN\alpha-2b aumentada adicionalmente, o una mayor resistencia a la proteolisis.

También se ofrecen en este documento citocinas IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a modificadas, seleccionadas del grupo consistente en proteínas que comprenden una o múltiples sustituciones de un solo aminoácido en las SEC ID Nos. 1 ó 182, correspondientes a las sustituciones de; N por D en la posición 45 (por ejemplo, SEC ID Nº: 978); D por G en la posición 94 (por ejemplo, SEC ID Nº: 979); G por R en la posición 102 (por ejemplo, SEC ID Nº: 980); A por G en la posición 139 (por ejemplo, SEC ID Nº: 981); o cualquier combinación de las mismas. Estas proteínas particulares han demostrado tener también una resistencia aumentada a la proteolisis.

En otra forma de realización, se producen proteínas IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a que contienen una pluralidad de mutaciones basadas en los LEAD (véanse las Tablas en los Ejemplos, que enumeran los LEAD candidatos y los sitios LEAD) para generar proteínas IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a que tienen una actividad optimizada adicionalmente. En este documento se describen ejemplos de tales proteínas. Se pueden preparar otras combinaciones de mutaciones, que se ensayan de la forma descrita en este documento para identificar otros LEAD de interés, en especial los que poseen una actividad antiviral IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a más aumentada o una mayor resistencia a la proteolisis.

3) Adición de Sitios de N-glicosilación

En formas de realización adicionales es posible agregar sitios de N-glicosilación para incrementar la resistencia a la proteolisis, a la vez que se conserva o mejora la actividad biológica requerida. En el Ejemplo 3 se presentan Ejemplos de mutantes de N-glicosilación que contienen sustituciones dobles de aminoácidos correspondientes a las secuencias consenso N-X-S o N-X-T. En consecuencia, en este documento se ofrecen proteínas mutantes IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a que tienen una resistencia aumentada a la proteolisis en comparación con IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a no modificados, seleccionadas del grupo consistente en proteínas que comprenden uno o más conjuntos de sustituciones de dos aminoácidos en SEC ID Nº: 1, correspondientes a:

: D por N en la posición 2 y P por S en la posición 4;

: D por N en la posición 2 y P por T en la posición 4;

: L por N en la posición 3 y Q por S en la posición 5;

: L por N en la posición 3 y Q por T en la posición 5;

: P por N en la posición 4 y T por S en la posición 6;

: P por N en la posición 4 y T por T en la posición 6;

: Q por N en la posición 5 y H por S en la posición 7;

: Q por N en la posición 5 y H por T en la posición 7;

: T por N en la posición 6 y S por S en la posición 8;

: T por N en la posición 6 y S por T en la posición 8;

: H por N en la posición 7 y L por S en la posición 9;

: H por N en la posición 7 y L por T en la posición 9;

: S por N en la posición 8 y G por S en la posición 10;

: S por N en la posición 8 y G por T en la posición 10;

: L por N en la posición 9 y S por S en la posición 11;

: L por N en la posición 9 y S por T en la posición 11;

: M por N en la posición 21 y K por S en la posición 23;

: M por N en la posición 21 y K por T en la posición 23;

: R por N en la posición 22 e I por S en la posición 24;

: R por N en la posición 22 e I por T en la posición 24;

: K o R por N en la posición 23 y S por S en la posición 25;

: K o R por N en la posición 23 y S por T en la posición 25;

: I por N en la posición 24 y L por S en la posición 26;

: I por N en la posición 24 y L por T en la posición 26;

: S por N en la posición 25 y F por S en la posición 27;

: S por N en la posición 25 y F por T en la posición 27;

: L por N en la posición 26 y S por S en la posición 28;

: L por N en la posición 26 y S por T en la posición 28;

: S por N en la posición 28 y L por S en la posición 30;

: S por N en la posición 28 y L por T en la posición 30;

: L por N en la posición 30 y D por S en la posición 32;

: L por N en la posición 30 y D por T en la posición 32;

: K por N en la posición 31 y R por S en la posición 33;

: K por N en la posición 31 y R por T en la posición 33;

: D por N en la posición 32 y H por S en la posición 34;

: D por N en la posición 32 y H por T en la posición 34;

: R por N en la posición 33 y D por S en la posición 35;

: R por N en la posición 33 y D por T en la posición 35;

: H por N en la posición 34 y F por S en la posición 36;

: H por N en la posición 34 y F por T en la posición 36;

: D por N en la posición 35 y G por S en la posición 37;

: D por N en la posición 35 y G por T en la posición 37;

: F por N en la posición 36 y F por S en la posición 38;

: F por N en la posición 36 y F por T en la posición 38;

: G por N en la posición 37 y P por S en la posición 39;

: G por N en la posición 37 y P por T en la posición 39;

: F por N en la posición 38 y Q por S en la posición 40;

: F por N en la posición 38 y Q por T en la posición 40;

: P por N en la posición 39 y E por S en la posición 41;

: P por N en la posición 39 y E por T en la posición 41;

: Q por N en la posición 40 y E por S en la posición 42;

: Q por N en la posición 40 y E por T en la posición 42;

: E por N en la posición 41 y F por S en la posición 43;

: E por N en la posición 41 y F por T en la posición 43;

: E por N en la posición 42 y G por S en la posición 44;

: E por N en la posición 42 y G por T en la posición 44;

: F por N en la posición 43 y N por S en la posición 45;

: F por N en la posición 43 y N por T en la posición 45;

: G por N en la posición 44 y Q por S en la posición 46;

: G por N en la posición 44 y Q por T en la posición 46;

: N por N en la posición 45 y F por S en la posición 47;

: N por N en la posición 45 y F por T en la posición 47;

: Q por N en la posición 46 y Q por S en la posición 48;

: Q por N en la posición 46 y Q por T en la posición 48;

: F por N en la posición 47 y K por S en la posición 49;

: F por N en la posición 47 y K por T en la posición 49;

: Q por N en la posición 48 y A por S en la posición 50;

: Q por N en la posición 48 y A por T en la posición 50;

: K por N en la posición 49 y E por S en la posición 51;

: K por N en la posición 49 y E por T en la posición 51;

: A por N en la posición 50 y T por S en la posición 52;

: A por N en la posición 50 y T por T en la posición 52;

: S por N en la posición 68 y K por S en la posición 70;

: S por N en la posición 68 y K por T en la posición 70;

: K por N en la posición 70 y S por S en la posición 72;

: K por N en la posición 70 y S por T en la posición 72;

: A por N en la posición 75 y D por S en la posición 77;

: A por N en la posición 75 y D por T en la posición 77;

: D por N en la posición 77 y T por S en la posición 79;

: D por N en la posición 77 y T por T en la posición 79;

: I por N en la posición 100 y G por S en la posición 102;

: I por N en la posición 100 y G por T en la posición 102;

: Q por N en la posición 101 y V por S en la posición 103;

: Q por N en la posición 101 y V por T en la posición 103;

: G por N en la posición 102 y G por S en la posición 104;

: G por N en la posición 102 y G por T en la posición 104;

: V por N en la posición 103 y V por S en la posición 105;

: V por N en la posición 103 y V por T en la posición 105;

: G por N en la posición 104 y T por S en la posición 106;

: G por N en la posición 104 y T por T en la posición 106;

: V por N en la posición 105 y E por S en la posición 107;

: V por N en la posición 105 y E por T en la posición 107;

: T por N en la posición 106 y T por Sen la posición 108;

: T por N en la posición 106 y T por T en la posición 108;

: E por N en la posición 107 y P por S en la posición 109;

: E por N en la posición 107 y P por T en la posición 109;

: T por N en la posición 108 e I por S en la posición 110;

: T por N en la posición 108 e I por T en la posición 110;

: K por N en la posición 134 y S por S en la posición 136;

: K por N en la posición 134 y S por T en la posición 136;

: S por N en la posición 154 y N por S en la posición 156;

: S por N en la posición 154 y N por T en la posición 156;

: T por N en la posición 155 y L por S en la posición 157;

: T por N en la posición 155 y L por T en la posición 157;

: N por N en la posición 156 y Q por S en la posición 158;

: N por N en la posición 156 y Q por T en la posición 158;

: L por N en la posición 157 y E por S en la posición 159;

: L por N en la posición 157 y E por T en la posición 159;

: Q por N en la posición 158 y S por S en la posición 160;

: Q por N en la posición 158 y S por T en la posición 160;

: E por N en la posición 159 y L por S en la posición 161;

: E por N en la posición 159 y L por T en la posición 161;

: S por N en la posición 160 y R por S en la posición 162;

: S por N en la posición 160 y R por T en la posición 162;

: L por N en la posición 161 y S por S en la posición 163;

: L por N en la posición 161 y S por T en la posición 163;

: R por N en la posición 162 y K por S en la posición 164;

: R por N en la posición 162 y K por T en la posición 164;

: S por N en la posición 163 y E por S en la posición 165; y

: S por N en la posición 163 y E por T en la posición 165,

en donde el resto 1 corresponde al resto 1 de la proteína IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a madura que se expone en SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 182, respectivamente. En formas de realización particulares, la proteína mutante IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a muestra una resistencia incrementada a la proteolisis en comparación con IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a no modificados, y se selecciona del grupo consistente en proteínas que comprenden uno o múltiples conjuntos de sustituciones de dos aminoácidos en SEC ID Nº: 1, correspondientes a:

: Q por N en la posición 5 y H por S en la posición 7;

: P por N en la posición 39 y E por S en la posición 41;

: P por N en la posición 39 y E por T en la posición 41;

: Q por N en la posición 40 y E por S en la posición 42;

: Q por N en la posición 40 y E por T en la posición 42;

: E por N en la posición 41 y F por S en la posición 43;

: E por N en la posición 41 y F por T en la posición 43;

: F por N en la posición 43 y N por S en la posición 45;

: G por N en la posición 44 y Q por T en la posición 46;

: N por N en la posición 45 y F por S en la posición 47;

: N por N en la posición 45 y F por T en la posición 47;

: Q por N en la posición 46 y Q por S en la posición 48;

: F por N en la posición 47 y K por S en la posición 49;

: F por N en la posición 47 y K por T en la posición 49;

: I por N en la posición 100 y G por S en la posición 102;

: I por N en la posición 100 y G por T en la posición 102;

: V por N en la posición 105 y E por S en la posición 107;

: V por N en la posición 105 y E por T en la posición 107;

: T por N en la posición 106 y T por S en la posición 108;

: T por N en la posición 106 y T por T en la posición 108;

: E por N en la posición 107 y P por S en la posición 109;

: E por N en la posición 107 y P por T en la posición 109;

: L por N en la posición 157 y E por S en la posición 159;

: L por N en la posición 157 y E por T en la posición 159;

: E por N en la posición 159 y L por S en la posición 161; y

: E por N en la posición 159 y L por T en la posición 161.

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F. Rediseño de Proteínas

En este documento se proporcionan métodos para rediseñar y generar nuevas versiones de citocinas nativas o modificadas tales como IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a. Con el empleo de estos métodos, la citocina rediseñada conserva niveles suficientes, típicamente iguales o mejorados, de un fenotipo seleccionado tal como actividad biológica de la proteína original, en tanto que, simultáneamente, su secuencia de aminoácidos se modifica por sustitución de hasta al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, al menos 10%, al menos 12%, al menos 14%, al menos 16%, al menos 18%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40% hasta 50% o más de sus aminoácidos nativos por los aminoácidos pseudo-naturales apropiados. Aminoácidos pseudo-naturales son aquellos aminoácidos que cuando sustituyen un aminoácido original o nativo en una posición determinada en la secuencia de proteína, la proteína resultante exhibe sustancialmente los mismos niveles de actividad biológica (o actividad suficiente para su uso terapéutico u otro uso) comparada con la proteína original, por ejemplo, nativa. En otras formas de realización, aminoácidos pseudo-naturales son los aminoácidos que cuando sustituyen un aminoácido original, o nativo, en una posición determinada en la secuencia de proteína, la proteína resultante muestra el mismo fenotipo, por ejemplo, niveles de actividad biológica, comparada con la proteína original, típicamente una proteína nativa. Los aminoácidos pseudo-naturales y las posiciones de sustitución apropiadas se pueden detectar e identificar por cualquier medio analítico o predictivo tal como, por ejemplo, llevando a cabo un barrido con alanina. Para la exploración se puede usar cualquier otro aminoácido, en especial otro aminoácido que tenga un efecto neutro sobre la estructura como, por ejemplo, Gly o Ser. Todas las sustituciones de aminoácidos originales, por ejemplo, nativos, por Ala que no conducen a la generación de un HIT (una proteína que ha perdido la actividad biológica deseada) conducen a la generación de un LEAD (una proteína con una actividad biológica mayor); o la sustitución con Ala será una sustitución neutra, es decir, la proteína resultante exhibirá niveles comparables de actividad biológica en comparación con la proteína original o nativa. Los métodos que se proporcionan en este documento para el rediseño proteico de citocinas, tales como IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a, están dirigidos a diseñar y generar proteínas "artificiales" (frente a las naturales ya existentes), de manera que están formadas por secuencias de aminoácidos que no existen en la naturaleza, pero que exhiben actividades biológicas características de la proteína original, o nativa. En este documento se considera que estas proteínas rediseñadas son útiles para evitar potenciales efectos secundarios que, de lo contrario, podrían existir en otras formas de citocinas para el tratamiento de enfermedades. Otros usos de las proteínas rediseñadas que se ofrecen en este documento son establecer una comunicación cruzada entre rutas desencadenadas por diferentes proteínas; facilitar la biología estructural por, la generación de mutantes que pueden ser cristalizados mientras conservan su actividad; y destruir una actividad de una proteína sin modificar una segunda actividad o múltiples actividades adicionales.

En otra forma de realización, el método para obtener proteínas rediseñadas comprende: i) identificar algunos o todos los posibles sitios diana en la secuencia de proteína que son susceptibles de sustitución de aminoácidos sin pérdida de actividad de la proteína, (actividad de la proteína en el sentido más amplio del término; enzimática, de unión, hormonal, etc.). (Estos sitios son los sitios pseudo-naturales, sitios \Psi-wt); ii) identificar los aminoácidos de sustitución apropiados (aminoácidos \Psi-wt) específicos para cada sitio \Psi-wt, de manera que si se utilizan para sustituir los aminoácidos nativos en ese sitio \Psi-wt específico, cabe esperar que generen una proteína con una actividad biológica comparable con la de la proteína original, o nativa, conservando sustancialmente inalterada, de este modo, la actividad biológica de la proteína; iii) introducir de forma sistemática los aminoácidos \Psi-wt en cada posición \Psi-wt de manera que se genere una colección que contenga las correspondientes moléculas mutantes. Los mutantes se generan, producen y caracterizan fenotípicamente uno a uno, en matrices direccionables, de manera que cada molécula mutante contiene, inicialmente, sustituciones de aminoácidos solamente en un sitio \Psi-wt. En ciclos subsiguientes, también se pueden generar moléculas mutantes de tal forma que contengan uno o más aminoácidos \Psi-wt en uno o más sitios \Psi-wt. Estas proteínas mutantes, portadoras de varias mutaciones en una serie de sitios \Psi-wt, y que exhiben una actividad biológica comparable o mejorada, se denominan proteínas rediseñadas o proteínas \Psi-wt. En formas de realización particulares, al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25% o más de las posiciones de restos aminoacídicos en una citocina determinada, por ejemplo, IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a, están sustituidas con un aminoácido de tipo pseudo-natural apropiado.

La primera etapa consiste en una exploración de aminoácido a lo largo de la totalidad de la proteína. En esta etapa, se sustituyen todos y cada uno de los aminoácidos de la secuencia de la proteína por un aminoácido de referencia seleccionado, tal como alanina. Esto permite la identificación de posiciones "HIT de rediseño", es decir, posiciones que son sensibles a la sustitución de aminoácidos. Todas las demás posiciones que no son posiciones HIT-rediseño (es decir, aquellas en las que la sustitución del aminoácido original, o nativo, por el aminoácido de sustitución, por ejemplo, Ala, no conduce a una reducción del ajuste de la proteína o de su actividad biológica) se denominan en este documento posiciones "pseudo-naturales". Cuando el aminoácido de sustitución, por ejemplo, Ala, sustituye el aminoácido original, o nativo, en una posición no-HIT, se trata de una sustitución neutra, en términos de actividad de la proteína, y se dice que el aminoácido de sustitución es un aminoácido pseudo-natural en esa posición. Las posiciones pseudo-naturales parecen ser menos sensibles que las posiciones HIT-rediseño, puesto que toleran la sustitución del aminoácido sin afectar a la actividad de la proteína, que se conserva o mejora. La sustitución del aminoácido en las posiciones pseudo-naturales dan como resultado una no modificación del ajuste de la proteína (por ejemplo, posee sustancialmente la misma actividad biológica) y, simultáneamente, conduce a una divergencia de la secuencia de la proteína resultante en comparación con la secuencia original o nativa.

Para identificar inicialmente las posiciones aminoacídicas en la proteína IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a que intervienen o no en la actividad proteica de IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a, tal como la actividad de unión de IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a a su receptor, el barrido con Ala se llevó a cabo en la secuencia IFN\alpha-2b de la forma descrita en el Ejemplo 4. A tal efecto, se cambió cada aminoácido de la secuencia de la proteína IFN\alpha-2b con alanina. Se puede utilizar cualquier otro aminoácido, en especial otro aminoácido que posea un efecto neutro sobre la estructura, tal como Gly o Ser. La proteína mutante IFN\alpha-2b resultante se expresó seguidamente y se analizó la actividad de la molécula de interferón. Estas posiciones aminoacídicas particulares, designadas en este documento como HIT, no serían, en principio, dianas adecuadas para la sustitución de aminoácidos para incrementar la estabilidad de la proteína, debido a su implicación en el reconocimiento del receptor de IFN, o en las vías corriente abajo que intervienen en la actividad de IFN. Para el barrido con Ala, la actividad biológica medida para las moléculas de IFN\alpha-2b fue: i) su capacidad para inhibir la replicación vírica cuando se agregan a células permisivas infectadas previamente con el virus apropiado, y ii) su capacidad para estimular la proliferación celular cuando se agregan a las células adecuadas. La actividad relativa de cada mutante individual, comparado con la proteína nativa, se indica en las Figs. 10A hasta C. HIT son aquellos mutantes que producen un descenso de la actividad de la proteína (en el ejemplo, todos los mutantes con actividades menores que aproximadamente 30% de la actividad nativa).

Adicionalmente, se usó el barrido con alanina para identificar los restos aminoacídicos en IFN\alpha-2b que, cuando son sustituidos con alanina, corresponden a una actividad "pseudo-natural", es decir, los que se pueden sustituir con alanina sin dar lugar a una reducción de la actividad biológica. El conocimiento de estos aminoácidos resulta útil para el rediseño de las proteínas IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a. Los resultados se presentan en la Tabla 5 e incluyen posiciones aminoacídicas pseudo-naturales de IFN\alpha-2b correspondiente a la SEC ID Nº: 1, restos aminoacídicos: 9, 10, 17, 20, 24, 25, 35, 37, 41, 52, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 64, 65, 76, 89 y 90.

En consecuencia, en este documento se ofrecen proteínas mutantes IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a que comprenden mutaciones de tipo pseudo-natural en las posiciones aminoacídicas de IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a correspondientes a SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 182, respectivamente, restos aminoacídicos: 9, 10, 17, 20, 24, 25, 35, 37, 41, 52, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 64, 65, 76, 89 y 90. Las mutaciones pueden ser una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones del o de los restos aminoacídicos nativos. En una forma de realización, las sustituciones de tipo pseudo-natural son mutaciones con alanina en cada posición. En otra forma de realización, las sustituciones de tipo pseudo-natural son una o más mutaciones en SEC ID Nº: 1 correspondientes a:

: L por A en la posición 9, L por A en la posición 17,

: Q por A en la posición 20, I por A en la posición 24,

: S por A en la posición 25, D por A en la posición 35,

: G por A en la posición 37, E por A en la posición 41,

: T por A en la posición 52, P por A en la posición 54,

: L por A en la posición 56, H por A en la posición 57,

: E por A en la posición 58, I por A en la posición 60,

: I por A en la posición 63, F por A en la posición 64,

: N por A en la posición 65, W por A en la posición 76,

: Y por A en la posición 89, y Q por A en la posición 90.

Además, el barrido con alanina de IFN\alpha-2b reveló que los siguientes HIT-rediseño tienen una actividad antiviral disminuida en las posiciones aminoacídicas de IFN\alpha-2b correspondientes a SEC ID Nº: 1, restos aminoacídicos: 2, 7, 8, 11, 13, 15, 16, 23, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 53, 69, 91, 98 y 101. Por lo tanto, el formas de realización particulares en las que se desea reducir la actividad viral de IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a se pueden llevar a cabo una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones del o de los restos aminoacídicos nativos en una o más de las posiciones aminoacídicas de IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a correspondientes a SEC ID Nº: 1, restos aminoacídicos: 2, 7, 8, 11, 13, 15, 16, 23, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 53, 69, 91, 98 y 101.

Cada una de las mutaciones de rediseño descritas anteriormente se puede combinar con una o más de las mutaciones LEAD candidatas de IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a o uno o más de los mutantes LEAD de IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a que se dan a conocer en este documento.

G. Exploración Tridimensional y su Uso para Modificar Citocinas

En este documento se propone también un método de análisis de homología estructural para la comparación de proteínas, independientemente de sus secuencias de aminoácidos subyacentes. Esta información se utiliza racionalmente para producir proteínas modificadas derivadas de un subconjunto de familias de proteínas tal como la familia de las citocinas humanas. Este método de análisis de homología estructural es aplicable a proteínas que se han desarrollado por cualquier método, incluido el de exploración bidimensional descrito en este documento. Cuando se utiliza con el método bidimensional en el que se modifica un fenotipo, actividad o característica particular de una proteína para la exploración 2D, el método se denomina exploración 3D.

El uso del análisis de "homología estructural", combinado con los métodos de desarrollo dirigido que se proporcionan en este documento, constituye una técnica potente para identificar y producir diversos nuevos mutantes de proteínas, tales como las citocinas, que poseen actividades biológicas deseadas, tales como una resistencia mayor a la proteolisis. Por ejemplo, el análisis de la "homología estructural" entre una versión mutante optimizada de una proteína determinada y proteínas "estructuralmente homólogas" permite la identificación de las correspondientes posiciones aminoacídicas estructuralmente relacionadas o estructuralmente similares (designadas en este documento también como "loci estructuralmente homólogos") en otras proteínas. Esto permite la identificación de versiones mutantes de estas últimas que tienen una o múltiples características deseadas optimizadas (actividad biológica, fenotipo) de manera sencilla, rápida y predictiva (independientemente de la secuencia de aminoácidos y de la homología de la secuencia). Una vez que se ha desarrollado la versión mutante de una proteína, mediante la aplicación de las reglas de homología estructural, se identifican con facilidad las correspondientes posiciones aminoacídicas estructuralmente relacionadas (y aminoácidos de sustitución) en otras proteínas "estructuralmente homólogas", lo que permite descubrir de manera rápida y predictiva las versiones mutantes de las nuevas proteínas.

Las posiciones aminoacídicas equivalentes estructuralmente desde el punto de vista tridimensional, que están situadas en dos o más secuencias de proteínas que comparten un cierto grado de homología estructural, tienen misiones funcionales comparables (actividades y fenotipos). Estos dos aminoácidos que ocupan un espacio estructural tridimensional sustancialmente equivalente dentro de sus proteínas respectivas se pueden considerar, entonces, "estructuralmente similares" o "estructuralmente relacionados" entre sí aun cuando sus posiciones precisas en las secuencias de aminoácidos, cuando estas secuencias están alineadas, no son coincidentes. Se afirma también que los dos aminoácidos ocupan "loci estructuralmente homólogos". La "homología estructural" no tiene en consideración la secuencia de aminoácidos subyacente, sino que compara exclusivamente las estructuras tridimensionales de las proteínas. De este modo, se puede decir que dos proteínas poseen un grado determinado de homología estructural siempre que compartan regiones o dominios conformacionales que exhiben estructuras o formas comparables, con solapamiento tridimensional en el espacio. Las posiciones aminoacídicas en una o más proteínas que son "estructuralmente homólogas" pueden estar relativamente alejadas entre sí en las secuencias de proteína cuando se alinean estas secuencias siguiendo las normas de la homología de secuencias primarias. De esta forma, cuando se determina que dos o más esqueletos proteicos son estructuralmente análogos, los restos aminoacídicos que fueron coincidentes en la superposición estructural tridimensional se designan como restos aminoacídicos "estructuralmente similares" o "estructuralmente relacionados" en proteínas estructuralmente homólogas (también denominadas "loci estructuralmente homólogos"). Los restos aminoacídicos estructuralmente similares están localizados en posiciones espaciales sustancialmente equivalentes en las proteínas estructuralmente homólogas.

Por ejemplo, para proteínas de tamaño medio (aproximadamente, 180 restos), dos estructuras con un plegamiento similar exhibirán, por lo general, desviaciones de medias cuadráticas (rms) que no son superiores a 3 a 4 angstroms. Por ejemplo, los restos aminoacídicos estructuralmente similares o estructuralmente relacionados pueden ocupar en el esqueleto separadas entre sí por menos de 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,7 ó 1,5 angstroms tras la superposición de las proteínas. Los cálculos de desviación RMS y la superposición de proteínas se pueden llevar a cabo usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la superposición de proteínas y los cálculos de desviaciones RMS se pueden efectuar usando todos los átomos del esqueleto peptídico (por ejemplo, N, C, C(C=O), O y CA* (cuando está presente)). De manera alternativa, la superposición de proteínas se puede llevar a cabo usando uno solo o cualquier combinación de átomos del esqueleto peptídico tales como, por ejemplo, N, C, C(C=O), O y CA* (cuando está presente). Además, el experto en la técnica reconocerá que la superposición de proteínas y los cálculos de desviación RMS se pueden realizar, generalmente, sobre un único subconjunto de la estructura proteica total. Por ejemplo, si la superposición de proteínas se realiza usando una proteína que tiene muchos más restos aminoacídicos que otra proteína, la superposición de proteínas se puede llevar a cabo en el subconjunto (por ejemplo, un dominio) de la proteína más larga que adopta una estructura similar a la de la proteína más pequeña. De manera similar, sólo porciones de otras proteínas pueden ser apropiadas para la superposición. Por ejemplo, si la posición de los restos C-terminales de dos proteínas estructuralmente homólogas difiere significativamente, se pueden omitir los restos C-terminales de la superposición estructural o de los cálculos de desviación RMS.

Preferentemente consiguiente, en este documento se ofrecen métodos de desarrollo racional de proteínas basados en la identificación de sitios diana potenciales para la mutagénesis (is-HIT) a través de la comparación de patrones de plegamiento del esqueleto proteico entre proteínas estructuralmente relacionadas, independientemente de las secuencias subyacentes de las proteínas comparadas. Una vez que se han identificado las posiciones aminoacídicas estructuralmente relacionados en la nueva proteína, se pueden emplear los criterios adecuados de sustitución de aminoácidos, tal como el análisis PAM, para identificar los LEAD candidatos para la construcción y la exploración, según se describen en este documento.

Por ejemplo, se usó el análisis de "homología estructural" entre una serie de citocinas relacionadas en diversos miembros de la familia de las citocinas distintos del interferón alfa, de aquellas posiciones y restos aminoacídicos que son estructuralmente similares o están estructuralmente relacionados con los encontrados en los mutantes de IFN\alpha-2b descritos en este documento, y cuya estabilidad ha sido optimizada. Se proporcionan las citocinas modificadas resultantes. Este método se puede aplicar a cualquier fenotipo usando cualquier proteína, por ejemplo una citocina, como material de partida sobre el que se aplica un procedimiento de desarrollo tal como el procedimiento de desarrollo dirigido racional de la solicitud de Estados Unidos de Nº Serie 10/022.249 o el método de exploración bidimensional que se describe en este documento. Seguidamente, se alteran los restos estructuralmente correspondientes en miembros de la familia, para producir citocinas adicionales con alteraciones fenotípicas similares.

1) Homología

De manera típica, la homología entre proteínas se compara a nivel de sus secuencias de aminoácidos en base al porcentaje o nivel de coincidencia de aminoácidos individuales, aminoácido por aminoácido, cuando las secuencias se alinean a partir de una referencia, generalmente el resto codificado por el codón de inicio. Por ejemplo, se afirma que dos proteínas son "homólogas" o que portan un cierto grado de homología cuando sus respectivas secuencias de aminoácidos muestran un determinado grado de coincidencia en la comparación del alineamiento. La biología molecular comparativa se basa principalmente en esta forma de abordaje. A partir del grado de homología o coincidencia entre secuencias de aminoácidos, se pueden extraer conclusiones acerca de la distancia evolutiva entre dos o más secuencias de proteínas y sistemas biológicos.

El concepto de "evolución convergente" se aplica para describir los fenómenos por los que organismos o sistemas biológicos filogenéticamente no relacionados han evolucionado hasta compartir características relacionadas en su anatomía, fisiología y estructura como respuesta a fuerzas, limitaciones y demandas evolutivas comunes procedentes del entorno y de los organismos vivos que los rodean. De forma alternativa, se aplica la expresión "evolución divergente" para describir los fenómenos por los que organismos o sistemas biológicos filogenéticamente muy relacionados entre sí han evolucionado para divergir de la identidad o la similitud, en respuesta a fuerzas, limitaciones y demandas evolutivas divergentes procedentes del entorno y de los organismos vivos que los rodean.

En el análisis tradicional típico de proteínas homólogas existen dos sesgos conceptuales correspondientes a: i) "evolución convergente", y ii) "evolución divergente". Cuando las secuencias de aminoácidos alineadas de dos proteínas no coinciden bien entre sí, estas proteínas se consideran "no relacionadas" o "menos relacionadas" entre sí, y que tienen diferentes orígenes filogenéticos. Existe una homología nula (o baja) entre estas proteínas y sus correspondientes genes no son homólogos (o presentan escasa homología). Si estas dos proteínas "no homólogas" en estudio comparten alguna característica funcional común (por ejemplo, interacción con otras moléculas específicas, actividad), se establece que han surgido por "evolución convergente", es decir, por el desarrollo de sus secuencias de aminoácidos no homólogas de tal forma que terminan generando estructuras funcionalmente "relacionadas".

Por otra parte, cuando las secuencias de aminoácidos de dos proteínas coinciden entre sí en un cierto grado, se considera que estas proteínas están "relacionadas" y que comparten un origen filogenético común. Se asigna un determinado grado de homología entre estas dos proteínas y sus correspondientes genes comparten, del mismo modo, un determinado grado de homología. Durante el desarrollo de su secuencia de aminoácidos inicial, altamente homóloga, pueden acumularse cambios suficientes de manera que terminen generando secuencias "menos relacionadas" y una función menos relacionada. Se afirma, entonces, que la divergencia con respecto a la coincidencia perfecta entre estas dos proteínas "homólogas" estudiadas proviene de la "evolución divergente".

2) Métodos de Exploración Tridimensional (Homología Estructural)

El concepto de homología estructural se refiere a la homología entre la topología y la estructura tridimensional de dos proteínas. La homología estructural no está necesariamente relacionada con la "evolución convergente" o la "evolución divergente", ni lo está tampoco con la secuencia de aminoácidos subyacente. Más bien, la homología estructural está probablemente dirigida (por la evolución natural) por la necesidad de una proteína de adaptarse a demandas conformacionales específicas impuestas por su entorno. Así, no estaría permitido que dos "puntos" o "loci" estructuralmente homólogos particulares divergieran estructuralmente de la estructura original, aun cuando diverjan sus propias secuencias subyacentes. Esta homología estructural se utiliza en este documento para identificar loci para mutaciones.

Dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína residen las señales bioquímicas y estructurales apropiadas para alcanzar un plegamiento específico de manera independiente o asistida. De hecho, este plegamiento espacial específico determina en último término los rasgos y la actividad de la proteína. Las proteínas interaccionan con otras proteínas y moléculas en general a través de sus topologías específicas y sus conformaciones espaciales. En principio, estas interacciones no se basan solamente en la secuencia precisa de aminoácidos subyacente a la topología o conformación en cuestión. Si los rasgos, la actividad (comportamiento y fenotipos) e interacciones descansan en la topología y la conformación de la proteína, entonces cabe esperar que las fuerzas evolutivas y las limitaciones que actúan sobre las proteínas actúen sobre la topología y la conformación. Proteínas que comparten funciones similares compartirán características comparables en su topología y conformación, a pesar de las secuencias subyacentes de aminoácidos que crean dichas topología y conformaciones.

3) Aplicación de la Exploración 3D a Citocinas

El método basado en homología estructural, incluido el método de exploración 3D que se ofrece en este documento, se puede aplicar a cualquier proteína relacionada. A modo de ejemplo, se aplica en este caso a citocinas. En ejemplos de formas de realización, se proponen métodos para alterar fenotipos de miembros de familias de citocinas mediante la alteración de un miembro, como cuando se emplea el método de exploración bidimensional racional. Como se señala en este documento, se pueden modificar de manera similar entonces otros miembros de estas familias de citocinas mediante la identificación y el cambio de restos estructuralmente homólogos para modificar de igual forma los fenotipos de tales proteínas.

En un ejemplo de forma de realización, se generan mutantes de IFN\alpha-2b con una resistencia aumentada a la proteolisis por el método de exploración bidimensional racional; también se generaron mutantes de IFN\beta. Se identificaron los restos correspondientes en miembros de las familias de citocinas que poseen homología estructural con IFN\alpha-2b, y se modificaron de manera similar los restos identificados en las otras citocinas para producir citocinas con una resistencia incrementada a la proteolisis. Por lo tanto, en este documento se proporcionan también mutantes de citocinas que exhiben una mayor resistencia a la proteolisis y/o a la filtración glomerular, que contienen una o más sustituciones de aminoácidos.

En este documento se proporcionan citocinas mutantes (modificadas) que muestran características y propiedades alteradas, tales como resistencia a la proteolisis. También se ofrecen métodos para la producción de estas citocinas modificadas.

En este documento se ofrece igualmente un método de análisis de homología estructural para comparar proteínas, independientemente de sus secuencias de aminoácidos subyacentes. Esta información se utiliza de manera racional en este documento para un subconjunto de familias de proteínas, como la familia de las citocinas humanas. Todas las citocinas humanas comparten un plegamiento helicoidal que se usa para definir estructuralmente la superfamilia de citocinas 4-helicoidales en la clasificación estructural de la base de datos de proteínas SCOP® (Clasificación Estructural de Proteínas; véanse, por ejemplo, Murzin et al., J. Mol. Biol., 247:536-540, 1995, y http://scop-mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/). Esta superfamilia incluye tres familias diferentes: 1) la familia de interferones/interleucina-10 (SEC ID Nos. 1 y 182-200); 2) la familia de citocinas de cadena larga (SEC ID Nos. 210-217); y 3) la familia de citocinas de cadena corta (SEC ID Nos.201-209).

Por ejemplo, una característica distintiva de las citocinas de la familia de los interferones/interleucina-10 es una (quinta) hélice adicional. Esta familia incluye interleucina-10 (IL-10, SEC ID Nº: 200; interferón beta (IFN\beta; SEC ID Nº: 196), interferón alfa-2a (IFN\alpha-2a; SEC ID Nº: 182), interferón alfa-2b (IFN\alpha-2b; SEC ID Nº: 1), e interferón gamma (IFN-\gamma; SEC ID Nº: 199). La familia de proteínas citocinas de cadena larga incluye, entre otros, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF; SEC ID Nº: 210), el factor inhibidor de leucemia (LIF; SEC ID Nº: 213), la hormona de crecimiento (hGH; SEC ID Nº: 216), el factor neurotrófico ciliar (CNTF; SEC ID Nº: 212), leptina (SEC ID Nº: 211), oncostatina M (SEC ID Nº: 214), interleucina-6 (IL-6; SEC ID Nº: 217) e interleucina-12 (IL-12; SEC ID Nº: 215). La familia de proteínas citocinas de cadena corta incluye, entre otros, eritropoyetina (EPO; SEC ID Nº: 201), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF; SEC ID Nº: 202), interleucina-2 (IL-2; SEC ID Nº: 204), interleucina-3 (IL-3; SEC ID Nº: 205), interleucina-4 (IL-4; SEC ID Nº: 207), interleucina-5 (IL-5; SEC ID Nº: 208), interleucina-13 (IL-13; SEC ID Nº: 209), ligando Flt3 (SEC ID Nº: 203), y el factor de células madre (SCF; SEC ID Nº: 206).

Aunque el grado de similitud entre las secuencias de aminoácidos subyacentes de estas citocinas no parece ser alto, sus correspondientes estructuras tridimensionales presentan un elevado nivel de similitud (véanse, por ejemplo, Figs. 8B hasta D). En efecto, la mejor similitud estructural se obtiene entre las dos estructuras tridimensionales de proteína de la misma familia en la superfamilia de citocinas 4-helicoidales.

Los métodos propuestos en este documento para producir citocinas mutantes se ejemplifican con referencia a la producción de citocinas que muestran un incremento sustancialmente equivalente en la resistencia a la proteolisis en relación con los mutantes optimizados de IFN\alpha-2b. Se entiende que este método se puede aplicar a otras familias de proteínas y para otros fenotipos.

En una forma de realización, se ofrecen en este documento proteínas de la superfamilia de las citocinas 4-helicoidales que son mutantes LEAD de IFN\alpha-2b estructuralmente homólogos propuestos en este documento. Por ejemplo, gracias al conocimiento de las posiciones tridimensionales de aminoácidos estructurales dentro de los mutantes LEAD de IFN\alpha-2b que proporcionan una resistencia superior ante un desafío de proteasas, lisado de sangre o suero, a la vez que conservan o mejoran la actividad biológica requerida, se identifican los restos aminoacídicos correspondientes que están relacionados estructuralmente (por ejemplo, que son estructuralmente similares) en una variedad de otras citocinas (Fig. 9).

En la técnica, se conocen numerosos métodos para identificar posiciones aminoacídicas estructuralmente relacionadas con proteínas estructuralmente homólogas de tipo tridimensional. Ejemplos de estos métodos incluyen, sin limitaciones: CATH (superfamilia Clase, Arquitectura, Topología y Homóloga) que es una clasificación jerárquica de estructuras de dominio de proteínas basada en cuatro niveles diferentes (Orengo et al., Structure, 5(8):1093-1108, 1997); CE (Extensión Combinatoria de la vía óptima), que es un método que calcula los alineamientos estructurales por pares (Shindyalov et al., Protein Engineering, 11(9):739-747, 1998); FSSP (clasificación de plegamiento basada en el alineamiento Estructura-Estructura de Proteínas), que es una base de datos fundada sobre la comparación completa de todas las estructuras tridimensionales de proteínas actualmente existentes en el Banco de Datos de Proteínas (Holm et al., Science, 273:595-602, 1996); SCOP (Clasificación Estructural de Proteínas), que proporciona una base de datos descriptiva de las relaciones estructurales y evolutivas entre todas las proteínas de estructura conocida (Murzin et al., J. Mol. Biol. 247:536-540, 1995), y VAST (Instrumento de Búsqueda de Alineamiento de Vectores), que compara las coordenadas recientemente determinadas de las estructuras de proteínas tridimensionales con las encontradas en la base de datos MMDB/PDB (Gibrat et al., Current Opinion in Structural Biology, 6:377-385, 1995).

En una forma de realización particular, se utiliza el proceso paso a paso, incluido el uso de un programa denominado TOP (véanse la Fig. 8A y Lu, G., J. Appl. Cryst., 33:176-189, 2000; publicidad disponible en www.bioinfo1.mbfys.
lu.se/TOP) para la comparación de la estructura proteica. Este programa lleva a cabo dos etapas para cada comparación de estructura de la proteína. En la primera etapa, se compara la topología de la estructura secundaria en las dos estructuras. El programa usa dos puntos para representar cada elemento de la estructura secundaria (hélices alfa o cadenas beta) y, seguidamente, busca de forma sistemática todas las superposiciones posibles de estos elementos en el espacio tridimensional (definido como la desviación cuadrática media - rmsd, el ángulo entre las dos líneas formadas por los dos puntos y la distancia entre ambas líneas). El programa intenta determinar si es posible ajustar elementos estructurales secundarios adicionales por la misma operación de superposición. Si las estructuras secundarias ajustables superan un número determinado, el programa identifica que dos estructuras son similares. El programa da como resultado una puntuación de comparación denominada "Diversidad Estructural" que considera la distancia entre átomos carbono-\alpha coincidentes y el número de restos coincidentes. Cuanto más baja sea la puntuación de "Diversidad Estructural", más similares son las dos estructuras. En varias formas de realización de este documento las puntuaciones de Diversidad Estructural se encuentran dentro de un intervalo entre 0 hasta aproximadamente 67.

En la forma de realización que se presenta como ejemplo, se alinearon estructuralmente, en primer lugar, todas las citocinas frente a la estructura de IFN\alpha-2b. Para las proteínas pertenecientes a la misma familia que IFN\alpha-2b (por ejemplo, la familia de citocinas interferones/interleucina-10), este alineamiento se usó directamente para identificar las posiciones aminoacídicas diana, is-HIT, estructuralmente relacionadas y/o las regiones correspondientes a las posiciones y/o regiones estructuralmente homólogas en IFN\alpha-2b en las que encontraron mutantes LEAD (Fig. 8B). Para las otras citocinas, se seleccionó como representativa de esa familia la proteína de la familia (de citocinas de cadena larga o corta) que mostró el mejor alineamiento tridimensional con IFN\alpha-2b usando la puntuación de "Diversidad Estructural". De la familia de citocinas de cadena corta, se identificó eritropoyetina (EPO; véase la Fig. 8C) como el mejor homólogo estructural de IFN\alpha-2b (rmsd = 1 m 7 angstroms; número de restos alineados = 77; Diversidad Estructural = 7,8).

A continuación, en estas dos proteínas se identificaron las posiciones y/o regiones de aminoácidos correspondientes a las regiones mutantes LEAD en IFN\alpha-2b. Estos dos mejores homólogos estructurales de IFN\alpha-2b (por ejemplo, EPO y G-SCF; véanse las Figs. 12L y 12E, respectivamente) se alinearon con cada una de las otras citocinas dentro de sus respectivas familias de proteínas citocinas. Como resultado, se identificaron en todas las citocinas las regiones que tuvieron probabilidades de ser dianas para la resistencia a proteasas séricas (véanse las Figs. 12A hasta T). Seguidamente, se comprobó en los aminoácidos de estas regiones diana su exposición al disolvente y su susceptibilidad a ser sustratos de proteasas. Restos expuestos y de sustrato se sometieron, entonces, a un análisis PAM250 como se ha descrito anteriormente, de manera que se seleccionó un grupo de restos aminoacídicos no sustrato y funcionalmente conservadores como sustituciones. Los resultados del citado análisis de homología estructural para cada una de las citocinas propuestas en este documento se presentan en las Figs. 12A hasta T.

Por lo tanto, se ofrecen en este documento citocinas modificadas que exhiben una resistencia mayor a la proteolisis en comparación con las proteínas citocinas no modificadas, que comprenden una o múltiples sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones diana en la citocina correspondiente a una posición aminoacídica modificada, estructuralmente relacionada, dentro de la estructura tridimensional de una proteína IFN\alpha-2b que se proporciona en este documento. La resistencia a la proteolisis se puede medir mezclándolo in vitro con una proteasa, y sometiéndolo a incubación con sangre o con suero. También se ofrecen en este documento homólogos estructurales de citocinas de una proteína IFN\alpha-2b modificada, que se ofrece en esta memoria, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en el homólogo estructural de la citocina en posiciones correspondientes a las posiciones modificadas tridimensionales, estructuralmente similares, dentro de la estructura tridimensional del IFN\alpha-2b modificado. En una forma de realización, el homólogo de la citocina muestra una resistencia aumentada a la proteolisis, comparada con la citocina equivalente no modificada y/o natural, en donde la resistencia a la proteolisis se mide por la mezcla con una proteasa in vitro, la incubación con sangre o la incubación con suero.

a) Mutantes de Interferón Estructuralmente Homólogos

También se proporcionan en este documento citocinas modificadas u homólogos estructurales de citocinas de IFN\alpha-2b que son citocinas IFN\alpha. Estas citocinas IFN\alpha pueden seleccionarse del grupo que consiste en IFN\alpha-2a, IFN\alpha-c, IFN\alpha-2c, IFN\alpha-d, IFN\alpha-5, IFN\alpha-6, IFN\alpha-4, IFN\alpha-4b, IFN\alpha-I, IFN\alpha-J, IFN\alpha-H, IFN\alpha-F, IFN\alpha-8 y citocina IFN\alpha-consenso. Por consiguiente, las citocinas IFN\alpha modificadas proporcionadas en este documento comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones diana en IFN\alpha-2a, IFN\alpha-c, IFN\alpha-2c, IFN\alpha-d, IFN\alpha-5, IFN\alpha-6, IFN\alpha-4, IFN\alpha-4b, IFN\alpha-I, IFN\alpha-J, IFN\alpha-H, IFN\alpha-F, IFN\alpha-8 o citocina IFN\alpha-consenso correspondientes a una posición aminoacídica modificada estructuralmente relacionada dentro de la estructura tridimensional de las proteínas modificadas IFN\alpha-2b proporcionadas en este documento, en las que las sustituciones conducen a una mayor resistencia a proteasas, según se evaluó por incubación con una proteasa o con un lisado de sangre o por incubación con suero, en comparación con el IFN alfa-2a no modificado.

En realizaciones particulares, las citocinas IFN\alpha modificadas se seleccionan del grupo que consiste en:

: el IFN\alpha-2a modificado que es humano y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 182, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 58,78, 107,117, 125,133 y 159;

: el IFN\alpha-c modificado que es humano y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido de la SEC ID Nº: 183, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 59,79, 108,118, 126, 134 y 160;

: la citocina IFN\alpha-2c modificada que es humana y se selecciona del grupo que consiste en citocinas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 185, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 58, 78, 107, 117, 125, 133 y 159;

: la proteína modificada IFN\alpha-d que es humana y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 186, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 y 160;

: la proteína modificada IFN\alpha-5 que es humana y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 187, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 y 160;

: la proteína modificada IFN\alpha-6 que es humana y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 188, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 y 160;

: la proteína modificada IFN\alpha-4 que es humana y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 189, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 y 160;

: la proteína modificada IFN\alpha-4b que es humana y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 190, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 y 160;

: la proteína modificada IFN\alpha-I que es humana y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 191, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 y 160;

: la proteína modificada IFN\alpha-J que es humana y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 192, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 y 160;

: la proteína modificada IFN\alpha-H que es humana y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 193, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 y 160;

: la proteína modificada IFN\alpha-F que es humana y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 194, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 y 160;

: la proteína modificada IFN\alpha-8 que es humana y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 195, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 y 160; y

: la proteína modificada IFN\alpha-consenso que es humana y se selecciona del grupo que consiste en proteínas que comprenden una o más sustituciones de un solo aminoácido en la SEC ID Nº: 232, correspondientes a las posiciones aminoacídicas: 41, 58, 78, 107, 117, 125, 133 y 159.

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b) Mutantes de Citocina Estructuralmente Homólogos

Como se ha expuesto anteriormente, se proporcionan en este documento citocinas modificadas que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones diana en interleucina-10 (IL-10), interferón beta (IFN\beta), IFN\beta-1, IFN\beta-2a, interferón gamma (IFN-\gamma), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y eritropoyetina humana (EPO); correspondientes a una posición aminoacídica modificada estructuralmente relacionada dentro de la estructura tridimensional de las proteínas modificadas IFN\alpha-2b proporcionadas en este documento, en las que las sustituciones conducen a mayor resistencia a proteasas, según se evaluó por incubación con una proteasa o con un lisado de sangre o por incubación con suero, en comparación con la citocina no modificada.

También se proporcionan en este documento citocinas modificadas que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones diana en factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-13 (IL-13), ligando Flt3 y factor de células madre (CSF); correspondientes a una posición aminoacídica modificada estructuralmente relacionada dentro de la estructura tridimensional de las proteínas modificadas con EPO humanas proporcionadas en este documento, en las que las sustituciones conducen a una mayor resistencia a proteasas, según se evaluó por incubación con una proteasa o con un lisado de sangre o por incubación con suero en comparación con la citocina no modificada.

También se proporcionan en este documento citocinas modificadas que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones diana en interleucina-10 (IL-10), interferón beta (IFN\beta), interferón gamma (IFN-\gamma), factor estimulante de colonias de granulocitos humano (G-CSF), factor inhibidor de leucemia (LIF), hormona del crecimiento humana (hGH), factor neurotrófico ciliar (CNTF), leptina, oncostatina M, interleucina 6 (IL-6) e interleucina 12 (IL-12); correspondiente a una posición aminoacídica modificada estructuralmente relacionada dentro de la estructura tridimensional de las proteínas modificadas G-CSF humanas proporcionadas en este documento, en las que las sustituciones conducen a una mayor resistencia a proteasas, según se evaluó por incubación con una proteasa o con un lisado de sangre o por incubación con suero, en comparación con la citocina no modifi-
cada.

En realizaciones particulares, las citocinas modificadas se seleccionan de las siguientes.

Una citocina IFN\beta modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de IFN\beta correspondientes a la SEC ID Nº: 196: 39, 42, 45, 47, 52, 67, 71, 73, 81, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 116, 120, 123, 124, 128, 130, 134, 136, 137, 163 y 165, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 196 expuesta en la Fig. 12A correspondiente a las SEC ID Nº: 233-289, en la que el primer aminoácido indicado se sustituye por el segundo en la posición indicada para todas las sustituciones expuestas en las Fig. 12A a T.

Una citocina IFN\beta-1 modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos del IFN\beta-1 correspondiente a las SEC ID Nº: 197: 39, 42, 45, 47, 52, 67, 71, 73, 81, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 116, 120, 123, 124, 128, 130, 134, 136, 137, 163 y 165, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos.

Una citocina IFN\beta-2a modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos del IFN\beta-2a correspondiente a las SEC ID Nº: 198: 39, 42, 45, 47, 52, 67, 71, 73, 81, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 116, 120, 123, 124, 128, 130, 134, 136, 137, 163 y 165, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos.

Una citocina IFN-gamma modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos del IFN-gamma correspondiente a las SEC ID Nº: 199: 33, 37, 40, 41, 42, 58, 61, 64, 65 y 66, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 199, expuesta en la Fig. 12B correspondiente a las SEC ID Nº: 290-311.

Una citocina IL-10 modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de IL-10 correspondiente a las SEC ID Nº: 200: 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 67, 68, 71, 72, 74, 75, 78, 81, 84, 85, 86 y 88, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 200 expuesta en la Fig. 12C correspondiente a las SEC ID Nº: 312-361.

Una citocina de eritropoyetina modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de eritropoyetina correspondiente a las SEC ID Nº: 201: 43, 45, 48, 49, 52, 53, 55, 72, 75, 76, 123, 129, 130, 131, 162 y 165, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 201 expuesta en la Fig. 12L correspondiente a las SEC ID Nº: 940-977.

Una citocina GM-CSF modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de GM-CSF correspondiente a las SEC ID Nº: 202: 38, 41, 45, 46, 48, 49, 51, 60, 63, 67, 92, 93, 119, 120, 123 y 124, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 202 expuesta en la Fig. 12N correspondiente a las SEC ID Nº: 362-400.

Una citocina ligando Flt3 modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos del ligando Flt3 correspondiente a las SEC ID Nº: 203: 3, 40, 42, 43, 55, 58, 59, 61, 89, 90, 91, 95 y 96, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 203 expuesta en la Fig. 12M correspondiente a las SEC ID Nº: 401-428.

Una citocina IL-2 modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de IL-2 correspondiente a las SEC ID Nº: 204: 43, 45, 48, 49, 52, 53, 60, 61, 65, 67, 68, 72, 100, 103, 104, 106, 107, 109, 110 y 132, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 204 expuestas en la Fig. 12P y las SEC ID Nº: 429-476.

Una citocina IL-3 modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de IL-3 correspondiente a las SEC ID Nº: 205: 37, 43, 46, 59, 63, 66, 96, 100, 101 y 103, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 205 expuesta en la Fig. 12Q correspondiente a las SEC ID Nº: 477-498.

Una citocina SCF modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de SCF correspondiente a las SEC ID Nº: 206: 27, 31, 34, 37, 54, 58, 61, 62, 63, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 106, 107, 108, 109, 134 y 137, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 206 expuesta en la Fig. 12T correspondiente a las SEC ID Nº: 499-542.

Una citocina IL-4 modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de IL-4 correspondiente a las SEC ID Nº: 207: 26, 37, 53, 60, 61, 64, 66, 100, 102, 103 y 126, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 207 expuesta en la Fig. 12R correspondiente a las SEC ID Nº: 543-567.

Una citocina IL-5 modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de IL-5 correspondiente a las SEC ID Nº: 208: 32, 34, 39, 46, 47, 56, 84, 85, 88, 89, 90, 102, 110 y 111, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 208 expuesta en la Fig. 12S correspondiente a las SEC ID Nº: 568-602.

Una citocina IL-13 modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de IL-13 correspondiente a las SEC ID Nº: 209: 32, 34, 38, 48, 79, 82, 85, 86, 88, 107, 108, 110 y 111, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 209 expuesta en la Fig. 12O correspondiente a las SEC ID Nº: 603-630.

Una citocina G-CSF modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de G-CSF correspondiente a las SEC ID Nº: 210: 61, 63, 68, 72, 86, 96, 100, 101, 131, 133, 135, 147, 169, 172 y 177, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 210 expuesta en la Fig. 12E correspondiente a las SEC ID Nº: 631-662.

Una citocina leptina modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de leptina correspondiente a las SEC ID Nº: 211: 43, 49, 99, 100, 104, 105, 107, 108, 141 y 142, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 211 expuesta en la Fig. 12I correspondiente a las SEC ID Nº: 663-683.

Una citocina CNTF modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de CNTF correspondiente a las SEC ID Nº: 212: 62, 64, 66, 67, 86, 89, 92, 100, 102, 104, 131, 132, 133, 135, 136, 138, 140, 143, 148 y 151, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 212 expuesta en la Fig. 12D correspondiente a las SEC ID Nº: 684-728.

Una citocina LIF modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de LIF correspondiente a las SEC ID Nº: 213: 69, 70, 85, 99, 102, 104, 106, 109, 137, 146, 148, 149, 153, 154 y 156, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 213 expuesta en la Fig. 12J correspondiente a las SEC ID Nº: 729-760.

Una citocina oncostatina M modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de oncostatina M correspondiente a las SEC ID Nº: 214: 59, 60, 63, 65, 84, 87, 89, 91, 94, 97, 99, 100, 103 y 106, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 214 expuesta en la Fig. 12K correspondiente a las SEC ID Nº: 761-793.

Una citocina IL-12 modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de IL-12 correspondiente a las SEC ID Nº: 215: 56, 61, 66, 67, 68, 70, 72, 75, 78, 79, 82, 89, 92, 93, 107, 110, 111, 115, 117, 124, 125, 127, 128, 129 y 189, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 215 expuesta en la Fig. 12G correspondiente a las SEC ID Nº: 794-849.

Una citocina hGH modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de hgH correspondiente a las SEC ID Nº: 216: 56, 59, 64, 65, 66, 88, 92, 94, 101, 129, 130, 133, 134, 140, 143, 145, 146, 147, 183 y 186, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 216 expuesta en la Fig. 12F correspondiente a las SEC ID Nº: 850-895.

Una citocina IL-6 modificada que comprende mutaciones en uno o más restos aminoacídicos de IL-6 correspondiente a las SEC ID Nº: 217: 64, 65, 66, 68, 69, 75, 77, 92, 98, 103, 105, 108, 133, 138, 139, 140, 149, 156, 178 y 181, en la que las mutaciones comprenden inserciones, deleciones o sustituciones del resto o restos aminoacídicos nativos. En realizaciones particulares, las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en sustituciones de aminoácidos en la SEC ID Nº: 217 expuesta en la Fig. 12H correspondiente a las SEC ID Nº: 896-939.

En ciertas realizaciones, las citocinas modificadas proporcionadas en este documento poseen una estabilidad aumentada en comparación con la citocina no modificada, donde la estabilidad se evalúa por medición de la actividad biológica residual para inhibir la replicación viral o estimular la proliferación celular en células apropiadas después de la incubación con mezclas de proteasas, proteasas individuales, lisado de sangre o suero.

En otras realizaciones, las citocinas modificadas proporcionadas en este documento poseen una estabilidad disminuida en comparación con la citocina no modificada, donde la estabilidad se evalúa por medición de la actividad biológica residual para inhibir la replicación viral en las células apropiadas o estimular la proliferación celular de las células apropiadas, después de la incubación con mezclas de proteasas, proteasas individuales, lisado de sangre o suero.

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H. Desarrollo racional de IFN\beta para una resistencia aumentada a proteolisis y/o mayor estabilidad conformacional

El tratamiento con interferón b (IFN\beta) es una terapia bien establecida. Típicamente, se usa para el tratamiento de la esclerosis múltiple (MS). Los pacientes que reciben interferón \beta se someten a aplicaciones repetidas frecuencias del fármaco. La inestabilidad del IFN\beta en el torrente sanguíneo y en las condiciones de almacenamiento es bien conocida. Por lo tanto sería útil aumentar la estabilidad (semivida) del IFN\beta en suero y también in vitro lo mejoraría como fármaco.

El método de exploración 2D y el método de exploración 3D (usando homología estructural) proporcionado en este documento (véase el documento en trámite junto con el presente) se aplicaron cada uno al interferón \beta. En este documento se proporcionan variantes mutantes de la proteína IFN\beta que presentan una estabilidad mejorada según se evaluó por resistencia a proteasas (poseyendo por la tanto una semivida proteica aumentada) y una actividad biológica al menos comparable según se evaluó por la actividad antiviral o antiproliferación en comparación con la proteína IFN\beta nativa tipo silvestre y no modificada (SEC ID Nº: 196). Las proteínas mutantes de IFN\beta proporcionadas en este documento confieren una mayor semivida y una actividad biológica al menos comparable con respecto a la secuencia nativa. Por lo tanto, los mutantes de proteína IFN\beta optimizados proporcionados en este documento que poseen una resistencia aumentada a la proteolisis dan como resultado una disminución en la frecuencia de inyecciones necesarias para mantener un nivel de fármaco suficiente en suero, conduciendo por lo tanto a, por ejemplo: i) mayor comodidad y aceptación por los pacientes, ii) menores dosis necesarias para conseguir efectos biológicos comparables y iii) como consecuencia de (ii), probable atenuación de cualquier efecto secundario.

En realizaciones particulares, la semivida de los mutantes de IFN\beta proporcionados en este documento se aumenta en una cantidad seleccionada de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 100%, al menos el 150%, al menos el 200%, al menos el 250%, al menos el 300%, al menos el 350%, al menos el 400%, al menos el 450%, al menos el 500% o más, en comparación con la semivida del IFN\beta humano nativo en sangre humana, suero humano o en una mezcla in vitro que contiene una o más proteasas. En otras realizaciones, la semivida de los mutantes de IFN\beta proporcionados en este documento se aumenta en una cantidad seleccionada de al menos 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces o más, en comparación con la semivida del IFN\beta humano nativo en sangre humana, suero humano o una mezcla in vitro que contiene una o más proteasas.

Se usaron dos estrategias en este documento para aumentar la estabilidad del IFN\beta por sustitución de aminoácidos: i) Resistencia a proteasas: sustitución de aminoácidos que conduce a una mayor resistencia a proteasas por destrucción directa del resto o secuencia diana de proteasas, al tiempo que se mantiene o mejora la actividad biológica necesaria (por ejemplo, actividad antiviral y antiproliferación), y/o ii) Estabilidad conformacional: sustitución de aminoácidos que conduce a un aumento en la estabilidad conformacional (es decir, semivida a temperatura ambiente o a 37ºC), al tiempo que se mejora o mantiene la actividad biológica necesaria (por ejemplo, actividad antiviral y antiprolifera-
ción).

Se usaron dos metodologías para abordar las mejoras descritas anteriormente: (a) se usaron métodos de exploración 2D para identificar cambios de aminoácidos que conducen a mejora en la resistencia a proteasas y a una mejora en la estabilidad conformacional y (b) también se usó exploración 3D, que emplea métodos de homología estructural, para identificar cambios de aminoácidos que conducen a un aumento en la resistencia a proteasas. Los métodos de exploración 2D y exploración 3D se usaron cada uno para identificar los cambios de aminoácidos en IFN\beta que conducen a un aumento en la estabilidad cuando se expone a proteasas, lisado de sangre humana o suero humano. El aumento en la estabilidad de la proteína a proteasas, lisado de sangre humana o suero humano se contempla en este documento para proporcionar una mayor semivida in vivo para las moléculas proteicas particulares y, por lo tanto, una reducción en la frecuencia de las inyecciones necesarias en pacientes. Las actividades biológicas que se han medido para las moléculas de IFN\beta son i) su capacidad para inhibir la replicación de virus cuando se añaden a células permisivas previamente infectadas con el virus apropiado y ii) su capacidad para estimular la proliferación celular cuando se añaden a las células apropiadas. Antes de la medición de la actividad biológica, las moléculas de IFN\beta se expusieron a proteasas, lisados de sangre humana o suero humano durante tiempos de incubación diferentes. La actividad biológica medida se corresponde entonces con la actividad biológica residual después de la exposición a mezclas
proteolíticas.

Como se ha expuesto anteriormente, en este documento se proporcionan métodos para la generación de moléculas de IFN\beta (o cualquier proteína diana, particularmente citocinas) que, al tiempo que mantienen una actividad biológica necesaria sin un cambio sustancial (suficiente para su aplicación o aplicaciones terapéuticas) se han vuelto menos susceptibles a la digestión por proteasas sanguíneas y, por lo tanto, presentan una mayor semivida en la circulación sanguínea. En este ejemplo particular, el método usado incluía las siguientes etapas específicas, como se ejemplifica en los Ejemplos:

Para la mejora de la resistencia a proteasas por exploración 2D, el método incluía:

1): Identificar algunos o todos los sitios diana posibles en la secuencia proteica que son susceptibles a la digestión por una o más proteasas específicas (estos sitios son los is-HIT); y

2): Identificar aminoácidos de sustitución apropiados específicos para cada is-HIT, de modo que si se usan para sustituir uno o más de los aminoácidos originales en ese is-HIT específico puede esperarse que aumenten la resistencia del is-HIT a la digestión por proteasas mientras que, al mismo tiempo, mantienen la actividad biológica de la proteína no modificada (estos aminoácidos de sustitución son los LEAD candidatos).

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Para la mejora de la resistencia a proteasas por exploración 3D (homología estructural):

1): Identificar algunos o todos los sitios diana posibles (is-HIT) en la secuencia proteica que presenten un grado aceptable de homología estructural alrededor de las posiciones aminoacídicas mutadas en las moléculas LEAD previamente obtenidas para IFN\alpha usando exploración 2D y que sean susceptibles a la digestión por una o más proteasas específicas; y

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2): Identificar aminoácidos de sustitución apropiados específicos para cada is-HIT, de modo que si se usan para sustituir uno o más de los aminoácidos originales en ese is-HIT específico puede esperarse que aumenten la resistencia del is-HIT a la digestión por proteasas mientras que, al mismo tiempo, mantienen la actividad biológica de la proteína son modificada (estos aminoácidos de sustitución son los LEAD candidatos).

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Para la mejora de la estabilidad conformacional por exploración 2D, como se proporciona en este documento:

1): Identificar algunos o todos los sitios diana posibles en la secuencia proteica que sean susceptibles a estar directamente implicados en la flexibilidad intramolecular y el cambio conformacional (estos sitios son los is-HIT); y

2): Identificar aminoácidos de sustitución apropiados específicos para cada is-HIT, de modo que si se usan para sustituir uno o más de los aminoácidos originales en ese is-HIT específico, puede esperarse que aumenten la estabilidad térmica de la molécula mientras que, al mismo tiempo, mantienen la actividad biológica de la proteína no modificada (estos aminoácidos de sustitución son los LEAD candidatos).

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Véanse las Figuras 6(O)-6(S) y la Figura 8(A).

Usando los métodos de exploración 2D y exploración 3D y la estructura tridimensional del IFN\beta, se identificaron las posiciones diana de aminoácidos siguientes como is-HIT en IFN\beta, cuya numeración es la de la proteína madura (SEC ID Nº: 196):

Por exploración 3D (véanse, las SEC ID Nº: 234-289, 989-1015): D por Q en la posición 39, D por H en la posición 39, D por G en la posición 39, E por Q en la posición 42, E por H en la posición 42, K por Q en la posición 45, K por T en la posición 45, K por S en la posición 45, K por H en la posición 45, L por V en la posición 47, L por I en la posición 47, L por T en la posición 47, L por Q en la posición 47, L por H en la posición 47, L por A en la posición 47, K por Q en la posición 52, K por T en la posición 52, K por S en la posición 52, K por H en la posición 52, F por I en la posición 67, F por V en la posición 67, R por H en la posición 71, R por Q en la posición 71, D por H en la posición 73, D por G en la posición 73, D por Q en la posición 73, E por Q en la posición 81, E por H en la posición 81, E por Q en la posición 107, E por H en la posición 107, K por Q en la posición 108, K por T en la posición 108, K por S en la posición 108, K por H en la posición 108, E por Q en la posición 109, E por H en la posición 109, D por Q en la posición 110, D por H en la posición 110, D por G en la posición 110, F por I en la posición 111, F por V en la posición 111, R por H en la posición 113, R por Q en la posición 113, L por V en la posición 116, L por I en la posición 116, L por T en la posición 116, L por Q en la posición 116, L por H en la posición 116, L por A en la posición 116, L por V en la posición 120, L por I en la posición 120, L por T en la posición 120, L por Q en la posición 120, L por H en la posición 120, L por A en la posición 120, K por Q en la posición 123, K por T en la posición 123, K por S en la posición 123, K por H en la posición 123, R por H en la posición 124, R por Q en la posición 124, R por H en la posición 128, R por Q en la posición 128, L por V en la posición 130, L por I en la posición 130, L por T en la posición 130, L por Q en la posición 130, L por H en la posición 130, L por A en la posición 130, K por Q en la posición 134, K por T en la posición 134, K por S en la posición 134, K por H en la posición 134, K por Q en la posición 136, K por T en la posición 136, K por S en la posición 136, K por H en la posición 136, E por Q en la posición 137, E por H en la posición 137, Y por H en la posición 163, Y por I en la posición 1631, R por H en la posición 165, R por Q en la posición 165.

Por exploración 2D (véanse las SEC ID Nº 1016-1302): M por V en la posición 1, M por I en la posición 1, M por T en la posición 1, M por Q en la posición 1, M por A en la posición 1, L por V en la posición 5, L por I en la posición 5, L por T en la posición 5, L por Q en la posición 5, L por H en la posición 5, L por A en la posición 5, F por I en la posición 8, F por V en la posición 8, L por V en la posición 9, L por I en la posición 9, L por T en la posición 9, L por Q en la posición 9, L por H en la posición 9, L por A en la posición 9, R por H en la posición 11, R por Q en la posición 11, F por I en la posición 15, F por V en la posición 15, K por Q en la posición 19, K por T en la posición 19, K por S en la posición 19, K por H en la posición 19, W por S en la posición 22, W por H en la posición 22, N por H en la posición 25, N por S en la posición 25, N por Q en la posición 25, R por H en la posición 27, R por Q en la posición 27, L por V en la posición 28, L por I en la posición 28, L por T en la posición 28, L por Q en la posición 28, L por H en la posición 28, L por A en la posición 28, E por Q en la posición 29, E por H en la posición 29, Y por H en la posición 30, Y por I en la posición 30, L por V en la posición 32, L por I en la posición 32, L por T en la posición 32, L por Q en la posición 32, L por H en la posición 32, L por A en la posición 32, K por Q en la posición 33, K por T en la posición 33, K por S en la posición 33, K por H en la posición 33, R por H en la posición 35, R por Q en la posición 35, M por V en la posición 36, M por I en la posición 36, M por T en la posición 36, M por Q en la posición 36, M por A en la posición 36, D por Q en la posición 39, D por H en la posición 39, D por G en la posición 39, E por Q en la posición 42, E por H en la posición 42, K por Q en la posición 45, K por T en la posición 45, K por S en la posición 45, K por H en la posición 45, L por V en la posición 47, L por I en la posición 47, L por T en la posición 47, L por, Q en la posición 47, L por H en la posición 47, L por A en la posición 47, K por Q en la posición 52, K por T en la posición 52, K por S en la posición 52, K por H en la posición 52, F por I en la posición 67, F por V en la posición 67, R por H en la posición 71, R por Q en la posición 71, D por Q en la posición 73, D por H en la posición 73, D por G en la posición 73, E por Q en la posición 81, E por H en la posición 81, E por Q en la posición 85, E por H en la posición 85, Y por H en la posición 92, Y por I en la posición 92, K por Q en la posición 99, K por T en la posición 99, K por S en la posición 99, K por H en la posición 99, E por Q en la posición 103, E por H en la posición 103, E por Q en la posición 104, E por H en la posición 104, K por Q en la posición 105, K por T en la posición 105, K por S en la posición 105, K por H en la posición 105, E por Q en la posición 107, E por H en la posición 107, K por Q en la posición 108, K por T en la posición 108, K por S en la posición 108, K por H en la posición 108, E por Q en la posición 109, E por H en la posición 109, D por Q en la posición 110, D por H en la posición 110, D por G en la posición 110, F por I en la posición 111, F por V en la posición 111, R por H en la posición 113, R por Q en la posición 113, L por V en la posición 116, L por I en la posición 116, L por T en la posición 116, L por Q en la posición 116, L por H en la posición 116, L por A en la posición 116, L por V en la posición 120, L por I en la posición 120, L por T en la posición 120, L por Q en la posición 120, L por H en la posición 120, L por A en la posición 120, K por Q en la posición 123, K por T en la posición 123, K por S en la posición 123, K por H en la posición 123, R por H en la posición 124, R por Q en la posición 124, R por H en la posición 128, R por Q en la posición 128, L por V en la posición 130, L por I en la posición 130, L por T en la posición 130, L por Q en la posición 130, L por H en la posición 130, L por A en la posición 130, K por Q en la posición 134, K por T en la posición 134, K por S en la posición 134, K por H en la posición 134, K por Q en la posición 136, K por T en la posición 136, K por S en la posición 136, K por H en la posición 136, E por Q en la posición 137, E por H en la posición 137, Y por H en la posición 138, Y por I en la posición 138, R por H en la posición 152, R por Q en la posición 152, Y por H en la posición 155, Y por I en la posición 155, R por H en la posición 159, R por Q en la posición 159, Y por H en la posición 163, Y por I en la posición 163, R por H en la posición 165, R por Q en la posición 165, M por D en la posición 1, M por E en la posición 1, M por K en la posición 1, M por N en la posición 1, M por R en la posición 1, M por S en la posición 1, L por D en la posición 5, L por E en la posición 5, L por K en la posición 5, L por N en la posición 5, L por R en la posición 5, L por S en la posición 5, L por D en la posición 6, L por E en la posición 6, L por K en la posición 6, L por N en la posición 6, L por R en la posición 6, L por S en la posición 6, L por Q en la posición 6, L por T en la posición 6, F por E en la posición 8, F por K en la posición 8, F por R en la posición 8, F por D en la posición 8, L por D en la posición 9, L por E en la posición 9, L por K en la posición 9, L por N en la posición 9, L por R en la posición 9, L por S en la posición 9, Q por D en la posición 10, Q por E en la posición 10, Q por K en la posición 10, Q por N en la posición 10, Q por R en la posición 10, O por S en la posición 10, Q por T en la posición 10, S por D en la posición 12, S por E en la posición 12, S por K en la posición 12, S por R en la posición 12, S por D en la posición 13, S por E en la posición 13, S por K en la posición 13, S por R en la posición 13, S por N en la posición 13, S por Q en la posición 13, S por T en la posición 13, N por D en la posición 14, N por E en la posición 14, N por K en la posición 14, N por Q en la posición 14, N por R en la posición 14, N por S en la posición 14, N por T en la posición 14, F por D en la posición 15, F por E en la posición 15, F por K en la posición 15, F por R en la posición 15, Q por D en la posición 16, Q por E en la posición 16, Q por K en la posición 16, Q por N en la posición 16, Q por R en la posición 16, Q por S en la posición 16, Q por T en la posición 16, C por D en la posición 17, C por E en la posición 17, C por K en la posición 17, C por N en la posición 17, C por Q en la posición 17, C por R en la posición 17, C por S en la posición 17, C por T en la posición 17, L por N en la posición 20, L por Q en la posición 20, L por R en la posición 20, L por S en la posición 20, L por T en la posición 20, L por D en la posición 20, L por E en la posición 20, L por K en la posición 20, W por D en la posición 22, W por E en la posición 22, W por K en la posición 22, W por R en la posición 22, a por D en la posición 23, Q por E en la posición 23, Q por K en la posición 23, Q por R en la posición 23, L por D en la posición 24, L por E en la posición 24, L por K en la posición 24, L por R en la posición 24, W por D en la posición 79, W por E en la posición 79, W por K en la posición 79, W por R en la posición 79, N por D en la posición 80, N por E en la posición 80, N por K en la posición 80, N por R en la posición 80, T por D en la posición 82, T por E en la posición 82, T por K en la posición 82, T por R en la posición 82,1 por D en la posición 83,1 por E en la posición 83,1 por K en la posición 83,1 por R en la posición 83,1 por N en la posición 83, I por Q en la posición 83,1 por S en la posición 83,1 por T en la posición 83, N por D en la posición 86, N por E en la posición 86, N por K en la posición 86, N por R en la posición 86, N por Q en la posición 86, N por S en la posición 86, N por T en la posición 86, L por D en la posición 87, L por E en la posición 87, L por K en la posición 87, L por R en la posición 87, L por N en la posición B7, L por Q en la posición 87, L por S en la posición 87,L por T en la posición 87, A por D en la posición 89, A por E en la posición 89, A por K en la posición 89, A por R en la posición 89, N por D en la posición 90, N por E en la posición 90, N por K en la posición 90, N por Q en la posición 90, N por R en la posición 90, N por S en la posición 90, N por T en la posición 90, V por D en la posición 91, V por E en la posición 91, V por K en la posición 91, V por N en la posición 91, V por Q en la posición 91, V por R en la posición 91, V por S en la posición 91, V por T en la posición 91, Q por D en la posición 94, Q por E en la posición 94, Q por Q en la posición 94, Q por N en la posición 94, Q por R en la posición 94, Q por S en la posición 94, Q por T en la posición 94,1 por D en la posición 95,1 por E en la posición 95,1 por K en la posición 95,1 por N en la posición 95, i por Q en la posición 95, I por R en la posición 95, I por S en la posición 95, I por T en la posición 95, H por D en la posición 97, H por E en la posición 97, H por K en la posición 97, H por N en la posición 97, H por Q en la posición 97, H por R en la posición 97, H por S en la posición 97, H por T en la posición 97, L por D en la posición 98, L por E en la posición 98, L por K en la posición 98, L por N en la posición 98, L por Q en la posición 98, L por R en la posición 98, L por S en la posición 98, L por T en la posición 98, V por D en la posición 101, V por E en la posición 101, V por K en la posición 101, V por N en la posición 101, V por Q en la posición 101, V por R en la posición 101, V por S en la posición 101, V por T en la posición 101, M por C en la posición 1, L por C en la posición 6, Q por C en la posición 10, S por C en la posición 13, Q por C en la posición 16, L por C en la posición 17, V por C en la posición 101, L por C en la posición 98, H por C en la posición 97, Q por C en la posición 94, V by C en la posición 91, N por C en la posición
90.

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1. Súper-LEAD y Mutagénesis Direccional Aditiva (ADM)

También se proporcionan en este documento proteínas mutantes súper-LEAD que comprenden una combinación de mutaciones de un solo aminoácido presentes en dos o más de las proteínas mutantes LEAD respectivas. Por lo tanto, las proteínas mutantes súper-LEAD tienen dos o más de las mutaciones de un solo aminoácido derivadas de dos o más de las proteínas mutantes LEAD respectivas. Como se describe en este documento, las proteínas mutantes LEAD proporcionadas en este documento se definen como mutantes cuyo comportamiento o aptitud se ha optimizado con respecto a la proteína nativa. Los LEAD contienen típicamente una sola mutación respecto a su proteína nativa respectiva. Esta mutación representa una sustitución de aminoácido apropiada que tiene lugar en una posición is-HIT. Se generan proteínas mutantes súper-LEAD adicionales de modo que lleven en la misma molécula proteica más de una mutación LEAD, cada una en una posición is-HIT diferente. Una vez que las proteínas mutantes LEAD se han identificado usando los métodos de exploración 2D proporcionados en este documento, pueden generarse súper-LEAD por combinación de dos o más mutaciones de mutantes LEAD individuales usando métodos bien conocidos en la técnica, tales como recombinación, mutagénesis y barajado de ADN, y por métodos tales como mutagénesis direccional aditiva y Extensiones de Cebadores Multisolapados proporcionados en este
documento.

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1) Mutagénesis Direccional Aditiva

También se proporcionan en este documento métodos para ensamblar en una sola proteína mutante múltiples mutaciones presentes en las moléculas LEAD individuales para generar proteínas mutantes súper-LEAD. Este método se denomina en este documento "Mutagénesis Direccional Aditiva" (ADM). La ADM comprende un proceso multi-etapa repetitivo en el que en cada etapa después de la creación de la primera proteína mutante LEAD se añade una nueva mutación LEAD sobre la proteína mutante LEAD previa para generar proteínas mutantes súper-LEAD sucesivas. La ADM no se basa en mecanismos de recombinación genética ni en metodologías de barajado; en su lugar, es un proceso simple de una mutación cada vez repetido tantas veces como sea necesario hasta que se introduzca el número total de mutaciones deseadas en una misma molécula. Para evitar el aumento exponencial del número de todas las combinaciones posibles que pueden generarse reuniendo en la misma molécula un número dado de mutaciones individuales, se proporciona un método en este documento que, aunque no abarca todo el espacio combinatorio posible, captura aún una gran parte del potencial combinatorio. La palabra "combinatorio" se usa en este documento en su significado matemático (es decir, subconjuntos de un grupo de elementos que contiene algunos de los elementos en cualquier orden posible) y no en el significado de biología molecular o de evolución dirigida (es decir, generar combinaciones o mezclas o colecciones de moléculas mezclando aleatoriamente sus elementos constitutivos).

Se genera una población de conjuntos de moléculas de ácido nucleico que codifican una colección de nuevas moléculas mutantes súper-LEAD, se ensayan y se caracterizan fenotípicamente una por una en matrices direccionables. Las moléculas mutantes súper-LEAD son tales que cada molécula contiene un número y tipo variable de mutaciones LEAD. Las moléculas que presentan una aptitud adicionalmente mejorada para la característica particular que se está desarrollando se denominan súper-LEAD. Pueden generarse súper-LEAD por otros métodos conocidos por los expertos en la materia y ensayarse mediante los métodos de alto rendimiento de este documento. Para los fines de este documento un súper-LEAD tiene típicamente actividad con respecto a la función o actividad biológica de interés que difiere de la actividad mejorada de un LEAD en una cantidad deseada, tal como de al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% o más de al menos uno de los mutantes LEAD de los que procede. En otras realizaciones más, el cambio en la actividad es de al menos aproximadamente 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces o más superior al de al menos una de las moléculas LEAD de la que procede. Como con los LEAD, el cambio en la actividad para los súper-LEAD depende de la actividad que se esté "desarrollando". La alteración deseada, que puede ser un aumento o una reducción en la actividad, dependerá de la función o propiedad de interés.

En una realización proporcionada en este documento, el método de ADM emplea varias etapas repetitivas de modo que en cada etapa se añade una nueva mutación en una molécula dada. Aunque son posibles numerosas formas diferentes de combinar cada mutación LEAD en una proteína súper-LEAD, una forma ejemplar en la que pueden añadirse nuevas mutaciones (por ejemplo, mutación 1 (m1), mutación 2 (m2), mutación 3 (m3), mutación 4 (m4), mutación 5 (m5), mutación n (mn)) se corresponde con el diagrama siguiente:

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2) Extensiones de Cebadores Multi-Solapados

En otra realización, se proporciona en este documento un método para el desarrollo racional de proteínas usando mutagénesis mediada por oligonucleótidos denominada "extensiones de cebadores multisolapados". Este método puede usarse para la combinación racional de LEAD mutantes para formar súper-LEAD. Este método permite la introducción simultánea de varias mutaciones por toda una pequeña proteína o región proteica de secuencia conocida. Se designan oligonucleótidos solapantes de típicamente aproximadamente 70 bases de longitud (puesto que oligonucleótidos de mayor longitud conducen a un aumento del error) a partir de la secuencia de ADN (gen) que codifica las proteínas LEAD mutantes de tal modo que solapan entre sí en una región de típicamente aproximadamente 20 bases. Estos oligonucleótidos solapantes (que incluyen o no mutaciones puntuales) actúan tanto como molde como cebadores en una primera etapa de PCR (usando una polimerasa con corrección de errores, por ejemplo, ADN polimerasa Pfu, para evitar mutaciones inesperadas) para generar pequeñas cantidades de gen de longitud completa. Después, el gen de longitud completa resultante de la primera PCR se amplifica selectivamente en una segunda etapa de PCR usando cebadores flanqueantes, cada uno marcado con un sitio de restricción para facilitar la clonación posterior. Un proceso de extensión multisolapada produce una molécula de ácido nucleico de longitud completa (multi-mutada) que codifica una proteína súper-LEAD candidata que tiene múltiples mutaciones en la misma derivadas de proteínas mutantes LEAD.

Aunque típicamente se usan aproximadamente 70 bases para generar los oligonucleótidos solapantes, la longitud de los oligonucleótidos solapantes adicionales para su uso en este documento puede variar de aproximadamente 30 bases hasta aproximadamente 100 bases, de aproximadamente 40 bases hasta aproximadamente 90 bases, de aproximadamente 50 bases hasta aproximadamente 80 bases, de aproximadamente 60 bases hasta aproximadamente 75 bases y de aproximadamente 65 bases hasta aproximadamente 75 bases. Como se ha expuesto anteriormente, se usan en este documento típicamente aproximadamente 70 bases.

Asimismo, aunque típicamente la región solapante de los oligonucleótidos solapantes es de aproximadamente 20 bases, la longitud de otras regiones solapantes para su uso en este documento puede variar de aproximadamente 5 bases hasta aproximadamente 40 bases, de aproximadamente 10 bases hasta aproximadamente 35 bases, de aproximadamente 15 bases hasta aproximadamente 35 bases, de aproximadamente 15 bases hasta aproximadamente 25 bases, de aproximadamente 16 bases hasta aproximadamente 24 bases, de aproximadamente 17 bases hasta aproximadamente 23 bases, de aproximadamente 18 bases hasta aproximadamente 22 bases y de aproximadamente 19 bases hasta aproximadamente 21 bases. Como se ha expuesto anteriormente, típicamente se usan aproximadamente 20 bases en este documento para la región solapante.

J. Usos de las Citocinas y Genes de IFN\beta, IFN\alpha Mutantes en Métodos Terapéuticos

Las citocinas optimizadas proporcionadas en este documento, tales como las proteínas IFN\alpha-2b e IFN\beta y otras citocinas modificadas están destinadas a su uso en diversos métodos terapéuticos así como de diagnóstico. Estos incluyen todos los métodos para los que se usan las proteínas no modificadas. En virtud de sus fenotipos y actividades mejoradas, las proteínas proporcionadas en este documento deberían presentar mejora en el fenotipo in vivo correspondiente.

En particular, las citocinas optimizadas, tales como las proteínas IFN\alpha-2b e IFN\beta están destinadas a su uso en métodos terapéuticos en los que se han usado citocinas para el tratamiento. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, métodos de tratamiento de enfermedades infecciosas, alergias, enfermedades microbianas, enfermedades relacionadas con la gestación, enfermedades bacterianas, enfermedades cardíacas, enfermedades víricas, enfermedades histológicas, enfermedades genéticas, enfermedades hematológicas, enfermedades fúngicas, enfermedades adrenales, cánceres, enfermedades hepáticas, enfermedades autoinmunes, trastornos del crecimiento, diabetes, enfermedades neurodegenerativas incluyendo esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer.

1) Proteínas de Fusión

También se proporcionan proteínas de fusión que contienen un agente de dirección e IFN\alpha mutante, incluyendo IFN\alpha-2b e IFN\alpha2a y proteínas mutantes IFN\beta o proteínas citocinas. Se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen dichas proteínas de fusión formuladas para su administración por una vía adecuada. Se forman proteínas de fusión por unión en cualquier orden de la proteína mutante y un agente, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, factor de crecimiento, receptor, ligando u otro agente de este tipo para dirigir la proteína mutante a una célula o tejido diana. Puede efectuarse la unión directa o indirectamente mediante un enlazador. Las proteínas de fusión pueden producirse de forma recombinante o química por enlace químico, tal como por agentes heterobifuncionales o enlaces tiol u otros enlaces de este tipo. Las proteínas de fusión pueden contener componentes adicionales, tales como proteína de unión a maltosa de E. coli (MBP) que ayuda en la captación de la proteína por células (véase la Solicitud Internacional PCT Nº WO 01/32711).

2) Moléculas de Ácido Nucleico para su Expresión

También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican las citocinas mutantes incluyendo las proteínas IFN\beta mutantes y proteínas IFN\alpha, tales como las proteínas IFN\alpha-2b e IFN\alpha-2a, proporcionadas en este documento, o la proteína de fusión unida operativamente a un promotor, tal como un promotor inducible para su expresión en células de mamífero. Dichos promotores incluyen, pero sin limitación, promotores CMV y SV40; promotores de adenovirus, tales como el promotor del gen E2, que es sensible a la oncoproteína E7 de HPV; un promotor de PV, tal como el promotor p89 de PBV que es sensible a la proteína E2 de PV; y otros promotores que se activan por el VIH o PV u oncogenes.

Las citocinas mutantes, incluyendo las proteínas interferones mutantes (IFN\alpha e IFN\beta) proporcionadas en este documento, también pueden suministrarse a las células en vectores de transferencia génica. Los vectores de transferencia también pueden codificar otros agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento de la enfermedad o trastorno, tal como cáncer o infección por VIH, para el que se administra la citocina.

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3) Formulación de Citocinas Optimizadas

Pueden formularse composiciones farmacéuticas que contienen una citocina optimizada producida en este documento, tal como IFN\alpha-2b, IFN\alpha-2a e IFN\beta, proteínas de fusión o moléculas de ácido nucleico codificantes de cualquier forma convencional por mezcla de una cantidad seleccionada de una citocina optimizada con uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. La selección del vehículo o excipiente depende del modo de administración (es decir, sistémico, local, tópico o cualquier otro modo) y del trastorno tratado. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento pueden formularse para la administración de una sola dosificación. Las concentraciones de los compuestos en las formulaciones son eficaces para el suministro de una cantidad, tras la administración, que sea eficaz para el tratamiento deseado. Típicamente, las composiciones se formulan para la administración de una sola dosificación. Para formular una composición, la fracción en peso de un compuesto o mezcla del mismo se disuelve, suspende, dispersa o mezcla de otro modo en un vehículo seleccionado a una concentración eficaz de modo de que la afección tratada se alivie o mejore. Los vehículos o excipientes farmacéuticos adecuados para la administración de los compuestos proporcionados en este documento incluyen cualquier vehículo de este tipo que sepan los expertos en la materia que es adecuado para el modo de administración particular.

Además, los compuestos pueden formularse como el ingrediente farmacéuticamente activo único en la composición o pueden combinarse con otros ingredientes activos. También pueden ser adecuadas suspensiones liposomales incluyendo liposomas dirigidos a tejidos como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden prepararse formulaciones de liposomas como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.522.811.

El compuesto activo se incluye en el vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos secundarios indeseables en el paciente tratado. La concentración terapéuticamente eficaz puede determinarse empíricamente por ensayo de los compuestos en sistemas in vitro e in vivo conocidos tales como los ensayos proporcionados en este documento. Los compuestos activos pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, intravenosa, intradérmica, subcutánea o tópica, en forma líquida, semilíquida o sólida y se formulan de una forma adecuada para cada vía de administración.

La citocina optimizada y sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden formularse para su administración por inhalación (a través de la boca o la nariz) o por administración oral, bucal, parenteral o rectal. Para la administración por inhalación, la citocina optimizada puede suministrarse en forma de una presentación de pulverización en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para que contengan una mezcla en polvo de un compuesto terapéutico y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Para su administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato cálcico); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o almidón glicolato sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico). Los comprimidos pueden recubrirse por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden adoptar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones o pueden presentarse como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tamponantes, agentes saporíferos, colorantes y edulcorantes según sea
apropiado.

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Las preparaciones para administración oral pueden formularse convenientemente para dar una liberación controlada del compuesto activo. Para la administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos o grageas formuladas de forma convencional.

Las citocinas optimizadas pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos acuosos u oleosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma liofilizada en polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua apirógena estéril, antes del uso.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, la citocina optimizada también puede formularse como una preparación de liberación prolongada. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos terapéuticos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

Los agentes activos pueden formularse para su aplicación tópica o local, tal como para su aplicación tópica en la piel y membranas mucosas, tal como en el ojo, en forma de geles, cremas y lociones y por aplicación en el ojo o por aplicación intracisternal o intraespinal. Dichas soluciones, particularmente las destinadas a uso oftálmico, pueden formularse como soluciones isotónicas al 0,01%-10%, pH de aproximadamente 5-7, con sales apropiadas. Los compuestos pueden formularse como aerosoles para su aplicación tópica, tal como por inhalación (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.044.126, 4.414.209 y 4.364.923, que describen aerosoles para suministrar un esteroide útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, particularmente asma).

La concentración de compuesto activo en la composición farmacológica dependerá de las tasas de absorción, inactivación y excreción del compuesto activo, del programa de dosificación y de la cantidad administrada, así como de otros factores conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la cantidad que se suministra es suficiente para tratar los síntomas de hipertensión.

Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El envase puede, por ejemplo, comprender papel metálico o plástico, tal como un envase tipo blíster. El envase o dispositivo dispensador pueden acompañarse de instrucciones para su administración.

Los agentes activos pueden envasarse como artículos de fabricación que contienen material de envasado, un agente proporcionado en este documento y una etiqueta que indique el trastorno para el que se proporciona el agente.

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K Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen con fines ilustrativos solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención. Los métodos específicos ejemplificados pueden ponerse en práctica con otras especies. Los ejemplos están destinados a ejemplificar procesos genéricos.

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Ejemplo 1

Este ejemplo describe una pluralidad de etapas cronológicas que incluye las etapas de (i) a (viii):

(i): clonación de ADNc de IFN\alpha en un plásmido de expresión de células de mamífero (sección A.1)

(ii): generación de una colección de mutantes diana en el ADNc de IFN\alpha en el plásmido de expresión de células de mamífero (sección B)

(iii): producción de mutantes de IFN\alpha en células de mamífero (sección C.1)

(iv): exploración y caracterización parcial in vitro de mutantes de IFN\alpha producidos en células de mamífero en la búsqueda de mutantes LEAD (sección D)

(v): clonación de los mutantes LEAD en un plásmido de expresión de células bacterianas (sección A.2)

(vi): expresión de mutantes LEAD en células bacterianas (sección C.2)

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(vii): caracterización in vitro de mutantes LEAD producidos en bacterias (sección D)

(viii): caracterización in vivo de mutantes LEAD producidos en bacterias (sección E)

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A. Clonación de ADNc codificante de IFN\alpha-2b A.1. Clonación de ADNc de IFN\alpha-2b en un plásmido de expresión de células de mamífero

El ADNc de IFN \alpha-2b se clonó primero en un vector de expresión de mamífero antes de la generación de los mutantes seleccionados. Después se generó una colección de mutantes de modo que cada mutante individual se generaba y se procesaba individualmente, separados físicamente entre sí y en matrices direccionables. El vector de expresión de mamíferos pSSV9 CMV 0.3 pA se modificó por ingeniería genética de la forma siguiente:

El pSSV9 CMV 0,3 pA se cortó con PvulI y se volvió a ligar (esta etapa se deshace de las funciones ITR), antes de la introducción de un nuevo sitio de restricción EcoRI por mutagénesis Quickchange (Strategene). Los cebadores oligonucleotídicos eran:

: Cebador directo EcoRI 5'- GCCTGTATGATTTATTGGATGTTGGAATTCCCTGATGCGGTATTTTCTCCT TACG-3' (SEC ID Nº: 218)

: Cebador inverso EcoRI 5'- CGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGGAATTCCAACATCCAATAAATCATA CAGGC-3' (SEC ID Nº: 219).

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La secuencia de la construcción se confirmó usando los siguientes oligonucleótidos:

: Cebador directo Seq ClaI: 5'-CTGATTATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGC-3' (SEC ID Nº: 220)

: Cebador inverso Seq XmnI 5'-TACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAA-C-3' (SEC ID Nº: 221).

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Después, el fragmento XmnI-ClaI que contiene el sitio EcoRI recién introducido se clonó en pSSV9 CMV 0.3 pA (SSV9 es un clon que contiene el genoma del virus adenoasociado (AAV) completo insertado en el sitio PvulI del plásmido pEMBL (véase, Du et al. (1996) Gene Ther 3: 254-261)) para sustituir el fragmento de tipo silvestre correspondiente y producir la construcción pSSV9-2EcoRI.

La secuencia de ADN del ADNc de IFN\alpha-2b, que se insertó en el vector de mamífero pDG6 (Nº de acceso de ATCC 53169) se confirmó usando un par de cebadores internos. Las secuencias de los oligonucleótidos relacionados con IFN\alpha-2b para la secuenciación son las siguientes:

: Cebador directo Seq: 5'-CCTGATGAAGGAGGACTC-3' (SEC ID Nº: 222)

: Cebador inverso Seq: 5'-CCAAGCAGCAGATGAGTC-3' (SEC ID Nº: 223).

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Puesto que el comienzo del ADNc codificante de IFN\alpha-2b (la secuencia codificante del péptido señal) está ausente en pDG6, se añadió usando el oligonucleótido (véase a continuación) para el gen amplificado. En primer lugar, el ADNc de IFN\alpha-2b se amplificó por PCR usando pDG6 como un molde usando los oligonucleótidos siguientes como cebadores:

: Cebador 5' de IFN\alpha-2b 5'-TCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTG-3' (SEC ID Nº: 224)

: Cebador 3' de IFN\alpha-2b 5'-GCTCTAGATCATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTTGAC-3' (SEC ID Nº: 225)

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El producto de PCR se usó después en una PCR solapante usando las secuencias oligonucleotídicas siguientes que tienen los sitios de restricción Hind III o XbaI (subrayados) o la secuencia de ADN ausente en pDG6 (subrayado):

: Cebador IFN\alpha-2b HindIII 5'-CCCAAGCTTATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGGTG-3' (SEC ID Nº: 226)

: Cebador IFN\alpha-2b XbaI 5'-GCTCTAGATCATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTTGAC-3' (SEC ID Nº: 227)

: Cebador 5' IFN\alpha-2b 80 pb 5'-CCCAAGCTT ATGGCCTTGACCTTTGCTTTA CTGGTGGCCCTCCTGGT GCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTG-3' (SEC ID Nº: 228).

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El ADNc de IFN\alpha-2b completo se clonó en el vector pTOPO-TA (Invitrogen). Después de comprobar la secuencia génica por secuenciación de ADN automática, el fragmento HindIII-XbaI que contenía el gen de interés se subclonó en los sitios correspondientes de pSSV9-2EcoRI para producir pAAV-EcoRI-IFNalfa-2b (pNB-AAV-IFN alfa-2b).

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A.2 Clonación de los LEAD de IFN \alpha-2b en un plásmido de expresión de E. coli A.2.1 Caracterización de las células bacterianas

Se obtuvieron células de Escherichia coli competentes BL21-CodonPlus(DE3)-RP® a partir de células competentes BL21-Gold de alto rendimiento de Stratagene. Estas células permiten un alto nivel de expresión eficaz de proteínas heterólogas en E. coli. La producción eficaz de proteínas heterólogas en E. coli está limitada frecuentemente por la rareza en E. coli de ciertos ARNt que son abundantes en los organismos de los que proceden las proteínas heterólogas. La disponibilidad de ARNt permite un alto nivel de expresión de muchos genes recombinantes heterólogos en células BL21-Codon Plus que se expresan muy poco en cepas BL21 convencionales. Las células BL21-CodonPLus(DE3)-RP contienen un plásmido basado en pACYC compatible con ColE1 que contiene copias extra de los genes de ARNt argU y proL.

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A.2.2 Clonación de IFN \alpha de tipo silvestre

Para expresar IFN \alpha-2b en E. coli, el ADNc que codifica la forma madura de IFN-2-\alpha-2b se clonó finalmente en el plásmido pET-11 (Novagen). En resumen, este fragmento de ADNc se amplificó por PCR usando los cebadores de las SEC ID Nº 1306 y 1305, respectivamente:

: IFNA-DIR-5' AACATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGC 3'

: IFNA-INV-5' AAGGATCCTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTTG3', de pSSV9-EcoRI-IFN \alpha-2b (véase anteriormente), que contiene el ADNc de IFN-2 alfa de longitud completa como matriz usando ADN-polimerasa Herculase (Stratagene). El fragmento de PCR se subclonó en vector pTOPO-TA (Invitrogen) dando pTOPO-IFN \alpha-2b. La secuencia se verificó por secuenciación. Se preparó el pET11 IFN \alpha-2b por inserción del fragmento NdeI-Bam HI (Biolabs) de pTOPO-IFN \alpha-2b en los sitios NdeI-Bam HI de pET 11. La secuencia de ADN de la construcción pET 11-IFN \alpha-2b resultante se verificó por secuenciación y el plásmido se usó para la expresión de IFN \alpha-2b en E. coli.

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A.2.3 Clonación de mutantes de IFN \alpha-2b del plásmido de expresión de mamífero en el plásmido de expresión de E. coli

Se generaron primero mutantes LEAD de Interferón alfa en el plásmido pSSV9-IFNa-EcoRI. Con la única excepción de E159H y E159Q, todos los mutantes se amplificaron usando los cebadores a continuación. Los cebadores contenían los sitios de restricción NdeI (en el Directo) y BamHI (en el Inverso):

: IFNA-DIR-5' AACATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGC 3' (SEC ID Nº 1306); y

: IFNA-INV-5' AAGGATCCTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTTG 3' (SEC ID Nº 1305)

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Los mutantes E159H y E159Q se amplificaron usando los siguientes cebadores en el lado inverso (el cebador directo era el mismo que se ha descrito anteriormente):

: el IFNA-INV-E159H-5' AAGGATCCTCATTCCTTACTTCTTAAACTGTGTTGCAAGTTTGTTG 3' SEC ID Nº 1304 anterior; y

: el IFNA-INV-E159Q-5' AAGGATCCTCATTCCTTACTTCTTAAACTCTGTTGCAAGTTTGTTG 3' SEC ID Nº 1305.

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Se amplificaron los mutantes con Polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) por consiguiente. Se clonaron los productos de PCR en plásmido pTOPO (kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO, Invitrogen). La presencia de las mutaciones deseadas se comprobó por secuenciación automática. El fragmento NdeI + BamHI de los clones positivos de pTOPO-IFN\alpha se clonó después en los sitios NdeI + BamHI del plásmido pET11.

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B. Construcción de una colección de mutantes de IFN\alpha-2b en un plásmido de expresión de mamífero

Se diseñó una serie de cebadores mutagénicos para generar las mutaciones específicas apropiadas en el ADNc de IFN\alpha-2b. Se realizaron reacciones de mutagénesis con el kit de mutagénesis Chameleon® (Stratagene) usando pNB-AAV-IFN\alpha-2b como molde. Cada reacción de mutagénesis individual se diseñó para generar una sola proteína mutante. Cada reacción de mutagénesis individual contiene un y sólo un cebador mutagénico. Para cada reacción, se mezclan 25 pmol de cada cebador mutagénico (fosforilado) con 0,25 pmol de molde, 25 pmol de cebador de selección (que introduce un nuevo sitio de restricción) y 2 \mul de tampón de mutagénesis 10X (Tris-acetato 100 M, pH 7,5; MgOAc 100 mM; KOAc 500 mM pH 7,5) en cada pocillo de placas de 96 pocillos. Para permitir la hibridación de ADN, se incubaron placas de PCR a 98ºC durante 5 min y se colocaron inmediatamente 5 min en hielo antes de incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Se permitieron reacciones de elongación y ligación por adición de 7 ml de mezcla de nucleótidos (2,86 mM de cada nucleótido; tampón de mutagénesis 1,43 X y 3 ml de una mezcla de tampón de dilución de enzimas recién preparada (Tris HCl 20 mM pH 7,5; KCl 10 mM, \beta-mercaptoetanol 10 mM; DTT 1 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 50%), ADN polimerasa T7 nativa (0,025 U/\mul) y ADN ligasa T4 (1 U/\mul) en una proporción de 1:10; respectivamente. Las reacciones se incubaron a 37ºC durante 1 h antes de la inactivación de la ADN ligasa T4 a 72ºC durante 15 min. Para eliminar el plásmido precursor, se añadieron 30 ml de una mezcla que contenía tampón de enzima 1X y 10 U de enzima de restricción a las reacciones mutagénicas seguido de incubación a 37ºC durante al menos 3 horas. A continuación, se pusieron alícuotas de 90 ml de células competentes XLmutS (Stratagene) que contenían \beta-mercaptoetanol 25 mM en placas de pocillos profundos enfriadas en hielo. Después, las placas se incubaron en hielo durante 10 min con agitación vorticial suave cada 2 min. Se realizó la transformación de células competentes añadiendo alícuotas de las reacciones de restricción (1/10 de volumen de reacción) e incubándolas en hielo durante 30 min. Se realizó un choque térmico en un baño de agua a 42ºC durante 45 s, seguido de incubación en hielo durante 2 minutos. Se añadió medio SOC precalentado (0,45 ml) a cada pocillo y se incubaron las placas a 37ºC durante 1 h con agitación. Para enriquecer para plásmidos mutados, se añadió 1 ml de medio de caldo 2 X YT complementado con ampicilina 100 \mug/ml a cada mezcla de transformación seguido de incubación durante una noche a 37ºC con agitación. El aislamiento de ADN plasmídico se realizó por lisis alcalina usando el Kit de Plásmidos Nucleospin Multi-96 Plus (Macherey-Nagel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La selección de plásmidos mutados se realizó por digestión de 500 \mug de preparación de plásmido con 10 U de endonucleasa de selección en una incubación durante una noche a 37ºC. Se transformó una fracción de las reacciones digeridas (1/10 del volumen total) en 40 \mul de células competentes XL1-Blue de Epicurian coli (Strategene) complementadas con \beta-mercaptoetanol 25 mM.

Se realizó la transformación como se ha descrito anteriormente. Se seleccionaron transformantes en placas de agar LB-ampicilina incubadas durante una noche a 37ºC. Se escogieron colonias aisladas y se cultivaron durante una noche a 37ºC en placas de pocillos profundos. Se exploraron cuatro clones por reacción mediante digestión con endonucleasa de un nuevo sitio de restricción introducido por el cebador de selección. Por último, cada mutación que se introdujo para producir esta colección de plásmidos mutantes LEAD IFN\alpha-2b candidatos que codifican las proteínas expuestas en la Tabla 2 del Ejemplo 2 se confirmó por secuenciación de ADN automática.

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C. Producción de mutantes de IFN\alpha-2b C.1. En células de mamífero

Se produjeron mutantes de IFN\alpha-2b en células de riñón embrionario humano (HEK) 293 (obtenidas de la ATCC) usando medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con glucosa (4,5 g/l; Gibco-BRL) y suero bovino fetal (10%, Hyclone). Las células se transfectaron de forma transitoria con los plásmidos que codifican los mutantes IFN\alpha-2b de la forma siguiente: se sembraron 0,6 x 10^{5} células en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 36 h antes de la transfección de células con una confluencia de aproximadamente el 70%, se complementaron con 2,5 mg de plásmido (mutantes de IFN\alpha-2b) y polietilenimina 10 mM (PEI 25 kDA, Sigma-Aldrich). Después de agitación suave, las células se incubaron durante 16 h. Después, el medio de cultivo se cambió con 1 ml de medio recién preparado complementado con 1% de suero. Se midió el IFN\alpha-2b en sobrenadantes de cultivo obtenidos 40 h después de la transfección y se almacenó en alícuotas a -80ºC hasta el uso.

Los sobrenadantes que contenían IFN\alpha-2b de células transfectadas se exploraron siguiendo ensayos biológicos secuenciales de la forma siguiente. La normalización de la concentración de IFN\alpha-2b de sobrenadantes de cultivo se realizó por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando un kit comercial (R & D) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Este ensayo incluye placas recubiertas con un anticuerpo monoclonal IFN\alpha-2b que puede desarrollarse por acoplamiento de un anticuerpo secundario conjugado con la peroxidasa de rábano picante (HRP). Las concentraciones de IFN\alpha-2b en muestras que contienen (i) IFN\alpha-2b de tipo silvestre producido en condiciones comparables a las de los mutantes, (ii) los mutantes de IFN\alpha-2b y (iii) muestras de control (producidas a partir de células que expresan GFP) se estimaron usando un patrón de referencia internacional proporcionado por el NIBSC, Reino Unido.

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C.2 En bacterias

Un volumen de 200 ml de medio de cultivo (LB/Ampicilina/Cloranfenicol) se inoculó con 5 ml de precultivo BL21-pCodon + -pET-IFN \alpha-2b muta durante una noche a 37ºC con agitación constante (225 rpm). La producción de IFN \alpha-2b se indujo por adición de 50 \mul de IPTG 2 M a una DO_{600\ nm}\sim0,6.

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El cultivo se continuó durante 3 horas adicionales y se centrifugó a 4ºC y 5000 g durante 15 minutos. El sobrenadante (medio de cultivo) se desechó y las bacterias se lisaron en 8 ml de tampón de lisis por choque térmico (congelación-descongelación: 37ºC-15 min; -80ºC-10 min; 37ºC-15 min; -80ºC-10 min; 37ºC-15 min). Después de la centrifugación (10000 g, 15 min, 4ºC), el sobrenadante (fracción de proteína soluble) se desechó y el material precipitado (fracción de proteína insoluble que contiene la proteína IFN \alpha-2B como cuerpos de inclusión) se
purificó.

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C.3 Pre-purificación de IFN \alpha-2b como cuerpos de inclusión en E. coli C.3.1 Lavado de cuerpos de inclusión por sonicación

Se suspendieron sedimentos que contenían los cuerpos de inclusión en 10 ml de tampón y se sonicaron (80 vatios) en hielo, 1 segundo "encendido", 1 segundo "apagado" durante un total de 4 min. Después las suspensiones se centrifugaron (4ºC, 10000 g, 15 min) y se recuperaron los sobrenadantes. Los sedimentos se resuspendieron en 10 ml de tampón para un nuevo ciclo de sonicación/centrifugación. Después, se eliminó el Tritón X-100 mediante dos ciclos adicionales de sonicación/centrifugación con tampón. Los sedimentos que contenían los cuerpos de inclusión se recuperaron y se disolvieron. Los sobrenadantes lavados se almacenaron a 4ºC.

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C.3.2 Solubilización de cuerpos de inclusión por desnaturalización

Una vez lavados, los cuerpos de inclusión se solubilizaron en un tampón a una concentración estimada en 0,3 mg/ml midiendo la DO_{280} (considerando el coeficiente de extinción molar del IFN \alpha-2b). La solubilización se realizó durante la noche a 4ºC con agitación.

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C.3.3 Renaturalización de IFN \alpha-2b por diálisis de GdnHCl

Las muestras contenían 1 mg de proteína a 0,3 mg/ml (5 ml en total) en tampón. El GdnHCl (clorhidrato de guanidio) presente en las muestras se eliminó por diálisis (corte de membrana mínimo = 10 kDa) durante una noche a 4ºC contra tampón (1 litro) (concentración final de GdnHCl: 43 mM). A continuación, las muestras se dializaron adicionalmente contra 1 litro de tampón durante 2:30 h. Esta etapa se repitió dos veces adicionales. Después de la diálisis, era visible muy poco precipitado.

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D. Exploración y caracterización in vitro de mutantes de IFN \alpha-2b

Se midieron dos actividades directamente en muestras de IFN: actividades antiviral y antiproliferación. Los experimentos de dosis (concentración)-respuesta (actividad) para actividad antiviral o antiproliferación permitían el cálculo de la "potencia" para las actividades antiviral y antiproliferación, respectivamente. Las actividades antiviral y antiproliferación también se midieron después de la incubación con muestras proteolíticas, tales como proteasas específicas, mezclas de proteasas seleccionadas, suero humano o sangre humana. La evaluación de la actividad después de la incubación con muestras proteolíticas permitió determinar la actividad residual (antiviral o antiproliferación) y la cinética respectiva de semivida tras la exposición a proteasas.

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D.1. Actividad antiviral

El IFN\alpha-2b protege a las células frente a la infección viral mediante un mecanismo complejo dedicado a crear un entorno desfavorable para la proliferación viral. La respuesta antiviral celular debida a IFN\alpha-2b (ensayo antiviral de IFN) se evaluó usando una línea celular HeLa sensible a interferón (Nº de acceso a la ATCC CGL-2) tratado con el virus de la encefalomiocarditis (EMCV). La evaluación de los efectos citopáticos inducidos por virus (CPE) o la cantidad de ARNm de EMCV en extractos de células infectadas por RT-PCR se usó para determinar la actividad de IFN\alpha en las muestras.

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D.1.1 Actividad antiviral - medida por RT-qPCR

Se tripsinizaron células confluentes y se sembraron placas a una densidad de 2 x 10^{4} células/pocillo en medio DMEM SVF 5% (Día 0). Las células se incubaron con IFN\alpha-2b (a una concentración de 500 U/ml) para obtener 500 pg/ml y 150 pg/pocillo (100 \mul de solución de IFN) durante 24 h a 37ºC antes de exponerse a EMCV (dilución 1/1000; MOI 100). Después de una incubación de 16 h, cuando el CPE inducido por virus estaba próximo al máximo en células sin tratar, el número de partículas de EMCV en cada pocillo se determinó por cuantificación por RT-PCR de ARNm de EMCV usando lisados de células infectadas. Se purificó el ARN de extractos celulares después de un tratamiento con ADNasa/proteinasa K (Applied Biosystems). El CPE se evaluó usando los métodos tanto Uptibleu (Interchim) como MTS (Promega) que se basan en la detección de bio-reducciones producidas por la actividad metabólica de células de una forma fluorométrica y colorimétrica, respectivamente. Para producir una curva patrón para la cuantificación de EMCV, se amplificó un fragmento de ADN de 22 pb del ADNc de la proteína de la cápside por PCR y se clonó en el vector pTOPO-TA (Invitrogen). A continuación, la cuantificación por RT-PCR de cantidades conocidas de pTOPO-TA-gen de la cápside de EMCV se realizó usando el kit de RT-PCR de una etapa (Applied Biosystems) y los oligonucleótidos (de clonación) relacionados con EMCV y la sonda siguientes:

Cebador directo EMCV 5'-CCCCTACATTGAGGCATCCA-3' (SEC ID Nº: 229)

Cebador inverso EMCV 5'-CAGGAGCAGGACAAGGTCACT-3' (SEC ID Nº: 230)

Sonda EMCV 5'-(FAM)CAGCCGTCAAGACCCAACCGCT(TAMR A)-3' (SEC ID Nº: 231).

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D.1.2 Actividad antiviral - medida por CPE

Se determinó la actividad antiviral de IFN \alpha-2b por la capacidad de la citocina para proteger células Hela contra los efectos citopáticos inducidos por el virus EMC (encefalomiocarditis de ratón). El día antes, se sembraron células Hela (2 x 10^{5} células/ml) en placas de 96 pocillos de fondo plano que contenían 100 \mul/pocillo de medio MEM de Dulbecco-Glutamaxl-piruvato sódico complementado con SVF al 5% y el 0,2% de gentamicina. Las células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% durante 24 horas.

Se realizaron dilución seriadas de dos veces de muestras de interferón con medio MEM completo en placas de 96 Pocillos Profundos con una concentración final que variaba de 1600 a 0,6 pg/ml. El medio se aspiró de cada pocillo y se añadieron 100 \mul de diluciones de interferón a las células Hela. Cada dilución de muestra de interferón se evaluó por triplicado. Las dos últimas filas de las placas se llenaron con 100 \mul de medio sin muestras de dilución de interferón para servir como controles para las células con y sin virus.

Después de 24 horas de cultivo, se puso una solución de dilución de virus EMC 1/1000 en cada pocillo excepto por la fila de control de células. Las placas se devolvieron a la incubadora de CO_{2} durante 48 horas. Después, el medio se aspiró y las células se tiñeron durante 1 hora con 100 \mul de solución de tinción azul para determinar la proporción de células intactas. Las placas se lavaron en un baño de agua destilada. El colorante unido a células se extrajo usando 100 \mul de monoetiléter de etilenglicol (Sigma). La absorbancia del colorante se midió usando un lector de placas de ELISA (Spectramax). La actividad antiviral de muestras de IFN \alpha-2b (expresada como número de UI/mg de proteínas) se determinó como la concentración necesaria para la protección del 50% de las células frente a los efectos citopáticos inducidos por virus EMC. Para los experimentos de proteolisis, cada punto de las mediciones cinéticas se evaluó a 500 y 166 pg/ml por triplicado.

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D.2. Actividad antiproliferación

Se determinó la actividad antiproliferativa del interferón \alpha-2b por la capacidad de la citocina para inhibir la proliferación de células Daudi. Se sembraron células Daudi (1x10^{4} células) en placas de 96 pocillos de fondo plano que contenían 50 \mul/pocillo de medio RPMI 1640 complementado con SVF al 10%, glutamina 1X y 1 ml de gentamicina. No se añadieron células a la última fila (fila "H") de las placas de 96 pocillos de fondo plano para evaluar la absorbancia de fondo del medio de cultivo.

Al mismo tiempo se realizaron diluciones seriadas de dos veces de muestras de interferón con medios completos RPMI 1640 en placas de 96 pocillos profundos con una concentración final que variaba de 6000 a 2,9 pg/ml. Se añadieron diluciones de interferón (50 \mul) a cada pocillo que contenía 50 \mul de células Daudi. El volumen total de cada pocillo debería ser ahora de 100 \mul. Cada dilución de muestra de interferón se evaluó por triplicado. Cada pocillo de la fila "G" de las placas se llenó con 50 ml de medios completos RPMI 1640 para usarlo como control positivo. Las placas se incubaron durante 72 horas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada.

Después de 72 horas de cultivo, se añadieron 20 \mul de reactivo Cell titer 96 Aqueous one solution (Promega) a cada pocillo y se incubó 1 h 30 a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Para medir la cantidad de formazán soluble coloreado producido por reducción celular del MTS, se midió la absorbancia del colorante usando un lector de placas de ELISA (Spectramax) a 490 nm.

Las absorbancias corregidas (restado el valor de fondo de la fila "H") obtenidas a 490 nm se representaron frente a la concentración de citocina. El valor de DE50 se calculó por determinación del valor del eje X correspondiente a la mitad de la diferencia entre los valores de absorbancia máximo y mínimo (DE50 = concentración de citocina necesaria para dar la mitad de la respuesta máxima).

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D.3 Tratamiento de IFN \alpha-2b con preparaciones proteolíticas

Se trataron los mutantes con proteasas para identificar moléculas resistentes. Se determinó la resistencia de las moléculas IFN \alpha-2b mutantes en comparación con el IFN \alpha2-b de tipo silvestre frente a la escisión enzimática (30 min, 25ºC) por una mezcla de proteasas (que contiene 1,5 pg de cada una de las siguientes proteasas (1% p/p, Sigma): \alpha-quimotripsina, carboxipeptidasa, endoproteinasa Arg-C, endoproteinasa Asp-N, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Lys-C y tripsina). Al final del tiempo de incubación, se añadieron 10 \mul de Roche antiproteasas completo sin mini EDTA (se disolvió un comprimido en 10 ml DMEM y después se diluyó a 1/1000) a cada reacción para inhibir la actividad de proteasas. Después, se usaron las muestras tratadas para determinar las actividades antiviral o antiproliferación residuales.

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D.4 Resistencia a proteasas - análisis cinético

Se evaluó el porcentaje de actividad IFN \alpha-2b residual con el tiempo de exposición a proteasas mediante un estudio cinético usando (a) 15 pg de quimotripsina (10% p/p), (b) un lisado de sangre humana a una dilución 1/100, (c) 1,5 pg de mezcla de proteasas o (d) suero humano. Los tiempos de incubación eran: 0 h, 0,5 h, 1 h, 4 h, 8 h, 16 h, 24 h y 48 h. En resumen, se añadieron 20 \mul de cada muestra proteolítica (proteasas, suero, sangre) a 100 \mul de IFN \alpha-2b a 1500 pg/ml (500 U/ml) y se incubaron durante tiempos variables, según se indica. A los puntos temporales apropiados, se añadieron 10 \mul de mezcla antiproteasas Roche sin mini EDTA (se disolvió un comprimido en 10 ml de DMEM y después se diluyó a 1/500) a cada pocillo para interrumpir las reacciones de proteolisis. Después se realizaron ensayos de la actividad biológica como se describe para cada muestra para determinar la actividad residual en cada punto temporal.

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D.5 Comportamiento

Las diversas actividades biológicas, resistencia a proteasas y potencia de cada mutante individual se analizaron usando un modelo y algoritmo matemático (NautScanä; descrito en la Patente Francesa Nº 9915884; (publicado como Solicitud Internacional PCT Nº WO 01/44809 basada en la PCT Nº PCT/FR00/03503). Los datos se procesaron usando un modelo basado en la ecuación de Hill que usa indicadores de características clave del comportamiento de cada mutante individual. Los mutantes se clasificaron basándose en los valores de su comportamiento individual y los de la parte superior de la lista de clasificación se seleccionaron como LEAD.

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E. Farmacocinética de mutantes LEAD seleccionados en ratones

Los mutantes de IFN\alpha-2b seleccionados en base a su comportamiento global in vitro, se ensayaron para determinar su farmacocinética en ratones para tener un indicio de su semivida en sangre in vivo. Los ratones se trataron por inyección subcutánea (SC) con alícuotas de cada uno de varios mutantes LEAD seleccionados. Se recogió sangre a puntos temporales crecientes entre 0,5 y 48 h después de la inyección. Inmediatamente después de la recogida se añadieron 20 ml de solución antiproteasas a cada muestra de sangre. Se obtuvieron sueros para un análisis adicional. Se determinó la actividad de IFN-\alpha residual en sangre usando los ensayos descritos en las secciones anteriores para su caracterización in vitro. El IFN\alpha de tipo silvestre (que se había producido bacterias en condiciones comparables a las de los mutantes LEAD) así como un derivado pegilado de IFN \alpha, Pegasys (Roche), también se ensayó para determinar su farmacocinética en los mismos experimentos.

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Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra la exploración bidimensional (2D) de IFN\alpha-2b para una resistencia aumentada a la proteolisis. Para los resultados, véanse las Figuras 6(A)-6(N), 6(T) y 6(U).

A) Identificación de algunos o todos los sitios diana posibles en la secuencia proteica que son susceptibles a la digestión por una o más proteasas específicas (estos sitios son los is-HIT)

Debido a que IFN-\alpha2b se administra como proteína terapéutica en el torrente sanguíneo, se identificó un conjunto de proteasas que se esperaba mimetizaron ampliamente el contenido de proteasas en suero. De esa lista de proteasas, se identificó una lista de los aminoácidos diana correspondientes (mostrados entre paréntesis) de la forma siguiente: \alpha-quimotripsina (F, L, M, W e Y), endoproteinasa Arg-C (R), endoproteinasa Asp-N (D), endoproteinasa Glu-C (E), endoproteinasa Lys-C (K) y tripsina (K y R). También se incluyó en la mezcla de proteasas Carboxipeptidasa Y, que escinde inespecíficamente a partir de los extremos carboxi-terminales de proteínas. La distribución de los aminoácidos diana sobre la secuencia proteica abarca la longitud completa de la proteína, sugiriendo que la proteína es potencialmente sensible a la digestión por proteasas por toda su secuencia (Fig. 6A). Para limitar el número de is-HIT a un menor número de posiciones candidatas, se usó la estructura tridimensional de la molécula IFN\alpha-2b (Código de PDB 1 RH2) para identificar y seleccionar sólo los restos expuestos en la superficie, al tiempo que se descartaban de la lista de candidatos los que permanecían enterrados en la estructura y, por lo tanto, permanecían menos susceptibles a la proteolisis (Fig. 6B).

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B) Identificación de aminoácidos de sustitución apropiados específicos para cada is-HIT, de modo que si se usan para sustituir uno o más de los aminoácidos originales, tales como nativos, en ese is-HIT específico, puede esperarse que aumenten la resistencia de la posición aminoacídica de is-HIT a la digestión por proteasas mientras que al mismo tiempo mantengan o mejoren la actividad biológica necesaria de la proteína (estos aminoácidos de sustitución son los LEAD candidatos)

Para seleccionar los aminoácidos de sustitución candidatos para cada posición is-HIT, se usó un análisis basado en matriz PAM250 (Fig. 7). En una realización, se seleccionaron los dos mayores valores en una matriz PAM250, correspondientes a la mayor aparición de sustituciones entre restos ("sustituciones conservativas" o "mutaciones puntuales aceptadas") (Fig. 8). Cuando sólo estaba disponible una sustitución conservativa para un alto valor dado de PAM250, se seleccionaba el siguiente mayor valor y se consideraban la totalidad de sustituciones conservativas para este valor. La sustitución de aminoácidos que se exponen en la superficie por restos cisteína (como se muestra en la Fig. 8, mientras que se sustituye Y por H o I) se evitaba explícitamente puesto que este cambio conduciría potencialmente a la formación de puentes disulfuro intermoleculares.

Por lo tanto, basándose en la naturaleza de las proteasas de exposición y en consideraciones evolutivas, así como en el análisis estructural de proteína, se definió una estrategia para el diseño racional de mutantes IFN\alpha-2b humanos que tenían una resistencia aumentada a la proteolisis que produciría proteínas terapéuticas que tuvieran una semivida más prolongada. Mediante el uso del algoritmo PROTEOL (http://www.infobiogen.fr), se estableció una lista de restos a lo largo de la secuencia de IFN\alpha-2b, que puede reconocerse como un sustrato para diferentes enzimas presentes en el suero. Debido a que el número de restos en esta lista particular era elevado, se usó la estructura tridimensional de IFN\alpha-2b obtenida de la estructura de RMN de IFN\alpha-2a (Código de PDB 1ITF) para seleccionar sólo los restos expuestos al disolvente. Usando esta estrategia, se identificaron 42 posiciones cuya numeración es la de la proteína madura (SEC ID Nº: 1): L3, P4, R12, R13, M16, R22, K23, F27, L30, K31, R33, E41, K49, E58, K70, E78, K83, Y89, E96, E107, P109, L110, M111, E113, L117, R120, K121, R125, L128, K131, E132, K133, K134, Y13S, P137, M148, R149, E159, L161, R162, K164 y E165. Cada una de estas posiciones se sustituyó por restos aminoacídicos, tales como los que se definen como compatibles por la matriz de sustitución PAM250, mientras que al mismo tiempo los aminoácidos de sustitución no generan nuevos sitios para
proteasas.

La lista de sustituciones de restos realizadas según se determinó por análisis PAM250 es la siguiente:

: R a H, Q

: E a H, Q

: K a Q, T

: L a V, I

: M a I, V

: P a A, S

: Y a I, H.

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C) Introducción sistemática de los aminoácidos de sustitución específicos (LEAD candidatos) en cada posición is-HIT específica para generar una colección que contenga las moléculas mutantes correspondientes

Se generaron los mutantes IFN\alpha-2b individuales, se produjeron y se caracterizaron fenotípicamente uno por uno en matrices direccionables como se ha expuesto en el Ejemplo 1, de modo que cada molécula mutante contiene inicialmente sustituciones de aminoácidos en un solo sitio is-HIT. Se obtuvieron posiciones LEAD en variantes de IFN\alpha-2b después de una exploración para determinar la protección frente a proteasas y una comparación de preparaciones de variantes tratadas con proteasas y no tratadas con proteasas con las condiciones correspondientes para el IFN\alpha-2b de tipo silvestre. El porcentaje de actividad residual (antiviral) para la variante E113H de IFN\alpha-2b después del tratamiento con quimotripsina, mezcla de proteasas, lisado de sangre o suero se comparó con el IFN\alpha-2b de tipo silvestre tratado. Los LEAD de IFN\alpha-2b seleccionados se muestran en la Tabla 2.

Una vista superior y lateral de la estructura del IFN\alpha-2b en una representación de lazos (obtenida a partir de la estructura de RMN de IFN\alpha-2b, Código de PDB 1ITF) representa restos en el "llenado de espacio" que definen (1) la "región de unión al receptor" según se deduce por datos del "barrido con alanina" y estudios por Piehler et al., J. Biol. Chem., 275: 40425-40433, 2000, y Roisman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 98: 13231-13236, 2001, y (2) restos de sustitución (LEAD) para resistencia a proteolisis.

TABLA 2

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Ejemplo 3

Estabilización de IFN\alpha-2b por Creación de Sitios de N-Glicosilación

La creación de sitios de N-glicosilación en la proteína era una segunda estrategia que se usó para estabilizar el IFN\alpha-2b. El IFN\alpha-2b humano natural contiene un sitio de O-glicosilación único en la posición 129 (la numeración se corresponde con la proteína madura; SEC ID Nº: 1), sin embargo, no se encuentran sitios de N-glicosilación en esta secuencia. Los sitios de N-glicosilación se definen por las secuencias consenso N-X-S o N-X-T. Se ha descubierto que la glicosilación desempeña un papel en la estabilidad de proteínas. Por ejemplo, se ha descubierto que la glicosilación aumenta la biodisponibilidad por medio de una estabilidad metabólica superior y un aclaramiento reducido. Para generar variantes de IFN\alpha-2b más estables, las secuencias consenso de N-glicosilación indicadas anteriormente se introdujeron en la secuencia IFN\alpha-2b por mutagénesis. Se evaluaron las variantes de IFN\alpha-2b que llevaban nuevos sitios de glicosilación como se ha descrito anteriormente.

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La estructura de IFN\alpha-2b se caracteriza por un haz de hélices compuesto por 5 hélices (A, B, C, D y E) conectadas entre sí por una serie de bucles (un gran bucle AB y tres bucles BC, CD, DE más cortos). Las hélices se unen entre sí mediante dos puentes disulfuro entre los restos 1/98 y 29/138 de la SEC ID Nº: 1. Se contempla en este documento que los bucles representan sitios preferentes para la glicosilación dada su exposición. Por lo tanto, se crearon sitios de N-glicosilación (N-X-S o N-X-T) en cada una de las secuencias de bucle (Tabla 3). Los mutantes de IFN\alpha-2b pseudo-silvestres y LEAD seleccionados después de la exploración para la adición de sitios de glicosilación se muestran en la Tabla 4.

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TABLA 3

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TABLA 4

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Ejemplo 4

Rediseño de proteínas de interferón \alpha-2b

El uso de la estrategia de rediseño de proteínas proporcionada en este documento permite la generación de proteínas de modo que mantengan los niveles y tipos necesarios de actividad biológica en comparación con la proteína nativa aunque sus secuencias de aminoácidos subyacentes se hayan modificado significativamente por sustitución de aminoácidos. Para identificar primero las posiciones aminoacídicas en la proteína IFN\alpha-2b que están implicadas o no implicadas en la actividad de proteínas IFN\alpha-2b, tales como la actividad de unión de IFN\alpha-2b a su receptor, se realizó un barrido con alanina en la secuencia de IFN\alpha-2b. Con este fin, cada aminoácido en la secuencia proteica de IFN\alpha-2b se modificó individualmente a alanina. Cualquier otro aminoácido, particularmente otro aminoácido que tenga un efecto neutro sobre la estructura, tal como Gly o Ser, también puede usarse. Cada proteína IFN\alpha-2b mutante resultante se expresó después y se ensayó la actividad antiviral de los mutantes individuales. Las posiciones aminoacídicas particulares que son sensibles a la sustitución por Ala, denominadas en este documento HIT, no serían en principio dianas adecuadas para sustitución de aminoácidos para aumentar la estabilidad de la proteína, debido a su implicación en la actividad de la molécula. Para el barrido con alanina, la actividad biológica medida para las moléculas de IFN\alpha-2b era: i) su capacidad para inhibir la replicación viral cuando se añaden a células permisivas previamente infectadas con el virus apropiado y, ii) su capacidad para estimular la proliferación celular cuando se añaden a las células apropiadas. Se ensayó la actividad relativa de cada mutante individual en comparación con la proteína nativa. Los HIT son aquellos mutantes que producen una disminución en la actividad de la proteína (por ejemplo, en este ejemplo, todos los mutantes con actividades por debajo de aproximadamente el 30% de la actividad
nativa).

Además, para identificar las posiciones HIT, se usó barrido con alanina para identificar los restos aminoacídicos en IFN \alpha-2b que cuando se sustituyeron con alanina condujeron a una actividad "pseudo-silvestre", es decir, los que pueden sustituirse por alanina sin conducir a una disminución en la actividad biológica.

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Se generó una colección de moléculas mutantes y se caracterizaron fenotípicamente de modo que se seleccionaron proteínas IFN\alpha-2b con secuencias de aminoácidos diferentes de las nativas pero que todavía generarían el mismo nivel y tipo de actividad que la proteína nativa. Se muestran las posiciones aminoacídicas pseudo-silvestres y HIT en la Tabla 5.

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TABLA 5

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Ejemplo 5

Súper-LEAD de Proteína Interferón \alpha-2b por Mutagénesis Direccional Aditiva

El uso de una estrategia de mutagénesis direccional aditiva proporcionó un método para el ensamblaje de múltiples mutaciones previamente presentes en las moléculas LEAD individuales en una sola proteína mutante generando de este modo proteínas mutantes súper-LEAD. En este método, se genera una colección de moléculas de ácido nucleico que codifican una biblioteca de nuevas moléculas mutantes, se ensayan y se caracterizan fenotípicamente una por una en matrices direccionables. Las moléculas mutantes súper-LEAD son tales que cada molécula contiene un número y un tipo variable de mutaciones LEAD.

Usando los LEAD obtenidos en el Ejemplo 2, se generaron seis series de moléculas mutantes con más de una mutación por molécula como se muestra en la Tabla 6. Algunas moléculas mutantes súper-LEAD se caracterizaron fenotípicamente y los resultados se muestran en la Tabla 7. Como se muestra en la tabla no todas los súper-LEAD tienen una actividad mejorada en comparación con los LEAD originales; algunos muestran una actividad disminuida de algún tipo.

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TABLA 6 Esquema de posición de LEAD para generación de súper-LEAD

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TABLA 7

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Se generaron cuatro mutantes con mutaciones adicionales a las seleccionadas por la mutagénesis racional en la cepa MutS de E. coli y se detectaron por secuenciación. Los mutantes eran los siguientes: E410/D94G SEC ID Nº: 199; L117V/A139G SEC ID Nº: 204; E41H/Y89H/N45D SEC ID Nº: 198; y K1210/P109A/K133Q/G102R SEC ID Nº: 204.

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Ejemplo 6

Clonación de IFN \beta en pNAUT, un plásmido de expresión de células de mamífero

El ADNc que codifica IFN \beta (véase, SEC ID Nº: 499) se clonó en un vector de expresión de mamífero antes de la generación de las mutaciones seleccionadas (véanse las Figuras 6(O)-6(S) y 8(A)). Después, se generó una colección de mutantes diana prediseñados de modo que se creara y se procesara individualmente cada mutante individual, separados físicamente entre sí y en matrices direccionables. El vector de expresión de mamíferos pSSV9 CMV 0.3 pA (véase, el Ejemplo 1) se modificó por ingeniería genética de la forma siguiente:

El pSSV9 CMV 0.3 pA se cortó con PvuII y se volvió a ligar (esta etapa se deshace de las funciones ITR) antes de la introducción de un nuevo sitio de restricción EcoRI por mutagénesis Quickchange (Stratagene). Las secuencias oligonucleotídicos usadas eran las siguientes:

: Cebador directo EcoRI: 5'-GCCTGTATGATnATTGGATGTTGGAATTCCCTGATGCGGTATTTTCTCCTT ACG-3' (SEC ID Nº: 218)

: Cebador inverso EcoRI: 5'-CGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGGAATTCCAACATCCAATAAATCAT ACAGGC-3' (SEC ID Nº: 219)

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: Cebador inversor Seq XmnI: 5'-TACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAAC-3' (SEC ID Nº: 221).

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Después, el fragmento XmnI-ClaI que contenía el sitio EcoRI recién introducido se clonó en pSSV9 CMV 0.3 pA para sustituir el fragmento de tipo silvestre correspondiente y producir la construcción pSSV9-2EcoRI.

El ADNc de IFN \beta se obtuvo de la construcción pIFN\beta1 (ATCC). La secuencia del ADNc de IFN \beta se confirmó por secuenciación usando los cebadores a continuación:

: Cebador directo Seq: 5'-CCTGATGAAGGAGGACTC-3' (SEC ID Nº: 222)

: Cebador inverso Seq: 5'-CCAAGCAGCAGATGAGTC-3' (SEC ID Nº: 223).

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El ADNc codificante de IFN \beta verificado se clonó primero en el vector pTOPO-TA (Invitrogen). Después de comprobar la secuencia de ADNc por secuenciación de ADN automática, el fragmento HindIII-XbaI que contenía el ADNc de IFN se subclonó en los sitios correspondientes de pSSV9-2EcoRI conduciendo a la construcción de pAAV-EcoRI-IFNbeta (pNB-AAV-IFNbeta). Por último, el fragmento Pvu II del plásmido pNB-AAV-IFN beta se subclonó en el sitio PvuII de pUC 18 conduciendo a la construcción final pUC-CMVIFNbetapA denominada pNAUT-IFNbeta.

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Producción y normalización de IFN\beta en células de mamífero

Se produjo IFN \beta en células de Ovario de Hámster Chino CHO (obtenidas en la ATCC) usando medio de Eagle modifico por Dulbecco complementado con glucosa (4,5 g/l; Gibco-BRL) y suero bovino fetal (5%, Hyclone). Las células se transfectaron de forma transitoria de la forma siguiente: se sembraron 0,6 x 10^{5} células en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 24 h antes de la transfección. Se complementaron células con una confluencia de aproximadamente el 70%, con 1,0 \mug de plásmido (de la biblioteca de mutantes de IFN \beta) mediante lipofectamina más reactivo (Invitrogen). Después de agitar suavemente, las células se incubaron durante 24 h con 1 ml de medio de cultivo complementado con 1% de suero. Se obtuvo el IFN \beta de los sobrenadantes de cultivo 24 h después de la transfección y se almacenó en alícuotas a -80ºC hasta su uso.

Se exploraron preparaciones de IFN \beta producido a partir de células transfectadas siguiendo ensayos biológicos secuenciales de la forma siguiente. Se realizó la normalización de la concentración de IFN \beta de los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. Se estimaron las concentraciones de IFN \beta de muestras de tipo silvestre y mutantes usando un patrón de referencia internacional proporcionado por el NIBSC, Reino Unido.

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Exploración y caracterización in vitro de mutantes de IFN \beta

Se midieron dos actividades directamente en muestras de IFN: actividades antiviral y antiproliferación. Los experimentos de dosis (concentración)-respuesta (actividad) para actividad antiviral o antiproliferación permitieron el cálculo de la "potencia" para las actividades antiviral y antiproliferación, respectivamente. Las actividades antiviral y antiproliferación también se midieron después de la incubación con muestras proteolíticas, tales como proteasas específicas, mezclas de proteasas seleccionadas, suero humano o sangre humana. La evaluación de la actividad después de la incubación con muestras proteolíticas permitió determinar la actividad residual (antiviral o antiproliferación) y las cinéticas de semivida respectivas tras la exposición a proteasas.

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Actividad Antiviral - medida por Efectos Citopáticos (CPE)

Se determinó la actividad antiviral de IFN\alpha-2b por la capacidad de la citocina para proteger a células Hela frente a los efectos citopáticos inducidos por el virus EMG (encefalomiocarditis de ratón). El día antes, se sembraron células Hela (2 x 10^{5} células/ml) en placas de 96 pocillos de fondo plano que contenían 100 \mul/pocillo de medio MEM de Dulbecco-Glutamaxl-piruvato sódico complementado con SVF al 5% y 0,2% de gentamicina. Las células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% durante 24 horas. Se realizaron diluciones seriadas de dos veces de muestras de interferón con medios completos MEM en placas de 96 pocillos profundos con una concentración final que variaba de 1600 a 0,6 pg/ml. El medio se aspiró de cada pocillo y se añadieron 100 \mul de diluciones de interferón a las células Hela. Cada dilución de muestra de interferón se evaluó por triplicado. Las dos últimas filas de las placas se llenaron con 100 \mul de medio sin muestras de dilución de interferón para servir como controles para células con y sin virus.

Después de 24 horas de cultivo, se puso una solución de dilución de virus EMC 1/1000 en cada pocillo, excepto por la fila de control de células. Las placas se devolvieron a la incubadora de CO_{2} durante 48 horas. Después, el medio se aspiró y las células se tiñeron durante 1 hora con 100 \mul de solución de tinción azul para determinar la proporción de células intactas. Las placas se lavaron en un baño de agua destilada. El colorante unido a las células se extrajo usando 100 \mul de monoetiléter de etilenglicol (Sigma). La absorbancia del colorante se midió usando un lector de placas de ELISA (Spectramax). La actividad antiviral de muestras de IFN \beta (expresada como número de UI/mg de proteínas) se determinó como la concentración necesaria para una protección del 50% de las células frente a los efectos citopáticos inducidos por virus EMC. Para los experimentos de proteolisis, cada punto de la cinética se evaluó a 800 y 400 pg/ml por triplicado.

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Actividad antiproliferativa

Se determinó la actividad antiproliferativa de IFN \beta evaluando la capacidad de la citocina para inhibir la proliferación de células Daudi. Se sembraron células Daudi (1 x 10^{4} células) en placas de 96 pocillos de fondo plano que contenían 50 \mul/pocillo de medio RPMI 1640 complementado con SVF al 10%, glutamina 1X y 1 ml de gentamicina. No se añadieron células a la última fila (fila "H") de las placas de 96 pocillos de fondo plano para evaluar la absorbancia de fondo del medio de cultivo.

Al mismo tiempo, se realizaron diluciones seriadas de dos veces de muestras de interferón con medio RPMI 1640 completo en placas de 96 pocillos profundos con una concentración final que variaba de 6000 a 2,9 pg/ml. Se añadieron diluciones de interferón (50 \mul) a cada pocillo que contenía 50 \mul de células Daudi. El volumen total en cada pocillo debería ser ahora de 100 \mul. Cada dilución de muestra de interferón se evaluó por triplicado. Cada pocillo de la fila "G" de las placas se llenó con 50 \mul de medio RPMI 1640 completo para usarse como control positivo. Las placas se incubaron durante 72 horas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada.

Las absorbancias corregidas (restado el valor de fondo de la fila "H") obtenidas a 490 nm se representaron frente a la concentración de citocina. El valor de DE50 se calculó por determinación del valor del eje X correspondiente a la mitad de la diferencia entre los valores de absorbancia máximo y mínimo. (DE50 = concentración de citocina necesaria para dar la mitad de la respuesta máxima).

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Tratamiento de IFN \beta con preparaciones proteolíticas

Se trataron mutantes con proteasas para identificar moléculas resistentes. Se determinó la resistencia de las moléculas IFN \beta mutantes en comparación con IFN b de tipo silvestre frente a la escisión enzimática (120 min, 25ºC) por una mezcla de proteasas (que contenía 1,5 pg de cada una de las proteasas siguientes (1% p/p, Sigma): \alpha-quimotripsina, carboxipeptidasa, endoproteinasa Arg-C, endoproteinasa Asp-N, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Lys-C y tripsina). Al final del tiempo de incubación, se añadieron 10 \mul de anti-proteasas completo sin mini EDTA Roche (se disolvió un comprimido en 10 ml de DMEM y después se diluyó a 1/1000) a cada reacción para inhibir la actividad de proteasas. Después las muestras tratadas se usaron para determinar las actividades antiviral o antiproliferación residuales.

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Resistencia a proteasas - análisis cinético

Se evaluó el porcentaje de actividad IFN \beta residual con el tiempo de exposición a proteasas mediante un estudio cinético usando 1,5 pg de mezcla de proteasas. Los tiempos de incubación eran: 0 h, 0,5 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h y 48 h. En resumen, se añadieron 20 ml de cada muestra proteolítica (proteasas, suero, sangre) a 100 \mul de IFN \beta a 400 y 800 pg/ml y se incubaron durante tiempos variables según se indica. A los puntos temporales apropiados, se añadieron 10 \mul de mezcla anti-proteasas sin mini EDTA, Roche (se disolvió un comprimido en 10 ml de DMEM y después se diluyó a 1/500) a cada pocillo para interrumpir las reacciones de proteolisis. Después se realizaron ensayos de actividad biológica como se describe para cada muestra para determinar la actividad residual en cada punto temporal.

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Comportamiento

Las diversas actividades biológicas, resistencia a proteasas y potencia de cada mutante individual se analizaron usando un modelo y algoritmo matemático (NautScan^{TM} Patente Francesa Nº 9915884; (véase también la Solicitud PCT Internacional publicada Nº WO 01/44809 basada en la PCT Nº PCT/FR00/03503). Los datos se procesaron usando un modelo basado en la ecuación de Hill que usa indicadores de características clave del rendimiento de cada mutante individual. Los mutantes se clasificaron basándose en los valores de su rendimiento individual y se seleccionaron los de la parte superior de la lista de clasificación como LEAD.

Usando los métodos de exploración 2D y de exploración 3D descritos anteriormente además de la estructura tridimensional de IFN \beta, se identificaron las siguientes posiciones de diana de aminoácidos como is-HIT en IFN\beta, cuya numeración es la de proteína madura (SEC ID Nº: 196):

: Por exploración 3D (véanse, las SEC ID Nº 234-289, 989-1015): D por Q en la posición 39, D por H en la posición 39, D por G en la posición 39, E por Q en la posición 42, E por H en la posición 42, K por Q en la posición 45, K por T en la posición 45, K por S en la posición 45, K por H en la posición 45, L por V en la posición 47, L por I en la posición 47, L por T en la posición 47, L por Q en la posición 47, L por H en la posición 47, L por A en la posición 47, K por Q en la posición 52, K por T en la posición 52, K por S en la posición 52, K por H en la posición 52, F por I en la posición 67, F por V en la posición 67, R por H en la posición 71, R por Q en la posición 71, D por H en la posición 73, D por G en la posición 73, D por Q en la posición 73, E por Q en la posición 81, E por H en la posición 81, E por Q en la posición 107, E por H en la posición 107, K por Q en la posición 108, K por T en la posición 108, K por S en la posición 108, K por H en la posición 108, E por Q en la posición 109, E por H en la posición 109, D por Q en la posición 110, D por H en la posición 110, D por G en la posición 110, F por I en la posición 111, F por V en la posición 111, R por H en la posición 113, R por Q en la posición 113, L por V en la posición 116, L por I en la posición 116, L por T en la posición 116, L por Q en la posición 116, L por H en la posición 116, L por A en la posición 116, L por V en la posición 120, L por I en la posición 120, L por T en la posición 120, L por Q en la posición 120, L por H en la posición 120, L por A en la posición 120, K por Q en la posición 123, K por T en la posición 123, K por S en la posición 123, K por H en la posición 123, R por H en la posición 124, R por Q en la posición 124, R por H en la posición 128, R por Q en la posición 128, L por V en la posición 130, L por I en la posición 130, L por T en la posición 130, L por Q en la posición 130, L por H en la posición 130, L por A en la posición 130, K por Q en la posición 134, K por T en la posición 134, K por S en la posición 134, K por H en la posición 134, K por Q en la posición 136, K por T en la posición 136, K por S en la posición 136, K por H en la posición 136, E por Q en la posición 137, E por H en la posición 137, Y por H en la posición 163, Y por I en la posición 163I, R por H en la posición 165, R por Q en la posición 165.

: Por exploración 2D (véanse las SEC ID Nº 1016-1302, y la tabla anterior): M por V en la posición 1, M por I en la posición 1, M por T en la posición 1, M por Q en la posición 1, M por A en la posición 1, L por V en la posición 5, L por I en la posición 5, L por T en la posición 5, L por Q en la posición 5, L por H en la posición 5, L por A en la posición 5, F por I en la posición 8, F por V en la posición 8, L por V en la posición 9, L por I en la posición 9, L por T en la posición 9, L por Q en la posición 9, L por H en la posición 9, L por A en la posición 9, R por H en la posición 11, R por Q en la posición 11, F por I en la posición 15, F por V en la posición 1 5, K por Q en la posición 19, K por T en la posición 19, K por S en la posición 19, K por H en la posición 19, W por S en la posición 22, W por H en la posición 22, N por H en la posición 25, N por S en la posición 25, N por Q en la posición 25, R por H en la posición 27, R por Q en la posición 27, L por V en la posición 28, L por I en la posición 28, L por T en la posición 28, L por Q en la posición 28, L por H en la posición 28, L por A en la posición 28, E por Q en la posición 29, E por H en la posición 29, Y por H en la posición 30, Y por I en la posición 30, L por V en la posición 32, L por I en la posición 32, L por T en la posición 32, L por Q en la posición 32, L por H en la posición 32, L por A en la posición 32, K por Q en la posición 33, K por T en la posición 33, K por S en la posición 33, K por H en la posición 33, R por H en la posición 35, R por Q en la posición 35, M por V en la posición 36, M por I en la posición 36, M por T en la posición 36, M por Q en la posición 36, M por A 36, D por Q en la posición 39, D por H en la posición 39, D por G en la posición 39, E por Q 42, E por H 42, K por Q 45, K por T 45, K por S en la posición 45, K por H en la posición 45, L por V en la posición 47, L por I en la posición 47, L por T en la posición 47, L por, Q en la posición 47, L por H en la posición 47, L por A en la posición 47, K por Q en la posición 52, K por T 52, K por S en la posición 52, K por H en la posición 52, F por I en la posición 67, F por V en la posición 67, R por H en la posición 71, R por Q en la posición 71 D por Q en la posición 73, D por H en la posición 73, D por G en la posición 73, E por Q en la posición 81, E por H en la posición 81, E por Q en la posición 85, E por H en la posición 85, Y por H 92, Y por I en la posición 92, K por Q 99, K por T en la posición 99, K por S en la posición 99, K por H en la posición 99, E por Q en la posición 103, E por H en la posición 103, E por Q en la posición 104, E por H 104, K por Q 105, K por T en la posición 105, K por S en la posición 105, K por H en la posición 105, E por Q en la posición 107, E por H en la posición 107, K por Q en la posición 108, K por T en la posición 108, K por S 108, K por H 108, E por Q en la posición 109, E por H en la posición 109, D por Q en la posición 110, D por H en la posición 110, D por G en la posición 110, F por I en la posición 111, F por V en la posición 111, R por H en la posición 113, R por Q en la posición 113, L por V en la posición 116, L por I en la posición 116, L por T en la posición 116, L por Q en la posición 116, L por H en la posición 116, L por A en la posición 116, L por V 120, L por l en la posición 120, L por T en la posición 120, L por Q en la posición 120, L por H en la posición 120, L por A en la posición 120, K por Q en la posición 123, K por T en la posición 123, K por S en la posición 123, K por H en la posición 123, R por H en la posición 124, R por Q en la posición 124, R por H en la posición 128, R por Q en la posición 128, L por V en la posición 130, L por I en la posición 130, L por T en la posición 130, L por Q en la posición 130, L por H en la posición 130, L por A en la posición 130, K por Q en la posición 134, K por T en la posición 134, K por S en la posición 134, K por H en la posición 134, K por Q en la posición 136, K por T en la posición 136, K por S en la posición 136, K por H en la posición 136, E por Q en la posición 137, E por H en la posición 137, Y por H en la posición 138, Y por I en la posición 138, R por H en la posición 152, R por Q en la posición 152, Y por H en la posición 155, Y por I en la posición 155, R por H en la posición 159, R por Q en la posición 159, Y por H en la posición 163, Y por I en la posición 163, R por H en la posición 165, R por Q en la posición 165, M por D en la posición 1, M por E en la posición 1, M por K en la posición 1, M por N en la posición 1, M por R en la posición 1, M por S en la posición 1, L por D en la posición 5, L por E en la posición 5, L por K en la posición 5, L por N en la posición 5, L por R en la posición 5, L por S en la posición 5, L por D en la posición 6, L por E en la posición 6, L por K en la posición 6, L por N en la posición 6, L por R en la posición 6, L por S en la posición 6, L por Q en la posición 6, L por T en la posición 6, F por E en la posición 8, F por K en la posición 8, F por R en la posición 8, F por D en la posición 8, L por D en la posición 9, L por E en la posición 9, L por K en la posición 9, L por N en la posición 9, L por R en la posición 9, L por S en la posición 9, Q por D en la posición 10, Q por E en la posición 10, Q por K en la posición 10, Q por N en la posición 10, Q por en la posición 10, Q por S en la posición 10, Q por T en la posición 10, S por D en la posición 12, S por E en la posición 12, S por K en la posición 12, S por R en la posición 12, S por D en la posición 13, S por E en la posición 13, S por K en la posición 13, S por R en la posición 13, S por N en la posición 13, S por Q en la posición 13, S por T en la posición 13, N por D en la posición 14, N por E en la posición 14, N por K en la posición 14, N por Q en la posición 14, N por R en la posición 14, N ay S en la posición 14, N por T en la posición 14, F por D en la posición 15, F por E en la posición 15, F por K en la posición 15, F por R en la posición 15, Q por D en la posición 16, Q por E en la posición 16, Q por K en la posición 16, Q por N en la posición 16, Q por R en la posición 16, Q por S en la posición 16, Q por T en la posición 16, C por D en la posición 17, C por E en la posición 17, C por K en la posición 17, C por N en la posición 17, C por Q en la posición 17, C por R en la posición 17, C por S en la posición 17, C ay T en la posición 17, L por N en la posición 20, L por Q en la posición 20, L por R en la posición 20, L por S en la posición 20, L por T en la posición 20, L por D en la posición 20, L por E en la posición 20, L por K en la posición 20, W por D en la posición 22, W por E en la posición 22, W por K en la posición 22, W por R en la posición 22, Q por D en la posición 23, Q por E en la posición 23, Q por K en la posición 23, Q por R en la posición 23, L por D en la posición 24, L por E en la posición 24, L por K en la posición 24, L por R en la posición 24, W por D en la posición 79, W por E en la posición 79, W por K en la posición 79, W por R en la posición 79, N por D en la posición 80, N por E en la posición 80, N por K en la posición 80, N por R en la posición 80, T por D en la posición 82, T por E en la posición 82, T por K en la posición 82, T por R en la posición 82, I por D en la posición 83, I por E en la posición 83, I por K en la posición 83, I por R en la posición 83, I por N en la posición 83, I por Q en la posición 83, I por S en la posición 83, I por T en la posición 83, N por D en la posición 86, N por E en la posición 86, N por K en la posición 86, N por R en la posición 86, N por Q en la posición 86, N por S en la posición 86, N por T en la posición 86, L por D en la posición 87, L por E en la posición 87, L por K en la posición 87, L por R en la posición 87, L por N en la posición 87, L por Q en la posición 87, L por S en la posición 87, L por T en la posición 87, A por D en la posición 89, A por E en la posición 89, A por K en la posición 89, A por R en la posición 89, N por D en la posición 90, N por E en la posición 90, N por K en la posición 90, M por Q en la posición 90, N por R en la posición 90, N por S en la posición 90, N por T en la posición 90, V por D en la posición 91, V por E en la posición 91, V por K en la posición 91, V por N en la posición 91, V por Q en la posición 91, V por R en la posición 91, V por S en la posición 91, V por T en la posición 91, Q por D en la posición 94, Q por E en la posición 94, Q por Q en la posición 94, Q por N en la posición 94, Q por R en la posición 94, Q por S en la posición 94, Q por T en la posición 94, I por D en la posición 95, I por E en la posición 95, I por K en la posición 95, I por N en la posición 95, I por Q en la posición 95, I por R en la posición 95, I por S en la posición 95, I por T en la posición 95, H por D en la posición 97, H por E en la posición 97, H por K en la posición 97, H por N en la posición 97, H por Q en la posición 97, H por R en la posición 97, H por S en la posición 97, H por T en la posición 97, L por D en la posición 98, L por E en la posición 98, L por K en la posición 98, L por N en la posición 98, L por Q en la posición 98, L por R en la posición 98, L por S en la posición 98, L por T en la posición 98, V por D en la posición 101, V por E en la posición 101, V por K en la posición 101, V por N en la posición 101, V por Q en la posición 101, V por R en la posición 101, V por S en la posición 101, V por T en la posición 101, M por C en la posición 1, L por C en la posición 6, Q por C en la posición 10, S por C en la posición 13, Q por C en la posición 16, L por C en la posición 17, V por C en la posición 101, L por C en la posición 98, H por C en la posición 97, Q por C en la posición 94, V por C en la posición 91, N por C en la posición 90.

Puesto que serán evidentes modificaciones para los expertos en la materia, se pretende que esta invención esté limitada solamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> Nautilus Biotech

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Gantier, Rene

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Guyon, Thierry

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Vega, Manuel

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Drittanti, Lila

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<120> Desarrollo Racional de Citocinas para una Mayor Estabilidad, las Citocinas y las Moléculas de Ácido Nucleico Codificantes

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<130> BLOcp1374/6PCT

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<150> 60/457,135

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<151> 21-MAR-03

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<150> 60/409,898

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<151> 09-SEP-02

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<160> 1306

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<170> PatentInVer. 2.1

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<210> 1

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<211> 165

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip0,8cm

32

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<210> 2

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<211> 165

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> IFN-alfa 2b mutante D2A

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<400> 2

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\hskip0,8cm

33

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34

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<210> 3

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<211> 165

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> IFN-alfa 2b mutante P4A

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<400> 3

\hskip0,8cm

35

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<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Q5A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip0,8cm

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante T6A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip0,8cm

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante H7A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante S8A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L9A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante G10A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip0,8cm

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante S11A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R12A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R13A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante T14A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

45

\hskip0,8cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L15A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante M16A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L17A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Q20A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R23A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

51

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante I24A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante S25A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip0,8cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L26A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip0,8cm

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante S28A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante C29A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L30A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

57

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K31A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante D32A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R33A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

60

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante D35A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

61

\hskip0,8cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante G37A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante P39A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

64

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E41A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E42A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F43A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

67

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante N45A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F47A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip0,8cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E51A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip0,8cm

70

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante T52A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante I53A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante P54A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante V55A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L56A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip0,8cm

75

\hskip0,5cm

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante H57A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip0,8cm

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E58A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante M59A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante 160A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

80

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante I63A

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F64A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante N65A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

83

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L66A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F67A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip0,8cm

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante T69A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

86

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K70A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante D71A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip0,8cm

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante S72A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

89

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante W76A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante D77A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

91

\hskip0,8cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E78A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L81A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante D82A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K83A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

96

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F84A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Y85A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Y89A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Q90A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

100

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Q91A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante N93A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante D94A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\hskip0,8cm

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante C98A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante V99A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

105

\hskip0,8cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante G104A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L110A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante S115A

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\hskip0,8cm

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Y122A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\hskip0,8cm

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante W140A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\hskip0,8cm

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E146A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\hskip0,8cm

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L3V

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R12H

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R13H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

115

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante M16V

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante M16I

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R22H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

118

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F27I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F27V

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\hskip0,8cm

120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L30I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

121

\hskip0,8cm

122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K31Q

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R33H

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E41Q

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

125

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E41 H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E58Q

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\hskip0,8cm

127

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E58H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\hskip0,8cm

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K70T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E78Q

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E78H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

131

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Y89I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E107Q

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E107H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

134

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante P109A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L110V

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\hskip0,8cm

136

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante M111l

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\hskip0,8cm

137

\hskip0,8cm

138

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E113Q

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E113H

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L117V

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

141

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L117l

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K121Q

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K121T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

144

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R125H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R125Q

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L128V

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

147

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L128I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K131Q

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

149

\hskip0,8cm

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K131T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\hskip0,8cm

151

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E132Q

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E132H

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\hskip0,8cm

153

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K133Q

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\hskip0,8cm

154

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K133T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\hskip0,8cm

155

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K134Q

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\hskip0,8cm

156

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Y135H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Y135I

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante P137A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

159

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante M148V

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante M148I

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R149H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

162

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R149Q

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E159Q

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\hskip0,8cm

164

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E159H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

165

\hskip0,6cm

166

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante P4S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Q5N/H7S

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

168

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Q5N/H7T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

169

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante T6N/S8S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante S8N/G10S

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante S8N/G10T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

172

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<210> 132

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<211> 165

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante M21 N/R23S

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

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<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R23N/S25T

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

174

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante124N/L26S

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

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\hskip0,8cm

175

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<210> 135

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<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante S25N/F27S

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

176

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante S25N/F27T

\newpage

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<400> 136

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\hskip0,8cm

177

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

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<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L26N/S28S

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

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\hskip0,8cm

178

\newpage

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<210> 138

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<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L26N/S28T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

179

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L30N/D32S

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\hskip0,8cm

180

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R33N/D35S

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

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\hskip0,8cm

181

\hskip0,6cm

182

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<210> 141

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<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante R33N/D35T

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

183

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante H34N/F36S

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<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

184

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante H34N/F36T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

185

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante D35N/G37S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F36N/F38S

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

187

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F36N/F38T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

188

\newpage

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<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante G37N/P39T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F38N/Q40S

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

190

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F38N/Q40T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\hskip0,8cm

191

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante P39N/E41S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante P39N/E41T

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

193

\hskip0,6cm

194

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Q40N/E42S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

195

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Q40N/E42T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

196

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E41 N/F43S

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E41 N/F43T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

198

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante G44N/Q46S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante G44N/Q46T

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante N45N/F47S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

201

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante N45N/F47T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Q46N/Q48S

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

203

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Q46N/Q48T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\hskip0,8cm

204

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F47N/K49S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante F47N/K49T

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K49N/E51S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

207

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante A75N/D77S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante I100N/G102S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

209

\hskip0,8cm

210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante I100N/G102T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante V103N/V105S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante V103IW105T

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante G104N/T106T

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante V105N/E107S

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante T106N/T108S

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante T106N/T108T

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\hskip0,8cm

217

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E107N/P109S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

218

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E107N/P109T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante K134N/S136T

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.8cm

220

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L157N/E159S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\hskip0,8cm

221

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante L157N/E159T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante Q158N/S160T

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E159N/L161S

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\hskip0,8cm

224

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IFN-alfa 2b mutante E159N/L161T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\hskip0,8cm

225

\hskip0,8cm

226

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA23805

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 17-12-1994

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank P01566

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 21-07-1986

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

228

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Marmota monax

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAL76913

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 12-02-2002

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

229

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<309> - -

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\hskip0,8cm

230

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAB59403

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 15-11-1994

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA26702

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 30-03-1995

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA26704

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 30-03-1995

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\hskip0,8cm

233

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank NP_066546

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 02-11-2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\hskip0,8cm

234

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA26701

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 30-03-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAA52725

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 08-11-1994

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

236

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA23792

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 04-08-1994

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\hskip0,8cm

237

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA23794

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 17-12-1994

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAA52718

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 08-11-1994

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\hskip0,8cm

239

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA26903

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 30-03-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\hskip0,8cm

240

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAC41702

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 01-01-1995

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA23795

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 12-09-1993

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

242

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA00839

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 03-12-1993

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA31639

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 15-11-1994

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\hskip0,8cm

244

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank NP_00063

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 31-10-2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\hskip0,8cm

245

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAA52400

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 08-11-1994

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\hskip0,8cm

246

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAA98768

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 02-05-1996

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\hskip0,8cm

247

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAA19825

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 19-07-1994

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> AAD48509

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 11-08-1999

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\hskip0,8cm

249

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAA59146

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 06-01-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAA85480

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 19-01-1996

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

\hskip0,8cm

251

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAA59149

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 06-01-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

\hskip0,8cm

252

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA28390

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 21-03-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

\hskip0,8cm

253

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank NP_002179

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 31-10-2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\hskip0,8cm

254

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA27168

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 21-03-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

255

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAA60470

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 13-01-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 211

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

256

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank NP_000605

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 17-07-2002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

257

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank CAA32147

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 22-03-1995

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

258

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAA36388

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 27-04-1993

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

259

\hskip0,5cm

260

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AF101062

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 03-03-1999

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

261

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<309> - -

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

262

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> Genbank AAD13886

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 28-06-1993

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

263

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Directo EcoRI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctgtatga tttattggat gttggaattc cctgatgcgg tattttctcc ttacg

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Inverso EcoRI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtaaggaga aaataccgca tcagggaatt ccaacatcca ataaatcata caggc

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Directo Sec ClaI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgattatca accgcggtac atatgattga catgc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Inverso Sec ClaI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Directo Seq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgatgaag gaggactc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Inverso Seq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagcagca gatgagtc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador 5' IFN alfa-2b

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagctgcaa gtcaagctgc tctgtgggct g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador 3' IFN alfa-2b

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctctagatc attccttact tcttaaactt tcttgcaagt ttgttgac

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador IFN alfa-2b HindIII

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccaagctta tggccttgac ctttgcttta ctggtg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador IFN alfa-2b XbaI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctctagatc attccttact tcttaaactt tcttgcaagt ttgttgac

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador 5' IFN alfa-2b 80 pb

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

\hskip0,8cm

264

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Directo EMCV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccctacatt gaggcatcca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Inverso EMCV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggagcagg acaaggtcac t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda EMCV

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es FAM

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es TAMR A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ncagccgtca agacccaacc gctn

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia consenso de Interferón alfa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

\hskip0,8cm

265

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

\hskip0,8cm

266

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

\hskip0,8cm

267

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\hskip0,8cm

268

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

269

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

270

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

271

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

\hskip0,8cm

272

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\hskip0,8cm

273

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\hskip0,8cm

274

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\hskip0,8cm

275

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

\hskip0,8cm

276

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

\hskip0,8cm

277

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

278

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\hskip0,8cm

279

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\hskip0,8cm

280

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

\hskip0,8cm

281

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

\hskip0,8cm

282

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

283

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\hskip0,8cm

284

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\hskip0,8cm

285

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

286

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

287

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

\hskip0,8cm

288

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\hskip0,8cm

289

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

290

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

291

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

\hskip0,8cm

292

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 260

\hskip0,8cm

2920

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

\hskip0,8cm

293

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

\hskip0,8cm

294

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 263

\hskip0,8cm

295

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<210> 264

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 264

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

296

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 265

\hskip0,8cm

297

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<210> 266

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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298

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 267

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299

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 268

\hskip0,8cm

300

\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 269

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

301

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\vskip1.000000\baselineskip

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 270

\hskip0,8cm

302

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<210> 271

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 271

\hskip0,8cm

303

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<210> 272

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 272

\hskip0,8cm

304

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 273

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 273

\hskip0,8cm

305

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 274

\hskip0,8cm

306

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<210> 275

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

307

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

308

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 277

\hskip0,8cm

309

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

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310

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<212> PRT

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311

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

312

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

313

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 282

\hskip0,8cm

314

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

315

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 284

\hskip0,8cm

316

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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317

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

318

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip0,8cm

319

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

320

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\vskip1.000000\baselineskip

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

321

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

322

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\vskip1.000000\baselineskip

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<211> 100

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

323

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

324

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

325

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

326

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

327

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328

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

329

\hskip0,8cm

330

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

331

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\hskip0,8cm

332

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<212> PRT

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333

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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334

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335

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336

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337

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\hskip0,8cm

338

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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343

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<213> Homo sapiens

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344

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<213> Homo sapiens

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345

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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346

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347

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

348

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352

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353

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354

\hskip0,8cm

3540

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356

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363

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\hskip0,8cm

364

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371

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<213> Homo sapiens

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372

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373

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374

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\hskip0,8cm

376

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\hskip0,8cm

377

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<212> PRT

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379

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381

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<212> PRT

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382

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\hskip0,8cm

383

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

384

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

467

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512

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523

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

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<212> PRT

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<211> 129

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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632

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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633

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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634

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635

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636

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639

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641

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643

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653

\hskip0,8cm

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<213> Homo sapiens

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654

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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658

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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659

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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660

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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662

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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663

\hskip0,8cm

664

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<211> 112

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 626

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\hskip0,8cm

665

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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667

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 629

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\hskip0,8cm

668

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<211> 112

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 630

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\hskip0,8cm

669

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 632

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671

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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672

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<210> 634

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 634

\hskip0,8cm

673

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 635

\hskip0,8cm

674

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 636

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\hskip0,8cm

675

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 637

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676

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<210> 638

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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677

\hskip0,8cm

678

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 639

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679

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 640

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680

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 177

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<213> Homo sapiens

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682

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683

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 644

\hskip0,8cm

684

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<211> 177

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<212> PRT

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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688

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

691

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\hskip0,8cm

692

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\hskip0,8cm

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 658

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\hskip0,8cm

699

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<211> 177

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

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<213> Homo sapiens

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<400> 660

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702

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

703

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

704

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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705

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<213> Homo sapiens

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706

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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708

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

709

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<211> 146

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 668

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\hskip0,8cm

710

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 669

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\hskip0,8cm

711

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<211> 146

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 670

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\hskip0,8cm

712

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<211> 146

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 671

\hskip0,8cm

713

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

714

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

715

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 674

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\hskip0,8cm

716

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

718

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

719

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 678

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\hskip0,8cm

720

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

721

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\hskip0,8cm

722

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

723

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

724

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

725

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

726

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<211> 200

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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727

\hskip0,8cm

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729

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733

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\hskip0,8cm

734

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735

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\hskip0,8cm

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737

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738

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752

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757

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762

\hskip0,8cm

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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773

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<213> Homo sapiens

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774

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\hskip0,8cm

775

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776

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777

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779

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782

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783

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784

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786

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799

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801

\hskip0,8cm

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\hskip0,8cm

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806

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<213> Homo sapiens

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811

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<213> Homo sapiens

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<211> 227

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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817

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819

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\hskip0,8cm

820

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821

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\hskip0,8cm

822

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<210> 771

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<211> 227

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

823

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<210> 772

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<211> 227

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 772

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\hskip0,8cm

824

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<211> 227

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

825

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<211> 227

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

826

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

828

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

829

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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830

\hskip0,8cm

831

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<211> 227

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

832

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<211> 227

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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833

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834

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835

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836

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837

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838

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839

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

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<212> PRT

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841

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<212> PRT

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842

\hskip0,8cm

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<212> PRT

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843

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844

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

845

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

846

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\hskip0,8cm

848

\hskip0,8cm

849

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<211> 197

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

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<211> 197

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<213> Homo sapiens

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<400> 796

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\hskip0,8cm

851

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

852

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 798

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\hskip0,8cm

853

\hskip0,8cm

854

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

857

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

859

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858

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<211> 197

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

862

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<211> 197

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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863

\hskip0,8cm

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

864

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<211> 197

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

865

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<211> 197

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip0,8cm

866

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<211> 197

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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869

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871

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876

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887

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888

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889

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892

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897

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<212> PRT

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900

\hskip0,8cm

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\hskip0,8cm

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\hskip0,8cm

903

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\hskip0,8cm

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

909

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<211> 197

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 848

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\hskip0,8cm

910

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<211> 197

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 849

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912

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<210> 850

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<211> 191

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<212> PRT

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943

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994

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<212> PRT

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 937

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1010

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1011

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1012

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 939

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1013

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1014

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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1022

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1026

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1036

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1037

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<213> Homo sapiens

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1039

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1040

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1043

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1046

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1047

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 976

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\hskip0,8cm

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

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\hskip0,8cm

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1058

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 979

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 979

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 980

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1060

\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 981

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1061

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<211> 165

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 982

\hskip0,8cm

1062

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 983

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1063

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 984

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1064

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<213> Homo sapiens

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1065

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1067

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1069

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

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<213> Homo sapiens

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1077

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1079

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1080

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\hskip0,8cm

1082

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1083

\hskip0,8cm

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\hskip0,8cm

1085

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1086

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\hskip0,8cm

1087

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1088

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\hskip0,8cm

1089

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<213> Homo sapiens

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<400> 1007

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\hskip0,8cm

1090

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1091

\hskip0,8cm

1092

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1093

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1010

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1094

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1095

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1096

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1097

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1098

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1099

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1016

\hskip0,8cm

1100

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1101

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1102

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1103

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1020

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1104

\hskip0,8cm

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<213> Homo sapiens

\newpage

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\hskip0,8cm

1106

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1022

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\hskip0,8cm

1107

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1108

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1024

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1109

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

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\vskip1.000000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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1111

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1112

\hskip0,8cm

1113

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip0,8cm

1114

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1029

\hskip0,8cm

1115

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1030

\hskip0,8cm

1116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1031

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1031

\hskip0,8cm

1117

\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1118

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1033

\hskip0,8cm

1119

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<210> 1034

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1034

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1036

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1122

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1037

\hskip0,8cm

1123

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<210> 1038

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1038

\hskip0,8cm

1124

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1125

\hskip0,5cm

1126

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1040

\hskip0,8cm

1127

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1041

\hskip0,8cm

1128

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1042

\hskip0,8cm

1129

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<210> 1043

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<211> 165

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1043

\hskip0,8cm

1130

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<210> 1044

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1044

\hskip0,8cm

1131

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1132

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<212> PRT

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1047

\hskip0,8cm

1135

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1048

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\hskip0,8cm

1136

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1049

\hskip0,8cm

1137

\newpage

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1138

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1051

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\hskip0,8cm

1139

\hskip0,8cm

1140

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1052

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\hskip0,8cm

1141

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 1053

\hskip0,8cm

1142

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1144

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1056

\hskip0,8cm

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1057

\hskip0,8cm

1146

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1058

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1147

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1060

\hskip0,8cm

1149

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1061

\hskip0,8cm

1150

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1062

\hskip0,8cm

1151

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1063

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1152

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<210> 1064

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1064

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\hskip0,8cm

1153

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1065

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1154

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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\hskip0,8cm

1155

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1067

\hskip0,8cm

1156

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1068

\hskip0,8cm

1157

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1069

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1158

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1070

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1159

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1071

\hskip0,8cm

1160

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<210> 1072

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1072

\hskip0,8cm

1161

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<210> 1073

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1073

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1162

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1074

\hskip0,8cm

1163

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1075

\hskip0,8cm

1164

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1076

\hskip0,8cm

1165

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1077

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1078

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1078

\hskip0,8cm

1167

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1079

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1079

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1168

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<210> 1080

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1080

\hskip0,8cm

1169

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1081

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1170

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1082

\hskip0,8cm

1171

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1083

\hskip0,8cm

1172

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<210> 1084

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1084

\hskip0,8cm

1173

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<210> 1085

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1085

\hskip0,8cm

1174

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<210> 1086

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1086

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\hskip0,8cm

1175

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1087

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\hskip0,8cm

1176

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<210> 1088

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1088

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1089

\hskip0,8cm

1178

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1090

\hskip0,8cm

1179

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1180

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1092

\hskip0,8cm

1181

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<212> PRT

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1182

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<212> PRT

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1183

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<212> PRT

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1184

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<400> 1096

\hskip0,8cm

1185

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1097

\hskip0,8cm

1186

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1187

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1188

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1100

\hskip0,8cm

1189

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<210> 1101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1101

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1190

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1102

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1102

\hskip0,8cm

1191

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\hskip0,8cm

1192

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1104

\hskip0,8cm

1193

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1105

\hskip0,8cm

1194

\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1107

\hskip0,8cm

1196

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1108

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1108

\hskip0,8cm

1197

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1109

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1198

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<210> 1110

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1110

\hskip0,8cm

1199

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<210> 1111

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1111

\hskip0,8cm

1200

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<210> 1112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1112

\hskip0,8cm

1201

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<210> 1113

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1113

\hskip0,8cm

1202

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1114

\hskip0,8cm

1203

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1115

\hskip0,8cm

1204

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1116

\hskip0,8cm

1205

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1117

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1117

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\hskip0,8cm

1206

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1118

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1207

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1119

\hskip0,8cm

1208

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1120

\hskip0,8cm

1209

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1121

\hskip0,8cm

1210

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1122

\hskip0,8cm

1211

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1123

\hskip0,8cm

1212

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1124

\hskip0,8cm

1213

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1125

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1126

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\hskip0,8cm

1215

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1128

\hskip0,8cm

1217

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1129

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1218

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<210> 1130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 1130

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

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1256

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<211> 166

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<213> Homo sapiens

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1257

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1259

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

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1262

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1170

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 1171

\hskip0,8cm

1264

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1172

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1172

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1265

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1267

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1268

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1269

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1272

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1273

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1180

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1274

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<210> 1181

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1181

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1275

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<213> Homo sapiens

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1276

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1277

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1184

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1278

\hskip0,8cm

1279

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<213> Homo sapiens

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1280

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<213> Homo sapiens

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1282

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1283

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1284

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<400> 1190

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1285

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1286

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1287

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<212> PRT

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1288

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1289

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1195

\hskip0,8cm

1290

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<213> Homo sapiens

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1291

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\hskip0,8cm

1292

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

1293

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<211> 166

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

1294

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1200

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1295

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1201

\hskip0,8cm

1296

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<210> 1202

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1202

\hskip0,8cm

1297

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1298

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\hskip0,8cm

1299

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<212> PRT

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip0,8cm

1300

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1301

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<213> Homo sapiens

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<400> 1207

\hskip0,8cm

1302

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1208

\hskip0,8cm

1303

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1209

\hskip0,8cm

1304

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1210

\hskip0,8cm

1305

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<210> 1211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1211

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1306

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1212

\hskip0,8cm

1307

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<210> 1213

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1213

\hskip0,8cm

1308

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1214

\hskip0,8cm

1309

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1215

\hskip0,8cm

1310

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1216

\hskip0,8cm

1311

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1217

\hskip0,8cm

1312

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1218

\hskip0,8cm

1313

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1219

\hskip0,8cm

1314

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<210> 1220

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1220

\hskip0,8cm

1315

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<210> 1221

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1221

\hskip0,8cm

1316

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<210> 1222

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1222

\hskip0,8cm

1317

\hskip0,8cm

1318

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1223

\hskip0,8cm

1319

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1224

\hskip0,8cm

1320

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1225

\hskip0,8cm

1321

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1226

\hskip0,8cm

1322

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1227

\hskip0,8cm

1323

\hskip0,8cm

1324

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1228

\hskip0,8cm

1325

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1229

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1229

\hskip0,8cm

1326

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1230

\hskip0,8cm

1327

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1231

\hskip0,8cm

1328

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1232

\hskip0,8cm

1329

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<213> Homo sapiens

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1342

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<212> PRT

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<212> PRT

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1354

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<213> Homo sapiens

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1355

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<211> 166

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<212> PRT

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1356

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1357

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1358

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1359

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1260

\hskip0,8cm

1360

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1261

\hskip0,8cm

1361

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1262

\hskip0,8cm

1362

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1263

\hskip0,8cm

1363

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1264

\hskip0,8cm

1364

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1265

\hskip0,8cm

1365

\hskip0,8cm

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<210> 1266

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1266

\hskip0,8cm

1367

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<210> 1267

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1267

\hskip0,8cm

1368

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<210> 1268

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1268

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1369

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<210> 1269

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1269

\hskip0,8cm

1370

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1270

\hskip0,8cm

1371

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1271

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1271

\hskip0,8cm

1372

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<210> 1272

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1272

\hskip0,8cm

1373

\hskip0,8cm

1374

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<210> 1273

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1273

\hskip0,8cm

1375

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1274

\hskip0,8cm

1376

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1275

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1275

\hskip0,8cm

1377

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1276

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1276

\hskip0,8cm

1378

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1277

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1277

\hskip0,8cm

1379

\hskip0,8cm

1380

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<210> 1278

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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1381

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<210> 1279

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1279

\hskip0,8cm

1382

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<210> 1280

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1280

\hskip0,8cm

1383

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1281

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 1281

\hskip0,8cm

1384

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1282

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<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1282

\hskip0,8cm

1385

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1283

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1283

\hskip0,8cm

1386

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1284

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1284

\hskip0,8cm

1387

\hskip0,8cm

1388

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1285

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1285

\hskip0,8cm

1389

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1286

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1286

\hskip0,8cm

1390

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1287

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1287

\hskip0,8cm

1391

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1288

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1288

\hskip0,8cm

1392

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1289

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1289

\hskip0,8cm

1393

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1290

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1290

\hskip0,8cm

1394

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1291

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1291

\hskip0,8cm

1395

\hskip0,8cm

1396

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1292

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1292

\hskip0,8cm

1397

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1293

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1293

\hskip0,8cm

1397

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1294

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1294

\hskip0,8cm

1398

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1295

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1295

\hskip0,8cm

1399

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1296

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1296

\hskip0,8cm

1400

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1297

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1297

\hskip0,8cm

1401

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1298

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1298

\hskip0,8cm

1402

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1299

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1299

\hskip0,8cm

1403

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1300

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1300

\hskip0,8cm

1404

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1301

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1301

\hskip0,8cm

1405

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1302

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1302

\hskip0,8cm

1406

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1303

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1303

\hskip0,8cm

1407

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1304

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador inverso INFA-E159H

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1304

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctc attccttact tcttaaactg tgttgcaagt ttgttg

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1305

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador inverso INFA-E159Q

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1305

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctc attccttact tcttaaactc tgttgcaagt ttgttg

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1306

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador inverso IFNA-E159Q

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1306

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacatatgtg tgatctgcct caaacccaca gcctgggtag c

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Una citocina interferón alfa modificada que presenta una resistencia aumentada a la proteolisis en comparación con la citocina no modificada, en la que:

: la citocina interferón alfa modificada es una IFN\alpha-2b o una IFN\alpha-2a que comprende una sustitución de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 ó 182, correspondiente a la sustitución de E por Q en la posición 41, en la que el resto 1 se corresponde con el resto 1 de la citocina IFN\alpha-2b o IFN\alpha-2a madura expuesta en las SEC ID Nº: 1 ó 182; o

: la citocina interferón alfa modificada es un homólogo estructural de IFN\alpha-2b que comprende una sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente a la sustitución de E por Q en la posición 41 en IFN\alpha2b.

2. La citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, en la que la citocina modificada es un interferón \alpha modificado que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87 o una citocina modificada basándose en la homología tridimensional con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87.

3. La citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, que es una proteína humana.

4. La citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, que es una citocina IFN\alpha-2b modificada.

5. Una citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, en la que la citocina comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87, en la que la arginina en la posición 23 se sustituye con una lisina.

6. La citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, en la que el homólogo estructural de IFN\alpha-2b se selecciona de entre IFN\alpha-c, IFN\alpha-d, IFN\alpha-5, IFN\alpha-6, IFN\alpha-4, IFN\alpha-4b, IFN\alpha-I, IFN\alpha-J, IFN\alpha-H, IFN\alpha-F, IFN\alpha-8 y citocina IFN\alpha-consenso.

7. La citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, que es una IFN\alpha-2b o una IFN\alpha-2a que comprende una sustitución de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 ó 182, que se corresponden con la sustitución de E por Q en la posición 41.

8. Una molécula de ácido nucleico que codifica una citocina de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.

10. Una célula eucariota aislada que comprende el vector de la reivindicación 9.

11. Un método para la expresión de una citocina interferón alfa modificada que comprende:

: introducir un ácido nucleico de la reivindicación 8 en un hospedador; y

: cultivar la célula, en condiciones y en la que se expresan las citocinas codificadas modificadas.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el hospedador es una célula hospedadora eucariota.

13. Una citocina interferón alfa modificada de acuerdo con la reivindicación 1 producida por el método de la reivindicación 11.

14. Una composición farmacéutica que comprende una citocina de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, que se formula para administración oral.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, que es un comprimido o una cápsula.

17. Una composición farmacéutica de la reivindicación 14 o reivindicación 15 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en la que se ha usado interferón alfa para el tratamiento.

18. Uso de una citocina interferón alfa modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la formulación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección en la que se ha usado interferón alfa para el tratamiento.