JPH04235198A - 修飾ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬あるいは診断薬と
して利用し得る生理活性ポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、種々の有用な生理活性を有するポ
リペプチドおよびタンパク質が数多く見い出され、それ
らを医薬あるいは診断薬として利用しようとする試みが
なされている。この応用の際に重要なことは、それらの
ポリペプチド類が応用時に十分にその生理活性を発揮し
得ることである。これを達成するために、そのポリペプ
チドの安定化条件を選んだり、調製方法を工夫したりす
るほか、いわゆる遺伝子組換え技術によってその一次構
造中のアミノ酸残基を変換し、積極的に生理活性の安定
化や生理活性の増大を図る例がある。

【０００３】この試みは、いずれもアミノ酸重合体であ
るポリペプチド鎖の立体構造に注目してポリペプチド鎖
自身の修飾として行なわれている。例えば、ヒト・イン
ターフェロンβの遊離のシステインをセリンに変換して
会合を防いだり〔Ｍａｒｋら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．
　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　８１，　５６６
２　（１９８４）〕、Ｔ４ファージに新たにシステイン
を導入して分子内ジスルフィド結合を作って耐熱性を向
上させたり〔Ｐｅｒｒｙ　とＷｅｔｚｅｌ，　Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，　２２６，　５５５　（１９８４）〕、あるい
はヒト・リゾチームでアルギニンの位置を変えて至適ｐ
Ｈを変化させた例〔Ｍｕｒａｋｉら、Ｐｒｏ　ｔｅｉｎ
　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　２，　４９　（１９８８
）〕などがある。

【０００４】しかしながら、アミノ酸残基変換による機
能改良の試みは、ポリペプチド鎖の立体構造と機能との
相関が十分に解明されていない現在、個々のポリペプチ
ドおよびタンパク質においてある程度試行錯誤的に行な
われ、成功の確率も低く、十分にその目的が達せられな
い場合がしばしば生じている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】今まで述べてきたよう
に、生理活性ポリペプチドを医薬や診断薬として応用し
ていくためには、該ポリペプチドの安定化や生理活性の
増大などが改良されるべき課題として残っている。すな
わち、生理活性ポリペプチドはその物質的特性上、生体
内に投与された場合にはプロテアーゼに分解されやすい
という弱点があるため、これを改善して血中安定性や熱
安定性を高めることが求められている。また、生理活性
ポリペプチドは複数の生物学的作用を有していることが
多いため、標的細胞や標的臓器への選択的な取り込みを
促進させることも改善すべき点とて挙げられる。

【０００６】これらの課題が解決され得れば、生理活性
ポリペプチドは本来の生理的濃度に準じた必要最低限の
用量で十分に薬効を発揮させることができ、副作用を抑
えながら優れた薬剤として実用に供することができる。

【０００７】血清タンパク質に代表される生理活性ポリ
ペプチドの多くは、糖タンパク質やリポタンパク質など
の複合タンパク質である。これらの複合タンパク質の生
理活性は、単にポリペプチド鎖自身の立体構造によって
のみ規定されるものではなく、結合している糖鎖やリピ
ドによってもその活性が制御されていることが最近明ら
かになってきた。

【０００８】特に糖タンパク質においては、糖鎖はタン
パク質の安定化、代謝におけるシグナル作用、細胞内局
所のシグナル作用およびレセプターや標的細胞に対する
認識分子としてのシグナル作用などの機能を持つことが
報告されている〔例えば、高崎誠一、実験医学、Ｖｏｌ
．５，　ｐ．４２７　（１９８７）　〕。従って、生理
活性ポリペプチドを医薬や診断薬として応用を図ってい
くためには、ポリペプチド鎖自身の立体構造に着目した
改変ばかりでなく、糖鎖のような機能性高分子を人工的
に導入して高機能化ポリペプチドへ改変することにより
、さらに有用性の高い生理活性ポリペプチド誘導体を作
成することが可能となる。

【０００９】しかしながら、糖タンパク質の糖鎖機能に
注目した研究は、糖鎖をアシアロ化すると肝での代謝が
速まるという研究〔Ａｓｈｗｅｌｌ　と　Ｍｏｒｒｅｌ
ｌ，　Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　４１，　９９　（
１９７４）　〕を始めとして、糖鎖を除去すると性腺刺
激ホルモンの生理活性が消失するという研究〔Ｍｏｙｌ
ｅ　ら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２５０，　９
１６３　（１９７５）〕に代表されるように、既存の糖
鎖を修飾したり欠失させたりして、その生物学的機能を
調べる研究がほとんどであり、タンパク質の機能改善は
十分に達成されていないのが現状である。

【００１０】本発明は、医薬あるいは診断薬となる可能
性のある生理活性ポリペプチドおよびタンパク質に対し
て、遺伝子工学的にアミノ酸残基変換を行ない、糖鎖結
合部位を導入することによって生合成的に糖鎖を付加さ
せ、上記の課題を解決しようとするものである。本発明
者は、この目的に沿って鋭意研究の結果、本発明を完成
した。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記目的は、以下の本発
明により達成される。すなわち本発明は、下記の部分配
列 Ｘ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ Ｘ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ Ｘ−Ｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ　　または Ｘ−Ｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ （ここで、ＸおよびＹはＡｓｎ以外のアミノ酸を示す）
を含む生理活性ポリペプチドのＸまたはＹの全部または
一部をアスパラギンに変換させた修飾ポリペプチド、お
よび該修飾ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。 すなわち本発明は、特定配列中のアミノ酸をアスパラギ
ンに変換させた修飾ポリペプチドをコードする遺伝子を
、真核細胞を宿主として発現させることにより、アスパ
ラギン結合型糖鎖を付加させることを特徴とする修飾ポ
リペプチドに関する。本発明のアミノ酸変換により新た
に導入されたアスパラギン−Ｙ−セリンまたはスレオニ
ン−セリンまたはスレオニン（Ａｓｎ−Ｙ−Ｓｅｒ／Ｔ
ｈｒ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、Ｘ−アスパラギン−セリンま
たはスレオニン−セリンまたはスレオニン（Ｘ−Ａｓｎ
−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、あるいはアスパ
ラギン−アスパラギン−セリンまたはスレオニン−セリ
ンまたはスレオニン（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ
−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）というアスパラギン結合型糖鎖結合
部位によって、該ポリペプチドにアスパラギン結合型糖
鎖を生合成的に付加させることができる。

【００１２】この場合、導入されたアスパラギン残基の
Ｎ末端側４、５あるいは６番目にセリンあるいはスレオ
ニンが存在していることがより好ましく、従って導入さ
れたアスパラギン残基のＮ末端側４、５あるいは６番目
のアミノ酸残基を同時にセリンあるいはスレオニンに変
換させることが好ましい。具体的には、上記部分配列の
アミノ酸残基ＸあるいはＹからそれぞれＮ末端側の４、
５あるいは６番目のアミノ酸残基をセリンあるいはスレ
オニンに変換させることを意味する。

【００１３】本発明でアスパラギンに変換されるＸまた
はＹのアミノ酸残基は、いかなるアミノ酸でもかまわな
い。また、Ｙをアスパラギンに変換しない場合、Ｙはプ
ロリン以外であることが好ましく、プロリンの場合には
、このプロリンを他のアミノ酸残基（例えば、アラニン
など）に置換することが好ましい。

【００１４】上記の糖鎖結合アミノ酸配列を導入する一
次構造の部位は、導入によってその生理活性ポリペプチ
ドの立体構造に大きな変化を与えずに本来の生理活性を
消失あるいは減弱しない部位が選ばれるべきで、本発明
に述べたセリンあるいはスレオニンの一方または両方が
少なくとも２残基以上並んだ配列の領域はこれに該当す
る。また、この領域の近傍にはプロリンや親水性アミノ
酸が存在することが好ましい。また、セリンあるいはス
レオニンの一方または両方が少なくとも２残基以上並ん
だ配列があれば、ポリペプチドの一次構造上、基本的に
いずれの部位も本発明による改変の対象となり得るが、
アミノ末端あるいはカルボキシル末端、近傍においては
、生体内で生理活性発現のためにプロセシングを受けて
切断除去される可能性のある領域は避けることが望まし
い。具体的には、プレプロ体あるいはプロ体となってい
る生理活性ポリペプチドを考慮し、シグナル配列が除去
された天然型ポリペプチドのアミノ末端から９残基以降
をアスパラギンに変換することが好ましい。

【００１５】本発明でいう生理活性ポリペプチドは、下
記の部分配列 Ｘ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ Ｘ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ Ｘ−Ｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒまたは Ｘ−Ｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ （ここで、ＸおよびＹはＡｓｎ以外のアミノ酸を示す）
を有するものであれば特に限定されないが、具体的には
、免疫調節作用のあるリンフォカインやサイトカイン類
〔インターフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（
ＩＬ）類、腫瘍懐死因子（ＴＮＦ）など〕、増殖因子類
〔上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ
）、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（Ｆ
ＧＦ）など〕、造血ホルモン類〔コロニー刺激因子（Ｃ
ＳＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、血小板因子４
（ＰＦ４）など〕などが挙げられる。この中でも、ＩＦ
Ｎ−β、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、
Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＰＦ
４、ｂＦＧＦなどが好ましく用いられる。

【００１６】また、本発明の対象になり得る生理活性ポ
リペプチドは、自然界に存在する哺乳動物細胞で生産さ
れ得るアミノ酸配列を有するもの、すなわち天然型が好
ましく、該天然型と実質的に同等の活性を有するもので
あれば、アミノ酸の置換、欠失、挿入などから構成され
るポリペプチドでもよい。

【００１７】本発明の糖鎖結合部位を導入した修飾ポリ
ペプチドを得る方法は、いわゆる遺伝子組換え技術によ
り、前記部分配列を有する目的のポリペプチドの任意の
ＸまたはＹをアスパラギンに変換させたＡｓｎ−Ｙ−Ｓ
ｅｒ／Ｔｈｒ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｘ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ／
Ｔｈｒ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、またはＡｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅ
ｒ／Ｔｈｒ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒなる糖鎖結合アミノ酸配列
をコードする塩基配列を導入したｃＤＮＡを作成し、こ
れを適当な発現ベクターに組込み、さらにこれを適当な
真核細胞に感染させて、その細胞において生合成的に糖
鎖の付加されたポリペプチドを生産させる方法が用いら
れる。

【００１８】上記の糖鎖結合アミノ酸配列をコードする
塩基配列を導入する方法は、いわゆる部位特異的突然変
異誘発法といわれ、具体的には亜硝酸と合成オリゴタク
レオチドを用いた方法〔広瀬　　進、実験医学、Ｖｏｌ
．５，　ｐ．１０８６　（１９８７）〕、カセット変異
法〔岸本利光、同誌、Ｖｏｌ．５，　ｐ．１０９２　（
１９８７）〕やＥｃｋｓｔｅｉｎらの方法〔Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃｉｄ．　Ｒｅｓ．，　１３，　８７４７　（
１９８５）　および同誌、１３，　８７６４　（１９８
５）　〕などがある。

【００１９】宿主として用いらる真核細胞には、酵母、
昆虫、両生類および哺乳動物の細胞が挙げられるが、好
ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズ・ハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＬ
細胞、サルＣＯＳ細胞などが挙げられる。

【００２０】また、生合成的に付加される糖鎖構造は、
目的とするポリペプチドの立体構造と宿主細胞の糖鎖合
成能に依存するため特に限定されないが、フコース、マ
ンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコンサミン
、およびシアル酸のうちの１種類以上を構成単位として
成立する、いわゆる高マンノース型、複合型、混成型な
どのアスパラギン結合型糖鎖を主に含み、Ｎ−アセチル
ガラクトサミンを構成単位とする糖鎖を含むこともある
。さらにまた、このようにして生合成的に新たに付与さ
れた糖鎖を該ポリペプチドに対してより有用な機能発現
に貢献させるために、この糖鎖に酵素学的修飾あるいは
化学的修飾を必要に応じて加えることも本発明に含まれ
る。

【００２１】糖が付加されたことの確認は、該ポリペプ
チドを精製純化して糖組成分析または糖鎖構造分析で確
定できるほか、電気泳動上で分子量が増加すること、ま
た予想される電気泳動上のポリペプチド・バンドが糖鎖
結合性レクチンと反応することからも推定することがで
きる。

【００２２】このようにして得られた該ポリペプチドは
、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマ
トグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどで精製
純化して、医薬あるいは診断薬として供される。

【００２３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明す
るが、本発明は何らこれに限定されるものではない。 実施例１ １６６個のアミノ酸をコードするヒト・インターフェロ
ンβ（ＩＦＮ−β）のｃＤＮＡにおいて、Ｎ末端から７
２番目のグルタミンをコードする塩基配列（ＣＡＡ）を
アスパラギン（ＡＡＴ）をコードする塩基配列に変え、
アミノ酸配列でアスパラギン７２−アスパラギン酸７３
−セリン７４−セリン７５となる配列を新たに導入した
ｃＤＮＡを次のように構築した。

【００２４】ここで用いたＩＦＮ−β構造遺伝子は、大
腸菌でのＩＦＮ−β発現用ベクターｐＫＭ６より得た。 ｐＫＭ６は、トリプトファン・プロモータ支配下にＩＦ
Ｎ−β遺伝子を発現するように組立てられたプラスミド
ｐＫＴ１−９のＳＤ−ＡＴＧ間の塩基配列を修飾するこ
とにより得たプラスミドである。ＳＤ−ＡＴＧ間の配列
はＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＧであり、ＡＴＧの２
塩基上流のＣの位置で制限酵素ＣｌａＩにより切断され
る。ｐＫＴ１−９の作製方法および構造は、すでに報告
されているｐＦＩＦｔｒｐ６９〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
ｉｄ．　Ｒｅｓ．，　８，　４０５７，　（１９８０）
　〕と同一である。

【００２５】ｐＫＭ６を制限酵素ＣｌａＩおよびＢｇｌ
ＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、ＩＦＮ
−β構造遺伝子をコードする５００塩基対のＤＮＡ断片
を分離した。シグナルペプチド遺伝子は、ＩＦＮ−βの
シグナル配列を化学合成して用いた。本合成シグナルペ
プチド遺伝子は、翻訳開始コドンＡＴＧの直前に制限酵
素ＸｂａＩの認識配列を持ち、かつ５′末端はＨｉｎｄ
ＩＩＩ　切断配列を、３′末端はＣｌａＩ切断配列を持
つように設計して合成した。具体的には、まず上記配列
を構成する７５塩基対の二本鎖ＤＮＡを、９から１６オ
リゴタクレオチドの一本鎖ＤＮＡ１０本（ＢＳ１〜ＢＳ
１０）に分けて回相法により合成し、これらをアニーリ
ング（９５℃、２分→０℃、５分→７０℃から徐々に冷
却）した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで１１℃、１６時間反
応させて、１０本のオリゴマーをつなぎ合わせることに
より行なった（図１）。

【００２６】次に、Ｍ１３ｍｐ１１（アマシャム・ジャ
パンより購入）をＳｍａＩＩで消化、ＢｇｌＩＩリンカ
ーを連結後、ＢｇｌＩ消化し、さらにＨｉｎｄＩＩＩ　
消化して得たベクターＤＮＡ断片と、上で述べたＩＦＮ
−β構造遺伝子およびシグナルペプチド遺伝子をコード
するＤＮＡ断片を混合、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結し、この反応液を用いてＥ．ｃｏｉｌＪＭ１０５（ア
マシャム・ジャパンより入）をトランスフェクションし
た。得られたプラークから二本鎖ＤＮＡを調製し、制限
酵素処理により目的の遺伝子構造を確認し、Ｍ１３−Ｉ
ＦＮ−βを得た（図２）。さらに、このＭ１３−ＩＦＮ
−βを保持するＥ．ｃｏｉｌＪＭ１０５を培養し、変異
体取得の際の鋳型となる一本鎖ＤＮＡを得た。Ｍ１３フ
ァージ組換え体による大腸菌のトランスフェクション、
プラークからの二本鎖ＤＮＡの調製、および一本鎖ＤＮ
Ａの調製はＭｅｓｓｉｎｇ　らの方法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ
　Ｅｎｚｙｍｏｉ．，　１０１，２０　（１９８３）　
〕によった。

【００２７】次に、変異部分に対応する下記のＤＮＡオ
リゴマーを化学合成した。

【００２８】

【化１】

【００２９】このＤＮＡオリゴマーと鋳型になるＭ１３
−ＩＦＮ−βの一本鎖ＤＮＡを材料に、Ｅｃｋｓｔｅｉ
ｎらの開発した方法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ．　Ｒ
ｅｓ．，　１３，　８７４９（１９８５）および同誌、
１３，　８７６４　（１９８５）　〕のキット（アマシ
ャム・ジャパン製）を用いてＤＮＡ上に変異を導入し、
Ｅ．ｃｏｉｌＪＭ１０５をトランスフェクションした。 得られたプラーク３個から一本鎖ＤＮＡを調製し、Ｓａ
ｎｇｅｒらの方法〔Ｓｃｉｅｎ　ｃｅ，　２１４，　１
２０５　（１９８１）〕により塩基配列を確認し、目的
部分に変異を起こしているファージＭ１３−ＩＦＮ−β
−Ｑ７２Ｎを得た。

【００３０】次に、このファージを保持するプラークよ
り二本鎖ＤＮＡを調製し、変異１ＦＮ−βをコードする
ｃＤＮＡ断片をデヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）／Ｓ
Ｖ４０ベクターに連結し〔Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙら
、ＤＮＡ，　３，　２９７　（１９８４）〕、このベク
ターをチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に
リン酸カルシウム法でトランスフェクションさせた。こ
のＣＨＯ細胞Ｑ７２Ｎ株を１μＭメトトレキセートと５
％ウシ胎児血清を含むイーグルＭＥＭアルファ培地で培
養すると、培養上清中には、３７℃、３日間で構成的に
ＩＦＮ−βが２４，０００単位／ｍｌ産生されていた。

【００３１】この培養上清１０リットルを集め、既報の
方法〔Ｕｔｓｕｍｉら、Ｅｕｒ，　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，　１８１，　５４５　（１９８９）　〕でＩＦＮ
−βを精製、分離した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による分子量測定では、ヒト線維芽細胞由来
の天然型ＩＦＮ−βと変異を加えていないＣＨＯ細胞由
来の遺伝子組換え型ＩＦＮ−β（ＣＨＯ−ＩＦＮ−β）
がともに分子量２３，０００の均一なバンドを示したの
に対し、変異を加えたＣＨＯ細胞Ｑ７２Ｎ株由来のＩＦ
Ｎ−β（ＣＨＯ−Ｑ７２Ｎ−ＩＦＮ−β）は、分子量２
３，０００と２６，０００の２本のバンドを示した。ま
た、糖組成ではＣＨＯ−Ｑ７２Ｎ−ＩＦＮ−βのフコー
ス、マンノース、ガラクトース、グルコサミンの各単糖
の測定値は、ＣＨＯ−ＩＦＮ−βのそれらの値のそれぞ
れ１．２〜１．７倍であった。以上の結果から、ＣＨＯ
−Ｑ７２Ｎ−ＩＦＮ−βには、新たに導入されたアスパ
ラギン７２−アスパラギン酸７３−セリン７４なる配列
によって、新たにアスパラギン結合型糖鎖が付加された
分子種が含まれることが明らかであった。

【００３２】０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
塩酸（ｐＨ２）中での３７℃における安定性では、３日
目にＣＨＯ−ＩＦＮ−βの抗ウイルス活性が４２％に減
少したのに対し、ＣＨＯ−Ｑ７２Ｎ−ＩＦＮ−βでは７
１％が残存しており、熱安定性が向上していた。また、
両ＩＦＮ−βをウサギに静脈内投与して、その薬効の持
続性の指標となる血中半減期を調べてみると、ＣＨＯ−
ＩＦＮ−βが約１６分であったのに対し、ＣＨＯ−Ｑ７
２Ｎ−ＩＦＮ−βでは約２８分で、ＣＨＯ−ＩＦＮ−β
のそれより１．８倍延長し、血中でより安定であった。

【００３３】実施例２ １６６個のアミノ酸をコードするヒト・インターフェロ
ンβ（ＩＦＮ−β）のｃＤＮＡにおいて、Ｎ末端から７
３番目のアスパラギン酸をコードする塩基配列（ＧＡＴ
）をアスパラギン（ＡＡＴ）をコードする塩基配列に変
え、アミノ酸配列で７３−セリン７４−セリン７５−セ
リン７６となる配列を新たに導入したｃＤＮＡを次のよ
うに構築した。

【００３４】まず、実施例１で示した方法により、ＩＦ
Ｎ−β遺伝子をもつＭ１３ファージ組換え体（Ｍ１３−
ＩＦＮ−β）およびその一本鎖ＤＮＡを調製した。次に
、変異部分に対する下記のＤＮＡオリゴマーを化学合成
し、このＤＮＡオリゴマーと鋳型になるＭ１３−ＩＦＮ
−βの一本鎖ＤＮＡを材料に実施例１で示した方法によ
り、目的部分に変異を起しているファージＭ−１３ＩＦ
Ｎ−β−Ｄ７３Ｎを得た。

【００３５】

【化２】

【００３６】このファージから二本鎖ＤＮＡを調製し、
変異ＩＦＮ−βをコードする部分を実施例１と同様の方
法でＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、ＣＨＯ細胞
Ｄ７３Ｎ株を得た。この株を１μＭメトトレキセートと
５％ウシ胎児血清を含むイーグルＭＥＭアルファ培地で
培養すると、培養上清中には３７℃、３日間で構成的に
ＩＦＮ−βが３０，０００単位／ｍｌ産生されていた。

【００３７】この培養上清を１０リットル集めて、実施
例１と同様の方法でＩＦＮ−βを分離・精製および分析
を行った。その結果、ＣＨＯ細胞Ｄ７３Ｎ株由来のＩＦ
Ｎ−β（ＣＨＯ−Ｄ７３Ｎ−ＩＦＮ−β）には、分子量
２３，０００および２６，０００の２種類の分子種が含
まれていた。またフコース、マンノース、ガラクトース
、グルコサミンの各単糖の測定値は変異を加えていない
ＣＨＯ細胞由来の遺伝子組換え型ＩＦＮ−β（ＣＨＯ−
ＩＦＮ−β）のそれらの値のそれぞれ１．３から１．６
倍であった。このことから、ＣＨＯ−Ｄ７３Ｎ−ＩＦＮ
−βには、新たに導入されたアスパラギン７３−セリン
７４−セリン７５なる配列によって、新たにアスパラギ
ン結合型糖鎖が付加された分子種が含まれることが明ら
かであった。

【００３８】０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
塩酸（ｐＨ）中での３７℃における安定性では、３日目
にＣＨＯ−ＩＦＮ−βの抗ウイルス活性が４２％に減少
したのに対し、ＣＨＯ−Ｄ７３Ｎ−ＩＦＮ−βでは６８
％が残存しており、熱安定性が向上していた。また、両
ＩＦＮ−βをウサギに静脈内投与して、その薬効の持続
性の指標となる血中半減期を調べてみると、ＣＨＯ−Ｉ
ＦＮ−βが約１６分であったのに対し、ＣＨＯ−Ｄ７３
Ｎ−ＩＦＮ−βでは約２４分で、ＣＨＯ−ＩＦＮ−βの
それより１．５倍延長し、血中でより安定であった。

【００３９】

【発明の効果】本発明により得られた修飾ポリペプチド
は、その一次構造中に導入されたアスパラギン結合型糖
類の結合を誘導するアミノ酸配列により、新たに糖鎖を
有することが可能となる。このため、従来よりポリペプ
チドおよびタンパク質を医薬あるいは診断薬として応用
する際に挙げられていた課題のうち、糖鎖との関連が推
察される課題を解決することが可能である。すなわち、
血中安定性を高め、シグナル作用を強調して標的細胞あ
るいは標的臓器への取込みを促進させることが可能とな
り、その結果、薬効を高め、かつ投与量を減らして副作
用を軽減させることができる。

【００４０】また、糖鎖付加によるポリペプチド分子の
表面疎水性の低下により、会合や凝集などの分子間相互
作用が減るため、熱安定性を高めポリペプチド分子個々
の生理活性を十分に発揮させることができる。また、糖
類を有することはポリペプチド分子がより親水的になる
ことでもあり、経口および非経口投与時の体内への吸収
、分布移行性を改善することも期待できる。

【００４１】本発明の糖鎖結合部位を導入した修飾ポリ
ペプチドは、真核生物細胞で生合成されるときに糖鎖を
付与され、精製後、ポリペプチド性製剤としてそのまま
粉末として、また薬理学的に許容され得る担体、賦形済
、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤、錠剤、カプ
セル剤、液剤、軟膏）としてヒトなどの温血動物に対し
て用いられるほか、診断薬としてｉｎ　ｖｉｔｒｏある
いはｉｎ　ｖｉｖｏ　で用いることができる。このよう
に本発明の糖鎖結合部位を導入し、糖鎖を有するポリペ
プチドは、これまで未解決の課題が多かったポリペプチ
ド性医薬および診断薬の分野に新規で有用な薬剤として
提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】合成オリゴマーからＤＮＡ断片を作成する方法
を示す。

【図２】ＩＦＮ−βをコードする遺伝子を含む発現ベク
ターＭ１３−ＩＦＮ−βの作成方法を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　下記の部分配列 Ｘ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ Ｘ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ Ｘ−Ｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ　　または Ｘ−Ｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ （ここで、ＸおよびＹはＡｓｎ以外のアミノ酸を示す）
   を含む生理活性ポリペプチドのＸまたはＹの全部または
   一部をアスパラギンに変換させた修飾ポリペプチド。
2. 【請求項２】　　請求項１記載の修飾ポリペプチドをコ
   ードする遺伝子。