JPH01502196A - 炭水化物含量を低下させたコロニー刺激因子 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 炭水化物含量を低下させたコロニー刺激因子この発明は、一般にＧＭ−ＣＳＦ生 物活性を有する遺伝子操作をに反応し得る霊長類造血前駆細胞を刺激することに よる治療に使用されるタンパク質含有治療用組成物に関するものである。

造血系は有用なタンパク質医薬品を開発し得る独自の機会を提供する。この系で は、骨髄中に存在する造血前駆細胞が絶えず分裂・分化を続け、その結果、究極 的に成熟血球を末梢血へ放出するに至る。多数の、少なくともイン・ビトロ（試 験管内）で成熟血球の産生を調節することが可能な異なったポリペフチド成長因 子が同定されている［メトカーフ（総説）、１９８４年、ザ・ヘモポイエティッ ク・コロニー・スティミュレーティング・ファクターズ（アムステルダム）、エ ルセビル社］、これらの成長因子は、原則的にいずれも自然に起こる血球減少お よびガンの化学療法もしくは放射線治療によって生じる血球減少の双方の処置に 有用であるとが立証できた【ギャッソンら、１９８３年、「リンフオカインズ・ アンド・ヘマトボイエシス」（ゴールドおよびマークス編））、リス、ＮＹＩ　 、これらのタンパク質は、骨髄中におけるその標的細胞が循環系を介して易溶性 薬物を容易に受容し得るので治療薬として特に魅力的である。

半固体培地における骨髄前駆細胞のクローン伸長刺激能によって同定された［メ トカーフ、１９８４年、前掲１０本来、コロニー刺激因子はイン・ビトロで発育 したコロニー内に見出される血球の種類に基づいて分類される。したがって顆粒 球・マクロファージコロニー刺激因子（即ちＧＭ−ＣＳＦ）は顆粒球およびマク ロファージの両者を含んだコロニー形成を刺激し得る増血系成長因子として同定 された［メトカーフ（総説）、１９８５年、サイエンス、２２９巻、１６頁］、 ネズミおよびヒトのＧＭ−ＣＳＦ　ｃＤＮＡをクローン化し、これを用いてそれ ぞれ対応する組換え体成長因子が生産された（ゴーら、１９８４年、ネーチャー 、３０９巻、７６３頁；ウオングら、１９８５年、サイエンス、２２８巻、８１ ９頁）、これらの進展によって、これらタンパク質の詳細な生理学的および生物 学的研究を遂行することが初めて可能となった（ウオングら、１９８５年、キャ ンサー・セルズ、３巻、グロース・ファクターズ・アンド・トランスフォーメー ション、２３５頁、コールドスプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１ＮＹ：メト カーフら、１９８６年、ブラッド、６７巻、３４頁；トモナガら、１９８６年、 ブラッド、６７巻、３１頁）、これらの研究はそれまで知られていたＧＭ−ＣＳ Ｆの活性範囲を著しく拡大した。即ち、ＧＭ−Ｃ３Ｆは成熟好中球、好酸球およ び単球の強力な活性化因子であることが判明した（ワイスパートら、１９８５年 、ネーチャー、３４１巻、３６１頁；グラブスタインら、１９８６年、サイエン ス、２３２巻、５０６頁）、さらにネイサンおよびその共同研究者らは、エリス ロボエチンの存在下にヒトＧＭ−ＣＳＦが正常なヒト前駆細胞を刺激して赤血球 細胞を含んだコロニーを形成する事実を発見し、エリスロポエチンが最初考えて いたよりも一層初期の段階の前駆細胞と相互に作用し合うのかもしれないことを 示唆した（サイ７ら、１９８５年、サイエンル・オブ・クリニカル・インベステ イゲーション、７６巻、１２８７頁；ドナヒユーら、１９８５年）。

組換え体ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆを大規模に生産できたことによって、この発明の発明 者らはイン・ビボにおけるこの分子の生物学的な諸性質の研究を開始することが 可能となった（ドナヒユーら、１９８６年、ネーチャー、３２１巻、６０７３． ８７２〜８７５頁）、先に発明者らは、霊長類モデルにおいてヒトＧＭ−ＣＳＦ が強力な造血活性化因子であることを示した。また他の研究者らはネズミのモデ ルを用いて、別の造血因子、即ちネズミのインターロイキン３（ＩＬ−３）がイ ン・ビボにおいてネズミの血球産生を刺激し得るこズ・オブ・ザ・ナショナル・ アカデミ−・オプ・サイエンシズ・オブーＵＳＡ、８３巻、１００１頁）０組換 え体ヒトＧＭ−ＣＳＦで臨床研究の開始を準備するため、発明者らはこのタンパ ク質およびその変異体の生体内における性質の研究をさらに拡大実施した。

この発明による変異体は、一層物質な形態で生産でき、したがって天然型もしく は組換え体ＧＭ−ＣＳＦと比較して改善された薬効学的挙動を示す活性型コロニ ー刺激因子である。

天然型ヒトＧＭ−ＣＳＦのポリペプチド主鎖は、２７〜２９位のＡｓｎ−Ｌｅｕ −３ｅｒと３７〜３９位のＡ　ｓ　ｎ−Ｇ　１　ｕ−Ｔｈ　ｒからなる２つの共 通したＡｓｎ一連鎖グリコシル化部位を含んでいる。

天然型ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆおよびその「組換え体」変形では２つの共通グリコジル 化部位の双方とも、または何れか一方または何れでもない部位を炭水化物部分で 占められることもある多少不均質な形で生産され回収される。この説明の目的の ため、アミノ酸の配列番号はＡ　ｌ　ａ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ａ　１　ａ−Ａｒ　ｇ− ３ｅ　ｒ−Ｐ　ｒ　ｏ−−−−−−−を含んだＮ−末端を持つ成熟タンパク質の Ａｌａ−１で始める。

この発明は、Ａｓｎに連鎖する炭水化物部分を全く含まないか、またはそのよう な部分を一つしか含んでいないヒトＧＭ−ＣＳＦの新規グリコジル化部位変異体 を包含する。完全にグリコジル化された天然型または組換え体ＧＭ−ＣＳＦと比 べて炭水化物部分の存在を低下させたことを精造的特徴とするＧＭ−ＣＳＦタン パク質が、完全グリコジル化された天然型または組換え体ＧＭ−ＣＳＦと比べて 改善された比活性（約１０倍まで）により、生物学的にも明らかに特徴付けられ ることがこの発明によって判明した。この炭水化物部分の存在の低下は、天然型 ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ分子の共通Ｎ一連鎖グリコシル化認識部位の一方またはその双 方の部位におけるアミノ酸置換によって生じたものである。現在、Ａｓｎ一連鎖 グリコシル化認識部位は細胞の好適なグリコジル化酵素によって特異的に認識さ れるトリペプチド配列からなると信じられている。これらのトリペプチド配列は アスパラギン−Ｘ−スレオニンか、またはアスパラギン−Ｘ−セリン［ここでＸ は任意のアミンＲ（但し恐らくプロリンを除く）である］の何れかである。グリ コジル化認識部位の３つの位置の１またはそれ以上でさまざまなアミノ酸置換、 挿入または欠失を行うと修飾されたペプチド配列に非グリコジル化が生じる。こ れを例示すれば、例えば−態様としてＧＭ−Ｃ３ＦのＡｓｎ−２７がＧｌｎで置 換され、もう一つの態様ではＡ　ｓ　ｎ−３７がＧｉｎで置換され、第三の態様 では両方のＡｓｎがＧｉｎで置換される。Ｎ一連鎖炭水化物部分をゼロ、１個ま たは２個含有したタンパク質混合物であるヒト天然型ＧＭ−Ｃ３Ｆとは対象的に 、二重にＧｉｎ置換した場合、得られた糖タンパク質（Ｇｉｎ−２７、Ｇｌｎ− ３７）はそのようなＮ一連鎖炭水化物部分を含んでいない、同様にＧｌｎ−２７ 変異体およびＧｌｎ−３７変異体はそれぞれ炭水化物部分をゼロまたは１個含ん でいる。この技術に熟練した専門家ならば、Ａｓｎ−２７および／またはＡ　ｓ 　ｎ−３７を欠失することにより、そして／または２７位および３７位のその他 のアミノ酸を置換することにより、そして／または対応するグリコジル化認識部 位内のその他の位置の１またはそれ以上のアミノ酸（例えば上記の５ｅｒ−２９ およびＴｈ　ｒ−３９）を置換しまたは欠失することにより、そして／またはト リペプチド部位の１またはそれ以上の「ｘ」位置を置換、挿入または欠失するこ とによって、同程度のグリコジル化または非グリコジル化を有する類似の糖タン パク質を生産し得ることが理解できよう、この発明はそのような非グリコジル化 およびモノグリコジル化されたヒトＧＭ−ＣＳＦ変異体を包含する。

これらの変異体は、下式（１） ％式％（１） （式中・Ａ、ＢおよびＣは、実質的に第１表に示しｆニ下８己のヒトＧ＼ｔ−Ｃ ５Ｆのドメインを表し、ＡはＡ１　ａ−１からＬｅｕ−２６、ＢはＡｒｇ−３０ からＭｅｔ−３６、ＣはＶａｌ−４０からＧｌｕ−１２７までのポリペプチド配 列である） のポリペプチドとして図式的に記載できる。上式（１）のＲ１およびＲ２はペプ チド結合によって上記のポリペプチドドメインＡ、ＢおよびＣとそれぞれつなが っているペプチド結合またはペプチド配列を表す、したがってこの発明の化合物 は、Ｒ１およびＲ２の一方または双方を除きヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ（第１表）と実質 上同一のペプチド配列を有する。この発明の変異体では　Ｒ１およびＲ２の一方 または双方が、（ｉ）共通グリコジル化部位以外のトリペプチド配列、（ｉ）ジ ペプチド配列、（ｉ）単一アミノ酸残基、または（檜）上述のようなペプチド結 合である。Ｒ１およびＲ２に選ばれた部分は同一でもよくまたは互いに異なって もよく、即ち独立して選ぶことができる。ヒトＧＭ−ＣＳＦのポリペプチド配列 に存在する共通グリコジル化部位以外のペプチド配列を下記の第２表に示す。

第２表　代替ペプチド配列 （ｗｔ）　（Ａｓｎ　Ｌｅｕ　５ｅｒ）　（Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ）１　（Ｘ 　Ｌｅｕ　５ｅｒ）　（Ｘ　ＡｒｇＴｈｒ）ｎ　（Ａｓｎ　Ｙ　５ｅｒ）　（Ａ ｓｎ　Ｖ　Ｔｈｒ）璽　（ＡｓｎＬｅｕ　Ｚ　）　（ＡｓｎＡｒｇ　Ｚ　）Ｘ＝ Ａｓｎを除く任意のアミノ酸またはペプチド結合Ｙ＝Ｌｅｕを除く任意のアミノ 酸またはペプチド結合Ｚ＝ＴｈｒまたはＳｅｒを除く任意のアミノ酸またはペプ チド結合Ｖ＝Ｇ１ｕを除く任意のアミノ酸またはペプチド結合ｗｔ＝野生型、即 ち突然変異誘発前のもの第１表　ＧＭ−ＣＳＦのペプチドおよびヌク得るヌクレ オチドおよび塩基を併記し、Ｒ１領域を下線で示した） レオチド配列（変化し およびＲ２に対応する １１ｅ Ｔｈ【 τ ＧＧＣＧＴＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧ　ＴＣ，にＣＡＧＴＧＧＣ例として 、第３表にこの発明の幾つかの糖タンパク質を示す。

第３表　化合物の代表例 Ａ−Ｒ″−Ｂ−Ｒ”−Ｃ” ８　−−　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ９　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅ ｒ　−−Ｇｌｕ　Ｔｈｒｌｏ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　−−Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒｌ ｌ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　−−−−Ｇｌｕ　Ｔｈｒ１２　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　−−Ｇｉ ｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ１３　Ａｓｎ　−−Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ會”Ａ 、Ｂ、Ｃは前記と同意義、突然変異誘発位置を下線で示す、突然変異誘発を行わ なかったＲ基は共有結合によってＮ一連鎖炭水化物部分を含んでおり、「−一」 は欠失したアミノ酸部位（即ちペプチド結合）を表す。

さらにこの発明は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ変異体がＧＭ−Ｃ３Ｆ型の生物学ように一方ま たは双方の共通Ｎ一連鎖グリコシル化部位に修飾を有することをもって構造的特 徴とするものである限り、その他のそのような変異体、例えば対立変異体、およ び欠失および／または種々のアミノ酸で置換された１またはそれ以上のアミノ酸 を有する変異体を包含する。またそのような変異体は、構造的に（ｉ）当業界で 既知のようにストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下で天然型ヒトＧ Ｍ−ＣＳＦを暗号化しているＤＮＡ配列へのハイブリッド化が可能であり、もし くは遺伝暗号の縮重さえなければそのようなハイブリッド化が可能であるＤＮＡ 配列によって暗号化されていることにより、または（ｉ）共通Ａｓｎ一連鎖グリ コシル化部位の一方または双方を共通Ａｓｎ一連鎖グリコシル化部位以外に修飾 される限り、ヒトＧＭ−ＣＳＦのペプチド配列と少なくとも約９０％、好ましく は少なくとも約９５％まで相同であるペプチド配列によって特徴付けられている 。

謂「複合糖質」糖部分の一形質を含有する。以下、例を挙げてさらに詳細に説明 するように、そのような「複合糖質」糖タンパク質は哺乳動物の宿主細胞で所望 のポリペプチド配列を暗号化しているＤＮＡ分子の発現によって産生され得る　 、好適な哺乳動物宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび 生産物の生産および精製方法は当業界で既知のものである［例えば、ゲシングお よびサムプルツク、ネーチャー、２９３巻、６２０〜６２５頁（１９８１年）、 または別法としてカウフマンら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ ー、５巻（７）、１７５０〜１７５９頁（１９８５年）またはハウレイら、米国 特許第４４１９４４６号９照］。

さらにこの発明のもう一つの態様は、哺乳動物由来のＧＭ−ＣＳＦ等を含む哺乳 動物糖タンパク質の「複合糖質」置換基形質とは対照的に、炭水化物部分が、昆 虫細胞が産生ずる糖タンパク質の最初のドリコール一連鎖オリゴ糖形質をプロセ スした形のものである先に定義したモノグリコジル化変異体を包含する。この明 細書では簡単のために、そのような昆虫細胞型グリコジル化を「高マンノース」 炭水化物と呼ぶ、この開示の目的のため、複合体および高マンノース炭水化物は コーンフェルトらの定義を用いる［アニュアル・レイューズ・オブ・バイオケミ ストリー、５４巻、６３１〜６４頁（１９８５年）］、この発明のｒ高マンノー ス」変異体は、先に記載した第３表に例示した変異体ポリ−ペプチド主鎖によっ て特徴付けられる。そのような変異体は、該変異体を暗号化しているＤＮＡ配列 を昆虫宿主細胞で形質発現することにより生産され得る。好適な昆虫宿主細胞お よびこの発明の態擾を実施する際に有用な形質転ｆＡ／トランスフェクション、 昆虫細胞培養、スクリーニングおよび生産物の生産および精製方法および材料は 当業界で既知のものである。

またそのようにして生産された糖タンパク質は、天然型ＧＭ−ＣＳＦおよびこれ まで組換え操作技術によって哺乳動物細胞で生産されたＧＭ−Ｃ３Ｆとは異なり 、この発明の態様の変異体が炭水化物部分の末端シアル酸またはガラクトース置 換基または哺乳動物由来の糖タンパク質形質の他のタンパク質修飾を含んでいな い。

またＮ一連鎖炭水化物部分を含んでいないこの発明の変異体タンパク質は、所望 の変異体を暗号化しているＤＮＡ分子、例えば第３表の化合物２．６．７．１１ および１２を哺乳動物、昆虫、酵母、真菌または細菌宿主細胞で発現することに よって生産し得る。

上述のように好適な哺乳動物および昆虫宿主細胞に加えて、好適な酵母、真菌ま たは細菌宿主細胞、およびこの発明の態様を実施する際に有用な形質転換／トラ ンスフェクション、細胞培養、スクリーニング、生産物の生産および精製方法お よび材料は当業界で既知のものである。

これらの化合物を暗号化しているｃＤＮＡは容易に調製され、Ｒ１およびＲ２に 対するコドンの一方または双方で突然変異を誘発することができ、形質発現ベク ターへ挿入し、ここに開示した方法により宿主細胞で発現することができる。

これまでの説明から明らかなように、この発明のすべての変異体は、天然型ヒト ＧＭ−Ｃ３Ｆと比べてＮ一連鎖グリコシル化可能部位が少ないか、または全く含 有していないＧＭ−ＣＳＦ類似体を暗号化したＤＮＡ配列を使用する組換え体技 術によって調製される。

そのようなりＮＡ配列はＧＭ−ＣＳＦを暗号化したＤＮＡの通常の部位特異的突 然変異によって生産し得る。

ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆを暗号化しているＤＮＡ配列はクローン化し、確認されている 。そのような−クローンは、それをプラスミドｐＣＳＦ−１（エシェリキア・コ リＭＣ１０６１）の形で受付番号３９７５４のもとに寄託されているアメリカン ・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１．パークローン・ドライブ、 ロックビル、マリーンランド、２０８５２　（ＵＳＡ）から入手できる。所望に よりヒトＧＭ−Ｃ３ＦクローンはｐＣ唖Ｆ−１から一７８０塩基対（ｂｐ）のＥ ｃｏＲ１断片として容易に切り出すことができる。上述のようにこの発明の個々 の変異体を暗号化したＤＮＡ配列は、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆまたはその類似体または 変異体を暗号化しているＤＮＡ配列を通常の部位特異的突然変異によっても生産 できる。そのような突然変異誘発の方法は、−重鎖ＤＮＡを使用するシラーおよ びスミスのＭ　１３システム［ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、１０巻、６ ４８７〜６５００頁（１９８２年）；メソツズ・イン・エンザイモロジー、１０ ０巻、４６８〜５００頁（１９８３年）：ＤＮＡ、３巻、４７９〜４８８頁（１ ９８４年）］、およびヘテロ二重！ｌＤＮＡを使′−用するモリナガらの方法［ バイオ／テクノロジー、６３６〜６３９頁（１９８４年７月）］等が挙げられる 。そのような方法でアスノ＼ラギン残基をスレオニンまたはグルタミンに変換す るのに使用したオリゴヌクレオチドの幾つかの代表例を第４表に示す、いうまで もなく、この技術に熟練した専門家であれば、適切に選ばれたオリゴヌクレオチ ドを使用し、部位特異的突然変異によってこの発明のそれぞれの糖タンパク質を 暗号化したＤＮＡを生産し得ることは理解されよう０通常の方法によってこのＤ ＮＡを哺乳動物、酵母、真菌、細菌または昆虫宿主細胞系で形質発現することに より所望の変異体が得られる。現在のところ哺乳動物形質発現系およびそれによ って得られる変異体が好ましい。

ここに記載した哺乳動物細胞形質発現ベクターは、この技術に熟練した専門家周 知の技術によって合成され　得る。　細菌レプリコン、選択遺伝子、エンハンサ −、プロモーター等のようなベクターの各要素は天然供給源から得てもよく、あ るいは既知方法によって合成してもよい［カウフマンら、ジャーナル・オプ・モ レキュラーバイオロジー、１５９巻、５１〜５２１頁（１９８２年）；カウフマ ン、プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン シズ・オブ・ＵＳＡ、８２巻、６８９〜６９３頁（１９８５年）コ　。

第４表　代表的なオリゴヌクレオチド類”Ｎｏ、　配列　突然変異 ｌ　ＴＣＴ入ＣＴＣＡＧＣ工ＧＣＡＧＧＡＧ入ＣＧ　Ｎ−２７−−−→　Ｇ　１ 　ｎ２　ＴＡＣＴＧＴＴＴＣｇ工９ＣＡＴＣＴＣＡＧＣＮ−３７−Ｇｉｎ３　Ｔ ＣｒＡＣＴＣＡＧＴ′Ｘ！１ＸＣＡＧＧ入ＧＡＣＧ　Ｎ−２７−−２Ｔｈｒ会ア ミノ酸を置き換えるコドンを下線で示した。この技術の専門家であれば、ｌまた はそれ以上のアミノ酸を欠失するのに使用し、または１またはそれ以上のコドン を欠失することによって所望の部位で異なったアミノ酸を挿入しく置き換え）、 またはオリゴヌオリゴヌクレオチドをそれぞれ容易に組み立て得ることは理解さ む元のコドンを置き換え、または欠失することにより、所望の部位を約２０〜５ ０ヌクレオチド配列に伸長することに基づいて設計できる。

形質転換した細胞系等を含め、株化細胞系は宿主として好適である。また正常な 二倍体細胞、原組織の試験管内培養に由来する細胞株ばかりでなく、初代外植片 （至）血幹細胞のような比較的未分化の細胞をも含み）も同様に好適である。候 補となる細胞は選択遺伝子が優勢に作用している限り選択遺伝子内で遺伝子型的 に欠損している必要はない。

宿主細胞は好ましくは株化した哺乳動物細胞系であろう０通常の方法でベクター ＤＮＡを染色体ＤＮＡへ好適に組み込み、組み込んだＤＮＡを引き続き増幅する には、現在のところＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞が好ましい、そ れに代わるベクターＤＮＡとしてはウシ・パピローマ・ウィルス・ゲノム［ラス キーら、セル、３６巻、３９１〜４．０１頁（１９８４年）］の全部または一部 を含有し、これを０１２７マウス細胞のような細胞系に安定なエピソーム要素と して組み込まれたものでもよい、その他の好適な哺乳動物細胞系は、ヘラ細胞、 ＣＯ５−１サル細胞、マウスＬ−９２９細胞、スイス、Ｂａ１ｂ−ｃまたはＮＩ Ｈマウス由来の３７３系、Ｂ）ＩＫまたはＨＡＫハムスター細胞系等がある。

ついで標準的な免疫学的または活性検定によって安定な形質転換体を、生産物の 形質発現についてスクリーニングする。サザン・プロッティングのような標準的 な手技によって変異体タンパク質を暗号化しているＤＮＡの存在を検出してもよ い、ＣＯ５−１サル細胞のような好適な宿主細胞へ形質発現ベクターＤＮＡを導 入した後、数日間、変異体を暗号化したＤＮＡｆ）遷移的形質発現を活性または 培地内タンパク質の免疫学的検定により無選択に測定する。

細菌形質発現の場合、変異体を暗号化したＤＮＡをさらに修飾して、当業界で既 知の細菌形質発現をするための種々のコドンを含ませてもよく、これもまた当業 界で既知のように好ましくは成熟変異体タンパク質の細菌形質発現、分泌および １０セツシングを達成し得る分泌リーダーポリペプチドを暗号化したヌクレオチ ド配列の枠内へ機能的につなぐ、ついで哺乳動物、昆虫、酵母、真菌または細菌 宿主細胞で形質発現した化合物を回収し、精製し、そして／または生理化学的ま たは生化学的および／または臨床的各特性に関し、何れも周知の方法によってそ の特徴を明らかにする。

これらの化合物はヒトＧＭ−ＣＳＦに対する単クローン抗体と結合することが判 明し、したがってそのような抗体を使用した免疫アフィニティークロマトグラフ ィーにより、またはその他の通常の方法または以下に記載の方法により回収およ び／または精製してもよい、またこれらの化合物はヒトＧＭ−ＣＳＦ型の活性を 有し、例えばこの発明の化合物は、通常の検定法による測定で顆粒球およびマク ロファージの増殖を効果的に刺激する。

またこの発明は、１またはそれ以上の製薬上許容し得る非経口用担体および／ま たは通常の賦形薬と混和して上記変異体の治療的有効量を含有してなる増血治療 用組成物を包含する。そのような組成物は、ヒトＧＭ−ＣＳ　Ｆ’に関して記載 されているのと同様に使用でき、ヒトまたはその他の霊長類に有用である。正確 な投与量および投与方法は、特定の化合物の力価および薬効学的挙動、および薬 物作用を修飾する種々の要因、例えば特定側毎の体重、性、食事、投与時間、薬 物配合、過敏反応および重篤度に基づいて担当医により決定される。

以下に実施例を挙げてこの発明の態様をさらに詳細に説明する。

これらの実施例は単に発明を説明するためのものであって、発明の範囲を限定す るものではない。

この発明に関係する技術に熟練した通常の専門家であれば、以上説明した以外の 宿主細胞、プロモーターおよびそれに関連するｃＤＮＡを含有したベクター等が この発明の各態様の実施に際して同様に使用し得ることはよく理解できよう。

採用したＤＮＡ操作は、特に説明しない限りマニアティスらのモレキュラー・ク ローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル［コールド・スプリング・ハーバ− ２ＮＹ（１９８２年）〕によって実施した。

［実施例］ ［方法］ ［′ｄ３胞培養］ ＭｏＴ−細胞系の増殖に関しては以前に報告されている（ウォ′クラ゛１９８５ 年、サイエンス、前掲）、ＣＩＯ−ＭＪ２　Ｔ、ｉ胞系はアリャら（１９８４年 、サイエンス、２２３巻、１０８６頁）の記載の方法に従って増殖させた。１０ ％ウシ胎児血清の存在下に、０．３％フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）および５ ｍｇ／ｍ＋ホルボールミリステート・アセテ−）−（ＰＭＡ）の存在で、これら の細胞を５×１０５細胞／ｍｌの濃度で２４時間インキュベートすることによっ て誘導し、ＧＭ−ＣＳＦを生産した。同様にフィコールで分離した末梢血リンパ 球（ＰＢＬ）を使用して最終密度Ｉ　Ｘ　１０’細胞／ｍ＋に調製したＰＢＬ調 製培地を作成した。先に報告したようにり四ロキン処理を加えたＤＥＡＥ−デキ ストラン・１０トコールを用いて、サルＣＯ５−１ａ胞のトランスフェクション を実施したくつオンゾら、１９８５年、サイエンス、前掲）、クロロキンで処理 して４８時間後に、細胞を３５Ｓ−メチオニン０．５ｍｃと共にダルベツコ修飾 イーグル培地（ＤＭＥＭ）０．５ｍｌ　（１０ｃｍの皿一枚当り）中で４時間イ ンキュベートすることによりパルスラベルした。−トランスフェクションでは、 Ｎ一連鎖炭水化物の付加を抑制するため標識３０分前にツニカマイシン（シグマ 社）Ｌｏｇ／ｍｌを添加した。

形質発現クローニングによって単離したプラスミドｐＣ３Ｆ−１を標準的な方法 （カウフマンおよびシャープ、１９８２年、ジャーナル・オプ・モレキュラー・ バイオロジー、１５９巻、６０１頁）によってチャイニーズハムスター卵巣細胞 （ＣＨＯ）へ導入し、得られた細胞中のＧＭ−ＣＳＦ配列をメソトレキセートに よる段階的選別法により細胞当り約２００コピーに増幅し、高濃度のヒトＧＭ− Ｃ３Ｆを形質発現する細胞系（ＣＨＯ−Ｄ２）を生産した。気密的なＣＨＯ−Ｄ ２細胞の皿を、３ｓＳ−メチオニン０．５ｍｃと共にＤＭＥＭ　０．５ｍｌ中で ４時間パルスラベルした。

［天然型ＧＭ−Ｃ３Ｆの分析］ ＭＯ細胞、ＣＩＯ−ＭＪ２細胞、レクチン刺激ＰＢＬおよび急性骨髄芽球性白血 病患者から得た初代ブラスト　［ダナ・ファーバー・キャンサー・インキュベー ト（ボストン、マサチューセッツ）、Ｊ、グリフイン氏の厚意により提供を受け た］から得た調整培地試料各１０ｍ１を、組換え体ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆで免疫によ り生じたヒツジ抗血清から作成した３ｍｌ抗体カラムに通した。結合したＧＭ− ＣＳＦｔ−０，１Ｍグリシン（ｐＨ２，８＞で溶出し、セントリコン１０コンセ ントレータ−（アミコン社）で遠心した。これらの試料のアリコートおよびＣＨ Ｏ−Ｄ２調整培地のアリコートを１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛け て分画し、タンパク質をニトロセルロース（ビオラド・トランスプロット社）へ 移し、得られたフィルターを家兎抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体とともにインキュベートす ることによって各試料のＧＭ−ＣＳＦ種の位置を可視化した。フィルターに結合 した抗体は”’ｌ−５ｔａｐｈ−Ａ〜タンパク質（ＮＥＮ社）で処理によって視 覚化し、オートラジオグラフィーにより追跡した。

［ＧＭ−Ｃ３Ｆの部位特異的突然変異］ＧＭ−ＣＳＦ配列における強力なＮ一連 鎖炭水化物付加可能第一部位（部位１）または第２部位（部位２）の何れかを脱 離する特異的突然変異はモリナガら（１９８４年、バイオテクノロジー、２巻、 ６３６頁）が記載したギヤラフト・ペテロ二重鎖部位特異的突然変異を用いて誘 発した。これは２個の合成２１量体［ｄ（ＴＣＴＡＣＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡ ＧＡＣＧ）配列を有する＃１５８５およびｄ（ＴＡＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＴ ＣＴＣＡＧＣ）配列を有する＃１５９０１を使用して、アスパラギン２７（＃１ ５８５）またはアスパラギン３７（＃１５９０）の何れかに対応するコドンをオ リゴヌクレオチド中央へ配置させ、これらをグルタミン・コドンへ変換するよう に部位１または部位２の何れかに対応するＤＮＡ配列を伸長することによって達 成した。

ｐＣＳＦ−Ｉ　ＤＮＡをテトラサイクリン耐性遺伝子内の独自部位のところで切 断するＳａｌ　Ｉ　で処理することにより、このプラスミドを直線化し、ｐ９１ ０２３（ｂ）をＥｃｏＲＩ　で切断することによりその独自のクローニング部位 のところで直線化した。直線化したプラスミドＤＮＡをそれぞれ当モル量ずつ混 合し、塩基処理によって変性し、再アニーリングすることによってヘテロ二重鎖 を作成した。これらのへテロ二重鎖をオリゴヌクレオチド＃１５８５または＃１ ５９０の何れかでアニーリングし、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸のすべ て、およびＡＴＰおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼの存在下にＤＮＡポリメラーゼ夏 の巨大断片（クレノー断片）で処理することにより、これを修復した。これらの 反応生産物を使用してエシェリキア・コリＭＣ１０６１を形質転換し、所望の突 然変異株を好適なオリゴヌクレオチドでコロニーハイブリダイゼーションするこ とにより同定した０両方の部位を二つとも脱離した二重突然変異株は部位１の単 一変異株からのＤＮＡで始まる同一の突然変異手段を反復することにより作成し た。すべての変異株をＤＮＡ配列分析によって確認した。

ついでこの発明のＧＭ−ＣＳＦ変異体を暗号化したｃＤＮＡ突然変異体を含有す るＰＣＳＦ−１、もしくは所望によりｃＤＮＡ突然変異体を含有するその他の通 常の哺乳動物、細菌または昆虫形質発現ベクターを使用して所望の対応する宿主 細胞をトランスフェクトし、あるいは形質転換することができる０通常の手段に よってトランスフェクトまたは形質転換した宿主細胞の培養により所望の変異体 を生産し、ついでそれを回収し、さらに所望により例えば天然型または組換え体 ＧＭ−ＣＳＦに対する抗体を使用する免疫アフィニティークロマトグラフィーの ような通常の方法で、または以下に記載する精製方法により精製してもよい。

これに代わる哺乳動物形質発現ベクターは当業界で周知であり、２Ｍ７２等のよ うなベクターが含まれる。ｐＭＴ２−ＶＭＦ（ＡＴＣＣ番号６７１２２）からの ｐＭＴ２の調製およびその使用に関しては公開された国際比１１ＷＯ８７１０７ １４４（２３頁参照）に開示されている。好適な細菌、真菌およびその他の哺乳 動物形質発現ベクターおよびそれらの使用方法に関しては公開された国際出願Ｗ ｏ８８１００２０６に開示されている。好適な酵母およびそれに代わる細菌およ び哺乳動物形質発現ベクターおよびそれらの使用方法は国際出願ＷＯ３６１００ ６３９に開示されている。

［”Ｓ−Ｍｅｔ−１［！ＩＧＭ−ＣＳ　ＦのＭ！］代謝的に標識したＣ　ＨＯ− Ｄ　２細胞から採った調整培地を０．０２Ｍ　トリスＨＣＩ　（ｐＨ７，４）、 １．０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０１％ツイーン８０で１＝１に希釈して、ＤＥＡＥ −トリスアクリルＭ（ＬＫＢ）の１ｍｌカラムに掛けた。５０ｍＭ　ＮａＣ１を 含有する同じバッファーでカラムを洗浄し、ついで２５０ｍＭ　ＮａＣ１を含有 する同じバッファー溶液でＧＭ−Ｃ９Ｆを溶出した。一方（１−Ｎ）あるいは両 方（２−Ｎ）にＮ一連鎖炭水化物を有するＧＭ−ＣＳＦの何れかを単離するため 、ＤＥＡＥカラムから溶出させたＧＭ−ＣＳＦを以前に記載したヴイダックＣ４ 分析用逆相カラム（ウォングら、１９８５年、キャンサー・セルズ、前掲）に掛 けた。２−Ｎ　ＧＭ−Ｃ３Ｆは親水性が低いのでこのカラムから最初に溶出した （約４１％アセトニトリル）、Ｎ一連鎖炭水化物を欠いたＧＭ−ＣＳＦを単離す るため、ＤＥＡＥで精製したタンパク質をヒドロキシルアパタイト（バイオラド 社、ＤＮＡ級品）の１ｍｌカラムに通した。カラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム （ｐＨ７，０）で洗浄し、１−Ｎおよび２−Ｎタンパク質および０−Ｎ（Ｎ一連 鎖炭水化物を欠いた）ＧＭ−Ｃ３Ｆを２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０） で溶出した。すべての形のＧＭ−Ｃ３Ｆを一度に単離するには、標識したＣＨＯ −Ｄ２培地を抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体カラム（３ｍｌ；先の調整培地試料の項で記載 ）に掛けた。標識したＧＭ−ＣＳＦのシアリル化度はレクチン［リチヌス・コン ムニス・アグルチニンＩ　（ＲＣＡＩＬ２０、アガロース結合型、ベクター・ラ ボラトリーズ）］と結合させることによって検討した【デブレイら、１９８３年 、レクチン：バイオロジー、バイオケミストリー、クリニカル・バイオケミスト リー、３巻、３３５頁（ボグーハウゼン＆スベングラー編）、クレノー・デ・グ ルイタ−社、ベルリン、ＮＹｌ、これを実施するには、Ｇ　Ｍ−ＣＳ　Ｆを０． ０１Ｍ）リス−ＣＩ　（ｐＨ７，４＞、０．１Ｍ　ＮａＣ１，０，０１％ツイー ン８０で１＝１に希釈し、ＲＣＡ１２０の０．２ｍｌカラムに通した。同じバッ ファーの１０容量でカラムを洗浄し、０．５Ｍガラクトースを含有する同じバッ ファーで結合タンパク質を溶出した。一般に標ｉＧＭ−ＣＳＦはＲＣＡ１２０と 結合できなかった。

実質上すべての１−Ｎおよび２−Ｎ　ＧＭ−Ｃ３Ｆはノイラミニダーゼ処理によ ってＲＣＡと特異的に結合するので、Ｎ一連鎖炭水化物を有するＧＭ−Ｃ３Ｆの 各分子から少なくとも１個のシアル酸残基が脱離したことが判った。もしＯ−Ｎ 　ＧＭ−ＣＳＦが少しでもＲＣＡ１２０と結合したとしたら、それは〇一連鎖炭 水化物のシアル酸がノイラミニダーゼ処理に対して抵抗性であるが、または脱シ アリル化された０−Ｎ　ＧＭ−Ｃ３Ｆがリチン１２０と結合しないことを示唆す るものである。

［ラットにおけるクリアランスの研究］３ｓＳ−標９ＧＭ−ＣＳＦの各試料をセ ントリコン１０マイクロセントレータ−（アミコン社）で遠心することにより、 これをＰＢＳ中で０．２ｍｌまで濃縮した。これらの試料（１０’　ｃｐｍ）を 、あらかじめベントパルビタールナトリウムで麻酔した（１５ｍｇ／２５０ｇ） スプレーク・ドーリ−系雄ラット（体重２００〜３００ｇ）の尾静脈へ急速に注 射した。注射後各単位時間毎に、０．２〜０．３ｍｌの血液アリコートを尾端か らヘパリン４０単位含有の試験管へ採取した。最終試料を採取後、ラットを瀉血 し、主要臓器（肺、腎臓、肝臓）を採り、秤量した。血漿アリコート０．０５ｍ １をグラスファイバー・フィルター上へ落とし、冷５％トリクロロ酢酸、ついで 冷メタノールで静かに洗浄した後、乾燥し、無水シンチレーション液（ＮＥＮ社 ）でカウントした。各臓器の放射活性は２００〜３００ｍｇの試料を１％ＳＤＳ 　１ｍｌにホモジナイズし、１００℃に加熱し、アクアゾール（ＮＥＮ社）５ｍ ｌ中、０．１ｍｌをカウントすることにより計測した。

［ＧＭ−ＣＳＦのサルへの投与］ ３匹の別のサル（マカカス・ファシキュラリス）へ、以前報告されたように（ド ナヒユーら、１９８６年）、外科的に頚静脈へ埋め込んだカテーテルから連続注 入によってＧＭ−Ｃ３Ｆを投与した。ＧＭ−Ｃ３Ｆは、ジェネティック・インス ティチュート・パイロット・デベロップメント・ラボラトリ−により、主として ギヤ→ソンらの記載のようにレンチル−レクチン・アフィニティークロマトグラ フィーおよび逆層ＨＰＬＣを用いて精製した（ギャッソンら、１９８４年、サイ エンス、２２６巻、１３３９頁）、このＧＭ−ＣＳＦは、発明者らが別話に報告 （ドナヒユーら、１９８６年、ネーチャー、前掲）したＣＭＬ増殖検定法により １ｍｌ当り１〜２Ｘ１０’単位の比活性を示した。このタンパク質は、約３０％ の１−Ｎおよび約７０％の２−ＮのＧＭ−Ｃ３Ｆの混合物であることが判明した 。

［成Ｍ］ ［ＧＭ−ＣＳＦの炭水化物構造］ ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆを精製しようとする最も初期の試みから、この増血因子が不均 一にグリコジル化されていることが認められていた［リュシスら、１９８１年、 ブラッド、５７巻、１３頁；つオングら、１９８５年、サイエンス（前掲）およ びキャンサー・セルズ（前掲）コ、然しながらこの不均一度は最初に考えていた よりも更に大きいものであることが判った。レクチン刺激型末梢血リンパ球（Ｐ ＢＬ）、二、三のＴ−細胞系および急性骨髄性白血病患者から得られた初代白血 病ブラースト細胞等を含むさまざまな供給源に由来するＧＭ−Ｃ３Ｆは、見掛け の分子質量範囲が１４．５ＫＤがら約３２〜３４ＫＤの間にまたがっていた。− 次配列から推定された分子質量は１４．５ＫＤであるから、ある種の形のＧＭ− ＣＳＦは炭水化物を５０％以上含有していた。

さまざまな供給源からのＧＭ−ＣＳＦのサイズ範囲が類似していることが判って いるが、その範囲内でのサイズ分布は著しく変動し得ることが考えられる０例え ば正常なＰＢＬによって産生されたＧＭ−ＣＳ　Ｆは主として高い側の範囲の分 子からなっている（２２から約３２〜３４ＫＤ）が、ＡＭＬブラースト細胞に由 来したタンパク質では平均的にグリコジル化が遥かに少なかった。この発明の技 術によるチャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯ−Ｄ２）によって生産され た組換え体ＧＭ−ＣＳＦ種の分布は正常なＰＢＬから得たＧＭ−ＣＳＦで見られ るサイズ分布と類似していた。

さまざまな供給源から得られたすべての異なったＧＭ−ＣＳＦ種の分布の観察か ら、それらはＡＭＬ由来のタンパク質の場合に最も明白な全般的な三サイズ階層 に分けられることが判る。ＧＭ−ＣＳＦの一次配列は炭水化物が連鎖したアスパ ラギンに対する二つの共通配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／５ｅｒ）を含んでいる（ 部位１はＡｓｎ２７１、部位２はＡｓｎ３７）から［ウィンズラー、１９７３年 、ホルモナル・プロテインズ・アンド・ペブタイズ、１巻、１頁（Ｃ。

Ｈ，リー編）、アカデミツク・プレス社、ＮＹ］　、発明者らはこれら二つの部 位の占有状態によってこれらのサイズ階層が生じるものと予測した０発明者らは 、部位１および部位２を両者とも修飾された分子は最大のサイズ階層に入り（２ ２から約３２〜３４ＫＤ）、部位１または部位２の何れか一方が占有された分子 は中間サイズ階層に入り（１８〜２２ＫＤ）　、何れの部位をも占有されない分 子は最小の階層サイズに入るものと予測した。この予測を確かめるために、部位 特異的突然変異を組み込んだオリゴヌクレオチドを使用してアスパラギン・コド ンをグルタミン・コドンへ変換することにより、ＧＭ−ＣＳＦ配列に共通Ｎ一連 鎖炭水化物付加配列の一方または双方の何れかを脱離する突然変異を起こした。

形質発現ベクターｐ９１０２３（ｂ）（つオングら、サイエンス、前掲）でそれ ぞれ組み立てられたこれらの突然変異体ＤＮＡをサルｃｏｓ−ＩＭＡ胞のトラン スフェクトに使用した　３ＳＳ−メチオニンでパルスラベルしたトランスフェク ト細胞から得た調整培地をＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析することによって形質発現した タンパク質を視覚化した。炭水化物付加部位を変えることによって、ＧＭ−Ｃ３ Ｆのサイズ分布に予想したシフトを生じた６部位１または部位２の何れかを脱離 すると最大サイズ階層に入る分子の合成は全く阻止されるが、部位１および部位 ２の両者を同時に変えると大または中間サイズの何れかのＧＭ−ＣＳＦ形質発現 が阻止される。二重に突然変位すると、アスパラギンに連鎖する炭水化物付加を 阻害する薬物であるツニカマイシン（ダスキンおよびマホニー、１９８２年、ジ ャーナル・オブ・バイオロジカル・クミストリー、２５７巻、３１０５頁）で、 野生型ＧＭ−ＣＳＦ配列でトランスフェクトしたｃｏｓ−１細胞を処理したとき に観察されるのとよく似たサイズ分布を有するＧＭ−Ｃ３Ｆ形質発現が生じる。

これらの結果からＧ　Ｍ−ＣＳ　Ｆの主たるサイズ不均一性は、二つの部位にお けるＮ一連鎖炭水化物の占有程度の相違がら生じることが証明された。一般にこ の発明の変異体が、対応するＮ一連鎖グリコシル化水準を保有する天然型または Ｍ換え体ＧＭ−Ｃ３Ｆタンパク質と類似した薬効学的挙動および生物学的活性を 有するものと予想される。

［ＧＭ−ＣＳＦクリアランスにおける炭水化物の役割］Ｇ　Ｍ−ＣＳ　Ｆの炭水 化物修飾の役割については余りよく判っていない、ＰＢＬから得られた天然型タ ンパク質が高度にグリコジル化されているにもかかわらず、イン・ビトロで測定 したＧＭ−ＣＳＦの活性は炭水化物含量が増大するにつれて低下することが判明 した。

血流からのタンパク質のクリアランスに対する炭水化物修飾の影響の検討を開始 するため、ラットモデル系を使用し、代謝的に標識したＧＭ−ＣＳＦを静脈注射 し、その生体内運命を追跡した。この研究では、この発明のＣＨＯ−Ｄ２．ＩＢ 胞系によって発現したＧＭ−ＣＳＦの三つの興なる大きさを解消するため従来の タンパク質分画を使用した。エリスロボエチンで観察されたように（スタインバ ーブら、１９８６年、ブラッド、６７巻、６４６頁）、ラット血流からのＧＭ− Ｃ３Ｆのクリアランスは二相性の速度曲線を示す、クリアランスの初めの相（α 相）は、動物のあらゆる細胞外液へタンパク質が分布する様子を大きく反映して いるが、真の血漿クリアランスは消失曲線の第２相（即ち、β相）部分によって 表される（シャーゲル、Ｌ、およびＡ、Ｂ、Ｃ，ユ、１９８５年、アプライド・ パイオフアーマシューティカル・アンド・ファーマコキネテイツクス、アプレト ン・センチユリ−・クロフ゛ソ社、ノーウオ一り、コネテイカット）。

ｃＭ−ｃｓｐのＮ一連鎖炭水化物による修飾の度合いは曲線のα部分に著しい影 響を与えるが、β部分には影響しない、Ｎ一連鎖炭水化物を有しないＧＭ−Ｃ３ Ｆの場合は、約２．５分の見掛けの半減期でその６０％以上のＧＭ−ＣＳＦが血 流から消失した。残りの４０％は１６分の見掛けの半減期で消失した。Ｎ一連鎖 炭水化物残基を１個有するＧＭ−ＣＳＦでは４分の見掛けの半減期で約６０％が 血流中から消失したが、残りは１５分の半減期を示すβ相で消失した。

これに反して、二つのＮ一連鎖グリコシル化部位とも塞がっているＧＭ−Ｃ３Ｆ では４．５分の半減期を示すβ相で血流からＧＭ−ＣＳＦの１０％だけが消失し 、注射したタンパク質の９０％は１５分の見掛けの半減期を示すβ相の間に消失 した。これらの相違は細胞外体液中のＧＭ−Ｃ３Ｆ分布率の相違を反映している のか、あるいは観察された速度変化に同じく寄与している何らかのクリアランス 機序を反映しているのかも知れない。

注射３０分後のラットの各種臓器における標識ｃＭ−ｃｓｐの分布を解析した結 果、このタンパク質の主なりリアランス部位は腎臓であることが判明した。ラッ トの主要臓器は高度に血管性であるから、血中含量は各臓器で検出される標識Ｇ Ｍ−Ｃ３Ｆに有忘に影響を与えることが予想された０例えば、もし肺におけるＧ Ｍ−Ｃ３Ｆのクリアランスが有意でないと考えれば、肝臓（肺の重量の５〜７倍 ）における放射能合計は血液の混入によって大きく影響を受け、この臓器固有の 糖タンパク質クリアランスでないことは明らかである。然しながら腎臓で検出さ れたＧＭ−Ｃ３Ｆの比放射能が高いことは、この臓器がこのタンパク質の重要な りリアランス部位であることを明白に示している。

別の研究で、発明者らは代謝的に標識したＧＭ−Ｃ５Ｆの末端シアル酸残基を除 去するためノイラミニダーゼ酵素を使用した。レクチン（リチニン１２０）を共 有結合的に付着させたカラムへ結合することによって脱シアリル化したＧＭ−Ｃ ＳＦを単離した。このレクチンは、糖タンパク質からシアル酸の酵素的脱離によ って露出された末端ガラクトース残基と特異的に結合することが知られている（ デブレイら、１９８３年、前掲）、ノイラミニダーゼ処理の前には、標識したＧ Ｍ−Ｃ３Ｆはレクチン・カラムで全く結合しない、処理をするとＮ一連鎖炭水化 物を有する標識したＧＭ−ＣＳＦはすべてカラムと結合し、０．５Ｍガラクトー スとの競合によって特異的に溶出された。この発明では、シアリル化したＧＭ− ＣＳＦと脱シアリル化したＧＭ−Ｃ３Ｆとのクリアランスの比較をラットモデル で実施した。この実験で、注射１５分後にラットを層殺し、各臓器のＣＳＦ分布 を調べた。この実験から、シアル酸の脱離によって末端ガラクトース残基が露出 するとＧＭ−ＣＳＦの臓器クリアランスは劇的に変化し、脱シアリル化したＧＭ −Ｃ３Ｆは肝臓で浄化されるが、シアリル化したＧＭ−Ｃ３Ｆは腎臓によって浄 化されることが明らかである。これらの試料は両者ともサイズ階層の異なったＧ Ｍ−Ｃ３Ｆ混合物であるから、クリアランス速度を解析するのは難しい、然し注 射１５分後の血中ＧＭ−ＣＳＦ濃度から、脱シアリル化したＧＭ−ＣＳＦは十分 にシアリル化されたタンパク質より一層速やかに浄化されることが裏付けられた 。

［ＩＩｉ長類におけるＧＭ−ＣＳＦの用量一応答性］ラットにおけるＧＭ−ＣＳ Ｆクリアランスに対する炭水化物の効果から、このタンパク質の生体での有効性 への影響が期待された。

先に発明者らは、ＣＨＯ−Ｄ２由来のＧＭ−ＣＳＦが、マカカス・ファシキュラ リス［短尾ザル（マカーク）］およびマカカス・ムラツタ（アカゲザル）で強力 な造血刺激因子であることを明らかにした（ドナヒユーら、１９８６年、ネーチ ャー、前掲）、ヒトにおける臨床試験の準備のため、サルにおけるＧＭ−ＣＳＦ 投与の用量一応答の関係検討に着手した。初期の実験で脱シアリル化したＧＭ− ＣＳＦ（リチン１２０カラムに１００％結合することにより判定）が霊長類の造 血作用刺激に無効であることが判明した（資料未提出）。

これに反してシアル歌合ｌが遥かに高いＧＭ−ＣＳＦ　（ＧＭ−Ｃ３Ｆ１モル当 り１０モル）では、１０μｇ／ｋｇ／日の割合で投与すると、急速な白血球増加 作用をもたらすことが判った。循環血中の血球濃度で観察した応答は用量依存性 であった。５μｇ／ｋｇ／日の割合でＧＭ−ＣＳＦを投与した場合はごく僅かな がら反応が認められた。また用量依存性は白血球数の増加率でも明らかであり、 このタンパク質の投与割合の増大に伴って増加した。

［考察］ ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロボエチン（ゴールドワッサーら、１９７４年、ジャーナ ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２４９巻、４２０２頁）およびＣ５ Ｆ−１［スタンレー（総説）、１９８５年、メソッズ・イン・エンザイモロジー 、１１６巻、５６４頁、アカデミツク・プレス社、ＮＹ］等を含む数種の天然造 血因子は、アスパラギンに連鎖する炭水化物付加により著しく修飾を受ける。

ＧＭ−ＣＳＦにおけるこの形式の修飾はことに不均一であって、異なったタンパ ク質供給源により著しく変化する。ＧＭ−Ｃ３Ｆの突然変異型の生成に加えて発 明者らの天然配列の詳細な構造解析から、この不均一性が、大部分Ｎ一連鎖糖を 付加する二つの部位の占有状態の相違から起こることが判明した。またＣＨＯ細 胞またはサルのｃｏｓ−ｘ＊胞の何れかで生産した組換え体ＧＭ−Ｃ３Ｆは、分 子内の異なった数ケ所の部位で〇一連連鎖付付加よってさらに修飾され、このタ ンパク質構造にさらに不均一性を生じる。

この増血因子の炭水化物修飾の働きはまだ明らかでない、イン・ビトロで測定し たＧＭ−Ｃ３Ｆの比活性はこのタンパク質の最大で最も十分にグリコジル化され た形では、それよりも小さいグリコジル化度の低い分子と比較して有意に抑制さ れる。この理由から現在の努力は、専らこのホルモンの血流がらのクリアランス に対する炭水化物構造の影響に気中されている。今回、Ｎ一連鎖炭水化物付加に よって１回大量静脈注射によるラット血流中のＧＭ−ＣＳＦの有効半減期が有意 に増大することを示した。ラットにおけるＧＭ−ＣＳＦのクリアランスは二相性 の速度曲線を描き、炭水化物修飾によって延長されるのは、その最初の相、即ち α相である。この研究では、動物の細胞外液全最にわたるこのホルモンの単純分 布と特殊臓器を介するクリアランスとを区別し得なかった。動物の循環系内の分 子貯留に対して効果があるかどうが、あるいはこのタンパク質の炭水化物修飾に よって阻害されるＧＭ−ＣＳＦの急速なりリアランス部位があるかどうかを決定 し得たら興味があろう、ＧＭ−ＣＳＦは主として腎臓で浄化されるから、このク リアランスの第２部位もまた最もこの臓器に存在するらしく思われる。

アシアロ糖タンパク質の血流からのクリアランスについては十分に報告されてい る［ノイフェルトら、１９８０年、ザ・バイオフミストリー・オブ・グリコプロ テインズ・アンド・１０テオグリカンズ、２４１頁、（レンナルツ編）、プレナ ム・プレス社、ＮＹＩ　。

複合炭水化物が脱シアリル化されると露出される糖タンパク質の終わりから二番 目のガラクトース残基に対する受容体が肝臓で発見され、詳細に検討されたくシ ュバルッら、１９８１年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・クミストリー、 ２５６巻、８８７８頁）。

予想していたように脱シアリル化されたＧＭ−Ｃ５Ｆは肝臓で血流から急速に浄 化される。この急速なりリアランスは、サルにおいて白血球数を上昇するこの分 子の効果を低下させるようである。広範にシアリル化されたＧＭ−ＣＳＦによっ て達成された循環血流中の血球水準における刺激は、脱シアリル化したタンパク 質を使用して観察した場合より遥かに劇的である。シアリル化されたＧＭ−Ｃ３ Ｆによる刺激は用量依存的であり、投与量を高めると、それに伴って循環血流中 の血球数をさらに急速に上昇する。

発明者らは噴孔動物細胞形質発現系を使用し、その天然分子と構造的に極めて類 似しているグリコジル化したＧＭ−ＣＳＦを大量に生産した。この物質はサルで 強力な増血作用刺激因子であり、しがも動物に何ら有害な影響を示さない、これ らの研究は、組換え体ＧＭ−ＣＳＦがヒトにおいて癌化学療法または放射線療法 によってしばしば生じる血球減少症の処置に有効であろうという仮説をよく裏付 けるものである。またこの分子が骨髄移植術を受ける患者の回復を促進するのに 有効性を示すことが期待される。もしこれが事実でせるであろう。

国際調査報告

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．ＧＭ−ＣＳＦ型生物活性を有し、Ａｓｎ−２７からＳｅｒ−２９までの領域 およびＡｓｎ−３７からＴｈｒ−３９までの両者の領域のうちの一つを完全に欠 失し、または単一アミノ酸残基、ジペプチド配列、またはＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒま たはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ以外のトリペプチド配列（ここでＸはＰｒｏを除く任意 のアミノ酸である）によって置き換えられるように、１〜６個のアミノ酸を異な ったアミノ酸で置き換え、そして／または前述の領域内で欠失した以外、実質上 第１表に示したペプチド配列を有することからなるタンパク質。
2. ２．ゼロまたは１個のＮ−連鎖炭水化物部分を有する請求の範囲第１項記載のタ ンパク質。
3. ３．請求の範囲第１項記載のタンパク質を暗号化しているｃＤＮＡ。
4. ４．請求の範囲第３項記載のｃＤＮＡを含有し、そのｃＤＮＡを形質発現するこ とが可能な宿主細胞。
5. ５．請求の範囲第１項記載のタンパク質を暗号化しているｃＤＮＡを含有し、こ れを形質発現することが可能な宿主細胞を培養することからなる該タンパク質の 生産方法。
6. ６．請求の範囲第１項記載のタンパク質の治療的有効量を１またはそれ以上の製 薬上許容し得る非経口用担体および／または通常の賦形薬と混和して含有する造 血治療用医薬組成物。