CN102292349B - 稳定的生长激素化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及稳定的生长激素(GH)化合物，其通过导入半胱氨酸残基而具有二硫键，这使得该化合物耐受蛋白水解性降解。
Description
技术领域
本发明涉及耐受蛋白水解性降解的稳定的生长激素(GH)化合物。
背景技术
生长激素(GH)是由哺乳动物的垂体前叶分泌的多肽激素。依赖于物种，GH是由大约190个氨基酸残基组成的蛋白，相应的分子量是大约22kDa。GH结合细胞表面受体（GH受体(GHR)）并通过该受体发信号。GH在促进生长、维持正常身体组成、合成代谢和脂类代谢中起关键作用。它也对中间代谢（诸如减少的葡萄糖摄取、增加的脂解作用、增加的氨基酸摄取和蛋白合成）具有直接的作用。该激素也对其它组织发挥作用，所述组织包括脂肪组织、肝、肠、肾、骨骼、结缔组织和肌肉。已经生产并可商业得到重组hGH，例如作为：健高灵?(PharmaciaUpjohn)、Nutropin?和Protropin?(Genentech)、Humatrope?(EliLilly)、Serostim?(Serono)、诺地托品(NovoNordisk)、Omnitrope(Sandoz)、NutropinDepot(Genentech和Alkermes)。另外，在N-末端具有一个额外的甲硫氨酸残基的类似物也面市，例如作为：Somatonorm?(PharmaciaUpjohn/Pfizer)。
GH与GH-家族的蛋白的其它成员催乳素(PRL)和胎盘催乳素(PL)具有共同的拓扑学。GH被归类成四螺旋束蛋白(图1)，其表现出具有2个保守二硫键的“上-上-下-下”拓扑学。具体地，野生型人GH(hGH)由191个氨基酸残基组成，且具有4个在位置53、165、182和189处的半胱氨酸残基，其通过形成2个分子内二硫键（分别连接C53和C165以及C182和C189），稳定化蛋白的三维结构(图1)。通过X-射线结晶学，已经实验地确定了游离形式(ChantaletL.等人(1995)ProteinandPeptideLetters3,333-340)和与它的结合蛋白(人GHR(hGHR)的胞外域)复合(Devos,A.M.等人(1992)Science255,306-312)的hGH的结构。这些结构已经储存在蛋白数据库(PDB)中，且可公开得到(PDB登录码分别是1HGU和1HWG)。因而，从公开的hGH结构，可以鉴别出对于hGH与hGHR的结合而言重要的残基。此外，已经通过核磁共振(NMR)波谱学研究了hGH的动力学性质(KasimovaM.R.等人J.Mol.Biol.(2002)318,679-695)。X-射线和NMR数据组合起来可以将确定地结构化和确定地定义的hGH区域与更少结构化和动力学的区域区分开。预期hGH的更少结构化和动力学的区域对蛋白酶剪切特别易感，且这样的区域的正确稳定化可以提高蛋白水解稳定性。
已经对hGH进行了广泛的诱变，以尝试生成具有希望的化学或生物学性质的hGH类似物。具体地，已经描述了用于几种目的的半胱氨酸突变体。
US2003/0162949公开了GH超基因家族的成员的半胱氨酸变体。提供了产生这些蛋白的位点特异性的生物活性缀合物的一般方法。所述方法包括，将半胱氨酸残基添加到蛋白的非必需区域，或使用位点定向诱变，用半胱氨酸残基置换蛋白中的非必需氨基酸，然后通过添加的半胱氨酸残基，将半胱氨酸-反应性的聚合物或其它类型的半胱氨酸-反应性的部分共价地偶联到蛋白上。
WO02/055532描述了具有至少一个共价地附着的非多肽部分的基团工程改造的hGH突变体，尤其是其中使用导入的半胱氨酸残基用于进行加入聚乙二醇的hGH突变体。
US5,951,972描述了生理活性的、衍生化的天然的和重组的哺乳动物和人蛋白和多肽，其中用各种取代基衍生化蛋白中的至少一个天然存在的或掺入的半胱氨酸残基。
已经详细研究了hGH的蛋白酶剪切。由残基128至154组成的长环具有几种蛋白酶（诸如凝血酶、纤溶酶、胶原酶、枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶）的推定剪切位点。因此，已经表明，该hGH部分对蛋白酶剪切特别易感(Lewis,U.J.Ann.Rev.Physiol.(1984.)46,33-42)。据报道降解hGH的酶包括凝血酶、纤溶酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶和激肽释放酶。
已经研究了大鼠组织中的hGH的降解(Garcia-Barros等人J.Endocrinol.Invest.(2000)23,748–754)。
在大鼠甲状腺胰凝乳蛋白酶-样蛋白酶中，最初发现在大体积（bulky）和亲脂的氨基酸残基处的有利切割切开Y143和S144之间的肽键，从而导致产生双链分子，随后在Y42和S43之间切割，从而释放出N-末端肽F1-Y42。通过胰凝乳蛋白酶-样蛋白酶在F146和D147之间的切割，并进一步通过羧肽酶的作用，进一步加工双链分子中的裂开的环。
已经报道了几种生产针对蛋白水解性降解稳定化的hGH类似物的方法。
Alam等人（J.Biotech.65,183–190(1998)）通过特异性的点突变，设计了耐受凝血酶和纤溶酶的hGH突变体。凝血酶特异性地在R134和T135之间切割hGH，且双突变体R134D、T135P产生耐受凝血酶切割的hGH变体，且三突变体R134D、T135P、K140A导致产生对纤溶酶的耐受性。此外，后一种hGH突变体在7天时间段内耐受人血浆的蛋白酶解。
EP534568描述了通过将R134突变成丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或组氨酸，针对蛋白水解性降解稳定化的hGH突变体。
WO2004022593/Nautilus描述了一般的高通量定向进化方法，以生产具有增加的蛋白水解稳定性的修饰的细胞因子，包括GH变体。
WO2006048777/Nautilus具体地描述了具有提高的蛋白水解稳定性的修饰的hGH类似物。所述类似物含有1-5个在位置1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185和187-191处的突变。半胱氨酸残基的导入，可以潜在地导致不希望的二硫键连接的二聚体的形成，且在WO2006048777中，特别地从该范围中排除了半胱氨酸对氨基酸残基的置换；在WO2006048777(第65页)中叙称：“明确地避免半胱氨酸残基对氨基酸的置换，这是因为该变化可能导致分子间二硫键的形成”。
明显需要开发可耐受蛋白水解性降解的hGH化合物。这样的稳定化的化合物应当表现出增加的对蛋白酶剪切的稳定性，同时保留hGH的希望的生物学性质。这样的GH分子会具有增加的稳定性、更慢的清除率和/或延长的体内半衰期。
此外，蛋白治疗剂通常需要静脉内地或皮下地施用，这是因为它们通常不是充分地可口服的。蛋白的低口服生物利用率部分地归因于在胃肠道中的蛋白水解性降解。因此，也需要开发可口服施用来治疗hGH相关障碍的hGH化合物。
发明内容
本发明涉及包含额外二硫键的hGH化合物。在本发明的hGH化合物中，已经通过将野生型hGH序列中的至少一个氨基酸突变成半胱氨酸，导入了至少一个额外的半胱氨酸残基。在本发明的hGH化合物中，以下述方式选择突变位点：(1)将导入的一个或多个半胱氨酸残基适当地放入折叠的蛋白的三维结构中，以允许形成在野生型蛋白中不存在的额外二硫键，(2)不破坏hGH的天然结构，(3)与野生型hGH相比，所述hGH化合物表现出增加的对蛋白酶剪切的稳定性或其它增强的功能性，和(4)所述hGH化合物保留与野生型hGH有关的希望的生物活性。这样的可耐受在胃肠道中的蛋白水解性降解的hGH化合物的二硫化物变体，可以被开发成口服施用的用于治疗hGH相关障碍的药物。
附图说明
图1结合到hGH结合蛋白的2个拷贝上的hGH的结构(PDB1HWG)。hGH中的4个主要螺旋显示为深灰色，并标记为H1-H4。用箭标指示方向(N→C末端)。分别用N和C标记hGH的N-和C-末端。用黑色棍和球分别表示连接C53和C165以及C182和C189的2个二硫键。还标记了L128和D154，它们分别表示连接H3和H4的长柔性环中的第一个和最后一个残基。
图2hGH的野生型氨基酸序列，其中突出显示和标记了4个主螺旋(H1-H4)。还标记了3个连接主螺旋的环(L1-L3)。螺旋定义表示与它的结合蛋白复合的hGH(PDB1HWG)。
图3野生型hGH和具有额外二硫键的hGH化合物的蛋白水解性消化的时程。使用的蛋白酶是胰凝乳蛋白酶(图A)和弹性蛋白酶(图B)。如实施例5所述进行测定。相对于温育时间绘制完整蛋白的量(按照相对于t=0时的%)。在表中列出了通过将数据拟合至一次指数所衍生出的T?(小时)。
具体实施方式
本发明涉及具有额外二硫键的稳定的hGH化合物。所述二硫键是在半胱氨酸对之间形成，所述半胱氨酸中的一个或两个通过点突变导入到野生型hGH序列中。选择突变位点，从而使得导入的半胱氨酸残基适当地放入折叠的蛋白的三维结构中，以允许形成二硫键。如果仅导入一个半胱氨酸，它在形成二硫键时的配偶体将包括在野生型hGH中存在的4个半胱氨酸残基之一。可以如下得到具有额外二硫键的折叠的蛋白：通过由合适的宿主生物体表达可溶形式的hGH的适当半胱氨酸突变体，或使用本领域技术人员众所周知的生长激素化合物的标准重折叠条件，从内含体回收(Cabrita和Bottomley,BiotechnologyAnnualReview10,31-50(2004))。通过计算方法可以辅助鉴别导入额外二硫键的候选位置，例如使用实验地确定的与它的结合蛋白的2个拷贝复合的hGH的三维结构(PDB登录码1HWG)。导入二硫键的适当位置的选择，可以基于在DombkowskiA.,A.,Bioinformatics19,1852-1853(2003)和Petersen等人,ProteinEng.12,535-548(1999)中所述的二硫键的距离和几何学标准。
选择半胱氨酸突变体，从而使得导入的二硫键不破坏蛋白的天然结构，且对希望的与hGH有关的生物活性具有最小的负面影响。因而，构建化合物，从而使得导入的二硫键不损害与hGHR的相互作用。已经从1HWG中鉴别出对于受体相互作用而言重要的hGH区域。因而，通过分析1HWG结构，可以引导用于导入二硫键的适当位置（它们就生物活性而言是中性的）的选择。
可以选择半胱氨酸突变体，从而使得导入的二硫键提供增加的对蛋白酶剪切的稳定性。所述蛋白的一级氨基酸序列，部分地确定了蛋白对蛋白酶切割的易感性。蛋白酶可以是相对非特异性的，或可以以可变程度的选择性，识别一级氨基酸序列中的特定基序。但是，起底物作用的蛋白分子的三维结构和动力学强烈地影响蛋白水解稳定性。高度柔性的和动态的环结构对蛋白酶催化的切割特别脆弱，而确定地结构化的区域通常具有更低的脆弱度。因而，通过导入二硫键稳定化蛋白的动态区域，可以保护免于蛋白酶剪切。
本发明的一个方面涉及在SEQIDNo.1中包含额外二硫键的生长激素化合物。如下文所述，根据本发明的生长激素化合物多肽优选地与SEQIDNo.1表示的人生长激素具有高水平的同一性，因此与在SEQIDNo.1中定义的人生长激素相比，生长激素化合物包含一个或多个额外的二硫键。
因此，本发明的一个实施方案提供了根据SEQIDNo.1的稳定的GH化合物，其通过引入额外二硫键而耐受蛋白水解性降解。
在根据本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含在与SEQIDNo.1中的R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、/S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C相对应的位置处的至少一个氨基酸对之间的额外二硫键。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含在与SEQIDNo.1中的R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C相对应但不限于此的位置处的至少一个氨基酸对之间的额外二硫键。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含在与SEQIDNo.1中的A17C/E174C、H21C/M170C、S71C/S132C、Q84C/Y143C和R94C/D107C相对应但不限于此的位置处的至少一个氨基酸对之间的额外二硫键。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含在与SEQIDNo.1中的Q84C/Y143C相对应的位置处的氨基酸对之间的额外二硫键。
在根据本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着、但不限于SEQIDNo.1中的R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着、但不限于SEQIDNo.1中的A17C/E174C、H21C/M170C、S71C/S132C、Q84C/Y143C和R94C/D107C。
在本发明的一个实施方案中，本发明的生长激素化合物包含一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的位置Q84C/Y143C。
在本发明的一个实施方案中，通过在环区段和螺旋结构之间导入二硫键，实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性。
在本发明的一个实施方案中，通过在一个环区段内导入二硫键，实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性。
在本发明的一个实施方案中，通过在多个环区段内导入二硫键，实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性。
在本发明的一个实施方案中，通过在螺旋之间导入二硫键，实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性。
在本发明的一个实施方案中，至少一个导入的二硫键连接生长激素化合物的2个半胱氨酸残基，其中至少一个所述半胱氨酸残基在野生型hGH中不存在。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物的导入的二硫键位于使用在DombkowskiA.,A.,Bioinformatics19,1852-1853(2003)和Petersen等人,ProteinEng.12(7),535-548(1999)中所述的距离和几何学标准选择的半胱氨酸残基之间。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物的导入的一个或多个二硫键稳定化连接H3和H4的环(L3，残基128-154)，即导入的二硫键中的至少一个半胱氨酸位于包含残基128-154的区段中(图1和2)。
表1
如上所述，本发明涉及生长激素化合物，其包含在多肽的一个环区段和一个螺旋区段之间、或在一个环区段内、或在多个环区段之间、或在多个螺旋区段之间的额外二硫键。为了本申请的目的，参照在SEQIDNo.1中定义的hGH多肽，描述任意这样的额外二硫键的位置。
在一个实施方案中，根据本发明的生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的A17C/E174C、H21C/M170C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。
根据本发明的一个实施方案涉及包含额外二硫键的生长激素化合物，其中至少一个半胱氨酸存在于L3(SEQIDNO1中的氨基酸128-154)中，或诸如在由氨基酸135-148或对应的氨基酸残基定义的环的中央区域。
在生长激素化合物的一个实施方案中，额外二硫键的至少一个半胱氨酸存在于L3中，在与SEQIDNo.1中的氨基酸141、氨基酸142、氨基酸143、氨基酸144、氨基酸145或氨基酸146、优选氨基酸143或氨基酸144相对应的位置。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C和/或F92C/T148C。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C和/或F92C/T148C。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或F92C/T148C。
根据本发明的一个实施方案涉及生长激素化合物，其包含连接L3和L1的额外二硫键。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含一个额外二硫键，其连接与SEQIDNo.1的L3中氨基酸54、氨基酸55、氨基酸56、氨基酸57、氨基酸58或氨基酸59相对应的氨基酸残基和与SEQIDNO.1的L1中氨基酸143或氨基酸144相对应的氨基酸。
在一个实施方案中，根据本发明的生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C和/或S71C/S132C。
在一个实施方案中，生长激素包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C和/或S71C/S132C。
根据本发明的一个实施方案涉及生长激素化合物，其包含连接L3和螺旋区段（诸如螺旋2(H2)）的额外二硫键。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含一个额外二硫键，其连接与SEQIDNo.1的H2中氨基酸84或氨基酸85相对应的氨基酸残基和与SEQIDNO.1的L3中氨基酸143或氨基酸144相对应的氨基酸。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.中的L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C和F92C/T148C。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C和/或F92C/T148C。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或F92C/T148C。
根据本发明的一个实施方案涉及生长激素化合物，其包含连接L2和螺旋1的额外二硫键。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着D26C/V102C或D26C/Y103C。
对于2个半胱氨酸残基之间的二硫键，可以将半胱氨酸残基导入或置换进上文定义的任一个区域或位置，以促进需要的一个或多个导入的二硫键的形成。通过本领域技术人员已知的标准技术，可以实现氨基酸残基的置换和插入。
根据本发明，通过与SEQIDNo.1相比至少2个氨基酸的氨基酸置换，得到一个或多个额外的二硫键。在另一个实施方案中，所述化合物与SEQIDNo.1相比精确地包含一个额外二硫键。在一个实施方案中，根据本发明的化合物与SEQIDNo.1相比包含至少2个氨基酸置换。在另一个实施方案中，所述化合物与SEQIDNo.1相比精确地包含2个氨基酸置换。在一个实施方案中，根据本发明的生长激素化合物多肽与在SEQIDNo.1中定义的人生长激素相比包含至少2个额外的半胱氨酸。在另一个实施方案中，所述多肽与在SEQIDNo.1中定义的人生长激素相比精确地包含2个额外的半胱氨酸。
在本发明的一个实施方案中，除了包含额外二硫键以外，通过向生长激素化合物的侧链或主链附着部分（例如，但不限于、PEG、碳水化合物、清蛋白结合剂、脂肪酸、烷基链、亲脂基团、维生素、胆汁酸或间隔区），化学地修饰生长激素化合物。
在本发明的一个实施方案中，为了促进与hGH相比跨上皮的转运，化学地修饰生长激素化合物。
在本发明的一个实施方案中，为了得到延长的体内作用持续时间，化学地修饰本发明的生长激素化合物。
在本发明的一个实施方案中，为了得到延长的功能性体内半衰期持续时间，化学地修饰生长激素化合物。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物的化学修饰在性质上也可以是暂时的，即它们在体内可以容易地去除。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物修饰可以发生在不干扰生长激素化合物与hGHR的结合的任意氨基酸残基处。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物具有增加的对蛋白酶剪切的稳定性。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物具有增加的对胰腺蛋白酶的蛋白水解性降解的稳定性。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物具有增加的对在胃肠道中存在的蛋白酶的蛋白水解性降解的稳定性。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物具有增加的对在哺乳动物血浆中存在的蛋白酶的蛋白水解性降解的稳定性。
本发明的一个实施方案涉及包含一个或多个额外二硫键的生长激素化合物，它针对一种或多种蛋白酶的降解被稳定化，所述蛋白酶例如消化蛋白酶，诸如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和/或弹性蛋白酶。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物具有增加的对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或弹性蛋白酶的蛋白水解性降解的稳定性。
在一个实施方案中，生长激素化合物针对胰凝乳蛋白酶和/或弹性蛋白酶的降解被稳定化。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的H21/M170、D26/V102C、D26/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的H21/M170、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C和/或S85C/Y143C。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的D26/V102C、D26/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。
在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的Q84C/Y143C和/或S85C/Y143C。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物具有增加的体内半衰期。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物具有增加的贮存期限。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物可以是融合蛋白。
本发明的一个实施方案涉及生长激素化合物，其中所述多肽序列与由SEQIDNo.1定义的hGH具有至少80%、诸如90%或诸如95%同一性。在其它实施方案中，所述多肽与由SEQIDNo.1定义的hGH具有96%、97%、98%或99%同一性。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物是这样的多肽，其包含与SEQIDNo.1具有至少20%、诸如至少30%、诸如至少40%、诸如至少50%、诸如至少60%、诸如至少70%、诸如至少80%、诸如至少90%同一性、诸如至少95%、诸如至少96%、诸如至少97%、诸如至少98%、诸如至少99%同一性的氨基酸序列，且所述多肽在实施例3和实施例3A(垂体切除的（hyposectomized）大鼠)所述的测定中的活性是hGH的活性的少1%、诸如至少5%、诸如至少10%、诸如至少25%。为了避免疑惑，本发明的生长激素化合物在这些测定中也可以具有比hGH更高的活性。如果以某种方式衍生化生长激素化合物，应当用未衍生化的生长激素化合物，测量相对于hGH的生长激素活性，这是因为衍生化可能显著改变活性。例如，在用性质修饰基团（其延长生长激素化合物的功能性体内半衰期）衍生化的生长激素化合物的情况下，衍生化的生长激素化合物的活性可能远远低于hGH的活性，这种降低被延长的停留时间相抵消。在一个实施方案中，所述生长激素化合物是这样的多肽的片段，所述片段已经保留了大量上述的生长激素活性。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物是hGH的截短形式，即已经从与SEQNo.1相对应的N-和/或C-末端删除了一个或多个氨基酸残基，其中所述化合物保留希望的野生型hGH的生物学性质。
本发明的一个实施方案涉及生长激素化合物，其包含在SEQIDNo.1中的额外二硫键，或与在SEQIDNo.1中定义的人生长激素相比包含一个或多个额外二硫键，其中所述化合物的体外活性与由SEQIDNo.1定义的hGH的体外活性相匹敌。优选地，在本文实施例3所述的BAF测定中，测量生长激素化合物的体外活性。在一个实施方案中，根据本发明的化合物的体外活性可以不同于hGH的体外活性。如上所述，更低的体外活性可以被其它体内功能性补偿。在一个实施方案中，体外活性可以是hGH活性的诸如至少1%、诸如至少5%、诸如至少10%、诸如至少25%。在另一个实施方案中，化合物相对于由SEQIDNo.1定义的野生型hGH的EC50比不超过10、不超过8、不超过6、不超过4、不超过2。在一个实施方案中，所述化合物相对于由SEQIDNo.1定义的野生型hGH的EC50比是5-0.01，或诸如3-0.01，或诸如2-0.01。在替代实施方案中，通过在实施例4中所述的表面等离振子共振分析(Biacore)，可以测量根据本发明的EC50。在对应的实施方案中，通过Biacore测定的体外活性可以是hGH活性的诸如至少1%、诸如至少5%、诸如至少10%、诸如至少25%。在其它实施方案中，通过Biacore测定的化合物相对于由SEQIDNo.1定义的野生型hGH的EC50比不超过10、不超过8、不超过6、不超过4、不超过2。在一个实施方案中，所述化合物相对于由SEQIDNo.1定义的野生型hGH的EC50比是5-0.01，或诸如3-0.01，或诸如2-0.01。
其中可以导入额外二硫键的GH化合物的其它实例包括在WO92/09690(Genentech)、US6,004931(Genentech)、US6,143,523(Genentech)、US6,136,536(Genentech)、US6,057,292(Genentech)、US5,849,535(Genentech)、WO97/11178(Genentech)、WO90/04788(Genentech)、WO02/055532(MaxygenAPS和MaxygenHoldings)、US5,951,972(AmericanCynanamidCorporation)、US2003/0162949(BolderBiotechnologies,Inc.)中公开的那些，它们引入本文作为参考。另外包括hGH的天然变体，诸如由Masuda,N等人,Biochim.Biophys.Acta949(1),125-131(1988.)描述的20kDa。
在本文描述的所有实施方案中，另一个选择是，生长激素化合物具有在与SEQIDNo.1的位置120相对应的位置处的Gly残基。
在本上下文中，词语“人生长激素(hGH)’、“hGHwt”和“野生型hGH(wthGH)”可互换使用，且都表示具有SEQIDNo.1中的氨基酸序列的蛋白。
在本上下文中，术语“肽”和“多肽”可互换使用，且意在表示相同物。术语“肽”或“多肽”意在表示通过肽键连接的2个或更多个氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是天然的或非天然的。组分氨基酸可以来自由遗传密码编码的氨基酸组，且它们可以是不是由遗传密码编码的天然氨基酸以及合成氨基酸。不是由遗传密码编码的天然氨基酸是例如Hyp(羟脯氨酸)、y-羧基谷氨酸、Orn(鸟氨酸)、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包含通过化学合成生产的氨基酸，诸如由遗传密码编码的氨基酸的D--异构体，诸如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aad(α-氨基己二酸)、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Agl(α-氨基-甘氨酸)、Asu(α-氨基辛二酸)、Cha(β-环戊基-丙氨酸)、Chg(环己基甘氨酸)、Dab(α,γ-二氨基丁酸)、Dap(α,β-二氨基丙酸)、Hcy(高半胱氨酸)、Hpr(高脯氨酸)、Nle(正亮氨酸)、Phg(苯甘氨酸)、Hph(高苯丙氨酸)、1Nal(β-(1-萘基-丙氨酸)、2Nal(β-(2-萘基-丙氨酸)、2Pal(-(2-吡啶基)-丙氨酸、3Pal(β-(3-吡啶基)-丙氨酸)、Pip(4-氨基-哌啶-4-羧酸)、Pra(炔丙基-甘氨酸)、Pyr(焦谷氨酸)、Gla(γ-羧基-谷氨酸)、Hci(高瓜氨酸)、Nva(正缬氨酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨甲基苯甲酸和邻氨基苯甲酸。
该术语也包括术语“蛋白”，其可以由一条多肽链组成，或由通过非共价或共价相互作用（诸如半胱氨酸桥）保持在一起的2条或更多条多肽链组成。
应当理解，该术语也意在包括除包含额外二硫键外已经衍生化的肽，诸如通过向肽的侧链或主链附着部分（例如，但不限于、PEG、碳水化合物、脂肪酸、清蛋白结合剂、烷基链、亲脂基团、维生素、胆汁酸或间隔区）。该术语肽包括任意合适的肽，且可以与术语多肽和蛋白同义地使用，除非另有说明或上下文相抵触，条件是，读者认识到，每类各个含有氨基酸聚合物的分子可以伴随显著差异，且由此形成本发明的个别实施方案(例如，由多条多肽链组成的肽（诸如抗体）明显不同于例如单链抗体、肽免疫粘附素或单链免疫原性肽)。因此，本文的术语肽通常应当理解为表示任意适当大小和组成(就蛋白分子中的氨基酸的数目和结合的链的数目而言)的任意合适的肽。此外，本文所述的肽可以包含非天然存在的和/或非-L氨基酸残基，除非另有说明或上下文相抵触。
除非另有说明或上下文相抵触(且如果作为术语多肽和/或蛋白的个别实施方案进行讨论)，术语肽也包括衍生化的肽分子。衍生化的肽分子是这样的分子，其中所述肽的一个或多个氨基酸残基已经被化学修饰(例如通过烷基化、酰化、酯形成或酰胺形成)，或结合了一个或多个非-氨基酸的有机和/或无机原子或分子取代基(例如聚乙二醇(PEG)基团、亲脂取代基(其可以任选地通过间隔区残基或诸如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、L/D-谷氨酸、琥珀酸等基团连接到肽的氨基酸序列上)、荧光团、生物素、放射性核素等)，或者还可以或可替代地包含非必需的、非天然存在的和/或非-L氨基酸残基，除非另有说明或上下文相抵触(但是，再次应认识到，这样的衍生物自身且独自可以视作本发明的独立特征，且为了描述本发明的方便（而不是暗示裸肽和这样的衍生物之间的任何类型的等价性），在肽的含义内包含这样的分子)。
这样的氨基酸残基的非限制性实例包括例如2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基-丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基-庚酸、2-氨基-异丁酸、3-氨基-异丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基-天冬酰胺、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基-甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、炔丙基-甘氨酸和抑制素(statine)卤代的氨基酸。
在本发明中描述的“化合物”可以是保留希望的与wthGH类似的生物活性的“蛋白”或“肽”或“多肽”，它们可以是“类似物”或“衍生物”或“变体”，无论其修饰方式如何。
当表示多肽时，本文使用的术语“类似物”或“变体”是指所述肽的修饰形式，其中所述肽的一个或多个氨基酸残基已经被置换为其它氨基酸残基，和/或其中一个或多个氨基酸残基已经从该肽删除，和/或其中一个或多个氨基酸残基已经添加到该肽上。氨基酸残基的这种置换或添加或缺失，可以发生在肽的N-末端和/或肽的C-末端和/或在肽的N-或C-末端之间。没有阐明其旋光异构体的所有氨基酸应当理解为是指L-异构体。
术语“二硫键”或“二硫桥”可互换使用，且意在表示相同物。蛋白中的“二硫键”或“二硫桥”形成在半胱氨酸残基的硫醇基之间。
术语“额外的半胱氨酸”或“导入的半胱氨酸”可互换使用，且意在表示相同物。该术语意在包括在野生型hGH中不存在的半胱氨酸残基。为了使结构变化最小化，通常通过一个或多个氨基酸残基的置换，导入一个或多个半胱氨酸残基，由此维持hGH的长度。在环部分中或在螺旋边界处可以容忍额外的cys残基的插入，而在螺旋内导入cys残基不太吸引人。
术语“额外的二硫键”或“导入的二硫键”可互换使用，且意在表示相同物。该术语意在包括在2个半胱氨酸残基之间形成的二硫键，所述2个半胱氨酸残基中的至少一个在野生型hGH中不存在。
本文使用的术语“衍生物”表示肽或多肽，其中通过向生长激素化合物的侧链或主链导入聚合物（诸如PEG、碳水化合物部分、清蛋白结合剂、脂肪酸、亲脂基团、维生素、胆汁酸或间隔区），已经化学地修饰了所述肽的一个或多个氨基酸残基。所述化学修饰在性质上也可以是暂时的，即它们在体内可以容易地去除。所述化学修饰可以是翻译后导入的，诸如通过细胞自身，或通过在表达后在肽上进行的化学修饰。
本领域中公知的术语“同一性”意指如通过比较序列测定的两种或多种肽序列之间的相互关系。在本领域中，“同一性”还指如由两个或多个氨基酸残基的串之间的匹配数确定的肽之间的序列相关性程度。“同一性”测量了具有通过特定数学模型或计算机程序(即“算法”)处理的缺口比对(如果有的话)的两种或多种序列之间的相同匹配百分比。易于通过公知方法计算相关肽的同一性。这种方法包括，但不限于那些在如下文献中描述的方法：ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988；Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,Part1,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987；SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M.StocktonPress,NewYork,1991；和Carillo等,SIAMJ.AppliedMath.48,1073(1988)。
设计测定同一性的优选的方法，以给出测试序列之间的最大匹配。测定同一性的方法在公开可利用的计算机程序中描述。测定两种序列之间同一性的优选计算机程序包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等,Nucl.Acid.Res.12,387(1984)；GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.)；BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等,J.Mol.Biol.215,403-410(1990))。公众可以从NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)和其它来源(BLASTManual,Altschul等NCB/NLM/NIHBethesda,Md.20894；Altschul等,文献同上)获得BLASTX程序。众所周知的Smithwaterman算法也可以用于测定同一性。
例如，使用计算机算法GAP(GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.)，对测定百分比序列同一性的两种肽进行序列对比，以达到其各自氨基酸的最佳匹配(“匹配的跨度”，如通过算法测定的)。缺口开放罚分(gapopeningpenalty)(计算为3x对角线平均值(averagediagonal)；“对角线平均值”为所用比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”为通过特定比较矩阵指定各完美氨基酸匹配的评分或数字)和缺口延长罚分(通常为{分数(1/10)}x缺口开放罚分)以及比较矩阵，诸如PAM250或BLOSUM62与算法结合使用。算法还使用标准比较矩阵(参见：用于PAM250比较矩阵：Dayhoff等人,AtlasofProteinSequenceandStructure,5,(1978)；用于BLOSUM62比较矩阵：Henikoff等人,PNASUSA89,10915-10919(1992))。
用于肽序列对比的优选参数包括如下：
算法：Needleman等人,J.Mol.Biol.48,443-453(1970)；比较矩阵：BLOSUM62，来自Henikoff等人,PNASUSA89,10915-10919(1992)；缺口罚分：12,缺口长度罚分：4,相似性阈：
GAP程序利用上述参数是有用的。上述参数为使用GAP算法进行肽对比(对末端缺口而言无罚分)的默认参数。
术语“蛋白酶”意在包括具有催化肽键的水解切割的能力的所有酶。蛋白酶可以是细胞内的、细胞外的或膜结合的蛋白酶（protease）、蛋白水解酶（proteinase）或肽酶，且包括哺乳动物肠腔中的蛋白酶和存在于哺乳动物血浆中的蛋白酶。蛋白酶可以属于内切蛋白酶和外切蛋白酶类型。蛋白酶可以属于、但不限于下述类型：丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或金属蛋白酶。蛋白酶的具体实例是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、因子VIIa、因子Xa、蛋白酶K、羧肽酶、DPPIV、中性内肽酶、粒酶B、脯氨酸-内肽酶、葡萄球菌肽酶I、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、胱天蛋白酶1-10、梭菌蛋白酶、肠激酶、谷氨酰内肽酶、粒酶B、LysC、LysN、脯氨酸-内肽酶和葡萄球菌肽酶I。
术语“耐受蛋白水解性降解的”或“增加的对蛋白水解性降解的稳定性”或“增加的对蛋白酶剪切的稳定性”或“提高的蛋白水解稳定性”或“蛋白水解稳定性”可互换使用，且意在指示相同含义。与本发明的hGH化合物结合使用时，该术语意在表示，在特定条件下，与野生型hGH相比，所述hGH化合物的多肽链以更慢的速率被蛋白酶切割。
通过本领域技术人员已知的几种技术，可以测量蛋白的蛋白酶剪切的速率。在实施例5中，描述了测量hGH或hGH化合物的降解速率的测定的一个实例。
本发明也涉及用于提高hGH化合物的药理学性质的方法。这些药理学性质可以是例如：功能性体内半衰期、血浆体内半衰期、平均停留时间的增加，肾清除率的降低。
术语“功能性体内半衰期”以它的正常含义使用，即，诸如生长激素化合物的肽的生物活性的50%的时间，其中所述生长激素化合物仍然存在于体内/靶器官内，或诸如生长激素化合物的肽的活性是它的起始值的50%的时间。作为测定功能性体内半衰期的替代方案，可以测定“体内血浆半衰期”和延长的作用，即，在被清除之前50%的肽在血流中循环的时间。测定血浆半衰期通常比测定功能性半衰期更简单，且血浆半衰期的量级通常是功能性体内半衰期的量级的良好指示。
本发明也涉及药物组合物，其包含本文定义和描述的生长激素化合物。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以以几种剂型来施用，例如作为溶液、悬浮液、乳剂、微乳、多层乳剂、泡沫、油膏剂、糊剂、药膏、软膏、片剂、包衣片、与增强吸收的化合物共同配制的片剂、冲洗剂、胶囊、例如硬明胶胶囊和软明胶胶囊、包衣的胶囊、栓剂、滴剂、凝胶、喷雾剂、粉末、微粒、纳米颗粒(nanoparticles)、气溶胶、吸入剂、注射液、原位转化液(insitutransformingsolution)、例如原位胶凝、原位凝结、原位沉淀、原位结晶、输注溶液以及植入片。
在本发明的一个实施方案中，通过口服、皮下、肌内、鼻和静脉内施用，可以施用药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，通过几种施用途径（例如，舌的、舌下、口腔含化的、在口中、在胃和肠中），可以施用口服药物组合物。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可用于肽缀合物（例如GH缀合物）的肺施用的固体、半固体、粉末和溶液组合物中，其中使用例如计量剂量吸入器、干粉吸入器和喷雾器，它们都是本领域技术人员众所周知的设备。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以进一步配合入或附着到(例如通过共价、疏水和静电相互作用)药物载体、药物递送系统和高级药物递送系统，以进一步增强GH缀合物的稳定性、提高生物利用率、提高溶解度、减少不良作用、实现本领域技术人员所熟知的时间治疗、和提高患者的顺从性、或它们的任意组合。载体、药物递送系统和高级药物递送系统的实例包括但不限于：聚合物例如纤维素及衍生物、多糖例如葡聚糖及衍生物、淀粉和衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯与甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乳酸与聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白例如清蛋白、凝胶例如热胶凝系统(thermogellingsystem)、例如本领域技术人员所熟知的嵌段共聚物系统、微团、脂质体、小球体、纳米微粒(nanoparticulate)、液晶及其分散体、L2相及其分散体（为脂质-水系统中相行为领域的技术人员所熟知）、聚合微团、多层乳剂、自乳化、自微乳化、环糊精及其衍生物、以及树状聚体。
引入本文作为参考的口服制剂的递送系统的各种实例包括非离子型表面活性剂，已知它们增加亲水化合物的穿透。非离子型表面活性剂的实例是：癸酸钠、酒石酸、Brij56、Brij58、Brij35、Brij30、脂肪酸糖类、牛磺脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、对叔辛基苯酚聚氧乙烯-9.5(TritonX-100)，如Takatsuka等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.62,52-58(2006)所述。口服递送系统还可以包括蛋白酶抑制剂和粘液溶解物质。蛋白酶抑制剂的实例是大豆胰蛋白酶抑制剂、抑酶肽和胰凝乳蛋白酶抑制剂。粘液溶解物质的实例是二硫苏糖醇和N-乙酰基半胱氨酸。通过同时使用粘液溶解剂和非离子型表面活性剂，增强吸收较差的亲水化合物的肠吸收。也包括由Emisphere开发的5-CNAC和类似的化合物(WO2008101240、WO200811283687、WO2008027854、WO2008014430、US20080095837)。
口服制剂递送系统还可以包括密蛋白（claudine）调节剂，其起上皮细胞的特异性紧密连接开具(opener)的功能。这些密蛋白调节剂暂时地或非暂时地起作用，并干扰使上皮细胞紧密保持到一起形成紧密连接的蛋白复合物(Kondoh等人,MolPharmacology67,749-756(2005))。口服制剂递送系统的其它实例包括粘膜粘着剂，例如含有硫醇的添加剂(共制剂)或共价地附着的侧链可以增加与粘膜层、聚氨基葡萄糖和卡波姆分子、聚丙烯酸酯、PEG及其衍生物的粘附(Palmberger等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.66,405-412(2007);Leitner,V.M等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.56,207-214(2003);H.L.Leu?en等人,Parm.Res.13,1668-1672(1996);H.L.Leu?en等人,Int.J.Pharmaceuticals141,39-52(1996);Takatsuka等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.62,52-58(2006)。口服制剂递送系统的其它实例包括胞膜窖/脂质筏、SMVT(钠依赖性的多种维生素运载蛋白)。口服递送制剂的另一个实例包括受体-介导的转胞吞作用，诸如使用维生素B12(钴胺素)作为底物的IRF(内因子受体)、FcRn(新生Fc受体)和运铁蛋白(M.Gumbleton,Adv.Drug.Del.Rev.49,281-300(2001);K.C.Partlow等人,Biomaterials29,3367-3375(2008);(Lee等人,Biotechnol.Appl.Biochem.46,211-217(2007);S.Y.Chae等人,BioconjugateChem.19,334-341(2008);Russell-JonesG.:MembraneTransportersasDrugTargets中的第17章(1999);Said和MohammedCurr.Opin.Gastroent.22,140-146(2006);Chalasani等人,J.Con.Release117,421-429(2007);H.Li&Z.M.QianMed.Res.Rev.22,225-250(2002);Liang&YangBiochem.Biophys.Res.Comm.225,734-738(2005)。
在一个实施方案中，本发明的GH化合物发挥生长激素活性，且可以用于治疗将从循环生长激素量的增加获益的疾病或状态。此种疾病或状态包括：生长激素缺乏(GHD)；Turner综合征；Prader-Willi综合征(PWS)；Noonan综合征；唐氏综合征；慢性肾脏病，青少年类风湿性关节炎；囊性纤维化；接受HAART治疗的儿童中的HIV-感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄出生儿童（shortchildrenbornshortforgestationalage）(SGA)；以极低出生体重(VLBW)出生，但SGA的儿童中的身材矮小症；骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成年人中的GHD；长骨内或其骨折，诸如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、中手骨（matacarpea）、中足骨（matatarsea）和指；松质骨，诸如颅骨、手底（baseofhand）和足底内或其骨折；例如手、膝或肩中的腱或韧带外科手术后的患者；具有或正在进行牵引成骨作用（distractionoteogenesis）的患者；髋关节或盘置换、弯月面修复、脊柱融合或假体固定后的患者，诸如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中；已固定入骨接合术材料，诸如钉、螺钉和板的患者；具有骨折的不连接或连接不正的患者；骨切除术（osteatomia）后，例如来自胫骨或第一趾的患者；移植物植入后的患者；因创伤或关节炎导致的膝中的关节软骨变性；具有Turner综合征的患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD)；APCD中与营养不良相关的心血管疾病；APCD中恶病质的逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病；APCD中的HIV；具有APCD的老年人；APCD中的慢性肝病，APCD中的疲劳综合征；Chron氏病；受损的肝功能；具有HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV-相关脂肪营养障碍综合征(HALS)；男性不育症；大的选择性外科手术，酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老；虚弱老人；骨关节炎；创伤损害的软骨；勃起机能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁症；创伤性脑损伤；蛛网膜下出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌病；或因儿童糖皮质激素治疗导致的身材矮小症。生长激素还已经用于加速肌肉组织、神经组织或伤口的愈合；加速或改善血流到达受损组织；或降低受损组织中的感染率。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗疾病的方法，其中生长激素化合物活性可以用于治疗将从循环生长激素化合物量的增加获益的疾病或状态，所述方法包括，给患者施用有效量的SEQIDNo.1的生长激素化合物或其缀合物的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括，给有此需要的患者施用治疗有效量的根据本发明的生长激素化合物。本发明因而提供了治疗这些疾病或状态的方法，所述方法包括，给有此需要的患者施用治疗有效量的根据本发明的生长激素化合物。
本文使用的本发明化合物的“治疗有效量”意指足以治愈、减轻或部分抑制给定疾病及其并发症的临床表现的量。将足以达到这一目的的量定义为“治疗有效量”。对每一目的而言，有效量将取决于例如疾病或损伤的严重性以及受试者的体重、性别、年龄和总体状态。应该理解，使用常规实验可以确定合适的剂量，这完全属于受过训练的医师或兽医的能力范围。
在一个实施方案中，本发明提供了生长激素化合物或其缀合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗上述疾病或状态。
在本文中定义和描述的本发明的生长激素化合物预期用作治疗用蛋白。
多肽的生产是本领域众所周知的。例如，通过经典的肽合成，例如使用tert-Boc或Fmoc化学法或其它非常确定的技术的固相肽合成，可以生产多肽，参见例如Greene和Wuts,“ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis”,JohnWiley&Sons,2006。
多肽还可以通过包括以下步骤的方法产生：在允许肽表达的条件下，在合适的营养培养基中，培养含有编码所述多肽的DNA序列并能表达所述多肽的宿主细胞。对于包含非天然氨基酸残基的多肽，应当修饰重组细胞，从而使得非天然氨基酸掺入多肽中，诸如通过使用tRNA突变体。
使用无细胞的体外转录/翻译系统，也可以生产多肽。使用移码或无义阻抑系统，也可以生产含有新颖的非天然氨基酸的多肽，例如如在J.Am.Chem.Soc.125,11782-11783(2003),Science301,964-967(2003),Science292,498-500(2001),Science303,371-373(2004)和本文的参考文献中所述。
用于培养细胞的培养基可以是适合用于培养宿主细胞的任何常规的培养基，例如含有合适的补充物的基本培养基或复合培养基。合适的培养基可得自商业供应商或可以按照公开的配方制备(例如在美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的产品目录中)。然后，细胞所产生的肽可以通过常规程序从培养基中回收，所述常规程序包括：经离心或过滤，将宿主细胞从培养基中分离。对于细胞外产物，通过下述分离上清液的蛋白质组分：过滤、柱层析或沉淀，例如微量过滤、超滤、等电沉淀，通过多种层析程序纯化，例如离子交换层析、疏水作用层析、凝胶过滤层析、亲和层析等，这取决于正被讨论的多肽的类型。对于细胞内或周质产物，分解或透化处理从培养基分离的细胞，并提取，以回收产物多肽或其前体。
编码多肽的DNA序列可以适当地来源于基因组或cDNA，例如通过以下步骤获得：依照标准技术，制备基因组或cDNA文库，并通过使用特异性的DNA或RNA探针杂交，筛选出编码全部或部分肽的DNA序列(参见，例如，Sambrook,J,Fritsch,EF和Maniatis,T,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,1989)。编码所述多肽的DNA序列也可以通过已确立的标准方法来合成制备，例如在Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetters22,1859-1869(1981)中描述的亚磷酰胺(phosphoamidite)法，或在Matthes等人,EMBOJournal3,801-805(1984)中描述的方法。DNA序列也可以使用特异性引物通过聚合酶链反应来制备，例如在US4,683,202或Saiki等人,Science239,487-491(1988)中所描述的。
可以将编码要表达的肽的DNA序列插入任何载体，所述载体可以方便地施以重组DNA的程序，且载体的选择将常常将取决于它所要引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外的实体存在的载体，所述载体的复制独立于染色体复制，例如质粒。可替代地，载体可以是当引入到宿主细胞中时整合到宿主细胞基因组中并随它所整合入其中的染色体一起复制的载体。
载体可以是表达载体，其中编码多肽的DNA序列与DNA转录所需的另外区段(例如启动子)可操作地(oprerably)连接。启动子可以是在所选的宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，且可以从编码对于宿主细胞是同源或异源的蛋白的基因中获得。用于指导编码要表达的肽的DNA在多种宿主细胞中转录的合适启动子的实例在本领域中众所周知，参考例如Sambrook等人,同上。
如有必要，编码要表达的肽的DNA序列也可与合适的终止子、多腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列可操作性地连接。本发明的重组载体可以进一步包含使载体能够在正被讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。
载体也可以包含选择标记，例如其产物补足宿主细胞缺陷的基因，或赋予对药物(例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤)抗性的基因。对于大规模生产，选择标记可以例如不是抗生素抗性，例如当将所述载体用于大规模生产时，可以切除载体中的抗生素抗性基因。从载体消除抗生素抗性基因的方法是本领域已知的，参见例如US6,358,705，它引入本文作为参考。
为了指导要表达的肽进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前序列原(prepro-sequence)、前序列(pre-sequence))。分泌信号序列在正确的阅读框中与编码所述肽的DNA序列连接。分泌信号序列一般位于编码肽的DNA序列的5’。分泌信号序列可以是与肽正常地结合的分泌信号序列或者可以来自编码另一种分泌的蛋白的基因。
用于分别连接编码要表达的肽的DNA序列、启动子以及任选的终止子和/或分泌信号序列，以及用于将它们插入含有复制所需信息的合适载体的程序为本领域技术人员所熟知(参考例如Sambrook等人,同上)。
引入了DNA序列或重组载体的宿主细胞可以是能够产生本文所述肽的任何细胞，且包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。为本领域所熟知并使用的合适宿主细胞的实例是而不限于：大肠杆菌(E.coli)、啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)或哺乳动物的BHK或CHO细胞系。使用本领域普遍已知的体外转录/翻译系统，也可以生产要表达的肽。
将本文引述的所有参考文献（包括公开文献、专利申请和专利）完整地引入本文作为参考，且其引入程度与指定将每篇参考文献个别和特别地引入作为参考并且在本文中完整地列出相同(法律允许的最大程度)。
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本发明包括了所附权利要求书中所记载主题的、适用法律所允许的所有修改与等同方案。
通过下述的实施方案（不限于此）进一步描述了本文所述的发明。
实施方案1.在SEQIDNo.1中包含额外二硫键的生长激素化合物。
实施方案2.根据实施方案1所述的生长激素化合物，其包含在与SEQIDNo.1中的R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C相对应的位置处的至少一个氨基酸对之间的额外二硫键。
实施方案3.根据实施方案2所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含在与SEQIDNo.1中的A17C/E174C、H21C/M170C、Q84C/Y143C、S71C/S132C和/或R94C/D107C相对应的位置处的至少一个氨基酸对之间的额外二硫键。
实施方案4.根据实施方案1所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。
实施方案5.根据实施方案4所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的A17C/E174C、H21C/M170C、S71C/S132C、Q84C/Y143C和R94C/D107C。
实施方案6.与在SEQIDNo.1中定义的人生长激素相比包含一个或多个额外二硫键的生长激素化合物。
实施方案7.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含在一个环区段和一个螺旋区段之间、或在一个环区段内、或在多个环区段之间、或在多个螺旋区段之间的额外二硫键。
实施方案8.根据实施方案6或7所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。
实施方案9.根据实施方案8所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。
实施方案10.根据实施方案9所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的A17C/E174C、H21C/M170C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。
实施方案11.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个额外二硫键，其中至少一个半胱氨酸存在于对应着SEQIDNO1中的氨基酸128-154的L3中，或诸如在与SEQIDNo.1中的氨基酸135-148相对应的区域中。
实施方案12.根据实施方案11所述的生长激素化合物，其中所述额外二硫键的至少一个半胱氨酸存在于L3中，在与SEQIDNo.1中的氨基酸141、氨基酸142、氨基酸143、氨基酸144、氨基酸145或氨基酸146、优选氨基酸143或氨基酸144相对应的位置。
实施方案13.根据实施方案12所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C和/或F92C/T148C。
实施方案14.根据实施方案13所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C和/或F92C/T148C。
实施方案15.根据实施方案14所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或F92C/T148C。
实施方案16.根据任一项前述权利要求的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个连接L3和L1的额外二硫键。
实施方案17.根据实施方案16所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含一个额外二硫键，其连接与SEQIDNo.1的L3中的氨基酸54、氨基酸55、氨基酸56、氨基酸57、氨基酸58或氨基酸59相对应的氨基酸残基和与SEQIDNO.1的L1中的氨基酸143或氨基酸144相对应的氨基酸。
实施方案18.根据实施方案16所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C和/或S71C/S132C。
实施方案19.根据实施方案18所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C和/或S71C/S132C。
实施方案20.根据实施方案1-15中任一项所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个连接L3和螺旋区段的额外二硫键。
实施方案21.根据实施方案20所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个连接L3和螺旋2的额外二硫键。
实施方案22.根据实施方案21所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含一个额外二硫键，其连接与SEQIDNo.1的H2中的氨基酸84或氨基酸85相对应的氨基酸残基和与SEQIDNO.1的L3中的氨基酸143或氨基酸144相对应的氨基酸。
实施方案23.根据实施方案21所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C和F92C/T148C。
实施方案24.根据实施方案23所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C和/或F92C/T148C。
实施方案25.根据实施方案24所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或F92C/T148C。
实施方案26.根据实施方案1-10中任一项所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个连接L2和螺旋1的额外二硫键。
实施方案27.根据实施方案26所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着D26C/V102C或D26C/Y103C。
实施方案28.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其中所述多肽序列与由SEQIDNo.1定义的hGH具有至少80%、诸如90%、诸如95%、诸如96%、诸如97%、诸如98%或诸如99%同一性。
实施方案29.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其中所述化合物的体外活性是由SEQIDNo.1定义的野生型hGH的活性的至少5%。
实施方案30.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其中所述多肽的功能性体内半衰期是人生长激素的2倍或更多。
实施方案31.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其中所述多肽的功能性体内半衰期是人生长激素的2-10倍。
实施方案32.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物针对一种或多种蛋白酶的降解被稳定化，所述蛋白酶例如消化蛋白酶，诸如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和/或弹性蛋白酶。
实施方案33.根据实施方案32所述的生长激素化合物，其中所述化合物针对胰凝乳蛋白酶和/或弹性蛋白酶的降解被稳定化。
实施方案34.根据实施方案33所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的H21/M170、D26/V102C、D26/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。
实施方案35.根据实施方案33所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的H21/M170、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C和/或S85C/Y143C。
实施方案36.根据实施方案33所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的D26/V102C、D26/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。
实施方案37.根据实施方案33所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。
实施方案38.根据实施方案33所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。
实施方案39.根据实施方案33所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的Q84C/Y143C和/或S85C/Y143C。
实施方案40.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其中所述一个或多个额外二硫键通过与SEQIDNo.1相比至少2个氨基酸的氨基酸置换得到。
实施方案41.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其中所述化合物与SEQIDNo.1相比精确地包含一个额外二硫键。
实施方案42.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其中所述化合物与SEQIDNo.1相比精确地包含2个氨基酸置换。
实施方案43.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其与在SEQIDNo.1中定义的人生长激素相比包含至少2个额外的半胱氨酸。
实施方案44.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其与在SEQIDNo.1中定义的人生长激素相比精确地包含2个额外的半胱氨酸。
实施方案45.根据任一项前述实施方案的生长激素化合物，其中如下化学地修饰生长激素化合物：通过加入聚乙二醇，通过向肽的侧链或主链附着聚合物，所述聚合物例如但不限于糖部分、脂肪酸、亲脂基团、清蛋白结合剂、维生素、胆汁酸、间隔区。
实施方案46.根据实施方案45所述的生长激素化合物，其中生长激素化合物的化学修饰在性质上是暂时的，即它们在体内可以容易地去除。
实施方案47.根据实施方案45-46中任一项所述的生长激素化合物，其中氨基酸残基的化学修饰可以发生在肽的N-末端、在肽的C-末端和/或在肽的N-和C-末端之间。
实施方案48.根据实施方案45-47中任一项所述的生长激素化合物，其中所述化学修饰发生在氨基酸残基Phe1、Gln40、Gln141或Phe191。
实施方案49.根据实施方案45-48中任一项所述的生长激素化合物，其中所述化学修饰是通过PEG，且其中PEG是500Da至50kDa。
实施方案50.根据实施方案1-49中任一项所述的生长激素化合物，其中化学地修饰所述生长激素化合物，以促进跨上皮的转运。
实施方案51.根据实施方案1-49中任一项所述的生长激素化合物，其中化学地修饰所述生长激素化合物，以促进与wthGH相比跨上皮的转运。
实施方案52.根据实施方案1-49中任一项所述的生长激素化合物，其中化学地修饰所述生长激素化合物，以得到与wthGH相比延长的功能性体内半衰期。
实施方案53.根据实施方案52所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物的功能性体内半衰期是hGH的2倍或更多。
实施方案54.根据实施方案53所述的生长激素化合物，其中所述功能性体内半衰期是hGH的2-10倍。
实施方案55.根据实施方案45-49中任一项所述的生长激素化合物，其中所述化学修饰发生在不干扰生长激素化合物与hGHR的结合的氨基酸残基处。
实施方案56.根据实施方案49-55中任一项所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物针对一种或多种蛋白酶的蛋白水解性降解被稳定化，所述蛋白酶例如消化蛋白酶，诸如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和/或弹性蛋白酶。
实施方案57.一种用于制备具有增加的对蛋白水解性降解的稳定性的生长激素化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a.在hGH中导入额外的二硫键。
实施方案58.一种用于制备根据实施方案1-14中任一项的具有增加的对蛋白水解性降解的稳定性的生长激素化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a.通过用一个或多个半胱氨酸置换hGH中的一个或多个氨基酸残基，在hGH中导入额外的二硫键。
实施方案59.一种于制备根据实施方案1-14的具有增加的对蛋白水解性降解的稳定性的生长激素化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a.通过添加一个或多个半胱氨酸残基，在hGH中导入额外的二硫键。
实施方案60.一种药物组合物，其包含根据实施方案1-56中任一项所述的生长激素化合物和药学上可接受的载体。
实施方案61.根据实施方案60所述的药物组合物，其中所述组合物可以通过舌的、舌下的、口腔含化的、在口中、口服、在胃和肠中、鼻的、肺的、表皮的、皮的、经皮的和肠胃外的途径施用给患者。
实施方案62.根据实施方案60或61所述的药物组合物，其中所述组合物是口服的组合物。
实施方案63.一种制备药物组合物的方法，其中所述组合物包含根据实施方案1-56中任一项所述的生长激素化合物和药学上可接受的载体。
实施方案64.一种治疗疾病的方法，其中生长激素活性可以用于治疗将从循环生长激素化合物量的增加获益的疾病或状态，所述方法包括，给患者施用有效量的根据实施方案1-56中任一项所述的生长激素化合物或根据实施方案60-62中任一项的药物组合物。
实施方案65.根据实施方案63或64所述的治疗疾病的方法，其中所述疾病选自：生长激素缺乏(GHD)；Turner综合征；Prader-Willi综合征(PWS)；Noonan综合征；唐氏综合征；慢性肾脏病，青少年类风湿性关节炎；囊性纤维化；接受HAART治疗的儿童中的HIV-感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄出生儿童(SGA)；以极低出生体重(VLBW)出生，但SGA的儿童中的身材矮小症；骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成年人中的GHD；长骨内或其骨折，诸如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、中手骨、中足骨和指；松质骨，诸如颅骨、手底和足底内或其骨折；例如手、膝或肩中的腱或韧带外科手术后的患者；具有或正在进行牵引成骨作用的患者；髋关节或盘置换、弯月面修复、脊柱融合或假体固定后的患者，诸如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中；已固定入骨接合术材料，诸如钉、螺钉和板的患者；具有骨折的不连接或连接不正的患者；骨切除术后，例如来自胫骨或第一趾的患者；移植物植入后的患者；因创伤或关节炎导致的膝中的关节软骨变性；具有Turner综合征的患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD)；APCD中与营养不良相关的心血管疾病；APCD中恶病质的逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病；APCD中的HIV；具有APCD的老年人；APCD中的慢性肝病，APCD中的疲劳综合征；Chron氏病；受损的肝功能；具有HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV-相关脂肪营养障碍综合征(HALS)；男性不育症；大的选择性外科手术，酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老；虚弱老人；骨关节炎；创伤损害的软骨；勃起机能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁症；创伤性脑损伤；蛛网膜下出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌病；或因儿童糖皮质激素治疗导致的身材矮小症。
实施方案66.用作药物的根据实施方案1-56中任一项所述的生长激素。
实施方案67.根据实施方案1-56中任一项所述的生长激素作为药物的用途。
实施方案68.根据实施方案1-56中任一项所述的生长激素化合物在疾病治疗中的用途。
实施方案69.根据实施方案67或实施方案68所述的用途，其中所述疾病选自：生长激素缺乏(GHD)；Turner综合征；Prader-Willi综合征(PWS)；Noonan综合征；唐氏综合征；慢性肾脏病，青少年类风湿性关节炎；囊性纤维化；接受HAART治疗的儿童中的HIV-感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄出生儿童(SGA)；以极低出生体重(VLBW)出生，但SGA的儿童中的身材矮小症；骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成年人中的GHD；长骨内或其骨折，诸如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、中手骨、中足骨和指；松质骨，诸如颅骨、手底和足底内或其骨折；例如手、膝或肩中的腱或韧带外科手术后的患者；具有或正在进行牵引成骨作用的患者；髋关节或盘置换、弯月面修复、脊柱融合或假体固定后的患者，诸如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中；已固定入骨接合术材料，诸如钉、螺钉和板的患者；具有骨折的不连接或连接不正的患者；骨切除术后，例如来自胫骨或第一趾的患者；移植物植入后的患者；因创伤或关节炎导致的膝中的关节软骨变性；具有Turner综合征的患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD)；APCD中与营养不良相关的心血管疾病；APCD中恶病质的逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病；APCD中的HIV；具有APCD的老年人；APCD中的慢性肝病，APCD中的疲劳综合征；Chron氏病；受损的肝功能；具有HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV-相关脂肪营养障碍综合征(HALS)；男性不育症；大的选择性外科手术，酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老；虚弱老人；骨关节炎；创伤损害的软骨；勃起机能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁症；创伤性脑损伤；蛛网膜下出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌病；或因儿童糖皮质激素治疗导致的身材矮小症。
实施方案70.根据实施方案1-56中任一项所述的生长激素化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗：生长激素缺乏(GHD)；Turner综合征；Prader-Willi综合征(PWS)；Noonan综合征；唐氏综合征；慢性肾脏病，青少年类风湿性关节炎；囊性纤维化；接受HAART治疗的儿童中的HIV-感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄出生儿童(SGA)；以极低出生体重(VLBW)出生，但SGA的儿童中的身材矮小症；骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成年人中的GHD；长骨内或其骨折，诸如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、中手骨、中足骨和指；松质骨，诸如颅骨、手底和足底内或其骨折；例如手、膝或肩中的腱或韧带外科手术后的患者；具有或正在进行牵引成骨作用的患者；髋关节或盘置换、弯月面修复、脊柱融合或假体固定后的患者，诸如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中；已固定入骨接合术材料，诸如钉、螺钉和板的患者；具有骨折的不连接或连接不正的患者；骨切除术后，例如来自胫骨或第一趾的患者；移植物植入后的患者；因创伤或关节炎导致的膝中的关节软骨变性；具有Turner综合征的患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD)；APCD中与营养不良相关的心血管疾病；APCD中恶病质的逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病；APCD中的HIV；具有APCD的老年人；APCD中的慢性肝病，APCD中的疲劳综合征；Chron氏病；受损的肝功能；具有HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV-相关脂肪营养障碍综合征(HALS)；男性不育症；大的选择性外科手术，酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老；虚弱老人；骨关节炎；创伤损害的软骨；勃起机能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁症；创伤性脑损伤；蛛网膜下出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌病；或因儿童糖皮质激素治疗导致的身材矮小症。
实施例
参考下面的实施例进一步定义本发明，所述实施例描述了本文所述的各种化合物的制备和表征，以及测定它们的生物活性的方法。对于本领域技术人员将显而易见的是，可以在不脱离本发明的范围的情况下实践许多对材料和方法的改进。
在实施例中使用的TGase是根据US5156956从茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense)得到的微生物转谷氨酰胺酶。
实施例1:制备hGH化合物的一般方法。
将编码生长激素化合物的基因重组地插入质粒载体中。使用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)，导入半胱氨酸突变。随后使用该质粒载体，转化合适的大肠杆菌菌株。将蛋白表达为含有N-末端组氨酸富集的肽标签的可溶蛋白，所述肽标签适合于固定化的金属亲和层析纯化。
在50%甘油中制备细胞原液，并在-80℃储存。将甘油原液菌株接种进LBA板中，且随后在37℃温育过夜。用LB培养基洗涤每个平板的内容物，并稀释进500mlLB+AMP培养基中，进行表达。在220rpm摇动下，在37℃温育培养物，直到达到OD6000.6。使用0.2mMIPTG，在30℃随后诱导6小时，得到最终的OD6002.0。最后，通过离心收获细胞。
随后，将细胞悬浮于20mMTris-HCl、pH8.5中，并使用细胞破碎机（celldisrupter）在30kPSI进行破碎。通过离心收集上清液，且随后进行层析纯化。
如下进行纯化：使用固定化的金属亲和层析作为捕获步骤，随后使用来自Unizyme的二氨基-肽酶，去除肽标签。通过离子交换层析，实现最后的纯化。通过使用、但不限于本领域技术人员已知的离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析、尺寸排阻层析和基于膜的分离技术，也可以实现纯化。
通过使hGH化合物与2当量的例如Peg-5000-醛(RAPPPolymere,125000-6)反应，将PEG基团附着到N-末端上。通过在10个步骤中添加在0.5mlMeCN中的NaCNBH3，开始反应。将反应混合物放置20h。
使用微生物转谷氨酰胺酶作为催化剂，通过首先使hGH化合物与1,3-二氨基-2-丙醇(Fluka33262)反应，将PEG基团附着到Q40上。
转氨基的和氧化的hGH化合物(I)与mPEG-基团的偶联
制备下述溶液:
缓冲液A:将三乙醇胺(119mg,0.8mmol)溶解于水(40mL)中，并将pH调至8.5。
缓冲液B:20mM三乙醇胺;0.2MNaCl。
(A)hGH(III)与1,3-二氨基-2-丙醇的转氨基作用
在搅拌下，将hGH(8.64g)溶解于缓冲液A(500mL)中。向该溶液中缓慢地添加1,3-二氨基-2-丙醇(DAP)(8.1g,Fluka33262)在缓冲液A(50mL)中的混合物。通过添加HCl水溶液，将得到的混合物的pH调至8.5。在混合时，添加mTGase(2.8mL,1.3mg/mL))。将最终的混合物在室温搅拌过夜。
用缓冲液A(1.2L)稀释反应混合物，并通过离子交换层析纯化产物。100mL/min-200mL/级分。
分步缓冲液B40%-梯度40-100%缓冲液B，经15CV=225min。
(B)转氨基的hGH的氧化
缓冲液A:将三乙醇胺(119mg,0.8mmol)溶解于水(40mL)中，并将pH调至8.5。
缓冲液B:将3-甲硫基-1-丙醇(725mg,7.1mmol)溶解于缓冲液A(10mL)中。
缓冲液C:将HEPES(5.96g)溶解于水(1.0L)中，并将pH调至7.0。
高碘酸盐:将NaIO4(48.1mg,0.225mmol)溶解于水(1.0mL)中。
向DAP反应的hGH(10mg,0.5μmol)的溶液中，添加缓冲液B(0.2mL)，随后添加高碘酸盐溶液(0.03mL)。冷温育20min后，用缓冲液C透析该混合物4次。将残余物浓缩至1mL。
(C)使用PEG-试剂对氧化的hGH进行还原胺化。
在25mMHEPES缓冲液pH7.0中，将来自(B)的最终溶液(1mL,0.45μmol)与PEG-胺溶液(2mL,0.3μmol)相混合，且将得到的混合物在室温缓慢旋转1小时。1小时后，逐份(10x)添加NaCNBH3(100μLNaCNBH3(20mg)在水(0.5mL)中的溶液)。将该混合物在室温在暗处放置18-24小时。在MonoQ上纯化混合物，改变缓冲液，并浓缩。mPEG-胺试剂是可商业得到的。
实施例2:纯化的生长激素化合物的蛋白化学表征。
使用MALDI-MS，分析了完整的纯化的蛋白。观察到的质量对应着从氨基酸序列推论出的理论质量。
如下证实预期的每种化合物中的3个二硫键的连接：使用胰蛋白酶和AspN消化进行肽作图（mapping），随后，在用DTT还原二硫键之前和之后对消化物进行MALDI-MS分析。
实施例3:纯化的生长激素化合物的生物活性分析。
在基于细胞的受体效价增殖测定（即BAF测定）中，测量hGH化合物的生物活性。该方法是hGH化合物通用的。
BAF-3细胞(源自骨髓的鼠前-B淋巴样细胞系)的生长和存活是IL-3依赖性的。IL-3活化JAK-2和STAT（它们是相同的介质），GH在刺激后被活化。
用含有hGH受体的质粒转染BAF-3细胞。在hGH刺激后能增殖的克隆变成hGH-依赖性的细胞系，以后称作BAF3-GHR。所述细胞系以剂量相关的生长模式对GH做出响应，且因此可以用于在增殖测定中评价不同的hGH化合物的作用。
在饥饿培养基(不含GH的培养基)中在37℃、5%CO2培养BAF-3GHR细胞24小时。离心细胞，去除培养基，并将细胞重新悬浮于饥饿培养基中，至2.22x105细胞/ml。将90μl细胞上清液部分接种进微量滴定板(96孔NUNC-clone)中。将不同浓度的生长激素化合物添加给细胞，且将板在37℃、5%CO2温育72小时。
AlamarBlue是一种氧化还原指示剂，AlamarBlue?(BioSource目录号Dal1025)被细胞代谢固有的反应还原，且因此提供活细胞数目的间接度量。将AlamarBlue?稀释6倍(5μlAlamarBlue?+25μl饥饿培养基)，并将30μl稀释的AlamarBlue?添加给每个孔。然后将细胞温育另外4小时。最后，使用544nM的激发滤光片和590nM的发射滤光片，在荧光板读数器中，测量细胞的代谢活性。
将给定化合物的结果表示为所述化合物的EC50和平行运行的wthGH的EC50之比。在下面的表6中给出了其它结果。
表2hGH化合物的EC50值与hGH的EC50值的对比
测试的所有hGH化合物与wthGH等效或比它更有效。
表2A具有PEG基团的hGH化合物的EC50值与hGH的EC50值的对比。
实施例3A.在垂体切除的SpragueDawley大鼠中的体内剂量响应研究(测定3A)
在垂体切除的雄性SpragueDawley大鼠中，研究了体内剂量响应关系。垂体切除的大鼠是众所周知的和公认的生长激素缺乏动物模型，其中在外科手术去除脑垂体后不产生生长激素。这也导致胰岛素-样生长因子-1(IGF-1)的低循环水平，这是人类生长激素缺乏的另一个重要临床特征。
在体重90-100g的4周龄雄性大鼠中进行垂体切除术。在外科手术后3-4周，对动物进行研究，称重100-110g。对在外科手术后3-4周期间体重增加超过10%的动物不允许进入研究。
将70只垂体切除的SpragueDawley大鼠随机地分配成7个给药组，每组10只动物。一组仅接受载体，并用作未治疗的对照组。3组分别接受实验化合物(hGHQ84C，Y143C)33、3.3和0.33nmol，且3组分别接受hGH作为比较物(comparator)50、5.0和0.5nmol。化合物和载体都作为单次皮下剂量施用在颈处。每天在上午8-10点之间测量体重，进行1周。
对比第0天的体重和第7天的体重的，hGHQ84C，Y143C和hGH都诱导体重的剂量依赖性的增加。
通过非线性回归分析，使S形剂量响应方程式拟合实验数据(在第0-7天之间的体重增加)，以计算Emax、E0和ED50的参数估计值。所述方程式是在用于Windows的GraphPadPrism4.00版(GraphPadSoftwareInc.,SanDiego,USA)中的S形剂量响应内置方程式。在表3中，显示了包括参数估计值和95%置信区间在内的数据。
对于hGHQ84C，Y143C和hGH，没有观察到E0和Emax的参数估计值的差异。但是，hGHQ84C，Y143C的ED50显著低于hGH，指示hGHQ84C，Y143C的增加的体内效价。
表3将第7天相对于第0天的体重增加的响应拟合至S形剂量响应方程式，以估计Emax、E0和ED50。
实施例4.通过表面等离振子共振分析进行的受体相互作用研究。
使用表面等离振子共振分析，分析了hGH化合物的受体相互作用。该方法是hGH化合物通用的，且由Q84C/Y143ChGH化合物例证。
使用BiacoreT100仪器(GEHealtcare,瑞典)，通过表面等离振子共振，研究了hGH和类似物与hGH结合蛋白(hGHBP)的相互作用。根据生产商的说明书，在通常5000RU的水平，将抗-hGHmAb(FitzgeraldIndustriesInternational,USA,#10G05B)固定化在CM-5芯片上。在运行缓冲液(10mMHEPES,0.15MNaCl,30mMEDTA,0.05%表面活性剂P20,pH7.4)中，以10-25μg/ml，捕获wthGH或类似物，这导致产生250-400RU捕获的配体。随后在30μl/min，将浓度为0-800nM的hGHBP注射在表面上。具有固定化的抗-hGHmAb、但是没有捕获的hGH的表面用作参考。
使用含有1:1Langmuir结合模型的Biacore?评价软件2.0，分析动力学数据。
分析表明(表4)，hGHQ84C，Y143C具有与wthGH类似或稍微更高的对生长激素结合蛋白的亲和力。
表4
分析表明(表4A)，hGHQ84C，Y143C与野生型hGH等效，在实验误差内。
表4A
实施例5.用于测量蛋白酶对野生型hGH和hGH化合物的降解速率的测定
在适当的缓冲液(例如PBS或碳酸氢铵)中，在37℃，用有关的蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、因子VIIa、因子Xa、蛋白酶K、羧肽酶、DPPIV、中性内肽酶、粒酶B、脯氨酸-内肽酶、葡萄球菌肽酶I、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、胱天蛋白酶1-10、梭菌蛋白酶、肠激酶、谷氨酰内肽酶、粒酶B、LysC、LysN、脯氨酸-内肽酶和葡萄球菌肽酶I或组织提取物)消化目标化合物，最高到24小时。通过HPLC测定，评估蛋白水解性降解。
一般方法
蛋白水解性消化:
在37℃，用酶降解100μL实验化合物溶液（1mg/ml，在碳酸氢铵缓冲液中），最高到24小时。在各个时间点采取子样品，并通过在1%TFA中稀释10倍，酸化样品，来终止蛋白水解反应。通过反相HPLC，分析这些稀释的样品，以估计蛋白水解性消化的程度。
HPLC方法:
将10μL上述溶液注射到反相VydacC42×150mm柱上，用从0.1%TFA水溶液至含有0.1%TFA的100%乙腈的线性梯度洗脱30min，流速为0.2ml/min。在214nmUV吸收，进行峰检测。从时间点t=T的峰面积(AT)和t=0的峰面积(A0)，计算在时间点t=T时的%完整化合物，作为(AT/A0)×100%。4小时后(在上面的方程式中，T=4)，得到在下文表6中提供的结果。
使用GraphPadPrims软件5.01版，相对于时间绘制%完整化合物。也通过GraphPadPrism软件，将T?计算为单相衰减。
在该实施例中使用的酶是弹性蛋白酶(Sigma，来自猪胰)和胰凝乳蛋白酶(Roche，测序级)。缓冲液是50mM碳酸氢铵pH8.5。
实施例5.1
在含有13ng胰凝乳蛋白酶的100μL缓冲液中，温育100μgwthGH。T?=3.6小时。
实施例5.2
在含有135ng弹性蛋白酶的100μL缓冲液中，温育100μgwthGH。T?=1.6小时。
实施例5.3
在含有135ng弹性蛋白酶的100μL缓冲液中，温育100μghGHQ84C，Y143C。T?=6.2小时。
实施例5.4
在含有13ng胰凝乳蛋白酶的100μL缓冲液中，温育100μghGHA17C，E174C。T?=7.5小时。
实施例5.5
在含有13ng胰凝乳蛋白酶的100μL缓冲液中，温育100μghGHH21C，M170C。T?=22小时
实施例5.6
在含有13ng胰凝乳蛋白酶的100μL缓冲液中，温育100μghGHR94C，D107C。T?=2.5小时。
实施例5.7
在含有13ng胰凝乳蛋白酶的100μL50mM碳酸氢铵缓冲液pH8.5中，温育100μghGHQ84C，Y143C。因为没有观察到降解，不能计算T?。
表4胰凝乳蛋白酶降解野生型hGH和化合物的T?(小时)
表5弹性蛋白酶降解野生型hGH和hGHQ84C，Y143C化合物的T?(小时)。
实施例6通过实施例3和实施例5所述的BAF测定和蛋白水解性消化，分析选择的化合物
表6.包含额外二硫键的生长激素化合物的分析
序列表
<110>NovoNordiskA/S
Demuth,Helle
Schi?dt,ChristineB
Breinholt,Jens
Olsen,OleH
Thygesen,Peter
N?rskov-Lauritsen,Leif
<120>稳定的生长激素化合物
<130>7878.204-WO
<160>1
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>191
<212>PRT
<213>人生长激素
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(35)
<223>螺旋1
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(71)
<223>环1
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(72)..(98)
<223>螺旋2
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(99)..(106)
<223>环2
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(107)..(127)
<223>螺旋3
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(128)..(154)
<223>环3
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(155)..(184)
<223>螺旋4
<400>1
PheProThrIleProLeuSerArgLeuPheAspAsnAlaMetLeuArg
151015
AlaHisArgLeuHisGlnLeuAlaPheAspThrTyrGlnGluPheGlu
202530
GluAlaTyrIleProLysGluGlnLysTyrSerPheLeuGlnAsnPro
354045
GlnThrSerLeuCysPheSerGluSerIleProThrProSerAsnArg
505560
GluGluThrGlnGlnLysSerAsnLeuGluLeuLeuArgIleSerLeu
65707580
LeuLeuIleGlnSerTrpLeuGluProValGlnPheLeuArgSerVal
859095
PheAlaAsnSerLeuValTyrGlyAlaSerAspSerAsnValTyrAsp
100105110
LeuLeuLysAspLeuGluGluGlyIleGlnThrLeuMetGlyArgLeu
115120125
GluAspGlySerProArgThrGlyGlnIlePheLysGlnThrTyrSer
130135140
LysPheAspThrAsnSerHisAsnAspAspAlaLeuLeuLysAsnTyr
145150155160
GlyLeuLeuTyrCysPheArgLysAspMetAspLysValGluThrPhe
165170175
LeuArgIleValGlnCysArgSerValGluGlySerCysGlyPhe
180185190
Claims (16)
1.与SEQIDNo.1定义的hGH相比包含额外二硫键的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物针对蛋白酶的降解是稳定化的，并且其中所述生长激素化合物的多肽包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。
2.根据权利要求1所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个额外二硫键，其中至少一个半胱氨酸存在于与SEQIDNo.1中的氨基酸128-154相对应的环3中。
3.根据权利要求1所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个额外二硫键，其中至少一个半胱氨酸存在于与SEQIDNo.1中的氨基酸135-148相对应的区域中。
4.根据权利要求2所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个连接环3和螺旋2或环1的额外二硫键。
5.根据权利要求1所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C和/或F92C/T148C。
6.根据权利要求1所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含额外的二硫键，所述二硫键连接对应于SEQIDNO.1的螺旋2中的AA84或AA85的氨基酸残基与对应于SEQIDNO.1的环3中的AA143或AA144的氨基酸。
7.根据权利要求1所述的生长激素化合物，其中所述蛋白酶是消化蛋白酶。
8.根据权利要求7所述的生长激素化合物，其中所述消化蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和弹性蛋白酶。
9.根据权利要求1所述的生长激素化合物，其与在SEQIDNo.1中定义的人生长激素相比精确地包含2个额外的半胱氨酸。
10.根据权利要求1所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物是化学修饰的。
11.根据权利要求10的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物是通过附着部分对生长激素化合物的侧链或主链进行化学修饰的。
12.根据权利要求11的生长激素化合物，其中所述部分选自PEGs、碳水化合物、清蛋白结合剂、脂肪酸、烷基链、亲脂基团、维生素、胆汁酸或间隔区。
13.一种用于制备具有增加的对蛋白水解性降解的稳定性的生长激素化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a.制备与SEQIDNo.1定义的hGH相比包含额外的二硫键的生长激素化合物，其中所述额外的二硫键的至少一个半胱氨酸存在于与SEQIDNo.1定义的人生长激素的氨基酸128-154相对应的环3中，并且其中所述生长激素化合物的多肽包含至少一对突变，所述突变对应着SEQIDNo.1中的H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C，
b.测量所述生长激素化合物的蛋白酶降解，和
c.选择与hGH相比蛋白酶稳定性增加的生长激素化合物。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的生长激素化合物和药学上可接受的载体。
15.权利要求1-12中任一项所述的生长激素化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗患者将从循环生长激素量的增加获益的疾病或状态。
16.权利要求1-12中任一项所述的生长激素化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗生长激素缺乏(GHD)；Turner综合征；Prader-Willi综合征(PWS)；Noonan综合征；唐氏综合征；慢性肾脏病，青少年类风湿性关节炎；囊性纤维化；接受HAART治疗的儿童中的HIV-感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄出生儿童(SGA)；以极低出生体重(VLBW)出生，但SGA的儿童中的身材矮小症；骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成年人中的GHD；长骨内或其骨折；松质骨内或其骨折；腱或韧带外科手术后的患者；具有或正在进行牵引成骨作用的患者；髋关节或盘置换、半月板修复、脊柱融合或假体固定后的患者；已固定入骨接合术材料的患者；具有骨折的不连接或连接不正的患者；骨切除术后的患者；移植物植入后的患者；因创伤或关节炎导致的膝中的关节软骨变性；具有Turner综合征的患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD)；APCD中与营养不良相关的心血管疾病；APCD中恶病质的逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病；APCD中的HIV；具有APCD的老年人；APCD中的慢性肝病，APCD中的疲劳综合征；Chron氏病；受损的肝功能；具有HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV-相关脂肪营养障碍综合征(HALS)；男性不育症；大的选择性外科手术，酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老；虚弱老人；骨关节炎；创伤损害的软骨；勃起机能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁症；创伤性脑损伤；蛛网膜下出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌病；或因儿童糖皮质激素治疗导致的身材矮小症。
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Non-Patent Citations (2)
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