PT996629E

PT996629E - Análogos de hormonas glicoproteicas reticulados com ligações dissulfito, sua preparação e utilização

Info

Publication number: PT996629E
Application number: PT98930477T
Authority: PT
Inventors: William R Moyle
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 2006-12-29
Also published as: ES2268781T3; JP2007016040A; KR100560279B1; EP1775346A1; DE69835433T2; SI1775346T1; EP1775346B1; WO1998058957A3; EP0996629B1; BR9810478A; CN1548459A; JP4278668B2; HUP0100681A3; KR20040039421A; ATE335000T1; WO1998058957A9; CA2293731A1; CN1269833A; CY1109439T1; EP0996629A2

Description

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DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS DE HORMONAS GLICOPROTEICAS RETICULADOS COM LIGAÇÕES DISSULFITO, SUA PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO"

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Campo da invenção A presente invenção refere-se a análogos de hormonas glicoproteicas e à sua preparação e utilização. Mais especificamente, a invenção refere-se a análogos de hormonas glicoproteicas com uma reticulação por meio de uma ligação dissulfito e à sua preparação e utilização.

Descrição do estado da técnica relacionado

As hormonas glicoproteicas incluem as hormonas gonadotropina coriónica (CG), também conhecida por coriogonadotropina, a hormona luteinizante (LH), igualmente conhecida por lutropina, a hormona foliculo-estimulante (FSH), também conhecida por folitropina, e a hormona estimulante da tiróide (TSH), igualmente conhecida por tirotropina.

Aquelas de humanos são conhecidas como gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona luteinizante humana (hLH), hormona foliculo-estimulante humana (hFSH), e hormona estimulante da tiróide humana (hTSH). Estas hormonas possuem importantes papéis na função das gónadas e da tiróide (Pierce et al., 1981, Moyle et al., 1995). A CH e a LH ligam-se aos e estimulam receptores de LH, a FSH liga-se a e estimula receptores FSH, a TSH liga-se a e estimula receptores TSH. A CG é uma hormona produzida em grandes quantidades principalmente pelas placentas de alguns 2 mamíferos, incluindo as de primatas. A sequência de aminoácidos da subunidade β da CG de primatas difere, usualmente, das de LH. Os equídeos também produzem uma CG, contudo, esta possui a mesma sequência de aminoácidos que a LH equídea (Murphy et al., 1991).

Tal como revisto por Pierce et al (1981) , as hormonas glicoproteicas são heterodímeros consistindo de uma subunidade α e uma subunidade β. Os heterodímeros não se encontram ligados covalentemente e as suas subunidades podem ser dissociadas por tratamento das hormonas com ácido ou ureia (Pierce et al, 1981). Os vertebrados superiores contêm apenas um gene que codifica para a subunidade α (Fiddes et al, 1984); a mesma subunidade α combina, normalmente, com as subunidades β de LH, FSH, TSH e, quando presente, CG. Não obstante, o processamento proteico pós-transcrição, nomeadamente a glicosilação (Baenziger et al, 1988), pode contribuir para diferenças nas composições das subunidades α de LH, FSH, TSH e CG. A maioria das diferenças na sequência de aminoácidos entre as hormonas reside nas suas subunidades β específicas das hormonas (Pierce et al, 1981) . Estas são produzidas a partir de genes separados (Fiddes et al, 1984, Bo et al, 1992).

Com poucas excepções (Blithe et al, 1991), os heterodímeros α-β possuem uma actividade hormonal muito maior do que qualquer uma das subunidades livres (Pierce et al, 1981). As subunidades α e β que ocorrem naturalmente, formam heterodímeros α, β muito melhores do que a sua forma de homodímeros oí,oí ou homodímeros β,β. De facto, a expressão de genes da subunidade α e da subunidade β de hCG em conjunto, em células de mamíferos, conduz à formação de heterodímeros α-β, monómeros de subunidade α e monómeros de 3 subunidade β. Apenas quantidades vestigiais, se é que alguma, do homodímero α,α ou do homodímero β, β são produzidas ou secretadas pelas células.

Estruturas cristalinas de raios X de elevada resolução de gonadotropina coriónica humana (hCG) têm disso divulgadas por dois laboratórios (Lapthorn et al, 1994; Wu et al, 1994). Estas estruturas revelaram que os padrões da ligação dissulfito originalmente propostos (Mise et al, 1980 e 1981) estavam incorrectos e que a hormona é um membro da família de proteínas do nó de cisteína (Sun et al, (1995) . Uma vez que as localizações relativas das cisteínas em todas as hormonas glicoproteicas são semelhantes, é provável que tenham uma arquitectura do tipo nó de cisteína encontrada na hCG.

As localizações dos resíduos de cisteína nas subunidades α das hormonas glicoproteicas de vertebrados são similares (Figuras IA e 1B). Utilizando a subunidade α da hCG como um modelo, pode observar-se que o nó de cisteína é formado pelas cisteínas da segunda, terceira, quinta, sétima, oitava e nona subunidade a. Isto origina três grandes laços da subunidade α (Figuras IA e 1B) . O laço 1 é a sequência de aminoácidos entre a segunda e terceira cisteína; o laço 2 é a sequência de aminoácidos entre a quinta e a sétima cisteína da subunidade a; e o laço 3 é a sequência de aminoácidos entre a sétima e a oitava cisteína. As localizações dos resíduos de cisteína nas subunidades β de hormonas glicoproteicas de vertebrados são semelhantes (Pierce et al, 1981). Utilizando a subunidade β da hCG como um modelo pode verificar-se que o nó de cisteínas é formado pela primeira, quarta, quinta, sexta, oitava e nona cisteína. Isto origina três grandes laços da subunidade β 4 (Figuras 2A e 2B) . 0 laço 1 corresponde à sequência de aminoácidos entre a primeira e a quarta cisteína; o laço 2 corresponde à sequência de aminoácidos entre a quinta e sexta cisteína; e o laço 3 corresponde à sequência de aminoácidos entre a sexta e a oitava cisteína. Por substituição de partes da subunidade α com porções homólogas de outra subunidade a ou por substituição de porções da subunidade β com porções homólogas de outra subunidade β, é possível preparar quimeras funcionais de cada uma das subunidades da hormona glicoproteica (Campbell et al, 1991; Moyle et al, 1990; Moyle et al, 1994; Cosowsky et al, 1995; Moyle et al, 1995; Cosowsky et al, 1997). Um esquema geral dos elementos estruturais nas subunidades da hormona glicoproteica é apresentado na Figura 1C, e a correspondência com as subunidades da hormona glicoproteica humana por resíduos de aminoácidos é apresentada abaixo na Tabela IA.

Tabela IA

Correspondência das sequências de aminoácidos da subunidade da hormona humana aos elementos estruturais retirados da

Figura 1C

Term-N Laço 1 Laço 2 Laço 3 Term-C/ Cinto de segurança Nó-Cys α 1 -6 ΟΘβ 1-8 Ι_Ηβ 1-8 ΡεΗβ 1-2 τεΗβ 1 α 11-27 ΟΘβ 10-33 Ι_Ηβ 10-33 ΡεΗβ 4-27 Τ3Ηβ 3-26 α 33-59 Οΰβ 39-56 ϋΗβ 39-56 ΡεΗβ 33-50 ΤδΗβ 32-51 α 61-81 ΟΘβ 58-87 LH(3 58-87 FSI-Ιβ 52-81 Τ3Ηβ 53-82 α 85-92 ΟΘβ 91-145 ίΗβ 91-end FSP^ 85-111 ΤεΗβ 86-end ΤεΗβ 1 α 10,28-32, 60, 82-84 Οΰβ 9,34-38, 57, 88-90 LP-Ιβ 9,34-38, 57, 88-90 ΡεΗβ 3,28-32, 51,82-84 ΤεΗβ 2,27-31, 52, 83-85

Para além do seu nó de cisteínas, a subunidade β também compreende uma sequência denominada por cinto de segurança 5 (Lapthorn et al, 1994) que se encontra enrolada em torno do segundo laço da subunidade a. 0 cinto de segurança começa na nona cisteina, o último resíduo no nó de cisteínas da subunidade β, e inclui a décima, décima primeira e décima segunda cisterna. Encontra-se ligado ao primeiro laço da subunidade β através de uma ligação dissulfito, formada entre a cisteina doze (isto é, no fim do terminal carboxilo do cinto de segurança) e a cisteina três (isto é, no primeiro laço da subunidade β). 0 cinto de segurança é uma porção da subunidade β da hCG que possui uma influência significativa (se não primordial) na capacidade da hCG para distinguir receptores de LH e FSH (Campbell et al, 1991; Moyle et al, 1994). A substituição de toda ou partes da sequência de aminoácidos do cinto de segurança da hCG com a sequência do cinto de segurança encontrado na hFSH altera a especificidade da ligação ao receptor dos análogos da hormona resultantes. Normalmente, a hCG liga-se a receptores da LH mais de 1000 vezes melhor do que a receptores da FSH ou da TSH.

No entanto, os análogos de hCG, tais como CF94-117 e CF101-109, nos quais os resíduos 101-109 do cinto de segurança da hCG (isto é, Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr) são substituídos com os seus homólogos de hFSH (isto é, Thr-Val-Arg-Gly-Leu-Gly-Pro-Ser-Tyr), ligam-se a receptores de FSH muito melhor do que a hCG (Moyle et al., 1994) . Para além disso, por manipulação da composição do cinto de segurança, é possível preparar análogos da hCG que possuem vários graus de actividades de LH ou FSH (Moyle et al, 1994; Han et al, 1996). Estes possuem importantes utilizações terapêuticas potenciais para melhorar a fertilidade em machos e fêmeas. 6 A maior parte, mas não todas, das ligações dissulfito intrasubunidade de hormonas glicoproteicas são essenciais para as suas actividades biológicas. Estudos em que cisteinas individuais foram substituídas por outros aminoácidos, nomeadamente, alanina, mostraram que todas as ligações dissulfito do nó de cisteinas e do cinto de segurança são essenciais para o enrolamento do heterodímero (Suganuma et al, 1989; Bedows et ai, 1993; Furuhashi et al, 1994). As restantes ligações de dissulfito entre as cisteinas 7-31 e 59-87 da subunidade α humana e entre as cisteinas 23-72 da subunidade β da hCG, não são essenciais para a formação do heterodímero ou para a actividade hormonal.

Até ao presente ainda não existe uma estrutura cristalina de alta resolução que descreva a interacção de qualquer hormona glicoproteica com o seu receptor. Vários modelos têm vindo a ser montados num esforço para descrever a estrutura do complexo hormona-receptor. A maioria deles baseia-se nas estruturas cristalinas de hCG e do inibidor da ribonuclease, uma proteína que pode ser semelhante, em termos de estrutura, aos domínios extracelulares dos receptores de hormonas glicoproteicas. A maior parte dos esforços para resíduos hormonais que contactam com o receptor têm-se baseado na influência de mutações químicas, enzimáticas ou genéticas, que conduzem a uma redução na ligação ao receptor. Infelizmente, uma vez que a redução na ligação pode ser provocada pela interrupção de um contacto específico ou por uma alteração na conformação da hormona (Cosowsky et al, 1997), os efeitos destas modificações são difíceis, se não impossíveis, de interpretar. Isto conduziu a um desacordo considerável nesta área (Remy et al, 1996; 7

Berger et al, 1996) e alguns investigadores concluíram que não é possível determinar a orientação da hormona no complexo receptor (Blowmick et ai, 1996).

Outras abordagens para determinar a orientação da hormona no complexo receptor baseiam-se na identificação de regiões da hormona que não contactam com 0 receptor. Estas permanecem expostas após a hormona se ter ligado ao receptor e/ou podem ser alteradas sem prejudicar as interacções hormona-receptor.

Quando estas são mapeadas na estrutura cristalina da hCG (Lapthorn et ai, 1994; Wu et al, 1994), é possível desenvolver um modelo hipotético do modo como a hCG possa interagir com receptores da LH (Moyle et al, 1995) . Esta abordagem sugeriu que a reentrância formada pelo segundo laço da subunidade α e o primeiro e terceiro laço da subunidade β está envolvida no contacto primário com o receptor (Cosowsky et al, 1995). Isto também explicaria o facto de ambas as subunidades serem necessárias para a ligação hormona-receptor superior (Pierce et al, 1981). Os dados que suportam esta conclusão são discutidos em vários dos parágrafos a seguir. No entanto, deve notar-se que a maior parte de outros investigadores, se não todos, nesta área suportam um modelo no qual a hormona é orientada de forma muito diferente (Remy et al, 1996; Berger et al, 1996), mesmo assim, estes investigadores estão conscientes do modelo descrito acima (isto é, os mesmos citam o artigo que descreve o modelo, no qual o principal local de ligação ao receptor é feito pela reentrância da hormona).

Muitas das porções da subunidade α da hCG que não parecem contactar com o receptor podem ser substituídas sem 8 prejudicar a ligação a receptores de LH. Algumas destas regiões encontram-se nitidamente expostas no complexo hormona-receptor, umas vez que as mesmas podem igualmente ser reconhecidas por anticorpos monoclonais, enquanto a hCG está ligada ao receptor de LH (Moyle et ai, 1990; Cosowsky et al, 1995; Moyle et al, 1995) . Por exemplo, embora as subunidades α e β de humanas e bovinas tenham sequências de aminoácidos muito diferentes, heterodimeros compreendendo a subunidade α bovina e a subunidade β humana ligam-se bem a receptores de LH de ratazana e humanos (Cosowsky et al, 1997). Estes heterodimeros são facilmente distinguidos pela maioria de anticorpos monoclonais, que reconhecem os epitopos nos laços 1 e 3 da subunidade α da hCG (Moyle et al, 1995). Estas observações mostram que as superfícies dos laços 1 e 3 da subunidade α humana e bovina diferem e sugerem que esta região da hormona não desempenha um papel essencial nos contactos com o receptor.

Comparando as capacidades de anticorpos monoclonais para reconhecer análogos da hCG, nos quais partes da subunidade α derivaram de proteínas humanas ou bovinas, foi possível identificar resíduos da subunidade α chave, que participam na ligação a anticorpos (Moyle et al, 1995). Alguns anticorpos monoclonais que reconhecem epitopos na subunidade α da hCG, também se ligaram a um fragmento da subunidade α que foi preparado por digestão com tripsina e que tinha falta da maior parte do segundo laço da subunidade α (Lapthorn et al, 1994; Wu et al, 1994; Birken et al, 1986) . Esta observação foi igualmente utilizada para determinar e/ou para confirmar os locais de ligação destes anticorpos (Moyle et al, 1995). Dois anticorpos monoclonais que reconhecem epitopos da subunidade α e que são referidos como A105 e A407 (Moyle et al, 1995) ligaram-se à hCG, 9 quando a hormona estava complexada com receptores de LH. Assim, os resíduos da subunidade α reconhecidos por estes anticorpos não parecem contactar com o receptor de LH (Moyle et al, 1995) . O restante da subunidade oí inclui o segundo laço da subunidade α e o terminal C da proteína. Alguns dos resíduos nestas porções altamente conservadas da subunidade α podem participar em contactos com o receptor.

Muitas porções da subunidade β da hCG, que não parecem contactar com o receptor de LH, podem igualmente ser substituídos por mutagénese sem prejudicar a ligação ao receptor de LH. Estas incluem o laço 2 da subunidade β da hCG. Um análogo da hCG, no qual resíduos do laço 2 da subunidade β da hCG foram substituídos com aqueles normalmente encontrados no laço 2 da subunidade β da hFSH, denominados CF39-58 (Campbell et al, 1991), foi facilmente distinguido por anticorpos monoclonais que reconheceram a FSH, mas não resíduos no laço 2 da subunidade β da hCG. Isto mostrou que a estrutura do segundo laço da subunidade diferia neste análogo e na hCG. Todavia, este análogo da subunidade β foi combinado com a subunidade oí, para formar um heterodímero α, β, que interage com receptores de LH de modo semelhante à hCG (Campbell et al, 1991) . Por conseguinte, poucos resíduos, se é que alguns, no segundo laço da subunidade β da hCG parecem estabelecer contacto directo essencial com receptores de LH. Similarmente, o segundo laço da subunidade β da hFSH não parece contactar com receptores de FSH. Têm sido descritos análogos da subunidade β da hCG, nos quais resíduos entre a décima cisteína da subunidade β e o terminal C ou entre os resíduos 94-114, foram substituídos com os correspondentes resíduos de hFSH. Estes análogos são denominados CF94-117 (Campbell et al, 1991) e CFC94-114 (Wang et al, 1994). 10

Ligam-se muito melhor a receptores da FSH do que a receptores de LH, mesmo contendo a sequência total da hCG no segundo laço da subunidade β. Dado que o segundo laço da subunidade β da hCG parece ter uma influência mínima na capacidade da hormona para se ligar a receptores LH ou FSH, não parece provável que o mesmo participe em contactos essenciais, de elevada afinidade, com o receptor LH ou FSH.

Para além disso, o segundo laço da subunidade β da hCG encontra-se localizado perto dos primeiro e terceiro laços da subunidade a, uma porção da subunidade α que também não parece contactar com o receptor. Assim, parece provável que toda a região da hCG que compreende resíduos no primeiro e terceiro laços da subunidade α e no segundo laço da subunidade β, não contactem com o receptor. Como será discutido mais à frente, pensa-se que estas porções da hormona se projectem para o interior da cavidade criada pela forma de ferradura do domínio extracelular do receptor (Moyle et al, 1995).

Os resíduos da subunidade β da hCG que não participam em contactos de elevada afinidade com o receptor podem igualmente ser reconhecidos por anticorpos monoclonais após a hormona se ter ligado a receptores de LH (Campbell et al, 1991); Moyle et al, 1990; Moyle et al, 1994; Cosowsky et al, 1995) . Estes incluem porções da subunidade β da hCG encontradas nos laços 1 e 3 mais afastadas da interface da subunidade a, que pode ser reconhecida por anticorpos, tais como B105, B108, Blll e B112. Estes anticorpos ligam a hCG quando a mesma se encontra complexada com receptores de LH (Moyle et al, 1990; Cosowsky et al, 1995), demonstrando que estas porções dos laços 1 e 3 da subunidade β não estabelecem contactos essenciais com o receptor. Outros 11 estudos demonstraram que é possível remover resíduos entre o terminal-N e a primeira cisteína e entre a décima segunda cisteína e o terminal-C da subunidade β da hCG, sem eliminar a capacidade da hormona para se ligar a receptores da LH (Huang et al, 1993) . A porção restante da subunidade β inclui o cinto de segurança. Poucos destes resíduos parecem estabelecer contactos essenciais, necessários para a ligação a receptores de LH ou FSH com elevada afinidade. Por exemplo, verificou-se que alterando os resíduos no cinto de segurança entre as cisteínas décima primeira e décima segunda não produzia um efeito mínimo, se que algum, na ligação a receptores de LH (Moyle et al, 1994).

Alterando os resíduos entre as cisteínas décima e décima primeira produzia menos de 5 vezes efeito na ligação ao receptor de FSH (Moyle et al, 1994) . Para além disso, a maior parte dos resíduos no cinto de segurança de LH de equídeos (eLH) e de CG de equídeos (eCG) difere da FSH (Pierce et al, 1981; Murphy et al, 1991), contudo estas hormonas apresentam uma boa ligação ao receptor de FSH de ratazana. De facto, eLH purificada liga-se em pelo menos 30%, assim como a hFSH, ao receptor de FSH de ratazana in vitro (Moyle et al, 1994) . As porções da subunidade β de hCG que permanecem por explicar incluem as superfícies dos laços 1 e 3 que estão mais próximo da interface da subunidade a. Por conseguinte, estes são locais da hormona prováveis de contactar com o receptor. As porções da subunidade α podem igualmente ser reconhecidas por anticorpos monoclonais, quando a hCG se encontra complexada com receptores da LH. Estas incluem resíduos reconhecidos pelos anticorpos A105 e A407 (Moyle et al, 1995).

Outras estratégias para identificar regiões de hormonas glicoproteicas que interagem com os receptores envolvem a 12 utilização de análogos hormonais, que reconhecem mais do que um receptor (Campbell et al, 1991; Moyle et al, 1994; Han et al, 1996; Campbell et al, 1997) . Assim, foi possível preparar análogos da hCG que se ligam a receptores da FSH e da TSH, simplesmente por alteração do cinto de segurança da subunidade β da hCG, para aquele encontrado na hFSH (Campbell et al, 1997) . Este análogo não compreende resíduos específicos da TSH, contudo foi capaz de estimular uma resposta TSH ao mesmo nível máximo que a TSH. Comparando as actividades de vários destes análogos funcionais, é possível concluir que a maioria dos resíduos no cinto de segurança e quase todos os do segundo laço da subunidade β não são prováveis de formar contactos chave essenciais de elevada afinidade com o receptor. Não existem descrições da estrutura cristalina para qualquer um dos receptores de LH, FSH ou TSH. No entanto, as sequências de aminoácidos de vários receptores de hormonas glicoproteicas são conhecidas (Moyle et al, 1994; McFarland et al, 1989; Loosfelt et al, 1989; Segaloff et al, 1990; Sprengel et al, 1990; Braun et al, 1991; Nagayama et al, 1991; Nagayama et al, 1989; Jia et al, 1991). Estas proteínas parecem possuir domínios extracelulares, transmembranares e intracelulares. Quando expressas sem os domínios transmembranares ou intracelulares (Braun et al, 1991; Ji et al, 1991; Xie et al, 1990; Moyle et al, 1991) ou em conjunto com outros domínios transmembranares (Moyle et al, 1991), observa-se que o domínio extracelular fornece a maior parte da afinidade do receptor para o seu ligando. Os domínios extracelulares destas proteínas são membros da família de proteínas com repetições ricas em leucina e os domínios transmembranares parecem possuir sete hélices hidrófobas que atravessam a membrana plasmática (McFarland 13 et al, 1989) . Uma estrutura cristalina do inibidor da ribonuclease, uma estrutura modelo de uma proteína com repetições ricas em leucina, foi determinada e mostrou possuir uma forma de ferradura (Kobe et al, 1993 e 1995) . Esta constatação sugeriu que os domínios extracelulares dos receptores de LH, FSH e TSH são em forma de ferradura (Moyle et al, 1995). Porções do domínio extracelular dos receptores de LH e FSH, que controlam a sua especificidade de ligação à hCG e hFSH, foram identificadas por meio da utilização de quimeras do receptor de LH/FSH (Moyle et al, 1994) . Considerando as porções da hCG mais prováveis de contactar com o receptor de LH e as porções do receptor de LH que são responsáveis pela especificidade da ligação ao ligando, foi desenvolvido um modelo que explica as capacidades desta hormona para interagir com receptores de LH e para gerar um sinal de transdução (Moyle et al, 1995). Neste modelo, a reentrância entre o segundo laço da subunidade α e o primeiro e terceiro laços da subunidade β contacta a superfície do domínio extracelular do receptor, na proximidade do centro da ferradura (Moyle et al, 1995). 0 restante da hormona projecta-se para o interior do espaço entre os braços da ferradura. Quando a hormona se liga ao receptor e se projecta para o interior deste espaço, ela estabiliza a conformação do domínio extracelular, necessária para a transdução do sinal. Este é conduzido para o domínio transmembranar por meio de contactos específicos entre os domínios extracelular e transmembranar, necessários para uma expressão apropriada do receptor na superfície celular (Moyle et al, 1991). 0 modelo tem em conta as capacidades dos oligossacáridos para influenciar a transdução de sinal (Moyle et al, 1975; Matzuk et al, 1989) . Contudo, enquanto este modelo consegue explicar estes dados, outros modelos, nos quais diferentes 14 partes da hCG interagem com os receptores, têm sido propostos (Jiang et al, 1995). Consequentemente, ainda não é clara a forma como as hormonas glicoproteicas interagem com os seus receptores.

Esta perspectiva da interacção hormona receptor, também explica a inibição da ligação da hCG por alguns anticorpos monoclonais que reconhecem regiões da hCG, que se pensa não participarem em contactos chave com o receptor. Tal como discutido anteriormente, estes incluem a superfície da hormona formada pelos laços 1 e 3 da subunidade α e o laço 2 da subunidade β. No modelo, estas regiões projectam-se para o interior de um espaço entre os braços N-terminal e C-terminal do domínio extracelular do receptor. A ligação de anticorpos a estes locais impede que a hormona entre neste espaço.

Semelhanças nas localizações das cisteínas das hormonas glicoproteicas da maior parte das especíes de vertebrados (Pierce et al, 1981) sugerem que não de enrolarão como a hCG. As estruturas dos receptores para hormonas glicoproteicas são prováveis de ser bastante comparáveis, devido às semelhanças nas repetições ricas em leucina dos seus domínios extracelulares e ao grande número de resíduos conservados nos seus domínios transmembranares (Moyle et al, 1994; Braun et al, 1991; Nagayama et al, 1991) . Por conseguinte, parece provável que qualquer modelo que explique com sucesso a interacção da hCG com receptores de LH, também irá prever as capacidades de outras hormonas glicoproteicas para interagir com os seus receptores. Uma forma que o cinto de segurança pode influenciar a especificidade da interacção ligando-receptor seria alterando as posições relativas das subunidades da hormona 15 (Cosowsky et al, 1997). Isto iria alterar a forma da reentrância entre o segundo laço da subunidade α e o primeiro e terceiro laços da subunidade β. Sugeriu-se que elementos inibidores na hormona e no receptor são responsáveis pelo impedimento de interacções ligando-receptor inapropriadas (Moyle et al, 1994). Consequentemente, o efeito do cinto de segurança seria o de alterar a forma da hormona para reduzir a sua capacidade para se ajustar à porção central da ferradura.

As hormonas glicoproteicas possuem várias utilizações terapêuticas. A FSH é utilizada para induzir o desenvolvimento de foliculos ováricos em preparação para a indução da ovulação em fêmeas (Galway et al, 1990; Shoham et al, 1991; Gast, 1995; Olive, 1995) . A LH e a hCG são igualmente utilizadas para induzir a ovulação de foliculos que iniciaram o seu desenvolvimento. A FSH, LH e a hCG são utilizadas para induzir a função testicular em machos. Enquanto as hormonas existentes podem ser utilizadas para estimular as funções das gónadas masculinas e femininas e a glândula tiróide, a aplicação prática das hormonas para esta utilização requer que as mesmas sejam heterodimeros. Estes podem ser isolados a partir da glândula pituitária (isto é, LH e FSH), do soro (gonadotropina coriónica equídea) , ou da urina de grávidas (hCG) ou de mulheres em fase de pós-menopausa (misturas de hLH e hFSH) . Heterodimeros activos podem igualmente ser isolados a partir de culturas de células que expressam ambas as subunidades α e β, incluindo algumas de tumores (Cole et al, 1981) ou aquelas que foram transfectadas com cDNA ou DNA genómico que codifica para as subunidades α e β (Reddy et al, 1985). De facto, as últimas são uma fonte importante de hormonas glicoproteicas, que têm utilidade terapêutica. 16

Uma vez que foi demonstrado que os oligossacáridos das hormonas glicoproteicas influenciam as suas capacidades para gerar um sinal de transdução (Moyle et al, 1975; Matzuk et al, 1989), a preparação e síntese de heterodímeros activos é melhor realizada em células eucariótas. Estas células são capazes de adicionar oligossacáridos de manose superiores a oligossacáridos e, em alguns casos, de processá-los para dar origem aos oligossacáridos complexos que são encontrados nas hormonas naturais (Baenziger et al, 1988) . Todavia, dado que as células eucariótas podem processar as glicoproteínas de forma diferente, a síntese de hormonas glicoproteicas é frequentemente realizada em linhas celulares de mamíferos, tais como as que derivam do ovário do hamster chinês (CHO). Ao passo que as hormonas podem ser produzidas em células de não mamíferos, a antigenecidade potencial das cadeias de oligossacáridos limita a sua utilização clínica.

As hormonas heterodiméricas também têm sido utilizadas como imunogenes para extrair anti-soro que pode ser utilizado para limitar a fertilidade (Singh et al, 1989; Pal et al, 1990; Talwar et al, 1986; Talwar et al, 1992; Moudgal et al, 1971 e 1972; Moudgal, 1976; Ravindranath et al, 1990; Moudgal et al, 1978).

Devido aos papéis essenciais da hCG na manutenção da gravidez humana, seria útil o desenvolvimento de uma resposta imune relativamente a hCG, como um meio de contracepção e um esforço substancial tem sido realizado no sentido de encontrar uma vacina contraceptiva baseada em hCG. No entanto, em princípio, anticorpos para hormonas poderiam também ser utilizados para promover a fertilidade. Por exemplo, os níveis de LH parecem ser excessivos em 17 algumas mulheres que possuem a doença ovárica policistica. Por conseguinte, o desenvolvimento de um método que reduzisse, mas não eliminasse a actividade da LH em circulação, seria benéfico no restabelecimento da fertilidade. 0 metabolismo das hormonas glicoproteicas é muito pouco conhecido. As semi-vidas das hormonas parecem ser influenciadas pelo seu conteúdo em oligossacáridos (Baenziger et al, 1988), particularmente pelos seus resíduos de açúcar terminais. As hormonas mais estáveis são aquelas que possuem o conteúdo de ácido siálico mais elevado neste local (Murphy et al, 1991; Baenziger et al, 1992; Fiete et al, 1991; Smith et al, 1993; Rosa et al, 1984). Não obstante, os oligossacáridos não são inteiramente responsáveis pela estabilidade das hormonas, uma vez que se sabe que as subunidades livres das hormonas possuem tempos de semi-vida em circulação significativamente mais curtos, mesmo possuindo os mesmos oligossacáridos que os heterodímeros (Wehmann et al, 1984; Kardana et al, 1991) . De facto, tem sido proposto que as hormonas podem ser inactivadas por proteólise, o que conduz à dissociação das subunidades (Kardana et al, 1991; Birken et al, 1991; Cole et al, 1991; Cole et al, 1991; Cole et al, 1993) . hCG com ranhura dissociou-se nas suas subunidades inactivas muito mais rapidamente que a hCG (Cole et al, 1993) . Assim, espera-se que um procedimento que possa impedir ou reduzir a dissociação das subunidades potenciaria a eficácia da hormona.

As subunidades das hormonas glicoproteicas dissociam-se rapidamente em condições desnaturantes, as quais incluem tratamento com calor, extremos de pH, e ureia (Pierce et 18 al, 1981; Cole et al, 1993) . Por esta razão, a maior parte das preparações de hormonas glicoproteicas são armazenadas como pós liofilizados. Um procedimento que conduza a um aumento da estabilidade do heterodimero, pode permitir que preparações hormonais sejam armazenadas e distribuídas em soluções aquosas. Isto eliminaria a necessidade de enviar diluente de hormona em separado e o passo adicional da reconstituição da hormona pelo utilizador final. Várias tentativas foram realizadas para estabilizar as hormonas por "crosslinking" (reticulação) das suas subunidades. Métodos de reticulação químicos têm sido utilizados (Weare et al, 1979 e 1979); contudo, estes conduzem a uma actividade reduzida. É igualmente possível fundir geneticamente as subunidades β e a, de forma a produzir uma hormona de cadeia simples. Esta molécula é mais estável do que o heterodimero e possui uma actividade biológica elevada (Sugahara et al, 1995); no entanto, é bastante diferente da molécula nativa.

Outro método de reticular proteínas seria ligá-las por meio de uma ligação de dissulfito. Esta estratégia ocorre naturalmente para estabilizar outras proteínas da superfamília do grupo de cisteínas (Sun et al, 1995) e provavelmente substitui o cinto de segurança. Para além disso, a adição de ligações dissulfito às proteínas pode aumentar a sua estabilidade, desde que a adição de ligações dissulfito não aumente a tensão interna na proteína (Matthews, 1987; Matsumura et al, 1989). Esforços para estabilizar heterodímeros glicoproteicos por meio de uma ligação dissulfito foram divulgados na patente canadiana CA 2188508. Também existe um comentário em Han et al (1986) que sugere tais ligações dissulfito intersubunidades, mas 19 esta referência relata que a introdução de tal ligação dissulfito pode diminuir a actividade da hormona. Isto é o mais provável, já que estes heterodimeros são proteínas complexas com vários dissulfitos. A adição de uma cisteína aos mesmos possui o potencial de desfazer o enrolamento, resultando em proteínas não funcionais. Além disso, não é provável que se possa utilizar outras proteínas do grupo de cisteínas para prever as localizações das ligações dissulfito, que estabilizariam as hormonas glicoproteicas, uma vez que a organização das subunidades noutras proteínas do grupo de cisteínas é substancialmente diferente da existente nas hormonas glicoproteicas (Sun et al, 1995). A citação de qualquer documento na presente não pretende reconhecer que esse documento seja estado da técnica pertinente, ou considerado material para a patentabilidade de qualquer reivindicação do presente pedido. Qualquer afirmação relativamente ao conteúdo ou a uma data de qualquer documento baseia-se em informação disponível ao requerente no momento do depósito e não constitui um reconhecimento da exactidão de tal afirmação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É, por conseguinte, objecto da invenção ultrapassar as deficiências do estado da técnica discutidas anteriormente. Os análogos das hormonas glicoproteicas da presente invenção fornecem uma estabilidade melhorada, enquanto retêm pelo menos uma parte da bioactividade da correspondente hormona glicoproteica.

De preferência, os análogos da presente invenção retêm pelo menos 25% da afinidade da hormona correspondente para o seu receptor nativo. Estes análogos da presente invenção 20 fornecem um aperfeiçoamento relativamente aos análogos de hormonas glicoproteicas do estado da técnica, uma vez que o posicionamento, projectado de forma apropriada, da ligação dissulfito intersubunidades, criada pela modificação de resíduos numa ou em ambas as subunidades α ou β, minimiza o impacto potencial das reticulações intersubunidade na estrutura da hormona. O presente inventor verificou que tais análogos de hormonas glicoproteicas melhorados, seguem preferencialmente a regra de acordo com a qual as reticulações intersubunidade têm de ser posicionadas entre os dois resíduos de cisterna (nativos) existentes, envolvidos nas ligações dissulfito nativas e não fora das cisteínas mais exteriores da subunidade nativa correspondente. Nenhum dos análogos de hormonas glicoproteicas do estado da técnica, com dissulfitos intersubunidades obedece a esta regra.

Outro aspecto da presente invenção é a disponibilização de análogos de hormonas glicoproteicas com uma reticulação dissulfito intersubunidade entre um grupo de cisteínas de uma subunidade α e um grupo de cisteínas de uma subunidade β. Isto minimiza as perturbações para a hormona glicoproteica e permite-lhe reter de forma substancial a actividade de estimular um receptor de gonadotropina, possuída pela hormona nativa correspondente, enquanto lhe confere uma estabilidade melhorada. Esta característica também não se encontra divulgada ou sugerida pelo estado da técnica.

Outros aspectos da presente invenção são a disponibilização de análogos de hormonas glicoproteicas com uma reticulação 21 dissulfito intersubunidade entre um resíduo de cisteína localizado no laço 3 da subunidade α e um resíduo de cisteína localizado no laço 2 da subunidade β ou entre o laço 1 da subunidade α e o laço 2 da subunidade β. Isto também limita as perturbações para a hormona glicoproteica e permite-lhe reter uma parte da actividade de estimular um receptor de gonadotropina, possuída pela hormona nativa correspondente, enquanto lhe confere uma estabilidade melhorada. Esta característica também não se encontra descrita ou sugerida no estado da técnica.

Quando preparados numa composição farmacêutica, os análogos da presente invenção podem ser utilizados para o tratamento da infertilidade ou para limitar a fertilidade, num paciente com necessidade de tal. 0 heterodímero dos análogos da presente invenção é estável para ser transportado e armazenado como uma formulação farmacêutica líquida. A presente invenção fornece ainda moléculas de DNA recombinante contendo sequências nucleotídicas que codificam para as subunidades α e β de um análogo de hormona glicoproteica, moléculas de DNA recombinante essas que podem ser vectores de expressão. Células hospedeiras eucariótas transformadas com tais moléculas de DNA recombinante são igualmente disponibilizadas para e utilizadas num processo para a preparação dos análogos da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As figuras 1A-1C mostram a estrutura da subunidade a da hCG (Figura IA) , bem como a sua sequência de aminoácidos no 22 código de letra única (Figura 1B) e um esquema geral dos elementos estruturais em subunidades de hormonas glicoproteicas (Figura 1C). Pode se pode verificar na Figura IA, o grupo de cisternas divide a subunidade em três grandes laços. Os laços 1 e 3 encontram-se apresentados no topo. Note-se que as linhas a negro se referem aos átomos Ca da estrutura principal de aminoácidos, enquanto que as linhas a cinzento se referem às ligações dissulfito. As linhas na Figura 1B foram desenhadas para ilustrar as ligações dissulfito. Os elementos estruturais das subunidades das hormonas glicoproteicas tal como listados na Tabela IA encontram-se apresentados na Figura 1C de forma esquemática.

As Figuras 2A e 2B mostram a estrutura da subunidade β da hCG (Figura 2A), bem como a sua sequência de aminoácidos no código de letra única (Figura 2B). Tal como pode ser observado na Figura 2A, o grupo de cisteinas divide a subunidade β em três grandes laços. 0 laço 2 encontra-se apresentado no topo. 0 pequeno laço, do lado direito da figura, encontra-se localizado no cinto de segurança.

Resíduos carregados positiva e negativamente nesta região são importantes para a actividade da LH e da TSH, respectivamente. Os resíduos apresentados, que ligam este laço pequeno ao laço 1 da subunidade β, os quais vão desde o pequeno laço do cinto de segurança até ao restante da subunidade β, no sentido descendente, exercem uma grande influência sobre a ligação da FSH e da TSH ao receptor.

Note-se que as linhas a negro se referem aos átomos Ca da estrutura principal de aminoácidos, enquanto que as linhas a cinzento se referem às pontes dissulfito. As linhas na 23

Figura 1B foram desenhadas para ilustrar as ligações dissulfito.

As Figuras 3A e 3B mostram as sequências de aminoácidos traduzidas de α (Figura 3A) e aC7S (Figura 3B) codificadas pelos plasmideos pSVL-a, pCI-α, pSVL-aC7S e pC7-aC7S. Uma vez que cada proteína traduzida tem a mesma sequência líder, espera-se que ambas sejam processadas da mesma forma para gerar proteínas de 92 aminoácidos e com uma sequência de aminoácidos do terminal-N iniciada por APD. 0 código de letra única utilizado nesta e noutras figuras é: A, alanina (Ala); C, cisteína (Cys); D, ácido aspártico (Asp); E, ácido glutâmico (Glu); F, fenilalanina (Phe); G, glicina (Gly); H, histidina (His); I, isoleucina (Ile); K, lisina (Lys); L, leucina (Leu); M, metionina (Met); N, asparagina (Asn); P, prolina (Pro); Q, glutamina (Gin); R, arginina (Arg); S, serina (Ser) ; T, treonina (Thr); V, valina (Vai); W, triptofano (Trp); e Y, tirosina (Tyr). A letra maiúscula denota a localização da substituição de Cys7 por serina, que formou C7S.

As Figuras 4A e 4B mostram as sequências de aminoácidos traduzidas de hCG/3' (Figura 4A) e de hCG/3'Y37C (Figura 4B) , codificadas pelos plasmideos pSVL-hCG/3' e pSVL-hCG/3'C7S. Uma vez que cada uma possui a mesma sequência líder, espera-se que ambas sejam processadas da mesma forma para gerar proteínas consistindo de 145 aminoácidos e com uma sequência de aminoácidos do terminal-N iniciada por SKE. A letra maiúscula refere-se à localização da mutação de Tyr37 para cisteína. A Figura 5 mostra a influência da mutação C7S na subunidade oí sobre a ligação de anticorpos para a subunidade oí 24 monoclonais A113 e A407. A hCG recombinante preparada em estrutura celular (rhCG) e os análogos indicados abaixo de cada par de barras e cujas estruturas são descritas nos exemplos, foram sujeitos a imunoensaios em "sandwich", utilizando ο B112 como anticorpo de captura e A113 ou A407 marcados com iodo radioactivo, como anticorpos de detecção. 0 B112 reconhece um epítopo que contém resíduos no laço 3 da subunidade β; ο A113 reconhece epítopos que envolvem resíduos no laço 1 da subunidade a; e ο A407 reconhece epítopos que envolvem resíduos no terminal-N da subunidade α e uma parte diferente de um laço 1 da subunidade a. Os epítopos para ο A407 e ο A113 não se sobrepõem, uma vez que ambos são capazes de se ligar à hCG ao mesmo tempo. A barra à direita de cada par refere-se ao ensaio B112/A407. A barra à esquerda refere-se ao ensaio B112/A113. Como pode ser observado na presente, a mutação de C7S tem um efeito muito maior na ligação do A407, do que na ligação do A113. A Figura 6 mostra a ligação ao receptor de LH da hCG(a31-β37) . Esta figura ilustra as capacidades da rhCG preparada em cultura celular (triângulos voltados para cima), hCG purificada a partir de urina (quadrados), ou hCG(α31-β37) preparada em cultura celular (triângulos voltados para baixo) para inibir a ligação de 125I-hCG a 200 000 células CHO, que expressam receptores LH. Os valores na ordenada referem-se à quantidade de hCG marcada radioactivamente que se ligou às células no final da incubação. Estes ensaio mostrou que a hCG(a31-337) se liga aos receptores de LH de forma semelhante que a hCG.

A Figura mostra a actividade de transdução de sinal do receptor de LH da hCG(a31-p37) e ilustra as capacidades da rhCG e da hCG(a31^37) para promover a acumulação de AMP 25 cíclico em 200 000 células CHO, que expressam receptores de LH. A produção de AMP cíclico em resposta à estimulação hormonal é um parâmetro da transdução de sinal amplamente reconhecido. Este ensaio mostrou que a hCG(a31-p37) estimulou a acumulação de AMP cíclico de forma semelhante que a hCG. A Figura 8 apresenta as estabilidades térmicas da hCG e de análogos da hCG, que contêm uma ligação dissulfito intersubunidade. Quantidades similares de hCG e de análogos foram incubadas a 85 °C durante os intervalos indicados na abcissa. As amostras foram arrefecidas e submetidas a um imunoensaio em " sandwich", utilizando 0 anticorpo anti- subunidade α da hCG A113 (captura) e 0 anticorpo anti- subunidade β da hCG BI 12 (detecção) , para determinar a quantidade de heterodímero que restou. Os valores na abcissa referem-se à quantidade de actividade remanescente neste ensaio, relativamente à quantidade inicial de hCG, antes do aquecimento. Este ensaio mostrou que a hCG é rapidamente destruída a 85 °C, enquanto que os análogos reticulados mantiveram as suas actividades, durante pelo menos 20 minutos. A Figura 9 apresenta a estabilidade da hCG e de análogos reticulados à dissociação por ureia. É ilustrada a influência de 8M de ureia sobre rhCG e sobre os análogos de hCG reticulados, identificados no topo de cada banda. É bem conhecido que o tratamento da hCG com 8M de ureia promove a dissociação das suas subunidades, um dado confirmado na presente. Como pode ser observado, o tratamento dos análogos reticulados com 8M de ureia não promoveu a dissociação das subunidades, o que teria resultado na perda da banda correspondente ao heterodímero. As posições do 26 heterodímero e da subunidade β livre encontram-se anotadas do lado esquerdo da figura. Após a electroforese de amostras não tratadas e tratadas com ureia, as proteínas no gel foram electro-transferidas para nitrocelulose, os locais proteicos não-específicos remanescentes na superfície da nitrocelulose foram bloqueados, e o dímero e a subunidade β detectados utilizando ο B105 marcado com iodo radioactivo.

As Figuras 10A e 10B mostram as sequências de aminoácidos de CFC101-114/3' traduzidas (Figura 10A) e CFC101-114/3'Y37C (Figura 10B) , codificadas pelos plasmídeos pSVL-CFC101-114/3 e pSVLCFC101-114/3Y37C no código de aminoácido de uma só letra. Uma vez que cada uma possui a mesma sequência líder, espera-se que ambas sejam processadas da mesma forma para gerar proteínas consistindo de 145 aminoácidos e com uma sequência de aminoácidos do terminal-N iniciada por SKE. A letra maiúscula indica a localização da mutação de Tyr37 para cisteína. As sequências sublinhadas derivam da subunidade β da hFSH. Os codões para resíduos Arg95-Ser96 formam um local BglII e aqueles para Vall02-Argl03-Glyl04 formam um local SstII. A Figura 11 mostra a influência das dissulfito α31-β37 e α51-β99 na ligação dos anticorpos para a subunidade α monoclonais A113 e A407 a um análogo quimérico hCG/hFSH bifuncional. A hCG e os análogos CFC101-114 indicados abaixo de cada par de barras e cujas estruturas são descritas nos exemplos, foram submetidos a um imunoensaio em "sandwich", utilizando ο B112 como anticorpo de captura e ο A113 ou ο A407 marcados com iodo radioactivo, como anticorpos de detecção. 0 B112 reconhece um epítopo que contém resíduos no laço 3 da subunidade β; ο A113 reconhece 27 epitopos que envolvem resíduos no laço 1 da subunidade a; e ο A407 reconhece epitopos que envolvem resíduos no terminal-N da subunidade oí e uma parte diferente do laço 1 da subunidade a. Os epitopos para ο A407 e ο A113 não se sobrepõem, uma vez que ambos são capazes de se ligar à hCG simultaneamente. A barra à direita de cada par refere-se ao ensaio B112/A407. A barra à esquerda refere-se ao ensaio B112/A113. Tal como pode ser observado na presente, nem a dissulfito α31-β37 ou a α51-β99 restabeleceram a actividade de ligação do A407 ao CFC101-114. A Figura 12 apresenta as estabilidades térmicas da hCG, CFC101-114 e dos análogos CFC101-114 que contêm uma ligação dissulfito intersubunidade. A hCG, CFC101-114 e os análogos CFC101-114 foram incubados a 85 °C durante os intervalos indicados na abcissa. As amostras foram arrefecidas e sujeitas a um imunoensaio em "sandwich" utilizando 0 anticorpo anti-subunidade α da hCG AI13 (captura) e 0 anticorpo anti-subunidade β da hCG B112 marcado com iodo radioactivo (detecção), para determinar a quantidade de heterodímero que restou. Os valores na abcissa referem-se à quantidade de actividade remanescente neste ensaio, relativamente à quantidade inicial de hCG, antes do aquecimento. Este ensaio mostrou que a hCG e CFC101-114 são rapidamente destruídos a 85 °C, enquanto que os análogos reticulados retêm uma actividade substancial durante pelo menos 20 minutos. A Figura 13 apresenta as capacidades da hCG, CFC101-114 e CFC101-114 para estimular a acumulação de AMP cíclico em células que expressam receptores de LH. Esta figura ilustra que a potência de CFC101-114 (α31-β37) (triângulos fechados), foi pelo menos tão grande como a de CFC101-114 28 (símbolos abertos) em ensaios projectados para comparar as suas capacidades para estimular a transdução de sinal pelo receptor de LH. Enquanto CFC101-114(α51-β99) também estimula a transdução de sinal, a sua potência foi inferior do que a de CFC101-114 ou CFC101-114 (α51-β99) . Assim, ao contrário das mutações requeridas para preparar a dissulfito α51-β99, as mutações necessárias para preparar a dissulfito α31-β37 não influenciaram a transdução de sinal. 0 cinto de segurança é bem conhecido como sendo capaz de influenciar a especificidade da ligação ao receptor. Por conseguinte, os dados nesta figura suportam a ideia de que a introdução de dissulfitos em regiões hormonais que não se pensa não participarem em contactos com o receptor ou na especificidade de ligação irão exercer uma influência mínima na ligação ao receptor ou na transdução de sinal. Deste modo, regiões da hormona que não contactam com o receptor e/ou não contribuem para a especificidade da ligação ao receptor serão locais preferidos para a preparação de heterodímeros reticulados por ligações dissulfito. A Figura 14 apresenta as capacidades da hFSH, CFC101-114 e CFC101-114(α31-β37) para estimular a acumulação de AMP cíclico em células que expressam receptores de FSH. Esta figura ilustra que a resposta semi-máxima a CFC101-114(a31-β37) (triângulos fechados) foi semelhante à de CFC101-114 (símbolos abertos) em ensaios projectados para comparar as suas capacidades para estimular a transdução de sinal por receptores de FSH. A actividade de CFC101-114(α51-β99) foi muito inferior à de CFC101-114 ou CFC101-114(α51-β99). Consequentemente, ao contrário das mutações necessárias para preparar a dissulfito α51-β99, as mutações requeridas para preparar a dissulfito α31-β37 tiveram uma influência 29 mínima na transdução de sinal da FSH. 0 cinto de segurança é bem conhecido como sendo capaz de influenciar a especificidade da ligação ao receptor. Assim, os dados nesta figura suportam a ideia de que a introdução de dissulfitos em regiões da hormona que não se pensa não participarem em contactos com o receptor ou na especificidade de ligação irão ter uma influência mínima na ligação ao receptor de FSH ou na transdução de sinal. Por conseguinte, regiões da hormona que não contactam o receptor e/ou que não contribuem para a especificidade da ligação ao receptor serão locais preferidos para a preparação de heterodímeros reticulados por ligações de dissulfito.

As Figuras 15A e 15B apresentam as sequências de aminoácidos traduzidas de aKSIC (Figura 15A) e hCG/3D99C (Figura 15B), codificadas pelos plasmídeos pSVL-aKSIC e pSVL-hCG/3D99C. Uma vez que cada proteína baseada na subunidade α da hCG e cada proteína baseada na subunidade β da hCG possui a mesma sequência líder do péptido sinalizador, tal como as subunidades α e β da hCG, espera-se que as mesmas sejam processadas da mesma forma. Assim, espera-se que aKSIC contenha 92 resíduos de aminoácidos, sendo que a sequência N-terminal contém APD, e espera-se que hCG/3D99C contenha 145 resíduos de aminoácidos, contendo a sequência N-terminal SKE. 0 código de aminoácidos de uma só letra utilizado na presente foi definido na legenda das Figuras 3A e 3B. A letra maiúscula refere-se às localizações das mutações que foram efectuadas para formar a ligação dissulfito intersubunidades. A Figura 16 mostra as capacidades relativas da hCG, representada como uma linha cheia com círculos, e da 30 hCG(α51-β99), representada como uma linha a tracejado com triângulos voltados para cima, para inibir a ligação de hCG marcada radioactivamente a células CHO, que expressam receptores de LH. A Figura 17 mostra as capacidades relativas da hCG, representada como uma linha cheia com quadrados, da hCG(a-βϋ990), representada como uma linha a tracejado com triângulos voltados para baixo, da hCG(α51-β99) , representada como uma linha a tracejado com triângulos voltados para cima; e da hCG(αΚ51ο-β), representada como uma linha a tracejado com losangos, para inibir a ligação de hCG marcada radioactivamente a células CHO, que expressam receptores de LH. A Figura 18 mostra as capacidades relativas da hCG, representada como uma linha cheia com círculos, e da hCG(αΚ51ο-β), representada como uma linha a tracejado com triângulos voltados para baixo, para competir com hCG marcada radioactivamente para a ligação a células CHO, que expressam receptores de LH. A Figura 19 mostra as actividades relativas de transdução de sinal do receptor LH da hCG, representada como uma linha cheia com círculos, da hCG(α51-β99), representada como uma linha a tracejado com quadrados abertos, da hCG (α-βϋ990), representada como uma linha a tracejado com triângulos voltados para cima; e da hCG(αΚ510-β), representada como uma linha a tracejado com círculos. A Figura 20 mostra as actividades relativas de transdução de sinal do receptor LH da hCG, representada como uma linha 31 cheia com círculos; da hCG(αΚ51Α-β), representada como uma linha a tracejado com quadrados abertos. A Figura 21 apresenta a sequência de aminoácidos traduzida, codificada pelo plasmídeo pSVL-CFC101-114/3'D99C. Uma vez que esta proteína traduzida possui a mesma sequência sinalizadora que a subunidade β da hCG, espera-se que a mesma seja processada do mesmo modo e que conduza a uma proteína secretada de 145 aminoácidos, com uma sequência de aminoácidos N-terminal SKE. A letra maiuscula refere-se à localização da mutação que foi realizada para introduzir a ligação dissulfito. A Figura 22 ilustra as actividades de ligação ao receptor de LH relativas de hCG, representada por uma linha cheia, de CFC101-114, representada por uma linha a tracejado com triângulos voltados para cima, CFC101-114(α51-β99), representado por uma linha a tracejado com triângulos voltados para baixo, CFC101-114 (oí^D99C) , representado por uma linha a tracejado com losangos fechados, e CFC101-114(αΚ510-β), representado por uma linha com losangos abertos. A Figura 23 ilustra as actividades de ligação ao receptor de LH relativas de rhCG, representada por uma linha cheia com quadrados; CFC101-114, representado por uma linha a tracejado com triângulos voltados para cima; e CFC101-114 (aK51A-/3) , representado por uma linha a tracejado com círculos. A Figura 24 ilustra as actividades de transdução de sinal do receptor de LH relativas da hCG, representada por uma linha cheia, com círculos fechados; de CFC101-114, 32 representado como uma linha a tracejado, com quadrados abertos; CFC101-144(α-βΌ990) , representado por uma linha a tracejado com losangos, CFC101-114 (aK51C-/3D99C) , representado por pontos individuais; e CRC101-114 (oíK51C-/3) , representada como a linha mais próxima da abcissa. A Figura 25 ilustra as actividades de transdução de sinal do receptor de LH relativas da rhCG, representada por uma linha cheia, com círculos; e CFC101-114 (οίΚ51<2-β) , representado como uma linha a tracejado, com triângulos voltados para cima. A Figura 26 ilustra as capacidades relativas da hFSH, representada como uma linha cheia com círculos; CFC101-114, representado por uma linha a tracejado com quadrados; CFC101-114 (a-/3D99C) , representado como uma linha tracejado com triângulos voltados para cima; CFC101-114 (aK51C-/3D99C) , representado como uma linha cheia com triângulos voltados para baixo; e CFC101-114 (aK51C-/3) , representado por uma linha cheia com símbolos abertos, para inibir a ligação de 1 p c I-FSH a células CHO, que expressam receptores para hFSH. A Figura 27 ilustra as capacidades relativas da hFSH, representada como uma linha cheia com círculos e CFC101-114, representado por uma linha a tracejado com símbolos abertos, para estimular a transdução de sinal em células CHO com receptores de hFSH. As actividades de transdução de sinal de CFC101 («51-/399) , CFC101-114 (OÍ-/3D99C) e CFC101-114 (aK5lC-/3) foram demasiado baixas para serem detectadas às concentrações dos análogos utilizados.

Figura 28 ilustra as capacidades relativas da hFSH, representada por uma linha cheia com círculos, de CFC101- 33 114, representado por uma linha a tracejado com quadrados abertos, e CFC101-114 (oíK51A-/3) , representado por uma linha a tracejado com triângulos voltados para cima, para estimular a transdução de sinal em células CHO, que expressam os receptores de hFSH. A Figura 29 ilustra as capacidades da hCG, representada por uma linha a cheio com símbolos abertos, e da hCG (a31C-/337, 0(51-/399) , representada por uma linha a tracejado com símbolos fechados, para inibir a ligação da 125I-hCG a células CHO, que expressam receptores LH. A Figura 30 ilustra as capacidades da hCG, representada por uma linha cheia com triângulos voltados para baixo, e hCG (oí31 — /337, oí51-/399) , representada por uma linha cheia com círculos, para estimular a transdução de sinal em células CHO, que expressam receptores de LH.

As Figuras 31A e 31B apresentam as sequências de aminoácidos de oíC7S, K51C (Figura 31A) e hCG3'Y37, D99C (Figura 31B) em letras minúsculas, representado o código de aminoácidos de uma só letra. A serina na Figura 31A, que substitui a Cys7, e as cisteínas na Figura 31B, que substituem a Tyr37 e Asp99, encontram-se apresentadas em letras maiusculas.

As Figuras 32A e 32B mostram as sequências de aminoácidos de oíC7A (Figura 32A) , de um análogo da subunidade α, o qual se espera ser útil para a preparação de análogos de hCG, hFSH e hTSH, estabilizados por um nó dissulfito intercisteína entre as subunidades α e β e hFSH/3Y31C (Figura 32B), um análogo da subunidade β, que se espera ser útil na preparação de análogos da hFSH estabilizados por um 34 nó dissulfito intercisteina entre as subunidades α e β. Esta figura ilustra as sequências de aminoácidos de um análogo da subunidade α e um análogo da subunidade β da hFSH, em letras minúsculas, representando o código de aminoácidos de uma só letra. Espera-se que a substituição de Cys7 por alanina na subunidade oí, ilustrada em letras maiúsculas na sequência de aminoácidos de oíC7A, tenha o mesmo efeito que a substituição de Cys7 por serina, tal como ilustrado nos exemplos 1 e 2. A presença de um residuo de cisterna na posição 31 na sequência hFSH/3Y31C também se encontra ilustrada em letra maiúscula. Espera-se que as células que expressam este análogo da subunidade β da FSH ou o análogo da subunidade oí, anteriormente identificado como aC7S, sejam proteínas heterodiméricas reticuladas com dissulfito secretadas, com actividade de FSH. Esta sequência sinalizadora de hFSH/331C é idêntica à da subunidade β de hFSH, consequentemente, espera-se que seja processada de forma semelhante à subunidade β de hFSH. Assim, a sua sequência N-terminal seria NSC. A Figura 33 mostra o código genético para a preparação de análogos de hormonas glicoproteicas.

As Figuras 34A e 34B apresentam as sequências de aminoácidos de aV5C (Figura 34A), um análogo da subunidade α que se espera ser útil para a preparação de análogos de hCG, hLH, hFSH e hTSH, estabilizados por dissulfito intersubunidades entre as regiões N-terminais das subunidades α e β, e de hCG/3R8C (Figura 34B) , um análogo da subunidade β que se espera ser útil para a preparação de análogos da hCG, estabilizados por uma dissulfito intersubunidade entre regiões N-terminais das subunidades α e β. Esta figura ilustra a sequência que codifica para um 35 análogo de um análogo da subunidade α e um análogo da subunidade β da hCG que, quando co-expresso, esperar-se-ia que formasse um análogo hormonal reticulado com dissulfito, com actividade de LH. As sequências de aminoácidos das proteínas e das suas sequências sinalizadoras encontram-se ilustradas no código de uma só letra. A letra maiúscula representa as posições das mutações necessárias para formara a ligação dissulfito intersubunidade. A Figura 35 mostra as sequências de aminoácidos de hFSH/352C, um análogo da subunidade β da hFSH, que se espera ser útil para a preparação de análogos da hFSH, estabilizados por ligações dissulfito intersubunidades, entre as regiões N-terminais das subunidades α e β, em que Ser2 é convertido numa cisterna. Seria de esperar que as células que co-expressam oíQ5C (descrito anteriormente) e hFSH/3S2C produzissem um heterodímero reticulado por meio de uma ligação dissulfito, que possuísse uma substancial actividade de FSH. A Figura 36 mostra a sequência de aminoácidos de hLH/3Y37C, um análogo da subunidade β que se espera ser útil na preparação de análogos de hLH, estabilizados por uma ligação dissulfito entre grupos de cisteínas, entre as subunidades α e β, com as letras minúsculas a representar o código de aminoácidos de uma só letra. A presença de um resíduo de cisteína na posição 37 é ilustrada como uma letra maiúscula. Espera-se que as células que expressam este análogo da subunidade β de LH e o análogo da subunidade a, anteriormente identificado como aC7S ou aC7A, secretem uma proteína heterodimérica reticulada com ligações dissulfito, com actividade de LH. Esta sequência sinalizadora de hLH/3Y31C é idêntica à da subunidade β de 36 hLH e, por conseguinte, espera-se que seja processada de forma semelhante à subunidade β de hLH. Assim, a sua sequência N-terminal seria SRE. A Figura 37 apresenta a sequência de aminoácidos de hLH/3W8C, um análogo da subunidade β que se espera ser útil na preparação de análogos de hLH, estabilizados por meio de uma ligação dissulfito intersubunidades entre as regiões N-terminais das subunidades α e β, em que Trp8 é convertido em cisteina. Espera-se que as células que co-expressam aQ5C (descrito anteriormente) e hLH/3W8C produzam um heterodimero reticulado por meio de ligações dissulfito, que possui uma substancial actividade de LH. A Figura 38 mostra a sequência de aminoácidos de hTSH/3Y30C, um análogo da subunidade β que se espera ser útil para a preparação de análogos de hTSH, estabilizados por uma ligação dissulfito entre grupos de cisteinas, entre as subunidades α e β, com as letras minúsculas a representar o código de aminoácidos de uma só letra. A presença de um resíduo de cisteina na posição 30 é ilustrada como uma letra maiúscula. Espera-se que as células que expressam este análogo da subunidade β de TSH e os análogos da subunidade a, previamente identificados como aC7s ou aC7A, secretem uma proteína heterodimérica reticulada por meio de uma ligação dissulfito, com actividade de TSH. A sequência sinalizadora de hTSH/3Y31C é idêntica à da subunidade β de hTSH, e, consequentemente, espera-se que seja processada de forma semelhante à subunidade β de hTSH. Assim, a sua sequência N-terminal seria FCI. A Figura 39 mostra a sequência de aminoácidos de hTSH/3FlC, um análogo da subunidade β que se espera ser útil na 37

preparação de análogos de hTSH, estabilizados por uma ligação dissulfito intersubunidades, entre as regiões N-terminais das subunidades α e β, em que Phel é convertido em cisteina. Espera-se que as células que co-expressam aQ5C (descrito anteriormente) e hTSH/3FlC produzam um heterodimero dissulfito, com substancial actividade de TSH A Figura 40 ilustra de forma esquemática a construção dos codões de aC7S. A Figura 41 ilustra de forma esquemática a construção de pSVL-CFCl 01-114/3' . A Figura 42 ilustra de forma esquemática a construção de pSVL-CVC94-114/3' . A Figura 43 ilustra de forma esquemática a construção de pSVL-CFCl01-106/3'. A Figura 44 ilustra de forma esquemática a construção de pSVL-Ak51C.

A Figura 45 mostra as capacidades da hFSH e do análogo, aV7 6C + hFSH/3V38C, para estimular a acumulação de AMP ciclico em células CHO, que expressam o receptor de FSH humana. A Figura 46 mostra as capacidades da hCG e do análogo, a + hCG/3R6C, Y37C, para estimular a acumulação de AMP ciclico em células CHO, que expressam receptores de LH. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Os análogos de hormonas glicoproteicas de acordo com a presente invenção representam um aperfeiçoamento dos 38 ensinamentos generalizados da CA 2188508 e de Han et al (1996) .

As ligações dissulfito intersubunidades estabilizam as subunidades oí e β dos heterodimeros das hormonas glicoproteicas. Os análogos melhorados são especificamente desenhados para reduzir a perturbação da estrutura tridimensional da hormona, criando, assim, uma maior probabilidade de o dimero vir a ser formado in vivo e de o dimero formado vir a ter afinidade para os receptores nativos e ter uma actividade agonista sobre os mesmos.

Os termos "análogo" ou "análogos", tal como empregues na presente, pretendem significar uma hormona glicoproteica seleccionada de entre a gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona luteinizante humana (hLH), hormona folículo-estimulante humana (hFSH), hormona estimulante da tiróide humana (hTSH) e mutantes funcionais das mesmas, nos quais as sequências de aminoácidos das suas subunidades α e β são modificadas para gerar cisteinas livres em cada uma das subunidades, as quais formam ligações dissulfito intersubunidades, estabilizando, assim, o heterodimero.

Também como utilizados na presente, os termos "mutante" ou "mutantes" tencionam referir-se às hormonas glicoproteicas hCG, hLH, hFSH e hTSH, gue são modificadas, mas não modificadas de modo a gerar ligações dissulfito intersubunidades, e que retêm substancialmente (pelo menos 80%) da sua actividade biológica funcional, por exemplo, afinidade para o receptor e potência hormonal, reconhecimento por anticorpos, ou que aumentam a sua afinidade ou especificidade para uma hormona glicoproteica diferente, tal como pode ocorrer com hormonas 39 glicoproteicas quiméricas, quer estes mutantes sejam ou não expressamente designados como sendo funcionais.

Para gerar mutantes de hormonas glicoproteicas, a proteína pode ser modificada por qualquer um dos meios reconhecidos no estado da técnica. Por conveniência, as modificações são divididas entre aquelas que são alcançadas por expressão, numa célula hospedeira apropriada, de um gene ou de genes modificados que codificam para a proteína modificada, que serão designadas por "mutações", e aqueles que não são, os quais serão designadas por "derivatizações".

Enquanto que, normalmente, os derivados são preparados por primeiramente sintetizar a molécula líder e depois derivatizá-la, os derivados podem também ser preparados de forma directa. No entanto, está implícito no termo "derivados" que é tecnicamente possível obter o derivado por modificação da molécula líder, mesmo que este não seja o método de preparação preferido.

Modificações de proteínas podem ser classificadas como se segue:

Favoráveis -- estas modificações aumentam a utilidade de uma proteína para uma determinada utilização.

Neutras -- estas modificações não aumentam, nem diminuem a utilidade de uma proteína para uma determinada utilização.

Desfavoráveis -- estas modificações diminuem, mas não necessariamente eliminam, a utilidade de uma proteína para uma determinada utilização.

Inactivantes -- estas modificações eliminam a utilidade de uma proteína para uma determinada utilização. 40

Toleráveis -- estas modificações são favoráveis, neutras ou desfavoráveis, mas não inactivantes.

Uma vez que uma proteína pode possuir mais do que uma utilização, é possível que uma modificação seja favorável para uma utilização, desfavorável para uma segunda, neutra para uma terceira e inactivante para uma quarta.

Em geral, o efeito das modificações sobre a aptidão da proteína será discutido para utilizações que são específicas, a grau superior ou inferior, sobre a estrutura específica da proteína, em vez daquelas que apenas dependem da composição em aminoácidos da proteína, massa moléculas ou propriedades físicas vulgares.

Uma proteína pode ser modificada por uma variedade de razões, incluindo um ou mais dos seguintes propósitos: • Para tornar a molécula mais detectável, como no caso de derivados marcados radioactivamente, marcados enzimaticamente e marcados com fluorescência; • Para tornar a molécula mais estável relativamente a um determinado agente físico, químico ou biológico, tal como calor, luz, agentes oxidantes, agentes redutores e enzimas; • Para tornar a molécula mais solúvel num solvente de interesse, por exemplo, para facilitar a sua administração, ou menos solúvel, por exemplo, para facilitar a sua precipitação ou para permitir a sua utilização na captura de outra molécula; • Para limitar a natureza das reacções em que a molécula pode participar, por exemplo, colocação de grupos 41 protectores em cadeias laterais de aminoácidos, ou, ao contrário, para expandir as reacções possíveis, por exemplo, colocação de um grupo reactivo na molécula para facilitar uma subsequente reacção de acoplamento; • Para tornar a molécula menos (ou mais) imunogénica; • Para aumentar (ou diminuir) o tempo em que a molécula reside num determinado órgão ou tecido, caso administrada a um indivíduo, ou para acelerar (ou desacelerar) a sua chegada a um determinado órgão ou tecido; • Para aumentar (ou diminuir) uma ou mais das suas actividades biológicas ou imunológicas, por exemplo, para aumentar ou diminuir a sua afinidade para um receptor ou para alterar a sua especificidade; ou • Para conferir uma nova actividade, a qual complementa uma actividade anterior (por exemplo, ligação de uma toxina a um anticorpo anti-tumor); ou • Para inibir um efeito secundário indesejado da molécula. A maior parte dos resíduos de uma proteína podem tolerar algum grau de mutação. As mutações podem tomar a forma de substituições simples ou múltiplas, inserções ou deleções. De preferência, as inserções ou deleções são dirigidas aos terminais da molécula, ou a laços superficiais ou a fronteiras entre domínios. Não existe um máximo no que respeita a uma inserção num terminal, a qual é mais convenientemente designada por "adição" ou "fusão". É rotineiro fundir uma proteína a outra para facilitar a expressão, ou para originar uma proteína de fusão, que possui as actividades biológicas 42 combinadas dos seus componentes. Uma proteína de fusão pode ser útil como um precursor, que pode ser clivado para libertar uma proteína activa, mesmo que a proteína de fusão em si não possua actividade.

No que respeita à deleção num terminal, mais convenientemente designada por "truncamento", o propósito da modificação é importante. É rotineiro truncar extensivamente uma proteína, quando se está interessado apenas nas suas propriedades imunológicas. É possível subtrair de uma proteína um epítopo tão pequeno como cinco aminoácidos, e utilizá-lo, por si, para despoletar uma resposta de células T, conjugá-lo a cópias dele próprio ou a um agente veicular imunogénico, para despoletar uma resposta de células B. Quando se trata de uma actividade biológica que tem de ser preservada, os limites do truncamento podem ser mais rigorosos.

De preferência, após considerar substituições e quaisquer deleções e inserções internas, o mutante é pelo menos 50%, com maior preferência, pelo menos 80%, idêntico em termos de sequência à proteína original. É mais provável que uma proteína tolere uma mutação que (a) seja uma substituição em vez de uma inserção ou deleção; (b) seja uma inserção ou deleção nos terminais, do que internamente ou, se internamente, num laço ou numa ligação interdomínios; (c) afecte um resíduo superficial, em vez de um resíduo interno; 43 (d) afecte uma parte da molécula distante do local de ligação; (e) seja uma substituição de um aminoácido por outro de tamanho, carga e/ou hidrofobicidade semelhantes; e (f) seja num local que esteja sujeito a uma variação substancial entre uma família de proteínas homólogas, à qual a proteína de interesse pertence.

Estas considerações podem ser utilizadas para desenhar mutantes funcionais.

De preferência, para os resíduos da estrutura, e com maior preferência, para toda a cadeia, a estrutura 3D prevista ou experimentalmente determinada da proteína modificada possui uma conformação da cadeia principal (Ca-carbono), cujo desvio do valor quadrático médio da estrutura 3D prevista ou determinada experimentalmente da proteína original é, preferencialmente, inferior a 5Â, com maior preferência, inferior a 3Â, com maior preferência ainda inferior a 2Â, com especial preferência, inferior a 1Ã. A determinação da estrutura 3D de uma proteína pode fornecer uma orientação substancial para quem pretende modificar essa proteína para um propósito útil, ou pelo menos para evitar modificações inactivantes. Se a estrutura 3D total for conhecida, o investigador sabe que resíduos estão à superfície e que resíduos estão no interior, que resíduos possuem cadeias laterais direccionadas para o exterior, que resíduos estão mais próximos uns dos outros e quais não estão, o local onde a cadeia é flexível e onde 44 está constrangida, quais os resíduos que estão em estruturas secundárias, quais os resíduos que são aproximados como resultado do enrolamento da cadeia, e quais podem estar a interagir sob a forma de pontes de H e pontes salinas.

As mutações em resíduos superficiais são mais prováveis de serem toleradas, do que as em resíduos internos. As mutações nestas últimas posições têm um maior potencial para destabilizar a proteína, desnaturando, assim, a proteína, afectando todas as suas actividades de ligação. Uma mutação num resíduo superficial pode não ter qualquer efeito na actividade de ligação, ou pode afectar algumas actividades, mas não outras. Em qualquer caso, são pouco prováveis de desnaturar a proteína.

Os métodos principais para determinar a estrutura 3D completa de uma proteína são cristalografia de raios-X e espectroscopia de RMN, sendo a dificuldade principal na obtenção de dados de difracção de raios-X de elevada resolução, o passo de cristalização.

Estruturas cristalinas de elevada resolução da hCG encontram-se disponíveis de dois laboratórios (Lapthorn et al, 1994; Wu et ai, 1994) e servem como um modelo para a hLH, hFSH e hTSH.

No caso de proteínas mais pequenas, de preferência mais pequenas que 20 kDa, a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) pode, igualmente, elucidar sobre a estrutura 3D. Para a utilização da determinação da estrutura por RMN vide Mclntosh et al, (1987) . A RMN pode também fornecer informação parcial a cerca da estrutura de proteínas maiores. Regiões de uma proteína maior, que são 45 de especial interesse, podem ser produzidas separadamente, quer por técnicas de DNA recombinante, quer por proteólise controlada, e, em seguida, ser estudadas por RMN.

Diversas variações espectrais acompanham a alteração da carga do meio ambiente de certos aminoácidos. Se os aminoácidos triptofano, tirosina, fenilalanina e histidina são transferidos para um meio menos polar, ο λιτ^χ e ο ε aumentam. Por conseguinte, se forem maiores para um destes aminoácidos num solvente polar, então, para o aminoácido livre no mesmo solvente, o resíduo tem de ser ocultado e rodeado por aminoácidos não polares. Igualmente, se o espectro de uma proteína é sensível a variações na polaridade do solvente, o aminoácido em questão tem de estar na superfície. Para dar outro exemplo, para aminoácidos, λιτ^χ e ε aumentam sempre se um grupo titulável (por exemplo, o OH da tirosina, o imidazol da histidina, e o SH da cisteína) for carregado. Assim, correlacionando alterações especiais com alterações de pH, é possível deduzir se o grupo titulável está na superfície ou enterrado. Os resíduos em fendas profundas podem ser distinguidos daqueles que estão completamente à superfície, ou completamente enterrados, por comparação de resultados com solventes cujas moléculas possuem diferentes diâmetros médios.

Para além de ter utilidade na determinação da localização de determinados resíduos, estas técnicas espectroscópicas podem ajudar a resolver ambiguidades na análise de raios-X e RMN.

Marcadores de afinidade química específicos para aminoácidos podem ser utilizados investigar quais resíduos 46 é que estão de facto expostos. Os marcadores de maior utilidade são provavelmente aqueles que reagem com resíduos carregados, uma vez que estes são os mais prováveis de aparecerem na superfície. Marcadores de amostras incluem os seguintes: 46 Aminoácido Asp, Glu

Lys

Arg

Marcador de afinidade Compostos diazo (com AA não ionizada) ou epóxidos (com AA ionizada) Ácido 2,4,6- trinitrobenzenossulfónico; anidridos succínico, maleico e citracónico Cilco-hexadiona, hidrazina A proteína marcada e não marcada é, em seguida, submetida, separadamente, a um reagente de fragmentação, tal como brometo de cianogénio, pepsina, papaína, quimotripsina, tripsina ou ácido iodobenzóico. Os péptidos resultantes da clivagem da proteína marcada são comparados com aqueles derivados da proteína nativa, utilizando uma electroforese bidimensional. Os péptidos que possuem uma mobilidade alterada são sequenciados, e os aminoácidos modificados são determinados.

Adachi et al (1989) utilizou reagentes específicos para Arg e Lys, para investigar o papel destes resíduos em ambas as actividades catalíticas e de ligação de heparina de EC-SOD. Verificaram que a modificação destes resíduos resultou numa diminuição destas actividades; no entanto, não tentaram descobrir quais resíduos é que haviam sido modificados. 47

Os resíduos superficiais podem, igualmente, ser identificados por meio de marcadores de foto-afinidade, os quais, após exposição à luz, formam intermediários altamente reactivos, por exemplo, nitrenos e carbenos. Estas espécies são capazes de inserção em ligações C-H e, por conseguinte, podem reagir com qualquer aminoácido acessível. Por este motivo é que a marcação por foto-afinidade tem sido utilizada para estudar a topografia membranar. Algumas proteínas encontram-se na periferia da membrana, outra são integrais à mesma.

Outro exemplo de reagente de marcação não específico é o trítio. Uma proteína enrolada pode ser tritiada (por troca de hidrogénio com água tritiada), desnaturada e fragmentada, e os fragmentos sequenciados e testados relativamente à presença de trítio (o qual é radioactivo).

Todos estes métodos de marcação podem também ser utilizados para determinar se os resíduos, para além de estarem na superfície, fazem parte de um local de ligação. A distribuição do marcador obtida quando a proteína livre é marcada é comparada com aquela obtida quando a proteína complexada é marcada. Uma vez que no complexo, o parceiro de ligação oculta os resíduos do local de ligação da proteína ligante, os resíduos do local de ligação devem estar marcados na proteína livre e não na proteína complexada.

Em geral, entre famílias de proteínas de sequência e função similares, os resíduos superficiais são mais prováveis de variar do que os resíduos internos. Isto é o mais provável, uma vez que os resíduos superficiais não parecem estar 48 envolvidos em interacções com outros resíduos, que são necessários para manter a conformação total da proteína. 0 método mais fiável para a identificação de resíduos superficiais de uma proteína corresponde à determinação da estrutura 3D da proteína por difracção de raios-X. Mesmo uma estrutura 3D incompleta pode ser útil no desenho de mutantes. Os resíduos com uma mobilidade elevada, evidenciada por um factor cristalográfico térmico superior à média, são aqueles menos susceptíveis de destabilizar mutações. Vide Alber et al (1987) .

Embora muitas substituições de aminoácidos possam ser efectuadas em posições superficiais, sem quaisquer efeitos adversos, as substituições em posições internas tendem a ser altamente destabilizadoras. Entre famílias de proteínas homólogas, os resíduos mais conservados, para além dos aminoácidos funcionais, são aqueles que estão enterrados. A contribuição principal para a energia livre do enrolamento proteico e, por conseguinte, para a estabilidade da proteína provém do facto de enterrar cadeias laterais hidrófobas no interior, protegendo-as, consequentemente, do solvente. As densidades de empacotamento são, tipicamente, elevadas. Em geral, a capacidade de uma proteína para tolerar mutações que alteram o volume de resíduos nucleares depende mais da alteração líquida no volume total do resíduo nuclear, depois da magnitude das alterações de volume dos resíduos individualmente. Noutras palavras, um aumento de volume de uma posição nuclear pode compensar um decréscimo de volume de outra posição nuclear. 49

De preferência, a alteração liquida no volume total do resíduo nuclear não é mais do que 10%, com maior preferência, não mais do que 5%. Vide Lim et al (1989); Lim et al (1992).

Na ausência de evidência do contrário, todos os resíduos identificados como sendo resíduos internos podem ser assumidos como fazendo parte de um único núcleo. Contudo, se for provável que a proteína se enrole de modo a formar núcleos distintos, a regra de conservação do volume acima enunciada deve ser aplicada separadamente a cada núcleo. A composição do núcleo enterrado de uma proteína depende não só da tendência de cada aminoácido, se presente, para ser enterrado, mas também da frequência total de ocorrência desse aminoácido na proteína. Os resíduos mais comummente enterrados são, por ordem decrescente, Vai, Gly, Leu, Ala, Ile e Ser.

Lim et al (1992) reportaram que a substituição de um único aminoácido hidrófobo (Leu, Vai) no núcleo da proteína, por um aminoácido hidrófilo (Asn, Gin) impedia o enrolamento completo da proteína e destruía a actividade biolóqica.

Cys enterrada, (forma -S-S-) , Asp, Gly, His, Pro e Trp são em mais de 70% prováveis permanecerem inalterados numa proteína homóloga. Por conseguinte, caso estes resíduos ocorram numa posição enterrada na proteína de interesse, é preferível deixá-los inalterados. A sua conservação é provavelmente explicada como se segue: Cys (ligações dissulfito), Asp (cadeia lateral carregada, mas rígida), Gly (flexibilidade na cadeia), His (ambos os estados carregados e não carregados disponíveis ao pH fisiológico), 50

Pro (geometria de cadeia única) e Trp (maior cadeia lateral) .

Os outros resíduos, com a excepção de Met, são 40-60% prováveis de permanecerem inalterados quando enterrados (Met é apenas inalterada 26% das vezes, mas é 25% provável de ser substituída por Leu).

As seguintes probabilidades de substituição de resíduos enterrados excedem os 10%:

Ile^-Leu, Ile^-Val, Met->Leu, Met->Val, Arg^-GIn, Ser^-Ala, Tyr->Phe, Cys(-SH)->Ala.

Ala->Val, Lys->Arg, Asn->Asp, Thr^-Ser,

Glu^-GIn, Leu->lle, Asn^-Ser, Val->lle,

Phe->Leu, Leu->Val, Arg-»l_ys, Val->Leu,

As seguintes substituições possuem probabilidades na ordem dos 5-10%:

Glu->Val, Phe->lle, Leu->Phe, Met->Ala, Gln->Met, Ser->Gly,_ Trp->Phe, Tyr->Leu, Cys

Ala^-Ser, Phe^Val, Met^-lle, Ser^-Thr, (-SH)-»

Asp->Asn, Phe->Tyr, Gln^-Glu, Thr^Val, Ser.

Glu^-Arg, His->Val, Gln-^His, Val->Ala,

Vide Overington et al (1992), Tabela 5.

Os grupos trocados mais consistentes parecem ser (Arg, Lys), (Leu, lie, Met, Vai, Phe) e (Ser, Thr, Ala). Contudo, Ala e Vai parecem ser razoavelmente ocasionais.

Consequentemente, é preferível, em geral, evitar de todo a mutação de resíduos enterrados. No entanto, caso seja mutado, deve limitar-se a alteração de volume do núcleo total e, com maior preferência, deve limitar-se a mutação à 51 substituição de um resíduo por outro, cuja probabilidade de substituição típica exceda zero, com maior preferência, seja de pelo menos 5%, e com maior preferência ainda seja pelo menos 10%. A mutação de Cys (-S-S) , Asp, Gly, His, Pro e Trp deve ser evitada, justificação ausente por outra evidência. As mutações do núcleo mais seguras são permutas de um aminoácido hidrófobo por outro, e de Arg por Lys (ou vice-versa).

Todavia, mutações sensatas em resíduos internos podem ser utilizadas para aumentar a estabilidade da proteína. Tais mutações poderiam introduzir interacções de estabilização adicionais (ligações por hidrogénio, pares iónicos), compatíveis com a estrutura nativa, ou poderiam reduzir a mobilidade de grupos interactuantes próximos, por substituição de aminoácidos mais pequenos por maiores, ou cadeias laterais lineares por cadeias laterais ramificadas ou aromáticas. Vide Alber et al, (1987)

Para além das generalizações sobre as modificações em resíduos em hormonas glicoproteicas, discutidas acima, o mais importante é que existe uma quantidade de informação considerável disponível sobre regiões de hormonas glicoproteicas (em particular da hCG) que podem ou não ser expostas durante a ligação a um receptor de uma hormona glicoproteica e que não impedem as interacções hormona-receptor, isto é, a afinidade do receptor e a potência da hormona. Tal informação disponível sobre resíduos e regiões que podem ser modificados com segurança encontra-se presente na descrição da secção do estado da técnica relacionado, assim como noutros locais da presente especificação. Assim, a partir da grande quantidade de dados estruturais e funcionais apresentados na presente e 52 disponíveis na literatura científica, é bem conhecido daqueles peritos na matéria o modo de efectuar modificações a sequências de aminoácidos de hormonas glicoproteicas, não prejudicando a sua função.

Para além disso, os mutantes funcionais das hormonas glicoproteicas pretendem englobar hormonas glicoproteicas quiméricas, nas quais um ou mais resíduos ou regiões de uma hormona glicoproteica, isto é, o cinto de segurança da subunidade β, são substituídos por um resíduo ou resíduos, ou por uma região ou regiões de outra glicoproteína que pode, por exemplo, alterar a especificidade de ligação ao receptor. Alguns exemplos de resíduos e regiões que afectam a especificidade de ligação ao receptor, etc., são discutidos na presente especificação.

Os mutantes de hormonas glicoproteicas pretendem ainda englobar hormonas glicoproteicas de cadeia simples, nas quais as subunidades α e β são traduzidas como uma cadeia simples e correctamente enroladas na sua conformação de heterodímero. A seguir é descrito um procedimento, que pode ser utilizado para identificar resíduos que têm o potencial de formar ligações dissulfito. Como será demonstrado nos exemplos que se seguem, nem todos os heterodímeros da hCG estabilizados por ligações dissulfito e os seus análogos retêm a sua potência biológica total. No entanto, a introdução de uma ligação dissulfito intersubunidades entre os grupos de cisteína, tem a capacidade de aumentar a estabilidade da proteína sem prejudicar a potência da hormona. 53

Análogos de hormonas glicoproteicas reticuladas por ligações dissulfito, de acordo com a presente invenção, podem ser preparados por meio da criação de cisteinas livres em cada uma das subunidades, as quais podem ser reticuladas para formar uma ou mais ligações dissulfito intersubunidades. Isto pode ser levado a cabo por substituição dos codões para um ou mais aminoácidos por aqueles para cisteína ou por substituição do codão para um resíduo de cisteína numa ligação dissulfito existente por um codão para qualquer outro aminoácido. Contudo, nem todas estas substituições são esperadas criar ligações dissulfito intersubunidades. Dois dos factores que devem ser considerados no desenho de análogos encontram-se ilustrados na presente. 1) Espera-se que os análogos de hormonas glicoproteicas reticuladas com ligações dissulfito mais úteis, possuam uma estrutura semelhante à da hCG, hLH, hFSH ou hTSH. Por conseguinte, a ligação dissulfito não deve distorcer grandemente a conformação total da proteína. As localizações das ligações dissulfito que se espera possuírem uma influência menos perturbadora sobre a conformação da proteína podem ser previstas a partir dos dados na Tabela 1B, que ilustra as distâncias aproximadas entre átomos de carbono Ca e Ζβ de resíduos de aminoácidos seleccionados na subunidade α da hCG (coluna esquerda de cada par de colunas) e um ou mais resíduos próximos da subunidade β da hCG (coluna direita de cada par de colunas). Estes valores podem ser calculados a partir da estrutura cristalina de hCG por qualquer um dos vários pacotes de modelagem molecular, bem conhecidos e ampla e publicamente disponíveis, incluindo Sybyl, Insight, Rasmol, 54 e Kinemage, para mencionar alguns. A distância entre resíduos de aminoácidos na subunidade α da hCG e um ou mais resíduos próximos da subunidade β da hCG, para além daquelas apresentadas na Tabela 1B, pode ser facilmente calculada a partir de dados da estrutura cristalina de hCG publicados (Lapthorn et al, 1994; Wu et al, 1994).

55 λ.· vai 4 15¾ í?:l: ?:2i AoV) -i. ··: · <SIn5 |i:i: V,-«a 15 ?, 3.03! £521 U:2: í:èi £1$ í!J; 1:¾ Atai 11..,.1,...5...5.1. Cys7 Proí (?.?. 7.4 Í$l ícl: tlí m (1:1: t\l mu \i:l: í:?i . .ST.Í1J» Í7.1. 4.6) Pros Asg« Í7.3, 7.S) ,,=rnai.,<:7v,2 , ,,S ,4i, ................ r..&ss5...?.7 -.4 ,. e.,:s > cunr; ?,0i 2 6.35 Prc39 <7.í, 7 Sí Thi-40 is.4, a.2; Metíi (5.0, 4.8! ..r.h.r.43 47.S. 9.0) slyso IIIIII CysJl ArgS !7.6. 5.1) gíij M: |:í| Tor<o 1.1:5: c!) Cys32 1111! fhe3 3 Ifillí Ber34 .6. S.9> i i r Cvs$ Í8.0, S.í) h^3 (7 Jf 6.5) II

Tabela 1B Distâncias aproximadas entre átomos de carbono Ca e Cfi de resíduos seleccionados das subunidades α e β da hCG Χ«!ψΛ<» ΛΧΚΉΜΟΦί' líS v _ * wtoNtofr β -' ftlaiiS 11*33 <$.4« s.$í CVS 54 ·$,£>, 4.7) M5 8l.il Tyr37 .mi__u±±u ...P.1S.3S............ Ai S, 11...(5.,.6^...1, ?! ...... AOT74 Í7,s.. í.c? Pro40 8s&!]èVsn> ...!,.e.UlvS {7,7, 7.7.1 ..í-euw.............. ...Glu79...í7..7. ..5.2) -Sin*) ...T5)r97 '7.8, 9.21 bysSÍ mm fcsn52 Thr97 <8.4, 6.3) jmt N b ?:ã! Val53 S3i j‘:l: S:â| ...).5.0.55 Í5,5,...í,9t ThtfS* Thr3$ (5.8,, 7.5) Asp99 (4,S. 4,5) L. SerSS X|||j í|;|: ]:? IIIIV II GlvíSe IIII!: I S&Xh7 88$ (!:i: l:ii CyslCO (7.9. 7.9) tiytoí j!:S: l:ês li.' ·<· λ·. ?,?l TteSS ív:l: Hi Cy$53 m: I:li (5)754 17. 5, .1,9! CysíO .131.11:1:. J;l! VaUi *8 ÍH: l:!! 3ΐ<ο:ΐχκ L/S75. ..ISSLIliiiL Vai!7« 1 Glu7? IIIJIíílW!..... ))3 579 V31.41 <7.7. 7 1 )...... ThrR6 cb/uu ;« .5.. s. .5.)... '2VSS7 lisui-liia.

Distância entre [Distância entre carbonos Ca (Â) , carbonos <Ζβ (Â) ] 56 0 valor da esquerda de cada par de valores apresentado entre parêntesis, associado com cada residuo da subunidade β mostra a distância entre o átomos de carbono Ca desse residuo da subunidade β e o correspondente residuo da subunidade a, na coluna da esquerda. 0 valor da direita de cada par de valores apresentado entre parêntesis mostra a distância correspondente entre os átomos de carbono <Ζβ destes resíduos. Em princípio, a substituição destes pares de resíduos por cisteínas permitiria a formação de uma ligação dissulfito intersubunidades, desde que não esteja presente outra cisteína interferente em ambas as subunidades.

Nem todos os pares de cisteínas teriam uma probabilidade igual de formar uma ligação dissulfito intersubunidades. A formação de uma ligação dissulfito intersubunidades que se esperaria ter a menor influência sobre a conformação do heterodímero seria influenciada pela orientação dos átomos das cadeias laterais das suas cisteínas componentes. Posições favoráveis e preferidas para o posicionamento de ligações dissulfito incluiria pares de aminoácidos, em que a distância entre os átomos de carbono <Ζβ é menor do que entre os seus carbonos Ca. As localizações mais favoráveis e preferidas para a formação de uma ligação dissulfito intersubunidades são aquelas em que as distâncias entre os carbonos Ca e Cfi são similares àquelas de ligações dissulfito que ocorrem naturalmente, nomeadamente, cerca de 5,0-6,5Â e cerca de 3,5-4,2Â, respectivamente.

Por conseguinte, seria de esperar que substituições que geram um par intersubunidades de cisteínas com átomos de carbono Ca distanciados 4-8Â e átomos de carbono Cfi 1-2Ã 57 mais próximos, tenham a maior probabilidade de formar uma ligação dissulfito com a menor influência sobre a estrutura total da proteína e/ou de promover a reticulação intermolecular de duas ou mais moléculas. De facto, tal como apresentado nos exemplos, esta regra prática, de acordo com a presente invenção, foi utilizada com sucesso para criar vários análogos de hCG reticulados por ligações dissulfito, que retêm muitas das suas propriedades imunológicas e hormonais. 2) Seria de esperar que os análogos de hormonas glicoproteicas reticulados por ligações dissulfito mais activos contivessem a reticulação em locais não necessários para a ligação ao receptor ou para a transdução de sinal e/ou em locais não necessários para a estabilização da conformação activa da hormona. Existe um grande número de resíduos nas hormonas glicoproteicas que são conhecidos por não serem necessários para as suas actividades biológicas. Estes incluem a maioria dos resíduos N-terminais do grupo de cisteínas (isto é, a segunda cisteína na subunidade α nativa e a primeira cisteína nas subunidades β nativas). Por exemplo, análogos da hFSH extremamente potentes foram preparados, em que estes resíduos da subunidade β de FSH (Asnl, Ser2) foram substituídos pelos seus homólogos de hCG (Serl, Lys2, Glu3, Pro4, Leu5, Arg6, Pro7, Arg8). Assim, não seria de esperar que uma ligação dissulfito nesta região da molécula, gerada por substituição da Gln5 da subunidade α da hCG e da Arg8 da subunidade β por cisteínas eliminasse a actividade de LH do heterodímero reticulado por ligações dissulfito. De modo semelhante, não seria de esperar que uma ligação dissulfito formada por substituição da Gln5 da subunidade α da hFSH e da Ser2 da subunidade β 58 por cisteínas eliminasse a actividade de FSH do heterodimero reticulado por ligações dissulfito. Por alteração da Cys31 da subunidade α para Ala ou Ser e por substituição da Arg6 da subunidade β da hCG por Cys ou por adição de uma Cys ao terminal N da subunidade β da FSH, espera-se que uma ligação dissulfito possa ser formada na região N-terminal das subunidades α e β da hCG ou hFSH. Não seria de esperar que esta ligação dissulfito prejudicasse a actividade de qualquer um dos análogos hormonais. A estrutura cristalina da hCG revelou que cada uma das suas subunidades é composta por um grupo de cisteínas. Consequentemente, cada subunidade compreende três laços designados al, a2, a3 e βΐ, β2 e β.3. Para além disso, da subunidade β possui 20 aminoácidos adicionais, conhecidos como o cinto de segurança que rodeia a2, para segurar o heterodimero e para estabilizá-lo na sua conformação capaz de se ligar ao seu receptor único. As localizações das cisteínas em lutropinas, folitropinas e tirotropinas sugerem que todas as três moléculas possuem um padrão de enrolamento total semelhante e que a estrutura cristalina da hCG será um guia razoável para a introdução de ligações dissulfito intersubunidades. No entanto, as estruturas da FSH e da TSH não foram determinadas e podem apenas ser deduzidas a partir da de hCG. As estruturas cristalinas dos grupos de cisteínas de cada subunidade mostram que cada uma é extremamente semelhante. Isto ocorre porque as mesmas são altamente constrangidas pelas suas três ligações dissulfito componentes. Por conseguinte, espera-se que resíduos no ou adjacentes ao grupo de cisteínas tenham conformações similares em cada hormona. Para além disso, existe uma cisteína nos laços βΐ e pi, em posições similares nas três 59 classes de hormonas. Estas formam uma ligação dissulfito na hCG e seria de esperar que formassem uma ligação dissulfito em todas as hormonas glicoproteicas. Esta ligação dissulfito e o grande número de ligações de hidrogénio dentro e entre os átomos da cadeia principal destes laços da hCG, sugerem que as conformações de βΐ e β3 serão bastante semelhantes nas três classes de hormonas. Os laços al e a3 também compreendem várias ligações de hidrogénio, sugerindo que esta porção da molécula será, igualmente, semelhante nas três classes de hormonas. Esta perspectiva é suportada pela observação de que uma estrutura de RMN da subunidade α livre, mostra que al e a3 possuem conformações semelhantes, mesmo quando não estão no heterodimero (DeBeer, et al, 1996). Enquanto que as restantes porções das três classes de hormonas são quase de certeza semelhantes em conformação à da hCG, não é provável que estejam tão intimamente relacionadas com a estrutura da hCG, como as porções da molécula discutidas acima. Por exemplo, β2 compreende relativamente poucas ligações de hidrogénio internas e/ou contacta com al e a3. Dado que não parece que estejam altamente constrangidas em hCG, não existe qualquer razão para acreditar que a sua estrutura seja completamente idêntica à de outras hormonas. De facto, o laço β2 em TSH é dois aminoácidos maior do que o de hCG ou hFSH. As extremidades dos terminais N e C de a2 participam em contactos extensivos com ligações de hidrogénio e as porções da extremidade do terminal C de a2 também estão em contacto com βΐ. Assim, estas partes de a2 podem ser semelhantes na maior parte das hormonas. Contudo, a parte central de a2 apenas contacta o cinto de segurança, uma região da proteína que não é muito 60 conservada nas três classes de hormonas. A estrutura de RMN da subunidade a, mostrou que a2 é altamente desordenado, sugerindo que esta parte da hormona em hCG possui uma estrutura bem ordenada no heterodimero, apenas porque é comprimido entre βΐ e β3 e o cinto de segurança. Esperar-se-ia que diferenças no cinto de segurança alterassem a conformação de a2, particularmente daquelas porções não localizadas perto do grupo de cisteinas.

Informações sobre a influência do cinto de segurança na estrutura da hormona foram obtidas pelo presente inventor, utilizando sondas imunológicas, para estudar análogos de hCG que possuem a capacidade para se ligar a receptores de lutropina e folitropina. Estes dados sugerem que a composição do cinto de segurança pode alterar a conformação da hormona. Dados similares também sugerem que a conformação da hormona pode ser influenciada pelo receptor. Por exemplo, anticorpos monoclonais cujos locais de ligação foram parcialmente determinados (Moyle, et al, 1990; Moyle, et al, 1995) foram utilizados para estudar a conformação de um análogo de hCG bifuncional (CF101-109), quando está livre e quando está ligado a receptores de LH e FSH. O CF101-109 foi preparado por substituição dos resíduos 101-109 do cinto de segurança de hCG pelos resíduos 95-103 do cinto de segurança de hFSH (Moyle, et al, 1994) . As capacidades de CF101-109 de ser reconhecido por anticorpos monoclonais mostraram que a presença dos resíduos de FSH no cinto de segurança alterou a interacção entre as duas subunidades. Consequentemente, A407, um anticorpo para um epítopo conformacional que incluía resíduos na extremidade do terminal N da subunidade α em hCG, mas não em hFSH, tem uma afinidade extremamente reduzida para CF101-109, apesar 61 do seu epítopo estar distante do local da mutação (Tabela 1C) . A influência do receptor na estrutura da hormona foi observada através do facto de A407 reconhecer o CF101-109, quando o mesmo estava ligado a receptores de LH, mas não quando estava ligado a receptores de FSH (Tabela 1D). Outros anticorpos que reconhecem epitopos localizados inteiramente em <xl e/ou a2 ou em βΐ e/ou β3, reconheceram o CF101-109, mesmo quando este estava combinado com receptores.

Em conjunto, as observações sugerem que as posições das subunidades nas hormonas podem não ser idênticas e podem ser influenciadas por interacções com os seus receptores. Por conseguinte, o presente inventor determinou que, para além de considerar as localizações e orientações relativas de potenciais substituições de cisteína, obtidas a partir da estrutura cristalina da hCG, deve também ter-se em conta a probabilidade de a estrutura cristalina da hCG representar as estruturas de folitropinas e tirotropinas e/ou a conformação da hormona no complexo hormona-receptor.

As porções da hormona que têm maior probabilidade de serem idênticas às da hCG e pelo menos prováveis de serem alteradas durante a interacção com o receptor incluem aquelas no ou perto de resíduos no grupo de cisteínas. 62

Tabela 1C

Reconhecimento de quimeras de hCG, hFSH e hCG/hFSH por anticorpos monoclonais anti-subunidade α da hCG

Anticorpo de teste anti-subunidade ti. marcado radioartivamente Análogo Captura «H-A105 i£;i-Alcg i^FAH? 5KI-A11.3 ; 1111A2Q2 12S|,A407 :B112 114ÍIÍ1Í:1Í: 1 teollli 11180:*.£ÍÍ 10S:í:4l|l 108::4 S 1180::4.9 100:1 7 hCG :B413 mÊÊÊÊÈ 1 100.. 2 c· iiiiiiili 200.; 3.0 : 100: 1.3 100:.1 3 1 108:4 2 CFS4-97 :B112 :B4lt ilillÉll 111111111 1 76.8: 4 0 145.0:6.0 llãlliii: 125-ÍV: 2.5 110.7:::111 1101.2::3.2 120.4 .V 1.8 113 3:2 7 illillll 103.4:4.9 '523.2.1.12,5 CF191-1Q9 :BJ 52 :B4SS 102.1 :.0.6 |:||;|Í|Í| 49.6:.2.3 S0 3?. 3 A 8·2.&* 3.8 llllilll 06.3.-:.2.5 82.7.:--:.4 24.2.:. 1.6 110 8:0.?. 6611111: isliliil 6.8:0.9 56.7.:0.1 CF54-117 IBi 1:!14ÍIIÍÍ1 134.5:9.4 lÍ4ÍSÍIi 144 7 : 26 109 4:. 2 3 137;ii!i! 31 0:1.0 :3410 lilllill -558.3.-:3.7 .....141«.: 1.2 11-53.: 1 ?. llitligll 5 397:.88 56.8::0.3 CF39-S8 :B112 1 2 0.1 78.8.-:2.0 68.8;: 3.5 1 ll:ÍliÉÍl: : 75.0.-: 1 4 95.4.1.5.6 :3410 Í)|Í|i|Í| 29:0.3 60.3.-::0.1 67.5.-:. 5.5 | 105.3:.5.3 120.1:1.3 í'FSH* 3602 lllllllll 26:0.6 49.0.::6.1 |Íã;::0.S illllill; 65.2:. S. 1 -6 7:1.4

Notas: As quimeras são identificadas pelos resíduos de hCG que são substituídos por aqueles de hFSH. Assim, CF94-97 refere-se a um análogo, em que os resíduos 94-97 da subunidade β de hCG são substituídos pelos seus homólogos de FSH. Os resíduos 94-97 da subunidade β da hCG encontram-se laço pequeno do cinto de segurança; 101-109 encontram-se na metade carboxi-terminal do cinto de segurança; 94-117 encontram-se no laço pequeno do cinto de segurança, na metade carboxi-terminal do cinto de segurança e no terminal carboxi; e 39-58 encontram-se no laço 2 e o primeiro resíduo no laço 3. A hCG e as quimeras foram capturadas com B112 (linha de topo) e B410 (linha de baixo) . A hFSH foi capturada pelo anticorpo B602. Os valores representa as médias de triplicados e são normalizados relativamente à hCG (indicada como 100%). Apenas ο A105 e ο A407 também se ligam à hCG quando a mesma se encontra complexada com LHR (Moyle et al, 1995). 63

Tabela 1D

Ligação de anticorpos marcados radioactivamente a hCG ou CF101-109 complexado com o LHR de ratazana ou o FSHR humano

Análogo Ensaio Ajiticoipo anti-subunidade « Anticoipo anti-siibunidade |J li Atollllll ............ || 3165 B112 841Q LHR de ratazana *03 : 1 1Í|s3:í: fflll 52150. 1:4706.:.2042 Não testado Não testado : 2 lllldâr tlili 352843653 21532:. 1272 Não testado Não testado ! 3 llllgSx 37555o 2051 ^24 1l .671 Não i estado 12713.:. 2044 : 4 ||||S7± 550 205115:. 1016 21037 957 11937::.154 ll|ji2i Tes1e<3 Razão para 3505: |||27rG.05 1.33:': G:f§ 1.0 G.S7 III 0.57 CP101-109..................... : 11! 1000::315 17044::2804 Não testado Não testado ; 2 ::107:79:::1673 4130ll|7 29110.:.2445 Não testado Não testado ; 3 lllSIrtrM 2854 r. 535 1;3S74i:Í585 Não testado 6202:·:: 1437 4 ll|||:7r 171 liill§s...... 27647: 387 14161 |1f,2 Not Tsstsci Razãopara 31G5: !!|gr&22..... ',||:|||θ:θ||1·: lllllll lllpçi 0.48 FSHR humano 1 Não testado Não testado Não testado Nao testado Não testado 2 iiiSiirSEB Mi 1::14041::::1064. Não testado Não testado f: 3-....... .....15651::26811 ........91::.347::..... 731312555 Não testado 3038·:. 1212 : : 4 5321|:|||| 56±4:1:|i 2:32!||lÍ481 2320:::574 Net Tsstal Razãopara B1C?. eor|||l llll 0:§52 I 0.082 0.42 iiiiiiiiiiiiiiiii ; 1 Não testado Não testada Não testado Não testado Não testado •1· : 4L. 8956:::601 lllifl 2451 16A Não testado Não testado : 3·....... 5511::511 U214 5750 455.· 1056 4383:6 IDSs : 4 735Sv;.43& li|liÍ323 2052::.741 Não testado Não testado Razãopara B5G5: 9.42:::008 111111 0.33 0:46 0.4S

Notas: Os complexos ligando-receptor foram formados e, em seguida, detectados utilizando anticorpos monoclonais marcados radioactivamente, como descrito no texto. Os valores indicados (média de triplicados ± SEM) são em cpm menos o branco. Na maior parte dos casos, os dados para a ligação ao LHR e ao FSHR foram obtidos no mesmo ensaio (identificado pelo número na coluna da esquerda). "Razão para B105" foi calculada por divisão da quantidade de marcador radioactivo observado com cada anticorpo pela obtida com B105 e considerando a média destes valores.

Todos os valores excepto aqueles para a ligação de A407 a CF94-117 e CF101-109 relativos a FSHR são maiores do que 0 (p<0,05). 64 A região entre os grupos de cisternas é um dos locais mais atraentes para projectar uma ligação dissulfito e é um local preferido para uma ligação dissulfito intersubunidade. 0 grupo de cisteinas de cada subunidade é estabilizado por três ligações dissulfito, tornando-o uma das partes mais rígidas da molécula. Os resultados laboratoriais do presente inventor indicam que alterando o resíduo Tyr37 da subunidade β de hCG, tem relativamente pouca influência na actividade da hormona. Assim, o presente inventor não espera que a presença de uma cisteína neste local altere a actividade da hormona. A patente Canadiana CA 2188508 não divulga que uma ligação dissulfito entre os grupos de cisteína das subunidades α e β estabilizaria um heterodímero de gonadotropina, com a manutenção da actividade hormonal. Tal como mostrado nos presentes exemplos, uma forma de conseguir isto é por substituição do resíduo Cys7 da subunidade α por Ala ou Ser, para eliminar a ligação dissulfito intrasubunidade Cys7-Cys31 e por substituição de Tyr37 da subunidade β de hCG por Cys. O análogo reticulado de hCG que foi produzido apresentava uma elevada actividade de LH.

De modo semelhante, noutro exemplo não limitante, foi possível preparar um análogo reticulado de CFC101-114, uma quimera de hCG/hFSH, na qual os resíduos de aminoácidos 101-114 na subunidade β da hCG foram substituídos pelos seus homólogos de hFSH (isto é, os resíduos 95-108 da subunidade β) . O CFC101-114 liga-se e activa ambos os receptores LH e FSH. O análogo reticulado por ligações dissulfito foi igualmente capaz de se ligar e activar ambos os receptores LH e FSH. Esta última observação mostra que esta ligação dissulfito não impede a actividade do receptor 65 de FSH, tornando altamente provável que uma ligação dissulfito em hFSH também não destruiria a sua actividade hormonal. A preparação de uma hFSH reticulada por ligações dissulfito poderia ser levada a cabo por meio da co-expressão do cDNA da subunidade a, na qual Cys7 é convertida em Ala, e do cDNA da subunidade β da hFSH, na qual Tyr31 é convertida em Cys. Uma ligação dissulfito entre os grupos de cisterna pode, igualmente, ocorrer com outra ligação dissulfito intersubunidade, noutro local qualquer, tal como entre o laço 2 de α e o cinto de segurança de β ou entre o terminal N de α e o terminal N de β, como uma forma de realização preferida. Para além disso, as ligações dissulfito formadas entre os grupos de Cys das subunidades α e β iriam libertar um resíduo próximo do terminal N, isto é, aCys7Ser, o qual pode ser utilizado com vantagem para PEGuilação.

Uma ligação dissulfito intersubunidade localizada entre os grupos de cisteína das subunidades α e β pode, igualmente, seguir a regra geral de minimização do potencial impacto das reticulações intersubunidades na estrutura da hormona, por colocação de ambas as posições de reticulação entre dois resíduos de cisteínas existentes (nativas), envolvidas em ligações dissulfito nativas e não fora, isto é, outras cisteínas do terminal N ou do terminal C, da maioria das cisteínas nativas do terminal N ou do terminal C (a unidade de cisteína mais exterior da correspondente subunidade nativa), como um meio de minimizar os risco de perturbações estruturais. Nenhuma das ligações dissulfito intersubunidades divulgadas e ensinadas na patente Canadiana CA 2188508 segue esta regra geral. 66

Seria de esperar que análogos hormonais reticulados por meio de uma ligação dissulfito entre os laços 1 ou 3 da subunidade α e o laço 2 da subunidade β, que não seguem a regra geral descrita anteriormente, também retivessem a actividade hormonal. Estas regiões são altamente propensas a substituições de aminoácidos. Assim, substituindo a subunidade α humana em hCG ou hFSH pela subunidade α de bovino não elimina, usualmente, a actividade hormonal, apesar de as subunidades α bovina e humana diferirem significativamente nesta região.

Do mesmo modo, substituições por atacado de resíduos de hFSH por resíduos de hCG e vice-versa no laço 2 da subunidade β, não eliminaram a actividade de qualquer uma das hormonas. Por conseguinte, , não seria de esperar que ligações dissulfito nesta região perturbassem a actividade biológica de lutropinas ou folitropinas. Estas ligações dissulfito incluem aquelas formadas por alteração da Gln27 da subunidade α e Val44 da subunidade β de hCG ou hLH ou Val38 da subunidade β de hFSH para Cys. As mesmas também incluem ligações dissulfito preparadas por alteração de Val7 6 da subunidade α e Val44 da subunidade β de hCG ou Val38 da subunidade β de hFSH para Cys. Outro análogo reticulado por meio de ligações dissulfito que se espera que retenha uma actividade substancial é um com um resíduo Lys75 da subunidade α e um resíduo Gln46 da subunidade β de hCG ou hLH ou um resíduo Lys40 da subunidade β de hFSH convertido em Cys. No entanto, este último análogo seria menos carregado positivamente do que a hCG ou a hFSH, podendo, consequentemente, a sua actividade total de LH ou FSH ser reduzida. É ainda possível inserir ligações 67 dissulfito intersubunidade noutras regiões de lutropinas ou folitropinas. Algumas destas ligações dissulfito envolvem resíduos no cinto de segurança da subunidade β (isto é, formadas por substituição de Asp99 da subunidade β da hCG por Cys) e o laço 2 da subunidade α (isto é, formadas por substituição da Lys51 da subunidade α por Cys).

Esta ligação dissulfito reduziu significativamente a actividade de LH da hCG e as actividades de LH e FSH do análogo bifuncional CFC101-114. A localização de resíduos na hLH, hFSH e hTSH gue pode ser mutada para cisteína, com a expectativa de produzir uma ligação dissulfito, pode ser determinada a partir das localizações "eguivalentes" dos resíduos da subunidade α e β nestas proteínas, como definido nas Tabelas 2-4.

Tabela 2

Posições equivalentes nas subunidades β da hormona glicoproteica humana (Sequências líder não apresentadas)

Nota: um ponto (.) indica que não existe um resíduo nessa posição. 69 A informação na Tabela 2 pode ser utilizada para calcular os resíduos que ocupam posições "equivalentes" em cada subunidade β da hormona humana. As estruturas cristalinas estão apenas disponíveis para a hCG. No entanto, devido ás elevadas semelhanças nas sequências de aminoácidos de todas as hormonas glicoproteicas, nomeadamente das suas ligações dissulfito intrasubunidade, espera-se que todas as hormonas tenham formas similares. A conclusão de que a conformação total de todos os heterodímeros é semelhante à de hCG é, então, suportada pelas observações de que é possível preparar quimeras de hCG/hFSH, hCG/hLH e hCG/hTSH que retêm epítopos encontrados nas regiões dos seus progenitores, utilizados para derivar as quimeras. Consequentemente, espera-se que a substituição de resíduos equivalentes, como definido na tabela, conduza a ligações dissulfito intersubunidades que possuem propriedades semelhantes àquelas que foram formadas e caracterizadas. Posições "equivalentes" são definidas num eixo vertical. Assim, na subunidade β de hFSH, cisteína 3 é "equivalente" a cisteína 9 da subunidade β da hCG. 70 Tabela 3

Posições equivalentes em sequências de amínoácídos da subunídade α seleccionadas vertebrados (Sequências líder não apresentadas) de

mMummtmmmmímmiMmmmmitmmkmmmmmmmmmímmmmÊmfmiímmrnmmmmmmmmmmmmm

Nota: um ponto (,) indica que não existe um resíduo nessa posição. 71 A informação na Tabela 3 pode ser utilizada para calcular resíduos que ocupam posições "equivalentes" em cada subunidade α da hormona. A estrutura cristalina da hCG foi a única a ser reportada. Devido a elevadas semelhanças nas sequências de aminoácidos de todas as hormonas glicoproteicas, nomeadamente nas suas ligações dissulfito, espera-se que as hormonas de todas as espécies tenham formas similares. Esta ideia é igualmente suportada pela observação de que é possível preparar quimeras de subunidade α humana/bovina que retêm epítopos encontrados em regiões dos seus progenitores, observados em quimeras. Por conseguinte, espera-se que a substituição de resíduos equivalentes, tal como definido nesta tabela, conduza a ligações dissulfito intersubunidade que possuem propriedades semelhantes àquelas que foram formadas e caracterizadas. 72

Tabela 4

Posições equivalentes em sequências da subunidade β seleccionadas de vertebrados (Sequências líder não apresentadas)

Abreviaturas: h, humano; e, equídeo; d, cão; c, galinha; b, bovino; o, ovino; 1, coelho; s, salmão; p, suíno; r, ratazana; m, rato

Nota; uni ponto (.) indica que não existe um resíduo nessa posição. 73 A informação na Tabela 4 pode ser utilizada para calcular os resíduos que ocupam posições "equivalentes" em cada uma das subunidades β de vertebrados. 0 exemplos na presente invenção ensinam como é que as ligações dissulfito podem ser introduzidas em hormonas glicoproteicas e análogos capazes de ligar a receptores de LH, FSH e/ou TSH. A presença de ligações dissulfito intersubunidades aumenta as estabilidades de hCG e de um análogo de hCG, que possui actividade significativa de FSH. Assim, seria de esperar que a adição de ligações dissulfito intersubunidades estabilizaria outros membros e análogos relacionados nesta família de hormonas.

Quando localizadas em locais da hormona que não estão envolvidos na ligação ao receptor ou na especificidade de ligação ao receptor, as ligações dissulfito não impedem a função hormonal. Na realidade, algumas ligações dissulfito intersubunidades podem potenciar a função de análogos hormonais. Com uma excepção (Blithe et al, 1991), as subunidades hormonais estão quase desprovidas de actividade endócrina. Por conseguinte, é provável que procedimentos que estabilizam o heterodímero, prolonguem as actividades biológicas destas hormonas, sendo de esperar que aumentem a sua utilidade terapêutica. 0 método para aumentar a estabilidade de hormonas glicoproteicas heterodiméricas de acordo com a presente invenção envolve a identificação de resíduos, que podem ser substituídos de forma a gerar cisteínas livres em cada uma das subunidades, cisteínas livres essas que apresentam um elevado potencial para formar uma ligação dissulfito 74 intersubunidades, que melhoraria a estabilidade do heterodímero, sem distorcer a conformação total da proteína hormonal. A substituição de resíduos para formar cisteínas livres em cada uma das subunidades pode ser conseguida a um nível genético, por substituição dos codões correspondentes nas sequências nucleotídicas das subunidades α e β. Células hospedeiras transformadas com moléculas de DNA recombinante, transportando as sequências nucleotídicas modificadas, que codificam para as subunidades α e β, operacionalmente ligadas a uma sequência promotora e capazes de expressar a hormona glicoproteica modificada, são cultivadas e a hormona glicoproteica modificada, referida como o análogo, de acordo com a presente invenção, é expressa. 0 análogo da hormona glicoproteica expresso é, em seguida, recuperado e purificado de acordo com técnicas bem conhecidas do estado da técnica relativo à purificação de hormonas glicoproteicas.

Ao nível genético, os análogos de hormonas glicoproteicas de acordo com a presente invenção são gerados por qualquer mutagénese dirigida apropriada, bem conhecida do estado da técnica, tal como descrito por Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience (Nova Iorque, 1987-1997), Capítulo 8 sobre mutagénese de DNA clonado. Esta publicação Current Protocols in Molecular Biology, incorporada na presente por referência, constitui um exemplo de um texto de referência padrão, que descreve os princípios gerais da tecnologia de DNA recombinante.

As sequências nucleotídicas que codificam para as subunidades α e β do análogo das hormonas glicoproteicas, 75 tal como contidas numa molécula de DNA recombinante, podem ser inseridas em vectores de expressão apropriados, capazes de expressar os análogos nas células hospedeiras. Para ser capaz de expressar o análogo da hormona glicoproteica, um vector de expressão deve possuir sequências nucleotidicas especificas compreendendo informação reguladora da transcrição e da tradução ligada ao DNA que codifica para as subunidades, de tal forma a permitir a expressão genética e a produção do análogo da hormona glicoproteica. Primeiro, para que o gene seja transcrito, tem de ser precedido por um promotor capaz de ser reconhecido pela RNA polimerase, ao qual a polimerase se liga, iniciando, assim, o processo de transcrição. 0 DNA é dito "capaz de expressar" um polipéptido se contiver sequências nucleotidicas que compreendam informação reguladora da transcrição e da tradução, e se tais sequências estiverem "ligadas de forma operacional" às sequências nucleotidicas que codificam para o polipéptido. Uma ligação operacional corresponde a um ligação na qual as sequências de DNA reguladoras e a sequência de DNA que se pretende que seja expressa, estiverem ligadas de modo a permitir a expressão genética. As regiões reguladoras necessárias para a expressão genética incluem, em geral, uma região promotora, assim como as sequências de DNA que, quando transcritas para RNA, irão sinalizar o inicio da síntese proteica. Tais regiões irão, normalmente, incluir aquelas sequências não codificantes 5', envolvidas na iniciação da transcrição e da tradução. Existe uma variedade de promotores usualmente utilizados para a expressão proteica a um nível elevado em sistemas celulares de mamíferos e insectos. 76

As moléculas de DNA recombinante, contendo as sequências nucleotidicas que codificam para as subunidades α e β dos análogos da invenção, e os sinais reguladores da transcrição e da tradução operacionalmente ligados, podem ser inseridas num vector ou vectores que expressam transientemente as subunidades nas células hospedeiras ou é possível integrar as sequências genéticas pretendidas nos cromossomas da célula hospedeira. Para que as células que integraram de forma estável o DNA introduzido nos seus cromossomas possam ser seleccionadas são utilizados um ou mais marcadores, que permitem a selecção das células hospedeiras que contêm o vector de expressão. 0 marcador pode conferir prototropia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a um biocida, por exemplo, resistência a antibióticos, ou a metais pesados, como o cobre, ou semelhantes. 0 gene marcador seleccionável pode ser directamente ligado às sequências genéticas de DNA a serem expressas, ou introduzido na mesma célula por co-transfecção. Podem ser necessários elementos adicionais para uma síntese óptima de mRNA. Estes elementos podem incluir sinais de controlo do processamento de RNA, bem como promotores da transcrição, "enhancers", e sinais de terminação. Vectores de expressão de cDNA que incorporam tais elementos englobam aqueles descritos por Okayama (1983) .

Os vectores de expressão capazes de expressar de forma transiente um nível elevado da proteína pretendida, quando transfectados para células hospedeiras eucariótas, são bem conhecidos no estado da técnica e estão, em geral, disponíveis ao público ou disponíveis comercialmente de fornecedores da área da biologia molecular (por exemplo, o plasmídeo pcDM8 é disponibilizado pela Invitrogen, San 77

Diego, CA; o pSVL é disponibilizado pela Pharmacia, Piscataway, NJ; o pCI é disponibilizado pela Promega, Madison, WI; etc.)· Uma vez preparado o vector ou a sequência de DNA contendo a(s) estrutura (s) para expressão, o vector de expressão pode ser introduzido numa célula hospedeira apropriada por uma variedade de meios adequados, tais como transformação, transfecção, lipofecção, conjugação, fusão de protoplásto, electroporação, precipitação de fosfato de cálcio, microinjecção directa, etc. Células hospedeiras eucariótas podem ser células de mamífero, por exemplo, células humanas, de macaco (células COS) , de rato e células de ovário de hamster chinês (CHO) , uma vez que as mesmas conferem modificações pós-tradução às moléculas proteicas, incluindo o enrolamento correcto, a formação correcta de ligações dissulfito, bem como a glicosilação em locais correctos. No entanto, as células de insectos, por exemplo, de baculovírus, podem sobre-produzir polipéptidos e, também, levar a cabo modificações peptídicas pós-tradução, incluindo a glicosilação. A expressão proteica ectópica em COS, CHO e células de insectos é bem conhecida no estado da técnica e podem ser utilizados de forma apropriada protocolos, tais como aqueles descritos em Ausubel et al, (1987-1997), secções 16.9-16.14, sobre a expressão de proteínas em células de insectos, utilizando vectores de baculovírus e em células de mamíferos. As células hospedeiras transformadas que expressam as subunidades α e β de um análogo de hormona glicoproteica podem ser cultivadas para produzir o análogo. 78

As células hospedeiras transformadas que expressão as subunidades α e β de um análogo de hormona glicoproteica podem ser cultivadas para produzir o análogo de hormona glicoproteica, o qual é, subsequentemente, recuperado e purificado de acordo com técnicas de purificação para hormonas glicoproteicas comuns e bem conhecidas. A quantidade de hormona glicoproteica produzida pode ser quantificada por um método, tal como o método do ensaio imunológico em "sandwich", descrito no exemplo 1. Para além disso, ensaios para determinar a afinidade do receptor e a actividade biológica dos análogos de hormonas glicoproteicas da presente invenção, tais como os ensaios de radioligando e de transdução de sinal (medindo a capacidade de ligação ao receptor para despoletar uma resposta de acumulação de AMP cíclico) descritos no exemplo 1, podem ser facilmente realizados sem experimentação excessiva.

Os análogos de hormonas glicoproteicas de acordo com a presente invenção possuem várias utilizações terapêuticas. Análogos de hFSH destinam-se a ser utilizados para induzir o desenvolvimento foliculos ováricos na preparação para a indução da ovulação em fêmeas. Análogos de hLH e hCG destinam-se a ser utilizados para a indução da ovulação de foliculos que tenham iniciado o desenvolvimento. Estes análogos são também para ser utilizados a indução da função testicular em machos. Além disso, os análogos de hormonas glicoproteicas de acordo com a presente invenção podem, igualmente, ser utilizados como imunogénios para produzir anti-soros para limitar a fertilidade, por exemplo, vacina contraceptiva. Contrariamente, análogos antagonistas ou anticorpos para os análogos das hormonas glicoproteicas podem, também, ser utilizados para promover a fertilidade, 79 por exemplo, quando níveis excessivos de hLH aparecem em mulheres com a doença ovárica policistica.

Um análogo de hormona glicoproteica com estabilidade melhorada, que retém, igualmente, a actividade biológica e função, afinidade para receptores da hormona glicoproteica e potência hormonal, tal como é o caso dos análogos de acordo com a presente invenção, é bastante útil. Os análogos de análogos de acordo com a presente invenção não são apenas úteis para propósitos terapêuticos específicos, mas, estes análogos, também apresentam propriedades superiores de estabilidade funcional em solução e a temperaturas elevadas, resistência à desnaturação por agentes desnaturantes de proteínas, tais como ureia, etc. Devido a estas propriedades de estabilidade, espera-se que os análogos da presente invenção tenham um tempo de semi-vida melhorado in vivo.

Os análogos de hormonas glicoproteicas de acordo com a presente invenção podem ser administrados a um paciente a necessitar dos mesmos, por qualquer meio que atinja o objectivo pretendido. Por exemplo, a administração pode ocorrer por uma multiplicidade de vias parentéricas diferentes incluindo, mas não limitadas a, vias subcutânea, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, oral, transdérmica ou bocal. A administração parentérica pode ser por injecção do bolus ou por perfusão gradual ao longo do tempo.

Um regime típico para prevenir, suprimir ou tratar uma condição associada com depósitos amilóides ou semelhantes a amilóides, compreende a administração de uma quantidade 80 eficaz, em uma ou mais doses, durante um período de tempo até e incluindo vários meses ou vários anos.

Entende-se que a dosagem administrada dependerá da idade, sexo, estado de saúde e peso do receptor, do tipo de tratamento actual, se algum, da frequência do tratamento e da natureza do efeito pretendido. A dose total necessária para cada tratamento pode ser administrada por meio de doses múltiplas ou por meio de uma única dose. Por "quantidade eficaz" entende-se uma concentração do análogo da hormona glicoproteica que é capaz de alcançar o objectivo desejado. Tais concentrações podem ser determinadas de forma rotineira por aqueles peritos na matéria.

As preparações para administração parentérica incluem soluções aquosas ou não-aquosas estéreis, suspensões e emulsões, que podem conter agentes auxiliares ou excipientes que são conhecidos do estado da técnica.

Composições farmacêuticas compreendendo os análogos de hormona glicoproteica da presente invenção incluem todas as composições em que os análogos estão contidos numa quantidade eficaz para alcançar o objectivo pretendido. Para além disso, as composições farmacêuticas podem conter agentes veiculares farmaceuticamente aceitáveis, compreendendo excipientes e agentes auxiliares que facilitam o processamento dos compostos activos nas preparações, que podem ser utilizadas em termos farmacêuticos. Agentes veiculares farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos no estado da técnica e encontram-se, por exemplo, descritos em Alfonso Gennaro, Ed., Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a edição, Mack 81

Publishing Co. (easton, PA, 1990), um texto de referência padrão nesta área.

Agentes veiculares farmaceuticamente aceitáveis podem ser seleccionados de forma rotineiro de acordo com o modo de administração e a solubilidade e estabilidade dos análogos de hormonas glicoproteicas. Por exemplo, formulações para administração intravenosa podem incluir soluções aquosas estéreis, que podem igualmente conter agentes tamponantes, diluentes e outros aditivos apropriados.

Formulações adequadas para a administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos na forma hidrossolúvel, por exemplo, sais hidrossolúveis. Adicionalmente, pode ser administrada uma suspensão do composto activo como suspensões para injecções oleosas. Solventes lipófilos ou agente veiculares apropriados incluem óleos gordos, por exemplo, óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, por exemplo, oletato de etilo ou triglicéridos. Suspensões para injecção aquosa, que podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluem, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode também conter agentes estabilizadores.

Tendo agora descrito de forma geral a invenção, a mesma será mais facilmente compreendida por meio da referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos como meio de ilustração, não pretendendo ser limitantes da presente invenção. EXEMPLO 1: hCG estabilizada por uma ligação dissulfito intersubunidades entre grupos de cisteina: hCG(α31-β-37) 82

De acordo com os critérios para a reticulação intersubunidades, por ligações dissulfito, os dados na Tabela 1B sugerem gue seria possível preparar um análogo de hCG estabilizado por uma ligação dissulfito intersubunidades entre os seus grupos de cisteína, se fosse formada uma cisteína livre no resíduo 31 da subunidade α e se a Tyr37 da subunidade β fosse substituída por uma cisteína. Isto foi conseguido por meio da preparação de um análogo da subunidade β, em que a Tyr37 foi substituída por uma cisteína e um análogo da subunidade a, em que a Cys7 foi substituída por Ser. Esta última modificação rompeu a ligação dissulfito normalmente encontrada na subunidade α entre os aminoácidos Cys7 e Cys31, deixando a cisteína da subunidade α livre no resíduo 31 disponível para formar uma ligação dissulfito com a cisteína da subunidade β, introduzida no resíduo 37. Quando cada uma destas estruturas de subunidades foi expressa em células de mamífero cultivadas, as cisteínas da subunidade α no resíduo 31 e da subunidade β no resíduo 37 formaram uma ligação dissulfito intersubunidades. A formação da ligação dissulfito aumentou significativamente a estabilidade do heterodímero. Ao contrário da hCG, o heterodímero reticulado não se dissociou na presença de ureia ou pH baixo. No entanto, a capacidade da hCG (a31-/?37) para ser reconhecida pela maior parte dos anticorpos, para se ligar a receptores LH e para desencadear um sinal de transdução foi semelhante à da hCG. Isto demonstrou que a presença da ligação dissulfito não prejudicou a função hormonal. 83 A alteração do codão para Cys7 para um codão para serina na subunidade α foi realizada num vector de expressão (pKBM-hCGa) , que foi descrito em Campbell et al (1991) e que contém o cDNA da subunidade α de hCG. 0 vector pKBM é um derivado dos vectores pUC (Yanisch-Perron et al, 1985) , no qual o "polylinker" foi substituído por um contendo um local Xhol e que permitiu a transferência de insertos de cDNA entre pKBM e o vector de expressão pSVL (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Uma vez que existe apenas um gene para a subunidade α, o cDNA para a subunidade α da hCG, hLH, hFSH e hTSH contém os mesmos codões, sendo este vector daqui em diante referido como pKBM-α. Tal como apresentado na Figura 40, o pKBM-α contém um único local de restrição 5' de endonuclease Xhol da sequência que codifica para a subunidade α e um único local de restrição por endonuclease próximo dos codões para os aminoácidos 9-11. Os "primers" para a reacção em cadeia da polimerase (PCR) (Oligo425 e Oligo847, Tabela 5) foram desenhados para associar esta região, alterar o codão para Cys7 para Ser e criar um novo local de restrição de endonuclease (BspEI), que poderia ser utilizado para facilitar a identificação de estruturas mutantes. 84

Tabela 5

Sequências dos "primers" utilizados para preparar os análogos reticulados por ligações dissulfito 5 ’ -AGCTGTCCTGGAGCTAGGAATCT- 3 ‘ Oligo354 a'-CTAGCCTAGAAGCTCTGACTGTC-3' 31-AGCTGTCCTGGASCTAGGAATCTCTGTACGGAAGTCTTaCTXCTQCTCT-S‘ 01jgo3S3 5 1 - CTAGCCTAGAAGCTCTGACTGTCCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACIC&TC- 3 ’ Oiigo42 5 S'-A&CCXSCCCTGAACACRTCCYGCAAAAAGCCCAGA-3' 01is0435 S ' -GTGGCTCTCASCTGTCAATGCSCGCTCTGCCGCAGATCTACCACYGACTGCGGGGTCCCTA-AGGACCAC-3' OIigo-135 3 -CCACACGGATCCGAGCTCTTAC5CGGGG3TCATCACAGGTCAÍutíGGaTGGTCCTTASGGACC-^.CGCAGYCAGT··3' Oligo503 5'"ACTGTCCGGGGCTCGGGTCCCTTGACCTGTGATGACCCCGGCTTC-S' CligoSiG 5 ' - GGGACCCAAGCCGCGGACAGT&CAGTCAGTACTGTCGCTGTeGCAGAG-· V.' Cligo5S2 5'-CCCAAGACCGCGGACAGTGCAGTCAGTGGTAGATC"rGCG~3' 5'-TGCACTGTCCGCGGTCTTGGCCCílAGCTATTGCAGGTTCGGCGAATTCCRGGACTCCirjTT-CCrCAAAGGCC-3' 01 i<;o7 JG 5 -GATCCTTAAGATTri'GTGATAÍVÍAACAAGTACTOCA-3 ' Oligo753 S ' - GGTTCTfíGTACCGATGACGATGACAACTCTAAAGAACCGCTGCGGCCGCGTTGCCGCÇXCA·· TCAATGCCACCCTG GCTOTG 3 * 0.1 igo76G 5’-CCCACCGG.AICCTXAAGATTTGTGAT&ATAACAAGTACTGCA-3' Oi igo839 3* TGCTTCTCTAGAGCATATCCAACTCCATTGAGATCTAAGAAGACTATGTTGGTCCAAA&GCV AAGTCACTAGTGAGTCCACTTGC-3 * Oligo845 5 * -CCGGCTGTTGTCCTACCATGACACGTGTGCTGCA-3' Cligo847 51-CYGTAGCGTGCATTCCGGACrATCCTGCACATCAGGAGC-3' OligoSSO 5f-CCATTGAGATCYA&GAAGACTATGTTGGTCCAAAAGGACGTCACTAGTGAGTCCACTTGC3 OligoSSX 5f ~ACAAGTACTGCAGTGftCAAGCAGTGTGTTGCTCCACTTTGAAACC-3 > OiigoS74 5'-GCACACGTGTCATGmAOGACAACAG* 3 * QÍigoS?7 5'-ÇATCTGCTAGCTAAGCA-3' OXigo878 S'-CTAGTGCTTAGCTAÇCA-3' Oiigo921 5'-GATCTAAGAAGACTATGCTTGTACAATGTAACGTTA-3' Gligo922 5'- cr AGTAACGTTACA3TGTACAAGCATAGTCTTCTTA-3' Oligo923 5 < -GGACTGTACAACAAGTAGTA-3' Oligo924 5’ -GATCTACTACTrGTYGTACAGTCCGC ~ 3< oiígosas 5‘-TGCCGCAGATCTACTACTYGCTGCGGGGGTCCCAAGGACCAC-3' OligoiiXi 5 - CCATTOAGATCTAAf.AAGACTATGTTGSTCCAAAAGAACGTCACTAGYGAOi OC 3 · Oligoll32 li -ACAAGTACTGCAflT^iAGACGCOGTÍÍ-GGTrCTCACATTCAAAACC''XCAl“ACTSr-3 ' Oligc.1133 5 -CCGGCnv-TGT-.VTA··.".VrGACGCGi -GTGYGCA·- 3 ' j Oligoll34 5 1 -GACAA-r--X«TC.V;7v;tA JSACAATAfi-3' I Oligoli34 5 ' -CTGTGCTATAAG·- 3 1 OligolXSS 3’-GTCCTTATAGCACAGATCC-3' OligolXCi 3 ’ * CTTAATACGAC'”· A' "V., AGGCTAG07TC 3.· v : - 3 : | 01igoliS3 5’- CGU’CCCGCGGCACCTAGGACAAAGCGSCTCCTTGGATGCCCATGT~3: 85 0 produto de PCR, utilizando estes "primers" e pSVL-hCGa (Campbell et al, 1991) como molde, foi digerido com Xhol e Bsml e subclonado em locais únicos Xhol-Bsml de pKBM-a, utilizando procedimentos que são bem conhecidos no estado da técnica (Maniatis et al, 1989). A sequência de um plasmideo recombinante contendo um local de restrição de endonuclease BspEI foi determinada por meio de métodos didesoxi (Maniatis et al, 1989) na região que foi modificada por mutagénese baseada em PCR. Este vector (pKBM-aC7S) codificava para uma proteína com uma sequência de aminoácidos apresentada na Figura 3. 0 cDNA da subunidade α modificado foi removido do vector pKBM por meio de digestão com Xhol e BamHI e subclonado nos locais Xhol-BamHI de pSVL, para formar pSVL-aC7S, um procedimento que permitiu que aC7S fosse expressa em células COS-7. As sequências codificantes foram igualmente inseridas nos locais Xhol-BamHI de outro vector de expressão (pCI), obtido da Promega (Madison, WI), que foi modificado para facilitar a subclonagem do mesmo e de estruturas relacionadas. As modificações de pCI envolvem a remoção do seu local BamHI e a substituição do ser "polylinker" (isto é, locais de restrição Nhel-Notl) por um novo "polylinker" com os seguintes locais de restrição de endonuclease: Nhel-XhoI-EcoRI-MluI-Kpnl-Xbal-SalI-BamHI. Isto permitiu a subclonagem de estruturas baseadas nos vectores pKBM e pSVL em vectores baseados em pCI, por remoção dos fragmentos Xhol-BamHI contendo a região codificante pretendida de ambos os pKBM ou pSVL, e a ligação dos mesmos a pCI, que foi digerido com Xhol e BamHI. Referência adicional a vectores baseados em pCI pretende, na presente, dizer respeito ao vector pCI modificado descrito imediatamente 86 acima. A transferência da região que codifica para a subunidade a de pSVL para pCI, formou pCI-α e pCI-aC7S, respectivamente, e foi efectuada para facilitar a expressão em células cultivadas. Não é necessário utilizar a substituição de serina para cisteina para preparar um análogo da subunidade α que não possua a capacidade de formar uma ligação dissulfito entre Cys7 e Cys31. Foi utilizada alanina para romper esta ligação (Furuhashi et al, 1994), e seria de esperar que a substituição de Cys7 por outro aminoácido qualquer também destruísse a ligação dissulfito Cys7-Cys31.

Modificações da sequência que codifica para a subunidade β de hCG para substituir o codão para Tyr37 por aquele para Cys, foram realizadas por meio de mutagénese em cassete no cDNA da subunidade β de hCG, que foi incorporado num vector baseado em pUC, designado pKBM-hCG/?' (Campbell et al, 1991). Esta estrutura contém locais de restrição NgoMI e PstI únicos, nos codões para os aminoácidos 35-36 e 45-46. 0 codão mutante foi introduzido por substituição do pequeno pedaço de DNA entre os locais NgoMI e PstI pela cassete gerada por hibridização de 01igo845 e 01igo874 (Tabela 5) . Isto também introduziu um local de restrição de endonuclease Pmll, que poderia ser utilizado para facilitar a identificação de plasmídeos que continham a mutação. A subclonagem desta cassete em pKBM-hCG/?' (Campbell et al, 1991) foi realizada por meio de métodos padrão, bem conhecidos no estado da técnica (Maniatis et al, 1989) e a sequência pretendida da região mutada foi confirmada pelos métodos de sequenciação didesoxi. Uma vez que pKBM não é um 87 vector de expressão, este foi subclonado em pSVL para permitir que esta estrutura da subunidade β fosse expressa em células de mamíferos. Isto foi realizado tomando o pequeno pedaço obtido por digestão de pKBM-hCG/?' com Xhol e BamHI e ligando-o com o fragmento grande que resta após a digestão de pSVL com Xhol e BamHI, para gerar um vector de expressão denominado pSVL-hCG/?'Y37C. As sequências de aminoácidos codificadas por pSVL-hCG/?' e pSVL-hCG/?'Y37C encontram-se apresentadas da Figura 4. Estas são igualmente subclonadas no vector pCI modificado nos locais Xhol e BamHI. A preparação destas sequências codificantes poderia também ser conseguida por meio de procedimentos de síntese de DNA tradicionais, utilizando instrumentos comercialmente disponíveis. Estes procedimentos podem ser utilizados para produzir oligonucleótidos compridos, que podem ser ligados entre si como descrito (Campbell et al, 1992) . Deve notar-se que as sequências codificantes de DNA poderiam também ser compradas de qualquer uma das muitas empresas que se especializaram na construção de oligonucleótidos sintéticos e na preparação de genes de cDNA sintéticos. Estas incluem a Misland Certified Reagent Company, Midland, Texas, e a Genosys Biotechnologies, Inc., The Woodlands, Texas. A expressão destas subunidades pode igualmente ser realizada em células de mamíferos em cultura (isto é, células COS-7), utilizando qualquer um dos vários vectores comercialmente disponíveis, tal como pSVL (Pharmacia, Piscataway, NJ) ou pCI (Promega, Madison, WI), usando métodos similares àqueles que foram descritos (Campbell et al, 1991) e que são comuns no estado da técnica. 88 A co-expressão de pSVL-α e pSVL-hCG/?', pSVL-aC7S e pSVL-hCG/?'Y37C, pCI-a e pCI-hCG/?', e pCI-aC7S e pCI-hCGj#'Y37C em células COS-7 foi realizada por meio de métodos de rotina, que são bem conhecidos no estado da técnica e que foram descritos (Campbell et al, 1991). A transfecção para células COS-7 foi levada a cabo por meio de um método de precipitação de fosfato de cálcio usual, como descrito (Kriegler, 1990) . As células COS-7 foram obtidas a partir de ATCC, Rockville, MD. No dia a seguir à transfecção, o meio da cultura celular foi removido e substituído por meio DMEM isento de soro. As células foram incubadas durante mais três dias, para permitir que os produtos secretados se acumulassem no meio de cultura. Os meios foram, então, centrifugados para remover o lixo celular e outros precipitados, o sobrenadante foi transferido para um saco de diálise, e os componentes de elevada massa molecular foram concentrados por colocação do saco sobre uma cama de pó higroscópico (Aquacide, Calbichem, La Jolla, CA). A hCG e a hCG reticulada que foram secretadas para o meio de cultura foram quantificadas utilizando um ensaio imunológico em "sandwich" (Moyle et al, 1982), utilizando os anticorpos A113 e 125I-B105 para captura e detecção, respectivamente, e hCG que foi purificada a partir de urina, como um padrão. Neste ensaio, o anticorpo A113 anti-subunidade α de hCG (1 pg em 0,05 ml) foi adsorvido à superfície de uma placa de microtitulação, durante uma hora a 37 °C. O anticorpo não adsorvido foi removido e cada poço foi incubado com uma solução que continha NaCl 0,9% e 1 mg de albumina de soro bovino/ml, para bloquear os locais de adsorção de proteína remanescentes. Uma alíquota (0,05 ml) do meio de cultura das células transfectadas durante três 89 dias foi adicionada aos poços e permitiu-se que a hCG e o análogo de hCG reticulado se ligassem ao anticorpo adsorvido, durante uma hora a 37 °C. A hormona ou análogo hormonal não ligado foi removida, os poços lavados com solução de NaCl 0,9%, e as substâncias a analisar foram deixadas reagir com o anticorpo 125I-B105 anti-subunidade β de hCG, que foi preparado como descrito abaixo. O 125I-B105 que não se ligou à hCG ou ao análogo de hCG reticulado foi aspirado e o marcador radioactivo ligado à superfície dos poços das placas de microtitulação foi determinado utilizando um contador γ. Este ensaio detectou facilmente 0,1 ng de hCG. Não é necessário utilizar estes anticorpos específicos para este ensaio, existindo vários anticorpos comercialmente disponíveis que podem ser igualmente usados. A maior parte dos anticorpos anti-subunidade α de hCG e qualquer anticorpo anti-subunidade β de hCG que apresenta uma afinidade para a hCG e para a subunidade β de hCG superior a 108M'1 será suficiente. Este último inclui ZMCG13 e ZMCG7 disponível de Pierce, 3747 North Meridian Road, Rockford, IL. A radioiodinação de anticorpos, hCG e hFSH foi realizada com Iodo-Gen obtido da Pierce Chemical Co, Rockford, IL. Neste procedimento, 1,5 microgramas de Iodo-Gen em 50 microlitros de acetona foram adicionados a um pequeno tubo de vidro, capaz de conter aproximadamente 0,75 ml de fluido e permitiu-se que a acetona evaporasse. Isto deixou o resíduo de Iodo-Gen a revestir o fundo do tubo. Subsequentemente, foram adicionados 10 microgramas de B105, o tubo selado com uma tampa de plástico, sendo adicionados 5 microlitros contendo 250-500 μCi de Na125I em tampão 90 fosfato de sódio 0,2 M (pH 7,2), por injecção da solução com uma micro-seringa através da tampa. Após vinte-trinta segundos, foram adicionados 0,1 ml de solução de NaCl 0,9% em tampão fosfato de sódio 0,02M (pH 7,2) e a mistura aspirada e carregada numa coluna de 2 ml de BioGel P6DG (BioRad, Richmond, CA) . O iodo livre e a proteína iodada foram separados por filtração em gel. A quantidade de Na125I utilizada para a iodinação variou dependendo da capacidade da proteína para reter a sua função após a radioiodinação. Os anticorpos e a hCG foram usualmente radioiodados para uma actividade específica de 50μΟί/μρ, enquanto que a hFSH foi usualmente radioiodada para uma actividade específica de 10-25 μCi/μg. A Tabela 6 ilustra que a mutação não destrói a formação do análogo de hCG reticulado. As células que foram transfectadas, quer com sequências codificantes contendo pSVL, quer com sequências codificantes para pCI produziram quantidades comparáveis de análogo reticulado e hCG.

Tabela 6

Produção de hCG e hCG (a31-/?37) por células COS-7 transfectadas hCG ou Análogo Concentração hCG (pSVL) 5,07 ng/0,05 ml hCG (pCL) 4,98 ng/0,05 ml hCG (α31-β37) (pSVL) 0,94 ng/0,05 ml hCG (α31-β37) (pCL) 10,66 ng/0,05 ml A hCG e o hCG(a31-p37) foram medidos em ensaios imunológicos em "sandwich" relativamente a um padrão de hCG, utilizando anticorpos para a subunidade α (A113) para 91 a captura e anticorpos radioiodados para a subunidade β (B105) para a detecção.

Os anticorpos A113 e B105 foram utilizados no ensaio imunológico em "sandwich" para determinar a produção de análogo de hCG reticulado, uma vez que os mesmos reconheceram regiões da hormona que se esperava estarem distantes do local da mutação (Cosowsky et al, 1995; Moyle et al, 1995) . 0 análogo hCG(a31-p37) não se ligou como a hCG ao A407 (Figura 5) , um anticorpo que reconhece um epitopo que foi mostrado incluir parte do N-terminal da subunidade α, o local da mutação C7S (Moyle et al, 1995). 0 anticorpo A407 foi obtido do Dr. Robert E. Canfield, Universidade Columbia, Nova Iorque, NI.

Contudo, uma vez que ο A407 mostrou reconhecer complexos hCG-receptor (Moyle et al, 1995), não se esperava que esta pequena alteração na conformação da hormona interferisse com a actividade biológica dos análogos de hCG reticulados.

As actividades biológicas de hCG(a31~P37) e outros análogos reticulados foram monitorizadas em ensaios de receptor radioligando e de transdução de sinal. Estes empregaram células CHO que foram transfectadas com os genes que codificam para o cDNA do receptor de LH e que, por isso, expressão receptores de LH funcionais na sua superfície. As células CHO foram obtidas da ATCC, Rockville, MD. 0 cDNA do receptor de LH de ratazana foi obtido a partir de um banco ovárico de ratazana, utilizando a reacção em cadeia da polimerase, como foi descrito (Bernard et al, 1990) . Deve notar-se que estas células que expressão o receptor de LH foram utilizadas por conveniência e que o ensaio de receptor radioligando pode ser realizado com outros tecidos 92 que expressem receptores de LH. Estes incluem homogenatos de testículos de ratazana adulta ou homogenatos de ovários obtidos de ratazanas sexualmente imaturas, que foram injectadas com gonadotropina sérica de equídeas grávidas (ambos obtidos da Sigma, St. Louis, MO). Para produzir uma preparação ovárica, capaz de se ligar à hCG com elevada afinidade, fêmeas de ratazana com 21 dias foram injectas subcutaneamente com 50 u.i. de gonadotropina sérica de equídeas grávidas. Aproximadamente 65 horas mais tarde, foram injectadas subcutaneamente com 25 i.u. de hCG. Sete dias mais tarde foram sacrificadas, os seus ovários homogeneizados e alíquotas do homogenato, correspondendo a um vinteavos de um ovário, foram utilizadas para cada tubo de ensaio. As células que expressam receptores de LH de ratazana ligam hCG radioiodada, um marcador que pode ser preparado como descrito anteriormente ou adquirido da New England Nuclear, Boston, MA. Elas também ligam hCG não marcada, uma hormona que pode ser comprada à Sigma Co., St. Loius, MO. As células CHO que expressam o receptor LH também sintetizam AMP cíclico em resposta ao tratamento com hCG durante 10-30 minutos a 37 °C. O AMP cíclico que é produzido foi medido por ensaio radioimunológico (RIA), que é específico para o APM cíclico e que foi descrito (Brooker et al, 1979). A adição de uma ligação dissulfito intersubunidades entre resíduos nos grupos cisteína da subunidade α e β de hCG não destruiu a capacidade do heterodímero reticulado para se ligar a receptores de LH ou para desencadear uma resposta de acumulação de AMP cíclico.

Consequentemente, ambos hCG e hCG3(α31-β37) foram capazes de bloquear a ligação de 125I-hCG a células CHO que 93 expressão receptores de LH (Figura 6) . Ambos hCG e hCG(a31-p37) foram igualmente capazes de desencadear a acumulação de AMP cíclico nestas mesmas células (Figura 7). Isto mostrou que a presença desta ligação dissulfito intrasubunidade não prejudicou a actividade funcional global da hCG. A presença da ligação dissulfito intrasubunidade permitiu que a hCG(a31-p37) resistisse a tratamentos com ácido, ureia, e calor que destruíram a hCG. Isto pode ser observado pelos dados nas Figuras 8 e 9). A Figura 8 ilustra a influência da temperatura elevada na estabilidade do heterodímero monitorado no ensaio imunológico em "sandwich", utilizando A113 para a captura e 125I-B112 para a detecção. Note-se que ο B105 e ο B112 ligam-se a um epítopo sobreposto que envolve resíduos próximos da volta no terceiro laço da subunidade β (Moyle et ai, 1990; Cosowsky et ai, 1995), um local distante da mutação que na subunidade a, quer na subunidade β de hCG(a31~P37). Neste ensaio, a hCG e o hCG(a31~P37) foram submetidos a uma temperatura de intervalos de 85 °C, durante até 20 minutos. Enquanto que a actividade da hCG foi virtualmente destruída aos 7-8 minutos, pelo menos 75% da actividade do análogo reticulado manteve-se após 20 minutos de incubação (Figura 8). Uma vez que este imunoensaio em "sandwich" é específico para dímeros, a perda da actividade da hCG pareceu ser devida à dissociação das subunidades, um processo que é prevenido pela presença da ligação dissulfito intersubunidades. A incubação de gonadotropinas em concentrações elevadas de ureia é bem conhecida de promover a dissociação das 94 subunidades (Pierce et al, 1981) . Assim, quando a hCG foi incubada na presença de ureia 8M, ela dissociou-se nas suas subunidades, um fenómeno facilmente detectado por "Western blotting" (Figura 9). Células de mamíferos que foram transfectadas com genes que codificam para as subunidades α e β secretam, frequentemente, subunidade β livre, bem como o heterodímero αβ para o meio de cultura. Isto pode ser prontamente distinguido por imunoensaios em "sandwich" que utilizam um anticorpo específico para a subunidade α e um para a subunidade β. 0 heterodímero αβ e a subunidade β livre podem também ser distinguidos pelos seus tamanhos em "Western blots". Por conseguinte, é possível monitorizar as quantidades relativas de hCG e de subunidade β livre no meio de cultura, separando-os, utilizando uma electroforese em gel de poliacrilamida e, em seguida, detectá-los em "Western blots". Isto é facilitado por meio da utilização de um anticorpo monoclonal radioiodado, que liga hCG e a subunidade β livre de hCG, como apresentado na Figura 9. A análise do meio de cultura de células que expressam ambas as subunidades α e β da hCG, indicou a presença de heterodímero (banda superior) e de subunidade β livre (banda inferior). 0 tratamento do meio de cultura com ureia 8M provocou a dissociação do heterodímero nas suas subunidades. Consequentemente, a banda superior desapareceu. A ureia não promoveu a dissociação de hCG(α31-β37), 0 heterodímero reticulado por meio de uma ligação dissulfito nas suas subunidades e a banda correspondente ao heterodímero permaneceu intacta (Figura 9) . EXEMPLO 2: Um análogo de hormona glicoproteica multifuncional estabilizado por uma ligação dissulfito 95 intersubunidades localizada entre os grupos de cisteína e as suas subunidades α e β. É bem conhecido o facto de o cinto de segurança influenciar a actividade de ligação ao receptor da hCG (Campbell et al, 1991; Moyle et al, 1994; Han et al, 1996). A substituição dos residuos de aminoácidos 101-109 da subunidade β da hCG pelos seus homólogos da hFSH (isto é, os residuos 95-103 da subunidade β de hFSH) conduziu um aumento significativo da actividade de FSH do análogo sem prejudicar a sua actividade de LH (Moyle et al, 1994; Han et al, 1996). Na realidade, esta substituição também aumentou a actividade de TSH da hCG (Campbell et al, 1997) , mesmo não sendo introduzidos quaisquer residuos especificamente encontrados na hTSH. O estudo da influência das ligações dissulfito intersubunidades nas actividades de um análogo multifuncional relacionado, mostrou como ligações dissulfito específicas poderiam influenciar as actividades das lutropinas, folitropinas e tirotropinas. Este exemplo ilustra como é que uma ligação dissulfito intersubunidades entre os grupos de cisteína influencia a actividade de LH e FSH do análogo de hCG (CFC101-114) , no qual os resíduos 101-114 da subunidade β da hCG foram substituídos pelos seus homólogos de hFSH (isto é, os resíduos 95-108 da subunidade β de hFSH). A expressão de CFC101-114(α31-β37), exigiu que as células fossem transfectadas com vectores que codificavam para aC7S e para CFC/?' 101-114Y37C. A modificação da subunidade α foi descrita no Exemplo 1. As sequências de DNA do percursor da subunidade β de CFC101-114, utilizadas para produzir CFC101-114/?'Y37C, codificam os residuos 1-100 da 96 subunidade β de hCG, os resíduos 95-108 da subunidade β de hFSH e os resíduos 115-145 da subunidade β de hCG, ligados sequencialmente por essa ordem. Foi produzido por combinação das sequências codificantes de duas quimeras da subunidade β de hCG/hFSH, nos seus locais SstII comuns (Figuras 41-43). O fragmento de Xhol-SstII de pSVL-CFClOl-10 6/?', contendo codões para a sequência sinalizadora e os resíduos 1-103 de pSVL-CFC101-114/?', foi subclonado no fragmento de Xhol-BamHI de pSVL-CFC94-114/?'. Isto substituiu os codões para os resíduos 89-94 da subunidade β de hFSH, encontrados em pSVL-CFC101-114/?', pelos seus homólogos da subunidade β de hCG (isto é, os resíduos 94-100) e introduziu um local BglII. Cada um destes vectores codificantes foi derivado do cDNA da subunidade β da hCG, por modificação de codões na metade 3' da molécula como descrito a seguir. O pSVL-CFC94-114/?' foi preparado por meio de mutagénese por PCR do pSVL-CFC94-106/?', um vector que codifica para os resíduos 1-93 da subunidade β da hCG, os resíduos 88-100 da subunidade β da hFSH e os resíduos 107-145 da subunidade β da hCG, ligados sequencialmente por essa ordem. O primeiro passo na produção de pSVL-CFC94-114/?' foi a preparação de pSVL-CFC94-106/?' por mutagénese por PCR SOEing (Ho et al, 1989) . Uma reacção de PCR com Oligo508 e Oligo368 (Tabela 5) como "primers" e pSVL-hCG/?' (Campbell et al, 1991) como molde originou um produto contendo codões 101-145 da subunidade β de CFC94-106, o codão de terminação da subunidade β de hCG, a região 3' não traduzida, um local de restrição da endonuclease BamHI, e parte da sequência 3' do 97 local BamHI do vector pSVL. Uma segunda reacção de PCR com Oligo510 e 01igo365 (Tabela 5) como "primers" originou um produto contendo sequências 5' do local Xhol de pSVL, a região 5' não traduzida de pSVL-hCG/? (Campbell et ai, 1991), os 20 codões para a sequência sinalizadora da subunidade β de hCG e os codões 1-107 da subunidade β de CFC94-106. As porções destes produtos de PCR contendo os codões 101-107 da subunidade β de CFC94-106 eram complementares, um requisito para a extensão da sobreposição durante "PCR SOEing". Estes dois produtos de PCR foram misturados com Oligo363 e Oligo364 (Tabela 5) e amplificados numa terceira reacção de PCR, para originar um produto de PCR que codificava para toda a sequência da subunidade β de CFC94-106, que possuia locais de restrição Xhol e BamHI próximo dos seus terminais 5' e 3', respectivamente. Este produto de PCR, que também continha um local SstII nos codões para os residuos 102-104, foi clonado nos locais Xhol e bamHI de pSVL, para produzir pSVL-CFC94-10 6/?'. A sequência da região codificante foi confirmada por meio de métodos de sequenciação didesoxi. O passo final para a produção da subunidade β de pSVL-CFC94-114/?', envolveu um PCR utilizando os "primers" Oligo596 e Oligo368 (Tabela 5) e o molde pSVL-hCG/?', para produzir um produto que possuia locais SstII e BamHI próximo dos seus terminais 5' e 3', respectivamente. Quando digerido com estes enzimas, o mesmo originou um fragmento de DNA que continha codões para os residuos 97-108 da subunidade β de hFSH e codões 115-145 para a subunidade β de hCG, nessa ordem. Este foi sub-clonado nos locais únicos SstII-BamHI de pSVL-CFC94-106/?', para formar o pSVL-CFC94- 98 114β' e a porção da sequência que foi amplificada durante o PCR foi confirmada por meio de métodos de sequenciação didesoxi. A preparação do pSVL-CFClOl-106/?' teve inicio com um vector designado por pMB135, que codificava para um análogo da subunidade β da hCG truncado no resíduo 114 e que continha um codão para a valina no lugar do de para Glyl02. 0 pMB135 foi preparado por hidridização do Oligo435 e Oligo436 (Tabela 5) e enzimaticamente preenchido para formar uma cassete de cadeia dupla, que continha os locais PvuII e SstI. Este último era 3' do codão de terminação. Esta cassete codificava para os resíduos 87-101 da subunidade β, valina e os resíduos 103-114 da subunidade β da hCG, por essa ordem, e continha um local de restrição para a BglII nos codões 94-95. Foi sub-clonado nos locais PvuII-Sstl de pSVL-hCG/?' e a sua sequência entre os locais PvuII e SstI foi confirmada por meio de métodos de sequenciação didesoxi. O pMBl35 foi utilizado como um molde numa reacção de PCR com Oligo562 e 01igo365 (Tabela 5) , para formar um produto de PCR, que quando digerido com Xhol e SstII possuía a região de cDNA não traduzida da subunidade β da hCG e a sequência sinalizadora, os codões 1-100 da subunidade β da hCG, e os codões 95-98 da subunidade β de hFSH, nessa ordem. Este produto de PCR foi clonado nos locais Xhol-SstII de pSVL-CFC94-106/?' para formar o pSVL-CFC101-106/?', sendo a sua sequência determinada por meio de métodos de sequenciação didesoxi. Não foi claramente necessário ter esta abordagem para formar o pSVL-CFC101-114/?'. Estes passos foram utilizados 99 por razões históricas. Os vários vectores intermediários foram produzidos durante o decorrer de outros ensaios e estavam disponíveis para a preparação do vector que codifica para CFC101-114/?'. 0 plasmídeo pSVL-CFCl01-114/?'Y37C foi preparado por combinação da "metade" 5' do pSVL-hCG/?'Y37C, que codificava para a mutação Y37C, com a "metade" 3' de pSVL-CFClOl-114/?', que codificava para os aminoácidos 95-108 da subunidade β de hFSH. Isto foi conseguido por ligação da parte pequena de pSVL-hCG/?'Y37C, obtida por digestão com Xhol e Bsu36I, à parte grande, produzida por digestão do pSVL-CFC101-114/?' com os mesmos enzimas. Isto substituiu os codões para a sequência sinalizadora e os aminoácidos 1-54 de CFC101-114/?' pelos de hCG/?'Y37C, uma alteração que resultou na substituição da Tyr37 por cisteína. A sub-clonagem do fragmento Xhol-BamHI nos locais Xhol-BamHI da estrutura modificada de pCI, descrita anteriormente, conduziu a estrutura designada por pCI-CFClOl. 114/?'Y37C. As sequências de aminoácidos de CFC101-114/?' e de CFC'101-114/?'Y37C encontram-se descritas na Figura 10. A produção de CFC101-114 e de CFC101-114 (a31-/?37) foi conseguida por meio da co-expressão de pSVL-α mais pSVL-CFC101-114/?; pSVL-aC7S mais pSVL-CFC101-114/?Y37C; pCI-a mais pCI-CFClOl-114/?; e pCI-aC7S mais pCI-CFC101-114/?Y37C em células COS-7, utilizando os métodos descritos no Exemplo 1. O CFC101-114 (a31-/?37) no meio de cultura foi quantificado utilizando um imunoensaio em "sandwich" (Moyle et al, 1982), empregando os anticorpos A113, para a captura, e 125 I-BI 0 5 ou 125

I-B112 para a detecção, com hCG 100 que foi purificada a partir de urina, como um padrão. Tal como anteriormente, deve notar-se que não é necessário utilizar estes anticorpos em particular para este ensaio; espera-se que anticorpos disponíveis comercialmente funcionem de modo satisfatório. A maior parte dos anticorpos anti-subunidade α da hCG, que também possuem uma elevada afinidade para a hFSH, como ο A113 ou anticorpos α anti-hFSH, que possuem uma elevada afinidade para a hCG, podem ser utilizados neste ensaio. Contudo, uma vez que estes análogos contêm resíduos de hFSH na parte da região do cinto de segurança, que têm uma grande influência na actividade da FSH (isto é, os resíduos de aminoácidos entre a décima primeira e a décima segunda cisteínas da subunidade β (Moyle et al, 1994)), os análogos de CFC101-114 não são reconhecidos por todos os anticorpos anti-subunidade α da hCG. Isto pode ser observado para A407 (Figura 11), um anticorpo que liga a hCG, mas não a hFSH. Por conseguinte, enquanto que ο A407 liga hCG, o mesmo possui uma capacidade muito inferior para ligar CFC101-114 e análogos de CFC101-114 reticulados. Ο A407 também possui uma baixa capacidade para ligar CFC101-114 (a31-/737) .

Os análogos CFC101-114 podem ser detectados pela maior parte dos anticorpos anti-subunidade β de hCG, que possuem uma afinidade superior a 108M_1 para a hCG e para a subunidade β livre de hCG, excepto aqueles que reconhecem resíduos na subunidade β próximos da região ocupada pelos resíduos de FSH. Assim, o CFC101-114 e os análogos não foram reconhecidos pelo Blll, um anticorpo que se mostrou ser altamente influenciado pelos resíduos 108-114 de hCG (Cosowsky et al, 1995) . Todavia, a maior parte dos anticorpos que reconhecem a hCG, a hLH, a subunidade β 101 livre de hCG e a subunidade β livre de hLH, tais como o B105, podem ser utilizados neste ensaio. Para além disso, muitos anticorpos que reconhecem a hCG e a subunidade β livre de hCG, como ο B112, podem também ser utilizados neste ensaio. A região do epítopo B105/B112 corresponde a uma das regiões mais antigénicas da hCG em ratos, e os anticorpos para esta região encontram-se comercialmente disponíveis, como observado no Exemplo 1. A presença de uma reticulação por meio de uma ligação dissulfito em CFC101-114 (a31-/?37) aumentou a sua estabilidade térmica, relativamente à de CFC101-114 (Figura 12) . Ensaios imunológicos em "sandwich" mostraram que as actividades da hCG e de CFC101-114 eram quase destruídas por aquecimento a 85 °C, durante 7,5 minutos e 15 minutos, respectivamente. No entanto, uma quantidade substancial de CFC101-114 (a31-/?37) permaneceu após 20 minutos à mesma temperatura. Isto mostrou que a presença de uma ligação dissulfito aumentou a estabilidade deste análogo. Uma vez que este e outros análogos, que possuem resíduos de FSH entre o décimo primeiro e o décimo segundo resíduos da subunidade β, possuem ambas as actividades de FSH e TSH (Campbell et al, 1997), seria de esperar que esta ligação dissulfito também aumentasse da estabilidade da FSH e da TSH. O CFC101-114 consegue estimular a transdução de sinal em receptores de LH. A adição da ligação dissulfito intersubunidades a31-/?37, entre os grupos de cisteína de CFC101-114, não reduziu a sua actividade neste ensaio (Figura 13) . Consequentemente, ambos CFC101-114 e CFC101-114 (a31-/?37) possuíam aproximadamente a mesma capacidade 102 elevada para estimular a acumulação de AMP cíclico em ensaios com células CHO, que foram projectadas para expressar receptores de LH. Assim, a presença desta ligação dissulfito não parece influenciar a actividade de moléculas com actividade de lutropina. Seria de esperar que a capacidade desta ligação para estabilizar estas moléculas conferisse propriedades terapêuticas úteis às lutropinas.

Embora a sequência de aminoácidos de CFC101-114 seja muito mais próxima da de hCG do que de hFSH, o CFC101-114 (a31-β37) possui uma actividade de FSH muito maior do que a hCG, uma hormona conhecida por ser quase desprovida de actividade neste ensaio. A adição da ligação dissulfito intersubunidades a31-/73 7 entre os grupos de cisteína de CFC101-114, teve apenas uma pequena influência na sua capacidade para estimular a acumulação de AMP cíclico em células CHO que expressam receptores de FSH (Figura 14) . Por conseguinte, a presença desta ligação dissulfito não parece possuir um impacto negativo na actividade de moléculas com actividade de folitropina e seria de esperar que a capacidade desta ligação para estabilizar estas moléculas conferisse propriedades terapêuticas úteis às folitropinas. EXEMPLO 3: hCG estabilizada por meio de uma ligação dissulfito entre o cinto de segurança e o laço 2 da subunidade α

As distâncias entre os átomos de carbono Ca e C/7 dos resíduos nas subunidades α e β da hCG (Tabela 1B) sugerem que seria possível preparar muitos outros dímeros adicionais, nos quais as subunidades seriam unidas por uma 103 ou mais ligações dissulfito. A reticulação de hCG e CFC101-114 entre o resíduo 31 da subunidade α e o resíduo 37 da subunidade β aumentou significativamente a estabilidade dos análogos resultantes e teve uma influência mínima nas suas actividades biológicas. Para verificar se a introdução de uma reticulação por meio de uma ligação dissulfito numa parte da molécula previamente mostrada de influenciar a ligação ao receptor alteraria a sua estabilidade e actividade, foram introduzidas ligações dissulfito na hCG e em CFC101-114 entre o laço 2 da subunidade α e o cinto de segurança. Estes estudos mostraram que essa introdução de uma ligação dissulfito nesta região de hormonas glicoproteicas aumentava a sua estabilidade. No entanto, as substituições que foram necessárias para formar a ligação dissulfito influenciaram as suas capacidades para interagir com receptores e desencadear a transdução de sinal. Isto mostrou que a introdução de uma ligação dissulfito numa parte da hormona que não participa nas interacções com o receptor ou a na especificidade para o receptor, é preferível para manter uma actividade endócrina elevada. Uma vez que ambos os tipos de análogos reticulados por meio de ligações dissulfito retêm as suas actividades imunológicas, a posição da ligação dissulfito pode ser menos importante para projectar imunogénios. A influência desta ligação dissulfito na transdução de sinal pode ser útil para desenvolver antagonistas hormonais ou imunogénios.

Para preparar um análogo de hCG estabilizado por uma ligação dissulfito entre o laço 2 da subunidade α e o cinto de segurança, Lys51 do laço 2 da subunidade α e Asp99 do cinto de segurança da subunidade β foram 104 substituídos por cisteínas. A alteração na subunidade α envolveu uma mutagénese em cassete de vectores existentes, que não foram previamente descritos. Por conseguinte, a construção destes vectores intermediários será descrita na presente (Figura 44). O "polylinker" de pIBI31, um vector de clonagem adquirido da International Biotechnologies, Inc. (New Haven, CT) foi substituído por um "polylinker" contendo locais de restrição enzimática EcoRI-XhoI-NcoI-PacI-BamHI-EcoRl, para produzir um vector designado por pRM102. O pKBM-α foi digerido com Ncol e BamHI e clonado nos locais NcoI-BamHI de pRM102, para produzir o pRM116, eliminando, assim, a sua sequência líder 5' não traduzida e um local Xbal 5' não desejado, que havia sido introduzido durante a clonagem de pKBM-α. Por conseguinte, o único local Xbal no pRM116 correspondia aos codões para os aminoácidos 34-35 da subunidade α. O fragmento Xbal-BamHI de pRM1116 foi substituído pelo fragmento Xbal-BamHI de um vector que foi produzido por PCR do cDNA da subunidade a, com Oligo758 e Oligo760 (Tabela 5), para produzir o pRM117. Isto permitiu eliminar a região 3' não traduzida encontrada no cDNA da subunidade a, um processo que também eliminou os locais de restrição PstI indesejados nesta região. O único local PstI remanescente no pRM17 estava localizado nos codões para os resíduos 83-85. A clonagem do produto obtido por PCR do cDNA da subunidade α com Oligo730 e Oligo839 (Tabela 5) nos únicos locais Xbal-PstI de pRM117, produziu o pMB507. Isto conduziu à introdução dos locais BglII e Spel na sequência que codifica para a subunidade α nos codões 42-43 e 54-55, respectivamente. A sub-clonagem do fragmento Xhol-BamHI de pMB507 nos locais Xhol-BamHI de pSVL, levou à 105 produção de pMB512. O fragmento de pMB512 entre os locais Bgll e Spel foi substituído pelos Oligo877 e Oligo878 (Tabela 5) para produzir pMB561. Finalmente, o fragmento BglII-Spel de pMB512 foi substituído por uma cassete produzida pela hibridização de Oligo921 e 01igo922 (Tabela 5) , para produzir pSVL-aK51C (Figura 15) . Esta estratégia não seria necessária para produzir pSVL-aK51C e foi utilizada apenas por razões históricas, devido à disponibilidade de vários intermediários de vectores que foram produzidos durante outros ensaios. O análogo da subunidade β hCG/?'D99C foi preparado por mutagénese por PCR, utilizando o pSVL-hCG/?' como molde e os Oligo368 e Oligo925 (Tabela 5) como "primers". O Oligo368 é um "primer" reverso, complementar a um local em pSVL 3' do local de restrição da endonuclease BamHI. O Oligo925 contém a mutação pretendida e também produz o local BglII. O produto de PCR foi digerido com BglII e BamHI e sub-clonado nos locais BglII-BamHI de pSVL-CFC101-114/?'. Isto permitiu a remoção dos codões de hFSH de pSVL-CFC101-114/?' e alterou a Asp99 para cisteína (Figura 15).

Os plasmídeos pSVL-aK51C e pSVL-hCG/?/'D99C foram co-expressos em células COS-7, como descrito no Exemplo 1. A hCG e o hCG (a51-/?99) foram medidos em ensaios imunológicos em "sandwich" relativamente a uma hCG padrão, utilizando anticorpos para a subunidade α (A113) para a captura e anticorpos radioiodados para a subunidade β (B105) para a detecção. Não é necessário utilizar estes anticorpos em particular para este ensaio. Quase todos os anticorpos que reconhecem subunidade α da hCG no heterodímero e qualquer 106 anticorpo para a subunidade β que reconhece a hCG e a sua subunidade β livre, com afinidades superiores a 108M_1 podem ser utilizados neste ensaio. Esta produção de hCG e hCG (a51-/?99) por células COS-7 transfectadas conduziu à acumulação de um análogo proteico reticulado no meio de cultura celular, facilmente detectado pelo imunoensaio em "sandwich" com A113/125IB105 ou A113/125IB112 (Tabela 7), mostrando que as mutações necessárias para introduzir a ligação dissulfito não impediram a combinação das subunidades.

Tabela 7

Produção da hCG e hCG (a51-/?99) por transfecção de células COS-7 hCG ou análogo Concentração hCG (pSVL) 19,50 ng/0,05 ml hCG (a51-/?99) 4,85 ng/0,05 ml A actividade biológica da hCG (a51-/?99) foi medida em ensaios de ligação ao receptor de LH e de transdução de sinal, utilizando os métodos detalhados no Exemplo 1. A hCG (a51-/?99) foi capaz de inibir a ligação de 125I-hCG a células CHO que expressam receptores de LH, se bem que com apenas 5-10% da potência da hCG (Figura 16) . A redução da afinidade para os receptores de LH, provocada pela ligação dissulfito pode ter sido decida a 1) a substituição do resíduo Lys51 da subunidade α por cisteína (isto é, a substituição de uma aminoácido carregado por um aminoácido neutro), 2) a substituição do resíduo Asp99 da subunidade β por cisteína (isto é, a substituição de um aminoácido carregado negativamente por um aminoácido neutro), ou 3) o 107 constrangimento adicionado pela presença de uma ligação covalente entre as duas subunidades. As modificações de Asp99 mostraram reduzir ou eliminar a actividade de LH da hCG (Chen et al, 1991) . Por comparação das actividades de ligação ao receptor de LH de análogos da hCG contendo uma subunidade β não modificada e uma subunidade a, na qual a Lys51 foi substituída por cisteína (hCG (aK51C-/?) e análogos de hCG contendo uma subunidade α não modificada e uma subunidade β, em que a Asp99 foi substituída por uma cisteína (hCG (a-/?D99C) ) , com aquelas de hCG e hCG (a51-/?99) , foi possível distinguir a influência das substituições de cisteína da influência da ligação dissulfito (Figura 17) . Estas análises mostraram que a substituição da Lys51 da subunidade α por cisteína tinha uma influência inibidora substancial na capacidade dos análogos para inibir a ligação de 125I-hCG a receptores de LH. As actividades de hCG (a51-/?99) e hCG(a-/?99) foram similares, demonstrando que a substituição da Asp99 na subunidade β por cisteína era maioritariamente responsável pela reduzida actividade de ligação de hCG (a51-/?99) a receptores de LH. Substituindo Lys51 por alanina também reduziu a actividade da hCG (Figura 18) .

Foram igualmente testadas as capacidades destes análogos de hCG para estimular a transdução de sinal (acumulação de AMP cíclico). A substituição do resíduo de Lys51 da subunidade α por cisteína ou alanina, provocou uma perda completa na capacidade da hormona para estimular a acumulação de AMP cíclico (Figuras 19 e 20). A adição de cisteínas a ambas as subunidades para a produção de hCG (a51-/?99) restitui quantidades significativas da actividade relativamente ao 108 análogo contendo apenas a única substituição de cisteína para a Lys51 da subunidade α (Figura 19). A substituição do resíduo da subunidade β em Asp99 por cisteína teve, por si só, uma influência muito menor na transdução do sinal em receptores de LH. Isto sugeriu que a ligação dissulfito reduziu a eficácia relativa dos análogos de hCG, uma propriedade que pode ser útil para o design de antagonistas. A presença de uma ligação dissulfito intersubunidades entre o cinto de segurança e o laço 2 da subunidade α aumentou a estabilidade térmica da hCG (Figura 8) . A mesma também impediu que as subunidades se dissociassem na presença de ureia 8M (Figura 9) . Estas observações confirmam o efeito benéfico de uma ligação dissulfito intersubunidades sobre a estabilidade das hormonas glicoproteicas. EXEMPLO 4: Um análogo hormonal glicoproteico bifuncional estabilizado por uma ligação dissulfito intersubunidades entre o cinto de segurança e o laço 2 da subunidade α

Foi criada uma ligação dissulfito entre o cinto de segurança e o laço 2 da subunidade α de CFC101-114, o análogo hormonal glicoproteico que possuía as capacidades de interagir com os três principais receptores de hormonas glicoproteicas. Isto permitiu a caracterização da influência relativa desta região da proteína nas interacções com os receptores de LH e FSH. O vector de expressão da subunidade β necessário para a produção de CFC101-114/?' (a51-/?99) , (isto é, pSVL-CFClOl- 109 114/?'D99C) foi preparado por meio de mutagénese por cassete de pSVL-CFC101-114/?'. Este vector contém um local de restrição para a endonuclease BglII nos codões para os aminoácidos 95-96 e um local para a SstII nos codões para os aminoácidos 102-104. O pSVL-CFC101-114/?'D99C foi preparado por digestão do pSVL-CFC101-114/?' com BglII e SstII e por substituição do fragmento pequeno por uma cassete oligonucleotídica sintética, obtida por hibridização do Oligo924 e 01igo923 (Tabela 5). Isto também introduziu um local BsrGI, que foi utilizado para a selecção de clones recombinantes. A sequência das bases substituídas no vector resultante, pSVL-CFC101-114/?'D99C, foi confirmada por meio de métodos de sequenciação didesoxi. As sequências de aminoácidos de CFC101-114/?' (a51-/?99), codificado por este vector, encontram-se ilustradas na Figura 21. A co-expressão de pSVL-aK51C e pSVL-CFC101-114/?'D99C por células COS-7 foi realizada como descrito no Exemplo 1. O dímero foi medido em ensaios imunológicos em "sandwich", utilizando A113 para captura, B112 radioiodado para a detecção, e hCG purificada a partir de urina como padrão. Como no caso de outros análogos, não seria necessário utilizar estes anticorpos em particular para detectar o CFC101-114/?' (a51-/?99) no meio de cultura. Muitos dos anticorpos para a subunidade α que foram capazes de ligar a ambas as hCG e hFSH poderia ter sido utilizados para a captura. Muitos dos anticorpos capazes de se ligar à hCG e à subunidade β livre, excepto aqueles que reconheceram resíduos envolvendo a sequência que foi alterada para FSH, poderiam ser utilizados para a detecção. Um exemplo de um 110 anticorpo que não poderia ser utilizado é o Blll (Cosowsky et al, 1995). Ο A407, um anticorpo monoclonal para a subunidade a, que reconheceu uma porção determinante no terminal-N da subunidade α em hCG (Moyle et al, 1995) , quase não reconhece CFC101-114, embora lique hCG (Figura 5). Pensou-se que isto era devido à influência do cinto de segurança na interacção global das subunidades α e β da hormona glicoproteica, que pode estar envolvida no controlo da especificidade de ligação ao receptor. A adição de uma ligação dissulfito entre o resíduo 51 da subunidade α e o resíduo 99 da subunidade β não possibilitou que o análogo resultante fosse reconhecido pelo A407 (Figura 11).

Tal como outros análogos reticulados por meio de ligações dissulfito, o CFC101-114 (a51-/?99) também é mais estável que os seus percursores pais (isto é, CFC101-114 e hCG) em ensaios de desnaturação térmica (Figura 12). Na realidade, parece que a presença da ligação dissulfito entre o resíduo 51 da subunidade α e o resíduo 99 da subunidade β aumentou a estabilidade da proteína mais do que a ligação dissulfito entre o resíduo 31 da subunidade α e o resíduo 37 da subunidade β. A presença da ligação dissulfito entre o cinto de segurança e o laço 2 da subunidade α do CFC101-114 (a51-/?99) reduziu a sua capacidade para se ligar a receptores de LH (Figura 22) . Por conseguinte, enquanto que o CFC101-114 era quase tão eficaz quanto a hCG recombinante na inibição da ligação de hCG radioiodada a receptores LH, o CFC101-114 (a51-/?99) 111 foi aproximadamente 100 vezes menos activo. A importância relativa das mutações nas subunidades individuais e a ligação dissulfito foi comparada por monitorização das actividades de CFC101-114, CFC101-114 (a51-/?99) , CFC101- 114 (aK51C-/?) , CFC101-114 (aK51A-/?) e CFC101-114 (a-/?D99C) .

Esta comparação mostrou que a substituição da Lys51 na subunidade α por cisteina ou alanina, possuía, per se, uma influência inibitória substancial na ligação ao receptor (Figuras 22 e 23). Por conseguinte, a actividade de CFC101-114 (aK51C-/?) foi relativa à de CFC101-114 (a51-/?99) . Ao contrário do seu efeito na actividade de LH de hCG, a substituição de Asp99 da subunidade β de CFC101-114 por cisteina foi apenas responsável uma parte da reduzida capacidade do CFC101-114 (a51-/?99) para se ligar a receptores de LH. Todavia, o CFC101-114 (a51-/?99) foi substancialmente mais activo que o CFC101-114 (aK51C-/?) , um efeito que não pôde ser explicado pela presença de cisteina na subunidade a, no lugar de Lys51.

Foram igualmente efectuados estudos para determinar a influência da ligação dissulfito cinto de segurança-subunidade α sobre as actividades de transdução de sinal de CFC101-114 (Figuras 24 e 25) . O CFC101-114 foi apenas ligeiramente menos potente do que a hCG na estimulação da transdução de sinal em receptores de LH (Figura 24) . No entanto, o CFC101-114 (α51-/?99) , o análogo reticulado por uma ligação dissulfito, foi activo apenas para a concentração mais elevada testada. Nos estudos de confirmação, discutidos anteriormente, isto pareceu dever-se principalmente à alteração da Lys51 da subunidade α para cisteina, o análogo em que apenas a Asp99 da 112 subunidade β foi convertida em cisteina (isto é, CFC101-114 (a51-/?99) reteve actividade substancial. Tal como no caso dos ensaios de ligação, em que a ligação dissulfito foi capaz de compensar alguma da perda da actividade causada pela substituição da Lyst51 da subunidade α por cisteina ou alanina, a ligação dissulfito intersubunidades restituiu alguma transdução de sinal (Figura 24). 0 CFC101-114 teve actividades substanciais em ensaios para a FSH. Contudo, as substituições de cisteina necessárias para produzir a reticulação cinto de segurança-laço 2 da subunidade α por meio de uma ligação dissulfito, teve um maior efeito sobre a actividade de FSH do CFC101-114, do que sobre a sua actividade de LH (Figuras 26, 27 e 28), não sendo possível distinguir a influência da ligação de dissulfito per se. Assim, análogos em que apenas a Lys51 da subunidade α ou a Asp99 da subunidade β foram alteradas, perderam a maior parte das suas actividades de FSH. A observação de que as mutações na Asp99 da subunidade β tinham uma maior influência sobre a actividade de FSH do que sobre a actividade de LH, suporta as observações prévias sobre o papel do cinto de segurança na actividade de LH e FSH (Han et al, 1996; Baird et ai, 1993) . Estes relatos sugerem que a região do cinto de segurança que influencia a ligação ao receptor LH está próxima dos aminoácidos 94-96, enquanto que aquela que influencia a ligação ao receptor de FSH está próxima dos aminoácidos 101-109. EXEMPLO 5: hCG estabilizada por ligações dissulfito dos Exemplos 1 e 3 113

Para compreender como é que a introdução de múltiplas ligações dissulfito nas hormonas glicoproteicas influenciariam as suas actividades biológicas, foram produzidos análogos de hCG que continham as ligações dissulfito apresentadas nos exemplos 1 e 3. Estes análogos foram preparados por troca das porções dos vectores de expressão que foram descritos nos Exemplos 1 e 3. 0 pCI- α(C7S,K51C) foi preparado por digestão de pSVL-aC7S e pSVL-aK51C com Bsml, separação dos fragmentos pequeno e grande produzidos em cada uma das digestões por meio de electroforese em agarose, e ligação do fragmento grande de pSVL-aC7S ao fragmento pequeno obtido de PSVL-aK51C. A estrutura resultante foi digerida com Xhol e BamHI e ligada no pCI que tinha um "polylinker" modificado e que foi descrito no Exemplo 1. 0 pCI-hCG/?' (Y31C, D99C) foi preparado por digestão de pSVL-hCG/?'D99C e pCI-hCG/?'Y37C com Aocl (um isoquizómero de Bsu36I) e BamHI, separação das porções pequena e grande por electroforese em agarose e ligação da porção pequena, derivada de pSVL-hCG/?/’D99C, à porção grande, derivada de pCI-hCG/?'Y37C. As sequências de aminoácidos dos análogos codificados por estes vectores encontram-se apresentadas na Figura 31. pCI-α (C7S, K51C) e pCI-hCG/?' (Y31C, D99C) foram co-expressos em células COS-7 tal como descrito no Exemplo 1. As proteínas secretadas para o meio de cultura foram concentradas e monitorizadas por meio de um ensaio imunológico em "sandwich", também descrito no Exemplo 1, excepto que foi utilizado B112 radioiodado em vez de B105. A presença de múltiplas ligações dissulfito não impediu a hormona glicoproteica de se enrolar ou de ser secretada pelas células, como confirmado pela presença de análogo no 114 meio de cultura (Tabela 8). A hCG (α31-/?37, a51-/?99) foi medida, em imunoensaios em "sandwich", relativamente a uma hCG padrão, utilizando anticorpos para a subunidade α (A113), para a captura e anticorpos radioiodados para a subunidade β (B112), para a detecção. 0 análogo não foi bem reconhecido pelo anticorpo A407, uma consequência provável da mutação próxima do N-terminal da subunidade a. Uma vez que esta região da proteína não é necessária à actividade da hormona, a falta deste epítopo pareceu ter pouca importância. As letras maiúsculas na Figura 31 referem-se às localizações das mutações que foram introduzidas para formar as ligações dissulfito.

Tabela 8

Produção de hCG e hCG(a31 j£37, α51-)599) por células COS-7 transfectadas hCG ou análogo Concentração hCG 35,33 ng/0,05 ml hCG (α31-/737, a51-/799) 36,60 ng/0,05 ml A presença de duas ligações dissulfito em hCG(α31-/%7, a51-β99) aumentou a sua estabilidade relativamente à hCG, em ensaios de desnaturação térmica (Figura 8). Para além disso, a hCG (a31->037, a51-/?99) era mais estável do que a hCG, relativamente à desnaturação por ureia (Figura 9) . Isto sugeriu que a presença de mais do que uma ligação dissulfito não destabilizava a molécula. A hCG (α31-/?37, a51-/79 9) foi capaz de se ligar a receptores de LH e de estimular a acumulação de AMP cíclico (Figuras 29 e 30). As suas actividades nestes ensaios eram similares 115 às de hCG (a51-/?99) , mostrando novamente que a ligação dissulfito intersubunidades entre o resíduo 31 da subunidade α e o resíduo 37 da subunidade β, tinha pouca, se alguma, influência determinante sobre a ligação ao receptor ou a transdução de sinal. Por conseguinte, o local do grupo intercisteína a31-/?37 seria preferido para a projecção de uma ligação dissulfito para estabilizar hormonas glicoproteicas, quando é pretendida a manutenção da actividade endócrina. EXEMPLO 6: Um análogo da hFSH estabilizado por uma ligação dissulfito entre grupos de cisteína entre as suas subunidades α e β A verificação de que a hCG e o CFC101-114 poderiam ser estabilizados por uma ligação dissulfito intersubunidades entre os seus grupos de cisteína, sem destruir as suas actividades de LH e/ou FSH, sugeriu nitidamente que esta região não é necessária para a actividade hormonal. Assim, espera-se que a projecção de uma ligação dissulfito semelhante em FSH resultaria num análogo de hFSH com uma estabilidade aumentada e uma potente actividade de FSH. Seria de esperar que este análogo ligasse anticorpos que reconhecem as subunidades α de hCG e hFSH, tal como o A113. Seria igualmente esperado que ligasse anticorpos que reconhecem uma região dos laços 1 e/ou 3 da subunidade β de hFSH, distante do local da mutação, como ο B602. A sequência de um análogo da subunidade α necessária para preparar um análogo de hFSH reticulado entre o resíduo 31 da subunidade α e o resíduo 31 da subunidade β foi descrita na Figura 3. A sequência de aminoácidos de uma subunidade 116 α menos polar, que também deveria ser útil para prepara este análogo (aC7A) encontra-se apresentada na Figura 32. A sequência de aminoácidos de hFSH que se espera formar uma ligação dissulfito entre grupos de cisteina com aC7A ou aC7S, também se encontra apresentada na Figura 32. As sequências de ácidos nucleicos necessárias para preparar os vectores que codificam para estas proteínas poderiam ser preparadas a partir dos cDNAs da subunidade α humana e da subunidade β de hFSH, por um perito na arte de clonar utilizando o código genético ilustrado na Figura 33. Estas sequências poderiam ser igualmente compradas de um dos fornecedores listados no Exemplo 1.

Vectores capazes de levar a cabo a expressão de aC7S e hFSH/?Y31C ou aC7A e hFSHy9i31C de forma transiente ou estável, seriam introduzidos em COS-7 ou outras células eucariótas, por meios bem conhecidos no estado da técnica, tal como os mencionados no Exemplo 1. A proteína produzida seria medida num imunoensaio em "sandwich", utilizando a hFSH como padrão e anticorpos de captura que reconhecem epítopos da hFSH distantes do N-terminal da subunidade α e anticorpos de detecção que reconhecem epítopos da hFSH em locais nos laços 1 e/ou 3 da subunidade β.

Seria de esperar que o análogo reticulado da hFSH fosse mais estável do que a hFSH em ensaios de desnaturação térmica e com ureia, tal como realizados para os análogos de hCG reticulados, no Exemplo 1. Também seria de esperar que o análogo de FSH reticulado competisse com hFSH radioiodada para a ligação a células CHO, que foram transfectadas com receptores de FSH humanos. Seria 117 igualmente de esperar que estimulasse a cumulação de AMP cíclico nestas células. Ensaios in vitro podem prever com sucesso as actividades biológicas de análogos de hormonas glicoproteicas completamente glicosilados in vivo. Uma vez que não se espera que as mutações que seriam introduzidas para reticular os análogos da hormona glicoproteica, alterem os seus padrões de glicosilação globais, relativamente a hormonas glicoproteicas recombinantes, espera-se também que o análogo de FSH reticulado seja activo in vivo.

EXEMPLO 7: Um análogo de hCG estabilizado por uma ligação dissulfito entre as porções N-terminais das subunidades α e_J

Os Exemplos 1-4 ensinam que uma única ligação dissulfito intersubunidades entre as subunidades de hormonas glicoproteicas e dos seus análogos pode aumentar a sua estabilidade. Estes exemplos também mostram que o efeito de uma ligação dissulfito nas actividades de ligação ao receptor e de transdução de sinal da será pequeno, desde que não envolva resíduos que são importantes para a ligação ao receptor, a especificidade de ligação ao receptor, ou que contorção a proteína numa conformação inapropriada. As porções N-terminais de ambas as subunidade α e β podem ser substancialmente alteradas, sem com isso destruir a actividade hormonal, uma indicação de que esta parte da proteína não participa em contactos chave com o receptor. Por conseguinte, antecipa-se que a introdução de uma ligação dissulfito nos terminais N de hormonas glicoproteicas, em locais na Tabela 1B que mostram ser 118 favoráveis, irá estabilizar as mesmas sem prejudicar seriamente as suas actividades biológicas. A Tabela 1B mostra que a Gln5 da subunidade α e a Arg8 da subunidade β de hCG, encontram-se posicionadas de forma favorável, de tal modo que a substituição de cada um deles por resíduos de cisteína conduziria à formação de um análogo reticulado por meio de uma ligação dissulfito. Seria de esperar que este análogo tivesse uma estabilidade aumentada, relativamente à hCG e que mantivesse a capacidade de ligação aos e estimulação dos receptores de LH.

As sequências de aminoácidos necessárias para preparar vectores que seriam úteis para expressar este análogo encontram-se apresentadas nas Figuras 34A e 34B. EXEMPLO 8: Um análogo de hFSH estabilizado por uma ligação dissulfito entre as porções N-terminais das subunidades α e β

Tal como observado anteriormente, os Exemplos 1-4 ensinam que uma ligação dissulfito intersubunidades entre as subunidades de hormonas glicoproteicas e dos seus análogos pode aumentar a sua estabilidade. Estes exemplos também mostram que o efeito de uma ligação dissulfito na ligação ao receptor e na transdução de sinal da será pequeno, desde que não envolva resíduos que são importantes para a ligação ao receptor ou para a especificidade de ligação ao receptor. Por conseguinte, de acordo com a presente invenção, espera-se que a introdução de uma ligação dissulfito nos terminais N da hFSH irá estabilizá-la e 119 conduzir a um análogo que terá propriedades terapêuticas úteis.

Com base nos dados da Tabela 1B, que mostram as posições favoráveis da Gln5 da subunidade α e da Arg8 da subunidade β de hCG, e nos dados da Tabela 2 que mostram resíduos "equivalentes" em hCG e hFSH, seria de esperar que a substituição da Gin 5 da subunidade α e da Ser2 da subunidade β de hFSH por resíduos de cisteína, produziria análogos de hFSH reticulados por meio de uma ligação dissulfito. Esperar-se-ia que estes análogos possuíssem uma estabilidade aumentada relativamente à hFSH e mantivessem a capacidade para se ligar a e estimular receptores de FSH. As sequências de aminoácidos necessárias para preparar um vector que seria útil para expressar estes análogos encontram-se apresentadas na Figura 35. EXEMPLO 9: Um análogo de hLH estabilizado por uma ligação dissulfito entre grupos de cisteína entre as subunidades α e β ou uma ligação dissulfito intersubunidades entre as porções N-terminais das subunidades α e β

As lutropinas relacionadas de forma mais próxima são a hCG e a hLH. Consequentemente, seria de esperar que as mutações necessárias para preparar análogos de hCG reticulados por uma ligação dissulfito activos, também seriam úteis para a preparação de análogos de hLH reticulados por uma ligação dissulfito activos. A hLH é a gonadotropina menos estável, sendo também esperado que as ligações dissulfito intersubunidades aumentem significativamente a estabilidade da hLH. As sequências de aminoácidos da subunidade β, necessárias para a preparação de hLH reticulada por uma 120 ligação dissulfito entre grupos de cisterna e hLH que é reticulada próximo do seu terminal N, encontram-se apresentadas nas Figuras 36 e 37, respectivamente.

EXEMPLO 10: hTSH/?Y30C, um análogo da subunidade β que se espera ser útil para a preparação de análogos de hTSH estabilizados por uma ligação dissulfito entre grupos de cisteína entre as subunidades α e β ou uma ligação dissulfito intersubunidades entre as porções N-terminais das subunidades α e β

Tal como observado anteriormente, os Exemplos 1-4 ensinam que uma ligação dissulfito intersubunidades entre as subunidades de hormonas glicoproteicas e dos seus análogos pode aumentar a sua estabilidade. Estes exemplos também mostram que o efeito de uma ligação dissulfito na ligação ao receptor e na transdução de sinal da será pequeno, desde que não envolva resíduos que são importantes para a ligação ao receptor ou para a especificidade de ligação ao receptor. Por conseguinte, antecipa-se que a introdução de uma ligação dissulfito entre resíduos nos grupos de cisteína das subunidades α e β de hTSH ou no terminal N das subunidades α e β de hTSH, irá estabilizar o heterodímero, conduzindo a um análogo que terá propriedades terapêuticas úteis, tal como a estimulação da glândula tiróide antes da terapia de ablação com iodo radioactivo.

Com base nos dados da Tabela 1B, que mostram as posições favoráveis da Cys31 da subunidade α e da Tyr37 da subunidade β de hCG, e nos dados da Tabela 2 que mostram resíduos "equivalentes" em hCG e hTSH, seria de esperar que células que expressam aC7S ou aC7A e um análogo da 121 subunidade β de hTSH, em que a Tyr30 é substituída por um resíduo de cisteína, produzissem análogos de hTSH reticulados por meio de uma ligação dissulfito. De modo semelhante, com base nos dados na Tabela 1B, que mostram as posições favoráveis Gln5 da subunidade α e Arg8 da subunidade β de hCG, e nos dados da Tabela 2, que mostram "equivalentes" em hCG e hTSH, seria de esperar que a substituição da Gln5 da subunidade α e da Phel da subunidade β de hCG, por resíduos de cisteína produzisse análogos de hTSH reticulados por meio de uma ligação dissulfito. Esperar-se-ia que estes análogos possuíssem uma estabilidade aumentada relativamente à hTSH e mantivessem a capacidade para se ligar a e estimular receptores de TSH.

As sequências de aminoácidos necessárias para preparar um vector que seria útil para expressar estes análogos encontram-se apresentadas nas Figuras 38 e 39. EXEMPLO 11: Preparação de antagonistas hormonais reticulados por ligações dissulfito É bem conhecido que a desglicosilação das hormonas glicoproteicas reduz as suas capacidades para desencadear um sinal biológico (Moyle et al, 1975; Matzuk et al, 1989). NO entanto, devido à sua instabilidade, as hormonas desglicosiladas são inúteis em termos terapêuticos. Espera-se que a introdução de uma reticulação por meio de uma ligação dissulfito em hormonas geneticamente desglicosiladas aumentará a sua utilidade como antagonistas hormonais. Um antagonista de LH ou hCG teria ambas as utilizações de profertilidade e anti-fertilidade. Por conseguinte, quando administrado a mulheres que são 122 inférteis, porque possuem niveis anormalmente elevados de LH, um antagonista de LH potenciaria a fertilidade. Quando administrado a mulheres, que estão nos estádios iniciais de gravidez, um antagonista de hCG iria por termo à gravidez. Um antagonista de uma molécula de LH/FSH bifuncional, tal como CFC101-114 ou CFC101-109 (Moyle et al, 1994) seria igualmente útil. A utilização transiente de um antagonista deste tipo, poderia ser usada para por termo a uma função ovárica inapropriada, causando, assim, a reposição do ciclo menstrual. Isto teria um efeito potencial de profertilidade. Seria de esperar que a utilização de um tal antagonista, durante os estádios iniciais de gravidez, suprimisse a produção de ambos progesterona e estradiol e pusesse termo à gravidez.

Para além da introdução de uma reticulação por meio de uma ligação dissulfito intersubunidades, a preparação de antagonistas reticulados envolveria a alteração de sinais de glicosilação ligados ao N-terminal na subunidade α ou nas subunidades α e β dos análogos que foram descritos ou que podem ser produzidos por referência à Tabela 1B. Isto envolveria a alteração a sequência Asn-X-Ser/Thr, encontrada nas subunidades α e β das hormonas glicoproteicas, para substituir a Asn por outro aminoácido, substituir a Ser ou Thr por outro aminoácido ou para substituir o aminoácido entre Asn ou Ser/Thr (representado por X) por prolina. EXEMPLO 12:

Outros análogos de gonadotropinas, reticulados por meio de ligações dissulfito, que se espera serem mais estáveis do que as hormonas mães, encontram-se apresentados nas Tabelas 123 9-15. Estes seriam preparados por co-transfecção de células com vectores capazes de expressar as estruturas da subunidade α e da subunidade β, como indicado nos Exemplos 1-5.

Tabela 9

Análogos da subunidade α humana adicionais, que podem ser utilizados para preparar análogos de hCG, hLH, hFSH e hTSH reticulados por meio de ligações dissulfito (Nota: a mutação encontra-se em letras maiúsculas) ftCãiS íi(jyysfkyaaitÍvtlSv£ir.viiiaapdvqdcpectjijefipi;i:sqpçapi i qcmgíic f sr avp tp i r a kkfcail vqk fivt. .<ses t cc

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i eOçjyeptfafcjfvlqgvlpalpqvYCJiyrdvvf e SirlpCTcprqxTXpvysya-jalscqgãlcrrsttdeggpkAf.pltcaáprJiqdssõskapppslpaptiilpSpfidt-pllpit ÍxCGííI33C íaefnlqnlll 1111 EB.ggtvFaskeplrE;rerpinaulav«kBgBp<vcítv«ttCc*gyepfcf8fcrvlÍ3'3vlpalp<j’'~.i'..~i'/!rilv::í e slx.: po :f- rq sίρννpy s ρρρyyy; cr ysP Iccqgpkdr.pllcddpy f qdpsssrxapppyC pyyy r Ipypsyy Ί1 pq hCGSTSSC meeíqgll 11111 aroggtvsskepXrprKrpinBPlavekesqpvcitvnttieagycptr.trvlggYlíislpqvvirnytdvr £* siir.i pgcprgynp\--syavalscqcãlcrrst:Cdeggpkáhpl tcdAppf qdssaskapppslpppsplpqpsxitrjl Ipq_ HCCÍffMOC mstr.iqglliilli smjgsviaskepli-pxcxpplqatlavekegcpvcitvntticagyepCsiKKviqg-vlpalpqvvKnyrilvríe _sirlpgcprgvnpvvsyavalacqcalerrgttdaggpRdhpÍtcddprtqd.saagk&pppalpSFeripçjpaátpllpet_ iiCGííl-i 2C pe^fqgllIllllsrrqgpwaskeplrpxxrpinatlavekegcpvcitvHtticagYcptsiCrvlqçfvlpaipijvvcriygàvrier _si ilpggprqyqipvvsypvalscqes-n-yraqdápggpkdhpIlcádp.vfqasf.ssXapFpsIpspsrlpGPSdppj.lpq HCGírOkSC mt-iRf qglillllIswjvypwaskeplipxcgpiqaslavekegcpveitvnttxcagycplmtgvlCefvlpaipqvveTiyríii-rf'" si rlpqapyg\'fipwx;yav.í3.sr.,xjea:o.irfsttiipggpkdhpltcddprfqAssss.>capppalpapaxrlpgpgilcpilpgKGQSVÍ ...................... :ne[ts£ççillllllls!T!;gç:tw3skHplipx'cípinatlaveke<(cpvcltvn6txcagycpl.mtiC:.!5gwl.pS!.p!jvvcriyrávríe slglpgcpyximpwsyaval.gcqisa.i.axrrstt-.dcgfgpkaixpltcxtdprtqásssgitapppalpspaylpgpgdtpxlpqt hCGjSQ54C »emSq;gllllllls!ne(çt.wasKepl!cpx-c;ípixxatlavekíyçfcpvcitvr.t:tÍc»gr>,cpkmtrx'.:.qgv3.palpCv'/críyjrdvsrfs sx.rlP3cprgvixpwisyavalscqcal.egrsttãeggpkdixpli:càáprl'qdBSgsk3pppslpap3X.lpgpgdtpilpg 126 Tabela 12 Análogos da subunidade β de hLH adicionais, úteis para a preparação de análogos de hLH reticulados por meio de ligações dissulfito, quando combinados com análogos da subunidade α apropriados (Nota: a mutação encontra-se em letras maiúsculas) hUt;W4*C memlqgillllllsmggawaaraplrpwc&pinallavekegcpvcítvnteieagyeptmirClgavipplpgvvccyrdvrfe slrlpgeprgvdpvv.a£pvals<;ygt)pcys:gt;Íjdcggpkdfrjpít:cdi'tjpqlg«ll;El hLHiíM.UC iKat»Xqgllllilleagga«3sy.epXrpwchp±nailaYekegcpvoitvnt.ticagycptCiarvlqavlpplpqwcsyxávrfe a^rXpgeprgvápwafpvalacrSgpciratsdgggakdhpltcáhaqXagllfl_ hUl£V56C iáâiRlggllill 1Ismggawasrepl.cpwcfapinai lavakagcpvei tvyitticagycptmtorwlgavlpplpqvCctyrdvr £ e slrlpgcpygvdpyvsípvalscycggcrrstsflcggpkahpxfccahpqisgllfl_ hLKSA35C astiaqglIlIlIiaaiggawasrepirpwchpiKailavekcgcpwiCTOCticCçíycptsíKjrvlqavXppipqvvctyrdvrfe sxrlpgcprgvdpwBfpvalsgrcgpcrrstsdcggpkdhplPcdhpqlBglliil hI.Hi3I3JC maKdqgllllXílsraggawaaispIrpwghpiiiailavekagcpvcifcvTsr.pCcagycptKBarvlqavXppXpqwcpyjrdvjría airlagoprsvttpwsfpvaX.aerctipcri-stsdcggpkdhpItcdhpqlsglIfi hLHífS38C meaiqgiillXilsmggawasYapiiptójyigailavekegcpvcitvr^ticagv^pPKasrvlqavlppxpqv-xctyrdvyie íxxrlpggprgvdryx^gfpvalgcyggpcrrstCdggirakdhpltgdhT-qÍsgliy Ϊ MM&ZiOC nantlqglllll i.l®mggawas'.-eplrpwchpinai lavekaggpvcitvntticagyopCiiimirvlgavlpplpqwctyrdvrf e airipgcprgvdpvvafpvaXsgrcrócrjrataãcgçpkdhpit.adhpí!: ygl X£ 1 ttiaiclqvjix iriIlsroggawasyapxiqíwchpindxiavtíkaygpvgxqvriyticagygpt-mCrvlçíavlpplFqv^vctyjrdvx-fe _giyxpggpYgvdpwaÍpva : sgrcgpcrrgfcsicggpkãpplpcdhpql agiltU _ hLHSQjJíC ;f‘ssiqgl 11111 Iswggawasrepl rp«chp.i;idi · avek*«opveí tvr.t ticasycptmrarv 1 CavippXpgwcty y dvyf s sixlr-qcnygvtipwsfpvaiscrcyccrrstsdco-TpkdhDlttodhpqisqll fl.................................... hLH0QS4C masilqgx 111111 afóggavasreplrpwcrfcpínailavekaçFCpvgitvrit PieagycpPMarvlqavlpplpCvvcpyrdvrfa sirlpÍ:cprgvdpwa£pvalsorggpgrrst:sdf.ggp:K.dliplÍcnhgiqlsgll£l 127

Tabela 13

Heterodímeros de hFSH que contêm ligações dissulfito intersubunidades, que aumentam a sua estabilidade

Estrutura da subunidade α Estrutura da subunidade β aC31A hFSH/?Y31C* aQ27C hFSH/?V38C* cxM2 9C hFSHygR35C aS34C hFSH/5T50C aR35C hFSH/fc29C aY37C hFSH/5W27C aS55C hFSH/5T92C aS57C hFSH/?T50C aC87A hFSH/5T34C aV61C hFSH/?D36C aK75C hFSHySK40C aV7 6C hFSH/?738C aC5 9A hFSH/?Q4 8C

Nota: Aqueles que se espera que mantenham uma actividade biológica substancial encontram-se indicados com um asterisco. Isto é calculado com base no papel dos resíduos que estão envolvidos na ligação ao receptor ou na especificidade de ligação ao receptor, como mostrado nos Exemplos 1-4. Os heterodímeros reticulados seriam preparados por co-transfecção do cDNA do análogo da subunidade α e β indicado, em células de mamífero, utilizando os métodos descritos no Exemplo 1. 128

Tabela 14

Heterodímeros de hCG que contêm ligações dissulfito intersubunidades, que aumentam a sua estabilidade

Estrutura da subunidade α Estrutura da subunidade β aC31A hCG/?Y37C* aC31A hCG/?R6C* aQ27C hCGyS\744C* aM2 9C hCG/3yi41C aS34C hCG/?756C aR35C hCGy®435C aY37C hCG/?I33C aS55C hCG/?I98C aS57C hCG/?Y56C aC87A hCG/0T4 OC aV61C hCG/?T42C aK75C hCGy^)4 6C aV7 6C hCGyS\744C aC59A hCGy^)54C

Nota: Aqueles que se espera que mantenham uma actividade biológica substancial encontram-se indicados com um asterisco. Isto é calculado com base no papel dos resíduos que estão envolvidos na ligação ao receptor ou na especificidade de ligação ao receptor, como mostrado nos Exemplos 1-4. Os heterodímeros reticulados seriam preparados por co-transfecção do cDNA do análogo da subunidade α e β indicado, em células de mamífero, utilizando os métodos descritos no Exemplo 1. 129

Tabela 15

Heterodímeros de hLH que contêm ligações dissulfito intersubunidades, que aumentam a sua estabilidade

Estrutura da subunidade α Estrutura da subunidade β aC31A hLH/?Y37C* aC31A hLH/?R6C* aQ2 7C hLH/?Y44Cd aM2 9C hLH/3yi41C aS34C hLH^V56C aR35C hLHySA35C aY37C hLH/?I33C aS55C hLH/?I98C aS57C hLHy9V56C aC87A hLH/5T40C aV61C hLH/?T42C aK75C hLHy^)4 6C aV76C hLH/?V44C aC59A hLH/%)54C

Nota: Aqueles que se espera que mantenham uma actividade biológica substancial encontram-se indicados com um asterisco. Isto é calculado com base no papel dos resíduos que estão envolvidos na ligação ao receptor ou na especificidade de ligação ao receptor, como mostrado nos Exemplos 1-4. Os heterodímeros reticulados seriam preparados por co-transfecção do cDNA do análogo da subunidade α e β indicado, em células de mamífero, utilizando os métodos descritos no Exemplo 1. EXEMPLO 13: Um análogo da hCG, contendo uma ligação dissulfito entre o laço 2 da subunidade β e o laço 3 da subunidade α 130

Os resíduos que formam esta ligação dissulfito encontram-se na região da hCG que se propõe não participar nos contactos de elevada afinidade com o receptor (Moyle et al, 1995). Nem o segundo laço da subunidade β, nem o terceiro laço da subunidade β da hCG são necessários para a actividade de lutropina, podendo ser produzidos análogos de hCG activos, em que ambos foram eliminados (Moyle et al, 1998). Para além disso, foram preparados análogos de hCG que possuem uma actividade total, nos quais o laço 2 da subunidade β foi substituído pelo seu homólogo de hFSH (Campbell et al, 1991). Por conseguinte, não seria de esperar pelo presente inventor que a adição de uma ligação dissulfito intersubunidades entre estas porções da proteína prejudicasse as suas actividades biológicas. Este análogo seria preparado por meio da modificação de vectores que codificam para as subunidades α e β da hCG e co-expressão dos mesmos em células de mamífero. A estrutura da subunidade a, codificava uma proteína com a sequência de aminoácidos designada aV76C, tal como apresentado na Tabela 9. Esta estrutura foi preparada por mutagénese por PCR, utilizando os oligonucleótidos 1131 e 1132 como "primers" (Tabela 5) e o pMB589 como molde. O plasmídeo pMB589 corresponde a uma estrutura em pCI', que codifica para um análogo da subunidade α humana, em que o codão para Asn52 foi substituído pelo de ácido aspártico e em que os codões para Arg42 e Ser43 foram modificados para produzir um local silencioso BglII. O pMB589 foi produzido por sub-clonagem da inserção Xhol-BamHI de pMB532 no vector pCI', entre os locais Xhol-BamHI, e o pMB532 foi produzido a partir de pMB507, uma estrutura 131 descrita anteriormente, por meio de PCR, utilizando os oligonucleótidos 850 e 851 como "primers" (Tabela 5) e o pMB507 como molde. O produto de PCR foi digerido com BglII e Spel, sub-clonado nos locais de BglII e Spel de pMB507 e sequenciado, para dar origem ao pMB532. O produto de PCR foi diferido com BglII e PstI e a inserção foi clonada nos locais de BglII e PstI de pMB507, para produzir o pMB910. Os clones positivos foram identificados pela presença de um local Dral extra, que tinha sido introduzido na estrutura. Após a confirmação da sequência de DNA de pMB910 pelo método didesoxi, o fragmento de DNA, que codificava para todo o análogo da subunidade α foi removido do pMB910, por digestão com Xhol e BamHI, e sub-clonado nos locais de Xhol e BamHI do vector pCI' , para produzir o pMB926. O pMB926 codifica para a aV76C.

Para produzir o par subunidade β de hCG para aV7 6C, foi preparado um vector que codificava para hCG/?'V44C. Este é um análogo da subunidade β de hCG que se espera que forme um heterodímero reticulado por meio de uma ligação dissulfito com aV76C, quando expresso nas mesma células que o pMB926. Os oligonucleótidos 1133 e 1134 (Tabela 5) foram sintetizados e ligados no local NgoMI-PstI de pKMB-β', para produzir o pMB90 9. O fragmento Xohl-BamHI de pMB909 foi transferido para o pCI', para produzir pMB941. A sequência de aminoácidos de hCG/?V44C codificada pelo pMB941 encontra-se apresentada na tabela 11. EXEMPLO 14: Um análogo da hFSH, contendo uma ligação dissulfito entre o laço 2 da subunidade β e o laço 3 da subunidade α 132

Com base nas semelhanças das sequências de aminoácidos das subunidades β de hCG e hFSH, notavelmente de cisteínas (Tabela 4), seria de esperar que ambas as proteínas apresentassem arquitecturas similares. As posições relativas de Val44 no laço 2 da subunidade β de hCG e de Val7 6 no laço 3 da subunidade a, sugerem que a alteração destes resíduos para cisteínas iria produzir uma ligação dissulfito intersubunidades entre o laço 2 da subunidade β e o laço 3 da subunidade α. A Vai 38 ocupa uma posição semelhante na subunidade β da hFSH que a Val44 da subunidade β da hCG. Por conseguinte, pensou-se que alterando hFSH/?Val38 para cisteína e expressando a estrutura resultante com aV76C resultasse num heterodímero reticulado por meio de uma ligação dissulfito. Para alterar a Val38 na subunidade β de hFSH para cisteína, o presente inventor começou com pMB603, uma estrutura que contém a sequência que codifica para o cDNA de hFSH/? menos os terminais 3' e 5' não traduzidos no vector pCI', entre os locais de restrição Xhol e BamHI. 0 pequeno fragmento de DNA, entre os locais BstXI e PpuMI, foi substituído por uma cassete de oligonucleótidos, preparada por hibridização dos oligonucleótidos 1154 e 1155 (Tabela 5). A estrutura resultante, designada por pMB920, foi analisada relativamente à falta do local de BstXI e à presença de um local PpuMI. Após a sequenciação de DNA ter confirmado a presença da alteração pretendida, o pMB920 foi co-transfectado para células COS-7 com pMB926, o vector que controla a expressão de aV76C. As células secretaram um heterodímero para o meio, que foi prontamente detectado num ensaio imunológico em "sandwich", utilizando o anticorpo 133 monoclonal anti-subunidade α A113, para a captura, e o anticorpo monoclonal anti-subunidade hFSH/? radioiodado B602. A sequência de aminoácidos de hFSH/£38C codificada pelo pMB920 encontra-se apresentada na Tabela 10. O heterodimero composto por aV7 6C e hFSH/?V38C estimulou a acumulação de AMP cíclico em células CHO que expressam o receptor de FSH humana (Figura 45). EXEMPLO 15: Um análogo da hCG, contendo uma ligação dissulfito entre os terminais N de cada subunidade e entre os grupos de cisteína

Os heterodímeros reticulados por meio de uma ligação dissulfito anteriores foram preparados por meio da modificação de cada uma das subunidades, para produzir um tiol livre que pudesse participar numa ligação dissulfito intersubunidades. No presente mostra-se que é possível preparar um análogo de hCG reticulado por uma ligação dissulfito, por modificação apenas da subunidade β da hCG. A estrutura cristalina de hCG mostrou que a Cys31 da subunidade α se encontrava localizada próximo da Tyr37 da subunidade β, e que as cadeias laterais de ambas as subunidades estavam direccionadas uma para a outra. Esta observação foi utilizada anteriormente para inserir uma ligação dissulfito intersubunidades entre o resíduo 31 da subunidade α de hCG e o resíduo 37 da subunidade β. A estrutura cristalina da hCG também mostrou que o resíduo Cys37 da subunidade α se encontra localizado próximo do resíduo Arg6 da subunidade β de hCG. Na realidade, os resíduos Cys7 e Cys31 da subunidade α encontram-se posicionados próximo dos resíduos Arg6 e Tyr37 da subunidade β, de tal modo que a conversão de Arg6 e Tyr37 134 pode promover a formação de um heterodímero contendo as ligações dissulfito intrasubunidade aCys7-aCys31 e βCγs6-βCγs3Ί, um heterodímero contendo as ligações dissulfito intersubunidades aCys7-/?Cys6 e aCys31-/?Cys37, ou um heterodímero contendo aCys7-/?Cys37 e aCys31-/?Cys6.

Simulações por computador mostraram que estas ligações dissulfito poderiam ser formadas sem uma tensão indevida sobre a proteína. A formação de múltiplas ligações dissulfito deveria ser útil para produzir um grupo de isómeros ou isoformas que possuem tempos de semi-vida diferentes. Estas poderiam ter novos usos terapêuticos, particularmente quando uma resposta biológica necessita de ser desencadeada subitamente. Ao utilizar os mesmos, seria administrado um grande bolus de análogo para iniciar uma resposta hormonal. Seria de esperar que a fracção do heterodímero que não foi reticulada fosse libertada mais rapidamente do que a de heterodímero reticulado. Consequentemente, uma grande injecção inicial seria suficiente para iniciar a resposta, mas a sua actividade dissiparia para um nível inferior que seria mantido durante um período de tempo mais longo, para manter a resposta. Esperar-se-ia igualmente que este análogo servisse como um intermediário para a preparação de análogos PEGuilados. Os resíduos de cisteína possuem reactividades únicas, e é frequentemente pretendido adicionar uma cisteína livre a uma superfície proteica. No entanto, devido à reactividade da cisteína, este tipo de proteína pode ser difícil de produzir. Sabe-se que a ligação dissulfito Cys7-Cys31 na subunidade α e rapidamente reduzida para um estado que poderia produzir uma cisteína livre. Esperar-se-ia que a introdução de uma cisteína na subunidade β, entre os resíduos 6 e 37 produzisse um tipo semelhante de ligação 135 dissulfito. É expectável que as cisteínas nestas ligações dissulfito sejam mais activa que outra na proteína, particularmente porque as mesmas se encontram numa localização que facilitaria a troca de dissulfito. Assim, o presente inventor esperaria que fosse possível fazer reagir a cisteína da subunidade α existente no resíduo Cys7 e uma cisteína adicionada no resíduo Cys6 da subunidade β com agentes que modificariam a proteína. Estes poderiam incluir aqueles capazes de PEGuilar a proteína e estabilizar os seus tempos de semi-vida. As cisteínas que são "libertadas" neste processo seriam capazes de formar uma ligação dissulfito intersubunidades que estabilizaria a proteína. A preparação deste análogo requereu a adição de uma segunda cisteína ao análogo conhecido como hCG/?'Y37C. 0 pMB940, uma estrutura que codifica para o análogo hCG/7' , foi preparado por meio de mutagénese por PCR, utilizando os oligonucleótidos 1161 e 1163 (Tabela 5) como "primers" e pCI'-hCG/?' como molde. 0 oligonulceótido 1161 serve como ponto de partida para a replicação de sequências que se encontram localizadas no vector pCI' e o oligonucleótido 1163 codifica para a mutação. 0 produto de PCR foi digerido com Xhol e Bani e ligado ao fragmento BanI-BamHI, obtido de pSVL-hCG/?' Y37C, no fragmento Xhol-BamHI grande de pCI', para produzir pMB941. A sequência de DNA da sequência codificante de pMB941 foi confirmada pelo método didesoxi. 0 pMB941 codifica para a sequência de aminoácidos apresentada a seguir: hCG/?'R6C, Y37C: raercf qglllilllsmggtvraskeplCprcrpinatlavekegcpvcitvntticagCc ptnstrvlqgvlpalpqwcnyrdvrfesirlpgcprgvripwsy&valscqcalcrrsttdc ggp k dhp1tcddprfqdssssk 136 Ο ρΜΒ940 e ο pSV2Neo foram co-transfectados para células CHO, sendo seleccionada uma linha estável por meio da sua resistência à droga tóxica G418. A proteína foi recolhida do meio e quantificada utilizando um ensaio imunológico em "sandwich", empregando o anticorpo anti-subunidade α A113, para a captura e o anticorpo anti-subunidade β radioiodado B112, para a detecção. Este ensaio confirmou a presença de heterodímero no meio de cultura. A actividade biológica do heterodímero foi medida num ensaio de acumulação de AMP cíclico, utilizando células CHO que expressam o receptor de LH de ratazana. Os resultados deste ensaio encontram-se ilustrados na Figura 46. EXEMPLO 16: Um análogo da hFSH contendo uma ligação dissulfito entre os terminais N de cada subunidade e entre os grupos de cisteína

Tal como observado anteriormente, a formação de múltiplas ligações de dissulfito pode ser útil para produzir um grupo de isoformas proteicas com diferentes tempos de semi-vida. Um análogo similar ofereceria uma abordagem melhorada para estimular o desenvolvimento folicular. A fracção do heterodímero não contendo uma ligação dissulfito intersubunidades e que não estava reticulada deveria ser libertada mais rapidamente do que a fracção do heterodímero que contém uma reticulação intersubunidades. Consequentemente, uma grande injecção inicial seria suficiente para estimular o desenvolvimento folicular inicial, mas a sua actividade seria dissipada para um nível inferior, o qual seria mantido durante um maior período de tempo. Isto mimetizaria mais rigorosamente o tipo de estimulação da FSH observado durante a fase folicular e pode reduzir a probabilidade de hiper-estimulação. Seria de esperar que a adição de uma cisteína ao terminal N da 137 subunidade β da hFSH ou que a adição do terminal amino da subunidade β de hCG ao terminal N da subunidade β de hFSH, facilitasse a formação do heterodimero e da reticulação intersubunidades. Um análogo da subunidade β de hFSH que se espera que forme um heterodimero semelhante ao do análogo do Exemplo 15, teria a sequência de aminoácidos apresentada a seguir: hFS3'0S-2C,Y31C: asemfqgill X XXls$aggfcwask©pXCt*seeXtni fc i&vakegc^fcitiKfc twc&gCcyt rdlvykáçazpkiqkt c t Xvye t vrvpgcahhads lytypvatqchcgkc dsd s t. dc tvr glgpsy cs f gsttike EXEMPLO 17: Um análogo de hCG com uma actividade de hFSH potente, contendo um arranjo dissulfitico semelhante ao análogo no Exemplo 15

Análogos de hCG, nos quais os aminoácidos 94-110 da subunidade β são substituídos pelos seus homólogos de hFSH, possuem uma elevada actividade de FSH. Seria de esperar que quimeras de hCG e hFSH contendo os resíduos 95-103 da subunidade β de hFSH no lugar dos resíduos 101-109 da subunidade β de hCG e contendo cisteínas nos resíduos 6 e 37 da subunidade β, formassem um arranjo dissulfitico semelhante àquele do Exemplo 15. Esperar-se-ia igualmente que estas possuíssem uma elevada actividade de FSH. A sequência de aminoácidos da subunidade β de um de tais análogos seria: CFC94 - 117#R6C, Y37C: memtqg 111111 Isrnggt waskeplCprcrpr na 11 svs ksg cpvc i t vr t r. icagCcpt ani srvXqgvlpalpqwcny rdvr f esirlpgcprgvnpwsy&valseqc&ic U a tí S t d C tvr- g I gp g y c S £ q e m k · :? o u s S H: a p- p O £ 1 p p â r I pg p S v* t-p 11 p q 138

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Lisboa, 30 de Outubro de 2006

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um análogo de uma hormona glicoproteica, em gue a referida hormona glicoproteica é seleccionada a partir do grupo constituído por gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona luteinizante humana (hLH) , hormona foliculo-estimulante humana (hFSH), hormona estimulante da tiróide humana (hTSH), e mutantes funcionais das mesmas, em gue os mutantes funcionais são formas modificadas das hormonas glicoproteicas, em gue as modificações não produzem ligações dissulfito inter-subunidades, e em que pelo menos 80% da actividade biológica funcional da hormona original é retida, com uma subunidade α e uma subunidade β, em que as sequências de aminoácidos das referidas subunidades da hormona glicoproteica são modificadas de tal modo a produzir uma ligação dissulfito intersubunidades entre uma cisteína da subunidade α e uma cisteína da subunidade β, cisteínas essas que estão dispostas entre dois resíduos de posições de resíduos de cisteína nativos da referida hormona glicoproteica e não fora das unidades de cisteína mais externas da correspondente subunidade nativa, para uma estabilidade melhorada, retendo o referido análogo pelo menos 25% da afinidade da correspondente hormona para o seu receptor da hormona glicoproteica nativa.

2. O análogo de acordo com a reivindicação 1, em que as sequências de aminoácidos das referidas subunidades da hormona glicoproteica são modificadas de tal modo a produzir uma ligação dissulfito intersubunidades, entre um resíduo de cisteína localizado no laço 2 da referida subunidade α e um resíduo de cisteína localizado no laço 2 da referida subunidade β. 2 3. 0 análogo de acordo com a reivindicação 1, em que as sequências de aminoácidos das referidas subunidades da hormona glicoproteica são modificadas de tal modo a produzir uma ligação dissulfito intersubunidades, entre um resíduo de cisteína localizado entre oito resíduos do terminal C da referida subunidade α e um resíduo de cisteína localizado no laço 2 da referida subunidade β.

4. Uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do análogo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

5. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, a qual é um líquido.

6. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, a qual é estável.

7. Uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6 para utilização no tratamento da infertilidade.

8. Utilização de um análogo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 na preparação de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, para a utilização no tratamento da infertilidade.

9. Uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6 para utilização na limitação da fertilidade. 3

10. Utilização de um análogo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 na preparação de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, para a utilização na limitação da fertilidade.

11. Uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica para uma subunidade α do análogo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3.

12. A molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 11, a qual é um vector de expressão.

13. Uma célula hospedeira eucarióta transformada com a molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 12, em que a referida célula hospedeira é capaz de expressar a subunidade α de um análogo de hormona glicoproteica.

14. Uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica para uma subunidade β do análogo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3.

15. A molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 14, a qual é um vector de expressão.

16. Uma célula hospedeira eucarióta transformada com a molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 14, em que a referida célula hospedeira é capaz de expressar a subunidade β de um análogo de hormona glicoproteica. 4

17. Um processo para preparar um análogo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, compreendendo os passos de: cultura de uma célula hospedeira eucarióta transformada com as sequência nucleotidicas das subunidades α e β, colocadas no mesmo vector de expressão ou em vectores de expressão separados; expressão do análogo; e recuperação do análogo expresso. Lisboa, 30 de Outubro de 2006