HU227908B1

HU227908B1 - Disulfide cross-linked glycoprotein hormones, their preparation and use thereof

Info

Publication number: HU227908B1
Application number: HU0100681A
Authority: HU
Inventors: William R Moyle
Original assignee: Serono Lab
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 2012-05-29
Also published as: ATE335000T1; CN1548458A; ES2268781T3; WO1998058957A3; KR100706469B1; AU7986198A; AR013139A1; SI1775346T1; EP1775346A1; KR20040039421A; JP4278668B2; EP0996629A2; US8530190B1; JP2005162734A; WO1998058957A2; DE69835433T2; CN1197968C; CN1302010C; IL133686A; EP0996629B1

Description

Dtsz-rshldküíésekkel keresrikötőtí gfc>pfotetehörtt®sok, etóálktásuk és alkalmazásuk

A találmány tárgya «·- ás β-stegységeí tartalmazó glikoproteinhornron, amely humán koriortgoaadoövpia (hCG) vagy humán tüszőserkentő hormon (hFSH), amely legalább egy, az a-alegyságbes található Tyt Cys ammosavra történő cseréjével nrődosított, miáltal az «- és β-aiegységek között drsaulfidkötés képződik.

A találmány tárgyát képezik továbbá a glikoproternhornronokaí tartalmazó gyógyászati készítmények, a glíkoproteiuhomronokat kódoló rekombináns nukleinsavak és eljárások a gltkoproteinhonnonok előállítására.

A ghköproteínhormoaok közé tartozóak a karkwgomd^ropm (CG), más néven korfegcasadoíropm, a lateinizálő hormon (Í-H), más néven (atropin, a thszőserkentö-kormos (FSH), más néven fhliitropin, valamint a pajzsmtrigysetkeotó hormon (TSH), más néven tirotropin. Ember esetében e hormonok neve humán korion-gosadotropin thCG), barnán lutéinízáló tamon (hLH), tartón tüszőserkentő hormon (hFSH) és tanán. pajzsrairigyserfetFo hormon (hTSH), E honsösok fontos szerepet töltenek be az iwaángyek és a psjzsmírigy thrikeiőjában (Pieree és mtsai., 1981; Moyle és tatai, 1995). A CG és az- LH az LH-mceptorokhoz kötődik, és azokat stimulálja, az FSH az FSHreeepiorokhoz kötődik és azokat stimulálja, a TSH pedig a TSH-reeepíorokboz kötődik: és azokat stimulálja. A CG elsősorban néhány emlösfaj, köztük a iöemlősök méhlepényében termelődik nagy mennyiségben. Főemlősökben a CG P-alegységének aminosavszekveneiája általában krUonhözik. az III aminosavszekvecc iájától, A lő félékben ugyancsak termelődik CG, ennek azonban: ngy-asm ammosavszekn-mvhájs, mini' a LH-nak (Murphy és mtsai., 1991),

Ahogy sz Píeree és mtsai. (1991} ősszefegiaM ptádskáetójáhsas szerepel a glifcoprö&intamonok. egy «- és egy S-alegységekből álló heterodrmerek. A hsíeroöimeíek nem kovalensen kapcsolódnak egymáshoz, {gy alegységeik savvagy «reakezelés hatására átsszoeiáihatnak (Pierce es mtsai, 19S1), A nragasabhreudő gerincesek többségében az aalegységet csak egy gén kódolja (Fiddes és mtsai., 1984); ugyanaz az «-alegység heterodimert képezhet az EH, az FSíf, a TSH, valamint - ha jelen van - a CG ^-alegységével is. A posztbsnsziációs tertöjcmódöátások, különösen a giikozilálás (Baenziger és mtsai., 1988) miatt azonban mégis különböznek egymástól az LH, az FSri, a TSH és a CG «-alegységei. A hormonok: közötti szekvenciális különbségek az egyes hormonokra speeiökss β-aiegységekben jelentessek (Fíerce és mtsai., 1981). Ezek az alegységek különböző gének termékei (Fiddes és mtsai,, 1984; Bo és mtsai., 1992).

Néhány kivételtől eltekintve (Bilibe és mtsai,, 1991) az α-β-beísroiiitnerek hormonális aktivitása jóval nagyobb, mint bármelyik alegységé önmagában: (Pterce ás misül, 1981). A természetben előforduki «- és ^-alegységek sokkal inkább képezitek «,β-heterodimereket, mint α,α-bomoáimere-lmt vagy β,β-boirsodirnereket. A hCG ot- és pafegységét kódoló gének együttes expressziója emlősökben α,β-beíerodimerek, továbbá íx-aiegység-moríornerek és βalegység-monomerek képződéséhez vezet, a,a- és β,β-honjoáínrereket a sejtek csak nyommá metmyiségekbexs termelnek vagy válasz-iMíak ki.

A tanárt kotta-gomáotropia (hCG) ttagydblbontású röntgenkrészíaliográSás szerkezetéi két munkacsoport is meghatározta (Eapthora és mtsai,, 1994; Wu és mtsai., 1994). A meghatározok szerkezetek alapján kiderült, hogy az eredetileg javasolt disztilődlád-misiáztst (Mise és mtsai. , Í98ö & 1981) nem felei meg a valóságnak, és hogy a hormon a ciszim-esornőí tartalmazó fehérjék családjába tartozik (Sun és tstsaí., 1995). Mivel a cisztemek egymáshoz képesti elhelyezkedése minden glikoproteínhormonhan hasonló,, valószínűleg ezekben is megtaláitötó a hCG-re jellemző eiszdn-csomó_: szerkezet,

A gerkteesek gh'koproteiahorm&tijaínak «.-alegységében a císzíőnek hasoaló módos helyezkednek el (l-A. és 1B. ábra). A hCG α-alegységét basználva «sodellkést látható, hogy a císztln-csomöi sz α-ategység második, harmadik, ötödik, hetedik, rtyolosdik és kilencedik ciszteisje hozza leire, igy slakul ki az «-alegység bárom «agy imrka (IÁ. és 1B. ábra). Az 1. hurkot a. második és a harmadik císzteír: közötti anánosay^zekveneia, a 2. hurkot az ötödik és a hetedik ősziem közötti aminosavszekversőa, a 3, hurkot pedig a hetedé és a nyolcadik cisztem közötti amwsavszéfotewsa alkotja. A gerwesek giiköpro-teinhormopainak β-alegységSxjo a cisztömek hasonló -módon keiyezkedmtk el (Pisroe és mtsak, 19813. A hCö β-alegységéí használva modellként látható, hogy a eisziin-csomót a 6alegység első, «egyedik, ötödik, hatodik, nyolcadik és kíie«cedik őszteinje hozza létre, így alakul ki a β-aiegység három nagy hurka (2A. és 2B. ábra). Az 1. hurkot az első és a negyedik ősziéin közötti ammosavszekvmcia, a 2. hurkot az ötödik és a hatodik cisztein közötti a«űnosavszekvencia, a 3. hurkot pedig a hatodik és a nyolcadik ősziem közötti amioösavszekveneia alkotja. A glikoprotemfeomronok egyes. alegységeiből úgy hozhatunk létre működőképes kimérákaí, ha egy «-alegység egyes részleteit egy másik «alegység homológ régióival heiyetíesitjök, vagy ha egy' p-alegység egyes részletest egy másik 3-ategység homológ régióival Iteiyeítesítjük (Campbell és mtsai., 1991; Moyle és mtsai., 1999; híoyie és mísai., 1994; Cosowsky és ssteai., 1995; Moyle és .mtsak, 1995: Cosowsky és mísai, 1997). A ghköpröteÍHho.vwn-alögységek szerkezeti elemeinek általános sémáját az IC. ábrát*, mutatjuk be, az 1A. táblázat pedig a hutnánglAoproteiohorntoti-alegységek megteletö pozícióit tartalmazza.

IÁ. táblázat

Az IC. ábrán bemufstöit szerkezed el&meknek megtelelő amtsosavszekveseiák a taxán hortnonaisgységeköen

i N-teműítálls	L hurok	•7	hurok	3, hurok	Cisziut-esomö
i a	1-6	a	11-27	«	61-81	a	85-92	c:	10,	28-32,
[.CGp	1-8	CGd	10-3.3	CCS	58-8?	cop	91-145		60,	82-24
ΙΉβ	1-8	UiB	10-33	w	58-87	ΕΗβ	91-vcg	CG0	9,	34-38,
FSH8	1-2	FSl-Ιβ	4-2?	FSl-Ιβ	52-81	FSHŐ	85-111		57,	88-90
TSH0	1	TSHg	3-26	TSHg	53-82	TSH0	8Ő~vég	ΕΗβ	$,	34-38,
									57,	88-90 i
								FSl-Ιβ	A v>_V	28-32, j
									51,	82-84
										'W 7 í
								i 3 rí p	-i-X	X· t i-χ.
1									52	83-85
A efezt-b	r-cse	mó ste	lett a β-aiegys	tégegyl	izíonsági övt	tek nevezek szekvsmciarészfetet	is tartalmaz (Lapthom

és mísai., 1994), amely az «-alegység második hurkát burkolja be, A biztonsági öv a kilencedik csszíeinnél kezdődik, amely a β-alegységhes lévő esontö utolsó amioosava, és magában foglalja a tizedik, tizenegyedik és tizenkettedik cisztemí. Egy diszulíiákőtéseo keresztül kapcsolódik a β-alegység. első tokához, amely a tizenkettedik ősziem (azaz a btonsági öv karfeoxitermiualis vége) és a harmadik ősziéin (azaz a, főegység első hurka) között aktiad ki,

A hCö β-alegységében a biztonsági öv jelentős (ha sem elsődleges) szerepet tölt be abban, hogy a hCG meg tudja különböztetni egymástól az LH- és az FSH-receptörokat (Ca=«pfeeli és mísai,. 1991; Moyle és mísai., 1994). Ha a liCG-beslévő biziooságílöy atEŰoosavszekyem: iáját részben vagy egészbet: & hFSH-ban található χ« XX

Φ χ » χ χ *

XXX X biztonsági Öv anthrnsavszekvenoíájávai helyettes kjük, akkor megváltozik a kapott homtonanaiőg receptorspecifi-t-ása. A hCG normális körüituények között több náwt lööti-szer jobban kötődik az L-H· reccptotokhoz, min!: az FSH-receptorokhoz. A ÖCG egyes analógjai, jutat például a CF94-H? vagy a CF101109, amelyekben a biztonsági öv KH. antinosavtöl 109, aofetosavig terjedő szakaszát {ödy-Gly-Pro-i..ys-Asp·· MIs-Pro-ltea-Thr) a hPSH megfelelő aminosavaira (Thr-Vai-Arg-Gly-I.eu-Gly-Pro-Ser-Tyr) cseréltük, sokkal jobban kötődnek az PSH-reeeptorökhoz, mint a hCG (Moyfe és snísat., 1994). A. biztonsági öv szekvenciájának, manipulálásával előállíthatunk továbbá, meghatározott I.H- és FSi-l-akövkássai rendelkező hCG-tmslógokat is (hfeyle és mtsai., 1994; Hars és latsai., 1996). Az említett analógoknak esetleg fontos terápiás szerep juthat a terft és női íonnékenység fokozásában.

.A ghkoproteinhomiooók alegységen bekül disznlítdköléseinek többsége elengedhetetlen a biológiai aktivitás kifejtéséhez. Az egyes ciszteinek más am kősavakkal, nevezetes alanlnaai történő helyettesítése alapján kiderült, hogy a eisztin-csomő és a biztonsági óv áiszuliklkötései mind esszenciálisak a heteroditner feltek.eredése szempontjából (Sagasuma és mtsai., 1989; Sedov/s ás mtsai., 199); kawhashi és mtsai., 1994), A többi - a hantán «-alegység 7. és 31. císziemje, valamint 59. és 87, clszíeinje, továbbá a hCG β-aiegységének 23, és 72. cisztelnje közötti - diszsdíldkőíés sem a heterodsmer kialakulása, sem pedig a hormonaktivkás szempontjából nem esszenciális.

Ma még nem létezik olyan nagyfélbontáső krisztidfegráfiss szerkezet, amelynek .segítségével le tudnánk írni a giikrmrmeinhotnmnok és receptoraik közötti kölcsönhatásokat. Számos modell készüli már a hormemreceptor komplex szerkezetének leírására, amelyek többsége a hCG és egy olyan fehérje - a ribonnkleázinhibiinr - teztailűgráfíás szerkezetét veszi alapul, amelynek szerkezete hasonló lehet a gííkoproteaibctfEnon-reeeptotok exíraeelluiárss doménjébez, A : receptorral kölcsönhatásba lépő aminosavak azonosítására. tett erőfeszítések többsége a receptorkötés csökkenéséi: eredményező kémiai, enzimatíkus vagy genetikai mutációk hatását vizsgálta. Sajnos .azonban a kötés csökkenését nem csak a specifikus koní&ktfolülei megbomlása, hanem a hormon konformációjának megváltozása is előidézheti (Cosowsky és mtsai., 1997), ami miatt a fenti módosítások hatásainak interpretálása igen nehéz, ha nem lehetettem Ennek nyomán a szakterületéé jelentős nézeteltérések keletkeztek {Resnyés mtsai., 1996, Bergen és mtsai,, 1996), sőt egyes kutatók arra a meggyőződésre jutottak, hogy nem lehet meghatároz®! a hormonnak a reeepiorkomplexbett kialakuló otiemáelóját (Blowmfek és mtsai,, 1996).

A hormonnak a reeepterkenvplexben jellemző orientációját más módszerekkel is megpróbálták meghatározni. Itt a bemosnak azokat a régióit próbálták beazonosítani, amelyek nem lépnek kontaktusba a receptorra! és így a receptorkötés ntá« is hozzáférhetőek és/vagy anélkül módosíthatók, hogy ezzel zavar keletkezne a hormon-receptor kölcsönhatásokban. Ezeknek a régióknak a hCG kriszSttilográliás szerkezetén (Lapthotrs és mis»·.., 1994; Wu és mísak, 1994) történő elhelyezésével sikerük kidolgozni egy, a hCG és az 'LMl-receptorok közelii kolcsötátatásokni. leíró bipoietíkus modellt (Moyie és mtsai., 1995). Az eredmények arra engedtek következtetni, hogy az α-alcgység második hurka, valamint a jh-ategy ség első és hartoadik barka által kialakított barázda vesz részt az elsődleges receptorkotüaktusban (Cosoteslty és mtsai,, 1995). Ez azt is megmagyarázná, hogy miért van szükség mind a két alegységre ahhoz, hogy a hormon és a receptor közölt erős kötés alakuljon. ki (Pierce és mísak, 1981). A fenti következtetést alátámasztó adatokat részletesebben az alábbi bekezdésekbe» ismertetjük. Meg kell azonban jegyezni, hogy a szakterületen érdekeli többi kutató általában azi a modell támogatja, amely szerint a hormon teljesen másképp helyezkedik el (Remy és srtteai,, 1996; Berger és mtsai., 1996), bár ők Is Isν Φ ν V Φ κ ·» » Φ Φ- φ y Φ * * « >«*» *φ ΦΦΦ y merik. a- fonti másik modellt (azaz idézik azt a publikációt, atnsfiy szerint az elsődleges röcepiorköioheíyet a hormonban lévő barázda alakítja ki).

A hCG «-alegységének a receptorkontaktusban látszólag részt som vevő régiói közöl több is lecserélhető anélkül, hogy ezzel megzavarnánk az I,í-I-secspíorokhoz való kötődést. E régiók közül egyesek egyértelműenhozzáférhetők a bonnon-receptor komplexben, átível akkor ís reakcióba lepnek a iáink specifikus monokíonáfis antitestekkel, ha a hCG LH~reeeptöKtkboz kötődik. (Moyle és misak, I791): Cosowsky és tntsai., i 795; Moyle és misak, 1995), Bár a tanán és a szarvasmarha «-aíegy ségek ummosavszekveucisja igen különböző, a szarvasmarha «•‘alegységből- és a hCG- b-aiegységből kialakuló heíotodlmer jól kötődik mind a humán, mind pedig a patkány I.H-reeepiorokhoz: (Cosowsky és misai., 1997), Ezeket a Imterodhnereket a h€G «-alegységének 1, és 3, hurkán lévő epiíópokát felismerő mottokionálts antitestek köíssyedén megkülönböztetik egymástól (Moyle és misei,, 1995). A fenti megfigyelések azt mutatják, hogy a humán és a szarvasmarha «-alegységek. I. és 3. burka különbözik egymástól, ami arra. enged következtetek hogy a hormon ezen régiói nem játszanak kulcsfontosságú szerepet a reeeptorkontaktesban.

Annak összehasonlításával, hogy egyes monoklonális antitestek milyen mértékben, képesek olyan hCöanalógok fölismerésére, amelyekben az: «-alegység egyes részletei hn-nán vagy szarvasmarha eredeté fehérjékből szánnaznak, meg lehetett. határozni azokat az amiamavakat, amelyek részi vesznek az antitesikbtésben (Moyle és mtsak, 19§5>. Egyes, a- hCG «-alegységén lévő epitópokra specifikus monoklonális antitestek az «-alegység egy fcípszmes emésztéssel előáiíttotf és így az «-alegység második hurkának nagy részét nem. tartalmazó fragmenséi is felismerték (Lapihotn és rntsai., 1 794; Wn és snt&h., 1994; fiirken és mssai., 1986). Ezt a megfigyelést a fonti antitestek kötőhelyeinek meghatározására és/vagy igazolására Is felhasználták (Moyle és mtsak,

1995). Az «-alegység-e pltőpokaí fölismerő A löd és A4(i7 jelé (Moyle és misak, 1995) monoklonális antitestek akkor Is kőtődnek a bCG-hez, amikor a hormon az LH-recepforokhoz kötődik. Az «-alegységnek a fenti antitestek áltál felismert amínosaval tehát feltehetőleg nem kötődnek az LH-receptorhoz (Moyle és-mtsai., 1795). Az «-alegység fennmaradó része magában foglalja a második hurkot, valamint a fehérje C-tenmnusát is. Az «:· alegység e nagymértékben konzerválódott aminosavamak egy része részt vehet a reeepíorkontoktasbat·..

A hCG ^-alegységben is van számos olyan, az LH-reeepíorökksl való kontaktusban feltehetőleg részt nem vevő régió, amelyet az LH-receptorokhoz való kötődés megzavarása nőikül mntagenizálhatnnk. Ide tartozik: például a ((-alegység 2.. hurka. A CT39-SS jelű bCG-asalógos, amelyben a b-alegység 2. hurkát a bESH 2, hurkával helyettesítették. (Campbell és mtsak, 1391), az FSH β-alegységének 2, barkára specifikus, de a hCG galegységenek 2. hurkával nem reagáló monoklonális antitestek könnyedén meg tudták különböztem!. Ez azt oatatja, hogy az említett analóg második burkának szerkezete különbözött a hCG második hurkának szerkezetétől. Mindezek ellenére ez a fi-alegység egy «-alegységgel olyan «,β-hefoíodlmeri alakítod ki, amely a hCG-hez hasonló ínértékben kötődőd az kB-receptorokhoz (Casspbeli és misak, 1991). A hCG β-aiegységének második hurkában tehát alig van, ha egyáltalán van olyas aminosav, amelynek esszenciális szerepe lenne az LHreceptorokksil alkotott kontaktusban. Hasonló módon. feltehetőleg a hFS'H ^alegységének második hurka sem vesz részt az FSH-receptorokkal alkotott kontaktusban. A hCG β-alegységének €f94-117 jeíü aoalögja (Campbell és mtsak, 1991), -amelyben a tizedik ciszteintől a molekula. C-leonínálisáig terjedő szakaszt a biSH megfelelő szekvenciájával helyettesítették, továbbá a hCG β-alegységmek Cf 94-114 jelű analógja (Wang és *4 φ» *5. ♦ * *

4 4« 4' '»'»·# 4 « 4 4

4X44 4 4 4 Μ « 4 sassal.. 5994), aowíyben a 94. amicosavtó-l s 1!4, aminosavig terjedő sztksiszt a hFSM tnegfeiető szekvenciájával helyettesítették, -sokkal jobban- kötődik sz FSH-mceptorokhoz, mini az öi-reeeptorofchoz, bár a β-alsgység második hurka kizárólag hCG-szekvenclát tartalmaz. Mivel a β-alegység második 'hurka feltehetőleg csak igen kis mértékű hatást -gyakorol a hormonnak az LH- vagy az FSH-recepíorokhoz történő kötődésére, valószínűtlennek látszik az a feltételezés, hogy ez a régió részt venne- az LH- és k SH-receptorokkal kialakított nagy affinitássá kontaktusokban. A β-alegység második burka az «-alegység alsó és harmadik hurkának közelében helyezkedik el, amelyek látszólag ugyancsak nem- lépnek kontaktusba a .receptosTki. Valószínűnek látszik tékái, hogy a hCG «.-alegységének első és ivirmadik hurka, továbbá a β-alegység második hnrka egyáltalán nem lép kontaktusba a receptorral, Ahogy arról a későbbiekben majd részletesebben is szótok, föltételezhető, hogy a hormonnak ez a régiója a receptor extraeelkdans doménje által alkotott -paikóalaká mélyedésbe sn-álik be (Moyle és mtsai, 1995).

A :hC<3 β-aiegységének a nagy affinitásé reoeptoskotoktusban részt nem vevő anrinosavait a specifikus monoklonál'fe antitestek akkor is felismerik, ha a hormon az Ul-receptorokhoz kötődik (Campbell és mtsai., 1991; Moyfö és mtsai., 1990; Cosowsky és mtsai.. 5995). Ide tartoznak többek között a Ó-alegység 1. és 3. tokának az «-alegység-interfésztöl legtávolabb elhelyezkedő, a B1Ö5, a 13 583, a 13115 és a 13112. stb. jelű monokksuális antitestek által felismert régiói. Az említett antitestek akkor is kötődnek a bCO-hez. amikor az az LH-receptorokkai alkotott komplexben van (Moyle és .mtsai,, 5990 Cosowky és mtsai., 1995), ami Igazolja, hogy a β-alegység 1. és 3 . harisának ezen részletei valóban cere létesítenék esszenciális receptorisontakáusokat. Más vizsgálatokból az is kiderült, hogy a hCö P-a-legységénekN-Imslnálísa és első- ciszteittje, továbbá tizenkettedik. ciszteinje és C-terminálisa közötti szakaszokon et lehet távoittoí részleteket a;telküi, hogy a hormon LHrecepí-or-kötését ezzel megszüntetnénk (Huang és mtsai;, 1993). A β-alegység fennmaradó része .tartalmazza a biztonsági ővet. Ezért aminosavak közűi feltehetőleg csak kevés vesz részt az 1..H- vagy FSH-rec-eptotok nagy affinitása kötése szempontjából esszenciális kontaktusokban. Kiderült például, hogy .az LH-feceptorokhoz való kötődésre alig, vagy egyáltalán nem hat, ha a biztonsági övnek a tizenegyedik és a tizenkettedik eiszteiu közé eső szakaszában egyes aminosovakat megváltoztatunk (Moyie és uttsai., 1994). A tizedik és a tizenegyedik ciszte in közé eső .aminosavak megváltoztatása kevesebb, mmt ötszörös Íratást gyakorolt -az FSH-kötésre (Moyle és attssi., 1994). A lóból szánnaző 111-ban (eLH) és Cö-bso icGG) található- biztonsági öv legfőbb aminosava különbözik az FSli-étöl (Pieree és mtsai., 1981; Murphy és mísas., 1991), az eLH és az eCG mégis jól kötődik a patkány PSH-receptorboz. Sőt, a tisztított eLH /« vitro legalább 30%-kal jobban kötődik az FSFI-receptorho^ mint. a hPSH (Moyle és mtsai.., 1994), A hCG b-afögységének eddig nem tárgyalt részletei közé tartoznak az 1. és· 3. hmkoknak az a-aiegység-mterfészhez legközelebb elhelyezkedő felszínei.. Valószínű tehát, hogy a hormon ezeken a helyeken keresztül érintkezik a -receptorral. A «-alegység egyes részletei akkor is felismerhetők a spedfxkns -nronoklüttáíis. antitestek számára, ha a hCG lil-Kjeeptor-komplexben satu. Ide tartoznak az A105 és az Á4Ö7 jelű- antitestek által felismert aminosavak (Moyle és rn-tsai, 1995).

A .glikoprotemhormoxtek receptorral kölcsönható régiótok azonosítása történhet .egynél több receptort: felismerő honrtonanalőgok alkalmazásával, is (Campbell és tntsat., 1991; Moyle és mtsai.,. 1994: I-ían -és mtsai., 1996; Campbell és rnísai., 1997). Ha a hCG β-alegységébee található biztonsági övei egyszerűen a hFSH-ban találhatóval helyettesítjük, azzal olyan hormonanalógot hozhatunk léire, amely az PSH- és a TSH-receptorokbo-z: is kötődik (Campbell és mtsai., 5997), Ez az analóg semmilyen TSH-specilikus atejnosavszekvencíe-részfötet nem tartalmaz, mégis a 'FSH-hoz hasonlóan ki -tudta váltani a maximális TSH-cábszt. A többfunkciós analógok

X ·♦ ** X* * A X 4 » * ♦ ♦ * 4 X

A XX 44 XX X * * 4 aktivúasának összehasonlítása alapján arra a következtetése juthatunk, hogy a biztonsági övben található legtöbb atninosav feltehetőleg nem létesít kulcsfmtosságö és nagy atöbiiíású raceptorkontaktusokat. Ugyanez: mondható el a β-alegység második hurkában található majdnem romáén ammosavsói is.

A .LH-, FSH- és TSHrreceptorok egyikérői sem áll rendelkezésre krísztdiográttás szerkezet. Nagyon sok. gW^roteinhoonoa-receptoxnak azonban ismert az atntnosavszekveactája (Moyleés mtsai., 1994: MeFarlandés mtsai., 1989; Loosfclt és mtsai., 1989: Segafotfés mtsai.,. 1999; Spreagd és mtsai,, 1990; Braun és mtsai., 1991;. Nugayama és mtsai., 1991; Nagayamaés mtsai., 1989; íia és mtsai., 1991). Valószínű, hogy e fehérjék mindegyike rendelkezik extraeellulárís, tmnszmembrán és isö-aeeMáns doménnel. Ha a receptorokat: a íranszmerahtán vagy -az iatraeeifeláris dómén nélkül (Braun és mtsai., 1991; Ji és tnísai,, 1991; Xie és mtsab, 1990; Moyle és mtsai·,, 1991), vagy más öaaszmembxán doménekbez kötve expresszijük (Moyle és mtsai., 1991), akkor káderül, hogy a iiganóamaBmitás túlnyomó részben az extracelíuláris dómén sajátja. Az említet? reeeptorfehérjék estraoeíluíárís dométije; a leucittban gazdag, ismétlődő szakaszokat íartaímaző fehérjék családjába tartoznak, a transzmerobrán dómén pedig hét olyan bidrofób hélíxet tartalmaz, amely átéri a plaznnunfimbráut (McFarlaoá és mtsai,, 1989). Már ismert a leucktban gazdag, ismétlődő szakaszokai tartalmazó fehérjék szerkezeti model íjéként használt ríbonukfeázinbibltor krsszíaltográlsás szerkezete,, amelyről kiderüli, hogy psfköalakő (Köbe és mtsai., 1193 és 1995). Ez a felismerés arra engedett következtetni, hogy az LH-, FSH- és TSH-recepiorok exísaeelWáris döménie is patkóaíató (Moyle és .mtsai.·, 1995). Az 1,13- és az FSH-recepteokbaa a hCG- és a hFSH-kötó specífisást meghatározó extracellutám dómén egyes részleteit LH/FSH-kiinérák segítségével azonosították be (Moyle és mtsai., 1994). A hCG-nek az LH-reeeptorokkal legnagyobb valószínűséggel kontaktusba lépő .szakaszuk továbbá az LH-rcceptontsk a Itgsndumkőtö specifilásért felelés szakaszai fjgyeiembe.vételéve.1 elkészült egy olya» modell, amely megnxagyarázza, hogy a hCG hogyan lep kölcsönhatásba az LH-receptorokkal és hogyan váltja ki a jelátvitelt íMoyle és mtsai,, 1995), Ebben a modellben az α-siegység. második. burka és a βalegység első és harmadik hurka között kialakuló barázda a patkóalak közepének közeiében lép kontaktusba a receptor sxtracellalám doméajémek peremével (Moyle és mtsai., 1995), A hormon többi része a patkó karjai közötti térbe nyúlik be. Araikor a hormon a receptorhoz kötődik és beayúlik az említett térbe, az «xtracsílulárfe doméimek egy, a jelátvitelhez szükséges koöíbrmáctéíiát stabilizálja. Ezt .az extraceltöíáris és a transzmembrán dómén közötti, a receptor megfelelő sejtfelszíni expressziójahoz szükséges specifikus kontaktusok továbbítják a transzmembrán, dómén felé (Moylo és latsai., 1991). A modell alapján az is megmagyarázható, hogy az olígoszachaiidók hogyan befolyásolják a jelátvitelt (Moyle és missi,, 1975; Maizok és mtsai., 1989). Bár e modell alapján meg lehet magyaráznia fenti adatokat, mégis szüléitek ettől eltérő modellek is, amelyekben a bC<5 .más részei vesznek részt a receptotral való kölcsönhatásban (Jiaag és mtsai., 1995), Továbbra sem világos tehát, hogy hogyan lépnek kölcsönhatásba a glikoprotefehormonok és receptoraik.

Ha Így·· tekintünk a öonnoa-reoeptor kölcsönhatásra, akkor arra is tnagyarázatoi kaphatunk, hogy miképpen gátolják a hCG kötődését: olyan régiókra specifikus morioklenáhs antitestek, amelyek a feltételezések szórtat nem vesznek részt, -a kulcsfontosságú oeceptorkoaíaktusokban. Ahogy azt már korábban emiúetmic, ide tartozik többek között az «-alegység 1. és 3, burkai, valamint a h-aísgység 2. burka által kialakított felszín, A modellben ezek a régiók a receptor extraceliuiáxis áornéojének N- és C-termlnáíis karjai közötti térbe nyúlnak be. Hu azonban ezekhez a régiókhoz antitestek kötődnek, az megakadályozza, hogy a hormon bekerüljön az említett térbe.

A legtöbb gerinces fajba» a glikcproteiuitermonokhaa található raszternek hasoaíö· triódon, helyezkednek el (Píöree és rntw.., 1991), aoít arra enged következtéim, hogy-a hCG-hez hasonló módon tekerednek fél, .A ghkoprcncifemrsxmok receptorainak szerkezete· az exiraeellulárfs doménbeo található· íeucinban gazdag, ismétlődi) szakaszok, valamint a transzmemferán doménbeo. található nagyszámú konzerválódott amlnosav közti hasonlóság alapján valószínűleg ugyancsak meglehetősen jól össze vethető egymással (Moyle és mtsai,, 1994; Braun és mtsai,, 1991; Nagáyama és mtsai,, 1991). Valószínű tehát, hogy bármely modell -alapján, amely le tudja írni a hCG és 82 Ltí-recepíorok közötti kölcsönhatást, meg leket majd jósolni az egyéb g'tíköpfotemhocmono.k és receptoraik közti fcőlesöshatásokat. A biztonsági öv például ágy befolyásolhatja .a Hgandum-receptor kölcsönhatást, hogy megváltoztatja a he nnoxiafegy ségek egymáshoz képesti pozícióját (Cososvskv és mtsai., 1997), aminek eredményeként megváltozik az «-alegység: második hurka, valamint a β-alegység első és harmadik burka között kialakuló barázda alakja is. Ezek alapján az a feltételezés szüléiéit, hogy a hormonban és a receptorban lévő inhibhoreiemek felelősek a nem megfelelő figandunvreceptorkőlcsönlmtásokért (Moyle és mtsai., 1994). A biztonsági öv hatása tehát úgy jelentkezik, hogy a hormon alakjának megváltoztatásával csökkenti .a hormon azon képességét, hogy bele tudjon rlles^cednr a padcő központi részébe.

A gíikoproteirátormonolmt sokféleképpen használják lel a. gyógyászatban.. Az FSH-t a petefészekben lévő tüszők fejlődésének beindítására alkalmazzák az: ovuláció- (peteérés) beindításának előkészítési fázisában (Galway és mtsai,, 1990; Shctham és mtsai., 1991; Gsst, 1995; Öltve, 1995). Az I.R-t és a h€G-t ugyancsak a már fejlődésnek indult tüszők ovulációjának kiváltására használják. Férfiaknál az F-SH-t, az Όϊ-i és a hCG-t a herefunkció beindítására alkalmazzák. Sár az isméit hormonok -mind nőkben, mind férfiakban felhasználhatók az ívarmírxgyek és a psjzsmtógv funkciójának stimtrlálására, a gyakorlatban ebhez az szükséges, hogy -a hormonok heterodinserként legyenek jelen. .Az -említett hormonok közül pl. az LH-t és a FSfí-ί a hipofízisből (agyalapi mirigy), a lő korkm-gorradotropmt -a szérumból, a hCG-ϊ terhes, a bili és a hFSFl keverékét pedig posztmenopauzálts nők vizeletéből lehet izolálni. Aktív heterodimerek elöállirbatók továbbá olyan-sejtek, ezen belül tumorok tenyészeteiből, -amelyek mind az.mind pedig a β-aíegységet expresszálják (Colé és mtsai., 1981), vagy amelyeket az a- és a β-alegységei kódoló cDNS-sel vagy genondáíis· DNS-sei traaszfoktáltak (Reddy és mtsai-,, 1985). Sőt. ez utóbbiak jelentik a terápiásán alkalmazható glrkoproteinhormonok egyik tegfoxtossbb forrását. Ismert tény, hogy a giilícpretelnhörmonok oKgoszackaridtoidaíláseai befolyással vannak a hormon jelátvtvö képességére (Moyle és mtsai:., 1975; Matzuk és mtsai., 1989), igy az aktív beterodimereketeukaríőla sejtekben lehet a legjobban előállítani. Ezek a -sejtek ugyanis képesek arra, hogy az olígoszaeharidoldalláncokhoz mamxózbau gazdag obgonzaeharxdokat kapcsoljanak, sőt bizonyos esetekben arra is, hogy ezeket a természetes előfordulású hormonokra jellemző komplex •ol.igoszacharidokká alakítsák át (Baersziger és mtsai., 1988). Mindezek ellenére mivel a különböző eukarióta sejtek különbözőképpen processzálják a gliteíivcleinekeg a gííkpprotehxhortaonoknt gyakran emlős sejtven alakban, például kínai· hörcsög petefészek sejtekben- (CHO-sejtekj állítják elő. Bár a hormonok cleállíthatók nem emlős eukarióta sejtekben is, az öíígoszaehatid-oldaliáncök feltételezhető autigemertása korlátozhatja klmikai afeatorazhatóságukat.

A heterodxuxer hormonok felhasználhatók ezen kívül ímmunogénként is olyan -axitiszérum- előállítására, amelynek .segítségével esökkeotlxető a termékenység. (Singh és mtsaí,, 1989; Pál és mtsai., 1990; Xabvar és mtsai., 1986; Tahvar és mtsai, 1992; Moudg&l és mtsaí., 1971: és 1972; Moudgal, 1976; Ra-vindranath és mtsai., 1990; Móudgal és mtsai,, 1978), A hCG-nek az embert terhesség fenntartásában betöltőit esszenciális· szerepe miatt hCG-re specifikus ímm-unreakció· kialakításával fogamzásgátlást Métánk et, ezért, már eddig is jelentős

* ·♦ erőfeszítések fottésitek a bCG-alnpó fogamzásgátló oltóanyagok kifejlesztése érdekében. .Elvben azonban a hormonokra specifikus antitestek a termékenység fokozására is alkalmazhatók. A sokcisztás petefészekbetegségben szenvedő nőkben például igen magas az: LH-szint A termékenység belyreállbása szempontjából tehát igen hasznos lenne egy olyan eljárás kidolgozása, -amelynek -segítségével anélkül csökkemhetjők a kerisgéshen az LS-aktivitásÁ hogy teljesen megszüntetnénk.

Ma. tnég nagyon keveset tudunk a gükopwteihhonnonok metabdizmasáfok Ismert, hogy a hormonok feléfefefejé'Í a Irozzájak kapcsolódó oKgoszachuridfoldallfetcok, különösen a terminális cukorkotaponensek határozzák meg ('.Baettztger és mtsai., 1988). Azok a legstabilabb hormonok, melyek ezen a helyen a legtöbb sziálsavat tartalmazzák (Murphy és mtsai., 1991; Baetóger és mtsai., 1992; Fiete és mtsai., 1991; Soiith és mtsai., 1993; Rosa és mtsai., I 984), Mindazonáltal w csak az eügoszaehartdok felelősek a hormon stabilitásáéi?!, feszes ismert, hogy a szabad honaonalegységeköek sokkal Povidebö a féiéletideje· a keringésben, pétiig ugyanazokat az oligoszacbarid-oldalláneokat hordozzák, suttt a tóetodimerefc (Wehmann és mtsai., 1984; Kardana és mtsai., 1991). Emiatt aztán felmerült az a gondolat, hogy a .hormonok inaktiválódásáí az alegységek dísszocaicióitó előidéző-proíeülizis okozhatja (Kardsna ás mtsai, 1991; Birken és mtsai, 1:991; -Colé és mtsai., 1.991; Colé és mtsai, 1991: Colé és mtsai, 1993). A behasttott hCG sokkal gyorsabban esik szét alegységeire, mint a hCG (Colé és mtsai, 1993). Valószínűnek látszik tehát, hogy az -alegységdisszociácló megakadályozássá val neveim isiiéi a hormon hatskoítyságái.

Denaturáló körülmények, például hőkezelés, szélsőséges pH vagy orca hatására a giikoprotemhormonok alegységei gyorsan disszociábsak (Fieree és mtsai, 1981; Colé és mtsai, 1993). A legtöbb glikoprotemhormonpreparátamot ezért liollbzáh por alakjában szokták .tárolni. Ha sikerülne növebú a heterodbner stabilitását akkor a hormonokat, vizes oldat formájában is lehetne, tárolni és: forgalmazni. Emsek eredményeként, azután, nem lenne szükség sara, hogy a gyártó a hormon mellé külön oldószert is szállítson, továbbá a végfelhasználónál is megszűnne a rekonstttúc-lós lépés.

Sokan próbálkoztak-már azzal, hogy az alegységek ‘’keresztkőtéséver s;ablhzalják a hormonokat. Ehhez kémiai keresztköiésí eljárásokat alkalmaztak (Weare és mtsai, 1979 és 1979), ami azonban csökkentette a hormon aktivitását Arra is megvan a lehetőség, hogy az ct~ és a β-alegység genetikai totójával egyláneó hormont állítsunk elő. Az így kapott molekula stabilabb, mint a beterodimer és biológiai aktivitása is nagy (Sugahara és mtsai, 1985), azonban nagyba» különbözik a natív molekulától.

A fehérjék keresztkötésének egy további módja a dísztó(kikötésekkel· történő ktpányvázás. Ezt a stratégiát - amely vtóöszináleg átveszi a biztonsági Öv szerepét - köved a természet is, amikor a eisziín-csomót tartalmazó fehérjék szapercsaládjába tartozó egyéb molekulákat stabilizálja {Sun és mtsai, 1995). Disztdüdkőtések beiktatásával fokozhatjuk egy fehérje stabilitását, feltéve hogy ez nem növeli a fehérjén belüli belső feszültséget {Mattbem és mtsai, 1987; Maísumura és mtsai., 1989). Gbfeoprotejnbommn-hetemdimmek diszulfidkötésekkeí történő stabilizálására tett kísérleteket ismertet példán! & CA 2188508 sz. kanadai szabadalom. Han ás mtsai. (1996) is megemlítik az alegységközi diszaltidkötesekeí, azonban égy «ydaikoznak, hogy az. ilyen disznlbákötések beiktatása csökkentheti a hormon aktivitását, Esnek az az oka, hegy az -említett heterodimerek komplex fehérjék, amelyekben számos diszutíidkörés található. Ha ezekbe újabb tószt.eisit viszünk be, azzal megzavarhattuk a folíékeredést, amelynek. eredményeként funkciőképteíeu fehérjékhez jntttuk. 'Nem-valószínδ továbbá, hogy más. cisztin-csomói tartalmazó fehérjék segítségével meg lehetne jósolni azoknak a diszalfklkotéseknek az elhelyezχ Φ ΦΦ Φ**Φ * «. *. « χ * *

ΦΧΦΦ « » φ * * ν ΦΦΧΧ *« * kedését, -amelyekkel stabilizálni tehetne a glikoproteinhormonokat, isivel más -riszttn-csomót tartalmazó fehérjék afegységszerkezete igen különböző lehet a gllkopmieirtormenekétól (San és másai., 1995),

A különböző publikációkra történő hivatkozások -nem jelentik. az, hogy ezek a publikációk a találmány tárgyköréhez tartózó technika álláséi, mutatják be, vagy hogy a bejelentésben ismertetett szabadalmi igénypontok szabadalom képessége szempontjából ügyeimbe kellene őket venni. Az egyes publikációk tartalmára vagy publikálásának Időpontjára vonatkozó- állítások a bejelentő számára a bejelentés időpontjában hozzáférhető loformáctókca alapszanak, és nem j elentik annak elismerését hogy bizonyosan megfelelnek a valóságnak.

Az. alábbiakban röviden ismertetjük a találmányt.

A találmány célja tehát többek között az, hogy megoldást nyújtson a technika állása szerinti, fent- ismerte* tett hiányosságokra, A találmány tárgyát képező gHkoproteíahoreion-uufoógokat fokozott stabilitás- jellemzi, ugyanakkor rendelkeznek a megfelelő glskoprotemborm.on biológiai aktivbásáuak legalább egy részévei, A találmány szerinti -analógok a megfelelő hormon natív receptora, iram mutatott affinitásával összehasonlítva előnyösen legalább· 25%-os aíSnitással rendelkeznek. A találmány szerinti analógok a- technika állása szerint ismert gíiknproteitámtmon-miáfógokhoz képest előrelépést jelentenek, mivel a megfelelően megtervezett, majd az aés/vagy a β-alegység bizonyos atamosavamak módosításával létrehozott alegységkőzi diszatfiákőtósek minimálisra csökkentik az .alegységközi. díszuílulkötéseknek a hormon: .szerkezetére gyakorolt hatását.

Felismertük, hogy az ilyen továbbfejlesztett glikoptoteinhormcas-aBalógök előnyösen .azt a szabályi követik, hogy az ategységközí dlszalfidkőtéseket már meglévő (natív), és natív dlsznlridkőtések kialakításában résztvevő ciszzeinektöl legfeljebb két smlnosav távolságban, és -nem a megfelelő natív alegység legkülső cisztemjeln kávait kell létrehozni. A technika állása -szerint ismert, ategységkőzl diszulfidkötéssket tartalmazó gbkopmteixfeomtou-analógok egyike sem köved. a fenti szabályt.

A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát olyan glikoprotemhonnon-.®nalógo-k képezik, amelyekben az alegységközi diszulfit&ötést. az «-alegység riszrin-csamója és a β-aíegység cisztíncsomója között alakítjuk ki, Ezzel minimálisra esökkeaíbeljük a gbköproíeinhcrmon perturbációját, és egyúttal lehetővé tesszük a megfelelő natív hormonra jellemző gooadeiropteeeepter stltnolálő aktivitás jelentős mértékű megőrzésé·, miközben fokozott stabilitást biztosítunk a hormon szántára. A technika állása szerint ez: a. jellegzetesség nem ismert, és & szakirodalom sem tartalmaz utalást erre nézve,.

.A találmány további szempontjai szerint a találmány tárgyát, olyan glíkoproteitdiormon-analőgok képezik, amelyekben az alegységkőzi átezulfidkötést az -a-alegység 3. hurkában és a β-alegység 2. hurkában elhelyezkedő, vagy az α-alegység 1. hurkában és a β-alegység 2. hurkában elhelyezkedő risztéinek között alakítjuk ki. így is- esőkkeulhetjük a glikoprotriahcrmon perturbációját, és egyúttal lehetővé tesszük a megfelelő 'natív hormonra jellemző gönadotropln-reeeptor stimuláló aktivitás egy részének megőrzését, miközben fokozott stabilitást biztosítunk a boraxm számára. A technika állasat ezt a jellegzetességet sem ismerteti, és nem is tartalmaz utalást estre nézve.

A találmány szerinti analógok gyógyászati készítmények forrásában is előállítbatók. Ekkor a. terméketlenség kezelésére, vagy a termékenység csökkentésére· alkalmazhatók. A találmány szerinti analógok heterodimerei folyékony gyógyászati készítmények ibmájábau stabilan szállíthatók és tárolhatók.

A találmány tárgyát képezik, továbbá, glikepretemhomm-analőgok <·< és β-alegységét kódoló nokleobdszekvencíákal tartalmazó xekornbtnáns DNS-motekstlák, amelyek, lehetek exprassziős vektorok. A találmány ιο tárgyát képezik továbbá a fenti rokombioáos DNS-ntolekttlákkal transzformált enkaúota gazdssejtek, amelyeket a találmány -szerinti analógok előállítására szolgáló eljárásokban teaszsosíthatuak.

Az. alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó- ábrákat.

Az IA-1C. ábrák e. hCG «-oiegységének. szerkezeiéi {IÁ. ábra), egybetüs 'kóddal leirt amm>savszekve«ciáját (ΪΒ. ábra), valamint a glikoprotetófernton-ategységek szerkezeti elémeúsek általános sénsáját (IC, ábra) mutatják be. Ahogy az az íA. ábrán látható, a -cisztm-csemó három nagy hurokra osztja az alegységet. Felöl az. 1. és 3. hurok látható. A fekete vonalak az amihosavakoak a fehérje gerincét képező aszénafomjait, a szárke vonalak pedig a dlszalfídköíéseket jelképezik. Ás 1B. ábrán látható vonalak -a áiszolödkőtéseket illusztrálják, A glikoproteinhotmoii-áfegységcteík az fA- táblázatban felsorolt szerkezeti elemeit az IC', áferá·! sematikusan mutatjuk be.

A 2A. és a 2B. ábrán a hCG β-alegységének szerkezeté; (2A. ábra) és egybetüs kóddal leírt ammosavszekveaciájáí (28. ábra) mutatjuk he. Ahogy az a 2 A, ábrán látható, a cisztin-csomó három nagy hurokra osztja az alegységet. .Felül a 2. hurok látható. Az ábra jobboldalán, látható kisebb hurok a biztonsági, övben található. Az ebben a régióban lévő pozitívan töltőit amtnosavaknafc fontos szerep jut az LH-aküvításbaxt, a xsegatívan töltöítefcuek pedig a TSH-aktivitásban. A biztonsági övben lévő kis huroktól a is-alegység többi része- iribyáiam lefelé fotó i . hurkot a kis hurokhoz kötő aminosavak jelentősen befolyásolják az FSH- és a TSH-reeeptorofchoz való kötődést. A fekete vonalak az aminosavaknak a fehérje gerincét képező a-szénatoinjaií, a szürke vonalak periig, a diszulfírikötéseket jelképezik. A 2B. ábrán látható vonalak a· riiszul'fidkötéseket illusztrálják.

A 3A. és a 3-B. ábra a pSVL-«, a pCl-rt, a pSV'L.-a€75 és a pCl-ecCTS-jelű plazmidek által kódolt <;<(3A. ábra) és -aCTS-szekvenci-ák (38. ábra) irai-szlalt atnisossvab mutatja be. Mivel mindkét transz-iáit fehérje ugyanazzal a vezetöszekvenciával rendelkezik, -várhatóan mindkettő agyanoiyan módon processzálődik és hozza létre a 92 aariaosav hosszúságú, az N-terromáhson APD-vel kezd&lő szekvenciával rendelkező fehérjéket. Az egybetús kódok, jelentése Itt és a többi ábrán a következő: A, alsóm (Ab); C, risztéin (Cys); D, aszparaginsav (Asp); B, gluíaminssv (Gto); F, fenílalanin (Phe); G, glieró (Gly); H, hsszhdia (í-íis); I, izoleucin (Hej; K, lizht (Lysí; b, leuc'm (í.eu); M, metiosin (Met>; N, .aszparagm (Aso); F, prolin (Pro): Q, gluiatnin (Gizi); R. a-rgiais (Arg); S, szerin (Ser); T, treoató (Thr); V, valin (Vaj); W, triptofan fírpk és Y, tirozift (Tyf), A nagybetűvel jelölt pozíció a Cys? -széruméi való helyettesítését jelöli, amely kialakítja a C7S mutációt.

A 4.A. és 48, ábra a pSVI.-hCGÜ’ és a pSVÍ..-hCG-p^!Y3?C jelű plazmidok által kódolt hCGB ~ (4A. ábra) ss liCGb’Y3?C-vzekvet!eiák (48. ábra) transziáit aroinosavast. mutatja be. Mivel mindkét transzlált fehérje ugyanazzal a vezetöszekveoclávai-rendelkezik, várhatóan mindkettő ugy^olyan niődon processzálődik és. hozza létse a 145 aminosav hosszúságú, az N-terminálison SKF-vel kezdődő szekvenciával rendelkező fehérjéket. A nagybetűvel jelölt pozíció a Tyr3?-*Cys; mutációt jelöli.

Az 5. ábrán az α-alegység C?S-mntáriójának az «-alegységre specifikus A113 és az A4Ö7 jelű mottoklösális antitestek kötődésére gyakorolt hatását totóst juk be. Az oszloppárok alatt feltüntetett, sejdenyészetóen előállított rekontbináns hCG-ί. (rhCG) és .analógot, amelyeknek szerkezetét a példáknál mutatjuk he, szendvics-.imtn-unteszhel vizsgáitok. Ehhez kikötő antitestként a 3 i 12 jelűt, detektáló antkésiként pedig vagy ez Ai 13 vagy az A4Ü7 jelüt alkalmaztok, amely utóbbiakat radioaktív jitóízotóppai jelöltünk. A BI 12 egy elvan epiiőpot Ismer fel, amely a β-alegység 3, barkában helyezkedik el, sz A113 egy olyat, amelyik az «-alegység 1. hurkában helyezkedik el, az A407 pedig egy olyat, amelyik az «-alegység N-tormioáifs régiójában és az 1. hurok ** egy másik régiöishíto elhelyezkedő aotinosavakat tartalmaz. Az A4Ö7 -és az AII 3 epitópjas nem fednek át, mivel a két antitest. egyszerre is tud kötődi» a h€G-hess. Az oszloppárok jobboldali tagjai a B I 12/A4Ö7-toszt, a baloldali tagok pedig a δΐ 12/Al 13-teszt eredményeit mulatják be. Mim. látható, a C7S mutációnak sokkal nagyobb hatása van az A4Ö7 kötődésére, m int az A113 kötődésére.

A ö. ábra a hCG(«31-p3?} IJr-reeeptorhoz való kötődését matatja, konkrétabba® pedig azt, hogy a sejttenyészetben előállított rhCG (felfelé .mutató háromszögek}, a vizeletből tisztított bCG (négyzetek) és a sejtre·· nyészethett elöálílíott hCG(<x.31-p37} (lefelé mutató-háromszögek) sülyen mértékben gátolják az ^:25l-hGG 1..1Íreceptorokat expresszáió 200,ÖÖÖ Ciiö-sejthez történő kötődését, Az. v-tengelyen feltüntetett értékek az inkub&iáx végén a sejtekhez kőtoti, radtoakdvan jelölt hCG mennyiségéi jelölik. A teszt eredménye azt mutatta, hogy a hCG<«31-β·37) hasonló mértékben kötődik az· Ellreceptorokhoz, mint a hCG.

A !. ábra a ΚΧ)(<χ31-β37) LH-recepforon keresztüli jelátviteli aktivitását mutatja be, konkrétabban pedig azt, hogy az rhCG· és a hÜG(«31~β«7) milyen mértekben indukálnak ciklikus AMP termelődést Lllree'epiorokat expresszáió 200,000 CHG-sejtben. A hormonális stimuláció- hatására termelődő ciklikus· AMP mennyisége· a jelátvitel széles körben elfogadott paramétere. A teszt -eredménye azt mutatta, hogy a h€G(a3!-p37} hasonló mértékben váltja ki a ciklikus AMP termelődését, trónt a hCG.

A 8. ábra a hCG és az afegységkozi djszalfidkőfesefeet tartalmazó hCG-analógok hőstabií kását mutatja be. Hasonló mennyiségű hCG-t és feCG-analégot az x-iengelyen feltüntetett időkig :85Χ'-οη inkubáltonk. A mintákat ezután lehűtötték, majd saeudvics-lniniuateszttei vizsgáltak a megmaradt heterodimer mennyiségét, Ebhez, kikötő antitestként a hCG «-alegységére specifikus A113 jelű antitestet, detektáló antitestként pedig a hCG βalegységére specifikus öl 12 jelű antitestet alkalmaztuk, amelyet radioaktív jódízotóppal jeiöltíb-k. Az: tengelyen feltüntetett 'értékek a ű€G hevítés: előtti mennyiségéhez képest kapott, a fenti· teszttel meghatározott megmaradó aktivitást jelzik. A teszt -eredménye azt mutatta, begy a feCG S5^cC-oa gyorsan elbomlik, a keresztköíöít analógok viszont legalább 20 percen át megörÉrték aktivitásukat,

A 9. ábra a hCG és a keresxíkotott analógok, ttreás disszociációval szembeni stabilitását mutatja be, konkrétabban pedig azt, hogy 8 M üres hatására az rhCG-t és a keresztkötött hCG-analógokat jelentő felső sávok hogyan változnak. meg. Közismert, hogy 8 M üres hatására a hCG alegységei' disszociálnak, amit a mi eredményeink is megerősítenek. Mint az jói látható, a kereszikőtöö analógok 8 M urnával történő· kezelése ttem okozott olyan mérvű alegységdfeszociációt, amelynek eredményeként a heterodimett jelentő sáv csökkent volna, A heterodimer és a szabad β-álegysóg pozícióját az ábra bal oldalán jelöltük. A nem kezeit és utcával kezelt minták elektroferéziséí követően a gélben lévő fohétjéket ntttooellulózra •elektrobioitoliuk, majd blokkoltuk a nitroceliufóz fennmaradó, nem specifikus febérjekőtö helyeit, és végöl a -dánért és a szabad ((-alegységei t-adtoáktí-v jótiizotóppal jelölt BlOS-tel detektáltuk.

A 10A. ás 10B, ábra u pSVL-CFC 101-114β és a pSVL-CEClöl-U4j5Y37C jelű plazmidok által kódolt CFCíöl-1.14β’- GöA, ábrái és CFCldl-114ü'Y37C-szekveneiák (1013, ábra) traoszláii amiaosavait mulatja be az -egybetfe amtstosavkőd segítségévei. Mivel mindkét transziáit fehérje ugyanazzal a vezstőszekvenciával rendelkezik, várhatóan mindkettő ugyanolyan ..módon processzálod ík és hozza létté a 145 aminosav hosszúságii, az N-tennínáíisoa SKE-vel kezdődő szekvenciával rendelkező fehérjéket, A nagybetűvel jelölt pozíció a Tyt37—Cys -nutácíót jelöli. Az aláhúzott, szekveaeiarészletek a hFSH β-alegységéből származnak.

A II. ábra az «31-1337 és az α5Ι-β99 dtszalfedoknak az A113 és az A4Ö7 «-alegység-specifikus· * ♦ * *♦»» morsoklonáíis antitestek és egy bifunkciós hCG/FSH-fcimfeanatóg közötti kötődésre gyakorolt hatását snut/ttia be. Az oszloppatok alatt feíthntefett feCG-t és CFC16 i -1 {4-analőgot, amelyeknek szerkezetéi a példáknál .mutatják be, szendvics-immuttteszttól vizsgáltuk. Ehhez, kikötő antitestként a 8112 jelű·, detektáló antitestként pedig vagy az Al 13 vagy az A4ő? jelöt alkalmaztuk, amely utóbbiakat radioaktív jödizotéppal jelöltünk. A 8112 egy olya»· epitópot ismer fel, amely.» β-alegység 3. hurkában helyezkedik el, az. Al 13 egy olyat, amelyik az «alegység í. tarkába» helyezkedik el, az A4Ö7 pedig egy olyat, .amelyik az α-aiegység N-ierminális régsőjáfeaa és az 1. hurok egy másik régiójában elhelyezkedő amidősavakat tartalmaz, Az A4Ö7 és az Al 13 epítópjai nem lédnek át, mivel a kél antitest egyszerre is tud kötődni a hCG-hez. Az oszleppárok jobboldali tagjai a 8112/A407teszt, a baloldali tagok pedig a B112/A113-teszt eredményeit mutatják be. Mbit látható·, sem az «31 -β37, sem pedig az «517399 íbszsdfídok nem állították helyre az A4Ó7-nek a GFC1Ő1-114-hez való kötődését.

A 12. ábra a hCG, a CFClöi-114 és az alegységközi diszulttdkőíéseket tartalmazó· CFG 101-114analógok höstabiíitásál mutatja be. Hasonló mennyiségű hCG-t, CFCIÖ-l-i I4-es és CFCTOl-i 14-aöafógokat az x-tengeiyen teiídatetett időkig 85^sG-o» inkubátank. A mintákat ezután lekötöttük, majd szeadvíesimmunteszttel vizsgáltuk a megmaradt heterodimer mennyiségét. Ehhez kikötő antitestként a hCG «-alegységére specifikus Alid jelit antitestet, detektáló astiíestként pedig, a hCö ^-alegységére specifikus 8112 jelű antitestet alkalmaztuk, amelyet radioaktív jödazotóppat felőliünk.. Az jc-tengelyen feltüntetett értékek a hCG hevítés előtti mennyiségéhez képest kapott, a fenti teszttel meghatározott megmaradó aktivitást jelzik. A teszt eredménye azt mutatta, hogy a hCG és a CFC1Ö 1-114 85*C-oa gyorsas elbomlik, a kereszskötött analógok viszont legalább 20 percen át megőrizték aktivitásukat.

A 13. ábra azt taoíötja be. hogy a hCG, a CFClÖi-114, és CFC161 - l.ld-analógok milyen ménekben indukálnak ciklikus AMF termelődést 'LH-reeeptómkal. expresszáió sejtekbe». Az ábra azt mutatja be, hogy a CFC1Ö1-114(α31~β37) (sötét háromszögek) hatása legalább olyan nagy volt, mint a -CFClŐl-l 14-é (világos szimbótanok) abban a tesztben, ahol az LH-receptoroa keresztüli jelátvitel .stimuláló aktivitásokat hasonlítjuk, össze. Bár a CFCiöl-114(«51-β99) ugyancsak stimulálta a jelátvitelt, hatása kisebb volt, mint a CFClöl-114-é vagy a CFCÍöl-114(«31-β37)~0. Az «51-399 diszuliídok előállításához szükséges, mutációkkal szemben, az «3 !~p37 diszaifídok előállításához, szükséges mutációk nem ibe&lyásoltak a jelátvitelt. tanért, hogy a biztonsági öv hatással vart a reeeptorkötő specifitásra.. Az itt feltünteted adatok tehát alátámasztják. azt az elképzelést, hogy a receptorkontaktttsokbaa vagy a kötési spéci ínás meghatározásában feitefceíöfeg részt nem vevő régiók esetében a diszultidok beépítése minimális hatással vas a receptorkötésre vagy a jelátvitelre, A diszultidkölésekkel keresztkötött heterodímerek előállításához tehát, előnyösek a mofekuláknak azok a helyei, amelyek nem lépnek kontaktusba a receptorral és/vagy nem befolyásolj^ a receptorköfés specifitásák

A 14. ábra azt mutatja be, hogy a hFSli, a CFClől-l 14 és CFCl-Öl-11·4-(«31-β37> milyen· ménékben indukálnak ciklikus AMR termelődést FSH-feceptorokat expresszáió .sejtekben. Az ábra azt mutatja be, hogy a CFC1O1-114(«31-1537} (sötét háromszögek) féhnaximálís feitásá hasonló volt a CFClől-114-éhez (világos szimbólumok) abban a tesztben, ahol az FSH-mceptóron keresztüli jelátvitel-stimulálö aktivitásokat hasonlítjuk össze. A CFClöi-114(α5ΐ-β99) aktivitása so-kkal kisebb volt, mint a CFG 101-114-é vagy a CFClöi-i 14(«3'id3?)-é. Az «51 -β99 disznlfídok előállításához .szükséges mutációkkal szemben, az α31-β3·7 diszulfidök előállításához szükséges mutációk asm befolyásolták az FSK-urdukált jeiáívhelt Ismeri, hogy a biztonsági öv hatással van a receptorkötő specifitáara. Az itt feltüntetett adatok tehát alátámasztják azt. az. elképzelést, hogy a receptorX « koataktasokhaa vagy a kötési spectlkás rnegbatározásábatt feltehetőleg. részt sem vevő régiók' esetében a diszulfidek beépítése mmitnáEs hatással van sz FS-H-reccpw kötésére vagy a ielátviíehe. A dfezuifídkötésekkd keresztkőtőö heferodímeM. eléállltásához tehát előnyösek a molekuláknak azok a helyei, amelyek nem lépnek kontaktusba a receptorral és/vagy sear befolyásollak a receptoikötés speeifitását,

A ISA. és 158. áöraapSVt.-«K5íC és-a pSVL-hCGp'D99C jelű pfazmidök által kódolt otK51C~ (15A. ábrás és hCGdD99C-szekveBeíák (158. ábra) hanszláit ammasavaít aratava be. Mivel mindegyik, a hCG <taiegységére épölő fehérje és a hCG 0-alegységére épülő feltétje ugyanazzal a vezetöszekvenciával rendelkezik, mint s hCG a- és β-afegysége, várhatóan mindegyik ugyanolyan módos processzálódik és hozza létre a 92 (<xK5lCj vagy 145 íh€Gí>'D99C) ami-nösav hosszúságú, az N-termináhson ADP-vel (rxK5IC) vagy SKE-vel (bCGP^!D99C) kezdődő szekvenciával rendelkező fehérjéket. Az itt alkalmazott egybetűs ami-nosavkódok definícióját már a 3A-38. ábra ismertetésénél megadtuk, A nagybetűvel Jelölt pozíció az atogységközí diszxslfidkötés kialakításához szükséges rouiáciéh jelöli.

A 16. ábra azt mutatja be, .hogy a hCG (folytonos vonal körökkel) és a bCG(«'51-899) (szaggatott vonal felfelé mulató háromszögekkel) milyen mértékben gátolja a radioaktívan jelöl· hCG XJ-l-reeeptotekat espresszálő CHO-sejtekbez történő kötődését,

Á 17. ábra azt .matatja be, hogy a hCG (folytonos vonal kötőkkel), a hCG(a-j)D99'C) (szaggatott vonallefelé mutató háromszögekkel), a hCGfoSfoihfo) (szaggatott vonal felfelé mutató háromszögekkel), és a hCö(«K51C-8) (szaggatott vonal, felfelé matató rombuszokkal) milyen mértékben gátolja a radioaktívan jelölt hCG LH-receptorokat espresszáló· CMÖ-sejtekbez történő kötődését.

A 18. ábra azt mutatja be, hogy a hCG (folytonos vonal körökkel) és a hCG(oX51A-p) (szaggatott vonal lefelé mutató háromszögekkel) milyen mértékben, kompelál a radioaktívan jelölt hCG-vei. az ΙΉ-reeeptörokat expresszáló CHO-sejtekhez való kötődésért.

A 1.9. ábra a. hCG (folylonos -vonal, körökkel), a hCG(«51-p99) (szaggatott'vonal világos négyzetekkel), a h€ö(«~pö99G) (szaggatott vonal felfelé mutató- háromszögekkel) és a hCG(aK5 IC-β) (szaggatott vonal körökkel) relatív, LH-mceptor-kősvettteit jelátviteli aktivitását mutatja be.

A 29. ábra a ItCG (folytonos vonat körökkel) és- a h(Xi(«fo5l Α-β) (szaggatott vonal világos négyzetekkel) relatív, LH-recsptor-közvetitett jelátviteli aktivitását mutass he.

A 21. ábra a pSVL-ChClüi - l 14p‘D99C jelé ptezmld által kódolt transz-iáit amíaosavakat mutatja. Mivel ez a transzáéit féhérie ugyanazzal a vezeíőszekvenesával rendelkezik, mirst a ItCQ β-afegvsége, várhatóan ugyanolyan módon processzálődik és hozza léire a szekretálí, 145 aminnsav hosszúságú, az N-term-ináíison SKE-vel kezdődő szekvenciával rendelkező fehérjéi. A. nagybetűvel jelölt pozíció az alegységközi diszulfidkötés kialakításához szükséges- mutációt jelöli,

A 22. ábra a hCö (folytonos vonal), a CFC191-114 (szaggatott vonal felfelé matató háromszögekkel), a GFC1Ö1-1Ι4(α5/|-β99) (szaggatott vonal lefelé mutáló háromszögekkel) és a CFCKH- l.14(a-8^;D99C) (szaggatott vonal sötét rombuszokkal) relatív Í..H -reeepiot-köfo aktivitását mulatja be·.

A 23. ábra az rhCG (folytonos vonal négyzetekkel), aCFÜIbl-114 (szaggatott vonal felfelé mutató-háromszögekkel)·, és a GrCI01-i 14(αΚ5Ι.Α-β) (szaggatott vonal körökkel) relatív LH-receptor-kőtő aktivitását mutatja be.

A 24. ábra a feCG (folytonos vonal sötét körökkel'), a CFC1Ö1-114 (szaggatott vonal világos négyzetek14 kel),. a CFCiÖl-11.4(st-pD99C) (szaggatott vonal rombuszokkal), a CFC101-! 14 («K51€-pD99C· (egyesien pont) ás a CFC1Ó1-1 14(«K51-Cyg> (az χ-tengelyhez legközelebb eső vonal) relatív. .LH-receptor-közvetttett jelátviteli aktivitását mutatja be.

A 25. ábra az rhCG (folytonos vonal körökkel) és a CFG 1.01-114ίαΚ51Α-β) (szaggatott vonal felfelé mutató· háromszögekkel) relatív, IH-recepíor-közveíftett jelátviteli aktivitását rnafeíja be..

A 26. ábra azt mutatja be, hogy az bFSH (folytonos vonal körökkel), a CFClöl-l14 (szaggatott vonal négyzetekkel), a CFG 101-ί 14(α-βΟ99£) (szaggatott vonal felfelé mutató 'hároníszőgekfeei), a CFC1Ö1n4(«&31C~hD99C) (folytonos vonal lefelé mutató feámmstögékkel) és a CFdól-H4(aK5IC-i5) (folytonos vonal világos szimbólumokkal) milyen mértékben- gátolja az ’ ’’ 'l~hF$.H hFSll-receptorokai -expresszáló CHQsejtekhez, történő kötődését.

A 27. -ábra azt mutatja be, 'hogy az hFSH (folytonos: vonal. körökkel) és a CFG 101- i 14 .(szaggatott vonal világos szimbólumokkal) milyen mértékben .stimulálja .hFSH-receptorak&t hordozó CHO-sejtekben a jelátvitelt. A CFG 101-114(051-699), a CFG]:ÖMI4(tt-bD99C) és a CFCIOI-114{αΚ51<’·β) -eifevttsh aktivitása az: alkalmazóit koncentrációkban a kimutatási határ alatt volt.

A 28, ábra azt mutatja be, hogy az hFSH. (folytonos vonal kőtökkel). a CFG 1.01-114 (szaggatott vonal világos négyzetekkel) és a CFCíÖl-í14(.αΚ51Α-β) (szaggatott vonal felfele mutató háromszögekkel) milyen mértékben stimulálja hFSH-receptorokat hordozó CHO-sejlekben a jelátvitelt.

A. 29. ábra azt matatja be, hogy az bCG (folytonos vonal világos szimbólumokkal) és a hCG(«3l-j337, 0.51-699) (szaggatott vonal sötét szimbólumokkal) milyen tnértékben gátolja az ^,x5l-hCG LH-feeeptorokat expiesszálö CHO-sejtekhez történő kötődését.

A 30. ábra azt matatja be, hogy az bCö (folytonos· vonal lefelé mutató· háromszögekkel) és a hCG(«3iβ.3?, cőlB99) (folytonos vonal körökkel) milyen mértékben stimulálja LK-reoepton>kat hordozó CFSOsejtekbett s.jelátvitelt.

A. 3ΊΑ. és .31B. ábra az «G7S,K51C (31A. ábra) és a hCG^’Y37CWC (31B. ábra) anúnosavszekvenciáját mutatja be a kisbetűkkel jelzett egy-betősamimisavkéd segítségévek A 31 A. ábrán a Cys7-et helyettesítő szerint, a 31B, ábrán pedig -a Tyr?7-et és az Asp99-eí helyettesítő két cisztelnt nagybetűkkel jelöltük.

A 32.A. és 328. ábra az oC?A és a bPSFtpY31C amiaosavszekvecciáját mutatja be, Az aC7A. egy «.alegység-analóg, amelynek segítségével feltehetőleg előállíthatunk: az «- és a β-alegység cisztin-csomója között kialakított diszuífidokkal stabilizált feCG-, h£H-, hFSH- és hTSH-anaiógeta,. A hFSH3Y3 IC egy β-afegységanaiög, amelynek segítségévéi feltehetőleg előállíthatunk az «- és a β-alegység ciszön-csoraója között kialakított diszulhdokáal stabilizált hFSH-antdógokaí. Az et-eíegység-anaiőg és a bFSH β-alegység analóg aminosavszekveneiájátaz ábrákon: kisbetűkkel jelzett egybeíró aminosavkód segítségével mutatjuk be. Valószínű,. hogy az «-alegységben létrehozott Cys7~*Ala szubsztitúció, amelyet az O.C7A antinosavszekveneiájában nagy betűvel jeleztünk, ugyanolyan halásó, mint az 1, és 2, példában bemutatott Cys7~+Ser szubsztitúció. A bFSH6Y3 IC szekvenciáiéban ugyancsak nagy betűvel jeleztük a 31. pozícióban lévő cisztelnt. Az ezt az FSH βaíegységet, valamint az. oC7A «-alegység-analógot, vagy tsz előzőekben definiált aC7S «-alegység-analógot expresszivé sejtek várhatóan FSFI-akbyíiással rendelkező, díszttifidokkal keresztköiött heterodimer fehériét szekretálnak. A hFSHjJYÖlC szigsálszekveoeiája megegyezik a hFSH β-alegységének szignálszekvenciájával.

*·*. ** ♦ « · « ν κ « * * Φ X * ·» * » φ*ΦΦ Φ X ·» 9 4

Χ· ΧΦΦφ Χχ Φ*# * így várhatóan ugyanúgy pmeeísszálődik, mint a hFSfl β-afegysége, Az N-temúnáiis szekvencia tehát várhatóan NSC-vel kezdődik.

Á 3-3. ábra a glikoprotein-mafógdí előállításához alkalmazott genetikai kódot mntaga be.

A 34Á, és 348. ábra az «V5C és a hCGpRUC nmlxíosavszekveneiáját mutatja be, Az aV5C egy aalegység-astaióg, amelynek segítségévei feltehetőleg. előállíthatunk az <x- és a β-aíegység N-termináns régiója között kbdakbett diszulfidokkal stabilizált hCG-, bt?í-_f feFSH- és hTSlf-analőgofeat.. A hCGpRSC egy βategység-analős, amelynek segítségével feltehetőleg előállíthatnak az a- és a β-alegység N-terminális régiója között kialakított dlszulfidókknl stabilizált h€G-asalógokat. Az ábra egy «•alegység-analóg ős egy hOG βalegység-anaíög kódoló szekvenesmát matatta be. Valószínű, hogy ezek koexotesszlója nyomán egy LHaktivitással rendelkező, diszulfídokkal keresztkőtött. hormon-analóg jön lésre. A fehérjék aminosav- és szignálszekvenciáját tsz egyhstüs köd segítségével írtak te . A nagybetűvel jelzett pozíciók az alegységközi diszulfkiok kiaíaföásához szükséges mutációk helyét jelölik.

A 35. ábra a hFSHpSzC ammosavszekvcncláját mutatja be, A hFSlipSSC a b-FSH β-alegységének egy olyan analógja, amelyben a 2. pozícióban lévő .szerint eíszteinre cseréltük, és amelynek segítségével feltehetőleg előállíthatunk az et- és a p-alegység M-terminábs régiója között kialakított disznlfidokkal. stabilizált hPSH•analógofcat Az «.Q5C fid., fent) és a hFSHf)S2C kompressziója nyomán várhatóan jelentős FSH~aktivitással rendelkező, díszül fedokkal keresztkőtött heteroditner jön létre,

A 36. ábra a ΰί1ίβΥ37€ an«®ösavszekvenciáját mutálja be, amelyet kisbetűkkel, az egybetüs annaíssavköd -segítségével jelöltünk, A feLHpY37C egy olyan Ü-alegység-snáióg, amelynek segítségévei feltehetőleg előállíthatunk :az a- és a β-alegység císztin-esmriőja közöst kialakított diszulfídokkal stabilizált hl.Idanaiőgokat. A. 37. pozícióban íévó cí&zteint nagy betűvel jelöltük. Az ezt sz LH β-alegység-analőgot, valamint az előzőekben deliméit «€75 vagy c<C7A «ategyrég-ímaiogot: cxpresszálő sejtek várhatóim LH-aktivdássíű •rendelkező, diszulfídokkal keresztk-őtőtí heterodlmer fehérjét szekresáluak, A bi..HBY37C szignál-szekvenciája sxíégegyezik a bLH B-afegységések sságnálszekvenelájávaí, igy várhatóan ugyanúgy processzálóink, jkíbí a hlH β-alegysége, Az N-termmá'ils szekvencia tehát várhatóan SRE-vel kezdődik.

A 37, ábra a hLHbWSC arninosavszekvsíxsiáját matatja, be. A hUífiW&C' a hlJf p-áiegységének egy olyan analógja, amelyben a 8. pozícióban lévő íriptofánl eisztemre cseréltük, és amelynek segítségévei felteheíöleg előáll írhatunk az a- és a β-alegység N-tereunáhs régiója között kialakítóit diszulfedokkal stabilizált hi..H anaiógokat. Az ttQSC (Id. fest) és &ld..HpW€ kesxpre^zi^a-nyomán várhatóan jelentős- LH-aksi vitással rendelkező, diszuifídokkal keresztkőtött heterodlmer te létre.

A 38, ábra a b'fSHBY30C amínoxavszek véne iáját mutatja be, amelyet kisbetűkkel, az egyhetüs araínosavkód segítségével jelöltünk, A hTSH$Y30C egy olyan β-ategység-asalóg, amelynek segítségévei feltehetőleg .előállíthatunk az a- és a β-alegység eiszbn-csomóía között kialakított diszulfídokkal stabilizált hTSHanatógókaí. A 30. pozícióban lévő esszíeirrt nagy betűvel jelöltük. Az ezt az TSH β-alegység-analógot valamint az előzőekben definiált «G7S vagy uC7A α-siegysóg-anaíögoS exptesszsiő sejtek várhatóan TSH--ákttvitássaÍ rendelkező, diszulfídokkal keresztkőtött heterodlmer fehérjét xzekreíélnak. A hTSHpY30C szignálszekvenciája megegyezik a hTS-H β-alegységének szigíktíszekvencteiávai, igy várhatóan ugyanúgy processzálótok, mint a hTSH β-alegysége. Az N-termmálís szekvencia téted várhatóan FCí-veí kezdődik.

* «· X β * X » Φ ·♦'* * ί » * «*«.» «X *

Α 36. ábra a hTSHöFJC asninosavszekverscsíyáí.mutatja be. AhTSH$FIC egy olyas p-alegység-anaióg, amelyben az 1. pozícióban lévő íésilaiattint elszteinre eseréltük, és amelynek segítségévei feltehetőleg döálíithtíuráí. az «- és a j3-alegység N~tertainális régiója között kialakított diszrdliílokkai stabilizált M'SH-analógokat. Az «QSC (id. lenit és a hTSHpF 1 € koexpress2iőj» nyomán várhatóan jelentős TSH-akuvitással rendelkező, diszulliöakka! kereszíkotött heteroáhner jön lésre.

A 41). ábrán az «C?S kodon előállításának sémáját tnrttaíjuk be.

A 41, ábrán a pS VÍ,-CFClöl-l 146’ eiőáUitásának sémáját muttitjok be.

A 42. ábrán a pSVL*CVC94-l 140’ előáll kásának sémáját ;noíaíjuk be.

A 43. ábrán a pSVLATC 101-1063’ előállításának sémáját nrutaijuk be.

A 44. ábrán a pSVL-aK5!C előállításának sémáját matatjuk be,

A 45. ábra azt mutatja be, hogy a ísFSH és az a V76C-l;FbláOV38C analóg milyen mértékben indukálnak ciklikus A.MF termelődést FShbreceptorohat expresszálé CHOsejlekben.

A 46. ábra azt mutatja be, hogy a h.Cö és az a-bÖ'éí0Ró€,Y3?€ analóg milyen mértékben indukáfesk eiklskus AMP termelődést EH-teoeplorokaí expresszáló CHö-sejtekbea.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányi.

A találmány szériád giikoproíeishommmaasiógok előrelépést jelentenek a Han és mtsai. (1096) állal a CA 218b50b sz. kanadai szabadiamba® leírt kitasháshoz képest. Az alegységközt íkszuifídkötések stabilizálják: a glikopsoteíslmrmos heferoáimer ·«- és 3-alegységét. .A javított analógokat célirányosan úgy terveztük, hogy csökkentsék a hormon SráromúhnenziÓB szerkezeiében jelentkező perturbációt. így nagyobb lesz a valószínűsége annak, hogy a átmér 6; vb·® létrejön, továbbá hogy a létrejött tűmet alSnkásí matat a natív receptor Mint ás agonisía aktivitási feji ki rajta.

A leírás szerimi értelemben az analógok az alábbiak bármelyikével megegyező giikeproíeinhormonok: a humán l«biou-gona<lotropm (hCG), a barnán htteínízáíó hormon (hti-í), a humán íüszősericentő hontnon íhFSl-1), a humán pajz.smirigyserkentő hormon (hTSH), vagy azok olyan hmkeióképes muíetnjeí, amelyekben az a- és a β-alegység aminosavszekvenciáiáf úgy módosítottak, hogy szabad esszlemefc alakuljanak ki bennük, amelyekkel alegységközi diszulSdkötések alakíthatok ki, és így stabilizálódik a heteredimer,

A leírás szerinti értelemben a műtétnek a feCö, a bili, a hFSH vagy a h'l'SM gi&optoteírthormofiök. módosított formái, amelyek nem tartalmaznak alegységközí disznílldliőséseket, és amelyek biológiai aktivitásukat, pk receptorai·!®! Írásukat és horrnonaktivitásukst, vagy antitestek általi lellsmerhetŐségűket jelentős ttiértékhen (legalább 80%-ban.} megőrzik, vagy amelyek fokozod airimtást vagy speciRtást matatnak egy másik glikoproteínlrormoK-meeptormi szemben, ahogy az például a kanéra g&kapmteinhoraaonok esetében látható, rtiggetlenul attól, hogy ezeket a n-ntemeket kimondottan luokcióképesnek tekintik-e vagy sem,

A gbkoporteinltorrnoaok janíeinjsí a technikában. ismert bármely fehérjeméílestté eljárás segítségévei eloáihlhatök. Az egyszerűség kedvéért a módosításokat két csoportra osztjuk. Az egyiknél a módosítást a módosított iehérjéí kódoló módosítóit gén vagy gének megfelelő gazdasejtben történő expresszáltatásávai érhetjük eh Ekkor mutációkról beszélünk. A másik esetben a fentiektől eltérő módon származékokat hozunk létre.

Bár a származékokat rendes kör&hnényekkőzött úgy állítjuk elő, hogy első lépésben rnegszmtetizáijok az alapmoíekmát, majd származékot állítunk eiö belőle, a származékok közvetlenül is előállithatók. A származék”' kilójezés azonban köphette magában hordozza azt a lehételezést, hogy a származék technikailag az slsprooleku»·’”'♦·♦' * ♦ * > V 9 * χ««» ♦ * ♦*·» te módosításával ís előállítható, még akkor is ha sz előállltásmk nem ez :a legelőnyösebb módja.

A íéhé^emódositásokat az alábbiak szerint osztályozzuk::

Kedvező - az Ilyen jellegű módosítások növelik a féhetje alfcataazhaíőságár az adott alkalmazási tcröfeten.

Neutrális — az ilyen jellegé módosítások se nem növelik, se nem csökkentik a fehérje alkalmazhatóságát az adott alkalmazási ténífetem

Kedvezőtlen -- az ilyen jellegű módosítások csökkentik, de sem téltédettél szűntetik meg a fehérje aikalmazhatóságísl az .adott alkalmazási területen.

feaktiváló - az ilyen jellegű módosítások megszüntetik a fehérje alkalmazhatóságát az adott alkalmazási területen.

Tolerálható — az ilyen jellegű, módosítások lehetnek kedvezőek, neutrálisak vagy kedvezőtlenek, de nem inaktíválóak.

Mivel a fehérjéknek általában többféle alkalmazásuk. is létezik, eiőídrduihat, hogy egv módosítás az egyik, alkalmazás szempontjából kedvező,, a másik alkalmazás szempontjából viszont kedvezőtlen, egy harmadik alkalmazás szemponljáfeói neutrális, egy negyedik alkalmazás· szempontjából pedig maktiváló.

A. felfesjemödosítesokaak az alkalmazhatóságra gyakorolt hatását általánosságban a fehérje konkrét szerkezetére többé vagy kevésbé specifikus alkalmazások Szempontjából tárgyaljuk, nem pedig a csak a fehérje assteosavösszetéteíére, molekulasúlyára vagy általános fizikai ntlajdonságaha specifikus alkalmazások szempontjából.

A felfedek módosításának számos oka tehet, többek közölt például az alábbiak:

» a molekula detektálhatóvá tétele, például radioaktlvan, enzimmel vagy fluoreszcensen jelölt származékok elöállrlásávöl;

» a molekula stabilabbá tétele valamely fizikai, kémiai vagy biológiai ágenssel, például hővel, fénnyel, osidlőszerekkei, rednkáiőszerekkel vagy enzimeidkel szemben;

* a molekula oldhatóságának tokozása adott oldószerben, peleiéül amrak érdekében, hogy könnyebben teltessen beadni, vagy a molekula oldhatóságának csökkentése, például a kicsapódás elősegítése érdekébe», vagy azért, hogy ezáltal egy másik molekula megkötésére alkalmazhassuk;

* a molekula reakcióképességének korlátozása például az amteősavak. védőcsoportokkal való ellátásával, vagy a molekula reakcióképességeink kibővítése· reaktív csoportok bevitelével, ami elősegítheti egy konjugációs reakció végbemeteeteiét;

• a molekula hsananogenitásáoak csökkentése (vagy növelésé);

• az alanynak történő beadást kővetően a molekula által az adott szervben vagy szövetben eltöltött idő növelése (vagy csökkentése), vagy egy adott szervbe vagy szövetbe való eljutáshoz szükséges idő csökkentése (vagy növelése);

• a molekula valamelyik biológiai vagy immunológiát aktivitásának növelése (vagy csökkentése), például adott receptor iránti affinitásának csökkentése vagy Követése, vagy specifiissának megváltoztatása; vagy * a meglévőt kiegészítő· új aktivitás létrehozása (pl. egy toxin hozzákapcsolása egy daganatellenes antitesthez); vagy ♦ a molekula netn kívánatos mellékhatásainak gátlása.

Egy foiforje a legtöbb poziclöfeatt elvisel bizonyos fokú mutációi. A. mutáció jelentheti egy vagy több amínosav -cseréjéi, isszercfoját vagy deléctóját is. Az iuszermókai és tieléciókat előnyösen a molekula termluáUs régióiban, vagy felszíni hurkain, vagy a ifornéttek közötti régiókban alkalmazhatjuk.

A terminuson való laszerclö -esőiében, amelyet szahatosabbstt addiciórtak vagy fúziónak nevezünk, nincs előnyös maximum, A lekérjék fozínnáíttaás» rutin eljárásnak szánni:. Célja vagy az expresszió megkönnyítése. vagy olyan fúziós fehérjék -előállítása, amelyek mindkét fúziós partner biológiai aktivitásával rendelkeznek. A fúziós lekérjék prekatzorként is alkalmazhatók, amelyek dhasitásával felszabadítható az aktív fehérje, még akkor is ha maga a fúziós fehérje oeoa rendelkezik aktivitással.

A terminuson történő <feléctó, szabadosabban csonkolás. esetében fontos, hogy mi a célunk a módosítással. Ha egy fehérjének csak az immuaolőgim tnlajdotrságait vizsgáljuk, rutin eljárásnak -szánni a kiterjedt csonkolás. Ilyen módon akár 5 .anxasosavból álló epítőpokar is kiemelhetünk, amelyeket azután önmagukban Tsejtes itxtimmválasK kiváltására, továbbá saját kópiáikhoz vagy immunogén hordozóhoz kapcsolva B-sejtes immunválasz kiváltására alkalmazhatunk. Korlátozottabb a csonkolás lehetősége akkor, ha öreg kívánjuk őrizni a fehérje biológiai aktivitását.

A szubsztitúciók, valamint a belső deléeiök és imszercíók figyelembevételével a mutáns fehérje szekvenciája előnyösen legalább öiM-febatp még előnyösebben legalább SO éó-bars azonos az eredeti fehérje szekvenciájával

A. fehérjék vsíószinSfeg sokkal jobban toleráljak az. alábbi mutációkat:

(a) iuszerciő vagy delóciő helyett inkább szubsztitúció;:

íb) a belső ínszerció vagy dotáció helyeit inkább terminális inszercló vagy déléeiő, vagy ha mégis belső, akkor lehetőleg bürköt vagy domének közötti: régiót érintő iuszerció vagy dciécíó;

(c) a belső .amisnsavak helyett inkább felszíni. amínosavakaí érintő mutációk;

<tl) a molekula kötőhelyétől távol eső régiót érintő mutációk;

ís) hasonló méretű, -töltésű és/vstgy hidrofóbieitású amlnosavakkal történő szubsztitúció:

(fi az. adott föhétjocsaládba tartozó homológ fehérjékben jelentős variabilitást mutató pozíciót érintő mutáció.

A fenti szenxpemok fúskcióképes mutánsok tervezéséhez is felhasználhatók.

Előnyösen a fehérje vázszerkezetét alkotó ammosavatoa, még előnyösebben pedig az egész láncra, a módosított fehérje jósolt vagy kísérletesen meghatározott háromdimenziós szerkezetében a gerinc (a-szénatonxok) konformációja olyan, begy négyzetes középhfoája az eredeti fehérje jósolt vagy kísérletesen meghatározott háromdtsnenziós szerkezeSdtébez képest előnyösön kevesebb, taint 5 Λ, még előnyösebben kevesebb, mint 3 A, érméi is előnyösebben- kevesebb, mint 2 A, legelőnyösebben pedig kevesebb, mint 1 Á,

A háromdimenziós szerkezei: meghatározásával fontos útmutatást kaphatunk' ara nézve, hogy hogyan módosithatjuk a fehérjét valamilyen hasznos cél érdekében, vagy legalább hogyan kerülhetjük el az ínaktíváló módosításokat, A teljes háromdimenziós szerkezet istnerelében a technikában .jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy mely aminosavak vannak a felszínen, és. melyek a molekula belsejében, továbbá, mely amü»>sav-oldalláncok muta-b oak kíieié, melyek, vannak szorosan bepakolva és melyek nem, hol rugalmas a tánc és hol nem az, mely aminosavak alkotnak másodlagos szerkezetekei, mely aminosavak kerültek egymás közelébe a fehérjeroolekuia feltekeredése nyomás, továbbá hogy mely aminosavak vehetnek reszt H-kÖtések és sólúdak képzésében.

» *

X * ♦ A * *

A felszíni am'mosavalart érintő mutációkat a fehérjék várhatóan jobbat) tolerálják, m-int a belső amihosavahat érintő mutációkat, mivel az utóbbiaknál nagyobb az esélye :a fehérje deslabíhzáiődásának, és ebből kővetkező denaturálődásának, amely a fehérje összes kőtőakt-ívítására befolyással lesz, .A felszíni aminossvak esetében azonban előfordulhat, hogy a -mutáció egyáltalán »» hat. a kötőakd vitásra, vagy begy egyes akti vitásokra hat, másokra pedig nesr. Ákáíhogy is, ezek a mutációk várhatóan nesn denaturálják a fehérjét.

A teljes három-dimenziós szerkezet meghatározásának elsődleges módjai a röntacskrisztaliográtia és az NMR-spektroszkópia, A nagyfelbontású röntgeskrlszíallográuás vizsgálat legproblémásabb lépése a kristályosttás. A .feOG nagyfelbontású kriszíaliográhás szerkezetét két munkacsoport is meghatározta (Lapdiom és mtsai., 1994; W» és mtsai,,. 1994), Ezt a szerkezetet használjuk: a hhlt, a hFSÜ és a'hTSH modellezésére is.

Kisebb, előnyösen legfeljebb 2,0 kOa moíekulatőmegö fehérjék esetében- magmágnesea rezonancia (NMRj spektroszkópia segítségével is meg leltet határozni a háromdimenziós· szerkezetet. Az NMR-es szetkezetmeghaiárezás tárgyában ki, Mchsfosb és mtsai. (1987) arankáját. NMR-rfe nagyobb felfesjék kisebb részleteinek szerkezetéről is kaphatunk adatokat. Rekombútáns-DNS eljárásokkal, vagy szabsilyozort proteollzis segítségévei egy nagyobb fehérjéből külöu-kőlöa előálikhaikík a számunkra különösen érdekes- régiókat, majd ezeket NMR-rel vizsgálhatlak.

Egyes smiuosavak környezetében az elektromos töltések megváltozását különböző spektrális változások k ísérik. Ha a triptrdárs, a tirozin, a femlaianin vagy a hísziídío kevésbé poláros környezetbe kerül, nő az Xmax és az €. Ha tehát azt kapjak, hogy a .fenti amínosavak valamelyik® esetében ezek az értékek poláris oldószerben magasabbak, mint ha a szabad aminosavai ugyanebbe» az oldószerben mérjük, akkor az armaosav el van. temetve és «poláris ammosavak veszik körül. Ugyanígy, ha a fehérje spetanaa érzékeny az: oldószer polaritására, akkor a kérdéses anúnosav a felszínen található. Hogy adjunk egv másik példát is; az Xmax és az ε mindig, nő, ha. egy útfelható csoport (pl. a tirozi» OH~ja, a hisxbdín isnida-zclja vagy a fesztéin Sfí-ja) töltött. Ha tehát korrelációba tudjuk hozni a speciális változásokat, a pH változásaival, meg. tudjuk határozni, hogy egy túrálfeató csoport a felszínen található, vagy el van temetve. A mélyebb hasadékokban tévő aminosavakat úgy tudjuk megkülönböztetni a felszíni vagy a teljesen .eltemetett am-ínosavakíől, ha olyan oldószereket alkalmazunk, amelyeknek különböző az átlagos moieku'laátmérbje.

Az ismertetett spektroszköpiás eljárások -nemcsak egyes aminossvak helyzetének meghatározására alkaintazhatők, hunén; a tönígenkrismllográfíás és az NMR vizsgálatok nem egyértelmű, eredményeink tisztázásában is segíthetnek.

Annak fcideritésére. hogy mely axniaosavak vannak valójában a felszínen, amiftosav-speciltkus kémiai alias Írásjelek alkalmazhatók. Azok a jelölések a legjobbak, amelyek töltéssel rendelkező ammosavakkal reagálnak, mivel ezek -esetében a legvalószínűbb a felszíni elhelyezkedés, ilyen jelek például a következők:

Asm?,«sav	Aihmtásjel
Asp, Gin	diazo-vegyüsetek (a nem ionizált aminosgvakiioz} és epoxidok (az ionizált síslnosavakhoz)
l..ys	2,4,ő-trinltrt!be;5ziEszuhő»sav; ecelsavanhidrid, szukfethisavanhidrld, maleinsavanhídrí.d és feírakonaahlddd
Arg	feklehexáa-dion. hidráéin

A jelölt és nem jelöl; fehésjékeí ezután külön-külon valamely tegmentálő- -reagenssel, például eianogénbrorniddal, gépszínnél, papahmai, kimotripszítmel, tripszhmel vagy jódbenzoesavval reagáltatjuk. Ezt kővetően kétdimenziós elektroíksrézis segítségével őssxehssoalíbuk egymással a jelölt fehérje és a natív fehérje hasításával kapott· pepddeket. A megváltozott mobilitásé peptidekeí rnegszekvenáljak, majd meghatározzuk a módosított aminosavakat.

Adachi és mtsai . (1989) Arg- és Lys-specltekux reagensek alkalmazásává derítették fel ezen•ammoaavaknak az EC-SOC katalitikus és hepariakötő aktivitásában betöltött szerepét. 'Megállapították, hogy a fenti amiaosavak módosítása csökkenti az em-lííett aktivitásokat, arra azonban nem tettek kísértetek hogy megállapítsák mely autínosav-oldailáncokat módosítottak

A felszíni -ammbsav-oldidteook fatoaífimtás-jelékkel ts meghatározhatók. Az ilyen jelölések fény lukasára erősen reaktív intermediereket, pl. oitréneket és kárkéneket képeznek, amelyek képesek arra, hogy beépüljenek a C-Η kötésekbe. így minden hozzáférhető aminosavval reakcióba léphetnek. A foto&ffinií&s-jelölést ezért oxoxtbTán-í0pogtá.fi3Í vizsgálatokhoz szokták alkalmazni. Egyes· fehérjék a. membrán szélén helyezkednek el, míg mások annak integráns részét képezik.

A nem specifikus jeíöíőreagensek. egy további típusa a trícium. A kísérlet során a feltekeredett. fehérjét •először (trtéiáh vízben történő'hidrogéacsem segítségével) trtcíáljuk, majd denaturáljuk és feagmeasekre Irasítjuk, és· végül meghatározzuk a tcagmensek szekvenciáját és ídeimmartalmáf (amely radioaktív).

Az ismertetett jelölő «(járások bármelyike felhasználható annak eldöntésére, hogy egy aminosavoldalláac, amellett hogy a felszínen vau, részt vesz-e a kötőhely kialakításában,. Ehhez -az keli, hogy összehasonlítsak a szabad fehérje jelölésekor kapod ielöléseíoszktst, a. komplexéit fehérje jelöléseloszíásával. Mivel a komplexben a kötöpartner elzárja a kötőhelyet alkotó antínossvsoldailáncQkat, ezek csak a szabad fehérében jelölődnek, a komplexáitb&n uesr.

A hasonló szekvenciáját és lutfeeióió fehérjéket tömörítő febérjecsaiádokou beiül a belső aminósavakkal szemben általában a felszíni ammosavak mutatnak nagyobb .hajlamot a variabilitásra. Ennek feltehetőleg az az oka, hogy a felszínt amínosavak nagy valószínűséggel nem vesznek részt azokban az am Isosavak közötti köíesöabatásokban, amelyek a fehérje általános szerkezeteié hivatottak fenntartani.

A felszíni afémosavak nieghatározásársak legmegbízhatóbb módja, ha röntgendifiraksíó segítségével meghatározzuk a fehérje háromdimenziós szerkezetét. Λ mutánsok tervezéséhez gyakran egy részleges térszerkezet te sok segítséget nyújthat. Az átlagosnál magasabb krissáállográítás hőfaktorral fémjelzett nagy mobilitásé ammosav-oldalláneok lesznek azok, amelyek mníációja a legkisebb valószínűséggel vezet destabilizáló mutációkhoz. Ld. például Aíherés mtsai. (í9:87>.

Habár .számos felszínt ammosav lecserélhető káros snellékhatások rteíkül, a belső pozíciókban történő szubsztitúciók általában erősen ítessabilizálő hatásúak. Az egy febérjecs&ládba tartozó homológ fehérjékben a funkcionális ammosavak mellett az eltemetett aminosavak a. konzerválódtak leginkább.

A fehérje feííekeredtetenek .wiwfenergiáj'át, és így sufei&asát is legnagyobb mértékben a tódrofőb oldalláncok eltemetése és; oldószertől való elzárása szolgáltatja. A pakolást sűrűség általában igen nagy. ÁltalánosSágban elmondható, hogy a fehérje központi magját alkotó aminosavak térfogatát megváltoztató mutációk tőlerálhaíósága sokkal inkább fégg a -magot, alkotó aminesavak együttes tetfogatában bekövetkező- nettó változás mértékétől, mint az egyes amlnosav-oldalláacok térfogati változásának nagyságától. Más szóval egy központi pozíció térfogatának növekedése lifcompenzálhatjá egy másik központi pozíció térfogatának csökkenését. A központi mag tárfogatának .nettó változása előnyösen Bem lehet nagyobb, raiat iÖ%, még előnyösebben pedig tnint 5%. Ed. Lím és tntsai. (1989); Lan és-mtsaí. (1992), .Hacsak az ellenkezője nett! bizöuyifetg feltételezhető, hogy a belsőként azonosított poakíőkbau lévő utninossvak mind egyetlen központi mag· alkotóelemet. Ha azonban valószínűsíthető., hogy a fehérje úgy tökere·· dik fel, hogy több különálló mag keletkezik, akkor az említett térfcgafmegörzési szabályt -minden egyes mag esetében külön kell alkalmazni.

Az eltemetett központ; mag felépítése nem csak az. egyes aminesavak esetleges eitomefodésf hajlamától függ, hanem attól is, hogy az adóit aminosav milyet) gy'akotisággal fordul elő a fehérjében. A leggyakrabban eltemetett am inossvak (ehemetődéss gyakoriságok csökkenő sorrendjében) a valló, a glioln, a fenéin, az alasün, az szelesein és a szerin.

lint és rnisaí. (1 §92) mól szántottak he, hogy a fehérje központi magjában egyetlen hidrofób aminosav (Leu, Vaj! hidrofil aminosavra (Asn, Gin) történő lecserélése· meggátolta a fehérje felles fe (feketedését és ezáltal íoateeföifö biológiai aktivitását Is.

Homológ fehérjékben több, mint 7Ö% a valószínűsége, hogy az eitetttetest €ys(-S~S- forma), Asp, Gly, Hts, Pro vagy Trp konzerválódjon. Ha tehát a kérdéses fehérjében ilyen amisosavak eltemetett pozícióban vannak, előnyös ha nem módosítjuk. őket. Konzerválódások feltehetőleg a következőképpen magyarázható; Cys - diszulfidkölés, Asp - töltéssel rendelkező, de merev oldailúoe, Gly--- láncfiezibihíás, His - fiziológiás pH-η töltéssel rendelkező és nem töltött állapotban is előfordulhat, Trp - a legnagyobb oldallánceal rendelkező aminosav.

A roetionin kivételével a többi atrútiosav eltemetett pozícióban 40-öö%-os valószínűséggel konzerválódik (a msdonte csak az esetek 26%-ában konzerválódik, de 25% a valószínűsége, hogy feucima cserélődik).

10%-nái nagyobb valószínűséggel a következő ettemetettaminosaveserek várhatók.;

Á!a~»Vsk öíu-vöín, Phe~>Leu, lle->f.e«, ile-sVal, Lys-vArg, I..eu~»lle, Leu~>Val, Met-vkev, Met-vVai, Asn-» Asp, Asn->Ser. Arg~»kys, Arg-vGlrt, Se:r-»Ala, Thr-oSer, Val~-ri!e, Vsd—sLeu, Tyr-rPhe, Cysi-SHí-oÁla.

Az alábbi szubsztitúció valószínűsége 5 és lö százalék között mozog.

Ala-ofier, Asp-»Asn, Glu-»Arg, Gin->Vai, Phe-víie, Phc-t-Val, Phe-kíyr, Hís~»Val, Gin-v-Met, Ser~»Gly, Ser-riíbr, Thr-->Vak Val~»Ala, Trp—vPhe, Tyr~-sT.cn, Gysí-SHl-vSer.

Ld. Overingloo és misai. (1992), 4. táblázat.

A legkövetkezetesebb sznbsztttúclös csoportok a következők: (Arg, tys), (tea, fie, Meu Val. Pbej és (Ser, Thr, Alai. Mfedazonáhai például az Alá és a Val Is msglehetöseu gyakran helyettesítik egymást.

Alkukban tehát az az előnyös, ha teljesen elkerüljük az eltemetett amittösavak mutációját. Ha azonban mégis amtáhatjok őket, figyelembe kei; venni a központi mag nettó térfogatváltozását, és előnyösen olyan mutációt keli alkalmazni, amelynek tipikus valószínűsége nagyobb, mint nulla, vagy még előnyösebben olyat, amelynek valószínűsége legalább 5%, legelőnyösebben pedig olyat, amelynek valószínűsége legalább 10%. Hacsak: egyébiráttyü bizonyíték nem indokolja, kerülendő az eltemetett Cysí-S-S- forma), Asp, Gly, Hís, Pro és Trp mutációja. A központi magot érintő mutációk közül azok a legbiztonságosabbak, amelyekben hldrofob atninosavat hidrofób amisresawak vagy az arginist lizimtel (és vice rvzvn) helyettesítjük,

A fentiek ellenére a belső asninosavak ésszerű mntálístása is felhasználható a fehérjék stabilitásának növelésére. Az ilyen imitációk nyomán a natív szerkezettel összeférhető áj stabilizáló kölcsönhatások (hidrogénkötések vagy formázok) jöhetnek létre, vagy az is előfordulhat, hogy egy kisebb aminosav nagyobb amtnosavra, ·'>·>

* φ.« X vagy egy 1 jneáris ammosav elágazó vagy aromás -oldalláncú am-ino-savra történő lecserélésekor -csökkenhet a közelben tévő,. kölcsönható csoportok mobilitása, í..d. példáéi Alber és mtsai. (1987).

Ennél is fontosabb, hogy a giikop-oteinhoíruonok axoinosavainak módosítására vonatkozó általánosítások mellett, jelentős mennyiségű adat áll rendelkezésre a gíikoproteinhormonok (és különösen a hCG) azon régióival kapcsolatosan, amelyek a gliks^rotemhormon-receptorhoz való kötődéskor a fehérje felszínén, helyezkedhetnek el és amelyek nem zavatják meg a hormon és a receptor közötti kölcsönhatást, azaz nem csökkentik a receptor iránti affinitást. vagy a hormonális aktivitást. A biztonságosan nakiosítható aminosavakkaí és régiókkal kapcsolatos adatokat a leírásnak a technika állását bemutató részében, továbbá egyéb részeiben ismertettük, ideivé ismertetjük. Az itt, valamint a tudományos -szakirodalomban hozzáférhető szerkezeti és funkcionális adatok nagy számának .figyelembevételével a technikában jártas szákember szántára nyilvánvaló, hogy hogyan lehet a glikoproteiniiormonok ammosavszekvenc iáját a funkció elrontása .nélkül módosítani,

A gíikoprotemhortáonok fonkrióképes nnheinj-ri közé tartoznak azok a- tóméra glíkoptoteinek íst amelyekben a glikoproteinhormon egy vagy több aminosavát vagy régióiak például a β-afegységben levő biztonsági öv régiót, egy másik gljkoproíeiohörmos egy vagy töirb nregfelelö ammosavával-vagy régiójával helyettesítünk, és ezzel például nregváltozíutfok a hormon .tce^torspecifrtását. A leírásban több példa is szerepei, amelyekben néhány, a recepíorkőtő speclfitásí, stb, befolyásoló aminosavai és régin. mutatunk be.

A. glikoprotemhcrtöonok muteítóei közé tartóznak továbbá azok: as egylánrii hormonok, amelyek ágy jönnek létre, hogy az a- és a jí-afogység egyetlen fehérjeléoc formájában.-expresszálódik majd megfelelő módon ieliekeredve létrehozza a heierodkaeraek megfelelő konformációi.

Az alábbiakban ismertetünk egy olyan: eljárást, .amelynek. segítségével meg lehet, határozni azokat az andsósavakat, amelyek potenciálisan képesek disztdödkötéseket kiaiakííajil. Ahogy azt majd a példákban bemutatjuk, nem minden díszolSdkótós stabilizálja a hCG-heterodimereket és nem mindén analóg őrzi meg. teljes biológiai aktivitását. Az alegységek ciszim-csomő-i közötti diazaifidkőtések esetében azonban- megvan a lehetőség arra, hogy a hormonális; aktivitás tönkretételé nélkül fokozhassuk a fehérje stabilitását,

A találmány szériád, diszulfidkőtésekkel keteszikötöti: glíkoprotemhormon-snalógek ágy állíthatók elő, hogy az alegységekben szabad riszté Éneket alakítunk ki, amelyek keresztkötésével azután egy vagy több, alegysegkozí dxszuffidkötés jöhet létre. Ehhez egy vagy több ammosav keáonját a risztéin, kodonjám, vagy egy meglévő díszül fidkötésben résztvevő risztem kodonjái valamely más amiuosa-v kódoltjára kell lecserélni. Azonban nem minden ilyen szubsztitáciő eredményez alegységközi dtszulSdkőiéseket. Az analógok tervezésekor az alábbi két tényezőt keli figyelembe venni:

1) A lesfoobsn használható, diszulfol-keresztkőtők gfikoproteiritormon-analógok szerkezetének hasoaionak kell lennie a hCG, a lri.fi, a ItFSH vagy a hTSH szerkezetéhez. Az új áiszuffid íelrál nem deformálhatja jelentős mértékben a fehérje általános konfotmárióját; Az IS, táblázat adatai alapján, amelyek a hCG aalegységében fmimlen oszioppátbao a baloldali oszlop) lévő egyes aminosavak, valamint.a bCO j3--alegységfetek (minden oszioppárfean a jobboldali oszlop) legközelebb eső egy vagy -öbb amihosava «- és β-széaatomjaí között) távolságot adják meg, meg fokét jósolni azoknak a diszuiftdeknak. a helyzetét, amelyek várhatóan a lehető legkevésbé zavarták a fehérje konformációját. Ezeket az- értékeket bármely ismert, széles körben, alkalmazott és nyilvánosan hozzáférhető- molekuláris, modellező prograntcsooras (pl. a Sybyl, az insiglu, a Rasmoi vagy a Kinemage, stb.) segítségévei a fohérte kriszta-ilográfiás szerkezetéből kiszámolhatjuk. Az IB. táblázatban meg23:

« « adott, 8 hCG α-íilegységéoek aoisaosavai és a hCG ó-alegységében hozzájuk legközelebb eső egy vagy több asninosav közötti távolságok a hCG publikált krisziallegráftás szerkezeiéből ('Laptbont és írásai., 1994; Wu és mísai., i994i egyszerűen kiszámolhatok.

1B. táblázat .Egyes hCG «· és β-alegységek o- és a β-szénatoíryoi közötti hozzávetőleges távolság

i'a- ialegység	Ó-alegység*
(Val 4	Pro4 (7.2. 5.7) Pro? (7.3, 7.2) Arg8 (7,6,8,4)
iGlt;5	Pro4 (6.3, 6.5) Pro? (5.6, 7.1} Arab (5.2, 3.9)
ÍAsp6	,Pro4 (4.7, 4.1) Levő (6,2, 6.0} Argó (5.3,6.0} Pro? (4.7, 6.8) Arg8 (5Λ 9.8}
Cys 7	Pro4 (7.7,7.4) LeoS (7.3, 7.8) Argó (4,9, 3.9) Pr»7 (5,9, 6,7) Atg8 (5,6, 5.0} Tyr37 (6,3, 3.5) Cys38 (7.1, 7.4} Prs>39 (7. 5,6.6)
ÍProS	Argó (7 .3, 7.5) Pro39 (7.2, 6.4)
jGkt9	Argó (7.4,6.3}
jGÍ«27	Met41 (7.9,6.6) Thx42 (7.Ő, 7,7) Arg43 (7,9, 8,6): VŐ44 (6.7 5.5)
iCys28	Me;41 (6.3, 7.0) Thr42 (6.9 6,3)
Mei:29	Pro39 (7,6,7,9) Tbr40 (6.4, 8..2) Met41 (5.0,4.8}

«-alegység	β-alegység* }
A18.36	Iie33 (6 4, 6.8} i€ys34 (5.0,4.7) i Áta35 (6.3, 7.5} j Cys57 (6.4,6.0) j Ás«58 (5.5, 5.6} j Tyr59 (6.7, 5.8) i
Tyrá?	Iie33 (5,6,4.3) \| Cys34 (6.6, 7.61 j
Pn>39	Ála83 (6.8,4.9)
i'hr39	Asp99 (7.8, 6.0) i
Pro40	Alak? (7.9,7,0) i Pro-,07 (8,0, 5,9) j Leó 198 (7.7. 7.7) j
!,.eu41	Gi»59 (7.7,6.2) i
Gb50	Tbr97 (7.8,9.2) j
l.ysS 5	Ser96 (7.6, 8.8} i Thr97 (5.2,6.4} j Tbr98 (.5,4,6.25 t Ásp99 (3.8,4,2) \|
As«52	Thr97 (6.4,6.3} I Tbr98 (6.4, S.3) j Asp99 (7.7,9.0} ϊ
Val53	'GtrO? (6.9,6.4) ΐ Thr98 (4.9,4.8} \| Asg99 (5.9 6.9.1 i
Thr54	'H-r98 (5.8,7.5) i Asp99 (4.5,4.5} i Cysiöö (6.7, 8.9} i Gly 101 17,6, 7.6}
Ser55	Val56 (7.6,5.0} Aso58 (7.7.6.7)

«-alegység	β-alegység*
Lys75	Leo45 (6,L 7.7} G.l»46. (5.4,4,6} Gly47 (7.4, 7.4}
Vall 76	Val44 (5.3,4. 5) Leo45 (4,4, 5.5) Gb?.4ő (5.4, 6.5}
Gin 7?	Vaí44 (4.8, 5.7) I,eo45 (6.2, 8.2) G&46 (6.7 6.0)
His79	Val44 (7,9 7.1)
Thr86	Gly í 02 (6.5, 6.5}
Cys8'7	GtaS4 (6.9, 5.0) Gly 101 (7.7, 7.7} GlylŐ2 (7.2, 7.2}
Tyr88	Gly 101 (7.2. 7,2}

y V XX * XX ♦ » <-

	Tfer42 (7.5 9.0) ;
GO'O	Cys33 (7.8, 7 8)j Pro39(5,l,5.1) ; ThrdO (5,6, 5.6) 1 Metél (6.7, 6.7)1
ÍGys31	Argó (7 6, 5,1) 1 Tyiö? (5.7, 3.6): ,Cys3« (5,0, 5.8) i Pro39 (4.2, 5,4) j Tht-40 (5,7, 7,2) ί
fc'ys32	Gíy36 (7.9, 7.9) j Tvr37 (5.2, 6,3) j Cys38 (5.5, 6.5) j Fro39 (6.7, 8.8) j Tbr40 <7.1, 6.2) j
jPite33	.Argó (7.7, 7,4) 1 Alaki (7.7, 7,8); Giy3ö (5.1,5.1)) Tyr37 (4.5, 6.0) j Cys38 (6.6 ,8.5) i
Ser34	Cys9 (7.6, 6.9) : Ala35 (6.0, 7.6) íily.36 (5.3,5.3) Tyr37 (5.3, 7.1) VaI56 (6.0. 4.7) Cys5? (5.2, 3.9)
:Atg35	Cys9 (8.0, 8.2) llo33 (7,9, 6.5) Cys34 (5.6, 6.4) A.ia35 (4.4,3.5) Gly36 (6.2, 6.2) Vai56 (7.2, 8.2) Cys57 (5.3, 5.4} Ass58 (6.8. 9.1)

	Cys93 (7.2,4.6) :j Titr98 (6.6, 5.0) \| Asp99 (5.5,6,3) CyslöO (5.1, 5.2) Glylöl (5.7,5.7) } GiylOz (7.3, 7 3) \|
iGht56	CyslöO (7.2,9.7) j Glylöl (5.6, 5,6) 1 Glylöz (4.8,4.8} \| Proiöe (4.8, 5.2) j l,ysl()4 (7.0, 6.5) \|
iSer>7	Val55 (6,3,4,2) i CysS7 (7.9,6.9) :i CyslöO (7.9, 7.9) i üiy tő i (6.4, 6.4) ) GlylOO (5,0, 5.0) \| Pml03 (6.1 7.8) :i
Tlu-SS	Glylöz (6.8, 6.8) \| Pro 103 (7.4, 6.6) j
Cys59	Thr40 (6.3,4.5) ί Metél (7.7, 8.6) j Gln54 (7.3 4 0) j
CysóO	Pro39 (7.8, 7.8) Thr40 (5.6,4,7) Metél (5,9, 6.1) Thr42 (7.9.7 0)
Valói	Metél ih.A 8 8_S Thr4.2 (6.6,5.8)
Pho?4	Le«45 (7.1,6.5) Gln46 (7 ,8,8,4}

* [«-szénatomok közötti távolság (A), p~széeafotnck közötti távolság (Á)j

A β-alegységben lévő aminosavakhöz. tartozó, zárójelben megadott értékpárok baloldali tagja az adott aminosav «-szénatomja és a baloldalt oszlopban: lévő a-afegység-ajnínosav «-szénatomja közötti távolságot adja meg. A zárójelbeo feküníeteti jobboldali érték pedig ugyanezen két aminosav β-szénatomjai közötti távolságot jelzi. Ha ezeket az aoxmosavakat slsztemre cseréljük, elvben létrejöhet közöttük alegységközi díszttífidkötés, .féltévé, hogy az alegységeken más zavaró clsz-tein nincs jelen. hfem minden ciszteiapár esetében azonos a valószínűsége az alegységközi di-szulfldkőtések ki alakulásán ak, A heterodinxer konformációját a lehető legkevésbé befolyásoló alegységközi disznlOdkötésék létrejöttét a kél. eisztein oldalláncúinak: orientációja határozza meg. A dlszalfidok beiktatásához kedvező és előnyös pozíciót jelentenek azok .az aminosavpárok, ahol a β-széxtatomtsk közötti távolság kisebb, mint -az a-szénatorttofe. közötti távolság. Az alegységközi diszalftdkotések -számára a legkedvezőbb és legelőnyösebb pozíciókban az-«- és a ^-szénatomok közötti távolság hasonló, mint a természetes előfordulást? diszullxdokbaa, azaz az «-szénatomok esetében körülbelül 5.0-6,5 A, a ^-szénatomok esetében pedig körülbelül 3,5-4,2 A.

Az alegységközi siszte lapátokat kialakító: szubsztitúciók kozol tehát azoknak van. legnagyobb esélye .arra, hogy a lehető legkisebb mértékben befolyásolja a fehérje szerkezetét és/vagy előmozdítsa két vagy több molekula keresztkötődését, amelyekben az o-szénatomok. közötti távolság 4-S Á, a β-széaatomok közötti pedig ennél 12 Á-snel kisebb. Sőt., ahogy az :a példákból is kiderül, ezt a találmány szerinti általános szabályt alkalmazva számos olyan kereszakötöít hCG-analögot tudtok előállítani, amelyek immunológiai és hormonális tulajdonságaik jó részét.megőrizték.

2} A legnagyobb .aktivitást matató, díszulöd-kemsztköfőtt gíikoproteinhormoo-analógok várhatóan olyan pozícióban tartólm&zzák. a .keíöszikStéát, amely sem. a reeeptofkőteshez, sem a jelátvitelhez nem szükséges és/vagy olya/! pozíciókban, amelyek nem vesznek részt a hormon aktív konformáelőjattak: stabilizálásában. A glikoproíejxfoomtookhannagy számban vannak olyan aminosavak, amelyekről tudjuk, hogy nem szükségesek a biológiai aktivitáshoz. Ide tartozik, többek között a exsztm-csomt^ól (azaz a -natív «-alegység második eiszieiajétöl és a h-aiegység első cisztemjétől) 'N-terrolnállsan elhelyezkedő aminosavak. többsége is. Léteznek például olyan, nagy aktivitással rendelkező hFSH-anaiógok. amelyekben a β-aíegyscg N-Serannálls aminosavait (Ásni, Ser2j a foOG-hen tévő megfelelő amiaosavakra (Seri, Lys2, Glu3, Pro4, Leu5, Argő, Pro?, Argb) cseréltük Várható- tehát, hogyha a hCG «-alegységetek 5.· pozíciójában lévő- gtutamiré és a p-alegység 8. pozíciójában lévő arginint císzteinre cserélve a molekulának ebben a régiósában alakítjuk ki a diszulfidkötést, akkor az így létrehozott diszalfid-keresztkőtött. hctcroditneraek nem szűrne meg az LH-áktívhása. Ebhez hasonlóan, ha a hFSH «-alegységében lévő Ota5 és β-aiegységében lévő -Ser2 helyére viszünk be cis-zteineket, akkor ugyancsak megmaradna az így léixekozoti áiszulhd-keresztkőtött heterodimsr FSH-aktívhása. Ha az «-alegység 3I. ctszteüijét alatora vagy szeiinre, a bCG ^-alegység. ő. -arginxnjét pedig císzteinre· cseréljük, vagy az FSH β-alegység N-termiaálisára egy etsztemí addicio-ráhíuk, akkor várhaton létrejön egy díszultíd a hCG vagy a hFSH a- és a β-alegységsínsk N-taninusai között. Ez a átszulfid várhatóan .semelyik hormommalóg esetében sem «avatja meg « honaonaaalóg aktivitását.

A hCG krisztabográöás szerkezetéből kiderül, hogy mindegyik alegység- tartalmaz egy cisztm-csomőt és igy bárom hurkot is, amelyek neve ad, «2 és et3, illetve βΐ, β2 és 83. A β-afegység emellett tartalmaz egy olyan, 20 amlnosav hosszúságú, brétoixságl övnek evezett régiót is, amely körülveszi «2-t. igy biztosítva a betenxiímert és egyben stabilizálva a «hát receptor kelésére képes konformációt. A eiszt-eineknek a httropinokra, íöilítropürokra és tirotropfookra jellemző elhelyezkedése, arra enged következtetni, hogy a három fehérje hasonló áJtaláws iélíekcredési mintázatot követ és hogy a hCG krisztallográfíás. szerkezete megfelelő útmutatást nyújthat az alegységközi díszuiíidok kialakításához. Az FSH. és a TSH szerkezete azonban még nem

ΖΟ «

ismert, csak követtetettietünk rájuk a h€G szerkezete alapján. Az egyes alegységek ctsziittrcsomöinak ktisztttilográfíás szerkezete azt m atatja, hogy ezek igen hasonlóak .egymáshoz, aminek-az az -oka, hogy az Őket létrehozó három diszuindköíés nagy mértékben limitálja térszerkezetűket A cisztin-csomókbas vagy azok közelében elhelyezkedő antioosavak tehát várhatóan- hasonló konformációt vesztsek fel mindegyik hormonban. A Sl-be« és a ji3-ban van továbbá egy-ogy olya® elmem, amely mindhárom· hormoatípusban hasonló pozícióban helyezkedik eb Mivel a hCö-brn ezek diszttitidot képeznek, várható, hogy minden glikoproteinbonnoaban. árszulfolot képeznek. Ez a diszuifld és a hCG-ben lévő hurkok gerincét alkotó atomok közötti nagyszámó, barkón belüli és burkok közötti hidrogénkötés alapján arra böveíkezfeíhetűsk, hogy a βί és a β3 konformációja nagyon hasonló a bárom hoauontípusban. Az «1 -ben és -az a3-bau is számos hiűrogéokotés van, ami azt sugallja, hogy valöszfoöleg ez a régió is hasonlóan alakul a három különböző hormontfpns esetében. Ezt az elképzelést támasztja alá az a megfigyelés is, hogy a -szabad «-alegység AMR-szerkezete szerint az «1 és az «3 akkor is hasonló konformációt mutat, ha az alegység « alkot hetereátmert (DcBeer és mtsai., 1996). Sára bárom hormontipus fennmaradó részletei is majdnem biztosan hasonló konformációt vesznek lel, mint a bCG-hen, valószínű, hogy ez a hasonlóság nem olyan nagy mértékű, mint az eddigiekben tárgyalt régiók esetében. A β2 például viszonylag kevés belső híórogóukőlési és/vagy «; - és oA-koatakíust tartalmaz. Mivel ez a régió a hCG-ben sem tűnik erősen korlátozott térszerkezetűnek, semmi okunk azt feltételezni, hogy .szerkezete teljesen megegyezik a többi hormon azonos régiójának szerkezetével. Sót, & TSH β'2-hntka 2 amiisosa-wal hosszabb, mint a hCG-é vagy a hFSff-é. Az «2 Nés C-tetminálís· vége számos hídrogénkötést képez, sót a C-temsin-átis vég egyes részei a β I -gyei is kontaktusba lépnek. Valószínű tehát, hogy az «2 ezen régiói ugyancsak hasonlóak a legtöbb hormonba®. A «2 középső része azonban csak a biztonsági övvel érintkezik, amely viszont nem jól konzerválódott a három hotmontipusban. Az α-alégység NMR-szejkezcie azt nartatatta, hogy az «2 nagymértékben, rendezetlen, ez pedig arra ural, hogy ahormonnak, ez a része csak azért mutat a hCG-beterodiínerfeea rendezett szerkezetet, mert közrefogja a β 1., a β3 és- a biztonsági öv, A biztonsági öv területén várható eltérések várhatóan megváltoztatják az «2 'konformációját is, mégpedig küiöoöseo azokon a részeken, amelyek messze esnek a eisztia-esomóíól.

A.biztonsági övnek a hormon szerkezetére gyakorolt hatásai lutropin- és follitrop-in-reeeptorokho2 kötődni képes hCG-analógok vizsgálatára alkalmas mmnxnelégiai próbák segítségévet igyekeztünk megismerni. Az eredmények azt matatták, hogy a biztorísági öv összetétele megváltoztathatja a hormon konformációját. Hasonló adatok alapján az is valószínűsíthető, hogy a borsion-konformációját: a receptor is befolyásolhatta. Részlegesen ismert kötőhelye monökfonálss antitestek (Moyle ás mtsai., 1990, Moyle és mtsai., 1995) segítségével vizsgáltuk egy bifenkciós feCG-analóg (CE IC 1-199) konformáció jói szabad állapotban, valamint EH- vagy FSHreceptorokhoz kötve. A CFlö 1-1.99-eí ügy áliiióttiik elő, hogy a hCG biztonsági övének a 19 I. aminosavíól- .a 109. aminosavíg terjedő szakaszát a bFSH biztonsági övének a 95. amínosavtól a 103. arninosavig terjedő szakaszával helyettesítettük {Moylé és mtsai., 1994). A CFíö 1-199 monoklonális antitestekkel adott reakciói alapján megállapítottuk, hogy az FSH-amtnosavak jelenléte a- biztonsági övben -megváltoztatta az alegységek. közötti kolssöehatásokat. Az A4Ö7 antitest egy olyan konformációs epítópot ismer fel, amely tartalmazza a hCG «alegységének egyes N-tennmális amínosavait, de a hESH-ét nem. Ez az antitest -nagyon kis atlSnitási mutatott a CF :01-199 irányába®, pestig az epitóp messze vas a mutáció lieíyóiől (IC. táblázat). A receptornak a hormon szerkezetére gyakorolt hatását pedig az jelezte, hogy az LH-receptorokboz kötött CElö 1-109-ot felismerte az A4Ö7, az- FS.lf-ree-eptorokho?, kötött CFtŐ!~iö9-et viszont sem (lö. táblázat). Más antitestek, amelyek teljes egészében az al-bea és/vagy az.a2-hen, vagy a β í-ben és/vagy a 03-ban elhelyezkedőepiíópetet ismernek fel, még akkor is felismerték az CF1Θ l -1 09-et, am ikor receptedhez kötödött.

A fenti megfigyelések «lapján összességében megállapíthatjuk, hogy a hormonokon belül az egyes alegységek portciői sm feltétlenül azonosak, és a receptorral való kölcsönhatás- is befolyásolhatja őket. Megáilápit.<xtuk tehát, hogy a hCG krisztaliegráfiás szerkezete· alapján meghatározott lehetséges cisztemszabsztltációk relatív helye és orientációja mellett azt is figyelembe teli venni, hogy & hCG kráztaífográbás szerkezete milyen valószínűséggel ltja le a follítropínek és tlrotropinok szerkezetét és/vagy a homton-receptor komplexben felvett konformációját. A botsnonofcnak várhatóan azok a részletei lesznek azonosak a hCG megfelelő részleteivel és várhatóan azokra van a legkisebb hatással a receptor-kölcsörthajás, atnelyek a ctszísn-csomőban vagy annak közelében helyezkednek el.

IC. táblázat

A feCG, a IrFSH és a hCO/hF'SM-kitnérák reakciója a hCö «-alegységére speciilRas monokfonáiis- antitestekkel

	.Radioaktívat} jelölt .antt-o-alegység antitest
Analóg :kíkótö antitest.	^i:'j-A?05	^!?5i-A109	^U3l-Ail0	’1-A112	^!:í5I-A113	^í;;j-A202	^i?5í-A4Ö7
hCG	:Bi 12	1ŐÖ±4,Ö	100+2,4	100+4,7	100+4,7	100+4,9	i 00+4,9	100+1,7
	:B410	! 00+5,7	1.00+2,5	100+2,4	200+3,6	100+ÍJ	1O0+IJ	100+4,2
CF94-9?	:BÍ 12	90-,5±4,ö	136,8+4.0	105,0+.6.,6	116,7+1,9	101.2+3,2	í 13,3+2,7	103,4+4,9
	:13410	145,3+6,0	145,0+6,0	125,9+2,5	104,4+3,6	120.4+1,8	136,6+9,0	128,2+12,5
CF101-1Ö9	:Bi 12	ró2,12:0,6	49,6+2,3	82,8+3,8	86,3+2,1	84,2+1,5	66,7+0,8	6,8+0,9
	:B4W	87,8-444	80.0+3,8	87,9+1,7	82,7+1,4	119,8+0,3	100,5+4,0	16,7+0,1
CF94-Í17	:8 11.2	149,8+5,6	1.84,5+9,4	140,8+4,1 :	144,7+2,6	109,4+2,3	137,3+4,7	31,0+1,0
	:33410	1 18,0+8,7	158,3+3,7	141,9+1,2	1118,+1,3	124.1+2 J	139,7+3,8	18,0+0,8
CF39-S3	,BI 12	'38,1*2,3	1,2+0,1	78,8+2,0	68,8+3,5	73,1+0,7	79,6+1,4	96,4+0,6
	:8410	; 11,4+2,7	2,9+0,3	69,8+0,1	67,5+1,3	96,9+0,4	106,3+1,3	129,1+1,3
bFSi-fe	::B6ö2	-2,5+5,8	2,8+0,6	49,0+6,1	56,0+0,9	77,7+2,6	.65,2+1. ,1.	-6,7+1,4

Megiggygfeek; A kbxiérákat a bCö azon arnioosavai. alapján azonosítjuk, amelyek a h'FSH-höl származnak. A CF94-97 tehát egy olyan analógot jelöl, amelyben a hCG fii-alegységének 94-9?. aminosavait az FSH-hól származó aminosavakra cseréltük. A hCG 0-alegységének 94-97. aminosavai a biztonsági öv kis hurkában találhatók;. a 101-109. aminosavak a biztonsági Öv C-termrnális felében- találhatók; a 94-1 i?. atnirtosa-vafc a biztonsági öv kishmkában, C-termináhs felében és a C-termmáirsátr találhatók; a 39-58, aminosavak a 2. burokban és « 3. burok első pozíciójában találhatók'. A hCG-hez és a kimérákhoz kikötő antitestként a 8112-t (felső sor} és a 84'lö-et. felső sor) használtuk. A fcFHS-hoz kikötő antitestként a .8302-t használtak. A megadott értékek hárem párhuzamos mérés átlagát adják meg a hCG-re, mint lö9%~ra norroalizálva. Csak az A105 és az A4Ö7 kötődik az ÍJIR-receptorhoz kötött hOö-hez (Moyle ésmtsai., 1995).

1.0, táblázás

A radíeaktivan jelölt antitestek kötődése a patkány IHR-bez vagy a humán FSHR-hex kötött hCö-hez vagy CFíÖl-I09-hez

íj Arnilóg	Kísérlet	Ánti-ot-alegység antitest	Aníi-B-aiegység antitest
A-05	A407	B105	öl 12	8410
		patkány FHR
jhCG	1	3853+1709	6215+968	14706+2042	nincs adat	nincs adat
	•J	7749+1484	38294+3653	21582+1272	nincs adat	nincs adat :
	3	5486+ 757	37855+2051	22415+3071	nincs adat	127:8+2094 j
	4	.4.197+.55fi	22915+1014	21037+957	.11937.+ 154	PÍS9s.adat i
	B'iÖ5-arásy	0,27+0,05	:,33+0,45	1,0	0,57	0,57 \|
jer 101 -109	1	4846+1737	1900+315	17944+2804	nincs adat	nincs adat j
	·> z.	10770+1673	41.30+627	29110+2445	nincs adat	nincs adat j
	3	11781+1754	2854+695	13074+1985	nincs adat	6282+1437 j
	4	•3537+ 171	.7960+406:	27647+.387	.1.4101+1152	•nincs adat j
	B105-aránv	0,46+0,22	0,19+0,07	1,0	0,51	0,48 \|
	Humán FSHR. j
ÍCF94-117	1	Nincs adat	nincs adat	nincs adat	nincs adat	nincs adat j
		2910+603		14641:21064	nincs adat	nincs adat j
	3	1665+269	61+747	7.317+2569	nincs adat	3039+1242 j
	4	5321+308	5.9+4.13:	.2.8204+1481.	2320+574	fetscs adat j
	8105-arány	0,2:-0,02	0	0,082	0,082	0,42 \|
CF101-109	t	Nincs adat	nincs adat	nincs adat	nincs adat	nincs adat j
	7 c.	8958+601	<03271	24781+1369	nincs adat	nincs adat j
	3	56 1 1 +611	129+286	10214+5750	4693+1056	4693+1056 j
	4	7358+439	444+323	20923+771	sincs adat	nincs adat j
	BIOS-arány	0,42+0,09	0	0,33	0,46	0,46 ;

Megjegyzések: Ogandúm-receptör -komplexeket slakitoisunk fos, .majd radioaktivan jelölt nxmökkmáiis antitestekkel elválasztottuk őket, ahogy az a szövegbe» szerepei A megadott eredmények (három párhuzamos ± középhiba) .a vak .feletti cpm-értékel matatják. A legtöbb esetben az LHR-re- és az FSHR+re vonatkezó adatokat ugyanabban a kísérletben kaptuk (ahogy azt a baloldal: oszlopban feltűntetett .szám jelzi). A BlöS-arányt úgy számoltak, hogy az egyes antitestekkel kapeti radioaktív jel sseanyisógét -elosztottuk a Β-105-tel kapod radioaktív jel· mennyiségével, majd átlagoltuk az értékeketAz FSHR-bez kötött CP94~Í 1.7 és CF ; 01.-109 A4ö7-hez való kötődése kivételével az értékek nullánál nagyobbnak adódtak tp<0,05}.

A diszulísdfcöiések. bevitelére az egyik legvonzóbb hely a eixzim-esomók közötti régió, amely igy az alegységközi dsszntiidkőíések előnyös helye. Az egyes alegységekben a csszth-csomót három dlszulőd stabilizálja, így ez a molekula egyik legmerevebb része. Saját laboratóriumunk eredményei azt maíatták, hogy a hCG 0alegységének 37. pozíciójában lévő tiruzin módosítása viszonylag kis mértékben hatott a hormonális aktivitásra,. Folfételczíuk tehát, hogy ha a 37- pozícióba risztem? viszitek be, az nem befolyásolja-míijd a hormonális aktivitást. A CÁ 21885Ö8 sz, kanadai szabadalom nem tartalmaz olyas kitételt mely szerint az a- és -β-alegység mszlte-esoreója között kialakított dhzulfidköíés· a hramotóílis aktivitás megőrzése mellett stabilizálná a gonadotropm-hetemdimert. A leíráshoz tartozó példákból is kxlerül, hogy eretek egyik módja, ha. az: «-alegység 7. pozíciójában lévő risztemt aiaa'inra vagy szerinte cseréljük - így megszűnik az alegységen belüli Cys7-Cys31 ílíszalódkötss - és a Í;CG β-alegységében a Tyr37-t pedig -risztemnél helyettesítjük. A hCG így kapóit keresztkötött analógia nagy EH-aktivltáss&l rendelkezett Ehhez 'hasonlóan, egy másik, az. oltalmi kőn nem korlátozó példában a CPClÖl-i 14 «gy ker&sztkötött analógjának előállítását mutatjuk be. A CFC101-114 egy hCGZbFSHkíxséra, amelyben a hOG β-afegységéírek a 101, amreosavlöl a 114, aratnosavíz terjedő szakaszába hFSH megfelelő (azaz a β-ategység 95- tök.) aroiaosavatra cseréltük. A CFCI0-M.I4 «únd az LH-, mire· pedig az PSHreceptorokhoz kötődhet, és mindkettőt képes aktiválni. A díszuííld-ketosztkótött analóg ugyancsak képes volt mindkét receptor .kötésére és aktiválására, Ez utóbbi megfigyelés alapján megállapíthatjuk, begy az áj diszuífid rsern gátolja az FSH-rsceptor aktivitást. Ez alapján pedig nagy a valószínűsége armak, hogy egy hasonló diszaffid a hFSH-han sere savatná meg a hormonális aktivitást Diszulfid-teeszlkötöh hFSH egy Cys7~»Ala aalegységet kódoló cDNS és egy fyr37-->Cys hFSH β-alegységet kódoló cDNS koexptessriójával állítható elő, A találmány előnyös megvalósítási módjában a eiszífe-csoreok közötti dlszolfidhötés reás dtszulfiddal, pékiául az «.-alegység 2. hurka és a β-alegység biztonsági öv régiója közötti, vagy az «-alegység N-temúnusa és a βaíegység N-termmusa közötti díszolírdkötéssel is megvalósítható. Az «- és a β-alegységek cisztin-csomói között kialakított diszulfidkötés emellett felszabadó egy, az hi-íeratoiáíis közelében lévő antinosavat (aCysTSer), amelyet így előnyösen használhatnak PEG-addicióhoz.

Az «- és a β-alegység risztin-csomős 'közötti áfeznifidtötés annak sz általános szabálynak is megfelel, hogy az aítegységkŐzi keresztkotéseknek a hormon térszerkezetére gyakorolt hatását mlrerealizálandó a keresztkötő pozíciókat a már meglévő (natív) és natív diszoífitiköfeseket képező cisztemektől legfeljebb kél aminosav íávoiságbarí, és nem a legelső vagy legutolsó natív riszté inén (azaz a megfelelő aatív alegység legkülső cisztoíitögységeln) kívül, azaz ezektől N- vagy a C-terehniiís Irányb&a keli elhelyezni, Ily módón csökken a szerkezeti perturbációk kockázata. A CA 2188508 sz. kanadai szabadalomban leltárt alegységközi diszulfidköíések egyike sere felel reeg ennek a szabálynak.

Azok az «-alegység 1. vagy .3. hurka és a β-alegység 2. karós közötti diszulfidokkaí keresztkötöíí hooríonretalógok, amelyek nem követik a fenti szabályt, várhatóan ugyancsak megőrzik hormonális aktivitásakát. Ezek a régiók nagyon jól hozzáférhetek sz areinraíavszstesztltómó számára.. így tehát, ha a hCG-hen vagy a bFSH-ban lévő humán «-alegységet s szarvasmarha «-alegységgel helyettesítjük, általában megmarad a hormonális aktivitás, pedig a szarvasnunbáből származó «-alegységnek ez a régiója nagyban különbözik a humán «alegység ugyanezen régiójától. Hasonló módon, ha a hFSH d-sfégységrétek 2. hurkát teljes egészébe» a hCG βalegységének 2. hurkával íislyestesitiűk, vagy tóra? versre mindkét hormonnak megmarad az aktivitása. Az ezekben .a réglókbun kialakítóit diszuifidok tehát feltehetőleg sere a haropírsok, sem a iblltirophtok esetében nem rontják el a biológiai aktivitást. Ilyen diszuifidok hozhatók léire példás! az «.-alegység öre27--v€ys és a.hCG βalegység Val44->Cys, vagy a hFSH β-alegység Val38->€y$ mutációival kialakított helyek közötti Egy másik, alegységkor! díszül «dokkal keresztkötött analógot, amely várhatóan jelentős mértékben megőrzi az aktivitását.

»»*» ** pedig ügy lehet előállítani, hogy az «-alegység 75. pozíciójában lévő Iszist és a bCG vagy az LH β-alegység 4b. pozíciójában lévő gkúatniní vagy a hFSM β-alegység. 40, pozíciójában lévő íiztnt clszteinné alakítjuk. Ez utóbbi aaaíóg azonban kisebb pozitív töltéssel rendelkezik, mint a h€G vagy a bESH, így összességében .csökkenhet az LH- vagy FSH-akóvjtása. A lubopmok es íbílítropirtok.írás régióiba!! is kialakíthattak'alegységközi d&zuUxlok Némelyik. ezek közöl a β-stégység biztonsági öve (hCG β-alegység: Asp99~>Cvsj és az «-alegység 2. barka (aalegység: Lys51 ->Cvs} között jen létre. Ez a dlszulfid azonban nagy mértékben csökkentette a bCG inaktivitását, valamint a C’FCWl-114 jelé bi&ítkciós analóg LH- és FSH-aktiviiását. A hLH, a hFSH és a hTSH várhatóan álasulfidkötéseket képzó císziemmatáctós helyeit az említett fehérjék cí- és β-alegységeinek a 2-4. táblázatokban definiált ekvivalens pozíciói alapján, határozhatjuk meg.

2. táblázat

A humán glikoprotenhorinonok β-a-legységeiaek ekvivalens pozíciót (á vezeíöszekvatoa. nincs féitíhueívei hCG

SR£RLRPRCRP?NATLÁVEKEGCPVCtTVNTri€AGYCPTMTRV..LQGVLPÁEPQVVCNYRDVR

PESlRí,PGCRRGVGPVVSYAvALSGQCAFCRRSTTDCGÖPRDHPí..TCDDPREGr)SS$5RAEPPSLESESRF

PGESDIPILFQ hl.H

ER£Pi..RF'W€HPlNAiLAVFKFGCPVCÍTVNTTtGAGYCPTMMRV..LGAVLPPLPQVVCrYRDVR

FESlRL.PGGPRGVaPVVSFPVAl.SGRCGPGRRS4YDCGGFSDHPLIGDHPQFSGI.LFI............................

hFSH

.......NSCELTNHlAVFKLöCGFemNTrW€AGYCYTRDLV..YKDPARPSIGSTCTFK£LVYETVR

VPGCAHHADSLYTYPVÁTQCHGGSGDSDS'FDGIYRGLGPSYCSEGFMSE.............................

hTSH

.........FaPTEYLMTHiERRECAYCLTmTTlCA'GYCMTRDlNGKLFLFKYALSQDVCTYkDFIYRTVE

IFQCFLHVAFYFSYPVALSCK.GGKCNTDYS-DC1HEAÍK1WCTKPQKSY..............................

Megjegyzés: a pont (.) azt jelöli, hogy nincs aminosav az adott pozícióban

A 2. táblázat adataj slagján iaszáoriihatiuk. azokat az amiítosavakaí. amelyek minden humán ((-alegységben ekvivalens' pozícióban vaunak. Krisztallógráfiás szerkezet csak a hCG esetében ismert A glíkoproíemhomsonok anunoaavszekvenciája, és különösen az. alegységen belüli dhzalfiáok közötti nagyfoké hasonlóság alapján várhatóim «smdegyrk hormonnak hasonló az alakja. Következtetésünket, hogy usíítdegyik. heterodtmernek hasonló a konformációja: a hCG konformációjához, az a megfigyelés ís alátámasztja, hogy elé tudunk állitani olyan hCG/hFSH-, híXLhLH ós bCG/blSH-kímérákaí, amelyek megőrzik a kbnérár alkotó fehérjék különböző régióiban található epltóppkat. Várható tehát, hogy a táblázatban, megadott ekvivalens pozíciók szubsztitúciói nyomán olyan alegységközi dlszulfidkötések keletkeznek, amelyek hasonlítanak a tnár előállított és jellemzett diszulfiákötésekhez. Az ekvivalens pozíciókat a függőleges tengely mentén definiáljak, így például ahESH βalegységének 3. pozíciójában tévő eisztein a hCG β-alegységének 9. pozícióban lévő cisztelnnel ekvivalens.

3. táblázat

Ekvivalens; pozíciók egyes gerincesek «-alegységeinek ajaihosuvszekvexjciájáfetm {'a vezető szekvencia nincs feltüntetve)

Humán

....APDVQDCPECTIXiENPFFSQPGAPn,QCMGCCF$RAYPTPERSKtóTMLVQKNYT

SESTCCVAK.SYNEVTVMGGFKVFNHTACHCSTCYYHKS juh

FPIXlEFfMCyCPECKLKENKWSODráPÍYOCMGCCFSKAYPTFARSKKTMLVPK

EiITSEÁTCCV.AKAFTKArVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKS

Sertés

FFDGFFTMQGCPECREKENKYFSKLGAPiYQCMGCGFSRAYPTPARSSÓGTMLVPK

Nn'SEATGCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHRS

Szarvasmarha

FPDGEPTYIGGCPECKEKENKYFSRPDAPIYQGMGCGFSRAYPTFARSKKTMEYFK

NITSEAJCCVAKAFTKAYVAÍGNVRVENHTECFKSTGYYHKS

Eó

FPDGEFTTOÖCPEGKI.RFNKYEFKLGVP1YQCKGCGPSRAYPTEARSRKTMEVPKN n'SESTCGVAK.APIP.VYYMGNIKLENFFFQCYCSYCYHHSí

Patkány

I.PÍÓGGLHQGCPECKLKFNKYFSkl.GAPIYQCMGCCFSPAYP'iPARSRK'PMEVPKN n'SEAIYiCVAKSFTRAFYMGNARVENlíTKGHGSTCYYHRS

Egér

PPDGDFniAGCPECKLR£NK.YFSKI,GAPíYQCMGGCESRAYP'FPARSKKYMLVPKNI rSEATCCVAKÁFI'KATVMGNARVp’NHTECBGSTÜYYHKS

Nyűi

FPDGEFAAÍQGCPECKEKENKYFSKLÖAPIYQCÍMGCCFSRAYPTPARSKKYMLVPK

NfíSEAGCCVAKAFTKATVMGNAKVENin'ECHCSFCYYHKS

Csirke

FRDGEFLYíQGCPECRLKENSEPSKPGAPIYGC'rGCCFSRAYPTPMRSKKYMj..VPKN

ITSEATCCVAKAFTKITFRDNVRIPNHTEaiCSTCYYHYS

Ponty-1

YPRNDAíNNFGCFECKF.RENNffSRPGAPVYQCMGCCFSRAYPTPl..RSKKTMI,VFK.

NlTSEATCCVAKEVKK(EVNDyKl.YNin'OCHGSYCYYHKS

Po«ty-2

YPRNYY5NNFG€EECTERE^NIFSKPGAPVYQCMGCCFSRAYP3'PFRSKKYY1LVPR.

NITSEATCCVAK.EFKQVLVNUt.KLVNFFroCHCSTCYYÍ<S

Eur-angolna

YPNNFMARGGCDEGRLQENiGESKPSAPIFQCVGGCFSgAYPIPLRSlCKTMEVPKN (TSFATCCVAREVfRI.....ÖNMK.LENHTDCGCSTCYYHRF » *« 9* **· ♦ *»♦*** « « * * * *

9 9 9 »*<·$ ♦ « **♦

Csatangolna

YPMN:EiSRGGCDECPl.KDNOP$KPSAPiE0CVGiXFSR.AYPIPi..SSKKTMLVPKöí

T5EATCCVAREVTKt...DNMKtENHTD€0€S'FÜYYHK$

Lazac-1

YQNSDMTYVGCPECKI.KEWVPSNPGAPYLQCTGCCESS.AYPYPÍ..QSKRAME.VP

KNrrSPArCCVAKEÖERY.VVDNrKETNH'rECWGNTCYHHKS

Lazac-2

YPYSOKIKMGCEECKLKPNTÍPFNPGAEÍMQCTGCCPSRAYPTPLRSKQTMIAPKN rT'SEATCCVAKYGFSYTTKDGFPVTNHTECílCSTCYYEKS

Megjegyzés; a pont t.) azt jelöli, hogy nincs atntnosav az adott pozícióba»

A 3. táblázat adatai .alapján kiszámitfeatjuk azokat az amínesavakat, amelyek míxtden o-alegységben Ekvivalens” pozícióban -vannak. Krisztaliográfiás szerkezet csak a hCG esetében ismert. A giikoproteinfeormoaok ammosavszekvencíája, és különösen -az alegységen belüli diszulfidok közötti nagyfokú hasonlóság alapján várhatóan mináegytk fejből származó bőmsosnak hasonló az alakja. Következtetésünket az a megfigyelés is alátámasztja, hogy elő tudunk állítani olyan humán/swvasmarha-kímérákm, amelyek megőrzik a kímérát alkotó fehérjék különböző régióiban íaláfeatö epitöpokat. Várható tékák hogy a táblázatban megadott ekvivalens pozíciók, sznfeszihücióí nyomán olyan afegységkezi disznífidkőtések keletkeznek, amelyek hasonlítanak a már jellemzett disznítidkötésekhez.

:

4. táblázat

Ekvivalens pozíciók egyes gerincesek «-alegységeinek axsisosavszekveaciájáhao (e vezető szekvencia nincs feltüntetve) hCG

SKFPLRPRCRPlNATLAVEKEGCPVaTVNTTICAGYCPTMTRV..I..QGVL.PAI..PQVVCNYRDVRF ESIRLPGCPRGVYPVVSYAVAESCQCAkCRRST'FöCGGPKJDHPEIGDDFRP'QDSSSSKAPPPSEPSPSREP GPSDTPILPQ—.

hlH

SREPE8PWeWiNAÍLAVEKEG€PVCITVNTTJ€ÁGYCPTMMRV.,LQAVLPPEPQVV€TYRDVRF

ES1'RLPö:CPRGVD.PVVSFPVALSCRCGPCRRSTSDCGGPKDHP:LTC»HPQLSGLLF1.....................................

sCG

SRGPERFlXRPíNAlI,XYEfeEACPlCrFFTTSlCAGYCPSMVRy,,MPAALPAiPQPVCTYREERPÁSJ

REPGCPPGVDPMVSFPVALSCHCGPCQIK.TTDCGVPRDQEEACAPQASSSSKDPPSQPLTSTSTPTPGAS

RRSSHPLP1K.TS dLH

SRGPLRPlCRPlNATLAAENE.ACFVClTFFniCAÖYCPSMVRV...LPAALPPV.PQPVCTYHELHFA

SIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSGRCGECRESNSDCGGRRAQSEACDSPL.I..PGLL..n...............................

oLH .LGGGG.RPPCRPíNVTVAVFKD{3CTQGMAVTn-ACGG'rCRIREPV..YSSPLGPPPQSACTYGALR

YERWAE,W'G€P1GSDPRVLEFVAESGRGÁRGPMAISDCTVQGI.GPAFCGAPGGFGGE..................................

feLH

SRGPI.RPLCQPtNATLAAEREACPVCi'FPTTSKAGYGPSMKRV,ITVIFPPMPQRVCTYHELRFAS

VRÍPGCPPGVGPMVSPPVALSCilCGPCRESSTDCGGPR'TQPLACDHPPi..PD{LFI...............................

otil

SP.GPLRPlXQPINAT:LAAEKEACPVCnTTTSICAGYCPSMR.RV...L.PVlLPPM:PQRVC'I'YlÍELRFAS

VRLPGCPPGA^ZDPMVSFPVAESCÍÍCGPCRLSSTD€GPGRTQPLACDHP'PLPD1E.,.............................

U.H PÉP

ARGPLRPL.eRPV‘NATEAAENEACFVCnyFTSíGAGYGPSMVRV..EPAAEFFVPQPVCFYREI.REASi REPGGPPGVnpEVSFPVALSCRCGPCRI.SSSDCGGPRAEPF,ACOEPHLPG..................................

sGTi-í

SEMQ..P.CQPkNQTVSLEKEGCPTCIXIRAPíCSGH€VTKEPV.AKSPFSTVTGHVCTYRDVRYEMl

RLRDC.P.PWSERHVTY^xPVAí..SCGCSECNMGTSDCTí£S.L.QPDFeiTQRVLTDG.DMW............................

sGTHI ,örECRYGCRLHNMTnYERFDCHGSiTITF..CAÖ.LCETTOF.N.,YES'FWLPRSQGVeNER.EWSYEK

VYLFGCPSGVEPFFí.pyAKSCDCiKCRTDNTDGDRISMATPSaVNFEEYI..................................

sGTHz

Sl..MQ..P.CQPINQTVSI..EKEGCFrCIA^r?QTRICSGPíCVTKEPV..FKSPFSTVIQHVG'rYRDVRYE1GR

EPDCPPWVBPHVTYPVAL$CDCSLCWiyrEDCFiESLGPDFCn'QRVF.TDGDMW..............................

hFSH

.......NSCEETYÍ'nAVEK.EGCGFCrnNTTWGAGYCYl'RDi..Y..YKDFARFKi'QRFCIPKEEVYETVR

V?ÖCAHHADSLYTVPVATQCHCGKCDSÖSTDCTVRGí..GPSYCSfGEMK£.....................................

eFSH

.......NSCEE'XWnAIEKEECRFCSmTWAGYCYPRElEV.YKDFARPNlQKTCTFKEEVYETVKV

PGCÁffllADSLYTYPVATACHCGKGNSDSTlYÍTVRGI.GPSYCSEGDMKE................................

oESH

.........SCYÍ,'rNnnVFKF£CSPClSINTrWCAGYGYTRDLV.YKDPARPNlQOGTFKFI.VYETVKV

PGCAHHADSI.Y'rYRVATECRCGRCDSDSTDGTVRGLGPSYCSESDIER....................................

bFSH

.......SGEETNITITVEKEECGFClSIYTTWCAGYCYTP.OI,V..YRDPARPbilGRTCrEK£LVYEYVKV

PGCAHHADStYTYPVATBCHC’SKCQSDSTIXTVRGLGPSYaiFRElKE....................................

pFSH

........NSCFlYNrnTVER£ECNFClSWW€AGYCYTRl>IY..YKDPARPNIQK;rCTFKEI.VYE'rVK

VPGCAGHAÖSE.Y'rYPVYrECHCGRCDSDSTDCTVRGÍGRSYCSESE.MKE.................................

riSH

.......SÜEETNÍTISVEK.EBCRFCISÍNTWeEGYCYTRÖEV..YKDPÁRPNTQKVCTFKEEVYETIRLP

GCARHSDSEYTYPVAFEGHCGKCDSDSTDGTVRÖEGPSYCSEGEMKE.................................

bTSH

.........ECIPTEYMTHIERRECAYCLYIN’IYICAGYCM'FRDÍNGRIPIPKYAL.SQDYCTYRDFIYRTVEÍ

PQCPLHVAPYESYPYALSCKCGKCNIDYSDCHÍEAIKI'NYCTKPQK.SY................................

ETSH

.........EGIP'EEYMMPIVER&FCAYGETÍNTTVCáGYCRíERDYYKjKLFLRKYaESQDVCTYKGMYKT

AEIPQCPRHVTPYESYPVA1SCKCGKCNTDYSDCIHEA1K.TNYCTKPQKSYMVGPS1.............................

pTSH

.........ECIPTEYMMHVERK£CAYCETINSTÍCáGY€MTRDFDGK1.ELPí<YALSQDVC'1YRDMYKTV

EIPQGPHGVTPYFSYPVAÍSCK.CGK.a>IGYSDaHEAiSTNYCTKPEK.SY..................................

rnTSII

.......FCIP'FEYTMYVORRECÁYCETlNTTlCAGYCMTRDÍNGKEPI.PRYAE.StbDVCTYRDIYRTYEl

PQCPHHV'IPYfSPPVAVSCKCGKCHTDNSöCiHEAVRÍNYCIKFQSFYLGCESY.................................

rl’SH

........FCIP1EYY1MYVDRREEAYCI..TíYTTíCaGYGMTRI)1FÍGK.LEEPKYALSQDVCTYRDTYRTVE iFQCPIffiVAPYESYPYAtSCKeGKCGTDYSDCTEEAVKTNYCTKPQTEYI.GÖESG.............................

Rövidítések: h, humán; e, ló; d, kutya;, c, csirke; b. sze-rvnsmaása; o. juh; i, nyúl; s, lazac; p, sertés; r, patkány; xn, egér

Megjegyzést a pont (.1 -azt jelőH, hogy nincs aminosav az adott pozícióban

A 4. táblázat adatai alapján kiszámíthatjuk azokat az asninos&vakat. amelyek minden gerince* b~ alegységben ekvivalens pozícióban vannak.

A leírásban közölt példák azt mutatják be, hogy hogyan alakíthatunk ki drszulfidkötéseket glíkoprotemhotmonökban, továbbá LH-, FSH- és/vagy TSH-teceptotJokboz kötődni képes glikoproteinhormo»·· analógokban. Az alegységközt diszuiíidkötések jelenléte fokozta a hCG és egy jelentős FSH- és TSH•aktívltással bíró hGG-analóg stabilitását. Várható tehát, hogy aíegységkőzi dlszulbdok kialakításával a hormorrcsalád más.-tagjai, vagy -ezek-analógjai ís stabiiizálhatők,· Ha a diszulfidokai olyan helyekre építjük be, amelyek nem vesznek részt a receptorkötésben vagy a reeeptorspecifitás meghatározásában, akkor várhatóan «ént akadályozzák a hormon ixtnkcióját. Sőt, egyes aiegységközst diszulíSdkötések növelhetik a hormonanaiógok fíinkcső-át, Egy kivétellel (Blíthe és mtsai,, 1991) a bormona-légységek szinte teljesen mentesek az endokrin aktivitássói. Valószínű tehát, hegy beteroditner -stabilizálását szolgáló eljárások meghosszabbítják a hormonok biológiai aktivitását, és így fokozhatják terápiás hasznukat,

A találmány tárgyát képező, a heterodlmer glikoptítte-inbormonok stabilitásának fokozására szolgáló eljárás során első lépésben mindkét alegységben meghatározzuk azokat az aminosavakat, amelyek szubsztitúciójával a heterodteer stabilitását fokozó, de a hormonféhérje általános konformációját sem torzító, afegységközi diszulridkótések kialakítására nagy valószínűséggel alkalmas szabad cisztemeket alakíthatunk ki, A szabad -ciszte-inek kialakítása érdekébetr a fentiek, szerte azonosított amstíosavak szubsztitúciója megoldható genetikai m&eipeíácí.óvai, amelynek sósén az «- és a ^-alegység n-ukleotiteekv-eociájában kicseréljük a megfelelő kodonokat, Ezt követően szaporítjuk az «·· és a β-alegységet kódoló, promőterszekvenciával működőképesen összekapcsolt és a módosított gükoproteitátonnonokat expresszálai képes módosított nukkrotidszekvenciáka-t tartalmazó rekombináns DNS-molekulákkal transzformált gazdasejteket, majd expresszáltahuk a módosított glíköprmemhtmuoaokat, amelyeket a leírásban analógokként említünk. Az expresszit glíkoproieinbormonanaíögífoat ezt követően a- glikoproteinhormonok tisztításának szakterületén jól ismert eljárások segítségével izolálj uk és tisztítjuk.

A taláteány szerinti giíkopröieinhöwoa-analógök: genetikai szinten bármilyen,, a célnak megfelelő és a technikában jól ismert, helyspeciSkusan irányított nsuíagenezts- eljárás (Id. például Ausubel és mtsai., Current: Protocols in iMolecuiar Biology, Greene Puhbeations and Wlíey lnt«rscience {.New York, 1937-1997), S. fejezet: A klónozott DNS-ek tnut-ágenrzáiása] segítségévei sldálihhaiók. A kitarihás részét képező idézett publikáció jő példa azokra a standard refemxdamuakákra, amelyek a rekombináns DNS-technológia általános alapelveit ismertetik,

A gíikopmteinhonnöH-analógok « és β-alegységét kódoló és rekombináns GNS-moíekulákhan elhelyez:· kedo nnkleotidszekvenciák bármely expressziós vektorba bei lles síbe tök, amely képes arra, hogy az analógokat az adott gazdasejthea -expxesszáíja, Ahhoz, hogy egy exptessziós vektor képes legyen. egy glíkoproteiteormonanalóg exptessziójára, speciális, transzkripció- és transzláció-szabályozó nukleotidszekveacíákat kell tartalmaznia, méghozzá olyan módon az alegységeket kódoló DNS-hez kapcsolva, amely lehetővé teszi a. génexpressziöt és a ghkoprotei-foonaomnnalóg termelését, A gén ttmszkripciéjához először A arra van szükség, hogy a gén elölt legyen egy psomóter, amit az RNS-polimeráz. felismer és amelyhez a poí'imeráz hozzá tad kötődni és el tadja indítani a transzkripciós folyamatot.

Akkor mondjuk, hogy egy DNS képes egy polipeptid expresszíbjám'b ha olyan nukleotídázekvenciákat tartalmaz, amelyekben a poiípeptiáet kódoló sukiéotldszekveneiá-k*mökteőképese«· transzkripció- ős transzláció-szabályozó szekvenciákhoz -kapcsolódnak. A működőképes kapcsolat” -olyan- összeköttetést jelent, amely· « * « * ben a szabályozó DNS-szekveíicsák és az exptcsszálandő DNS-szelo/eudák. olyan módon kapcsolódnak egymáshoz, ami lehetővé teszi a gén expresszióját A génexpressziohoz szükséges szabályozó régiók általában promóteteket, továbbá olyan DNS-szekvenclákat jeleotesek, amelyek RNS-be átlródva jelzik a fehérjeszintézis totciáclés helyéi. Áhalánossáshan ide tartoznak s transzkripció és a transzláció iniciálásában részt vevő 5' nem kódoló szekvenciák. Sok promőter létezik, amelyeket széles, körben alkalmaznak fehérjék emlős- vagy rovarsejtekben történő nagy mennyiségű expresszáhaíására..

A találmány szerinti analógok «- és. β-itlegységeit kódoló nukteolMszskveneiákat, valamint a működőképesen hozzájuk kapcsolt transzkripció- és traoszláeíő-szabáfyoző szignálokat tartalmazó rekombináns· DNSmolekulákat az alegységeket tranziensen expresszáió, vagy a kívánt gént a gazdasejt kromoszómáiba beépítő vektorba, vagy vektorokba itiszeriáihstjok. Azon sejtek kiszelektálására, amelyek, kromoszómájába stabilan beépült a bevitt DNS, egy vagy több markért alkalmaztatunk, amely tehetővé teszi, hogy az expressziós vektort tartalmazó gszd-asejteket kiszelektáljuk. A markor biztosíthat például. fctotrófiát auxotrof szervezeteknek, vagy biocidokkaí szembeni rezisztenciát, ezen beiül antihíotíkam- vagy nehézfém-, pl. .rézrezisztensiát, stb. A szelektálható· marfcergén kötődhet közvetlenül az expresszáísndő DNS-szekvenciához, vagy 3 gazdasejtbe juttatható kotraaszfekeióval is. Az mRNS optimális szintéziséhez egyéb elemek is szükséges tehernek, ilyen elemek példáid sz átszabást (spliee) szignálok, továbbá a transzkripciós promóterefc, enhanszerek és a tensmáeiós szignálok, A fenti elemeket, tartalmazó «DNS expressziós vektorok közé tartoznak például az ökayama (1983) által felsoroltak is.

Az eukarióta sejtbe való ízanszfekciót kővetően a kívánt fehérjét nagy mennyiségben tranziense® expresszátó képes expressziós vektorok a technikában jól tanértek, és általában nyilvánosan hozzáférhetők, vagy molekuláris biológiai. termékeket forgalmazó cégektől (pl. a pcDMS-piazmid az Invitrogentöl (San Dlego, CA); a pSV.La Pharmaeiáíől (Piscaiaway, Rt>; a pCl a Promegátől (Madison, Wl)', stb.] kereskedelmi hton heszörezhetők. Miután -expresszlóképes. állapotban előállítjuk a konstrukciót V3gy konstrukciókat tartalmazó vektort vagy DMS-szekvencíáb az expressziós vektort bármely Ismert módon, pl. transzformációval, transzfekcióval, íipofekcióval, konjugációval, protoplaszt&riéval, elektroporézissel, kak:úsm--fezrá-os kiesapással vagy dlfekt míkroio jekdóvai, stb. bevihetjük a megfelelő gazdasejtbe.

Az eukarióta gazdasejt lehet emlőssejt, például humán sejt, majom sejt (COS-sejl), egér vagy kínai hörcsög petefészeksejt (CBO-sejí), mivel ezekben biztosítva van a fehérjemolekuláfc poszttraisszááeiós módesiiása, .ezen belül is a megfelelő-feltekeredés és a diszultidkőtések kialakulása mellet- a megfelelő helyek glikoztlálása ri biztosított. Rovarsejtekben, pl. a bakulovirax-renöszerekben azonban túl is termeltethetjük a polipepíideket, továbbá ezekben is megtórténheínek a poszrtranszláeiős pcp-liífe-kíilosiíások,, és ezen belül a glikoziíáció is. .A fehérjék COS-, €110- vagy rovarsejtekben történő ekíöpiás expresszáltatása jól Ismert a technikában, továbbá jól alkalmazhatók a szakirodalomban - Iá. például Ausubel és nttsai. 11987-1997), a feltérjek rovnraejtekbes (hakutovlrus-vektorok aíkalraazásávsí) és emlőssejtekben történő expresszáltatásárói szóló lő.9-16.14 fejezetek - leírt konkrét protokollok, A gkfeootxketrdwmen-anatóg ö- és ^-alegységét expresszáló transzformált gazdasejtek. szaporításával azután előáll tthatj-uk az -analógot.

A gílkop-Oteiohontton-analóg «- és β-alegységét expresszáió transzformált gazdásejl szaporításával előállítható az analóg, amelyet azután széles körben használt és jól ismert glikoproteí-d-oríuon-tiszihási eljárások segítségével nyerhetünk.ki és tssztlthafítok meg. A termelődő glíkoprotemhormon mennyiségének meghatározása történhet például az l. példában ismertetett szerklvies-immuuteszüel. 'Túlzott kísérletezés nélkül,, könnyedén elvégezhetjük, továbbá a t&kihnáay -szerinti gHkoprotehütormon-anah^-ok. receptomífiaításának és biológiai aktivitásának -meghatározását, többek között például az 1, példában ismertetett rudtóltgasdum-ieceptor és jelátviteli (a receptork-ötősi és a ciklikus AMP termelődést kiváltó képességet mérő) tesztek -segítségévei,

A találmány szerinti glikoprpíeishrmnon-an&lőgoknak számos terápiás alkalmazása van. A IxFSHanatógokat például a petefészekben lévő tüszők fejlődésének beindítására alkalmaztatják az ovuláció (peteérés) beindításának előkészítési fázisában; A bLH-analógokat és- a hCG-:analógokat ugyancsak a már fejlődésnek indult tüszők ovulációjának kiváltására használhatják. Férfiaknál emellett a herefunkció beindítására is alkalmaz* hatják ezeket az analógokat A találmány szerinti gíikopxoteiuhmmoa-aaafegok felhasználhatók ezen kívül Immunogénként is a termékenységet csökkenteni képes antlszéram, azaz fogamzásgátló oltóanyagok, előállításains. Az .an-fcagonísta- hatású attalógok vagy a .gliköptoteíxdmnxKm-aualőgokra specifikus antitestek a termékenység, fokozására- is alkalmazhatók például policiszhis petefészek-betegségben szenvedő nőknél, ahol például igen magas az Ul-szint.

A fokozottan stabil és a biológiai aktivitást és funkciót - pl. a glikopnüemhormoo-receptorok iránti affinitást és a hermestálts aktivitási - megőtző glikoproteíxíhonHon-atxalőgx^, mipt például a találmány tárgyát képező analógok, igét! hasznosak. A találmány szerinti analógok, nem csak a konkrét terápiás célokra alkalmazhatók, hímem azzal s ibkozőttan előnyös tulajdonsággal is rendelkeznek, hogy oldatban és magasabb hőmérsékleten istónkcionálisan stabilak, továbbá ellenállnak a fehérjédenaünúló szerek, pl, «reá, stb. hatásának, Stabilitásuk alapján várható, hogy a találmány tárgyát -képező analógok fétóletldejem vivő is megnő.

A találmány szerinti ghkoproteiíátosnoa-wtógok. a kezelendő betegnek bármilyen, a célnak megfelelő módon beadhatók. A beadás jelentheti például sokféle psrerstcráks át hánnel-ytkéí, ezen beiül többek közöt?. szubfeutás, intravénás;, mtradetmálís, ratramuszkuíáris, int-raperitoneális, Intranazálxs, orális, transzdermális vagy bukká-lis útvonalat. A parextterális beadás jelenthet botos injekciót, vagy időben elnyúló fokozatos per&aót

Az amiiold vagy amiloídszerü lerakódásokkal kísért betegségek megelőzésére, elnyomására vagy kezelésére alkalmazható tipikus kúra során néhány hónaptól több éven át tartó időszakban, egy vagy több .dózisban adjuk be a hatásos nsemxyiséget.

Nyilvánvaló, hogy .a beadott dózis nagyságát a beteg neme, életkora, egészségi állapota, testsúlya, az. esetleges párhuzamos kezelések típusa, a kezelés gyakorisága, valamint a kívánt terápiás itatás szabja meg. Az egyes kezelések során beadandó- teljes dózis beadható egyszerre, vagy több kisebb adagban, .A leírásban hatásos mennyiség” alatt a glikopttitcinhonnon-anaktg olyan koncentrációját érijük, amellyel a kívánt hatás elérhető. Az ebhez szükséges koncentrációt a technikában jártas szakember rutm kísérletezéssel meg tudja határozni.

A parenteráíis adagolásra szánt készítmények: lehetnek steril vizes vagy nem vizes oldatok, szuszpenztók és cnxúlzíók, amelyek tartalmazhatnak egyes, a techslkáhan ismert segéd- vagy kötőanyagokat is,

A találmány szerinti glikoprotenshormoti-analógoí taitahnazó -gyógyászati készítmények közé tartoznak, mindazon készítmények, amelyekben az analóg a kívánt hatás eléréséhez szükséges hatásos mennyiségben van jeles. A gyógyászati készítmények tartalmazhatnak továbbá megfeleld és-gyógyászati tag elfogadott hordozókat, pl. kötő- vagy segédanyagokat, -amelyek megkönnyítik az aktív komponensek gyógyászatilag alkalmazható készítményekké történő feldolgozását. A megfelelő és gyógyászatilag .elfogadott hordozok jel ismertek a technikád bán. [id. például Alfonso Gena&ro, szerk., Rertxragtoüs; Phannacerrtical Sciences, 18, kiadás. Mack: Publishmg.

« » * ♦ * * φ *

Co. {fcastoa, PA), amely a szakterületen stoadará referenriamankának számit}. A gyógyászaimig elfogadott hordozókat a beadás módjának, továbbá a gllkoproteiahomoa-amlőgok oldhatóságának és stabilitásának ngyriemfeevétolével rutin utódon meg lehet határozni. Az intravénás beadáshoz használatos formulák például lehetnek steril vizes oldatok, amelyek tartahnazhatnak pnífereket. hígitöszereket és egyéb megfelelő adalékokat

A parenteráhs beadáshoz alkalmazható formulák lehetnek a vízoidható formában, például vízoidható só tormájában lévé aktív komponens vizes oldatai. Az aktív komponens szuszpenziökéru, azaz megfelelő olajos injekeib-sznszpenzió formájában is adagolható. Megfelelő tipofil oldószerek vagy hordozók például az zsírsavak - igy pl, a szszáosnagolaj -, vagy a szintetikus zsírsav-észterek - igy pl. az etii-oleát vagy a. trigirceridek. A szuszpenzió viszkozitását fokozó adalékokat tartalmazó vizes injekció-oldatok kozó tartozik többek között a harbox énei íb cellulóz, a szsubltoi és/vagy a dextrán. A szoszpenzió emriieü esetleg stubihzátorokat is tartalmazhat.

A találmány általános ismertetését kővetően az alábbiakban konkrét példákkal próbáljuk még részletesebben megrilágfouu a találmányi gondolatot. Ezek. a példák azonban, csak a találmány illusztrálását, szolgálják, és az oltalmi kört semmilyen módon nem korlátozzák

I. példa

Az aiegy ségközb díszül fldkötésekkel történő kerssztkótesekfcei kapcsolatos szempontokkal összhangban, az 1B. táblázat adatot alapján arra következtektok, hogy elő lehetne állítani egy olyan hCG-analógot, amelyet a cisztin-csomók között kialakított alegységközs dtszutíid stabilizálna, feltéve hogy szabad clszteiaeket tudunk kialakítom az «-alegység 31, pozíciójában és hogy a β-aáegység 37. pozietóiában levő ttrozlnt cisztemre cserélhetjük. Ezt a következőképpen értük el: előáliltolfok a hCG β-alegységéaek egy olyan analógiát, amelyben a Tyr37-et risztemre cseréltük, majd előállItottuúk egy olyan humán «-alegységet, amelyben a 7. pozícióban lévő risztéin! szerbire cserékük. Ez. utóbbi móifosltéssal tnegszönistiük a. natív «-alegység 7. es 31. pozíciójúban lévő eiszteiítek közötti diszuiísdot és szabaddá tettük az «-alegység 31. pozlriojűban lévő ciszteim, amely így már képessé vált arra, hogy diszuliídot alakítson ki a β-alegyrég 37. pozíciójában újonnan megjelent eisztrinnri. Ha a két alegység-konstrukciót emlőssejt-tenyészetben exprexsxáStaüuk, az «.-alegység 51. pozíciójában lövő risztéin és a β-alegység 57. pozíciójában lévő risztéin létrehozott egy alegységközi díszülriökötési.

.A diszulffokötés kialakulása drámai módon megnövelte a heíerodimer stabilitását. .A hCG-ve! ellentétben, a keresztkötött heterodírner nem disszociált üres jelenlétében vagy alacsony pl-l-«, A b€G(«31-))37} monoklonális antitestekkel adob reakciója, Ltí-receptorokhoz való kötődése és jelátvitelt indukáló képessége hasonló, mint a hCG-έ. Ez azt bizonyltja, hogy a álszuliídköíés nem tette íőnlsre a hormon fonkctójáí.

Az «-alegységben lévő Cys? kodoojának szerm-kodonra történő módosítását egy Campbell ás mtsai. (1991) által leiri, a hCG «-alegységei: tartalmazó expresszié* vektor ípKBM-hCGo} segítségévei végeztük el. A pKBM-vektor a pUC-vekíorok (Yamsóh-Perroa és: mtsai,, 1985) olyan származéka, amelyben a pólóinkért egy Xhoí-kasitóhelyei tartalmazóra cseréltük, ami lehetővé tette a cDNS-mszertek mozgatását a pKBM és az expresszié» vektorként használt pSVL {Phanmeia, Fiscatarvay, N.I) között. Mivel csak egy «-alegység-gén lótezák, a hCG, a bi,B, a bFSH és a. hTSH «.-alegységét: kódoló cDbtS-ek ugyanazokat a kodeinokat tartalmazzák,, igy a vektort a továbbiakban csak pKB.M -ra-nak nevezzük. Ahogy az a 40, ábrán látszik, a pKBM-« az «-alegység kódoló szekvenciájának S'-végéu e:gy unikálís Xliol restrikciós endonukieáz hasítohelyet, a 9-11. aminosavai kódoló ködösök közelében pedig egy uaikális Bsml restrikciós endonukleáz hasttóhelyel tartalmaz. A poiiíncfáz-iáscreakcsóhoz (PCR) alkalmazott láneindltókat (0Pgo425 és OügoM?, id. 5. táblázat) ágy tervezőik, hogy ezt a régiót fogják be, a Cys7 kodoniát változtassák szma-kodoto, és hozzanak létre egy áj restrikciós ettáoaokleáz te&óhéiyet (BspS), amit a mmáss konstrukciók azonosításának megkönnyítésére alkalmazhatunk.

5. táblázat

A diszulfidkötésefckel keresztkölött analógok előállításához alkalmazott láncinditök szekvenciája

iOHgo363	5^!-AGCTGTCCIGGAGCTAGGAATCT-3^! i
iOl$go3ó4	ő’-CTAGCCTAGAAGCTCrGACrGTC-s’ i
iOligo3ö5	5^:-AGCdGT£CTGGÁG0rAGGAAICTCTö'IACGGAAGTGTFACYTCTGCTG?-3’ i
plígoóóá	5t-CTAG€CT.AGAAGCTCTGACTG'í'CCTAG?TGTGGTTfG'ÍCCAAÁ€TCÁTC-3' \|
;0íig<;425	5^;-AACCGCCCTGAACACATCCTGCAAAAAGGCCAGA-3^! i
phgo435	5'XGOGCT€TCAGCTGTCAATGGGüGC'rCTGCCG€AGATCTACCACTGA.CTGC·· i GGGGTCCCTXAGGACCAC-3’ j
ipligö436	5’~CCA£á€GGATC€GAGCYCTTAGCGGGGGTCAT€ACAGGTCAAGGGGTGGT- \| CCTTÁGGGACCCCGCAGTCAGT-3’' j
ÍOligoSOS	5^:-ACrGTCGGGGGClrGGG'rCCC3'TGACGTGTGATGACCGCCGCTT€--3' i
iíŐiigos iö	5'-GÖGACC'CAAöeCGCGGACAGTACAGTCAG'rACTGTCGCTGTCGGAGAG-3' i
jöíigo562	5^:-CCCAAGACGGCGGAGAGTGCAGTCAGTGGTAÖATGTGCG -3^: \|
Ghgo59ó	5^,-TGCACYGTCCGCGGTCTTGGC€CÁA.GCTATTGCAGCn'CGGCGAATTCCA- 1 GGACTCCTCTTCCTCXAckGGCC-y \|
Öhgo'730	5'-GATCCTTAAGArn'örGATAArAA.CAAffFAC'rGGA-3’
01igo75S	5G3GrrCTGGTACeGATGACGAT0ÁCAAG2'C7AAAGAAC€GCTGCGGCCGC- Gl?TG€CGCCCCATCAATöCCACCCTGG€TG¥G-3'
OkgöToü	SXXCACCGGATCCTTAAGA'ITrGTGATAATÁACkEAGTACTGCA-·.?
Öbg<>839	5^:~rGCTTCTCTAGAGCATAI'CCAACTCCATTGAÖATC7rAAGAAGACI'A'rG'rT- GGTCCAAAAGCAAÖTCA<B'AGTGA0TCCAGTTGC-3^!
Gti;>o845	S^:A:CGGCTGTTGTCCTaCCÁTGáCACGTGTG€TGCA-3'
0hgo84?	5^x-CTÖTAGCÖ'TGCATiX3CGöACTATCCTCCACATCAGGAGC-3'
QligoSSO	5^:-C€ATiGAGATCTAAGAAGACTATGTTGGTCCÁAAAGGACGTCAC'ÍAGTG~ AG7CCACTTGC~3''
Oiigohői	S^;-ACAAGTACTGCAGTGACAAGCAGTGTÖTTGCfCCACn‘TGAAAGC-3’
0tigoS?4	é’-GCÁCACGTGTCATGGTAGGACAACAG-d'
OhgoS77	p'-GATGTGCTAGCTAAGCA-u’
0tigö878	S'-CrAGIGCrrAGCTAGeAB’
0bgo921	5 -GATCTAAGAAG ACTÁTGCITGTACAATGT AACG TTA-3'
Olig«922	SVCTÁGTáACGTTaCATTGTA<2Aá<X:áTAÖTCTTGTTA-3'
Öbgo923	Y-GGACTGTACAáCáAGTáGTá-3'

4Ö *♦ * ' < * · .·

0&κ024	.?-OATCTACTACTrGn'GTACAGTCCGC-3*
Οϊί§ο925	Só'rGCCGGAGArfCTACTACTTGCIOGGGGGGTCCCAAGGACCAC-O'
OHg<?1151	S'-C€.ATTGAGATCTAAGAAGACTATGTTGGTCCAAAAGAACGTCACTAGTGAGT€CG^!
ObgoGll	5-z«3AAÖTACTGCAGTGACAeGCCGTGT(3ÖTTCTCACATTTAAA.ACCCCCCATT- actgt-t
ÖbgolGB	S-CGGGCTA'n'örCCTACTATGACGCGTTGTC'rGCAG'
ÖEgoHM	S’-GACAACGGöíCATAGTAGGACAATAG-?'
Oligos 154	5'-CTGTGC'TATAAG-3‘
öligol í 55	5’ -GTCCTTA’ f AGCAC AGATCC-y
öligoí 161	S'--CTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCGTCGAG-3^!
Óiig»! í 65	5'-C ATCCCGGGGCACCTAGGAC AAAGGGGCTCG'n'GG ATGCCC ATGT-A
Öligís363	S^AGCI'GTCCTGGAGCTAGGAÁTCTG¹
Oilgo364	5-GTAGCCTAGAAGCTCTGACTGTC-5^;
ÖIigo365	5^:-AöCTGT'CCTGÖÁGCTAGGAATCTCTGTACGGÁAG4GrrACTrCTGGTCT-3’
Oligo368	S'-CTAGCCTÁöAAGCTCTGACTGTGCTAG'nOTGGTTTGT'CCAAACTCATC-S'
Ö’bgí>425	5'-A ACCGCCCTG A AGACA'FCCTGCAAAÁAGCCCÁGÁ-T
ö!ig<>435	S^;-ÖTGGCTCTCAGGTGTCAATGCGCGCTCrGCCGCAGATCTACCACTGACTGGG- GGGTCCCTAAGGACCACG’
Öhgö436	S'-CCACACGGATCCGáGCTCTTÁÖCGOGGGTCáTGáCAGGTCAAGGGGTGGTCCT- TAGGGACCCCGCAGTCAGT-3-
Oago5Ö8	5ⁱ-ACTGTCGÜGGGCTTGGGTCCCTTGA€CTGTGAröACCCCCGCTTC-3‘
01 ig<>,510	5'-GGGACCCAA.GÖ3GCGGAGAGTACAGTCAGTACTGTGGGTGTCGCAGAG-3^:
01 lg» 562	5-Ct'CAAG AÜCGCGGACAG'Í Go AG Ϊ C'AGIGGf AGArCYGCG~3'
Oligí<596	S'-TGCACTöTCCGCGGTCTÍGGCCCAAGCTATTGCAGCTTCGöCGAATTCCAGGA- CTGCTCTTCCICAÁAGGCG-3’
Obgo?3ö	3^!'-GATCCTTAAGATTTGTGATAATAACAAGTACTOCA-3‘
OiigÖ	5^:-GGTTCTGGTACCGATGACGA'rGACAAG'rc:TAAAGAACCGCTGCGGGCGCGTTG- CCGCCCCATCAATGCCACCCTGGCTGTG-y
OHgíOO)	5^r-CCC:ACCGGATCCTTAAGArT'fGTGATAATAACAAGTACTGGAG^:
Obg»859	5'-'GX?rrCI'CTAGAG€ATATCCÁACTC€ATTGAGATCTAAGÁAGAüTÁTG'n'GG'I'C~ C AAAAGCAAGTC ACTAGTG AGTCCACTTGC - A
Oíig»845	5^!-CCGGCTGTTGTCCTACCATGACACGrGTGCTG€A-r
OligoB4'í	S^CT'GTAGCG.TGCA’n'CCCjGACT'ATCCTGCACATCAGöAGC-S'
OMgoS50	5--CC:a9'TGAGATC’TAAGAAGACTA'íGTTGGTCCAAAAGÖACGTCACTAG1'G.AGTC'- CACTTGC-3’
Oíigo»51	5FÁCÁAGTACTGCAGTGAC\AAGCÁGTGTGTfGCTCCACTnGAAACC-y
Olig<A?4	5^f-GCACACGTGTC.ATGGTAGGACÁACAGG^f

χ*χ*

Oligo877	5’-ÖATCTGCTAGCTAAGCA-3' I
Ülis®8?8	ő’-GTAGTGCTTAGCrAGCA-S' j
Okgo92I	5'-GATCTAAGAAGÁCTATG€TlGTA€ÁATGTAACGTf A~3^: j
Oiigo§22	5M7TAGTAAEXíTTACzm'áTACAACi€ATAGTCTTCIT.A-3· i
Oligo9'23	5^!-GGACTGTACAACAAGTAGTA-3’ i
Gligo924	5‘-GATCTAGTaCTTG'H'GTACAGTCCGC-3¹ i
Öligol#25	5^,-iOCCGCAGArCTAG'bACTrGCI'GCGGGGGTCCCAAGG.ACCAC-3^Í J
Oligol 131	5MXAXTGA.GÁ'TCrAAGAAGÁCTATGTiXjGTOCAAÁAGAA€GT€kACTÁGTGAGTCC3'* \|
Öíigo 1.132	5'-ACAAGl'AC:TGGAGTGACACGCCG'.rGTGGTTCTCAGATTTAAAÁCCCCCGA'fTA- \| CTGT~3^: j
Olígol 133	5^,~CCGGCTATdX5TCCTACTA'lGACG€GTTGTCTGCA-3' 1
Oligo'l 134	5M3AC.AACGCGTCATAÖTAGÜACAAfAG-3' (
Ölige II54	5’-CI'ö'EG€TATAAG-3' j
Olígol 15.5	ó'-GTCCTTATAGCACAGATCCG' i
Oligoliől	S'-CTTAATAGGACTCACrArAGGGTAGCCTGGAG-e' í
Olígol 163	5--CATCCCOCGGGACClAGGACAAAGCGGCTCC2'TGGATGGCCAdGT-3^:

A láneindltók és a tempódként alkalmazott pSVL-hCGot {Catnp'beí 1 és mtsai, 1991) segítségével .előállított PCR-terméket Xhol-gyel és. BstnI-gyel emészteítíik,. majd a technikában jól ismert eljárások (Maaiatis és mtsai., 1989) segítségévei a pKBM-a anikábs Xhoí-Bsmí-helyére szubklónoztufc.

A BspEI restrikciós endoaukleáz- hasttóhelyet ttittalmazó rekombináns plazmái PCR-alapő mutagenezissei -módosított régiójának szekvenciáját dideoxi eljárás (Maniaíis és mtsai., 1989) segítségével határoztok meg. Ez a vektor <pXBM-a€7S) egy, a 3. ábrás, bemutatott a-tonosavszekveneiával rendelkező fehérjét kódol. A módosított «-alegység cDNS-ét Xhol-gyel és Bajsítl-gyei történő emésztéssel kivágtuk a pKBMvektorból, majd a pSVL. Xtóí-BamHJ-beíyére aAtfeklónoztck, így állítottuk elő a pSVl..-«C7S-t, ami tehetővé tette az «C7S COS-7-sej-ekbea történő expresxzákatását. A kódoló szekvenciát -egy másik expressziős vektor, a pCí (Promega, Másítson, Wí) Xhoí-SamHI-helyére- is beillesztettük, miután a fenti és hasonló konstrukciók «zubklöuozásához optimalizáltak. A pCí usódosttása (optimalizálása) során egyrészről eltávolítottak a BatnHlbasitóhelyet, -másrészről pedig kicseréltük a polllinkert (Nheí-Norl) a következő restrikciós endonnkieáz hasítóhelyekei· tartalmazó poliímfeetre: Nhei-Xhoí-EeoRI-Mluí-Ktgtl-Xbal-S-alí-BanjHI. Ennek nyomán már lehetővé vált, hogy a pKBM- és pSVE-elapá vektoroktól a konstrukciókat pCl-alapó vektorokba szubklénozzuk. Ehhez először kivágtok a kívánt kódoló szekvenciát tartalmazó Xhoí-BatuHi-ftagroenst a p.KBM-tóí vagy pSVL-bőí, maid Xhol-gyel és BaruH'í-gyel emésztett pCí-be ligáitok. A leírás további részében említett pCbalapú vektorok mindig az imént Ismertetett módosított pCI-veks-ort jelentik. Az «-alegység kódoló régiójának pSVL-tói pGl-lte történő átvitelével előállítottuk a pCÍ-a-t és p€í-a€7S-t, amelyek lehetővé tették a sejttenyészetben történő- expressziét.

Nem feltétlenül kell szemre cseréinhök a 7, pozícíöbm lévő ciszteim ahhoz, hogy olyan «-ategységanalógot kapjunk, amelyben nem jön létre a Cys7 és a CysSl közötti disznlfíd. Aláásni, is alkalmaztak.már e kötés megszüntetésére (Eoruhashi és mtsai.,. 1994), és várható, hogy ha a -Cys7-et más bármely más amtnosawal «« * helyettesítjük, akkor ugyancsak megszűnik a Cys7Cys31 diszalbdköíés.

A hCG β-alsgységének kódoló szekvenciáját úgy tttodosítottuk, hogy a 37. pozícióban lévő tirozin kodouját cisztemkodonnal belyetteslietiük. Ehhez a bCö β-alegységének a pKBM-hCöp' elnevezésű pUC-alapú vektorba bed lesztek cDNS-ét kazetoí-matagenezisssl n-ódosltottuk {CamobeO és «rtsaL, i 991). Ez a konstrukció a 35-36, és 45-46. aminosavak kodortjánál. umkális NgoMÍ- és Psd-hasítöWyeket tartalmaz. A mutáns kodont ügy vipük be, hogy az NgoMl- és a Psti-helyek közötti rövid DNS-szakasz helyére az Öfrgo&45 és az Öiígo8?4 (5. táblázat) híbritiizáliatásával előállított kazettát lllesztottak be. Ezzel együtt egy Proli restrikciós endonukleáz baskőbelyet is hevittünk, ami lehetővé tette a «sutáélói ttrtalmazó· ptoaidok azonosítását.

Ezt a kazettát azután a technikában jól ismén standard eljárások (Maniatis és mtsai., 1939) segítségével a pKRM-h€G$' plazmáiba {Campbell és mtsai., 1991); sznbkiőnoztuk, és a «sutáit régió kívánt szekvenciája!, dídeoxi szekvenálo eljárás segítségévei határoztuk meg. A pKBM netrs expresszié» vektor, ezért az így előállított β-alegység^krmtnációl pSVL-be kellett szabklönoznnnk.ahhoz, begy emlőssejtekben expresszálni tudjuk. Ehhez vettük a pKBM-hCGp’-bŐ! Xhol- és Bamffi-emésztéssel kapott kisebbik fragmenst, majd ligáitok a pSVL

Xhoí- és BamHl-emésstésével kapott nagyobbik íragtnenssel. Az így kapott depressziós vektor neve: pSVLh€G8'Y37€', A pSVL-hCGb' és a pSVL-hCGP’YlTC által kódolt aminossavszekveHciákat a 4. ábrán mutatjuk be. Ezeket azután módosított pGl.-vekior Xbol-BamBI-helyére is szabklőnoztak.

A. fenti kódoló szekvenciák elöálllthatök standard GNS-színtézissel is, kereskedelmi forgalomban kapható berendezések segítségével. Ezeket az eljárásokat felhasználhatjuk bosszú oligonukteotidok előállítására, amelyeket azután össxeligálhsmnk (Campbell és raí-sai., 1992). Meg kell jegyezni, hogy a kívánt kódoló szekvenciák olyan cégektől is beszerezhetők, amelyek szintetikus oligonukleotidök és· .szintetikus cDNS-géoek előállítására specializálódlak:. Ilyen eégek: például a Midland. Certiíied Reagant Compaay (Mídlaaó,. Texas), valansmt a Genosys Bioíechnologies, Inc, (The Woodlands, Texas). Az alegységeket emlőssejtek tenyészeteiben ípl. COS7-seítekbcn) expresszákalhatfuk. kereskedelmi forgalomban- kapható vektorok, pl, pSVL (Pharmaels, Piscatavvay, N.i) vagy pCI (Promega, Miaáisott, WI) segítségével, a Campbell és mtsai, I1991) által leírtakhoz hasonló, és a technikában széles körben használt eljárások alkalmazásával.

A pSVL-« és a pSVE-hCG^', valamint a pSVL-€7Sa és a. pSVE-hCQP-Y3'7C, vagy a pCÍ-α és a: pCIhCGb', valamint s pCÍ~C?Sa és a pCi-hCGpY3?C piazsndpárokaí a technikában jól ismert (ki. például Campbell és mtsai., 1991) rutin eljárások segítségével COS-7-sejt.ekben koexpresszákatiuk. A COS-7-sejtek transsfektálásúboz egy, a Kriegier és mtsai.. (1999) által: leírt standard kalcium-fosziáí kiosapásos eljárást alkalmaztusk, A COS-7-sejtekét az ATCC-től (Roekviile, MD) kaptuk. A Irsnsztskcíö után egy nappal eltávolitottuk a sejtek szaporításához használt lápközeget, és széíummentos DMEM-iápközegre cseréltük. A sejteket további bárom napon át litkuoáhnk, hogy a szekretáit tennék megfelelő mennyiségben télgyűlhessen a tápközegben. Ezt követően a sejttörmeíék és egyéb csapadékok eltávolítása érdekében iecenlrílbgtóluk a tápkőzeget, a felölúszót dializáló zsákba plpettázmk, és a zsákol hrgroszkófxjs pocrútegre (Auusscíde Calbiocbem, La Jolin, CA) helyezve betoményíietíűk a nagy ttxslekulasólyú komponenseket.

A íápközegbe szekretált hCG és keresztkötöít hCG mennyiségéi Al 13-antilesl (kikötő antitest) és ^!1B!ö5-sníitest (detektáló antitest) segítségévei, szendvics-hranunteszttel (Moyfe és mtsai,, 1982} határoztuk meg. Standardként vizeletből tisztított hCG-t alkalmazttmk. A teszt során első lépésben kikötöttük a hCG «alegységére specifikus Ai 13-aatitesteí (1 pg 0,05 mi-ben) egy nikrottíráló lemez felszínére (mkobálás: 1 őrá.

X*

37^CC> A ki nem kötött antitestek eltávolítása után a megmaradt fehérjekötő helyeket 0,9% NaCl-f és 1 mg/ml •szarvasmarha széramalburaiaí tartalmazó oldattal blokkotok. A lemez lyukaiba ezután a három napon át trans2fsktált sejtek tápközegéből 0,05 ml-t pipettázfemk, és 1 órán át 37^cC-on iukubálíok, hogy a hCG vagy a hCG-analóg. a lemezhez adszorbeál; antitestekhez kötődhessen. A meg nem kötődő hormon vagy hormonanalőg eltávolítása után a lyukakat 0,9%-os sőoidattal mostak, majd a· kikötött leszlanyagot: a h.CG Ó-alegységére specifikus, radioaktívon jelölt atttitesttel ('i-BlÖSt reagáltattak (az antitest előállítását id. később), A hCG vagy a hCG-analóg által -meg nem kötött ^,J>í-BIÖS-öt leszívtak, majd a lemez felszínén megkötőit radioaktív Jetei, yszámlálő segítségével határoztuk meg. Ezzel a teszttel akár 9,1 ag hC-G is könnyen kimutatható. A teszthez nem csak ezek az nsritestek, hanem számos, kereskedelmi imgafemban kapható antitest is használható.. A. h>CG «alegységére specifikus antitestek többsége mellett minden olyas β-alegység-speciükus antitest télhasznáfeatö, amelynek a hCG-vel és a szabad hCG β-alegységgel szembeni affinitása nagyobb, mint K)⁸ M’. Ez utóbbiak közé tartozik: például a Pieree eég (3747 North Meridián Road, Rockfotd, ;L) által kínált ZMCG13- és a Zh4CG7-antitest is.

Az antitestek, a hCG és a bFSH radioaktív jelölése a Píerce Chemical Co.-tól (Roefcfbrd, II,) vett iodoGea segítségével történt. Az eljárás sorún egy körülbelül ö,75:ml-es kis övegkémcsöbe 50· pl aeetonban 1,5 mg íodo-Gent raktunk, majd megvártak, mfg az aeeton elpárolog. Esnek eredményeként: a Íodo-Gen a kémcső alján egy vékony réteget képezve maradi vissza. Ezt követően lő pg B1Ö5-ÖÍ adtunk hozza, a csövet m&aayagsapkával lezártok, majd mikroinjekcióstd segítségével, a sapkás át, 0,2 M nátríumfoszfet pufíerben (pH 7,2), 250-500 uCi Na^usI-t fecskendeztünk hozzá, 21)-31)-másodperc után az elegyhez 0,1 ml, ő,9% NaCl-t tartalmazó 0,02 M nátrium-foszfát paffért (pH 7,2}· adtok, majd az egészet egy 2 ml-es BioGel PŐDG-oszlopra (BioRad, Sichmond, GA) vittük fel és· a jödozott fehérjét gél filtrálássál elválasztottuk a szabad jódtól. A jődozáshoz használt Ν«’·^ί5ί mennyiségét attól lóggően választottok meg, Isosy a fehérje milyen mértékben őrizte meg funkcióját a radioaktív jóddal történő jelölés után. Az antitestek és a hCG radioaktív jelölése során általában 50 jsCi/pg specifikus aktivitású, a hFSH esetében pedig 1 0-25 pCi/ug specifikus aktivitású termékeket állítottunk elő,

A 6. táblázatból látható, hogy a mutáció nem zavarta a kereszfkötőtt hCG-analóg expresszi-óját, A pSVLben vagy pGl-ben lévő kódoló szekvenciával transzföktált sejtekben hasonló mennyiségű keresztkötött analóg vagy hCG termelődött.

6. táblázat

A hCG és a i:CG(«3 1-(537) exprssszióia traaszfektált COS-7-sejtokben

hCG vagy analóg	Koneentració
ICG (pSVL)	5,07 »g / ífiö5 rnl
hCG (pGI)	4,98 ng:/0,95 ml
hCG{«31-{33?) (pSVL)	0,94 ng / Ö.Ö5 ml
hCG(«31~b37;lpCl)	10,06 ng/0,05 ml

A termelt hCG és ;b€G(a31 -(537} egy ItöG-standardhoz viszonyított mennyiségét szendvicsimmuttteszttei határoztuk meg. Kikötő antitestként egy, az ct-alegységrs specifikus {.AH 3) antitestet, detektáló antitestként pedig egy, a fi-atogységre specifikus, radioakfivan jelölt aniiiestef (B I1Í5} használtunk.

Μ· « «

A termelődő keresztkötöh hCG-analóg mennyiségének meghatározásához alkalmazott szendvicsimmnntesztben az Ali 3- és a 81 Ö5-antííestekei. használtak, mivel szék olyan epitőpekat ismernek fél, amelyek várhatóan távol, esnek a mutáció helyétől (Cosowsky és mtsai,, 1995; Moyle és mtsai,, 1995). Az A4Q7-aníiíest a kCö-vel ellentétben a hCG(«3 l-(137)-ana-lógct nem Ismeri lel (5, ábra), mivel ez az antitest egy olyan epnópra -specíBkús, amely egy, az «.-alegység N-terminális- részletét, igy -a C7S mutációt helyét is magában foglalja (Moyle és mtsai,, 1995). Az A4Ö?-aatitesteí Dr. Róbert E„ Cauíield {Columbia University, New York, NY) bocsátotta. scnílelkezésűokrö. Mivel az A4Ö7 a hCG-recepíor komplexet is felssumri (Moyle és mtsai., 1995), várható· volt, hogy ez a kis változtatás a hormon konformációjában asa zavarja meg a keresztkötött hCG-anaiógok biológiai akíivitásáí.

Á bCG(«31-1)37) és más kereszikötött analógok biológiai aktivitását radioijgandam-receptor és jelátviteli tesztek segítségével határoztuk meg. Á. tesztekhez az LH-receptort kódoló gén-cDNS-évei iranszfektált, igy fel·· színükön funkclöképes LH-receptort expresszáiö CHÖ-sejtekét alkalmaztunk, A CHÖ-sejteket az ATCC-tó! (Roekvílle, MD) kaptok. A patkány LB-reeepíor cDNS-ét egy patkány petefészekből előállított' könyvtárból, iXílimeráz-láncreakelö segítségévei izoláltok (ld. Bemard és mtsai·., 199Ő). Meg kell jegyezni, hogy csak az egyszerűség kedvéért alkalmaztok, ezeket az LH-receptort hordozó sejteket, és hogy a mliofigandum-reeeptor teszt bármely egyéb olyan szövet segítségével elvégezhető, amely LH-receptorokat espresszák például felnőtt natkányheréból készült homogenizátom, vagy terhes patkányokból származó szérum-gonadotropinnal és feCG-vel kezelt éretlen patkányok petefészkéből készült hömogeaizátum (mindkettő beszerezhető a Sigmától (St. Loais, MOij. A hOG-t nagy affinitással kötő · petefészek-preparátum előállításához 21 napos patkányoknak szubkután injekcióban 5b NE, terhes patkányból származó szé.nnn-goncdoíropirít adunk, Körülbelül 65 óra múlva a patkányoknak újabb szobkutáu injekcióban 25 NE IsCG-i sduok, majd hét nap múlva ieöijük őket, és a kiemelt .petefészkeket elhemogenizáijuk. A teszthez mindegyik kémcsőbe a petefészek agyiizenketied részének megfelelőmennyiségű- homogén-izátömot teszünk. A patkány LH-reeeptort expresszáiö -sejtek kőtik a radioaktívat jelölt hCG-t, amelyet vagy a korábban ismertetett eljárással áiiithatuok elő, vagy készen megvebetjük a New England Nóclear-tól {Boston, MA). .A sejtek, a jelöletlen hCG-t is megkötik (ezt a hormont a Sigmától lehet beszerezni (St. Lonis, MO)}, Az LH-receptort expresszáiö sejtek 10-30 perces hCG-kezelés (37^;'C) fonására ciklikus AMP-t kezdenek termelni. Ennek mennyiségét egy. a ciklikus AMP -re .specifikus radioimmuateszt. ÍRIA) segítségével határoztak meg {Brooker és mtsai,, 1979),

A hCG oc- és a (3-alegységének cbzlin-csotnöi között kiafak&ott Hegységközi diszuííldköfés nem zavarta meg a keresstköloll heterodaner azon képességét, hogy LH-seeeptorókiioz kötődjön és ciklikus AMP termelődést vgtsoa ki. Miad a hCG, mind pedig a b€GfeGI~p37) képes volt tehát a “l-hCG LH-receptort expresszáiö CHÖ-ségekhez való kötődésének blokkolására (ó. ábra), és arra. is, hogy ezekben a -sejtekben ciklikus AMP termelődést váltson ki (7. ábra). Az eredmények alapján tehát isegállapiihaljuk, hogy az alegységközi disznlfiákőtés sem zavarta meg a hCG általános funkcionális aktivitását.

Az alegységközi diszolfídköfés jelenlétének köszönhetően a hCG<«.31-))37) ellenáll a hCG-Ί denaturáló a. sav-, «reá- és hőkezelések hatásának. Ezt igazolják a 8. és 9. ábrán látható adatok is. A 8. ábráit azt mutatjuk be, hogy milyen hatást gyakorol a magas hőmérséklet a beterodimer szendvics- hmnunteszttel mért -stabilitására. Ebben a tesztben kikötő antitestként az AllŐ-anirtestet, íleteksálö -antitestként pedig a ^mI-8íő5-aatítestet alkalmaztuk. Megjegyezzük, hogy az 8105-aatítest és a 8112-antitest egymással átfedik a β-afegység harmadik húr4' kának visszahajlási régiójában iévó epkópokat ismer fel (Moyic és mtsai., 1991): Cososvsky és mtsai, 19931 A hCG{a3í-£37)-ben ezek az epitópok távol essek ntinti az «.-, ntitsd pedig a δ-alegységben létrehozott mutáció helyétől. A mérés során a hCG-t és a hCG(«31 4337}-et különböző időkig (max.. 20 percig) 85^cC-ob inkubáttuk. Míg a hCG- aktivitása látszólag 7-8 perc alatt, teljesei! megszánt, a keresztkötött analóg a 29 perces íntobáiás után még mindig legalább 75%-os aktivitással rendelkezett ·<§. ábra). Mivel ez a szendvics-imrautrteszt dhnerspecblkos, a bCG-aktívitásásak eltűnését feitebetőieg az alegységek disszociációja. okozta, amit az alegységközi diszulfidkőtés jelenléte megakadályozott.

Közismert, hogy koncentrált urea hatására a gonadotropinok alegységeikre disszociálnak (Pi-erce és mtsai., 1981). Antikor & hCG-t 8 M arca jelenlétében mfcabáltak, a molekula alegységeire disszociált, arait Westem-blotí eljárás segítségévéi egyszerűen ki tudtunk mut-atm <9. ábra).. A hCG a- és β-alegységét kódoló génekkel írasszfektélt emlőssejtek az· ob-ltoierodimer mellett gyakran szekretálnak szabad β-alegységet is. anti így megjelenik a sejttenyészet tápkozegébea. A szabad β-alegység és az αβ-netercdimer könnyen megkülönböztetheti) egymástól, ha -a szetidvlcs-immantesztbea egy «-alegység-specifikus és egy ö-álegység-speefokus antitestét használunk, továbbá méretük alapján is elválaszthatók Westem-blott segítségévei, amelyhez radioaktívan jelölt, a hCG-re és a szabad j3-alegységre specifikus monoklonális antitestet kell .alkalmazni <ld. 9, ábra). Az bCG «-· és δ-alegységés is expresszáló sejtek tápközegében tn ind a heterodímer (felső sáv), mind a szabad β-alegység (alsó sáv) kimutatható volt. Ha a tápközeget § M arcával kezeltük, a heterodtmer alegységeire esett szét. Ennek megfelelően a felső sáv eltűnt. A. diszulód-keresztketőtt heterodimer, a hCG(«31-íl3?) azonban arca hálására nem disszociált, így a heterctiimercek megfelelő sáv ép maradt (9, ábra).

iLűdlda bzálhsöbafejtireiös gokoptoicrebsoitoö-anatog

Közismert, hogy a hCG biztonsági öve listással van a hormon reeeptorkőtö aktivitására (Campbell és mtsai,, 1991; (Moyle és mtsai... 1994; Han és nttsal, Í996). Ha a hCG β-afegységébeo az löl. aatiaosavtóí a 109.. aminosavig terjedő szakaszt a hFSH megfelelő (azaz a hFSH β «hegységének a 95. -armnosavtőí a 1(53, amíoosavíg terjedő) szakaszával helyettesítettük, drámai módon megnőtt sz analóg FSH-aktivi-tása anélkül, hogy az LH-akíivitás károsodott volna (Moyle és mtsai, 1994; Han és mtsai, 199ó). Sőt, a fenti szub.S2titóció a hCG TSH-aktlvitását ís fokozta (Campbell és mtsai, 1997), pedig hTSH-ból származó specifikus .szekvenciadaxadok bevitelére nem került sor. Az alegységkőzi diszulfidkőiéseknek egy ebhez hasonló több futske sós analógra gyakorolt hatását tanulmányozva meg tudtuk állapítani, hogy a specifikus diszulfídok. várhatóan· hogyan befolyásolnák a luttopinok, foiliimpínok és tírctfropiaok aktivitását. A példában azt mutatok be, hogy egy, a cxsztin-csotnók között kialakított alegységhez! diszulhd hogyan befolyásolta amak a hCG-amílőgrutk (CFC101-114) .az LH- és FSH-aktiviíását, amelyben a hCG β-alegységéaek a 101 atomosáétól a 114. aminosavig terjedő szakaszát az hFSH megfelelő (azaz a hFSH β-alegységének a 98, aminosavtót a 1(53, aminosavig terjedd) szakaszával helyettesítettük.

ACFClől-114(α3!.-β·3?) expresszlöjáltoz a sejteket az ®C7S-t és a CbCp'l(5!-114Y37C-Í kódoló vektorokkal transzfeksáitok. Az o-alegyseg módosítását az I. példában ismertettük. ACfC101-ÍI4B'Y37C előállításához használt CFClöl-l 14 β-alegység-prekurzor DNS-sszekveaciája a hCG Ö-slegységének. l-Wü, armnosavait, a'hFSH β-alegységének 95-1 Ok. ammosavaít és a hCG jl-alegységének 15.4-543. aminosavait kódolta, ebben a ♦ ♦ sorrendben egymáshoz kapcsolva. Ezt a koostratóot úgy állítottuk: elő, hogy közös Sstll-basítóhelyűk segítségévei össsekombtaátak két IRfG/bFSH-kimém kódoló szekvenciáját (41-43. ábra). A pSVL-CFC94-l 14β' Xhoi-BamHf-fragíaemébe szubldóaozfok a pSVE-CPCKH-lÖö^ Xboi-Sstll-fraginessét, amely a· szignálsaekvettcia kódoltjai mellett a pS¥L-€FClöl-114B‘ 1-103. aminosavast kódoló oukleotidszekveneiát tartalmazta. Ennek eredményeként a pSVL-CFC4Ől~i Í4p^j-beoa bFSH p-alc:gységénok a 88. ammossvtól a 94.. amínosavsg terjedő szakaszát, a hCG β-alegységének megfelelő (azaz a 94-100.) aminosavaira cseréltük, és bevetőnk egy Bglll-hasrídhelyet. Mindegyik kódoló vektort a ItCG β-slegységét kódoló cDNS-böl állítottuk elő. mégpedig úgy, hogy az alábbiakban Ismerteteti módon megváltoztattunk egyes, a molekula .S'-felébea elhelyezkedő kodouokat.

A pSVL-C.F€94-Í 14β’-ί a pSVL-€fC94-106P’· FCR-es mutageoezísével állítottuk elő. A pSVI,-CE€94;0όβ· a MM β-alegységértek 1-93. aminosavaií, g RF8H Ó-alegységének 88-100. aminossvait és a hCG βalegységé-rek: 107-145. ammosavit kódolja, ebben a sorrendben egymáshoz kapcsolva. A pSVL-CFC94-l 14β' eleállltbssrsak első lépése a pSVL-CEC94-íöőj3’ SÖEmg FCR-rnníagenezissel iHo és misai., 1989) történd előállítása. A ECR-reakciófeoz látjemdiiöként az Ollgo5ö8~ar és tsz Ofígo36S-at (5. táblázat), terápiáiként pedig a pSVL-hCGB'-t alkalmaztok (Campbell és misai., 1991). Az igy kapott termék tartalmazta a CFC94-106 fi~ alegység 101-145. kodonjmt, a hCG β-alegységének stopkodonjáí, a 3* nem transzlálódó régiót, egy Báróin restrikciós eodonnkleáz basítöhelyet, továbbá a pSVC-vcktornak a BamHl-íöl 3'-irányban elhelyezkedő részét A második PCR-reakcioban az Oltgo51ö-et és sz Oiigo3ő5-et (5. táblázat) használtak lánc indítóként. Az így kapott termék tartalmazta a pSVE-vektornak az Xhol-től SMrányban elhelyezkedő részé·:, a p$VL-hCGp 5' nem transzlálódó régióját (Campbell és misai., 1991), a hCG β-alegység szignálszekvenctájának 20 kodonját, valamint & CEC94-1Ö6 Ó-alegység 1-107. koáesjaít E két FCR-íennékben a CEC94-I06 S-alegyseg 101-107, kedosjah tartalmazó szakaszok komplementerek voltak egymással, ami a “.SOEíxíg PCR-rel történő átfedéshosszabbítás előfeltétele. A két PCR-termékhez hozzáadtuk az Ol.igo363-ai: és az ö;igo364-et (5. táblázat), majd egy harmadik PCR-reakoíöban ttmpiiískálíak őket. Az így kapott PCR-lermék a CEC94-10Ó β-alegység teljes szekvenciáját kódolta, amely az 5’-vég közelében, egy Xboí-helyet, a 8’-vég köze lében pedig egy IkatnKí-helyeí tartalmazott. A E€R:-termékes, amely a Kö-104. aminosavak kodonjainál egy Sstíl-helyef is tartalmazott, ezután a pSVÍ. Xhoi-Bamffidíelyére klónozink, és igy kaptuk a pSV'L-CF€94-ÍöóS'-t. A kódoló régió szekvenciáját dtdeoxí szekvenáió eljárás segítségével határoztuk meg.

A pSVE-€EC94-l Ι4β’ β-alegység előáll kásának utolsó lépésében a PCR-reakctőhoz iánemditókéní az OiígoS9ő-ot és az Obgo3ő8-at (5, táblázat) használtuk. templátként pedig a pS VL-bCGp'-t, Az így kapott termék az ó-végen egy Ssíll-helyet, a 3 -végén pedig egy Band-H-hdyeí tartalmazott. Antikor a terméket SstlI-vel és BmnHl-gyei emésztettük, egy olyan DNS-íragmenst kaptunk, amely & bF-’SH B-a:egységének 97- IÖ8. aminosavait és a hCG β-alegységének 115-145. atninosavah kódoló Radonokat tartalmazta, ebben a sorrendben. Ezt a ífagmensl azután a pSVL-CFC94-106^' umkális Sstli-BamHl-helyére klónoztuk, és így kaptuk a pSVl..-CFG94114β'-ί, majd a PCR során asnplifikált szekvestela egy részletét dedeozi -szskvetsálásstd eliettőriztük,

A pSVI.-GFCl.01 -1066' előállítás» soron a pMBl3S jelű vektorból indultunk ki, amely egy, a 114, aminosavnál csonkolt és a Glyl(?2 kodeinja helyén valin ködöst tartalmazó bCG β-aiegység-airalógot kódol, A pMB135 előállításához az OHgo435-ö£ ttz Oligeődo-tal (5, táblázat) üibrtdizáítattuk, majd a 3'-végeket .*••7

**'»·* enzimatikasan féltőitőítük. így egy PvuO- és egy Sstl-helyet tartalmazó kétszáló kazettát kaptunk. Ez utóbbi hashohely a stopkodontőí .l'-irányban helyezkedik el Ez a kazetta. a bCG β'-alegységének 87-lök amiaosavait, egy vallót és a bCG β-aiegységének 103-114. aminosavaít kódolja, ebben a -sorrendben, továbbá tartalmaz egy Bgill-belyet a 94-95. ködösöknél, A kazettái a pSVE-hCGp’ .fYalí-Sstl-helyére szubklónoztuk, majd a Pvull·· és; az SSü-beiyek közé eső szekvenciát dideoxi szekvenálással leellsoőriztük. A pMBUS-őt templátként, az Ofigo5ó2-t és az <Migo3ó5-t (5. táblázat) pedig bbubcökékésí alkalmazva egy olyan PCR-íerméket kaptunk, amelynek XboESslH-feagmsttse a következő szekvenciákat tartalmazta.· a hCG β-alegységét kódoló cDNS nem transziálódö régióját és szignálszekvenciáját, a bCG β-alegység 1-190. kodonjmt, és a hFSH β-alegység 9-5-98, tefomaik ebbe» a sorrendben. Ezt a PCR-terméket azután a pSVL-CEC94-iöóE‘ Xhol-SstH-helyére klónoztuk, így kaptuk a pSVL-CFCl-Öl-lÖőp-t, melynek -szekvenciáját dideoxl székvenálással határoztuk meg.

Nyilvánvaló, hogy a pSVL-CECIOl-l I4i)‘ előállításához nem feltétlenül kel’ ezt a uexlszert alkalmaztál. A festi lépéseket csak. történeti okok miatt követtük. A különböző'köztes vektorokat más kísérletek során állítottuk elő, így retideikezésre álltak a CFC101-114j)‘-t kódoló vektor előállításához.

A pSVL-CFCIÖl-11;4β Y37G piazmidot ügy állítottuk ele. hegy összekombináltak a pSVL-hCGf3'Y3-?C S'-feié·” - -amely az Y37C-rautáeiőt tartalmazta, a pSVE-CEC 191-114-3’ S'-félével, amely pedig a hFSH βafegység 95-198. amúH>savaít kódoló szekvenciát tartalmazta, Ez konkrétan ágy történt,, hogy összeligáltufc a pSVE-aCö)FY37C Xhol-gyeí é.s 8su36í-gyel történő emésztése során kapott kisebbik fragmenst -a pSY'LCFCIÖl-i140’ ugyanezen enzimekkel történő emésztése során kapott nagyobbik fragmenssel. Ezzel kicseréltük a szígnálszekvmcia és a CEC 101 - ί 14β’kodönjais a ΜΧϊβ·Ύ37€ megfelelő- kodonjas-ra,-aminek eredményeként a 37.. pozícióban lévő tirozirs crsztelme cserélődött. Az- Xbol-SamRl-éragmeásí a .korábban ismertetett módosított pCí-komtrakeió Xlml-HamHl-helyéte klónozva kaptuk a pCi-€FCI01-!14f)^íY37C elnevezésű konstrukciót A CFC 1.91-1 14β’ és a CFC’löl-114ÖY37C annaosavszekvencíájáí-a lő. ábrán mutatjuk be.

A CFCIOi-s 14 és a CFC1Ö1-114(«3ΐ-β37) előállításához az 1. példában ismertetett eljárást alkalmazva a következő vekiorpárokai köexptesszáit&Jtök-COS-T-sejtekben: pSVE-o; és pSVE-CFCIOi-1. Ι4β’; pSVL-«C7S és _:pSVE-CEC10Mi4E'Y37C; pCl-o. és pCI-CFClÖl-i ?4jY és pCE«C7S és pCl-CFC19M143Y3?C. A betöményített tápközegbeu a CFC101-114 és a kereszt-kötött CFC 1151-1141α31-β37) koncentrációját olyan szeudvics-ímmunteszttel (Moyle és mtsai., 1982) határoztuk meg,, amelybe·?, kikötő amuestként All3-at. detektáló antitestként ^! ^:?i-BiOS-öt vagy ^!;'l-BH2-t, standardként- pedig -vizeletből tisztított bCG-ί -alkaksazamk. hl is megjegye?.zük, hogy a teszthez nem kell feltetteBÜl pont ezeket az antitesteket használni; kereskedelmi íargaiomhan Is kaphatok olyan antitestek, amelyekkel várhatóan megfelelő módon elvégezhető ugyanez a kísérlet.. A bCG «-alegységére specifikus, de a ní-'SH-t is nagy affinitással kötő antitestek többsége - pl. az A113 vagya hFSH íi-siffgységére .specifikus, de a hCG-t is nagy affinitással kőtő untilsslek többsége megfelelően alkalmazható ebben a tesztben. Mivel azonban a fenti analógok a biztonsági övnek abban a fogíójálbau, .amely erősen befolyásolja az FSH-akdvttást (azaz a β-alegység -tizenegyedik és tizenkeüeáíg ciszteinje közötti szakaszon ÍMoyleés- sttis&i., 1994)) IsESll'-szekverscsákat tartalmaznak, a CFClöl-114 analógjait nem minden, a hCG alegységére specifikus, antitest ismeri fel. Ez látható annak az antitestek - az A4ö7-nek ~ az esetében is. (II. ábra). amely bCG-ί felismeri, a hFSH-ί azonban nem. így tehát bár az A4Ő7 a hCG-t megköti, a CÉGIG I --114-et és. a. keresztkőtött CF-C.lÖl-I14-anaiőgokat .sokkal kevésbé képes felismerni. Az Α4Ό7 emellett a; CFCIÖI48

1141ο21-β37 i-et xs kevéssé .köti.

A CFC1-Ö1-114-anaiógokat -a hCG β-alegységére specifikus antitestek többsége ki tudja, matatni, feltéve, hogy a hCG-vel és a szabad hCG β-slegységgel szembeni affinitása nagyobb, mist 10' M ''. Kivételt képzenek ez alól azok az .antitestek, amelyek a· β-alegységnek sz FSH-szekveaclák által -elfoglalt szakaszához közel eső snüoosavafcat isixsernek fel. A. Bili -antitest, amelyet erősen befolyásolnak a h€G- 10S-114. aminosavai (Cosowskv és mtsai., 1995), tehát nem ismerte fel a -CFC-iÖl-1 14-et és analógjait. A legtöbb olyan antitest azonban, amely felismeri a hOG-i, a hLH-í, a szabad hCG- β-alegységet és a szabad hLH β-álegységet - ilyen például a 8112 ugyancsak telhasználbató a teszt céliám, A 8105-8112 epilópfegfo égéiben a hCG egyik legnagyobb antigenitással rendelkező- régiója, és - -ahogy azt már az 1. példánál említettük - az erre a régióm specifikus antitestek kereskedelmi forgalomban is kaphatók.

A CFClŐI-'ll4(«31'-fi37)-ben lévő díszulfid-keresrtkőtés a-CFC10-1-1 H-gyei összehasonlítva fokozta az analógok hő-stabilitását fi2. ábra). A szenávics-immuntesztek eredményei azt mutatták, hogy a 85°C~on·történő inkobálás hatására a hCG aktivitása körülbelül 7,5, a CFClö'i-114 aktivitása pedig körülbelül 15 pere alatt szinte teljesen .megszűnt. 'Ha azonban a CFC1Ö1-114(«:3'l-j337}-et inkubáltuk ugyanezen a hőmérsékleten, 20 perc után is jelentős aktivitást tapasztaltunk. Ez azt bizonyítja, hegy a diszalfid jelenléte fokozta az analóg sfcahihtását. Mivel a CFClöl-l 14(«31-β37), valamint a β-alegység tizenegyedik és tizenkettedik císztemjé között hJFSHszekvenciökat tartalmazó más analógok TSH-aktivhással is rendelkeznek (Campbell és mtsai., 1997), -ez a diszulfidtoés feltehetőleg. az FSH és a TSH stabilitását is fokozza.

A CFCl'31-1 14 képes az IJí-receptorokon keresztüli jelámiel sömréálására. A -clsztó-csomók között'kialakttoít «31-β37 alegységkőzi diszalfid hatására a CFC191.-114 aktivitás ebben a tesztben sem csökkeni <13. ábra), azaz a CFCW1-1I4 és a CKAOl-d 14<g3 ί-β37) körülbelül ugyanolyan mértékben stimulálta az LHrezeptofokíá expresszálő CHO-sejtekben a ciklikus AMP tetmehödését. Megállapítóaljuk tehát, hogy a öiszulíidkőtés jeteoléte nem befolyásolja a luiropinakfivííással rendelkező molekulák aktivitását. A stabilizáló hatás alapján várható, hogy a diszulfkikötés bevitelével kedvező terápiás mlajdonságokkal szerelhetjük lel a lutropinokat..

Habár a CPClöl-l 14 atónosavszskventóija sokkal jobban hasonlít a hCG anrmosavszekveneiájára, mint. az hFSH .antimsavázekvencíájára, a CFClQS-i 14(«31-β37) jóval nagyobb FSH·aktivitással rendelkezik, -mint a hCG, amely ebben a tesztben szinte semmilyen FSHraktivitást nem matat. Az </.3'i -β'Π alegységközi dtszuffiőkötés bevitele- a CFC'IÖ1-1.14 éiszti'n-csomóí közé csak igen kis mértékben befolyásolta a hormon azon képességéi:, begy az FSH-seeeptorokat espresszáló CHO-sejtekben a ciklikus AMP termelődést stimulálja (14, ábra).

Xjtéíás

A hCG «-alegységében és β-ategységehen lévő különböző aminosavak -a- és β-szénatomjai közötti távolságok (IB. táblázat) alafoán feltételeztük, hogy számos további olyan dánért is létrehozhatunk, amelyben az alegységeket egy vagy több diszuffidkötés egymáshoz pányvázza. A h€G és a CFC1Ö1-114 «-alegységének 3 '1. atónosava és β-alegységének 37, .aminosava közötti kereszthőtés jelentős mértékben- fokozta, a kapott analógok stabilitását, ugyanakkor mifoínális volt a biológiai: aktivitásukra- gyakorolt hatás. Ezt kővetően azt akartuk megtudns, hogy ha a dlszuifid-ksresakötést a molekula egy olyan részében alakítjuk ki, amelyről tttdink, hogy befolyással van a recepsorkótésre, megváltozik-e a hormon stabilitása és aktivitása. Ehhez a hCG és a CFC10-1-114 «-alegységének 2. barka és biztonsági öv régiója között alakítottunk ki egy díszalfidkőlést.. A vizsgálat eredtné49

X »4 « ♦ 4 ♦ 4 4« ♦

Μ nyel alapján megállapítottuk, hogy a gíikopreteufoermonck stabilitását fokozza, ha az említett régióban egy disxahihisölésí alakítónk ki. A diszutfid kíatokitásáhez: szükséges szubsztitúciók azonban hatással vetek a hormon recepíorkötö és jelátvitoi-kiváltó képességére. Ez arra utal. hogy a magas endokrin aktivitás, fenntartása eretekében a dísze líidköíést előnyösen a hormon sgy olyan régiójában kell létrehozni, amely nem vesz részt a receptorokkal kialakított kőícsöuhatásekhao, vagy a receptorspeciíhás: meghatározásában, Mivel ssíxidlrél típusú diszulfid-keresztkőtött analóg megőrizte únmonoiógtei tulajdonságait, lehetséges, hogy imtntmogéaek tervezésekor nem olyan fontos· a· dtszulfidok pozíciója. A díszulfldnak a jelátvitelre gyakorolt, hatása, a hormonaniagornsták vagy immunogének kifejlesztése .során lehet hasznos.

.Egy, az «-alegység .2. hurka és a biztonsági öv között kialakítandó alegységkor! diszulfiódal stabilizált hCG-analóg előállításához az «-alegység 2. hurkában elhelyezkedő Lys5 i -et és a β-alegység biztonsági öv régiójában elhelyezkedő Asp9‘3-ot ciszíeinehre cseréltünk. Az «-alegység módosítását korábban nem ismertetett, meglévő vektorok kazetüt-mutagenszisévei végeztük el. A köztes vektorok előállítását tehát itt israertetjük (44. ábra).

Az International Hioíechnologies, Inc. (Név? Haven, CT) aliai forgalmazott ρ.ΙΒΪ31 .klónozó vektor peirimkerjét a- következő restrikciós endonukieáz.hasitóhelyekeí tartalmazó polilinkerre cseréltük: EcoRl-XhoINcol-Pací-BamHl-EcoRl. így kaptuk a pRM102 elnevezésű vektort. A pKBM-a-t Ncol-gyel és BamHI-gyel emésztettük, irtajd a pRM.lÖ2 .Ncúí-BamHl-helyére klónoztuk. Így kaptak a pRM 1 lő-ot, amelyben már aaa volt jelen az 5‘ nem transzfálódé vezetöszekveneia és egy nem· kívánt 5' Xbal-hely, amit a pKBM-α klónozása során, vittünk be. A pRM'l. lő egyetlen Xb&l-helye az «.-alegység. 34-35. anúnosavaít kódoló kodonoknak felelt meg, A pRMl 16 Xbal-BsndH-ftagmensének helyére, egy olyan vektor .Xbal-Bamin-fragmensét vittük be, amelyet -az «alegység c£>NS-nek az Ötigo?58-ca·!. és az Olrgö76Ö-nal (5. táblázat) tórienö PCR-es ampíffikáetójával: kaptunk. Így jutottunk a pRM 117-feez, amelyben már nem volt jelen az α-alegység eDNS-beu lévő 3' nem transziáiódó régió, sem pedig egy .Psd-heiy, .mely ugywbben a régióba!? helyezkedett el. A. pRMl 17 egyetlen Esd-helye a. 83-85. ammosavakat kódoló kodonoknait Felélt üreg. Az «-alegység cDNS-ének az Oügo730-cai és az Oligo839-ceí (5. táblázat) történő ECR~es amplifikációjakor kapott terméket a pK.M-11? ouikáhs Xbal-Psíibetyére: klónozva kaptuk a pMB-5O7-et. A ECR-reakció során az «-alegység kódoló szekvenciájának 42-43. ketonjához egy Bglli-.be.lyet, az: .54-55. kotonokhoz pedig egy Spel-hslyet vittünk be. Á pMB507 Xhoí-BanrHl fragmensét pSVL Xhol-SamMI-heiyére klónozva kaptuk a pMB512-t. A pMBSl?. Bgin-Spel-foagmensér az Olígo8'77-tél és az Öligo378-eaí (5. táblázat) cserékük le. Ennek eredményeként jött léte a pMBSól. Végül a pM85i2 BglíF-Spel-lragmeneének helyére egy, az Oligo92i és az Öligo922 (5. táblázat) hibriáizáita-tásávaí előállítok kazettát ijesztettünk be, és így kaptuk a pSV'L-«K51C-t-(15. ábra). A pS-VT-aKSlC előállítása nem réítéílesíül 'igényli a fentiekben vázolt stratégiát, amelyet mi. csak történed okok miatt alkalmaztunk, konkrétan azért, mert már rendelkezésünkre álltok a ?t?ás kisédetokbea előállított különböző köztes vektorok,

A hCGb^:D99C β-álegység-anafogot ECR-es mtttagenezlssel állitoduk elő, Ismpiátkőtó & pSVL-hCGjh-í, lánemdítóként pedig az Ohg<?3ö3-at és az Ölgío925-öt (5. táblázat) alkalmazva. Az Olígo368 egy reverz láneindító, amely egy, a pSVL BamHl-helyétöi 3'-lráoybau .elhelyezkedő régióval komplementer. A Oligo925 tartalmazza a kívánt mutációt és létrehoz egy BgíK-heiyet is, A PCR-terméket BglH-vel és BamHÍ-gyel eanészfettük, í?iaid a pSVL-CFCI01-í^:14β^? Bglll-Barafil-heiyére szubkiówztuk. Ezzel eltávolítottak a pSVL-ÜFCIOI-l 14β·bői a hFSH-kodonokat és a 99. pozícióban lévő aszparagtosavaí císzteihre cseréltük 115. ábra).

: .··./·..· » ν χ * * · ··:· .:.. ...

A pS'VL-d&SlC-t és· a pSVl.-bCG0'í39OC-t az 1. példában ismertetett módon COS-7-sejtekben koexpresszáltattek. A termett hCG es bGö^:(«5i-099) egy h€G-standardhoz viszonyított mennyiségé; szertdGcsimmusteszttei határoztuk meg. Kikötő antitestként egy, az «-alegységre specifikus (A113) antitestet, detektáló antitestként pedig egy, a 0-aiegységre specifikus, radloaktlvan jelölt antiteste; (3105} használtunk. Nem keli feltétlenül ezt a két antitestet használni, mert szinte minden, a WG-heterodhner «-alegységét felismerő antitest és minden a hCG-t, vagy a szabad β-aiegységet felismerő antitest felhasználható, feltéve hogy afiődiása nagyobb, mint Ifi* M'’, A hCG és a hCGfixS 1-099) transzfektált CGS-7-sejf.ekben történő expresszátelása. nyomán a tápközegbett megjelent egy kereszikötőtt fehérjeanakig, amelyet A1 i3/'^Λϊ-Β105- -vagy A1 12szetmvics-itnmutst&szEtes (7. táblázat) egyszerűen ki tudtunk mutatni. Ezek szmnt a diszuifid beviteléhez szükséges mutációk nem akadályozták meg sz alegységek asszociációját.

7. táblásat

A hCG és a bCG(«5 1-899) expressziója ísanszfektáh íOS-7-settekben

hCG vagy analóg	Koncentráció
ICO (pSVL)	19,59 ng / 0,95 mi
hCG<«51 -099}	4,85 ssg / 0,05 mi

A hCG(<x51-099) biológiai aktivitását LH-receptor-kötésí és jelátviteli tesztek segítségévek az 1, példában vázolt módon határoztuk meg, A hCG(«5l-S99) meg tudta akadályozni a ^tz'!-hCG l..H~reoeptorokat expresszáló CHO-sejtekfeez való kötődését, jóllehet a bCG-hez viszonyítva csak mintegy 5-i0%-os mértékben. (16. ábra). Az LH-receptorok iránti afiánitásaak; a diszulfidkőíés miatti, csökkenését vagy í) az «-alegység 51. pozíciójában lévő lizit; lisztemre cserélésével (azaz egy töltéssel rendelkező aminosav helyére egy semleges andnosavaí vittünk. be), vagy pedig 2) a ^-alegység 99. pozíciójában lévő aszparagírtsav císzteinre cserélésével .(azaz egy negatív töltésű am idősáv helyére egy semleges aminosavat vittünk be), -vagy 3) a két alegység között kialakított kovalens kötés térszerkezet-korlátozó hatásával magyarázhatjuk. Ismert, hogy a hCG-ben az Asp99 módosítása csökkenti, vagy teljesen megbétdija az. Ll-I-aktivitást (Chen és mtsai., 1991). A cisztáinszubsztitúciók és a dísztdfidkőtés hatásai: ágy tudtuk elkülöníteni' egymástól, hogy összehasonlítottuk módosítatlan β-aiegyságböi és Lys51~>€ys.mutációt hordozó «-alegységből felépülő hCG-analógok, valamint módosítatlan: «-alegységből és Asp99-»Cys mutációt hordozó ^alegységből felépülő hCG-analógok LH-ieceptor-kötő aktivitását a hCG és a hCGféíS 1-099} LH-reeeptor-kőtő aktivitásával (17. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy az «-alegység 51. pozíciójában lévő lizln eiszteinnei való helyettesítése nagyfokú gátló hatást gyakorolt az analóg azon képességére, hogy gátolni tudja a ^í2G-h€G EH-receptorokhoz történő kötődését. A bCG(«5^:í-p99) és a hCG(«-099} aktivitása hasonlónak adódott, and bizonyltja, hogy legnagyobbrészt a 0-alegység 99. pozíciójában lévő-aszparagfosav ciszteinoei való helyettesítése volt a felelős a hCGfeó 1-099} LH-receptor-kötŐ aktivitásának csökkenésért. Az 5 f. pozícióban lévő Ifotn aten fonal történő helyettesítése is csökkentette a h-CG aktivitását (18. ábra).

Ezt követően megvizsgáltuk a lenti hCG-analógok jelátvitel-stdnnláió képességét is (azaz hogy milyéu mértékben képesek ciklikus ΑΑΊΡ termelődést kiváltául), Az «.-alegység 51. pozíciójában lévő hzfe cís2tefonel vagy alanínnal történő· helyettesítése szinte teljesen taegszüntette a hormon -azon képességét, hogy a ciklikus

Λ;

»'* * *

AMF tetrttelődés stimulálja (19. és 20. ábra). Ha mind a kés alegységben megtörtént a risztemnél való belyetteátés fhCGfo.5 -1 -β99)], akkor a csak az .«-alegység 51, pozíciójában mutáíl (Lys-»Cys> asalóghoz képest jelentős mértéké aktivitás visszanyerést tapasztaltunk (Í9. ábra). A S-aiegység 99, aszparaginsavanak -risztotnael való helyettesítése önmagában sokkal kisebb Íratást gyakorolt az IH-ífecepforon keresztüli jelátvitelre. Ez arra enged következtetni, hogy a diszulííd csökkentette a bCG-analögok relatív hatékonyságát, ami hasznos tulajdonság lehet esetleges antagonisták tervezéséhez,

A biztonsági öv és az «.-aicgj-scg 2. barka közötti alégységközi diszulftd fokozta a hCG höstabl Utasát (8. ábra), továbbá azt »s megakadályozta, hogy 8 M arca jelenlétében aiegységim tbsszoriáljon (9, ábra). Ezek a megfigyelések igazolják az alegységköz; dtszulíldketéseköek a giikoprotemhormonok. stabilitására gyakorolt jótékony hatását.

tkóeida £í2A2Übr22FSá2Í<AAsUSFttteragvsé^

Egy, mindhárom fő .glikeproteínkormoo-recepte-rrai. reagálói képes giikoproícinhorfnou-analóg, a CFClöl-114 biztonsági öv régiója és «-alegységének 2. hurka között egy diszalfídkötést alakítottunk, ki, amelynek segítségével meg tudtuk vizsgába, hogy fehérje ezen régiója milyen relatív hatást gyakorol a horoton és az LH- és FSH-roceptorok közötti kőlcsőtrhatásokts.

A. CFCiÖI-114(«51-B99) előállításához szükséges β-alegység expresszié.*? vektort (azaz a pSVLCFClÖl-1 !4j?'D99C-0 a pSVF-CFCiŐl-114β' kazetta-mntagenezísével hoztak létre. Fz a vektor a 102-134. araíaossvak koáonjainá; tartalmaz egy .BgHI restrikciós endonakleáz helyet. A pSVl.-C'FClOI-114b'D99C-t ügy állítottak elő, hogy Bgsli-ve! és Sstí-gyél emésztettük a pSVL-CECiöl-; Μβ'-ί, majd a kisebbik fragtnenst egy szintetikus olígimukleobd-kazíttiával helyettesítettük. amelyet az Okgo924 és az O?ige923 (5, táblázat) hibridizálíatásávai állítottunk elő. Az eljárás során egy BsrGl-hslyet is bevittünk, amelyet a rekombínáns kiének szelektálásához használtnak tél. A kapott vektorban, a pSVF-CFC 101-114p'D99C-berí megváltozott bázisok szekvenciáját dkleexi szekvenálással ellenőriztük. Az igy kapott és a. CFG 101-114β'(«51-β99) amísosavszekvooeiáját kódoló vektort a 21. ábrán mutatjuk be.

A. pSVL-CFC 101 -αΚ.51G és a pSVF-CFClOl-l 14fi'O99G' COS-7-sejtekben történő koexpresszáltatását az F példában leírtak szerint végeztük el, A. dinter mennyiségéi olyan szesdvfes-ímmuníeszt segítségével határoztok meg, amelyben kikötő antitestként Al 1 mai, detektáló antitestként radfoakdvan. jelöli B FI 2-t, standardkést pedig vizeletből száfmazó hCG-t alkalmazóink. Csakúgy mint a többi analóg esetében, itt sem feltétlenül csak ezeket az antitesteket használhatjuk a CFG 131-11410.51-099) tápküzeghen történő kimutatására. Az «alegység-specifikus, és a mtud a hCG-fi mind pedig a bFSH-t felismerő antitestek többsége ugyancsak felhasználható kikötő antitestként. Detektáló antitestként pedig - az. FSH-szekvencíával módosított szakaszokra specifikus antitestek kivételével · majdnem minden olyan- antitest felhasználható, amely felismeri a feCG-t és a szabad β-alegységet. Megfelelő antitest például a Bl 11 is i'üosowsky és mtsai... 1995).

Az A487 nevű «-alegység-specifikus antitest, amely egy, a hGG «-alegységének N-termínáli-sához közel eső determinánst ismer fel (Moyle és mtsai,, 1995), a CFClÖf-FI4-et közel sem kötötte olyan jól, mmt a hCG-t (5, ábra). Azt gondoltuk, hogy ezt a biztonsági övnek a glikopreteinhorsnon «- és β-alegysége közötti általános, teltéieiezbelóleg a receptorköfo speclfitásí meghatározó kölcsönhatásra gyakorolt befolyása okozza, Ha az «alegység 51, pozíciósa és a β-alegység 99, pozíciója között fejsiakítnnk egy diszulftákőtés!, a kapott analóg nem reagál az A40?-teS (1:j, ábra).

Csakúgy, mint a többi dfemlfíd-k-emszJ&ötött analóg, a CFC1ŐI --1 14(«5Ι-β99) is stabilabbnak mutatkozott a hödenaturáciős tesztben, miöt prekmzoral (azaz a CFG IS!·· I 14 vagy a hCG) (12. ábra). .Sőt ágy tant, hogy az a-aiegység 51. pozíciója és a β-alegység 99. ixízícröja közötti díszalSd jelentére nagyobb mértékben fokozta & fehérje stabilitását, mini az: a-ategyseg 3F pozíciója és a β-alegység 37, pozíciója között kialakított ttiszuíttd.

A biztonsági óv és az «.-alegység 2. hurka közötti díszalfldkötes jelenléte csökkentette a CFC 191114(ct51-β99) LFI-receptoí-köto aktivitását (22, ábra}, igy tehát, bár a radioakűvan jelölt bCG LHreeeptorokhoz való kötődésének gátlása terén a CFC 19 5-1 14 majdnem olyan, hatásos volt. mint a rekombináns&CG, a CFCíől-114(α5Ι-β99) körülbelül 199-szor kisebb aktivitást mutatott. A két alegységen lévő -mutáció és s diszulfídkötés- relatív jelentőségét ügy vetettük össze, hogy mértük a CFC löt-114, a-CFClŐÍ-1 Μ(α51-β·99>, a CFCl(tM14(«51KC-Ö), a CFC!0-M14(«51KA-p> és a. CFClőí-l Í4(«-bD99C) aktivitását. A letol összehasonlítás rssgmttíaíia, hogy ha az «-alegység 51, pozíciójában lévő iizint císzteinre vagy alattittra cseréljük, ez már önmagában jelentősen gátolja a receptorkötést (22. és 23 ábra), A. CFC101-114(o;K51 C-β) aktivitása teltei összehasonliiható volt a CFC 10 i--ii4(«fe51:-4)99) aktivitásával. A GFC101-114 β-alegységének 99. pozíciójában lévő .aszparagwav cisasemnet való helyettesítése, a hCG LH-aknvitására kifejtett hatással ellentétben csak részben magyarázta a CFClői-114(«5l-p99) esőkként Lid-reeeptor-kőtö képességét. Mindazoítáitai a CFC5ÖI114(«51-β99) még így is jóval aktívabb -volt, nrürt a CFG'lő t -I14(«K51C jé), amit nem. lehet csak 'az «-alegység 51. pozíciójában történt szafesztitúcfóval -megmagyarázni.

Megvizsgáltuk továbbá a biztonsági öv és az ©-alegység közötti alegységközi diszalftdkőtésnek a CFC101-114 jelátviteli aktivitására gyakorolt hatását (24. és 25, ábra). A CFG 191-114LH-receptorotr keresztüli yelátvitel'-stimaiáló aktivitása csak kicsivel volt alacsonyabb, mint a hCG-é (24. ábra),. A drszulfíd-keresztkötött analóg, a CFClö 1-1. ;14(«:51-β99) azonban csak a legmagasabb vizsgált koncentrációban mutatott aktivitást. A korábban tárgyalt vizsgálatok eredményeivel összhangban ágy ránt, hogy ennek elsősorban- az «-alegységben történt Lys51~»Cys csere volt az oka. Annál az analógnál, amelyben csak a β-alegysógbea történt meg az Asp99~»Cys csere (azaz a CFCWI-1 l4(ri-pD99C>nélj az aktivitás jelentős részben megmaradt. Csakúgy mint a kötóaktivitási tesztekben, ahol a disztdííd részben ellensúlyozni tudta az ©-alegységben történt Lyső1 ->Cys csere miatt bekövetkező akiivitásvesztest, az alegységközi diszxtlfídkőtés részben a jelátviteli aktivitást ís helyreállította (24. ábra).

Az FSH-aküvitási tesztekben a CFC 191-114 jelentős aktivitást mutatott. A biztonsági öv és az «•alegység 2. hurka közötti öíszirlfeí-keresziköfes kiatekísásához: szükséges clsztein.sztá>sztifocíókaak nagyobb hatása volt a CFCIŐi-FM FSH-akttvltására, mist LH-akttvitesára (26., 27, ás 28. ábra), továbbá nem lehetett elkülönítem a. diszuksdkötésaek suiajdonifeaíó hatást. Azokban az analógokban tehát, ahol csak: az «-alegység Lys51~*€ys, vagy csak a β-ategység Asp99~A3ys csere történt meg, majdnem teljes- mértékben elveszítettek FSH-íjkírvitásukat. Az a felismerés, hogy a β-alegység 99. pozíciójában lévő aszparagmsav mutációja nagyobb hatást gyakorol az FSfi-akiivitesxa, mint az LH-atövitősra, alátámasztja a biztonsági övnek az I,H- és az FSHaktivhásbao betöltött szerepével kapcsolatos korábbi íuegűgyeléseket (Has. és ártsál., 1993; Sasrd és mtsai., 1993). Ezek a vizsgálatok arra engedtek..fcőwlkezteíni, hogy a biztonsági övnek az LM-reeeptor-kötő aktivitást » * * fe * * « » « * * «««« » * φ «.«*· befolyásoló része a 94-96. axninosavak közeiében- található, míg az ESH-reeeptor-kőtö -aktivitást befolyásoló része a 191-109, smihosavak közelében található,

5. példa

Az,L,.SS3L3,géldáb£gLÍsstóeteíí.disZttlitóftkkalg^lj^t.MiS

Mags'ízsgáltok, hogy hogyan hat a gl-ikoproteinhonnoaok biológiai akttviiásá-ra, ha több diszalfidkötést alakítunk ki bennük. Ehhez olyan hCG-anaíógokat állítottunk elő, amelyek az 1. és a 3. példában beatutatott diszuKklokat -tartalmazták. Az -analógokat úgy állítottuk elő, hogy az 1. és 5. példában ismertetett expressziós vektorok egyes részeit más·-szekvenciákkal helyettesítettük. A pCI-a-(C?S,K5t^:-C)-eí úgy álliiottuk elő, hogy a pSVL-«C7s-et és a pSVL-akSIC-t Bsmí-gyel entósztettük, majd agatózgéí-elekroforézissel elválasztottuk egymástól a kél emésztési reakció nyomán keletkező kisebbik és nagyobbik fragm-enseket. Ezt követően a pSV k-«C?S-ből származó nagyobbik fragmeost a pSVL-aKSlC-ből származó kisebbik ffagmenshez ligáitok, akapott konstrukciót Xhoí-gyel és SasnHI-gyel emésztediA, végül az 1. példában leírtak szerinti módosítóit pelífinkert tartalmazó pCl-be igáitok. A $>Cl-CGpXY3í€,I)99€)--t úgy állítottuk elő, hogy a pSW h.€GjTD99C-t és a pSVL-bCGp^fY37C-i Aoci-gyel (a Bs’uJól izosktzomerje) és BamHÍ-gyel -emésztettük, a nagyobbik és a kisebbik fragmenseket agatózgél-elektroforézissel elválasztottak, majd a pS VL~h€Gp^:D99€~-bol származó kisebbik fragmenst a pSVL4:C66’Y37€-Í3öí származó nagyobbik firagmenshez ligáhufc. A fentiek szériái előállított vektor által kódolt analógok aminosav-szekvenciáliit a 31. ábrán mutatjuk be.

A p€k«(C7S,K51C)-t és a ρ€Ι-ό€ϋβ'(Υ3 í€,D99C)-t az 1, példába® leírtok szerint €OS-?--sejtekfeen Aíöxpresszáitok. A iápközegbe .szekretátt fehérjéi töményités után szejtóvico-ihummieszttel vizsgáltak, ahogy az az 1. példában szerepel, kivéve hogy .a radío&ktívas jelölt BlÖS-antítest helyett radioaktívon jelölt B112antitestet haszaáltank. Az analógot ki tadtuk mutatni tápközegben (b. táblázat), ami jelzi, hogy a két diszulfid jelenléte nem akadályozd: a gífkoproteinhormon tehekeredését és szekrécióját. A bCGíod 1 -037,«51 -999} egy hCö-stondaráho-z -viszonyított .mennyiségét szendvies-ánmutóeszttel határoztak meg. Kikötő antitestként egy, az α-alegységre specifikus (Aí 13) antitestei, detektáló antitos-kéto pedig egy, .a ^-alegységre specifikus, radioaktívan jelölt .antitestet (Bl 12) használton!;. Az A4ö7-es antitest nem jól reagált az analóggal, valószínűleg az onlegység N-terminálisán törtére: mutáció miatt Mivel a fehérjének ez a régiója nem szükséges a hormonális aktivitás kifejtéséhez, az epitóp megszűnése egyébként nem okozott problémát. A 31. ábrán nagybetűvel jelölt aminosa-vak a dtszulfiidok kialakítása érdekében léttehozott nmttteiök helyét jelzik.

8. táblázat

A hCG és a ΕίΌ<α31-β.37,α51-699)· expressziéja .iranszfekíáli COS-7-sejtekben

hCG vagy analóg í pCl)	Koncentráció
hCG	35,33 ng ·' 0,05 ml
hCGí«31-j337,«51-399)	36,60 ng / 9.95 mi

A hődenatarációs teszlek eredményei (8. ábra) alapján megállapíthatjuk, hogy a hCG(<t3-l-:03'7,a51699)-b«n a két diszalfid jelenléte a hCG-ve-l összehasonlítva fokozta: a molekula stabilitását. A hCG(«31β3-7,<:«5Ι-β99) az nreadenaiaráciés tesztben ss stabilabbnak bizonyult a bCG-aél- (9. ábm). Mindez arra enged következtetni, hogy egynél több diszulfid jelenléte nem destabilizálta a molekulát.

« X « «

A hCö<«31-β·37,α51-899) képes volt az LFí-te-ceptorekhez kötődni és ciklikus AMP termelődését stimulálni (29. és 30. ábra). A hCG{«3 1 -β3?',«51-899) ezekben a tesztekbe» a hCöőrél -Ö99í-óhoz hasonló aktivitást mutatott, ami megáit csak azt jelzi, hogy az «-alegység: 31, ciszteírdc és a β-alegység .37. eiszteínje közötti afegységközi áiszallld uetn vagy alig volt káros hatással a rccoptorkörésre és a jelátvitelié·. A cisztin-csomók közötti u.3.1 -037 pozíció tehát -a giikoproteinhortnonok stabilizálására szolgáló, és az endokrin aktivitást jelentősen nem betblyásolő d-íszuífidkötés· beépítésének előnyös helye.

Mintán felismertük, hogy a hCG és a CFG lök- i 14 az .alegységek ciszíin-csonfeí között kialakított díszülfeidal az I..H- és/vagy az FSH-aktívít.ás megzavarása nélkül stabilizálható, arra a megalapozott következtetésre jutottunk, hogy ez a régsó nem szükséges a hormonális aktivitás kifejtéséhez. 'Várható tehát, hegy egy hasonló, diszulfíd beépítésével a űFSH-hőI ís előállítható olyan analóg, amelyet fokozott stabiliiás és erős FSH-aktívitás· jellemez.. Várható továbbá, hogy .a hCG és a hFSH «-alegységére sjjeci&kas antitestek, mint -példám az Á113, ezt az analógot ís felismernék. Sőt az is valószínű, hogy a hFSH β-alegységének 1. és/vagy 3, -hurkában a mutáció helyétől távolabb eső régiókat felismerő antitestek, mint .például a BŐÖ-2, ugyancsak reagálnának ezzel az analóggal.

Az «-alegység 31. és a. β-alegység 31. aminosava közötti diszoiriddai keresztkőtött hFSH-analóg slóáiliásáhez .szükséges «-alegység-analóg szekvenciáját a 3. ábrán mutatják be. A 32. ábrán egy, az analóg előállításához ugyancsak alkalmazható, de kevéssé poláros· «-alegység («C7A) anhnosavszekvcuciáiát mutatjuk 'be. .Azt vártuk, hogy a hFSPípYÓIC anriar-savsze.kvencíáia és az a€?A vagy «C7S disztis-csomók közötti dlszaífidkereszttötést létesít, ahogy az a 33. ábrán látható. A klónozás terén jártas szakember a 33. ábrán bemutatott genettor kód tdk&hnazásával, a hutnáa «-alegység -és a hPS-K β-ategység cDNS-ébő! elő tudja állítani az említett fehérjéket kódoló vektorok előállításához szükséges nukleotidszékvenc-iák&t. Ezek a szekvenciák beszerezhetők továbbá az 1. példában ismertetett cégektől is.

Az aC7S-t és a hFSKj>Y3 IC-ű vagy az «CTA-t és a hFSliBY31:C-t tranziensen vagy stabila» expresszálai képes expressziós vektorok a technikában ismert, és az 1. példában felsorolt bármely eljárás segítségéve! bevihetők COS-7-,. vagy más eukarióts sejtekbe. A termelődő fehérje- szendvics-immunteszíjéhez standardként hFSH-·, kikötő antitestként egy, az .«-alegységnek az N-termxsustói távol eső, vagy a β-alegység 1. és/vagy 3. hurkában lévő epiíópokra specifikus antitestet használnánk.

A hFSH keresztkőtött analógja az l. példában, a keresztkőtött hCG -analógok vizsgálatánál ismertetett bibés oreadenaturációs tesztekben várhatóan stabilabb' lesz majd, mint a hFSH. Várható továbbá, hogy a kere-sztkötőtt hFSH-analög kompetűlm fog a radioaktív jóddal jelölt h-FSl'í-vai a torsin FSH-rsoepíortal transzferált CKO-sejtekhez való kötődésért. Várható továbbá az. is, hogy ugyanezen sejtekben képes- lesz ciklikus AMP termelődésének kiváltására, ős vízre- tesztek segítségével sikeresek megjósolhatjuk teljesen glikoz-ilált glíkoproteinhonnofi-anafőgok ót >«« biológiai aktivitását. Mivel a tekotnhmátts glikoprotei-ahotmonokkal. őszszehasou-lítva a gHkoprotei-nhormon-anaiógok keresztkötése érdekében bevitt mutációk várhatóan nem befolyásolják a ghkozifációs mintázarét, várható, hogy a kersszSkótőtí hFSH-analóg in vivő- is aktív lesz.

L. példa

Az.«-.és.ajYréegyfegréysoréoálís.részciközötijdréakhoh. diszulhódul stabiliaál t hCG -aoalóg «« * · ««»Χ « χ « « « * * *

X A v « X * * *««« » X 'X * * « »»«« «X 4X« «

Az 1-4, példákban azt mutattuk be, hogy a gíikoproteháionnonok és analógjaik stabilitása egyetlen alegységközi diszulftd beépítésével megnöveibetö. Azl is bemutattuk továbbá,. hogy a beépített diszullídkőtéseknek a molekula teeeptorkötési és jelátviteli aktivitására gyakoreh hatása igen kis -mértékű, féltévé hogy nem érintettek a reeeptorköíéS'ben vagy a reeepstotkötés spéci inasának meghatározásában részt vevő amtnosavakatés hogy nem torzítják el a molekula konformációját. Mind az mind perig. a. β-alegység esetében az N-terminálls axmnosavak jelentős mértékű módosítása sem vezet a hormonális aktivitás-megszűnéséhez, ami arra utal, hogy a feltétjének ez- a része nem vesz részt kulcsfontosságé receptorkoniakrésokban. Várható-tehát, hogy az N'-tensiaálisok kedvező pozíciókat .id. az ÍR. táblázatban - között létrehozott riszrifiákötések anélkül stabilizálják a ghkoproteinhonnonokat, hogy komolyabban megzavarnák a molekulák biológiai aktív?tásás.

Az 18. táblázat -szerint az «-alegység Ghrő-pozieioja és a hCG β-alegységénsk ArgS-ooziciója egymáshoz képest kedvező 'helyzetet foglalnak el, ami' azt jelenti, hogyha ezeket az aminosavakat riszteinnel hélysrteskjük, akkor végeredményben egy kéreszikötőít analógot kapnak. Várható, hogy az így kapott analóg a hCG-vel összehasonlítva nagyobb stabilitással -rendelkezik, továbbá megtartja azt a képességét, hogy kötni és stimulálni tudja az LH-receptorokati

Az említett analóg előállítására alkalmazható vektorokhoz .szükséges atninosavszekvenciákat a 34 A. és a 348. ábrákon mutatjuk. be.

8,.péi<la

Az a- és. a js-alegység N-tenotóálisjőszriközőli kialakított diszulfiddal stafeiIlzáit..hFSH-analóg

Ahogy azt már jeleztük, az 1-4. példákban azt. mutattak be, hogy a gíikoprotehdsonmmok és analógjaik stabilitása alegységhez! díszül fíáok beépítésével megnövelhető. Azt is bemutattuk továbbá, hogy a beépített diszulfidkötésnek a -molekula receptorkötési és jelátviteli aktivitására gyakorolt hatása igen kis mértékű, feltéve hogy nem érint a receptórkőlésben vagy -a receptorkötés speridtásának meghatározásában részt ve vő amínosavakat. Várható tehát, hogy a találmány szerint a hFSH ^-terminálisai között létrehozott riszulfidkőtésefc stabilizáló hatásúak, és hogy--az Így kapott analógok hasznos terápiás tulajdonságokkal rendelkeznek majd.

Az «-alegység GtoS-pozfcüóját és a hCG β-alegységének ArgS-pozírióját kedvező pozícióként feltüntető 18; táblázat, valamint a hCG és a hFSH ekvivalens” arornosavaií bemutató 2, táblázat adatai alapján várható, hogy ha az «-alegység 5. pozíciójában lévő gfutammt és a hFSH 2. pozíciójában lévő szerint risztemnél helyettesítjük, akkor végeredményben keresztkötött hhSH-asalógokas kapunk. Várható, hogy az Így kapóit analógok a hbSH-val összehasonlítva nagyobb stabilitással rendelkeznek, továbbá megtartják az a képességüket, hogy kölni és stimulálni tudják az FSH-recepíorokati Az említet? analóg expresszáiására alkalmazható vektorokhoz szükséges aminosavszekvmtcíákat a 35. ábrán mutatjuk be.

9. példa

Giszt'' rao nók

:.N_:.

ináiisaiközötí.kiahfeh to«riszzilüdn> - ,b reti lOblsalőg

A humán lutropinok közül a hCG és a htl-1 állnak egymáshoz a legközelebb. Várható tehát, hogy az aktív, diszulíiö-keresztkőtött hCG-analósok előál l kásához használt mutációk segítségével aktív, áiszufítdkeresztkölölt feLH-analögok is előállkhatók.. A bili a legkevésbé -stabil gonadotropin, és várható, hogy az aiegységkőzi díszül fidok jelentősen növelnék a molekula stabilitását. Á risztin-esomők közötti dxszulfíddal, vagy a Nteístmális régiók között keresztkőtöd hLH-kat a 36.6$ a 37; ábrákon -mutatjuk be.

* ♦

K.&:afegysg«.g^tM^cSSSHm^^yj^siü^&l^Ü52SaÖ^őI^hottdta^íM

Ahogy azt mar jeleztük, az 1-4. példákban azt mulattak: he, hogy a glikoproteinhormonok és analógjaik stabilitása aíegységközí diszulfidok beépítésével megnövelhető. Azt is bemutattuk továbbá, hogy a beépített dlszulfidkötésnek a molekula reeepterkdiósi és jelátviteli aktivitására gyakorolt 'hatása Igen kis mértékű, feltéve kogy nem érint a receptorkötésben vagy a receptorkötés specíStásáttak meghatározásában részt vevő atomosávákát. Várható· tehát, hogy a találmány szerint a 11TSH α - és β-alegységének cisztin-esomóí. vagy N-terminálisai között létrehozott diszulfídtötés stabilizáló hatású, és hogy az így kapott analógok hasznos terápiás, tulajdonságokkal rendelkeznek majd, igy képesek lehetnek a pajzsmtrigy stiraaíálására. a radioaktív jód eltávolításán alapuló terápia előtt.

Az «-alegység Cys31-pozícióját és a hCG jl-alegységéaefc 'Tyr3?-pozíeiöjás kedvező pozícióként feltüntető i 13. táblázat, valamint a hCG és -a bTSH ekvivalens** amínosav&it bemutató 2. táblázat adatai alapján várható,. hogy az «C7S-t vagy az a.C7A~£, valamint a hTSH TyfdÖ--»Cys mutációt tartalmazó h-afegység-anaíógíát expresszáió sejtekben kemsztkötótt bTSF-í-analógofatt kapunk. Hasonló módon az «-alegység GlaS-pozioxóját és a hCG β-alegységéxtek Argó-pozícióját kedvező pozícióként feltüntető IS. táblázat, valamint a hCG és a hTSH ekvivalens·'* aminosavaít bemutató 2. táblázat adatai alapján várható, hogy ha az «.-alegység 5. pozíciójában lévő glutamintés a feTSH β-afegységének 1. pozíciójában lévő feoii&lanint.ciszteionel helyettesítjük, akkor végeredményben keresztkőtött hTS'lfeanalógokaí kapunk. Várható, hogy az így kapott analógok a h'l'S-H-val összehasonlítva nagyobb stabilitással rendelkeznek, továbbá megtartják az a képességüket, hogy kötni és stimulálni tudják az TSfi-reecptoroteas.

Az említett analógok expresszálására alkalmazható vektorokhoz szükséges aniinosavszekvertciákaí a 38. és 39, ábrán mutatjuk be,

IkE^fe ísssert, hogy a gliteíproíeíííhormoítok deglxtetlálása csökkend biológiai jeíátvivő képességüket (Moyle és mtsai., 1975; Maízak és misai., 1989). A deglikoziiált hormonok azonban túlságosan instabilak althoz, hogy terápiásán alkalmazhassak őket. Várható, hogy ha genetikai lag degfíkozilált hormonokba diszalltdikeresztkötéseket viszünk be, akkor megnövelhetjük, honnsnamagonistaként történő alkalmazásuk lehetőségét Egy LH- vagy hCG-antagonlslának mind termékenységet elősegítő, mint termékenységet csökkentő alkalmazása is sebei. Ha például olyan nőbetegeket kezelnék velük, ak ik abnormálisán magas· LH-szintjüfc.miatt meddők, egy I,H-an.tagoní^:sta alkalmazásával ioknzhátónk termékenységüket. Ha azonban a terhesség korai szakaszában lévő nőknek adagolnánk, egy hüG-antagonísta megszüntethetné a terhességet Egy fcétfunkciós LH/F'Sli-molekula, például a CFCiöl-114 vagy a CFC1Ő1-IÖ9 (Moyle és mis:»., 1994) antagoaistái ugyancsak alkalmazhatok lennének. Az antagontsták átmeneti adagolásával megszüntethető fenne a hibás petefészekmökődés, így be lehetne állítani a menstruációs ciklust, .ilyen értetemben tehát az antagomstának termékenységíokozó· Itatása is lehet. Fia azonban az antagonsstát a terhesség korai szakaszában- adjak, akkor várható a pregeszteron- és az ősztradioltermeíés.elnyomása és a terhesség megszűnése.

Az alegységközi dísztdfid kialakítása mellett a fcereszfkötött analógok előállítása során az «-alegységen, valiatnírtt 82 eddigiekben ismertetett vagy az Ι.Β, táblázat sápján előállítható analógok «.· és β-afegységein levő X-kapcsolt glikozilációs helyet is meg kellene változtatói. Ehhez először is módosítani kell a gbkoprotemhormoaok «- és β-alegységoin található A»n-X-SebThr sxekvenciarészietet, mégpedig ügy, hogy vagy lecseréljük az Asn-t és a SertThr-t, vagy az As« és a Ser/Thr közötti aminosavas tX) prelhmtó helyettesítjük.

IXjnéjda

A 9-15. táblázatokban további olyan diszalhd-keresztkötótt gonadottopin-anaiégokaí smíataak be, amelyek stabilabbak, mim prekurzoraik. Ezek az analógokat az 9-15. táblázatokban tehhnteteti «-tóegység- és βalogyseg-konstíVikcíókaí: espresszáhn képes vektorok sejtekbe történő kotrasszféktálásával állítanánk elő.

9, táblázat

A humán «-alegység további analógiái, amelyek. íéliKísznáihatók diszol&lkőtéssei keresztköíötf hCG~, ht-H-. hbSH- és bTSB-anaiégok előáll kására (Megjegyzés: a mutációt nagy betűvel jeleztük)

\|«C51A ΐ	md yy rky aai 1! vt is v 111- ttnivqknvtsesícevíiks	vthsapdvqbepssí:i;lqeí!pftsqpg; ynrs’ívmggíkvenbíaehcstcyyh	pdqcmgAcfsraypipIrskk ks
$.«O2?'C

1}	ndy yíkyaax 11 vtisv Oh	vlhsápdvqdo.peeílqenpffsqpgí	ípilComgeotsrayptph'skk
	tml vqkn γ; ses tee vaks	Yarvrv'tagw&Yenhtac&cstcyYh.
§
\|«M29C
	mclyyrkysaibvtisvAh	vlhsapdvi)dc.'peeílqenpft's<tpg;	tpilqeCgccísravptpirskk:
	tnnvqknvtsestecvaks	yHmvnjgg&venteacbesteyyh
íj
1 «Só-le
	mdyyrkyasitlvtlss'fll·	ylksapdvqdepectlqenpffsqpgí	tpilqcmgcofCrsypíptrskk
i:	iml vqku vtsestec vaks	yEKvtvínggfkvenhíaehcstoyyh	ks
I «R35C
	mdvvrkvaatdvflsvfih	vihsandvpdcoecílüespl'fsoo.gÍ	ipílqonigeeisCaYptph'skk

íj	tótsvqknvtsesteevaks	ynrvtvmggfoveöhíáencsteyyl·	ks
jÍ«YX7C
	mdyyrkyaaiflvdsvfll'	vihsapd vqdepee tlqenpllsqpg;	milqcmgccisraCptpkskk:
íí	índvqknvtsestcov&ks	yímtá.vísggikveHhíachcsteyyh	ks
:í

íj	ntlyyrkyamdvítsvfib	vlhsapdvqdopoctlqeitpll'sqpgt	^piigvmgecjsraypiptmkk

t-nivqknvíCestecvsksytuvívínggfkvetóitaehostcyybks <x$57C mdyyrkyaaidví]svflhvlhsapdvqdcpectlqenp:d:sqpg;apiiqcK!gt:i?ísraypi?pkskk:

KolvqkovtseGtavaksynrvtvnsggíkvenhtachcstóyyhks » ·* * « « » « » * * « «IX X * « * « φ ♦♦ ♦:««: *

A hFSH p-alegységének további' analógia!, amelyek megieldöa-alegyxégckkel kombinálva feihaszsáihatők diszulfíákötéssel keresxácöfoít bESH-aostogok előállítására (Megjegyzés: a matáeiót nagy betűvel jeleztük) hFSHBIÖ5C

Írikő<{O:teew:k3Íeenseeitnitiatekegeg&í:ÍÍnúwcagycyiCdleykdpaí'í?klgkíe ííkeivyeívrvpgeafelimisiytypvaígciKgkedsósídelvrglgpsyesígsnÁfi hFSHBA29C nÁiiqivDfccwkaiccssceiínnias'ekegogfcitisgwcCgycYíMlyykdparpkigktc hfSfeíW27C mkdqíYSfeeyvkaíeciiseeií.ititiavekegegféitintíCeagycytídlvykilparpkiqkie hFSH0T$2C

KsküqSHfóe'ivka iccn.se eiínitiavekegegfeiílnííwesgytytrdivykáparpkiökto tfeieyeívrvpgcahbndslytypvatqefecgkcdsdsCdctergigpaycstgöirÍiíff feEWisöc inktkfffilfccwkmecnsceitnmavekegcgEáídíttweagyeyfedlvykőparpkiökCc

1Α$ΗβΤ3<:

:firktiqftf!Íccsvkascensceimitlavekegcgfeitinií:svesgycyCfolvykáp&rpfciq:k!e ti'ikeivyeÍvrvpgcablsadslysypvaíqcbcgkedsőstőeívrglgpsycsfgosske »·>

hFSM£D3óC nfetlqfBiecwktóccascdtaítiavekegcgfeííírthwcagycylrClvykdparpkíqkto ídcelvyetvTvpgcahfeidsiyíypwqchcgiíedsdstdcsvrglgpsycsígeöxke

I hFSl$K40C •nktlqffilfeewkakxííseedaibaveksgfig&idnPxvcsgycytrdivyCdparpkiqktc ifteivyebTv’pgcambadsIyiApvaíqebcgkcdedsÍdctvi-glgpsycsfgsníke j hFSHp V38C

I mkdqfíBfeoR'kibeeftsedtoKjavekegegícidatbA-cagycytixílCykdpaípkiqktc tíkdvyetvr\pgeahi5adslytypvatqohegi«:d5dsíxtetvrgigpsyosígemke thFWQ48C íidökpfsIfcewkaiecsseeteidavekegcgfcidíStweagyeyírdivykdpsrpkiCkte síkeivyeívrvpgcaixhadsIytypvatqciKgkodsdsídctvrglgpsyvsiigerí'ks

11. táblázat

A hCö β-idegységéuek további analógjai, amelyek íoegtetelöa-akgységekkel kombinálva felhasználhatók diszulfidkotéssei keresztkötört bCö-analógok előállítására (Megjegyzés: a műtőétől nagy betűvel jeleztük)

hCGp	M4ÍC
	memfqghllllteggtw	ótephprerp	tsatíavekegepveih	«icagycptCírviqgvlpaipqvvvnyrdvrfcs f
	IrlpgeprgvnpvvsysvaL	«eqcskrrsta	ieggpkdhplteddpr	’qdsssKkapppslpspsripgpsdtpdpq !
ibCOp	V5ó€
	xnem fq g 111 11 Hsuiggt»· a	skepkp-'Oi’p	ittadavekegepveib	utticagycptmtrvlqgs.'lpalpqvCcnyrdV'rfes \|
	ibpgcprgvjípvvsysval·	«qealerrs-tk	k.ggpfcdbpltcddpr	’qásssskapppslpspsbpgpsdípilpq \|
hCGf:	A35C meraíqglffiOsanggtwa	-íkeplrprexp	natlavekegep ve i	oídeCgyepímirvlqgvlpakpqvvcnyrdvrfes j
	irlpgeprgv op v vsya va 1	<eqeaknatt<	íoggpkdhpíteddpr	tqdsssskapppsipspsrlpgpsái.pdpq I

hCGpI^:33C memhighlllllim^gmas^ephprcrpitiaÖavekegeps'cilvnttCcagyeptxntrvlqgvIpalpqvvenyrdx.'Tfes íripgeprg\7ípvvsyav3lscqcak'i're-Pd.cg.gpkdhpiteddp!'íqdsssskappp8Ípsps:dpgpsdípilpq hCGpükC snejnfQgOiUllsas^ghvadmplnzroxp-íaatlavekegcpveítvstttíeagycptmtni'.lQgsdpalpqvs'cnyrdvrfes íxlpgeptgvtgtvvsyavalseqealcwrtCdeggpkdhpíteddprfi^sssskapppslpspsrtp^Jsdipilpq a€‘G0T4OC niemfqg01íttlwggt»^tepljprcrpinallavekegepvcitvnttícagyspCnttrvlqgvlpalpq.vvcn>^dvrfes iHpgcprgvrspvvsyavateoqe8krrsíídíggs>kdbpto:ldpdqdsssskappps;psps:dpgpsdípdpq hCGpWX ntexnfqglhlllte^gtvyasdseitlntrexptrtatlavekegcpvejtvmiicagycptíráFrvlqgvlpsIpqvs'cnyTdvTfes •irlpgeptgvnpvvsysvalseqeaicmttdeg^tkdltpltedt^tfqssssskapppslpspsrtpgpsdlpüpq

toenyí^gUlílilsniggtwafikfiphpi'crpinadiivekcgcpvcisVírtíícíigycpfenín.dCgvlpalptjVv'Cííyí'dví'iei;

I bSpgcprgvQpvxsyavabeqeakrcsttdcggpkdkphcddprtodsssskapppslpspsrípggsdípbpq | hCGp V94C nsesní^gUll.HlsmggtwaskeplrprctpinatlaveisegcpvejtvntíicagycptetrClqgvlpalpqsfvenyrds'rfes írspgcprgv-spyvsyavaiscqcalciTSítdcggpkdbpíteddpGgdsssskappjyslpspsripgpsdSpíipq | hCGj3Q54C j»e»tíqgl{lll.lls«3gg{waskepliprcrplnatlavekeg«pvehvattieagycptetrvl^gvípalpCvvcnyTdvrfes hlpgoprgvnpvvsyavalscqíateresPácggpkdhpkcdápdqdsssskapppxIpspsripgpsdípdpq

Í2. iabféxa·

A bLH p~slegy:$dgéfiek további analógjai, amelyek ínegtoieitoí-alegysegekkel kötabimlva felhasználhatók dí~ szulfidköíéssel keresztkdtott híJI-analőgok előállítására (Megjegyzés: a natíáseíót nagy betűvel jeleztak)

M.BSV44C öíetolqglllÍiHsmggawaserpb'pwehpinaiiavekegcpvciiynaí.cíígycpföíiíOPŐlqa’vippipqrx-'ctyrdvrfcs blpgq>ígvdpvysfyy;d$c:egper3:sísdcgg3&díg>h.aihp<dsgbd fclSpM4iC wtnl.<5gllÍllHsmggawa8eíplrpw.hpjaaites^k«gcpvc«vn8teagye^O3jrvlqavípplpqvvetysdvrfes irlpgcprgvdpvvsípvvifscrcgpcrreGdcggpkdbplfedbjíqlsgibl bLHgiVSőC mendqgdnidstoggavoseiphpwchpínadíívekegcpvckvífíStKsgycpSirorEytoaylppipqyCciyrdyrfes tofegcprgyÍlpyvslpvaisctogpcíTstsikggpkiáhpkcdhpeögdfl hLÍ0A35C meialtíglilllllsxnggawasespltpwehpinailavekegepvettVHtüeOgy'íptaaítrvlqavfppl^vveíyfdvrfes lrlpgcprgvdpwafpvalscpe^cmtsde^>kdhpltcjS^(áí^ílfl hLHpme {«emlqginillh?ssggawaseípltpwebp.ínaílas'ekegcpvetívattCcagyep)n}r8rv{qavipplpQvs’CtyTdvrfes iripgcpígvdpvysfyvibscicgpcrrsttdcggpkdhpitedbpdsgbd bl.HbSÓdC ...............

meml.qgffiHllsínggawase^íspwehpiaaiíavekegqívcitwíticsgyeptearvlqavlpplp^wctyrdvrfes kipgcprgvdpvvsIpvaíscí'cgpűri'Císdcggpkdhpbűdhpqlsgdrl hUMT-toC n}.enűqgllOl.llsn.5ggawaseíplipwchph)ailavekegq)vcítv3atttcagycpC!mmn'leavlpplpqvvetyrdvríes sftegcprgvdpvvslpvtoscrcgpcrrsfödcgggfcdbpifedbpglsgníl hLHpM42C memlqglílllllsmggawase^lípwel^mílavekegcpveityijaícai^^teCndqavlppipqvvctyTdvrfcs «IpgpptgvdpwslpvíaíscrcgperfStsde^pkdhpItetSípq-bgllíi * ♦ ·♦ * * hLHBQ46C wrnilqgllirtllstx^ga^se^l^wl^mailavekegcpvcitvnttícagycptoísr/IGavlpplpqwctyrdvrfes írlpgeprgvtlpwsfpvalsercgpcrrstsdcggpkdlrpitctlhpqlsglM

.......................................................................

Oiejnliqgifilílkmggavt^serplrpwhptnaaavefcegcpvcítvafbcagycpfmnsrvliqavl^lpCvvetyrdvrfes irlpgcprgvdpvvsIpvatecrcgpeirstsdeggpkdltplícdbpítlsgilO

13, táblázat

Stablllíásfokozó, alegységen 'belüli disznlftdkötéseket. taríalmazö hFSH-beterodimerek

«-alegység konstrukció	d-aíegység konstrukció
«CM Λ	bFSH0Y31C*
«Q27C	bFSH(IV38C*
«M29C	hFSH(’R35C
«S34C	hFSKjTFOÜ
«R35C	1:ιΡ8ΗβΑ29€
«Y37C	bFSíipW27C
«S55C	hFwwc
otS57C	hFSl^TSÓC
«C87A	hFSÍCCAdC
ttVolC	hFSiibDlCC
«K75C	bF'SHjÍK40C
«V76C	hFSHitXASC
«C59A	hF$HbQ4SC

Megjegyzés: Csillaggal jelöltök azokat, amelyek várhatóan jelentős biológiai aktivitást őriznek meg. Ezt az M. példákban bemutatott, a receptorkötésben vagy a •receptorkötés. speeifbásának meghatározásában résztvevő aminosavak szerepe alapján számítottuk ki. A. keresztkőtőö heíerodimerekaí ágy állítottak elő, hogy az I. példában ismertetett eljárás segítségévei emlőssejtekbe kottanszfektáltak a lent jelelt «-alegység- és b-alegység-analógok cDNS-ét.

14. táblázás

Stabüitásfokozó, alegységen belüli diszulfidkőtéseket tartalmazó hCG-heterodimexek

«-alegység konstrukció	β-a-íegység konstrukció
őtC31A	h«$Y37C*
aC3 IÁ	bCÖplGC*
ctQ27C	hCGpV44C*

»»««

«S.S5C	hCGpI’98C
y.$5~C	hCGpVSőC
«CE7A	hCG^IAŐC
«Vő IC	hCGöT42€
O.K75C	hCGpQ4őC
«V7ŐC	hCGpV44C
«C59A	hCG0Q54C

Megjegyzés; Csillaggal jelöltük azokat, amelyek várhatóan jeietttös biológiai aktivitást őriznek meg. Ezt az 1-4. példákban bematatott, a recepiorköíásbcsi vagy a receptorkötés speerfitásának meghatározásában résztvevő andnosavak szerepe alapján számítottuk ki. A fceresztkötött heterödímerekei ágy áihtottufc elő, hogy az L példában ismertetett eljárás segítségévei emlőssejtekbe· kottanszfekiáltok a fem jelölt «-alegység- és 0-alegység-anaíógok cDKS-éí.

15. táblázat •Stahihiásfokozik alegységen fedőit íkszdSdkötésekeí tartalmazó htH-heterodhaerok

«-alegység konstrukció	^-alegység konsixukeió
tzC31A	hLí$Y3?C*
«C31A	hLHpRóC*
«Q27C	hLH(SV44C*
«M2$C	hLHSM41C
«S34C	bLHfeVóóC
a.R35C	bLHpA35C
«Y37C	bLHÖDoC
«SS5C	ηΙΜβΤόΒί.:
«S57C	hLHp'VSóC
«C87A	hllipIAdC
«VöiC	hLHpT42C
O.K.75C	faLRI)Q4«C
CíV7őC	hLH0V44C
Ö.C59A	hLHpQ54C

Megjegyzés: Csillaggal jdokkk szokat, .amelyek: várhatóan jelentős biológiai aktivitást Őriznek ttieg. Ezt az 1 -4.

»Λ » * példákban bemotatoít, a reeepíotkötésben vagy a receptorköíés spéciIrtásának meghatárazásában résztvevő amisósavak szerepe alapján számítottuk. id. A keresztkőtött feeterodánereket úgy állítottuk elő, hogy az 1. példában ismertetett eljárás segítségével emlőssejtekbe kottanszfektáltnk a fest jelölt «-alegység- -és β-alegység-analógok •cDNS-ét, .□„.példa

A címben feltüntetett dtszulfidot létrehozó ammosavak. a hCG olyas régiójában találhatók, amelyek valószínűleg sem vesznek részt nagy affinitás» recepiojkotttoktosokhan ÍMoyle és mtsai., 19-95.), A hCG-ben sem a β -alegység második kutka, sem az «-alegység: harmadik hurka nem szükséges a lu-ttopin akti vitás kifejtéséhez, és létrehozhatók olyan aktív hCG-analógok, amelyekből mindkét említett régid deieíálva van (Moyle és. mtsai., 1995). Előállítottak továbbá olya·), teljesen aktív hCö-anatógekat is, amelyekben a b-aiegység második hurkát a hFSH β-alegységének másíxhk. hurkával helyettesítették (Cámpbell és mtsai., 1991). Azt várjuk tehát, hogy ha a fehérje ezen két része közölt alakittnrk ki áiszulBáot, az uem zav.atja majd meg a biológiai aktivitást. Ezt az analógot ágy állítanánk eíö, hogy -módosittmánk. a. hCG «· és β-alégységét kódoló vektorokat, és emlőssejtekben koexpmsszálnánk őket Az «-alegység-konstrukció által kódolt fehérje «V7öC jetii atnmosavszekveaciáját a 9. táblázat mutatja, Ezt a konstrukciót PCR-muíageneztssel állítottak elő. amihez láncindítöként az 1131. és 1132. számú oltgonukleotídökKt használtok {ld. 5. táblázat), terápiáiként pedig a pM8589-et. A pMB589 jelű plazmíd' egy pCIMtonsírukcsó. ami a barnás «-alegység egy olyan analógját kódolja, amelybe» az 52. pozícióban lévő aszparagint aszparaginsavra cseréltük, a 42. pozícióban lévő arginsn és a 43. pozícióban lévő szerén kodonját pedig úgy módosítottuk, hogy egy csendes· Bglö-heiy alakuljon ki.

A pMB589-et ügy állítottuk elő, hogy a pMB532~böl származó XhoI-BamHI-inszertet egy pCf-vektor Xhol-BamHl-helyére szubkióríoztók. .A pM85'32-t közvetlenül egy korábban már ismertetett konstrukcióból, a pMB5í)?-hől állítottak .elő PGR-rel, amelyhez láactadííókéttt a 350. és a 851. számú cdigonukleotidokea. (5. táblázat), templátkértt pedig a -pM85Ö?-et használtak. A PCR-tconéket BglII-vsl ás Spel-gyel emésztettük, majd egy pMB5Ö7 .BglH-Spel-helyáre szabkíónoztuk és megszekvenáltok,

A kapott KX-terméket BglII-vel és Pstl-gyel emésztettük, majd az iuszertei pMB5ö7 BglIÍ-Pstl-helyére klónoztok. Igy kaptuk a pMB910-et A pozitív klánokat egy, a konstrukcióba beépített extra Dral-hciv alapján azonosítottuk. Miután a pMB9l Ö szekvenciáját dideoxi eljárás segítségével leellenőriztük, a teljes a-alegységanalőget kódoló DNS-fragmenst Xhcl-gyel és SantHí-gyel történő emésztéssel kivágtuk & pMBŐIÖ-bői·, majd egy pCI'-vektor Xhol-BamHl-helyére szabfclősoztofc így kaptuk a pM392ő-o!, amely az «V?'őC-t kódolja..

Az <xV7'6C-hez partnerként egy-olyan hOG β-alegységet állítottunk elő, amely a h€G3'V44€-í kódolta. Ez egy olyan hCG β-alegység-aualóg, amely, ha a pM892ő-fal egy sejtben expresszáljuk, várhatóan diszulfidkexesztkőtött- heterodimert képez az. «V76C-vei. Megszmtetjzálíuk az 1133. és az 1134. számú oíígosukleotidokat (5. táblázat), tntíjd a pKMÖ-0* NgoMl-Pstl-heívére klónoztok. Az így kapott pMB9ö9 XholBamHf-Sagmensét pCl'-vektotfea átültetve kaptuk a pM941-et. A pMB941 által kódolt hCG’pV44C amiaosavszekvenciáját a 11. táblázat mutatja.

.ilUíéld»

A hCG β-alegységének és a hFSH β-alegységének anr;ttos..,s,. -veaciáje igét· hasonló, különösen ami a ciszíeu-eket illeti (4. i&hiáto}, így várható, hogy tétszerfeezeíük is hasonló fesz. A hCG β-afegyssgéssk 2. hurkában lévő Víd44 ős az «-alegység 3. burkában lévő Vsd7S egymáshoz képesti helyzete alapján azt váróik, .hogy ha ezt a két amínosavat cisztónre cseréljük, akkor létrejöhet egy alegységközi diszulfid a β-afegység 2. toka és az a-afegység 3. toka között. A hFSH β-alegységébeo a Val38 hasonló pozícióban van. mint a hCG β» alegységében a V'al44. Ha tehát a hfSHpVal3S-t ciszteinae! helyettesítjük, majd a kapott konstrukciót etV?6Cvei együtt expresszáita-jrék, várható, hogy egy diszufod-ketesztkötőü beterodimert kapunk:. A hFSH βaiegységéhen a 38. pozícióban lévő veim éisztehw cseréléséhez a pMBőOl konstrukcióból indultunk ki, amely a hFSHpí cDNS kódoló szekvenciáját tartalmazza, <fe nem tartalmazza a pCT-vektor Xhoí és Bandii hasítóhelyei között a 3' és az 5' nem transzlálódó régiók végét A pMBóÖ3 BstXÍ- és a PpuMI-helyei között lévő kis .DNS-fragmensi egy olyan oligonokltoid-kazettára cseréltük, amelyet az 1154. és az 1155. számú olígonukleotidok (5 . táblázat)· hibrid;-záltatásával állítottunk elő·.

Az így kapott konstrukciót, a pMB929-ai, a BstXI.-heiy hiányára és a PpaMl-hely jelenlétére szőttük. Mimén a DNS-szekvenálás megerősítette & kívánt mótfositások jelenlétét, a pMB920~a· az «V76C expresszióját irányító pMB92ő~ vektorral COS-7-sejtekhe kotwaszfektáhnk. A. sejtek által a tápközegbe szefeetált heterodtott szendvies-immunteszttel egyszerűen ki tudtuk m-utahú. A. részi: .során kikötő antitestként az aalegységre specifikus, monokionálís AJ 13-antitesto·, detektáló antitestként pedig a hFSH β-aiegységére specifikus, radioaktívan jelölt,, monokionálís BőÖ2-«atitest«t alkalmaztuk. A pMÖ920 által kódolt bf-SHBchC amínosavszekvenciáját a lö. táblázat matatja. Az aV79ÖC-hől és a hFSH$V38C-ből kialakíitó hetenxinner humán FSH-t expresszáló CHO-seitekbeo képes volt ciklikus AMP termelődést kiváltani (45. ábra).

15. példa fe.h£ör^ó&..^^toffiá^Jtób2^-M^mj«^JS^2aÍMlfejá&íÓ.Js.SÍSglÍacSSP^...?ég^í között

Az eddigiekben ismertetett diszulfid-keresztkőtöít toerodimerekst ágy állítottak elő, hogy az egyes alegységeken szabad üol-esopertokat hoztunk .létre, amelyek így részt tadtak venni az .alegységközi diszulfid kialakításában. Az alábbiakban bebizonyítjuk, hogy elő lehet állítani diszulfid-keresztkötött hCG-analőgot úgy Is, hogy csak a β-alegységet módosítjuk, A feCG knsAallográ&s szerkezete azt mutatja, hogy az o-alegység 3 i. pozíciójában lévő «risztéin térben közel helyezkedik el a β-alegység 37. tirozjajához, és hogy a két alegység oídaíiáncaí egymás· .felé mutatnak. Ezt a megfigyelést használtak ki a korábbiakban is, amikor a hCG «alegységének 31, pozíciója és a hCG ö-alcgységénck .37, pozíciója között aiegységközi diszulfidot alakítottunk ki. A hCG tószíallográfiás szerkezete arra is rámutatott, begy az «-alegység?. pozíciójában lévő ciszteín térben közel vari a hCG β-alegységének ó. pozíciójában lévő asgininhez. Mindez valójában azt jelenti, hogy az «alegység 7, és 31. pozíciójában fevő «risztéinek térben olyas közei vannak a β-alegység 6. pozíciójában· lévő atgínínbez és 37. pozíciójában lévő iirozinboz, hogy e két pozíció módosításával előállított heterodimerek vagy 0fCys7-Cys3! és fiCysó-Cys37 alegységen belüli diszuifidok&t, vagy aCys?-p€ysó és· oCys.3 l-SCys37 alegységközl d'íszalfidokat, vagy aCys'?-|3Cys.3? és aCys3í-pCysó aiegységközi diszulfidokat fognak tartalmazni. A számítógépes szimuláció -azt matatta, hogy a felsorolt őiszulfoikötések bármelyike létrejöhet anélkül, hogy különösebb feszültséget indukálna a fehérje szerkezetében, Az egynél, több diszaiSdkőtes kialakulása abból a szempontból lehet hasznos^ hogy különböző feiéfetidöveí jellemezhető izomer- vagy izoferma-csoportokat hozhatunk léire. Ennek nyomán áj terápiás -alkalmazásokra is lehetőség, nyílhat, különösen ha a kívánt biológiai folyamat ugróstartot” igényel. Ezek alkalmazásával a hormonális válasz beindításához nagy hokisként adnánk be az analógot. A heterodimernék az a frakciói a, amely nem keresz&ötőtt, várhatóan gyorsabban ürül ki, mint a keresztkötött tteteroöimer, A nagy fedítófejekdó tehát elegendő lenne a hormonális válasz elindításához, de az aktivitás ezt kővetően alacsonyabb színire csökkenőé, ami a válasz fenntartása érdekében hosszabb ideig megmaradtra. Várható továbbá az is, hogy az analógot köztes termékként lehetne alkalmazni FEG-addieionált analógok előállításához. A ctszíeinek -egyedi aktivitással bírnak, ezért gyakran kívánatos lehet, hogy a íeíisrneröheíy felszínén egy szabad· ciszteint alakítsunk ki. A -eísztsin reaktivitása miatt azonban ilyen típusú fehérjét nem könnyű eiÓáiStani. ismert, hogy az cx-alegységen belüli Cys7-C'ys31 diszullid .könnyen olyan állapotba redukálható,..amelyben szabad cbzíeinek keletkeztetnek. Ha tehát a β-alegységnek a Cys? és a Cys37 közötti szakaszán egy eíszfeim építenénk be, akkor hasonló típusú disznifidokst kapnánk. 'Várható, hogy a diszulfidokban lévé fesztéinek a fehérjében Ifeáiható többi ciszteinhez képest aktívabbak, különösen mivel olyan helyen vannak, amely elősegíti a áiszuifid-cserét. Azt várnánk, tetei, hogy az α-alegység már meglévő, s.7. pozícióban, elhelyesötedö-eiszteinjé, valamint a β-alegység 6. pozíciójában kialakítandó cisztein reakcióba léphetne íéhérjemódosító anyagokkal, például olyanokkal amelyek PPG-et addieiónálnak, ás így stabilizálják a molekula biológiai föléletidejét. Az igy felszahs-dstott” fesztéinek azután képesek leimének a fehérjét stabilizáló alegységkor» drszulfídok kialakítására. Ennek az analógnak az előállításához a bCGd’Y37€~fee egy második fesztónt is be kellett vinni.

A hCGp'-t kódoló pMB940-ei pCR-mutagenezissel állítottuk elő. amelyhez lánc-indítóként az 1161. és· az 11.63., számú óligonukleolidokat Ϊ5. táblázat), templátként pedig pCf-hCGp -t: alkalmaztunk. Az 1161. számú •oligonúkieotid a pCí’-vektofi>an található egyik szekvenciánál indít, az 1163. számú oligonúkieotid pedig a mutációt tartalmazza. A kapott PCR-terméket Xhof-gyel és BamHI-gyel.emésztettük, majd -a pSVl-hCG3'Y37C Banl-BamílI-fragmettsévfe iigálmfc és végül a pCT Xtel-BaatHl-helyére ültettük be. így kaptuk a pMB94l-et. A pMB941 kódoló szekvenciájának DNS-szekvenctáját a dideox.í eljárással ellenőriztük. A pMB64t az alábbi .aminosavszekvesciát kódolja:

hCGikR6C,Y3?G:

memfqglHllilsn^gtwaskeplCprorpmdavekegepvcstvntócagCcptmtrvl^gvipalpqvvenyrd\trfesirlpgcptgttnp vvsyavalscqcalcrrsttdcggpkdbplíed^rfqdssssk

A pMB94ö-t. és a pSV2Meo-t Cflö-sejtekbe ketranszféktáítuk, majd a G418 nevű mérgező szerrel szembeni rezisztencia alapján kiszelektáltunk egy stabil sejivonalat. A tápközeggel levett fehérje mennyiségét szendvics-immunteszttd határoztuk meg, amelyhez kikötő antitestként az α-alegységre· specifikus, monoklonális Al 13-anti-tesiet, detektáló antitestként pedig a hFSH β-aiegysegére specifikus, radioaktivas jelölt, monoklonális 8 {12-amítestet alkalmaztuk. Á vizsgálatok eredményei megerősítették, hogy a -heteroditnef megjelenik a iápközegben, amelynek biológiai .aktivitását patkány I B-reeeptort expresszáló CHO-sejtek ciklikus ÁMP termelődése alapién mértük. A teszt eredményei a 46. ábráit láthatok.

Egv.hCGfeteió&.ameíy között

Ahogy azt mér .említettük, több dt-szulfid beépítésével különböző féléletidejű izoformákat állíthatunk elő. Egy hasonló analóg a tüszőérés stsmulálásaten Is előnyös lenne. Az alegységhözí diszulfidot nem tartalmazó, és *« »*»* így itetn keresztkötött heteredűnsrtrafceiő várhatóan gyorsabban ürül ki a szervezetből, mint az alegységköri diszuifidot tartalmazó beterodáoerfeakeíó. Ez azt jelenti, hogy egyetlen nagyobb injekció elegendő lenne a kezdeti töszőésés beindításához, de az aktivitás ezt kővetően alacsonyabb színire csökkenne, és ezen a szinten bőszszabb ideig fennmaradna. Ez sokkal jobban követed azt a típusú FSR-sfewláríöí, amit a töszöfazis során láthatunk, így csökkenthetné a hipersthnnláció kockázatát. Várható tehát, hogy ka a hESH β-aíegységének Niemnnálísához egy ciszteint adónk, vagy ha a hPSll β-alegységének aminotennlnálisához a hCG' β-alegység Mtermínáilsát kapcsoljuk, az elősegítené a beterodinter és az alegységközi diszuifid kialakulását. Egy, a 15. példairars bemutatott analóghoz hasonló het-erodimert képező feFSHanalóg. aminosavszekvencíája az alábbi lenne:

hESH'pR2C,V3IC:

mexníi}gllliílls.mggtwaskeplOiseeltnhiav€kegcgfeit'i.nöwc8gCeytrdlvykdp3rpklqktcdke.lvyetvrvpgcahhads!

yiypvatqehcgkcdsdstdeivrglgpsyeslgesfe

1?. példa benmtátott analóghoz hagonlé

Az olyan. hCG-analógok, amelyekben a β-alegység 94-110. asriínösavait a hPSH megfelelő aminosavaíta cseréltük, jelentős FSH-akhvitással bírnak, A. hCG β-alegységéoek lő'l-iőó. aminosavaí helyet;, a hESH βalegységének 95-103. aminosavait tartalmazó, továbbá a b-alegység 6, és 37. pozíciójában ciszteíat tartalmazó hCGdtFSH-kimérákhan várhatóan hasonló diszulddok alakulnak ki, mint a IS. példában -bemutatott analógban. Várható továbbá, hogy ezek sz analógok jelentős FSH-aktivítással rendelkeznek. Egy ilyen analóg βalegységének aminosavszekvenciája sí következő lenne:

CbC94-ií70R6C,¥37C:

memfqgllillllsmggtwaskeplCpmíp-xnadavek.egq>vcítv»njcagCcp!mövk{gvlpalp<|vven.yrdvrfesirlpgcprgvmp v'vsyavatscqcaicdsősttíctvTgtgpsycstgemessssKapppstpspsrtpgpsd-lpdpq

A találmány részletes ismertetése nyomán a technikában jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a megadott paraméterek, koncentráció és kísérleti körülmények jelentős- mértékben módosíthatók anélkül, hogy ezzel a találmányi gondolattól eltérnénk, vagy annak oltalmi kórén kívül kerülnénk, és hogy mindehhez túlzott mértékű kísérletezésre lenne szükség.

Bár a találmányt annak konkrét megvalósítási módjain keresztül ismertettük, nyilvánvaló hogy további módosításokra is képes. A bejelentésben igyekeztünk a telalsíáuy minden változatát, alkalmazását vagy adaptációi á; lefedni és ennek: során általánosságban a találmány alapelveit követtük, és megpróbáltuk belevenni mindazon eltéréseket, amelyek a találmány szakterületét érintő technika állása szerinti gyakorlatban elfogadottak vagy szokásosak, és amelyek a találmány eddigiekben ismertetett lényegi jellemzői tekintetében és a. .csalóit szabadalmi igénypontok ahai definiált oltalmi kör szempontjából alkalmazhatok.

A leírásba® szereplő hivatkozások, ezen belül, folyóirat cikkek .vagy kivonatok, megjelent vagy megfelelő amerikai egyesült államokbeli vagy külföldi szabadalmi bejelentések, megadott amerikai egyesült államokbeli vagy küllőid! szabadalmak, továbbá bármely egyéb hivatkozás teljes mértékben a kitanítás részét képezi, Teljes mértékben a ki-tanítás részét képezik továbbá a hivatkozót; nmukákban található hivatkozások is.

Az ismert eljárási lépésekre, hagyományos eljárási lépésekre, ismert vagy hagyományos eljárásokra való hivatkozás- semmiképpen nem értendő úgy, hogy az a találmány bármely szempontjának, leírásának vagy megvalósítási utódjának ismertetése vagy ki-tanítása fesme a vonatkozó szakterületen.

A konkrét megvalósítási módok leírása tehát teljes részletességgel ismerteti a íaláimány általános tulajdonságaik, amelyet technikában (beleértve a leírásban hivatkozóit publikációkat is) jártas szakember egyszerűen, túlzóit kísérletezés nélkül módosíthat és/vagy adaptálhat konkrét megvalósítási módoknak megfelelően, anélkül, hogy ezzel a találmányi gondoláitól eltérne. Az említed adaptációk és módosítások tehát a leírásban adóit kitanitás és útmutatás szerint a leírt megvalósítási módok ekvivalenseinek számítanak. Az is nyilvánvaló, hogy a leírásban használ! szakszavak és terminológia csak a leírás celláit szolgálja. és nem jelent semmiféle korlátozást. A leírásban használt szakszavakat és terminológiát tehát a technikában jártas szakembernek a közölt ki tanítás és úmmiatás fenyőben, illetve a szakemberre jellemző jártasság alapján kell értelmeznie.

HIVASDZÁSOK

Adashi és mtsai,, J. Bioi. Chem. 264, 8537-41 (1989)

Alher és sasai, Biochemistry 26,3751-3753: (1987)

Ausubel és mtsai., Currem Proíoeols in Moleeular Bíoiogy, Greene Publicstíons and Wiley interscieu.ee (New York, 1987-1997)

Baenziger és mtsai,., Bloehim. Brophys. A.cía 947,287-306 (1988)

Baenziger és mtsai., Proc. Natl. Aead. Seb, 'USA 89, 334-338 (1992}

Barrel és mtsai., Oxf. Rév. Repróik Slol. 15, 191-232 (1993) Sedows és: mtsai., .1. Bioi. Chem. 268, 1165511662 G 993}

Berger és mtsai., Motecular and Ceilaiar Endocnnology 125, 33-43 (1996)

Bemard és mtsai., Mól. Ceti, Riróoerinok 71., 819-823 (1990) Birken és mtsai., í. Biok Chenr. 261, 10719íö'72.7 (1986) Bükén és mtsai,, Endocrmoíogy 129, 1551-1558 (1991)

Shíheés mtsai., Endoeninnlogy 129, 2257-2259 (1991)

Blowmick és mtsai., Mól Endocrtnol. .1.0, 1147-1159 (:1996}

Bo és mtsai., .1. Bioi Chem. 267, 3179-3184 (1992)

Braun és .mtsai., EMBO. J. jó. 1885-1890 (1991)

Braustetn és mtsai., Endocnnology 91., 1030-1036 (1972)

Brooker és mtsai., Adv. Cycíic Nucl. Rés, 10, 1-33 11979}

Campbell és mtsai., Proc. Natl. Aead. Seb, USA 8.8,.760-764 (1991)

Campbell és mtsai,, Mól. Celh Endocrinol. .83, 195-200 (1992)

Campbell és mtsa-L, Natúré Biotech. 15, 439-443 (1997)

Chen és mtsai., 1. Siói. Chem. 266, 19357-19361 (1991}

Colé és mtsai., Cancer. Rés. 41., 1615-1619 (1981)

Colé és mtsai., Endociinology 129. 1559-1567 (1.991)

Colé és mtsai., J. Btól. Med. 64, 627-637 (1991)

Colé és mtsai... J. Gin, Endocrinol. Metals. 76, 704-710 (1993) Cosowsky és mtsai., .1. Bioi. Chem. 27í), 20011 20019 (1995)

Cosowsky és mtsai., J. Bioi. Chem. 272, 3309-3314 (1997) β Φ: « # X *

X ί « Ί» β *

Φ««« Φ Φ φ * » * ««»« Χφ ΧφΦ Φ

OeBeer és misak, .Fut J. Bit’chem. 291,229-242 (1996)

Fidsles és «mai, a következő publikációban: Recent Progress in Hormoné Research, Voí. 90; R. O. Greep, szerk., Acaderoie Press, New York (1984), pp. 43-78;.

Etele és misai.., Coll 67, 1103-1 i10 (1991)

Fomtferi ésmtsak, J, Bioi Chem. 257. 7976-7931 (1982)

Forsikashi és rotsal, j. Bioi. Chem. 269, 25543-25548 (1994)

Galroay és misai., Fmdocrinology .1.27, 3023-3028 (1990)

Gast, M, .1, Μ 1 Obs&eí. Gymeeol. 172. 753-759 (1995)

Gemmte, A,, szerk., Remiagton’s Pnarrnaeeuílcal Sclesees, 18. kiadás, Maok Pafelsshing Co. (Easton, PA, 1 990) Kan és misai., Mól. Coll Eadocrieol 124, 151-161 (1996)

Ho és misai,, Gene 77, 51-59 (1989) l'luaxtg és rntsai... .1 Bioi. Chem. 268,935. 1 -9315 (1993) tat és tnisak, Rioconjag, Chetn..1., 544-148 (1990) .11 és misai., Faáoeriaology .128, 2648-2658 (199 i)

Jia és misai., Moh EndocritxöL 5, 759-768 (1991) .hang és trusai., Slmcture .3, 1341-1353 (1995)

Karátma és rntsai,, Fndocrínoíogy 129, 1541 - 5 550 (1991)

Köbe és misai.. Natúré 366, 751 -756 (1993)

Köbe és mtsai.. Natúré .374, 183-186 (1995)

Kriegfer, M„ Gene Transíer and Expresszit. A Laboratory Marosak Stockion Press, New York (1990)

Laptnom és rntsai., Natsre .369, 455-461 (1994)

Fám és mtsak, Naróre .339, 31 -36 (1989)

Lím és misei., Broehemisiry 31, 4324 -4333 (1992)

Loosléíi ésroisai., Science 245, 525-523 (1989)

Manlaíts és trosak, M'oiecnlar Cloning, A Caboraiory Matasd, Cold Sprróg Karbor Laboratory, Coki Spd-tg I-íarbor, NY (1989) Matsumura és misai., Natúré 342, 29 i -293 (1989)

Mmtbews, B, %k, Biecherois-ry 26, 6885-6888 (1987)

Mrozuk és misai., 5. Bioi. Chem. 264, 2409-2414 (1989) McFarland és misai., Science 245, 494-499 (1989) Mclmnsk és misai., í. Biomolecnlar Síracíure and Dynamics 5, 21-33 (1987)

Mise és misak, J. Bioi Chem. 2:55, 8516-8522 (198s))

Mise és mtsak, í. Bioi. Cltero, 256,6587-6592 (1981)

Moudgakés tn-ssk, 1. Cím. Endocrinel Metsb, 32, 579-581 (1:971)

Monágal es rmsak, I Cím. EndocrmoF Meíab. 3.5, 113-116 (1972)

Momlgak N. R., a következő pablikáeióPan: iromimizatioa tvíth Hormoné* irs Raprodnotion Research, E. Nieseblag, szedi.. Nobb-Bölted, Amsterdam (1976), p. 233

Moudgal és misai., FertiBiy & Sisriltry 30, 223-229 (1978) Mbyíe és misai., 1. Biok Cirem, 250, 9163-9169 (1:975)

Moyle és misai., Proc, Nuik Ac<-:d. Sck, USA 79, 2245-2249 (1982)

Moyle és misak, J. Bioi. Chem. 265, 8511.-85 i 8 G890) <59 * « * · * * « * «- * *κ κ*»

Moyle és mtsai., .1, Biot Chem. 26ő, 10807-40312 {I091)

Moyle és mtsai., Mstore 368, 251 -255 (1994)

Moyle és mtsaí... Endectiuology, L,1. DeGroot, szerit, Saunders, Philadelphia (1995), pp. 230-241,

Moyle és mtsai.,,1, Siói. Chere. 270,20020-20031 (1995)

Moyle és mtsai,, CEemishy & Biology 5, '241-254 (1998)

Murphy és tnisai., Badőcr. Rév. 12,27-44 (1991)

Nagayatm és mís&L, Bioelsem·. Bíophys. Rés. Commnn. 165. 1184-1190 (1989)

Nagavatna és mts&L, Proc. Natl, Acad. Sei.. USA 38, 902-905 (1991)

Pál és mtsai., Am. 1. Repród. immunot 22, 124-126 (1990) Okayam-a, Mot Cél. Bioi. 3, 280 (1983)

Oiive,. D, 1... Ám, 3. Obsiet Gysecot 172, 759-765 (1995) Ovcringfcn és mtsai,, Protein Seience .1, 215-226 (1992)

Piarca és mtsai., Arm. Rév. Biochem. 50,465-495 (1981)

Ravimlranath és retsai., 1 Repród. Feriit 88, 25-30 (1990)

Reddy és mtsai., Prc-c. Natl, Acad. Sei., USA 82, 3649- 3648 (1985)

Remyés mtsai, Molecular and Ceiltilar Endeerínology .125, 79--91 (1996)

Rosa és mtsai,, J, Cint. Eadocriaot Metab. 59, 1215-1219 (1984)

Segalo-ff és mtsai., Recent. Prog. Hmm. Rés-. 46, 261 -301, dise. (1990)

Sbobam és mtsaí.,.Feriit Steril, 56, 1048-1053 (1991)

Singh és mtsai., Pertíí. Steril. 82, 739-744 (1989)

Smilh és mtsai., J. Bioi. Chem, 268, 795-802 (1993)

Spmigel és mtsai., Mot Endocrinot 4, 525-530.

Sugallata és-mtsaí,, Proc. Natí. Acad. Sei., USA 92, 2041-2045 (1995)

Suganatm ss mis:»., J. Bioi. Chem. 264, 19302-19307 (1939)

Sun ás mtsai., Atma. Rév, Biopbys. Biomét Struct. 24,269-291 (1995)

Ta-lrór és mtsaí., Feriit Steril. 46, 120-126 (1936)

Tálwar és mtsaí., Indián. Journal of Experimenial. Bíoldgy. 30,947-950 (1992) van ö;jk és mtsai., Endoc.rinol-ogy 132, 534-538 (1993 )

Wang és mtsai., a következő publikációban: Ovulstma inőuctim, Basic Science and Clinlcal Advances, M, Fiiicorí and C. Flamígní, szerkesztők, Excerpta. Medica. ind. Cengr. Sértés 1046, Eisevier Science 8.V. Amsterdam (1994), ρρ. 191-196

Weare és mtsai., J. Bioi, Ültem. 254, 6964-6971 (1979)

Wéam és mtsai., J. Bioi Chem. 254, 6972-6979 (1979)

Wehmasm és mtsai,, Aan. Endocrinot -(Paris) 45, 291-295 (1984)

Wn és mtsai., Söncture 2, 545-553 11994)

Xis és ntisai., I. Biot Chem. 265, 21411-21414 (1990)

Ymt-bcb-PeiTon és mtsai., (lene 33, 103-119 (1985)

1.S2 ♦ / ki

SZEKVENCIÁIISΤΑ

AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAIk' A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 9 ssdnosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PÚS: peptid

AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr

5

A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 9 aminosav

TÍPUSA,: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 2.- AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Thr Val Arg Gly Len Gly Pro Ser Tyr

S

A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 92 aminosav

TÍPUSA: aminosav

X5á ** ♦ *<-·>

* -X < ♦ +ΛΤ * »

HÁNY SZÁLÖ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptíd

A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ala X

Pro

Asp

Val

Gin 5

Asp

Cys

Pro

Gin

Cys 10

Thr

Len

Gin

Gitt

Asn 15

Pro

Phe

Ser

Gin 20

Pro

Gly

Ala

Pro

Xle <& 3

len

Olo

Cys

Mai

Gly 30

Cys

Phe

Sár

Arg 35

Ala

Tyr

Pro

Thr

Pro 40

Dsu

Arg

Ser

Gys

hys 45

Thr

Mer

A&tt

Val

Sírt 50

Lys

Asa

Val

Thr

Ser 55

Gin

S&x*

Thr

Cys

Cys 50

Val

&X«Sl

Lys

Ser

Tyr SS

Asn

Arg

Val

Thr

Val 70

Mafc

Gly Gly

Phe

Lys 75

Val

Gla

Asn

His

Thr SO

Ala

cys

His

Cys

Ser SS

Thr

Cys

Tyr Tyr

His 30

hys

Sár

A 4» AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 145 aptinosev

TÍPUSA: aininosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: 11neár is

MOLEKULÁT!PUS: peptiá

A L AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser

Lys

Ο1.1Λ

Pro

Len

Arg

Pro

Arg

Cys Arg

Pro

Xle

Asn

Ala

Thr

lsen

1

5

10

15

Ala

Val

£Xu

Cys

Gin

Gly

Cys

Pro

Val Cys

Xle

Thr

Val

Asn

Thr

20

2S

30

ns

Cys

Gly

Tyr

Cys

Pro

Thr

Méh Thr

Arg

Val

Lso

Gin

Gly

Val

3S

40

45

- 1.

,S4 ~

' u

♦

: „♦* » ** x β * *♦ ♦♦

*»*♦ # * Φ ♦

Len

Pro 50

Alá

Len

Pro

Gin

Val SS

Val

Cys

Asn Tyr

Arg S8

Asp

Val

Arg

Phe

Gin SS

Ser

Ile

Arg

Len

Pro 70

Gly

Cys

Pro

Arg Gly 75

Val

Asn

Pro

Val

Val 80

Ser

Tyr

Alá

Vei

Alá 85

Len

Ser

Cys

Gin

Cys Alá §0

Len

Cys

Arg

Arg SS

Ser

Thr

Asp

Cys 100

Gly

Pro

Lys

Asp 105

Kis Pro

Lee

Thr

Cvs 110

Asp

Pro

Arg

Phe 115

Gxxi

Asp

Ser

Ser 120

Ser

Lys Alá

Pro

Pro 125

Pro

Ser

Len

Pr©

Sex 133

Pro

Ser

Arg

Len

Pro 135

Gly

Pro

Ser Asp

'Thr 140

Pro

He

Len

Pro

Sin

145

AZ 5. AZONOSÍTŐSZÁMŰ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 116 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚT agy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

AZ S. AZONOSÍTŐSZÁMÓ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Méh 1

Asp Tyr

Tyr

Arg S

Lys

Tyr

Alá Als

He 10

Phe

Len

Val

Thr

Len 15

Ser

Val

Phe

Len

Kis 20

Val

Len

Kis

Ser Alá 25

Pro Asp

Val

Gm

Asp 30

Cys

Pro

Gin

Cys

Thr 35

Len

Gin

&S&

Pro Phe 40

Phe

Ser

Gin

Pro 45

Gly

Alá

Pro

Ile

Len 50

Gin

Cys

Méh

Gly

Cys SS

Cys Phe

Ser

Arg

Alá 80

Tyr

Pro

Thr

Pro

Len SS

Arg

Ser

Lys

Thr 70

Méh

Len Val

Gin

Lys 75

Asn

Val

Thr

Ser

Gin 80

Ser

Thr

Cys

Val 85

Alá

Lys

Ser Tyr

Asn 50

Arg

Val

Thr

Val

Mefc 55

Gly

Phe

Lys

v&l 100

Gin

Asn

Thr Alá 10S

Cys

Kis

Cys

Ser

Thr 110

Cys

Tyr

Tyr Kis Lys Ser 115

Λ.....\

Α 6, AZONOSÍTÖSZÁMU SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 116 aminosav

T í FOSA: aamo s a v

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!FUS: peptid

A S, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Asp Tyr Tyr Arp hys Tyr Alá Alá lle Pfee hév Val Thr hév Ser

1

5

10

15

Vei

The

Leu

has 20

Val

he»

Kis

Ser

Alá 25

Pro

Asp

Vaí

Gin

Asp 3ö“

Ser

Tré-

ciu

Cys

Thr 35

Le»

Cin

©1»

Asn

Pro 40

The

Ser

Gin

Pro 85

Gly

Alá

sre

lle

Le» 50

Gin

Cys

Met

Gly

Cys SS

Cys

Phe

Ser

Arg

A1 a 60

Tyr

Pro

Thr

Pro

Leu 65

Arg

Ser

hys

Lys

Thr 70

Met

he»

Val

51»

hys 75

Asn

Val

Thr

Ser

Siti 50

Ser

Thr

Cys

Val 85

Alá

Lys

Ser

Tyr

Áss 90

Arg

Val

Thr

Val

Met 55

Gly

Che

Lye

Val 100

Glu

Aan

Has

Thr

Alá 105

Cys

Kis

Cys

Ser

Thr 110

Cys

Tyr

Tyr Hís tyr Ser 1X5

A ?. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HŐS S2 A: 165 ami nos a v

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: Iineáris

MOLEKULÁTí FUS: peptid « X

	- láö -	« « « * ♦ ♦ »	♦ « »-· *
A 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Mefc Gitt X	Mefc Phe Gin Gly Leu Lett Lett Lett § XG	Le® Leu Le® Ser Mefc 15	Gly
Sly Thr	Trp Alá Ser Lys GIu Pro Lett Arg 2$ 25	Pro Arg Cys Arg Pro 30	XI®
Asn Alá	Thr Lett Alá Vei Glu Lys Gl® Gly 35 40	Cys Pro Vai Cys χχ® 45	Thr
Val Asxx 50	Thr Thr xle Cys Alá Gly Tyr Cys SS	Pro Thr Két Thr Arg 50	VaX
Lett Gin SS	GXy VaX Leu Pro Alá Lett Pro Gla 70	Vei Vei Cys Asxx Tyr 75	Arg 80
Asp Vei	Arg Phe Gl® Ser XI® Arg La® Pro δ 5 so	Gly Cys Pro Arg Gly 55	Vei
Asrs. Pro	Vei Val Ser Tyr Alá Vei Alá Len 100 105	Ser Cys Gin Cys Alá 110	Le®
Cys Arg	Arg Ser Thr Thr As® Cys Gly GXv 1X5 120	Pro Lys Áss Hús Pro 125	Lett
Xhr Cys 130	Asp Asp Pro Arg Pfee Gin Aap Ser 13 S	Ser Ser Ser Lys Alá 240	Pro
Pro Pro 2.45	Ser Lett Pro Ser Pro Ser Arg· Lett ,150	Pro Gly Pro Ser Asp IS 5	Thr ISO

Pro lle Leu Pro Sin 165

A B, AZONOSÍTÓSZÁMÖ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1S5 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY	SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: Iineáris
MOLEKULÁTíFUS: peptid
A 8,	AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA I	.SÍRÁSA
Kefe 1	Gitt Mer. Phe Gin Gly S	Le«	Le®	Lett	Leu 10	Leu	Lett	Leu	Ser	Mst 15	GXy
Gl y	Thr Trp Alá Ser Lys 20	Gitt	Pro	Lett 25	Arg	Pro	Arg	Cys	Arg 30	Pro	lle
Asa	Alá. Thr Le® Alá VaX 35	Gitt	Lys 40	Gitt	Gly	Cys	Pro	Vei 45	Cys	lle	Thr
Vei	Áss Tfer Túr Xle Cys 50	Alá 55	Gly	Cys	Cys	Pro	Tfer 'δ^:0	Met	TLr	Arg	VaX
Lett SS	Gin Gly Vei Les Pro 78	Alá	Lett	Pro	Gitt	Vei 75	v&x	Cys	Aso	Tyr	Arg 80
Asp	Vei. Arg Phe Gitt Ser 85	Xle	Arg	Leu	Pro 50	Gly	Cys	Pro	Arg	Gly 55	Vei

***»*%·*

Asn

Pro

Val

Val 100

Ser

Pyr

Ala

Var

Ala len 205

Ser

Cys

Gin

Cys 110

Ala

Len

Cys

Arg

Arg 115

Ser

Ifer

TAr

Asp

Cys 120

Gly Gly

Pro

Lys

Asp 125

Kis

Pro

Len

Thr

Cys 130

Asp

Pro

Arg

Phe 235

Gin

Asp Ser

Ser

Ser 240

Ser

Lys

Ala

Pro

Pro 145

Pro

Ser

Len

Pro

Ser 150

Pro

Ser

Arg Lev

Pro 255

Gly

Pro

Ser

Asp

•Pfer XSÖ

Pro Xle Len Pro Gin 2SS

A 9» AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

MOSSZA: 165 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: IIneárí s

MOLEKULÁTíPUS: peptid

A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Gin Mer Phe Gin Gly Len Len Len Len Leu Len Len Ser Kér Gly

5 10 15

Gly Thr Tro Ala Ser Lys Gin Pro Len Arg Pro Arg Cys Arg Pro 21 e ‘ 20 25 30

Asn

Ala

Thr 35

Leó

Ala

Val

Gin

Lya 40

Gin

Gly Cys

Pro

V&l 45

Cys

Ile

Thr

Val

ASn 50

Thr

He

Cys

Ala 55

Gly

Tyr

Cys

Pro

Thr «0 .

tíefc

Thr

Arg

Val

Len SS

Gin

Gly

Val

Len

Pro 70

Ala

Len

Pro

Sin

Val 75

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg S0

Asp

Val

Arg

Phe

Sin 35

Ser

He

Arg

Len

Pro 50

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 05

Val

Asn

Pro

Val

Val 200

Ser

Vyr

Ala

Val

Ala 205

Len

Ser

Cys

Gin

Cys 210

Ala

Len

Cys

Arg

Arg 115

Ser

Chr

Thr

Asp

Cys 120

Thr Val

Arg

Gly

Len 125

Gly

Pro

Ser

Tyr

Cys 130

Ser

Phe

Gly

Gin

Phé 135

Gin

Asp

Ser

Ser 140

Ser

Lys

Ala

Pro

Pro 245

Pro

Ser

Len

Pro

Ser

Pro

Ser

Arg

Len

Pro 155

Gly

Pro

Ser

Asp

Thr ISO

Pro XXe Len Pro Gin 2S5

*«**· ifc. X V

A IQ, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1S5 aainosav

TÍPUSA: aatínosov

HÁNY SZÁLÚ'; egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTíPÜS: péptI d

A 10, AZONOSÍTÓSZÁMÖ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Mefc 1·

Glu

Mát

PH®

Glu 5

Gly

Leu

Leu 20

Leu

Ser

Méh •25

Gly

Thr

Trp

Alá 20

Ser

Lys

Glu

Pro

Leu Arg 25

Pro

Arg

Cys

Arg 30

Pro

lle

Asn

Alá

Thr 35

Leu

Alá

Val

Glu

Lys 40

Glu

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

l'le

Thr

Val

Asn 50

Thr

lle

Cys

Alá '55

Gly

Cys

Pro

Thr 40

Mer

Thr

Arg

Val

Leu SS

Gin

Gly

Val

Leu

Pro 70

Alá

Leu

Pro

Glu

Val 75

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg se

Asp

Val

Arg

Phe

Glu 85

Ser

lle

Arg

Leu

Pro 50

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 55

Val

Asn

Pro

Val

Val 10Ö

Ser

Tyr

Alá

Val

Alá 105

leu

Ser

Cys

Glu

Cys 110

Alá

Leu

Cys

Arg

Arg 225

Ser

Thr

Asp

Cys 12 Ö

Thr

Val

Arg

Gly

Leu 125

Gly

Pro

Ser

Tyr

Cys 130

Ser

Phe

Gly

Glu

The 135

Glu

Asp

Ser

Ser 140

Ser

Lys

Alá

Pro

Ser

Leu

Pro

Ser

Pro

Ser

Arg

Leu

Pro

Gly

Pro

Ser

Asp

Thr

145 250	155	ISO
Pro He Leu Pro Gin
1SS
A 11, AZONOS Í TÓSZÁMÖ	S ZEKVSNCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA. JELLEMZŐI;

HOSSZA: II6 am.inosav

TÍPUSA: aj&inossv HÁNY SZALÖ: egy TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

L59 <» *** *»>».»,» jí^ ♦ νφφ *

-»» “,»· ;' »“ . *

Α 11. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Alá Alá He Phe Lett Val Thr Leu Ser

Λ

5

10

15

Val

PHe

Lett

His 20

Val

Lett

Hís

Ser

Alá. 25

Pro

Asp

Val

Gitt

Asp 30

Cys

Pro

Glu

Cys

Thr 35

Len

Gin

Gitt

Asn.

Pro 40

PAe

Ser

Gitt

Pro 45

Gly

Alá

Pro

ne

Leu 50

Gin

Cys

Mefc

Gly Cys SS

Cys

PAe

Ser

Arg

Alá SO

Tyr

Pro

Thr

Pro

Leu 55

Arg

Ser

Lys

Thr 70

Mer

Lett

Val

Gitt

Cys 75

Asu

Vei

Thr

Ser

Glu 80

Ser

TAr

Cys

Vei 85

Alá

Lys

Ser

Tyr

AStt Sö

Arg

Val

Thr

Val

Mefc 55

Gly

Ph.e

Lys

Val 100

Gitt

Asn

Pis

Thr

Alá 105

Cys

Hls

Cys

Ser

TAr 110

Cys

Tyr

Tyr His lys Ser 3.15

A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1SS ard.no sav

TÍPUSA; amínosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS; peptid

A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Mefc Glu Mer. Phe Gin Gly Lett Len Leu leu Leu Lee Lee Ser Mefc Gly _χ 5 10 IS

Öly Tb-r Trp Alá Ser Lys Gitt Pro Len Arg Pro Arg Cys Arg Pro Us

25 30 to Alá Thr Len Alá Vei. Glu lys Gitt Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr 35 40 45

Vei Asn Thr TAr 11« Cys Al» Gly Tyr Cys Pro Thr Met TAr Arg

Val

- 2.60 -

tea 55

Gin Gly

Val

tea

Pro 70

Alá

tea

Pro

Gin

Véül 75

Vei Cys

Asn

Tyr

Arg 80

Asp Val

Arg

Phe

Gla SS

Ser

He

Arg

tea

Pro 50

Gly

Cys Pro

&rg

Gly 55

val

Asn

Pro

Val

Val 100

Ser

Tyr

Alá

Vei

Alá 105

tea

Ser

Cys Gin

Cys 110

Alá

tea

Cys

Arg

Arg 115

Ser

Thr

Cys

Cys 120

Pro

tys Asp 125

Kis

Pro

tea

Thr

Cys 130

Asp

Pro

Arg

Phe 135

Gin.

Asp

Ser

Ser Ser 14 δ

tys

Alá

Pro

Pro 145

Pro

Ser

tea

Pro

Ser 158

Pro

Ser

Arg tea

Pro 155

Gly Pro

Ser

Asp

Thr ISO

Pro

He

tea

Pro

Gin 155

Ά 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI.:

KOS S ZA: 165 a.te.ino s av

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÓ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁIT PÜS: peptid

A 13. AZONOSÍTŐSZÁMÖ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

heh 1

Gin

heh

Phse

Gin 5

Gly

tea

£<&ú

tea 18

tea

Ser

Méh IS

Gly

Thr

Trp

Alá 50

Ser

tys

Gla

Pro

tea. 25

Arg

Pro

Arg

Cys

Arg 30

Pro

He

Asn

Alá

Thr 35

tea

Alá

Val

Gla

tys 40

Gla

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

He

Thr

Val

Asn 58

Thr

lle

Cys

Alá 55

Gly Tyr

Cys

Pro

Thr 50

Met

Thr

Arg

Val

tea SS

Gin

Gly

Val

tea

Pro 70

Ara

tea.

Pro

Gin

Vei 75

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg 88

Asp

Val

Arg

Phe

Gla 85

Ser

He

Arg

tea

Pro 53

Gly

Cys

Pro

Arg Gly SS*

Val

Asn

Pro

Val

Val 103

Ser

Tyr

Alá

Val

Alá 185

tea

Ser

Cys

Gla

cy® 110

Alá

tea

Cys

&rg

Arg 115

Ser

Thr

Cy®

Cys 120

Thr

Val

Arg

Gly

tea 125

Gly

Pro

Ser

Tyr

Cys 130

Ser

Phe

Gly

Gla

Phe 135

Gin

Asa

Ser

Ser 140

Ser

tv®

Alá

Pro

Pro 145

Pro

Ser

tea

Pro

Ser 150

Pro

Ser

Arg

tea

Pro 155

Gly

Pro

Ser

Asp

ISO

?ro He tea Pro Gin 3.6 5

A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HŐSS ZA: 116 aminos a v

TÍPUSA: asiíxiosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: 1ineáris

MOLEKULÁTíFOS; pép t1d

A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Mát 1

Asp

Tyr

Arg 5

Lys

Tyr

Alá

AX$

lle 10

The

Leu

val

Thr

Leu IS

Ser

Val

Phe

Leu

His 20

Val

Leu

His

Ser

Alá. *3 c

Pro

Asp

Val

Gin

Asp 30

Ser

Pro

Slu

Cys

Thr 35

Leu

Gin

GIu

Asa

Pro 40

Phe

Ser

Gin

Pro 45

Gly

Alá

Pro

Ile

Leu 50

Sin

Cya

Mer

Sly

Cys 55

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá SQ

Tyr

Pro

Thr

Pro

Leu SS

Arg

Ser

Lys

Thr 70

Mefc

Leu

Val

Gin

Cys 75

Asn

Val

Thr

Ser

GIu 80

Ser

Thr

Cys

Val 85

Alá

Lys

Ser

Tyr

Asn 50

Arg

Val

Thr

Val

Mefc SS

Gly

Sly

Phe

Lys

Val 100

Glu

Asn

Sís

Thr

&3L& xos

Cys

Kis

Cys

Ser

Thr 110

cys

Tyr

Tyr Kis Lys Sár 115

A 15. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 165 aminosav ammosav

HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineári s MOLEKULATÍPUS: peptid

- ,1,<2 Α 15. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Két 1

Gin

Met

Phe

Gin S

Gly

len

Lee

Len

Len IS

Len

Ser

Met 15

Gly

Thr

Trp

Alá 20

Ser

Lys

Gin

Pro

Len 35

Arg

Pro

Arg

Cys

Arg 30

Pro

He

Asn

Alá

Tár 35

Len

Alá

Val

Gin

Lys 40

Gin

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

He

Thr

Val

Asn SS

Thr

X Xí5

Cys

Alá SS

Gly Cys

Cys

Pro

Thr SÖ

Mer

Thr

Arg

Val

Len SS

Gin

Gly

Val.

Leu

Pro 70

Alá

Lee

Pro

Gin

Val 75

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg 00

Asp

Val

Ar«

Phe

Gin SS

Ser

He

Arg

Len

Pro 50

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly SS

Val

Asn

Pro

Val

Val 10Ö

Ser

Tyr

Alá

Val

Alá 105

Len

Ser

Cys

Gin

Cys 110

Alá

Lan

Cys

Arg

Arg 115

Ser

Thr

Cys

Cys ISO

Gly

Pro

Lys

Aan 115

Mis

Pro

Len

Thr

Cys 130

Asp

Pro

Arg

Phe 135

Gin

Asp

Ser

Ser 140

Ser

Lys

Alá

Pro

Pro 145

Pro

Ser

Len

Pro

Ser 150

Pro

Ser

Arg

Len

Pro 155

Gly

Pro

Ser

Asp

Thr ISO

Pro

11 e

Len

Pro

Gin

155

Α 1δ. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 116 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKOLATÍPÚS: pepiid

16.	AZONOSÍTÓ	SZÁMÚ SZÉK	VENCXÁ	LEÍRÁSA:
Mer 1	Asp Tyr Tyr	Arg Lys Tyr 5	Alá Alá	He Phe len Val Thr Len Ser lö xs
Val	Phe Len Mis 20	Val Len Hís	Ser Alá 25	Pro Asp Val Gin Asp Alá Pro 30
Gin	Cys Thr Len 35	Gin Gin Asn	Pro Phe 90	Phe Ser Gin Pro Gly Alá Pro 45
He	Len Gin Cys 50	Mer Gly Cvs 55	Cys Phe	Ser Arg Alá Tvr Pro Thr Pro Sö
Len 65	Arg Ser Lys	Lys Thr Mer 70	Len Val	Gin Lys Asn Val Thr Ser Gin 75 SÖ

* « idd

Ser

Thr

Cys

Val SS

Alá

Lys

Ser Tyr Asn se

Val

Thr

Vei

Pfer SS

<2Xy

Ply

Phe

Lys

Val 100

Gitt

Asn

His

Thr Alá Cys 105

Tys

Ser

TKr 110

Cys

Tyr

Kis

Lys 115

Ser

A 17. AZONOSíTŐSZÁMÚ· SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HŐS S Z A: 129 ami no s a v

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 17. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys

TAr

Leu

Gin S

Phe

Píie Lee

Phe 10

Lee

lett

W

Lys

Alá IS

He

Cys

Áss

Ser 20

Cys

Gitt

Thr Asn 25

He

Thr

He

Alá

Val 30

Gin

Lys

Gitt

Gly

Cys 35

Gly

Phe

Cys

He

Thr 40

He

Asa

Thr

Trp 45

Cys

Alá

Gly

Cys

Cys SO

Tyr

Thr

Arg Asp

Lett 55

Val

Tyr

Lys Asp

Pro SQ

Alá

Arg

Pro

Lys

He SS

Gin

Lys

Thr

Cys

Thr 70

Phe

Lys

Gitt

Leu

Val 75

Tyr

Gitt

Thr

Val

Arg 80

Val

Pro

Gly

Cys

Alá 85

Sás

His

Alá

Asp

Ser 80

Lett

Tyr

Thr

Tyr

Pro 85

Val

Alá

Thr

Gin

Cys 100

Sis

Cys

Gly

Lys

Cys 105

Asp

Ser

Asp

Ser

Thr 210

Asp

Cys

Thr

Val

Arg 115

Giy

neu.

Sly

Pro

Ser 120

Tyr

Cys

Ser

The

Gly 125

Gitt

Sfet

Lys

18. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HŐSS ZA: 116 ami no s av

T1 FOSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 18. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

heh X

Asp

Tyr

Arg 5

Lys

Tyr

Alá

Xle 10

The

Leu

Val

Thr

Leu 15

Ser

Val

Phe

Leu

sás 20

Val

Leu

Hls

Ser

Alá 25

Pro

Asp

Val

Cys

Aso 30*

cys

Pro

Gin

Cys

Thr 35

Leu

Gin

Asn

Pro 48

Phe

Ser

Gin

Pro 45

Gly

Alá.

Pro

Xle

Len 50

Gin

Cys

heh

Gly

Cys 55

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá 60

Tyr

Pro

Thr

Pro

Len 65

Arg

Ser

Lys

Thr 70

Mefc

Len

Val

Gin

Lys 75

Asn

Val

Thr

Ser

Glu 80

Ser

Thr

Cys

Val 85

Alá

Lys

Ser

Tyr

Áss SS

Arg

Val

Thr

Val

Méh 55

Gly

Phe

Lys

Val xos

Gin

Asn

Sxs

Thr

Alá 105

Cys

His

Cys

Ser

Thr 110

Cys

Tyr

Tyr His Lys Ser 13.5

A 19. AZONOSí TÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 165 aminosav

IíPüS A: ami no s av

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A IS

. AZONOSÍTÓSZÁMÚ

SZEKVENCIA

LE

ÍRÁSA:

Méh 1

Gin Méh The

Gin 5

Gly

Leu

Leu 18

Len.

Len

Ser

Méh 15

Gly

Thr Trp Alá 20

Ser

Lys

Gin

Pro

Leu 25

Arg

Pro

Cys

Arg 38

Pro

Xle

Áss

Alá Thr Leu 35

Alá

Val

Gin

Lys 40

Gin

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

Xle

Thr

Val

Asn Thr Thr 50

Xle

Cys

Alá 5S·

Gly

Tyr

cys

Pro

Thr 60

Mefc

Thr

Arg

Val

Leu SS

Gin Gly Val

Leu

Pro 70

Leu

Pro

Gin

Val 75

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg 80

- 166 --

Asp

Val Arg

Phe

Gin SS

Ser

Xle

Arg

Len

Pro 30

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 35

Val

Asn

Pro Val

Vei 100

Ser

Tyr

Ala

val

Ala 105

Len

Ser

Cys

Gin

Cys llö

Ala

lan

Cys

Arg Arg 1X5

Ser

Thr

Asp

Cys 120

Gly

Pro

Lys

Asp 12S

His

Pro

Len

Thr

Cys Asp 130

Asp

Pro

Arg

Phe 13 5

Gin

Asp

Ser

Ser 140

Ser

Lys

Ala

Pro

Pro 145

Pro Ser

Lsu

Pro

Ser 150

Pro

Ser

Arg

Len

Pro IS 5

Gly

Pro

Ser

Asp

Thr 150

Pro Xle Len Pro Gin 1€5

A 20. AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 129 aminosav

TÍPUSA; axaínosav

HÁNY SZÁLÚM egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTÍPJS: pepiid	LE í KÁSA:
A 20.	AZONOS 1TÓSZÁMÚ SZEKVENCIA
Mefc 1	Lys Thr Len Gin Phe Phe Phe Lea S	Phe Len Len Trp Lys Ala Xle 10 15
Cys	Cys Asn Cys Cys Gin Len Thr Asn 20 25	Xle Thr Xle Ala Val Gin Lys 30
Gin	Gly Cys Gly Phe Cys Xle Thr Xle 35 40	Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 45
Tyr	Cys Tyr Thr Arg Asp len Val Tyr 58 55	Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 50
Xle SS	Gin Lys Thr Cys Thr Phe Lys Gin 70	Len Val Tyr Gin Thr Vei Arg ?5 88
Vei	Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp SS	Ser Len Tyr Thr Tyr Pro Val 30 SS
Al e	Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys 2 188 XöS	Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 1X0
Thr	Val Arg Gly Len Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Gin Mer Lys 115 120 125

Glu **

A 21, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI ;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZÁ: 141 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULÁTÍPUS: pepiid

A 21- AZONOSíTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Méh 1

Glu

Met

Leu

Sin S

Gly

Leu

Leu 10

Len

Leu

Ser

Mefc 15

Gly

Aia

Trp

Alá 20

Ser

Arg

Glu

Pro

Leu 25

Arg

Pro

Trp

Cys

Kis 30

Pro

He

Asn

Alá

He 35

Leu

Alá

Val

Glu

Lys 40

Glu

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

He

Thr

Val

Asn 50

Thr

Jle

Cys

Alá SS

Gly

Cys

Pro

Thr 60

heh

Met

Arg

Val

Len SS

Gl»

Alá

Val

Leu

Pro 70

Pro

Leu

Pro

Gin

Val 75

Val

Cys

Thr

Tyr

Arg 80

Asp

Val

Arg

The

Glu SS

Ser

Ile

Arg

Leu

Pro 80

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 55

Val

Asp

Pro

Val

Val 100

Ser

Phe

Pro

Val

Alá 105

Leu

Ser

Cys

Arg

Cys 110

Gly

Pr©

Cys

Arg·

Arg 125

Ser

Thr

Ser

Asp

Cys 120

€»Xy GXy

Pro

Lys

Asp 125

Kis

Pro

Leu

Thr

Cys 130

Asp

Hls

Pro

Glu

Leu 135

Ser

GXy Leu

Leu

The 240

Leu

A 22- AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 141 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: agy

TOPOLÓGIÁJA: 1ineáris

MOLEKULÁTÍPUS- pepiid

- lg? A 22. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Glu

Met

Leu

Gin

©ly

Len

Leu

1

S

20

Gly

AXs.

Trp

Alá

Ser

Arg

Glu

Pro

Len

Arg

Pro

Cys

20

25

Asn

Alá

lle

Leu

Alá

Val

Glu

Lys

Gin

Gly

Cys

Pro

Val

35

4Ö

45

Ser	Met 25	Gly
His	Pro	lle
30
Cys	lle	Thr

Val

Asn 50

Thr

He

Cys

Alá 55

Gly

Tyr

Cys

Pro

Thr SQ

Met

Arg

VaJ

Leu 65

Gin

Alá

Val

Leu

Pro 70

Pro

Leu

Pro

Glu

val 75

Val

Cys

Thr

Tyr

Arg SO

Asp

Val

Arg

Phe

Glu 85

Ser

He

Arg

Leu

Pro SS

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 95

Val

Asp

Pro

Val

Val 100

Ser

Phe

Pro

Val

Alá 105

Leu

Ser

Cys

Arg

Cys 120

Gly

Pro

Cys

Arg

Arg 115

Ser

Thr

Ser

Asp

Cys 120

Gly Glv

Pro

Lys

Asp 125

Kis

Leu

Thr

Cys 130

Asn

Kis

Pro

Gin

Leu 13 5

Ser

Gly

Leu

Phe 240

Leu

A 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 132 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTíHÚS: peptid

A 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA XEÍRÁSA:

Met 2

Thr

Alá

Leu

Phe 5

Leu

Met

Ser

Met

Leu Phe 10

Gly

Leu

Alá

Cys 15

Gly

Gxxi

Alá

Mer

Ser 20

Phe

Cys

lle

Pro

Thr 25

Glu Tyr

Met

Thr

Kis 30

21 e

Glu

Arg

Glu 3:5

Cys

Alá

Tyr

Cys

Len 40

Thr

lle Asn

Thr

Tar 45

lle

Cys

AXa

Gly

Cys 50

Cys

Met

Thr

Arg Asp SS

lle

Asn

Gly Lys

Leu 60

Phe

Leu

Pro

Lys

Tyr 65

Alá

Leu

Ser

Gin

Asp 70

Val

Cys

Thr

Tyr Arg 75

Asp

Phe

lle

Tyr

Arg 8 0

Thr

Val

Glu

1 le

Pro 85

Gin

Cys

Pro

Leu

Kis Val 90

Alá

Pro

Tyr

Phe 55

Ser

Tyr

Pro

Val

Alá 100

Len

Ser

Cys

Lys

Cys 20 5

Gly Lys

Cys

Asn

Thr 120

Asp

Tyr

Ser

Asp

Cys 215

lle

Kis

Glu

Alá

a le 120

Lys

Thr Asn

Tyr

Cys 125

Thr

Lys

Pro

Gin Lys Ser Tyr 130 ν' Á”-\ tt

- 3,6 8 »» *« * »

A 24. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 132 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁTí PUS: pepi id

A 24- AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSAí

Méh 1

Xhr

Ala

Len

Phe 5

Len

Méh

Ser

Méh Len Phe 10

Gly

Len

Ala

cys 25

Gly

Gin

Ala

Méh

Ser 2G

Cys

Xle

Prn

Thr Gin Xyr 25

Méh

Thr

His 30

Xle

Gin

Arg

Gin 35

Cys

Ala

Xyr

Cys

Len 40

Xhr He Asn

Thr

Thr 45

Xle

Cys

Ala

Gly

Tyr 50

Cys

Mefc

Thr

Arg

Asp 55

He

Asn Gly Lys

Len 50

Phe

Len

Pro

Lys

Tyr 55

Ala

Leu

Ser

Gin

Asp 70

Val

Cys

Xhr Xyr Arg 75

Asp

Phe

He

Xyr

Arg S8~

Chr

Val

Glu

He

Pm SS

Glsx

Cys

Pro

Len His Val 50

Ala

Pro

Xyr

Phe SS

Ser

Pm

Val

Ala 100

Len

Ser

Cys

Lys

Cys Gly Lys 105

Cys

Asn

Xhr XX ö

Asp

Xyr

Ser

Asp

Cys 1.15

Xle

Prs

Gin

Ala

He 12 8

Lys Thr Asn

Tyr

Cys 22 5

Xhr

nys

Pm

Gin Lys Ser Tyr 130

A 25. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HŐSS Z A: 145 araino sav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

Α

AZONOS ÍTÓS ZÁMÖ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

φ *# ί* φ « ·Φ·5

Μ* Λ * ♦ ·*·».♦ * 9 * Λ Φ

Ser 2

Lys

Glu

Pro

Leu 5

Arg

Pro

Arg

Cys

Arg 20

Pro

lle

Asn Alá

Thr. 25

Leu

Alá

Val

Glu

Lys 20

Glu

Gly Cys

Pro

Val 25

Cys

21a

Thr

Val

Asn 30

Thr

lle

Cys

Alá 35

Gly

Tyr

Cys

Pro

Thr 40

hét

Thr

Arg

Val

Leu 45

Gin

Gly

Val

Leu

Pro 50

Alá

Leu

Pro

Glu

Val 55

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg S8

Asp

Val

Arg

Phe

Glu SS

Ser

22«

Arg

Leu

Pro 70

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 25

Val

Asu

Pro

Val

Val 80

Ser

Tyr

Alá

Val

Alá SS

Leu

Ser

Cys

Glu

Cys 30

Alá

Leu

Cys

Arg

Arg 35

Ser

Thr

Asp

Cys 250

Gly

Pro

Lys

Asp 205

Has

Pro

Leu

Thr

Cys 220

Asp

Pro

Arg

Phe 225

Glu

Asp

Ser

Ser 220

Ser

Lys

Alá

Pro

Pro 225

Pro

Ser

Leu

Pro

Ser 230

Pro

Ser

Arg

Leu

Pro 235

Gly

Pro

Ser

Asp

Thr 240

Pro

lle

Leu

Pro

Gin

245

A 26, AZ ONOS Í TÓS ZÁMÖ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 121 aminosav

TÍPUSA; aioínosav

HÁNY SZÁLÚ: egy •TOPOLÓGIÁJA; .lineáris

MOLEKULATÍPUS; peptid

A 25, AZONOSÍTÓSZÁMÖ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Ser •4 Jk

Arg

Glu

Pro

Leu 5

Arg

Pro

Trp

cys

Pia 20

Pro

21a

Alá

lle 25

Leu

Alá

Val

Glu

Lys 20

Glu

Gly

Cys

Pro

Val 25

Cys

lle

Thr

VslX

Asn 30

Thr

lle

Cys

Alá 33

Gly Tyr

Cys

Pro

Thr 40

hét

Mer

Arg

Val

4$

Gin

Alá

Val

Leu

Pro 50

Pro

Leu

Pro

Gin

val 55

Val

Cys

Thr

Tyr

Arg SO

Asp

Val

Arg

Phe

Glu SS

Per

21a

Arg

Len

Pro 70

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 75

Val

Asp

Pro

Val

Val 80

Ser

Phe

Pro

Val

Alá 85

Leu

Ser

Cys

Arg

cys 50

Gly

Pro

Cys

Arg

Arg ss

Ser

Thr

Ser

Asp

Cys 200

Gly

Pro

Lys

Asp 205

Sás

Pro

Leu

Thr

Cys 220

Asp

Has

Pro

Glu

Leu 223

Ser

Gly

Leu

Lau

Phe 220

Leu

»-*·

Α 27, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 111 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 27

L AZONOSÍTÓSZÁMÚ

SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asn 1

Ser

Cys

slu

Leu S

Thr

Asn

He.

Thr

He 10

Alá

V&.S.

Glu

Lys

Glu 15

Gly

cys

Gly

Phe

Cys 20

Ile

Thr

He

Asn

Thr 25

Thr

Trp

Cys

Alá

Giy 30

Tyr

Cys

Tyr

Thr

Arg 35~

Asp

Leu

Vei

Tyr

Lys 40

Asp

Pro

Alá

Arg

Pro 45

Lys

He

Gin

Lys

Thr 50

Cys

Thr

Phe

Lys

Glu 55

Leu

Val

Tyr

Glu

Thr SO

Val

Arg

Val

Pro

Gly SS

Cys

Alá

Kis

Alá 78

Asp

Ser

Leu

Tyr

Thr 75

Tyr

Pro

vei

Alá

Thr SO

Gin Cys Kis Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 80 SS

Arg Gly Len Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly GIu Met Lys Glu 100 105 , 11S

A 28, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 112 aadnosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

28

. azonosít:

5SZÁ

iMÖ

SZSI

IVEK

IC IÁ.

LEÍRÁSA:

Phe 1

Cys

11 e Pro

Thr 5

Glu

Tyr

Heh

Thr

Kis He lö

Glu

Arg

Glu 15

Cys

Ale

Tyr

Cys Len •y {Λ X·

Thr

He

Asn

Thr

Thr 25

He Cys

Alá

Gly

Tyr IC-

Cys

Siet

Thr

Arg

Asp He 35*

Asn

c-iy

Lys

Leu 40

Phe

Len Pro

Lys

Tyr 45

AI a

Leu

Ser

Gin

Asp 50

Val Cys

Thr

Tyr

Arg 55'

Asp

Phe

He Tyr

Arg SO

Thr

Val

Glu

He

Pro

Gin

Cys

Pro

Len

Kis

Val

Alá

Pro

Tyr

Phe

Ser

Tyr

Pro

Val

Alá

55

70

75

80

Len

Ser

Cys

Lys

Cys

Gly

Lys

Cys

Asn

Thr

Asp

Tyr

Ser

Asp

Cys

Xle

SS

95

Kis

Gin

Alá

He

Lys

Thr

Asn

Tyr

Cys

Thr

Lys

Pro

Gin

Lys

Ser

Tyr

ISO

105

118

A 29. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 92 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTíPUS: pépt id

A 29. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá 1

Pro

Asp

Val

Gin S

Asp

Cys

Pro

Gin

Cys 10

Thr

Len

Gin Gin

Asn 15

Pro

Phe

Ser

Cin 30

Pro

Gly

Alá

Pro

He 25

Len

Gin

Cys

Net Gly 30

Cys

Phe

Ser

Arg 35

Alá

Tvr

Pro

Thr

Pro 90

Len

Arg

Ser

Lys

Lys Thr 45

Méh

Len

Val

Cin 50

Lys

Asn

Vei

Thr

Ser 55

Gin

Ser

Thr

Cys

Cys Sö

Var Alá

Lys

Ser

Tyr 85

Asn

Ars

Val

Thr

Val 70

Méh

Gly Gly

Phe

Lys 75

vei

Gin Asn

Kis

Thr 80

Alá

Cys

Kis

Cys

Ser

Thr Cys

Tyr

Tyr Kis

Lys Ser

90 a só. azonosítószámú szekvencia adatai: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: SS aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: 1ineár i s

MOLEKULÁT!PUS: pepiid

- 1 ~	* * ) φ 4 « 4 .· »	»«, ► « » >	y * φ
«ís' Y íL

30, AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Méh Gin Gly Cys Pro 1 5 XO	Glu Cys	Lys 15	Leu
Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Alá Pro 20 25	He Tyr 30	Gin	Cys
Mefc Gly Cys Cys Phe Ser Arg Alá Tyr Pro Thr Pro 35 40	Alá Arg 45	Ser	Lys
Lys Thr Méh Leu Val Pro Lys Asn He Thr Ser Glu 50 55 60	Alá Thr	Cys	Cys
Val Alá Lys Alá Phe Thr Lys Alá Thr Val Mefc Gly SS 70	Asn Val	Arg	Val SO
Glu Asn Kis Thr Glu Cys Kis Cys Ser Thr Cys Tyr 85 30	Tyr Kis	Lys SS	Ser

a 31. azonosítószámú szekvencia adatai ; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 anínosav

TÍPUSA; asinosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPöLŐGIÁJA: 1in eáris

MOLEKÜIATÍPUS: peptid

A 31	. AZONOSÍTÓSZÁMÚ	SZEKVENCIA	LEÍRÁSA;
Phe 1	Pro Asp Gly Glu Phe 5	Thr Mer Gin	Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu 3.0 15
Lys	Glu Asn Lys Tyr Phe 20	Ser Lys Leu 25	Gly Alá Pro He Tyr Gin Cys 30
Méh	Gly Cys Cvs Phe Ser 35	Arg Alá Tyr 40	Pro Thr Pro Alá Arg Ser Lys 45
Lys	Thr Mefc Leu Val Pro 50	Lvs Asn He 55	Thr Ser Glu Alá Thr Cys Cys 50
Val SS	Alá Lys Alá Phe Thr 70	Lys Alá Thr	Val Mefc Gly Asn Alá Arg Val 75 ~ 80
Glu	Asn Kis Thr Glu Cys 85	Sás Cys Ser	Thr Cys Tyr Tyr Kis Lys Ser 50 ss

··· 1/3 *·* « > _% χ*· 4W.

·> * r *

A

A 32. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: SS aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTí PUS; pept id

32.	AZONOSÍTŐSZÁ	ZÚ SZEKVENCIA	LEÍRÁSA:
Phe 1	Pro Asp Gly Gin 5	Phe Thr Mer. Gin	Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu 10 _ 15
Lys	Gin Asn Lys Tyr 20	Phe Ser Lys Pro 25	Asp Alá Pro Xle Tyr Gin Cys 30
Mefc	Gly Cys Cys Phe 35	Ser Arg Alá Tyr 40	Pro Thr Pro Alá Ara Ser Lys 45
Lys	Thr Méh Leu Vei 50	Pro Lys Asn Xle SS	Thr Ser Gin Alá Thr Cys Cys 60
Val 65	Alá Lys Alá Phe	Thr Lys Alá Thr 20	Val hét Gly Asn Val Arg Val 75 80
Gin	Asn Kis Thr Gin 85	Cys Kis Cys Ser	Thr Cys Tyr Tyr Kis Lys Ser 50 35

A 33. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA. JELLEMZŐI:

HOSSZA: 96 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTtPÜS: peptid

A 33, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe 1

Pro

Asp

Gly

Gin 5

Phe

Thr

Gin

Asp 10

Cys

Pro

Gin

Cys

Lys 1.5

Len

Arg

Gin

Asn

Lys 20

Tyr

Phe

Lys

Len 25

Gly

Val

Pro

Xle

Tyr 30

Gin

Cys

Lys

Gly

Cys 35

Cys

Phe

Ser

Arg

Ara 48

Tyr

Pro

Thr

Pro

Alá 45

Arg

Ser

Arg

Lys

Thr 50

Met.

Len

Val

Pro

Lys 55

Asn

Xle

Thr

Ser

Glu 60

Ser

Thr

Cys

Val 65

Lys

Alá

Phe

Xle 70

Arg

Val

Thr

Val

hét 75

Gly

Asn

Xle

Lys

Leu 80

Gin

Asn

Kis

Thr

Gin 85

Cys

Tyx

Cys

Ser

Thr SS

VjT S

Tyr

Kis

Lys 85

Xle

Μ ♦♦

A 34. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 96 aiainosav

TÍPUSA: astínosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 34. AZONOS!TŐSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Leu 2.

Pro Asp

Gly

Asp 5

Leu

lle

Gin Gly Cys 10

Pro

Gitt

Cys

Lys xs

Lee

Lys

Glu Asn

Lys 20

Tyr

Phe

Ser

Lys

Leu Gly Alá 25

Pro

lle

Tyr 30

Gin

Cys

Kát

Gly Cys 35

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá 40

Tyr Pro Tor

Pro

Alá 45

Arg

Ser

Lys

Thr Mac 50

Leu

Val

Pro

Lys 55

Asn.

lle Thr Ser

Gitt 60

Alá

Thr

Cys

Val 65

Alá Lys

Ser

Ffee

Tfer 70

Lys

Alá

Tfer Val Mer 75

Gly

Asu

Alá

Arg

Val 80

Glu

Asu Kis

Tfer

Lys 85

Cys

Kis

Cys

Ser Thr Cys 88

Tyr

His

Lys 85

Ser

A 35. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 96 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 3.5. AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Le® Pro Asp Gly Asp Fha lle He Gin Gly Cys Pro Sitt Cys Lys Leu

Lys Gl® Asn Lys Tyr Fhe Ser Lys Leu Gly Alá Pro lle Tyr Gin Cys 20 2S

- US -

* K X ♦ 0 * *

0 > K 0 A 0 0 '

Méh

Gly

Cys 35

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá Tyr 40

Pro

Thr

Pro

Alá 45

X * 0· * * Arg Ser

tys

Thr 50

Mefc

tea

Val

Pro

tys 55

Asn lle

Thr

Ser

Gla 50

Alá

ThrCys

Cy®

Val SS

Alá

ty®

Alá

Phe

Thr 70

tys

Alá Thr

Val

Méh 75

Gly

Asn

Alá Arg

Val 80

Gla

Asn

Hl®

Thr

Gla 85

Cys

Hls

Cy® Ser

Thr 90

Cys

Tyr

Hls tys SS

Ser

A 36. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 96 aminosav

TÍPUSA: arsinosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS; peptid

A 36. AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe 1

Pro

Asp

Gly

Gla 5

Phe

Alá

Mer

Gin

Gly Cys 10

Pro

Ölj

cys

tys 1:5

tea

tys

Gla

Asn

tys 20

Tyr

Phe

Ser

tys

tea. 25

Gly

Alá

Pro

lle

Tyr 30

Gin

Cys

Méh

Gly

Cys 35

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá 40

Tyr

Pro

Thr

Pro

Alá 45

Arg

Ser

tys

Ly®

Thr 50

Méh

tea

Val

Pro

Ly® 55

Asn

Xle

Thr

Ser

Gla 50

Alá

Gly

Cys

Val SS

Alá

tys

Alá

Phe

Thr 70

tys

Alá

Thr

Val

heh 75

Gly

Asn

AXh

tys

Val so

Gla

Asn

Hls

Thr

Gla 85

Cvs

Hls

Cys

Ser

Thr 30

Cys

Tyr

His

tys 35

Ser

A 37. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 96 aminosav

TÍPUSA; aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTí PUS; peptid

A 37, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe 1

Pro

Asp

Gly

Gle 5

Phe

Len

Hét

Gin

Gly 20

Cys

Pro

Gin

Cys

Lys 15

Len

Lys

&1λ&

Asn

Arg 20

Phe

Ser

Lys

Pro 25

Gly Ala

Pro

Xle

Tyr 38

Gin

Cys

Thr

Gly

Cys 35

Cys

Phe

Ser

Arg

Ala 40

Tyr

Pro

Thr

Pro

Mefc 45

Arg

Ser

Lys

Thr 50

Mefc

Len

Val

Pro

Lys 55

Asn

Xle

Thr

Ser

Gin 50

Ala

Thr

Cys

Vei SS

Alá

Lys

Ala

Phe

Thr 70

Lys

Xle

Thr

Lee

Lys 75

Asp

Asn

vei

Arg

Xle 80

Gin

Asn

His

Thr

Gle. 85

Cys

His

Cys

Ser

Thr 30

Cys

Tyr

His

Tyr 85

Ser

A 38. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 95 sisinos&v

TÍPUSA: aaúhossv

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineár is

MOLEKULÁT í PUS: pepiid

A 38. AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Tyr Pro Arg Asn Asp Heh Asn Asn Phe Gly Cys Cin Gin Cys Lys Lan

X

5

28

25

Lys

Gin

Asn

Asn 20

Xle

Phe

Ser

Lys

Pro 25

Gly

Ala

Pro

Val

Tyr 30

Sin

Cys

Mefc

Gly

Cys 35

Cys

Phe

Ser

Arg

Ala 40

Tyr

Pro

Thr

Pro

Len 45

Arg

Ser

Lys

Thr 50

Heh

Len

Val

Pro

Lys 55

Asn

Xle

Thr

Ser

Gíu £0

Ala

Thr

Cys

Val 55

Ala

Lys

Gin

val

Lys 70

Lys

Xle

Len

Val

Asn 75

Asp

Val

Lys

Len

Val 50

Asn

His

Thr

Asp

Cys 85

His

Cys

Ser

Thr

Cys 30

Tyr

His

Lys

Ser 35

A 39, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 95 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!PUS; pepiid

A 39. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Tyr 1

Rr©

Arg

Asn

Tyr s

Méh

Asn

Phe

Gly IQ

Cys

Glu

Cys

Thr 15

Len

Lys

Glu

Asn

Asn 20

Ile

Phe

Ser

Lys

Rr© 25

siy

Alá

Rr©

Val

Tyr 30

Gin

Cys

Méh

Oly

Cys 35

Cys

Rhe

Ser

Arg

Alá 40

Tyr

Rr©

Thr

Rr©

Leu 45

Arg

Ser

Lys

Thr 50

Méh

Len

Val

Rr©

Lys 55

Asn

Xle

Thr

Ser

Gin 60

Alá

Thr

Cys

Val 65

Alá

Lys

Glu

Rhe

Lys 70

Gl©

Val

Len

Val

Asn 75

Asp

Xle

Lys

Len

Val 00

Asn

His

Thr

Asn

Cys S5

Hís

Cys

Ser

Thr

Cys 50

Tyr

Kis

Lys

Ser 55

A 40- AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 93 aminosav

TÍPUSA; aminosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA; 1ineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

A 40- AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Tyr

Rr©

As©

Asn

Glu

Méh

Als

Arg

Gly

Glv

Cys

ASR

Glu

Cys

Arg

Leu

1

5

10

15

Gin

Glu

Asn

Lys

Ile

Rhe

Ser

Lys

Pro

Ser

Rr©

He

Rhe

GI©

Cys

20

25

30

Val

Gly

Cys

Rhe

Ser

Arg

Alá

Tyr

Rr©

Thr

Rr©

Leu

Arg

Ser

Lys

35

40

45

X..-7 C

Lys	Thr	Neh	Lea	Val	Pro	Lys
	SÖ					SS
Val		Arg	Gitt	Val	Thr	Arg
SS					70
Thr	Asp	Cys	Oly	Cys	Ser	Thr

Asa	He	Thr	Ser
Len.	Asp	AStt	bfeh 75
Cys	Tyr	Tyr 50	His

Gitt	Alá	Thr	Cys	Cys
80
Lys	Leu	Gitt	Asv	Ris
				80
Lys	Éhe

A 41. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 93 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 41. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Tyr 1

Pro

Asn &e

Gin 5

He

Ser Arg

Gly Gly lö

Cys

Asp

Gitt

Cys

Arg 25

Lett

Lys

Asp

Astt Lys 20

The

Ser Lys

Pro 25

Ser

Alá

Pro

He

Fhe 30

Gitt

Cys

Val

Slv

Cys Cys 35

Phe

Ser

Arg Alá 40

Tyr

Pro

Thr

Pro

Lett 45

Arg

Ser

Lys

Thr SO

Mer Lee

Val

Pre

Lys Asp SS

He

Thr

Ser

Gitt SO

Alá

Thr

Cys

Val SS

Alá

Arg Gitt

Val

Thr 70

Lys Les

Asp

Asn

btet 7S

Lys

Lett

Gin

Asn

Sás SO

Thr

Asp

Cys Kis

Cys SS

Ser

Thr Cys

Tyr

Tyr SO

Kis

Lys

Ser

A 42. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA .ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 95 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTí PUS: pepi i á ♦ ♦»· *»· » ·4> * »

- l/Ó -

A 42

. A

ZONÍ

3SÍ4

’ÓSZ

ÁMÚ

SZEKV.E

NCIA LE

;íhá

SA:

Tyr

Glu

Asn

Ser

Asp

Met

Thr

Asn

Val

Gly

Cys

Glu

Cys

Lys

Leu

1

5

18

25

Lys

Glu

ASÖ

Lys

VssX

Phe

Ser

As®.

Pro

Gly

Alá

Pro

Val

Leu

Gin

Cys

20

25

30

Thr

Gly

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá

Tyr

Pr©

Thr

Pro

Leu

Gin

Ser

Lys

35

48

45

Lys

Alá

Met

Leu

Val

Pro

Lys

Áss

Tle

Thr

Ser

Glu

Alá

Thr

Cys

50

55

50

Vei

Alá

Lys

GlU

Gly

Glu

Arg

Val

Asp

Asu

lle

Lys

Leu

Thr

65

70

75

80

Asn His Thr Glu Cys Trp Cys Asn Thr Cys Tyr Kis Kis Lys Ser 85 96 95

A 43. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 96 aminosav

Tí FOSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁI í FUS: peptid

A 43. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Tyr 1

Pro

Asn

Ser

Asp 5

Lys

Thr

Asn

hét Gly 10

Cys

Glu

Cys

Lys 25

Leu

Lys

Pro

Asu

Thr 20

lle

Phe

Pro

Asn

Pro 25

Gly

Alá

Pro

lle

Met 30

Gin

Cys

Thr

Gly

Cys 35

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá 40

Tyr

Pro

Thr

Pro

Leu 45

Arg

Ser

Lys

Gin

Thr 50

Met

Leu

Val

Pro

Lys 55

Asn

Lle

Thr

Ser

Glu 60

Alá

Thr

Cys

Vei 65

Alá

Lys

Glu

Gly

Glu 70

Arg

Val

Thr

Lys 75

Asp

Gly

Phe

Pro

Vei 80

Thr

Asn

Hxs'

Thr

Glu 85

Cys

Kis

Cys

Ser

Thr SQ

Cys

Tyr

Kis

Lys 95

Ser

A 44, AZONOS ÍTÓSZÁMÖ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZÁ: 14 S aainosav

TÍPUSA: asúnosav

HÁNY SZÁLÓ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PÜS: péptid

A 44, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser 2

Arg

Gly

Pro

Leu 5

Arg

Pro

Leu

Cys

Arg 2Ö~

Pro lle

Asn

Alá

Thr 2.5

Leu

Alá.

Alá

Glu

Lys 20

Glu

Alá

Cys

Pro

lle 25

Cys

lle Thr

Phe

Thr 30

Thr

Ser

lle

Cys

An® 35

Gly

Tyr

Cys

Pro

Ser 40

hefc

Val

Arg Val

hét 45

Pro

'Alá

Al®

Leu

Pro 50

Alá

Lle

Pro

Gin

Pro 55

Vei

Cys

Thr

Tyr Arg 60

Glu

Leu

Arg

Phe

Alá SS

Ser

lle

Arg

Leu

Pro 70

Gly

Cys

Pro

Gly Val 75

Asp

Pro

heh

Val S0

Ser

Phe

Pro

Val

Alá SS

Len

Ser

Cys

Hls

Cys PO

Gly Pro

Cys

Gin

lle 85

Lys

Thr

Asp

Cys 200

Gly

Val

Phe

Arg

Asp 205

Sin

Pro Leu

Alá

Cys 220

Alá

Pro

Gin Alá Ssr Ser ser Ser Lys Asp Pro Pro Ser Gin Pro Leu Thr Ser 225 220 22 S

Thr Ser Thr Pro Thr Pro Gly Alá Ser Arg Arg Ser Ser His Pro Leu 130 235 KO

Pro lle Lys Thr Ser

245

A 45, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 121 asaínosav

T í PUSA: amno s av

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: 1ineáris

MOLEKÜIATÍEUS; peptid ~ irí * ’« b . t

A 45. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Ser 1

Arg

Gly

Pro

Len 5

Arg

Pro

Len

Cys

Arg 18

Pro

Xle

Asn

Ala

Thr 15

Len

Ala

Gin

Asn 20

Gin

Ala

Cys

Pro

Val 25

Cys

Xle

Thr

Phe

Thr 30

Thr

Xle

Cys

Ala 35

Gly

Tyr

Cys

Pro

Ser 40

her

Val

Arg

Val

Len 45

Pro

Ala

Len

Pro 58

Pro

Val

Pro

Gin

Pro 55

Val

Cys

Thr

Tyr

Pis 50

Gin

Len

Kis

Phe

Ala SS

Ser

Xle

Arg

Len

Pro 70

Gly

Cys

Pro

Gly 75

Val

Asp

Pro

Méh

Val SS

Ser

Phe

Pro

Val

Ala SS

2«en

Ser

Cys

Arg

Cys Gly 50

Pro

Cys

Arg

Len 95

Ser

Asn

Ser

Asp

Cys 1QQ

Gly Gly

Pro

Arg

Ala 185

Gin

Ser

Len

Ala

Cys 110

Asp

Arg

Pro

Len

Len 115

Pro

Gly

Len

Phe 120

Len

A 46. AZONOSÍTÖSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

KOS S ZA.: 119 aj&ino sav

TÍPUSA: amnosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 46. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Len Gly Gly

Gly

Arg

Pro

Cys

Arg

Pro

He

Asn

Val

Thr

Val

1

5

10

15

Ala Val Gin

Lys

Asp

Gly

Cys

Pro

Gin

Cys

heh

Ala

Val

Thr

20

25

38

Ala Cys Gly

Gly

Thr

Cys

Arg

Thr

Arg

Gin

Pro

Val

Tyr

Arg

Ser

Pro

35

48

55

Len

Gly 50

Pro

Gin

Ser 55

Cys

Thr

Tyr

Gly 88

Ala

Len

Arg

Tyr

Gin SS

Arg

Trp

Ala

Len

Trn 78

Gly

Cys

Pro

He

Gly 75

Ser

Asp

Pro

Arg

Val 80

Len

Pro

Val

Ala SS

Len

Ser

Cys

Arg

Cys 58

Ala

Arg

Cys

Pro

Mer 95

Ala

Thr

Ser

Asp

Cys 200

Thr-

Val

Gin

Gly

Len 185

GIv

Pro

Ala

Phe

Cys XX8

Gly

Ala

Gly Gly Gin

Pro Gly Gly Phe

115

- l.S'2 A 47. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 121 aminosav

TÍPUSA; aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 47. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser 1

Arg

Gly

Pro

Leu 5

Arg

Pro

Leu.

Cys

Glu 18

Pro

21e

Asn

Alá

Thr 25

Leu

Aia

Glu

Lys 28

Glu

Alá

Cys

Pro

Vei 25

Cys

2 le

Thr

Phe

Thr 38

Thr

Ser

He

Cys

Aia 35

Gly

Tyr

Cys

Pro

Ser 40

Mefc

Lys

Arg

Val

Leu 45

Pro

Val

Xie

Leu

Pro 58

Pro

Mer

Pro

Glu

Arg 55

Vei

Cys

Thr

Tyr

Has 58

Glu

Leu

Arg

Phe

Alá £5

Ser

Val

Arg

He

Pro 70

Gly

Cys

Pro

Giy 75

Val

Asp

Pro

Met

Val 80

Ser

Phe

PX’O

Val

Alá 85

Leu

Ser

Cys

Kis

Cys 58

Gly

Pro

Gys

Arg

Leu 95

Ser

Thr

Asp

Cys 288

Giy

Gly

Pro

Arg

Thr 205

Gin

Pro

Leu

Alá

Cys 220

Asp

Kis

Pro

Les. 3.15

Pro

Asp

Xie

Leu

Phe 220

Leu

A 48, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA; 119 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPQLCCIÁJA; lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

183 * * Κ» ♦ * ♦ » 1 * « X

A 48. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEI

Ser Arg Gly Pro X	Len Arg Pro Len Cys Gin Pro He Asn Alá Thr	Len
5	18	IS
Alá Alá Gin. Lys	Gin	Alá Cys Pro Val Cys He Thr	Phe Thr Thr	Ser
20		25	30
He Cys Alá Gly	Tyr	Cys pro Ser Mefc Lys Arg Val	Len Pro Val	He
33		40	43
Len Pro Pro Mefc	Pro	Gin .Arg Val. Cys Thr Tyr Hís	Gin Len Arg	Phe
50		55 60
Alá Ser Val Arg	Len	Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val	Asp Pro Mefc	Val
65		78 75		80
Ser Phe Pro Val	Alá	Len Ser Cys His Cys Gly Pro	Cys Arg Len	Ser
	85	30	95
Ser Thr Asp Cys	Gly	Pro Gly Arg Thr Gin Pro Len	Alá Cys Asp	Hís
100		105
Pro Pro Len Pro	Asp	He Len

1X5

A 49. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 128 aaínosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: agy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁT! WS; peptid

A 49. AZONOSíTÖSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Pro 1

Gin

Pro

Alá

Arg 5

Gly

Pro Len

Arg

Pro 20

Len

Cys

Arg

Pro

Val 15

Asn

Alá

Thr

Len

Alá 20

Alá

Gin

Asn Gin

Ara 25

Cys

Pro

Val

Cys

He 30

Thr

Phe

Thr

Ser 35

He

Cys

Alá

Gly Tyr 40

Cys

Pro

Ser

Mer

Val 45

Arg

Val

Len

Pro

.Alá 30

Alá

Len

Pro

Val Pro 55

Gin

Pro

Val

Cys 30

Thr

Tyr

Ax

Gin

Len 65

Arg

Phe

Alá

Ser

He 70

Arg Len

Pro

Gly

Cys 75

Pro

Gly

Val

Asp 90

Pro

Gin

Val

Ser

Phe SS

Pro

Val Alá

Len

Ser 90

Cys

Arg

Cys

Gly

Pro 95

Cys

Arg

Len

Ser

Ser 100

Ser

Asp

Cys Gly

Gly 105

Pro

Arg

Alá

Gin

Pro 110

Len

XX &

Cys

Asp

Len 115

Pro

Mis

Len

Pro Gly 120

♦ * »

AZ 50, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI i

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA; 119 atninosav

TÍPUSA; axainosav

HÁNY SZÁLÓ; egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁT! PUS; peptid

AZ 50. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser 1

Leu

Mer

Gin

Pro 5

Cys

Gitt

Pro

He

Asn 20

Gin

Thr

VssX

Ser

Leu 25

Glu

Lys

Gitt

Gly

Cys 20

Pro

Thr

Cys

Leu

Val '25

He

Arg

Alá Pro

He 30

Cys

Ser

Gly

Kis

Cys 35

Val

Thr

Lys

Glu

Pro 40

Val

Phe

Lys

Ser

Pro 45

Phe

Ser

Thr

val

Thr 5Ö

Gin

Kis

Val

Cys

Thr 55

Tyr Arg Asp

Val.

Arg Sö

Tyr

Gitt

Mer

He

Arg SS

Leu

Pro

Asp

Cys

Pro 78

Pro

Trp

Ser

Gin

Pro 75

Sis

Val

Thr

Tyr

Pro 80

Val

Alá

Leu

Ser

Cys 85

Asp

Cys

Ser

Len

Cys 50

Asn

Mai

Asp

Thr

Ser SS

Asp

Cys

Thr

Xle

Glu ISO

Ser

Leu

Gin

Pro

Asp 105

Phe

Cys

He

Thr

Gin 220

Arg

Val

Leu

Thr

Asp

Gly

Asp

Mefc

Trp

115

AZ 51. AZONOS ÍTŐSZÁMÖ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 1X3 aminosav

TÍPUSA; ajoinosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁTíPUS: peptid

- 135 « » >

AZ 51. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly 2	Thr Gl® Cys Arg 5	Tyr Gly Cys	Arg Lett 10	Asu	Asm Hét	Thr	Xle 25	lis
Val	Glu Arg Glu Asp Cys Sís Gly	Ser Xle	Thr	Xle Thr	Thr	Cys	Alá
	20		25			30
Gly	Leu Cys Glu Thr	Thr Asp Leu	Asn Tyr	Glu	Ser Thr	Trp	Leu	Pro
	35	40			45
Arg	Ser Gin Gly Vei	Cys Asn Phe	Lys Glu	Crp	Ser Tyr	Glu	Lys	Val
	58	55			S0
Tyr	Leu Glu Gly Cys	Pro Ser Gly	Val Glu	Pro	Phe Phe	lle	Pro	Val
65		70		75				80
Alá	Lys Ser Cys Asp	Cys Xle Lys	Cys Lys	Thr	Asp Áss	Thr	Asp	Cys
	55		98				35
Asp	Arg 11® Ser Hét	Alá Thr Pro	Ser Cys	Xle	Val Asu	Pro	Leu	Glu
	200		X05			110
Met
AZ	52, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA	ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 119 aminosav
TÍPUSA: amínosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
AZ	52. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA	LEÍRÁSA:
Ser	Leu Mer Glu Pro	Cys Gin. Pro	lle Asa	Gl»	Thr Val	Ser	Leu	Glu
X	5		10				15
Lys	Glu Oly Cys Pro	Thr Cys Leu	Val Xle	Gitt	Thr Pro	Xle	Cys	Ser
	20		25			30
Gly	Kis Cys Val Thr	Lys Glu Pro	Val Phe	Lys	Ser Pro	Phe	Ser	Thr
	35	48			45
VaX	lle Gin Kis Val	Cys Thr Tyr	Arg Asp	Val	Arg Tyr	Gitt	Thr	Xle
	58	55			50
Arg	Leu Pro Asp Cys	Pro Pro Trp	Val Asp	Pro	Kis Val	Thr	Tyr	Pro
65		73		75				80
Val	Alá Leu Ser Cys	Asp Cys Ser	Leu Cys	As»	Hét Asp	Thr	Ser	Asp
	85		58				35
Cys	Thr lle Glu Ser	Leu Gin Pro	Asp Phe	Cys	lle Thr	Glu	Arg	Val
	208		105			110

Le® Thr Asp Gly Asp Mer Trp 2.15 ~ Ι^β * * ♦

AZ 53, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI ;

HOSSZA: 111 ssinossv

TÍPUSA: aminc-sa?

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

AZ 53. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Len 1

Ser

Cys

Gin

Len S

Thr

Asn

Xle

Thr

Xle 18

Ala

Xle

Gin

Lys

Gin 15

Gin

Cys

Arg

Phe

Cys 20

Xle

Ser

Xle

Asn

Thr 25

Thr

Trp

Cys

Ala

Gly 30

Tyr

Cys

Tyr

Thr

Arg 35

Asp

Len

Val

Tyr

Lys 40

Asp

Pro

Ala

Arg

Pro 45

Asn

Xle

Gin.

Lys

Thr 58

Cys

Thr

Phe

Lys

Gln 55

Lee

Vei

Tyr

Gin

Thr 50

Val

Lys

Val

Pro

Gly SS

Cys

Ala

His

Ala 78

Asp

Ser

Len

Tyr

Thr 75

Tyr

Pro

Val

Ala

Thr 80

jfkxss.

Cys

His

Cys

Gly SS

Lys

Cys

Asn

Ser

Asp 98 ’

Ser

Thr

Asp

Cys

Thr 35

VaX

Arg

Gly

Len

Gly 108

Pro

Ser

Tyr

Cys

Ser LOS

Phe

Gly

Asp

Mer

Lys 1X8

Gin

AZ 54. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA .ADATAI: A SZEKVENCIA .JELLEMZŐI;

HŐS SZA; 110 a® inasav

TÍPUSA; aa.inos.av

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: Iincáris

MOLEKULÁT!PUS: pepi i d

AS 54 . AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA

Ser 1

Cys

Gitt

Leu

Thr 5

Asn

Xle

Thr

lle

Thr Vei 10

Gitt

Lys

Gitt

Gitt 15

Cys

Ser

The

Cys

Xle 20

Ser

XXe

Asa

Thr

Thr 25

Trp Cys

Alá

Gly

Tyr 30

Cys

Tyr

Tar

Arg

Asp 35

Leu

Val

Tyr

Lys

Asp 40

Pro

Alá

Arg

Pro

Asa 45

lle

Gin.

Lys

Thr

Cys 50

Thr

The

Lys

Giu

Leu 55

Val

Tyr

Cin

Thr

Val 50

Lys

Val

Pro

Gly

Cys 55

Alá

Kis

Alá

Asp 70

Ser

hau

Tyr

Thr

Tyr 75

Pro

Val

Alá

Thr

Gin 80

Cys

Kis

Cys

Gly

lys SS

Cys

Asp

Ser

Asp

Ser SO

Thr

Asp

Cys

Thr

Val 55

Arg

Gly

Vsa

Gly

Pro löö

Ser

Tyr

Cys

Ser

Phe 165

Ser

Asp

XXe

Gitt

Arg 2.10

AZ 55» AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 110 aminosav

TÍPUSA: amnosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT! FUS: pepiid

AZ SS. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser 4

Cys

Gitt

Lett

Thr 5

ÁSÓ

lle

Thr

lle

Thr .10

Val

Gitt

Lys

Gitt

Gitt 15

Cys

Gly

The

Cys

Tle 20

Ser

Tle

Astt

Thr

Thr 25

Trp

Cys

Alá

Gly

Tyr 30

Cys

Tyr

Thr

Ara

Asp 3S~

Aett

Val

Tyr

Arg

Asp 40

Pro

Alá

Arg

Pro

Ase 4S

Tle

Gin

Lys

Thr

Cys 50

Thr

Khe

Lys

Ί ν»

Lett 55

Val

Tyr

Gitt

Thr

Val 50

Lys

Val

Pro

Gly

Cys 55

Alá

Kis

AJXss.

Asp 70

Ser

Lea

Tyr

Thr

Tyr 75

Pro

Val

Alá

Thr

Gitt 8 0

Cys

Kis

Cys

Ser

85

Cys

Asp

Ser

Asp

Ser 50

Thr

Asp

Cys

Thr

Val 5S

Arg

Gly

lett

Gly

Pro 100

S<S.£

Tyr

Cys

Ser

Phe 105

Arg

Gitt

XXe

Lys

Gitt 110

- iáé φ »♦ Λ «

AZ 56. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA	ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 111 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
AZ SS. AZONOSí TÖSZÁMÚ SZEKVENCIA	LEÍRÁSA:
Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Xle Thr Xle	Thr Val Glu Lys Gin Gin
1 5 XO	IS
Cys Áss Phe Cys Xle Ser Xle Asn Thr Thr	Trp Cys Alá Gly Tyr Cys
2S 25	30
Tyr Thr Arg Asp Len Val Tyr Lys Asp Pro	Alá Arg Vro Asn Xle Gin
35 4Ö	45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Len Val Tyr	Gin Thr Val Lys Val Pro
SS 55	60
Gly Cys Alá His Mis Alá Asp Ser Leu Tyr	Thr Tyr Pro Val Ale Thr
SS ' 70	75 80
Gin Cys Sís Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp	Ser Thr Asp Cvs Thr Val
85 80	95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser The	Ser Glu Mer Lys Glu
100 105	1X8

AZ 57. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 110 aminosav

TÍ PUSÁ: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: 1insár is

MOLEKULÁTÍEUS: peptid

,.*· «

AZ 57. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser t Λ.

Cys

Gla-

tea

Thr 5

Asn

Xle

Thr

Xle

Ser 18

Vei

Gla

tys

Gla

Gla 15

cys

Arg

Phe

Cys

Zle 20

Ser

Xle hsa

Thr

Thr 25

Trp

Cys

Gla

Gly Tyr 30

Cys

Tyr

Thr

Arg

Asp 35

tea

Val

Tyr tys

Asp 40

Pro

Alá

Arg

Pro

Asn 45

Thr

Gin

tys

Val

Cys 50

Thr

Phe

tys

Gla

tea 55

Vei

Tyr

Gla

Thr

Xle 50

Arg

tea

Pro

Gly

Cys SS

Alá

Arg

Hls

Ser

Asp 70

Ser

tea

Tyr

Thr

Tyr 75

Pro

Val

Alá

Thr

Gla SO

Cys

His

Cys

Gly

tys 85

Cys

Asp

Ser

Asp

Ser 38

Thr

Asp

cys

Thr

Val 35

Arg

Gly

tea

Gly

Pro ICO

Ser

Tyr

Cys

Ser

Phe 105

Gly

Gla

Méh

tys

Gla XXQ

AZ 58. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 117 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁIíPUS: peptid

AZ 58. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe

Cys

Xle

Pro

Thr

Gla

Tyr

Méh

Hls

Val

Gla

Arg

tys

Gla

Cys

1

5

10

15

Alá

Tyr

Cys

tea

Thr

Xle

Asn

Thr

Val

Cys

Alá

Gly

Tyr

Cys

Méh

20

25

-

38

Thr

Arg

Asp

Val

Asa

Gly

tys

tea

Phe

tea

Pro

tys

Tyr

Alá

tea

Ser

35

4 0

45

Gin

Asp

Val

Cys

Thr

Tyr

Arg

Asp

Méh

Tyr

tys

Thr

Alá

Gla

Xle

Prrs

50

55

50

Gin

Cys

Pro

Arg

Hls

Vei

Thr

Pro

Tyr

Phe

Ser

Tyr

Pro

Val

Alá

Xle

55

78

75

80

Ser

Cv’c '-'U

tys

Cys

Gly

tys

cys

Asn

Thr

Asp

Tyr

Ser

Asp

Cys

Xle

Kis

85

3Ö~

35

Gla

AXss.

He

tys

Thr

Asn

Tyr

Cys

Thr

tys

Pro

Gin

tys

Ser

Tyr

Heh

100

105

110

Val Gly Phe Ser Xle

115

- 1.30 Μ 59. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 111 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: Iin sári s

MOLEKULÁTíPÚS: peptId

AZ 59. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe 1

Cys

Xle

Pro

Thr 5

Gitt Tyr

Méh

Mát

Kis IS

Val

Clv

Arg

Lys

Glv xs

Cys

Alá

Tyr

Cys

Leu 2©

Thr

Xle

Asa

Ser

Thr 25

Xle

Cys

Alá

Gly

Tyr 3©

Cys

Met

Thr

Arg

Asp 35

Phe

Asp

Gly

Lys

lett

Phe

Lett

Pro

hys

Tyr as

Alá

Len

Ser

Gin

Asp 50

Val

Cys

Thr

Tyr

Arg ss”

Asp

Msfc

Tyr

Lys

Thr S0

Val

GIv

Ha

Pro

Gla SS

Cys

Pro

Sls

His

Val ?©

Thr

Pro

Tyr

Phe

Ser 75

Tyr

Pro

Val

Alá

Xle SS

Ser

Cys

1-ys

Cys

Gly SS

lys

Cys

Asp

Thr

Asp 90

Tyr

Ser

Asp

Cys

Xle SS

Hls

gIv

Alá

Xle

Lys ISO

Thr

Asa

Tyr

Cys

Thr 105

Lys

Pro

Gitt

hys

Ser 110

Tyr

A 60. AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 117 aminosav

TÍPUSA: amínosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: 1íneáris

MOLEKULÁT!PUS: pepiid ~ Wi VA 60. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe Cys 2	11 e	Pro	Thr Gitt Tyr Thr Hefc Tyr Val Asp Arg Arg Gitt	Cys
S	Xö	25
Alá Tyr	Cys	Leu 29	Thr He	Asa Thr Thr Xls Cys 25	Ála Gly Tyr Cys 20	Hét
Thr Arg	Asn 35~	Xle	Asa Gly	Lys Lett Phe Leu Pro 40	Lys Tyr Alá Lau 45	Ser
Gin Asp Sö	Val	Cys	Thr Tyr	Arg Asp Tle Tyr Arg SS	Thr Val 01« Xle SS	Pro
Gitt Cys SS	Pro	His	His Val 70	Thr Pro Tyr Phe Ser ?S	The Pro Val Alá	Val SO
Ser Cys	Lys	Cys	Gly Lys 85	Cys Asn Thr Asp Asa 80	Ser Asp Cys Xle 35	His
Glu Alá	Val	Arg 200	Thr Asa	Tyr Cys Thr Lys Pro 205	Gin Ser Phe Tyr 2X0	Lett

Gly Gly Phe Ser Tyr 215

A 61. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI : A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: II? aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTíPUS: peptid a 6i. azonosítószámú szekvencia leírása:

Phe Cys Xle Pro Thr Gl.« Tyr Hét. Heh Tyr Val Asp Arg Arg Gitt Cys

2

5

20

25

Alá

Tyr

Cys

Leó 28

Thr

Xle

Astt

Thr

Thr 25

Xle

Cys

Alá

Gly

Tyr 30

Cys

Heh

Thr

Arg

Asp 35

Xls

Asa

Gly

Lys

Leu 40

Phe

Lea

Pro

Lys

Tyr 45

Alá

Leu

Ser

Gla

Asp 50

Val

Cvs

Thr

Tyr

Arg S5~

Asp

Thr

Tyr

Arg

Thr S0

Val

Gitt

He

Pro

hitt SS

Cys

Pro

His

Val 70

Alá

Pro

Tyr

Phe

Ser 75

Tyr

Pro

Val

Alá

Lett SO

Ser

Cys

Lys

Cys

Gly Lys SS

Cys

Asa

Thr

Asp Tyr 30

Ser

Asp

Cys

Thr SS

His

Gitt

AXst

Val

Lys 209

Thr

Asa

Tyr

Cys

Thr 205

Lys

Pro

Gitt

Thr

Phe XX 0

Tyr

Lett

1.92

A 62 - AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI': A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 23 bázispár

TÍPUSA; nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁT í PUS; cUMS

A 62- AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

AGCTGTCCTG OAGCTAGGAA TCT

A 63- AZONOStTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A. SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 23 bárispár Tí PUSA; aukie ins av HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA; lineáris MOLEKULATÍPUS; cDNS

A €3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

CTAOCCTAGA AGCTCTCACT GTC

A 64- AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA; 49 bázispár

T í FOSA; no kiéi. ns av

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLŐOIÁJA: lineáris

MOLEKUIATÍPUS; cDNS

*»’ϊ ”·’ϊ , U ί - 1Χ'3 Α 64. AZONOSÍTÓSZÁMŰ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

áGCTGTCCTG GAGCTAGGAA TCTCTGTACG GAASTGTTAC TTCTGCTCT 49

A 65. AZONOSÍTÓSZÁMŰ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 49 bázispár

TÍPUSA: sukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 65. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAGCCTAGA AGCTCTGACT GTCCTAGTTG TGGTTTGTCC AAA.CTCATC 49

A 66. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 34 bázispár

TÍPUSA: nukleínsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTÍPJS: cDNS

A 66. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AACCGCCCTG AACACATCCT GCAAAAAGCC CAGA 34

A 67. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 69 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY .SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTí PUS i e DL S

A 67. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTGGCTCTCA GOTGTCAATG CGCGCTCTGC CGCAGATCTA CCACTGACTG 50

CGGGGTCCCT AAGGACCAC 69

A 68. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 72 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: Iineár is

MOLEKULÁT!PUS: cDNS

A 68. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACACGGAT CGGAGCTCTT AGCGGGGGTC ATCACAGGTC AAGGGGTGGT 50

CCTTAGGGAC CCGGCAGTCA GT 72

A 69. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

MOSS Z A: 45 bá z i sp á r

Tí PUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!.PUS: cDNS

A 69. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACTGTCCGGG GCTTGGGTCC CTTGACCTGT GATGACCCCC GCTTC 45

196

A 70. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 4S bázispár

TÍPUSA: mxk.lein.sav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULATÍPUS; cDNS

A 70. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGGACCCAAG CCGCGGACAG TACAGTCAGT ACTGTCGCTG TCGCAGAG 48

A 71.. AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 71. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCCAASACCG CGGACAGTGC AGTCAGTGCT AGÁTCTGCG

A 72. AZONOS ÍTÖSZ.

ZEKVENCI.A ADATAI

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI HOSSZA: 72 báslspá.r TÍPUSA: nnkleinsev HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS; cDNS

I9'S

A 72. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

TGCACTGICC GCGGTCTIGG CCCAAGCTAT TGCA.GCTTCG GCGAATTCCA 50

GGACTCCTCT TCCTCAAAGG CC 72

A 73. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 .bázispár

TÍPUSA: nuxleinsav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris·

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 73. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATCCTTAAG ATTTGTGATA ATAACÁAGTA. CTGCA

A 74. AZONOS ÍTÖSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: SÍ básíspár

TÍPUSA: nukleínsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTÍPUS: cDNS

A 74. AZONOSíTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTTCTGGTA CCGATSACGA TGAOÁAGTCT AÁÁGAACCGC TGCGGCCGCG 50

T.TGCCGCCCC ATCAATGCCÁ CCCTGGCTGT G 81 *» *

A 75. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 42 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: Iíneáris

MOLEKULÁT! PUS: cDNS

A 75. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCCACCGGAT CCTTAAGATT TGTGATAATA ACAAGTACTG CA

A 76. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 84 bázispár TÍPUSA: mikleinsav HÁNY SZÁLÚ; egy

MOLEKULÁTIPUS: cDNS

A 76. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

TGCTTCTCTA GAGCATATCC AACT0CATT6 AGATCTAAGA AGÁCTATGTT 5Ö

GGTCCAAAAG CAAGTCACTA GTGAGTCCAC TTGC 84

A 77. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 34 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ; egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULÁTíPUS: cDNS

A 77, AZONOS ÍTÓSZÁMÖ' SZEKVENCIA LEÍRÁSA

CCGGCTGTTG TCCTACCATG ACACGTGT'GC TGCA

A 78, AZONOS ÍTÓSZÁMÖ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZÁ: 39 bázíspár TÍPUSA: nuLleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT! PUS; cDNS

A 78. AZONOS ÍTÓSZÁMÖ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTGTAGCGTG OATTCCGGAC TATCCTGCÁC ATCAGGAGC

A 79, AZONOS ÍTÓSZÁMÖ SZEKVENCIA ADATAI

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 60 bázispár

TÍPUSA; nukl .nsav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS; cDNS

A 79, AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

CCATTGACAT CTAAGAAGAC TATGTTGGTC CAAKAGGACG TCACTAGTGA

GTCCACTTGC 60

A 8ö, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 45 bázispár

T Í PVSA; nuk 1 ei.ns a v

1Á9 ~ ** ♦ ♦♦ ♦ ♦ χ # ♦ *

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTí PUScUNS

A 80. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACAAGTACTG CAGTGACAAS CAGTGTGTTG CTCCACTTTG AAACC 45

A 81. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 26 foázáspár TÍPUSA: nukleínsav HÁNY SZÁLÚ: sgy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULÁT í PUS: eDNS

A 81. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCACACGTOT CATGGTAGGA CAACAG

A 82. AZONOSíTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: eDNS

A 82. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATCTGCTAG CTAAGCA

A 83. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 básispár TíPUS A: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: 1ineáris

MOLEKULÁT!PUS: eBNS

A 83- .AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAGTGCTTA GCTAGCA

A 84. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ALATA: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 básisnár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: 1 ineári s

MOLEKULÁT IPUS : cDNS

A 84. AZONOSITŐSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA

GATCTAAGAA GACTATGCTT GTACAATGTA ACOTTA

A 85. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA .ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 báaispár

TÍPUSA: nekieinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATIPUS: cDNS ~ 2/51 -i ί

Α 85. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA. LEÍRÁSA:

CTAGTAACGT TACATTGTAC AAGCATAGTC TTCTTA

A 86. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

KOSSZÁ: 20 .bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTíPUS: cDNS

A 86. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGACTGTACA ACAA.GTAGTA

A 87. AZONOSÍIŐSZÁMŰ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 26 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁTíPUS: cDNS

A 87. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATCTAC7AC TTGTTGIACÁ GTCCGC

A 88. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 42 bázispár

TÍPUSA; nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ; eqy lineáris

MOLEKULÁTÍPUS: cDNS

A 88. AZONOS!TÖSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TGCCOCAGAT CIACTÁCTTG CTGCGGGGGT CGCAASGACC

A 89. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 54 básispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁIÍPUS: cDNS

A 89. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCÁIIGAGAT CTAAGÁAGAC IATGTTGGTC CÁAAAOÁACG TCA.C.IAGTGÁ 50

GTCC 54

A 90. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 57 .bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: Iíneárís

MOLEKULÁIÍPUS: cDNS

A 90. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AOAAGTAOIG CAGTGACACG CCGTGTGGTT CTCACATTTA AAACCCCCCA 50

TTACTGT

2J3 ♦ **♦

A 91. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA; 34 báaispár TÍPUSA; nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULÁTÍPUS: cDNS

A 91. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCGCCTATTG TCCTA..CTATG ACGCGTTGTC TGCA

A 92. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 26 bacispár

TÍPUSA: nukleinsav egy

TOPOLÓGIÁJA: 1ineár i s

MOLEKULÁT íPUS: cDNS

A 92. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GACAACGGGT CATAGTAGGA. OAATÁG

A 93. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 12 básispáx

TÍPUSA; nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS «* «φφ*

2Ό4

A 93. AZONOSÍTŐSZÁMÜ SZEKVENCIA LE

CTGTGCTATA AG

A 94. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19 bázispár

TíPUSA: nukl.einsav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT ÍPÚS: cDNS

A 94. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁS

GTCCTTATAG CACAGATCC

A 95. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 32 bázispár

TÍPUSA: műkleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 95. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTTAATACGA. CTCACTATAG GCTAOCCTCG AG

A 96. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 45 báeispar

TÍPUSA: nnkieinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

2.,es ** ♦ **>· Ψν.ί

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTíPUS: cONS

A 96. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

CATCCCGCGG CACCTAGGAC AAAGCGGCTC CTTGGATGCC CATGT 45

A 97. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 1X6 axsinosav

TÍPUSA; aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT íPUS; péptid

A 97. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Heh X

Asp

Tyr

Arg tys 5

Tyr

Jd.s, &X&

Xle XG

Phe

tea

Val

Thr

tea 15

Ser

Val

Phe

tea

His 20

Val

tea

His

Ser

Alá 25

Pro

Asp

Val

Gin

Asp 30

Cys

Pro

Gin

Cys

Thr 35

tea

Gin

Gla

Asn

Pm 48

Phe

Ser

Gla

Pro 45

Gly

Alá

Pro

Xle

tea 50

Gin

Cys

Heh

Gly

Alá. 55

Cys

Phe

Ser

Arg

.Alá 50

Tyr

Pro

Thr

Pro

tea SS

Arg

Ser

tys

Thr 70

Heh

tea

Vei

Gin

tys 75

Asn

Val

Thr

Ser

Gla 80

Ser

Thr

Cys

Vei SS

Alá

tys

Ser

Tyr

Asn 30

Arg·

Val

Thr

Val

Heh 55

Gly

Phe

tys

Vei 100

Gin

Asn

His

Thr

Alá 105

Cys

His

Cys

Ser

Thr 110

Cys

Tyr

Tyr His tys Ser 115

A 93. AZONOSí TŐSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

ROSSZA: 116 asdnosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris φ φ ί

MOLEKULÁT ίPUS: péptί d

A 98. AZONOSÍTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Bet X

Asp

Tyr

Arg 5

Lys

Tyr

Alá

Xle 10

Phe

Leu

Val

Thr

Lett 15

Ser

Val

Phe

Leu

His 20

Vad

Let

Kis

Ser

Alá 25

Pro

Asp

Vei

Gin

Asp 30

Gye

Pro

Slu

Cys

Thr 35

Let

Gin

Glu

Asa

Pro 40.

Phe

Ser

Gitt

Pro 45

Gly

Ale

Pro

He

Leu 50

Cys

Két

Gly

Cys SS

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá Sö

Tyr

Pro

Thr

Pro

Leu SS

Arg

Ser

Lys

Thr 78

Két

Lea

Val

Sin

Lys 75

Ash

Val

Thr

Ser

Glu. 80

Ser

Thr

Cys

Val SS

Alá

Lys

Ser

Tyr

Asa 30

Arg

Vei

Thr

Vei

Két 35

Giy

r-ι xt

Phe

Lys

Val 100

Gitt

Asa

His

Thr

Alá 105

Cys

Sls

Cys

Ser

TAr 220

Cys

Tyr

Xyr Kis Lys Ssr 2X5

A 99. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 116 sxainossv

TÍPUSA: aair.osav

HÁNY SZÁLÚ: égy

TOPOLÓGIÁJA: Iineár ís

MOLEKULÁTí PUS; peptid

A 99. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Két X

Asp

Tyr

Tyr Arg 5

Lys

Tyr

Alá

Xle XO

Phe

Lett

Val

Thr

Lee 15

Ser

Val

Phe

len

Hla 20

Val.

Lett

Pia

Ser

Alt 25

Pro

Asp

Val

Gla

Asp 3ö~

Cys

Pro

Gitt

Cys

Thr 35

Let

Gitt

Asa

Pro 40

Phe

Ser

Gitt

Pro 45

Gly

Alá

Pro

Xle

Let 50

Gin

Cys

Gly

Cys 55

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá 58

Tyr

Pro

Thr

Pro

Lee SS

Arg

Ser

Lys

Thr 78

Kér

Let

Vei

Gitt

Lys 75 .

Asa

Val

Thr

Ser

Gin SS

- 2ο;/**** *VÍ i

Ser

Thr

Cys

val

&.X&

Lys

Ser

Tyr

Asa

Arg

Val

Thr

Val

Heh

Gly

85

SO

SS

Gly

Phe

Lys

Val

Gitt

Asn

His

Thr

AX&

Cys

His

Cys

Ser

Thr

Cys

Tyr

200

185

120

Tyr

His

Lys

Ser

JhXvó

Α 100 . AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

EOSSZA: II6 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT1PUS: pépt id

A 100. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Mer 2

Asp

Tyr

Arg 5

Lys

Tyr Alá

Alá

Xle 10

Phe

Leu

Val

Thr

Leu 25

Ser

Val

Phe

Leu

His 2 δ

Val

Len

His

Ser

Alá 25

Pro

Asp

Val

Gin

Asp 30

Cys

Pro

Glu

Cys

Thr 35

Leu

Gin

Gitt

Asa

Pro 40

Phe

Ser

Gin

Pro 45

Gly

Alá

Pro

Xle

Leu SO

Gin

Cys

Mefc

Gly

Cys 55

Cys

Phe

Cys

Arg

Alá SO

Tyr

Pro

Thr

Pro

Leu SS

Arg

Ser

Lys

Thr 70

Mer

Leu

Val

Gin

Lys 75

Asa

Val

Thr

Ser

Gitt 80

Ser

Thr

Cys

Val 85

&X&

Lys

Ser

Tyr

Asn 80

Arg

Val

Thr

Val

Heh 35

Gly

Phe

Lys

Val 100

Gin

Asn

His

Thr

Alá 105

Cys

His

Cys

Ser

Thr 110

Cys

Tyr

Tyr His Lys Ser
225

A 10.1. AZONOS í TÖS ZÁMÚ SZEKVENC1A ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1X6 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris *χ ·*·*·♦.

**»♦ 0» «φ

MOLEKULÁT!PUS; pepiid

A 101. AZONOSXTÓSSÁMÖ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Met Asp Tyr Tyr Arg hys Tyr Al® Alá Xle Phe Ken Val Thr Ken Ser 15 10 15

Val Phe Len Sás Val Keu Has Ser Als Pro Asp Val Gin Asp Cys Pro 20 25 30

Sle Cys Thr Ken Gin. Gin Asn Pro Phe Phe Ser Gin Pro Gly Alá Pro

35

48

45

21a

Ken 50

Gin

Cys

heh

Gly Cys 55

Cys

Phe

Ser

Cys

Alá SQ

Tyr

Pro

Thr

Pro

Ken SS

Arg

Ser

Cys

Kys

Thr 70

heh

Ken

Val

Gin

Kys 75

Asn

Val

Thr

Ser

Glu SG

Ser

Thr

Cys

Val 55

Alá

Kys

Ser

Tyr

Asn 30

Arg

val

Thr

Val

Met SS

Gly

Phe

Kys

Val

Glu

Asn

Kis

Thr

Alá

Cys

Kis

Cys

Ser

Thr

Cys

Tyr

200 205 120

Tyr Has Kys Ser 115

A 102. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 116 aminosav

TÍPUSA: aiainosav
HÁNY SZÁLÚ; egy
TOPOLÓGIÁJA; lineáris
MOLEKULÁTí PUS; pepiid
A 102. AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
heh Asp Tyr Tyr Arg 1 5	Kys	Tyr	Aila	Alá	Xle 18	Phe	Keu	Val	Thr	Ken 25	Ser
Val The Keu Kis Val 20	Ken	Kis	Ser	Alá 25	Pro	Asp	Val	Gin	Asp 30	Cys	Pro
Glu Cys Thr Ken Gin 35	Glu	Asn.	Pro 40	Phe	Phe	Ser	Gin	Pro 45	Gly	Alá	Pro
Xle Ken Gin Cys Méh 50	Gly	Cys 55	Cys	Phe	Ser	Arg	Aia 50	Cys	Pro	Thr	Pro
Keu Arg Ser- Kys lys SS	Thr 70	Met	Kan	Val	Gin	Kys 75	Asn	Val	Thr	Ser	Gin 88
Ser Thr Cys Cys Val 85	Alá	Xys		Tyr	Asn 30	Arg	Val	Thr	Val	Met 35	Gly
Gly Phe Kys Val Glu 100	Áss.	Kis	Thr	Alá 205	Cys	Kis	cys	Ser	Thr 210	Cys	Tyr

Tyr has Lys Ser 125

- 2.09 - ' - ^:

Α 103. AZONOSίTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 116 aminosav

TÍPUSA: and.no s a v

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris ♦*

X

W X < »♦ * á <e ♦ *** *<t · » ♦ » κ * « 4>

* «- » 4 » » »»>

A .103. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val

Phe

név

Mis 20

Val

nett

Mis

Ser

Alá 25

Pro

Asp

Val

Gin

Asp 30

Cys

Pro

Gitt

Cys

Thr 35

név

Gin

GIv

Asa

Pro 40

Phe

Ser

Gin

Pro 45

Gly

Alá

Pro

Xle

neu 50

Gin

Cys

Mefc

Gly

Cys SS

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá 50

Tyr

Pro

Thr

Pro

Lett 95

Arg

Ser

Lys

Thr 70

Met

Lett

Val

Gls

Lys 75

Asa

Val

Thr

Cys

GIv SÖ

Ser

Thr

Cys

Val 85

Alá

Lys

Ser

Tyr

Áss 90

Arg

Val

Thr

Val

Mát 95

Gly

Phe

hys

Val 100

Gitt

Astt

Mis

Thr

Alá xos

Cys

Mis

Cys

Ser

Thr 110

Cys

Tyr

Hia

Lys

Ser

1X5

A 104. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 116 ami no sav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTÍPUS; pepiid * Jfc; .. Φ

A 104- AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 't

Asp

Tyr

Arg 5

Lys

Tyr

Als

Alá

Ile 20

Phe

Leu

Val

Thr

Leu 15

Ser

Val

Phe

Len

Kis 20

Val

Leu

Sás

Ser

Alá 25

Rr©

Asp

Val

Gin

Asp 30

cys

Pr©

Glu

Cys

Thr 35

Leu

Glu

Asn

Rr© 40

Phe

Rhe

Ser

Glu

Rr© 45

Gly

Alá

Pr©

Xle

Leu 50

Glu

Cys

hét

Gly Cys 35

Cys

Rhe

Ser

Arg

Alá 60

Tyx

Rr©

Thr

'Rr©

Leu 55

Arg

Ser

Lys

Thr 70

Met

Leu

Val

Gin

Lys 75

Asn

Val

Thr

Ser

Glu 80

Cys

Thr

Cys

Val 85

Lys

Ser

Tyr

Asn 90

Arg

Val

Thr

Val

Két 55

Gly

Rhe

Lys

Val 100

Glu

Asn

Sás

Thr

Alá 205

Cys

Hás

Cys

Ser

Thr 110

Cys

Tyr

Kis

Lys 115

Ser

A 105. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 116 aminosav

T ÍPUS.A: ami.nosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

T QPOLÚGIÁJA: Iinaári s

MOLEKULATÍPUS: pepiid

A 105. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Méh 2

Asp

Tyr

Arg 5

Lys Tyr Alá

Alá

Xle Phe Leu 20

Val

Thr

Leu 25

Ser

Val

Phe

Leu

Kis 20

Val

Leu Hls

Ser

Alá 25

Rr©

Asp

v&i

Gin

Asp 30

Cys

Rr©

Glu

Cys

Thr 35

Leu

Gin

Glu Asn

Rr© 46

Rhe

Ser

Gin

Rr© 45

Gly

Alá

Pr©

Xle

Leu 50

Glu

Cys

Két

Gly Cys 55

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá SO

Tyr

Rr©

Thr

Rr©

Leu 65

Arg

Ser

Lys

Thr Met 70

Leu

Val

Gin

Lys 75

Asn

Val

Thr

Ser

Glu 50

Ser

Thr

Cys

Val 85

Alá Lys

Ser

Tyr

Asn 50

Arg

Val

Thr

Val

Met 95

Gly

Rhe

Lys

Val 200

Glu

Asn Sás

Thr

Alá 205

Cys;

Kis

Cys

Ser

Thr 110

Alá

Tyr Kis Lys Ser 2X5

Ά 106. AZONOS ί TÖSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 116 amíhosav

TÍPUSA: aiaiaosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTíPUS: péptid

A 106. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Asp

Tyr

Tyr Arg 5

Lys

Tyr

Alá

Tle 10

Phe

Lett

Val

Thr

Lett ÁS

Ser

Val

Phe

Lett

Kis 20

Val

Lett

Kis

Ser

c

Pro

Asp

Val

Gitt

Asp 30

Cys

Pro

Gitt

Cys

Thr 35

Leu

Gin

Gitt

Astt

Pro 40

The

Phe

Ser

Gin

Pro 45

Gly

Álé

Pro

lle

Len 50

Gitt

Cys

hét

Gly

Cys SS

Cys

Pha

Ser

Arg

Alá 50

Tyr

Prs

Thr

Pro

Leu SS

Arg

Ser

Lys

Th-r 70

heh

Lett

Val

Gin

Lys 75

Astt

Val

Thr

Ser

Gitt 80

Ser

Thr

Cys

Cys 85

Alá

Lys

Ser

Tyr

Asn 30

Arg

Val

Thr

Val

hét SS

Gly

Phe

Lys

Val xoo

Gitt

Asn

His

Thr

Alá 105

Cys

Kis

Cys

Ser

Thr XXO

Cys

Tyr

Kis

Lys 1X5

Ser

A 10?» AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 116 aminosav

TÍPUSA: 3si.nosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: Iineáris

MOLEKULÁT í PUS: pepi id !12

A 107. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met I

Asp

Tyr

Arg 5

Lys

Tyr

Alá

lle 10

Phe

Leu

Val

Thr

Léu 15

Ser

Val

Phe

Leu

Kis 20

Val

Leu

hás

Ser

Alá 25

Pro

Asp

Val

Gin

Asp 30

Cys

Pro

Gitt

Cys

Thr 35

Leu

Gin

Glu

Asn

Pro 40

Phe

Ser

Gin

Pro 45

Gly

Alá

Pro

11«

Leu 50

Gin

Cys

Met

Gly

Cys 55

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá 60

Tyr

Pro

Thr

Pro

Leu 65

Arg

Ser

Lys Lys

Thr 70

Met

Leu

Val

Gin

Lys 75

Asn

Val

Thr

Ser

Glu so

Ser

Thr

Cys

Val 85

Alá

Lys

Ser

Tyr

Asn 90

Arg

Val

Thr

Val

M&t 55

Gly

Phe

Cys

Val 200

Gin

Asn

Hás

Thr

Alá 205

cys

Hás

Cys

Ser

Thr 120

Cys

Tyr

Tyr Mis Lys Ser

1X5

A. 108 . AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 116 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í FUS: peptid

A 108. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 2

Asp

Tyr

Arg 5

Lys

Tyr

Alá

lle 20

Phe

Len

Val

Thr ,

Leu 25

Ser

Val

Phe

Len

His 30

Val

Len

Hás

Ser

Alá. 25

Pro

Asp

Val

Gin

Asp 38

Cys

Pro

Glu

Cys

Thr 35

Leu

Gin

Glu

Asn

Pro 40

Phe

Ser

Gin

Pro 45

Gly

Alá

Pro

lle

Leu 50

Gin

Cys

Met

Gly Cys 55

Cys

Phe

Ser

Arg

Alá 80

Tyr

Pro

Thr

Pro

Leu 65

Arg

Se r

Lys

Α.£4.ίΓ 70

Met

Len

Val

Gin

Lys 75

Asn

Val

Thr-

Ser

Glu SO

Ser

Thr

Cys

Val 85

Alá

Lys

Ser

Tyr

Asn 90

Arg

Val

Thr

Val

Met 55

Gly

Phe

Lys

Cys 200

Glu

Asn

Kis

Thr

Axa 205

Cys

Hás

Cys

Ser

Thr 220

Cys

Tyr

Tyr His Lys Ser 225

- 2/3 A 109. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 116 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 109. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met X

Asp

Tyr

Arg S

Lys

Tyr

Alá

Aia

He LG

Phe

Leu Val

Thr

Leu 25

Ser

Val

Phe

Leu

Kis 20

Val

Leu

Kis

Ser

Alá 25

Tro

Asp

Val

Gin

Asp 30

Cys

Pro

Glu

Cys

Thr 35

Leu

Gin

Glu

Asn

Pro 40

?he

Ser

Gin

Pro, 45

Gly

Alá

Pro

Xie

Leu 58

Gin

Cys

Két

Gly

Cys 55

cys

Phe

Ser

Arg

Alá SO

Tyr

Pro

Thr

Pro

Leu. SS

Arg

Ser

Lys

Thr 70

Mefc

Leu

Val

Gin

Lys 75

Asn

Val

Thr

Ser

Glu 80

Ser

Thr

Alá

Cys

Val 85

Alá

Lys

Ser

Tyr

Asn 80

Arg

Val

Tr-if*

Val

Mefc 95

Gly

Oly

Phe

Lys

Val 200

Glu

Asn

Kis

Thr

Alá X05

Cys

Ars

Cys

Ser

Thr X20

Cys

Tyr

Sás

Lys 225

Ser

A 110. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

KO S S ZA: 129 ami no sav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ; agy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 110. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

*» *

Met I

Lys

TAr

Len

Girt Pfee 5

Pfee

Len

PAs 10

Cys

Trp

Lys

Alá 15

Xle

Cys

Asn

Ser 20

Cys Glrt

Leu

Thr

Asn 25

21a

Thr

xle

Aló

val 38

Glu

Lys

Glrt

Sly

Cys 35

Gly

PAe Cys

Xle

Thr 48

XX e

Asr

TAr

Tfer

Trp 45

Cys

Alá

Gly

Tyr

Cys 50

Tyr

Tfer

Cys Asp

Len 55

Val

Tyr

Lys

Asp

Pro SS

Alá

Arg

Pro

Lys

He SS

Gin

Lys

TAr

Cys TAr 70

PAs

Lys

Glu

.te'.i

Val 75

Tyr

Gin

Tfer

Val

Arg 80

Val

Pro

Gly

Cys

Alá Kis 85

Kis

Alá

Asp

Ser §8

L«rt

Tyr

Tfer

Tyr

Pro 55

Val

Alá

Thr

Gin

Cys 100

Kis Cys

Gly

Lys

Cys 105

&sp

Ser

Asp

Ser

Tfer 228

Asp

Cys

TAr

Val

Arg 11.5

Gly

Len. Gly

Pro

Ser 128

Tyr

Cys

Ser

Pha

Gly 125

Girt

Méh

Lys

Glrt

A Cl. AZONOSÍTÖSZÁMŰ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 129 astinosav

TÍPUSA: amlnosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptití

A 111. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Lys

Thr

Len

Gin 5

PA»

PA®

PAe

Len

PAe 10

Cys

Trp

Lys

Alá 15

Xle

Cys

Asrt

Ser 20

cys

Girt

Lert

Thr

Ást 25

lle

Tfer

Xle

Alá

Val 30

Girt

Lys

Glu

Gly

cys 35

Gly

Pfee

Cys

11 e

TAr 40

lle

Asn

Thr

Tfer

Trp 45

Cys

cys

Gly

Cys 58

Tyr

Tfer

Arg

Asp

Leu SS

Val

Tyr

Lys

Asp

Pro 58

Alá

Arg

Pro

Lys

Xle 55

Gin

Lys

Thr

cys

Orr 78

PAe

Lys

Girt

Lert

Val 75

Tyr

61 rt

Tfer

Val

Arg 80~

Val

Pro

Gly

Cys

Alá 85

Kló

Hxs

Alá

Asp

Ser se

Len

Tyr

Thr

Tyr

Pro 55

Val

Alá

Thr

Gin

Cys ISO

Sás

Cys

Gly

lys

Cys 205

Asp

Ser

Asp

Ser

Thr 110

Asp

Cys

TAr

Val

Arg 225

Gly

Leu.

Gly

Pro

Ser 120

Tyr

Cys

Ser

PAe

Gly 125

Gin

Mer

Lys

Glu

- 2/5 ~

A 112. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HŐS SZA: 129 amino sav

TÍPUSA; aminosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKOLATÍRÚS: peptid

112 Met 1	. AZONOS ÍTŐSZÁMÖ SZEKVENCIA	LEÍRÁS Phe Cys 10	»Ci. v Cys	Trp Lys	Alá 25	He
: Lys Thr Len Gin Phe Phe 5	Phe Leu
Cys Cys Asn Ser Cys Glu Len 20	. Thr Asn 25	He Thr	Xle	Alá Val 30	Glu	Lys
Glu	Gly Cys Gly Phe Cys He 35 '	Thr He 40	Asn Thr	Thr	Cys Cys 45	Als	Gly
Tyr	Cys Tyr Thr Arg Asp Leu 50 SS	Vei Tyr	Lys &sp	Pro S0 ♦	Alá Arg	Pro	Lys
Xle SS	Glu Lys Thr Cys Thr Phe 70	Lys Glu	Leu Vei 75	Tyr	Gin Thr	Val	Arg SÓ
Val	Pro Gly Cys Alá Kis Kis 85	Alá Asn	Ser Leu 80	Tyr	Thr Tyr	Pro 55	Val
Alá	Thr Gin Cys Kis Cys Gly 100	Lys Cys 205	Asp Ser	Asp	Ser Thr 220	Asp	cys
Thr Glu	Val Arg Gly Leu Gly Pro 115	Ser Tyr 220	Cys Ser	Phe	Gly Gin 225	heh	Lys

A 113. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 129 aminosav

TÍPUSA; ami.no.sav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁTíPUS: peptid > Η »

A 113. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Lys

Thr he®

Gin 5

Phe

Len

Phe 20

Cys

Trp

Lys

Alá 15

Xle

Cys

Asn Ser 20

Cys

Gitt

Lett

Thr

Asn 25

Xle

Thr

Xle

Alá

Val 30

Glu

Lys

Gitt

GXy

Cys Gly 35

Phe

Cys

Xle

Thr 40

Xle

Asn

Thr

Trp 45

Cys

Alá

Gly

Tyr

Cys 50

Tyr Thr

Arg

Asp

Leu 55

Val

Tyr

Lys

Asp

Pro 60

Alá

Arg

pro

Lys

Xle SS

Gl®

Lys Thr

Cys

Thr 70

Phe

Lys

Gitt

Len

VaX 75

Tyr

Gitt

Thr

Val

Arg 80

VaX

Pro

GXy Cys

Alá 35

His

Alá

Asp

Ser 50

Len

Tyr

Thr

Tyr

Pro 55

Val

Alá

Thr

Cin Cys 100

Hís

Cys

Gly

Lys

Cys 205

Asp

Ser

Asp

Ser

Cys 210

Asp

Cys

Thr

VaX

Arg Gly 215

Lett

Gly

Pro

Ser 120

Tyr

Cys

Ser

Phe

Gly 225

Gitt

Mer

Lys

Glu

A 114. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 129 aminosav

TÍPUSA: airínosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 114. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 2

Lys

Thr

Len

Gitt 5

Phe

Len

Phe 10

Cys

Trp

Lys

Alá 25

Xle

Cys

Asn

Ser 20

cys

Gitt

Leu

Thr

Asn 25

Xle

Thr

Xle

Alá

Val 38

Gitt

Lys

Gitt

Gly

Cys 35

GXy

Phe

Cys

lle

Thr 40

Xle

Asn

Thr

Trp 45

Cys

Alá

Gly

Tyr

Cys 50

Tyr

Thr

Arg

Asp

Lett SS

Val.

Tyr

Lys

Asp

Pro 60

Alá

Arg

Pro

Lys

He 85

Gitt

Lys

Cys

Thr 70

Phe

Lys

Gitt

Len

VaX 75

Tyr

Gitt

Thr

Val

Arg 80

Val

Pro

Gly

Cys

Alá 85

His

Alá

Asp

Ser 30

Lett

Tyr

Thr

Tyr

Pro SS

Val

Alá

Thr

Gin

Cys 108

His

Cys

Gly

Lys

Cys 105

ASp

Ser

Asp

Ser

Thr 210

Asp

Cys

Thr

Val

Arg 125

Gly

Lett

Gly

Pro

Ser 120

Tyr

Cys

Ser

Phe

Gly 22 S

Gitt

Mer

Lys

A < w vlU

A 115. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 129 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT íPUS: peptid

A 115. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Mefc 2

Lys

Lett

Gitt S

Phe

Lett

Phe 20

Cys

Trp

Lys

Alá 'is

Xle

Cys

Ars

Ser 20

Cys

GXxí

Leu

Thr

Ássa 25

Xle

Thr

Xl®

Alá

Val 30

Gitt

Lys

Gin

G2y

Cys SS

Gly

Phe

Cys

Xle

Thr 48

Xle

Ássa

Thr

Trp 45

Cys

Alá

Gly

Tyr

Cys SO

Tyr

Cys Arg

Asp

Leu SS

Val

Tyr

Lys

Asp

Pro 88

Alá

Arg

Pro

Lys

Xle SS

Gitt

Lys

Thr

Cys

Thr 70

Phe

Lys

Gitt

Lett

Val 75

Tyr

Gitt

Thr

Val

Arg 80

Val

Pro

Gly

Cys

Alá 85

His

Alá

Asp

Ser 38

Lee

Tyr

Thr

Tyr

Pro 55

Vei

Alá

Thr

Gin

Cys 200

His

Cys

Gly

Lys

Cys 205

Asp

Ser

Asp

Ser

Thr 2X0

Asp

Cys

Thr

val

Arg XXS

Gly

Leu.

sxy

Pro

Ser 120

Tyr

Cys

Ser

Phe

Glv 125

Gitt

Mer

Lys

A 116. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

MOSSZA: 129 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: agy

TOPOLÓGIÁJA: 1ineár is

MOLEKULATÍPUS: peptid ~ 2Í8 ~

Α 116. AZONOS Í TÓSZÁMŰ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met X

Lys

Thr

hév

Gin 5

Phe

Leu

Phe 16

Cys

Trp

Lys

Alá IS

Ile

Cys

Asn

Ser 20

Cys

Glu

Leu

Thr

Asn 25

Ile

Thr

Ile

Alá

Val 30

Glu

Lys

Gin

Sly

Cys 35

Gly

The

Cys

Ile

Thr 40

He

Asn

Thr

Trp 45

Cys

Alá

Gly

Tyr

Cys 50

Tyr

Thr

Arg

Cys

Len SS

Val

Tyr

Lys

Asp

Pro 80

Alá

Arg

Pro

Lys

Ile 85

Gin

Lys

Thr

Cys

Thr 70

Phe

Lys

Gla

Leu

Val 75

Tyr

Glu

Thr

Val

Arg 8ö

Val

Pro

Gly

Cys

Als 85

Kis

Alá

Asp

Ser 50

Leu

Tyr

Thr

Tyr

Pro 55

Val

Alá

Thr

Gin

Cys 1GÖ

Kis

Cys

Gly Lys

Cys 105

Asp

Ser

Asp

Ser

Thr 110

Asp

Cys

Thr

Val

Arg- HS

Gly

Len

Gly

Pro

Ser 120

Tyr

Cys

Ser

Phe

Gly 125

Gin

Met

Lys

Glu

A 117 . AZONOS ÍTÓSZÁMŰ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 129 asaxnosav

T í POSA: aminosav

HÁNY SZÉLŰ: egy

TOPOLÓGIÁJA: 1íneáris

MOLEKULÁTtPUS: peptid

A 117. AZONOS ÍTÓSZÁMŰ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Két 1

Lys

Thr

Leu

Gin 5

Phe

Phe 10

cys

Cys

Trp

Lys

Alá X5

Ile

Cys

Asn

Ser 20

Cys

Glu

Leu

Thr

Asn *> ϊΐ

Ile

Thr

He

Alá

Val 30

Glu

Lys

Glu

Gly

Cys 35

Gly

Phe

Cys

ne

Thr 40

Ile

Asn

Thr

Trp 45

Cys

Alá

Gly

Tyr

Cys 50

Tyr

Thr

Arg

Asp

Leu 55

Val

Tyr

Cys

Asp

Pro 80

Alá

Arg

Pro

Lys

Ile 85

Gin

Lys

Thr

Cys

Thr 70

Phe

Lys

Glu

Leu

Val 75

Tyr

Glu

Thr

Val

Arg 80

Val

Pro

Gly

Cys

Alá 85

Kis

Alá.

Asp

Ser- go

Len

Tyr

Thr

Pro 95

Val

Alá

Thr

Gin

Cys 100

Kis

Cys

Gly

Lys

Cys 105

Asp

Ser

Asp

Ser

Thr 110

Asp

Cys

Thr

Val

Arg 115

Gly

Len

Gly

Pro

Ser 120

Tyr

Cys

Ser

Phe

Gly 125

Glu

híet

Lys

Glu «r* V 0

X *00 * 0 » < X X 0 « 0 «

0 » « 0 0 0·*

A 118. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 129 amlnosav

TÍPUSA: aodnosav HÁNY SZÁLÚ; egy TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁT ÍPÚS :	peptid
A 118. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;
Méh tys Thr tea X	Gin Phe Phe Phe tea Phe Cys Cys Trp tys Alá Xle 5 10 15
Cys Cys Asn Ser 20	Cys Gin tea Thr Asn Xle Thr lle Alá Val Gin tys 25 30
Gla Gly Cys Gly 35	Phe Cys lle Thr lle Asn Thr Thr Trp Cys Alá Gly 40 45
Tyr Cys Tyr Thr 50	Arg Asp tea Cys Tyr tys Asp Pro Alá Arg Pro tys 55 ' 60
Xle Gin tys Thr SS	Cys Thr Phe tys Gla tea Val Tyr Gla Thr Val Arg 70 75 SS
Val Pro Gly Cys	Alá Hls Kis Alá Asp Ser tea Tyr Thr Tyr Pro Val SS 50 55
Alá Thr Gin Cys löö	His Cys Gly tys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 105 3.10
Thr Val Arg Gly 115 Gla	tan. Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Gin Msh tys 120 X2S

A 119. AZONOS íTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 129 amlnosav

TÍPUSA: aminösnv

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁTíPUS; peptid

22.,6

A 119» AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

heh Lvs Thr Leu Sin Phe Phe Phe Lee Phe Cys Cys Trp Lys Alá lle

5 10 IS

Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn lle Thr lle Alá Val Glu Lys

2S ’ 30

Gin Gly Cys Gly Phe Cys lle Thr lle Asn Thr Thr Trp Cys Alá Gly 35 40 45

Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Len Val Tyr Lys Asp Pro Alá Arg Pro Lys SS * 55 so lle CVs Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu ?hr Val- Arg

70 75 SO

Val Pro Gly Cys Alá Hás Sás Alá Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val

50 55

Alá Thr Glu Cys Hás Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 208 205 XXO

Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu heh Lys 12 S 120 225

Glu

A 120. AZONOSÍTÓSZÁMÖ SZEKVENCIA ADATAI :

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 165 asűnoshv

TÍPUSA; aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 120. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

heh X	Glu hét	Phe Gin 5	Gly	Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser heh Gly
10	25
Gly	Thr Trp	Alá Ser 20	Lys	Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro lle 25 30
Asn	Alá Thr 35	Leu Al á	Val	Glu Lys Glu Gly Cys 40	Pro Val Cys lle Thr 45
Val	Asn Thr 50	Thr He	Cys	Alá Gly Tyr Cys Pro SS	Thr Cys Thr Arg Val SS
Leu SS	Gin Gly	Val Leu	Pro 70	Alá 2»eu Pro Gin Val 75	Val Cys Asn Tyr Arg SO
Asp	Val Arg	Phe Glu SS	Ser	lle Arg Leu Pro Gly 80	Cys Pro Arg Gly Val SS
Ara	Pro Val	Val Ser 100	Tyr	Alá Val Alá Leu Ser 205	Cys Gin Cys Alá Leu 210
Cys	Arg Arg 225	Ser Thr	Thr	Asp Cys Gly Gly Pro 220	Lys Asp Hás Pro Leu 225
Thr	Cys Asp 230	Asp Pro	Arg	Phe Gin Asp Ser Ser 235	Ser Ser Lys Alá Pro 240
Pro 145	Pro Ser	Leu Pro	Ser 25 Ö	Pro Ser Arg Leu Pro 155	Gly Pro Ser Asp Thr ISO

Pro Tle Leu Pro Gin 265 « » « « V <

* ♦ X Λ V ♦ ♦ ♦

A 121. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 165 asiinosav

T í PUSA: aminos av

HÁNY S ZÁLü; egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁTfPUS: peptid

A 121. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Giu

Mafc

Phe

Gin 5

Gly

Len

Len XO

Len

Ser

Méh 15

Gly

Thr

Trp

Ala 20

Ser

Lys

Gin

Pro

Lee 25

Arg

Pro

Arg

Cys

Arg 3 8

Pro

Xle

Asn

Ala

Thr 35

Leó

Ala

Val

Gin

Lys 40

Gin

Gly

Cys

Pro

Val 45

Gye

Xle

Thr

Val

Asn 5S

Thr

Xle

Cys

Ala 55

Gly

Tyr

Cys

Pro

Thr SQ

Heh

Thr

Arg

Val

Len SS

Gin

Gly

Val

Len

Pro 7G

Ala

Len

Pro

Gin

Vei 75

Cys

Asn

Tyr

Arg 3G

Asp

Val

Arg

Phe

Gin SS

Ser

Xle

Arg

Len

Pro 90

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 35

VaX

Asn

Pro

Val

Val Χδδ

Ser

Tyr

Ala

Val

Ala 105

Len

Ser

Cys

Gin

Cys 220

Ala

Len

Cys

Arg

Arg 1X5

Ser

Thr

Asp Cys X20

Gly

Pro

Lys

Asp 225

His

Pro

Len

Thr

Cys Asp X3Ö

Asp

Pro

Arg

Phe 235

Gin

Asp

Ser

Ser 140

Ser

Lys

Ala

Pro

Pro 145

Pro

Ser

Lee

Pro

Ser X50

Pro

Ser

Arg

Len

Pro 255

Gly

Pro

Ser

Asp

Thr 250

Pro

Xle

Len

Pro

Gin

XS'5

A 122. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 165 aaúnosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : pepiid

A 122. AZONOSÍTÖSZÁMÖ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Mer Gin Mefc Phe Gin Giy len Len Len Len Len Len Len Ser Mer Giy ^S 10 15

Giy Thr Trp Alá 20	Ser Lys Gin Pro	L«n Arg Pro Arg Cys Arg	Pro	Xle
25	30
Asn Alá Thr Len	Alá Val Gin Lys	Gin Giy Cys Pro Vai	Cys	Xle	Thr
SS	40	' 45
Val Asn Thr Thr	21« Cys Cys Giy	Tyr Cys.Pro Thr Mefc	w	Arg	Val
50	SS	50		«·
Len Gin Giy Val	Len Pro Alá Len	Pro Gin Val Val Cys	Asn	Tyr	Arg
SS	7Ö	75			S0
Asp Val Arg Phe	Gin Ser Xle Arg	Len Pro Giy Cys Pro	Arg	oly	Val
	85	50		55
Asn Pro Val Val	Ser Tyr Alá Val	Alá Len Ser Cys Gin	Cys	Alá	Len
100		185	118
Cys Arg Arg Ser	Thr Thr Asp Cys	Giy Giy pro Lys Asp	Kis	Pro	Len
115	128	125
Thr Cys Asp Asp	Pro Arg Phe Gin	Asp Ser Ser Ser Ser	Lys	Alá	Pro
1.30	135	148
Pro Pro Ser Len	Pro Ser Pro Ser	Arg Len Pro Giy Pro	Ser	Asp	Tfer
145	158	155			ISO
Pro Xle Len Pro	Gin
	IS 5
A 123 . AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA; 2.65 atoinosav

TÍPUSA; amínosav HÁNY SZÁLÚ; egy TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MO.LEKULATÍWS; pepiid

A 123. AZONOSíTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Mer 1

Gin

Met

Phe

Gin 5

Giy

Len

Len 10

Len

Sex

Met 15

Giy

Thr

Trp

Alá 28

Ser

Lys

Gin

Pro

Len 25

Arg

Pro

Arg

Cys

Arg 30

Pro

Xle

Asn

Ara

Thr 35

Len

Alá

Val

Gin

Lys 40

Gin

Giy

Cys

Pro

Val 45

Cys

Xle

Thr

Val

Asn SO

Thr

Cys

Alá SS

Giy

Tyr

Cys

Pro

Thr SO

Mer

Thr

Arg

Val

Len SS

Gin

Giy

Val

Len

Pro 70

Alá

Len

Pro

Gl.n

Val 75

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg 80

Asp

Val

Arg

Phe

Gin SS

Ser

Xle

Arg

Len.

Pro 38

ciy

Cys

Pro

Arg

Gly 55

Val

v ^Χ'·«

223

Asn ?rs Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Len Ser Cys Gin Cys Ala Len löö 105 · no

Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro lys Asp Kis Pro Len 115 no _12S

Thr	Cys	Asp	Asp	Pro	Arg	Phe	Cin	Asp	Ser
	138					135
Pro	Pro	Ser	Len	Pro	Ser	Pro	Ser	Arg	Leó
145					158
Pro	Ile	Len	Pro	Gin
				155

155

148

ISO

A 124. AZONOS ÍTÖSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 165 aminosav

TÍPUSA: ami nos av

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: 1ineár is

MOLEKULÁT X PUS: peptid

A 124. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Mer 1

Gin

Mer

Phe

Glo

Gly

Leó

Len Len 18

Len.

Leó

Len

Ser

Kefe 15

Gly

Thr

Trp

Ala 20

Ser

Lys

Glu

Pro

Leó Arg 25

Pro

Arg

Cys

Arg 38

Pro

He

Asn

Ala

Thr 35

Leó

Ala

Val

Glo

Lys «0

Gin Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

Ile

Thr

Val

Asn 50

Thr

Xle

Cys

Ala 55

Gly

Tyr Cys

Pro

Thr SO

Mer

Thr

Arg

Val

Len SS

Gin

Gly

Val

Len

Pro 78

Ala

Leó

Pro Gin

Val 7S

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg 80

Asp

Val

Arg

Phe

Gin SS

Ser

Ile

Arg

Len Pro 38

Gly Cys

Pro

Arg

Gly 35

Val

Asn

Pro

Val

Val 200

Ser

Tyr

Ala

Val

Al a Leó 105

Ser

Cys

Gin

Cys 118

Ala

Len.

Cys

Arg

Arg 't n sr

Ser

Thr

Cys

Asp

Cys 228

Gly Gly

Pro

Lys

Asp 125

Kis

Pro

Len

Thr

Cys 130

Asp Asp

Pro

Arg

Phe 135

Gin

Asp Ser

Ser

Ser 148

Ser

Lys

Ala

Pro

Pro 145

Pro

Ser

Len

Pro

Ser ISO

Pro

Ser

Arg Len

Pro 155

Gly

Pro

Ser

Asp

Thr ISO

Pro He Len Pro Gin

XS5

224 * ♦

A 125. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 165 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULÁTíPUS; pepiid

A 125. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Mefc 1

Gin

Mefc

Phe

Cin 5

Gly

Len

Len Len

Len 10

Len

Ser

Mefc 15

Gly

Thr

Trp

Alá 28

Ser

Lys

Gin

Pro Len 15

Arg

Pro

Arg

Cys

Arg 30

Pro

He

Asn

Alá

Thr 35

Len

Alá

Val

Gin

Lys Gin 40

Oly

Cys

Pro

Val 45

Cys

Xle

Thr

Val

Asn 50

Thr

He

Cys

Alá 55

Gly Tyr

Cys

Pro

Cys 60

Mefc

Thr

Arg

Val

Len 65

Gin

Gly

Val

Len

Pro 70

Ar a

Len Pro

Gin

Val ?S

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg 80

Asp

Val

Arg

Phe

Cin 85

Ser

He

Arg Len

Pro 30

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 55

Val

Asn

Pro

Val

Val ISO

Ser

Tyr

Ara

Val Alá 105

Len

Ser

Cys

Gin

Cys 110

Alá

Len

Cys

Arg

Arg : 115

Ser

Thr

Asp

Cys Gly Gly 120

Pro

Lys

Asp 125

Ars

Pro

Len

Thr

Cys 130

Asp

Pro

Arg

Phe 135

Cin Asp

Ser

Ser 140

Ser

Lys

Alá

Pro

Pro 145

Pro

Ser

Len

Pro

Ser ISO

Pro

Ser Arg

Len

Pro 155

Gly

Pro

Ser

Asp

Thr .160

Pro He Len Pro Sírt 3 SS

A 126. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 165 aminosav

TÍPUSA; aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris .MOLEKULATÍPUS: peptxd

2/5

Α 126. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Mer X

Gitt

Méh

Phe

Gin s

Gly

Len

Lett Lett

Leu 20

Lett

Leu

Ser

Nett XS

Gly

Thr

Trp

Alá 20

Ser

Lys

Gitt

Pro Lett 25

Arg

Pro

Arg

Cys

Arg 30

Pro

Xle

Asn

Alá

Thr 35

Len

Alá

Val

Gitt

Lys Gitt 40

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

Xle

Thr

Val

Asn SÖ

Thr

Xle

Cys

Alá 55

Gly Tyr

Cys

Pro

Thr 50

Met

Cys

Arg

Val

Leu SS

Gin

Gly

Val

Len

Pro 7Ö

Alá

Lett Pro

Gitt

Val 7S

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg 80

Asp

Val

Arg

Phe

Gitt 85

Ser

Xle

Arg Lee

Pro 90

Gly

Cys

Pre

Arg

Gly 95

Val

Asn

Pro

val

Val 100

Ser

Tyr

Alá

Val Alá 105

Lett

Ser

Cys

Gin

Cys Xlö

Alá

Lett

Cys

Arg

Ser

Thr

Asp Cys

Gly Gly

Pro

Lys

Asp

His

Pro

Lett

1X5

120

125

Thr

Cys

Asp

Pro

Arg

Phe

Gin

Asp

Ser

Lys

Alá

Pro

130

135

14 ö

Pro

Ser

Lett

Pro

Ser

Pro

Ser

Arg

Lett

Pro

Gly

Pro

Ser

Asp

Thr

14 S

150

155

ISO

Pro Xle Lett Pro Gin IS 5

A 127. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 165 aminosav

Tí PUSA: amin o sa v

HÁNY SZÁLÚ: agy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

127	. AZONOSÍTÓSZÁMÚ	SZEKVENCIA	LEÍRÁSA:
Ner <A	Gitt Nett Phe Gin Gly 5	Len len Leu	Len Lett Lett Lett Ser Mer Gly 10 15
Gly	Thr Trp Alá Ser Lys 20	Gitt Pro Len 25	Arg Pro Arg Cys Arg Pro Xle 30
Asn	Alá Thr Lett Alá Val 35	Gitt Lys Gitt 4Ö	Gly Cys Pro Val Cys Xle Thr 4ώ
Val	Asn Thr Thr Xle Cys 50	Alá Gly Tyr 55	Cys Pro Thr Méh Thr Arg Val 80
Lett 55	Cys Gly Val Len Pro 70	Alá Lett Pro	Gin Val Val Cys Asn Tyr Arg 7S 80
Asp	Val Arg Phe Gitt Ser SS	Xle Arg Lett	Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val 90 95

226

Asn	Pro	val	Vei	Ser	Tyr	Alá	Val
			100
Cys	Arg	Arg	Ser	Thr	Thr	Asp	Cys
		115					120
Thr	Cys	Asp	Asp	Pro	Arg	Phe	Glu
	130					135
Pro	Pr©	Ser	Leu	Pro	Ser	Pro	Ser
145					150
Pro	Xle	Leu	Pro	Glu
				165

<·« *«** «ς»_ν

Alá 105	Leu	Ser	Cys	Glu	Cys 110	V « λ Alá	Leu
Gly	Gly	Pro	Lys	Asp 125	Hís	Pro	Leu
Asp	Ser	Ser	Ser 140	Ser	Lys		Pro
Arg	X*eu	Pro 155	Gly	Pro	Ser	Asp	Thr ISO

A 128. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 165 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT!PÜS: peptid a 128. azonosítóssAmű szekvencia leírása:

Met Glu 1	Mer Phe Glu Gly 5	Leu Glu	Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly
10	Cys	15
Gly	Thr	Trp	AXa Ser 20	Lys	Pro	Leu Arg Pro Arg 25	Arg 30	Pro	He
Asu	Alá	Thr 35	Leu Alá	Val	Glu	Lys 40	Glu Gly Cys Pro	Val 45	Cys	Xle	Thr
Val	Asn 50	Thr	Thr He	Cys	Alá 55	Gly	Tyr Cys Pro Thr 80	Kst	Thr	Arg	Cys
Leu SS	Glu	Gly	Val Leu	Pro 70	Alá	Leu	Pro Glu Val Val 75	Cys	Asu	Tyr	Arg 60
Asp	Val	Arg	Phe Glu 85	Ser	He	Arg	Leu Pro Gly Cys 50	Pro	Arg	Gly 55	Val
Asn	Pro	Val.	Val Ser 100	Tyr	Alá	Val	Alá Len Ser Cys 135	Glu	Cys 110	Alá	Len
Cys	Arg	Arg XX5	Ser Thr	Thr	Asp	Cvs? 120	Gly Gly Pro Lys	Asp 125	His	Pro	Leu
Thr	Cys 130	Asp	Asp Pro	Arg	Phe 13 5	Gin	Asp Ser Ser Ser 140	Ser	Lys	.Alá	Pro
Pro 14 S	Pro	Ser	Leu Pro	Ser 150	Pro	Ser	Arg Leu Pro Gly 155	Pro	Ser	ASp	Thr 160

Pro IIe

Len Pro Gin 185

Α .129, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI ; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 165 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKUIATÍPUS: pepiid

A 12 S- AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA

Hét 1

Gin

Hét

Rhe

Gla 5

Gly

Leu

Leu 10

Leu

Ser

Hét 15

Gly

Thr

Trp

Alá 28

Ser

Lys

Gin

Rr©

Leu 25

Arg

Rr©

Arg

Cys

Arg 38

Pro

Ile

Asa

Alá

Thr 35

Len

Alá

Val

Glu

Lys 48

Glu

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

Ile

Thr

Val

Asn 58

Thr

Ile

Cys

Alá 55

Gly

Tyr Cys

Rr©

Thr 68

Mer

Thr

Arg

Val

Len SS

Gin

Gly

Vei

Leu

Rr© 78

Alá

Len

Rr©

Cys

Val 75

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg 80

Asp

Val

Arg

Phe

Glu 85

Ser

Xle

Arg

Leu

Rr© 30

Gly

Cys

Rr©

Arg

Gly 95

Val

Asn

Pro

Val

Val 108

Ser

Tyr

Alá

Val

Alá 105

Leu

Ser

Cys

Gin

Cys 118

AXjb.

Leu

Cys

Arg

Arg 115

120

125

Thr

Cys 130

Asp

Pr©

Arg

Rhe 135

Gin Asp

Ser

Ser 148

Ser

Lys

Alá

Rr©

Rr© 145

Pro

Ser

Leu

Rr©

Ser 150

Pr©

Ser Arg

Leu

Pr© 155

Gly

Pr©

Asp

Thr 160

A 130- AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 141 aminosav

TfPUSA; aminosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: pepiid

- 2p ~

A 130. AZONOSÍTÓSZÁMŰ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Met 1

Glu

Met

Keu

Gin 5

Gly

Keu

Keu 10

Keu

Kau

Keu

Ser

Met 25

Gly

Alá

Trp

Alá 20

Ser

Arg

Glu

Pro

Keu 25

Arg

Pro

Trp

Cys

Has 30

Pro

Xle

Asn

Alá

Xle 35

Keu

Alá

Val

Glu

Kys 40

Glu

Gly

Cys

Pro

Vei 45

Cys

Xle

Thr

Val

Asn 58

Thr

Xle

Cys

Alá 55

Gly

Tyr

cys

Pro

Thr 58

Met

Arg

Cys

Ken SS

Gin

&X&.

Val

Kan

Pro 70

Pro

Keu

Pro

Gin

Vei 75

Val

Cys

Thr

Tyr

Arg 80

Asp

Val

&arg

Phe

Gin 85

Ser

Xle

Arg

Keu

Pro 58

Gly Cys

Pro

Arg

Gly 55

Val

Asp

Pro

Vei Val 208

Ser

Phe

Pro

Val

Alá 105

Keu

Ser

Cys

Arg

Cys 228

Gly

Pro

Cys

Arg

Arg 225

Ser

Thr

Ser

Atsp

cys 22 ö

Pro

Kys

Asp 125

hás

Pro

Keu

Thr

Cys 23 ö

Asp

Sás

Pro

Gin

Keu 235

Ser

Sly I*eu

Keu

Phe 240

Keu

A 131. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 141 atainosav

TÍPUSA; andnosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptíd

A 131. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Mefc Glu Met Keu Gin Gly Len Ken Ken Keu Keu Keu Ken Ser Met Gly l 5 ^rS

Gly

Alá

Trp

Alá 20

Ser

Arg

Glu

Pro

Keu 25

Arg

Pro

Trp Cys

His 30

Pro

Xle

Asn

Alá

Xle 35

Keu

Alá

Val

Glu.

Kys 40

Glu

Gly

Cys

Pro Val • 45

Cys

Xle

Thr

Val

Asn 58

Thr

Xle

Cys

Ale 55

Gly

Tyr

Cys

Pro

Thr Cys S8

Mőt vL

Arg

Val.

Keu SS

Gin

.&X&

Val

Len

Pro 70

Pro

Keu

Pro

Gin Vei 75

Val Cys

Thr

Tyr

Atrg 80

♦ *

Asp

Val

Arg

Phe

Sít 85

Ser

Xle

Arg

Lett

Pro 50

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly SS

Val

Asp

Pro

Val

Val ISO

Ser

Phe

Pro

Val

Alá 105

Lett

Ser

Cys

Arg

Cys 110

Gly

Pro

Cys

Arg

Arg 115

Per

Thr

Ser

Asp

Cys 120

Gly

Pro

Lys

Asp 12 S

Kis

Pro

Lett

Thr

Cys

Asp

Kis

Pro

dr

Lett

Ser

Gly

Leu

Le«

Phe

Lett

13 8

135

140

A 132. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI : A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 141 asúnosav

TÍ FÜSA: ami.no s a v

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTíPUS: peptid .A 132. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Két 1

Gitt

Két

Lett

Gin 5

siy

Lett

Leu

Lett 28

Lett

Leu

Lett

Ser

Mát 15

Gly

Alá

Trp

Alá 20

Ser

Arg

Gitt

pro

Lett 25

Arg Pro

Trp

Cys

His 30

Pro

Xle

Am

Alá

Xle IS

Lett

Alá

Val

Gitt

Lys 40

Gitt

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

Xle

Thr

Val

Astt 50

Thr

Xle

Cys

Alá 55

Gly

Tyr

Cys

Pro

Thr 80

Met

Mefc

Arg

Val

Lett SS

Gitt

Alá

Val

Lett

Pro 70

Pro

Let

Pro

Gla

Val 05

Cys

Thr

Tyr

Arg SG

Asp

Vei

Arg

Phe

Gitt SS

Ser

Xle

Arg

Lett

Pro SG

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly SS

Val

Asp

Pro

Val

Val 100

Ser

Phe

Pro

Val

Alá XS5

Lett

Ser

Cys

Arg

Cys 220

Gly

Pro

Cys

Arg

Arg 215

Ser

Thr

Ser

Asp

Cys 120

Gly

Pro

Lys

Asp 125

Has

Pro

Let

Thr

Cys 130

.Asp

Kis

Pro

Gitt

Lett 135

Ser

Gly

Lett

Let

Phe 14 ö

Lett

A 133. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI.:

HOSSZA: 141 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOL.EKULATÍPUS: pepiid

A 133. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Glu Met

Leu

Gin 5

Gly

Leu

Len 20

Leu

Len

Ser

Met 25

Gly

Alá

Trp

Alá 20

Ser

Arg

Glu

Pro

Leu 25

Arg Pro

Trp

Cys

Ars 30

Pro

22a

Asn

Alá

lle 35

Len

Alá

Val

Gin

Lys 40

Glu

Gly

Cys

Pro

val 45

Cys

lle

Thr

Val

Asn SO

Thr

lle

Cys

Cys SS

Gly

Cys

Pro

Thr 50

Met

Arg

Val

Leu. SS

Gin

Alá

Val

Len

Pro 78

Pro

Len

Pro

Gin

Val 75

Val

Cys

Thr

Tyr

Arg SO

Asp

Val

Arg

Phe.

Glu SS

Ser

lle

Arg

Leu

Pro 90

Gly

Cys

Pro

Arg Gly 55

Val

Asp

Pro

Val

Val 200

Ser

Phe

Pro

Val

Alá 285

Leu

Ser

Cys

Arg

Cys 228

Gly

Pro

Cys

Arg

Arg 225

Ser

Thr

Ser

Asp

Cys 220

Gly

Pro

Lys

Asp 225

Hás

Pro

Leu

Thr

Cys 130

Asp

Hás

Pro

Gin

Len 235

Ser

Gly

Leu

Phe 240

Len

A 134. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA. ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 141 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: 1ineáris

MOLEKUI.ATÍPUS: peptid * a »

A 134. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Heh 2

Glu

Heh

Len

Sin 5

Gly

Leu

Leu XÖ

Leu

Ser

Méh 25

Gly

Ars

Trp

Alá 28

Ser

Arg

Glu

Pro

Leu 25

Arg

Pro

Trp

Cys

His 30

Pro

Xie

Asn

Alá

Xie 35

Leu

Aia

Val

G2U

Lys 40

Glu

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

Xie

Thr

Val

Asn 58

Thr

Cys

Alá 55

Gly Tyr

Cys

Pro

Thr SO

Hat

Met

Arg

Val

Leu SS

Gin

Alá

Val

Len

Pro 78

Pro

Leu

Pro

Gin

Val 75

Val

Cys

Thr

Tyr

Apg BŐ

Asp

Val

Arg

Phe

Glu 85

Ser

21a

Arg

Leu

Pro 50

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 55

Val

Asp

Pro

Val

Val 208

Ser

Phe

Pro

val

Alá 18 5

Leu

Ser

Cys

Arg

Cys 2X8

Gly

Pro

Cys Arg Arg Ser Thr Ser Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp Kis Pro Leu 215 22 Ö X25

Thr Cys Asp Kis Pro Gin Len Ser Gly Leu Len Phe Leu 138 X3S 24 0

A 135. AZ ONOS í TÓS ZÁMÚ S ZSKVSNCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA; 141 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 135. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Heh

Glu

Méh

Leu

Gin 5

Gly

Leu

Leu 10

Leu

Ser

Méh 25

Gly

Alá

Trp

Alá 20

Ser

Arg

Glu

Pro

Leu 25

Arg

Pro

Trp

Cys

His 30

Pro

Xie

Asn

Alá

Xie 35

Leu

Alá

Val

Glu

Lys 48

Glu

Gly

cys

Pro

Val 45

Cys

Xie

Thr

Val

Asn £8

Thr

Xie

Cys

Alá 55

Gly

Tyr

Cys

Pro

Thr eo

Heh

Arg

Val

Leu SS

Gin

Alá

Val

Len

Pro 78

Pro

Leu

Pro

Gin

Val *7 £

Val

Cys

Thr

Tyr

Arg 80

Asp

Val

Arg

Phe

Glu SS

Ser

Xie

Arg

Leu

Pro 90

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 55

Val

Asp

Pro

Val

Val 100

Ser

Phe

Pro

Val

Aia 105

Leu

Ser

Cys

Arg

Cys s T A .4* W

Gly

Pro

Cys

Arg

Arg 2XS

Per

Thr

Cys

Asp

Cys X20

Gly Gly

Pro

Lys

Asp 125

His

Pro

Leu

Thr

Cys .230

Asp

His

Pro

Gin

Leu 235

Ser

Gly

Leu

Phe 148

Leu

: ««*»»» ♦ Φ Μ; * · »*« «Φ Φ φ

Α 136. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZÁ: 14.1 ámínosav

TÍPUSA: asűnosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: Iineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 136. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

heh Glu heh 1	hév	Gin 5	Gly Lett Len Lett Len Lan 10	Len	Len	Ser	hét 15	Gly
Gly Alá Trp	Alá	Ser	Arg Gin Pro Len Arg Pro	Trp	Cys	His	Pro	Xle
	20		25			30
Asn Alá Xle	Lett	Alá	Val Gitt Lys Gitt Gly Cys	Pro	Val	Cys	lle	Thr
35			40 _:t		45
Val Asn Thr	Thr	lle	Cys Alá Gly Tyr Cys Pro	Cys	heh	hét	Arg	Val
50			55	50
Lett Gl» Alá	Val	Lau	Pro Pro Lett Pro Gin Val	Val	Cys	Thr	Tyr	Arg
SS			70 75	*				80
Asp Val Arg	Phe	Gitt	Ser Xle Arg Len Pro Gly	Cys	Pro	Arg	Gly	Val
		85	80				SS
Asp Pro Val	Val	Ser	Phe Pro Val Alá Lee Ser	Cys Arg	Cys	Gly	Pro
	100		105			110
Cys Arg Arg	Ser	Thr	Ser Asp Cys Gly Gly Pro	Lys	Asp	Hls	Pro	Len
115			120		125
Thr Cys .Asp	Si.s	Pro	Gin Len Ser Gly Lee Len	Phe	Len
130			135	140

A 137 . AZONOSí TÖSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 141 aad.no sav

TÍPUSA; axainosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTíPUS: peptid

A 137. AZONOSÍTÓSZÁMŰ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Hat 2

Gin

Két

Leu

Gitt S

Gly

Len

Lett

Lea

Lett 20

Leu

Lett

Leu

Ser

Két 15

Gly

Alá.

Trp

Alá 20

Ser

Arg

Gitt

Pro

Leu 25

Arg

Pro

Trp

cys

Kis 30

Pro

Xle

Asn

Alá

Xle 35

Lett

Alá

Val

Gin

Lys 40

Gitt

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

Xle

Thr

Val

Asa SO

Thr

Xls

Cys

Alá 55

Gly Tyr

Cys

Pro

Thr 50

Két

Cys

Arg

Val

Lett SS

Gin

Alá

Val

Lett

Pro 70

Pro

Lett

Pro

Gin

Val 75

Val

Cys

Thr

Tyr

Arg SO

Asp

Val

Arg

Phe

Sin 85

Ser

Xle

Arg

Lee

Pro 50

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 55

Val

Asp

Pro

Val

Val 100

Ser

Phe

Pro

Val

Alá 205

Lau

Ser

Cys

Arg

Cys 220

Gly

Pro

Cys

Arg

Arg 325

Sár

Thr

Ser

Asp

Cys 220

Gly Gly

Pro

Lys

Asp 225

His

Pro

Len

Thr

Cys 230

Asp

His

Pro

Gin

Lee 135

Ser

Gly

Leu

Xeu

Phe 240

Leu

A 138. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 141. aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: 11neár i s

MOLEKULÁT!PUS: peptid

A 138. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Két 2

Gitt

Két

Lttt

Gitt 5

Gly

Lett

Leu

Lett

Lett 20

Lett

Leu

Lee

Ser

Két 25

Gly

Ál a

Trp

Alá 20

Ser

Arg

Gitt

Pro

Leu. <ά S*

Arg

Pro

Trp

Cys

His 30

Pro

Xle

Asn

Alá

Xle 35

Leó

Alá

Val

Gitt

Lys 40

Gitt

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

He

Thr

Val

Asa 50

Thr

Xle

Cys

Alá 55

Gly

Tyr

Cys

Pro

Thr 50

Két

Arg

Vei

Lett SS

Cys

j&Xst

Vei

Lett

Pro 70

Pro

Leu

Pro

Gin

Val 75

Val

Cys

Thr

Tyr

Arg S0~

2Í4 ~ »*00 «00«

Asp	Val	Arg	Phe	Glu 85	Ser	lle	Arg	tea	Pro 90	Gly
Asp	Pro	Val	Val 280	Ser	Phe	Pro	Val	Alá 285	tea	Ser
Cys	Arg	Arg 225	Ser	Thr	Ser	Asp	Cys 228	Gly	Gly	Pro
Thr	Cys 238	Asp	His	Pro	Gin	Len 135	Ser	Gly	tea	tea

Cys	Pro	Arg	Gly SS	Val
Cys	Arg	Cys 220	Gly	Pro
tys	Asp 225	His	Pro	tea
Phe 240	tea

A 133. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 141 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA; lineáris

MOLEKULATÍPUS; peptid

A 139. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Met 2

Gla

Heh

tea

Gla s

Gly

tea

tea 20

tea

Ser

Heh 25

Gly

Alá

Trp

Alá 20

Ser

Arg

Gla

Pro

tea 25

Arg

Pro

Trp

Cys

His 30

Pro

Xle

Asn

Alá

Xle 35

tea

Alá

Val

Gla

tys 40

Gla

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

Xle

Thr

Val

Asn 50

Thr

Xle

Cys

Alá 55

Gly

Tyr

Cys

Pro

Thr S0

Méh

Moh

Arg

Val

tea SS

G2a

Alá

Val

tea

Pro 70

Pro

tea

Pro

Cys

Val Val 75

Cys

Thr

Tyr

Arg 80

Asp

Val

Arg

Phe

Glu 85

Ser

Xle

Arg

tea

Pro 58

Gly

Cys

Pro

Arg

ÖXy 55

Val

Asp

Pro

Val

Val 280

Ser

Phe

Pro

Val

Alá 105

tea

Ser

Cys

Arg

Cys 228

Gly

Pro

Cys

Arg

Arg 225

Ser

Thr

Ser

Asp

Cys 230

Gly Gly

Ρϊ'Ο

tys

Asp 225

Hls

Pro

tea

Thr

Cys 238

Asp

Hr s

Pro

Gla

Aeu 235

Ser

Gly

tea

Phe 240

tea

X « **« φ φφ φ < φ φ * φ ♦ φ ««« φ φ φ

X Φ X Α Φ *

ΦΦΧ φφ φ φ φ*

Α 140. AZONOS ÍTÓSZÁMÖ SZEKVENCIA .ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 142 axsiLOS&v

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: Lí na ár is

MOLEKULÁTíPÜS: paptid

A 140. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Heh 1

Glu

Hét

Phe

Glu 5

Gly

Leu

Len

Leu

Leu 10

Leu

Ser

Hét 15

Gly

Thr

Trp

Alá 20

Ser

Lys

Glu

Pro

Leu 35

Cys

Pro

Arg

Cys

Arg 30

Pro

Tis

ASU

Alá

Thr 35

Leu

Alá

Val

Glu

Lys 40'

Glu

Gly

Cys

Pro

Val 45

Cys

lle

Thr

Vei

Asn 50

Thr

lle

Cys

Alá 55

Gly

cys

Cys

Pro

Thr 50

Mer

Thr

Arg

Val

Leu SS

Glu

Gly

Val

Leu

Pro ?0

Alá

Leu

Pro

Glu

Val 75

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg 80

Asp

Val

Arg

Phe

Glu 85

Ser

lle

Arg

Leu

Pro 80

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 85

Val

Asn

Pro

Val

Val 100

Ser

Tyr

Alá

Val

Alá 105

Leu

Ser

Cys

Glu

Cys 110

Alá

Leu

Cys

Arg

Arg HS

Ser

Thr

Asp

Cys 120

Gly

siy

Pro

Lys

Asp 125

Kis

Pro

Leu

Thr

Cys 13 0

Asp

Pro

Arg

Phe 135

Glu

Asp

Ser

Ser 140

Ser

Lys

A 141.. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 13? aminosav

T í PUS A: ami acsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTí PUS: papt id < Κ« 4. „ ......

{ .♦ *

-> *♦* X * » X « * *

Λ* ♦ « *♦

A 141. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Glu

Mefc

Phe

Gin Gly

Leu

. Leu

Leu

Ser

heh

Sly

1

5

10

25

uxy

Thr

Trp

Alá

Ser Lys

Giu

Pro

Leu

Cys

Asn

Ser

Cys

Glu

Lea

Thr

20

25

30

Asn

Xle

Thr

Xle

Alá Vei

Gin

Lys

Glu

Gly

' «ys

Gly

Phe

Cys

Xle

Thr

35

48

45

21e

Asn

Thr

Trp Cys

Ale

Gly

Cys

; Tyr

Thr

Arg

Asp

Lea.

Vei

50

55

SO

Tyr

Lys

Asp

Pro

Ale Arg

Pro

Lys

Xle

Gin Lys

Thr

Cys

Thr

Phe

Lys

SS

70

75

SO

Glu

Leu

Val

Tyr

Glu Thr

Vei

Arg

Val

Pro

Gly

Cys

Alá

Kis

Ale

SS

S0

95

Asp

Ser

Leu

Tyr

Thr Tyr

Pro

Vei

Alá

Thr

Gin

Cys

Hls

Cys

Gly

Lys

200

285

210

Cys

Asp

Ser

Asp

Ser Thr

Asp

Cys

Thr

val

Arg j

Gly

Leu

Gly

Pro

Ser

125

220

Tyr

Cys

Ser

Phe

Gly Glu

Heh

Lys

Glu

230 235

A 142. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 165 arolnosav

TÍPUSA; aainosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPÚS: peptid

A 142. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Kefe 2

Glu

?íet

Phe

Gin 5

Gly

Leu

Len

Leu 20

Leu

Ser

Met 25

Gly

Thr

Trp

Ale 20

Ser

Lys

Gla.

Pro

Lea 25

Cys

Pro

Arg

Cys

Ara 30~

Pro

Xle

Asn

Thr 35

Leu

Ale

Vei

Glu

Lys 40

Glu

Gly

Cys

Pro

Var 45

Cys

Xle

Thr

- 2 y? -'

K* * ♦ * * * ♦ ♦ w

»« *»*« **·.♦' *♦** .« *· * »♦ * a * « * * a ♦

Vei

Asn 50

Thr

lle

cys

Alá 55

Gly

Cys

Pro

Thr 60

Mer

Thr

Arg

Val

Len 65

Gin

Gly

Val

Leu

Pro 70

Alá

Leu

Pro

Gin

Val 75

Val

Cys

Asn

Tyr

Arg 80

Asp

Val

Arg

Phe

Glu 8,5

Ser

lle

Arg

Len

Pro 38

Gly

Cys

Pro

Arg

Gly 35

Val

Asn

Pro

Val

Val 100

Ser

Tyr

Alá

Val

Alá 135

Leu

Ser

Cys

Gin

Cys 220

Alá

Leu

Cys

Asp

Ser 225

Asp

Ser

Thr

Asp

Cys 120

Thr

Val

Arg

Gly

Leu 125

Gly

Pro

Ser

Tyr

Cys 130

Ser

Phe

Gly

Glu

Met 135

Lys

Glu

Ser

Ser 148

Ser

Lys

Alá

Pro

Pro 145

Pro

Ser

Leu

Pro

Ser 150

Pro

Ser

Arg

Leu

Pro 155

Gly

Pro

Ser

Asp

Thr 260

Pro Xle Leu Pro Gin

1SS

S56

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. «- és β-alegységet tartalmazó gHkoprotesöhöx»3<;a, amely a következő csoportból választott (a) tanár* korton-gonadotropin (hCC), amelyben a-z. «-alegység am!no.savszekv£aciáia a C^xys?-aminosav szmmnel történt cseréjével módosított és ahol a β-aiegység ammosavszekvenciája a Tyr37-ammosav ciszternáéi történt cseréjével módosított, miáltal alegységek közötti disznlfidköíés képződik az. «-alegység natív Cys31-amioosava és a β-alegység 3-7-es· aminosava között, és ahol a β-alegység aminosavszekvenciája adott esetbe® tovább módosított a Töl-114, aminosavaknak a hPSH β~ alegységének 95-103. amíaosavaívak (b'i barnáin koriott-gonadoiropm <hCG>, amelyben az α-alegység mninosavszekvenciája a Vaí7ó amisosav cisztáméi történt cseréjével módosított, és amelyben a. β-alegység amlaosavszekvenciája a V&I44 amtnosav eiszíoinnel történt cseréjével módosított, miáltal alegységek közötti dbzoifidkötés képződik az ·«alegység 76-os aminosava és a β-alegység 44-es aminosava között, (e) hantán í&szöserken.tö hormon (hFSH), amelyben a β-alegység amirmsavszetancíája a Tyr31 aminosav ciszternáéi történt cseréiével módosított, csahol;

(r) az: «-alegység ammosavszekvenoiája a Cys? szerűméi történt cseréjével módosított; vagy (ii) az «.-alegység ammomtszefcvencíájs a Cys? alarmmal történt cseréjével módosítóit; miáltal alegységek közötti dlsztíifidkötés képződik az «-alegység natív CysSl-aminosava és a β-aiegység 3 l-es aminosava közöd, (d) barnáit rtlszósétksatö hormon íhFSH), .amélybm az «-alegység asmátosavszekvwciája a ValTg aminosav eisztohwei történt cseréjével módosított, és ahol a β-alegység aminosavsz^venciája a Va!38 aminosav ciszternád történt cseréjével módosított, miáltal alegységek kőzööi diszdfidkötés képződik az «-alegység 76-os aminosava és a β-aiegység 38-as.aminosava között
2. Gyógyászati készítmény, amely 'hatásos mennyiségben 1. igénypont szerinti gnkoproteinhorasont és gyégyászatilag elfogadott excipieasi tartalmaz.
3. A 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely folyadék,
4. A 3. igénypont szerbit* gyógyászati készítmény, amely stabil,
5. Sékombmáas' DNS-molekaía, amely az 1. igénypont szerinti gítkoproteinhortnon «-alegységét kódoló nakleoddszekvcöciát tartalmaz.
6. Rekombináns- DNS-molekula, amely az 1. igénypont sserhdi glikoprotoinhormos β-alegységét kódoló saklsoíidszekv'endát tartalmaz.
7, Az S, -vagy 6. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekala, amely expressziós vektor.
8, A igénypont szerinti rekombináns DNS-molekulával transzformált enkarióta gazdasejt, amely alkalmas a gkkoproteinhrsrsnon-alegység expresszálásázs,
9, Eljárás az 1. igénypont szerinti -glikopmfoinhermon-előállítására, «ssö/>e?//emerw, hogy az 1, igénypont szerint meghatározott a- és β-alegységet kódoló míkJeotídszekvenciákkal transzformált enkartóta gazdasejtet szaporítunk, .ahol a n«kleotidSzekveöci&al egyááón expressziós vektor hordozza vagy külön expressziós vektorok hordozzák; expresszáljuk a glikeproieinhormoní; és kinyerjük az. expresszit glikopiOtembormont,