ES2268781T3 - Analogos de hormonas glicoproteinicas reticuladas con disulfuro, su preparacion y uso. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a análogos de hormonas de glicoproteínas con una unión reticulada disulfito entre las subunidades, su preparación y su utilización. También se describen las correspondiente secuencias de ADN y células huéspedes correspondientes, así como composiciones farmacéuticas.

Description

Análogos de hormonas glicoproteínicas reticuladas con disulfuro, su preparación y uso.

Antecedentes del invento Campo del invento

El presente invento se refiere a compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas y a su preparación y su uso. Más específicamente, el invento se refiere a compuestos análogos de las hormonas glicoproteínicas, entrelazados por enlaces disulfuro, y a su preparación y su uso.

Descripción de la técnica relacionada

Las hormonas glicoproteínicas incluyen las hormonas gonadotropina coriónica (CG; del inglés, chorionic gonado-
tropin), también conocida como coriogonadotropina, hormona luteinizante (LH; del inglés, luteinizing hormone), también conocida como lutropina, hormona estimulante del folículo (FSH; del inglés, follicle stimulating hormone), también conocida como folitropina, y hormona estimulante del tiroides (TSH; del inglés, thyroid stimulating hormone), también conocida como tirotropina. Las de seres humanos son conocidas como gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona luteinizante humana (hLH), hormona humana estimulante del folículo (hFSH) y hormona humana estimulante del tiroides (hTSH). Estas hormonas ejercen papeles importantes en las funciones gonadal y tiroidea (Pierce et al., 1981; Moyle et al., 1995). La CG y la LH se unen a, y estimulan, los receptores de LH, la FSH se une a, y estimula, los receptores de FSH, y la TSH se une a, y estimula, los receptores de TSH. La CG es una hormona producida en grandes cantidades principalmente por las placentas de unos pocos mamíferos, incluyendo las de primates. Las secuencias de aminoácidos de las subunidades \beta de la CG de primates difieren normalmente de las de la LH. Los caballos también producen una CG; sin embargo, ésta tiene la misma secuencia de aminoácidos que la LH equina (Murphy et al., 1991).

Conforme a la revisión de Pierce et al. (1981), las hormonas glicoproteínicas son heterodímeros que consisten en una subunidad \alpha y una subunidad \beta. Los heterodímeros no están covalentemente unidos entre sí, y sus subunidades pueden ser disociadas mediante el tratamiento de las hormonas con ácido o urea (Pierce et al., 1981). La mayor parte de los vertebrados superiores sólo contienen un gen que codifica la subunidad \alpha (Fiddes et al., 1.984); la misma subunidad \alpha se combina normalmente con las subunidades \beta de LH, FSH, TSH y, cuando está presente, CG. No obstante, el procesamiento proteico posterior a la traducción, notablemente la glicosilación (Baenziger et al., 1988), puede contribuir a diferencias en las composiciones de las subunidades \alpha de LH, FSH, TSH y CG. La mayor parte de las diferencias de secuencia de aminoácidos entre las hormonas radica en sus subunidades \beta específicas de la hormona (Pierce et al., 1981). Éstas se producen a partir de genes separados (Fiddes et al., 1984; Bo et al., 1992).

Con pocas excepciones (Blithe et al., 1991), los \alpha,\beta-heterodímeros presentan mucha más actividad hormonal que cada subunidad libre (Pierce et al., 1981). Las subunidades \alpha y \beta presentes en la naturaleza forman mucho mejor \alpha,\beta-heterodímeros que \alpha,\alpha-homodímeros o \beta,\beta-homodímeros. En realidad, la expresión conjunta de los genes de la subunidad \alpha y la subunidad \beta de hCG en células de mamífero conduce a la formación de \alpha,\beta-heterodímeros, monómeros de subunidad \alpha y monómeros de subunidad \beta. Las células sólo crean o secretan cantidades mínimas, si las hubiera, del \alpha,\alpha-homodímero o el \beta,\beta-homodímero.

Dos laboratorios (Lapthorn et al., 1994; Wu et al., 1994) han presentado estructuras cristalinas de alta resolución de la gonadotropina coriónica humana (hCG) por rayos X. Estas estructuras revelaron que los propuestos patrones originales de enlaces disulfuro (Mise et al., 1980 y 1981) eran incorrectos y que la hormona es un miembro de la familia de proteínas con nudos de cisteínas (Sun et al., 1995). Puesto que las posiciones relativas de las cisteínas son similares en todas las hormonas glicoproteínicas, es probable que tengan la arquitectura de nudos de cisteínas hallada en la hCG.

Las posiciones de los restos de cisteína en las subunidades \alpha de las hormonas glicoproteínicas de vertebrados son similares (Figuras 1A y 1B). Usando la subunidad \alpha de hCG como modelo, se ve que el nudo de cisteínas está formado por las cisteínas segunda, tercera, quinta, séptima, octava y novena de la subunidad \alpha. Esto crea tres grandes bucles en la subunidad \alpha (Figuras 1A y 1B). El bucle 1 es la secuencia de aminoácidos entre las cisteínas segunda y tercera; el bucle 2 es la secuencia de aminoácidos entre las cisteínas quinta y séptima de la subunidad \alpha; y el bucle 3 es la secuencia de aminoácidos entre las cisteínas séptima y octava. Las posiciones de los restos de cisteína en las subunidades \beta de las hormonas glicoproteínicas de vertebrados son similares (Pierce et al., 1981). Usando la subunidad \beta de hCG como modelo, se ve que el nudo de cisteínas está formado por las cisteínas primera, cuarta, quinta, sexta, octava y novena. Esto crea tres grandes bucles en la subunidad \beta (Figuras 2A y 2B). El bucle 1 es la secuencia de aminoácidos entre las cisteínas primera y cuarta; el bucle 2 es la secuencia entre las cisteínas quinta y sexta; y el bucle 3 es la secuencia entre las cisteínas sexta y octava. Sustituyendo porciones de la subunidad \alpha por porciones homólogas de otra subunidad \alpha o sustituyendo porciones de la subunidad \beta por porciones homólogas de otra subunidad \beta, es posible preparar quimeras funcionales de cada subunidad de hormona glicoproteínica (Campbell et al., 1991; Moyle et al., 1990; Moyle et al., 1994; Cosowsky et al., 1995; Moyle et al., 1995; Cosowsky et al., 1997). En la Figura 1C se presenta un esquema general de los elementos estructurales de las subunidades de hormonas glicoproteínicas, y en la Tabla 1A siguiente se muestra la correspondencia con subunidades de hormonas glicoproteínicas humanas por restos de aminoácido.

TABLA 1A Correspondencia de secuencias de aminoácidos de subunidades de hormonas humanas con elementos estructurales representados en la Figura 1C

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Además de su nudo de cisteínas, la subunidad \beta contiene también una secuencia denominada "cinturón de seguridad" (Lapthorn et al., 1994) que está enrollada alrededor del segundo bucle de la subunidad \alpha. El cinturón de seguridad comienza en la novena cisteína, el último resto del nudo de cisteínas de la subunidad \beta, e incluye las cisteínas décima, undécima y duodécima. Está fijado al primer bucle de la subunidad \beta por un enlace disulfuro entre la cisteína doce (es decir, en el extremo carboxílico terminal del cinturón de seguridad) y la cisteína tres (es decir, en el primer bucle de la subunidad \beta).

El cinturón de seguridad es una porción de la subunidad \beta de hCG que ejerce una significativa (si no esencial) influencia sobre la capacidad de hCG para distinguir los receptores de LH y FSH (Campbell et al., 1991; Moyle et al., 1994). La sustitución de toda la secuencia de aminoácidos del cinturón de seguridad de hCG, o de partes de ella, por la secuencia del cinturón de seguridad hallada en hFSH alteró la especificidad del compuesto hormonalmente análogo resultante en cuanto a la unión al receptor. Normalmente, la hCG se une a los receptores de LH más de 1.000 veces mejor que a los receptores de FSH o TSH. Sin embargo, compuestos análogos de hCG tales como CF94-117 y CF101-109 en que los restos 101-109 del cinturón de seguridad de hCG (es decir, Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr) están sustituidos por sus restos correspondientes de hFSH (es decir, Thr-Val-Arg-Gly-Leu-Gly-Pro-Ser-Tyr) se unían a los receptores de FSH mucho mejor que la hCG (Moyle et al., 1994). Además, manipulando la composición del cinturón de seguridad, es posible preparar compuestos análogos de hCG que tengan diversos grados de actividades LH y FSH (Moyle et al., 1994; Han et al., 1996). Éstos presentan posibles usos terapéuticos importantes para potenciar la fecundidad en machos y hembras.

La mayoría de los enlaces disulfuro intrasubunitarios de las hormonas glicoproteínicas, aunque no todos, son esenciales para sus actividades biológicas. Estudios en que se han sustituido cisteínas individuales por otros aminoácidos, notablemente alanina, han mostrado que todos los enlaces disulfuro de los nudos de cisteínas y el cinturón de seguridad son esenciales para la plegadura del heterodímero (Suganuma et al., 1989; Bedows et al., 1993; Furuhashi et al., 1994). Los restantes enlaces disulfuro entre las cisteínas 7-31 y 59-87 de la subunidad \alpha humana y entre las cisteínas 23-72 de la subunidad \beta de hCG no son esenciales para la formación del heterodímero ni para la actividad hormonal.

Hasta ahora, no hay una estructura cristalina de alta resolución que describa la interacción de una hormona glicoproteínica con su receptor. Se han creado diversos modelos en un esfuerzo para describir la estructura del complejo hormona-receptor. La mayoría de estos se basan en las estructuras cristalinas de hCG y el inhibidor de ribonucleasas, una proteína cuya estructura puede ser similar a la de los dominios extracelulares de los receptores de hormonas glicoproteínicas. La mayoría de los esfuerzos para identificar los restos hormonales que entran en contacto con el receptor se han basado en la influencia de mutaciones químicas, enzimáticas o genéticas que conducen a una reducción de la unión al receptor. Desafortunadamente, puesto que la reducción de la unión podría ser causada por la alteración de un contacto específico o por un cambio de la conformación hormonal (Cosowsky et al., 1997), es difícil, si no imposible, interpretar los efectos de estos cambios. Esto ha conducido a un considerable desacuerdo en este campo (Remy et al., 1996; Berger et al., 1996), y algunos investigadores han concluido que no es posible determinar la orientación de la hormona en el complejo del receptor (Blowmick et al., 1996).

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Otros planteamientos para determinar la orientación de la hormona en el complejo del receptor se basan en identificar regiones de la hormona que no entran en contacto con el receptor. Éstas permanecen expuestas después de que la hormona se ha unido al receptor y/o pueden ser alteradas sin interrumpir las interacciones hormona-receptor. Cuando éstas son mapeadas sobre la estructura cristalina de hCG (Lapthorn et al., 1994; Wu et al., 1994), es posible desarrollar un modelo hipotético del modo en que hCG podría interaccionar con los receptores de LH (Moyle et al., 1995). Este planteamiento sugería que el surco hormonal formado por el segundo bucle de la subunidad \alpha y los bucles primero y tercero de la subunidad \beta está implicado en el contacto primario con el receptor (Cosowsky et al., 1995). Esto también explicaría por qué son necesarias ambas subunidades para la máxima unión de hormona-receptor (Pierce et al., 1981). Los datos en que se apoya esta conclusión se discuten en los diversos párrafos siguientes. Sin embargo, ha de advertirse que, en este campo, la mayoría de los demás investigadores, si no todos, apoyan un modelo en que la hormona está orientada muy diferentemente (Remy et al., 1996; Berger et al., 1996), aun cuando estos investigadores estuvieran al corriente del modelo recién descrito (es decir, citan el artículo en que se describe el modelo en que el sitio primario de unión al receptor era creado por el surco hormonal).

Muchas porciones de la subunidad \alpha de hCG que parecen no entrar en contacto con el receptor pueden ser sustituidas sin alterar la unión con los receptores de LH. Algunas de estas regiones están claramente expuestas en el complejo hormona-receptor ya que pueden ser también reconocidas por anticuerpos monoclonales mientras la hCG está unida a los receptores de LH (Moyle et al., 1990; Cosowsky et al., 1995; Moyle et al., 1995). Por ejemplo, aunque las subunidades \alpha humana y bovina tienen secuencias de aminoácidos muy diferentes, los heterodímeros que contienen la subunidad \alpha bovina y la subunidad \beta de hCG se unen bien a receptores de LH humanos y de rata (Cosowsky et al., 1997). Éstos heterodímeros son fácilmente distinguidos por la mayoría de los anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos en los bucles 1 y 3 de la subunidad \alpha de hCG (Moyle et al., 1995). Estas observaciones muestran que las superficies de los bucles 1 y 3 de las subunidades \alpha humana y bovina difieren, y sugieren que esta región de la hormona no forma contactos esenciales clave con el receptor.

Al comparar las capacidades de anticuerpos monoclonales para reconocer compuestos análogos de hCG en que partes de la subunidad \alpha procedían de proteínas humanas o bovinas, fue posible identificar los restos clave de la subunidad \alpha que participaban en la unión a anticuerpos (Moyle et al., 1995). Algunos anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos en la subunidad \alpha de hCG también se unían a un fragmento de la subunidad \alpha que había sido preparado por digestión con tripsina y que carecía de la mayor parte del bucle segundo de la subunidad \alpha (Lapthorn et al., 1994; Wu et al., 1994; Birken et al., 1986). Esta observación fue también utilizada para determinar y/o confirmar los sitios de unión de estos anticuerpos (Moyle et al., 1995). Dos anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos de la subunidad \alpha y a los que se hace referencia como A105 y A407 (Moyle et al., 1995) se unían a hCG cuando la hormona estaba complejada con receptores de LH. De esta manera, parecía que los restos de la subunidad \alpha reconocidos por estos anticuerpos no entraban en contacto con el receptor de LH (Moyle et al., 1995). El resto de la subunidad \alpha incluye el bucle segundo de la subunidad \alpha y el extremo C de la proteína. Algunos de los restos de estas porciones muy conservadas de la subunidad \alpha pueden participar en contactos con el receptor.

Muchas porciones de la subunidad \beta de hCG que parecen no entrar en contacto con el receptor de LH (LHR; del inglés, LH receptor) pueden ser también sustituidas por mutagénesis sin alterar la unión con el receptor de LH. Esto incluye el bucle 2 de la subunidad \beta de hCG. Un compuesto análogo de hCG en que restos del bucle 2 de la subunidad \beta de hCG estaban sustituidos por los normalmente hallados en el bucle 2 de la subunidad \beta de hFSH, denominado CF39-58 (Campbell et al., 1991), fue rápidamente distinguido por anticuerpos monoclonales que reconocían restos de FSH pero no de hCG en el bucle 2 de la subunidad \beta. Esto mostraba que la estructura del bucle segundo de la subunidad difería en este compuesto análogo y en hCG. No obstante, este compuesto análogo de subunidad \beta se combinaba con la subunidad \alpha para formar un \alpha,\beta-heterodímero que interaccionaba con receptores de LH similarmente a hCG (Campbell et al., 1991). De este modo, parece que pocos restos, si acaso alguno, del bucle segundo de la subunidad \beta de hCG tienen contactos directos esenciales con el receptor de LH. Similarmente, parece que el bucle segundo de la subunidad \beta de hFSH no entra en contacto con los receptores de FSH. Se han presentado compuestos análogos de la subunidad \beta de hCG en que restos entre la décima cisteína de la subunidad \beta y el extremo C o entre los restos 94-114 estaban sustituidos por los correspondientes restos de hFSH. Estos compuestos análogos son denominados CF94-117 (Campbell et al., 1991) y CFC94-114 (Wang et al., 1994). Ambos se unen a receptores de FSH mucho mejor que a receptores de LH aun cuando contienen la secuencia entera de hCG en el bucle segundo de la subunidad \beta. Puesto que parece que el bucle segundo de la subunidad \beta de hCG ejerce una influencia mínima sobre la capacidad de la hormona para unirse a receptores de LH o FSH, parece improbable que participe en contactos esenciales de alta afinidad con el receptor de LH o FSH. Además, el bucle segundo de la subunidad \beta de hCG está situado cerca de los bucles primero y tercero de la subunidad \alpha, una porción de la subunidad \alpha que tampoco parece entrar en contacto con el receptor. De este modo, parece probable que la región entera de hCG que contiene restos de los bucles primero y tercero de la subunidad \alpha y el bucle segundo de la subunidad \beta no puede entrar en contacto con el receptor. Como se discutirá más adelante, se piensa que esta porción de la hormona se proyecta en una cavidad creada por la forma de herradura del dominio extracelular del receptor (Moyle et al., 1995).

Los restos de la subunidad \beta de hCG que no participan en contactos de alta afinidad con el receptor pueden ser también reconocidos por anticuerpos monoclonales una vez que la hormona se ha unido a receptores de LH (Campbell et al., 1991; Moyle et al., 1990; Moyle et al., 1994; Cosowsky et al., 1995). Aquellos incluyen porciones de la subunidad \beta de hCG halladas en los bucles 1 y 3 más allá de la interfase de la subunidad \alpha, que pueden ser reconocidos por anticuerpos tales como B105, B108, B111 y B112. Estos anticuerpos se unen a hCG cuando está complejada con receptores de LH (Moyle et al., 1990; Cosowsky et al., 1995), lo que demuestra que estas porciones de los bucles 1 y 3 de la subunidad \beta no tienen contactos esenciales con el receptor. Otros estudios han mostrado que es posible eliminar restos entre el extremo N y la primera cisteína y entre la duodécima cisteína y el extremo C de la subunidad \beta de hCG sin eliminar la capacidad de la hormona para unirse a receptores de LH (Huang et al., 1993). La restante porción de la subunidad \beta incluye el cinturón de seguridad. Parece que pocos de estos restos tienen contactos esenciales necesarios para la unión de alta afinidad con los receptores de LH o FSH. Por ejemplo, se halló que el cambio de los restos en el cinturón de seguridad entre las cisteínas undécima y duodécima ejercía un efecto mínimo, si acaso alguno, sobre la unión con los receptores de LH (Moyle et al., 1994). El cambio de restos entre las cisteínas décima y undécima ejercía un efecto inferior al quíntuplo sobre la unión al receptor de FSH (Moyle et al., 1994). Además, la mayor parte de los restos del cinturón de seguridad de LH equina (eLH) y CG equina (eCG) difieren de los de FSH (Pierce et al., 1981; Murphy et al., 1991); sin embargo, estas hormonas se unen bien al receptor de FSH (FSHR; del inglés, FSH receptor) de rata. En realidad, la eLH purificada se une al menos un 30% tan bien como la hFSH al receptor de FSH de rata in vitro (Moyle et al., 1994). Las porciones de la subunidad \beta de hCG que quedan por explicar incluyen las superficies de los bucles 1 y 3 que están más próximas a la interfase de la subunidad \alpha. De esta manera, son probablemente sitios de la hormona que entran en contacto con el receptor. Porciones de la subunidad \alpha pueden ser también reconocidas por anticuerpos monoclonales cuando la hCG está complejada con receptores de LH. Aquéllas incluyen restos reconocidos por los anticuerpos A105 y A407 (Moyle et al., 1995).

Otras estrategias para identificar regiones de las hormonas glicoproteínicas que interaccionan con receptores implican el uso de compuestos hormonalmente análogos que reconocen más de un receptor (Campbell et al., 1991; Moyle et al., 1994; Han et al., 1996; Campbell et al., 1997). De esta manera, fue posible preparar compuestos análogos de hCG que se unen con receptores de FSH y TSH, cambiando simplemente el cinturón de seguridad de la subunidad \beta de hCG con el hallado en hFSH (Campbell et al., 1997). Este compuesto análogo no contiene restos específicos de TSH; sin embargo, era capaz de estimular una respuesta de TSH con el mismo nivel máximo que la TSH. Comparando las actividades de varios de estos compuestos análogos multifuncionales, es posible concluir que es improbable que la mayoría de los restos del cinturón de seguridad y casi todos los del bucle segundo de la subunidad \beta formen contactos esenciales clave de alta afinidad con el receptor.

No hay comunicados sobre una estructura cristalina para el receptor de LH, de FSH ni de TSH. Sin embargo, se conocen las secuencias de aminoácidos de varios receptores de hormonas glicoproteínicas (Moyle et al., 1994; McFarland et al., 1989; Loosfelt et al., 1989; Segaloff et al., 1990; Sprengel et al., 1990; Braun et al., 1991; Nagayama et al., 1991; Nagayama et al., 1989; Jia et al., 1991). Parece que estas proteínas tienen dominios extracelulares, transmembranales e intracelulares. Cuando se expresa sin los dominios transmembranales o intracelulares (Braun et al., 1991; Ji et al., 1991; Xie et al., 1990; Moyle et al., 1991), o junto con otros dominios transmembranales (Moyle et al., 1991), se ve que el dominio extracelular contribuye a la mayor parte de la afinidad del receptor por su ligando. Los dominios extracelulares de estas proteínas son miembros de la familia de proteínas con repeticiones ricas en leucina, y parece que los dominios transmembranales tienen siete hélices hidrófobas que atraviesan la membrana plasmática (McFarland et al., 1989). Se ha determinado una estructura cristalina del inhibidor de ribonucleasas, una estructura modelo de una proteína con repeticiones ricas en leucina, y se ha mostrado que tiene forma de herradura (Kobe et al., 1993 y 1995). Este hallazgo sugería que los dominios extracelulares de los receptores de LH, FSH y TSH tienen forma de herradura (Moyle et al., 1995). Mediante el uso de quimeras de receptores de LH/FSH (Moyle et al., 1994), se han identificado porciones del dominio extracelular de los receptores de LH y FSH que controlan su especificidad de unión a hCG y hFSH. Considerando las porciones de hCG que más probablemente entran en contacto con el receptor de LH y las porciones del receptor de LH que son responsables de la especificidad de la unión a ligandos, se desarrolló un modelo que explica las capacidades de esta hormona para interaccionar con receptores de LH y provocar la transducción de señales (Moyle et al., 1995). En este modelo, el surco entre el bucle segundo de la subunidad \alpha y los bucles primero y tercero de la subunidad \beta entra en contacto con el borde del dominio extracelular del receptor próximo al centro de la herradura (Moyle et al., 1995). El resto de la hormona se proyecta en el espacio situado entre los brazos de la herradura. Cuando la hormona se une al receptor y se proyecta en este espacio, estabiliza una conformación del dominio extracelular necesaria para la transducción de señales. Ésta es conducida al dominio transmembranal mediante contactos específicos entre los dominios extracelular y transmembranal necesarios para la apropiada expresión del receptor sobre la superficie celular (Moyle et al., 1991). El modelo explica las capacidades de los oligosacáridos para influir en la transducción de señales (Moyle et al., 1975; Matzuk et al., 1989). Sin embargo, aunque el modelo puede explicar estos datos, se han propuesto otros modelos en que partes diferentes de la hCG interaccionan con los receptores (Jiang et al., 1995). Por lo tanto, no está aún claro cómo interaccionan las hormonas glicoproteínicas con sus receptores.

Esta visión de la interacción hormona-receptor también explica la inhibición de la unión de hCG por ciertos anticuerpos monoclonales que reconocen regiones de hCG de las que se piensa que no participan en contactos clave con el receptor. Como se discutió previamente, éstas incluyen la superficie hormonal formada por los bucles 1 y 3 de la subunidad \alpha y el bucle 2 de la subunidad \beta. En el modelo, estas regiones se proyectan en un espacio entre los brazos N y C terminales del dominio extracelular del receptor. La unión de anticuerpos a estos sitios evita que la hormona entre en este espacio.

Las similitudes en las posiciones de las cisteínas en las hormonas glicoproteínicas de la mayor parte de las especies de vertebrados (Pierce et al., 1981) sugieren que se plegarán como hCG. Es también probable que las estructuras de los receptores para las hormonas glicoproteínicas sean bastante comparables debido a las similitudes en las repeticiones ricas en leucina de sus dominios extracelulares y al gran número de restos conservados en sus dominios transmembranales (Moyle et al., 1994; Braun et al., 1991; Nagayama et al., 1991). Por lo tanto, parece probable que cualquier modelo que explique satisfactoriamente la interacción de hCG con los receptores de LH prediga también las capacidades de las demás hormonas glicoproteínicas para interaccionar con sus receptores. Un modo en que el cinturón de seguridad puede influir en la especificidad de la interacción de ligando-receptor sería alterar las posiciones relativas de las subunidades hormonales (Cosowsky et al., 1997). Esto cambiaría la forma del surco entre el bucle segundo de la subunidad \alpha y los bucles primero y tercero de la subunidad \beta. Se ha hecho la sugerencia de que elementos inhibidores en la hormona y el receptor son responsables de la evitación de unas inapropiadas interacciones de ligando-receptor (Moyle et al., 1994). Por lo tanto, el efecto del cinturón de seguridad sería alterar la forma de la hormona para reducir su capacidad para encajar en la porción central de la herradura.

Las hormonas glicoproteínicas tienen diversos usos terapéuticos. La FSH se utiliza para inducir el desarrollo de folículos ováricos en preparación para la inducción de la ovulación en hembras (Galway et al., 1990; Shoham et al., 1991; Gast, 1995; Olive, 1995). La LH y la hCG son también utilizadas para inducir la ovulación de folículos que han iniciado el desarrollo. La FSH, la LH y la hCG se utilizan para inducir la función testicular en machos. Aunque las hormonas existentes pueden ser utilizadas para estimular las funciones de las gónadas masculinas y femeninas y la glándula tiroides, la aplicación práctica de las hormonas para este uso requiere que sean heterodímeros. Éstos pueden ser aislados de la hipófisis (es decir, LH y FSH), el suero (gonadotropina coriónica equina), o la orina de mujeres embarazadas (hCG) o posmenopáusicas (mezclas de hLH y hFSH). Pueden también aislarse heterodímeros activos de cultivos de células que expresan tanto la subunidad \alpha como la \beta, incluyendo algunas de tumores (Cole et al., 1981) o aquellas que han sido transfectadas con cDNA o DNA genómico que codifican las subunidades \alpha y \beta (Reddy et al., 1985). En realidad, las últimas son una fuente importante de hormonas glicoproteínicas que tienen utilidad terapéutica. Puesto que se ha mostrado que los oligosacáridos de las hormonas glicoproteínicas influyen en sus capacidades para provocar la transducción de señales (Moyle et al., 1975; Matzuk et al., 1989), la preparación y la síntesis de heterodímeros activos se llevan mejor a cabo en células eucarióticas. Estas células son capaces de añadir oligosacáridos de alto contenido en manosa a oligosacáridos y, en algunos casos, procesarlos para obtener los oligosacáridos complejos que se encuentran en las hormonas naturales (Baenziger et al., 1988). Sin embargo, puesto que las células eucarióticas pueden procesar glicoproteínas diferentemente, la síntesis de hormonas glicoproteínicas es llevada frecuentemente a cabo en líneas celulares de mamífero tales como las derivadas del ovario de hámster chino (CHO; del inglés, chinese hamster ovary). Aunque las hormonas pueden generarse en células eucarióticas que no sean de mamífero, la antigenicidad potencial de las cadenas oligosacáridas limita su uso clínico.

Las hormonas heterodímeras han sido también utilizadas como inmunógenos para obtener antisueros que pueden ser utilizados para limitar la fecundidad (Singh et al., 1989; Pal et al., 1990; Talwar et al., 1986; Talwar et al., 1992; Moudgal et al., 1971 y 1972; Moudgal, 1976; Ravindranath et al., 1990; Moudgal et al., 1978). A causa de los papeles esenciales de hCG en cuanto a mantener el embarazo humano, el desarrollo de una respuesta inmune hacia hCG sería útil como un medio de anticoncepción, y se ha realizado un esfuerzo sustancial para crear una vacuna anticonceptiva basada en hCG. Sin embargo, en principio, los anticuerpos contra las hormonas podrían ser también utilizados para activar la fecundidad. Por ejemplo, parece que los niveles de LH son excesivos en ciertas mujeres que padecen la enfermedad ovárica poliquística. Por lo tanto, el desarrollo de un método que redujera pero no eliminara la actividad LH circulante sería beneficioso para el restablecimiento de la fecundidad.

Se conoce poco del metabolismo de las hormonas glicoproteínicas. Se sabe que las semividas de las hormonas están influidas por su contenido de oligosacáridos (Baenziger et al., 1988), particularmente por sus restos terminales de azúcar. Las hormonas más estables son aquellas que tienen el mayor contenido de ácido siálico en esta posición (Murphy et al., 1991; Baenziger et al., 1992; Fiete et al., 1991; Smith et al., 1993; Rosa et al., 1984). Sin embargo, los oligosacáridos no son totalmente responsables de la estabilidad de las hormonas ya que se sabe que las subunidades hormonales libres tienen semividas circulantes significativamente más cortas aún cuando tengan los mismos oligosacáridos que los heterodímeros (Wehmann et al., 1984; Kardana et al., 1991). En realidad, se ha propuesto que las hormonas pueden ser inactivadas mediante una proteolisis que conduzca a la disociación de las subunidades (Kardana et al., 1991; Birken et al., 1991; Cole et al., 1991; Cole et al., 1991; Cole et al., 1993). La hCG mellada se disociaba en sus subunidades inactivas mucho más rápidamente que la hCG (Cole et al., 1993). Por lo tanto, se espera que un procedimiento que pueda evitar o reducir la disociación de las subunidades potencie la eficacia de las hormonas.

Las subunidades de las hormonas glicoproteínicas se disocian rápidamente en condiciones desnaturalizantes que incluyen tratamiento térmico, valores extremos de pH, y urea (Pierce et al., 1981; Cole et al., 1993). Por esta razón, la mayoría de las preparaciones de hormonas glicoproteínicas son almacenadas en forma de polvos liofilizados. Un procedimiento que conduzca a una estabilidad potenciada del heterodímero puede permitir que las preparaciones de hormonas se almacenen y distribuyan en forma de disoluciones acuosas. Esto eliminaría la necesidad de incluir un diluyente separado para hormonas y la operación adicional de la reconstitución de la hormona por el usuario final.

Se han realizado varios intentos para estabilizar las hormonas por "entrelazamiento" de sus subunidades. Se han utilizado métodos de entrelazamiento químicos (Weare et al., 1979 y 1979); sin embargo, estos conducen a una actividad reducida. También es posible fusionar genéticamente las subunidades \beta y \alpha entre sí para producir una hormona de cadena única. Esta molécula es más estable que el heterodímero y tiene una elevada actividad biológica (Sugahara et al., 1995); sin embargo, es muy distinta de la molécula nativa.

Otro método para entrelazar proteínas sería atarlas por medio de un enlace disulfuro. Esta estrategia se produce naturalmente para estabilizar otras proteínas de la superfamilia con nudos de cisteínas (Sun et al., 1995) y sustituye probablemente al cinturón de seguridad. Además, la adición de enlaces disulfuro a proteínas puede potenciar su estabilidad con tal que la adición del enlace disulfuro no aumente la tensión interna en la proteína (Matthews, 1987; Matsumura et al., 1989). En la Patente Canadiense CA 2188508 se han comunicado esfuerzos para estabilizar los heterodímeros glicoproteínicos mediante un enlace disulfuro. En un comentario, Han et al. (1996) también sugieren dichos enlaces disulfuro intersubunitarios, pero en esta referencia se comunica que la introducción de dicho enlace disulfuro puede disminuir la actividad de la hormona. Esto es muy probablemente porque estos heterodímeros son proteínas complejas que tienen varios disulfuros. La adición de una cisteína a los mismos presenta la posibilidad de alterar la plegadura para dar lugar a proteínas no funcionales. Además, no es probable que se puedan utilizar otras proteínas con nudos de cisteínas como una base para predecir las posiciones de enlaces disulfuro que estabilizarían a las hormonas glicoproteínicas, ya que la organización de las subunidades en las otras proteínas con nudos de cisteínas es sustancialmente diferente de la hallada en las hormonas glicoproteínicas (Sun et al., 1995).

La mención aquí de cualquier documento no quiere decir que sea una admisión de que dicho documento es la técnica previa pertinente, ni material considerado para la patentabilidad de cualquier reivindicación de la presente solicitud. Toda afirmación relativa a un contenido o una fecha de un documento se basa en la información disponible para el solicitante en el momento de la presentación y no constituye una admisión de la exactitud de dicha afirmación.

Sumario del invento

En consecuencia, un objeto del invento es superar las deficiencias de la técnica anteriormente discutidas. Los compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas del presente invento proporcionan una estabilidad mejorada mientras conservan al menos una porción de la bioactividad de la correspondiente hormona glicoproteínica. Preferiblemente, los compuestos análogos del presente invento conservan al menos el 25% de la afinidad de la correspondiente hormona por su receptor nativo. Estos compuestos análogos del presente invento proporcionan una mejora con respecto a los compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas de la técnica anterior porque la disposición adecuadamente diseñada del enlace disulfuro intersubunitario, creado al modificar restos en una de las subunidades \alpha y \beta o en ambas, minimiza el posible impacto de los entrelazamientos intersubunitarios sobre la estructura de la hormona.

El presente inventor ha descubierto que dichos compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas mejorados cumplen preferiblemente la norma por la que los entrelazamientos intersubunitarios deben estar dispuestos en dos restos de cisteína existentes (nativos) implicados en enlaces disulfuro nativos y no más allá de las cisteínas extremas de la correspondiente subunidad nativa. Ninguno de los compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas de la técnica anterior con disulfuros intersubunitarios cumple esta norma.

Otro aspecto del presente invento es la provisión de compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas que tienen un entrelazamiento disulfuro intersubunitario entre un nudo de cisteínas de una subunidad \alpha y un nudo de cisteínas de una subunidad \beta. Esto minimiza las perturbaciones sobre la hormona glicoproteínica y permite que ésta conserve sustancialmente la actividad de estimular un receptor gonadotropínico poseída por la correspondiente hormona nativa, mientras confiere una estabilidad mejorada. Esta característica tampoco es descrita ni sugerida por la técnica anterior.

Otros aspectos del presente invento son la provisión de compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas que tienen un entrelazamiento disulfuro intersubunitario entre un resto de cisteína situado en el bucle 3 de la subunidad \alpha y un resto de cisteína situado en el bucle 2 de la subunidad \beta o entre el bucle 1 de la subunidad \alpha y el bucle 2 de la subunidad \beta. Esto también limita las perturbaciones sobre la hormona glicoproteínica y permite que conserve una porción de la actividad de estimular un receptor gonadotropínico poseída por la correspondiente hormona nativa, mientras confiere una estabilidad mejorada. Esta característica tampoco es descrita ni sugerida por la técnica anterior.

Cuando se preparan en una composición farmacéutica, los compuestos análogos del presente invento pueden ser utilizados para tratar la esterilidad o para limitar la fecundidad en un paciente que lo necesite. Los heterodímeros de los compuestos análogos del presente invento son estables en cuanto al transporte y el almacenamiento en forma de formulación farmacéutica líquida.

El presente invento proporciona además moléculas de DNA recombinante que contienen secuencias de nucleótidos que codifican las subunidades \alpha y \beta de un compuesto análogo de hormona glicoproteínica, moléculas de DNA recombinante que pueden ser vectores de expresión. También se proporcionan células huésped eucarióticas transformadas con dichas moléculas de DNA recombinante y se usan dichas células en un procedimiento para preparar los compuestos análogos del presente invento.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1C muestran la estructura de la subunidad \alpha de hCG (Figura 1A) junto con su secuencia de aminoácidos según el código de una sola letra (Figura 1B) y un esquema general de los elementos estructurales de las subunidades de las hormonas glicoproteínicas (Figura 1C). Como puede verse en la Figura 1A, el nudo de cisteínas divide la subunidad en tres grandes bucles. Los bucles 1 y 3 se muestran en la parte superior. Adviértase que las líneas negras se refieren a los átomos C\alpha de la cadena principal de aminoácidos mientras que las líneas grises se refieren a los enlaces disulfuro. Las líneas de la Figura 1B se han dibujado para ilustrar los enlaces disulfuro. Los elementos estructurales de la subunidades de las hormonas glicoproteínicas, como se enumeran en la Tabla 1A, se muestran en la Figura 1C de forma esquemática.

Las Figuras 2A y 2B muestran la estructura de la subunidad \beta de hCG (Figura 2A) junto con su secuencia de aminoácidos según el código de una sola letra (Figura 2B). Como puede verse en la Figura 2A, el nudo de cisteínas divide la subunidad \beta en tres grandes bucles. El bucle 2 se muestra la parte superior. El pequeño bucle del lado derecho de la figura se halla en el cinturón de seguridad. Los restos positiva y negativamente cargados de esta región son importantes para las actividades LH y TSH, respectivamente. Los restos mostrados que conectan este pequeño bucle con el bucle 1 de la subunidad \beta, vistos yendo desde el pequeño bucle del cinturón de seguridad hacia abajo, hasta el resto de la subunidad \beta, ejercen una influencia principal sobre la unión a los receptores de FSH y TSH. Adviértase que las líneas negras se refieren a los átomos C\alpha de la cadena principal de aminoácidos mientras que las líneas grises se refieren a los enlaces disulfuro. Las líneas de la Figura 2B se han dibujado para ilustrar los enlaces disulfuro.

Las Figuras 3A y 3B muestran las secuencias de aminoácidos traducidas de \alpha (Figura 3A) y \alphaC7S (Figura 3B) codificados por los plásmidos pSVL-\alpha, pCI-\alpha, pSVL-\alphaC7S y pC7-\alphaC7S. Puesto que cada proteína traducida tiene la misma secuencia líder, se espera que ambas sean procesadas del mismo modo para crear proteínas que consisten en 92 aminoácidos y que tienen una secuencia de aminoácidos N-terminal que comienza con APD. El código de una sola letra usado en esta y otras figuras es: A, alanina (Ala); C, cisteína (Cys); D, ácido aspártico (Asp); E, ácido glutámico (Glu); F, fenilalanina (Phe); G, glicocola (Gly); H, histidina (His); I, isoleucina (Ile), K, lisina (Lys); L, leucina (Leu); M, metionina (Met); N, asparagina (Asn); P, prolina (Pro); Q, glutamina (Gln); R, arginina (Arg); S, serina (Ser); T, treonina (Thr); V, valina (Val); W, triptófano (Trp); e Y, tirosina (Tyr). La letra mayúscula indica la posición de la sustitución de Cys7 por serina que formaba C7S.

Las Figuras 4A y 4B muestran las secuencias de aminoácidos traducidas de hCG\beta' (Figura 4A) y hCG\beta'Y37C (Figura 4B) codificados por los plásmidos pSVL-hCG\beta' y pSVL-hCG\beta'C7S. Puesto que cada uno tiene la misma secuencia líder, se espera que ambos sean procesados del mismo modo para crear proteínas que consisten en 145 aminoácidos y que tienen una secuencia de aminoácidos N-terminal que comienza con SKE. La letra mayúscula se refiere a la posición de la mutación de Tyr37 a cisteína.

La Figura 5 muestra la influencia de la mutación C7S en la subunidad \alpha sobre la unión de los anticuerpos monoclonales A113 y A407 anti-subunidad \alpha. hCG recombinante preparada en estructura celular (rhCG) y los compuestos análogos indicados debajo de cada pareja de barras y cuyas estructuras se describen en los Ejemplos, fueron sometidos a inmunoensayos de tipo sándwich empleando B112 como anticuerpo de captura y A113 o A407 radioyodados como anticuerpos de detección. B112 reconoce un epítopo que contiene restos del bucle 3 de la subunidad \beta; A113 reconoce epítopos que comprenden restos del bucle 1 de la subunidad \alpha; y A407 reconoce epítopos que comprenden restos del extremo N de la subunidad \alpha y una parte diferente del bucle 1 de la subunidad \alpha. Los epítopos para A407 y A113 no solapan ya que ambos pueden unirse a hCG al mismo tiempo. La barra situada a la derecha de cada pareja se refiere al ensayo B112/A407. La barra situada a la izquierda se refiere al ensayo B112/A113. Como se ve aquí, la mutación de C7S producía un efecto mucho mayor sobre la unión de A407 que sobre la unión de A113.

La Figura 6 muestra la unión de hCG(\alpha31-\beta37) al receptor de LH. Esta figura ilustra las capacidades de rhCG preparada en cultivo celular (triángulos derechos), hCG purificada de orina (cuadrados) y hCG(\alpha31-\beta37) preparada en cultivo celular (triángulos invertidos), para inhibir la unión de ^{125}I-hCG a 200.000 células CHO que expresan receptores de LH. Los valores en ordenadas se refieren a la cantidad de hCG radiomarcada que estaba unida a las células al final de la incubación. Este ensayo mostró que hCG(\alpha31-\beta37) se unía a los receptores de LH de forma similar a hCG.

La Figura 7 muestra la actividad de hCG(\alpha31-\beta37) en cuanto a la transducción de señales del receptor de LH e ilustra las capacidades de rhCG y hCG(\alpha31-\beta37) para provocar la acumulación de AMP cíclico en 200.000 células CHO que expresan receptores de LH. La producción de AMP cíclico en respuesta a una estimulación hormonal es un parámetro muy reconocido de transducción de señales. Este ensayo mostró que hCG(\alpha31-\beta37) estimulaba la acumulación de AMP cíclico de forma similar a hCG.

La Figura 8 muestra las estabilidades térmicas de hCG y compuestos análogos de hCG que contienen un enlace disulfuro intersubunitario. Se incubaron cantidades similares de hCG y de compuestos análogos a 85°C durante los intervalos indicados en abscisas. Las muestras fueron enfriadas y fueron sometidas a un inmunoensayo de tipo sándwich empleando el anticuerpo A113 anti-subunidad \alpha de hCG (captura) y el anticuerpo B112 radioyodado anti-subunidad \beta de hCG (detección) para determinar la cantidad de heterodímero que quedaba. Los valores en abscisas se refieren a la cantidad de actividad que queda en este ensayo con respecto a la cantidad de partida de hCG antes del calentamiento. Este ensayo mostró que la hCG es rápidamente destruida a 85°C, mientras que los compuestos análogos entrelazados conservaban sus actividades durante al menos 20 minutos.

La Figura 9 muestra la estabilidad de hCG y de compuestos análogos entrelazados frente a la disociación con urea. Se ilustra la influencia de urea 8 M sobre rhCG y los compuestos análogos de hCG entrelazados, identificados en la parte superior de cada carril. Es bien sabido que el tratamiento de hCG con urea 8 M provoca la disociación de sus subunidades, un hallazgo aquí confirmado. Como puede verse, el tratamiento de los compuestos análogos entrelazados con urea 8 M no provocaba la disociación de la subunidades, lo que habría dado lugar a la pérdida de la banda correspondiente al heterodímero. En la parte izquierda de la figura se indican las posiciones del heterodímero y de la subunidad \beta libre. Después de la electroforesis de las muestras tratadas con urea y no tratadas, se sometieron las proteínas del gel a electrotransferencia sobre nitrocelulosa, se bloquearon los restantes sitios proteicos inespecíficos de la superficie de la nitrocelulosa y se detectaron el dímero y la subunidad \beta libre utilizando B105 radioyodado.

Las Figuras 10A y 10B muestran las secuencias de aminoácidos traducidas de CFC101-114\beta' (Figura 10A) y CFC101-114\beta'Y37C (Figura 10B) codificados por los plásmidos pSVL-CFC101-114\beta y pSVLCFC101-114\betaY37C, según el código de aminoácidos de una sola letra. Puesto que cada uno tiene la misma secuencia líder, se espera que ambos sean procesados del mismo modo para crear proteínas que consisten en 145 aminoácidos y que tienen una secuencia de aminoácidos N-terminal que comienza con SKE. La posición de la letra mayúscula indica la posición de la mutación de Tyr37 a cisteína. Las secuencias subrayadas proceden de la subunidad \beta de hFSH. Los codones para los restos Arg95-Ser96 forman un sitio BglII y aquellos para Val102-Arg103-Gly104 forman un sitio SstII.

La Figura 11 muestra la influencia de los disulfuros \alpha31-\beta37 y \alpha51-\beta99 sobre la unión de los anticuerpos monoclonales A113 y A407 anti-subunidad \alpha con un compuesto análogo quimérico de hCG/hFSH bifuncional. hCG y los compuestos análogos de CFC101-114 indicados debajo de cada pareja de barras y cuyas estructuras se describen en los Ejemplos, fueron sometidos a inmunoensayos de tipo sándwich empleando B112 como anticuerpo de captura y A113 o A407 radioyodados como anticuerpos de detección. B112 reconoce un epítopo que contiene restos del bucle 3 de la subunidad \beta; A113 reconoce epítopos que comprenden restos del bucle 1 de la subunidad \alpha; y A407 reconoce epítopos que comprenden restos del extremo N de la subunidad \alpha y una parte diferente del bucle 1 de la subunidad \alpha. Los epítopos para A407 y A113 no solapan ya que ambos pueden unirse a hCG al mismo tiempo. La barra situada a la derecha de cada pareja se refiere al ensayo B112/A407. La barra situada a la izquierda se refiere al ensayo B112/A113. Como
se ve aquí, ni el disulfuro \alpha31-\beta37 ni el \alpha51-\beta99 restablecieron la actividad de unión de A407 con CFC101-114.

La Figura 12 muestra las estabilidades térmicas de hCG, CFC101-114, y compuestos análogos de CFC101-114 que contienen un enlace disulfuro intersubunitario. Se incubaron hCG, CFC101-114 y compuestos análogos de CFC101-114 a 85°C durante los intervalos indicados en abscisas. Las muestras fueron enfriadas y fueron sometidas a un inmunoensayo de tipo sándwich empleando el anticuerpo A113 anti-subunidad \alpha de hCG (captura) y el anticuerpo B112 radioyodado anti-subunidad \beta de hCG (detección) para determinar la cantidad de heterodímero que quedaba. Los valores en abscisas se refieren a la cantidad de actividad que queda en este ensayo con respecto a la cantidad de partida de hCG antes del calentamiento. Este ensayo mostró que hCG y CFC101-114 son rápidamente destruidos a 85°C,
mientras que los compuestos análogos entrelazados conservaban una actividad sustancial durante al menos 20 minutos.

La Figura 13 muestra las capacidades de hCG, CFC101-114 y compuestos análogos de CFC101-114 para estimular la acumulación de AMP cíclico en células que expresan receptores de LH. Esta figura ilustra que la potencia de CFC101-114(\alpha31-\beta37) (triángulos negros) era al menos tan grande como la de CFC101-114 (símbolos blancos) en ensayos diseñados para comparar sus capacidades para estimular la transducción de señales del receptor de LH. Aunque CFC101-114(\alpha51-\beta99) también estimulaba la transducción de señales, su potencia era menor que la de CFC101-114 o de CFC101-114(\alpha31-\beta37). Por lo tanto, por contraste con las mutaciones requeridas para preparar el disulfuro \alpha51-\beta99, las mutaciones necesarias para preparar el disulfuro \alpha31-\beta37 no influyeron en la transducción de señales. Es bien sabido que el cinturón de seguridad influye en la especificidad de la unión al receptor. Por consiguiente, los datos de esta figura apoyan la idea de que la introducción de disulfuros en regiones hormonales de las que se piensa que no participan en contactos con el receptor ni en la especifidad de unión ejercerá una influencia mínima sobre la unión al receptor o la transducción de señales. Por lo tanto, las regiones de la hormona que no entran en contacto con el receptor y/o no contribuyen a la especifidad de la unión al receptor serán sitios preferidos para la preparación de heterodímeros entrelazados por enlaces disulfuro.

La Figura 14 muestra las capacidades de hFSH, CFC101-114 y CFC101-114(\alpha31-\beta37) para estimular la acumulación de AMP cíclico en células que expresan receptores de FSH. Esta figura ilustra que la respuesta semimáxima de CFC101-114(\alpha31-\beta37) (triángulos negros) era similar a la de CFC101-114 (símbolos blancos) en ensayos diseñados para comparar sus capacidades para estimular la transducción de señales del receptor de FSH. La actividad de CFC101-114(\alpha51-\beta99) era mucho menor que la de CFC101-114 o de CFC101-114(\alpha31-\beta37). Por lo tanto, por contraste con las mutaciones requeridas para preparar el disulfuro \alpha51-\beta99, las mutaciones necesarias para preparar el disulfuro \alpha31-\beta37 ejercían una influencia mínima sobre la transducción de señales inducida por FSH. Es bien sabido que el cinturón de seguridad influye en la especificidad de la unión al receptor. Por consiguiente, los datos de esta figura apoyan la idea de que la introducción de disulfuros en regiones hormonales de las que se piensa que no participan en contactos con el receptor ni en la especifidad de unión ejercerá una influencia mínima sobre la unión al receptor de FSH o la transducción de señales. Por lo tanto, las regiones de la hormona que no entran en contacto con el receptor y/o no contribuyen a la especifidad de la unión al receptor serán sitios preferidos para la preparación de heterodímeros entrelazados por enlaces disulfuro.

Las Figuras 15A y 15B muestran las secuencias de aminoácidos traducidas de \alphaKSIC (Figura 15A) y hCG\betaD99C (Figura 15B) codificados por los plásmidos pSVL-\alphaK51C y pSVL-hCG\beta'D99C. Puesto que cada proteína basada en la subunidad \alpha de hCG y cada proteína basada en la subunidad \beta de hCG tiene la misma secuencia líder de péptido señal que las subunidades \alpha y \beta de hCG, se espera que sean procesadas del mismo modo. De esta manera, sería de esperar que \alphaK51C contuviera 92 restos de aminoácido que contuvieran la secuencia N-terminal APD y sería de esperar que hCG\beta'D99C contuviera 145 restos de aminoácido que contuvieran la secuencia N-terminal SKE. El código de aminoácidos de una sola letra aquí usado ha sido definido en la leyenda para las Figuras 3A y 3B. La letra mayúscula se refiere a las posiciones de las mutaciones que se realizaron para formar el enlace disulfuro intersubunitario.

La Figura 16 muestra las capacidades relativas de hCG, representada como una línea continua con círculos, y hCG(\alpha51-\beta99), representada como una línea discontinua con triángulos derechos, para inhibir la unión de hCG radiomarcada a células CHO que expresan receptores de LH.

La Figura 17 muestra las capacidades relativas de hCG, representada como una línea continua con cuadrados, hCG(\alpha-\betaD99C), representada como una línea discontinua con triángulos invertidos, hCG(\alpha51-\beta99), representada como una línea discontinua con triángulos derechos, y hCG(\alphaK51c-\beta), representada como una línea discontinua con rombos, para inhibir la unión de hCG radiomarcada a células CHO que expresan receptores de LH.

La Figura 18 muestra las capacidades relativas de hCG, representada como una línea continua con círculos, y hCG(\alphaK51A-\beta), representada como una línea discontinua con triángulos invertidos, para competir con hCG radiomarcada por unirse a células CHO que expresan receptores de LH.

La Figura 19 muestra las actividades relativas de hCG, representada como una línea continua con círculos, hCG(\alpha51-\beta99), representada como una línea discontinua con cuadrados blancos, hCG(\alpha-\betaD99C), representada como una línea discontinua con triángulos derechos, y hCG(\alphaK51C-\beta), representada como una línea discontinua con círculos, en cuanto a la transducción de señales del receptor de LH.

La Figura 20 muestra las actividades relativas de hCG, representada como una línea continua con círculos, y hCG(\alphaK51A-\beta), representada como una línea discontinua con cuadrados blancos, en cuanto a la transducción de señales del receptor de LH.

La Figura 21 muestra las secuencia de aminoácidos traducida codificada por el plásmido pSVL-CFC101-114\beta'
D99C. Puesto que esta proteína traducida tiene la misma secuencia señal que la subunidad \beta de hCG, se espera que sea procesada del mismo modo y conduzca a una proteína secretada de 145 aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal SKE. La letra mayúscula se refiere a la posición de la mutación que se realizó para introducir el enlace disulfuro.

La Figura 22 ilustra las actividades relativas de hCG, representada como una línea continua, CFC101-114, representada como una línea discontinua con triángulos derechos, CFC101-114(\alpha51-\beta99), representada como una línea discontinua con triángulos invertidos, CFC101-114(\alpha-\betaD99C), representada como una línea discontinua con rombos negros, y CFC101-114(\alphaK51C-\beta), representada como una línea discontinua con rombos blancos, en cuanto a la unión al receptor de LH.

La Figura 23 ilustra las actividades relativas de rhCG, representada como una línea continua con cuadrados, CFC101-114, representada como una línea discontinua con triángulos derechos, y CFC101-114(\alphaK51A-\beta), representada como una línea discontinua con círculos, en cuanto a la unión al receptor de LH.

La Figura 24 ilustra las actividades relativas de hCG, representada como una línea continua con círculos negros, CFC101-114, representada como una línea discontinua con cuadrados blancos, CFC101-114(\alpha-\betaD99C), representada como una línea discontinua con rombos, CFC101-114(\alphaK51C-\betaD99C), representada como un punto solitario, y CFC101-114(\alphaK51C-\beta), representada como la línea más próxima a las abscisas, en cuanto a la transducción de señales del receptor de LH.

La Figura 25 ilustra las actividades relativas de rhCG, representada como una línea continua con círculos, y CFC101-114(\alphaK51A-\beta), representada como una línea discontinua con triángulos derechos, en cuanto a la transducción de señales del receptor de LH.

La Figura 26 ilustra las capacidades relativas de hFSH, representada como una línea continua con círculos, CFC101-114, representada como una línea discontinua con cuadrados, CFC101-114(\alpha-\betaD99C), representada como una línea discontinua con triángulos derechos, CFC101-114(\alphaK51C-\betaD99C), representada como una línea continua con triángulos invertidos, y CFC101-114(\alphaK51C-\beta), representada como una línea continua con símbolos blancos, para inhibir la unión de ^{125}I-hFSH a células CHO que expresan receptores de FSH.

La Figura 27 ilustra las capacidades relativas de hFSH, representada como una línea continua con círculos, y CFC101-114, representada como una línea discontinua con símbolos blancos, para estimular la transducción de señales en células CHO que poseen receptores de hFSH. Las actividades de transducción de señales de CFC101(\alpha51-\beta99), CFC101-114(\alpha-\betaD99C) y CFC101-114(\alphaK51C-\beta) fueron demasiado pequeñas para ser detectadas en las concentraciones de compuestos análogos empleadas.

La Figura 28 ilustra las capacidades relativas de hFSH, representada como una línea continua con círculos, CFC101-114, representada como una línea discontinua con cuadrados blancos, y CFC101-114(\alphaK51A-\beta), representada como una línea discontinua con triángulos derechos, para estimular la transducción de señales en células CHO que expresan receptores de hFSH.

La Figura 29 ilustra las capacidades de hCG, representada como una línea continua con símbolos blancos, y hCG(\alpha31-\beta37, \alpha51-\beta99), representada como una línea discontinua con símbolos negros, para inhibir la unión de ^{125}I-hCG a células CHO que expresan receptores de LH.

La Figura 30 ilustra las capacidades de hCG, representada como una línea continua con triángulos invertidos, y hCG(\alpha31-\beta37, \alpha51-\beta99), representada como una línea continua con círculos, para estimular la transducción de señales en células CHO que expresan receptores de LH.

Las Figuras 31A y 31B muestran las secuencias de aminoácidos de \alphaC7S,K51C (Figura 31A) y hCG\beta'Y37C,D99C (Figura 31B) en letras minúsculas que representan el código de aminoácidos de una sola letra. La serina de la Figura 31A, que sustituye a Cys7, y las cisteínas de la Figura 31B, que sustituyen a Tyr37 y Asp99, se muestran en letras mayúsculas.

Las Figuras 32A y 32B muestran las secuencias de aminoácidos de \alphaC7A (Figura 32A), un compuesto análogo de subunidad \alpha del que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hCG, hLH, hFSH y hTSH estabilizados por un disulfuro del nudo intercisteínas entre las subunidades \alpha y \beta, y hFSH\betaY31C (Figura 32B), un compuesto análogo de subunidad \beta del que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hFSH estabilizados por un disulfuro del nudo intercisteínas entre las subunidades \alpha y \beta. Esta figura ilustra las secuencias de aminoácidos de un compuesto análogo de subunidad \alpha y un compuesto análogo de subunidad \beta de hFSH en letras minúsculas que representan el código de aminoácidos de una sola letra. Sería de esperar que la sustitución de Cys7 por alanina en la subunidad \alpha, ilustrada con letra mayúscula en la secuencia de aminoácidos de \alphaC7A, tuviera el mismo efecto que la sustitución de Cys7 por serina, como se ilustra en los Ejemplos 1 y 2. La presencia de un resto de cisteína en la posición 31 de la secuencia de hFSH\betaY31C también se ilustra con letra mayúscula. Sería de esperar que las células que expresan este compuesto análogo de subunidad \beta de FSH y \alphaC7A o el compuesto análogo de subunidad \alpha previamente identificado como \alphaC7S secretaran una proteína heterodímera entrelazada con disulfuros que tuviera actividad FSH. Esta secuencia señal de hFSH\betaY31C es idéntica a la de la subunidad \beta de hFSH y, por lo tanto, se espera que sea similarmente procesada a la subunidad \beta de hFSH. De esta manera, su secuencia N-terminal sería NSC.

La Figura 33 muestra el código genético para preparar compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas.

Las Figuras 34A y 34B muestran las secuencias de aminoácidos de \alphaV5C (Figura 34A), un compuesto análogo de subunidad \alpha del que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hCG, hLH, hFSH y hTSH estabilizados por un disulfuro intersubunitario entre las porciones N-terminales de las subunidades \alpha y \beta, y hCG\betaR8C (Figura 34B), un compuesto análogo de subunidad \beta del que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hCG estabilizados por un disulfuro intersubunitario entre las porciones N-terminales de las subunidades \alpha y \beta. Esta figura ilustra la secuencia de codificación de un compuesto análogo de un compuesto análogo de subunidad \alpha y un compuesto análogo de subunidad \beta de hCG de los que sería de esperar que, cuando fueran coexpresados, formaran un compuesto hormonalmente análogo entrelazado por disulfuros que tuviera actividad LH. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas y sus secuencias señal se ilustran según el código de una sola letra. La letra mayúscula ilustra las posiciones de las mutaciones necesarias para formar el disulfuro intersubunitario.

La Figura 35 muestra la secuencia de aminoácidos de hFSH\beta52C, un compuesto análogo de subunidad \beta de hFSH del que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hFSH estabilizados por un disulfuro intersubunitario entre las porciones N-terminales de las subunidades \alpha y \beta, en el que Ser2 está convertido en cisteína. Sería de esperar que las células que coexpresan \alphaQ5C (previamente descrito) y hFSH\betaS2C produjeran un heterodímero entrelazado por disulfuros que tuviera una sustancial actividad FSH.

La Figura 36 muestra la secuencia de aminoácidos de hLH\betaY37C, un compuesto análogo de subunidad \beta del que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hLH estabilizados por un disulfuro del nudo intercisteínas entre las subunidades \alpha y \beta, representando las letras minúsculas el código de aminoácidos de una sola letra. La presencia de un resto de cisteína en la posición 37 se ilustra con una letra mayúscula. Sería de esperar que las células que expresan este compuesto análogo de subunidad \beta de LH y el compuesto análogo de subunidad \alpha previamente identificado como \alphaC7S o \alphaC7A secretaran una proteína heterodímera entrelazada con disulfuros que tuviera actividad LH. Esta secuencia señal de hLH\betaY31C es idéntica a la de la subunidad \beta de hLH y, por lo tanto, se espera que sea similarmente procesada a la subunidad \beta de hLH. De esta manera, su secuencia N-terminal sería SRE.

La Figura 37 muestra la secuencia de aminoácidos de hLH\betaW8C, un compuesto análogo de subunidad \beta del que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hLH estabilizados por un disulfuro intersubunitario entre las porciones N-terminales de las subunidades \alpha y \beta, en el que Trp8 está convertido en cisteína. Sería de esperar que las células que coexpresan \alphaQ5C (previamente descrito) y hLH\betaW8C produjeran un heterodímero entrelazado con disulfuros que tuviera una sustancial actividad LH.

La Figura 38 muestra la secuencia de aminoácidos de hTSH\betaY30C, un compuesto análogo de subunidad \beta del que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hTSH estabilizados por un disulfuro del nudo intercisteínas entre las subunidades \alpha y \beta, representando las letras minúsculas el código de aminoácidos de una sola letra. La presencia de un resto de cisteína en la posición 30 se ilustra con una letra mayúscula. Sería de esperar que las células que expresan este compuesto análogo de subunidad \beta de TSH y los compuestos análogos de la subunidad \alpha previamente identificados como \alphaC7S o \alphaC7A secretaran una proteína heterodímera entrelazada con disulfuros que tuviera actividad TSH. La secuencia señal de hTSH\betaY31C es idéntica a la de la subunidad \beta de hTSH y, por lo tanto, se espera
que sea similarmente procesada a la subunidad \beta de hTSH. De esta manera, su secuencia N-terminal sería FCI.

La Figura 39 muestra la secuencia de aminoácidos de hTSH\betaF1C, un compuesto análogo de subunidad \beta del que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hTSH estabilizados por un disulfuro intersubunitario entre las porciones N-terminales de las subunidades \alpha y \beta, en el que PheI está convertido en cisteína. Sería de esperar que las células que coexpresan \alphaQ5C (previamente descrito) y hTSH\betaF1C produjeran un heterodímero entrelazado con disulfuros que tuviera una sustancial actividad TSH.

La Figura 40 ilustra esquemáticamente la construcción de los codones de \alphaC7S.

La Figura 41 ilustra esquemáticamente la construcción de pSVL-CFC101-114\beta'.

La Figura 42 ilustra esquemáticamente la construcción de pSVL-CFC94-114\beta'.

La Figura 43 ilustra esquemáticamente la construcción de pSVL-CFC101-106\beta'.

La Figura 44 ilustra esquemáticamente la construcción de pSVL-\alphaK51C.

La Figura 45 muestra las capacidades de hFSH y el compuesto análogo \alphaV76C + hFSH\betaV38C para estimular la acumulación de AMP cíclico en células CHO que expresan el receptor de FSH humano.

La Figura 46 muestra las capacidades de hCG y el compuesto análogo \alpha + hCG\betaR6C,Y37C para estimular la acumulación de AMP cíclico en células CHO que expresan receptores de LH.

Descripción detallada del invento

Los compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas de acuerdo con el presente invento representan mejoras con respecto a las enseñanzas generalizadas de los documentos CA 2188508 y Han et al. (1996). Los enlaces disulfuro intersubunitarios estabilizan las subunidades \alpha y \beta del heterodímero de hormona glicoproteínica. Los compuestos análogos mejorados son diseñados específicamente para reducir la perturbación de la estructura tridimensional de la hormona, creándose por ello una probabilidad mayor de que el dímero se forme in vivo y de que el dímero formado tenga afinidad por los receptores nativos y tenga actividad agonista sobre ellos.

Mediante las expresiones "compuesto análogo" y "compuestos análogos", como se utilizan aquí, se quiere significar una hormona glicoproteínica seleccionada entre gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona luteinizante humana (hLH), hormona estimulante del folículo humana (hFSH), hormona estimulante del tiroides humana (hTSH) y muteínas funcionales de las mismas, en que las secuencias de aminoácidos de sus subunidades \alpha y \beta son modificadas para crear cisteínas libres en cada una de las subunidades, cisteínas que forman enlaces disulfuro intersubunitarios estabilizando por ello el heterodímero.

Mediante los términos "muteína" y "muteínas", como se usan también aquí, se quiere hacer referencia a hormonas glicoproteínicas hCG, hLH, hFSH y hTSH que están modificadas, pero no modificadas para crear enlaces disulfuro intersubunitarios, y que conservan sustancialmente (al menos el 80%) su actividad biológica funcional, tal como, por ejemplo, afinidad por el receptor y potencia hormonal, reconocimiento por anticuerpos, o aumento de su afinidad o especificidad hacía una hormona glicoproteínica diferente, tal como puede ocurrir con hormonas glicoproteínicas quiméricas, se afirme expresamente o no que estas muteínas son funcionales.

Para generar muteínas de hormonas glicoproteínicas, la proteína puede ser modificada por cualquier medio reconocido en la técnica. Por conveniencia, las modificaciones se dividen en las alcanzables mediante la expresión, en una célula huésped adecuada, de un(os) gen(es) modificado(s) que codifica(n) la proteína modificada, que serán denominadas "mutaciones", y aquellas que no, que serán denominadas "derivatizaciones".

Aunque los derivados se preparan normalmente sintetizando primero la molécula líder y luego derivatizándola, pueden ser también preparados directamente. Sin embargo, en el término "derivados" está implícito que sea técnicamente factible obtener el derivado por modificación de la molécula líder aun cuando no sea éste el método de producción preferido.

Las modificaciones de proteínas pueden ser clasificadas del modo siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

Favorables

- {}\hskip0.1cm estas modificaciones potencian la utilidad de una proteína para un uso concreto.

Neutras

- {}\hskip0.1cmestas modificaciones no potencian ni disminuyen la utilidad de una proteína para un uso{}\hskip0,4cmconcreto.

Desfavorables

- {}\hskip0.1cm estas modificaciones disminuyen, pero no necesariamente eliminan, la utilidad de una pro-{}\hskip0,4cmteína para un uso concreto.

Inactivantes

- {}\hskip0.1cm estas modificaciones eliminan la utilidad de una proteína para un uso concreto.

Tolerables

- {}\hskip0.1cm estas modificaciones son favorables, neutras o desfavorables, pero no inactivantes.

\vskip1.000000\baselineskip

Puesto que una proteína puede tener más de un uso, es posible que una modificación sea favorable para un uso, desfavorable para un segundo, neutra para un tercero e inactivante para un cuarto.

En general, el efecto de las modificaciones sobre la idoneidad de la proteína será discutido para usos que son específicos, en mayor o menor grado, de la estructura específica de la proteína, en vez de para aquellos que sólo dependen de la composición de aminoácidos, el peso molecular o las propiedades físicas groseras de la proteína.

Una proteína puede ser modificada por una diversidad de razones, incluyendo uno o más de los fines siguientes:

\bullet

hacer la molécula más detectable, como en el caso de derivados radiomarcados, enzimáticamente marcados y fluorescentemente marcados;

\bullet

hacer la molécula más estable con respecto a un agente físico, químico o biológico particular, tal como el calor, la luz, agentes oxidantes, agentes reductores y enzimas;

\bullet

hacer la molécula más soluble en un disolvente de interés, por ejemplo, para facilitar su administración, o menos soluble, por ejemplo, para facilitar su precipitación o permitir su uso en la captura de otra molécula;

\bullet

limitar la naturaleza de las reacciones en que la molécula puede participar, por ejemplo, colocando grupos protectores sobre cadenas laterales de aminoácidos, o, por el contrario, ampliar las reacciones posibles, por ejemplo, colocando un grupo reactivo sobre la molécula para facilitar una subsiguiente reacción de copulación;

\bullet

hacer la molécula menos (o más) inmunogénica;

\bullet

aumentar (o disminuir) el tiempo que permanece la molécula en un órgano o tejido particular si es administrada a un sujeto, o acelerar (o lentificar) su llegada a un órgano o tejido particular;

\bullet

potenciar (o disminuir) una o más de sus actividades biológicas o inmunológicas, tal como, por ejemplo, aumentar o disminuir su afinidad por un receptor, o alterar su especificidad;

\bullet

conferir una nueva actividad que complemente una actividad previa (por ejemplo, la fijación de una toxina a un anticuerpo antitumoral); e

\bullet

inhibir un efecto secundario indeseable de la molécula.

La mayoría de los restos de una proteína pueden tolerar cierto grado de mutación. Las mutaciones pueden tomar la forma de sustituciones, inserciones o deleciones únicas o múltiples. Preferiblemente, las inserciones o deleciones se dirigen a los extremos de la molécula, o a bucle superficiales o límites interdominios.

No hay un máximo preferido con respecto a una inserción en un extremo, la cual es más apropiadamente denominada "adición" o "fusión". Es rutinario fusionar una proteína con otra para facilitar la expresión, o proporcionar una proteína de fusión que tenga las actividades biológicas combinadas de sus componentes. Una proteína de fusión puede ser útil como un precursor, el cual puede ser escindido para liberar una proteína activa aún cuando la propia proteína de fusión carezca de actividad.

Con respecto a la deleción en un extremo, la cual es más apropiadamente denominada "truncamiento", la finalidad de la modificación es importante. Es rutinario truncar ampliamente una proteína cuando sólo se está interesado en sus propiedades inmunológicas. Se puede extraer de una proteína un epítopo de tan sólo cinco aminoácidos y usarlo solo para obtener una respuesta de células T o conjugado con copias de sí mismo o con un portador inmunogénico para obtener una respuesta de células B. Cuando es una actividad biológica la que debe ser conservada, los límites del truncamiento pueden ser más restrictivos.

Preferiblemente, después de considerar sustituciones y cualesquier deleciones e inserciones internas, la secuencia del mutante es al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 80%, idéntica a la de la proteína original.

Es más probable que una proteína tolere una mutación que

(a)

sea una sustitución en lugar de una inserción o deleción;

(b)

sea una inserción o deleción en los extremos en vez de internamente, o, si fuera internamente, en un bucle o un conector interdominios;

(c)

afecte a un resto superficial en vez de a un resto interior;

(d)

afecte a una parte de la molécula distal con respecto al sitio de unión;

(e)

sea una sustitución de un aminoácido por otro de tamaño, carga y/o hidrofobia similares; y

(f)

sea en un sitio que está sujeto a una variación sustancial entre los miembros de una familia de proteínas homólogas a la que pertenece la proteína de interés.

Estas consideraciones pueden ser utilizadas para diseñar mutantes funcionales.

Preferiblemente, para los restos del armazón, y más preferiblemente para la cadena completa, la estructura 3D predicha o experimentalmente determinada de la proteína modificada tiene una conformación de cadena principal (carbono C\alpha) cuya desviación cuadrática media de la estructura 3D predicha o experimentalmente determinada de la proteína original es preferiblemente inferior a 5 \ring{A}, más preferiblemente inferior a 3 \ring{A}, aún más preferiblemente inferior a 2 \ring{A}, muy preferiblemente inferior a 1 \ring{A}.

La determinación de la estructura 3D de una proteína puede proporcionar una considerable orientación a quien busca modificar esa proteína con un fin útil, o al menos para evitar las modificaciones inactivantes. Si se conoce la estructura 3D total, el profesional sabe qué restos están en la superficie y cuáles están en el interior, qué restos tienen cadenas laterales que apuntan hacia el exterior, qué restos están estrechamente apilados y cuáles no, dónde es flexible la cadena y dónde está forzada, qué restos están en estructuras secundarias, qué restos están próximos como resultado de la plegadura de la cadena, y cuáles pueden estar interaccionando en forma de enlaces de H y puentes salinos.

Es más probable que sean toleradas las mutaciones en restos superficiales que en restos internos. Las mutaciones en las últimas posiciones tienen un mayor potencial para desestabilizar la proteína, desnaturalizando por ello la proteína y afectando a todas sus actividades ligantes. La mutación en un resto superficial puede no afectar en absoluto a la actividad ligante o puede afectar a ciertas actividades pero no a otras. En cualquier caso, es improbable que dichas mutaciones desnaturalicen la proteína.

Los métodos principales para determinar la estructura 3D completa de una proteína son la cristalografía por rayos X y la espectroscopía por resonancia magnética nuclear, y el obstáculo principal para obtener datos de difracción de rayos X de alta resolución es la operación de cristalización. La estructura cristalina de alta resolución de hCG se puede obtener de dos laboratorios (Lapthorn et al., 1994; Wu et al., 1994) y sirve como modelo para hLH, hFSH y hTSH.

En el caso de proteínas más pequeñas, preferiblemente con un tamaño inferior a 20 kDa, la espectroscopía por resonancia magnética nuclear (NMR; del inglés, nuclear magnetic resonance) permite también elucidar la estructura 3D. Para uso de la determinación de estructuras por NMR, véase McIntosh et al. (1987). La NMR puede también proporcionar información parcial acerca de la estructura de proteínas más grandes. Las regiones de una proteína más grande que son de especial interés pueden ser producidas separadamente, mediante técnicas de DNA recombinante o mediante una proteolisis controlada, y ser luego estudiadas por NMR.

Diversos cambios espectrales acompañan a la alteración de la carga del ambiente de ciertos aminoácidos. Si los aminoácidos triptófano, tirosina, fenilalanina e histidina son desplazados a un ambiente menos polar, aumentan \lambdamax y \varepsilon. Por lo tanto, si son mayores para uno de estos aminoácidos en un disolvente polar, luego para el aminoácido libre en el mismo disolvente, el resto debe estar enterrado y rodeado por aminoácidos apolares. Además, si el espectro de una proteína es sensible a cambios en la polaridad del disolvente, el aminoácido en cuestión debe estar en la superficie. Para dar otro ejemplo, para aminoácidos, \lambdamax y \varepsilon siempre aumentan si un grupo valorable (por ejemplo, el OH de la tirosina, el imidazol de la histidina y el SH de la cisteína) está cargado. Por consiguiente, correlacionando los cambios espectrales con cambios de pH, se puede deducir si el grupo valorable está en la superficie o está enterrado. Los restos de grietas profundas pueden ser distinguidos de aquellos que están completamente en la superficie, o están completamente enterrados, por comparación de los resultados con disolventes cuyas moléculas tienen diferentes diámetros medios.

Además de ser útiles para determinar la posición de restos concretos, estas técnicas espectroscópicas pueden ayudar a resolver ambigüedades en los análisis por rayos X y NMR.

Pueden utilizarse marcadores de afinidad química específicos de aminoácidos para descubrir qué restos están realmente expuestos. Es probable que los marcadores más útiles sean aquellos que reaccionan con restos cargados, ya que es muy probable que estos aparezcan en la superficie. Los marcadors de muestras incluyen los siguientes:

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Aminoácido	Marcador de afinidad
Asp, Glu	diazocompuestos (con aa no ionizados) o epóxidos (con aa ionizados)
Lys	ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico; anhídridos acético, succínico, maleico y citracónico
Arg	ciclohexanodiona, hidrazina

\vskip1.000000\baselineskip

Las proteínas marcada y no marcada son luego separadamente sometidas a un reactivo de fragmentación tal como bromuro de cianógeno, pepsina, papaína, quimotripsina, tripsina o ácido yodosobenzoico. Los péptidos que resultan de la escisión de la proteína marcada son comparados con los que proceden de la proteína nativa, usando una electroforesis bidimensional. Se secuencian los péptidos que tienen una movilidad alterada y se determinan los aminoácidos modificados.

Adachi et al. (1989) usaron reactivos específicos para Arg y Lys, para explorar el papel de estos restos en las actividades de la superóxido dismutasa extracelular, tanto catalítica como ligante de heparina. Hallaron que la modificación de estos restos daba lugar a una disminución de estas actividades; sin embargo, no intentaron discernir qué restos habían sido modificados.

Los restos superficiales pueden ser también identificados por medio de marcadores de fotoafinidad que, tras una exposición a luz, forman productos intermedios muy reactivos, por ejemplo, nitrenos y carbenos. Estas especies son capaces de insertarse en enlaces C-H y, por lo tanto, pueden reaccionar con cualquier aminoácido accesible. Por esta razón, la marcación de fotoafinidad ha sido utilizada para estudiar la topografía de membranas. Algunas proteínas se extienden en la periferia de la membrana, otras son parte integral de ella.

Otro ejemplo de un reactivo de marcación inespecífico es el tritio. Una proteína plegada puede ser tritiada (mediante intercambio de hidrógeno con agua tritiada), desnaturalizada y fragmentada, y los fragmentos pueden ser secuenciados y ser analizados en cuanto a la presencia de tritio (que es radiactivo).

Todos éstos métodos de marcación pueden ser también utilizados para determinar si ciertos restos, además de estar en la superficie, son parte de un sitio de unión. La distribución del marcador obtenida cuando se marca la proteína libre es comparada con la obtenida cuando se marca la proteína complejada. Puesto que, en el complejo, la pareja ligante ocluye los restos del sitio de unión de la proteína ligante, los restos del sitio de unión deberían estar marcados en la proteína libre y no en la proteína complejada.

En general, en familias de proteínas con una secuencia y una función similares, es más probable que varíen los restos superficiales que los restos interiores. Esto es más probable porque es improbable que los restos superficiales estén implicados en interacciones con otros restos que son necesarios para mantener la conformación global de la proteína.

El método más fiable para identificar los restos superficiales de una proteína es determinar la estructura 3D de la proteína mediante difracción de rayos X. Incluso una estructura 3D incompleta puede ser útil para diseñar mutantes. Los restos con movilidad elevada, según es evidenciado por un factor térmico cristalográfico superior al medio, son los menos susceptibles a mutaciones desestabilizantes. Véase Alber et al. (1987).

Aunque pueden hacerse muchas sustituciones de aminoácidos en posiciones superficiales sin efectos negativos, las sustituciones en posiciones internas tienden a ser gravemente desestabilizantes. Dentro de familias de proteínas homólogas, los restos más conservados, aparte de los aminoácidos funcionales, son aquellos que están enterrados.

La principal contribución a la energía libre de la plegadura proteica y, por lo tanto, a la estabilidad proteica, proviene del enterramiento de cadenas laterales hidrófobas en el interior, enterramiento que las protege del disolvente. Las densidades de empaquetamiento son típicamente elevadas. En general, la capacidad de una proteína para tolerar mutaciones que alteren el volumen de restos centrales depende más del cambio neto en el volumen total de restos centrales que de la magnitud de los cambios en los volúmenes individuales de los restos. En otras palabras, un aumento del volumen de una posición central puede compensar una disminución del volumen de otra posición central. Preferiblemente, el cambio neto en el volumen total de restos centrales no es superior a 10%, mas preferiblemente no superior a 5%. Véanse Lim et al. (1989); Lim et al. (1992).

En ausencia de una evidencia contraria, puede suponerse que todos los restos identificados como restos interiores son parte de un único núcleo. Sin embargo, si es probable que la proteína se pliegue para formar diversos núcleos distintos, la anteriormente expresada regla de conservación del volumen debería ser aplicada separadamente a cada núcleo.

La composición del núcleo enterrado de una proteína depende no sólo de la tendencia de cada aminoácido, si está presente, a enterrarse sino también de la frecuencia global de aparición de ese aminoácido en la proteína. Los restos más comúnmente enterrados son, en orden descendente, Val, Gly, Leu, Ala, Ile y Ser.

Lime et al. (1992) comunicaron que la sustitución de un solo aminoácido hidrófobo (Leu, Val) del núcleo de la proteína por un aminoácido hidrófilo (Asn, Gln) evitaba la plegadura completa de la proteína y destruía la actividad biológica.

Hay una probabilidad superior al 70% de que Cys (forma -S-S-), Asp, Gly, His, Pro y Trp enterrados permanezcan inalterados en una proteína homóloga. Por lo tanto, si estos restos se encuentran en una posición enterrada en la proteína de interés, es preferible dejarlos inalterados. Su conservación es probablemente explicable del modo siguiente: Cys (formación de enlaces disulfuro), Asp (cargado, pero cadena lateral rígida), Gly (flexibilidad de cadena), His (tanto el estado cargado como el no cargado son asequibles al pH fisiológico), Pro (geometría única de cadena) y Trp (cadena lateral más larga).

Hay una probabilidad de 40-60% de que los demás restos, con la excepción de Met, permanezcan inalterados cuando están enterrados (Met está inalterado sólo el 26% de las veces, pero hay una probabilidad de 25% de que sea sustituido por Leu).

Las siguientes probabilidades de sustitución de restos enterrados sobrepasan el 10%:

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Ala\rightarrowVal, Glu\rightarrowGln, Phe\rightarrowLeu, Ile\rightarrowLeu, Ile\rightarrowVal,

Lys\rightarrowArg, Leu\rightarrowIle, Leu\rightarrowVal, Met\rightarrowLeu, Met\rightarrowVal,

Asn\rightarrowAsp, Asn\rightarrowSer, Arg\rightarrowLys, Arg\rightarrowGln, Ser\rightarrowAla,

Thr\rightarrowSer, Val\rightarrowIle, Val\rightarrowLeu, Tyr\rightarrowPhe, Cys(-SH)\rightarrowAla.

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Estas otras sustituciones tienen probabilidades en el intervalo 5-10%:

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Ala\rightarrowSer, Asp\rightarrowAsn, Glu\rightarrowArg, Glu\rightarrowVal, Phe\rightarrowIle,

Phe\rightarrowVal, Phe\rightarrowTyr, His\rightarrowVal, Leu\rightarrowPhe, Met\rightarrowAla,

Met\rightarrowIle, Gln\rightarrowGlu, Gln\rightarrowHis, Gln\rightarrowMet, Ser\rightarrowGly,

Ser\rightarrowThr, Thr\rightarrowVal, Val\rightarrowAla, Trp\rightarrowPhe, Tyr\rightarrowLeu, Cys(-SH)\rightarrowSer.

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Véase Overington et al. (1992), Tabla 5.

Parece que los grupos de intercambio más consistentes son (Arg, Lys), (Leu, Ile, Met, Val, Phe) y (Ser, Thr, Ala). Sin embargo, parece que Ala y Val son bastante promiscuos.

Por lo tanto, en general, es preferible evitar totalmente las mutaciones de restos enterrados. Sin embargo, si son mutados, se debería limitar el cambio global del volumen del núcleo y, muy preferiblemente, se debería limitar la mutación a la sustitución de un resto por otro cuya probabilidad típica de sustitución exceda de cero, más preferiblemente sea al menos 5% y muy preferiblemente sea al menos 10%. Debería evitarse la mutación de Cys (-S-S-), Asp, Gly, His, Pro y Trp enterrados, ausente una justificación por otra evidencia. Las mutaciones más seguras en el núcleo son intercambios de un aminoácido hidrófobo por otro y de Arg por Lys (o viceversa).

No obstante, puede utilizarse una mutación juiciosa en restos internos para mejorar la estabilidad de la proteína. Dichas mutaciones podrían introducir interacciones estabilizantes adicionales (enlaces de hidrógeno, pares iónicos) compatibles con la estructura nativa, o podrían reducir la movilidad de grupos interaccionantes próximos al sustituir aminoácidos más pequeños por mayores o cadenas secundarias lineales por ramificadas o aromáticas. Véase Alber et al. (1987).

Más importantemente, además de las anteriormente discutidas generalizaciones sobre modificaciones a restos de las hormonas glicoproteínicas, hay una considerable cantidad de información disponible sobre regiones de las hormonas glicoproteínicas (hCG en particular) que pueden o no estar expuestas tras la unión a un receptor de hormona glicoproteínica y que no alteran las interacciones de hormona-receptor, es decir, la afinidad por el receptor y la potencia de la hormona. Dicha información disponible sobre restos y regiones que se pueden modificar con seguridad se presenta en la sección "Descripción de la técnica relacionada", así como en otra parte de la presente memoria descriptiva. En consecuencia, a partir de la riqueza de datos sobre estructura y función que aquí se presentan y que están disponibles en la bibliografía científica, está bien dentro de la experiencia en la técnica el hacer modificaciones en las secuencias de aminoácidos de las hormonas glicoproteínicas que no alteren la función de éstas.

Además, se pretende que las muteínas funcionales de las hormonas glicoproteínicas abarquen hormonas glicoproteínicas quiméricas en que uno o más restos o regiones de una hormona glicoproteínica, es decir, el cinturón de seguridad de la subunidad \beta, están sustituidos por un(os) correspondiente(s) resto(s) o región(es) de otra hormona glicoproteínica que, por ejemplo, pueden cambiar la especificidad de la unión al receptor. En la presente memoria descriptiva se discuten algunos ejemplos de restos y regiones que afectan a la especificidad de la unión al receptor, etc.

Se pretende además que las muteínas de las hormonas glicoproteínicas abarquen hormonas glicoproteínicas de cadena sencilla en que las subunidades \alpha y \beta son traducidas como una cadena sencilla y correctamente plegadas en su conformación heterodímera.

Más adelante se esboza un procedimiento que puede ser utilizado para identificar restos que tienen el potencial para formar enlaces disulfuro. Como se demostrará en los ejemplos siguientes, no todos los heterodímeros de hCG estabilizados por enlaces disulfuro ni sus compuestos análogos conservan su potencia biológica completa. Sin embargo, la introducción de un disulfuro intersubunitario entre los nudos de cisteínas tiene la capacidad de aumentar la estabilidad de la proteína sin alterar la potencia hormonal.

Pueden prepararse compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas entrelazados por enlaces disulfuro de acuerdo con el presente invento al crearse cisteínas libres en cada una de las subunidades, cisteínas que pueden entrelazarse para formar uno o más enlaces disulfuro intersubunitarios. Esto puede ser llevado a cabo sustituyendo los codones para uno o más aminoácidos por aquellos para cisteína o sustituyendo el codón para un resto de cisteína de un enlace disulfuro existente por un codón para cualquier otro aminoácido. Sin embargo, sería de esperar que no todas las citadas sustituciones crearan enlaces disulfuro intersubunitarios. Se ilustran aquí dos de los factores que deberían considerarse a la hora del diseño de los compuestos análogos.

1)

Se espera que los compuestos análogos de hormona glicoproteínica entrelazados por disulfuro más útiles tengan una estructura similar a la de hCG, hLH, hFSH o hTSH. De esta manera, el disulfuro no debería deformar groseramente la conformación global de la proteína. Las posiciones de los disulfuros de las que se espera que ejerzan la menor influencia perturbadora sobre la conformación de la proteína pueden ser pronosticadas a partir de los datos de la Tabla 1B que ilustran las distancias aproximadas entre los átomos de carbono C\alpha y C\beta de restos de aminoácido seleccionados de la subunidad \alpha de hCG (columna izquierda de cada pareja de columnas) y uno o más restos próximos de la subunidad \beta de hCG (columna derecha de cada pareja de columnas). Estos valores pueden ser calculados a partir de la estructura cristalina de hCG mediante cualquiera de los diversos sistemas de modelado molecular bien conocidos y amplia y públicamente disponibles, que incluyen Sybyl, Insight, Rasmol y Kinemage por citar algunos. Las distancias entre restos de aminoácido de la subunidad \alpha de hCG y uno o más restos próximos de la subunidad \beta de hCG, además de las mostradas en la Tabla 1B, pueden ser fácilmente calculadas a partir de los datos publicados sobre la estructura cristalina de hCG (Lapthorn et al., 1994; Wu et al., 1994).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1B Distancias aproximadas entre átomos de carbono C\alpha y C\beta de restos seleccionados de las subunidades \alpha y \beta de hCG

2

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El valor izquierdo de cada pareja de valores presentada entre paréntesis, asociado con cada resto de la subunidad \beta, muestra la distancia entre el átomo de carbono C\alpha de ese resto de la subunidad \beta y el correspondiente resto de la subunidad \alpha de la columna izquierda. El valor derecho de cada pareja de valores presentada entre paréntesis muestra la correspondiente distancia entre los átomos de carbono C\beta de estos restos. En principio, sustituir estas parejas de restos por cisteínas permitiría la formación de un enlace disulfuro intersubunitario con tal que no estuviera presente ninguna otra cisteína interferente en cualquier subunidad. No todas las parejas de cisteínas tendrían una probabilidad igual de formar un disulfuro intersubunitario. La formación de un disulfuro intersubunitario del que se espera que ejerza la mínima influencia sobre la conformación del heterodímero estará influida por la orientación de los átomos de cadena lateral de sus cisteínas componentes. Las posiciones favorables y preferidas para la colocación de disulfuros incluirían parejas de aminoácidos en que la distancia entre los átomos de carbono C\beta es menor que aquélla entre sus carbonos C\alpha. Las posiciones más favorables y preferidas para la colocación de un enlace disulfuro intersubunitario son aquéllas en que las distancias entre los carbonos C\alpha y C\beta son similares a las de los disulfuros presentes en la naturaleza, es decir, aproximadamente 5,0-6,5 \ring{A} y aproximadamente 3,5-4,2 \ring{A}, respectivamente.

De esta manera, sería de esperar que las sustituciones que crean una pareja intersubunitaria de cisteínas que tienen átomos de carbono C\alpha separados 4-8 \ring{A} y átomos de carbono C\beta 1-2 \ring{A} más próximos tuvieran la mejor probabilidad de formar un disulfuro con la mínima influencia sobre la estructura proteica global y/o provocar un entrelazamiento intermolecular de dos o más moléculas. En realidad, como se muestra en los ejemplos, esta regla empírica de acuerdo con el presente invento ha sido utilizada exitosamente para crear diversos compuestos análogos de hCG entrelazados por disulfuro que conservan muchas de sus propiedades inmunológicas y hormonales.

2)

Sería de esperar que los compuestos análogos de hormona glicoproteínica entrelazados por disulfuro más activos contuvieran el entrelazamiento en sitios no necesarios para la unión al receptor ni para la transducción de señales y/o en sitios no necesarios para la estabilización de la conformación activa de la hormona. Hay un gran número de restos en las hormonas glicoproteínicas de los que se sabe que no son necesarios para sus actividades biológicas. Estos incluyen la mayoría de los restos N-terminales del nudo de cisteínas (es decir, la segunda cisteína de la subunidad \alpha nativa y la primera cisteína de las subunidades \beta nativas). Por ejemplo, se han preparado compuestos análogos de hFSH muy potentes en que estos restos de la subunidad \beta de FSH (AsnI, Ser2) estaban reemplazados por los restos correspondientes de hCG (Ser1, Lys2, Glu3, Pro4, Leu5, Arg6, Pro7, Arg8). De este modo, no sería de esperar que un disulfuro en esta región de la molécula, preparado al sustituir Gln5 de la subunidad \alpha y Arg8 de la subunidad \beta de hCG por cisteínas, eliminara la actividad LH del heterodímero entrelazado por disulfuro. Similarmente, no sería de esperar que un disulfuro preparado al sustituir Gln5 de la subunidad \alpha y Ser2 de la subunidad \beta de hFSH por cisteínas eliminara la actividad FSH del heterodímero entrelazado por disulfuro. Cambiando Cys31 de la subunidad \alpha por Ala o Ser y sustituyendo Arg6 de la subunidad \beta de hCG por Cys o añadiendo una Cys al extremo N de la subunidad \beta de FSH, se espera que pueda crearse un disulfuro en la región N-terminal de las subunidades \alpha y \beta de hCG o hFSH. No sería de esperar que este disulfuro alterara la actividad de ningún compuesto hormonalmente análogo.

La estructura cristalina de hCG reveló que cada una de sus subunidades está compuesta de un nudo de cisteínas. Por lo tanto, cada subunidad contiene tres bucles denominados \alpha1, \alpha2, \alpha3 y \beta1, \beta2, \beta3. Además, la subunidad \beta tiene 20 aminoácidos adicionales, conocidos como "cinturón de seguridad", que rodean a \alpha2 para asegurar el heterodímero y estabilizarlo en una conformación que permita la unión con su receptor único. Las posiciones de las cisteínas en lutropinas, folitropinas y tirotropinas sugieren que las tres moléculas tienen un patrón de plegadura global similar y que la estructura cristalina de hCG es una guía razonable para introducir disulfuros intersubunitarios. Sin embargo, las estructuras de FSH y TSH no han sido determinadas y sólo pueden ser inferidas a partir de la estructura de hCG. Las estructuras cristalinas de los nudos de cisteínas de cada subunidad muestran que estos son muy similares. Esto es porque están muy forzados por sus tres enlaces disulfuro componentes. De esta manera, se espera que los restos existentes dentro de, y adyacentes a, los nudos de cisteínas tengan conformaciones similares en cada hormona. Además, hay una cisteína en los bucles \beta1 y \beta3 en posiciones similares en las tres clases de hormonas. Aquéllas forman un disulfuro en hCG y sería de esperar que formasen un disulfuro en todas las hormonas glicoproteínicas. Este disulfuro y el amplio número de enlaces de hidrógeno dentro de, y entre, los átomos de la cadena principal de estos bucles de hCG sugieren que las conformaciones de \beta1 y \beta3 serán muy similares en las tres clases de hormonas. Los bucles \alpha1 y \alpha3 contienen también varios enlaces de hidrógeno, lo que sugiere que esta porción de la molécula también será similar en las tres clases de hormonas. Esta visión viene apoyada por la observación de que la estructura de la subunidad \alpha libre por NMR muestra que \alpha1 y \alpha3 tienen conformaciones similares incluso cuando no están en el heterodímero (DeBeer et al., 1996). Aunque las porciones restantes de las tres clases de hormonas tienen una conformación casi seguramente similar a la de hCG, no es probable que estén tan estrechamente relacionadas con la estructura de hCG como las porciones de las moléculas recién discutidas. Por ejemplo, \beta2 contiene relativamente pocos enlaces de hidrógeno internos y/o contactos con \alpha1 y \alpha3. Puesto que no parece que esté muy forzado en hCG, no hay razón para creer que su estructura sea completamente idéntica a la existente en las otras hormonas. En realidad, el bucle \beta2 de TSH es 2 restos de aminoácido más grande que el de hCG o hFSH. Los extremos N- y C-terminales de \alpha2 participan en amplios contactos por enlaces de hidrógeno, y porciones del extremo C-terminal de \alpha2 también entran en contacto con \beta1. Por lo tanto, estas partes de \alpha2 podrían ser similares en la mayoría de las hormonas. Sin embargo, la porción central de \alpha2 sólo entra en contacto con el cinturón de seguridad, una región de la proteína que no está bien conservada en las tres clases de hormonas. La estructura de la subunidad \alpha por NMR mostró que \alpha2 está muy desordenada, una observación que sugiere que esta parte de la hormona hCG tiene una estructura bien ordenada en el heterodímero sólo porque está intercalada entre \beta1, \beta3 y el cinturón de seguridad. Sería de esperar que diferencias en el cinturón de seguridad alterasen la conformación de \alpha2, particularmente de aquellas porciones no situadas cerca del nudo de cisteínas.

El presente inventor ha obtenido ideas relativas a la influencia del cinturón de seguridad sobre la estructura de las hormonas usando sondas inmunológicas para estudiar compuestos análogos de hCG que tienen la capacidad para unirse a receptores de lutropina y folitropina. Éstos datos sugieren que la composición del cinturón de seguridad puede alterar la conformación de la hormona. Datos similares también sugieren que la conformación de la hormona puede estar influida por el receptor. Por ejemplo, se han utilizado anticuerpos monoclonales cuyos sitios ligantes han sido parcialmente determinados (Moyle et al., 1990; Moyle et al., 1995), para estudiar la conformación de un compuesto análogo de hCG bifuncional (CFC101-109) cuando está libre y cuando está unido a receptores de LH y FSH. Se preparó CFC101-109 sustituyendo los restos 101-109 del cinturón de seguridad de hCG por los restos 95-103 del cinturón de seguridad de hFSH (Moyle et al., 1994). La capacidad de CFC101-109 para ser reconocido por anticuerpos monoclonales mostró que la presencia de los restos de FSH en el cinturón de seguridad alteraba la interacción entre las dos subunidades. De esta manera, A407, un anticuerpo contra un epítopo conformacional que incluía restos del extremo N-terminal de la subunidad \alpha de hCG pero no de hFSH, tenía una afinidad muy reducida hacia CFC101-109 aun cuando su epítopo está alejado del sitio de la mutación (Tabla 1C). La influencia del receptor sobre la estructura hormonal fue vista por el hecho de que A407 reconocía CFC101-109 cuando estaba unido a receptores de LH pero no cuando estaba unido a receptores de FSH (Tabla 1D). Otros anticuerpos que reconocen epítopos situados completamente en \alpha1 y/o \alpha2 o en \beta1 y/o \beta3 reconocían CFC101-109 incluso cuando estaba combinado con receptores.

Tomadas en su conjunto, estas observaciones sugieren que las posiciones de las subunidades en las hormonas pueden no ser idénticas y pueden estar influidas por interacciones con sus receptores. Por lo tanto, el presente inventor ha determinado que, además de considerar las posiciones y orientaciones relativas de posibles sustituciones de cisteína, obtenidas de la estructura cristalina de hCG, se debería también considerar la probabilidad de que la estructura cristalina de hCG represente las estructuras de folitropinas y tirotropinas y/o la conformación de la hormona en el complejo hormona-receptor. Las porciones de las hormonas que son más probablemente idénticas a las de hCG y son menos probablemente alteradas durante la interacción con el receptor incluyen las de restos de, o próximas a, el nudo de cisteínas.

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TABLA 1D Unión de anticuerpos radiomarcados a hCG o CF101-109 complejado con el LHR de rata o el FSHR humano

4

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La región entre los nudos de cisteínas es uno de los sitios más atractivos para construir un enlace disulfuro y es un sitio preferido para un enlace disulfuro intersubunitario. El nudo de cisteínas de cada subunidad está estabilizado por tres disulfuros lo que le hace una de las partes más rígidas de la molécula. Los resultados del laboratorio del presente inventor indican que el cambio del resto Tyr37 de la subunidad \beta de hCG ejercía relativamente poca influencia sobre la actividad de la hormona. Por lo tanto, el presente inventor no espera que la presencia de una cisteína en este sitio altere la actividad de la hormona. En la patente canadiense CA 2188508 no se describe que un disulfuro intersubunitario entre los nudos de cisteínas de las subunidades \alpha y \beta estabilice un heterodímero gonadotropínico y conserve la actividad hormonal. Como se muestra en los presentes ejemplos, un modo en que puede llevarse esto a cabo es sustituyendo el resto Cys7 de la subunidad \alpha por Ala o Ser para alterar el disulfuro intrasubunitario Cys7-Cys31, y sustituyendo el Tyr37 de la subunidad \beta de hCG por Cys. El compuesto análogo entrelazado de hCG que se produjo tenía una elevada actividad LH. Similarmente, en otro ejemplo no restrictivo, fue posible preparar un compuesto análogo entrelazado de CFC101-114, una quimera de hCG/hFSH en que los restos de aminoácido 101-114 de la subunidad \beta de hCG estaban sustituidos por sus correspondientes restos de hFSH (es decir, los restos 95-108 de la subunidad \beta). CFC101-114 se une a, y activa, tanto receptores de LH como de FSH. El compuesto análogo entrelazado por disulfuro era también capaz de unirse a, y activar, tanto receptores de LH como de FSH. La última observación muestra que este disulfuro no evita la actividad del receptor de FSH, lo que hace muy probable que un disulfuro similar en hFSH tampoco destruya su actividad hormonal. La preparación de una hFSH entrelazada por disulfuro podría ser llevada a cabo haciendo que se coexpresara el cDNA de la subunidad \alpha en que Cys7 está convertida en Ala, y el cDNA de la subunidad \beta de hFSH en que Tyr31 está convertida en Cys. Como una realización preferida, puede también producirse un enlace disulfuro entre los nudos de cisteínas con otro enlace disulfuro intersubunitario de otra parte, tal como entre el bucle 2 de \alpha y el cinturón de seguridad de \beta o entre el extremo N de \alpha y el extremo N de \beta. Además, los enlaces disulfuro formados entre los nudos de Cys de las subunidades \alpha y \beta liberarían un resto cerca del extremo N, es decir, \alphaCys7Ser, que puede ser ventajosamente utilizado para PEGilación (fijación de cadenas de polietilenglicol).

Un enlace disulfuro intersubunitario situado entre los nudos de cisteínas de las subunidades \alpha y \beta puede también cumplir la regla general de minimizar el posible impacto de los entrelazamientos intersubunitarios sobre la estructura hormonal al situar ambas posiciones de entrelazamiento en dos restos de cisteínas existentes (nativas) implicadas en enlaces disulfuro nativos y no más allá, es decir, más N-terminal o C-terminal, de la cisteína nativa más N-terminal o C-terminal (la unidad de cisteína extrema de la correspondiente subunidad nativa), como un medio para minimizar el riesgo de perturbaciones estructurales. Ninguno de los disulfuros intersubunitarios descritos y enseñados en la la Patente Canadiense CA 2188508 cumple esta regla general.

Sería también de esperar que los compuestos hormonalmente análogos entrelazados por un disulfuro entre el bucle 1 ó 3 de la subunidad \alpha y el bucle 2 de la subunidad \beta que no cumplen la regla general anteriormente descrita conservasen actividad hormonal. Estas regiones son muy sensibles a las sustituciones de aminoácidos. De esta forma, la sustitución de la subunidad \alpha humana de hCG o hFSH por la subunidad \alpha bovina no elimina normalmente la actividad hormonal aun cuando las subunidades \alpha bovina y humana difieren significativamente en esta región. Asimismo, las sustituciones en masa de restos de hCG por restos de hFSH y viceversa en el bucle 2 de la subunidad \beta no eliminaban la actividad de ningún hormona. Por lo tanto, no sería de esperar que disulfuros en esta región alterasen la actividad biológica de lutropinas o folitropinas. Estos disulfuros incluyen los creados al cambiar Gln27 de la subunidad \alpha y Val44 de la subunidad \beta de hCG o hLH o Val38 de la subunidad \beta de hFSH por Cys. También incluyen los disulfuros preparados al cambiar Val76 de la subunidad \alpha y Val44 de la subunidad \beta de hCG o Val38 de la subunidad \beta de hFSH por Cys. Otro compuesto análogo entrelazado por disulfuro intersubunitario del que se espera que conserve una actividad sustancial es uno que tiene un resto Lys75 de la subunidad \alpha y un resto Gln46 de la subunidad \beta de hCG o hLH o un resto Lys40 de la subunidad \beta de hFSH convertidos en Cys. Sin embargo, el último compuesto análogo estaría menos positivamente cargado que hCG o hFSH y, por lo tanto, su actividad LH o FSH global podría ser pequeña. También es posible insertar disulfuros intersubunitarios en otras regiones de lutropinas y folitropinas. Algunos de estos disulfuros afectan a restos del cinturón de seguridad de la subunidad \beta (es decir, creados por sustitución de Asp99 de la subunidad \beta de hCG por Cys) y el bucle 2 de la subunidad \alpha (es decir, creados por sustitución de Lys51 de la subunidad \alpha por Cys). Este disulfuro reducía significativamente la actividad LH de hCG y las actividades LH y FSH del compuesto análogo bifuncional CFC101-114. Las posiciones de los restos de hLH, hFSH y hTSH que pueden ser mutados a cisteína con la excepción de que produzcan un enlace disulfuro puede ser determinadas a partir de las posiciones "equivalentes" de los restos de las subunidades \alpha y \beta de estas proteínas, como se definen en las
Tablas 2-4.

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La información de la Tabla 2 puede ser usada para calcular los restos que ocupan posiciones "equivalentes" en cada subunidad \beta de hormona humana. Sólo se dispone de estructuras cristalinas para hCG. Sin embargo, a causa de las elevadas similitudes en las secuencias de aminoácidos de todas las hormonas glicoproteínicas, notablemente en sus disulfuros intrasubunitarios, se espera que todas las hormonas tengan formas similares. La conclusión de que la conformación global de todos los heterodímeros es similar a la de hCG se apoya además en la observación de que es posible preparar quimeras de hCG/hFSH, hCG/hLH y hCG/hTSH que conservan epítopos hallados en regiones de los progenitores usados para obtener las quimeras. Por lo tanto, se espera que la sustitución de restos equivalentes como los definidos en esta tabla conduzca a enlaces disulfuro intersubunitarios que tengan propiedades similares a los que se han preparado y caracterizado. Las posiciones "equivalentes" se definen en un eje vertical. De esta manera, en la subunidad \beta de hFSH, la cisteína 3 es "equivalente" a la cisteína 9 de la subunidad \beta de hCG.

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La información de la Tabla 3 puede ser usada para calcular los restos que ocupan posiciones "equivalentes" en cada subunidad \alpha de hormona. Sólo se ha informado de la estructura cristalina de hCG. A causa de las elevadas similitudes en las secuencias de aminoácidos de todas las hormonas glicoproteínicas, notablemente en sus disulfuros intrasubunitarios, se espera que las hormonas de todas las especies tengan formas similares. Esta idea se apoya también en la observación de que es posible preparar quimeras de subunidad \alpha humana/bovina que conservan epítopos hallados en regiones de los progenitores encontrados en las quimeras. Por lo tanto, se espera que la sustitución de restos equivalentes como los definidos en esta tabla conduzca a enlaces disulfuro intersubunitarios que tengan propiedades similares a los que se han preparado y caracterizado.

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La información de la Tabla 4 puede ser utilizada para calcular los restos que ocupan posiciones "equivalentes" en cada una de las subunidades \beta de vertebrados.

Los Ejemplos del presente invento enseñan cómo pueden introducirse enlaces disulfuro en hormonas glicoproteínicas y compuestos análogos capaces de unirse a receptores de LH, FSH y/o TSH. La presencia de enlaces disulfuro intersubunitarios potenciaba las estabilidades de hCG y de un compuesto análogo de hCG que tiene unas actividades FSH y TSH significativas. Por lo tanto, se espera que la adición de disulfuros intersubunitarios también estabilice otros miembros y compuestos análogos relacionados de esta familia de hormonas. Cuando se sitúan en sitios de la hormona que no están implicados en la unión al receptor ni en la especificidad de la unión al receptor, los disulfuros no impiden la función hormonal. En realidad, ciertos disulfuros intersubunitarios pueden potenciar la función de compuestos hormonalmente análogos. Con una excepción (Blithe et al., 1.991), las subunidades hormonales están casi desprovistas de actividad endocrina. Por lo tanto, es probable que los procedimientos que estabilizan el heterodímero prolonguen las actividades biológicas de estas hormonas, y de ellos se espera que potencien su utilidad terapéutica.

El método para mejorar la estabilidad de hormonas glicoproteínicas heterodímeras de acuerdo con el presente invento implica identificar los restos que pueden ser sustituidos con objeto de crear cisteínas libres en cada una de las subunidades, cisteínas libres que tienen un elevado potencial para formar un enlace disulfuro intersubunitario que mejore la estabilidad del heterodímero sin deformar la conformación global de la proteína hormonal. La sustitución de los restos para crear las cisteínas libres en cada una de las subunidades puede ser llevada a cabo a nivel genético sustituyendo los correspondientes codones en las secuencias de nucleótidos de las subunidades \alpha y \beta. Se cultivan células huésped transformadas con moléculas de DNA recombinante que llevan las secuencias de nucleótidos modificadas que codifican las subunidades \alpha y \beta, operativamente enlazadas a una secuencia promotora y capaces de expresar la hormona glicoproteínica modificada, y se hace que se exprese la hormona glicoproteínica modificada a la que se hace referencia como compuesto análogo de acuerdo con el presente invento. El compuesto análogo de hormona glicoproteínica expresado es luego recuperado y es purificado de acuerdo con técnicas bien conocidas en el campo de la purificación de hormonas glicoproteínicas.

A nivel genético, los compuestos análogos de hormona glicoproteínica de acuerdo con el presente invento son generados mediante cualquier adecuada mutagénesis dirigida al sitio, bien conocida en la técnica, tal como describen Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience (New York, EE.UU., 1987-1997), Capítulo 8 sobre mutagénesis de DNA clonado. Esta publicación Current Protocols in Molecular Biology, incorporada aquí por referencia, es un ejemplo de un texto de referencia estándar en que se exponen los principios generales de la tecnología de DNA recombinante.

Las secuencias de nucleótidos que codifican las subunidades \alpha y \beta del compuesto análogo de hormona glicoproteínica, según están contenidas en una molécula de DNA recombinante, pueden ser insertadas en apropiados vectores de expresión capaces de expresar los compuestos análogos en células huésped. Para ser capaz de expresar el compuesto análogo de hormona glicoproteínica, un vector de expresión debería tener secuencias de nucleótidos específicas que contuvieran una información reguladora de la transcripción y la traducción, unidas al DNA que codifica las subunidades de tal modo que permitiera la expresión génica y la producción del compuesto análogo de hormona glicoproteínica. En primer lugar, para que el gen sea transcrito, debe ir precedido por un promotor reconocible por RNA polimerasa, al cual se une la polimerasa e inicia así el proceso de transcripción.

Se dice que un DNA es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de nucleótidos que contienen información reguladora de la transcripción y la traducción y dichas secuencias están "operativamente unidas" a secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido. Una unión operativa es una unión en que las secuencias de DNA reguladoras y la secuencia de DNA que se busca expresar están conectadas de un modo tal que permite la expresión génica. Las regiones reguladoras necesarias para la expresión génica incluyen, en general, una región promotora así como las secuencias de DNA que, una vez transcritas a RNA, darán la señal para el inicio de la síntesis proteica. Dichas regiones incluirán normalmente las secuencias 5' no codificadoras implicadas en el inicio de la transcripción y la traducción. Hay una diversidad de promotores de uso común para la expresión proteica de alto nivel en sistemas celulares de mamíferos e insectos.

Las moléculas de DNA recombinante que contienen las secuencias de nucleótidos que codifican las subunidades \alpha y \beta de los compuestos análogos del invento, y las señales reguladoras de la transcripción y la traducción operativamente unidas, pueden ser insertadas en un vector o vectores que expresen transitoriamente las subunidades en células huésped o sean capaces de integrar las secuencias génicas deseadas en el cromosoma de la célula huésped. Con objeto de poder seleccionar las células que tienen establemente integrado en sus cromosomas el DNA introducido, se utilizan uno o más marcadores que permiten la selección de las células huésped que contienen el vector de expresión. El marcador puede proporcionar prototrofia a un huésped auxótrofo, resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos o metales pesados, tal como el cobre, o similares. El gen marcador seleccionable puede ser directamente unido a las secuencias génicas de DNA que se van a expresar o puede ser introducido en la misma célula por cotransfección. Puede que también se necesiten elementos adicionales para una síntesis óptima de mRNA. Estos elementos pueden incluir señales de corte y empalme, así como promotores de la transcripción, potenciadores, y señales de terminación. Los vectores de expresión de cDNA que llevan incorporados dichos elementos incluyen los descritos por Okayama (1.983).

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Los vectores de expresión que son capaces de expresar transitoriamente un nivel elevado de la proteína deseada cuando se transfectan células huésped eucarióticas con ellos son bien conocidos en la técnica y, generalmente, son públicamente asequibles o comercialmente asequibles de proveedores de biología molecular (por ejemplo, el plásmido pcDM8 es asequible de Invitrogen, San Diego, California, EE.UU., el plásmido pSVL es asequible de Pharmacia, Piscataway, New Jersey, EE.UU., el plásmido pCI es asequible de Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU., etc.). Una vez que se ha preparado para expresión el vector o la secuencia de DNA que contiene la(s) construcción(es), puede introducirse el vector de expresión en una célula huésped apropiada mediante una diversidad de medios adecuados, tales como transformación, transfección, lipofección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, etc.

Las células huésped eucarióticas pueden ser células de mamífero, por ejemplo células de ser humano, de mono (células COS), de ratón y de ovario de hámster chino (CHO), porque proporcionan modificaciones postraduccionales a moléculas proteicas, incluyendo una correcta plegadura, una correcta formación de enlaces disulfuro y también una glicosilación en sitios correctos. Sin embargo, las células de insecto, por ejemplo, con baculovirus, pueden sobreproducir polipéptidos y pueden llevar también a cabo modificaciones peptídicas postraduccionales, incluyendo glicosilación. La expresión ectópica de proteínas en células COS, CHO y de insecto es bien conocida en la técnica, y pueden utilizarse adecuadamente protocolos, tales como los proporcionados por Ausubel et al. (1987-1997), secciones 16.9-16.14, para la expresión de proteínas en células de insecto usando vectores baculovíricos y en células de mamíferos. Las células huésped transformadas que expresan las subunidades \alpha y \beta de un compuesto análogo de hormona glicoproteínica pueden ser cultivadas para que produzcan el compuesto análogo.

Las células huésped transformadas que expresan las subunidades \alpha y \beta de un compuesto análogo de hormona glicoproteínica pueden ser cultivadas para que produzcan el compuesto análogo de hormona glicoproteínica, el cual puede ser luego recuperado y ser purificado de acuerdo con técnicas de purificación comunes y bien conocidas para hormonas glicoproteínicas. La cantidad de la hormona glicoproteínica producida puede ser cuantificada mediante un método tal como el método de inmunoensayo de tipo sándwich descrito en el Ejemplo 1. Además, pueden llevarse fácilmente a cabo, sin una experimentación excesiva, ensayos para determinar la afinidad por el receptor y la actividad biológica de los compuestos análogos de hormona glicoproteínica del presente invento, tales como los ensayos de radioligando-receptor y de transducción de señales (medición de la capacidad para unirse al receptor para provocar una respuesta de acumulación de AMP cíclico) descritos en el Ejemplo 1.

Los compuestos análogos de hormona glicoproteínica de acuerdo con el presente invento presentan varios usos terapéuticos. Se van a usar compuestos análogos de hFSH para inducir el desarrollo de folículos ováricos en preparación para la inducción de la ovulación en hembras. Se van a usar compuestos análogos de hLH y hCG para inducir la ovulación de folículos que han iniciado el desarrollo. Estos compuestos análogos se van a usar también para inducir la función testicular en machos. Además, los compuestos análogos de hormona glicoproteínica de acuerdo con el presente invento pueden ser también utilizados como inmunógenos para obtener antisueros para limitar la fecundidad, por ejemplo, una vacuna anticonceptiva. Por el contrario, podrían también usarse compuestos análogos antagonistas o anticuerpos contra los compuestos análogos de hormona glicoproteínica para activar la fecundidad, tal como cuando aparecen niveles excesivos de hLH en ciertas mujeres que padecen la enfermedad ovárica poliquística.

Es bastante útil un compuesto análogo de hormona glicoproteínica que tenga una estabilidad mejorada y que además conserve la actividad y la función biológicas, por ejemplo, afinidad por receptores de hormonas glicoproteínicas y potencia hormonal, tal como en los compuestos análogos de acuerdo con el presente invento. Los compuestos análogos de acuerdo con el presente invento no son sólo útiles para fines terapéuticos específicos sino que también proporcionan las propiedades superiores de estabilidad funcional en disolución y a temperaturas elevadas, resistencia a la desnaturalización por agentes desnaturalízantes de proteínas, tal como la urea, etc. A causa de estas propiedades de estabilidad, se espera que los compuestos análogos del presente invento tengan una semivida mejorada in vivo.

Los compuestos análogos de hormona glicoproteínica del presente invento pueden ser administrados a un paciente que lo necesite mediante cualquier medio con el que se alcance su fin previsto. Por ejemplo, la administración puede ser por diversas vías parenterales diferentes que incluyen, pero no se limitan a, las vías subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, oral, transdérmica y bucal. La administración parenteral puede ser por inyección de un bolo o por perfusión gradual a lo largo del tiempo.

Un régimen típico para prevenir, suprimir o tratar un estado asociado con depósitos amiloides o de tipo amiloide comprende la administración de una cantidad eficaz en una o múltiples dosis durante un periodo de tiempo de hasta, y que incluye, varios meses a varios años.

Se entiende que la dosificación administrada dependerá de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, la clase del tratamiento concurrente, si lo hubiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. La dosis total requerida para cada tratamiento puede ser administrada mediante dosis múltiples o mediante una sola dosis. Por "cantidad eficaz" se quiere significar una concentración de compuesto análogo de hormona glicoproteínica con la que se puede alcanzar el fin previsto. Dichas concentraciones pueden ser rutinariamente determinadas por los expertos en la técnica.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas, las cuales pueden contener agentes auxiliares o excipientes que son conocidos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos análogos de hormona glicoproteínica del presente invento incluyen todas las composiciones en que los compuestos análogos están contenidos en una cantidad eficaz para alcanzar el fin previsto. Además, las composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y agentes auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos hasta preparaciones que pueden ser usadas farmacéuticamente. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos en la técnica y son descritos en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, compilado por Alfonso Gennaro, 18ª edición, Mack Publishing Co. (Easton, Pennsylvania, EE.UU., 1990), un texto de referencia estándar en este campo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser rutinariamente seleccionados de acuerdo con el modo de administración y con la solubilidad y estabilidad de los compuestos análogos de hormona glicoproteínica. Por ejemplo, las formulaciones para administración intravenosa pueden incluir disoluciones acuosas estériles que pueden contener también tampones, agentes diluyentes y otros aditivos adecuados.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, pueden administrarse suspensiones del compuesto activo como apropiadas suspensiones oleosas para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, por ejemplo, triglicéridos u oleato de etilo. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetil-celulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también agentes estabilizadores.

Una vez descrito el invento de forma general, el mismo será fácilmente entendido por referencia a los Ejemplos siguientes que se proporcionan a modo de ilustración y con los que no se pretende limitar el presente invento.

Ejemplo 1 Hcg estabilizada por un enlace disulfuro intersubunitario entre sus nudos de cisteínas: hCG(\alpha31-\beta37)

De acuerdo con los criterios para el entrelazamiento intersubunitario por enlaces disulfuro, los datos de la Tabla 1B sugerían que sería posible preparar un compuesto análogo de hCG estabilizado por un disulfuro intersubunitario entre sus nudos de cisteínas si se creara una cisteína libre en el resto 31 de la subunidad \alpha y si se sustituyera Tyr37 de la subunidad \beta por cisteína. Esto fue llevado a cabo preparando un compuesto análogo de subunidad \beta de hCG en que Tyr37 estaba sustituido por cisteína, y un compuesto análogo de subunidad \alpha humana en que Cys7 estaba sustituido por Ser. Este último cambio alteraba el disulfuro normalmente hallado en la subunidad \alpha entre los aminoácidos Cys7 y Cys31, quedando la cisteína libre del resto 31 de la subunidad \alpha disponible para formar un enlace disulfuro con la cisteína introducida en el resto 37 de la subunidad \beta. Cuando cada una de estas construcciones subunitarias se expresaba en células de mamífero en cultivo, las cisteínas del resto 31 de la subunidad \alpha y del resto 37 de la subunidad \beta formaban un enlace disulfuro intersubunitario.

La formación del enlace disulfuro aumentaba drásticamente la estabilidad del heterodímero. A diferencia de hCG, el heterodímero entrelazado no se disociaba en presencia de urea ni de un pH bajo. Sin embargo, la capacidad de hCG(\alpha31-\beta37) para ser reconocido por la mayoría de los anticuerpos monoclonales, para unirse a receptores de LH y para provocar la transducción de señales era similar a la de hCG. Esto mostraba que la presencia del enlace disulfuro no alteraba la función hormonal.

El cambio del codón para Cys7 por un codón para serina en la subunidad \alpha fue llevado a cabo en un vector de expresión (pKBM-hCG\alpha) que ha sido descrito por Campbell et al. (1.991) y que contiene el cDNA de la subunidad \alpha de hCG. El vector pKBM es un derivado de los vectores pUC (Yanisch-Perron et al., 1985) en que el policonector había sido reemplazado por uno que contiene un sitio XhoI, y que permitía la transferencia de insertos de cDNA entre pKBM y el vector de expresión pSVL (Pharmacia, Piscataway, New Jersey, EE.UU.). Puesto que sólo hay un gen de subunidad \alpha, los cDNA para las subunidades \alpha de hCG, hLH, hFSH y hTSH contienen los mismos codones, y a este vector de expresión se hará referencia en adelante como pKBM-\alpha. Como se muestra en la Figura 40, pKBM-\alpha contiene un sitio de restricción único para la endonucleasa XhoI, 5' con respecto a la secuencia de codificación de la subunidad \alpha, y un sitio de restricción único para la endonucleasa BsmI, cerca de los codones para los aminoácidos 9-11. Se diseñaron cebadores (Oligo425 y Oligo847, Tabla 5) para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction), para agrupar esta región, cambiar el codón para Cys7 por un codón para Ser y crear un nuevo sitio de restricción para endonucleasa (BspEI) que pudiera ser utilizado para facilitar la identificación de las construcciones mutantes.

TABLA 5 Secuencias de los cebadores usados para preparar los compuestos análogos entrelazados por disulfuro

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El producto de la PCR en que se utilizaron estos cebadores y pSVL-hCG\alpha (Campbell et al., 1991) como molde fue sometido a digestión con XhoI y BsmI y fue subclonado en los sitios únicos XhoI-BsmI de pKBM-\alpha usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica (Maniatis et al., 1989).

La secuencia de un plásmido recombinante que contiene un sitio de restricción para la endonucleasa BspEI fue determinada mediante métodos didesoxi (Maniatis et al., 1989) en la región que había sido cambiada por mutagénesis basada en PCR. Este vector (pKBM-\alphaC7S) codificaba una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3. El cDNA de la subunidad \alpha modificada fue separado del vector pKBM mediante una digestión con XhoI y BamHI y fue subclonado en los sitios XhoI-BamHI de pSVL para crear pSVL-\alphaC7S, un procedimiento que permitía que se expresara \alphaC7S en células COS-7. Las secuencias de codificación fueron también insertadas en los sitios XhoI-BamHI de otro vector de expresión (pCI), obtenido de Promega (Madison, Wisconsin, EE.UU.), que había sido modificado para facilitar la subclonación de esta y otras construcciones relacionadas. La modificación de pCI implicaba separar su sitio BamHI y sustituir su policonector (es decir, sitios de restricción NheI-NotI) por un nuevo policonector que tenía los siguientes sitios de restricción para endonucleasas: NheI-XhoI-EcoRI-MluI-KpnI-XbaI-SalI-BamHI. Esto permitía la subclonación de construcciones de vectores basados en pKBM y pSVL en vectores basados en pCI separando el fragmento XhoI-BamHI que contenía la región de codificación deseada de pKBM o pSVL y ligándolo a pCI que había sido sometido a digestión con XhoI y BamHI. Con otra referencia a vectores basados en pCI se pretende aquí referirse al vector pCI modificado descrito inmediatamente antes. La transferencia de la región de codificación de la subunidad \alpha, de pSVL a pCI, creó pCI-\alpha y pCI-\alphaC7S, respectivamente, y se realizó para facilitar la expresión en células en cultivo.

No es necesario usar la sustitución de cisteína por serina para preparar un compuesto análogo de subunidad \alpha que carezca de la capacidad para formar un disulfuro entre Cys7 y Cys31. Se ha usado alanina para alterar este enlace (Furuhashi et al., 1.994), y se espera que la sustitución de Cys7 por cualquier otro aminoácido también altere el enlace disulfuro Cys7-Cys31.

La modificación de la secuencia de codificación de la subunidad \beta de hCG para sustituir el codón para Tyr37 por el codón para Cys fue llevada a cabo mediante una mutagénesis, por inserción de un casete, en el cDNA de la subunidad \beta de hCG que había sido incorporado a un vector basado en pUC y denominado pKBM-hCG\beta' (Campbell et al., 1.991). Esta construcción contiene sitios de restricción NgoMI y PstI únicos en los codones para los aminoácidos 35-36 y 45-46. El codón mutante se introdujo al sustituir el tramo corto de DNA entre los sitios NgoMI y PstI por el casete creado al hibridar Oligo845 y Oligo874 (Tabla 5). Esto también introdujo un sitio de restricción para la endonucleasa pMII que pudo ser utilizado para facilitar la identificación de los plásmidos que contenían la mutación.

La subclonación de este casete en pKBM-hCG\beta' (Campbell et al., 1991) fue llevada a cabo mediante métodos estándares bien conocidos en la técnica (Maniatis et al., 1989), y la secuencia deseada de la región mutada fue confirmada mediante los métodos didesoxi de secuenciación. Puesto que pKBM no es un vector de expresión, fue subclonado en pSVL para permitir que esta construcción de subunidad \beta se expresara en células de mamífero. Esto fue llevado a cabo tomando el trozo pequeño obtenido por digestión de pKBM-hCG\beta' con XhoI y BamHI y ligándolo con el fragmento grande que quedaba después de la digestión de pSVL con XhoI y BamHI, para crear un vector de expresión denominado pSVL-hCG\beta'Y37C. En la Figura 4 se muestran las secuencias de aminoácidos codificadas por pSVL-hCG\beta' y pSVL-hCG\beta'Y37C. Estos fueron también subclonados en el vector pCI modificado, en los sitios XhoI y BamHI.

La preparación de estas secuencias de codificación podría ser llevada también a cabo mediante procedimientos de síntesis de DNA estándares usando instrumentos comercialmente asequibles. Estos procedimientos pueden ser usados para preparar oligonucleótidos largos que pueden ser ligados entre sí del modo descrito (Campbell et al., 1992). Debería advertirse que las secuencias de codificación de DNA podrían ser también adquiridas a una de las diversas compañías que se especializan en la construcción de oligonucleótidos sintéticos y en la preparación de genes de cDNA sintéticos. Éstas incluyen Midland Certified Reagent Company, Midland, Texas, EE.UU., y Genosys Biotechnologies, Inc., The Woodlands, Texas, EE.UU. La expresión de estas subunidades puede ser llevada también a cabo en células de mamífero en cultivo (es decir, células COS-7) usando cualquiera de los diversos vectores comercialmente asequibles, tal como pSVL (Pharmacia, Piscataway, New Jersey, EE.UU.) o pCI (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.), utilizando métodos similares a los que han sido descritos (Campbell et al., 1991) y que son comunes en la técnica.

La coexpresión de pSVL-\alpha y pSVL-hCG\beta', pSVL-\alphaC7S y pSVL-hCG\beta'Y37C, pCI-\alpha y pCI-hCG\beta', y pCI-\alphaC7S y pCI-hCG\beta'Y37C, en células COS-7 fue llevada a cabo mediante métodos rutinarios que son bien conocidos en la técnica y que han sido descritos (Campbell et al., 1991). La transfección de células COS-7 fue llevada a cabo mediante un método estándar de precipitación con fosfato cálcico, del modo descrito (Kriegler, 1990). Las células COS-7 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, EE.UU. El día siguiente a la transfección, el medio de cultivo celular fue retirado y fue sustituido por medio DMEM exento de suero. Las células fueron incubadas durante tres días más para permitir que los productos secretados se acumularan en los medios de cultivo. Se centrifugaron luego los medios para eliminar los fragmentos celulares y otros agentes precipitantes, se transfirió el sobrenadante a una bolsa de diálisis, y se concentraron los componentes de alto peso molecular colocando la bolsa sobre un lecho de polvo higroscópico (Aquacide, Calbiochem, La Jolla, California, EE.UU.).

La hCG y la hCG entrelazada que habían sido secretadas a los medios de cultivo fueron cuantificadas usando un inmunoensayo de tipo sándwich (Moyle et al., 1982) en el que se emplearon los anticuerpos A113 y ^{125}I-B105 para la captura y la detección, respectivamente, y utilizándose como patrón hCG que había sido purificada de orina. En este ensayo, se dejó que el anticuerpo A113 anti-subunidad \alpha de hCG (1 \mug en 0,05 ml) se adsorbiera a la superficie de una placa de microtitulación durante una hora a 37°C. Se eliminó el anticuerpo no adsorbido y se incubó cada pocillo con una disolución que contenía NaCl al 0,9% y 1 mg de albúmina sérica bovina/ml para bloquear los restantes sitios de absorción de proteínas. Se añadió a los pocillos una parte alícuota (0,05 ml) del medio de cultivo de células trasfectadas durante tres días y se dejó que durante 1 hora, a 37°C, la hCG o el compuesto análogo de hCG entrelazado se uniera al anticuerpo adsorbido. Se separó la hormona o el compuesto hormonalmente análogo no unidos, se enjuagaron los pocillos con una disolución de NaCl al 0,9%, y se dejó que el analito capturado reaccionara con el anticuerpo radioyodado ^{125}I-B105 anti-subunidad \beta de hCG, que había sido preparado del modo descrito más adelante. Se aspiró el anticuerpo ^{125}I-B105 que no se había unido a hCG ni al compuesto análogo de hCG entrelazado y se determinó el radiomarcador unido a la superficie de los pocillos de mitrotitulación usando un contador de radiación \gamma. Con este ensayo se determinaban fácilmente 0,1 ng de hCG. No es necesario usar estos anticuerpos concretos para este ensayo ya que hay varios anticuerpos comercialmente asequibles que también pueden utilizarse. Bastarán la mayoría de los anticuerpos anti-subunidad \alpha de hCG y cualquier anticuerpo anti-subunidad \beta de hCG que tenga una afinidad por hCG y por la subunidad \beta libre de hCG superior a 10^{8} M^{-1}. El último incluiría ZMCG13 y ZMCG7, asequibles de Pierce, 3747 North Meridian Road, Rockford, Illinois, EE.UU.

La radioyodación de anticuerpos, hCG y hFSH fue llevada a cabo con Iodo-Gen obtenido de Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, EE.UU. En este procedimiento, se añadieron 1,5 microgramos de Iodo-Gen en 50 microlitros de acetona a un pequeño tubo de vidrio capaz de contener aproximadamente 0,75 ml de fluido y se permitió que se evaporase la acetona. Esto dejó un residuo de Iodo-Gen que cubría el fondo del tubo. A continuación, se añadieron 10 microgramos de B105, se cerró el tubo con un tapón de plástico y se añadieron 5 microlitros que contenían 9,25-18,50 x 10^{6} Bq de Na^{125}I en tampón de fosfato sódico 0,2 M (pH de 7,2) inyectando la disolución con una microjeringa a través del tapón. Veinte-treinta segundos más tarde, se añadieron 0,1 ml de disolución de NaCl al 0,9% en tampón de fosfato sódico 0,02 M (pH de 7,2), y la mezcla fue aspirada y fue cargada en una columna de 2 ml de BioGel P6DG (BioRad, Richmond, California, EE.UU.). Se separaron el yodo libre y la proteína yodada por filtración en gel. La cantidad de Na^{125}I utilizada para la yodación variaba dependiendo de la capacidad de la proteína para conservar su función después de la radioyodación. Los anticuerpos y la hCG se radioyodaron normalmente hasta una actividad específica de 1,85 x 10^{6} Bq/\mug, mientras que la hFSH se radioyodó normalmente hasta una actividad específica de 3,70-9,25 x 10^{5} Bq/\mug.

La Tabla 6 ilustra que la mutación no alteró la formación del compuesto análogo de hCG entrelazado. Las células que habían sido trasfectadas con secuencias de codificación que contenían pSVL o secuencias de codificación de pCI produjeron cantidades comparables de compuesto análogo entrelazado y hCG.

TABLA 6 Producción de hCG y hCG(\alpha31-\beta37) por células COS-7 transfectadas

hCG o compuesto análogo	Concentración
hCG (pSVL)	5,07 ng/0,05 ml
hCG (pCL)	4,98 ng/0,05 ml
hCG(\alpha31-\beta37) (pSVL)	0,94 ng/0,05 ml
hCG(\alpha31-\beta37) (pCL)	10,66 ng/0,05 ml

Se midieron hCG y hCG(\alpha31-\beta37) en inmunoensayos de tipo sándwich con respecto a un patrón de hCG usando anticuerpos contra la subunidad \alpha (A113) para la captura y anticuerpos radioyodados contra la subunidad \beta (B105) para la detección.

Se utilizaron los anticuerpos A113 y B105 en el inmunoensayo de tipo sándwich para determinar la producción del compuesto análogo de hCG entrelazado porque reconocían regiones de la hormona de las que se esperaba que estuvieran alejadas del sitio de la mutación (Cosowsky et al., 1.995; Moyle et al., 1995). El compuesto análogo de hCG(\alpha31-\beta37) no se unía como hCG a A407 (Figura 5), un anticuerpo que reconoce un epítopo del que se ha mostrado que incluye parte del extremo N de la subunidad \alpha, el sitio de la mutación C7S (Moyle et al., 1995). El anticuerpo A407 se obtuvo del Dr. Robert E. Canfield (Universidad de Columbia, New York, EE.UU.). Sin embargo, puesto que se había mostrado que A407 reconoce complejos de hCG-receptor (Moyle et al., 1995), no se esperaba que este pequeño cambio en la conformación de la hormona interfiriera en la actividad biológica de los compuestos análogos de HCG entrelazados.

Se verificaron las actividades biológicas de hCG(\alpha31-\beta37) y de otros compuestos análogos entrelazados, en ensayos de radioligando-receptor y de transducción de señales. En estos se emplearon células CHO que habían sido trasfectadas con los genes que codifican el cDNA del receptor de LH y que, por lo tanto, expresan receptores de LH funcionales en sus superficies. Las células CHO se obtuvieron de la ATCC, Rockville, Maryland, EE.UU. El cDNA del receptor de LH de rata se obtuvo de un banco ovárico de rata usando la reacción en cadena de la polimerasa del modo descrito (Bernard et al., 1990). Ha de advertirse que estas células que expresan el receptor de LH se utilizaron por conveniencia y que el ensayo de radioligando-receptor puede ser llevado a cabo con otros tejidos que expresen receptores de LH. Estos tejidos incluyen productos de homogeneización de testículos de rata adulta o productos de homogeneización de ovarios obtenidos de ratas sexualmente inmaduras a las que se ha inyectado hCG y gonadotropina de suero de yegua preñada (ambas asequibles de Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Para producir una preparación ovárica que pueda unirse a hCG con una afinidad elevada, se administró una inyección subcutánea de 50 unidades internacionales (UI) de gonadotropina de suero de yegua preñada a hembras de rata de 21 días de edad. Aproximadamente 65 horas más tarde, recibieron una inyección subcutánea de 25 UI de hCG. Siete días más tarde, se sacrificaron las ratas, se homogeneizaron sus ovarios y, para cada tubo de ensayo, se utilizaron partes alícuotas del producto de homogeneización correspondientes a la veinteava parte de un ovario. Las células que expresan receptores de LH de rata se unen a hCG radioyodada, un trazador que puede ser preparado de la forma anteriormente descrita o ser adquirido a New England Nuclear, Boston, Massachusetts, EE.UU. También se unen a hCG no marcada, una hormona que puede ser adquirida a Sigma Company, St. Louis, Missouri, EE.UU. Las células CHO que expresan el receptor de LH también sintetizan AMP cíclico en respuesta a un tratamiento con hCG durante 10-30 minutos a 37°C. El AMP cíclico que se produce fue medido mediante un radioinmunoensayo (RIA) que es específico para el AMP cíclico y que ha sido descrito (Brooker et al., 1979).

La adición de un disulfuro intersubunitario entre restos de los nudos de cisteínas de las subunidades \alpha y \beta de hCG no destruyó la capacidad del heterodímero entrelazado para unirse a receptores de LH ni para provocar una respuesta de acumulación de AMP cíclico. De esta manera, tanto hCG como hCG(\alpha31-\beta37) eran capaces de bloquear la unión de ^{125}I-hCG a células CHO que expresan receptores de LH (Figura 6). Tanto hCG como hCG(\alpha31-\beta37) eran también capaces de provocar la acumulación de AMP cíclico en esas mismas células (Figura 7). Esto mostró que la presencia de este enlace disulfuro intrasubunitario no alteraba la actividad funcional global de hCG.

La presencia del enlace disulfuro intrasubunitario permitía a hCG(\alpha31-\beta37) resistir los tratamientos con ácido, urea y calor que destruían la hCG. Esto puede verse a partir de los datos de las Figuras 8 y 9. La Figura 8 ilustra la influencia de una temperatura elevada sobre la estabilidad del heterodímero, verificada en un inmunoensayo de tipo sándwich en que se emplean A113 para la captura y ^{125}I-B112 para la detección. Adviértase que B105 y B112 se unen a un epítopo solapante que afecta a restos próximos a la curva del bucle tercero de la subunidad \beta (Moyle et al., 1990; Cosowsky et al., 1995), un lugar alejado de las mutaciones en cualquiera de las subunidades \alpha y \beta de hCG(\alpha31-\beta37). En este ensayo, hCG y hCG(\alpha31-\beta37) fueron sometidas a una temperatura de 85°C en intervalos variables de hasta 20 minutos. Mientras que la actividad de hCG resultó casi destruida en 7-8 minutos, al menos el 75% de la actividad del compuesto análogo entrelazado permaneció después de 20 minutos de incubación (Figura 8). Puesto que este inmunoensayo de tipo sándwich es específico del dímero, parecía que la pérdida de actividad de hCG era debida a la disociación de las subunidades, un proceso que es evitado por la presencia del enlace disulfuro
intersubunitario.

Es bien sabido que la incubación de gonadotropinas en urea a elevadas concentraciones provoca la disociación de las subunidades (Pierce et al., 1981). Por lo tanto, cuando se incubó hCG en presencia de urea 8 M, se disoció en sus subunidades, un fenómeno fácilmente detectado por transferencia Western (Figura 9). Las células de mamífero que han sido trasfectadas con genes que codifican las subunidades \alpha y \beta de hCG a menudo secretan la subunidad \beta libre así como el \alpha,\beta-heterodímero a los medios de cultivo. Dichos compuestos pueden ser fácilmente distinguidos mediante inmunoensayos de tipo sándwich en que se emplean un anticuerpo específico de la subunidad \alpha y un anticuerpo específico de la subunidad \beta. El \alpha,\beta-heterodímero y la subunidad \beta libre pueden ser también distinguidos por sus tamaños en transferencias Western. Por lo tanto, es posible determinar las cantidades relativas de hCG y de la subunidad \beta libre en los medios de cultivo separándolas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y detectándolas luego en transferencias Western. Esto es facilitado por el uso de un anticuerpo monoclonal radioyodado que se une a hCG y a la subunidad \beta libre de hCG, como se muestra en la Figura 9. El análisis de los medios de cultivo de las células que expresan tanto la subunidad \alpha como la \beta de hCG indicó la presencia tanto del heterodímero (banda superior) como de la subunidad \beta libre (banda inferior). El tratamiento de los medios de cultivo con urea 8 M causó la disociación del heterodímero en sus subunidades. En consecuencia, desapareció la banda superior. La urea no provocó la disociación de hCG(\alpha31-\beta37), el heterodímero entrelazado por disulfuro, en sus subunidades y quedó intacta la banda correspondiente al heterodímero (Figura 9).

Ejemplo 2 Un compuesto análogo multifuncional de hormona glicoproteínica estabilizado por un disulfuro intersubunitario situado entre los nudos de cisteínas de sus subunidades \alpha y \beta

Es bien sabido que el cinturón de seguridad influye en la actividad de hCG para unirse al receptor (Campbell et al., 1991; Moyle et al., 1994; Han et al., 1996). La sustitución de los restos de aminoácido 101-109 de la subunidad \beta de hCG por los correspondientes restos de hFSH (es decir, los restos 95-103 de la subunidad \beta de hFSH) condujo a un drástico aumento de la actividad FSH del compuesto análogo sin deterioro de su actividad LH (Moyle et al., 1994; Han et al., 1996). En realidad, esta sustitución también potenciaba la actividad TSH de hCG (Campbell et al., 1997) aun cuando no introducía restos específicamente hallados en hTSH. El estudio de la influencia de disulfuros intersubunitarios sobre las actividades de un compuesto análogo multifuncional relacionado mostró cómo disulfuros específicos influirían en las actividades de lutropinas, folitropinas y tirotropinas. Este ejemplo ilustra cómo un disulfuro intersubunitario entre los nudos de cisteínas influía en las actividades LH y FSH del compuesto análogo de hCG (CFC101-114) en que los restos 101-114 de la subunidad \beta de hCG estaban sustituidos por los restos correspondientes de hFSH (es decir, los restos 95-108 de la subunidad \beta de hFSH).

La expresión de CFC101-114(\alpha31-\beta37) requería que las células fueran trasfectadas con vectores que codifican \alphaC7S y CFC\beta'101-114Y37C. La modificación de la subunidad \alpha ha sido descrita en el Ejemplo 1. Las secuencias de DNA del precursor de la subunidad \beta de CFC101-114, utilizado para preparar CFC101-114\beta'Y37C, codificaban los restos 1-100 de la subunidad \beta de hCG, los restos 95-108 de la subunidad \beta de hFSH y los restos 115-145 de la subunidad \beta de hCG conectados sucesivamente en ese orden. Se había producido por combinación de las secuencias de codificación de dos quimeras de subunidades \beta de hCG/hFSH en sus sitios SstII comunes (Figuras 41-43). El fragmento XhoI-SstII de pSVL-CFC101-106\beta' que contenía codones para la secuencia señal y los restos 1-103 de pSVL-CFC101-114\beta' fue subclonado en el fragmento XhoI-BamHI de pSVL-CFC94-114\beta'. Esto sustituía los codones para los restos 88-94 de la subunidad \beta de hFSH hallados en pSVL-CFC101-114\beta' por sus homólogos de la subunidad \beta de hCG (es decir, los restos 94-100) e introducía un sitio BglII. Cada uno de estos vectores de codificación había sido derivado del cDNA de la subunidad \beta de hCG modificando codones de la mitad 3' de la molécula, como se describe a continuación.

Se preparó pSVL-CFC94-114\beta' mediante la mutagénesis por PCR de pSVL-CFC94-106\beta', un vector que codificaba los restos 1-93 de la subunidad \beta de hCG, los restos 88-100 de la subunidad \beta de hFSH y los restos 107-145 de la subunidad \beta de hCG conectados sucesivamente en ese orden. La primera operación en la preparación de pSVL-CFC94-114\beta' fue preparar pSVL-CFC\beta'94-106 mediante mutagénesis por "PCR SOEing" (Ho et al., 1.989). Una reacción PCR con Oligo508 y Oligo368 (Tabla 5) como cebadores y pSVL-hCG\beta' (Campbell et al., 1991) como molde proporcionó un producto que contenía los codones 101-145 de la subunidad \beta de CFC94-106, el codón de terminación de la subunidad \beta de hCG, región 3' no traducida, un sitio de restricción para la endonucleasa BamHI, y parte de la secuencia del vector pSVL 3' con respecto al sitio BamHI. Una segunda reacción PCR con Oligo510 y Oligo365 (Tabla 5) proporcionó un producto que contenía secuencias de pSVL 5' con respecto a su sitio XhoI, la región 5' no traducida de pSVL-hCG\beta (Campbell et al., 1991), los 20 codones para la secuencia señal de la subunidad \beta de hCG, y los codones 1-107 de la subunidad \beta de CFC94-106. Las porciones de estos productos de PCR que contenían los codones 101-107 de la subunidad \beta de CFC94-106 eran complementarias, un requisito para la extensión de solapamiento durante la "PCR SOEing", Estos dos productos de PCR fueron mezclados con Oligo363 y Oligo364 (Tabla 5) y fueron multiplicados en una tercera reacción PCR para obtener un producto de PCR que codificaba la secuencia de longitud completa de la subunidad \beta de CFC94-106 que tenía sitios de restricción XhoI y BamHI cerca de sus extremos 5' y 3', respectivamente. Este producto de PCR, que también contenía un sitio SstII en los codones para los restos 102-104, fue clonado en los sitios XhoI y BamHI de pSVL para crear pSVL-CFC94-106\beta'. La secuencia de la región de codificación fue confirmada por métodos didesoxi de secuenciación.

La operación final en la preparación de la subunidad \beta de pSVL-CFC94-114\beta' implicaba una PCR en que se usaban los cebadores Oligo596 y Oligo368 (Tabla 5) y el molde pSVL-hCG\beta' para crear un producto que tenía sitios SstII y BamHI cerca de sus extremos 5' y 3', respectivamente. Cuando era sometido a digestión con estas enzimas, se producía un fragmento de DNA que contenía los codones para los restos 97-108 de la subunidad \beta de hFSH y los codones 115-145 de la subunidad \beta de hCG en ese orden. Éste fue subclonado en los sitios SstII - BamHI únicos de pSVL-CFC94-106\beta' para crear pSVL-CFC94-114\beta', y la porción de la secuencia que había sido multiplicada durante la PCR fue confirmada por métodos didesoxi de secuenciación.

La preparación de pSVL-CFC101-106\beta' comenzó con un vector denominado pMB135 que codificaba un compuesto análogo de subunidad \beta de hCG truncado en el resto 114 y que contenía un codón para valina en lugar de para Gly102. Se preparó pMB135 hibridando Oligo435 y Oligo436 (Tabla 5) y completando enzimáticamente los extremos 3' para crear un casete de doble cadena que contenía sitios PvuII y SstI. El último era 3' del codón de terminación. Este casete codificaba los restos 87-101 de la subunidad \beta de hCG, valina y los restos 103-114 de la subunidad \beta de hCG en ese orden, y contenía un sitio de restricción para BglII en los codones 94-95. Fue subclonado en los sitios PvuII-SstI de pSVL-hCG\beta', y su secuencia entre los sitios PvuII y SstI fue confirmada por métodos didesoxi de secuenciación. Se utilizó pMB135 como molde en una reacción PCR con Oligo 562 y Oligo365 (Tabla 5) para crear un producto de PCR que, cuando fue sometido a digestión con XhoI y SstII, tenía la secuencia señal y la región no traducida del cDNA de la subunidad \beta de hCG, los codones 1-100 de la subunidad \beta de hCG y los codones 95-98 de la subunidad \beta de hFSH en ese orden. Este producto de PCR fue clonado en los sitios XhoI-SstII de pSVL-CFC94-106\beta' para obtener pSVL-CFC101-106\beta', y su secuencia fue determinada por métodos didesoxi de secuenciación.

Claramente, no era necesario utilizar este planteamiento para crear pSVL-CFC101-114\beta'. Estas operaciones se usaron por razones históricas. Se habían preparado los diversos vectores intermedios durante el curso de otros experimentos y estaban disponibles para la preparación del vector que codifica CFC101-114\beta'.

Se preparó el plásmido pSVL-CFC101-114\beta'Y37C combinando la "mitad" 5' de pSVL-hCG\beta'Y37C que codificaba la mutación Y37C, con la "mitad" 3' de pSVL-CFC101-114\beta' que codificaba los aminoácidos 95-108 de la subunidad \beta de hFSH. Esto fue llevado a cabo ligando el trozo pequeño de pSVL-hCG\beta'Y37C obtenido por digestión con XhoI y Bsu36I con el trozo grande creado por digestión de pSVL-CFC101-114\beta' con las mismas enzimas. Esto sustituía los codones para la secuencia señal y los aminoácidos 1-54 de CFC101-114\beta' por los de hCG\beta'Y37C, un cambio que daba lugar a la sustitución de Tyr37 por cisteína. La subclonación del fragmento XhoI-BamHI en los sitios XhoI-BamHI de la construcción de pCI modificada anteriormente descrita condujo a la construcción denominada pCI-CFC101-114\beta'Y37C. Las secuencias de aminoácidos de CFC101-114\beta' y CFC101-114\beta'Y37C se describen en la Figura 10.

La producción de CFC101-114 y CFC101-114(\alpha31-\beta37) fue llevada a cabo haciendo que se coexpresaran pSVL-\alpha más pSVL-CFC101-114\beta; pSVL-\alphaC7S más pSVL-CFC101-114\betaY37C; pCI-\alpha más pCI-CFC101-114\beta; y pCI-\alphaC7S más pCI-CFC101-114\betaY37C en células COS-7 usando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Se cuantificaron CFC101-114 y CFC101-114(\alpha31-\beta37) entrelazado en los medios de cultivo concentrados, usando un inmunoensayo de tipo sándwich (Moyle et al., 1.982) en que se emplearon los anticuerpos A113 para la captura y ^{125}I-B105 o ^{125}I-B112 para la detección; se usó hCG que había sido purificada de orina como patrón. Como antes, ha de advertirse que no es necesario usar estos anticuerpos concretos para este ensayo; se espera que los anticuerpos comercialmente asequibles de que se dispone se comporten satisfactoriamente. En este ensayo pueden utilizarse la mayoría de los anticuerpos anti-subunidad \alpha de hCG que también tienen una elevada afinidad por hFSH, tal como A113, o los anticuerpos anti-subunidad \alpha de hFSH que tienen una elevada afinidad por hCG. Sin embargo, puesto que estos compuestos análogos contienen restos de hFSH en la parte de la región del cinturón de seguridad que ejerce una influencia fundamental sobre la actividad FSH [es decir, los restos de aminoácido entre las cisteínas undécima y duodécima de la subunidad \beta (Moyle et al., 1994)], los compuestos análogos de CFC101-114 no son reconocidos por todos los anticuerpos anti-subunidad \alpha de hCG. Esto puede verse para A407 (Figura 11), un anticuerpo que se une a hCG pero no a hFSH. De esta manera, aunque A407 se unía a hCG, tenía mucha menos capacidad para unirse a compuestos análogos de CFC101-114 y CFC101-114 entrelazado. A407 también tenía poca capacidad para unirse a CFC101-114(\alpha31-\beta37).

Los compuestos análogos de CFC101-114 pueden ser detectados por la mayoría de los anticuerpos anti-subunidad \beta de hCG que tienen una afinidad superior a 10^{8} M^{-1} para hCG y la subunidad \beta libre de hCG, salvo por aquellos que reconocen restos de la subunidad \beta próximos a la región ocupada por restos de FSH. Por lo tanto, CFC101-114 y los compuestos análogos no fueron reconocidos por B111, un anticuerpo del que se ha mostrado que está muy influido por los restos 108-114 de hCG (Cosowsky et al., 1995). No obstante, en este ensayo puede usarse la mayor parte de los anticuerpos que reconocen hCG, hLH, la subunidad \beta libre de hCG y la subunidad \beta libre de hLH, tal como B105. Además, en este ensayo también pueden usarse muchos anticuerpos que reconocen hCG y la subunidad \beta libre de hCG, tal como B112. La región epitópica B105/B112 es una de las regiones más antigénicas de hCG en ratones y se dispone comercialmente de anticuerpos hacia esta región, como se indicó en el Ejemplo 1.

La presencia de un entrelazamiento disulfuro en CFC101-114(\alpha31-\beta37) aumentó su estabilidad térmica con respecto a la de CFC101-114 (Figura 12). Inmunoensayos de tipo sándwich mostraron que las actividad de hCG y CFC101-114 resultaban casi destruidas tras 7,5 minutos y 15 minutos de calentamiento a 85°C, respectivamente. Sin embargo, quedó una cantidad sustancial de CFC101-114(\alpha31-\beta37) después de 20 minutos a la misma temperatura. Esto mostraba que la presencia de un disulfuro potenciaba la estabilidad de este compuesto análogo. Puesto que éste y otros compuestos análogos que tienen restos de FSH entre las cisteínas undécima y duodécima de la subunidad \beta tienen tanto actividad FSH como actividad TSH (Campbell et al., 1997), sería también de esperar que este enlace disulfuro aumentara la estabilidad de FSH y TSH.

CFC101-114 puede estimular la transducción de señales en los receptores de LH. La adición del disulfuro intersubunitario \alpha31-\beta37 entre los nudos de cisteínas de CFC101-114 no redujo su actividad en este ensayo (Figura 13). De esta manera, CFC101-114 y CFC101-114(\alpha31-\beta37) tenían aproximadamente la misma elevada capacidad para estimular la acumulación de AMP cíclico en ensayos en que se empleaban células CHO que habían sido creadas para que expresaran receptores de LH. De este modo, no parece que la presencia de este enlace disulfuro influya en la actividad de las moléculas con actividad lutropina. Sería de esperar que la capacidad de este enlace para estabilizar estas moléculas confiriese unas propiedades terapéuticas útiles a las lutropinas.

Aunque la secuencia de aminoácidos de CFC101-114 es mucho más próxima a la de hCG que a la de hFSH, CFC101-114(\alpha31-\beta37) tiene una actividad FSH mucho mayor que hCG, una hormona de la que se sabe que está casi desprovista de actividad en este ensayo. La adición del enlace disulfuro intersubunitario \alpha31-\beta37 entre los nudos de cisteínas de CFC101-114 sólo ejercía una pequeña influencia sobre su capacidad para estimular la acumulación de AMP cíclico en células CHO que expresan receptores de FSH (Figura 14). De esta forma, no parece que la presencia de este enlace disulfuro afecte negativamente a la actividad de moléculas con actividad folitropina, y sería de esperar que la capacidad de este enlace para estabilizar estas moléculas confiriese unas propiedades terapéuticas útiles a las folitropinas.

Ejemplo 3 hCG estabilizada mediante un disulfuro intersubunitario entre el cinturón de seguridad y el bucle 2 de la subunidad \alpha

Las distancias entre los átomos de carbono C\alpha y C\beta de restos de las subunidades \alpha y \beta de hCG (Tabla 1B) sugieren que sería posible preparar muchos otros dímeros adicionales en que las subunidades estuvieran atadas por uno o más enlaces disulfuro. El entrelazamiento de hCG y CFC101-114 entre el resto 31 de la subunidad \alpha y el resto 37 de la subunidad \beta potenció significativamente la estabilidad de los compuestos análogos resultantes y ejerció una influencia mínima sobre sus actividades biológicas. Para saber si la introducción de un entrelazamiento disulfuro en una parte de la molécula de la que se ha mostrado previamente que influye en la unión al receptor altera su estabilidad y su actividad, se construyeron enlaces disulfuro en hCG y CFC101-114 entre el bucle 2 de la subunidad \alpha y el cinturón de seguridad. Estos estudios mostraron que la introducción de un disulfuro en esta región de las hormonas glicoproteínicas aumentaba su estabilidad. Sin embargo, las sustituciones que se requerían para crear el disulfuro influyeron en sus capacidades para interaccionar con receptores y provocar la transducción de señales. Esto mostró que, para mantener una elevada actividad endocrina, es preferible la introducción de un enlace disulfuro en una parte de la hormona que no participa en interacciones con el receptor ni en la especificidad por el receptor. Puesto que ambos tipos de compuestos análogos entrelazados por disulfuro conservaban sus actividades inmunológicas, puede que la posición del disulfuro sea menos importante a la hora de diseñar inmunógenos. La influencia de este disulfuro sobre la transducción de señales puede ser útil para desarrollar inmunógenos o antagonistas hormonales.

Para preparar un compuesto análogo de hCG estabilizado por un disulfuro intersubunitario entre el bucle 2 de la subunidad \alpha y el cinturón de seguridad, se sustituyeron Lys51 del bucle 2 de la subunidad \alpha y Asp99 del cinturón de seguridad de la subunidad \beta por cisteínas. El cambio en la subunidad \alpha implicaba la mutagénesis, por inserción de un casete, de vectores existentes que no han sido descritos previamente. Por lo tanto, se describirá aquí la construcción de esos vectores intermedios (Figura 44).

El policonector de pIBI31, un vector de clonación adquirido a International Biotechnologies, Inc. (New Haven, Connecticut, EE.UU.), fue sustituido por un policonector que contiene los sitios para enzimas de restricción EcoRI-XhoI-NcoI-PacI-BamHI-EcoR1 para preparar un vector denominado pRM102. Se sometió pKBM-\alpha a digestión con NcoI y BamHI y se clonó en los sitios NcoI-BamHI de pRM102 para crear pRM116, eliminando de este modo su secuencia líder 5' no traducida y un indeseado sitio XbaI 5' que había sido introducido durante la clonación de pKBM-\alpha. Por lo tanto, el único sitio XbaI de pRM116 correspondía a los codones para los aminoácidos 34-35 de la subunidad \alpha. El fragmento XbaI-BamHI de pRM116 fue sustituido por el fragmento XbaI-BamHI de un vector que había sido creado por PCR del cDNA de la subunidad \alpha con Oligo758 y Oligo760 (Tabla 5), para crear pRM117. Esto eliminó la región 3' no traducida hallada en el cDNA de la subunidad \alpha, un proceso que también eliminó los indeseados sitios de restricción PstI en esta región. El único sitio PstI que quedaba en pRM17 estaba situado en los codones para los restos 83-85. La clonación del producto obtenido de la PCR del cDNA de la subunidad \alpha con Oligo730 y Oligo839 (Tabla 5) en los sitios XbaI-PstI únicos de pRM117 condujo a pMB507. Esto introdujo sitios BglII y SpeI en la secuencia de codificación de la subunidad \alpha, en los codones 42-43 y 54-55, respectivamente. La subclonación del fragmento XhoI-BamHI de pMB507 en los sitios XhoI-BamHI de pSVL condujo a pBM512. El fragmento de pBM512 entre los sitios BglII y SpeI fue sustituido por Oligo877 y Oligo878 (Tabla 5) para crear pMB561. Finalmente, el fragmento BglII-SpeI de pMB512 fue sustituido por un casete preparado al hibridar Oligo921 y Oligo922 (Tabla 5), para crear pSVL-\alphaK51C (Figura 15). Esta estrategia no es necesaria para preparar pSVL-\alphaK51C y se usó sólo por razones históricas a causa de la disponibilidad de los diversos vectores intermedios que habían sido creados durante otros experimentos.

Se preparó el compuesto análogo de subunidad \beta hCG\beta'D99C mediante una mutagénesis por PCR usando pSVL-hCG\beta' como molde y Oligo368 y Oligo925 (Tabla 5) como cebadores. Oligo368 es un cebador inverso, complementario de un sitio de pSVL 3' con relación al sitio de restricción para la endonucleasa BamHI. Oligo925 contiene la mutación deseada y también crea el sitio BglII. El producto de PCR fue sometido a digestión con BglII y BamHI y fue subclonado en los sitios BglII-BamHI de pSVL-CFC101-114\beta'. Esto eliminó los codones hFSH de pSVL-CFC101-114\beta' y cambió Asp99 por cisteína (Figura 15).

Se hizo que se coexpresaran los plásmidos pSVL-\alphaK51C y pSVL-hCG\beta'D99C en células COS-7 del modo descrito en el Ejemplo 1. Se midieron hCG y hCG(\alpha51-\beta99) en inmunoensayos de tipo sándwich con respecto a un patrón de hCG usando anticuerpos hacia la subunidad \alpha (A113) para la captura y anticuerpos radioyodados hacia la subunidad \beta (B105) para la detección. No es necesario usar estos anticuerpos concretos para este ensayo. En este ensayo puede usarse casi cualquier anticuerpo que reconozca la subunidad \alpha de hCG en el heterodímero y cualquier anticuerpo anti-subunidad \beta que reconozca hCG y su subunidad \beta libre con afinidades superiores a 10^{8} M^{-1}. Esta producción de hCG y hCG(\alpha51-\beta99) por células COS-7 transfectadas condujo a la acumulación de un compuesto proteico análogo entrelazado en los medios de cultivo celular, fácilmente detectado mediante un inmunoensayo de tipo sándwich con A113/^{125}I-B105 o A113/^{125}I-B112 (Tabla 7), lo que muestra que las mutaciones necesarias para introducir el disulfuro no evitaban la combinación de subunidades.

TABLA 7 Producción de hCG y hCG(\alpha51-\beta99) por células COS-7 transfectadas

hCG o compuesto análogo	Concentración
hCG(pSVL)	19,50 ng/0,05 ml
hCG(\alpha51-\beta99)	4,85 ng/0,05 ml

Se midió la actividad biológica de hCG(\alpha51-\beta99) en ensayos de unión al receptor de LH y de transducción de señales usando los métodos esbozados en el Ejemplo 1. hCG(\alpha51-\beta99) fue capaz de inhibir la unión de ^{125}I-hCG a células CHO que expresan receptores de LH, aunque con sólo el 5-10% de la potencia de hCG (Figura 16). La reducción de la afinidad por los receptores de LH causada por el enlace disulfuro podría haber sido debida a 1) la sustitución del resto Lys51 de la subunidad \alpha por cisteína (es decir, la sustitución de un aminoácido cargado por un aminoácido neutro), 2) la sustitución del resto Asp99 de la subunidad \beta por cisteína (es decir, la sustitución de un aminoácido negativamente cargado por un aminoácido neutro), o 3) las constricciones añadidas por la presencia de un enlace covalente entre las dos subunidades. Se ha mostrado que modificaciones de Asp99 reducen o eliminan la actividad LH de hCG (Chen et al., 1991). Comparando las actividades, relativas a la unión al receptor de LH, de compuestos análogos de hCG que contienen una subunidad \beta no modificada y una subunidad \alpha en que Lys51 había sido cambiada por cisteína [hCG(\alphaK51C-\beta)] y de compuestos análogos de hCG que contienen una subunidad \alpha no modificada y una subunidad \beta en que Asp99 había sido cambiado por cisteína [hCG(\alpha-\betaD99C)] con las actividades de hCG y hCG(\alpha51-\beta99), fue posible distinguir la influencia de las sustituciones de cisteína, de la influencia del enlace disulfuro (Figura 17). Estos análisis mostraron que la sustitución de Lys51 de la subunidad \alpha por cisteína ejercía una influencia inhibidora sustancial sobre la capacidad de compuestos análogos para inhibir la unión de ^{125}I-hCG a receptores de LH. Las actividades de hCG(\alpha51-\beta99) y hCG(\alpha-\beta99) eran similares, lo que demuestra que la sustitución de Asp99 de la subunidad \beta por cisteína da cuenta de la mayor parte de la actividad reducida de hCG(\alpha51-\beta99) en cuanto a la unión al receptor de LH. El cambio de Lys51 por alanina también redujo la actividad de hCG
(Figura 18).

También se analizaron las capacidades de estos compuestos análogos de hCG para estimular la transducción de señales (acumulación de AMP cíclico). La sustitución del resto Lys51 de la subunidad \alpha por cisteína o alanina causó una pérdida casi completa de la capacidad de la hormona para estimular la acumulación de AMP cíclico (Figuras 19 y 20). La adición de cisteínas a ambas subunidades para crear hCG(\alpha51-\beta99) restableció cantidades significativas de actividad con respecto al compuesto análogo que sólo contiene la simple sustitución de Lys51 de la subunidad \alpha por cisteína (Figura 19). La simple sustitución del resto Asp99 de la subunidad \beta por cisteína tenía una influencia mucho menor sobre la transducción de señales del receptor de LH. Esto sugería que el disulfuro reducía la eficacia relativa de los compuestos análogos de hCG, una propiedad que puede ser útil a la hora de diseñar antagonistas.

La presencia de un disulfuro intersubunitario entre el cinturón de seguridad y el bucle 2 de la subunidad \alpha aumentó la estabilidad térmica de hCG (Figura 8). También evitó que se disociaran las subunidades en presencia de urea 8 M (Figura 9). Estas observaciones confirman el efecto beneficioso de un enlace disulfuro intersubunitario sobre la estabilidad de las hormonas glicoproteínicas.

Ejemplo 4 Un compuesto análogo bifuncional de hormona glicoproteínica estabilizado por un disulfuro intersubunitario entre el cinturón de seguridad y el bucle 2 de la subunidad \alpha

Se creó un enlace disulfuro entre el cinturón de seguridad y el bucle 2 de la subunidad \alpha de CFC101-114, el compuesto análogo de hormona glicoproteínica que tenía la capacidad para interaccionar con los tres principales receptores de hormonas glicoproteínicas. Esto permitió la caracterización de la influencia relativa de esta región de la proteína sobre las interacciones con receptores de LH y FSH.

El vector de expresión de la subunidad \beta necesario para la producción de CFC101-114\beta'(\alpha51-\beta99) (es decir, pSVL-CFC101-114\beta'D99C) fue preparado mediante la mutagénesis de pSVL-CFC101-114\beta' por inserción de un casete. Este vector contiene un sitio de restricción para la endonucleasa BglII en los codones para los aminoácidos 95-96 y un sitio SstII en los codones para los aminoácidos 102-104. Se preparó pSVL-CFC101-114\beta'D99C sometiendo pSVL-CFC101-114\beta' a digestión con BglII y SstII y sustituyendo el fragmento pequeño por un casete oligonucleotídico sintético obtenido al hibridar Oligo924 y Oligo923 (Tabla 5). Esto también introdujo un sitio BsrGI que fue usado para seleccionar los clones recombinantes. La secuencia de las bases cambiadas en el vector resultante, pSVL-CFC101-114\beta'D99C, fue confirmada por métodos didesoxi de secuenciación. En la Figura 21 se ilustra la secuencia de aminoácidos de CFC101-114\beta'(\alpha51-\beta99), codificado por este vector.

La coexpresión de pSVL-\alphaK51C y pSVL-CFC101-114\beta'D99C en células COS-7 fue llevada a cabo del modo descrito en el Ejemplo 1. Se midió el dímero en inmunoensayos de tipo sándwich usando A113 para la captura, B112 radioyodado para la detección y hCG urinaria purificada como patrón. Como en el caso de los otros compuestos análogos, no es necesario usar estos anticuerpos específicos para detectar CFC101-114(\alpha51-\beta99) en los medios de cultivo. Para la captura podrían usarse la mayoría de los anticuerpos anti-subunidad \alpha que fueran capaces de unirse tanto a hCG como a hFSH. Para la detección podrían usarse la mayoría de los anticuerpos capaces de unirse a hCG y a la subunidad \beta libre, salvo aquellos que reconocieran restos implicados en la secuencia que había sido cambiada por la de FSH. Un ejemplo de un anticuerpo que no podría utilizarse es B111 (Cosowsky et al., 1995).

A407, un anticuerpo monoclonal anti-subunidad \alpha que reconocía un determinante de la porción N-terminal de la subunidad \alpha de hCG (Moyle et al., 1995) no reconoce ni mucho menos CFC101-114 tan bien como se une a hCG (Figura 5). Se pensó que esto era debido a la influencia del cinturón de seguridad sobre la interacción global de las subunidades \alpha y \beta de hormona glicoproteínica que pueden estar implicadas en el control de la especificidad de la unión al receptor. La adición del disulfuro entre el resto 51 de la subunidad \alpha y el resto 99 de la subunidad \beta no hizo que el compuesto análogo resultante fuera reconocido por A407 (Figura 11).

Se halló también que CFC101-114(\alpha51-\beta99), como los otros compuestos análogos entrelazados por disulfuro, era más estable que sus precursores originarios (es decir, CFC101-114 y hCG) en los ensayos de desnaturalización térmica (Figura 12). En realidad, parecía que la presencia del disulfuro entre el resto 51 de la subunidad \alpha y el resto 99 de la subunidad \beta aumentaba la estabilidad de la proteína más que el disulfuro entre el resto 31 de la subunidad \alpha y el resto 37 de la subunidad \beta.

La presencia del enlace disulfuro entre el cinturón de seguridad y el bucle 2 de la subunidad \alpha de CFC101-114(\alpha51-\beta99) reducía su capacidad para unirse a receptores de LH (Figura 22). De este modo, mientras que CFC101-114 era casi tan eficaz como la hCG recombinante en cuanto a inhibir la unión de hCG radiomarcada a receptores de LH, CFC101-114(\alpha51-\beta99) era aproximadamente 100 veces menos activo. Se compararon las importancias relativas de las mutaciones subunitarias individuales y del enlace disulfuro determinando las actividades de CFC101-114, CFC101-114(\alpha51-\beta99), CFC101-114(\alphaK51C-\beta), CFC101-114(\alphaK51A-\beta) y CFC101-114(\alpha-\betaD99C). Esta comparación mostró que la sustitución de Lys51 de la subunidad \alpha por cisteína o alanina ejercía per se una influencia inhibidora sustancial sobre la unión al receptor (Figuras 22 y 23). Por lo tanto, la actividad de CFC101-114(\alphaK51C-\beta) era relativa a la de CFC101-114(\alpha51-\beta99). A diferencia de su efecto sobre la actividad LH de hCG, la sustitución de Asp99 de la subunidad \beta de CFC101-114 por cisteína explicaba sólo una parte de la capacidad reducida de CFC101-114(\alpha51-\beta99) para unirse a receptores de LH. No obstante, CFC101-114(\alpha51-\beta99) era sustancialmente más activo que CFC101-114(\alphaK51C-\beta), un efecto que no podía explicarse por la presencia de cisteína en la subunidad \alpha en lugar de Lys51.

También se llevaron a cabo estudios para determinar la influencia del enlace disulfuro entre el cinturón de seguridad y la subunidad \alpha sobre la actividad de CFC101-114 en cuanto a la transducción de señales (Figuras 24 y 25). CFC101-114 era sólo ligeramente menos potente que hCG a la hora de estimular la transducción de señales en los receptores de LH (Figura 24). Sin embargo, CFC101-114(\alpha51-\beta99), el compuesto análogo entrelazado por disulfuro, sólo era activo a la mayor concentración ensayada. En confirmación de estudios previamente discutidos, esto parecía ser debido principalmente al cambio de Lys51 de la subunidad \alpha por cisteína; el compuesto análogo en que sólo Asp99 de la subunidad \beta era convertido en cisteína [es decir, CFC101-114(\alpha51-\beta99)] conservaba una actividad sustancial. Como en el caso de los ensayos de unión, en que el disulfuro era capaz de compensar algo de la pérdida de actividad causada por la sustitución de Lys51 de la subunidad \alpha por cisteína o alanina, el enlace disulfuro intersubunitario restableció cierta transducción de señales (Figura 24).

CFC101-114 tenía actividades sustanciales en ensayos de FSH. Sin embargo, las sustituciones de cisteína necesarias para crear el entrelazamiento disulfuro entre el cinturón de seguridad y el bucle 2 de la subunidad \alpha producían un efecto mayor sobre la actividad FSH de CFC101-114 que sobre su actividad LH (Figuras 26, 27 y 28) y no era posible distinguir la influencia del enlace disulfuro per se. De esta manera, los compuestos análogos en que sólo se había cambiado Lys51 de la subunidad \alpha o Asp99 de la subunidad \beta perdían la mayor parte de sus actividades FSH. El hallazgo de que las mutaciones de Asp99 de la subunidad \beta tenían mayor influencia sobre la actividad FSH que sobre la actividad LH apoya observaciones previas sobre el papel del cinturón de seguridad en las actividades LH y FSH (Han et al., 1.996; Baird et al., 1993). Estos informes sugieren que la región del cinturón de seguridad que influye en la unión al receptor de LH está cerca de los aminoácidos 94-96 mientras que la que influye en la unión al receptor de FSH está cerca de los aminoácidos 101-109.

Ejemplo 5 hCG estabilizada por disulfuros de los Ejemplos 1 y 3

Para aprender cómo la introducción de múltiples disulfuros en las hormonas glicoproteínicas influye en sus actividades biológicas, se prepararon compuestos análogos de hCG que contenían los disulfuros mostrados en los Ejemplos 1 y 3. Estos compuestos análogos fueron preparados al intercambiar porciones de los vectores de expresión que han sido descritos en los Ejemplo 1 y 3. Se preparó pCI-\alpha(C7S,K51C) sometiendo pSVL-\alphaC7S y pSVL-\alphaK51C a digestión con BsmI, separando, por electroforesis en agarosa, los fragmentos pequeño y grande producidos en cada digestión y ligando el fragmento grande de pSVL-\alphaC7S con el fragmento pequeño obtenido de pSVL-\alphaK51C. La construcción resultante fue sometida a digestión con XhoI y BamHI y fue ligada en pCI que tenía un policonector modificado y que fue descrito en el Ejemplo 1. Se preparó pCI-hCG\beta'(Y31C,D99C) sometiendo pSVL-hCG\beta'D99C y pCI-hCG\beta'Y37C a digestión con AocI (un isosquizómero de Bsu36I) y BamHI, separando los trozos pequeño y grande por electroforesis en agarosa, y ligando el trozo pequeño procedente de pSVL-hCG\beta'D99C con el trozo grande procedente de pCI-hCG\beta'Y37C. En la Figura 31 se ilustran las secuencias de aminoácidos de los compuestos análogos codificados por éstos vectores.

pCI-\alpha(C7S,K51C) y pCI-hCG\beta'(Y31C,D99C) fueron hechos coexpresar en células COS-7 del modo descrito en el Ejemplo 1. La proteína secretada a los medios de cultivo fue concentrada y fue comprobada mediante un inmunoensayo de tipo sándwich, también del modo descrito en el Ejemplo 1 salvo por que se utilizó B112 radioyodado en lugar de B105. La presencia de múltiples enlaces disulfuro no evitó que la hormona glicoproteínica se plegara ni que fuera secretada por las células, como mostró la presencia de compuesto análogo en los medios de cultivo (Tabla 8). Se midió hCG(\alpha31-\beta37,\alpha51-\beta99) en inmunoensayos de tipo sándwich con respecto a un patrón de hCG utilizando anticuerpos contra la subunidad \alpha (A113) para la captura y anticuerpos radioyodados contra la subunidad \beta (B112) para la detección. El compuesto análogo no fue bien reconocido por el anticuerpo A407, una probable consecuencia de la mutación próxima al extremo N de la subunidad \alpha. Puesto que esta región de la proteína no es necesaria para la actividad hormonal, parecía que la falta de este epítopo tenía pocas consecuencias. Las letras mayúsculas de la Figura 31 se refieren a las posiciones de las mutaciones que fueron introducidas para formar los enlaces disulfuro.

TABLA 8 Producción de hCG y hCG(\alpha31-\beta37,\alpha51-\beta99) por células COS-7 transfectadas

hCG o compuesto análogo (pCL)	Concentración
HCG	35,33 ng/0,05 ml
hCG(\alpha31-\beta37,\alpha51-\beta99)	36,60 ng/0,05 ml

La presencia de dos enlaces disulfuro en hCG(\alpha31-\beta37,\alpha51-\beta99) aumentó su estabilidad relativa a la de hCG en los ensayos de desnaturalización térmica (Figura 8). Además, hCG(\alpha31-\beta37,\alpha51-\beta99) era más estable que hCG frente a la desnaturalización por urea (Figura 9). Esto sugería que la presencia de más de un enlace disulfuro no desestabilizaba la molécula.

hCG(\alpha31-\beta37,\alpha51-\beta99) era capaz de unirse a receptores de LH y estimular la acumulación de AMP cíclico (Figuras 29 y 30). Sus actividades en estos ensayos eran similares a las de hCG(\alpha51-\beta99), lo que mostraba de nuevo que el disulfuro intersubunitario entre el resto 31 de la subunidad \alpha y el resto 37 de la subunidad \beta tenía poca influencia perjudicial, si acaso alguna, sobre la unión al receptor o la transducción de señales. Por lo tanto, el sitio del nudo intercisteínas \alpha31-\beta37 sería preferido para construir un enlace disulfuro para estabilizar hormonas glicoproteínicas cuando se desea la conservación de la actividad endocrina.

Ejemplo 6 Un compuesto análogo de hFSH estabilizado por un disulfuro del nudo intercisteínas entre sus subunidades \alpha y \beta

El descubrimiento de que hCG y CFC101-214 podían ser estabilizados por un disulfuro intersubunitario entre sus nudos de cisteínas sin alterar sus actividades LH y/o FSH sugiere firmemente que no se necesita esta región para la actividad hormonal. Por lo tanto, se espera que la construcción de un disulfuro similar en FSH dé lugar a un compuesto análogo de hFSH que tenga una estabilidad aumentada y una potente actividad FSH. Sería también de esperar que este compuesto análogo se uniera a anticuerpos que reconocen las subunidades \alpha de hCG y hFSH, tal como A113. Sería también de esperar que se uniera a anticuerpos que reconocen una región de los bucles 1 y/o 3 de la subunidad \beta de hFSH, alejada del sitio de la mutación, tal como B602.

En la Figura 3 se ha descrito la secuencia de un compuesto análogo de subunidad \alpha necesario para preparar un compuesto análogo de hFSH entrelazado entre el resto 31 de la subunidad \alpha y el resto 31 de la subunidad \beta. En la Figura 32 se ilustra la secuencia de aminoácidos de una subunidad \alpha menos polar que también debería ser útil para preparar este compuesto análogo (\alphaC7A). En la Figura 32 también se muestra la secuencia de aminoácidos de hFSH\betaY31C, del que se espera que forme un disulfuro del nudo intercisteínas con \alphaC7A o \alphaC7S. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para preparar los vectores que codifican estas proteínas podrían ser preparadas por un experto en la técnica de la clonación a partir de los cDNAs de la subunidad \alpha humana y la subunidad \beta de hFSH, usando el código genético ilustrado en la Figura 33. Estas secuencias podrían ser también adquiridas a uno de los proveedores indicados en el Ejemplo 1.

Los vectores capaces de conducir transitoria o establemente la expresión de \alphaC7S y hFSH\betaY31C o de \alphaC7A y hFSH\betaY31C serían introducidos en células COS-7 u otras células eucarióticas mediante los medios bien conocidos en la técnica, tales como los referidos en el Ejemplo 1. La proteína producida sería medida en un inmunoensayo de tipo sándwich usando hFSH como patrón y anticuerpos de captura que reconozcan epítopos de hFSH alejados del extremo N de la subunidad \alpha y anticuerpos de detección que reconozcan epítopos de hFSH en sitios de los bucles 1 y/o 3 de la subunidad \beta.

Sería de esperar que el compuesto análogo entrelazado de hFSH fuera más estable que hFSH en los ensayos de desnaturalización térmica o por urea como los llevados a cabo en el Ejemplo 1 para los compuestos análogos de hCG entrelazados. También sería de esperar que el compuesto análogo de FSH entrelazado compitiera con hFSH radioyodada para unirse a células CHO que han sido trasfectadas con receptores de FSH humanos. También sería de esperar que estimulara la acumulación de AMP cíclico en esas células. Mediante ensayos in vitro se puede pronosticar exitosamente las actividades biológicas in vivo de compuestos análogos de hormona glicoproteínica totalmente glicosilados. Puesto que no se espera que las mutaciones que se introducen para entrelazar los compuestos análogos de hormona glicoproteínica alteren sus patrones globales de glicosilación con respecto a los de las hormonas glicoproteínicas recombinantes, también sería de esperar que el compuesto análogo de FSH entrelazado fuese activo in vivo.

Ejemplo 7 Un compuesto análogo de hCG estabilizado por un disulfuro entre las porciones N-terminales de las subunidades \alpha y \beta

En los Ejemplos 1-4 se enseña que un solo enlace disulfuro intersubunitario entre las subunidades de hormonas glicoproteínicas y de sus compuestos análogos puede potenciar su estabilidad. En estos ejemplos también se muestra que el efecto del enlace disulfuro sobre las actividades de la molécula en cuanto a la unión al receptor y la transducción de señales será pequeño con tal que no afecte a restos que son importantes para la unión al receptor o la especificidad de la unión al receptor, ni retuerza la proteína en una conformación inapropiada. Las porciones N-terminales tanto de la subunidad \alpha como de la subunidad \beta pueden ser sustancialmente cambiadas sin destruir la actividad hormonal, una indicación de que esta parte de la proteína no participa en contactos clave con el receptor. Por lo tanto, se prevé que la introducción de un enlace disulfuro en los extremos N de las hormonas glicoproteínicas, en sitios mostrados como favorables en la Tabla 1B, las estabilizará sin alterar gravemente sus actividades biológicas.

En la Tabla 1B se muestra que Gln5 de la subunidad \alpha y Arg8 de la subunidad \beta de hCG están situadas favorablemente para que la sustitución de cada una por restos de cisteína conduzca a la formación de un compuesto análogo entrelazado por disulfuro. Sería de esperar que este compuesto análogo tuviera una estabilidad potenciada con respecto a la de hCG y conservara la capacidad para unirse a receptores de LH y estimularlos.

En las Figuras 34A y 34B se ilustran las secuencias de aminoácidos necesarias para preparar vectores que serían útiles para la expresión de este compuesto análogo.

Ejemplo 8 Un compuesto análogo de hFSH estabilizado por un disulfuro entre las porciones N-terminales de las subunidades \alpha y \beta

Como se indicó anteriormente, en los Ejemplos 1-4 se enseña que un enlace disulfuro intersubunitario entre las subunidades de hormonas glicoproteínicas y de sus compuestos análogos puede potenciar su estabilidad. En estos ejemplos también se muestra el efecto del enlace disulfuro sobre la unión al receptor y la transducción de señales con tal que no afecte a restos que son importantes para la unión al receptor o la especificidad de la unión al receptor. Por lo tanto, de acuerdo con el presente invento, se espera que la introducción de un enlace disulfuro en los extremos N de la hFSH la estabilice y conduzca a un compuesto análogo que tenga propiedades terapéuticas útiles.

Basándose en los datos de la Tabla 1B que muestran las posiciones favorables de Gln5 de la subunidad \alpha y Arg8 de la subunidad \beta de hCG y los datos de la Tabla 2 que muestran los restos "equivalentes" en hCG y hFSH, sería de esperar que la sustitución de Gln5 de la subunidad \alpha y Ser2 de la subunidad \beta de hFSH por restos de cisteína creara compuestos análogos de hFSH entrelazados por disulfuro. Sería de esperar que estos compuestos análogos tuvieran una estabilidad potenciada con respecto a la de hFSH y conservaran la capacidad para unirse a receptores de FSH y estimularlos. En la Figura 35 se ilustran las secuencias de aminoácidos necesarias para preparar un vector que sería útil para la expresión de este compuesto análogo.

Ejemplo 9 Un compuesto análogo de hLH estabilizado por un disulfuro del nudo intercisteínas entre las subunidades \alpha y \beta o un disulfuro intersubunitario entre las porciones N-terminales de las subunidades \alpha y \beta

Las lutropinas humanas más íntimamente relacionadas son hCG y hLH. Por lo tanto, sería de esperar que las mutaciones necesarias para preparar compuestos análogos activos de hCG entrelazados por disulfuro fueran también útiles para la preparación de compuestos análogos activos de hLH entrelazados por disulfuro. La hLH es la menos estable de las gonadotropinas, y también se espera que los disulfuros intersubunitarios aumenten significativamente la estabilidad de la hLH. En las Figuras 36 y 37 se ilustran, respectivamente, las secuencias de aminoácidos de la subunidad \beta necesaria para preparar hLH entrelazada por disulfuro del nudo intercisteínas y hLH que está entrelazada cerca de su extremo N.

Ejemplo 10 hTSH\betaY30C, un compuesto análogo de subunidad \beta del que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hTSH estabilizados por un disulfuro del nudo intercisteínas entre las subunidades \alpha y \beta o un disulfuro intersubunitario entre las porciones N-terminales de las subunidades \alpha y \beta

Como se indicó anteriormente, en los Ejemplos 1-4 se enseña que un enlace disulfuro intersubunitario entre las subunidades de hormonas glicoproteínicas y de sus compuestos análogos puede potenciar su estabilidad. En estos ejemplos también se muestra el efecto del enlace disulfuro sobre la unión al receptor y la transducción de señales con tal que no afecte a restos que son importantes para la unión al receptor o la especificidad de la unión al receptor. Por lo tanto, se prevé que la introducción de un enlace disulfuro entre restos de los nudos de cisteínas de las subunidades \alpha y \beta de hTSH o en los extremos N de las subunidades \alpha y \beta de hTSH estabilice el heterodímero para conducir a un compuesto análogo que tenga unas propiedades terapéuticas úitiles, tal como estimular la glándula tiroides antes de una terapia de ablación con yodo radiactivo.

Basándose en los datos de la Tabla 1B que muestran las posiciones favorables de Cys31 de la subunidad \alpha y Tyr37 de la subunidad \beta de hCG y los datos de la Tabla 2 que muestran los restos "equivalentes" en hCG y hTSH, sería de esperar que células que expresan \alphaC7S o \alphaC7A y un compuesto análogo de subunidad \beta de hTSH en que Tyr30 está sustituido por un resto de cisteína crearan compuestos análogos de hTSH entrelazados por disulfuro. Similarmente, basándose en los datos de la Tabla 1B que muestran las posiciones favorables de Gln5 de la subunidad \alpha y Arg8 de la subunidad \beta de hCG y los datos de la Tabla 2 que muestran los restos "equivalentes" en hCG y hTSH, sería de esperar que la sustitución de Gln5 de la subunidad \alpha y Phe1 de la subunidad \beta de hTSH por restos de cisteína crease compuestos análogos de hTSH entrelazados por disulfuro. Sería de esperar que estos compuestos análogos tuvieran una estabilidad potenciada con respecto a la de hTSH y conservaran la capacidad para unirse a receptores de TSH y estimularlos. En las Figura 38s y 39 se ilustran las secuencias de aminoácidos necesarias para preparar un vector que sería útil para la expresión de estos compuestos análogos.

Ejemplo 11 Preparación de antagonistas hormonales entrelazados por disulfuro

Es bien sabido que la desglicosilación de las hormonas glicoproteínicas reduce sus capacidades para generar una señal biológica (Moyle et al., 1975; Matzuk et al., 1989). Sin embargo, a causa de su inestabilidad, las hormonas desglicosiladas no son terapéuticamente útiles. Se espera que la introducción de un entrelazamiento disulfuro en hormonas genéticamente desglicosiladas aumente su utilidad como antagonistas hormonales. Un antagonista de LH o hCG tendría usos profecundidad y antifecundidad. De este modo, cuando fuera administrado a mujeres estériles a causa de tener niveles de LH inapropiadamente elevados, un antagonista de LH potenciaría la fecundidad. Cuando fuera administrado a mujeres que están en las primeras fases del embarazo, un antagonista de hCG terminaría el embarazo. También sería útil un antagonista de una molécula bifuncional de LH/FSH, tal como CFC101-114 o CF101-109 (Moyle et al., 1994). El uso transitorio de dicho antagonista podría ser utilizado para terminar una función ovárica inapropiada, causando por ello el reinicio del ciclo menstrual. Esto tendría un posible efecto profecundidad. Sería de esperar que el uso de dicho antagonista al principio de un embarazo suprimiera la producción tanto de progesterona como de estradiol y terminara el embarazo.

Además de introducir un entrelazamiento disulfuro intersubunitario, la preparación de los antagonistas entrelazados implicaría cambiar las señales de glicosilación N-enlazadas en la subunidad \alpha o en las subunidades \alpha y \beta de los compuestos análogos que han sido descritos o que pudieran producirse por referencia a la Tabla 1B. Esto implicaría cambiar la secuencia Asn-X-Ser/Thr hallada en las subunidades \alpha y \beta de las hormonas glicoproteínicas para sustituir el Asn por otro aminoácido, cambiar la Ser o Thr por otro aminoácido, o cambiar el aminoácido situado entre Asn y Ser/Thr (representado como X) por prolina.

Ejemplo 12

En las Tablas 9-15 se presentan otros compuestos análogos de las gonadotropinas entrelazados por disulfuro, de los que se espera que sean más estables que las hormonas originarias. Aquellos se prepararían cotransfectando células con vectores que pueden expresar las construcciones de subunidad \alpha y subunidad \beta indicadas en los Ejemplos 1-5.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 9 Compuestos análogos adicionales de la subunidad \alpha humana que pueden utilizarse para preparar compuestos análogos de hCG, hLH, hFSH y hTSH entrelazados por disulfuro (Nota: la mutación está en letra mayúscula)

9

TABLA 10 Compuestos análogos adicionales de la subunidad \beta de hFSH útiles para preparar compuestos análogos de hFSH{}\hskip0,4cm entrelazados por disulfuro cuando se combinan con los apropiados compuestos análogos de subunidad \alpha (Nota: la mutación está en letra mayúscula)

10

TABLA 11 Compuestos análogos adicionales de la subunidad \beta de hCG útiles para preparar compuestos análogos de hCG{}\hskip0,3cm entrelazados por disulfuro cuando se combinan con los apropiados compuestos análogos de subunidad \alpha (Nota: la mutación está en letra mayúscula)

11

TABLA 12 Compuestos análogos adicionales de la subunidad \beta de hLH útiles para preparar compuestos análogos de hLH{}\hskip0,3cm entrelazados por disulfuro cuando se combinan con los apropiados compuestos análogos de subunidad \alpha (Nota: la mutación está en letra mayúscula)

12

TABLA 13 Heterodímeros de hFSH que contienen enlaces disulfuro intersubunitarios que aumentan su estabilidad

13

TABLA 14 Heterodímeros de hCG que contienen enlaces disulfuro intersubunitarios que aumentan su estabilidad

14

TABLA 15 Heterodímeros de hLH que contienen enlaces disulfuro intersubunitarios que aumentan su estabilidad

15

Ejemplo 13 Un compuesto análogo de hCG que contiene un disulfuro entre el bucle 2 de la subunidad \beta y el bucle 3 de la subunidad \alpha

Los restos que crean este disulfuro están en una región de hCG de la que se ha propuesto que no participa en los contactos de alta afinidad con el receptor (Moyle et al., 1995). Ni el bucle segundo de la subunidad \beta ni el bucle tercero de la subunidad \beta de hCG son necesarios para la actividad lutropina, y pueden prepararse compuestos análogos activos de hCG en que se hayan suprimido ambos (Moyle et al., 1988). Además, se han preparado compuestos análogos de hCG que tienen actividad completa en que el bucle 2 de la subunidad \beta ha sido reemplazado por el correspondiente bucle de hFSH (Campbell et al., 1991). De esta manera, el presente inventor no espera que la adición de un disulfuro intrasubunitario entre estas porciones de la proteína altere la actividad biológica de ésta. Este compuesto análogo se prepararía modificando vectores que codifican las subunidades \alpha y \beta de hCG y haciendo que se coexpresasen en células de mamífero. Como se muestra en la Tabla 9, la construcción de subunidad \alpha codificaba una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos denominada \alphaV76C. Esta construcción fue preparada mediante mutagénesis por PCR usando los oligonucleótidos 1131 y 1132 como cebadores (Tabla 5) y pMB589 como molde. El plásmido pMB589 es una construcción en pCI' que codifica un compuesto análogo de la subunidad \alpha humana en que el codón para Asn52 estaba cambiado por aquél para ácido aspártico y en que los codones para Arg42 y Ser43 estaban modificados para crear un sitio BglII silencioso.

Se preparó pMB589 subclonando el inserto XhoI-BamHI de pMB532 en el vector pCI', entre los sitios XhoI-BamHI, y se preparó pMB532 a partir de pMB507, una construcción previamente descrita, por PCR usando los oligonucleótidos 850 y 851 como cebadores (Tabla 5) y pMB507 como molde. El producto de PCR fue sometido a digestión con BglII y SpeI y fue subclonado en los sitios BglII y SpeI de pMB507 y secuenciado para obtener pMB532.

El producto de PCR fue sometido a digestión con BglII y PstI y el inserto fue clonado en los sitios BglII y PstI de pMB507 para crear pMB910. Los clones positivos fueron identificados por la presencia de un sitio DraI extra que había sido introducido en la construcción. Una vez que se hubo confirmado la secuencia de DNA de pMB910 por el método didesoxi, el fragmento de DNA que codificaba el compuesto análogo entero de subunidad \alpha fue separado de pMB910 por digestión con XhoI y BamHI y fue subclonado en los sitios XhoI y BamHI del vector pCI' para crear pMB926. pMB926 codifica \alphaV76C.

Para crear la pareja de subunidad \beta de hCG para \alphaV76C, se preparó un vector que codificaba hCG\beta'V44C. Éste es un compuesto análogo de la subunidad \beta de hCG del que se espera que forme un heterodímero con \alphaV76C, entrelazado por disulfuro, cuando se exprese en las mismas células que pMB926. Se sintetizaron los oligonucleótidos 1133 y 1134 (Tabla 5) y se ligaron en el sitio NgoMI-PstI de pKMB-\beta' para crear pMB909. El fragmento XhoI-BamHI de pMB909 fue transferido a pCI' para crear pMB941. En la Tabla 11 se muestra la secuencia de aminoácidos de hCG\betaV44C, codificada por pMB941.

Ejemplo 14 Un compuesto análogo de hFSH que contiene un disulfuro entre el bucle 2 de la subunidad \beta y el bucle 3 de la subunidad \alpha

Basándose en las similitudes de las secuencias de aminoácidos de las subunidades \beta de hCG y hFSH, notablemente de las cisteínas (Tabla 4), sería de esperar que ambas proteínas tuvieran arquitecturas similares. Las posiciones relativas de Val44 en el bucle 2 de la subunidad \beta de hCG y Val76 en el bucle 3 de la subunidad \alpha sugerían que el cambio de estos restos por cisteínas crearía un disulfuro intersubunitario entre el bucle 2 de la subunidad \beta y el bucle 3 de la subunidad \alpha. Val38 ocupa una posición similar en la subunidad \beta de hFSH, como Val44 de la subunidad \beta de hCG. Por lo tanto, se pensó que cambiar hFSH\betaVal38 por cisteína y hacer que se expresara la construcción resultante con \alphaV76C daría lugar a un heterodímero entrelazado por disulfuro. Para cambiar Val38 de la subunidad \beta de hFSH por cisteína, el presente inventor comenzó con pMB603, una construcción que contiene la secuencia de codificación del cDNA de hFSH\beta menos los extremos no traducidos 3' y 5' en el vector pCI', entre los sitios de restricción XhoI y BamHI. El fragmento de DNA pequeño situado entre los sitios BstXI y PpuMI de pMB603 fue reemplazado por un casete oligonucleotídico preparado al hibridar los oligonucleótidos 1154 y 1155 (Tabla 5).

La construcción resultante, denominada pMB920, fue explorada en cuanto a la falta de un sitio BstXI y la presencia de un sitio PpuMI. Una vez que la secuenciación del DNA confirmó la presencia del cambio deseado, se cotransfectaron células COS-7 con pMB920 y pMB926, el vector que conduce la expresión de \alphaV76C. Las células secretaban al medio un heterodímero que fue fácilmente detectado en un inmunoensayo de tipo sándwich usando el anticuerpo monoclonal A113 anti-subunidad \alpha para la captura y el anticuerpo monoclonal B602 radiomarcado anti-subunidad \beta de hFSH. En la Tabla 10 se muestra la secuencia de aminoácidos de hFSH\beta38C codificada por pMB920. El heterodímero compuesto de \alphaV76C y hFSH\betaV38C estimulaba la acumulación de AMP cíclico en células CHO que expresan el receptor de FSH humano (Figura 45).

Ejemplo 15 Un compuesto análogo de hCG que contiene un disulfuro entre los extremos N de cada subunidad y entre los nudos de cisteínas

Los precedentes heterodímeros entrelazados por disulfuro fueron preparados al modificar cada subunidad para crear un tiol libre que pudiera participar en un disulfuro intersubunitario. Se muestra aquí que es posible preparar un compuesto análogo de hCG entrelazado por disulfuro al modificar sólo la subunidad \beta de hCG. La estructura cristalina de hCG mostró que Cys31 de la subunidad \alpha estaba situada cerca de Tyr37 de la subunidad \beta y que la cadena lateral de cada subunidad apuntaba hacia la otra. Esta observación fue usada previamente para insertar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 31 de la subunidad \alpha y el resto 37 de la subunidad \beta de hCG. La estructura cristalina de hCG también muestra que el resto Cys7 de la subunidad \alpha está situado cerca del resto Arg6 de la subunidad \beta de hCG. De hecho, los restos Cys7 y Cys31 de la subunidad \alpha están dispuestos cerca de los restos Arg6 y Tyr37 de la subunidad \beta, de modo que la conversión de Arg6 y Tyr37 podría provocar la formación de un heterodímero que contuviese los disulfuros intrasubunitarios \alphaCys7-\alphaCys31 y \betaCys6-\betaCys37, un heterodímero que contuviera los disulfuros intersubunitarios \alphaCys7-\betaCys6 y \alphaCys31-\betaCys37, o un heterodímero que contuviera los disulfuros intersubunitarios \alphaCys7-\betaCys37 y \alphaCys31-\betaCys6. Simulaciones informáticas mostraron que podría formarse cada uno de estos enlaces disulfuro sin una excesiva tensión sobre la proteína. La formación de múltiples disulfuros debería ser útil para crear un grupo de isómeros o isoformas que tuvieran diferentes semividas. Estos podrían tener nuevos usos terapéuticos, particularmente cuando se necesita "reimpulsar" una respuesta biológica. En estos usos, se administraría un gran bolo de compuesto análogo para iniciar una respuesta hormonal. Sería de esperar que la fracción del heterodímero que no está entrelazada fuera aclarada más rápidamente que la del heterodímero entrelazado. En consecuencia, la gran inyección inicial sería suficiente para iniciar la respuesta, pero su actividad se disiparía hasta un menor nivel que sería sostenido durante un periodo más prolongado para mantener la respuesta. También sería de esperar que este compuesto análogo sirviera como un producto intermedio para la preparación de compuestos análogos PEGilados. Los restos de cisteína tienen reactividades únicas, y a menudo es deseable añadir una cisteína libre a la superficie de una proteína. Sin embargo, a causa de la reactividad de la cisteína, puede ser difícil crear este tipo de proteína. Se sabe que el disulfuro Cys7-Cys31 de la subunidad \alpha es rápidamente reducido a un estado que crea una cisteína libre. Sería de esperar que la introducción de una cisteína en la subunidad \beta entre los restos 6 y 7 creara un tipo similar de disulfuro. Se espera que las cisteínas de estos disulfuros sean más activas que otras de la proteína, particularmente puesto que están en una situación que facilita el intercambio de disulfuros. Por lo tanto, el presente inventor espera que sea posible hacer reaccionar la existente cisteína de la subunidad \alpha en el resto Cys7 y una cisteína añadida en el resto Cys6 de la subunidad \beta con agentes que modifiquen la proteína. Estos podrían incluir los capaces de PEGilar la proteína y estabilizar su semivida biológica. Las cisteínas que se "liberasen" en este proceso serían capaces de formar un disulfuro intersubunitario que estabilizaría la proteína. La preparación de este compuesto análogo requería añadir una segunda cisteína al compuesto análogo conocido como hCG\beta'Y37C.

Se preparó pMB940, una construcción que codifica el compuesto análogo hCG\beta', mediante mutagénesis por PCR utilizando los oligonucleótidos 1161 y 1163 (Tabla 5) como cebadores y pCI'-hCG\beta' como molde. El oligonucleótido 1161 ceba secuencias que están situadas en el vector pCI', y el oligonucleótido 1163 codifica la mutación. El producto de PCR fue sometido a digestión con XhoI y BanI y fue ligado con el fragmento BanI-BamHI obtenido de pSVL-hCG\beta'Y37C en el fragmento XhoI-BamHI grande de pCI' para crear pMB941. La secuencia de DNA de la secuencia de codificación de pMB941 fue confirmada por el método didesoxi. pMB941 codifica la secuencia de aminoácidos mostrada a continuación:

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Se cotransfectaron células CHO con pMB940 y pSV2Neo y se seleccionó una línea estable por su resistencia al fármaco tóxico G418. La proteína recolectada del medio fue cuantificada usando un inmunoensayo de tipo sándwich en que se empleó el anticuerpo A113 anti-subunidad \alpha para la captura y el anticuerpo B112 anti-subunidad \beta radioyodado para la detección. Este ensayo confirmó la presencia de heterodímero en el medio de cultivo. La actividad biológica del heterodímero fue medida en un ensayo de acumulación de AMP cíclico usando células CHO que expresan el receptor de LH de rata. Los resultados de este ensayo se ilustran en la Figura 46.

Ejemplo 16 Un compuesto análogo de hFSH que contiene un disulfuro entre los extremos N de cada subunidad y entre los nudos de cisteínas

Como se indicó anteriormente, la formación de múltiples disulfuros podría ser útil para crear un grupo de isoformas proteicas que tuvieran diferentes semividas. Un compuesto análogo similar ofrecería una aproximación mejorada a la estimulación del desarrollo folicular. La fracción del heterodímero que no contuviera disulfuro intersubunitario y que no estuviera entrelazada debería ser aclarada más rápidamente que la fracción del heterodímero que contuviera un entrelazamiento intersubunitario. En consecuencia, una gran inyección inicial sería suficiente para estimular el desarrollo inicial del folículo, pero su actividad se disiparía hasta un menor nivel que sería sostenido durante un periodo más prolongado. Esto simularía más estrechamente el tipo de estimulación por FSH vista durante la fase folicular y podría reducir la posibilidad de hiperestimulación. Sería de esperar que la adición de una cisteína al extremo N de la subunidad \beta de hFSH o que la adición del extremo amínico de la subunidad \beta de hCG al extremo N de la subunidad \beta de hFSH facilitase la formación del heterodímero y el entrelazamiento intersubunitario. Un compuesto análogo de subunidad \beta de hFSH del que se espera que forme un heterodímero similar al del compuesto análogo del Ejemplo 15 tendría la secuencia de aminoácidos mostrada a continuación:

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Ejemplo 17 Un compuesto análogo de hCG que tiene una potente actividad hFSH, que contiene una disposición de disulfuros similar a la del compuesto análogo del Ejemplo 15

Los compuestos análogos de hCG en que los aminoácidos 94-110 de la subunidad \beta están sustituidos por los correspondientes aminoácidos de hFSH tienen una elevada actividad FSH. Sería de esperar que las quimeras de hCG y hFSH que contienen los restos 95-103 de la subunidad \beta de hFSH en lugar de los restos 101-109 de la subunidad \beta de hCG y que tienen cisteínas en los restos 6 y 37 de la subunidad \beta formasen una disposición de disulfuros similar a la del Ejemplo 15. También sería de esperar que tuvieran una elevada actividad FSH. La secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de dicho compuesto análogo sería:

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Claims (17)

1. Un compuesto análogo de una hormona glicoproteínica, en el que dicha hormona glicoproteínica es seleccionada del grupo que consiste en gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona luteinizante humana (hLH), hormona humana estimulante del folículo (hFSH), hormona humana estimulante del tiroides (hTSH) y muteínas funcionales de las mismas, en que las muteínas funcionales son formas modificadas de las hormonas glicoproteínicas, en que las modificaciones no crean enlaces disulfuro intersubunitarios y en que se conserva al menos el 80% de la actividad biológica funcional de la hormona original, que tiene una subunidad \alpha y una subunidad \beta, en el que las secuencias de aminoácidos de dichas subunidades de hormona glicoproteínica están modificadas con objeto de crear un enlace disulfuro intersubunitario entre una cisteína de la subunidad \alpha y una cisteína de la subunidad \beta, cisteínas que están dispuestas en dos restos de posiciones de restos de cisteína nativos de dicha hormona glicoproteínica y no más allá de las unidades de cisteína extremas de la correspondiente subunidad nativa, para una estabilidad mejorada, conservando dicho compuesto análogo al menos el 25% de la afinidad de la hormona correspondiente por su receptor de hormona glicoproteínica nativo.

2. Un compuesto análogo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las secuencias de aminoácidos de dichas subunidades de hormona glicoproteínica están modificadas con objeto de crear un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto de cisteína situado en el bucle 2 de dicha subunidad \alpha y un resto de cisteína situado en el bucle 2 de dicha subunidad \beta.

3. Un compuesto análogo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las secuencias de aminoácidos de dichas subunidades de hormona glicoproteínica están modificadas con objeto de crear un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto de cisteína situado dentro de los ocho restos del extemo C de dicha subunidad \alpha y un resto de cisteína situado en el bucle 2 de dicha subunidad \beta.

4. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto análogo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, que es un líquido.

6. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, que es estable.

7. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para uso en el tratamiento de la esterilidad.

8. Uso de un compuesto análogo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la preparación de una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para uso en el tratamiento de la esterilidad.

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para uso en la limitación de la fecundidad.

10. Uso de un compuesto análogo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la preparación de una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para uso en la limitación de la fecundidad.

11. Una molécula de DNA recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad \alpha de un compuesto análogo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

12. Una molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 11, que es un vector de expresión.

13. Una célula huésped eucariótica transformada con una molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 12, en que dicha célula huésped es capaz de expresar la subunidad \alpha de un compuesto análogo de hormona glicoproteínica.

14. Una molécula de DNA recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad \beta de un compuesto análogo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

15. Una molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 14, que es un vector de expresión.

16. Una célula huésped eucariótica transformada con una molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 14, en que dicha célula huésped es capaz de expresar la subunidad \beta de un compuesto análogo de hormona glicoproteínica.

17. Un procedimiento para preparar un compuesto análogo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende las operaciones de:

cultivar una célula huésped eucariótica transformada con secuencias de nucleótidos de las subunidades \alpha y \beta conducidas en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión diferentes;

hacer que se exprese el compuesto análogo; y

recuperar el compuesto análogo expresado.