CN101250531B - 一核苷酸序列、包含该序列的表达载体、该载体转化的动物细胞及利用该细胞生产人fsh的方法 - Google Patents

Abstract

一种核苷酸序列，其包含一基因，该基因可以编码与含有α亚单位和β亚单位的天然的人FSH相同的蛋白序列，并可提高该蛋白序列的表达水平。本发明还公开了一核苷酸序列、包含该序列的表达载体、该载体转化的动物细胞及利用该细胞生产人FSH的方法。根据本发明设计表达载体BSYH/CGα-DHFR和BSYH/FSHβ-DHFR来表达动物细胞分泌型人FSH，表达的分泌型重组人FSH蛋白具有同天然的FSH同样的氨基酸序列，并具有足够临床使用的效价，因此适宜商业化，并可用于有效治疗不育症。

Description

一核苷酸序列、包含该序列的表达载体、该载体转化的动物细胞及利用该细胞生产人FSH的方法

技术领域

本发明涉及一种利用动物细胞生产分泌型人促卵泡激素(folliclestimulating hormone，下文称之为FSH)蛋白的方法，确切地讲，本发明涉及一包含新基因的核苷酸序列，一包含该核苷酸序列的重组表达载体，受到该重组表达载体转化的动物细胞，以及一种利用该转化后的动物细胞生产分泌型人FSH的方法，其中该新基因可以编码与含有α亚单位(CGα)和β亚单位(FSHβ)的天然的人FSH相同的蛋白序列，并可提高该蛋白序列的表达水平。 

背景技术

FSH、黄体化激素(luteinizing hormone，下文称之为LH)和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，下文称之为hCG)是在生殖机能中起重要作用的生殖相关的激素。FSH和LH由脑垂体分泌，其产生受到下丘脑表达的促性腺激素释放激素(gonadotropin releasinghormone，GnRH)的调节。在月经初期，相应于血液中的FSH水平提高，卵泡的生长和发育受到激发。成熟的卵泡分泌出越来越多的雌激素。LH诱导膜细胞产生雄激素。所得到的雄激素本身具有激素活性，同时可作为颗粒细胞芳香酶的底物。在月经初期，即卵泡期，FSH通过作用于颗粒细胞促进雌激素的产生。自中卵泡期后由颗粒细胞诱导的LH受体的表达最终通过促进颗粒细胞的增殖使得卵泡生长。因此，在这一时期，FSH和LH对卵泡生长和子宫内膜发育具有协同作用。当颗粒细胞产生的血雌激素的水平达到峰值时，LH突然被分泌。最后，血LH的这种突然增多引发排卵。排卵后，膜细胞和颗粒细胞发育成黄体。早期妊娠中胎盘产生的hCG不断刺激孕酮和雌激素的生成，而孕酮和雌激素为维持妊娠所必需。 

根据双细胞双促性腺激素理论(Fevold，(1941)，Synergic of folliclestimulating and luteinizing hormones in producing estrogen secretion.Endocrinology 28：33-26；Greep et al.，(1942)Gonadotropin of swinepituitary：various biological effects of purified thykentrin(FSH)and pure matakentrin(ICSH)，Endocrinology 30：635-649)，FSH和LH对卵泡生长和卵巢激素的产生都是必要的。除促进卵泡生长外，FSH还增强芳香酶，即细胞色素P450酶，在颗粒细胞中的表达(Richards，(1994) Hormonal control of gene expression in the ovary.Endocrine.Rev.15：725-751)。同时，LH还可活化膜细胞中的17-α-羟化酶，从而促进由胆固醇和孕烯醇酮(pregnenalone)生成雄激素。生成的雄激素被分散在颗粒细胞中并被其中的芳香酶转化为雌激素(Erickson et al.，(1985)Theovarian androgen producing cells：a review of structure/functionrelationships，Endocrine.Rev.6：371-399；Magoffin et al.，(1990)Insulin-like growth factor-1 selectively stimulates cholesterolside-chain cleavage expression inovarian thecal-interstitial cells，Mol.Endocrinol.4：489-496)。雌激素的适当生成对于创造成功的受精和植入所必需的环境极为关键。 

FSH激活已经被基于传统的内分泌学原理发展起来的多种分析方法证实，此外，FSH也依靠分析所鉴定的生物学特征来定义(Jeffcoate，(1994)From TNA to DNA：60 years of follicle stimulating hormone(FSH)ingynecology.In：The Yearbook of the RCOG.Royal College ofObstetricians and Gynecologists，London，chapter 6，00 55-57)。这些生物学特征一直以来被用作定义FSH的重要因素。然而，早期发展起来的生物学分析具有以下缺点：首先，没有针对FSH的特异性的分析方法；其次，由于没有标准化所致的定量的困难，没有办法比较不同实验室的结果。因此，采用早期的测定法只能研究对不同的促性腺要素(gonadotrophicprinciples)的多种生物学响应。此外，当时被认为具有促性腺活性的提取物乃是多种促性腺素的混合物。 

但是，随着物理化学分析在二十世纪七十年代的发展和分子生物学在二十世纪八十年代的突破，FSH在分子水平上被更精确地定义。FSH是一种脑垂体中产生的糖蛋白激素，是由α亚单位和β亚单位非共价互作形成的异质二聚体糖蛋白(heterondimetric glycoprotein)。虽然在脑垂体产生的LH、TSH(Thyroid Stimulating Hormone，促甲状腺激素)和hCG等不同糖蛋白激素中都有α亚单位，但β亚单位完全不同，因此每个激素具有独特的功能。维持这两个亚单位的适当二聚体作用对FSH的生物学功能是关键性的。和每个亚单位结合的糖结构的结构、成分和结合程度都是生物学功能的性能及稳定性的关键因素。α亚基蛋白由92个氨基酸组成，其中糖结构(N-糖基化结构)结合在第52位和第78位天冬酰胺上。β亚基蛋白由111个氨基酸组成，其中糖结构(N-糖基化结构)结合在第7位和第24位天冬酰胺上。在FSH中没有发现O-糖基化结构(Recombinant human FSHproduct development Group，(1998)Recombinant follicle stimulatinghormone：development of the first biotechnology product for thetreatment of infertility，Human Reproduction Update 4：862-881)。 

一般的商品化的重组FSH是由通过在中国仓鼠卵巢细胞基因组中插入人FSH表达基因而得到的永久性表达细胞系(permanent expression cellline)所产生。迄今为止，重组人FSH都采用了含动物来源的血清(animal-derived serum)的培养基进行培养(Recombinant human FSHproduct development Group，1998，Wiebe，O.et al.，1996)，其中表达细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO，中国仓鼠卵巢细胞)固定在微载体上。其中所使用的动物来源的血清可能是最终纯化产物安全性的一个负面影响因素。最近，有多个关于在医学产品生产中利用这类动物来源的血清最终导致牛海绵样脑病(bovine spongiform encephalopathy)和动物来源的病毒感染人的个案的被报道，这已经成为国际性的事件。然而，不在培养中使用动物来源的血清的话，重组FSH的表达率将显著降低。本发明就涉及一种采用含有新基因核苷酸序列的动物细胞表达载体来克服上述采用不含血清的培养基所致的人FSH低表达率的问题的方法。 

发明内容

本发明的一个目的是为克服上述问题而提供一段包含一种可在动物细胞中表达与天然的人FSH相等同的人FSH且可以提高该蛋白表达的新基因的核苷酸序列、包含该核苷酸序列的表达载体，以及转化有该表达载体的转化子。 

本发明的另一个目的是提供一种利用这种转化子生产人FSH的方法。 

本发明的上述目的和其他目的可以通过以下的本发明的实施例来实现。 

为达成本发明的上述目的，本发明提供了包含新基因的核苷酸序列，该新基因可编码与天然的人FSH相同的蛋白序列并且可以提高该蛋白的表达水平。 

本发明还提供了包含该核苷酸序列的重组表达载体。 

本发明进一步提供了被该表达载体转化的动物细胞。 

本发明还提供了一种利用该转化后的动物细胞生产人FSH的方法。 

在下文中对本发明进行详细描述。 

本发明所描述的FSH的结构和物理化学性质是通过分别比较LG-rhFSH(LG recombinant FSH，LG重组FSH)、uFSH(natural urine derived FSH，天然尿来源的促卵泡激素)和Gonal-F(Serono重组促卵泡激素，Seronorecombinant FSH)的结构和物理化学性质来确定的。 

本发明提供了一段包含一个可表达与天然的人FSH相同的蛋白序列且能提高该蛋白表达的新基因的核苷酸序列。 

编码天然的人FSH的基因由α亚单位和β亚单位组成。编码α亚单位的CGα基因作为FSH、LH、TSH和hCG共有的α亚单位起作用。尽管它作为共有的α亚单位的功能尚不清楚，人们猜想它作为这些激素共有的α亚单位的原因可能是在α亚单位的表达受限制的情况下来控制这些激素的相对水平。这四种激素的β亚单位使它们具有各自特有的功能，其中FSH的β亚单位是FSHβ基因。FSH直接作用于卵泡，它在诱导卵泡生长和促进颗粒细胞中雌激素的合成中起作用。 

采用PCR合成了编码CGα和FSHβ的基因。每个合成基因的核苷酸序列由胞外分泌的天然信号肽和含有编码天然α亚单位或β亚单位的新基因的基因序列组成。 

作为优选，编码CGα的基因的序列由SEQ.ID.NO：13表示，而编码FSHβ的基因序列由SEQ.ID.NO：15表示。 

在编码CGα或FSHβ的基因的核苷酸序列中的信号肽在完成将每个亚单位引导至内质网的功能后被去除。去除了信号肽的成熟的α亚单位和β亚单位将通过二聚体化和适当的糖基化被分泌到细胞外基质。 

作为优选，成熟的α亚单位的序列可由SEQ.ID.NO：14表示，而成熟的β亚单位的序列可由SEQ.ID.NO：16表示。 

本发明还提供了包含编码CGα或FSHβ基因的核苷酸序列的重组表达载体。更确切地讲，本发明提供了一种构建含有天然信号肽和能够促进蛋白在动物细胞中翻译的新型FSH基因的核苷酸序列的分泌型动物细胞表达载体的方法。 

该重组表达载体的特征在于其含有SEQ.ID.NO：13或SEQ.ID.NO：15所表示的序列。含有SEQ.ID.NO：13所表示的序列的表达载体可以是具有图2所示的酶切图谱的BSYH-CGα-DHFR。含有SEQ.ID.NO：15所表示的序列的表达载体可以是具有图3所示的酶切图谱的BSYH-FSHβ-DHFR。 

此处的表达载体也可以是能够同时翻译SEQ.ID.NO：13或SEQ.ID.NO：15表示的序列和一标记物以提高FSH蛋白表达的双顺反子表达载体。 

双顺反子表达系统是一种能够使将一目的基因和一选择标记连续转录至同一mRNA得以实现的表达系统。 

在本发明的FSH表达载体中，目的亚单位基因和作为选择标记的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)基因在同一连续的mRNA中表达，这两个基因由脑心肌炎病毒(Encephalo Myocarditis Virus，EMCV)的5′非翻译区相互连接，该5′非翻译区是一种内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES)，这间接表明α亚单位或β亚单位的翻译与DHFR的翻译是独立进行的。最终，DHFR基因的表达保证了位于DHFR前面的亚单位基因的表达。 

这种双顺反子表达系统的一个优点是可以尽量减少选择标记基因拷贝数在基因扩增过程中的增加从而获得高表达的细胞系。表1描述了该表达载体的元件和它们的功能。 

表1 

遗传因子	功能
		pCMV(CMV启动子)	转录起始
pT7(T7启动子)	体外mRNA转录起始
		-L/-L(引导序列)	CGα或FSHβ亚单位的胞外分泌信号蛋白
CG/FSH(开放阅读框)	人CGα或FSHβ密码子核苷酸序列
		EMCV(脑心肌炎病毒的5′    非翻译区)	用于双顺反子高效表达DHFR基因的内部核糖体进入位点
DHFR(选择标记基因)	氨甲喋呤(MTX)抗性
		Poly A信号	Late SV40多腺苷酸化信号：转录终止和转录后RNA加工的信号
SV40起点/多瘤病毒起点	表达late SV40 T抗原或在感染多瘤病毒的细胞中以游离基因形式扩增的复制起点
		ColE1	在大肠杆菌中扩增载体的复制起点
SupF(抑制基因tRNA)	P3游离基因MC/P3：在含有F-hsdR(rk-，mk+)araD139(araABC-leu)7679galU galK lacX74 rpsL(StrR)thi-mcrB{P3：KanR AmpR(am)TetR(am)}的大肠杆菌中保持载体的选择标记

本发明进一步提供了转化了该表达载体的动物细胞。 

为了在动物细胞中表达血糖蛋白，通常尝试利用目的蛋白的天然的分泌信号肽将其分泌到细胞外基质。对于FSH，则将含有每一亚单位的天然分泌信号肽的基因转化入动物细胞。导入细胞的基因被整合进寄主细胞的基因组中，从而维持稳定的表达。分别表达的α亚单位和β亚单位经过内质网和高尔基复合体，然后进行二聚化和糖基化等翻译后修饰，从而作为功能蛋白分泌到细胞外。由于需要进行的二聚化和糖基化导致蛋白的表达率降低，这可能成为商品化的一种经济性障碍。克服低蛋白表达率的一般方法是利用更强的启动子来提高mRNA的转录率。对红细胞生成素而言，尽管它需要类似的糖基化，但采用同样的启动子时其表达量每升至少可达到毫克级。最终，该先例暗示出，FSH低表达的根本原因并不是翻译后修饰或者低转录水平。一种尝试克服FSH低表达的方法就是通过提高蛋白合成效率 来提高内质网中二聚化的效率。在此基础上，本发明利用包含编码FSH的新基因的动物细胞分泌型表达载体显著提高了天然人FSH蛋白表达，该基因和有天然核苷酸序列组成的基因相比能提高蛋白合成的效率。 

这里所用的动物细胞可选自中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠细胞(NIH/3T3 cell)、猴细胞(COS-1 cell)和人细胞(Hela cell)。 

本发明还提供了一种在动物细胞中产生人FSH蛋白的方法，该方法包括以下步骤：制备含有能提高该蛋白表达的新基因的核苷酸序列，将所得核苷酸序列插入一表达载体，用该表达载体转化动物细胞，培养转化子，并从培养物中分离纯化该蛋白。 

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：如前文所述，根据本发明设计表达载体BSYH/CGα-DHFR和BSYH/FSHβ-DHFR来表达动物细胞分泌型人FSH，被该表达载体转化的动物细胞表达的分泌型重组人FSH蛋白具有同天然的FSH同样的氨基酸序列，并具有足够临床使用的效价，因此适宜商业化，并可用于有效治疗不育症。 

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。 

附图说明

图1是BSYH-CGα-DHFR载体和BSYH-FSHβ-DHFR载体构建过程的概略图。 

图2是显示BSYH-CGα-DHFR载体结构的酶切图谱。 

图3是显示BSYH-FSHβ-DHFR载体结构的酶切图谱。 

图4a和图4b显示了同时转化了BSYH-CGα-DHFR载体和BSYH-FSHβ-DHFR载体的动物细胞所表达和分泌的重组人FSH用反相色谱法得到的肽谱分析的结果。 

图5a和图5b显示了同时转化了BSYH-CGα-DHFR载体和BSYH-FSHβ-DHFR载体的动物细胞所表达和分泌的重组人FSH的生物效价(biologicaltiter)。 

具体实施方式

以下例子用来说明本发明具有实用性的目前优选的实施例。 

但，本领域的技术人员在本发明披露的内容基础上，有可能做出不超出本发明的精神和范围的修正和改进。 

例1：人FSH基因的制备 

蛋白序列通过已知编码构成天然人FSH的α亚单位和β亚单位的cDNA的信息预测(Fiddes and Goodman，(1979)Isolation，cloning，andsequence analysis of the cDNA for the α-subunit of human chorionicgonadotropin，Nature 281：351-356；Fiddes and Goodman，(1981)Thegene encoding the common α-subunit of the four human glycoproteinhormones，J.Mol.Appl.Genet.1：13-18；Watkins et al.，(1987)DNAsequence and regional assignment of the human follicle stimulatinghormone β-subunit gene to the short arm of human chromosome 11，DNA6：205-211)。在此基础上，使用了编码与由α亚单位(CGα)和β亚单位(FSHβ)构成的天然的人FSH相等同的蛋白序列并可促进该蛋白合成效率以使该蛋白在动物细胞中的表达水平最大化的新基因。制备所得的α亚单位和β亚单位和天然的人FSH基因中的序列都不同。参考SEQ.ID.NO：14和SEQ.ID.NO：16所示的α亚单位和β亚单位的序列，构建了聚合酶链式反应(PCR)的引物。用于各个亚单位基因合成的Oligo引物序列表示如下。 

<CGαPCR克隆的Oligo引物> 

CGfor1：Hind III 

atccaagcttatggactactaccgcaagtacgccgccatcttcctggtgaccctgagcgtgttcctgcac(70-mer；SEQ.ID.NO：1) 

CGfor2  ： 

gagcgtgttcctgcacgtgctgcacagcgcccccgacgtgcaggactgccccgagtgcactctgcaggagaacccc(76-mer；SEQ.ID.NO：2) 

CGfor3： 

ctgcaggagaaccccttcttcagccagcccggcgcccccatcctgcagtgcatgggctgctgcttcagccgcgcc(75-mer；SEQ.ID.NO：3) 

CGrev4： 

tcgctggtcacgttcttctgcaccagcatggtcttcttgctgcgcaggggggtggggtaggcgcggctgaagca(74-mer；SEQ.ID.NO：4) 

CGrev5： 

accttgaagccgcceatcacggtcacgcggttgtagctcttggccacgcagcaggtgctttcgctggtcacgtt(74-mer；SEQ.ID.NO：5) 

CGrev6：XbaI 

gaactctagattagctcttgtggtagtagcaggtgctgcagtggcaggcggtgtggttctctaccttgaagccgcc(76-mer；SEQ.ID.NO：6) 

引物CGfor1和CGrev6在各自的5′端添加了HindIII和XbaI限制性酶切位点，以便于将其终产物，即合成CGα基因，容易地插入到表达载体中。 

合成CGα基因由以下步骤制备： 

第一步：用引物CGFor3和CGrev4进行第一步PCR反应。 

第二步：用第一步PCR产物和引物CGfor2和CGrev5进行第二步PCR反应。 

第三步：用第二步PCR反应产物和引物CGfor1和CGrev6进行第三步PCR反应。 

<FSHβ的PCR克隆的Oligo引物> 

FSHfor1：HindIII 

cctgaagcttatgaagaccctgcagttcttcttcctgttctgctgctggaaggccatctgctgcaatagctgcgagctgaccaac(85-mer；SEQ.ID.NO：7) 

FSHfor2： 

agctgcgagctgaccaacatcaccatcgccatcgagaaggaggagtgccgcttctgcatcagcatcaacaccacctggtgcgcc(84-mer；SEQ.ID.NO：8) 

FSHfor3： 

caacaccacctggtgcgccggctactgctacacccgagatctggtgtacaaggaccccgcccgccccaagatccagaagacc(82-mer；SEQ.ID.NO：9) 

FSHrev4： 

gagtcggcgtggtgggcgcagccgggcacgcgcacggtctcgtacaccagctccttgaaggtgcaggtcttctggatcttggg(83-mer；SEQ.ID.NO：10) 

FSHrev5： 

gcagtcggtgctgtcgctgtcgcacttgccgcagtggcactgggtggccacggggtaggtgtacagtgagtcggcgtggtgggcg(85-mer；SEQ.ID.NO：11) 

FSHrev6：XbaI 

cttatctagactactccttcatctcgccgaaggagcagtagctgggccccaggccgcgcacggtgcagtcggtgctgtcgct(82-mer；SEQ.ID.NO：12) 

引物FSHfor1和引物FSHrev6在各自的5′端添加了HindIII和XbaI限制性酶切位点，以便于将其终产物，即合成FSHβ基因，容易地插入到表达载体中。 

合成FSHβ基因由以下步骤制备： 

第一步：用引物FSHfor3和FSHrev4进行第一步PCR反应。 

第二步：用第一步PCR产物和引物FSHfor2和FSHrev5进行第二步PCR反应。 

第三步：用第二步PCR反应产物和引物FSHfor1和FSHrev6进行第三步PCR反应。 

上文所述的PCR反应按下述方法进行。 

每一DNA模板和引物的浓度为100pmol，将DNA模板和引物加入到含有10mM tris-HCl、1.5mM MgCl₂、50mM KCl、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、 0.2mM dTTP、0.2mM dCTP、10％(v/v)二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide)和1单位(unit)taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)的反应混合物中(终体积50μl)，并进行PCR反应扩增目标DNA片段，其PCR参数为95℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共30个循环。 

编码FSH每个亚单位的基因的核苷酸序列分别由SEQ.ID.NO：13和SEQ.ID.NO：15表示，由核苷酸序列产生的蛋白质序列分别由SEQ.ID.NO：14和SEQ.ID.NO：16表示。 

例2：动物细胞分泌型表达载体的构建 

pLCED表达载体是pCDM8的变体，在pLCED这一双顺反子表达载体中，已经消除了M13起点(origin)并插入了IRES和DHFR基因。rhFSH表达载体的构建过程概述如下，并表示如图1。 

rhFSH表达载体的构建过程 

1.pLCED的构建 

用限制性内切酶NHE I和Sac II除去pCDM8载体(Invitrogen，Cat.No.V308-20)中的M13起点以构建pCDMBS。然后通过限制性内切酶Xba I和Bam II用pED载体中的EMCV/DHFR/poly A信号序列替代肉瘤病毒40(SV40)内含子/poly A信号序列，构建得到pLECD。 

2.BSYH-CGα-DHFR的构建 

用Hind III和Xba I酶切合成CGα DNA序列，再将其插入pLECD中。 

所得到的重组载体被命名为“BSYH-CGα-DHFR”，并于2006年10月19日保存于韩国典型菌种保藏中心(KCTC，Korean Collection for TypeCultures，52 Eoeun-dong Yuseong-gu，Daejon，Korea)(保藏号：KCTC11005BP)。 

3.BSYH-FSHβ-DHFR的构建 

用Hind III和Xba I酶切合成FSHβ DNA序列，再将其插入pLECD中。 

所得到的重组载体被命名为“BSYH-FSHβ-DHFR”，并于2006年10月19日保存于韩国典型菌种保藏中心(KCTC，Korean Collection for TypeCultures，52 Eoeun-dong Yuseong-gu，Daejon，Korea)(保藏号：KCTC11006BP)。 

编码α亚单位的载体BSYH/CGα-DHFR和编码β亚单位的载体BSYH/FSHβ-DHFR的结构分别如图2和图3所描述。 

例3：制备转化了表达载体的动物细胞 

采用由敲除了二氢叶酸还原酶的中国仓鼠卵巢细胞(CHO/dhfr-)派生的永久细胞系(ATCC CRL 9096)为寄主细胞。该细胞系购买自美国模式菌 种收集中心(ATCC，American Type Culture Collection)，该细胞系的生长依赖于脯氨酸，并具有典型的成纤维细胞的形态。 

表达α亚单位的动物细胞表达载体和表达β亚单位的动物细胞表达载体各自独立构建，但它们除了编码区不同以外，具有相同的结构。表达FSH的转化细胞系的制备如下。 

用于转化的寄主细胞CHO/dhfr-是用含有10％FBS(GibcoCat.#16000-044，Lot.#1105269)和1xHT混合盐(HT supplement，Cat.#111067-030，Lot.#1120062)的IMDM培养基在37℃下含5％CO₂空气中培养2天(第一培养)。从该培养物中回收细胞，以不同的浓度接种到6孔板，在同样的条件下用同样的培养基进行24-36小时的第二培养。 

含有FSHα亚单位的BSYH-CGα-DHFR和含有FSHβ亚单位的BSYH-FSHβ-DHFR以5∶1的比例混合(总量为1μg)，并将混合物加入到100μL的IMDM中。加入6μL的Plus reagent(Invitrogen，Cat.#11514-015，Lot.#10964-021)并混匀，室温下放置15分钟，再加入100μL的IMDM和4μL lipofectamine(Invitorogen，Cat.#19324-012)的混合物并混匀，室温下放置15分钟得到DNA混合溶液。或者是通过磷酸钙-DNA共沉淀制备DNA混合溶液(Wigler et al，1979)。用2mL D-PBS冲洗培养寄主细胞的6孔板。在每一个孔中加入1mL IMDM，然后将DNA混合溶液加入每个孔中并混匀。然后将含有DNA混合溶液的6孔板放在37℃下5％CO₂浓度空气中培养3-12小时(第一培养)。往每个孔中加入1mL含有10％FBS(Gibco Cat.#16000-044，Lot.#1105269)和1xHT混合盐(HTsupplement，Cat.#111067-030，Lot.#1120062)的IMDM培养基，在37℃下5％CO₂浓度空气中进行至少3小时的第二培养。一旦培养完成，每孔用2mL D-PBS冲洗。每孔用1mL胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA，Gibco，Cat.#25300-054，Lot.#1124774)回收贴壁细胞，所回收的细胞用1mLα-MEM、10％D-FBS(Gibco，Cat.26400-044，Lot.#1103151)和0.25μM MTX的混合物重悬。将每1mL的悬浮液涂布到10cm培养皿上，其中加入9mLα-MEM、10％D-FBS和0.25μM MTX的混合物达到10mL的终体积，并在37℃下5％CO₂浓度空气中培养两周。两周的培养一结束，培养皿上产生的菌落用菌落挑取杯(colony selection cup)和100μl胰蛋白酶-EDTA收集，并在含有α-MEM、10％D-FBS和0.25μM MTX的培养基上扩培(expansion)。结果得到4种单克隆细胞系，即CD14A、CD14B、CD14C和CD14E。此外，用类似上述的方法但采用不同的MTX浓度得到了40种单克隆细胞系。并研究了FSH表达和上述44种单克隆细胞系的表达水平。为此，每个细胞培养溶液的FSH表达水平都用FSH ELISA试剂盒(IBL，Cat.RE 52121)测量两次。结果CD14B被证实具有最高的FSH生产能力，达到0.0085mlU/ 细胞/48小时，因此被选作FSH生产的母种。同时，也使用了含有天然核苷酸序列的FSH的α亚单位和β亚单位的表达载体，只得到两种转化子，其表达水平未能达到检测限。 

所得到的单克隆细胞系用混合液重悬浮并保存到液氮罐LN2 tank中，所用的混合液含有比例为6∶3∶1的α-MEM、D-FBS和DMSO。 

例4：人FSH在动物细胞中的分泌及其纯化 

用上述方法得到表达的单克隆母细胞系(expression monoclonalmother cell line)(源于单个细胞)被处理以适应无血清的悬浮培养条件，其适应方法如下。将一小瓶保存于液氮中的细胞系解冻，用无血清的培养基在T-80烧瓶里静置培养1天。回收并离心细胞，在搅拌瓶(spinner flask)中悬浮培养。第一次培养的体积为70ml，第二次培养时用按1∶4的比例稀释(1/4 dilution)使细胞浓度接近1×10⁶ cells/ml。培养体积增加到500ml得到原种并培养。在液氮中保存原种。 

制得的表达细胞系进行几次成批的搅拌瓶预培养，再进行成批的生物反应器中的预培养。当生物反应器中的细胞浓度达到目标水平时，转为连续培养，然后进行主培养来表达重组FSH。主培养得到的培养液利用包括亲和柱、疏水柱、离子交换树脂柱及体积排阻色谱柱等不同的分离柱来纯化得到纯化的重组FSH。 

例5：动物细胞分泌型人FSH的鉴定 

为了鉴定动物细胞分泌型人FSH，用胰蛋白酶完全降解从培养基中纯化得到的蛋白质，然后用液质联用仪(LC mass spectrophotometer)来分析峰的形式。所得到的结果用来和NCBI和网络上提供的胰蛋白酶降解该蛋白的数据相比较。结果发现所得到的纯化蛋白质与人FSH完全相同，因此该经鉴定的蛋白质被命名为“LG-rhFSH”。 

[肽谱] 

肽谱是一种通过比较样品蛋白质的结构与标准蛋白质的初级结构来鉴定蛋白质的代表性方法。进行LG-rhFSH的肽谱分析是为了确认重组FSH的α亚单位和β亚单位的初级结构是否与理论结构一致。具体而言，在还原条件下打开所有的S-S键(二硫键)，并烷基化游离的硫基，用胰蛋白酶消化所得的样品，用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分离所得到的肽段，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)进行质谱分析和氨基酸序列分析。理论推断得到的LG-rhFSHα亚单位和β亚单位被胰蛋白酶降解得到的肽段如表2和表3所示。 

表2 

理论推断得到的LG-rhFSHα亚单位被胰蛋白酶降解得到的肽段 

时间  顺序	m/z2)  (mi)	m/z  (av)	起  始	终  止	肽序列
						T1	4121.67	4124.62		5	(-)APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSR(A)
T2	817.46	817.97	6	2	(R)AYPTPLR(S)
						T3	234.15	234.28	3	4	(R)SK(K)
T4	147.11	147.20	5	5	(K)K(T)
						T5	719.41	719.93	6	1	(K)TMLVQK(N)
T61)	1357.56	1358.50	2	3	(K)NVTSESTCCVAK(S)
						T7	539.26	539.57	4	7	(K)SYNR(V)
T8	838.45	839.05	8	5	(R)VTVMGGFK(V)
						T9	2069.78	2071.24	6	1	(K)VENHTACHCSTCYYHK(S)
T10	106.05	106.10	2	2	(K)S(-)

1)T6形成N-52糖肽，而T9形成N-78糖肽。 

2)m/z表示质量/电荷比，在MALDI-TOF中以独立质子化的形式[M+H⁺]⁺ 表示。表中，mi代表单个各向同性质量值(single isotropic mass value)，而av代表平均质量值(average mass value)。 

表3 

理论推断得到的LG-rhFSHβ亚单位被胰蛋白酶降解得到的肽段 

时间  顺序	m/z (mj)	m/z (av)	起始	终止	肽序列
						T11)	1606.80	1607.83	1	14	(-)NSCELTNITIAIEK(E)
T2	594.22	594.62	15	18	(K)EECR(F)
						T3	2175.88	2177.45	19	35	(R)FCISINTTWCAGYCYTR(D)
T4	637.36	637.76	36	40	(R)DLVYK(D)
						T5	683.38	683.79	41	46	(K)DPARPK(I)
T6	388.26	388.49	47	49	(K)IQK(T)
						T7	657.29	657.77	50	54	(K)TCTFK(E)
T8	1008.54	1009.15	55	62	(K)ELVYETVR(V)
						T9	2732.15	2734.04	63	86	(R)VPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGK(C)
T10	1317.46	1318.34	87	97	(K)CDSDSTDCTVR(G)
						T11	1433.61	1434.64	98	110	(R)GLGPSYCSFGEMK(E)
T12	148.06	148.14	111	111	(K)E(-)

1)T1形成N-7糖肽，而T3形成N-24糖肽。 

2)m/z表示质量/电荷比，在MALDI-TOF中以独立质子化的形式[M+H⁺]⁺ 表示。表中，mi代表单个各向同性质量值，而av代表平均质量值。 

LG-rhFSH的α亚单位和β亚单位分别有5个和6个二硫键。由于DTT和碘乙酸在实验中被处理了，上表描述了在所有半胱氨酸都被羧甲基化条件下的期望得到的肽片断。在LG-rhFSH的α亚单位和β亚单位的RP-HPLC色谱图中出现了代表MALDI-TOF所证实的肽和糖肽的峰，结果如图4a和图4b所示。 

[LG-rhFSH肽谱结果] 

LG-rhFSH的α亚单位中，除了肽T3和糖肽(N-52和两个N-78)，所有肽(T1、T2、T4+T5、T6和T7)都被证实了。由于肽T3超出了MALDI-TOF的分析量程，因此未能被证实。在某些片段中(T4+T5及两个N-78)，肽是结合形式而不是降解形式。已证实糖肽N-52结合在肽T6上，糖肽N-78以聚糖形式结合在T9+T10或T8+T9+T10上。符号“+”表示两个肽联结在一起。 

在LG-rhFSH的β亚单位中，糖肽N-24以外的所有肽(T4+T5、T6、T7、T8、T9、T8+T9、T9+T10、T8+T9+T10和T11+T12)和糖肽(N-7)都被证实了。在某些片段中(N-7、T4+T5、T9+T10、T8+T9和T11+T12)，肽是结合形式而不是降解形式。已证实糖肽N-7以聚糖形式结合在T1+T2上。LG-rhFSH的β亚单位中的糖肽片段N-24未被证实。图中的符号“+”表示两个肽联结在一起。 

图4a显示了LG-rhFSH的α亚单位肽谱。图中，糖肽类以括号中的文字表示。已证实，N-52糖肽包含肽T6，第一个N-78糖肽包含肽T9+T10，而第二个N-78糖肽包含肽T8+T9+T10。 

图4b显示了LG-rhFSH的β亚单位肽谱。图中糖肽类以括号中的文字表示。糖肽N-7包含肽T1+T2，糖肽N-24包含肽T3。 

例6：采用动物模型测定动物细胞分泌型人FSH的效价 

以上制备的动物细胞分泌型人FSH的效价的测定采用了测量未成熟大鼠的卵巢增重的方法(Steelman-Pohley；Steelman，(1953)assay of thefollicle stimulating hormone based on the argumentation withchorionic gonadotropin Endocrinology 53：604-616)，并同重组FSH的国际标准品的效价比较以确认生物效价的等值。 

活体生物测定 

活体生物测定，又称为Steelman-Pohley测定法(Steelman-Pohleyassay，Steelman，(1953)assay of the follicle stimulating hormonebased on the argumentation with chorionic gonadotropin Endocrinology53：604-616)，一直被用于测定源自脑垂体或尿的FSH的生物活性，也是 迄今为止药典描述的唯一用作测定治疗用FSH效价的方法[请参见欧洲药典中的尿促卵泡素(urofollitorpin)和尿促性素(menotrophin)和英国药典中的尿促性素(menotropinum)]。这一常规测定方法测量hCG处理的未成熟大鼠的卵巢增重。目前，已知卵巢生长受到FSH和颗粒细胞分泌的雌激素的直接激发。活体生物测定不仅可以用于定量测定FSH的生物活性，也能用来证实FSH的活性。 

为证实LG-rhFSH的生物学特征与天然的来自尿的FSH的生物学特征相同，进行了Steelman-Pohley活体生物测定。以重组FSH国际标准品(NIBSC92/642)为标准。采用并行性分析来度量所测得的生物活性的统计显著性。 

如图5a和图5b(重组FSH的活体生物测定(NIBSC，n＝3；LG-rhFSH，n＝4))所示，LG-rhFSH对卵巢生长具有和国际标准品相同的剂量响应。该活体生物测定的结果证明LG-rhFSH具有和重组FSH国际标准品相同的生物特征。此外，用以上描述的方法将LG-rhFSH和商品化的重组FSH(Gonal-F)相比较，结果显示这两种物质具有相同的生物学特征。 

如前文所述，根据本发明设计表达载体BSYH/CGα-DHFR和BSYH/FSHβ-DHFR来表达动物细胞分泌型人FSH，被该表达载体转化的动物细胞表达的分泌型重组人FSH蛋白具有同天然的FSH同样的氨基酸序列，并具有足够临床使用的效价，因此适宜商业化，并可用于有效治疗不育症。 

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。 

                    序列表

<110>株式会社LG生命科学 

<120>包含-基因的核苷酸序列、包含该序列的表达载体、该表达载体转化的动物细胞以及利用该细胞生产分泌型人促卵泡激素的方法 

<130>PIY07299WN-KR 

<160>16 

<170>KopatentIn 1.71 

<210>1 

<211>70 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物1 

<400>1 

atccaagctt atggactact accgcaagta cgccgccatc ttcctggtga ccctgagcgt    60 

gttcctgcac                                                           70 

<210>2 

<211>76 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物2 

<400>2 

gagcgtgttc ctgcacgtgc tgcacagcgc ccccgacgtg caggactgcc ccgagtgcac    60 

tctgcaggag aacccc                                                    76 

<210>3 

<211>75 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物3 

<400>3 

ctgcaggaga accccttctt cagccagccc ggcgccccca tcctgcagtg catgggctgc    60 

tgcttcagcc gcgcc                                                     75 

<210>4 

<211>74 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物4 

<400>4 

tcgctggtca cgttcttctg caccagcatg gtcttcttgc tgcgcagggg ggtggggtag    60 

gcgcggctga agca                                                      74 

<210>5 

<211>74 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物5 

<400>5 

accttgaagc cgcccatcac ggtcacgcgg ttgtagctct tggccacgca gcaggtgctt    60 

tcgctggtca cgtt                                                      74 

<210>6 

<211>76 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物6 

<400>6 

gaactctaga ttagctcttg tggtagtagc aggtgctgca gtggcaggcg gtgtggttct    60 

ctaccttgaa gccgcc                                                    76 

<210>7 

<211>85 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物7 

<400>7 

cctgaagctt atgaagaccc tgcagttctt cttcctgttc tgctgctgga aggccatctg    60 

ctgcaatagc tgcgagctga ccaac                                          85 

<210>8 

<211>84 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物8 

<400>8 

agctgcgagc tgaccaacat caccatcgcc atcgagaagg aggagtgccg cttctgcatc    60 

agcatcaaca ccacctggtg cgcc                                           84 

<210>9 

<211>82 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物9 

<400>9 

caacaccacc tggtgcgccg gctactgcta cacccgagat ctggtgtaca aggaccccgc    60 

ccgccccaag atccagaaga cc                                             82 

<210>10 

<211>83 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物10 

<400>10 

gagtcggcgt ggtgggcgca gccgggcacg cgcacggtct cgtacaccag ctccttgaag    60 

gtgcaggtct tctggatctt ggg                                            83 

<210>11 

<211>85 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物11 

<400>11 

gcagtcggtg ctgtcgctgt cgcacttgcc gcagtggcac tgggtggcca cggggtaggt    60 

gtacagtgag tcggcgtggt gggcg                                          85 

<210>12 

<211>82 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物12 

<400>12 

cttatctaga ctactccttc atctcgccga aggagcagta gctgggcccc aggccgcgca    60 

cggtgcagtc ggtgctgtcg ct                                             82 

<210>13 

<211>351 

<212>DNA 

<213>智人 

<220> 

<221>信号肽-肽 

<222>(1)..(72) 

<220> 

<221>CDS 

<222>(73)..(348) 

<400>13 

atggactact accgcaagta cgccgccatc ttcctggtga ccctgagcgt gttcctgcac    60 

gtgctgcaca gc         gcc ccc gac gtg cag gac tgc ccc gag tgc act    105 

ctg cag gag aac ccc ttc ttc agc cag ccc ggc gcc ccc atc ctg cag      153 

tgc atg ggc tgc tgc ttc agc cgc gcc tac ccc acc ccc ctg cgc agc      201 

aag aag acc atg ctg gtg cag aag aac gtg acc agc gaa agc acc tgc      249 

tgc gtg gcc aag agc tac aac cgc gtg acc gtg atg ggc ggc ttc aag      297 

gta gag aac cac acc gcc tgc cac tgc agc acc tgc tac tac cac aag      345 

agc     ta a                                                         351 

<210>14 

<211>92 

<212>PRT 

<213>智人 

<400>14 

Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro 

  1               5                  10                  15 

Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys 

             20                  25                  30 

Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu 

         35                  40                  45 

Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser 

     50                  55                  60 

Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr 

 65                  70                  75                  80 

Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 

                 85                  90 

<210>15 

<211>390 

<212>DNA 

<213>智人 

<220> 

<221>信号肽-肽 

<222>(1)..(54) 

<220> 

<221>CDS 

<222>(55)..(387) 

<400>15 

atgaagaccc tgcagttctt cttcctgt tc tgctgctgga aggccatctg ctgc        54 

aat agc tgc gag ctg acc aac atc acc atc gcc atc gag aag gag gag    102 

tgc cgc ttc tgc atc agc atc aac acc acc tgg tgc gcc ggc tac tgc    150 

tac acc cga gat ctg gtg tac aag gac ccc gcc cgc ccc aag atc cag    198 

aag acc tgc acc ttc aag gag ctg gtg tac gag acc gtg cgc gtg ccc    246 

ggc tgc gcc cac cac gcc gac tca ctg tac acc tac ccc gtg gcc acc    294 

cag tgc cac tgc ggc aag tgc gac agc gac agc acc gac tgc acc gtg    342 

cgc ggc ctg ggg ccc agc tac tgc tcc ttc ggc gag atg aag gag tag    387 

     tag                                                     390 

<210>16 

<211>111 

<212>PRT 

<213>智人 

<400>16 

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu 

  1               5                  10                  15 

Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 

             20                  25                  30 

Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln 

         35                  40                  45 

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 

     50                  55                  60 

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 

 65                  70                  75                  80 

Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 

                 85                  90                  95 

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu 

            100                 105                 110 

Claims (11)

1.一种核苷酸，其序列为一编码人促卵泡激素的序列，该人促卵泡激素由α亚单位和β亚单位构成，其特征在于所述序列中编码α亚单位的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：13所示，编码β亚单位的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：15所示，该核苷酸可提高该人促卵泡激素的表达水平。

2.一种用于动物细胞中表达的表达载体，其特征在于包含权利要求1所述的编码α亚单位的核苷酸序列。

3.一种用于动物细胞中表达的表达载体，其特征在于包含权利要求1所述的编码β亚单位的核苷酸序列。

4.权利要求2或3所述的表达载体，其特征在于该表达载体是能够同时转录一标记物和一个编码α亚单位或β亚单位的核苷酸序列的双顺反子表达载体。

5.权利要求2所述的表达载体，其特征在于该表达载体具有如图2所示酶切图谱的载体结构。

6.权利要求3所述的表达载体，其特征在于该表达载体具有如图3所示酶切图谱的载体结构。

7.一种由权利要求2和3所述的表达载体所同时转化的动物细胞。

8.权利要求7所述的动物细胞，其特征在于该动物细胞选自于中国仓鼠卵巢细胞、小鼠细胞、猴细胞和人细胞。

9.权利要求8所述的动物细胞，其特征在于该动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

10.一种利用转化的动物细胞来生产人促卵泡激素的方法，其特征在于其包括以下步骤：

培养由包含如权利要求1所述的编码人促卵泡激素的核苷酸序列的表达载体转化的动物细胞；并

从培养液中分离纯化人促卵泡激素。

11.一种生产人促卵泡激素蛋白的方法，其特征在于其包括以下步骤：

制备编码α亚单位如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列和编码β亚单位如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列；

将该编码α亚单位的核苷酸序列和编码β亚单位的核苷酸序列分别插入表达载体；

用所述表达载体转化动物细胞；

培养转化子，并且

从培养液中分离纯化人促卵泡激素蛋白。

Images