ES2332931T3 - Analogos de hormonas glicoproteinicas entrelazadas por disulfuro, su preparacion y uso. - Google Patents
Analogos de hormonas glicoproteinicas entrelazadas por disulfuro, su preparacion y uso. Download PDFInfo
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Abstract
Hormonas glicoproteínicas, que consisten en una subunidad alfa y una subunidad ß, seleccionadas del grupo que consiste en: (a) gonadotropina coriónica humana (hCG) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa está modificada para sustituir el resto Cys7 por serina, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Tyr37 por cisteína, para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto Cys31 nativo de dicha subunidad alfa y el resto 37 de dicha subunidad ß, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está opcionalmente más modificada para sustituir los restos 101-114 por los restos 95-108 de la subunidad ß de la hFSH; (b) gonadotropina coriónica humana (hCG) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa está modificada para sustituir el resto Val76 por cisteína, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Val44 por cisteína para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 76 de dicha subunidad alfa y el resto 44 de dicha subunidad ß; (c) hormona humana estimulante del folículo (hFSH) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Tyr31 por cisteína, y en que o bien (i) la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa está modificada para sustituir el resto Cys7 por serina; o bien (ii) la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa está modificada para sustituir el resto Cys7 por alanina; para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto Cys31 nativo de dicha subunidad alfa y el resto 31 de dicha subunidad ß; y (d) hormona humana estimulante del folículo (hFSH) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa está modificada para sustituir el resto Val76 por cisteína, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Val38 por cisteína para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 76 de dicha subunidad alfa y el resto 38 de dicha subunidad ß.
Description
Análogos de hormonas glicoproteínicas
entrelazadas por disulfuro, su preparación y uso.
El presente invento se refiere a hormonas
glicoproteínicas y a su preparación y su uso. Más específicamente,
el invento se refiere a hormonas glicoproteínicas entrelazadas por
enlaces disulfuro y a su preparación y su uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Las hormonas glicoproteínicas incluyen las
hormonas gonadotropina coriónica (CG; del inglés, chorionic
gonado-
tropin), también conocida como coriogonadotropina, hormona luteinizante (LH; del inglés, luteinizing hormone), también conocida como lutropina, hormona estimulante del folículo (FSH; del inglés, follicle stimulating hormone), también conocida como folitropina, y hormona estimulante del tiroides (TSH; del inglés, thyroid stimulating hormone), también conocida como tirotropina. Las de seres humanos son conocidas como gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona luteinizante humana (hLH), hormona humana estimulante del folículo (hFSH) y hormona humana estimulante del tiroides (hTSH). Estas hormonas ejercen papeles importantes en las funciones gonadal y tiroidea (Pierce et al., 1981; Moyle et al., 1995). La CG y la LH se unen a, y estimulan, los receptores de LH, la FSH se une a, y estimula, los receptores de FSH, y la TSH se une a, y estimula, los receptores de TSH. La CG es una hormona producida en grandes cantidades principalmente por las placentas de unos pocos mamíferos, incluyendo las de primates. Las secuencias de aminoácidos de las subunidades \beta de la CG de primates difieren normalmente de las de la LH. Los caballos también producen una CG; sin embargo, ésta tiene la misma secuencia de aminoácidos que la LH equina (Murphy et al., 1991).
tropin), también conocida como coriogonadotropina, hormona luteinizante (LH; del inglés, luteinizing hormone), también conocida como lutropina, hormona estimulante del folículo (FSH; del inglés, follicle stimulating hormone), también conocida como folitropina, y hormona estimulante del tiroides (TSH; del inglés, thyroid stimulating hormone), también conocida como tirotropina. Las de seres humanos son conocidas como gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona luteinizante humana (hLH), hormona humana estimulante del folículo (hFSH) y hormona humana estimulante del tiroides (hTSH). Estas hormonas ejercen papeles importantes en las funciones gonadal y tiroidea (Pierce et al., 1981; Moyle et al., 1995). La CG y la LH se unen a, y estimulan, los receptores de LH, la FSH se une a, y estimula, los receptores de FSH, y la TSH se une a, y estimula, los receptores de TSH. La CG es una hormona producida en grandes cantidades principalmente por las placentas de unos pocos mamíferos, incluyendo las de primates. Las secuencias de aminoácidos de las subunidades \beta de la CG de primates difieren normalmente de las de la LH. Los caballos también producen una CG; sin embargo, ésta tiene la misma secuencia de aminoácidos que la LH equina (Murphy et al., 1991).
Conforme a la revisión de Pierce et al.
(1981), las hormonas glicoproteínicas son heterodímeros que
consisten en una subunidad \alpha y una subunidad \beta. Los
heterodímeros no están covalentemente unidos entre sí, y sus
subunidades pueden ser disociadas mediante el tratamiento de las
hormonas con ácido o urea (Pierce et al., 1981). La mayor
parte de los vertebrados superiores sólo contienen un gen que
codifica la subunidad \alpha (Fiddes et al., 1.984); la
misma subunidad \alpha se combina normalmente con las subunidades
\beta de LH, FSH, TSH y, cuando está presente, CG. No obstante,
el procesamiento proteico posterior a la traducción, notablemente
la glicosilación (Baenziger et al., 1988), puede contribuir a
diferencias en las composiciones de las subunidades \alpha de LH,
FSH, TSH y CG. La mayor parte de las diferencias de secuencia de
aminoácidos entre las hormonas radica en sus subunidades \beta
específicas de la hormona (Pierce et al., 1981). Éstas se
producen a partir de genes separados (Fiddes et al., 1984; Bo
et al.,
1992).
1992).
Con pocas excepciones (Blithe et al.,
1991), los \alpha,\beta-heterodímeros presentan
mucha más actividad hormonal que cada subunidad libre (Pierce et
al., 1981). Las subunidades \alpha y \beta presentes en la
naturaleza forman mucho mejor
\alpha,\beta-heterodímeros que
\alpha,\alpha-homodímeros o
\beta,\beta-homodímeros. En realidad, la
expresión conjunta de los genes de la subunidad \alpha y la
subunidad \beta de hCG en células de mamífero conduce a la
formación de \alpha,\beta-heterodímeros,
monómeros de subunidad \alpha y monómeros de subunidad \beta.
Las células sólo crean o secretan cantidades mínimas, si las
hubiera, del \alpha,\alpha-homodímero o el
\beta,\beta-homodímero.
Dos laboratorios (Lapthorn et al., 1994;
Wu et al., 1994) han presentado estructuras cristalinas de
alta resolución de la gonadotropina coriónica humana (hCG) por
rayos X. Estas estructuras revelaron que los propuestos patrones
originales de enlaces disulfuro (Mise et al., 1980 y 1981)
eran incorrectos y que la hormona es un miembro de la familia de
proteínas con nudos de cisteínas (Sun et al., 1995). Puesto
que las posiciones relativas de las cisteínas son similares en
todas las hormonas glicoproteínicas, es probable que tengan la
arquitectura de nudos de cisteínas hallada en la hCG.
Las posiciones de los restos de cisteína en las
subunidades \alpha de las hormonas glicoproteínicas de vertebrados
son similares (Figuras 1A y 1B). Usando la subunidad \alpha de
hCG como modelo, se ve que el nudo de cisteínas está formado por
las cisteínas segunda, tercera, quinta, séptima, octava y novena de
la subunidad \alpha. Esto crea tres grandes bucles en la
subunidad \alpha (Figuras 1A y 1B). El bucle 1 es la secuencia de
aminoácidos entre las cisteínas segunda y tercera; el bucle 2 es la
secuencia de aminoácidos entre las cisteínas quinta y séptima de la
subunidad \alpha; y el bucle 3 es la secuencia de aminoácidos
entre las cisteínas séptima y octava. Las posiciones de los restos
de cisteína en las subunidades \beta de las hormonas
glicoproteínicas de vertebrados son similares (Pierce et
al., 1981). Usando la subunidad \beta de hCG como modelo, se
ve que el nudo de cisteínas está formado por las cisteínas primera,
cuarta, quinta, sexta, octava y novena. Esto crea tres grandes
bucles en la subunidad \beta (Figuras 2A y 2B). El bucle 1 es la
secuencia de aminoácidos entre las cisteínas primera y cuarta; el
bucle 2 es la secuencia entre las cisteínas quinta y sexta; y el
bucle 3 es la secuencia entre las cisteínas sexta y octava.
Sustituyendo porciones de la subunidad \alpha por porciones
homólogas de otra subunidad \alpha o sustituyendo porciones de la
subunidad \beta por porciones homólogas de otra subunidad
\beta, es posible preparar quimeras funcionales de cada subunidad
de hormona glicoproteínica (Campbell et al., 1991; Moyle
et al., 1990; Moyle et al., 1994; Cosowsky et
al., 1995; Moyle et al., 1995; Cosowsky et al.,
1997). En la Figura 1C se presenta un esquema general de los
elementos estructurales de las subunidades de hormonas
glicoproteínicas, y en la Tabla 1A siguiente se muestra la
correspondencia con subunidades de hormonas glicoproteínicas
humanas por restos de aminoácido.
Además de su nudo de cisteínas, la subunidad
\beta contiene también una secuencia denominada "cinturón de
seguridad" (Lapthorn et al., 1994) que está enrollada
alrededor del segundo bucle de la subunidad \alpha. El cinturón
de seguridad comienza en la novena cisteína, el último resto del
nudo de cisteínas de la subunidad \beta, e incluye las cisteínas
décima, undécima y duodécima. Está fijado al primer bucle de la
subunidad \beta por un enlace disulfuro entre la cisteína doce
(es decir, en el extremo carboxílico terminal del cinturón de
seguridad) y la cisteína tres (es decir, en el primer bucle de la
subunidad \beta).
El cinturón de seguridad es una porción de la
subunidad \beta de hCG que ejerce una significativa (si no
esencial) influencia sobre la capacidad de hCG para distinguir los
receptores de LH y FSH (Campbell et al., 1991; Moyle et
al., 1994). La sustitución de toda la secuencia de aminoácidos
del cinturón de seguridad de hCG, o de partes de ella, por la
secuencia del cinturón de seguridad hallada en hFSH alteró la
especificidad del compuesto hormonalmente análogo resultante en
cuanto a la unión al receptor. Normalmente, la hCG se une a los
receptores de LH más de 1.000 veces mejor que a los receptores de
FSH o TSH. Sin embargo, compuestos análogos de hCG tales como
CF94-117 y CF101-109 en que los
restos 101-109 del cinturón de seguridad de hCG (es
decir,
Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr)
están sustituidos por sus restos correspondientes de hFSH (es
decir,
Thr-Val-Arg-Gly-Leu-Gly-Pro-Ser-Tyr)
se unían a los receptores de FSH mucho mejor que la hCG (Moyle
et al., 1994). Además, manipulando la composición del
cinturón de seguridad, es posible preparar compuestos análogos de
hCG que tengan diversos grados de actividades LH y FSH (Moyle et
al., 1994; Han et al., 1996). Éstos presentan posibles
usos terapéuticos importantes para potenciar la fecundidad en machos
y hembras.
La mayoría de los enlaces disulfuro
intrasubunitarios de las hormonas glicoproteínicas, aunque no todos,
son esenciales para sus actividades biológicas. Estudios en que se
han sustituido cisteínas individuales por otros aminoácidos,
notablemente alanina, han mostrado que todos los enlaces disulfuro
de los nudos de cisteínas y el cinturón de seguridad son esenciales
para la plegadura del heterodímero (Suganuma et al., 1989;
Bedows et al., 1993; Furuhashi et al., 1994). Los
restantes enlaces disulfuro entre las cisteínas 7-31
y 59-87 de la subunidad \alpha humana y entre las
cisteínas 23-72 de la subunidad \beta de hCG no
son esenciales para la formación del heterodímero ni para la
actividad hormonal.
Hasta ahora, no hay una estructura cristalina de
alta resolución que describa la interacción de una hormona
glicoproteínica con su receptor. Se han creado diversos modelos en
un esfuerzo para describir la estructura del complejo
hormona-receptor. La mayoría de estos se basan en
las estructuras cristalinas de hCG y el inhibidor de ribonucleasas,
una proteína cuya estructura puede ser similar a la de los dominios
extracelulares de los receptores de hormonas glicoproteínicas. La
mayoría de los esfuerzos para identificar los restos hormonales que
entran en contacto con el receptor se han basado en la influencia de
mutaciones químicas, enzimáticas o genéticas que conducen a una
reducción de la unión al receptor. Desafortunadamente, puesto que la
reducción de la unión podría ser causada por la alteración de un
contacto específico o por un cambio de la conformación hormonal
(Cosowsky et al., 1997), es difícil, si no imposible,
interpretar los efectos de estos cambios. Esto ha conducido a un
considerable desacuerdo en este campo (Remy et al., 1996;
Berger et al., 1996), y algunos investigadores han concluido
que no es posible determinar la orientación de la hormona en el
complejo del receptor (Blowmick et al., 1996).
Otros planteamientos para determinar la
orientación de la hormona en el complejo del receptor se basan en
identificar regiones de la hormona que no entran en contacto con el
receptor. Éstas permanecen expuestas después de que la hormona se
ha unido al receptor y/o pueden ser alteradas sin interrumpir las
interacciones hormona-receptor. Cuando éstas son
mapeadas sobre la estructura cristalina de hCG (Lapthorn et
al., 1994; Wu et al., 1994), es posible desarrollar un
modelo hipotético del modo en que hCG podría interaccionar con los
receptores de LH (Moyle et al., 1995). Este planteamiento
sugería que el surco hormonal formado por el segundo bucle de la
subunidad \alpha y los bucles primero y tercero de la subunidad
\beta está implicado en el contacto primario con el receptor
(Cosowsky et al., 1995). Esto también explicaría por qué son
necesarias ambas subunidades para la máxima unión de
hormona-receptor (Pierce et al., 1981). Los
datos en que se apoya esta conclusión se discuten en los diversos
párrafos siguientes. Sin embargo, ha de advertirse que, en este
campo, la mayoría de los demás investigadores, si no todos, apoyan
un modelo en que la hormona está orientada muy diferentemente (Remy
et al., 1996; Berger et al., 1996), aun cuando estos
investigadores estuvieran al corriente del modelo recién descrito
(es decir, citan el artículo en que se describe el modelo en que el
sitio primario de unión al receptor era creado por el surco
hormonal).
Muchas porciones de la subunidad \alpha de hCG
que parecen no entrar en contacto con el receptor pueden ser
sustituidas sin alterar la unión con los receptores de LH. Algunas
de estas regiones están claramente expuestas en el complejo
hormona-receptor ya que pueden ser también
reconocidas por anticuerpos monoclonales mientras la hCG está unida
a los receptores de LH (Moyle et al., 1990; Cosowsky et
al., 1995; Moyle et al., 1995). Por ejemplo, aunque las
subunidades \alpha humana y bovina tienen secuencias de
aminoácidos muy diferentes, los heterodímeros que contienen la
subunidad \alpha bovina y la subunidad \beta de hCG se unen bien
a receptores de LH humanos y de rata (Cosowsky et al.,
1997). Éstos heterodímeros son fácilmente distinguidos por la
mayoría de los anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos en
los bucles 1 y 3 de la subunidad \alpha de hCG (Moyle et
al., 1995). Estas observaciones muestran que las superficies de
los bucles 1 y 3 de las subunidades \alpha humana y bovina
difieren, y sugieren que esta región de la hormona no forma
contactos esenciales clave con el receptor.
Al comparar las capacidades de anticuerpos
monoclonales para reconocer compuestos análogos de hCG en que partes
de la subunidad \alpha procedían de proteínas humanas o bovinas,
fue posible identificar los restos clave de la subunidad \alpha
que participaban en la unión a anticuerpos (Moyle et al.,
1995). Algunos anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos en
la subunidad \alpha de hCG también se unían a un fragmento de la
subunidad \alpha que había sido preparado por digestión con
tripsina y que carecía de la mayor parte del bucle segundo de la
subunidad \alpha (Lapthorn et al., 1994; Wu et al.,
1994; Birken et al., 1986). Esta observación fue también
utilizada para determinar y/o confirmar los sitios de unión de estos
anticuerpos (Moyle et al., 1995). Dos anticuerpos
monoclonales que reconocen epítopos de la subunidad \alpha y a los
que se hace referencia como A105 y A407 (Moyle et al., 1995)
se unían a hCG cuando la hormona estaba complejada con receptores
de LH. De esta manera, parecía que los restos de la subunidad
\alpha reconocidos por estos anticuerpos no entraban en contacto
con el receptor de LH (Moyle et al., 1995). El resto de la
subunidad \alpha incluye el bucle segundo de la subunidad
\alpha y el extremo C de la proteína. Algunos de los restos de
estas porciones muy conservadas de la subunidad \alpha pueden
participar en contactos con el receptor.
Muchas porciones de la subunidad \beta de hCG
que parecen no entrar en contacto con el receptor de LH (LHR; del
inglés, LH receptor) pueden ser también sustituidas por
mutagénesis sin alterar la unión con el receptor de LH. Esto
incluye el bucle 2 de la subunidad \beta de hCG. Un compuesto
análogo de hCG en que restos del bucle 2 de la subunidad \beta de
hCG estaban sustituidos por los normalmente hallados en el bucle 2
de la subunidad \beta de hFSH, denominado CF39-58
(Campbell et al., 1991), fue rápidamente distinguido por
anticuerpos monoclonales que reconocían restos de FSH pero no de
hCG en el bucle 2 de la subunidad \beta. Esto mostraba que la
estructura del bucle segundo de la subunidad difería en este
compuesto análogo y en hCG. No obstante, este compuesto análogo de
subunidad \beta se combinaba con la subunidad \alpha para formar
un \alpha,\beta-heterodímero que interaccionaba
con receptores de LH similarmente a hCG (Campbell et al.,
1991). De este modo, parece que pocos restos, si acaso alguno, del
bucle segundo de la subunidad \beta de hCG tienen contactos
directos esenciales con el receptor de LH. Similarmente, parece que
el bucle segundo de la subunidad \beta de hFSH no entra en
contacto con los receptores de FSH. Se han presentado compuestos
análogos de la subunidad \beta de hCG en que restos entre la
décima cisteína de la subunidad \beta y el extremo C o entre los
restos 94-114 estaban sustituidos por los
correspondientes restos de hFSH. Estos compuestos análogos son
denominados CF94-117 (Campbell et al., 1991)
y CFC94-114 (Wang et al., 1994). Ambos se
unen a receptores de FSH mucho mejor que a receptores de LH aun
cuando contienen la secuencia entera de hCG en el bucle segundo de
la subunidad \beta. Puesto que parece que el bucle segundo de la
subunidad \beta de hCG ejerce una influencia mínima sobre la
capacidad de la hormona para unirse a receptores de LH o FSH, parece
improbable que participe en contactos esenciales de alta afinidad
con el receptor de LH o FSH. Además, el bucle segundo de la
subunidad \beta de hCG está situado cerca de los bucles primero y
tercero de la subunidad \alpha, una porción de la subunidad
\alpha que tampoco parece entrar en contacto con el receptor. De
este modo, parece probable que la región entera de hCG que contiene
restos de los bucles primero y tercero de la subunidad \alpha y el
bucle segundo de la subunidad \beta no puede entrar en contacto
con el receptor. Como se discutirá más adelante, se piensa que esta
porción de la hormona se proyecta en una cavidad creada por la forma
de herradura del dominio extracelular del receptor (Moyle et
al., 1995).
Los restos de la subunidad \beta de hCG que no
participan en contactos de alta afinidad con el receptor pueden ser
también reconocidos por anticuerpos monoclonales una vez que la
hormona se ha unido a receptores de LH (Campbell et al.,
1991; Moyle et al., 1990; Moyle et al., 1994; Cosowsky
et al., 1995). Aquellos incluyen porciones de la subunidad
\beta de hCG halladas en los bucles 1 y 3 más allá de la interfase
de la subunidad \alpha, que pueden ser reconocidos por
anticuerpos tales como B105, B108, B111 y B112. Estos anticuerpos
se unen a hCG cuando está complejada con receptores de LH (Moyle
et al., 1990; Cosowsky et al., 1995), lo que
demuestra que estas porciones de los bucles 1 y 3 de la subunidad
\beta no tienen contactos esenciales con el receptor. Otros
estudios han mostrado que es posible eliminar restos entre el
extremo N y la primera cisteína y entre la duodécima cisteína y el
extremo C de la subunidad \beta de hCG sin eliminar la capacidad
de la hormona para unirse a receptores de LH (Huang et al.,
1993). La restante porción de la subunidad \beta incluye el
cinturón de seguridad. Parece que pocos de estos restos tienen
contactos esenciales necesarios para la unión de alta afinidad con
los receptores de LH o FSH. Por ejemplo, se halló que el cambio de
los restos en el cinturón de seguridad entre las cisteínas undécima
y duodécima ejercía un efecto mínimo, si acaso alguno, sobre la
unión con los receptores de LH (Moyle et al., 1994). El
cambio de restos entre las cisteínas décima y undécima ejercía un
efecto inferior al quíntuplo sobre la unión al receptor de FSH
(Moyle et al., 1994). Además, la mayor parte de los restos
del cinturón de seguridad de LH equina (eLH) y CG equina (eCG)
difieren de los de FSH (Pierce et al., 1981; Murphy et
al., 1991); sin embargo, estas hormonas se unen bien al
receptor de FSH (FSHR; del inglés, FSH receptor) de rata. En
realidad, la eLH purificada se une al menos un 30% tan bien como la
hFSH al receptor de FSH de rata in vitro (Moyle et
al., 1994). Las porciones de la subunidad \beta de hCG que
quedan por explicar incluyen las superficies de los bucles 1 y 3 que
están más próximas a la interfase de la subunidad \alpha. De esta
manera, son probablemente sitios de la hormona que entran en
contacto con el receptor. Porciones de la subunidad \alpha pueden
ser también reconocidas por anticuerpos monoclonales cuando la hCG
está complejada con receptores de LH. Aquéllas incluyen restos
reconocidos por los anticuerpos A105 y A407 (Moyle et al.,
1995).
Otras estrategias para identificar regiones de
las hormonas glicoproteínicas que interaccionan con receptores
implican el uso de compuestos hormonalmente análogos que reconocen
más de un receptor (Campbell et al., 1991; Moyle et
al., 1994; Han et al., 1996; Campbell et al.,
1997). De esta manera, fue posible preparar compuestos análogos de
hCG que se unen con receptores de FSH y TSH, cambiando simplemente
el cinturón de seguridad de la subunidad \beta de hCG con el
hallado en hFSH (Campbell et al., 1997). Este compuesto
análogo no contiene restos específicos de TSH; sin embargo, era
capaz de estimular una respuesta de TSH con el mismo nivel máximo
que la TSH. Comparando las actividades de varios de estos compuestos
análogos multifuncionales, es posible concluir que es improbable
que la mayoría de los restos del cinturón de seguridad y casi todos
los del bucle segundo de la subunidad \beta formen contactos
esenciales clave de alta afinidad con el receptor.
No hay comunicados sobre una estructura
cristalina para el receptor de LH, de FSH ni de TSH. Sin embargo,
se conocen las secuencias de aminoácidos de varios receptores de
hormonas glicoproteínicas (Moyle et al., 1994; McFarland
et al., 1989; Loosfelt et al., 1989; Segaloff et
al., 1990; Sprengel et al., 1990; Braun et al.,
1991; Nagayama et al., 1991; Nagayama et al., 1989;
Jia et al., 1991). Parece que estas proteínas tienen
dominios extracelulares, transmembranales e intracelulares. Cuando
se expresa sin los dominios transmembranales o intracelulares
(Braun et al., 1991; Ji et al., 1991; Xie et
al., 1990; Moyle et al., 1991), o junto con otros
dominios transmembranales (Moyle et al., 1991), se ve que el
dominio extracelular contribuye a la mayor parte de la afinidad del
receptor por su ligando. Los dominios extracelulares de estas
proteínas son miembros de la familia de proteínas con repeticiones
ricas en leucina, y parece que los dominios transmembranales tienen
siete hélices hidrófobas que atraviesan la membrana plasmática
(McFarland et al., 1989). Se ha determinado una estructura
cristalina del inhibidor de ribonucleasas, una estructura modelo de
una proteína con repeticiones ricas en leucina, y se ha mostrado
que tiene forma de herradura (Kobe et al., 1993 y 1995). Este
hallazgo sugería que los dominios extracelulares de los receptores
de LH, FSH y TSH tienen forma de herradura (Moyle et al.,
1995). Mediante el uso de quimeras de receptores de LH/FSH (Moyle
et al., 1994), se han identificado porciones del dominio
extracelular de los receptores de LH y FSH que controlan su
especificidad de unión a hCG y hFSH. Considerando las porciones de
hCG que más probablemente entran en contacto con el receptor de LH
y las porciones del receptor de LH que son responsables de la
especificidad de la unión a ligandos, se desarrolló un modelo que
explica las capacidades de esta hormona para interaccionar con
receptores de LH y provocar la transducción de señales (Moyle et
al., 1995). En este modelo, el surco entre el bucle segundo de
la subunidad \alpha y los bucles primero y tercero de la subunidad
\beta entra en contacto con el borde del dominio extracelular del
receptor próximo al centro de la herradura (Moyle et al.,
1995). El resto de la hormona se proyecta en el espacio situado
entre los brazos de la herradura. Cuando la hormona se une al
receptor y se proyecta en este espacio, estabiliza una conformación
del dominio extracelular necesaria para la transducción de señales.
Ésta es conducida al dominio transmembranal mediante contactos
específicos entre los dominios extracelular y transmembranal
necesarios para la apropiada expresión del receptor sobre la
superficie celular (Moyle et al., 1991). El modelo explica
las capacidades de los oligosacáridos para influir en la
transducción de señales (Moyle et al., 1975; Matzuk et
al., 1989). Sin embargo, aunque el modelo puede explicar estos
datos, se han propuesto otros modelos en que partes diferentes de
la hCG interaccionan con los receptores (Jiang et al.,
1995). Por lo tanto, no está aún claro cómo interaccionan las
hormonas glicoproteínicas con sus receptores.
Esta visión de la interacción
hormona-receptor también explica la inhibición de la
unión de hCG por ciertos anticuerpos monoclonales que reconocen
regiones de hCG de las que se piensa que no participan en contactos
clave con el receptor. Como se discutió previamente, éstas incluyen
la superficie hormonal formada por los bucles 1 y 3 de la subunidad
\alpha y el bucle 2 de la subunidad \beta. En el modelo, estas
regiones se proyectan en un espacio entre los brazos N y C
terminales del dominio extracelular del receptor. La unión de
anticuerpos a estos sitios evita que la hormona entre en este
espacio.
Las similitudes en las posiciones de las
cisteínas en las hormonas glicoproteínicas de la mayor parte de las
especies de vertebrados (Pierce et al., 1981) sugieren que se
plegarán como hCG. Es también probable que las estructuras de los
receptores para las hormonas glicoproteínicas sean bastante
comparables debido a las similitudes en las repeticiones ricas en
leucina de sus dominios extracelulares y al gran número de restos
conservados en sus dominios transmembranales (Moyle et al.,
1994; Braun et al., 1991; Nagayama et al., 1991). Por
lo tanto, parece probable que cualquier modelo que explique
satisfactoriamente la interacción de hCG con los receptores de LH
prediga también las capacidades de las demás hormonas
glicoproteínicas para interaccionar con sus receptores. Un modo en
que el cinturón de seguridad puede influir en la especificidad de la
interacción de ligando-receptor sería alterar las
posiciones relativas de las subunidades hormonales (Cosowsky et
al., 1997). Esto cambiaría la forma del surco entre el bucle
segundo de la subunidad \alpha y los bucles primero y tercero de
la subunidad \beta. Se ha hecho la sugerencia de que elementos
inhibidores en la hormona y el receptor son responsables de la
evitación de unas inapropiadas interacciones de
ligando-receptor (Moyle et al., 1994). Por lo
tanto, el efecto del cinturón de seguridad sería alterar la forma
de la hormona para reducir su capacidad para encajar en la porción
central de la herradura.
Las hormonas glicoproteínicas tienen diversos
usos terapéuticos. La FSH se utiliza para inducir el desarrollo de
folículos ováricos en preparación para la inducción de la ovulación
en hembras (Galway et al., 1990; Shoham et al., 1991;
Gast, 1995; Olive, 1995). La LH y la hCG son también utilizadas para
inducir la ovulación de folículos que han iniciado el desarrollo.
La FSH, la LH y la hCG se utilizan para inducir la función
testicular en machos. Aunque las hormonas existentes pueden ser
utilizadas para estimular las funciones de las gónadas masculinas y
femeninas y la glándula tiroides, la aplicación práctica de las
hormonas para este uso requiere que sean heterodímeros. Éstos
pueden ser aislados de la hipófisis (es decir, LH y FSH), el suero
(gonadotropina coriónica equina), o la orina de mujeres embarazadas
(hCG) o posmenopáusicas (mezclas de hLH y hFSH). Pueden también
aislarse heterodímeros activos de cultivos de células que expresan
tanto la subunidad \alpha como la \beta, incluyendo algunas de
tumores (Cole et al., 1981) o aquellas que han sido
transfectadas con cDNA o DNA genómico que codifican las subunidades
\alpha y \beta (Reddy et al., 1985). En realidad, las
últimas son una fuente importante de hormonas glicoproteínicas que
tienen utilidad terapéutica. Puesto que se ha mostrado que los
oligosacáridos de las hormonas glicoproteínicas influyen en sus
capacidades para provocar la transducción de señales (Moyle et
al., 1975; Matzuk et al., 1989), la preparación y la
síntesis de heterodímeros activos se llevan mejor a cabo en células
eucarióticas. Estas células son capaces de añadir oligosacáridos de
alto contenido en manosa a oligosacáridos y, en algunos casos,
procesarlos para obtener los oligosacáridos complejos que se
encuentran en las hormonas naturales (Baenziger et al.,
1988). Sin embargo, puesto que las células eucarióticas pueden
procesar glicoproteínas diferentemente, la síntesis de hormonas
glicoproteínicas es llevada frecuentemente a cabo en líneas
celulares de mamífero tales como las derivadas del ovario de hámster
chino (CHO; del inglés, chinese hamster
ovary). Aunque las hormonas pueden generarse en células
eucarióticas que no sean de mamífero, la antigenicidad potencial de
las cadenas oligosacáridas limita su uso clínico.
Las hormonas heterodímeras han sido también
utilizadas como inmunógenos para obtener antisueros que pueden ser
utilizados para limitar la fecundidad (Singh et al., 1989;
Pal et al., 1990; Talwar et al., 1986; Talwar et
al., 1992; Moudgal et al., 1971 y 1972; Moudgal, 1976;
Ravindranath et al., 1990; Moudgal et al., 1978). A
causa de los papeles esenciales de hCG en cuanto a mantener el
embarazo humano, el desarrollo de una respuesta inmune hacia hCG
sería útil como un medio de anticoncepción, y se ha realizado un
esfuerzo sustancial para crear una vacuna anticonceptiva basada en
hCG. Sin embargo, en principio, los anticuerpos contra las hormonas
podrían ser también utilizados para activar la fecundidad. Por
ejemplo, parece que los niveles de LH son excesivos en ciertas
mujeres que padecen la enfermedad ovárica poliquística. Por lo
tanto, el desarrollo de un método que redujera pero no eliminara la
actividad LH circulante sería beneficioso para el restablecimiento
de la fecundidad.
Se conoce poco del metabolismo de las hormonas
glicoproteínicas. Se sabe que las semividas de las hormonas están
influidas por su contenido de oligosacáridos (Baenziger et
al., 1988), particularmente por sus restos terminales de
azúcar. Las hormonas más estables son aquellas que tienen el mayor
contenido de ácido siálico en esta posición (Murphy et al.,
1991; Baenziger et al., 1992; Fiete et al., 1991;
Smith et al., 1993; Rosa et al., 1984). Sin embargo,
los oligosacáridos no son totalmente responsables de la estabilidad
de las hormonas ya que se sabe que las subunidades hormonales
libres tienen semividas circulantes significativamente más cortas
aún cuando tengan los mismos oligosacáridos que los heterodímeros
(Wehmann et al., 1984; Kardana et al., 1991). En
realidad, se ha propuesto que las hormonas pueden ser inactivadas
mediante una proteolisis que conduzca a la disociación de las
subunidades (Kardana et al., 1991; Birken et al.,
1991; Cole et al., 1991; Cole et al., 1991; Cole
et al., 1993). La hCG mellada se disociaba en sus subunidades
inactivas mucho más rápidamente que la hCG (Cole et al.,
1993). Por lo tanto, se espera que un procedimiento que pueda evitar
o reducir la disociación de las subunidades potencie la eficacia de
las
hormonas.
hormonas.
Las subunidades de las hormonas glicoproteínicas
se disocian rápidamente en condiciones desnaturalizantes que
incluyen tratamiento térmico, valores extremos de pH, y urea (Pierce
et al., 1981; Cole et al., 1993). Por esta razón, la
mayoría de las preparaciones de hormonas glicoproteínicas son
almacenadas en forma de polvos liofilizados. Un procedimiento que
conduzca a una estabilidad potenciada del heterodímero puede
permitir que las preparaciones de hormonas se almacenen y
distribuyan en forma de disoluciones acuosas. Esto eliminaría la
necesidad de incluir un diluyente separado para hormonas y la
operación adicional de la reconstitución de la hormona por el
usuario
final.
final.
Se han realizado varios intentos para
estabilizar las hormonas por "entrelazamiento" de sus
subunidades. Se han utilizado métodos de entrelazamiento químicos
(Weare et al., 1979 y 1979); sin embargo, estos conducen a
una actividad reducida. También es posible fusionar genéticamente
las subunidades \beta y \alpha entre sí para producir una
hormona de cadena única. Esta molécula es más estable que el
heterodímero y tiene una elevada actividad biológica (Sugahara
et al., 1995); sin embargo, es muy distinta de la molécula
nativa.
Otro método para entrelazar proteínas sería
atarlas por medio de un enlace disulfuro. Esta estrategia se produce
naturalmente para estabilizar otras proteínas de la superfamilia
con nudos de cisteínas (Sun et al., 1995) y sustituye
probablemente al cinturón de seguridad. Además, la adición de
enlaces disulfuro a proteínas puede potenciar su estabilidad con
tal que la adición del enlace disulfuro no aumente la tensión
interna en la proteína (Matthews, 1987; Matsumura et al.,
1989). En la Patente Canadiense CA 2188508 se han comunicado
esfuerzos para estabilizar los heterodímeros glicoproteínicos
mediante un enlace disulfuro. En un comentario, Han et al.
(1996) también sugieren dichos enlaces disulfuro intersubunitarios,
pero en esta referencia se comunica que la introducción de dicho
enlace disulfuro puede disminuir la actividad de la hormona. Esto es
muy probablemente porque estos heterodímeros son proteínas
complejas que tienen varios disulfuros. La adición de una cisteína
a los mismos presenta la posibilidad de alterar la plegadura para
dar lugar a proteínas no funcionales. Además, no es probable que se
puedan utilizar otras proteínas con nudos de cisteínas como una base
para predecir las posiciones de enlaces disulfuro que
estabilizarían a las hormonas glicoproteínicas, ya que la
organización de las subunidades en las otras proteínas con nudos de
cisteínas es sustancialmente diferente de la hallada en las
hormonas glicoproteínicas (Sun et al.,
1995).
1995).
La mención aquí de cualquier documento no quiere
decir que sea una admisión de que dicho documento es la técnica
previa pertinente, ni material considerado para la patentabilidad de
cualquier reivindicación de la presente solicitud. Toda afirmación
relativa a un contenido o una fecha de un documento se basa en la
información disponible para el solicitante en el momento de la
presentación y no constituye una admisión de la exactitud de
dicha
afirmación.
afirmación.
\vskip1.000000\baselineskip
En consecuencia, un objeto del invento es
superar las deficiencias de la técnica anteriormente discutidas.
Las hormonas glicoproteínicas del presente invento (aquí denominadas
"compuestos análogos") proporcionan una estabilidad mejorada
mientras conservan al menos una porción de la bioactividad de la
correspondiente hormona glicoproteínica. Preferiblemente, los
compuestos análogos del presente invento conservan al menos el 25%
de la afinidad de la correspondiente hormona por su receptor
nativo. Estos compuestos análogos del presente invento proporcionan
una mejora con respecto a los compuestos análogos de hormonas
glicoproteínicas de la técnica anterior porque la disposición
adecuadamente diseñada del enlace disulfuro intersubunitario, creado
al modificar restos en una de las subunidades \alpha y \beta o
en ambas, minimiza el posible impacto de los entrelazamientos
intersubunitarios sobre la estructura de la
hormona.
hormona.
El presente inventor ha descubierto que dichos
compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas mejorados cumplen
preferiblemente la norma por la que los entrelazamientos
intersubunitarios deben estar dispuestos en dos restos de cisteína
existentes (nativos) implicados en enlaces disulfuro nativos y no
más allá de las cisteínas extremas de la correspondiente subunidad
nativa. Ninguno de los compuestos análogos de hormonas
glicoproteínicas de la técnica anterior con disulfuros
intersubunitarios cumple esta norma. Sin embargo, dichas hormonas
no son parte del invento reivindicado en la presente solicitud.
Un aspecto del presente invento es la provisión
de compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas como los
reivindicados en la Reivindicación 1, que tienen un entrelazamiento
disulfuro intersubunitario entre un nudo de cisteínas de una
subunidad \alpha y un nudo de cisteínas de una subunidad \beta.
Esto minimiza las perturbaciones sobre la hormona glicoproteínica y
permite que ésta conserve sustancialmente la actividad de estimular
un receptor gonadotropínico poseída por la correspondiente hormona
nativa, mientras confiere una estabilidad mejorada. Esta
característica tampoco es descrita ni sugerida por la técnica
anterior.
Otros aspectos del presente invento son la
provisión de compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas como
los reivindicados en la Reivindicación 1, que tienen un
entrelazamiento disulfuro intersubunitario entre un resto de
cisteína situado en el bucle 3 de la subunidad \alpha y un resto
de cisteína situado en el bucle 2 de la subunidad \beta o entre
el bucle 1 de la subunidad \alpha y el bucle 2 de la subunidad
\beta. Esto también limita las perturbaciones sobre la hormona
glicoproteínica y permite que conserve una porción de la actividad
de estimular un receptor gonadotropínico poseída por la
correspondiente hormona nativa, mientras confiere una estabilidad
mejorada. Esta característica tampoco es descrita ni sugerida por la
técnica anterior.
Cuando se preparan en una composición
farmacéutica, los compuestos análogos del presente invento pueden
ser utilizados para tratar la esterilidad o para limitar la
fecundidad en un paciente que lo necesite. Los heterodímeros de los
compuestos análogos del presente invento son estables en cuanto al
transporte y el almacenamiento en forma de formulación farmacéutica
líquida.
El presente invento proporciona además moléculas
de DNA recombinante que contienen secuencias de nucleótidos que
codifican las subunidades \alpha y \beta de un compuesto análogo
de hormona glicoproteínica, moléculas de DNA recombinante que
pueden ser vectores de expresión. También se proporcionan células
huésped eucarióticas transformadas con dichas moléculas de DNA
recombinante y se usan dichas células en un procedimiento para
preparar los compuestos análogos del presente invento.
\newpage
En particular, un primer aspecto del presente
invento proporciona hormonas glicoproteínicas, que consisten en una
subunidad \alpha y una subunidad \beta, seleccionadas del grupo
que consiste en:
- (a)
- gonadotropina coriónica humana (hCG) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha está modificada para sustituir el resto Cys7 por serina, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta está modificada para sustituir el resto Tyr37 por cisteína, para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto Cys31 nativo de dicha subunidad \alpha y el resto 37 de dicha subunidad \beta, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta está opcionalmente más modificada para sustituir los restos 101-114 por los restos 95-108 de la subunidad \beta de la hFSH;
- (b)
- gonadotropina coriónica humana (hCG) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha está modificada para sustituir el resto Val76 por cisteína, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta está modificada para sustituir el resto Val44 por cisteína para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 76 de dicha subunidad \alpha y el resto 44 de dicha subunidad \beta;
- (c)
- hormona humana estimulante del folículo (hFSH) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta está modificada para sustituir el resto Tyr31 por cisteína, y en que o bien
- (i)
- la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha está modificada para sustituir el resto Cys7 por serina; o bien
- (ii)
- la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha está modificada para sustituir el resto Cys7 por alanina;
- \quad
- para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto Cys31 nativo de dicha subunidad \alpha y el resto 31 de dicha subunidad \beta; y
- (d)
- hormona humana estimulante del folículo (hFSH) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha está modificada para sustituir el resto Val76 por cisteína, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta está modificada para sustituir el resto Val38 por cisteína para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 76 de dicha subunidad \alpha y el resto 38 de dicha subunidad \beta.
Un segundo aspecto del presente invento
proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad
eficaz de la hormona glicoproteínica de acuerdo con el primer
aspecto del presente invento, y un excipiente farmacéuticamente
aceptable. Preferiblemente, dicha composición farmacéutica es un
líquido. Preferiblemente, dicha composición farmacéutica es
estable.
Un tercer aspecto del presente invento
proporciona una molécula de DNA recombinante que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad \alpha de la
hormona glicoproteínica de acuerdo con el primer aspecto del
presente invento, o una molécula de DNA recombinante que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad \beta de
la hormona glicoproteínica de acuerdo con el primer aspecto del
presente invento. Preferiblemente, la molécula de DNA recombinante
es un vector de expresión.
Un cuarto aspecto del presente invento
proporciona una célula huésped eucariótica transformada con la
molécula de DNA recombinante del tercer aspecto del presente
invento, en que la molécula de DNA recombinante es un vector de
expresión, y en que dicha célula huésped es capaz de expresar dicha
subunidad de una hormona glicoproteínica.
Un quinto aspecto del presente invento
proporciona un procedimiento para preparar una hormona
glicoproteínica de acuerdo con el primer aspecto del presente
invento, que comprende las operaciones de:
- (a)
- cultivar una célula huésped eucariótica transformada con secuencias de nucleótidos de las subunidades \alpha y \beta, conducidas en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión distintos;
- (b)
- hacer que se exprese la hormona glicoproteínica; y
- (c)
- recuperar la hormona glicoproteínica expresada.
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 1A-1C muestran la
estructura de la subunidad \alpha de hCG (Figura 1A) junto con su
secuencia de aminoácidos según el código de una sola letra (Figura
1B) y un esquema general de los elementos estructurales de las
subunidades de las hormonas glicoproteínicas (Figura 1C). Como puede
verse en la Figura 1A, el nudo de cisteínas divide la subunidad en
tres grandes bucles. Los bucles 1 y 3 se muestran en la parte
superior. Adviértase que las líneas negras se refieren a los átomos
C\alpha de la cadena principal de aminoácidos mientras que las
líneas grises se refieren a los enlaces disulfuro. Las líneas de la
Figura 1B se han dibujado para ilustrar los enlaces disulfuro. Los
elementos estructurales de la subunidades de las hormonas
glicoproteínicas, como se enumeran en la Tabla 1A, se muestran en
la Figura 1C de forma esquemática.
Las Figuras 2A y 2B muestran la estructura de la
subunidad \beta de hCG (Figura 2A) junto con su secuencia de
aminoácidos según el código de una sola letra (Figura 2B). Como
puede verse en la Figura 2A, el nudo de cisteínas divide la
subunidad \beta en tres grandes bucles. El bucle 2 se muestra la
parte superior. El pequeño bucle del lado derecho de la figura se
halla en el cinturón de seguridad. Los restos positiva y
negativamente cargados de esta región son importantes para las
actividades LH y TSH, respectivamente. Los restos mostrados que
conectan este pequeño bucle con el bucle 1 de la subunidad \beta,
vistos yendo desde el pequeño bucle del cinturón de seguridad hacia
abajo, hasta el resto de la subunidad \beta, ejercen una
influencia principal sobre la unión a los receptores de FSH y TSH.
Adviértase que las líneas negras se refieren a los átomos C\alpha
de la cadena principal de aminoácidos mientras que las líneas grises
se refieren a los enlaces disulfuro. Las líneas de la Figura 2B se
han dibujado para ilustrar los enlaces disulfuro.
Las Figuras 3A y 3B muestran las secuencias de
aminoácidos traducidas de \alpha (Figura 3A) y \alphaC7S
(Figura 3B) codificados por los plásmidos
pSVL-\alpha, pCI-\alpha,
pSVL-\alphaC7S y pC7-\alphaC7S.
Puesto que cada proteína traducida tiene la misma secuencia líder,
se espera que ambas sean procesadas del mismo modo para crear
proteínas que consisten en 92 aminoácidos y que tienen una secuencia
de aminoácidos N-terminal que comienza con APD. El
código de una sola letra usado en esta y otras figuras es: A,
alanina (Ala); C, cisteína (Cys); D, ácido aspártico (Asp); E,
ácido glutámico (Glu); F, fenilalanina (Phe); G, glicocola (Gly);
H, histidina (His); I, isoleucina (Ile), K, lisina (Lys); L, leucina
(Leu); M, metionina (Met); N, asparagina (Asn); P, prolina (Pro);
Q, glutamina (Gln); R, arginina (Arg); S, serina (Ser); T, treonina
(Thr); V, valina (Val); W, triptófano (Trp); e Y, tirosina (Tyr).
La letra mayúscula indica la posición de la sustitución de Cys7 por
serina que formaba C7S.
Las Figuras 4A y 4B muestran las secuencias de
aminoácidos traducidas de hCG\beta' (Figura 4A) y hCG\beta'Y37C
(Figura 4B) codificados por los plásmidos
pSVL-hCG\beta' y
pSVL-hCG\beta'C7S. Puesto que cada uno tiene la
misma secuencia líder, se espera que ambos sean procesados del mismo
modo para crear proteínas que consisten en 145 aminoácidos y que
tienen una secuencia de aminoácidos N-terminal que
comienza con SKE. La letra mayúscula se refiere a la posición de la
mutación de Tyr37 a cisteína.
La Figura 5 muestra la influencia de la mutación
C7S en la subunidad \alpha sobre la unión de los anticuerpos
monoclonales A113 y A407 anti-subunidad \alpha.
hCG recombinante preparada en estructura celular (rhCG) y los
compuestos análogos indicados debajo de cada pareja de barras y
cuyas estructuras se describen en los Ejemplos, fueron sometidos a
inmunoensayos de tipo sándwich empleando B112 como anticuerpo de
captura y A113 o A407 radioyodados como anticuerpos de detección.
B112 reconoce un epítopo que contiene restos del bucle 3 de la
subunidad \beta; A113 reconoce epítopos que comprenden restos del
bucle 1 de la subunidad \alpha; y A407 reconoce epítopos que
comprenden restos del extremo N de la subunidad \alpha y una parte
diferente del bucle 1 de la subunidad \alpha. Los epítopos para
A407 y A113 no solapan ya que ambos pueden unirse a hCG al mismo
tiempo. La barra situada a la derecha de cada pareja se refiere al
ensayo B112/A407. La barra situada a la izquierda se refiere al
ensayo B112/A113. Como se ve aquí, la mutación de C7S producía un
efecto mucho mayor sobre la unión de A407 que sobre la unión de
A113.
La Figura 6 muestra la unión de
hCG(\alpha31-\beta37) al receptor de LH.
Esta figura ilustra las capacidades de rhCG preparada en cultivo
celular (triángulos derechos), hCG purificada de orina (cuadrados) y
hCG(\alpha31-\beta37) preparada en
cultivo celular (triángulos invertidos), para inhibir la unión de
^{125}I-hCG a 200.000 células CHO que expresan
receptores de LH. Los valores en ordenadas se refieren a la cantidad
de hCG radiomarcada que estaba unida a las células al final de la
incubación. Este ensayo mostró que
hCG(\alpha31-\beta37) se unía a los
receptores de LH de forma similar a hCG.
La Figura 7 muestra la actividad de
hCG(\alpha31-\beta37) en cuanto a la
transducción de señales del receptor de LH e ilustra las
capacidades de rhCG y
hCG(\alpha31-\beta37) para provocar la
acumulación de AMP cíclico en 200.000 células CHO que expresan
receptores de LH. La producción de AMP cíclico en respuesta a una
estimulación hormonal es un parámetro muy reconocido de
transducción de señales. Este ensayo mostró que
hCG(\alpha31-\beta37) estimulaba la
acumulación de AMP cíclico de forma similar a hCG.
La Figura 8 muestra las estabilidades térmicas
de hCG y compuestos análogos de hCG que contienen un enlace
disulfuro intersubunitario. Se incubaron cantidades similares de hCG
y de compuestos análogos a 85ºC durante los intervalos indicados en
abscisas. Las muestras fueron enfriadas y fueron sometidas a un
inmunoensayo de tipo sándwich empleando el anticuerpo A113
anti-subunidad \alpha de hCG (captura) y el
anticuerpo B112 radioyodado anti-subunidad \beta
de hCG (detección) para determinar la cantidad de heterodímero que
quedaba. Los valores en abscisas se refieren a la cantidad de
actividad que queda en este ensayo con respecto a la cantidad de
partida de hCG antes del calentamiento. Este ensayo mostró que la
hCG es rápidamente destruida a 85ºC, mientras que los compuestos
análogos entrelazados conservaban sus actividades durante al menos
20 minutos.
La Figura 9 muestra la estabilidad de hCG y de
compuestos análogos entrelazados frente a la disociación con urea.
Se ilustra la influencia de urea 8 M sobre rhCG y los compuestos
análogos de hCG entrelazados, identificados en la parte superior de
cada carril. Es bien sabido que el tratamiento de hCG con urea 8 M
provoca la disociación de sus subunidades, un hallazgo aquí
confirmado. Como puede verse, el tratamiento de los compuestos
análogos entrelazados con urea 8 M no provocaba la disociación de
la subunidades, lo que habría dado lugar a la pérdida de la banda
correspondiente al heterodímero. En la parte izquierda de la figura
se indican las posiciones del heterodímero y de la subunidad
\beta libre. Después de la electroforesis de las muestras tratadas
con urea y no tratadas, se sometieron las proteínas del gel a
electrotransferencia sobre nitrocelulosa, se bloquearon los
restantes sitios proteicos inespecíficos de la superficie de la
nitrocelulosa y se detectaron el dímero y la subunidad \beta
libre utilizando B105 radioyodado.
Las Figuras 10A y 10B muestran las secuencias de
aminoácidos traducidas de CFC101-114\beta' (Figura
10A) y CFC101-114\beta'Y37C (Figura 10B)
codificados por los plásmidos
pSVL-CFC101-114\beta y
pSVLCFC101-114\betaY37C, según el código de
aminoácidos de una sola letra. Puesto que cada uno tiene la misma
secuencia líder, se espera que ambos sean procesados del mismo modo
para crear proteínas que consisten en 145 aminoácidos y que tienen
una secuencia de aminoácidos N-terminal que comienza
con SKE. La posición de la letra mayúscula indica la posición de la
mutación de Tyr37 a cisteína. Las secuencias subrayadas proceden de
la subunidad \beta de hFSH. Los codones para los restos
Arg95-Ser96 forman un sitio BglII y aquellos para
Val102-Arg103-Gly104 forman un
sitio
SstII.
SstII.
La Figura 11 muestra la influencia de los
disulfuros \alpha31-\beta37 y
\alpha51-\beta99 sobre la unión de los
anticuerpos monoclonales A113 y A407 anti-subunidad
\alpha con un compuesto análogo quimérico de hCG/hFSH
bifuncional. hCG y los compuestos análogos de
CFC101-114 indicados debajo de cada pareja de barras
y cuyas estructuras se describen en los Ejemplos, fueron sometidos
a inmunoensayos de tipo sándwich empleando B112 como anticuerpo de
captura y A113 o A407 radioyodados como anticuerpos de detección.
B112 reconoce un epítopo que contiene restos del bucle 3 de la
subunidad \beta; A113 reconoce epítopos que comprenden restos del
bucle 1 de la subunidad \alpha; y A407 reconoce epítopos que
comprenden restos del extremo N de la subunidad \alpha y una
parte diferente del bucle 1 de la subunidad \alpha. Los epítopos
para A407 y A113 no solapan ya que ambos pueden unirse a hCG al
mismo tiempo. La barra situada a la derecha de cada pareja se
refiere al ensayo B112/A407. La barra situada a la izquierda se
refiere al ensayo B112/A113. Como se ve aquí, ni el disulfuro
\alpha31-\beta37 ni el
\alpha51-\beta99 restablecieron la actividad de
unión de A407 con CFC101-114.
La Figura 12 muestra las estabilidades térmicas
de hCG, CFC101-114, y compuestos análogos de
CFC101-114 que contienen un enlace disulfuro
intersubunitario. Se incubaron hCG, CFC101-114 y
compuestos análogos de CFC101-114 a 85ºC durante
los intervalos indicados en abscisas. Las muestras fueron enfriadas
y fueron sometidas a un inmunoensayo de tipo sándwich empleando el
anticuerpo A113 anti-subunidad \alpha de hCG
(captura) y el anticuerpo B112 radioyodado
anti-subunidad \beta de hCG (detección) para
determinar la cantidad de heterodímero que quedaba. Los valores en
abscisas se refieren a la cantidad de actividad que queda en este
ensayo con respecto a la cantidad de partida de hCG antes del
calentamiento. Este ensayo mostró que hCG y
CFC101-114 son rápidamente destruidos a 85ºC,
mientras que los compuestos análogos entrelazados conservaban una
actividad sustancial durante al menos 20 minutos.
La Figura 13 muestra las capacidades de hCG,
CFC101-114 y compuestos análogos de
CFC101-114 para estimular la acumulación de AMP
cíclico en células que expresan receptores de LH. Esta figura
ilustra que la potencia de
CFC101-114(\alpha31-\beta37)
(triángulos negros) era al menos tan grande como la de
CFC101-114 (símbolos blancos) en ensayos diseñados
para comparar sus capacidades para estimular la transducción de
señales del receptor de LH. Aunque
CFC101-114(\alpha51-\beta99)
también estimulaba la transducción de señales, su potencia era
menor que la de CFC101-114 o de
CFC101-114(\alpha31-\beta37).
Por lo tanto, por contraste con las mutaciones requeridas para
preparar el disulfuro \alpha51-\beta99, las
mutaciones necesarias para preparar el disulfuro
\alpha31-\beta37 no influyeron en la
transducción de señales. Es bien sabido que el cinturón de
seguridad influye en la especificidad de la unión al receptor. Por
consiguiente, los datos de esta figura apoyan la idea de que la
introducción de disulfuros en regiones hormonales de las que se
piensa que no participan en contactos con el receptor ni en la
especifidad de unión ejercerá una influencia mínima sobre la unión
al receptor o la transducción de señales. Por lo tanto, las regiones
de la hormona que no entran en contacto con el receptor y/o no
contribuyen a la especifidad de la unión al receptor serán sitios
preferidos para la preparación de heterodímeros entrelazados por
enlaces disulfuro.
La Figura 14 muestra las capacidades de hFSH,
CFC101-114 y
CFC101-114(\alpha31-\beta37)
para estimular la acumulación de AMP cíclico en células que
expresan receptores de FSH. Esta figura ilustra que la respuesta
semimáxima de
CFC101-114(\alpha31-\beta37)
(triángulos negros) era similar a la de CFC101-114
(símbolos blancos) en ensayos diseñados para comparar sus
capacidades para estimular la transducción de señales del receptor
de FSH. La actividad de
CFC101-114(\alpha51-\beta99)
era mucho menor que la de CFC101-114 o de
CFC101-114(\alpha31-\beta37).
Por lo tanto, por contraste con las mutaciones requeridas para
preparar el disulfuro \alpha51-\beta99, las
mutaciones necesarias para preparar el disulfuro
\alpha31-\beta37 ejercían una influencia mínima
sobre la transducción de señales inducida por FSH. Es bien sabido
que el cinturón de seguridad influye en la especificidad de la
unión al receptor. Por consiguiente, los datos de esta figura
apoyan la idea de que la introducción de disulfuros en regiones
hormonales de las que se piensa que no participan en contactos con
el receptor ni en la especifidad de unión ejercerá una influencia
mínima sobre la unión al receptor de FSH o la transducción de
señales. Por lo tanto, las regiones de la hormona que no entran en
contacto con el receptor y/o no contribuyen a la especifidad de la
unión al receptor serán sitios preferidos para la preparación de
heterodímeros entrelazados por enlaces disulfuro.
Las Figuras 15A y 15B muestran las secuencias de
aminoácidos traducidas de \alphaKSIC (Figura 15A) y hCG\betaD99C
(Figura 15B) codificados por los plásmidos
pSVL-\alphaK51C y
pSVL-hCG\beta'D99C. Puesto que cada proteína
basada en la subunidad \alpha de hCG y cada proteína basada en la
subunidad \beta de hCG tiene la misma secuencia líder de péptido
señal que las subunidades \alpha y \beta de hCG, se espera que
sean procesadas del mismo modo. De esta manera, sería de esperar
que \alphaK51C contuviera 92 restos de aminoácido que contuvieran
la secuencia N-terminal APD y sería de esperar que
hCG\beta'D99C contuviera 145 restos de aminoácido que contuvieran
la secuencia N-terminal SKE. El código de
aminoácidos de una sola letra aquí usado ha sido definido en la
leyenda para las Figuras 3A y 3B. La letra mayúscula se refiere a
las posiciones de las mutaciones que se realizaron para formar el
enlace disulfuro intersubunitario.
La Figura 16 muestra las capacidades relativas
de hCG, representada como una línea continua con círculos, y
hCG(\alpha51-\beta99), representada como
una línea discontinua con triángulos derechos, para inhibir la
unión de hCG radiomarcada a células CHO que expresan receptores de
LH.
La Figura 17 muestra las capacidades relativas
de hCG, representada como una línea continua con cuadrados,
hCG(\alpha-\betaD99C), representada como
una línea discontinua con triángulos invertidos,
hCG(\alpha51-\beta99), representada como
una línea discontinua con triángulos derechos, y
hCG(\alphaK51c-\beta), representada como
una línea discontinua con rombos, para inhibir la unión de hCG
radiomarcada a células CHO que expresan receptores de LH.
La Figura 18 muestra las capacidades relativas
de hCG, representada como una línea continua con círculos, y
hCG(\alphaK51A-\beta), representada como
una línea discontinua con triángulos invertidos, para competir con
hCG radiomarcada por unirse a células CHO que expresan receptores de
LH.
La Figura 19 muestra las actividades relativas
de hCG, representada como una línea continua con círculos,
hCG(\alpha51-\beta99), representada como
una línea discontinua con cuadrados blancos,
hCG(\alpha-\betaD99C), representada como
una línea discontinua con triángulos derechos, y
hCG(\alphaK51C-\beta), representada como
una línea discontinua con círculos, en cuanto a la transducción de
señales del receptor de LH.
La Figura 20 muestra las actividades relativas
de hCG, representada como una línea continua con círculos, y
hCG(\alphaK51A-\beta), representada como
una línea discontinua con cuadrados blancos, en cuanto a la
transducción de señales del receptor de LH.
La Figura 21 muestra las secuencia de
aminoácidos traducida codificada por el plásmido
pSVL-CFC101-
114\beta'D99C. Puesto que esta proteína traducida tiene la misma secuencia señal que la subunidad \beta de hCG, se espera que sea procesada del mismo modo y conduzca a una proteína secretada de 145 aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal SKE. La letra mayúscula se refiere a la posición de la mutación que se realizó para introducir el enlace disulfuro.
114\beta'D99C. Puesto que esta proteína traducida tiene la misma secuencia señal que la subunidad \beta de hCG, se espera que sea procesada del mismo modo y conduzca a una proteína secretada de 145 aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal SKE. La letra mayúscula se refiere a la posición de la mutación que se realizó para introducir el enlace disulfuro.
La Figura 22 ilustra las actividades relativas
de hCG, representada como una línea continua,
CFC101-114, representada como una línea discontinua
con triángulos derechos,
CFC101-114(\alpha51-\beta99),
representada como una línea discontinua con triángulos invertidos,
CFC101-114(\alpha-\betaD99C),
representada como una línea discontinua con rombos negros, y
CFC101-114(\alphaK51C-\beta),
representada como una línea discontinua con rombos blancos, en
cuanto a la unión al receptor de LH.
La Figura 23 ilustra las actividades relativas
de rhCG, representada como una línea continua con cuadrados,
CFC101-114, representada como una línea discontinua
con triángulos derechos, y
CFC101-114(\alphaK51A-\beta),
representada como una línea discontinua con círculos, en cuanto a
la unión al receptor de LH.
La Figura 24 ilustra las actividades relativas
de hCG, representada como una línea continua con círculos negros,
CFC101-114, representada como una línea discontinua
con cuadrados blancos,
CFC101-114(\alpha-\betaD99C),
representada como una línea discontinua con rombos,
CFC101-114(\alphaK51C-\betaD99C),
representada como un punto solitario, y
CFC101-114(\alphaK51C-\beta),
representada como la línea más próxima a las abscisas, en cuanto a
la transducción de señales del receptor de LH.
La Figura 25 ilustra las actividades relativas
de rhCG, representada como una línea continua con círculos, y
CFC101-114(\alphaK51A-\beta),
representada como una línea discontinua con triángulos derechos, en
cuanto a la transducción de señales del receptor de LH.
La Figura 26 ilustra las capacidades relativas
de hFSH, representada como una línea continua con círculos,
CFC101-114, representada como una línea discontinua
con cuadrados,
CFC101-114(\alpha-\betaD99C),
representada como una línea discontinua con triángulos derechos,
CFC101-114(\alphaK51C-\betaD99C),
representada como una línea continua con triángulos invertidos, y
CFC101-114(\alphaK51C-\beta),
representada como una línea continua con símbolos blancos, para
inhibir la unión de ^{125}I-hFSH a células CHO que
expresan receptores de FSH.
La Figura 27 ilustra las capacidades relativas
de hFSH, representada como una línea continua con círculos, y
CFC101-114, representada como una línea discontinua
con símbolos blancos, para estimular la transducción de señales en
células CHO que poseen receptores de hFSH. Las actividades de
transducción de señales de
CFC101(\alpha51-\beta99),
CFC101-114(\alpha-\betaD99C)
y
CFC101-114(\alphaK51C-\beta)
fueron demasiado pequeñas para ser detectadas en las
concentraciones de compuestos análogos empleadas.
La Figura 28 ilustra las capacidades relativas
de hFSH, representada como una línea continua con círculos,
CFC101-114, representada como una línea discontinua
con cuadrados blancos, y
CFC101-114(\alphaK51A-\beta),
representada como una línea discontinua con triángulos derechos,
para estimular la transducción de señales en células CHO que
expresan receptores de hFSH.
Las Figuras 29A y 29B muestran las secuencias de
aminoácidos de \alphaC7S,K51C (Figura 29A) y hCG\beta'Y37C,D99C
(Figura 29B) en letras minúsculas que representan el código de
aminoácidos de una sola letra. La serina de la Figura 29A, que
sustituye a Cys7, y las cisteínas de la Figura 29B, que sustituyen a
Tyr37 y Asp99, se muestran en letras mayúsculas.
La Figura 30 ilustra las capacidades de hCG,
representada como una línea continua con símbolos blancos, y
hCG(\alpha31-\beta37,
\alpha51-\beta99), representada como una línea
discontinua con símbolos negros, para inhibir la unión de
^{125}I-hCG a células CHO que expresan receptores
de LH.
La Figura 31 ilustra las capacidades de hCG,
representada como una línea continua con triángulos invertidos, y
hCG(\alpha31-\beta37,
\alpha51-\beta99), representada como una línea
continua con círculos, para estimular la transducción de señales en
células CHO que expresan receptores de LH.
Las Figuras 32A y 32B muestran las secuencias de
aminoácidos de \alphaC27A (Figura 32A), un compuesto análogo de
subunidad \alpha del que se espera que sea útil para preparar
compuestos análogos de hCG, hLH, hFSH y hTSH estabilizados por un
disulfuro del nudo intercisteínas entre las subunidades \alpha y
\beta, y hFSH\betaY31C (Figura 32B), un compuesto análogo de
subunidad \beta del que se espera que sea útil para preparar
compuestos análogos de hFSH estabilizados por un disulfuro del nudo
intercisteínas entre las subunidades \alpha y \beta. Esta
figura ilustra las secuencias de aminoácidos de un compuesto análogo
de subunidad \alpha y un compuesto análogo de subunidad \beta
de hFSH en letras minúsculas que representan el código de
aminoácidos de una sola letra. Sería de esperar que la sustitución
de Cys7 por alanina en la subunidad \alpha, ilustrada con letra
mayúscula en la secuencia de aminoácidos de \alphaC7A, tuviera el
mismo efecto que la sustitución de Cys7 por serina, como se ilustra
en los Ejemplos 1 y 2. La presencia de un resto de cisteína en la
posición 31 de la secuencia de hFSH\betaY31C también se ilustra
con letra mayúscula. Sería de esperar que las células que expresan
este compuesto análogo de subunidad \beta de FSH y \alphaC7A o
el compuesto análogo de subunidad \alpha previamente identificado
como \alphaC7S secretaran una proteína heterodímera entrelazada
con disulfuros que tuviera actividad FSH. Esta secuencia señal de
hFSH\betaY31C es idéntica a la de la subunidad \beta de hFSH y,
por lo tanto, se espera que sea similarmente procesada a la
subunidad \beta de hFSH. De esta manera, su secuencia
N-terminal sería
NSC.
NSC.
La Figura 33 muestra el código genético para
preparar compuestos análogos de hormonas glicoproteínicas.
Las Figuras 34A y 34B muestran las secuencias de
aminoácidos de \alphaQ5C (Figura 34A), un compuesto análogo de
subunidad \alpha del que se espera que sea útil para preparar
compuestos análogos de hCG, hLH, hFSH y hTSH estabilizados por un
disulfuro intersubunitario entre las porciones
N-terminales de las subunidades \alpha y \beta,
y hCG\betaR8C (Figura 34B), un compuesto análogo de subunidad
\beta del que se espera que sea útil para preparar compuestos
análogos de hCG estabilizados por un disulfuro intersubunitario
entre las porciones N-terminales de las subunidades
\alpha y \beta. Esta figura ilustra la secuencia de codificación
de un compuesto análogo de un compuesto análogo de subunidad
\alpha y un compuesto análogo de subunidad \beta de hCG de los
que sería de esperar que, cuando fueran coexpresados, formaran un
compuesto hormonalmente análogo entrelazado por disulfuros que
tuviera actividad LH. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas
y sus secuencias señal se ilustran según el código de una sola
letra. La letra mayúscula ilustra las posiciones de las mutaciones
necesarias para formar el disulfuro intersubunitario.
La Figura 35 muestra la secuencia de aminoácidos
de hFSH\beta52C, un compuesto análogo de subunidad \beta de
hFSH del que se espera que sea útil para preparar compuestos
análogos de hFSH estabilizados por un disulfuro intersubunitario
entre las porciones N-terminales de las subunidades
\alpha y \beta, en el que Ser2 está convertido en cisteína.
Sería de esperar que las células que coexpresan \alphaQ5C
(previamente descrito) y hFSH\betaS2C produjeran un heterodímero
entrelazado por disulfuros que tuviera una sustancial actividad
FSH.
La Figura 36 muestra la secuencia de aminoácidos
de hLH\betaY37C, un compuesto análogo de subunidad \beta del
que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hLH
estabilizados por un disulfuro del nudo intercisteínas entre las
subunidades \alpha y \beta, representando las letras minúsculas
el código de aminoácidos de una sola letra. La presencia de un
resto de cisteína en la posición 37 se ilustra con una letra
mayúscula. Sería de esperar que las células que expresan este
compuesto análogo de subunidad \beta de LH y el compuesto análogo
de subunidad \alpha previamente identificado como \alphaC7S o
\alphaC7A secretaran una proteína heterodímera entrelazada con
disulfuros que tuviera actividad LH. Esta secuencia señal de
hLH\betaY31C es idéntica a la de la subunidad \beta de hLH y,
por lo tanto, se espera que sea similarmente procesada a la
subunidad \beta de hLH. De esta manera, su secuencia
N-terminal sería
SRE.
SRE.
La Figura 37 muestra la secuencia de aminoácidos
de hLH\betaW8C, un compuesto análogo de subunidad \beta del que
se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hLH
estabilizados por un disulfuro intersubunitario entre las porciones
N-terminales de las subunidades \alpha y \beta,
en el que Trp8 está convertido en cisteína. Sería de esperar que
las células que coexpresan \alphaQ5C (previamente descrito) y
hLH\betaW8C produjeran un heterodímero entrelazado con disulfuros
que tuviera una sustancial actividad LH.
La Figura 38 muestra la secuencia de aminoácidos
de hTSH\betaY30C, un compuesto análogo de subunidad \beta del
que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hTSH
estabilizados por un disulfuro del nudo intercisteínas entre las
subunidades \alpha y \beta, representando las letras minúsculas
el código de aminoácidos de una sola letra. La presencia de un
resto de cisteína en la posición 30 se ilustra con una letra
mayúscula. Sería de esperar que las células que expresan este
compuesto análogo de subunidad \beta de TSH y los compuestos
análogos de la subunidad \alpha previamente identificados como
\alphaC7S o \alphaC7A secretaran una proteína heterodímera
entrelazada con disulfuros que tuviera actividad TSH. La secuencia
señal de hTSH\betaY31C es idéntica a la de la subunidad \beta
de hTSH y, por lo tanto, se espera que sea similarmente procesada a
la subunidad \beta de hTSH. De esta manera, su secuencia
N-terminal sería FCI.
La Figura 39 muestra la secuencia de aminoácidos
de hTSH\betaF1C, un compuesto análogo de subunidad \beta del
que se espera que sea útil para preparar compuestos análogos de hTSH
estabilizados por un disulfuro intersubunitario entre las porciones
N-terminales de las subunidades \alpha y \beta,
en el que PheI está convertido en cisteína. Sería de esperar que
las células que coexpresan \alphaQ5C (previamente descrito) y
hTSH\betaF1C produjeran un heterodímero entrelazado con
disulfuros que tuviera una sustancial actividad TSH.
La Figura 40 ilustra esquemáticamente la
construcción de los codones de \alphaC7S.
La Figura 41 ilustra esquemáticamente la
construcción de
pSVL-CFC101-114\beta'.
La Figura 42 ilustra esquemáticamente la
construcción de
pSVL-CFC94-114\beta'.
La Figura 43 ilustra esquemáticamente la
construcción de
pSVL-CFC101-106\beta'.
La Figura 44 ilustra esquemáticamente la
construcción de pSVL-\alphaK51C.
La Figura 45 muestra las capacidades de hFSH y
el compuesto análogo \alphaV76C + hFSH\betaV38C para estimular
la acumulación de AMP cíclico en células CHO que expresan el
receptor de FSH humano.
La Figura 46 muestra las capacidades de hCG y el
compuesto análogo \alpha + hCG\betaR6C,Y37C para estimular la
acumulación de AMP cíclico en células CHO que expresan receptores de
LH.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos análogos de hormonas
glicoproteínicas de acuerdo con el presente invento representan
mejoras con respecto a las enseñanzas generalizadas de los
documentos CA 2188508 y Han et al. (1996). Los enlaces
disulfuro intersubunitarios estabilizan las subunidades \alpha y
\beta del heterodímero de hormona glicoproteínica. El contenido
subsiguiente, en la medida en que no hace referencia a las
reivindicaciones, ha de ser considerado como ilustrativo y no como
una parte del invento.
Más adelante se esboza un procedimiento que
puede ser utilizado para identificar restos que tienen el potencial
para formar enlaces disulfuro. Como se demostrará en los ejemplos
siguientes, no todos los heterodímeros de hCG estabilizados por
enlaces disulfuro ni sus compuestos análogos conservan su potencia
biológica completa. Sin embargo, la introducción de un disulfuro
intersubunitario entre los nudos de cisteínas tiene la capacidad de
aumentar la estabilidad de la proteína sin alterar la potencia
hormonal.
Pueden prepararse compuestos análogos de
hormonas glicoproteínicas entrelazados por enlaces disulfuro de
acuerdo con el primer aspecto del presente invento al crearse
cisteínas libres en cada una de las subunidades, cisteínas que
pueden entrelazarse para formar uno o más enlaces disulfuro
intersubunitarios. Esto puede ser llevado a cabo sustituyendo los
codones para uno o más aminoácidos por aquellos para cisteína o
sustituyendo el codón para un resto de cisteína de un enlace
disulfuro existente por un codón para cualquier otro aminoácido. Sin
embargo, sería de esperar que no todas las citadas sustituciones
crearan enlaces disulfuro intersubunitarios. Se ilustran aquí dos
de los factores que deberían considerarse a la hora del diseño de
los compuestos análogos.
1) Se espera que los compuestos análogos de
hormona glicoproteínica entrelazados por disulfuro más útiles
tengan una estructura similar a la de hCG, hLH, hFSH o hTSH. De esta
manera, el disulfuro no debería deformar groseramente la
conformación global de la proteína. Las posiciones de los disulfuros
de las que se espera que ejerzan la menor influencia perturbadora
sobre la conformación de la proteína pueden ser pronosticadas a
partir de los datos de la Tabla 1B que ilustran las distancias
aproximadas entre los átomos de carbono C\alpha y C\beta de
restos de aminoácido seleccionados de la subunidad \alpha de hCG
(columna izquierda de cada pareja de columnas) y uno o más restos
próximos de la subunidad \beta de hCG (columna derecha de cada
pareja de columnas). Estos valores pueden ser calculados a partir
de la estructura cristalina de hCG mediante cualquiera de los
diversos sistemas de modelado molecular bien conocidos y amplia y
públicamente disponibles, que incluyen Sybyl, Insight, Rasmol y
Kinemage por citar algunos. Las distancias entre restos de
aminoácido de la subunidad \alpha de hCG y uno o más restos
próximos de la subunidad \beta de hCG, además de las mostradas en
la Tabla 1B, pueden ser fácilmente calculadas a partir de los datos
publicados sobre la estructura cristalina de hCG (Lapthorn et
al., 1994; Wu et al., 1994).
El valor izquierdo de cada pareja de valores
presentada entre paréntesis, asociado con cada resto de la subunidad
\beta, muestra la distancia entre el átomo de carbono C\alpha
de ese resto de la subunidad \beta y el correspondiente resto de
la subunidad \alpha de la columna izquierda. El valor derecho de
cada pareja de valores presentada entre paréntesis muestra la
correspondiente distancia entre los átomos de carbono C\beta de
estos restos. En principio, sustituir estas parejas de restos por
cisteínas permitiría la formación de un enlace disulfuro
intersubunitario con tal que no estuviera presente ninguna otra
cisteína interferente en cualquier subunidad. No todas las parejas
de cisteínas tendrían una probabilidad igual de formar un disulfuro
intersubunitario. La formación de un disulfuro intersubunitario del
que se espera que ejerza la mínima influencia sobre la conformación
del heterodímero estará influida por la orientación de los átomos de
cadena lateral de sus cisteínas componentes. Las posiciones
favorables y preferidas para la colocación de disulfuros incluirían
parejas de aminoácidos en que la distancia entre los átomos de
carbono C\beta es menor que aquélla entre sus carbonos C\alpha.
Las posiciones más favorables y preferidas para la colocación de un
enlace disulfuro intersubunitario son aquéllas en que las
distancias entre los carbonos C\alpha y C\beta son similares a
las de los disulfuros presentes en la naturaleza, es decir,
aproximadamente 5,0-6,5 \ring{A} y aproximadamente
3,5-4,2 \ring{A}, respectiva-
mente.
mente.
De esta manera, sería de esperar que las
sustituciones que crean una pareja intersubunitaria de cisteínas
que tienen átomos de carbono C\alpha separados 4-8
\ring{A} y átomos de carbono C\beta 1-2
\ring{A} más próximos tuvieran la mejor probabilidad de formar un
disulfuro con la mínima influencia sobre la estructura proteica
global y/o provocar un entrelazamiento intermolecular de dos o más
moléculas. En realidad, como se muestra en los ejemplos, esta regla
empírica ha sido utilizada exitosamente para crear diversos
compuestos análogos de hCG entrelazados por disulfuro que conservan
muchas de sus propiedades inmunológicas y hormonales.
2) Sería de esperar que los compuestos análogos
de hormona glicoproteínica entrelazados por disulfuro más activos
contuvieran el entrelazamiento en sitios no necesarios para la unión
al receptor ni para la transducción de señales y/o en sitios no
necesarios para la estabilización de la conformación activa de la
hormona. Hay un gran número de restos en las hormonas
glicoproteínicas de los que se sabe que no son necesarios para sus
actividades biológicas. Estos incluyen la mayoría de los restos
N-terminales del nudo de cisteínas (es decir, la
segunda cisteína de la subunidad \alpha nativa y la primera
cisteína de las subunidades \beta nativas). Por ejemplo, se han
preparado compuestos análogos de hFSH muy potentes en que estos
restos de la subunidad \beta de FSH (Asn1, Ser2) estaban
reemplazados por los restos correspondientes de hCG (Ser1, Lys2,
Glu3, Pro4, Leu5, Arg6, Pro7, Arg8). De este modo, no sería de
esperar que un disulfuro en esta región de la molécula, preparado
al sustituir Gln5 de la subunidad \alpha y Arg8 de la subunidad
\beta de hCG por cisteínas, eliminara la actividad LH del
heterodímero entrelazado por disulfuro. Similarmente, no sería de
esperar que un disulfuro preparado al sustituir Gln5 de la
subunidad \alpha y Ser2 de la subunidad \beta de hFSH por
cisteínas eliminara la actividad FSH del heterodímero entrelazado
por disulfuro. Cambiando Cys31 de la subunidad \alpha por Ala o
Ser y sustituyendo Arg6 de la subunidad \beta de hCG por Cys o
añadiendo una Cys al extremo N de la subunidad \beta de FSH, se
espera que pueda crearse un disulfuro en la región
N-terminal de las subunidades \alpha y \beta de
hCG o hFSH. No sería de esperar que este disulfuro alterara la
actividad de ningún compuesto hormonalmente
análogo.
análogo.
La estructura cristalina de hCG reveló que cada
una de sus subunidades está compuesta de un nudo de cisteínas. Por
lo tanto, cada subunidad contiene tres bucles denominados \alpha1,
\alpha2, \alpha3 y \beta1, \beta2, \beta3. Además, la
subunidad \beta tiene 20 aminoácidos adicionales, conocidos como
"cinturón de seguridad", que rodean a \alpha2 para asegurar
el heterodímero y estabilizarlo en una conformación que permita la
unión con su receptor único. Las posiciones de las cisteínas en
lutropinas, folitropinas y tirotropinas sugieren que las tres
moléculas tienen un patrón de plegadura global similar y que la
estructura cristalina de hCG es una guía razonable para introducir
disulfuros intersubunitarios. Sin embargo, las estructuras de FSH y
TSH no han sido determinadas y sólo pueden ser inferidas a partir de
la estructura de hCG. Las estructuras cristalinas de los nudos de
cisteínas de cada subunidad muestran que estos son muy similares.
Esto es porque están muy forzados por sus tres enlaces disulfuro
componentes. De esta manera, se espera que los restos existentes
dentro de, y adyacentes a, los nudos de cisteínas tengan
conformaciones similares en cada hormona. Además, hay una cisteína
en los bucles \beta1 y \beta3 en posiciones similares en las
tres clases de hormonas. Aquéllas forman un disulfuro en hCG y
sería de esperar que formasen un disulfuro en todas las hormonas
glicoproteínicas. Este disulfuro y el amplio número de enlaces de
hidrógeno dentro de, y entre, los átomos de la cadena principal de
estos bucles de hCG sugieren que las conformaciones de \beta1 y
\beta3 serán muy similares en las tres clases de hormonas. Los
bucles \alpha1 y \alpha3 contienen también varios enlaces de
hidrógeno, lo que sugiere que esta porción de la molécula también
será similar en las tres clases de hormonas. Esta visión viene
apoyada por la observación de que la estructura de la subunidad
\alpha libre por NMR muestra que \alpha1 y \alpha3 tienen
conformaciones similares incluso cuando no están en el heterodímero
(DeBeer et al., 1996). Aunque las porciones restantes de las
tres clases de hormonas tienen una conformación casi seguramente
similar a la de hCG, no es probable que estén tan estrechamente
relacionadas con la estructura de hCG como las porciones de las
moléculas recién discutidas. Por ejemplo, \beta2 contiene
relativamente pocos enlaces de hidrógeno internos y/o contactos con
\alpha1 y \alpha3. Puesto que no parece que esté muy forzado en
hCG, no hay razón para creer que su estructura sea completamente
idéntica a la existente en las otras hormonas. En realidad, el
bucle \beta2 de TSH es 2 restos de aminoácido más grande que el de
hCG o hFSH. Los extremos N- y C-terminales de
\alpha2 participan en amplios contactos por enlaces de hidrógeno,
y porciones del extremo C-terminal de \alpha2
también entran en contacto con \beta1. Por lo tanto, estas partes
de \alpha2 podrían ser similares en la mayoría de las hormonas.
Sin embargo, la porción central de \alpha2 sólo entra en contacto
con el cinturón de seguridad, una región de la proteína que no está
bien conservada en las tres clases de hormonas. La estructura de la
subunidad \alpha por NMR mostró que \alpha2 está muy
desordenada, una observación que sugiere que esta parte de la
hormona hCG tiene una estructura bien ordenada en el heterodímero
sólo porque está intercalada entre \beta1, \beta3 y el cinturón
de seguridad. Sería de esperar que diferencias en el cinturón de
seguridad alterasen la conformación de \alpha2, particularmente de
aquellas porciones no situadas cerca del nudo de
cisteínas.
cisteínas.
El presente inventor ha obtenido ideas relativas
a la influencia del cinturón de seguridad sobre la estructura de
las hormonas usando sondas inmunológicas para estudiar compuestos
análogos de hCG que tienen la capacidad para unirse a receptores de
lutropina y folitropina. Éstos datos sugieren que la composición del
cinturón de seguridad puede alterar la conformación de la hormona.
Datos similares también sugieren que la conformación de la hormona
puede estar influida por el receptor. Por ejemplo, se han utilizado
anticuerpos monoclonales cuyos sitios ligantes han sido
parcialmente determinados (Moyle et al., 1990; Moyle et
al., 1995), para estudiar la conformación de un compuesto
análogo de hCG bifuncional (CFC101-109) cuando está
libre y cuando está unido a receptores de LH y FSH. Se preparó
CFC101-109 sustituyendo los restos
101-109 del cinturón de seguridad de hCG por los
restos 95-103 del cinturón de seguridad de hFSH
(Moyle et al., 1994). La capacidad de
CFC101-109 para ser reconocido por anticuerpos
monoclonales mostró que la presencia de los restos de FSH en el
cinturón de seguridad alteraba la interacción entre las dos
subunidades. De esta manera, A407, un anticuerpo contra un epítopo
conformacional que incluía restos del extremo
N-terminal de la subunidad \alpha de hCG pero no
de hFSH, tenía una afinidad muy reducida hacia
CFC101-109 aun cuando su epítopo está alejado del
sitio de la mutación (Tabla 1C). La influencia del receptor sobre
la estructura hormonal fue vista por el hecho de que A407 reconocía
CFC101-109 cuando estaba unido a receptores de LH
pero no cuando estaba unido a receptores de FSH (Tabla 1D). Otros
anticuerpos que reconocen epítopos situados completamente en
\alpha1 y/o \alpha2 o en \beta1 y/o \beta3 reconocían
CFC101-109 incluso cuando estaba combinado
con
receptores.
receptores.
Tomadas en su conjunto, estas observaciones
sugieren que las posiciones de las subunidades en las hormonas
pueden no ser idénticas y pueden estar influidas por interacciones
con sus receptores. Por lo tanto, el presente inventor ha
determinado que, además de considerar las posiciones y orientaciones
relativas de posibles sustituciones de cisteína, obtenidas de la
estructura cristalina de hCG, se debería también considerar la
probabilidad de que la estructura cristalina de hCG represente las
estructuras de folitropinas y tirotropinas y/o la conformación de
la hormona en el complejo hormona-receptor. Las
porciones de las hormonas que son más probablemente idénticas a las
de hCG y son menos probablemente alteradas durante la interacción
con el receptor incluyen las de restos de, o próximas a, el nudo de
cisteínas.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La región entre los nudos de cisteínas es uno de
los sitios más atractivos para construir un enlace disulfuro y es
un sitio preferido para un enlace disulfuro intersubunitario. El
nudo de cisteínas de cada subunidad está estabilizado por tres
disulfuros lo que le hace una de las partes más rígidas de la
molécula. Los resultados del laboratorio del presente inventor
indican que el cambio del resto Tyr37 de la subunidad \beta de hCG
ejercía relativamente poca influencia sobre la actividad de la
hormona. Por lo tanto, el presente inventor no espera que la
presencia de una cisteína en este sitio altere la actividad de la
hormona. En la patente canadiense CA 2188508 no se describe que un
disulfuro intersubunitario entre los nudos de cisteínas de las
subunidades \alpha y \beta estabilice un heterodímero
gonadotropínico y conserve la actividad hormonal. Como se muestra
en los presentes ejemplos, un modo en que puede llevarse esto a cabo
es sustituyendo el resto Cys7 de la subunidad \alpha por Ala o
Ser para alterar el disulfuro intrasubunitario
Cys7-Cys31, y sustituyendo el Tyr37 de la subunidad
\beta de hCG por Cys. El compuesto análogo entrelazado de hCG que
se produjo tenía una elevada actividad LH. Similarmente, en otro
ejemplo no restrictivo, fue posible preparar un compuesto análogo
entrelazado de CFC101-114, una quimera de hCG/hFSH
en que los restos de aminoácido 101-114 de la
subunidad \beta de hCG estaban sustituidos por sus
correspondientes restos de hFSH (es decir, los restos
95-108 de la subunidad \beta).
CFC101-114 se une a, y activa, tanto receptores de
LH como de FSH. El compuesto análogo entrelazado por disulfuro era
también capaz de unirse a, y activar, tanto receptores de LH como de
FSH. La última observación muestra que este disulfuro no evita la
actividad del receptor de FSH, lo que hace muy probable que un
disulfuro similar en hFSH tampoco destruya su actividad hormonal. La
preparación de una hFSH entrelazada por disulfuro podría ser
llevada a cabo haciendo que se coexpresara el cDNA de la subunidad
\alpha en que Cys7 está convertida en Ala, y el cDNA de la
subunidad \beta de hFSH en que Tyr31 está convertida en Cys.
También se puede producir un enlace disulfuro entre los nudos de
cisteínas con otro enlace disulfuro intersubunitario de otra parte,
tal como entre el bucle 2 de \alpha y el cinturón de seguridad de
\beta o entre el extremo N de \alpha y el extremo N de
\beta.
Además, los enlaces disulfuro formados entre los
nudos de Cys de las subunidades \alpha y \beta liberarían un
resto cerca del extremo N, es decir, \alphaCys7Ser, que puede ser
ventajosamente utilizado para PEGilación (fijación de cadenas de
polietilenglicol).
Un enlace disulfuro intersubunitario situado
entre los nudos de cisteínas de las subunidades \alpha y \beta
puede también cumplir la regla general de minimizar el posible
impacto de los entrelazamientos intersubunitarios sobre la
estructura hormonal al situar ambas posiciones de entrelazamiento en
dos restos de cisteínas existentes (nativas) implicadas en enlaces
disulfuro nativos y no más allá, es decir, más
N-terminal o C-terminal, de la
cisteína nativa más N-terminal o
C-terminal (la unidad de cisteína extrema de la
correspondiente subunidad nativa), como un medio para minimizar el
riesgo de perturbaciones estructurales. Ninguno de los disulfuros
intersubunitarios descritos y enseñados en la la Patente Canadiense
CA 2188508 cumple esta regla general.
Sería también de esperar que los compuestos
hormonalmente análogos entrelazados por un disulfuro entre el bucle
1 ó 3 de la subunidad \alpha y el bucle 2 de la subunidad \beta
que no cumplen la regla general anteriormente descrita conservasen
actividad hormonal. Estas regiones son muy sensibles a las
sustituciones de aminoácidos. De esta forma, la sustitución de la
subunidad \alpha humana de hCG o hFSH por la subunidad \alpha
bovina no elimina normalmente la actividad hormonal aun cuando las
subunidades \alpha bovina y humana difieren significativamente en
esta región. Asimismo, las sustituciones en masa de restos de hCG
por restos de hFSH y viceversa en el bucle 2 de la subunidad
\beta no eliminaban la actividad de ninguna hormona. Por lo
tanto, no sería de esperar que disulfuros en esta región alterasen
la actividad biológica de lutropinas o folitropinas. Estos
disulfuros incluyen los creados al cambiar Gln27 de la subunidad
\alpha y Val44 de la subunidad \beta de hCG o hLH o Val38 de la
subunidad \beta de hFSH por Cys. También incluyen los disulfuros
preparados al cambiar Val76 de la subunidad \alpha y Val44 de la
subunidad \beta de hCG o Val38 de la subunidad \beta de hFSH
por Cys. Otro compuesto análogo entrelazado por disulfuro
intersubunitario del que se espera que conserve una actividad
sustancial es uno que tiene un resto Lys75 de la subunidad \alpha
y un resto Gln46 de la subunidad \beta de hCG o hLH o un resto
Lys40 de la subunidad \beta de hFSH convertidos en Cys. Sin
embargo, el último compuesto análogo estaría menos positivamente
cargado que hCG o hFSH y, por lo tanto, su actividad LH o FSH
global podría ser pequeña. También es posible insertar disulfuros
intersubunitarios en otras regiones de lutropinas y folitropinas.
Algunos de estos disulfuros afectan a restos del cinturón de
seguridad de la subunidad \beta (es decir, creados por sustitución
de Asp99 de la subunidad \beta de hCG por Cys) y el bucle 2 de la
subunidad \alpha (es decir, creados por sustitución de Lys51 de la
subunidad \alpha por Cys). Este disulfuro reducía
significativamente la actividad LH de hCG y las actividades LH y
FSH del compuesto análogo bifuncional CFC101-114.
Las posiciones de los restos de hLH, hFSH y hTSH que pueden ser
mutados a cisteína con la excepción de que produzcan un enlace
disulfuro puede ser determinadas a partir de las posiciones
"equivalentes" de los restos de las subunidades \alpha y
\beta de estas proteínas, como se definen en las
Tablas 2-4.
Tablas 2-4.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \cr}
\newpage
La información de la Tabla 2 puede ser usada
para calcular los restos que ocupan posiciones "equivalentes"
en cada subunidad \beta de hormona humana. Sólo se dispone de
estructuras cristalinas para hCG. Sin embargo, a causa de las
elevadas similitudes en las secuencias de aminoácidos de todas las
hormonas glicoproteínicas, notablemente en sus disulfuros
intrasubunitarios, se espera que todas las hormonas tengan formas
similares. La conclusión de que la conformación global de todos los
heterodímeros es similar a la de hCG se apoya además en la
observación de que es posible preparar quimeras de hCG/hFSH, hCG/hLH
y hCG/hTSH que conservan epítopos hallados en regiones de los
progenitores usados para obtener las quimeras. Por lo tanto, se
espera que la sustitución de restos equivalentes como los definidos
en esta tabla conduzca a enlaces disulfuro intersubunitarios que
tengan propiedades similares a los que se han preparado y
caracterizado. Las posiciones "equivalentes" se definen en un
eje vertical. De esta manera, en la subunidad \beta de hFSH, la
cisteína 3 es "equivalente" a la cisteína 9 de la subunidad
\beta de
hCG.
hCG.
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \cr}
\newpage
La información de la Tabla 3 puede ser usada
para calcular los restos que ocupan posiciones "equivalentes"
en cada subunidad \alpha de hormona. Sólo se ha informado de la
estructura cristalina de hCG. A causa de las elevadas similitudes
en las secuencias de aminoácidos de todas las hormonas
glicoproteínicas, notablemente en sus disulfuros intrasubunitarios,
se espera que las hormonas de todas las especies tengan formas
similares. Esta idea se apoya también en la observación de que es
posible preparar quimeras de subunidad \alpha humana/bovina que
conservan epítopos hallados en regiones de los progenitores
encontrados en las quimeras. Por lo tanto, se espera que la
sustitución de restos equivalentes como los definidos en esta tabla
conduzca a enlaces disulfuro intersubunitarios que tengan
propiedades similares a los que se han preparado y
caracterizado.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \cr}
\newpage
La información de la Tabla 4 puede ser utilizada
para calcular los restos que ocupan posiciones "equivalentes"
en cada una de las subunidades \beta de vertebrados.
Los Ejemplos del presente invento enseñan cómo
pueden introducirse enlaces disulfuro en hormonas glicoproteínicas
y compuestos análogos capaces de unirse a receptores de LH, FSH y/o
TSH. La presencia de enlaces disulfuro intersubunitarios potenciaba
las estabilidades de hCG y de un compuesto análogo de hCG que tiene
unas actividades FSH y TSH significativas. Por lo tanto, se espera
que la adición de disulfuros intersubunitarios también estabilice
otros miembros y compuestos análogos relacionados de esta familia de
hormonas. Cuando se sitúan en sitios de la hormona que no están
implicados en la unión al receptor ni en la especificidad de la
unión al receptor, los disulfuros no impiden la función hormonal.
En realidad, ciertos disulfuros intersubunitarios pueden potenciar
la función de compuestos hormonalmente análogos. Con una excepción
(Blithe et al., 1.991), las subunidades hormonales están
casi desprovistas de actividad endocrina. Por lo tanto, es probable
que los procedimientos que estabilizan el heterodímero prolonguen
las actividades biológicas de estas hormonas, y de ellos se espera
que potencien su utilidad
terapéutica.
terapéutica.
Un método para mejorar la estabilidad de
hormonas glicoproteínicas heterodímeras implica identificar los
restos que pueden ser sustituidos con objeto de crear cisteínas
libres en cada una de las subunidades, cisteínas libres que tienen
un elevado potencial para formar un enlace disulfuro
intersubunitario que mejore la estabilidad del heterodímero sin
deformar la conformación global de la proteína hormonal. La
sustitución de los restos para crear las cisteínas libres en cada
una de las subunidades puede ser llevada a cabo a nivel genético
sustituyendo los correspondientes codones en las secuencias de
nucleótidos de las subunidades \alpha y \beta. Se cultivan
células huésped transformadas con moléculas de DNA recombinante que
llevan las secuencias de nucleótidos modificadas que codifican las
subunidades \alpha y \beta, operativamente enlazadas a una
secuencia promotora y capaces de expresar la hormona
glicoproteínica modificada, y se hace que se exprese la hormona
glicoproteínica modificada a la que se hace referencia como
compuesto análogo de acuerdo con el presente invento. El compuesto
análogo de hormona glicoproteínica expresado es luego recuperado y
es purificado de acuerdo con técnicas bien conocidas en el campo de
la purificación de hormonas
glicoproteínicas.
glicoproteínicas.
A nivel genético, los compuestos análogos de
hormona glicoproteínica de acuerdo con el presente invento son
generados mediante cualquier adecuada mutagénesis dirigida al sitio,
bien conocida en la técnica, tal como describen Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene
Publications and Wiley Interscience (New York, EE.UU.,
1987-1997), Capítulo 8 sobre mutagénesis de DNA
clonado. Esta publicación Current Protocols in Molecular
Biology es un ejemplo de un texto de referencia estándar en que
se exponen los principios generales de la tecnología de DNA
recombinante.
Las secuencias de nucleótidos que codifican las
subunidades \alpha y \beta del compuesto análogo de hormona
glicoproteínica, según están contenidas en una molécula de DNA
recombinante, pueden ser insertadas en apropiados vectores de
expresión capaces de expresar los compuestos análogos en células
huésped. Para ser capaz de expresar el compuesto análogo de hormona
glicoproteínica, un vector de expresión debería tener secuencias de
nucleótidos específicas que contuvieran una información reguladora
de la transcripción y la traducción, unidas al DNA que codifica las
subunidades de tal modo que permitiera la expresión génica y la
producción del compuesto análogo de hormona glicoproteínica. En
primer lugar, para que el gen sea transcrito, debe ir precedido por
un promotor reconocible por RNA polimerasa, al cual se une la
polimerasa e inicia así el proceso de transcripción.
Se dice que un DNA es "capaz de expresar"
un polipéptido si contiene secuencias de nucleótidos que contienen
información reguladora de la transcripción y la traducción y dichas
secuencias están "operativamente unidas" a secuencias de
nucleótidos que codifican el polipéptido. Una unión operativa es una
unión en que las secuencias de DNA reguladoras y la secuencia de
DNA que se busca expresar están conectadas de un modo tal que
permite la expresión génica. Las regiones reguladoras necesarias
para la expresión génica incluyen, en general, una región promotora
así como las secuencias de DNA que, una vez transcritas a RNA, darán
la señal para el inicio de la síntesis proteica. Dichas regiones
incluirán normalmente las secuencias 5' no codificadoras implicadas
en el inicio de la transcripción y la traducción. Hay una diversidad
de promotores de uso común para la expresión proteica de alto nivel
en sistemas celulares de mamíferos e insectos.
Las moléculas de DNA recombinante que contienen
las secuencias de nucleótidos que codifican las subunidades
\alpha y \beta de los compuestos análogos del invento, y las
señales reguladoras de la transcripción y la traducción
operativamente unidas, pueden ser insertadas en un vector o vectores
que expresen transitoriamente las subunidades en células huésped o
sean capaces de integrar las secuencias génicas deseadas en el
cromosoma de la célula huésped. Con objeto de poder seleccionar las
células que tienen establemente integrado en sus cromosomas el DNA
introducido, se utilizan uno o más marcadores que permiten la
selección de las células huésped que contienen el vector de
expresión. El marcador puede proporcionar prototrofia a un huésped
auxótrofo, resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a
antibióticos o metales pesados, tal como el cobre, o similares. El
gen marcador seleccionable puede ser directamente unido a las
secuencias génicas de DNA que se van a expresar o puede ser
introducido en la misma célula por cotransfección. Puede que también
se necesiten elementos adicionales para una síntesis óptima de
mRNA. Estos elementos pueden incluir señales de corte y empalme, así
como promotores de la transcripción, potenciadores, y señales de
terminación. Los vectores de expresión de cDNA que llevan
incorporados dichos elementos incluyen los descritos por Okayama
(1.983).
Los vectores de expresión que son capaces de
expresar transitoriamente un nivel elevado de la proteína deseada
cuando se transfectan células huésped eucarióticas con ellos son
bien conocidos en la técnica y, generalmente, son públicamente
asequibles o comercialmente asequibles de proveedores de biología
molecular (por ejemplo, el plásmido pcDM8 es asequible de
Invitrogen, San Diego, California, EE.UU., el plásmido pSVL es
asequible de Pharmacia, Piscataway, New Jersey, EE.UU., el plásmido
pCI es asequible de Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU., etc.). Una
vez que se ha preparado para expresión el vector o la secuencia de
DNA que contiene la(s) construcción(es), puede
introducirse el vector de expresión en una célula huésped apropiada
mediante una diversidad de medios adecuados, tales como
transformación, transfección, lipofección, conjugación, fusión de
protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato cálcico,
microinyección directa, etc.
Las células huésped eucarióticas pueden ser
células de mamífero, por ejemplo células de ser humano, de mono
(células COS), de ratón y de ovario de hámster chino (CHO), porque
proporcionan modificaciones postraduccionales a moléculas
proteicas, incluyendo una correcta plegadura, una correcta formación
de enlaces disulfuro y también una glicosilación en sitios
correctos. Sin embargo, las células de insecto, por ejemplo, con
baculovirus, pueden sobreproducir polipéptidos y pueden llevar
también a cabo modificaciones peptídicas postraduccionales,
incluyendo glicosilación. La expresión ectópica de proteínas en
células COS, CHO y de insecto es bien conocida en la técnica, y
pueden utilizarse adecuadamente protocolos, tales como los
proporcionados por Ausubel et al.
(1987-1997), secciones 16.9-16.14,
para la expresión de proteínas en células de insecto usando vectores
baculovíricos y en células de mamíferos. Las células huésped
transformadas que expresan las subunidades \alpha y \beta de un
compuesto análogo de hormona glicoproteínica pueden ser cultivadas
para que produzcan el compuesto análogo.
Las células huésped transformadas que expresan
las subunidades \alpha y \beta de un compuesto análogo de
hormona glicoproteínica pueden ser cultivadas para que produzcan el
compuesto análogo de hormona glicoproteínica, el cual puede ser
luego recuperado y ser purificado de acuerdo con técnicas de
purificación comunes y bien conocidas para hormonas
glicoproteínicas. La cantidad de la hormona glicoproteínica
producida puede ser cuantificada mediante un método tal como el
método de inmunoensayo de tipo sándwich descrito en el Ejemplo 1.
Además, pueden llevarse fácilmente a cabo, sin una experimentación
excesiva, ensayos para determinar la afinidad por el receptor y la
actividad biológica de los compuestos análogos de hormona
glicoproteínica del presente invento, tales como los ensayos de
radioligando-receptor y de transducción de señales
(medición de la capacidad para unirse al receptor para provocar una
respuesta de acumulación de AMP cíclico) descritos en el Ejemplo
1.
Los compuestos análogos de hormona
glicoproteínica de acuerdo con el primer aspecto del presente
invento presentan varios usos terapéuticos. Estos usos terapéuticos
son meramente descritos a modo de información básica y no forman
parte del presente invento. Se pueden usar compuestos análogos de
hFSH para inducir el desarrollo de folículos ováricos en
preparación para la inducción de la ovulación en hembras. Se pueden
usar compuestos análogos de hLH y hCG para inducir la ovulación de
folículos que han iniciado el desarrollo. Estos compuestos análogos
se pueden usar también para inducir la función testicular en machos.
Además, los compuestos análogos de hormona glicoproteínica de
acuerdo con el presente invento pueden ser también utilizados como
inmunógenos para obtener antisueros para limitar la fecundidad, por
ejemplo, una vacuna anticonceptiva. Por el contrario, podrían
también usarse compuestos análogos antagonistas o anticuerpos contra
los compuestos análogos de hormona glicoproteínica para activar la
fecundidad, tal como cuando aparecen niveles excesivos de hLH en
ciertas mujeres que padecen la enfermedad ovárica poliquística.
Es bastante útil un compuesto análogo de hormona
glicoproteínica que tenga una estabilidad mejorada y que además
conserve la actividad y la función biológicas, por ejemplo, afinidad
por receptores de hormonas glicoproteínicas y potencia hormonal,
tal como en los compuestos análogos de acuerdo con el primer aspecto
del presente invento. Los compuestos análogos de acuerdo con el
presente invento no son sólo útiles para fines terapéuticos
específicos sino que también proporcionan las propiedades
superiores de estabilidad funcional en disolución y a temperaturas
elevadas, resistencia a la desnaturalización por agentes
desnaturalízantes de proteínas, tal como la urea, etc. A causa de
estas propiedades de estabilidad, se espera que los compuestos
análogos del presente invento tengan una semivida mejorada in
vivo.
Los compuestos análogos de hormona
glicoproteínica del presente invento pueden ser administrados a un
paciente que lo necesite mediante cualquier medio con el que se
alcance su fin previsto. Por ejemplo, la administración puede ser
por diversas vías parenterales diferentes que incluyen, pero no se
limitan a, las vías subcutánea, intravenosa, intradérmica,
intramuscular, intraperitoneal, intranasal, oral, transdérmica y
bucal. La administración parenteral puede ser por inyección de un
bolo o por perfusión gradual a lo largo del tiempo.
Un régimen típico para prevenir, suprimir o
tratar un estado asociado con depósitos amiloides o de tipo amiloide
comprende la administración de una cantidad eficaz en una o
múltiples dosis durante un periodo de tiempo de hasta, y que
incluye, varios meses a varios años.
Se entiende que la dosificación administrada
dependerá de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, la
clase del tratamiento concurrente, si lo hubiera, la frecuencia del
tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. La dosis total
requerida para cada tratamiento puede ser administrada mediante
dosis múltiples o mediante una sola dosis. Por "cantidad
eficaz" se quiere significar una concentración de compuesto
análogo de hormona glicoproteínica con la que se puede alcanzar el
fin previsto. Dichas concentraciones pueden ser rutinariamente
determinadas por los expertos en la técnica.
Las preparaciones para administración parenteral
incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas
o no acuosas, las cuales pueden contener agentes auxiliares o
excipientes que son conocidos en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
los compuestos análogos de hormona glicoproteínica del presente
invento incluyen todas las composiciones en que los compuestos
análogos están contenidos en una cantidad eficaz para alcanzar el
fin previsto. Además, las composiciones farmacéuticas pueden
contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que
comprenden excipientes y agentes auxiliares que facilitan el
procesamiento de los compuestos activos hasta preparaciones que
pueden ser usadas farmacéuticamente. Los vehículos farmacéuticamente
aceptables adecuados son bien conocidos en la técnica y son
descritos en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical
Sciences, compilado por Alfonso Gennaro, 18ª edición, Mack
Publishing Co. (Easton, Pennsylvania, EE.UU., 1990), un texto de
referencia estándar en este campo. Los vehículos farmacéuticamente
aceptables pueden ser rutinariamente seleccionados de acuerdo con
el modo de administración y con la solubilidad y estabilidad de los
compuestos análogos de hormona glicoproteínica. Por ejemplo, las
formulaciones para administración intravenosa pueden incluir
disoluciones acuosas estériles que pueden contener también tampones,
agentes diluyentes y otros aditivos
adecuados.
adecuados.
Las formulaciones adecuadas para administración
parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos
en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua.
Además, pueden administrarse suspensiones del compuesto activo como
apropiadas suspensiones oleosas para inyección. Los disolventes o
vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo,
aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, por
ejemplo, triglicéridos u oleato de etilo. Las suspensiones acuosas
para inyección pueden contener sustancias que aumentan la
viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo,
carboximetil-celulosa sódica, sorbitol y/o
dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también
agentes estabilizadores.
Una vez descrito el invento de forma general, el
mismo será más fácilmente entendido por referencia a los ejemplos
siguientes. Los Ejemplos 1, 2, 6, 13 y 14 se refieren directamente a
hormonas de acuerdo con el primer aspecto del presente invento. Los
ejemplos restantes se proporcionan sólo a modo de información básica
y no forman parte del presente invento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
De acuerdo con los criterios para el
entrelazamiento intersubunitario por enlaces disulfuro, los datos de
la Tabla 1B sugerían que sería posible preparar un compuesto
análogo de hCG estabilizado por un disulfuro intersubunitario entre
sus nudos de cisteínas si se creara una cisteína libre en el resto
31 de la subunidad \alpha y si se sustituyera Tyr37 de la
subunidad \beta por cisteína. Esto fue llevado a cabo preparando
un compuesto análogo de subunidad \beta de hCG en que Tyr37 estaba
sustituido por cisteína, y un compuesto análogo de subunidad
\alpha humana en que Cys7 estaba sustituido por Ser. Este último
cambio alteraba el disulfuro normalmente hallado en la subunidad
\alpha entre los aminoácidos Cys7 y Cys31, quedando la cisteína
libre del resto 31 de la subunidad \alpha disponible para formar
un enlace disulfuro con la cisteína introducida en el resto 37 de
la subunidad \beta. Cuando cada una de estas construcciones
subunitarias se expresaba en células de mamífero en cultivo, las
cisteínas del resto 31 de la subunidad \alpha y del resto 37 de la
subunidad \beta formaban un enlace disulfuro
intersubunitario.
La formación del enlace disulfuro aumentaba
drásticamente la estabilidad del heterodímero. A diferencia de hCG,
el heterodímero entrelazado no se disociaba en presencia de urea ni
de un pH bajo. Sin embargo, la capacidad de
hCG(\alpha31-\beta37) para ser reconocido
por la mayoría de los anticuerpos monoclonales, para unirse a
receptores de LH y para provocar la transducción de señales era
similar a la de hCG. Esto mostraba que la presencia del enlace
disulfuro no alteraba la función hormonal.
El cambio del codón para Cys7 por un codón para
serina en la subunidad \alpha fue llevado a cabo en un vector de
expresión (pKBhCG\alpha) que ha sido descrito por Campbell et
al. (1.991) y que contiene el cDNA de la subunidad \alpha de
hCG. El vector pKBM es un derivado de los vectores pUC
(Yanisch-Perron et al., 1985) en que el
policonector había sido reemplazado por uno que contiene un sitio
XhoI, y que permitía la transferencia de insertos de cDNA entre
pKBM y el vector de expresión pSVL (Pharmacia, Piscataway, New
Jersey, EE.UU.). Puesto que sólo hay un gen de subunidad \alpha,
los cDNA para las subunidades \alpha de hCG, hLH, hFSH y hTSH
contienen los mismos codones, y a este vector de expresión se hará
referencia en adelante como pKBM-\alpha. Como se
muestra en la Figura 40, pKBM-\alpha contiene un
sitio de restricción único para la endonucleasa XhoI, 5' con
respecto a la secuencia de codificación de la subunidad \alpha, y
un sitio de restricción único para la endonucleasa BsmI, cerca de
los codones para los aminoácidos 9-11. Se diseñaron
cebadores (Oligo425 y Oligo847, Tabla 5) para la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction), para
agrupar esta región, cambiar el codón para Cys7 por un codón para
Ser y crear un nuevo sitio de restricción para endonucleasa (BspEI)
que pudiera ser utilizado para facilitar la identificación de las
construcciones mutantes.
El producto de la PCR en que se utilizaron estos
cebadores y pSVL-hCG\alpha (Campbell et
al., 1991) como molde fue sometido a digestión con XhoI y BsmI
y fue subclonado en los sitios únicos XhoI-BsmI de
pKBM-\alpha usando procedimientos que son bien
conocidos en la técnica (Maniatis et al., 1989).
La secuencia de un plásmido recombinante que
contiene un sitio de restricción para la endonucleasa BspEI fue
determinada mediante métodos didesoxi (Maniatis et al., 1989)
en la región que había sido cambiada por mutagénesis basada en PCR.
Este vector (pKBM-\alphaC7S) codificaba una
proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Figura 3. El cDNA de la subunidad \alpha modificada fue separado
del vector pKBM mediante una digestión con XhoI y BamHI y fue
subclonado en los sitios XhoI-BamHI de pSVL para
crear pSVL-\alphaC7S, un procedimiento que
permitía que se expresara \alphaC7S en células
COS-7. Las secuencias de codificación fueron
también insertadas en los sitios XhoI-BamHI de otro
vector de expresión (pCI), obtenido de Promega (Madison, Wisconsin,
EE.UU.), que había sido modificado para facilitar la subclonación de
esta y otras construcciones relacionadas. La modificación de pCI
implicaba separar su sitio BamHI y sustituir su policonector (es
decir, sitios de restricción NheI-NotI) por un
nuevo policonector que tenía los siguientes sitios de restricción
para endonucleasas:
NheI-XhoI-EcoRI-MluI-KpnI-XbaI-SalI-BamHI.
Esto permitía la subclonación de construcciones de vectores basados
en pKBM y pSVL en vectores basados en pCI separando el fragmento
XhoI-BamHI que contenía la región de codificación
deseada de pKBM o pSVL y ligándolo a pCI que había sido sometido a
digestión con XhoI y BamHI. Con otra referencia a vectores basados
en pCI se pretende aquí referirse al vector pCI modificado descrito
inmediatamente antes. La transferencia de la región de codificación
de la subunidad \alpha, de pSVL a pCI, creó
pCI-\alpha y pCI-\alphaC7S,
respectivamente, y se realizó para facilitar la expresión en
células en cultivo.
No es necesario usar la sustitución de cisteína
por serina para preparar un compuesto análogo de subunidad \alpha
que carezca de la capacidad para formar un disulfuro entre Cys7 y
Cys31. Se ha usado alanina para alterar este enlace (Furuhashi
et al., 1.994), y se espera que la sustitución de Cys7 por
cualquier otro aminoácido también altere el enlace disulfuro
Cys7-Cys31.
La modificación de la secuencia de codificación
de la subunidad \beta de hCG para sustituir el codón para Tyr37
por el codón para Cys fue llevada a cabo mediante una mutagénesis,
por inserción de un casete, en el cDNA de la subunidad \beta de
hCG que había sido incorporado a un vector basado en pUC y
denominado pKBM-hCG\beta' (Campbell et
al., 1.991). Esta construcción contiene sitios de restricción
NgoMI y PstI únicos en los codones para los aminoácidos
35-36 y 45-46. El codón mutante se
introdujo al sustituir el tramo corto de DNA entre los sitios NgoMI
y PstI por el casete creado al hibridar Oligo845 y Oligo874 (Tabla
5). Esto también introdujo un sitio de restricción para la
endonucleasa PmlI que pudo ser utilizado para facilitar la
identificación de los plásmidos que contenían la mutación.
La subclonación de este casete en
pKBM-hCG\beta' (Campbell et al., 1991) fue
llevada a cabo mediante métodos estándares bien conocidos en la
técnica (Maniatis et al., 1989), y la secuencia deseada de la
región mutada fue confirmada mediante los métodos didesoxi de
secuenciación. Puesto que pKBM no es un vector de expresión, fue
subclonado en pSVL para permitir que esta construcción de subunidad
\beta se expresara en células de mamífero. Esto fue llevado a
cabo tomando el trozo pequeño obtenido por digestión de
pKBM-hCG\beta' con XhoI y BamHI y ligándolo con
el fragmento grande que quedaba después de la digestión de pSVL con
XhoI y BamHI, para crear un vector de expresión denominado
pSVL-hCG\beta'Y37C. En la Figura 4 se muestran las
secuencias de aminoácidos codificadas por
pSVL-hCG\beta' y
pSVL-hCG\beta'Y37C. Estos fueron también
subclonados en el vector pCI modificado, en los sitios XhoI y
BamHI.
La preparación de estas secuencias de
codificación podría ser llevada también a cabo mediante
procedimientos de síntesis de DNA estándares usando instrumentos
comercialmente asequibles. Estos procedimientos pueden ser usados
para preparar oligonucleótidos largos que pueden ser ligados entre
sí del modo descrito (Campbell et al., 1992). Debería
advertirse que las secuencias de codificación de DNA podrían ser
también adquiridas a una de las diversas compañías que se
especializan en la construcción de oligonucleótidos sintéticos y en
la preparación de genes de cDNA sintéticos. Éstas incluyen Midland
Certified Reagent Company, Midland, Texas, EE.UU., y Genosys
Biotechnologies, Inc., The Woodlands, Texas, EE.UU. La expresión de
estas subunidades puede ser llevada también a cabo en células de
mamífero en cultivo (es decir, células COS-7) usando
cualquiera de los diversos vectores comercialmente asequibles, tal
como pSVL (Pharmacia, Piscataway, New Jersey, EE.UU.) o pCI
(Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.), utilizando métodos similares
a los que han sido descritos (Campbell et al., 1991) y que
son comunes en la técnica.
La coexpresión de pSVL-\alpha
y pSVL-hCG\beta', pSVL-\alphaC7S
y pSVL-hCG\beta'Y37C, pCI-\alpha
y pCI-hCG\beta', y
pCI-\alphaC7S y
pCI-hCG\beta'Y37C, en células
COS-7 fue llevada a cabo mediante métodos
rutinarios que son bien conocidos en la técnica y que han sido
descritos (Campbell et al., 1991). La transfección de
células COS-7 fue llevada a cabo mediante un método
estándar de precipitación con fosfato cálcico, del modo descrito
(Kriegler, 1990). Las células COS-7 se obtuvieron de
la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland,
EE.UU. El día siguiente a la transfección, el medio de cultivo
celular fue retirado y fue sustituido por medio DMEM exento de
suero. Las células fueron incubadas durante tres días más para
permitir que los productos secretados se acumularan en los medios
de cultivo. Se centrifugaron luego los medios para eliminar los
fragmentos celulares y otros agentes precipitantes, se transfirió el
sobrenadante a una bolsa de diálisis, y se concentraron los
componentes de alto peso molecular colocando la bolsa sobre un lecho
de polvo higroscópico (Aquacide, Calbiochem, La Jolla, California,
EE.UU.).
La hCG y la hCG entrelazada que habían sido
secretadas a los medios de cultivo fueron cuantificadas usando un
inmunoensayo de tipo sándwich (Moyle et al., 1982) en el que
se emplearon los anticuerpos A113 y ^{125}I-B105
para la captura y la detección, respectivamente, y utilizándose como
patrón hCG que había sido purificada de orina. En este ensayo, se
dejó que el anticuerpo A113 anti-subunidad \alpha
de hCG (1 \mug en 0,05 ml) se adsorbiera a la superficie de una
placa de microtitulación durante una hora a 37ºC. Se eliminó el
anticuerpo no adsorbido y se incubó cada pocillo con una disolución
que contenía NaCl al 0,9% y 1 mg de albúmina sérica bovina/ml para
bloquear los restantes sitios de absorción de proteínas. Se añadió a
los pocillos una parte alícuota (0,05 ml) del medio de cultivo de
células trasfectadas durante tres días y se dejó que durante 1
hora, a 37ºC, la hCG o el compuesto análogo de hCG entrelazado se
uniera al anticuerpo adsorbido. Se separó la hormona o el compuesto
hormonalmente análogo no unidos, se enjuagaron los pocillos con una
disolución de NaCl al 0,9%, y se dejó que el analito capturado
reaccionara con el anticuerpo radioyodado
^{125}I-B105 anti-subunidad
\beta de hCG, que había sido preparado del modo descrito más
adelante. Se aspiró el anticuerpo ^{125}I-B105
que no se había unido a hCG ni al compuesto análogo de hCG
entrelazado y se determinó el radiomarcador unido a la superficie
de los pocillos de mitrotitulación usando un contador de radiación
\gamma. Con este ensayo se determinaban fácilmente 0,1 ng de hCG.
No es necesario usar estos anticuerpos concretos para este ensayo
ya que hay varios anticuerpos comercialmente asequibles que también
pueden utilizarse. Bastarán la mayoría de los anticuerpos
anti-subunidad \alpha de hCG y cualquier
anticuerpo anti-subunidad \beta de hCG que tenga
una afinidad por hCG y por la subunidad \beta libre de hCG
superior a 10^{8} M^{-1}. El último incluiría ZMCG13 y ZMCG7,
asequibles de Pierce, 3747 North Meridian Road, Rockford, Illinois,
EE.UU.
La radioyodación de anticuerpos, hCG y hFSH fue
llevada a cabo con Iodo-Gen obtenido de Pierce
Chemical Company, Rockford, Illinois, EE.UU. En este procedimiento,
se añadieron 1,5 microgramos de Iodo-Gen en 50
microlitros de acetona a un pequeño tubo de vidrio capaz de
contener aproximadamente 0,75 ml de fluido y se permitió que se
evaporase la acetona. Esto dejó un residuo de
Iodo-Gen que cubría el fondo del tubo. A
continuación, se añadieron 10 microgramos de B105, se cerró el tubo
con un tapón de plástico y se añadieron 5 microlitros que contenían
9,25-18,50 x 10^{6} Bq de Na^{125}I en tampón de
fosfato sódico 0,2 M (pH de 7,2) inyectando la disolución con una
microjeringa a través del tapón. Veinte-treinta
segundos más tarde, se añadieron 0,1 ml de disolución de NaCl al
0,9% en tampón de fosfato sódico 0,02 M (pH de 7,2), y la mezcla fue
aspirada y fue cargada en una columna de 2 ml de BioGel P6DG
(BioRad, Richmond, California, EE.UU.). Se separaron el yodo libre
y la proteína yodada por filtración en gel. La cantidad de
Na^{125}I utilizada para la yodación variaba dependiendo de la
capacidad de la proteína para conservar su función después de la
radioyodación. Los anticuerpos y la hCG se radioyodaron normalmente
hasta una actividad específica de 1,85 x 10^{6} Bq/\mug,
mientras que la hFSH se radioyodó normalmente hasta una actividad
específica de 3,70-9,25 x 10^{5} Bq/\mug.
La Tabla 6 ilustra que la mutación no alteró la
formación del compuesto análogo de hCG entrelazado. Las células que
habían sido trasfectadas con secuencias de codificación que
contenían pSVL o secuencias de codificación de pCI produjeron
cantidades comparables de compuesto análogo entrelazado y hCG.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron hCG y
hCG(\alpha31-\beta37) en inmunoensayos de
tipo sándwich con respecto a un patrón de hCG usando anticuerpos
contra la subunidad \alpha (A113) para la captura y anticuerpos
radioyodados contra la subunidad \beta (B105) para la
detección.
Se utilizaron los anticuerpos A113 y B105 en el
inmunoensayo de tipo sándwich para determinar la producción del
compuesto análogo de hCG entrelazado porque reconocían regiones de
la hormona de las que se esperaba que estuvieran alejadas del sitio
de la mutación (Cosowsky et al., 1.995; Moyle et al.,
1995). El compuesto análogo de
hCG(\alpha31-\beta37) no se unía como hCG
a A407 (Figura 5), un anticuerpo que reconoce un epítopo del que se
ha mostrado que incluye parte del extremo N de la subunidad
\alpha, el sitio de la mutación C7S (Moyle et al., 1995).
El anticuerpo A407 se obtuvo del Dr. Robert E. Canfield (Universidad
de Columbia, New York, EE.UU.). Sin embargo, puesto que se había
mostrado que A407 reconoce complejos de hCG-receptor
(Moyle et al., 1995), no se esperaba que este pequeño cambio
en la conformación de la hormona interfiriera en la actividad
biológica de los compuestos análogos de HCG entrelazados.
Se verificaron las actividades biológicas de
hCG(\alpha31-\beta37) y de otros
compuestos análogos entrelazados, en ensayos de
radioligando-receptor y de transducción de señales.
En estos se emplearon células CHO que habían sido trasfectadas con
los genes que codifican el cDNA del receptor de LH y que, por lo
tanto, expresan receptores de LH funcionales en sus superficies.
Las células CHO se obtuvieron de la ATCC, Rockville, Maryland,
EE.UU. El cDNA del receptor de LH de rata se obtuvo de un banco
ovárico de rata usando la reacción en cadena de la polimerasa del
modo descrito (Bernard et al., 1990). Ha de advertirse que
estas células que expresan el receptor de LH se utilizaron por
conveniencia y que el ensayo de
radioligando-receptor puede ser llevado a cabo con
otros tejidos que expresen receptores de LH. Estos tejidos incluyen
productos de homogeneización de testículos de rata adulta o
productos de homogeneización de ovarios obtenidos de ratas
sexualmente inmaduras a las que se ha inyectado hCG y gonadotropina
de suero de yegua preñada (ambas asequibles de Sigma, St. Louis,
Missouri, EE.UU.). Para producir una preparación ovárica que pueda
unirse a hCG con una afinidad elevada, se administró una inyección
subcutánea de 50 unidades internacionales (UI) de gonadotropina de
suero de yegua preñada a hembras de rata de 21 días de edad.
Aproximadamente 65 horas más tarde, recibieron una inyección
subcutánea de 25 UI de hCG. Siete días más tarde, se sacrificaron
las ratas, se homogeneizaron sus ovarios y, para cada tubo de
ensayo, se utilizaron partes alícuotas del producto de
homogeneización correspondientes a la veinteava parte de un ovario.
Las células que expresan receptores de LH de rata se unen a hCG
radioyodada, un trazador que puede ser preparado de la forma
anteriormente descrita o ser adquirido a New England Nuclear,
Boston, Massachusetts, EE.UU. También se unen a hCG no marcada, una
hormona que puede ser adquirida a Sigma Company, St. Louis,
Missouri, EE.UU. Las células CHO que expresan el receptor de LH
también sintetizan AMP cíclico en respuesta a un tratamiento con
hCG durante 10-30 minutos a 37ºC. El AMP cíclico que
se produce fue medido mediante un radioinmunoensayo (RIA) que es
específico para el AMP cíclico y que ha sido descrito (Brooker
et al., 1979).
La adición de un disulfuro intersubunitario
entre restos de los nudos de cisteínas de las subunidades \alpha
y \beta de hCG no destruyó la capacidad del heterodímero
entrelazado para unirse a receptores de LH ni para provocar una
respuesta de acumulación de AMP cíclico. De esta manera, tanto hCG
como hCG(\alpha31-\beta37) eran capaces
de bloquear la unión de ^{125}I-hCG a células CHO
que expresan receptores de LH (Figura 6). Tanto hCG como
hCG(\alpha31-\beta37) eran también
capaces de provocar la acumulación de AMP cíclico en esas mismas
células (Figura 7). Esto mostró que la presencia de este enlace
disulfuro intrasubunitario no alteraba la actividad funcional
global de hCG.
La presencia del enlace disulfuro
intrasubunitario permitía a
hCG(\alpha31-\beta37) resistir los
tratamientos con ácido, urea y calor que destruían la hCG. Esto
puede verse a partir de los datos de las Figuras 8 y 9. La Figura 8
ilustra la influencia de una temperatura elevada sobre la
estabilidad del heterodímero, verificada en un inmunoensayo de tipo
sándwich en que se emplean A113 para la captura y
^{125}I-B112 para la detección. Adviértase que
B105 y B112 se unen a un epítopo solapante que afecta a restos
próximos a la curva del bucle tercero de la subunidad \beta
(Moyle et al., 1990; Cosowsky et al., 1995), un lugar
alejado de las mutaciones en cualquiera de las subunidades \alpha
y \beta de hCG(\alpha31-\beta37). En
este ensayo, hCG y hCG(\alpha31-\beta37)
fueron sometidas a una temperatura de 85ºC en intervalos variables
de hasta 20 minutos. Mientras que la actividad de hCG resultó casi
destruida en 7-8 minutos, al menos el 75% de la
actividad del compuesto análogo entrelazado permaneció después de
20 minutos de incubación (Figura 8). Puesto que este inmunoensayo de
tipo sándwich es específico del dímero, parecía que la pérdida de
actividad de hCG era debida a la disociación de las subunidades, un
proceso que es evitado por la presencia del enlace disulfuro
intersubunitario.
intersubunitario.
Es bien sabido que la incubación de
gonadotropinas en urea a elevadas concentraciones provoca la
disociación de las subunidades (Pierce et al., 1981). Por lo
tanto, cuando se incubó hCG en presencia de urea 8 M, se disoció en
sus subunidades, un fenómeno fácilmente detectado por transferencia
Western (Figura 9). Las células de mamífero que han sido
trasfectadas con genes que codifican las subunidades \alpha y
\beta de hCG a menudo secretan la subunidad \beta libre así
como el \alpha,\beta-heterodímero a los medios
de cultivo. Dichos compuestos pueden ser fácilmente distinguidos
mediante inmunoensayos de tipo sándwich en que se emplean un
anticuerpo específico de la subunidad \alpha y un anticuerpo
específico de la subunidad \beta. El
\alpha,\beta-heterodímero y la subunidad
\beta libre pueden ser también distinguidos por sus tamaños en
transferencias Western. Por lo tanto, es posible determinar las
cantidades relativas de hCG y de la subunidad \beta libre en los
medios de cultivo separándolas mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida y detectándolas luego en transferencias Western.
Esto es facilitado por el uso de un anticuerpo monoclonal
radioyodado que se une a hCG y a la subunidad \beta libre de hCG,
como se muestra en la Figura 9. El análisis de los medios de cultivo
de las células que expresan tanto la subunidad \alpha como la
\beta de hCG indicó la presencia tanto del heterodímero (banda
superior) como de la subunidad \beta libre (banda inferior). El
tratamiento de los medios de cultivo con urea 8 M causó la
disociación del heterodímero en sus subunidades. En consecuencia,
desapareció la banda superior. La urea no provocó la disociación de
hCG(\alpha31-\beta37), el heterodímero
entrelazado por disulfuro, en sus subunidades y quedó intacta la
banda correspondiente al heterodímero (Figura 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Es bien sabido que el cinturón de seguridad
influye en la actividad de hCG para unirse al receptor (Campbell
et al., 1991; Moyle et al., 1994; Han et al.,
1996). La sustitución de los restos de aminoácido
101-109 de la subunidad \beta de hCG por los
correspondientes restos de hFSH (es decir, los restos
95-103 de la subunidad \beta de hFSH) condujo a
un drástico aumento de la actividad FSH del compuesto análogo sin
deterioro de su actividad LH (Moyle et al., 1994; Han et
al., 1996). En realidad, esta sustitución también potenciaba la
actividad TSH de hCG (Campbell et al., 1997) aun cuando no
introducía restos específicamente hallados en hTSH. El estudio de
la influencia de disulfuros intersubunitarios sobre las actividades
de un compuesto análogo multifuncional relacionado mostró cómo
disulfuros específicos influirían en las actividades de lutropinas,
folitropinas y tirotropinas. Este ejemplo ilustra cómo un disulfuro
intersubunitario entre los nudos de cisteínas influía en las
actividades LH y FSH del compuesto análogo de hCG
(CFC101-114) en que los restos
101-114 de la subunidad \beta de hCG estaban
sustituidos por los restos correspondientes de hFSH (es decir, los
restos 95-108 de la subunidad \beta de hFSH).
La expresión de
CFC101-114(\alpha31-\beta37)
requería que las células fueran trasfectadas con vectores que
codifican \alphaC7S y CFC\beta'101-114Y37C. La
modificación de la subunidad \alpha ha sido descrita en el
Ejemplo 1. Las secuencias de DNA del precursor de la subunidad
\beta de CFC101-114, utilizado para preparar
CFC101-114\beta'Y37C, codificaban los restos
1-100 de la subunidad \beta de hCG, los restos
95-108 de la subunidad \beta de hFSH y los restos
115-145 de la subunidad \beta de hCG conectados
sucesivamente en ese orden. Se había producido por combinación de
las secuencias de codificación de dos quimeras de subunidades
\beta de hCG/hFSH en sus sitios SstII comunes (Figuras
41-43). El fragmento XhoI-SstII de
pSVL-CFC101-106\beta' que
contenía codones para la secuencia señal y los restos
1-103 de
pSVL-CFC101-114\beta' fue
subclonado en el fragmento XhoI-BamHI de
pSVL-CFC94-114\beta'. Esto
sustituía los codones para los restos 88-94 de la
subunidad \beta de hFSH hallados en
pSVL-CFC101-114\beta' por sus
homólogos de la subunidad \beta de hCG (es decir, los restos
94-100) e introducía un sitio BglII. Cada uno de
estos vectores de codificación había sido derivado del cDNA de la
subunidad \beta de hCG modificando codones de la mitad 3' de la
molécula, como se describe a continuación.
Se preparó
pSVL-CFC94-114\beta' mediante la
mutagénesis por PCR de
pSVL-CFC94-106\beta', un vector
que codificaba los restos 1-93 de la subunidad
\beta de hCG, los restos 88-100 de la subunidad
\beta de hFSH y los restos 107-145 de la
subunidad \beta de hCG conectados sucesivamente en ese orden. La
primera operación en la preparación de
pSVL-CFC94-114\beta' fue preparar
pSVL-CFC\beta'94-106 mediante
mutagénesis por "PCR SOEing" (Ho et al., 1.989). Una
reacción PCR con Oligo508 y Oligo368 (Tabla 5) como cebadores y
pSVL-hCG\beta' (Campbell et al., 1991)
como molde proporcionó un producto que contenía los codones
101-145 de la subunidad \beta de
CFC94-106, el codón de terminación de la subunidad
\beta de hCG, región 3' no traducida, un sitio de restricción
para la endonucleasa BamHI, y parte de la secuencia del vector pSVL
3' con respecto al sitio BamHI. Una segunda reacción PCR con
Oligo510 y Oligo365 (Tabla 5) proporcionó un producto que contenía
secuencias de pSVL 5' con respecto a su sitio XhoI, la región 5' no
traducida de pSVL-hCG\beta (Campbell et
al., 1991), los 20 codones para la secuencia señal de la
subunidad \beta de hCG, y los codones 1-107 de la
subunidad \beta de CFC94-106. Las porciones de
estos productos de PCR que contenían los codones
101-107 de la subunidad \beta de
CFC94-106 eran complementarias, un requisito para la
extensión de solapamiento durante la "PCR SOEing", Estos dos
productos de PCR fueron mezclados con Oligo363 y Oligo364 (Tabla 5)
y fueron multiplicados en una tercera reacción PCR para obtener un
producto de PCR que codificaba la secuencia de longitud completa de
la subunidad \beta de CFC94-106 que tenía sitios
de restricción XhoI y BamHI cerca de sus extremos 5' y 3',
respectivamente. Este producto de PCR, que también contenía un sitio
SstII en los codones para los restos 102-104, fue
clonado en los sitios XhoI y BamHI de pSVL para crear
pSVL-CFC94-106\beta'. La secuencia
de la región de codificación fue confirmada por métodos didesoxi de
secuenciación.
La operación final en la preparación de la
subunidad \beta de
pSVL-CFC94-114\beta' implicaba una
PCR en que se usaban los cebadores Oligo596 y Oligo368 (Tabla 5) y
el molde pSVL-hCG\beta' para crear un producto
que tenía sitios SstII y BamHI cerca de sus extremos 5' y 3',
respectivamente. Cuando era sometido a digestión con estas enzimas,
se producía un fragmento de DNA que contenía los codones para los
restos 97-108 de la subunidad \beta de hFSH y los
codones 115-145 de la subunidad \beta de hCG en
ese orden. Éste fue subclonado en los sitios SstII - BamHI únicos
de pSVL-CFC94-106\beta' para crear
pSVL-CFC94-114\beta', y la porción
de la secuencia que había sido multiplicada durante la PCR fue
confirmada por métodos didesoxi de secuenciación.
La preparación de
pSVL-CFC101-106\beta' comenzó con
un vector denominado pMB135 que codificaba un compuesto análogo de
subunidad \beta de hCG truncado en el resto 114 y que contenía un
codón para valina en lugar de para Gly102. Se preparó pMB135
hibridando Oligo435 y Oligo436 (Tabla 5) y completando
enzimáticamente los extremos 3' para crear un casete de doble
cadena que contenía sitios PvuII y SstI. El último era 3' del codón
de terminación. Este casete codificaba los restos
87-101 de la subunidad \beta de hCG, valina y los
restos 103-114 de la subunidad \beta de hCG en
ese orden, y contenía un sitio de restricción para BglII en los
codones 94-95. Fue subclonado en los sitios
PvuII-SstI de pSVL-hCG\beta', y su
secuencia entre los sitios PvuII y SstI fue confirmada por métodos
didesoxi de secuenciación. Se utilizó pMB135 como molde en una
reacción PCR con Oligo 562 y Oligo365 (Tabla 5) para crear un
producto de PCR que, cuando fue sometido a digestión con XhoI y
SstII, tenía la secuencia señal y la región no traducida del cDNA de
la subunidad \beta de hCG, los codones 1-100 de
la subunidad \beta de hCG y los codones 95-98 de
la subunidad \beta de hFSH en ese orden. Este producto de PCR fue
clonado en los sitios XhoI-SstII de
pSVL-CFC94-106\beta' para obtener
pSVL-CFC101-106\beta', y su
secuencia fue determinada por métodos didesoxi de
secuenciación.
secuenciación.
Claramente, no era necesario utilizar este
planteamiento para crear
pSVL-CFC101-114\beta'. Estas
operaciones se usaron por razones históricas. Se habían preparado
los diversos vectores intermedios durante el curso de otros
experimentos y estaban disponibles para la preparación del vector
que codifica CFC101-114\beta'.
Se preparó el plásmido
pSVL-CFC101-114\beta'Y37C
combinando la "mitad" 5' de
pSVL-hCG\beta'Y37C que codificaba la mutación
Y37C, con la "mitad" 3' de
pSVL-CFC101-114\beta' que
codificaba los aminoácidos 95-108 de la subunidad
\beta de hFSH. Esto fue llevado a cabo ligando el trozo pequeño de
pSVL-hCG\beta'Y37C obtenido por digestión con
XhoI y Bsu36I con el trozo grande creado por digestión de
pSVL-CFC101-114\beta' con las
mismas enzimas. Esto sustituía los codones para la secuencia señal y
los aminoácidos 1-54 de
CFC101-114\beta' por los de hCG\beta'Y37C, un
cambio que daba lugar a la sustitución de Tyr37 por cisteína. La
subclonación del fragmento XhoI-BamHI en los sitios
XhoI-BamHI de la construcción de pCI modificada
anteriormente descrita condujo a la construcción denominada
pCI-CFC101-114\beta'Y37C. Las
secuencias de aminoácidos de CFC101-114\beta' y
CFC101-114\beta'Y37C se describen en la Figura
10.
La producción de CFC101-114 y
CFC101-114(\alpha31-\beta37)
fue llevada a cabo haciendo que se coexpresaran
pSVL-\alpha más
pSVL-CFC101-114\beta;
pSVL-\alphaC7S más
pSVL-CFC101-114\betaY37C;
pCI-\alpha más
pCI-CFC101-114\beta; y
pCI-\alphaC7S más
pCI-CFC101-114\betaY37C en células
COS-7 usando los métodos descritos en el Ejemplo 1.
Se cuantificaron CFC101-114 y
CFC101-114(\alpha31-\beta37)
entrelazado en los medios de cultivo concentrados, usando un
inmunoensayo de tipo sándwich (Moyle et al., 1.982) en que se
emplearon los anticuerpos A113 para la captura y
^{125}I-B105 o ^{125}I-B112 para
la detección; se usó hCG que había sido purificada de orina como
patrón. Como anteriormente, ha de advertirse que no es necesario
utilizar estos anticuerpos concretos para este ensayo; se espera
que los anticuerpos comercialmente asequibles de que se dispone se
comporten satisfactoriamente. En este ensayo pueden utilizarse la
mayoría de los anticuerpos anti-subunidad \alpha
de hCG que también tienen una elevada afinidad por hFSH, tal como
A113, o los anticuerpos anti-subunidad \alpha de
hFSH que tienen una elevada afinidad por hCG. Sin embargo, puesto
que estos compuestos análogos contienen restos de hFSH en la parte
de la región del cinturón de seguridad que ejerce una influencia
fundamental sobre la actividad FSH [es decir, los restos de
aminoácido entre las cisteínas undécima y duodécima de la subunidad
\beta (Moyle et al., 1994)], los compuestos análogos de
CFC101-114 no son reconocidos por todos los
anticuerpos anti-subunidad \alpha de hCG. Esto
puede verse para A407 (Figura 11), un anticuerpo que se une a hCG
pero no a hFSH. De esta manera, aunque A407 se unía a hCG, tenía
mucha menos capacidad para unirse a compuestos análogos de
CFC101-114 y CFC101-114 entrelazado.
A407 también tenía poca capacidad para unirse a
CFC101-114(\alpha31-\beta37).
Los compuestos análogos de
CFC101-114 pueden ser detectados por la mayoría de
los anticuerpos anti-subunidad \beta de hCG que
tienen una afinidad superior a 10^{8} M^{-1} para hCG y la
subunidad \beta libre de hCG, salvo por aquellos que reconocen
restos de la subunidad \beta próximos a la región ocupada por
restos de FSH. Por lo tanto, CFC101-114 y los
compuestos análogos no fueron reconocidos por B111, un anticuerpo
del que se ha mostrado que está muy influido por los restos
108-114 de hCG (Cosowsky et al., 1995). No
obstante, en este ensayo puede usarse la mayor parte de los
anticuerpos que reconocen hCG, hLH, la subunidad \beta libre de
hCG y la subunidad \beta libre de hLH, tal como B105. Además, en
este ensayo también pueden usarse muchos anticuerpos que reconocen
hCG y la subunidad \beta libre de hCG, tal como B112. La región
epitópica B105/B112 es una de las regiones más antigénicas de hCG
en ratones y se dispone comercialmente de anticuerpos hacia esta
región, como se indicó en el Ejemplo
1.
1.
La presencia de un entrelazamiento disulfuro en
CFC101-114(\alpha31-\beta37)
aumentó su estabilidad térmica con respecto a la de
CFC101-114 (Figura 12). Inmunoensayos de tipo
sándwich mostraron que las actividad de hCG y
CFC101-114 resultaban casi destruidas tras 7,5
minutos y 15 minutos de calentamiento a 85ºC, respectivamente. Sin
embargo, quedó una cantidad sustancial de
CFC101-114(\alpha31-\beta37)
después de 20 minutos a la misma temperatura. Esto mostraba que la
presencia de un disulfuro potenciaba la estabilidad de este
compuesto análogo. Puesto que éste y otros compuestos análogos que
tienen restos de FSH entre las cisteínas undécima y duodécima de la
subunidad \beta tienen tanto actividad FSH como actividad TSH
(Campbell et al., 1997), sería también de esperar que este
enlace disulfuro aumentara la estabilidad de FSH y TSH.
CFC101-114 puede estimular la
transducción de señales en los receptores de LH. La adición del
disulfuro intersubunitario \alpha31-\beta37
entre los nudos de cisteínas de CFC101-114 no redujo
su actividad en este ensayo (Figura 13). De esta manera,
CFC101-114 y
CFC101-114(\alpha31-\beta37)
tenían aproximadamente la misma elevada capacidad para estimular la
acumulación de AMP cíclico en ensayos en que se empleaban células
CHO que habían sido creadas para que expresaran receptores de LH.
De este modo, no parece que la presencia de este enlace disulfuro
influya en la actividad de las moléculas con actividad lutropina.
Sería de esperar que la capacidad de este enlace para estabilizar
estas moléculas confiriese unas propiedades terapéuticas útiles a
las lutropinas.
Aunque la secuencia de aminoácidos de
CFC101-114 es mucho más próxima a la de hCG que a la
de hFSH,
CFC101-114(\alpha31-\beta37)
tiene una actividad FSH mucho mayor que hCG, una hormona de la que
se sabe que está casi desprovista de actividad en este ensayo. La
adición del enlace disulfuro intersubunitario
\alpha31-\beta37 entre los nudos de cisteínas
de CFC101-114 sólo ejercía una pequeña influencia
sobre su capacidad para estimular la acumulación de AMP cíclico en
células CHO que expresan receptores de FSH (Figura 14). De esta
forma, no parece que la presencia de este enlace disulfuro afecte
negativamente a la actividad de moléculas con actividad folitropina,
y sería de esperar que la capacidad de este enlace para estabilizar
estas moléculas confiriese unas propiedades terapéuticas útiles a
las folitropinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las distancias entre los átomos de carbono
C\alpha y C\beta de restos de las subunidades \alpha y \beta
de hCG (Tabla 1B) sugieren que sería posible preparar muchos otros
dímeros adicionales en que las subunidades estuvieran atadas por
uno o más enlaces disulfuro. El entrelazamiento de hCG y
CFC101-114 entre el resto 31 de la subunidad
\alpha y el resto 37 de la subunidad \beta potenció
significativamente la estabilidad de los compuestos análogos
resultantes y ejerció una influencia mínima sobre sus actividades
biológicas. Para saber si la introducción de un entrelazamiento
disulfuro en una parte de la molécula de la que se ha mostrado
previamente que influye en la unión al receptor altera su
estabilidad y su actividad, se construyeron enlaces disulfuro en
hCG y CFC101-114 entre el bucle 2 de la subunidad
\alpha y el cinturón de seguridad. Estos estudios mostraron que
la introducción de un disulfuro en esta región de las hormonas
glicoproteínicas aumentaba su estabilidad. Sin embargo, las
sustituciones que se requerían para crear el disulfuro influyeron en
sus capacidades para interaccionar con receptores y provocar la
transducción de señales. Esto mostró que, para mantener una elevada
actividad endocrina, es preferible la introducción de un enlace
disulfuro en una parte de la hormona que no participa en
interacciones con el receptor ni en la especificidad por el
receptor. Puesto que ambos tipos de compuestos análogos
entrelazados por disulfuro conservaban sus actividades
inmunológicas, puede que la posición del disulfuro sea menos
importante a la hora de diseñar inmunógenos. La influencia de este
disulfuro sobre la transducción de señales puede ser útil para
desarrollar inmunógenos o antagonistas
hormonales.
hormonales.
Para preparar un compuesto análogo de hCG
estabilizado por un disulfuro intersubunitario entre el bucle 2 de
la subunidad \alpha y el cinturón de seguridad, se sustituyeron
Lys51 del bucle 2 de la subunidad \alpha y Asp99 del cinturón de
seguridad de la subunidad \beta por cisteínas. El cambio en la
subunidad \alpha implicaba la mutagénesis, por inserción de un
casete, de vectores existentes que no han sido descritos
previamente. Por lo tanto, se describirá aquí la construcción de
esos vectores intermedios (Figura 44).
El policonector de pIBI31, un vector de
clonación adquirido a International Biotechnologies, Inc. (New
Haven, Connecticut, EE.UU.), fue sustituido por un policonector que
contiene los sitios para enzimas de restricción
EcoRI-XhoI-NcoI-PacI-BamHI-EcoR1
para preparar un vector denominado pRM102. Se sometió
pKBM-\alpha a digestión con NcoI y BamHI y se
clonó en los sitios NcoI-BamHI de pRM102 para crear
pRM116, eliminando de este modo su secuencia líder 5' no traducida
y un indeseado sitio XbaI 5' que había sido introducido durante la
clonación de pKBM-\alpha. Por lo tanto, el único
sitio XbaI de pRM116 correspondía a los codones para los aminoácidos
34-35 de la subunidad \alpha. El fragmento
XbaI-BamHI de pRM116 fue sustituido por el fragmento
XbaI-BamHI de un vector que había sido creado por
PCR del cDNA de la subunidad \alpha con Oligo758 y Oligo760 (Tabla
5), para crear pRM117. Esto eliminó la región 3' no traducida
hallada en el cDNA de la subunidad \alpha, un proceso que también
eliminó los indeseados sitios de restricción PstI en esta región. El
único sitio PstI que quedaba en pRM17 estaba situado en los codones
para los restos 83-85. La clonación del producto
obtenido de la PCR del cDNA de la subunidad \alpha con Oligo730 y
Oligo839 (Tabla 5) en los sitios XbaI-PstI únicos
de pRM117 condujo a pMB507. Esto introdujo sitios BglII y SpeI en la
secuencia de codificación de la subunidad \alpha, en los codones
42-43 y 54-55, respectivamente. La
subclonación del fragmento XhoI-BamHI de pMB507 en
los sitios XhoI-BamHI de pSVL condujo a pBM512. El
fragmento de pBM512 entre los sitios BglII y SpeI fue sustituido
por Oligo877 y Oligo878 (Tabla 5) para crear pMB561. Finalmente, el
fragmento BglII-SpeI de pMB512 fue sustituido por
un casete preparado al hibridar Oligo921 y Oligo922 (Tabla 5), para
crear pSVL-\alphaK51C (Figura 15). Esta
estrategia no es necesaria para preparar
pSVL-\alphaK51C y se usó sólo por razones
históricas a causa de la disponibilidad de los diversos vectores
intermedios que habían sido creados durante otros
experimentos.
experimentos.
Se preparó el compuesto análogo de subunidad
\beta hCG\beta'D99C mediante una mutagénesis por PCR usando
pSVL-hCG\beta' como molde y Oligo368 y Oligo925
(Tabla 5) como cebadores. Oligo368 es un cebador inverso,
complementario de un sitio de pSVL 3' con relación al sitio de
restricción para la endonucleasa BamHI. Oligo925 contiene la
mutación deseada y también crea el sitio BglII. El producto de PCR
fue sometido a digestión con BglII y BamHI y fue subclonado en los
sitios BglII-BamHI de
pSVL-CFC101-114\beta'. Esto
eliminó los codones hFSH de
pSVL-CFC101-114\beta' y cambió
Asp99 por cisteína (Figura 15).
Se hizo que se coexpresaran los plásmidos
pSVL-\alphaK51C y
pSVL-hCG\beta'D99C en células
COS-7 del modo descrito en el Ejemplo 1. Se
midieron hCG y hCG(\alpha51-\beta99) en
inmunoensayos de tipo sándwich con respecto a un patrón de hCG
usando anticuerpos hacia la subunidad \alpha (A113) para la
captura y anticuerpos radioyodados hacia la subunidad \beta
(B105) para la detección. No es necesario usar estos anticuerpos
concretos para este ensayo. En este ensayo puede usarse casi
cualquier anticuerpo que reconozca la subunidad \alpha de hCG en
el heterodímero y cualquier anticuerpo
anti-subunidad \beta que reconozca hCG y su
subunidad \beta libre con afinidades superiores a 10^{8}
M^{-1}. Esta producción de hCG y
hCG(\alpha51-\beta99) por células
COS-7 transfectadas condujo a la acumulación de un
compuesto proteico análogo entrelazado en los medios de cultivo
celular, fácilmente detectado mediante un inmunoensayo de tipo
sándwich con A113/^{125}I-B105 o
A113/^{125}I-B112 (Tabla 7), lo que muestra que
las mutaciones necesarias para introducir el disulfuro no evitaban
la combinación de subunidades.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se midió la actividad biológica de
hCG(\alpha51-\beta99) en ensayos de unión
al receptor de LH y de transducción de señales usando los métodos
esbozados en el Ejemplo 1.
hCG(\alpha51-\beta99) fue capaz de
inhibir la unión de ^{125}I-hCG a células CHO que
expresan receptores de LH, aunque con sólo el 5-10%
de la potencia de hCG (Figura 16). La reducción de la afinidad por
los receptores de LH causada por el enlace disulfuro podría haber
sido debida a 1) la sustitución del resto Lys51 de la subunidad
\alpha por cisteína (es decir, la sustitución de un aminoácido
cargado por un aminoácido neutro), 2) la sustitución del resto Asp99
de la subunidad \beta por cisteína (es decir, la sustitución de
un aminoácido negativamente cargado por un aminoácido neutro), o 3)
las constricciones añadidas por la presencia de un enlace covalente
entre las dos subunidades. Se ha mostrado que modificaciones de
Asp99 reducen o eliminan la actividad LH de hCG (Chen et al.,
1991). Comparando las actividades, relativas a la unión al receptor
de LH, de compuestos análogos de hCG que contienen una subunidad
\beta no modificada y una subunidad \alpha en que Lys51 había
sido cambiada por cisteína
[hCG(\alphaK51C-\beta)] y de compuestos
análogos de hCG que contienen una subunidad \alpha no modificada y
una subunidad \beta en que Asp99 había sido cambiado por cisteína
[hCG(\alpha-\betaD99C)] con las
actividades de hCG y
hCG(\alpha51-\beta99), fue posible
distinguir la influencia de las sustituciones de cisteína, de la
influencia del enlace disulfuro (Figura 17). Estos análisis
mostraron que la sustitución de Lys51 de la subunidad \alpha por
cisteína ejercía una influencia inhibidora sustancial sobre la
capacidad de compuestos análogos para inhibir la unión de
^{125}I-hCG a receptores de LH. Las actividades
de hCG(\alpha51-\beta99) y
hCG(\alpha-\beta99) eran similares, lo
que demuestra que la sustitución de Asp99 de la subunidad \beta
por cisteína da cuenta de la mayor parte de la actividad reducida
de hCG(\alpha51-\beta99) en cuanto a la
unión al receptor de LH. El cambio de Lys51 por alanina también
redujo la actividad de hCG
(Figura 18).
(Figura 18).
También se analizaron las capacidades de estos
compuestos análogos de hCG para estimular la transducción de
señales (acumulación de AMP cíclico). La sustitución del resto Lys51
de la subunidad \alpha por cisteína o alanina causó una pérdida
casi completa de la capacidad de la hormona para estimular la
acumulación de AMP cíclico (Figuras 19 y 20). La adición de
cisteínas a ambas subunidades para crear
hCG(\alpha51-\beta99) restableció
cantidades significativas de actividad con respecto al compuesto
análogo que sólo contiene la simple sustitución de Lys51 de la
subunidad \alpha por cisteína (Figura 19). La simple sustitución
del resto Asp99 de la subunidad \beta por cisteína tenía una
influencia mucho menor sobre la transducción de señales del
receptor de LH. Esto sugería que el disulfuro reducía la eficacia
relativa de los compuestos análogos de hCG, una propiedad que puede
ser útil a la hora de diseñar
antagonistas.
antagonistas.
La presencia de un disulfuro intersubunitario
entre el cinturón de seguridad y el bucle 2 de la subunidad
\alpha aumentó la estabilidad térmica de hCG (Figura 8). También
evitó que se disociaran las subunidades en presencia de urea 8 M
(Figura 9). Estas observaciones confirman el efecto beneficioso de
un enlace disulfuro intersubunitario sobre la estabilidad de las
hormonas glicoproteínicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se creó un enlace disulfuro entre el cinturón de
seguridad y el bucle 2 de la subunidad \alpha de
CFC101-114, el compuesto análogo de hormona
glicoproteínica que tenía la capacidad para interaccionar con los
tres principales receptores de hormonas glicoproteínicas. Esto
permitió la caracterización de la influencia relativa de esta
región de la proteína sobre las interacciones con receptores de LH y
FSH.
El vector de expresión de la subunidad \beta
necesario para la producción de
CFC101-114\beta'(\alpha51-\beta99)
(es decir,
pSVL-CFC101-114\beta'D99C) fue
preparado mediante la mutagénesis de
pSVL-CFC101-114\beta' por
inserción de un casete. Este vector contiene un sitio de restricción
para la endonucleasa BglII en los codones para los aminoácidos
95-96 y un sitio SstII en los codones para los
aminoácidos 102-104. Se preparó
pSVL-CFC101-114\beta'D99C
sometiendo pSVL-CFC101-114\beta' a
digestión con BglII y SstII y sustituyendo el fragmento pequeño por
un casete oligonucleotídico sintético obtenido al hibridar Oligo924
y Oligo923 (Tabla 5). Esto también introdujo un sitio BsrGI que fue
usado para seleccionar los clones recombinantes. La secuencia de las
bases cambiadas en el vector resultante,
pSVL-CFC101-114\beta'D99C, fue
confirmada por métodos didesoxi de secuenciación. En la Figura 21
se ilustra la secuencia de aminoácidos de
CFC101-114\beta'(\alpha51-\beta99),
codificado por este vector.
La coexpresión de
pSVL-\alphaK51C y
pSVL-CFC101-114\beta'D99C en
células COS-7 fue llevada a cabo del modo descrito
en el Ejemplo 1. Se midió el dímero en inmunoensayos de tipo
sándwich usando A113 para la captura, B112 radioyodado para la
detección y hCG urinaria purificada como patrón. Como en el caso de
los otros compuestos análogos, no es necesario usar estos
anticuerpos específicos para detectar
CFC101-114(\alpha51-\beta99)
en los medios de cultivo. Para la captura podrían usarse la mayoría
de los anticuerpos anti-subunidad \alpha que
fueran capaces de unirse tanto a hCG como a hFSH. Para la detección
podrían usarse la mayoría de los anticuerpos capaces de unirse a
hCG y a la subunidad \beta libre, salvo aquellos que reconocieran
restos implicados en la secuencia que había sido cambiada por la de
FSH. Un ejemplo de un anticuerpo que no podría utilizarse es B111
(Cosowsky et al.,
1995).
1995).
A407, un anticuerpo monoclonal
anti-subunidad \alpha que reconocía un
determinante de la porción N-terminal de la
subunidad \alpha de hCG (Moyle et al., 1995) no reconoce ni
mucho menos CFC101-114 tan bien como se une a hCG
(Figura 5). Se pensó que esto era debido a la influencia del
cinturón de seguridad sobre la interacción global de las
subunidades \alpha y \beta de hormona glicoproteínica que pueden
estar implicadas en el control de la especificidad de la unión al
receptor. La adición del disulfuro entre el resto 51 de la subunidad
\alpha y el resto 99 de la subunidad \beta no hizo que el
compuesto análogo resultante fuera reconocido por A407 (Figura
11).
Se halló también que
CFC101-114(\alpha51-\beta99),
como los otros compuestos análogos entrelazados por disulfuro, era
más estable que sus precursores originarios (es decir,
CFC101-114 y hCG) en los ensayos de
desnaturalización térmica (Figura 12). En realidad, parecía que la
presencia del disulfuro entre el resto 51 de la subunidad \alpha
y el resto 99 de la subunidad \beta aumentaba la estabilidad de la
proteína más que el disulfuro entre el resto 31 de la subunidad
\alpha y el resto 37 de la subunidad \beta.
La presencia del enlace disulfuro entre el
cinturón de seguridad y el bucle 2 de la subunidad \alpha de
CFC101-114(\alpha51-\beta99)
reducía su capacidad para unirse a receptores de LH (Figura 22). De
este modo, mientras que CFC101-114 era casi tan
eficaz como la hCG recombinante en cuanto a inhibir la unión de hCG
radiomarcada a receptores de LH,
CFC101-114(\alpha51-\beta99)
era aproximadamente 100 veces menos activo. Se compararon las
importancias relativas de las mutaciones subunitarias individuales y
del enlace disulfuro determinando las actividades de
CFC101-114,
CFC101-114(\alpha51-\beta99),
CFC101-114(\alphaK51C-\beta),
CFC101-114(\alphaK51A-\beta)
y
CFC101-114(\alpha-\betaD99C).
Esta comparación mostró que la sustitución de Lys51 de la subunidad
\alpha por cisteína o alanina ejercía per se una influencia
inhibidora sustancial sobre la unión al receptor (Figuras 22 y 23).
Por lo tanto, la actividad de
CFC101-114(\alphaK51C-\beta)
era relativa a la de
CFC101-114(\alpha51-\beta99).
A diferencia de su efecto sobre la actividad LH de hCG, la
sustitución de Asp99 de la subunidad \beta de
CFC101-114 por cisteína explicaba sólo una parte de
la capacidad reducida de
CFC101-114(\alpha51-\beta99)
para unirse a receptores de LH. No obstante,
CFC101-114(\alpha51-\beta99)
era sustancialmente más activo que
CFC101-114(\alphaK51C-\beta),
un efecto que no podía explicarse por la presencia de cisteína en
la subunidad \alpha en lugar de Lys51.
También se llevaron a cabo estudios para
determinar la influencia del enlace disulfuro entre el cinturón de
seguridad y la subunidad \alpha sobre la actividad de
CFC101-114 en cuanto a la transducción de señales
(Figuras 24 y 25). CFC101-114 era sólo ligeramente
menos potente que hCG a la hora de estimular la transducción de
señales en los receptores de LH (Figura 24). Sin embargo,
CFC101-114(\alpha51-\beta99),
el compuesto análogo entrelazado por disulfuro, sólo era activo a
la mayor concentración ensayada. En confirmación de estudios
previamente discutidos, esto parecía ser debido principalmente al
cambio de Lys51 de la subunidad \alpha por cisteína; el compuesto
análogo en que sólo Asp99 de la subunidad \beta era convertido en
cisteína [es decir,
CFC101-114(\alpha51-\beta99)]
conservaba una actividad sustancial. Como en el caso de los ensayos
de unión, en que el disulfuro era capaz de compensar algo de la
pérdida de actividad causada por la sustitución de Lys51 de la
subunidad \alpha por cisteína o alanina, el enlace disulfuro
intersubunitario restableció cierta transducción de señales (Figura
24).
CFC101-114 tenía actividades
sustanciales en ensayos de FSH. Sin embargo, las sustituciones de
cisteína necesarias para crear el entrelazamiento disulfuro entre
el cinturón de seguridad y el bucle 2 de la subunidad \alpha
producían un efecto mayor sobre la actividad FSH de
CFC101-114 que sobre su actividad LH (Figuras 26, 27
y 28) y no era posible distinguir la influencia del enlace
disulfuro per se. De esta manera, los compuestos análogos en
que sólo se había cambiado Lys51 de la subunidad \alpha o Asp99 de
la subunidad \beta perdían la mayor parte de sus actividades FSH.
El hallazgo de que las mutaciones de Asp99 de la subunidad \beta
tenían mayor influencia sobre la actividad FSH que sobre la
actividad LH apoya observaciones previas sobre el papel del
cinturón de seguridad en las actividades LH y FSH (Han et
al., 1.996; Baird et al., 1993). Estos informes sugieren
que la región del cinturón de seguridad que influye en la unión al
receptor de LH está cerca de los aminoácidos 94-96
mientras que la que influye en la unión al receptor de FSH está
cerca de los aminoácidos 101-109.
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Ejemplo
5
Para aprender cómo la introducción de múltiples
disulfuros en las hormonas glicoproteínicas influye en sus
actividades biológicas, se prepararon compuestos análogos de hCG que
contenían los disulfuros mostrados en los Ejemplos 1 y 3. Estos
compuestos análogos fueron preparados al intercambiar porciones de
los vectores de expresión que han sido descritos en los Ejemplo 1 y
3. Se preparó pCI-\alpha(C7S,K51C)
sometiendo pSVL-\alphaC7S y
pSVL-\alphaK51C a digestión con BsmI, separando,
por electroforesis en agarosa, los fragmentos pequeño y grande
producidos en cada digestión y ligando el fragmento grande de
pSVL-\alphaC7S con el fragmento pequeño obtenido
de pSVL-\alphaK51C. La construcción resultante fue
sometida a digestión con XhoI y BamHI y fue ligada en pCI que tenía
un policonector modificado y que fue descrito en el Ejemplo 1. Se
preparó pCI-hCG\beta'(Y31C,D99C) sometiendo
pSVL-hCG\beta'D99C y
pCI-hCG\beta'Y37C a digestión con AocI (un
isosquizómero de Bsu36I) y BamHI, separando los trozos pequeño y
grande por electroforesis en agarosa, y ligando el trozo pequeño
procedente de pSVL-hCG\beta'D99C con el trozo
grande procedente de pCI-hCG\beta'Y37C. En la
Figura 31 se ilustran las secuencias de aminoácidos de los
compuestos análogos codificados por éstos vectores.
pCI-\alpha(C7S,K51C) y
pCI-hCG\beta'(Y31C,D99C) fueron hechos coexpresar
en células COS-7 del modo descrito en el Ejemplo 1.
La proteína secretada a los medios de cultivo fue concentrada y fue
comprobada mediante un inmunoensayo de tipo sándwich, también del
modo descrito en el Ejemplo 1 salvo por que se utilizó B112
radioyodado en lugar de B105. La presencia de múltiples enlaces
disulfuro no evitó que la hormona glicoproteínica se plegara ni que
fuera secretada por las células, como mostró la presencia de
compuesto análogo en los medios de cultivo (Tabla 8). Se midió
hCG(\alpha31-\beta37,\alpha51-\beta99)
en inmunoensayos de tipo sándwich con respecto a un patrón de hCG
usando anticuerpos contra la subunidad \alpha (A113) para la
captura y anticuerpos radioyodados contra la subunidad \beta
(B112) para la detección. El compuesto análogo no fue bien
reconocido por el anticuerpo A407, una probable consecuencia de la
mutación próxima al extremo N de la subunidad \alpha. Puesto que
esta región de la proteína no es necesaria para la actividad
hormonal, parecía que la falta de este epítopo tenía pocas
consecuencias. Las letras mayúsculas de la Figura 31 se refieren a
las posiciones de las mutaciones que se introdujeron para formar
los enlaces
disulfuro.
disulfuro.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La presencia de dos enlaces disulfuro en
hCG(\alpha31-\beta37,\alpha51-\beta99)
aumentó su estabilidad relativa a la de hCG en los ensayos de
desnaturalización térmica (Figura 8). Además,
hCG(\alpha31-\beta37,\alpha51-\beta99)
era más estable que hCG frente a la desnaturalización por urea
(Figura 9). Esto sugería que la presencia de más de un enlace
disulfuro no desestabilizaba la molécula.
hCG(\alpha31-\beta37,\alpha51-\beta99)
era capaz de unirse a receptores de LH y estimular la acumulación
de AMP cíclico (Figuras 30 y 31). Sus actividades en estos ensayos
eran similares a las de
hCG(\alpha51-\beta99), lo que mostraba
de nuevo que el disulfuro intersubunitario entre el resto 31 de la
subunidad \alpha y el resto 37 de la subunidad \beta tenía poca
influencia perjudicial, si acaso alguna, sobre la unión al receptor
o la transducción de señales. Por lo tanto, el sitio del nudo
intercisteínas \alpha31-\beta37 sería preferido
para construir un enlace disulfuro para estabilizar hormonas
glicoproteínicas cuando se desea la conservación de la actividad
endocrina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El descubrimiento de que hCG y
CFC101-114 podían ser estabilizados por un disulfuro
intersubunitario entre sus nudos de cisteínas sin alterar sus
actividades LH y/o FSH sugiere firmemente que no se necesita esta
región para la actividad hormonal. Por lo tanto, se espera que la
construcción de un disulfuro similar en FSH dé lugar a un compuesto
análogo de hFSH que tenga una estabilidad aumentada y una potente
actividad FSH. Sería también de esperar que este compuesto análogo
se uniera a anticuerpos que reconocen las subunidades \alpha de
hCG y hFSH, tal como A113. Sería también de esperar que se uniera a
anticuerpos que reconocen una región de los bucles 1 y/o 3 de la
subunidad \beta de hFSH, alejada del sitio de la mutación, tal
como B602.
En la Figura 3 se ha descrito la secuencia de un
compuesto análogo de subunidad \alpha necesario para preparar un
compuesto análogo de hFSH entrelazado entre el resto 31 de la
subunidad \alpha y el resto 31 de la subunidad \beta. En la
Figura 32 se ilustra la secuencia de aminoácidos de una subunidad
\alpha menos polar que también debería ser útil para preparar
este compuesto análogo (\alphaC7A). En la Figura 32 también se
muestra la secuencia de aminoácidos de hFSH\betaY31C, del que se
espera que forme un disulfuro del nudo intercisteínas con
\alphaC7A o \alphaC7S. Las secuencias de ácido nucleico
necesarias para preparar los vectores que codifican estas proteínas
podrían ser preparadas por un experto en la técnica de la clonación
a partir de los cDNAs de la subunidad \alpha humana y la
subunidad \beta de hFSH, usando el código genético ilustrado en
la Figura 33. Estas secuencias podrían ser también adquiridas a uno
de los proveedores indicados en el Ejemplo 1.
Los vectores capaces de conducir transitoria o
establemente la expresión de \alphaC7S y hFSH\betaY31C o de
\alphaC7A y hFSH\betaY31C serían introducidos en células
COS-7 u otras células eucarióticas mediante los
medios bien conocidos en la técnica, tales como los referidos en el
Ejemplo 1. La proteína producida sería medida en un inmunoensayo de
tipo sándwich usando hFSH como patrón y anticuerpos de captura que
reconozcan epítopos de hFSH alejados del extremo N de la subunidad
\alpha y anticuerpos de detección que reconozcan epítopos de hFSH
en sitios de los bucles 1 y/o 3 de la subunidad \beta.
\newpage
Sería de esperar que el compuesto análogo
entrelazado de hFSH fuera más estable que hFSH en los ensayos de
desnaturalización térmica o por urea como los llevados a cabo en el
Ejemplo 1 para los compuestos análogos de hCG entrelazados. También
sería de esperar que el compuesto análogo de FSH entrelazado
compitiera con hFSH radioyodada para unirse a células CHO que han
sido trasfectadas con receptores de FSH humanos. También sería de
esperar que estimulara la acumulación de AMP cíclico en esas
células. Mediante ensayos in vitro se puede pronosticar
exitosamente las actividades biológicas in vivo de compuestos
análogos de hormona glicoproteínica totalmente glicosilados. Puesto
que no se espera que las mutaciones que se introducen para
entrelazar los compuestos análogos de hormona glicoproteínica
alteren sus patrones globales de glicosilación con respecto a los
de las hormonas glicoproteínicas recombinantes, también sería de
esperar que el compuesto análogo de FSH entrelazado fuese
activo
in vivo.
in vivo.
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Ejemplo
7
En los Ejemplos 1-4 se enseña
que un solo enlace disulfuro intersubunitario entre las subunidades
de hormonas glicoproteínicas y de sus compuestos análogos puede
potenciar su estabilidad. En estos ejemplos también se muestra que
el efecto del enlace disulfuro sobre las actividades de la molécula
en cuanto a la unión al receptor y la transducción de señales será
pequeño con tal que no afecte a restos que son importantes para la
unión al receptor o la especificidad de la unión al receptor, ni
retuerza la proteína en una conformación inapropiada. Las porciones
N-terminales tanto de la subunidad \alpha como de
la subunidad \beta pueden ser sustancialmente cambiadas sin
destruir la actividad hormonal, una indicación de que esta parte de
la proteína no participa en contactos clave con el receptor. Por lo
tanto, se prevé que la introducción de un enlace disulfuro en los
extremos N de las hormonas glicoproteínicas, en sitios mostrados
como favorables en la Tabla 1B, las estabilizará sin alterar
gravemente sus actividades
biológicas.
biológicas.
En la Tabla 1B se muestra que Gln5 de la
subunidad \alpha y Arg8 de la subunidad \beta de hCG están
situadas favorablemente para que la sustitución de cada una por
restos de cisteína conduzca a la formación de un compuesto análogo
entrelazado por disulfuro. Sería de esperar que este compuesto
análogo tuviera una estabilidad potenciada con respecto a la de hCG
y conservara la capacidad para unirse a receptores de LH y
estimularlos.
En las Figuras 34A y 34B se ilustran las
secuencias de aminoácidos necesarias para preparar vectores que
serían útiles para la expresión de este compuesto análogo.
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Ejemplo
8
Un compuesto análogo de hFSH estabilizado por un
disulfuro entre las porciones N-terminales de las
subunidades \alpha y \beta
Como se indicó anteriormente, en los Ejemplos
1-4 se enseña que un enlace disulfuro
intersubunitario entre las subunidades de hormonas glicoproteínicas
y de sus compuestos análogos puede potenciar su estabilidad. En
estos ejemplos también se muestra el efecto del enlace disulfuro
sobre la unión al receptor y la transducción de señales con tal que
no afecte a restos que son importantes para la unión al receptor o
la especificidad de la unión al receptor. Por lo tanto, se espera
que la introducción de un enlace disulfuro en los extremos N de la
hFSH la estabilice y conduzca a un compuesto análogo que tenga
propiedades terapéuticas úitiles.
Basándose en los datos de la Tabla 1B que
muestran las posiciones favorables de Gln5 de la subunidad \alpha
y Arg8 de la subunidad \beta de hCG y los datos de la Tabla 2 que
muestran los restos "equivalentes" en hCG y hFSH, sería de
esperar que la sustitución de Gln5 de la subunidad \alpha y Ser2
de la subunidad \beta de hFSH por restos de cisteína creara
compuestos análogos de hFSH entrelazados por disulfuro. Sería de
esperar que estos compuestos análogos tuvieran una estabilidad
potenciada con respecto a la de hFSH y conservaran la capacidad
para unirse a receptores de FSH y estimularlos. En la Figura 35 se
ilustran las secuencias de aminoácidos necesarias para preparar un
vector que sería útil para la expresión de este compuesto
análogo.
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Ejemplo
9
Las lutropinas humanas más íntimamente
relacionadas son hCG y hLH. Por lo tanto, sería de esperar que las
mutaciones necesarias para preparar compuestos análogos activos de
hCG entrelazados por disulfuro fueran también útiles para la
preparación de compuestos análogos activos de hLH entrelazados por
disulfuro. La hLH es la menos estable de las gonadotropinas, y
también se espera que los disulfuros intersubunitarios aumenten
significativamente la estabilidad de la hLH. En las Figuras 36 y 37
se ilustran, respectivamente, las secuencias de aminoácidos de la
subunidad \beta necesaria para preparar hLH entrelazada por
disulfuro del nudo intercisteínas y hLH que está entrelazada cerca
de su extremo N.
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Ejemplo
10
Como se indicó anteriormente, en los Ejemplos
1-4 se enseña que un enlace disulfuro
intersubunitario entre las subunidades de hormonas glicoproteínicas
y de sus compuestos análogos puede potenciar su estabilidad. En
estos ejemplos también se muestra el efecto del enlace disulfuro
sobre la unión al receptor y la transducción de señales con tal que
no afecte a restos que son importantes para la unión al receptor o
la especificidad de la unión al receptor. Por lo tanto, se prevé
que la introducción de un enlace disulfuro entre restos de los
nudos de cisteínas de las subunidades \alpha y \beta de hTSH o
en los extremos N de las subunidades \alpha y \beta de hTSH
estabilice el heterodímero para conducir a un compuesto análogo que
tenga unas propiedades terapéuticas útiles, tal como estimular la
glándula tiroides antes de una terapia de ablación con yodo
radiactivo.
Basándose en los datos de la Tabla 1B que
muestran las posiciones favorables de Cys31 de la subunidad \alpha
y Tyr37 de la subunidad \beta de hCG y los datos de la Tabla 2
que muestran los restos "equivalentes" en hCG y hTSH, sería de
esperar que células que expresan \alphaC7S o \alphaC7A y un
compuesto análogo de subunidad \beta de hTSH en que Tyr30 está
sustituido por un resto de cisteína crearan compuestos análogos de
hTSH entrelazados por disulfuro. Similarmente, basándose en los
datos de la Tabla 1B que muestran las posiciones favorables de Gln5
de la subunidad \alpha y Arg8 de la subunidad \beta de hCG y los
datos de la Tabla 2 que muestran los restos "equivalentes" en
hCG y hTSH, sería de esperar que la sustitución de Gln5 de la
subunidad \alpha y Phe1 de la subunidad \beta de hTSH por restos
de cisteína crease compuestos análogos de hTSH entrelazados por
disulfuro. Sería de esperar que estos compuestos análogos tuvieran
una estabilidad potenciada con respecto a la de hTSH y conservaran
la capacidad para unirse a receptores de TSH y estimularlos. En las
Figura 38s y 39 se ilustran las secuencias de aminoácidos necesarias
para preparar un vector que sería útil para la expresión de estos
compuestos análogos.
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Ejemplo
11
Es bien sabido que la desglicosilación de las
hormonas glicoproteínicas reduce sus capacidades para generar una
señal biológica (Moyle et al., 1975; Matzuk et al.,
1989). Sin embargo, a causa de su inestabilidad, las hormonas
desglicosiladas no son terapéuticamente útiles. Se espera que la
introducción de un entrelazamiento disulfuro en hormonas
genéticamente desglicosiladas aumente su utilidad como antagonistas
hormonales. Un antagonista de LH o hCG tendría usos profecundidad y
antifecundidad. De este modo, cuando fuera administrado a mujeres
estériles a causa de tener niveles de LH inapropiadamente elevados,
un antagonista de LH potenciaría la fecundidad. Cuando fuera
administrado a mujeres que están en las primeras fases del embarazo,
un antagonista de hCG terminaría el embarazo. También sería útil un
antagonista de una molécula bifuncional de LH/FSH, tal como
CFC101-114 o CF101-109 (Moyle et
al., 1994). El uso transitorio de dicho antagonista podría ser
utilizado para terminar una función ovárica inapropiada, causando
por ello el reinicio del ciclo menstrual. Esto tendría un posible
efecto profecundidad. Sería de esperar que el uso de dicho
antagonista al principio de un embarazo suprimiera la producción
tanto de progesterona como de estradiol y terminara el embarazo.
Además de introducir un entrelazamiento
disulfuro intersubunitario, la preparación de los antagonistas
entrelazados implicaría cambiar las señales de glicosilación
N-enlazadas en la subunidad \alpha o en las
subunidades \alpha y \beta de los compuestos análogos que han
sido descritos o que pudieran producirse por referencia a la Tabla
1B. Esto implicaría cambiar la secuencia
Asn-X-Ser/Thr hallada en las
subunidades \alpha y \beta de las hormonas glicoproteínicas
para sustituir el Asn por otro aminoácido, cambiar la Ser o Thr por
otro aminoácido, o cambiar el aminoácido situado entre Asn y
Ser/Thr (representado como X) por prolina.
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Ejemplo
12
En las Tablas 9-15 se presentan
otros compuestos análogos de las gonadotropinas entrelazados por
disulfuro, de los que se espera que sean más estables que las
hormonas originarias. Aquellos se prepararían cotransfectando
células con vectores que pueden expresar las construcciones de
subunidad \alpha y subunidad \beta indicadas en los
Ejemplos
1-5.
1-5.
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Ejemplo
13
Los restos que crean este disulfuro están en una
región de hCG de la que se ha propuesto que no participa en los
contactos de alta afinidad con el receptor (Moyle et al.,
1995). Ni el bucle segundo de la subunidad \beta ni el bucle
tercero de la subunidad \beta de hCG son necesarios para la
actividad lutropina, y pueden prepararse compuestos análogos
activos de hCG en que se hayan suprimido ambos (Moyle et al.,
1988). Además, se han preparado compuestos análogos de hCG que
tienen actividad completa en que el bucle 2 de la subunidad \beta
ha sido reemplazado por el correspondiente bucle de hFSH (Campbell
et al., 1991). De esta manera, el presente inventor no
espera que la adición de un disulfuro intrasubunitario entre estas
porciones de la proteína altere la actividad biológica de ésta.
Este compuesto análogo se prepararía modificando vectores que
codifican las subunidades \alpha y \beta de hCG y haciendo que
se coexpresasen en células de mamífero. Como se muestra en la Tabla
9, la construcción de subunidad \alpha codificaba una proteína que
tiene la secuencia de aminoácidos denominada \alphaV76C. Esta
construcción fue preparada mediante mutagénesis por PCR usando los
oligonucleótidos 1131 y 1132 como cebadores (Tabla 5) y pMB589 como
molde. El plásmido pMB589 es una construcción en pCI' que codifica
un compuesto análogo de la subunidad \alpha humana en que el codón
para Asn52 estaba cambiado por aquél para ácido aspártico y en que
los codones para Arg42 y Ser43 estaban modificados para crear un
sitio BglII silencioso.
Se preparó pMB589 subclonando el inserto
XhoI-BamHI de pMB532 en el vector pCI', entre los
sitios XhoI-BamHI, y se preparó pMB532 a partir de
pMB507, una construcción previamente descrita, por PCR usando los
oligonucleótidos 850 y 851 como cebadores (Tabla 5) y pMB507 como
molde. El producto de PCR fue sometido a digestión con BglII y SpeI
y fue subclonado en los sitios BglII y SpeI de pMB507 y secuenciado
para obtener pMB532.
El producto de PCR fue sometido a digestión con
BglII y PstI y el inserto fue clonado en los sitios BglII y PstI de
pMB507 para crear pMB910. Los clones positivos fueron identificados
por la presencia de un sitio DraI extra que había sido introducido
en la construcción. Una vez que se hubo confirmado la secuencia de
DNA de pMB910 por el método didesoxi, el fragmento de DNA que
codificaba el compuesto análogo entero de subunidad \alpha fue
separado de pMB910 por digestión con XhoI y BamHI y fue subclonado
en los sitios XhoI y BamHI del vector pCI' para crear pMB926.
pMB926 codifica \alphaV76C.
Para crear la pareja de subunidad \beta de hCG
para \alphaV76C, se preparó un vector que codificaba
hCG\beta'V44C. Éste es un compuesto análogo de la subunidad
\beta de hCG del que se espera que forme un heterodímero con
\alphaV76C, entrelazado por disulfuro, cuando se exprese en las
mismas células que pMB926. Se sintetizaron los oligonucleótidos
1133 y 1134 (Tabla 5) y se ligaron en el sitio
NgoMI-PstI de pKMB-\beta' para
crear pMB909. El fragmento XhoI-BamHI de pMB909 fue
transferido a pCI' para crear pMB941. En la Tabla 11 se muestra la
secuencia de aminoácidos de hCG\betaV44C, codificada por
pMB941.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Basándose en las similitudes de las secuencias
de aminoácidos de las subunidades \beta de hCG y hFSH,
notablemente de las cisteínas (Tabla 4), sería de esperar que ambas
proteínas tuvieran arquitecturas similares. Las posiciones
relativas de Val44 en el bucle 2 de la subunidad \beta de hCG y
Val76 en el bucle 3 de la subunidad \alpha sugerían que el cambio
de estos restos por cisteínas crearía un disulfuro intersubunitario
entre el bucle 2 de la subunidad \beta y el bucle 3 de la
subunidad \alpha. Val38 ocupa una posición similar en la subunidad
\beta de hFSH, como Val44 de la subunidad \beta de hCG. Por lo
tanto, se pensó que cambiar hFSH\betaVal38 por cisteína y hacer
que se expresara la construcción resultante con \alphaV76C daría
lugar a un heterodímero entrelazado por disulfuro. Para cambiar
Val38 de la subunidad \beta de hFSH por cisteína, el presente
inventor comenzó con pMB603, una construcción que contiene la
secuencia de codificación del cDNA de hFSH\beta menos los
extremos no traducidos 3' y 5' en el vector pCI', entre los sitios
de restricción XhoI y BamHI. El fragmento de DNA pequeño situado
entre los sitios BstXI y PpuMI de pMB603 fue reemplazado por un
casete oligonucleotídico preparado al hibridar los oligonucleótidos
1154 y 1155
(Tabla 5).
(Tabla 5).
La construcción resultante, denominada pMB920,
fue explorada en cuanto a la falta de un sitio BstXI y la presencia
de un sitio PpuMI. Una vez que la secuenciación del DNA confirmó la
presencia del cambio deseado, se cotransfectaron células
COS-7 con pMB920 y pMB926, el vector que conduce la
expresión de \alphaV76C. Las células secretaban al medio un
heterodímero que fue fácilmente detectado en un inmunoensayo de tipo
sándwich usando el anticuerpo monoclonal A113
anti-subunidad \alpha para la captura y el
anticuerpo monoclonal B602 radiomarcado
anti-subunidad \beta de hFSH. En la Tabla 10 se
muestra la secuencia de aminoácidos de hFSH\beta38C codificada por
pMB920. El heterodímero compuesto de \alphaV76C y hFSH\betaV38C
estimulaba la acumulación de AMP cíclico en células CHO que
expresan el receptor de FSH humano (Figura 45).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
Los precedentes heterodímeros entrelazados por
disulfuro fueron preparados al modificar cada subunidad para crear
un tiol libre que pudiera participar en un disulfuro
intersubunitario. Se muestra aquí que es posible preparar un
compuesto análogo de hCG entrelazado por disulfuro al modificar sólo
la subunidad \beta de hCG. La estructura cristalina de hCG mostró
que Cys31 de la subunidad \alpha estaba situada cerca de Tyr37 de
la subunidad \beta y que la cadena lateral de cada subunidad
apuntaba hacia la otra. Esta observación fue usada previamente para
insertar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 31 de
la subunidad \alpha y el resto 37 de la subunidad \beta de hCG.
La estructura cristalina de hCG también muestra que el resto Cys7
de la subunidad \alpha está situado cerca del resto Arg6 de la
subunidad \beta de hCG. De hecho, los restos Cys7 y Cys31 de la
subunidad \alpha están dispuestos cerca de los restos Arg6 y Tyr37
de la subunidad \beta, de modo que la conversión de Arg6 y Tyr37
podría provocar la formación de un heterodímero que contuviese los
disulfuros intrasubunitarios
\alphaCys7-\alphaCys31 y
\betaCys6-\betaCys37, un heterodímero que
contuviera los disulfuros intersubunitarios
\alphaCys7-\betaCys6 y
\alphaCys31-\betaCys37, o un heterodímero que
contuviera los disulfuros intersubunitarios
\alphaCys7-\betaCys37 y
\alphaCys31-\betaCys6. Simulaciones
informáticas mostraron que podría formarse cada uno de estos enlaces
disulfuro sin una excesiva tensión sobre la proteína. La formación
de múltiples disulfuros debería ser útil para crear un grupo de
isómeros o isoformas que tuvieran diferentes semividas. Estos
podrían tener nuevos usos terapéuticos, particularmente cuando se
necesita "reimpulsar" una respuesta biológica. En estos usos,
se administraría un gran bolo de compuesto análogo para iniciar una
respuesta hormonal. Sería de esperar que la fracción del
heterodímero que no está entrelazada fuera aclarada más rápidamente
que la del heterodímero entrelazado. En consecuencia, la gran
inyección inicial sería suficiente para iniciar la respuesta, pero
su actividad se disiparía hasta un menor nivel que sería sostenido
durante un periodo más prolongado para mantener la respuesta.
También sería de esperar que este compuesto análogo sirviera como
un producto intermedio para la preparación de compuestos análogos
PEGilados. Los restos de cisteína tienen reactividades únicas, y a
menudo es deseable añadir una cisteína libre a la superficie de una
proteína. Sin embargo, a causa de la reactividad de la cisteína,
puede ser difícil crear este tipo de proteína. Se sabe que el
disulfuro Cys7-Cys31 de la subunidad \alpha es
rápidamente reducido a un estado que crea una cisteína libre. Sería
de esperar que la introducción de una cisteína en la subunidad
\beta entre los restos 6 y 7 creara un tipo similar de disulfuro.
Se espera que las cisteínas de estos disulfuros sean más activas
que otras de la proteína, particularmente puesto que están en una
situación que facilita el intercambio de disulfuros. Por lo tanto,
el presente inventor espera que sea posible hacer reaccionar la
existente cisteína de la subunidad \alpha en el resto Cys7 y una
cisteína añadida en el resto Cys6 de la subunidad \beta con
agentes que modifiquen la proteína. Estos podrían incluir los
capaces de PEGilar la proteína y estabilizar su semivida biológica.
Las cisteínas que se "liberasen" en este proceso serían capaces
de formar un disulfuro intersubunitario que estabilizaría la
proteína. La preparación de este compuesto análogo requería añadir
una segunda cisteína al compuesto análogo conocido como
hCG\beta'Y37C.
hCG\beta'Y37C.
Se preparó pMB940, una construcción que codifica
el compuesto análogo hCG\beta', mediante mutagénesis por PCR
utilizando los oligonucleótidos 1161 y 1163 (Tabla 5) como cebadores
y pCI'-hCG\beta' como molde. El oligonucleótido
1161 ceba secuencias que están situadas en el vector pCI', y el
oligonucleótido 1163 codifica la mutación. El producto de PCR fue
sometido a digestión con XhoI y BanI y fue ligado con el fragmento
BanI-BamHI obtenido de
pSVL-hCG\beta'Y37C en el fragmento
XhoI-BamHI grande de pCI' para crear pMB941. La
secuencia de DNA de la secuencia de codificación de pMB941 fue
confirmada por el método didesoxi. pMB941 codifica la secuencia de
aminoácidos mostrada a continuación:
Se cotransfectaron células CHO con pMB940 y
pSV2Neo y se seleccionó una línea estable por su resistencia al
fármaco tóxico G418. La proteína recolectada del medio fue
cuantificada usando un inmunoensayo de tipo sándwich en que se
empleó el anticuerpo A113 anti-subunidad \alpha
para la captura y el anticuerpo B112 anti-subunidad
\beta radioyodado para la detección. Este ensayo confirmó la
presencia de heterodímero en el medio de cultivo. La actividad
biológica del heterodímero fue medida en un ensayo de acumulación de
AMP cíclico usando células CHO que expresan el receptor de LH de
rata. Los resultados de este ensayo se ilustran en la Figura 46.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
Como se indicó anteriormente, la formación de
múltiples disulfuros podría ser útil para crear un grupo de
isoformas proteicas que tuvieran diferentes semividas. Un compuesto
análogo similar ofrecería una aproximación mejorada a la
estimulación del desarrollo folicular. La fracción del heterodímero
que no contuviera disulfuro intersubunitario y que no estuviera
entrelazada debería ser aclarada más rápidamente que la fracción del
heterodímero que contuviera un entrelazamiento intersubunitario. En
consecuencia, una gran inyección inicial sería suficiente para
estimular el desarrollo inicial del folículo, pero su actividad se
disiparía hasta un menor nivel que sería sostenido durante un
periodo más prolongado. Esto simularía más estrechamente el tipo de
estimulación por FSH vista durante la fase folicular y podría
reducir la posibilidad de hiperestimulación. Sería de esperar que
la adición de una cisteína al extremo N de la subunidad \beta de
hFSH o que la adición del extremo amínico de la subunidad \beta
de hCG al extremo N de la subunidad \beta de hFSH facilitase la
formación del heterodímero y el entrelazamiento intersubunitario.
Un compuesto análogo de subunidad \beta de hFSH del que se espera
que forme un heterodímero similar al del compuesto análogo del
Ejemplo 15 tendría la secuencia de aminoácidos mostrada a
continuación:
Ejemplo
17
Los compuestos análogos de hCG en que los
aminoácidos 94-110 de la subunidad \beta están
sustituidos por los correspondientes aminoácidos de hFSH tienen una
elevada actividad FSH. Sería de esperar que las quimeras de hCG y
hFSH que contienen los restos 95-103 de la subunidad
\beta de hFSH en lugar de los restos 101-109 de
la subunidad \beta de hCG y que tienen cisteínas en los restos 6 y
37 de la subunidad \beta formasen una disposición de disulfuros
similar a la del Ejemplo 15. También sería de esperar que tuvieran
una elevada actividad FSH. La secuencia de aminoácidos de la
subunidad \beta de dicho compuesto análogo sería:
\vskip1.000000\baselineskip
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(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 14, John B. Gorsiraweg
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Curaçao
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ANTILLAS HOLANDESAS
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 00000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: William R. MOYLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 952 River Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Piscataway
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: New York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 08854
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DEL INVENTO: COMPUESTOS ANÁLOGOS DE HORMONAS GLICOPROTEÍNICAS CON {}\hskip3.75cm ENTRELAZAMIENTO POR DISULFURO, Y SU PREPARACIÓN Y SU USO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 142
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: BROWDY AND NEIMARK
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 419 Seventh Street, N.W., Suite 300
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Distrito de Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 20004
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con ordenador personal IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn, emisión nº 1.0, versión nº 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/13070
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/050.784
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 de Julio de 1998
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE DE PATENTES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: YUN, Allen C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 37.971
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: MOYLE=1A PCT
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 92 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 145 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº
6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 132 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 132 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 145 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 121 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 111 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 112 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 92 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 95 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 95 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 93 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 93 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 95 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 149 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 121 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 119 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 121 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 119 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 119 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 119 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 111 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 111 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 117 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 111 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 117 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 117 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 73:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 81 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 79:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 81:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 82:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 85:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 86:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 87:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 88:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 89:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 90:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 90:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 91:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 91:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 92:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 93:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 93:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 94:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 95:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 95:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 96:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 97:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 97:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 98:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 98:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 99:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 99:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 100:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 100:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 101:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 101:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 102:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 102:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 103:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 103:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 104:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 104:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 105:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 105:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 106:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 106:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 107:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 107:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 108:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 108:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 109:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 109:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 110:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 110:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 111:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 111:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 112:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 112:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 113:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 113:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 114:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 114:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 115:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 115:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 116:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 116:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 117:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 117:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 118:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 118:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 119:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 119:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 120:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 120:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 121:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 121:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 122:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 122:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 123:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 123:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 124:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 124:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 125:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 125:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 126:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 126:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 127:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 127:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 128:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 128:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 129:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 129:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 130:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 130:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 131:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 131:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 132:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 132:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 133:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 133:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 134:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 134:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 135:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 135:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 136:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 136:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 137:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 137:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 138:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 138:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 139:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 139:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 140:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 142 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 140:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 141:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 137 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 141:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 142:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 142:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Hormonas glicoproteínicas, que consisten en
una subunidad \alpha y una subunidad \beta, seleccionadas del
grupo que consiste en:
- (a)
- gonadotropina coriónica humana (hCG) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha está modificada para sustituir el resto Cys7 por serina, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta está modificada para sustituir el resto Tyr37 por cisteína, para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto Cys31 nativo de dicha subunidad \alpha y el resto 37 de dicha subunidad \beta, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta está opcionalmente más modificada para sustituir los restos 101-114 por los restos 95-108 de la subunidad \beta de la hFSH;
- (b)
- gonadotropina coriónica humana (hCG) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha está modificada para sustituir el resto Val76 por cisteína, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta está modificada para sustituir el resto Val44 por cisteína para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 76 de dicha subunidad \alpha y el resto 44 de dicha subunidad \beta;
- (c)
- hormona humana estimulante del folículo (hFSH) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta está modificada para sustituir el resto Tyr31 por cisteína, y en que o bien
- (i)
- la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha está modificada para sustituir el resto Cys7 por serina; o bien
- (ii)
- la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha está modificada para sustituir el resto Cys7 por alanina;
- \quad
- para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto Cys31 nativo de dicha subunidad \alpha y el resto 31 de dicha subunidad \beta; y
- (d)
- hormona humana estimulante del folículo (hFSH) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha está modificada para sustituir el resto Val76 por cisteína, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta está modificada para sustituir el resto Val38 por cisteína para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 76 de dicha subunidad \alpha y el resto 38 de dicha subunidad \beta.
2. Una composición farmacéutica que comprende
una cantidad eficaz de la hormona glicoproteínica de acuerdo con la
reivindicación 1, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
3. La composición farmacéutica de la
reivindicación 2, que es un líquido.
4. La composición farmacéutica de la
reivindicación 3, que es estable.
5. Una molécula de DNA recombinante que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad
\alpha de la hormona glicoproteínica de la reivindicación 1.
6. Una molécula de DNA recombinante que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad
\beta de la hormona glicoproteínica de la reivindicación 1.
7. La molécula de DNA recombinante de la
reivindicación 5 o la reivindicación 6, que es un vector de
expresión.
8. Una célula huésped eucariótica transformada
con la molécula de DNA recombinante de la reivindicación 7, en que
dicha célula huésped es capaz de expresar dicha subunidad de una
hormona glicoproteínica.
9. Un procedimiento para preparar una hormona
glicoproteínica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende
las operaciones de:
cultivar una célula huésped eucariótica
transformada con secuencias de nucleótidos de las subunidades
\alpha y \beta, conducidas en el mismo vector de expresión o en
vectores de expresión distintos;
hacer que se exprese la hormona glicoproteínica;
y
recuperar la hormona glicoproteínica
expresada.
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