ES2389835T3 - Glicoproteínas mutantes - Google Patents
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Abstract
Un mutante de FSH, caracterizado porque se ha introducido un sitio de N-glicosilación en la subunidad alfa deFSH mediante la mutación F17T, en el que el mutante de FSH comprende la secuencia de aminoácidos SEQ IDNO:3.
Description
Glicoproteínas mutantes.
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de las gonadotropinas, y en particular a su uso en el tratamiento de trastornos 5 reproductivos.
Las gonadotropinas son un grupo de glicoproteínas heterodímeras que incluyen hormona estimuladora del folículo (FSH), hormona luteinizante (LH) y gonadotropina coriónica (CG). Estas hormonas regulan la función gonadal en el macho y en la hembra. Cada una de estas hormonas está compuesta por dos subunidades unidas de modo
10 covalente: una subunidad alfa, que es común a FSH, LH y hCG, y una subunidad beta, que es única para cada una de ellas, y que confiere especificidad biológica a cada hormona.
En todas las gonadotropinas, cada subunidad tiene cadenas laterales de oligosacáridos unidas (unidas por N) a asparagina. En la subunidad alfa común de las hormonas humanas, estas están unidas en las posiciones 52 y 78. En ambas FSH y CG humanas, dos cadenas laterales de oligosacáridos unidas por N se unen a la subunidad beta,
15 en las posiciones 7 y 24 en FSH, y en las posiciones 13 y 30 en hCG. En LH humana, un oligosacárido se une en la posición 30 de la subunidad beta. La hCG tiene adicionalmente cuatro cadenas laterales de oligosacárido unidas (unidas por O) a serina, presente en la porción terminal de carboxilo (CTP).
Las gonadotropinas desempeñan papeles cruciales en el ciclo reproductivo, y su uso es esencial para las técnicas de reproducción asistida (ART), tales como fertilización in vitro (IVF), IVF en conjunción con inyección
20 intracitoplásmica de esperma (IVF/ICSA) y transferencia de embrión (ET), así como para inducción de ovulación (OI) en pacientes anovuladoras que se someten a fertilización in vivo ya sea de modo natural o a través de inseminación intrauterina (IUI).
Típicamente, la ART se lleva a cabo usando hiperestimulación ovárica controlada (COH) para aumentar el número de gametos femeninos. Los regímenes estándar para COH incluyen una fase de regulación a la baja en la que se 25 suprimen las gonadotropinas endógenas mediante administración de una gonadotropina que libera hormona agonista (GnRH) seguida por una fase estimuladora en la que se induce desarrollo folicular (foliculogénesis) mediante administración diaria de FSH, habitualmente 150-225 UI/día aproximadamente. Como alternativa, se inicia la estimulación después de la menstruación espontánea o inducida al tiempo que se previene que ocurra un incremento repentino de LH por enfermedad planificada mediante administración de un antagonista de GnRH (que
30 se inicia típicamente alrededor del sexto día de la fase estimuladora). Cuando hay al menos 3 folículos >16 mm (uno de 18 mm), se administra un bolus único de hCG (5-10.000 UI) para imitar el incremento repentino natural de LH e inducir la ovulación. La recuperación de oocito se planifica para 36-38 horas después de la inyección de hCG.
Típicamente, la OI se lleva a cabo con administración diaria de FSH a una dosis de aproximadamente 75-150 UI/día. Se puede usar regulación a la baja con agonistas de GnRH o antagonistas, aunque menos frecuentemente que en la
35 indicación de ART. Se administra hCG para imitar el incremento repentino de LH previo a la fertilización in vivo que se consigue bien por relación sexual natural o por IUI.
Los regímenes típicos anteriormente descritos para ART y OI requieren inyecciones diarias de gonadotropinas durante un período prolongado, esto es durante una media de 10 días, y hasta 21 días en algunas pacientes. El desarrollo de preparaciones de FSH de mayor eficacia permitiría que la dosis diaria de FSH se disminuyera, y/o
40 permitiría el acortamiento del período de tratamiento (esto es menos inyecciones), y/o permitiría que las inyecciones se administraran menos frecuentemente. Esto haría que los regímenes de ART y OI fueran más cómodos y llevaderos para la paciente.
Además, la ART que usa fertilización in vitro está plagada de posibles contratiempos. Por ejemplo, no todos los folículos producirán oocito viable, no todos los oocitos viables se fertilizarán con éxito, y algunos embriones puede
45 que no sean viables. Aun más, una vez que se seleccionan embriones viables, puede que la transferencia al útero y la implantación no tengan éxito. A fin de maximizar las oportunidades de un nacimiento vivo es por tanto deseable estimular el crecimiento y la maduración de varios folículos, para garantizar la recogida de múltiples oocitos.
En contraposición, en la indicación de OI el objetivo es obtener no más de tres y preferiblemente un folículo dominante (para evitar embarazos múltiples).
50 Algunas pacientes que se someten a ART y OI presentan un número reducido de folículos que crecen cuando se tratan con preparaciones de FSH convencionales. Esto es un factor limitante del éxito al someterse a ART, porque limita el número de embriones disponibles para la transferencia y/o la crioconservación. También puede ser un factor limitante del éxito en pacientes que se someten a IUI, en la que es importante obtener más de un folículo. Pacientes que presentan este tipo de respuesta incluyen pacientes por encima de aproximadamente 33-35 años de edad,
55 pacientes con elevada línea de base de FSH, elevada línea de base de estradiol o reducida línea de base de
inhibina b.
En el macho, la espermatogénesis depende de la estimulación de las células de Sertoli por la FSH. La deficiencia de FSH da como resultado la oligospermia, y por tanto la infertilidad. El tratamiento de la infertilidad del macho con preparaciones convencionales de FSH requiere inyecciones de FSH tres veces a la semana durante hasta 18 meses.
En el documento WO 01/58493 (Maxygen) se describen moléculas de FSH modificadas, que tienen sitios de glicosilación adicionales. Se prueba un ejemplo de moléculas de FSH modificadas y se informa que tienen bioactividad reducida y un período de semidescomposición in vivo aumentado. El documento WO 01/58493 describe una variante de FSH con una mutación F17N en la subunidad alfa. Esta mutación introduce un tripéptido de consenso Asn17-Phe18-Ser19, en el que Asn17 está glicosilada.
El desarrollo de preparaciones de FSH con capacidad potenciada para estimular foliculogénesis, es una necesidad permanente. También existe necesidad de nuevas preparaciones de FSH para tratar a pacientes con baja respuesta a FSH. También son deseables preparaciones de FSH de período de semidescomposición más largo, que permitan protocolos más cortos de tratamiento y/o dosis acumulativas menores y/o dosificación menos frecuente, para ART, OI e infertilidad masculina.
Los inventores han diseñado nuevos mutantes de FSH con glicosilación aumentada y más largos períodos de semidescomposición para uso en tratamiento de trastornos reproductivos en pacientes humanos. El uso de una preparación mutante de FSH de la invención permite el uso de dosis acumulativas más bajas de FSH para conseguir un resultado clínico igual o mejor.
Por consiguiente, la invención proporciona una FSH mutante que muestra actividad de FSH, teniendo la FSH mutante al menos un sitio de glicosilación adicional, en comparación con FSH de tipo nativo, sitio de glicosilación que tiene un glicano. La invención proporciona además moléculas de ácido nucleico que codifican la FSH mutante. También se incluye en la invención un vector que contiene alguno de los ácidos nucleicos de la presente invención.
La presente invención también se dirige a células hospedadoras recombinantes que expresan una FSH mutante de la invención, en particular una célula hospedadora transformada con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de FSH que codifica la FSH mutante. En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición que incluye una FSH mutante y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Todavía más, la invención proporciona un procedimiento para producir una FSH mutante. El procedimiento incluye proporcionar una célula que contiene un ácido nucleico de FSH mutante, por ejemplo, un vector que incluye un ácido nucleico de mutante de FSH, y cultivar la célula en condiciones suficientes para que exprese el mutante de FSH. A continuación el mutante de FSH expresado se recupera de la célula.
En otro aspecto, la invención proporciona una FSH mutante para uso en tratamiento de infertilidad mediante inducción de ovulación, estimulación de foliculogénesis e hiperestimulación ovárica controlada, en particular en conjunción con ART.
Breve descripción de las Figuras:
La Figura 1 ilustra la actividad de FSH como respuesta a la dosis para mutantes F17T y E56N, en comparación con FSH recombinante convencional y FSH de tipo nativo.
La Figura 2 ilustra la actividad de FSH como respuesta a la dosis para mutantes D41N/A43T y G100N, en comparación con FSH recombinante convencional y FSH de tipo nativo.
La Figura 3 ilustra la actividad de FSH como respuesta a la dosis para mutante A70N, en comparación con FSH recombinante convencional.
La Figura 4 ilustra la actividad de FSH como respuesta a la dosis para mutantes F17T y E56, en comparación con FSH recombinante convencional y FSH de tipo nativo. La Figura 5 es una representación de un gel electroforético que demuestra el peso molecular más alto del mutante V78N, en comparación con FSH de tipo nativo.
La Figura 6 es la secuencia de aminoácidos para la subunidad alfa de FSH humana madura (SEQ ID NO: 1).
La Figura 7 es la secuencia de aminoácidos para la subunidad beta de FSH humana madura (SEQ ID NO: 2).
La Figura 8 es la secuencia de aminoácidos para mutante F17T de FSH (SEQ ID NO: 3).
La Figura 9 es la secuencia de aminoácidos para mutante E56N de FSH (SEQ ID NO: 4).
La Figura 10 es la secuencia de aminoácidos para mutante A70N de FSH (SEQ ID NO: 5).
La Figura 11 es la secuencia de aminoácidos para mutante V78N de FSH (SEQ ID NO: 6).
La Figura 12 es la secuencia de aminoácidos para mutante G100N de FSH (SEQ ID NO: 7).
La Figura 13 es la secuencia de aminoácidos para mutante D41N/A43T de FSH (SEQ ID NO: 8).
Sobre la base de la información derivada de la estructura cristalina de FSH, los inventores han diseñado mutantes con glicosilación aumentada sustituyendo aminoácidos específicos por asparagina o treonina, creando con ello sitios de reconocimiento de glicosilación adicionales.
Las sustituciones específicas fueron como sigue:
En la subunidad beta: A70N, V78N, G100N y D41N/A43T;
En la subunidad alfa: F17T y E56N.
Se sabe que los potenciales sitios de N-glicosilación in vivo son específicos para el patrón de consenso Asn-Xaa-Ser/Thr, y menos específicamente para el patrón Asn-Xaa-Cys, donde Xaa puede ser cualquier resto aminoácido. La probabilidad de N-glicosilación para la secuencia Asn-Pro-Ser/Thr es aproximadamente 50%, que es estadísticamente mucho más baja que la del otro patrón de consenso de Asn-Xaa-Ser/Thr. Sin embargo, la presencia del tripéptido de consenso no es suficiente para concluir que un resto asparagina vaya a ser glicosilado.
El plegamiento de la proteína desempeña un papel importante en la regulación de la N-glicosilación. Si los restos de consenso están enterrados en el interior de la estructura plegada de la proteína, es improbable que la glicosilación vaya a ocurrir en el sitio particular. Además, si se introduce por mutación un sitio de glicosilación, los restos mutados no deberían alterar la estructura tridimensional de la proteína ni detraer sustancialmente la función deseada de la proteína, tal como unión a receptor o activación. Por estas razones, el conocimiento estructural de la molécula de proteína es crítico para el éxito del diseño de mutantes de glicosilación.
Dos procedimientos que se han usado para progresar en el conocimiento de la estructura tridimensional de proteínas son el modelado y la estructura cristalina de rayos-X. Aunque hCG y FSH tienen patrones de plegamiento esencialmente idénticos, las dos estructuras son significativamente diferentes (Fox y col., 2001), y la estructura detallada para restos de aminoácidos individuales para la molécula de FSH no se puede modelar apropiadamente a partir de estructuras de hCG previamente determinadas (Wu y col., 1994; Lapthorn y col., 1994). Los inventores han diseñado mutantes solamente sobre la base de las estructuras cristalinas de la molécula de FSH humana (Fox y col., 2001).
Hay dos moléculas de FSH (cuatro subunidades) en cada unidad asimétrica en la estructura cristalina. Estas dos moléculas se superpusieron y se compararon, y cada resto se inspeccionó visualmente para identificar potenciales sitios de glicosilación que no alteraran la estructura de la molécula de proteína.
También se analizó el conocimiento estructural para descubrir potenciales regiones funcionales importantes de las moléculas glicoproteínicas de las hormonas, que incluyen FSH, hCG y TSH. El estudio comparado de las estructuras cristalinas de molécula de hCG sola (Wu y col., 1994; Lapthorn y col., 1994) y su complejo con fragmentos Fv de anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes (Tegoni y col., 1999) proporcionó pistas de importantes regiones para unión a receptor y activación. Una cara de la región "de tipo cintura" de la molécula de hCG es muy probable que se una al dominio extracelular del receptor, y se infirió este tipo de interacción para el sistema FSH-FSHR.
Usando el conocimiento estructural, se hizo un ajuste fino del ligando de FSH (Fox y col., 2001) a su modelo de receptor (Jiang y col., 1995). Se seleccionaron las siguientes seis mutaciones de sitio, que evitan todas ellas la interfaz ligando-receptor en un lado de la "región de cintura" de la molécula de FSH:
En la subunidad beta: A70N, V78N, G100N y D41N/A43T;
En la subunidad alfa: F17T y E56N;
en las que A es alanina, D es ácido aspártico, E es ácido glutámico, F es fenilalanina, G es glicina, N es asparagina, T es treonina, V es valina, y la notación "E4N" representa una sustitución de un ácido glutámico (E) en la posición 4 con una asparagina (N). Para la numeración de la secuencia, la secuencia de aminoácidos de FSH humana alfa se numera según la secuencia madura que se muestra en la Figura 6 o SEQ ID NO:1. La secuencia de aminoácidos de FSH humana beta se numera según la secuencia madura que se muestra en la Figura 7 o SEQ ID NO:2.
Así, la presente invención se refiere a preparaciones de FSH que tienen período de semidescomposición aumentado que resultan de una glicosilación aumentada añadiendo sobre la proteína uno o más sitios de glicosilación adicionales. Los sitios de este tipo se introdujeron mediante sustitución de restos en el esqueleto de la proteína de FSH con restos serina, treonina, lisina o asparagina usando, por ejemplo, mutagénesis. Para glicosilación in vivo, el sitio que se introduce debería ser tal que formara un "sitio de N-glicosilación", de la siguiente secuencia: N-X'-S/T/C-X'', donde X' es cualquier resto aminoácido excepto prolina, X'' es cualquier resto aminoácido que puede ser o no idéntico a X' y que preferiblemente es diferente de prolina, N es asparagina, y S/T/C representa un resto que puede ser serina, treonina o cisteína, preferiblemente serina o treonina, y lo más preferiblemente treonina.
Procedimientos para generar mutantes de FSH:
Los mutantes de FSH de la presente invención se pueden producir mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Estos procedimientos incluyen la construcción de secuencias de nucleótidos que codifican los respectivos mutantes de FSH y expresan la secuencia de aminoácidos en un hospedador transfectado adecuado. También se pueden producir mutantes de FSH de la presente invención mediante síntesis química o mediante una combinación de síntesis química y tecnología de ADN recombinante.
Los mutantes de FSH que se describen en la presente invención pueden comprender las subunidades FSH alfa y FSH beta en la forma de dos cadenas de polipéptidos separadas, donde las dos cadenas llegan a dimerizarse in vivo de modo que forman un polipéptido dímero, o pueden comprender un constructo de cadena única que comprende dos subunidades unidas de modo covalente mediante un enlace peptídico o un péptido enlazante. Los restos aminoácido del péptido enlazante deberán exhibir propiedades que no interfieran significativamente con la actividad del mutante de FSH.
La secuencia de nucleótidos que codifica las subunidades alfa y beta de los mutantes de FSH que se describen en la invención se puede construir aislando o sintetizando una secuencia de nucleótidos que codifican la subunidad de FSH progenitora, tal como la hFSH-alfa o hFSH-beta con las secuencias de aminoácidos que se muestran en las Figuras 6 y 7, respectivamente o SEQ ID Nos 1 y 2, respectivamente. A continuación se cambia la secuencia de nucleótidos de modo que se efectúe la sustitución de los restos de aminoácidos relevantes. La secuencia de nucleótidos se puede modificar mediante mutagénesis dirigida al sitio como en el Ejemplo 1 de la presente memoria de patente. En un caso alternativo, la secuencia de nucleótidos se puede preparar mediante síntesis química, en la que los oligonucleótidos se diseñan sobre la base de la secuencia específica de aminoácidos del mutante de FSH.
La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido se inserta en un vector recombinante y unido operablemente a secuencias de control necesarias para expresión del polipéptido en la célula hospedadora transfectada deseada. Un experto en la técnica puede hacer una selección entre estos vectores, secuencias de control de expresión y hospedadores sin excesiva experimentación.
El vector recombinante puede ser un vector que se replica de manera autónoma, esto es un vector que existe como entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Como alternativa, el vector es uno que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto con el o los cromosomas en que se ha integrado.
El vector es preferiblemente un vector de expresión en el que la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención se une operablemente a segmentos adicionales que se requieren para transcripción de la secuencia de nucleótidos. El vector se deriva típicamente de ADN plasmídico o viral. Numerosos vectores de expresión adecuados para expresión en las células hospedadoras que se mencionan en este documento están disponibles comercialmente o están descritos en la bibliografía.
El vector recombinante puede comprender adicionalmente una secuencia de ADN que permite que el vector se replique en la célula hospedadora en cuestión. Un ejemplo de una secuencia de este tipo, (cuando la célula hospedadora es una célula de mamífero) es el origen de replicación de SV40.
El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo un gen cuyo producto complementa una carencia en la célula hospedadora, tal como el gen que codifica dihidrofolato reductasa (DHFR) o uno que confiere resistencia a un fármaco, por ejemplo ampicilina, kanamicina, tetraciclina cloramfenicol, neomicina, higromicina o metotrexato.
El vector también puede comprender un gen amplificable, tal como DHFR, de manera que las células que tienen múltiples copias del gen amplificable y secuencias flanqueantes, que incluyen al ADN de FSH mutante, se pueden seleccionar sobre medios apropiados.
La expresión "secuencias de control" se define en este documento de modo que incluye todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión del polipéptido de la invención. Ejemplos de secuencias de control adecuadas para dirigir la transcripción en células de mamíferos incluyen los promotores tempranos y tardíos de SV40 y adenovirus, por ejemplo el promotor principal tardío de adenovirus 2, el promotor de MT-1 (gen de metalotioneína) y el promotor de gen inmediato-temprano de citomegalovirus humano (CMV).
Las secuencias de nucleótidos de la invención que codifican los mutantes de FSH, ya sean preparadas mediante mutagénesis dirigidas al sitio, síntesis, PCR u otros procedimientos, también puede incluir opcionalmente una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal. El péptido señal está presente cuando el polipéptido se ha de segregar a partir de las células en las que está expresado. El péptido señal de este tipo, si está presente, debería ser alguno reconocido por la célula elegida para expresión del polipéptido. El péptido señal puede ser homólogo (por ejemplo ser el que se asocia normalmente con una subunidad de hFSH) o heterólogo (esto es que se origina de otra fuente distinta de hFSH) al polipéptido o puede ser homólogo o heterólogo a la célula hospedadora, es decir ser un péptido señal que se expresa normalmente desde la célula hospedadora o uno que no se expresa normalmente desde la célula hospedadora.
Se puede usar cualquier hospedador adecuado para producir las subunidades de polipéptido de la invención, incluyendo bacterias, hongos, (incluyendo levaduras), planta, insecto, mamífero, u otras células animales apropiadas
- o líneas celulares, así como animales o plantas transgénicas. Ejemplos de células hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen líneas celulares de ovario de hamster chino (CHO), (por ejemplo CHO-KL; ATCC CCL-61), líneas celulares de mono verde (COS) (por ejemplo COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de ratón (por ejemplo NSIO), líneas celulares de riñón de hamster recién nacido (BI-EK) (por ejemplo ATCC CRL1632 o ATCC CCL-10), y células humanas (por ejemplo BEK 293 (ATCC CRL-1573)), así como células de plantas en cultivo tisular. En la técnica se conocen líneas celulares adicionales adecuadas y disponibles a partir de depositarios públicos tales como American Type Culture Collection, EE.UU. Procedimientos para introducir ADN exógeno en células hospedadoras de mamíferos incluyen transfección mediada por fosfato de calcio, electroporación, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposoma y vectores virales.
Se cultivan células en un medio nutritivo adecuado para producción del polipéptido usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede cultivar la célula mediante cultivo en matraz con agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (que incluye fermentaciones continuas, por lotes, lotes alimentados,
- o en estado sólido) en fermentadores industriales o de laboratorio que se realiza en un medio adecuado y en condiciones que permiten que se exprese y/o se aísle el polipéptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y de nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo en catálogos de American Type Culture Collection). Si el polipéptido se segrega en el medio nutritivo, se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se segrega, se puede recuperar desde lisados celulares.
El polipéptido de FSH mutante que resulta se puede recuperar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede recuperar del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a ellos, centrifugación, filtración, extracción, secado por atomización, evaporación, o precipitación.
Los polipéptidos de FSH mutante se pueden purificar mediante una serie de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a ellos, cromatografía (por ejemplo de intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y exclusión por tamaño), procedimientos por electroforesis (por ejemplo enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extracción.
En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende mutantes de FSH según la invención. Se pueden usar composiciones farmacéuticas de este tipo para estimular la foliculogénesis, por ejemplo en conjunción con inducción de ovulación o técnicas de reproducción asistida (ART). Dado que los mutantes de FSH de la invención son particularmente eficaces para inducir que se desarrollen y maduren folículos múltiples, son particularmente adecuados para uso en las ART, en las que se desea recoger oocitos múltiples.
Como alternativa, eligiendo cuidadosamente la dosis a la medida del caso, los mutantes de FSH de la invención se pueden usar para inducir mono-foliculogénesis para OI, o paucifoliculogénesis (hasta tres folículos aproximadamente) para IUI, para fertilización in vivo. También se puede obtener mono-foliculogénesis con dosis reducida de un mutante de FSH, o dosificación menos frecuente en comparación con preparaciones de FSH convencionales. Por ejemplo, en OI se puede administrar una preparación de FSH de la invención a 225-400 UI cada tres días, o dosis inferiores, dependiendo de la respuesta de la paciente. La respuesta de la paciente se puede seguir mediante ecografía.
Los mutantes de FSH de la invención se pueden usar en un régimen de hiperestimulación ovárica controlada (COH). Los regímenes estándar para COH incluyen una fase de regulación a la baja en la que la hormona luteinizante endógena (LH) se regula a la baja mediante administración de un agonista de hormona que libera gonadotropina (GnRH) a lo que sigue una fase estimulante en la que se induce el desarrollo folicular (foliculogénesis) mediante administración diaria de hormona estimuladora del folículo (FSH), habitualmente a aproximadamente 150-225 UI/día. Como alternativa, la estimulación se inicia con FSH después de la menstruación espontánea o inducida, a la que sigue administración de un antagonista de GnRH (que se inicia típicamente alrededor del día seis de la fase estimulante). Cuando hay al menos 3 folículos >16 mm (uno de 18 mm), se administra un bolus único de hCG (5
10.000 UI) para imitar el incremento repentino natural de LH e inducir la ovulación. La recuperación de oocito se planifica para 36-38 horas después de la inyección de hCG.
Los mutantes de FSH de la invención también se pueden usar para OI e IUI. Por ejemplo, la estimulación de FSH con una preparación de la invención se inicia después de la menstruación espontánea o inducida, con una dosis diaria de 75-150 UI. Cuando 1 o 3 folículos han alcanzado un diámetro de al menos 16 mm, se administra un bolus único de hCG para inducir la ovulación. La inseminación se realiza in vivo, mediante relación sexual natural o IUI.
Dado que los mutantes de FSH de la invención tienen un período de semidescomposición aumentado con respecto a las preparaciones de FSH conocidas, los regímenes tales como los que se han descrito anteriormente pueden emplear dosis de FSH con UI inferiores, y/o se pueden modificar disminuyendo el período de estimulación de FSH, consiguiendo al tiempo igual o mejor respuesta, en términos de número y viabilidad de folículos. Por ejemplo, usando una preparación de FSH de la invención, se puede conseguir foliculogénesis adecuada con dosis diarias de 50-150 UI de FSH o aproximadas, preferiblemente de 50-100 o aproximadas, más preferiblemente de 50-75 UI de FSH o aproximadas. La dosificación de FSH es habitualmente sobre base diaria o semidiaria. El período de dosificación puede ser de menos de 14 días o aproximadamente, preferiblemente menos de 12 días o aproximadamente, más preferiblemente menos de 11 o 10 días o aproximadamente.
Para OI, las preparaciones de mutantes de FSH de la invención se pueden administrar a dosis de 25-150 UI de FSH/día, preferiblemente, 50-125 UI de FSH/día.
Para el tratamiento de la infertilidad masculina, se puede administrar una preparación de mutante de FSH de la invención a 3 x 150 a 300 UI/semana hasta que la espermatogénesis alcanza niveles adecuados para inseminación, ya sea por relaciones sexuales naturales o técnicas de ART.
Dado el período de semidescomposición más prolongado de la FSH mutante de la invención, se puede administrar como preparación de actuación prolongada. Se puede administrar FSH convencional a 300 UI o aproximadamente en días alternos, mientras que se alcanzan resultados similares para administración todos los días a 150 UI o aproximadamente. La expresión "actuación prolongada" quiere dar a entender que abarca preparaciones de FSH que se pueden administrar menos frecuentemente que cada dos días. Se puede administrar FSH mutante preferida de la invención cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, o cada siete días, mientras se consiguen resultados similares o mejores que con administración diaria de FSH convencional.
Composiciones farmacéuticas de la invención:
En un aspecto los mutantes de FSH o sus composiciones farmacéuticas según la invención se usan para la fabricación de un medicamento para tratamiento de enfermedades, trastornos o dolencias.
En otro aspecto el polipéptido o la composición farmacéutica según la invención es para uso en un procedimiento para tratar a un mamífero, en particular un ser humano, que comprende administrar al mamífero que lo necesita un polipéptido o composición farmacéutica de este tipo.
Será evidente para los expertos en la técnica que una cantidad eficaz de un conjugado, preparación o composición de la invención depende, inter alia, de la enfermedad, la dosis, el esquema de administración, de si el polipéptido o conjugado o composición se administra solo o en conjunción con otros agentes terapéuticos, el período de semidescomposición del suero de las composiciones, y la salud general del paciente. Típicamente, una dosis eficaz de la preparación o composición de la invención es suficiente para garantizar un efecto terapéutico.
Los mutantes de FSH de la presente invención se administran normalmente en una composición que incluye uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. "Farmacéuticamente aceptable" quiere dar a entender un vehículo o excipiente que no produce ningún efecto adverso en pacientes a quienes se administra. Vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables de este tipo son muy conocidos en la técnica, y el polipéptido o conjugado de la invención se puede formular en composiciones farmacéuticas mediante procedimientos muy conocidos (véanse, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)). Excipientes farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en composiciones que comprenden el polipéptido o conjugado de la invención incluyen, por ejemplo, agentes tamponadores, agentes estabilizadores, conservantes, isotónicos, tensioactivos no iónicos o detergentes ("agentes humectantes"), antioxidantes, agentes de volumen o cargas, agentes quelantes o codisolventes.
La composición farmacéutica de los mutantes de FSH de la invención se puede formular en diversas formas, que incluyen líquidos, por ejemplo disoluciones o suspensiones preparadas para uso inmediato, geles, liofilizados, o cualquier otra forma adecuada, por ejemplo polvo o cristales adecuados para preparar una disolución. La forma preferida dependerá de la indicación particular que se esté tratando y será evidente para el experto en la técnica.
La composición farmacéutica que contiene un mutante de FSH de la invención se puede administrar de forma intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, sublingual, bucal, intranasal, transdérmica, por inhalación, o de cualquier otra manera aceptable, por ejemplo, usando tecnología PowderJect o ProLease o un sistema de inyección de lápiz. El modo de administración preferido dependerá de la indicación particular que se esté tratando y será evidente para el experto en la técnica. En particular, es ventajoso que la composición se administre subcutáneamente, puesto que esto permite que la paciente realice su auto-administración.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar en conjunción con otros agentes terapéuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte de la misma composición farmacéutica o se pueden administrar separadamente del polipéptido o conjugado de la invención, ya sea concurrentemente o en conformidad con cualquier otro esquema de tratamiento aceptable. Además, el polipéptido, conjugado o composición farmacéutica de la invención se puede usar como adjunto para otras terapias.
La invención se ilustrará con los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1: Generación de mutantes de FSH por glicosilación de unión por N
Se subclonaron los ADNc de las subunidades alfa y beta de FSH en el vector pDONR (Invitrogen). Se usó el kit QuickChange® de mutagénesis dirigida al sitio para introducir los sitios de glicosilación de unión por N en las subunidades alfa y beta de FSH. El sistema QuickChange® utiliza dos cebadores oligonucleotídicos sintéticos que contienen la(s) mutación(es) deseada(s). Se usaron los siguientes pares de oligonucleótidos para introducir los sitios de glicosilación de unión por N: CC TTG TAT ACA TAC CCA AAC GCC ACC CAG TGT CAC y GTG ACA CTG GGT GGC GTT TGG GTA TGT ATA CAA GG para V78N, GC TGT GCT CAC CAT AAC GAT TCC TTG TAT ACA TAC C y GGT ATG TAT ACA AGG AAT CGT TAT GGT GAG CAC AGC para A70N, GAT CTG GTG TAT AAG AAC CCA ACT AGG CCC AAA ATC CA y TGG ATT TTG GGC CTA GTT GGG TTC TTA TAC ACC AGA TC para D41N/A43T, TGT ACT GTG CGA GGC CTG AAC CCC AGC TAC TGC TCC y GGA GCA GTA GCT GGG GTT CAG GCC TCG CAC AGT ACA para G100N, G AAC GTC ACC TCA AAC TCC ACT TGC TG y CA GCA AGT GGA GTT TGA GGT GAC GTT C para E56N, y CAG GAA AAC CCA ACC TTC TCC CAG CC y GG CTG GGA GAA GGT TGG GTT TTC CTG para F17T. La secuencia de los mutantes se confirmó usando el kit ABI PRISM BigDye® Terminator v3.0 Ready para secuenciación por ciclos de reacción a lo que siguió análisis con el analizador genético ABI PRISM
310.
El vector de expresión pCI de mamífero (Promega) se convirtió en un vector de destino GATEWAY usando el sistema GATEWAY para conversión de vectores (Invitrogen). Los mutantes alfa y beta junto con las subunidades recombinantes convencionales fueron subclonados en el vector de expresión pCI usando la tecnología de clonación Gateway® (Invitrogen). El vector de expresión pCI contiene el potenciador/promotor inmediato-temprano de citomegalovirus humano para regular la expresión del gen insertado, un intrón cadena arriba del gen para promover la expresión y la señal de poliadenilación tardía del virus 40 de simio cadena abajo desde el gen insertado para terminar la transcripción. Los mutantes alfa de E56N y F17T en pCI fueron co-transfectados con FSH beta recombinante convencional en pCI mientras que los mutantes beta A70N, G100N, V78N y D41N/A43T en pCI fueron co-transfectados con la subunidad alfa recombinante convencional en pCI. Como control, fueron co-transfectadas la subunidad beta de FSH beta recombinante convencional en pCI y la subunidad alfa en pCI. Los plásmidos fueron transfectados transitoriamente en células HEK293 (ATTC, CRL-10852) usando el procedimiento de fosfato de calcio (patente Wurm). Un día después de la transfección se cambió el medio a DMEM/F12 (Invitrogen, 11320-033) que contenía 1 !g/ml de insulina (Invitrogen, 18140-020), 6,8 ng/ml de selenito de sodio (Sigma, S5261) y 12,2 ng/ml de citrato férrico (Sigma, F3388). El día siguiente al cambio de medio, se recogió el medio acondicionado y se centrifugó durante 5 minutos a aproximadamente 800 x g a 4ºC para retirar cualquier fragmento celular. La concentración de la FSH en el medio acondicionado se determinó con un kit de ELISA específico para FSH (Alpha Diagnostic International, 0200).
Se probó la actividad agonista de los mutantes de FSH y FSH recombinante convencional en un análisis CHO/FSHR/Luc. En este análisis una línea celular de ovario de hamster chino (CHO) se transfectó establemente con el receptor de FSH humana y un gen reportero de luciferasa bajo la regulación del elemento de respuesta al AMPc (CRE). Un agonista del receptor de FSH aumenta el nivel de AMPc en la célula lo que da como resultado la activación de la proteína CREB (unión del elemento de respuesta al AMPc). Esta proteína interactúa con el CRE sobre el ADN y da como resultado una transcripción aumentada del gen de luciferasa que está cadena abajo de este elemento. Se añadieron cantidades variables de medio acondicionado de las transfecciones transitorias a las células de CHO/FSHR/Luc y después de una incubación de 3,5 horas se midió la cantidad de luciferasa en las células tratadas con el kit de análisis de gen reportero de luciferasa LucLite (Packard BioScience, 6016911) y un contador de centelleo de microplaca y luminiscencia TopCount NXT (Packard). Los seis mutantes de glicosilación de unión por N tuvieron actividad en el análisis CHO/FSHR/Luc comparable a la de FSH recombinante convencional (Véanse Figuras 1, 2, 3, y 4).
Ejemplo 3: Análisis de un mutante de glicosilación de unión por N
El plásmido pCI que contiene o bien la subunidad beta recombinante convencional o el mutante beta de V78N fue co-transfectado con subunidad alfa recombinante convencional en pCI. Los plásmidos se transfectaron transitoriamente en células de CHO usando el procedimiento de Lipofectamina 2000 (Invitrogen). El día después de la transfección, las células se marcaron con [35S]cisteína incubando las células en DMEM-metionina, cistina y Lglutamina (Sigma, D0422) que contenía 4mM de L-glutamina, 15!g/ml de L-metionina, 1% de suero bovino fetal dializado (Invitrogen, 26400-044) y 100 uCi/ml de [35S]cisteína (Amersham-Pharmacia, SJ15232) durante cuatro horas. Se retiró el medio acondicionado y se centrifugó a 16.000 x g en Biofuge fresco (Heraeus Instruments) durante 5 minutos y a continuación se reclarificó adicionalmente el medio filtrando a través de un filtro Acrodisc de 0,45 !m (Gelman Sciences, 4184). Se añadió tris 1 M, pH 4 al medio clarificado para tener una concentración final de 50 mM y se añadió Tween20 para tener una concentración final de 0,1%. Se añadió Sepharose CI-4B acoplada a anticuerpo monoclonal dirigido contra la subunidad beta de FSH para inmunoprecipitar la FSH marcada. El inmunoprecipitado se lavó tres veces con una disolución que contenía tris 50 mM, pH 7,4 Tween 20 al 0,1% y cloruro de sodio 150 mM a lo que siguió un lavado con tris 50 mM, pH 7,4. Se añadió tampón de muestra de tris-glicina que contenía ditiotreitol (Jule, Inc., TGSB2XR) al inmunoprecipitado y se calentó a 100ºC aproximadamente durante tres minutos y se centrifugó a 16.000 x g en Biofuge fresco (Heraeus Instruments) durante 5 minutos. Lo sobrenadante se cargó a un gel prefabricado de poliacrilamida Tris-glicina del 12% (Jule Inc., HLC156) y el gel se trató en una unidad de electroforesis Hoefer SE400 a 125 V durante 12 horas. Tras la electroforesis se colocó el gel en una disolución fijadora que contenía 40% de metanol y 10% de ácido acético durante 30 minutos a temperatura ambiente y a continuación en una disolución de glicerol que contenía 10% de ácido acético y 1% de glicerol durante 30 minutos. Se secó el gel en un secador de geles Bio-Rad modelo 583 a 80ºC durante 1 hora. Después de secar, el gel se expuso a un Molecular Dynamics Phosphorimager: 455SI durante 20 horas. Los resultados muestran que la subunidad beta de mutante V78N tenía una masa molecular mayor que la subunidad beta de FSH recombinante convencional, indicando que el mutante V78N está glicosilado en el sitio introducido.
Ejemplo 4: Generación de FSH mutante a escala prep
Se subclonaron los ADNc de las subunidades alfa y beta de FSH humana en el vector pDONR (Invitrogen). Se usó el kit QuickChange® de mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene) para introducir los sitios de glicosilación de unión por N en las subunidades alfa y beta de FSH. El sistema QuickChange® utiliza dos cebadores oligonucleotídicos sintéticos que contienen la(s) mutación(es) deseada(s). Se usaron los siguientes pares de oligonucleótidos para introducir los sitios de glicosilación de unión por N: CC TTG TAT ACA TAC CCA AAC GCC ACC CAG TGT CAC y GTG ACA CTG GGT GGC GTT TGG GTA TGT ATA CAA GG para V78N, GC TGT GCT CAC CAT AAC GAT TCC TTG TAT ACA TAC C y GGT ATG TAT ACA AGG AAT CGT TAT GGT GAG CAC AGC para A70N, GAT CTG GTG TAT AAG AAC CCA ACT AGG CCC AAA ATC CA y TGG ATT TTG GGC CTA GTT GGG TTC TTA TAC ACC AGA TC para D41N/A43T, TGT ACT GTG CGA GGC CTG AAC CCC AGC TAC TGC TCC y GGA GCA GTA GCT GGG GTT CAG GCC TCG CAC AGT ACA para G100N, G AAC GTC ACC TCA AAC TCC ACT TGC TG y CA GCA AGT GGA GTT TGA GGT GAC GTT C para E56N, y CAG GAA AAC CCA ACC TTC TCC CAG CC y GG CTG GGA GAA GGT TGG GTT TTC CTG para F17T. Se confirmaron las secuencias de ADN de los ADNc mutantes usando el kit ABI PRISM BigDye® Terminator v3.0 Ready para secuenciación por ciclos de reacción a lo que siguió análisis con el analizador genético ABI PRISM 310.
El vector de expresión pCI de mamífero (Promega) se convirtió en un vector de destino GATEWAY usando el sistema GATEWAY para conversión de vectores (Invitrogen). Los mutantes alfa y beta junto con las subunidades de tipo nativo fueron subclonados en el vector de expresión de pCI usando la tecnología de clonación Gateway® (Invitrogen). El vector de expresión pCI contiene el potenciador/promotor inmediato-temprano de citomegalovirus humano para regular la expresión del gen insertado, un intrón cadena arriba del gen para promover la expresión y la señal de poliadenilación tardía del virus 40 de simio cadena abajo del gen insertado para terminar transcripción. Los mutantes alfa de E56N y F17T en pCI fueron co-transfectados con FSH beta de tipo nativo en pCI mientras que los mutantes beta A70N, G100N, V78N y D41N/A43T en pCI fueron co-transfectados con la subunidad alfa de tipo nativo en pCI. Como control, fueron co-transfectadas la subunidad beta de FSH beta de tipo nativo en pCI y la subunidad alfa en pCI. Los plásmidos fueron transfectados transitoriamente en células HEK293 (ATTC, CRL-10852) usando el procedimiento del fosfato de calcio (por ejemplo, según se describe en el documento WO 96/07750). Como alternativa, el plásmido pCI que contiene o bien la subunidad beta de tipo nativo o el mutante beta V78N se co-transfectó con subunidad alfa de tipo nativo en pCI. Los plásmidos también pueden ser transfectados transitoriamente o establemente en células de CHO. Un día después de la transfección se cambió el medio a DMEM/F12 (Invitrogen, 11320-033) que contenía 1 !g/ml de insulina (Invitrogen, 18140-020), 6,8 ng/ml de selenito de sodio (Sigma, S5261) y 12,2 ng/ml de citrato férrico (Sigma, F3388). El día siguiente al cambio de medio, se recogió el medio acondicionado y se centrifugó durante 5 minutos a aproximadamente 800 x g a 4ºC para retirar cualquier fragmento celular. Se retiró lo sobrenadante y se centrifugó a 16.000 x g en Biofuge fresco (Heraeus Instruments) durante 5 minutos y a continuación se reclarificó adicionalmente el medio filtrando a través de un filtro Acrodisc de 0,45 !m (Gelman Sciences, 4184). Se añadió tris 1 M, pH 4 al medio clarificado para tener una concentración final de 50 mM de Tris y se añadió Tween20 para tener una concentración final de 0,1% de Tween20.
Los mutantes de FSH se purificaron del extracto celular usando cromatografía de inmunoafinidad, en Sepahrose derivatizada con anticuerpos monoclonales anti-FSH inmovilizados usando divinilsulfona (Immunoresin anti-FSHMcAb-DVS-Sepharose). Se pueden producir resinas de este tipo mediante procedimientos conocidos por un profesional experto, por ejemplo, según se describe en el documento WO/88/10270.
La resina se equilibró en un tampón equilibrador, consistente en un tampón de Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,3 M a pH = 7,5, a 4ºC. La columna estaba cargada con una cantidad de UI de FSH (mediante radioinmunoanálisis, RIA) correspondiente a 80-90% de la capacidad total de unión de FSH de la columna.
Las proteínas no retenidas se eluyeron con tampón equilibrador (como anteriormente) hasta que la OD280 del eluído era inferior a 0,02.
La FSH mutante absorbida se eluyó de la inmunorresina con disolución de amoníaco 1 M a 4ºC. Se acumularon en el mismo recipiente los eluídos correspondientes a aproximadamente 4 veces el volumen de inmunorresina, se ajustó el pH a 9,0 mediante adición de ácido acético glacial a 4ºC, lo antes posible después de la recogida, y la disolución se sometió a ultrafiltración en un aparato Amicon (corte de la membrana en 10.000 Da) y se concentró hasta un pequeño volumen.
La disolución concentrada de FSH mutante se sometió a continuación a una etapa de HPLC de fase inversa, usando un cromatógrafo de líquidos Waters Prep LC 500A provisto de un detector de UV y un generador de gradiente preparativo. Antes de la aplicación a la columna, se ajustó el pH de la disolución a aproximadamente 5,6. La disolución se cargó a una columna de fase inversa C18 (cartuchos Prepak 500 C18 de Waters) que se había equilibrado previamente con tampón de acetato de amonio 0,05 M, pH = 5,6 a temperatura ambiente. El caudal fue de 100 ml/min y el eluído se monitorizó a 280 nm.
La FSH mutante se eluyó mediante un gradiente de isopropanol hasta 50% de la fase móvil. Las fracciones se comprobaron mediante cromatografía analítica en fase gaseosa (GPC), y radioinmunoanálisis (RIA). El disolvente orgánico se retiró mediante destilación al vacío a menos de 40ºC, y la disolución se congeló y se liofilizó.
Todas las publicaciones y solicitudes de patentes citadas en esta memoria de patente se incorporan a este documento por referencia como si cada publicación individual o solicitud de patente hubieran indicado específicamente e individualmente que fueran incorporadas por referencia. Aunque la invención precedente se ha descrito con detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de aclarar su comprensión, será inmediatamente evidente para los expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención que se pueden hacer a la misma ciertos cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu ni del alcance de las reivindicaciones que se adjuntan.
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3) Tegoni M et al, 1999. Crystal structure of a ternary complex between human chorionic gonadotropin (hCG) and two Fv fragments specific for the alpha and beta-subunits.
4) Jiang X. et al, 1995. Structure predictions for the ligand-binding region of glycoprotein hormone receptors and the nature of hormone-receptor interactions. Structure. 3:1341.
Claims (8)
- REIVINDICACIONES1. Un mutante de FSH, caracterizado porque se ha introducido un sitio de N-glicosilación en la subunidad alfa de FSH mediante la mutación F17T, en el que el mutante de FSH comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3.5 2. Una composición que comprende un mutante de FSH según la reivindicación 1 y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
- 3. El uso de un mutante de FSH según la reivindicación 1 para la fabricación de una medicina para tratamiento de la infertilidad de un mamífero estimulando la foliculogénesis, o induciendo hiperestimulación ovárica.
- 4. Un mutante de FSH según la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de la infertilidad de un mamífero 10 estimulando la foliculogénesis, o induciendo hiperestimulación ovárica.
-
- 5.
- Una secuencia de nucleótidos que codifica un mutante de FSH de la reivindicación 1.
-
- 6.
- Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 5.
-
- 7.
- Una célula hospedadora que comprende un vector según la reivindicación 6.
-
- 8.
- Una célula hospedadora de la reivindicación 7 que es eucariota.
15 9. Una célula hospedadora de la reivindicación 7 que es de mamífero. - 10. Un procedimiento para producir un mutante de FSH, que comprende someter a una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 a cultivo en condiciones que conducen a la expresión de dichos mutantes.
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